FENOLOGIA, BIOLOGIA FLORAL E GERMINAÇÃO - PGMP

1
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
MELHORAMENTO DE PLANTAS
ESTABELECIMENTO IN VITRO SOB CONDIÇÕES
MIXOTRÓFICAS E CRIOPRESERVAÇÃO DE Hancornia speciosa
GOMES
MARCOS DE CASTRO CARDOSO
Orientador:
Prof. Sérgio Tadeu Sibov
.
Dezembro - 2015
2
MARCOS DE CASTRO CARDOSO
ESTABELECIMENTO IN VITRO SOB CONDIÇÕES
MIXOTRÓFICAS E CRIOPRESERVAÇÃO DE Hancornia speciosa
GOMES
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Genética e Melhoramento de
Plantas, da Universidade Federal de Goiás,
como exigência para obtenção do título de
Mestre em Genética e Melhoramento de
Plantas.
Orientador:
Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov
Dezenbro - 2015
3
4
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
Na qualidade de titular dos direitos de autor, autorizo a Universidade Federal
de Goiás (UFG) a disponibilizar, gratuitamente, por meio da Biblioteca Digital de Teses
e Dissertações (BDTD/UFG), sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a
Lei nº 9610/98, o documento conforme permissões assinaladas abaixo, para fins de
leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica
brasileira, a partir desta data.
1. Identificação do material bibliográfico:
2. Identificação da Tese ou Dissertação
Autor (a): Marcos de Castro Cardoso
E-mail:
[email protected]
Seu e-mail pode ser disponibilizado na página?
[x] Dissertação
[x]Sim
[ ] Tese
[ ] Não
Vínculo empregatício do autor
Agência de fomento:
Bolsista CAPES
Coordenação de Aperfeiçoamento Sigla:
de pessoal de nível superior
País:
Brasil
UF:
GO
CNPJ: 00889834/000108
Título: Estabelecimento in vitro sob condições mixotróficas e criopreservação de
Hancornia speciosa Gomes
Palavras-chave:
Mangabeira, sistemas heterotróficos, sistemas mixotróficos,
criopreservação, vitrificação
Título em outra língua:
In vitro establishment under mixotrophic conditions and
cryopreservation of Hancornia speciosa Gomes
Palavras-chave em outra língua: mangabeira, heterotrophic systems, mixotróficos
systems, cryopreservation, vitrification
Área de concentração:
Genética e Melhoramento de Plantas
Data defesa: (dd/mm/aaaa)
18/12/2015
Programa de Pós-Graduação:
Genética e melhoramento de plantas
Orientador (a): Sergio Tadeu Sibov
E-mail:
[email protected]
Co-orientador (a):*
E-mail:
*Necessita do CPF quando não constar no SisPG
3. Informações de acesso ao documento:
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[
] NÃO1
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torna-se
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________________________________________
Assinatura do (a) autor (a)
1
Data: _20_ / _12_ /_2015_
Neste caso o documento será embargado por até um ano a partir da data de defesa. A extensão deste prazo
suscita justificativa junto à coordenação do curso. Os dados do documento não serão disponibilizados durante
o período de embargo.
5
“A terra fez brotar a vegetação: plantas que dão sementes
de acordo com as suas espécies, e árvores cujos frutos
produzem sementes de acordo com as suas espécies.
E Deus viu que ficou bom.”
Gênesis 1:12
A minha amada esposa, Débora Cristina da Silva Lima por
permanecer ao meu lado com seu carinho e atenção.
DEDICO
A minha mãe, Irene de Castro Rosa, por sempre
me apoiar e não medir esforços, para que eu
alcançasse este objetivo.
OFEREÇO
6
AGRADECIMENTOS
Acima de tudo, sou grato a Deus por me estender à mão nos momentos de
dificuldade, renovar a minha força, me fazer repousar em águas tranquilas, me dar
sabedoria para seguir nos caminhos corretos e me proteger até o fim dos meus dias.
À saudosa Universidade Federal de Goiás que por meio do Programa de PósGraduação em Genética e Melhoramento de Plantas, me proporcionou a oportunidade de
cursar o Mestrado, de receber e compartilhar o conhecimento de seus professores e pelo
apoio hábil e humano de seus técnicos administrativos.
Ao meu Orientador, Professor Doutor Sérgio Tadeu Sibov, não só por seus
ensinamentos, mas pelo seu exemplo de pessoa integra e humana, que sempre soube a hora
certa de incentivar e advertir, com sua participação nas revisões, correções, e sugestões que
possibilitaram a conclusão deste trabalho.
Ao Engenheiro Agrônomo Paulo Faria que com sua paciência e sábios
conselhos trouxesse muitas vezes, além de metodologias eficientes, palavras de conforto.
Aos colegas do Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da EA/UFG pelas
trocas de experiências, pelas conversas descontraídas sobre os mais variados assuntos que
tornaram os dias de trabalho no laboratório mais agradáveis e divertidos.
A todos os meus familiares que me apoiaram e creditaram que eu era capaz de
sobrepujar o desafio de concluir o curso.
E aqueles que não foram citados, mas que de alguma maneira caminharam
comigo nesta busca.
7
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS .................................................................................................
06
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................
07
LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS .............................................................................
10
RESUMO ....................................................................................................................
11
ABSTRACT ...............................................................................................................
12
1
INTRODUÇÃO GERAL..........................................................................
13
2
REVISÃO DE LITERATURA.................................................................
15
2.1
ASPECTOS GERAIS DA ESPÉCIE Hancornia speciosa GOMES...........
15
2.2
CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS......................................................
16
2.3
CULTURA DE TECIDOS DE ESPÉCIES DO CERRADO......................
20
2.4
SISTEMA DE MICROPROPAGAÇÃO MIXOTRÓFICA........................
23
2.5
CONSERVAÇÃO DE GERMOPLASMA IN VITRO ...............................
25
3
MICROPROPAGAÇÃO
EM
SISTEMA
MIXOTRÓFICO
DE
Hancornia speciosa GOMES
RESUMO....................................................................................................................
29
ABSTRACT.................................................................................................................
30
3.1
INTRODUÇÃO...........................................................................................
31
3.2
MATERIAL E MÉTODOS........................................................................
33
3.2.1
Descontaminação de sementes.................................................................
33
3.2.2
Germinação das sementes.........................................................................
34
3.2.3
Brotação.....................................................................................................
35
3.2.4
Enraizamento e aclimatização..................................................................
36
3.2.5
Delineamento experimental e análises estatísticas.................................
37
3.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................
37
3.3.1
Descontaminação de sementes..................................................................
37
3.3.2
Germinação das sementes.........................................................................
39
3.3.3
Brotação......................................................................................................
42
3.3.4
Enraizamento e aclimatização..................................................................
47
3.4
CONCLUSÕES ..........................................................................................
54
4
CRIOPRESERVAÇÃO DE GEMAS AXILARES DE Hancornia
speciosa GOMES
8
RESUMO .....................................................................................................................
55
ABSTRACT ................................................................................................................
55
4.1
INTRODUÇÃO ..........................................................................................
56
4.2
MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................
58
4.2.1
Delineamento experimental e análises estatísticas.................................
60
4.3
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................
60
4.4
CONCLUSÕES ..........................................................................................
63
5
REFERÊNCIAS ........................................................................................
64
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1
Tratamentos utilizados para indução de brotações in vitro, em
segmentos nodais de Hancornia speciosa Gomes.............................. 36
Tabela 3.2
Tratamentos utilizados na indução de raízes, em brotações
estabelecidas in vitro a partir do cultivo de segmentos nodais de
Hancornia speciosa Gomes.................................................................
37
Tabela 3.3
Taxa (%) de contaminação das sementes de H. speciosa com e sem
tegumento, submetidas a diferentes tempos de exposição ao
hipoclorito de sódio, após 45 dias de inoculação em meio
MS.....................................................................................................
39
Tabela 3.4
Viabilidade de plantas de Hancornia speciosa cultivadas em
diferentes
tipos
de
vedação
após
150
dias
de
incubação...........................................................................................
42
10
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1
Hancornia speciosa: A – Estádio adulto da mangabeira; B e C – Aspecto
morfológico do fruto; D - Flores, E – Aspecto das sementes no interior do
fruto.......................................................................................................
17
Figura 2.2
Tipos de sistemas de micropropagação in vitro: Heterotrófico - total
vedação e adição de sacarose (C12H22O11) ao meio de cultura.
Fotomixotrófico - maior eficiência luminosa (fontes PAR –
Photossynthetically Active Radiation), frascos ventilados (CO2) e adição
de sacarose ao meio de cultura; Fotoautotrófico - maior eficiência
luminosa, frascos ventilados, e sem adição de sacarose ao meio (adaptado
de Kozai et al., 2005) .................................................................
26
Figura 3.1
Etapas da inoculação de segmentos nodais de H. speciosa – A – retirada
da plântula germinada in vitro do tubo de ensaio em câmara de fluxo
laminar; B – remoção das raízes; C – excisão dos explantes com
aproximadamente duas gemas laterais; D – remoção das folhas; E –
inoculação do explante em meio de cultura suplementado com
reguladores de crescimento (AIA e BAP); F – tubo pronto para ser
mantido em sala de crescimento...............................................................
37
Figura 3.2
Sementes de H. speciosa inoculadas em meio MS, contaminadas por
bactérias, após serem tratadas com solução desinfestante a base de
hipoclorito de sódio......................................................................................
39
Figura 3.3
Germinação in vitro de sementes de H. speciosa: A – emissão de radícula;
B – emissão de plântula; C – sistema radicular; D – plântula em
desenvolvimento...........................................................................................
40
Figura 3.4
Aspecto visual de mudas de H. speciosa germinadas in vitro: A – sistema
fotomixotrófico; B – sistema fotoheterotrófico............................................
41
Figura 3.5
Teste de regressão quadrática para número de brotos de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIA inoculados em meio
de cultura MS, com vedação que permite trocas gasosas (p =
0,8296)......................................................................................................
43
Figura 3.6
Teste de regressão quadrática para número de brotos de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIA inoculados em meio
de cultura WPM, com vedação que permite trocas gasosas (p =
0,2985)......................................................................................................
44
Figura 3.7
Teste de regressão quadrática para comprimento de brotos de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIA inoculados em meio
de cultura MS, com vedação que permite trocas gasosas (p =
0,6793).......................................................................................................
46
11
Figura 3.8
Teste de regressão quadrática para comprimento de brotos de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIA inoculados em meio
de cultura WPM, com vedação que permite trocas gasosas (p =
0,3883).................................................................................
46
Figura 3.9
Segmentos nodais de Hancornia speciosa, inoculados em diferentes
meios de cultura e suplementados com diferentes concentrações dos
reguladores de crescimento AIA e BAP: A – Brotos em meio WPM e
vedação semipermeável; B – Brotos em meio MS e vedação
semipermeável; C – broto bem desenvolvido, em meio MS e vedação
total; D – Brotos em meio WPM, a esquerda vedação semipermeável e a
direita vedação total. Setas indicam a formação de calos......................
47
Figura 3.10
Raízes de Hancornia speciosa Gomes, inoculados em meio de cultura
WPM, e com vedação semipermeável: A – Raízes de segmentos nodais;
B – Raizes de mudas germinadas a partir de semententes.......................
48
Figura 3.11
Teste de regressão quadrática para número de raízes de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIB inoculados em meio
de cultura WPM, com vedação que permite trocas gasosas (p =
0,0276)....................................................................................................
48
Figura 3.12
Teste de regressão quadrática para comprimento das raízes de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIB inoculados em meio
de cultura WPM, com vedação que permite trocas gasosas (p =
0,2398)......................................................................................................
49
Figura 3.13
Teste de regressão quadrática para comprimento da parte aérea de
Hancornia speciosa Gomes, em função da concentração de AIB
inoculados em meio de cultura WPM, com vedação que permite trocas
gasosas (p = 0,4894)...................................................................................
50
Figura 3.14
Enraizamento de segmentos nodais de Hancornia speciosa Gomes,
inoculados em meio de cultura WPM, suplementado com diferentes
concentrações de AIB e com vedação semipermeável: A – 2 mg.L-1 de
AIB; B – 4 mg.L-1 de AIB; C – 6 mg.L-1 de AIB.......................................
51
Figura 3.15
Comparação de diferentes genótipos de Hancornia speciosa Gomes,
inoculados em meio de cultura WPM, suplementado com AIB e com
vedação semipermeável: A – 4 mg.L-1 de AIB; B – 6 mg.L-1 de AIB......... 52
Figura 3.16
Aspecto visual de mudas aclimatizadas de H. speciosa: A – 7 dias em casa
de vegetação; B – 45 dias em casa de vegetação...........................................
53
Figura 4.1
Esquema da metodologia de criopreservação de explantes de Hancornia
speciosa Gomes pela técnica de vitrificação droplet..................................
59
12
Figura 4.2
Recuperação, Sobrevivência e Regeneração de gemas axilares de
Hancornia speciosa Gomes, submetidas ou não ao processo de
criopreservação, expostas a diferentes tempos de pré-cultivo em solução
de meio WPM + 0,3 M de sacarose: T1 – 24h em pré-cultivo +
criopreservação; T2 – 12h em pré-cultivo + criopreservação; T3 – 6h em
pré-cultivo + criopreservação; T4 – 24h em pré-cultivo; T5 – 12h em précultivo; T6 – 6h em pré-cultivo..................................................................
61
Figura 4.3
Explantes de Hancornia speciosa Gomes, inoculados em meio de cultura
WPM: A – Gemas axilares inoculadas depois do descongelamento; B –
Calos
e
primórdios
foliares;
C
–
Mudas
regeneradas.................................................................................................
62
13
LISTA DE SÍMBOLOS E SIGLAS
% – Porcentagem
± – Variando entre
°C – Grau Celsius
½ MS – Meio Murashige & Skoog (1962) com metade da concentração dos
macronutrientes
NL – Nitrogênio Líquido
AIB – Ácido indolbutílico
ANA – Ácido naftalenoacético
Atm - Atmosfera
BAP – 6-Benzilaminopurina
C.A. – Cloro ativo
cm2 – Centímetros quadrados
DNA – Ácido desoxirribonucleico
Embrapa – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
g - Grama
g.L-1 – Gramas por litro
GO – Goiás
h – horas
Hz - Hertz
ICB-I/UFG – Instituto de Ciências Biológicas – I, da Universidade Federal de Goiás
ITS – Instituto do Trópico Subúmido
mg.L-1 – Miligramas por litro
mL – Mililitros
mm – Milímetros
MS – Meio Murashige & Skoog (1962)
NaOCl – Hipoclorito de sódio
ns – Não significativo
pH – Potencial hidrogeniônico
PVP – Polivinilpirrolidona
UFG – Universidade Federal de Goiás
T(n-1) – Tratamento (1, 2, 3, ..., n-1)
14
RESUMO
CARDOSO, M. C. Estabelecimento in vitro sob condições mixotróficas e
criopreservação de Hancornia speciosa Gomes. 2015. 89 f. Dissertação (Mestrado em
Genética e Melhoramento de Plantas)-Escola de Agronomia, Universidade Federal de
Goiás, Goiânia, 2015.1
A espécie Hancornia speciosa Gomes, conhecida também como mangabeira, é uma
frutífera nativa do Cerrado, que nos últimos anos vem sofrendo uma acelerada perda de seu
habitat, principalmente por ações antrópicas. Por esse motivo, torna-se necessário o
desenvolvimento de técnicas para a conservação e uso sustentável deste recurso genético
vegetal. O trabalho teve como objetivo estabelecer a espécie in vitro utilizando protocolos
de descontaminação de sementes, germinação in vitro e desenvolvimento sob condições
mixótróficas - tipo de vedação que permite trocas gasosas entre o meio interno e externo
do frasco de cultura. Também foi testado um protocolo de criopreservação de gemas
laterais pela técnica de vitrificação droplet. Os experimentos foram conduzidos no
Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais da EA/UFG. Sementes de H. speciosa foram
divididas em duas categorias: com tegumento e sem tegumento. Após pré-assepsia com
detergente e álcool 70%, as sementes foram submetidas a cinco tratamentos com diferentes
tempos de exposição a concentrações de hipoclorito de sódio com 0,5% de cloro ativo: 0; 5;
10; 15; 20 e 25 minutos. As sementes foram inoculadas em meio MS. As menores
porcentagens de contaminação ocorreram com sementes sem tegumento imersas por, no
mínimo, cinco minutos. No experimento seguinte, testou-se a influência do tipo de vedação
da germinação e desenvolvimento in vitro de H. speciosa em meio MS. As sementes foram
divididas em dois tratamentos com vedações diferentes. Um tratamento com tampas que
vedavam totalmente o frasco e o outro tratamento com tampas que permitiam a troca de
gases com o meio externo. As avaliações feitas mensalmente durante 150 dias demostraram
que nos frascos com tampas que permitiam a troca gasosa o desenvolvimento das plantas foi
marcadamente superior nas condições gerais da planta in vitro e na maior sobrevivência
quando comparadas com as plantas em frascos com tampas que vedavam totalmente o
frasco. Para o desenvolvimento das gemas laterais testou-se o meio de cultura MS ou WPM,
ambos suplementados com 2,0 mgL-1 de BAP e a influência da auxina AIA com quatro
concentrações: 0,0; 0,5; 1,0 e 1,5 mg/L. Avaliando o número de brotos desenvolvidos e seu
crescimento, constatou-se que nenhum tratamento diferiu estatisticamente com relação às
dosagens de AIA. Com relação ao tipo de meio, o meio WPM promoveu um maior número
de brotos que o MS, mas sem diferenças significativas com relação ao crescimento. Para o
enraizamento, microestacas de H. speciosa obtidas in vitro foram submetidas a quatro
tratamentos com AIB: 0,0; 2,0; 4,0 e 6,0 mg.L-1. A melhor concentração para a indução de
novas raízes foi a concentração de 6 mg.L-1. Com os protocolos de desenvolvimento in vitro
estabelecidos, testou-se o processo de vitrificação droplet para a criopreservação de gemas
laterais de H. speciosa. Os melhores resultados de sobrevivência e regeneração das gemas
laterais ocorreram com um pré-tratamento de 24 h seguido de congelamento rápido em
nitrogênio líquido.
Palavras-chave: Mangabeira,
riopreservação, vitrificação.
1
sistemas
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Tadeu Sibov. EA-UFG.
heterotróficos,
sistemas
mixotróficos,
15
ABSTRACT
CARDOSO, M.C. In vitro establishment under mixotrophic conditions and
cryopreservation of Hancornia speciosa Gomes. 2015 89 f. Dissertation (Master in
Genetics and Plant Breeding) - College of Agronomy, Universidade Federal de Goiás,
Goiânia, 2015.
The Hancornia speciosa Gomes species, also known as mangabeira, is a native fruit of the
Cerrado, which in recent years has undergone an accelerated loss of their habitat, mainly
by human activities. For this reason, it is necessary to develop techniques for the
conservation and sustainable use of this plant genetic resource. The study aimed to in vitro
establish the species using seed decontamination protocols in vitro germination and
development under mixotrophic conditions - type of cap that allowed gas exchange
between the internal and external environment of the culture flask. Also, cryopreservation
protocol for lateral buds droplet vitrification technique was tested. The experiments were
conducted at the Plant Tissue Culture Laboratory at EA/UFG. H. speciosa seeds were
divided into two categories: with and without husk seed coat. After pre-disinfected with
detergent and 70% alcohol, the seeds were submitted to five treatments with different times
of exposure to sodium hypochlorite concentrations with 0.5% of active chlorine: 0; 5; 10;
15; 20 and 25 minutes. The seeds were inoculated in MS medium. Smaller percentages
contamination occurred witn seeds without tegument immersed for at least five minutes. In
the following experiment we tested the influence of type of flask seal for germination and
growth of H. speciosa in vitro on MS medium. The seeds were divided into two treatments
with different seals. A treatment with covers entirely the flask and the other treatment with
cap flask that allowing gas exchange with the external environment. The evaluations
monthly for 150 days showed that the flasks with caps that allow gas exchange the plant
growth was markedly higher in the general conditions of the plant in vitro and increased
survival in comparison with plants in flasks with caps which completely covers teh flasks.
For the development of lateral buds, the type of culture medium, WPM or MS, was tested.
Both were supplemented with 2.0 mg / L BAP and the influence of four concentrations of
auxin IAA were tested too: 0.0; 0.5; 1.0 and 1.5 mg.L-1. Assessing the number of
developed buds and growth, it was found that no treatment was statistically different with
respect to IAA dosages. Regarding the type of medium, the medium WPM was superior to
MS in the number of shoots, but without significant differences with respect to growth. For
rooting, microcutting H. speciosa obtained in vitro were subjected to four treatments with
IBA: 0.0; 2.0; 4.0 and 6.0 mg.L-1. The optimal concentration for inducing new roots was 6
mg.L-1. With the in vitro development of protocols established, we tested the process
droplet vitrification for cryopreservation of lateral buds of H. speciosa. The best results of
survival and regeneration of lateral buds occurred with a pre-treatment 24 h followed by
rapid freezing in liquid nitrogen.
Key-words: mangabeira, heterotrophic systems, mixotróficos systems, cryopreservation,
vitrification
16
1 INTRODUÇÃO GERAL
O Cerrado é considerado um hotspot mundial de biodiversidade (Batalha,
2011). O domínio Cerrado ocupa quase toda área do Brasil Central, com aproximadamente
200 milhões de hectares, em sua maior parte, na região Centro-Oeste.
O produtor agrícola, principalmente o familiar, sempre busca novos nichos de
mercado, para produzir produtos diferenciados que atendam uma demanda cada vez mais
crescente que exige sustentabilidade na produção. Neste contexto, as espécies nativas do
Cerrado estão ganhando destaque na economia nacional, pelo seu uso em sistemas
agropastoris, na indústria alimentícia, medicinal, madeireira, na recuperação de áreas
degradadas, dentre outros. Contudo, a exploração extrativista dessas espécies, na maioria
das vezes, implica na utilização do indivíduo como um todo, ocasionando extinção de
muitas delas, sem que sejam devidamente estudadas (Silva & Almeida, 1990).
A conservação da biodiversidade objetiva proteger o patrimônio genético
existente garantindo para o futuro a possibilidade de desenvolver soluções alternativas para
problemas que a agricultura possa enfrentar como novas pragas, estiagens, doenças, etc.
No entanto, algumas espécies de plantas produzem sementes em épocas específicas do ano
e, às vezes, em número reduzido, sendo necessário o armazenamento dessas sementes por
longos períodos. Dessa forma, o estudo da longevidade, conservação e germinação de
sementes é de suma importância para programas de conservação de recursos genéticos
vegetais, recuperação de áreas degradadas, suporte ao paisagismo urbano ou plantio e
exploração comercial (Tresena et al., 2010).
A espécie Hancornia speciosa Gomes, mais conhecida como mangabeira, se
destaca pelo seu potencial econômico, pois o processamento de seus frutos pode subsidiar
uma economia baseada na utilização sustentável de recursos naturais do Cerrado. Porém,
suas sementes possuem curto período de viabilidade (são recalcitrantes) o que dificulta seu
armazenamento.
Em geral, a conservação das sementes é prejudicada devido à porcentagem de
umidade presente em seu interior, o que pode favorecer a degradação de substâncias e a
17
presença de micro-organismos. Para reduzir os problemas encontrados na conservação
convencional de sementes, recorre-se a cultura in vitro de propágulos vegetais (calos,
ápices, gemas axilares, brotos, segmentos nodais e outros). Esta técnica de preservação
apresenta muitas vantagens, destacando o fato de necessitar de menor espaço para dispor o
material, manutenção de material vegetal livre de pragas e patógenos, disponibilidade de
material para ser imediatamente propagado, redução dos custos de manutenção, alta taxa
de multiplicação independente de condições climáticas e a simplificação e eficiência do
processo de intercambio de germoplasma (Eira, 2001; Fortes & Pereira, 2001).
O estudo preliminar do comportamento de cada espécie, quando submetidas às
condições in vitro, é o que vai possibilitar o estabelecimento de protocolos de propagação.
A produção de mudas in vitro irá proporcionar matéria-prima tanto para programas de
melhoramento genético, quanto para a conservação ex situ do germoplasma dessa espécie.
Este trabalho teve como objetivo, desenvolver protocolos de propagação e conservação in
vitro da espécie frutífera Hancornia speciosa Gomes.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 ASPECTOS GERAIS DA ESPÉCIE Hancornia speciosa GOMES
Hancornia speciosa Gomes, popularmente conhecida como mangabeira, é uma
espécie frutífera pertencente ao grupo das Eudicotiledôneas, ordem Gentianales e família
Apocynaceae. É uma espécie típica das restingas do litoral nordestino e dos Cerrados do
Centro-Oeste (Freire et al., 2011). Em razão do agradável sabor e aroma, o fruto da
mangabeira é um dos mais conhecidos do Nordeste do Brasil (Bastos et al., 2007).
É espécie arbórea (Figura 2.1) de porte médio, podendo chegar a até 15 m de
altura, tronco tortuoso e áspero, com folhas opostas e coriáceas. Suas inflorescências são
brancas. Toda a planta exsuda látex que pode ser usado na fabricação de borracha. O fruto
é do tipo baga, elipsóide ou arredondado, com 2 cm a 6 cm, exocarpo amarelo, com
manchas avermelhadas, podendo apresentar de 2 a 15 sementes discóides, com 7 mm a 8
mm de diâmetro. O peso de cem sementes com 50% de umidade é, em média, de 18 g
(Soares et al., 2002).
O fruto da mangabeira é rico em vitaminas A, B1, B2 e C, além de ferro,
fósforo, cálcio e proteínas. Possui grande potencial de mercado e produção de frutos que
não atende à demanda, pois, em sua grande maioria, os frutos são provenientes de
atividade extrativista. Sua polpa amarela e adocicada é consumida in natura, como também
é industrializada sob a forma de doces, geléias, compotas, vinho, vinagre, suco e sorvete
(Lederman et al., 2000).
Estudos recentes demonstraram que o extrato das folhas possui efeito antihipertensivo e vasodilatador (Pereira et al., 2012), enquanto o látex possui propriedades
anti-inflamatórias (Marinho et al., 2011).
A mangabeira é uma planta perenifólia de clima tropical. Apresenta maior
desenvolvimento vegetativo nas épocas com temperatura mais elevada. Os solos nos quais
se desenvolve são pobres e arenosos, com floração durante o período de agosto a
novembro, com pico em outubro. A frutificação pode ocorrer em qualquer época do ano,
19
mas concentra-se principalmente de julho a outubro ou de janeiro a abril (Soares et al.,
2002).
Figura 2.1 Hancornia speciosa: A – Estádio adulto da mangabeira; B e C – Aspecto
morfológico do fruto; D – Flores; E – Aspecto da semente no interior do fruto.
Fonte: cerratinga.org e plantasdocerrado.com.
2.2 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS
A cultura de tecidos vegetais abrange um conjunto de técnicas mediante em
que um explante (células, pequenos fragmentos de tecido ou mesmo um órgão) é cultivado
20
de forma asséptica em meio nutritivo e sob condições controladas de temperatura e
luminosidade (Souza et al., 2006). Esta técnica se fundamenta no princípio da totipotência,
proposto pelo fisiologista Haberlandt, que em 1902, enunciou que cada célula vegetal
possui o potencial genético para regenerar uma planta inteira (Flores, 2006).
A multiplicação in vitro, ou micropropagação, segundo Vasil & Hildebrandt,
(1965) é um termo usado exclusivamente para referir-se à propagação in vitro a partir de
alguma parte específica da planta. Bastos et al. (2007) complementam que este processo
vai até o enraizamento e culmina na aclimatização da planta produzida in vitro.
Grattapaglia & Machado (1998) afirmam que a micropropagação é o princípio básico de
todos os outros procedimentos de cultivo in vitro, pois dela depende o sucesso da técnica.
O intuito deste método é obter clones de um genótipo selecionado em um intervalo curto
de tempo, num espaço físico reduzido e livre de micro-organismos contaminantes.
O primeiro e decisivo passo para efetuar a micropropagação é escolher uma
planta matriz que apresente as características de interesse do pesquisador, pois ela será a
fonte de todos explantes designados ao processo de propagação in vitro. Deste modo,
genótipos superiores poderiam ser multiplicados sem alteração na sua estrutura genética
(Bertozzo & Machado, 2010).
O tipo de explante, bem como a definição de seu estádio de desenvolvimento, é
um dos fatores que determinam a capacidade de resposta in vitro (Freitag et al., 2012). A
escolha do explante deve ser voltada para tecidos que apresentem maior proporção de
tecido meristemático, ou que sejam tecidos mais jovens, que tenham maior capacidade de
expressar a totipotência (Torres et al., 1998).
A desinfestação, ou seja, a remoção de contaminantes existentes na superfície
do explante proveniente de material de campo ou de casa de vegetação, é uma etapa
imprencindível no estabelecimento in vitro (Cid et al., 2010). Substâncias germicidas
podem ser empregadas em diversas situações por agirem em diferentes locais da célula
microbiana, eliminando ou impedindo o crescimento dos micro-organismos, além de
importante efeito residual (Reis et al., 2011). Dentre as substâncias com ação germicida
destacam-se: o etanol, os compostos a base de cloro, tais como hipoclorito de sódio e de
cálcio, cloreto de mercúrio, ácido clorídrico, peróxido de hidrogênio, alguns ácidos e bases
concentrados, isopropanol entre outros (Silva, 2012).
Os detergentes são empregados para maximizar o contato das substâncias
germicidas com os tecidos (Grattapaglia & Machado, 1998). É aconselhável que o material
21
utilizado na coleta seja previamente esterilizado ou que seja realizada uma assepsia para
evitar contaminações (Junghans & Souza, 2009).
Espécies de plantas e seus tecidos têm respostas diferentes quando expostas a
substâncias descontaminantes, sendo o tempo e a concentração, variáveis relevantes que
influenciam nestas respostas. A superexposição aos agentes desinfetantes, no geral,
danifica o explante e leva à morte celular, sendo difícil recomendar um procedimento
padrão. Assim, é necessário investigar os procedimentos de desinfestação para os
diferentes tipos de espécies e tecidos, para que o cultivo in vitro inicie com explantes
saudáveis e a cultura desenvolva-se com sucesso (Smith, 2000).
Uma vez realizada a desinfestação do explante, em ambiente asséptico, este é
inoculado em meio de cultura. A formulação dos meios baseia-se nas exigências das
plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para atender às
necessidades específicas nas condições de cultivo in vitro (Caldas et al., 1998; Torres et al.,
2001). Os estudos da nutrição de plantas provenientes do âmbito da fisiologia vegetal
informam que os elementos que compõem o meio nutritivo da cultura in vitro devem
pertencer à categoria dos essenciais, isto é, a planta não se desenvolve na ausência deles
(Embrapa, 2006).
Grande parte dos pesquisadores utiliza o meio de cultura MS de Murashige e
Skoog (1962), cuja formulação é a mais utilizada para diferentes processos de cultura de
tecidos, e o WPM (Woody Plant Medium) elaborado por Lloyd & McCown (1981), para a
propagação de plantas lenhosas. A principal diferença do meio MS para os demais meios é
sua alta concentração de sais, sendo muitas vezes utilizado em diluições (Mantovani &
Franco, 1998).
Um fator que exerce influência na propagação in vitro é o uso de moléculas
sintéticas, chamadas de reguladores de crescimento, na formulação do meio de cultura. A
adição destas substâncias visa suprir possíveis deficiências endógenas de hormônios nos
explantes (Grattapaglia & Machado, 1998). Os reguladores de crescimento mais usados na
cultura de tecidos são as auxinas e citocininas.
Skoog & Miller (1957) demostraram que a morfogênese é regulada pela
disponibilidade e interação destas classes de reguladores de crescimento, onde a reação do
tecido in vitro depende do balanço entre auxinas e citocinina: aumentando a concentração
de auxina haveria a formação de raízes; aumentando a de citocinina haveria formação de
gemas adventícias; numa relação intermediária haveria a formação de calo, o qual é
22
considerado um tecido indiferenciado, ou pouco diferenciado, podendo ser induzido,
tornando-se determinado e, finalmente sofrer diferenciação para formar gemas caulinares
ou raízes, conforme o balanço hormonal oferecido.
Segundo Pierik (1987) a disponibilidade dos nutrientes, dos reguladores de
crescimento e a solidificação do ágar, dependem do pH do meio. Para cada espécie de
planta existe uma faixa ideal de pH do meio. Para o cultivo in vitro, geralmente ele é
ajustado entre 5,0 a 6,5, mas para espécies arbóreas o adequado é de 5,7 a 5,8, pois nesta
faixa há um equilíbrio na disponibilidade de macro e micromutrientes. Quando ajustado a
níveis inferiores a 4,5 ou superiores a 7,0, pode haver paralisação do desenvolvimento dos
tecidos in vitro (Murashige, 1974).
Terminada a inoculação os explantes são transferidos para a sala de
incubação/crescimento. Esta sala tem luminosidade e temperatura controladas, pois cada
espécie tem faixas ideais que favorecem o seu desenvolvimento. É aconselhável que a sala
seja de fácil limpeza, e que os acessos a ela sejam limitados, pois desta maneira a chance
de entrada de poeira e contaminação são mais reduzidas (Quisen & Angelo, 2008).
Depois de um tempo incubado, o explante começa a manifestar sintomas de
deficiência nutricional, caracterizados pelo escurecimento de tecidos, murchamento, folhas
amarelas e senescentes. Isso ocorre porque há redução de nutrientes, desidratação do meio
e acúmulo de substâncias tóxicas. Sendo assim, é necessário realizar a troca do meio de
cultura. Para isso, os explantes retornam para a câmara de fluxo laminar e são repicados e
logo depois voltam para a sala de crescimento. Este processo pode se repetir várias vezes
para aumentar a vida útil do explante e/ou para multiplicá-lo (Andrade, 2002).
De acordo com a finalidade do estudo, em uma situação hipotética em que um
explante desenvolva parte aérea e raízes, ele está pronto para o transplantio. Nesta fase
ocorre a transferência da planta in vitro para a casa de vegetação, onde é submetida a um
processo de aclimatização. Nesta etapa, segundo Moraes et al. (2002), é necessário que a
planta esteja em um substrato que lhe propicie boas condições para seu melhor
desenvolvimento. A aclimatização é delicada, não só porque representa um estresse para a
planta, mas também pelo período de infecção por fungos e bactérias que podem se
desenvolver neste estágio (Tombolato & Costa, 1998).
Torres et al. (1998), afirmam que há muitas perdas de mudas, na ocasião da
aclimatização, pelos seguintes fatores: (i) a planta é retirada de uma condição em que há
abundância de nutrientes, para um ambiente onde ela deve buscar seu alimento; (ii) deixa
23
seu estado heterotrófico, pois era suprida por sacarose do meio, e passa para o estado
autotrófico, em que retoma as atividades fotossintéticas; (iii) passa de um ambiente com
temperatura, iluminação e umidade relativa controladas para outro que demanda um
aumento nas taxas de transpiração, o que a deixa vulnerável ao estresse hídrico.
Sendo assim, além de se ter uma planta in vitro de boa qualidade é essencial
que haja um bom processo de aclimatização. Isso é o que possibilitará a adaptação da
planta ao seu novo ambiente. Quanto menos drástica é a mudança de ambiente, melhor será
a adaptação. Medidas como: abertura dos frascos ainda na sala de crescimento; envolver as
plantas em sacos plásticos vazados e ir retirando-os aos poucos; controlar a temperatura e a
irrigação interna da casa de vegetação para manter um ambiente com alta umidade no
início do processo, sendo esta umidade gradualmente diminuída com o tempo, são
procedimentos que podem garantir uma melhor adaptação da planta desenvolvida in vitro
ao ambiente externo (Silva et al., 2011).
2.3 CULTURA DE TECIDOS DE ESPÉCIES DO CERRADO
A flora do Cerrado apresenta grande variedade de frutíferas, algumas têm alto
valor comercial e crescente demanda do mercado, na forma in natura e processados
(Souza, 2000). Segundo Mendonça et al. (2008), o número de espécies de plantas
encontradas no Cerrado ultrapassa a casa dos 12.000. Porém, estima-se que cerca de 50%
do domínio já foi convertido em áreas de pastagem e agricultura nos últimos anos (Klink &
Machado, 2005). No entanto, as espécies nativas são de difícil propagação seminífera, por
apresentarem heterogeneidade no processo de maturação dos frutos e sementes com algum
tipo de dormência. Estas características comprometem a germinação e a formação de
mudas, sendo mais um limitador para a comercialização (Pinhal et al., 2011).
Uma classificação foi proposta por Roberts (1973) quanto às características de
armazenamento das sementes em duas categorias: ortodoxas e recalcitrantes. Ortodoxas
são aquelas que podem ter o seu teor de água reduzido pela secagem até a umidade de 5 a
2% ou menos e, que suportam baixas temperaturas, inclusive as temperaturas subzero
empregadas na conservação em longo prazo, sem ter a sua viabilidade comprometida. Já as
sementes recalcitrantes são aquelas que não toleram dessecação a níveis abaixo de 12 a
31%, e que não sobrevivem em temperaturas subzero.
24
Pelo fato de grande parte das espécies florestais serem de propagação
seminífera, existe a chance de que plantas de genótipos superiores, não transmitam suas
características satisfatórias à sua descendência, na ocasião de um cruzamento de
polinização aberta (alógamas). Contudo, quando ocorre a autofecundação ou a propagação
vegetativa o risco de perdas de características satisfatórias é quase nulo (Ribas et al.,
2005). Muitos protocolos usados na cultura de tecidos vegetais são maneiras artificiais de
realizar uma propagação vegetativa.
O cultivo de plantas germinadas in vitro é uma etapa importante para a
aquisição de explantes juvenis que tenham uma resposta morfogenética satisfatória e livres
de contaminação. Segundo Lédo et al. (2007) em seu estudo com Hancornia speciosa, os
meios de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962); MS + 2,0 g.L-1 de carvão ativado; ½ MS
(meio de cultura MS com metade da concentração salina); ½ MS + 2,0 g.L-1 de carvão
ativado, são eficientes para a germinação in vitro de sementes e formação de plântulas
normais, sendo que o meio ½ MS acrescido de 2,0 g.L-1 de carvão ativado proporcionou
100% de germinação e bom desenvolvimento da parte aérea e sistema radicular de
plântulas de H. speciosa.
Oliveira et al. (2014) estudando a H. speciosa in vitro aferiram o efeito de
diferentes meios de cultura na germinação. Sementes desprovidas do tegumento passaram
pelo processo de desinfestação em fluxo laminar imersas em álcool 70% e hipoclorito
(2,5% de cloro ativo). Posteriormente, as sementes foram distribuídas ao acaso nos
tratamentos de T1 - vermiculita, T2 - vermiculita + areia, T3 - vermiculita + areia barrada,
T4 - vermiculita + MS, T5 - vermiculita + ½ MS, T6 - areia, T7 - areia barrada, T8 - areia
+ areia barrada. No que diz respeito à porcentagem de germinação o tratamento T3 foi o
que apresentou maior índice (90%). Para o índice de velocidade de germinação os
tratamentos T1, T2 e T3 (1,37 a 1,46 dias) foram os de maiores médias e estatisticamente
iguais. Em relação ao tempo médio de germinação, os resultados indicaram valores
estatisticamente iguais para todos os tratamentos (7,37 a 10,32 dias).
Avaliando as respostas morfogenéticas de diferentes explantes cultivados in
vitro, Lédo et al. (2005) constataram que a concentração de 1 mg.L-1 de AIA com 0,5; 1 ou
2 mg.L-1 de BAP induz uma boa formação de calos em segmentos caulinares de plântulas
de H. speciosa germinadas in vitro e a concentração de 1 mg.L-1 de AIA combinada com 1
ou 2 mg.L-1de BAP promove uma boa formação de calos em segmentos nodais, com a
proliferação de brotações adventícias após 45 dias. Avaliando a aplicação exógena de
25
poliaminas em calos de H. speciosa, Fráguas et al. (2009) concluíram que estas substâncias
não proporcionam aumento no crescimento de calos e que a oxidação promovida por
longos períodos de cultivo in vitro induz aumento nos níveis de putrescina.
Pesquisas sobre micropropagação tiveram como objetivo aferir os efeitos dos
reguladores de crescimento (auxinas e citocininas) nas plantas, para estimular o
crescimento in vitro. Sousa et al. (2007) estudaram os efeitos da benilaminopurina (BAP)
nas concentrações 0,0; 1,0; e 2,0 mg.L-1 e ácido indolacético (AIA) nas concentrações 0,0;
0,25; 0,50 mg.L-1, isolados e combinados, para estimular a organogênese. Concluíram que
a combinação de 1 mg.L-1 de BAP e 0,5 mg.L-1 de AIA é a que proporciona melhor
resposta organogênica dos explantes de mangabeira. Soares et al. (2007) observaram que
concentrações de 1,0 ou 2,0 mg.L-1 de BAP promoveram multibrotações em segmentos
nodais de H. speciosa e induziu a formação de calos na base dos explantes, e o ácido
indolbutírico (AIB) induz, na concentração de 3,0 mg.L-1, a formação de raízes em
brotações de H. speciosa in vitro.
Estudos relacionados à rizogênese em brotos de H. speciosa tem utilizado
auxinas como indutores. Segundo Lemos et al. (2006), adicionar isoladamente AIB, ANA
e 2,4-D, nas concentrações de 1,0 e 2,0 mg.L-1, ao meio de cultura MS não foi satisfatório,
sendo que o enraizamento ocorreu em apenas dois explantes, após oito semanas de
incubação.
Pinheiro et al. (2002) alcançaram 18,39% e 15,23% de enraizamento em
propágulos de H. speciosa, submetidos ao alongamento e oriundos de explantes basais em
meio WPM e ½ MS, respectivamente, suplementado com 0,5 mg.L-1 de ANA combinado
com 0,1 mg. L-1 de BAP, na presença de carvão ativado. Contudo, Grigoletto (1997),
obteve maiores porcentagens de enraizamento em meio de cultura ¼ Knoop´s (61,5%) e ½
MS (58,5%), suplementado com diferentes tratamentos de AIA e BAP.
O aumento da concentração de gás etileno no cultivo in vitro corresponde a um
dos principais problemas encontrados na propagação in vitro de H. speciosa, pois essa
substância apresenta efeito adverso no desenvolvimento, morfologia e crescimento das
plantas, diminuindo a expansão foliar e a regeneração de novos brotos (Biddington, 1992).
Pereira Netto & McCown (1999), inferiram que o desenvolvimento de parte aérea de H.
speciosa em atmosfera enriquecida com 5 ou 10 μL.L-1 de etileno, resulta em inibição do
alongamento de ramos laterais e do ramo principal, e a concentração de 1 μL.L-1 de etileno
resulta em redução da ordem de 50% na proliferação de ramos laterais.
26
Trocas gasosas possibilitadas pela abertura dos frascos na ocasião da
renovação do meio de cultura, e pelo tipo de vedação utilizada, podem baixar a
concentração de etileno dentro dos frascos minimizando os efeitos deletérios no vigor das
plantas.
Em outros estudos foram realizados com espécies do cerrado, Silveira (2015)
inferiu sobre micropropagação in vitro de Eugenia dysenterica em condições mixotróficas,
concluindo que o sistema mixotrófico é superior no momento da formação de novos brotos
no que se refere ao maior número de brotos, maior número de folhas por broto, e síntese de
pigmentos fotossintéticos. Silva (2012) estudou a germinação in vitro de Dipteryx alata
VOGEL e Eugenia dysenterica DC., e obteve resultados como sendo o meio ½ MS o mais
indicado para germinação in vitro de sementes de E. dysenterica, entretanto, o meio MS
completo obteve maiores porcentagens de germinação para sementes de D. alata.
Porto (2013) estudou a criopreservação de calos, ápices caulinares e sementes
de barbatimão [Sthyphnodendron adstringens (Mart.) coville] e concluiu que é possível
criopreservar ápices caulinares e sementes de barbatimão, porém o protocolo para
criopreservação de calos precisa de mais estudos. Ribeiro et al. (2009) utilizaram a
germinação in vitro como método para fornecer elementos que superassem a dormência em
sementes de araticum (Annona crassiflora Mart.). Melhores resultados foram obtidos em
meio WPM suplementado com 25-32mg L-1 de GA3. Santos et al. (2006) utilizaram como
explantes segmentos nodais provenientes de plantas obtidas por meio de germinação de
sementes in vitro de pequizeiro (Caryocar brasiliense Camb.), obtiveram êxito na cultura
destes tecidos, diretamente inoculados em meio WPM.
2.4 SISTEMA DE MICROPROPAGAÇÃO MIXOTRÓFICA
O sistema de micropropagação possibilita, por meio da repetição de ciclos de
cultivo in vitro, a multiplicação de explantes do germoplasma selecionado. Entretanto,
cada espécie tem um número máximo de ciclos para evitar desordens genéticas como, por
exemplo, a variação somaclonal (Silveira, 2015), isto é, à variação fenotípica de plantas
regeneradas de cultura de células ou tecidos in vitro, e que pode ser transitória ou
permanente e herdável (Illg, 1990).
De maneira geral na micropropragação, as plantas isentas de agentes
patogênicos, são mantidas em recipientes (hermeticamente fechados ou não) contendo
27
meio de cultura, acondicionados em salas de incubação com temperatura, luminosidade e
umidade controladas (Hartmann et al., 1990). Partindo desta premissa e aplicando algumas
modificações na metodologia geral, a micropropagação, segundo Kozai et al. (2005), pode
ser conduzida em três sistemas diferentes:

Sistema heterotrófico, as mudas são mantidas dentro de frascos totalmente lacrados,
sob baixa luminosidade, e os carboidratos exógenos são a única fonte de energia para
o vegetal.

Sistema fotomixotrófico, as mudas se desenvolvem em frascos ventilados, o meio de
cultura recebe carboidratos e ocorre o favorecimento da fotossíntese com a utilização
de sistemas de iluminação com maior eficiência luminosa - fontes PAR
(Photossynthetically Active Radiation).

Sistema mixotrófico, um sistema mixotrófico difere do fotomixotrófico apenas pela
ausência de iluminação PAR (Figura 2.2).

Sistema fotoautotrófico, onde as mudas crescem dentro de frascos com ventilação,
sem nenhuma fonte exógena de carboidrato e dependendo unicamente da fotossíntese
(fontes PAR).
A ventilação dentro dos frascos no sistema fotomixotrófico reduz o tempo de
aclimatização de mudas (Saldanha et al., 2012), pois a ventilação dos frascos estimula os
estômatos tornando-os funcionais. Este fato reduz consideravelmente as perdas durante a
adaptação das plantas ao ambiente ex vitro na aclimatização. Esta ventilação pode ser feita
de várias maneiras como, por exemplo, a não utilização de fitas de vedação das tampas e,
membranas semipermeáveis que permitam trocas gasosas sem a entrada de microorganismos (Silveira, 2015).
Em termos nutricionais, nas condições fotomixotróficas, células, tecidos,
órgãos ou mudas que apresentem clorofila crescem fazendo uso de meio de cultura,
contendo ou não açúcar. Os vegetais utilizam os hidratos de carbono não só endógenos,
mas exógenos como fonte de energia (Kozai et al., 2005).
Hdider & Desjardins (1994) inferiram sobre como o sistema fotomixotrófico
age sobre a capacidade fotossintética em mudas micropropagadas de morango (Fragaria x
ananassa Duch. cv Kent) em função da concentração de sacarose e membranas comerciais
à base de celulose (Sorbarods®). Os autores concluíram que a capacidade fotossintética foi
influenciada pelo nível de sacarose no meio de cultura e as maiores taxas de fotossíntese
correspondiam às culturas com 0 e 1% de sacarose.
28
PAR: Photosynthetically active radiation
Figura 2.2 Tipos de sistemas de micropropagação in vitro: A - Heterotrófico - total
vedação e adição de sacarose (C12H22O11) ao meio de cultura; B Fotomixotrófico - maior eficiência luminosa (fontes PAR –
Photossynthetically Active Radiation), frascos ventilados (CO2) e adição de
sacarose ao meio de cultura; C - Fotoautotrófico - maior eficiência luminosa,
frascos ventilados, e sem adição de sacarose ao meio (adaptado de Kozai et
al., 2005).
2.5 CONSERVAÇÃO DE GERMOPLASMA IN VITRO
O germoplasma, que é o patrimônio genético de uma espécie, é composto
pelos parentes silvestres das plantas cultivadas, por variedades locais, também conhecidas
como variedades crioulas ou landraces, por variedades obsoletas ou antigas, por linhas
avançadas de melhoramento e por variedades elite atuais (Hoyt, 1992). O Brasil é detentor
de uma das maiores biodiversidades do planeta. Para utilizar estes recursos genéticos de
forma sustentável é vital que pesquisas busquem meios de conservar o material genético
disponível de maneira adequada e por longos períodos de tempo. O objetivo primordial das
tecnologias destinadas à conservação de germoplasma é maximizar a preservação da
diversidade genética de determinada espécie ou variedade objetivando o uso atual e futuro
como fonte de variabilidade (Razdan, 2003).
29
Um dos sistemas de conservação de germoplasma é a conservação in situ,
definida pela Convenção sobre Diversidade Biológica (CDB), como: “a conservação dos
ecossistemas e dos habitats naturais e a manutenção e a reconstituição de populações
viáveis de espécies nos seus ambientes naturais e, no caso de espécies domesticadas e
cultivadas, nos meios onde tenham desenvolvido suas propriedades características” (Brasil,
2000). Outra forma de conservação é a ex situ, segundo Medeiros (2014), consiste na
manutenção de uma representatividade da biodiversidade, fora dos habitats naturais.
Segundo Mroginski et al. (1991) a definição de qual método a ser utilizado
para a conservação do germoplasma de plantas superiores dependerá do sistema de
propagação de cada espécie. Quando plantas apresentam sementes não ortodoxas, que se
multiplicam
exclusivamente
por
propagação
vegetativa,
apresentando
intensa
heterozigosidade ou elevada segregação, e também espécies arbóreas de grande porte que
demoram muitos anos para passar do estádio juvenil à fase adulta reprodutiva, é necessário
utilizar métodos alternativos de conservação. Um destes métodos seria a cultura in vitro, na
qual se pode obter uma planta completa a partir do cultivo de células, tecidos ou órgãos
meristemáticos (Souza et al., 2009).
Segundo Simon (2010), Engelmann (2011) e Reed (2013), as técnicas de
conservação in vitro apresentam muitas vantagens em relação aos outros sistemas de
conservação convencional:

Otimização do espaço físico e redução dos custos e mão-de-obra;

Manutenção dos genótipos em condições assépticas;

Rápida multiplicação de material vegetal em grande escala;

Reduzido risco de perda por desastres climáticos e ataques de pragas e doenças;

Possibilita um rápido acesso ao germoplasma;

Facilidade de intercâmbio do material vegetal.
Entretanto a cultura de tecidos in vitro apresenta algumas limitações, segundo
Santos (2000) e Carvalho & Vidal (2003), podemos destacar:

Necessidade de frequentes subculturas;

Risco de perda por contaminação;

Possibilidade de variação genética ao longo do cultivo;

Necessidade de instalações e mão de obra especializada para a manutenção do
germoplasma;

Dificuldade de estabelecimento de protocolos de micropropagação.
30
As desvantagens do método in vitro de conservação de germoplasma, podem
ser minimizadas utilizando sistemas que limitam o desenvolvimento das plantas, tais como
a criopreservação, que consiste na manutenção dazo material vegetal a temperaturas muito
baixas de -150ºC (nitrogênio na fase de vapor) ou -196ºC (nitrogênio na fase líquida) e
sistema de crescimento mínimo, onde há adição de retardantes osmóticos e hormonais no
meio de cultura (Winthers & Williams, 1998; Scherwinski-Pereira & Costa, 2010). O
objetivo principal nestes sistemas é realizar a conservação por meio de alterações no
ambiente de cultivo, que desaceleram ou suspendam o desenvolvimento do material
cultivado, isto sem interferir na viabilidade e na estabilidade genética (Withers &
Engelmann, 1998).
As plantas têm comportamentos diferentes quando submetidas ao ambiente in
vitro, e isto também se aplica a variedades de uma mesma espécie. Sendo assim as
pesquisas devem aferir de forma singular cada caso, objetivando otimizar as técnicas de
conservação in vitro para resolver problemas que dificultam a utilização de alguns
germoplasmas. É necessário estudar sobre a fisiologia, aspectos estruturais e a estabilidade
genética do material a ser conservado, para se utilizar técnicas de conservação in vitro mais
adequadas, com os melhores resultados possíveis (Razdan, 2003).
2.5.1 Criopreservação
A criopreservação é considerada o método ideal para a conservação de
germoplasma por permitir o armazenamento de materiais biológicos por tempo
indeterminado, mantendo sua estabilidade genética e suas características fenotípicas,
usando pouco espaço e requerendo pouca manutenção (Engelmann, 1997).
A técnica da criopreservação reduz o metabolismo a níveis muito baixos, no
qual todos os processos bioquímicos são significativamente reduzidos e a deterioração
biológica é virtualmente paralisada. A criopreservação possui vantagens tais como o
pequeno espaço a ser ocupado por um banco de germoplasma, a facilidade de manuseio
das condições de armazenamento e, por fim, o baixo custo do processo (Almeida et al.,
2002; Kartha, 1985).
O principal desafio para a criopreservação é realizar o congelamento sem a
formação de cristais de gelo no interior das células. A formação de gelo no meio
intracelular causa ruptura do sistema de membranas celulares, resultando em perda da
31
semipermeabilidade e da compartimentação celular em consequência disso, as células
entram em colapso (Buzó & Rosa, 2007).
A criopreservação pode ser uma alternativa para a conservação de espécies que
são atualmente mantidas em coleções de campo, jardins botânicos, reservas naturais ou
sistemas de conservação in vitro com plantas em regime de crescimento controlado
(Harding et al., 1997). Ainda segundo o Internacional Board for Plant Genetic Resources
– IPBGR (1982) a criopreservação é uma técnica indicada para as espécies de propagação
vegetativa, espécies com sementes recalcitrantes, germoplasmas raros, de espécies
ameaçadas de extinção e de plantas silvestres (Stanwood, 1980, 1985, 1987).
A escolha da técnica de criopreservação irá depender do tempo de
armazenamento, da espécie, da parte da planta a ser preservada, da disponibilidade de mão
de obra e dos recursos financeiros disponíveis. A perspectiva futura é que a
criopreservação se torne mais utilizada no armazenamento de materiais vegetais, e
consequentemente, na conservação das fontes genéticas vegetais por longo prazo
(Engelmann, 2004).
No entanto, apesar dos métodos de conservação in vitro serem considerados
potenciais, é importante ressaltar que nenhum método de conservação ex situ deve ser visto
como substituto para a conservação in situ. Isso por que nenhuma técnica que seja aplicada
isoladamente conserva de modo adequado toda a diversidade genética de determinada
espécie, ou seja, seu pool gênico (Divakaran et al., 2006).
32
3
MICROPROPAGAÇÃO
EM
SISTEMA
MIXOTRÓFICO
DE
Hancornia speciosa GOMES
RESUMO
A micropropagação tem sido utilizada como técnica de propagação vegetativa e também
como de conservação ex situ de germoplasma vegetal. Tradicionalmente esta técnica utiliza
o sistema heterotrófico que utiliza a sacarose como fonte de energia para o tecido vegetal
no meio de cultura e os recipientes que acondicionam o material vegetal são fechados
cuidadosamente. Outra vertente da micropropagação é o sistema mixotrófico, que também
adiciona sacarose ao meio, mas os recipientes são vedados de maneira a permitir trocas
gasosas entre o meio interno e externo, e esta ventilação favorece o desenvolvimento
vegetal no ambiente in vitro. O presente trabalho teve como objetivo aprimorar a técnica
de propagação in vitro da Hancornia speciosa Gomes, por meio da comparação do sistema
heterotrófico com o sistema mixotrófico, visando o estabelecimento de um protocolo de
micropropagação, com a seleção da melhor vedação dos frascos (que permite ou não as
trocas gasosas), tipo do meio de cultura (MS ou WPM) e concentração de reguladores de
crescimento para indução de brotação (BAP e AIA) e rizogênese (AIB). Para a fase de
germinação, sementes devidamente desinfestadas foram inoculadas em tubos de ensaio
com ou sem troca gasosa em meio MS. Na fase de indução de brotação foi utilizado meio
MS e WPM suplementados com 2 mg.L-1 de BAP e 0,0; 0,5; 1,0 e 1,5 mg.L-1 de AIA. Para
o enraizamento, foi usado meio WPM suplementado com 2, 4 e 6 mg.L-1 de AIB. Os
experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado em sala de
crescimento com temperatura de 25 ± 1ºC em condição luminosa de 45 µmol.m-2.s-1 e
fotoperíodo de 16 horas. O tipo de vedação de frasco mais favorável para viabilidade de
mudas germinadas in vitro foi o que permitiu trocas gasosas. Quanto ao número de brotos
o meio WPM foi o que obteve resultados mais satisfatórios, enquanto que para o
comprimento do broto não houve diferença estatística entre os meios. O tratamento mais
33
satisfatório para o enraizamento foi a concentração de 6 mg.L-1 de AIB. A aclimatização
foi procedida com sucesso, com 80% de sobrevivência após noventa dias de aclimatização.
Palavras-chave: Cultura de tecidos, sistema heterotrófico, mangabeira.
ABSTRACT
The micropropagation has been used as vegetative propagation technique as well as ex situ
conservation of plant germplasm. Traditionally this technique uses heterotrophic system
that uses sucrose as a source of energy for the plant tissue culture medium in the flasks
contained therein and the plant material are carefully closed. Another aspect the
micropropagation is mixotrophic system, which also adds to the sucrose medium, but the
flasks are sealed so as to allow gas exchange between the internal and external
environment, and this ventilation promotes best plant development on in vitro
environment. This study aimed to improve the in vitro propagation technique of H.
speciosa by comparing the heterotrophic system with mixotrophic system, aiming to
establish a micropropagation protocol, with the selection of better sealing of flasks (which
allows or no gas exchange), type of culture medium (MS or WPM) and concentration of
growth regulators for budding induction (BAP and IAA) and rooting (IBA). For
germination stage, properly sterilized seeds were seeded in test tubes with or without gas
exchange in MS medium. In budding induction phase, a medium MS and WPM
supplemented with 2 mg.L-1 BAP and 0.0; 0.5; 1.0 and 1.5 mg L-1 IAA. For rooting was
used WPM medium supplemented with 2, 4 and 6 mg.L-1 IBA. The experiments were
conducted in a completely randomized design in a growth chamber at 25 ± 1 ° C
temperature in light condition of 45 μmol.m-2.s-1 and photoperiod of 16 hours. The most
favorable type of flask seal for viability of in vitro germinated seedlings was thus allowing
gas exchange. Regarding the number of shoots the WPM medium was what obtained more
satisfactory results, while for the shoot length there was no statistical difference between
the mediums. The most satisfactory treatment for rooting was the concentration of 6 mg.L1 IBA. Acclimatization was proceeded successfully, with 80% survival after ninety days of
acclimatization.
Key words: Tissue culture, heterotrophic system, mangabeira
34
3.1 INTRODUÇÃO
A propagação de Hancornia speciosa Gomes, na maioria dos casos, é realizada
pela via sexuada, sendo que as sementes devem ser extraídas de frutos maduros e ter a
polpa retirada por meio de lavagem com água, pois esta impede a germinação (Barros,
2006). Segundo Soares (2014), o teor de água inicial das sementes é de aproximadamente
de 40%. Depois de 33 horas em estufa com circulação de ar e temperatura de 30ºC, a
porcentagem de germinação foi de 79%. Após 48 horas, a taxa de germinação decresceu
chegando a 13% em 72 horas de secagem. Isso demonstra a característica de recalcitrância
das sementes. Em condições controladas, in vitro, sementes da H. speciosa apresentam
uma boa taxa germinativa. Segundo Ledo et al. (2007) e Soares et al. (2009), os índices de
germinação alcançaram mais de 80% utilizando diferentes meios de cultura, entre eles o
meio MS e WPM.
Uma vez selecionado um genótipo de interesse e escolhido o sistema de
micropropagação para a produção de mudas, tem-se a vantagem da produção de clones em
larga escala e, principalmente, livres de patógenos. Martin (1985) já sinalizava vantagens
nas chamadas “técnicas de melhoramento in vitro”. Quando bem executadas, resultam em
indivíduos uniformes e muito semelhantes aos provenientes de sementes, o que pode elevar
significativamente a produtividade quando comparadas a técnicas convencionais de
propagação. Contudo, a aplicação da micropropagação convencional em plantas lenhosas
ainda é limitada devido ao oneroso custo de produção, atribuído em grande parte às taxas
de crescimento relativamente baixas, perdas significativas por contaminação, falta de
enraizamento e baixas percentagens de sobrevivência de plantas in vitro após a
transferência para ex vitro (Kozai & Kubota, 2001).
No sistema heterotrófico de micropropagação, as mudas são acondicionadas
em recipientes hermeticamente fechados e com luminosidade baixa. As plantas cultivadas
sob este sistema podem parecer normais, entretanto não produzem clorofila ativamente
devido à baixa taxa de fotossíntese. Além disso, ocorrem alterações morfológicas
ocasionadas pela alta umidade relativa e acúmulo de gases no interior dos recipientes, o
que desencadeia a formação de estômatos disformes, hiperhidricidade, folhas reduzidas,
morte prematura de explantes, e consequentemente, perdas elevadas na aclimatização
(Kozai & Kubota, 2005; Hazarika, 2006). A justificativa para a micropropagação
heterotrófica é a tentativa de se evitar ou anular a contaminação do meio de cultura pela
35
vedação total dos frascos e a compensação da baixa fotossíntese pela suplementação
exógena de sacarose, muitas vezes em altas concentrações, o que é contestado em vários
estudos (Nguyen et al., 1999; Rahman e Alsadon, 2007; Damiani & Schuch, 2009).
No sistema mixotrófico, mantém-se a fonte de carbono para melhorar a taxa de
transpiração e, consequentemente, a absorção de nutrientes. Adicionando-se a ventilação
aos frascos do sistema (Kozai & Kubota, 2005). Quando o recipiente de cultura possui
ventilação, a taxa de fotossíntese pode ser aumentada significativamente devido ao
aumento das concentrações de CO2. Além disso, a umidade relativa no interior do
recipiente é reduzida, o que, por sua vez aumenta a taxa de transpiração (Chun & Kozai,
2001).
Diversos fatores podem afetar o potencial germinativo das sementes, dentre
eles a presença de micro-organismos, especialmente fungos e bactérias (Corder & Borges
Junior, 1999). Os agentes contaminantes muitas vezes inviabilizam a cultura in vitro e são
os maiores entraves para a micropropagação, pois toda a fonte de explantes fica
comprometida. Para que a planta formada a partir da germinação in vitro possa ser fonte de
explante confiável, os métodos de desinfestação devem ser eficazes, proporcionando total
ausência de agentes patológicos (Nascimento et al., 2007).
O processo de desinfestação utiliza várias substancias com ação germicida,
dentre elas se destacam o etanol e os compostos à base de cloro (Couto et al., 2004 e Sousa
et al., 1999). O hipoclorito de sódio ou de cálcio vem mostrando grande eficiência na
desinfestação de sementes, eliminando fungos e bactérias, assim como a utilização de
fungicidas e bactericidas, promovendo aumento no total de plântulas germinadas a partir
de sementes tratadas (Nascimento et al., 2007).
Cada tipo de tecido, de uma mesma planta, tem uma sensibilidade diferente
quando exposto a uma substancia desinfestante. Essa resposta pode variar ainda mais em
função da concentração e do tempo de exposição a estas substancias (Montarroyos, 2000).
Desta maneira é imprescindível um estudo individualizado de cada espécie para o
estabelecimento de protocolos eficazes de desinfestação.
Reguladores de crescimento podem ser adicionados ao meio de cultura para
suprir as possíveis deficiências dos teores endógenos de hormônios nos explantes
(Grattapaglia & Machado, 1998). As auxinas controlam o crescimento e o alongamento
celular e as citocininas controlam a citocinese ou divisão celular, estando também
intimamente ligadas à diferenciação das células, sobretudo no processo de formação de
36
gemas caulinares (Kerbauy, 2004). O balanço entre estes dois tipos de reguladores controla
muitos aspectos da diferenciação e organogênese nas culturas de tecidos de órgãos vegetais
(Pasqual, 2001).
Estudos sobre a micropropação da H. speciosa pesquisaram sobre a eficiência
de diferentes meios de cultura para a germinação in vitro de sementes e formação de
plântulas (Lédo et al., 2007; Oliveira et al., 2014). Outros estudos verificaram a ação dos
reguladores de crescimento e indução de calos (Lédo et al., 2005; Fráguas et al., 2009).
Sousa et al. (2007) observaram que concentrações de BAP podem promover brotações;
estudos relacionados à rizogênese utilizaram auxinas como indutores, como se pode
encontrar em Lemos et al. (2006), Pinheiro et al. (2002) e Grigoletto (1997).
Levando em consideração as mudanças climáticas e a ação antrópica sobre o
domínio Cerrado, assim como a necessidade de assegurar a conservação de germoplasma
da H. speciosa para programas de melhoramento genético, este trabalho teve como
objetivo desenvolver protocolos de micropropagação em sistema mixotrófico, visando a
melhor qualidade das mudas produzidas in vitro.
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos
Vegetais da Universidade Federal de Goiás – UFG, em Goiânia, GO. Sementes de H.
speciosa foram removidas de frutos maduros coletados, em outubro de 2013, de exemplares
da espécie pertencentes à Coleção de Frutíferas Nativas do Cerrado da Escola de Agronomia
da UFG.
3.2.1 Descontaminação de sementes
Após a colheita, os frutos foram despolpados em peneira e as sementes lavadas
em água corrente. Para a retirada do excesso de mucilagem foi usado um pano de algodão.
Em seguida as sementes foram colocadas sobre folhas de papel toalha, onde secaram à
sombra, em temperatura ambiente, por 24 horas. As sementes de H. speciosa foram
separadas em dois grupos: com tegumento e sem tegumento. O tegumento do segundo grupo
foi removido com o auxílio de bisturi. Na pré-assepsia dos dois grupos, as sementes
receberam 20 gotas de detergente neutro e permaneceram por 20 min. em água corrente. Em
37
seguida, as sementes de cada grupo foram imersas em álcool 70% por um min. e destinadas
aos respectivos tratamentos. Ambos os grupos de sementes foram submetidos a cinco
tratamentos em solução com 0,25% de cloro ativo onde permaneceram por 5, 10,15, 20 e 25
minutos. Tratamentos de T1 a T5 utilizaram sementes com tegumento. Tratamentos de T6 a
T10 utilizaram sementes sem tegumento. Dentro da câmara de fluxo laminar, as sementes
foram submetidas a uma tríplice lavagem em água destilada e autoclavada, sendo inoculadas
em meio de cultura MS (Murashige & Skoog, 1962) com 30 g.L-1 sacarose sem adição de
reguladores de crescimento. O pH do meio de cultura utilizado foi ajustado para 5,7 – 5,8
antes da adição de ágar (5,5 g.L-1). Foram utilizados tubos de ensaio com capacidade de 50
mL, preenchidos com 17 mL de meio de cultura e autoclavados a 120ºC e 1 atm, por 20
minutos. Após a inoculação das sementes, cada tubo de ensaio foi mantido em sala de
crescimento com temperatura de 25 ± 1ºC em condição luminosa de 45 µmol.m-2.s-1 e
fotoperíodo de 16 horas. Utilizou-se 11 repetições por tratamento e as avaliações sobre a
taxa de contaminação foram realizadas quinzenalmente durante 45 dias.
3.2.2 Germinação das sementes
As sementes, após coletadas, despolpadas e com o excesso de mucilagem
retirado, foram armazenadas sobre papel toalha umedecido e acondicionadas em placas de
Petri a uma temperatura de 12°C para a conservação da umidade. No preparo do
experimento tiveram o tegumento removido com auxílio de bisturi. Os tratamentos
consistiam em dois diferentes tipos de vedação, sendo o primeiro de vedação completa e
outro semipermeável que permitia trocas gasosas (mixotrófica), em meio de cultura MS,
sendo as sementes desinfestadas em hipoclorito de sódio a 0,25% de cloro ativo por 15 min.
O pH do meio foi ajustado para 5,7 - 5,8 antes da adição de ágar (5,5 g.L-1) e os tubos de
ensaio autoclavados a 120ºC a 1 atm, por 20 minutos. Após a inoculação das sementes, os
tratamentos foram mantidos em sala de crescimento com temperatura de 25 ± 1ºC em
condição luminosa de 45 µmol.m-2.s-1 e fotoperíodo de 16 horas. No experimento foram
utilizadas 40 repetições. Primeiramente foram avaliadas as sementes que iniciaram a emissão
de radícula (considerada como germinada) até o período de 30 dias, em seguida, para aferir a
taxa de plantas viáveis, foram feitas avaliações mensalmente durante 150 dias observando
se a taxa de sobrevivência das plantas e se estas apresentavam alterações morfológicas.
38
3.2.3 Brotação
Sementes de H. specisa Gomes foram germinadas in vitro, obtendo-se
plântulas assépticas. Este material livre de contaminantes foi usado na obtenção de
explantes para a indução de brotações em sistema mixotófico (a vedação do tubo de ensaio
permite trocas gasosas). Para estimular a brotação lateral, foram excisados as folhas, raízes
e os ápices caulinares, deixando somente duas gemas axilares. Para verificar o efeito da
interação entre BAP e AIA, em dois tipos de meio de cultivo (MS e WPM), foi utilizado
2,0 mg.L-1 de BAP e diferentes concentrações de AIA (0,0; 0,5; 1; e 1,5 mg.L-1) nos
tratamentos. A combinação destes dois reguladores de crescimento em dois meios de
cultura resultou em um total de 8 tratamentos (Tabela 3.1).
Tabela 3.1 Tratamentos utilizados para indução de brotações in vitro, de segmentos nodais
de Hancornia speciosa Gomes.
No de
tratamentos
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
Meio de cultura
MS
MS
MS
MS
WPM
WPM
WPM
WPM
Concentrações (mg.L-1)
AIA*
BAP**
0,0
2,0
0,5
2,0
1,0
2,0
1,5
2,0
0,0
2,0
0,5
2,0
1,0
2,0
1,5
2,0
* Ácido indolacético (AIA) ** 6-benzilaminopurina (BAP)
Os explantes de H. speciosa foram inoculados em câmara de fluxo laminar,
individualmente, em tubos de ensaio (25 x 150 mm) contendo 17 mL meio de cultura
(Figura 3.1). A incubação foi mantida com temperatura de 25 ± 1ºC em condição luminosa
de 45 µmol.m-2.s-1 e fotoperíodo de 16 horas. Cada um dos tratamentos possuíam 25
repetições, totalizando 200 tudos. Avaliou-se quinzenalmente por 75 dias o número de
brotações, o comprimento dos brotos, a presença de raízes nos explantes, e a presença ou
não de calos na base.
39
Figura 3.1 Etapas da inoculação de segmentos nodais de H. speciosa. A – retirada da
plântula germinada in vitro do tubo de ensaio em câmara de fluxo laminar; B
– remoção das raízes; C – excisão dos explantes com aproximadamente duas
gemas laterais; D – remoção das folhas; E – inoculação do explante em meio
de cultura suplementado com reguladores de crescimento (AIA e BAP); F –
tubo pronto para ser mantido em sala de crescimento.
3.2.4 Enraizamento e aclimatização
Brotos obtidos in vitro de H. speciosa foram induzidos ao desenvolvimento de
raízes. As brotações foram transferidas em câmara de fluxo laminar para tubos de ensaio
(25 x 2,3 cm) contendo 50 mL meio de cultura. Os tratamentos consistiram em sistema
mixotrófico de vedação, meio WPM, suplementado com diferentes concentrações de AIB
(0; 2; 4; e 6 mg.L-1), totalizando quatro tratamentos (Tabela 3.2).
Tabela 3.2 Tratamentos utilizados na indução de raízes, em brotações estabelecidas in
vitro a partir do cultivo de segmentos nodais de Hancornia speciosa Gomes.
No de Tratamentos
T1
T2
T3
T4
Descrição
Meio WPM + sistema mixotrófico
Meio WPM + 2 mg.L-1de ANA + sistema mixotrófico
Meio WPM + 4 mg.L-1de ANA + sistema mixotrófico
Meio WPM + 6 mg.L-1de ANA + sistema mixotrófico
O meio de cultura teve o pH ajustado para 5,7 - 5,8, a incubação foi mantida
com temperatura de 25 ± 1ºC em condição luminosa de 45 µmol.m-2.s-1 e fotoperíodo de 16
40
horas. Com 25 repetições por tratamento, avaliou-se a presença ou não de raízes, o número
médio e o comprimento médio de raízes, presença ou não de plântulas e sua altura, aos 30,
45, 60 e 75 dias.
Para a aclimatização, foram utilizadas dez mudas com pelo menos cinco
centímetros de altura, quatro folhas formadas e comprimento de raízes de pelo menos dois
cm. As mudas foram retiradas dos tubos de ensaio, lavadas com água destilada, colocadas
em substrato próprio sugerido por Oliveira et al. (2012) e mantidas em estufa por noventa
dias. Verificou-se a porcentagem de sobrevivência das mudas após 90 dias de cultivo.
3.2.5 Delineamento experimental e análises estatísticas
Em todos os experimentos o delineamento experimental usado foi o inteiramente
casualizado em que cada parcela consistiu de um tubo de ensaio com uma semente ou
explante. Para o experimento de brotação os tratamentos foram arranjados em um fatorial
4x2 – quatro concentrações de AIA e dois meios de cultura. A normalidade dos dados
obtidos para os tratamentos foi testada pelo teste de Lilliefors. Os tratamentos foram
comparados por análise de variância ANOVA, seguido por teste Tukey. As concentrações
de AIA e AIB foram submetidas a regressão polinomial quadrática. Quando detectadas
diferenças significativas entre os tratamentos e entre as interações, as médias foram
comparadas entre si, pelo teste t de Student. Todos os testes foram realizados ao nível de
significância de 5%. As análises estatísticas foram conduzidas com auxílio do software
Biostat 5.0 (Ayres et al., 2007).
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.3.1. Descontaminação de sementes
No experimento de descontaminação, o procedimento para todos os tratamentos
das sementes com tegumento, apresentou baixa eficácia. Independentemente do tempo de
exposição ao cloro ativo, o índice de contaminação por bactérias superou 27%. Nos
tratamentos em que houve a remoção do tegumento a porcentagem de contaminação não
ultrapassou 9,09%, o que evidência uma influência do tegumento na contaminação das
41
sementes in vitro. Acredita-se que um dos fatores que possa ter influenciado no alto índice de
contaminação são a pilosidade e a mucilagem residual do tegumento das sementes de H.
speciosa.
Nas sementes sem tegumento, os tratamentos utilizados não diferiram
estatisticamente entre si, quando analisados pelo teste de Tukey (Tabela 3.3). Quando
presente a contaminação, foi exclusivamente por bactérias, fato este reforçado pela
testemunha que apresentou somente este tipo de agente contaminante (Figura 3.2).
Tabela 3.3 Taxa (%) de contaminação das sementes de H. speciosa com e sem tegumento,
submetidas à diferentes tempos de exposição ao hipoclorito de sódio (0,25%
de cloro ativo), após 45 dias de inoculação em meio MS.
Tegumento
Com
Sem
Tempos de exposição ao hipoclorito de sódio (minutos)
0
5
10
15
20
25
100 Aa 54,55 Ba 36,36 Ba 54,55 Ba 31,82 Ba 27,27 Ba
100 Aa
9,09 Bb
9,09 Bb
0,00 Bb
9,09 Bb
0,00 Bb
Médias seguidas de mesma letra maíuscula na linha não diferem entre si, pelo teste Tukey a 5% de
significância.
Médias seguidas de mesma letra minúscula na coluna não diferem entre si, pelo teste t de Student, a 5% de
significância.
Figura 3.2 Sementes de H. speciosa inoculadas em meio MS, contaminadas por bactérias,
após serem tratadas com solução desinfestante à base de hipoclorito de sódio
(0,25% de cloro ativo).
Silva (2012), em seu estudo sobre descontaminação de sementes de Eugenia
dysenterica DC testou, em dois grupos de sementes: com tegumento e sem tegumento, sete
tratamentos, sendo quatro doses de cloro ativo e três doses de casugamicina
(fungicida/bactericida sistêmico). Concluiu que o processo de desinfestação se mostrou
ineficiente para todos os tratamentos das sementes com tegumento, pois independentemente
42
das concentrações de cloro ativo e casugamicina, o índice de contaminação por fungos e/ou
bactérias foi de 100%. Já a menor taxa de contaminação (6,66%), foi obtida no tratamento da
semente sem tegumento imersa por 20 min. em hipoclorito de sódio na concentração de
2,5% de cloro ativo.
Pereira et al. (2008), constataram que a retirada do tegumento de sementes de
Abarema cochliacarpos (B.A. Gomes) Barneby e J.W.Grimes foi fundamental para a
redução da porcentagem de contaminação, havendo uma redução de 81,1% da contaminação
do tratamento controle com tegumento para o melhor tratamento sem tegumento. Fick et al.
(2007), constataram que a retirada do tegumento das sementes de Cordia trichotoma (Vell.)
Arrabida ex Steudel (louro-pardo) foi essencial para o sucesso da germinação in vitro, já que
a presença do tegumento promoveu 100% de contaminação. Retirando-se o tegumento a taxa
de contaminação diminuiu consideravelmente, cerca de 90% a 100%.
3.3.2. Germinação das sementes
Os resultados demonstraram que em ambos os tratamentos, T1 (vedação
completa) e T2 (permite trocas gasosas), as sementes de H. speciosa apresentaram uma alta
porcentagem de germinação, cerca de 90% das sementes emitiram a radícula (Figura 3.3).
Para este item de avaliação, não houve diferença significativa entre os tratamentos T1 e T2,
os quais apresentaram taxas de 90% e 87,5% de germinação respectivamente.
43
Figura 3.3 Germinação in vitro de sementes de H. speciosa: A – emissão de radícula; B –
emissão de plântula; C – sistema radicular; D – plântula em desenvolvimento.
Em relação ao desenvolvimento de plantas, foi possível observar que após 120
dias de cultivo todas as plantas germinadas no tratamento T1 começaram a apresentar
senescência foliar e/ou amarelecimento dos tecidos. Entretanto, no tratamento T2, 88% das
plantas permaneceram com tecidos verdes e com suas folhas, as quais estavam mais
expandidas. Embora não tenha sido realizada análise estatística, através das análises visuais
observou-se que as plantas do tratamento T2 demonstraram um maior crescimento (sendo
limitadas pelo comprimento do tubo de ensaio) quando comparadas com as plantas do
tratamento T1 (Figura 3.4).
44
Figura 3.4 Aspecto visual de mudas de H. speciosa germinadas in vitro, após 90 dias de
inoculação: A – sistema mixotrófico; B – sistema heterotrófico.
A última avaliação feita aos 150 dias, sobre as sementes que germinaram,
mostrou que no tratamento T1 nenhuma planta estava viável (0%), pois das 36 plantas que
germinaram, 36 apresentaram senescência, 7 estavam com amarelecimento e 29 estavam
mortas, enquanto que tratamento T2 das 35 plantas germinadas, 4 (12%) apresentaram
senescência (Tabela 3.4).
O ambiente fechado do sistema heterotrófico favorece o acúmulo do gás etileno.
Este gás é um fitohormônio responsável pela abscisão de folhas, frutos e flores o qual é
produzido em maior quantidade nas folhas jovens em desenvolvimento, do que nas folhas
completamente expandidas (Taiz & Zeiger, 2006). O etileno, mesmo em pequenas
concentrações, pode ser fisiologicamente ativo e desencadear vários processos, dentre esses a
abscisão foliar (Kerbauy, 2004).
45
Tabela 3.4 Viabilidade de plantas de Hancornia speciosa cultivadas em diferentes tipos de
vedação após 150 dias de incubação.
Senescência
Amarelecimento
Morte
Senescência
Amarelecimento
Morte
Plantas germinadas em tubos fechados
30 dias
60 dias
90 dias
120 dias
1
13
28
36
0
0
7
18
0
0
0
0
Plantas germinadas em tubos com trocas gasosas
30 dias
60 dias
90 dias
120 dias
0
0
2
4
0
0
0
0
0
0
0
0
150 dias
36
7
29
150 dias
4
0
0
Soares et al. (2009) verificaram o efeito de meios de cultura WPM, WPMx2
(com o dobro da concentração de sais), WPM/2 (com metade da concentração de sais), MS e
MS/2 (com metade da concentração de sais), suplementados com 30,0 g L-1 de sacarose),
concentrações de GA3 (0,0; 0,2 e 0,4 mg.L-1) e pH (4,8; 5,8 e 6,8) na germinação in vitro de
mangabeira (Hancornia speciosa Gomes). Apesar da não significância estatística, os autores
aferiram uma pequena superioridade dos meios de cultura WPM e MS/2, ambos
proporcionando 100% de germinação. Quanto ao efeito do GA3 a concentração de 0,2 mg L-1
favoreceu a germinação e não houve diferenças estatísticas para as faixas de pH testadas,
sendo alcançado uma taxa de germinação de 100% com o pH de 5,8.
Silveira (2015) em seu trabalho de comparação do sistema heterotrófico de
propagação in vitro de Eugenia dysenterica (Mart.) DC. com um sistema mixotrófico,
utilizou explantes inoculados em tubos de ensaio com ou sem troca gasosa em meio WPM
suplementado com concentrações variadas de ANA e BAP. A autora inferiu que o sistema
mixotrófico é superior no momento da formação de novos brotos no que se refere ao maior
número de brotos, maior número de folhas por broto, e síntese de pigmentos fotossintéticos.
3.3.3 Brotação
Para a variável número de brotos, na análise do fatorial 4 concentrações de
AIA x dois tipos de meios (MS e WPM) não houve significância para o efeito dos meios (p
= 0,2911) nem na interação dos dois fatores (0,2054). Porém, a análise detectou diferenças
significativas entre os tratamentos (p = 0,0106). Entretanto, quando as concentrações foram
avaliadas pela regressão polinomial, não houve diferença estatística entre as concentrações
46
de AIA em nenhum dos meios testados: MS (p = 0,8296) e WPM (p = 0,2985) (Figuras 3.5
e 3.6). Porém, comparando-se somente os tratamentos T1 (MS + 2,0 mg.L-1) e T5 (WPM +
2,0 mg.L-1), sem a presença de AIA, verifica-se pelo teste t que o meio WPM é o mais
indicado para estimular a brotação (p = 0,0302).
Figura 3.5 Análise de regressão quadrática para número de brotos de Hancornia speciosa
Gomes, em função da concentração de AIA inoculados em meio de cultura
MS, com vedação que permite trocas gasosas (p = 0,8296).
47
Figura 3.6 Análise de regressão quadrática para número de brotos de Hancornia speciosa
Gomes, em função da concentração de AIA inoculados em meio de cultura
WPM, com vedação que permite trocas gasosas (p = 0,2985).
Soares et al. (2010) em seus estudos com Hancornia speciosa Gomes, afirmam
que as citocininas promoveram a proliferação de brotações em todos os seus tratamentos
testados, sendo a 6-benzilaminopurina (BAP) com a concentração de 2,0 mg.L-1 a que
obteve melhor média de 1,8 brotos por explante. Morales et al. (1999) inferiram que em
macieira, cv. gala RW1, para o número de brotos, a presença do BAP no meio MS,
favoreceu uma maior formação de brotações. Na pesquisa de Bezzera et al. (2014) sobre o
efeito da citocinina na multiplicação de brotos de Mimosa caesalpiniifolia Benth
(Fabaceae), a curva de resposta apresentou-se ascendente até a concentração de 17,76
μmol/L de BAP em meio WPM, atingindo o ápice de brotações, seguido pelo declínio
quando os explantes são submetidos a concentrações superiores à supracitada.
Para a variável comprimento de brotos, na análise do fatorial 4x2 também não
houve significância para o efeito dos meios (p = 0,5478) nem na interação dos dois fatores
(0,6140). Porém, a análise detectou diferenças significativas entre os tratamentos (p =
0,0001). Entretanto, da mesma forma para número de brotos, quando as concentrações
foram avaliadas pela regressão polinomial, também não houve diferença estatística em
nenhum dos meios testados: MS (p = 0,6793) e WPM (p = 0,3883) (Figuras 3.7 e 3.8). O
mesmo resultado ocorreu na comparação dos tratamentos T1 (MS + 2,0 mg.L-1) e T5
48
(WPM + 2,0 mg.L-1), sem a presença de AIA, verifica-se pelo teste t que não há diferença
estatística entre os meios (p = 0,0646).
Reis (2011) em seu estudo de indução de brotações em microestacas de H.
speciosa, utilizou segmentos caulinares contendo até duas gemas laterais inoculados em
meio de cultura WPM, suplementado com diferentes concentrações de BAP (0,0; 1,0; 2,0;
3,0 e 4,0 mg.L-1), ANA (0,0; 0,5; 1,0 e 1,5 mg.L-1) e sacarose à 3%. O autor concluiu que a
concentração de 3 mg.L-1 de BAP possibilita a obtenção de brotações mais desenvolvidas,
porém induz também a formação de calos na base dos explantes e à adição de ANA ao
meio de cultura é dispensável na multiplicação in vitro de microestacas de mangabeira.
Soares et al. (2007) relataram que os maiores comprimentos médios das
brotações, em explantes caulinares de mangabeira, 3,17; 3,0 e 2,87 cm, foram verificados
nos tratamentos com 1,0; 2,0 e 3,0 mg.L
-1
de BAP, respectivamente. Acima dessas
concentrações houve uma tendência de redução do tamanho dos brotos formados.
Após 15 dias de incubação várias repetições nos tratamentos que possuíam
concentrações de AIA, apresentaram a formação de calos na base do explante. No final da
avaliação aos 75 dias, os tratamentos que apresentaram maior número de calos foram os
que tinham 1,5 mg.L-1 de AIA e 2 mg.L-1 de BAP ( T4, T8, T12, T16) mostrando que na
medida em que se elevava a concentração de AIA também se elevava a incidência de calos
não só na quantidade, mas também no tamanho deles (Figura 3.9).
A formação de calos na base do explante, seja este do tipo segmento nodal ou
ápice caulinar, é muito frequente em espécies lenhosas (Soares et al., 2007). Segundo
Grattapaglia & Machado (1998) a formação de calos na base dos explantes pode ser
atribuída às quantidades excessivas de auxina e sacarose, podendo ainda comprometer a
rizogênese e o crescimento de partes aéreas.
49
Figura 3.7 Análise de regressão quadrática para comprimento de brotos de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIA inoculados em meio de
cultura MS, com vedação que permite trocas gasosas (p = 0,6793).
Figura 3.8 Análise de regressão quadrática para comprimento de brotos de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIA inoculados em meio de
cultura WPM, com vedação que permite trocas gasosas (p = 0,3883).
50
Figura 3.9 Segmentos nodais de Hancornia speciosa, inoculados em diferentes meios de
cultura e suplementados com diferentes concentrações dos reguladores de
crescimento AIA e BAP: A – Brotos em meio WPM e vedação que permite
trocas gasosas; B – Brotos em meio MS e vedação que permite trocas gasosas;
C – broto bem desenvolvido, em meio MS e vedação total; D – Brotos em meio
WPM, a esquerda vedação semipermeável e a direita vedação total. Setas
indicam a formação de calos.
3.3.4 Enraizamento e aclimatização
Os tratamentos de enraizamento de H. speciosa, estimularam a formação de
raízes (Figura 3.10). Após trinta dias iniciou-se a fase de elongamento, observando-se
raízes mais espessas em comparação com raízes de plantas com semente (Figura 3.11).
Quanto ao número médio de raízes, houve diferença estatística significativa
entre as concentrações de AIB (p = 0,0276), sendo 6 mg.L-1
a concentração que
apresentou o resultado mais satisfatório com 9,35 raízes por explante, seguida da
concentração de 4 mg.L-1 com 6,57 raízes por explante e da concentração de 2 mg.L-1 com
2,72 raízes por explante (Figura 3.12).
51
Já para o comprimento médio da raiz não houve diferença significativa entre os
tratamentos (p = 0,2398), sendo que a média das concentrações 6, 4, e 2 mg.L-1 de AIB,
foram respectivamente 4,83, 4,85 e 2,21 cm de comprimento (Figura 3.13).
Figura 3.10 Enraizamento de segmentos nodais de Hancornia speciosa Gomes,
inoculados em meio de cultura WPM, suplementado com diferentes
concentrações de AIB e com vedação semipermeável: A – 2 mg.L-1 de AIB;
B – 4 mg.L-1 de AIB; C – 6 mg.L-1 de AIB.
52
Figura 3.11 Raízes de Hancornia speciosa Gomes, inoculados em meio de cultura WPM,
e com vedação que permite trocas gasosas: A – Raízes de segmentos nodais;
B – Raízes de mudas germinadas a partir de sementes.
Figura 3.12 Análise de regressão quadrática para número de raízes de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIB inoculados em meio
de cultura WPM, com vedação que permite trocas gasosas (p = 0,0276).
53
Figura 3.13 Análise de regressão quadrática para comprimento das raízes de Hancornia
speciosa Gomes, em função da concentração de AIB inoculados em meio de
cultura WPM, com vedação que permite trocas gasosas (p = 0,2398).
Todos os três tratamentos apresentaram a formação de parte aérea e não houve
diferença estatística entre eles (p = 0,4894), as concentrações 2, 4 e 6 mg.L-1 de AIB
obtiveram médias de 3,9, 9,6 e 6,7 cm, respectivamente (Figura 3.14).
Em se tratando de rizogênese in vitro de espécies lenhosas o AIB é utilizado
com maior frequência devido à estabilidade maior no espectro de ação e menor fitotoxidez
ao explante (Proebsting, 1984). Segundo Wang & Anderson (1988), o AIB é a auxina
sintética mais comumente utilizada na indução de enraizamento.
Em geral as espécies arbóreas, respondem com baixas taxas de enraizamento a
tratamentos in vitro (Kozai & Kubota, 2005). Certas espécies, principalmente as lenhosas,
enraízam com dificuldade ou não enraízam, mesmo na presença de auxinas (Rohr &
Hanus, 1987).
O que não foi observado no presente estudo, pois o tratamento de maior média
de número de raízes (T3 com 6 mg.L-1 de AIB) com 9,35 raízes por explante, se aproximou
bastante do número de raízes encontrado nos estádios iniciais de plantas desenvolvidas a
partir de sementes, as quais tem em média 11 raízes por planta. Provavelmente o
enraizamento satisfatório dos explantes ocorreu devido ao genótipo da planta matriz e/ou
aos níveis endógenos de auxinas dos explantes que podem ter contribuído para ativar esse
processo morfogenético.
54
Figura 3.14 Análise de regressão quadrática para comprimento da parte aérea de
Hancornia speciosa Gomes, em função da concentração de AIB inoculados
em meio de cultura WPM, com vedação que permite trocas gasosas (p =
0,4894).
A formação de raízes adventícias em partes aéreas é essencial para o
transplantio nas condições ex vitro e pode estar relacionada a diversos fatores como as
condições de crescimento da planta, idade fisiológica, posição do explante na planta
matriz, regulador de crescimento utilizado, potencial genético da planta, concentração
endógena de fitohormônios nos explantes e outros fatores como meio nutritivo, estado
físico do meio de cultura, pH e condições de incubação (Assis & Teixeira, 1998).
Um fato que reforça a hipótese do potencial genético e/ou dos níveis
endógenos de auxinas nos explantes, foi à resposta de diferentes genótipos de H. speciosa a
uma mesma concentração de AIB (4 e 6 mg.L-1). Na ocasião da montagem do experimento
de enraizamento, uma planta servia de matriz para, em média três explantes. Sendo assim
eles tinham o mesmo genótipo. Ao final do experimento havia diferenças visuais evidentes
no enraizamento, as quais podem ser atribuídas exclusivamente ao genótipo dos
indivíduos, já que as condições ambientais eram as mesmas para todas as repetições do
experimento (Figura 3.15).
55
Figura 3.15 Enraizamento de diferentes genótipos de Hancornia speciosa Gomes,
inoculados em meio de cultura WPM, suplementado com AIB e com
vedação que permite trocas gasosas: A – 4 mg.L-1 de AIB; B – 6 mg.L-1
de AIB.
Na aclimatização das dez mudas obteve-se 80% de sobrevivência após noventa
dias (Figura 3.16). Plantas que realizam mais fotossíntese tendem a ter um bom aspecto
nutricional, uma vez que o estímulo das trocas gasosas entre o ambiente externo e interno
pelo sistema de membranas favorece a absorção eficaz de nutrientes pelas plantas a partir
do meio de cultura (Arigita et al., 2010). Os estômatos possuem considerável importância
nessas alterações, pois o movimento de água contido nos espaços intercelulares para a
atmosfera ocorre quase que completamente por difusão do vapor de água por meio deles,
cujo principal mecanismo de controle é a resistência estomática (Taiz & Zeiger, 2004).
Além dos estômatos, a presença de cerosidade, na superfície de folhas formadas in vitro,
também possui papel regulatório sobre a elevada transpiração foliar das plantas
micropropagadas (Lamhamedi et al., 2003).
56
Figura 3.16 Aspecto visual de mudas aclimatizadas de H. speciosa: A – 7 dias em casa
de vegetação; B – 45 dias em casa de vegetação.
Segundo Shin et al. (2014), o sucesso da aclimatização está relacionado à
adição de CO2 nos frascos de cultura, assim como a presença de carboidratos de reserva
presentes nos sistemas fotoautotróficos e fotomixotróficos. Em seu estudo sobre a
aclimatização de um híbrido de Doritaenopsis ssp., os autores concluíram que dos três
sistemas estudados, heterotrófico, fotomixotrófico e fotoautotrófico, os dois últimos foram
superiores na aclimatização, com altas nas concentrações de pigmentos fotossintéticos,
amido e demais enzimas relacionadas à síntese de clorofila como a PEP-carboxilase.
Tendo em vista os resultados obtidos, a concentração de 6 mg.L-1 de AIB seria
a mais recomendada para realizar a rizogênese in vitro da Hancornia speciosa Gomes
cabendo mais estudos, principalmente em clones, para uma especificidade na dosagem.
57
3.4 CONCLUSÕES

O tratamento mais indicado para a desinfestação de sementes de H. speciosa é o
que utiliza 0,25% de cloro ativo com o tempo de exposição mínimo de 5 minutos,
com remoção do tegumento.

Para a germinação in vitro de H. speciosa, a utilização da vedação semipermeável
dos recipientes é a mais indicada, pois produz mudas mais vigorosas.

Em relação à indução de brotações em H. speciosa, a suplementação com AIA é
dispensável e os tratamentos que apresentam maiores médias em relação à
quantidade de brotos foram aqueles com meio de cultura WPM com 2,0 mg.L-1
com vedação semipermeável.

É satisfatório para o enraizamento a concentração de 6 mg.L-1 de AIB, por produzir
maior quantidade de mudas para aclimatização.
58
4
CRIOPRESERVAÇÃO DE GEMAS AXILARES DE Hancornia
speciosa GOMES
RESUMO
Técnicas de criopreservação utilizam temperaturas ultrabaixas (-196oC) para suspender a
atividade metabólica dos tecidos vegetais estendendo a sua viabilidade por um período
indefinido. Sendo assim, esta é uma estratégia promissora na conservação ex situ à longo
prazo, para o armazenamento de germoplasma vegetal. A técnica de vitrificação droplet
tem sido empregada para a conservação de diversas espécies tropicais recalcitrantes, pois
permite um congelamento e descongelamento ultrarrápidos. Objetivou-se desenvolver
protocolos de criopreservação de gemas axilares de Hancornia speciosa Gomes utilizando
a técnica de vitrificação droplet. Brotações de H. speciosa desenvolvidas in vitro tiveram
as gemas axilares separadas com o auxílio de um bisturi. Esses explantes foram utilizados
para o experimento de vitrificação, a fim de inferir sobre a influência do tempo de imersão
em solução de pré-cultivo (24, 12, e 6 horas) seguida ou não pela imersão em nitrogênio
líquido (NL), na recuperação, sobrevivência e regeneração dos tecidos. Foi observado que
o tempo de 24 horas em solução de pré-cultivo, permite uma maior porcentagem de
regeneração a partir de gemas axilares após a criopreservação.
Palavras-chave: vitrificação droplet, conservação ex situ, mangabeira
ABSTRACT
Cryopreservation techniques use ultra low temperatures (-196oC) to suspend the metabolic
activity of plant tissue extending its viability for an indefinite period, so this is a promising
strategy in ex situ conservation in the long run, for the storage of plant germplasm. The
droplet vitrification technique has been employed for the storage of several tropical
59
recalcitrant species therefore allows ultrafast freezing and thawing. The objective was to
develop protocols for axillary buds cryopreservation of H. speciosa using the droplet
vitrification technique. Axillary buds of H. speciosa explants grown in vitro were separated
with a scalpel. These explants were used for vitrification experiment in order to infer the
effect of immersion time in the pre-culture solution (24, 12, and 6 hours), followed or not
by immersion in liquid nitrogen (NL), the recovery, survival and regeneration of tissues. It
was observed that the time of 24 hours in pre-culture solution enables a higher percentage
of regeneration from axillary buds after cryopreservation.
Key words: droplet vitrification, ex situ conservation, mangabeira
4.1 INTRODUÇÃO
A criopreservação é definida como a conservação de material biológico em
nitrogênio líquido a -196ºC, ou em sua fase de vapor, a -150ºC (Santos, 2002). A
temperatura em que é realizada a criopreservação é conhecida como “temperatura
criogênica”. Nesta temperatura, extremamente baixa, os gases encontram-se liquefeitos à
pressão atmosférica, onde todas as reações químicas, biológicas e as atividades intra e
extracelulares estão suspensas (Castro et al., 2011).
A criopreservação é considerada o método ideal para a conservação de
germoplasma, por permitir o armazenamento de materiais biológicos por tempo indefinido,
mantendo sua estabilidade genética e suas características fenotípicas, usando pouco espaço
e requerendo pouca manutenção (Engelmann, 1997; Carvalho & Vidal, 2003).
A criobiologia alcançou grande progresso nos últimos anos sendo
desenvolvidos com sucesso protocolos de criopreservação para numerosas espécies de
plantas de propagação vegetativa, cereais, gramíneas, plantas ornamentais, frutíferas
tropicais e temperadas, entre outras (Santos, 2002). Para cada grupo, usa-se uma técnica
diferente, tendo em vista o tipo de material a ser criopreservado. Um exemplo pode ser
dado por sementes ortodoxas, as quais, pelo fato de resistirem à desidratação, podem ser
criopreservadas sem qualquer tratamento, o que não vale para a maioria dos materiais
empregados em experimentação (calos, meristemas e sementes recalcitrantes), os quais
possuem quantidade elevada de água no meio celular.
60
O grande desafio para a criopreservação é realizar o congelamento sem a
formação de cristais de gelo no interior das células. A formação de gelo no meio
intracelular causa ruptura do sistema de membranas celulares, resultando em perda da
semi-permeabilidade e da compartimentação celular em consequência disso, as células
entram em colapso (Buzó & Rosa, 2007).
Segundo Carvalho & Vidal (2003), os métodos de criopreservação podem ser
desdobrados
nas
seguintes
etapas:
pré-crescimento,
crioproteção,
resfriamento,
armazenamento, descongelamento e regeneração. O pré-crescimento consiste em uma fase
preparatória, onde se fornece à cultura condições para tolerância ao congelamento.
Envolve suplementação de compostos osmoticamente ativos ao meio, além de outras
substâncias; a crioproteção é a aplicação de um ou mais compostos que permitam à célula
tolerar as mudanças físicas e químicas relacionadas ao congelamento e descongelamento; o
resfriamento (congelamento) pode ser feito de forma lenta ou rápida.
O armazenamento é feito em botijões ou tanques criogênicos contendo
nitrogênio, mantendo as espécies a (-196ºC) na fase líquida, ou (-150ºC) na fase de vapor;
o descongelamento, etapa tão importante quanto à fase de resfriamento, deve ser realizado
rapidamente para assegurar que nenhum gelo na célula descongele com possibilidade de se
recristalizar; a regeneração consiste em reestabelecer o crescimento após a criopreservação
e também é uma das fases críticas. Deve-se permitir a retomada dos processos metabólicos
interrompidos pelo congelamento com o mínimo distúrbio osmótico e físico.
De modo geral, os métodos de criopreservação são classificados quanto ao
modo de congelamento dentro de dois grupos: lento utilizando-se temperatura controlada,
ou rápido utilizando vitrificação. Desde o estabelecimento do primeiro protocolo de
vitrificação proposto por Sakai & Oiyama (1990), vários outros métodos foram propostos,
dentre eles vitrificação droplet e encapsulamento-desidratação. Com isso, vários tipos de
tecidos agora podem ser criopreservados com maior eficiência.
O tratamento com agentes crioprotetores é de extrema importância, pois
suprimem o dano causado pelo congelamento ajudando a manter a resistência às injúrias
resultantes do processo. Contudo, independente do método empregado, a adição de um
agente crioprotetor representa um fator chave para o sucesso da criobiologia, sendo
indispensável sua presença (Castro et al., 2011), principalmente se tratando de materiais
que possuem quantidade de água elevada no interior celular. Em geral, o mais utilizado é o
61
DMSO, embora haja indícios que esta substância tenha efeitos fisiológicos deletérios
quando inserido em concentrações maiores que a célula permite (Fahy, 1986).
Entre as vertentes da criopreservação a vitrificação droplet é uma técnica
derivada da técnica de congelamento de gotículas desenvolvido por Kartha et al. (1985),
para o congelamento de brotos de mandioca, em que os brotos são colocados em gotas de
meio crioprotector e refrigeradas lentamente com gelo ou em congelador programável. O
diferencial
desta
técnica
é
a
possibilidade
de
atingir
altas
taxas
de
refrigeração/aquecimento devido ao pequeno volume de meio contendo crioprotetor em
que os explantes são colocados.
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos
Vegetais da Universidade Federal de Goiás – UFG, em Goiânia, GO. Sementes de H.
speciosa Gomes foram removidas de frutos maduros coletados, em outubro de 2013, de
exemplares da espécie pertencentes à Coleção de Frutíferas Nativas do Cerrado da Escola de
Agronomia da UFG.
Os frutos foram despolpados e, em câmara de fluxo laminar, as sementes foram
desinfestadas com hipoclorito de sódio (0,25% de cloro ativo) durante 15 minutos, em
seguida lavadas com água destilada e autoclavada em abundância e inoculadas em meio
WPM (Lloyd & Mccown, 1980), suplementado com 30 g de sacarose, 5,5 g L-1 ágar e pH
ajustado em 5,75 antes da autoclavagem à 120ºC, durante 20 minutos. A partir das plantas
obtidas pela germinação in vitro, segmento nodais de mangabeira foram excisados e
multiplicados em meio WPM, suplementado com 2 mg.L-1 BAP (6 benzilaminopurina), e
geleificado com 5,5 g L-1 de ágar. O pH do meio foi ajustado em 5,75 antes da
autoclavagem. Após crescimento in vitro, gemas axilares foram extraídas para os testes de
criopreservação. A temperatura da sala de crescimento durante a fase de micropropagação
ou de cultivo das gemas axilares foi de 25°± 1°C, com fotoperíodo de 16h e condição
luminosa de 45 µmol.m-2.s-1.
As gemas axilares (3 mm2) foram excisadas com auxílio de um bisturi e em
seguida foram submetidas a diferentes tempos de exposição (6, 12 e 24 horas) a solução de
pré-cultivo (meio MS, suplementado 0,3 M de sacarose). Decorrido este intervalo, as
gemas axilares foram submetidas à solução de carregamento por 20 minutos, composta de
62
2 M de glicerol + 0,4 M de sacarose dissolvido em meio MS, seguido pela imersão em
plant vitrification solution 2 (PVS2) a 0ºC, onde permaneceram por 15 minutos. A PVS2 é
composta de 3,26 M de glicerol + 2,42 M de etileno glicol + 1,9 M de dimetilsufóxido +
0,4 M de sacarose, todos dissolvidos em meio MS líquido (Sakai, et al., 1990).
A criopreservação foi realizada conforme a técnica de vitrificação droplet
(Panis, et al., 2005) a qual, antes da imersão em nitrogênio líquido (NL), as gemas são
acomodadas em tiras de papel alumínio (1,5 × 0,5 cm), sobre uma superfície gelada. Nos
tratamentos T1 (24h), T2 (12h) e T3 (6h) as gemas axilares ficaram imersas em NL por, no
mínimo 30 minutos. Nos tratamentos T4 (24h), T5 (12h) e T6 (6h) as gemas não foram
submetidas ao NL. Na sequência, as gemas axilares de todos os tratamentos ficaram
imersas na solução de descarregamento composta de 0,4 M de sacarose dissolvido em meio
MS. Todas as soluções tiveram o pH ajustado em 5,75 e foram filtro-esterilizadas (Figura
4.1).
Após o descongelamento, as gemas axilares foram inoculadas em tubos de
ensaio contendo 17 mL de meio WPM com 2 mg L-1 de BAP, 5,5 g L-1 ágar e pH 5,75. As
gemas foram mantidas em sala de crescimento por 30 dias. Foram avaliadas a retomada de
crescimento das gemas e a formação de calos.
Figura 4.1 Esquema da metodologia de criopreservação de explantes de Hancornia
speciosa Gomes pela técnica de vitrificação droplet.
63
3.2.5 Delineamento experimental e análises estatísticas
O delineamento experimental usado foi o inteiramente casualizado em que cada
parcela consistiu de um tubo de ensaio com duas gemas axilares. A normalidade dos dados
obtidos para os tratamentos foi testada pelo teste de Lilliefors. Os tratamentos foram
comparados por análise de variância ANOVA, seguido por teste Tukey. As análises
estatísticas foram conduzidas com auxílio do software Biostat 5.0 (Ayres et al., 2007).
4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O pré-cultivo das gemas axilares em 0,3 M de sacarose por 24 horas alcançou
maior porcentagem de sobrevivência ao processo de criopreservação com 52%, quando
comparado aos demais, 12 horas com 30% e 6 horas com 20% (Figura 4.2). No tratamento
controle como não houve a imersão das gemas axilares em nitrogênio líquido a principal
variável que afetou a sobrevivência foi à toxixidade das substâncias crioprotetores. Sendo
observado que os tratamentos controle não diferiram estatisticamente entre si, com
porcentagens de sobrevivência de 64%, 60% e 60%, respectivamente para T4, T5 e T6.
Quanto à regeneração entre os tratamentos que passaram pelo processo de
criopreservação o de maior porcentagem foi o T1 (24h) com 32%, seguido de T2 com 12%
e T3 com 10% (Figura 4.2). Depois da criopreservação a recuperação não ocorreu em 48%
das gemas do tratamento T1. Nos tratamentos T2 e T3 as porcentagens de não recuperação
foram respectivamente de 70% e 80% (Figura 4.3).
A sobrevivência dos explantes pode ser atribuída ao efeito benéfico da
absorção de sacarose no decorrer do pré-cultivo que promove tanto a redução do conteúdo
de água dos explantes por desidratação (efeito osmótico) quanto à redução do ponto de
congelamento da água presente nos tecidos (Panis et al., 1996). Além disso, a sacarose
aumenta a proteção das membranas celulares durante o resfriamento (Carpentier et al.,
2010; Quain et al., 2009). De acordo com Burrit (2008), os açúcares solúveis, glicose e
frutose, exercem um importante papel na estabilização da bicamada fosfolipídica e de
proteínas em condições de baixas quantidades de água.
Mesmo sem o processo de criopreservação houve perdas nos tratamentos
controle, isso pode ser explicado pelo fato dos crioprotetores serem potencialmente tóxicos
64
(Fuller, 2004) e as substâncias que compõem a PVS2, principalmente o DMSO, podem
levar à morte celular, especialmente se a imersão ocorre em temperaturas superiores a 0ºC
ou se o período de exposição for muito prolongado (Fuller, 2004; Panis, 2005). O précultivo e a etapa de carregamento podem influenciar na tolerância do explante a exposição
ao PVS2 (Sakai & Engelmann, 2007).
Figura 4.2 Recuperação, Sobrevivência e Regeneração de gemas axilares de Hancornia
speciosa Gomes, submetidas ou não ao processo de criopreservação, expostas a
diferentes tempos de pré-cultivo em solução de meio WPM + 0,3 M de
sacarose: T1 – 24h em pré-cultivo + criopreservação; T2 – 12h em pré-cultivo
+ criopreservação; T3 – 6h em pré-cultivo + criopreservação; T4 – 24h em précultivo; T5 – 12h em pré-cultivo; T6 – 6h em pré-cultivo.
65
Figura 4.3 Explantes de Hancornia speciosa Gomes, inoculados em meio de cultura
WPM: A – Gemas axilares inoculadas depois do descongelamento; B – Calos
e primórdios foliares; C – Mudas regeneradas.
O choque osmótico provocado pelas soluções de carregamento, PVS2 e
descarregamento, principalmente pela longa exposição ao PVS2 somado ao efeito do précultivo em alta concentração de sacarose, podem promover efeitos deletérios nos explantes
(Halmagyi & Pinker, 2006; Raba‟a et al., 2012). Essa redução da sobrevivência dos
explantes após períodos maiores de pré-cultivo também foi observada por Coste et al.,
(2012); Shatnawi & Johson, (2004). Matsumoto et al., (1994) observaram que plantas de
wasabi pré-cultivadas por três dias em 0,3-0,7M de sacarose também apresentavam
redução na sobrevivência após a criopreservação.
Santos (2013), em seu estudo sobre criopreservação por meio da técnica de
vitrificação droplet, concluiu que a porcentagem de sobrevivência de ápices caulinares de H.
speciosa a um pré-cultivo de 24 horas alcançou 90% e não diferiu estatisticamente de um
período de 48 horas. Sartor et al., (2012), em estudo sobre a criopreservação de gemas de
H. speciosa, concluiu que o encapsulamento-desidratação e a vitrificação não foram meios
adequados de crioproteger as gemas de mangabeira, já que não houve regeneração.
A relativa baixa taxa de sobrevivência das gemas axilares alcançada no
presente estudo pode ser atribuída ao tamanho do explante utilizado (3 mm2), pois maior
massa favorece o acumulo de água, que na etapa de criopreservação, se transforma em
cristais de gelo. Segundo Bekheet et al., (2007), o tamanho do explante pode influenciar na
disponibilidade de água livre no interior do tecido.
66
É importante destacar que a concentração ideal dos crioprotetores e o tempo de
exposição a eles podem variar entre as espécies e até mesmo entre variedades da mesma
espécie. Wang et al., (2000) observaram regeneração de 40% em brotos do híbrido LN33
(Vitis L. x Vitis vinifera L.) com a concentração de 1 M de sacarose na osmoproteção.
Entretanto, Marković et al., (2013) utilizando Vitis vinifera L. cv., constatou regeneração
de 37,1% fazendo uso de 1 M de sacarose.
Por este motivo, antes de se aplicar um protocolo de criopreservação é
necessário avaliar qual a concentração ideal de crioprotetores e tempo de exposição para a
espécie/variedade de interesse. Como a H. speciosa possui polinização aberta, não
autofecunda e não é domesticada, deve-se considerar que a espécie possui grande
variabilidade genética, o que também pode ter influenciado na variação encontrada para a
tolerância à criopreservação.
4.4 CONCLUSÕES

O pré-cultivo das gemas axilares de mangabeira por 24 horas, em meio MS com 0,3
M de sacarose proporciona a sobrevivência dos explantes criopreservados pela
técnica de vitrificação droplet.
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