A Imunomodulação dos Linfócitos T CD4+ e TCD8+

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE CLÍNICA MÉDICA
FELIPE SALDANHA DE ARAUJO
A Imunomodulação dos Linfócitos T CD4+ e TCD8+
Induzida pelas Células Tronco Mesenquimais
Ribeirão Preto
2010
2
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE CLÍNICA MÉDICA
FELIPE SALDANHA DE ARAUJO
A Imunomodulação dos Linfócitos T CD4+ e TCD8+ Induzida pelas
Células Tronco Mesenquimais
Tese
apresentada
Medicina
de
à
Faculdade
Ribeirão
Preto
de
da
Universidade de São Paulo como parte
dos
requisitos
obtenção
do
necessários
título
de
para
Doutor
a
em
Ciências Médicas
Área de Concentração: Clínica Médica
Opção: Investigação Biomédica
Orientador: Marco Antonio Zago
Co-orientador: Rodrigo Alexandre Panepucci
Ribeirão Preto
2010
3
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por
qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e
pesquisa, desde que citada a fonte.
FICHA CATALOGRÁFICA
Saldanha-Araujo, Felipe
A imunomodulação dos Linfócitos TCD4+ e TCD8+ Induzida pelas Células
Tronco Mesenquimais. Ribeirão Preto, 2010.
Tese de doutorado apresentado à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/USP – Área de Concentração: Clínica Médica
Orientador: Zago, Marco Antonio
1.Células Tronco Mesenquimais. 2.Linfócitos T. 3.Imunomodulação.
4.Microarray.
4
Esta
tese
recebeu
fomento
da
Fundação de Amparo a pesquisa do
Estado
de São Paulo
processo 06/61127-4.
(FAPESP),
5
SALDANHA-ARAUJO, F. A Imunomodulaçao dos Linfócitos T CD4+ e
TCD8+ induzida pelas Células Tronco Mesenquimais. Tese apresentada a
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo como
parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Ciências Médicas.
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof.Dr._____________________Instituição:___________________________
Julgamento__________________Instituição:___________________________
Prof.Dr._____________________Instituição:___________________________
Julgamento__________________Instituição:___________________________
Prof.Dr._____________________Instituição:___________________________
Julgamento__________________Instituição:___________________________
Prof.Dr._____________________Instituição:___________________________
Julgamento__________________Instituição:___________________________
Prof.Dr._____________________Instituição:___________________________
Julgamento__________________Instituição:___________________________
6
Dedico esta tese a meus filhos,
Thais, Felipe e Renato, meus
amores e minha motivação.
7
Agradeço ao Prof. Marco
Antonio Zago, pela formação,
pelo apoio e pela grande
oportunidade.
8
Agradecimentos
A Deus pela oportunidade e apoio;
A meus Pais, Renato (in memoriam) e Celi, que acompanham todos os meus
passos e certamente são as pessoas que mais me apoiaram e torceram por
mim durante essa jornada;
A minha esposa Liliane pela paciência, companheirismo e incentivo durante
esse período;
Ao meu padrinho Alcino pela torcida;
Ao Prof. Dr. Rodrigo Alexandre Panepucci pela grande amizade, co-orientação
e pelos ensinamentos;
Ao Prof. Dr. Dimas Tadeu Covas por disponibilizar a estrutura da Fundação
Hemocentro de Ribeirão Preto para realização desse trabalho;
A Marli e a Amélia pela grande amizade, pelos ensinamentos e pelo apoio
técnico durante a realização desse trabalho;
A Patrícia Palma e Camila Menezes pela amizade e pela colaboração nas
análises de citometria de fluxo;
9
Aos colegas do laboratório de Biologia Celular, Maristela Orellana, Sâmia
Caruso, Karina Candido e Taísa Fernandes, pelo apoio dado para a realização
desse trabalho;
A Professora Dra. Regina Helena Queiroz, da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto, por colaborar com esse trabalho;
A Dra. Simone Kashima e Dra. Kelen Farias pela colaboração durante este
período;
A Professora Dra. Ana Maria de Souza pela grande colaboração para a minha
formação profissional;
A Professora Cristina Fabião e ao Dr. Rodrigo Proto-Siqueira por viabilizarem
minha vinda para Ribeirão Preto e colaborarem com meu desenvolvimento
acadêmico e profissional;
Aos colegas e amigos do Laboratório de Hematologia e Biologia Molecular,
Francisco, Josi, Lucila, Carol, Rodrigo (Turquinho), Mariane, Claudinha, Júlia e
Beth;
Aos grandes amigos e colegas de pós-graduação com os quais compartilhei
por um ano a mesma moradia: Antonio Roberto, Germano Aguiar, Otone
Verissímo e Bruno Verbeno.
10
A amiga Dalvinha pela dedicação;
A todos os demais colegas que estiveram envolvidos no meu desenvolvimento
profissional.
A FAPESP pela bolsa concedida.
11
“Disciplina é a ponte que
liga
nossos
sonhos
nossas realizações”
(Pat Tillman)
às
12
PREFÁCIO
O projeto de doutorado proposto tinha como objetivo principal identificar
as bases moleculares envolvidas na imunomodulação dos linfócitos TCD4+ e
TCD8+ mediada pelas células troncos mesenquimais (CTMs), por metodologia
de microarray. Entretanto, a medida que foi sendo executado, o projeto se
desmembrou em outros dois estudos que serão separadamente abordados
nessa tese. O primeiro estudo refere-se à geração de linfócitos com fenótipo
CD69+ (marcador de ativação e de célula regulatória), que são induzidos pelas
CTMs. Esse resultado, obtido durante a padronização dos experimentos foi
posteriormente confirmado no estudo por microarray. A segunda observação,
que se vincula a anterior, foi a demonstração que dentre os genes mais
diferencialmente expressos entre os linfócitos TCD4+ cultivados isoladamente e
na presença de células tronco mesenquimais, estavam componentes
envolvidos no metabolismo da adenosina, um potente imunomodulador.
A
comprovação funcional deste resultado completou essa tese, em que
esclarecemos, pelo menos em parte, a questão que nos propusemos a
investigar.
No presente trabalho, os resultados serão apresentados separadamente.
Inicialmente discutiremos os achados obtidos pelo estudo de microarray. Os
capítulos (vide índice) I e II serão destinados a discussão da expressão do
marcador CD69 em linfócitos cultivados com CTMs, e ao envolvimento da
adenosina na imunomodulação induzida pelas CTMs, respectivamente.
13
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................................................. 19
ABSTRACT .............................................................................................................................................. 21
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 24
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 34
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................ 36
3.1 CASUÍSTICA ...................................................................................................................................... 36
3.2 CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS (CTMS)...................................................................................... 36
3.3 CARACTERIZAÇÃO POR CITOMETRIA DE FLUXO DAS CTMS ............................................................. 37
3.4 ISOLAMENTO DE LINFÓCITOS T CD3+ DO SANGUE PERIFÉRICO ........................................................ 38
3.5 AVALIAÇÃO DA PUREZA DAS CÉLULAS T .......................................................................................... 39
3.6 CONDIÇÕES DE CULTURA DOS LINFÓCITOS T ................................................................................... 39
3.8 ISOLAMENTO DE LINFÓCITOS T CD4 E TCD8 DOS CULTIVOS CELULARES ....................................... 41
3.9 AVALIAÇÃO DA PUREZA DAS CÉLULAS TCD4 E TCD8 ..................................................................... 42
3.10 EXTRAÇÃO DO RNA ....................................................................................................................... 42
3.11 QUANTIFICAÇÃO DO RNA .............................................................................................................. 43
3.12 ANÁLISE DE QUALIDADE DO RNA ................................................................................................. 43
3.13 CULTURA EM PLACA DE 12 POÇOS (ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR) ...................................... 43
3.14 ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR PELO KIT BRDU ................................................................... 44
3.15 MICROARRAY ................................................................................................................................. 46
3.15.1 Análise dos Dados de Microarray ......................................................................................... 47
3.16 PCR EM TEMPO REAL...................................................................................................................... 50
4. RESULTADOS ..................................................................................................................................... 52
4.1 CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DAS CTMS ...................................................................................... 52
4.2 CARACTERIZAÇÃO IMUNOFENOTÍPICA DAS CTMS ........................................................................... 53
4.3 PUREZA DOS LINFÓCITOS T CD3 OBTIDOS POR SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA ............................... 53
4.4 PUREZA DOS LINFÓCITOS TCD4 E TCD8 OBTIDOS POR SEPARAÇÃO IMUNOMAGNÉTICA .................. 54
4.5 PROLIFERAÇÃO DOS LINFÓCITOS CULTIVADOS OU NÃO COM CTMS ................................................. 55
4.6 MICROARRAY ................................................................................................................................... 56
4.6.1 Qualidade dos Microarrays ..................................................................................................... 56
4.6.2 Similaridades Gerais entre os Perfis Transcricionais ............................................................. 57
4.6.3 Genes Diferencialmente Expressos .......................................................................................... 59
4.6.4 Vias de Sinalização e Transcritos Diferencialmente Expressos .............................................. 60
4.7 PCR EM TEMPO REAL........................................................................................................................ 64
5. DISCUSSÃO ......................................................................................................................................... 69
6. CONCLUSÃO ...................................................................................................................................... 79
CAPÍTULO 1- PAPEL DIFERENCIAL DAS VIAS CANONICA E NÃO CANONICA DE NF-KB
NO MARCADOR CD69 EM LINFÓCITOS CULTIVADOS COM CTMs
RESUMO .................................................................................................................................................. 81
ABSTRACT .............................................................................................................................................. 82
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................... 84
2. OBJETIVOS ......................................................................................................................................... 87
3. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................................ 89
3.1 EXPRESSÃO TEMPORAL DO MARCADOR CD69 EM LINFÓCITOS T CD3 APÓS CULTIVO COM CTMS. .. 89
3.2 EXPRESSÃO DO MARCADOR CD69 NAS SUB-POPULAÇÕES DE LINFÓCITOS T CD3 ............................ 89
3.3 PCR EM TEMPO REAL........................................................................................................................ 90
3.4 EXPRESSÃO DE RELB POR CITOMETRIA DE FLUXO ............................................................................ 91
3.5 INIBIÇÃO DA VIA NF-KB ................................................................................................................... 91
3.6 INIBIÇÃO DE RELB POR RNA DE INTEREFERÊNCIA ........................................................................... 92
14
4. RESULTADOS ..................................................................................................................................... 94
4.1 CTMS PROMOVEM E SUSTENTAM A EXPRESSÃO DO MARCADOR CD69 EM LINFÓCITOS T CD3. ....... 94
4.2 EXPRESSÃO DO MARCADOR CD69 NAS SUB-POPULAÇÕES DE LINFÓCITOS T CD3 ............................ 95
4.3 ALTERAÇÕES DE EXPRESSÃO GÊNICA DOS LINFÓCITOS T CD4+ OCASIONADAS PELAS CTMS........... 97
4.4 LINFÓCITOS TCD4+ CULTIVADOS COM CTMS EXPRESSÃO NÍVEIS ELEVADOS DA PROTEINA RELB .. 97
4.5 EXPRESSÃO DO MARCADOR CD69 MEDIANTE A INIBIÇÃO DA VIA NÃO CANÔNICA DE NF-KB. ......... 98
4.6 INIBIÇÃO DE RELB POR SIRNA ELIMINA A EXPRESSÃO TARDIA DO CD69 EM LINFÓCITOS T,
INDUZIDA POR CTMS. ............................................................................................................................ 99
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................................... 102
6. CONCLUSÃO .................................................................................................................................... 109
CAPÍTULO II - CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS AUMENTAM A EXPRESSÂO DE
CD39 E PRODUZEM ADENOSINA PARA IMUNOMODULAR OS LINFÓCITOS T
RESUMO ................................................................................................................................................ 111
ABSTRACT ............................................................................................................................................ 113
1.
INTRODUÇÃO ............................................................................................................................. 116
2. OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 119
3. MATERIAIS E METODOS .............................................................................................................. 121
3.1 CONDIÇÕES DE CULTURA DOS LINFÓCITOS T ................................................................................. 121
3.2 PCR EM TEMPO REAL...................................................................................................................... 121
3.3 ATIVIDADE DA ENZIMA ADENOSINA DEAMINASE (ADA) ................................................................ 121
3.4 CITOMETRIA DE FLUXO .................................................................................................................. 123
3.5 QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ADENOSINA EXTRACELULAR POR CROMATOGRAFIA
LIQUIDA DE ALTA PRESSÃO. .................................................................................................................. 123
4. RESULTADOS ................................................................................................................................... 125
4.1 ALTERAÇÕES DE EXPRESSÃO GÊNICA ENTRE LINFÓCITOS CULTIVADOS E NÃO CULTIVADOS COM
CTMS................................................................................................................................................... 125
4.2 ATIVIDADE DA ENZIMA ADENOSINA DEAMINASE (ADA) ................................................................ 126
4.3 EXPRESSÃO DE CD26, CD39 E CD73 EM LINFÓCITOS E CTMS ...................................................... 127
4.4 CTMS PRODUZEM ADO EM SITUAÇÃO INFLAMATÓRIA .................................................................. 130
5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................................... 133
6. CONCLUSÃO .................................................................................................................................... 138
CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................................................. 140
ANEXOS ................................................................................................................................................. 158
15
LISTA DE ABREVIATURAS
ADA
adenosina desaminase
ADO
adenosina
BrdU
Bromodesoxiuridina
BTRC
beta-transducin repeat containing
CMSPs
células mononucleares de sangue periférico
CTHs
células tronco hematopoéticas (HSC, hematopoietic stem cell)
CTLA4
cytotoxic T-lymphocyte antigen 4
CTMs
células tronco mesenquimais (MSC, mesenchymal stem cell)
DECH
doença do enxerto contra o hospedeiro (GVHD, graft versus host
disease)
FOXP3
transcription factor foxhead box P3
GITR
glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor
HGF
hepatocyte growth factor (fator de crescimento de hepatócitos)
HLA
human leukocyte antigen (antígeno leucocitário humano)
HLAG5
human leukocyte antigen-G5 (antígeno leucocitário humano G5)
ICAM-1
inter-cellular adhesion molecule 1 (molécula de adesão
intercelular -1)
IDO
indoleamine-2,3-desoxigenase (2,3 desoxigenase de indolamina)
IL-10
interleucina 10
IL-2
interleucina 2
16
IRAK3
interleukin-1 receptor-associated kinase 3
LIF
leukemia inhibitory factor (fator indutor de leucemia)
MO
Medula Óssea
NFAT
nuclear factor of activated T-cells
NF-KB
nuclear factor kappa B
NO
nitric oxide (óxido nítrico)
PCR
polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)
PGE2
prostaglandin E2 (prostaglandina E2)
RANK
receptor activator of nuclear factor kappa B (receptor ativador de
NF-KB)
TCR
T cell receptor (receptor de células T)
TGF-β
tumor growth factor beta (fator de crescimento tumoral beta)
TLR
toll-like receptor
TNFAIP
tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3
Tregs
regulatory T cells (linfócitos T regulatórios)
VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1 (moleculas de adesão
vascular-1)
17
PREÂMBULO
Os dados resultantes desta tese foram submetidos para publicação em
revistas cientificas internacionais. Alguns destes trabalhos receberam auxílios
da organização dos congressos internacionais para sua apresentação.
Artigos:
1) Saldanha-Araujo, F; Panepucci, R.A.; Haddad, R; Farias, K.M.; Palma, P.V.;
Araujo, A.G.; Orellana, M.D., Kashima-Haddad, S.; Covas, D.T.; Zago, M.A.
Differential Roles of Canonical and Non-Canonical NF-kB Signaling in the
Induction of CD69+ T-Cells by Mesenchymal Stem Cells. Submetido.
2) Saldanha-Araujo, F; Panepucci, R.A.; Ferreira, F.I.; Palma, P.V.; Araujo,
A.G., Queiroz, R.H.; Covas, D.T.; Zago, M.A. Cross-Talk with Activated T
Lymphocytes Increases Adenosine Production by Mesenchymal Stromal Cells,
Trough the Up-Regulation of CD39. Submetido.
3) Saldanha-Araujo, F; Panepucci, RA; Araujo, A.G.; Covas, D.T.; Zago, M.A.
Immunomodulation of T CD4 and TCD8 lymphocytes by Mesenchymal Stomal
Cells: a microarray study. Manuscrito em preparação.
Prêmios:
1) Travel Award - 50th American Society of Hematology Meeting
Saldanha-Araujo, F.; Panepucci, R. A.; Farias, K.C.; Araujo, A. G. ; Orellana,
M.; Menezes, C.B ; Palma, P.V. ; Covas, D.T. ; Zago, M. A. Mesenchymal
Stromal Cells Promote A Sustained Increase Of The CD69 Marker On Activated
18
CD3+ Lymphocytes: Potential Immunomodulatory Role. In: American Society of
Hematology, 2008, San Francisco. Blood, 2008. V. 112. P. 2417.
2) EHA Travel Grant
Saldanha-Araujo, F.; Panepucci, R. A. ; Farias, K.C. ; Araujo, A. G. ; Orellana,
M. ; Careta, F. P. ; Menezes, C.B. ; Palma, P.V. ; Haddad, S. K. ; Covas, D.T. ;
Zago, M. A. . Sustained Increase of CD69 on Activated Lymphocytes Mediated
By Mesenchymal Stromal Cells and Its Potential Immunoregulatory Role. In: 14
Congress of European Hematology Association (EHA), 2009, Berlin. Congress
of European Hematology Association (EHA), 2009. Haematologica V. 94. P.
228-228.
19
RESUMO
O transplante alogênico de medula óssea é usado como adjuvante no
tratamento de neoplasias hematopoéticas, outros tumores e em algumas
doenças auto-imunes, com o objetivo de restabelecer o sistema hematopoético
após quimioterapia e radioterapia. A doença do enxerto contra o hospedeiro
(DECH) é uma das complicações mais freqüentes deste procedimento, ocorre
em mais da metade dos pacientes que são submetidos a transplante alogênico
de medula óssea, e representa uma importante causa de morbidade,
mortalidade e baixa qualidade de vida. As células T são as principais
responsáveis pelo desenvolvimento da DECH, com o reconhecimento de
antígenos estranhos por células T CD4 e ativação conjunta de linfócitos T CD8
resultando em dano tecidual. As CTMs humanas suprimem a proliferação de
linfócitos T citotóxicos e também alteram o perfil de citocinas e a maturação
das células apresentadoras de antígenos, desempenhando importante função
imunomoduladora, podendo, portanto, ser úteis na terapia celular contra a
DECH. O objetivo central deste trabalho foi identificar as bases moleculares da
imunomodulação dos linfócitos T mediada pelas CTMs. Para isso, as
alterações ocasionadas no perfil de expressão gênica de linfócitos TCD4 e
TCD8 mediante estimulo proliferativo, na presença ou ausência de CTMs,
foram analisadas pela metodologia de microarray. Ambos, os linfócitos TCD4+ e
TCD8+ que foram imunomodulados pelas CTMs apresentaram alterações na
expressão de componentes das vias do ciclo celular (G1/S) e de vias
envolvidas na regulação da resposta imune, como sinalização da via NF-KB e
do receptor TCR. Realizamos a validação desse estudo com base na análise
de expressão gênica de componentes envolvidos nessas sinalizações, como
20
RelA, RelB, NF-KB2, IRAK, TNFAIP3 e BTCR (sinalização da via NF-KB);
CTLA4 (sinalização TCR); GITR, FOXp3 e IL-10 (regulação da resposta
imunológica). Nossos resultados demonstram que as CTMs induzem a
imunomodulação dos linfócitos tanto por alterar componentes envolvidos na
proliferação celular, como de genes envolvidos na resposta imunológica dessas
células.
21
ABSTRACT
Allogeneic bone marrow transplantation is used as an adjunct for the
treatment of hematopoietic cancers, other tumors, and in some autoimmune
diseases, in order to restore the hematopoietic system after chemotherapy and
radiotherapy. Graft-versus-host disease (GVHD) is one of the most frequent
complications of this procedure, that occurs in more than half of patients who
undergo allogeneic bone marrow, and is a major cause of morbidity, mortality
and poor quality of life. T cells are primarily responsible for the development of
GVHD, with the recognition of foreign antigens by CD4 T cells and joint
activation of CD8 T cells, resulting in tissue damage. Human MSCs suppress
the proliferation of cytotoxic T lymphocytes and alter the cytokines profile and
antigen presenting cells maturation. Consequently, the cells play important
immunomodulatory function and may therefore be useful in cell therapy against
GVHD. Our objective was to identify the molecular basis of T lymphocytes
immune modulation mediated by MSCs. For this, the changes caused in the
gene expression profile of activated CD4 and CD8 T lymphocytes, co-culture or
not with MSCs, were analyzed by microarray methodology. Our results reveled
that the main changes in both CD4+ and CD8T lymphocytes caused by CTMs
were in components of cell cycle pathways (G1/S) and components involved in
regulating the immune response, such as NF-kB signaling and TCR receptor.
This findings were validated by analysis of gene expression of components
involved in these signals, such as Real, RelB, NF-kB2, IRAK, and TNFAIP3
BTCR (NF-kB signaling pathway), CTLA4 (TCR signaling), GITR, Foxp3 and IL10 ( regulation of immune response). Our results demonstrated that MSCs
induce lymphocytes immunomodulation both by changing the components
22
involved in proliferation, as well as genes involved in immune response of these
cells.
23
INTRODUÇÃO
24
1. INTRODUÇÃO
A medula óssea é um tecido complexo que abriga células tronco
hematopoéticas (CTHs) e células células progenitoras, em contato com uma
rede conectiva de células estromais (Dorshkind, 1990;Dorshkind, 1990) As
células estromais da medula óssea constituem um tecido multifuncional,
formado por uma população heterogênea de células que oferecem um
ambiente especializado para o controle da hematopoese (Dexter, 1989).
Este ambiente estromal é em parte derivado de outra população de
células tronco, as chamadas células tronco mesenquimais (CTMs), que foram
inicialmente reconhecidas por Friedenstein e seus colaboradores, que
identificaram uma população celular aderente e morfologicamente semelhante
aos fibroblastos (Le Blanc K. & Ringden, 2005).
As CTMs participam do microambiente medular, estando envolvida na
produção de moléculas da matriz extracelular, como a fibronectina, laminina,
colágeno e proteoglicanos (Azizi et al, 1998;Chichester et al, 1993;Conget &
Minguell, 1999;Pittenger et al, 1999;Azizi et al, 1998;Chichester et al,
1993;Conget & Minguell, 1999;Friedenstein et al, 1966;Pittenger et al, 1999),
além de secretar citocinas importantes para a diferenciação das CTHs (Deans
& Moseley, 2000;Majumdar et al, 2000;Mbalaviele et al, 1999;Neuss et al,
2004). Ademais, estas células tronco são caracterizadas por sua capacidade
de auto-renovação e sua habilidade em se diferenciar em adipócitos,
condrócitos e osteócitos (Le Blanc K. & Ringden, 2005).
As CTMs podem ser isoladas de tecido adiposo, fígado fetal, sangue
periférico, medula óssea, pulmão e sangue de cordão umbilical (Erices et al,
2000;De Ugarte et al, 2003), e têm a capacidade de diferenciar-se em osso,
cartilagem e tecido adiposo (Le Blanc K. et al, 2003a;Pittenger et al, 2000). De
25
acordo com alguns estudos in vitro, as CTMs poderiam formar músculos
(Dezawa et al, 2005;Rangappa et al, 2003), hepatócitos (Hong et al, 2005),
endotélio (Oswald et al, 2004) e mesmo células do sistema nervoso central
(Jeong et al, 2004;Sanchez-Ramos et al, 2000).
As células estromais podem ser extraídas da medula e expandidas ex
vivo sem nenhuma modificação no seu fenótipo ou perda de função (Bruder et
al, 1997). No estado não diferenciado, as CTMs são fusiformes, semelhante
aos fibroblastos (Friedenstein et al, 1966;Pittenger et al, 1999); no entanto são
caracterizadas imunofenotipicamente por não apresentarem os marcadores de
superfície hematopoéticos e endoteliais CD11b, CD14, CD31, CD34 ou CD45,
mas expressam CD29, CD44, CD73, CD105, CD106 e CD166 (Barry &
Murphy, 2004;Jorgensen et al, 2003;Pittenger et al, 1999).
Nos últimos anos as CTMs receberam atenção especial do meio
cientifico, especialmente devido suas propriedades biológicas que as tornam
candidatas a uso na terapia celular. Esse segmento da medicina visa promover
um tratamento regenerativo em uma grande variedade de doenças. Vários
estudos com modelos animais e humanos demonstram que as CTMs são
recrutadas e que possuem capacidade de enxertar no tecido lesado (Caplan,
1995;Nakamizo et al, 2005;Picinich et al, 2007;Ozawa et al, 2008), entretanto,
os mecanismos moleculares que governam o destino, a mobilização e o
recrutamento dessas células para os sítios de enxertia não são totalmente
conhecidos.
Além da necessidade de se desvendar os mecanismos moleculares que
regem o comportamento in vivo dessa célula, algumas questões técnicas
quanto à sua administração precisam ser revisadas. Os ensaios clínicos atuais
26
utilizam duas metodologias para aplicação das CTMs, administração
intravenosa ou injeção direta dessas células ao tecido lesado. As duas
abordagens
apresentam
problemas
que
devem
ser
cientificamente
contornados: a primeira delas expõe o paciente a um grande número de células
(1-5 milhões de células/kg) e a um aumento significativo de complicações por
efeitos colaterais (Dimmeler et al, 2008;Ott et al, 2005;Sherman et al, 2006),
enquanto a segunda metodologia nem sempre é viável por ser um
procedimento invasivo. Além disso, existem relatos de que em muitas situações
as células administradas morrem antes de provocar o beneficio esperado, por
limitações de nutrientes e oxigênio (Muschler et al, 2004;Karp & Leng Teo,
2009).
Como estratégia terapêutica, a administração intravenosa seria ideal,
dado o fácil acesso e a ampla distribuição fornecida por essa via, entretanto, foi
demonstrado, que após administração intravenosa, a maioria das CTMs são
retidas nos pulmões, provavelmente em virtude de seu tamanho (Gao et al,
2001;drup-Link et al, 2004;Schrepfer et al, 2007). Schrepfer et al (2007)
demonstraram que pequenas esferas (4–5 µm) eram capazes de vencer a
circulação pulmonar, enquanto que a grande maioria das CTMs (15–19 µm)
ficavam retidas no órgão. O uso de vasodilatadores pode ser uma alternativa
para que um maior número de CTMs passem pelos pulmões.
Baseado nessas observações, alguns pesquisadores sugerem que o
beneficio clinico, quando observado, é devido a um efeito parácrino dessas
células, em vez de diferenciação ou substituição do tecido danificado por CTMs
infundidas (Picinich et al, 2007;Ozawa et al, 2008;Ohtaki et al, 2008). De fato,
estudos in vitro demonstram que as CTMs agem por meio da secreção de
27
fatores
anti-inflamatórios,
neovascularização,
fatores
neurotróficos,
antifibroticos e imunomoduladores (Caplan & Dennis, 2006).
Apesar das propriedades biológicas das CTMs não serem totalmente
conhecidas, numerosos ensaios clínicos baseados no uso dessas células,
apresentaram resultados promissores, como: em doença hepática (Kharaziha
et al, 2009), ulceras no pé diabético (Vojtassak et al, 2006), feridas cutâneas
(Falanga et al, 2007), doença neurológica difusa (Lee et al, 2008), transplante
de medula óssea (MacMillan et al, 2009) e na doença do enxerto contra o
hospededeiro (DECH) (Le Blanc K. et al, 2008;Ringden et al, 2006;Friedenstein
et al, 1966;Pittenger et al, 1999) .
Quando o doador e o receptor não são imunologicamente idênticos, o
transplante alogênico de medula óssea é usado como tratamento para
neoplasias hematopoéticas, tumores contínuos, e em algumas doenças autoimunes. A doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) é uma das
complicações mais freqüentes deste tratamento, resulta da reação dos
linfócitos T do doador com os antígenos do receptor, dependendo do numero
de incompatibilidades no complexo principal de histocompatibilidade (Armitage,
1994;Gilliam, 2004). A DECH ocorre em mais da metade dos pacientes que
são submetidos a transplante alogênico de medula óssea, e representa uma
importante causa de morbidade e mortalidade. Essa doença é caracterizada
por
lesões
hepáticas,
dermatológicas
e
intestinais
(Armitage,
1994;Ratanatharathorn et al, 2001). As CTMs humanas suprimem a formação
de linfócitos T citotóxicos e também alteram o perfil de citocinas e a maturação
das células apresentadoras de antígenos (Rasmusson, 2006b). Essas
propriedades motivaram o uso clínico das CTMs e os resultados obtidos
28
mostram claramente que elas são capazes de prevenir ou atenuar a DECH (Le
Blanc K. et al, 2008).
De fato, as características mais intrigantes das CTMs são o escape do
reconhecimento imune e a inibição da resposta imune. Vários trabalhos relatam
que as CTMs escapam o reconhecimento de células alo-reativas, possuindo
um caráter pouco imunogênico (Bartholomew et al, 2002;Le Blanc K. et al,
2003a;Maitra et al, 2004). Esse mecanismo de escape imune das CTMs pode
ter um valor terapêutico no transplante alogênico, pois seria possível criar um
estoque de células, com condições de uso imediato, ao contrário da utilização
autóloga das CTMs, em que é necessário o cultivo celular especifico para cada
paciente (Rasmusson, 2006a). De maneira geral, as CTMs expressam
moléculas HLA classe I, mas podem ser induzidas por baixas doses de INF-γ
(10U/ml) a expressar HLA classe II. Entretanto, CTMs de camundongos que
não expressam HLA de classe I e II, e de humanos que expressam ambas as
moléculas de HLA, classe I e II, não mostraram potencial imunogênico, e foram
capazes de inibir a resposta imune. Esses achados indicam que o escape
imunológico e a imunomodulação promovida por essas células não se deve à
expressão das moléculas de HLA classe I e II. Devido a essas propriedades, as
CTMs exercem um papel supressivo nos sítios inflamatórios sem induzir a
reação imune, onde as citocinas inflamatórias poderiam induzir um aumento na
expressão das moléculas HLA dessas células (Krampera et al, 2003;Potian et
al, 2003;Rasmusson, 2006a).
As CTMs suprimem a proliferação de linfócitos T induzida por
aloantígenos em cultura mista de linfócitos (Bartholomew et al, 2002;Le Blanc
K. et al, 2003b;Potian et al, 2003;Tse et al, 2003), por mitógenos como a
29
fitohemaglutinina (Le Blanc K. et al, 2003b;Le Blanc K. et al, 2004a),
concavalina A (Djouad et al, 2003;Le Blanc K. et al, 2003b) e tuberculina
(Maitra et al, 2004), assim como a ativação celular pelos anticorpos CD3 e
CD28 (Aggarwal & Pittenger, 2005;Krampera et al, 2003;Tse et al, 2003).
Porém, as CTMs podem exercer um efeito contrário, e estimular a proliferação
de linfócitos T quando essas células não estão ativadas ou quando a relação
entre o número de CTMs e os linfócitos é muito baixa (Le Blanc K. et al,
2003a;Potian et al, 2003).
A supressão in vitro da resposta imune pelas CTMs é mediada, em
parte, por fatores solúveis, visto que a sua separação das células
mononucleares
de
sangue
periférico
por
uso
de
uma
membrana
semipermeável (Trans-well), que permite a troca de fatores solúveis sem o
contato celular, inibiu a proliferação (Klyushnenkova et al, 2005;Tse et al,
2003). Entretanto, o contato célula-célula (CTMs-linfócitos) promove uma
supressão mais forte sobre as células imunes (DiNicola M. et al, 2002). Em
meio inflamatório, as CTMs exibem aumento de expressão de VCAM-1 e de
ICAM-1 e passam a recrutar mais linfócitos atraves do contato célula-célula. O
bloqueio da expressão dessas moléculas de adesão ocasionou uma menor
capacidade supressora pelas CTMs (Gajewski et al, 2006).
Alguns fatores participativos dos mecanismos pelos quais as CTMs
imunomodulam os linfócitos já foram descritos, como HGF (DiNicola M. et al,
2002), TGF-β (DiNicola M. et al, 2002), IDO (Meisel et al, 2004), PGE2
(Aggarwal & Pittenger, 2005), NO (Sato et al, 2007), HLAG5 (Selmani et al,
2008), LIF (Nasef et al, 2008) e IL-10 (Yang et al, 2009). Além de produzir
fatores moduladores da resposta imune, as CTMs são capazes de induzir a
30
diferenciação de células regulatórias CD4+CD25hiFOXP3+ (Di Ianni M. et al,
2008;Maccario et al, 2005;Von Boehmer H., 2005) e também de outras
populações de linfócitos com capacidade supressora e de fenótipo diferente
dos linfócitos regulatórios clássicos (Prevosto et al, 2007).
Alguns estudos em humanos avaliaram o efeito das CTMs nas
subpopulações linfocíticas. As CTMs inibiram a proliferação de linfócitos CD3+,
CD4+ e CD8+ ativados por aloantígenos e mitógenos
(DiNicola M. et al,
2002;Le Blanc K. et al, 2004a;Maccario et al, 2005). Em um estudo com
murinos, as CTMs obtidas da medula óssea inibiram a proliferação de linfócitos
T e B, estimulados por mitógenos (Augello et al, 2005).
Vários autores relatam que ambas as CTMs, autólogas ou alogênicas,
exercem um efeito supressivo similar, e que esse efeito imunomodulatório não
apresenta restrições genéticas (Bartholomew et al, 2002;Klyushnenkova et al,
2005;Le Blanc K. et al, 2003a;Maccario et al, 2005). Entretando, um estudo in
vitro indica que as CTMs alogênicas possuem um efeito imunosupressivo mais
poderoso quando comparadas às CTMs autólogas (Maccario et al, 2005). Além
disso, Beyth et al (2005) demonstraram que CTMs cultivadas com linfócitos
TCD4+ autólogos na presença de enterotoxina estafilocócica podem atuar
como células apresentadoras de antigeno e induzir a ativação e proliferação
das células TCD4+.
Recentemente foi demonstrado que as CTMs isoladas com base na
expressão do marcador STRO-1 apresentam a capacidade imunomoduladora
mais potente quando comparada as CTMs obtidas pelo método tradicional de
adesão ao plástico (Nasef et al, 2009). Além disso, a capacidade supresora das
CTMs parece estar diretamente relacionada a expressão do marcador CD90,
31
sendo que quanto maior é a expressão dessa molecula, maior é a capcidade
moduladora das CTMs (Campioni et al, 2009).
Dados recentes apontam que o estimulo dos receptores toll-like (TLR) na
superficie das CTMs afetam a capacidade dessas células em modular a
resposta imune (Hwa et al, 2006;Pevsner-Fischer et al, 2007;Tomchuck et al,
2008). Esses receptores reconhecem sinais de “perigo” e sua ativação leva a
mobilização de células imunes inatas e adaptativas (Akira & Sato,
2003;Matzinger, 2002;Miggin & O'Neill, 2006;Takeda et al, 2003;West et al,
2006). Interessantemente, a sinalização dos TLR-4 nas CTMs induz essas
células a produzirem mediadores pró-inflamatórios e ativar linfócitos T,
enquanto que a sinalização dos TLR-3 levou as CTMs a secretarem agentes
imunosupressores e inibir a ativação linfocitária (Waterman et al, 2010).
As CTMs obtidas de outros tecidos, como de cordão umbilical,
lipoaspirado e placenta também apresentam potencial imunomodulador e
surgem como uma alternativa importante ao uso de CTMs obtidas de medula
óssea, já que são de fontes descartáveis (Puissant et al, 2005;Magatti et al,
2008;Wolbank et al, 2007;Chang et al, 2006;Li et al, 2007;Yoo et al, 2009).
Embora os dados da literatura indiquem que as CTMs poderiam ser
clinicamente úteis para previnir e tratar a DECH, ainda falta uma visão
abrangente dos mecanismos envolvidos na imunomodulaçao dos linfócitos T
causados pelas CTMs. Para compreender esses mecanismos, nesse trabalho
nós examinamos, pelo método de microarray, as alterações provocadas no
perfil de expressão gênica de linfócitos TCD4 e TCD8 quando são cocultivados com CTMs.
32
O estudo de microarray revelou que os linfócitos TCD4 e TCD8
imunomodulados pelas CTMs apresentam um perfil transcricional muito similar,
apresentando diferenças de sinalização em diversos processos biológicos,
como a sinalização da via NF-kB, controle do ciclo celular e sinalização da via
TCR, quando comparados aos linfócitos cultivados isoladamente. Devido ao
nosso interesse nos linfócitos TCD4 e a similaridade transcricional entre essas
células e os linfócitos TCD8 imunomodulados pelas CTMs, a discussão
apresentada nesse trabalho é baseada nos resultados obtidos pela analise de
microarray dos linfócitos TCD4 cultivados ou não com as CTMs.
Além disso, genes relacionados com o metabolismo da adenosina, um
potente imunossupressor, foram diferencialmente expressos em linfócitos
TCD4 cultivados na presença de CTMs quando comparados com aqueles
cultivados na ausência dessas células. Em conseqüência, dedicamo-nos
também a explorar o efeito da adenosina na imunomodulação promovida pelas
CTMs. Por fim, pesquisamos a inesperada elevação do marcador CD69 nos
linfócitos cultivados com CTMs.
33
OBJETIVOS
34
2. OBJETIVOS
Objetivo Geral
- Identificar mecanismos moleculares responsáveis pela imunomodulação de
linfócitos TCD4 e TCD8 quando expostos a CTMs.
Objetivos Específicos
- Investigar as alterações ocasionadas no perfil de expressão gênica de
linfócitos TCD4 e TCD8 humanos pela exposição a CTMs, usando para isso a
metodologia de microarrays;
- Selecionar 8 a 10 genes que sofrem significativa alteração de sua expressão
(“genes diferencialmente expressos”) na analise por microarrays e validar
essas diferenças por PCR em tempo real;
- Consolidar os resultados obtidos em uma hipótese explicativa do mecanismo
molecular envolvido.
35
MATERIAIS E MÉTODOS
36
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Casuística
Foram utilizadas amostras de sangue periférico de 3 indivíduos
saudáveis e uma alíquota de 30mL de medula óssea coletada de doadores
para transplantes no centro de transplante de medula óssea do Hospital das
Clinicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
Os doadores tiveram a faixa de idade entre 25 e 29 anos. Os ensaios
foram realizados com doadores distintos, de forma a nos permitir a análise de
significância das diferenças observadas.
Todos os doadores concordaram em participar do projeto e assinaram o
termo de consentimento livre e esclarecido, aprovado no processo do HCRP
n°14272/2006.
3.2 Células tronco mesenquimais (CTMs)
As culturas de CTMs utilizadas neste projeto foram obtidas conforme
descrito em trabalhos anteriores (Panepucci et al, 2004;Silva, Jr. et al, 2003) a
partir de amostras de medula óssea de doadores com consentimento após total
esclarecimento dos doadores ou responsáveis, de acordo com protocolos
aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital das Clínicas da
U.S.P de Ribeirão Preto que estão inseridos no projeto: “Isolamento e
Caracterização de Células Progenitoras Mesenquimais de Diferentes Tecidos.”
Processo HCRP no 4855/2004.
Em suma, a medula óssea foi obtida por punção aspirativa realizada na
crista ilíaca, usando material excedente de doadores de transplante de medula
37
óssea. As células mononucleares foram separadas por centrifugação em
gradiente de ficoll (Ficoll-Paque, Pharmacia; Peapack, NJ), lavadas em solução
salina tamponada, e então cultivadas em frascos de cultura celular de 25cm2
(Falcon; Franklin Lakes, NJ) em meio alfa-mínimo essencial (alpha-MEM,
Minimum Essential Medium) suplementado com 100 µg/ml penicilina, 100µg/ml
estreptomicina, 2mM L-glutamina, e 20% de soro bovino fetal (Atlanta
Biological; Norcross, GA). Depois de 24 horas as células não aderentes foram
removidas e a camada aderente cultivada até atingir confluência de 50% a 70%
seguindo protocolo estabelecido na literatura (Goodwin et al, 2001;Jaiswal et al,
1997) . As células foram então colhidas por tripsinização utilizando uma
solução 0,2% tripsina-EDTA. As células coletadas na 4a passagem foram
caracterizadas imunofenotipicamente por citometria e funcionalmente por
diferenciação em osteoblastos e adipócitos como descrito (Pittenger et al,
1999;Goodwin et al, 2001).
3.3 Caracterização por Citometria de Fluxo das CTMs
As células foram caracterizadas previamente como descrito a seguir:
Depois de colhidas, lavadas e ressuspensas em salina tamponada, as células
foram divididas em amostras e incubadas com diversos anticorpos específicos
ou controles de isotipo (Pharmingen; http://www.pharmingen.com). Um total de
10.000 eventos foram registrados correspondentes às células marcadas,
utilizando um aparelho FACSort, e analisados com o software Cell Quest
(Becton Dickinson; San Jose, CA; http://www.bd.com). Os anticorpos utilizados
foram: CD90-PE, CD51/61-PE, CD29-PE, CD49e-PE, CD49d-PE, CD44-FITC,
CD45-FITC, CD54-PE, CD13-PE, CD14-PE, CD31-FITC, CD33-FICT, CD34-
38
PE, CD36-FITC, CD133-PE, CD106-PE, HLADR-FITC or HLAclassI-FITC como
descrito (Silva, Jr. et al, 2003). A detecção dos anticorpos primários anti-KDR e
anti-cadherin 5 foi realizada com anticorpos de cabra anti-camundongo
conjugados a FITC.
3.4 Isolamento de Linfócitos T CD3+ do Sangue Periférico
A população total de linfócitos T dos três doadores sadios foi isolada
utilizando o kit comercial Pan T Cell Isolation Kit II, human (Miltenyi BiotecMACS) para depleção das demais populações presentes na fração de células
mononucleares do sangue. Desta forma, obtivemos linfócitos T intocados que
foram então submetidos ao estimulo de ativação e proliferação em cultura
(conforme descrito a seguir).
Foram coletados 100ml de sangue periférico de cada doador. Esse
material foi alicotado em 10 tubos falcon e acrescentado de 20ml de PBS (0,6%
ACD). Adicionamos nessas amostras 13ml de Ficoll-Paque (Amersham
Biosciences), após centrifugamos a 2000rpm, por 30 minutos. Após esse
período, o anel de células mononucleares foi recolhido por auxílio de uma
pipeta pasteur e transferido para outro tubo falcon. As células mononucleares
foram lavadas duas vezes em PBS por 10 minutos e submetidas à contagem
celular.
Obtivemos em média, 1,25x108 células mononucleares que foram
centrifugadas e ressuspendidas em 500µl de solução tampão (PBS-10% ACD 2,5% albumina). Adicionamos 125µl do coquetel de anticorpos (anti-CD14,
CD16, CD19, CD56, CD36, CD123, TCR γ/δ e CD235a) nessa suspensão
39
celular. Após, as amostras foram homogeneizadas e incubadas por 10 minutos
a 4°C. No término desse período adicionamos 375µl de solução tampão e
250µl de partículas magnéticas ligadas a anticorpos anti-biotina (microbeads).
A seguir, as amostras foram homogeneizadas e incubadas por 15 minutos a
4°C. As células foram lavadas e ressuspensas em 5ml de solução tampão para
a separação magnética.
As amostras foram aplicadas na coluna de separação magnética e as
células eluídas foram coletadas e novamente submetidas à separação
magnética para aumentar o teor de pureza das amostras. As suspensões de
linfócitos T foram submetidas para avaliação do teor de pureza, e em seguida
dividida em duas alíquotas, para realização dos cultivos e dos ensaios de
proliferação através da incorporação de bromodeoxyuridina pelos linfócitos, kit
APC BrdU (BD Pharmingen).
3.5 Avaliação da pureza das células T
Para avaliação da pureza das células T, reservamos 5x105 células para
marcação com 10µl de FITC anti-CD3 (Pharmingen) e com 10µl do isotipo
controle. A análise foi realizada no citômetro FACScan (BD Bioscience) do
laboratório de citometria de fluxo do hemocentro de Ribeirão Preto.
3.6 Condições de Cultura dos Linfócitos T
Com o objetivo de simular o estímulo de ativação e proliferação
envolvido
na
resposta
imune
do
GVHD,
utilizamos
o
kit
T
Cell
Activation/Expansion (Miltenyi Biotec-MACS). Este sistema utiliza partículas
40
ligadas a anticorpos anti-CD2, anti-CD3 e anti-CD28, capazes de co-estimular
os respectivos receptores, fornecendo os estímulos necessários para a
ativação e proliferação (com o uso concomitante de IL-2) dos linfócitos T.
Para cada amostra, preparamos as partículas de beads com
concentração de 1,5x107/ 150µl de PBS 0,2% SBF e com 2mM EDTA
(conforme instruções do fabricante). Essa quantidade é suficiente para
estimular 3x107 de linfócitos. As beads concentradas foram centrifugadas a
1200 rpm por 5 minutos. Após esse período, desprezamos o sobrenadante e
ressuspendemos o precipitado em 150µl de meio RPMI 10% SBF.
Adicionamos 1,5x107 beads na alíquota de 3x107 linfócitos T (por
doador), seguindo assim as instruções do fabricante, de usar uma bead para
dois linfócitos. Após, retiramos o meio alpha-MEM 15% SBF dos poços onde
estavam as CTMs em 4° passagem previamente plaqueadas (24horas) em
placas de 100x20mm e de 12 Well e adicionamos os linfócitos em meio RPMI
10%SBF. Esse material foi incubado a 37oC em estufas de CO2 por um período
total de 5 dias. Para promover a expansão celular, no 3° dia de cultivo,
adicionamos 20U/ml de IL-2 (Peprotech) sobre os linfócitos ativados.
Este ensaio foi realizado em triplicata, com linfócitos T obtidos de
amostras de doadores distintos, de forma a nos permitir a análise de
significância das diferenças observadas (tanto nos ensaios funcionais como
nas diferenças de expressão obtidas pela técnica de microarray).
3.7 Cultura em placa 100x20mm (extração de RNA, microarray)
Para cada amostra, utilizamos três placas de 100x20mm, sendo uma
utilizada para expansão dos linfócitos isolados e as outras duas destinadas aos
41
co-cultivos de linfócitos com CTMs. Essas receberam 1,5x106 CTMs e 7,5x106
linfócitos em 30 ml de meio RPMI 10%.
No terceiro de dia de cultura,
adicionamos em cada placa 20U/ml de IL-2 para expansão dos linfócitos. Após
cinco dias de cultura, as células foram recolhidas para separação magnética
(Miltenyi Biotec-MACS) dos linfócitos T CD4.
3.8 Isolamento de Linfócitos T CD4 e TCD8 dos Cultivos
Celulares
Após 5 dias de cultivo, os linfócitos cultivados ou não com CTMs foram
recolhidos por pipetagem, a suspensão celular foi passada em um filtro de
nylon (Miltenyi Biotec-MACS) para remoção de eventuais grumos de CTMs. A
seguir, as células foram transferidas para tubos de ensaio de 1,5ml e alocadas
em
um
magneto
(DYNAL)
para
remoção
das
beads
de
ativação
CD2/CD3/CD28. Posteriormente, foi realizada a contagem celular e obtenção
dos linfócitos TCD4 e TCD8 por separação magnética.
Em suma, marcamos em média 7x107 linfócitos CD3. Essas células
foram ressuspendidas em 560µl de tampão de coluna (PBS-10% ACD - 2,5%
albumina) e marcadas com 140µl de anti-CD4 micro beads. Posteriormente a
amostra foi incubada por 15 min. a 4°C. Ao término da incubação, as células
foram lavadas em 2ml da solução tampão e ressuspendidas em 2ml da mesma
solução. Os linfócitos CD4 ficaram retidos na coluna magnética e foram obtidos
por flush em um tubo falcon de 15ml. O Eluido coletado foi submetido à
marcação com anti-CD8 micro beads. A obtenção dos linfócitos citotóxicos foi
realizada com mesmo protocolo acima descrito.
42
Uma vez obtido os linfócitos TCD4 e TCD8, uma alíquota foi enviada ao
laboratório de citometria de fluxo para determinação da pureza e as células
restantes foram utilizadas para extração de RNA pelo método de Trizol
(Invitrogen), conforme instruções do fabricante.
3.9 Avaliação da pureza das células TCD4 e TCD8
Para avaliação da pureza das células TCD4 e TCD8, reservamos 5X105
células para marcação com 10µl de PE anti-CD4 ou FITC anti-CD8
(Pharmingen) e com 10µl dos respectivos isotipos controle. A análise foi
realizada no citômetro FACScan (BD Bioscience) do laboratório de citometria
de fluxo do hemocentro de Ribeirão Preto.
3.10 Extração do RNA
Depois de isolados, os linfócitos TCD4 e TCD8 foram centrifugados e
ressuspensos em PBS tratado com 0.1% do inibidor de RNAse DEPC
(diethylpyrocarbonate), em seguida o reagente TRIZOL-LS foi adicionado e a
mistura homogeneizada. Neste ponto, as amostras foram guardadas em
freezer –800 C para serem posteriormente extraídas. Para a extração, foi
adicionado clorofórmio para separação da fase aquosa contendo o RNA. O
RNA presente na fase aquosa foi em seguida precipitado por centrifugação
após a adição de isopropanol. Após ser lavado com etanol 75%, o RNA
ressuspenso em água (tratada com DEPC) foi guardado em freezer a -70oC até
ser utilizado. A quantificação do RNA foi calculada a partir da absorbância a
260nM (obtida em espectrofotômetro), e a pureza, a partir da razão A260/A280
43
(Sambrook & Russell, 2001). A qualidade do RNA obtido foi verificada pela
integridade das bandas 28S e 18S por visualização em gel de agarose 1%
corado com brometo de etídio.
3.11 Quantificação do RNA
A quantificação do RNA total foi realizada em espectrofotômetro
utilizando uma equivalência de 40µg/ml para 1 unidade de Absorbância (obtida
em espectrofotômetro) a 260nM (Sambrook & Russell, 2001).
3.12 Análise de Qualidade do RNA
A qualidade do RNA dos linfócitos TCD4 e TCD8 utilizados para análise
de expressão gênica pela técnica de microarray e posteriormente por PCR em
tempo real foi verificada pela evidência das bandas 18S e 28S e pela ausência
de contaminação da amostra por DNA genômico. Para isso, realizamos
eletroforese do RNA obtido em gel de agarose 1%, corado por brometo de
etídio e analisado sob luz ultravioleta.
3.13 Cultura em placa de 12 poços (ensaio de proliferação
celular)
Para avaliar a proliferação (kit BrdU) dos linfócitos cultivados ou não com
as CTMs, utilizamos uma placa de 12 poços para cada doador. Para isso,
plaqueamos previamente 1x105 CTM em dois poços, no dia seguinte,
adicionamos 4 alíquotas de 5x105 linfócitos ativados na placa, sendo duas
44
sobre as CTMs. Deste modo, tínhamos uma duplicata de linfócitos cultivados
isolados e outra de linfócitos em presença de CTMs em 2ml de meio RMPI
10%. Após cinco dias de cultura, realizamos o ensaio de proliferação celular
pelo kit APC BrdU (BD Pharmingen).
3.14 Ensaio de Proliferação Celular pelo Kit BrdU
A imunomodulação mediada pelas CTMs foi avaliada utilizando um kit
comercial para a determinação da proliferação celular dos linfócitos, na
presença ou não das CTMs. Para isso, utilizamos o kit APC BrdU Flow Kit (BD
Pharmigen). A bromodeoxyuridina (BrdU) é um análogo da timidina (um
precursor do DNA); neste método, a BrdU é incorporada nas células durante a
síntese de DNA (fase S da proliferação celular), sendo então detectada
intracelularmente por anticorpos anti-BrdU (após permeabilização da célula).
Em suma, reservamos dois poços de co-cultivo e dois poços de cultura
simples de linfócitos para a realização desse ensaio. Adicionamos 2mM de
BrdU na última hora em um poço de co-cultivo e outro de linfócitos simples. Os
outros dois poços foram reservados para controle do experimento. Incubamos
a placa por 1hora a 37°C. Em seguida, transferimos as células para tubos de
citometria, realizamos a contagem celular e reservamos 1x106 células para
prosseguir o experimento. As células foram lavadas com staining buffer (PBS
3% SBF - 0,09% azida), marcadas com 20µl de PerCP anti-CD3, PE anti-CD4
e FITC anti-CD8 ou os respectivos isotipos, e ressuspensas em 100µl de
Cytofix/ cytoperm buffer para que houvesse a fixação e permeabilização das
células. Incubamos a amostra por 15 minutos em temperatura ambiente. Após
esse período, as células foram lavadas com 1ml de Perm/wash buffer, tampão
45
que contém uma saponina que reverte a permeabilização. As células foram
ressuspensas em 500µl de staining buffer e reservados overnight (opção
fornecida pelo fabricante).
No dia seguinte, as células foram ressuspensas em 100µl de citoperm
plus buffer e incubadas por 10 minutos no gelo. Esse tampão é utilizado para
realçar a permeabilização das células. Em seguida, as células foram lavadas
com 1ml de perm/wash buffer e ressuspendidas em 100µl de citofix/cytoperm
buffer e incubadas por 5 minutos no gelo. Após esse período, as células foram
lavadas em 1ml de perm/wash buffer e ressuspendidas em 1ml de DNAse
(100Kunitz). Em seguida, as células foram lavadas em 1ml de perm/wash
buffer e ressuspensas em uma solução de anti-BrdU diluído em perm/wash
buffer. As amostras foram incubadas por 20 minutos em temperatura ambiente
e após, lavadas em 1ml de perm/wash buffer. Por fim, as células foram
ressuspendidas em 500µl de staining buffer e analisadas no citômetro
FACScan (BD Bioscience) do laboratório de hematologia da FMRP/USP.
É importante salientar a reprodutibilidade entre as placas de cultura de
100x20mm e 12 poços, uma vez que a proporção da quantidade de CTMs
plaqueadas foi proporcional à área dos poços e o ao volume de meio de cultura
utilizado.
Cada poço da placa de 12 poços possui área de 3,8 cm2, nesse
espaço adicionamos 1x105 CTMs em 2ml de meio de cultura. A placa de
100x20 tem área de 57 cm2, nesse espaço adicionamos 1,5x105 CTMs em
30ml de meio de cultura.
46
3.15 Microarray
A análise do perfil de expressão gênica das amostras foi realizada
utilizando a plataforma comercial Agilent de microarrays de oligonucleotídeos
utilizando o Kit “Whole Human Genome Oligo Microarray Kit” (Agilent, G4112F),
contendo seqüências de mais de 41.000 transcritos de genes. Em suma, após
a obtenção e quantificação do RNA total, 1µg de cada amostra foi utilizados
para gerar o RNA complementar (cRNA) marcado com o fluorocromo,
utilizando o kit “Quick Amp Labeling Kit, one-color” (Agilent, 5190-0442),
seguindo as instruções do fabricante. Resumidamente, uma quantidade prédeterminada de RNA controle “One Color RNA Spike-In Kit” (Agilent, 51885282) foi adicionada a cada amostra e o RNA submetido a uma transcrição
reversa utilizando primers oligo(dT) contendo a seqüência promotora da RNA
T7 polimerase. Após a síntese da segunda fita, o cDNA gerado foi purificado e
utilizado em reações de transcrição de RNA in vitro utilizando a enzima T7 RNA
polimerase e nucleotideos marcados com Cyanina 3 (Cyanine 3-CTP). Este
passo amplifica a amostra de RNA (e os controles do Spike in Kit) linearmente,
mantendo a representatividade original da amostra, gerando um RNA
complementar (cRNA) marcado. O cRNA de cada amostra foi então purificado
com o kit llustra RNAspin mini Kit (GE Lifesciences, 25050071), quantificado e
avaliado quanto à eficiência da marcação utilizando o espectrofotômetro
NanoDrop 1000 (Thermo Scientific). O cRNA marcado foi fragmentado e
hibridizado às laminas utilizando o Kit “Gene Expression Hybridization Kit”
(Agilent, 5188-5242). Como cada lamina compreende 4 arrays, para a
hibridização, o cRNA marcado e fragmentado de cada amostra foi colocado em
laminas auxiliares especiais contendo anéis isolantes que definem a região de
47
cada array na lamina de microarray (Hybridization Gasket Slide Kit, Agilent,
G2534-60011). Os microarrays foram colocados sobre as laminas auxiliares de
maneira que uma câmara, contendo o material a ser hibridizado, se formou.
Esta montagem foi realizada em câmaras de hibridação SureHyb (Agilent,
G2534A) que foram então colocadas em um rack/rotor (Agilent, G2530-60029)
dentro de um forno de hibridação (Agilent, G2545A). As lâminas foram
incubadas durante a noite por 17 horas a 65oC a 4 RPM.
Após hibridização,
as laminas foram lavadas em recipientes especiais com tampões específicos
“Wash Buffers 1 e 2 Kit” (Agilent, 5188-5327) e depois de secas foram
finalmente escaneadas e analisadas. O Kit “One Color RNA Spike-In Kit”
consiste de um conjunto de 10 transcritos de RNA bacteriano poliadenilados
que são utilizados como controles positivos da hibridação. Estes controles
estão presentes em concentrações abrangendo 6 logs de diferença e são
otimizados para anelarem a oligonucleotideos complementares, presentes em
múltiplos spots distribuídos ao longo do microarray, com um mínimo de
hibridação cruzada ou auto hibridação. Desta forma, após escaneamento e
quantificação dos spots presentes na lâmina utilizando o software “Agilent
Feature Extraction“ (version 8.5), um relatório de qualidade das hibridações é
gerado para o controle dos experimentos.
3.15.1 Análise dos Dados de Microarray
Clusterização Hierárquica
Com o objetivo de avaliar globalmente as similaridades transcricionais
entre as amostras de linfócitos T (CD4 e CD8), ativados e cultivados na
ausência ou na presença de CTMs, o software de clusterização Cluster 3.0
48
desenvolvido por Eisen (Eisen et al, 1998) e aprimorado por de Hoon e
colaboradores (de Hoon et al, 2004) (disponível em http://bonsai.ims.utokyo.ac.jp/~mdehoon/software/cluster) foi utilizado para o agrupamento
hierárquico dos perfis transcricionais.
Com o objetivo adicional de identificar o efeito global da ativação sobre o
perfil transcricional dos linfócitos, utilizamos dados correspondendo ao perfil de
expressão gênica de linfócitos TCD4 e TCD8 não estimulados, obtidos de
similarmente por seleção imunomagnética positiva e utilizando a mesma
plataforma de microarray. Os dados cedidos foram derivados de um projeto de
colaboração do nosso laboratório (doutorado de Alessandra de Paula Souza,
desenvolvido sob orientação do Dr. Julio Voltarelli).
A matriz de dados utilizada como entrada para o software Cluster 3.0, foi
gerada utilizando os niveis transcricionais normalizados de um total de 43376
spots. Esta matriz foi gerada com auxílio do software Microsoft Access e
exportada como um arquivo de texto (separados por TABs) com os genes
dispostos em linhas e os respectivos niveis transcricionais dispostos à frente,
em sucessivas colunas, correspondendo aos perfis transcricionais das
diferentes amostras.
Nenhuma normalização ou transformação adicional foi utilizada para a
realização da clusterização hierárquica, obtida pelo método de Average
Linkage utilizando uma métrica baseada no coeficiente de correlação de
Spearman Rank. O dendograma ilustrando o agrupamento (cluster) resultante
foi gerado e visualizado utilizando o software Java TreeView, desenvolvido
pelos mesmos autores referidos acima.
49
Seleção de Genes Diferencialmente Expressos e Identificação de Vias de
Sinalização Moduladas
Linfócitos T ativados e cultivados na ausência de CTMs foram
comparados com aqueles derivados dos co-cultivados na presença de CTMs.
As amostras de linfócitos TCD4 e TCD8 foram analisadas em separado e,
alternativamente, em conjunto. Os valores de expressão normalizados de cada
spot foram utilizados em uma análise estatística (teste-T) não pareada, de
forma a identificar transcritos diferencialmente expressos entre as classes
consideradas. A plataforma de análise online Gene Expression Profile Analysis
Suite - GEPAS (acessada em: http://gepas.bioinfo.cipf.es/) foi utilizada.
Com o objetivo de permitir a identificação de vias de sinalização
alteradas, a plataforma de análises on-line Ingenuity Pathway Analysis
(http://www.ingenuity.com/) foi utilizada. Dada à abordagem escolhida, um valor
de p pouco estringente foi escolhido (P<0,05), resultando na seleção de um
número maior de transcritos diferencialmente expressos. Esta abordagem
permite que a seleção de genes biologicamente relevantes, não se baseie
unicamente na significância estatística, mas também, na existência de genes
participantes de uma mesma via de sinalização e que apresentam mudanças
em um mesmo sentido. Desta forma a baixa significância estatística (oriunda
do valor de p relativamente alto, para estudos de microarray) é compensada
pela “significância biológica” (oriunda dos indícios adicionais, fornecidos pela
observação de alterações congruentes de genes interligados funcionalmente).
50
3.16 PCR em tempo real
A validação dos resultados obtidos pela técnica de microarray foi
realizada por PCR em tempo real.
Realizamos
(Hs00203958_m1),
a
quantificação
IL-10
relativa
(Hs00174086_m1),
dos
CTLA4
genes
FOXP3
(Hs00175480_m1),
GITR/TNFRSF18 (Hs00188346_m1) IRAK3 (Hs00200502_m1), A20/TNFAIP3
(Hs00234713_m1),
BTRC/
betaTrC
(Hs00182707_m1),
NFKB1
(Hs00765730_m1), NFKB2 (Hs00174517_m1), RELA (Hs00153294_m1) e
RELB (Hs00232399_m1). As reações foram feitas em duplicatas, no aparelho
de detecção de PCR em tempo real 7300 Real Time PCR System (Applied
Biosystems), com uso de sondas TaqMan e de MasterMix (Applied
BioSystems). As amostras foram normalizadas pela diferença de ciclos (∆Ct)
entre os genes avaliados e a referência interna (média de GAPD e β-actin). O
fold relativo foi obtido pela fórmula 2-∆∆Ct (Pfaffl, 2001) , usando a mediana dos
Cts dos linfócitos cultivados isoladamente como referência; o
∆∆Ct foi
calculado pela subtração do ∆Ct da referência pelo ∆Ct da amostra.
O
software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) foi
utilizado para gerar os gráficos e para calcular a significância estatística,
aplicando o teste t pareado.
51
RESULTADOS
52
4. RESULTADOS
4.1 Caracterização Funcional das CTMs
A caracterização funcional foi avaliada pela capacidade das CTMs de se
diferenciar em adipócitos e osteócitos, em meio de cultura específico.
Conforme esperado as células apresentaram características típicas de
células troncas mesenquimais (Pittenger et al, 1999). Quando cultivadas com
dexametasona e acido ascórbico, as celulas se diferenciaram para a linhagem
osteogênica, como demonstrado pelo acúmulo de cálcio revelado pela
coloração von Kossa, enquanto que em culturas com insulina, dexametasona e
indometacina elas originaram adipócitos, identificados por vacuolos corados
com Sudan III (Fig. 1).
Fig 1 . Diferenciação das CTMs. Imagens aumentadas 1000X ilustrando a diferenciação das
CTMs em adipócitos (coloração Sudan III) e osteócitos (von Kossa). Esquerda: controle
negativo de diferenciação. Centro: diferenciação das CTMs em adipócitos. Direita:
diferenciação das CTMs em osteócitos.
53
4.2 Caracterização Imunofenotípica das CTMs
A imunofenotipagem revelou um perfil típico de CTMs, as células não
apresentaram expressão de marcadores hematopoéticos, CD45, CD34 e
CD14, nem da molécula de adesão CD31 (molécula de adesão celular
endotelial plaquetária), mas expressaram CD105 (SH2), CD73 (SH3/4), CD44,
CD90 (Thy-1) e as moleculas de adesão CD106 (molécula de adesao celular
vascular), CD166 (molécula de adesao celular de leucócito ativado) e CD29. As
células não expressaram HLA DR e anti-KDR.
4.3 Pureza dos linfócitos T CD3 obtidos por separação
imunomagnética
Para avaliação da pureza das células T (Fig. 2), reservamos 5X105
células para marcação com 10µl de FITC anti-CD3 (Pharmingen) e com 10µl
do isotipo controle.
As seleções realizadas para obtenção dos linfócitos T nos três pacientes
apresentaram pureza de 97,02 %, 97,62% e 99,09%. A análise foi realizada no
citômetro FACScan (BD Bioscience) do laboratório de citometria de fluxo do
Hemocentro de Ribeirão Preto.
54
97,62%
Fig. 2. Avaliação por citometria de fluxo da pureza das células T obtidas por seleção negativa
(representativo de um experimento). Esquerda: Dot plot do isotipos controle. Direita: Dot plot
com 97,64% (gated) de células T CD3.
4.4 Pureza dos linfócitos TCD4 e TCD8 obtidos por separação
imunomagnética
Para avaliação da pureza das células TCD4 e TCD8 (Tab. 1),
reservamos 5x105 células para marcação com 10µl PE anti-CD4 FITC ou antiCD8 (Pharmingen) e com 10µl dos respectivos isotipos controle. A análise foi
realizada no citômetro FACScan (BD Bioscience) do laboratório de citometria
de fluxo do hemocentro de Ribeirão Preto.
55
Tabela 1. Pureza das subpopulações linfocitárias avaliada pela porcentagem
de CD4 e CD8. A análise foi realizada no citômetro FACScan (BD Bioscience)
do laboratório de citometria de fluxo do Hemocentro de Ribeirão Preto.
Linfócitos cultivados
isoladamente
Linfócitos cultivados com CTMs
Amostras
CD4
CD8
CD4
CD8
1
99,02
99,85
94,21
97,38
2
93,82
99,00
94,00
96,35
3
97,92
97,69
99,00
99,00
4.5 Proliferação dos linfócitos cultivados ou não com CTMs
A imunomodulação mediada pelas CTMs foi avaliada utilizando o kit
APC BrdU Flow Kit (BD Pharmigen). As CTMs exerceram um forte efeito
imunomodulatório sobre os linfócitos (Fig. 3). Como pode ser visto na tabela 2,
houve maior incorporação de bromodeoxyuridina pelos linfócitos cultivados
isoladamente, comparados aos co-cultivados com CTMs.
Linfócitos
CTM - linfócitos
1:5
Fig. 3. Avaliação da imunomodulação dos linfócitos pelas CTMs. Imagens aumentadas 40X
comparando a cultura isolada de linfócitos e o co-cultivo, em proporção CTMs-linfócitos (1:5).
56
Tabela 2. Porcentagem de proliferação dos subtipos linfocitários que foram
cultivados isoladamente ou em presença das células tronco mesenquimais. A
análise foi realizada no citômetro FACScan (BD Bioscience) do laboratório de
citometria de fluxo do Hemocentro de Ribeirão Preto.
Linfócitos cultivados
Linfócitos cultivados com CTMs
isoladamente
Amostras
CD3
CD4
CD8
CD3
CD4
CD8
1
43,5
31,6
41,3
25
19,0
26,5
2
NR
NR
NR
17,7
7,7
11,1
3
41,3
31,9
40,5
19,2
10,5
16,8
* as células incorporaram BrdU por 1h. NR – Não realizado
4.6 Microarray
4.6.1 Qualidade dos Microarrays
Após escaneamento e quantificação dos spots presentes na lâmina
utilizando o software “Agilent Feature Extraction“ (version 8.5), um relatório de
qualidade das hibridações é gerado para o controle dos experimentos.
O relatório gerado a partir do uso do kit “One Color RNA Spike-In Kit”
revelou que as hibridizações foram realizadas com sucesso (Fig. 4). O
coeficiente de variação mediano obtido a partir dos sinais de fluorescência dos
diferentes controles foi inferior a 5% para todas as hibridações (Fig. 4,
esquerda). Adicionalmente, uma relação linear entre o sinal obtido e a
concentração dos Spikes ao longo de 4 Logs foram obtidas em todas as
hibridações, demonstrando um alcance dinâmico (Dynamic Range) abrangendo
4 ordens de magnitude.
57
Fig. 4. Qualidade de hibridização dos 10 transcritos de RNA bacteriano, controles positivos de
hibridização. Esquerda: Coeficiente de Variação dos sinais de fluorescência obtidos para os
diferentes controles. Direita: Relação linear entre o sinal obtido e a concentração dos Spikes.
Resultados representativos de um experimento.
4.6.2 Similaridades Gerais entre os Perfis Transcricionais
Clusterização Hierárquica
Após a clusterização hierárquica, obtivemos um dendograma revelando
um panorama geral das diferenças e similaridades entre as distintas células e
condições avaliadas (Fig. 5). Interessantemente, enquanto as amostras de
linfócitos T auxiliares não ativados (CD4) podem ser claramente distinguidas
dos linfócitos T citotoxicos (CD8), com base em seu perfil transcricional (com a
formação de dois clusters distintos), o mesmo não ocorre após a ativação dos
linfócitos. As diferenças transcricionais existentes entre linfócitos TCD4 e TCD8
em repouso, passam a ter um peso menor no agrupamento dos linfócitos
ativados, tanto co-cultivados (CD4-M e CD8-M) ou não (CD4-L e CD8-L). Este
58
agrupamento aleatório entre amostras CD4 e CD8 indica que as mudanças
transcricionais induzidas pela ativação, acabam por superar as diferenças
evidentes nas células em repouso. Apesar das mudanças induzidas pela
ativação
tornarem
os
linfócitos
TCD4
e
TCD8
mais
próximos
transcricionalmente, o agrupamento separado dos linfócitos co-cultivados
(CD4-M e CD8-M) e não co-cultivados (CD4-L e CD8-L) indica claramente que
o co-cultivo resulta em amplas modificações no perfil transcricional dos
linfócitos ativados.
Fig. 5. Clusterização hierárquica das amostras. O Agrupamento obtido revela que as
diferenças entre linfócitos T CD4 e CD8 não estimulados (em cima), diminuem após a ativação
com beads CD3/CD28 (centro). A clusterização entre os linfócitos cultivados isoladamente e os
co-cultivados demonstra claramente que as CTMs alteram o perfil transcricional dos linfócitos
59
ativados (em baixo). Resultados do Software Cluster 3.0 visulalisados utilizando o programa
Java TreeView.
4.6.3 Genes Diferencialmente Expressos
O agrupamento separado dos linfócitos co-cultivados (CD4-M e CD8-M)
e não co-cultivados (CD4-L e CD8-L), obtido naturalmente pela análise não
assistida de clusterização, reflete a existência de genes diferencialmente
expressos ligados a processos moleculares modulados mediante o co-cultivo
com as CTMs. Assim, apesar do número pequeno de amostras, um conjunto
relevante de transcritos diferencialmente expressos pôde ser obtido.
A análise das amostras de linfócitos TCD4 revelou que de um total de
43376 spots presentes na lâmina, um total de 11353 spots foram considerados
diferencialmente expressos, sendo 4855 mais expressos e 6498 menos
expressos nos linfócitos co-cultivados com as CTMs, comparados aos linfócitos
cultivados isoladamente.
A análise das amostras de linfócitos TCD8 revelou que de um total de
43376 spots presentes na lâmina, um total de 8322 spots foram considerados
diferencialmente expressos, sendo 3758 mais expressos e 4564 menos
expressos nos linfócitos co-cultivados com as CTMs, comparados aos linfócitos
cultivados isoladamente.
A comparação dos conjuntos de genes diferencialmente expressos
obtidos para as amostras CD4 e CD8 revelou pouquíssimas diferenças. De
fato, dos 4855 transcritos mais expressos nos linfócitos TCD4 co-cultivados
com CTMs, 4647 (95,7%) foram igualmente modulados nos linfócitos TCD8
(não considerando o valor de p obtido). Da mesma forma, dos 6498 transcritos
60
menos expressos nos linfócitos TCD4 cocultivados com CTMs, 6146 (94,6%)
foram igualmente modulados nos linfócitos TCD8.
Ainda, dos 3758 transcritos mais expressos nos linfócitos TCD8 cocultivados com CTMs, 3670 (97,6%) foram igualmente modulados nos linfócitos
TCD4; enquanto, dos 4564 transcritos menos expressos nos linfócitos TCD8
co-cultivados com CTMs, 4471 (97,9%) foram igualmente modulados nos
linfócitos TCD4.
Estes resultados estavam em linha com os resultados obtidos pela
clusterização, evidenciando a similaridade transcricional entre linfócitos TCD4 e
TCD8 ativados, e indicaram que a análise estatística conjunta das amostras
CD4 e CD8 poderia permitir a seleção adicional de transcritos diferencialmente
expressos, excluídos em função do valor de p elevado (resultante do número
reduzido de amostras).
Assim, esta nova análise revelou que de um total de 43376 spots
presentes na lâmina, um total de 15032 spots foram considerados
diferencialmente expressos, sendo 6655 mais expressos e 8377 menos
expressos nos linfócitos co-cultivados com as CTMs, comparados aos linfócitos
cultivados isoladamente.
4.6.4 Vias de Sinalização e Transcritos Diferencialmente Expressos
A comparação entre o perfil de expressão gênica dos linfócitos
imunomodulados ou não pelas CTMs, pelo software Ingenuity Pathway
Analysis, revelou modificações em vias relacionadas ao ciclo celular (G1/S), e
de vias envolvidas na regulação da resposta imune como, a do receptor TCR e
da sinalização da via NF-KB (Fig. 6, 7 e 8, respectivamente).
61
Fig. 6. Via de progressão da fase G1 para S do ciclo celular gerada pelo Software
Ingenuity Pathway Analysis. As cores vermelha e verde representam, respectivamente, a
maior ou menor expressão nos linfócitos imunomodulados (co-cultivados), em comparação aos
linfócitos cultivados isoladamente. A intensidade é proporcional à razão (fold) de expressão
entre os sinais obtidos no microarray. Dados representativos das diferenças obtidas para
linfócitos TCD4.
62
Fig. 7. Via de sinalização do receptor de células T gerada pelo Software Ingenuity
Pathway Analysis. As cores vermelha e verde representam, respectivamente, a maior ou
menor expressão nos linfócitos imunomodulados (cocultivados), em comparação aos linfócitos
cultivados isoladamente. A intensidade é proporcional à razão (fold) de expressão entre os
sinais obtidos no microarray. Dados representativos das diferenças obtidas para linfócitos
TCD4.
63
Fig. 8. Via de Sinalização NF-KB gerada pelo Software Ingenuity Pathway Analysis. As
cores vermelha e verde representam, respectivamente, a maior ou menor expressão nos
linfócitos
imunomodulados
(cocultivados),
em
comparação
aos
linfócitos
cultivados
isoladamente. A intensidade é proporcional à razão (fold) de expressão entre os sinais obtidos
no microarray. Dados representativos das diferenças obtidas para linfócitos TCD4.
64
4.7 PCR em tempo real
As validações das vias de sinalização mencionadas acima foram
realizadas por PCR em tempo real. Na via NF-KB, elegemos validar a
expressão dos genes RelA (Applied Biosystem, Hs00153294_m1), RelB
(Applied Biosystem, Hs00232399), NFKB1 (Applied Biosystem, Hs00765730),
NFKB2 (Applied Biosystem, Hs001174517), IRAK (interleukin-1 receptorassociated kinase 3), TNFAIP3 (tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3)
e BTCR (beta-transducin repeat containing). Validamos a diferença de
expressão do gene CTLA4 (Applied Biosystem, Hs001175480) que esta
envolvida na sinalização TCR.
Analisamos também as diferenças de expressão de genes clássicos
relacionados à resposta imunológica e geração de células regulatórias, como
GITR (Applied Biosystem, Hs00188346_m1), FOXP3 (Applied Biosystem,
Hs00203958_m1) e IL-10 (Applied Biosystem, Hs00174086_m1).
A avaliação transcripcional por PCR em tempo real revelou que a
expressão dos genes FOXp3, CTLA-4, GITR e IL-10 (envolvidos no mecanismo
de immunoregulação), RELA, RELB e NFKB2, IRAK3 e TNFAIP/A20, e BTCR,
foram toda estatisticamente mais elevada nos linfócitos co-cultivados com
CTMs, quando compara aos cultivados isoladamente (Fig. 7).
65
A
p=0,0016
p=0,0202
8
50
40
Fold
4
2
30
20
10
L
L
L/
M
0
L/
M
0
FOXP3
IL-10
p=0,0026
p< 0.0001
15
20
15
Fold
Fold
10
5
10
5
0
CTLA4
L
L
L/
M
0
L/
M
Fold
6
GITR
66
B
p=0,2147
p= 0,0011
2.5
3
2.0
Fold
Fold
2
1
1.5
1.0
0.5
L
L/
M
L
L/
M
0.0
0
NFKB1
REL A
0,0468
p=0,0038
6
5
4
Fold
Fold
4
2
3
2
1
L
L
REL B
NFKB2
p=0,0006
p=0,0006
20
50
40
Fold
15
10
5
30
20
10
0
L
L/
M
L
0
L/
M
Fold
L/
M
0
L/
M
0
IRAK3
TNFAIP
p=0,0010
5
Fold
4
3
2
1
L
L/
M
0
BTRC
+
Fig. 7. Analise de expressão gênica por PCR em tempo real. Linfócitos T CD3 de 4
indivíduos foram ativados com beads anti-CD2/CD3/CD28 e cultivados isoladamente ou com
+
CTMs. Após 5 dias de cultivo, os linfócitos T CD4 foram obtidos tanto da cultura isolada (L)
67
como do co-cultivo (L/M) (seleção imunomagnética) e submetidos a analise de expressão
gênica de transcritos típicos de células regulatórias (A) e componentes da via de sinalização
-∆∆Ct
NF-kB (B). Os valores relativos em fold foram obtidos pela fórmula 2
, usando mediana do
Ct dos linfócitos cultivados isoladamente como referência. A significância estatística foi
calculada pelo teste T não pareado.
68
DISCUSSÃO
69
5. DISCUSSÃO
No presente trabalho, demonstramos que as CTMs exercem seu efeito
imunossupressor por alterar o perfil transcricional de genes relacionados aos
processos de ciclo celular, ativação do receptor de células T (TCR) e da via
NF-kB de linfócitos TCD4+ e TCD8+ .
O processo de transição do ciclo celular envolve múltiplos checkpoints
que coordenam fatores de crescimento extracelular, tamanho celular e
integridade do DNA.
O ciclo de celular de células somáticas compreende
quatro fases distintas, em duas das quais as células executam eventos básicos
da divisão, como geração do material genético (fase S - síntese) e divisão dos
componentes celulares para as células filhas (Fase M – mitose). As outras
duas fases do ciclo celular representam os períodos gap (G1 e G2), quando as
células preparam-se para a conclusão bem sucedida das fases S e M,
respectivamente. Quando as células cessam a proliferação, seja por ausência
de estimulo mitogênico ou por um estimulo anti-mitogênico, elas assumem um
estado quiescente, conhecido por G0 (Pardee et al, 1978;Park & Lee, 2003).
A transição de uma fase do ciclo celular para outra ocorre de forma
ordenada e é regulamentada por diferentes proteínas celulares. As principais
proteínas reguladoras são as ciclinas e as ciclinas dependentes de quinases
(CDK), uma família de serina / treonina quinases que são ativadas em pontos
específicos do ciclo celular e participam da fosforilação de um grupo de
proteínas alvo (Morgan, 1995;Pines, 1995). Cada fase do ciclo celular tem sua
combinação própria de ciclinas e CDK, sendo que as ciclinas D-CDK4/6 e a
ciclina E-CDk2 as principais reguladoras da transição da fase G1 para a fase S
do ciclo celular (Sherr & Roberts, 1999;Boonstra, 2003), a inativação delas
70
bloqueia temporariamente a progressão da fase G1 do ciclo celular (Ezhevsky
et al, 1997;Serrano et al, 1993). O primeiro complexo a ser ativado durante a
gase G1 do ciclo celular é o ciclina D-CDK4/6 (Sherr, 1995). Durante a
progressão dessa fase, ocorre a síntese da ciclina E, a qual possui um pico
máximo de síntese no final da fase G1. A associação da ciclina E com CDK2 é
essencial para a entrada da fase S do ciclo celular (Ohtsubo et al, 1995). Os
nossos resultados obtidos pela técnica de microarray indicam que um dos
mecanismos pelo qual as CTMs inibem a proliferação dos linfócitos TCD4 e
TCD8 é a inibição das vias da ciclina D e E. De fato, em 2005, utilizando um
modelo murino, Sarah Glennie et al (2005) observaram que CTMs inibem
irreversivelmente a proliferação dos linfócitos T por diminuir a expressão de
ciclina D2, e consequentemente, bloquear a fase G1 do ciclo celular,
ocasionando um ciclo celular arrastado nessas células.
Além disso, eles
demonstram que as CTMs induzem a maior expressão da proteína inibitória
p27Kip1 nos linfócitos, e dessa maneira bloqueiam a progressão da fase G1
para S do ciclo celular.
Ademais, recentemente foi demonstrado que as CTMs expressam uma
molécula que exerce uma função co-estimulatória negativa, chamada B7-H4,
que provoca um bloqueio na progressão da fase G0/G1 e desse modo diminui
proliferação dos linfócitos T ativados por anti-CD3 e anti-CD28 (Xue et al,
2010).
Além da menor expressão de genes envolvidos na progressão da fase
G1 para a fase S do ciclo celular, o estudo de expressão gênica por microarray
revelou que os linfócitos co-cultivados com CTMs apresentaram diminuição na
expressão de vários componentes envolvidos na sinalização da via TCR.
71
Funcionalmente, o efeito das CTMs no estado de ativação dos linfócitos
T foi estudado por alguns grupos. Embora seja sabido que as CTMs inibem a
ativação dos linfócitos in vitro e in vivo (Aggarwal & Pittenger, 2005;Augello et
al, 2005;Glennie et al, 2005;Krampera et al, 2003;Lazarus et al, 1995;Lazarus
et al, 2005;Le Blanc K. et al, 2004b;Le Blanc K. et al, 2008;Tse et al, 2003), a
análise exclusiva de alguns marcadores de ativação podem apresentar
diferenças. Ramasamy et al (2008) analisou o efeito das CTMs em linfócitos T
ativados por beads anti-CD3/CD28 e reportou que não há alteração na
expressão dos marcadores CD25 e CD69 nos três primeiros dias de co-cultivo,
comparado a linfócitos ativados cultivados isoladamente. Nós analisamos
exclusivamente a expressão do marcador CD69 e nossos resultados são
similares aos de Ramasamy nas primeiras 24 horas de cultivo, entretanto as
CTMs foram capazes de promover e sustentar o aumento da expressão desse
marcador no terceiro e quinto dia de cultivo (esses resultados serão discutidos
posteriormente). Entretanto, de acordo com Groh et al (2005) e Le Blanc
(2004), as CTMs inibem a expressão dos marcadores de ativação CD25, CD38
e CD69 em linfócitos T estimulados por fitohemaglutinina (PHA).
Essas
diferenças nos resultados provavelmente derivam de diferenças experimentais
no cultivo das células, como a relação entre o número de linfócitos e de CTMs
cultivados ou, mais provavelmente, tempo de avaliação e os estímulos de
ativação utilizado.
In vitro, a ligação do anti-CD3 no receptor TCR, simultânea à
estimulação de receptores co-estimulatórios como o CD28 é necessária para
provocar a ativação dos linfócitos T (Aggarwal & Pittenger, 2005;Augello et al,
2005;Glennie et al, 2005;Tse et al, 2003;Weiss & Littman, 1994). A sinalização
72
da via TCR leva à ativação da família de quinases src p56lck (LCK) e p59fyn
(FYN). A proteína quinase de 70kDa (ZAP70) pode ser ativada pela LCK ou
recrutada pelo receptor CD3 fosforilado (Salmond et al, 2009). Uma vez ativa,
ZAP70 fosforila duas importantes proteínas adaptadoras para a ativação das
células T, LAT e SLP-76 (Au-Yeung et al, 2009). A proteína LAT é capaz de
ativar as proteínas GRB2 e Vav. Juntos, os sinais integrados dessas moléculas
efetoras regulam os mecanismos de sinalização (via IP3-Ca++, proteína quinase
C, NF-kB e Ras/ERK) que estão associados com respostas celulares
especificas, como por exemplo, a ativação dos linfócitos T (Salmond et al,
2009;Samelson, 2002;Nel, 2002).
Nossos resultados claramente mostram a diminuição da expressão de
diversas moléculas efetoras que participam dos sinais iniciais para ativação via
TCR nos linfócitos imunomodulados pelas CTMs, dentre elas Vav, LAP e
ZAP70.
De fato, os linfócitos cultivados isoladamente apresentaram maior
expressão de genes participativos da via Ras/ERK e de alguns componentes
da via JNK, embora o gene c-Jun esteja mais expresso nos linfócitos
imunomodulados pelas CTMs.
A ativação da via JNK é dependente da sinalização TCR e de CD28 e,
assim como a via Ras/ERK, promove a ativação do promotor do gene da IL-2,
citocina que confere os estímulos de sobrevivência e expansão celular (Su et
al, 1994;Kempiak et al, 1999;Genot et al, 1996). O gene da IL-2 bem como seu
receptor foram mais expressos nos linfócitos imunomodulados. Em parte, isso
poderia ser explicado pelo fato de que a população de linfócitos T isolada para
estudo é uma população mista que contém Tregs além de linfócitos helper. A
geração de Tregs é um dos mecanismos de imunomodulação desempenhado
73
pelas CTMs (Di Ianni M. et al, 2008;Maccario et al, 2005;Prevosto et al, 2007).
Nesse contexto, a IL-2 desempenha função central na geração, sobrevida e
função das Tregs (Yao et al, 2007;Zorn et al, 2006;Ahmadzadeh et al, 2007).
A
via
de
sinalização
de
TCR
demonstrou
que
os
linfócitos
imunomodulados pelas CTMs apresentaram maior expressão dos genes CTLA4 (validado por RT-PCR) e NFAT, enquanto que a via de progressão da fase
G1 para a fase S do ciclo celular revelou que o gene Smad3 também estava
mais expresso nesses linfócitos suprimidos. Interessantemente, esses 3 genes
estão diretamente relacionados à geração e função das Tregs.
A proteína CTLA-4 tem como principal função inibir a resposta
imunológica dos linfócitos T, o uso de anti-CTLA4 inibe a ativação e
proliferação dos linfócitos T (Krummel & Allison, 1996;Walunas et al, 1996).
Essa proteína é constitutivamente expressa em lTregs (Takahashi et al,
2000;Read et al, 2000).
Ambos os fatores de transcrição Smad3 e NFAT cooperam para induzir
a expressão de FOXP3 e consequentemente participam do processo de
diferenciação dos Tregs. A ativação de Smad3 não é necessária para
manutenção da expressão de FOXP3, esse processo parece ser dependente
da sinalização TCR-CD3 e da ativação da via NFAT (Wu et al, 2006;Tone et al,
2008). Nessa linha, nossos resultados mostram claramente que os linfócitos
co-cultivados com CTMs expressavam níveis elevados de genes relacionados
à função imunoreguladora, como FOXP3 (Read et al, 2000); GITR (Kanamaru
et al, 2004)e IL10 (Von Boehmer H., 2005), quando comparados aos linfócitos
ativados cultivados isoladamente.
74
Por fim, a via de sinalização TCR revelou que a expressão do gene NFKB está elevada nos linfócitos co-cultivados com CTMs. Inicialmente esse
resultado nos pareceu contraditório, visto que a co-estimulação dos linfócitos T
pela via TCR e CD28 induz a ativação da via NF-KB e as CTMs diminuem o
estado de ativação dos linfócitos (Ghosh & Hayden, 2008;Groh et al,
2005;Harhaj & Sun, 1998;Kane et al, 2002;Le Blanc K. et al, 2004a;Wang et al,
2004). No entanto a diversidade de genes envolvidos nessas vias, em especial
sua dualidade, explica o achado como discutido a seguir.
A família NF-kB é composta por cinco diferentes subunidades: NFKB1
(p105 e 150), NFKB2 (p100 e p52), c-Rel, RelB e RelA (p65). A sinalização de
NF-KB pode ser ativada por duas vias: via canônica (mediada principalmente
pelos heterodímeros de RelA – p50) e a via não canônica (mediada pelos
heterodímeros RelB – p52). Ambas as vias atuam por complexos do fator de
transcrição de NF-KB, composto pelas subunidades regulatórias NF-KB1/p50
ou NF-KB2/p52, e as subunidades trancricionalmente ativas, RelA, RelB ou cRel (Bonizzi & Karin, 2004;Ghosh & Hayden, 2008;Vallabhapurapu & Karin,
2009).
Na via canônica de NF-KB, os heterodimeros de RelA são inativados no
citoplasma pelas proteínas inibitórias IkB (IkBα, IkBβ, IkBε ou proteínas
precursoras p105 e p100). As IkB podem ser fosforiladas por um complexo de
IkB quinases (IKKβ e IKKγ, mas não IKKα), ocasionando uma degradação
proteosomal que libera o complexo NF-KB que migra para o núcleo celular e
ativa a transcrição de seus genes alvos (Karin & Ben-Neriah, 2000).
Ao contrário da via canônica de NF-kB, na via não canônica os
heterodímeros de RelB (RelB – p100 ou RelB – p50) são mantidos inativos no
75
citoplasma apenas pela subunidade p100, não sendo inibidos por outras
proteínas IkB (Derudder et al, 2003).
Em sítios inflamatórios, o fator de transcrição NF-kB responde à
sinalização do meio, induzindo a transcrição de diversos genes pró-inflamatório
(Bonizzi & Karin, 2004), incluindo citocinas, quimiocinas e moléculas de adesão
que são essenciais para a resposta inata e adaptativa. Nesse processo, a via
canônica de NF-kB parece ser a principal via atuante (Ghosh & Karin, 2002).
Entretanto, pesquisas recentes têm revelado que a via NF-KB possui
importante papel na resolução da inflamação, por inibir genes pró-inflamatórios
e por induzir a expressão de genes antiinflamatórios, como por exemplo, a IL10 (Fong et al, 2008;Greten et al, 2007;Tomczak et al, 2006).
O papel da via NF-KB na resolução da inflamação, em parte, justifica a
maior expressão desse fator de transcrição nos linfócitos imunomodulados
pelas CTMs. Além disso, foi demonstrado recentemente que, junto ao CD28, cRel
(mais
expresso
nos
linfócitos
co-culitvados
com
CTMs)
parece
desempenhar um importante papel na geração das Tregs (Vang et al,
2010;Deenick et al, 2010;Ruan et al, 2009;Long et al, 2009).
A sinalização da via NF-kB gerada pelo Ingenuity Pathway Analysis
aponta para uma sinalização preferência da via não canônica de NF-KB nos
linfócitos imunomodulados. Essas células apresentam expressão elevada tanto
de genes participativos dessa via de sinalização como também de inibidores
clássicos da via canônica de NF-kB, como IRAK-M e TNFAIP/A20. De fato,
durante a fase inicial da resposta imune, a via canônica de NF-kB induz a
expressão de citocinas inflamatórias como TNF- α e IL-1 nos linfócitos ativados,
caracterizando um estado inflamatório inicial com resposta rápida e intensa
76
(Ghosh & Hayden, 2008). Entretanto, essa resposta inflamatória deve ser
controlada, e mecanismos finamente regulados atuam para diminuir a resposta
de NF-kB (Renner & Schmitz, 2009). Entre as proteínas que modulam a
atividade dessa via, algumas, como TNFAIP/A20 e IkBα, são alvos
transcricionais diretos de NF-kB e constituem assim um mecanismo clássico de
feedback negativo que pode exercer diferentes efeitos na sinalização da via
clássica de NF-KB (Werner et al, 2008).
Enquanto a ativação da via canônica sofre regulação por mecanismos
de feedback negativo, a contínua ativação dos linfócitos leva a um aumento na
transcrição de componentes da via não canônica de NF-kB (Tian et al,
2005a;Tian et al, 2005b). Essa mudança dinâmica na sinalização da via NF-KB
leva a atuação dos dímeros não canônicos que, ao contrário da via canônica,
não sofrem ação inibitória das IkBs (Saccani et al, 2003).
De maneira geral, os resultados obtidos na primeira etapa desse
trabalho indicam que alterações transcricinais nos processos de ciclo celular,
ativação do TCR e sinalização da via NF-kB estão diretamente envolvidas na
imunomodulação dos linfócitos TCD4+ e TCD8+ pelas CTMs.
Conforme descrito no prefácio desse trabalho, durante a padronização
dos experimentos evidenciamos que CTMs promovem e sustentem o aumento
da
expressão
do
marcador
CD69
nos
linfócitos
T.
Esse
achado,
posteriormente, foi confirmado nas análises dos resultados da técnica de
microarray. Pelo fato de esse receptor de ativação ser controlado pela via
canônica de NF-KB (Lopez-Cabrera et al, 1995) e nossos resultados
inicialmente apontarem para uma sinalização preferencial da via não canônica
77
de NF-kB nos linfócitos imunomodulados, resolvemos investigar a participação
dessa via na expressão do receptor CD69 em linfócitos cultivados com CTMs.
78
CONCLUSÃO
79
6. CONCLUSÃO
Esses achados permitem concluir que:
- Quando em contato com CTMs, os linfócitos TCD4 e TCD8 sofrem
modificações do perfil de expressão de genes envolvidos na regulação do ciclo
celular, sinalização por TCR e estimulação da via NF-KB não canônica. Muito
semelhante ao parágrafo anterior.
- As CTMs atuam de maneira muito similar para imunomodular os linfócitos
TCD4 e TCD8.
- Essas alterações moleculares seriam responsáveis pela imunomodulação
produzida pelas CTMs.
80
CAPÍTULO I
PAPEL DIFERENCIAL DAS VIAS CANÔNICA E NÃO CANÔNICA DE NFKB NO MARCADOR CD69 EM LINFÓCITOS T CULTIVADOS COM
CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS
81
RESUMO
A ativação dos linfócitos T envolve a sinalização da via NF-KB que
media a expressão de citocinas inflamatórias e a expressão de marcadores de
ativação, como o CD69. A expressão estável desse marcador, ao contrário de
sua expressão inicial, esta associada com um subtipo de células regulatórias.
Nesse trabalho, nós descrevemos que linfócitos TCD3+ ativados com beads
anti- CD2/CD3/CD28, quando co-cultivados com células tronco mesenquimais
(CTMs), sustentam a expressão de CD69 em diversos subtipos de linfócitos e,
além disso, os linfócitos TCD4+ obtidos do co-cultivo expressam elevados
níveis de fatores imunoregulatórios (FOXP3, CTLA-4, GITR e IL-10). Esses
linfócitos TCD4+ isolados do co-cultivo também expressam elevados níveis de
subunidades da via não canônica de NF-kB (RELB e NFKB2) e inibidores da
via canônica de NF-kB (IRAK3 e A20). Por fim, enquanto o inibidor da via
canônica de NF-kB (BAY11-7082) bloqueia completamente a indução inicial de
CD69 (como marcador de ativação), ele sustenta tardiamente (como uma
molécula imunoregulatória) essa expressão quando a via canônica é inibida no
terceiro dia de cultivo. O uso de siRNA contra RelB inibiu completamente a
expressão do CD69, confirmando que a expressão tardia dessa molécula é
dependente da via não canônica de NF-kB. Portanto, as CTMs podem
promover uma transição de sinalização da via canônica para não canônica,
controlando a expressão do CD69. Em situações de inflamação crônica, esse
mecanismo pode estar envolvido na geração de células regulatórias na
periferia.
82
ABSTRACT
Upon T-cell activation, the canonical NF-κB pathway mediates the
expression of inflammatory cytokines and of activation markers, such as CD69.
In contrast to its early and transient expression, its stable expression is
associated with a regulatory T lymphocyte subset. In this work, we describe that
purified CD3+ lymphocytes activated with anti-CD2/CD3/CD28 beads, when
cocultured with mesenchymal stem cells (MSC), sustains the expression of
CD69 in diverse sub-sets; moreover, in CD4+ lymphocytes isolated from
cocultures, this is associated with higher levels of immunoregulatory factors
(FOXP3, CTLA-4, GITR and IL10). Cocultured CD4+ lymphocytes also express
higher levels of non-canonical NF-κB transcription factor subunits (RELB and
NFKB2) and inhibitors of canonical signaling (IRAK3 and A20). Finally, while the
inhibitor of canonical NF-κB signaling (BAY11-7082) completely blocks the early
induction of CD69 (as an activation marker), its late and sustained expression
(as an immunoregulatory molecule) is actually promoted when canonical
signaling is inhibited later. RELB siRNA inhibited the late expression of CD69,
confirming that the late expression of this molecule is dependent of the noncanonical NF-kB pathway. Thus, MSC may promote a potential shift from
canonical to noncanonical NF-κB signaling, controlling the expression of CD69.
Such a mechanism could be involved in the development of regulatory T cells in
the periphery, in situations of chronic inflammation.
83
INTRODUÇÃO
84
1. INTRODUÇÃO
As CTMs são capazes de suprimir a proliferação dos linfócitos T
induzida por diferentes estímulos, incluindo cultura mista de linfócitos, uso de
mitógenos (como fitohemaglutinina e concavalina A) e anticorpos (antiCD2/CD3/CD28) que mimetizam a ativação via TCR (DiNicola M. et al,
2002;Djouad et al, 2003;Krampera et al, 2003;Le Blanc K. et al, 2003a;Tse et
al,
2003).
Devido
essa
importante
propriedade,
foram
desenvolvidos
importantes trials clínicos utilizando as CTMs para prevenir ou tratar a DECH
(Le Blanc K. et al, 2008). Apesar dos resultados serem promissores, é
necessário desvendar os mecanismos moleculares que regulam esse efeito
imunomodulatório.
Apesar das CTMs inibirem a ativação dos linfócitos T (Groh et al,
2005;Le Blanc K. et al, 2004a), assim como Ramasamy et al (2008), não
encontramos diminuição na expressão do marcador de ativação CD69 nas
primeiras 24hs de co-cultivo de CTMs e linfócitos T ativados. Além disso, as
CTMs promoveram e sustentaram o aumento na expressão desse marcador.
Interessantemente, estudos recentes in vivo demonstram que em
situações de inflamação o marcador CD69 atua como uma molécula
imunoregulatória (Esplugues et al, 2003;Sancho et al, 2003;Sancho et al,
2005).
Conforme discutido anteriormente, a via canônica de NF-kB está
centralmente envolvida na ativação dos linfócitos T, mediando a produção de
diversas citocinas inflamatórias (Esplugues et al, 2003;Ghosh & Hayden, 2008)
e a expressão do marcador CD69 (Esplugues et al, 2003;Lopez-Cabrera et al,
1995). Entretanto, nossos dados preliminares apontavam para a sinalização
85
preferencial pela via não canônica de NF-KB nos linfócitos imunomodulados
por CTMs, no quinto dia de cultivo.
Portanto, nessa etapa do trabalho nos dedicamos a investigar se as
CTMs promovem a expressão tardia do marcador CD69 em linfócitos T, por
um mecanismo dependente da sinalização da via não canônica de NF-kB.
Nossos resultados sugerem que a expressão do marcador CD69 em
linfócitos T, induzida pelas CTMs, pode caracterizar a geração de um sub-tipo
de linfócitos regulatórios. Além disso, a expressão elevada de componentes da
sinalização da via NF-kB e o efeito diferencial da inibição dessa via na
expressão do marcador CD69 em fases diferentes indicam que, enquanto a via
canônica de NF-kB inicialmente controla a expressão do CD69 como um
marcador de ativação, a sua expressão tardia como molécula imunoregulatória
é controlada pela via não canônica de NF-kB. Esses resultados corroboram
recentes evidencias de que a via NF-kB atua na resolução da inflamação (Fong
et al, 2008;Greten et al, 2007;Tomczak et al, 2006), e também no
desenvolvimento e função de diferentes tipos de células regulatórias (Vang et
al, 2010;Deenick et al, 2010;Ruan et al, 2009;Long et al, 2009).
86
OBJETIVOS
87
2. OBJETIVOS
Objetivo Geral
- Investigar a expressão do marcador CD69 em linfócitos cultivados com CTMs,
assim como o mecanismo molecular que sustenta a expressão dessa molécula.
Objetivos específicos
- Avaliar a expressão do marcador CD69 em linfócitos cultivados ou não com
CTMs;
-Caracterizar fenotipicamente as subpopulações de linfócitos que expressam o
marcador CD69;
- Explorar os papéis da via canônica e não canônica de NF-kB na indução do
marcador CD69 em linfócitos T cultivados com CTMs.
88
MATERIAIS E MÉTODOS
89
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Expressão temporal do marcador CD69 em linfócitos T CD3
após cultivo com CTMs.
Para determinar o efeito das CTMs na expressão do marcador CD69, a
porcentagem células CD69+ foi avaliada por citometria de fluxo, após uma gate
nos linfócitos T CD3+ (também caracterizados por tamanho e complexidade).
A avaliação da expressão temporal do marcador CD69 em linfócitos T
CD3+ foi realizada em 6 amostras de indivíduos saudáveis. Os cultivos foram
realizados com 2.5x105 células mononucleares de sangue periférico (CMSPs)
ativadas por uso do kit Cell Activation/Expansion (Miltenyi Biotec-MACS),
cultivadas ou não com 5x104 CTMs previamente aderidas em placa de 24
poços. As CMSPs foram recolhidas para avaliação da porcentagem de CD69
no 1°, 3° e 5° dia de cultivo.
3.2 Expressão do marcador CD69 nas sub-populações de
linfócitos T CD3
Para caracterizar a expressão do marcador CD69 nas sub-populações
de linfócitos, utilizamos 3 amostras de células mononucleares de sangue
periférico adicionais. As amostras foram ativadas por uso do kit Cell
Activation/Expansion (Miltenyi Biotec-MACS) e cultivadas na presença ou não
de CTMs (conforme descrito acima) e avaliadas no 5 ° dia de cultivo, por
citometria de fluxo. Avaliamos a expressão de CD69 nos linfócitos T CD4, T
90
CD8 e nas células com fenótipo regulatório: CD4+CD25hi and CD8+CD25hi, and
CD8+CD28-.
Para essas avaliações, utilizamos os seguintes anticorpos: anti-CD4,
anti-CD8 e anti-CD28 conjugados ao fluorocromo APC, anti-CD8 e anti-CD25 ,
conjugados ao fluorocromo FITC, anti-CD3 conjugado ao fluorocromo PerCP,
anti-CD69
conjugado
ao
fluorocromo
PE
e
os
isotipos
controles
correspondentes (Pharmingen, San Jose-CA, USA).
3.3 PCR em tempo real
Para explorar os mecanismos moleculares envolvidos no aumento da
expressão do CD69 em linfócitos cultivados com CTMs, isolamos linfócitos T
CD3 de 4 indivíduos, ativamos e cultivamos por 5 dias conforme descrito
acima. Após esse período, os linfócitos T CD4+ foram obtidas por separação
imunomagnética e submetidas à extração de RNA e posterior transcrição
reversa pelo kit High Capacity cDNA Archive Kit (Applied BioSystems, Foster
City, CA), conforme instruções do fabricante.
Avaliamos por PCR em tempo real a expressão dos genes FOXP3
(Hs00203958_m1),
IL-10
(Hs00174086_m1),
CTLA4
(Hs00175480_m1),
GITR/TNFRSF18 (Hs00188346_m1) IRAK3 (Hs00200502_m1), A20/TNFAIP3
(Hs00234713_m1),
BTRC/
betaTrC
(Hs00182707_m1),
NFKB1
(Hs00765730_m1), NFKB2 (Hs00174517_m1), RELA (Hs00153294_m1) e
RELB (Hs00232399_m1). As reações foram feitas em duplicatas com uso de
sondas TaqMan e de MasterMix (Applied BioSystems). As amostras foram
normalizadas pela diferença de ciclos (∆Ct) entre os genes avaliados e a
referência interna (média de GAPD e β-actin). O fold relativo foi obtido pela
fórmula 2-∆∆Ct (Pfaffl, 2001), usando a mediana dos Cts dos linfócitos cultivados
91
isoladamente como referência; o ∆∆Ct foi calculado pela subtração do ∆Ct da
referência pelo ∆Ct da amostra.
3.4 Expressão de RelB por citometria de fluxo
Os linfócitos T obtidos após seleção imunomagnetica foram ativados e
cultivados em presença ou não de CTMs (conforme descrito anteriormente). No
quinto dia de cultivo, avaliamos a expressão de RelB nos linfócitos TCD4+ por
citometria de fluxo. A marcação intracelular de RelB foi realizada com uso de
um anticorpo policlonal anti-RelB como anticorpo primário e um anticorpo antiFITC
de
coelho
como
anticorpo
secundário
(sc-226
and
sc-3839,
respectivamente; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). A
detecção dos linfócitos TCD4+ foi realizada com o anticorpo anti-CD4
conjugado com APC e o respectivo isotipo controle (Pharmingen, San Jose-CA,
USA).
3.5 Inibição da via NF-kB
Para determinar o efeito da inibição da via canônica de NF-KB na
expressão do marcador CD69, linfócitos TCD3+ foram ativados com beads antiCD2/CD3/CD28 (como descrito anteriormente) e 2,5x105 células foram
cultivadas na presença ou ausência de 5x104 CTMs, previamente aderidas a
placa de 24 poços.
O inibidor da via canônica de NF-kB, BAY11-7082
(Calbiochem) foi adicionado (10µM) imediatamente após ativação ou no
terceiro dia de cultivo. As células foram coletadas no 5° dia de cultura e a
porcentagem de linfócitos CD3+CD69+ avaliada por citometria de fluxo. Para
geração dos gráficos e calcular a significância estatística (n=3, teste t não
92
pareado), utilizamos o software Prism 4 (GraphPad Software Inc., San Diego,
CA, USA).
3.6 Inibição de RelB por RNA de intereferência
Após seleção imunomagnética, os linfócitos T foram incubados por 2
horas a 37 ºC e 5% de CO2. Após esse período, 2,5X105 linfócitos T foram
ressuspendidos em 75µl de tampão de eletroporação (siPORTTM siRNA
electroporation buffer, Ambion, Austin, TX) e eletroporado em uma cubeta de
1mm utilizando o eletroporador Gene Pulser Xcell Electroporation System
(pulso de 0.4ms , 150V)
de acordo com instruções do fabricante. Como
controle negativo, usamos um siRNA não relacionado (The Silencer Selected
Negative Control #1 siRNA, Ambion). Após a eletroporação, as células foram
incubadas por 4horas e posteriormente ativadas com uso de beads antiCD2/CD3/CD28.
As células ativadas foram cultivadas na presença ou não de CTMs,
como descrito anteriormente. A avaliação dos níveis transcricionais de RelB foi
realizada no segundo dia após ativação celular, enquanto que a porcentagem
de linfócitos (CD4+ and CD8+) expressando CD69 foi analisada no quanto dia
de experimento, por citometria de fluxo.
93
RESULTADOS
94
4. RESULTADOS
4.1 CTMs promovem e sustentam a expressão do marcador
CD69 em linfócitos T CD3.
O efeito das CTMs na expressão do marcador CD69 nas CMSPs foi
avaliada no 1°, 3° e 5° dia de cultivo, na presença ou ausência das CTMs.
Como esperado, a ativação dos linfócitos cultivados isoladamente foi
evidenciada pela expressão de CD69 em 5% (média) das células no primeiro
dia de cultivo, seguido por diminuição de expressão nos dias seguintes (4% e
3%, respectivamente). Os linfócitos co-cultivados com CTMs tiveram um
padrão diferente, com uma expressão inicial do marcador CD69 similar (7%),
mas com um aumento significante no 3° (16%) e 5° (14%) dia (Fig. 8).
CD3+CD69+
25
% células
20
p=0,0118
p=0,0009
15
p=0,2153
10
5
0
L
L/M
1°dia
L
L/M
3°dia
L
L/M
5°dia
Fig. 8. CTMs sustentam o aumento de expressão do marcador CD69 em linfócitos T
+
ativados. Avaliação da expressão do marcador CD69 em linfócitos T CD3
cultivados
isoladamente (L, barra branca) ou na presença de CTMs (L/M, barra cinza), por citometria de
95
fluxo. As avaliações foram realizadas no 1°, 3° e 5° dia de cultivo. A significância estatística foi
calculada pelo teste t não pareado.
4.2 Expressão do marcador CD69 nas sub-populações de
linfócitos T CD3
A caracterização das sub-populações de linfócitos que expressam CD69,
após co-cultivo com CTMs por 5 dias, revelou que esse marcador não é restrito
a nenhuma das sub-populações analisadas (Fig. 9).
A porcentagem média de expressão de CD69 após co-cultivo de
linfócitos T CD3+ com CTMs nas populações CD4+, CD8+, CD4+CD25+,
CD8+CD25+ e CD8+CD28-, foi 45%, 38%, 32%, 21% e 15%, respectivamente.
Essas porcentagens foram significantemente mais elevadas que o observado
nos linfócitos T CD3+ cultivados isoladamente, que foram 8%, 8%, 4%, 3% e
1%, respectivamente.
96
B
p=0,0390
p=0,0250
60
% células CD69+
60
40
20
40
20
L
L
L/
M
CD8+
CD4+
p=0,0013
p=0,0312
30
% células CD69+
40
% células CD69+
L/
M
0
0
30
20
10
10
0
L
L
L/
M
0
20
L/
M
% células CD69+
80
CD4+ CD25hi
CD8+ CD25hi
p=0,0830
% células CD69+
25
20
15
10
5
L/
M
L
0
CD8+ CD28-
Fig. 9. Avaliação por citometria de fluxo da expressão do marcador CD69 nas subpopulações linfocitárias. Células mononucleares do sangue periférico foram ativadas com
beads anti-CD2/CD3/CD28 e cultivadas isoladamente (barra branca) ou com CTMs (barra
cinza) e por fim, avaliadas por citometria de fluxo no 5 dia de cultivo. Os linfócitos,
+
caracterizados por tamanho e complexidade interna, expressando CD3 foram avaliados
+
+
quanto à expressão de CD69 nos subtipos CD4 e CD8 e nas sub-populações de fenótipo
97
+
hi
+
regulatório, CD4 CD25 , CD8 CD25
hi
+
-
e CD8 CD28 . As triplicatas foram comparadas para
analise estatística, pelo teste t não pareado.
4.3 Alterações de expressão gênica dos linfócitos T CD4+
ocasionadas pelas CTMs
A avaliação transcripcional por PCR em tempo real revelou que os
genes FOXP3, CTLA-4, GITR e IL-10 (envolvidos no mecanismo de
immunoregulação), RELA, RELB e NFKB2, IRAK3 e TNFAIP/A20, e BTCR,
foram todos estatisticamente mais elevados nos linfócitos co-cultivados com
CTMs, comparados aos cultivados isoladamente (Fig. 7).
4.4 Linfócitos TCD4+ cultivados com CTMs expressão níveis
elevados da proteina RelB
No quinto dia após ativação, enquanto 39,8% dos linfócitos TCD4+
cultivados isoladamente expressaram RelB, essa proteína foi expressa em
77,7% dos linfócitos cultivados com CTMs (Fig. 10).
L
L/M
39,8%
77,7%
+
Fig.10. Expressão intracelular de RelB por citometria de fluxo. Linfócitos CD3
98
selecionados imunomagnéticamente foram ativados com beads anti-CD2/CD3/CD28 e
cultivados em presença (L/M) ou ausência de CTMs (L). As células foram coletadas no quinto
dia de cultivo e a porcentagem intracelular de RelB nos linfócitos T, avaliada por citometria de
fluxo.
4.5 Expressão do marcador CD69 mediante a inibição da via
não canônica de NF-kB.
A porcentagem de linfócitos CD3+ expressando CD69 no quinto dia de
cultura foi similar aos resultados obtidos usando CMSPs (descrito acima), com
células co-cultivadas mostrando um significante aumento na porcentagem de
linfócitos CD69+ (12%), comparados as células cultivadas isoladamente (1%).
Como
esperado,
a
inibição
da
via
NF-kB
com
BAY11-7082,
imediatamente apos ativação inibiu completamente a expressão de CD69 nos
linfócitos CD3+ em ambas as situações, cultivados isoladamente ou cocultivados com CTMs.
A inibição da via NF-kB no terceiro dia após ativação apresentou um
efeito oposto: houve um aumento significante na expresão do marcador CD69
nos linfócitos CD3+ em ambas situações, co-cultivados ou não com CTMs (Fig.
11), sendo esse aumento mais pronunciado nos linfócitos cultivados com CTMs
(~20%), comparados aos cultivados isoladamente (~10%).
99
p=0,0149
% células CD69+
25
20
15
p=0,0014
p=0,0016
p=0,0039
10
5
0
L
L/M
sem BAY
L
L/M
BAY no Dia 0
L
L/M
BAY no 3°° dia
Fig. 11. Efeitos diferenciais da sinalização da via canônica de NF-kB na expressão inicial
+
de tardia de CD69. Linfócitos CD3 selecionados imunomagnéticamente foram ativados com
beads anti-CD2/CD3/CD28 e cultivados em presença (L/M) ou ausência (L) de CTMs. O
inibidor da via canônica de NF-kB, BAY11-7082, foi adicionado imediatamente após ativação
+
ou no terceiro dia de cultivo. As células foram coletadas no 5° dia e a porcentagem de CD69
+
foi avaliada por citometria de fluxo em linfócitos CD3 (também caracterizados por tamanho e
complexidade interna). As triplicatas foram comparadas para análise estatística, pelo teste t
não pareado.
4.6 Inibição de RelB por siRNA elimina a expressão tardia do
CD69 em linfócitos T, induzida por CTMs.
Avaliamos, o papel direto de RelB na expressão tardia do marcador
CD69 (Fig. 12). Em concordância com os resultados anteriores, os linfócitos T
cultivados isoladamente não expressaram CD69 no quinto dia após ativação,
enquanto que os linfócitos co-cultivados com as CTMs expressaram a molécula
(4%). Os linfócitos T que foram transfectados com o siRNA controle
inespecífico apresentaram um comportamento semelhante aos linfócitos não
transfectados. Entretanto, os linfócitos T transfectados com o siRNA dirigido
100
contra o gene RelB não expressaram CD69 (0,4%), mesmo quando cocultivados com CTMs. A analise de expressão gênica de RelB por RT-PCR,
após transfecção, revelou que os níveis de transcrição de RelB diminuíram em
25%, quando comparados aos linfócitos transfectados com o siRNA controle
negativo inespecífico.
% células CD69+
6
4
2
0
sem siRNA
C-
siRNA RelB
Fig.12. Efeitos da sinalização da via não canonica de NF-kB na expressão tardia de CD69
+
em linfócitos cultivados com CTMs. Linfócitos CD3 selecionados imunomagnéticamente
foram transfectados com siRNA dirigido contra a subunidade RelB de NF-kB (siRNA RelB) ou
com siRNA controle inespecifico (C-), antes da ativação e cultura. Os resultados foram obtidos
de um experimento independente de linfócitos cultivados com CTMs.
101
DISCUSSÃO
102
5. DISCUSSÃO
Nessa segunda etapa do trabalho, exploramos os efeitos das CTMs nos
linfócitos ativados. Os resultados obtidos mostram que as CTMs induzem e
sustentam a expressão de CD69 em vários subtipos de linfócitos, mecanismo
que é dependente da via não canônica de NF-KB.
Os achados obtidos pelo nosso desenho experimental demonstram
consistentemente que as CTMs não alteram o estado inicial de ativação dos
linfócitos T, baseado na expressão do marcador CD69, com o uso de beads
CD2/CD3/CD28. Entretanto, no 3° e 5° dia de cultivo, as CTMs provocaram um
significante aumento na expressão do CD69 nos linfócitos T, comparado ao
cultivo isolado de linfócitos ativados.
Pelo fato de as CTMs inibirem a proliferação dos linfócitos T, a elevada
expressão do CD69 nessas células foi inicialmente intrigante, dado o seu uso
clássico como marcador de ativação. Entretanto, recentemente tem aumentado
muito o número de trabalhos que demonstram o papel do CD69 como uma
molécula
imunoregulatória
em
sítios
inflamatórios
(Esplugues
et
al,
2003;Sancho et al, 2003;Sancho et al, 2005). Além disso, a geração de
linfócitos regulatórios representa um dos mecanismos pelo qual as CTMs
imunomodulam os linfócitos T (Di Ianni M. et al, 2008;Maccario et al,
2005;Prevosto et al, 2007). De fato, como descrito anteriormente, os linfócitos
co-cultivados com as CTMs apresentavam um perfil molecular típico de células
regulatórias, com níveis elevados de FOXP3, CTLA-4 (Read et al,
2000;Takahashi et al, 2000), GITR (Kanamaru et al, 2004) and IL10 (Von
Boehmer H., 2005) , comparado aos linfócitos cultivados isoladamente.
103
De acordo com Di Ianni et al (2008), as CTMs recrutam, regulam e
mantêm a função supressora em Tregs. Além disso, as CTMs são capazes de
gerar não somente Tregs clássicas, CD4+CD25hiFOXP3+, mas também células
CD4+ e CD8+ com capacidade supressiva, porém não caracterizadas
fenotípicamente (Prevosto et al, 2007).
A caracterização fenotípica dos linfócitos no quinto dia de cultivo revelou
que a expressão do CD69 não está restrita a uma sub-população linfocitária,
mas similarmente expressa em distintos subtipos celulares, incluindo células
CD4+ e CD8+, tregs clássicas (CD4+CD25hi) e outros tipos de linfócitos
regulatórios, como os CD8+CD25hi (Maggi et al, 2005) e CD8+CD28- (Cortesini
et al, 2001).
Recentemente um novo subtipo de célula regulatória foi descrito em
camundongos. Segundo Han et al (2009), linfócitos CD4+CD25-CD69+ são
capazes de suprimir a proliferação de linfócitos T e durante a progressão
tumoral, o número dessas células aumenta significantemente.
A indução de células supressoras pelo tumor e pelas CTMs não é
surpreendente,
já
que
o
estroma
tumoral
secreta
diversos
fatores
imunoregulatórios, como IDO, PGE2 e TGF- β (Gajewski et al, 2006;Kim et al,
2006), os quais são similarmente produzidos pelas CTMs (Aggarwal &
Pittenger, 2005;DiNicola M. et al, 2002;Meisel et al, 2004). Do mesmo modo
que as CTMs presentes no nicho tumoral induziriam um mecanismo de escape
imune para favorecer o desenvolvimento do câncer (Direkze & Alison, 2006), as
CTMs localizadas na parede dos vasos sanguíneos (Covas et al, 2008),
poderiam contribuir para a homeostase do sistema imune (Uccelli et al, 2008).
De fato, os mecanismos que controlam a indução de tolerância periférica, estão
104
diretamente relacionados com diversas doenças auto-imunes e na resposta
imune contra patógenos, tumores e enxertos (Jiang & Chess, 2006;Jiang &
Chess, 2006;Sakaguchi et al, 2008).
Dada
à
importância
de
uma
melhor
compreensão
dos
mecanismos que levam à indução desses linfócitos TCD4+CD69+, voltamos
nossa atenção para a regulação transcricional especifica do marcador CD69.
Conforme mencionado anteriormente, a via canônica de NF-kB está
centralmente envolvida na ativação de células T (Ghosh & Hayden, 2008) e na
expressão do CD69 (Lopez-Cabrera et al, 1995).
Devido ao conhecido papel de NF-kB na regulação do CD69 (LopezCabrera et al, 1995), ao papel imunoregulatório dessa molécula em situações
inflamatórias (Esplugues et al, 2003;Sancho et al, 2003;Sancho et al, 2005), e
aos mecanismos que promovem a substituição da via canônica pela via não
canônica de NF-kB (Esplugues et al, 2003;Kahn-Perles et al, 1997;Saccani et
al, 2003;Tian et al, 2005b), nos levantamos a hipótese de que enquanto a via
canônica de NF-kB atuaria controlando a expressão inicial do CD69 como um
marcador de ativação, a via não canônica de NF-kB poderia estar envolvida na
expressão tardia do marcador CD69 nos linfócitos T, promovida pelas CTMs.
Em linha com a nossa hipotese, nos linfócitos co-cultivados com as
CTMs, as subunidades da via canônica (RelA) e não canônica (RelB and
NFKB2)
de NF-kB estavam presentes em níveis elevados.
Além disso,
avaliamos também as níveis da proteína RelB (citometria de fluxo)
nos
linfócitos co-cultivados com CTMs. Alem do papel direto dessa proteína na
transcrição de genes alvos, recentes trabalhos indicam que ambas as
subunidades da via não canônica de NF-kB (NFKB2 e RelB) podem atuar como
105
imunomoduladores, por regular negativamente a via clássica de NF-kB.
Enquanto RelB pode sustentar a expressão de IkBα, inibidor da via canônica
(Chen et al, 2009;Esplugues et al, 2003), NFKB2/p100 sequestra diretamente
os dímeros NFKB1-RelA para o citoplasma, os deixando inativos (Ishimaru et
al, 2006;Legarda-Addison & Ting, 2007).
Nossos dados mostram ainda,
que a expressão de dois reguladores negativos da via canonica de NF-kB,
IRAK3 (Kobayashi et al, 2002) e TNFAIP/A20 (Beyaert et al, 2000) estavam
expressos em niveis elevados nos linfócitos co-cultivados com CTMs,
caracterizando uma ampla inibição na ativação da via canônica de NF-kB.
Conforme descrito anteriormente, enquanto a ativação da via NF-kB nos
leucócitos, em sítios inflamatórios, esta associada com a expressão de genes
pro-inflamatórios, posteriormente, durante a resolução da inflamação, a
ativação da via associa-se com a expressão de genes anti-inflamatórios (Fong
et al, 2008;Greten et al, 2007;Tomczak et al, 2006). Alem disso, as IKKα,
envolvidas na ativação da via não canônica de NF-kB contribuiriam para a
inibição da via canônica de NF-kB, promovendo a remoção das subunidades
de RelA e c-Rel da região promotora dos genes pró-inflamatórios (Lawrence et
al, 2005).
Para a valiar o papel diferencial da via canônica de NF-kB na expressão
inicial do CD69 e na expressão sustentada dessa molécula, adicionamos no
primeiro e tercerio dia de cultvo celular, a droga BAY11-7082, um inibidor
irreversível da fosforilação de IkBα e consequentemente da translocação
nuclear do complexo canônico de NF-kB (Pierce et al, 1997). De acordo com a
nossa hipótese, enquanto a inibição da via canônica de NF-kB durante a fase
de ativação, elimina completamente a expressão do marcador CD69 nos
106
linfócitos T (como esperado), a inibição da via clássica no terceiro dia do
experimento, causa um efeito completamente oposto, provocando um aumento
na expressão dessa molécula nos linfócitos T. Interessantemente, a atividade
de RelB parece ser reprimida durante a ligação de RelA no núcleo celular
(Jacque et al, 2005), portanto o aumento na expressão do CD69, resultante da
inibição da via clássica de NF-kB, pode ser explicado pela reduzida localização
nuclear de RelA, e conseqüente sinalização de RelB.
Utilizamos a técnica de RNA de intereferencia para avaliar diretamente o
papel de RelB na expressão do CD69. Assim como o esperado, a inibição de
RelB nos linfócitos T cocultivados com as CTMs inibiu completamente a
expressão do CD69. Enquanto a via canônica de NF-kB controla a expressão
inicial dessa molécula, como marcador de ativação, a sua expressão tardia e
estável, como molécula imunoregulatória, seria regulada pela via não canônica
de NF-kB (Esplugues et al, 2003;Sancho et al, 2003;Sancho et al, 2005).
Seria importante investigar se outras moléculas relacionadas com função
imunoregulatória podem ser controladas por um mecanismo semelhante.
Interessantemente,
para
exercerem
seu
efeito,
as
Tregs
clássicas
CD4+CD25+FOXP3+ são dependentes da sinalização mediada pelo receptor
ativador de NF-kB (RANK) (Esplugues et al, 2003;Green et al, 2002), que é um
potente indutor da via não canônica de NF-kB (Hauer et al, 2005). Além disso,
recentes trabalhos sugerem que a expressão de FOXP3 nas Tregs é
dependente da via NF-KB (Long et al, 2009) . Os recentes trabalhos apontam
que ao contrario de componentes da via canônica de NF-kB, c-Rel
desempenha um importante papel no desenvolvimento e na função das Tregs,
107
entretanto, o papel da via não canônica de NF-kB nesse processo, necessita
ser investigado.
Nossos resultados demonstram que as CTMs promovem e sustentam a
expressão do marcador CD69 em linfócitos T ativados com beads antiCD2/CD3/CD28. Os linfócitos TCD4+ obtidos após co-cultivo, possuem um
perfil molecular típico de células regulatórias (FOXP3, CTLA-4, GITR e IL10)
expressando CD69. Além disso, enquanto a via canônica de NF-kB regula a
expressão do CD69 como um marcador de ativação, a expressão tardia, como
uma molécula imunoregulatória, parece ser controlada pela via não canônica
de NF-kB. Por fim, os resultados obtidos na segunda etapa desse trabalho,
estão em linha com o papel da via NF-kB na resolução da inflamação (Fong et
al, 2008;Greten et al, 2007;Tomczak et al, 2006) e no desenvolvimento de
células regulatórias em sítios inflamatórios (Long et al, 2009).
108
CONCLUSÃO
109
6. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos nesse estudo nos permitem concluir que:
- CTMs induzem e sustentam a expressão da molécula CD69 em linfócitos T
ativados com beads anti-CD2/CD3/CD28.
- Ao contrário da expressão do CD69 como marcador de ativação, que é
controlada pela via canônica, a expressão tardia dessa molécula, como
molécula regulatória, é controlada pela via não canônica de NF-kB.
110
CAPÍTULO II
CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS AUMENTAM A EXPRESSÂO DE
CD39 E PRODUZEM ADENOSINA PARA IMUNOMODULAR OS
LINFÓCITOS T
111
RESUMO
As CTMs são um grupo heterogenio de células stromais que suprimem a
proliferação dos linfócitos T, porem ate o presente momento, os mecanismos
responsáveis por essa propriedade são desconhecidos. A ADO é um
importante mensageiro extracelular produzido pelo processamento do ATP
pelas ectonucleotidases CD39 e CD73, respectivamente. Esse mensageiro
exerce vários efeitos fisiológicos através da sinalização de seus quatro
receptores. Alem disso, os níveis de ADO são controlados pela ADA que
converte adenosina em iosina. Diversos estudos demonstram um papel
immunomodulador da ADO quando ela sinaliza o receptor de adenosina A2a.
Nesse trabalho, nos avaliamos o envolvimento da ADO com o papel
imunomodulatório das CTMs. Para isso, linfócitos TCD3+ ativados por beads
anti-CD3/CD28 foram cultivados por 5 dias isoladamente ou em presença de
CTMs. Os linfócitos TCD4+ cultivados com CTMs apresentaram maior
expressão do receptor de adenosina A2a e menor expressão da enzima ADA,
comparados aos linfócitos cultivados isoladamente. A atividade da enzima ADA
e a concentração de ADO foram determinadas por ensaio enzimático
colorimetrico e por cromatografia liquida de alta eficiência, respectivamente. A
expressão de CD39 e CD73 em linfócitos e nas CTMs, antes e após co-cultivo,
foi determinada por citometria de fluxo. Como esperado, as CTMs inibiram a
proliferação dos linfócitos (incorporação de BrdU). A enzima ADA foi mais ativa
nos linfócitos cultivados com CTMs, mas mesmo assim a concentração de
ADO também foi mais elevada no meio de
cultura dessas células. Por fim, a
porcentagem de linfócitos expressando CD39 e CD73 e de CTMs expressando
CD39 aumentou significantemente apos o co-cultivo, indicando produção de
112
adenosina. Nesse trabalho, demonstramos que a expressão de CD39/CD73 e
do receptor de adenosina A2a nos linfócitos e de CD39 nas CTMs apontam para
um
novo
mecanismo
imunoregulatorio
promovido
pelas
CTMs,
que
provavelmente leve a elevados niveis de ADO na superfície de ligação de
linfócitos e CTMs, o que aumenta a sinalização do receptor de adenosina A2a.
113
ABSTRACT
MSCs are a heterogeneous subset of stromal stem cells that suppress T
cell proliferation, but at present, the mechanisms underlying this property are
largely unknown. ADO, a potent extracellular messenger produced by the
sequential processing of ATP by ectonucleotidases CD39 and CD73,
respectively, exerts several physiological effects though the interaction with four
adenosine receptors. Moreover, ADO levels are controlled by its convertion to
inosine by the enzyme ADA. Several studies clearly show the role of ADO as a
T-cell immune modulator, mainly by activation of adenosine receptor A2a. In this
work we evaluated the involvement of ADO signaling components in the
immunomodulation promoted by MSCs. Immunomagnetically purified CD3+
cells, activated by anti-CD3/CD28 beads were cultured by 5 days either in the
absence or in the presence of MSCs. T- Cells co-cultured with MSC showed
higher level of Adenosine receptor A2a and lower level of ADA than T-cells
cultured alone. ADA activity and adenosine levels were analyzed in culture
medium by colorimetric assay and high performance liquid chromatography
(HPLC), respectively. Percentage of CD39+ and CD73+ cells was accessed by
flow cytometry on T-cells and MSC before and after the co-culture period. As
expected, proliferation of T-cells co-cultured with MSC was significantly
inhibited (BrdU incorporation assay). Selected genes were validated by RTPCR. Moreover, ADA activity was higher in culture medium from cells cultivated
with MSCs and despite that, the extracellular levels ADO were higher in cells
cultivated with MSCs compared to T-cells cultivated alone. Finally, the
percentage of T- cells expressing CD39 and CD73, and of MSC expressing
CD39, increased significantly upon co-culture, indicating a shift toward
114
adenosine production. In summary, the up-regulation of CD39/CD73 in T-cells
and MSC, and of Adenosine receptor A2a in T-cells point to a new
immunoregulatory mechanism promoted by MSCs, that may lead to higher local
levels of Adenosine in the MSCs/Lymphocyte interface and increased signaling
trough the immunomodulatory Adenosine receptor A2a.
115
INTRODUÇÃO
116
1. INTRODUÇÃO
As CTMs são células multipotentes que podem se diferenciar em
diversos componentes do microambiente medular, como osso, adipocito e
tecido estromal
(Pittenger et al, 1999;Prevosto et al, 2007). Além da
capacidade de diferenciação, as CTMs exercem um efeito imunosupressivo em
varias células imunes, incluindo linfócitos T, B e NK (Spaggiari et al,
2006;Krampera et al, 2003;Corcione et al, 2006;Di et al, 2002;Tse et al,
2003;Rasmusson et al, 2005). Um dos mecanismos pelo qual as CTMs
modulam a resposta imune, é pela geração de Tregs (Maccario et al,
2005;Prevosto et al, 2007).
Recentemente foi demonstrado que as Treg sao capazes de produzir
ADO, e que essa molécula desempenha um importante papel na supressão
mediada por essas células (Borsellino et al, 2007;Deaglio et al, 2007;Kobie et
al, 2006;Mandapathil et al, 2010).
A ADO é um nucleosideo endógeno que esta constitutivamente presente
em baixos níveis no meio extracelular, mas que pode ter seus níveis
aumentados em condições de estresse metabólico (Sitkovsky & Lukashev,
2005). O efeito imunoregulatório exercido pela ADO ocorre pela sinalização
dessa molécula nos seus receptores, A1, A2a, A2b, A3 (Thiel et al, 2003).
Interessantemente, o receptor A2a funciona como um “sensor” dos niveis
extracelulares de ADO (Sitkovsky & Ohta, 2005).
Nas células imunes, a
ligação da ADO a esse receptor ativa uma cascata imuno-inibitória que eleva
os níveis intracitoplasmaticos de cAMP, um potente agente imunosupressor
(Gessi et al, 2007;Ohta & Sitkovsky, 2001;Sitkovsky et al, 2004;Fredholm et al,
2003). Alem disso, o receptor A2a é capaz de reduzir a inflamação por inibir a
117
proliferação dos linfócitos T e a produção de citocinas pró-inflamatórias
(Koshiba et al, 1997;Lappas et al, 2005).
Durante a inflamação, a produção de ADO é mediada por duas enzimas.
O CD39, um membro da família ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase,
converte ATP e ADP em 5´- AMP, enquanto o CD73 (ecto-5’-nucleotidase)
hidrolisa o 5´- AMP para formar adenosina (Behdad et al, 2009;Eltzschig et al,
2003;Resta et al, 1998). Entretanto, a enzima adenosine deaminase, controla
os niveis de ADO, por mediar a sua conversão em iosina (Franco et al, 1998).
Interessantemente, a ADA pode se ligar no CD26 (dipeptidil-peptidase IV),
reduzir a concentração de adenosina na superfície celular, e proteger a célula
de ser imunomodulada pela ADO (Kameoka et al, 1993;Morimoto &
Schlossman, 1998;Dong et al, 1996).
Nossa analise transcricional pela técnica de microarray revelou que o
receptor A2a e a ADA estavam diferencialmente expressos entre os linfócitos
cultivados isoladamente e os cocultivados com CTMs. De fato, enquanto que a
geração de adenosina pelas Tregs já foi reportada, a capacidade das CTMs em
produzir adenosina em ambiente inflamatório nunca foi investigada. Nessa
etapa do trabalho, nos dedicamos a avaliar o envolvimento de componetentes
envolvidos na sinalização da ADO na imunomodulação promovida pelas CTMs.
Os resultados obtidos nesse trabalho apontam para um novo mecanismo
imunoregulatório das CTMs, que em situações inflamatórias geram elevados
níveis de ADO e provocam sua atividade imunosupressora por sinalizar o
receptor A2a. Além disso, as CTMs induzem a geração de Tregs com elevados
níveis de CD73, que potencialmente produziria elevados níveis de ADO.
118
OBJETIVOS
119
2. OBJETIVOS
Objetivo Geral
- Investigar a participação de componentes envolvidos na sinalização da
adenosina na imunomodulação dos linfócitos T pelas CTMs
Objetivos específicos
- Validar a expressão do gene ADA e ADORA2A, encontrados nos
estudos de microarray por PCR em tempo real;
- Avaliar pela expressão dos marcadores de superficie CD39 e CD73,
quais as populações celulares capazes de gerar adenosina;
- Investigar se em meio inflamatório as CTMs são capazes de produzir
adenosina para imunomodular os linfócitos.
120
MATERIAIS E MÉTODOS
121
3. MATERIAIS E METODOS
3.1 Condições de Cultura dos Linfócitos T
Inicialmente, os linfócitos foram obtidos (seleção imunomagnética) de
três indivíduos saudáveis e ativados por uso de anticorpos anti-CD2, anti-CD3
e anti-CD28 (conforme descrito anteriormente). Após ativação, procedemos 4
situações de cultivo em placa de 24 well por 5 dias; 2,5x105 linfócitos T isolados
ou em presença de 5x104 CTMs, e por fim cultivamos 5x104 CTMs isoladas ou
cultivadas em sobrenadante de linfócitos ativados por 3 dias (meio
inflamatório).
3.2 PCR em tempo real
Os dados de microarray revelaram que os genes da ADA e do receptor
de adenosina A2a estavam entre os mais diferencialmente expressos a partir da
comparação de linfócitos TCD4+ cultivados isoladamente ou em presença de
CTMs. Esses resultados foram validados por PCR em tempo real, com uso de
sondas TaqMan para ADA (Hs01110945_m1) e ADORA2A (Hs00169123_m1).
As reações e as analises foram realizadas conforme descrito anteriormente.
3.3 Atividade da enzima adenosina deaminase (ADA)
A determinação da atividade da enzima ADA foi realizada no
sobrenadante de linfócitos cultivados isoladamente ou em presença das CTMs.
Após o 5 dia de cultivo, recolhemos 250µl do sobrenadante das culturas
para procedermos esse ensaio.
122
A atividade da enzima foi realizada por uso do kit Quimiada adenosina
deaminase (Ebram). O principio do ensaio esta baseado na deaminação
enzimática de adenosina à iosina que é convertida a hipoxantina através da
fosforilase do nucleosideo purina (PNP). A hipoxantina é convertida então à
acido úrico e peróxido de hidrogênio (H2O2) através da xantina oxidase (XOD).
O H2O2 reage mais adiante com N-etil-N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3-metilanilina
(EHSPT) e 4-aminoantipirina (4-AA) na presença de peroxidase (POD) para
gerar pigmento de quinona que é monitorado de maneira cinética. O esquema
da reação enzimática é mostrado abaixo.
Adenosina + H2O ------ADA-------» Iosina + NH3
Iosina + Pi ------PNP-------» Hipoxantina + Ribose-1-fosfato
Hipoxantina + 2 H2O + 2 O2 ------XOD-------» Ácido úrico + 2 H2O2
2 H2O2 + 4-AA + EHSPT ------POD-------» 4 H2O + quinona dye
Para realização da reação calorimétrica, pipetamos em placa de 96
poços 110µl do reagente 1 ( 4-AA, PNP, XOD e POD), a seguir adicionamos
50µl da amostra e incubamos por 5 minutos a 37°C. Após esse período
registramos a primeira leitura colorimétrica em comprimento de onda de 550nm
(Versamax, Molecular Devices). Adicionamos ao meio 55µl do reagente R2 e
registramos a segunda leitura calorimétrica aos 8 minutos de reação. As
reações foram realizadas em triplicatas e em presença de um calibrador interno
do kit.
123
3.4 Citometria de Fluxo
Após recolhermos o sobrenadante das culturas para analise da
ativididade da enzima ADA e para quantificação de adenosina extracelular,
submetemos as células a analise fenotipica por citometria de fluxo.
Analisamos
a
expressão
de
CD73
(ecto-5’-nucleotidase), CD39
(NTPDase1) e CD26 (Human Dipeptidyl Peptidase IV) na membrana de
linfócitos TCD4+ e TCD4+CD25hi (Tregs) oriundos da cultura isolada de
linfócitos TCD3+ e do co-cultivo dessas células com as CTMs. A expressão
desses marcadores foi também analisada em CTMs cultivadas isoladamente e
após co-cultivo com linfócitos T
3.5 Quantificação da concentração de adenosina extracelular
por cromatografia liquida de alta pressão.
A quantificação da concentração de adenosina extracelular foi realizada
nos sobrenadantes dos linfócitos ativados cultivados isoladamente ou em
presença das CTMs, nas CTMs cultivadas isoladamente ou em ambiente
inflamatório. Para isso, após 5 dias de cultivo, adicionamos imediatamente
500µl do sobrenadante das culturas em 1000µl de acetonitrila. Após, essas
amostras foram vortexadas por 1 minuto e em seguida centrifugadas 10.000
rpm por 10 minutos. Recolhemos 1000µl do meio desproteinizado e
submetemos ao Laboratório de Toxicologia da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto para quantificação de adenosina por
cromatografia liquida de alta pressão.
124
RESULTADOS
125
4. RESULTADOS
4.1 Alterações de expressão gênica entre linfócitos cultivados
e não cultivados com CTMs.
As diferenças de expressão dos genes ADA e do receptor de adenosina
A2a (ADORA2A) encontradas nas análises de microarray, foram validadas por
PCR em tempo real.
Os linfócitos TCD4+ co-cultivados com CTMs apresentaram menor
expressão do gene ADA (p=0,047) e maior expressão do transcrito ADORA2A
(p=0,0033) comparados aos linfócitos TCD4+ cultivados isoladamente (Fig. 13)
p=0,0460
p=0,0009
3
8
6
Fold
Fold
2
1
4
2
ADA
C
D
4L
/M
C
D
4L
/M
C
D
4L
0
C
D
4L
0
ADORA2A
+
Fig. 13. Analise de expressão gênica por PCR em tempo real. Linfócitos T CD3 de 3
indivíduos foram ativados com beads anti-CD2/CD3/CD28 e cultivados isoladamente (L) ou
+
com CTMs (L/M). Após 5 dias de cultivo, os linfócitos T CD4 foram obtidos por seleção
imunomagnética e submetidos a analise de expressão dos genes adenosina deaminase
(esquerda) e receptor de adenosina 2A (direita). Os valores relativos em fold foram obtidos pela
-∆∆Ct
fórmula 2
, usando mediana do Ct dos linfócitos cultivados isoladamente como referência. A
significância estatística foi calculada pelo teste T não pareado.
126
4.2 Atividade da enzima adenosina deaminase (ADA)
A atividade da enzima Adenosina deaminase foi determinada por ensaio
enzimático colorimétrico (Fig. 9). A enzima adenosina deaminase presente nos
linfócitos cultivados em presença das CTMs apresentou atividade 10% maior
que a enzima do cultivo isolado de linfócitos ativados (p=0,0821).
Delta (L2-L1)
0.016
0,0581
0.014
0.012
M
L/
M
L
0.010
Atividade ADA
+
Fig. 14. Analise da atividade da enzima ADA. Linfócitos T CD3 de 3 indivíduos foram
ativados com beads anti-CD2/CD3/CD28 e cultivados isoladamente (L) ou com CTMs (L/M).
Paralelamente cultivamos também, Células Tronco Mesenquimais isoladas (M) e em meio de
cultura de linfócitos ativados por 3 dias (M+SN). Após 5 dias de cultivo, os meios de cultura
foram recolhidos para análise da atividade da enzima ADA pelo kit Quimiada adenosina
deaminase (Ebram). Os valores obtidos decorrem da diferença entre duas leituras (delta) que
ocorre por 3 minutos, tempo em que a enzima ADA converte a ADO livre em iosina. A
significância estatística foi calculada pelo teste T não pareado.
127
4.3 Expressão de CD26, CD39 e CD73 em linfócitos e CTMs
Determinamos por citometria de fluxo, a expressão de CD26, CD39 e
CD73 em linfócitos TCD4+ (auxiliares), TCD4+CD25hi (Tregs) e em CTMs (Fig.
15).
Inicialmente, os linfócitos foram identificados com base em seu tamanho
(SS, do inglês sideward scatter) e complexidade interna (FS, do inglês forward
scatter). Após, selecionamos para analise da expressão de CD26, CD39 e
CD73, os linfócitos TCD4+ e TCD4+CD25hi advindos as cultura isolada de
linfócitos TCD3+ e do co-cultivo com CTMs.
Tanto na cultura isolada de linfócitos como no co-cultivo dessas células
com as CTMs, a expressão de CD26 é prepondeante entre os Tregs
comparados aos linfócitos auxiliares, sendo essa diferença de expressão mais
acentuada nas células do co-cultivo. Nessas, 91,71% (média) dos Tregs
expressaram CD26, enquanto que nos linfócitos auxiliares essa expressão foi
de 59,79% (p= 0.0006). Nos linfócitos cultivados isoladamente, 94.71% dos
Tregs expressaram CD26, enquanto que essa expressão nos linfócitos
auxiliares foi de 82.85% (p=0.0036). Por fim, as CTMs induziram menor
expressão de CD26 nos linfócitos auxiliares, comparado aos linfócitos
cultivados isoladamente (p= 0.0016).
Observamos também que existem mais Tregs expressando CD39 que
linfócitos auxiliares, tanto na cultura isolada de linfócitos T (p= 0.0001), como
no co-cultivo com CTMs (p= 0.0027).
A expressão de CD73 é maior em ambos os linfócitos auxiliares e Tregs
do co-cultivo, comparado aos linfócitos cultivados isoladamente. Apenas 1,19%
dos linfócitos auxiliares expressaram CD73, mas a presença de CTMs elevou
128
essa porcentagem para 11,78% (p=0,0057).
A porcentagem de Tregs
expressando CD73 foi de 1,16%, enquanto que nas células regulatórias obtidas
do cultivo com CTMs essa expressão foi de 17% (p= 0,0090). Embora não seja
estatisticamente significante, no co-cultivo, as Tregs apresentaram 31% mais
expressão de CD73 que as células auxiliares.
As analises de expressão de CD26, CD39 e CD73 nas CTMs foram
feitas na população CD45- (célula não hematopoética). A porcentagem de
CTMs que expressaram CD26 foi mais elevada antes do co-cultivo (p= 0.0082).
A presença dos linfócitos T ativados aumentou a porcentagem de CTMs
expressando CD39 de 15,5% (media) para 34,9% (p= 0.0094) e diminuiu a
expressão de CD73 de 99,3% para 91,10% (p= 0.0142).
129
CTMs
Linfócitos T
p=0,0082
0,0036
100
% células
10
50
i
L/
M
L
M
CD26
C
D
25
h
L
po
s
pr
e
M
L/
M
0
0
CD26 em CD4
p=0,0094
25
50
0,0001
20
% células
40
% células
0,0006
0,0016
5
C
D
25
hi
% células
15
30
20
15
10
0,0027
5
10
CD39
D
25
hi
C
L/
M
L
M
C
L/
M
L
po
s
pr
e
M
D
25
hi
0
0
CD39 em CD4
30
p=0,0142
0,0090
% células
% células
100
80
20
0,0057
10
60
25
hi
C
D
C
D
L/
M
L/
M
CD73
L
M
M
po
s
pr
e
L
25
hi
0
CD73 em CD4
Fig. 15. Analise da expressão de CD26, CD39 e CD73 em linfócitos TCD4 e CTMs.
+
Linfócitos T CD3 de 3 indivíduos foram ativados com beads anti-CD2/CD3/CD28 e cultivados
130
isoladamente (L) ou com CTMs (L/M). Paralelamente analisamos também, Células Tronco
Mesenquimais isoladas (Mpre) e após co-cultivo com linfócitos (M pos). Após 5 dias de cultivo,
as células foram colhidas para fenotipagem por citometria de fluxo (FACsort flow cytometer Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA). A significância estatística foi calculada pelo teste
T não pareado.
4.4 CTMs produzem ADO em situação inflamatória
Determinamos,
por
cromatografia
liquida
de
alta
pressão,
a
concentração de ADO em linfócitos ativados cultivados isoladamente ou com
CTMs, em CTMs cultivadas isoladamente e em CTMs cultivadas em
sobrenadante de linfócitos ativados (meio inflamatório) (Fig. 16).
A concentração média de ADO nos linfócitos cultivados isoladamente foi
de 0,006µg/ml, a presença das CTMs elevou essa concentração para
0,072µg/ml (p= 0.0009). A concentração de ADO na cultura isolada de CTMs
foi de 0,043µg/ml, e quando essas células foram cultivadas em meio
inflamatório (linfócitos T ativados por 3 dias), a produção de ADO elevou-se
para 0.091µg/ml, indicando portanto que as CTMs produzem mais ADO em
ambientes inflamatórios.
131
0.10
ug/ml
0.08
0.06
0.04
0.02
M
+S
N
M
M
L/
L
0.00
ADO
Fig. 16. Quantificação de Adenosina em sobrenadante de linfócitos e CTMs. Linfócitos T
+
CD3
de 3 indivíduos foram ativados com beads
anti-CD2/CD3/CD28 e cultivados
isoladamente (L) ou com CTMs (L/M). Paralelamente analisamos também, Células Tronco
Mesenquimais isoladas (M) e em meio de cultura de linfócitos ativados por 3 dias (M+SN).
Tronco Mesenquimais isoladas (M) e em meio de cultura de linfócitos ativados por 3 dias
(M+SN). Após 5 dias de cultivo, os meios de cultura foram recolhidos para quantificação da
concentração de ADO por cromatografia liquida de alta eficiência. A significância estatística foi
calculada pelo teste T não pareado.
132
DISCUSSÃO
133
5. Discussão
O acumulo extracelular de ADO induz a um forte efeito imunosupressivo
mediado pela sinalização de seus receptores, principalmente o A2a (Sitkovsky &
Ohta, 2005). Recentes trabalhos revelaram que as Tregs produzem ADO e que
essa molécula é essencial para o efeito supressivo dessas células (Deaglio et
al, 2007;Kobie et al, 2006;Mandapathil et al, 2010;Schmitt et al, 2009). Nesse
trabalho, mostramos pela primeira vez, que em ambiente inflamatório,
aumentam porcentagem de CTMs que expressam CD39 e a produção de ADO
para imunomodular os linfócitos T, os quais apresentam elevados níveis do
receptor de adenosina A2a.
A expressão do receptor de receptor de adenosina A2a nos linfócitos T é
diretamente proporcional à intensidade de resposta dessas células a ADO
(Armstrong et al, 2001;Apasov et al, 2000). Alem disso, foi demostrando que a
sinalização do receptor A2a nos linfócitos T inibe a ativação e expansão dos
linfócitos T (Huang et al, 1997). Em concordância, nossos resultados mostram
que a presença das CTMs leva a maior expressão desse receptor nos linfócitos
TCD4+. De fato, o cocultivo de linfócitos com CTMs, aumentou a expressão de
CD39 na população de CTMs e consequentemente a produção de ADO,
comparado a cultura isolada de linfócitos ativados.
Recentemente foi reportado que a ativação do receptor de adenosina
A2a limita a DECH após tranplante alogenico de células tronco hematopoeticas
(Lappas et al, 2010). Nesse trabalho, os autores mostraram que a ativação do
receptor A2a em murinos, inibe a perda de peso e a mortalidade associada com
a progressão da doença. Alem disso, eles demonstraram os níveis de citocinas
pró-inflamatórias foram significantemente reduzidos nesses animais. Nossos
134
resultados indicam que pela produção de ADO, as CTMs podem ocasionar um
mecanismo semelhante para tratar a DECH (Le Blanc K. et al, 2004b;Le Blanc
K. et al, 2008).
A enzima ADA catalisa a desaminaçao hidrolitica da ADO em iosina
(Hershfield, 1998). As CTMs induziram a menor expressão transcricional de
ADA nos linfócitos TCD4+, comparado aos linfócitos cultivados isoladamente.
Porem, essa enzima foi mais ativa no co-cultivo. Em parte, isso pode ser
explicado pela menor porcentagem de linfócitos TCD4+ expressndo CD26 no
co-cultivo com CTMs, isso faz com que os níveis de ADA na superfície celular
sejam reduzidos, liberando a enzima para atuar. Alem disso, mesmo com a
maior atividade da enzima ADA, os níveis de ADO foram maiores no co-cultivo.
Mandapathil et al (2010) revelou que enquanto que as Tregs de
ocorrência natural expressam pouco CD26, a expressão dessa proteína é
elevada nos linfócitos TCD4+. Diferentemente, nossos resultados mostram que
as Tregs induzidas expressam elevados níveis de CD26 e provavelemente isso
constitua um mecanismo de proteção que aumente os níveis de ADA na
superfície celular e impeça que essas células tenham suas funções suprimidas
pela sinalização da ADO (Dong et al, 1996). Em contraste, os linfócitos TCD4+,
principalmente do co-cultivo, apresentam reduzida expressão de CD26 e
consequentemente baixos níveis de ADA na superfice, o que os torna
suceptiveis a supressão mediada pela ADO.
Recentes trabalhos revelaram que a expressão de CD39 predomina nas
Tregs (Schmitt et al, 2009;Mandapathil et al, 2010) e que essa molécula pode
ser útil para definer populações de Tregs (Borsellino et al, 2007;Dwyer et al,
2007). De fato, diferentemente das Tregs clássicas CD4+CD25hi, as células
135
CD4+CD25hiCD39+ são capazes de suprimir células patogênicas Th17 (Fletcher
et al, 2009). Nossos resultados são concordantes, uma vez que o CD39 foi
predominantemente expresso nas células Tregs geradas pela ativação ou
induzidas por CTMs.
A expressão de CD73 (ecto-5′-nucleotidase) pode ser detectada em
difetentes tipos celulares e o papel fisiológico dessa molécula difere de acordo
com o contexto (Zimmermann, 1992). Alem de sua atividade enzimática, essa
proteína esta envolvida com sinais de ativação de leucócitos (Robinson, 1991)
e com adesão de linfócitos T ao endotélio (Airas et al, 1993). Um recente
trabalho mostrou que difeferentemente de camundongos (Alam et al, 2009),
linfócitos T humanos expressam pouco CD73 e que esta proteína esta
principalmente localizada no citoplasma das Tregs (Alam et al, 2009;Kobie et
al, 2006;Mandapathil et al, 2010). Em parte, nossos resultados são
concordantes com essas observações. Poucos linfócitos TCD4+ e Tregs,
gerados pela ativação dos linfócitos, expressaram CD73 (marcação de
superfície e intracelular), enquanto que em presença das CTMs aumenta a
porcentagem dessas células expressando essa proteína. Por outro lado, Alam
et al (2009) relatou que TCD4+ e Tregs apresentam elevada expressão de
CD73 na superficie celular. Em parte, esses resultados conflitantes podem ser
explicados por diferenças experimentais. Alem disso, a molécula CD73 parece
ser instável na superfície de células humanas (Thomson et al, 1990;Airas et al,
1997).
Em conclusão, nossos resultados claramente apontam para um novo
mecanismo imunoregulatorio promovido pelas CTMs, que pode levar a
136
elevados niveis de ADO na interface das CTMs com os linfócitos TCD4+ e
promover a sinalização do receptor de adenosina A2a..
137
CONCLUSÃO
138
6. CONCLUSÃO
Os resultados obtidos nesse estudo permitem concluir que:
- Os linfócitos TCD4+ obtidos do cultivo com CTMs possuem maior expressão
do gene ADORA2A e menor do gene ADA, comparado aos linfócitos TCD4+
derivados do cultivo isolado de linfócitos, indicando que enquanto os linfócitos
co-cultivados com CTMs possivelmente recebem maior sinalização da
adenosina, os cultivados isoladamente possuem maior potencial para promover
a desaminação hidrolitica da adenosina.
- A expressão de CD26 e CD39 é predominante em Tregs comparado aos
linfócitos TCD4+, indicando que células regulatórias alem de serem capazes de
gerar adenosina, recrutam ADA na sua superficie o que as impedem de serem
sinalisadas por esse nucleosídeo.
- As CTMs expressam mais CD39 e produzem mais ADO quando cultivadas
com linfócitos ativados, comparadas as CTMs cultivadas isoladamente.
139
CONSIDERAÇÕES FINAIS
140
CONSIDERAÇÕES FINAIS
De maneira geral, esse estudo demonstrou os principais mecanismos
moleculares que sofreram alterações em linfócitos T imunomodulados por
CTMs, comparados aos linfócitos cultivados isoladamente. Além disso, o perfil
transcricional dos linfócitos TCD4 e TCD8 imunomodulados foi muito similar, o
que nos permite concluir que as CTMs atuam por mecanismos muito similares
para exerceu seu efeito imunomodulador nesses dois subtipos linfocitários.
Conforme discutimos nessa tese, in vitro, existem três aspectos criticos
na imunomodulação dos linfócitos T induzida pelas CTMs: a adesão entre
essas células, a produção de fatores imunoregulatórios e a indução de
linfócitos supressores. Os resultados obtidos pela validação funcional do
estudo de microarray muito possivelmente contribuirão para reforçar dois dos
mecanismos que compõe essa tríplice de atuação das CTMs, a possível
geração de linfócitos regulatórios que expressam a molécula CD69 e a
participação da adenosina como um dos fatores produzidos pelas CTMs para
imunomodular os linfócitos T.
141
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