Documentos - A Embrapa

Documentos
ISSN 0102-0110
Março, 2006
SEMINÁRIOS NÚCLEO TEMÁTICO DE BIOTECNOLOGIA – 2005
169
ISSN 0102 0110
Março, 2006
Recursos Genéticos e
Biotecnologia
Documentos 169
SEMINÁRIOS NÚCLEO TEMÁTICO DE
BIOTECNOLOGIA – 2005
Coordenador Seminários NTBio
Luis Pedro Barrueto Cid
Brasília, DF
2006
Exemplares desta edição podem ser adquiridos na
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Serviço de Atendimento ao Cidadão
Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) –
Brasília, DF CEP 70770-900 – Caixa Postal 02372 PABX: (61) 3348-4739 Fax: (61)
3340-3666 www.cenargen.embrapa.br
e.mail:[email protected]
Comitê de Publicações
Presidente: Mauro Sergio Folle
Secretário-Executivo: Maria da Graça Simões Pires Negrão
Membros: Arthur da Silva Mariante
Maria de Fátima Batista
Maurício Machain Franco
Regina Maria Dechechi Carneiro
Sueli Correa Marques de Mello
Vera Tavares de Campos Carneiro
Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão
Normalização Bibliográfica: Maria Iara Pereira Machado
Editoração eletrônica: Maria da Graça S. P. Negrão
1ª edição
1ª impressão (2006):
Todos os direitos reservados.
A reprodução não-autorizada desta publicação, no todo o em parte, constitui violação
dos direitos autorais (Lei nº 9.610)
S 471
Seminários Núcleo Temático de Biotecnologia – 2005 / Luis Pedro
Barrueto Cid, Coordenador Seminários NTBio. -- Brasília, DF: Embrapa
Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2006.
22 p. -- (Documentos / Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia, 0102 - 0110; 169).
1. Biotecnologia – núcleo temático – seminários. 2. Embrapa Recursos
Genéticos e Biotecnologia. I. Barrueto Cid, Luis Pedro. II. Série.
631.5233 – CDD 21.
Editor
Luis Pedro Barrueto Cid
Biólogo, M.Sc., Ph.D., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília
DF.
APRESENTAÇÃO
Recursos, SAAD, relatórios, renovação de projetos, manutenção, prestação de
contas e, muitas outras coisas que nem sempre achamos agradáveis de fazer. Mas,
nas Segundas feiras, às 10 h, temos um bom momento de aproximação com o mundo
da ciência, onde a criatividade, o debate, o raciocínio encontram o seu ponto forte.
Além disso, é um momento em que podemos conhecer o trabalho dos colegas,
firmar colaborações, estreitar as relações pessoais. Portanto, é com grande prazer que
apresento o resumo do conjunto de seminários proferidos durante o ano de 2005.
No seu segundo ano de existência do Ciclo de Seminários da Biotecnologia,
conseguimos dar regularidade as apresentações com a aquisição de um Datashow,
graças a recursos recebidos pelo treinamento de pessoal, gentilmente realizado pelos
colegas João B. Teixeira, Pedro Barrueto, Elibio Rech e Francisco Aragão. Ressalto
ainda a figura do coordenador dos seminários, o colega Pedro Barrueto, a quem
agradeço pela forma com que aceitou e tem conduzido este desafio.
Mauro Carneiro
Gestor do NTBio
SUMÁRIO
ABORDAGENS PARA O CONTROLE DE DOENÇAS FÚNGICAS EM CACAU (THEOBROMA CACAO). .................................................................. 20
CAROTENÓIDES EM ALIMENTOS\.................................................................................................................................................................................
ASPECTOS QUÍMICOS E TECNOLÓ-GICOS, IMPLICAÇÕES NA SAÚDE HUMANA. ................................................................... 10
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA DE CAFÉ PARA FINS DE CLONAGEM E TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA............................................................... 11
ENDEREÇAMENTO DE PROTEÍNAS PARA CLOROPLASTOS E MITOCÔNDRIAS\.....................................................................................................
O MODELO THI1. ............................................................................................................................................................................. 17
ESTUDOS DA REPRODUÇÃO VEGETAL VISANDO O DOMÍNIO DA APOMIXIA, CLONAGEM DE PLANTAS ATRAVÉS DE
SEMENTES. ....................................................................................................................................................................................................... 13
ESTUDOS ULTRAESTRUTURAIS, MOLECULARES E BIOQUÍMICOS DA INTERAÇÃO Carica papaya X Colletotrichum gloesporioides
X Cryptococcus magnus ..................................................................................................................................................................................... 21
EVOLUÇÃO MOLECULAR IN VITRO\ ..............................................................................................................................................................................
ESTRATÉGIA PARA A SELEÇÃO DE MOLÉCULAS INSETICIDAS................................................................................................ 22
Introdução ....................................................................................................................................................................................................................... 7
MELHORAMENTO DE BANANEIRA E TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA .................................................................................................................... 14
MUTAÇÃO SUGARY EM MANDIOCA\ .............................................................................................................................................................................
UMA NOVA
CLASSE
MANDIOCA ..................................................................................................................................... 15
NOVOS GENES PARA ANTIGAS CULTURAS\ ...............................................................................................................................................................
UTILIZAÇÃO DE RGAS COMO MARCADORES MOLECULARES PARA INTROGRESSÃO DE RESISTÊNCIAS EM AMENDOIM.19
PROTEOMA E SECRETOMA DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. CAMPESTRIS NA INTERAÇÃO COM A PLANTA
HOSPEDEIRA. ..................................................................................................................................................................................................... 9
REGENERAÇÃO DE PLANTAS DE MANDIOCA VIA ALGINATO DE CÁLCIO........................................................................................................... 18
REGENERAÇÃO E TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE BRAQUIÁRIA...................................................................................................................... 16
RNA NÃO CODANTE, UMA QUEBRA NO DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR..................................................................................... 12
TUBERIZAÇÃO IN VITRO DE MANDIOCA (MANIHOT ESCULENTA
CRANTZ). .................................................................................................................. 23
SEMINÁRIOS NÚCLEO TEMÁTICO
BIOTECNOLOGIA – 2005
DE
Luis Pedro Barrueto Cid
INTRODUÇÃO
ll Ciclo de Seminários do Núcleo Temático de Biotecnologia – NTBio.
Apresentamos uma síntese dos seminários de 2005 do NTBio. A publicação dos
resumos, em sua maioria, visa difundir de forma concisa, porém, clara a nossa
produção de conhecimentos.
Gerar conhecimentos para o crescimento sustentável do agronegócio é nossa
missão, assim o dinheiro publico que recebemos é transformado em conhecimento,
um recurso sutil e pouco tangível, mas altamente valioso e gerador de poder e riqueza
dentro desse novo paradigma que é a biotecnologia, que visa reduzir o impacto do
homem no meio ambiente, melhorar a qualidade de vida das pessoas, bem como,
aumentar a eficiência do agronegócio.
Por outro lado, o seminário é o crisol onde o conhecimento borbulha, aprimorase, depura-se e forja-se. Neste cenário, o rigor científico patrulha a fragilidade
conceptual e não deixa a duvida ou erro represar-se, mas, pratica-se a tolerância, a
camaradagem profissional e a perspicácia intelectual como exercício salutar do fluir
das idéias e foi exatamente isso, o que empolgou a nosso auditório, registrando-se no
final do ciclo em torno de 500 participantes.
Nossos seminários tem se desenvolvido a um ritmo continuado a pesar de
nossas dificuldades financeiras, no âmbito da captação de recursos, mas, refletem
nossa vocação e nosso entusiasmo pela pesquisa, isto é, por essa espécie de jogo
cientifico de "tentativa e erro", dentro da perspectiva de viabilizar soluções para o
desenvolvimento sustentável.
Pedro Barrueto
Coordenador Seminários NTBio
PROTEOMA E SECRETOMA DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV.
CAMPESTRIS NA INTERAÇÃO COM A PLANTA HOSPEDEIRA.
Angela Mehta (Ph.D.)
Projeto: Proteoma de Xanthomonas campestris pv. campestris na interação com a
planta hospedeira.
A podridão negra, causada por Xanthomonas campestris pv. campestris, é uma
doença de grande importância econômica no Brasil e no mundo, pois atinge diversas
culturas como repolho, brócolis, couve, entre outras crucíferas. Embora alguns genes
de X. campestris envolvidos na patogenicidade tenham sido reportados, pouco se
conhece sobre a expressão diferencial global desta bactéria na interação com a planta
hospedeira ou em condições controladas. O objetivo deste estudo foi analisar a
expressão diferencial de proteínas de X. campestris pv. campestris na interação com a
planta hospedeira (repolho). Folhas jovens de Brassica Oleracea foram infiltradas com
uma suspensão de bactéria e 6 dias após a infiltração, a bactéria foi recuperada para
extração de proteínas. As proteínas foram analisadas através de eletroforese
bidimensional (2-DE) e visualizados após a coloração com nitrato de prata. A bactéria
cultivada em meio complexo (NYG) foi utilizada como controle. A análise dos mapas
obtidos revelou um total de 300 a 350 proteínas por gel, sendo que os tamanhos
variaram de 10 a 100 KDa e o pI de 4 a 8. A comparação dos mapas da bactéria in
vivo e cultivada em NYG revelou 17 proteínas diferencialmente expressas na condição
in vivo e 20 na condição controle (NYG). Algumas proteínas diferenciais observadas
foram analisadas através de espectrometria de massa e identificadas utilizando o
Programa Mascot. Foi realizada também a determinação da atividade de algumas
enzimas hidrolíticas extracelulares de X. campestris pv. campestris in vivo, envolvidas
na degradação da parede celular das células hospedeiras, incluindo xilanases, αarabinofuranosidases e celulases.
CAROTENÓIDES EM ALIMENTOS: ASPECTOS QUÍMICOS E TECNOLÓ-GICOS,
IMPLICAÇÕES NA SAÚDE HUMANA.
Delia B. Rodriguez Amaya1 (Ph.D.)
Os carotenóides são corantes naturais que apresentam funções biológicas em relação
a saúde humana tais como atividade pró-vitamínica A; redução do risco de doenças
degenerativas como câncer, doenças cardiovasculares, catarata e degeneração
macular; e fortalecimento do sistema imunológico. O Brasil possui uma variedade
notável de alimentos carotenogênicos. Uma boa parte desta riqueza natural já foi
analisada, inclusive produtos processados e alimentos preparados, proporcionando o
banco mais extenso de dados confiáveis sobre carotenóides no mundo. Os principais
carotenóides encontrados em alimentos são o β-caroteno, α-caroteno, β-criptoxantina,
luteína, licopeno e violaxantina. Os primeiros cinco são também os mais encontrados
no sangue humano. Juntamente com a zeaxantina, são os carotenóides já
demonstrados como benéficos à saúde humana. Os carotenóides β-caroteno, αcaroteno e β-criptoxantina são pró-vitaminas A. A luteína e a zeaxantina são os
carotenóides implicados na redução do risco de degeneração macular (principal causa
de cegueira no idoso) e catarata. Mais eficiente que o β-caroteno como antioxidante, o
licopeno mostrou ação contra o câncer, a evidência sendo mais forte em relação ao
câncer de próstata, estômago e pulmão. A possível atuação de violaxantina em
relação às doenças ainda não foi demonstrada. Os alimentos variam largamente na
sua composição qualitativa e quantitativa de carotenóides. Existe também variação na
composição de um dado alimento devido aos fatores como variedade ou cultivar,
estágio de maturação, clima ou localização geográfica, parte da planta utilizada, e
técnica de produção. Por serem moléculas altamente insaturadas, os carotenóides são
susceptíveis a isomerização e oxidação, as condições para as quais ocorrem durante
o preparo doméstico, processamento industrial e estocagem dos alimentos. Calor, luz
e ácidos promovem a isomerização dos carotenóides trans, como são normalmente
encontrados na natureza, para a forma cis, com ligeira perda de cor e atividade
biológica. A oxidação, principal causa de degradação dos carotenóides, depende da
disponibilidade de oxigênio, tipo de carotenóide e de seu estado físico. É estimulada
pela luz, calor, metais, enzimas oxidativas e peróxidos, e é inibida por antioxidantes.
Por outro lado, o processamento pode aumentar a bio-disponibilidade dos
carotenóides.
1
Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas, C.P. 6121, 13083-862 Campinas, SP.
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA DE CAFÉ PARA FINS DE CLONAGEM E
TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
João Batista Teixeira (Ph.D.)
Projeto: Avaliação da resposta embriogênica e produção de mudas de dez híbridos de
café via embriogênese somática.
Com os sucessivos retrocruzamentos e autofecundações na busca da uniformidade
genética de uma nova variedade, os caracteres de interesse acabam por segregar nas
gerações avançadas. Assim, a alternativa passa a ser o lançamento de variedades
híbridas, que possam reunir diferentes caracteres de interesse, além de apresentar
algum grau de heterozigose. Entretanto, para isso é essencial dispor de uma
metodologia eficiente de clonagem via embriogênese somática para produção de
mudas em larga escala, a qual apresenta as seguintes vantagens: grande número de
embriões podem ser produzidos por g de células; a muda de embrião somático é muito
semelhante à de semente; as pesquisas encontram-se bastante adiantadas; o
comportamento no campo não difere de plantas derivadas de sementes. O processo
vem sendo ajustado e melhorado na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia,
mas já apresenta no momento uma alta eficiência. Cada folha inoculada resulta em
torno de 60 segmentos, dos quais de 15 a 100% vão produzir pelo menos um setor
embriogênico. Os 10 calos embriogênicos produzidos pesam em média 0,5 g, que, em
cultivo em meio de multiplicação líquido, vai resultar em 16 g de células após três
meses de cultivo. Cada grama em meio de regeneração tem produzido em média
20.000 embriões. Assim, as 16 g vão produzir ao final do processo, considerando uma
eficiência de 50% em cada fase, em torno de 75.000 mudas. Os testes de campo tem
mostrado uma alta uniformidade das plantas, o que demonstra a viabilidade do
processo.
RNA NÃO CODANTE, UMA QUEBRA NO DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA
MOLECULAR.
Natália Florêncio Martins (Ph.D.)
Projeto: BIEM – Bioinformática a serviço da EMBRAPA
O dogma central da biologia molecular descreve que o DNA é transcrito em RNAm
que por sua vez é traduzido numa sequencia de aminoácidos para formar uma
proteína. Neste cenário o RNA executa um papel acessório, de transferência de
informação. Contudo o RNA não é usado meramente como um intermediário na
produção de proteínas. Existem outros tipos de RNAs, conhecidos como não codante
(ncRNA), cuja função não é ser traduzido em proteína. Exemplos de RNA não
codantes tRNA, rRNA, RNAs.
Esta apresentação revisa os conceitos importantes e as novas descobertas destas
moléculas intrigantes. Mostra os métodos experimentais e computacionais para
detecção de RNA não codantes.
ESTUDOS DA REPRODUÇÃO VEGETAL VISANDO O DOMÍNIO DA APOMIXIA,
CLONAGEM DE PLANTAS ATRAVÉS DE SEMENTES.
Vera Tavares de Campos Carneiro (Ph.D.)
Projeto: Estudos da reprodução vegetal visando o domínio da apomixia, clonagem de
plantas através de sementes.
Apomixia é um modo de reprodução assexual de angiospermas que gera progênie
geneticamente idêntica à planta-mãe. O embrião se desenvolve autonomamente, de
gametófito feminino não reduzido. Trata-se portanto de um modo natural de clonagem
de plantas por sementes. Nossa equipe vem estudando elementos da apomixia de
Brachiaria visando domínio do processo para desenvolver estratégias tecnológicas de
fixação de genótipos. Foram identificados genes de expressão na megasporogênese e
megagametogênese de ovários de plantas sexuais e apomíticas. Método de
transformação foi otimizado com alterações na cultura de tecidos usados em
experimentos de biobalística, determinação de promotores heterólogos de maior
expressão, condições de bombardeamento e seleção de explantes transformados. Foi
evidenciada pseudogamia em plantas apomíticas por análises morfológicas e
verificada a formação de endosperma triplóide. Plantas sexuais de B. brizantha que
tiveram o número de cromossomos duplicado pela aplicação de colchicina, tornandose tetraplóides, mantiveram características da sexualidade como a estrutura do
gametófito feminino que, de modo geral, é diferenciada em plantas apomíticas. Iniciouse o estabelecimento de técnicas de cultura de tecidos para obtenção de haplóides e
fertilização in vitro. Foram estabelecidas condições de cultura in vitro de anteras de
diferentes genótipos e, mantidos os calos derivados. Explantes da flor feminina como
pistilo, ovário e óvulo foram avaliados no estudo da polinização e fertilização in vitro e
definidos meios nutritivos para germinação dos grãos de pólen e crescimento do tubo
polínico na ausência e presença de explante feminino. Marcadores moleculares foram
desenvolvidos com estratégia de microsatélites. Apomixia foi detectada em outras
espécies de plantas tropicais e nativas.
MELHORAMENTO DE BANANEIRA E TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA
Kazumitsu Matsumoto (Ph.D.)
Projeto: Melhoramento genético da bananeira
Banana é uma importante fruta, tanto social quanto economicamente. Entretanto
existem relativamente poucos cultivares geneticamente melhorados. Isto deve ser
causada, pelo menos alguma parte, por sua natureza de partenocarpia. Para superar o
problema, têm sido desenvolvidos vários métodos de melhoramento além do
aperfeiçoamento do método convencional de hibridação por polinização cruzada. Em
comparação com o método convencional, foram então revisados métodos de indução
de mutação, hibridação por fusão de protoplastos e transformação genética. Dentro da
transformação genética, foram ainda detalhados métodos por biolística, Agrobacterium
e eletroporação. O método de hibridação por polinização cruzada foi, até no momento,
o que deu mais sucesso, criando várias novas variedades. Entretanto, sua aplicação é
restrita para alguns cultivares, não podendo aplicar aos cultivares de banana para
exportação que é do grupo Cavendish. Para o melhoramento dos cultivares do grupo
Cavendish, os métodos de transformação genética podem ser de mais promissores.
MUTAÇÃO SUGARY EM MANDIOCA: UMA NOVA CLASSE
MANDIOCA
Luiz Joaquim Castelo Branco Carvalho (Ph.D.)
Projeto: Análise de expressão gênica em mutantes espontâneos na rota metabólica de
sacarose/amido e carotenóides em raiz de reserva de mandioca (Manihot esculenta
Crantz)
Um tipo distinto de raiz de reserve de mandioca é conhecido na Comunidade Indígena
Brasileira, pelo menos há mais de 500 anos. No entanto esta planta não é cultivada
para exploração comercial e nem como fonte de genes para o melhoramento genética
da cultura da mandioca. Através de nossos estudos de coleta no centro de origem e
domesticação da mandioca na Amazônia Brasileira, da caracterização bioquímica,
genética e molecular, identificamos varias variantes de rupturas na rota metabólica de
sínteses de amido nesta diversidade que são de grande importância para o
melhoramento da cultura da mandioca. Entre elas destacam-se as identificações de
mutações espontâneas na rota metabólica sacarose-amido originando a mutação
sugary em mandioca com elevados teores de açúcar livre (principalmente glicose) e
três variantes na estrutura da amilopectina (amido tipo glicogênio, amido seroso,
amido não convencional). Técnicas de genômica funcional, biologia molecular
convencional e bioquímica usadas indicaram que o gene que codifica para a enzima
de ramificação subunidade I não é expresso no mutante amido tipo glicogênio e que
cerca de 4 genes são responsáveis pelo fenótipo sugary em raiz de reserva de
mandioca, o que estabelece uma nova classe de mandioca.
REGENERAÇÃO E TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE BRAQUIÁRIA.
Glaucia Barbosa Cabral (M.Sc.)
Projeto: Transformação genética de Braquiária
A necessidade de desenvolvimento de uma metodologia eficiente de transformação
genética de braquiária para ser utilizada com finalidades de suporte em melhoramento,
gerando plantas transgênicas estáveis com alta eficiência, foi o fator indutor deste
trabalho. Assim, no desenvolvimento deste projeto, estão sendo desenvolvidas ações
em todos os níveis que possam contribuir para a melhoria final da transformação
genética, desde a manutenção in vitro de plantas, passando pela cultura de tecidos e
transformação. Neste trabalho, estão sendo, então, desenvolvidas metodologias de
regeneração in vitro de plantas de B. brizantha e de B. decumbens de reprodução
apomítica e sexual. Plântulas foram obtidas a partir de calos embriogênicos e de
segmentos basais. O sistema de embriogênese indireta da planta apomítica partindo
de sementes maduras foi otimizado, atingindo 80% de regeneração de plantas no total
de sementes inoculadas. Foi desenvolvida metodologia para cultura de células
embriogênicas de braquiária, que estão sendo mantidas em repicagens periódicas. Foi
construído e testado vetor de transformação, contendo promotores específicos para
monocotiledôneas, que está sendo utilizado na construção de vetor binário para o
sistema Agrobacterium tumefasciens. Foram conduzidos testes de susceptibilidade e
co-cultivo de Brachiaria spp. à Agrobacterium spp. Variáveis físicas da técnica de
biobalística foram estabelecidas e plantas transgênicas de braquiária foram obtidas
por este método. O resultado final foi que existe agora a possibilidade de utilização
para a transformação de vários explantes, com ótima eficiência embriogênica ou
organogênica, e de regeneração de plantas, além do avanço na identificação das
variáveis de impacto na transformação, que juntos com o desenvolvimento de vetores
de transformação mais apropriados à braquiária tornam mais próxima a obtenção de
metodologia de transformação de braquiária de alta eficiência.
ENDEREÇAMENTO DE PROTEÍNAS PARA CLOROPLASTOS E MITOCÔNDRIAS:
O MODELO THI1.
Juliana Dantas de Almeida (Ph.D.)
THI1 é provavelmente uma proteína bifuncional, já que está envolvida na biossíntese
de tiamina e na estabilidade do DNA organelar, notadamente o mitocondrial.
Interessantemente, a biossíntese de tiamina ocorre em compartimentos distintos em
plantas (cloroplastos) e em leveduras (mitocôndrias). A proteína THI1 de Arabidopsis
thaliana é codificada por um único gene. Uma análise detalhada do N-terminal da
proteína revelou a presença de duas sequências de direcionamento adjacentes: um
peptídeo de trânsito cloroplástico e uma região capaz de formar uma α-hélice anfifílica,
tipicamente encontrada em pré-sequências de direcionamento mitocondriais. Com o
objetivo de avaliar se a localização final de THI1 apresenta algum tipo de regulação
temporal ou espacial, foram obtidas plantas transgênicas de A. thaliana expressando
THI1 fundida a GFP ("green fluorescent protein"). Análises dessas plantas por meio de
microscopia confocal revelaram que THI1 está presente majoritariamente em
cloroplastos e raramente em mitocôndrias. Ao contrário do que acontece em A.
thaliana, em cana de açúcar foram encontrados pelo menos três isoformas/parálogos
de thi1. O alinhamento da seqüência de aminoácidos dessas isoformas com a THI1 de
A. thaliana revelou alta similaridade, inclusive na seqüência de direcionamento. Com o
objetivo de avaliar o padrão de direcionamento dessas isoformas de cana de açúcar,
foram obtidas construções gênicas contendo ou a seqüência de direcionamento
completa ou o peptídeo de trânsito cloroplástico ou a pré-seqüência mitocondrial,
fundidas a GFP sob o comando do promotor 35S. A expressão transiente dessas
construções em epiderme de cebola revelou que no caso da presença da seqüência
de direcionamento completa ou o peptídeo de trânsito, o direcionamento ocorreu
apenas para os cloroplastos. No caso das construções contendo somente a seqüência
de direcionamento mitocondrial a GFP permaneceu difundida no citoplasma.
REGENERAÇÃO DE PLANTAS DE MANDIOCA VIA ALGINATO DE CÁLCIO
L. Pedro Barrueto Cid (Ph.D.)
Projeto: Análise de expressão gênica em mutantes espontâneos na rota metabólica de
sacarose/amido e carotenóides em raiz de reserva de mandioca (Manihot esculenta
Crantz)
Aproveitando a existência de mutantes naturais, no projeto sobre agrobiodiversidade
da mandioca na Amazônia em execução no Cenargen, os estudos têm estado
focalizados na rota metabólica da síntese do amido e carotenóide, presente na raiz.
Estes estudos estão sendo executados com auxílio de varias técnicas, envolvendo
genômica funcional, biologia molecular e bioquímica.
A cultura de tecido em relação a estes estudos tem sido um complemento eficaz
porque tem permitido conservar in vitro estes diferentes genótipos elites, em lugar de,
um dispendioso campo experimental. Mas, a rápida dinâmica de crescimento in vitro
destes materiais tem obrigado, a constantes repicagem dos mesmos, redobrando os
esforços de mão-de-obra e consumo de reagentes. Por tanto, foi levantada a hipótese,
de que, o armazenamento destes genótipos poderiam ser feito por algum tempo, via
sementes sintéticas. Para tanto, gemas axilares de plantas in vitro de diferentes
genótipos de nossa coleção de mutantes, foram encapsuladas em alginato de cálcio
envolvendo diferentes tratamentos, e mantidas, por 30 dias em placa Petri, com meio
SP, 15 °C e no escuro. Após deste período, as gemas encapsuladas foram
transferidas para tubos de ensaios com o mesmo meio e deixadas em presença de luz
e temperatura de 27 °C. Nestas condições, foi verificado que altos porcentagem de
conversão de plantas foram obtidos (70%-80%), indicando que o alginato não teve um
efeito deletério sobre as gemas. Tais resultados abrem boas perspectivas de
exploração para novos ensaios, testando outras variáveis visando aprimorar o
armazenamento de mandioca com alginato.
NOVOS GENES PARA ANTIGAS CULTURAS: UTILIZAÇÃO DE RGAS COMO
MARCADORES MOLECULARES PARA INTROGRESSÃO DE RESISTÊNCIAS EM
AMENDOIM.
Soraya C. M. Leal-Bertioli (Ph.D.)
Projeto: Desenvolvimento de ferramentas genéticas para o uso de espécies silvestres
de Arachis em programas de pré-melhoramento de amendoim.
O amendoim, Arachis hypogaea, é uma leguminosa cultivada nos trópicos em cerca
de 4.8 milhões de hectares, em mais de 90% dos casos, por pequenos produtores.
Surgiu na América do Sul, a partir de um evento de hibridização de uma espécie com
genoma “A” e uma espécie com genoma “B”. A planta resultante, o amendoim
tetraplóide, ficou geneticamente isolado dos parentes diplóides. Conseqüentemente,
esta espécie tem baixa diversidade genética e fontes limitadas de resistência. Faz-se
necessário, então, transferir genes de resistência das espécies silvestres para a
cultivada, pulando a barreira de fertilidade através da criação de híbridos tetraplóides e
do desenvolvimento de marcadores moleculares baseados em regiões análogas em
genes de resistência (RGAs) para auxiliar o melhoramento assistido.
A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia possui o maior banco de
germoplasma de espécies silvestres de Arachis do mundo, a partir das quais foram
isolados RGAs (Bertioli et al., 2003). Para transforamação dos mesmos em
marcadores moleculares foram utilizados os seguintes métodos: Southern blot
(utilizando RGAs como sonda, Guimarães et al., 2005), PCR (utilizando RGAs para
desenhar primers específicos) e AFLP-display (Linden et al., 2004), uma técnica
semelhante ao AFLP, em que um primer é específico para os motivos de RGAs. No
total, 38 marcadores foram desenvolvidos e genotipados em uma população de
mapeamento de genoma AA, para a qual, um mapa já foi desenvolvido (Moretszohn et
al., 2005). Com bioensaios espera-se poder relacionar estes RGAs com resistênciaa
nematóides.
ABORDAGENS PARA O CONTROLE DE DOENÇAS FÚNGICAS EM CACAU
(THEOBROMA CACAO).
Lucilia Helena Marcellino (Ph.D.)
Projeto: Estudos moleculares e ultraestruturais da interação entre endofíticos,
Crinipellis perniciosa e Theobroma cacao
O cacau é uma commodity de grande importância para o Brasil. Esta cultura é atacada
por doenças fúngicas que podem levar a perda de até 90% da lavoura tendo
conseqüências sociais, econômicas e ecológicas importantes. Dentre estas doenças
estão a Vassoura-de-Bruxa causada pelo fungo Crinipellis perniciosa, a Podridão
Parda causada por Phytophthora spp. e Monilíase causada pelo fungo Moniliophthora
roreri. No intuito de entender e buscar soluções para o controle destas doenças,
diversas linhas de pesquisa estão sendo conduzidas enfocando aspectos moleculares
dos patógenos, hospedeiros e a interação entre eles. No nosso laboratório, iniciamos a
análise proteômica do patosistema Crinipellis/Cacau em diferentes tempos de
infecção. Identificamos populações protéicas que são expressas durante o curso da
infecção. Além disto, clonamos o gene de osmotina. A osmotina é uma proteína
potencialmente expressa quando da infecção por patógenos e possui propriedades
antifúngicas. A análise deste gene pode oferecer maior entendimento sobre a
interação cacau/patógeno. Adicionalmente, foi feita a busca de componentes naturais
contra o fungo. Neste aspecto, identificamos novas substâncias capazes de inibir o
crescimento de micélios de Phytophthora e Crinipellis além de inibir a germinação de
esporos de Crinipellis.
Atualmente estamos avaliando o papel dos endofíticos na resistência da planta ao
patógeno no âmbito do projeto “Estudos moleculares e ultraestruturais da interação
entre endofíticos, C. perniciosa e T. cacao”. Assim, iniciamos o isolamento e teste de
endofíticos com potencial de oferecer resistência tanto a Crinipellis quanto
Phytophthora. É nossa expectativa obter conhecimento sobre as respostas de
resistência da planta ao patógeno sob este novo enfoque.
ESTUDOS ULTRAESTRUTURAIS, MOLECULARES E BIOQUÍMICOS DA
INTERAÇÃO Carica papaya X Colletotrichum gloesporioides X Cryptococcus
magnus
Guy de Capdeville (Ph.D.)
Projeto: Rede de Pesquisa em Sanidade Vegetal: análise e mitigação dos riscos na
importação e exportação de produtos agrícolas
Estão sendo estudados microrganismos antagônicos para controle da antracnose do
mamão em pós-colheita. Foram coletados da microflora epifítica de folhas e frutos de
mamão 167 isolados de microorganismos fúngicos e bacterianos. Tais isolados foram
testados "in vitro" e "in vivo" para sua efetividade em controlar a antracnose do mamão
em pós-colheita. Foram realizados estudos ultraestruturais, moleculares e bioquímicos
desta interação tripla para tentar entender os modos e mecanismos de ação destes
agentes de controle de forma a gerar subsídios para o estabelecimento de uma
estratégia de controle ambientalmente amigável para o controle de doenças póscolheita de frutos. De posse destas informações tornar-se-á possível desenvolver um
produto comercial que possa ajudar no combate a enfermidades pós-colheita de frutos
de Carica papaya.
EVOLUÇÃO MOLECULAR IN VITRO: ESTRATÉGIA PARA A SELEÇÃO DE
MOLÉCULAS INSETICIDAS.
Maria Cristina Mattar da Silva (Ph.D.)
Projeto: Estratégias moleculares aplicadas à prospecção de genes para o controle de
insetos-praga.
Evolução de moléculas in vitro é uma metodologia que vêm sendo aplicada
recentemente em importantes problemas ligados à agricultura. A nossa linha de
pesquisa tem empregado esta metodologia para obter genes com atividade nova ou
melhorada para controle de pragas de impacto econômico para agricultura. Neste
contexto, os genes que codificam para proteínas com potencial bioinseticida, tais como
as toxinas Bacillus thurigiensis (Bt) e os inibidores de α-amilases, isolados de feijão
comum, foram fragmentados e recombinados seguindo protocolos básicos de DNA
shuffling. Os produtos da aplicação de DNA shuffling combinados com a técnica de
Phage Display possibilitaram a criação de bibliotecas combinatórias composta por
biomoléculas de formas variantes, apresentadas na superfície de fagos filamentosos.
Cada membro da biblioteca apresenta uma forma distinta que determinará a
capacidade de interação deste com a molécula alvo.
Partindo das bibliotecas de genes variantes para diferentes toxinas Cry e de variantes
para inibidores de α-amilases foram identificadas moléculas mostrando afinidade pelas
proteínas receptoras (BBMV) ou pelas enzimas α-amilases do intestino das larvas do
bicudo do algodoeiro e da largarta-do-cartucho do milho, duas importantes pragas das
plantas de algodão. Alguns genes variantes para diferentes toxinas Cry foram
selecionados em ensaios in vivo quanto ao efeito letal sobre as larvas de Anthonomus
grandis e/ou Spodoptera frugiperda. Os resultados preliminares validam a estratégia
de evoluir moléculas in vitro para selecionar genes ativos e específicos com o objetivo
final de aplicação em programas de melhoramento de plantas, a fim de conferir-lhes
resistência a inseto-pragas.
TUBERIZAÇÃO IN VITRO DE MANDIOCA (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ).
Ricardo Daniel Medina21
O fenômeno de tuberização de raiz de mandioca tem sido pouco pesquisado.
Informações sobre a biologia, a bioquímica e a fisiologia do mesmo aguardam ser
exploradas. Isto gera a necessidade de definirmos um modelo controlado de formação
de raiz de reserva para estudos avançados. O objetivo deste trabalho foi determinar os
fatores que afetam este processo em mandioca e estabelecer um modelo in vitro que
servirá como ferramentas para estudos bioquímicos e moleculares. Procedimentos de
cultura de tecidos e anatomia vegetal foram utilizados. Foram analisados fatores
intrínsecos (genótipo e posição de nós) como extrínsecos (tratamentos com
concentração diferente de sacarose e reguladores de crescimento vegetal). Os
estudos morfológicos e anatômicos revelaram a diferenciação de dois tipos de raízes.
Uma que tem a função de absorção (raiz fibrosa) e outra que apresenta características
de uma raiz de reserva (raiz tuberosa). Embora esta ultima não tenha semelhança à
raiz de reserva de planta cultivada em campo, a mesma diferenciou tecidos de
parêmquima competentes para sintetizar e armazena amido. A formação deste tipo de
raiz foi afetada significativamente pelo genótipo e distribuição das gemas no caule
original. Alem do mais, as mesmas, produziram o rendimento ótimo com determinada
concentração de sacarose e combinações de reguladores de crescimento. Estudos
bioquímicos e moleculares serão desenvolvidos para caracterizar estes dois tipos de
raízes em mandioca.
2
Instituto de Botánica del Nordeste (IBONE), Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Técnicas (CONICET), Corrientes, Argentina.