Plantas

54º Congresso Brasileiro de Genética
1
Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
Bahia Othon Palace Hotel • Salvador • BA • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Exploring genotyping technologies for low
to medium-throughput single nucleotide
polymorphism detection based on
candidate gene approach in common
sunflower (Helianthus annuus)
Fusari, CM1; Nishinakamasu, V1; Puebla, AF1; Maligne, A1; Hopp, EH1,2; Heinz, R1,2; Lia, VV1, 2; Paniego, N1
Biotechnology Institute CICVyA, CNIA, INTA (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria). N Repetto y Los Reseros s/n, Hurlingham,
CP1686, Pcia. Buenos Aires, Argentina
2
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160, Ciudad Universitaria,
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, C1428EGA, Pcia. de Buenos Aires, Argentina
[email protected]
1
Keywords: single nucleotide polymorphism (SNPs), dHPLC, CEL1 cleavage, heteroduplex detection, Helianthus annuus
The analysis of DNA sequence variation is of major importance in genetic studies. To achieve this challenge, different types of
molecular markers have been employed in genetic analysis of crop plants. In sunflower, analyses of genetic diversity were based
on traditional techniques such as allozymes, AFLPs, SSRs and recently on single nucleotide polymorphism and short insertion/
deletion (SNPs and InDels). The abundance, ubiquity and interspersed nature of SNPs together with the potential of automatic
high-throughput analysis make them ideal candidates as molecular markers for construction of high density genetic maps, QTL
fine mapping, marker assisted plant breeding and genetic association studies. In addition, SNPs located in known genes provide a
fast alternative to analyse the fate of agronomically important alleles in breeding populations, thus providing functional markers.
Recent advances in DNA sequence analysis and the establishment of high-throughput assays have provided the framework for
large-scale discovery and analysis of SNPs. Despite the many methodologies available for SNP genotyping, most of these methods
are expensive and often beyond the budget of the low to medium throughput academic laboratory. Many laboratories are pursuing
candidate gene approaches rather than a genome scan, in order to limit the extent of markers that need to be typed. Those
projects demand simple, accurate and cost-effective technology for SNPs typed both on hundreds of individuals or on pooled
samples for a candidate gene region. In this study, we tested 10 out of 28 candidate gene characterized previously in our lab with
two genotyping methods, denaturing high-performance liquid chromatography (dHPLC) and CEL1 endonuclease cleavage of
missmatch heteroduplex. In order to set up a systematic detection platform for medium/high-throughput SNP genotyping we
redesigned primers to amplify 10 regions in a 200-500 bp fragment range. Amplifications were performed using DNA from a
set of sunflower inbred lines of known and unknown genotypes. Since inbred lines are homozygous for any particular allele, it is
necessary to create heterozygous samples to discriminate between homoduplex and heteroduplex molecules. Hence, PCR products
from known genotypes were added in equimolar concentration to all the known genotypes to form the heteroduplex. Samples were
either analysed by dHPLC or incubated with CEL1 endonuclease followed by capillary electrophoresis to detect the corresponding
fragments. For dHPLC: melting temperature, gradient conditions, flow rate and quantity of heteroduplex were optimized. For
the CEL1 cleavage: purification of the enzyme, quantity of enzyme and quantity of heteroduplex were also tested to reach the best
detection. Results from these experiments indicate that both dHPLC and CEL1 cleavage can be efficiently employed in analysing
SNPs on a medium/high-throughput scale for genotyping in sunflower.
Finantial support: INTA, ANPCyT, CONICET.
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Seleção simultânea para teor de
macronutrientes em uma população natural
de Mabea fistulifera Mart.
Durigan, MR1; Moraes, MA1; Silva, ECB1; Santos, EAO1; Kubota, TYK1; Moraes, SMB1; Rodrigues, CJ2; Moraes, MLT1
Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP
2
Companhia Energética de São Paulo - CESP
[email protected]
1
Palavras-chave: canudo-de-pito, conservação genética, índice de seleção, parâmetros genéticos, teste de progênies
O canudo-de-pito (Mabea fistulifera) é uma espécie arbórea pertencente à família Euphorbiaceae. Caracteriza-se
como uma planta heliófita, pioneira e também por ser encontrada em vegetação secundária de terrenos arenosos,
principalmente do cerrado e de sua transição para floresta semidecídua. É pouco exigente em solos, sendo ótima para
plantios mistos destinados a restauração ecológica. Tendo em vista a grande devastação dos biomas brasileiros, tornase cada vez mais necessário a adoção de programas que visem à conservação genética das espécies arbóreas nativas, e
o conhecimento da variação genética associada à composição química das sementes, em especial os macronutrientes,
o que é fundamental para o estabelecimento dos regenerantes. O presente trabalho teve como objetivo selecionar as
melhores árvores matrizes de uma população natural de M. fistulifera, com base no teor de macronutrientes (N, P,
K, Ca, Mg e S) das sementes, utilizando a seleção simultânea por meio do índice com base em soma de postos (ou
“ranks”). Foram coletadas sementes em 30 árvores matrizes de uma população natural de M. fistulifera, localizada no
município de Castilho-SP. A partir das sementes de cada uma destas matrizes foram feitas avaliações do grau de umidade
(105°C, 24h) e do teor dos macronutrientes: Nitrogênio (N), Fósforo (P), Potássio (K), Cálcio (Ca), Magnésio (Mg)
e Enxofre (S). O delineamento foi o de blocos casualizados com 30 tratamentos (árvores matrizes) e 3 repetições. Os
parâmetros genéticos e em especial o índice baseado em soma de postos ou “ranks”, foram estimados utilizando-se
o programa GENES. As médias para os teores dos macronutrientes, em g.kg-1, foram de 35,49 (N), 5,35 (P), 8,78
(K), 1,06 (Ca), 2,55 (Mg) e 2,54 (S). As estimativas de herdabilidade e do coeficiente de variação genotípico para os
caracteres nutricionais foram de: (0,62; 4,31%) N; (0,98; 10,39%) P; (0,97; 16,84%) K; (0,93; 24,66%) Ca; (0,88;
11,23%) Mg; (0,95; 16,28%) S, respectivamente. O ganho com base na seleção simultânea foi de 49,68%, sendo
que as contribuições individuais para este ganho foram de: 13,43% (Ca), 10,89% (K), 9,02% (P), 8,68% (S), 5,86%
(Mg) e 1,8%(N). Dessa forma, verificou-se que a população de M. fistulifera estudada é promissora, permitindo que
a mesma possa ser utilizada em programas de conservação genética ex situ visando o futuro fornecimento de material
para a formação de Pomares de Sementes.
Apoio: FAPESP e CNPq.
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Avaliação da resistência genética de híbridos
intraespecíficos de maracujazeiro-‘amarelo’
(Passiflora edulis Sims F. flavicarpa O. DEG)
inoculados artificialmente com Cowpeaaphid borne woodiness virus (CABMV)
Melo, JRF; Oliveira, AC
Laboratório de Biologia Geral, Departamento de Ciências Naturais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), Vitória da Conquista/BA
[email protected]
Palavras-chave: Passiflora, CABMV, resistência genética, VEFM, Passicultura
A passicultura tem elevada importância para a fruticultura brasileira, sendo o maracujazeiro-‘amarelo’ a espécie mais
cultivada do gênero Passiflora. Dentre as doenças que acometem a cultura, a virose do endurecimento dos frutos do
maracujazeiro (VEFM), cujo agente causal no Brasil é o cowpea aphid-borne mosaic vírus (CABMV), é uma das doenças
mais graves. Por conseguinte, são importantes os estudos de genética e melhoramento que visem a síntese e seleção
de híbridos intra-específicos de maracujazeiros-‘amarelo’ que apresentem menor grau de suscetibilidade e/ou maior
grau de resistência a essa virose. O objetivo do presente trabalho foi o de avaliar a resistência genética de híbridos de
maracujazeiros-‘amarelo’ ao CABMV, pertencentes a seis progênies segregantes intraespecíficas de irmãos completos
(PS-2, PS-5, PS-6, PS-12, PS-13 e PS-14), previamente geradas na UESB a partir do cruzamento de genótipos de
contrastantes (‘resistentes’ x ‘suscetíveis’) quanto a resposta da planta ao CABMV. Um montante de 24 híbridos de
cada uma das seis progênies foi desafiado mediante inoculação mecânica artificial do isolado CABMV ‘UESB-9’ sob
delineamento inteiramente casualizado constituído de 6 tratamentos (1 tratamento = 1 progênie) e 8 repetições com
3 unidades experimentais cada (1 unidade experimental = 1 planta). A resistência genética das plantas foi avaliada aos
30 dias após a inoculação quanto a incidência e a severidade da virose, essa última mensurada via índice de intensidade
de infecção (‘III’). Detectou-se menor incidência dos sintomas foliares do vírus em híbridos provenientes das progênies
PS-2 e PS-14 (87,5% e 91,7%, respectivamente), quando comparado com a incidência de 100%, detectada nos híbridos
das demais progênies. A seu modo, híbridos oriundos da PS-2 e PS-14 também se mostraram mais resistentes ao
CABMV no que tange a severidade da doença, face a diferença estatística detectada entre os menores resultados médios
de severidade foliar em PS-2 (24,39) e PS-14 (27,52), em relação ao apurado quanto as demais progênies (38,36 a 52,7)
(Teste Sckott-Knott, α = 0,01). Haja vista não existirem relatos na literatura de acessos nativos e seleções comerciais de
maracujazeiro-‘amarelo’ resistentes ao CABMV, as plantas e os progenitores das progênies PS-2 e PS-14 encontram-se
depositadas na coleção de trabalho de germoplasma de Passiflora da UESB, com vistas a realização de estudos mais
detalhados da caracterização da resistência genética desses híbridos ao vírus CABMV.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Análise comparativa de SSR genômicos e
SSR-ESTS visando associação de genes de
resistência a vassoura-de-bruxa no cacaueiro
Lima, SL1; Gramacho, KP1; Lima, L1; Paternostro, GC1; dos Santos, EA1; Braz, NGR1; Lopes, UV1; Gaiotto, FA2;
Clement, D1,3; Gesteira, AS2; Cascardo, JCM2; Pires, JL1; Micheli, F2, 3
1
CEPEC, CEPLAC
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
3
CIRAD-BIOS, UMR DAP
[email protected]
2
Palavras-chave: Microssatélites, polimorfismo, EST-SSR, SSR genômicos, Theobroma cacao
Os microssatélites (SSRs) são considerados poderosos marcadores moleculares com herança mendeliana por revelarem
um alto nível de polimorfismo, além de apresentarem alelismo múltiplo, reprodutibilidade, codominância (Hamada
et al., 1982) e ampla distribuição no genoma, podendo ser encontrados tanto em regiões não-codificantes como em
regiões transcritas (Varshney et al., 2005). Diversos estudos já mostraram a eficiência de SSRs genômicos em cacau
(Lanaud et al., 1999; Motamayor et al., 2002; Faleiro et al., 2003; Albuquerque, 2006; Sereno et al., 2006; Araújo
et al., 2007). Além disso, alguns estudos em cacau já vêm comprovando a eficiência de SSRs desenvolvidos a partir
de ESTs, conhecidos como EST-SSRs (Borrone et al., 2007; Lima et al., 2008). Estes EST-SSRs têm a vantagem de
permitir a localização de marcas mais próximas dos genes de resistência no mapa genético por se tratar de seqüências
expressas. Dentro deste contexto, esse trabalho objetivou a comparação de SSRs obtidos de seqüências de ESTs com
os SSRs obtidos de seqüências de DNA genômico, com o intuito de serem posteriormente usados em trabalhos de
mapeamento, co-localização com QTL relacionado com vassoura-de-bruxa, estudos de diversidade e também seleção
assistida por marcadores (SAM). O polimorfismo de 11 primers EST-SSRs foi comparado com 11 primers SSRs de DNA
genômico em 21 acessos de cacau previamente avaliados em relação à resistência à vassoura-de-bruxa (Pires, 2003).
Comparando-se os parâmetros gerados pelos marcadores EST-SSRs e SSRs genômicos, observou-se que o numero médio
de alelos foi maior nesses últimos (3,81 e 5,22, respectivamente), embora a diferença não tenha sido estatísticamente
significativa segundo o teste t (p>0,05). Dos 11 SSRs genômicos, 9 foram polimórficos, com valores de PIC entre
0,20 e 0,80. Os marcadores EST-SSRs tiveram valores de PIC entre 0,05 e 0,71. Também não houve diferenças
significativas entre esses dois tipos de marcadores para a média desse parâmetro, sendo de 0,62 nos SSRs genômicos e de
0,49 nos EST-SSRs. Portanto, podemos concluir que os EST-SSRs de cacau obtidos nesta análise são tão polimorfícos
quanto os SSRs genômicos, o que contradiz trabahos ja publicados (Cho et al., 2000; Liewlaksaneeyanawin et al.,
2004; Eujayl et al., 2001) mas que esta em conformidade com dados obtidos em Eucalyptus spp. (Cupertino, 2007).
Finalmente, pôde-se perceber que o uso de EST-SSR junto com SSRs genômicos reforçou a análise de distância genética
entre os 21 genótipos confirmando dessa forma a potencialidade de uso desses dois tipos de marcadores para associação
de genes de resistência.
Apoio financeiro: FAPESB, CNPq, CAPES, MAE.
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Desempenho de genitores e populações
segregantes de trigo sob estresse de calor
Assis, JC1; Oliveira, DM1; Machado, JC1, Favarato, LF1; Pimentel, AJB1; Souza, MA1
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Triticum aestivum L., melhoramento de trigo, aquecimento global
O Brasil é dependente da importação de trigo, produzindo menos de 50% da demanda nacional do grão. A Região do
Brasil-Central apresenta grande potencial para expansão da triticultura, contudo é caracterizada por temperaturas mais
elevadas, que constitui séria limitação para a cultura em determinadas micro-regiões. Além disso, mudanças climáticas
decorrentes do aquecimento global poderão impor restrições à cultura do trigo. Diante disto, o desenvolvimento de
cultivares de trigo com tolerância ao calor tem sido uma preocupação dos melhoristas desde o início dos estudos com a
cultura na Região do Brasil-Central. Objetivando-se detectar variabilidade genética para tolerância ao calor, identificar
populações e genitores mais tolerantes e quantificar o efeito de altas temperaturas sobre estes genótipos de trigo foi
realizado este trabalho. Para isto, foram conduzidos dois experimentos na área experimental da Universidade Federal de
Viçosa, em Viçosa-MG. O primeiro experimento foi semeado no mês de fevereiro de 2007, correspondendo à estação
de verão (temperaturas elevadas) e o segundo foi semeado no mês de junho de 2007, correspondendo à estação de
inverno (temperaturas amenas). Utilizou-se o delineamento látice quadrado 16x16 com duas repetições, composto por
240 famílias oriundas de oito populações segregantes (30 famílias cada), mais 16 genitores. No primeiro experimento,
semeado no verão, foram avaliadas famílias F2:4 e no segundo, semeado no inverno, famílias F2:5. Cada parcela foi
constituída de três linhas de 3,0 m de comprimento, com espaçamento entre linhas de 18,6 cm, conferindo área útil
de 1,67 m2. Para a densidade de plantas desejada, foram semeadas 350 sementes aptas por m2. Foram coletados dados
2
referentes aos seguintes caracteres agronômicos: floração (dias), altura de plantas (cm), produção de grãos (g/1,67 m ) e
massa de mil grãos (g). Os dados dos caracteres avaliados nas duas épocas (verão e inverno) foram submetidos à análise
de variância com o auxílio do software MSTAT (1983). Diferenças de temperatura da emergência ao florescimento
foram determinantes nas variações das características entre os ambientes para os genótipos avaliados. Todos os caracteres
avaliados apresentaram redução sob altas temperaturas, sendo a produção de grãos o caráter mais afetado, seguido da
altura, floração e massa de mil grãos. Há variabilidade genética para tolerância ao calor entre genitores e populações
segregantes de trigo. Os genótipos mais tolerantes ao calor foram os genitores 2 (BR 24), 3 (Aliança) e 4 (EP 93541)
e as populações segregantes 1 (BH1146/BR24//Aliança/EP93541), 2 (BR24/Aliança//EP93541/CPAC9662) e
3 (Aliança/EP93541//CPAC9662/Pioneiro).
Apoio financeiro: FAPEMIG e CAPES.
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Alinhamento dos mapas genéticos
AA e BB de Arachis utilizando SNPs
em marcadores gênicos
Alves, DMT1 Moretzsohn, MC2; Gobbi, AV3; Teixeira, C2; Pereira, RW1; Leal-Bertioli, SCM2; Guimarães, PM2; Lopes, CR3;
Gimenes, MA.2, Bertioli, DJ1
1
Universidade Católica de Brasília, Campus II, SGAN 916, CEP 70.790-160, Brasília, DF, Brazil
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C.P. 02372, CEP 70.770-900, Brasília, DF, Brazil
3
Departamento de Genética, IB-UNESP, Rubião Jr., CEP 18618-000, Botucatu, SP, Brazil
[email protected]
2
Palavras-chave: amendoim, mapeamento comparativo, sintenia, SNP
O desenvolvimento de mapas de ligação é fundamental para estudos genéticos e genômicos de plantas. Entretanto, para
o amendoim cultivado os baixos níveis de variabilidade dificultam a obtenção de mapas de ligação úteis. Uma alternativa
à baixa variabilidade do amendoim cultivado é a utilização de espécies silvestres de Arachis, as quais possuem maior
variabilidade genética. Enquanto o amendoim cultivado é tetraplóide com genoma AABB, a maioria das espécies silvestres
taxonomicamente próximas do amendoim é diplóide com genomas do tipo AA ou BB. Assim, um mapa do cultivado
seria equivalente a dois mapas de silvestre, respectivamente com genomas AA e BB. Recentemente tais mapas diplóides
foram construídos por nós, a partir de cruzamentos entre os prováveis ancestrais silvestres do amendoim e espécies afins.
Como os genomas AA e BB são relacionados evolutivamente, é esperado que a sintenia dos marcadores e dos genes seja
bastante conservada entre os dois mapas. Uma vez alinhados os mapas, seria possível transferir informações entre eles,
acrescentando assim dados importantes aos dois mapas. Marcadores microssatélites têm geralmente alta transferibilidade
dentro do gênero Arachis. Muitos pontos de comparação já estão presentes entre os dois mapas, já que os mapas AA e
BB foram desenvolvidos com um mesmo conjunto de microssatélites. Entretanto, muitas regiões dos mapas ainda não
apresentavam correspondências. Neste trabalho, foram escolhidos marcadores gênicos com posições estratégicas no mapa
AA, para transferência para o mapa BB. Esses marcadores foram amplificados por PCR e seqüenciados, para identificação
de SNPs entre os parentais da população BB, analisados por extensão de única base. Um total de 16 marcadores foram
desenvolvidos, dos quais 10 foram mapeados em seis diferentes grupos de ligação. O alinhamento dos mapas AA e BB
revelou um alto grau de sintenia, com algumas grandes recombinações, desde a divergência dos genomas.
Apoio Financeiro: Generation Challenge Program (Project 31) e The European Union Grain Legume Integrated
Project (GLIP).
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Desvendando as bases genéticas
de variações naturais de Solanum
galapagense possivelmente relacionadas
à sensibilidade a giberelina
Goldenberg, CS1; Peres, LEP1
ESALQ/USP - Departamento de Ciências Biológicas. Laboratório de Controle Hormonal do Desenvolvimento Vegetal
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Variação genética natural, giberelinas, tomateiro
O tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill. Syn. Solanum lycopersicom L) possui várias mutações no hormônio giberelina
(GA) que afetam o desenvolvimento das plantas, tais como gib1, gib2, gib3 (deficientes) e procera (supersensível).
Além dessas mutações, variações naturais afetando GA poderiam estar presentes em Lycopersicon cheesmaniae f.minor
(Hook.f.) C.H.Hill. Syn. Solanum galapagense S.Darwin & Peralta, endêmica das Ilhas Galápagos e que possui porte
reduzido, dormência de sementes e folhas com bordos muito recortados, sendo esta última característica devido ao
locus Pts (Petroselinum). Em tomateiro, ainda não foram descritas variações naturais afetando GA ou qualquer outra
classe hormonal. Como mutantes de tomateiro deficientes em GA também afetam germinação, altura e recorte foliar,
a proposta do presente trabalho foi verificar se os loci presentes em S.galapagense e já conhecidos Sp (Self pruning) e Pts,
bem como o locus por nós chamado de Gdw (Galapagos Dwarf ) também afetam estas respostas de modo dependente
de GA. Para entender a natureza de tais alterações em S.galapagense, foram realizados cruzamentos e retrocruzamentos
sucessivos dessa espécie com a cultivar miniatura de tomateiro Micro Tom (MT) para isolar loci monogênicos que
levem ao nanismo exagerado, dormência de sementes e aumento do recorte foliar. Em estudos de recorte foliar com
plantas contendo o locus Pts e isogênicas a MT, observou-se que este locus não é suficiente para explicar o recorte foliar
acentuado de S.galapagense. Coerentemente, o locus Gdw também afeta a arquitetura foliar mostrando baixa razão
área/perímetro em relação a MT. Ainda não foi esclarecido como o locus Sp afeta a arquitetura foliar, porém sugere-se
que este contribua para o afilamento dos folíolos, quando expressado de forma dominante, e desenvolva folíolos mais
compactos, porém em menor número, quando recessivo. Plantas possivelmente portadoras do locus Gdw se encontram
hoje na geração BC4 e apresentam nanismo e dormência de sementes. Vale lembrar que, por proporcionar crescimento
contínuo (indeterminado), o locus Sp afeta altura e pode estar interagindo com Gdw no que se refere à composição final
de altura. Ainda não foi possível determinar também se Pts afeta a altura. Estudos em andamento permitirão esclarecer
o comportamento de sementes de plantas portadoras dos loci Pts, Gdw e Sp em relação à germinação, embora já se saiba
que ela é afetada por Gdw. Finalmente, em conjunto a análise desses resultados elucidará a contribuição de cada um
destes loci para as características de altura, germinação e nanismo. Além disso, uma vez determinado quais loci afetam
essas respostas, poderemos elucidar se o locus (ou loci) em questão representam uma mutação em GA.
Apoio Financeiro: Capes.
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Distinção de amostras quanto a dosagem
de alelos por PCR semiquantitativo
e microssatélites fluorescentes
Martins, FA1; Carneiro, PCS1; Guimarães, CT2
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
2
Embrapa Milho e Sorgo
[email protected]
1
Palavras-chave: PCR semiquantitativo, detecção de QTL, microssatélites
A falta de informatividade dos indivíduos heterozigotos é uma das dificuldades do mapeamento e detecção de QTLs
em populações exogâmicas, uma vez que não é possível identificar a origem de cada um dos seus alelos, implicando
na exclusão desses indivíduos nas análises do contraste entre médias para a detecção de QTLs. Uma possível forma de
incluí-los nas análises é por meio da genotipagem do seu endosperma, onde espera-se que um indivíduo heterozigoto
Aa apresente um endosperma AAa ou Aaa, quando o genitor feminino é o doador do alelo A ou a, respectivamente.
Devido ao potencial uso do PCR semiquantitativo (PCRSQ) para inferir o número de moléculas amplificadas, o
objetivo deste trabalho foi utilizar esta metodologia para a determinação do número de cópias dos alelos em misturas
de DNA que simulam as condições observadas no tecido endospermático. DNA foliar das linhagens de milho
L3 e L1113-01 foram extraídos. Amostras de DNA individuais bem como de misturas nas proporções 1:2 (10ng do
DNA L3 e 20ng do DNA L1113-01) e 2:1 (20ng do DNA L3 e 10ng do DNA L1113-01) foram amplificadas por
meio da metodologia de PCRSQ com primers microssatélites fluorescentes, onde o número de ciclos de amplificação
ideal foi pré-determinado em 30 ciclos. Os produtos amplificados foram separados por eletroforese no seqüenciador
ABI Prism 377 (Applied Biosystems). A intensidade dos fragmentos amplificados foi analisada e quantificada pelo
programa Genescan 2.1 (Applied Biosystems). Foram calculadas as razões de intensidade de fluorescência entre os
picos correspondentes ao alelo presente no genitor L3 e L1113-01. O cálculo da intensidade das bandas, resultantes
da reação de amplificação do primer umc1653 permitiu diferenciar a mistura 1:2 da mistura 2:1. A razão entre os
valores de intensidade de fluorescência dos produtos de amplificação da mistura 1:2 se aproximou a 0, 53, indicando
que o número inicial de alelos da linhagem L1113-01 é o dobro em relação ao número de alelos da linhagem L3, nessa
mistura. Enquanto a RIF na análise da mistura 2:1 se aproximou de 2,16, indicando que o número inicial de alelos
da linhagem L1113-01 é a metade em relação ao número de alelos da linhagem L3. As reações de PCRSQ realizadas
com os demais primers apresentaram comportamento semelhante. Assim, conclui-se que a utilização da metodologia
de PCR semiquantitativo com marcadores microssatélites fluorescentes foi eficiente em discriminar a dose de alelos
nas amostras, indicando que o uso desta metodologia na genotipagem do endosperma possibilita a determinação da
origem dos alelos de um indivíduo heterozigoto, que uma vez incluídos nas análises de detecção de QTL, permite que
a mesma seja mais acurada.
Apoio Financeiro: CNPq, Fapemig e Embrapa.
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Mapeamento de QRL (Quantitative
Resistance Loci) para resposta à Xanthomonas
axonopodis pv. passiflorae com base em um
mapa genético integrado de maracujá-amarelo
Laperuta, LC1; Matta, FP1; Oliveira, EJ1; Moraes, MC1; Lopes, R1; Consoli, L1; Pastina, MM1; Garcia, AAF1; Vieira, MLC1
Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
[email protected]
1
Palavras-chave: Maracujá-amarelo, Xanthomonas axonopodis, QRL
O Brasil abriga o centro de diversidade genética do gênero Passiflora. A principal espécie cultivada é Passiflora edulis f.
flavicarpa (2n=18), ou maracujá-amarelo, uma fruteira de clima tropical com ampla distribuição geográfica. Nosso país
destaca-se como o maior produtor mundial devido às condições edafoclimáticas favoráveis para o cultivo e à crescente
evolução da área de plantio, a partir dos anos 70, quando ocorreu a instalação de indústrias para o beneficiamento
de suco e a aceitação comercial da fruta para consumo in natura. Entretanto, se verifica uma baixa produtividade
que é explicada por fatores nutricionais, plantas matrizes de pouca qualidade genética e por problemas fitossanitários
que aumentaram com a ampliação da monocultura. A bacteriose causada por Xanthomonas axonopodis pv. passiflorae
é um fator limitante para o cultivo do maracujazeiro, pois causa danos irreparáveis nos pomares, acarretando prejuízos
altíssimos para o produtor. O presente trabalho teve como objetivo identificar e mapear possíveis QRL associados
à resposta de uma população segregante (F1) à infecção por X. axonopodis pv. passiflorae. A população resultou do
cruzamento entre os acessos ‘IAPAR-06’ e ‘IAPAR-123’, pertencentes ao à coleção do Instituto Agronômico do Paraná.
A F1, composta de 160 indivíduos, foi utilizada para o mapeamento de QRL com base em marcadores AFLP, SSR e
RGA. Para a geração do mapa integrado, foram utilizados locos com várias configurações, com segregação 1:1, 1:2:1,
1:1:1:1 e 3:1. Os genótipos de F1 foram inoculados com um isolado bacteriano e as áreas de lesão mensuradas, em
quatro datas distintas, usando-se o programa computacional QUANT, depois de digitalizar as folhas. Os dados de
genotipagem molecular e das avaliações fenotípicas foram submetidos à análise pelo programa estatístico Map QTL5,
o qual constatou a existência de possíveis QRL em todos os grupos de ligação (LOD>3,8), exceto no IV. Alguns desses
QRL se mantiveram constantes em todas as datas de avaliação, demonstrando que atuam na resposta à infecção em
diferentes fases da doença. O QRL presente no grupo de ligação I só foi identificado na primeira data de avaliação,
sendo possivelmente um QRL de resposta imediata à infecção. Pode-se especular que a seleção assistida com base no
mapeamento de QRL é viável e seu uso pode ser importante para a obtenção de variedades resistentes.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Seleção de modelos para o mapeamento
de múltiplos QTLs em progênies
de irmãos completos
Margarido, GRA1; Mollinari, M1; Pastina, MM1; Gazaffi, R1; Garcia AAF1
Departamento de Genética, ESALQ/USP
[email protected]
1
Palavras-chave: MIM, BIC, AIC, regressão, seleção assistida
Com o advento dos marcadores moleculares, tornou-se possível compreender melhor a herança dos caracteres poligênicos,
devido à sua aplicação nos estudos sobre QTLs, ou locos que controlam caracteres quantitativos. Para o mapeamento
de QTLs, foram propostos diversos métodos genético-estatísticos sofisticados, sendo que alguns deles permitem a
estimação de epistasia e do valor genético dos indivíduos. No entanto, tais métodos foram desenvolvidos apenas para
populações oriundas de linhagens homozigóticas. Para muitas espécies, como cana-de-açúcar e maracujá, é difícil obter
essas linhagens, sendo utilizadas populações oriundas de genitores não endogâmicos, nas quais um loco pode apresentar
até quatro alelos, há diferentes tipos de segregação possíveis e as fases de ligação entre marcadores são desconhecidas. O
presente trabalho teve como objetivo desenvolver um método de seleção de modelos para o mapeamento de múltiplos
QTLs nessas populações. Os modelos comparados permitem o ajuste de múltiplos QTLs simultaneamente, e baseiam-se
em três contrastes ortogonais entre efeitos principais e nove contrastes para epistasia. Para avaliar o método, foi simulado
um mapa genético para uma espécie vegetal diplóide com cinco cromossomos com 11 marcadores cada, separados
por 10cM e com segregação 1:1:1:1. Foram simulados cinco QTLs em quatro cromossomos, com diferentes tipos de
segregação (1:1:1:1, 1:2:1, 3:1 e 1:1), aos quais foram adicionados nove efeitos epistáticos de diferentes tipos, com
herdabilidade total de 50%, em uma população com 200 indivíduos. O procedimento de busca por QTLs consistiu no
ajuste seqüencial de modelos de regressão, com a inclusão de efeitos principais e possíveis epistasias, utilizando como
critérios de busca o BIC (critério de informação bayesiano) e o AICc (critério de informação de Akaike corrigido para
o tamanho amostral). Para o critério BIC, o procedimento mapeou quatro QTLs e quatro efeitos epistáticos, mas
ressalva-se que três dos efeitos epistáticos não encontrados envolviam o QTL não mapeado. Foram também detectados
três efeitos epistáticos não existentes. De maneira geral, os efeitos e posições estimados ficaram próximos aos reais e os
QTLs conjuntamente explicaram 50,46% da variação fenotípica, o que está de acordo com o simulado. Já o critério
AICc permitiu a inclusão no modelo de vários QTLs não existentes, o que resultou em problemas de colinearidade
e na obtenção de estimativas ruins. Para o tamanho populacional utilizado, os resultados com o BIC mostraram-se
satisfatórios, pois é preciso levar em consideração a informação fornecida pelos dados e o grande número de parâmetros
envolvidos no modelo. Conclui-se que a aplicação de métodos para o mapeamento de múltiplos QTLs nesse tipo de
população pode ser realizada de maneira eficaz, de modo a fornecer estimativas de epistasia e do valor genético dos
indivíduos, o que é de grande interesse para programas de seleção assistida.
Apoio financeiro: CNPq e Fapesp.
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Construção de mapas de ligação com
dados incompletos de marcas moleculares
Salgado, CC1; Nascimento, M2; Campana, ACM2; Cruz, CD1; Ferreira, A1; Barrera, CF1
1
Laboratório de Bioinformática – BIOAGRO, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
Laboratório de Bioinformática – BIOAGRO, Departamento de Informática – Área Estatística, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
2
Palavras-chave: valores perdidos, mapa de ligação, simulação
Com o desenvolvimento da biologia molecular, surgiram ferramentas novas que possibilitaram a construção de mapas
genéticos. Os marcadores de DNA têm permitido a construção de mapas genéticos para várias espécies vegetais e animais.
O ideal é que o conjunto de dados moleculares para mapeamento não tenha valores perdidos, erros de genotipagem,
e a razão de segregação dos marcadores seja como esperado para o tipo de população analisada, o que na prática é
muito difícil de ser obtido. O objetivo do trabalho foi determinar a influência de perdas de dados moleculares em
uma população F2 na reconstrução de mapas genéticos. Para a geração dos dados utilizou-se o módulo de simulação
do aplicativo computacional GQMOL. Uma população F2 de referência, com 200 indivíduos, foi estabelecida
pela simulação de dados moleculares, com marcadores de natureza dominante, de uma espécie diplóide hipotética
(2n = 2x = 20) a partir de um genoma simulado com 10 grupos de ligação e 100 cM de tamanho cada e intervalos
entre marcas adjacentes de 5 cm. Para cada grupo de ligação foram estabelecidas 21 marcas eqüidistantes, totalizando
210 marcas no genoma. A partir desta população de referência com módulo de “Simulação de dados perdidos” do
aplicativo computacional GQMOL obteve-se 60 populações, as quais variavam o número de marcadores que não foram
completamente informativos e a percentagem de perda nos marcadores não informativos. Nos genomas analisados,
estimou-se, em cada situação, o número de grupos de ligação obtidos, o número de marcas por grupo, o tamanho dos
grupos de ligação, a distância média entre marcadores adjacentes nos grupos de ligação, as variâncias das distâncias
entre marcas adjacentes nos grupos de ligação e o estresse. Os cenários mais indicados para a construção de mapas de
ligação são aqueles que apresentam até 20% de perdas informação, independentemente do número de indivíduos. Os
cenários cujas perdas estão entre 30 e 60% não são adequados para construção de mapas genéticos.
Apoio Financeiro: FAPEMIG.
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Construção de bibliotecas genômicas
enriquecidas com microssatélites
em Ricinus communis L. para
o desenvolvimento de marcadores SSR
Bajay, MM1; Batista, CEA1; Pinheiro, JB1; Zucchi, MI2
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” ESALQ
2
Recursos Genéticos Vegetais, Instituto Agronômico de Campinas IAC
[email protected]
1
Palavras-chave: Mamona, Biodiesel, Microssatélites
O Brasil é o terceiro maior produtor de mamona, porém existe um déficit anual de óleo de mamona superior a 80 mil
toneladas, demanda que é satisfeita pela importação de óleo bruto proveniente da Índia e da China. A utilização de óleo
de mamona para produção de biodiesel é uma das alternativas brasileiras para redução da importação de petróleo, além
de promover inclusão social através da agricultura familiar. O óleo de rícino é a melhor substância para produzir biodiesel
porque é único que é solúvel no álcool, e requer menos calor que os outros óleos vegetais para a produção de combustível.
O aumento da demanda para o óleo de mamona proporcionará o aumento das áreas agrícolas exploradas pela cultura,
gerando milhares de postos de trabalho diretos e indiretos. A grande diversidade genética observada no germoplasma de
mamoneira permite a identificação de genótipos promissores para os programas de melhoramento, entretanto torna-se
fundamental a caracterização do germoplasma. Visando a melhor caracterização da variabilidade genética na espécie foi
construída uma biblioteca genômica para a seleção dos fragmentos contendo marcadores moleculares microssatélites
(SSR). Para isto utilizou-se o protocolo descrito por Kijas et al. (1994), com modificações, e otimizado pelo pesquisador
Angie-Marie Risterruci, do CIRAD/França. A partir da biblioteca genômica construída, foram obtidas e seqüenciadas
84 colônias, dentre as quais, em apenas seis delas não foram encontrados microssatélites, representando um ótimo
índice de enriquecimento das colônias (92,86%). No total foram identificados 201 microssatélites, 84 dinucleotídeos
(41,79%), 4 trinucleotídeos (1,99%), 9 teranucleotídeos (4,48%), 79 pentanucleotídeos (39,3%) e 25 hexanucleotídeos
(12,44%). Através dos programas WEBTROLL, PRIMER3, GENE RUNNER e CHROMAS 2 foram sintetizados
39 marcadores SSR que foram considerados superiores, com porcentagem média de GC igual a 47,56%, amplificando
produtos com tamanho médio de 207,49 pb, com temperatura de anelamento média de 59,85 ˚C na PCR, desenhados
a partir de seqüências com tamanho médio de 844,69 nucleotídeos. Os marcadores SSR sintetizados nesse trabalho
poderão ser utilizados para a análise de genótipos de mamoneira, em estudos de diversidade ou mapeamento genético.
A construção de biblioteca genômica para a síntese de marcadores SSR em Ricinus communis L. é inédita no país e as
informações geradas são de suma importância para a identificação, exploração e a conservação da variabilidade genética
dessa espécie, além de ser de extrema importância para os programas de melhoramento da mamoneira.
Orgão financiador: FAPESP.
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Desenvolvimento de modelo genéticoestatístico para mapeamento de QTLs em
progênies de irmãos completos, utilizando
mapeamento por intervalo
Gazaffi, R; Margarido, GRA; Pastina, MM; Mollinari, M; Garcia, AAF
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Departamento de Genética, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: mapa consenso, verossimilhança, software R
Diversas metodologias para o mapeamento de QTLs apresentadas na literatura baseiam-se na utilização de populações
experimentais obtidas a partir de linhagens endogâmicas. No entanto, para algumas espécies, como maracujá e canade-açúcar, isto não é possível, dada a indisponibilidade desse tipo de linhagem. Atualmente, não há metodologias
consolidadas para mapeamento de QTLs nesses casos, ou seja, considerando conjuntamente mistura de marcadores
moleculares com diferentes padrões de segregação. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver um modelo genéticoestatístico para mapeamento de QTLs em progênie de irmãos completos. A metodologia desenvolvida considerou
um cruzamento biparental de indivíduos não aparentados, em que há um máximo de quatro QTLs segregantes,
caracterizando um modelo de mistura de probabilidades. O novo modelo genético-estatístico foi desenvolvido a partir
de três contrastes, para efeitos aditivos em cada um dos pais, bem como a interação (dominância) entre esses efeitos. Os
estimadores foram obtidos através do método da máxima verossimilhança. Esta abordagem permite mapear QTLs com
diferentes segregações, independentemente da fase de ligação considerada entre marcador e QTL. Para implementação
destas análises, foi desenvolvido um software no ambiente estatístico R e a validação deste modelo foi estudada com
simulações. Simulou-se uma população com mapa genético com seis grupos de ligação, os quais eram compostos por
11 marcadores que apresentam quatro alelos segregantes na progênie, distanciados a 10 cM. Foram simulados 100 e
400 indivíduos, e os caracteres fenotípicos com herdabilidade 0,50 e 0,70. De forma geral, o mapeamento de QTLs
na população composta por 100 indivíduos permite detectar corretamente os QTLs com maiores efeitos, sendo que
para o caráter com herdabilidade de 0,50 nenhum QTL fantasma foi detectado. Já para a população composta por
400 indivíduos apresentou resultados satisfatórios para as duas diferentes herdabilidades consideradas, pois houve a
correta localização e estimação dos efeitos dos QTLs, sem a presença de falsos positivos. Deste modo, conclui-se que o
novo modelo desenvolvido é capaz de localizar e estimar os efeitos de QTLs com boa precisão, podendo ser utilizado
em situações reais para espécies que não possuem linhagens endogâmicas.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Seleção genética com base na altura
de bifurcação em diferentes situações
em uma população base de Eucalyptus
camaldulensis Dehnh., proveniente
de Katherine River - Austrália
Silva, JM1; Santos, EAO1; Silva, ECB1; Senna, SN1; Kubota, TYK1; Ferrari, VM1; Moraes, MLT1; Freitas, MLM2
Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP
2
Instituto Florestal de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: melhoramento florestal; desdobramento de madeira; desbaste seletivo; acurácia seletiva; REML/BLUP
O Eucalyptus camaldulensis se destaca como a espécie do gênero que possui maior plasticidade em termos de adaptação às
condições brasileiras, principalmente no que diz respeito à fertilidade e déficit hídrico, em função da adaptação a condições
ecológicas muito variadas, grande número de procedências existentes, e rapidez de crescimento, que, juntamente com a
vigorosa brotação de cepa, proporcionam benefícios em curto prazo. Tais fatores levam empresas reflorestadoras a conduzir
experimentos de avaliação de famílias de meios-irmãos com essa espécie. O estudo da variabilidade genética de uma população
base de E. camaldulensis, originária da Austrália e instalada em Selvíria-MS, teve por finalidade a seleção de matrizes superiores
com base na altura de bifurcação. Isso, porque, árvores com maior altura de bifurcação são comercialmente mais interessantes,
pois possibilita o desdobramento de maior número de toras úteis para pranchas e afins. A população base foi instalada em
26/04/1986, na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão da Faculdade de Engenharia, Campus de Ilha Solteira (UNESP),
localizada no município de Selvíria-MS. O delineamento experimental utilizado foi blocos casualizados, com 60 repetições,
25 tratamentos (matrizes), uma planta/parcela, no espaçamento 4x4 m. Aos 21 anos após o plantio realizou-se um desbaste
de intensidade 83%, avaliou-se a altura de bifurcação de árvores em diferentes situações: Sit.A) antes do desbaste seletivo
(n=1500); Sit.B) árvores desbastadas (n=1250); Sit.C) árvores remanescentes ao desbaste (n=250), e estimaram-se parâmetros
estatísticos e genéticos com base na metodologia da máxima verossimilhança restrita e melhor predição linear não viciada
(REML/BLUP), utilizando o programa SELEGEN. A altura média de bifurcação foi de 9,08±0,16 m (Sit.A), 8,21±0,17 m
(Sit.B) e 12,6±0,31 m (Sit.C). Ocorreram diferenças significativas entre as matrizes, mesmo na presença de coeficientes de
variação experimental relativamente altos (Sit.A = 57,78%; Sit.B = 61,88% e Sit.C = 37,61%). A estimativa de herdabilidade
individual, no sentido restrito, para Sit.A, Sit.B e Sit.C, respectivamente, foi de 0,27±0,08; 0,18±0,08 e 0,09±0,11 e o
coeficiente de variação genética foi de 30,97%, 27,25% e 11,69%, indicando que apesar de baixas herdabilidades existe
variabilidade genética na população para o caráter estudado. A acurácia seletiva ( r̂aaaa ) foi de alta magnitude nas situações A,
B e C respectivamente, 0,90, 0,86 e 0,77, indicando reais possibilidades de altos ganhos genéticos e precisão na seleção de
matrizes superiores. O desbaste possibilitou resultados positivos em relação à altura de bifurcação, sendo que os indivíduos
têm potencial para utilização em reflorestamentos com finalidade de exploração da madeira. A população base apresenta
bom desenvolvimento na região de Selvíria – MS e possui variabilidade genética e condições favoráveis para sua utilização em
programas de conservação e melhoramento genético, com base nos resultados obtidos para o caráter altura de bifurcação.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Heterose em soja associada a caracteres
de resistência a percevejos
Möller, M1; Pierozzi, PHBP1; Santos, MdaF1; Arruda, MP1; Mulato, BM1; Zucchi, MI2; Pinheiro, JB1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”/US
2
Centro de Recursos Genéticos Vegetais, Instituto Agronômico de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: Glycine max, resistência a insetos, parâmetros genéticos, caracteres agronômicos
A soja é considerada uma das mais importantes culturas no mundo, sendo comercializada em grão, farelo e óleo (bruto
ou refinado), e representa grande fonte de proteína para toda a humanidade. O Brasil é o segundo maior produtor de
soja, responsável por aproximadamente 24% da oferta global do produto. Quando cultivada, está sujeita ao ataque
de insetos desde a germinação até a colheita, destacando-se os percevejos sugadores de vagens, considerados como a
principal praga da cultura. Dessa forma, a característica de resistência a insetos constitui um dos grandes desafios dos
melhoristas de soja. Visando estudar esta característica, o presente trabalho avaliou a geração F2 do cruzamento entre
as cultivares IAC-100 (resistente) e Conquista (suscetível). Nove caracteres foram avaliados: período de enchimento de
grãos (PEG), acamamento (AC), valor agronômico (VA), retenção foliar (RF), número de vagens por planta (NVP),
índice percentual de dano por vagem (IPDV), sementes manchadas (SM), produtividade de grãos (PG) e peso de
cem sementes (PCS). Os valores de AC, VA e RF foram avaliados através de uma escala de notas e, portanto, foram
transformados utilizando a fórmula √x; já os caracteres IPDV e SM foram avaliados em porcentagem, e para análise a
transformação arcsen√(x/100) foi empregada. A geração F2 foi avaliada num experimento em condições de campo na
safra de 2004/2005 no município de Piracicaba-SP. Adotou-se o delineamento de blocos ao acaso, com seis repetições,
sendo cada parcela representada por 12 plantas espaçadas 0,5 x 0,5m. As análises visaram estimar a heterose média
dos caracteres analisados, permitindo avaliar a divergência entre parentais e possíveis influências de genes dominantes
na expressão do caráter. Estimativas de heterose positivas foram obtidas para os caracteres VA (6,87%), RF (7,53%),
NVP (23,92%), SM (6,41%) e PCS (1,68%); estimativas negativas foram observadas para PEG (-1,21%),
AC (-29,95%), IPDV (-25,11%) e PG (-10,23%). Para alguns caracteres (PEG e IPDV, por exemplo) a observação de
heterose negativa indica vantagem da geração F2 em relação ao genitor resistente. Considerando PEG, heterose negativa
indica uma redução no período de enchimento de grãos, de maneira que as plantas ficarão expostas por um menor
tempo ao ataque dos percevejos e, conseqüentemente, o IPDV irá diminuir. Entretanto, observa-se também que PG
apresentou estimativa negativa para heterose, ou seja, houve uma menor produtividade média.
Apoio Financeiro: Fapesp e CNPq.
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Identificação de marcadores moleculares
espécie – específicos para Eucalyptus
utilizando Bulked Segregant Analysis (BSA)
Madacki, ACA1; Bortoloto, TM1; Oda, S2; Marino, CL 1
Departamento de Genética Instituto de Biociências de Botucatu - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
2
Suzano Papel e Celulose
[email protected]
1
Palavras–chave: BSA, RAPD, Eucalyptus, melhoramento, polimorfismo
Os programas de melhoramento de Eucalipto vêm intensificando a produção de híbridos interespecíficos procurando
agregar características de interesse relacionadas à tolerância a estresse biótico, abiótico e qualidade da madeira. Para isso a
identificação de marcadores moleculares espécie - específico torna - se uma ferramenta extremamente útil na identificação
de progênies de meios irmãos e irmãos completos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi identificar marcadores
moleculares específicos para as espécies E. tereticornis, E. saligna, E. grandis, E. brassiana e E. urophylla, utilizando a
metodologia de Bulked Segregant Analysis (BSA) e marcadores Random amplified polimorphic DNA (RAPD). Foram
utilizados 550 indivíduos pertencentes às cinco espécies para construir cinco “bulks”, um para cada espécie, com dez
indivíduos compondo cada “bulk”. Foram testados 57 “primers” de RAPD, gerando um total de 489 marcas, entre
300pb e 2000 pb, das quais 290 foram polimórficas entre os “bulks”, comprovando a esperada diversidade molecular
entre as diferentes espécies de Eucalipto. Das bandas geradas, 119 foram candidatas a identificar as espécies em estudo.
Os marcadores moleculares demonstraram potencial para a identificação das espécies, sendo que há 39 marcadores
para E. tereticornis, 30 para E. saligna, 29 para E. grandis, 15 para E. brassiana e 6 para E. urophylla. Esses marcadores
precisam ser validados em um grande número de indivíduos de cada uma dessas espécies, para que os mesmos possam
ser posteriormente utilizados na identificação de híbridos de eucalipto.
Apoio financeiro: Fapesp – Processo n° 2007/56375-1, Suzano Papel e Celulose.
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Desenvolvimento de marcador SCAR
(Sequence Characterized Amplified Region)
relacionado a uma anomalia de viveiro em
Eucalyptus grandis
Tambarussi, EV2; Lourenção, JC1; Bortoloto, TM1; Sassaki, FT1; Oda, S3; Marino, CL1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”- Campus Botucatu
2
Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Biotecnologia Agrícola, Labotarório de Biologia molecular e Genômica,
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – Universidade de São Paulo
3
Suzano Papel e Celulose
[email protected]
1
Palavras-chave: anomalia, marcador SCAR, Eucalyptus
A identificação e estudo de genes relacionados a doenças e anomalias é importante para os programas de melhoramento
florestal, tendo em vista as perdas causadas por esses genes em plantios operacionais. Uma anomalia, em Eucalyptus
grandis, foi detectada dentre os indivíduos da progênie F1 de um cruzamento controlado entre genitores normais e sem
parentesco em viveiro de mudas para plantios comerciais da Suzano Bahia Sul Papel e Celulose SA. Essa anormalidade
causa o super-brotamento caulinar, a redução da altura da planta, a redução drástica da área foliar e a alteração na forma
do limbo da folha. A proporção entre plantas afetadas e normais foi de 3:1 (3 plantas normais: 1 planta anômala).
A segregação mendeliana do caráter foi confirmada pela análise do Qui-quadrado (x2=2,32). Ante essas evidências, esse
estudo teve por objetivo desenvolver marcadores moleculares relacionados à anomalia. A técnica de BSA foi utilizada
em conjunto com marcadores RAPD, tornando possível identificar um marcador ligado ao gene causador dessa
anomalia, que foi convertido em SCAR. O SCAR foi testado nos genitores, nos 10 (dez) indivíduos integrantes do
“Bulk” anômalo e em 9 dos 10 indivíduos do “Bulk” normal. Uma banda de aproximadamente 500pb esteve presente
em todos os indivíduos integrantes do “Bulk” anômalo. Nos indivíduos normais, 2 indivíduos apresentaram a banda
(22,2%), isto deve-se ao fato do marcador estar ligado ao alelo recessivo presente em apenas um dos genitores que
apresentou a banda. Isto demonstra que a característica é controlada por um único gene, e que o marcador encontra-se
ligado em repulsão ao alelo recessivo de um genitor. Através da ferramenta de BLAST, a seqüência do SCAR (514nt) foi
comparada com banco de ESTs de Eucalipto e apresentou similaridade com um “contig”. A seqüência do “contig” foi
comparada com banco de dados públicos de proteínas e mostrou identidade com um domínio de proteínas relacionado
à via metabólica do ácido abscísico. Esse marcador será utilizado como sonda para a identificação de clones positivos
em uma biblioteca de BAC de eucalipto, com isso o gene poderá ser clonado e possíveis mutações nessa região poderão
ser relacionadas com o fenótipo da anomalia.
Apoio Financeiro: UNESP - Instituto de Biociências de Botucatu, Fundibio, Capes, FAPESP.
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Desenvolvimento de marcador Scar
(sequenced characterized amplified region)
relacionado a lignotúber em Eucalyptus sp
Martins, L1; Bortoloto, TM1; Sassaki, FT1; Oda, S2; Marino, CL1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP
2
Suzano Papel e Celulose
tâ[email protected]
1
Palavras-chave: Lignotúber, Eucalipto, SCAR, Marcador molecular
O lignotúber é uma estrutura morfológica presente nas axilas dos cotilédones nos primeiros estádios do desenvolvimento
de algumas espécies florestais. Nos eucaliptos, essa estrutura é presente em 95% das espécies, e está intimamente
relacionada à resposta das plantas a condições de estresse abiótico. Esse órgão oferece à planta uma alta capacidade de
regeneração, pois provê às árvores um banco de tecido meristemático protegido das temperaturas letais do fogo. Apesar
da maioria dos eucaliptos apresentarem lignotuberes em todo o ciclo de vida como E. urophylla e E saligna, outras
espécies como E. grandis não apresentam o órgão. Diante da importância deste órgão no melhoramento das espécies
de eucalipto, o objetivo desse trabalho foi desenvolver marcadores relacionados à presença de lignotúber neste gênero.
Um marcador SCAR (SCARLIG) foi desenvolvido e apresentou relação com a ausência do lignotúber. O SCARLIG é
presente em indivíduos da espécie E. grandis e em híbridos “urograndis” que não apresentam o órgão. Os indivíduos
E. urophylla e E. saligna, além de “urograndis”, que apresentam lignotúber, não possuem o marcador. Foi encontrada
uma correlação da seqüência do SCARLIG com um “contig” de uma biblioteca de EST de Eucalyptus. A seqüência do
“contig” apresentou similaridade a um domínio de proteínas com representantes envolvidos no sistema “hsp-70 heatshock”. Algumas destas proteínas hsp-70 são chaperonas e estão envolvidas na proteção de proteínas contra agressões
devido a estresse abiótico durante a síntese protéica; também participam na defesa contra patógenos; dentre outras
funções relacionadas à proteção da planta contra o estresse. Esses resultados indicam a correlação destes domínios de
proteínas com o órgão lignotúber. A seqüência do SCARLIG desenvolvido será utilizada como sonda para a identificação
de clones de bibliotecas de BAC de eucalipto, possibilitando a clonagem desse gene e sua utilização.
Apoio financeiro: IBB-Unesp, Fundibio, FAPESP, CAPES.
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Metodologia para detecção e mapeamento
de gene letal, responsável pela distorção de
segregação em cruzamento interespecífico
de Eucalyptus spp
Rosado, TB1; Tomaz, RF1; Rosado, AM2; Araújo, EF3; Alfenas, AC4; Cruz, CD1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa (UFV)
2
Celulose Nipo-Brasileira S.A. - CENIBRA
3
Departamento de Microbiologia Universidade Federal de Viçosa (UFV)
4
Departamento de Fitopatologia Universidade Federal de Viçosa (UFV)
[email protected]
1
Palavras-chave: alelo letal, distorção de segregação e Eucalyptus
Estudos de mapeamento genético em espécies de Eucalyptus, baseados em marcadores moleculares, permitem a identificação
de genes envolvidos no controle de caracteres de interesse. No entanto, o mapeamento genético em espécies florestais
é mais complexo em relação espécies para as quais é factível a obtenção de linhagens endogâmicas. Além disso, em
Eucalyptus principalmente em cruzamentos interespecíficos observa-se alta freqüência de locos marcadores com distorção
de segregação (DS). A presença de locos com DS prejudica prever as relações genotipicas e estimar as frequências de
recombinações. Geralmente, marcadores que exibem distorção de segregação são descartados, prejudicando a qualidade
e precisão do mapeamento. Neste trabalho foi formulada a hipótese da existência de um gene letal responsável pela
distorção de segregação em locos adjacentes do grupo de ligação três em Eucalyptus, e prosposta uma metodologia de
mapeamento desses locos. Para tanto, foram genotipados dezenove locos microssatélites, do grupo de ligação três, em
uma progênie de 135 irmãos-completos derivadas de um cruzamento interespecífico. Para verificar a razão de segregação
esperada conforme o grau de informatividade de cada loco, foram realizados testes de segregação genotípico e
gamético, utilizado a estatística do qui-quadrado. Para os locos em que foi detectada distorção de segregação, foram
desenvolvidas funções para estimar a taxa de distorção. A partir das taxas de distorção foi estabelecido um processo de
ordenação e mapeamento para locos com distorção. Foi verificado que dos dezenove locos microssatélites, nove foram
polimorficos na progênie e desses, sete apresentaram distorção gamética para o genitor masculino. Dessa forma, foi
comprovado que a distorção observada para os locos do grupo de ligação três era devida a um gene letal. A partir das
taxas de distorção e da freqüência de recombinação estimadas, para cada loco, o gene letal foi mapeado em relação aos
demais locos do grupo de ligação três. A ordem dos locos microssatélites foi consistente com os mapas disponíveis na
literatura, demonstrando adequabilidade do mapeamento proposto com base nas taxas de distorção.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG.
19
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Desenvolvimento de marcadores
microssatélites para Macadamia integrifolia
a partir de bibliotecas enriquecidas
Sobierajski, GR1,2; Jungmann, L3,4; Souza, AP3; Garcia, AAF2
Centro de Fruticultura, Instituto Agronômico (IAC)
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ/USP)
3
CBMEG, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
4
Laboratório de Biotecnologia de Plantas, EMBRAPA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Macadamia integrifolia, marcador molecular, microssatélites, melhoramento genético, divergência genética
A macadâmia (Macadamia integrifolia) é uma noz de origem australiana que vem apresentando significativa expansão da
área de cultivo no Brasil, visto a boa rentabilidade aos produtores. Existem 17 variedades genéticas desenvolvidas para
as condições climáticas brasileiras, porém 80% dos pomares são constituídos por variedades estrangeiras, confirmando
a necessidade de desenvolvimento de novos materiais locais de performance superior. O uso de técnicas moleculares
fornece informações genéticas e auxiliam nos programas de melhoramento, desde a caracterização do material e seleção
de parentais até a detecção de QTLs (Quantitative Traid Loci). A existência de um marcador codominate específico,
como os microssatélites (SSR), facilita tais estudos. Assim, realizou-se nesse estudo a construção de uma biblioteca
enriquecida de SSR para a espécie M. integrifolia e a caracterização parcial dos primers de SSR encontrados. Para a
construção da biblioteca enriquecida foi utilizado o DNA de um único genótipo (variedade IAC 9-20) e realizada
seguindo as etapas de digestão do DNA genômico; ligação dos adaptadores, amplificação, purificação e seleção dos
fragmentos contendo SSR; amplificação dos fragmentos selecionados; ligação dos fragmentos a um vetor de clonagem;
amplificação dos insertos clonados; e, isolamento do fragmento para posterior seqüenciamento. Foram seqüenciados
96 clones utilizando os primers SP6 e T7 promoter, obtendo-se 192 seqüências e estas foram analisadas e manipuladas
utilizando-se os programas DNASTAR e Microsat. Das 192 seqüências, 190 foram consideradas adequadas para análise,
agrupando-as em 131 clusters (47 contigs e 84 singletons). Para a busca por SSR nos clusters, utilizou-se a ferramenta
Simple Sequence Repeat Identification Tool - SSRIT (disponível em www.gramene.org). Para isso foram estabelecidos como
critério de seleção que os SSR deveriam ter no mínimo 10 nucleotídeos e/ou três repetições. Nas análises encontraram-se
82 SSR que foram classificados como simples ou compostos, e posteriormente, como perfeitos ou imperfeitos. Desta
forma, foram localizados 66 SSR perfeitos (dos quais 62 eram formados por dinucleotídeos, um por trinucleotídeos
e três tetranucleotídeos), e 16 SSR compostos por dois e três motivos. Os motivos dinucleotídeos mais encontrados
foram AG/GA/CT/TC (60%), sendo também o motivo AG abundante nas espécies de eucaliptos. Foram encontrados
36 SSR dinucleotídeos com mais de 10 repetições (por exemplo, AG29, TC31), sendo esses considerados muito longos,
mas em conformidade com outras espécies arbóreas, como por exemplo, Eucalyptus ssp. Conforme dados apresentados,
a técnica de construção de bibliotecas enriquecidas para microssatélites mostrou-se adequada para detecção de primers
específicos para macadâmia. Espera-se com a continuação do estudo, obter um número satisfatório de primers para
locos polimórficos que poderão ser utilizados em diversos estudos genéticos para a espécie M. integrifolia.
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Mapeamento de clones BAC
contendo RGAs em Arachis
Vidigal, BS1,2; Nielen, S2; Guimarães, PM2; Leal-Bertioli, SCM2; Morgante, CV2; Moretzsohn, MC2; Bertioli, DJ2
Pós Graduação da Universidade Católica de Brasília
Universidade Católica de Brasília (UCB), Brasília, DF
2
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
[email protected]
1
Palavras-chave: Subclonagem, BAC, RGA, SSR, QTL
Arachis hypogaea, o amendoim cultivado, é uma leguminosa de grande importância na alimentação humana em
países da África e Ásia. O amendoim cultivado apresenta um genoma tetraplóide muito extenso e apesar de ser
morfologicamente variável, apresenta baixa diversidade genética, além de não possuir fontes de resistência a diversas
pragas como Cercospora arachidicola, Cercosporidium personatum, e Meloidogyne spp. Essa baixa variabilidade genética
em A. hypogaea pode causar um grande problema com a geração de marcadores moleculares polimórficos, tornando
muito difícil a construção de mapas genéticos. Por constituírem importante fonte de genes úteis, espécies silvestres
de Arachis vêm sendo introduzidas em programas de melhoramento. O processo de introgressão apenas dos genes
úteis pode ser utilizado e acelerado pelo uso de seleção assistida por marcadores. Para o uso dessa seleção assistida, é
necessário identificar marcadores proximamente ligados a genes de resistência a doenças (RGAs). Muitos dos genes
de resistência são caracterizados pela presença do domínio NBS-LRR, que, em plantas, a única função associada é em
resistência a doenças. Um mapa genético foi construído para uma população F2 de 93 indivíduos obtidos através do
cruzamento entre duas espécies silvestres de genoma AA (A. duranensis e A. stenosperma), e um QTL para resistência
à mancha foliar causada pelo fungo Cercosporidium personatum foi mapeado no grupo de ligação 4. O RGA S1-A-36
que co-segrega com este QTL foi utilizado para identificar clones positivos nas bibliotecas BAC de espécies silvestres
do gênero Arachis. O clone positivo encontrado foi subclonado e parcialmente seqüenciado obtendo-se um total de
132 seqüências processadas e reunidas em 64 contigs através do programa Staden. Os resultados mostraram que 24,5%
do total de seqüências analisadas obtiveram similaridades com domínios associados a genes de resistência, incluindo
a proteína de resistência PLTR de Arachis hypogaea. Com o auxílio da ferramenta TROLL, oito microssatélites foram
encontrados e um deles revelou um perfil dominante quando genotipado na população F2 segregante, podendo dessa
forma ser mapeado no grupo de ligação 4. O seqüenciamento total deste clone BAC possibilitará a identificação de
mais SSRs na região designada, provendo marcadores mais próximos ao QTL já identificado. Um total de 17 clones
BAC contendo RGAs estão em processo de subclonagem, com intuito de gerar marcadores mais robustos, como os
SSR, saturando o mapa genético e possibilitando o isolamento dos genes de resistência de interesse. Juntamente com
programas de seleção assistida por marcadores (MAS), os RGAs podem auxiliar a transferência de genes de resistência
a diversas pragas e doenças do gênero e outras leguminosas.
Apoio Financeiro: CAPES, FUNARBE.
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Caracterização de genes análogos de
resistência em cultivares
de Musa acuminata contrastantes
em resistência à estresses bióticos
Emediato, FL; Passos, MAN; Nunes, FAC; Teixeira, CC; Pappas Jr, GJ; Miller, RNG
Universidade Católica de Brasília, SGAN 916, Módulo B, Brasília, DF, CEP 70790-160, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Musa acuminata, Genes de Resistência, estresses bióticos, RGA, Sigatoka Negra
No Brasil, a banana é o segundo produto mais consumido,e o segundo país no ranking da produção mundial. Porém,
em todo o mundo, a cultura de banana tem enfrentado uma série de problemas relacionados à ocorrência de doenças
e pragas, para as quais, a obtenção de cultivares resistentes é a forma mais viável de controle. Genótipos de plantas
resistentes podem impedir a entrada de um patógeno simplesmente pelo fato dela não ser hospedeira, ou através de
mecanismos de defesa atribuída à interação entre produtos de genes de resistência e fatores de avirulência. Uma das mais
importantes doenças de bananeira é a Sigatoka negra (BLSD), devido ao fato da grande velocidade de propagação da
doença. É causada pelo fungo Mycosphaerella fijiensis, e no Brasil surgiu em 1998 na região do Amazonas, se espalhando
por quase todo o país. O objetivo desse trabalho é dar continuidade à caracterização de RGAs da família NBS-LRR em
cultivares de M. acuminata contrastantes em resistência a BLSD, e em concomitância, o desenho de primers degenerados
para a família receptor-like kinases (genes de resistência com LRR extracelular e domínio transmembrana ligado a uma
ser/thr kinase no citoplasma). Outra doença não menos importante é a murcha bacteriana causada pela Xanthomonas
vasicola que tem causado grande impacto na África, onde milhões de pessoas dependem da fruta como alimento e
fonte de renda. O gene Xa21, que pertece a esta classe de genes de resistência, confere resistência a murcha bacteriana
em Oryza sativa. O desenho de novos primers será feito utilizando o programa ICODEHOP e as amplificações serão
conduzidas com DNA genômico de cultivares contrastando em resistência a estresses bióticos por meio de PCR. Uma
análise filogenética de RGAs novos de Musa será feito, e em comparação com outros taxa de plantas. Os novos RGAs
também serão usados como sondas para mapeamento físico, utilizando as bibliotecas de BAC de M. acuminata Calcutta
4 (AA), M. acuminata Grande Naine (AAA), e M. balbisiana Pisang Klutuk Wulung (PKW) (BB).
Apoio financeiro: FINEP, IAEA, CNPq, UCB.
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Estudo da Herança da resistência à
ferrugem em progênies interespecíficas
de Eucalyptus ssp
Resende Jr., MFR1; Rosado, TB1; Rosado, AM3; Christo, GGO2; Alfenas, AC2; Cruz, CD1
1
Laboratório de Bioinformática – BIOAGRO, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
Laboratório de Patologia Florestal – BIOAGRO, Departamento de Fitopatologia –Universidade Federal de Viçosa
3
CENIBRA – Celulose Nipo Brasileira
[email protected]
2
Palavras-chave: Estudo de Herança, Puccinia psidii, eucalipto
A ferrugem causada por Puccinia psidii Winter é considerada uma das mais severas doenças do eucalipto. A resistência
genética é uma das melhores alternativa ao controle da doença. Um gene de resistência dominante de efeito principal,
denominado Ppr1, foi identificado em Eucalyptus grandis e mapeado em uma família de irmãos completos. Variações
no aspecto e tamanho da pústula de plantas com Ppr1, assim como diferentes padrões de segregação dependendo dos
cruzamentos indicaram que outros genes determinam eficiência à resposta de defesa. Para o uso eficiente da resistência
genética como estratégia de controle da ferrugem é necessário confirmar se a resistência em outras progênies é dependente
de Ppr-1, assim como, detectar outros genes. Assim, este trabalho objetivou estudar o padrão de herança da resistência à
ferrugem em oito progênies interespecíficas de Eucalyptus spp Quatro progênies foram provenientes de autofecundações
de clones cujos níveis de resistência eram previamente conhecidos (7074 e 57 resistentes e 1046 e 1213 suscetíveis) e
outras quatro progênies derivadas de cruzamentos entre os clones resistentes e suscetíveis.As mudas foram inoculadas
(2 x 104 urediniósporos/mL) e a severidade avaliada 20 dias após a inoculação utilizando-se escala de notas com quatro
classes.Dois modelos foram hipotetizados. O primeiro considerou herança mendeliana simples em que a resistência é
controlada por um gene dominante de efeito principal. No segundo modelo assumiu-se que a resistência tem herança
oligogênica com dois genes de efeito maior complementares. A autofecundação dos clones 7074 e 57 geraram progênies
segregantes indicando heterozigose com predomínio de indivíduos resistentes e diferentes padrões de segregação
(R:S 3:1; P=0,1% ou R:S 9:7; P=84,6% para o clone 7074 e R:S 3:1; P=86,2% ou R:S 9:7; P=27,1% para o clone 57
no teste χ2). A primeira hipótese (modelo monogênico) teve melhor ajuste no cruzamento entre os clones 7074 e 1213
(R:S 1:1; P=34,3% contra R:S 3:5; P=4,5% no teste χ2). A segunda hipótese (modelo oligogênico) teve melhor ajuste
nos cruzamentos envolvendo o clone 1046 (57x1046 e 7074x1046). O predomínio de indivíduos suscetíveis e a baixa
significância estatística às hipóteses indicaram possíveis problemas de distorções de segregação nos cruzamentos. O estudo
genômico é fundamental para elucidar estas questões e averiguar a possibilidade de que o gene de resistência presente
nestes genitores dependa de outros genes que também estão segregando nos cruzamentos com parentais suscetíveis.
Apoio Financeiro: FAPEMIG, CENIBRA.
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Mapeamento de QTL para resistência à
ferrugem (Puccinia psidii) em cruzamento
interespecífico de Eucalyptus spp
Tomaz, RS1; Rosado, TB1; Rezende Jr., MFR1; Rosado, AM2; Araújo, EF3; Cruz, CD1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
2
CENIBRA® Belo Oriente, MG
3
Departamento de Microbiologia, Universidade Federal de Viçosa
1
Palavras-chave: Detecção de QTL, resistência à ferrugem, Eucalyptus
A ocorrência da ferrugem causada pelo fungo Puccinia Psidii é limitante para as plantações de Eucalyptus. O plantio de
genótipos de Eucalyptus resistentes a esse fungo é a medida mais recomendável de controle dessa doença. Dessa forma,
torna-se imprescindível a detecção de genes responsáveis pela resistência à ferrugem, visando a seleção precoce de genótipos
resistentes e a clonagem desses para sua transferência para genótipos suscetíveis de Eucalyptus. Assim, o objetivo desse
trabalho foi o mapeamento de QTLs responsáveis pela resistência à ferrugem em um cruzamento interespecífico de
Eucalyptus utilizando marcadores moleculares microssatélites. Foram utilizadas informações fenotípicas, provenientes
da avaliação da resistência ao patógeno, em família composta de 133 indivíduos e informações genotípicas de sete locos
microssatélites do grupo de ligação três do genoma do Eucalyptus. A detecção de QTL foi feita por meio de metodologias
baseada em marca simples (contraste entre médias e regressão de Haseman e Elston) e pela metodologia baseada em
intervalo simples (regressão de Fulker e Cardon). As metodologias de marcas simples evidenciaram associação significativa
dos marcadores EMBRA 181 e EMBRA 125 com o QTL de resistência à ferrugem. A regressão de Fulker e Cardon
visa complementar as metodologias de marcas simples por meio do posicionamento do QTL nos intervalos entre as
marcas, possibilitado ainda estimar o seu efeito. Desta forma, esta metodologia posicionou o QTL próximo ao marcador
E125 (r = 0,002cM) com um valor da estatística F de 67,31. O QTL mapeado explicou 42% da variação fenotípica.
Devido à proximidade com o marcador EMBRA 125, e da grande proporção da variância fenotípica explicada pelo
QTL, é grande a possibilidade de utilização desta marca em procedimentos de seleção assistida.
Apoio Financeiro: CAPES e FAPEMIG.
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Construção de um mapa genético integrado
para o maracujá-doce (Passiflora alata
Curtis) utilizando marcadores AFLP e SSR
Nunes, ES; Penha, HA; Hanai, LR; Oliveira, CA; Vieira, MLC
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Maracujá-doce, mapa genético, marcadores microssatélites, marcadores AFLP e freqüência de recombinação
O maracujá-doce é uma espécie alógama e auto-incompatível. Este mecanismo impossibilita a obtenção de populações
de mapeamento convencionais (F2, de retrocruzamento e RIL), portanto usam-se populações F1 (cujos locos mostram
diferentes tipos de segregação) para a construção dos mapas genéticos. Marcadores dominantes e codominantes podem
ser utilizados na obtenção do mapa, sendo que os codominantes fornecem estimativas de freqüência de recombinação
e da fase de ligação com maior precisão. O objetivo deste estudo foi o desenvolver o primeiro mapa genético para o
maracujá-doce. A população de mapeamento é originária do cruzamento dos acessos SV3 e 2(12) e constituída por
180 indivíduos. Os locos de AFLP foram gerados utilizando duas combinações de enzimas de restrição (EcoRI/MseI
e PstI/MseI). As reações para amplificar os SSR foram realizadas utilizando-se primers transferidos da espécie Passiflora
edulis f. flavicarpa e primers desenvolvidos para P. alata. Para a construção do mapa foi utilizado o software Onemap
(Margarido et al. Hereditas.144(3):78-79, 2007) que usa a metodologia proposta por Wu et al. (Theo. Pop. Biology.
61:349–363,2002). As freqüências de recombinação foram transformadas em distância de mapa (cM) através da função
de mapeamento de Kosambi (Ann. Of Eugenetics,12:172-175 1944). O mapa foi construído a partir da análise de
312 locos segregantes, sendo 304 AFLP e 8 SSR. Dentre os AFLP, 115 locos foram informativos para o acesso
2(12), 92 para o acesso SV3 e 84 locos foram bi-parentais. Três locos SSR foram oriundos de transferibilidade, com
segregação 1:1:1:1, 1:2:1 e 1:1 e cinco foram desenvolvidos por Penha (Dissertação de Mestrado, USP, 2007), a partir
de uma biblioteca enriquecida para a espécie. Dois apresentaram segregação de 1:1:1:1 e três 1:2:1. Apenas 13 locos
não foram alocados no mapa final. O mapa foi constituído de 299 marcas, distribuídas em 9 grupos de ligação (GL),
com comprimento 966 cM. A distância média entre as marcas foi de 4,52 cM. O comprimento dos grupos de ligação
variou de 6,1 cM (GL 9) a 287,1 cM (GL 2). Com esta metodologia foi possível alocar marcas com diferentes tipos
de segregações, contribuindo para a integração de 9 grupos de maracujá-doce (2n=18). Este mapa integrado será útil
na alocação de QTL relacionados às características de produção e qualidade de fruto, uma vez que a população de
mapeamento está instalada no campo, em dois locais.
Apoio: FAPESP e CNPq.
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Desenvolvimento e caracterização de
marcadores microssatélites para Aniba
rosaeodora Ducke (Lauraceae), Uma
espécie florestal amazônica
Angrizani, RC1,2; Lemes, MR1,2, Contim, LS2,3
Laboratório de Genética e Biologia Reprodutiva de Plantas, INPA, Manaus, AM
Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, INPA, Manaus, AM
3
Centro Universitário Nilton Lins (UNI-NILTONLINS), Manaus, AM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Microssatélites, Aniba rosaeodora. Pau Rosa, Amazônia, Árvore tropical
O Pau-rosa, Aniba rosaeodora Ducke (Lauraceae), é um dos principais recursos florestais não-madeireiros da Amazônia
brasileira utilizado principalmente como fonte de óleo essencial na indústria de perfumaria. As populações naturais
de Pau-rosa têm sido fortemente exploradas e o status de conservação da espécie é preocupante. Estratégias efetivas
para a conservação e manejo de recursos florestais devem considerar, entre outros fatores, dados ecológicos e genéticos.
Marcadores de DNA microssatélites são amplamente reconhecidos por seu alto conteúdo informativo e têm sido
freqüentemente utilizados em estudos de genética de populações, conservação genética e manejo de espécies. Neste estudo
reportamos o isolamento e caracterização de sete locos microssatélites para Aniba rosaeodora, visando disponibilizar uma
bateria de marcadores informativos para aplicações em estudos sobre a diversidade e estrutura genética de populações,
fluxo gênico e sistema de reprodução desta espécie. Para tal foi construída uma biblioteca genômica enriquecida para o
dinucleotídeo AG utilizando-se DNA genômico extraído de um único indivíduo de A. rosaeodora. O DNA genômico
foi clivado utilizando-se a enzima Sau3A1. Fragmentos ricos em repetições foram selecionados por meio de hibridização
e posteriormente clonados em plasmídeo p-GEMT e transformados em Escherichia coli. No total, 196 clones positivos
foram selecionados e seqüenciados em um seqüenciador de DNA ABI 377. Dos 196 clones seqüenciados, 72 (37,5%)
continham seqüências repetidas (microssatélites). No total foram desenhados 40 pares de primers dos quais 14 foram
testados para análise de polimorfismos. Os produtos amplificados foram analisados em gel de poliacrilamida 4% corado
com nitrato de prata. Dos 14 locos microssatélites analisados, 10 foram polimórficos, dois monomórficos e dois não
amplificaram. Dentre os 10 locos polimórficos detectados, sete foram caracterizados com base em detecção fluorescente
em sistema multiplex, sob eletroforese, em gel de poliacrilamida 5% em seqüenciador de DNA ABI 377, utilizandose 68 indivíduos de duas populações naturais de A. rosaeodora. No total foram detectados 94 alelos para os sete locos
analisados (média de 13,4 alelos por loco). A heterozigosidade média observada foi 0,57 e a heterozigosidade média
esperada foi igual a 0,80. O índice de exclusão de paternidade e a probabilidade de identidade genética estimados
para os locos em conjunto foram 0,9999951 e 1,51 x10-9, respectivamente. Os altos níveis de polimorfismo e poder
de discriminação individual observados para esses locos permitirão realizar estimativas precisas de fluxo gênico, análise
de parentesco e sistema de cruzamento em populações de A. rosaeodora, contribuindo assim para o conhecimento da
genética de populações bem como conservação e manejo desse valioso recurso florestal amazônico.
Apoio financeiro: CNPq/CT-Amazônia.
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Sequenciamento “shotgun” para
o desenvolvimento de marcadores SSR
em Dipteryx alata Vogel
Soares, TN¹,²; Resende, LV²; Melo, DB²; Brondani, RPV³; Telles, MPC²; Borba, TCO³; Chaves, LJ¹
Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Universidade Federal de Goiás
2
Laboratório de Genética e Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
3
Laboratório de Biotecnologia, Embrapa Arroz e Feijão
[email protected]
1
Palavras-chave: baru, cerrado, conservação, microssatélite, seqüenciamento aleatório
O barueiro (Dipteryx alata) é uma das espécies nativas do Cerrado amplamente utilizada pela população regional,
principalmente pela exploração extrativista. Os marcadores microssatélites, por serem codominantes, multialélicos,
abundantes e bem distribuídos ao longo do genoma, são eficientes para avaliar a variabilidade genética em populações
naturais, o que é importante para a sugestão de estratégias de conservação e uso do barueiro. Este estudo utiliza uma
estratégia de desenvolvimento de primers que se baseia no seqüenciamento aleatório de fragmentos provenientes de
uma biblioteca genômica “shotgun” para a detecção de regiões microssatélites. O DNA foi extraído, a partir de folhas
jovens de barueiro, em seguida foi quantificado e diluído para a fragmentação em sonicador. Após o tratamento das
extremidades dos fragmentos de qualidade e tamanho adequados, foram realizadas reações de ligação ao vetor de
clonagem. As células transformadas foram aplicadas em placas de petri, contendo meio LB sólido com ampicilina e
tetraciclina, que foram incubadas (37ºC/12h) e estocadas (4°C). As colônias positivas foram transferidas para uma
placa (96 poços) contendo meio líquido Circle Grow para o crescimento, secagem e posterior extração dos plasmídios
(minipreps). O sequenciamento foi realizado no sequenciador automático ABI3100. As sequências foram depositadas no
Sistema Genoma BioFoco, que permitiu, em seguida, a busca por regiões microssatélites. Os primers foram inicialmente
testados com quatro indivíduos e os padronizados foram avaliados, utilizando 63 indivíduos, quanto aos parâmetros
genéticos de diversidade. Das 668 sequências obtidas, foram encontradas doze regiões microssatélites que possibilitaram
a construção dos pares de primers. Estas regiões são compostas por motivos com dois a seis nucleotídeos, que variam
entre 136 a 380pb. Dez primers foram amplificados com sucesso, utilizando-se quatro indivíduos. Ao avaliá-los com
63 indivíduos, cinco apresentaram padrão satisfatório, sendo que dois foram polimórficos, apresentando três alelos cada.
As estimativas de He e Ho para estes locos foram 0,2946 e 0,2879, e 0,1613 e 0,1429, respectivamente. As freqüências
de alelos nulos foram de 0.103 e 0.113. As estimativas de probabilidade de exclusão de paternidade e probabilidade
de identidade para todos os locos foram de 0.255 e 0,0357, respectivamente. A estratégia de sequenciamento aleatório
a partir de bibliotecas “shotgun” é interessante por não realizar a etapa de enriquecimento da biblioteca para regiões
repetitivas e possibilita a obtenção de diferentes regiões repetitivas e não só as complementares às sondas utilizadas. O
número de primers sintetizados e otimizados foi satisfatório, entretanto, foram encontrados baixo número de alelos e
polimorfismo, o que indica que há a necessidade de se desenvolver mais pares de primers para uma melhor cobertura
do genoma e detecção de variabilidade genética em D. alata. A continuidade deste trabalho poderá ser realizada pela
estratégia utilizada, pois ela se mostrou eficiente para a rápida detecção de regiões repetitivas.
Apoio financeiro: Pró-Reitoria de Pós-graduação e Pesquisa da UCG, CNPq.
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Mapa genético para a população de feijão
‘carioca’ X ‘flor de mayo’, visando ao
mapeamento de QTL de resistência
à mancha angular e ao oídio
Santini, L1; Hanai, LR1; Santos, JB2; Camargo, LEA3; Vieira, MLC1
Departamento de Genética, ESALQ, Universidade de São Paulo
²Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
3
Departamento de Entomologia, Fitopatologia e Zoologia Agrícola, ESALQ, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Mapeamento genético, genes de resistência, marcadores moleculares, RGA, Phaseolus vulgaris
A cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) é de extrema importância para países do leste da África e da América Latina,
sendo uma das principais fontes de ferro e proteínas para suas populações de baixa renda. Frente a isso, é necessário o
desenvolvimento de pesquisas que contribuam para o aumento da produtividade das lavouras e a melhoria da qualidade
dos grãos. Neste aspecto, os problemas fitossanitários são os principais limitadores. Este trabalho buscou a construção
de um mapa genético, visando o mapeamento de genes de resistência a doenças em feijão. Uma população de 94 RILs,
segregando para reação a mancha angular e oídio foi genotipada a partir de três marcadores moleculares: microssatélite,
RGA e AFLP. Os marcadores microssatélites foram analisados conforme Hanai et al. (Genome, 50:266-277, 2007) e
os marcadores RGA foram gerados conforme Santini et al. (Resumos do 15º SIICUSP, 2007). Os marcadores AFLP
seguiram o protocolo de Vos et al (Nucleic Acids Research, 23:4407-4414, 1995) otimizado em nosso laboratório.
Para a construção do mapa de ligação, os dados de segregação de 295 locos (225 AFLPs, 27 microssatélites e 43 RGA)
foram analisados através do software MapMaker 3.0. Os grupos de ligação (GL) foram denominados conforme o mapa
referência da espécie, Bat x Jalo (B1-B11). Os marcadores microssatélites comuns ao mapa Bat x Jalo foram ancorados
aos seus grupos de ligação e o restante dos marcadores foi atribuído aos respectivos grupos por meio do comando assign
com LOD>5.0. O ordenamento dos marcadores nos GL com até 10 marcadores foi realizado pelo comando compare.
Para os GL com mais de 10 marcadores, o posicionamento dos demais foi realizado através do comando build, e aqueles
que não puderam ser adicionados ao framework com LOD>2 foram atribuídos aos intervalos mais verossímeis. O mapa
de ligação gerado apresentou 12 GL, o grupo B8 permaneceu dividido em dois menores. No total, 161 marcadores
foram ordenados no framework com LOD>2, gerando um mapa com 878 cM de comprimento, com uma distância
média de 5,5 cM entre marcas e uma cobertura de aproximadamente 73% do genoma da espécie, cujo tamanho é
estimado em 1200 cM. Com relação aos marcadores RGA, dos 43 locos analisados, 41 estão distribuídos em 9 GL.
Interessantemente, os GL B2 e B8 foram os que apresentaram maiores números de marcadores RGA mapeados tanto
neste trabalho, quanto em Bat x Jalo (Santini et al., resumos do 15º SIICUSP, 2007). Estes resultados são corroborados
pela presença de um gene de resistência à mancha angular no grupo B8 (Miklas et al. Crop Sci.46:910-916, 2006).
O mapa apresentado será usado no mapeamento de QTL de resistência a oídio e mancha angular, onde a co-localização
de RGA com os QTL de resistência poderá ser confirmada.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e FAPESP.
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Desenvolvimento e validação de marcadores
microssatélites em Passiflora alata Curtis
Penha, HA1; Zucchi, MI2; Fungaro, MHP3; Paula, FM3; Vieira, MLC1
Departamento de Genética, ESALQ, Universidade de São Paulo
2
Instituto Agronômico - IAC
3
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
1
Palavras-chave: Passiflora alata, Microssatélites, Desenvolvimento de primers
Os microssatélites, ou SSR (Simple Sequence Repeats), consistem de seqüências com um a seis nucleotídeos repetidos
em tandem que estão distribuídas aleatoriamente nos genomas de eucariotos e procariotos. Estas seqüências se prestam
como marcadores genéticos e, por isso, os locos de microssatélites são usados na construção de mapas de ligação e no
mapeamento de genes, sendo muito úteis por suas características como codominância, fácil análise e alto polimorfismo.
Uma biblioteca genômica enriquecida em microssatélites foi desenvolvida para Passiflora alata, o maracujá-doce (Penha,
2007, Dissertação de Mestrado, ESALQ/USP), segundo o método de Billote et al (Fruits, v. 54, 1999). Neste trabalho,
a partir da análise das seqüências oriundas dessa biblioteca, foram desenhados e validados pares de primers para serem
usados em estudos genéticos de espécies cultivadas de Passiflora. Assim, 177 pares de primers foram cuidadosamente
desenhados com a utilização de diversos softwares (TROLL, Primer3, Chromas v.2.31 e Gene Runner) e, destes,
95 foram sintetizados e validados em 10 indivíduos de uma população segregante (F1) de P. alata e respectivos genitores.
Verificou-se que 19 pares de primers revelaram polimorfismo entre os progenitores, correspondendo a uma taxa de
20%. Esta taxa de polimorfismo foi considerada elevada, comparando-se com os níveis de polimorfismo obtidos com
marcadores AFLP (13%) em P. edulis f. flavicarpa, espécie próxima à P. alata (Lopes et al. Genome, 49, 2006; Oliveira
et al. Journal American Society Horticultural Science, 133, 2008), e próxima aos níveis encontrados por Carneiro et
al. (Genome, 45, 2002) usando marcadores RAPD (29,7%). Todos os pares de primers (100%) amplificaram o alelo
predito pelo seqüenciamento, e apenas 25% deles amplificaram, também, outros locos. Além disso, o resultado de todas
as amplificações foi de fácil interpretação. Entre os locos polimórficos, 57,9% apresentaram dois alelos nos genitores
(a, b ou nulo), configurando cruzamentos do tipo ab x ab, ao x ab, bo x ab ou ab x ao, que resultam em uma segregação
na proporção de 1:2:1, e dois locos com a configuração ao x bo, com uma segregação esperada de 1:1:1:1. Em 42,1%
dos locos, observaram-se três alelos, com uma segregação esperada de 1:1:1:1, com as configurações ac x bo e ac x bc. A
caracterização dos níveis de polimorfismo e da configuração genética dos locos é importante na construção de mapas
genéticos para a espécie, que é auto-incompatível. Por isso, populações F1 são usadas para fins de mapeamento.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Caracterização da constituição genômica de
bananeira por meio de marcadores PCR-RFLP
Jesus, ON1; Figueira, A2; Silva, SO3
1
Departamento de Genética-Esalq-USP
Centro de Energia Nuclear na Agricultura
3
Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical
[email protected]
2
Palavras-chave: Musa spp., PCR-RFLP, germoplasma, caracterização, melhoramento
Cultivares de bananeira e plátanos originaram-se por cruzamento entre espécies selvagens diplóides Musa acuminata
Colla (genoma A) e Musa balbisiana Colla (genoma B). As bananeiras comestíveis apresentam genoma com vários
níveis de ploidia: diplóides (AA, BB e AB), triplóides (AAA, AAB e ABB) e tetraplóides (AAAA, AAAB, AABB e
ABBB), com 2n=22, 33 ou 44 cromossomos, respectivamente. O programa de melhoramento da Embrapa Mandioca e
Fruticultura Tropical conta com um banco ativo de germoplasma com acessos de diversas ploidia e constituição genômica
caracterizado principalmente por descritores morfológicos. Apesar da amplitude de materiais disponíveis, poucos têm
sido utilizado efetivamente nos programas de melhoramento devido uma caracterização deficiente desses acessos. A
identificação precisa da composição genômica A e B é de extrema relevância para os programas de melhoramento, pois
estão associados a características importantes, como resistência a estresse biótico e abióticos e características de qualidade
dos frutos. Para identificar a composição genômica dos acessos do banco de germoplasma de bananeira utilizou-se a
técnica de PCR-RFLP, amplificando as regiões espaçadora (ITS1 e ITS2) do gene ribossomal seguido de digestão com
RsaI. Dos 200 acessos avaliados 11 acessos apresentaram discordância em relação a composição genômica descrita.
Assim, o acesso Tip tida como ABB apresentou um padrão típico de AAB; os acessos Yangambi-2, Waik, e Ustrali tidas
AAB apresentaram um perfil molecular de um triplóide AAA; a Figue Rose Naine e o acesso Chifre de vaca tidas como
AAB mostraram-se como um triplóide AAA. Os acessos tetraplóides AAAB: Tropical, FHIA-21, FHIA-02 e FHIA-01,
confirmados em outros estudos com SSR, mostrou-se no presente estudo como AAAA. Esses acessos apresentaram
discrepância em relação a presença do genoma B, possivelmente devido a competição entre o menor número de cópias
do genoma B em relação ao genoma A, o que impossibilita sua visualização após a digestão. Os marcadores PCR-RFLP
foram eficientes na definição da composição genômica de bananeira. A análise conjunta com marcadores SSR poderá
auxiliar na definição da composição genômica nos tetraplóides tipo AAAB.
Apoio: CNPq.
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Uma coleção nuclear dentro do banco
ativo de germoplasma de pupunha
(Bactris gasipaes Kunth, Palmae)
Araújo, MC1; Rodrigues, DP1; Clement, CR2
Universidade Federal do Amazonas; Instituto de Ciências Biológicas, Manaus AM
2
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, AM
[email protected]
1
Palavras-chave: caracterização genética, distância genética, distribuição geográfica, critérios de seleção
Estudos usando marcadores moleculares contribuíram para identificar e avaliar a variabilidade genética das raças
primitivas e populações cultivadas e silvestres de pupunha depositadas no Banco Ativo de Germoplasma de Pupunha
(BAG) (INPA, Manaus, Amazonas). Por ser uma coleção viva, custos de manutenção do BAG são altos e recursos
financeiros para caracterizar e avaliar são escassos, restringindo sua utilização. Uma forma de conservar melhor e cruzar
informações para promover o uso eficiente do BAG é criando uma Coleção Nuclear, que consiste em um conjunto
de acessos com pelo menos 70% da diversidade genética da coleção inteira, com um mínimo de repetição. Foram
amostradas 314 plantas da var. gasipaes [raça Putumayo (n=68); Utilis (n=2); Pará (n=15); Pastaza (n=1); Solimões
(n=62); Pampa Hermosa (n=153)]; populações não designadas a uma raça [Pucallpa (n=6), Contamana (n=1); Puerto
Maldonado (n=4); Plácido de Castro (n=2)]; e plantas da var. chichagui tipo 3 (n=4). Oito iniciadores para RAPD geraram
132 marcadores polimórficos. O conjunto de raças e populações apresentou heterozigosidade média de 0,34, com 97,7%
de polimorfismo. A diversidade genética (GST) entre as raças bem representadas foi de 0,09, menor que a diversidade
dentro de raças (Hs = 0,32). O dendrograma das distâncias de Rogers (apropriada para criação de coleções nucleares)
apresentou estrutura similar às análises anteriores para raças com maior número de plantas, mas com distâncias maiores
que as de Nei. O alto fluxo gênico (Nm=14,8) entre as raças Solimões e Pampa Hermosa, e entre as raças Putumayo e
Solimões (Nm=14,5) explica as relações no dendrograma de Nei e Rogers. As informações moleculares deste estudo e
anteriores, e de distribuição geográfica do BAG foram reunidas e sistematizadas para designar os acessos à Coleção após
estratificação com base no grau de domesticação: silvestres e cultivadas, este último subdividido em raças primitivas
e populações híbridas. As raças e populações com pouca representatividade no BAG foram alocadas à Coleção em
proporção ao seu número: Juruá (2); Cauca (2); Guatuso (2); Pastaza (1); Tuira (1); Utilis (2); Vaupés (2); populações
não designados (5); e as populações silvestres tipo 1 e 3 (4). Aquelas bem representadas foram alocadas conforme o
logaritmo do seu número: Pará (5); Putumayo (4); Solimões (3); Pampa Hermosa (4); e populações híbridas (3). Os
acessos dentro das raças e populações foram selecionados com base na divergência observada em matrizes de similaridade
de Jaccard ou Dice previamente publicadas. A Coleção Nuclear contém 10% da coleção inteira, sendo 28 acessos de
raças primitivas, 3 de populações híbridas, 5 de populações não designadas e 4 de populações silvestres. Essa Coleção
facilitará um novo esforço de caracterização e avaliação, bem como o planejamento adequado de programas que visem
conservação e melhoramento, aumentando a probabilidade de utilização.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEAM.
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Isolamento e desenvolvimento de microssatélite
para pimenteira-do-reino Piper nigrum L.
Menezes, IC1; Sampaio, MIC2; Cidade, FW3; Souza, AP3
Embrapa Amazônia Oriental, Belém Pará
Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará
3
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Piper nigrum, pimenteira-do-reino, microssatélite
A pimenta-do-reino Piper nigrum é a especiaria mais consumida no mundo e também o mais importante produto agrícola
de exportação do Estado do Pará, o qual contribui com 95% da produção nacional. Segundo dados da peppertrade,
em 2007 o Brasil exportou 37.009 toneladas de grãos de pimenta-do-reino, aparecendo como o segundo exportador
mundial. A pimenta-do-reino participa com cerca de 25% do mercado de exportação de produtos tradicionais do
Estado do Pará, que inclui entre outros, madeira e dendê. Entretanto, a fusariose, doença causada pelo fungo Nectria
haematococca f. sp piperis (Fusarium solani f. sp. piperis), que afeta o sistema radicular da planta, tem sido o principal
fator limitante para expansão desta cultura. O estabelecimento da espécie no Brasil se deu com baixíssima variabilidade
tornando os campos cultivados homogêneos e vulneráveis. Atualmente o Brasil dispõe de cultivares introduzidas da
Índia que fazem parte do Banco de Germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental em Belém-PA e tenta-se acessar
o grau de variabilidade desse material. O objetivo desse trabalho é o isolamento, desenvolvimento de microssatélites
para Piper nigrum L. e avaliação da variabilidade genética nas cultivares conservadas no Banco Ativo de Germoplasma
(BAG) da Embrapa Amazônia Oriental (Belém-PA). Para tanto, uma biblioteca enriquecida com microssatélites foi
desenvolvida com motivos (CT)8 e (GT)8 a partir do DNA genômico extraído de um único indivíduo. Dos 192 clones
positivos isolados e sequenciados foram identificados 89 microsatélites simples perfeitos utilizando-se o software webbased SSRIT (www.gramene.org). Os motivos mais encontrados foram os dinucleotídeos GT/AC e TG/CA, devido ao
método de enriquecimento da biblioteca. Para esses microssatélites 16 primers já foram desenhados. O passo seguinte
será o desenho de 40 novos primers, caracterização a análise das cultivares existentes no Banco de Germoplasma da
Embrapa Amazônia Oriental.
Orgão financiador: UFPA/EMBRAPA.
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Avaliação da repetibilidade de marcadores
RAPD em Tibouchina papyrus utilizando
técnica de otimização
Ramos, JR1; Soares, TN¹; Oliveira, G2; Telles, MPC1; Resende, LV1; Diniz-Filho, JAF2
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
2
Laboratório de Ecologia Teórica e Síntese, Universidade Federal de Goiás
[email protected]
1
Palavras-chave: cerrado, endemismo, marcador molecular, pau-papel, RAPD
O RAPD é um marcador que apresenta um padrão de herança de natureza “dominante”, utiliza um único iniciador de
seqüência arbitrária, normalmente composto de 10 nucleotídeos e com alvo desconhecido no genoma. Embora existam
críticas sobre a confiabilidade e reprodutibilidade dos dados gerados por RAPD, acredita-se que, quando algumas medidas
de padronização são adotadas, garantindo o máximo de repetibilidade dos locos, ele apresenta a grande vantagem de ser
potencialmente aplicável a qualquer tipo de organismo, custo relativamente baixo e de rápida obtenção dos resultados.
Deste modo, o marcador RAPD é uma boa ferramenta para a ampliação do conhecimento de espécie que ainda pouco
conhecidas do ponto de vista genético, como é o caso da Tibouchina papyrus, uma espécie endêmica e de distribuição
restrita aos campos rupestres do cerrado. Entre as possibilidades para a ocorrência de problemas de repetibilidade estão
a falta de padronização das condições de amplificação, tais como: preparo da solução, erros de pipetagem, qualidade
dos reagentes e efeito da variação entre termocicladores. Para auxiliar nessa padronização, o presente trabalho objetiva
avaliar a repetibilidade de marcadores RAPD em Tibouchina papyrus, utilizando uma técnica de otimização (simulated
annealing), a partir da matriz de genótipos (presença (1) e ausência (0) de bandas). Para tanto, foram utilizados seis
primers RAPD (OPB-04, OPB-05, OPB-10, OPM-03, OPM-05 e OPM-13), tomando-se o cuidado de manter
constante todas as condições de preparo das reações de PCR, para minimizar erros advindo dessa fonte de variação,
mantendo-se um único termociclador para cada primer. Após a amplificação, com 215 indivíduos, os produtos de PCR
foram separados em eletroforese em agarose 1,5%. A codificação dos foi realizada como o usual, gerando a matriz de
genótipos. A partir dessa matriz, utilizando-se o algoritmo de otimização, foi possível definir dezenas de soluções que
contemplasse o número mínimo de indivíduos que apresentassem todos os locos. O DNA desses indivíduos foi reutilizado
para nova reação de PCR, com as mesmas condições anteriores. Após a nova amplificação e eletroforese, os géis foram
codificados, sendo os locos gerados comprados com a matriz de dados original. Da análise inicial, foram obtidos 176
locos. Após a análise, que gerou soluções com um número de indivíduos que variou entre 3 e 5, a que apresentou o menor
número de indivíduos, para cada primer, foi escolhida. A matriz de repetibilidade, após a comparação com a planilha
original, possibilitou a codificação de 147 locos coincidentes, ou seja, que foram reprodutíveis. Portanto, considerando
todos os primers, apenas 29 locos não repetiram, ou seja, um índice de repetibilidade igual a 84% entre as matrizes,
confirmando que, quando padronizadas as condições de PCR, pode-se obter uma boa taxa de repetibilidade dos locos
RAPD, confirmando a possibilidade de uso dessa importante ferramenta em estudos genético-populacionais.
Apoio financeiro: PROPE/UCG e CNPq (Proc. 471492/2007-8).
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Isolamento de marcadores microssatélites
de Aureliana fasciculata var. fasciculata
(Solanaceae)
Zamberlan, PM1; Stehmann, JR2; Bonatto, SL3; Salzano, FM1; Freitas, LB1
Departamento de Genética – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
2
Departamento de Botânica – Universidade Federal de Minas Gerais
3
Centro de Biologia Genômica e Molecular – Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
Palavras-chave: Mata Atlântica, Aureliana fasciculata, processos históricos, microssatélites, biblioteca enriquecida
Aurelina fasciculata (Vell.) Sendtn. var. fasciculata é uma espécie arbustiva que se distribui ao longo de toda a Mata
Atlântica. Sua distribuição a torna um modelo ideal para investigação de questões relacionadas aos processos históricos
da floresta Atlântica. Os microssatélites são marcadores genéticos bastante variáveis, sendo apropriados para este tipo
de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver marcadores do tipo microssatélite específicos para Aureliana
fasciculata var. fasciculata a partir da construção de uma biblioteca enriquecida. O material genético total foi extraído a
partir de folhas jovens secas em sílica gel. O DNA obtido foi digerido com a enzima RsaI, depois ligado a adaptadores
e amplificado por PCR com o “primer” Rsa21, complementar ao adaptador. Os fragmentos contendo microssatélites
foram selecionados através de sondas ([CT]8 e [GT]8) biotiniladas, capturados por partículas magnéticas ligadas a
estreptavidina, que tem alta afinidade por biotina. O DNA enriquecido em microssatélites foi novamente amplificado e
os produtos da reação de PCR foram clonados em vetor “pGEM-T Easy”. O vetor foi inserido em células competentes de
Escherichia coli através de choque térmico. As bactérias transformadas foram selecionadas em meio de cultura contendo
ampicilina, IPTG e X-Gal. Noventa e cinco colônias positivas foram repicadas em meio líquido e armazenadas. Oitenta
e dois insertos já foram amplificados diretamente com os “primers” T7 e SP6 do vetor e seqüenciados em equipamento
MegaBace 1000. Doze seqüências apresentaram microssatélites, sendo seis microssatélites dinucleotídicos perfeitos,
quatro microssatélites dinucleotídicos compostos perfeitos, um microsatélite dinucleotídico composto imperfeito e um
microsatélite composto com repetições di e tetranucleotídicas. Foram desenhados dez conjuntos de “primers”, com
o auxílio do programa Primer3. Neste momento os conjuntos de “primers” sintetizados estão sendo otimizados para
amplificação. Quinze indivíduos de ao menos dois locais de ocorrência serão genotipados. Com base nos resultados
preliminares obtidos, serão avaliados o número de alelos detectados em cada locus, a heterozigosidade esperada e a
observada, bem como a existência de desequilíbrio de ligação.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERGS, PROPESQ-UFRGS.
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Comparação de métodos de extração de DNA
de teca (Tectona grandis L. f.) para estudos
de caracterização genética usando SSR
Alcântara, BK; Siqueira, MVBM; Veasey, EA
Laboratório de Ecologia Evolutiva e Genética Aplicada, Departamento de Genética
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: teca, Tectona grandis, extração de DNA
A implantação de teca (Tectona grandis) no Brasil tem se mostrado crescente nos últimos anos devido ao seu valor
econômico que chega a ser mais alto que o mogno da Amazônia (Swietenia macrophilla). A madeira da teca é usada para a
construção de navios, madeiramento de casas e fabricação de móveis por sua leveza, durabilidade e resistência. No entanto,
pouco se sabe sobre as características genéticas dos materiais de teca introduzidos no Brasil, além de existirem poucos
trabalhos que testam métodos que facilitem a extração de DNA desta espécie visando sua caracterização molecular. O
objetivo inicial deste trabalho foi testar diferentes métodos de extração de DNA para teca, com a finalidade de uma futura
caracterização genética dos materiais introduzidos no Estado do Mato Grosso, por meio de marcadores microssatélites
ou simple sequence repeats (SSR). Foram testados três métodos de extração de DNA das folhas recém-expandidas de
teca: método I (Elias et al., 2004 modificado), método II (Doyle & Doyle, 1990) e método III (Saghai-Maroof et al.,
1984 modificado). Dentre os métodos testados, o método I obteve bons resultados, com média de 66 µg de DNA/g
de material seco; no método II foi obtido 20 µg de DNA/g de material seco; já o método III não foi eficiente para a
extração. A média do índice de pureza pela relação da absorbância (A260/A280) foi de 3,3 no método I e 2,9 no método
II. Nota-se que a houve grande diferença entre as quantidades obtidas e nenhuma diferença na qualidade do DNA. Estes
resultados serão muito úteis para a obtenção de DNA nos estudos de caracterização genética de teca, tendo em vista
que o método I irá viabilizar a obtenção de materiais para o estudo, pois neste método as folhas são secas em estufa a
30oC e por 30 horas, portanto não havendo a preocupação de manter folhas frescas durante o transporte, principalmente
em se tratando de grandes distâncias entre o local de plantio e o local para a condução das análises genéticas.
Apoio financeiro: CNPq e PROTECA.
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Identificação de primers polimórficos para
mapeamento do gene ‘Luteus-Pa’
em Theobroma cacao L. (Malvaceae)
Rehem, BC1; Silva, AS2; São Mateus, WMB2; Almeida, A-AF3; Corrêa, RX3; Gesteira, AS3; Yamada, MM4; Valle, RR4
Doutoranda em Genética e Biologia Molecular
2
Graduandos em Ciências Biológicas
3
Departamento de Ciências Biológicas - Universidade Estadual de Santa Cruz
4
CEPEC/CEPLAC
[email protected]
1
Palavras-chave: Cacau, Fator letal, Marcador genético
Alguns genótipos de Theobroma cacao, provenientes de uma família originária do Peru, caracterizam-se por expressar
o caráter recessivo letal ‘Luteus-Pa’. Esse fator causa clorose e manchas necróticas foliares em mudas jovens, levandoas, conseqüentemente, à morte. Para avaliar os mecanismos de herdabilidade desse gene, foram realizadas análises
genéticas entre dois genótipos pertencentes a essa família. Objetivou-se, com o presente trabalho, identificar marcadores
microssatélites (SSR) e RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) polimórficos para aplicação em estudos de
mapeamento localizado desse gene, visando elucidar possíveis mecanismos letais e de herança do ‘Luteus-Pa’. Efetuaram-se
extrações de DNA e amplificações via PCR com 34 primers SSR marcados com fluorescência e 100 primers RAPD. Nas
análises moleculares com esses primers, foram selecionados 20 SSR e 83 RAPD por apresentarem polimorfismo entre
esses clones. Os primers SSR amplificaram 65 bandas e os RAPD 118 bandas polimórficas, das quais foram selecionadas
46 bandas SSR e 59 bandas RAPD informativas, aplicáveis no mapeamento localizado. Por meio do screening dos
marcadores SSR e RAPD, foi possível selecionar 20 primers SSR e 22 primers RAPD polimórficos e informativos para
os genótipos avaliados. Estes primers poderão ser utilizados para comprovar sua ligação genética ao gene letal ‘Luteus-Pa’
e estimar a distância genética entre o gene letal e os marcadores nas progênies resultantes de cruzamentos entre esses
genitores, que se caracterizam por expressar o fator letal.
Apoio financeiro: FAPESB, CAPES e CNPq.
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Herdabilidade de caracteres associados à
resistência da soja aos percevejos sugadores
Pierozzi, PHB1; Santos, MdaF1; Möller, M1; Arruda, MP1; Zucchi, MI2; Pinheiro, JB1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”/USP
2
Centro de Recursos Genéticos Vegetais, Instituto Agronômico de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: Glycine max, resistência genética, complexo de percevejos, parâmetros genéticos, caracteres agronômicos
Atualmente o Brasil está posicionado como 2º maior produtor mundial de soja e entre os fatores limitantes para o
aumento da produtividade da cultura está o complexo de percevejos sugadores de vagens. Por esse motivo, a característica
de resistência a insetos em cultivares de soja é um fator altamente desejável. Visando estudar esta característica o presente
trabalho avaliou a geração F2 do cruzamento entre as cultivares IAC-100 (resistente) e Conquista (suscetível). Nove
caracteres foram avaliados: período de enchimento de grãos (PEG), acamamento (AC), valor agronômico (VA), retenção
foliar (RF), número de vagens por planta (NVP), índice percentual de dano por vagem (IPDV), sementes manchadas
(SM), produtividade de grãos (PG) e peso de cem sementes (PCS). A avaliação para acamamento foi feita utilizando
uma escala de 1 a 5, sendo plantas totalmente eretas consideradas como 1 e totalmente prostradas como 5; para o
valor agronômico também foi utilizada uma escala de 1 a 5, recebendo nota 5 aquelas consideradas de elevado padrão
agronômico; para retenção foliar a nota 0 corresponde à ausência de haste e folhas verdes e 5 corresponde a presença de
cor verde em todas as folhas e hastes; o caráter sementes manchadas foi avaliado de acordo com o ataque por percevejos
e a colonização da levedura Nematospora coryli, variando de 0 a 100%; o IPDV foi calculado considerando o número
de vagens intermediárias e vagens planas. Os valores de AC, VA e RF foram transformados utilizando a fórmula √x,
enquanto que para IPDV e SM foi empregado arcsen√(x/100). Para a obtenção da geração F2 utilizada foram realizados
cruzamentos artificiais em casa-de-vegetação no verão de 2003/2004, com avanço no inverno de 2004 e condução do
experimento a campo na safra 2004/2005. O experimento foi instalado na Estação Experimental do Departamento de
Genética da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, localizado em Piracicaba-SP. O delineamento experimental
utilizado foi o de blocos ao acaso, com seis repetições, sendo cada parcela representada por 12 plantas espaçadas
0,5 x 0,5m. Para as análises foram utilizadas as médias das plantas de cada parcela, sendo realizada a análise de variância
para cada um dos caracteres de resistência e produtividade, visando avaliar o desempenho da geração F2. A partir do
teste F foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos para os caracteres PEG, AC,
RF, IPDV, SM e PG. Os coeficientes de herdabilidade no sentido amplo para os caracteres associados à resistência ao
ataque de percevejos foram: PEG (98,98%), RF (83,55%), IPDV (97,42%), SM (96,86%) e PCS (64,55%).
Apoio Financeiro: Fapesp e CNPq.
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Efeito das poliaminas no enraizamento in
vitro de brotos de Citrus sinensis L. Osb.
oriundos de transformação genética via
Agrobacterium tumefaciens
Mendes, AFS; Cidade, LC; Costa, MGC
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus-BA
[email protected]
Palavras-chave: transformação genética, citros, enraizamento, poliaminas, agrobactéria
As poliaminas são moléculas envolvidas em muitos processos celulares, como divisão celular, síntese de proteínas, replicação
do DNA e resposta a estresse abiótico. Estudos recentes têm demonstrado o papel das poliaminas, especialmente a
putrescina, na formação e diferenciação de raízes, bem como o aumento do número de raízes quando associadas com
auxinas, como o ácido indolbutírico. A transformação genética de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens é
uma ferramenta biotecnológica promissora, na medida em que permite, de modo controlado, a inserção de genes que
conferem características de interesse em espécies vegetais. Porém, devido a dificuldades no enraizamento de brotos
transgênicos e influência do genótipo, o sucesso na recuperação de plantas transgênicas de citros é relativamente limitado.
Baseado nestas informações, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da poliamina putrescina na formação
e crescimento de raízes adventícias em brotos de laranja-doce (Citrus sinensis L. Osb, variedades ‘Pêra’ e ‘Pineapple’)
obtidos seguindo os trabalhos de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens. Partindo-se de um
meio de enraizamento já previamente estabelecido para as variedades estudadas, composto dos sais do meio MS “força
completa” e uma combinação das auxinas ácido naftalenoacético (ANA) a 0,5 mg.L-1, e ácido indolbutírico (AIB) a
0,5 mg.L-1, a putrescina foi adicionada nas concentrações de 1 μM, 100 μM ou 1000 μM. Em relação ao comprimento
da raízes, a concentração de 1000 μM de putrescina promoveu um maior crescimento das raízes em ‘Pêra’ (2,39 cm,
em média) e ‘Pineapple’ (2,08 cm, em média). Em relação ao número médio de raízes por broto, a putrescina 1000μM
também promoveu uma maior diferenciação de raízes por broto para ‘Pineapple’ (2,32). Porém, para ‘Pêra’ não houve
diferença significativa entre os tratamentos, apesar da putrescina a 100 μM tenha proporcionado um número de raízes
por brotos ligeiramente maior (2,8) do que as demais concentrações testadas. Desse modo, pode-se concluir que a
putrescina pode influenciar positivamente a formação e o alongamento de raízes em citros, mas a resposta pode ser
considerada genótipo-específica.
Apoio Financeiro: CAPES, FAPESB e IFS.
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Amplificação cruzada de marcadores
microssatélites (SSR) entre espécies de
Maracujazeiro (Passifloraceae; Passiflora)
Cerqueira-Silva, CBM1; Conceição, LDHCS1; Cardoso-Silva, CB2; Oliveira, AC2; Souza, MM1; Corrêa, RX1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
2
Lab. Biol. Geral, Departamento de Ciências Naturais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
[email protected]
1
Palavras-chave: Passifloras silvestres, Maracujá-amarelo, Marcadores moleculares, Transferência, Transferibilidade
O gênero Passiflora é amplamente distribuído na América e possui grande variabilidade genética a ser conservada e utilizada
em programas de melhoramento. O interesse econômico pelo gênero é relacionado principalmente com a produtividade
de frutos, merecendo destaque o maracujazeiro-‘amarelo’ (Passiflora edulis f. flavicarpa – ‘Pe’), espécie, deste gênero, mais
cultivada no mundo e predominante no mercado brasileiro. As passifloras também despertam interesse pela beleza de
suas flores e pelo seu potencial uso como fitoterápico. A variabilidade genética do gênero vem sendo caracterizada por
meio de estudos fenotípicos e moleculares. Contudo, a caracterização molecular de passifloras, pode ser considerada
ainda incipiente, visto o grande número de espécies ainda não estudadas e o potencial, ainda inexplorado para essas
espécies, de marcadores moleculares a exemplo de microssatélites (SSR). Uma justificativa para ausência de trabalhos
envolvendo SSR em passifloras está associada ao tempo e aos gastos para gerações destes marcadores. Uma estratégia
para minorar os custos relacionados ao uso destes marcadores é a utilização de primers, já anteriormente descritos para
algumas espécies do gênero, que possa vir apresentar amplificação cruzada em/entre as espécies de interesse. Diante do
exposto, objetivou-se avaliar a transferibilidade de 25 primers de SSR, desenvolvidos em ‘Pe’ (Molecular Ecology Notes,
v.5, n.2, p.331-33, 2005) para 13 espécies de passifloras (P. cincinata, P. cocciniea, P. kermesina, P. gardineri, P. rubra,
P. capsulares, P. misera, P. suberosa, P. nitida, P. watsoniana, P. bahienses, P. eichleriana e P. setacea). Para tanto, amostras de
DNA das 13 espécies testadas e de ‘Pe’ (controle positivo) foram submetidos à amplificação via PCR. Os produtos de
amplificação foram resolvidos em gel agarose (3%) e analisados para determinar a presença/polimorfismo de amplicons
SSR. Observou-se um percentual de amplificação cruzada entre 32 e 76%, sendo que 9 das 13 espécies apresentaram
amplificação superior a 52%. Os resultados mostraram que os primers desenvolvidos para identificar locos de SSR
em ‘Pe’ apresentam porcentagem considerável de amplificação cruzada com as espécies avaliadas. Portanto, os pares
de primers SSR avaliados possuem grande potencial para estudos genéticos no gênero Passiflora, tais como estudos de
variabilidade intra e interespecíficos, filogenia e mapeamento genético moleculares, etc. Desta forma, os fragmentos
amplificados serão separados em gel de poliacrilamida (6%) e novos ensaios envolvendo outros primers SSR e acessos/
espécies de passifloras estão sendo realizados.
Apoio Financeiro: FAPESB, UESC e CNPq.
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Identificação e freqüência de elementos
transponíveis transcricionalmente ativos em três
espécies de Coffea (Gentianales: Rubiaceae)
Lopes, FR1; Carazzolle, MF2; Pereira, GAG2; Colombo, CA3; Carareto, CMA1
1
Departamento de Biologia, UNESP – Universidade Estadual Paulista, São José do Rio Preto–SP
Departamento de Genética e Evolução, UNICAMP – Universidade Estadual de Campinas, Campinas–SP
3
Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Recursos Genéticos Vegetais, IAC – Instituto Agronômico de Campinas, Campinas–SP
[email protected]
2
Palavras-chave: C. arabica, C. canephora, C. racemosa, elementos transponíveis, atividade transcricional
Elementos transponíveis (TEs) são os principais componentes na evolução dos genomas de eucariotos. Sua atividade
é controlada por fatores relacionados ao próprio TE (eg. conservação em nível de seqüência e estrutural, número de
cópias), ao genoma hospedeiro (eg. controle transcricional) e a condições de estresse (eg. infecção por patógenos,
injúrias físicas e estresse abiótico). O Projeto Genoma Café Brasileiro (FAPESP, MAPA, CBP&DC) produziu 131.150
ESTs de Coffea arabica e 10.566 ESTs de C. racemosa oriundas de bibliotecas de cDNA de uma ampla variedade de
tecidos, estágios de desenvolvimento e tecidos vegetais submetidos a condições de estresse biótico e abiótico. As análises
em C. canephora foram realizadas em 12.607 ESTs somadas a 46.914 seqüências expressas produzidas pelo esforço
colaborativo do Centro de Pesquisa da Nestlé (França) e Universidade de Cornell (EUA), totalizando 50.255 ESTs.
Este estudo registra a identificação de elementos transponíveis transcricionalmente ativos em seqüências expressas nas
três espécies de Coffea pelas buscas por meio de palavras-chave, tais como: “transposon”, “transposase”, “polyprotein”,
“retrotransposon”, “retroposon”, “MITEs”, “LINEs”, “SINEs” e nomes de famílias (eg. “hAT”, “MuDR”, “En/Spm”).
Os hits obtidos nas buscas foram selecionados conforme um valor de cut-off estringente (E= e-30). As ESTs foram
classificadas em famílias de acordo com o melhor alinhamento usando o programa BLAST contra uma biblioteca
de nucleotídeos e aminoácidos de elementos de transposição de referência completamente caracterizados obtidas no
GenBank, RepBase e PubMed. Como resultado, de 191.921 ESTs de Coffea derivadas de 41 bibliotecas de cDNA,
333 (0,17%) clones são homólogos a TEs completamente caracterizados. Para C. arabica, a proporção de seqüências
homólogas a transposons (51%) foi similar a de retrotransposons (49%) (P<0,05). A quantidade de elementos expressos
das superfamílias Copia/Ty1 também foi similar à de Gypsy/Ty3 (P<0,05). Em C. racemosa, a proporção de seqüências
de transposons (3) foi igual a de retrotransposons (3) (P<0.05). Finalmente, a proporção de seqüências de transposons
(13%) e retrotransposons (87%) em C. canephora foi muito diferente (P>0,05). O mesmo foi observado em relação à
quantidade de TEs expressos da superfamília Gypsy/Ty3, que foi maior do que a de Copia/Ty1 (P>0,05). Estas diferenças
se devem a maior freqüência de elementos Gypsy/Ty3 nas bibliotecas de “Sementes – 18 semanas após a polinização”
(91%) e “Pericarpo – todos os estágios de desenvolvimento” (87%). Os clones foram classificados em famílias, de acordo
com o melhor alinhamento contra elementos completamente caracterizados, que possibilitou classificar os 102 clones
de C. arabica em 25 famílias, 224 clones de C. canephora em 19 e 6 clones de C. racemosa em quatro famílias. A maior
freqüência de elementos Gypsy/Ty3 pode estar associada com a expressão específica de apenas dois TEs: Dea1, descrito
em Ananas comosus e Retrosat, em Oryza sativa.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Desenvolvimento de um mapa genético em
feijoeiro utilizando marcadores microssatélites
Campos, T1,2,3; Sforça, DA1,2,3; Oblessuc, PR1,2,3; Cardoso, JMK3; Sousa, ACB1,2; Baroni, RM3;
Benchimol, LL3; Carbonell, SAM3; Chioratto, AF3; Souza, AP1,2
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG/UNICAMP), Campinas, SP
2
Depto. de Genética e Evolução – Instituto de Biologia (IB), UNICAMP, Campinas, SP
3
Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Recursos Genéticos Vegetais, Fazenda Santa Elisa, IAC, Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: Mapas genéticos, Microssatélites, Feijoeiro, SSRs
Microssatélites (SSRs) são marcadores baseados em seqüências repetitivas abundantes nos genomas de eucariotos,
caracterizados pelo alto grau de polimorfismo, distribuição aleatória e herança co-dominante. São transferíveis e
informativos, sendo que uma das maiores aplicações da tecnologia de marcadores é o desenvolvimento de mapas
genéticos. A localização das regiões do genoma responsáveis pela expressão das características e quantificação de sua
importância para a expressão do fenótipo, estudos de sintenia e clonagem de genes com base em mapas genéticos
são complementos importantes a serem considerados em programas de melhoramento. A cultura do feijoeiro
tem potencial a ser explorado para apresentar melhores condições em seu desempenho, no campo de produção, e
resistência a patógenos. O feijoeiro é uma leguminosa diplóide (2n=22) com um genoma relativamente pequeno
(65 pg por genoma haplóide). Programas de melhoramento da cultura têm grande interesse no desenvolvimento de um
mapa genético robusto, com o maior número de marcadores possíveis. Este trabalho teve como objetivo a construção
de um mapa genético em feijoeiro baseado apenas em microssatélites. O mapa genético foi estabelecido com base em
uma população F10 segregante, composta de 380 linhas endogâmicas, derivadas do cruzamento entre IAC-UNA e
Cal-143. Os produtos das amplificações foram verificados em géis de agarose 3%, corados com brometo de etídeo.
A genotipagem da população foi feita em géis de poliacrilamida 6%, corados com nitrato de prata. Foram testados
772 microssatélites, dentre locos publicados e desenvolvidos pelo grupo. O resultado dos testes foi de 277 (35,88%)
locos polimórficos entre os genitores da população. Até o momento, foram genotipados 138 marcadores na população
de mapeamento. Após a analise do teste de aderência (x2) e correção de Bonferroni, foram encontradas 92 marcas com a
segregação esperada de 1:1. Dentre as 92 marcas, puderam ser ligadas 83 marcas a 8 grupos de ligação, com uma média
de 10,375 microssatélites por grupo. O grupo de ligação mais saturado foi o B2, com 27 microssatélites. Ainda não foi
possível formar os grupos de ligação B1, B5 e B7. O mapa resultante cobre 1343,6 cM, com uma média de distância
para cada marcador de 16,18 cM. Entretanto, a distribuição dos locos foi variável, e vários grupos permaneceram com
poucas marcas. Espera-se, ainda, uma maior saturação do mapa com outros marcadores microssatélites, e assim, a
obtenção dos 11 grupos de ligação correspondentes.
Apoio: CNPq e FAPESP.
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Construção de um mapa de ligação
com marcadores microssatelites
(gSSR e EST – SSRs) em uma progênie de
cana-de-açúcar do programa cana IAC
Leite, DC1; Fávero, TM2; Sousa, BG3; Perecin, D1; Bidóia, MP2; Creste, S2;
De Rosa Jr, VE2; Xavier, MA2; Souza, AP4; Landell, M2; Pinto, LR2
1
UNESP – FCAV – Jaboticabal
Instituto Agronômico de Campinas – Centro de Cana
3
USP – Ribeirão Preto
4
Departamento de genética e Evolução – UNICAMP
[email protected]
2
Palavras-chave: Mapa de ligação, microssatélites, cana-de-açúcar
A construção de mapas de ligação possibilita a localização de regiões genômicas que controlam características agronômicas
de interesse para os programas de melhoramento genético. O objetivo deste trabalho foi o de construir um mapa
de ligação com base no cruzamento biparental entre o clone elite IACSP95-3018 e a variedade IACSP93-3046,
ambos pertencentes ao Programa de Melhoramento Genético de Cana-de-Açúcar do IAC. Cinqüenta e três locos de
microssatélites genômicos e funcionais (gSSR e EST – SSRs) foram abertos na população de mapeamento constituída de
192 indivíduos. O programa Join Map 3.0 foi utilizado para a construção do mapa adotando-se LOD>3.0, freqüência
de recombinação r<0.45 e função de mapeamento de Kosambi. O mapa obtido foi composto por 54 marcadores em
dose única (MDUs), os quais deram origem a 24 grupos de ligação e 6 grupos de homologia, sendo que 4 grupos de
ligação permaneceram independentes. Este mapa apresentou cobertura de 354 cM com uma distância media entre
marcadores de 6,5 cM. Dos 54 MDUs mapeados, 14 (10,3%) representam marcadores do tipo D1 (presente apenas
no genitor feminino IACSP95-3018), 18 (13,3%) marcadores do tipo de D2 (presente apenas no genitor masculino
IACSP93-3046) e 22 (16,2%) marcadores do tipo C (presente em ambos os genitores). A este mapa ainda serão
adicionados marcadores do tipo AFLP, os quais provavelmente, permitirão a ligação dos 82 MDUs que não foram
incorporados ao mapa preliminar.
Apoio financeiro: Fapesp, Programa Cana IAC.
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Identificação de marcadores do tipo
microssatélites associados aos parâmetros
agroindustriais em cana-de-açúcar
Fávero, TM1; Leite, DC2; Sousa, BG3; Pastina, MM4; Perecin, D2; Garcia, AAF4;
Bidóia, MP5; Souza, AP6; Creste, S5; De Rosa Jr, VE5; Pinto, LR5
Instituto Agronômico de Campinas – Centro de Cana
2
UNESP – FCAV – Jaboticabal
3
USP – Ribeirão Preto
4
Departamento de Genética – ESALQ - USP
5
Instituto Agronômico de Campinas – Centro de Cana
6
Departamento de Genética e Evolução - UNICAMP
[email protected]
1
Palavras-chave: QTLs, microssatélites, cana-de-açúcar
A produção de açúcar por hectare constitui o foco principal dos programas de melhoramento de cana-de-açúcar e depende
tanto da produção da cana colhida no campo como da concentração de açúcar (sacarose) contida no colmo. Uma progênie
do Programa de Melhoramento de Cana-de-Açúcar do IAC, derivada do cruzamento entre o clone IACSP95-3018 e
a variedade IACSP93-3046 está sendo utilizada para a identificação de marcadores moleculares (gSSRs e EST-SSRs)
associados aos componentes de produção (número de colmos, altura e diâmetro) e aos parâmetros tecnológicos Brix,
Pol e Fibra. Cento e trinta e cinco marcadores em dose única (derivados de marcadores do tipo microssatélites) foram
avaliados através de uma análise de marcas simples pelo teste da razão de máxima verossimilhança (LRT). Setenta e
três associações entre marcadores e características fenotípicas avaliadas em cana planta foram significativas ao nível de
5%. Destas, 20 associações foram identificadas para altura, 12 para número de colmos, 3 para diâmetro, 14 para Brix,
16 para Pol e 8 para Fibra. Estes resultados preliminares demonstram que a progênie de mapeamento apresenta potencial
para a identificação de marcadores associados às características agroindustriais em cana-de-açúcar.
Apoio financeiro: Fapesp, Programa Cana IAC.
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Comparação de métodos de agrupamentos
hierarquicos em populações
de retrocruzamentos
Campana, ACM1; Salgado, CC2; Nascimento, M1; Cruz, CD2; Ferreira, A2
Laboratório de Bioinformática – BIOAGRO, Departamento de Informática – Área de Estatística, Universidade Federal de Viçosa
2
Laboratório de Bioinformática – BIOAGRO, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Diversidade genética, correlação cofenética, matriz de dissimilaridade
A análise de agrupamento tem como objetivo dividir os elementos da amostra, ou população, em grupos de forma que
os elementos pertencentes a um mesmo grupo sejam similares entre si com respeito às variáveis (características) que neles
foram medidas, e os elementos em grupos diferentes sejam heterogêneos em relação às estas mesmas características. Estas
técnicas são de extrema importância em estudos sobre diversidade genética, com objetivo de identificar as combinações
híbridas de maior efeito heterótico e maior heterozigose, e ainda na avaliação do impacto da atividade humana na
biodiversidade (Cruz et. al, 2004). Existem várias técnicas hierárquicas aglomerativas, que diferem do modo no qual a
formação do grupo é realizada, como por exemplo os métodos: Ligação Simples; Ligação Completa; Ward; Mediana;
Ligação Média Dentro do Grupo; Ligação Média Entre Grupo (UPGMA); Grower; e Cetróide. Este trabalho teve
como objetivo estudar, utilizando populações com estrutura genética bem definida, a eficiência dos métodos citados,
comparando-os através do coeficiente de correlação cofenética (CCC). A significância do CCC foi avaliada a partir da
estatística qui-quadrado ao nível de 5%. Para este fim, foram simuladas duas populações para cada tipo de marcador
(dominante e co-dominante) e posteriormente efetuados cruzamentos, F1 e retro-cruzamentos, de forma que seja
conhecida a estrutura genética das populações e formação previsível dos grupos. Os índices de dissimilaridade utilizados
para as análises foram a Distância Binária de Sokal e índice Ponderado para os dados de natureza dominante e codominante, respectivamente. Percebe-se que para ambas as populações, natureza dominante e co-dominante, apenas
o CCC associado ao método de Grower diferiu-se significativamente dos demais. Além disso, este método foi o único
a não apresentar a configuração esperada do dendrograma.
Apoio Financeiro: CAPES e FAPEMIG.
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Estimação da taxa de cruzamento
em Stylosanthes guianensis utilizando
marcadores microssatélites
Santos, MO1; Chiari, L2; Resende, RMS2; Souza, AP3
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
2
Embrapa Gado de Corte, Campo Grande – MS
3
Instituto de Biologia, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: Microssatélites, Stylosanthes, forrageiras, taxa de cruzamento, autogamia
No Brasil, a pecuária bovina é baseada principalmente na utilização de pastagens para alimentação animal, sendo a
maioria destas cultivadas. Gramíneas do gênero Brachiaria têm sido as mais utilizadas pelos pecuaristas, juntamente
com algumas leguminosas de origem sul-americana. Dentre as leguminosas já testadas como pastagens, as do gênero
Stylosanthes têm se mostrado passíveis de utilização em regiões de solos de baixa fertilidade, apresentando, ainda, bons
resultados quando consorciadas a gramíneas. Estudos utilizando marcadores moleculares são de grande utilidade para
o programa de melhoramento de Stylosanthes, visto que faltam informações genéticas básicas de suas espécies. Neste
contexto, este trabalho teve como objetivo caracterizar e selecionar microssatélites para estimar a taxa de cruzamento
de acessos brasileiros de Stylosanthes guianensis. Para este propósito, a Embrapa Gado de Corte desenvolveu uma
população a partir de 20 plantas mães das quais 10 sementes foram colhidas para gerar a população de plantas filhas. O
DNA das 20 mães foi utilizado para os testes iniciais de amplificação e seleção dos marcadores polimórficos. A análise
desses microssatélites foi feita em géis de acrilamida 6% corados com prata. Foram caracterizados 46 microssatélites
desenvolvidos anteriormente, dos quais apenas três foram polimórficos nas mães. Além desses microssatélites, foram
testados 18 marcadores já disponíveis na literatura, dos quais apenas dois foram polimórficos. Até o momento, três
marcadores polimórficos foram genotipados nas progênies e utilizados para estimação da taxa de cruzamento utilizando
o programa MLTR (Multilocus Mating System Program). A taxa de cruzamento multiloco foi de 0,18 (0,05), indicando
predominância de autogamia. Os outros marcadores polimórficos também serão utilizados para melhorar a precisão
dessa estimativa. A informação sobre o sistema de cruzamento de S. guianensis será de grande utilidade para o programa
de melhoramento em andamento na Embrapa Gado de Corte, visto que permite a escolha do melhor método a ser
empregado.
Apoio Financeiro: Fapesp.
45
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Identificação da origem genética de plântulas
de sementes poleimbriônicas de mangueira
‘Ubá’ por meio de marcadores ISSR
Rocha, A1; Fernandes-Salomão, TM2; Salomão, LCC1; Siqueira, DL1
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: plântula zigótica, plântula nucelar, seleção massal, porta-enxerto, Mangifera indica
A mangueira ‘Ubá’ é produzida na Zona da Mata Mineira e é de grande importância para a agroindústria desta região.
Além disto, a sua semente poliembriônica pode ser utilizada para produção de porta-enxertos, pois possibilita a formação
de pomares uniformes dado que os embriões nucelares são geneticamente iguais à planta-mãe. Os viveiristas utilizam
a plântula mais vigorosa por acreditar, que esta seria nucelar, porém esta identificação pode ser falha considerando
que, um embrião zigótico pode se mostrar mais vigoroso que os nucelares devido ao vigor híbrido. O objetivo deste
trabalho foi identificar a origem genética, se zigótica ou nucelar, de plântulas oriundas de sementes poleimbriônicas de
mangueira ‘Ubá’ por meio de marcadores moleculares ISSR. Foram analisadas 117 plântulas oriundas de 30 sementes. O
DNA genômico destas plântulas foi extraído e amplificado com 8 primers ISSR. Para a análise dos dados comparou-se
o padrão ISSR apresentado pelas plântulas em relação ao apresentado pela planta-mãe. As plântulas com padrão ISSR
diferente em pelo menos três primers foram consideradas como sendo de origem zigótica. Observou-se a presença de
plântula zigótica em 18 sementes (60% das sementes avaliadas) e a plântula zigótica foi a mais vigorosa em seis sementes
(30% das sementes que apresentaram plântulas zigóticas). Estes resultados mostram que a plântula mais vigorosa nem
sempre é geneticamente igual à planta-mãe, pois em 20% das sementes avaliadas a plântula zigótica foi a mais vigorosa,
indicando existir variabilidade genética em pomares que utilizam mudas vindas de sementes, possibilitando a seleção
de materiais superiores por seleção massal. O marcador ISSR mostra se útil como ferramenta para identificação da
origem genética de plântulas de sementes poliembriônicas.
Apoio Financeiro: FAPEMIG.
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Incremento da diversidade alélica de
Arachis hypogaea pela introgressão gênica
a partir de parentes silvestres
Batista, ARS1,2; Moretzsohn, MC1; Custodio, AR1,4; Oliveira, MAP1; Guimarães, PM1, Leal-Bertioli, SC1; Bertioli, DJ3
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
Departamento de Biologia Celular, IB-Universidade de Brasília (UnB), Brasília, DF
3
Universidade Católica de Brasília, Campus II,Brasília, DF
4
Departamento de Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
[email protected]
2
Palavras-chave: Arachis, introgressão gênica, citogenética molecular, genotipagem, auto-necrose
Devido à sua origem, juntamente com barreiras de fertilidade com as espécies silvestres, diplóides, o amendoim cultivado
(Arachis hypogaea), que é tetraplóide, apresenta uma baixa diversidade genética, além de ser limitado quanto à diversidade
de algumas características de importância agronômica, tais como resistência a estresses abióticos e bióticos. Ao contrário
das espécies silvestres, que detém uma gama de diversidade genética, sobre a qual a seleção natural vem atuando.
De acordo com essas informações, um anfidiplóide sintético, derivado de uma espécie de genoma BB (Arachis gregoryi)
com outra de genoma AA (A. linearifolia), foi retrocruzado com o amendoim cultivado (A. hypogaea cv IAC-Caiapó),
com a proposta de introgredir genes silvestres em plantas cultivadas utilizando seleção assistida por marcadores. De
acordo com as informações acima, este trabalho tem como proposta a criação de linhagens de introgressão (ILs),
nas quais os segmentos exóticos doados pelo anfidiplóide sintético são ilhados em um “background” do genoma de
uma variedade elite. Após genotipagem com 45 marcadores microssatélites, foi verificado que, dos 150 indivíduos da
progênie do retrocruzamento um (BC1), apenas 15 eram híbridos. Desses quinze indivíduos, nove apresentaram vigor
suficiente para sobreviver até a maturidade. Algumas particularidades morfológicas foram observadas, como a ausência
de flores; pouca fertilidade, decorrente do mecanismo natural de auto-fecundação e amarelecimento, seguido de queda
da folha. Para esta última característica, foram realizadas análises microscópicas na tentativa de encontrar a presença de
algum fator patogênico. No entanto, não foi detectada a presença de vírus, bactérias ou fungos, como provável causa de
uma resposta auto-imune. Diante deste fato, suporta-se a hipótese de auto-necrose (síndrome da incompatibilidade).
A auto-necrose é um exemplo de fenótipo deletério causado por interações epistáticas que podem ser observadas em
muitos cruzamentos intra- e interespecíficos. Para investigar tal hipótese está sendo utilizada a ferramenta citogenética
molecular, para evidenciar a compatibilidade ou não dos segmentos genômicos introgredidos.
Apoio financeiro: Generation Ghallenge Program TL1.
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Estimativas de parâmetros genéticos
para três características agronômicas em
população híbrida de trigo duro
Del Guercio, AMF; Camargo, CEO
Centro de Análise e Pesquisa Tecnológica do Agronegócio dos Grãos e Fibras, Instituto Agronômico
[email protected]
Palavras-chave: Herdabilidades e correlações, produção de grãos, tolerância ao alumínio e altura das plantas
O trigo duro (Triticum durum L.), também conhecido como “trigo para macarrão”, caracteriza-se por apresentar uma
farinha amarelada (sêmola) adequada para o fabrico de massas. No Brasil ainda não ocorre seu cultivo extensivo devido,
principalmente, a problemas com sua adaptação aos solos ácidos, com níveis tóxicos de alumínio. Visando estimar os
valores de heterose e de heterobeltiose, graus de dominância e herdabilidades em sentido amplo e restrito para produção
de grãos, tolerância ao Al3+ e altura das plantas, bem como as correlações entre essas características, foram efetuados
cruzamentos entre os genótipos L33, tolerante ao alumínio (Al3+) e de porte alto e IAC-1003, sensível ao Al3+ e de porte
semi-anão. Plântulas representando os parentais, as gerações F1 e F2 e os retrocruzamentos para ambos os parentais,
foram testadas para a reação a 2mg L-1 de Al3+ em solução nutritiva. As plântulas, devidamente identificadas, foram
transplantadas para vasos em área telada, localizada no Centro Experimental de Campinas, do Instituto Agronômico.
Nas populações F1 e F2 somente ocorreu heterose para tolerância ao Al3+ e altura das plantas. Não houve heterobeltiose
para as três características nas populações avaliadas. Os graus de dominância para tolerância ao Al3+ e altura das plantas
foram de 0,81 e 0,99, respectivamente. Os valores das herdabilidades em sentido amplo e restrito para altura das
plantas foram altos (0,85 e 0,73); para o caráter tolerância ao Al3+, os valores das herdabilidades em sentido amplo e
restrito foram moderados (0,46 e 0,54); os valores das herdabilidades em sentido amplo e restrito para produção de
grãos apresentaram-se baixos (0,28 e 0,03). As correlações fenotípicas entre a tolerância ao Al3+ e a altura das plantas,
a tolerância ao Al3+ e a produção de grãos e entre a altura das plantas e a produção de grãos, foram todas positivas e
significativas. As correlações genéticas entre essas características foram de 0,78; -0,18 e -0,03, respectivamente. Os
resultados obtidos sugerem ser possível selecionar plantas de porte semi-anão e tolerantes ao Al3+ nas gerações iniciais e
com alto potencial produtivo nas gerações mais avançadas, desde que grandes populações segregantes sejam conduzidas,
para permitir a identificação dos genótipos desejáveis, oriundos de eventuais recombinações genéticas.
Apoio financeiro: FUNDAG e CNPq.
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Correlação entre caracteres agronômicos e de
resistência ao complexo de percevejos da soja
Santos, MF1; Möller, M1; Pierozzi, PHBP1; Arruda, MP1; Zucchi, MI2; Pinheiro, JB1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”/USP
2
Centro de Recursos Genéticos Vegetais, Instituto Agronômico de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: Glycine max, parâmetros genéticos, resistência a inseto, correlação, percevejos
Atualmente a cultura da soja assume o maior destaque no agronegócio brasileiro, sendo o complexo líder em exportações.
Diversos fatores afetam essa posição, estando entre eles os insetos pragas, com destaque para o complexo de percevejos
(Euschistus heros, Piezodorus guildinii e Nezara viridula). Assim, é de grande interesse a obtenção de cultivares
agronomicamente competitivas e resistentes a estes percevejos sugadores de vagens. Visando estudar esta característica,
o presente trabalho avaliou a geração F2 do cruzamento entre as cultivares IAC-100 (resistente) e Conquista (suscetível).
Para o presente trabalho foram avaliados um total de nove caracteres agronômicos e associados à resistência: período de
enchimento de grãos (PEG), acamamento (AC), valor agronômico (VA), retenção foliar (RF), número de vagens por
planta (NVP), índice percentual de dano por vagem (IPDV), sementes manchadas (SM), produtividade de grãos (PG)
e peso de cem sementes (PCS). Os valores de AC, VA e RF foram transformados utilizando a fórmula √x, enquanto
que para IPDV e SM foi empregado arcsen√(x/100). A geração F2 e os genitores foram avaliados num experimento
semeado em novembro de 2004, adotando-se o delineamento experimental de blocos ao acaso, com seis repetições,
sendo cada parcela representada por 12 plantas espaçadas 0,5 x 0,5m. Para as análises foram utilizadas as médias de
parcelas e obtidas as correlações fenotípicas e genotípicas entre os nove caracteres avaliados. O estudo das correlações
é de grande interesse, pois fornece parâmetros que possibilitam verificar a magnitude e o tipo de associação (direta
ou inversa) existente entre pares de caracteres. Foram obtidas correlações fenotípicas positivas para PEG e RF (0,95),
NVP e VA (0,99), RF e IPDV (0,86), RF e SM (0,99), e também valores negativos para RF e VA (-0,73), VA e IPDV
(-0,98), SM e VA (-0,83). Dessa maneira, verificou-se correlação negativa entre os caracteres ligados à produtividade
(VA e PG) e aqueles relacionados com danos causados pelos percevejos (RF, IPDV e SM).
Apoio Financeiro: Fapesp e CNPq.
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Caracterização parcial do gene de
resistência à mancha angular presente no
cultivar de feijoeiro-comum Ouro Negro
Sanglard, DA1; Balbi, BP1; Ribeiro, CAG1; Oliveira, MSG1; Rocha, GAF1; Boldt, AS1; Barros, EG1,2; Moreira, MA1,3
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agricultura (BIOAGRO), Universidade Federal de Viçosa
2
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Testes de alelismo, Pseudocercospora griseola, Phaseolus vulgaris, fontes de resistência, melhoramento genético
A mancha-angular, incitada pelo fungo Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, tem sido considerada uma
das principais doenças do feijoeiro. Fontes de resistência têm sido identificadas e caracterizadas. Para Minas Gerais foram
encontradas cinco principais: México 54, AND 277, MAR-2, Cornell 49-242 e BAT 332. Em trabalhos anteriores
conduzidos pelo Programa de Melhoramento Genético do Feijoeiro do BIOAGRO/UFV foram realizados estudos
independentes da caracterização dessas cinco variedades, encontrando-se herança monogênica dominante para todas
elas. Posteriormente, uma análise conjunta foi conduzida para entender a relação e a independência desses genes de
resistência. Os resultados evidenciaram uma maior complexidade que a encontrada nos estudos de herança. O programa
de piramidação de genes de resistência à mancha-angular, conduzido no BIOAGRO/UFV, tem utilizado também o
cultivar Ouro Negro como fonte de resistência para essa doença. O objetivo deste trabalho foi caracterizar o(s) gene(s) de
resistência à mancha angular presente em Ouro Negro perante as cinco fontes citadas. Estas foram cruzadas com o cultivar
Ouro Negro (doador de pólen) visando à obtenção de populações F2, as quais foram usadas para os testes de alelismo.
Para confirmação dos cruzamentos foram analisadas a cor e o tamanho das sementes F2, exceto no caso de Ouro Negro
x Cornell 49-242, onde foi utilizado o marcador molecular SCAR F101050a. Cada população F2 foi inoculada com uma
raça de P. griseola que apresentou reação de incompatibilidade simultânea aos dois parentais. As freqüências fenotípicas
foram testadas pelo teste χ2 (P<0,05), com o auxílio do programa GQMOL (www.ufv.br/dbg/gqmol/gqmol.htm).
Até o momento foram avaliadas as populações F2: Ouro Negro x AND 277 (raça 63.23), Ouro Negro x
MAR-2 (raça 31.17) e Ouro Negro x México 54 (raça 63.39) que apresentaram segregações (Resistência/
Susceptibilidade) de 15:1 (dois genes dominantes independentes) 9:7 (dois genes dominantes complementares) e
13:3 (dois genes epistáticos, um dominante e um recessivo), respectivamente. Estes resultados indicam que Ouro
Negro possui pelo menos um gene distinto das demais fontes de resistência testadas. Entendendo as relações alélicas
de diferentes fontes de resistência, o melhorista tem a oportunidade de escolher os genitores de forma a obter uma
variedade com a melhor combinação possível de genes de resistência.
Apoio Financeiro: CAPES e CNPq.
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Mapeamento de QTL’S em cana-de-açúcar
usando mapeamento por intervalo
Pastina, MM1; Gazaffi, R1; Mollinari, M1; Margarido, GRA1; Oliveira, KM3; Souza, AP3; Garcia, AAF2
Aluno(a) de Pós-graduação, ESALQ, USP
Departamento de Genética, ESALQ, USP
3
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética - CBMEG, UNICAMP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: mapas genéticos, poliplóides, caracteres quantitativos
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) representa para o Brasil uma importante fonte de renda, emprego e energia, com
participação significativa na economia nacional. Com o surgimento dos marcadores moleculares, tornou-se possível
compreender melhor a herança dos caracteres poligênicos, devido à sua aplicação nos estudos sobre QTL’s, ou locos
que controlam caracteres quantitativos. Atualmente, existem inúmeras metodologias disponíveis para o mapeamento de
QTL’s, incluindo Mapeamento por Intervalo (simples e composto), métodos bayesianos e Mapeamento de Múltiplos
Intervalos. No entanto, essas metodologias não estão disponíveis para muitas espécies, como é o caso da cana-deaçúcar, em que a obtenção de linhagens endogâmicas não é viável. Nesse caso, são utilizadas populações F1 segregantes
(irmãos completos), como base para a construção de mapas genéticos e o mapeamento de QTL’s. O presente trabalho
teve por objetivo detectar, estimar os efeitos e a posição de possíveis QTL’s para cana-de-açúcar, com o uso de um novo
modelo de Mapeamento por Intervalo desenvolvido especificamente para essa espécie. Os caracteres avaliados foram:
PCC (POL% cana), % de fibra, TPH (toneladas de POL por hectare) e TCH (toneladas de cana por hectare). Os
dados utilizados são referentes a uma progênie F1, constituída por 100 indivíduos, derivada do cruzamento entre duas
variedades pré-comerciais (SP80-180 x SP80-4966). Para a construção do mapa genético, definiu-se freqüência de
recombinação 0,35 e LOD 5, como sendo os melhores critérios para a formação dos grupos de ligação. As distâncias de
mapeamento, expressas em centiMorgans (cM), foram calculadas com base na freqüência de recombinação por meio da
função de Kosambi. Ao final da etapa de mapeamento, foi obtido um mapa genético com 192 cromossomos. Os QTL’s
que apresentaram efeitos com LOD superior a 3 foram considerados significativos. Tal análise resultou na detecção de
possíveis QTL´s localizados nos cromossomos 1A, 1B, 35, 51 e 191 para a característica % de fibra; cromossomos 1A,
1B, 34 e 191 para TCH; cromossomos 1A, 1B, 34 e 35 para TPH; e nos cromossomos 1A, 33, 35, 191 para PCC,
sendo que em cada cromossomo foi detectado um QTL associado aos respectivos caracteres. Foi possível estimar os
efeitos e as fases de ligação para todos os QTL’s mapeados. Os resultados comprovam que a adoção do novo modelo
foi muito vantajosa, uma vez que a realização dessas análises usando marcas individuais mostraram resultados muito
inferiores. Provavelmente, os QTL’s encontrados nos cromossomos 1A, entre os marcadores SMC36C2 e AGGCTT89c;
1B, entre os marcadores ESTB65m1D2 e ACACTT81c; e 34, entre os marcadores ESTA63m3D2 e ESTB35m2C,
para as características TCH e TPH, tratam-se de um mesmo QTL com efeito pleiotrópico.
Apoio financeiro: CNPQ.
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Caracterização molecular de genótipos
tetraplóides conservados no germoplasma de
Panicum maximum, uma forrageira tropical
Sousa ACS1; Jank, L2; Boaventura, LB1; Silva, GMB1; Jungmamm, L1; Souza, AP1
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia,
UNICAMP, CP 6010, CEP 13083-875, Campinas, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Forrageiras, microssatélites, marcadores moleculares, Panicum maximum
Panicum maximum é originária do Sudeste Africano, e está sendo avaliada no Brasil desde 1984. Devido a sua excelente
adaptação e produtividade, esta espécie se dispersou no Brasil e ficou conhecida como capim Colonião. O P. maximum
ocupa hoje uma posição de destaque na pecuária brasileira, por apresentar elevada produção e qualidade, ser de fácil
propagação por sementes e ser altamente palatável ao gado. Por causa da importância e do potencial desta espécie
nas pastagens cultivadas brasileiras, este trabalho tem por objetivo caracterizar genótipos conservados do banco ativo
do germoplasma de P. maximum, através de marcadores microssatélites, visando gerar informações que serão capazes
de auxiliar no programa de melhoramento, reduzindo o custo e o tempo de lançamento de novos cultivares. Foram
utilizados 50 pares de primers, para caracterizar vinte e cinco genótipos tetraplóides de P. maximum, pertencentes ao
banco ativo do germoplasma da Embrapa gado de Corte-MS. As reações de PCR foram realizadas para um volume
final de 25 µl, contendo: 20mM de Tris-HCl pH 8,4; 50mM de KCl, 1,5mM de MgCl; 0,15mM de cada dNTP;
0,8mM de primers (forward e reverse); 10ng de DNA e 0,1U de Taq DNA polimerase, em termocicladores PTC 100
da MJ Research. O programa utilizado para amplificação consistiu de: 94°C por 1 minuto, 30 ciclos de 94°C 1 minuto
seguido de 60°C 1 minuto, 72°C por 1 minuto e uma extensão final de 72°C por 5 minutos. Os produtos amplificados
foram analisados inicialmente em géis de agarose TBE 3%, e posteriormente em géis desnaturantes de acrilamida
6% corados com nitrato de prata. Para realizar o estudo dos locos dos microssatélites entre os diferentes genótipos,
foi calculado o valor de PIC, o qual fornece uma estimativa do poder discriminatório de cada loco. Para as análises
de divergência genética foi utilizado o programa NTSYS-PC versão 2.1. O número de alelos/loco variou de um a dez
alelos. Os menores valores de PIC foram encontrados para os microssatélites 2PMc125 (PIC = 0,13) que apresentou o
motivo (GTT)8, e 2PMc198.1 (PIC = 0,27) portador do motivo (CTTTA)3. Os maiores valores de PIC foram obtidos
para os microssátelites 2PMc222 (PIC = 0,92), portador do motivo (PIC = GA)8, e 2PMc144 (PIC = 0,89) o qual
possui o motivo (GT)13. Através do dendrograma, foi possível observar claramente o alto grau de polimorfismo entre
os genótipos de P. maximum. Todos os genótipos avaliados foram coletados no Leste da África (sul do Quênia e norte
da Tanzânia), por isso não houve correlação entre distância genética e a localização. Os genótipos de P. maximum
(T21, T110 e T77) agruparam separadamente dos demais. Eles são possivelmente híbridos naturais entre P. maximum
e P. infestum. Isso comprova a eficiência dos marcadores microssatélites para determinar o polimorfismo e a diversidade
genética dentro da espécie
Apoio: CNPq e FAPESP.
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Comportmento de acessos de maxixe
quanto a germinação de sementes
Silva, ML1; Santos, MAC2; Queiroz, MA2; Santos, AL2; Oliveira, RS2; Silveira, LM2; Ferreira, MAJF3; Wenzel, O2; Neto, ISL2;
Benko-Isepon, AM1
Universidade Federal de Pernambuco – Programa de Pós-Graduação em Genética
2
Universidade do Estado da Bahia – DTCS, Campus III
3
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
[email protected]
1
Palavras-chave: Cucumis anguria, dormência, evolução
O maxixe pertence à família Cucurbitaceae e é originária do continente africano, tendo sido introduzido no Brasil pelos
escravos. Inicialmente foi cultivado nas hortas das senzalas, sendo disseminado para o interior do Nordeste brasileiro
tendo permanecido nas áreas da agricultura familiar. No entanto, diferentemente da outras espécies de cucurbitáceas,
também introduzidas do continente africano como Citrullus spp. e Cucumis melo, o maxixe apresenta uma forte dispersão
de sementes, principalmente feita por animais diversos fazendo com que as sementes fossem expostas à germinar em
diferentes ambientes. Nessas condições, sementes com características evolutivas mais favoráveis como, por exemplo,
dormência, seriam favorecidas no sentido de deixar descendentes, pois, as sementes sem essa características germinariam
de imediato e, em regiões semi-áridas, a maior parte do Nordeste brasileiro, não teriam condições de completar o
ciclo. No entanto, as sementes com dormência permaneceriam por logo tempo e quando o próximo período chuvoso
iniciasse, aí germinariam e teriam condições de deixarem descendentes. Assim sendo, visando examinar as características
de germinação de treze acessos de maxixe coletados em diferentes regiões do Nordeste brasileiro foram estudados. Para
tanto, trinta sementes de cada acesso foram semeadas em bandejas de polietileno preenchidas com substrato comercial
Plantmax, com irrigação diária, sendo colocada uma semente por célula. A leitura da germinação foi efetuada diariamente
para verificar a germinação de cada semente por célula. Três acessos começaram a germinar aos seis dias após o semeio,
dois aos sete dias, dois aos nove dias, quatro aos dez dias, um aos quinze dias e um aos sessenta e dois dias. Considerando,
que alguns acessos foram coletados há cerca de 17 anos o acesso que germinou tardiamente pode ser explicado pela perda
de vigor. Contudo, alguns acessos que oram coletados na mesma época e tiveram o mesmo período de conservação nas
mesmas condições apresentaram germinação aos seis dias após o semeio, o que sugere que o acesso tardio apresente genes
para o caráter dormência. O caráter de dormência das sementes também foi evidenciado em outros acessos, pois apesar
de iniciarem a germinação com poucos dias após o semeio (15 dias ou menos) apresentaram germinação de sementes
por mais de 50 dias e em caso, até os 60 dias após o inicio da germinação. Dessa forma os dados sugerem que o caráter
dormência apresenta razoável freqüência nos acessos de maxixe, o que explica como a espécie está se tornando silvestre.
As plantas que deixam os frutos no campo até sua completa decomposição também são favorecidas pela dormência,
pois as sementes liberada a partir desse processo serão integradas aos chamados bancos de sementes no solo e germinam
no próximo período chuvoso e assim tem permitido a evolução da espécie no Semi-Árido brasileiro.
Apoio Financeiro: FAPESB; CNPq; UNEB; UFPE.
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Divergência genética em linhagens de milho
em alto e baixo nitrogênio
Lima, RO1; Miranda, GV1; Souza, LV2; Andrade, JJ1, Galvão, JCC1
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa
2
Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: nitrogênio, diversidade, Zea mays L., eficiência, raiz
O cruzamento de linhagens selecionadas em condições de baixa disponibilidade de nitrogênio é uma maneira eficiente
de se obter híbridos mais aptos a ambientes com estresse de N (Presterl et al. 2002). Outro fator relevante na seleção de
linhagens é a presença de divergência genética entre essas de modo que possa explorar a heterose no cruzamento destas.
Assim, este trabalho tem como objetivo estudar a divergência genética em linhagens de milho em ambientes de alto e
baixo nitrogênio. Foram avaliadas, trinta linhagens endogâmicas de milho, provenientes do banco de germoplasma do
Programa Milho® UFV. O ensaio foi instalado no delineamento inteiramente casualizado, com duas repetições. As parcelas
foram constituídas de vasos de polietileno de cinco dm3 de volume, preenchidos com areia lavada. A fertilização utilizada
foi feita com solução nutritiva de Hoagland completa e modificada para nitrogênio, nos ambientes de alto e baixo N,
respectivamente. A divergência genética foi estudada pelo método de Tocher, usando a distância de Mahalanobis como
medida de dissimilaridade. As plantas foram colhidas quando apresentavam quatro folhas completamente desenvolvida.
Foram avaliadas características do sistema radicular, parte aérea e eficiência do uso de nitrogênio (EUN, g2. mg), dado
pela expressão EUN=(MST)2/CNT, onde MST é matéria seca total e CNT conteúdo de nitrogênio total na planta.
Houve diferença significativa a 1% de probabilidade pelo teste F, para todas as características avaliadas. A análise da
contribuição relativa das características mostrou que as características que mais contribuíram para diversidade genética
foram eficiência do uso do nitrogênio (49,75%), matéria seca total (24,38%) e matéria seca parte aérea (16,57%) em
alto nitrogênio. Já em baixo nitrogênio, as características: matéria seca da raiz (49,08%), matéria seca total (25,39%),
matéria seca da parte aérea e EUN ambas com 12,00 %, foram as que mais contribuíram para a diversidade genética.
Foram formados sete grupos divergentes de linhagens em alto nitrogênio e seis grupos no ambiente de baixo nitrogênio.
Não houve muita semelhança entre as linhagens agrupadas no ambientes de baixo e alto nitrogênio com exceção para
o grupo um, sendo que no alto nitrogênio formaram sete grupos divergentes e no baixo, apenas seis. Conclui-se que
a análise divergência genética deve-se ser realizada no ambiente especifico, visando identificar linhagens divergentes
em cada ambiente.
Apoio financeiro: CAIXA, Fapemig.
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Progresso genético do feijoeiro no estado
de São Paulo entre 1989 e 2007
Chiorato, AF1,2; Carbonell, SAM2; Fonseca Júnior, NS3; Pinheiro, JB4
Pós- Graduação em Genética e Melhoramento de Plantas - Escola Superior de Agricultura “ Luiz de Queiroz” - ESALQ/USP
2
Centro de Análise e Pesquisa Tecnológica do Agronegócio dos Grãos e Fibras – Instituto Agronômico – IAC
3
Instituto Agronômico do Paraná – IAPAR
4
Departamento de Genética - Escola Superior de Agricultura “ Luiz de Queiroz” - ESALQ/USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, progresso genético, seleção
O Brasil destaca-se na produção mundial de feijão, mas a média nacional de produtividade é considerada baixa,
em torno de 822 kg.ha-1. Os programas de melhoramento genético procuram desenvolver genótipos mais estáveis e
produtivos, sendo que para isto buscam aumentar a tolerância a pragas, doenças e possíveis adversidades climáticas. No
programa de melhoramento genético de feijoeiro do Instituto Agronômico de Campinas (IAC) foram disponibilizadas
para o setor produtivo 32 cultivares de feijoeiro, contribuindo para o aumento da produtividade média no Brasil e,
principalmente, no Estado de São Paulo. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o progresso genético
obtido para produtividade do feijoeiro com a pesquisa desenvolvida entre os anos de 1989 a 2007 pelo programa de
melhoramento genético do IAC. Foram avaliados 211 experimentos (Ensaios de VCU) entre os anos de 1989 a 2007.
Um total de 134 linhagens avançadas, distribuídas em 10 ciclos finais de avaliação foram conduzidas em três épocas de
semeadura do feijão: época das águas com 62 experimentos, época de inverno com 85 experimentos e época da seca com
64 experimentos. O progresso genético foi estimado através da análise de regressão linear a partir da obtenção das médias
ajustadas das linhagens utilizadas nos experimentos de VCU. Com a obtenção de médias ajustadas, a metodologia
diminuiu os efeitos ambientais, da interação genótipos por ambiente e do erro experimental nas estimativas de
progresso genético. No período considerado entre os anos de 1989 a 2007, o ganho genético foi positivo e significativo
estatisticamente com 87,85 kg/ha/ciclo final de seleção. Neste período de pesquisa (19 anos), obteve-se um ganho
absoluto de 46,23 kg/ha/ano representando um ganho relativo de 4,75% kg/ha/ano. Entre os anos de 1989 e 2007 a
área ocupada apenas com sementes certificadas de feijão no Estado de São Paulo foi de 23.790 hectares. Considerando
o progresso genético médio obtido de 46,23 kg/ha/ano, tem-se uma estimativa anual de crescimento na produção de
grãos de 1.099.811 kg, representando um aumento de 18.330 sacas de 60 kg. Assim, verifica-se que a contribuição da
pesquisa no desenvolvimento de genótipos superiores, disponibilizados pelo IAC para os agricultores, é significativa e
eficiente. Isto justifica os investimentos realizados para a condução do programa de melhoramento genético de feijoeiro
no estado de São Paulo.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Diversidade genética do banco de
germoplasma de Brachiaria humidicola,
uma gramínea forrageira tropical
Vigna, BBZ2; Jungmann, L1,2; Paiva, J2; do Valle, CB1; Souza, AP2
Laboratório de Biotecnologia de Plantas, Embrapa Gado de Corte, CP 154, CEP 79.002-970. Campo Grande, MS, Brasil
2
CBMEG, Universidade Estadual de Campinas, CP 6010, CEP 13.083-875, Campinas, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Brachiaria humidicola, diversidade genética, germoplasma, microssatélites
Com cerca de 177 milhões de hectares cobertos por pastagens nativas e cultivadas, o Brasil é, atualmente, o maior
produtor e exportador de carne bovina no mundo. Dentre as forrageiras utilizadas no país, o gênero africano Brachiaria
é o mais plantado. A espécie Brachiaria humidicola vem sendo utilizada em todo o país e está incluída no programa
de melhoramento da Embrapa Gado de Corte, onde está localizado o seu banco de germoplasma. O conhecimento
da variabilidade genética é importante para garantir a manutenção desta, para obter informações sobre o sistema de
reprodução, para o estabelecimento de estratégias que visem à conservação da espécie e para a seleção de genótipos com
aspectos agronômicos de interesse. Com essa finalidade, foram caracterizados os 58 acessos de B. humidicola pertencentes
ao banco de germoplasma desta espécie, juntamente com duas cultivares comerciais – Tupi e B. humidicola comercial,
a partir de 14 locos microssatélites polimórficos desenvolvidos por nosso grupo. Os locos apresentaram de quatro a
dezessete alelos (média de 10), seus valores de Conteúdo de Polimorfismo (PIC) variaram entre 0,5454 e 0,857, com
valor médio de 0,7219, e o Poder Discriminatório (PD) dos locos variou entre 0,3311 e 0,9706, com valor médio de
0,8155. Estes dados confirmam a validade dos locos para a análise dos acessos. Devido à poliploidia do gênero, os dados
foram coletados como para marcadores dominantes e foi calculado o coeficiente de similaridade por Simple Matching.
Uma análise SAHN (Sequencial, Aglomerative, Hierarchical and Nested clustering methods) foi realizada utilizando-se o
método UPGMA (Unweighyted pair-group method, arithmetic average) para agrupamento, as quais foram feitas com
o programa NTSyspc v.2.1. O dendrograma resultante permitiu a distinção dos acessos em seis grupos principais: o
primeiro com o genótipo H31, que é o mais divergente em relação aos outros grupos e o único acesso sexual de todo
o germoplasma (67,5% de similaridade), o segundo grupo com os genótipos H16, H26 e Tupi (84% de similaridade),
o terceiro grupo com os genótipos H29, H33, H35 e H36 (91% de similaridade), o quarto grupo com os genótipos
H34 e H46 (93% de similaridade), o quinto grupo com os genótipos H03, H04, H08, H09, H10, H11, H12, H21,
H23, H24, H25, H42, H43, H44, H106 e H124 (80% de similaridade), e o sexto grupo com os outros genótipos,
apresentando 77% de similaridade. Os acessos H05 e H07 apresentaram 100% de identidade, assim como os acessos
H125 e H126. Analisando-se o número de cromossomos de cada acesso, observamos que, embora alguns grupos
apresentem somente acessos com o mesmo número cromossômico, não existe correlação direta entre a ploidia e os
grupos. A análise com os marcadores microssatélites permitiu diferenciar os acessos de B. humidicola e caracterizar a
diversidade genética dentro do material.
Apoio Financeiro: Fapesp, Embrapa, CNPq, Unipasto e Fundect-MS.
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Seleção de genótipos resistentes
a Phytophthora palmivora em uma
população segregante de cacaueiro
Santos, ESL1; Silva, CL2; Pimenta Neto, AA2; Clement, DPL2; Luz, EDMN2
Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular – Universidade Estadual de Santa Cruz
2
Setor de Fitopatologia, Centro de Pesquisa do Cacau (CEPEC/CEPLAC)
[email protected]
1
Palavras-chave: podridão-parda, resistência genética, Theobroma cacao, teste foliar, cacaueiro
A podridão parda do cacaueiro causada por Phytophthora spp., é considerada uma das principais doenças da cultura,
uma vez que ocorre em todas as regiões produtoras de cacau do mundo. A obtenção de genótipos resistentes de cacau
é desejável no controle desta enfermidade por minimizar o uso de fungicidas químicos, prejudiciais ao meio ambiente,
além de serem úteis em programas de melhoramento genético. Objetivou-se neste trabalho caracterizar o gradiente de
resistência de uma progênie F2 (Sca6 X ICS1) a Phytophthora palmivora, através do teste de disco foliar. Para tanto,
folhas de 229 genótipos correspondentes à progênie F2, estabelecida em casa de vegetação e de quatro testemunhas
disponíveis no banco ativo de germoplasma do CEPEC/CEPLAC, foram coletadas durante a manhã. Vinte discos
foliares de 1,5 cm de diâmetro foram obtidos de cada indivíduo e acondicionados em bandejas forradas com espuma
esterilizada úmida. Cada disco foliar foi inoculado com 0,2 mL de suspensão de zoósporo (3x105 zoósporo/mL) de
Phytophthora palmivora. Após inoculação as bandejas foram fechadas a fim de manter ausência de luz e umidade
relativa próxima de 100%. O progresso da doença foi avaliado por meio de escala de seis pontos aos 7 dias após a
inoculação e os dados submetidos à análise de variância (ANOVA) e testes de comparação de médias (Scott-knott e
Mann-whitney). Análises estatísticas indicaram existir diferença entre os genótipos avaliados (p < 0,0001; ANOVA),
sendo os mesmos agrupados em 10 clusters (p < 0,05; scott-knott), cujas médias variaram de 1,2 a 4,9. A freqüência dos
genótipos apresenta maior número de indivíduos nos cluster intermediários (clusters 5 e 6). Genótipos contrastantes,
selecionados por meio de índice de seleção de 10%, apresentaram gradiente de sintomas estatisticamente diferentes
(p < 0,0001; Mann-whitney) sendo as médias dos genótipos mais resistentes e mais susceptíveis 2 e 4,7 respectivamente.
Os resultados indicam gradiente de resistência à Phytophthora palmivora na progênie avaliada, podendo esta ser utilizada
em futuros programas de melhoramento da cultura.
Apoio Financeiro: FAPESB, CNPq.
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Herança da resistência à gomose
de Phytophthora em citros
Faldoni, L1; Cristofani-Yaly, M1; Campos, TMP1; Agnello Júnior, J1; Sasseron, RG1; Bastianel, M1; Targon, MLPN1; Machado, MA1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC, Cordeirópolis, 13.490-970, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: porta-enxertos, gomose, híbridos, citros, resistência
A gomose de Phytophthora, causada principalmente por Phytophthora parasitica, é uma das principais doenças dos
citros (Citrus spp.). Programas de melhoramento visando obtenção de plantas resistentes a gomose exigem informações
detalhadas sobre o tipo de herança e a localização de genes de resistência no genoma. Fontes de resistência às doenças
podem ser encontradas em gêneros correlatos a citros como Poncirus sp. Esse estudo objetivou a avaliação da resistência
à gomose em uma população de híbridos de limão Cravo (suscetível) vs citrumelo Swingle (resistente ou tolerante).
Uma população de 94 híbridos e os parentais foi estabelecida em casa de vegetação e inoculada com Phytophthora
parasitica por meio de inserção de agulha infestada com micélio. A inoculação foi realizada em hastes de plantas que
apresentavam dois anos de idade. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com três repetições. A
avaliação foi realizada após dois meses da inoculação através de medição do comprimento e da largura das lesões. A
análise de variância detectou efeito significativo (0,001<p<0,05) para genótipo. A avaliação da resistência dos híbridos
à gomose, em condições de casa de vegetação, indicou a baixa herdabilidade (h2 =0,24) do caráter. A característica
quantitativa mensurada está sendo empregada para a identificação/localização de QTL (Quantitative Trait Loci) em
mapas de ligação construídos com marcadores moleculares para ambos os parentais.
Apoio: Fapesp e CNPq.
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Construção de mapas genéticos em
progênies de irmãos completos usando
Cadeias de Markov Ocultas
Mollinari, M1; Margarido, GRA1; Garcia, AAF1
Departamento de Genética, ESALQ/USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Estimativas mutiponto, fase de ligação, fração de recombinação
Os mapas genéticos são ferramentas de grande importância para o estudo detalhado da arquitetura genética dos
caracteres quantitativos. Geralmente, esses mapas são obtidos usando populações experimentais oriundas de linhagens
endogâmicas, como retrocruzamentos e populações F2. Para muitas espécies, cana-de-açúcar, citros, seringüeira e
diversas espécies florestais, não há linhagens é disponíveis e as análises são realizadas em populações geradas através do
cruzamento de indivíduos não endogâmicos. Nesse caso, um único loco pode apresentar até quatro alelos, há diferentes
tipos de segregação e as fases de ligação entre os marcadores também devem ser estimadas. O presente trabalho teve como
objetivo desenvolver um método para obtenção simultânea das estimativas multiponto das frações de recombinação, das
fases de ligação e da verossimilhança de uma dada ordem de marcadores via Cadeia de Markov Oculta. Para a avaliação
do método, foram simulados mapas combinando marcadores com segregações 1:1:1:1 (tipo A), 1:2:1 (tipo B), 3:1
(tipo C) e 1:1, sendo o genitor 1 e 2 heterozigoto (tipos D1 e D2, respectivamente). Os mapas simulados apresentaram
de 4 a 6 marcadores, dependendo da combinação de marcadores escolhida, com distância fixa de 5 cM. Para cada
situação foram simuladas 100 populações com dois tamanhos (n=100 e n=300). Os marcadores foram ordenados com
base na verossimilhança. Os resultados mostraram uma boa eficiência do método em todas combinações de marcadores
analisadas. Para combinações que apresentavam apenas marcadores dos tipos A, B, C e D1, 99% dos mapas obtidos
apresentaram ordens idênticas à simuladas. Nos casos que apresentavam misturas de marcadores dos tipos A, B, C, D1 e
D2, com estes dois últimos ocupando posições não adjacentes, 88,5% dos mapas apresentaram ordens corretas. Quando
os marcadores D1 e D2 ocupavam posições adjacentes, que é o caso mais difícil de se analisar, foram verificadas 77,8%
de ordens corretas. Em todos os casos as distâncias estimadas foram próximas das simuladas e as fases sempre foram
estimadas corretamente. Vale ressaltar que, desde que haja informação nos demais marcadores, o modelo usado permite
o cálculo da fração de recombinação entre marcadores dos tipos D1 e D2, o que não é possível através de estimativas
de dois pontos. A utilização da verossimilhança como critério para a ordenação dos marcadores mostrou-se bastante
adequada. Conclui-se que o uso desse novo método pode ser utilizado para construção de mapas de ligação confiáveis,
integrando diversos tipos de marcadores com diferentes tipos de segregação.
Apoio financeiro: CNPq.
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Seleção simultânea para caracteres
relacionados à qualidade de sementes,
em progênies de Tabebuia roseo-alba
Santos, FW¹; Tung, ESC¹; Rodrigues, CJ²; Moraes, SMB¹; Sebbenn, AM³; Moraes, MLT¹
¹Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP
²Companhia Energética de São Paulo - CESP
³Instituto Florestal
[email protected]
Palavras-chave: Ipê-branco, melhoramento florestal, conservação genética, parâmetros genéticos, população natural
Diante do atual cenário de devastação da vegetação dos biomas brasileiros, torna-se de extrema importância a adoção
de programas que visem a conservação genética das espécies vegetais nativas, seja para a manutenção das áreas ainda
preservadas, ou para a recuperação de áreas degradadas. O ipê-branco (Tabebuia roseo-alba) é uma espécie com grande
potencial de aproveitamento para a preservação da vegetação nativa do cerrado. Em função de sua adaptação a terrenos
secos e pedregosos, é muito útil para reflorestamentos nesse tipo de ambiente, destinados à recomposição da vegetação
arbórea. Nesse sentido, o presente trabalho teve por objetivo estimar o ganho genético com a seleção simultânea
das progênies mais vigorosas de T. roseo-alba, tendo por base caracteres relacionados à qualidade de sementes. Para
tal, foram coletadas sementes de 27 progênies, procedentes de Selvíria-MS, em fevereiro de 2007. O delineamento
utilizado foi inteiramente ao acaso, com 27 tratamentos (progênies), distribuídos em 4 repetições, sendo avaliados os
caracteres condutividade elétrica (CO), massa de 100 sementes (MS) e germinação (Ge). As estimativas dos parâmetros
genéticos e em especial o índice baseado na soma de postos ou ranks foram obtidas utilizando-se o programa GENES.
As médias gerais obtidas foram de 173,1 µS.cm-1.g-1 para a CO, 1,34 g para MS e 74,55 % para Ge. Os coeficientes de
variação genotípica entre progênies (CVgp) foram de 63,72%, 25,20% e 21,20%, para CO, MS e Ge, respectivamente,
evidenciando a existência de variabilidade genética significativa entre as progênies para os três caracteres estudados. A razão
CVg/CVe, que indica a precisão do experimento, foi de 3,70 para CO, 3,14 para MS e 3,26 para Ge. A herdabilidade
estimada, em nível de médias de progênies, foi alta para todos os caracteres, com valores de 98,21% para CO, 97,53%
para MS e 97,73% para Ge. Para a estimativa de ganho genético por seleção, utilizou-se o índice baseado em soma de
ranks, com seleção de 30% (8 melhores progênies) Os valores de ganho, por seleção, em porcentagem, obtidos foram de
63,98 % para CO; 10,65% para MS e 14,02% para Ge, sendo o ganho total obtido com os três caracteres de 39,31%.
Na população de T. roseo-alba estudada, ficou evidenciado que o caráter Condutividade Elétrica, por apresentar maiores
estimativas para a razão CVg/CVe, herdabilidade e coeficiente de variação genética, seria o caráter mais indicado para a
seleção. Porém, com a utilização do índice com base na soma de postos ou ranks foi possível selecionar progênies com
ótima performance em relação aos três caracteres analisados CE, MS e Ge, maximizando os ganhos e permitindo a
utilização das mesmas em programas de melhoramento florestal a partir da população de T. roseo-alba estudada, visando
a ocupação de indivíduos desta espécie em áreas degradadas por ação antrópica.
Apoio financeiro: CNPq.
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Análise dialélica do número de perfilhos em
trigo sob estresse de calor
Moura, LM1; Souza, RS1; Fonseca, GM1; Franco, MO1; Machado, JC1; Assis, JC1; Souza, MA1
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: perfilhamento, capacidade de combinação, estresse de calor
O número de perfilhos é um dos componentes de rendimento que mais influenciam a produtividade final em trigo. A
obtenção de informações sobre o controle genético de perfilhamento, em condições de alta temperatura, pode tornar
mais eficientes os programas de melhoramento a serem conduzidos. Objetivou-se com esse trabalho estimar a capacidade
geral e capacidade específica de combinação para o caráter número de perfilhos em trigo sob condições de estresse
térmico e identificar genitores com alta freqüência de alelos favoráveis para o caráter em questão. Os experimentos foram
conduzidos em casa de vegetação pertencente ao Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de Viçosa, com o
plantio realizado em fevereiro de 2008 (simulando estresse de calor). Utilizou-se 12 genitores, que foram estratificados
em dois grupos, conforme suas aptidões de cultivo e qualidade dos grãos. Realizou-se a análise de variância dialélica
adaptada a dialelos parciais. No desdobramento dos efeitos de tratamento em capacidade geral de combinação (CGC)
dos grupos I e II e capacidade específica de combinação (CEC), detectaram-se diferenças significativas para todas as
fontes de variação. Verificou-se também que a variabilidade referente aos efeitos aditivos, expressa pelos quadrados
médios da CGC é comparativamente maior que a não-aditiva. Em relação aos genitores do grupo I, destacaram-se o
IAC 24 e IAC 364, com alta freqüência de alelos favoráveis para o caráter número de perfilhos em trigo. Quanto aos
genitores do grupo II destacaram-se o Anahuac, Aliança e BRS 207. Conclui-se sobre a predominância dos efeitos
aditivos na determinação do caráter número de perfilhos em condições de estresse de calor, e sobre a possibilidade de
identificar genótipos com alta freqüência de alelos favoráveis para o caráter em questão.
Apoio Financeiro: FAPEMIG e CNPq.
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Avaliação do polimorfismo de marcadores do
tipo microssatélites entre os genitores de uma
população segregante de cana-de-açúcar
Gonçalves, BS1; Leite, DC2; Fávero, TM3; de Rosa Jr, VE3; Creste, S3; Souza,AP4; Landell, MGA3; Pinto, LR3
Universidade de São Paulo
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
3
Centro de Cana, Instituto Agronômico de Campinas
4
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cana-de-açúcar, microssatélite, mapeamento
A construção de mapas genéticos de ligação em plantas utiliza progênies segregantes derivadas de cruzamentos entre
genitores contrastantes para características agronômicas de interesse. O mapeamento genético em cana-de-açúcar é feito
através da seleção de marcadores em dose única. O presente trabalho avaliou 70 locos de EST-SSRs (microssatélites
derivados de seqüências expressas provenientes do banco de dados do SUCEST) quanto ao polimorfismo entre os
genitores (IACSP95-3018 e IACSP93-3046) e uma amostra aleatória de seis indivíduos deste cruzamento, o qual
está sendo utilizado para a construção de um mapa genético de ligação para o Programa de Melhoramento de Canade-Açúcar do IAC. O polimorfismo dos marcadores microssatélites foi revelado pela reação de PCR efetuada em um
volume final de 25 µl contendo 40 ng do DNA molde, 0.2µM de cada par de primer (forward e reverse), 100 µM de
cada dNTP, 2.0 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, e 0.5 unidades de Taq DNA polimerase. O programa de
amplificação constou de uma desnaturação inicial à 940C por 5 minutos, seguida de 30 ciclos, cada ciclo contendo uma
etapa de desnaturação à 940C por 30s, temperatura de anelamento específica para cada par de primer (forward/reverse)
por 30s, extensão à 730C por 30s, e um ciclo final à 730C por 3 minutos. Os produtos da amplificação foram separados
por eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante a 6% e revelados pela coloração com prata. Os marcadores
foram genotipados de acordo com sua presença (1) ou sua ausência (0). Dos 70 EST-SSRs avaliados, 39 (55,7%)
foram selecionados para serem abertos na população de mapeamento. Os 39 EST-SSRs detectaram 199 alelos, sendo
que o número de alelos por loco variou de dois (SCB02; SCC33) a dez (SCB07), com média de cinco alelos por loco.
Oitenta e seis alelos (43%) representaram marcadores monomórficos entre os genitores, enquanto 113, marcadores
polimórficos. Destes alelos, 76 (38%) foram encontrados em apenas um dos genitores e 37 (19%), encontrados em
ambos os genitores, porém com segregação na progênie utilizada. Esses alelos podem corresponder a marcadores em
dose única com segregação 1:1 e 3:1, respectivamente, sendo que o genitor IACSP95-3018 apresentou maior número
de marcadores. A população de mapeamento mostrou, portanto, polimorfismo adequado para permitir a construção
do mapa de ligação.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Análise das proteínas de reserva do grão
dos 550 acessos da coleção nuclear
de arroz da embrapa (CNAE)
Silveira, RDD1,2; Santos, KFEN1,2; Cruzeiro, GAV1,2; Borba, TCO2; Didonet, CGM2; Brondani, C2
1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás
Laboratório de Biotecnologia, Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antônio de Goiás
[email protected]
2
Palavras-chave: Qualidade do grão, recursos genéticos, proteômica, Oryza sativa,proteínas
O arroz (Oryza sativa) é um cereal rico em carboidratos e proteínas, as quais possuem aminoácidos essenciais para a dieta
humana. Este trabalho objetivou determinar a variação das proteínas de reserva do grão de arroz da CNAE, coleção
contendo 550 genótipos, e que representa a maior parte da variabilidade genética do Banco Ativo de Germoplasma da
Embrapa, composto por mais de 15.000 acessos. A CNAE possui três estratos: a) 308 variedades tradicionais (VT),
b) 148 acessos provenientes de programas de melhoramento do exterior, denominadas de Linhagens e Cultivares
Introduzidas (LCI), e c) 94 acessos provenientes de programas de melhoramento brasileiros, denominadas de Linhagens
e Cultivares do Brasil (LCB). Os acessos de cada estrato estão subdivididos com relação ao sistema de cultivo, que pode
ser irrigado, sequeiro, e no caso de VTs, ainda o facultativo, composto por acessos que podem ser cultivados tanto no
irrigado quanto no sequeiro. A proteína total do grão de todos os acessos da CNAE foi quantificada através do método
de Bradford. As médias encontradas foram comparadas pelo teste de Scott-knott. O acesso irrigado Wc 0144 (LCI),
oriundo da Colômbia, apresentou o maior teor protéico (20,2%), e o acesso de sequeiro Piojota (VT) apresentou o
menor teor (4,4%). Analisando a CNAE de acordo com o sistema de cultivo, os acessos irrigados apresentaram um
valor médio de 10,5%, com variação de 6 a 20,2%. Para os acessos de sequeiro, o valor médio foi de 10,1%, com
variação de 4,4 a 15,9% e para os acessos facultativos a média foi 10,4%, com variação de 5,9 a 15,8%. Comparando
o teor protéico dos estratos da CNAE, as VTs obtiveram uma média de 10,3%, com variação de 4,4 a 15,9%; para
as LCIs a média foi de 10,2%, com variação de 4,8 a 20,2%; e para as LCBs a média foi de 10,4%, variando de
4,8 a 15,9%. Não houve diferença significativa na comparação da média dos estratos, nem na média dos grupos de acordo
com sistema de cultivo. Contudo, foram identificados acessos da CNAE significativamente superiores em relação ao
teor protéico, cujos valores são maiores que o valor máximo descrito para as cultivares comerciais de arroz (12%). Este
resultado foi relevante para o programa de melhoramento genético, pois os genótipos com alto teor protéico estão sendo
avaliados quanto à presença de aminoácidos essenciais. Posteriormente, os acessos selecionados serão utilizados como
ponto de partida para o desenvolvimento de cultivares comerciais de arroz com alto valor nutricional, com a finalidade
de fornecer um produto com qualidade superior, importante principalmente para a população de baixa renda.
Apoio Financeiro: Finep/MCT.
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Segregação transgressiva para conteúdo de
ácido oléico em soja
Rocha, GAF1; Oliveira, MSG1; Good-God, PIV1; Matta, LB1; Pinto MO1; Barros, EG1,2; Moreira, MA1,3
BIOAGRO – Universidade Federal de Viçosa (UFV)
2
Departamento de Biologia Geral - UFV
3
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular - UFV
[email protected]
1
Palavras-chave: Glycine max, Biodiesel, Ácido Oléico, Estabilidade Oxidativa, Segregação Transgressiva
Uma maior estabilidade oxidativa do óleo de soja potencializa a sua utilização na alimentação, na indústria e na produção
de biodiesel. O aumento desta estabilidade pode ser alcançado geneticamente pela redução do teor de ácido linolênico
(C18:3) e pelo aumento do teor de ácido oléico (C18:1), sendo esta uma das principais metas do melhoramento da
qualidade do óleo de soja para a produção de biodiesel. Levando em consideração os teores de ácido oléico, este trabalho
teve com objetivos: (i) estimar parâmetros genéticos e ganhos de seleção no cruzamento PI417360 x CS303TNKCA; e,
(2) verificar a ocorrência de segregação transgressiva no cruzamento PI417360 x N85-2176. As linhagens não-adaptadas
PI417360 e N85-2176 apresentam teor médio de C18:1 de 300 e 400 g kg-1, respectivamente. A linhagem CS303TNKCA
apresenta baixo teor de ácido linolênico (35 g kg-1). Foram analisadas sementes dos genitores, e de indivíduos F1:2 e F2:3
dos cruzamentos entre PI417360 x N85-2176 e PI417360 x CS303TNKCA. O teor de ácidos graxos foi avaliado por
Cromatografia Gasosa em bulks de 10 sementes. Com base nas variâncias genotípicas e fenotípicas foi detectada alta
herdabilidade para ácido oléico (88%) no cruzamento PI417360 x CS303TNKCA. O ganho de seleção predito obtido
para este cruzamento foi de 37,9%. Foi observada segregação transgressiva para o cruzamento PI417360 x N85-2176.
Os valores médios observados para os genitores foram de 316 g Kg-1 (PI417360) e 400 g Kg-1 (N85-2176). Na geração
F2:3 os valores médios variaram de 189 a 603 g Kg-1. O percentual de indivíduos com valores médios superiores ao pai
de maior desempenho foi de 8%. Estes resultados evidenciam a ocorrência de segregação transgressiva para o conteúdo
de ácido oléico nos cruzamentos estudados. A segregação transgressiva observada nessa população indica que os alelos
que condicionam alto oléico em PI417360 e N85-2176 são diferentes entre si. Esses alelos podem ser úteis para elevar
o conteúdo de ácido oléico no desenvolvimento de cultivares. Estudos adicionais devem ser realizados em gerações
avançadas para confirmar a presença de tais alelos.
Apoio: FAPEMIG, CNPq, FINEP.
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Delineamento sistemático no estudo de
espaçamento e da variação genética em
progênies de Jacaranda cuspidifolia (Mart)
Moraes, MA1; Freitas, MLM2; Durigan, MR1; Baldo, T1; Moraes, SMB1; Silva, AM1; Rodrigues, CJ3; Moraes, MLT1
Departamento de Fitotecnia, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, SP
2
Instituto Florestal, São Paulo
3
Companhia Energética de São Paulo, CESP
[email protected]
1
Palavras-chave: teste de progênies, melhoramento genético, manejo florestal, parâmetros genéticos, população natural
Em função da grande diversidade das florestas tropicais, dos riscos de perdas de populações naturais e dos conhecimentos
limitados sobre recursos genéticos de espécies arbóreas, Instituições mundiais vêm desenvolvendo estratégia de conservação
in situ e ex situ, com a máxima integridade genética e biológica possível das espécies. Desse modo, torna-se importante
utilizar em delineamento que permita o estudo da resposta de um grande número de progênies em diferentes espaçamentos
numa área compacta. Assim, foi instalado um teste de progênies de Jacaranda cuspidifolia, em 06/11/2006, na Fazenda
de Ensino, Pesquisa e Extensão da FEIS/UNESP, localizada em Selviria-MS, com o objetivo de avaliar o comportamento
e a variação genética para os caracteres: altura de plantas, diâmetro a altura do peito (DAP) e sobrevivência, aos quinze
meses após o plantio, submetidos a diferentes espaçamentos. Utilizou-se o delineamento sistemático tipo “leque”,
disposto em um sistema de 30 raios concêntricos, com uma progênie por raio, distribuídas de forma aleatória, em
ângulos de 12o. As plantas foram dispostas, nos raios, em progressão geométrica, de razão 1,21; correspondendo a nove
espaçamentos por planta: 1,95 m2; 2,86 m2; 4,18 m2; 6,12 m2; 8,96 m2; 13,12 m2; 19,21 m2; 28,13 m2 e 41,19 m2. As
estimativas dos parâmetros genéticos foram obtidas a partir do procedimento REML/BLUP (Máxima verossimilhança
restrita/Melhor preditor linear não viciado), utilizando-se o programa SELEGEN. A sobrevivência observada foi de
98% e a média geral para altura de plantas foi de 2,25 m e 4,74 cm para o DAP, indicando boa adaptação da espécie
na região estudada. A acurácia estimada para a altura (0,79) e DAP (0,76) foram altas. A variação entre as progênies
foi expressiva, ficando evidente no coeficiente de variação genética para a altura (13,46%) e no DAP (10,33%). As
estimativas da herdabilidade foram de 0,65 para a altura e de 0,55 para o DAP. Houve variação entre os espaçamentos
estudados. A melhor performace das progênies, para todos os caracteres, foi no espaçamento de 8,96 m2 por planta, o
que equivale a 3 x 3 m. À seleção dos melhores indivíduos, neste espaçamento, das nove primeiras progênies (30%),
corresponde a um ganho na seleção de 24,24%. Dessa forma, verificou-se que a variabilidade genética presente nesta
população de J. cuspidifolia, para os caracteres estudados é expressiva e que o delineamento utilizado permitiu a escolha
do espaçamento em que as progênies expressam a sua melhor performace.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Estimativa de parâmetros genéticos para o
caráter dormência de sementes em acessos
de alfavaca (Ocimum selloi Benth)
Brasileiro, BP; Lyra, DH; Brasileiro, MP, Pereira, DA; Almeida, OS; Amaral, CLF
Laboratório de Genética Experimental, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia - UESB
[email protected]
Palavras-chave: Planta Medicinal, Domesticação, Melhoramento Genético
A dormência de sementes é um dos mecanismos de sobrevivência das espécies, significando adaptação ao meio ambiente
heterogêneo, constituindo-se em importante fator na dinâmica das populações naturais (Veasey & Martins, 2000), pois
permite a germinação diferencial de genótipos armazenados no solo, levando a sobreposição entre gerações sucessivas,
funcionando como um mecanismo efetivo de fluxo gênico no tempo, o que é relevante em programas de conservação
(Martins, 1987). Espécies não domesticadas, assim como muitas medicinais, apresentam grande variação no grau de
dormência, gerando dificuldades para o cultivo destinado à produção comercial (Montanari, 2002). Este trabalho teve
como objetivo analisar a variabilidade para o grau de dormência de sementes entre 15 progênies de Alfavaca (Ocimum
selloi Benth) e estimar parâmetros genéticos relacionados a este caráter nesta importante espécie aromática, condimentar
e medicinal. Sementes não escarificadas foram colocadas em placas de Petri previamente forradas com papel filtro e
acondicionadas em câmara de germinação do tipo B.O.D. (Incubadora: 411 D/FPD), regulada para proporcionar
temperatura de 25 ± 1°C e fotoperíodo de 12 horas, condições estas semelhantes àquelas encontradas no sítio de coleta
das plantas matrizes, das quais foram obtidas as sementes utilizadas neste experimento (Brito et al., 2006). O critério
adotado para a avaliação do teste da germinação foi baseado nas recomendações das Regras para Análise de Sementes
(Brasil, 1992), considerando germinadas, as sementes que originaram plântulas normais. O delineamento experimental
foi em blocos casualisados, constando de 15 tratamentos (progênies) e 3 repetições, totalizando 45 parcelas. Cada
unidade experimental foi constituída de uma placa de Petri contendo 50 sementes. Para os dados transformados em raiz
quadrada de 0,5 foi realizada análise de variância para o caráter germinação de semente, estimando a variância genética
entre famílias e a variância fenotípica. Com base nestas estimativas, foram calculados o coeficiente de variação genética
e o coeficiente de determinação genotípica, equivalente ao coeficiente de herdabilidade no sentido amplo. O coeficiente
de variação foi baixo, sendo de 11,87%, demonstrando assim boa precisão para o ensaio e para critério de avaliação. A
porcentagem média de germinação foi de 58,56%, havendo ampla variabilidade entre progênies (p<0,05), com médias
de germinação variando de 0 à 95,89%. O valor estimado para o coeficiente de variação genética foi baixo, isto é, de
0,55%; indicando que grande parte da variabilidade é devido a fatores ambientais. Entretanto, o valor estimado para a
herdabilidade no sentido amplo, foi elevado, ou seja, de 95%. Tendo em vista que o progresso esperado com a seleção
depende da herdabilidade do caráter, da intensidade de seleção e do desvio padrão fenotípico do caráter (Dudley &
Moll, 1969), estes resultados sugerem que métodos de melhoramento simples podem ser aplicados, obtendo ganhos
consideráveis na seleção para maior potencial germinativo.
Apoio: UESB, FAPESB, FTC, PLANTGEN e PLANTMED.
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Desenvolvimento e caracterização de novos
marcadores microssatélites para analise
genética em amendoim
Macedo, SE1,2; Ciampi, AY1; Azevedo, VCR1; Leal-Bertioli, SCM1; Guimarães, PM; Bertioli, DJ2; Moretzsohn, MC1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C.P. 02372, CEP 70.770-900, Brasília, DF
2
Universidade Católica de Brasília, Campus II, SGAN 916, CEP 70.790-160, Brasília, DF
[email protected]
1
Palavras-chave: Arachis hypogaea, SSR, Biblioteca genômica, Polimorfismo
O amendoim (Arachis hypogaea) é uma leguminosa de importância econômica mundial, sendo autógama, alotetraplóide
com um genoma AABB e 2n = 40 cromossomos. Apresenta limitada variabilidade genética, devido a sua origem por
hibridização de duas espécies silvestres e da sua espontânea duplicação cromossômica. Portanto, os estudos genéticos do
amendoim são dificultados pela baixa diversidade genética e por sua poliploidia. Nos últimos anos, aproximadamente
900 marcadores microssatélites foram publicados para o amendoim cultivado. Apesar disso o número de marcadores
polimórficos para esta espécie tem-se mostrado insuficiente para alguns estudos genéticos, incluindo a construção
de mapas genéticos. Visando ao desenvolvimento de novos marcadores microssatélites, uma biblioteca genômica
enriquecida para TC/AG foi construída. A fração enriquecida, contendo fragmentos de 200 a 600 bp, foi purificada
e amplificada. Os produtos de PCR foram clonados em plasmídeo pGEM-T Easy e, em seguida, transformados em
E. coli, cepa XL1-Blue (Promega), por eletroporação. As células transformadas foram multiplicadas em placas com o
meio de crescimento LB-ampicilina, contendo X-Gal e IPTG a 37o C. Para sequenciamento, o DNA plasmidial das
colônias positivas (brancas) foi extraído por lise alcalina (“mini-preps”) ou o DNA inserido foi amplificado por PCR.
As reações de seqüenciamento foram realizadas com os primers M13 ou T7 e SP6 e o kit Big-Dye Terminator Cycle
Sequencing (Applied Biosystems). Foram seqüenciados 1580 clones, usando-se seqüenciadores automáticos de DNA
ABI 3700 e 3130. As 1580 seqüências obtidas foram processadas e analisadas utilizando-se o programa Staden Package,
com adaptações. A ferramenta “Pregap4” foi utilizada para o pré-processamento das amostras, como controle da qualidade
das seqüências (Phred), corte da seqüência do vetor, e busca de microssatélites, utilizando TROLL. Foram encontrados
266 microssatélites longos (com mais de seis repetições), sendo 214 inéditos, para os quais foram desenhados pares
de primers, que estão sendo testados e caracterizados em 24 acessos de A. hypogaea. Esses novos marcadores abrem
uma nova perspectiva para a construção de mapas genéticos para o amendoim cultivado, bem como para análise de
germoplasma e estudos de diversidade genética desta espécie e de espécies silvestres afins.
Apoio Financeiro: Generation Challenge Program (Project 31) e The European Union Grain Legume Integrated
Project (GLIP).
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Identificação de novas fontes de resistência
à antracnose entre os acessos do banco
de germoplasma de feijão da Universidade
Federal de Viçosa (BGF-UFV)
Calil, IP1; Arruda, KMA1; Barros, EG1,2; Carneiro, JES3; Carneiro, PCS2
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agricultura (BIOAGRO), Universidade Federal de Viçosa (UFV), 36571-000, Viçosa, MG, Brazil
2
Departamento de Biologia Geral/UFV
3
Departamento de Fitotecnia/UFV
[email protected]
1
Palavras-chave: Germoplasma, feijão, antracnose, patótipos, resistência
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é um importante constituinte da dieta da população brasileira, por ser
reconhecidamente uma excelente fonte protéica, além de possuir bom conteúdo de carboidratos e de ser rico em ferro.
O Brasil destaca-se como maior consumidor e produtor mundial da cultura e Minas Gerais é o segundo maior estado
produtor. A produtividade da cultura, entretanto, ainda é considerada baixa devido, em grande parte, à incidência
de doenças. No Brasil, umas das doenças de maior importância no feijoeiro é a antracnose, cujo agente etiológico é o
fungo Colletotrichum limdemuthianum, causando perdas de até 100% quando se empregam sementes contaminadas
em regiões onde prevalecem condições ideais para o desenvolvimento da doença. O uso da resistência genética no
controle de doenças tem sido apontada como uma das estratégias mais eficientes, principalmente por reduzir o custo de
produção e os impactos negativos causados ao homem e ao ambiente. Assim, o objetivo deste trabalho foi determinar
a reação de 100 acessos de feijoeiro comum pertencentes ao banco de germoplasma da Universidade Federal de Viçosa
(BGF – UFV) a 6 patótipos de Colletotrichum lindemuthianum, visando a identificação de novas fontes de resistência.
Para a avaliação da resistência ao C. lindemuthianum foram utilizados os patótipos 9, 64, 65, 73, 89 e 453, os quais
foram caracterizados por RAVA et al. (1994). Para a avaliação da reação a cada patótipo, foram utilizadas 12 sementes
de cada um dos 100 acessos e das testemunhas Rudá (suscetível) e Rudá “R”(resistente). As inoculações foram realizadas
após a expansão completa das folhas primárias das plântulas, aproximadamente 6 a 8 dias após a semeadura. O inóculo
foi aplicado com pulverizador ‘De Vilbiss´, acionado por compressor, em toda a plântula, até o ponto de escorrimento.
Após a inoculação, as bandejas foram transferidas para câmaras de nevoeiro sob temperatura em torno de 20°C ± 2,
com fotoperíodo de 12 horas e umidade relativa superior a 95% onde permaneceram por 5-7 dias até serem avaliadas.
As reações foram medidas, conforme escala de notas de 1 a 9 descrita por PASTOR-CORRALES (1992). Foi verificado
maior número de acessos com reação de resistência ao patótipo 64, seguido pelos patótipos 9, 89, 73, 65 e 453
(com 66, 45, 43, 42,35 e 21 acessos, respectivamente, dos 100 avaliados). As linhagens RAÇA D (carioca), 1862
SACAVEM 538 (mulatinho), 1868 SACAVEM 1061(mulatinho), 1836S 464 VENEZUELA (preto), 1845 77G
(vermelho), 1849 FLORESTA 13041 (vermelho) e 1861 SACAVEM 486 (vermelho), assim registradas no banco,
totalizando sete acessos, apresentaram reação de resistência aos seis patótipos utilizados. A identificação de novas fontes
de resistência iniciada neste trabalho contribuirá para a seleção de potenciais genitores para uso nos programas de
melhoramento, visando resistência a doenças.
Apoio Financeiro: CNPq e Fapemig.
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Diversidade genética em germoplasma
exótico de soja identificada por caracteres
agromorfológicos
Mulato, BM1; Möller, M1; Bosetti, F1; Santos, MF1; Pavan GC1; Pinheiro, JB1
Departamento de Genética– ESALQ/USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Glycine max, Diversidade genética, Análise Multivariada
Estudos sobre a variabilidade genética de soja [Glycine Max (L) Merr.] têm destacado que o germoplasma elite da
cultura possui uma base genética estreita, tendo se originado a partir de algumas poucas linhagens ancestrais. Tal fato
traz algumas dificuldades para programas de melhoramento, como falta de variabilidade em genótipos elite para genes
de resistência a doenças e pragas, e eminente alcance de um limite de produtividade. Existem inúmeros acessos de soja
nos bancos de germoplasma ao redor do mundo, portanto, saber escolher criteriosamente quais acessos introduzir em
seu programa é fundamental. A introdução de novas fontes de germoplasma no melhoramento, como PIs, pode prover
a variabilidade genética necessária ao contínuo desenvolvimento de cultivares mais produtivas e resistentes a fatores
bióticos e abióticos. A avaliação de 79 PIs de soja provenientes de várias regiões geográficas do mundo foi realizada
através de nove caracteres agromorfológicos (número de dias para o florescimento, número de internódios, início
da granação, término da granação, período de granação, altura de inserção da primeira vagem, altura da planta na
maturidade, acamamento e ciclo). O delineamento de blocos casualizados com quatro repetições foi o adotado para o
experimento de campo conduzido no campus da ESALQ/USP em Piracicaba. Esses caracteres foram submetidos a análises
multivariadas para a estimação da diversidade genética. A dissimilaridade genética entre os acessos foi calculada pela
distância generalizada de Mahalanobis, utilizando-se, a seguir, o algoritmo de otimização de Tocher para o agrupamento
dos acessos. Foram distinguidos 40 grupos, sendo que 10 desses possuíam um único acesso. Esse resultado era esperado,
já que as PIs são originárias de 39 países diferentes. A dispersão dos acessos foi visualizada graficamente pela análise de
variáveis canônicas, a fim de compará-las aos agrupamentos de Tocher e avaliar a influência de cada característica na
análise de diversidade entre os acessos. A primeira variável canônica absorveu 90,8% da variação observada, sendo que
as características com maior contribuição foram o término da granação, ciclo e número de dias para o florescimento.
Isto demonstra que esses três caracteres além de serem importantes agronomicamente, também são úteis na análise da
diversidade genética em acessos de soja.
Apoio Financeiro: FAPESP e CAPES.
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Herança de genes de resistência à antracnose
presentes no cultivar de feijão AND 277
Arruda, KMA1,2; Alzate-Marin, AL3; Oliveira, MSG1; Barros, EG1,4; Moreira, MA1,5
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária, Universidade Federal de Viçosa
2
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento de Genética, Universidade de São Paulo
4
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
5
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, Colletotrichum lindemuthianum, genes de resistência, mancha-angular, testes de alelismo
O cultivar de feijão AND 277 {[Cargabello x (Pompadour Checa x Linea 17)] x (Linea 17 x Red Kloud)} é uma
importante fonte de resistência à mancha-angular no Brasil. Além disso, este cultivar possui uma forma alélica do gene
de resistência à antracnose Co-1, designada Co-14, e tem mostrado amplo espectro de resistência à antracnose, inclusive
à raça 2047 de Colletotrichum lindemuthianum. Esta raça identificada na Costa Rica é tida como uma das raças de
maior virulência já identificadas; o único gene de resistência à antracnose já caracterizado capaz de conferir resistência
à raça 2047 é o gene Co-42, identificado no cultivar G 2333. Desta forma, novos estudos fazem-se necessários para
completar a caracterização desta importante fonte de resistência. O objetivo deste trabalho foi determinar a herança
do(s) gene(s) de resistência à antracnose presente(s) em ‘AND 277’ pela análise de populações segregantes obtidas dos
cruzamentos AND 277 vs. Rudá e AND 277 vs. Cornell 49-242. Plantas F2 obtidas, os genitores e uma testemunha
suscetível foram inoculados com uma suspensão de 1,2 x 106 esporos/mL de C. lindemuthianum. Esporos da raça 73
foram inoculados em ambas as populações F2, e as raças 9 e 453 apenas nas populações AND 277 vs. Cornell 49-242
e AND 277 vs. Rudá, respectivamente. A avaliação dos sintomas da doença demonstrou que a resistência do cultivar
AND 277 à raça 453 parece ser controlada por um gene dominante e independente no cruzamento com ‘Rudá’, pois a
população F2 apresentou segregação de 3:1 (resistente:suscetível). Para a raça 73, no cruzamento com ‘Rudá’, a segregação
observada foi de 15:1, indicando que a resistência de ‘AND 277’ a essa raça parece ser controlada por dois genes independentes.
No entanto, as populações F2 derivadas do cruzamento AND 277 vs. Cornell 49-242 quando inoculadas com as raças 9 e
73 de C. lindemuthianum segregaram de acordo com a relação de 57:7. Estes resultados indicam que ‘AND 277’ possui
dois genes dominantes e independentes para estas raças, e que eles podem interagir de forma complementar com um
terceiro gene, dependendo do cruzamento e da raça testada. Resultados preliminares do teste de alelismo do cultivar
AND 277 com cultivares diferenciadores da antracnose e com BAT 93 confirmam que um dos genes presentes em
‘AND 277’ está localizado no mesmo loco ocupado pelos alelos previamente caracterizados Co-1, Co-12 e Co-13; um
outro gene de resistência à antracnose de ‘AND 277’ está localizado no mesmo loco ocupado pelo gene Co-9.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPEMIG.
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Localização de marcador molecular
potencialmente relacionado com a
resistência do cafeeiro a ferrugem em
mapas de ligação gênica
Hufnagel, B; Alvarenga, SM; Thiebaut, F; Caixeta, ET; Zambolim, EM; Sakiyama, NS
Laboratório de Biotecnologia do Cafeeiro (BioCafé), Bioagro, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: café, genômica, Hemileia vastatrix, gene de resistência, melhoramento
A produção do café é freqüentemente afetada por doenças e pragas que ocorrem durante praticamente todo o ciclo.
Dentre as doenças que ocorrem no cafeeiro, a ferrugem, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix Berk. et Br,
é a mais importante, por causar grandes prejuízos para a cafeicultura. O Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC)
consistiu no sequenciamento em larga escala de seqüências expressas e gerou um banco de dados de mais de 200.000 ESTs
(Expressed Sequence Tags). Em trabalhos preliminares, as informações geradas pelo PBGC foram utilizadas buscando-se
identificar genes envolvidos ou ligados à resistência do cafeeiro à ferrugem. Visando verificar a ligação de seqüências
mineradas com genes que controlam a ferrugem do cafeeiro, o marcador molecular CARF 005, desenvolvido a partir
de uma das seqüências, foi testado em três populações F2 segregantes para a resistência a essa doença. Esse marcador,
que amplifica uma região do genoma correspondente a uma ORF de Coffea arabica codificadora de uma proteína de
resistência a doenças, foi localizado nos mapas genéticos dessas três populações, nas quais já estavam localizados os
genes responsáveis pela resistência à raça II de H. vastatrix. Na população H 511-1 esse marcador ficou localizado no
grupo de ligação 1, a 3,7 cM do marcador SSR CCG5. Na população H 464-2, está presente no grupo de ligação 7, a
36,2 cM do marcador OPK13c. Já na população H419-1 esse marcador está presente no grupo de ligação 1, a 24,15
cM do marcador RAPD OPX 05 e a 22,15 cM do OPAR 18a. Apesar deste marcador estar presente no mesmo grupo
de ligação de genes de resistência nas duas últimas populações, ele não está ligado aos mesmos. Neste trabalho, não foi
confirmada a ligação do marcador CARF 005 com a resistência a ferrugem, no entanto, apenas os genes para a raça II
de H. vastatrix foram analisados. A ligação ou envolvimento desse marcador com outros genes que conferem resistência
a diferentes raças de H. vastatrix poderá ser verificada após a localização desses genes nos mapas de ligação.
Apoio Financeiro: PNP&D/CAFÉ, FINEP e FAPEMIG.
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Transferencia de primers SSR de Cucumis
melo para Cucurbita moschata e estudo
de diversidade genética
Leite, TL¹, Diniz, BT¹, Ferreira, MA², Amaral, ZSP2, Buso, GSC2
¹Agronomia, graduando, Universidade de Brasília – UnB
²Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Palavras-chave: SSR, transferibilidade, diversidade genética, Cucurbita moscata, Cucumis melo
A família Cucurbitaceae, grupo vegetal que ocorre nas regiões tropicais do mundo, é formada por cerca de 118 gêneros
que contém em torno de 825 espécies. Entre as espécies cultivadas desta família estão o melão (Cucumis melo), abóbora
(Cucurbita moschata) e a abobrinha (Cucurbita pepo) que junto com outras espécies desta família, ocupam uma parcela
significativa do agronegócio brasileiro, estimado em R$ 300 milhões anuais. Estas espécies também são importantes
para a agricultura familiar que cultiva inúmeras variedades locais. Devido a sua importância econômica, programas
de melhoramento genético vêm sendo desenvolvidos para aumentar a eficiência do sistema produtivo. Uma forma
eficiente de auxiliar os programas de melhoramento é a análise da variabilidade genética por meio de marcadores
moleculares, pois detectam dissimilaridades entre diferentes acessos em nível de DNA. Considerando o alto custo para
o desenvolvimento de marcadores SSR, a análise de transferibilidade dos microssatélites entre espécies aparentadas é
bastante oportuna. O objetivo desse trabalho foi testar SSRs desenvolvidos para melão e após otimização dos mesmos
estudar a diversidade em abóbora. Foram testados 350 primers SSR de melão e cerca de 40 amplificaram em indivíduos
de abóbora. A possibilidade de usar os mesmos marcadores SSR em mais de uma espécie reduzirá de forma significativa
o custo e o tempo necessário para realização das analises.
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Herança da resistência à ferrugem asiática da
soja no acesso de feijoeiro comum PI 181996
Dessaune, SN1; Souza, TLPO1; da Silva, MF1; Moreira, MA1,2; Barros, EG1,3
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO)
2
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
3
Departamento de Biologia Geral - Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Phakopsora pachyrhizi, Phaseolus vulgaris, Glycine max, feijão, doenças fúngicas
A ferrugem asiática da soja (FAS), incitada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Syd. & Syd., pode ocasionar severos prejuízos
ao produtores de soja. A resistência a esta doença, anteriormente encontrada em cultivares de soja, foi suplantada em
condições de campo. O feijoeiro-comum é uma espécie hospedeira alternativa de P. pachyrhizi e, no futuro, a FAS poderá
se tornar uma doença de grande impacto no cultivo do feijão-comum no Brasil. Por isso, estudos de identificação e
caracterização de fontes de resistência à FAS são de suma importância. O presente estudo teve como objetivo determinar
o modo de herança da resistência à FAS no acesso de feijoeiro-comum PI 181996, que foi identificado, em estudos
preliminares, como uma potencial fonte de resistência à FAS. Para a determinação da herança, foram obtidas populações
F2 e F3 derivadas do cruzamento entre o acesso PI 181996 e a cultivar US Pinto 111 (suscetível à FAS). Sementes de
cada uma destas populações, bem como de seus genitores e das cultivares de soja CAC-1 e Cristalina (testemunhas
suscetíveis), foram plantadas em casa de vegetação. Quinze dias após a semeadura, as plantas foram inoculadas com uma
mistura de raças do patógeno, na concentração de 3,0 x 105 uredosporos/mL. A avaliação visual foi realizada 20 dias
após a inoculação. Para a população F2, foi encontrada uma segregação de 3 plantas resistentes para 1 planta suscetível
(3R:1S), a qual foi confirmada pelo teste do Qui-quadrado. Para a população F3, foi observada uma segregação de 5
plantas resistentes para 3 plantas suscetíveis (5R:3S), também confirmada pelo teste do Qui-quadrado. Os resultados
indicam que a herança do caráter “resistência à ferrugem asiática da soja no acesso de feijoeiro comum PI 181996” é
monogênica dominante. Esta informação é de grande importância para os programas de melhoramento, pois pode
permitir a rápida mobilização desse gene de resistência para cultivares comerciais de feijão-comum, minimizando danos
futuros caso esta doença venha a se tornar importante para a cultura do feijoeiro.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Otimização e caracterização de microssatélites
do fitopatógeno Moniliophthora roreri
Gramacho, KP1; Souza, JT2; Santos, RMF3; Jucá, FF3; Rehner, SA4; Hebbar, PK4
1
Centro de Pesquisa do Cacau
Universidade Federal do Recôncavo
3
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
4
USDA
[email protected]
2
Palavras-chave: otimização, SSR, Moniliophthora rorei, Theobroma cação, fungo
Moniliophthora roreri (Ciferri) Evans et al. é um fungo endêmico do noroeste da América Latina que infecta principalmente
espécies dos gêneros Theobroma (T. cacao, T. grandiflorum, T. bicolor, T. gileri) e Herrania (H. nítida, H. purpúrea)
(Ram et al. 2004). A podridão de Moniliophthora tem se disseminado ao longo das regiões costeiras do norte e sul
do Pacífico da América do Sul e também mais recentemente próximo a Amazônia, sendo um perigo eminente para
as plantações de cacau do Brasil (Griffith et al. 2003). A melhor forma de controle a esta doença é o emprego da
resistência genética. Para tal, o conhecimento acerca da estrutura populacional do fitopatógeno é necessário. Marcadores
moleculares têm sido utilizados em estudos de filogenia e estrutura genética de populações de vários fitopatógenos. São
ferramentas adicionais e importantes para desenvolver estratégias satisfatórias tanto no controle destas doenças como
também no desenvolvimento de cultivares resistentes. Neste trabalho, objetivou-se otimizar e utilizar pares de primers
SSR desenvolvidos para M. roreri visando à caracterização de marcadores microssatélites em isolados de M. roreri de
diversas regiões do Equador. Um total de 23 isolados foi amplificado com 12 pares de primers SSR, dentre os quais sete
foram polimórficos. O primer mais polimórfico foi o mMR33, seguido do mMR33 e mMR22. Obteve-se um total
de 21 alelos, com um valor médio de três alelos por loci e tamanhos que variaram de 104 pb até 159 pb. Resultados
preliminares indicaram que os isolados oriundos da região de Mocache, situada em Los Rios, oeste do Equador,
apresentaram diversidade genética mais alta com relação aos demais. O loco mMR33 foi o que mais contribuiu na
distinção dos isolados das diversas regiões. Estes resultados são bastante promissores, vez que com sete primers foi possível
distinguir isolados de diferentes regiões, possibilitando o desenvolvimento de estudos futuros no sentido de melhor
caracterizar e distinguir populações de M. roreri. Este estudo está em andamento pelo grupo permitindo preencher
lacunas acerca deste importante fitopatógeno.
Apoio financeiro: CEPLAC/CEPEC, CFC/ICCO, FAPESB e CNPq.
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Single nucleotide polymorphism DNA
marker development in common bean
Buso, GSC1; Pereira, PAA2; Pastor-Corrales, MA3; Ronghui, Y4; Cregan, P3
Embrapa Genetic Resources and Biotechnology, Brasilia, Brazil
2
Embrapa Rice and Beans, Goiania, Brazil
3
USDA, ARS, Beltsville, MD USA
4
Univ. of Maryland, College Park, MD, USA
[email protected]
1
Keywords: SNP, Phaseolus vulgaris, soybean, molecular marker, Glycine max
The common bean is an important source of protein, dietary fiber, iron and other minerals, complex carbohydrates,
vitamins and calories for millions of people in developing and developed nations in South America and Eastern and
Southern Africa. Because the common bean is closely related to soybean, many of the thousands of SNP-containing
sequence tagged sites (STS) available in soybean might be of use in common bean without the need for de novo SNP
marker development. In soybean, SNPs occur at a frequency of about one SNP per 1000 nucleotides in genomic
DNA and they can be used to directly detect alleles responsible for a trait of interest. Every SNP in context with its
surrounding genomic sequence is unique. SNPs can mark functionally important allelic differences, and SNPs that flag
individual alleles of known genes have been used widely as molecular markers. Recent work at the USDA, Beltsville
resulted in SNP discovery in P. vulgaris via the analysis of an 864 PCR primer sets designed to soybean ESTs. Annealing
temperatures of 48 and 58 oC were used to amplify genomic DNA of bean genotypes BAT93, Jalo EEP558, DOR364
and G19833 (international population parental). The percentage of primer sets that amplified a single band in P.
vulgaris was 46.3%. A total of 391 amplicons from each of the four genotypes were sequenced from both ends for SNP
discovery. The forward and reverse sequence reads of the 4 genotypes were aligned and analyzed to discover SNPs using
Phred, Phrap and PolyBayes software. From the 391 STS analyzed, 91 (23.3%) had at least one SNP, with 1 to 23
SNPs/STS, producing a total of 304 single base polymorphisms in the 4 bean genotypes. A second set of 960 primers
derived from soybean Bacterial Artificial Chromosome-end sequences was tested at the same annealing temperatures.
The percentage of amplification in P. vulgaris was 35.61% and 346 primer sets were used in the amplification and
sequence analysis of the same 4 bean genotypes. The alignment of the 346 sets of 8 sequence traces resulted in the
discovery of 529 SNPs in 89 of the 346 STS. In total, 833 common bean SNPs were discovered in 180 different STS,
which represents a significant increase in the tools available for genetic mapping and diversity analysis.
Orgão financiador: EMBRAPA.
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Variabilidade genética em caracteres
agronômicos de variedades crioulas de milho
Matiello, RR1; Gardingo, JR1; Peretto, DD2; Ferreira, R2; Torrecija, M2
Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade, Universidade Estadual de Ponta Grossa
2
Acadêmicos do Curso de Agronomia, Universidade Estadual de Ponta Grossa
[email protected]
1
Palavras-chave: adaptação agronômica, variabilidade, potencial rendimento, ciclo reprodutivo, variedades crioulas,l fontes de genes
A uniformização genética das áreas de cultivo com sementes híbridas de milho têm acarretado uma drástica redução da
variabilidade genética do germoplasma. Neste sentido, as variedades crioulas de milho podem ser consideradas fontes
potenciais de genes de interesse para a agricultura. Os objetivos deste trabalho foram estudar diferentes acessos de milho
crioulo, oriundos da região Sul, com relação aos caracteres morfológicos, adaptativos e ao potencial de rendimento,
visando a seleção de novas fontes de genes de interesse para programas de melhoramento. O experimento foi instalado
na Fazenda Escola da UEPG no delineamento de blocos casualizados com 4 repetições na safra 2006/2007. A unidade
experimental foi composta de 4 linhas de 5m de comprimento e 0,80m na entrelinha, com densidade de semeadura
de 55000 plantas ha-1. Os tratamentos consistiram de 20 variedades crioulas oriundas de pequenos agricultores de
municípios da Região dos Campos Gerais do Paraná. As variedades foram caracterizadas com relação à estatura de
planta, florescimento masculino e feminino, altura de inserção da espiga principal, número total de folhas e rendimento
de grãos. Os dados foram submetidos a análise de variância e as médias dos tratamentos agrupadas pelo teste de ScottKnott a 5% de probabilidade no programa SASM-Agri (Canteri et al., 2001). Os resultados da análise de variância
demonstraram diferenças significativas (Pr < 0,001) para todas as características analisadas entre as variedades crioulas.
Para a estatura as variedades apresentaram um predomínio para porte elevado, acima de 3,10m, com amplitude de
2,50 a 3,54m. Entretanto, os genótipos crioulos Caiano Rajado e Roxo Índio I apresentaram as menores estaturas com
apenas 2,53 e 2,50m, respectivamente. O número total de folhas variou de 15 a 19 entre as variedades, sendo os resultados
deste caráter associados com a estatura de planta ou seja, variedades crioulas com maior estatura apresentaram maior nº
de folhas e vice-versa. Os genótipos Crioulo Pururuca, Oito Carreiras, Caiano Rajado e Roxo Índio I demonstraram
o melhor potencial para a altura da espiga principal, com médias de 1,55 a 1,70m. Com relação ao ciclo, todas as
variedades apresentaram protandria, com diferença média de 4,5 dias. Sendo as variedades crioulas Pururuca, Roxo
Índio I, Caiano Rajado e Oito Carreiras as mais precoces, com média de 74,4 (masculino) e 78,3 dias (feminino), para
o florescimento. Para o rendimento de grãos a análise ranqueou as variedades em 2 grupos estatísticos, com rendimento
de grãos de 2911 a 4638 kg ha-1. Das 20, 7 destacaram-se com elevado potencial, acima de 4045 kg ha-1, dentre elas:
Nutricional, Caiano, Vinten, Amarelo Antigo, Asteca, Carioca e Astequinha Sabugo Fino. As avaliações fenotípicas
das variedades permitiram identificar variabilidade genética potencial para todas as características estudadas entre os
genótipos crioulos de milho.
Apoio Financeiro: FINEP e Fundação Araucária.
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AValiação de populações de milho crioulo
para milho-verde
Gardingo, JR1; Matiello, RR1; Ferreira, R2; Bach Junior, JM2; Campo, CH2; Ramos, EGP2
Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade, Universidade Estadual de Ponta Grossa
2
Acadêmicos do Curso de Agronomia, Universidade Estadual de Ponta Grossa
[email protected]
1
Palavras-chave: adaptação agronômica, variabilidade, potencial de rendimento, variedades crioulas, Zea mays
A produção de milho-verde tem crescido ao longo dos últimos anos e os consumidores passaram a exigir espigas longas
e bem formadas. As variedades destinadas a produção de milho-verde são genótipos selecionados para esta finalidade.
O desenvolvimento de novos genótipos exige a escolha correta do germoplasma para a seleção ou desenvolvimento
de novas variedades. Assim, este trabalho teve como objetivo avaliar 17 variedades crioulas coletadas na região sul do
Brasil (Palha Roxa 72, Paiol, Branco 57, Asteca, Caiano, Roxo Índio, Branco para Palha, Pérola, Carioca, Astequinha,
Sabugo Fino, Vintém, Palha Roxa 64, Encatilado, Branco 62, Amarelo Antigo, Oito Carreiras, Crioulo Pururuca,
Caiano Rajado), duas variedades melhoradas (IPR 114 e Nutricional) e dois híbridos (BM 3061 e AG 1051) destinados
a produção de milho-verde. As parcelas foram constituídas por duas linhas de 5m de comprimento e 0,8m entre
linhas, numa população de 50.000 plantas por hectare, na safra 2007/08. Foram avaliados a massa, o comprimento e
diâmetro da espiga, aparência da espiga com palha e sem palha, e o rendimento de espigas comerciais (t/ha). O ensaio
foi conduzido em blocos casualizados com 4 repetições. Os dados foram submetidos a análise de variância e as médias
foram separadas pelo método de Skott-Knott. As variedades crioulas com maior massa, diâmetro e comprimento médio
da espiga foram: Branco 62, Palha Roxa72, Encatilado, Carioca, Branco 57, Caiano, IPR 114, Roxo Indio e Amarelo
Antigo. As populações crioulas que apresentaram os maiores rendimentos de espiga despalhada foram: Caiano, Carioca,
Palha Roxa 72, Amarelo Antigo, Nutricional e Encatilado, cuja produtividade variou de 6 a 8 t/ha, com produtividade
equivalente ao híbrido AG 1051, mas inferiores ao híbrido BM 3061. As variedades oriundas da Região dos Campos
Gerais do Paraná, apresentaram maior rendimento em relação às variedades do Rio Grande do Sul, demonstrando a
maior adaptação agronômica das populações locais. Estas variedades apresentam espigas longas com boa cobertura de
palha, as quais fornecem ótima proteção contra o ataque de lagartas da espiga. Os grãos apresentaram grande variação
da cor do endosperma, desde o amarelo ao alaranjado. As espigas despalhadas apresentaram boa aparência visual quando
comparadas aos híbridos comerciais, pois as fileiras foram bem definidas, com os grãos largos e longos. As variedades
crioulas necessitariam passar por ciclos de seleção para aumentar o potencial de rendimento de espigas comerciais
bem como a eliminação dos pigmentos presentes no sabugo e nos grãos. A variedade Palha Roxa 72 apresentou palha,
sabugo e grãos de cor indesejável para a produção de milho-verde. Os genótipos Encatilado e Carioca apresentaram
alguns grãos contendo pigmentos hidrossolúveis, os quais intensificam a coloração na presença de luz, e no processo
de cocção do milho-verde causam escurecimento da água.
Apoio Financeiro: FINEP e Fundação Araucária.
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Correlações genotípicas e fenotípicas
e herdabilidade em gergelim
Diniz, AL1,2; Arriel, NHC1; Silva, SGA1,2; Silva, FKG1,2; Gondim, TM1
Embrapa Algodão – CNPA
Departamento de Biologia, Universidade Estadual da Paraíba
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Herdabilidade, coeficiente de variação genético, Sesamum indicum L., produtividade e seleção
Durante todo o processo de desenvolvimento de uma planta, grande parte das características que determinam seu
crescimento e produção são governados por genes pleiotrópicos, sendo de grande importância o conhecimento dessa
interferência para trabalhos de melhoramento, permitindo selecionar genótipos com características agronômicas
superiores positivamente correlacionadas. Assim, pela seleção de um caráter pode-se obter ganhos indiretos com
outro que esteja favoravelmente correlacionado. Nesse contexto, os coeficientes de correlação, têm grande utilidade
na quantificação da magnitude e direção das influências dos fatores que determinam caracteres complexos, como a
produção de grãos. No caso do gergelim, estudos demonstram uma alta correlação da produtividade com o número
de ramificações e de frutos por planta, além do comprimento dos frutos e peso de 1000 sementes. Objetivando-se
estimar a herdabilidade e ganho genético e obter estimativas de correlações genéticas e fenotípicas entre os caracteres
relacionados à produtividade em gergelim, foram realizadas análises baseadas na altura de inserção dos primeiros frutos,
altura da planta, número de frutos por planta, de ramos e produção de sementes. O experimento foi conduzido nos anos
de 2002 e 2007 nas cidades de Patos-PB e Missão Velha-CE, utilizando 14 genótipos de gergelim, em blocos ao acaso
com 4 repetições. A avaliação das características foi realizada no estágio de maturação fisiológica das plantas. Análises
conjunta de variância a nível de média em todos os caracteres, realizadas a partir do programa GENES, forneceram
as estimativas da variância genética; a variância ambiental, a variância fenotípica ao nível de média, a herdabilidade
ao nível de média e as correlações genética e fenotípica. Constatou-se que a precisão experimental foi assegurada a
partir de um baixo Coeficiente de Variação (CVE), principalmente quanto à altura da planta. O nível de herdabilidade
verificado foi relativamente alto com destaque para altura de inserção dos primeiros frutos e altura da planta. A partir
da razão CVE/CVG ficou constatado que pouco ganho genético seria obtido na seleção dos genótipos avaliados, visto
que encontram-se em elevado estágio de endogamia. As maiores correlações fenotípicas obtidas foram observadas entre
altura da planta e altura de inserção dos primeiros frutos. Quanto às correlações genéticas, ficou constatado que número
de frutos e ramificações determinam diretamente a magnitude da produtividade. As correlações apresentadas reforçam
o alto grau de associação entre os caracteres avaliados e que seleções efetuadas, principalmente a partir do número de
frutos e ramos, serão eficientes para identificação de genótipos agronomicamente superiores.
Apoio Financeiro: Embrapa e CNPq.
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Uso de marcadores SSR na tomada de
decisões em programas de pré-melhoramento
do algodoeiro (Gossypium hirsutum)
Silva, UC1,5; Alves, MF2,5; Freitas, RB3,5; Barroso, PAV4,5; Hoffmann, LV4,5
1
Graduada em Ciências Biológicas, UEPB
Mestranda em Genética e Biologia Molecular, UFRN
3
Granduando em Ciências Biológicas, UEPB
4
Pesquisador Embrapa Algodão
5
Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Algodão
[email protected]
2
Palavras-chave: Gossypium, marcadores SSR, polimorfismo
Os programas de melhoramento do algodoeiro herbáceo (Gossypium hirsutum r. latifolium) usam como genitores
apenas genótipos com características similares às cultivares. Caso aportes contínuos de nova variabilidade não sejam
realizados, esta estratégia pode resultar na redução dos ganhos genéticos e tornar os cultivares vulneráveis a mudanças
ambientais e à ação de patógenos. Algodoeiros nativos e naturalizados do Brasil são fontes potenciais de variabilidade.
Porém é necessário uma etapa intermediária – o pré-melhoramento – para que os genes que se pretende introgredir
sejam incorporados à genótipos com melhores características agronômicas. Marcadores genéticos podem ser usados
para acelerar o pré-melhoramento, auxiliando a escolha de combinações de genitores e a seleção dentro de populações
segregantes. Este trabalho teve como objetivo identificar as melhores combinações de acessos de algodoeiro para serem
usados como genitores em programa de pré-melhoramento e identificar primers SSR a serem utilizados em seleções
genômicas. Foram usados dois genótipos de cada uma das seguintes espécies: G. mustelinum, G. hirsutum, G. barbadense
e G. hirsutum var. marie-galante. Os genótipos foram avaliados com marcadores SSR obtidos pela amplificação do DNA
genômico com 141 pares de primers. Os dados foram usados para estimar o conteúdo de informação de polimorfismo
(PIC) e para construir um dendrograma (Neighbor-Joining). A taxa de polimorfismo foi 94% e 12% entre e dentro
das espécies, respectivamente, havendo 14 primers cujo padrão permitiu a distinção entre as quatro espécies. Os
genótipos de cada espécie formaram um grupo distinto no dendrograma. Os algodoeiros herbáceos se agruparam mais
próximos a G. hirsutum r. marie galante, de modo intermediário de G. barbadense e mais distantes de G. mustelinum.
Caso uma característica a ser introgredida para cultivares esteja disponível em indivíduos das três espécies, deve-se optar
pela variabilidade de G. hirsutum r. marie galante. O valor do PIC considerando todas as espécies variou de 0 a 0,84
e permitiu descartar primers pouco informativos. O PIC avaliado somente entre os alelos dos algodoeiros herbáceos
e de uma das espécies possibilitou identificar os primers mais adequados à realização das seleções genômicas para
cada espécie. Porém, o valor do PIC deve estar associado à informação sobre a posição do loco no genoma para que a
informação seja a mais útil.
Orgão financiador: CNPq.
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Capacidade de combinação em
pimentão para resistência a oídio
[Leveillula taurica (Lév.) Arn.]
Marchesan, CB1; Melo, AMT2; Paterniani, MEZ3
IAC – Centro de Horticultura, Campinas-SP
IAC – Centro de Horticultura, Campinas-SP
3
IAC - Centro de Grãos e Fibras, Campinas-SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Capsicum annuum L., Oidiopsis taurica (Lév) Arn., melhoramento genético, hortaliças, híbridos
Com o aumento do cultivo de pimentão em ambiente protegido, patógenos que antes não tinham importância passaram a
causar sérios prejuízos aos produtores pelo fato do cultivo protegido oferecer as condições ótimas para o desenvolvimento
desses organismos, a exemplo da Leveillula taurica (Lev.) Arn., fungo causador do oídio. Em sua forma anamórfica
esse fungo é conhecido por Oidiopsis taurica e é nessa fase que se torna patogênico. Com o aparecimento do oídio nas
plantações de pimentão em casa de vegetação, os agricultores passaram a usar fungicidas sistêmicos e específicos, porém,
os resultados nem sempre são satisfatórios. Além disso, o uso indiscriminado pode induzir e promover o surgimento
de raças resistentes do patógeno ao fungicida. Levando-se em conta que o cultivo protegido de pimentão no Brasil
é importante e crescente, a incorporação de genes que conferem resistência ao oídio é de grande importância para a
manutenção desse sistema de cultivo. O objetivo desse trabalho, realizado em 2007, em Campinas-SP, foi avaliar o grau
de severidade da doença dos híbridos triplos de pimentão e alguns aspectos agronômicos por meio da capacidade geral
e específica de combinação dos genitores. Os híbridos foram obtidos por meio de cruzamentos entre cinco híbridos
comerciais suscetíveis (Margarita, P-36R, Platero, Quantum-R e Rubia-R), utilizados como genitores femininos, e
duas fontes de resistência (pimentão HV-12 e pimenta #124), usadas como genitores masculinos. Para a avaliação da
severidade da doença utilizou-se escala de notas de 1 a 5, variando de plantas resistentes a altamente suscetíveis. Para a
caracterização agronômica dos frutos, avaliaram-se peso médio do fruto, comprimento médio do fruto, largura média
do fruto, relação entre comprimento e largura do fruto e espessura da polpa. Para as análises estatístico-genéticas,
adotou-se o método dois, modelo I de Griffing, adaptado para dialelo parcial. O delineamento experimental foi o
de blocos ao acaso, com 17 tratamentos, incluindo 10 híbridos experimentais e 7 genitores, 8 repetições e 4 plantas
por parcela. Os resultados mostraram que os efeitos aditivos foram superiores aos efeitos não-aditivos para todos os
componentes agronômicos avaliados. O quadrado médio significativo da capacidade específica de combinação para a
severidade da doença indicou a importância de genes com efeito de dominância e epistasia. Os híbridos triplos obtidos
do cruzamento com ‘Quantum-R’ e ‘Rubia-R’ apresentaram capacidade geral de combinação negativa e mostraram-se
os mais tolerantes ao oídio. O pimentão ‘HV-12’ foi considerado a melhor fonte de resistência ao patógeno.
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Estabelecimento de protocolo para extração
de RNA de plantas nativas do Brasil
Cordeiro, MCR1; Oliveira-Filho, EC1; Miranda, ZG1; Aquino, FG1; Silva, MS1; Fragoso, RR1; Barros, LMG2; Almeida, J 2;
Andrade, LRM1
1
Embrapa Cerrados, BR 020, km 18, CEP 73310-970
Embrapa Rec. Gen. e Biotecnologia, SAIN Parque Rural, Brasília, DF
[email protected]
2
Palavras-chave: plantas nativas, extração, RNA
A obtenção de RNA em boa quantidade e qualidade é fundamental para análises de expressão gênica como RT-PCR
ou preparação de bibliotecas de cDNA. Um dos principais problemas encontrados para isto é que, muitas vezes, as
plantas nativas do Brasil contêm grande quantidade de compostos fenólicos que são facilmente oxidados e, este fato
interfere na preparação, resultando em RNA de má qualidade para as análises posteriores. Muitas são as estratégias que
podem ser utilizadas em prol de superar o problema da oxidação fenólica durante a extração de RNA total de plantas,
tais como a utilização de substâncias como a polivinilpirrolidona (PVP), o 2-mercaptoetanol, o cetiltrimetilbrometo
de amônio (CTAB) entre outras. O objetivo desse trabalho foi estabelecer um protocolo padrão para a extração de
RNA com qualidade, de plantas nativas do Brasil para ser utilizado em técnicas de análises de expressão de genes como
o RT-PCR e construção de bibliotecas de cDNA. Para o estabelecimento desta metodologia foram selecionados ao
menos três protocolos descritos na literatura para serem testados que, em alguns casos, sofreram algumas modificações.
O primeiro protocolo que recupera o RNA por meio de precipitação com acetato de lítio, o segundo com cloreto
de lítio e o terceiro com tiocianato de guanidina. Foi necessário incorporar ao tampão de extração substâncias antioxidantes para controlar a oxidação fenólica, tais como o 2-mercaptoetanol a 2 ou 4%, o polivinilpirrolidona a 2% e,
um deles ainda, continha CTAB. Demonstrou-se que apenas a metodologia em que se utiliza no tampão de extração o
2-mercaptoetanol a 2%, o PVP a 2% e o CTAB e, precipita o RNA com cloreto de lítio foi capaz de recuperar RNA de
pelo menos cinco espécies diferentes de plantas nativas do Brasil com quantidade e qualidade satisfatórias para análises
posteriores. Este mesmo protocolo resultou na melhor recuperação de RNA sendo que os demais recuperaram material
degradado ou parcialmente degradado.
Financiado por: CT-Mineral/CNPq, Embrapa.
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Fenotipagem para resistência a ferrugem
em uma população F3 segregante de
Arachis hypogaea e um anfidiplóide
sintético, visando à identificação de QTLs
Ramos, VR1; Galhardo, IC1,2; Castro, RCS1,3; Guimarães, PM1, Bertioli, DJ4; Moretzsohn, MC1; Leal-Bertioli, SCM1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
2
Universidade de Brasília (UnB), Brasília, DF
3
Centro Universitário de Brasília (UniCEUB), Brasília, DF
4
Universidade Católica de Brasília (UCB), Brasília, DF
[email protected]
1
Palavras-chave: Amendoim, espécies silvestres, ferrugem, QTLs, pré-melhoramento
O amendoim (Arachis hypogaea) é uma excelente fonte de proteína e óleo vegetal. No Brasil, 70- 80% da produção
comercial é concentrada no Estado de São Paulo. O maior problema da cultura é ocasionado pelas doenças fúngicas,
entre elas a ferrugem, causada pelo fungo Puccinia arachidis. O gênero Arachis vem sendo muito estudado, pelo alto
potencial de suas espécies silvestres como fontes de genes de resistência para o melhoramento genético da cultura.
Um anfidiplóide sintético, obtido do cruzamento de duas espécies diplóides: A. ipaënsis KG 30076 (susceptível a
doenças foliares) e A. duranensis V 14167 (resistente). O híbrido foi tetraploidizado, por tratamento com colchicina,
e cruzado com A. hypogaea cv. IAC-Runner 886, gerando indivíduos F1, F2 e F3. A fenotipagem da população F3 deste
cruzamento é o foco deste trabalho e, através da construção de um mapa genético, espera-se identificar QTLs para
resistência a ferrugem. A técnica de folhas destacadas foi utilizada para a fenotipagem, onde uma suspensão de inóculo
a 100.000 esporos por mL foi aplicada às folhas, que foram mantidas por 25 dias sob condições de luz e temperatura
controladas. Na avaliação, foram observados três componentes da resistência: tamanho e número de lesões e número
de esporos por área foliar. Quanto à ausência ou presença de sintomas, todos os controles foram consistentes, sendo
que o parental A. duranensis V 14167, o anfidiplóide sintético, e A. cardenasii (controle negativo) não apresentaram
sintomas; e o parental A. ipaënsis KG30076, A. hypogaea cv. IAC-Runner 886, cv. IAC-Caiapó e cv. IAC-Tatu-ST
foram considerados suscetíveis. Dos 309 genótipos segregantes testados, 52 apresentaram susceptibilidade maior
do que A. ipaënsis KG30076, entre estes, o híbrido (KG 30076x V 14167)c x A. hypogaea cv IAC-Runner 886.
197 genótipos apresentaram susceptibilidade menor do que A. ipaënsis KG30076, e 59 não apresentaram sintomas. Estes
resultados demonstram com clareza o aumento da resistência ao se incorporar genes de acessos silvestres no genoma
do amendoim cultivado. Este trabalho servirá como base para a identificação de QTLs, partes do genoma de acessos
silvestres. A população avaliada mostrou grande segregação, quanto à resistência à ferrugem, sendo alguns indivíduos
completamente resistentes e outros completamente suscetíveis.
Apoio Financeiro: Generation Challenge Program, Projeto TL1.
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Determinação do grau de heterozigose de
progênies de gerações avançadas do híbrido
natural intraespecifico W 34b (BRA 041122)
da espécie Arachis Pintoi Krapov. & Gregory
por meio de marcador molecular SSR
Leite, VS1; Otto, JCS1; Carvalho, S2; Lopes, CR1,3
1
Departamento de Genética, Instituto de Biociencias, Universidade Estadual Paulista, UNESP-Botucatu, SP
Departamento de Ciências Biológicas e Tecnologia. Universidade Estadual do Norte do Paraná, UENP-Bandeirantes, PR
3
Bolsista de Produtividade em Pesquisa do CNPq
2
O uso de espécies silvestres do Gênero Arachis para o estabelecimento de pastagens, cobertura em culturas perenes,
conservação do solo, como planta ornamental, além de obtenção de compostos de interesse farmacológico ou cosmetológico
vem sendo intensificado, a partir do aumento no número de acessos disponíveis para pesquisa, nas ultimas décadas. Dentre
as espécies com potencial uso em sistemas de cultivo e pastagem e como cobertura e controle de erosão, se destacam
A. Pintoi e A repens da Seção Caulorrhizae, apontadas como as mais promissoras do gênero. Entre os acessos da espécie
A. Pintoi, o genotipo W34b (BRA 041122) vem se destacando devido à sua grande produção de forragem, alto teor de
proteina, alto nivel de fixação de N2 atmosferico, rápida ocupação de solo, adaptação a ambientes variados e capacidade
de consorciação com diferentes gramíneas. O presente trabalho tem por objetivo principal a avaliação molecular de
progênies de gerações avançadas do genótipo W 34b, para definir o grau médio de homozigose das mesmas visando a
seleção dos genótipos homozigotos, para o processo de melhoramento da espécie e futuro lançamento de cultivares, para
tanto, foi usado o marcador molecular microssatélite o qual tem sido utilizado com muita eficiência em avaliações desse
tipo. Foram avaliados 83 indivíduos adultos de 37 genótipos do acesso BRA 041122 com 20 locos microssatelites. Dos
vinte pares de “primers” utilizados 15 amplificaram produtos de PCR e foram polimórficos, o restante não amplificou
ou amplificou multiplas bandas. Os 15 locos SSR polimorficos permitiram observar 112 alelos na população, com
uma media geral de 7,47 alelos por loco. Os locos mais polimórficos foram o AP190, AP40, AP161 e Ag39 com dez
alelos cada e os locos menos polimorficos foram o Ag171 e o Ah7 com apenas quatro alelos cada. Dos 37 genótipos
avaliados sete apresentaram grau de homozigose acima de 70%, os 30 genótipos restantes ainda estão com o grau de
homozigose variando de 40,48% a 66,63%. O genótipo G14 apresentou o maior grau de homozigose com media geral de
77,78% sendo as plantas G14-1 com 73,33%, G14-2 com 80% e G14-3 com 80% de homozigose. O genótipo G9
apresentou plantas (G9-3 e G9-4) com o maior grau de homozigose observado (93,33%) e media geral de 72,14%,
no total de plantas analizadas. O genótipo com menor grau de homozigose foi o G13 com media geral de 40,48% nas
tres plantas analizadas e também apresentou a planta (G13-3) com menor grau de homozigose (28,57%).
Apoio: FAPESP e CNPq.
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Marcador molecular ligado a um gene
recessivo que controla dormência das
sementes em trigo
Franco, FA1; Pinto, RB2; Pelizzarro, K3; Predebon, CT4; Spies, DF4; Vieira, ESN4; Marchioro, VS1; Schuster, I4
1
Melhoramento de trigo, Coodetec
Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de Maringá
3
Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, Universidade Estadual de Maringá
4
Biotecnologia, Coodetec
[email protected]
2
Palavras-chave: Herança da dormência, BSA, Mapeamento genético, Seleção Assistida por Marcadores Moleculares,
Tolerância à germinação pré-colheita
A germinação das sementes de trigo na pré-colheita é um dos principais fatores que contribuem para a queda na qualidade
da farinha de trigo. Os programas de melhoramento de trigo têm procurado incorporar a tolerância à germinação na précolheita em suas cultivares, sem muito sucesso, devido a complexidade da característica. Uma estratégia mais simples pode
ser a incorporação de genes de dormência nas cultivares, uma vez que a dormência é controlada por um menor número
de genes. Durante o processo de armazenamento das sementes, a dormência é naturalmente quebrada, não havendo
influência na taxa de germinação do plantio seguinte. Para facilitar a incorporação destes genes nas cultivares de trigo,
é necessária uma ferramenta de seleção assistida por marcadores moleculares. Para identificar marcadores moleculares
para a tolerância a germinação na pré-colheita foi utilizada uma população de 258 famílias F2:3, derivada do cruzamento
entre as cultivares Frontana (tolerante) e OCEPAR 18 (sensível). Os progenitores e as populações F2:3 foram semeados a
campo e na maturação fisiológica foram colhidas 20 espigas de cada família. Dez espigas foram submetidas a um sistema
de chuva artificial, e a avaliação da tolerância à germinação/dormência na espiga foi realizada por uma escala de notas de
1 a 11. Trinta e duas famílias F2:3 foram 100% resistentes, e 226 famílias foram suscetíveis ou segregaram. Neste caso,
apenas plantas F2 homozigotas foram consideradas no grupo de plantas tolerantes. Os resultados se ajustam a proporção
de 7:57 (χ2 = 0,57, P=45,07) revelando a existência de três genes no controle da dormência de sementes em trigo, sendo
um gene epistático e dois genes de efeitos duplicados. Uma vez que apenas plantas F2 homozigotas foram consideradas
no grupo de plantas resistentes, não é possível saber, por meio do estudo de herança, se os genes são dominantes ou
recessivos. A estratégia de BSA foi utilizada para identificar marcadores moleculares ligados aos genes responsáveis pela
dormência das sementes. O marcador microssatélite Xbarc170 foi identificado como ligado a um gene recessivo, no
cromossomo 4AL do genoma do trigo. O gene ligado a este marcador é essencial para a dormência das sementes em
trigo. Este marcador molecular poderá ser utilizado nos programas de melhoramento de trigo, para eliminar as plantas
suscetíveis e aumentar a probabilidade de obtenção de tolerância à germinação na pré-colheita em trigo. Novos estudos
deverão ser realizados para identificar os outros dois genes envolvidos com tolerância a germinação.
Apoio financeiro: Coodetec.
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Mapeamento genético da resistência da soja
à necrose da haste da soja
Oliveira, MAR1; Carpentieri-Pipolo, V2; Dalla Nora, T3; Mioranza, F3; Rocha, M4; Pellizzaro, K5; Calgaro, LC4; Vieira, ESN4;
Dellagostin, M1; Vicente, D1; Schuster, I4
1
Melhoramento de soja, Coodetec
Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de Londrina
3
Fitopatologia, Coodetec
4
Biotecnologia, Coodetec
5
Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, Universidade Estadual de Maringá
[email protected]
2
Palavras-chave: Cowpea mild mottle virus, Herança da resistência, Marcadores Microssatélites, BSA,
Seleção Assistida por Marcadores Moleculares
Identificada pela primeira vez no Brasil na safra 2000/2001, a necrose da haste da soja (NHS) é causada pelo vírus
CpMMV – Cowpea mild mottle virus, pertencente ao grupo Carlavirus. É uma virose altamente destrutiva, que pode
levar à morte das plantas. Esta virose tem se disseminado pelas lavouras de soja do país, por meio do vetor, a mosca
branca (Bemisia tabaci biótipo B). Este inseto está associado a outras culturas importantes no país, e apresenta grande
capacidade de desenvolver resistência aos inseticidas. Os objetivos deste trabalho foram estudar a herança da resistência
da soja à NHS e mapear o(s) gene(s) de resistência, com o auxílio de marcadores moleculares. Foi obtida uma população
F2 segregante para a resistência à NHS, a partir do cruzamento entre as cultivares BRS133 (resistente) e CD206
(suscetível). A avaliação foi realizada em casa-de-vegetação, e a inoculação foi realizada antes da abertura completa do
primeiro trifólio, e repetida após 10 dias. As avaliações foram realizadas 20 dias após a primeira inoculação, e repetidas
15 dias após. Das 114 plantas F2 avaliadas, 92 foram resistentes e 22 foram suscetíveis. O resultado é compatível com
a herança de um gene dominante (χ2=1,98, P=15,97%). O mapeamento deste gene de resistência foi realizado pelo
método de análise de bulks segregantes (BSA). O gene, denominado Rssn (Resistance to soybean steam necrosis) foi
mapeado no Grupo de Ligação G do genoma da soja, entre os marcadores Sat_308 e Satt303, a 28,87cM do primeiro
e 29,64cM do segundo. O mapeamento fino desta região genômica poderá identificar marcadores mais proximamente
ligados ao gene Rssn, os quais poderão ser utilizados em programas de seleção assistida por marcadores moleculares,
no melhoramento genético da soja.
Apoio financeiro: Coodetec.
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Diversidade genética em germoplasma de
arroz utilizando caracteres agromorfológicos
Bosetti, F1; Aguillar, CAJ1; Chiorato, AF1; Santos, MF1; Pinheiro, JB1
Departamento de Genética– ESALQ/USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Oryza sativa, Germoplasma, Análise Multivariada
A diversidade genética existente nos bancos de germoplasma precisa ser identificada para que possa ser eficientemente
utilizada em programas de melhoramento da cultura. A caracterização e avaliação de 192 acessos japoneses de Oryza
sativa do Banco de Germoplasma do Departamento de Genética da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz/
USP foi realizada por meio de dez caracteres agromorfológicos (número de dias para o florescimento, número de
perfilhos por planta, comprimento do colmo, altura da planta na maturidade, comprimento da panícula, comprimento
e largura da folha bandeira, ciclo total da planta, produtividade de grãos e massa de cem sementes). Essas características
foram submetidas a técnicas de análise multivariada para a análise da diversidade genética. O delineamento em blocos
aumentados de Federer foi utilizado para avaliar os genótipos e as seis cultivares comerciais (Caiapó, Curinga, Sertaneja,
IAC 1246, IAC 201 e IAC 202) que foram utilizadas como testemunhas. A dissimilaridade genética entre os acessos foi
obtida pela distância generalizada de Mahalanobis e, em seguida, foi utilizado o algoritmo de otimização de Tocher para
o agrupamento dos acessos, que foram reunidos em 10 grupos. O primeiro grupo absorveu 70% dos acessos, enquanto
que os quatro últimos grupos absorveram um acesso cada. Os acessos que ficaram sozinhos em um grupo foram Ego
Wase, Touzan Mochi, Shina Mochi e Saitama Senshou. As maiores distâncias intergrupos foram observadas entre os
grupos 9 (Shina Mochi) e 10 (Saitama Senshou), e entre 5 (Hitachi Nishiki e Ishiwari Mochi) e 9 (Shina Mochi). A
análise de variáveis canônicas foi utilizada para visualizar a dispersão dos acessos graficamente, procurando comparálas aos agrupamentos de Tocher e para analisar a representatividade dos caracteres para a diversidade entre os acessos.
A primeira variável canônica absorveu 94% da variação observada entre os acessos e as características relacionadas a
ela foram altura da planta na maturidade, comprimento do colmo, e comprimento da panícula, demonstrando que
essas características que tem importância agronômica também são importantes na análise da diversidade genética em
bancos de germoplasma.
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Desenvolvimento e otimização
de marcadores de microssatélites de
castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa)
Azevedo, VCR1; Sujii, PS1; Ciampi, AY1
Laboratório de Genética Vegetal, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
[email protected]
1
Palavras-chave: SSR, Lecythidaceae, conservação, Genética de populações, PCR
Nos programas de conservação, as indicações de estratégias e ações necessárias ao manejo de espécies nativa fortemente
explorada podem ser realizadas de maneira mais eficaz com utilização de marcadores moleculares. Dentre os marcadores
disponíveis, o mais recomendado para estudos de espécies nativas é o SSR (Simple Sequence Repeats) ou microssatélite,
por ser multialélico, de natureza codominante e permitir amplificação via PCR. Por, gerar alto conteúdo informacional
e confiabilidade em seus dados, possibilita análise de fluxo gênico, diversidade genética e estrutura genética. Com o
objetivo de estimar a diversidade genética de Bertholletia excelsa, foram desenvolvidos marcadores microssatélites. A
extração de DNA genômico foi feita a partir de folhas de um indivíduo adulto de B. excelsa da Bacia Amazônica,
utilizando-se o protocolo CTAB 2%. No desenvolvimento dos marcadores moleculares SSR o DNA total foi digerido
com a enzima MSE I e a biblioteca genômica foi enriquecida com poli AG/TC, ligada ao vetor pGEMT e transformado
em E. coli da cepa XL1-Blue. Foram seqüenciados cerca de 300 produtos de PCR dos insertos de clones positivos
contendo regiões repetitivas. As seqüências foram analisadas para o desenho dos iniciadores utilizando-se os programas
Staden Package, TROLL e Primer 3. Do total, 16 locos SSR desenhados e sintetizados, dois não amplificaram e 14
amplificaram fragmentos esperados em temperaturas de anelamento que variaram desde 52oC à 62oC. Estes locos
SSRs foram analisados quanto ao grau de polimorfismo, verificando o número de alelos/loco em gel desnaturante de
poliacrilamida 4%, corado com nitrato de prata. Após a otimização três locos não amplificaram fragmentos nítidos, dois
apresentaram fragmentos monomórficos e 11 pares de iniciadores apresentaram polimorfismo satisfatório evidenciando
de 2 a 10 alelos/loco, com os fragmentos que variaram de 90 a 275pb. Os dados gerados para os locos polimórficos foram
analisados com o programa GDA (Genetic Data Analysis) e foram calculados o número de alelos polimórficos por loco
(Ap), heterozigosidade esperada (He), heterozigosidade observada (Ho) e índice de fixação (f ). Foram observados Ap
variando entre 2 e 3; He=0,40; Ho=0,28; e f=0,30 consistente (IC entre 0,08 e 0,49). Os resultados obtidos mostram que
a bateria de marcadores SSRs de B. excelsa constituem uma ferramenta promissora para a execução de análises genéticas
que visem obter critérios e indicadores práticos da sustentabilidade genética e do manejo florestal da espécie.
Apoio Financeiro: Natura/FUNARBE – Fundação Arthur Bernardes.
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Informações de medidas descritivas para
o estudo da diversidade intrapopulacional
baseado em marcadores multialélicos
Ferreira, FM1; Barros, WS1; Cruz, CD2; Dias, LAS3; Carneiro, PCS2; Waldschmidt, AM2
Instituto de Ciências Exatas e Tecnologia da Universidade Federal do Aamazonas
2
Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: número efetivo de alelos, conteúdo polimórfico, Índice Shannon-Wiener
Vários estudos moleculares em populações, baseados em marcadores multialélicos, se destinam a quantificar o grau
de informação associado aos alelos e, ou locos amplificados, permitindo uma melhor compreensão da dinâmica da
diversidade genética inter ou intrapopulacional. Informações sobre a diversidade ajudam a elucidar processos evolutivos
das espécies, direcionar ações de conservação genética e de técnicas de melhoramento. Medidas descritivas fornecem uma
idéia inicial de como se encontra o polimorfismo genético intrapopulacional. No entanto, alguns autores as utilizam
e não percebem o quanto são informativas e o que se extrai quando empregadas nas análises. Buscando auxiliar neste
entendimento, o presente trabalho baseou-se num estudo simulado em que foram constituídas populações base e
oriundas dessas: populações híbridas; gerações de acasalamento ao acaso; autofecundações; gerações segregantes Fn e de
retrocruzamento, todas com 200 indivíduos, com informações provenientes de 10 locos codominantes, multialélicos e
polimórficos para cada população. Destacaram-se as medidas número de alelos efetivos por loco (ae), conteúdo médio de
informação polimórfica (PIC) e índice Shannon-Wiener (H’), quando interpretadas juntamente com outras. A medida ae
mostrou ser um índice representante do número de alelos com freqüências iguais em um loco e que, consequentemente,
contribue de forma efetiva para a diversidade gênica (ou heterozigosidade esperada, he), permitindo comparar populações
cujo número e distribuição de alelos difere drasticamente. Outro aspecto que chamou atenção foi a relação de ae com
a quantidade de alelos raros. Ao ser calculada a diferença entre o número de alelos do loco (aj) e ae, verificou-se que
quanto maior esta diferença maior era a presença de alelos de baixa freqüência. Para o loco que possuía o valor máximo
de he (quando as freqüências alélicas são iguais), encontrou-se aj = ae. Para ae = 1 ou próximo a unidade ocorreu quando
existia um único alelo de freqüência predominante no loco. Observou-se que valores de PIC tendem aos valores de
he na medida em que se aumenta o número de alelos de um loco. Assim valores de PIC revelaram o poder discriminatório
do marcador por considerar o número de alelos por loco bem como a freqüência relativa desses alelos. Quanto ao
índice H’ verificou-se alta correlação com o número de genótipos das populações. A população F2, que exibe máxima
variabilidade genotípica deteve os maiores valores de H’ em relação as demais. Populações oriundas de autofecundação e
de retrocruzamentos, com o avanço de gerações, reduziram os valores de H’, em virtude da tendência de fixar genótipos
homozigotos. Entende-se H’ como um índice de riqueza genotípica, que assumiu valor máximo quando freqüências
genotípicas eram iguais em um loco. Tais medidas em destaque caracterizaram muito bem a diversidade e o grau de
polimorfismo dentro das populações simuladas, inclusive agregaram informações de outros índices.
Apoio financeiro: CNPq e UFAM.
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Cross-genera transferability of
microsatellite markers from brazilian
(Swietenia macrophylla) to african (Khaya
senegalensis) Mahogany (Meliaceae)
Lemes, MR1; Feitosa, IL1; Martiniano, TM1; Ganoue, O2
Laboratório de Genética e Biologia Reprodutiva de Plantas, INPA, Av. André Araújo, 2936, 69083-000, Manaus, AM, Brasil
2
Botany Department, University of Hawaii at Manoa, Honolulu, HI 96822 USA
[email protected]
1
Keywords: Cross-amplification, transferability, SSR, Meliaceae, microsatellites
The mahoganies are highly economic valuable tree species of the tropical family Meliaceae naturally distributed in the
Neotropics and Africa. The Brazilian mahogany (Swietenia macrophylla) is the most valuable Neotropical timber species
and its conservation status has been a subject of increasing concern due to over exploitation. In recent years, the patterns
of genetic variation and other important population genetic parameters have been characterized for Swietenia species
across Central America and the Brazilian Amazon using DNA microsatellite markers. Khaya senegalensis (Meliaceae),
the African mahogany, is heavily harvested by indigenous people in West Africa for its bark and foliage. The extent of
over-harvesting of K. senegalensis in Benin suggests that this may have affected the genetic diversity and structure of its
populations. Microsatellite, or simple sequence repeats (SSR), have been widely recognised as powerful and informative
genetic markers. Microsatellite primers developed for one species can be used to detect polymorphism at homologous
sites in related species. Here we present results on transferability of microsatellite markers previously developed and
characterized for the Brazilian mahogany Swietenia macrophylla to the African mahogany, Khaya senegalensis, in order
to provide a set of polymorphic markers available to investigate the genetic diversity, population structure, gene flow
and mating system of this valuable species. Leaves were collected from 20 adult individuals of K. senegalensis from
different populations in Benin, West Africa and preserved in silica gel for DNA extraction. Genomic DNA extraction
followed standard CTAB protocol. PCR amplification was carried out using 20 microsatellite pairs of primers previously
developed for S. Macrophylla and amplified products were evaluated in agarose gel. All 20 primer pairs tested have
successfully amplified microsatellites in K. senegalensis. For polymorphism analysis, alelles were visualized and sized
in 4% polyacrylamide gel (PAGE) stained with silver nitrate for a set of 10 SSR loci and in 5% PAGE in an ABI 377
sequencer for other set of eight loci.. From 18 loci analysed in PAGE, 13 (72,2%) were polymorphic and five showed
monomorphic. The analysis of 20 individuals of K. senegalensis using the 18 loci revealed a total of 55 alelles. Allelic
richness varied from 2 to 8 alleles per locus considering the 13 polymorphic loci. Informative SSR transferability in
plants is mostly restricted to congeners. The results showed here demonstrated successful cross-amplification and
very high level of transferability of SSR loci between mahogany genera with potential for immediate application on
studies of genetic diversity and population structure, gene flow and mating system of K. senegalensis populations. Such
information will provide important insigths to develop effective conservation and sustainable management for this
valuable species.
Finnacial support: CNPq/Brazil, European Union, University of Hawaii/USA.
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Desenvolvimento de marcador molecular do
tipo SNP potencialmente associado com a
resistência do cafeeiro à ferrugem
Thiebaut, F; Caixeta, ET; Hufnagel, B; Alvarenga, SM; Zambolim, EM; Zambolim, L; Sakiyama, NS
Laboratório de Biotecnologia do Cafeeiro (BioCafé), Bioagro, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: café, primers, genômica, marcadores moleculares, ESTs
No Projeto Brasileiro do Genoma Café (PBGC) foram identificadas 8.968 ESTs (Expressed Sequence Tags) potencialmente
envolvidas com a resistência do cafeeiro a doenças. Após seleção dessas seqüências, 40 pares de primers específicos que
as amplificam foram desenhados. Desses, 28 apresentaram produto de amplificação monomórfico entre os cafeeiros
resistentes e susceptíveis à ferrugem. Considerando a possível diferença em apenas uma base dentro da seqüência
em estudo, um dos primers monomórficos foi escolhido para amplificar os fragmentos a serem seqüenciados com o
objetivo de verificar a presença de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) entre cafeeiros resistentes e susceptíveis. O
primer selecionado foi o CARF 006, desenhado a partir da EST do PBGC, com anotação automática correspondente
a gene R (disease resistance protein; CC-NBS-LRR class). O procedimento para verificar a presença de SNP consistiu na
amplificação, por meio de reação de PCR, do primer CARF006 em quatro genótipos susceptíveis à ferrugem (UFV214857, UFV2190-100, caturra 812, C. excelsa) e sete resistentes (UFV440-22, UFV443-3, UFV445-46, CIFC832-1,
CIFC33-1, CIFC1343-269 e CIFC420-10). Após a amplificação, foi realizada uma corrida eletroforética em gel de
agarose 1,2%. As bandas amplificadas foram excisadas do gel e purificadas com o Kit Gel Extraction (Qiagen). Com
os insertos obtidos, procedeu-se à clonagem no vetor pGEM®-T Easy (Promega). Células competentes Escherichia coli
DH5α foram transformadas, por choque térmico, com os insertos ligados aos vetores. Utilizando o Kit Wizard Plus SV
minipreps (Promega) realizou-se a extração do DNA plasmidial das colônias contendo o inserto. As amostras de DNA
plasmidial (85ng) foram encaminhadas para o seqüenciamento. As seqüências obtidas foram analisadas no programa
CodonCode Aligner. Comparou-se o resultado do seqüenciamento e a EST minerada no banco de dados do PBGC
utilizando os aplicativos Blast2sequences do NCBI e ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html). Para
verificar a presença de SNPs, duas seqüências consensos formadas, uma relacionada aos indivíduos resistentes e outra
aos indivíduos susceptíveis, foram alinhadas. A análise do seqüenciamento dos fragmentos amplificados pelo primer
CARF 006 comprovou a sua correspondência com a EST que originou o primer. O fragmento amplificado possui
840 pares de base (pb) e a EST minerada contém 571 pb, essa diferença de tamanho pode ser atribuída à presença de
introns. A comparação das seqüências consenso indicou a presença de uma mutação do tipo inserção/deleção (indel)
que os diferenciavam. Sendo observado um SNP entre esses indivíduos, representado por um gap para os genótipos
resistentes e por uma citosina/guanina para os susceptíveis. Este resultado permitiu concluir que os genes relacionados
com a EST possuem um SNP que diferem cafeeiros resistentes dos susceptíveis. Este SNP tem potencial para ser
usado como marcador molecular relacionado à resistência do cafeeiro à ferrugem e a ligação desse marcador com genes
específicos de resistência poderá ser verificada por análises em populações segregantes.
Apoio Financeiro: PNP&D/CAFÉ, FAPEMIG e FINEP.
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Confirmação de fecundação cruzada entre
espécies passifloras, visando a obtenção
de híbridos ornamentais
Conceição, LDHCS; Souza, PSC; Cerqueira-Silva, CBM; Corrêa, RX; Souza, MM
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: Passiflora Ornamental, RAPD, Hibridação interespecífica, P. gibertii, P. gardneri
As espécies silvestres são a base para um programa de melhoramento de passiflora ornamental. Essas espécies são utilizadas
como fontes de variabilidade para seleção de plantas com características ornamentais desejadas, sendo as progênies
obtidas por meio de cruzamentos interespecíficos e retrocruzamentos. A confirmação de obtenção de plantas híbridas
no estágio inicial de desenvolvimento é extremamente importante para um programa de melhoramento, reduzindo
tempo e recursos na manutenção de plantas em campo ou casa de vegetação. O uso de técnicas moleculares possibilita
uma avaliação rápida e precisa da paternidade com custo relativamente baixo. Desta forma, o objetivo do trabalho foi
confirmar a natureza híbrida de plantas, obtidas de cruzamentos dirigidos entre P. gibertii vs. P. gardneri, com o uso de
marcadores moleculares. Para tanto, realizou-se em duplicata, a amplificação de sete primers decâmeros de seqüências
arbitrárias (RAPD), sendo utilizada amostra de DNA do genitor masculino (Passiflora gibertii N.E. Brown), do genitor
feminino (Passiflora gardneri Mast.) e amostra de dez supostos híbridos. Os fragmentos amplificados via PCR foram
separados em gel de agarose (1,6%) e analisados quanto à presença ou não de bandas informativas (alelos presentes
no genitor masculino e ausentes no genitor feminino), sendo consideradas somente as bandas com elevada nitidez e
reprodutibilidade. Obteve-se um total de 13 bandas informativas entre os primers testados. A ocorrência de fecundação
cruzada foi confirmada em 46% das bandas encontradas em cinco primers. Os resultados permitem afirmar que a técnica
de RAPD é perfeitamente adequada para confirmação de híbridos em cruzamentos interespecíficos do gênero Passiflora
de forma rápida, precisa e com baixo custo.
Apoio Financeiro: FAPESB, UESC e CNPq.
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Desenvolvimento de oídio em linhagens e
variedades de soja em diferentes épocas de
avaliação em condições de campo
Pereira, DG1; Sediyama, T2; Reis, MS2; Cruz, CD3; Lopes, JLL2; Nogueira, APO2; Melo, CVVD4
Departamento de Química e Exatas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
2
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
4
Departamento de Ciências Biologias, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
[email protected]
1
Palavras-chave: Doenças da soja, Erysiphe diffusa
Entre os fatores que contribuem para a variação no rendimento da cultura da soja nas diversas regiões produtoras estão
as doenças. Entre elas, o oídio [Erysiphe diffusa (U. Braun & S. Takam)] é uma das potencialmente mais importantes.
Neste trabalho, objetivou-se avaliar o nível de infecção causado pelo oídio em genótipos de soja em épocas de avaliação.
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados, com quatro repetições, disposto em parcelas subdivididas,
com 15 genótipos (parcelas) e sete épocas de avaliação (subparcela). O recurso genético constou de linhagens e variedades
de soja fornecidas pelo Programa de Melhoramento Genético de Soja da UFV. A avaliação dos genótipos de soja foi
feita para a característica Nível de Infecção da Área Foliar Infectada pelo Oidio (NIAFI), seguindo o modelo tradicional
por meio de regressão, utilizando o aplicativo computacional em genética e estatística, denominado programa GENES
(Cruz, 2006). Foram verificadas diferenças significativas a 1% de probabilidade, pelo teste F, entre os genótipos, entre
as épocas de avaliação e para a interação genótipo × época, em relação a NIAFI. Pelas curvas de regressão, quando se
considerou os genótipos FT-Abyara RC5 (F4), FT-104, UFV 95-4121333 e UFV 94-5126, foi verificado que a partir
dos 30 dias após a inoculação, houve diferença de comportamento entre os genótipos, tornando-se mais evidente, por
ocasião da quarta avaliação. Desta forma, nas duas primeiras avaliações, todos os genótipos comportaram-se como
resistentes; na terceira, apenas ‘FT-104’ demonstrou moderada resistência, enquanto os demais se mostraram com
bom nível de resistência; na Quarta, ‘FT-104’ foi moderadamente suscetível apresentando variação para maior grau
de suscetibilidade com a evolução das avaliações, enquanto que entre as demais, apenas ‘FT-Abyara RC5 (F4)’ e ‘UFV
95-4121333’ se destacaram com variação de moderadamente resistente a Resistente. Por outro lado, valores acima de
95% para o R2 podem explicar tais variações. Para os genótipos UFV 94 - 3500, FT - Cristalina e FT-Estrela, também
pode-se inferir que após a terceira avaliação, constatou-se que o genótipo com maior grau de suscetibilidade foi
‘FT-Estrela’, porém, houve um progresso muito grande para os demais nas últimas avaliações.. Com respeito aos genótipos
UFV-16 (Capinópolis), UFV-19 (Triângulo), UFV 89 – 361826 T2 e FT-Abyara RC6 (F2), ambos comportaram-se
como resistentes, havendo, portanto, pouca ou quase nenhuma variação ou mudança de comportamento dos mesmos
durante as sete avaliações. Os resultados para os genótipos FT-10 RC5 (F3), Doko RC, UFV 94 - 334268 e BR 16
demonstram grande evolução no progresso do oídio durante as sete avaliações para o genótipo ‘BR 16’, garantindo
assim alto grau de suscetibilidade ao mesmo. Para os demais, praticamente, não houve variações de comportamento,
caracterizando-os como fontes de resistência, dados consistentes com os valores de R2, associando os maiores valores
ao maior grau de suscetibilidade e os menores aos melhores níveis de resistência.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESB.
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Seleção de marcadores WRKY, RGH, SSR
e SSR-EST visando a contrução de mapa
genético em Theobroma cacao L.
Araújo, IS1; Silva, DV1; Branco, SMJ1; Farias, NS1; Santos, CS1; Smith, WS1; Souza, MM1; Ahnert, D1; Machado, RCR2;
Carmo, VS2; Corrêa, RX1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
2
MARS Centro de Ciência do Cacau
[email protected]
1
Palavras-chave: SSR, Theobroma cacao L., Mapa genético
Nos últimos anos, fatores climáticos adversos, baixos preços do produto no mercado internacional e o alastramento de
doenças como a vassoura-de-bruxa e a podridão parda, levaram ao declínio da cultura cacaueira na Bahia. Pesquisas
voltadas ao melhoramento genético da cultura tem buscado, com o auxílio de ferramentas moleculares, alternativas
mais breves que levem à obtenção de novas fontes de resistência a doenças das até então utilizadas. Nesse sentido, a
construção de mapas genéticos com base em marcadores moleculares tem sido um dos estudos mais aplicados. O presente
estudo teve como objetivo selecionar marcadores gênicos (WRKY e RGH) e genéticos (SSR e SSR-EST) polimórficos
a serem utilizados na construção de um mapa genético de ligação em cacaueiro a partir de uma população composta
por 587 indivíduos. O DNA de cada um dos genitores da população (TSH 1188 e CCN 51) foi extraído á partir do
método CTAB sendo posteriormente quantificados em gel de agarose 0,8% e diluídos a 10ng. O teste de polimorfismo
entre os genitores foi realizado á partir de 12 pares de primers RGH, seis WRKY, 20 SSR e 26 SSR-EST. As reações
de amplificação foram feitas em um volume total de 20 µL e baseadas nas condições específicas descritas pelos autores
de cada classe de marcador. Posteriormente, as amostras foram amplificadas em termociclador automático com o
programa: 94 °C por 4 min + 40 ciclos de 94 °C por 30 seg, Tm (°C) específica de cada primer por 40 seg, 72 °C por
1 min + um ciclo final de extensão de 72°C por 7 min e redução a 15 °C. Os produtos de PCR foram separados
inicialmente em gel de agarose a 3% com o objetivo de verificar a qualidade da reação. Em seguida, as amostras foram
aplicadas em gel de poliacrilamida 6% para separação eletroforética dos fragmentos, sendo a detecção dos marcadores
feita a partir da coloração com nitrato de prata. As reações amplificadas com os primers RGH e WRKY também foram
avaliadas em gel de acrilamida 6% e coradas com nitrato de prata, mas baseadas nas condições específicas da técnica
de SSCP. Como resultado, foram detectados seis primes RGH polimórficos, três WRKY, 15 SSR e nove SSR-EST. A
detecção de polimorfismos de cada classe de marcador serão úteis para a construção do mapa genético da população
F1 de cacaueiro. Tais marcadores serão utilizados para selecionar genótipos segregantes para resistência às doenças
podridão-parda e vassoura-de-bruxa, auxiliados através de dados fenotípicos.
Apoio financeiro: UESC/FAPESB/CNPq/MARS Centro de Ciência do Cacau.
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Desenvolvimento de marcadores
microssatélites a partir de uma biblioteca
genômica enriquecida com trinucleotídeo
para Panicum maximum
Silva, GMB1; Sousa, ACS1; Boaventura, LB1; Souza, AP1
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Departamento de Genética e Evolução,
Instituto de Biologia, UNICAMP, CP 6010, CEP 13083-875, Campinas, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Forrageiras, microssatélites, Panicum maximum
O Panicum maximum é uma gramínea de origem africana, tetraplóide (2n=32 ou 36), com número básico de 8 a
9 cromossomos e se reproduz por apomixia. Devido a sua fácil adaptação, elevado valor nutritivo, alta qualidade e
produtividade, encontra-se atualmente entre as principais forrageiras cultivadas no país. O conhecimento genético dessas
forrageiras tropicais pode contribuir significativamente para a sustentabilidade do agronegócio da pecuária brasileira.
Por causa do potencial desta gramínea nas pastagens cultivadas, este trabalho tem por objetivo desenvolver marcadores
microssatélites, visando contribuir com os programas de melhoramento e o maior conhecimento genético desta espécie.
Foi construída uma biblioteca genômica enriquecida com as sondas [(ATC)8 e (CCT)8] a partir de um único genótipo
tetraplóide de P. maximum (T58). Foram selecionados 96 clones. Para a análise das seqüências e desenho de primers
foi utilizado o programa LaserGene, vs. 5.03 (DNAStar Ins.). Os 96 clones foram seqüenciados a partir dos quais, se
obtiveram 66 (68,75%) seqüências contendo microssatélites. Destas 66 seqüências, foi possível desenhar 22 pares de
primers. A biblioteca apresentou trinucleotídeos (81,82%) simples e compostos (perfeitos e imperfeitos). As outras
seqüências continham repetições de dinucleotídeos (10,61%), tretranucleotídeos (6,06%) hexanucleotídeo (1,51%).
Apoio: CNPq e FAPESP.
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Otimização de métodos para detecção de
mudas contaminantes em viveiros de eucalipto
Kettener, K1; Bortoloto, TM1; Bonine, CAV2; Teixeira, JEC2; Marino, CL1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
2
VCP - Votorantin Celulose e Papel
[email protected]
1
Palavras-chave: Eucalipto, viveiros, contaminação, “pools” de DNA
As empresas do setor florestal vêm utilizando com muito sucesso o plantio clonal intensivo de eucalipto, desta forma,
a correta identificação das plantas que serão utilizadas para produção de mudas nestes plantios clonais é extremamente
importante para garantir os ganhos genéticos desejados. Este processo de produção é executado manualmente, e passa
por diversas etapas onde podem ocorrer erros de rotulagem, quando isso ocorre, plantas com menor produtividade
são plantadas erroneamente em uma determinada região, resultando em uma menor produtividade. O objetivo deste
trabalho foi otimizar a identificação de material contaminante dentro de um minijardim clonal de eucalipto antes
da plantação em campo, a avaliação é feita através de reação de PCR com primers de RAPD ou SSR em indivíduos
selecionados randomicamente dentre os clones que serão plantados em campo. A estratégia utilizada para essa otimização
foi identificar dois clones altamente polimórfico com marcador SSR e confeccionar “pools” de DNA desses indivíduos,
misturando-os em diferentes proporções. Isso possibilitou a verificação da porcentagem mínima de contaminação que
pode ser detectada em reação de PCR. Em eletroforese em gel de agarose a contaminação de DNA detectada variou
de 10% (em uma mistura de DNA de 10 indivíduos, conseguimos detectar a presença de 1 indivíduo contaminante)
a 20% (1 indivíduo em uma mistura de 5) dependendo das características dos primers utilizados. Em eletroforese em
gel de poliacrilamida foi possível detectar 5% de contaminação, ou seja, em uma mistura de 20 é possível detectar um
indivíduo contaminante. Isso torna possível a redução de custos operacionais para a detecção de fidelidade de clones às
matrizes em um programa de melhoramento em eucalipto evitando prejuízos devidos ao plantio de material genético
contaminante em uma área clonal.
Apoio financeiro: Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”; VCP - Votorantin
Celulose e Papel; Fundibio.
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Uso de marcadores moleculares microssatélites
para detecção de polimorfismo entre genitores
de uma população de mapeamento de
Theobroma cacao L.
Smith, WS1; Silva, DV1; Branco, SMJ1; Farias, NS1; Santos, CS1; Ahnert, D1; Souza, MM1; Machado, RCR2; Carmo, VS2;
Corrêa, RX1; Araújo, IS1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
2
Centro de Estudos Almirante Cacau
[email protected]
1
Palavras-chave: Theobroma cacao L., Mapa genético, Marcadores moleculares, Polimorfismo, Microssatélites
Através dos avanços no uso de marcadores moleculares, a biologia molecular tem gerado novas alternativas para suas
aplicações no estudo da engenharia do DNA. Propondo-se estudar a amplitude do efeito dos principais fatores genéticos
envolvidos no controle de características de grande importância, novos marcadores moleculares têm sido desenvolvidos
no intuito de manipular esses fatores em base individual durante os procedimentos de seleção e recombinação genética.
Tais marcadores moleculares, além de fornecer um número ilimitado de polimorfismos com base no DNA são, ainda,
independentes dos efeitos ambientais e da condição fisiológica da planta. Em relação ao cacaueiro, os marcadores
moleculares têm sido usados no mapeamento de genes de valor agronômico, e essa técnica tem mostrado significativa
notabilidade na identificação de genótipos superiores. A detecção de polimorfismo entre estes marcadores constitui
uma etapa imprescindível para a avaliação da segregação em populações. Partindo deste princípio, este trabalho teve o
objetivo de avaliar um conjunto de marcadores moleculares microssatélites quanto à presença de polimorfismo entre
os clones CCN51 e TSH1188, os quais são genitores de uma população F1 de mapeamento de cacaueiro. O DNA dos
genitores foi previamente extraído pelo método CTAB, quantificados em gel de agarose 0,8% e diluídos a 10ng. As
reações de amplificação foram feitas em um volume total de 20µL, contendo 10 mM (pH 8,3) de Tris-HCl, 50 mM
de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 200uM de cada dNTP (dATP, dTTP, dGTP e dCTP), 200 µM de cada um dos primers
SSR específicos foward e reverse, 1 U de Taq DNA polimerase e, aproximadamente, 20 ng de DNA. Em seguida, as
amostras foram amplificadas em termociclador automático com o seguinte programa: 94 °C por 4 min + 40 ciclos de
94 °C por 30 seg, 46° C por 1 mim, 72 °C por 1 min + um ciclo final de extensão de 72°C por 10 min e redução a
15 °C. Visando avaliar a qualidade do produto de amplificação, as amostras foram inicialmente aplicadas em gel de
agarose a 3%, corados com brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta. Em seguida, as amostras foram aplicadas
em gel de acrilamida 6% e corados com nitrato de prata. Dos 28 pares de primers avaliados, 27 geraram produtos
de amplificação, sendo que 12 foram polimórficos (mTcCIR68, mTcCIR75, mTcCIR77, mTcCIR81, mTcCIR82,
mTcCIR85, mTcCIR88, mTcCIR91, mTcCIR92, mTcCIR94, mTcCIR96, mTcCIR97) entre os genitores CCN51
e TSH1188. Os resultados obtidos neste trabalho serão utilizados no estudo de segregação dos 587 genótipos da
população, visando, posteriormente, a seleção de genótipos superiores para o caráter resistência às doenças.
Apoio financeiro: UESC/FAPES/CNPq/MARS Centro de Ciência do Cacau.
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Utilização de marcadores microssatélitesEST visando detecção de polimofismos
entre genitores de uma população de
mapeamento (F1) de cacaueiro
Farias, NS1; Silva, DV1; Branco, SMJ1; Santos, CS1; Smith, WS1; Souza, MM1; Ahnert, D1; Carmo, VS2; Machado, RCR2;
Corrêa, RX1; Araújo, IS1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
2
MARS Centro de Ciências do Cacau
[email protected]
1
Palavras-chave: Theobroma cacao L., Marcadores SSR-EST
A construção de mapas de ligação é de suma importância no processo de localização de genes de interesse. Levando-se
em consideração que os marcadores moleculares são ferramentas essenciais para a construção destes mapas, a aplicação
de diferentes classes dos mesmos têm sido relevante na saturação de mapas. Dentre os marcadores disponíveis para a
construção de mapas genéticos, os microssatélites têm sido um dos mais utilizados. Atualmente, uma nova classe de
marcadores moleculares tem surgido com grande potencial, eles são obtidos a partir de seqüências expressas do genoma
e são conhecidos como microssatélites derivados de EST, ou simplesmente SSR-EST. O cacaueiro (Theobroma cacao
L.), na região sul da Bahia, tem sofrido prejuízos significativos na sua produção de amêndoas devido à ocorrência de
várias doenças. Assim, a construção de mapas genéticos para esta espécie tem se constituído em uma das alternativas
mais interessantes no auxílio à busca de genótipos que se apresentem como fontes de resistência a doenças. O
objetivo do presente estudo foi avaliar a presença de polimorfismo entre os genitores (TSH1188 X CCN51) de uma
população de 587 genótipos de cacaueiro com base nos marcadores SSR-EST, visando posterior aplicação no estudo
de segregação na população F1 descendente. O DNA de cada um dos genitores foi extraído a partir do método CTAB
sendo posteriormente quantificados em gel de agarose 0,8% e diluídos a 10ng. As reações de amplificação foram feitas
em um volume total de 20 µL, contendo 10 mM (pH 8,3) de Tris-HCl, 50 mM de (NH4)2SO4, 1,5 mM de MgCl2,
200uM de cada dNTP, 0,1 µM de cada um dos 26 diferentes primers SSR-EST específicos foward e reverse, 0,4 U
de Taq DNA polimerase e, aproximadamente, 15 ng de DNA. As amostras foram amplificadas em termociclador
automático com o seguinte programa: 94 °C por 4 min + 40 ciclos de 94 °C por 30 seg, 50°C por 1 min, 72 °C por
1 min + um ciclo final de extensão de 72°C por 7 min e redução a 15 °C. Inicialmente, os produtos de PCR foram
submetidos à separação em gel de agarose a 3% objetivando visualizar a qualidade do produto de amplificação. Em
seguida, as amostras foram aplicadas em gel de acrilamida 6% e corados em nitrato de prata. Dos 26 pares de primers
SSR-EST availados 7 não aplificaram, 19 geraram produto de amplificação sendo que, destes 9 foram polimórficos
entre os genitores CCN51 e TSH1188, por meio das análises em gel de acrilamida. A detecção de primers SSR-EST
polimórficos entre os genitores CCN51 e TSH1188 neste estudo será muito importante para a utilização dos mesmos
na população de mapeamento de cacaueiro.
Apoio financeiro: UESC/FAPESB/CNPq/MARS Centro de Ciências do Cacau.
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Desenvolvimento de marcadores
microssatélites para a fava d’anta
Dimorphandra mollis (Fabaceae)
por meio de técnica de shotgun
Rabelo, SG; de Sousa, C; Leoi, L; Collevatti, RG
Pós-graduação em Ciência Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília
[email protected]
Palavras-chave: Dimorphandra mollis, faveira, Cerrado, rutina, microssatélites
Produtos florestais não-madeireiros são utilizados de diversas formas a milhares de anos, representando fonte de consumo
e renda para milhões de pessoas no mundo. O emprego desses recursos inclui várias partes da planta: casca, flores,
frutos, resinas, sementes, entre outras. Espécies vegetais como pequi, fava d’anta e plantas medicinais são exploradas
indiscriminadamente no Brasil e com o emprego de baixa tecnologia, apesar do alto valor comercial desses produtos
no mercado externo. Um exemplo de produto florestal não-madeireiro explorado no entorno da Floresta Nacional do
Araripe/CE é o fruto verde imaturo de fava d’anta (Dimorphandra mollis), pois a indústria farmacêutica tem interesse
neste fruto devido à presença da rutina, uma substância bioflavonóide que atua nas paredes dos vasos capilares. Estima-se
que 20.000 toneladas de frutos verdes são coletadas anualmente no Brasil. Acredita-se que a sua exploração sustentável
possa ser uma alternativa frente ao desmatamento, utilizando estratégia para conservação da biodiversidade em florestas
tropicais. Esta é uma questão central para a biologia da conservação dos recursos naturais da FLONA do Araripe, pois é
a última porção de vegetação original da região, conseqüentemente, o alvo principal para a obtenção de matéria prima
pelas comunidades locais. A ação desta pesquisa está focada em estudos que possibilitem avaliar o comportamento
da estrutura ecológica e genética das populações de fava d’anta submetidas à intensa ação extrativista. Neste trabalho
foram isolados microssatélites a partir de biblioteca genômica obtida pela técnica de shotgun. Foram seqüenciados
768 clones e desenhados pares de iniciadores (primers) a partir das seqüências que continham microssatélites com
auxílio dos programas Staden e Primer 3. Está em processamento a caracterização de polimorfismo para os locos de
microssatélites identificados e subseqüentemente a análise genética das populações.
Apoio Financeiro: FUNAPE.
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Avaliação da qualidade do DNA do Buriti
(Mauritia flexuosa Mart.) obtido de folhas
e caule para utilização em estudos de
diversidade genética
Silva, CM; Ferreira, MFM; Melo Junior, AF; Oliveira, DA; Pimenta, MAS
Laboratório de Biotecnologia, Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Montes Claros – Unimontes
[email protected]
Palavras-chave: Buriti, Extração, DNA
O Buriti (Mauritia flexuosa Mart.) é uma palmeira amplamente distribuída no território nacional, ocorrendo desde
as veredas do cerrado até os estuários de rios e áreas alagadas da floresta amazônica, pertencente à família Palmae
(Arecaceae). Encontra-se figurando entre as espécies ameaçadas de extinção no Estado de Minas Gerais, principalmente
por causa dos altos índices de fragmentação e extrativismo intensivo na região Norte do Estado. O extrativismo resulta
em perdas ou redução de populações naturais afetando a diversidade genética das populações exploradas. Dessa forma,
o presente projeto de pesquisa teve como objetivo avaliar a qualidade do DNA de duas populações do buriti extraído
de folhas e caule para ser utilizado em estudos de caracterização da estrutura genética de duas populações naturais na
Área de Proteção Ambiental APA-Pandeiros (Norte de Minas Gerais). No processo de extração, amostras foliares e de
caule de 30 indivíduos de cada uma das populações foram coletadas e encaminhadas ao Laboratório de Biotecnologia
da Universidade Estadual de Montes Claros - Unimontes para extração do DNA segundo a metodologia descrita por
Doyle & Doyle (1990) modificada por Faleiro et al. (2003). A coleta de parte do caule teve como finalidade verificar
se haveria diferenças entre o DNA extraído das folhas e do caule. Os resultados mostraram que a extração de DNA a
partir do caule do buriti não foi eficiente, e mesmo as plantas que tiveram o DNA extraído o mesmo não foi de boa
qualidade além de estar em boa parte degradado. Diante disso, no processo de extração dos demais indivíduos será
utilizado como material biológico as folhas das plantas por terem permitido a extração de DNA de todas as plantas e
o mais importante, o DNA obtido foi de boa qualidade.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG (Bolsas PCRH e BIPDT).
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Análise da microsporogênese e viabilidade
do grão de pólen em Alchornea triplinervia
(Euphorbiaceae)
Godoy, SM; Alonso-Pereira, AR; Risso-Pascotto, C, Romagnolo, MB
Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Paranaense – UNIPAR, Campus de Paranavaí (PR)
[email protected]
Palavras-chave: Alchornea triplinervia, microsporogênese, meiose, gametas 2n, viabilidade do pólen
Alchornea triplinervia é uma espécie pertencente à família das Euphorbiaceae. Planta dióica de 15 a 30 metros de altura
com tronco de 40 a 100 cm de diâmetro, folhas subcoriáceas levemente impubescentes na face inferior. Encontra-se
amplamente distribuída pelos estados da Bahia ao Rio Grande do Sul e é característica da floresta pluvial atlântica
que sofreu interferência do homem (LORENZI, 2002). No Brasil há ocorrência de cerca de 70 gêneros e cerca de
1000 espécies de Euphorbiaceae, representando uma das principais famílias da flora brasileira e uma das mais complexas
do ponto de vista taxonômico (SOUZA, 2005). Considerando que estudos meióticos são inexistente para a espécie
Alchornea triplinervia e que a citogenética tem sido muito utilizada para fins de análise citotaxonômicas e evolutivas de
várias espécies vegetais. O presente estudo teve como objetivo analisar o comportamento dos cromossomos durante a
microsporogênese de Alchornea triplinervia. Inflorescências jovens foram coletadas e fixadas em solução de etanol: ácido
acético (3:1) por 24 horas e em seguida armazenadas em álcool a 70% sob refrigeração até o momento das análises. As
inflorescências foram dissecadas com auxílio de microspcópio esteroscópio e as lâminas coradas com carmim acético a
1%. As mesmas foram analisadas ao microscópio óptico. Nas diacineses os cromossomos foram observados associados
em bivalentes e tetravalentes, porém, como havia muita sobreposição não foi possível sua contagem. Foram encontradas
em metáfase I e II células com cromossomos em ascensão precoce e também cromossomos não congressados. Em anáfase
I e II a presença de cromossomos retardatários e formação de pontes cromossômicas foram observadas, assim como,
aderências em anáfase I. Na fase de telófase foi observada a presença de micronúcleos, tanto em telófase I, quanto, na
telófase II, e nesta última observou-se, também, restituição nuclear em um dos pólos, levando a formação de díades e
tríades. A formação de micronúcleos ocorreu, também, em células na fase de prófase II. Como produto final da meiose,
além de tétrades normais, foram encontradas tétrades com micrócitos. Estas irregularidades culminaram com a formação
de micrósporos 2n, binucleados e desbalanceados. Porém, tais anormalidades não comprometeram a viabilidade dos
grãos de pólen, pois apenas 9,91% mostraram-se estéreis.
Apoio Financeiro: UNIPAR e Fundação Araucária.
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Análise molecular de variedades de canade-açúcar (Saccharum spp.) contrastantes
à seca pelo uso do marcador ISSR
Costa, MLM1; Amorim, LLB2; Melo, LJOT3; Benko-Iseppon, AM2; Carvalho, R1
Laboratório de Genética-Bioquímica e Seqüenciamento de DNA, Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco
2
Laboratório de Genética Molecular Vegetal, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
3
Estação Experimental de Cana-de-Açúcar do Carpina, Carpina-PE (EECAC/UFRPE)
[email protected]
1
Palavras-chave: ISSR, Diversidade genética, Estresse abiótico
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) apresenta extensa complexidade genética, compreendendo variedades comerciais
resultantes de hibridação interespecífica com padrões aneuplóides distintos. Após algum tempo tais variedades sofrem
uma degenerescência perdendo parte de sua capacidade produtiva, tornando-se necessária a introdução de novas
variedades selecionadas localmente. Estresses abióticos (como déficit hídrico) estão entre os fatores mais limitantes para
a produtividade, gerando enormes demandas de identificação e caracterização de variedades tolerantes à seca ou a outras
características de importância agronômica, para uso como linhas parentais em programas de melhoramento. ISSR ou Inter
Simple Sequence Repeat é um marcador baseado em PCR que permite acessar as regiões hipervariáveis de microssatélites,
dispersas principalmente no genoma nuclear, apresentando-se como ótimo marcador para caracterização molecular
de indivíduos dentro das populações. A diversidade genética foi estudada com base nos polimorfismos gerados por
12 primers ISSR entre nove variedades de cana-de-açúcar (SP79-1011, SP70-1143, SP78-4764, RB98710, RB763710,
RB683129, RB75126, RB943365, B8008) contrastantes para resistência à seca, além de duas outras variedades
(Co331, Co419, ambas procedentes da Índia) usadas como grupo externo na geração do dendrograma. O DNA
genômico foi isolado a partir de folhas jovens seguindo protocolo CTAB maxiprep. As reações de amplificação foram
preparadas em um volume total de 20 µL de solução, incluindo 15 ηg de DNA genômico, 2,0 μl 10x PCR buffer,
2,5 mM MgCl2, 10mM de dNTP-mix, 50 μM oligonucleotídeos e 0,5 unidade de Taq DNA polimerase. As amplificações
de DNA foram realizadas em termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient. As reações incluíram uma desnaturação
inicial de 4’ a 94ºC, seguida de 30 ciclos como segue: desnaturação a 94°C por 30”, anelamento de 1’ a 50,4 a 60,5°C,
dependendo do primer, e extensão a 72°C por 2 min, com uma etapa de extensão final na mesma temperatura por
7 min. Os produtos finais foram separados em gel de agarose 1,8%, corados com brometo de etídio e visualizados
sobre luz ultravioleta. Todos os 12 primers testados amplificaram fragmentos polimórficos permitindo a inserção de
301 bandas na matriz de dados. A análise dos clusters para geração do dendrograma pelo programa neighbor-joining
(MEGA) dividiu os acessos em dois clados principais, onde o cluster ‘A’ agrupou as variedades CO331 e CO419 e
o cluster ‘B’ reuniu outras oito variedades brasileiras e uma de Barbados (B8008). Um sub-cluster reuniu variedades
com características agronômicas similares, com valor de bootstrap de 84%, agrupando as variedades SP79-1011,
SP70-1143, RB98710, RB763710 e RB683129, todas tolerantes à seca. As variedades SP79-1011 e RB763710 possuem
tolerância à seca, mas diferem no tempo de maturação, teor de sacarose e resistência à ferrugem. Os resultados obtidos
se apresentam promissores para a seleção assistida por marcadores moleculares e para posterior mapeamento genético,
auxiliando na seleção de variedades com caracteres desejáveis.
Apoio Financeiro: EECAC/UFRPE; UFPE.
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Variação somaclonal em plantas de canade-açúcar micropropagadas
Hsie, BS1; Souza, RB2; Oliveira, LMS3; Brito, JZ4; Silva, MV5; Donato, VMTS6
Estudante de graduação em ciências biológicas da UFPE/Bolsista da FACEPE
2
Estudante de graduação em ciências biológicas da UFPE
3
Estudante de graduação em ciências biológicas da UFRPE
4,6
Pesquisadores/Instituto Agronômico de Pernambuco-IPA
5
Departamento de Bioquímica da UFPE
[email protected]
1
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, micropropagação, variação somaclonal, marcadores moleculares
A cultura da cana-de-açúcar tem sido uma importante fonte de riqueza para a economia brasileira, sendo o Brasil
considerado o maior produtor mundial. Em decorrência da posição de destaque que ocupa na economia mundial, a
cultura da cana está freqüentemente inserida em programas de melhoramento de espécies cultivadas. A micropropagação
visa fornecer rapidamente um grande número de mudas de materiais livres de doenças ou resistentes, usando instalações
reduzidas, porém sua grande limitação é o surgimento de variantes somaclonais. Variação somaclonal é o termo utilizado
para descrever variações genéticas que ocorrem durante o processo de cultivo in vitro. Esse trabalho teve como objetivo
identificar variação somaclonal na variedade de cana-de-açúcar proveniente de micropropagação, utilizando marcadores
de DNA do tipo RAPD e ISSR. Foi utilizado como material vegetal, plantas de cana-de-açúcar da variedade RB 92579
provenientes de micropropagação, em meio MS acrescido de tiamina (0,1 g.L-1), inositol (0,1 g.L-1), BAP (0,2 mg.L-1),
KIN (0,1 mg.L-1) e sacarose (20 g.L-1). Foram realizados 8 subcultivos consecutivos com intervalos de 15 dias. Para a
extração do DNA foi utilizado tecido foliar coletado a cada subcultivo. O DNA obtido foi amplificado com 10 primers
de RAPD e 11 de ISSR. Os fragmentos de DNA amplificados foram separados por eletroforese em géis de agarose,
corados com SyBr Gold, em tampão TBE, a 80V e fotografados sob luz UV com um fotodocumentador. O marcador
1 Kb Plus DNA Ladder DNA foi utilizado como padrão para estimar o tamanho dos fragmentos. De acordo com a
amplificação dos fragmentos obtidos, observou-se que não houve diferença no padrão de amplificação para nenhum
dos marcadores utilizados, sugerindo uma provável ausência de variação genética. Assim, pode-se considerar segura a
propagação in vitro de até 7 subcultivos consecutivos, adotado pelos laboratórios que produzem mudas micropropagadas
de cana-de-açúcar. No entanto, como há muito pouca informação na literatura a respeito, este trabalho terá continuidade
até o 15º subcultivo a fim de identificar em qual deles começa a surgir variação genética e, portanto, definir com mais
segurança o número de subcultivos mais adequado para a produção in vitro de mudas.
Financiado pelo FACEPE.
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Caracterização de cultivares comerciais de
batata através de marcadores moleculares
microssatélites
Rosa, PM; Campos, T; Souza, AP
Universidade Estadual de Campinas
Patrí[email protected]
Palavras-chave: Solanum tuberosum, Batata, Microssatélites
A batata (Solanum tuberosum L.) é um alimento consumido em todo o mundo e utilizado para várias finalidades.
Grande parte da produção de batata é destinada ao processamento de produtos alimentícios, principalmente o de batata
“chips”. Cultiva-se atualmente milhares de variedades, e um significante número de novos cultivares são desenvolvidos
anualmente para atender as exigências do mercado. A caracterização de cultivares é importante para que o produtor possa
utilizar as variedades mais adaptadas e produtivas, ter garantia da legitimidade da cultivar, alta qualidade fitossanitária
na produção de batata semente, e retorno ao melhorista de seu investimento na pesquisa. A identificação de cultivares
com base em características morfológicas é um processo complexo e moroso, e por estas razões um método rápido e
robusto para a diferenciação de cultivares é necessário. Este trabalho teve o propósito de selecionar um número mínimo
de marcadores microssatélites capaz de identificar 14 cultivares comerciais de batata utilizados no Brasil. Para isto, foram
testados 24 marcadores microssatélites disponíveis na literatura. A genotipagem foi realizada em géis de poliacrilamida
6% corados com nitrato de prata.Dentre os 24 locos utilizados, foram polimórficos 23 microssatélites. A seleção dos
melhores marcadores para a identificação varietal atendeu aos seguintes critérios: a) qualidade visual dos produtos
no gel; b) marcadores com alto poder disciminatório, que assim pudessem distinguir maior número de amostras; c)
número mínimo de marcadores que pudessem discriminar as variedades e pudessem ser aplicados em um único gel.
Com base nos resultados obtidos, foi possível identificar um conjunto de 2 microssatélites capazes de distinguir todos
os cultivares analisados.
Apoio Financeiro: Fapesp.
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Seleção fenotípica de tucumãzeiros para
a produção de frutos
De Oliveira, NP1; de Oliveira, MSP2; Junqueira, NV3
1
Universidade Federal do Pará, bolsista ITI A CNPq
Laboratório de Genética, Embrapa Amazônia Oriental
3
Embrapa Cerrados
[email protected]
2
Palavras-chave: tucumã, biocombustível, melhoramento genético, palmeira, Amazônia
A produção de óleo vegetal para abastecer a crescente demanda por biocombustíveis ainda é um grande desafio para o setor
produtivo e requer grandes investimentos em pesquisa e desenvolvimento. O tucumãzeiro (Astrocaryum vulgare Mart.)
é uma palmeira perene nativa da América do Sul, cujos frutos, além de comestíveis, apresentam composição de ácidos
graxos desejáveis para o mercado de biodiesel. Em conseqüência disso, foi indicada como uma das espécies prioritárias
para pesquisas com essa finalidade. Entretanto, pouco se conhece sobre seu potencial agronômico que possa orientar
cultivos racionais, especialmente sobre a disponibilidade de sementes melhoradas. O objetivo deste trabalho foi
selecionar tucumãzeiros com alta produção de frutos e formar uma população melhorada para atender esse mercado.
Para tanto, foi avaliada a produção de frutos de todas as plantas dos 32 acessos (progênies de polinização livre) de
tucumãzeiro pertencentes à Coleção de Germoplasma da Embrapa Amazônia Oriental, com base em três caracteres
produtivos: número total de meses em produção (NTM), número total de cachos produzidos (NTC) e produção total
de frutos (PTF), durante cinco anos (1997 a 2001). Para a seleção dos indivíduos foi utilizado o caráter produção
total de frutos auxiliado pela seleção visual para perfilhamento. Primeiramente, foram selecionadas as progênies que
apresentaram produção acima da média da Coleção. Em seguida, foram selecionados os indivíduos mais produtivos
dentro de cada progênie. As progênies exibiram diferenças altamente significativa para os três caracteres avaliados
evidenciando a possibilidade de sucesso na seleção. As herdabilidades médias para esses caracteres apresentaram
altas magnitudes, com 71,93 %, 79,12 % e 78,23 % para NTM, NTC e PTF, respectivamente, sendo a razão entre
CVg/CVe próximo de 1. As correlações fenotípicas e genotípicas entre os caracteres foram positivas e também, atingiram
altas magnitudes. A média da coleção (µo) para o caráter PTF foi de 5,93 kg de frutos/planta/ano, sendo selecionadas
10 progênies como as mais produtivas. Na seleção dentro das progênies 36 tucumãzeiros tiveram alta produção, mas
apenas 29 apresentaram perfilhamento. De um modo geral, os tucumãzeiros selecionados além de apresentarem boa
produção (µs= 11,70 kg), tiveram em média, rendimento de polpa por fruto, rendimento de óleo e o número de
perfilhos por planta de 61,22%, 31,68% e 5, 69, respectivamente. O ganho genético esperado com a seleção foi de
37,94% e a estimativa de média para a população melhorada foi de 8,81 kg de frutos/planta/ano. Os 29 tucumãzeiros
devem compor a população melhorada que fornecerá sementes aos plantios comerciais.
Apoio Financeiro: FINEP, Embrapa.
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Macho esterilidade em progênie de
Theobroma grandiflorum (Willd. ex Spreng.)
Schum. (Sterculiaceae) (Cupuaçu)
Pinheiro, TM1; Cunha Neto, WV1; Maués, MM2; Alves, RM2
Graduando em Agronomia pela Universidade Federal Rural da Amazônia e bolsista da Embrapa Amazônia Oriental
2
Pesquisador (a) da Embrapa Amazônia Oriental
[email protected]; [email protected]; [email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Macho esterilidade, Pólen, Botão Floral, Progênie, Theobroma grandiflorum
Durante a realização de cruzamentos controlados em plantas de Theobroma grandiflorum no BAG da Embrapa Amazônia
Oriental, foi verificado que uma das 17 progênies presentes no experimento não apresentava pólen nas anteras,
enquanto as demais 16 progênies do BAG apresentavam produção normal de pólen. Para verificar a ocorrência de
macho esterilidade nessa progênie, foi feita uma estimativa da quantidade de grãos de pólen por flor em todas as plantas
(n = 15). Dentre as 17 progênies presentes, foram escolhidas aleatoriamente sete progênies como testemunhas
(01, 02, 06, 07, 12, 14 e 21) e destas foram escolhidas ao acaso duas plantas, de um total de quinze, das quais foram
coletados dois botões florais em fase de pré-antese, pois a contagem do pólen deve ser feita em anteras fechadas. Os estames
foram macerados em uma ml de solução de etanol com azul de metileno 1%, ficando nessa solução por 24 horas para
absorção do corante. Foram retiradas seis sub-amostras de 1 µl com micropipeta, colocadas em lâminas, cobertas com
lamínulas, e levadas ao microscópio ótico para a contagem direta do pólen. A quantidade de grãos de pólen presentes
em cada botão floral coletado foi estimada, extrapolando-se os valores obtidos para 1ml e em seguida multiplicando-se
pelo número de anteras (cinco) Os resultados foram analisados estatisticamente e comparados entre si. A progênie 13
apresentou grande variabilidade na produção de pólen entre as plantas, variando entre 2.500 a 22.083, com média de
11.422 ± 1.260,49. As progênies 01, 02, 06, 07, 12, 14 e 21 obtiveram, respectivamente, médias iguais a 20.833 ±
1.767, 80.833 ± 2.332, 76.250 ± 4.481, 26.042 ± 6.678, 39.792 ± 8.067, 45.625 ± 5.583, 35.208 ± 6.652 de pólen.
Não se pode afirmar, portanto, que haja ocorrência de macho esterilidade na progênie 13, pois foi encontrado pólen
nas anteras de algumas plantas em quantidade semelhante a outras plantas testemunhas. Entretanto, essa produção foi
muito variável e baixa na maioria plantas estudadas, com um valor médio que está próximo da metade do menor valor
encontrado para as outras progênies, o que torna interessante a investigação da viabilidade dos grãos de pólen dessa
progênie, para confirmar se existe esterilidade funcional do pólen.
Apoio Financeiro: Embrapa Amazônia Oriental.
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Efeito de antibióticos para eliminação de
agrobacterium no enraizamento in vitro de
brotos de Citrus sinensis L. Osb
Neves, DM; Mendes, AFS; Cidade, LC; Costa, MGC
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus-BA
[email protected]
Palavras-chave: transformação genética, citros, enraizamento, antibióticos, agrobactéria
A Agrobacterium tumefaciens possui a habilidade de transferir e integrar fragmentos específicos de DNA exógeno no genoma
de uma planta hospedeira, e devido a esta capacidade, esta bactéria tem sido utilizada como uma ferramenta importante
na engenharia genética de plantas. Para uma alta eficiência na obtenção de planta transgênicas, deve-se dispor de um
protocolo de regeneração bem definido associado a um sistema de transformação otimizado para a introdução do gene
de interesse. Em citros, o sucesso na recuperação de plantas transgênicas é relativamente limitado, devido a dificuldades
no enraizamento de brotos transgênicos e influência do genótipo. Portanto, a escolha do antibiótico empregado para
a eliminação de Agrobacterium nos protocolos de transformação genética de citros é extremamente importante, pois
o mesmo não deve promover a inibição do crescimento e a organogênese de brotos ou raízes, não deve ser de custo
elevado, devendo ser estável quando em cultura e principalmente promover a eficiente eliminação da agrobactéria. Os
antibióticos mais utilizados nos trabalhos de transformação genética incluem a cefotaxima, o meropenem e o timentim,
que têm sido utilizados com sucesso para a transformação genética mediada por Agrobacterium de diversas espécies
vegetais. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência dos antibióticos cefotaxima, meropenem e timentim
no enraizamento in vitro de brotos de duas variedades de laranja-doce [Citrus sinensis (L.) Osb, ‘Pêra’ e ‘Pineapple’].
Ao meio de enraizamento [MS “força completa” e uma combinação das auxinas ácido naftalenoacético (ANA) a 0,5
mg.L-1 e ácido indolbutírico (AIB) a 0,5 mg.L-1] foram adicionados os antibióticos nas seguintes concentrações: 250 ou
500 mg.L-1 de cefotaxima, 150 ou 300 mg.L-1 de timentin ou 6,25 ou 12,5 mg.L-1 de meropenem. Para a variedade
‘Pêra’, o antibiótico meropenem em ambas as concentrações testadas promoveu o maior número de raízes por broto
(3,59) e comprimento de raízes (2,66 cm, em média). Para ‘Pineapple’, não houve diferenças significativas entre os
tratamentos em relação ao número médio de raízes por broto. No entanto, o antibiótico timentim a 150 mg.L-1
promoveu um maior crescimento de raízes (3,78 cm em média) para essa variedade. A análise dos resultados permite
concluir que o efeito dos antibióticos usados para a remoção de Agrobacterium no enraizamento in vitro de citros é
genótipo-dependente, sendo meropenem a melhor opção para a variedade ‘Pêra’ e timentim o antibiótico de escolha
para a variedade ‘Pineapple’.
Apoio financeiro: FAPESB, CAPES e CNPq.
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Geração de progênie segregante
interespecífica entre maracujazeiro-‘doce’
(Passiflora alata Curtis) e maracujazeiro‘do-sono’ (Passiflora setacea DC)
Porto, PC; Pereira, AS; Nonato, JVA; Oliveira, AC
Laboratório de Biologia Geral, Departamento de Ciências Naturais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Vitória da Conquista/BA
[email protected]
Palavras-chave: Melhoramento de plantas, hibridação, virose, resistência, maracujá
Passiflora alata Curtis, denominada popularmente de maracujazeiro-‘doce’ (‘MD’), vem destacando-se na passicultura
pelo expressivo valor comercial de seus frutos, que se caracterizam pelas suas propriedades nutritivas e, sobretudo, pelo
sabor adocicado dos mesmos. Não obstante, essa passiflorácea é suscetível ao vírus CABMV (Cowpea aphid-borne mosaic
virus), pertencente à família Potyviridae, causador da virose do endurecimento de frutos do maracujazeiro (VEFM), que se
configura como uma das principais doenças que acomete o maracujazeiro-‘doce’. São reportadas na literatura espécies de
Passiflora silvestres que constituem fontes de resistência ao CABMV, como a P. setacea DC (maracujazeiro-‘do-sono’; ‘MS’).
Tanto quanto se sabe, inexiste relato na literatura quanto à geração de progênie segregante entre genótipos de ‘MD’
e ‘MS’. A hibridação sexual de maracujazeiros comerciais com espécies silvestres do gênero, com vistas à introdução
de genes de resistência a fitopatógenos, é uma importante estratégia a ser explorada em programas de melhoramento.
O presente trabalho objetivou (i) gerar progênie segregante interespecífica entre essas duas espécies de Passiflora e (ii)
determinar o índice de cruzabilidade entre essas espécies. Foram realizados 55 cruzamentos, utilizando dois genótipos
de ‘MS’ e quatro genótipos de ‘MD’, sendo 35 e 20 cruzamentos tendo plantas de ‘MS’ e ‘MD’ como progenitor
feminino, respectivamente. As flores receptoras foram emasculadas em pré-antese e cobertas. O pólen das flores doadoras
foi coletado e armazenado até a antese das flores receptoras (antese de 04h00min às 19h00min nas plantas de ‘MD’
e de 18h00min às 07h00min nas plantas de ‘MS’), procedendo-se a polinização. Detectaram-se 34,3% de taxa de
pegamento de frutos, 32 a 153 sementes/fruto e média de sementes/fruto de 100 ± 34,7 para o cruzamento ‘MS’ vs
‘MD’. Para o cruzamento ‘MD’ vs ‘MS’, das 20 flores polinizadas nenhuma desenvolveu fruto. A progênie segregante
obtida deste cruzamento compõe a coleção de trabalho de germoplasma de Passiflora da UESB para futuros estudos
genéticos no que tange a caracterização da resistência de ‘MS’ ao CABMV.
Apoio financeiro: FAPESB.
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Desenvolvimento de marcadores
moleculares do tipo microssatélite a partir
de ESTs em cana-de-açúcar
Costa, EA1; Marconi, TG1; Oliveira, KM3; Vaz, TR; Rodrigues, A1; Garcia, AAF2; Souza, AP1,4
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-UNICAMP, Campinas-SP
2
Depto. de Genética – ESALQ/USP, Piracicaba-SP
3
Centro de Tecnologia Canavieira, Piracicaba-SP
4
Depto. de Genética e Evolução – IB/UNICAMP, Campinas-SP
[email protected]
1
Palavras-chave: cana-de-açúcar, EST-SSRs, polimorfismo
A cana-de-açúcar (Saccharum sp.) está entre as espécies de maior importância econômica no mundo, constituindo uma
das principais fontes de produção de açúcar e álcool. O projeto de sequenciamento de ESTs (Expressed sequence Tags) da
cana-de-açúcar (SUCEST) já identificou cerca de 43 mil clusters que representam genes relacionados com características
de interesse econômico os quais apresentam grande potencial para desenvolvimento de marcadores genéticos. Através de
uma busca no banco de dados foi possível identificar 2005 clusters contendo seqüências repetitivas (SSRs), revelando
uma significável fonte para desenvolvimento de marcadores moleculares. O presente projeto teve como objetivo central
desenvolver marcadores moleculares do tipo microssatélite, PCR específicos, obtidos em buscas neste banco de dados
de ESTs (SUCEST), bem como avaliar o potencial destes marcadores em gerar polimorfismo. A caracterização do
polimorfismo revelado pelos EST-SSRs foi feita com base em uma amostra de 18 clones de cana-de-açúcar, incluindo
três espécies de Saccharum (S. officinarum, S. barberi, S. sinense). Foram selecionados 100 clusters para o desenho de
oligonucleotídeos específicos às regiões flanqueadoras dos motivos de microssatélites (trinucleotídeos). Os 100 pares de
primers desenhados foram avaliados para a determinação da temperatura ótima de anelamento em um termociclador
PTC-200, com gradiente de temperaturas variando entre 50ºC e 65ºC, utilizando dois clones selecionados no estudo.
Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 3% corado com brometo de etídeo e os EST-SSRs
que apresentaram produto de amplificação no tamanho esperado foram selecionados para a avaliação nos 18 clones.
Os EST-SSRs selecionados foram submetidos à análise de polimorfismo em gel de poliacrilamida 6% corado com
nitrato de prata. Os géis foram genotipados manualmente, verificando presença e ausência de bandas, com a ajuda de
um transluminador e para cada EST-SSR verificou-se o número de alelos, o conteúdo de informação de polimorfismo
(PIC) e o poder discriminatório (PD). Com os dados obtidos através da genotipagem foi construído um dendograma
para a análise da diversidade genética com auxilio do programa NTSYS versão 2.1 para Windows. Os resultados estão
de acordo com a diversidade previamente encontrada entre os indivíduos analisados e se mostraram satisfatórios,
indicando que os marcadores selecionados possuem grande potencial para serem incorporados a um programa de
mapeamento genético.
Apoio Financeiro: FAPESP, CTC.
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Seleção de marcadores segregantes em
população de mapeamento de cacaueiro
(Theobroma cacao L.)
Silva, DV1; Corrêa, RX1; Branco, SMJ1; Farias, NS1; Smith, WS1; Santos, CS1;
Souza, MM1; Ahnert, D1; Carmo, VS2; Machado, RCR2; Araújo, IS1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
2
MARS-Centro de Ciências do Cacau
[email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: Segregação, Primers microssatélites, Theobroma cacao L., Polimorfismo, Mapa genético de ligação
Marcadores moleculares são todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um gene expresso ou de um segmento
específico de DNA, e representam importantes ferramentas em estudos de mapeamento genético. Habitualmente, tais
marcadores são selecionados em estudos prévios de detecção de polimorfismo entre os genitores da população, visando
posteriormente sua utilização em avaliações de segregação. Assim, o objetivo deste trabalho foi utilizar primers de
microssatélites polimórficos em uma população F1 de cacaueiro. Cinqüenta e quatro pares de primers microssatélites
UENF/CEPLAC foram testados previamente a partir dos DNAs dos genitores da população (TSH1188 X CCN51),
composta por 587 genótipos, visando detectar o polimorfismo. Destes, cinco pares de primers polimórficos foram
selecionados por revelarem produtos de amplificação mais evidentes (UENF/CEPLAC 16, UENF/CEPLAC
102, UENF/CEPLAC 110, UENF/CEPLAC 121, UENF/CEPLAC 131). Neste trabalho foi utilizado o primer
UENF/CEPLAC 121 nos 587 DNAs da população. As condições para as amplificações, com volume final de 20 µL,
foram: 10 mM (pH 8,3) de Tris-HCl, 50 mM de (NH4)2SO4, 1,5 mM de MgCl2, 200uM de cada dNTP, 0,1 µM de
cada primers UENF/CEPLAC 121, 0,4 U de Taq DNA polimerase e, aproximadamente, 10 ng de DNA. As amostras
foram amplificadas em termociclador automático com as seguintes condições: 94 °C por 4 min + 45 ciclos de 94 °C
por 30 seg, 42°C por 1 min, 72 °C por 1 min + um ciclo final de extensão de 72°C por 7 min e redução a 15 °C. Como
resultado, pôde-se observar que o primer UENF/CEPLAC 121, além de polimórfico entre os genitores, revelou-se
segregante entre os 587 genótipos da população. Conclui-se desta forma, que a segregação observada na população
de estudo através do marcador utilizado, representa um passo inicial importante na construção do mapa genético de
ligação da maior população de cacaueiro existente atualmente.
Apoio financeiro: UESC/FAPESB/CNPq/MARS-Centro de Ciências do Cacau.
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Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
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Avaliação fenotípica de uma população de
cacaueiro visando mapeamento de genes
de resistência à vassoura-de-bruxa
Branco, SMJ1; Araújo, IS1; Silva, DV1; Farias, NS1; Smith, WS1; Santos, CS1;
Souza, MM1; Ahnert, D1; Carmo, VS2; Machado, RCR2; Corrêa, RX1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
2
MARS-Centro de Ciências do Cacau
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Moniilophtora perniciosa, Theobroma cacao L., Segregação, TSH 1188, CCN 51
O cacaueiro Theobroma cacao L. foi durante muitos anos a cultura mais explorada na região Sul da Bahia. A doença
vassoura-de-bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniilophtora perniciosa, levou a quase total destruição da lavoura
cacaueira sul-baiana e, como conseqüência, o Brasil passou de exportador a importador de amêndoas de cacau. A busca
de fontes de resistência às doenças é a etapa básica para programas de melhoramento genético. Nesse sentido, este estudo
objetivou avaliar fenotipicamente uma progênie oriunda do cruzamento entre os clones TSH 1188 e CCN-51, dois
genótipos contrastantes para diversas características, inclusive para resistência à vassoura-de-bruxa. Foram avaliados
em condições de campo o número de vassouras vegetativas em três ramos de 587 plantas da população de estudo. As
estatísticas descritivas da resistência a doenças foram calculadas considerando os valores máximo, médio e mínimo, o
desvio padrão, o coeficiente de variação e a distribuição da freqüência. Foram realizadas duas coletas de dados com um
intervalo de tempo de 6 meses, sendo contabilizados 36.954 pontos de crescimento. Como resultado, observou-se que
dos 36.954 pontos de crescimento avaliados, apenas 1.427 apresentaram a doença na forma de vassoura vegetativa,
uma média de 2,43 por planta. O genótipo que mostrou a maior variação da média foi o 6/20, o qual apresentou 31
pontos de crescimento sadios e 39 pontos de crescimento infectados. A média de pontos sadios por planta foi de 60,52
e o genótipo 14/15 foi o que apresentou a maior variação da média, dos 314 pontos de crescimento avaliados, 310
são sadios e apenas 4 pontos de crescimento são infectados. Na análise dos resultados foi demonstrado que o caráter
resistência à vassoura-de-bruxa é segregante na população de estudo, podendo-se concluir que a mesma é útil para a
construção do mapa genético de ligação. Os dados fenotípicos avaliados nesta pesquisa são de suma importância para
as etapas futuras, tal como a detecção de QTLs, a qual será direcionada à identificação de genótipos de superiores.
Apoio financeiro: UESC/FAPESB/CNPq/MARS Centro de Ciências do Cacau.
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Expressão quantitativa do gene
da trealose em cana-de-açúcar
em resposta ao déficit hídrico
Almeida, CMA1; Amaral, DOJ1; Correia, MTS1; Donato, VMTS3; Silva, MV1
1
Centro de Ciências Biológicas - Departamento de Bioquímica - UFPE
Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária - IPA, Laboratório de Genoma/Cultura de Tecidos
[email protected]
2
Palavras-chave: Saccharum oficcinarum, tolerância à seca, PCR em tempo real, Trealose, Expressão Gênica
A cultura da cana-de-açúcar é de grande importância econômica nas regiões tropicais e subtropicais, especialmente para
o Brasil, que é atualmente o maior produtor mundial. Estresses abióticos, como a seca, podem reduzir os rendimentos
das lavouras. Sendo assim, a identificação e quantificação de genes relacionados aos mecanismos de tolerância à seca
são fundamentais no desenvolvimento de novas cultivares comerciais mais tolerantes ao déficit hídrico. O objetivo do
trabalho foi investigar a participação da trealose no mecanismo tolerância à seca de uma variedade de cana-de-açúcar
mediante a técnica da PCR quantitativo (qPCR). O RNA total foi extraído utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) das
folhas das plantas com 20% (tratamento controle) 10% e 3% de umidade do solo e obtido o cDNA utilizando o Kit
SuperScript III First-Strand Syntesis for RT-PCR (Invitrogen). Para as reações de qPCR foi desenhado oligonucleotídeo
para amplificação do gene da trealose e a normalização da expressão desse gene foi feita a partir da expressão do fator
transcrição 14-3-3 de cana-de-açúcar, chamado gene controle. As reações de amplificação foram conduzidas em volume
final da amostra de 15μL contendo: 50 ng de cDNA, 1X do Real Master Mix (Eppendorf ), e 200 mM de cada um
dos oligonucleotídeos. As condições de amplificação estabelecidas foram: 95 °C por 2 minutos, 40 ciclos de 95° C por
15 segundos e 58° C por 20 segundos 68°C por 20 segundos seguidos pela curva de melting. Todas as reações foram
realizadas em termociclador Mastercycler ep realplex (Eppendorf ), em triplicata com a presença de controle branco e
do gene controle. Os resultados foram analisados utilizando-se a quantificação relativa, calculada a partir do valor de
2 -ΔΔCt. A análise feita por qPCR, permitiu verificar o aumento da expressão da trealose em plantas submetidas a 3% de
umidade do solo, confirmando que o gene é diferencialmente expresso em condições de déficit hídrico.
Apoio Financeiro: Embrapa/Programa Macro 3 e FACEPE.
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Canonical correlation of agroindustry traits
and molecular in sugarcane cultivars
Franco, FP1; Freitas, EG1; Dias, CTS2; Hoffmann, HP1; Vieira, MAS1; Carneiro, MS1
1
Departamento de Biotecnologia Vegetal, Universidade Federal de São Carlos
Departamento de Ciências Exatas, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
[email protected]
2
Keywords: microsattelites, breeding, sugarcane variety
Sugarcane cultivars are polyploids, aneuploids and outbreeding. An individual cultivar is highly heterozygous and
clonally propagated. Modern cultivars are derivatives from the high sucrose containing Saccharum officinarum (2n=80)
and the hardier but low sugar content wild species Saccharum spontaneum (2n=40–128). The use of molecular tools
has the potential to increase the efficiency of conventional breeding programmes. The analysis of canonical correlation
measures the existence and the intensity of the association between two groups of variables. The aim of this research
project is to evaluate the canonical correlation between agroindustry characters and microsatellites markers in sugarcane
cultivars, and to verify the interdependence among the groups of studied variables. The sample studied consisted of
32 modern sugarcane ‘‘clones’’ from various breeding stations around the world and mainly from breeding stations in
Brazil. These genotypes were used the most cultivated varieties in the last fifty years in Brazil and, the most used genotypes
as parents in breeding programs. This collection was extensively characterized 10 years ago for sugar yield (tons of sugar
per hectare – TSH), cane yield (tons of cane harvested per hectare – TCH) and TPH (tons of pool per hectares) which
were collected through many agricultural trials in different agricultural years in several yield environment. We used
20 microsatellite loci (SSR) for analyses. The analysis indicated that the canonical correlations were high and that in two
cases the first (0.96) and second (0.92) pair were significant at the level of 1% of probability. The analysis of canonical
correlation showed that the groups are not independent.
Orgão financiador: CNPQ E FAPEMIG.
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Inserção de novas marcas a um mapa
funcional integrado prévio em cana-de-açúcar
Marconi, TG1; Oliveira, KM3; Vaz, TR1; Costa, EA1; Rodrigues, A1; Garcia, AAF2; Souza, AP1,4
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-UNICAMP, Campinas-SP
2
Depto. de Genética – ESALQ/USP, Piracicaba-SP
3
Centro de Tecnologia Canavieira, Piracicaba-SP
4
Depto. de Genética e Evolução – IB/UNICAMP, Campinas-SP
[email protected]
1
Palavras-chave: mapeamento funcional, cana-de-açúcar, ESTs-SSRs
Cultivares modernas de cana-de-açúcar possuem um genoma complexo, poliplóide e aneuplóide, derivado principalmente
do cruzamento interespecífico entre S. officinarum (2n=80) responsável pelo alto teor de sacarose e S. spontaneum
(2n=40-128) responsável pelo vigor vegetativo e resistência a estresses bióticos e abióticos. Devido ao processo de
nobilização, 80% do genoma destas cultivares é representado por cromossomos de S. officinarum, enquanto S.
spontaneum representa 15% a 20% do genoma. O desenvolvimento de marcadores moleculares e a utilização destes
para a construção de mapas genéticos e detecção de QTLs têm propiciado grandes avanços no melhoramento genético
da cana-de-açúcar. Os ESTs apresentam grande potencial para serem utilizados para tais finalidades, pois podem estar
associados a genes que controlam características de interesse agronômico e industrial. A partir do banco de dados de
ESTs de cana-de-açúcar (SUCEST), marcadores moleculares foram desenvolvidos e integrados ao mapa genético de
uma população derivada do cruzamento dos híbridos pré-comerciais SP 80-180 e SP 80-4966, originando o primeiro
mapa funcional de cana-de-açúcar. O presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de marcadores EST-SSRs
suplementares para a inserção neste mapa prévio, em uma população F1 segregante de 210 indivíduos.. Para isso foram
desenvolvidos 200 novos EST-SSRs através de busca no banco de dados SUCEST dos quais 102 foram polimórficos
entre os parentais. As análises de mapeamento foram baseadas na metodologia de identificação de marcadores em dose
única no genoma, de acordo com Wu et al. (2002), com o auxílio do programa OneMap. Para a formação dos grupos
de ligação (GLs) utilizou-se LOD 5 e fração de recombinação de 0.35. A função de mapeamento de Kosambi foi
adotada para conversão das frequências de recombinação em distâncias de mapa em centiMorgans (cM). Os resultados
obtidos foram satisfatórios e novas marcas foram adicionadas ao mapa anterior, aumentando a densidade e a cobertura
do mapa, possibilitando, assim, perspectivas para detecção de novos QTLs associados a características de importância
econômica para a cultura da cana-de-açúcar.
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Construção de primers degenerados para
identificação de microssatélites no urucum
(Bixa orellana L.)
Ribeiro, JAC; Ribeiro, ILAC; Nóbrega, RB; Lopes Neto, AV; Llamoca-Zárate, RM
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Departamento de Biologia Molecular, Universidade Federal da Paraíba
Palavras-chave: Urucum, Microssatélite, Variabilidade genética
O urucum (Bixa orellana L.) é uma planta pertencente à família Bixaceae, cultivada em vários continentes devido ao
fato de ser fonte de corante natural para medicamentos, cosméticos, alimentos, têxteis e etc. O urucum apresenta alta
variabilidade genética, principalmente relacionada com o número de sementes por cápsula, cor e teor dos pigmentos
contidos no tegumento das sementes. Na pesquisa do urucum, faz-se necessário a caracterização do germoplasma das
variedades, visando assegurar informações sobre essas fontes de genes, sendo uma importante estratégia de melhoramento e
conservação desses recursos. Esta caracterização pode ser feita por marcadores moleculares, dentre eles, os mais polimórficos
são os microssatélites. Com o uso de ferramentas de bioinformática é possível identificar os microssatélites em seqüências
disponíveis nos bancos de dados públicos, diminuindo o trabalho e o custo desta técnica. Este trabalho teve como objetivo
a construção de primers para os microssatélites visando a análise da variabilidade genética das variedades do urucum.
Através de um datamining no banco de dados GenBank pertencente ao NCBI, foram obtidas 25 seqüências nucleotídicas
do urucum sendo de DNA genômico, cDNA, DNA mitocondrial ou DNA do cloroplasto. Após o alinhamento, através
do pacote de ferramentas Bioedit 7.0.9 foi eliminada uma seqüência redundante. Para a identificação das seqüências de
microssatélites foram utilizados os programas de bioinformática SSRIT e TROLL, que identificaram 94 seqüências de
microssatélites. Os microssatélites GA(n), AT(n), GAA(n), AAG(n) e TAAT(n) apresentaram as maiores freqüências,
com valores de 100%, 92%, 64%, 52% e 16%, respectivamente. Para a construção dos primers, foram selecionadas as
seqüências de microssatélites que apresentaram maior freqüência e maior numero de repetições do motivo no núcleo.
Estes foram os dinucleotídeos GA(n) e GT(n), e o trinucleotídeo GGT(n). Para cada motivo, foram separadas seqüências
de 30 pares de bases flanqueadoras em cada extremidade, as quais foram alinhadas pelo programa CLC Combined
Wokbench 3.6.2, que identificou as seqüências consenso forward: 5’-NNCAGAATCGNGATTGAATCAATG-3’,
5’-GACTCTGANAGNGTNAN NCANNAG-3’, 5’-TNGCTCNTTGTNTTNATTCNCNG-3’ e reverse:
5’-AGTGTNAGGTGGAG CNAGCGATG-3’, 5’-CGGAAGACAAGCNACAAATGAGNG-3’, 5’-GAAGGTGGGCTCNGN
GNTGGNAGGN-3’ para cada motivo, respectivamente.
Apoio financeiro: PIBIC/CNPQ/UFPB.
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Seleção simultânea para teor
de macronutrientes em uma população
natural de Tabebuia impetiginosa
(Mart. ex DC.) Standl
Baldo, T; Moraes, MA; Moraes, SMB; Santos, EAO; Silva, ECB; Kubota, TYK; Rodrigues, CJ; Moraes, MLT
Departamento de Fitotecnia, Tecnologia de Alimentos e Sócio-Economia - Faculdade de Engenharia - Campus de Ilha Solteira
[email protected]
Palavras-chave: Conservação ‘ex situ’, Variação genética, Índice de seleção, Herdabilidade, Ganho de seleção
As espécies do gênero Tabebuia têm sido utilizadas com propósitos madeireiros, de restauração de áreas devastadas,
bem como para fins medicinais; mas, apesar da importância dessas espécies no contexto nacional, o alto grau de
desmatamento tem levado à diminuição das populações e à destruição das árvores, como a espécie ipê-roxo-de-bola
(Tabebuia. Impetiginosa). Desse modo, a avaliação da variação genética para os teores dos macronutrientes em sementes
é de fundamental importância para a formação de seguimentos que irão substituir as árvores adultas nos fragmentos
florestais. Assim, a partir da coleta de sementes em 20 árvores matrizes de uma população natural de T. impetiginosa,
localizada no município de Ilha Solteira. A partir das sementes de cada uma destas árvores matrizes foram feitas avaliações
do grau de umidade (105°C, 24h) e do teor dos macronutrientes: nitrogênio (N), fósforo (P), potássio (K), cálcio (Ca),
magnésio (Mg) e enxofre (S). Adotou-se o delineamento em blocos inteiramente casualizados com 20 tratamentos e
3 repetições. Os parâmetros genéticos e em especial o índice baseado em soma de postos ou “ranks”, foram estimados,
utilizando-se do programa GENES. As médias dos macronutrientes, em g/kg, foram: 30,29±1,12 de nitrogênio,
6,65±0,11 de fósforo, 0,66±0,02 de potássio, 0,15±0,001 de cálcio, 0,29±0,0005 de magnésio e 2,13±0,02 de enxofre.
O coeficiente de variação experimental variou de 2,88% (Mg) a 8,50% (Ca). Houve variação genética entre as árvores
matrizes para todos os macronutrientes analisados, o que foi corroborado pelas altas estimativas dos coeficientes de
variação genética que ficaram entre 4,94% (N) a 33,61% (K). As estimativas de herdabilidade, no sentido amplo, foram
altas: 0,79 (N) a 0,99 (Mg). Utilizando o índice baseado em soma de ranks, foram selecionados 30% das progênies
analisadas, ou seja, 6 progênies. Dentre as progênies selecionadas a progênie 13 obteve a maior média de Fósforo 8,00,
Potássio 1,45 e Magnésio 0,3967. Já a progênie 17 teve a maior média de Nitrogênio 34,19, progênie 14, Enxofre 2,47
e a progênie 18, Cálcio 0,28. Obteve-se um ganho de seleção que variou de 3,51 (N) a 25,98% (K). Em vista dos
resultados apresentados verifica-se que a população, dispõe de considerável variabilidade genética, em relação aos teores
dos macronutrientes, o que é de suma importância na estratégia de sobrevivência desta espécie a partir de sementes.
Apoio: PIBIC - CNPq.
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Mapeamento genético de uma população
de Capsicum annum utilizando marcadores
dominantes e co-dominantes
Beltrão, LHBB1,2; Marques, JM1,2; Souza, LM1,2; Ferreira, MA2; Buso, GSC2
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília
2
[email protected]
Palavras-chave: Pimenta, Pimentão, RAPD, SSR, Mapa Genético
O cultivo de pimenta é muito antigo, registros pré-históricos datam de aproximadamente nove mil anos e foram
obtidos através de explorações arqueológica na região de Tehuacán, no México. Diversos relatos de exploradores do
Brasil-colônia afirmam que o cultivo de pimentas no Brasil é anterior a chegada dos portugueses, o que mostra a
grande importância da pimenta na alimentação dos povos indígenas. Atualmente o cultivo de pimentas ocorre em
praticamente todas as regiões do país e é um dos melhores exemplos de agricultura familiar e de integração do pequeno
agricultor-agroindústria. As pimentas (doces e picantes), além de serem consumidas frescas, podem ser processadas e
utilizadas em diversas linhas de produtos na indústria de alimentos. A produção dessa cultura é muito influenciada pela
ocorrência de doenças que têm dificultado o cultivo de Capsicum no Brasil, afetando a qualidade dos seus frutos, entre
elas destacam-se o mosaico, causado pelo potyvirus Pepper Yellow Mosaic Virus (PepYMV) e a murcha-de-fitófitora,
causada pelo fungo Phytophthora capsici. Recentemente, o melhoramento genético de plantas está utilizando ferramentas
que possibilitam a obtenção de resultados mais rápidos e precisos, dentre elas pode-se citar os mapas genéticos, obtidos
por meio de marcadores moleculares co-dominantes e dominantes. Este trabalho objetivou o desenvolvimento de
um mapa genético, baseado em marcadores RAPD e microssatélites. Os indivíduos utilizados foram duas cultivares
de Capsicum annuum contrastantes para resistência à murcha-de-fitóftora e ao PepYMV (linhagem CNPH 148). Do
cruzamento dessas cultivares originaram-se indivíduos F1 e da auto-fecundação desses, obteve-se 238 indivíduos F2.
A genotipagem dos indivíduos F2 foi feita com o emprego de marcadores RAPD e microssatélites desenvolvidos no
Laboratório de Genética Vegetal da Embrapa – Recursos Genéticos e Biotecnologia. O DNA amplificado nas reações
de PCR foi visualizado em gel de agarose 1,5 % e 3,5% corado com brometo de etídio, fotografado sob luz UV e em
gel de poliacrilamida 5% corado com nitrato de prata. Trezentos e quarenta e cinco primers RAPD foram testados para
avaliar o polimorfismo entre os parentais do cruzamento. Os marcadores SSR e RAPD que apresentaram polimorfismo
foram analisados no programa Mapmaker. O LOD de 3,0 e a freqüência de recombinação de 0,40 foram empregados
para realizar o agrupamento dos marcadores moleculares em grupos de ligação e as freqüências de recombinação
foram convertidas em distâncias de mapa de Kosambi. Os 65 marcadores SSR e os 45 RAPD foram empregados no
mapeamento, sendo mapeados em 12 grupos de ligação.
Orgão financiador: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
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Implantação de análises de DNA de plantas
da região amazônica por marcadores RAPD
em Porto Velho - RO
Teixeira, LPB1; Holanda, JF1,2; Moura, MMF1
Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho – RO
2
Universidade Federal do Amazonas, Manaus – AM
[email protected]
1
Palavras-chave: Solanum crinitum, variabilidade genética, PCR, RAPD e Rondônia
O DNA pode ser extraído de diferentes materiais, desde fósseis e amostras herbarizadas a tecidos frescos. Normalmente,
estudos de identificação e de caracterização da diversidade genética das plantas, por meio de técnicas moleculares,
envolvem a avaliação de um grande número de indivíduos, necessitando de métodos rápidos e precisos de extração
de DNA. O RAPD, além de ser relativamente fácil, rápida e de simples aplicação, apresenta um custo baixo que os
demais marcadores e evidencia um bom número de locos polimórficos por reação. Por outro lado, a reprodutibilidade
dos ensaios depende da espécie analisada, do executor dos experimentos, da qualidade dos reagentes e da estabilidade
do termociclador. A otimização e padronização das condições de realização da PCR-RAPD e a avaliação do grau de
reprodutibilidade dos resultados são essenciais. Este estudo objetivou implantação da técnica de extração de DNA de
plantas amazônicas em Rondônia no Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnologia da UNIR,
e aplicar análises moleculares utilizando os marcadores RAPD em plantas regionais. Para os testes foram selecionadas
espécimes de Solanum crinitum Lam. que apresenta atividade larvicida contra vetores da malária e dengue. Foram
coletadas 50 amostras de folhas, sendo 25 em Rondônia e 25 em Manaus. Para a extração de DNA foram testados
3 protocolos e a qualidade do DNA foi conferida em gel de agarose a 0,8%, corado com brometo de etídio. No
PCR-RAPD foi utilizado 20ng de DNA, 2,5 mM de dNTPs, MgCl2 a 25mM tampão 10x da Taq, primers a 5pmol/
µL, 1uni. de Taq DNA polimerase (5U/µL) e água pura q.s.p 30 µL. Programado para 2 ciclos de 94º a 5 min, 36º a
1 min e 72º a 2 min e 33 ciclos de 90º a 10 seg, 40º a 20 seg e 74º a 2 min e 4º por tempo indefinido. As bandas foram
observadas em géis de agarose a 1,5% corado com brometo de etídio e fotografadas. O protocolo do “Kit Plant DNAzol
foi adotado para a extração de DNA da planta em estudo, fornecendo DNA em quantidade e qualidade suficientes para
a realização dos experimentos com RAPD. Dos 11 oligos decâmeros avaliados 4 amplificaram uma maior quantidade
de bandas polimórficas. Foram obtidos 36 locos que convertidos em uma matriz de dados binários foi utilizada para o
cálculo da distância genética pelo coeficiente de similaridade de Jaccard, ocorreu uma alta variabilidade dentro e entre
as duas populações com valores 17% a 85% de dissimilaridade, com dois grupos distintos, r = 0,78128. As análises dos
resultados dessa amostragem validam a implantação da técnica de extração de DNA e PCR-RAPD na UNIR, e dará
suporte a estudos de investigação da variabilidade genética e caracterização de populações de plantas da região.
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Obtenção de microssatélites derivados
de ESTs potencialmente envolvidas na
tolerância do algodoeiro à seca
Brito, GG1; Lima, LHGM1; Silva, GEL1; Lima, LM1; Beltrão, NEM1; Lima, MMA1
Laboratório de Biotecnologia, Embrapa Algodão, Campina Grande, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Algodoeiro, SSR, tolerância à seca, ESTs, bioinformática
A disponibilidade de água constitui um fator determinante para o rendimento de todas as commodities agrícolas, incluindo
o algodoeiro. A seleção intensiva visando o aumento do rendimento e da qualidade da fibra produzida, muitas vezes
melhoradas sob irrigação, tem, não intencionalmente, conduzido ao estreitamento da variabilidade genética para a
tolerância ao déficit hídrico, aumentando a demanda desta cultura para o suprimento de água via irrigação. Em uma
época onde a disponibilidade hídrica para emprego na agricultura é cada vez menor e de custo cada vez maior, torna-se
prioritário o desenvolvimento de estudos visando a obtenção de genótipos com maior eficiência no uso da água e/ou
mais tolerantes frente aos cenários climáticos futuros. Devido ao emprego crescente de marcadores do tipo microssatélites
(SSR) como uma ferramenta útil em programas de melhoramento vegetal, especialmente para estudos envolvendo
tolerância a estresses abióticos, neste trabalho, objetivou-se a obtenção de SSRs a partir de ESTs potencialmente
envolvidas na tolerância do algodoeiro ao déficit hídrico. As ESTs empregadas na identificação de SSRs e no desenho
de primers originaram-se da mineração do banco de dados público The Cotton Genome Database. Com este fim, uma
coleção de genes da família DREB (DREB1/CBF3, DREB1A, DREB2, DREB3A, DREB2A, DREB2B e DREB3), já
caracterizada em outras espécies vegetais, foi gerada a partir de literatura e utilizada como “isca”. Efetuou-se a mineração
das seqüências ESTs utilizando a plataforma de bioinfomática disponível em http://cotondb.org/cdbpages/webblast.html,
por meio da ferramenta tBlastn, visando identificar sequências com e-value ≤ 10-20 potencialmente relacionadas à
tolerância à seca. Pelo emprego das “iscas” DREBs foram identificadas 161 ESTs potencialmente envolvidas na resposta
do algodoeiro ao déficit hídrico. Por meio do software Webtroll (http://wsmartins.net/webtroll/troll.html), utilizando
as ESTs potencialmente envolvidas na tolerância à seca, foram obtidos 42 microssatélites considerando os seguintes
parâmetros: 2-6 motivos de base SSR, estrutura perfeita e core mínimo de 12 bases. Flanqueando estes microssatélites,
28 pares de primers foram desenhados utilizando o software Primer3, com os mesmos parâmetros empregados para a
identificação dos SSR. Em etapas subsequentes, estes serão utilizados em PCR visando verificar a sua amplificação e
detecção de polimorfismos entre genótipos de algodoeiro contrastantes para tolerância à seca e seu agrupamento visando
incorporá-los ao programa de melhoramento do algodoeiro.
Apoio/Concessão de bolsa: CNPq.
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Determinação de parâmetros para o uso
de marcadores ISSR na análise de feijãocomum cultivado in vitro
Corrêa, LS1,2; Barros, BA1,2; Mendonça, MAC1,2; Sanglard, DA1,2; Moreira, MA1,3; Barros, EG1,2
1
BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
2
Palavras-chave: feijão, marcadores ISSR, SSR, cultura de tecidos, diversidade genética
O feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) representa um importante componente da dieta da população brasileira por
ser uma boa fonte de proteínas, carboidratos e minerais. Além disso, a cultura do feijoeiro se destaca pela mão-deobra que é empregada durante o ciclo da cultura. Tradicionalmente, os pequenos agricultores têm sido os principais
responsáveis pela produção do feijão sendo aplicada pouca tecnologia na cultura. Com o advento dos marcadores
moleculares, vários estudos têm sido feitos para analisar a diversidade e a estrutura genética de populações de feijãocomum. Marcadores moleculares também têm se mostrado uma ferramenta útil na determinação da uniformidade
genética de plantas cultivadas in vitro. A obtenção de marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) é uma técnica
baseada em PCR que utiliza primers únicos, ancorados ou não, para amplificar seqüências entre duas seqüências SSR
invertidas. Estes marcadores não requerem um conhecimento anterior da seqüência a ser amplificada, apresentam
uma alta reprodutibilidade, além de propiciarem fingerprints altamente polimórficos. O objetivo deste trabalho foi
estabelecer e validar metodologias baseadas em marcadores ISSR aplicáveis a futuros estudos de fidelidade clonal de
plantas de feijão regeneradas in vitro. DNA genômico foi extraído de folhas do cultivar Talismã e, aproximadamente,
30 ng de DNA de duas amostras foram utilizadas para testar todos os 100 primers do conjunto UBC#9 obtido junto
à University of British Columbia. A partir dos padrões de amplificação foram selecionados 12 primers (801, 807, 808,
810, 818, 834, 855, 873, 884, 886, 890 e 891). Posteriormente, novos testes foram feitos para otimizar as reações de
PCR, analisando-se temperatura de anelamento (gradiente de 45-56ºC), concentração de MgCl2 (2 mM ou 3mM)
e concentração de formamida (1% ou 2%). As condições ideais foram determinadas para cada primer por meio de
avaliações visuais dos padrões de bandeamento para intensidade e reprodutibilidade. Após esses testes, dos 12 primers
inicialmente selecionados, 10 (807, 807, 810, 834, 855, 873, 884, 886, 890, 891) que apresentaram maior número de
bandas reprodutíveis foram escolhidos para análises definitivas de determinação da uniformidade genética de plantas
de feijão cultivadas in vitro.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Determinação da pureza varietal de clones
de cacau com base em marcadores RAPD
e microssatélites
Branco, MCS1; Andrade, IS2; Araújo, IS1; Corrêa, RX1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
Departamento de Ciências Agrárias e Ambientais, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Theobroma cacao L., melhoramento genético, marcadores moleculares,
bancos de germoplasma, homogeneidade genética
Os diferentes clones de cacaueiro representados nas coleções de germoplasma encontram-se em réplicas de pelo
menos 10 indivíduos. Entretanto, não há registros sobre a genealogia exata dos materiais selecionados nas fazendas
como resistentes à vassoura-de-bruxa e das coleções dos bancos de germoplasma do cacau. Com base em marcadores
moleculares, tem-se demonstrado que algumas dessas réplicas representam misturas varietais. Desta forma, os materiais
envolvidos em pesquisas devem ter sua identidade confirmada para possibilitar seu uso no melhoramento e conservação
dos recursos genéticos. Objetivou-se, neste estudo, caracterizar a identidade genética dos indivíduos representativos
dos clones TSH-1188 e CCN-51 provenientes do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) da Fazenda Almirante
Cacau (Itajuípe, BA). Esses indivíduos foram utilizados como genitores para obtenção da população segregante
F1(TSH-1188xCCN-51), empregada no mapeamento genético de cacau. Para isso, folhas de cada planta de cada clone foram
coletadas em campo para extração do DNA genômico, sendo 24 plantas de TSH-1188 e 8 plantas de CCN-51. Os
resultados das amplificações de cada amostra de DNA, com base em dois primers RAPD e sete locos microssatélites,
evidenciaram uniformidade genética entre os indivíduos de mesmo clone, revelando ausência de mistura varietal. Além
disso, ficou evidenciado, por estes primers, polimorfismo entre os clones TSH-1188 e CCN-51, os quais serão utilizados
para mapeamento genético nesta população.
Apoio Financeiro: CNPq, Fapesb e UESC.
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Herdabilidade e ganho de seleção em
populações F2:3 de soja provenientes de
cruzamentos entre progenitores com teores
modificados de ácido oléico
Oliveira, MSG1; Rocha, GAF1; Good-God, PIV1; Moreira, MA1,2; Barros, EG1,3
BIOAGRO – Universidade Federal de Viçosa (UFV)
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular - UFV
3
Departamento de Biologia Geral - UFV
1
2
Palavras-chave: Glycine max, Biodiesel, Herdabilidade, Estabilidade Oxidativa, Seleção
A maior parte dos grãos de soja produzida é utilizada na indústria como fonte de óleo comestível e proteína para a
alimentação humana e animal. Entretanto, dentro do contexto atual, a utilização do óleo de soja na produção de
biodiesel tem sido largamente investigada, para o uso em programas de energia renovável. A composição de ácidos
graxos do óleo de soja não é ideal para a produção de biodiesel. O aumento do teor de ácido oléico (C18:1) permite
o aumento do índice de cetanos e da estabilidade oxidativa do biodiesel de soja. O objetivo deste trabalho foi estimar
parâmetros genéticos e o ganho de seleção para o teor de C18:1 em três populações F2:3 dos cruzamentos entre (1)
FA22 x CD219RR, (2) FA22 x CS303TNKCA e (3) FA22 x Vencedora. O genitor FA22 apresenta alto teor de ácido oléico
(400-500 g kg-1). As variedades comerciais CD219RR, CS303TNKCA e Vencedora apresentam baixo teor de ácido oléico
(< 250 g kg-1). O teor de ácidos graxos em grãos de indivíduos da geração F2:3 foi determinado por Cromatografia Gasosa,
em bulks de 10 sementes. A partir desses dados foram estimados os valores de herdabilidade, ganho de seleção direta e
média dos indivíduos selecionados na população F2:3. No cruzamento 1 foi estimada a herdabilidade no sentido amplo
em 84% e um ganho de seleção de 45%. O teor médio de C18:1 dos indivíduos selecionados foi de 370 g kg-1. Para
a população 2, a herdabilidade no sentido amplo foi de 87%; o ganho de seleção foi de 42% e o teor médio de C18:1
dos indivíduos selecionados, de 300 g kg-1. Já na população 3, foram observados valores de herdabilidade no sentido
amplo, ganho de seleção e teor médio de C18:1 dos indivíduos selecionados de 92%, 52% e 350 g kg-1, respectivamente.
A alta herdabilidade observada nos cruzamentos indica que a seleção para esse caráter pode ser realizada em gerações
precoces. Os indivíduos selecionados serão retrocruzados com as linhagens CD219RR, CS303 e Vencedora para a
obtenção da geração RC1F1, com intuito de recuperar o alto desempenho agronômico dos genitores recorrentes. As
plantas obtidas em RC1F1 serão autofecundadas e posteriormente avançadas até a obtenção da geração RC1F2:3, quando
será efetuado novo ciclo de seleção.
Apoio: FAPEMIG, CNPq e FINEP.
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Efeitos da cultura de tecidos em Rosa X
híbrida sob o aspecto da variação somaclonal
Cavalcanti, GJF1; Azevedo, HMA1; Silva, CMM1; Benko-Iseppon, AM1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Mutantes somaclonais, elementos florais, plantas ornamentais, micropropagação, fitormônios
A micropropagação in vitro consiste na técnica mais utilizada para multiplicação de mudas de plantas ornamentais,
propiciando uma produção em larga escala e em curto espaço de tempo, além de oferecer material livre de contaminações.
Contudo, por se tratar de uma metodologia onde as espécies são cultivadas sob condições ex situ e sob ação de hormônios
sintéticos, há a possibilidade de surgimento de alterações espontâneas designadas como variações somaclonais, as
quais eventualmente podem ser fixadas e transmitidas por reprodução sexuada. Para o presente trabalho um indivíduo
de Rosa X híbrida (cor vermelha, porte subarbustivo) foi utilizado como matriz, considerando-se ser este material
resultante de processos de hibridização a partir de espécimes do gênero Rosa (família Rosaceae), planta com significativa
importância econômica. Os experimentos tiveram como objetivo estabelecer o cultivo e a propagação in vitro, bem
como induzir e avaliar eventuais características diferenciadas indicativas de mutações somaclonais. Inicialmente, regiões
meristemáticas foram submetidas à desinfestação passando pelas etapas de banho em álcool 70% (3 min); imersão com
constante agitação em água sanitária a 20% (20 min); três lavagens em água comum autoclavada e banho do material
no fungicida e bactericida Kasumin (40 min). Em seguida, os explantes foram inoculados em meio MS (Murashige
& Skoog) padrão acrescido de fitormônios com concentrações ajustadas de acordo com suas respectivas exigências. O
experimento inicial consistiu da inoculação em meios com três diferentes associações de hormônios: (1) GA3 (ácido
giberélico) e AIB (ácido indolbutírico); (2) GA3 e BAP (6-benzilaminopurina) e (3) apenas BAP. Em (1) houve o
aparecimento de excessivas raízes e folhas, em (2) elevada taxa de multiplicação e em (3) baixo índice de multiplicação.
As repicagens seguintes foram estabelecidas em meio (2), uma vez que este se mostrou com resposta mais satisfatória
porém com adição do antioxidante PVP (Polivinilpirrolidona) e de AIB para equilíbrio com o BAP que apresentou
atividade acima do desejado formando calos e folhas em número exacerbado. Todas as amostras foram mantidas sob
condições de luminosidade e temperatura controladas. Após inúmeras repicagens, constataram-se modificações na
inflorescência, com o aparecimento de folhas (ou elementos da corola) entre as pétalas, resultantes, provavelmente, de
variação somaclonal induzida pelas condições in vitro, fato comprovado pela existência da mesma alteração em mais
de um exemplar e em repicagens posteriores. Trata-se de um tipo incomum de alteração fenotípica, uma vez que são
mais comuns alterações de tamanho e número de elementos florais em rosas cultivadas, desconhecendo-se alterações
da posição dos elementos florais. Análises mais detalhadas dos indivíduos variantes (caracterização citogenética e/ou
molecular) e verificação da estabilidade da nova característica em casa de vegetação são necessárias para um melhor
entendimento do processo associado à variação observada.
Apoio financeiro: CNPq/UFPE.
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Seleção de marcadores microssatélites para
mapeamento genético de citros
Guimarães, CG1; Faldoni, L1; Diogo, JA1; Cristofani-Yaly, M1; Bastianel, M1; Novelli, VM1; Machado, MA1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC
[email protected]
1
Palavras-chave: SSR, melhoramento
A citricultura é uma das mais importantes cadeias produtivas, sendo o Brasil o maior exportador de suco concentrado
do mundo. Dentre os problemas enfrentados pelo setor, destacam-se os fitossanitários, cujas doenças e pragas, agindo
isoladamente, ou em conjunto, limitam a produção. Adicionalmente, os desafios ao melhoramento dos citros são
grandes e impõem a agregação de ferramentas no estudo da variabilidade e herança genética. Marcadores moleculares
co-dominantes, como os marcadores microssatélites (Simple Sequence Repeats-SSRs) tornaram-se uma importante
ferramenta em programas de melhoramento genético de citros via hibridação controlada, sendo utilizados na caracterização
genética de parentais, identificação de híbridos, mapeamento genético e localização de QTLs. O objetivo deste estudo
foi estabelecer e validar marcadores moleculares SSRs baseados em informações de seqüenciamento de ESTs (CitEST)
para construção de mapas genéticos de citros. Foram selecionadas três populações de citros: laranja Pêra x tangor
Murcott, laranja Pêra x tangerina Cravo e toranja x tangerina Cravo, compostas de 94 indivíduos cada. Essas populações
possuem características agronômicas desejáveis tais como resistência a doenças como CVC, leprose, e mancha marrom
de alternária, entre outras. Foram avaliados, em média, 64 pares de primers SSR nestas populações, sendo que a média
da porcentagem de polimorfismo nas populações foi de 29,5%. Os marcadores serão incluídos nos mapas de ligação
já existentes das populações acima citadas. Estes resultados comprovam a eficiência do banco CitEST para obtenção
de novos marcadores e sua utilização para construção de mapas genéticos de citros.
Suporte Financeiro: Fapesp, CNPq.
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Protocolo de desinfestação de sementes
de maracujá-amarelo (Passiflora edulis F.
Flavicarpa) visando a micropropagação in vitro
Alves, MC; Londe, LN; Perdigão, TVF; Dias, ACC; Kerr, WS; Bonetti, AM
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
Palavras-chave: Passiflora edulis f. flavicarpa, biotecnologia, micropropagação, desinfestação, meio MS
A cultura do maracujazeiro possui significativa participação no mercado nacional. A evolução da produção do maracujáamarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa) possibilitou ao Brasil se destacar como maior produtor mundial. Entretanto, a
produtividade nacional ainda é baixa, cerca de 14 t.ha./ano (IBGE, 2006), devido a problemas fitossanitários, técnicas
inadequadas de cultivo e ausência do uso de cultivares superiores (FARIA et al., 2007). Existem pesquisas realizadas em
espécies do gênero Passiflora, empregando-se diversas técnicas e meios de biotecnologia no cultivo de maracujazeiros,
com a finalidade de regenerar plantas in vitro e de obter novas variedades de interesse agronômico (LIMA et al., 2000).
Na micropropagação de plantas lenhosas é mais difícil obter a regeneração de plantas de material fisiologicamente
maduro (BONGA & VON ADERKAS, 1992; KAWATA et al., 1995), enquanto que o tecido jovem é também
conveniente para o isolamento de protoplasto e seu uso em protocolos de transformação de plantas. Essa característica
foi igualmente observada no caso do maracujazeiro (D’UTRA VAZ et al., 1993; MANDERS et al., 1994; KAWATA
et al., 1995). Neste trabalho, objetivou-se otimizar um protocolo de desinfestação de sementes de maracujá-amarelo,
visando a micropropagação in vitro. O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Cultura de Tecidos, Instituto de
Genética e Bioquímica, da Universidade Federal de Uberlândia, no período de março a abril de 2008. Para realização do
mesmo, frutos inteiros de Passiflora edulis f. flavicarpa foram higienizados com detergente e posteriormente submersos
em álcool 70% por 10 minutos. Em seguida, os mesmos foram transferidos para um outro frasco com hipoclorito de
sódio 2% por mais 15 minutos e por fim foram flambados. Os frutos foram abertos com bisturi estéril e, as sementes
retiradas, foram limpas e lavadas em água autoclavada. Após a higienização das sementes, estas foram transferidas para
câmara de fluxo laminar e passadas para frascos com meio MS 100% (Murashige & Skoog) e deixadas em sala de
crescimento a temperatura de 30° C e fotoperíodo de 16 horas. Não se observou qualquer tipo de contaminação, seja
por fungos ou bactérias, em mais de 90% dos tubos, constatando assim que o protocolo de desinfestação foi favorável
à micropropagação da espécie.
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Seleção de primers ISSR para monitoramento
de homogeneidade clonal em plantas
regeneradas por cultura de tecidos
Pereira, DA1,2; Mendonça, MAC1,3; Barros, BA1,2; Corrêa, LS1,2; Cunha, PS1,3; Moreira, MA1,3; Barros, EG1,2
1
BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
2
Palavras-chave: soja, marcadores ISSR, fidelidade genética, Inter Simple Sequence Repeats, microssatélites
Os marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeats), que amplificam uma seqüência de DNA delimitada por duas regiões
microssatélites invertidas, são abundantes ao longo do genoma de eucariotos. Os ISSR são úteis em estudos genéticos,
especialmente na detecção clonal, estudos de diversidade genética e identificação de indivíduos proximamente relacionados.
Recentemente, tem sido sugerida a utilização desse tipo de marcador molecular na confirmação da fidelidade genética
em plantas regeneradas por meio de cultura de tecidos. Considerando-se o exposto, o objetivo do presente trabalho foi
selecionar primers ISSR e otimizar condições de amplificação dos mesmos, para que sejam utilizados na avaliação da
fidelidade genotípica de plantas de soja (Glycine max) CAC-1 regeneradas in vitro via organogênese e embriogênese.
Para tanto, utilizou-se um conjunto de 100 primers, obtido da Universidade de British Columbia (UBC set #9),
que foi testado em amplificação inicial em duas amostras de DNA de soja da variedade CAC-1, não propagadas por
cultura de tecidos. Com base no padrão de amplificação das amostras, 30 primers foram selecionados. A seguir, foram
analisados os efeitos de concentração de MgCl2 (2 mM ou 3mM), formamida (1% ou 2%) e a influência da temperatura
de anelamento (gradiente de 45-56ºC) na reprodutibilidade do padrão de bandas de DNA. A seleção foi realizada
por meio de avaliações visuais dos padrões de bandas quanto à intensidade e reprodutibilidade. Todos os parâmetros
avaliados afetaram o padrão de bandas. Utilizando-se os 30 primers previamente definidos e as condições otimizadas,
foram selecionados 10 primers (UBC 807, UBC 808, UBC 812, UBC 814, UBC 825, UBC 834, UBC 835, UBC
836, UBC 890, UBC 891) que produziram o maior número de bandas reprodutíveis. Os primers selecionados serão
utilizados para análises definitivas de determinação da uniformidade genética de plantas de soja cultivadas in vitro.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Mapeamento genético de Citrus sunki
e Poncirus trifoliata cv Rubidoux para
a suscetibilidade e tolerância ao
Huanglongbing
Marengo, S1; Cristofani, M1; Diogo, JA1; Machado, MA1
Centro de Citricultura Sylvio Moreira/IAC, Cordeirópolis, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: mapeamento, citros, huanglongbing, greening
O Brasil é o maior produtor mundial de citros e exportador de suco concentrado de laranja. O histórico da citricultura
é assinalado por uma sucessão de doenças causadas por diferentes agentes etiológicos. O huanglongbing (HLB) ou
greening, causado pela bactéria Candidatus Liberibacter, é considerado a mais grave das doenças de citros. Embora a
literatura relate a suscetibilidade de praticamente todas as espécies e variedades de citros ao huanglongbing, o grupo de
trifoliata (Poncirus trifoliata Raf.), incluindo seus híbridos, são considerados mais tolerantes. A construção de mapas de
ligação é de fundamental importância em programas de melhoramento, permitindo a associação de regiões genômicas
às características de interesse agronômico. Neste sentido o objetivo do presente trabalho foi saturar os mapas de ligação
previamente estabelecidos com marcadores SSR, RAPD e AFLP de Citrus sunki Hort. Ex Tan e Poncirus trifoliata
utilizando marcadores microssatélites (SSR, single sequence repeat) e TRAPs (target region amplification polymorphism)
visando ao mapeamento de regiões genômicas associadas a tolerância/suscetibilidade ao HLB. Foram genotipados
94 híbridos, com primers TRAP e SSR a partir de DNA genômico e ESTs do banco de dados do CitEST. Um total de
148 pares de primers SSR foram testados, e 36 foram informativos, totalizando 36 marcas SSR. Para o marcador TRAP,
foram testados 12 pares de primers e o número médio de marcas foi 4. Estes marcadores foram integrados aos mapas
de ligação utilizando o programa JoinMap v 3.0. O mapa de ligação de P. trifoliata ficou composto de 74 marcadores
RAPD, 56 AFLP, 24 marcadores SSR e 22 TRAP. O mapa de ligação de C. sunki ficou composto de 80 marcadores
RAPD, 58 AFLP, 14 marcadores SSR e 19 TRAP. Os resultados preliminares obtidos por qPCR (PCR quantitativo)
indicam que existe diferença na multiplicação da bactéria entre tangerina Sunki e Poncirus, sendo que a bactéria se
multiplica mais rapidamente na tangerina. Esses resultados indicam um grande potencial para detecção de híbridos
menos susceptíveis, pois os parentais são contrastantes para essa característica. A próxima etapa está sendo quantificar
a população de bactéria nos híbridos intergenéricos utilizando-se de qPCR e mapeamento de QTLs associados a
tolerância/suscetibilidade ao HLB.
Apoio Financeiro: Fapesp.
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Desenvolvimento e caracterização
de marcadores moleculares do tipo
microssatélite em Hevea brasiliensis
Souza, LM1; Mantello, CC1; Santos, MO1; Souza, AP1
CBMEG-UNICAMP
[email protected]
1
A necessidade de novos cultivares de seringueira (Hevea brasiliensis) adaptáveis a diferentes regiões ecológicas,
denominadas de regiões de escape, constitui um ponto importantíssimo para o sucesso da heveicultura no Brasil e
no mundo. De acordo com dados do IRSG (2008), em 2007, a produção mundial de borracha natural atingiu 9,9
milhões toneladas e o Brasil contribuiu com apenas 1% do total. Apesar da bacia Amazônica ser o centro de origem
dessa espécie, oferecendo ótimas condições climáticas para o desenvolvimento da cultura, há um tipo fungo chamado
Microcyclos ulei também conhecido como SALB (South American leaf bligtht), que é causador de uma doença que limita
a produção de borracha nessa região, por isso a heveicultura tem se expandido para aéreas de escape. O melhoramento
genético vem buscando clones adaptados a essas novas áreas de escape, mas como o ciclo de melhoramento genético
da seringueira leva de 20 a 30 anos para se concretizar, o uso de marcadores moleculares do tipo microssatélite pode
auxiliar, encurtando o tempo do melhoramento e selecionando clones produtivos e bem adaptados. Dessa forma, o
presente projeto teve como objetivo a construção de uma biblioteca enriquecida de microssatélites e o desenvolvimento
e caracterização de marcadores moleculares do tipo microssatélites. Foram seqüenciados 192 clones, e encontrado no
total 69 microssatélites, dentre os quais, 94,2% (65) são dinucleotídeos, 5,8% (4) somam os motivos de tri, tetra e
pentanucleotídeo. Do total de microssatélites dinucleotídeos encontrados (65), 4,6% (3) são compostos perfeitos e
3% (2) são compostos imperfeitos. O motivo mais comum encontrado foi TG-AC com 33,3% seguido pelos motivos
AG-TC e CT-GA com 29% e 18,9% respectivamente. Um maior número de clones está sendo seqüenciado para o
desenho e caracterização de primers.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Identificação de possíveis híbridos
de arroz vermelho e cultivares modernas
no estado do Rio Grande do Sul
Oliveira, LFV¹; Dornelles, SHB¹; Loreto, ELS¹; Garcia, DC¹; Sepel, LMN¹
¹Universidade Federal de Santa Maria, RS
[email protected]
Palavras-chave: Oryza sativa, arroz vermelho, microssatélites, híbridos
O arroz (Oryza sativa) irrigado é uma das culturas mais importantes para a agricultura no estado do Rio Grande do
Sul. Um dos fatores que interferem na produtividade e qualidade desta cultura é a presença de ervas daninhas nas
várzeas arrozeiras. O arroz vermelho é a invasora mais impactante para esta cultura, pois possui as mesmas necessidades
por nutrientes, água e luz. Foram coletados 88 acessos de arroz vermelho morfologicamente polimórficos nas
principais regiões orizícolas do RS. Também foram utilizados, na análise, 8 cultivares e uma espécie de arroz silvestre
(Oryza glumaepatula). Para a caracterização molecular foi utilizado 5 lócus de microssatélites já descritos para arroz:
RM154, RM204, RM212, RM422, RM545. O DNA foi extraído individualmente com o método descrito por
Edwards et al. (1996). Os amplicons, destes marcadores selecionados, foram caracterizados em géis de poliacrilamida
6% desnaturante 8M de uréia. Para a revelação das bandas foi usado o método com nitrato de prata como descrito por
Panaud et al. (1996). Com a análise destes acessos de arroz vermelho foi possível averiguar um considerado polimorfismo
molecular destes acessos, pois cada loco apresentou em média 24 eletromorfos. Quando neste conjunto de dados são
inseridos os padrões de cultivares observa-se fortes indicações de cruzamentos entre o arroz vermelho e cultivares. Esta
hipótese ganha reforço nas análises de clusterização em que se observa que as cultivares que se agrupam com a maioria
dos acessos de arroz vermelho são as cultivadas nesta região nos últimos 25 anos, enquanto eletromorfos presentes
em outras cultivares são raras nas populações de arroz vermelho do Rio Grande do Sul. Isto pode estar refletindo
em problemas encontrados na orizicultura recentemente, pois com estes cruzamentos, cada vez mais estas daninhas
receberiam características que dificultam sua identificação e controle.
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Uma nova proposta para o desenvolvimento de
marcadores microssatélites em feijão-comum
Tanure, JPM1; Mafra, VS1; Costa, MR4; Silva, LCC1; Moreira, MA1,2; Barros, EG1,3
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO) - Universidade Federal de Viçosa (UFV)
2
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular (UFV)
3
Departamento de Biologia Geral - (UFV)
4
Universidade Estadual de Montes Claros (Unimontes)
[email protected]
1
Palavras-chave: microssatélites, Phaseolus vulgaris, ISSR, marcadores moleculares, mapeamento
O feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma cultura de destacada importância nutricional, econômica e social, e se
encontra amplamente distribuída por todo o território nacional. Entretanto, o aporte de recursos para pesquisas com
essa leguminosa é bastante tímido e a produtividade brasileira está em um patamar muito abaixo do potencial da cultura.
Das estratégias utilizadas para minimizar as perdas na produção, o melhoramento genético tem se destacado. Marcadores
moleculares têm sido utilizados como importantes ferramentas auxiliares nos programas de melhoramento do feijoeiro,
sendo usados em estudos de diversidade genética, mapeamento e seleção assistida. Os marcadores microssatélites (SSR) são
seqüências simples repetidas de DNA encontradas ao longo do genoma dos organismos. Como marcadores apresentam
a vantagem de serem altamente polimórficos, de grande reprodutibilidade e podem ser aplicados em diversos tipos
de estudos, principalmente no mapeamento genético. Primers que flanqueiam sequências microssatélites geralmente
são desenhados a partir de clones obtidos de bibliotecas genômicas ou de bibliotecas genômicas enriquecidas. Podem,
também, ser desenhados a partir de sequências depositadas em bancos de dados. Alternativamente, tais marcadores
podem ser desenhados a partir de seqüências simples repetidas internas amplificadas (ISSR-PCR), um método bastante
simples e de baixo custo. O desenvolvimento do maior número de primers SSR possível é fundamental para a saturação
do mapa genético do feijoeiro-comum. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de primers SSR com o uso da
metodologia de ISSR-PCR. Foram obtidos 250 clones a partir da amplificação por ISSR-PCR, clonagem dos fragmentos
e transformação de células ultra-competentes. Destes, trinta foram selecionados e sequenciados, e 20 permitiram a análise
em busca de motivos microssatélites e desenho de primers flanqueadores. Dez pares de primers SSR foram construídos e
testados em dois progenitores de uma população de RILS, e em genótipos andinos e mesoamericanos. Todos os primers
geraram produtos de amplificação. Entretanto, nenhum deles foi polimórfico, sendo que seis comportaram-se como
marcadores codominantes e quatro, como dominantes. O resultado se enquadrou dentro do esperado, uma vez que a
chance de detecção de polimorfismo é baixa. A técnica de enriquecimento por ISSR-PCR foi eficaz para a seleção, no
feijoeiro, de seqüências a partir das quais fosse possível construir primers SSR. Entretanto, para tirar conclusões definitivas
é necessário que um maior número de seqüências seja analisado e um maior número de primers testado. Os outros
clones, do grupo inicial de 250, estão sendo sequenciados e analisados em busca da construção de outros primers.
Apoio Financeiro: CNPq e Fapemig.
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Ganho na seleção para diâmetro de cepa
e número de brotações em progênies de
Myracrodruon urundeuva (Engler) Fr. Allem
Tung, ESC1; Santos, FW1; Canuto, DSO1; Berti, CLF1; Florsheim, SMB2; Freitas, MLM2; Moraes, MLT1.
Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP
2
Instituto Florestal de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: aroeira, populações naturais, parâmetros genéticos, melhoramento genético, conservação genético
A espécie Myracrodruon urundeuva, popularmente conhecida como aroeira, pertence à família Anacardiaceae, possui
ampla distribuição geográfica abrangendo do Ceará aos estados do Paraná e Mato Grosso do Sul, ocorrendo em vários
biomas como a caatinga, o cerrado e a mata atlântica (floresta semidecidual). Apresenta madeira de maior durabilidade
em contato com o solo, sendo muito utilizada na construção civil. Além disso, também são atribuídas propriedades
medicinais. Por causa de suas qualidades, foi intensamente explorada, tornando-se escassa em todas as áreas de ocorrência
e passando a ser ameaçada de extinção, o que a torna uma espécie importante para que sejam feitos estudos visando
melhoramento e conservação genética. Desse modo, avaliou-se a brotação e diâmetro de cepa de árvores desbastadas
a partir de um teste de progênies de 20 anos instalado em Selvíria (MS), na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão
da Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira/UNESP. Os parâmetros genéticos foram estimados tendo por base 28
tratamentos (progênies), 3 repetições e 1 planta por parcela, aplicando-se o procedimento REML/BLUP (máxima
verossimilhança restrita/melhor predição linear não viciada). Para tanto, considerou-se o modelo misto (s = 0,5). As
médias encontradas foram de 3,8 para brotações por cepa e 19,2 cm para diâmetro de cepa. Dentre os caracteres analisados
apenas o diâmetro de cepa apresentou variação genética. As estimativas para a herdabilidade em nível de indivíduo ( ) e
coeficiente de variação genética (CVg) foram,respectivamente, 0,96 e 21,62% e uma ótima acurácia ( raˆa = 0,88). Assim,
com base na variação genética do diâmetro de cepa foi feita uma simulação de seleção dos 28 melhores indivíduos a
partir do índice de multi-efeito o que proporcionou ganho na seleção de 31,95%, para um tamanho efetivo de 41,26 e
diversidade genética de 0,57. Portanto o caráter escolhido apresenta bom ganho de seleção, o que permite a utilização
da população de M. urundeuva estudada em programas de conservação e melhoramento genético.
Apoio Financeiro: CNPq/PIBIC.
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Variação genética em indivíduos
remanescentes de jacarandá-da-Bahia
com base em marcadores RAPD
Barreto, MA; Santos, SG; Corrêa, RX
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: Fabaceae, marcadores moleculares, Mata Atlântica, conservação
O jacarandá-da-bahia (Dalbergia nigra (Vell.) Allem. ex. Benth.) é uma árvore que ocorre na Mata Atlântica, de elevado
valor econômico para indústria, motivo pelo qual foi explorada de forma desordenada para produção de mobílias e
instrumentos musicais. Por causa disso, tornou-se uma espécie ameaçada de extinção, incluída na lista da IUCN como
vulnerável. Atualmente as populações de D. nigra são encontradas em agrupamentos de baixa densidade. Portanto, é
pertinente o desenvolvimento de pesquisas sobre a diversidade genética dessa espécie, visando subsidiar elaboração de
estratégias que permitam a sua conservação e o seu uso racional. Umas das ferramentas importantes para estes estudos
são os marcadores moleculares RAPD, uma técnica prontamente disponível para espécies para as quais há poucos estudos
de genética molecular. Amostras de folhas de 20 indivíduos foram coletadas no município de Ilhéus (BA) e utilizadas
para a extração de DNA pelo método CTAB. Amostras de DNA foram submetidas a técnica RAPD/PCR. A análise
de agrupamento pelo método UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic averages) foi realizada com base
nas distâncias genéticas, utilizando-se o programa PAST. Foram testados 20 primers, dos quais 7 foram selecionados
por serem os mais polimórficos. A caracterização molecular possibilitou a identificação de 73 bandas RAPD, em que
33 foram informativas. Por ser uma planta ainda não domesticada, pôde-se acessar seu polimorfismo com um número
pequeno de primers. Com base no índice de dissimilaridade de Dice, observou-se uma variação de 0,14 à 0,96 entre
os indivíduos de D. nigra. Considerando um limite de 60% de similaridade entre os indivíduos foi possível identificar
oito grupos. Esses dados estão de acordo com o esperado para espécies arbóreas de vida longa que, usualmente mantêm
maior nível de diversidade genética dentro das populações. Serão testados mais primers, visando testar a estabilidade
desses agrupamentos, bem como permitir inferências estatísticas tais como diversidade genética de Nei (H), número
médio de alelos por loco (A) e a porcentagem de alelos polimórficos (P).
Apoio financeiro: FAPESB, UESC e CNPq.
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Estrutura genética espacial de Aechmea
nudicaulis (Bromeliaceae) no Parque Nacional
da Restinga de Jurubatiba (Macaé – RJ)
Loh, RM1; Salgueiro, F2; Alves-Ferreira, M3; Scarano, FR1
Laboratório de Ecologia Vegetal, Departamento de Ecologia, Instituto de Biologia, UFRJ
2
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRuralRJ
3
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ
[email protected]
1
Palavras-chave: Estrutura clonal, Aechmea nudicaulis, bromélia, AFLP, conservação
A bromélia tanque Aechmea nudicaulis Griseb. (Bromeliaceae) é uma espécie comum ao complexo vegetal da Mata
Atlântica ocorrendo em diferentes tipos vegetacionais como floresta de encosta, pântanos e restingas. Esta espécie é
encontrada em abundância no Parque Nacional da Restinga de Jurubatiba, uma relevante unidade de conservação
deste tipo de ambiente, onde desempenha funções importantes ao funcionamento do ecossistema. Esta espécie
apresenta metabolismo CAM (associado a ambientes com déficit hídrico) e pode se reproduzir sexuadamente ou por
crescimento clonal. Em Jurubatiba, a comunidade vegetal está organizada em grupos naturais conhecidos como ilhas
de vegetação onde uma espécie central fornece condições favoráveis à germinação e crescimento de outras espécies.
Estudos prévios mostraram que bromélias encontradas dentro das ilhas de vegetação apresentam crescimento clonal
direcionado preferencialmente para fora da ilha. Assim, é possível que indivíduos próximos a uma determinada ilha
sejam clones de indivíduos que teriam germinado no interior da ilha (onde as condições são mais favoráveis). Neste
caso, a distribuição da variação genética seguiria o padrão de organização da vegetação com indivíduos próximos a uma
determinada ilha sendo geneticamente mais similares entre si do que em relação a indivíduos de outras ilhas. Assim,
o objetivo do trabalho é avaliar a organização espacial da variabilidade genética para verificar se ela está estruturada
de acordo com a organização da vegetação. Para isto, rametes de A. nudicaulis foram amostrados em nove ilhas de
vegetação separadas por diferentes classes de distância (entre 160m e 2300m). Nas proximidades de cada ilha foram
amostrados seis rametes não conectados até uma distância de 20m do seu centro. A estrutura genética foi avaliada
através de marcadores AFLP. Foram analisados 254 loci e os dados obtidos foram testados através de análise molecular
de variância (AMOVA). Os resultados indicam uma baixa estruturação na distribuição da variação genética com a maior
parte da variação observada (96%) dentro dos grupos. Isto indica que indivíduos de diferentes grupos apresentam de
maneira geral uma alta similaridade. Foram detectados valores significativos de divergência apenas entre o grupo 6 e
os grupos 4, 5, 7 e 8. A diferença observada entre os grupos parece ser independente da distribuição geográfica. Estes
resultados preliminares indicam que a variação genética observada não está estruturada em ilhas, mas parece estar
distribuída ao acaso, ou seja, a proximidade espacial entre os grupos não implica em uma maior similaridade genética
apesar da predominância de reprodução assexuada. Para fins de conservação, esta é uma informação importante, pois
fornece uma indicação de que a diversidade genética da população estaria amplamente distribuída e não associada a
áreas específicas. O próximo passo é ampliar a amostragem de indivíduos analisados e testar a correlação entre distância
genética e distância geográfica através da comparação entre as respectivas matrizes.
Apoio financeiro: CAPES; FAPERJ e CNPq.
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Diversidade genética em acessos de
arroz filipino avaliada por caracteres
agromorfológicos
Mata, TL1; Bosetti, F1; Aguillar, CAJ1; Pavan, GC1; Pinheiro, JB1
Departamento de Genética– ESALQ/USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Oryza sativa, Análise Multivariada, Germoplasma, Diversidade Genética, Agromorfológicos
A utilização intensiva de germoplasma melhorado de arroz, como genitores em programas de melhoramento, reduziu
a variabilidade genética necessária para o processo de seleção. Para que a diversidade genética disponível nos bancos de
germoplasma seja utilizada, é necessário que os acessos sejam caracterizados e documentados de forma que o melhorista
identifique aqueles potencialmente úteis para o melhoramento. Para este fim, foram analisados e caracterizados
144 acessos de arroz Filipino, pertencentes ao banco de germoplasma da ESALQ-USP, por meio de cinco caracteres
agromorfológicos (número de perfilhos, ciclo total da planta, comprimento de panícula, altura de planta na maturidade
e produtividade de grãos). Utilizando análise multivariada buscou-se estudar a diversidade genética com base nas
características avaliadas. Para avaliação dos diferentes genótipos e comerciais utilizadas como testemunhas (Curinga,
IAC 1246, IAC 201, Caiapó, Sertaneja e IAC 202), adotou-se o delineamento de blocos aumentados. Segundo o
algoritmo de otimização de Tocher, foram reunidos 46 grupos de similaridade, sendo que o primeiro grupo abrange
cerca de 10% do total de acessos. Segundo este mesmo algoritmo, os grupos que relativamente apresentaram maior
divergência foram os grupo 11, constituído pelos acessos (Khao Kap Xang, Ketji, IAC-47 e Ku 94-2), e o grupo 42
composto apenas pelo genótipo Khae. Para visualização da dispersão dos acessos graficamente e a representatividade dos
caracteres para a diversidade, a análise de variáveis canônicas foi empregada. Assim, verificou-se que as duas primeiras
variáveis absorveram cerca de 88% da divergência encontrada entre os acessos. Dos cinco caracteres avaliados, o que
mais contribuiu para a primeira variável canônica, dentre os 66% da variação observada entre os acessos, foi ciclo
total da planta. Para a segunda variável canônica, a de maior importância foi a altura de planta na maturidade. Esses
resultados mostram que estes caracteres, além de grande importância agronômica, também se destacam na caracterização
de acessos do germoplasma de arroz.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Análise de marcadores cloroplásticos em
Araucaria angustifolia
Abs da Cruz, C; Turchetto-Zolet, AC; Margis R
Laboratório de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
Palavras-chave: marcadores de cloroplastos, polimorfismo nucleotídico, SNP
A família Araucariaceae é composta pelos gêneros Aghatis, Wollemia e Araucaria. Este último se encontra localizado
na Mata Atlântica, um dos cinco hotspots mundiais. Esta formação assume grande importância ecológica por abrigar a
única conífera de ocorrência natural do país, a Araucaria angustifolia. Alguns autores advogam a favor da existência de
variedades de araucárias com formações próprias, em manchas dentro de fragmentos de A. angustifolia, devido à morfologia
diferenciada destas variedades da totalidade da espécie já descrita. A diferenciação morfológica das variedades ainda não
foi testada molecularmente. Um número considerável de trabalhos foram feitos, utilizando isoenzimas e microssatélites
nucleares, no estudo da diversidade genética da araucária. Nenhum destes trabalhos avaliou o poliformismo total da
área de distribuição da espécie, relacionado com as variedades intra-específicas e utilizando marcadores cloroplásticos
associados a nucleares. Devido ao histórico de ocupação destas áreas, um estudo filogeográfico baseado em marcadores
cloroplásticos e nuclear seria de grande importância para sua conservação. O reduzido número de caracteres morfológicos
utilizados para identificação de variedades de A. angustifolia carece de análises filogenéticas através de marcadores
moleculares e do seqüenciamento de DNA. A sistemática filogenética utilizando variações de DNA cloroplástico tem
provado ser válida para a reconstrução da filogenia e filogeografia de espécies. Neste trabalho foi realizada a amplificação
das regiões cloroplásticas AccD, rbcLa, ndhJ, rpoC1, trnLI, matK, rpS16 e nucleares ITS1-2, foram seqüenciadas amostras
de araucárias do Pró-Mata, região com 4.500 hectares, localizado na borda leste do Planalto das Araucárias; da Floresta
Nacional de São Francisco de Paula, região localizada a nordeste do Rio Grande do Sul e amostras coletadas no Parque
Nacional de Itatiaia no Rio de Janeiro. Dentre o conjunto de marcadores testados, o que apresentou maior grau de
polimorfismo foi o gene rpoC1, onde foram detectados seis SNPs. Outras cinco regiões cloroplásticas serão analisadas,
bem como uma amostragem populacional cobrindo toda a área de distribuição da espécie e as diferentes variedades.
Apoio financeiro: CNPq.
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Análise de diversidade genética entre
populacões com diferentes tamanhos
Tomé, LGO1; Pinto, DS1; Maciel, TEF2; Ferreira, FM1; Cruz,CD1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
2
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Diversidade genética, Deriva genética e Tamanho populacional, Nei, Simulação
O conhecimento do padrão de variação genética entre e dentro de populações pode ser caracterizado a partir do estudo
de amostras de diferentes tamanhos populações ou de diferentes subpopulações. Objetivou-se estudar o efeito da deriva
genética, proporcionada pela subdivisão de 4000 populações, em subpopulações de diferentes tamanhos. Simulou-se
uma população base, composta por 1000 indivíduos, sendo esta representante de uma espécie qualquer de reprodução
sexuada e de acasalamentos ao acaso. Foram gerados quatro cenários constituídos por 10, 20, 50 e 100 indivíduos,
amostrados 100 vezes cada. Considerou-se 10 gerações de acasalamentos ao acaso. Simulações e análises estatísticas
foram realizadas no programa GENES, determinaram-se a distribuição das freqüências alélicas e a magnitude da
diferenciação genética de Nei (GST) entre e dentro de populações. Quanto à distribuição das freqüências alélicas, as
subpopulações de tamanhos 10 e 20 indivíduos apresentaram maior efeito de deriva genética. A diferenciação entre
populações é maior que dentro de populações, apenas para subpopulações de tamanhos de 10 indivíduos, mas para
os demais tamanhos populacionais, a diversidade dentro foi maior do que a entre populações. Entretanto, houve um
aumento das estimativas GST ao longo das gerações em todos os tamanhos populacionais enquanto que a diversidade
dentro de subpopulações tendeu a diminuir ao longo das gerações. Foi perceptível o efeito de diferenciação genética em
todos os 4 cenários analisados, entretanto, nas subpopulações com 10 indivíduos este efeito é mais evidente (GST=63%)
em relação às subpopulações de 20, 50 e 100 indivíduos que foram de GST=16,7; 8,1; 2,8%, respectivamente.
Apoio Financeiro: FAPEMIG.
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Análise isoenzimática em Stryphnodendron
adstringens (Fabales: Leguminosae:
Mimosoideae)
Glasenapp, JS1; Casali, VWD2; Martins, ER3; Sena, JS1
Departamento de Genética e Melhoramento, Universidade Federal de Viçosa
2
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa
3
Núcleo de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: isoenzimas, cerrado, plantas medicinais
O Stryphnodendron adstringens (Leguminosae), árvore do Cerrado conhecida popularmente como barbatimão, ocorre
desde o Pará, planalto central, Minas Gerais até São Paulo. É utilizado na medicina popular como cicatrizante, antiinflamatório, no tratamento de úlceras e diarréias, entre outros. Acredita-se que suas atividades farmacológicas são
devidas à grande quantidade de taninos encontrada, principalmente na casca. Uma vez que o barbatimão é desconhecido
geneticamente, este trabalho teve como objetivo proceder à análise das enzimas fosfogluco isomerase (PGI) e malato
desidrogenase (MDH). Foram estudadas três populações de S. adstringens no cerrado sticto sensu, norte de Minas Gerais,
município de Grão Mogol, às margens da BR251. Amostras foliares foram obtidas aleatoriamente, por meio de transectos,
respeitando-se um espaço amostral de cerca de 20 m. As amostras foram acondicionadas em nitrogênio líquido até a
chegada ao Laboratório de Melhoramento de hortaliças da Universidade Federal de Viçosa (UFV), onde se procedeu
à extração isoenzimática, corrida eletroforética e revelação de bandas por meio reagentes específicos. Foram obtidos
padrões de bandas nitidamente perceptíveis, facilitando a interpretação e verificação do número de alelos nos locos.
Para a enzima PGI foram observadas duas regiões de atividade enzimática formadas por dois locos, um monomórfico
contendo apenas um alelo, o outro polimórfico contendo dois alelos. Para a enzima MDH foi observada apenas uma
região de atividade, correspondendo a um loco com dois alelos. Ambas as enzimas foram consideradas diméricas, devido
ao padrão de bandas híbridas produzidas nos indivíduos heterozigotos. Bandas híbridas só podem ocorrer quando
diferentes alelos, que codificam diferentes cadeias polipeptídicas de uma mesma enzima, estão presentes no mesmo
loco. A análise adicional de um maior número de populações naturais poderá trazer resultados mais conclusivos, porém
os padrões de bandas observados neste trabalho, para ambas as enzimas, estão de acordo com padrões observados em
outras espécies.
Apoio Financeiro: FAPEMIG.
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Variabilidade genética de Pseudocercospora
griseola em Minas Gerais
Balbi, BP1; Sanglard, DA1; Ribeiro, CAG1; Boldt, AS1; Barros, EG1,2; Moreira, MA1,3
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agricultura (BIOAGRO), Universidade Federal de Viçosa
2
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Mancha angular, Pseudocercospora griseola, feijão, variabilidade genética, variedades diferenciadoras
A mancha angular incitada pelo fungo Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, apresenta grande importância
para cultura do feijoeiro (Phaseolus vulgaris) no Brasil. Estimativas de perdas na produção causadas pela mancha angular
atingem 70%, dependendo das condições ambientais e suscetibilidade dos cultivares. A eficiência no uso de variedades
resistentes depende do conhecimento sobre a variabilidade patogênica do agente incitador e sua distribuição geográfica.
A variabilidade genética de P. griseola tem sido determinada mediante a reação de um grupo padrão de variedades
diferenciadoras que contém genótipos de dois acervos genéticos do feijão, andinos e mesoamericanos. O objetivo
deste trabalho foi caracterização, em raças, de oito isolados de P. griseola oriundos de várias regiões do Estado de Minas
Gerais. Para a obtenção de culturas monospóricas, foi utilizado o isolamento direto a partir de folhas com sintomas
coletadas em campo. Após um crescimento inicial, os isolados foram transferidos para placas de petri contendo uma
mistura de água destilada, molho de tomate, ágar e carbonato de cálcio. Em seguida, as placas foram incubadas por
10 dias, a 24oC para multiplicação de conídios. Foram inoculadas folhas trifolioladas de doze plantas de cada variedade
diferenciadora utilizando uma suspensão contendo 2,0 x 104 conídios/mL. Após a inoculação, as plantas foram
transferidas para uma câmara úmida (20 ± 1oC e > 95% de umidade relativa) onde permaneceram por 48 horas, sob
fotoperíodo de 12 horas. Após esse período, foram transferidas para uma casa-de-vegetação onde permaneceram até
o aparecimento de sintomas. A severidade da doença foi avaliada visualmente aos 15, 18 e 21 dias após a inoculação,
utilizando-se uma escala com nove graus de severidade. Plantas que receberam notas de 1 a 3 (ausência de lesões com
esporulações) foram consideradas resistentes e plantas com notas de 4 a 9 (presença de lesões esporulantes) foram
consideradas suscetíveis. Como resultados foram identificadas cinco raças distintas (7.15, 15.7, 47.39, 63.39 e 63.63),
o que confirma a alta variabilidade patogênica do fungo em Minas Gerais. Quatro isolados apresentaram reações de
compatibilidade com todas as variedades diferenciadoras sendo classificados como raça 63.63. Estas informações acerca
da variabilidade genética do fungo P. griseola direcionam as pesquisas dos programas de melhoramento do feijoeiro que
visam a obtenção de cultivares resistentes.
Apoio Financeiro: CAPES e FAPEMIG.
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Estudo de diversidade Genética entre
espécies de Coffea usando marcadores
moleculares SSR e RAPDs
Setotaw, TA1; Caixeta, ET2; Sakiyama, NS3; Zambolim, EM1; Pena, GF1; Zambolim, L4; Perriera, AV5
1
BIOCAFÉ, Universidade Federal de Viçosa
EMBRAPA Café, Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento do Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa
4
EPAMIG
[email protected]
2
Palavras-chave: diversidade genética, Coffea, C. arábica, C. Canephora, Híbrido de Timor
O estudo de diversidade genética é importante para programas de melhoramento de quaisquer espécies de plantas
e animais. Para estudo de diversidade genética os marcadores moleculares são as ferramentas mais poderosas para
detectar diferenças ias ao nível de DNA sem ser afetado pela idade, ambiente e parte de órgãos tomados como amostras.
Marcadores moleculares SSR e RAPD foram usados para analisar diversidade genética em 57 acessos de cafeeiros, sendo
5 de C. arabica, 5 de C. caenphora, 4 premeiros Híbridos de Timor introduzidos pelo CIFIC (Centro da Investigação
de Ferrugem do Café) e 43 linhagens derivadas do Hibrido de Timor. Foram usados 52 primers oligo-nucleotídeos e
18 primers microsatelite obtido de (Combes et al 2000 e Rovelli et al. 2000) que geram 157 e 76 bandas polimórficas,
respectivamente. Para o estudo de diversidade genética, a proporção de loci polimórficos, o índice Shannon-Weiner
e análise de agrupamento foram usadas. A análise de agrupamento foi feita baseada no coeficiente dissimilaridade de
Jaccard. Os programas PopGene (Yeh and Boyle 1997) e GENES (Cruz, 1997) foram usados para estimar todos os
parâmetros genéticos e fazer o agrupamento. O estudo mostrou diferenciação genética entre os acessos das espécies
de Cafeeiro. A maior diversidade genética foi observada na C. canephora e nas linhagens derivadas do Hibrido de
Timor. Maior polimorfimsimo foi produzido pelo marcador RAPD em comparação como o marcador molecular SSR.
C. arábica apresentou menor variabilidade genética por ambos marcadores em comparação com outras espécies de café,
em acordo com estudos anteriores. O índice de Shannon –Weiner (Lewontin, 1972) mostrou maior diversidade genética
dentro de C. canephora usando ambos marcadores (I= 0,2197 e 0,26, para SSR e RAPD marcadores, respectivamente).
O índice de diversidade genética de Nei (h) (Nei 1973) mostrou maior diversidade genética dentro de C. canephora
(h= 0,174) e linhagens derivadas do Híbrido de timor (h=0,148). Presença da considerável diversidade genética dentro
de linhagens derivados do Híbrido de Timor é importante para programas de melhoramento do cafeeiro. Este material
tem sido extensivamente usado no programas do melhoramento de café no Brasil e no mundo, como fonte de genes de
resistência à doenças e pragas e por outras características importantes. O marcador molecular RAPD apresentou maior
poder para discriminar no estudo de diversidade entre espécies de cafeeiro em comparação marcador molecular SSR.
Na análise de agrupamento, produzida baseando-se no coeficiente de Jacard e usando método de Tocher, agrupou os
acessos do C. arábica e do Híbrido de Timor no mesmo grupo. Já o dendograma gerado pelo método UPGMA separou
C. canephora de C. arábica e Hibrido de Timor.
Apoio Financeiro: TWAS e CNPq.
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Variabilidade fenotípica em Sisyrinchium
micranthum Cav. (IRIDACEAE) no Rio grande
do sul: aspectos morfológicos e moleculares
Tacuatiá, LO1; Eggers, L2; Kaltchuk-Santos, E1; Souza-Chies, TT2
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Iridaceae, Sisyrinchium micranthum, variabilidade morfológica, citogenética
Sisyrinchium micranthum Cav. (Iridaceae) é uma monocotiledônea herbácea com ampla distribuição nas Américas. No
Brasil foi descrita para os estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, São Paulo e Rio de Janeiro. No Rio
Grande do Sul (RS), apresenta pronunciada variabilidade morfológica, sendo possível reconhecer plantas pequenas,
médias e grandes, e flores violáceas, amarelas ou rosas. Os trabalhos a respeito desta espécie são, principalmente, estudos
citogenéticos e sobre espécimes da América do Norte. Análises citogenéticas feitas por nossa equipe mostraram a
ocorrência de três níveis de ploidia no RS: n = 8, 16 e 24. Frente à tamanha diversificação morfológica e à escassez
de estudos, este trabalho tem o objetivo de caracterizar morfologicamente e geneticamente diferentes acessos de
S. micranthum no RS, a fim de contribuir para o conhecimento taxonômico e evolutivo da espécie. Para tal, foram
coletados 25 acessos no RS. A caracterização morfológica foi feita a partir dos testemunhos coletados e depositados
no herbário ICN e de flores conservadas em etanol 70%. DNA genômico foi extraído de nove acessos com flores
violáceas, sendo três para cada tipo, utilizando o método de Doyle & Doyle (1987). Foram utilizados seis iniciadores
de ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). A avaliação das amplificações foi feita em géis de agarose 1,5% corados
com GelRed™. A similaridade entre os indivíduos foi estimada pelo coeficiente de Jaccard e o dendrograma foi obtido
a partir do método de UPGMA. Para a verificação do ajuste entre a matriz de similaridade e o dendrograma obtido
foi calculado o coeficiente de correlação cofenética (r). As análises foram feitas com o programa NTSYS. As plantas
classificadas como médias e pequenas são muito semelhantes com relação ao hábito, caule e folhas. No entanto, as
plantas pequenas apresentam altura e diâmetro floral marcadamente menor. As plantas grandes apresentam hábito mais
ereto, as espatas são mais longas, estreitas e próximas, e as flores possuem a fauce com uma típica borda de coloração
amarela. Na análise de agrupamento, o dendrograma obtido é uma boa representação das relações entre os indivíduos
(r = 0,86; p = 0,001). Os nove acessos formaram grupos de indivíduos de cada área amostrada quase que exclusivamente,
indicando que os mesmos apresentam-se bem estruturados. No entanto, as relações entre os tipos morfológicos não se
mostraram muito claras. Análises citogenéticas paralelas têm mostrado a ocorrência de diferentes níveis de ploidia em
simpatria. Além disso, a campo ocorre uma variação ainda maior do que a amostrada para as análises morfológicas,
sendo possível reconhecer indivíduos com caracteres intermediários aos tipos pequeno e médio. Tais aspectos podem
justificar a não separação concisa dos três morfotipos, evidenciando a ampla variabilidade e a poliploidia como um
fenômeno importante na diversificação da espécie no RS.
Apoio financeiro: CNPq e FAPERGS.
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Diversidade genética e diferenciação de
genótipos de Gossypium barbadense e G.
hirsutum r. marie-galante do estado do
Piauí com base em marcadores SSR
Menezes, IPP1,2; Lucena, VS1; Pereira, GS1,3; Almeida, VC1,3; Barroso, PAV1; Hoffmann, LV1
1
Laboratório de Biotecnologia, Embrapa Algodão
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
3
Departamento de Biologia, Universidade Estadual da Paraíba
[email protected]
2
Palavras-chave: Algodoeiros não-cultivados, Marcador molecular, Microssatélite, Conservação genética, Germoplasma
O Brasil, como centro de diversidade de Gossypium spp. (Malvaceae) alotetraplóides no mundo, apresenta grande
responsabilidade na manutenção desse importante recurso genético. Conhecer a diversidade genética e a estrutura
de populações naturalizadas de algodoeiros a nível molecular tem sido fundamento indispensável no delineamento
de estratégias de conservação. Foram utilizados marcadores do tipo SSR para avaliar a variabilidade genética intra e
interespecífica e o grau de diferenciação de acessos das espécies G. barbadense L. e G. hirsutum L. r. marie-galante (Watt.)
Hutch. prospectados no estado do Piauí, Nordeste do Brasil. As coletas foram realizadas em 2004 (autorização IBAMA
processo nº 02001.004259/2004). Cinco sementes coletadas de cada um dos 47 acessos de G. hirsutum r. marie-galante
e 27 de G. barbadense tiveram o DNA extraído pelo método SDS. PCR foram realizadas com 17 primers SSR mapeados
em cromossomos diferentes. Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel desnaturante de
poliacrilamida e corados com nitrato de prata. As freqüências alélicas, a heterozigozidade e as estatísticas de Nei foram
estimadas pelos programas GDA e FSTAT. A distância entre genótipos foi calculada pelo programa MICROSAT e os
mesmos foram agrupados segundo Neighbor-Joining. Com média de 4,29 alelos polimórficos por loco, foram gerados
um total de 73 alelos, dos quais 31 foram exclusivos de G. hirsutum r. marie-galante e apenas dois foram exclusivos de
G. barbadense. A heterozigosidade observada (Ho = 0,079) foi moderada, o que refletiu no índice de endogamia total
(Fis = 0,806). G. bardadense, entretanto, mostrou-se mais isolada reprodutivamente (Fis = 0,911) que G. hirsutum r.
marie-galante (Fis = 0,776), a qual não se costuma encontrar tão isolada a campo quanto G. barbadense. A diversidade
genética total foi elevada (Ht = 0,678), indicando haver grande variabilidade nas populações. A maior parte da diversidade
estava dentro das espécies (Hs = 0,445), sendo a diversidade presente entre ambas (Dst = 0,232) também expressiva. A
diferença entre os indivíduos da mesma espécie foi baixa para G. hirsutum r. marie-galante (Gst = 0,182) e relativamente
elevada para G. barbadense (Gst = 0,302). A análise do agrupamento revelou a formação de dois grupos bem distintos,
correspondentes às duas espécies estudadas. Apareceram quatro indivíduos intermediários, possivelmente resultantes
de eventos antigos de hibridação. Há elevada diversidade genética do gênero Gossypium in situ no estado do Piauí,
devendo-se preservar estes acessos em bancos de germoplasma ex situ.
Apoio financeiro: Embrapa Algodão, FINEP e CNPq.
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Estudo da diversidade genética de clones
de cacau com base em marcadores
moleculares microssatélites
Bertolde, FZ; Almeida, AAF; Corrêa, RX; Gaiotto, FA
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: Theobroma cacao, marcadores SSR, variabilidade genética
O Theobroma cacao L. possui grande importância sócio-econômica e ecológica nas regiões produtoras do Brasil, sendo o
sul da Bahia a principal região produtora do país. A doença vassoura-de-bruxa, introduzida em 1989 na região cacaueira
da Bahia, causou grande crise na lavoura, aumentando a miséria e as diferenças sócio-econômicas. Para o resgate da
cacauicultura adotou-se a estratégia de clonagem de variedades resistentes à doença, recomendadas pela CEPLAC e
multiplicadas pela técnica de estaquia no Instituto Biofábrica de Cacau (IBC). Essas variedades resistentes têm sido
submetidas a análises da diversidade genética, com base em marcadores moleculares, objetivando a identificação de
materiais com alta diversidade genética como forma de aumentar a riqueza de genes relacionados com resistência a doenças
e outras características de interesse nesta cultura. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar a diversidade genética
de 46 clones de T. cacao, de alta produtividade, tolerantes à vassoura-de-bruxa e a outras enfermidades, multiplicados
pelo IBC e recomendados pela CEPEC/CEPLAC aos cacauicultores da região sul da Bahia, com base em marcadores
microssatélites. Amostras de DNA de folhas de 46 clones de T. cacao foram extraídas pelo método CTAB, com algumas
modificações, amplificadas utilizando 18 primers microssatélites (SSR) e analisadas em seqüenciador automático de
DNA ABI 377. A diversidade genética foi inferida com base nos coeficientes de similaridade genética, calculados a
partir dos 291 alelos amplificados com os primers SSR. Verificou-se, por meio da análise de agrupamento a formação
de três grupos, sendo que um dos grupos apresentou apenas dois dos acessos (TSA-654 e TSA-656) e os outros dois
50 e 45 % dos acessos. Os clones CA-7.1, CCN-51, CEPEC-2002, CEPEC-2004, CEPEC-2008, CEPEC-2009,
PH-16, PH-17 e TSA-792 apresentaram baixa heterozigosidade (≤ 40 %), e os clones CEPEC-2006, TSA-654,
PH-15, SJ-02, OURICO-428 e TSH-1188 apresentaram alta heterosigosidade (≥ 67 %), sendo que os demais
(67% dos clones) apresentaram média heterozigosidade. No geral, os clones avaliados apresentaram heterozigosidade
superior aos clones sabidamente pouco heterozigotos, a exemplo do CCN-51, porém inferior aos clones altamente
heterozigotos, TSH-1188, podendo-se inferir que a maior parte desses clones apresenta heterozigose intermediária.
Apoio financeiro: CAPES e FAPESB.
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Detecção de parâmetros moleculares em
jenipapeiros no recôncavo da Bahia com
auxílio de software de análise de dados
populacionais
Machado, EL1; Carvalho, DS dos1; Moreira, RF1; Silva, SA1; Sousa, CS1; Hansen, DS1
Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas, Universidade Federal do Recôncavo da Bahia - UFRB
[email protected]
1
Palavras-chave: jenipapo, recôncavo baiano, software de análise de dados populacionais
A Genipa americana L. é uma árvore frutífera, originária da América Tropical, pertencente à família Rubiacea.. No
Brasil sua distribuição é ampla, sendo muito comum encontrá-la no estado da Bahia, principalmente na região do
Recôncavo Baiano. A avaliação de dados moleculares de genótipos de jenipapeiro através de um programa computacional
faz-se necessária, a fim de gerar informações para subsidiar o processo de domesticação e melhoramento da espécie,
além da sua conservação na região. Para tanto, analisou-se, através de RAPD, 100 (cem) genótipos provenientes das
cidades de Cruz das Almas e Governador Mangabeira, Região do Recôncavo Baiano, localizada entre 12°23’ e 13°24’
de latitude sul e 38°38’ e 40° 10’ de longitude Oeste. Os locos RAPD, obtidos a partir de 10 primers da Operon
Technologies (OPA-08, OPB-01, OPE-06, OPE-09, OPA-04, OPA-11, OPH-13, OPH-18, OPAI-11 e OPN-20,
foram avaliados pela presença (1) e ausência (0) de bandas, gerando uma matriz de fenótipos moleculares. Calculouse os percentuais de polimorfismo total e dos indivíduos e as estimativas das distâncias genéticas e a distribuição da
variabilidade dos indivíduos em regiões geográficas através do software Popgene 1.32 (Yeh et al., 1997), utilizando
parâmetros para dados dominantes diplóides. Simulou-se o equilíbrio de Hardy-Weinberg em todos os indivíduos em
cada região. O número de alelos observados (na), número de alelos efetivos (ne), diversidade gênica de Nei (1973)
(Ĥe), porcentagem de locos polimórficos (P%), para os indivíduos de cada região e para o conjunto das regiões foi
estimado. Para a diversidade gênica em indivíduos utilizou-se o método de Nei (1978), estimando a heterozigosidade
total (HT), diversidade gênica média dentro (HS), divergência genética de indivíduos entre áreas (GST) e fluxo gênico
(Nm). A estrutura dos indivíduos para cada marcador, também foi avaliada pelo teste de qui-quadrado e pelo teste
G. Um total de 107 marcadores RAPD foi avaliado. O número de loci polimórficos variou de 5 (OPA08 e OPB01) a
13 (OPH13), com o percentual de polimorfismo entre 62,5% a 100% (OPA08 e OPAI11, respectivamente). O índice
de diversidade gênica de Nei (Ĥe) confirma os dois parâmetros anteriores. O alto índice de locos polimórficos (75,00 a
83,00%) indica que não ocorreu ainda um grande isolamento entre populações. A análise intrapopulacional mostrou
que 16,1% da variabilidade genética estava entre grupos (GST= 0,161) sendo 83,9% dentro dos grupos (Hs= 0,389).
A heterozigosidade total (HT) estimada foi relativamente alta com pequeno desvio para a maioria dos locos. Concluise que a utilização dos marcadores moleculares e de softwares de análise de dados populacionais, detectou diferenças
genotípicas entre grupos e populações de G. americana, gerando informações imprescindíveis para a tomada de decisões
em pesquisas para a espécie que vão desde a coleta até o melhoramento genético da mesma.
Apóio financeiro: FAPESB.
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Comparação dos métodos estatísticos
utilizados na construção de árvores
filogenéticas
Sobreira, FM1; Maciel, TEF2; Tomé, LGO1; Cruz, CD1
Departamento de Biologia Celular, Universidade Federal de Viçosa
2
Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: árvores filogenéticas, métodos estatísticos, variabilidade genética, β-tubulina, Basideomicetos
A versatilidade e poder discriminatório dos métodos de construção de árvores filogenéticas têm permitido suas
aplicações nas mais variadas áreas da ciência. Análises filogenéticas visam à reconstrução da história evolutiva de um
grupo de espécies, permitindo estimar e analisar relações de ancestralidade entre os organismos pertencentes a este
grupo sendo indispensável para o entendimento de processos evolutivos como: extinção, especiação, adaptação, dentre
outros. Estes métodos têm sido rotineiramente utilizados em trabalhos de melhoramento genético, conservação de
recursos genéticos e estudos filogenéticos. Vários softwares têm permitido a execução de tais análises, dentre os quais,
destaca-se o programa estatístico “Molecular Evolutionary Genetics Analysis” MEGA. Questiona-se a concordância dos
resultados quando diferentes métodos de construção de árvores filogenéticas são utilizados. Com o intuito de investigar
o problema foi utilizado tal software e os seguintes métodos: UPGMA, Neighbor-Joining (NJ), Evolução Mínima (ME)
e Máxima Parcimônia (MP). O experimento foi baseado no alinhamento da seqüência parcial do gene codificador
da β-tubulina de 17 espécies de fungos relacionados, considerando-se o modelo evolutivo de Kimura 2 parâmetros.
No geral, os resultados da análise, baseando-se nos quatro métodos, proporcionaram a alocação dos fungos em dois
clados (A e B) sendo o clado “A” constituído por dois subclados (A1 e A2). O subclado (A1), suportado por 100% de
bootstrap, é composto exclusivamente por basidiomicetos pertencentes a ordem Pucciniales, também conhecida como
ferrugens; e o segundo (A2), também suportado por 100% de bootstrap, é composto por Basideomicetos pertencentes
aos Himenomicetos que se encontram evolutivamente mais distantes das ferrugens. Pequenas alterações na alocação das
espécies ocorreram, mas a disposição das espécies em três grupos não foi alterada; com exceção da árvore gerada por
Máxima Parcimônia, que agrupou as espécies constituintes do clado “B” junto aos fungos do subclado “A2”, formando
assim somente dois clados. A discordância quanto a posição de alocação das espécies, entre os diferentes métodos
analisados, indica que os critérios adotados por cada metodologia é variáveis e peculiar. Assim, cabe ao pesquisador
analisar qual dos métodos é o mais indicado para o estudo de um conjunto particular de dados, devendo considerar
sempre as peculiaridades inerentes destes dados.
Apoio financeiro: CNPq e CAPES.
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Diversidade genética em acessos de
Paspalum notatum Flüggé com o uso de
marcadores microssatélites
Cidade, FW1; Souza-Chies2, TT; Souza, AP1
CBMEG, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
2
Departamento de Botânica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
Palavras-chave: Paspalum; Paspalum notatum; Diversidade genética; Marcadores moleculares; Marcadores microssatélites
Paspalum notatum Flüggé é uma gramínea rizomatosa nativa da América do Sul, sendo um importante componente
das pastagens naturais da Argentina, do sul do Brasil e do Paraguai. Diversos biótipos são encontrados no Brasil e
vários destes são dominantes na composição botânica de amplas áreas de pastagens nativas, especialmente no Estado
do Rio Grande do Sul. Graças ao apreciável valor forrageiro e a rapidez de estabelecimento de uma densa cobertura
do solo, inúmeros acessos de Paspalum notatum têm sido incorporados a experimentos de cunho agronômico. Dentre
os marcadores moleculares mais utilizados, os microssatélites se destacam, pois possuem herança co-dominante e alta
reprodutibilidade. Neste contexto este trabalho visa avaliar a diversidade genética em acessos de Paspalum notatum com
o uso de marcadores moleculares microssatélites. Foram avaliados dez locos microssatélites em 56 acessos de Paspalum.
(53 P. notatum e P. subciliatum, P. ionanthum e P. cromiohrizon). O PIC e o Poder discriminatório (PD) foram calculados
para cada loco. A partir da matriz binária, resultante da leitura dos géis de poliacrilamida 6%, foi calculado o coeficiente
de similaridade de Jaccard e método UPGMA foi utilizado para construção do dendrograma.A análise de dez locos em
56 acessos de Paspalum revelou que o número de alelos por loco variou de quatro a vinte e sete, com uma média de
8,7 alelos por loco. Por outro lado, os valores de PIC variaram entre 0,48 a 0,88 e os de PD entre 0,598 a 0,957, os
seus valores médios foram de 0,707 e 0,746, respectivamente. O maior valor de PIC e de PD encontrados foi 0,888 e
0,957, respectivamente, para o microssatélites PN02-F6A, que apresenta o motivo repetitivo (CT)11. Os microssatélites
que apresentaram os menores valores de PIC foram PN02 - A12 (0,449) e PN03 - A5 (0,480), que apresentam os
motivos repetitivos (GA)3AT(GAA)3 e (TG)8, respectivamente, ambos apresentaram apenas quatro alelos. Os valores de
PIC e de PD observados na análise em P. notatum mostram alto poder discriminatório dos marcadores microssatélites.O
coeficiente de similaridade de Jaccard variou de 0,04 entre P. ionanthum e o acesso 1074 (acessos que apresentaram maior
divergência) e 1,0 entre inúmeros acessos de P. notatum. O coeficiente médio de similaridade foi de 0,32 mostrando a
grande divergência apresentada entre os acessos analisados.. Paspalum notatum apresenta grande variação morfológica e
em função disso, alguns autores propuseram categorias intra-específicas informais para a espécie. Formalmente há duas
variedades para espécie, as quais se diferenciam, principalmente, pelo número cromossômico, onde Paspalum notatum
var. saurae é diplóide (2n = 2x = 20) sexual e auto-incompátivel e Paspalum notatum var. notatum é autotetraplóide
(2n = 4x = 40) apomítico apospórico obrigatória ou facultativa. Os acessos diplóides e tetraplóides de P. notatum se
posicionaram em agrupamentos diferentes no dendrograma.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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Eficiência de índices de similaridade em
diversidade genética para dados moleculares
na presença de perdas de dados
Nascimento, M1; Campana, ACM1; Salgado, CC2, Ferreira, A2, Cruz, CD2
Laboratório de Bioinformática – BIOAGRO, Departamento de Informática – Área de Estatística, Universidade Federal de Viçosa
2
Laboratório de Bioinformática – BIOAGRO, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Correlação cofenética, agrupamento hierárquico, matriz de dissimilaridade
Os recentes avanços na biologia molecular abriram novas perspectivas para a pesquisa em conservação de espécies
e para os estudos de biologia populacional. Com a utilização de marcadores moleculares é possível a detecção da
variabilidade existente diretamente ao nível do DNA (Cruz, 2008). Estudos de diversidade podem atingir um grande
número de informação devido à disponibilidade de elevado número de marcas genéticas, que têm a vantagem de não
serem influenciadas pelo ambiente (Ferreira e Grattapaglia, 1998). Entretanto, na prática, um problema comum é a
perda de dados. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência de índices de similaridade em
diferentes níveis de dados perdidos. Foram avaliados os índices não ponderado, ponderado e d 2 de Smouse e Peakall
(d 2) utilizando-se marcadores de natureza co-dominantes multialélica. E o de distância binária de Sokal (DBS), Jaccard
e Dice para marcadores de natureza dominantes. Para a comparação utilizou-se o coeficiente de correlação cofenética
(CCC) e a significância entre estes, foi realizada através da estatística qui-quadrado. Foram simuladas quatro populações,
duas com estrutura genética definida e duas com estrutura genética não definida, sendo uma de natureza co-dominante
e outra de natureza dominante, em relação a estrutura das populações. Destas populações iniciais foram geradas as
populações com níveis de perdas de dados de 0 a 60 %. Considerando as populações de estrutura genética definida com a
utilização de marcadores co-dominante observou-se que os índices ponderado e não ponderado apresentaram diferenças
significativas a um nível de 5% de significância apenas quando o percentual de perdas excede 45%, já o índice d 2 não
apresentou diferenças significativas entre os CCC para os diferentes percentuais de perda. Ainda para as populações de
estrutura genética definida, quando se utilizou marcadores dominantes os índices DBS e Jaccard apresentaram diferenças
significativas em níveis de perdas que excedem 45% e o índice Dice não apresentou diferenças significativas. No caso
onde a população não tem estrutura genética definida com marcadores co-dominantes todos os índices apresentaram
diferenças significativas quando o percentual de perdas excede 30%. Para as populações sem estrutura genética definida
utilizando marcadores dominantes os índices de Jaccard e Dice apresentaram diferenças significativas com o percentual
de perdas acima 45%, e o índice DBS não apresentou diferença entre os CCC. A partir destes resultados percebe-se
que, para níveis de perdas inferiores a 30%, os índices se comportam de forma eficiente e equivalente.
Apoio Financeiro: FAPEMIG.
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Evidências da atuação de paleorios como
barreiras ao fluxo gênico na Planície
Costeira do RS
Mäder, G1; Lorenz-Lemke, AP1; Fregonezi, JN1; Stehmann, JR2; Salzano, FM1; Bonatto, SL3; Freitas; LB1
Dep. Genética, Instituto de Biociências, UFRGS – Porto Alegre, RS
Departamento de Botânica, Centro de Ciências Biológicas, UFMG, Belo Horizonte, MG
3
Centro de Biologia Genômica e Molecular, Faculdade de Biociências, PUCRS – Porto Alegre, RS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Calibrachoa heterophylla, Filogeografia, Conservação, Planície Costeira, Paleorios
O gênero Calibrachoa é exclusivamente Sul-americano, seus representantes não possuem mecanismos de dispersão a
longas distâncias nem qualquer estratégia de multiplicação vegetativa. C. heterophylla habita dunas e campos arenosos
ao longo da Planície Costeira (PC) do RS. Essa região pode ser considerada como uma área altamente dinâmica do
ponto de vista da geografia histórica com recentes oscilações climáticas. Na PC do RS, áreas que conservam a fisionomia
natural são cada vez mais raras e fragmentadas ameaçando muitas espécies vegetais e animais. O avanço das técnicas
moleculares tem possibilitado de maneira eficaz a interpretação de possíveis cenários evolutivos. Dados filogeográficos
permitem estabelecer uma estratégia que prioriza a conservação de grupos que incluam representantes da maior parte
da história evolutiva das espécies. Este trabalho tem como objetivo caracterizar, através de marcadores moleculares
plastidiais, a variabilidade genética da espécie C. heterophylla ao longo de toda sua distribuição geográfica, fornecendo
dados sobre sua evolução e filogeografia, associando-os à geologia da Planície Costeira. Foram amostrados 220 indivíduos
pertencentes a 13 populações. O DNA foi extraído a partir de folhas jovens usando CTAB. Foram analisadas as
seqüências dos espaçadores intergênicos plastidiais trnH-psbA, e trnS-trnG. Análises filogeográficas e populacionais
foram realizadas com a finalidade de avaliar a diversidade e padrões evolutivos de C. heterophylla. O alinhamento das
seqüências de trnH-psbA e trnS-trnG apresentou 1280 pb com 26 sítios polimórficos. Na network foi observada uma
consistente estruturação geográfica (ΦST =0,6524). Esta característica foi reforçada pela significante correlação, entre as
distâncias genética e geográfica, observada através dos testes de Mantel e Autocorrelação Espacial. A análise de possíveis
barreiras ao fluxo gênico, realizada através do programa Samova, indicou a existência de duas barreiras formando três
grupos de populações. Não foram encontradas evidências de expansão demográfica recente para o conjunto completo
de dados, entretanto, quando os testes de neutralidade foram calculados para os agrupamentos formados pelo Samova
isoladamente, dois deles parecem ter passado por um período de expansão recente. A restrita capacidade de dispersão
de sementes e, a herança materna dos cloroplastos, podem ser as prováveis razões para a baixa variabilidade genética
intrapopulacional encontrada. A alta diversidade observada entre alguns dos grupos dificilmente teria surgido, em sua
totalidade, já na PC, região geologicamente muito recente. Essa região deve ter sido colonizada através de diferentes
rotas ou em momentos diversos e não se uniram devido às barreiras biogeográficas encontradas no ambiente. Quando
se compara a localização das barreiras biogeográficas sugeridas pelo programa Samova com a geologia da PC, percebe-se
que essas barreiras sobrepõem-se a paleorios mapeados através de dados sísmicos por diversos autores. C. heterophylla
demonstrou ser altamente vulnerável pela crescente degradação do seu ambiente. Durante as coletas, muitas vezes não
foi possível encontrá-la em regiões onde no passado havia sido descrita.
Apoio financeiro: CNPq, PRONEX, PROTAX (MCT/CNPq/CAPES) FAPERGS, PROPESQ-UFRGS.
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Diversidade e estrutura genética de espécies
arbóreas com diferentes síndromes de
dispersão em fragmentos de mata atlântica
do município de Campinas, SP
Schwarcz, KD; Solferini, VN
Programa de pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Genética e evolução, Instituto de Biologia, Unicamp
[email protected]
Palavras-chave: fragmentação, genética de populações, mata atlântica, síndrome de dispersão de sementes, fluxo gênico
A floresta semidecídua é uma das principais formações vegetais da Mata Atlântica brasileira. Os efeitos da fragmentação
do habitat sobre populações de espécies arbóreas com diferentes síndromes de dispersão de sementes ainda são pouco
estudados em regiões tropicais e, particularmente, na floresta atlântica semidecídua brasileira. A substituição de grandes
áreas florestais por agricultura e ocupação urbana tornaram a Mata Atlântica um ambiente formado por diversos
fragmentos que correspondem à ilhas de vegetação. Este processo é relativamente recente no município de Campinas
(SP), onde a degradação era pouco intensa até o início do séc. XIX, e se estabilizou há cerca de cinqüenta anos. O
alto tempo médio de vida das árvores possibilita a coexistência de indivíduos gerados antes e depois do processo de
fragmentação, permitindo uma comparação entre as duas situações no mesmo local. O objetivo deste trabalho foi
investigar e comparar os efeitos da fragmentação do habitat em uma espécie arbórea com dispersão de sementes realizada
pelo vento e em uma espécie com dispersão de sementes por deiscência explosiva do fruto. O estudo foi conduzido em
dois fragmentos de Mata Atlântica semidecídua localizados na Área de Proteção Ambiental de Souzas e Joaquim Egídeo,
no município de Campinas (SP). As espécies escolhidas foram Metrodorea nigra, com dispersão explosiva de sementes; e
Astronium graveolens, com dispersão pelo vento. Foram coletados de 18 a 57 indivíduos jovens e adultos de cada espécie
em cada fragmento. A variabilidade genética foi estimada por eletroforese de 8 a 10 loci de isoenzimas. Foram realizadas
análises comparativas entre indivíduos jovens e adultos de cada fragmento e entre os fragmentos. Observou-se uma
redução na estruturação genética em ambas as espécies após a fragmentação. A diversidade genética foi estatísticamente
igual entre jovens e adultos nas duas espécies. Em M. nigra, a heterozigosidade observada e o coeficiente de endogamia
foram semelhantes entre jovens e adultos. Em A. Graveolens, a heterozigosidade observada foi maior nos, que também
apresentaram menor coeficiente de endogamia. Os dados sugerem que a fragmentação, com a substituição de vegetação
nativa por pasto e agricultura, pode resultar na redução no coeficiente de endogamia e na estruturação genética de
espécies dispersas pelo vento. As conseqüências da fragmentação ambiental devem ser estudadas levando-se em conta
as características biológicas de cada espécie e suas interações com a matriz circundante.
Apoio: CAPES e FAPESP.
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Estudo filogenético das jabuticabas
(Myrciaria sensu lato – Myrtaceae) e grupos
afins por meio do marcador nuclear ITS
de Sousa, C1; Collevatti, RG1; Gonçalves, EG1
Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília
[email protected]
1
Palavras-chave: Jabuticaba, Myrciaria, Plinia, ITS, parsimônia
As jabuticabeiras são usualmente referidas ao genêro Neotropical Myrciaria O.Berg, amplamente distribuído desde o
México até o Uruguai. O gênero enfrenta sérios problemas de circunscrição, envolvendo Paramyrciaria Kausel e Plinia
L., não havendo consenso entre autores recentes sobre seu posicionamento. Os tradicionais frutos comestíveis são
comuns ao grupo e potencialmente promissores por apresentarem alta qualidade nutricional e indivíduos altamente
produtivos. Além das jabuticabas (M. cauliflora, M. jaboticaba, etc.), outros frutos promissores como o camu-camu
(M. dubia), riquíssimo em ácido ascórbico ocorrem neste complexo. Apesar disso, seu plantio em escala comercial
ainda é inexpressivo e depende da domesticação através de programas de melhoramento genético e desenvolvimento de
cultivares mais regulares e produtivos. Tais programas são hoje inviáveis pela falta de conhecimento sistemático sobre
o complexo. Considerando que o centro de diversidade das jabuticabeiras é o Brasil, é importante que os grupos aqui
encontrados sejam devidamente avaliados. O presente trabalho visa propor uma hipótese filogenética para o complexo
Myrciaria sensu lato utilizando a região conservada ITS do DNA nuclear. Amostras de folhas pertencentes aos gêneros
Myrciaria, Paramyrciaria e Plinia, além dos grupos externos Calyptranthes Sw. Gomidesia O. Berg e Marlierea Cambess.
e Eugenia L., totalizando 86 espécies foram obtidas através de coletas no campo ou doadas por colecionadores e
conservadas em gel de sílica. Seqüências de DNA da região do ITS obtidas destas amostras foram alinhadas e analisadas
pelo critério de parsimônia. Nossos resultados indicam que as Myrciaria s.l. encontram-se principalmente divididas em
dois clados: um clado contendo as espécies com cotilédones soldados (Myrciaria stricto senso) e um clado contendo
as jabuticabeiras tradicionais e que também inclui espécies amostradas de Plinia (com exceção de P. rivularis (Camb.)
Rotman, que saiu fora de ambos os clados). Apesar da espécie tipo do gênero Plinia (P. pinnata L.) ainda não tenha
sido amostrada, nossos dados apontam para a possível utilização desta denominação genérica para as jabuticabeiras.
Embora outros marcadores (incluindo marcadores plastidiais) devam ser incluídos em novas análises, acreditamos que
o presente trabalho auxilie na elucidação da identidade genérica de um dos frutos mais brasileiros.
Apoio financeiro: CNPq e Instituto Plantarum de Estudos da Flora Ltda.
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Estrutura filogeografica da arbórea de
florestas neotropicais Hymenaea courbaril
(Fabaceae: Caesalpinioideae) e sua relação
com a espécie vicariante H. stigonocarpa,
endêmica do cerrado
Ramos, ACS; Lemos-Filho, JP; Ribeiro, RA; Lovato, MB
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: Cerrado, cpDNA, Filogeografia, Leguminosae, Mata Atlântica,
Hymenaea courbaril, Hymenaea stigonocarpa, psbC/trnS
Muito tem sido debatido a respeito da origem, evolução e divergências históricas entre os biomas brasileiros. Certamente,
informações relevantes a esse respeito podem ser obtidas a partir do conhecimento de aspectos evolutivos e ecológicos
de espécies congenéricas que ocorrem em diferentes biomas. Várias dessas espécies congenéricas foram listadas como
sendo vicariantes, próximas filogeneticamente e em muitos casos de difícil distinção em material herborizado. Neste
estudo foram investigadas a diversidade genética e a estrutura filogeográfica de duas espécies vicariantes provenientes
de diferentes biomas, Hymenaea courbaril da Mata Atlântica e de matas de galeria do bioma Cerrado e Hymenaea
stigonocarpa espécie endêmica do Cerrado, através da análise de uma sequência de DNA de cloroplasto (cpDNA) não
codificante (psbC-trnS). Foram avaliados 175 indivíduos de 17 populações de H. stigonocarpa e 149 indivíduos de
15 populações de H. courbaril localizadas em seis diferentes estados brasileiros (MG, SP, GO, ES, BA, TO) e no Distrito
Federal. Em H. stigonocarpa, 23 haplótipos foram identificados e o nível de diferenciação genética entre populações
foi relativamente alto (FST = 0,692). As análises filogeográficas mostraram a divisão dessas populações em três grupos
geograficamente distintos e esses resultados foram corroborados pelo programa SAMOVA que indicou que a maior parte
da diversidade genética encontrada (58,8%) foi atribuída à divergência entre os três grupos, com baixa diferenciação
entre populações dentro de grupos (FSC = 0.252). Em H. courbaril foram identificados 18 haplótipos, sendo que os
três mais freqüentes em H. stigonocarpa foram também encontrados em H. courbaril. Esta espécie também mostrou
uma estruturação geográfica em três grupos. A AMOVA indicou que apenas 10,5% da variação genética total se deve
a diferença entre as espécies, com a maior parte da variação sendo atribuída à diferenciação entre populações dentro de
espécies. A estrutura filogeográfica similar destas duas espécies de Hymenaea sugere que elas sofreram os mesmos impactos
das mudanças climáticas do Quaternário. As análises filogeográficas sugerem a extinção de populações de H. courbaril
e de H. stigonocarpa na parte sul da área amostrada durante o último glacial máximo. Depois do restabelecimento
do clima, as partes ao sul devem ter sido re-colonizadas por linhagens de populações situadas no norte e leste da área
amostrada. Os dados filogeográficos suportam a hipótese de eventos passados de hibridização entre as duas espécies de
Hymenaea ou a presença de polimorfismo ancestral.
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Desenvolvimento e caracterização de
bibliotecas enriquecidas em microssatélites
em Hypochaeris angustifolia (Asteraceae)
Rodrigues, LA1; Ruas, CF1; Reck, M1; Ruas, PM1; Ruas, EA2; Ortiz, MA3; Talavera, S3; Stuessy, T4; Tremetsberger, K4;
Nakayama, TJ1; Conson, ARO1; Benício, LM1
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina
2
Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de Londrina
3
Departamento de Biología Vegetal y Ecología, Universidad de Sevilla, Espanha
4
Department of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, University of Vienna, Austria
[email protected]
1
Palavras-chave: Hypochaeris angustifolia, Asteraceae, SSR, Biblioteca, Hibridização
O gênero Hypochaeris (Asteracae) apresenta cerca de 60 espécies com dois centros principais de distribuição geográfica,
a região do Mediterrâneo e da América do Sul. Estudos apontam que o Mediterrâneo é o centro primário de dispersão,
enquanto a América do Sul corresponde ao centro de diversificação do gênero. Hypochaeris angustifolia é uma espécie
endêmica do Marrocos sendo considerada como a suposta espécie ancestral do todo o grupo sulamericano. Os marcadores
moleculares microssatélites (SSR ou Sequências Simples Repetitivas), são abundantes e uniformemente distribuídos por
todo o genoma, cuja variabilidade alélica permite a realização de estudos sobre a variabilidade genética de populações
de plantas. Neste trabalho foram identificadas sequências de DNA contendo SSRs, a partir do desenvolvimento de
bibliotecas enriquecidas em microssatélites tendo como base o método de hibridização e captura. Foram utilizados
oligos (CT)8 e (GT)8 marcados com biotina no passo de enriquecimento, sendo os fragmentos capturados com
streptavidina. De 120 clones sequenciados cerca de 30 (25%) apresentaram microssatélites e foram analisadas com o
auxílio do programa Gramene. Destes somente nove foram apropriados para o desenvolvimento de primers e sete foram
testados para amplificação. Foram amostrados DNA de 36 indivíduos de cinco populações de Hypochaeris angustifolia,
provenientes da região do Marrocos, sendo três populações da região do Médio Atlas (Larais, Bekrite e Boumia) e duas
da região do Alto Atlas (Jbel Azourki e Oukaimeden). Os sete locos analisados apresentaram um PIC que variou entre
0 a 0,726 e apenas um desses apresentou uma heterozigozidade observada que se desviou do equilíbrio Hardy–Weinberg.
Novos screenings estão sendo realizados para identificações de outros locos de SSR e construção de primers em
H. angustifolia. Esses marcadores poderão auxiliar na compreensão da estrutura genética desta espécie.
Apoio Financeiro: CAPES, Fundacion BBVA (BIOCON 04 to Salvador Talavera).
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Análise genética de populações de
H. catharinensis (Asteracea) utilizando
a técnica de AFLP simplificado
Reck, M1; Ruas, CF1; Rodrigues, LA1; Ruas, PM1; Ruas, EA2; Ortiz, MA3; Talavera, S3; Stuessy, T4; Tremetsberger, K4;
Nakayama, TJ1; Conson, ARO1; Benício, LM1
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina
2
Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de Londrina
3
Departamento de Biología Vegetal y Ecología, Universidad de Sevilla, Espanha
4
Department of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, University of Vienna, Austria
[email protected]
1
Palavras-chave: Hypochaeris catharinensis, AFLP, Estrutura de populações, Asteraceae, Marcadores
O gênero Hypochaeris (Asteraceae) apresenta cerca de 60 espécies distribuídas de forma mais intensa na região
do Mediterrâneo e na América do Sul que é apontada como centro de diversificação do gênero. Entre as espécies
sulamericanas de Hypochaeris, H. catharinensis, ainda pouca estudada, é uma planta herbácea endêmica da região sul do
Brasil, com uma maior concentração nos estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina. Os marcadores moleculares
representam uma ferramenta muito importante nos estudos sobre estrutura genética de populações. Entre os marcadores
moleculares, o AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorfism) tem sido amplamente utilizado para estudos genéticos
tanto em plantas como em animais. Neste trabalho foi utilizada a técnica de AFLP simplificada, para a análise genética
de duas populações de H. catharinensis (Rancho Queimado e Angelina, SC), com o objetivo de determinar a eficiência
do método, para sua aplicação em um estudo amplo de populações nesta espécie. A técnica do AFLP simplificado
consistiu na restrição do DNA com a enzima PstI, seguido de duas reações de PCR (pré-seletivo e seletivo). O produto
da amplificação seletiva foi separado em gel de agarose 1,3%. Neste estudo foram utilizadas amostras de 28 plantas de
cada uma das duas populações. Foram obtidos 65 marcadores de AFLP, sendo 42 (64,62%) polimórficos. A análise de
variância molecular (AMOVA) mostrou uma variabilidade genética entre populações de 31,24%, com um Fst de 0,3124.
Os resultados da AMOVA foram confirmados pela distribuição tridimensional das amostras, conforme observado pela
análise da coordenada principal. Esta análise mostra a separação das duas populações, porém, verifica-se que alguns
indivíduos aparecem misturados entre as populações. Estes resultados mostram que a técnica de AFLP simplificado
pode ser aplicado com eficiência no estudo proposto, porém, mais marcadores são necessários para definir a estrutura
genética das populações de H. catharinensis.
Apoio Financeiro: CAPES, Fundacion BBVA (BIOCON 04 to Salvador Talavera).
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Diversidade genética em pimentas Capsicum
spp. da coleção de germoplasma da UFPI
Silva, VB1; Sousa, THP5; Monteiro, ER2; Gomes, RLF3; Lopes, ACA4; de Melo, LF5
Ciências Biológicas, Universidade Federal do Piauí UFPI
2
Mestrado em Agronomia, UFPI
3
Departamento de Fitotecnia, UFPI
4
Departamento de Biologia, UFPI
5
Engenharia Agronômica UFPI
[email protected]
1
Palavras-chave: Descritores multicategóricos, caracteres morfológicos, dissimilaridade, recursos genéticos, melhoramento genético
O estudo de divergência genética é uma ferramenta útil e efetiva para diferenciação de acessos em bancos de germoplasma
e identificação de genitores adequados para geração de populações segregantes e obtenção de híbridos, com maior efeito
heterótico. Assim, objetivou-se estudar a dissimilaridade genética entre 23 sub-amostras de pimentas Capsicum spp. da
Coleção de Germoplasma da Universidade Federal do Piauí, previamente identificadas. O experimento foi conduzido
no delineamento em blocos casualizados, com três repetições. Cada parcela foi constituída por sete plantas, espaçadas de
1,0 m entre linhas e 0,80 m entre planta. O estudo da dissimilaridade entre as sub-amostras de Capsicum spp. foi feito
por meio da avaliação de 19 descritores qualitativos multicategóricos, analisados por meio do método de otimização de
Tocher, com base no índice de similaridade. Foram utilizados descritores relacionados à: 1) plântula - cor do hipocótilo,
pubescência do hipocótilo, cor da folha do cotilédone, forma da folha do cotilédone; 2) planta - cor do caule, posição
da flor, cor da corola, cor da mancha da corola, cor das anteras, hábito de crescimento, cor da folha, forma da folha;
3) fruto - cor do fruto em estado intermediário; cor do fruto em estado maduro; forma do fruto; constrição anelar do
cálice; margem do cálice; pescoço na base do fruto e tipo de epiderme. O método de otimização de Tocher permitiu a
formação de oito grupos distintos: Grupo I (78% de similaridade); Grupo II (82% de similaridade); Grupo III (72%
de similaridade); Grupo IV (79% de similaridade), Grupo V (67% de similaridade) e os Grupos VI, VII e VIII, com
apenas um única sub-amostra. As sub-amostras foram reunidas conforme a espécie botânica. O grupo I foi formado pelas
sub-amostras da espécie Capsicum frutescens L. Os grupos II, III, VI, VII e VIII foram compostos por sub-amostras de
Capsicum chinense Jacq. No grupo IV ficaram as sub-amostras de Capsicum annuum L e no V, as de Capsicum baccatum
L. Observou-se, portanto que houve maior diversidade entre as sub-amostras de Capsicum chinense, uma vez que elas
foram alocadas em cinco diferentes grupos. As espécies Capsicum chinense e Capsicum baccatum, divergiram em 77%
dos descritores estudados, sendo portanto, as de maior distância genética.
Orgão financiador: CNPq.
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Association of RAPD markers with climatic
and geographical variables in argentinean
populations of Acacia caven
(Fabaceae, Mimosoideae)
Pometti, C1; Vilardi, JC2; Hernández, DE1; Saidman, BO1
GEEL, EGE, FCEN. Universidad de Buenos Aires
2
GPA, EGE, FCEN. Universidad de Buenos Aires
[email protected]
1
Keywords: Acacia caven, varieties, RAPD, climatic variables, geographic variables
The genus Acacia (Leguminosae, Mimosoideae) includes more than 1450 species of pantropical distribution. In Argentina
the genus is represented by 21 species, distributed mainly in northern and central regions. One of the most widely
distributed species of Acacia in South America is A. caven, present in six countries. This species exhibits important
morphological variation and Aronson in 1992 differentiated a total of six varieties on the basis of fruit traits. Studies
on genetic variability of this species are relatively scarce and there is no data on genetic differentiation among varieties.
In this study, we used RAPD markers to study the distribution of genetic variability within and among 11 populations
of three varieties of A. caven (A. c. caven, A. c. macrocarpa, and A. c. dehiscens) involving the main distribution area
of this species in Argentina. We investigated the association of the estimated genetic variation with climatic and
geographical variables. Five arbitrary primers were chosen for this analysis. A total of 47 variable bands were detected.
Population structure was analyzed using programs AFLPSURV and Arlequin. Total heterozygosity was high (Ht= 0.38)
and variability within (Hw= 0.26) was higher than variability among populations (Hb= 0.12). Differentiation among
all populations (FST= 0.41) and among populations within varities (FSC= 0.02) were highly significant (P= 0) whereas
differentiation among varieties was non significant (FCT= 0.02; P= 0.26) RAPD data were also analyzed by means of
discriminant and canonical analysis (DA & CA). The DA allows classifying individuals in the corresponding population
with 100% coincidence between observed and expected classification. Possible associations between RAPD frequencies
and climatic (annual mean temperature, annual mean precipitation, annual mean potential evapotranspiration,
annual mean water vapor pressure, annual mean wind speed, and annual mean sun hours) and geographic (atitude,
longitude, and altitude) variables was evaluated using a general linear model for a binomial response variable using
R program. The results indicated RAPD dependency on physical variables. Thirty-nine (out of 47) loci showed significant
or highly significant association with at least one of the variables considered: thirty three loci were associated with
geographic variables and twenty four with climatic variables. Our results indicate that RAPD patterns do not reflect
genetic differences among the three varieties studied of A. caven but they are strongly associated with environmental
differences among populations.
Orgão financiador: ANPCYT.
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Divergência genética entre espécies do
gênero Capsicum
Sousa, THP1; Monteiro, ER2; Gomes, RLF3; Lopes, ACA4; Valente, SES4; Melo, LF1; Silva, VB5; Santos, JO2
Engenharia Agronômica, Universidade Federal do Piauí (UFPI)
2
Mestrado em Agronomia, UFPI
3
Departamento de Fitotecnia, UFPI
4
Departamento de Biologia, UFPI
5
Ciências Biológicas, UFPI
[email protected]
1
Palavras-chave: Descritores quantitativos, dissimilaridade, banco de germoplasma,
métodos de agrupamento, melhoramento genético
A determinação da divergência genética existente em Bancos de Germoplasma é importante na identificação de genitores
com potencial para serem utilizados em programas de melhoramento. Assim, objetivou-se analisar a divergência genética
entre 23 sub-amostras de Capsicum spp. do Banco Ativo de Germoplasma da Universidade Federal do Piauí (UFPI),
em experimento conduzido no Departamento de Fitotecnia da UFPI, em Teresina, PI, utilizando-se o delineamento
em blocos ao acaso, com três repetições. A divergência genética entre as sub-amostras foi determinada com base em
caracteres quantitativos de frutos: comprimento, largura e peso, espessura da polpa e número de sementes, avaliados
em cinco plantas da parcela. Utilizou-se os métodos de agrupamento de Tocher e hierárquico UPGMA (Unweighted
Pair Group Method with Arithmetic Mean), e a distância de Mahalanobis, como medida de dissimilaridade. Pelo
Método de Tocher foram formados oito grupos: grupo I, composto por sete sub-amostras de Capsicum chinense
(BGC 6, 22, 55, 14, 15, 31), uma de Capsicum baccatum var. pendulum (BGC 41) e uma de Capsicum annuum var.
annuum (BGC 39); grupo II, com quatro sub-amostras de Capsicum frutescens (BGC 10, BGC 37, BGC 1, BGC 68) e
três de Capsicum chinense (BGC 3, BGC 8, BGC 52); grupo III, constituído por duas sub-amostras de Capsicum frutescens
(BGC 2 e BGC 58); grupo IV, por duas de Capsicum chinense (BGC 42 e BGC 47); e nos grupos V, VI, VII e VIII constaram
as sub-amostras BGC 43 (Capsicum baccatum var. pendulum), BGC 48 (Capsicum chinense), BGC 32 (Capsicum baccatum
var. Pendulum) e BGC 40 (Capsicum annuum var. annuum), respectivamente. A maior divergência foi observada entre os
grupos IV e VIII e a menor entre I e V. Pelo método hierárquico UPGMA, formaram-se cinco grupos, considerando-se
o corte a uma distância genética de aproximadamente 32%. O grupo I, composto por sete sub-amostras de Capsicum
chinense (BGC 6, BGC 22, BGC 55, BGC 14, BGC 15, BGC 47, BGC 48), uma de Capsicum annuum var. annuum
(BGC 39) e uma de Capsicum baccatum var. pendulum (BGC 43); o grupo II, contendo as sub-amostras BGC 32 e
BGC 41 (Capsicum baccatum var. Pendulum); e o grupo III, com seis sub-amostras de Capsicum frutescens
(BGC 2, BGC 58, BGC 10, BGC 37, BGC 1, BGC 68) e quatro de Capsicum chinense (BGC 3, BGC 31, BGC 8,
BGC 52). Os grupos IV (BGC 40) e V (BGC 42), foram idênticos aos grupos VIII e IV formados pelo método de
Tocher, demonstrando concordância parcial entre os dois métodos. As sub-amostras da Coleção de Germoplasma da
UFPI são divergentes para a maioria dos descritores avaliados, apresentando frutos com variabilidade de formatos e
tamanhos.
Orgão financiador: CNPq.
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Filogeografia molecular de poaia (Psychotria
ipecacuanha) baseada na seqüência
nucleotídica da região espaçadora interna
transcrita do DNA ribossomal nuclear
Batista, FRC; Oliveira, LO
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular - BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa, MG
[email protected]
Palavras-chave: Psychotria ipecacuanha; internal transcribed spacer; Filogeografia; evolução molecular
Poaia (Psychotria ipecacuanha) é uma espécie medicinal que ocupa uma posição de destaque na medicina popular
brasileira. Atualmente, a exploração descuidada e o desmatamento levaram a um severo declínio demográfico da
população natural. Os resquícios de populações ocorrem em três áreas claramente definidas: 1- América Central e
região noroeste da América do Sul; 2- Região sudoeste da Amazônia Brasileira; 3- Floresta Atlântica, ao longo da costa
brasileira. Nós usamos dados de sequências do genoma nuclear para desenvolver um estudo de filogeografia molecular
da poaia abrangendo as regiões de distribuição da espécie. A região espaçadora interna transcrita (ITS) de 155 indivíduos
pertencentes a 11 populações (cinco delas da Amazônia, cinco da Floresta Atlântica e uma da América Central) foi
analisada a partir de reações de PCR que foram posteriormente seqüenciadas. As seqüências obtidas revelaram que as
populações da Floresta Atlântica apresentam maior diversidade genética. Muitos indivíduos dessa região apresentaram
variação intraespecifica de ITS, enquanto as populações na Amazônia e América Central apresentaram ribótipos únicos.
Uma rede de ribótipos foi obtida, tendo os ribótipos com origem na Floresta Atlântica ocupando a posição central e
conectando os ribótipos da Amazônia e América Central. Os dados moleculares favorecem a hipótese de que a região
da Floresta Atlântica abriga as populações ancestrais, a partir das quais derivaram as populações das outras duas regiões.
A análise das regiões conservadas e das estruturas secundárias da região ITS auxiliaram no entendimento da história
evolutiva da poaia em regiões disjuntas.
Apoio financeiro: Fapemig.
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Estrutura genética entre populações de
Tibouchina papyrus utilizando
a técnica PCR-RFLP
Melo, DB; Telles, MPC; Soares, TN; Gondin, SGCA
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Católica de Goiás
[email protected]
Palavras-chave: CAPS, conservação, diversidade genética, pau-papel, enzima de restrição
Tibouchina papyrus é uma planta endêmica do Cerrado que possui distribuição restrita aos campos rupestres das serras
goianas. A espécie é ornamental, apresenta a casca do tronco escamado em lâminas finíssimas, parecendo papel de
seda, por esse motivo, é denominada comumente de “pau-papel”. O objetivo deste trabalho foi avaliar a estrutura
genética de três populações situadas no Parque Estadual da Serra Dourada com base no polimorfismo de um gene
organelar utilizando a estratégia PRC-RFLP (ou CAPS). Este método se baseia na amplificação de fragmentos de DNA
amplificados via PCR, utilizando-se primers específicos, seguido da digestão com enzima de restrição, com a finalidade
de gerar polimorfismo em regiões conservadas. Foram utilizadas as folhas de 165 indivíduos para extração do DNA.
Posteriormente, o DNA foi quantificado e diluído para as reações de amplificação. Foi utilizado um primer de um
gene cloroplastidial (Trn) para a amplificação de fragmentos de DNA via PCR e essas amostras foram submetidas á
um gel de agarose 1,5 % para a confirmação da amplificação e, posteriormente, foram submetidas a uma reação de
clivagem com a enzima de restrição Eco RV. Os fragmentos da clivagem foram submetidos a um novo gel de agarose
1,5 % e corados com Cyber Gold, a partir da codificação desses géis foi gerada uma matriz de dados que foi analisada
no programa TFPGA. Obtiveram-se oito alelos, sendo que o mais freqüente foi o 1600 pb (0,45). Os valores médios
de diversidade genética nas populações variaram entre 0,50 e 0,75. A estimativa de estrutura genética populacional
revelou um valor de thetap igual a 0,35. De acordo com as distâncias genéticas de Nei 1972 as maiores distâncias foram
encontradas entre as populações SD1 e SD3 (2,36) e as menores entre SD2 e SD3 (0,08). Os resultados mostraram que
este loco, apesar de ser de uma região conservada do genoma organelar, possui altos níveis de diversidade genética, o
que possibilita a estimativa eficiente da estruturação da variabilidade genética nas populações de T. papyrus. Embora as
populações sejam relativamente próximas geográficamente o valor de estrutura genética foi alto, o que era de se esperar
em função da região do genoma utilizada neste estudo. O perfil das distâncias genéticas observado revela a formação
de dois grupos distintos compostos pelas populações SD2 e SD3 e outro pela SD1. Isto sugere que as populações
SD2 e SD3 têm a mesma origem, se comportando como uma única população do ponto de vista evolutivo.
Apoio financeiro: PROPE/UCG e CNPq (Proc. 471492/2007-8).
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Ampliação da variabilidade genética de
genes relacionados a produção em arroz
por meio da metodologia de AB-QTLs em
cruzamento Oryza sativa x O. glumaepatula
Melo, ATO1,2; Rangel, PN1; Brondani, C1; Rangel, PHN1; Brondani, RPV1; Mendonça, JA1,2
Embrapa Arroz e Feijão, Goiânia; 2Universidade Federal de Goiás, Goiânia
[email protected]
1
Palavras-chave: Cruzamento interespecífico; melhoramento genético; marcadores SSR; recursos genéticos
Os ganhos genéticos para produção em arroz estão estagnados em 1% ao ano nos programas de melhoramento de arroz
no mundo todo. A principal causa apontada é a redução da variabilidade genética para genes relacionados à produção.
Este trabalho objetivou identificar genes e alelos com potencial de aumento da produção em arroz oriundos da espécie
silvestre nativa do Brasil Oryza glumaepatula. Utilizando a metodologia de AB-QTLs, foram obtidas 112 linhagens
RC2F9 derivadas do cruzamento O. sativa Cica-8 x O. glumaepatula RS-16, avaliadas para produção em experimento
em lattice. Um total de 88 marcadores SSR fluorescentes foram testados para a presença de polimorfismo entre os
genitores. Destes, 65 (74%) apresentaram polimorfismo e foram organizados em multiplexes, distribuídos de acordo
com a cor da fluorescência e a amplitude de tamanho dos fragmentos. Os produtos amplificados foram visualizados
em analisador automático de DNA ABI 3100. A análise de variância e a comparação das médias de produção foram
realizadas pelo programa Genes. As proporções de introgressão do genoma de O. glumaepatula e os genótipos gráficos
foram obtidos pelo software CSSL Finder e a análise de QTL foi feita pelo software QGene versão 2.30 utilizando
o método de regressão por marca simples. Os 65 marcadores foram distribuídos nos 12 cromossomos do arroz, com
média de 5,4 marcadores por cromossomo. A média de introgressão de alelos silvestres foi de 14,2%, variando de 7,7%
a 24,6%, e o número de fragmentos cromossômicos de O. glumaepatula de um (linhagem 64) a 13 (linhagem 60).
O teste de comparação de médias mostrou que nenhuma linhagem apresentou produção estatisticamente superior à
cultivar Cica-8 e que a linhagem mais produtiva foi a 65, com média de 8.400 kg/ha. A análise de QTL identificou
dois marcadores associados à produção nos cromossomos 5 (RM267) e 6 (RM30), apresentando efeitos positivos dos
alelos de Cica-8 e RS-16, respectivamente. Esses marcadores já tinham sido anteriormente associados à produção nas
linhagens de introgressão provenientes do cruzamento interespecífico O. sativa BG90-2 x O. glumaepatula RS-16,
havendo forte indicativo da presença de genes e alelos silvestres relacionados a produção que podem ser identificados
a partir de mapeamento fino de QTLs nas regiões genômicas adjacentes aos dois SSRs. A linhagem mais produtiva
(65) apresentou média de introgressão de 7,09% e alelo de Cica-8 para o marcador RM267 e de RS-16 para o marcador
RM30, corroborando a contribuição positiva desses alelos para a produção. Esta linhagem foi indicada como genitora
para o programa de melhoramento do arroz e para o cruzamento com Cica-8, objetivando o mapeamento fino de
QTL na região do marcador RM30, para a identificação do gene ou fator de transcrição oriundo de O. glumaepatula,
a partir do qual será desenvolvido marcador específico para seleção assistida.
Orgão financiador: CNPq.
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Polimorfismo de populações de pequi com
e sem espinho no mesocarpo
Londe, LN1; Taveira, GF3; Vieira, CU2; Kerr, WE1; Bonetti, AM1
Universidade Federal de Uberlândia - Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Campus Umuarama, Bloco 2E sala 33
CEP 38400-902 Uberlândia, MG, Brasil. Telefone (55 34) 3218-2203 ramal.25, (55 34) 9162-0301, Fax: (55 34) 3218-2203 ramal 24
2
Universidade Federal do Triângulo, Departamento de Clínica Médica Rua Frei Paulino 30 Abadia
38025-180 - Uberaba, MG – Brasil
3
Universidade Federal de Uberlândia- Graduação em Ciências Biológicas
[email protected]
1
Palavras-chave: Caryocar brasiliense, marcador molecular, pequi, espinho, RAPD
O pequi, Caryocar brasiliense, é uma das espécies de destaque no bioma do Cerrado devido a sua utilização na culinária,
medicina popular, indústria e siderurgia. Apresenta índice de exploração elevado podendo entrar na lista das espécies
ameaçadas à extinção. A exploração do pequizeiro fundamenta-se na coleta de frutos, o que caracteriza uma ação extrativista
e como a tendência tem sido o crescimento da quantidade extraída, pode-se especular sobre sua possível extinção no
futuro (Pozo, 1997). A região do pequi ocupa quase 2000 municípios e estima-se em cerca de 40000 coletores para
vender os frutos ou os “caroços” aos compradores ou atravessadores. As pequenas farmácias e curandeiros das vilas e
cidades dessas regiões são procurados por aproximadamente 3000 pessoas para retirarem os espinhos deixados pelos
caroços no “céu da boca” de comedores descuidados. Essa característica é o principal defeito que elimina o pequi de ser
cultivado em casa e de ser considerado uma fruta de mercado (Gribel, 1993; Kerr, 2007). Na cidade de São José do Xingu,
Kerr et al.(2007) encontraram, interessantemente, uma planta com caroços (mesocarpo) sem espinhos, produzindo,
aproximadamente 500 frutos em 2004 e apenas 30 em 2005, sendo os “caroços” carnudos, um pouco mais doces que
os comuns e muito melhores por não possuírem espinho. Isso possibilita melhorar o pequi não somente para consumo
aproveitando a alta apreciação que já possui. Para detectar as diferenças genômicas existentes entre o pequi com e o
sem espinho no mesocarpo, utilizou-se marcadores RADP. Os polimorfismos gerados foram clonados e seqüenciados
a fim de identificar as seqüências responsáveis pela alteração fenotípica. Observou-se, que o pequi sem espinho fica
isolado geneticamente das demais populações de pequi com espinho no mesocarpo, no entanto essa característica
não está relacionada à divergência genética da espécie. Análises em BLASTn evidenciaram a similaridade aos genes
Dof1 de Zea mays, na população com espinho, e na população sem espinho, com o gene da acetiltransferase fosfinotricina de
Z. mays. Nas análise de BLASTx foi verificada a similaridade com as proteínas responsáveis pela deficiência em redutase
férrica 4, no pequi sem espinho e catalase, no pequi sem espinho.
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Evolução e desenvolvimento de gavinhas em
bignonieae (Bignoniaceae)
Sousa-Baena, MS; Lohmann, LG
Instituto de Biociências, Departamento de Botânica, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: desenvolvimento, folhas compostas, gavinhas, reconstrução de estados ancestrais de caráter
As folhas de Bignonieae são opostas, compostas e apresentam folíolos terminais modificados em gavinhas. Apresentam
alta variação morfológica, com folhas 2-3-folioladas, biternadas ou biternado-pinadas, e gavinhas com a porção terminal
indivisa ou dividida de maneira trífida ou multífida. Os diferentes tipos de gavinhas evoluíram múltiplas vezes em
Bignonieae, entretanto não está claro qual é o tipo ancestral de gavinha na tribo. Os objetivos deste estudo são investigar
o padrão evolutivo das gavinhas em Bignonieae e analisar a morfogênese de folhas visando um melhor entendimento de
como mudanças ontogenéticas geraram diferentes tipos de gavinhas. A filogenia molecular reconstruída por Lohmann
(2006) foi usada como base para o mapeamento do caráter “tipo de gavinha”, utilizando os princípios da parcimônia,
verossimilhança e bayesiano. Para os estudos ontogenéticos, foram utilizados ápices caulinares de três espécies com
gavinhas trífidas (Tanaecium pyramidatum, Mansoa difficilis e Dolichandra unguis-cati) e uma espécie com gavinha simples
(Bignonia prieurei). Os ápices foram examinados utilizando microscopia eletrônica de varredura e métodos usuais em
anatomia vegetal. As reconstruções dos estados ancestrais do caráter “tipo de gavinha” sugerem que as gavinhas trífidas
de T. pyramidatum originaram-se a partir de um ancestral com gavinhas simples, enquanto as gavinhas de M. difficilis
e D. unguis-cati derivaram de ancestrais com gavinhas trífidas. Resultados provenientes dos estudos ontogenéticos
corroboram estas reconstruções, indicando que as gavinhas de T. pyramidatum tornam-se trífidas apenas em estágios
avançados de desenvolvimento, apresentando os ramos secundários das gavinhas bem menores que o ramo primário.
Por outro lado, no caso de M. difficilis e D. unguis-cati, as gavinhas tornam-se trífidas cedo no desenvolvimento e os
ramos secundários apresentam-se mais proporcionais ao primário. É possível que o atraso no desenvolvimento dos
ramos secundários de T. pyramidatum represente resquícios do programa de desenvolvimento do ancestral desta espécie.
As reconstruções de caracteres ancestrais indicam ainda que B. prieurei (gavinhas simples), se originou a partir de um
ancestral com gavinhas trífidas. Estudos anatômicos indicam que as gavinhas de B. prieurei apresentam um tecido mais
compacto, com células menores, posicionado na região adaxial, onde se formam os ramos secundários das gavinhas
em espécies com gavinhas trífidas. Este tecido provavelmente representa resquícios do programa de desenvolvimento
do ancestral desta espécie. As modificações estruturais e temporais de desenvolvimento dos ramos secundários das
gavinhas trífidas estão provavelmente relacionadas a mudanças no padrão de expressão dos genes KNOX1 e/ou LEAFY.
Estes genes se expressam durante a formação das pinas em folhas compostas, e podem também estar relacionados à
formação das gavinhas. Desta forma, é possível que estes genes tornem-se ativos mais tardiamente na ontogênese de T.
pyramidatum que nas demais espécies com gavinhas trífidas. É possível ainda que estes genes atuem na proliferação do
tecido da porção adaxial da gavinha de B. prieurei.
Apoio financeiro: CNPq.
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Filogeografia e conservação de populações
naturais de annona crassiflora
do estado de Goiás
Blanco, AJV1; Pereira, MF1; Ciampi, AY2; Chaves, LJ3; Coelho, ASG1
Laboratório de Genética Vegetal - Departamento de Biologia Geral – ICB-UFG
2
EMBRAPA – CENARGEN
3
Escola de Agronomia – UFG
[email protected]
1
Palavras-chave: Filogeografia, cpDNA, Annona crassiflora
O Araticunzeiro (Annona crassiflora Mart.) é uma espécie de árvore frutífera nativa do bioma Cerrado com elevado
potencial de utilização econômica. A forte degradação desse bioma, aliada ao extrativismo predatório a que a espécie vem
sendo submetida, justifica a necessidade de desenvolvimento de pesquisas que subsidiem a sua conservação e manejo.
Objetivando obter informações que orientem ações futuras para manejo, conservação e melhoramento da espécie,
79 indivíduos provenientes de 11 populações naturais localizadas no estado de Goiás foram analisados geneticamente.
A amplificação da região trn-L (RNA Transportador da Leucina) do cpDNA gerou um alinhamento composto por
519 pares de base. O alinhamento múltiplo revelou que 13 sítios apresentaram-se polimórficos, dos quais 5 foram
informativos para parcimônia e permitiram identificar 7 diferentes haplótipos. A diversidade haplotípica total (Hd), a
diversidade nucleotídica (π) e o número médio de diferenças nucleotídicas (K) foram respectivamente 0,485, 0,00353
e 0,83350. A análise da filogeografia de Annona crassiflora, baseada numa network construída a partir do algoritmo
median-joining permitiu constatar que o haplótipo mais amplamente distribuído, é também o mais antigo. A análise
da região trn-L do cpDNA revelou ainda que a maior parte da diversidade genética dessa espécie (96,0%) encontrase distribuída dentro das populações, ainda que, parte significativa (4,0%) já tenha sido perdida. O atual padrão de
distribuição da diversidade genética de A. crassiflora aponta para a necessidade de contenção da fragmentação, decorrente
das práticas de extrativismo exagerado e expansão das fronteiras agrícolas, no intuito de impedir que a divergência
genética interpopulacional atinja níveis críticos para a espécie. Os resultados obtidos indicam que futuros programas
de conservação ex-situ devem amostrar o maior número possível de populações, a fim de se coletar a parte da variação
genética presente entre populações de A. crassiflora. É importante salientar que mais estudos, utilizando outros marcadores,
são necessários para que a efetiva conservação dessa espécie seja assegurada.
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Fluxo gênico intrapopulacional de
Euterpe edulis através do método direto
Sousa, FMO; Alves Filho, ER; Gaiotto, FA
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus-BA
[email protected]
Palavras-chave: fluxo gênico, Euterpe edulis, microssatélites, conservação, variabilidade genética
A palmeira juçara (Euterpe edulis Martius) é uma espécie nativa da floresta tropical atlântica brasileira e está distribuída
desde o sul da Bahia até o Rio Grande do Sul. Por ser a produtora de um palmito de excelente qualidade, muito apreciado
pela gastronomia, foi amplamente explorada. Em vista disso, é necessária a elaboração de estratégias que visem a sua
conservação. Essas estratégias devem ser baseadas não somente em dados ecológicos como também subsidiadas por
dados genéticos, como variabilidade genética da população e distância de fluxo gênico. Com base nesta necessidade
premente, este trabalho objetivou a análise de fluxo gênico intrapopulacional em uma população localizada na Serra do
Teimoso. A partir de tal análise é possível determinar o tamanho de vizinhança, ou seja, a área utilizada pela espécie para
que ela possa se perpetuar com o menor prejuízo de alelos possível. Desta forma, é possível o uso do recurso genético
com prejuízos mínimos à sua constituição gênica, uma vez que se conhecendo a distância de polinização e dispersão
de sementes dentro da área de ocorrência natural, será possível monitorar o fluxo gênico entre indivíduos adultos. Para
este estudo foram analisados 39 indivíduos adultos e 41 jovens da RPPN Serra do Teimoso, localizada no município de
Jussari, perfazendo um total de 80 indivíduos. As amostras foram genotipadas utilizando-se marcadores microssatélites
seguindo o protocolo de Gaiotto et al (2001). A partir de uma bateria de 12 locos microssatélites fluorescentes foram
feitas análises de exclusão de paternidade. Tais testes foram realizados comparando-se os genótipos de todos os indivíduos
adultos contra todos os jovens. Através dessas análises foi possível estabelecer o vínculo genético entre os indivíduos e, a
partir de então, estimar a probabilidade de paternidade/maternidade. As análises de exclusão de paternidade revelaram
vínculo genético entre 11 pares de indivíduos (jovens e adultos) da Serra do Teimoso, com probabilidade de paternidade/
maternidade superior a 99,9999%. Para os demais jovens nenhum possível genitor foi amostrado, uma vez que os
mesmos apresentaram locos excludentes, ou seja, locos que sozinhos comprovaram a ausência de vínculo genético entre
uma plântula e um adulto amostrado. A partir desses dados foi possível determinar a distância mínima e máxima de
fluxo gênico entre os indivíduos da população da Serra do Teimoso, que foi 65 cm e 120 m, respectivamente. De posse
de tais dados será possível elaborar alternativas mais eficientes para a conservação desta espécie, de forma a manejá-la
respeitando um espaçamento mínimo que permita a troca de genes entre os indivíduos e consequentemente mantenha
a variabilidade genética populacional.
Apoio financeiro: Fapesb e UESC.
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Integração fenotípica em caracteres florais
da tribo Bignonieae (Bignoniaceae)
Alcantara, S1; de Oliveira, FB2; Lohmann, LG1
1
Departamento de Botânica - Instituto de Biociências – USP
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva – Instituto de Biociências - USP
[email protected]
2
Palavras-chave: sinal filogenético, correlação, Mantel, polinização
A morfologia floral pode ser influenciada por diversos fatores funcionais. Em particular, acredita-se que pressões seletivas
exercidas por polinizadores em espécies zoófilas exerceram um papel muito importante na evolução floral. Neste contexto,
espera-se uma forte integração fenotípica devido à evolução correlacionada entre caracteres florais relacionados à atração
de polinizadores e eficiência na deposição de pólen. Neste estudo, avaliamos a variação fenotípica em caracteres florais da
tribo Bignonieae (Bignoniaceae), um grupo com diversos sistemas de polinização, visando identificar o padrão evolutivo
e o grau de integração fenotípica desses caracteres. Para tal, foram amostrados >1000 exsicatas correspondendo a 104
das 382 espécies e 18 dos 21 gêneros presentes na tribo. Esta amostragem corresponde às mesmas espécies amostradas
na única filogenia molecular disponível para a tribo até o momento (Lohmann, 2006). Medidas de 8 caracteres do
cálice e corola de pelo menos 10 indivíduos foram utilizadas para a construção de matrizes de correlação fenotípica
para comparações entre gêneros. Além disso, foi avaliado o sinal filogenético de cada uma das medidas realizadas e de
outros 9 caracteres relacionados ao tamanho e posicionamento de estames e estigmas. Para testar o sinal filogenético,
foram utilizadas 1000 randomizações para o cálculo da distribuição dos valores de K (Blomberg et al., 2003); tais valores
foram comparados aos valores de K calculados a partir dos dados originais. A maioria dos caracteres apresentou sinal
filogenético significativo e positivo, exceto o ângulo de inclinação da corola. Esses resultados indicam que a variação
das medidas florais entre espécies aumenta de acordo com a distância filogenética (DF). Por outro lado, análises de
correlação que utilizaram 18 dos 22 gêneros da tribo indicaram que as correlações entre a matriz de DF e as matrizes
de correlação fenotípica e de variância/covariância (VCV) não são significativas (teste de Mantel: p = 0,3531 para DF
e matriz de correlação; p = 0,078 para DF e matriz de VCV). Em particular, as matrizes de VCV foram constantes em
todas as 153 comparações pareadas, apresentando valores de correlação significativos e acima de 0,899. Além disso, as
correlações entre as matrizes de correlação foram significativas e positivas para metade das comparações, com os valores
não significativos correspondendo aos gêneros com as amostragens mais baixas. Apesar disso, o padrão geral das matrizes
de correlação fenotípica indica uma constância nas correlações entre caracteres que determinam o fenótipo externo
da flor. Esses resultados mostram que embora os caracteres tenham evoluído ao longo da diversificação de Bignonieae
(através de mudanças no valor fenotípico médio de cada caráter), é possível notar uma integração fenotípica significativa
entre caracteres que não é influenciada pela distância filogenética entre gêneros.
Apoio financeiro: FAPESP e MOBOT.
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Estrutura genética e distribuição geográfica
da variabilidade de Coccoloba cereifera
(Polygonaceae) SCHW., uma espécie rara
e endêmica da Serra do Cipó, MG, Brasil
Moreira, RG1; McCauley, RA2; Cortés-Palomec, AC2; Fernandes, GW1; Oyama, AK2
Departamento de Biologia Geral/ICB Universidade Federal de Minas Gerais
Centro de Investigaciones en Ecosistemas Universidad Nacional Autónoma de México
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Microssatélites, SSR, endemismo, campo rupestre, extinção
Estudos de estrutura genética populacional são importantes para avaliar o “status” genético das espécies, fornecendo
informações valiosas quanto aos níveis de diversidade existentes e os padrões de distribuição da variabilidade. Em espécies
raras e endêmicas estes estudos podem auxiliar no planejamento de estratégias de manejo e de conservação. Coccoloba
cereifera Schw. (Polygonaceae) é uma espécie subarbustiva rara, encontrada exclusivamente nos campos rupestres da
Serra do Cipó, MG, Brasil. O presente estudo teve como objetivo principal gerar os primeiros dados de estrutura
genética dessa espécie endêmica. Por meio da genotipagem de 13 loci microssatélites previamente desenvolvidos para
C. cereifera, buscou-se responder as seguintes perguntas: A espécie ocorre como uma única população panmítica? Há
algum risco genético de extinção? Como a variabilidade genética está distribuída por toda a área de ocorrência da espécie?
Foram coletados 139 indivíduos em nove subpopulações distribuídas por toda a área de existência de C. cereifera. O
número de alelos por locus variou de dois a dez e as heterozigosidades esperada e observada nas subpopulações foram
de 0.324 a 0.566 e 0.337 a 0.529, respectivamente. Os loci microsatélites detectaram níveis baixos, mas significativos
de diferenciação entre demes (Fst=0.123, Rst= 0.122). Já de acordo com os resultados da análise molecular de
variância (AMOVA) realizados no programa “Arlequin”, a maior parte da variação, cerca de 86%, estaria dentro das
subpopulações enquanto que o restante estaria entre as demes. Testes de Mantel realizados nos níveis de indivíduo e de
subpopulações revelaram padrões fracos, mas significativos de isolamento por distância (r= 0.25; r2=0.31; P<0,002).
Análises bayesianas realizadas no software STRUCTURE levam a crer que as subpopulações não são completamente
distintas, mas que estão estruturadas dentro de uma única população panmítica. A representação gráfica gerada no
programa “Alleles in Space” mostrou que a variabilidade está distribuída de forma homogênea na população, apesar do
centro da distribuição mostrar menor nível diversidade. Embora essa espécie endêmica restrita apresente altos níveis
de variabilidade prevenindo o risco genético direto de extinção, a sobrevivência de C. cereifera depende de esforços
para a manutenção do contínuo fluxo gênico e da conservação de seu hábitat. Qualquer perda subpopulacional ou
conseqüências relativas à fragmentação do ambiente podem representar importantes ameaças para a futura manutenção
da diversidade genética dessa espécie.
Auxílio Financeiro: CAPES e FAPEMIG.
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Inesperada redução da variabilidade
genética de populações de Rhizophora
mangle L. (Rhizophoraceae) no sentido
norte-sul na costa brasileira
Pil, MW1,2; Boeger, MR1,2,3; Muschner, VC1,3; Pie, M2,4; Ostrensky, A2; Boeger, WA2,4
Curso de Pós-Graduação em Ecologia e Conservação, Universidade Federal do Paraná
2
Grupo Integrado de Aqüicultura e Meio Ambiente, Universidade Federal do Paraná
3
Departamento de Botânica, Universidade Federal do Paraná
4
Departamento de Zoologia, Universidade Federal do Paraná
[email protected]
1
Palavras-chave: mangue vermelho; genética populacional
Comunidades de manguezais são naturalmente fragmentadas e estão submetidas à extensa pressão antrópica, tais como
a extração de seus componentes para comercialização, a especulação imobiliária e a poluição doméstica e industrial.
Para estabelecer modelos racionais de conservação e estratégias de manejo dos manguezais, é importante conhecer
os parâmetros genéticos básicos e a estruturação populacional dos seus organismos componentes. Em vista disso, o
presente estudo visa obter dados moleculares para caracterizar geneticamente populações de Rhizophora mangle do
litoral brasileiro, uma das espécies de mangue mais comum nos manguezais do país. Material vegetativo foi coletado
de 15 indivíduos de R. mangle para cada uma de nove populações distribuídas ao longo de toda a costa brasileira. As
populações estão localizadas em Macapá (AP), Belém (PA), Natal (RN), Recife (PE), Vaza Barris (SE), Ilhéus (BA), Barra
de Guaratiba (RJ), Ilha do Mel (PR) e Praia de Massiambú (SC). Os marcadores moleculares utilizados foram três loci
de microssatélites desenvolvidos para R. mangle (RM19, RM41 e RM46). As populações de R. mangle da costa norte
do país são geneticamente distintas de todas as outras populações amostradas ao sul do Pará. Os valores de distância
genética de Nei mostram que as populações do RN, PE, SE, BA, RJ, PR e SC são geneticamente muito semelhantes
entre si, apresentando uma baixíssima diversidade alélica e são cerca de 13% mais distantes das populações do norte
do país do que entre si. Esse mesmo índice de distância genética indica que a população do Amapá é a mais diversa
e distinta, seguida pela população do Pará. As relações encontradas indicam a existência de mecanismos que tornam
o fluxo gênico mais intenso entre o Rio Grande do Norte e as demais populações amostradas ao sul. Por outro lado,
a baixa variabilidade encontrada nas populações mais ao sul parece refletir um efeito fundador, associado à expansão
gradativa hipotética da espécie, subseqüente ao aumento gradativo da temperatura de regiões estuarinas mais austrais
durante o fim do último período glacial.
Orgão financiador: CNPq.
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Filogeografia de Pseudobombax munguba
(Malvaceae), nas várzeas amazônicas:
Distribuição Contrastante da variabilidade
Genética entre populações do rio Amazonas
e seus Tributários
Menicucci, T; Gribel, R; Lemes, MR
Laboratório de Genética e Biologia Reprodutiva de Plantas e Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva,
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Av. André Araújo 2936, 69083-000, Manaus, AM
[email protected]
Palavras-chave: Filogeografia, genética de populações, árvore tropical, Amazônia, genoma do cloroplasto
A estrutura das populações de espécies de plantas reflete padrões atuais de trocas genéticas dentro e entre populações e a
história de fluxo gênico e isolamento entre linhagens. A filogeografia é um campo interessado em reconstruir a história
das espécies visando determinar suas origens e respostas às alterações climáticas e perturbações ambientais do passado.
Várias hipóteses biogeográficas têm sido levantadas para explicar as origens da alta biodiversidade na Amazônia, entretanto,
pouco foi discutido sobre a diversidade genética de organismos das várzeas, as planícies inundáveis dos rios amazônicos.
No presente estudo apresentamos os padrões de distribuição da variabilidade genética e a filogeografia da mungubeira
(Pseudobombax munguba), uma espécie arbórea exclusiva das várzeas. Foram utilizados oito locos microssatélites do genoma
do cloroplasto (cpDNA) para analisar 162 indivíduos de 11 populações e seqüências da região trnG/trnS do cpDNA de
35 indivíduos de nove populações distribuídas na Amazônia brasileira. Na análise com microssatélites foram observados de
dois a cinco alelos por loco e um total de 35 haplótipos considerando os oito locos. As três populações situadas nos trechos
baixo e médio da calha do rio Amazonas mostraram-se monomórficas para os oito locos. A diversidade genética de Nei variou
entre 0,0 e 0,433, com média de 0,240 para todas as populações analisadas conjuntamente e de 0,301 quando apenas as oito
populações polimórficas foram consideradas. A análise de variância molecular (AMOVA), utilizando todas as populações,
mostrou que a maior parte da diversidade pode ser explicada pela variação contida dentro das populações (59%). Excluindo
as populações monomórficas da análise a variação subiu para 66%. O teste de Mantel, que correlaciona as distâncias genéticas
e as distâncias geográficas entre pares de populações, indicou que não há isolamento por distância entre as populações. As
seqüências da região trnG/trnS apresentaram 10 substituições nucleotídicas e somente três haplótipos, sendo o mais freqüente
(88,6%) amplamente distribuído na bacia amazônica. Os outros dois haplótipos ocorreram somente nos rios Juruá e Branco
respectivamente, tributários do rio Amazonas. Os resultados obtidos sugerem um fluxo gênico materno bastante limitado
entre as populações de P. munguba. A ausência de variação no baixo e médio Amazonas sugere uma colonização recente
nesta vasta região, resultante de efeito fundador a partir de uma única linhagem materna. Em contraste, a maior diversidade
encontrada nos trechos mais elevados dos tributários indica populações mais antigas e estáveis. O padrão de distribuição da
diversidade haplotípica encontrado sugere que as populações dos trechos baixo e médio da calha do Amazonas podem ter
sido repetidamente afetadas por diversos episódios de elevação e rebaixamento do nível do mar ocorridos no passado. Os
dados sugerem que a hipótese biogeográfica do Lago Amazônico pode ser determinante para explicar a estruturação genética
das populações de árvores do ecossistema da várzea.
Apoio financeiro: CNPq e União Européia.
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Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
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Estrutura genética espacial em uma
população natural de Copaifera langsdorffii
Desf. no cerrado de Assis, SP
Tarazi, R1,2; Moreno, MA2; Ferraz, EM2; Moreira, CM3; Kageyama, PY2; Sebbenn, AM4; Vencovsky, R1
Departamento de Genética da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz da Universidade de São Paulo
Laboratório de Reprodução e Genética de Espécies Arbóreas da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz da Universidade de São Paulo
3
Projeto Temático Parcelas Permanentes (Biota/FAPESP) da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz da Universidade de São Paulo
4
Instituto Florestal de São Paulo, CP 1322, São Paulo, SP, 01059-970
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Copaifera langsdorffii; estrutura genética espacial, SSR, endogamia, coancestria
A Copaifera langsdorffii Desf. (Caesalpiniaceae) ou copaíba é uma espécie arbórea comum do cerrado, predominantemente
de cruzamento que apresenta a melitofilia como principal síndrome de polinização e ornitoria como principal síndrome
de dispersão de sementes. C. langsdorffii tem grande potencial econômico, pois pode ser utilizada para diversos fins:
madeireiro, oléico, apícola, medicinal, paisagístico e empregado em recuperação de áreas degradadas. O conhecimento
sobre como a variabilidade genética está organizada nas populações oferece subsídios para a conservação, manejo das
populações e coleta de sementes para recuperação ambiental. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi investigar a
diversidade genética e a estrutura genética espacial de uma população natural de C. langsdorffii do cerrado utilizando
oito locos microssatélites. Para tanto, foram coletadas folhas de todos os indivíduos adultos, supostamente reprodutivos
(n=57; DAP ≥ 25cm) em uma parcela quadrada de 10,24ha (320m x 320m) do Projeto Parcelas Permanentes – Biota/
FAPESP, instalada dentro de um fragmento na Estação Ecológica de Assis, Assis, SP. As análises da diversidade genética
e do índice de fixação foram realizadas com auxílio do programa GDA. Para o conjunto dos oito locos foi detectado
um total de 116 alelos, com média de 14,5 alelos por loco, diversidade gênica de 0,849 e heterozigosidade observada
de 0,789. O índice de fixação foi significativamente diferente de zero (0,071; P<0,05), indicando endogamia na
população. A hipótese de uma recente redução no tamanho efetivo populacional foi testada utilizado o programa
BOTTLENECK. Foi detectada uma grande deficiência de heterozigosidade esperada para o modelo de equilíbrio de
mutação-deriva (Heq). A estrutura genética espacial (EGE) foi verificada pelo coeficiente de coancestria entre pares de
árvores dentro de diferentes classes de distância, utilizando o programa SPAGEDI. Essa análise detectou uma fraca
estrutura de famílias dentro da população, embora tenha sido significativamente diferente de zero até a distância de
42m ( θˆxy =0,01; p<0,01). Estes resultados da EGE e os da deficiência de heterozigosidade esperada para o modelo
de equilíbrio de mutação-deriva (Heq) são coerentes com as hipóteses de expansões recentes no tamanho efetivo ou
introgressão de um grande número de alelos raros via imigração de sementes. Nesse sentido, apesar da existência de
endogamia na população, aparentemente um segundo evento independente gerado pela dispersão de sementes a longas
distâncias tendeu a homogeneizar a diversidade genética na área, reduzindo a magnitude da EGE.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Fluxo gênico via polen em continuo florestal
e em árvores de Araucaria angustifolia
isoladas em lavouras e pastagens
Bittencourt, JVM1; Sebbenn, AM2
Universidade Tecnológica Federal do Paraná, Campus Dois Vizinhos (UTFPR, DV) Estrada para Boa Esperança, Km 4, Dois Vizinhos, PR,
CEP 85660-000, Caixa Postal: 157
2
Instituto Florestal de São Paulo, CP 1322, São Paulo, SP, 01059-970
[email protected]
1
Palavras-chave: fluxo gênico, análise de paternidade, locos microssatélite, fragmentação
Atualmente o bioma formado pela Floresta com Araucária se restringe a pequenos fragmentos isolados ou com limitada
conectividade, sendo que os contínuos florestais com grandes extensões são raros hoje em dia. Portanto, é premente a
necessidade de estimar a distância de dispersão de pólen da espécie, pois este conhecimento é básico para determinar
a conectividade funcional de populações remanescentes e elaborar estratégicas de conservação genética eficientes para
A. angustifolia. O objetivo deste trabalho foi determinar a distância de dispersão de pólen de A. angustifolia em um
transecto de 14 ha em condição de contínuo florestal e em três grupos de árvores de Araucária isoladas em campos e
pastagens, na região de Mangueirinha-PR. Os grupos de árvores não constituíam fragmentos florestais em si, mas sim
ilhas de árvores isoladas remanescente em campos de cultivo agrícola. Foram analisados oito locos microssatélites em
amostras de árvores adultas e sementes de polinização aberta, para realização de análise de paternidade. No transecto
foram genotipadas 108 árvores, sendo 52 femininas e 56 masculinas e 190 sementes, coletadas de 11 árvores matrizes.
Nos grupos isolados (ilhas) foram genotipados de 5 a 11 árvores, juntamente com 20 sementes de uma árvore matriz
de cada grupo. A análise de paternidade no contínuo florestal evidenciou que 57% das sementes foram fertilizadas
por indivíduos localizados fora do transecto analisado. Nas ilhas (arvores isoladas) a taxa de imigração de pólen variou
de 37% a 56%. A distância média de polinização dentro do transecto foi estimada em 101 m. O número efetivo de
doadores de pólen no transecto variou entre as árvores matrizes analisadas de 2 a 10 árvores doadoras, enquanto nas
árvores isoladas esta amplitude foi menor, variando de 3 a 6 árvores. A área de vizinhança reprodutiva no transecto
variou entre árvores matrizes de 0,64 to 12,08 ha. A análise da distribuição espacial dos genótipos no transecto indicou a
presença de estrutura genética espacial, provavelmente devido à dispersão de sementes por gravidade a curtas distâncias.
Os resultados sugerem ampla distância de dispersão de pólen dentro do transecto, curta de sementes e ausência de
isolamento reprodutivo no contínuo florestal. Concomitantemente, os resultados mostraram alta taxa de imigração
e dispersão de pólen nos grupos, indicando que tais árvores remanescentes em lavouras e pastagens são capazes de
manter a conectividade funcional entre os fragmentos florestais de A. angustifolia e, portanto, devem ser conservadas
para manter a conectividade genética de pequenos fragmentos espacialmente isolados.
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Características moleculares do gênero Croton
Duarte, RLR1; Ceccatto, VM2; Alencar, CERD3
Pesquisadora Doutora da Embrapa Meio Norte CPAMN, Teresina,PI
Professora, Doutora do Curso de Biologia Molecular da Universidade Estadual do Ceará, UECE
3
Graduando em Ciências Biológicas da Universidade Estadual da Paraíba, UEPB; Estagiário da Embrapa Algodão, Campina Grande, PB, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: marmeleiros, marcadores moleculares, Euphoebiaceae
As substâncias que geralmente são fontes de estudo quanto à atividade biológica são aquelas que advêm do metabolismo
secundários das plantas. A presença de metabólitos secundários é o resultado das complexas interações entre biossíntese,
transporte, estocagem e degradação. Cada um desses processos, por sua vez, é governado por genes e, portanto, sendo
influenciado por três fatores principais: hereditariedade, ontogenia (estágio de desenvolvimento) e o ambiente. Do
ponto de vista químico, este gênero se caracteriza por apresentar metabólitos secundários como o anetol ou estragol,
ou ambos e ainda o eugenol em concentrações elevadas. Estudos moleculares usando seqüências de rDNA 18S, rbcL, e
atpB indicam que a família Euphoebiaceae não é monofilética e deve ser separada dentro de, pelo menos, cinco linhagens
dentro da ordem. O gênero é o mais diverso em regiões semi-áridas, mas também ocorre em extensões de habitats, de
praias a florestas tropicais chuvosas. Este estudo objetivou identificar a semelhança genética entre as espécies estudadas
do gênero Croton, existentes na flora da caatinga, no Estado do Ceará. Foram coletadas seis espécies do gênero Croton,
C. sp; C. sonderianus Muell. Arg; C. zehtneri Pax. Et. Hoffm; C. nepetaeffolius BaiLL; C. argyrophylloides Muell e Croton
sp. no município de Viçosa do Ceará-CE e mantidas “in vivo” em canteiros, na área experimental do Curso de Ciências
Biológicas – Universidade Estadual do Ceará (UECE). O trabalho prático foi executado no Laboratório de Genética e
Bioinformática (NUGEM) da UECE-CE. A coleta foi efetuada no horário pela manhã, onde se utilizou cerca de cinco
mg de folhas frescas das espécies de Croton em estudo. Foram incluídas no estudo molecular primers homólogos às
seqüências de genes rDNA 18G e 18H pela alta conservação destas, por não haver seqüências parecidas depositadas no
GenBank (www. ncbi.nlm.nih.gov) e por causa da amplificação de genes específicos do fragmento de DNA genômico
extraído de folhas de plantas de Croton pela metodologia PCR. O controle negativo da reação foi feito utilizando-se
água ao invés de DNA. Foram utilizados dois primers: 18d (5´ CAC ACC GCC CGT CGC TAC TAC CGA TTG 3´)
e 11d (5´ GAT AGC CAC CAA AAC TTC GCT TC 3´). Após as amplificações das seqüências do gene, foi efetuada
a eletroforese em gel de agarose 1% e um transluminador UV usado para visualizar e em seguida foi fotografado. Estes
primers amplificaram a região gênica do espaçador inter ribossomal ITS1 incluindo uma faixa gênica do ribossomo
5,8S. Verificou-se amplificação para as amostras do marmeleiro preto e prateado. Estes dados ainda não demonstram a
viabilidade de sua utilização para verificar a variabilidade genética destas plantas. Dos resultados obtidos, concluiu-se que
a amplificação de genes ribossômicos ITS1 mostraram potencial na amplificação de marmeleiro prateado e preto.
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Diversidade genética entre populações
simuladas sob o efeito da deriva genética
Barrera, CF; Tomé, LGO; Cruz, CD
Laboratório de Bioinformática – BIOAGRO, Departamento de Biologia – Área de Genética e Melhoramento genético, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: Deriva genética, Diversidade, Simulação populações, Tamanho população, Shannon-Wiener, Análise Descritiva
A existência de variação genética é um fator fundamental para que ocorra a evolução. A seleção natural atua entre as
variantes dentro das populações em relação à adaptação ao ambiente, proporcionando variação entre populações e, por
fim, variação entre espécies. Dentro das populações, a variabilidade genética é freqüentemente reduzida ou aumentada
em função do tamanho das amostras. Naturalmente, as espécies cultivadas mostram ter baixo nível de variabilidade
genética em conseqüência das limitações de espaço, tempo, recursos financeiros e esforços, pois nestes casos é sempre
interessante utilizar tamanho mínimo de amostra. Consequentemente, as populações apresentam pequeno número
de indivíduos ou pequeno tamanho efetivo, mostrando níveis reduzidos de diversidade e levando a ocorrência da
deriva genética. A deriva genética refere-se às alterações aleatórias das freqüências alélicas de uma população devido ao
tamanho da amostra, levando eventualmente, a fixação ou a perda do alelo. Este trabalho teve como objetivo avaliar a
diferenciação genética dentro populações segundo índices de diversidade, e diferentes metodologias biométricas. Foram
simuladas 4000 populações no programa Genes, suscitas ao efeito da deriva genética proporcionada pelo acasalamento
entre 20, 50, 100 e 200 indivíduos. Considerou-se a amostragem de 100 subpopulações submetidas a 10 gerações de
acasalamento ao acaso com ênfase a 10 locos. Considerando-se a heterozigosidade obtida pela estatística do ShannonWiener e Análise Descritiva da diversidade, pode-se observar aumento das oscilações nas freqüências gênicas com o
transcorrer das gerações de acasalamento. Em relação aos efeitos causados pelo tamanho das subpopulações observa-se
uma maior oscilação nas freqüências gênicas da população formada por 20 indivíduos em relação aos demais tamanhos
populacionais em todas as gerações de acasalamento isso demonstra que quanto menor o tamanho da população e,
portanto, o tamanho da amostra de gametas, maior fica sendo a influência da variação devida à amostragem. Em todas
as interações avaliadas a estatística H` foi ineficiente em detectar a diferenciação das populações proporcionada pela
deriva genética em 10 gerações. Para tamanho igual a 20, o valor de H` na primeira geração 1,0297 sendo reduzido,
não significativamente para 0,8237 na demais gerações.
Orgão financiador: FAPEMIG.
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Análise da estrutura genética de
populações em Hypochaeris lutea
(Asteraceae) usando o método de AFLP
Ruas, CF1; Conson, ARO1; Rodrigues, LA1; Ruas, PM1; Ruas, EA2; Reck, M1; Ortiz, MA3;
Stuessy, T4; Talavera, S3; Tremetsberger, K4
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina
2
Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de Londrina
3
Departamento de Biología Vegetal y Ecología, Universidad de Sevilla, Espanha
4
Department of Systematic and Evolutionary Botany, Institute of Botany, University of Vienna, Austria
[email protected]
1
Palavras-chave: Asteraceae, Hypochaeris lutea, AFLP, genética de populações
O gênero Hypochaeris é considerado como um modelo de espécies endêmicas iberoamericanas onde, acredita-se que
os eventos de especiação decorreram principalmente devido a diversificação dos sistemas reprodutivos. Hypochaeris
lutea é considerada uma espécie endêmica no sul do Brasil, com poucos relatos de ocorrência na Argentina e Paraguai.
Por apresentar características ecológicas semelhantes à espécie co-irmã, H. angustifolia, suposta ancestral do grupo
sulamericano, H. lutea é de grande interesse para estudos genéticos. Neste trabalho foi utilizada a técnica de AFLP
para determinar a estrutura genética de populações desta espécie. Inicialmente foram utilizadas amostras de DNA de
60 indivíduos, provenientes de três populações de H. lutea, sendo duas do estado do Rio Grande do Sul e uma de Santa
Catarina. As amostras de DNA foram digeridas com EcoRI e MseI por 22hs a 37oC. Após reação de PCR preseletivo,
as amostras foram amplificadas seletivamente com três combinações de primers Eco/Mse. Os produtos de amplificação
foram separados em gel de poliacrilamida (29:1) e corados com nitrato de prata. Um total de 52 marcadores foram
obtidos e analisados utilizando a análise de variança para dados moleculares (AMOVA). Os resultados mostraram uma
variação genética de 29,40% entre populações e 70,60 dentro de populações, com um valor de Fst = 0.2940. Estes
resultados foram confirmados usando a análise da coordenada principal a qual mostrou um isolamento quase completo
de uma das populações investigadas. Embora nossos estudos sejam ainda preliminares, os resultados confirmam que a
técnica de AFLP pode ser utilizada com eficiência para determinar a estrutura genética das populações de H. lutea.
Apoio Financeiro: CAPES, Fundacion BBVA (BIOCON 04 to Salvador Talavera).
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Diversidade genética de populações
de Araucaria angustifolia de Santa Catarina
e Rio Grande do Sul
Sujii, PS1; Azevedo, VCR1; Inglis, PW1; Ciampi, AY1
Laboratório de Genética Vegetal, EMBRAPA/Cenargen
[email protected]
1
Palavras-chave: SSR, Genética de Populações, Barra Grande, Conservação, Estrutura Populacional
Análise de estrutura genética populacional tem contribuído para a definição de programas de manejo e de conservação
de espécies, principalmente para aquelas sob forte pressão antrópica, como Araucaria angustifolia (Bert.) O. Kuntze
(Araucariaceae). Devido à intensa exploração de madeira, frutos e sementes e à redução de 97% da área ocupada pela
Floresta de Araucária, da qual é a principal componente, a araucária é considerada em extremo risco de extinção pelo
IUCN 2006 - Red List of Threatened Species. Esse trabalho teve como objetivo a estimativa da diversidade genética em
duas populações de Araucaria angustifolia encontradas na Área de Aproveitamento Hidroelétrico Barra Grande – RS/SC.
Amostras de folhas e sementes das matrizes de duas populações foram coletadas e plantadas. Destes, foram analisados
262 indivíduos pertencentes a 15 famílias, cada uma composta de uma matriz e sua progênie. O DNA total foi extraído
a partir das folhas coletadas tanto das matrizes quanto da progênie seguindo o protocolo de extração CTAB 2%. As
amostras foram genotipadas por nove locos SSR (Simple Sequence Repeats)-marcadores microssatélites desenvolvidos
para a espécie. A detecção dos fragmentos amplificados por meio de PCR (Polimerase Chain Reaction) com iniciadores
marcados por fluorocromos foi efetuada por seqüenciador automático ABI 3700 e por programas GeneScan e
Genotyper. Os alelos foram normalizados com o programa AlleloBin e estes dados foram analisados pelo programa GDA
(Genetic Data Analysis), na estimativa da Heterozigosidade esperada (He) e observada (Ho), do número de
alelos polimórficos por loco (Ap) e índice de fixação (f ). Os nove loco SSR evidenciaram Ap variando entre
11 e 21, He=0,83, Ho=0,68 e f=0,19. Apesar de estudos com espécies arbóreas indicarem uma possível seleção contra
indivíduos homozigotos, foi possível observar um valor de f positivo, consistentemente e diferente de zero (IC entre
0,296 e 0,049) para a progênie, o que indica um excesso de homozigotos nas populações, ou seja, um possível efeito de
endogamia. O valor encontrado para as matrizes também foi positivo, entretanto não foi consistente (IC entre 0,186 e
-0,004). Trata-se de uma espécie dióica, portanto a fixação de alelos observada provavelmente é devida ao cruzamento
entre parentes. Esses resultados evidenciam o efeito negativo da fragmentação dessas áreas, com a possível perda de riqueza
alélica e o possível comprometimento da longevidade da população. Evidencia também a potência dos marcadores nas
investigações de estimativa de diversidade genética e permitindo subsidiar estratégias de conservação.
Apoio Financeiro: BAESA/Funarbe.
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Análise genética em populações de
Sinningia lineata (Hjelmq) Chautems
utilizando marcadores moleculares RAPD
Gavião, CFC1; Sujii, PS1; Inglis, PW1; Ciampi, AY1
Laboratório de Genética Vegetal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
[email protected]
1
Palavras-chave: Rainha-do-abismo, PCR, Variabilidade Genética, Conservação, Área de Aproveitamento Barra Grande
A avaliação da variabilidade genética da espécie é um importante parâmetro para definir programas de conservação e
coleta de espécies, principalmente para aquelas sob forte pressão antrópica como a Sinningia lineata (Hjelmq) Chautems
(Gesneriaceae). Esta foi considerada vulnerável de acordo com Lista de Espécies da Flora Ameaçadas de Extinção no
Rio Grande do Sul (Decreto 42.099 de 31 de dezembro de 2002). É uma espécie endêmica do Rio Grande do Sul
e ocorre geralmente em paredões rochosos úmidos. Rainha-do-abismo, como é conhecida, destaca-se pelos grandes
tubérculos, densa folhagem verde pilosa e suas flores vermelhas e alaranjadas. Apresenta grande importância ecológica,
sendo bem adaptada a ambientes rústicos, suportando longos períodos de seca, além de grande resistência às pragas.
Somado a isso, possui requisitos básicos para utilização em ornamentação, especialmente pela ocorrência de brotações
sucessivas, floração persistente ocorrendo durante quase todo o ano. Marcadores moleculares, como o RAPD (Random
Amplified Polimorphism DNA), possibilita analisar espécies das quais não se tem informação genética prévia, sendo uma
técnica baseada em PCR (Polimerase Chain Reaction), de baixo custo e que permite a análise de um grande número de
indivíduos em curto prazo. Neste trabalho foi utilizada a metodologia RAPD objetivando avaliar a variabilidade genética
em populações de S. lineata, da área de Aproveitamento Hidroelétrico (AHE) de Barra Grande, SC/RS. Para a análise
genética, foi extraído DNA de folhas frescas de 40 indivíduos de três populações. A seleção inicial de iniciadores foi feita
utilizando quatro indivíduos de cada população, com 48 iniciadores da Operon Technologies, dos quais 20 apresentaram
amplificações de três a sete fragmentos polimórficos por iniciador. A genotipagem dos 40 indivíduos permitiu gerar
77 marcas RAPD, que foram analisadas pelo programa NTSYS 2.1, utilizando o coeficiente DICE pelo método de
agrupamento UPGMA. O dendrograma gerado mostrou dissimilaridade em torno de 45% entre as três populações,
com coeficiente de correlação significativo (r=0,79). A maioria dos indivíduos de uma população apresentou um
agrupamento. Para amostrar a maior variabilidade genética possível é preciso coletar um número maior de indivíduos de
todas as populações. Com a finalidade de desenvolver estratégias de manejo de conservação com parâmetros genéticos
mais robustos, recomenda-se a realização de estudos utilizando outras técnicas de análise molecular codominante, como
marcadores moleculares microssatélites, os quais fornecem resultados mais detalhados para a definição de estratégias
de conservação e manejo sustentável da espécie.
Apoio Financeiro: BAESA/Funarbe.
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Análise de fingerpriting de dna (DAF),
em Chamaesyce hirta e C. thymifolia
(Euphorbiaceae), ocorrentes em fragmentos
urbanos e ambientes aNtropizados, Recife-PE
Pinangé, DSB1; Cruz, GAS1; Santana; KCB1; Alves, MV2; Benko-Iseppon, AM1
Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Botânica, Centro de Ciências Biológicas, Universidade federal de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fluxo gênico, degradação, genética ecológica, biondicadores, megacidade
Devido à fragmentação, a floresta Atlântica nordestina constitui-se em um cenário de extinção local e global de espécies,
especialmente considerando-se a riqueza em endemismos regionais. Muitos desses fragmentos estão localizados em
meio ou na periferia de centro urbanos, onde a interação com o homem é constante. O gênero Chamaesyce, pertencente
à família Euphorbiaceae, destaca-se pela presença de espécies pioneiras e bioindicadoras, em geral com uma grande
plasticidade de adaptação a ambientes degradados. O presente trabalho objetivou analisar populações urbanas de duas
espécies deste gênero (Chamaesyce hirta, CH001 e C. thymifolia, CH002) em áreas duas livres da cidade do Recife,
através da metodologia DAF (DNA Amplification Finferpriting). O material utilizado foi proveniente de 30 espécimes
(15 CH001 e 15 CH002) coletados em duas populações (Apipucos, API e Ilha do Bananal, IB) ambas elementos do
entorno da reserva ecológica de Dois Irmãos. Um dos problemas enfrentados referiu-se à extração de DNA, sendo
necessária uma adaptação do protocolo CTAB maxi-prep, com quantidades reduzidas de tecido foliar jovem recémcoletado em relação ao volume de tampão. Foi realizada uma análise prévia usando-se 40 oligonucleotídeos, dentre os
quais 10 mostraram-se mais informativos, selecionando-se cinco primers altamente informativos no intuito de inferir
preliminarmente sobre a estrutura populacional e a diversidade genética. A análise e posterior construção do dendograma
foram realizadas através do programa MEGA 4.1 (Máxima Parcimônia com função Bootstrap, 1000 replicacões). A
matriz de dados incluiu 168 bandas polimórficas em nível intraespecífico e 247 quando incluídos polimorfismos em
nível interpopulacional (entre API e IB). Os indivíduos de IB apresentaram-se menos polimórficos do que os coletados
em API, o que pode ser explicado através da localização geográfica de ambas as populações, sendo IB mais isolada
(tratando-se de uma ilha fluvial) o que pode dificultar a polinização cruzada entre espécimes de localidades diferentes.
O dendograma gerado apresentou quatro clados principais, sendo o grupo I formado pelo indivíduo CH001(5)-IB, o
que pode ser explicado pelo isolamento geográfico e conseqüente diferenciação deste em relação aos demais. Foi possível
observar uma separação tanto a nível interespecífico quanto interpopulacional dos indivíduos, sendo coerentemente
agrupados taxonomicamente. Estes estudos preliminares indicam que possivelmente há distinções populacionais para as
duas espécies sem indicação de possíveis eventos de hibridização ou fluxo gênico entre as mesmas. Através do marcador
DAF destacaram-se vários níveis polimórficos, indicando ser esta abordagem promissora e eficiente, devendo a seguir
ser ampliada para outras populações e áreas de estudo, de modo a fornecer um panorama mais amplo sobre o fluxo
gênico de populações urbanas e peri-urbanas.
Apoio: CNPq, UFPE.
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Análise da variabilidade genética de
cultivares de feijão com marcadores ISSR
Buso, GSC1; Ciampi, AY1; Amaral, ZPS1; Sartori MF1; Leão, DA1; Mazzucato, A2
1
Laboratório de Genética Vegetal Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
Dipartimento di Agrobiologia e Agrochimica (DABAC) of Università degli Studi della Tuscia, Viterbo
2
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, marcador molecular, Fabaceae, Variabilidade genética, Inter simple sequence repeats
O feijão é um alimento importante, principalmente em países em desenvolvimento, onde é utilizado como fonte primária
de proteínas, ferro e carboidratos. A média de produtividade no Brasil, no entanto, é baixa, em virtude, principalmente,
da complexidade dos sistemas e épocas de cultivo e, também, da estreita variabilidade genética das cultivares comerciais
em uso. Uma das alternativas para incrementar esta produtividade é a melhor utilização dos recursos genéticos existentes,
como fonte de introdução de variabilidade genética nos programas de melhoramento. O conhecimento da extensão
e distribuição da variabilidade genética das espécies cultivadas é uma condição básica para incrementar a utilização
do germoplasma nesses programas. Para esta finalidade, marcadores moleculares fornecem a melhor estimativa da
diversidade genética, pois são independentes de efeitos ambientais. A técnica de marcadores ISSR envolve a amplificação
de DNA por PCR, usando um único primer composto de uma seqüência de microssatélite, ancorado na região 3`ou
5`por dois a quatro nucleotídeos arbitrários e sempre degenerados. São supostamente, marcadores nucleares neutros
e dominantes, reproduzíveis e não requerem conhecimento prévio da seqüência genômica. A utilização de ISSRs
(Inter simple sequence repeats) tem sido uma forma rápida, simples e barata para acessar a diversidade, para identificação
de cultivares e populações geneticamente próximas e para estudos de processos evolucionários, como sistemas reprodutivos
e fluxo gênico. Foram analisadas 6 cultivares de feijão (Rim de porco, Enxofrão2, Enxofrão3, Rosinha, Paraná, Jalo1)
com 5 amostras de cada. Utilizou-se 9 primers ISSR que apresentaram marcadores no mapa referência de feijão
(Bat93 X Jalo EEP558), e nas cultivares analisadas amplificaram 26 marcadores. ISSR mostrou-se promissora,
reproduzível para detecção de variabilidade entre cultivares, não mostrando variação entre amostras da mesma cultivar
o que é esperado em uma espécie autógama.
Apoio Financeiro: Projeto Biodiversidade Brasil-Italia (PBBI).
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Análise in silico de relações filogenéticas entre
34 representantes da família Cyperaceae
baseadas em seqüências de ITS e rbcL
Cruz, GAS1; Pinangé, DSB1; Alves, MV 2 Benko-Iseppon, AM1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sistemática molecular, DNA plastidial, Eleocharis, Cyperus, Máxima parsimônia
Relações filogenéticas entre os diversos organismos estão entre os principais alvos de múltiplos estudos. Este trabalho
objetivou analisar in silico as relações biossistemáticas entre 34 representantes da família Cyperaceae usando seqüências
de aminoácidos e de nucleotídeos de genes conhecidos e transcritos internos a partir de dados do GenBank (NCBI). As
seqüências de nucleotídeos foram obtidas a partir de seqüências de DNA relativas aos genes de RNAr 5,8S, 26S e ITS2,
enquanto que as de proteínas foram provenientes de DNA de cloroplastos para a subunidade maior da ribulose 1,5
bifosfato carboxilase/oxigenase. Trata-se da primeira análise combinada de ambos grupos gênicos para os taxa em
questão. Para construção das árvores filogenéticas seqüências de nucleotídeos e aminoácidos foram alinhadas no Clustal
X 1.81 sendo posteriormente submetidas ao método de análise Máxima Parsimônia (MP) do programa Mega 4. Os
alinhamentos de nucleotídeos e aminoácidos se mostraram bastantes discrepantes, uma vez que se observou uma maior
conservação para aminoácidos do que para nucleotídeos, decorrente provavelmente da degeneração do código genético.
Em dados de nucleotídeos ocorreu a separação das espécies em quatro grupos, onde o externo (Grupo I) foi caracterizado
por uma única espécie (Schoenoplectus americanus). Nas três espécies do gênero Eleocharis (E. parvula, E. compressa
var. acutisquamata e E. albida) foi verificada grande proximidade, sendo estas localizadas em clados basais. Em relação
aos dados de aminoácidos foi obtida a separação dos táxons em quatro e três grupos, com o Grupo I representado por
Scirpus polystachyus. As árvores geradas na análise dos genes de ITS apresentaram valores de bootstrap mais elevados
(média de 90), quando comparados à inferência com rbcL. Em contrapartida ao que foi observado para nucleotídeos,
o Grupo I de aminoácidos não apresentou similaridade mais apurada. Para os genes de ITS, Lipocarpha microcephala
foi agrupada como espécie intermediária entre os grupos III (Cyperus) e IV (Uncinia e Carex) onde, o III se mostrou
mais próximo desta espécie (bootstrap de 99%). O mesmo aconteceu com Ficinia radiata (43% - bootstrap), na análise
de MP para aminoácidos, onde a mesma foi intermediária entre os grupos de Eleocharis e Cyperus, gêneros conhecidos
por apresentarem grandes complexos específicos. As demais espécies estudadas foram reunidas de maneira coerente
e esperada, ou seja, agrupando espécies pertencentes ao mesmo gênero e separando os gêneros distintos em clados
separados. A partir dos dados obtidos fica clara a relevância deste tipo de análise na geração de conhecimento para um
melhor entendimento filogenético do grupo em estudo. Portanto, a fim atingir maior consistência e abrangência das
relações filogenéticas de Cyperaceae é sugerido para trabalhos futuros um aumento no número de espécies bem como
a combinação de diversas seqüências (nucleares e extra-nuclares).
Apoio financeiro: UFPE.
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Fluxo gênico entre Gossypium barbadense
e Gossypium hirsutum, de regiões de Minas
Gerais e Bahia
Rocha, CES1; Santos, MCVG1,2; Azevedo, GR1,3; Ciampi, AY1
Laboratório de Genética Vegetal, EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia
2
Centro Universitário de Brasília - UniCeub
3
Universidade de Brasília – UNB
[email protected]
1
Palavras-chave: Gossypium, microssatélites, PCR, alotetraplóides, organismos geneticamente modificados
O Brasil é considerado um importante centro de diversidade de Gossypium com ocorrência da espécie silvestre G.
mustelinum, endêmica (não cultivada) e G. barbadense naturalizada. G. hirsutum e G. barbadense co-existem em diversas
regiões do Brasil e seus sistemas reprodutivos evidenciam que são sexualmente compatíveis. Esses algodoeiros silvestres
e naturalizados são arbustos perenes que produzem fibras curtas de pouco interesse econômico, enquanto G. hirsutum
é herbáceo, precoce e com elevado potencial produtivo. G. hirsutum e G. barbadense são espécies alotetraplóides,
co-ocorrendo em diversas regiões do Brasil, o que pode levar a troca de alelos entre os organismos geneticamente
modificados e seus correspondentes nativos e naturalizados. Entretanto através de análises genéticas com emprego de
marcadores moleculares, é possível verificar a ocorrência de fluxo gênico entre diferentes espécies. Assim os marcadores
baseados em PCR (Polimerase Chain reaction), como os microssatélites (simple sequence repeats – SSR) são excelentes
ferramentas neste tipo de abordagem. Com o objetivo de verificar a ocorrência de fluxo gênico entre populações de
G. barbadense e G. hirsutum, amostras de DNA foram genotipadas por locos SSR. Foram utilizadas folhas dessecadas
em sílica gel de 94 acessos de barbadense, coletados em regiões da Bahia e Minas Gerais e duas amostras de hirsutum
(algodão comercial). A extração do DNA foi feita a partir do método CTAB 2%, foram preparadas as reações de PCR
com cinco primers: BNL 3103; BNL 3034; BNL 1317; CML 43; CML 63. A detecção de fragmentos foi realizada em
géis desnaturantes de poliacrilamida 4% e corados com nitrato de prata. A comparação de alelos entre G. barbadense
e G. hirsutum foi realizada, não verificando nenhum alelo comum entre os dois algodoeiros. Esse resultado demonstra
que não há fluxo de genes de G. hirsutum em G. Barbadense, entretanto recomenda-se dar continuidade as análises,
aumentando-se o número amostral, para se obter maior confiabilidade dos resultados.
Apoio Financeiro: Finep/Funarbe e CNPq.
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Desenvolvimento de biblioteca enriquecida
em microssatélites para a árvore de mangue
Avicennia schaueriana (Acanthaceae)
Mori, GM1; Zucchi, MI2, Sampaio, MI da C3, Souza AP1
1
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas
Centro de Pesquisas e Desenvolvimento em Recursos Genéticos Vegetais, Instituto Agronômico de Campinas
3
Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará
[email protected]
2
Palavras-chave: Avicennia schaueriana, mangue, microssatélite
Os manguezais são considerados um dos ecossistemas tropicais mais ameaçados, estando em um nível tão crítico ou até
mesmo mais preocupante quando se compara com os recifes de corais ou com a Mata Atlântica. Há estimativas de que,
nos últimos 50 anos, um terço da área mundial com manguezais tenha sido destruída e, em relação ao Brasil, segundo
país em extensão de florestas de mangue, estima-se que, entre 1983 e 1997, 46,4% da área de manguezais foi perdida.
Esses ecossistemas apresentam uma baixa diversidade de plantas superiores dominantes, havendo no mundo, 34 espécies
em cinco gêneros de “plantas verdadeiras de mangue”. No entanto no Brasil esta diversidade é ainda menor: há apenas
seis espécies de árvores de mangue distribuídas em três gêneros. Um destes é o gênero Avicennia que está distribuído,
no Brasil, desde o extremo norte do nosso litoral até aproximadamente a Ilha de Florianópolis, em Santa Catarina. Em
nosso país, há apenas duas espécies do gênero, A. germinans e A. schaueriana, as quais apresentam distribuições distintas,
havendo apenas uma zona de simpatria, na região norte do país. Este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento
de marcadores microssatélites para A. schaueriana. Uma biblioteca genômica enriquecida em (CT)8 e (GT)8 foi feita
a partir do DNA genômico extraído de um indivíduo de A. schaueriana da região de Bragança-PA. Dos 288 clones
positivos isolados, até o momento, 96 foram seqüenciados. Utilizando-se o software web-based SSRIT (www.gramene.org),
buscaram-se microssatélites simples perfeitos e foram encontrados 53, dos quais apenas dois são de repetições com
motivos trinucleotídeos e os demais são de repetições de motivos dinucleotídeos. Os motivos mais encontrados foram
GT/AC e TG/CA, com 22 e 19 SSRs respectivamente. Esses resultados podem ser explicados pelos motivos com os quais
a biblioteca foi enriquecida. Os próximos passos serão o isolamento e a caracterização dos marcadores seqüenciados, o
desenvolvimento de primers e a avaliação do polimorfismos desses microssatélites. Pretende-se, com esses marcadores,
estudar aspectos populacionais e reprodutivos de A.schaueriana.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Análise filogenética de um cDNA homólogo
à ciclofilina (Cyp51) em tomateiro
Estevam, RK1; Ferreira, DC1; Peres, LE2; Medeiros, SRB1; Agnez-Lima, LF1; Scortecci, KC1
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Biologia Celular e Genética, UFRN
Departamento de Ciências Biológicas, ESALQ/USP
[email protected]
Palavras-chave: Floração, Cyp51, Biblioteca Subtrativa, Relações Filogenéticas
O processo de floração é marcado pela conversão do meristema apical vegetativo em meristema reprodutivo, devido
a interações entre diversos fatores, tanto internos quanto externos à planta. No modelo vegetal Arabidopsis thaliana
foram encontrados vários genes e proteínas relacionados a este processo e são propostas pelo menos quatro vias que
induzem à floração. Os conhecimentos moleculares gerados sobre a floração em A. thaliana podem ser comparados
com outras espécies de interesse. O objetivo deste trabalho foi de prospectar genes associados à floração em tomateiro.
Para isto, foram construídas bibliotecas subtrativas utilizando ápices meristemáticos de Lycopersicon esculentum cv
Micro Tom e L. pimpinellifolium. Foram construídas oito bibliotecas subtrativas. Para isto, foram utilizados os kits:
Super Smart cDNA synthesis e BD Clontech PCR select cDNA subtraction (Clontech). O material obtido foi clonado no
vetor pGEM T-easy (Promega) e transformado em células competentes de E. coli DH10B. Os clones obtidos foram
seqüenciados e analisados utilizando o programa BLASTn contra o banco de dados do NCBI. Foram encontrados
praticamente em todas as bibliotecas cDNAs homólogos a fatores de transcrição, transdução de sinais, compactação
do DNA e uma grande parcela (58-65 %) de genes desconhecidos. Neste trabalho foi realizado uma análise in silico
de um cDNA homólogo ao gene Cyp51. O gene Cyp51 é essencial para a biossíntese de esteróis que servem como
precursores de moléculas bioativas, tal como, em plantas, nos brassinosteróides (BRs) os quais possuem importante
função no desenvolvimento, incluindo o alongamento e divisão celular, diferenciação vascular, senescência e respostas
aos estresses. Foi realizado uma análise in silico utilizando os bancos de dados do NCBI, TAIR, TIGR POTATO,
WHEAT, Medicago truncatula, MAIZE e RICE, e no SGN, considerando um E-value <1.0x10-15 como critério de
exclusão. Os alinhamentos múltiplos foram desenvolvidos utilizando o ClustalW, com a caracterização de domínios
funcionais. Como resultado, foi observado uma conservação no domínio P450 superfamily em todas as seqüências
utilizadas, este domínio é característico em Cyp51 por ser ortólogo da família do citocromo P450. Foi também realizada
a reconstruções filogenéticas com o programa PAUP. A relação filogenética sugere uma evolução independente entre
mono e dicotiledôneas, as quais estão agrupadas, em cada ramo, em famílias. Entretanto, como o processo de floração
em plantas não-modelo ainda é pouco compreendido, é importante no futuro analisar a expressão gênica deste cDNA
em diferentes tecidos de tomateiro de modo a caracterizar a função deste.
Apoio financeiro: CNPq.
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Divergência genética entre 100 acessos
do banco de germoplasma de feijão da
Universidade Federal de VIÇOSA (BGF – UFV)
Santana, CP1; Carneiro, PCS1; Carneiro, JES2; Faria, GMP1; Menezes Junior, JAN2; Silva, VMP1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
2
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Banco de germoplasma, feijoeiro, divergência genética
A espécie Phaseolus vulgaris L. (feijão comum) possui dois centros de origem, o mesoamericano e o andino. O grande
número de acessos em coleções ex situ, fora do seu centro de origem, evidencia a ampla diversidade genética desta
espécie. A diversidade genética de uma espécie é uma importante forma de manter sua capacidade natural de responder
às mudanças climáticas e a todos os tipos de estresses bióticos e abióticos. A maior coleção de germoplasma de feijoeiro
encontra-se no Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT, Colômbia), que reúne mais de 30 mil acessos.
A Universidade Federal de Viçosa (UFV) também conta com uma coleção de germoplasma de feijoeiro, oriunda de
coletas internacionais e regionais, além da coleção de trabalho do Programa de melhoramento do feijoeiro da UFV,
incluindo linhagens, cultivares comerciais e fontes de resistência aos principais patógenos que acometem a cultura. Um
dos maiores problemas encontrados em bancos de germoplasmas é o custo de manutenção dos acessos e a dificuldade de
disponibilização de material para a pesquisa por falta de conhecimento. Para minimizar estas limitações, a caracterização e
avaliação da diversidade permitem a compreensão da variabilidade existente na coleção e constituem atividades prioritárias
no manejo do banco de germoplasma. Em março de 2007, foi instalado um experimento no campo experimental de
Coimbra-MG visando à caracterização de 100 acessos do banco de germoplasma de feijão da Universidade Federal de
Viçosa (BGF-UFV) com base em 19 descritores morfológicos necessários à proteção legal de cultivares, preconizada
no Decreto nº. 2366/97. Para tal utilizou-se como delineamento, um látice triplo (10x10), com três repetições, com
parcelas de três linhas de dois metros e espaçamento de 0,6m entre as linhas. Para a análise da divergência, obteve-se a
matriz de distâncias Euclidianas, com base nas médias dos dados morfo-agronômicos e esta foi analisada pelo método
hierárquico do vizinho mais próximo, gerando um dendrograma. Com um corte vertical a uma distância de ligação
de 25,94 no agrupamento hierárquico, observou-se a formação de 10 grupos, com pelo menos dois acessos, indicando
elevada diversidade entre os acessos avaliados. Constatou-se que o descritor peso de 1000 sementes foi o que teve
maior contribuição relativa, pelo método de Singh (1981), para a diversidade genética entre os 100 genótipos de feijão
estudados e, pela análise de componentes principais, foram identificados nove descritores que menos contribuíram
para a discriminação dos acessos sendo eles: presença de halo, produtividade, ápice da vagem, forma do dente apical
da vagem, brilho da semente, cor secundária da vagem, tipo de planta, forma da semente e perfil da vagem.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPEMIG.
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Filogenia molecular da subfamília
pantropical Lasioideae (Araceae) baseada
no marcador plastidial matk
Sales, VA1; Collevatti, RG1; Boyce, PC2; Gonçalves, EG1
Laboratório de Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília
2
Malesiana Tropicals, Kuching, Sarawak, Malaysia
[email protected]
1
Palavras-chave: Filogenia molecular, Lasioideae, Dracontium, matk, biogeografia
A subfamília Lasioideae (Araceae) é pantropical e agrega os gêneros neotropicais Dracontium L., Urospatha Schott,
Anaphyllopsis A.Hay e Dracontioides Engl., os gêneros asiáticos Lasia Loureiro, Podolasia N.E.Br., Pycnospatha Thorel
ex Gagnepain, Anaphyllum Schott e Cyrtosperma Griffith e o gênero africano Lasimorpha Schott. Dos dez gêneros que
formam a subfamília, pelo menos oito são principalmente compostos por espécies fortemente associadas a cursos de
água ou áreas pantanosas, sendo o helofitismo considerado plesiomórfico para o grupo. Dentre os gêneros neotropicais,
revisões recentes são conhecidas apenas para Anaphyllopsis, Dracontioides e Dracontium, mas as relações entre estes e
os gêneros restantes permanecem incógnitas. A última revisão da subfamília foi realizada por Hay em 1992, mas sua
taxonomia é ainda confusa. Uma reavaliação se faz necessária, não apenas para elucidar a circunscrição dos gêneros
desta subfamília, mas também para reconstruir as relações biogeográficas entre as floras sul-americanas, africanas e
asiáticas. No presente trabalho, para reconstruir a filogenia molecular, seqüências nucleotídicas do marcador plastidial
matK foram analisadas para 23 espécies, cobrindo todos os gêneros incluídos em Lasioideae, além de 3 grupos externos.
Para o marcador estudado, os gêneros reconhecidos para a subfamília surgem como um grupo monofilético fortemente
sustentado, confirmando o reconhecimento já antigo deste grupo baseado em morfologia. Em nossas análises, o gênero
mais diverso da tribo - Dracontium - surge como um clado monofilético, onde a idiossincrática espécie D. margaretae
surge profundamente aninhada dentro do gênero. O aspecto peculiar observável em D. margaretae (plantas plurifoliadas
com partições lineares quase e desprovidas de limbo) parece surgir em resposta à colonização de lagoas estacionais e
deve ser secundário dentro do gênero. Nossos dados também confirmam a condição plesiomórfica para o helofitismo
na subfamília. Outro resultado relevante é presença tanto de grupos neotropicais quanto paleotropicais (asiáticos) na
base do cladograma, possivelmente sugerindo uma radiação precoce para o grupo.
Apoio Financeiro: CNPq e Instituto Plantarum de Estudos da Flora Ltda.
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Isolamento e caracterização de microssatélites
de Vellozia gigantea (Velloziaceae), Espécie
endêmica da Serra do Cipó, Minas Gerais
Martins, APV1; Pena, IF2; Dias, F2; Borba, EL1; Kalapothakis, E2
Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Laboratório de Sistemática Vegetal, Universidade Federal de Minas Gerais
ICB, Departamento de Biologia Geral - Genética, Laboratório de Biotecnologia e Marcadores Moleculares, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Vellozia gigantea, microssatélite, variabilidade genética, Velloziaceae, canela-de-ema
Os marcadores moleculares são amplamente utilizados para estudos de genética humana, forense, biologia reprodutiva,
biologia evolutiva, e é crescente a sua utilização em genética de conservação. Dentro da área de genética de conservação,
os marcadores moleculares do tipo microssatélite podem ser empregados para estimar o fluxo gênico entre as populações
de espécies ameaçadas e estimar sua variabilidade genética. Essas estimativas permitem determinar ações práticas de
manejo que devem ser implementadas com a finalidade de assegurar a preservação da espécie. Neste trabalho foi
montada uma biblioteca genômica primaria não enriquecida a partir do DNA extraído de um indivíduo de V. gigantea,
espécie endêmica da Serra do Cipó (Minas Gerais, Brasil) e cujas populações são todas, de imediato, ameaçadas pelos
incêndios recorrentes, pela exploração mineral e pela extração predatória. Uma hibridização com sonda radioativa de
temas repetidos foi realizada com 910 desses clones para a triagem de microssatélites. Vários clones foram submetidos
ao seqüenciamento automático e 7 regiões contendo microssatélites, perfeitos e imperfeitos, foram encontrados com
tamanho variando entre 21 e 72 pares de bases. Estamos trabalhando na caracterização das regiões contendo os seguintes
microssatélites, (TA)27, (AAAT)3(AAT)3(AAT)8, (CT)16(CT)20, (GA)7(GA)3(GA)7, (TTC)7, (TA)3(TA)8(TA)3(TA)4.
Os primers desenvolvidos para esses marcadores poderão ser utilizados futuramente para estudos com outras espécies
dracenóides de Vellozia, além de outros complexos de espécies do gênero, sendo aplicados à sistemática, biogeografia,
conservação e entendimento de processos ecológicos e evolutivos no grupo.
Apoio Financeiro: FAPEMIG, CNPq, PRONEX, CAPES,
Martins, APV _ bolsista de iniciação científica CNPq, Ladeira, FD _ bolsista de doutorado CNPq, Kalapothakis, E
_ pesquisador IC CNPq.
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Diversidade Clonal em Populações de
Lymania azurea (Bromeliaceae) Detectada
Através de Marcadores RAPD
Pamponét, VCC; Fontoura, T; Gaiotto, FA
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: Genética de Populações, Mata Atlântica e Conservação
Lymania azurea é uma espécie endêmica da região sul da Bahia, que habita o sub-bosque, sendo epífita e de crescimento
clonal, formando grupos sobre os troncos que possuem de 2 a 10 ramets. Cada agrupamento constitui um único indivíduo,
genet. Esta espécie encontra-se ameaçada de extinção e por ser de ocorrência restrita, pode ser dizimada por perda de
habitat. O hábito clonal geralmente restringe a variabilidade genética de uma população. Entretanto, como relatado na
literatura, é possível encontrar diversidade genética semelhante a plantas de reprodução sexuada entre plantas clonais,
inclusive entre espécies da família Bromeliaceae. O objetivo deste trabalho foi avaliar o hábito clonal descrito para a
espécie Lymania azurea. Foram analisadas quatro subpopulações do estado da Bahia, três no município de Una-BA
e uma no município de Ilhéus-BA. Para a análise genética foram amostrados três ramets de 19 genets, totalizando 57
ramets em quatro subpopulações. Foram selecionados 10 primers que geraram 48 marcadores polimórficos. O índice
de similaridade genética de Jaccard mostrou diversidade dentro de genets, ou seja, variabilidade genética entre clones
(ramets). Eram esperados 19 genets no dendrograma, mas apenas dois genets foram confirmados como pertencendo a um
único genótipo. Entre os genets esperados, apenas 25% revelaram similaridade de 0,8 a 1,0. Nestes casos pode-se sugerir
que mutações somáticas estão adicionando variabilidade genética entre clones. Os demais 75% dos genets apresentaram
pares de ramets muito divergentes (0,2 à 0,8 de similaridade genética). A análise molecular de variância revelou 40% de
diversidade dentro de genets, evidenciando uma variabilidade anteriormente subestimada caso esta espécie continuasse
sendo tratada como de hábito clonal.
Apoio Financeiro: FAPESB, CNPq e Biodiversitas.
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Análise de relações genéticas entre
espécies silvestres de Arachis, por meio de
marcadores microssatélites fluorescentes
Gouvea, EG1,2; Oliveira, MAP1; Lustosa, FLF1,2; Leal-Bertioli, SCM1; Guimarães, PM1; Valls, JFM1; Bertioli, DJ2; Moretzsohn, MC1
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C.P. 02372, CEP 70.770-900, Brasília, DF
Universidade Católica de Brasília, Campus I, QS 07, Lote 1, Águas Claras, CEP 71966-700, Brasília, DF
[email protected]
2
Palavras-chave: amendoim, SSR, transferibilidade, UPGMA, melhoramento genético
O gênero Arachis é dividido em nove seções, sendo a seção Arachis o maior grupo e o de maior interesse, por incluir o
amendoim cultivado (A. hypogaea) e seus prováveis progenitores. Algumas questões sobre a diversidade e a afinidade
das espécies dessa seção são controversas. A análise da variabilidade genética existente nas espécies silvestres de Arachis é
fundamental para um melhor entendimento sobre as relações genéticas entre os acessos e espécies encontrados em coleções
de germoplasma; para conservação e um melhor gerenciamento desses bancos; para a identificação das espécies ancestrais
de A. hypogaea, ainda objeto de debate e para possibilitar seu uso em programas de melhoramento genético. O uso de
marcadores moleculares para análises de variabilidade genética entre indivíduos e populações tem-se mostrado de grande
utilidade. Técnicas de genotipagem estão sendo cada vez mais otimizadas, informativas, automatizadas e com custo eficaz.
Logo, o uso de marcadores microssatélites, juntamente com a detecção semi-automática dos fragmentos por fluorescência,
tem-se mostrado potente para cumprir muitos desses critérios. O objetivo deste trabalho foi, portanto, avaliar a variabilidade
genética de espécies da seção Arachis, utilizando marcadores microssatélites marcados com fluorescência. Foram amplificados
através de PCR, 30 locos de 180 acessos, incluindo 29 das 31 espécies descritas da seção Arachis. As distâncias genéticas
entre cada par de acessos foram obtidas pelo método dos alelos comuns (“allele shared distance”) e foi construído um
dendrograma pelo método UPGMA. As análises mostraram em geral, o agrupamento de acessos de uma mesma espécie,
assim como dos acessos com o mesmo tipo de genoma (genomas A e B). Arachis glandulifera, para a qual foi proposto
um novo genoma D, mostrou-se mais próxima do grupo de espécies com genoma B. Os acessos de A. kuhlmannii foram
divididos em dois grupos principais, distantes um do outro, confirmando diferenças morfológicas e de marcadores RAPD
observadas entre estes dois grupos, o que sugere que podem ser duas espécies separadas. Os resultados mostraram, ainda,
que os acessos de A. monticola e de A. hypogaea ficaram localizados em um mesmo grupo, de acordo com diversos autores
que têm sugerido tratar-se de uma única espécie. Os marcadores microssatélites utilizados, que foram desenvolvidos em sua
grande maioria para A. hypogaea, mostraram uma alta transferibilidade entre as espécies da seção Arachis, o que possibilita seu
uso em diversos estudos, incluindo mapeamento comparativo. Por apresentarem resistências a diferentes estresses bióticos e
abióticos, espécies silvestres de Arachis constituem uma importante fonte de genes úteis para o amendoim. Dessa forma, o
conhecimento da extensão e distribuição da variação genética disponível no amendoim cultivado e seus parentes silvestres,
serão de grande utilidade para seu uso eficiente nos programas de melhoramento de genético, visando, principalmente,
a melhores resultados na agricultura.
Apoio Financeiro: Generation Challenge Program (Project 31) e The European Union Grain Legume Integrated
Project (GLIP).
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Análise da variabilidade genética de acessos
de amendoim (Arachis hypogaea L.) com
marcadores microssatélites fluorescentes
Lustosa, FLF1,2; Gouvea, EG1,2; Leal-Bertioli, SCM1; Guimarães, PM1; Valls, JFM1; Bertioli, DJ2; Moretzsohn, MC1
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C.P. 02372, CEP 70.770-900, Brasília, DF
Universidade Católica de Brasília, Campus I, QS 07, Lote 1, Águas Claras, CEP 71966-700, Brasília, DF
[email protected]
2
Palavras-chave: Arachis hypogaea, variedades botânicas, SSR, UPGMA, melhoramento genético
O amendoim cultivado (Arachis hypogaea L.), leguminosa semi-tropical nativa da América do Sul, é uma importante
fonte de óleo comestível e de proteínas. A avaliação da variabilidade genética é essencial para manutenção e uso
do germoplasma de uma espécie. No presente estudo, 33 marcadores microssatélites fluorescentes, otimizados em
18 sistemas multiplex através do programa Multiplexer 4.0, foram utilizados para análise da variabilidade genética de
150 acessos de amendoim e dois acessos de A. monticola. Esses acessos foram provenientes de diferentes regiões geográficas
da América do Sul, representando as duas subespécies (fastigiata e hypogaea) e as seis variedades botânicas descritas
(fastigiata, vulgaris, aequatoriana, peruviana, hypogaea e hirsuta), além de tipos locais algo discrepantes, cultivados no Parque
Indígena do Xingu. As distâncias genéticas entre os acessos foram calculadas pelo método dos alelos comuns (“shared
allele distances”) e um dendrograma foi construído pelo método UPGMA. Cinco grupos principais foram formados,
reunindo, de maneira geral, os acessos pertencentes às mesmas variedades. Esses resultados foram consistentes com a
classificação taxonômica atual, exceto para as variedades peruviana e aequatoriana, que mostraram maior similaridade
genética com acessos pertencentes à subespécie hypogaea do que com as outras duas variedades da subespécie fastigiata.
As análises de agrupamento indicaram, ainda, que os acessos coletados no Parque Indígena do Xingu mostraram-se
geneticamente próximos da subespécie hypogaea, sugerindo que esse material pertence a esta subespécie. Apesar de
diversos estudos mostrarem que o amendoim cultivado possui uma estreita base genética, os marcadores SSR utilizados
no presente estudo detectaram consideráveis níveis de variabilidade. Além disso, grupos de similaridade entre acessos
foram estabelecidos e serão de grande utilidade na seleção de plantas a serem usadas como parentais em programas de
melhoramento genético e na construção de mapas genéticos.
Apoio Financeiro: Generation Challenge Program (Project 31) e The European Union Grain Legume Integrated
Project (GLIP).
184
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Produção e caracterização de anfidiplóides
sintéticos entre espécies silvestres de Arachis
Santos, SP1; Moretzsohn, MC2; Bertioli, DJ3
Universidade Católica de Brasília, Campus I, QS 07, Lote 1, Águas Claras, CEP 71966-700, Brasília, DF
2
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C.P. 02372, CEP 70.770-900, Brasília, DF
3
Universidade Católica de Brasília, Campus II, SGAN 916, CEP 70.790-160, Brasília, DF
[email protected]
1
Palavras-chave: Amendoim, hibridização, microssatélites, introgressão, melhoramento genético
Por volta de 10 mil anos atrás o homem deixa de ser nômade e passa a dominar o cultivo de algumas plantas. Registros
fósseis indicam que o amendoim foi domesticado por índios há 3.500 anos na América do Sul. Sua rica composição
química faz do amendoim útil para diversas aplicações. Selecionadas por meio do cultivo, desde então, muitas características
morfológicas e de produtividade foram substancialmente escolhidas, o que levou a um grande estreitamento da base
genética. Este trabalho teve como objetivo estabelecer um método funcional de hibridização, para intercruzar espécies
silvestres da seção Arachis com genoma “A” e espécies com genoma “B”, visando sua utilização em programas de
melhoramento genético. Nesses cruzamentos foram utilizadas como parentais femininos espécies silvestres diplóides
de genoma “B” (A. magna, A. ipaënsis e A. batizocoi) e como parentais masculinos, espécies diplóides de genoma “A”
(A. correntina e A. villosa). Foram feitas estacas das plantas obtidas destes cruzamentos, que foram imersas em solução
de colchicina a 0.2%, para duplicação do genoma “AB” dos híbridos, tornando-se “AABB”. Dessa forma, podem ser
cruzados com A. hypogaea, também com genoma “AABB”, desfazendo o gargalo genético (“genetic bottleneck”) ocorrido
na origem do amendoim cultivado. Foram obtidas 18 plantas híbridas, com as seguintes combinações: um cruzamento de
A. magna K30097 x A. correntina GP9548, dois A. ipaënsis KG 30076 x A. correntina, 10 A. batizocoi K9484 x A. correntina,
cinco A. batizocoi K9484 x A. villosa V12812. Os híbridos foram identificados por meio de marcadores microssatélites,
corridos em géis de poliacrilamida e posterior revelação com nitrato de prata. Os anfidiplóides sintéticos obtidos estão
sendo cruzados com A. hypogaea, visando à introgressão de genes de interesse para o melhoramento do amendoim.
Apoio Financeiro: Generation Challenge Program (Project 31) e The European Union Grain Legume Integrated
Project (GLIP).
185
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Desenvolvimento de linhagens de
introgressão (ILs) para o amendoim (Arachis
hypogaea L.) usando um anfidiplóide
sintético e marcadores microssatélites
Santos, RF1,2; Oliveira, MAP1; Gouvêa, EG1,3; Oliveira, UA3; Bertioli, DJ3; Moretzsohn, MC1*
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, C.P. 02372, CEP 70.770-900, Brasília, DF
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília (UnB), Campus Universitário, CEP 70.910-900, Brasília, DF
3
Universidade Católica de Brasília, Campus II, SGAN 916, CEP 70.790-160, Brasília, DF
*[email protected]
1
2
Palavras-chave: Arachis, espécies silvestres, SSR, melhoramento genético, linhagens de introgressão
O amendoim (Arachis hypogaea L.) é uma cultura importante internacionalmente, tanto para consumo direto, devido
ao seu alto conteúdo de proteína, como para produção de óleo, sendo cultivada em mais de 80 países nas Américas, na
Ásia e na África. A. hypogaea apresenta uma baixa variabilidade para diversas características de interesse agronômico,
tais como resistências a doenças como mancha preta (Cercosporidium personatum) e ferrugem (Puccinia arachidis), a
pragas e à restrição hídrica, típica do semi-árido brasileiro. O gênero Arachis é nativo da América do Sul e contém 80
espécies descritas, sendo diplóide a grande maioria. Essas espécies apresentam, em geral, maior variabilidade genética e
constituem uma importante fonte de genes para várias das características de interesse para o melhoramento do amendoim.
A exploração da variabilidade genética do germoplasma disponível de espécies silvestres de Arachis é ponto fundamental
para ampliar a base genética no desenvolvimento de populações adaptadas em programas de melhoramento genético.
Uma vez que a espécie cultivada é alotetraplóide (AABB), a transferência de genes de resistência para o amendoim é
feita via cruzamentos envolvendo anfidiplóides sintéticos de espécies silvestres. Para o desenvolvimento das linhagens
de introgressão (ILs), plantas da variedade elite IAC Runner 886 foram cruzadas com o anfidiplóide sintético A.
duranensis (genoma AA x A. ipaënsis (genoma BB). As 205 plantas resultantes foram genotipadas com oito marcadores
microssatélites, para identificação dos híbridos. Na estação de cruzamentos de 2006/07, 43 híbridos RC1 foram
obtidos, e a partir destes, 40 híbridos RC2 foram produzidos na estação de cruzamentos de 2007/08. Dessa forma, os
segmentos exóticos doados pelo anfidiplóide sintético serão ilhados em um “background” do genoma da variedade elite
cultivada, formando linhagens com uma alta porcentagem do genoma do parental recorrente vinculada a uma pequena
fração do genoma do parental doador. No conjunto de todas as linhagens, o genoma completo do anfidiplóide estará
representado. Essa metodologia permitirá uma análise fenotípica de um QTL específico através da comparação entre
duas ou mais linhagens e/ou o parental cultivado. Essas linhagens de introgressão, desenvolvidas a partir de espécies
silvestres de Arachis, com o auxílio de marcadores moleculares, abrem novas perspectivas para introgressão e clonagem
de genes úteis para o amendoim.
Apoio Financeiro: Generation Challenge Program (Project 31) e The European Union Grain Legume Integrated
Project (GLIP).
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Desenvolvimento de marcadores
microssatélites para jequitibá-rosa
(Cariniana legalis) através da estratégia
de biblioteca genômica enriquecida
Leal, JB; Ciampi, AY; Gaiotto, FA
Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC, PPG Genética e Biologia Molecular, Ilhéus, BA
[email protected]
O jequitibá-rosa (Cariniana legalis Mart. O. Kuntze) representa uma das árvores gigantes da Floresta Atlântica, distribuise geograficamente desde o estado do Alagoas até São Paulo. Devido à utilização madeireira e perda de habitat, a espécie
encontra-se em risco de extinção, classificada na categoria vulnerável da lista vermelha da IUCN (2007). Por isso, faz-se
necessária a elaboração de estratégias de conservação para a espécie. Avanços no conhecimento genético de espécies
arbóreas em condições naturais podem contribuir na construção de indicadores para monitorar ações como: tamanhos
mínimos viáveis de reservas florestais e fluxo gênico para estabelecimento de corredores. O conhecimento genético
necessário para a realização de tais ações só é possível através de análises moleculares. As ferramentas genéticas mais
eficientes para tal fim são os marcadores moleculares microssatélites (SSR). A técnica de enriquecimento de biblioteca
genômica tem sido a mais utilizada para o desenvolvimento de SSR em espécies arbóreas. Assim, este trabalho teve
como objetivo, obter um conjunto de 15 primers que amplificam locos independentes de microssatélites polimórficos
do genoma de C. legalis. O DNA genômico de um único indivíduo de C. legalis foi fragmentado com a enzima
Tsp (Biolabs) gerando fragmentos entre 300 e 800 pb. Fragmentos de DNA contendo regiões repetitivas e abundantes
em AG/CT foram selecionados através da hibridação com sondas (TC)13. O DNA recuperado foi clonado em plasmídeo
pGEMT e os transformantes foram obtidos por eletroporação em Escherichia coli. Observou-se que 67,8% eram de
colônias brancas (transformantes) e que 32,2% eram colônias azuis (não transformadas). Em seguida, foram realizadas
480 reações de PCR direto das colônias brancas, com primers complementares a regiões específicas do vetor. O produto
de PCR foi sequenciado. As seqüências próximas do plasmídeo e do adaptador foram descartadas, restando 42 seqüências
de boa qualidade contendo SSR. Foram desenhados 23 pares de primers de regiões microssatélites de C. legalis, que
serão disponibilizados para comunidade científica e permitirão a realização de estudos futuros de parâmetros genéticos
desta e de outras espécies da família Lecythidaceae.
Apoio financeiro: Fapesb.
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Variabilidade genética em erva-mate
(Ilex paraguariensis A. St. Hilaire) em
populações naturais da região noroeste
do Rio Grande do Sul
Cardoso, AC; Georg-Kraemer, JE
Laboratório da Biodiversidade Vegetal, Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada. Universidade Luterana do Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Marcadores moleculares, microssatélites, variabilidade genética, erva-mate, conservação
A erva-mate pertence à família Aquifoliaceae. É uma espécie arbórea e endêmica do continente Americano. Pode atingir
15 metros de altura, tem caule cinza, folhas ovais e fruto pequeno verde ou vermelho-arroxeado. Possui propriedades
medicinais e é de grande importância para a indústria alimentícia e farmacêutica, sendo uma espécie de forte apelo
econômico. O homem tem alterado a paisagem da floresta nativa e uma das principais conseqüências é a perda das
populações nativas com decorrente perda de variabilidade genética. Sendo a erva-mate uma das espécies ameaçadas
de extinção na região Noroeste do estado do Rio Grande do Sul, o presente trabalho tem como objetivo verificar a
variabilidade genética intrapopulacional e o grau de diferenciação existente entre populações remanescentes de ervamate da região Noroeste do Rio Grande do Sul. Estão sendo analisadas cinco populações naturais, sendo que de cada
população foram coletadas cinco sementes de cinco árvores femininas (planta-matriz), totalizando 125 indivíduos. As
sementes foram germinadas e as folhas coletadas para a extração de DNA. A técnica utilizada para extração de DNA
foi a descrita por Doyle e Doyle (1987) com modificações estabelecidas por Gauer (1999). A avaliação da variabilidade
populacional está sendo feita através primers heterólogos de microssatélites (SSR), desenvolvidos para a espécie Ilex
leucoclada (Torimaru et al., 2004). Obteve-se amplificação, em I. paraguariensis, com sete dos dez pares de primers
heterólogos testados, sendo que para dois houve a necessidade de baixar a temperatura de anelamento. As análises
populacionais já foram realizadas com três destes pares de primers. O número de alelos por loco variou de dois a quatro.
Para cada loco, o mesmo alelo foi o mais freqüente em todas as populações. A heterozigose observada média (Ho) foi
de 18,3%. A freqüência média de heterozigotos (HE) foi de 17,9%. O Índice de fixação de Wright (f ) foi de -0,0914.
As cinco populações analisadas também apresentaram uma baixa diversidade genética. O número médio de alelos por
loco (A) foi de 2,27, variando de dois a três. A proporção de locos polimórficos (P), foi alta em todas as populações. A
distância genética entre as cinco populações foi baixa e os valores observados para cada par de populações foram muito
semelhantes. Em função do baixo nível de variabilidade detectados nos locos microssatélites já estudados, novos locos
estão sendo investigados, visando otimizar a informação genética proporcionada por esses marcadores e se chegar a
conclusões definitivas sobre a variabilidade existente nestas populações.
Apoio financeiro: ULBRA.
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Variabilidade genética em jaborandi
(Pilocarpus pennatifolius Lemaire)
em populações naturais do noroeste
do Rio Grande do Sul
Bandeira, AJ; Georg-Kraemer, JE
Laboratório da Biodiversidade Vegetal. Programa de Pós Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada-PPGGTA. Universidade Luterana do Brasil-ULBRA
[email protected]
Palavras-chave: Marcadores ISSR, diversidade genética, conservação, Jaborandi, espécie nativa
O Jaborandi (Pilocarpus pennatifolius Lemaire) é uma planta importante da flora nativa brasileira, pelo seu valor medicinal,
econômico e ecológico. Devido à crescente degradação e fragmentação de florestas da Região Noroeste Colonial do
Rio Grande do Sul, espécies nativas que antes mantinham suas populações em níveis adequados, hoje se encontram
reduzidas, o que pode levar a perda de variabilidade genética, e até mesmo a extinção destas espécies. Este trabalho
tem como objetivo estudar a variabilidade intrapopulacional e o grau de diferenciação entre populações de Jaborandi,
uma das espécies incluídas em um projeto maior chamado “Reflorestamento com Espécies Ameaçadas de Extinção de
32 Municípios do Noroeste Colonial do Rio Grande do Sul”. Este projeto pretende conhecer a diversidade genética
de espécies florestais vulneráveis ao processo de fragmentação, gerando informações para um programa que visa à
formação de bancos de germoplasma e a criação de parques florestais na região. Para a análise da variabilidade genética
do Jaborandi, foi escolhido o marcador ISSR (Inter Simple sequence Repeats), por ser um marcador universal, além de
apresentar rápida e fácil manipulação, baixo custo e alta reprodutibilidade. As amostras analisadas são provenientes de
cinco populações naturais de Jaborandi de quatro municípios da região Noroeste Colonial do Rio Grande do Sul: São
Martinho, Augusto Pestana, Crissiumal e Catuípe onde foi coletado material de duas populações. De cada população
foram coletadas sementes de árvores femininas (plantas-matriz). Após, as sementes foram colocadas a germinar e, foram
coletadas folhas de cinco plântulas F1, de cinco plantas-matriz, por população, totalizando 125 indivíduos. A extração
de DNA, baseada no método de Doyle & Doyle (1987), foi adaptada para a espécie. Em um “screening” inicial para
11 primers, já foram selecionadas as condições ideais de amplificação e migração para o primer UBC 836 e este primer
tem se mostrado monomórfico para a maioria das bandas selecionadas para análise. Este monomorfismo, embora em
apenas um primer estudado, pode sugerir ausência da variabilidade genética na espécie estudada.
Apoio financeiro: ULBRA.
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Caracterização molecular de 56 híbridos de
Panicum maximum através de marcadores
microssatélites
Boaventura, LR1; Sousa ACS1; Silva, GMB1; Jank, L2; Souza, AP1
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) – Laboratório de Análise Genética e Molecular, UNICAMP, Campinas CEP 13083-970
2
EMBRAPA Gado de Corte, Campo Grande/MS
[email protected]
1
Palavras-chave: Forrageiras, microssatélites, marcadores moleculares, híbridos, Panicum maximum
Nos últimos anos o Brasil adquiriu um importante papel no mercado da exportação de carne principalmente pelo
crescente incentivo a pecuária do denominado “boi verde”, que evita a ocorrência de patologias relacionada à nutrição
como, por exemplo, a encefalopatia espongiforme bovina. Neste contexto, as forrageiras acabam ganhando projeção
por possuírem um alto valor nutricional para o rebanho. Panicum maximum, popularmente conhecido como capim
colonião, é uma espécie tetraplóide (2n=32 ou 36) que se reproduz por apomixia isto é, reprodução assexual por meio
de sementes. Através de cruzamentos sexuais foram produzidos híbridos que possuem maior vigor e tolerância a uma
mais ampla variação ambiental quando comparados com os genótipos parentais. Valendo-se do interesse econômico
que está espécie possui, este trabalho visa à caracterização de acessos híbridos obtidos a partir de cruzamentos de acessos
sexuais do BAG da EMBRAPA Gado de Corte-MS. Foram utilizados 10 microssatélites, para caracterizar cinqüenta e
seis genótipos híbridos e oito parentais de P. maximum. As reações de PCR foram realizadas para um volume final de
25 µl, contendo: 20mM de Tris-HCl pH 8,4; 50mM de KCl, 1,5mM de MgCl; 0,15mM de cada dNTP; 0,8mM de
primers (forward e reverse); 10ng de DNA e 0,1U de Taq DNA polimerase, em termocicladores PTC 100 da MJ Research.
O programa utilizado para amplificação consistiu de: 94°C por 1 minuto, 30 ciclos de 94°C 1 minuto seguido de 60°C
1 minuto, 72°C por 1 minuto e uma extensão final de 72°C por 5 minutos. Os produtos amplificados foram analisados
inicialmente em géis de agarose TBE 3%, e posteriormente em géis desnaturantes de poliacrilamida 6% corados com
nitrato de prata. Para realizar o estudo dos locos dos microssatélites entre os diferentes genótipos, foi calculado o valor
de PIC, o qual fornece uma estimativa do poder discriminatório de cada loco. O número de alelos/loco variou de
três a onze. PIC variou de 0,40 (53 e 54) até 0,86 (183 e 184). Para as análises de divergência genética foi utilizado o
programa NTSYS-PC versão 2.1, o qual gerou uma matriz de similaridade usando o coeficiente de Jaccard. A partir
desses resultados, foi possível constatar a eficiência dos microssatélites para determinar o polimorfismo e a diversidade
genética dentro da espécie. Esses resultados poderão auxiliar na seleção de novos genótipos com características superiores
e desejáveis para serem introduzidos nos programas de melhoramento.
Apoio: CNPq e FAPESP.
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Variabilidade genética em cana-de-açúcar
(Saccharum spp.), estimada por meio de
marcadores moleculares microssatélites (SSR)
Duarte Filho, LSC1; Silva, PP1; Santos, JM1; Barbosa, GVS1; Almeida, cCS2
Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Alagoas
2
Campus Arapiraca, Universidade Federal de Alagoas
1
[email protected]
Palavras-Chave: Cana-de-açúcar, Microssatélites, Diversidade genética, SSR, Melhoramento genético
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) tem papel importante na agricultura brasileira. O rendimento desta cultura tem
aumentado de forma significativa com o desenvolvimento de variedades adaptadas as condições de clima e solos. A
variabilidade genética apresenta grande importância no melhoramento genético, permitindo planejar os cruzamentos,
explorando de forma mais eficiente os recursos genéticos. O objetivo deste trabalho foi analisar a variabilidade genética
nos principais acessos de cana-de-açúcar do banco de germoplasma da Serra do Ouro, gerenciado pela Universidade
Federal de Alagoas, utilizando marcadores do tipo microssatélites (SSR). Foram analisados 18 marcadores microssátelites
em 30 acessos de cana-de-açúcar. Os resultados mostraram uma média de 3,2 alelos por loco, com um PIC que variou
de 0,34 a 0,78 para os primers ER3 e SCC2, respectivamente. O agrupamento dos acessos, usando o coeficiente de
similaridade genética de Jaccard, mostrou que a menor similaridade foi entre as variedades RB928064 e RB813804
(56,5%) e a maior similaridade foi entre as variedades RB93509 e RB931011 (95%), sendo de 77% a similaridade
média nos 30 acessos analisados. Os marcadores SSR mostraram-se eficientes para estimar a variabilidade genética
em acessos de cana-de-açúcar, com uma ampla variação no número de alelos. Os resultados de diversidade genética
sugerem que, para os acessos analisados, existe uma elevada similaridade genética, o que poderá diminuir os ganhos
genéticos no melhoramento.
Apoio Financeiro: CNPq, Banco do Nordeste, PMGCA.
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Estimativa da divergência genética
entre genótipos de feijão-caupi a partir
de análises multivariadas
Medeiros, AM1; Damasceno e Silva, KJ2; Assunção Filho, JR1; Rocha, MM2; Freire Filho, FR2
Iniciação Científica – Universidade Federal do Piauí
2
Embrapa Meio-Norte
[email protected]
1
Palavras-chave: Vigna unguiculata; Mahalanobis; Tocher; Variabilidade; Genótipos
Os estudos de divergência genética podem ser de grande importância para os programas de melhoramento de feijãocaupi (Vigna unguiculata L. Walp.), por fornecerem estimativas para a identificação de genitores que, quando cruzados,
aumentam as chances de seleção de genótipos superiores nas gerações segregantes. Objetivou-se, neste trabalho,
estimar a divergência genética entre genótipos de feijão-caupi por meio de técnicas multivariadas. Foram avaliados
16 genótipos de feijão-caupi (BRS-Novaera, BR3-Tracuateua, Cacheado Vagem Roxa, Vita-7, TVx 5058-09C, BRSParaguaçu, IT82D-60, Inhuma, Canapu amarelo, MNC00-599F-9, Capela, Corujinha-CE, Vita-3, Pretinho, Rajado,
BR14 – Mulato), obtidos do Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa Meio-Norte. O experimento foi executado na
área experimental da Embrapa Meio-Norte, em Teresina, PI, no delineamento experimental de blocos casualizados, com
quatro repetições. A parcela experimental foi representada por uma linha de seis metros, com espaçamento de 0,60m
entre plantas e 1,0m entre linhas. Os caracteres avaliados foram: comprimento da vagem (COMP), número de grãos
vagem (NGV), número de dias para o início da floração (NDIF), número de vagens por pedúnculo (NVP) e peso de
100 grãos (P100G). Inicialmente, todos os caracteres foram submetidos à analise de variância univariada e, posteriormente,
à multivariada. A divergência genética foi estimada com base na distância de Mahalanobis e o método de agrupamento
de Tocher. As análises de variância univariadas, revelaram diferenças significativas (P < 0,01), pelo teste F, para os cinco
caracteres avaliados. Foram detectadas baixas estimativas de coeficientes de variação, sendo a menor estimativa 5,42%,
para o comprimento de vagens e a maior, 10,79% para o número de vagens por pedúnculo, indicando boa precisão
experimental. Os genótipos Cacheado Vagem Roxa e Canapu Amarelo foram os que mais divergiram geneticamente. Já
as menores estimativas de distância genética foram obtidas para os genótipos Pretinho e BR14-Mulato. A característica
comprimento de vagem foi a que mais contribuiu para a divergência (46,83%) entre os genótipos. O menor e maior
valor para esta característica foi 12,2 cm e 21,4 cm, respectivamente. Portanto, pode-se inferir que o comprimento de
vagem é o principal fator de divergência genética no feijão-caupi. Na análise de agrupamento de Tocher baseada na
distância de Mahalanobis, obtiveram-se cinco grupos: Grupo 1- Pretinho, BR14-Mulato, MNC00-599F-9, Vita-7,
TVx 5058-09C, Corujinha-CE; Grupo 2- Capela, Rajado, Vita-3, Cacheado Vagem Roxa; Grupo 3- BRS-Novaera,
Inhuma, IT82D-60, BR3-Tracuateua; Grupo 4- Canapu amarelo; Grupo 5- BRS-Paraguaçu.
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Divergência genético-morfológica entre
genótipos de feijão-caupi
Assunção Filho, JR1; Damasceno e Silva, KJ2; Medeiros, AM1; Rocha, MM2; Freire Filho, FR2
Iniciação Científica – Universidade Federal do Piauí
2
Embrapa Meio-Norte
[email protected]
1
Palavras-chave: Vigna unguiculata, dissimilaridade, agrupamento, multicategórica, variabilidade
A análise da divergência genética constitui uma das etapas mais importantes do melhoramento, visto que as cultivares
geneticamente mais distantes podem apresentar um maior número de alelos diferentes, aumentando-se as chances da
obtenção de alelos favoráveis. Objetivou-se neste estudo estimar a divergência genética entre genótipos de feijão-caupi
por meio de análise multicategórica. Foram avaliados dezesseis genótipos (BRS-Novaera, BR3-Tracuateua, Cacheado
Vagem Roxa, Vita-7, TVx 5058-09C, BRS-Paraguaçu, IT82D-60, Inhuma, Canapu amarelo, MNC00-599F-9, Capela,
Corujinha-CE, Vita-3, Pretinho, Rajado e BR14-Mulato) por meio de descritores morfológicos que descrevem aspectos
relacionados à planta (forma da folha, hábito de crescimento, porte, pigmentação do pedúnculo da inflorescência,
desfolhamento na maturidade e ciclo da cultura), à flor (cor da flor, do cálice, da asa, da quilha e do estandarte, e tipo de
inflorescência), à vagem (cor e uniformidade da vagem madura, cor e uniformidade da vagem imatura, distribuição das
vagens na copa da planta e forma da vagem,) e semente (cor da semente, classe e subclasse comercial, cor do cotilédone,
tipo de tegumento, brilho da semente, cor do anel do hilo, cor do halo, quanto à presença do halo e forma da semente).
O delineamento experimental utilizado foi de blocos casualizados com quatro repetições. Cada parcela foi composta de
uma linha de seis metros e um total de dez plantas por linha. O espaçamento entre linhas foi de 1,0m. Para a análise
das variáveis multicategóricas foram considerados os dados de moda. A característica que apresentou maior variação
entre os genótipos foi a cor do grão, seguida das características subclasse comercial e cor da vagem madura. As cores
variando desde a cor branca à preta. Os genótipos Vita-7 e Rajado apresentaram a maior concordância de valores,
diferindo em apenas cinco (17,85%) dos 28 caracteres analisados, revelando-se assim, os mais próximos geneticamente.
Os genótipos BR3-Tracuateua e Capela, Cacheado Vagem Roxa e Canapu Amarelo, Cacheado Vagem Roxa e Vita3,
Cacheado Vagem Roxa e BR14-Mulato, TVx 5058-09C e MNC00-599F-9, IT82D-60 e Capela, apresentaram o maior
grau de discordância, tendo em vista que diferiram em 21 (75%) dos 28 caracteres avaliados, revelando-se assim, os mais
distantes geneticamente. A análise de agrupamento feita de acordo com o método de Tocher revelou existência de três
grupos: Grupo1- Vita-7, Rajado, BR14-Mulato, Corujinha-CE, Vita - 3, Inhuma, Canapu amarelo, TVx 5058-09C,
BRS-Novaera, BR3-Tracuateua, BRS-Paraguaçu e Pretinho; Grupo2- MNC00-599F-9, Capela e Cacheado Vagem
Roxa; Grupo3- IT82D-60. Os genótipos estudados apresentaram elevado grau de divergência genética para os caracteres
considerados, demonstrando a alta variabilidade e o grande potencial para a identificação de parentais promissores para
compor programas de cruzamento.
Orgão financiador: EMBRAPA.
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Diversidade genética de acessos de abóbora
(Cucurbita moschata) do banco ativo de
germoplasma da embrapa semi-árido
Ramos Neto, DC1; Pereira Filho, AS; Ramos, PI1; Alvarez, RC1; Souza, CO2; Vilas-Boas, LA;
Oliveira, CA3; Druzian, JI2; Assis, JGA1; Barbosa, LV1
Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal da Bahia
2
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia
3
Escola Superior de agricultura “Luis de Queiroz”, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Cucurbita moschata, carotenóides totais, RAPD
A abóbora (Cucurbita moschata Duch.), é uma espécie cultivada na agricultura tradicional nordestina, que se caracteriza
por possuir ampla variabilidade genética que pode ser explorada em programas de melhoramento genético. Dentre as
características de interesse, destaca-se altos teores de carotenóides totais (Gonçalves-Neto et al., 2004; Rodriguez-Amaya, 2002).
Esse trabalho teve por objetivos: 1) quantificar os teores médios de carotenóides totais em frutos de 23 acessos de C.
moschata provenientes do Banco Ativo de Germoplasma (BAG) da Embrapa Semi-Árido; e 2) estudar acessos contrastantes
para a característica “teores médios de carotenóides totais”, por meio de marcadores moleculares do tipo RAPDs. As
quantificações dos teores médios de carotenóides totais foram realizadas segundo a metodologia proposta por Silva e
Mercadante (2002), e analisadas em espectrofotometria-UV (495nm). Os resultados obtidos mostraram acessos com
teores médios de carotenóides totais variando de 16,72 a 244,12 µg/g. A análise destes acessos, pelo teste GMAV,
possibilitou o agrupamento dos acessos em doze grupos, dos quais 7 foram compostos apenas por um acesso. Como
segundo objetivo, e a partir dos resultados anteriores, foram selecionados 11 acessos contrastantes para a característica,
sendo 5 com altos teores e 6 com baixos teores de carotenóides totais. De cada um desses acessos, foi extraído o DNA
genômico pelo método do CTAB (Murray & Thompson 1980), e, após a quantificação e padronização para 5ng DNA/µl,
os acessos foram amplificados pela técnica de PCR-RAPD, utilizando-se 7 primers do kitA (Operon Technologies). Os
resultados obtidos mostraram grau de polimorfismo, explicado, em parte, pela origem das amostras, uma vez que tais
acessos foram obtidos a partir de culturas tradicionais e não-melhoradas. A análise dos dados permitiu o agrupamento dos
acessos de baixo teor com 60% de similaridade, enquanto que os acessos com alto teor mostraram 57% de similaridade.
Um dos acessos, selecionado dentre os acessos de alto teor, formou um grupo isolado, com 40% de similaridade dos
demais. Os resultados obtidos evidenciaram uma variação na característica teores médios de caroteno e o potencial da
técnica dos RAPDs para estudos da divergência genética como ferramenta para o melhoramento genético.
Apoio financeiro: FAPESB e CNPq.
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Diversidade genética do jacarandá-daBahia (Dalbergia nigra – leguminosae)
baseada em marcadores microssatélites
Resende, LC; Ribeiro, RA; Lovato, MB
Laboratório de Genética de Populações, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: Dalbergia nigra, fragmentação de habitats, espécie ameaçada, Mata Atlântica, microssatélites
Dalbergia nigra, o jacarandá-da-Bahia, é uma espécie encontrada estritamente na Mata Atlântica. O desmatamento
e fragmentação do bioma de sua ocorrência, associados à intensa exploração dessa arbórea, levaram à sua inclusão na
lista de espécies ameaçadas. O estudo da diversidade genética é importante para o desenvolvimento de estratégias de
conservação e manejo de espécies raras. Os microssatélites (SSR), marcadores co-dominantes, têm sido muito utilizados
para esse fim devido ao seu alto grau de polimorfismo. O objetivo desse trabalho foi avaliar os efeitos da fragmentação de
habitats sobre a diversidade e estrutura genética de três populações de D. nigra, uma delas encontrada dentro do Parque
Estadual do Rio Doce-MG e as outras duas em fragmentos próximos ao Parque, através da utilização de marcadores de
microssatélites recentemente desenvolvidos para a espécie. O DNA de 20 a 23 indivíduos de cada população foi extraído
usando o método CTAB com algumas modificações. Foram analisados cinco loci de microssatélites para genotipar os
indivíduos estudados. A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada empregando-se três iniciadores em uma
única reação: iniciador forward específico com cauda M13(-16) na extremidade 5’, iniciador específico reverse e iniciador
M13(-16) marcado com fluorescência 6-FAM ou HEX. Após detecção de fluorescência realizada no sequenciador
MegaBACE 1000, os alelos foram determinados por seus tamanhos em pb através do programa Fagment Profiler. As
análises estatísticas foram realizadas nos programas Genepop, Arlequin e Micro-Checker. Todos os loci apresentaram
polimorfismo, com número médio de alelos igual a nove e número total de alelos em cada população variando
entre seis e quinze. As populações Campolina (dentro do Parque), Santa Cruz e Areias (fragmentos) apresentaram
número médio de alelos por locus igual a 7,0, 8,2 e 6,4, respectivamente. A heterozigosidade observada variou entre
0,444 e 0,900 e a heterozigosidade esperada, entre 0,486 e 0,872. Os resultados da análise de variância molecular
(AMOVA) indicaram que 6,9% da variação total é devido à variação entre populações. Este fato, associado à existência
de alelos exclusivos nas áreas fragmentadas, revelam a grande importância dos fragmentos florestais na manutenção da
diversidade genética de D. nigra e apontam para a necessidade de sua preservação.
Apoio financeiro: FAPEMIG e CNPq.
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Filogenia e evolução das oxidases
alternativas de plantas e fungos
Thomazella, DPT; Tiburcio, RA; Rincones, J; Toni, IM; Pereira, GAG
Departamento de Genética e Evolução/Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
Palavras-chave: Oxidase Alternativa, Plantas, Fungos, Filogenia, Seleção diferencial
Oxidases Alternativas (AOX) são enzimas localizadas na membrana interna da mitocôndria, capazes de transferir elétrons
da ubiquinona para o oxigênio molecular. Em plantas termogênicas, a AOX tem uma importante função na produção
de calor para o amadurecimento de frutos e na volatilização de aminas para atração de polinizadores. Embora tenha
sido estudada principalmente em plantas, a AOX tem uma distribuição relativamente ampla, estando presente em
vários grupos de organismos eucariotos, dentre eles fungos, animais e protistas, bem como em alguns procariotos. Em
angiospermas, as AOXs são codificadas por uma família multi-gênica, tradicionalmente dividida em duas subfamílias,
AOX1 e AOX2. O presente trabalho buscou verificar se a estrutura de subfamílias gênicas encontrada nas AOXs de
angiospermas tem paralelo em fungos. Além disso, foram estudados aspectos da evolução destas proteínas visando
principalmente identificar a ocorrência de seleção natural diferencial entre as duas subfamílias de AOXs de angiospermas,
bem como entre as AOXs de angiospermas e fungos. Para tanto foi construída uma filogenia das Oxidases Alternativas
encontradas em plantas terrestres, algas e fungos pelo método da Máxima Verossimilhança, a qual foi então submetida
a análises de seleção através da comparação das taxas de mutação sinônima e não sinônima. A análise da filogenia
obtida não sugere a existência de subfamílias entre as AOXs de fungos, embora algumas espécies do grupo apresentem
mais de uma cópia do gene. No entanto, os resultados confirmam que em plantas a AOX claramente se divide nas
subfamílias gênicas já descritas. A análise de seleção encontrou evidências de seleção purificadora em todos os grupos,
o que corrobora o elevado grau de conservação das seqüências destas proteínas, exceto no que diz respeito às diferenças
relativamente marcantes encontradas entre as AOX de plantas terrestres e as demais. A estrutura de subfamílias da AOX
de angiospermas e as diferenças acentuadas da proteína em plantas terrestres podem ser conseqüência das peculiaridades
estruturais e necessidades metabólicas particulares do grupo das plantas em relação aos demais organismos estudados.
Pretende-se agora ampliar a análise desta família gênica incluindo tanto outros grupos de eucariotos quanto procariotos,
a fim de se obter um panorama geral da evolução desta enzima.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Diversidade genética de espécies do gênero
Philodendron (Araceae, Monocotyledoneae)
Através do marcador DAF (DNA
amplification fingerprinting)
Cansanção, IF1; Correia-da-Silva1, M; Soares2, MLC; Benko-Iseppon, AM1
Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
2
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-Chave: Philodendron, Meconostigma, DNA Amplification Fingerprinting, Floresta Amazônica, Mata Atlântica
O gênero Philodendron (Araceae) apresenta destacada importância não apenas devido a seu contingente populacional,
mas também pela ampla utilização ornamental, devido à beleza e diversidade de formas e cores de suas folhagens. Conta
com aproximadamente 600 espécies já registradas, distribuindo-se endemicamente nas Américas e apresentando grande
diversidade na região Amazônica como também na Mata Atlântica, onde os exemplares do presente estudo foram
coletados. Marcadores DAF (DNA Amplification Fingerprinting) são úteis na geração de polimorfismos especialmente
em nível intra e interespecífico, sendo informativos em análises de diversidade genética. A amplificação por DAF
usou 0,5 ng de DNA (folha ou raiz jovem) por µL de reação (total de 15 μL). No presente trabalho, 37 primers foram
avaliados em uma amostragem inicial incluindo seis espécies de Philodendron (dois acessos de P. megalophyllum, e um
acesso de cada espécie: P. imbe, P. ornatum, P. pedatum e P. sphalerum), bem como em dois táxons testados como grupo
externo: Dieffenbachia elegans e Monstera dubia. O resultado das amplificações foram visualizados em géis de agarose a
1,8%, corados com 1,5 μL de Brometo de Etídio (20 mg/mL) para cada 100 mL de gel, usando-se como referência de
análise o marcador 100 pb. A partir desta seleção, 12 primers decâmeros foram selecionados como mais informativos
para uma avaliação mais abrangente dos acessos selecionados. Foram avaliados membros de 26 acessos de 18 espécies de
Philodendron, comparados a representantes de Dieffenbachia (2 spp.) Monstera (3 spp.) e Scaphispatha (1 spp.). Todas as
espécies de Philodendron estudadas pertencem ao subgênero Philodendron, com exceção de P. goeldi e P. solimoesense, as
quais fazem parte do sbg. Meconostigma. No total 1108 bandas polimórficas foram incluídas na matriz de dados para a
geração do dendrograma usando o método de Neighbour-Joining (bootstrap de 1000 replicações), através do programa
MEGA 4. O dendrograma gerou ramos com valores de bootstrap consistentes entre os Philodendron (>85%). Uma
associação deste dendrograma a números cromossômicos disponíveis para as espécies analisadas, revelou que espécies com
2n=32 agruparam-se no dendrograma, enquanto espécies com 2n=30 e 34 uniram-se em um ramo separado. Espécies
com 2n=32 e 2n=34 encontradas em mais de um subramo, permitiu identificar agrupamentos coesos relacionando
os táxons que compõem os dois subgêneros de Philodendron, indicando que possam ter ocorridos eventos sucessivos
decrescentes de disploidias no gênero.
Agradecimentos: CNPq, MCT-MPEG, ECFPn, INPA, UFPE e CAPES.
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Diversidade genética da espécie florestal
Tabebuia roseo-alba no interior
do estado de São Paulo, baseada
em marcadores microssatélites
Martinez, MLL1,2; Feres, JM2,3; Mestriner, MA2; Martinez, CA4; Alzate-Marin, AL2,5
Pós-Graduação em Biologia Comparada - FFCLRP/USP, Ribeirão Preto, SP, Brasil
Laboratório de Genética Vegetal, Depto. de Genética, FMRP/USP, Ribeirão Preto, SP, Brasil
3
Pós-Graduação em Genética - FMRP/USP/RP, Ribeirão Preto, SP, Brasil
4
Departamento de Biologia – FFCLRP/USP/RP, Ribeirão Preto, SP, Brasil
5
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Ipê-Branco, Primers Heterólogos, SSR, Conservação, Banco de Germoplasma
O interior do Estado de São Paulo, anteriormente ocupado por matas semidecíduas e cerrado, hoje está praticamente
tomado por diferentes culturas ou pastagens, restando apenas algumas pequenas manchas de cerrado e de mata, apontando
para uma drástica perda do rico patrimônio genético florestal. A região de Ribeirão Preto é uma das mais devastadas do
Estado de São Paulo, principalmente nas regiões próximas aos mananciais e indústrias de cana-de-açúcar, restando somente
pequenas manchas de cerrado, cerradão e floresta mesófila semidecídua. Algumas espécies florestais, como o Ipê-Branco
(Tabebuia roseo-alba), já não são mais observadas em condições naturais e estudos genéticos visando o entendimento da
estrutura genética das espécies existentes nos fragmentos florestais remanescentes são fundamentais para a escolha correta das
estratégias de manejo e conservação a serem adotadas. Os marcadores microssatélites são indiscutivelmente os mais indicados
para este tipo de estudo, em razão de seu elevado conteúdo informativo, sua robustez analítica, transferibilidade e facilidade de
obtenção de dados genéticos via PCR. Este estudo teve por objetivo analisar a diversidade genética de 84 indivíduos adultos
de Tabebuia roseo-alba (maioria usados como matrizes em um programa de conservação ex situ no Banco de Germoplasma
da USP/RP), localizados em 31 municípios da Região de Ribeirão Preto (SP), utilizando 8 pares de primers SSR transferidos
de Tabebuia aurea. O DNA foi extraído de folhas de todos os indivíduos, amplificado e separado por eletroforese vertical em
géis de poliacrilamida e corados com nitrato de prata. A partir dos dados gerados foram estimados parâmetros genéticos de
diversidade com auxílio do programa GDA 1.0 e Cervus 3.0. Foi constatado que os 8 loci SSR analisados estão em equilíbrio
de ligação (P>0,05) e apresentam um valor médio de PIC altamente informativo de 0,726. Em termos gerais, as análises
dos 8 loci microssatélites detectaram um alto nível de polimorfismo (10,25 alelos/locus) e diversidade genética relativamente
baixa, sendo que a heterozigosidade média observada (0,238) foi menor que a esperada (0,754), evidenciando um déficit de
heterozigotos. O coeficiente de endogamia (Fis) foi de 0,685, diferindo significativamente de zero (Intervalo de Confiança 95%),
evidenciando cruzamentos entre indivíduos aparentados e auto-fecundação. A análise conjunta dos loci apresentou alta
probabilidade de exclusão de paternidade, com média de 0,992, indicando que esta bateria de loci tem alto potencial para
estudos de análise de paternidade/maternidade em T. roseo-alba. O conjunto de dados obtidos aponta o sucesso de marcadores
moleculares microssatélites para estudos genéticos em Tabebuia roseo-alba, constituindo uma ferramenta poderosa para
programas de coleta e conservação in situ e ex situ (Banco de Germoplasma da USP/RP) desta importante espécie florestal,
uma vez que o sucesso da amostragem, visando à conservação, depende da magnitude da variação genética disponível na
população e do sistema reprodutivo da espécie.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Genetic analysis of the gender Gossypium
of the state Maranhão
Menezes, IPP1; Lucena, VS2; Hoffmann, LV2; Barroso, PAV2; Oliveira, TS2
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
2
Embrapa Algodão
[email protected]
1
Keywords: cotton, diversity, conservation, population structure, microsatellite
The state of Maranhão has an allelic pool of the gender Gossypium of capital importance for the development of cotton
culture in the country. Besides the occurrence of cultivated varieties, there are cotton species, G. barbadense, G. hirsutum
r. Marie galante and verdões, which present a history associated with the agricultural development in the state since
the colonial period. Therefore, a fraction of the genetic diversity of cotton is present in the state of Maranhão, and no
variability study had been accomplished until then. The objective this work was to characterize the genetic diversity of
the gender Gossypium in the state Maranhão. A group of 38 cotton plants (7 G. barbadense and 31 Mocó) was collected
in expeditions in 2005. With authorization of CGEN and IBAMA, leaves or petals, stakes and seeds were collected
for storage in germplasm bank and for analysis with microsatellite markers. The analysis of the genetic diversity was
accomplished according to the cotton type and the municipality of collection, using F-START and GDA programs.
The genetic distance among individuals was calculated using MICROSAT program and dendrogram through MEGA4.
We selected 17 pairs of primers, which detected 15 polymorphic loci, distributed in different chromosomes. Of a total
of 26 amplified alleles in the species G. barbadense and 36 in the race Marie galante 25 were exclusive, 7 belonging to
the first and 18 to the second. Otherwise, the number of exclusive alleles were 3, 1, 1 and 2 for Mata Rome, Anapurus,
Santa Quitéria do Maranhão, Urbano Santos, respectivelly.The observed heterozygosity was extremely low for species
(0.009) and municipalities (0.013), directly influenced by the inbreeding coefficient GIS = 0.95 and 0.96, respectively,
showing that practically all accesses are homozygous. Therefore, reproduction occurs by selfing or between relative
individuals, as a reflex of the cotton system reproduction and the isolation of the plants, since, almost all collected
plants are unique individuals in dooryards. The species showed a high total genetic diversity (HT = 0.78), largely due
to differences between the species (GST = 0.774). When observed by municipalities it was found out that the genetic
composition of cotton in the state resides inside the municipal districts (HS = 0.313). The cluster analyzes resulted
in two groups, differentiating the species, furthermore revealed three interspecific hybrids. Based on the analysis, an
effective size of both species should be preserved to maintain a good representation of the diversity in germplasm banks
and populations, at municipal level, can be preserved in detriment of others.
Financial support: Brazilian Ministry of Environment (PROBIO) e CNPq.
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Diversidade genética em algodoeiros nãocultivados do estado de Alagoas usando
marcadores microssatélites
Pereira, GS1,2; Almeida, VC1,2; Gomes, MCC1,2; Lucena, VS1; Oliveira, TS1,2; Menezes, IPP1,3; Hoffmann, LV1; Barroso, PAV1
Laboratório de Biotecnologia, Embrapa Algodão
Departamento de Biologia, Universidade Estadual da Paraíba
3
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Gossypium barbadense, G. hirsutum r. marie-galante, Marcador SSR, Conservação, Germoplasma
O Brasil é centro de origem da espécie Gossypium mustelinum (Miers) Watt. e de distribuição das espécies G. barbadense
L. e G. hirsutum L. (r. latifolium Hutch. e r. marie-galante (Watt) Hutch.). Destas, apenas G. hirsutum r. latifolium é
cultivada, estando as demais passíveis de descaracterização genética. Conhecer a variabilidade ainda disponível nessas
populações faz-se necessário no sentido de se estabelecer estratégias de conservação. Para tanto, marcadores moleculares,
principalmente os microssatélites, têm-se sido amplamente utilizados. Este trabalho propôs-se a realizar estudo de
diversidade genética entre acessos de G. barbadense e G. hirsutum r. marie-galante (algodoeiro mocó) coletados no ano
de 2004 no estado de Alagoas, no Nordeste do Brasil (autorização IBAMA processo nº 02001.004259/2004). Extraiu-se
DNA genômico de cinco sementes de cada um dos 33 genótipos coletados, sendo cinco destes representantes do algodoeiro
mocó. Primers SSR foram amplificados em PCR, tendo seus produtos separados em gel desnaturante de poliacrilamida
e revelados com nitrato de prata. Os softwares GDA e FSTAT foram utilizados para estimar as freqüências alélicas,
a heterozigozidade e as estatísticas de Nei. O programa MICROSAT forneceu matriz de distâncias entre genótipos,
utilizada para o agrupamento segundo Neighbor-Joining. Dos 13 primers utilizados, 12 mostraram-se polimórficos,
sendo que um deles originou dois locos. Foram amplificados 38 alelos, com média de 3,08 alelos polimórificos por loco,
dos quais foram distinguidos oito alelos privados. Tratando populações por microrregiões do estado, verificou-se uma
heterozigozidade observada relativamente baixa (Ho = 0,044), com um índice de endogamia total conseqüentemente
elevado (Fis = 0,866), referindo-se à reprodução preferencial por meio de autofecundação. A diversidade genética total
foi relativamente elevada (Ht = 0,408), com diversidades significativas dentro das microrregiões (Hs = 0,289) e entre
as mesmas (Dst = 0,120). Essa diversidade entre as microrregiões representa 29,3% da diversidade total (Gst = 0,293),
podendo ser classificada como alta. A análise do agrupamento revelou a separação dos genótipos das duas espécies
avaliadas. Um dos acessos classificado como mocó e outro como G. barbadense, intermediários entre os dois grupos,
parecem envolvidos com eventos anteriores de hibridação interespecífica. O grupo da espécie G. barbadense ainda
originou dois subgrupos: um incluindo a maioria dos algodoeiros de três microrregiões (Mata Alagoana, Litoral
Norte Alagoano e São Miguel dos Campos) e outro com muitos exemplares de outras duas microrregiões (Maceió e
Penedo). Por se mostrar diverso, há necessidade de conservação da variabilidade presente nos algodoeiros alagoanos
em bancos de germoplasma, podendo-se priorizar os locais com ocorrência de alelos raros nas microrregiões
proximamente agrupadas.
Apoio Financeiro: Embrapa Algodão, FINEP e CNPq.
200
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Caracterização de germoplasma de
Brachiaria brizantha (gramínea forrageira
tropical) utilizando marcadores moleculares
do tipo microssatélite
Francisco, PM2; Jungmann, L1,2; do Valle, CB1; de Souza, AP2
Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Embrapa Gado de Corte, CP 154, CEP 79.002-970. Campo Grande, MS, Brasil
2
CBMEG, Universidade Estadual de Campinas, CP 6010, CEP 13.083-970, Campinas, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Brachiaria, marcadores moleculares, microssatélite, forrageira, diversidade genética
O Brasil tornou-se, nos últimos anos, um dos maiores exportadores de carne in natura no mundo. O fato de ter sua
pecuária bovina baseada principalmente na utilização de pastagens de forrageiras com alto valor nutricional para
alimentação do rebanho contribuiu muito para esta projeção. As espécies de Brachiaria, respondem por 50% das sementes
produzidas e por 85% das sementes comercializadas para formação de pastagens no Brasil Central. Brachiaria brizantha
apresenta diversas características de interesse agronômico e é a principal fonte de variabilidade genética no programa de
melhoramento de forrageiras tropicais (Embrapa Gado de Corte - Campo Grande/MS). Neste trabalho, seis marcadores
moleculares microssatélites desenvolvidos em nosso laboratório para B. brizantha foram utilizados na caracterização
da diversidade genética existente para esta espécie. Para tanto, foram utilizados 93 genótipos pertencentes ao banco
ativo de germoplasma da Embrapa Gado de Corte. Foram ainda analisados genótipos de cultivares comerciais: Xaraés,
Marandú, Toledo, Piatã e Arapoti. Devido a poliploidia em Brachiaria, os dados de genotipagem foram coletados como
se os marcadores fossem dominantes. Foram geradas um total de 48 bandas para os seis microssatélites. O coeficiente
de similaridade SM (Simple Matching) foi calculado com o programa NTSyspc v.2.1 para estimar a divergência entre os
genótipos que foram, em seguida, agrupados pelo método UPGMA. A verificação da estabilidade dos agrupamentos e
o coeficiente de variação do número de marcas foram avaliados pelo método bootstrap. A correlação entre as matrizes de
similaridade genética e de distância geográfica também foi avaliada, utilizando-se o teste Z de Mantel. No dendrograma
obtido foram discriminados sete grupos de diversidade, com coeficientes de similaridade variando de 0,77 a 1. Um
genótipo do banco de germoplasma (B022) não foi incluido em nenhum grupo. O bootstrap para avaliação do número
de marcas usado na análise mostrou que o coeficiente de variação se estabiliza (~11%) a partir de 35 marcas, indicando
que o número de marcas utilizado produziu uma análise confiável. Não foi encontrada correlação entre as matrizes
de similaridade genética e de distância geográfica (r = 0,0199; t = 0,2616; p = 0,6032). Estudos futuros, incluindo a
caracterização completa do banco de germoplasma da Embrapa Gado de Corte, serão realizados para determinar a
diversidade genética em B. brizantha. Estes estudos são de grande importância para programas de melhoramento dessa
espécie.
Apoio: Embrapa, CNPq, Fapesp, Unipasto e Fundect-MS.
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Distância genética entre linhagens-elite
de algodoeiro herbáceo com base em
marcadores microssatélites
Silva, MG1,2; Cazé, ALR1,2; Pereira, GS1,2; Almeida, VC1,2; Silva Filho, JL1; Barroso, PAV1; Hoffmann, LV1
1
Laboratório de Biotecnologia, Embrapa Algodão
Departamento de Biologia, Universidade Estadual da Paraíba
[email protected]
2
Palavras-chave: Gossypium hirsutum, SSR, diversidade, polimorfismo, melhoramento
O conhecimento da diversidade genética em algodoeiros é de grande importância para programas de melhoramento.
Os marcadores SSR constituem ótima ferramenta para análises genéticas devido à ampla distribuição no genoma do
algodoeiro, polimorfismo e co-dominância tornando-se úteis em estudos de diversidade. O presente estudo objetivou
estimar a distância genética de 16 linhagens-elite de algodoeiro e 4 variedades de programas de melhoramento da Embrapa
Algodão para Mato Grosso, Goiás e Cerrado Baiano ou Semi-Árido Nordestino a partir de marcadores SSR. Extraiu-se
DNA genômico de 20 genótipos de algodoeiro herbáceo pelo método CTAB. Os produtos da amplificação dos primers
SSR foram separados por eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida e corados com nitrato de prata. Os softwares
IDENTITY e MICROSAT foram utilizados para calcular a heterozigozidade esperada (He ) para cada loco e a distância
entre genótipos, respectivamente. O método utilizado na análise de agrupamento foi do tipo UPGMA. Dos 72 primers
amplificados, apenas 30 foram polimórficos, sendo dois destes polimórficos para dois locos. Considerando-se apenas
primers polimórficos, detectou-se 79 alelos, com média de 2,47 alelos por loco. A heterozigosidade esperada, calculada
para estimar a informatividade de cada primer, variou de 0,18 a 0,62 com uma média de 0,42 (desvio padrão de 0,11),
demonstrando que para estudos de diversidade genética intraespecífica os marcadores microssatélites são eficientes. As
distâncias genéticas calculadas apenas a partir dos primers polimórficos variaram de 0,156 (entre as linhagens GO 8022
e CNPA 2571) a 0,692 (entre BRS Pequi e BRS Buriti), com média de 0,437 (desvio padrão igual a 0,098), portanto
relativamente altas. A análise de distribuição dos 190 pares de genótipos comparados mostrou uma concentração dos
valores nas classes de 0,3-0,4 a 0,5-0,6. Não ocorreu agrupamento das linhagens e variedades segundo a região em que
é desenvolvido o programa de melhoramento indicando não haver uma associação entre a seleção efetuada em cada
local e mensuração das distâncias via marcadores moleculares. Foram selecionados marcadores SSR com diversidade
intraespecífica que podem ser muito importantes para mapeamento molecular, seleção assistida ou seleção genômica
em algodoeiro.
Apoio Financeiro: Fundação de Apoio à Pesquisa e Desenvolvimento do Oeste da Bahia, FIALGO, Embrapa e CNPq.
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Padrão de distribuição de bandas CMA3
e localização de sítios de DNAr 5S e
45S na análise de acessos de Heliconia
(Heliconiaceae)
Costa, A1; Ferreira-Leite, BS2; Loges, V1; Bernardes, ECS2; Brasileiro-Vidal, AC2
Universidade Federal Rural de Pernambuco
2
Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: FISH, fluorocromos
O gênero Heliconia (Heliconiaceae) constitui um grupo de plantas de grande importância ornamental. Embora o
cultivo de helicônias tenha crescido no Brasil, estudos relacionados à caracterização de recursos genéticos, ao prémelhoramento e ao melhoramento genético dessas plantas são recentes. Do ponto de vista citogenético, existem
apenas contagens cromossômicas, revelando o número básico x=12, com predominância de espécies diplóides (2n=24).
O presente trabalho teve como objetivo analisar a variabilidade cromossômica existente na Coleção de Helicônias
da UFRPE, visando subsidiar futuros trabalhos de melhoramento genético. Para esse fim, nove acessos da coleção
foram analisados através da coloração com fluorocromos base-específicos CMA3 e DAPI. Além disso, três acessos
(H. collinsiana, H. psittacorum x H. spathocircinata cv. Golden Torch e H. bihai) foram investigados via hibridização
in situ fluorescente utilizando sondas de DNAr 45S e 5S. Todos os acessos analisados apresentaram números diplóides
2n=24, morfologia submetacêntrica com padrão de condensação proximal, um par satelitado, cariótipo gradativo e
núcleos interfásicos do tipo semi-reticulado. Os pares satelitados apresentaram marcação positiva para CMA3 na região
proximal de H. bihai, H. collinsiana, H. stricta cv. Fire Bird, H rauliniana, H. rostrata, H wagneriana e terminal de
H. latispatha cv. Distans, sempre no braço curto. Em ambas cultivares de H. psittocorum x H. spathocircinata (‘Golden
Torch’ e ‘Golden Torch Adrian’), observou-se apenas um cromossomo satelitado com banda brilhante com CMA3 na
região subterminal. Nessas cultivares, dois cromossomos de tamanhos diferentes apresentaram fortes bandas terminais.
Além das bandas relacionadas às regiões organizadoras de nucléolo, foi observada a presença de outras bandas positivas
para CMA3, em metáfases de diversos acessos: (1) em H. bihai, foi observada uma banda proximal no braço curto de
um par cromossômico; (2) Heliconia collinsiana apresentou dois pares com bandas proximais evidentes; (3) Heliconia
latispatha cv. Distans mostrou em um par uma marcação ocupando todo o braço curto, com heteromorfismo para o
tamanho das bandas; (4) em H. stricta cv. Fire Bird, observou-se alguns pares com bandas positivas subterminais para
CMA3; (5) Heliconia wagneriana apresentou dois pares com bandas pericentroméricas evidentes. A FISH apresentou
marcação para DNAr 45S correspondente às bandas positivas para CMA3 dos cromossomos satelitados nos acessos
analisados, além da presença de um sítio proximal no braço curto de um par cromossômico de H. bihai e de dois sítios
terminais, todos correspondentes a bandas brilhantes com CMA3. Sítios para DNAr 5S foram localizados nos braços
curtos de um par cromossômico nas regiões subterminal, em H. psittocorum x H. spathocircinata cv. Golden Torch
e H. collinsiana, e proximal adjacente ao sítio de DNAr 45S, em H. bihai. Dessa forma, foi possível observar uma
diferenciação cariotípica dos acessos analisados através da localização das diferentes marcas cromossômicas.
Apoio Financeiro: Fundeci/Etene/BNB, Promata.
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Homeologias cromossômicas em
Citrus medica e Poncirus trifoliata
reveladas por BAC-FISH
Mendes, S; de Moraes, AP; Pedrosa-Harand, A
Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: mapeamento cromossômico, Citrus
O gênero Citrus é conhecido pela grande importância econômica de várias de suas espécies frutíferas e pela sua complexa
taxonomia. Esta complexidade é resultado da fraca barreira reprodutiva entre as espécies, permitindo a formação
de híbridos interespecíficos, associada com a freqüente poliembrionia nucelar. Apenas cinco espécies de Citrus são
consideradas verdadeiras, dentre elas está a cidra (C. medica L.). Estudos citogenéticos baseados no bandeamento
CMA/DAPI demostrou que esta espécie apresenta cariótipo homomórfico, permitindo diferenciar os cromossomos
em três grupos: um par cromossômico do tipo B (uma banda CMA+ na região terminal do braço longo e outra na
região proximal do braço curto), quatro do tipo D (uma banda CMA+ na região terminal do braço longo) e quatro
do tipo F (sem bandas). Com o objetivo de estabelecer um mapa cromossômico comparativo para os citros, BACs
oriundos de uma biblioteca genômica da espécie próxima Poncirus trifoliata (L.) Raf., e já mapeados nesta espécie, foram
hibridizados in situ (BAC-FISH) em cromossomos de cidra. Nove BACs foram mapeados, três dos quais apresentaram
marcação no par cromossômico do tipo B, sendo dois praticamente co-localizados no braço longo adjacente à banda
CMA+ (28A07 e 27P09) e um localizado na região terminal do braço curto (14A12). Esses BACs hibridizaram em
um mesmo cromossomo, também do tipo B, em P. trifoliata, porém nos braços opostos. Três BACs hibridizaram em
cromossomos tipo D na cidra: 21L13 (em posição adjacente a banda CMA+), 24E07 (em posição intersticial no braço longo)
e 02C12 (no braço curto). Apenas a posição e o tipo cromossômico de 02C12 coincidem com sua localização em P.
trifoliata, os outros dois correspondendo a cromossomos do tipo B e F, respectivamente, em Poncirus. Os BACs 01B09,
59C23 e 24C13 foram hibridizados em cromossomos do tipo F/FL em ambas as espécies. Re-hibridizações de diferentes
BACs na mesma preparação citológica permitirão estabelecer marcadores cromossomo-específico para os nove pares da
espécie. Esses dados demonstram um grau de conservação de seqüência suficiente entre estes dois gêneros, permitindo a
hibridização de BACs heterólogos, e a possibilidade de se determinar homeologias cromossômicas entre essas espécies.
Além disso, já indicam a presença de diversas alterações cromossômicas desde a separação dos dois gêneros.
Apoio Financeiro: CNPq, FACEPE.
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Cariomorfologia de oito espécies do
gênero Lippia (Verbenaceae)
Sousa, SM1; Torres, GA1; Viccini, LF2
1
Departamento de Biologia, Universidade, Federal de Lavras
Departamento de Biologia, Universidade Federal de Juiz de Fora
[email protected]
2
Palavras-chave: cromossomos, Lippia
A utilização da citogenética como uma abordagem auxiliar às classificações taxonômicas tem sido amplamente utilizada
para os mais diversos grupos de plantas. A maior parte dos estudos citogenéticos descritos na literatura para o gênero
Lippia (Verbenaceae) está relacionada à contagem cromossômica por meio de cromossomos obtidos em células mães do
grão de pólen. Esta ausência de estudos utilizando cromossomos mitóticos, neste grupo de plantas, pode ser explicada
pela baixa germinação de sementes e pela dificuldade de obtenção de raízes por meio de estacas. O principal objetivo
deste trabalho foi ampliar os estudos cariotípicos no gênero, utilizando para isto, estacas e meristemas apicais de oito
espécies do gênero Lippia. Para isso, vários testes foram realizados para a indução de raízes em estacas, utilizando-se
principalmente o fitormônio AIB em diferentes concentrações (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000ppm).
Para a visualização dos cromossomos, as regiões meristemáticas foram tratadas com HQ 2mM por cerca de 8-10h.
No caso dos meristemas radiculares, as lâminas foram preparadas pela técnica de dissociação celular com maceração
enzimática. No caso dos meristemas apicais, suspensões celulares foram preparadas e gotejadas nas lâminas. Em ambas
as metodologias a coloração foi realizada com Giemsa 5%. Foram estudadas as seguintes espécies: L. hermanioides
(2n=26), L. lacunosa (2n=56), L. lupulina (2n=28), L. pseudothea (2n=26), L. pohliana (2n=24), L. rotundifolia (2n=56),
L. rubella (2n=20), L. sidoides (2n=24). O menor cromossomo observado foi em L. pohliana (1.12 µm) e o maior em
L. lupulina (4.96 µm). O número de constrições secundárias observadas foi variável entre as espécies, variando de um
par em L. sidoides a três em L. lacunosa. Todas espécies apresentaram metáfases unimodais com cromossomos metafásicos
e submetafásicos, não sendo observados cromossomos telocêntricos e acrocêntricos. Tais resultados foram descritos pela
primeira vez e constituem importantes informações para a caracterização das espécies estudadas.
Apoio financeiro: Fapemig e CNPq.
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Variabilidade cariotípica em populações
naturais de Nothoscordum gracile (Ailton)
Stearn (Alliaceae)
Souza, LGR1; Crosa, O2; Guerra, M1
Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Botânica, Recife, PE, Brasil
2
Universidad de la República, Faculdad de Agronomia, Departamento de Biologia
Vegetal, Montevideo, Uruguay
[email protected]
1
Palavras-chave: bandas CMA+, Nothoscordum gracile, variabilidade cariotípica
Nothoscordum gracile se destaca no gênero por ser a única espécie invasora e apresentar ampla distribuição na América
do Sul, tendo sido introduzida também em outros continentes. Apresenta apomixia e possui um cariótipo incomum,
2n = 19 (13M + 6A). Embora seja a espécie mais estudada do gênero, a variabilidade cariotípica de populações naturais
não é conhecida. Assim, este trabalho teve por objetivo analisar a variabilidade cariotípica em populações naturais de
N. gracile visando contribuir para o entendimento da origem dessa espécie. Foram analisadas populações do Brasil,
Uruguai e Peru, utilizando bandeamento CMA/DAPI e FISH com DNAr 5S e 45S. As análises revelaram algumas
amostras com 2n = 19 (13M + 6A) e uma com 2n = 18 (14M + 4A). Foi observada uma banda CMA+ no braço curto
dos cromossomos acrocêntricos em todas as amostras analisadas. Essas bandas CMA+ foram co-localizadas com sítios
de DNAr 45S, enquanto os sítios de DNAr 5S foram localizados na posição terminal do braço longo de dois pares de
metacêntricos em ambos os cariótipos. Adicionalmente, foram observadas bandas CMA+ na região proximal dos braços
longos de alguns acrocêntricos, permitindo diferenciar três tipos de acrocêntricos: sem bandas proximais (A0); com
uma banda proximal (A1) e com duas bandas proximais (A2). Foram então reconhecidos quatro diferentes cariótipos:
2n = 19 (13M + 3A0 + 3A1) e 2n = 19 (13M + 1A0 + 4A1 + 1A2) em amostras do Sul e Sudeste do Brasil, este último
também observado na amostra de Lima (Peru), e 2n = 18 (14M + 4A1) em amostras do Uruguai. Análises anteriores de
distribuição de heterocromatina em plantas cultivadas na Argentina e Japão revelaram o mesmo padrão 2n = 19 (13M +
1A0 + 4A1 + 1A2) e em todas as análises de coloração convencional de plantas de outros continentes sempre foi observado
2n = 19. Portanto, parece haver uma seleção favorável para esse cariótipo, que apresenta área de distribuição mais ampla e
melhor adaptação à condição de cultivo. Comparando o cariótipo 2n = 19 e 18, seria esperado que um dos metacêntricos
do cariótipo 2n = 18 correspondesse a dois acrocêntricos do 2n = 19. Nesse caso, seria esperada uma banda CMA+ no
centrômero, mas isso não foi encontrado, sugerindo que a relação entre esses cariótipos não seja simplesmente devida
a uma fusão ou fissão cêntrica. A observação de diferentes cariótipos na região investigada neste trabalho corrobora a
hipótese de que esta região seja o centro de diversidade e de origem de N. gracile. O heteromorfismo de bandas CMA+
pode ter sido gerado por introgressão com espécies próximas ou por formação de novo desse tetraplóide. Em qualquer
caso parece provável que essa espécie tenha tido origem múltipla por hibridização e/ou poliploidia.
Apoio financeiro: CAPES e CNPq.
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Mapeamento citogenético dos
cromossomos 9 e 11 do feijão comum
(Phaseolus vulgaris L., Fabaceae)
Fonsêca, AFA; Pedrosa-Harand, A
Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: FISH, BAC, feijão comum, mapeamento citogenético, citogenética molecular
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.), 2n = 22, é uma das mais importantes plantas cultivadas para alimentação
da região tropical. Um mapa citogenético vem sendo construído para essa espécie através da FISH de BACs
(cromossomos artificiais de bactérias) e utilizado em análises comparativas intra e intergenérica. Com o intuito de
colaborar com a construção desse mapa, foram hibridizados in situ, nos cromossomos 9 e 11, seis BACs e um plasmídio
contendo o sítio de DNAr 45S. Os BACs utilizados foram selecionados com marcadores moleculares mapeados
geneticamente. O BAC 123O22, selecionado para o cromossomo 9, apresentou um padrão pericentromérico em todos
os cromossomos, não podendo ser mapeado. O BAC 224I16 mostrou uma marcação fracamente dispersa em alguns
cromossomos, porém com a adição do DNA bloqueador (50x Cot-100) foi possível obter um sinal único localizado
na extremidade do braço longo do cromossomo 9. O BAC 163I07 apresentou um sinal único, após a adição do DNA
bloqueador (20x Cot -100), na região intersticial do braço longo do cromossomo 9. A localização do BAC 163I07 neste
braço foi comprovada através de re-hibridização com o BAC 224I16. A sonda de DNAr 45S evidenciou um sinal forte
na extremidade do braço curto deste mesmo cromossomo. A posição desses sinais em relação aos braços cromossômicos
foi comprovada após re-hibridização com o BAC 81A17, usado como marcador das regiões pericentroméricas de todos
os cromossomos do complemento. Este BAC indicou que o braço curto desse cromossomo contém praticamente
apenas seqüências de DNAr 45S. O BAC 25D1, selecionado para o cromossomo 11, apresentou marcação dispersa em
vários cromossomos, apresentando sinal único, após a adição do DNA bloqueador (60x Cot-100), na região intersticial
do braço oposto ao marcado pelo BAC 179N14, o qual evidenciou um sinal terminal. Este trabalho permitiu orientar
os grupos de ligação referentes aos cromossomos 9 e 11 em relação à posição dos braços e relacionar as distâncias físicas
e genéticas entre seus marcadores. Além disso, estabeleceu novos marcadores citogenéticos cromossomo-específicos para
a espécie, fundamentais para estudos cariotípicos comparativos entre táxons relacionados. O estabelecimento desse mapa
cromossômico vem contribuir ainda para a localização de genes de interesse em programas de melhoramento do feijão comum.
Apoio financeiro: Pibic/CNPq/UFPE.
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Cariótipo comparado entre duas espécies
de Passiflora L
Viana, AJC; Corrêa, RX; Araújo, IS; Souza, MM
Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Passiflora, maracujazeiros silvestres, cariomorfologia, cromossomos, citogenética
O maracujazeiro roxo (Passiflora edulis Sims) pertence à família Passifloraceae, e vem sendo utilizado por indústrias de
sucos e no consumo in natura. Passiflora sp. foi recentemente coletada no estado da Bahia, e é morfologicamente muito
similar à P. edulis, diferenciando-se bastante quanto ao tamanho da flor e do fruto. Para programas de melhoramento
que objetivam obtenção de genótipos para ornamentação de interiores, o porte de P. edulis não é desejável. Porém,
Passiflora sp. tem características de interesse a esse propósito. Diante da necessidade de realização de estudos para delimitação
entre as duas espécies, determinou-se o cariótipo para as duas espécies. Ápices jovens de raízes foram coletados de estacas
quando apresentavam cerca de um centímetro de comprimento, pré-tratados com 8-hidroxiquinolina 0,002 M por
1 h em TA e mais 21 h a + 4 °C. A fixação foi feita em etanol-ácido acético (3:1) por 3 h em temperatura ambiente e as
amostras foram mantidas no próprio fixador a -20°C por, pelo menos, 24 h. As pontas de raízes, depois de lavadas em
água destilada por 10 minutos, foram hidrolisadas em ácido clorídrico 5N por 20 min em TA e coradas com reativo de
Schiff por 90 minutos, no escuro. As lâminas foram preparadas pela técnica do esmagamento utilizando o contra-corante
carmim 2% e as preparações fotografadas em microscópio ótico. As análises estatísticas foram realizadas utilizandose o programa Genes 2006.4.1. As duas espécies apresentaram 2n = 18, sendo 16 cromossomos metacêntricos e
2 submetacêntricos em suas fórmulas cariotípicas. No entanto houve variação na localização dos satélites, que em
P. edulis posicionou-se no braço curto do primeiro e quarto par, enquanto em Passiflora sp. ocorreram no braço
curto do sétimo e oitavo par cromossômico. O comprimento médio dos cromossomos foi de 3,28 µm e 3,27 µm,
e a razão média foi de 1,20 e 1,33 em P. edulis e Passiflora sp., respectivamente. As características cariomorfológicas
observadas estão de acordo com o descrito para alguns taxa do gênero Passiflora. Não houve diferença significativa
no comprimento do lote haplóide entre as duas espécies (P<0,05, teste F). Entretanto, houve variação significativa
(P<0,05, teste F) entre o comprimento individual de cada par cromossômico dentro e entre as espécies. Os cariótipos
das duas espécies apresentaram-se assimétricos, sendo observada uma variação média de 60% entre o maior e o
menor par cromossômico dentro de cada espécie. O índice de assimetria indicou que P. edulis seria uma espécie mais
derivada em comparação com Passiflora sp.
Apoio financeiro: FAPESB, CAPES.
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Evolução cariotípica em espécies da seção
Nothoscordum do gênero
Nothoscordum Kunth (Alliaceae)
Dantas, LG1; Crosa, O2; Guerra, M1
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco
2
Faculdade de Agronomia, Universidade da República, Montevidéu, Uruguai
[email protected]
1
Palavras-chave: Nothoscordum Kunth, evolução cariotípica, fusão-fissão cêntrica,
poliploidia, coloração com fluorocromos, FISH, DNAr 5S e 45S
O gênero Nothoscordum abrange cerca de 20 espécies divididas em duas seções, Nothoscordum e Inodorum, distribuídas
principalmente na América do Sul. Suas espécies se destacam por apresentarem grandes cromossomos e dois números
básicos (x = 4 e x = 5) relacionados entre si por fusão ou fissão cêntrica. Análises cito-moleculares revelaram números
cromossômicos de 2n = 8 a 2n = 26 e bandas CMA+ restritas às regiões organizadoras do nucléolo. Neste trabalho
foi realizado o estudo de outras seis espécies (Nothoscordum sp. 1 e 2, N. nudum, N. minarum, N. hirtellum e
N. grossibulbum) da seção Nothoscordum, visando obter uma melhor compreensão da evolução cromossômica no gênero
através de bandeamento com fluorocromos CMA e DAPI e localização dos sítios de DNAr 5S e 45S por FISH. Os
sítios de DNAr 5S foram localizados em todas essas espécies (exceto em N. grossibulbum) e em três outras previamente
analisadas com CMA e DNAr 45S (N. montevidensis, N. vittatum e N. bonariense). Os resultados indicaram a presença
de diplóides com 2n = 8 (Nothoscordum sp. 1 e N. montevidensis) e 2n = 10 (N. nudum, N. minarum, N. hirtellum
e N. vittatum), tetraplóides com 2n = 16 (Nothoscordum sp. 2) e 2n = 20 (N. grossibulbum) e um hexaplóide com
2n = 26 (N. bonariense). Nothoscordum montevidensis também apresentou um citótipo tetraplóide. Em geral, a morfologia
cromossômica e o padrão de bandas CMA+ foram constantes entre as espécies diplóides com mesmo número básico. O
número e a distribuição dos sítios de DNAr 5S e 45S foram bastante variáveis e, quando considerados em conjunto,
permitiram caracterizar citologicamente todas as amostras analisadas. Nothoscordum sp. 1 e N. montevidensis 2x (2n = 8)
apresentaram sítios de DNAr 45S em três cromossomos e bandas CMA+ co-localizadas em dois deles, além de quatro
e dois sítios de DNAr 5S, respectivamente. As espécies com 2n = 10 apresentaram bandas CMA+ em apenas um par
cromossômico, exceto N. hirtellum, que apresentou bandas CMA+ em cinco cromossomos. Essas espécies diferiram
no número e posição dos sítios de DNAr 45S e na posição dos sítios de DNAr 5S. Nothoscordum montevidensis 4x
(2n = 16) apresentou bandas CMA+ em cinco cromossomos e 11 sítios de DNAr 5S. Nothoscordum grossibulbum (2n
= 20) apresentou bandas CMA+ co-localizadas com sítios de DNAr 45S em cinco cromossomos. Sítios de DNAr 5S
duplicados também foram observados em um indivíduo de N. bonariense, com fórmula cariotípica composta por
21 metacêntricos e cinco acrocêntricos. Os dados obtidos sugerem que rearranjos associados à poliploidização e eventos
de amplificação e desamplificação de seqüências repetitivas parecem ter tido papel importante para a especiação na seção.
Apoio financeiro: CNPq, PIBIC.
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Mapeamento físico dos cromossomos 2 e 8
do feijão comum revela alta proporção de
clones com DNA repetitivo
Ferreira, JBMM; Pedrosa-Harand, A
Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, FISH, BAC, DNA repetitivo
Componente importante da dieta alimentar em países da América Latina e da África, o feijão comum (Phaseolus vulgaris L.,
Fabaceae, 2n = 22) é a principal leguminosa para consumo direto e uma das principais culturas brasileiras. Como pouco
é conhecido de sua constituição genômica, um mapa físico para a espécie está sendo construído através da hibridização
in situ fluorescente (FISH). Para isso, seqüências cópia simples, clonadas em cromossomos artificiais de bactéria (BACs)
da biblioteca de P. vulgaris ‘BAT93’, foram selecionadas com marcadores moleculares (RFLPs chamados Bngs) mapeados
nos grupos de ligação correspondentes e hibridizadas in situ (FISH) em preparações citológicas deste mesmo acesso.
Cinqüenta por cento dos BACs selecionados com marcadores cópia única mapeados geneticamente nos cromossomos
2 e 8 e hibridizados in situ apresentou sinais em vários pares cromossômicos, em padrões de distribuição indicativos de
seqüências repetidas: um pericentromérico, o BAC 92I7 (Bng 174), dois de sinais subteloméricos, os BACs 14F2 (Bng
57) e 234P20 (Bng 96) e um de sinal disperso, 169G16 (Bng 58). Desses, foi possível obter sinais únicos após FISH com
adição de DNA bloqueador (50 × Cot-1) apenas para o BAC 169G16, que se mostrou um marcador específico para o
cromossomo 8. A presença de um padrão repetitivo, mesmo após adição uma grande quantidade de DNA bloqueador
sugere a presença de quantidades significativas de DNA repetitivo dentro desses clones, intercalados com as seqüências
únicas utilizadas para seleciona-los. Dessa forma, certas regiões dos cromossomos, principalmente as heterocromáticas,
tornam-se difíceis de serem mapeadas fisicamente devido ao seu alto conteúdo de DNA repetitivo, mesmo em espécies
com pequeno genoma como o feijão comum (cerca de 500 Mb). Embora não possa ser usado como BAC marcador
específico para um cromossomo, os BACs de padrão repetitivo podem ser utilizados para caracterização do cariótipo
do feijão comum de forma semelhante às técnicas de bandeamento cromossômico, como o bandeamento CMA/DAPI.
De fato, ao menos para os cromossomos 2 e 8, o padrão pericentromérico do BAC 92I7 foi aparentemente semelhante
ao de bandeamento CMA/DAPI realizado para o feijão comum, sugerindo que as seqüências repetitivas contidas neste
BAC façam parte da heterocromatina.
Apoio financeiro: CNPq, FACEPE, UFPE.
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Padrão de distribuição das histonas
H4 acetilada e H3 fosforilada ou metilada
em Costus brasiliensis Schum. (Costaceae)
Feitoza, L1; Guerra, M1
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: acetilação, fosforilação, metilação, imunofluorescência, Costus brasiliensis
As histonas são as proteínas mais abundantes nos núcleos eucarióticos, sendo reconhecidos cinco tipos principais:
H1, H2A, H2B, H3 e H4. Todas altamente conservadas entre grupos distintos de organismos. No entanto, as histonas
são freqüentemente modificadas após sua síntese e essas modificações parecem associadas a funções distintas. Entre
essas modificações destacam-se a acetilação da H4 na lisina 5 (H4K5ac), metilação da H3 na lisina 4 (H3K4me2) e
fosforilação na serina 10 da H3 (H3S10f ), relacionadas principalmente com o reparo do DNA, atividade transcricional
e condensação cromossômica, respectivamente. Apesar de vários estudos nesse sentido, pouco se sabe sobre a visibilidade
dessas modificações em cromossomos mitóticos e meióticos e seu papel na estrutura dos cromossomos. No presente
trabalho foi analisado o padrão de marcação das histonas H4 acetilada na lisina 5 (H4K5ac), H3 dimetilada na lisina 4
(H3K4me2) e H3 fosforilada na serina 10 (H3S10f ) em cromossomos mitóticos de Costus brasiliensis. Essa espécie foi
selecionada por apresentar um padrão de condensação profásico bem diferenciado e número cromossômico relativamente
baixo. Para isso, pontas de raízes foram pré-tratadas com 8HQ, fixadas em formaldeído e imunodetectadas com
anticorpos primários contra H4K5ac, H3K4me2 e H3S10f e anticorpos secundários conjugados com FITC. A marcação
das histonas H4K5ac e H3K4me2 foi evidenciada nos domínios eucromáticos da cromatina interfásica, enquanto os
cromocentros e nucléolos não foram marcados. Durante a prófase até a metáfase, os sinais de H4K5ac e H3K4me2
foram localizados próximos aos terminais cromossômicos de todos os cromossomos, enquanto as demais partes destes
não foram marcadas. Por outro lado, o anticorpo contra H3S10f revelou marcação na região pericentromérica de
todos os cromossomos, iniciando na prófase e intensificando-se na metáfase. Nos núcleos interfásicos a marcação não
foi evidenciada. Esses resultados sugerem que em C. brasiliensis ocorre uma diferenciação pós-traducional das histonas
ao longo do cromossomo dividindo-o em uma região proximal hiperfosforilada, uma região terminal hipermetilada e
hiperacetilada e uma região intersticial não modificada em relação a esses radicais de histonas.
Apoio Financeiro: CNPq e FACEPE.
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Reavaliação do tamanho do genoma
nuclear de cinco plantas utilizadas como
padrão em análises de citometria de fluxo
Silva, TCR1; Praça, MM1; Carvalho, CR1
Departamento de Biologia Geral, Laboratório de Citogenética e Citometria, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Arabidopsis thaliana, citometria de fluxo, quantificação de DNA
Análises da literatura mostraram que plantas utilizadas como padrão em citometria de fluxo (CF), tais como Raphanus sativus,
Solanum lycopersicum, Glycine max, Zea mays e Pisum sativum, possuem distintos valores para a quantidade 2C
de DNA nuclear. Essas diferenças podem ser atribuídas a erros estequiométricos na coloração do DNA, a análises
realizadas em diferentes laboratórios, a utilização de diferentes variedades, tampões e padrões. O presente trabalho se
propõe a reavaliar o conteúdo de DNA dessas cinco espécies por meio da CF. Arabidopsis thaliana foi utilizada como
padrão interno para mensurar o conteúdo de DNA de R. sativus, pois essa espécie possui tanto a quantidade de DNA
conhecida quanto o genoma seqüenciado. Nas análises seguintes, a planta utilizada como padrão interno foi a que
apresentava o conteúdo de DNA inferior e mais próximo ao do da amostra. As suspensões nucleares foram obtidas
usando tampões de extração OTTO-I e de coloração OTTO-II acrescido com o fluorocromo iodeto de propídeo (IP).
As suspensões foram analisadas em um citômetro de fluxo Partec PAS equipado com uma fonte de laser (488nm).
Nove repetições independentes foram realizadas em três dias diferentes, sendo mais de 10.000 núcleos avaliados em
cada análise. Trabalhos de quantificação do DNA nuclear dos padrões foram previamente realizados no laboratório do
Dr. Jaroslav Dolezel do Instituto Experimental Botânico-Sokolovska-República Tcheca. Para R. sativus, S. lycopersicum,
G. max, Z. mays e P. sativum os valores relativos médios de DNA (2C), em picograma, são 1,11; 1,96; 2,65; 5,67; 9,09.
Visto que as plantas reavaliadas são de procedência do mesmo laboratório, objetivou-se a comparação estatística dos
dados obtidos por esse autor com os do presente trabalho. Os valores médios de conteúdo de DNA nuclear encontrados
foram 2C=1,02 para R. sativus; 1,99 S. lycopersicum; 2,39 G. max; 5,67 Z. mays e 9,64 P. sativum. A metodologia
utilizada para preparo das suspensões nucleares proveu histogramas com picos G0/G1 e G2 apresentando coeficiente
de variação (CV) de 1,12% a 4,25%. Esse resultado indica que a metodologia foi adequada. A análise de variância
(ANOVA) demonstrou que as diferenças entre os dados foram estatisticamente significantes (P<0,05). Apenas Z. mays
não apresentou diferença na quantidade de DNA nuclear quando os resultados dos dois laboratórios foram comparados.
Os dados podem contribuir para padronizar os valores de DNA das plantas padrões, uma vez que as análises foram
realizadas com A. thaliana que possui confiabilidade quanto ao conteúdo de DNA nuclear.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Localização cromossômica da principal
sequência satélite das espécies do
gênero Citrus (Rutaceae)
Marques, A; Guerra, M; Silva, AEB
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco – UFPE
[email protected]
Palavras-chave: Heterocromatina, Citrus, DNA satélite, FISH, CMA/DAPI
Citrus é um gênero citogeneticamente bastante estudado, principalmente por coloração com os fluorocromos CMA e
DAPI. As espécies Citrus apresentam 2n = 18 e grande variação na quantidade e distribuição das bandas heterocromáticas
CMA+/DAPI─. De acordo com a distribuição dessas bandas, os cromossomos dessas espécies podem ser classificados nos
seguintes tipos: A, com duas bandas terminais e uma proximal; B, com uma banda terminal e uma proximal; C, com
duas bandas terminais; D, com uma banda terminal; F, sem bandas. Embora a análise dos padrões da heterocromatina
tenha auxiliado muito na compreensão das relações evolutivas entre as espécies de Citrus, pouco se conhece sobre a
composição da heterocromatina e sua variabilidade dentro do gênero. Neste trabalho, foi feita uma análise do padrão
de distribuição cromossômica de uma seqüência satélite de 181 pb, isolada originalmente de C. ichangensis, em cinco
espécies de Citrus (C. sinensis, C. maxima, C. medica, C. reshni e C. sunki). As metáfases foram primeiramente analisadas
com CMA/DAPI e em seguida submetidas à hibridização in situ fluorescente (FISH) com a seqüência satélite. Essa
seqüência foi amplificada e marcada por PCR utilizando DNA genômico de C. sinensis e iniciadores construídos com
base na seqüência de C. ichangensis. A FISH com essa sonda denominada CsSat181, revelou marcação em todas as
espécies analisadas, sendo co-localizadas exclusivamente nos blocos heterocromáticos CMA+ terminais. Em C. sinensis,
com fórmula cariotípica 2B + 2C + 7D + 7F, a sonda hibridizou em todos os blocos terminais CMA+, exceto em um
cromossomo D. Em C. reshni (14D + 4F) a hibridização ocorreu em 12 dos 14 cromossomos do tipo D. Em C. sunki
(14D + 4F), a sonda marcou apenas 10 dos 14 cromossomos D. Em C. maxima (4A + 2C + 4D + 8F) a CsSat181
hibridizou em todas as bandas terminais CMA+. É conhecido da literatura que as bandas proximais das espécies de
Citrus são sempre sítios de DNAr 45S, bem como a banda terminal de alguns cromossomos D. Dessa maneira a sonda
do DNA satélite parece hibridizar em todos os blocos de heterocromatina CMA+, exceto aqueles constituídos de DNAr
45S. Isso sugere que essa seqüência seja o principal componente da heterocromatina das espécies de Citrus. Outras
seqüências, em menor proporção, devem participar da formação da heterocromatina das espécies desse gênero, visto
que a CsSat181 não foi localizada em um par cromossômico de C. sunki e hibridizou parcialmente com o bloco CMA+
de um par cromossômico do tipo D em C. sinensis.
Apoio Financeiro: CNPq e FACEPE.
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A alotetraploidia do genoma de Coffea arabica:
evidências citogenéticas e citométricas
Abreu, IS; Clarindo, WR; Carvalho, CR
Laboratório de Citogenética e Citometria, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Coffea arabica, genoma alotetraplóide, citogenética, citometria de imagem, conteúdo de DNA cromossômico
Estudos evolutivos têm proposto que Coffea arabica, única espécie do gênero com 2n = 44 cromossomos, é um
alotetraplóide segmental originado a partir do cruzamento natural entre duas espécies diplóides (2n = 22). A literatura
específica tem reportado que a ocorrência de cromossomos relativamente pequenos e morfologicamente semelhantes em
C. arabica justifica o não-estabelecimento de cariogramas e prejudica a geração de subsídios que auxiliam na elucidação
da origem e organização do genoma dessa espécie. O presente estudo se propôs a caracterizar os cromossomos de
C. arabica tendo como objetivos específicos: (a) quantificar o conteúdo de DNA nuclear como um pré-requisito para
a citometria de imagem (CI); (b) adaptar um protocolo citogenético para obtenção de cromossomos adequados para
caracterização e estabelecimento do cariograma, e para aplicação da técnica de CI; (c) estimar o conteúdo de DNA de
cada cromossomo. Inicialmente, o tamanho do genoma nuclear de C. arabica foi estimado utilizando a citometria de
fluxo, Solanum lycopersicum como padrão interno e os tampões OTTO. Os histogramas apresentaram picos de núcleos
em G0/G1 com coeficientes de variação de 2.75 a 4.80%, valores aceitáveis nesse tipo de análise. Com base nos picos
dos núcleos em G0/G1 do padrão e da amostra, foi constatado que o valor médio do conteúdo de DNA nuclear de
C. arabica equivale a 2C = 2.62 picogramas. A metodologia citogenética proveu cromossomos com diferentes níveis
de compactação da cromatina. Das imagens capturas foram selecionadas dez metáfases ou prometáfases apresentando
cromossomos com constrições primárias bem definidas, estequiometricamente corados pelo reativo de Schiff, e
sem sobreposições, deformações da cromatina e fragmentos citoplasmáticos. Essas imagens foram utilizadas para
estabelecimento dos cariogramas e para determinação da densidade óptica integrada (DOI) de cada cromossomo.
Distribuindo o valor médio 2C de DNA nuclear de acordo com os valores médios de DOI cromossômico, foi possível
quantificar o conteúdo de DNA de cada cromossomo de C. arabica. Os resultados evidenciaram que o cariograma de
C. arabica contém cromossomos citogeneticamente idênticos (3-4, 5-6, 7-8, 9-10, 11-12, 13-14, 15-16 e 17-18) e
distintos (1, 2, 19, 20, 21 e 22) com relação à classe cromossômica, e ao tamanho total e dos braços curto e longo. Por
meio da CI foi verificado que cada grupo de cromossomos morfometricamente idêntico possui o mesmo conteúdo de
DNA. Além das características citogenéticas, os cromossomos 1, 2, 21 e 22 também apresentaram conteúdo de DNA
cromossômico distinto, diferentemente dos cromossomos 19 e 20. Além do estabelecimento dos primeiros cariogramas
e da quantificação inédita do conteúdo de DNA de cada cromossomo de C. arabica, os resultados mostraram que
C. arabica é um verdadeiro alotetraplóide, não-segmental, e reforçam a hipótese de que essa espécie se originou do
cruzamento de duas espécies com genomas similares.
Apoio financeiro: CNPq, CBP&D/Café, FAPEMIG.
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Identificação e avaliação de
bananeiras autotetraplóides
Souza, EH1; Moreira, CV2; Campos, JMS3; Silva, SO4; Santos-Serejo, JA4
Programa de Pós-Graduação em Ciências Agrárias da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, Cruz das Almas, Bahia
2
Programa de Pós-Graduação em Fisiologia Vegetal da Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais
3
Instituto de Ciências Biológicas e Geociências da Universidade Federal de Juiz de Fora, Minas Gerais
4
Pesquisadores da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Cruz das Almas, Bahia
[email protected]
1
Palavras-chave: Musa spp., Duplicação cromossômica, Colchicina, Citometria de fluxo, Ploidia
O melhoramento genético de bananeira do subgrupo Cavendish, grupo genômico AAA (Nanica, Nanicão e Grande
Naine) é dificultado pela esterilidade. Uma alternativa para geração de genótipos desse grupo é a obtenção de
triplóides secundários, mediante a duplicação dos cromossomos de diplóides promissores e posterior cruzamento dos
autotetraplóides obtidos com um diplóide elite. No presente trabalho foram avaliadas as características citológicas,
morfológicas e agronômicas de seis genótipos de bananeira (Thong Dok Mak, Niyarma Yik, Ouro, Lidi, Malbut e
Berlin) submetidos ao tratamento in vitro com colchicina para duplicação de cromossomos. A ploidia das plantas foi
verificada mediante a observação de características morfológicas, contagem de cromossomos e citometria de fluxo.
Entre as 70 plantas selecionadas para plantio em campo, sete tiveram seus cromossomos duplicados (autotetraplóides),
quatorze eram mixoplóides (com 22 a 88 cromossomos em células de uma mesma planta) e as demais plantas (49),
apesar de terem sido tratadas com colchicina continuaram diplóides. Os autotetraplóides apresentaram folhas mais
arcadas, crescimento mais lento e maior número de dias para o florescimento em relação aos diplóides. As plantas
mixoplóides também apresentaram crescimento lento com folhas bastante espessas e a maioria não chegou a emitir o
cacho. Os dados, do segundo e terceiro ciclos de produção, mostram que os autotetraplóides apresentaram ciclo mais
longo que o dos diplóides. Sete autotetraplóides (AAAA) foram selecionados e estão sendo multiplicados para avaliação
clonal e cruzamento com diplóides melhorados.
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Meiotic and mitotic behaviour of
B chromosomes of ryegrass
(Lolium multiflorum Lam. - Poaceae)
Techio, VH; Mittelmann, A; Marció, S
Universidade do Contestado-UnC, Concórdia-SC
Embrapa Gado de Leite/Embrapa Clima Temperado, Juiz de Fora-MG/Pelotas-RS
[email protected]
Keywords: Lolium, Ryegrass, B chromosome, mitosis, meiosis
In the genus Lolium, the normal chromosomal complement is characterized by seven pairs of chromosomes, which
present disjunction and regular segregation during meiosis. In some varieties of L. multiflorum, L. Perenne, L. Rigidum,
L. persicum, L. remotum and L. strictum, there were described B chromosomes varying in number from one to eight in
microsporocytes of the same plant. The interest in the study of B chromosomes in Lolium is supported by the usefulness
of the knowledge regarding the origin of the polymorphism and investigation of the somatic and germinative cells, which
could clarify the possible role of the chromosomal rearranges in the evolution and speciation of this group of agronomic
importance. Mitotic and meiotic analyses using conventional and fluorescent stains were employed in plants (accession
ETBAZ 055 – origin: Capão do Leão, Rio Grande do Sul State, Brazil) from the Germplasm Active Bank of Ryegrass
(Banco Ativo de Germoplasma de Azevém) of Embrapa, for observing the behaviour of B chromosomes. In several meiotic
stages, there were observed up to two B chromosomes, which have presented an unstable behaviour regarding their
precocious ascension to metaphase I or delays during anaphase I. At the end of the process, the Bs showed predominantly
segregation for the nuclei under formation in order to guarantee their propagation. Concerning the cells that comprise
the anther tapetum and the root meristems, the B chromosomes have presented a more stable behaviour.
Apoio Financeiro: FAP-UnC.
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Chromosomal evolution of the genus
Crotalaria (Leguminosae-Papilionoideae)
and its taxonomy relationships
Mondin, M; Aguiar-Perecin, MLR; Fuchs, MCP; Andrade, LM
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – Universidade de São Paulo, Piracicaba-SP, 13400-970, Brazil
[email protected]
The Crotalaria genus comprises more than 600 species encountered in the tropics and subtropics. A previous work
described a relationship between karyotype characteristics and botanical sections based on morphological characters. In
the present work, some species of Crotalaria belonging to different sections were analyzed using chromosome banding
and FISH. Fluorescent staining with chromomycin A3 (CMA) revealed GC-rich heterochromatic regions around
the centromeres and NOR (on the chromosome 1), in C. juncea (2n=16) and the polyploids (2n=32) C. paulina and
C. stipularia (section Calycinae). A combination of CMA with distamycin A enhanced NOR-heterochromatin but
quenched pericentromeric heterochromatin of all chromosomes. These banding patterns were also observed in species of
section Crotalaria (C. spectabilis and C. virgulata (2n=16)) but not in C. retusa (2n=16). However, in C. incana (2n=14,
section Chrysocalycinae, subsection Incanae), staining with DAPI showed tiny AT-rich regions on most chromosomes.
FISH revealed 45S rDNA signals on chromosome 1 in the species analyzed, but additional minor signals were observed
in C. juncea, C. incana and the polyploid species. 5S rDNA FISH signals were detected on chromosome 1, except
for C. virgulata, C. incana and polyploids. These ones presented a lower number of 45S and 5S rDNA signals than
expected. This suggests that the polyploids lost rDNA sequences during evolution. The sections with features of floral
specialization to pollination accumulated GC rich regions around the centromeres, while C. incana, a species without
any kind of specialization, lacks this pattern, but have AT-rich regions dispersed on the chromosomes.
Supported by: PRODOC/CAPES, FAPESP and CNPq.
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Analysis of karyotype variability of tropical
maize inbred lines and hybrids using FISH
of tandemly repeated DNA sequences to
identify somatic chromosomes
Aguiar-Perecin, MLR; Mondin, M; Santos-Serejo, JA; Molina, SCM; Vida, ACF
The analysis of pachytene chromosomes has greatly contributed to maize cytogenetics. Recently, FISH procedures
using repeated DNA sequences have been described and improved the identification of somatic chromosomes. Due to
the polymorphism of knobs and repetitive DNA sequences, karyotype diversity is observed among varieties. Mitotic
chromosome analysis is valuable for the screening of several individuals, and studies of evolution. We investigated
root-tip chromosomes of inbred lines and hybrids, derived from a tropical variety (Cateto races), using the following
sequences as probes: subtelomeric 4-12-1 clone (PNAS 101, 13555), knob 180-bp sequence, 5S rDNA, centromeric
satellite 4 (Cent4). Pachytene chromosomes and C-banded metaphases were previously analysed, and except for
chromosomes 2, 4 and 5, most chromosomes were distinguished by their length, arm ratio or presence of knobs. We
identified chromosomes 2 and 4 using probes of 5S rDNA (2L) and Cent4, respectively, but their arm ratios were
atypical. Signals of the 180-bp sequence were correspondent to knobs detected by C-banding, and additional small
signals were found at 1S, 6S and 9S, located at arm tips, a feature also found in other varieties. The subtelomeric
sequence was observed at 1S, 2S, 4SL, 5S, 8L. One line was crossed with KYS, an inbred extensively investigated, and
the following observations should be emphasized: differences in the subtelomeric sequence signals; homologues (with
different arm ratios) of chromosomes 2 and 4 formed normal bivalents at pachtytene. This aspect apparently provides
evidence for epigenetical location of centromeres, a finding that has been observed in many organisms.
Supported by FAPESP, CAPES, CNPq-PIBIC.
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Caracterización del complemento
cromosómico y detección de regiones
génicas de interés mediante BAC-FISH en
girasol (Helianthus annus)
Talia, PM1; Diaz Quijano, C2; Pelufo, L1; Paniego, N1; Hopp, HE1; Poggio, L2; Greizertein, E2; Heinz, RA1
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Castelar, CICVyA, Instituto de Biotecnología,
CC 25 (B1712WAA) Villa Udaondo. Pcia. de Buenos Aires, Argentina
2
Laboratorio de Citogenética y Evolución, Departamento de Ecología, Genética y Evolución. Capital federal, Argentina
[email protected]
1
Palabras clave: FISH, BACs, Helianthus annus, cariotipo, mapa físico
El girasol cultivado (Helianthus annuus) posee 2n=34 cromosomas encontrándose cromosomas metacéntricos, submetacéntricos
y subtelocéntricos muy semejantes en tamaño. Existen diversos mapas genéticos de girasol construidos utilizando diferentes
marcadores moleculares (RFLP, AFLP, SSR, EST, QTL (Tang y col., 2002, 2003; Yu y col., 2003; Al-Chaarani y col.,
2004; Lai y col., 2005, Kiani y col., 2007). Sin embargo, a pesar de la importancia económica del girasol, la localización
física de regiones de interés agronómico no ha sido ampliamente desarrollada. La técnica de FISH es una herramienta
útil para el mapeo físico de genes, marcadores, secuencias de bajo número de copias y de copia única. En este trabajo
se presenta la caracterización de los cromosomas del complemento y la localización cromosómica de regiones génicas
de interés utilizando la técnica de BAC-FISH (Bacterial Artificial Chromosmome-Fluorescente In Situ Hybridization).
Para la identificación del complemento cromosómico se utilizó una sonda de ADN repetitivo identificada durante el
desarrollo de los marcadores microsatélites (SSR- Ha785; Paniego y col., 2002), la cual reveló similitud a una secuencia
altamente repetitiva de Helianthus annus, (AN AJ009965). Con esta sonda se identificó un BAC conteniendo secuencias
altamente repetitivas con similitud a secuencias de retrotransposon de tipo “copia like” y “gypsy like”. La utilización
de esta sonda en experimentos BAC-FISH permitió la identificación del complemento cromosómico completo y la
consiguiente confección de un cariotipo y su correspondiente idiograma. Con el fin de establecer la correlación del
mapa genético con el mapa físico de girasol se seleccionaron un conjunto de marcadores representativos de los grupos
de ligamiento de interés (Kiani y col., 2007), los cuales se utilizaron como sondas en filtros de alta densidad de girasol
(BAC: HA_HBa, www.genome.clemson.edu), para la búsqueda de BACs que contenían la secuencia de interés. Para
este fin se realizó la estrategia overgo (overlapping oligonucleotide) donde amplicones de PCR se utilizaron como sondas
marcadas radiactivamente en hibridaciones con filtros BAC de alta densidad. La confirmación de los clones positivos
se realizó por PCR. Se identificaron cinco clones de BAC que contienen cinco marcadores microsatélites y representan
a los 3 grupos de ligamiento seleccionados inicialmente en base a la localización de QTLs para el carácter resistencia
a Sclerotinia sclerotiorum (Maringolo et al 2008). Con el fin de evitar hibridaciones inespecíficas debidas a secuencias
repetitivas presentes en los clones BACs seleccionados, se realizó un ensayo de BAC- Southern-blot utilizando como sonda
la secuencia Ha785, seleccionándose distintos clones BAC con diferente número e intensidad de bandas repetitivas. Esta
secuencia repetitiva se utilizó como bloqueante para hibridaciones BAC-FISH en la detección de regiones cromosómicas
correspondientes a marcadores de localización única en el genoma.
Financiamiento: INTA, ANPCyT, CONICET.
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Fusão celular e citomixia durante
a microsporogênese em
Manihot esculenta Crantz
Risso-Pascotto, C1; Alonso-Pereira, AR1; Godoy, SM1; Perin, LR1; Silva, LA1; Takahashi, M2
Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Paranaense – UNIPAR, Campus de Paranavaí-PR
2
Instituto Agronômico do Paraná – IAPAR – Estação Experimental de Paranavaí-PR
[email protected]
1
Palavras-chave: Manihot esculenta, meiose, microsporogênese, citomixia, fusão celular
A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma importante fonte de carboidrato armazenada na raiz, servindo de
base alimentar para populações de países como África, Ásia e América Latina. A atividade mandioqueira movimenta
US$ 1,2 bilhão, gera um milhão de empregos no Brasil e ocupa uma área de 1,88 milhões de hectares. Além da
reconhecida importância social e econômica como cultura alimentar e de aplicação industrial, o Brasil é considerado
o principal centro de diversidade e a Amazônia, o provável centro de origem da espécie. O presente trabalho teve por
objetivo avaliar o comportamento meiótico de 10 clones da espécie de Manihot esculenta que estão sendo avaliados no
programa de melhoramento genético do IAPAR – Instituto Agronômico do Paraná – Estação Experimental de Paranavaí,
PR. Flores em estágio ideal para estudos meióticos foram coletadas e fixadas em solução de etanol:acético (3:1) por
24 horas e, após transferida para álcool 70% e estocadas sob refrigeração até o momento das análises. Os microsporócitos
foram preparados por esmagamento e coradas com carmim propiônico 1%. O número de cromossomos encontrado
foi (2n = 4x = 36) com número básico x = 9 sendo, portanto tetraplóides. Os resultados mostraram que os clones
analisados apresentaram poucas irregularidades, relacionadas ao nível de ploidia. Fusões celulares foram encontradas
entre os meiócitos em dois clones e transferência de cromossomos foi verificada em um dos clones analisados. A fusão
celular ocorreu preferencialmente entre dois meiócitos e, foi observada nas fases de prófase I a telófase II, e também entre
os grãos de pólen. A citomixia foi observada com mais freqüência na fase de prófase I, ocorrendo entre dois até cinco
meiócitos, com transferência total ou parcial do genoma, durante a migração, a cromatina apresentou alteração na sua
estrutura. Estas irregularidades têm sido relatadas para várias espécies de plantas, entretanto, estão sendo descritas pela
primeira vez no gênero Manihot. Contudo, as irregularidades observadas nestes clones não comprometem a fertilidade
do grão de pólen, pois a freqüência de grão de pólen viável variou de 94,10% a 96,43%. Podendo ser utilizados como
doadores de grão de pólen nos programas de melhoramento de Mandioca para cruzamentos intra- e interespecíficos.
Apoio Financeiro: UNIPAR e Fundação Araucária.
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Otimização da obtenção de plantas duplohaplóides de trigo através da hibridação
trigo x milho: seleção de híbridos
polinizadores e meios de cultura
Moura, MM1; Rosa, LMP1; Oliveira, LA2; Figueira, DP2; Martins, PK2; Franco, FA3; Marchioro, VS3; Vieira, ESN2; Schuster, I2,4
PIBIC Unipar, Universidade Paranaense, Campus Cascavel
2
Biotecnologia, Coodetec
3
Melhoramento de trigo, Coodetec
4
Departamento de Ciências Biológicas, Unipar, Campus Cascavel
[email protected]
1
Palavras-chave: Melhoramento genético, Haploidização, Cultura de tecidos, Meios de cultura, Homozigose
No melhoramento de plantas autógamas, busca-se atingir a homozigose após a realização de cruzamentos artificiais. Em
média, elevadas taxas de homozigose são obtidas após aproximadamente oito gerações de autofecundação. A produção
de plantas duplo-haplóides pode reduzir significativamente o tempo necessário para atingir a homozigose, pois neste
método, a homozigose é obtida em uma geração. A haploidização tem facilitado o desenvolvimento de linhagens
puras, trazendo economia de tempo, maior variância genética, melhor resposta à seleção através da homozigose obtida,
e contribuído para a identificação de cruzamentos promissores. Em trigo, a duplicação cromossômica em plântulas
haplóides gimnogenéticas, obtidas a partir da hibridação trigo x milho, têm sido utilizada com sucesso para a obtenção
de duplo-haplóides. Para que seja utilizada em programas de melhoramento, a técnica de obtenção de duplo-haplóides
deve apresentar elevada eficiência, e permitir o trabalho em larga escala. Este trabalho teve como objetivo a otimização
do método de obtenção de plantas duplo-haplóides de trigo, através da hibridação trigo x milho. Foram avaliados,
em dois experimentos independentes, oito diferentes híbridos de milho como fornecedores de pólen, e três meios de
cultura para a germinação dos embriões haplóides imaturos de trigo (Batata II, B5 Modificado, MS e MS modificado).
A freqüência de formação de cariopses, e a freqüência de formação de embriões foram influenciadas pelo híbrido de
milho utilizado na polinização, sendo que os resultados extremos foram obtidos com pólen do híbrido CD307 (maior
eficiência) e CD308 (menor eficiência). A composição dos meios de culturas também influenciou a taxa de germinação
dos embriões haplóides, sendo que as maiores taxas de germinação (22,6%) ocorreram no meio MS, e as menores (8,6%)
no meio B5. Os resultados indicam que ajustes metodológicos podem contribuir significativamente para o aumento da
eficiência da obtenção de plantas duplo-haplóides em larga escala nos programas de melhoramento genético de trigo.
Apoio financeiro: Coodetec, Unipar.
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Existe variação intra-específica no número
máximo de nucléolos por núcleo interfásico
em Ricinus communis?
Vasconcelos, S1; Souza, AA1; Milani, M2; Benko-Iseppon, AM1; Brasileiro-Vidal, AC1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
2
Embrapa Algodão, Campina Grande–PB
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Nitrato de prata, Ricinus communis, RON, FISH, CMA/DAPI
Devido à grande importância da mamoneira (Ricinus communis) como cultura para produção de biodiesel no Nordeste
do Brasil, principalmente pelo potencial produtivo sob condições de sequeiro, vários estudos têm sido desenvolvidos
para uma caracterização genética de acessos existentes no Banco Ativo de Germoplasma (BAG) da Embrapa Algodão.
Do ponto de vista citogenético, tem sido relatada em trabalhos anteriores, uma variação intra-específica para
R. communis com relação ao número máximo de nucléolos observado por núcleo interfásico. A fim de investigar um
possível polimorfismo cariotípico intra-específico, foram realizadas análises através de coloração com fluorocromos
base-específicos (CMA3/DAPI), com nitrato de prata (AgNO3) e com a técnica de hibridização in situ fluorescente
(FISH) para DNAr 45S. Os dois primeiros procedimentos foram realizados em oito acessos dessa espécie, sendo cinco
genótipos da Embrapa Algodão (‘CSRD-2’, ‘BRS Energia’, ‘BRS Nordestina’, ‘BRS Paraguaçu’ e ‘BRS Nordestina’)
e três populações subespontâneas do Estado de Pernambuco (FN1, FN2 e RB2), sendo a FISH efetuada apenas em
CSRD-2’. O número diplóide 2n=20, morfologia cromossômica predominantemente metacêntrica e sete pares com
blocos heterocromáticos ricos em GC foram observados em todos os acessos. Com relação à coloração com AgNO3,
obtiveram-se resultados discrepantes quando foram utilizadas duas técnicas distintas no mesmo material vegetal.
Seguindo a metodologia descrita por Hizume et al. (1980. Stain Technology 55: 87-90), de um a quatro nucléolos por
núcleo interfásico foram visualizados em todos os acessos (de um mínimo de 1.239 células contabilizadas por acesso,
ca. 97% apresentaram um e ca. 2,5% dois nucléolos), exceto em ‘BRS Energia’, na qual duas células contiveram oito
nucléolos. No entanto, quando foi aplicada a técnica de Vieira et al. (1990. Genome 33: 713-718), foram observados
de um a 14 nucléolos por núcleo interfásico, sendo mais freqüente a presença de um (ca. 85%) e dois nucléolos
(ca. 10%) para todos os acessos analisados. A FISH revelou a presença de sete pares cromossômicos portadores de sítios
de DNAr 45S, correspondendo estes a blocos heterocromáticos positivos para CMA. O par satelitado apresentou um
sítio fortemente marcado com a sonda utilizada, entretanto os demais sítios foram pequenos e nem sempre visualizados
nas células analisadas. O resultado obtido pela FISH corrobora a maior eficiência da metodologia proposta por Vieira
et al. (1990). A hipótese de variação entre populações de R. communis no que concerne ao número máximo de nucléolos
por núcleo interfásico, sugerida anteriormente com base na técnica de Hizume et al. (1980), pode ser descartada. A
referida metodologia parece apresentar deficiência na detecção nucléolos de tamanho reduzido em R. communis.
Apoio Financeiro: FACEPE, CNPq, ENENE/FUNDECI/BNB.
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Caracterização cariotípica de Chamaesyce
thymifolia, (Euphorbiaceae) por meio de
coloração convencional, bandeamento
com fluorocromos base-específicos e
hibridização in situ fluorescente (FISH)
Santana, KCB1; Pinangé, DSB1; Vasconcelos, S1; Brasileiro-Vidal, AC1; Alves, MV2; Benko-Iseppon, AM1
Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Botânica, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cromossomos, DNAr 45S, heterocromatina, disploidia, RONs
A família Euphorbiaceae está entre as mais representativas e diversificadas dentre as angiospermas, englobando várias
espécies de importância econômica, como a mamoneira (Ricinus communis), a seringueira (Hevea brasiliensis) e a mandioca
(Manihot esculenta). Sob uma ótica ecológica destaca-se a espécie Chamaesyce hirta que possui um alto potencial na
biorremediação de solos alcalinos enquanto o aveloz (Euphorbia tirucalli) e Chamaesyce thymifolia destacam-se na fitoterapia
pela ação antiviral e bactericida, dentre outras, apresentando esta última ainda atividade inibitória moderada do HIV e do HSV
em humanos. Análises citogenéticas foram realizadas em três populações de C. thymifolia do entorno da Reserva Ecológica de
Dois Irmãos por meio de técnicas de coloração convencional (Giemsa), coloração com fluorocromos base-específicos (CMA3/
DAPI) e hibridização in situ fluorescente (com sonda de DNAr 45S). Durante a análise convencional, os núcleos interfásicos
mostraram-se semi-reticulados, observando–se o padrão de condensação proximal. Contagens cromossômicas de 155 células
mitóticas confirmaram o número 2n=12 para a espécie. Avaliação da morfologia revelou cromossomos metafásicos pequenos
de tamanho decrescente (sem bimodalidade), com as médias do maior e do menor cromossomo iguais a 2,04 µm e 1,43 µm,
respectivamente e tamanho total médio do complemento diplóide de 20,51 µm. Tais dados diferem dos anteriormente citados
na literatura, onde cromossomos acrocêntricos foram descritos. Análises com fluorocromos base-específicos revelaram bandas
pericentroméricas CMA3+/DAPI0 (ricas em GC) em todos os cromossomos e blocos CMA-/DAPI+ (ricos em AT) na porção distal
de todos os braços cromossômicos, exceto nos três pares satelitados que exibiram blocos CMA3+/DAPI- associados às RONs. No
que concerne à FISH, oito marcações terminais em quatro pares cromossômicos foram evidenciadas, sendo um par de difícil
visualização por apresentar bandas com menor intensidade de sinal. As marcações dos três pares restantes coincidiram com as
bandas associadas às RONs, visualizadas com CMA3/DAPI. Possivelmente, esses sinais de maior intensidade correspondem
aos genes organizadores de nucléolos ativados com maior freqüência, o que pode vir a ser confirmado via coloração com
nitrato de prata. Trata-se da primeira análise de Chamaesyce com coloração de fluorocromos e FISH, revelando uma série de
marcadores físicos em nível cromossômico. Considerando-se tratar-se de um provável diplóide (2n=12) é notável o número
de pares portando sítios de DNAr 45S (quatro), dado indicativo de rearranjos estruturais possivelmente associados a eventos
de disploidia regressiva. Considerando todos os marcadores cromossômicos, foram identificados dois tipos de DNA satélite
(correspondente aos blocos de heterocromatina constitutiva) na espécie: (A) rico em GC nas regiões pericentroméricas, e
(B) rico em AT nas regiões distais. O número significativo de marcadores cromossômicos aqui observados indica o potencial
do uso de técnicas citogenéticas em análises biossistemáticas em espécies deste gênero no futuro.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, UFPE.
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Estudos cromossômicos em espécies de
leguminosae de ocorrência nas dunas do
Abaeté (Salvador-Bahia-Brasil)
Franco Cairo, JPL; Guedes, MLS; Cotias de Oliveira, ALP
Instituto de Biologia, UFBA
[email protected], [email protected]
Palavras-chave: Leguminosae, Citogenética, Cromossomo, Abaeté, Brasil
A APA do Abaeté, um ecossistema de restinga na região metropolitana de Salvador, possui registro de cerca 410
espécies de plantas pertencentes a 88 famílias. A área vem sofrendo forte degradação ambiental, além de ser alvo de
especulação imobiliária no entorno. A família Leguminosae é a mais representativa neste ecossistema com cerca de 50
espécies, abrangendo suas três subfamílias. Embora sejam cosmopolitas, as leguminosas tem centro de diversidade nas
regiões tropicais e subtropicais, possuindo cerca de 18.000 espécies descritas e distribuídas em 650 gêneros de hábitos
variados e muitas destas ainda carecem de informações citogenéticas, sendo sua filogenética um grande desafio. Este
trabalho tem por objetivo determinar número de cromossomos, nível de ploidia, variação no tamanho cromossômico
de algumas espécies e inferir sobre o número básico dos gêneros estudados, contribuindo para elucidar aspectos de sua
filogenia. Espécimes foram coletadas e registradas no herbário ALCB. Sementes foram germinadas em vermiculita em
temperatura ambiente. Raízes jovens foram pré-tratadas com 8-hidroxiquinoleína 0,002M durante 24 horas a 12º C
e fixadas em solução de Carnoy. A coloração foi feita pelo método de Feulgen e sobrecoloração com carmim acético
1%. Os resultados obtidos mostraram para Chamaecrista sp. 2n=28 e Macrolobium rigidum, 2n=24 (Caesalpinioideae);
Inga capitata com 2n = 26 e Inga laurina, 2n=52 (Mimosoideae); Bowdichia virgilioides e Poecilanthe itapoana (Faboideae)
mostraram 2n=18. Exceto para Inga laurina, estes registros são inéditos para as espécies e para os gêneros Macrolobium e
Poecilanthe. O gênero Chamaecrista é dibásico, x=8 e x=7, sendo Chamaecrista sp. 2n=4x=28, um tetraplóide do número
básico derivado x=7. Macrolobium rigidum mostrou 2n=2x=24, o que sugere x=12, em acordo com o número básico
da tribo Amherstieae a qual pertence. A contagem 2n=2x=26 para Inga capitata concorda com o número básico x=13
sugerido para o gênero, sendo I. laurina, um tetraplóide, 2n=4x=52. Poecilanthe itapoana é um diplóide de x=9 como
já registrado para outros gêneros de sua da tribo Brongniartieae. Bowdichia virgilioides com 2n=2x=18 tem o mesmo
número já registrado para B. nitida, de ocorrência na Amazônia, confirmando o número básico de x=9. Inga laurina
apresentou os menores cromossomos, na faixa de 0,8 a 2,5 μm e Macrolobium rigidum os maiores, variando de 2 a 4 μm;
os cromossomos das demais espécies estão dentro destes limites. Um par de satélite foi observado para I. capitata. Mais
estudos desta natureza deverá ser feito com espécies de Leguminosae do Abaeté, contribuindo com mais informações
para esclarecer a filogenia da família e como fonte de dados citogenéticos de ecossistemas de restinga.
Apoio FAPESB.
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Análise do comportamento meiotico em
Psychotria carthagenensis JACQ. (Rubiaceae)
Alonso-Pereira, AR; Godoy, SM; Risso-Pascotto, C; Romagnolo, MB
Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Paranaense – UNIPAR, Campus de Paranavaí (PR)
[email protected]
Palavras-chave: Psychotria carthagenensis, meiose, microsporogênese, políades, citocinese irregular
A família Rubiaceae é uma das maiores famílias de angiospermas distribuída em todo o mundo, inclui aproximadamente
637 gêneros e cerca de 10.700 espécies (CORREA, 2003), No Brasil esta representada por 130 gêneros e 1.500 espécies
distribuída por diversos locais do país, com grande ocorrência na Mata Atlântica. As plantas da família Rubiaceae
podem ser classificadas como árvores de grande, médio ou pequeno porte, arbustos, subarbustos, ervas perenes ou anuais
(SOUZA & LORENZI, 2005). O gênero Psychotria L.é considerada o maior gênero da família. A espécie Psychotria
carthagenensis distribui-se por todo país e é uma das espécies mais importantes do gênero, pois possui diversas utilidades
farmacológicas como antiviral, analgésico e antibacteriana. A maioria dos estudos sobre o gênero Psychotria são relacionados
aos estudos farmacológicos, o que deixa lacunas, principalmente no que se refere à taxonomia, morfologia e conservação.
De acordo com a literatura pesquisada para várias espécies do gênero há apenas contagem do número cromossômico
e algumas espécies foi verificada a viabilidade do grão de pólen, no entanto para a espécie P. carthagenensis Jacq. não
há registro destes estudos. Diante disto, o presente estudo teve como objetivo analisar o comportamento meiótico
da Psychotria carthagenensis, a fim de fornecer dados sobre o número e o comportamento dos cromossomos, visando
contribuir para a conservação da espécie. As inflorescências jovens foram colhidas e fixadas em etanol:ácido acético
(3:1) por 24 horas, em seguida foram transferidas para álcool a 70% e armazenadas sob refrigeração até o momento
das análises. Os microsporócitos foram preparados pela técnica de esmagamento e corados com carmim propiônico a
1,0%. A análise do comportamento meiótico mostrou que 87,83% dos microsporócitos comportaram-se de maneira
normal e, ao final da meiose II ocorreu a formação de quatro núcleos que, por meio de um processo denominado
citocinese simultânea se dividiu originando quatro micrósporos haplóide. A baixa freqüência de irregularidade observada
nesta espécie está relacionada ao processo de citocinese, pois em 1,61% dos microsporócitos foi verificada a presença
de citocinese irregular nas telófases I e em várias fases da meiose II, levando a formação de díades, tríades e políades,
como produto final da meiose. Contudo, apesar das irregularidades encontradas verificou-se uma baixa freqüência,
3,17% de grãos de pólen desbalanceados.
Apoio Financeiro: UNIPAR e Fundação Araucária.
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Mensuramento do conteúdo de DNA nuclear
e da composição de bases de Coffea
canephora e Coffea arabica por meio
da citometria de fluxo
Carvalho, GMA; Clarindo, WR; Carvalho, CR
Laboratório de Citogenética e Citometria, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Coffea arabica, Coffea canephora, citometria de fluxo, genoma nuclear, composição de bases
O conteúdo de DNA nuclear das duas espécies mais cultivada do gênero Coffea, Coffea canephora e Coffea arabica, tem
sido mensurado, em picogramas (pg), por meio da citometria de fluxo. Os estudos prévios de quantificação do tamanho
do genoma por meio dessa ferramenta apresentaram distintos valores médios de 2C nuclear para as duas espécies. O
presente trabalho se propõe a: (a) utilizar os tampões OTTO para obter as suspensões nucleares; (b) estimar o conteúdo
de DNA nuclear utilizando três plantas como padrão interno e externo de DNA conhecido: Raphanus sativus, Solanum
lycopersicum e Pisum sativum; (c) determinar a composição de bases de C. canephora e C. arabica. Folhas da amostra e
do padrão foram submetidas aos procedimentos de isolamento e coloração nuclear utilizando os tampões OTTO. As
suspensões nucleares; coradas com iodeto de propídeo (quantificação do DNA total), cromomicina A3 ou 4’,6’-diamino2-fenilindole (determinação da composição de bases GC e AT%); foram processadas em citômetro de fluxo Partec.
Nove repetições foram realizadas, sendo pelo menos 10.000 núcleos processados em cada análise. As posições dos picos
dos núcleos em G0/G1 e os coeficientes de variação (CV) foram calculados usando o programa FlowMaxPartec. Os
histogramas, obtidos a partir das suspensões nucleares mantidas no tampão OTTO-I por 10 minutos e no OTTO-II
por 30 minutos, apresentaram CVs entre 2.75 e 4.86%. Esses valores são considerados aceitáveis nesse tipo de análise,
especialmente para espécies que, como as do gênero Coffea, possuem metabólitos secundários que interferem na coloração
estequiométrica do DNA. O valor médio 2C nuclear de C. canephora e de C. arabica obtido nas diferentes repetições
foi estatisticamente idêntico conforme o teste F. Esse resultado, associado aos valores de CV, indica que a metodologia
proporcionou suspensões contendo uma grande quantidade de núcleos intactos e estequiometricamente corados, e que
o citômetro de fluxo foi adequadamente calibrado. Diferentemente dos outros dois padrões, os valores de tamanho
de genoma nuclear, obtidos por meio do uso de Solanum lycopersicum como padrão interno e externo, não deferiram
estatisticamente de acordo com o teste de Duncan. Portanto, Solanum lycopersicum foi o padrão mais adequado para
estimar o valor 2C nuclear e a composição de bases. O valor médio de conteúdo de DNA de C. canephora foi equivalente
2C = 1.41 pg ± 0.004, e o de C. arabica 2C = 2.62 ± 0.002. C. canephora apresentou uma proporção de bases igual a
65.27% AT e 34.73% GC, e C. arabica 63.04% AT e 36.96% GC. Os resultados do presente estudo demonstraram a
necessidade de testar diferentes plantas como padrão, pois os metabólitos secundários, liberados durante a preparação
das suspensões nucleares, interferem na acessibilidade do corante à molécula de DNA provocando pseudo-variações
do tamanho do genoma.
Apoio financeiro: CNPq, CBP&D/Café, FAPEMIG.
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Análise cariotípica em Theobroma cacao L.
e em mutantes espontâneos
Figueiredo, GSF1; Ahnert, D1; Zaidan, HA2; Araújo, IS1; Souza, MM1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
2
Ceplac, Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira
[email protected]
1
Palavras-chave: cacaueiro, morfometria, cromossomos
O cacaueiro é uma espécie perene, de origem neotropical. Suas amêndoas são apreciadas principalmente para a produção
de chocolates e medicamentos, enquanto a polpa é utilizada para a fabricação de sucos e para outras inúmeras aplicações.
No entanto, como para a maioria das espécies tropicais, pouco se sabe sobre seus aspectos citogenéticos. No Banco de
Germoplasma da CEPLAC são mantidos mutantes obtidos espontaneamente nas lavouras de cacaueiros, que apresentam
modificações fenotípicas. Esses genótipos vêm sendo estudados em relação ao seu cariótipo. Para isso, pontas de raízes da
variedade Comum foram obtidas por germinação de sementes enquanto as pontas de raízes dos mutantes espontâneos
foram obtidas por estaquiamento. Todas as pontas de raízes foram pré-tratadas com 8 HQ 0,002M, variando de 3 a 22 h
de acordo com o acesso. O material foi fixado em carnoy 3:1, amaciadas com enzima Pectinex ULTRA SP para os acessos
mutantes e hidrolisadas com HCL 5 N para a variedade Comum. As lâminas foram preparadas de acordo com a técnica
de esmagamento e transformadas em permanentes com auxílio do vapor de nitrogênio líquido. As Lâminas foram coradas
com Giemsa, a concentração variou de 1 a 2%, de acordo com o acesso. As metáfases foram fotografadas em câmera
digital e as medições e cariogramas foram obtidos com o auxílio do programa Adobe Photoshop CS. Os cariogramas
das variedades estudadas demonstraram-se simétricos, com cromossomos cuja morfologia variou de metacêntricos
à submetacêntricos. Foi detectada a presença de macrosssatélites no cariograma da variedade Comum e um par de
satélites esferoidal no mutante Pucala. Para o mutante Rui não foram visualizados satélites. O maior comprimento de
lote haplóide foi obtido para a o mutante Pucala, com 18,6 µm de comprimento, e o menor para a variedade Comum,
com 16,65 µm. Com relação ao índice de assimetria, o maior valor foi obtido para o mutante Rui, com TF= 44,95%,
e o menor valor para a variedade Comum, com TF = 39,25%. O Comprimento médio de cromossomos variou de
1,86µm à 1,66 µm de comprimento. Essas alterações estruturais podem ser resultantes de mecanismos de amplificação
de DNA, que podem estar envolvidas nas alterações fenotípicas observadas nessas plantas.
Apoio financeiro: FAPESB.
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Análise cariotípica em duas populações
de Harrisia adscendens
Aquino, JC; Oliveira, JPL; Botelho, RB; Assis, JGA
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética vegetal, Cactaceae, Trichocereae, Harrisia adscendens, Cactáceas
A família Cactaceae é representada por aproximadamente 1.500 espécies distribuídas em 100 gêneros e quatro subfamílias.
Esta família é endêmica das Américas, apresentando ampla distribuição na região semi-árida do nordeste brasileiro. O seu
número básico é x = 11, podendo apresentar variações ao nível de ploidia. O gênero Harrisia, pertencente à subfamília
Cactoideae e à tribo Trichocereeae, possui 14 espécies, sendo endêmico e nativo do leste do Brasil. O objetivo do trabalho
foi caracterizar citogeneticamente uma população da espécie Harrisia adscendens a fim de identificar possíveis variações
cromossômicas envolvidas na evolução do grupo, pois estas desempenham um papel muito importante na especiação.
As análises cromossômicas foram realizadas em pontas de raízes obtidas de estacas coletadas nos municípios de Capim
Grossa e Baixa Grande, ambos na Bahia. O material foi submetido ao pré-tratamento em 8-hidroxiquinolina por
24 h a 12ºC, fixadas em solução de Carnoy por 24h e estocagem em álcool a 70%. Para a coloração das raízes foi feito
hidrólise em HCL 1N a 60ºC por 8min com posterior coloração em reativo de Shiff, segundo o método de Feulgen por
45m a 2 h e sobrecoloração com carmim acético a 1%. As melhores metáfases foram selecionadas, fotomicrografadas
e medidas. Foram analisadas metáfases bem espalhadas que revelaram que a espécie é diplóide, apresentando 2n = 22
cromossomos, estando de acordo com o número básico sugerido da família. Embora a subfamília Cactoideae seja a que
apresenta maior registro de ocorrência de poliplóides, dentro da tribo Trichocereeae existe pouca variação numérica
registrada, talvez pela quantidade reduzida de trabalhos com essa tribo. No entanto, foi encontrada variação no tamanho
dos cromossomos. Enquanto a população de Capim Grosso apresentou amplitude no tamanho dos cromossomos de
1,24 a 2,89µ e comprimento do lote haplóide foi de 22,66µ, a população de Baixa grande apresentou amplitude de
1,9 a 3,7µ e o comprimento do lote haplóide foi de 22,66µ
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Mapa citogenético comparativo dos
cromossomos 2 e 10 da fava
(Phaseolus lunatus L.) utilizando BACs
do feijão comum (P. vulgaris L.)
Bonifácio, EM1,2; Pedrosa-Harand, A2
Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco
2
Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
Palavras-chave: FISH, BAC, Phaseolus
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) e a fava (P. lunatus L.) estão entre as leguminosas de maior importância para o
consumo humano direto. Dentre as cinco espécies cultivadas do gênero, estas são as mais distantes filogeneticamente.
Nos últimos anos, a localização de BACs (cromossomos artificiais de bactérias) través da técnica de hibridização in situ
fluorescente (FISH) tem sido bastante utilizada para construção de mapas físicos cromossômicos. Os BACs mapeados
em uma espécie podem ser então mapeados em espécies relacionadas para estudos de evolução cariotípica. Este trabalho
teve por objetivo comparar a localização de seqüências entre os cromossomos homeólogos do feijão comum e da fava
visando compreender a evolução cromossômica deste gênero. Para isso, foram mapeados através da FISH BACs dos
cromossomos 2 e 10 do feijão comum em cromossomos mitóticos da fava. Para o cromossomo 2 foram empregados três
BACs (92I7, 127F19 e 225P10). O BAC 92I7 hibridizou na região pericentromérica de todos os cromossomos, com
um par cromossômico apresentando sinais de menor intensidade. Este padrão foi semelhante ao observado no feijão
comum. Os dois outros BACs apresentaram-se praticamente colocalizados na região subtelomérica do cromossomos
2, sendo o 225P10 mais distal que o 127F19. Esta mesma localização relativa também foi observada em P. vulgaris,
entretanto, enquanto o cromossomo 2 do feijão comum é classificado como acrocêntrico, seu homeólogo na fava
apresentou morfologia metacêntrica. O BAC 63H06, que apresentou marcação subtelomérica em vários cromossomos
de P. vulgaris, revelou sinais únicos na região subtelomérica do braço curto deste cromossomo em P. lunatus. Esta
localização foi compatível com a posição terminal do marcador molecular associado a ele no mapa genético do feijão
comum. Apesar da diferença de morfologia cromossômica observada entre as espécies, os BACs mapeados até o momento
indicam uma conservação na localização destas seqüências entre as mesmas. A diferença observada foi na distribuição de
uma ou mais seqüências repetitidas subteloméricas presentes no BAC 63H06. Um maior número de seqüências estão
sendo mapeadas de modo a esclarecer as diferenças cariotípicas presentes entre o feijão-comum e a fava.
Apoio financeiro: CNPq.
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Desenvolvimento de ferramentas
biotecnológicas para o controle do bicudodo-algodoeiro: Identificação de gene
expressos exclusivamente em tecidos florais
para clonagem e caracterização preliminar
de promotores específicos de flor
Artico, S1; Nardeli, SM1; Alves-Ferreira, M1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: Gossypium hirstum, bicudo-do-algodoeiro, genes específicos de flor
O bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) é a praga de maior incidência e causador de dano na cultura do algodão (Gossypium
hirsutum). Este inseto se caracteriza por atacar botões florais com diâmetro variando de 3 a 6mm que são os preferidos para sua
alimentação e oviposição. Como método de controle, além das técnicas usuais como aplicação de inseticidas, o desenvolvimento
de plantas transgênicas expressando toxinas específicas para insetos têm sido extremamente bem sucedido no combate a pragas.
O exemplo mais bem sucedido é o de plantas expressando proteínas Cry do Bacillus thuringiensis, resistentes a uma ampla
gama de pragas na agricultura. No entanto, o desenvolvimento de plantas resistentes a insetos não depende só da identificação
e caracterização de toxinas para insetos, mas também na caracterização de promotores de expressão de genes que tenham uma
atividade forte e específica para os tecidos onde a planta será atacada. Portanto, o nosso objetivo é identificar e caracterizar
promotores em G.hirsutum que possam ser utilizados em combinação com proteínas inseticidas para o controle do A. grandis.
Para a identificação dos promotores específicos de flor, foi realizado um trabalho de bioinformática com o objetivo de encontrar
genes expressos predominantemente em flores. Inicialmente foi realizada uma busca no Banco de Dados de EST de Genoma do
Algodão por genes altamente expressos (apresentando seis ou mais reads) e cuja expressão estava restrita em bibliotecas de flores
ou óvulos. Com a seqüência desses genes foi realizado BLASTn no Banco de Dados de Arabidopsis com objetivo de encontrar os
possíveis ortólogos em Arabidopsis, somente genes com o um e-value menor do que 1 x 10-60 foram escolhidos. Os possíveis genes
ortólogos de Arabidopsis foram então analisados na plataforma Genevestigator que permite avaliar o padrão de expressão a partir
de centenas de experimentos de microarranjo. Estes genes também foram avaliados através de buscas no NCBI assim como dados
na literatura quanto a possível associação para eventos que ocorrem durante o desenvolvimento floral. Após está cuidadosa análise,
somente 19 genes foram selecionados como sendo possivelmente expressos de maneira predominante em flores. Entre os genes
selecionados estão o gene da pectina metilesterase que está envolvido nos processos de modificação de parede celular durante o
desenvolvimento do pólen e o gene da mio-inositol oxigenase que está envolvidos na síntese de precursores de matrix extracelular
em flores. As seqüências nucleotídicas destes genes foram utilizadas para desenho de oligonucleotídeos através da ferramenta
PRIMER3 para experimentos de PCR real time para comprovar a expressão. Os genes que apresentarem expressão específica de
flor serão utilizados como ponto de partida para clonagem da região promotora. A identificação de um promotor específico de
flor permitirá potencializar o efeito tóxico do transgene além de evitar possíveis efeitos tóxicos em insetos não alvo.
Financiamento: FACUAL, FAPERJ e CNPq.
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Studies of Plant-Xylella fastidiosa
interactions in tobaco transgenic plants
Carvalho, K1; Ferreira, CM1; Carvalho, JFRP1; Molinari, HBC2; Meneguim, L1; Marur, CJ1; Vieira, LGE1
Plant Biotechnology Laboratory, Agricultural Research Institute of Parana (IAPAR), CP481, CEP86001-970 Londrina PR
2
Embrapa Agroenergia, Brasília – DF
1
Keywords: Xylella fastidiosa, Citrus variegated chlorosis, sarcotoxin IA, Nicotiana tabacum, antimicrobial peptide
Citrus variegated chlorosis (CVC), caused by Xylella fastidiosa bacteria, has become an important disease of citrus
culture. This disease is present in almost half of the citrus growing areas in Brazil and strongly affects sweet orange
production, leading to important economic losses. Many studies have been carried out to understand how citrus plants
are colonized by X. fastidiosa. However, the lack of alternative experimental hosts has been an obstacle to accelerated
progress in this area. Some authors have shown the potential of tobacco as plant model. Sarcotoxin IA, a bactericidal
peptide from Sarcophaga peregrina, interacts with bacterial cell membrane causing loss of electrochemical potential.
These types of peptides are excellent candidates to increase the resistance in plants due mainly to the fast biostatic
capacity against the target cells, the activity at low concentrations and its non-toxic nature to eukaryotic higher
cells. Here we report the evaluation of tobacco transgenic plants constitutively producing the antimicrobial peptide
Sarcotoxin IA (STXIA) regarding the resistance to X. fastidiosa. No statistical differences were found between both
inoculated and non inoculated transformed and control plants regarding the parameters analyzed such as leaf area,
transpiration, chlorophyll content, xilematic flow and fresh and dry mass. The plant height was different between
control and transgenic plants independent of inoculation, with the transgenics were higher. The effect of sarcotoxin
observed on the non inoculated transgenic plants of Nicotiana tabacum cv. Turkish Samsum might be due the action
of this peptide on other pathogenic microorganisms or to position effect of transgene in the genome sites. Considering
previous report showing that tobacco is a suitable host for CVC, our results showed that differences in effects between
Nicotiana genotypes have to be taken into account for studies in plant-CVC interactions.
Financial support: CNPq.
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Regeneração in vitro de gemas adventícias
de laranja azeda
Silva, RP1; Mourão Filho, FAA1; Mendes, BMJ2
Laboratório de Biotecnologia de Plantas Hortícolas, Departamento de Produção Vegetal,
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
2
Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Citrus aurantium L., fitorregulador, organogênese, transformação genética, segmento de epicótilo
A transformação genética tem sido considerada uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento de citros. Por
isso, foram avaliadas a indução e a formação de gemas adventícias em explantes de laranja azeda (Citrus aurantium L.)
visando futuros trabalhos de transformação genética. Foram realizados experimentos de organogênese in vitro avaliandose concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) (0.5 e 1.0 mg L-1), thidiazuron (TDZ) (0.01 e 0.02 mg L-1) e cinetina
(CIN) (1.0 e 2.0 mg L-1) sob duas condições de luminosidade (fotoperíodo de 16 h e escuro por 30 dias), e, BAP
(1.0, 2.0 e 3.0 mg L-1) e CIN (1.0, 2.0 e 3.0 mg L-1) combinados ou não com ácido naftalenoacético (ANA)
(0.3 mg L-1). Segmentos de epicótilo com aproximadamente 1,0 cm de comprimento provenientes de plântulas
de laranja azeda germinadas in vitro foram utilizados como explantes e cultivados em meio MT sem e com adição
de fitorreguladores. O material foi cultivado a 27 ºC em ausência de luz por 30 dias, seguidos de mais 30 dias sob
fotoperíodo de 16 horas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco repetições, sendo cada
repetição constituída de uma placa de Petri com 20 explantes. Foram avaliados o percentual de explantes que formaram
gemas e o número de gemas regeneradas por explante. A adição de BAP ao meio de cultura, combinada ou não com
ANA, levou a melhor resposta organogênica. A ausência de luz prejudica a organogênese. A suplementação do meio
de cultura com TDZ não favoreceu a formação de gemas adventícias.
Apoio financeiro: CNPq.
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Eficiência de transformação genética de nós
cotiledonares e cotilédones imaturos
de soja via Agrobacterium,
mediada por sonicação
Texeira, LR1; Martins, PK2; Vieira, ESN2; Gioda, MD2; Oliveira, LA2; Braccini, AL1; Schuster, I2
Programa de Pós – Graduação em Genética e Melhoramento. Departamento de Agronomia, Universidade Estadual de Maringá
2
Biotecnologia, Coodetec
[email protected]
1
Palavras-chave: Plantas Transgênicas, Embrião Imaturo, Engenharia Genética, Biotecnologia, Cultura de Tecidos
Diversos fatores estão envolvidos na obtenção de plantas geneticamente modificadas. O método de transformação,
a capacidade de regeneração in vitro, e o tipo de explante são alguns dos principais fatores. No processo de obtenção
de soja [Glycine max (L.) Merril] geneticamente modificada muitos tipos de explantes podem ser utilizados, porém
estes diferem principalmente quanto à capacidade de regeneração e quanto à eficiência de transformação. Assim, o
trabalho teve como objetivo comparar a eficiência de transformação genética entre dois tipos de explantes de soja:
nós cotiledonares e cotilédones imaturos via Agrobacterium tumefaciens mediada por sonicação (SAAT). A linhagem
de A. tumefaciens utilizada foi a EAH 105 e os explantes obtidos da cultivar CD 211. Os explantes foram avaliados
três dias após o co-cultivo para transformação com o vetor binário pCAMBIA 3301 contendo ambos os genes GUS
(codificador a enzima β-glucuronidase) e o bar (codificador da enzima fosfinotricina aciltransferase) como marcador
de seleção em plantas. O ensaio histoquímico para o gene GUS demonstrou diferença na eficiência de transformação
para os dois tipos de explantes analisados. De acordo com os resultados, a taxa de transformação genética observada
foi de 85% em cotilédones imaturos, enquanto que em nós cotiledonares foi apenas de 45%. Embora a regeneração de
nós cotiledonares seja mais simples e rápida quando comparada a cotilédones imaturos, a eficiência de transformação
genética em cotilédones imaturos demonstrou-se mais promissora para obtenção de plantas geneticamente modificadas
a partir da transformação mediada por A. tumefaciens.
Apoio Financeiro: COODETEC, CAPES e FINEP/CNPq.
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Expressão transgênica da
eritropoietina humana em plantas
Sperb, F1; Werlang, ICR2; Pinheiro-Margis, MMAN1,3; Basso, LA1,2; Santos, DS2; Pasquali, G1
PPG Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS
2
Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional da Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS
3
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UFRGS, Porto Alegre, RS
[email protected]
1
Palavras-chave: Eritropoietina humana, expressão transgênica, Nicotiana tabacum, Oryza sativa
A eritropoietina (EPO) é um hormônio que pertence ao grupo de fatores de crescimento hematopoiético, que
controlam a proliferação e a diferenciação de células da medula óssea. Ela age induzindo a elevação da produção de
células vermelhas, aumentando a quantidade de hemoglobina e oxigênio circulante. Este hormônio é principalmente
secretado pelo rim, e é amplamente usado na medicina como tratamento para anemia, desordens renais e cardíacas,
tumores e diversas outras doenças. A EPO recombinante tem sido produzida em células de mamíferos COS-1 e CHO
e, experimentalmente, em células de insetos, leveduras e bactérias. Até o momento, há somente uma descrição da
expressão desta proteína em plantas. No presente trabalho, pretendemos avaliar a expressão do gene humano para a
EPO em plantas como o arroz (Oryza sativa) e o tabaco (Nicotiana tabacum). O gene da EPO foi sintetizado baseado
na técnica de “overlapping” de nucleotídeos. A identidade da seqüência foi confirmada e o fragmento foi transferido
para o vetor de expressão pWUbi.tm1, o qual possui o promotor do gene da ubiquitina e o terminador tm1’. Este
cassete de expressão foi transferido para o vetor binário pWBVec4a sendo, posteriormente, transformado nas cepas
AGL1 e LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Estas cepas foram utilizadas na transformação de calos de arroz e
segmentos foliares de tabaco, respectivamente. A integração do transgene no genoma das plantas foi avaliada por PCR.
Foram obtidas duas linhagens de tabaco transgênico confirmadas por PCR e RT-PCR. As plantas foram aclimatadas
ao solo e sementes T1 foram obtidas. Análises diretas de extratos protéicos por SDS-PAGE revelaram a presença da
proteína recombinante em baixa quantidade. Para arroz, cinco linhagens de calos foram produzidas até o momento
e seus estados transgênicos ainda deverão ser confirmados. Ensaios imuno-bioquímicos estão sendo conduzidos para
confirmar a expressão do gene da EPO tanto em tecidos de tabaco como de arroz.
Financiamento: CNPq.
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Biobalística na produção de plantas
geneticamente modificadas:
Um modelo didático
Marques, RA1; Purificação, M1; Rabelo-de-Sousa, J1
Departamento de Biologia, Universidade Católica do Salvador
[email protected]
1
Palavras-chave: Biobalística, Transgênicos, Ensino, Planta, Genes
A tecnologia de transferência de genes tem criado novas alternativas para a produção de plantas mais adaptadas ao
ambiente de cultivo e com maior capacidade de produção. Um dos métodos mais eficientes é o bombardeamento de
partículas, denominado biobalística. Esse método consiste na aceleração de micropartículas de metal, que atravessam
a parede celular e a membrana plasmática, carregando DNA para o interior da célula. Após o bombardeamento,
uma proporção de células atingidas permanece viável; o DNA é integrado no genoma vegetal e incorporado aos
processos celulares de transcrição e tradução, resultando na expressão do gene introduzido. O DNA é dissociado das
micropartículas pela ação do líquido celular, ocorrendo o processo de integração do gene exógeno no genoma do
organismo modificado. Uma das vantagens do sistema de transformação através da biobalistica é que este permite
a introdução e expressão gênica em qualquer tipo celular. Este trabalho teve como objetivo principal apresentar um
modelo didático para os alunos do curso de Ciências Biológicas da Universidade Católica do Salvador (UCSal) – Bahia
com a finalidade de facilitar o entendimento sobre o mecanismo e aplicações do bombardeamento de partículas. Para a
construção do modelo didático foram utilizados 2 placas de isopor 2X1,5m de 5mm; 2 caixas de massa de modelar, tinta
guache amarelo e verde; 1 cano de PVC de 5mm curvo; 1 bexiga de cor vermelha; grãos de milho; 2 garrafas PET de
600 mL e uma muda de dendezeiro (Elaeis guineensis). Foi construído um modelo de célula vegetal e suas organelas com
isopor e massa de modelar. As garrafas de 600 mL foram cortadas e a sua base representou uma placa de Petri. O tubo
de PVC foi utilizado para demonstrar a pistola PDS 1000/He e junto com a bexiga representou-se a propulsão que o
ar comprimido exerce sobre o projétil lançado. Os grãos de milho foram usados dentro da “pistola” representando as
micropartículas de ouro e a cola glitter colocada acima, de cor avermelhada, representou o DNA exógeno. O dendezeiro
foi utilizado para relacionar a técnica à sua aplicação prática na Natureza. O modelo didático foi apresentado para o
corpo discente do curso de Ciências Biológicas da UCSal juntamente com um pôster explicativo. Foram discutidos os
princípios da biobalística e suas aplicações na transformação de organismos.
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Agrobacterium-mediated transformation of
cry1Ia12 gene into Gossypium hirsutum
Costa, PHA1,2; Basso, AMM1,3; Miranda, VJ1; Lima, LTI1; Oliveira-Neto, OB1;
Evangelista, IB1; De Paula, AWM1,4; Lourenço, IT1,3; Grossi-de-Sa, MF1,4
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF
2
Universidade de Brasília–UnB
3
Centro Universitário de Brasília–UniCEUB
4
Universidade Católica de Brasília–UCB
[email protected]
1
Keywords: cotton, somatic embryogenesis, plant transformation
The importance of cotton culture in Brazil is increasing every year. However, the insect-pests, especially those of endophytic
habit, such as Anthomonus grandis and Spodoptera frugiperda, present economic impact on the production of this crop.
Nowadays, pesticides provide ineffective protection and their application can cause damage to the environment. The
introduction of insecticide protein into cotton has been appearing as an alternative control method. Consequently, the
aim of this research is to transform cotton plants via A. tumefaciens with a cry gene from B. thuringiensis, focusing on the
resistance of cotton plants against the insect-pests. After cotton seeds (cv. SLL-705) germination in Murashige & Skoog
(MS) medium, hypocotyls segments were used as explants and co-cultured with Agrobacterium carrying the pFSCry1
vector, which contains the gene cry1Ia12. The explants were maintained in PB38 medium (MS basal salts, 0.05 mg/L
IAA, 0.2 mg/L kinetin, 0.1 mg/L 2,4-D) until calli development. These calli were moved to C2 medium (MS basal
salts, 0.05 mg/L IAA, kinetin, 2,4-D) for embryogenic calli (EC) induction. Later, the EC were transferred to LAC
medium [MS basal salts (KNO3 doubled but NH4NO3 removed)] and maintained in this medium until the germination
of the embryos. When embryos are in torpedo and/or cotyledonary phases they were transferred to MSB5 medium
(MS basal salts, B5 vitamins) for embryo maturation. Plantlets with appropriate size were acclimated in greenhouse
and molecular analyses are being carried out to confirm the gene insertion into the plant genome. According to the
used protocol, the transformation and regeneration of new Brazilian cotton cultivar was obtained.
Supported: Embrapa, UCB, CNPq, CAPES, Facual, Fialgo, Fundeagro.
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Transformação de plantas de tabaco com o
gene VuHSP17.7 isolado de feijão-de-corda
Soares, CP1; Vidal, MS2; Simões-Araújo, JL2
Pós-graduação em Biotecnologia Vegetal - Universidade Federal do Rio de Janeiro-RJ
Embrapa Agrobiologia – Seropédica–RJ
[email protected]
Palavras-chave: Estresse abiótico, HSP, Vigna unguiculata, Transformação genética de plantas, Tabaco
O caupi ou feijão-de-corda (Vigna unguiculata) é uma espécie de leguminosa cultivada predominantemente em regiões
semi-áridas sendo capaz de suportar o estresse térmico comum nestas regiões, onde a temperatura na superfície do solo
pode atingir valores superiores a 40°C. Consequentemente, o caupi é uma fonte importante de genes de tolerância ao
estresse térmico. Em trabalho anterior foi isolado e caracterizado um gene de caupi denominados VuHSP17.7, pertencente
a família das HSP (do Inglês Heat Shock Proteins) cuja o nível de expressão é extremamente aumentado após exposição
da planta a altas temperaturas. Essa família gênica tem sido relacionada com a tolerância ao estresse térmico em diversas
espécies incluindo Arabidopsis thaliana, tomate, batata, dentre outras. O objetivo do presente trabalho foi subclonar
o gene VuHSP17.7 em vetor para expressão em planta (Arabidopsis thaliana e Nicotina tabacum) para estudar o efeito
da expressão heteróloga dessa proteína no processo de tolerância ao estresse térmico. Para tanto a região codificante de
VuHSP17.7 foi clonada sob o controle do promotor duplo 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) no vetor dos
sistema Gateway pK7WG2 para expressão em planta. O vetor recombinante foi mobilizado para a cepa de Agrobacterium
tumefacies LBA4404 e esta bactéria então empregada na transformação de N. tabacum. Plântulas transgênicas foram
selecionas através do cultivo em meio contendo antibiótico canamicina e, cerca de 20 linhagens resistentes ao agente
seletivo canamicina foram multiplicadas in vitro e, avaliadas por PCR quanto a presença do gene nptII e do VuHSP17.7.
As linhagens transformadas, contento o gene de interesse e o vetor vazio, foram crescidas em condições normais e,
estão sendo submetidas a um choque térmico para avaliar o nível de tolerância das linhagens transgênicas. A partir
dos resultado obtidos será possível estabelecer qual o papel dos genes VuHSP17.7 na tolerância ao estresse térmico em
plantas, uma característica extremamente importante diante das perspectivas de mudanças climática.
Apoio financeiro: Embrapa, FAPERJ e CNPq.
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Biolistic-mediated genetic transformation
of cowpea (Vigna unguiculata) and stable
Mendelian inheritance of transgenes
Ivo, NL1; Nascimento, CP1; Vieira, LS1; Campos, FAP2; Aragão, FJL1
1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, PqEB W5 Norte, Asa Norte, 70770-200 Brasília, DF, Brazil
Universidade Federal do Ceará, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Campus do Pici, Bloco 907, 60451-970 Fortaleza, CE, Brazil
[email protected]
2
Keywords: Gene expression, gene transfer, imazapyr, transgene, transgenic plan
Exploiting the biolistic process, we describe a novel system to generate stable transgenic cowpea (Vigna unguiculata)
plants. The system is based on combining the use of the herbicide imazapyr to select transformed meristematic cells
after physical introduction of the mutated ahas gene (coding for a mutated acetohydroxyacid synthase, under control of
the ahas 5´ regulatory sequence) and a simple tissue culture protocol. The gus gene (under control of the act2 promoter)
was used as a reporter gene. The transformation frequency (defined as the total number of putative transgenic plants
divided by the total number of embryonic axes bombarded) was 0.90%. Southern analyses showed the presence of both
ahas and gus expression cassettes in all primary transgenic plants, and demonstrated one to three integrated copies of the
transgenes into the genome. The progenies (first and second generations) of all self-fertilized transgenic lines revealed the
presence of the transgenes (gus and ahas) co-segregated in a Mendelian fashion. Western blot analysis revealed that the
GUS protein expressed in the transgenic plants had the same mass and isoelectric point as the bacterial native protein.
This is the first report of biolistic-mediated cowpea transformation in which fertile transgenic plants transferred the
foreign genes to next generations following Mendelian laws.
Apoio financeiro: CNPq.
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Quitinases de Chromobacterium
violaceum são funcionais em plantas de
tabaco trangênicas
Santos, LF1; Sena, JAL1; Macêdo, JNA2; Gomes, LMC1; Alvim, FC1; Cascardo, JCM1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
2
Programa de Pós-graduação USP- São Carlos
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: quitinase, transformação genética, Chromobacterium violaceum, seqüências genicas, plantas
O seqüenciamento completo do genoma Chromobacterium violaceum resultou na anotação de 4431 ORFs (Vasconcelos et
al., 2003). Dentre estas ORFs foram encontradas seqüências com potencial biotecnológico que apresentam similaridade
com quitinases, denominadas cv1897 e cv4240. Quitinases são glicosil hidrolases capazes de catalisar a degradação de
quitina que corresponde ao segundo mais abundante polímero na natureza sendo encontrada em diversos organismos,
onde elas possuem importantes papéis em funções fisiológicas e ecológicas (Cohen-Kupiec & Chet, 1998). O grande
interesse voltado para os estudos de quitinases está relacionado principalmente à possível aplicação para o controle
biológico de insetos, fungos e nematóides que prejudicam culturas de interesse econômico. Este trabalho teve como
objetivo avaliar a expressão de seqüências similares a quitinases, isoladas de C. violaceum, em plantas transgênicas de
fumo. As seqüências cv1897 e cv4240 foram identificadas e amplificadas a partir do DNA genômico de C. violaceum,
sendo posteriormente clonadas no vetor binário pCAMBIA 1390 modificado para expressão em plantas, contendo o
promotor CaMV35S dirigindo a expressão da seqüência em estudo. Este vetor foi utilizado na transformação de células
competentes de Agrobacterium tumefaciens (estirpe LBA4404), via eletroporação. A seguir discos foliares de N. tabacum
foram transformados seguindo o protocolo estabelecido por Brasileiro e Carneiro, (1998). Os brotos transformados
foram regenerados em meio seletivo contendo o antibiótico higromicina e para confirmação da inserção do transgene
foi realizada a extração de DNA genômico das plantas, seguida de reação de PCR utilizando primers específicos para a
seqüência terminadora nos. As plantas transgênicas foram micropropagadas e os clones foram submetidos à análise de
atividade quitinase pelo método estabelecido por Maximova et al., (2005). Para tanto, folhas das plantas transformadas
foram maceradas e o extrato foliar incubado em tampão acetato contendo quitinase RBV, a 37ºC durante 3 horas.
Em seguida, as reações foram mantidas em gelo, adicionando-se HCl 2M. Utilizou-se uma alíquota de cada reação
para leitura em espectrofotômetro a 550nm, quantificando o extrato foliar pelo método Bradford. De acordo com os
resultados de PCR, houve inserção dos transgenes em todos os brotos regenerados, demonstrando eficiência no método
de transformação utilizado. O ensaio da atividade de quitinases mostrou claras diferenças entre plantas transformadas
com as seqüências cv1897 e cv4240 quando comparadas com as plantas controle não transformadas, confirmando que
estas seqüências foram expressas e são funcionais em plantas. Estes resultados demonstram que estes genes transferidos
para plantas, aumentam a atividade de quitinases, e podem ser utilizadas para transformação genética de culturas de
interesse agronômico visando conferir resistência a fungos fitopatógenos.
Apoio financeiro: CNPq, UESC.
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Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
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Análise do genoma de espécies
de eucalipto visando a identificação
de genes/metabolismos chave para o
incremento da sua produtividade para
orientar o seu melhoramento
Salazar, MS1; Camargo, ELO1; Deckmann, AC1; Carazzolle, MF1; Lepikson-Neto, J1; Medrano, FJ1; Grattapaglia, D2; Pereira, GAG1
Laboratório de Genômica e Expressão, Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas
2
UNB, Universidade Católica de Brasília
[email protected]
1
Palavras-chave: eucalipto; celulose; Genolyptus; ESTs; expressão gênica
O Eucalyptus é o gênero florestal mais plantado do mundo, principalmente devido à utilização de sua madeira como
matéria-prima no setor de papel e celulose e outras indústrias do setor florestal. O Brasil é atualmente o primeiro
produtor de celulose de fibra curta do mundo e o sexto em produção de celulose total. Para manter sua competitividade
de produção, ficou clara a necessidade de investimentos em pesquisa básica pelo setor, o que tem sido feito através
de parcerias universidade/empresa. Neste sentido, em 2002 foi implantado o Projeto Genolyptus (Rede Brasileira de
Pesquisa do Genoma de Eucalipto), fruto do esforço conjunto de 7 universidades, a Embrapa e empresas do setor
de papel e celulose. Atualmente, o Genolyptus conta com uma grande quantidade de dados referentes a seqüências
genômicas e de expressão gênica em diferentes espécies e tecidos de eucalipto (www.lge.ibi.unicamp.br/eucalyptus).
Portanto, temos a base molecular necessária para identificar genes e metabolismos-chave à produção de celulose e lignina,
dois compostos diretamente envolvidos com a qualidade da madeira. Com base nisso, o presente trabalho realizou
uma ampla mineração dos dados presentes no banco Genolyptus, através de duas abordagens distintas: (i) a análise da
freqüência de ESTs em bibliotecas de cDNA produzidas a partir de diversos tecidos, visando identificar seqüências
mais expressas em xilema; (ii) a análise de microarranjos de cDNA, buscando comparar a expressão gênica no xilema
de espécies distintas. Para a mineração dos bancos Genolyptus, utilizamos o software GeneProjects, criado pelo grupo
de bioinformática do Laboratório de Genômica e Expressão (IB/UNICAMP). Para acessar a inter-relação entre genes
e sua participação em vias metabólicas e sinalizatórias conhecidas, foram utilizadas as ferramentas computacionais
BioCyc e KEGG. Resultados preliminares indicam a expressão diferencial de genes que codificam enzimas associadas
à formação de açúcares da parede celular entre os xilemas de E. globulus e E. grandis, como por exemplo o gene CesA,
que codifica a subunidade catalítica do complexo celulose sintase. Além disso, foram identificados como expressos
prioritariamente em xilema várias famílias de fatores de transcrição, entre as quais se destacam NST1 e NST3, tidos
como chave no processo de formação da parede secundária. Estes resultados constituem alvos para estudo aprofundado
e podem vir a fornecer alternativas para o melhoramento da espécie.
Apoio financeiro: FUNARBE, GENOLYPTUS, CNPq.
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Identificação de genes envolvidos na
biossíntese de terpenos em pau-rosa:
potenciais ferramentas biotecnológicas
para engenharia metabólica da síntese de
terpenos em plantas
Mello, EMCL1; Ferreira, JCC1; Contim, LAS1
Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Centro Universitário Nilton Lins, Manaus AM
[email protected]
1
Palavras-chave: Terpenos, Biotecnologia, Lauraceae
Muitas espécies pertencentes à família Lauraceae são aromáticas, dentre elas o pau-rosa (Aniba rosaeodora). O Óleo
essencial de pau-rosa apresenta alta complexidade química, rico em terpenos, principalmente o linalol. Os terpenos são
o mais diverso conjunto de produtos naturais conhecidos e estão envolvidos em rotas de sinalização química e defesa
contra patógenos e pragas, o que tem levado ao isolamento de enzimas envolvidas na sua biossíntese em diversas espécies
para uso em engenharia metabólica em plantas. A biossíntese de terpenos ocorre a partir de metabólitos primários em
pelo menos duas rotas distintas, a rota citoplasmática do ácido mevalônico e a rota biossintética plastídica. Considerando
a alta eficiência do pau-rosa na biossíntese de terpenos, o presente trabalho tem como objetivo principal identificar
genes envolvidos nesta rota em pau-rosa. Oligonucleotídeos degenerados foram desenhados a partir de sequências de
genes envolvidos na biossíntese de terpenos em outras espécies, considerando regiões com maior homologia. Um total
de 28 fragmentos foram amplificados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), sendo que 14 deles foram clonados
no vetor pGEM-T Easy (Promega) e utilizados na transformação de E. coli DH5α. Os fragmentos clonados foram
sequenciados e suas sequências comparadas com outras sequências de genes envolvidos na biossíntese de terpenos em
plantas depositadas em banco de sequências internacional (NCBI). Das 14 sequências analisadas 2 apresentaram alta
homologia com genes de MAP-Cinases de plantas e uma das sequências apresentou homologia moderada com ESTs
de genes para a biossintese de terpenos em plantas. Estudos funcionais estão sendo realizados a fim de se confirmar a
atividade do gene correspondente a sequência isolada em pau-rosa. A identificação destes genes em pau-rosa deverá
contribuir para o avanço da nossa compreensão sobre a biossíntese de terpenos e dos mecanismos de sinalização e
defesa de plantas, auxiliando o desenvolvimento biotecnológico de estratégias sustentáveis para a proteção de plantas
cultivadas contra patógenos e pragas.
Apoio Financeiro: CNPq/CT-Amazônia e FAPEAM.
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Genes expressos em dois genótipos de
milho inoculados com Herbaspirillum
seropedicae estirpe BR 11417
Alves, GC1,3; Galisa, PS2,3; Macedo, AVM3; Santos, CLR1,3; Vidal, MS3; Simões-Araújo, JL3; Reis, VM3
Pós-Graduação em Ciência do Solo - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal - Universidade Federal do Rio de Janeiro
3
Embrapa Agrobiologia – BR 465 Km 07, Seropédica – RJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Herbaspirillum seropedicae, Milho, Expressão gênica, cDNA-AFLP, Endofíticos
Herbaspirillum seropedicae é uma bactéria capaz de fixar nitrogênio atmosférico sob condições microaeróbicas
encontrada no interior de tecidos vegetais. O entendimento da interação bactéria-planta é essencial para sua utilização
no aumento da produção agrícola. Este trabalho teve como objetivo identificar os genes da planta cuja expressão seja
alterada em função da inoculação com bactérias diazotróficas endofíticas. Sementes do milho híbrido SHS 5050 e
milho variedade BRS Sol da Manhã foram plantadas em substrato esterilizado, inoculadas com a estirpe BR 11417
de H. seropedicae, previamente selecionada dentre 50 estirpes testadas em milho, em casa de vegetação. Todos os
vasos receberam adubação de 10 mg kg-1 de N, inclusive o controle sem inoculação. Aos 40 dias após o plantio, as
plantas foram coletadas, congeladas imediatamente em nitrogênio líquido e utilizadas para extração do RNA total. O
cDNA dupla fita foi sintetizado após a purificação do mRNA dos diferentes tratamentos. Para identificação dos genes
diferencialmente expressos foi utilizada a técnica de cDNA-AFLP. Para tal, o cDNA foi digerido com as enzimas de
restrições EcoRI/MseI e os fragmentos obtidos foram ligados a adaptadores. O cDNA ligado aos adaptadores foi então
submetido a uma reação de PCR (pré-amplificação) utilizando iniciadores complementares aos adaptadores. O produto
da pré-amplificação foi diluído e utilizado para PCR seletiva empregando 16 combinações diferentes de iniciadores.
Os iniciadores correspondentes a enzima EcoRI foram marcados com [γ-32P] ATP. Para separação dos fragmentos
amplificados, 5 µl do produto da PCR seletiva foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida e, após secagem
do gel junto ao um filme de raio-X, os fragmentos diferencialmente expressos foram removidos do gel, reamplificados
e seqüenciados. Foram obtidos 192 fragmentos, sendo 163 reamplificados e 47 seqüenciados até o momento. Após
análise utilizando o programa BlastX foi possível observar similaridade com genes relacionados com diversas atividades
celulares incluindo: ribonuclease bifuntional, N-acilesfigosina amidohidrolase, pirofosfatase de fosfato inorgânico solúvel
(pirofosfato fosfo-hidrolase), além de proteínas de função ainda não conhecida. A confirmação do padrão de expressão
desses genes está sendo realizada e será importante para auxiliar na elucidação do papel da planta na interação com a
estirpe de bactéria endofítica inoculada.
Apoio financeiro: Projeto Pronex/FAPERJ, CNPq, CAPES e EMBRAPA.
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Análise da expressão de genes relacionados
com a síntese de lignina e flavonóides em
diferentes espécies de eucalipto
Lepikson-Neto, J1; Deckmann, AC1; Carazzolle, MF1; Cascardo, JCM2; Pasquali, G3; Pereira, GAG1
Laboratório de Genômica e Expressão, Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas
2
DCB, Universidade Estadual Santa Cruz
3
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
Palavras-chave: Eucalipto, lignina, microarray, real-time
A madeira possui alta demanda em diversos setores da economia, notadamente na indústria de papel e celulose,
ocupando assim lugar de destaque na balança comercial do país. A demanda por biomassa lenhosa dessas indústrias é
suprida principalmente pelas florestas de eucalipto e, desta forma, o aumento das taxas de produtividade bem como
a implementação de técnicas visando o refinamento da qualidade da madeira, se tornarão pontos estratégicos para a
manutenção da vantagem competitiva deste setor no mercado internacional. Neste contexto, a compreensão dos processos
metabólicos envolvidos na formação da planta e, em particular, de seu sistema vascular (responsável pelo crescimento
do diâmetro), pode ser utilizada para acompanhar e interferir na qualidade da madeira produzida. Assim, em abril de
2002 foi lançado o Projeto Genolyptus, uma iniciativa conjunta de empresas públicas e privadas, buscando sequenciar
o genoma do eucalipto, fazer um mapeamento genético global e realizar trabalhos de mensuração de características
da madeira (tipo de madeira, teor de lignina, celulose, etc.). A partir de experimentos com microarranjos de cDNA e
PCR em tempo real, verificou-se a expressão diferencial de genes envolvidos com a síntese de lignina e flavonóides, vias
que compartilham enzimas e intermediários e competem pelos mesmos substratos. Por exemplo, os produtos da via de
flavonóides, chalcone e naringerin, sintetizados pelas enzimas chs e chi isomerase respectivamente, inibem a atividade
de enzimas da via de síntese de ligninas, como 4CL e PAL. Neste contexto, foram analisados os níveis transcricionais
dos genes que codificam as enzimas desta via em xilema secundário (responsável pela formação da madeira) de quatro
espécies representativas: E. globulus, E. grandis, E. urophylla e E. pellita. A expressão diferencial foi acessada através da
comparação com a expressão gênica em folhas maduras de E. grandis. Os resultados mostram uma clara correlação
entre a expressão destes genes e a formação da madeira nestas espécies estudadas, notadamente em E. globulus, espécie
que apresentou as maiores variações de expressão dos genes envolvidos em ambas as vias. Interessantemente, os genes
que codificam chs e chi estão reprimidos em seu xilema, enquanto os demais genes do início da via de ligninas estão
induzidos. Dessa forma, os resultados sugerem uma ativação da síntese de lignina paralelamente à repressão da síntese
de flavonóides em E. globulus, o que pode representar um dos mecanismos-chave para justificar a melhor qualidade da
madeira desta espécie e, portanto, constituem um excelente alvo para experimentos futuros de clonagem e expressão.
Apoio financeiro: FUNARBE, GENOLYPTUS, CAPES.
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Analysis of sugarcane protein kinases
expression related to sucrose content
Sato, PM1; Waclawovsky, AJ1; Souza, GM1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: cana-de-açúcar, proteínas quinase, expressão gênica
The sugarcane belong to the genus Saccharum L., which is part of the Poaceae family, it is a tropical plant with a
vigorous and robust growth higher than other agricultural plants, partly because of its high photosynthetic capacity
as a C4 grass. The large sugarcane genome, where a gene is represented on average by 10 alleles is a great challenge for
analysis. To this purpose were developed several collections of ESTs, being the largest of them called SUCEST which
is composed by 43141 possible unique transcripts, also known as sugarcane assembled sequences (SAS). From this
collection it is possible to study and characterize the genes of sugarcane. Among these, are stressed those encoding
proteins kinases, because these proteins are closely related to important regulatory processes of plant development. In
sugarcane, the phosphorylation of proteins seems to have a predominant role in internodes development process and
accumulation of sucrose, noticed by the number of thirty three protein kinases differentially expressed in this tissue
when comparing high and low brix plants or high level brix internodes and imature internodes. The real time PCR
analysis of the expression of protein kinase (caneCIPK-21) in progenies from a cross between two commercial varieties
(SP80-180 x SP80-4966) and thirty six genotypes of S. Officinarum and S. spontaneum shows greater expression in stem
samples of the progenies with higher sucrose content (high brix). This gene was significantly more expressed in internode
9 (mature) than internode 1 (immature) strengthening its association with the content of sucrose, thus indicating
that this gene may be related to sucrose accumulation signaling pathways in the stem of sugar cane. Furthermore the
Pks expression was compared in early and late cultivars, in accumulation of sucrose and by hybridization of the stem
tissues. Studies indicate a role for the plant SnRK protein family in the accumulation of sucrose in sugarcane, mainly
in progenies with high values of brix.
Financiamento: CNPq, Capes e FAPESP.
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Análise da expressão de fatores
de transcrição relacionados com
tolerância à seca, em soja, através da
técnica de PCR em tempo real
Pereira, SS1; Stolf, R2; Rolla, AAP1; Fuganti, R2; Marin, SRR2; Binneck, E2; Abdelnoor, RV2; Marcelino, FC2; Nepomuceno, AL2
Genetica e Biologia Molecular – Universidade Estadual de Londrina - UEL, Londrina, PR, Brazil
2
Embrapa Soja, Londrina, PR, Brazil
[email protected]
1
Palavras-chave: soja, déficit hidrico, fator de transcrição, expressão gênica, PCR em tempo real
Eventos de seca têm aumentado nas últimas décadas, provavelmente associados às mudanças climáticas decorrentes
do aquecimento do planeta. Atualmente as perdas provocadas pelo déficit hídrico constituem um grave problema na
produção de grãos. Previsões indicam que estas mudanças climáticas extremas tenderão a aumentar em freqüência e
períodos de duração. Centenas de genes estão envolvidos na resposta a estresses abióticos e a análise da expressão destes
genes demonstra a existência de diversos sistemas regulatórios estresses-responsivos. Os fatores de transcrição interagindo
nas complexas rotas metabólicas de resposta aos estresses ambientais induzem alterações nos níveis de expressão de
alguns genes, que em muitos casos, proporcionam o aumento da tolerância a esses estresses. Este fato mostra que a
regulação gênica em nível transcricional é um dos mecanismos principais de proteção da planta às restrições ambientais.
Em trabalho anterior utilizando a técnica de microarranjos de cDNA, foram encontrados 145 genes diferencialmente
expressos em condição de seca, os quais foram identificados e categorizados de acordo com suas funções biológicas.
O objetivo deste trabalho foi quantificar a expressão gênica dos fatores de transcrição, bzip50, c2h2, mybj7 e nac2,
identificados como diferencialmente expressos no estudo com microarranjos de cDNA, através da técnica de PCR em
tempo real. Deste modo, um experimento foi realizado em hidroponia com as cultivares de soja MG/BR46 (cultivar
Conquista) - tolerante a períodos de seca, e BR16 - padrão de sensibilidade à seca. Após 3 semanas de crescimento, as
plantas foram submetidas a estresses de déficit hídrico, nos tratamentos: tempo 0 (controle), 25 min, 50 min, 75 min
e 100 min. Raízes para extração de RNA total e síntese de cDNA foram coletadas de cada tratamento Os resultados
da quantificação relativa mostraram que todos esses fatores de transcrição tiveram sua expressão aumentada quando
amostras de plantas submetidas ao estresse hídrico foram comparadas com plantas utilizadas como controle. Isto indica
que, estes fatores de transcrição participam de rotas metabólicas importantes de resposta à seca, como já relatado em
trabalhos anteriores e na literatura. Assim, estes genes são potenciais candidatos, que se superexpressos em plantas
transgênicas, podem conferir tolerância a seca e a outros estresses abióticos.
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Análise transcricional de Vigna unguiculata
infectada por potyvírus (CABMV)
através de LongSAGE
Barbosa, PKA1; Calsa Jr., T1; Pandolfi, V1; Kido, EA1; Rocha, MM 2; Sittolin, IM2;
Andrade, GP3; Pio-Ribeiro, G 3; Benko-Iseppon, AM1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE, Brasil
2
Embrapa Meio-Norte (CPAMN), Teresina, PI, Brasil
3
Depto. de Fitopatologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Vigna unguiculata, SAGE, Tags, estresse biótico, CABMV
O feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] é uma leguminosa de elevado teor protéico, tradicionalmente cultivada
nas regiões Nordeste e Norte do Brasil tanto como cultura de subsistência quanto para comercialização. Recentemente,
seu cultivo se estendeu a outras regiões, devido ao seu maior valor de mercado em relação ao tradicional feijão-comum,
Phaseolus vulgaris, e à menor produtividade deste em áreas menos férteis. Trata-se do único feijão capaz de crescer
nestas regiões, embora existam perdas consideráveis em sua produção, principalmente devido a estresses bióticos
e abióticos. Entre os patógenos de maior incidência, destacam-se os potyvírus causadores de distorção de folhas,
mosaico intenso e redução acentuada no crescimento das plantas, reduzindo em até 80% a produtividade. Cultivares
tolerantes em geral carecem de características de mercado, havendo urgente necessidade de obtenção de variedades
comerciáveis com maior resistência. Visando identificar genes de interesse, ferramentas de genômica expressa como EST
(Expressed Sequence Tag) e SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) têm sido usadas para a identificação de genes
importantes. No âmbito Projeto Genoma do Feijão-Caupi (rede NordEST, Edital RENORBIO), tais técnicas têm
sido associadas a técnicas de mapeamento genético, de modo a possibilitar uma rápida conversão de dados genômicos
para programas de melhoramento desta cultura. Neste trabalho, a técnica de LongSAGE (Invitrogen) foi empregada
para caracterizar o perfil transcricional de cultivares contrastantes [suscetível (BR-14 Mulato, BP) e tolerante (IT85-F,
IP)] inoculadas com CABMV. Até o presente, 768 concatâmeros clonados em plasmídio foram seqüenciados, com
eficiência média de 92% (fração de seqüências contendo pelo menos 400 pb com qualidade Phred igual ou superior a
20). Dos 768 clones, um total de 5.367 tags válidos foram extraídos, dos quais 2.528 tags foram obtidos da biblioteca
IP (genótipo resistente), e 2.839 da biblioteca BP (suscetível). A anotação presumível dos 20 tags mais freqüentes em
cada biblioteca e dos tags com variação significativa na freqüência entre as bibliotecas foi realizada através da identidade
com ESTs de Vigna anotadas comparativamente a proteínas de espécies pertencentes à ordem Fabales disponíveis no
GenBank. Tags relativos a genes que codificam proteínas relacionadas ao metabolismo secundário, catabolismo de
proteínas, reguladores do ciclo celular, biossíntese de etileno e resposta a estresse biótico foram identificados. A análise
da ação destes genes nos processos metabólicos e fisiológicos permitirá a identificação de alvos interessantes para uso
no melhoramento genético da cultura.
Apoio Financeiro: MCT/FINEP/CNPq/BNB/FACEPE (Programa RENORBIO).
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SacRALF1, um peptídeo hormonal de canade-açúcar, está envolvido na expansão celular
Mingossi, FB1; Matos, JL1,3; Rizzato, AP1; Medeiros, AH 1; Falco, MC2; Silva Filho, MC1; Moura, DS1,4
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
2
Centro de Tecnologia Canavieira, CTC
3
Alellyx Applied Genomics
4
Departamento de Ciências Biológicas, Escola Paulista de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: peptídeo hormonal, desenvolvimento de planta, expansão da folha, suspensão celular, ensaio de alcalinização
“Rapid Alkalinization Factor” (RALF) pertence a uma crescente família de pequenos peptídeos com características
hormonais em plantas. Peptídeos RALF são ubíquos em plantas e foram isolados pela primeira vez através do ensaio
de alcalinização do meio de cultivo de suspensões celulares quando buscava-se novos peptídeos hormonais em extratos
protéicos de folhas de tabaco (Moura et al. 2006, Pearce et al. 2001a; Pearce et al. 2001b). Neste trabalho, foi relatado
o isolamento de dois peptídeos RALF de folhas de plantas jovens de cana-de-açúcar utilizando o ensaio de acalinização.
Ambos peptídeos SacRALF mostraram atividades similares no ensaio e um deles, SacRALF1, foi o mais abundante.
O peptídeo SacRALF1 foi adicionado ao meio de cultura e inibiu o crescimento de microcalos derivados de culturas
de suspensão celular em todas as concentrações analisadas (0.1 a 10µM). Microcalos expostos ao SacRALF1 exógeno
mostraram um número reduzido de células elongadas. Plantas de cana-de-açúcar apresentam quatro isoformas dos genes
SacRALF e foi identificado que o gene SacRALF1 é predominantemente expresso. SacRALF1 é expresso na zona de
elongação de pontas de raiz. Todos os quatro genes SacRALF são altamente expressos em folhas jovens e em expansão
e mostraram uma expressão baixa ou não detectável em folhas expandidas. Nos limbos de folhas, transcritos do gene
SacRALF foram encontrados em alta concentração na parte basal da folha e baixa concentração na porção apical. As
análises de expressão gênica desenvolvidas neste estudo localizaram os genes SacRALF nas zonas de elongação de raízes
e folhas. Folhas maduras, que são desprovidas de células em elongação, não mostraram expressão considerável dos
genes SacRALF. Os resultados foram consistentes com o papel dos genes SacRALF no desenvolvimento de plantas, e
particularmente na elongação celular.
Apoio financeiro: CAPES e FAPESP.
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Identificação e caracterização
in silico de SNPs em café
Vidal, R1; Carazzolle, M1; Pot, D2; Pereira, L2; Mondego, J1; Pereira, G1
UNICAMP, Campinas, SP, Brasil
2
IAPAR, Londrina, PR, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: SNP, haplotipos, coffea, pipeline, arabica
O sequenciamento do transcriptoma de três species de café: Coffea arabica (tetraploide), Coffea canephora (diploide) e
Coffea racemosa (diploide) abriu muitas possibilidades para estudar caracteristicas fenotípicas de interesse agronômico
entre as espécies. A espécie C. arabica é a mais cultivada e origina de um cruzamento relativamente recente entre
Coffea eugenioides e Coffea canephora. A qualidade da bebida derivada de C. arabica é considerada excelente. A espécie
C. canephora é mais bem adaptada ao clima equatorial quente e úmido e é cultivada freqüentemente em baixas ou
médias altitudes. C. canephora é também mais resistente a várias doenças e pestes do que C. arabica e a qualidade da
bebida é geralmente inferior. C. racemosa não é extensamente cultivada, tendo baixos índices de cafeína, tolerância
elevada à seca e resistência a algumas doenças. O maior interesse desta espécie está relacionado ao seu florescimento,
que acontece de modo precoce e concentrado em apenas três meses. Um pipeline computacional foi implementado
para descoberta e caracterização em larga escala de SNPs utilizando os programas qualitySNP e KaKs_calculator,
mysql para armazenamento dos dados e scripts php para a construção de interfaces para recuperação das informações.
Primeiro foi feita uma clusterização do total de 275.117 ESTs das três espécies que resultou em 15.885 contigs. Para
evitar contigs mal formados (possivelmente agrupamento de paralogos) foram excluidos os que tem quantidade de
ESTs menores que 4 e maiores que 100. O qualitySNP utiliza 3 níveis de filtros chegando a encontrar no café um total
de 45919 SNPs (0,53/100 bp) verdadeiro positivos. Para identificar os polimorfismos sinônimos ou não-sinônimos o
qualitySNP utiliza o fasty para alinhar as sequencias com um banco de dados, corrigir frame-shifts e definir a orf. Os
SNPs também são caracterizados como transversões ou transições e suas origens, se são intraespecificos ou interespecificos.
Através da separação por haplotipos é possível visualizar as possíveis origens dos trancritos de arábica (se do genoma
do C. canephora ou C. eugenioides). Os resultados mostraram que polimorfismos em café podem ser descobertos e
caracterizados confiavelmente em ESTs e é uma fonte de marcadores para mapeamento genetic e estudos de diversidade
nestas species.
Apoio Financeiro: FAPESP.
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Análise in silico dos genes que participam
da síntese da trealose em Arabidopsis
thaliana no genoma do feijão-caupi
Barros, PS; Soares-Cavalcanti, NM; Vieira-Mello, GS; Calsa-Jr, T; Benko-Iseppon, AM
Centro de ciências biológicas, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: bioinformática, estresse abiótico, feijão-caupi, CGKB, osmoprotetores
A trealose, um dissacarídeo da glicose, age como estabilizadora de enzimas, proteínas e lipídeos de membrana, assim como
protetora de estruturas biológicas durante vários tipos de estresses, entre eles salinidade e seca. Sua síntese é realizada em
duas etapas: Trealose-6-fosfato (T6P) sintase (TPS1) sintetiza T6P a partir de UDP-Glicose e Glicose-6-fosfato, seguida
pela ação da enzima Trealose-6-fosfato-fosfatase (TPPB) que desfosforila a T6P em trealose e ortofosfato. Este trabalho
teve como objetivo identificar e analisar ortólogos aos genes TPS1 e TPPB no genoma do feijão-caupi comparativamente
a outras angiospermas usando ferramentas in silico. As proteínas TPS1 e TPPB de arabidopsis foram utilizadas como
seed sequence, sendo submetidas ao banco CGKB (Cowpea Gene Knowledge Base), através da ferramenta tBLASTn. As
seqüências obtidas foram trimadas e clusterizadas, com o auxílio do programa CAP3. Os contigs/singlets obtidos foram
então traduzidos com o auxílio da ferramenta ORFinder tendo seus domínios analisados pelo CD-search. Posteriormente,
foi feito um alinhamento reverso no NCBI através do BLASTX. Alinhamentos múltiplos e dendrogramas foram gerados
usando-se os programas CLUSTALx e MEGA4 (método neighbour joining com bootsrap de 1000 replicações) a partir
das seqüências que possuíam os domínios característicos de cada proteína (Glicotransf_20 e TPP_ase). No CGKB foram
encontrados 50 reads para o TPS1 e 38 para o TPPB, os quais após montagem formaram 13 contigs e seis singlets para
o primeiro e oito contigs e nove singlets para o segundo. Após alinhamento reverso todas as 36 seqüências analisadas
apresentaram similaridade com os respectivos genes analisados. Dentre estas 17 não apresentaram os domínios procurados,
enquanto para as outras obtiveram-se domínios parciais. O dendrograma para a TPS1 uniu as duas seqüências de feijãocaupi no mesmo clado, não mostrando uma separação entre mono e dicotiledôneas, como esperado pela taxonomia
clássica. Por exemplo, em algodão silvestre (Gossypium hirsutum e G. raimondii) ambos ortólogos agruparam-se com
entidades taxonômicas não aparentadas (feijão-caupi e batata, respectivamente). Observou-se no alinhamento que o
grupamento em dois grandes clusters no dendrograma baseou-se em uma sinapomorfia unindo taxa que compõem
agrupamentos merofiléticos, indicando a possível existência de regiões de alta complexidade (mutações convergentes
e/ou reversas), possivelmente associadas à funcionalidade da TPS1. Ademais, a junção de mono e dicotiledôneas em
um mesmo clado parece estar relacionada à existência de diferente isofomas do gene TPS1, fato já observado em
Arabidopsis thaliana, onde 11 isoformas de TPS1 já foram descritas. Com relação ao dendrograma das TPPB o mesmo
padrão de agrupamento foi observado, indicando uma possível relação entre as alterações estruturais e a região funcional
do domínio conservado selecionado para essa análise. Assim, especula-se que o dendrograma reflita uma relação muito
mais funcional do que evolutiva entre as seqüências ortólogas nos organismos avaliados, sugerindo-se que se tratem de
variantes funcionais das proteínas analisadas.
Agradecimentos: CAPES, CNPq, MCT/FINEP/BNB/FACEPE (Programa RENORBIO).
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Clonagem de regiões promotoras de
genes de reparo em cana-de-açúcar
Oliveira, AL; Barros, WITS; Medeiros, SRB; Agnez-Lima, LF; Scortecci, KC
Departamento de Biologia Molecular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
Palavras-chave: cana-de-açúcar, promotor, apendonuclease
O DNA de plantas e animais está constantemente exposto à danos endógenos e exógenos, e para minimizar os efeitos
dessas lesões, as células contam com diferentes mecanismos de reparo. A via de reparo de interesse em nosso laboratório
é o Reparo por Excisão de Base (BER/REB) que apresenta um conjunto de proteínas que corrige bases lesadas no DNA.
Dentre estas proteínas nosso foco concentra-se nas AP endonucleases que tem por função retirar os sítios abásicos
gerados por diferentes mecanismos. Algumas proteínas de reparo já foram caracterizadas em plantas, porém ainda não
há muita informação sobre promotores de genes de reparo em plantas. Este trabalho visa clonar as regiões promotoras
de dois cDNAs homólogos à proteína AP (scARP1 e scARP3) obtidos no projeto SUCEST. Para isto, foi gerada uma
biblioteca de DNA genômico de cana-de-açúcar SP80-3280, através de digestões com as enzimas de restrição de ponta
cega como: EcoRV e SmaI. Em seguida, a amplificação das possíveis regiões promotoras foi realizada com a metodologia
de PCR Walking. Os fragmentos obtidos foram purificados utilizando o kit GFX (GE) clonados no vetor pGEM T-easy
(Promega), e transformados em bactérias competentes DH10B. Com as colônias obtidas foram realizadas minipreps e a
presença do inserto foi verificado com a digestão da enzima de restrição EcoRI. As amostras positivas foram seqüenciadas
e analisadas no programa Plantcare. Tanto para as possíveis regiões promotoras para ARP1 e ARP3 foram encontradas
os motivos TATA-box e CAAT-box. Foram encontrados também os motivos A-box, G-box e GARE, que na literatura
apresentam funções desconhecidas, e os motivos ABRE, CGTCA-motif, Sp1 e TCA-element que estão associados a
resposta ao estresse oxidativo, que geram radicais livres ativando conseqüentemente a via de reparo BER.
Apoio financeiro: PADCT-CNPq; CAPES.
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Classificação de prováveis metalotioneínas
encontradas no CAFEST
Ságio, SA1; Oliveira, RR1; Chalfun-Junior, A1; Paiva, LV2
Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
Departamento de Química, Universidade Federal de Lavras
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Transcriptoma, fitorremediação, expressão gênica
As Metalotioneínas (MTs) são proteínas de baixo peso molecular (<10kDa), com regiões ricas em cisteína e que apresentam
alta afinidade de ligação a metais. Considera-se que estas proteínas têm um papel específico no armazenamento de íons
essenciais, como o Zn2 e Cu1, e também na detoxificação de elementos não essenciais como Cd2 e Hg2, atuando assim na
homeostase de vários metais dentro da célula. A sua expressão pode ser induzida tanto por determinados íons metálicos
como também por uma variedade de estresses químicos e fisiológicos. Diversos trabalhos têm identificado a existência
de MTs em diferentes organismos, incluindo desde cianobactérias e algas protistas até plantas e animais. Isso indica a
alta conservação de certos domínios dentro desse grupo de proteínas e sua importância no desenvolvimento de diversas
espécies ao longo da evolução. O termo MT-like é preferido para MTs de plantas, já que são muitas vezes inferidas das
sequências de DNA, e podem ser divididas em classes de acordo com a localização dos resíduos de cisteína. As MTs
pertencentes a Classe I são caracterizadas por dois domínios ricos em cisteína separados por um espaço central livre desse
aminoácido. As da Classe II são representadas pela primeira proteína caracterizada EcMT de trigo, na qual os resíduos
de cisteína estão agrupados em três domínios ricos em cisteína separados por 10 a 15 aminoácidos (Zhou, et.al.;2004).
Neste trabalho foi realizada uma busca por palavra-chave e por similaridade no banco CAFEST utilizando-se seqüências
já publicadas relacionadas à metalotioneínas. As seqüências escolhidas foram agrupadas formando os EST-contigs, que
após anotação puderam ser validados em oito diferentes sequências. A classificação das prováveis metalotioneínas foi
realizada através de um alinhamento múltiplo utilizando-se o programa CLUSTALW, que reuniu seqüências homólogas
publicadas e as seqüências selecionadas do CAFEST. Foi construída uma árvore filogenética para essas seqüências por
meio do o programa MEGA 4. A análise dos resultados permitiu o agrupadamento de sete sequencias na Classe I e
apenas uma (MT4-1) na Classe II. A Classe I, geralmente subdivida em tipos, abrigou quatro sequências no clado de
proteínas do tipo 2, e três no clado do tipo 3. As expressões dos ESTs que apresentaram similaridade à metalotioneínas,
ocorreram principalmente em bibliotecas de plântulas e folhas tratadas com ácido araquidônico e em tecidos oriundos
de hipocótilo tratados com acibenzolar-S-methyl. Entretanto, o perfil de expressão apresentou-se variado indicando
uma atuação mais ampla das MTs nos tecidos onde são requisitadas e seu provável envolvimento em diferentes rotas
do ciclo celular.
Apoio Financeiro: CAPES.
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Sequenciamento de fragmentos genômicos
de Eugenia uniflora L. revela similaridade
com sequências ESTs de Eucalyptus sp.
Ferreira-Ramos, R1,2; de Souza-Bernardes, LA3,4; Mestriner, MA1; Giuliatti, S3;Alzate-Marin, AL1
Laboratório de Genética Vegetal, Depto. de Genética-USP/RP
2
PPG Biologia Comparada-USP/RP
3
Laboratório de Bioinformática, Depto. de Genética-USP/RP
4
PPG Genética-USP/RP, Ribeirão Preto-SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Espécies florestais, Homologia, Melhoramento genético, Myrtaceae, Pitanga
Eugenia uniflora L. (pitanga) é uma espécie florestal arbórea da família Myrtaceae endêmica da Mata Atlântica, que
ao longo do tempo vem sendo submetida a um freqüente processo de domesticação. Não existem informações previas
sobre o genoma de E. uniflora que poderiam ser úteis no melhoramento genético desta espécie, sobretudo pela sua
crescente demanda na indústria alimentícia e de cosméticos. Assim, a detecção de motivos comuns entre fragmentos
genômicos de E. uniflora e seqüências bem estabelecidas em outros organismos vegetais de importância econômica,
poderiam fornecer relevantes pistas sobre homologias entre genes de interesse e proteínas. Assim, no presente estudo,
72 clones genômicos de E. uniflora foram seqüenciados e as similaridades entre as seqüências obtidas e aquelas
disponíveis para os genomas de Arabidopsis e Eucalyptus foram avaliadas. O seqüenciamento dos clones foi realizado no
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), a partir do DNA de folhas de um único indivíduo de
E. uniflora, extraído no Laboratório de Genética Vegetal (USP/RP). Os eletroferogramas obtidos foram submetidos a um
Pipeline com os programas PHRED (análises da qualidade das seqüências), CROSSMATCH (exclusão de adaptadores
e vetor), CAP3 (formação de consensos). Finalmente foi usado o programa BLASTN para comparar as seqüências de
E. uniflora com os bancos de dados disponíveis on line. A seleção das seqüências foi feita com base no menor e-value (best
hit), comparando com o “The Arabidopsis Information Resource” (TAIR) e uma seleção de ESTs feita para Eucalyptus,
no “National Center for Biotechnology Information” (NCBI). Como resultado das análises, um total de 88,9% das
seqüências apresentou qualidade suficiente para a realização do BLASTN, sendo obtidos 71,9% de contigs e 28,1% de
singlets. Do total de seqüências disponíveis foram encontrados 45 hits no TAIR e, na análise de similaridade com ESTs
de Eucalyptus (NCBI) foram encontrados nove hits. A similaridade entre os conjuntos evidencia possíveis homologias
entre os genomas de Arabidopsis e E. uniflora, uma vez que 44 fragmentos seqüenciados apresentaram identidade
superior a 90% entre as espécies. Quando analisadas as seqüências de E. uniflora e os ESTs descritos para Eucalyptus,
ambas espécies pertencentes a família Myrtaceae, elevados valores de identidade foram encontrados para seis seqüências
(superior a 90%). Estes estudos apontam para a utilização destes dados como guia para futuras ações no sentido de
identificar, mapear e clonar genes de interesse em E. uniflora.
Apoio Financeiro: FAEPA e FAPESP.
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Modulation of aluminum tolerance by
Arabidopsis thaliana glycine-rich protein 3
(AtGRP3)
Menezes, ADM; Junqueira, R; Cardeal, V; Magioli, C; Sachetto-Martins, G
Laboratório de Genômica Funcional e Transdução de Sinal, Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ, RJ, Brasil
[email protected]
AtGRP3 is a member of a large and diverse group of proteins called glycine-rich proteins (GRPs) that are characterized
by the presence of quasi-repetitive glycine rich domains. GRP genes showed an expression profile highly regulated by
development and by physical, chemical and biological factors. In Arabidopsis, AtGRP3 was characterized as an extracellular
ligant of a kinase receptor protein WAK1. WAK1 has been implicated on plant-pathogen response and cell elongation
signal transduction. In order to characterize AtGRP3 function in plant physiology, transgenic lines that knockout
(GRP3-KO) and over-expresses AtGRP3 (GRP3-OX) have been obtained. Phenotypic analysis indicates that under
standard conditions KO-GRP3 plants show normal development. On the other hands AtGRP3 over-expression leads
a reduction in shoot and root elongation and leaf size, suggesting AtGRP3 as an important negative regulator of cell
elongation. Recently WAK1 over-expression (WAK1-OX) has been implicated in aluminum (Al) tolerance, making the
WAK1 one of the important candidates for plant defense against Al toxicity. In order to analyze the possible involvement
of AtGRP3 in this process, we evaluate Al-response in transgenic lines with disturbed levels of AtGRP3 expression. Wildtype (Col-0), GRP3-KO and GRP3-OX plants were grown 1/6 Murashige and Skoog (MS) media containing 300µM
AlCl3 in vertically placed plates in a growth chamber at 22oC, under 16h light/8h dark illumination. Fourteen-day-old
seedlings were carefully separated and their roots were measured. Al-treated wild-type plants show a reduction in root
elongation. Since in normal growth conditions GRP3-OX plants already present this phenotype we were not able to
evaluate this kind of alteration upon Al treatment on those plants. On the other hands the knockout of AtGRP3 leads
to plants with enhanced Al tolerance. Together with the WAK1 over-expression experiments our results indicates that
AtGRP3 seems to be involved in Al response. AtGRP3 may works as a negative regulator of WAK1 function during
Al exposition. It is possible that in physiological conditions in which WAK1 is free of AtGRP3 (mimic by GRP3-KO
or WAK-OX transgenic plants) a series of signal transduction events leads to Al-tolerance. Further analysis should be
performed in order to evaluate the possible application of the manipulation of AtGRP3 expression as a new strategy
to improve Al-tolerance in crops plants exposed to acid soils.
Orgão financeiro: FAPERJ, CNPq.
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Superexpressão e silenciamento da urease
ubíqua em soja
Wiebke-Strohm, B1; Bücker-Neto, L1; Alves, LB1; Pasquali, G2; Margis, M1, Bodanese-Zanettini, MH1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: embriogênese somática, genômica funcional, Glycine max, transformação genética, urease
A urease pode ser encontrada em plantas, fungos e bactérias. Existe grande similaridade na seqüência dos aminoácidos
mesmo entre organismos distantes, indicando uma única origem evolutiva e semelhanças na estrutura terciária e nos
mecanismos catalíticos. A urease catalisa a hidrólise da uréia, liberando amônia e CO2, estando, portanto, envolvida
na disponibilização do nitrogênio para os organismos. Contudo, em plantas sua relevância fisiológica continua incerta.
A soja possui dois genes estruturais. Eu4 codifica a urease ubíqua, expressa em baixos níveis em todos os tecidos e
apresenta atividade ureolítica durante o desenvolvimento das plantas. Eu1 codifica a urease embrião-específica, expressa
em altos níveis em embriões em desenvolvimento e sementes maduras, mas não apresenta papel essencial para hidrólise
da uréia. Diversos trabalhos mostram que a urease embrião-específica de soja e as isoformas de urease de Canavalia
ensiformis podem estar envolvidas no sistema de defesa das plantas, pois in vitro apresentam atividade inseticida e
fungicida, independentemente da ureolítica.Devido à similaridade entre as seqüências, assume-se que a urease ubíqua
também possa estar envolvida no mecanismo de defesa das plantas. O objetivo deste trabalho é a obtenção de plantas
transgênicas de soja apresentando superexpressão e silenciamento da urease ubíqua para posterior estudo das suas funções
fisiológicas e biológicas. Para superexpressão, o fragmento de 2520 bp correspondente ao cDNA da urease ubíqua foi
recombinado em pH7WG2D (promotor e terminador 35S, genes marcador hpt e repórter gfp), utilizando o sistema
Gateway. Da mesma forma, o fragmento de 150 bp (posições 188-338 do cDNA da urease ubíqua) foi recombinado
em pH7GWIWG2,1 (promotor e terminador 35S, gene marcador hpt) para silenciamento por RNA de interferência.
Embriões somáticos foram obtidos a partir de cotilédones imaturos. Para superexpressão foram bombardeados 280
conjuntos embriogênicos da cv. IAS5 e 105 conjuntos de cada uma das cvs Bragg e Vencedora. Para o silenciamento,
foram submetidos ao bombardeamento 210, 60 e 105 conjuntos embriogênicos das cvs IAS5, Bragg e Vencedora,
respectivamente. Atualmente o material vegetal encontra-se em fase de seleção em higromicina. Após, os tecidos
higromicina-resistentes serão separados e transferidos para novo meio para permitir a histodiferenciação dos embriões e
sua conversão em plantas. A expressão GFP permitirá o acompanhamento do desenvolvimento do material transformado.
Este é o primeiro estudo de superexpressão e silenciamento de uma urease de planta em planta.
Financiamento: CNPq, FAPERGS.
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Potencial biotecnológico de ureases
e peptídeos derivados como praguicidas
Carlini, CR
Dept. Biofísica & Centro de Biotecnologia, Univ. Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, CEP 91501-970, Brazil
[email protected]
Palavras-chave: urease, inseticida
Ureases (EC 3.5.1.5), enzimas níquel-dependentes que catalisam a hidrólise de uréia à amônia e CO2, estão presentes
em plantas, fungos e bactérias. Em plantas e fungos, as ureases são hexâmeros de subunidades de 90 kDa, e em bactérias,
as ureases são multímeros de 2 ou 3 subunidades menores. Ureases apresentam alta homologia entre si, sugestivo de
estruturas e mecanismos de ação similares. Apesar de abundantes nas plantas, pouco se sabe sobre a função de ureases
nos vegetais. Nosso grupo demonstrou que ureases são proteínas multifuncionais com propriedades biológicas que
independem da atividade enzimática. A canatoxina (CNTX), uma proteína neurotóxica isolada de Canavalia ensiformis,
é letal se injetada em ratos e camundongos, mas inativa por via oral. A CNTX, um dímero não covalente de cadeias
de 95 kDa, é uma das isoformas de urease dessa semente. A urease majoritária a CNTX possuem várias propriedades
biológicas independentes da ação enzimática, como indução de ativação plaquetária e ligação a glicoconjugados. Ureases
bacterianas também têm essas propriedades, potencialmente relevantes em patologias como, por exemplo, úlcera péptica
e câncer gástrico causado por Helicobacter pylori. Ureases bacterianas e vegetais apresentam atividade antifúngica contra
certos fungos fitopatogênicos. Ureases vegetais, mas não as microbianas, mostram importante atividade inseticida.
O barbeiro Rhodnius prolixus e insetos pestes na agricultura, como o caruncho Callosobruchs maculatus e o percevejo
manchador do algodão (Dysdercus peruvianus) morrem quando submetidos a uma dieta contendo 0.1% urease. A
CNTX é ativada proteoliticamente por catepsinas acídicas no trato digestório dos insetos susceptíveis, mas é inócua
para insetos com digestão baseada em tripsinas. Peptídeos (10-15 kDa) entomotóxicos foram produzidos in vitro por
digestão da CNTX com enzimas de C. maculatus. Um peptídeo recombinante, equivalente ao peptídeo entomotóxico
da CNTX liberado no intestino do inseto, foi expresso em E.coli. Além de atividade inseticida contra o percevejo D.
peruvianus, o peptídeo recombinante foi entomotóxico também na lagarta do cartucho do milho, Spodoptera frugiperda,
que não é susceptível à urease intacta (tem tripsina como enzima digestiva). Plantas de tabaco expressando o peptídeo
recombinante mostraram resistência aumentada contra S. frugiperda. Modelagem molecular aplicada ao peptídeo
inseticida sugeriu um domínio grampo beta. Este tipo de estrutura ocorre em neurotoxinas inseticidas de artrópodes,
concordando com achados experimentais que mostram propriedades neurotóxicas para o peptídeo recombinante, bem
como alterações de canais iônicos. Por outro lado, o peptídeo recombinante não produziu efeitos tóxicos quando injetado
ou administrado por via oral em camundongos e ratos neonatos. Nossos dados sugerem que ureases provavelmente
participam dos mecanismos de defesa das plantas contra insetos e pestes. O uso dessas proteínas e/ou de seus peptídeos
derivados como praguicidas ou como um transgene para construção de plantas resistentes à pragas são prováveis
aplicações desse conhecimento.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPERGS e Finep.
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Abundance and diversity of Cis-acting
elements in promoter regions of Yellow
Stripe gene family in rice genome
Vital, CE1; Priebe Bervald, CM2; Maia, LC2; Santos LS2; Bresolin, APS2; Almeida, AM1; Costa de Oliveira, A2
Department of Plant Physiology, Federal University of Viçosa
2
Department of Agronomy, Federal University of Pelotas
[email protected]
1
Keywords: Cis-acting elements, Iron, rice, promoter, Yellow Stripe
Structural differences can be found in promoter regions of genes regarding the type of modulating gene transcription
elements (cis-acting elements) present in those regions. These differences can be related to the diversity of these elements,
number of copies of a same element and/or mutations on different loci of a same element. A larger abundance/diversity
of cis-acting elements in a promoter region can reflect a finest efficiency and specificity for which the expression of
a specific gene or allele is modulated by different internal and external signs. The iron homeostasis in rice involves
several gene families, each one containing several homologue genes. In addition, the promoter regions of each one of
those different homologue genes contain different cis-acting elements. Genes that codify for the Yellow Stripe (YS), a
membrane protein responsible for translocation of Fe3+ complexes in rice, were analyzed in their promoter regions and
investigated concerning the abundance and diversity of putative cis-acting elements. DNA sequences representing 1,000
bp from the upstream region of eighteen loci coding YS were obtained from the annotated rice genome (Oryza sativa
subsp japonica cv. Nipponbare) deposited in NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).These sequences were subjected to
PLACE portal (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) for identification of putative cis-acting elements present in each
promoter region. It was observed the occurrence of 205 different cis-acting elements in the promoter region of the
18 members of the Yellow Stripe family in rice (OsYSL1 till OsYSL18). For each locus coding OsYSL it was found
64 up to 99 different elements. Only 17 elements were common to all OsYSL family. Three different cis-acting elements
are just present in 17 genes, 6 in 16 genes, 6 in 15 genes, 1 in 14 genes and 8 in 13 genes. For those less common
elements among the eighteen loci of the family, 20 different elements are just present in 2 genes and 46 elements in
one of the 18 genes. Due to these results we can foresee the complexity of the genetic control of this character and
iron homeostasis in rice.
Orgão financiador: CNPq.
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Análise in silico de um cDNA obtido em
bibliotecas subtrativas de cana-de-açúcar
para floração
Medeiros, ALM; Agnez-Lima, LF; Scortecci, KC
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, DBG, UFRN
[email protected]
Palavras-chave: cana-de-açúcar, floração, biblioteca subtrativa
A cana-de-açúcar é uma importante cultura tropical e tem sido utilizada como fonte para a produção de açúcar há
centenas de anos. O Brasil apresenta 25% da produtividade mundial e a região nordeste é responsável por apenas 14,32%
da produção nacional. A pouca contribuição da região nordeste não ocorre devido à área plantada, mas principalmente
por causa da baixa produtividade da cultura na região. No estado do Rio Grande do Norte tem sido observada uma
redução na produtividade de até 60% comparada com a região sudeste. Entre as razões para esse fenômeno temos o
estresse hídrico e a floração precoce que promove a isoporização do colmo, reduzindo seu teor de açúcar. Em 2001 foi
concluído o Projeto Genoma da Cana-de-açúcar (Sugarcane Expressed Sequence Tag – SUCEST), entretanto as bibliotecas
foram geradas utilizando espécies cultivadas na região sudeste. Com isso, foram construídas bibliotecas subtrativas
utilizando variedades cultivadas na região nordeste com o intuito de identificar genes que estejam associados ao processo
de florescimento. O objetivo deste trabalho foi de caracterizar um dos cDNAs obtidos nas bibliotecas subtrativas. A
identidade da seqüência foi confirmada por BLAST, sendo identificado como o gene que possui homologia a uma
proteína serina/treonina fosfatase (PP1). A análise in silico foi realizada por meio de comparação com diversos bancos
de dados de diferentes organismos utilizando o BLASTn. Foi gerado um banco de dados com sequências de outras
plantas, sendo utilizados os bancos do genoma de Arabidopsis thaliana, de arroz e milho disponíveis no The Institute
for Genomic Research (TIGR) e de pimenta, trigo, Medicago truncatula e tabaco no The Computational Biology and
Functional Genomics Laboratory. As seqüências nucleotídicas encontradas foram convertidas em seqüências peptídicas.
A partir da seqüência protéica foi analisado a presença e conservação do domínio funcional. Em todas as seqüências
do banco de dados foi encontrado o domínio funcional característico da proteína PP1. Um outro ponto analisado foi
a relação filogenética destas seqüências. Para isto, foi utilizado o programa PAUP 4.0. A árvore filogenética gerada foi
visualizada utilizando o programa TreeView. Foi possível observar na árvore obtida após essas análises, a duplicação dessa
seqüência em algumas plantas e dois ramos conservados com seqüências encontradas em plantas monocotiledôneas,
refletindo uma provável duplicação destas após a separação das plantas em monocotiledôneas e dicotiledôneas.
Auxílio Financeiro: CNPq.
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Análise computacional de gene DMI3
no genoma expresso do eucalipto
Vieira-Mello, GS; Barros, PB; Soares-Cavalcanti, NM; Wanderley-Nogueira, AC;
Castelletti, CHM; Calsa-Jr, TJ; Benko-Iseppon, AM
Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, Departamento de Genética, CCB, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: DMI-3, Eucalipto, FOREST, fixação de nitrogênio, Evolução
A fixação biológica de nitrogênio compreende uma associação vantajosa entre plantas e organismos simbióticos,
representando importante papel nos ecossistemas naturais e na agricultura, minimizando a necessidade de uso de
fertilizantes químicos. O gene DMI3 codifica uma proteína quinase cálcio-calmodulina dependente (CCaMK) envolvida
nas oscilações de cálcio e/ou calmodulina, responsáveis pela sinalização durante a simbiose. Trata-se de um gene
altamente conservado entre as leguminosas, tendo sido relatado em não leguminosas como o arroz (Oryza sativa) e a
planta-modelo Arabidopsis thaliana por seu papel em processos adicionais como defesa vegetal e mobilização do amido
durante a germinação da semente. Este trabalho objetivou identificar, através de procedimentos in silico, seqüências
ortólogas ao gene DMI3 no transcriptoma do eucalipto, inferindo sobre sua estrutura e seu padrão evolutivo em outras
plantas. A seqüência protéica DMI-3 de Medicago trucatula foi usada na busca por seqüências ortólogas (≤ e-10) no
banco de dados do FOREST com o auxílio da ferramenta tBLASTn. Os clusters obtidos foram traduzidos e tiveram
seus domínios conservados analisados com o auxílio das ferramentas ORFfinder e RPS_BLAST, respectivamente. Para a
análise normalizada do perfil de expressão foi utilizado o programa CLUSTER. Além disso, efetuou-se um alinhamento
múltiplo gerando-se um dendrograma a partir seqüências de M. trucatula, Eucalyptus e de outras angiospermas, com
a ajuda dos programas CLUSTALX e MEGA, respectivamente. A busca por seqüências ortólogas revelou a presença
de 97 clusters com alta similaridade. Entretanto, os resultados dos alinhamentos reversos no NCBI mostraram que o
transcriptoma do eucalipto apresenta, de fato, 21 candidatos ao citado gene. Na análise dos domínios conservados
observou-se que apenas uma seqüência apresentou os domínios procurados (um domínio S_TKc e dois domínios EFh)
completos, enquanto os outros clusters apresentaram domínios parciais. Na análise do padrão de expressão in silico foi
observada uma maior abundância de transcritos das bibliotecas de raiz e plântulas, como esperado, uma vez que estes
tecidos estão envolvidos no processo de transferência de compostos nitrogenados para os processos nutricionais do
vegetal. O dendrograma gerado revelou a existência de duas sinapomorfias, que caracterizam os grupos monofiléticos das
mono e dicotiledôneas. Além disso, neste último agrupamento, foi possível observar uma clara separação entre Fabacea
e Solanaceae, concordando com a taxonomia clássica. Esses resultados sugerem que o gene DMI3 deve ter surgido antes
da separação entre os principais grupos de Magnoliophyta, indicando que o mesmo tenha facilitado a colonização vegetal
do ambiente terrestre pelo aumento do acesso aos nutrientes vitais do solo nas estruturas primordiais semelhantes às
raízes em plantas não vasculares confirmando hipóteses de que genes envolvidos na nodulação de leguminosas estejam
também envolvidos em vias amplamente conservadas do desenvolvimento de plantas não-leguminosas.
Apoio financeiro: CAPES, MCT/FINEP/CNPq/BNB/FACEPE (Programa RENORBIO).
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Superexpressão do gene codificante do
peptídeo AtPep1 em A. thaliana visando
a obtenção de resistência à isolados de
diferentes espécies do gênero Pythium
Trivilin, AP; da Silva MM; Dariva, JM; de Moraes, MG
Faculdade de Agronomia, Departamento de Fitossanidade, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
Palavras-chave: transformação genética, PROPEP1, elicitor endógeno, mecanismos de defesa, Pythium spp
As plantas estão expostas a uma gama de patógenos que utilizam diversas estratégias para infectar seus hospedeiros. Em
resposta, as plantas expressam diferentes mecanismos de defesa, onde ocorre o reconhecimento de moléculas conservadas
do patógeno por receptores específicos das plantas, desencadeando as respostas de defesa. A descoberta de sinais
endógenos e exógenos que regulam a expressão de genes de defesa em Arabidopsis thaliana tem auxiliado a compreensão
dos mecanismos de defesa. Receptores celulares com regiões repetidas ricas em leucina (LRR) desempenham um papel
importante, pois monitoram a presença de moléculas associadas ao patógeno (PAMPs) e iniciam uma rápida expressão
de genes de defesa. As PAMPs também ativam a expressão de genes que codificam uma família de peptídeos endógenos
(AtPep) e seu receptor (PEPR 1) que amplificam a sinalização de defesa iniciada pelas PAMPs. O desenvolvimento de
uma estratégia de superexpressão do gene codificante do peptídeo AtPep1, PROPEP1 para avaliação do papel do peptídeo
endógeno AtPep1 na resistência a isolados de diferentes espécies do gênero Pythium é importante para a compreensão
do mecanismo de defesa e a futura utilização do mesmo em cultivares resistentes ao patógeno. Nesse sentido, foram
realizados experimentos que consistiram da inoculação de A. thaliana com isolados das espécies de P. graminicola, P.
inflatum, P. deliense e P. ultimum. As plantas foram avaliadas quanto à presença de sintomas da doença. Paralelamente,
o gene codificante do peptídeo AtPep1, PROPEP1, foi isolado de A. thaliana, ligado nos vetores binários pGSA1427
ou pEGAD, e transformados em Agrobacterium tumefaciens. Células de A. tumefaciens contendo os plasmídeos com
e sem PROPEP1 foram usadas para transformação floral de A. thaliana. As plantas transformadas foram selecionadas
pela presença do gene que confere tolerância ao herbicida glufosinato de amônio e, no caso da planta transformada
com o vetor pEGAD, também pela presença da GFP (proteína verde fluorescente). A presença dos genes inseridos foi
confirmada por PCR seguido de seqüenciamento. As plantas transformadas foram avaliadas quanto ao acúmulo de mRNA
de PROPEP1 e a resistência aos isolados do gênero Pythium. Os resultados indicam que plantas tipo selvagem de A.
thaliana são suscetíveis aos isolados das diferentes espécies do gênero Pythium. As plantas pEGAD-AtPep apresentaram
um aumento na expressão relativa de PROPEP1 de até 4.000 vezes a encontrada nas plantas controle. Este alto acúmulo
de mRNA de PROPEP1 nas plantas pEGAD-AtPep revelou ser importante na resistência ao isolado de P. deliense, pois
nestas plantas também foi verificado um grande acúmulo de mRNA da defensina PDF1.2. Os dados obtidos através
do teste de patogenicidade em plantas pEGAD-AtPep foram confirmados através da transformação pGSA-AtPep. As
evidências suportam o papel do peptídeo AtPep1 como um elicitor endógeno que é gerado em resposta aos patógenos
e suas PAMPs.
Apoio financeiro: Capes.
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Validação via qRT-PCR da expressão
de genes relacionados à qualidade
da madeira em Eucalyptus
Medeiros, AOS1; Dias, CV1; Breton, M2; Pasquale, G2; Micheli, FFL1,3; Costa, MGC1; Cascardo, JCM1
Laboratório de Genômica e Expressão Gênica, UESC, Ilhéus-BA
2
Lab. de Biologia Molecular Vegetal, UFRGS, Porto Alegre-RS
3
CIRAD-BIOS, UMR DAP, Montpellier, France
[email protected]
1
Palavras-chave: microarray,real-time PCR, xilogênese, lignina, celulose
O Brasil destaca-se no cenário internacional de produção de celulose e papel, sendo do interesse das indústrias o cultivo
de espécies de genótipos mais produtivos, com melhores características florestais e mais resistêntes a estresses bióticos
e abióticos. Neste cenário, duas espécies de eucaliptos ganham importância: o Eucalyptus grandis (Egr), por apresentar
rápido crescimento volumétrico, bom conteúdo de celulose e resistência a pragas; e o E. globulus (Egl) que tem como
maior atrativo de produção o baixo conteúdo de lignina. Sabe-se que essas diferenças fenotípicas são explicadas com
vistas à expressão diferencial de genes durante a xilogênese. A construção de microarrays a partir de RNA total xilema
de clones ‘Egr’ e ‘Egl’ permitiram, ao Projeto Genolyptus, identificar, cerca de 900 genes com expressão diferencial
entre os clones testados. No entanto, a confirmação desses dados carece de validação experimental por meio de análise
qRT-PCR (real-time quantitative RT-PCR). Assim, objetivou-se neste trabalho validar, por qRT-PCR, a expressão
gênica de alguns genes identificados nos microarrays do Projeto Genolyptus. Para tanto, 60 genes-candidatos foram
pré-selecionados e uma busca por clones de cDNA potencialmente mais completos foi realizada no EST bank do
Genolyptus. Os genes foram re-anotados com base na identidade molecular e homologia dos candidatos. No total
20 genes foram selecionados e primers para qRT-PCR foram projetados para resultarem em amplicons em torno de 100
pb. A especificidade dos primers foi avaliada via curva de dissociação (qRT-PCR). Amostras de xilema foram coletadas de
três indivíduos (clones), derivados de três matrizes não relacionadas, de ‘Egr e ‘Egl’ plantadas em 2002 no Hortoflorestal
Barbanegra – Aracuruz Celulose S.A., em Barra do Ribeira – RS. O RNA total foi extraído e tratado com DNase para
então ser sintetizado o cDNA usado como molde nas análise de qRT-PCR. A quantidade das amostras e qualidade
dos experimentos foi confirmada em gel de agarose (1,5%). Os resultados obtidos corroboram os dados do microarray,
e permitem analisar o perfil de expressão de genes que estão envolvidos direta ou indiretamente com a qualidade da
madeira e que apresentam homologia á diferentes grupos funcionais (proteínas de ligação, transportadoras, fosfatases,
nodulinas, ciclinas, quinases, lacases e fatores de tradução), além daqueles que expressam produtos protéicos de função
ainda desconhecida ou mesmo sem identidade molecular (no hits). Neste contexto, acredita-se que a compreensão do
nível de expressão dos genes envolvidos na formação da madeira pode ser utilizada para acompanhar e interferir nas
características desejáveis pela indústria durante a xilogênese.
Apoio financeiro: CNPq, FINEP, CAPES, Projeto Wood genes.
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Expressão in silico de genes para as
subunidades menor (SSU) e maior (LSU) da
RuBisCO em Coffea arabica L.
Lacerda, GA; Chalfun-Junior, A; Paiva, LV; Melo, EF; Oliveira, RR
Setor de Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
[email protected]
Palavras-chave: Ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase, Bioinformática, Transcriptoma, rbcL, rbcS
A enzima cloroplastidial ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase/oxigenase (RuBisCO, EC 4.1.1.39) possui 8 subunidades
maiores (LSU) e 8 subunidades menores (SSU) e controla a produtividade das plantas por catalisar a primeira reação
de assimilação do CO2 na fotossíntese e de oxidação do carbono na fotorrespiração. Os genes correspondentes às
subunidades da RuBisCO estão localizados em diferentes compartimentos celulares. O gene rbcL que codifica para
LSU é localizado no genoma do cloroplasto (Coen et al. 1977), o que significa um número de cópias (genes) centenas
de vezes expressos por células do mesofilo (Bohnert et al., 1982). O mRNA que é codificado pelo gene rbcL é transcrito
dentro da organela por ribossomos plastídiais (Wolter et al., 1988). Em contraste a SSU é codificada no núcleo e o
mRNA é transcrito no citoplasma por uma proteína precursora contendo uma extensão amino-terminal, nomeada transit
peptide, que media o transporte do polipeptídio para dentro do cloroplasto e é clivada durante ou após o transporte
(Schimidt et al., 1986). A SSU madura se une com a LSU, no estroma do cloroplasto, para formar a holoenzima
(Wolter et al., 1988). Nas plantas estudadas, várias cópias de genes rbcS tem sido encontradas (Dean et al., 1989).
Baseados em regiões conservadas das seqüências de genes para as subunidades maior e menor da RuBisCO, foi realizada
uma busca por prováveis membros dessa família dentro do banco de dados CAFEST. Após o processo de busca e seleção
de reads relacionados aos domínios LSU e SSU, foi realizada a montagem dos EST-contigs, alinhamento entre seqüências
relacionadas publicadas, análise filogenética, e análises de motivos de agrupamento, bem como, do perfil de expressão.
Desta forma, foi possível identificar 20 seqüências relacionadas ao domínio RuBisCO SSU e 1 seqüência ao domínio
RuBisCO LSU. A maioria delas foi expressa em bibliotecas de tecidos vegetativos e alguns em reprodutivos. Algumas
seqüências foram expressas em bibliotecas provindas de estresses bióticos, como ataques de fitopatógenos e abióticos
como déficit hídrico e encharcamento. O presente trabalho é um estudo comparativo entre seqüências que surge como
uma importante ferramenta para identificação de genes, baseada em uma característica de interesse.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Clonagem do cDNA da proteína mitogênica
CMS2MS2 de Carica candamarcensis
Corrêa, NCR; Mendes, IC; Junqueira, CF; Racioppi, L; Góes, TS; Lopes, MTP; Regis-da-Silva, CG; Salas, CE
Laboratório de Biologia Molecular Produtos Naturais, Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brasil 31270-901
[email protected]
Palavras-chave: Carica candamarcensis, cisteino protease, clonagem, látex, CMS2MS2
As cisteíno-proteases tem sido estudadas em vários organismos e se destacado por apresentar funções essenciais em
parasitos, mamíferos e plantas. Várias plantas que são fontes dessas cisteíno-proteases pertencem à família Caricaceae,
que tem como membro a espécie Carica candamarcensis. Uma das proteínas isoladas desse organismo por nosso grupo,
denominada CMS2MS2, é composta por 214 aminoácidos, possui atividade proteolítica e comprovada ação mitogênica
em células de mamíferos.O objetivo desse trabalho é produzir CMS2MS2 recombinante para posteriores estudos da
atividade biológica e caracterização estrutural da proteína. Para a clonagem desse gene, foi utilizado um par de “primers”
degenerados baseados na seqüência aminoacídica N-terminal e C-terminal da proteína, cuja estrutura foi recentemente
elucidada. Amplicons de aproximadamente 650 e 500 bp foram obtidos por transcrição reversa a partir do RNA da folha
da planta. A clonagem inicial do fragmento de 650 bp foi realizada no vetor pCR 2.1 (TA Cloning Kit, Invitrogen),
que por sua vez foi transformado em bactérias TOP10. Os clones positivos foram selecionados e a presença do fragmento
de interesse verificada através de digestão, PCR e seqüenciamento do inserto. A presença do inserto foi confirmada,
demonstrando cerca de 85% de identidade com a proteína obtida do látex. O inserto foi seguidamente excisado do
plasmídeo com as enzimas XhoI e Hind III para sub-clonagem no vetor pET28a (+) TEV entre os sítios Sal I e Hind
III. Esse vetor modificado possui um sítio para a protease TEV que será utilizado posteriormente para liberação da
proteína recombinante da cauda de histidina. O perfil de expressão dos clones em bactérias BL21-DE3 induzidas com
0,5 mM IPTG demonstrou uma proteína de aproximadamente 30 kDa, como esperado após a construção no vetor de
expressão. A purificação da proteína CMS2MS2 recombinante junto à demonstração da atividade biológica da proteína
são os próximos objetivos neste projeto.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG.
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Análise proteomica dos apices meristemátios
de cana-de-açúcar para o processo de floração
Duarte, MAG; Silva, FL; Uchôa, AF; Agnez-Lima, LF; Scortecci, KC
– Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN
[email protected]
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, proteômica, floração precoce, ápice meristemático e gel bidimensional
A cana-de-açúcar é uma planta pertencente à família Gramineae (Poaceae), sendo as espécies cultivares atuais, classificadas
como Saccharum spp. O processo de floração é um processo vital para as plantas. Este processo fisiológico é determinado
por uma rede de genes que atuam no meristema para promover a indução à floração e determinar a identidade floral.
Quando ocorre o processo de floração precoce em cana-de-açúcar, diminui-se o teor de sacarose dos colmos, finalizando
em um processo denominado de isoporização que pode promover uma redução em até 60 % da produção de açúcar
e álcool, acarretando a perda do valor econômico da espécie. Neste trabalho apresenta-se uma análise realizada com
duas variedades da cana-de-açúcar cultivadas no Rio Grande do Norte, uma variedade com floração tardia e a outra
variedade com floração precoce. O objetivo deste trabalho foi inicialmente estabelecer um protocolo de extração e
fracionamento de proteínas dessas variedades, e uma vez estabelecido realizar uma análise em gel bidimensional. Os
ápices meristemáticos dessas variedades de cana-de-açúcar foram pulverizados em nitrogênio líquido; em seguida este
material foi precipitado com acetona gelada contendo 0,07% de β-mercaptoetanol e ácido tricloroacético (TCA) a 10%.
A suspensão foi misturada e mantida a -20°C por 2 horas. Após esta precipitação, as amostras foram centrifugadas, e
o precipitado foi lavado com acetona gelada contendo 0,07% de β-mercaptoetanol, centrifugado e o precipitado seco
em capela. Este material foi quantificado de acordo com o método de Bradford. Em seguida, uma alíquota foi separada
em gel de poliacrilamida de modo a analisar a concentração destas amostras e a verificação do padrão de bandas. Foi
possível observar a variação de algumas bandas entre as variedades precoce e tardia, assim como foi possível observar
que a coleta em épocas diferentes do ano, existe um padrão diferente. O material da variedade precoce foi analisado
em gel bidimensional. Esta análise permitiu a visualização que alguns spots são mantidos nas duas coletas realizadas
em épocas diferentes, e outros desapareceram. Entretanto, não foi possível analisar as proteínas de alto peso molecular,
provavelmente podem ter ocorrido perdas nas precipitações realizadas com TCA. Algumas modificações estão sendo
realizadas de modo a aprimorar o protocolo de extração.
Auxílio Financeiro: CNPq.
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Análise comparativa do padrão de
expressão de genes de arroz, milho e canade-açúcar modulados durante associação
com bactérias diazotróficas endofíticas
Ferreira, LVS1,2; Figueiredo, PHB1,2; Baldani, VLD3; Baldani, JI3, Hemerly, AS1,2
Instituto de Bioquímica Médica, CCS - Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brazil
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Pesquisas do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Rua Pacheco Leão 915,
22460-030, Rio de Janeiro, RJ, Brazil
3
EMBRAPA Agrobiologia, BR465, Km47 23851-970, Seropédica, RJ, Brazil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bactéria diazotróficas endofíticas, gramíneas, fixação biológica de nitrogênio
Bactérias endofíticas fixadoras de nitrogênio são conhecidas por promover o crescimento de diversas espécies de gramíneas.
Além da fixação biológica de nitrogênio, já foi descrito que estas bactérias podem produzir hormônios vegetais e conferir
resistência a alguns patógenos. Tendo em vista que gêneros de milho (Zea mays), arroz (Oryza sativa) e cana-de-açúcar
(Saccharum officinarum) são essencialmente importantes para a agricultura mundial, o desenvolvimento de tecnologias
que visem o aumento da produtividade e da resistência a doenças, além da redução do uso de fertilizantes nessas
culturas é bastante interessante para uso a nível global, especialmente no Brasil. Contudo, os mecanismos moleculares
envolvidos na interação entre gramíneas e bactérias endofíticas que levam a esses benefícios para a planta ainda não
são bem conhecidos. Genes envolvidos na via de sinalização do hormônio vegetal etileno mostraram-se regulados em
diferentes análises de expressão gênica durante a interação de cana-de-açúcar com bactérias endofíticas realizadas pelo
grupo. O objetivo deste trabalho consiste em iniciar a caracterização do papel da via do etileno na interação gramínea
- endofíticos e estudar os genes relacionados a esta via envolvidos na associação de bactérias endofíticas com milho e
arroz, comparando-os com genes já descritos durante associação com cana-de-açúcar, dentre eles estão cinco receptores
de etileno (ScER) e quatro fatores de transcrição da família ERF (ScERF). Análise in silico mostrou que os genes de
receptores de etileno (ScER1, ScER2, ScER3, ScER4 e ScER5) e de fatores de transcrição relacionados a esta via
(ScERF1, ScERF2, ScERF3 e ScERF4) diferencialmente expressos durante a associação com cana-de-açúcar possuem
homólogos tanto em arroz quanto em milho. Uma análise detalhada do padrão de expressão gênica de plântulas crescidas
in vitro e transferidas após a germinação para meio inoculado com bactéria endofítica (Herbaspirillum seropedicae,
Herbaspirillum rubrisubalbicans, Azospirillum brasiliensis e/ou Burkholderia brasiliensis), e patogênicas (Xanthomonas
albilineans, Acidovorax avenae) está sendo realizada por PCR em Tempo Real. Resultados preliminares favorecem a idéia
de que as gramíneas permitem a colonização de seus tecidos por bactérias benéficas inibindo a expressão de genes de
defesa durante a colonização por estas bactérias, e de que um processo molecular conservado atua durante a associação
de gramíneas com essas bactérias.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FINEP e PRONEX.
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Análise transcricional dos genes ISA1, NFS1
e ISU1 de Eucalyptus grandis sob estresse
Oliveira, LA; Frazzon, APG; Margis, R; Pasquali, G; Frazzon, J
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
Palavras-chave: agrupamentos [Fe-S], Eucalyptus grandis, qRT-PCR
Os agrupamentos de ferro-enxofre (Fe-S) são grupos prostéticos necessários para a manutenção da vida, pois estão
envolvidos em diversos processos incluindo a transferência de elétrons, reações metabólicas, sinalização e regulação da
expressão gênica. As plantas realizam fotossíntese e respiração, dois processos que requerem proteínas Fe-S, sendo os
únicos organismos em que a síntese destas proteínas é compartimentalizada. Diversos fatores afetam o desenvolvimento
das plantas, entre eles, a temperatura baixa, fator limitante à produtividade e à distribuição geográfica das plantas,
incluindo Eucalyptus grandis, uma espécie com grande importância econômica. Neste trabalho foi realizada uma análise
transcricional dos genes NFS1, ISA1 e ISU1 de E. grandis após diferentes estímulos por meio de PCR quantitativa (qRTPCR) e microarranjos. Após o tratamento de plântulas de E. grandis com frio, foram realizados experimentos de qRT-PCR.
Os resultados foram normalizados com os genes constitutivos codificadores da histona H2B e da ribonucleoproteína
L23A. Considerando tal normalização, ISU1 aumentou sua expressão em 0,6 e 1,7 vezes, NFS1 apresentou um
aumento de 6 e 8 vezes, enquanto ISA1 apresentou um aumento de 69 a 114 vezes em relação à condição controle.
Utilizando-se a técnica de microarranjos, foi analisada a diferença de expressão entre folhas e xilema de árvores maduras
de E. grandis. O gene NFS1 apresentou maior expressão nas folhas do que em xilema, porém os genes ISA1 e ISU1
apresentaram um padrão de expressão equivalente entre os dois tipos de tecidos. Esses resultados sugerem que (i) os
genes NFS1 e ISA1 podem estar relacionados à resposta celular ao estresse causado por frio; e que (ii) os aumentos na
expressão devem-se, provavelmente, ao metabolismo de enxofre e à indução de enzimas antioxidantes. Foi também
realizado um experimento de curva de tempo com a submissão de plântulas de E. grandis ao resfriamento, objetivandose verificar em que momento esses genes começam a ter suas expressões aumentadas. O gene ISU1 apresentou maior
expressão gênica nas primeiras duas horas de tratamento, caindo drasticamente logo após este período. O gene ISA1,
que havia apresentado a maior expressão relativa no experimento anterior, não apresentou diferença significativa no
padrão de expressão durante as 16 horas de resfriamento, assim como o gene NFS1. Esses resultados indicam que as
proteínas Fe-S, frente ao resfriamento, estão possivelmente envolvidas na recuperação das plantas após tal estresse.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES e GENOLYPTUS.
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Efeito da colonização por Gluconacetobacter
diazotrophicus em plantas de cana-deaçúcar submetidas à salinidade
Barbosa, RR1A; Dias, JMR­­1B; de Souza Filho, GA2
Laboratório de Melhoramento Genético Vegetal CCTA/UENF
2
Laboratório de Biotecnologia CBB/UENF
A e B contribuíram igualmente para esse trabalho
[email protected]
1
Palavras-chave: salinidade, cana-de-açúcar, Gluconacetobacter diazotrophicus
Plantas podem interagir especificamente com diferentes microrganismos formando associações benéficas e prejudiciais.
Entre as bactérias endofíticas diazotróficas já caracterizadas está a Gluconacetobacter diazotrophicus. Inicialmente, tal
bactéria foi descrita como fixadora de nitrogênio, porém, recentemente foi demonstrado que plantas colonizadas
com bactérias endofíticas diazotróficas apresentam uma maior resistência a estresses abióticos, bem como um possível
envolvimento do hormônio etileno durante a interação bacteriana. Em trabalhos realizados por Cavalcante (2007),
foi demonstrado, pela primeira vez, o envolvimento do hormônio etileno na interação G. diazotrophicus­ X canade-açúcar por meio da caracterização molecular dos membros que participam da via de sinalização. No entanto, os
mecanismos moleculares de tais vias, que participam dessa associação, não são claramente entendidos. Nesse contexto,
para respaldar a hipótese da participação do etileno durante a interação, foi realizada uma análise preliminar, através
de northern in silico, dos genes das vias de regulação e percepção do etileno junto ao banco de dados do SUCEST
(Sugarcane EST Project). Nossos resultados permitiram identificar cinco clusters envolvidos na via de sinalização do
hormônio etileno com expressão diferencial na biblioteca de cDNA de plantas de cana-de-açúcar inoculadas com
G. diazotrophicus. Os clusters regulados apresentavam homologia com os genes NPR1 (nonexpressor of PR genes), EDR1
(enhanced disease resistance), ADR1 (activated disease resistance), RAV1 (transcription factor related to ABI3/VP1) e ER1
(ethylene receptor). A freqüência de ESTs dos respectivos genes foram quantificados, onde observou-se indução. Cabe
ressaltar que os genes identificados são responsivos a estresses bióticos e abióticos, sendo o gene ADR1 responsável por
conferir resistência a déficit hídrico. Adicionalmente, foram realizadas análises quanto à eficiência fotoquímica, teor
de pigmentos fotossintéticos, fotossíntese líquida, transpiração, concentração interna de CO2, condutância estomática
e peroxidação de lipídeos. Atualmente, encontram-se em andamento análises de expressão diferencial de 360 genes
responsivos à salinidade. Os resultados permitirão a validação dos dados obtidos e um melhor entendimento acerca do
efeito da inoculação dessas bactérias na proteção de plantas de cana-de-açúcar submetidas ao estresse salino.
Apoio Financeiro: UENF/FAPERJ/FINEP/CNPq.
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Caracterização funcional do gene
Os01g0125600 pela obtenção
de mutantes insercionais
Abreu-Neto, JB1; Richter, S1; Bevitori, R2; Zanettini, MH1; Margis-Pinheiro, M1
Laboratório de Genética Vegetal – Departamento de Genética UFRGS
2
EMBRAPA - Arroz e Feijão
[email protected]
1
Palavras-chave: genômica funcional, arroz, mutantes, transformação, transposon
O número de genes não relacionados a elementos transponíveis presentes no genoma do arroz (Oryza sativa ssp japonica)
foi estimado em 41.478 genes. Graças a um esforço envolvendo diversos países, o número desses genes cuja função é
conhecida tem aumentado nos últimos anos. A função de um gene pode ser inferida a partir da análise de seu padrão
de expressão, da estrutura da proteína gerada por ele e pela análise de mutantes nos quais a expressão de tal gene se
encontra alterado, interrompido, silenciado ou super-expresso. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu um projeto de
produção e análise de mutantes por inserção de T-DNA utilizando construções baseadas no sistema de transposon
Ac/Ds de milho (Upadhyaya et al. in Theor Appl Genet (2006), 112: 1326–1341). Em uma dessas linhagens mutantes,
a “tag” de T-DNA foi inserida próxima à região codificante do gene Os01g0125600, cuja função é ainda desconhecida.
O objetivo do presente trabalho é caracterizar funcionalmente o referido gene, utilizando as seguintes abordagens: i)
análise in silico da estrutura da proteína predita; ii) mobilização do elemento Ds para produção de novas linhagens
com inserções em diferentes pontos no gene e/ou na sua proximidade; iii) determinação da localização sub-celular a
partir da fusão do produto do gene alvo com GFP; iv) PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR) para avaliar seu
padrão de expressão em diferentes situações e tecidos. Não há nenhuma informação sobre a proteína produzida por
tal gene, nem por homólogos encontrados em outras plantas. Nas diferentes espécies analisadas encontramos somente
a comprovação de sua transcrição e suposições inferidas a partir de sua seqüência nucléica. A proteína predita possui
um motivo de ligação a metais pesados conservado em uma ampla variedade de espécies. A linhagem mutante inicial
foi obtida pela inserção de um T-DNA contendo o elemento Ds em seu interior. A transposição desse elemento pode
ser desencadeada somente pela expressão da transposase, que ocorre transientemente pelo co-cultivo de Agrobacterium
portando uma construção iAc com calos embrionários obtidos de sementes dessa linhagem. Até o momento, foram
geradas 60 linhagens de calos contendo o elemento Ds mobilizado da inserção original. Trabalhos prévios da literatura
já demonstraram que o elemento Ds freqüentemente se insere em locais próximos, menos de 1cM, da inserção
original. Portanto, há forte probabilidade de que nas novas linhagens o transposon possa estar interrompendo o gene
Os01g0125600 em outras regiões ou outros genes localizados próximos do mesmo. As análises de qRT-PCR indicaram
que a inserção do transposon na região 3’ não codificante do gene não impediu a sua expressão em nível transcricional.
Dados de expressão de Os01g0125600 em diferentes tecidos e em resposta a estresses serão apresentados.
Apoio financeiro: CNPq, EMBRAPA-CNPAF, FAPERGS, UFRGS-PROPESQ, Capes.
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Divergência genética de Cypella herbertii
Hook (Iridaceae) no Rio Grande do Sul
Marco EGD1; Chies, TTS1; Tacuatiá, LO2 Eggers, L1; Santos, EKD2
Departamento de Botânica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Departamento de Genética Vegetal, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cypella herbertii, ISSR
A espécie Cypella herbertii é caracterizada por ser uma erva perene e apresentar um caule bulboso. Essa espécie tem
sua origem na América Central e do Sul, onde se distribui do sul do Brasil ao nordeste da Argentina, sendo cultivada
como ornamental. Considerando a existência de quatro subespécies descritas até o momento. Este trabalho consiste
em comparar duas populações geograficamente distintas de C. herbertii utilizando uma abordagem molecular a fim de
contribuir para o conhecimento da variabilidade genética em C. herbertii. As duas populações estudadas são oriundas
dos municípios gaúchos de Piratini e Capão do Leão, distantes 22 quilômetros, com 26 e 28 espécimes, respectivamente,
sendo que a amostragem completa desse estudo é de 54 indivíduos. A metodologia empregada consiste na realização
de reações de PCRs – ISSR (Inter Simple Sequence Repeats). Até o momento foram testados seis “primers”, os quais
geraram 155 bandas, em média, 26 bandas por “primer”, variando de 150pb a mais de 2000pb. Foi calculada uma
matriz de presença e ausência de fragmentos e foi calculado o índice de coeficiente de Jaccard a partir desta matriz.
Construiu-se um dendrograma com base nos coeficientes calculados para que se pudesse avaliar o grau de estruturação
das duas populações analisadas. Com os resultados obtidos até o momento, pode-se observar a presença de padrões
altamente polimórficos, com uma estruturação em dois grandes grupos correspondentes às populações amostradas.
Também se observou que seis espécimes ficaram isolados desses grupos, sendo três de cada população. Isso se deve à
ocorrência de dados perdidos em alguns desses espécimes, ou seja, “primers” que não amplificaram. No entanto, existe
a possibilidade de que um aumento no número de “primers” englobe esses espécimes em algum dos grupos, deixando
a análise mais confiável e com um coeficiente de correlação maior que o obtido (r = 0,68). Com base nesses estudos
pretende-se aprimorar o conhecimento a respeito de aspectos evolutivos da espécie em questão.
Apoio Financeiro: FAPERGS, CNPq, PIBIC UFRGS/CNPq.
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Dual targeting of RNA-binding proteins
to mitochondria and chloroplasts
Morgante, CV1,2; Otto, PA3; Silva-Filho, MC1; Gualberto, JM2
1
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, USP, São Paulo, SP
Centre Nacional de la Recherche Scientifique (CNRS), Estrasburgo, França
3
Instituto de Biociências, USP, São Paulo, SP
[email protected]
2
Keywords: Arabidopsis, GFP, point mutations
A massive transfer of mitochondria and chloroplast DNA to the cell nucleus occurred during the evolution of these
organelles. As a consequence, most of their proteins are encoded by nuclear genes and have specific N-terminal targeting
sequences. Although cell compartmentalization enables distinct roles to organelles, they may have overlapping functions,
and a given protein may be required to more than one compartment. Dual targeting appears as a strategy to deal with
this requirement. Approximately 30 Arabidopsis thaliana proteins are known to be dual targeted, and most of them are
involved in transcription, translation, and oxidative metabolism. Herein we describe the dual targeting of three RNAbinding proteins of A. thaliana to mitochondria and chloroplasts. These proteins are characterized by a conserved RNA
recognition motif (RRM) and a C-terminal glycine-rich sequence. Proteins containing a RRM motif are involved in
post-transcriptional processes and regulation of gene expression. Using a GFP approach and bombardment of Nicotiana
benthamiana mesophyl cells, we demonstrated the dual targeting of the RBP1a (At4g13850), RBP1b (At3g23830),
and RPS19 (At5g47320) proteins. Their N-terminal amino acid sequences are relatively conserved, suggesting that
they originated by gene duplication after acquisition of the targeting sequence (TS). When the first 39 amino acids
of RBP1b were deleted, the protein was localized only to the cytosol, indicating that the signal for RBP1b targeting is
located in its N-terminal region. In order to identify residues important for chloroplast and/or mitochondria targeting,
we introduced point mutations and deletions into conserved residues of RBP1b TS, and evaluated their effect in the
relative mitochondria/chloroplast targeting, using a novel GFP quantitative approach supported by statistical analyses.
Mutations and deletions of serine residues along the TS had no effect on the dual targeting of RBP1b, although
chloroplast-targeting sequences are normally rich in serine residues. However, mutations of arginine and lysine at the
N-terminal region reduced targeting to mitochondria, pointing to the involvement of positive residues in the protein
targeting to this organelle. Deletion of the first part of the TS (amino acids 2 to 17) abolished RBP1b targeting to
mitochondria, and the protein was localized to the chloroplasts and cytosol. When the second part of the TS (amino
acids 18-30) was deleted, RBP1b was detected, but with lower intensity, in chloroplasts, mitochondria and cytosol.
Therefore, the signal for RBP1b targeting to chloroplasts is located along the TS, and targeting to mitochondria depends
on the first part of the TS. While the first part of RBP1b TS has the information to promote the protein dual targeting,
the second part appears to be involved with the efficiency of the process.
Financial Support: CNPq and the Centre Nacional de la Recherche Scientifique (CNRS)- France.
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A new branch of endoplasmic reticulumstress signaling and the osmotic signal
converge on plant specific asparagine-rich
proteins to promote cell death
Costa, MDL1; Reis, PAB1; Valente, MAS1; Irsigler, AST1; Carvalho, CM1; Loureiro, ME2;
Aragão, FJL3; Boston, RS4; Fietto, LG1; Fontes, EPB1
1
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, BIOAGRO-UFV
Departamento de Biologia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa
3
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
4
Department of Plant Biology, North Carolina State University
[email protected]
2
Palavras-chave: Osmotic stress, ER stress, Signal transduction, Programmed cell death and Abiotic stress
NRPs (N-rich proteins) were identified as targets of a novel adaptive pathway that integrates endoplasmic reticulum (ER)and osmotic-stress signals based on coordinate regulation and synergistic up-regulation by tunicamycin and polyethylene
glycol treatments. This integrated pathway diverges from the molecular chaperone-inducing branch of the unfolded protein
response (UPR) in several ways. While UPR-specific targets were inversely regulated by ER- and osmoticstresses, NRPs required
both signals for full activation. Furthermore, BiP (Binding protein) overexpression in soybean prevented activation of the
UPR by ER stress inducers but did not affect activation of NRPs. We also found that this integrated pathway transduces a
PCD signal generated by ER- and osmotic-stresses that results in the appearance of markers associated with leaf senescence.
Overexpression of NRPs in soybean protoplasts induced caspase-3 like activity and promoted extensive DNA fragmentation.
Furthermore, transient expression of NRPs in planta caused leaf yellowing, chlorophyll loss, malondialdehyde production,
ethylene evolution and induction of the senescence marker gene CP1. This phenotype was alleviated by the cytokinin zeatin,
a potent senescence inhibitor. Collectively, these results indicate that ER stress induces leaf senescence through activation of
plant specific NRPs via a novel branch of the ER stress response.
Apoio Financeiro: PRONEX, CAPES, CNPq e FAPEMIG.
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Caracterização do fator de transcrição
OsNAC1 e seu envolvimento na interação
entre arroz e bactérias diazotróficas
promotoras de crescimento vegetal
Carvalho, TLG1,2; Nogueira, EM2,4; Baldani, VLD3; Baldani, JI3; Hemerly, AS1,2
Instituto de Bioquímica Médica - Universidade Federal do Rio de Janeiro, Avenida Brigadeiro Trompowski Ed. CCS,
21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
2
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Pesquisas do Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Rua Pacheco Leão 915,
22460-030, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
3
EMBRAPA Agrobiologia, BR465 Km47, 23851-970, Seropédica, RJ, Brasil
4
Laboratório de Tecnologia de Bioquímica e Microscopia, Colegiado de Ciências Biológicas e da Saúde – Universidade Estadual da Zona Oeste,
Avenida Manuel Caldeira de Alvarenga 1203, 23070-200, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: auxina, NAC, promoção de crescimento vegetal, defesa
Na década de 90, foi descrito um sistema particular de associação entre monocotiledôneas, como arroz, e bactérias diazotróficas
promotoras de crescimento vegetal, como Herbaspirillum seropedicae. Nessa associação, as bactérias são endofíticas, colonizando
os espaços intercelulares do parênquima, lúmen de elementos de vaso e tecidos de raízes, caule e folha, sem a formação aparente
de qualquer estrutura especializada. Dentre os benefícios observados nessa associação está a promoção de crescimento vegetal,
em particular do sistema radicular. Além de fixar nitrogênio, essas bactérias apresentam efeitos independentes da Fixação
Biológica de Nitrogênio, possivelmente resultantes da produção de fitohormônios, já que foi descrita a produção in vitro de
auxina e outros reguladores por algumas dessas bactérias. Sendo a auxina um dos principais reguladores do desenvolvimento
radicular, o nosso grupo de pesquisa tem como um dos objetivos estudar o possível papel desse fitohormônio na associação
entre arroz e H. seropedicae. Em Arabidopsis thaliana, foi descrito um fator de transcrição regulado por auxina e que medeia
à sinalização em que auxina regula a formação de raiz lateral, chamado NAC1. Nosso grupo identificou o provável ortólogo
de NAC1 em arroz (OsNAC1), e experimentos de PCR em Tempo Real mostraram que OsNAC1 foi induzido em plantas
de arroz inoculadas com H. seropedicae. Realizou-se uma análise da função in vivo de OsNAC1 utilizando um sistema
heterólogo - A. thaliana – devido à facilidade e rapidez na obtenção de plantas geneticamente modificadas. OsNAC1 foi
superexpressa constitutivamente sobre o controle do promotor 35 e as linhagens 35S-OsNAC1 apresentaram uma promoção
do desenvolvimento radicular, possuindo um maior número de raízes laterais em relação ao controle, não ocorrendo nenhuma
modificação em relação ao tamanho da raiz principal. Esta linhagem transformante apresentou uma maior taxa de sobrevivência
quando submetida a estressa hídrico em relação às plantas controle. A varredura de uma biblioteca de duplo-híbrido de arroz
usando OsNAC1 como isca, revelou a interação com outro membro da família NAC, denominado OsNAC3, a interação foi
confirmada através da técnica de GST-Pulldown. OsNAC3 pertence a um ramo filogenético composto apenas de proteínas
NAC pertencentes a monocotiledôneas, outra proteína NAC pertencente a este ramo está envolvida na inibição da replicação
do geminivirus do trigo anão. Experimentos de PCR em Tempo Real mostraram que tanto OsNAC1 quanto OsNAC3 são
induzidos por auxina, e que somente OsNAC3 é induzido por jasmonato, conhecido regulador da resposta de defesa do tipo
ISR. Esses dados sugerem uma ligação entre processos de defesa e desenvolvimento vegetal, e o possível envolvimento da
auxina. Nossa hipótese é que a auxina estaria regulando os processos de defesa e desenvolvimento durante a associação entre
arroz e H. seropedicae, possivelmente através de vias que envolvem OsNAC3 e OsNAC1, respectivamente.
Apoio financeiro: FAPERJ, CNPq, FINEP e PRONEX.
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Efeito do silenciamento pós-transcricional
dos genes de ascorbato peroxidase OsAPX1
e OsAPX2 no transcriptoma de arroz
(Oryza sativa L.)
Ribeiro, CW1,3; Rosa, SB1,3; Alves-Ferreira, M2; Lazarotto, F3; Margis, R1,3; Margis-Pinheiro, M1,3
PPGBMC, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
Palavras-chave: estresse oxidativo, ERO, ascorbato peroxidase, microarranjo
As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas constantemente pelo metabolismo aeróbico. Em situações de
estresse biótico ou abiótico, a produção é aumentada e a toxicidade das ERO pode conduzir a diversos danos celulares.
As ERO atuam também como moléculas sinalizadoras regulando a expressão de genes de defesa a estresses, senescência,
morte programada da célula, crescimento e desenvolvimento da planta, entre outros processos. Uma vez que as ERO
são tóxicas e também participam de eventos de sinalização, as células vegetais requerem mecanismos que regulem
finamente a concentração intracelular dessas moléculas. A ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do
metabolismo antioxidante, catalisando a decomposição do H2O2. Em arroz, a APx é codificada por oito genes, cujas
isoformas são caracterizadas por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplastidial.
Este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente as ascorbato peroxidases citosólicas (OsAPx1 e OsAPx2),
estudando o papel destas isoformas nos mecanismos de defesa dos vegetais. A estratégia utilizada foi o silenciamento
pós-transcricional, por RNA de interferência (RNAi), de ambos os genes OsAPx1 e OsAPx2. A redução da expressão
destes genes resultou na modificação dos padrões de expressão transcricional dos genes da família OsAPx. A análise das
plantas silenciadas OsAPx1/OsAPx2 sob estresse com radiação UV e altas doses de alumínio, revelou a existência de um
mecanismo de compensação, pela ativação de outras enzimas antioxidantes e aclimatação, possivelmente sinalizados
pelos níveis mais elevados de H2O2. Para caracterizar o padrão de expressão global da linhagem mutante, silenciada
para os genes de APx citosólicas, em comparação com a planta normal, foi feita uma análise de microarranjos. Nesta
análise foi observado um nível de transcrição alterado para um grupo de genes que desempenham funções variadas
na planta. Também foi confirmada a repressão no nível de transcrição das isoformas silenciadas OsApx1 e OsApx2.
Análises de PCR em Tempo Real foram realizadas para validar os resultados obtidos por microarranjos. Estes resultados
constituem o primeiro passo para o entendimento da rede complexa de regulação da expressão gênica que ocorre na
planta em função da expressão de APx.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERGS, CAPES, UNESCO e ICGEB.
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Expressão diferencial dos genes de
ascorbato peroxidase de arroz em resposta
a diferentes tipos de estresses ambientais
Caverzan, A1*; Teixeira, kF2; Rauber, R1; Margis, R3; Margis-Pinheiro, M1
1
Departamento de Genética, UFRGS, RS
Laboratório de Genética Molecular Vegetal, Departamento de Genética, UFRJ, RJ
3
Centro de Biotecnologia, UFRGS; Departamento de Bioquímica, UFRGS, RS
2
*[email protected]
Palavras-chave: ascorbato peroxidase, expressão gênica, Oryza sativa, estresse ambiental, localização subcelular
As plantas são expostas a diversas condições de estresse ao longo do seu desenvolvimento, tais como alta salinidade,
temperaturas extremas, seca e dano mecânico, os quais resultam em um aumento dos níveis de espécies ativas de
oxigênio (EAO). Para proteger as membranas celulares e as organelas contra os efeitos danosos causados pela ação das
EAO sobre o tecido vegetal, as plantas ativam um complexo sistema antioxidante. O principal sistema de remoção das
EAO nos cloroplastos e mitocôndrias é o ciclo do ascorbato-glutationa, onde a ascorbato peroxidase (APx) é a enzima
chave, catalisando a conversão do H2O2 em H2O, usando ascorbato como doador de elétrons. Em arroz, oito genes
codificam APx, os quais foram parcialmente caracterizados em relação à localização subcelular de seus produtos, em
sistema heterólogo, e ao padrão de expressão de seus transcritos. O presente trabalho tem como objetivo: i) determinar
experimentalmente a localização subcelular das proteínas codificadas pelos diferentes genes de APx; ii) estudar o
padrão de expressão da família gênica de APx em resposta a diferentes estresses. Para o estudo de localização subcelular
foram obtidas proteínas de fusão com a proteína fluorescente GFP. Atualmente está em andamento a análise, por
microscopia confocal, dos calos de arroz transformados estavelmente com as construções que expressam as proteínas de
fusão. Experimentos de expressão dos genes OsAPx frente a estresses como seca, frio, tratamento com H2O2 e alumínio
exógeno demonstraram que os diferentes membros da família das APx de arroz apresentam expressão diferencial em
respostas a estímulos ambientais. O tratamento com concentrações tóxicas de alumínio provocou redução significativa
no nível de transcritos dos genes das isoformas mitocondriais (OsAPx5 e OsAPx6) após 4 horas de exposição ao Al. A
exposição de plantas de arroz ao H2O2 exógeno induziu a expressão dos genes que codificam isoformas de APx solúveis
(OsAPx1, OsAPx2, OsAPx5, OsAPx6 e OsAPx7). Nenhuma alteração no perfil de expressão nos genes que codificam
isoformas ancoradas à membrana (OsAPx3 e OsAPx4 peroxissomal, e OsAPx8 tilacóide) foi observada. Quando as
plantas foram submetidas à baixa temperatura ocorreu uma indução significativa na expressão nos genes citosólicos,
peroxissomais e na isoforma mitocondrial OsAPx6 e cloroplastidial OsAPx7 após 6 horas de exposição ao estresse. Após
24 horas a 10oC, os genes OsAPx2 e OsAPx8 foram fortemente reprimidos. A exposição de plantas de arroz a estresse
hídrico provocou forte redução na expressão no gene da isoforma cloroplastídica OsAPx8 e a peroxissomal OsAPx4
aos 15 dias de estresse hídrico. Ao contrário, os genes das isoformas citosólicas, mitocondriais e APx estromal foram
significativamente induzidas por esta condição de estresse. Esses resultados demonstraram a existência de uma complexa
regulação na expressão dos diferentes genes de ascorbato peroxidase.
Suporte financeiro: UNESCO, ICGEB, CNPq.
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AValiação da expressão de genes regulados
durante o desenvolvimento do fruto das
cultivares de uva isabel e isabel precoce
(Vitis labrusca)
Passaia, G1,2,3; Revers, LF2; Sbeghen, F2; Margis-Pinheiro, M1,3
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular – Centro de Biotecnologia/UFRGS
2
Laboratório de Biologia Molecular Vegetal - Embrapa Uva e Vinho
3
Departamento de Genética - IB/UFRGS
[email protected]
1
Palavras-chave: Vitis, expressão gênica, desenvolvimento do fruto, qRT-PCR, genômica funcional
A cultivar de uva Isabel precoce é resultante de uma mutação somática espontânea da cultivar Isabel (Vitis labrusca) e
caracteriza-se pela antecipação de cerca de trinta e três dias na colheita. A identificação de genes associados com o processo
de maturação poderá contribuir para a melhor compreensão do processo de amadurecimento do fruto, podendo gerar
tecnologias para a obtenção de novas cultivares e/ou plantas transgênicas com características agronômicas melhores. A
terceira fase do estudo dos genomas é chamada genômica funcional, a qual visa confirmar experimentalmente as funções
atribuídas aos genes in silico, contribuindo com informações de regulação gênica e níveis de expressão. Dessa forma, o
presente trabalho objetiva avaliar a expressão de genes relacionados com a maturação do fruto da videira, relacionando
seus níveis de expressão com a característica de maturação precoce da cultivar mutante, utilizando a técnica da reação
em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR).Foram utilizadas para a extração do RNA e síntese do
cDNA, bagas de ambas cultivares a partir do estabelecimento do fruto e aos 15, 30 e 90 dias após o estabelecimento do
fruto (DAEF) durante a safra de 2005/2006 e 10, 40 e 80 DAEF durante a safra 2007/2008. A partir de extensa revisão
bibliográfica, foram selecionados vinte e três pares de iniciadores que amplificam genes envolvidos no desenvolvimento
do fruto. Esses genes codificam fatores de transcrição, proteínas estruturais e proteínas do metabolismo secundário.
Os genes que mostraram expressão diferencial, pelo menos em um dos tempos amostrados entre as cultivares, foram
VvMYBPA1, VvSP2, VvBURP, VvFT, VvBeta-expansina e VvExpansina1. Os quatro primeiros codificam fatores de
transcrição, enquanto os dois últimos são genes estruturais que participam da expansão celular em diferentes períodos
da maturação do fruto. Todos são induzidos significativamente na cultivar mutante durante a morfogênese do fruto.
Os seis genes identificados com expressão diferencial entre as cultivares Isabel e Isabel Precoce serão avaliados em duas
cultivares elite da espécie Vitis vinifera: Cabernet Sauvignon, que possui ciclo de desenvolvimento longo, e Chardonnay
com ciclo curto. Essas análises permitirão verificar se os mesmos genes induzidos na mutante Isabel Precoce (Vitis
labrusca) reproduzem seu padrão de indução na cultivar Chardonnay também de ciclo curto em relação à Cabernet
Sauvignon, variedades da espécie Vitis vinifera.
Apoio financeiro - FAPERGS, CNPq e EMBRAPA Uva e Vinho.
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Caracterização de marcadores
microsatélites derivados de seqüências
de BAC e EST em Musa acuminata
Passos, MAN1; Menezes, NNP1; Emediato, FL; Vilarinhos, AD2; Souza Jr., MT3; Pappas Júnior, GJ1; Miller, RNG1; Ciampi, AY3
Universidade Católica de Brasília, SGAN 916, Módulo B, Brasília, DF, CEP 70790-160, Brazil
2
EMBRAPA Mandioca e Fruticultura Tropical, Cruz das Almas, BA., Brazil
3
EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, Parque Estação Biológica - PqEB - Av. W5 Norte, Caixa Postal 02372, Brasília,
DF, CEP 70770-900, Brazil
[email protected]
1
Palavras-chave: Musa acuminata, simple sequence repeats (SSRs), polimorfismo, estresse biótico, Sigatoka Negra
O Brasil é atualmente o segundo maior produtor de banana, contribuindo para aproximadamente 10% da produção
mundial. Estresses bióticos estão hoje entre os mais importantes fatores limitativos da produção de banana em todo o
mundo. O patógeno Mycosphaerella fijiensis, organismo causador de Sigatoka Negra causa na bananeira amadurecimento
precoce da fruta, lesões necróticas e decomposição foliar, além de perdas na produção de até 100% em variedades
suscetíveis. O objetivo deste trabalho é a identificação e caracterização de componentes genéticos de resistência ao
patógeno M. fijiensis em Musa spp., e o desenvolvimento de marcadores gênicos funcionais para o mapeamento
genético a ser utilizado em programas de melhoramento de Musa. Foram desenhados primers a partir de seqüências
de EST’s de 2 bibliotecas de cDNA originadas de M. acuminata spp. burmannicoides Calcutta 4 (cultivar resistente)
e Cavendish Grande Naine (cultivar susceptível), infectadas in vitro com M. fijiensis. Primers SSRs também foram
desenhados a partir de seqüências de subclones da biblioteca BAC de M. acuminata spp. burmannicoides Calcutta 4.
O DNA de 20 cultivares diplóides de M. acuminata resistentes e susceptíveis às Sigatokas negra e amarela foi utilizado
para caracterizar os marcadores microsatélites. Foram formados 4 agrupamentos (Bulks) da seguinte maneira: Bulk 1,
com DNA de 6 indivíduos resistentes à Sigatoka-negra; Bulk 2, com DNA de 2 indivíduos suscetíveis à Sigatoka-negra;
Bulk 3, com DNA de 11 indivíduos resistentes à Sigatoka-amarela; e Bulk 4, com DNA de 9 indivíduos suscetíveis à
Sigatoka-amarela. Foram realizadas reações de PCR com o objetivo de detectar presença/ausência de fragmentos entre
os Bulks. Para os locos onde foi detectado polimorfismo, novas reações foram realizadas com os Bulks abertos, ou seja,
para cada indivíduo, de modo a confirmar a presença da banda em todos os componentes do Bulk. Essa verificação
de polimorfismo foi realizada em eletroforese com gel de poliacrilamida 4% em resolução em nitrato de prata. Até o
momento foram encontrados 22 locos microsatélite polimórficos, sendo 20 locos originados de seqüências oriundas de
BAC’s e 2 originados a partir de seqüências de ESTs. Esses locos foram testados em 20 cultivares diplóides contrastantes
para a resistência às Sigatokas negra e amarela e em 2 indivíduos da F1 gerados do cruzamento entre os cultivares
“Calcutta 4” (resistentes às Sigatokas negra e amarela) e “Pisang Berlin” (suscetível às Sigatokas negra e amarela). No
caso de populações de Musa sp., contrastando para resistência a pragas, uma potencial co-segregacão de SSRs com
QTL’s para resistência também oferece a possibilidade de desenvolvimento de marcadores ligados à locos de resistência.
Dessa forma, esses marcadores moleculares podem possibilitar uma seleção assistida, além de saturar mapas genéticos
futuros em Musa.
Supported by: IAEA, CNPq, UCB.
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Modelagem por homologia de uma lectina
de Artocarpus incisa L. (Frutalina)
Nepomuceno, DR1; Moreira, RA1; Carvalho, CPS1; Correia, TO2; Pereira, HM3; Grangeiro, TB2
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará
2
Departamento de Biologia, Universidade Federal do Ceará
3
Universidade de São Paulo, USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Moraceae, modelagem, jacalina, estrutura, proteína
A lectina alfa-D-galactose ligante de Artocarpus incisa, a frutalina, é uma glicoproteína que se mostrou eficaz na
identificação de lesões malignas de mama e tireóide. A frutalina apresenta em torno de 98% de identidade com a
jacalina, a lectina galactose ligante de Artocarpus integrifolia. Como a estrutura primária da frutalina é muito semelhante
a da jacalina, é bastante razoável se pensar que a estrutura tridimensional da frutalina seja bem próxima a da jacalina. A
modelagem por homologia é a ferramenta mais bem sucedida de predição de estruturas tridimensionais de proteínas.
O nosso objetivo foi determinar a estrutura tridimensional da frutalina por meio da modelagem comparativa, analisar
os modelos e observar a ocorrência de mutações no sítio ligante de carboidrato. Para tal, a seqüência codificadora da
frutalina foi amplificada por RT-PCR a partir do RNA total extraído de sementes em diferentes estágios de maturação
dos frutos de A. incisa. O cDNA da frutalina dos estágios amplificados na reação de RT-PCR foi inserido no vetor de
clonagem pGEM-T Easy Vector (Promega). Os plasmídeos recombinantes transformados com a seqüência codificadora
da frutalina dos três diferentes estágios foram seqüenciados e analisados quanto à presença de mutações. Foram obtidos
cinco modelos diferentes da possível estrutura tridimensional da frutalina. Os sítios de ligação a carboidratos não foram
alterados pelas mutações ocorridas nos clones da frutalina. As mutações pontuais nos clones sugerem a existência de
isoformas dessa proteína.
Apoio Financeiro: CNPq, FUNCAP, CAPES.
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Quantificação do número de cópias de
inserções transgenes no genoma da soja
por PCR quantitativo via quantificação
absoluta e relativa
Rolla, AAP1; Beneventi, MA3; Fuganti, R2; Martins, MTB4; Pereira, SS1; Rubira, APR4; Marin, SRR2; Farias, JRB2;
Silveira, CA2; Binneck, E2; Abdelnoor, RV2; Marcelino, FC2; Nepomuceno, AL2
Genética e Biologia Molecular– Universidade Estadual de Londrina - UEL, Londrina, PR
2
Embrapa Soja. Londrina, PR
3
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS
4
Universidade Estadual do Norte do Paraná, Bandeirantes, PR
[email protected]
1
Palavras-chave: PCR quantitativo, número de cópias, soja, seca
O Brasil é o segundo maior produtor mundial de soja, sendo que a área cultivada com essa leguminosa vem crescendo
a cada ano, com conseqüente aumento de produção. Entretanto, os níveis de produção hoje alcançados ainda podem
ser melhorados. A biotecnologia tem possibilitado o desenvolvimento de organismos geneticamente modificados, que,
possibilitam a solução de problemas na produção, que agregam valor aos produtos agrícolas e que, em várias situações,
oferecem alternativas importantes para a melhoria na qualidade de vida humana e do ambiente. Após a obtenção de
plantas GM, a caracterização molecular dos eventos constitui uma etapa essencial para a identificação das linhagens
mais promissoras, que venham constituir o evento GM elite, a ser utilizado como linhagem parental no programa de
melhoramento. Esta avaliação visa caracterizar a integridade da seqüência inserida no genoma da espécie, o padrão
de expressão do transgene, a identificação do seu(s) sítio(s) de inserção, bem como o número de inserções do cassete
de expressão. A caracterização molecular quanto ao número de cópias do transgene, bem como do sítio de inserção
permite inferir sobre a estabilidade do genoma receptor após a transformação gênica. Este trabalho tem como principal
objetivo desenvolver e avaliar a eficácia da quantificação de inserções de cassetes transgenes no genoma da soja utilizando
a metodologia de PCR quantitativo. Serão testados dois sistemas de quantificação, um baseado em DNA genômico,
que empregará a técnica de quantificação relativa pelo método do 2-∆∆Ct, e outro baseado em DNA plasmidial, para
quantificação absoluta. Plasmídeos recombinantes, contendo as regiões de interesse (transgene) e parte do gene da
lectina, a ser utilizado como referência endógena, clonados, serão utilizados para construção de curvas de calibração para
determinação do número absoluto de cópias do transgene no genoma da soja. Para determinação da precisão dos diferentes
sistemas, a técnica de Southern blotting será utilizada para comparação dos resultados. Até o momento, 6 eventos GM
contendo o gene DREB1A, tiveram o número de cópias dos cassetes transgenes quantificados via PCR QT por quantificação
relativa, tendo a amostra BR16 como calibradora e gene lectina como referência endógena e por Southern blotting. De
acordo com os resultados, 4 eventos tiveram o número de cópias dos cassetes determinados por PCR QT confirmados por
Southern blotting. Dois eventos apresentaram número superior no PCR QT em relação ao resultado do Southern Blotting.
Isso pode ser explicado devido à ocorrência de inserções em tanden dentro do genoma. Tal resultado prelimar indica a
potencialidade do emprego da técnica de PCR para o screening inicial de plantas GM para seleção de eventos com baixo
número de cópias, e, conseqüentemente, a aceleração do desenvolvimento de eventos GM elites.
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Clonagem e análise da região promotora de
uma proteína de transferência de lipídeos
(CrLPT1) de frutos de Coffea racemosa
Salgado, LR1,3; Budzinski, IGF1; Cação, SMB1; Vieira, LGE1; Pereira, LFP1,2
IAPAR - Laboratório de Biotecnologia Vegetal, IAPAR, Rod. Celso Garcia Cid, Km 375, Londrina, PR
2
Embrapa Café – IAPAR
3
Departamento de Bioquímica e Biotecnologia, Universidade Estadual de Londrina
1
A produção de plantas geneticamente modificadas tem uma grande importância econômica pela possibilidade de incorporar
novas características agronômicas às plantas cultivadas como resistência a herbicidas, pragas e doenças, estresses abióticos
e melhora na qualidade dos alimentos. Um dos problemas encontrados na transformação genética de plantas é a falta
de promotores específicos para direcionar a expressão e atividade do gene/proteína para um determinado tecido, para
determinada fase de desenvolvimento, ou a partir da indução de um estresse biótico ou abiótico. Para novos produtos
biotecnológicos, a expressão desnecessária de genes em tecidos ou órgãos da planta pode ser indesejada do ponto de
vista da aprovação comercial. Por meio dos dados fornecidos pelo Projeto Genoma Café, foi identificado através de
Northern eletrônico um gene proteína de transferência de lipídeos (LTP), com alta expressão e específica para frutos
em Coffea racemosa, tornando sua região promotora uma forte candidata para atividade tecido/específica em frutos de
Coffea sp. LTPs são basicamente proteínas de 9-kDa presente em grande quantidade (quase 4% do total de proteínas
solúveis) em plantas superiores, e assim como outros genes de famílias de múltiplos genes, são potenciais candidatos
a estudos de promotores específicos, que regulam a sua atividade. Através da técnica Genome Walker, foi isolado e
clonado um fragmento de aproximadamente 900 bp a montante da ORF do gene CrLPT1. Análise da seqüencia do
fragmento demonstrou a presença de elementos “Core”, requisitos mínimos para iniciação da transcrição. Através de
comparação com o banco de dados da coleção de MOTIFs do PLACE (Plant Cis-Acting Regulatory DNA Elements),
foram identificados vários elementos típicos de promotores relacionados à resposta a fitorreguladores como ABA, etileno
e ácido giberélico. Para análise in vivo, o promotor foi clonado no vetor de expressão pCambia1281z contendo o gene
repórter GUS para verificar a expressão tanto em plantas modelos como em plantas em plantas de café geneticamente
modificadas.O trabalho de identificação de promotores específicos, tem importância estratégica para aplicação comercial,
podendo levar a produção de direitos de propriedade intelectual, para licenciamento da utilização não só em café mas
provavelmente em outras dicotiledôneas.
Agradecimentos: Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café.
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Validating housekeeping genes for
quantitative plant gene expression studies
in sunflower senescence process
Fernandez, P; Dosio, GAA2,4; Di Rienzo, J3; Aguirrezábal, LA2,4; Hopp, HE1; Paniego, N1,2; Heinz, RA1,2
INTA Castelar, Instituto de Biotecnología, CICVyA, Hurlingham (CP 1686), Pcia. de Buenos Aires, Argentina
2
Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Mar del Plata
3
Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina
4
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET)
[email protected]
1
Keywords: Helianthus annuus; sunflower; housekeeping genes, senescence, real-time PCR
Leaf senescence is a regulated process that corresponds to the last stage in leaf development. It is characterized by dramatic
changes in cellular metabolism and the sequential degeneration of cellular structures (Matile, 2000). Gene expression
associated to these degradations may be considered as early changes in senescence process. Real-time PCR has been the
largely and most accurate technique to quantify such instances. Besides being extremely powerful technique, real-time PCR
suffers from certain pitfalls, most important being the normalization with a reference or housekeeping gene (Bustin and
Nollan, 2004). It has been shown that abiotic stresses can induce (e.g. extreme temperatures, drought, flooding, nutrient
deficiency, oxidative stress, and shade) or delay (ablation of reproductive structure) senescence (Buchanan-Wollaston
et al. 2003) (Gan, 2003). The aim of this work was the validation of genuine housekeeping genes in sunflower leaves
for real time PCR analysis under senescence-induced (water stress) or senescence-depressed (ablation of reproductive
structure) treatments for this specie, and also for different aged leaves (from a medium and a high position in the
canopy), given an important variability in the occurrence of early events related to senescence. A total of eight putative
housekeeping genes were tested. Two-step real-time PCR was performed. The cDNA was synthesized from 1 ug of RNA
using the Superscript first-strand synthesis system for RT-PCR (Invitrogen) with random hexamer primers according
to manufacturer’s instructions. The qPCRs were performed using ABI Prism 7000 Sequence Detection System and
software (PE Applied Biosystems, USA) with SYBR detection (QuantiTect SYBR Green PCR master mix (Qiagen,
German). All the PCRs were performed under standardized conditions. The specificity of amplicons was verified by
melting curve analysis (60 to 95° C) after 40 cycles and agarose gel electrophoresis. Three biological replicates for each
sample were used for real-time PCR analysis and two technical replicates were analyzed for each biological replicate.
The real-time PCR efficiency was determined for each gene and each stress with the slope of a linear regression model
(Pflaff, 2001). To evaluate the gene expression stability, a mixed linear model was adjusted to the Ct values of every
gene considered in this assay. The model included a stressing factor (3 levels) a leaf position within the plant factor
(two positions) and the interaction between the stressing and leaf position factors. The model also included a random
plant effect. Several statistics were calculated from the fitted model. Considering the fixed effects p-value it is clear that
26S rRNA, UBQ13, TUB2 and 18SrRNA, present systematic variations between the stressing and/or position factors
making them not appropriate as reference controls. Within the remaining genes, TUB1 seems to be the best according
to plant’s variance component and CV value. In case it was decided to use more than one gene as a reference control
TUB2, PEP and EF-1 could be the best selection.
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Identificação e análise da expressão
de genes da via de biosíntese de ácido
jasmônico, através da aplicação de
indutores, em Theobroma cacao
Litholdo Jr., CG1; Leal Jr., GA1; Figueira, A1
Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo - CENA/USP
[email protected]
1
Palavras-chave: jasmonato, genes de biossíntese, Theobroma cacao, expressão gênica
O ácido jasmônico e seus derivados, denominados de jasmonatos, são hormônios vegetais que atuam no desenvolvimento
da planta e na regulação da resposta a estresses bióticos e abióticos. A biossíntese de ácido jasmônico acontece inicialmente
nos cloroplastos, com a oxigenação do ácido α-linolênico da membrana e finalmente nos peroxissomos onde sofre uma
redução e três β-oxidações resultando no ácido jasmônico, sendo esta via biossintética chamada de via LOX ou via do
octadecanóide. Alguns genes da biossíntese de jasmonato já foram identificados em bibliotecas de Theobroma cacao
tratados por indutores de resistência e durante interação com Moniliophthora perniciosa. Em geral a elevação dos níveis
de ácido jasmônico é correlacionada com a ativação de genes que codificam as enzimas da sua própria biossíntese e de
genes de resposta de defesa. O objetivo deste trabalho foi identificar os genes de biossíntese de jasmonato em bibliotecas
de cDNA de T. cacao, desenhar iniciadores a partir destas seqüências e demonstrar a indução específica destes genes pela
aplicação de metil-jasmonato. Para isto, plantas de T. cacao foram submetidas à aplicação de indutores (ácido salicílico;
etileno; metil-jasmonato e água-controle) e folhas foram coletadas após 6 horas. RNA foi extraído e realizado RT-PCR
quantitativo para análise da expressão de 4 genes (lipoxigenase, allene oxide ciclase, 12 oxo-fitodienoato redutase e acilCoA oxidase) da via de biossíntese de jasmonato utilizando o gene da actina como referência e os dados foram analisados
pelos métodos Delta-Delta e Pfaffl. Todos os genes analisados tiveram aumento da expressão apenas no tratamento com
metil-jasmonato corroborando a hipótese de que os genes da biossíntese de jasmonato sofrem um feedback positivo, ou
seja, jasmonato promove a expressão de genes responsáveis pela sua própria biossíntese.
Apoio financeiro: Fapesp.
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Identification of secondary metabolites from
Canavalia ensiformis: perspectives for the use
of metabolic engineering to control nematodes
Firmino, AAP1,3; Evaristo, RGS1,4; Franco, OL5; Carneiro, RMDG; Silveira, ER; Souza, DSL1,2 Silva, LP1; Magalhães, BS1;
Silva, MCM1; Sousa, BA5; Grossi de Sá, MF1,5; Rocha, TL1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, Brazil
2
Universidade de Brasília, Brasília-DF, Brazil
3
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre-RS, Brazil
4
Faculdades Integradas da Terra de Brasília, Brasília-DF, Brazil
5
Universidade Católica de Brasília, Brasília, Brazil
1
Plant parasitic nematodes of the genera Meloidogyne spp. cause remarkable losses to important world-wide crops reaching
up to 120 billion dollars annually. Currently, their control is based on synthetic nematicides that, beyond expensive,
cause risks to the human health and environment. Plants are source of metabolites, which may possess nematicidal
activity. These compounds are products of metabolic pathways regulated by genes that may be manipulated in order
to increase nematicidal metabolite production. In this context, a screening for specific and effective molecules against
second stage juvenile (J2) of Meloidogyne incognita was carried out using aqueous seed extracts of Canavalia ensiformes,
Crotalaria juncea, Crotalaria paulinea, Crotalaria spectabilis, Tagettes minuta, and Mucuna pruriens. Amongst all the tested
extracts, those from C. ensiformes showed the highest nematicidal activity (85%). Dialysis fractionation of the crude
components from C. ensiformes allowed us to separate molecules smaller than 3.5 kDa (External dialysis) which are very
effective against J2 nematodes but innocuous to phytopathogenic fungi, saprophytic nematode, protozoan, larvae of
Spodoptera frugiperda and Anthonomus grandis. Mass spectrometry revealed the existence of wide variety of secondary
metabolites in this fraction. Hemolysis tests showed that these components were not able to disrupt bovine red blood
cells. When submitted to 50°C for 24 hours nematicidal activity reduced only 20% illustrating their thermostability.
Greenhouse bioassays carried out on tomato roots employing the dialysis fraction reduced the number of egg masses
in 82.5% corroborating our results on nematicidal activity. Metabolites were further purified by HPLC resulting in a
more pure and very effective fraction causing 98% mortality of J2 nematodes. Microscopic analysis revealed that this
fraction induces the complete disruption of the J2 intestine due to an abundant vacuolization of epithelial cells. Mass
spectrometry and NMR analysis were performed in order to elucidate the molecular structure of these compounds,
whose patent process is underway. Molecular structure determination drives the current study of genes involved in
their metabolic pathways and will allow future experiments of metabolic engineering.
Supported by EMBRAPA, CNPQ, CAPES, FAP-DF.
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Cis-acting elements in promoter regions of
the Nramp genes family in rice genome
Bervald, CMP1; Maia, LC1; Vital, C2; Bresolin, APS1; Crestani, M1; Almeida, AM2; Carvalho, FIF1; Oliveira, AC1
Plant Genomics and Breeding Center, Federal University of Pelotas
2
Plant Physiology, Federal University of Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Cis-acting elements, promoter regions, Nramp, rice, genome
The understanding of the rice tolerance mechanisms to iron toxicity, in a physiological as well as molecular level will
contribute, excessively, with the rice breeding programs seeking to the obtaining of tolerant genotypes. The mechanisms
of tolerance to iron toxicity are extremely complex and several studies have been accomplished in the attempt of
elucidating them. The gene network responsible for responses to iron toxicity involves many gene families, containing
for each one of those families several copies of a same gene (paralogous). The Nramps genes (Natural resistance
associated macrophage proteins) constitute a highly conserved family of integral membrane proteins that are involved
in metal ion transport in a wide range of organisms, including bacteria, fungi, plants, and animals. Promoter region of
the different loci of these genes family can contain structural differences regarding to the different activator elements
of gene transcription (cis-acting) found in these regions, thus showing the complexity of the genetic control of this
character. Different loci of Nramp family genes in rice genome were investigated in order to assess the abundance and
diversity of cis elements. Using the annotated rice genome (Oryza sativa subsp japonica cv. Nipponbare) deposited in
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), sequence fragments representing 1,000 bp of the upstream region of eight loci.
These sequences were subjected to the portal PLACE (http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) to identify the different
cis elements present in each promoter region. The results obtained showed the occurrence of 170 different cis-acting
described in the PLACE portal. Among the eight OsNramp loci, the locus OsNramp 1 (96) presented the most quantity
of different elements, followed by the loci OsNramp 7 (82) and OsNramp 3 (78). Only 15 elements were common to
all gene families. The element CACTFPPCA1 (CACT) was the most common among these. The most occurrence
of these 15 elements happened in the gene OsNramp 4. Based on the positioning in the promoter region of the four
most common elements, can be observed that exist a large abundance and/or diversity of different elements in these
promoter regions, which can represent differences in the expression of each gene modulated by different transcription
factors activated by different signals of abiotic and/or biotic stresses. These most common elements did not follow a
pattern of distribution among the loci studied. It is important also point out that the most common elements studied
are not described as being involved in the expression of genes of iron metabolism, however, it can be justified by the
lack of studies accomplished with this focus.
Orgão financiador: CAPES.
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A recombinant plant defensin with high
antifungal activity
Del Sarto, RP1, 4,; Lacerda, AF1,2; Coelho, RR1; Silva, MS5; Prates, MV1; Firmino, AAP1,3; Pires, NF1; Grossi de Sa, MF1,2
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
2
Universidade Católica de Brasília- UCB
3
Universidade Federal do Rio Grande do Sul-UFRGS
4
Universidade de Brasília-UnB
5
Embrapa Cerrados
1
Phytopathogenic fungi are responsible for huge losses of important crop. Conventional control is extremely difficult,
expensive, not fully effective and enormously adverse to the environment. Alternative methods are continuously under
research and development in order to improve microorganism control. In this context, plant defense molecules are
largely studied due to their ability to block the action of invasive microorganisms. Plant defensins are small (~5 kDa),
basic, cysteine-rich antimicrobial peptides, which can play an important role in defense against diverse plant pathogens.
Because of their specificity, these molecules have promising biotechnological applications on pathogen control. However,
plants, as a natural source, are limited suppliers of defensins. Heterologous gene expression in Pichia pastoris is an
excellent method for achieving higher expression levels and for keeping the recombinant proteins bioactive. In this
work, the gene of pea (Pisum sativum) defensin, DRR230a (accession number: AF525685) was subcloned into the yeast
expression vector pPICZαA® (Invitrogen Co.), and expressed on P. pastoris strain GS115. The induction of expression was
done in 4 days, with daily addition of 1% methanol. Aliquots were collected at each 24 hours and analyzed on tricineSDS-polyacrylamide gel electrophoresis. The recombinant pea defensin, DRR230a expression occurs 48 hours after
induction. The amino acid sequence was confirmed by Edman degradation on automated sequencer. The recombinant
protein shows antifungal activity against Fusarium solani f. sp.glycines at low concentrations. The antifungal activity
was determined by inhibition assay of mycelial growth in vitro. High-scale expression was being carried out to evaluate
the specificity of the recombinant pea defensin DRR230a against other important phytopathogenic fungi, as soybean
rust, Phakopsora pachyrhizi, and ramulose, Coletotrichum gossypii.
Supported by: Embrapa Genectic Resources and Biotecnology, CNPq, CAPES, FINEP.
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Marcadores derivados de regiões expressas:
taxas de sucesso na ancoragem
de primers derivados de fl-cDNA contra
sequências genômicas
da Maia, LC1; Kopp, MM1; Bervald, CMP1; Farias, DR1; de Carvalho, FIF1; de Oliveira, AC1
Centro de Genômica e Fitomelhoramento, Departamento de Fitotecnia, FAEM, Universidade Federal de Pelotas
[email protected]
1
Palavras-chave: marcadores funcionais, genômica
Atualmente várias iniciativas estão sendo desenvolvidas com objetivo de conhecer as regiões expressas em diferentes
genomas através do sequenciamento de mRNAs (ESTs e/ou cDNAs). Marcadores moleculares obtidos a partir destas
regiões expressas são descritos como marcadores funcionais e de forma geral é bem aceito de que estes podem ser mais
eficientes em ligar diferenças gênicas com as diferenças do fenótipo. O desenho de primers apartir de fitas consenso obtidas
de seqüências expressas pode ser conseguida a partir de bancos de dados públicos de ESTs e/ou cDNAs ou ainda em
bancos de dados particulares de cada grupo de pesquisa. Entretanto, uma parte destes conjuntos de primers apresentam
resultados diferentes do previsto quando implementados em protocolos de PCR em laboratório (validação). Com o
objetivo de verificar o comportamento de primers derivados de regiões expressas, quando estes amplificam regiões do
genoma da mesma espécie, a partir de um banco de dados contendo 28.469 sequências não redundandes de fl-cDNA do
arroz (Oryza sativa subs. japonica), utilizando um programa de computador chamado SSRLocator, foram caracterizados
3.907 locos microssatélites Classe I e destes 3.329 possibilitaram o desenho de primers. Posteriormente, utilizando
uma função descrita como Virtual-PCR, incluída no mesmo programa, foi simulada a reação de PCR amplificando
a lista de 3.329 primers contra a o próprio banco de dados de fl-cDNA e posteriormente contra a pseudo-molécula
do genoma completo do arroz (Oryza sativa subsp. japonica cv. NiponBare). Os resultados da Virtual-PCR contra o
banco de cDNAs mostraram que dos 3.329 conjuntos de primers um total de 2.397 conjuntos amplificaram somente
em uma seqüência cDNA e 932 amplificaram em duas ou mais seqüências, que possivelmente sejam genes parálogos
ou domínios protéicos. Para a simulação da Virtual-PCR os resultados mostraram que somente 1.218 conjuntos de
primers (36%), amplificaram em regiões genômicas. Do ponto de vista da aplicabilidade prática destes resultados,
ressaltamos que confrontar primers obtidos a partir de dados de ESTs e/ou cDNAs contra a anotação da estrutura de
genes descritos nas espécies modelos pode ser uma estratégia que permite melhorar a taxa de sucesso na utilização de
primers derivados de regiões expressas de diferentes espécies.
Orgão financiador: CNPQ, CAPES.
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Análise global da expressão gênica em
um mutante de Arabidopsis thaliana com
desenvolvimento foliar e radicular alterados
Arongaus, AB1; Meyerowitz, EM2; Alves-Ferreira, M1
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ, RJ
2
California Institute of Technology, Pasadena, USA
[email protected]
1
Palavras-chave: Arabidopsis thaliana, microarranjo, parede celular
As vias de desenvolvimento que regulam a morfogênese em Arabidopsis thaliana podem ser estudadas pela análise de
mutantes nocaute. Um mutante de Arabidopsis isolado em nosso laboratório, por mutagênese insercional, apresentou
um fenótipo anão e por isso foi denominado aquitã (aqt), pequeno em tupi. Nessa linhagem, o T-DNA está localizado a
200bp abaixo do códon de início do gene At1g55430, que codifica uma proteína com dois possíveis domínios funcionais:
DC1 e C1-like. Além do fenótipo anão, o mutante aqt apresenta perda da dominância apical, aumento no número
de folhas, encurvamento das margens foliares, má formação dos feixes vasculares em cotilédones e folhas, aumento
no comprimento e diâmetro da raiz principal e número reduzido de raízes laterais. Para uma melhor compreensão do
papel da proteína AQT em Arabidopsis, foi realizada uma análise global da expressão por microarranjos de DNA de
plântulas inteiras e de raízes de plântulas comparadas com o tipo selvagem usando chips de oligos longos da Qiagen/
operon. Os chips foram lidos no escaneador AXON 4400A, processados no programa GenePix e os resultados foram
exportados para plataforma do Roseta Resolver para normalização. Em seguida foi aplicado o teste Bonferroni para
identificação dos genes que tiveram a expressão alterada considerando os limites de 0,05 para p-value e valor absoluto
de expressão maior que 2. Foi observado maior número de genes diferencialmente expressos em raízes (661) do que
na plântula (445). Além disso, apenas 11 genes induzidos e 24 reprimidos são comuns a ambas as amostras, indicando
que a ausência de AQT resulta em efeitos completamente distintos entre parte aérea e raiz. Para as avaliações das
categorias funcionais do Gene Ontology (GO) comparamos os números totais de genes no genoma com os obtidos em
nossos experimentos e consideramos significativas aquelas categorias que apresentavam p<0,05 para o teste de Fisher.
Uma análise mais detalhada mostrou que os processos biológicos mais induzidos em plântulas aqt estão relacionados
à sinalização por cálcio e fitohormônios, sendo a via do etileno a mais afetada. Por outro lado, são reprimidos no
mutante, o metabolismo secundário, incluindo diversas etapas da via dos fenilpropanóides, e o de parede celular, sendo
que a classe majoritária de proteínas envolvidas é a de expansinas. Esses resultados corroboram a observação fenotípica
de menor lignificação em cotilédones e hipocótilo em aqt, assim como uma parede celular, aparentemente, mais fina
devido a sua fraca coloração com azul de toluidina. Dados de expressão deste gene também indicam uma expressão
preferencial em células da raiz em expansão, assim como em células do tecido vascular no momento de diferenciação,
apoiando a hipótese que AQT pode ser fundamental para o processo de formação da parede celular e, em determinados
tecidos, do processo de lignificação.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, FAPERJ e IFS.
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Testes de isolamento das proteínas da
parede celular primária de cana-de-açúcar
em Suspensão celular
Rodrigues, MJC; de Andrade, A; Bonatto, JMC; Lacerda, GC; Barbosa, L; Labate, CA
[email protected]
Com a necessidade de uma fonte renovável de energia para substituir o petróleo, mais atenção é direcionada ao
Setor Sucroalcooleiro Brasileiro, pois considerando todo o processo agro-industrial, a cana-de-açúcar gera créditos
de carbono. A qualidade do solo, o clima e a tecnologia desenvolvida na área agrícola colocaram a cana-de-açúcar
brasileira como uma das mais promissoras fontes de energia renovável. As proteínas, produtos da expressão gênica, são
constituintes essenciais das paredes celulares vegetais; estando envolvidas em modificações dos componentes da parede,
em sua estrutura, sinalização e interação com proteínas da membrana plasmática na superfície celular. Neste trabalho,
isolou-se as proteínas da parede celular primária da variedade SP 80 3280 de cana-de-açúcar, Saccharum spp, a fim de
se estabelecer quais proteínas são encontradas. As proteínas da parede celular foram isoladas de células em suspensão,
sendo então filtradas e precipitadas em soluções de 10% ou 15% de glicerol, em diferentes tratamentos: trocando as
soluções a cada hora ou deixando três horas ininterruptas, já que o glicerol auxilia na separação da parede celular dos
demais componentes celulares. A fração da parede foi recuperada e ressuspendida em solução de CaCl2, para eliminar
proteínas fracamente ligadas. Os extratos foram concentrados por precipitação em acetona e ressuspendidos por um
tampão de solubilização. Após a quantificação protéica utilizando o método de Bradford, as amostras de proteínas
foram aplicadas num gel SDS-PAGE. Os resultados mostraram que a solução de glicerol 15% deixada por três horas,
sem trocar as soluções, foi a que mais isolou proteínas. Outro teste foi realizado quanto à concentração de CaCl2,
que variou entre 150, 200, 250, 300 e 400 mM. Os resultados colaboraram para a realização de uma análise dessas
proteínas por gel 2-D. Os próximos passos serão otimizar ainda mais o protocolo de extração e realizar uma análise e
sequenciamento das proteínas encontradas no gel 2-D, através de espectrômetro de massas Q-TOF. Com esses dados
será possível identificar as proteínas existentes na parede celular da cana-de-açúcar e estabelecer uma relação entre a
função de cada proteína, a expressão gênica, e a dinâmica da parede celular.
Apoio financeiro: CNPq e Fapesp.
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Análise de morte celular programada
induzida por cádmio em plantas de
Genipa americana L. (Rubiaceae)
cultivadas em solução nutritiva
Souza, VL1; Lima, SGC2; Almeida, A-AF3; Cascardo, JCM3; Silva, DC3
Doutoranda em Genética e Biologia Molecular
2
Bióloga
3
Departamento de Ciências Biológicas – Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
1
Palavras-chave: apoptose, metal pesado, fitorremediação, Genipa americana, TUNEL
O cádmio (Cd), proveniente de deposições atmosféricas e do uso de fertilizantes orgânicos e fosfatados, não é considerado
elemento essencial e benéfico aos seres vivos. Nas células vegetais o Cd dispara uma série de reações químicas que podem
levar a morte celular. O presente trabalho teve como objetivo analisar indicadores de alterações celulares característicos
de morte celular programada (MCP) induzida por Cd em Genipa americana cultivada em solução nutritiva, para
subsidiar estudos futuros de sua utilização como planta tolerante e,ou fitorremediadora desse elemento metálico. Plantas
de G. americana com 2,8 anos de idade foram submetidas a concentrações crescentes de Cd (0,5, 1, 2, 4, 8, 16 mg
L-¹), juntamente com o controle. Após 120 h de aplicação dos tratamentos foram realizadas coletas da porção mediana
da 2ª folha madura para análise de MCP. Após inclusão em parafina e obtenção dos cortes histológicos, as amostras
foram sondadas com o kit para detecção de fragmentação do DNA “In situ Cell Death Detection Kit, AP” (Boehringer
Mannheim; TUNEL assay) de acordo com as recomendações do fabricante. Os cortes sondados com TUNEL foram
observados em microscópio de fluorescência Leica DM RXA2, equipado com câmera digital. As imagens foram capturadas
utilizando-se o filtro I3 (450-490 nm de excitação). A reação TUNEL, realizada em secções transversais de folhas de
G. americana submetidas a diferentes concentrações de Cd, demonstraram núcleos TUNEL positivos na região da
medula para as concentrações 4, 8 e 16 mg Cd L-1 quando comparado ao controle. Na face adaxial da nervura central,
as células localizadas no colênquima e na epiderme que apresentaram núcleos TUNEL positivos, diferentemente da
medula, estavam agrupadas e os cloroplastos também se tornaram fluorescentes, principalmente para concentração 8
mg Cd L-1. Na face abaxial ocorreu uma predominância de núcleos TUNEL positivos na epiderme e no colênquima
com padrão morfológico distinto, além da presença de cloroplastos fluorescentes. A análise do padrão morfológico das
células da face abaxial evidenciou, nas concentrações de 4 e 8 mg Cd L-1, núcleos com esferas de cromatina condensada
e deslocados para a periferia celular. Constatou-se, em alguns casos, a perda da arquitetura nuclear, com exibição de
núcleos com formatos elípticos. Observou-se, também, em 8 mg Cd L-1, o aparecimento de micronúcleos e de núcleos
completamente fragmentados. Concluiu-se que o Cd disparou o processo de MCP nos tecidos foliares de G. americana
semelhante a apoptose evidenciada em animais, exibindo todas as fases de alterações do núcleo celular.
Apoio financeiro: FAPESB e CNPq.
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Análise da expressão quantitativa de quitinases
no tomateiro em resposta a colonização de
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
Amaral, DOJ1; Lima, VLM1; Correia, MTS1; Lima, MMA2; Donato, VMTS3; Silva, MV1
Centro de Ciências Biológicas/Departamento de Bioquímica/UFPE
2
Embrapa Algodão
3
Laboratório de Genoma/Instituto Agronômico de Pernambuco
[email protected]
1
Palavras-chave: Murcha-de-fusário, Lycopersicon esculentum, PCR em tempo real, Quitinase, Expressão Gênica
Na cultura do tomate, um dos maiores problemas enfrentados pelos produtores dessa olerícola é a murcha-de-fusarium
ou fusariose, doença causada pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, sendo a resistência genética a melhor
estratégia de manejo dessa doença. Identificação e quantificação de genes relacionados à patogenicidade são necessárias
para elucidar sua participação no processo de defesa da planta. O objetivo do trabalho foi investigar a participação de
uma quitinase (Chi3,) no mecanismo de resistência do tomateiro a fusariose mediante a técnica da PCR em tempo
real. Para as reações de PCR quantitativo foi desenhado oligonucleotídeo para amplificação do gene de quitinase na
cultivar resistente BRH. A normalização da expressão desse gene foi feita a partir da expressão do fator de elongação
α1 (EF-1α) de tomate, chamado gene controle. O RNA total foi extraído utilizando o reagente Trizol (Invitrogen)
das raízes das plantas com 0, 1 e 2 dias após a infecção com o fungo e obtido o cDNA utilizando o Kit SuperScript
III First-Strand Syntesis for RT-PCR (Invitrogen). As reações de amplificação foram conduzidas em volume final
da amostra de 15μL contendo: 50 ng de cDNA, 1X do Real Master Mix (Eppendorf ), e 200 mM de cada um dos
oligonucleotídeos. As condições de amplificação estabelecidas foram: 95 °C por 2 minutos, 40 ciclos de 95° C por
15 segundos e 60° C por 30 segundos 68°C por 30 segundos seguidos pela curva de melting. Todas as reações foram
realizadas em termociclador Mastercycler ep realplex (Eppendorf ), em triplicata com a presença de controle branco e do
gene controle. Os resultados foram analisados utilizando-se a quantificação relativa, calculada a partir do valor de 2 -ΔΔCt.
A expressão do gene da quitinase em plantas de tomateiro foi aumenta após 24 horas da inoculação do patógeno quando
comparada com plantas não inoculadas.
Apoio Financeiro: BNB e FACEPE.
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Análise da expressão gênica via SSH
e análise proteômica em xilemas de
genótipos de eucalipto segregando para
componentes da qualidade da madeira
Britto, DS1; Santos, AC1; Gonzalez, ER2; Silva, JF2; Cascardo, JCM1
Universidade Estadual de Santa Cruz
2
Suzano Papel e Celulose
[email protected]
1
Palavras-chave: qualidade da madeira, Eucalyptus, SSH, proteômica, características contrastantes
A madeira é a mais abundante fonte biológica na terra, ela também é uma importante matéria prima amplamente
utilizada na indústria de papel e móveis e é altamente explorada como uma renovável fonte de energia. As espécies do
gênero Eucalyptus são as mais utilizadas para plantação industrial, principalmente para fazer papel e móvel. Uma possível
estratégia para suprir a demanda da madeira, conservando assim as florestas naturais, é melhorar a qualidade dessa madeira
para melhor atender as necessidades dos usuários. Diante disso, é consideravelmente interessante identificar marcas
genéticas que caracterizam maiores eventos de diferenciação do xilema porque nele está, provavelmente, o fator chave para
determinação de algumas propriedades da madeira, influenciando seu desempenho e valor industrial. Como um primeiro
passo em direção a identificação de genes especificamente envolvidos na síntese da madeira e a caracterização dos papéis
desses genes em determinar à qualidade da madeira foram construídas três bibliotecas subtrativas supressivas (Suppression
Subtractive Hybridization - SSH) e foram confeccionados géis bidimensionais utilizando quatro amostras de xilema
com características contrastantes para qualidade da madeira, extraídas de árvores de uma população de meio-irmãos de
eucalipto proveniente de um plantio comercial da empresa Suzano. A partir do sequenciamento e análise de bioinformática
da primeira biblioteca, foi possível identificar um total de 686 sequências, sendo 328 unigenes. Entre os unigenes mais
representativos, identificados pelo programa SaqMan - Lasergene v7.2 (http://www.dnastar.com/products/LG7.2Features.php),
apareceu um fator de transcrição, o qual correspondeu a 44 repetições na biblioteca, e uma proteína de função
desconhecida, o qual correspondeu a 28 repetições. Também foram identificados genes, 30,2% do total, que apareceram
uma vez na biblioteca e muitos destes não possuem função conhecida, ao ser analisado com o programa Amigo
(http://www.geneontology.org/). Já as análises de 11 spots diferencialmente expressos entre dois genótipos contrastantes
para características ideais na indústria de celulose e papel, que foram isolados de géis bidimensionais (2-D) para serem
seqüenciados por espectrometria de massas, permitiram identificar entre outras proteínas uma proteína com função
importante no desenvolvimento e crescimento da planta, e outra com importante função em otimizar a energia
utilizando uma via alternativa de produção de ATP. Atualmente, as análises da primeira biblioteca subtrativa estão
sendo concluídas, ao passo que, estamos finalizando o sequenciamento das outras duas bibliotecas, para posterior
análise de bioinformática, validação por macroarranjo e posterior análise de expressão por qPCR. Quanto às análises
proteômicas, novos géis 2-D estão sendo confeccionados, entre outras amostras contrastantes, a fim de se identificar
proteínas “chaves” envolvidas na qualidade da madeira.
Apoio financeiro: FAPESB e SUZANO.
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Identificação de mecanismos de resposta
adaptativa à seca em citros baseada em
análise in silico do transcriptoma
Oliveira, TM; Villela Dias, C; Micheli, F; Costa, MGC
Centro de Biotecnologia e Genética, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: citros, EST, estresse hídrico
Entre os vários estresses abióticos, a seca é o principal fator que limita a produtividade das culturas no mundo. A
adaptação de plantas à seca é um fenômeno fisiológico complexo que, dependendo da intensidade ou duração do
estímulo causado pelo estresse, pode variar desde rápidas modificações no fluxo de íons, fechamento estomático e
produção de vários osmoprotetores, até alterações dramáticas no padrão de crescimento causadas pela seca prolongada.
Em citros, o crescimento e a produtividade são severamente afetados por estresse hídrico. Embora os mecanismos
moleculares envolvidos na resposta à seca em Citrus sejam pouco conhecidos, diferenças substanciais de tolerância
a esse estresse são observadas entre as diferentes espécies do gênero e espécies afins. Dados do genoma funcional
de citros, obtidos por meio de seqüenciamento de 220.000 ESTs (expressed sequence tags) de Citrus e Poncirus
(http://harvest.ucr.edu/), revelaram a existência de diversos genes induzidos pela seca homólogos a Arabidopsis.
Foram encontrados 42 transcritos em bibliotecas subtrativas de plantas submetidas à seca cuja seqüência deduzida de
aminoácidos mostra similaridade com várias proteínas de resposta e tolerância à seca de Arabidopsis. Sete desses genes
pertencem à classe de genes funcionais (ex.: dehidrinas, HSPs, proteínas LEA, P5CS); quatro são fatores de transcrição
(ex: WRKYs, MYBs), 24 estão envolvidos em sinalização (ex.: ADK, NSPK1) e sete possuem função desconhecida.
Assim, pode-se especular que a resposta adaptativa de citros à seca envolve a indução de proteínas funcionais de tolerância
ao estresse, envolvidas na proteção de membranas, restabelecimento da homeostase, regulação osmótica e proteção da
integridade celular, bem como de proteínas regulatórias envolvidas na regulação da transdução de sinal e expressão de
genes responsíveis ao estresse. A determinação do padrão de expressão desses genes é o pré-requisito necessário para
a confirmação e dissecação desse modelo de resposta adaptativa à seca em citros. A manipulação genética dos genes
induzidos pelo estresse hídrico pode ter um significante impacto no melhoramento da tolerância à seca em citros.
Orgão fianaciador: EMBRAPA.
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Do genoma ao proteoma: uma adaptação do
protocolo de extração de ácidos nucleicos
do cacau, para se estabelecer um novo
protocolo de extração de proteinas nativas
de meristemas e folhas de cacaueiros
Carvalho, HAS1; Gesteira AS1; Pirovani, CP1; Cascardo, JCM1; Micheli, FFL1,2
Laboratório de Genômica e Expressão Gênica, DCB, UESC, Rodovia Ilhéus-Itabuna, Km 16, Ilhéus-BA-Brasil
2
Cirad-BIOS, UMR DAP, Montpellier, France
[email protected]
1
Palavras-chave: Theobroma cacao, RNA, proteínas, butanol terciário
O cacaueiro é uma planta originária da floresta tropical úmida americana. Embora sejam conhecidas 22 espécies
pertencentes ao gênero Theobroma, o fruto do cacau (Theobroma cacao) é o único economicamente explorado para
produzir sementes, que após secas e beneficiadas, irão compor a base de chocolates e derivados. O cacaueiro é susceptível
a uma série de agentes patogênicos, e entre eles o fitopatógeno hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa, o agente
causal da doença vassoura-de-bruxa, que se espalhou por essa cultura e vem causando sérios danos econômicos e sociais
a diversas regiões do Brasil e em especial o Sul da Bahia. Devido a grande importância econômica do cacau, vários
estudos genômicos e proteômicos têm sido realizados no Laboratório de Genética e Biologia Molecular da UESC, na
tentativa de se compreender a interação entre o T. cacao e M. perniciosa. Por ser o cacaueiro uma planta que possui um
elevado nível de polissacarídeos em seus órgãos vegetativos, tais como em folhas e meristemas que são especificamente
infectados pelo fungo M. perniciosa, protocolos apropriados para extração de ácidos nucléicos já foram desenvolvidos
e bem ajustados a essa condição do material vegetal. Contudo, para a extração de proteínas nativas do cacau, nenhum
protocolo específico tinha sido ainda desenvolvido, o que dificultava bastante os trabalhos, pois não se obtinha proteínas
de boa qualidade e com um baixo teor de polissacarídeos. Essas proteínas obtidas, não se separavam bem durante as
corridas eletroforéticas, o que também interferia nas análises posteriores. Para superar esses problemas, e na tentativa
de minimizar a presença desses compostos, um novo protocolo de extração de proteínas de cacau (condição não
desnaturante) foi desenvolvido com base em algumas modificações no protocolo de extração de proteínas nativas de
Micheli et al. (2000) e adaptação do protocolo de extração de RNA de cacau inicialmente desenvolvido no laboratório
da UESC (Gesteira et al., 2003). Este protocolo permitiu extrair proteínas nativas utilizando o butanol terciário e o
acetato de sódio, importantes para precipitar os polissacarídeos tanto nos experimentos de extração de ácidos nucléicos
quanto nestes de extração de proteinas. Essa adaptação do protocolo de extração de RNA de cacau para o de extração de
proteínas, foi um dos fatores determinantes para conseguir amostras de boa qualidade e que permitiu posteriormente
a obtenção de bons resultados em diferentes experimentos de atividades enzimáticas (peroxidase, quitinase e protease).
Com esses resultados, novas perspectivas têm surgido com um intuito de avançar em estudos proteômicos e a partir
daí ter conhecimento das diferentes funções das proteínas envolvidas nesse patossistema.
Apoio financeiro: IFS, CAPES, FAPESB, MAE.
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Geração de ests e identificação de
marcadores SSR na interação cacauCeratocystis cacaofunesta
Santos, RMF1; Gramacho, KP2; Lopes, UV3; Argout, X4; Fouet, O4; Legavre, T4; Silva, SDM2; Lanaud, C4; Micheli, FFL1,4
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular
2
Universidade Estadual de Santa Cruz
3
CEPEC/CEPLAC
4
Almirante cacau; CIRAD
1
Palavras-chave: ESTs, SSR, Ceratocystis cacaofunesta, resistência, Theobroma cacao
A murcha-de-ceratocystis (MC), causada pelo fungo Ceratocystis cacaofunesta (Engelbrecht & Harrington, 2005) é
uma doença altamente danosa à cacauicultura, por causar a morte da planta. O controle mais eficiente e econômico
para a MC é o uso de material genético resistente. Com este objetivo, de busca de material resistente à doença, a
análise de Expressed Sequence Tags (ESTs) é uma abordagem potente no objetivo de selecionar genes que estão sendo
expressos em determinado organismo ou em determinada condição fisiológica. A obtenção de ESTs aliada com a busca
de polimorfismos pode ser uma ótima alternativa para contribuir com a seleção de cacaueiros resistentes à MC. Os
objetivos do presente trabalho foramn (i) gerar três bibliotecas de cDNA (duas subtrativas e uma full-length) da interação
cacau-Ceratocystis cacaofunesta, (ii) obter os ESTs correspondantes, e (iii) buscar marcadores SSR nas sequencias geradas.
Um total de 3748 ESTs foram gerados, e após processamento bioinformático, 3432 foram avaliadas. Os ESTs foram
agrupados em 216 contigs e 2632 singletons e foram distribuidos em 16 classes funcionais. A identificação de SSR
foi feita utilizando um programa desenvolvido em linguagem PEARL, posteriormente estes dados foram trabalhados
usando o SAS ®. Em seguida, foram desenhados primers que anelam nas regiões que flanqueiam os SSR, utilizando
o programa Primer 3.0. Um total de 35 primers foram desenhados e estão sendo utilizados para genotipar clones de
cacau com vários níveis de resistência à MC. ESTs são fontes de polimorfismos não-neutros e tem sido usado como
uma importante abordagem experimental para elucidar não somente a função gênica, mas também para compreender
como os mecanismos moleculares estão relacionados com processos biológicos. O uso de marcadores SSR derivados
desses ESTs gerados podem permitir a localização de marcas muito mais próximas dos genes de resistência por se tratar
de seqüências expressas.
Apoio: CNPq, FAPESB e Genoscope (França).
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Micropropagação de Jatropha curcas L.
Luiz, KCM1; Victória, JMN2; Kalapothakis, E1
Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Geral–Genética, Universidade Federal de Minas Gerais
2
Phoneutria Biotecnologia e Serviços Ltda
[email protected]
1
Palavras-chave: Jatropha curcas, micropropagação, biodiesel, pinhão-manso, regeneração in vitro
A mistura do biodiesel é prevista pela Lei 11.097/2005, que a partir de 2008, torna obrigatória a adição de 2% do
produto ao óleo diesel e aumenta para 5% em 2013, criando uma grande demanda anual pelo produto. Surge o interesse
pelo óleo do pinhão-manso (Jatropha curcas L.) para produção de biodiesel, sendo fonte de renda e emprego para o
semi-árido. Esta planta nativa do Brasil possui a vantagem de ser perene, exigir insolação constante, ser resistente à
seca, possuir alto teor de óleo em sua semente e poder ser cultivada em pequenas propriedades rurais e com mão-deobra familiar. Além disto, tem propriedades medicinais, é usada na indústria de fiação de lã, de tinta para escrever,
tinta de impressão e pintura, em saboarias, como cerca viva para pastos e na conservação do solo. O presente trabalho
visa desenvolver um processo comercialmente viável para a regeneração in vitro em massa de J. curcas. Embriões foram
excisados e inoculados em frascos com aproximadamente 30 ml de meio contendo 50% de sais do meio MS (Murashige
& Skoog), vitamina B5, sacarose, ágar e carvão ativado. As culturas foram mantidas em sala de crescimento, sob condições
controladas de temperatura e luminosidade, em fotoperíodo de 16 horas. Meristemas apicais e laterais foram isolados
e cultivados para indução da parte aérea em meio: MS, MS acrescido de vitamina B5 e MS acrescido de vitamina B5
e ácido indol-acético (AIA), todos suplementados com diferentes concentrações de benzilaminopurina (BAP). Os
resultados mostraram que o meio MS acrescido de vitamina B5 e BAP em diferentes concentrações apresentaram maior
número de brotos e o meio MS suplementado com vitamina B5, AIA e ausência de BAP, maior número de raízes. O
projeto se encontra na etapa de alongamento e proliferação dos brotos, os quais foram isolados e transferidos para o
meio MS acrescido de vitamina B5 e BAP em diferentes concentrações e que posteriormente serão subcultivados para
o meio de enraizamento.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG EDT 91/06, Phoneutria Biotecnologia e Serviços Ltda., Pós-Graduação em
Genética, UFMG.
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Construction and ESTs sequencing
of a full length cDNA library from
(Jatropha curcas L.) seeds: a strategic
crop for large-scale biodiesel production
Gomes, KA; Brito, DS; Villela Dias, C; Gesteira, AS; Carels, N; Cascardo, JCM
Biotechnology and Genetic Center, Laboratory of Genomics and Gene Expression, Department of Biological Sciences, UESC
[email protected]
Keywords: Jatropha Curcas L., Biodiesel, cDNA library, seeds, ESTs
Jatropha curcas L. is a native of Mexico and Central American region, it is found in the tropics and subtropics and
belongs to the Euphorbiaceae family (HELLER, 1996). It is well adapted to arid and semi-arid conditions, like soils
with low nutrient content and unfavorable climate in contrast to the most traditional food crops, as example, in Brazil
Northeast semi-arid. This species is very drought-resistant and show low susceptibility to pest and diseases. It is a shrub
that can reach more than three height meters in especial conditions. Recently, the high yield of seed from the tree
(~5 tons/ha/year) and the high oil content of its seeds (~66.4%) attracted global attention for the development of J.
curcas as a source for bio-fuel (LI et al., 2008). In view of these, the present study aimed to identify ESTs related with
fatty acids biosynthesis pathway in this crop. The total RNA from fruits of different development stages (5-10mm;1020mm;20-30mm) was extracted and quantified (300ng/µl). This RNA was used for cDNA library construction (SMART
PCR DNA Synthesis Kit). The fragments were purified with cDNA Size Fractionation column for fragments above
500pb and inserted in the vector pTZ57R/T used to transformation of the E. coli (MegaX DH10BTMT1R). Colony
PCR confirmed the cloning and showed the fragments insertion into vector with size above 500pb. At this moment
we analyzed 252 contigs for a total of 271 ESTs, showing a very low redundancy and high level of gene discovery.
The sequences have an average length of 490 bp with PHRED quality value >10. Computational tools like BLASTX
comparisons were used to infer function of ESTs against known databases. As example we found several genes involved on
starch and sucrose metabolism. Other ESTs encode for genes involved on lipid biosynthesis and endoplasmic reticulum
(ER) secretory pathway and defense. An average of 50% of reads show homology with unknown sequences deposited
on Genbank. We are currently searching for SSR markers within the ESTs UTR regions aiming the development of
molecular markers for breeding strategies.
Support: CNPq/FAPESB.
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Diferentes perfis de metilação de DNA
encontrados em uma espécie de mangue
afetam sua variação fenotípica
Lira-Medeiros, CF, Parisod, C, Mata, CS, Cardoso, MA, Ferreira, PCG
Instituto de Bioquímica Médica (UFRJ)/Jardim Botânico do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: alteração epigenética, Laguncularia racemosa, seleção natural, adaptação, MSAP
Seleção natural é uma força evolutiva que pode atuar sobre qualquer variação fenotípica numa população. Uma parte
desta variação é causada por variação de seqüência de DNA, mas outra parte é resultado de fenômenos epigenéticos.
A epigenia pode alterar fenótipos tanto de traços morfológicos como processos moleculares sem modificar a seqüência
de nucleotídeos do genoma. O padrão de metilação no DNA de uma planta pode ser alterado por situações de estresse
biótico e abiótico. Manguezais são formações vegetais bastante distintas que ocorrem nas costas tropicais e subtropicais,
onde estão submetidos às variações diárias de salinidade na água e oscilações do nível do mar. Espécies que vivem
exclusivamente neste ecossistema são dotadas de adaptações morfológicas e fisiológicas para sobreviverem às variações do
ambiente. Nos manguezais existem zonas definidas desde sua proximidade do rio (ribeirinhas) até dentro do continente
(apicum), geralmente com solos mais salinizados. No manguezal de Guaratiba (RJ) ocorre a Laguncularia racemosa,
uma espécie exclusiva de mangue, nestes dois ambientes: ribeirinha e no apicum, consideradas aqui como populações
diferentes. Plantas ribeirinhas são árvores altas com caules longos e retos, enquanto que próximas ao apicum, as plantas
são arbustivas de baixa estatura e bastante ramificadas no tronco. Estas diferenças fenotípicas podem ser resultado de
variação genética ou epigenética. Estudo prévio com estas populações de L. racemosa mostrou que não existe diferenciação
genética entre seus indivíduos (Fst = 0.0089). Portanto, as suas diferenças morfológicas devem ser resultado de alterações
epigenéticas. O objetivo deste trabalho foi estudar o perfil epigenético de indivíduos de L. racemosa provenientes de
ambas as regiões do manguezal de Guaratiba através da técnica do MSAP, que permite a identificação de loci metilados e
não-metilados, analisados aqui como perfil epigenético ou genético do indivíduo. Foram obtidos 97 loci do total de 34
amostras, metade proveniente de cada população. A população ribeirinha teve metilação em 42% dos loci e a população
do apicum teve apenas 26% metilados. ĺndices de diversidade genética em cada população mostram que a população
ribeirinha tem maior diversidade genética e principalmente epigenética do que apicum. A comparação entre os perfis
genético e epigenético mostrou maior diferenciação entre as populações no nível epigenético (θST = 0,160 e βST = 0,212)
do que genético (θST = 0,119 e βST = 0,148) nas duas abordagens: bayesiana e multivariável, respectivamente. Por fim,
PCAs corroboraram com os resultados de diferenciação epigenética maior do que genética. A população do apicum
ficou mais agrupada no nível epigenético e ainda aparentou ter uma preferência de perfil epigenético, o que poderia
ser interpretado como uma busca de um perfil mais favorável ao ambiente do apicum. Os resultados deste trabalho
nos permitem supôr que a epigenia esteja sob a ação da seleção natural.
Apoio financeiro: CNPq e CAPES.
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Identificação e caracterização funcional
parcial de uma ferredoxina que interage
com a proteína Sw-5 que confere
resistência a tospovírus
Almeida, LA; Lau, D; Yamazaki-Lau, E; Brommonschenkel, SH
Laboratório de Genômica, BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: duplo híbrido de leveduras, Nicotiana benthamiana, gene de resistência
O gene Sw-5 de tomateiro codifica uma proteína que confere resistência de amplo espectro a tospovírus. Essa proteína
contém um domínio amino-terminal coil-coiled, um domíno central de ligação a nucleotídeos fosfatados e uma região
carboxi-terminal com repetições ricas em leucina. Esses domínios sugerem que a proteína Sw-5 reconhece direta ou
indiretamente elicitores produzidos pelo vírus e participa de uma cadeia de transdução de sinais que leva à ativação de
respostas de defesa da planta, incluindo a morte das células (reação de hipersensibilidade) inicialmente infectadas pelos
tospovírus. Este trabalho teve como objetivo a identificar e caracterizar genes que codificam proteínas capazes de interagir
fisicamente com a proteína codificada pelo gene de resistência Sw-5 por meio da utilização do sistema duplo-híbrido
de leveduras. A triagem 5x107 clones de cDNAs de Nicotiana benthamiana (resistente a tospovírus devido à presença do
transgene Sw-5) por meio da obtenção de diplóides, não revelou nenhum cDNA que codifica proteína capaz de interagir
com a proteína Sw-5. A análise de 1,8 x 105 clones pelo processo de co-transformação resultou na identificação de um
cDNA que codifica uma proteína similar a ferredoxina I de cloroplasto (Nb-Fd1), capaz de interagir com Sw-5. Essa
proteína contém um domínio e uma assinatura característicos de proteínas 2Fe-2S. Resultados preliminares mostraram
que sob condições de silenciamento gênico mediado por vírus do gene que codifica a putativa Nb-Fd1 resulta em
uma maior visibilidade das lesões necróticas locais e presença de lesões no ápice das plantas resistentes desafiadas com
tospovírus evidenciando a não contenção do vírus ao sítio de infecção. Esse fenótipo sugere que a participação de Nb-Fd1
na resistência a tospovírus envolve o processo de alteração do potencial redox da célula, acúmulo de espécies reativas de
oxigênio e ativação de morte celular programada que caracterizam a resposta de hipersensibilidade mediada por Sw-5.
Apoio financeiro: CAPES e CNPq.
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Eventos evolucionários dos genes P5CS
em plantas
Turchetto-Zolet, AC1,2; Margis-Pinheiro, M1, Margis, R1,2
Departamento de. Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brasil
2
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: genes P5CS, biosíntese de prolina, árvores Neotropicais, filogenia molecular
A prolina é um osmólito cujo acúmulo por diferentes organismos vivos está diretamente relacionado à tolerância
a estresses hídricos. A prolina é sintetizada pela enzima δ-1-pirrolino-5-carboxilato sintase (P5CS) que inclui dois
domínios funcionais em plantas e animais: γ-glutamil kinase e glutâmico-γ-semialdeído desidrogenase. Em plantas é
comum a presença de duas cópias gênicas, denominadas de p5cs1 e p5cs2. Esta enzima catalisa a primeira das duas
etapas da rota da biosintese da prolina, sendo regulada por mecanismos de retroinibição pelos produtos formados.
Para investigar os eventos evolucionários relacionados aos genes p5cs, foram clonadas seqüências parciais do gene p5cs
de quatro espécies arbóreas Neotropicais. Os clones foram sequenciados e comparados as sequencias de outros taxa de
plantas. A topologia da árvore filogenética coloca todas as sequencias de genes p5cs de monocotiledôneas em um ramo
separado das dicotiledôneas, indicando que o evento de duplicação gênica ocorreu após a divergência desses dois grupos.
Também se observa que o processo de duplicação dos genes p5cs ocorreu de maneira distinta entre as diferentes ordens
das dicotiledôneas. As sequências correspondentes aos membros das Brassicales formaram um único grupo, com dois
ramos internos distintos, um contendo seqüências de p5cs1 e o outro de p5cs2. Os genes p5cs1 de Fabales agrupam
com os seus ortólogos de Asterales. O mesmo perfil ocorre no agrupamento dos genes p5cs2. Apesar do elevado número
de resíduos conservados nas seqüências de p5cs de plantas, um processo de seleção positiva foi observado em diferentes
regiões das seqüências dos genes parálogos. Outras regiões com seleção positiva foram detectadas quando sequências
de p5cs de monocotiledôneas foram contrastadas com as de dicotiledôneas.
Apoio Financeiro CNPq, EU-FP6.
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Identificação de serino proteinases
e inibidores de serino proteinases de
cana-de-açúcar diferencialmente expressos
em resposta à herbivoria
Medeiros, AH1; Moura, DS2; Silva-Filho, MC1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, C.P. 83, 13400-970 Piracicaba, SP, Brazil
2
Departamento de Ciências Biológicas, Escola Paulista de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo, Campus Diadema,
09972-270 Diadema, SP, Brazil
[email protected]
1
Palavras-chave: expressão gênica, defesa induzida, cana-de-açúcar, serino-proteinases, inibidores de serino- proteinase
As proteinases de plantas têm sido caracterizadas por seu importante papel na regulação de processos fisiológicos,
cascatas de sinalização e morte celular programada. A identificação de proteinases e inibidores de proteinases induzidos
e reprimidos por herbivoria é o primeiro passo para caracterizar o possível papel dessas proteínas na interação plantainseto. Através de macroarranjos de DNA especialmente desenhados para conter serino proteinases e seus inibidores,
provenientes do SUCEST (Sugarcane EST Project), foram identificados 8 proteinases e 11 inibidores de proteinases
e induzidos após 9 horas de ataque da broca da cana-de-açúcar, Diatraea saccharalis. Dentre as proteinases, as serino
carboxipeptidases (família S10) estão em maior número, seguidas das famílias S8, S28, S14 e S9. O grupo dos inibidores
de proteinases consistiu, em sua maioria, de inibidores do tipo Bowman-Birk e Maize Proteinase Inhibitor. Do conjunto
de genes reprimidos pela alimentação da broca-da-cana, 13 são proteinases (representados pelas famílias S1, S8 e S10
em maior número, seguidos de S41, S14 e S54), enquanto que houve somente um inibidor de proteinase do tipo
Bowman-Birk inibido. Os inibidores de proteinases são uma das mais importantes classes de proteínas de defesa de
plantas. A acumulação de inibidores de proteinase é induzida por vários estresses bióticos e abióticos, e seu papel como
proteínas antinutritivas para insetos herbívoros está estabelecida. A cana-de-açúcar tem um conjunto conservado de
inibidores de proteinases que podem estar envolvidos na resposta de defesa, como foi indicado por esse trabalho. Estudos
que mostram o envolvimento de serino proteinases na defesa de plantas contra insetos são escassos. A identificação de
serino proteinases e seus inibidores diferencialmente expressos após a alimentação da broca-da-cana poderá servir de
base para estudar sua provável função no processo de defesa da planta.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq.
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Estratégias para construção automática
de uma base de dados sobre proteínas
de defesa em plantas com interface para
acesso programático
Barbosa-Silva, A1; Fiorini-Magalhães, IL1; Ortega, JM1
Laboratório de Biodados, Departamento de Bioquímica e Imunologia, UFMG
[email protected]
1
Palavras-chave: PDM, web services, text-mining, SOAP
Mecanismos de defesa em plantas estão entre as características agronômicas de maior importância. Proteínas de defesa
estão envolvidas nos mais diversos processos que fazem com que as plantas driblem as condições adversas encontradas
no meio-ambiente. Recentemente, uma base de dados sobre proteínas de defesa em plantas fora desenvolvida: a
Plant Defense Mechanisms Database – PDM, disponível em: http://www.biodados.icb.ufmg.br/pdm. Descrevemos
aqui as estratégias adotadas para o desenvolvimento automático da PDM. Utilizamos técnicas de mineração de texto
implementadas no programa LAITOR para recuperar co-ocorrências de termos protéicos e de estímulos biológicos, tais
como fito-hormônios, na mesma sentença de resumos da base de dados PubMed juntamente com termos indicativos
de interação biológica interposto aos pares. Em seguida, nomes de proteínas foram associados a identificadores da
base de dados NCBI Gene e posteriormente a base UniProtKB. As seqüências correspondentes nesta última foram
obtidas e utilizadas em seguida como sementes de um processo de agrupamento. Usamos o programa Seed Linkage
para estender a busca de seqüências similares em outros organismos, criando agrupamento de seqüências co-ortólogas.
Em seguida para cada agrupamento, foi gerada uma árvore filogenética com programas do pacote Phylip para posterior
visualização. Para cada seqüência pertencente aos agrupamentos, foi executada uma rodada de aquisição de dados através
da biblioteca SRS.php conectada ao servidor Sequence Retrieval System (SRS) do EBI, onde o formato XML de cada
registro fora obtido. Criamos um servidor em HTML para consulta dos dados armazenados na PDM. Paralelamente,
desenvolvemos utilizando a classe NuSOAP.php uma interface para acesso programático a PDM baseado em Web
Services. A base de dados PDM é composta por 611 agrupamentos contendo um total de 15.699 entradas únicas do
UniProtKB originárias de um conjunto inicial de 1.390 sementes correspondentes a 780 termos obtidos da análise de
7.306 resumos da PubMed. Na interface HTML é possível (i) procurar pro seqüências a partir de palavras-chaves para
nomes de proteínas, nomes de organismos ou identificadores UniProtKB; assim como buscas utilizando alinhamentos
BLAST contra as seqüências da PDM. (ii) Visualizar os detalhes das seqüências; as co-ocorrências do termo selecionados
com outros termos da base de dados; os membros do agrupamento ao qual a seqüência selecionada pertence e a arvore
filogenética representativa do cluster. (iii) Verificar o detalhe das co-ocorrências identificadas. (iv) Visualizar o resumo
onde as co-ocorrências foram identificadas. Os dados da PDM também são distribuídos através de SOAP pelos métodos
descritos em seu arquivo WSDL, além disso desenvolvemos um cliente web para acessar os dados distribuídos via SOAP,
dessa maneira a PDM age como um verdadeiro serviço web por si só, implementando o conceito de Web Services para
Biologia Molecular Vegetal.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES e FAPEMIG.
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Análise da expressão gênica de diferentes
classes de quitinases em folhas de feijãode-corda em resposta ao ácido salicílico
Castro, PG1; Carvalho, CPS1, Correia, TO2; Oliveira, JTA1, Grangeiro, TB2; Costa, JH1
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará
2
Departamento de Biologia, Universidade Federal do Ceará
[email protected]
1
Palavras-chave: Vigna unguiculata, RT-PCR, defesa de plantas
As quitinases são enzimas que catalisam a hidrólise das ligações β-1,4 na quitina. O papel proposto para as quitinases
de plantas está relacionado com a defesa contra fitopatógenos e insetos. A expressão de genes de quitinase pode
ser induzida, em adição ao ataque por patógenos, por vários outros fatores, incluindo elicitores, injúria, ácido
salicílico, sais inorgânicos, etileno, auxina, citocinina, ozônio e luz UV. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a
expressão de genes que codificam quitinases pertencentes às classes I, II, IIIa, IIIb e IV em folhas de feijão-de-corda
(Vigna unguiculata L. Walp cv. Vita 5) tratadas com ácido salicílico. As sementes foram desinfestadas superficialmente
em solução de hipoclorito de sódio 0,2%, lavadas, embebidas em água por 20 minutos e colocadas para germinar no
escuro. Após três dias as plântulas foram transferidas para sistema de hidroponia (Hoagland ½), em casa de vegetação.
No sexto dia de semeadura, salicilato de sódio (0,5 mM) foi aplicado na solução nutritiva e pulverizado nas folhas. As
plantas pertencentes ao tratamento controle foram submetidas às mesmas condições de cultivo, excetuando a aplicação
do salicilato. Folhas foram coletadas nos tempos 0, 6, 12 e 24 horas após o tratamento. O experimento foi conduzido
em delineamento inteiramente casualizado, havendo três repetições por cada tempo de coleta e para cada tratamento.
RNA total, extraído das folhas de plantas não tratadas (controle) e tratadas com salicilato, foi usado em RT-PCR
semiquantitativo na presença de iniciadores específicos para os genes das diferentes classes de quitinases. Os resultados
revelaram a expressão dos genes das quitinases de classes I, IIIa, IIIb e IV sob condição controle apresentando indução
diferenciada desses genes nas plantas tratadas com salicilato de sódio. As maiores induções foram observadas com o
gene da quitinase de classe I, a partir de 6 horas e da quitinase de classe IIIa, após 24 horas de tratamento. O gene da
quitinase de classe II, não foi detectado em folhas em nenhuma das condições estudadas. Em conclusão, o ácido salicílico
induz expressão diferenciada de genes de quitinases de classes I, IIIa, IIIb e IV em folhas de feijão-de-corda sugerindo
que as referidas enzimas exercem um papel no mecanismo de defesa do feijão-de-corda face a estresse biótico.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES.
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Análise funcional dos genes ASR - Aba Stress
and Ripening de arroz (Oryza sativa L.) e suas
interações em estresse por alumínio
Arenhart, RA1,4; Pedron, M1; Bevitori, R2; Margis, R3,4; Margis-Pinheiro, M1,4
Laboratório de Genética Vegetal – Departamento de Genética UFRGS
2
EMBRAPA - Arroz e Feijão
³Centro de Biotecnologia – UFRGS
4
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, UFRGS
[email protected]
1
Palavras-chave: Alumínio, família ASR, qRT-PCR, arroz
Um dos graves obstáculos para a manutenção e estabilidade da produção nacional de arroz (Oryza sativa) reside na
susceptibilidade dos genótipos existentes a estresses abióticos. Tendo em vista a importância social e econômica do
arroz e os efeitos extremamente danosos dos estresses abióticos sobre a agricultura, o conhecimento detalhado das
interações entre os estresses abióticos e as respostas dos vegetais frente a esses estímulos ambientais faz-se necessário. O
alumínio é considerado um dos maiores fatores limitantes na produção agrícola, inibindo o crescimento das raízes, e
a absorção de minerais. A toxicidade do alumínio em plantas ocorre pela sua solubilização em solos com pH baixo ou
solos ácidos. O gene ASR (ABA, Stress and Ripening) é induzido por estresse e ácido abscísico (ABA) em plantas, e
seu nível de expressão é rapidamente aumentado em resposta à salinidade e seca. Recentemente foi demonstrado que o
gene que codifica a proteína ASR5 é responsivo ao alumínio em raízes de arroz. O arroz é considerado um dos cereais
mais resistentes a alumínio; no entanto, os mecanismos básicos de tolerância a este metal são pouco conhecidos nesta
cultura, em comparação a outros cereais. Além disso, não há estudos da regulação da expressão da família gênica ASR,
em nível de mRNA em resposta ao alumínio e a outros tipos de estresses abióticos. Este trabalho tem por objetivo, a
caracterização funcional dos membros da família gênica ASR de arroz em reposta ao alumínio, e a construção de um
vetor binário de transformação de plantas visando o estudo da localização subcelular da proteína codificada pelo gene
OsASR5. As análises dos transcritos por qRT-PCR mostraram que todos os genes da família ASR de arroz spp Japonica
respondem ao tratamento com alumínio, e seus níveis de expressão tornam-se aumentados quando a planta é exposta
a diferentes concentrações de Al. Esses resultados sugerem que a família ASR possa estar relacionada à proteção da
planta ao Al.
Orgão financiador: CNPq.
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Análise transcricional in silico em feijãocaupi (Vigna unguiculata) associada à
tolerância à salinidade
Ribeiro, ILAC1; Holanda, RA1; Souza, TS1; Barbosa, PKA1; Martins, TR1; Santana, MO1; Pestana-Calsa, MC1; Pandolfi, V1;
Hollou-Kido, LM1; Monte, SJH2; Kido, EA1; Benko-Iseppon, AM1; Calsa JR, T1
1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
Laboratório de Imunogenética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Piauí
[email protected]
2
Palavras-chave: Vigna, transcriptoma, tolerância, salinidade, EST
O feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] possui grande valor para a população nordestina brasileira por ser importante
fonte de renda e, sobretudo, por ser o principal ingrediente protéico na dieta da parcela mais carente da população.
Mesmo dotado de algumas características como rusticidade e precocidade, que facilitam o seu cultivo, o feijão-caupi ainda
sofre com a baixa produtividade devida, principalmente, ao manejo e irrigação incorretos do solo que podem promover
a salinização das zonas áridas e semi-áridas da região. O presente trabalho buscou desenvolver a análise transcricional in
silico em Vigna unguiculata, com o intuito de identificar genes que permitam tornar o feijão-caupi uma cultura altamente
produtiva e rentável no futuro, constituindo-se em uma fonte de renda e desenvolvimento no Nordeste brasileiro.
Para isso, foram utilizadas ferramentas de bioinformática para análise de ESTs disponíveis das bibliotecas de cDNA de
genótipos sensível e tolerante à salinidade, no contexto do projeto ReNorBio-Vigna (www.nordest.ufpe.br), visando
aspectos de maior importância para o melhoramento da cultura e para o mapeamento funcional dos genes expressos.
Numa porção mais restrita, foram selecionados os 20 contigs de cada biblioteca compostos pelo maior número de ESTs,
presumivelmente anotados via BlastX e utilizados para análise comparativa dos genes mais expressos. Observou-se,
dentre eles, a identificação de transcritos exclusivos de um ou de ambos os genótipos. Foi detectada expressão comum
nos genótipos para genes presumivelmente anotados como codificantes de elementos da fixação biológica de nitrogênio,
tradução e resposta a injúria. Destacou-se a maior expressão diferencial de genes codificantes para proteínas relacionadas
à patogênese no genótipo tolerante à salinidade, sugerindo a ativação de mecanismos de resposta incluindo elementos
de transdução comuns a estresses bióticos e abióticos. Os genes identificados neste trabalho poderão ser úteis como
marcadores auxiliares no melhoramento genético de feijão-caupi visando maior tolerância à salinidade.
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Seqüenciamento e caracterização molecular de
genes diferencialmente expressos em cana-deaçúcar sob condições de estresse hídrico
Barbosa, ACDR1; Nicolau Junior, N1; Pereira, MS2; Zingaretti, SM3
1
Brazilian Clone Collection Center (BCCC) - Departamento de Tecnologia - FCAV/UNESP, Jaboticabal/SP
Laboratorio de Bioquímica e Biologia Molecular – Departamento de Tecnologia - FCAV/UNESP, Jaboticabal/SP
3
Unidade de Biotecnologia – UNAERP, Ribeirão Preto/SP
[email protected]
2
Palavras-chave: cana-de-açúcar, estresse hídrico, expressão diferencial, ESTs, melhoramento genético
Desde os tempos de Brasil colônia até os dias atuais, a cultura da cana-de-açúcar (Saccharum spp.) tem sido uma grande
fonte de riqueza para a economia brasileira. O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, com mais de
426 milhões de toneladas produzidas na safra 2006/2007. O estresse hídrico, um dos fatores que mais influencia a
produtividade da cana-de-açúcar cultivada (Saccharum spp), é causado pela escassez de água no solo que desencadeia
uma cascata de respostas metabólicas e mudanças morfológicas necessárias para a sobrevivência da planta sob estresse.
O presente trabalho teve como objetivo analisar a expressão diferencial de ESTs em duas variedades de cana-de-açúcar
sob estresse hídrico. O ensaio experimental foi realizado com membranas de náilon, hibridizadas com sondas de
cDNA sintetizadas a partir de tecido foliar de cultivares de cana-de-açúcar, na presença de radioisótopo P33. A análise
das membranas foi realizada com o auxílio do software Array Vision. Cada uma dessas seqüências de nucleotídeos foi
analisada pelo programa BlastX disponível no banco de dados NCBI objetivando-se encontrar neste banco genômico
quais seqüências eram similares às seqüências de ESTs estudados. Cinco ESTs consideradas como proteínas hipotéticas
antes do início da pesquisa, apresentaram expressão diferencial nas duas variedades de cana estudadas nas membranas
de macroarranjo. As cinco ESTs estudadas apresentaram-se induzidas durante toda dinâmica de estresse na variedade
de cana-de-açúcar SP83-2847. Essa variedade possui alta tolerância ao estresse hídrico, o que indica que estes genes
têm relação direta com este fator de estresse. Os ESTs diferencialmente expressos foram então resequenciados e uma
nova busca por similaridade foi feita. Após o uso novamente do programa BlastX, apenas duas ESTs permaneceram
como proteínas hipotéticas. As outras ESTs apresentaram similaridade com o gene SPIRAL1 de Arabdopsis, uma
provável transcriptase reversa de sorgo e uma proteína desconhecida expressa em arroz. Análises de expressão, baseados
no método de RT-PCR semiquantitativo, serão realizadas como próxima etapa nos cinco genes descritos em plantas
sensíveis e tolerantes ao déficit hídrico para melhor confirmação da membrana de Macroarray. Os resultados já adquiridos
sugerem que esses genes possuem uma função biológica relacionada com respostas ao estresse hídrico, e se confirmados
os mesmos poderão ser utilizados em futuros trabalhos de melhoramento genético da cultura.
Apoio Financeiro: CAPES.
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Isolamento e caracterização de genes
potencialmente envolvidos na resistência
a fusariose através de hibridização
subtrativa de supressão
Nascimento, SB; 2de Menezes, IC; 1Costa, CNM; 1Moreira, ECO; 2Duarte, MLR; 1de Souza, CRB*
1
Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém-PA
2
Embrapa Amazônia Oriental, Belém-PA
*[email protected]
1
Palavras-chave: Biblioteca subtrativa, Fusariose, Fusarium solani f. sp. piperis, Piper tuberculatum Jacq, Resistência
A pimenteira-do-reino (Piper nigrum L.) pertence à família Piperaceae e seu cultivo é uma das atividades agrícolas de maior
importância para o Estado do Pará, por tratar-se de um produto de exportação. O principal fator limitante à produção
desta cultura refere-se à fusariose, doença também conhecida como podridão das raízes, causada pelo fungo Fusarium
solani f. sp. piperis, a qual afeta principalmente as raízes e conseqüentemente causa a morte da planta. Trabalhos relatam
a identificação de piperáceas nativas da Amazônia apresentando resistência à infecção pelo patógeno, entre elas, a Piper
tuberculatum Jacq. Deste modo, o objetivo do presente trabalho foi identificar transcritos diferencialmente expressos
em plantas de P. tuberculatum expostas ao F. solani f. sp. piperis e potencialmente relacionados com o mecanismo de
resistência à fusariose. Amostras de RNA total foram extraídas a partir de raízes de plantas P. tuberculatum inoculadas e
não inoculadas com o patógeno e os transcritos diferenciais para a planta inoculada foram obtidos através de processo
de subtração utilizando-se o PCR-Select cDNA Subtraction kit, da Clontech. Os cDNAs diferenciais foram clonados e
seqüenciados. As seqüências nucleotídicas obtidas foram avaliadas através de análises comparativas em banco de dados
utilizando-se o programa BLASTx do NCBI. Os resultados mostraram que dentre os genes isolados estão os que
codificam proteínas que apresentam alta identidade com proteínas com função conhecida em mecanismos de resistência
à patógenos, entre elas: a proteína transportadora de lipídeos (LTP), inibidor de protease, proteína induzida em resposta
à toxina ACR, proteína de tumor controlada traducionalmente (TCTP) e peroxidase classe III. Estes resultados indicam
possíveis funções destes transcritos no mecanismo de interação F. solani f. sp. piperis - P. tuberculatum, os quais poderão
ser utilizados em programas de melhoramento genético da pimenteira-do-reino e de outras culturas de interesse.
Apoio Financeiro: CNPq e FUNTEC/SECTAM-PA, UFPA e EMBRAPA.
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Transcriptome analysis of wild arachis under
drought stress
Martins, ACQ1; Morgante, CV1; Santos, CMR1; da Silva, FR1; Leal-Bertioli, SCM1; Bertioli, DJ2; Guimarães, PM1; Brasileiro, ACM1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia – Brasília - DF
2
Universidade Católica de Brasília – Brasília - DF
[email protected]
1
Keywords: ESTs, drought stress, Arachis
Peanut (Arachis hypogaea L.) is one of the world’s most important grain legumes and it is grown primarily for its high
quality edible oil and protein. Due to its origin, peanut has a very narrow genetic background. Therefore, wild relatives
are an important source of genes for resistance to biotic and abiotic stresses that affect peanut and other crop species.
For example, Arachis magna, a wild type BB diploid species, presents a high adaptability to water stress conditions. In
this study, the transcriptome of Arachis magna accession KG30097, from the EMBRAPA’s germplasm Arachis bank,
was analyzed. For that, stressed A. magna plants were submitted to a gradual dry down assay where the Normalized
Transpiration Ratio (NTR) was controlled daily. Two subtractive libraries were constructed using cDNA from leaf
tissues of stressed and well-watered control plants. Subtractive hybridization was performed in both directions: i.e., using
cDNA from stressed plants first as driver and then as tester against the cDNA from control plants. This allowed the
enrichment of the genes either induced or inhibited during osmotic stress. In silico analysis revealed 759 reads, which
were grouped into 249 clusters (138 singlets and 111 contigs), with a novelty index of 32,8%. Several genes that were
up- or down-regulated exclusively in the stressed or control conditions were identified. Numerous sequences related to
biotic and abiotic stress were revealed, such as drought induced proteins, disease resistance proteins and catalases. This is,
to date, the second report on the analysis of transcriptome of a wild relative of peanut. The ESTs produced in this study
are a valuable resource for gene discovery, the characterization of new wild alleles, and for marker development.
Financial support: Embrapa, UCB and Generation Challenge Program.
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Pathogenesis-related protein of Theobroma
cacao is transported via high-affinity
copper transporter of the Saccharomyces
cerevisiae plasma membrane
Cardoso, THS1; Pungartnik, C1; Micheli, F1,2; Cascardo, JCM1; Brendel, M1; Gesteira, AS1
Centro de Biotecnologia e Genética, UESC, Ilhéus, Bahia, Brasil
2
CIRAD-BIOS, UMR DAP, Montpellier, France
[email protected]
1
Plants and trees are susceptible to attack of pathogenic fungi. Once infected, they show poorer growth, lower
production and spoilage of fruits, and eventually die. During evolution, plants have acquired defense mechanisms
against phytopathogenic fungi that in many cases lead to resistance or tolerance to the pathogen. Enzyme-based
defenses are often inducible, i.e., after sensing invasion by a fungal pathogen the host cells induce transcription of genes
that encode proteins with anti-fungal activity. The discovery of the protein TcPR10 of Theobroma cacao (Tc) that can
block germination of basidiospores and kill the mono- and dikaryotic life forms of the Tc phytopathogenic fungus
Moliniophthora perniciosa (Mp) opened another perspective of studying host-pathogen interaction. With its genome
totally sequenced and with thousands of isogenic mutants deleted in one gene the yeast Saccharomyces cerevisiae (Sc) is
an ideal fungus for the molecular study of TcPR10p/host-cell interaction. Cells grown to stationary phase of growth
(2 d, 30oC, YPD – 1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose, 2% agar) were exposed to 5µg to 12 µg/plate of TcPR10p
in YPD agar plates, for 2 days. Results were expressed in percent of survival in relation to the control plates (no protein).
We have treated a set of isogenic mutants deleted in regulation of or in transport of metals (Cu2+, Fe2+, Zn2+) with
TcPR10p. Mutants ctr1, ctr2, fre1, fre2, ztr1, ztr2, zap1 and aft1 had the same resistance as the respective wild type,
while ctr3 (high-affinity copper transporter of the plasma membrane) and mac1 (copper-sensing transcription factor
involved in regulation of genes required for high affinity copper transport) were hyper-resistant when compared to the
isogenic wild type. Our results point to an involvement of high affinity copper transport in activation of the fungicide
activity of TcPR1p, either by interacting at the cytoplasma membrane (uptake of TcPR10p) or by activation through
correct intracellular copper content.
Financial support: CNPq, IFS, CAPES.
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Clonagem, silenciamento e super-expressão
de uma Proteína Rica em Prolina (PRP)
em Glycine max (L.) Merr
Oliveira, RR*; Neto, LB; Zanettini, MHB; Passaglia, LMP
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
*[email protected]
Palavras-chave: Osmólito, Glycine max, PRP, silenciamento, super-expressão
Os estresses abióticos, tais como a seca, a salinidade e as temperaturas extremas são a causa primária de quebras de safra
na agricultura mundial, reduzindo a produção das principais plantações em mais de 50% (Boyer, 1982; de Vries, 2000).
Dentre os estresses citados, a seca é um dos principais responsáveis pelas perdas na produção, mesmo que as plantas
tenham desenvolvido complexas vias metabólicas para resistirem à falta de água. Uma estratégia interessante é a produção
de osmólitos, tais como polissacarídeos e proteínas, que asseguram uma menor perda de água para o ambiente durante
o período de seca (He, 2002). Com o objetivo de entender o funcionamento dessa estratégia de adaptação fisiológica
na soja, a região codificadora do gene correspondente à Proteína Rica em Prolina (PRP) foi isolada por PCR a partir do
DNA total de Glycine max, variedade IAS5, utilizando-se iniciadores específicos. O fragmento amplificado foi clonado
em pGEMT-Easy e seqüenciado. O alinhamento da seqüência obtida com as disponíveis no GenBank, através do
programa BLASTN, confirmou a clonagem da região correspondente à PRP. Através do sistema Gateway foram obtidas
construções para super-expressão dessa proteína, sob regulação do promotor 35S do vírus mosaico de couve-flor, e
também para o silenciamento desta, através de RNA de interferência. Conjuntos embriogênicos somáticos da cultivar
IAS-5 foram bombardeados com as construções plasmidiais e transferidos para meio seletivo contendo higromicina
(marca de seleção do plasmídeo). Atualmente eles se encontram na fase de regeneração. As plantas transgênicas obtidas
serão submetidas a estresse hídrico, bem como serão realizadas as devidas análises moleculares dos transformantes das
gerações T0, T1 e T2.
Apoio: CNPq.
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Expressão gênica em meristemas florais
de espécies de Eucalyptus
Pedrazza, L; Breton, MC; Nhoque, R; Frazzon, J; Pasquali, G
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
Palavras-chave: florescimento, Eucalyptus, expressão gênica
O gênero florestal Eucalyptus, originário da Austrália, é utilizado no Brasil como fonte de madeira para produção de
celulose, papel e outros derivados. A iniciação do processo de florescimento e a manutenção dos meristemas florais
dependem de uma complexa cascata gênica regulada por fatores endógenos e ambientais. A regulação correta da transição e
da manutenção do florescimento é crucial para o sucesso reprodutivo das plantas, com o desenvolvimento de mecanismos
moleculares conservados para integrar sinais ambientais e endógenos, determinando o tempo de florescimento. Avanços
nos estudos moleculares em plantas de diversas espécies permitem a comparação detalhada de genomas vegetais, bem
como avaliar sua expressão gênica, tornando-se uma poderosa ferramenta na identificação de genes envolvidos no
regulamento das vias metabólicas relacionada ao processo de florescimento. Neste trabalho, são apresentados resultados
obtidos do seqüenciamento de bibliotecas de expressão de partes florais (Pétalas/Sépalas, Anteras, Pistilos e Carpelos/
Receptáculo Floral) de Eucalyptus saligna e Eucalyptus grandis, tendo como objetivo principal a obtenção de seqüências
envolvidas não somente no processo de florescimento e manutenção do meristema floral, como também os genes
expressos naquele momento fisiológico do botão floral e da flor aberta de Eucalyptus. Foram seqüenciadas ~1.000 ESTs
válidas para cada biblioteca de expressão correspondente a cada parte da flor analisada, composta de cDNAs originários
de botões florais e flores abertas. Alguns genes envolvidos no processo de florescimento foram identificados, como
por exemplo, TFL1, AGAMOUS, APETALA1 e CRYPTOCROMO1 bem como citocromo B, proteínas induzidas
por auxinas e heat shock proteins, que participam de outras rotas metabólicas na flor. A análise destes dados permitirá
identificar elementos conservados envolvidos nas vias controladoras do florescimento e manutenção do meristema floral,
contribuindo para a compreensão e monitoramento deste momento fisiológico da planta de Eucalyptus.
Apoio Financeiro: CAPES e GENOLYPTUS.
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Análise da expressão gênica de
transportadores ABC (Subfamília WBC) por
RT-PCR em tempo real em Nicotiana tabacum
Amorim, MF1; Brito, MS1; Quiapin, AC1; Goldman, GH2; Goldman, MHS1
Departamento de Biologia, FFCLRP, Universidade de São Paulo
2
FCFRP, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: transportadores ABC, Nicotiana tabacum, WBC
Os transportadores ABC utilizam a energia da hidrólise do ATP para transportarem moléculas através de uma
membrana. A unidade funcional de um transportador ABC consiste na combinação de 2 domínios de ligação ao ATP
e 2 domínios transmembrânicos (Schulz, 2006). Os genes da subfamília WBC (White-Brown Complex) codificam
metades de transportadores, pois possuem apenas 1 domínio de cada e sua funcionalidade só é possível pela formação
de hetero- ou homodímeros. A identificação e caracterização do gene NtWBC1, um transportador com expressão
preferencial no estigma/estilete de Nicotiana tabacum (Otsu et al., 2004), despertou interesse no estudo do padrão de
expressão de outros WBCs do estigma/estilete, os quais seriam fortes candidatos a dimerização com NtWBC1. Em
plantas, assim como em outros eucariotos, proteínas WBCs são componentes chaves do sistema de transporte de lipídeos
(Pighin, 2004) e sabe-se que os lipídeos desenvolvem um papel importante na interação pólen-pistilo (Wolters-Arts et
al., 1998). Foi proposto que NtWBC1 esteja envolvido no transporte de lipídeos para o exudato do estigma/estilete
(Otsu et al., 2004). Para o estudo da expressão, foram selecionados alguns genes da subfamília WBC encontrados em
bibliotecas de cDNAs de estigma/estilete (TOBEST e SSH). Os padrões de expressão de 3 genes (NtWBC3, NtWBC5
e NtWBC6) foram definidos por RT-PCR em tempo real, utilizando RNAs de raiz, caule, folha, sépala, pétala, estame,
estigma/estilete e ovário. A expressão do gene de β-actina nestas amostras foi usada como controle interno do RT-PCR
em tempo real. Os experimentos não mostraram nenhum gene que fosse específico ou preferencial de estigma/estilete.
O gene NtWBC3 apresentou expressão preferencial em caule e o gene NtWBC6 mostrou uma expressão maior em
folha e ovário, mas encontra-se também expresso em outros órgãos. O NtWBC5, o qual em análise por macroarray
(Quiapin, 2005) apresentou uma expressão 4,4x maior em estigma/estilete que nos órgãos vegetativos, mostrou-se
preferencial do ovário. Embora não tenha sido encontrado outro WBC específico de estigma/estilete, qualquer WBC
que seja expresso nesse órgão é potencialmente candidato a formar dímero com NtWBC1. Transportadores WBC
com expressão preferencial em estigma/estilete provavelmente têm uma função no processo reprodutivo. Entretanto,
a especificidade do transportador pode ser definida por apenas um dos membros do dímero e não obrigatoriamente
por ambos os membros, sendo possível que um dos genes se expresse em outros órgãos, onde forme dímero com outro
transportador WBC e participe de um processo distinto.
Apoio financeiro: Pró-Reitoria de Pesquisa –USP, FAPESP.
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Identificação dos Possíveis Genes Ortólogos
a Genes MADS-box em Gossypium hirsutum
Nardeli, SM; Artico, S; Alves-Ferreira, M
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
Palavras-chave: Gossypium hirsutum, MADS-box, desenvolvimento floral
O algodão (Gossypium hirsutum L.) é a fibra mundialmente mais importante e representa cerca de 4% do PIB nacional
e mais de 13% do PIB industrial do Brasil, contudo as pragas ainda são um fator limitante da produção. O bicudodo-algodoeiro (Anthonomus grandis Boheman) é o inseto com maior incidência na cultura de algodão, atacando os
botões florais para oviposição e alimentação, o que causa enorme dano aos cultivos. Os genes MADS-box constituem
uma família de fatores transcricionais que compartilham uma seqüência altamente conservada de ligação ao DNA,
de aproximadamente 180 nucleotídeos. Membros dessa família controlam diversos processos do desenvolvimento
em plantas, desde a formação da raiz até o amadurecimento do fruto. Durante o desenvolvimento floral, os genes
MADS-box são essenciais para o desenvolvimento e manutenção dos quarto verticilos florais. Mutações nesses genes
resultam em transformações homeóticas desses órgãos. A partir de ferramentas de bioinformática nós identificamos 48
genes MADS-box de algodão através da ferramenta de busca web PAVE (Program for Assembling and Viewing ESTs)
que concentra os bancos de etiquetas de seqüenciamento mais completos para algodão. Em seguida as seqüências
foram analisadas no programa Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) e a distância molecular baseada no
alinhamento das seqüências foi calculada de acordo como parâmetro distância-p. Esta análise permitiu a identificação
dos possíveis ortólogos de genes MADS-box envolvidos na determinação da identidade dos órgãos forais em Arabidopsis:
AGAMOUS - Cotton12_05753_01; APETALA1 - Cotton12_12173_01; APETALA3 - Cotton12_10943_01;
PISTILATTA - Cotton12_08278_01; SEPALLATA3 - Cotton12_ 05997_01 e Cotton12_16754_01; SEPALLATA4 Cotton12_03112_01. A nossa busca não foi capaz de encontrar alguns reguladores importantes como SEPALLATA1 e
2. Além da importância na genética evolutiva, a identificação destes genes chave no desenvolvimento floral será ponto
de partida para o isolamento de promotores com potencial utilização biotecnológica no melhoramento do algodão.
Por exemplo, o padrão de expressão de AG em Arabidopsis o qualifica como bom alvo de interesse para isolamento
de promotor já que a expressão é restrita em estames e carpelos, sítios de alimentação do bicudo do algodoeiro. No
entanto, além da análise por bioinformática, os padrões de todos reguladores do desenvolvimento floral serão avaliados
por PCR em tempo real assim como por hibridização in situ para validação dos dados de expressão in silico.
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Análises de seqüências simples repetidas
(SSR) em seqüências expressas (EST)
de Vigna unguiculata (L.) Walp
Correia, CN1; Ferreira Neto, JRC1; Houllou-Kido, LM2; Costa, AF2; Pandolfi, V1; Monte, SJH3; Iseppon, AMB1; Kido, EA1
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
2
Instituto Agronômico de Pernambuco
3
Universidade Federal do Piauí
[email protected]
1
Palavras-chave: microssatélites, marcador molecular, feijão-caupi, leguminosa, cultura-órfã
O Brasil é o segundo maior produtor mundial de feijão-caupi. A grande produção nacional ocorre na região Nordeste,
onde 412 mil toneladas são produzidas anualmente e auxiliam na alimentação de cerca de 27,5 milhões de nordestinos.
Apesar dessa importância, a espécie é considerada cultura-órfã e de potencial subutilizado. Para auxiliar o programa
de melhoramento genético nacional conduzido pela Embrapa Meio-Norte, marcadores moleculares estão sendo
desenvolvidos. Marcadores SSR (Simple Sequence Repeats), principalmente aqueles obtidos de seqüências expressas
(EST, Expressed Sequence Tags), apresentam-se como marcadores de escolha em diversos estudos, devido à sua detecção
facilitada, maior facilidade na interpretação de dados e íntima associação a regiões codificantes. Os objetivos deste trabalho
foram identificar e classificar motivos SSRs em ESTs do Projeto “Genômica Funcional, Estrutural e Comparativa do
feijão-caupi” (rede NordEST) e avaliar sua amplificação via PCR. Para tal, analisou-se 4.919 seqüências, das quais 89
(aproximadamente 1,81 %) apresentaram 103 motivos SSRs perfeitos (2 a 6 pb). Motivos triméricos foram os mais
abundantes (59,2 %), seguidos pelos diméricos (32,0%), enquanto que os pentaméricos foram os mais raros (1,9 %).
Os motivos triméricos mais abundantes foram AAG/AGA/GAA/TTC/TCT/CTT, ATC/TCA/CAT/TAG/AGT/GTA
e ATG/TGA/GAT/TAC/ACT/CTA, cada um com 18,0%, já os diméricos foram AT/TA, com 81,8%. A extensão
média dos SSRs analisados foi de ~ 30 pb, sendo os triméricos, os menores (~ 21 pb), e os diméricos, os maiores
(~ 49 pb). Uma explicação para tal fato pode estar associada à localização das repetições: ~ 58% dos trinucleotídeos
foram associados à ORFs, enquanto que 60 % dos dinucleotídeos, às UTRs. Essas regiões estão sob diferentes pressões
seletivas para SSRs, pois as ORFs se apresentam mais conservadas, enquanto que as UTRs estariam sob seleção positiva,
possibilitando uma maior extensão por parte de repetições nelas ancoradas. Tais dados são importantes, visto que existe
uma relação linear entre taxa de polimorfismo e extensão dessas repetições, que associadas às localizações das mesmas
podem aumentar a eficiência desses futuros marcadores. Foram desenhados 70 pares de primers, dos quais 20 foram
testados em diferentes genótipos (10), inclusive os dois genitores da progênie de mapeamento do projeto NordEST.
Dos 20 pares, oito apresentaram polimorfismos e cinco destes amplificaram amplicons de tamanhos esperados (100 500 pb). Este trabalho ratifica que o conhecimento da ocorrência e freqüência de seqüências repetidas nos genomas é
importante não apenas para um entendimento de sua distribuição, mas, também, para direcionar o desenvolvimento
de marcadores SSR específicos para uso em análises genéticas.
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Alterações dos perfis protéicos no tomateiro
submetido à inoculação com o Fusarium
oxysporum f. sp. lycopersici
Ferreira, FS1; Amaral, DOJ1; Almeida, CMA1; Donato, VMTS2; Silva, MV1; Silva, MLRB2
Centro de Ciências Biológicas/Departamento de Bioquímica/UFPE
2
Laboratório de Genoma/Instituto Agronômico de Pernambuco/IPA
[email protected]
1
Palavras-chave: Lycopersicon esculentum, Fusariose, proteoma, tomate, fitopatógeno
Apesar da importância socioeconômica do tomateiro, a cultura apresenta um aspecto nômade devido ao acúmulo de
inóculo de patógenos de solo, como Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, agente da murcha-de-fusário. A resistência
genética tem sido apontada como a melhor estratégia para o manejo desta doença fúngica. Os mecanismos de defesa
de plantas em muitos casos baseiam-se na expressão de genes e alterações no conjunto de proteínas da célula. Análise
do perfil de proteínas através de técnicas eletroforéticas é usada para estudar e entender mecanismos fisiológicos da
planta em condições normais e sob estresse. Este trabalho teve por finalidade avaliar as alterações no perfil protéico das
folhas de tomateiro após a infecção com o F. oxysporum f. sp. lycopersici e assim verificar o perfil de proteínas moduladas
pela infecção do fitopatógeno. Plântulas da cultivar BRH, resistente a murcha-de-fusário, com três semanas após a
germinação sob condições in vitro foram inoculadas com a raça 2 do F. oxysporum f. sp. lycopersici e após 24, 48 e 72h,
bem como as plantas controle, inoculadas com água estéril, foram extraídas proteínas totais de tecido foliar. Para análise
comparativa do perfil protéico dos extratos de plantas não-inoculadas ou inoculadas com o patógeno foi analisado através
da focalização isoelétrica na faixa de pH 3-10 e SDS PAGE a 12%. A análise dos diferentes perfis protéicos observados
nos tratamentos constatou que a maioria das proteínas extracelulares da cultivar BRH secretadas a partir de 24h após
a inoculação com o patógeno possuem peso molecular numa faixa de 20 a 60 kDa. A análise dos extratos protéicos
também revelou que a quantidade total de proteínas extracelulares de tomateiro se mostrou alterada nos diferentes
tratamentos. Os resultados obtidos mostraram que a metodologia proposta para identificar proteínas extracelulares de
tomateiro relacionadas com a resposta de defesa ao F. oxysporum f. sp. lycopersici é eficaz e fazendo-se os devidos ajustes
poderá ser utilizada em experimentos futuros visando validar a atividade de proteínas individualizadas.
Apoio Financeiro: BNB e CNPq/MCT/FACEPE.
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Transcriptome analysis of sugarcane
responses to drought stress
Lembke, CG1; Rocha, FR1; Nishiyama-Junior, MY1; Zingaretti, SM2; Souza, GM1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil
Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal, Universidade Estadual Paulista, São Paulo, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: sugarcane, drought, microarray, qRT-PCR
Sugarcane, is one of the most important crop plants around the world due to its peculiar capacity of accumulating
high levels of sucrose. Drought is one the major stress that limits normal plant development. In order to understand
sugarcane response to drought we have evaluated the expression profile of genes after 24 h, 72 h and 120 h of drought
stress in a sugarcane cultivar sensitive to drought (SP90-1638). Microarray hybridizations were performed in two
different arrays: one array containing 4594 genes primarily related to signal transduction (SUCAST – Sugarcane Signal
Transduction Project) and the other containing 1879 genes primarily related to metabolic pathways (SUCAMET –
Sugarcane Metabolism Project). Using the SUCAST Project array, we have identified 217 differentially expressed genes
between control and experimental samples in at least one of the drought treatments (Rocha et al., 2007). The three
most observed functional categories were stress response (15.7%), protein kinase (12.4%) and receptors (10.6%). Of
the 217 genes identified, 17 genes were selected to be analyzed using quantitative Real Time PCR (qRT-PCR) on the
basis of their expression profile and functional category. Twenty-eight experimental points, corresponding to those
genes, were tested and 78.6% were validated. Using the SUCAMET Project array, 96 differentially expressed genes
were identified and the three most observed functional categories were carbohydrate metabolism (24%), stress response
(16.7%) and photosynthesis (10.4%). The expression profile of 6 experimental points corresponding to 5 genes was
evaluated through qRT-PCR and 83.3% of validation was observed. Genes regulated by drought may be important
to obtain transgenic sugarcane plants with higher tolerance to this stress.
Supported by: CNPq and FAPESP.
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Genes expressos em nódulos de feijoeiro
inoculado com Rhizobium tropici CIAT 899 e
seu derivado curado no plasmídeo A (CIATa)
Junior, ZS1; da Silva, HAP2; Galisa, PS3,4; Macedo, AVM4; Vidal, MS4; Simões-Araújo, JL4
Engenheiro Agrônomo – Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
2
Ciências Biológicas - Universidade de Nova Iguaçu – UNIG
3
Pós-Graduação em Biotecnologia Vegetal - Universidade Federal do Rio de Janeiro
4
Embrapa Agrobiologia – BR 465 Km 07, Seropédica – RJ
[email protected]
1
Palavras-chave: Rhizobium, Competitividade, Nodulação, FBN, Plasmídeo simbiótico
A fixação biológica de nitrogênio (FBN) pode fornecer o nitrogênio necessário para o cultivo de leguminosas como:
soja, feijão, amendoim, dentre outras. Neste processo bactérias do gênero Rhizobium induzem a formação de nódulos,
estruturas especializadas nas raízes, que são capazes de utilizar os produtos da fotossíntese da planta como fonte de
energia e poder redutor (elétrons) para a FBN. O N2 atmosférico é então reduzido a amônia que será incorporada ao
metabolismo da planta; no entanto, nos solos tropicais a atividade da FBN é freqüentemente limitada por diversos
estresses bióticos e abióticos. As estirpes de Rhizobium tropici, como a CIAT899, são bastante usadas para inoculação
do feijoeiro por apresentarem características agronômicas importantes, como a capacidade de tolerar estresses térmicos e
acidez do solo, no entanto, inúmeros aspectos da interação planta microrganismos ainda merecem maiores estudos, como
por exemplo, os fatores que interferem na competitividade das bactérias. A conseqüente eliminação de plasmídeos causa
uma diminuição na competitividade por sítios de nodulação. A utilização dos derivados curados da estirpe CIAT899 é
uma boa estratégia para estudar a competitividade, dessa forma, poder-se-á identificar funções codificadas pelos genes
presentes em plasmídeos proporcionando um melhor entendimento do processo de nodulação no feijoeiro. Com o
objetivo de identificar, isolar e caracterizar os genes expressos diferencialmente em nódulos de feijão durante a simbiose
com Rhizobium tropici CIAT 899 (selvagem) e derivados curados do plasmídeo “a” foram realizados em casa de vegetação
para obtenção de material biológico. A partir do RNA total extraídos dos nódulos o cDNA foi sintetizado e utilizando
para o cDNA-AFLP. As endonucleases de restrição EcoRI e MseI foram utilizadas para digestão do cDNA. Após a ligação
do cDNA adaptadores específicos para as extremidades coesiva deixadas por cada enzima foram ligados ao cDNA para
amplificação utilizando iniciadores específicos. Foram utilizadas 15 combinações de iniciadores sendo o iniciadores
EcoRI-N marcados com radioatividade. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de poliacrilamida e, após a
secagem do gel e exposição junto a um filme de raio-X, os fragmentos gerados a partir de genes diferencialmente expresso
foram isolados, reamplificados e seqüenciados. Foram obtidos 172 fragmentos e 143 foram isolados e reamplificados.
Após analise de similaridade utilizando o programa BlastX foi possível identificar homologia com genes relacionados
a diferentes processos metabólicos, como por exemplo: tirosina fosfatase, proteínas de função ainda não conhecida,
esterase, dentre outras. Estes resultados preliminares mostram o potencial da utilização da técnica de cDNA-AFLP para
identificação de genes diferencialmente expresso em plantas. Uma análise mais detalhada do padrão de expressão será
realizada para os fragmentos já caracterizados buscando um maior entendimento do papel dos plasmídeos de CIAT na
expressão gênica e nodulação de feijoeiro.
Apoio financeiro: FAPERJ, CNPq, CAPES e EMBRAPA.
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Clonagem de regiões hipervariáveis da
superfamília das celuloses sintases em jatobá
Escaldelai, N1; Buckeridge, MS2; Gaspar, M3
Centro Universitário São Camilo
Departamento de Botânica, Universidade de São Paulo
3
Seção de Fisiologia e Bioquímica de Plantas, Instituto de Botânica de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: genes CesA, síntese de celulose, jatobá
O entendimento do processo de biossíntese dos polissacarídeos de parede celular tem atraído atenção não somente
devido à importância fundamental destas moléculas no desenvolvimento vegetal, mas também por sua relevância
para o homem. Dentre estes polissacarídeos, a celulose apresenta grande valor comercial para as indústrias químicas,
de polpa, papel e têxteis. Estudos bioquímicos identificaram em plantas superiores um grande complexo enzimático
contendo diversas subunidades catalíticas, denominadas celulose sintases (CesA), responsáveis pela síntese isolada das
cadeias de β(1,4)-glucano que compõem as microfibrilas de celulose. Todas as proteínas CesA vegetais isoladas até o
momento apresentam duas regiões, denominadas hipervariáveis (HVR), que representam sequências de DNA altamente
divergentes e que podem ser utilizadas em análises estruturais e de expressão entre os diferentes membros da família
multigênica CesA. Muitos genes CesA já foram isolados de espécies temperadas ou de interesse comercial, mas pouco
se sabe sobre estes genes em espécies arbóreas tropicais. Este trabalho objetivou o isolamento de genes CesA de jatobá
(Hymenaea courbaril), uma leguminosa arbórea nativa. Levando-se em conta que a celulose é um polímero-chave da
parede da maioria das células vegetais, entender a função dos genes CesA, determinar em que tecidos são expressos e quais
podem ser redundantes é importante para compreender o desenvolvimento da planta. Através da técnica de RT-PCR
com oligonucleotídeos degenerados, foram identificadas as regiões HVRII de sete genes CesA e um gene CesA-like D
(CslD) em jatobá (Hymenaea courbaril L.). As análises filogenéticas permitem concluir que o jatobá possui um número
de genes CesA compatível com o encontrado em Populus até o momento. O número de genes distintos isolados de
Arabidopsis é maior (10 genes) e ainda não foram isolados de jatobá os genes correspondentes a PtCesA1 e PtCesA6.
Os genes de jatobá se agrupam em 5 das 6 classes de CesA representadas nas várias espécies vegetais estudadas até o
momento. Dos genes isolados, cinco estão relacionados com o desenvolvimento da parede primária e dois com deposição
de parede secundária em Arabidopsis. O gene CSLD, apesar da similaridade com os genes CesA, está provavelmente
envolvido na biossíntese de outros polissacarídeos de parede celular, como o xiloglucano. Nossos resultados confirmam
as afirmações feitas anteriormente por outros autores de que a região HVRII determina diferentes classes de genes CesA.
O isolamento de novos genes CesA de jatobá constitui ferramenta importante para a compreensão do mecanismo de
síntese de celulose em árvores tropicais e para análises de expressão gênica em leguminosas nativas.
Orgão financiador: FAPESP.
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Circadian clock genes are regulated by
drought in sugarcane
Hotta, CT1; Valvassoura, TA1; Kazokas, LR1; Zingaretti, SM2; Menossi, M3; Souza, GM1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil
Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal, Brazil
3
Departmento de Genética e Evolução, IB-Unicamp, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas, SP, Brazil
1
2
[email protected]
Keywords: circadian clock, sugarcane, drought, qRT-PCR
The circadian clock is an important signalling pathway that relays temporal information to the plant. This pathway
allows the anticipation of rhythmic events such as sunlight in the morning and higher water deficit in the evening. Not
surprisingly, important pathways such as sugar synthesis and stress response are regulated by the plant circadian clock.
Arabidopsis lines that have a defective circadian clock have decreased photosynthesis, growth and competitive advantage.
Thus, the circadian clock is a key pathway in crop plants, usually selected for higher productivity and/or stress tolerance.
We are interested in the role of the circadian clock in sugarcane because its polyploid genome might result in an aberrant
circadian behaviour that may affect sugarcane response to drought stress and/or productivity. Firstly, we have screened
the Brazilian sugarcane EST project collection (SUCEST, http://sucest-fun.org) for orthologs of known plant circadian
clock genes. We found 22 putative unique sugarcane transcripts (sugarcane assembled sequences or SASs) that have high
identity to components of the central oscillator of the clock. As an example, we have found one SAS that is similar to
CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED (CCA1), two SAS that are similar to TIME OF CAB2 EXPRESSION (TOC1)
and four SAS that are similar to GIGANTEA (GI). The TOC1/CCA1/GI feedback loop is thought to be the central
oscillator in the plant circadian clock. Secondly, we have evaluated the transcript levels of circadian clock genes after 24
h, 72 h and 120 h of drought stress in a sugarcane cultivar that is sensitive to drought (SP90-1638) and have compared
to well watered sugarcane harvested at the same time points. Transcript levels of both sugarcane CCA1 (scCCA1) and
sugarcane GI (scGI) are higher in plants under 24 h of drought than in control plants. In contrast, transcript levels of
sugarcane TOC1 (scTOC1) are lower in plants under 24 h of drought at the same time point. This suggests that the
CCA1 repression of TOC1 described in other plant models are also found in sugarcane. However, scTOC1 levels were
found to be higher in plants under 48 h and 120 h of drought but transcript levels of sugarcane while transcript levels
of scCCA1 and scGI remained unchanged. In conclusion, we have shown that sugarcane has many SAS that have high
similarity to other plant circadian clock genes and these SAS are regulated by drought.
Orgão financiador: FAPESP.
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Análise da região promotora do gene
Gmhsp17.6-L em cultivares de soja
resistentes e suscetíveis ao nematóide
de galhas, Meloidogyne javanica
Fuganti, R1; Machado, MFPS1; Silva, JFV2; Arias, CAA2; Marin, SRR2; Binneck, E2;
Abdelnoor, RV2; Marcelino, FC2; Nepomuceno, AL2
Genetica e Melhoramento de Plantas – Universidade Estadual de Maringá - UEM, Maringá, PR, Brazil
2
Embrapa Soja. Londrina, PR, Brazil
[email protected]
1
Palavras-chave: soja, nematóide de galhas, expressão gênica, proteína de choque térmico, PCR em tempo real
Espécies de nematóide do gênero Meloidogyne provocam sérias perdas na produção de soja. As perdas anuais na produção
mundial são estimadas em 11% devido a este parasitismo. Marcadores moleculares associados a genes de resistência
podem acelerar o desenvolvimento de cultivares resistentes. O marcador molecular microssatélite 176 Soy HSP
mostrou alta correlação com o número de galhas em raízes de soja inoculadas com o patógeno. Uma análise de QTL
revelou a presença de pelo menos um gene localizado próximo ao marcador 176 Soy HSP, com valor de LOD score de
27.5. O fragmento amplificado, presente inicialmente apenas em amostras suscetíveis, mostrou 100% de similaridade
com a região promotora do gene que codifica uma proteína de choque térmico de baixo peso molecular, presente na
soja, Gmhsp17.6-L (Número de acesso no GenBank: M11317). Primers foram desenhados para amplificar a região
em ambos os genótipos resistente e suscetível. Todos os fragmentos também mostraram 100% de similaridade com a
região promotora do gene Gmhsp17.6-L. Dentro da região promotora, uma inserção de microssatélite correspondente
a repetições AT(n) foi observada em todas as amostras. No entanto, o número de repetições AT era diferente em cada
genótipo testado, com amostras resistentes apresentando maior número de repetições AT(n), quando comparadas com
amostras suscetíveis e também com a seqüência do gene Gmhsp17.6-L disponível no GenBank. Na seqüência de DNA
correspondente à região codante da proteína, nenhuma diferença significativa na seqüência nucleotídeos e aminoácidos
foi encontrada entre todas as amostras e a seqüência do GenBank. Para confirmar se a diferença no tamanho da inserção
AT, dentro da região promotora do gene Gmhsp17.6-L, refletia em diferentes níveis de expressão deste gene, um ensaio
de proteção de ribonucleases foi realizado, mas nenhuma diferença foi detectada nos indivíduos parentais. Finalmente,
uma quantificação relativa por PCR em tempo real foi executada. Os resultados indicaram que entre todas as amostras
testadas, os indivíduos resistentes, JF7002, JF7027 e JF7056, inoculados com o nematóide, mostraram maior nível
de expressão gênica quando comparados com todas as amostras restantes. Embriões de soja foram transformados com
cassetes de expressão construídos com diferentes tamanhos de inserção AT(n) na região promotora. Depois de submetidos a
estresses abióticos e biótico, a cultivar BRS133 mostrou melhor resultado no ensaio histoquímico para detectar expressão
do gene Gus. As plantas transformadas estão sendo mantidas em câmera para período de aclimatação, até que amostras
possam ser coletadas para confirmação de eventos positivos, via PCR, com primers específicos.
Orgão financiador: CAPES.
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Identificação de genes diferencialmente
expressos nas folhas de uma linhagem
de milho (Zea mays) resistente à seca
em resposta ao déficit hídrico
DeLaat, DM1; Carneiro, NP2; Guimarães, CT2; Oliveira, GC3; Franco, GR1
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de Minas Gerais
2
Embrapa Milho e Sorgo
3
Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ
[email protected]
1
Palavras-chave: microarranjos de DNA, milho, estresse hídrico, expressão diferencial
No Brasil, estima-se que 14,8% da área plantada com milho (Zea mays) seja afetada pela seca, equivalendo a
1,9 milhões de hectares ou uma perda na produção de mais de 3,7 milhões de toneladas. Periodicamente, estas áreas
são submetidas a condições de seca que afetam significativamente a produtividade, chegando até a uma perda total de
produção. Sabe-se que, sob condições de seca, um grande número de genes é ativado e outros reprimidos. O controle
desta ativação/repressão ocorre em diferentes níveis, que vão desde o momento da percepção do estresse, até a geração
de uma proteína/enzima ativa biologicamente. Este projeto tem sido realizado utilizando-se uma linhagem de milho
(Genótipo 31.2.1) caracterizada fisiologicamente, pelos pesquisadores da EMBRAPA Milho e Sorgo, como resistente
ao estresse hídrico. Microarranjos de DNA foram utilizados para explorar de modo global o perfil de expressão gênica
diferencial nas condições normal e de baixa disponibilidade de água. Para isso, as folhas foram coletadas e separadas
em 8 pools de três indivíduos sendo 4 pools sob estresse e 4 em condição normal de reposição de água. Os RNAs foram
extraídos e os mRNAs amplificados e marcados com corantes fluorescentes (Cy3 e Cy5). Após a hibridação das amostras
(estresse X normal) as lâminas foram escaneadas e os dados brutos de intensidade de luminosidade foram analisados
usando a linguagem estatística R. Foram identificados alguns genes diferencialmente expressos nos tecidos de folhas
desta linhagem de milho em resposta ao déficit hídrico. Vinte e seis genes tiveram o valor de log odds acima de 1,5
(probabilidade de serem diferencialmente expressos de 82%). Destes, onze genes diferencialmente expressos são de
folha com estresse e dezesseis de folha sem estresse. Em uma lista com os 10 principais genes diferencialmente expressos
observa-se cinco genes de Zea mays (glutamina sintetase, proteína rica em glicina, indol sintase, precursor de ferritina 1
e gliceraldeido 3-fosfato desidrogenase), além de genes com similaridade aos de Oryza sativa e Arabidopsis thaliana. A
classificação das proteínas diferencialmente expressas em categorias de ontologia gênica já esta sendo realizada. Com a
identificação de genes que têm o perfil de expressão diferencial sob pressão de baixa disponibilidade de água, esperamos
gerar informações que ajudem a decifrar os mecanismos fisiológicos de resistência a este tipo de estresse. Além disso, a
informação gerada será útil para a produção de plantas geneticamente modificadas que se adaptem melhor à condição
de pouca disponibilidade hídrica.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Transcritos da soja induzidos durante
interação com a ferrugem asiática
da Silva, DCG 1,2,3; Stolf, R1; Van de Mortel, M4; Lemos, NG1; dos Santos, JVM1; Pereira, RM1; Binneck, E1; Almeida, AMR1;
Nepomuceno, AL1; Yamanaka, N5; Marcelino, FC1; Baum, TJ4; Whitham, SA4; Lemos, EGM3; Abdelnoor, RV1
1
Empresa Brasileira da Pesquisa Agropecuária, Embrapa Soja
Departamento de Biologia e Tecnologia, Universidade Estadual do Norte do Paraná, FALM
3
Departamento de Tecnologia, Universidade Estadual Paulista, FCAV
4
Department of Plant Pathology, Iowa State University
5
Japan International Research Center for Agricultural Sciences, JIRCAS
[email protected]
2
Palavras-chave: Glycine max, microarranjos de cDNA, Phakopsora pachyrhizi, respostas de defesa, SSH
O maior problema enfrentado atualmente pelos produtores de soja é a doença ferrugem asiática, causada pelo fungo
Phakopsora pachyrhizi. Pouco se sabe sobre a interação molecular entre soja e ferrugem asiática e as complexas vias
metabólicas desencadeadas por esta interação. No presente trabalho foram identificados genes da soja ativados durante
interações compatível e incompatível com a ferrugem, mediante a análise de microarranjos de cDNA. Para a construção
dos microarranjos foram utilizados clones oriundos de bibliotecas subtrativas de cDNA de soja, construídas utilizando
o seguinte material vegetal: folhas do genótipo resistente PI 230970 (que possui o alelo de resistência Rpp2) e do
genótipo suscetível Embrapa 48, coletadas às 24 e 192 horas após a inoculação com esporos do fungo. O inóculo é
oriundo de campos comerciais de soja do Estado de Mato Grosso. Um total de 670 seqüências únicas foram impressas
em microarranjos sobre lâminas de vidro e hibridizadas com cDNAs-alvo representando as mesmas condições aplicadas
para a construção das bibliotecas. Apenas 65 transcritos foram diferencialmente expressos, estando eles envolvidos
na produção de espécies reativas de oxigênio, fitoalexinas e proteínas antimicrobianas, morte celular e senescência,
modificação, estabilização e degradação protéica, controle da expressão gênica e reforço de parede celular. Os resultados
deste trabalho contribuíram para a elucidação da interação molecular entre soja e ferrugem asiática e poderão, no futuro,
auxiliar no desenvolvimento de métodos mais eficientes de controle do fungo.
Orgão financiador: CNPq.
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Composição de gluteninas de alto peso
molecular e sua associação com parâmetros
de qualidade tecnológica de trigo
Tomazin, T1; Torres, GAM2; Miranda, MZ2; Nicolau, M2; Consoli, L2; Costa, LFMM2; Scheeren, PL2;
Caierão, E2; Silva, MS2; Albuquerque, ACS2
1
Acadêmica do curso de Química Bacharel, Universidade de Passo Fundo
Embrapa Trigo, Rodovia BR 285, km 294, Caixa Postal 451, CEP 99001-970, Passo Fundo, RS
[email protected]
2
Palavras-chave: trigo, gluteninas, proteínas de reserva, qualidade tecnológica, Triticum aestivum
O melhoramento genético de trigo visa à obtenção de genótipos que possuam, além de características como alto
rendimento e resistência a doenças, adequação para determinado produto final. Variações da qualidade de panificação
entre cultivares de trigo têm sido explicadas pela variação na composição de gluteninas de alto peso molecular
(HMW-GS), codificadas pelos locos Glu-1, situados nos braços longos dos cromossomos 1A, 1B e 1D (loco Glu-A1,
Glu-B1 e Glu-D1, respectivamente). Este trabalho teve como objetivo caracterizar a composição em HMW-GS e sua
associação com parâmetros de qualidade tecnológica de 81 dos genótipos de trigo avaliados, nos anos de 2004 e 2005,
pelo programa de melhoramento da Embrapa Trigo (Passo Fundo, RS). A composição de HMW-GS de cada genótipo
de trigo foi determinada em géis do tipo SDS-PAGE. Quanto à avaliação da qualidade tecnológica, foram realizadas
análises de: número de queda (NQ), microssedimentação com SDS (MS-SDS); alveografia, com os seus parâmetros:
força de glúten (W); tenacidade (P); extensibilidade (L) e índice de elasticidade (Ie), segundo metodologia da American
Association of Cereal Chemists (AACC, 2000). A associação entre os parâmetros de qualidade tecnológica e a composição
de proteínas de reserva foi estabelecida por meio da análise de componentes principais com auxílio do gráfico biplot.
Dez alelos foram identificados nos 81 genótipos de trigo avaliados. Três alelos no loco Glu-A1 (1, 2* e N), cinco alelos
no loco Glu-B1 (7, 7+8, 7+9, 13+16, 17+18) e dois no loco Glu-D1 (5+10 e 2+12) foram observados. Codificados
pelo loco Glu-A1, os alelos 2*, 1 e N foram identificados, respectivamente, em 74,7%, 16,9% e 8,4% dos genótipos
analisados. Considerando todos os parâmetros de qualidade tecnológica citados, 70% da variabilidade observada nos
genótipos com o alelo 2* podem ser explicados com dois componentes principais. Para estes genótipos, os parâmetros
MS-SDS, W e Ie apresentaram peso de participação equivalentes. O conhecimento destas proteínas, que determinam
as características de viscoelasticidade do glúten, abre perspectivas do seu uso como ferramenta para a seleção assistida
no desenvolvimento de linhagens de trigo.
Apoio Financeiro: FINEP e bolsa PIBIC-CNPq.
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Eucalyptus BAC clones sequencing and
assembly using 454 technology
Pappas, MCR1; Pappas, GJ1,2; Brommonschenkel, SH3; Faria, DA2; Sá, SV4; Kaiser, O5; Grattapaglia, D1,2
1
EMBRAPA Genetics Resources and Biotechnology – Estação Parque Biológico, Brasília, 70770-900 Brazil
Genomic Science Program – Universidade Católica de Brasília, Campus II SGAN 916 Norte, Brasília 70790-160
3
Universidade Federal de Viçosa, Departamento de Fitopatologia. Av. P. H. Rolfs, s/n - 36570-000 - Vicosa, MG - Brazil
4
Roche Diagnóstica Brasil Ltda Av. Eng Billings, 1729, prédio 11 05321-900 São Paulo SP Brazil
Roche Diagnostics - GmbH BC-2.3 Nonnenwald 2 - 82377 Penzberg, Germany
[email protected]
2
Keywords: BAC clones, pyrosequencing, assembly
With the forthcoming availability of a draft sequence of the Eucalyptus genome and parallel BAC genome resources,
ultra high throughput short read sequencing technologies will be increasingly useful for gene discovery. In this work
we analyzed the quality and assembly results of shotgun sequencing of Eucalyptus BAC clones generated by the GSFLX system (Roche Applied Science). We were interested in weighing pyrosequencing against the traditional Sanger
approach, and compare coverage and assembly efficiency. Ten BAC clones containing genes involved in wood formation
and disease resistance were selected by PCR screening of hierarchical pools. A single GS-FLX run was carried out in five
independent lanes with 4 individual BACs and a pooled sample of 10 BACs (including the 4 individually sequenced).
A total of 223,445 high quality reads averaging 256 bases were generated. Extremely high (43 to 264X) coverages were
obtained for individual BACs. A 18 Kb BAC clone containing the gene cinnamyl-alcohol dehydrogenase was completely
assembled, and the results were identical to a parallel Sanger sequencing experiment. Although the other larger BACs
could not be completely assembled, it was possible to obtain 86 contigs with lengths greater than 2 Kb, with the largest
one having 56.3 Kb. Gene rich regions were efficiently revealed with all 10 original genes being completely assembled.
Furthermore, 17 other genes could be identified by comparison with the Genolyptus EST database. Notwithstanding,
traditional Sanger is still required for assembly finishing. A primer walking strategy is currently being employed to this
end. However, after three rounds of sequencing the BAC clones could not be completely finished. Analysis of contig
ends revealed that approximately 85% contain repetitive or low complexity regions up to 250 bases from their ends.
In conclusion, a pooled BAC 454-sequencing approach is a cost and time efficient strategy to provide coverage and
assembly of the gene space.
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Obtenção de banco enriquecido em
microssatélites para a espécie vegetal
Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes)
Landrum (Myrtaceae)
Morgante, PG1; Vicente, FF1
Campus Experimental de Registro, UNESP
[email protected]
1
Palavras-chave: Marcadores microssatélites, Pimenta pseudocaryophyllus, Myrtaceae
A espécie vegetal Pimenta pseudocaryophyllus pertence à família Myrtaceae, de elevada importância na flora brasileira e
que abriga espécies muito valorizadas em termos econômicos. Sua ocorrência no Brasil é registrada desde o sul da Bahia
até o Rio Grande do Sul, sempre em áreas de Mata Atlântica. No Vale do Ribeira, a planta é bastante consumida como
chá ou bebida alcoólica, sendo seu aroma resultante de seus óleos essenciais. A população a utiliza, ainda, de forma
medicinal, estando suas propriedades terapêuticas relacionas também aos óleos essenciais. Sua classificação botânica
é difícil, existindo três variedades descritas atualmente. Considerando a ausência de conhecimento sobre a estrutura
genética de suas populações, a forte pressão extrativista que têm sofrido na região do Vale do Ribeira e a devastação
sofrida pela Mata Atlântica, torna-se fundamental o desenvolvimento de trabalhos científicos que possam trazer subsídios
para o manejo e a conservação de P. pseudocaryophyllus. Assim, o objetivo deste estudo foi obter um banco enriquecido
em microssatélites desta espécie nativa, a fim de utilizar este tipo de marcador molecular para estudos posteriores
de caracterização genética de populações de P. pseudocaryophyllus, coletadas no Vale do Ribeira (SP). Para tanto, foi
coletado material vegetal de um indivíduo adulto de uma população localizada no município de Cananéia (SP) para
isolamento de DNA. O DNA extraído foi hidrolisado com RsaI, ligado a adaptadores para realização de amplificação
via PCR e obtenção de maior número de fragmentos de até 1200 pb. Uma alíquota de DNA foi, então, incubada
com dois tipos de oligonucleotídeos biotinilados, oligoCT e oligoGT. Após o período de incubação para ligação dos
oligos nas seqüências-alvo do DNA vegetal, os fragmentos ligados foram capturados por meio de esferas magnéticas
cobertas com estrepdavidina. Os fragmentos selecionados nesta etapa foram amplificados por PCR, clonados em vetor
pGEM-T e usados para transformar bactérias XL1-BLUE. Foram selecionados 95 transformantes para montar o banco
em uma microplaca. Destes 95 clones, apenas 91 conseguiram proliferar nos repiques posteriores e em meio líquido
para extração de DNA plasmidial. Todos os 91 clones possuem plasmídeos carregando insertos de tamanhos variados
dentro da faixa esperada. Até o momento foram seqüenciados apenas 6 clones, que possuem microssatélites perfeitos
com os dinucleotídeos CT(15), CT(6), GT(2), CA(9) e o trinucleotídeo CTT(6) e, ainda, um microssatélite imperfeito
TTA(2)TTTA(2). Os demais clones estão em fase de seqüenciamento para permitir a caracterização do banco e posterior
desenho de primers para amplificação de locos microssatélites de P. pseudocaryophyllus.
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Análise da expressão de genes em frutos
de camu-camu (Myrciaria dubia
(H.B.K.) McVaugh)
Santo, MLE1; Almeida, ERP2; Yuyama, K3; Astolfi-Filho, S4; Martins, NF2
Universidade Federal do Amazonas - Instituto de Ciências Exatas e Tecnologia
2
Embrapa – Recursos Genético e Biotecnologia
3
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
4
Universidade Federal do Amazonas – Instituto de Ciências Biológicas
[email protected]
1
Palavras-chave: Myrciaria dubia, EST, genômica funcional
O camu-camu é uma espécie Amazônica, cujo fruto apresenta elevado teor de vitamina C, entre 0,845 a 6,1g de ácido
ascórbico/100g de polpa, tornando-o um fruto com grande potencial econômico. O presente estudo pretendeu analisar
e identificar genes expressos em frutos de camu-camu por meio de seqüenciamento de ESTs (Expressed Sequence Tags). A
biblioteca foi construída no Laboratório de Nutrigenômica - Embrapa/CENARGEN. O RNA total foi extraído a partir
da casca-polpa. Para o sistema de ligação foi usado o plasmídio pSPORT 1 para transformação de E. coli XL1-blue por
eletroporação. O seqüenciamento dos ESTs foi realizado tanto no Laboratório de Tecnologia do DNA do Centro de
Apoio Multidisciplina da UFAM, como na Plataforma de Seqüenciamento do CENARGEN. As seqüências ESTs foram
submetidas ao Sistema Genoma, programa de anotação genômica produzido pela Rede de Bioinformática do CentroOeste – BIOFOCO. A partir do seqüenciamento de 5000 ESTs da extremidade 5’ de insertos de cDNA da biblioteca
de frutos de camu-camu 3196 ESTs foram validados no programa Sistema Genoma, sendo formados 1546 singletons
e 358 contigs, resultando num total de 2586 seqüências ESTs com similaridade a seqüências encontradas no banco de
genes. A análise da clusterização da biblioteca revelou um índice de 81% de novidade e 32,54% de redundância para
a biblioteca de cDNA de camu-camu, estes índices mostram que a biblioteca ainda pode ser bastante explorada para a
obtenção e identificação de novos genes. Cerca de 90% dos contigs apresentaram baixa redundância (2-4 reads por contigs)
e 9% com média redundância (5-10 reads por contigs). A espécie com maior número de ESTs com similaridade a
seqüências de camu-camu foi Arabidopsis thaliana com 49% de seqüências similares. As seqüências gênicas com maior
similaridade (e-value 0.0) a genes conhecidos, são codificantes das seguintes proteínas: 26S proteossoma subunidade
4; alcool deidrogenase 2; alfa tubulina 1; catalase; H+ pirofosfatase; duas proteínas de choque térmico 83; proteína de
choque térmico 70KDa-1; SNF1-relacionada a proteína quinase; e fator de elongação 1A-9. Os genes mais abundantes
expressos e seus respectivos níveis de expressão foram os seguintes: glutationa S-transferase (1,04%); alergênica maior
Mal d 1.06A02 (0,73 %); proteína cognata de choque térmico 70 kDa-1 (0,58%); proteína extensina (0,58%); fator
de elongação 1A-9 (0,50%); giberelina 2 oxidase (0,46%); (S)-norcoclaurina síntase (0,46%). Verificou-se a partir da
análise dos genes expressos nos frutos de camu-camu que o sistema de defesa contra estresse ambiental e patógenos
estão ativos.
Órgão financiador: CNPq, FAPEAM, SUFRAMA.
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Análise proteômica de raizes de algodão
suscetível e resistente a Meloidogyne incognita
Carvalho, HES¹; Villeth, GRC²; Carneiro, RMD3; Rocha, TL³; Franco, OC4; Grossi de Sá, MF³; Mehta, A³
¹Universidade de Brasília, UnB
²Universidade Paulista, Unip
³Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
4
Universidade Católica de Brasília
[email protected]
Palavras-chave: Gossypium hirsutum, 2-DE, Meloidogyne incognita, expressão diferencial, espectrometria de massa
O algodão (Gossypium hirsutum) é uma cultura de grande interesse econômico no Brasil, não só pela produção de
fibras têxteis como também por produtos secundários como o óleo do caroço. Os nematóides representam um sério
problema na maioria das regiões onde o algodão é cultivado. A espécie mais importante é Meloidogyne incognita, o
nematóide causador de galha e conseqüente atrofia geral das plantas. O objetivo deste trabalho foi analisar o perfil de
proteínas diferencialmente expressas em dois genótipos de algodão, sendo um resistente (M315) e outro susceptível
(COODETEC) a M. incognita, ambos inoculados com o nematóide. Plantas de algodão com aproximadamente 2 meses
de idade foram inoculadas com 5000 J2 de M. incognita. As amostras das raízes foram coletadas em três tempos após
a infecção (3, 6 e 10 dias) e maceradas em nitrogênio líquido, sendo conservadas a -80º C. A extração de proteínas foi
realizada através da utilização de fenol e tampão de extração e as proteínas foram precipitadas com acetato de amônia
em metanol. As proteínas obtidas foram quantificadas em espectrofotômetro e analisadas através de 2-DE. Foram
observadas aproximadamente 230 proteínas variando em tamanho de 10 a 120 kDa e em pH de 4 a 7. Algumas
proteínas diferencialmente expressas foram observadas e serão analisadas por espectrometria de massa.
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Proteínas diferencialmente expressas em
tabaco (Nicotiana tabacum) transformado
com o gene rolA
Sato, JH¹; Barros, LMG²; Carneiro, M²; Mehta, A²
¹Universidade de Brasília, Brasília, DF
²Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
[email protected]
Palavras-chave: gene rolA, Nicotiana tabacum, 2-DE, expressão diferencial, espectrometria de massa
O gene rolA é originário da bactéria Agrobacterium rhizogenes, e quando expresso em plantas induz anomalias fisiológicas
e morfológicas, como a redução do porte da planta, inibição de crescimento da raiz e retardamento da floração. Estudos
já realizados demonstraram que o gene rolA influencia na diminuição da síntese de auxina ou no aumento da razão
citocinina/auxina, causando o nanismo, folhas enrugadas e verde-escuras. Compreender o mecanismo de ação desse
gene pode ser de utilidade na manipulação da estatura das plantas, levando ao aumento de densidade de plantio e
consequentemente elevando a produtividade agrícola. O objetivo desse trabalho foi analisar os perfis de proteínas
diferencialmente expressas em uma planta de tabaco (Nicotiana tabacum) transformada com o gene rolA e uma planta
controle, a fim de compreender a influência desse gene na expressão de outros genes. As folhas de plantas transformadas
e plantas controles foram coletadas, e maceradas com nitrogênio liquido. A extração de proteínas foi realizada através da
utilização de fenol e tampão de extração. As proteínas obtidas foram quantificadas, analisadas através de 2-DE e coradas
com nitrato de prata. Os géis obtidos revelaram proteínas variando de 10 a 110 KDa. Observou-se aproximadamente
30 spots diferenciais na comparação dos géis, sendo a maioria das proteínas reprimida no perfil da planta transformada.
Essas proteínas foram excisadas dos géis e estão em processo de análise por espectrometria de massa.
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Proteômica de folhas de arroz (Oryza
sativa L.) tolerante ao estresse hídrico
Rabello, FR1; Rabello, AR1; Rangel, PHN2; Guimarães, CM2; de Souza, EM3; Pedrosa, F3; Ferreira, ME4,5; Mehta, A4
Universidade de Brasília. Brasília-DF
Embrapa Arroz e Feijão. Goiânia-GO
3
Universidade Federal do Paraná
4
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Brasília-DF
5
Universidade Católica de Brasília. Brasília-DF
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Expressão diferencial, Oryza sativa, estresse hídrico, 2-DE
O arroz (Oryza sativa L.) é um dos cereais mais cultivados no mundo e cerca de três bilhões de pessoas dependem
desta cultura para sua nutrição. Desta forma, existe a necessidade de aumentar o potencial de produtividade desta
cultura, porém o estresse hídrico é um fator limitante à sua produção e à estabilidade do seu rendimento. O objetivo
deste trabalho foi encontrar proteínas diferencialmente expressas em folhas da variedade Três Meses Antigo, tolerante
ao déficit hídrico. O experimento foi realizado submetendo a variedade de arroz de sequeiro a dois tratamentos, um
mantendo-se as condições hídricas adequadas, ou seja, reposição de 100% da água evapotranspirada e outro aplicando-se
um estresse hídrico, com reposição de apenas 50% da água evapotranspirada. Após vinte dias nestas condições, foram
coletadas folhas para extração de proteína. O proteoma da variedade de arroz de sequeiro Três Meses Antigo foi analisado
utilizando a eletroforese bidimensional (2-DE) e espectrometria de massa, a fim identificar proteínas possivelmente
envolvidas na tolerância à seca. Foi observado um total de aproximadamente 300 proteínas variando em tamanho de
10 a 220 kDa e em pH de 4-7. A comparação dos perfis de proteínas expressas na condição controle e sob estresse
hídrico revelou uma maior intensidade das proteínas na condição de estresse. Cerca de 70 proteínas foram excisadas
dos géis e analisadas por espectrometria de massa. Um total de 45 proteínas foram identificadas, incluindo algumas
diretamente relacionadas ao estresse hídrico.
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Resumos do 54º Congresso Brasileiro de Genética • 16 a 19 de setembro de 2008
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Identificação e caracterização de genes
induzidos pela Xanthomonas campestris pv.
viticola em videira
Malafaia, CB1; Costa, AF2; Donato, VMTS2; Silva, MV1; Castro, NR2
Centro de Ciências Biológicas/Departamento de Bioquímica/UFPE
2
Laboratório Genoma/Instituto Agronômico de Pernambuco/IPA
[email protected]
1
Palavras-chave: Vitis vinifera, “Differential Display”, cancro bacteriano, genes de resistência
A videira (Vitis vinifera L.) constitui uma das principais culturas para exportação e se destaca entre as culturas irrigadas,
com maior importância para o mercado interno (Silva & Correia, 2000). Esta cultura apresenta sua produtividade
e qualidade prejudicada por diversos fatores, incluindo o cancro bacteriano, doença causada pela Xanthomonas
campestris pv. viticola (Nayudu). Os sintomas dessa bacteriose são principalmente necrose nas folhas e ráquis. Dentre
as medidas de controle da doença, destaca-se a resistência genética das plantas ao patógeno, uma vez que o uso de
tratamento químico e térmico, não tem mostrado eficiência adequada, além de elevar o custo de produção da cultura
(Lima e Mashima, 2000). A resposta da planta ao estresse biótico, a nível celular, envolve ativação de genes do hospedeiro
que estão inativos ou com expressão muito baixa, e que são regulados pela presença do patógeno. O objetivo desse
trabalho foi identificar e caracterizar molecularmente genes envolvidos no mecanismo de defesa da videira contra a
bactéria X. campestris pv. viticola. Mudas da variedade Pausen, padrão de resistência ao patógeno, cultivadas em casa-devegetação, foram inoculadas com uma suspensão da bactéria Xanthomonas campestris pv. viticola com uma concentração
108 ufc/ml utilizando método de pulverização foliar. O grupo de plantas controles foi inoculado com água estéril pelo
mesmo método. Após 0, 6, 12, 24 e 48 horas da inoculação, o RNA total foi extraído do tecido vegetal utilizando
o reagente Trizol. A síntese do cDNA total seguida da reação de PCR foi realizada utilizando-se o kit superscript III
one step RT-PCR (Invitrogen). Os produtos obtidos da RT-PCR diferencialmente expressos foram seqüenciados
e, posteriormente, realizada uma análise de homologia/similaridade com seqüências mantidas em banco de dados,
utilizando para tal o programa BLAST (Altschul et al., 1997). As análises permitiram a identificação de genes com
função em diferentes processos relacionados à resistência contra fitopatógenos como: resposta de hipersensibilidade,
síntese e transporte de metabólicos antimicrobianos, percepção e transdução de sinal e síntese de proteínas relacionadas
à patogênese que poderão ser usados como marcadores moleculares ou transferidos para cultivares sensíveis em programa
de melhoramento genético da videira.
Apoio financeiro: CNPq/MCT/FACEPE e Embrapa.
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Expressão gênica diferencial durante
tolerância à cochonilha do carmim
em palma forrageira
Pereira, KFR1; Santos, DC3; Silva, DMP3; Donato, VMTS3; Silva, MV2; Mergulhão, ACES3
Departamento de Ciências Biológicas/UFPE
2
Departamento de Bioquímica/UFPE
3
Laboratório de Genoma/Instituto Agronômico de Pernambuco/IPA
[email protected]
1
Palavras-chave: Opuntia sp, Dactylopius opuntiae, genes de tolerância, Clonagem, DDRT-PCR
A palma forrageira possui grande importância sócio-econômica para o semi-árido nordestino devido à sua utilização
como cultura de subsistência, principalmente como ração animal nos períodos de estiagem prolongada. A cochonilha
do carmim (Dactylopius opuntiae), constitui hoje a principal praga da palma forrageira nessa região. Uma alternativa
de cultivo para a palma nas regiões atacadas por esse inseto é a utilização de clones resistentes. A identificação de genes
diferencialmente expressos tem sido usada como uma importante abordagem experimental para conhecer função gênica
e compreender os mecanismos moleculares que estão relacionados com processos tolerância. A técnica de Differencial
display RT-PCR (DDRT-PCR) vem sendo eficiente na análise de genes de defesa em plantas sob estresse biótico. Este
trabalho teve como objetivo identificar, clonar e seqüenciar genes diferencialmente expressos em genótipo resistentes de
palma forrageira à cochonilha do carmim utilizando a técnica DDRT-PCR. Raquetes enraizadas da variedade resistente,
IPA Sertânia (IPA 200174), foram obtidas de cultivo in vitro e utilizadas na inoculação com ninfas de D. opuntiae. O
RNA total foi extraído das raízes das plantas com três dias após a infestação com o inseto utilizando o reagente Trizol
(Invitrogen) e o cDNA obtido utilizando o Kit SuperScript III First-Strand Syntesis for RT-PCR (Invitrogen). Os
produtos da RT-PCR diferencialmente expressos foram submetidos ao seqüenciamento em seqüenciador automático e,
posteriormente, realizada uma análise de homologia/similaridade com seqüências mantidas em banco de dados, utilizando
para tal o programa BLAST. Um total de 30 fragmentos de cDNA diferencialmente expressos foram detectados, clonados
em vetores TOPO TA (Invitrogen) e seqüenciados. Comparações das seqüências obtidas com seqüências depositadas em
bancos de dados mostraram identidade com genes que estão envolvidos em diversos processos relacionados à tolerância
a pragas, como formação de espécies de oxigênio reativas, resposta de hipersensibilidade, morte celular programada,
percepção e transdução de sinal, dentre outros. Com os resultados obtidos, foi possível identificar alguns fragmentos
potencialmente envolvidos em respostas à condição de infestação pela praga.
Apoio Financeiro: EMBRAPA/IPA.
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Avaliação da secreção de quitinases no
tomateiro durante o processo de infecção
com o Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
Silva, TD¹; Amaral, DOJ1; Silva, MLRB2; Donato, VMTS2; Silva, MV1
Centro de Ciências Biológicas/Departamento de Bioquímica/UFPE
2
Laboratório de Genoma/Instituto Agronômico de Pernambuco/IPA
[email protected]
1
Palavras-chave: Lycopersicon esculentum, quitinases, murcha-de-fusário
A cultura do tomateiro é a segunda hortaliça de importância econômica no Brasil. Entretanto, vários fatores têm
contribuído para reduzir a sua produtividade devido à ocorrência de problemas fitossanitários, dentre os quais se destaca
a murcha-de-fusário ou fusariose, causado pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici. A resistência genética tem
sido apontada como a melhor estratégia para o manejo desta doença fúngica. As enzimas hidrolíticas quitinases são
proteínas relacionadas à patogenicidade e a sua real função nas reações de defesa nas plantas ainda não está totalmente
esclarecida. Este trabalho tem como objetivo verificar a secreção de quitinases no tomateiro durante o processo de
infecção do Fusarium a fim de avaliar a sua participação na defesa contra a fusariose. Plântulas da cultivar BRH, resistente
a murcha-de-fusário, com três semanas após a germinação sob condições in vitro foram inoculadas com a raça 2 do F.
oxysporum f. sp. lycopersici e após 24, 48 e 72h extraídas proteínas totais dos tecidos foliares e radiculares. As proteínas
totais foram quantificadas por Bradford e atividade enzimática de quitinase foi determinada pela quantificação de N-acetil
glicosamina (NAcGlc) formada a partir da degradação dos substratos sintéticos N,N’-diacetilquitobiose (dímero) e
N,N’,N’’,N’’’-tetracetilquitotetraose (tetrâmero), além da detecção de atividade de quitinase em géis utilizando glicol
quitina (0,01%) como substrato. Os resultados demonstram que nos extratos protéicos obtidos a partir de folhas e raízes
da cultivar BRH após 24h da inoculação com Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici raça 2 aumentou significativamente
a secreção de endoquitinases em relação aos extratos de folhas e raízes tratadas com H20. Já as exoquitinases tiveram a
secreção aumentada nos tecidos analisados obtidos após 48h da inoculação. A síntese e o acúmulo em tecidos vegetais
de hidrolases como as quitinases, têm sido freqüentemente associados aos mecanismos de defesa de plantas a doenças,
uma vez que podem ser desencadeados por patógenos, metabólicos provenientes de microorganismos ou substâncias
químicas que agem como indutores de resistência.
Apoio Financeiro: BNB e CNPq/MCT/FACEPE.
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Geração de progênies segregantes
interespecíficas entre maracujazeiros
comerciais (Passiflora edulis Sims F. flavicarpa
O. DEG e P. alata Curtis) e silvestres
(P. cincinnata Mast e P. setacea DC)
Pereira, AS1; Cruz, DF1; Ganem, ELO2, Cerqueira-Silva, CBM3; Oliveira, AC1
Laboratório de Biologia Geral, Departamento de Ciências Naturais, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), Vitória da Conquista/BA
2
Diretoria do Campo Agropecuário/UESB
3
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus/BA
[email protected]
1
Palavras-chave: hibridação, melhoramento vegetal, passicultura, resistência, maracujá
O Brasil é o maior produtor mundial de maracujá com produção de 317mil/ton/ano em 35 mil ha, com a geração
de 250 mil empregos e receita de R$ 500 milhões/ano. O Estado da Bahia é o principal produtor com 139.910t/
ano. As espécies P. edulis flavicarpa (maracujazeiro-‘amarelo’; ‘MA’) e P. alata (maracujazeiro-‘doce’; ‘MD’) são as mais
cultivadas. ‘MA’ ocupa 95% do cultivo no país e ‘MD’ obtém bons preços in natura. Outras espécies são cultivadas
regionalmente como P. cincinnata (maracujazeiro-‘do-mato’; ‘MM’). A passicultura, por decorrência da ação de vários
patógenos como o vírus CABMV (cowpea aphid-borne mosaic virus), causador da virose do endurecimento dos frutos, a
bactéria Xanthomonas campestris pv. Passiflorae (Xc) e nematóides, incluindo os do gênero Meloidogyne, vem apresentando
produtividade diminuída. Alguns acessos de ‘MM’ foram reportados na literatura como resistentes a ‘Xc’ e tolerantes a
Meloidogyne sp e de ‘MS’ (maracujazeiro-‘do-sono’, P. setacea DC) como resistentes a antracnose e a viroses. Tanto quanto
se sabe, inexistem relatos na literatura quanto a geração de progênies segregantes entre genótipos de ‘MD’ e o ‘MM’,
nativos do Brasil e de ‘MA’ e ‘MS’, oriundos da Bahia. A hibridação sexual de maracujazeiros comerciais com espécies
silvestres do gênero, com vistas à introdução de genes de resistência a fitopatógenos, é uma importante estratégia a ser
explorada em programas de melhoramento. O presente trabalho objetivou (i) gerar progênies segregantes interespecíficas
entre essas quatro espécies de Passiflora e (ii) determinar a viabilidade de cruzamentos entre estas espécies. Para tanto se
realizou 25 cruzamentos entre dois genótipos ‘MD’ (prog. feminino) vs dois genótipos ‘MM’ (prog. masculino)] e 25
cruzamentos entre dois genótipos ‘MS’ (prog. feminino) vs dois genótipos‘MA’ (prog. masculino)]. Todas as plantas
apresentavam frutificação e estado fitossanitário satisfatórios, sendo oriundas de Vitória da Conquista/BA. As flores
receptoras foram emasculadas e cobertas em pré-antese, até o momento da polinização, sendo novamente recobertas. De
um total de 50 cruzamentos obteve-se taxa de pegamento, nº sementes/fruto e média de sementes/fruto de 28%, 59 a
135 e 90 ± 30; e 44%, 34 a 286 e 103.3 ± 81.6 para os cruzamentos ‘MD’ vs ‘MM’ e ‘MS’ vs ‘MA’, respectivamente.
As progênies segregantes obtidas destes cruzamentos compõem a coleção de trabalho de germoplasma de Passiflora da
UESB para futuros estudos, especialmente no que tange a caracterização da resistência genética de ‘MM’ e do ‘MS’ à
Xc e ao CABMV, respectivamente.
Apoio Financeiro: FAPESB.
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TCTP de mandioca: isolamento de uma
seqüência de cDNA e análise da expressão
em raízes e folhas
Santa Brígida, AB1; Nascimento, SB1; Conceição, LCS1; de Souza, CRB*
Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém-PA
1
Bolsista PIBIC-CNPq
*[email protected]
Palavras-chave: Mandioca, TCTP, Promotor, Raiz de reserva, RT-PCR semi-quantitativa
A Mandioca (Manihot esculenta Crantz), nativa da Amazônia, pertence à família Euphorbiaceae. As raízes da mandioca
são utilizadas como fonte alimentar por mais de 600 milhões de pessoas na África, América latina e Ásia. Contudo são
consideradas pobres em termos nutricionais devido ao baixo conteúdo de proteínas, micronutrientes e vitaminas. Neste
sentido, a Biotecnologia pode ser empregada para aumentar o valor nutricional da mandioca, e para isto, seqüências
promotoras tecido-específicas de raiz são essenciais para direcionar a expressão do gene de interesse no local adequado.
Genes de mandioca possivelmente envolvidos na formação da raiz de reserva foram identificados através de análise de
expressão gênica comparativa em amostras de raízes de reserva e adventícias. Entre eles, o gene que codifica para uma
proteína de tumor controlada traducionalmente (TCTP). A função desta proteína em plantas ainda é desconhecida,
porém plantas transgênicas expressando uma TCTP apresentaram crescimento aumentado. O gene TCTP de mandioca
é um potencial candidato para o isolamento da seqüência promotora de raiz, contudo estudos de expressão espacial
devem ser realizados para determinar a variação nos níveis de transcritos em diferentes órgãos/tecidos da planta. Desta
forma, o objetivo do presente trabalho foi isolar uma sequência de cDNA que codifica para uma TCTP de raiz de
mandioca e avaliar a sua expressão em raízes e folhas. Amostras de RNA total foram obtidas a partir de raízes e folhas,
as quais apresentaram padrão de qualidade satisfatório, de acordo com análise em gel de agarose contendo formaldeído.
As amostras de RNA total foram tratadas com DNAse e utilizadas na reação de transcrição reversa com o primer dT.
O cDNA sintetizado a partir da amostra de raízes foi utilizado como molde na PCR com primers para a TCTP. O
fragmento amplificado de 505 pb foi clonado e seqüenciado. A seqüência nucleotídica obtida foi avaliada através de
análises computacionais em bancos de dados empregando-se o programa BLASTx do NCBI. Os resultados mostram
que a proteína deduzida a partir da sequência nucleotídica obtida apresenta alta identidade com proteínas do tipo
TCTP depositadas em bancos de dados, entre elas, a TCTP de seringueira (Hevea brasiliensis). As amostras de cDNAs
de raízes e folhas estão sendo utilizadas em experimentos de RT-PCR semi-quantitativa. Como controle constitutivo
destes experimentos está sendo utilizado gene da tubulina.
Apoio financeiro: CNPq, SECTAM/FUNTEC-PA, Departamento de Ciência e Tecnologia do Ministério da Saúde,
Cassava Biotechnology Network (Cali, Colombia) e UFPA.
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Obtenção da sequência 5’ do cDNA
que codifica para uma proteína bZIP
de mandioca através de RACE - Rapid
Amplification of cDNA Ends
Cardoso, CMY1; Conceição, LCS1; Moreira, ECO; Santa Brígida, AB1; Nascimento, SB; de Souza, CRB
Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém-PA
1
Bolsista PIBIC-CNPq
[email protected]
Palavras-chave: bZIP, Fatores de Transcrição, Expressão Gênica, Mandioca, RACE
A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma espécie originária da América do Sul e pertencente à família Euphorbiaceae.
As raízes de reserva da mandioca constituem uma importante fonte energética para as populações de países da América
do Sul, Ásia e África, sendo composta de aproximadamente 80% de amido e apenas 1-2% de proteína. Estudos para a
identificação de genes e proteínas expressas na raiz de reserva são essenciais para um melhor entendimento do processo de
formação deste órgão de reserva. Dentre esses, as proteínas reguladoras do tipo bZIP (basic-leucine zipper) desempenham
funções importantes em diferentes processos biológicos, incluindo desenvolvimento em órgãos de reserva vegetais. Neste
sentido foram iniciados trabalhos que possibilitaram o isolamento de uma sequência parcial de cDNA que codifica
para uma proteína putativa do tipo bZIP de raiz de mandioca. Dando continuidade aos estudos iniciados, o presente
trabalho teve como objetivo o isolamento da extremidade 5’ do cDNA da bZIP através de experimentos de RACE
(Rapid Amplification of cDNA Ends). Para isto, foi extraída uma amostra de RNA total de raízes, a qual apresentou
padrão de qualidade satisfatório, de acordo com análise em gel de agarose contendo formaldeído. A amostra de RNA
foi utilizada na síntese do cDNA empregando-se o SMART RACE cDNA Amplification Kit, da Clontech. Para a
amplificação dos fragmentos de interesse foram utilizados primers específicos baseados na sequência parcial previamente
isolada. A análise em gel de agarose mostrou a amplificação de fragmentos com 650 pb, 800pb e 1100 pb, os quais
foram clonados e seqüenciados. As seqüências nucleotídicas obtidas foram avaliadas através de análises computacionais
em bancos de dados empregando-se o programa BLASTx do NCBI. Os resultados mostram que as proteínas deduzidas
a partir das seqüências nucleotídicas obtidas apresentam alta identidade com a proteína bZIP88 de Glycine max
(acesso ABP88230 do NCBI) que pode estar relacionada a estresse abiótico.
Apoio financeiro: CNPq, SECTAM/FUNTEC-PA, Departamento de Ciência e Tecnologia do Ministério da Saúde,
Cassava Biotechnology Network (Cali, Colombia) e UFPA.
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bZIP de Castanha-do-Brasil: isolamento
de uma seqüência de CDNA e análise da
expressão temporal e espacial
Moreira, ECO; Nascimento, SB; Darnet, SH; de Souza, CRB
Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém-PA
[email protected]
Palavras-chave: bZIP, Fatores de transcrição, Regulação da expressão gênica, Castanha-do-Brasil, RT-PCR semi-quantitativa
A castanha-do-Brasil (Bertholletia excelsa H.B.K) é uma semente que apresenta um elevado valor nutricional devido
à proteína Albumina 2S, rica em metionina. Essa proteína é codificada pelo gene BE2S1, cuja expressão é regulada
durante o desenvolvimento da semente, constituindo, desta forma, um modelo interessante para o estudo da regulação
da expressão gênica em nível transcricional. Sabe-se que este tipo de regulação ocorre através da interação de proteínas
reguladoras com seqüências específicas da região promotora do gene. Proteínas reguladoras do tipo bZIP são caracterizadas
por apresentarem uma região básica, responsável pela ligação ao DNA e um domínio Zíper de leucina conservado,
envolvido na dimerização. Opaco-2 é uma proteína do tipo bZIP que ativa a transcrição de genes de reserva de sementes
em diferentes espécies vegetais. Estudos anteriores indicaram a possibilidade de uma bZIP, similar a Opaco-2 de
milho, estar envolvida na regulação da expressão do gene BE2S1. Baseado nisto, foi isolada uma sequência parcial de
cDNA que codifica para uma proteína putativa do tipo bZIP de castanha-do-Brasil. Dando continuidade aos estudos
iniciados, o presente trabalho teve como objetivo o isolamento das extremidades 5’ e 3’ deste cDNA através de RACE
(Rapid Amplification of cDNA Ends) e a análise da expressão temporal e espacial em folhas e sementes através de RTPCR semi-quantitativa. Para isto, foram extraídas amostras de RNA total de folhas e sementes em três estágios de
desenvolvimento (II, III e IV). A amostra de RNA de sementes (estágio III) foi usada na síntese dos cDNAs 5’ e 3’
empregando-se o SMART RACE cDNA Amplification Kit, da Clontech. As amostras de cDNA foram utilizadas em
ensaios de PCR com primers específicos para a sequência parcial previamente isolada. Os fragmentos amplificados foram
clonados e seqüenciados. O alinhamento das seqüências nucleotídicas 5’ e 3’ mostrou uma região de sobreposição de
500 pb, além disso, quando alinhadas com a sequência parcial, comprovou se tratar do mesmo cDNA previamente
isolado. A análise da sequência de cDNA final empregando-se o programa BLASTx do NCBI mostrou que a proteína
deduzida apresenta alta identidade com a bZIP G/HBF-1 de Glycine max (acesso CAA71687 do NCBI). Para os
experimentos de RT-PCR semi-quantitativa, as amostras de RNA de sementes (estágios II, III e IV) e folhas foram
tratadas com DNase e utilizadas na reação de transcrição reversa com o primer dT. Em seguida, os cDNAs sintetizados
foram utilizados como templates nos ensaios de PCR com primers para o gene de tubulina (controle constitutivo) e da
bZIP. Os resultados da RT-PCR semi-quantitativa mostraram que o gene da bZIP é expresso em grandes quantidades
nas folhas e apresenta expressão regulada durante o desenvolvimento da semente, podendo desta forma, participar da
regulação do gene Be2S1.
Apoio financeiro: CNPq, Capes e UFPA.
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Construção de um cassete de expressão
para silenciamento do gene da estaquiose
sintase em soja (Glycine max),
via RNA de interferência
Lopes, LS; Fialho, LS; Barros, BA; Rezende, ST; Barros, EG
Departamento Biologia, BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: Alimentação, monogástrico, RNA de interferência, silenciamento gênico, galactooligossacarídeos
A soja é considerada excelente fonte de proteínas para uso na alimentação humana e animal. No entanto, existem fatores
que limitam o seu consumo e de seus derivados. Dentre eles estão os inibidores de proteases, lectinas, proteínas alergênicas,
ácido fítico e galactooligossacarídeos (GO). Os GO, dentre os quais o mais abundante é a estaquiose, são responsáveis
por distúrbios gastrointestinais em humanos e animais monogástricos uma vez que estes não possuem enzimas que
promovam a hidrólise desses açúcares. Técnicas de engenharia genética podem facilitar o desenvolvimento de novas
variedades de soja com reduzido conteúdo de GO. Uma estratégia que vem sendo empregada para o silenciamento de
genes específicos é a interferência por RNA ou RNA interference. Esta técnica de silenciamento gênico pós-transcricional
é altamente eficiente, principalmente quando a construção resulta na formação de um RNA hairpin espaçado com um
íntron (hpRNA). O objetivo deste trabalho foi a construção de um cassete de expressão para o silenciamento gênico, via
interferência por RNA, do gene da enzima estaquiose sintase (STS) de soja. O RNA total foi extraído de sementes da
variedade comercial CAC-1 e o cDNA foi sintetizado por RT-PCR, usando oligo(dT) e primers degenerados desenhados
a partir de seqüências conservadas disponíveis na literatura, do gene da STS de leguminosas. Um fragmento de 983
pb foi isolado, clonado e seqüenciado, demonstrando ser parte do gene da STS. Com base na seqüência desse clone,
foram desenhados primers internos específicos contendo, em suas extremidades, sítios de clivagem para as enzimas XhoI
ou KpnI, para a clonagem do fragmento sense, e sítios para as enzimas ClaI ou XbaI, para a clonagem do fragmento
antisense. Os dois produtos obtidos pela amplificação do DNA de soja com os referidos primers tinham 386 pb e
foram clonados no vetor pGEM-T Easy e confirmados por meio de seqüenciamento. Em seguida, foram clonados em
sítios apropriados no vetor de expressão pKANNIBAL flanqueados pelo promotor CaMV 35S e a região terminadora
OCS, e espaçados pelo íntron Pdk. O cassete obtido foi transferido para o vetor binário pCAMBIA 3301. O cassete
construído será transferido para o genoma de soja via Agrobacterium tumefaciens e via biobalística visando silenciar o
gene que codifica a enzima STS de soja. Espera-se que o silenciamento desse gene provoque uma redução no conteúdo
total de GO em sementes de soja, diminuindo os efeitos detrimentais do consumo da soja e de seus derivados por
humanos e animais monogástricos.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Análise in silico de cDNAs reguladores no
processo floral em cana-de-açúcar
Silva, FL; Souto, V; Duarte, MAG; Agnez-Lima, LF; Scortecci, KC
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Biologia Celular e Genética
[email protected]
Palavras-chave: floração, bibliotecas subtrativas, análise in sílico
A transição do meristema apical para o meristema floral é uma fase crucial na vida da planta. A indução da floração
em cana-de-açúcar produz um efeito drástico na redução da produção de açúcar, que pode chegar a até 60%. Este
trabalho tem como objetivo a análise in silico de cDNAs associados ao processo de floração em cana-de-açúcar. Para
tanto, foram construídas bibliotecas subtrativas de variedades precoce e tardia de cana-de-açúcar. Foi utilizado os kits:
Super Smart cDNA synthesis e BD Clontech PCR select cDNA subtraction (Clontech). O material obtido foi clonado no
vetor pGEM T-easy (Promega) e transformado em células competentes de E. coli DH10B. Os clones obtidos foram
seqüenciados e analisados utilizando o programa BLASTn contra o banco de dados do NCBI e do genoma de A. thaliana,
considerando e-value maior que 10-15. Posteriormente, foram escolhidas duas seqüências para realização de uma análise
in sílico utilizando várias ferramentas da bioinformática e banco de dados: TIGR, TAIR, NCBI, G-blocks, ClustalW,
Expansy,PAUP 4.0 e Tree View. Os resultados obtidos para as análises in sílico mostraram que para o cDNA de cana com
homologia a proteína FCA, este apresentou uma identidade que variou de 40% em A. thaliana e 92% em O. Sativa.
Foi analisado a presença do domíneo funcional para todas sequências, entretanto a sequencia scFCA apresentou um
domínio parcial com 3e-10-32. Para a segunda sequencia analisada scGRAS, foi encontrado que esta apresentou e-value
2e-10-72,com domínio conservado e identidade variado de 56% para A.thaliana e para Z. mays 76%. Foi realizado
também uma análise filogenética, que para a sequência scFCA foi observado a presença de duplicações em plantas, e a
presença de dois ramos um correspondente a sequências de monocotiledôneas e um segundo referente a dicotiledôneas.
Para a sequencia scGRAS foi possível duplicações entre os diferentes organismos, e provavelmente estas duplicações
possam ser antigas uma vez que não foi possível observar ramos diferentes com sequências de monocotiledôneas e
dicotiledôneas. duplicação diferente dos demais organismos comparados, e encontradas em cromossomos diferentes
de A.thaliana e O. sativa.
Auxílio Financeiro: CNPq.
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Caracterização de quatro fitocistatinas
da interação Theobroma cacaoMoniliophtora perniciosa
Freitas, ACO1; Pirovani, CP1; Santiago, AS1; dos Santos, LS1; Alvim, FC1; Margis, R2; Pereira, GAG3; Cascardo, JCM1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
2
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: cisteíno-protease, atividade antifúngica e splicing alternativo
As fitocistatinas são inibidores de cisteíno-proteinases de plantas envolvidos na regulação do “turnover” de proteínas
endógenas, morte celular programada (PCD) e defesa contra estresses bióticos e abióticos. Quatro clones de cistatinas
foram identificadas em bibliotecas de cDNA da interação Theobroma cacao-Monilliophytora perniciosa (Mp). As quatro
ORFs foram completamente seqüenciadas e nomeadas TcCYS1, TcCYS2, TcCYS3 e TcCYS4. As seqüências de
aminoácidos deduzidas codificam proteínas contendo a seqüência QxVxG das cistatinas, e com 209, 127, 124 e 205
resíduos de aminoácidos, respectivamente. Análise da estrutura gênica indica que TcCYS1/TcCYS3, correspondem a
formas de processamento alternativo de transcritos de um único gene, sendo representantes da família II das cistatinas.
Alinhamento de seqüências aminoacídicas e análises filogenéticas mostram que a identidade de seqüência entre
TcCYS1/TcCYS3 e TcCYS2/TcCYS4 é inferior a 50%, mas TcCYS1 e TcCYS3 possuem 97% de identidade de
seqüência e agrupa com cistatinas de arabidopsis (At5g05110) e bálsamo (PtCys9), enquanto, TcCYS2 e TcCYS4
têm 88% de identidade e agrupam com cistatinas de algodão (Tc59933), Eucalyptus grandis (19204304) e carvalhovermellho (DN950946). As Quatro ORFS foram expressas em bactéria e purificadas por cromatografia de afinidade.
A atividade inibitória de papaína foi testada com o substrato colorimétrico, BApNA, e os valores de Ki determinados
pela equação de Henderson foram 112, 76.8, 152.4 e 92.8 ηM, respectivamente. As proteínas inibiram o crescimento
do fungo Mp (Agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro) in vitro e as proteínas TcCYS3 e TcCYS4, imobilizadas
em CNBr-sepharose, capturaram duas isoformas de proteases secretadas pelo fungo, conforme atividade enzimática
em gelatina/SDS-PAGE 0.1%. As regiões C-terminal de TcCYS1 e TcCYS4 foram expressas em bactéria e as proteínas
recombinantes purificadas não inibiram papaína, mas capturaram as mesmas isoformas de proteases de extratos de
folha de cacau, que interagem com TcCYS3 e TcCYS4 inteiras. Anticorpos policlonais contra a proteína TcCYS4
recombinante foram produzidos em coelho permitindo a detecção da proteína endógena em diferentes tecidos de cacau,
por immunoblotting. A proteína com o peso molecular esperado de ~25 kDa foi detectada com maior intensidade em
extratos de semente e folhas jovens, raízes e caule. A banda menos intensa foi detectada em folha madura e a proteína
não foi detectada em folha de vassoura madura, corroborando com a atividade de cisteíno-proteases em PCD, que resulta
no estágio de vassoura seca. O immunoblotting também revelou reação cruzada do anticorpo anti-TcCYS4 contra uma
proteína de ~85 kDa, compatível com uma multicistatina já caracterizada em tomate e batata. Um immunoblotting
com extratos protéicos de meristema extraídos três dias após inoculação com basidiósporos de Mp, tratados com NEP
(necrosis and ethylene-inducing proteins) e tratados com sobrenadante de cultura do fungo, mostrou que a proteína
de 85 kDa foi induzida por esses tratamentos. Esses dados indicam a caracterização de novas fitocistatinas.
Apoio Financeiro: CNPq, FINEP/FAPESB e UESC.
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Caracterização da seqüência promotora
do cDNA scMUTM2
Trindade, AS; Medeiros, SRB; Agnez-Lima, LF; Scortecci, KC
LBMG, Depto. de Biologia Celular e Genética, DBG, UFRN, Natal, RN, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: MutM, Promotor, Cana-de-açúcar, motivos
A produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) ocorre de forma balanceada com moléculas anti-oxidantes, vários
danos podem ser causados às células inclusive necrose ou apoptose. O 7,8-dihidro-8-desoxiguanina (8-oxodG) é um
dos principais danos causados ao DNA e leva à formação de adutos deletérios, entre os quais está o 8-oxodG, que pode
causar transversões do tipo G-C para T-A, levando à mutações se estas não forem corrigidas. A correção destas lesões é
realizada pela enzima formamidopirimidina-DNA-glicosilase (FPG ou MUTM como conhecida em plantas), que atua
através da via de Reparo por Excisão de Bases (REB). No projeto SUCEST foram encontradas duas seqüências com
alta similaridade às proteínas MUTM denominadas scMUTM1 e scMUTM2. O objetivo deste trabalho é analisar o
cDNA scMUTM2 através de sua clonagem e caracterização. Sua região promotora foi clonada por meio do método de
PCR-walking. Com isto, foi obtida uma seqüência promotora de aproximadamente 880pb. Inicialmente o promotor
foi analisado quanto à presença de CARE (cis-acting Regulatory Elements) pelo programa PlantCare. Foram encontrados
vários elementos reguladores de resposta à luz, elementos de resposta às moléculas anti-oxidantes e ao ácido abcísico
através do PlantCARE o que indica uma possível relação desta região promotora com o reparo ao estresse oxidativo.
Para a análise funcional, deleções crescentes foram feitas através da metodologia de PCR, partindo da extremidade 5’
do promotor. Para isso foram desenhados sete primers forward e dois primers reverse. Foram realizadas as amplificações
do DNA com estes primers, e foram obtidos os fragmentos esperados correspondentes as diferentes deleções realizadas.
Dez diferentes deleções crescentes foram obtidas no promotor do gene scMUTM2 através da PCR, essas deleções
foram confirmadas por meio de digestões com enzimas de restrição. Estes fragmentos serão agora fusionados ao gene
repórtere β-gucuronidase (GUS) para posterior transformação de plantas como Oriza sativa, Nicotiana tabacum e
Arabidopsis thaliana.
Auxílio financeiro: CNPq, PROPESQ-UFRN.
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Expressão heteróloga de uma proteína
de choque térmico (VuHSP17.7) isolada
de feijão-caupi (Vigna unguiculata)
Hottz, ED1; Simões-Araújo, JL2
Biólogo - Curso de Biologia Centro Universitário de Barra Mansa - Pró-reitoria Acadêmica
2
Embrapa Agrobiologia – BR 465 Km 07, Seropédica – RJ
[email protected]
1
Palavras-chave: Tolerância ao estresse térmico, clonagem, expressão heteróloga,
HSP (Heat Shock Protein), feijão-caupi (Vigna unguiculata)
Previsões recentes têm mostrado uma alteração significativa nas condições climáticas globais, com mudanças significadas
no que refere a temperatura o que poderá trazer prejuízos para diversas espécies vegetais. Em condições tropicais, onde as
temperaturas são naturalmente mais altas, os efeitos deletérios das mundanas climática podem ser ainda mais prejudiciais
acarretando diminuição de produtividade significativas. Devido a sua característica séssil as plantas desenvolveram
diversos mecanismos de tolerância que possibilitam a conclusão do ciclo de vida mesmo em ambiente sob estresse. A
tolerância ao estresse térmico em plantas é uma característica complexo relacionada com vários mecanismo bioquímicos
e moleculares; no entanto, diversos genes relacionados à tolerância já foram isolados e caracterizados. O feijão-caupi
constitui-se uma espécie bastante interessante para a identificação de genes relacionados com o processo de tolerância,
pois apresenta boa tolerância a estresse hídrico e estresse térmico. Com o objetivo de contribuir para a compreensão dos
processos bioquímicos envolvidos nessa última característica, um gene de feijão-caupi relacionado à sua tolerância ao
estresse térmico foi clonado e a proteína para a qual este gene codifica expressa in vitro. A região codificadora do gene
denominado VuHSP17.7 foi amplificada por PCR a partir de um clone isolado de uma biblioteca de cDNA construída
a partir de nódulos submetidos a estresse térmico. Amplificação foi realizada em duas etapas para inclusão dos sítios
de recombinação necessários para a clonagem do produto de PCR nos vetores pDONR201, pDEST17 e pDEST24
do Sistema Gateway (Invitrogen). Após as reações de recombinação os clones foram utilizados para a transformação de
Escherichia coli DH10B. Para confirmação da clonagem, o DNA plasmidial extraído das bactérias transformadas foi
digerido com as endonucleases de restrição HindIII, EcoRI e PvuI e, o tamanho dos fragmentos verificado através de
eletroforese em gel de agarose. A expressão da proteína foi induzida com IPTG e a proteína purificada foi visualizada
através de eletroforese em gel de poliacrilamida. Através destes experimentos foi possível obter a seqüência codante do
gene VuHSP17.7 clonado em diferentes vetores interesse (pDONR201, pDEST17 e pDEST24) e a proteína expressa
em bactérias isolada.
Apoio financeiro: Embrapa, CNPq e FAPERJ.
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Construção de cassetes de super expressão
para o cDNAs scMUTM1 e scMUTM2
de cana-de-açúcar
Barros, WITS; Medeiros, SRB; Agnez-Lima, LF; Scortecci, KC
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica/UFRN
[email protected]
As vias de reparo de DNA são requeridas para manter a estabilidade genômica e garantir a sobrevivência do organismo.
No banco de dados da SUCEST foram identificados quatro clusters que apresentam alta similaridade com proteínas
MutM de bactérias da via de reparo BER. A MutM corresponde a uma DNA gliocosilase que em Escherichia coli detecta
e retira a 8-oxoG. O objetivo deste trabalho é caracterizar os cDNAs scMUTM1 e scMUTM2 em plantas através da
construção de cassetes de superexpressão. Inicialmente foi realizada a construção do cassete de super-expressão em
orientação anti-senso. Para isto, o cDNA scMUTM1 foi retirado do vetor pSPORT1 com as enzimas de restrição
Not1 e Sal1, tratado com a enzima de modificação T4 DNA polimerase de modo a gerar pontas cegas. O plasmídeo
contendo a região promotora 35S foi digerido com a enzima BamH1, e tratado com a T4 DNA polimerase de modo
a gerar pontas cegas. Esse material foi separado em gel de agarose 0,7 % e purificado com o kit GFX. Este material foi
ligado e transformado em bactérias competentes DH10B. Com as colônias obtidas foram realizadas o procedimento
de mini-prep. Para determinar a orientação o material foi digerido com a enzima BamH1. Para a construção do cassete
de super-expressão em orientação senso, a abordagem foi diferente. O plasmídeo pSPORT1 contendo os cDNAs foi
digerido com as enzimas de restrição KpnI e SmaI. A região promotora 35S foi retirada do plasmídeo pKCS42 por meio
da digestão com as enzimas de restrição KpnI e SmaI. Os fragmentos correspondente ao vetor pSPORT1 e promotor 35
S foram isolados em gel de agarose 0,7 % e purificados com o kit GFX (GE). Este material foi ligado e transformado
em bactérias competentes DH10B. Com as colônias obtidas foram realizadas o procedimento de mini-prep. Este DNA
plasmidial obtido foi digerido com as endonucleases de restrição Pst1, Sal1 e HindIII de modo a confirmar a presença
do promotor 35S no cassete. Os padrões obtidos após a digestão com estas diferentes enzimas confirma a presença da
região promotora 35S em orientação senso com os cDNAs. Estes clones foram sequenciados também confirmando a
integridade da construção. Agora, estes cassetes de super-expressão serão transferidos para o vetor binário pPZP211
para posterior transformação de plantas.
Auxílio Financeiro: CNPq.
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Investigação da presença de TIP100
em espécies do gênero Ipomoea nativas
do Rio Grande do Sul
Christoff, AP¹; Oliveira, LFV¹; Loreto, ELS¹; Sepel, LMN¹
Universidade Federal de Santa Maria, RS
[email protected]
1
Palavras-chave: TIP100, Elementos Transponíveis, Ipomoea
O gênero Ipomoea é amplamente distribuído no estado do Rio Grande do Sul, sendo bastante utilizado como planta
ornamental. As espécies desse gênero apresentam uma grande diversidade na morfologia e no padrão de pigmentação
das flores. Algumas dessas variações foram investigadas e estão associadas à presença de elementos de transposição.
O principal transposon de Ipomoea, denominado TIP100, pertence à família hAT (classe II), utilizando a enzima
transposase para sua transposição. Este elemento foi descrito inicialmente para a espécie Ipomoea purpurea associado ao
gene da Chalcona Sintase (CHS), sendo responsável pelo padrão variegado observado nas flores de algumas linhagens.
Este trabalho tem como objetivo principal avaliar a presença do elemento transponível TIP100 em seis espécies do
gênero Ipomoea através de amplificação por PCR. Foram usados primers específicos que delimitam uma região de 1kb
na parte central do elemento que possui 3.9kb. O elemento foi amplificado nas espécies I. purpurea, I. triloba, I. alba,
I. nil resultando em um único fragmento. Para as espécies I. indica e I. cairica o resultado das amplificações foram dois
ou mais fragmentos. Os fragmentos obtidos foram caracterizados em relação ao tamanho e posteriormente clonados
e seqüenciados. As seqüências obtidas apresentaram de 400 a 800pb e mostraram um alto grau de homologia com
o elemento já descrito. Com os dados obtidos até o momento podemos inferir que este elemento possui uma ampla
distribuição no gênero Ipomoea e encontra-se conservado. Novas espécies estão sendo incluídas nas análises para melhor
compreensão de como TIP100 está distribuído em Ipomoea e o quanto é conservado entre as diferentes espécies.
Apoio financeiro: FAPERGS.
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Desenvolvimento de marcadores funcionais
SNPs em cana-de-açúcar
Vaz, TR1; Oliveira, KM2; Rodrigues, A1; Marconi, TG1; Costa, EA1; Garcia, AAF3; Souza, AP1
Instituto de Biologia, Departamento de Genética e Evolução, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética,
Universidade Estadual de Campinas
2
Centro de Tecnologia Canavieira (CTC) Piracicaba
3
Universidade de São Paulo- Escola Superior de Agricultura-Luiz de Queiroz
[email protected]
1
Palavras-chave: cana-de-açúcar, marcadores SNPs, SUCEST
A cana-de-açúcar (Saccharum sp.) é a segunda maior fonte de energia do Brasil, com 16% de participação na matriz
energética atual, sendo o país o maior produtor mundial dessa cultura. A obtenção de novas variedades de cana-de-açúcar,
mais produtivas e resistentes a pragas e doenças torna-se um fator ímpar para o incremento da produção. O projeto
genoma (SUCEST – Sugarcane Expressed Sequence Tag) produziu o mais completo banco de dados de ESTs para a canade-açúcar. A maioria dos clusters