Introdução à Biotecnologia Biotecnologia, 1º Ano S1 Ana Isabel Ferraz Ana Sofia Rodrigues Introdução à Biotecnologia • Definição Conjunto de conhecimentos técnicos e métodos, de base científica ou prática, que permitem a utilização de seres vivos como parte integrante e activa do processo de produção industrial de bens e serviços A Biotecnologia resulta da integração das ciências da vida e da engenharia, de forma a conseguir a aplicação de organismos, células ou parte das mesmas e análogos moleculares, em produtos e serviços. Área de conhecimento científicotecnológica onde várias disciplinas das ciências da vida e da engenharia confluem para, interdisciplinarmente, construírem novos saberes e práticas. (Lima e Mota, 2003) Introdução à Biotecnologia • Definição “A biotecnologia pode ser definida, numa perspectiva alargada, como a utilização de seres vivos viáveis, ou porções deles activas, para a produção de bens e serviços. Assim, dentro desta definição de biotecnologia inclui-se a manipulação genética, a utilização de enzimas e a engenharia de proteínas, a tecnologia de cultura de tecidos animais e vegetais, os biossensores para monitorização biológica e a tecnologia de processos bioquímicos.” Fonte: Macedo, C., A.; Venâncio, A.; Malcata, F. X.; “Biotecnologia dos Alimentos”, capítulo XX, Biotecnologia Fundamentos e Aplicações, Lidel, 2003 Introdução à Biotecnologia • Definição sensu stricto diz exclusivamente respeito à engenharia e ambiente European Federation of Biotechnology (EFB) sensu lato, diz respeito a toda a tecnologia que utilize organismos vivos ou suas partes para produzir ou melhorar moléculas, melhorar um organismo, um animal ou uma planta, tendo em vista um objectivo especifico Introdução à Biotecnologia • Definição Aplicação em grande escala, ou transferência para indústria, dos avanços científicos e tecnológicos, resultantes de pesquisas em ciências biológicas. O próprio desdobramento da terminologia implica a biotecnologia como sendo o uso de organismos vivos (ou suas células e moléculas) para produção racionalizada de substâncias, gerando produtos comercializáveis. Embora a palavra biotecnologia tenha sido usada pela primeira vez em 1919 DC por um engenheiro agrícola da Hungria, as primeiras aplicações biotecnológicas pelo ser humano datam de 1800 AC, com o uso de leveduras (organismo vivo) para fermentar vinhos e pães (produtos). Desde então, o conceito de biotecnologia tem sido aplicado ao longo do tempo, como pode ser observado na listagem histórica de alguns marcos científicos e tecnológicos que contribuíram para o desenvolvimento da área. Introdução à Biotecnologia • ENGENHARIA GENETICA / TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE O crescimento acelerado do campo da biotecnologia, entretanto, ocorreu a partir da década de 70 com o desenvolvimento da engenharia genética (alteração directa do material genético) ou tecnologia do ácido desoxirribonucléico (DNA) recombinante. { Esta tecnologia implica na modificação directa do genoma do organismo alvo pela introdução intencional de fragmentos de DNA exógenos (genes exógenos) que possuem uma função conhecida. { Sendo assim, por meio de engenharia genética, o gene (DNA) que contém a informação para síntese de uma definida proteína de interesse pode ser transferido para outro organismo que então produzirá grandes quantidades da substância. { Estes conceitos têm definido e delimitado o que se denomina biotecnologia moderna, diferenciando-a da biotecnologia antiga. Introdução à Biotecnologia Engenharia genética / tecnologia do DNA recombinante { envolve modificação directa do DNA, que representa o material genético de um ser vivo, de forma a alterar características do organismo vivo ou introduzir novas características. Assim sendo, o uso da biotecnologia moderna implica o conhecimento e isolamento de sequências de DNA que correspondem a genes responsáveis em conferir a característica desejada (fenótipo). O isolamento dos genes de interesse é conduzido por meio de técnicas de clonagem molecular que consiste em induzir um organismo vivo a amplificar a sequência de DNA de interesse, em sistemas que permitem uma fácil purificação e recuperação do referido fragmento de DNA. Para isso, são utilizados vectores de clonagem (plasmídeos ou vírus), nos quais a sequência de DNA de interesse é inserida, utilizando a enzima DNA ligase. Quando necessário, o fragmento de DNA de interesse pode ser libertado do vector por meio de enzimas de restrição. Uma vez isolado o gene de interesse, estes fragmentos de DNA (genes) são incorporadas por meio de engenharia genética no genoma do organismo alvo, resultando em um organismo geneticamente modificado (OGM), cuja característica adquirida passa a ser hereditária. O termo geneticamente modificado tem sido amplamente usado para descrever: { a aplicação da tecnologia do DNA recombinante para alteração genética de animais, plantas e microorganismos. Essa tecnologia moderna, desenvolvida em 1973, permite a transferência do material genético de um organismo para outro efectiva e eficientemente. Ao invés de promover o cruzamento entre organismos relacionados para obter uma característica desejada, os cientistas podem identificar e inserir, no genoma de uma determinado organismo, um único gene responsável pela característica em particular. Isto permite que as alterações no genoma do organismo sejam precisas e previsíveis, ao contrário do melhoramento clássico que consiste na: transferência de genes de um organismo para outro por meio de cruzamentos (reprodução sexual), misturando todo o conjunto de genes dos dois organismos em combinações aleatórias. Introdução à Biotecnologia Processo Biotecnológico: aquele em que há uma utilização de microrganismos (leveduras, bactérias, etc.) e/ou enzimas, podendo ter como objectivo a síntese de compostos químicos intracelulares (proteínas) ou extracelulares (antibióticos, álcool), a produção de biomassa (fermento de padeiro), produção de alimentos (bebidas), produção de energia (biogás, etanol) ou ainda a despoluição biológica de efluentes (degradação da matéria poluente pelos microrganismos) Microrganismos cultivados em Bioconversão O crescimento de organismos num Reactor Biológico (BIORREACTOR) decorre através do fornecimento ao meio líquido de certos nutrientes ou substratos (fontes de carbono, azoto, oxigénio, vitaminas, micronutrientes,…) na presença de condições ambientais favoráveis Os BIORREACTORES são um elemento crucial dos processos biotecnológicos …geneticamente modificados Recuperação de Produtos Preparação de matérias-primas -separação, concentração, isolamento, purificação Introdução à Biotecnologia Biotecnologia Vegetal Biotecnologia dos Alimentos Biotecnologia Ambiental Biotecnologia da Saúde Biotecnologia Microbiana Biotecnologia Animal { Bioengenharia, bioinformática Biotecnologia Vegetal Engloba duas vertentes: { Agrobiotecnologia { Multiplicação de plantas em grande escala Propagação clonal de plantas Eliminação de vírus Hibridização Engenharia genética Biotecnologia Vegetal Industrial Produção de compostos para: { { { Industria alimentar “ farmacêutica “ cosmética Biotecnologia Vegetal Biotecnologia Vegetal Produzir mais: { { { na mesma superfície em menor tempo e com o menor impacto no ambiente Implementar métodos de produção eficientes que combinem as técnicas convencionais com as biotecnológicas. Biotecnologia Vegetal A Biotecnologia Agrícola e em particular a Engenharia Genética contribuem para a produção de alimentos na : { redução do tempo de produção de novas variedades; { inclusão apenas de genes desejáveis e não de todo o genoma; { capacidade de usar qualquer gene que exista na natureza. Biotecnologia Vegetal Biotecnologia Vegetal Milho resistente à seca Milho de alta produção Genoma do Milho Isolamento do gene correspondente Introdução do gene Genoma modificado Outras variedades Regeneração Outras espécies gene Milho resistente à seca e de alta produção Biotecnologia Vegetal Em 1994 não existiam organismos GM cultivados em nenhuma parte do mundo mas em 1997, 12,8 milhões de hectares de culturas GM foram cultivadas, sobretudo nos EUA (um quarto de todo o algodão, 14% soja e 10% de milho). Durante 2006, a superfície mundial cultivada com OGM’s foi superior a 102 milhões de hectares e o valor de mercado foi de 6,150 milhões de dólares. Os principais OGM são soja, milho, algodão e colza. 1996 Fonte: ISAAA.org 2000 2006 Biotecnologia Vegetal Biotecnologia Vegetal Fonte: ISAAA.org Biotecnologia Vegetal Fonte: ISAAA.org Biotecnologia Vegetal "Arroz dourado" é geneticamente modificado e contém uma grande quantidade beta-caroteno, que é convertido no organismo em Vitamina A. O beta-caroteno dá a cor laranja às cenouras e é a razão pela qual o arroz geneticamente modificado é dourado. Para que o arroz produza beta-caroteno, foram implantados três novos genes: dois de narcisos e o terceiro de uma bactéria. “Tomate long-life”modificado geneticamente para durar mais tempo foi o primeiro produto alimentar geneticamente modificado que os consumidores tiveram a possibilidade de adquirir. Este tomate foi lançado em 1994 nos EUA. É geneticamente modificado para se manter firme e fresco durante muito tempo, o que acontece porque, em consequência da modificação genética, o tomate produz uma quantidade inferior da substância que causa a sua degradação. Biotecnologia Vegetal Modificação genética feita no feijão { para que fique resistente ao vírus do mosaico dourado, transmitido pela mosca branca. A doença ocorre em vários países da América Latina. “Actualmente, o combate ao insecto é feito com insecticidas bastante tóxicos." Monsanto vai testar soja resistente à lagarta Variedades melhoradas de arroz ganham apoio na Índia Novo milho Gm na Argentina Biotecnologia Vegetal A Corporação de Investigação e Desenvolvimento de Cereais de Austrália (GRDC) apoiam desenvolvimento e comercialização de trigo rico em amilose. { { { O amido deste tipo de trigo contem mais de 50% de amilose. Esta proporção é cerca de 20% maior do que nas variedades convencionais de trigo. O amido com alto teor em amilose pode ser benéfico para a prevenção da obesidade, da diabetes e o cancro colorectal. Esta variedade especializada de trigo foi desenvolvida durante vários anos (CSIRO e Biogemma) http://www.grdc.com.au/whats_on/mr/south/southern_region06031.htm Biotecnologia Vegetal Do Spider-Man às Spider-gots! http://www.pubinfo.vcu.edu/secretsofth esequence/video/sots_133_1.mpg Biotecnologia Florestal Chile desenvolve eucalipto GM resistente à seca Com o objectivo de colocar à disposição de empresas florestais e agricultores do interior árido do Chile, árvores que possam resistir melhor a situações de stress hídrico. Eucalipto GM: uma fonte interessante para biocombustíveis Biotecnologia na Saúde Insulina produzida em alface geneticamente modificada (publicado em Julho de 2007 na Plant Biotechnology) Cápsulas de insulina produzidas em alface GM podem ser a chave para restaurar a habilidade do corpo em produzir insulina e ajudar pessoas que sofrem de diabete dependente de insulina (Universidade da Florida). Plantas de tabaco GM com um gene da insulina foram administradas a ratos diabéticos. No final do estudo, apresentaram níveis normais de açúcar no sangue e na urina e as células produziam níveis normais de insulina. Estes resultados indicam que as cápsulas de insulina poderão vir a ser usadas para prevenir o diabetes. Há propostas para o uso da alface em vez do tabaco para a produção de insulina porque esse cultivo é menos dispendioso e evita o estigma negativo associado ao tabaco. O método de produzir insulina nas plantas é similar ao que se usou para um estudo prévio da produção na vacina para anthrax em tabaco. Neste estudo, a equipa de investigação mostrou que um acre de tabaco produziria uma dosagem segura de vacina para inocular toda a população dos Estados Unidos. Cientistas criam enzima que extrai o HIV de células infectadas (Revista Science, Julho de 2007) Institutos Max Planck e Heinrich-Pette desenvolveram uma enzima capaz, em laboratório, de extrair o DNA implantado pelo vírus da AIDS (HIV), no genoma humano. Vírus como o HIV actuam inserindo seu próprio DNA no genoma da célula infectada. Além de permitir que os genes do vírus se expressem dentro da célula, esse processo garante que o material genético do HIV estará presente em todas as células geradas a partir da divisão da hospedeira original. “Consequentemente, o vírus liga-se de modo inseparável ao hospedeiro, o que torna uma ‘cura’ da AIDS virtualmente impossível”. Por isso, boa parte das pesquisas de combate à AIDS voltam-se para tentar impedir que o vírus penetre nas célula. No entanto, o trabalho alemão, mostra que “recortar” os genes virais já integrados ao genoma do paciente pode ser possível, erradicando o HIV do corpo. Os pesquisadores chegaram a esse resultado com a criação de uma forma específica da enzima recombinase (Cre), preparada para reconhecer e extrair os trechos de DNA do HIV do genoma humano. A equipa identificou um derivado da Cre, chamado Tre, que reconhece e extrai o DNA do HIV integrado aos genes do hospedeiro humano. A extracção de DNA não deverá ter aplicação terapêutica imediata – a experiência foi realizada em culturas de células – e terá obstáculos pela frente. “A mais importante, e provavelmente a maior, dessas dificuldades é que a enzima precisará de um meio de aplicação seguro e eficiente, e terá de funcionar sem efeitos colaterais adversos nas células-alvo”. Biotecnologia na Saúde Diagnóstico precoce (Revista Science de 08/06/2007, Vol. 316, N°. 5830) Cientistas desenvolvem método que acusa níveis mínimos de expressão de genes associados a doenças. Pesquisadores norte-americanos desenvolveram um método para detectar actividade de certos genes em níveis extremamente baixos, o que pode ajudar a diagnosticar doenças antes do surgimento de sintomas mais claros. À medida que um tecido fica doente, acontecem mudanças nos níveis de expressão de centenas ou milhares de genes. Essas mudanças são reflectidas nas moléculas de RNA mensageiro – pequenas fitas de material genético que carregam as instruções dos genes para o restante da célula. A equipa da Harvard Medical School (EUA), criou uma tecnologia que detecta essas moléculas com enorme sensibilidade. A técnica é capaz de acusar a presença de apenas uma dessas sequências de RNA em três células. Como teste, os cientistas aplicaram o método em ratos com cardiomiopatia hipertrófica, doença que faz com que o músculo cardíaco que forma as paredes dos ventrículos fique mais espesso. Nas cobaias, identificaram mudanças ínfimas na expressão de alguns genes antes que surgisse qualquer sinal de danos ao coração. EUA aprovam arroz GM que ajuda no combate à diarreia-Gene humano é inserido no arroz O governo dos Estados Unidos aprovou recentemente a plantação de um arroz GM capaz de produzir proteínas humanas que devem ser usadas no tratamento médico da diarreia. A aprovação permitiu a plantação de até 3.200 acres do arroz GM no Estado do Kansas. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA tem um protocolo restrito para fiscalizar plantações OGM com finalidade de produção de fármacos, com inspecções de campo e maiores distâncias de cultivos tradicionais com produção de alimentos. Pesquisas genéticas trazem esperança para os diabéticos A biotecnologia tem sido a principal ferramenta da ciência na busca pelo tratamento e melhorias na condição de vida dos diabéticos, Em 17/03/2007foi anunciado o nascimento das primeiras quatro vacas transgénicas, da raça Jersey, com o gene humano para a produção de insulina no leite. O feito ocorreu na cidade de Buenos Aires, Argentina e foi realizado pela empresa de biotecnologia Biosidus que pretende reduzir os custos do produto no mercado argentino em pelo menos 30%. De acordo com o director-executivo da empresa, a produção do leite pelas vacas transgénicas é uma etapa intermediária na elaboração da insulina, a qual posteriormente terá que ser isolada e purificada para produção em escala industrial. Os cientistas afirmam que seriam necessárias apenas 25 vacas produtoras de insulina para dar resposta à necessidade dos 1,5 milhões de argentinos diabéticos. Biotecnologia na Saúde Tomate transgênico rico em folato Pesquisadores da Universidade da Florida, nos EUA, criaram uma variedade de tomate transgénico que contém 25 vezes mais folato que as variedades convencionais. Contêm também 7 vezes mais folato do que as culturas hortícolas de folha (espinafres, acelgas, lentilhas e ervilhas) consideradas como a maior fonte de folato. Uma possível deficiência de folato durante a gravidez, está relacionada com graves deficiências no desenvolvimento da espinal-medula dos bebés. Nos países desenvolvidos recomenda-se que as mulheres grávidas tomem pílulas de ácido fólico, a forma sintética do folato. No entanto, em muitos países em vias de desenvolvimento, a distribuição deste suplemento é inexistente por motivos económicos. Alimentos baseados na engenharia genética de plantas poderiam representar alternativas reais para substituir o folato, através da alimentação. Biotecnologia na Saúde Butantan inaugura fábrica de vacina contra gripe Com a ferramenta da biotecnologia, o Instituto Butantan desenvolve pesquisa para diversas vacinas e produtos para a área de saúde. O processo de fabricação da vacina é feito com ovos de galinha, nos quais o vírus activo é inoculado para a produção da vacina. “Cada ovo corresponde a uma dose. Passam por uma desinfecção e são incubados 11 dias antes de entrarem na área de biossegurança. Um equipamento inocula o vírus na câmara de ar interna dos ovos, que são enviados para outra incubadora na qual ficam de 30 a 96 horas. Os ovos seguem para uma câmara fria, para destruir o embrião. Um equipamento separa o líquido alantóide em que está a vacina do embrião morto e cascas. Os dejectos são triturados e desinfectados Depois, mistura-se citrato ao líquido alentóide e centrifuga-se para tirar as impurezas. Com isso, dos cerca de 1.350 litros restam apenas 150, que são fraccionados e enviados para a ultracentrífuga. Em seguida, sobram 25 litros, que são diluídos e tratados com substâncias químicas para matar o vírus. Finalmente, passa-se à formulação farmacêutica. A fábrica piloto de vacina contra a gripe aviária aguarda a licença de manipulação do vírus pela CTNBio, pois ela é recombinante, ou seja transgência. O Butantan é um dos cinco centros produtores de vacina do mundo que compõem a equipa da Organização Mundial da Saúde (OMS) para o combate a gripe aviária. O objectivo é desenvolver uma vacina segura, eficaz e de baixo custo, que permita proteger a população no caso de uma eventual pandemia. Como a vacina da gripe aviária, outras vacinas também são recombinantes, como a da Hepatite B. Biotecnlogia Ambiental Descoberta explosiva em planta de tabaco GM O tabaco pode ser mau para a saúde mas pode ser bom para o meio ambiente, segundo um relatório de um novo estudo com planta GM de tabaco Poderá limpar a superfície do solo contaminado com o trinitrotolueno (TNT), um explosivo militar extensamente usado. A contaminação de TNT é um grande problema ambiental em muitos locais usados durante a Segunda Guerra Mundial, áreas de treino militar, e em locais de fabricação de explosivos. O TNT além a ser explosivo é tóxico e uma ameaça da saúde humana. Os pesquisadores sabiam que determinadas bactérias de solo poderiam metabolizar e modificar o TNT em compostos não tóxicos. Mas estas bactérias naturais existem em níveis muito baixos para eliminar o TNT. No novo estudo, os pesquisadores introduziram um gene para uma enzima bacteriana de transformação numa planta de tabaco. Testaram o efeito da planta no solo contaminado com TNT em comparação com plantas não modificadas de tabaco plantadas no mesmo solo por diversas semanas. As plantas GM reduziram significativamente a toxicidade do solo contaminado com a substância. “Este é o primeiro relatório para demonstrar que as plantas GM para a fitorremediação de poluentes orgânicos podem aumentar a diversidade funcional e genética da comunidade bacteriana no solo com poluição aguda em comparação ao tipo selvagem das plantas”, atesta o relatório. “Estas descobertas têm implicações importantes, não somente para o uso de plantas GM para a remediação de TNT mas também para limpar outras fontes de contaminação”. Biotecnologia Ambiental Technologies for decolourisation of textile wastewaters: Perspectives for anaerobic biotechnology { notable achievements were made in the use of biotechnological applications to textile wastewaters not only for colour removal but also for the complete mineralization of dyes. Different microorganisms such as aerobic and anaerobic bacteria, fungi and actinomycetes have been found to catalyse dye decolourisation. Biotecnologia Ambiental An Insilco approach to bioremediation: Laccase as a case study { { One of the most efficient processes to remove pollutants from environment is through bioremediation. It is the process by which living organisms degrade or transform hazardous organic contaminants into less toxic compounds. Screening of indigenous microbes of the pollutant contaminated site for their degradation potential is one way to approach the problem. Thus, microorganisms that can degrade various pollutants (e.g. nitroaromatics, chloroaromatics, polycyclic aromatics, biphenyls and components of oil) have been isolated with the eventual goal of exploiting their metabolic potential for the bioremediation of contaminated sites Biotecnologia Alimentar Tecnologia de DNA recombinante: plantas e animais transgénicos e microrganismos recombinantes. Produção microbiana de alimentos e ingredientes alimentares O processo de fabrico de cerveja. Bactérias ácido lácticas e fermentação por bactérias ácido lácticas. Prebióticos, simbióticos e nutracêuticos. Regulação da expressão génica em procariotas Produção microbiana industrial de ácido cítrico Produção microbiológica industrial de glutamato, lisina e prolina. Enzimas na indústria alimentar Quantificação de enzimas e tabelas de purificação. Imobilização de enzimas e células. Biorreactores Scale-up. Tipos de biorreactores. Substratos industriais. Cinética de crescimento de microrganismos. Purificação do produto (downstream processing). Técnicas de rompimento de células, de separação sólido-líquido e de concentração usadas em processos industriais. Biotecnologia Animal Desenvolvimento e produção de vacinas, tratamentos, suplementos e novos kits de diagnóstico { { Um dos primeiros suplementos, derivado de um organismo geneticamente modificado, produzido por bactérias para a utilização na produção animal foi a somatrotofina bovina (BST), uma hormona produzida no cérebro e que é responsável pelo crescimento dos bezerros, com um papel relevante na produção do leite em vacas em aleitamento. O diagnóstico molecular permite detectar doenças em estágios pré-clínicos, ou seja, logo no início da doença, e são extremamente importantes na medicina veterinária. Os sinais clínicos podem surgir em todos os animais ao mesmo tempo, levando à perda completa dos animais– epidemia de febre aftosa na Inglaterra, onde foram sacrificados milhões de animais, com prejuízos de biliões de dólares. Os kits de diagnóstico – usando produtos da engenharia genética ou usando PCR (Reacção de Polimerase em Cadeia) – permitem a detecção da doença no estágio inicial ou possibilitam eliminar os animais doentes e reduzir os efeitos nefastos das epidemias. Animais geneticamente modificados Metodologias http://www.biotecnologia.com.br/biocd/ 01_entendendo/metodologias.asp { { { Biolistica Agrobacterium tumefaciens Electropuração Links de Interesse Sociedade Portuguesa de Biotecnologia { http://www.spbt.pt/ International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications (ISAAA) http://www.isaaa.org/ ICGEB-International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology, Biosafety Database http://www.icgeb.org/~bsafesrv/db/biosafety.html EuropaBio EuropaBio is the European Association for Bioindustries and represents nearly 40 member companies operating worldwide and 18 national biotechnology associations. http://www.europabio.org/ Agricultural Biotechnology in Europe http://www.abeurope.info/ European Commission EU market of GMO’s http://gmoinfo.jrc.it/ http://www.cibpt.org/ Biotechnology Organizations and Research Institutes/Centres Proceedings of Congresses, Meetings and Workshops Declarations and Open Letters Events: Congresses, Meetings and Courses Information Sources MIRCENS Activities News Open Access Initiatives Publications Jornais Biotechnology Letters { http://www.springerlink.com/content/100138/ Biotechnology and Bioengineering { http://www3.interscience.wiley.com/cgibin/jhome/71002188?CRETRY=1&SRETRY=0 Acta Biotechnologica { http://www3.interscience.wiley.com/cgibin/jhome/60500214 Critical Reviews in Biotechnology { http://www.informaworld.com/smpp/title~content=t713400 865~db=all Electronic Journal of Biotechnology { http://www.ejbiotechnology.info/ Motores de pesquisa Biblioteca do Conhecimento online { http://www.b-on.pt { http://www.sciencedirect.com/ { http://www.springerlink.com Total number of summary notifications circulated on 11/05/2006 Country / Year 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 26 16 17 11 2 1 7 7 6 8 16 5 8 1 2 5 1 5 4 5 10 4 5 1 1 3 6 3 3 3 1 Austria Belgium Finland 2006 Total 3 Czech Republic Denmark 2005 130 2 3 5 1 1 42 1 1 22 France 1 35 57 69 91 72 70 64 34 17 3 17 11 14 18 573 Germany 3 1 8 12 17 20 18 23 7 8 7 9 10 7 9 159 1 5 7 6 10 7 Greece 19 Hungary Iceland 1 Ireland Italy Netherlands 4 15 2 2 5 19 43 50 46 43 9 25 16 10 14 19 Norway 18 5 1 5 9 2 4 19 4 4 7 7 1 Spain 2 2 1 3 10 11 8 Sweden United Kingdom 4 159 1 1 Portugal 6 295 1 Poland Total 1 1 51 17 1 2 2 5 4 5 21 3 3 16 44 39 39 19 19 17 40 20 26 41 344 10 9 8 19 6 2 2 1 14 4 4 87 1 232 78 93 2121 16 17 23 37 27 25 22 13 25 12 5 8 1 66 89 166 213 239 264 244 238 129 88 56 82 72 For Austria, Finland and Sweden data is not available before 1995 because the state did not yet belong to the EU