UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E
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UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas Lucas de Abreu Costa EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DE Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King et H. Rob. E DE SUA FRAÇÃO SOBRE A PRODUÇÃO DE CITOCINAS E PROLIFERAÇÃO DE LINFÓCITOS HUMANOS, IN VITRO. Diamantina 2016 Lucas de Abreu Costa EFEITO DO EXTRATO ETANÓLICO DE Ageratum fastigiatum (GARDN.) R. M. KING ET H. ROB. E DE SUA FRAÇÃO SOBRE A PRODUÇÃO DE CITOCINAS E PROLIFERAÇÃO DE LINFÓCITOS HUMANOS, IN VITRO. Dissertação apresentada ao Programa Multicêntrico de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre. Área de concentração: Ciências Fisiológicas Orientador: Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo Coorientadora: Prof ª Drª Elizabethe Adriana Esteves Diamantina 2016 Lucas de Abreu Costa Efeito do extrato etanólico de Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King et H. Rob. e de sua fração sobre a produção de citocinas e proliferação de linfócitos humanos, in vitro. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação Multicêntrico em Ciências Fisiológicas, nível de Mestrado, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo Coorientadora: Prof ª Drª Elizabethe Adriana Esteves Data da aprovação 13/05/2016 Prof. Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo – Orientador (UFVJM) Prof ª Drª Elizabethe Adriana Esteves Prof. Dr. Disney Oliver Sivieri Júnior (UFVJM) Prof.ª Dr.ª Etel Rocha Vieira (UFVJM) Diamantina AGRADECIMENTOS Gostaria de agradecer primeiramente a Deus por ter sido tão generoso em conceder tantas benções, proteção na minha vida e a oportunidade de ter uma família maravilhosa. Aos meus amados pais, Seu Antônio e Dona Rosa que estiveram sempre ao meu lado, pelo apoio incondicional em minhas decisões por mais difíceis que fossem; por me reerguerem em momentos de fraqueza; pelo esforço, e às vezes sacrifício, em proporcionar meu conforto; pela compressão nos momentos da minha ausência ou falta de atenção; em fim, agradeço imensamente por participarem de forma ativa da construção da minha vida pessoal, acadêmica e profissional, por me ensinarem o verdadeiro sentido da família na construção ética, moral e como base fundamental para formação do meu caráter. A meu querido irmão e amigo Danilo que foi essencial para que eu chegasse até aqui, sou eternamente grato aos seus conselhos, auxílios, amizade pura e verdadeira e companheirismo em todas as etapas da minha vida. Expresso minha gratidão ao meu amigo, eterno professor e orientador Gustavo, pelo incentivo, conselhos, pela oportunidade e pela confiança no meu desempenho na pesquisa. Sempre será minha referência de pesquisador, caráter, humildade, competência e liderança. Muito obrigado pelo comprometimento e ensinamentos transmitidos desde o início da minha graduação. À professora Drª Etel pela disposição em ajudar, pela amizade, pelo exemplo de integridade na condução da pesquisa científica e por todo conhecimento transmitido. Ao Professor Dr Mazza pela contribuição na análise fitoquímica Agradeço aos meus amigos do Labimuno e Bioex que fizeram parte da minha vida durante o período da pós-graduação. Nos momentos que mais precisei sempre me estenderam a mão amiga oferendo ajuda. Obrigado a todos pelo convívio tão amistoso. Agradeço em especial às minhas queridas amigas Michaelle, Bethânia e Valéria pelo companheirismo, pelos ensinamentos nas atividades experimentais do laboratório, pela boa vontade e paciência em auxiliar nos trabalhos das disciplinas, sem a ajuda de vocês nada disso teria se concretizado! Aos meus amigos Marcelo, Karine, Josué, Débora Jaci, Camilinha e Angélica pelo companheirismo e por proporcionar momentos de distração dando-me ânimo para que as tarefas antes complicadas se tornassem de mais fácil execução. Aos meus amigos Prof. Dr Wagner e Prof. Dr Fábio por participarem da minha formação acadêmica desde aluno de iniciação científica, obrigado pelo apoio e incentivo . A meus tios e primos pelo incentivo e apoio, em especial minha segunda mãe Tia Dalva, Tia Zélia, Tia Mila e aos meus queridos primos Marcelo (primo/irmão), Carlinha e Dênia, muito obrigado por tudo! Agradeço também aos meus amigos de infância e aos que surgiram ao longo da pósgraduação, muito obrigado pelos momentos de alegria vivenciados. À todos professores e colegas do PMPGCF da UFVJM, pela contribuição na minha formação acadêmica. Agradeço à equipe de funcionários do Campus JK e do CIPq pelo empenho e pela disposição em ajudar. À CAPES pelo financiamento do trabalho. “O verdadeiro caminho da descoberta não consiste em procurar novas paisagens, mas sim ter novos olhos”. Marcel Proust RESUMO A planta Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King et H. Rob. é comumente utilizada na medicina popular da região do Vale do Jequitinhonha como anti-inflamatório e analgésico. Em virtude do papel do sistema imune e de fatores inflamatórios solúveis na etiologia e no mecanismo fisiopatológico de diversas doenças inflamatórias, este trabalho teve como objetivo investigar parâmetros relacionados à atividade anti-inflamatória do extrato etanólico de A. fastigiatum e de uma fração derivada desse extrato. A identificação dos constituintes químicos da fração do extrato etanólico de A. fastigiatum foi realizada por meio da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detectores de Arranjo de Diodo acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-MS) seguida pela Espectrometria de Massas em Tandem com ionização por electrospray (ESI-MS/MS). A técnica de exclusão com azul de tripan foi utilizada para determinação da viabilidade das culturas de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) incubadas por 8, 24 e 120 horas com o extrato etanólico, a fração e o solvente Dimetilsulfóxido (DMSO). Na avaliação do perfil proliferativo de linfócitos pela técnica de citometria de fluxo, PBMC estimuladas com o mitógeno Fitohemaglutinina (PHA) foram incubados por 120 horas na ausência ou presença de diferentes concentrações não tóxicas dos componentes citados. Para análise da produção das citocinas pró-inflamatórias, PBMC tratadas ou não com diferentes concentrações não tóxicas do extrato etanólico de A. fastigiatum, da fração e do solvente DMSO foram incubadas por 8 horas e estimulada nas últimas 4 horas com Miristato Acetato de Forbol (PMA), utilizando a técnica de citometria de fluxo, linfócitos totais, células CD4+ e CD8+ foram avaliados quanto à produção de IFN-γ, TNF-α e IL-2. De acordo com nossos resultados, a concentração de DMSO, para todas as culturas celulares tratadas com o extrato etanólico ou sua fração, foi definida como sendo 1% v/v para avaliação da citotoxicidade e análise da produção de citocinas em linfócitos e de 0.5% v/v no ensaio de proliferação celular. Na análise fitoquímica da fração do extrato etanólico foram identificados dois flavonóis nunca antes descrito na constituição química da planta, a 7-metil-quercetina e a Rhamnocitrina, tais compostos não alteraram os parâmetros anti-inflamatórios avaliados neste estudo. O extrato etanólico, por sua vez, nas concentrações de 6,25 e 12,5 µg/mL reduziu significativamente a proliferação de linfócitos, ao mesmo tempo, nas concentrações de 50 e 75 µg/mL inibiu a produção das citocinas TNF-α e IL-2 em células CD8+, na maior concentração inibiu ainda a produção de IL-2 na população de linfócitos totais. Sugere-se que o extrato etanólico de A. fastigiatum possui componentes ativos agindo sinergicamente ou de forma isolada que contribuem para atividade antiinflamatória atribuída à planta em seu uso na medicina popular. Palavras - chave: Ageratum fastigiatum, anti-inflamatório, citocinas, proliferação celular. ABSTRACT Ageratum fastigiatum (Gardner.) R. M. King et H. Rob. is a plant commonly used in the folk medicine of the Jequitinhonha Valley as anti-inflammatory and analgesic. Because of the role of the immune system and soluble inflammatory factors in the etiology and pathophysiological mechanism of various inflammatory diseases, this study aimed to investigate parameters related to the anti-inflammatory activity of the ethanol extract of A. fastigiatum and a fraction derived from this extract. The identification of the chemical constituents of the fraction of ethanol extract of A. fastigiatum was performed by High Performance Liquid Chromatography with Efficiency Diode Arrangement detectors coupled to mass spectrometry (HPLC-DAD-MS) followed by Mass Spectrometry in Tandem with electrospray ionization (ESI-MS/MS). The exclusion technique with Trypan blue was used to determine the viability of peripheral blood mononuclear cell (PBMC) cultures, previously incubated for 8, 24 and 120 hours with the ethanol extract, the fraction and the solvent dimethylsulfoxide (DMSO). In the evaluation of the proliferative profile of lymphocytes using the flow cytometry technique, PBMC stimulated with the mitogen Phytohemagglutinin (PHA) were incubated for 120 hours in the absence or presence of different non-toxic concentrations of the mentioned components. In order to analyze the production of proinflammatory cytokines, PBMC treated or not with different non-toxic concentrations of the ethanolic extract of A. fastigiatum, of the fraction, and of the solvent DMSO was incubated for 8 hours and stimulated with phorbol myristate acetate (PMA) in the last 4 hours. Subsequently, total lymphocytes, CD4+ and CD8+ cells were assessed for production of IFNγ, TNF-α and IL-2, using flow cytometry. According to our results, the concentration of DMSO, for all cell cultures treated with ethanolic extract and its fraction was defined as 1% v/v for evaluation of cytotoxicity and analysis of cytokine production by lymphocytes, and 0.5% v/v to be used in the cell proliferation assay. In the phytochemical analysis of the fraction of ethanol extract, were identified two flavonols never before described in the chemical constitution of the plant, 7-methyl-quercetin and Rhamnocitrina. Such compounds did not modified the anti-inflammatory parameters evaluated in this study. The ethanol extract, on the other hand, in concentrations of 6.25 and 12.5 μg/ml significantly reduced the proliferation of lymphocytes, while at concentrations of 50 and 75 ug/mL, it inhibited the production of TNF-α and IL-2 in CD8+, in addition, at the highest concentration it inhibited IL-2 production by total lymphocytes population. It is suggested that the ethanol extract of A. fastigiatum has active components acting synergistically or separately, resulting in the antiinflammatory activity attributed to the plant by the folk medicine. Keywords: Ageratum fastigiatum, anti-inflammatory, cytokine, cell proliferation LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Imagens de Ageratum fastigiatum.. ........................................................................ 30 Figura 2 - Sequência de procedimentos para obtenção do extrato etanólico de A. fastigiatum. .................................................................................................................................................. 44 Figura 3 - Sequência de procedimentos adotados para a análise da proliferação de linfócitos marcados com CFSE.. .............................................................................................................. 52 Figura 4 - Estratégia de análise utilizada para avaliação do perfil de produção de citocinas em populações de linfócitos. .......................................................................................................... 55 Figura 5 - Estratégia de análise adotada para avaliação da emissão de fluorescência do extrato etanólico de A. fastigiatum, fração 46 e DMSO.. ..................................................................... 57 Figura 6 - Cromatograma da fração 46 gerado pelo Detector de Arranjo de Diodo (200-260 nm) por CLAE-DAD-MS. ........................................................................................................ 59 Figura 7 – Cromatograma da fração 46 gerado pelo detector do espectrômetro de massas (cromatograma de íons totais - TIC) por CLAE-DAD-MS...................................................... 60 Figura 8 - Espectro na região do ultravioleta (200 – 600 nm) para o pico com tempo de retenção de 14.9 min na análise da fração 46 por CLAE-DAD-MS. ....................................... 61 Figura 9 - Espectro na região do ultravioleta (200 – 600 nm) para o pico com tempo de retenção de 17.4 min na análise da fração 46 por CLAE-DAD-MS. ....................................... 61 Figura 10 - Espectro de massas para o pico com tempo de retenção de 14.9 min na análise da fração 46 por CLAE-DAD-MS. ............................................................................................... 62 Figura 11 - Espectro de massas para o pico com tempo de retenção de 17.4 min na análise da fração 46 por CLAE-DAD-MS. ............................................................................................... 62 Figura 12 - Estrutura química geral dos flavonoides............................................................... 64 Figura 13 - Espectro em ESI-MS/MS 0 eV do íon m/z 299 (bomba de infusão direta) da fração 46. .................................................................................................................................. 65 Figura 14 - Espectro em ESI-MS/MS 10 eV do íon m/z 299 (bomba de infusão direta) da fração 46. .................................................................................................................................. 65 Figura 15 – Espectro em ESI-MS/MS 20 eV do íon m/z 299 (bomba de infusão direta) da fração 46. .................................................................................................................................. 66 Figura 16 – Espectro em ESI-MS/MS 30 eV do íon m/z 299 (bomba de infusão direta) da fração 46. .................................................................................................................................. 66 Figura 17 - Estrutura química da 3,4',5-trihidroxi-7-metoxiflavona ou Rhamnocitrina ......... 67 Figura 18 – Espectro em ESI-MS/MS 0 eV do íon m/z 315 (bomba de infusão direta) da fração 46. .................................................................................................................................. 67 Figura 19 – Espectro em ESI-MS/MS 10 eV do íon m/z 315 (bomba de infusão direta) da fração 46. .................................................................................................................................. 68 Figura 20 – Espectro em ESI-MS/MS 20 eV do íon m/z 315 (bomba de infusão direta) da fração 46. .................................................................................................................................. 68 Figura 21 – Espectro em ESI-MS/MS 30 eV do íon m/z 315 (bomba de infusão direta) da fração 46. .................................................................................................................................. 69 Figura 22 - Estrutura química da 7-O-metil-quercetina .......................................................... 69 Figura 23 - Efeito do DMSO sobre a viabilidade celular em diferentes tempos de incubação.. .................................................................................................................................................. 71 Figura 24 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com DMSO e incubadas por 120 horas. ........................................................................................................................... 72 Figura 25 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com DMSO e incubadas por 8 horas. ............................................................................................................................... 73 Figura 26 – Efeito do DMSO sobre a proliferação de linfócitos.. .......................................... 74 Figura 27 - Efeito do solvente DMSO sobre a produção de IFN-γ em populações linfocitárias............................................................................................................................... 76 Figura 28 - Efeito do solvente DMSO sobre a produção de TNF-α em populações linfocitárias............................................................................................................................... 77 Figura 29 - Efeito do solvente DMSO sobre a produção de IL-2 em populações linfocitárias.. .................................................................................................................................................. 78 Figura 30 - Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a viabilidade celular em diferentes tempos de incubação.. ....................................................................................... 79 Figura 31 - Efeito da fração 46 sobre a viabilidade celular em diferentes tempos de incubação. ................................................................................................................................ 80 Figura 32 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com extrato etanólico de A. fastigiatum. .......................................................................................................................... 81 Figura 33 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com a fração 46 e incubadas por 120 horas.. ......................................................................................................... 82 Figura 34 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com extrato etanólico de A. fastigiatum e incubadas por 8 horas.. .................................................................................. 83 Figura 35 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com a fração 46 e incubadas por 8 horas.. ............................................................................................................. 83 Figura 36 – Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a proliferação de linfócitos. .................................................................................................................................. 85 Figura 37 – Efeito da fração 46 sobre a proliferação de linfócitos.. ....................................... 86 Figura 38 - Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a produção de IFN-γ em populações linfocitárias.. .................................................................................................... 88 Figura 39 - Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a produção de TNF-α em populações linfocitárias.. .................................................................................................... 89 Figura 40 - Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a produção de IL-2 em populações linfocitárias. ..................................................................................................... 90 Figura 41 - Estrutura química da quercetina ........................................................................... 99 Figura 42 - Estrutura química da Isohamnetina .................................................................... 100 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Posição sistemática da Ageratum fastigiatum. ........................................................ 30 Tabela 2 - Gradiente utilizado nas análises em CLAE-DAD-MS. .......................................... 46 Tabela 3 - Anticorpos monoclonais e seus respectivos fluorocromos utilizados na análise da produção de citocinas intracitoplasmáticas em populações de linfócitos................................. 54 Tabela 4 – Média dos parâmetros avaliados nos leucogramas dos doadores da amostra biológica. .................................................................................................................................. 70 Tabela 5 - Porcentagem média relativa de populações de linfócitos positivos para as citocinas IFN-γ, TNF-α e IL-2, tratados com a fração 46. ...................................................................... 91 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS % v/v Porcentagem em volume µg Microgramas AP-1 Proteína ativadora 1 APC Aloficocianina Bcl-2 Células-B de Linfoma 2 BSA Albumina de soro bovino CCDC Cromatografia de camada delgada comparativa CEP Comitê de Ética em Pesquisa CFSE Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CGEN Conselho de Gestão do Patrimônio Genético CIPq-Saúde Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência COX Ciclooxigenase CSA Chemical Abstracts Service CsA Ciclosporina A DAD Detector por Arranjo de Diodo DMSO Dimetilsulfóxido ERK Quinases reguladas por sinais extracelulares ERN Espécies reativas de nitrogênio ERO Espécies reativas de oxigênio ESI Ionização por electrospray EUA Estados Unidos da América eV Etrovolts FCFRP Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto FITC Isotiocianato de Fluoresceína FSC-A Forward Side Scatter Area FSC-H Forward Side Scatter Height IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis ICAM-1 Molécula Intercelular de Adesão 1 IFN-γ Interferon gamma IL Interleucina Inos Óxido Nítrico Sintase induzível IP Índice de proliferação JAK Janus quinase JNK c-Jun quinases amino-terminal LPS Lipopolissacarídeo m/z massa/carga MAPK Proteínas quinases ativadas por mitógenos mAU mili unidades de absorbância MG Miligrama MG Minas Gerais MHC Complexo principal de histocompatibilidade MIP-2 Proteína inflamatória de macrófagos 2 mL Mililitros MS Espectrometria ou espectrômetro de massas Na2HPO4 Fosfato de Sódio Dibásico NaCl Cloreto de Sódio NaH2PO4 Fosfato de Sódio Monobásico NaOH Hidróxido de Sódio NF-ҡB Fator de transcrição nuclear kappa-B NK Natural killer nm Nanômetro NO Óxido nítrico OMS Organização Mundial da Saúde PAF Fator Ativador de Plaquetas PAMP Padrões moleculares associados a patógenos PBMC Células Mononucleares do Sangue Periférico PBS Tampão Fosfato Salina PBS-P Tampão Fosfato Salina Permeabilization PBS-W Tampão Fosfato Salina Wash PE Ficoeritrina PE-Cy7 Ficoeritrina Cianina 7 PerCP - Cy5.5 Proteína Clorofila Peridinina combinada a Cianina PGE2 Prostaglandina E2 pH Potencial Hidrogeniônico PHA Fitohemaglutinina PI3K Fosfoinositídeo 3-quinase PMA Miristato Acetato de Forbol PNPMF Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos PR Porcentagem relativa PRR Pattern recognition receptors RDC Resolução da Diretoria Colegiada SEB Enterotoxina Estafilocócica do tipo B SSC-A Side light scatter Area SSC-H Side light scatter Height STAT Transdutor de sinal e ativador de transcrição SUS Sistema Único de Saúde TCR Receptores de Células T Tfh T Linfócitos T helper folicular TGF-β Fator de Crescimento Transformante beta Th Linfócitos T helper TLR Receptores Toll-Like TNF-α Fator de Necrose Tumoral alpha Tr Tempo de retenção Treg Linfócitos T reguladores UFVJM Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri USP Universidade de São Paulo UV/Vis Ultravioleta/Visível VCAM-1 Molécula de adesão vascular celular 1 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 23 2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 25 2.1 A utilização de plantas medicinais ................................................................................. 25 2.2 A família Asteraceae ...................................................................................................... 28 2.3 O gênero Ageratum ........................................................................................................ 29 2.4 Espécie Ageratum fastigiatum ........................................................................................ 29 2.4.1 Aspectos gerais ........................................................................................................ 29 2.4.2 Constituição química ............................................................................................... 30 2.4.3 Atividade biológica ................................................................................................. 31 2.5 Processo inflamatório ..................................................................................................... 32 3 JUSTIFICATIVA .................................................................................................................. 39 4 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 40 4.1 Objetivo Geral ................................................................................................................ 41 4.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 41 5 METODOLOGIA.................................................................................................................. 43 5.1 Coleta e identificação botânica da A. fastigiatum .......................................................... 43 5.2 Obtenção do extrato etanólico de A. fastigiatum ........................................................... 43 5.3 Fracionamento do extrato etanólico de A. fastigiatum ................................................... 44 5.3.1 Análise química da fração 46 .................................................................................. 45 5.4 Tamanho amostral .......................................................................................................... 46 5.5 Implicações éticas e seleção dos voluntários .................................................................. 46 5.6 Amostra biológica .......................................................................................................... 47 5.7 Parâmetros Hematológicos ............................................................................................. 47 5.8 Obtenção das células mononucleares do sangue periférico humano .............................. 47 5.9 Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre a viabilidade de PBMC humanas .................................................................................................................... 48 5.10 Avaliação da ação do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre a proliferação de linfócitos humanos....................................................................................... 49 5.11 Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre a produção de citocinas, in vitro, por linfócitos humanos ........................................................................... 52 5.12 Análise da emissão de fluorescência do extrato etanólico de A. fastigiatum, fração 46 e do solvente DMSO em linfócitos humanos ......................................................................... 55 5.13 Análise Estatística ........................................................................................................ 57 6 RESULTADOS ..................................................................................................................... 59 6.1 Análise química da fração 46 ......................................................................................... 59 6.1.1 Análise da fração 46 por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detectores de Arranjo de Diodo acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-MS) .............. 59 6.1.2 Análise da fração 46 por Espectrometria de Massas em Tandem com Ionização por Electrospray (ESI-MS/MS) (bomba de infusão direta).................................................... 64 6.2 Análise biológica do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46....................... 70 6.2.1 Leucograma dos voluntários da pesquisa................................................................ 70 6.2.2 Avaliação do efeito citotóxico do DMSO ............................................................... 70 6.2.3 Análise da emissão de fluorescência do DMSO ..................................................... 72 6.2.4 Análise do efeito anti-proliferativo do solvente DMSO ......................................... 73 6.2.5 Análise da inibição da produção de citocinas pelo DMSO sobre linfócitos humanos .......................................................................................................................................... 74 6.2.6 Avaliação do feito citotóxico do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 .......................................................................................................................................... 78 6.2.7 Análise da emissão de fluorescência pelo extrato etanólico de A. fastigiatum e fração 46 ........................................................................................................................... 80 6.2.8 Análise do efeito anti-proliferativo do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 ........................................................................................................................... 84 6.2.9 Análise da inibição da produção de citocinas pelo extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre linfócitos humanos ....................................................... 86 7 DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 93 7.1 Ensaios biológicos conduzidos com o solvente DMSO................................................. 93 7.2 Ensaios fitoquímicos e biológicos conduzidos com o extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 ....................................................................................................................... 96 8 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 103 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 105 ANEXO A - O acesso ao patrimônio genético e ao conhecimento tradicional associado ..... 119 ANEXO B - Autorização para coleta do material botânico ................................................... 125 ANEXO C - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO....................... 127 ANEXO D – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA ............................ 131 23 1 INTRODUÇÃO O uso de plantas para fins terapêuticos é uma prática com registros desde a antiguidade (DEVIENNE et al., 2004). O conhecimento adquirido ao longo dos anos pela necessidade do homem buscar nos vegetais fontes para cura de suas enfermidades foi se acumulando e transmitido ao longo de sucessivas gerações. Como resultado, várias comunidades ainda preservam uma rica cultura popular sobre plantas medicinais (GURIBFAKIM, 2006; BRASIL, 2010). Nesse contexto, a planta Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King et H. Rob. se destaca por ser amplamente utilizada na cultura popular do Vale do Jequitinhonha, em especial no município de Diamantina-MG, como alternativa terapêutica para o tratamento de quadros inflamatórios e álgicos derivados principalmente de contusões, distensões musculares e entorses (GONÇALVES et al., 2011). Em virtude da utilização bastante difundida da planta na medicina popular e com intuito de dar sequência às investigações conduzidas pelo nosso grupo de pesquisa sobre a atividade biológica e análises químicas da A. fastigiatum, este trabalho avaliou o efeito de concentrações não tóxicas do extrato etanólico da planta, bem como da fração derivada desse extrato que contém flavonoides identificados, sobre a produção de citocinas pró-inflamatórias e sobre a proliferação de linfócitos humanos do sangue periférico, in vitro. 24 25 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 A utilização de plantas medicinais Ao longo da sua evolução, o homem sempre procurou formas de retirar da natureza condições necessárias para sua sobrevivência e melhor adaptação ao ambiente. Antigas civilizações, antes mesmo do surgimento da escrita, já utilizavam plantas, tanto para o sustento quanto para o tratamento de diversas enfermidades (DEVIENNE et al., 2004). O discernimento humano entre plantas que tinham propriedades benéficas ou nocivas foi construído de forma empírica pela observação dos efeitos causados pelo seu uso, no organismo humano e no comportamento dos animais (GIRALDI et al., 2010; CRAGG et al. 2013). O conceito de fitoterapia consiste na terapêutica fundamentada na utilização de constituintes ativos derivados exclusivamente de plantas conhecidas pelo uso popular. No Brasil, essa ideia está historicamente enraizada na cultura indígena, africana e europeia. Registros constam que no início da colonização, portugueses diante da carência ou insuficiência dos medicamentos trazidos da Europa, se viram na necessidade de buscar plantas medicinais com uso já difundido na colônia. Povos indígenas e escravos africanos, tradicionalmente, detinham conhecimento acerca da utilização de plantas, uma vez que, em suas culturas era comum seu uso em rituais religiosos e para fins terapêuticos. O enriquecimento da fitoterapia no Brasil se deu, em especial, no início do século passado com a chegada de imigrantes orientais que contribuíram com a inserção de plantas medicinais exóticas na cultura brasileira. A miscigenação do saber popular aliado à transmissão de conhecimento entre sucessivas gerações culminou em uma cultura popular sobre plantas medicinais que se mantém presente em diversas comunidades brasileiras (GURIB-FAKIM, 2006; BRASIL, 2012). Esse conhecimento vem fornecendo ao longo dos anos, indícios sobre a atividade farmacológica de muitas espécies vegetais, despertando assim, o interesse de pesquisadores e da indústria farmacêutica (MACIEL et al., 2002; BALUNAS et al., 2005). Estima-se que 80% da população mundial faz uso de plantas medicinais na atenção primária à saúde (WHO, 2002). Apesar da utilização difundida, no Brasil, muitas plantas não têm seu uso padronizado e ainda carecem de estudos que comprovem suas propriedades farmacológicas (HEINRICH; GIBBONS, 2001; WHO, 2002). Produtos de origem vegetal são utilizados com respaldo popular baseado na crença de que por se tratarem de fontes naturais só trazem benefícios com total segurança terapêutica, entretanto isso não é 26 verdade, apesar de parecerem inofensivos à saúde humana, o uso inadequado ou indiscriminado de produtos de origem vegetal é perigoso e pode gerar intoxicação ou efeitos colaterais diversos (VEIGA JÚNIOR et al., 2005; CONSOLINI e RAGONE, 2010; TESCHK e EICKHOFF, 2015). Além disso, tendo em vista que produtos de origem vegetal constituem uma mistura complexa de componentes químicos, a eficiência de tratamentos convencionais pode ser comprometida em virtude do uso concomitante de plantas medicinais, podendo reduzir ou potencializar a atividade de medicamentos cientificamente consagrados pela eficácia terapêutica. (CAPASSO et al., 2000; CHAVEZ, et al., 2006) Apesar do uso de plantas medicinais ser uma prática comum há milhares de anos, a concepção que se tem hoje estabelecida sobre fármaco de origem vegetal, só foi idealizada, em 1803, pelo alemão Friedrich Wilhelm Adam Sertürner que em pesquisas de componentes ativos presentes em vegetais extraiu a morfina, um alcaloide biossintetizado pela papoula (Papaver somniferum) (DUTRA et al, 2016). Esse acontecimento marcou o início do processo de obtenção de princípios ativos derivados de plantas. A partir de então, diversas estruturas químicas foram isoladas, como os alcaloides quinina e quinidina com propriedade antimalárica, extraídos da casca das espécies Cinchona spp; a atropina, um alcaloide antagonista muscarínico, derivado da Atropa belladonna; o agente anti-hipertensivo, reserpina, alcaloide isolado a partir da Rauwolfia serpentina; a pilocarpina, um alcaloide com atividade colinérgica, usado no tratamento do glaucoma, obtido das folhas da planta Pilocarpus jaborandi; dentre vários outros princípios ativos (CORDELL et al., 2012; CRAGG et al., 2013). Dos fármacos antineoplásicos de uso clínico derivados de plantas, alguns dos mais conhecidos são os alcaloides da vinca (Catharanthus roseus), vimblastina e vincristina e o terpenoide taxol extraído da Taxus brevifolia (CALIXTO, 2001; KINGSTON, 2005). As plantas medicinais são definidas pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como espécies vegetais utilizadas integralmente, ou em parte, com finalidade terapêutica. Desempenham papel importante na medicina moderna, primeiramente por fornecerem a possibilidade do uso de fitoterápicos, que são produtos derivado de matéria-prima vegetal, validados e elaborados em formulações específicas (BRASIL, 2010). Outra alternativa referese ao isolamento de um princípio ativo para a produção de fitofármacos, como é o caso da digoxina, um glicosídeo cardiotônico extraído da Digitalis purpurea, cuja molécula dificilmente seria obtida pela síntese química (VEIGA JUNIOR et al., 2005). O composto uma vez isolado, pode ainda ser usado como protótipo para síntese química ou sofrer modificações estruturais dando origem a fármacos semissintéticos. Exemplo disso, foi o caso 27 do ácido acetilsalicílico mais eficaz e menos tóxico que seu precursor, o ácido salicílico isolado da Salix alba. (YOUNG, 1999; ROBBERS et al., 1996; TUROLLA et al., 2006; NEWMAN et al., 2012). A utilização de componentes químicos derivados de produtos naturais é reconhecidamente importante no desenvolvimento de fármacos e vem ao longo dos anos contribuindo expressivamente para o incremento de opções terapêuticas na prática clínica (CALIXTO, 1997; NEWMAN et al., 2012). Estima-se que cerca de 40% dos medicamentos atualmente disponíveis foram desenvolvidos a partir de fontes naturais e aproximadamente 25% são derivados direta ou indiretamente de constituintes químicos vegetais. Entre os antineoplásicos e antimicrobianos, o percentual é ainda mais significativo, superior a 60% (CALIXTO, 2001; NEWMAN et al., 2012). Dados da OMS indicam que das 252 drogas consideradas básicas e essenciais, 11% são originadas de plantas. (RATES, 2001; OMS, 2002; WHO, 2011). Nos últimos anos o desenvolvimento de tecnologias e pesquisas para explorar o potencial terapêutico da flora brasileira tem recebido incentivos governamentais. Dentre as iniciativas dessa natureza destaca-se a aprovação da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF), mediante o decreto n° 5813 de junho de 2006, que estabeleceu as diretrizes para atuação do governo na área de plantas medicinais e de fitoterápicos. Dessa forma, foram delineadas ações prioritárias com o objetivo de garantir o acesso seguro e uso racional de plantas medicinais e de fitoterápicos à população brasileira (BRASIL, 2006). Em 2008 o governo federal criou ainda o Grupo Interministerial para elaboração do Programa Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos com o objetivo de fortalecer as diretrizes norteadoras do PNPMF. Nesse contexto foram definidas medidas, ministérios e gestores visando a ampliação das opções terapêuticas e melhoria da atenção à saúde, uso sustentável da biodiversidade brasileira, além do resgate, valorização e preservação do conhecimento empírico de comunidades tradicionais acerca das plantas medicinais (BRASIL, 2008). Outra importante iniciativa do Ministério da Saúde foi a promulgação da Portaria MS nº 886/GM/MS, de 20/04/2010 que instituiu, no âmbito do SUS, a “Farmácia Viva”, tendo como objetivo realizar atividades em todas as fases da cadeia produtiva de fitoterápicos, desde o cultivo de plantas medicinais até a dispensação de fórmulas magistrais e oficinais. Recentemente a Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), como forma de promover o acesso da população a medicamentos fitoterápicos, por meio da Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) Nº 26, de 13 de maio de 2014, atualizou o registro dos medicamentos fitoterápicos e criou o registro de uma nova classe, os chamados 28 produtos tradicionais fitoterápicos cuja segurança e efetividade são fundamentadas no longo histórico do uso tradicional de plantas para fins terapêuticos. A relação de medicamentos e dos produtos tradicionais fitoterápicos foi listada na Instrução Normativa N° 2, de 13 de maio de 2014 (BRASIL, 2014a, 2014b). Apesar do crescente incentivo aos estudos de plantas medicinais por parte dos órgãos governamentais, dados da década passada revelaram que cerca de apenas 8% das 60.000 espécies vegetais brasileiras catalogadas foram estudadas sob o ponto de vista fitoquímico, e apenas uma parcela reduzida dessas espécies foram investigadas quanto às suas propriedades terapêuticas (GUERRA, et al. 2001, BRASIL, 2008). Diante desse panorama, e levando em consideração as ameaças constantes aos ecossistemas brasileiros, o incentivo à pesquisa científica acerca de plantas com potencial medicinal deve ser priorizado no nosso país (NETO et al., 2003, HAMILTON, 2004). 2.2 A família Asteraceae Aproximadamente 10% da cobertura vegetal mundial são compostos por vegetais da família Asteraceae (também conhecida por Compositae). Esse numeroso grupo de plantas está distribuído em cerca de 1500 gêneros e 2300 espécies apresentando grande diversidade morfológica e taxonômica (BREMER, 1994). A família Asteraceae é caracterizada pela elevada capacidade de biossinterizar metabólitos secundários com grande diversidade estrutural, como flavonoides, poliacetilenos, cumarinas, terpenóides, alcaloides pirrolizidínicos, lactonas sesquiterpênicas, dentre outros (ZDERO; BOHLMANN, 1990; EMERENCIANO et al., 2001). Diversas plantas dessa família são conhecidas pelas suas propriedades medicinais, com relatos de atividades analgésica, anti-inflamatória e antimicrobiana (LORENZI & MATOS, 2002). Como representantes da família, em especial, utilizadas como agentes antiinflamatórios, pode-se citar a Achyrocline satureioides (“marcela”); Baccharis trimera (“carqueja”); Arnica montana (“arnica”); Vernonia condensata (falso “boldo”) e Mikania glomerata (“guaco”) (BREMER et. al, 1994; COSENTINO et al., 2008; FREITAS et al., 2008; PAUL et al., 2009; DA SILVA et al., 2011; SHARMA et al., 2015). 29 2.3 O gênero Ageratum O gênero Ageratum compreende aproximadamente 30 espécies, sendo que apenas algumas plantas foram estudadas do ponto de vista fitoquímico e biológico (OKUNADE, 2002). Dentre as principais representantes do gênero encontram-se a A. fastigiatum, A. corymbosum, A. houstonianum, A. mexicanum e a A. conyzoides, com distribuição nas regiões tropicais e subtropicais da Ásia, África e América do Sul, sendo a A. conyzoides a espécie mais estudada dentre elas (BORTHAKUR et al., 1987). Algumas estruturas isoladas do óleo essencial de A. conyzoides como: terpenoides, esteroides, cromenos, cromonas, cumarinas, flavonoides polioxigenados e alcaloides pirrolizidínicos foram descritas. (EKUNDAYO et al., 1988; DUBEY et al., 1989; WIEDENFELD et al., 1991; OKUNADE, 2002; IQBAL et al., 2004; AMAL et al., 2010). Entre as principais atividades biológicas atribuídas à planta estão as ações analgésica, antimicrobiana, anti-inflamatória, antioxidante e gastroproterora (ABENA et al., 1993; JAGETIA et al., 2003; SHIRWAIKAR et al., 2003; AKINYEMI et al., 2005; MOURA et al., 2005). 2.4 Espécie Ageratum fastigiatum 2.4.1 Aspectos gerais A espécie Ageratum fastigiatum, cuja posição sistemática está representada na Tabela 1, é comumente encontrada no Cerrado da região sudeste do Brasil e apresenta-se como um subarbusto vernicoso ramificado desde a base, com cerca de 1,5 m de altura, possui folhas alternadas ou fasciculadas e pecioladas (Figura 1) (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2008). No Vale do Jequitinhonha, em especial na região de Diamantina – Minas Gerais, a planta é conhecida pela população local como “matapasto” ou “enxota”, e é utilizada na medicina tradicional para o alívio de dores geradas por contusões, distensões musculares, entorses, dores lombares, quadros de inflamações locais e reumatismo. Seu uso se dá sob a forma de emplastro, no qual, caules, folhas e inflorescências (caso estejam presentes) são friccionados manualmente e/ou macerados em água por algumas horas antes da aplicação local (GONÇALVES et al., 2011). 30 Tabela 1- Posição sistemática da Ageratum fastigiatum. Reino Plantae Divisão Magnoliophyta Classe Magnoliopsida Subclasse Asteridae Ordem Asterales Família Asteraceae Tribo Eupatorieae Gênero Ageratum Espécie Ageratum fastigiatum Figura 1 - Imagens de Ageratum fastigiatum. Partes aéreas da planta (A e B), detalhe das inflorescências de corola lilás (C e D). Fonte: Avelar-Freitas, B. A., 2013b. 2.4.2 Constituição química Bohlmann e colaboradores (1981 e 1983) foram os primeiros pesquisadores a avaliar a composição química de espécies de A. fastigiatum, coletadas no estado de Goiás. O perfil fitoquímico das partes aéreas da planta revelou a presença de estruturas químicas diversas como: cromenos, flavonoides, esqualeno, acetato de taraxasterol, o triterpenoide lupeol, glutinol, sesquiterpenoides derivados de eudesmano, derivado do epímero labdane, 31 além de alguns diterpenoides do tipo caurano. Nas raízes, as principais estruturas encontradas foram sesquiterpenoides germacreno D e α-humuleno, além do lupeol e lactonas. Del-Vechio-Vieira e colaboradores (2009a e 2009b), avaliaram a composição química do óleo essencial das partes aéreas de plantas coletadas em 2005 no município de São João Del Rei - MG, e constataram a presença em maior valor percentual de monoterpenos e sesquiterpenos, cujas quantidades representaram cerca de 90% da totalidade dos componentes. (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2009b). O óleo essencial dessa espécie foi caracterizado pela abundância de germacreno-D, β-cariofileno e 1,10-di-epicubenol, enquanto nos extratos de raízes os compostos presentes em maior valor percentual foram o βcariofileno, α-humuleno e óxido de cariofileno (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2009a). No mesmo material vegetal, a análise química do óleo essencial das folhas, indicou entre os principais constituintes químicos o germacreno-D , α-humuleno, β-cedreno, α-pineno, δcadineno, α-muurolene e β-gurjuneno (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2009b). Em estudos recentes com o óleo essencial de partes aéreas de A. fastigiatum, coletadas em dezembro de 2010, no município de Diamantina-MG, foram identificados 26 compostos, sendo 11 monoterpenos e 15 sesquiterpenos. Nesta amostra, os compostos presentes em maior valor percentual foram o α-pineno, limoneno, trans-cariofileno, αhumuleno, óxido de cariofileno, humuleno 1,2-epoxido, 1,6-humuladien-3-ol e α-cadinol (AVELAR-FREITAS et al., 2013b). 2.4.3 Atividade biológica Del-Vechio-Vieira e colaboradores (2007) observaram atividade antimicrobiana do extrato metanólico e das frações hexânicas e diclorometânica, frente aos microrganismos Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Staphylococcus typhosa, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. Del-Vechio-Vieirae colaboradores (2007) observaram atividade antimicrobiana do extrato metanólico de A. fastigiatum e das frações hexânicas e diclorometânica frente aos microrganismos Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Staphylococcus typhosa, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans. Esses pesquisadores também verificaram a atividade antinociceptiva do óleo essencial de A. fastigiatum em modelos animais, ao reduzir contorções abdominais induzidas por ácido acético, reduzir o tempo de lambida em pata induzida por formalina e aumentar o tempo de latência em teste de placa aquecida (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2009b). 32 Resultados semelhantes foram obtidos pelo tratamento prévio dos animais com extrato metanólico e fração hexânica e diclorometânica (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2007). Em modelos animais de inflamação aguda, o mesmo grupo de pesquisadores verificou que o tratamento prévio por via oral com o óleo essencial das folhas de A. fastigiatum teve efeito antiedematogênico no teste de indução de edema de pata e reduziu de forma significativa o volume do exsudato e da migração leucocitária na região pleural. Os resultados encontrados nesses trabalhos corroboram as propriedades analgésicas e anti-inflamatórias atribuídas à planta na medicina popular (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2009b). A atividade anti-inflamatória de alguns dos compostos presentes nos extratos e óleo essencial da planta A. fastigiatum citados anteriormente e obtidos de outras espécies vegetais apresentaram atividades sobre parâmetros envolvidos na resposta inflamatória. Dentre eles destaca-se o de Chavan e colaboradores (2010), em que foi demonstrado que o óxido de cariofileno reduziu o edema de pata induzido por carragenina. O α-pineno, transcariofileno e α-humuleno, em diferentes modelos experimentais, apresentaram efeito inibitório sobre a produção da citocina fator de necrose tumoral (TNF)-α e sobre a expressão de ciclooxigenase (COX)-2, sendo os dois últimos compostos supostamente inibidores da ativação do fator de transcrição nuclear kappa-B (NF-ҡB) (FERNANDES et al., 2007; MEDEIROS et al., 2007; YOON at al., 2010; BAE et al., 2012). O limoneno inibiu a produção de TNF-α em cultura de macrófagos e reduziu outros mediadores inflamatórios como a prostaglandina (PG)-E2 e o óxido nítrico (NO) (YOON et al., 2010). Em virtude da utilização popular de A. fastigiatum como agente anti-inflamatório e da existência de compostos químicos, em sua composição, com atividade anti-inflamatória já descrita na literatura, abordaremos a seguir aspectos relacionados ao processo inflamatório para auxiliar o entendimento dos objetivos deste estudo. 2.5 Processo inflamatório O processo inflamatório consiste em uma ação conjunta de múltiplos fatores solúveis e celulares cujo objetivo é a eliminação de agentes lesivos ao organismo, sejam eles de natureza infecciosa ou não, buscando o reparo do tecido lesado com retorno à homeostase (TILLEY et al., 2001; MEDZHITOV, 2008). A resposta inflamatória quando decorre de forma controlada e restrita é benéfica e resulta na eliminação do agente agressor e reparo tecidual. Porém, falhas nos mecanismos que regulam e restringem a inflamação, bem como a 33 perpetuação do processo inflamatório por períodos longos, podem trazer efeitos deletérios e indesejáveis ao tecido do hospedeiro (SCHETTER et al. 2010; SETHI et al., 2012). Nos tecidos, a existência de um agente infeccioso, ou mesmo produtos do seu metabolismo (toxinas), além de danos causados por injúrias físicas ou químicas, desencadeiam uma cascata de eventos mediada por fatores solúveis presentes no plasma ou sintetizados por células residentes, células endoteliais ou leucócitos infiltrados no sítio inflamatório. Como resultado, no decurso da fase aguda da inflamação, ocorrem alterações hemodinâmicas e celulares, caracterizadas por curto tempo de instauração e inespecificidade da resposta imune celular (MEDZHITOV, 2008). Inicialmente é observado maior aporte sanguíneo no foco inflamatório e aumento da permeabilidade do endotélio devido a alterações estruturais na rede microvascular, cujo propósito é facilitar a condução de mediadores solúveis e células para o sítio inflamatório. A vasodilatação é mediada principalmente pela atividade do óxido nítrico (NO) e prostaglandinas (PG) vasodilatadoras primárias, como PGD2, PGE2, PGF2A e as prostaciclinas (PGI2), que são mediadores lipídicos produzidos pela ação das enzimas COX 1 e COX 2 sobre o ácido araquidônico. Outro evento precoce do processo inflamatório consiste no extravasamento de líquido plasmático para o interstício, como resultado da ação da histamina, leucotrieno, fragmento da cascata proteolítica do sistema complemento, substância P e fator de agregação plaquetária (PAF). O exsudato formado, rico em proteínas, proporciona aumento da diferença da pressão oncótica entre o lúmen dos vasos e tecido, o que contribui para a retenção de líquido com formação de edema na área afetada. A vasodilatação e exsudação de fluido são acompanhados pela marginalização, adesão e transmigração de leucócitos do lúmen dos vasos até o sítio inflamatório, facilitada pela ação de mediadores quimiotáticos, como as quimiocinas [por exemplo a interleucina (IL)-8], que juntamente com citocinas (TNF-α e IL-1β) e PAF aumentam a expressão e avidez de moléculas de adesão (selectinas, ICAM-1, VCAM-1, integrinas e glicoproteínas) complementares entre células do endotélio e leucócitos (MULLER, 2003; KUMAR et al., 2003; MEDZHITOV, 2008; REGLERO-REAL et al., 2012). O sistema imune inato monta a resposta inicial ao agente agressor nos tecidos de acordo com as alterações hemodinâmicas e celulares discutidas previamente. Componentes celulares representados por macrófagos, células dendríticas, células Natural Killer (NK) e neutrófilos iniciam suas atividades efetoras pela ativação de receptores de reconhecimento de padrão (PRR – pattern recognition receptors), homólogos a receptores do tipo Toll, em humanos conhecidos como a família dos Toll-Like receptors (TLR), que reconhecem padrões 34 moleculares associados a patógenos (PAMP) comuns a uma variedade de microrganismo (AKIRA, 2006; LIBBY, 2007). Expressos na membrana das células do sistema imune inato, ao serem ocupados pelos seus ligantes específicos, os TLR deflagram cascatas de sinalização intracelular que culminam na ativação de membros da família das Proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK) como, c-Jun quinases amino-terminal (JNK) e p38, bem como na ativação de fatores de transcrição NF-ҡB e proteína ativadora 1 (AP-1), esses por sua vez se ligam a regiões promotoras de genes alvos que codificam a expressão de múltiplos elementos envolvidos na resposta inflamatória, induzindo, nesse contexto, a produção de mediadores inflamatórios como moléculas co-estimuladoras, enzimas induzíveis como a óxido nítrico sintase induzível (iNOS) e COX 2, aminas vasoativas, eicosanoides e citocinas próinflamatórias tais como: TNF-α, IL-6, IL-1β, interferon (IFN)-γ e IL-12. (LAWRENCE, 2001; JANEWAY et al., 2002; MEDZHITOV, 2010). A liberação de citocinas por células residentes no foco inflamatório, aliadas ao reconhecimento do agente lesivo, faz com que células do sistema imune inato se tornem ativadas e aptas a criarem mecanismo para destruição do patógeno. Os neutrófilos, primeiras células a migrarem para o sítio inflamatório, são caracterizados pela atividade fagocitária e liberação de grânulos tóxicos repletos de proteinases, catepsina G e elastase, além de enzimas que catalizam a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) e nitrogênio (ERN). Os linfócitos Natural killer (NK) também fazem parte do sistema imune inato e compreende uma importante linha de defesa celular inespecífica por meio de sua função efetora que envolve indução da apoptose de células-alvo após a liberação de seus grânulos citoplasmáticos compostos por granzimas e perforinas (NATHAN, 2002; POBER; SESSA, 2007; JOBIM et al., 2008). A resposta inflamatória aguda pode ser concluída com a eliminação do agente agressor, o posterior reparo do tecido local danificado e a transição para o estado homeostático é um processo ativo e regulado denominado resolução da inflamação. Em caso de ineficiência dos mecanismos de defesa da inflamação aguda e/ou persistência do agente causador, um quadro de inflamação crônica é instaurado (KUMAR et al., 2003). As novas características adquiridas pelo processo inflamatório são evidenciadas principalmente pela alteração na composição celular do infiltrado, antes rico em células polimorfonucleares, passando a ser substituído por fibroblastos, macrófagos e linfócitos com pequena quantidade ou inexistência de exsudatos de origem plasmática (MEDZHITOV, 2010). Tentativas fracassadas de fagocitose e destruição do agente patogênico podem conduzir à formação de granuloma, caracterizado pela formação de agregados de macrófagos semelhante a células 35 epiteliais circundados por um “colar” de linfócitos, cuja função é isolar o agente agressor e evitar sua disseminação para o tecido do hospedeiro (MEDZHITOV, 2008). Com considerável presença nas fases tardias da inflamação, os linfócitos T, células representantes da resposta imune adquirida, são classificados de acordo com o tipo de molécula de superfície que expressam, sendo assim divididos em linfócito T CD8 e linfócito T CD4. O primeiro, também denominado de linfócito T citotóxico, tem como principal função efetora a eliminação de células infectadas por patógenos intracelulares, desempenhando um papel chave no combate às infecções virais. Ao reconhecer especificamente um antígeno não próprio associado às moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) - I, os linfócitos T citotóxicos liberam grânulos tóxicos (perforinas e granzimas) que promovem a lise da célula infectada. Os linfócitos T CD4, também denominados de linfócitos T auxiliares ou T helper (Th), em resposta a apresentação de antígenos ligados à molécula de MHC-II, são ativados e coordenam a condução da resposta inflamatória através da produção de citocinas. Células da resposta imune inata, além de suas atividades efetoras, também podem atuar diretamente na ativação e amplificação da resposta imune adquirida, visto que citocinas como IL-12, produzidas por macrófagos residentes e células dendríticas, promovem a diferenciação de linfócitos T naïve em células do fenótipo Th1 (SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004). Os linfócitos Th são classificados de acordo com o padrão de citocinas que secretam. As citocinas que caracterizam células Th1 são representadas pelo IFN-ɣ e IL-2 e, em geral, favorecem a inflamação e a imunidade mediada por células, estimulando a fagocitose por macrófagos, bem como a proliferação e aumento da atividade citotóxica de linfócitos T CD8 e células NK, em resposta a microrganismos intracelulares e células tumorais. As citocinas que caracterizam células com perfil Th2 são representadas pelas IL-4, IL-5 e IL-13, envolvidas na proteção contra helmintos, além de estimularem a resposta humoral mediada por anticorpos, os quais são secretados por linfócitos B (CHARLES; DINARELLO, 2000; MOLDOVEANU et al., 2001). Em algumas condições, a IL-10 e o fator de transformação do crescimento (TGF)β possuem efeito inibitório sobre a produção de citocinas de ambos os padrões citados, suprimindo ou modulando a resposta imune. Essas citocinas são secretadas por um grupo de linfócitos T CD4 especiais, os chamados linfócitos T reguladores (Treg) (MOLDOVEANU et al., 2001; RAGHUPATHY, 2001). As células Th17, secretam predominantemente IL-17 e IL-21, citocinas envolvidas na defesa contra patógenos extracelulares e no aumento do recrutamento e ativação de granulócitos. Alguns estudos apontam ainda que as citocinas produzidas por 36 linfócitos Th17 atuam na patogênese de doenças autoimunes e inflamatórias, como esclerose múltipla e artrite reumatoide (FOUSER et al., 2008; OUKKA, 2008). Outra subpopulação de células T CD4 conhecida é a Th22, caracterizadas pela produção de IL-22, cuja função se relaciona à reparação dos tecidos pela indução da proliferação de células epiteliais, desempenhando também papel importante na manutenção da função de barreira da mucosa, por induzir a expressão de genes envolvidos na defesa antimicrobiana, como defensinas, lipocalinas e proteína S100 (HONDA, 2012; COSMI et al., 2014). Células T helper podem ainda secretar predominantemente IL-9, característica que as fazem ser classificadas como Th9. Acredita-se que linfócitos com esse perfil atuam em um amplo espectro de doenças autoimunes e alergia. Estudos apontam a presença expressiva de IL-9 nos pulmões de pacientes asmáticos, apesar desses achados representarem indícios, o mecanismo pelos quais a IL-9 contribui para inflamação e doenças alérgicas não está bem estabelecido (ERPENBECK et al., 2003; JABEEN et al., 2012). Por último, recentemente foi apontada a células T auxiliares folicular (Tfh) com a função principal de auxiliar células B na diferenciação e proliferação, além de induzir em tecidos linfoides humanos a expressão de receptores de quimiocinas (ZHOU et al., 2009). As citocinas desempenham papel fundamental na modulação da resposta inflamatória. Esses mediadores de natureza proteica proporcionam comunicação entre as células, facilitando diversas funções como crescimento, quimioatração, mudança no isotipo de imunoglobulinas, proliferação e diferenciação celular (BUSSE; LEMANSKE, 2001). Na resposta inflamatória, mediante diferentes estímulos, tais como estresse e agentes infecciosos, essas proteínas são sintetizadas por diversos tipos celulares, regulando a instauração, a manutenção e o término das reações inflamatórias (GIULIETTI, 2001; OPPENHEIM, 2001; BORISH; STEINKE, 2003; TURNER, 2014). Citocinas como a IL-1β, TNF-α e IL-12 quando secretadas estimulam a produção de mediadores inflamatórios e são classificadas como pró-inflamatórias. O TNF-α é sintetizado principalmente por macrófagos logo após a lesão local, juntamente com a IL-1β, atua em eventos envolvidos na formação do exsudato inflamatório. Age também sobre neutrófilos e fagócitos mononucleares potencializando suas atividades efetoras, além de atuar como um fator de crescimento para fibroblastos e promover angiogênese na fase de reparo tecidual. A IL-12 produzida por macrófagos ativados e células dendríticas, tem como função mais determinante a estimulação da produção de IFN-γ por células Th1, citocina essa envolvida na amplificação da resposta inflamatória, particularmente na estimulação da secreção de TNF-α, ativação fagocítica de macrófagos e citotóxicas das 37 células T CD8 e NK. Níveis locais aumentados de IFN-ɣ favorecem a diferenciação de linfócitos T CD4 em células Th1, em contrapartida, inibe a diferenciação em células Th2 (SHERWOOD e TOLIVER-KINSKY, 2004; POBER; SESSA, 2007). A IL-2 produzida por linfócitos ativados exerce seus efeitos em uma variedade celular, sendo as mais importantes os linfócitos T. Essas células expressam receptores para IL-2, que quando ocupados, desencadeiam sinais pró-proliferativos através de proto-oncogenes em combinação com sinais antiapoptóticas através de membros da família de Células-B de Linfoma 2 (Bcl-2), como resultado ocorre uma expansão rápida e seletiva das populações de células T CD4 e CD8 (NAKARAI et al., 1994; MIYAZAKI, 1995; GAFFEN e LIU, 2004). As citocinas tem papel fundamental no desenvolvimento da resposta inflamatória imune-mediada. O desequilíbrio entre a produção de citocinas pró e anti-inflamatórias está fortemente envolvida na manutenção da inflamação e a destruição tecidual. Nesse contexto, extratos vegetais e/ou seus derivados, bem como outros agentes terapêuticos, capazes de modular a resposta imunológica, a fim de restabelecer o equilíbrio perdido, se configuram como boas perspectivas para o desenvolvimento de novos fármacos no tratamento de doenças inflamatórias (CALIXTO et al., 2004; SHERWOOD; TOLIVER-KINSKY, 2004; MATALKA et al., 2007). 38 39 3 JUSTIFICATIVA O Brasil apresenta grande potencial para o desenvolvimento de fármacos derivados de plantas, uma vez que, em se tratando de biodiversidade, ocupa uma posição de destaque no mundo. Segundo a Convenção da Diversidade Biológica, o território que concentra uma das maiores diversidade genética do planeta com cerca de 60000 espécies vegetais superiores catalogadas, aspecto este que disponibiliza para estudos um vasto celeiro de moléculas (LORENZI e MATOS, 2002). Dentre os biomas brasileiros o Cerrado, que ocupa, em extensão, uma faixa de aproximadamente 23% do território nacional é considerado a segunda maior área de plantas nativas do país. Contribui consideravelmente para a diversidade da flora brasileira, apresentando cerca de 10000 espécies vegetais catalogadas, das quais, cerca de 4400 são consideradas endêmicas e correspondentes a 1,5% das plantas do planeta (RATTER, et. al, 2003). Dada sua tamanha importância no contexto da biodiversidade mundial, esse bioma está inserido entre os seis “hotspots” mundiais prioritários para a conservação (MYERS et al., 2000). Os estudos de plantas medicinais do Cerrado, em vista da área ocupada e da diversidade biológica oferecida, ainda continuam escassos. Esse contraste se torna ainda mais preocupante ao se constatar que nas últimas décadas o Cerrado tem sido considerado o ecossistema com os maiores índices de desmatamento no Brasil (GUARIM; MORAIS, 2003; SILVA et al., 2010). Aliada à variedade e complexidade da flora brasileira, o país conta com uma valiosa tradição do uso de plantas medicinais inerente ao conhecimento popular transmitido entre gerações (BRASIL, 2006). Para a comunidade científica, as informações etnobotânicas representam um ponto de partida ideal para obtenção de moléculas bioativas e redução dos custos envolvidos na etapa inicial de triagem da atividade biológica de plantas (HEINRICH; GIBBONS, 2001; DEVIENNE et al., 2004). Muitas plantas do Cerrado são utilizadas tradicionalmente, para fins medicinais, por diversas comunidades que residem nesse bioma. Nesse sentido, pesquisas envolvendo tais plantas além de fornecerem evidências científicas que confirmam o uso popular, colaboram para descoberta de novos medicamentos e para valorização do Cerrado (GONÇALVES et al., 2011). A A. fastigiatum uma planta abundante no Cerrado da região de Diamantina - MG é utilizada tradicionalmente como anti-inflamatório tópico. Estudos demonstraram efeito anti- 40 inflamatório e analgésico do óleo essencial e de alguns extratos da planta em modelo animal sem, no entanto, indicar os mediadores envolvidos nessa resposta (DEL-VECHIO-VIEIRA et al., 2009). Nosso grupo de pesquisa vem desenvolvendo nos últimos anos estudos voltados para a caracterização fitoquímica e investigação, in vitro, da atividade anti-inflamatória de extratos e frações derivados dessa planta. Fundamentados na concepção de que as citocinas são importantes mediadores de processos inflamatórios, alguns resultados obtidos em nossos trabalhos se demonstraram promissores. Constatamos que extratos brutos e algumas frações derivadas da planta A. fastigiatum reduziram a produção de citocinas pró-inflamatórias por leucócitos humanos estimulados (AVELAR-FREITAS et al., 2013a; 2013b; 2015). O presente trabalho busca aprofundar o conhecimento fitoquímico e sobre a atividade antiinflamatória atribuída a planta, tendo por objetivo avaliar se o extrato etanólico A. fastigiatum e uma fração obtida do mesmo seriam capazes de alterar a produção de citocinas IFN-γ ,TNFα e IL-2 e a proliferação de linfócitos humanos ativados. 41 4 OBJETIVOS 4.1 Objetivo Geral Avaliar o efeito do solvente DMSO, do extrato etanólico de A. fastigiatum e de sua fração, caracterizada quimicamente, sobre parâmetros da resposta inflamatória, in vitro. 4.2 Objetivos específicos Realizar um estudo químico da fração do extrato etanólico de A. fastigiatum. Investigar o efeito do solvente DMSO, do extrato etanólico de A. fastigiatum e da sua fração, sobre: o A proliferação de linfócitos humanos do sangue periférico. o A interferência no perfil de produção das citocinas intracitoplasmáticas IFN-γ, TNF-α e IL-2 por linfócitos humanos. 42 43 5 METODOLOGIA 5.1 Coleta e identificação botânica da A. fastigiatum As partes aéreas (ramos com folhas e inflorescências) de A. fastigiatum foram coletadas em fevereiro de 2011, no Campus Juscelino Kubitscheck - UFVJM (S 18º12.125´ W 43º34.367´, altitude 1392 m), localizado no município de Diamantina, Minas Gerais. O material testemunho foi depositado no Herbário DIAM UFVJM, sob número de registro 1300. O acesso ao patrimônio genético e ao conhecimento tradicional associado, conforme descrito na Lei nº 13.123, de 20 de maio de 2015, foi autorizado pelo Conselho de Gestão do Patrimônio Genético (CGEN) sob registro n° 010832/2014-9 (Anexo A). Como preconizado na Instrução Normativa 154/2007 do Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade (SISBIO) foi obtida a autorização para coleta de material botânico, com registro no Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) 5141849 (Anexo B). 5.2 Obtenção do extrato etanólico de A. fastigiatum As partes aéreas da planta foram secas em estufa de ar circulante a 40°C. Em seguida, o material vegetal foi pulverizado em moinhos de facas (Marconi®, Piracicaba, SP, BR) e utilizado para confecção do extrato. O material pulverizado foi macerado na proporção de 1:5 (m/v), sequencialmente em n-hexano, acetato de etila e etanol (96% v/v), conforme ilustrado na Figura 2. A maceração em cada solvente foi realizada com agitação manual e ocasional por 3 dias. 44 Figura 2 - Sequência de procedimentos para obtenção do extrato etanólico de A. fastigiatum. Os extratos obtidos foram filtrados em algodão e, em seguida, concentrados em evaporador rotativo (Fisatom®, São Paulo, SP, BR) (40 – 42 º C, sob pressão reduzida) e armazenados em frascos de vidro protegidos com papel alumínio e ao abrigo da luz solar direta. Após completa evaporação do etanol, foram obtidos 9g do extrato etanólico. Uma parte do extrato foi solubilizada em dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma), na concentração de 8 mg/mL e as alíquotas foram acondicionadas a -20°C até o momento do uso. 5.3 Fracionamento do extrato etanólico de A. fastigiatum Uma alíquota de 1,5 g do extrato etanólico de A. fastigiatum foi diluída em 20 mL de metanol e, posteriormente, centrifugada a 1500 xg. O sobrenadante foi coletado e filtrado em filtro Millex® de 0,46 μm e em seguida aplicado em coluna de Sephadex LH-20 (150 g) previamente condicionada em metanol. Ao final da eluição, foram coletadas 50 frações de 25 mL, sendo cada uma analisada em cromatografia de camada delgada comparativa (CCDC), utilizando como fase móvel uma solução clorofórmio : metanol : água (60 : 35 : 5) e fase estacionária sílica gel 60. A revelação foi realizada com luz ultravioleta (UV) e vanilina sulfúrica. As frações que apresentaram perfis cromatográficos semelhantes foram reunidas, resultando em 47 frações. Este procedimento foi repetido e ao final foram fracionados 3,0 g 45 do extrato etanólico. As frações das duas colunas foram reunidas após análises de CCDC, resultando em 49 frações. As frações foram concentradas em evaporador rotativo e mantidas em frasco de vidro envolvido por papel alumínio e ao abrigo da luz. Foram obtidos 8 mg da fração 46, que apresentou um precipitado amarelo (indicativo de flavonoides) e perfil cromatográfico em CCDC menos complexo. Por este motivo, a fração 46 foi submetida à análise química (6 mg) e avaliada quanto ao potencial anti-inflamatório (2 mg). Para a análise da atividade biológica, 2 mg da fração 46 foram solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma, St. Louise, MO, USA), na concentração de 1 mg/mL e as alíquotas mantidas à -20°C até o momento o uso. 5.3.1 Análise química da fração 46 A composição química da fração 46 foi investigada por cromatografia líquida de alta eficiência com detectores de arranjo de diodo acoplado a espectrômetro de massas (CLAE-DAD-MS) e Espectrometria de Massas em Tandem com ionização por electrospray (ESI-MS/MS) (por infusão direta). Inicialmente, 6 mg da fração 46 foram solubilizados em 3 mL de água deionizada contendo 1% de ácido acético glacial e, em seguida a solução foi filtrada em filtro de 0,45 µm (PTFE, Millex). Para a análise química foi utilizado um cromatógrafo líquido de ultra velocidade da (Shimadzu, modelo Proeminence CLAE) equipado com duas bombas de solvente, detector por arranjo de diodos (DAD) e injetor automático. Foi utilizada uma coluna VP-ODS-18 (Shimadzu), com 150 mm de comprimento x 2 mm de diâmetro, tamanho de partícula de 4,6 µm, protegida por pré-coluna empacotada com GPV-ODS C-18 (5 mm x 2 mm, Shimadzu). As análises em espectrometria de massas (MS) de alta resolução foram realizadas no espectrômetro de massas MicrOTOF-II da marca Bruker Daltonics, com fonte de ionização por electrospray (ESI) operando nos modos negativo e positivo. A eluição foi realizada por gradiente conforme apresentado na Tabela 2, onde foram injetados 20 µL da amostra. 46 Tabela 2 - Gradiente utilizado nas análises em CLAE-DAD-MS. Tempo (min) Fase móvel A (%) Fase móvel B (%) 0 90 10 40,0 0 100 45,0 0 100 50,0* 90 10 55,0* 90 10 55,1* 90 10 (fim) Fase Móvel A: água deionizada com 1% de ácido acético glacial Fase Móvel B: acetonitrila grau CLAE, com 1% de ácido acético glacial Fluxo: 0,5 mL/min Detecção UV: 200 - 600 nm e MS: modos negativo e positivo *Reequilíbrio das condições iniciais para a próxima injeção. As análises em CLAE-DAD-MS e ESI-MS/MS foram realizadas em colaboração com o Laboratório do Núcleo de Pesquisas em Produtos Naturais e Sintéticos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) da Universidade de São Paulo (USP). 5.4 Tamanho amostral A quantidade de indivíduos participantes em cada um dos ensaios realizados nesse trabalho foi calculada com auxílio do programa G*Power 3.1.9.2 ®, cujos parâmetros adotados foram referenciados por estudos prévios conduzidos por Avelar-Freitas (2013a) (FAUL et al, 2007). Para tal, foi determinado o tamanho da amostra necessária para que o teste estatístico com poder (1-β) de 90% tenha nível de significância (α) de 5%. 5.5 Implicações éticas e seleção dos voluntários Foram recrutados indivíduos nas imediações da UFVJM. Neste estudo foram incluídos adultos com idade entre 19 a 39 anos que gozavam de boas condições de saúde; sem reportar doenças infecciosas, autoimune, crônico degenerativa ou de hipersensibilidade; não fizeram uso de corticosteroides ou drogas imunossupressoras; não fumantes, não etilistas e que não haviam ingerido bebida alcoólica nas 12 horas que antecederam o momento da coleta. Foram excluídos do estudo indivíduos que apresentaram, parâmetros avaliados no hemograma, fora dos valores normais de referência. Inicialmente, os doadores receberam uma 47 explicação sobre os objetivos da pesquisa, assim como os possíveis riscos e benefícios do estudo. Em seguida, assinaram um termo de consentimento para a participação (Anexo C). A realização desse estudo obedeceu aos princípios éticos para pesquisa envolvendo seres humanos, conforme Resolução 196-96 do Conselho Nacional de Saúde, recebendo a aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Universidade Federal dos Vales dos Jequitinhonha e Mucuri (UFVJM) sob o registro número 146/10 (ANEXO D). No presente estudo foram utilizadas amostras de 36 voluntários, sendo 20 homens e 16 mulheres, com idade de 25 ± 5 anos. Os procedimentos experimentais descritos a seguir foram realizados no Laboratório de Imunologia do Centro Integrado de Pós-Graduação e Pesquisa em Saúde (CIPq-Saúde) da UFVJM. 5.6 Amostra biológica A amostra biológica constituiu de 15 mL de sangue periférico, coletado de forma asséptica por punção venosa em tubos a vácuo contendo como anticoagulante a heparina (Vacutainer; Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA). Os procedimentos para coleta foram realizados por pessoas treinadas e capacitadas para esse procedimento. Após os procedimentos experimentais, o material biológico remanescente foi devidamente descartado. 5.7 Parâmetros Hematológicos A contagem global de leucócitos foi realizada em câmara de Neubauer. Também foram realizadas extensões sanguíneas coradas pelo método May-Grunwald-Giemsa e analisadas em microscópio óptico para a contagem diferencial de leucócitos circulantes como descrito por Carvalho e Silva (1988). 5.8 Obtenção das células mononucleares do sangue periférico humano A amostra biológica foi submetida à separação das células mononucleares do sangue periférico (PBMC) que foram utilizadas para a confecção de culturas celulares com objetivo de avaliar a atividade do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46, na viabilidade celular, indução da emissão de fluorescência, proliferação celular e na produção 48 de citocinas intracitoplasmáticas, bem como da interferência ou não do solvente DMSO nas análises acima descritas. As PBMC foram obtidas a partir de aproximadamente 10 mL de sangue periférico venoso diluído na proporção 1:1 em Tampão Fosfato de Salina (PBS) (NaCl 1,50 M; Na2HPO4 0,08M; NaH2PO4 0,02M, pH 7,20-7,40) seguido de centrifugação (400 g, 21°C, 30 min) com o reagente Ficoll-Histopaque 1077 (Sigma, St. Louis, MO, USA). Por diferença de gradiente de densidade, foi formado um anel de PBMC recolhido e lavado por 2 vezes em PBS (250 g, 4ºC, 15 min). Em seguida, as células sedimentadas foram suspensas em 1 mL de PBS ou RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EUA). Em câmara hemocitométrica de Neubauer as células foram contadas e a concentração da suspensão celular foi ajustada para 1x107 células/mL em RPMI-1640 suplementado com L-glutamina (Sigma, St. Louis, MO, USA) (2 mM), soro fetal bovino (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EUA) (10%), e coquetel antibiótico/antimicótico (penicilina G 100UI/mL, estreptomicina 100 µg/mL e anfotericina B 250 ng/mL - Sigma, St. Louis, MO, USA), a partir de agora identificado ao longo do texto como RPMI completo. 5.9 Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre a viabilidade de PBMC humanas Inicialmente, procurou-se determinar as concentrações não tóxicas do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 que pudessem ser utilizadas nos ensaios de avaliação da atividade anti-inflamatória destes produtos naturais. Primeiramente, determinou-se em quais concentrações o solvente DMSO seria tóxico às PBMC. Para isso, cerca de 5x105 PBMC (n = 6) foram incubadas em tubos de polipropileno (Falcon 2059, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) em meio RPMI completo. O DMSO foi adicionado às culturas em concentrações finais de 1 a 20 % (v/v). Culturas não tratadas constituíram o controle negativo de morte. Para a análise do efeito citotóxico do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46, as culturas de PBMC (5x105 células) em RPMI completo foram tratadas com extrato etanólico de A. fastigiatum em diferentes concentrações (6,5 a 75,0 μg/mL) ou com a fração 46 em diferentes concentrações (1,25 a 10 μg/mL). As culturas foram confeccionadas em triplicata e permaneceram incubadas por 8, 24 ou 120 horas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. 49 Ao fim do período de incubação as células foram separadas do meio através da adição de 2 mL de PBS, transferidas para tubos de poliestireno (Falcon 2059, Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) seguido de centrifugação (240g, 7 min, 18°C). O sobrenadante foi descartado e a suspensão celular remanescente nos tubos foi utilizada para determinar a viabilidade celular por meio da técnica de exclusão com azul de tripan. Essa estratégia baseia-se no princípio de seletividade da membrana celular. Ao permear facilmente as células não viáveis, o azul de tripan se complexa a proteínas corando as células de azul, diferentemente das células viáveis, que permanecem não coradas devido à integridade da membrana (TENNANT, 1964). Dessa forma, 10 µL da suspensão celular foram incubados com 10 µL da solução de azul de tripan (0,4%) e o percentual de células viáveis dentre as células totais foi determinado utilizando câmara de neubauer por meio de microscopia óptica. 5.10 Avaliação da ação do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre a proliferação de linfócitos humanos Uma vez que a proliferação é um evento inicial importante da resposta funcional de linfócitos, avaliou-se o efeito anti-proliferativo do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre estas células. A técnica de incorporação e decaimento da fluorescência de CFSE (5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester), foi utilizada para essa análise (LYONS et al., 2000). Cerca de 5x105 PBMC isoladas de 6 indivíduos foram suspensas em PBS suplementado com Albumina de soro bovino (BSA) a 0,1% e incubadas a 37ºC por 10 min com CFSE (Sigma, St. Louis, MO, USA) na concentração final de 10 μM. A incorporação do CFSE foi interrompida adicionando-se 10 mL de RPMI completo gelado, seguido de incubação por 5 min em gelo. As células foram lavadas com RPMI-1640, (240 xg, 18º C, 10 min) e suspensas em RPMI completo de forma que a concentração atingisse a mesma do início do procedimento. Culturas de PBMC foram estimuladas com o mitógeno fitohemaglutinina (PHA), uma glicoproteína da classe das lectinas capaz de induzir a proliferação de linfócitos T quiescentes. O mecanismo de ação envolve interações com porções de carboidratos expressos na membrana celular, em especial nos receptores de células T (TCR) (GREAVES et al., 1972; CHILSON et al., 1984; KILPATRICK, 1999). As PBMC (5x105) incubadas em RPMI completo foram estimuladas com PHA (Sigma, St. Louis, MO, USA) (5μg/mL) e simultaneamente tratadas com extrato etanólico de A. fastigiatum nas concentrações de 3,125; 50 6,25 ou 12,5 µg/ml; ou da fração nas concentrações de 1,5; 2,5; 5 µg/mL ou de DMSO a 0,5; 1 ou 2 % (v/v). Foi confeccionada uma cultura contendo PHA e ciclosporina (Sandimmun®, ciclosporina 50 mg/mL, Novartis Biociências S. A., Indústria Brasileira) na concentração de 5 μg/mL, constituindo a cultura controle de inibição. Culturas contendo apenas células e RMPI completo, constituíram a cultura controle não estimulada. Culturas contendo células, RPMI completo e PHA, constituíram a cultura controle estimulada do ensaio que avaliou a atividade antiproliferativa do solvente DMSO e as culturas contendo RPMI completo, células, PHA e DMSO a 0,5% v/v, constituíram a cultura controle de estimulação do ensaio que avaliou a atividade antiproliferativa do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46. As culturas foram preparadas em placas de 24 poços e permaneceram por 120 horas em estufa úmida, a 37ºC contendo 5% de CO2. Após o período de incubação, as células foram transferidas para tubos de poliestireno e lavadas por duas vezes com PBS gelado (240 xg, 4ºC, 10 min). A proliferação celular foi determinada pela medida do decaimento da fluorescência do CFSE por citometria de fluxo com aquisição de 50000 eventos totais. No estudo foi utilizado o citômetro BD FACSCanto II (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA), equipado com 3 lasers (azul 488 nm, vermelho 633 nm e violeta 405 nm), um octógono (488/10 Band pass-BP, 530/30 BP, 585/42 BP, 670 Long Pass - LP e 780/60 BP) e dois trígonos (trígono I – 660/20 BP, 685 LP e 780/60 BP; trigono II – 450/50 BP e 510/50 BP). O que possibilita o a análise dos parâmetros de tamanho (FSC – forward scatter) e complexidade ou granulosidade celular (SSC – side light scatter) e 8 fluorescências. Para aquisição dos dados foi utilizado o software BD FACSDiva (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) versão 6.0 e para análise o software FlowJo versão 10.0.7. Na Figura 3 está representada a estratégia de análise de proliferação celular. Inicialmente foi gerado um gráfico bidimensional de distribuição pontual de tamanho celular (FSC – forward scatter) pela área do pico de voltagem (FSC-A) versus tamanho celular pela altura do pico de voltagem (FSC-H), para exclusão dos “doublets” celulares que estão localizados fora da região P1 (figura 3A). Em seguida, os eventos selecionados foram analisados em gráfico de distribuição pontual de tamanho (FSC-H) versus complexidade celular interna pela altura do pico de voltagem (SSC - H – side light scatter) e a população de linfócitos foi delimitada (Figura 3B). Os eventos selecionados foram analisados em histogramas de intensidade de fluorescência de CFSE em função do número de eventos (Figura 3C e 3D). O marcador M1 (Figura 3C e 3D) foi definido como região onde se encontravam células coradas com CFSE que não proliferaram ao longo das 120 horas de 51 incubação sob estímulo do PHA. As regiões M2 à M7 (Figura 3C e 3D) foram identificadas como picos de diferentes intensidades de fluorescência de CFSE correspondentes às gerações celulares que proliferaram no período de estimulação. A proliferação foi determinada pelo índice de proliferação (IP), calculado como a seguir: (1) Sendo, (2) M1 representa a porcentagem de células que não se dividiram (localizadas em M1), e M2 a M7 representam os picos de divisão gradual (localizados em M2 a M7) (ÂNGULO e FULCHER, 1998). 52 D Figura 3 - Sequência de procedimentos adotados para a análise da proliferação de linfócitos marcados com CFSE. Uma vez excluído os “doublets” celulares (A), foi selecionada a população de linfócitos por gráficos de distribuição pontual tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (B), Os linfócitos selecionados foram analisados em histogramas de intensidade de fluorescência de CFSE em função do número de eventos em C para cultura não tratada e em D para cultura tratada, ambas estimuladas com PHA (Fitohemaglutinina) por 120 horas. Nos histogramas, as regiões M1 a M7 foram definidas para o cálculo de índice de proliferação (IP) para a população de linfócitos. 5.11 Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre a produção de citocinas, in vitro, por linfócitos humanos Para avaliação do perfil de produção de citocinas intracitoplasmáticas em subpopulação linfocitárias, cerca de 1x106 PBMC isoladas de 6 indivíduos e suspensas em RPMI completo foram incubadas por 4 horas, em tubos de polipropileno, com extrato etanólico de A. fastigiatum nas concentrações de 12,5; 25; 50 e 75 µg/mL; com a fração 46 nas concentrações de 2,5; 5 e 10 µg/mL; DMSO nas concentrações de 1; 2,5; 5 e 10% (v/v), ou ainda ciclosporina na concentração de 5 μg/mL, constituindo o controle de inibição. Tubos contendo apenas as células e o meio constituíram as culturas controles. Ao fim da incubação, em todas as culturas celulares, foi adicionada Brefeldina A (Sigma, St. Louis, MO, EUA) a 10 µg/mL, um metabólito fúngico que impede o transporte de proteínas do retículo endoplasmático para o complexo de Golgi inibindo, portanto, a secreção proteica (MISUMI et al., 1986; ZELNICKOVA et al., 2007). As culturas foram estimuladas com miristato acetato de forbol (PMA) (Sigma, St. Louis, MO, EUA) na concentração final de 25 ng/mL, um éster de forbol caracterizado por ativar leucócitos a sintetizarem citocinas pró-inflamatórias, e de ionomicina (Sigma, St. Louis, 53 MO, EUA) a 1,0 μg/mL, cuja função foi potencializar a atividade do PMA (PRUSSIN & METCALFE, 1995; SEMPOWSKI et al., 1999). Cultura estimulada apenas com PMA e ionomicina constituiu o controle estimulado. A cultura controle não estimulada constituiu-se de células em RPMI na ausência de estímulos ou tratamentos. As culturas celulares foram incubadas por mais 4 horas sob as mesmas condições anteriores. Ao fim da incubação, as culturas celulares foram lavadas com PBS (240 g, 7 min, 18°C), o sobrenadante foi removido e a suspensão celular de cada cultura foi distribuído em novos tubos previamente acrescidos de solução de anticorpos monoclonais específicos para CD4, conjugados à Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) e CD8 conjugados à Proteína Clorofila Peridinina combinada a Cianina 5.5 (PerCP-Cy5.5) (Tabela 3). Os tubos permaneceram incubados por 20 min ao abrigo da luz e à temperatura ambiente. Ao final desse tempo, foram adicionados aos tubos, PBS e paraformaldeído a 4% (paraformaldeido 4%, NaOH 2,65mM, pH 7,2-7,4) na proporção de 1:1 para fixação celular. A suspensão foi incubada à temperatura ambiente por 20 min, seguido de centrifugação (240g, 7 min, 18°C). O sobrenadante foi descartado e as células foram lavadas com PBS-W (Tampão Fosfato Salina Wash) (PBS contendo 0,5% de BSA e 0,1% de azida sódica, pH 7,2-7,4) seguido de centrifugação (240g, 7 min, 18°C). Em seguida as células foram permeabilizadas com PBS-P (Tampão Fosfato Salina Permeabilization) (PBS contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida sódica e 0,5% de saponina, pH 7,2-7,4) por 10 min à temperatura ambiente. A suspensão foi homogeneizada, o volume de cada cultura celular foi ajustado e distribuído em três novos tubos contendo solução de anticorpos monoclonais específicos para as citocinas IFN-γ conjugados ao fluorocromo PE-Cy7, TNF-α conjugada à ficoeritrina (PE) e IL-2 conjugada à aloficocianina (APC) (Tabela 3), seguido de incubação por 30 min, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após incubação as células foram lavadas com PBS-P e PBS-W (250g, 7 min, 18°C). e avaliadas por citometria de fluxo (BD FACSCanto II® - Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) com aquisição de 30000 eventos por cultura (BRITO-MELO et al., 2006). Para aquisição dos dados foi utilizado o software BD FACSDiva (Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) versão 6.0 e para análise, o software FlowJo versão 10.0.7. 54 Tabela 3 - Anticorpos monoclonais e seus respectivos fluorocromos utilizados na análise da produção de citocinas intracitoplasmáticas em populações de linfócitos Anticorpos Especificidade Marca Clone Anti-CD4 humano marcado com FITCa População de BD Pharmingen RPA-T4 BD Pharmingen RPA-T8 Interferon—γ BD Pharmingen 45-B3 Fator de necrose BD Pharmingen MAb11 BD Pharmingen MQ1- Linfócitos CD4 Anti-CD8 humano marcado com PerCP - Cy5.5b População de Linfócitos CD8 Anti-IFN-γ humano marcado com PECy7c Anti-TNF-α humano marcado com PEd tumoral-α Anti-IL2 humano marcado com APCe Interleucina-2 17H12 a: Isotiocianato de Fluoresceína b: Proteína Clorofila Peridinina combinada a Cianina c: Ficoeritrina Cianina 7 d: Ficoeritrina e: Aloficocianina A Figura 4 ilustra a estratégia de análise sequencial para avaliação de citocinas intracitoplasmáticas. Inicialmente, foi gerado um gráfico bidimensional de distribuição pontual FSC-A versus FSC-H, para exclusão dos “doublets” celulares (Figura 4A). Em seguida, os eventos selecionados foram analisados em gráficos de distribuição pontual de FSC-H versus complexidade celular interna pela altura do pico de voltagem (SSC-H), para a seleção da população de linfócitos (figura 4B). As populações de linfócitos foram identificadas em gráfico de fluorescência para CD8 (conjugado ao PerCP-Cy5.5) versus fluorescência para CD4 (conjugado a FITC) (Figura 4C). As células CD4+ ou CD8+ foram avaliados quanto à produção das citocinas em histogramas de número de eventos versus fluorescência percentual para IFN-γ (conjugado ao PE-Cy7), TNF-α (conjugado ao PE) ou IL2 (conjugada ao APC) (Figura 4D). 55 B FSC-H SSC-H A P1 Linfócitos FSC-A FSC-H D C CD4 + CD8 + CD8 PerCp-Cy5.5-A Número de eventos em CD4 FITC-A Citocina + Fluorescência Figura 4 - Estratégia de análise utilizada para avaliação do perfil de produção de citocinas em populações de linfócitos. Gráficos de FSC-H versus FSC-A foram utilizados para a exclusão dos “doublets” celulares (A). A população de linfócitos foi selecionada em gráficos de FSC versus SSC (B), e as populações de células CD4+ e CD8+ selecionadas em gráficos de fluorescência para CD8-PerCP - Cy5.5 versus CD4-FITC (C). A porcentagem de linfócitos produtores de IFN-γ, TNF-α e IL-2 foram obtidos em histogramas de número de eventos versus fluorescência para as citocinas específicas (D). Neste gráfico está representada a estratégia de análise de uma cultura estimulada com PMA 5.12 Análise da emissão de fluorescência do extrato etanólico de A. fastigiatum, fração 46 e do solvente DMSO em linfócitos humanos Em virtude das duas análises anteriores utilizarem a citometria de fluxo como técnica de escolha para avaliar a atividade anti-inflamatória do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre células humanas, decidimos, como medida de cautela, avaliar em experimentos conduzidos anteriormente aos ensaios de proliferação celular e de produção de citocinas, se esses produtos vegetais, bem como o solvente DMSO, seriam capazes de, por 56 si só, induzirem PBMC a emitirem fluorescência contaminante em algum dos canais de detecção do citômetro de fluxo BD FACSCanto II®, o que poderia reduzir a confiabilidade dos resultados ou inviabilizar o uso de determinados marcadores fluorescentes. Para avaliação da emissão de fluorescência do extrato etanólico de A. fastigiatum, da fração 46 e do solvente DMSO, culturas de PBMC foram confeccionadas sob as mesmas condições descritas para o ensaio de proliferação celular (seção 5.10) e para o ensaio de análise da produção de citocinas (seção 5.11). A única diferença consistiu na ausência dos estímulos e dos respectivos marcadores fluorescentes. Neste caso, ausência do estímulo PHA e marcador fluorescente CFSE, utilizados no ensaio de proliferação celular, e ausência do estímulo PMA e de anticorpos monoclonais conjugados a fluorocromos na avaliação da produção de citocinas. Os dados foram adquiridos em citômetro de fluxo (BD FACSCanto II® - Becton Dickinson, San Jose, CA, EUA) com aquisição de 10000 eventos por cultura (BRITO-MELO et al., 2006), utilizando o software BD FACSDiva versão 6.0. A análise dos dados foi realizada no software FlowJo 10.0.7. A estratégia de análise ilustrada na Figura 5, consistiu em um gráfico de distribuição pontual de FSC-A versus FSC-H, para exclusão dos “doublets” celulares, localizados fora da região P1 (figura 5A e 5D). Posteriormente, foi realizada a seleção da população de linfócitos em gráficos de distribuição pontual de FSC-H versus SSC-H (Figura 5B e 5E.). A emissão de fluorescência pelas células tratadas foi analisada em histogramas de intensidade de fluorescência para cada um dos oito canais disponíveis no citômetro FACSCanto II ® em função do número de eventos (Figura 5C e 5F). A presença de fluorescência contaminante induzida nas culturas experimentais (Figura 5F) foi avaliada pelo deslocamento do pico de fluorescência para a direita, em relação ao pico de fluorescência da cultura não tratada (Figura 5C). 57 Figura 5 - Estratégia de análise adotada para avaliação da emissão de fluorescência do extrato etanólico de A. fastigiatum, fração 46 e DMSO. A à C e D à F ilustram a estratégia de análise utilizada para cultura não tratada e tratada, respectivamente. Uma vez excluído os “doublets” celulares (A e D), foi selecionada a população de linfócitos por gráficos de distribuição pontual tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (B e E), seguida da análise dessa população quanto à intensidade da emissão de fluorescência (C e F). 5.13 Análise Estatística Inicialmente, os resultados foram analisados de forma descritiva. Após a análise de normalidade (Shapiro-Wilk), as diferenças entre os dados para as variáveis com distribuição simétrica foram avaliadas utilizando o teste ANOVA com Post Hoc de Tukey. Para as variáveis com distribuição assimétrica, foi utilizado o teste Kruskall-Wallis seguido de Post Hoc de Dunns. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão e as diferenças estatisticamente significativas foram consideradas quando p ≤ 0,05. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 5. 58 59 6 RESULTADOS 6.1 Análise química da fração 46 6.1.1 Análise da fração 46 por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência com Detectores de Arranjo de Diodo acoplada à espectrometria de massas (CLAE-DAD-MS) A análise em CLAE-DAD-EM da fração 46 obtida do extrato etanólico de A. fastigiatum está representada nas Figuras 6 e 7. É possível identificar dois picos de alta intensidade com tempo de retenção de 14,9 e 17,4 min, indicando a presença de dois constituintes principais nesta fração. Intens. X 105 mAU 2 1 0 -1 10 20 30 40 50 Tempo (min) Figura 6 - Cromatograma da fração 46 gerado pelo Detector de Arranjo de Diodo (200260 nm) por CLAE-DAD-MS. 60 Intens. X 105 4 mAU 3 2 1 10 20 30 40 50 Tempo (min) Figura 7 – Cromatograma da fração 46 gerado pelo detector do espectrômetro de massas (cromatograma de íons totais - TIC) por CLAE-DAD-MS. As figuras 8 e 9 mostram o espectro de absorção na região do ultravioleta-visível (UV-vis) (200 – 600 nm) para os picos com Tr de 14,9 min (Figura 8) e com Tr de 17,4 min (Figura 9). Para o pico com Tr de 14,9 min observou-se uma banda de absorção com λmáxima de 370 nm e uma banda de 257 nm de menor intensidade (Figura 8). Para o pico com Tr de 17,4 min foi observado uma banda de absorção com λmáxima de 365 nm, além de uma banda de menor intensidade de 268 nm (Figura 9). 61 Intens. [mAU] 200 250 300 350 400 450 500 550 Tr: 14,9 min 1500 1000 500 0 Comprimento de onda (nm) Figura 8 - Espectro na região do ultravioleta (200 – 600 nm) para o pico com tempo de retenção de 14.9 min na análise da fração 46 por CLAE-DAD-MS. Intens. [mAU] 200 250 300 350 400 450 500 550 Tr: 17,4 min 2000 1500 1000 500 0 Comprimento de onda (nm) Figura 9 - Espectro na região do ultravioleta (200 – 600 nm) para o pico com tempo de retenção de 17.4 min na análise da fração 46 por CLAE-DAD-MS. O espectro de massas para o pico com Tr de 14,9 min (Figura 10) indicou a presença dos íons massa/carga (m/z) 315 (maior intensidade), 331 e 397. Para o pico com tempo de retenção de 17,4 min (Figura 11) observou-se no espectro de massas os íons m/z 299 (maior intensidade) e 315. 62 Intens. X 104 315.0562 4 3 2 1 331.0521 200 250 300 350 397.0596 400 450 500 550 600 m/z Figura 10 - Espectro de massas para o pico com tempo de retenção de 14.9 min na análise da fração 46 por CLAE-DAD-MS. Intens. X 104 299.0625 2 1,5 1 0,5 315.0560 200 250 300 350 400 450 500 550 600 m/z Figura 11 - Espectro de massas para o pico com tempo de retenção de 17.4 min na análise da fração 46 por CLAE-DAD-MS. De acordo com os espectros de absorção no UV-vis e os picos observados na espectrometria de massas, sugerimos tratar-se da classe química dos flavonoides especificamente da subclasse dos flavonóis. Os flavonoides são polifenóis de baixo peso molecular caracterizados por apresentarem variadas formas estruturais, todas elas compostas por 15 átomos de carbono em seu núcleo básico organizado na configuração C6-C3-C6, em geral são todos derivados do precursor 2- fenilcromona possuindo uma estrutura em comum com dois anéis aromáticos (A 63 e B), ligados por três carbonos que podem ou não formar um terceiro anel (C). A Figura 12A ilustra a estrutura genérica da classe dos flavonoides e o sistema de numeração utilizado para distinguir as posições dos átomos de carbono na molécula. Podem ser divididos em subclasses tais como as chanconas, flavonas (apegenina, luteolina, diosmetina), flavanonas (naringina, hesperidina), antocianidina, isoflavonoides (genisteína, daizdeína) e flavonóis (Quercetina e kaempferol) (Figura 12B). (MABRY et al., 1970; BRAVO, 1998; COOK e SAMMAN, 1996; BEHLING et al., 2004; KOZLOWSKA e SZOSTAK-WĘGIEREK, 2014). Os flavonoides apresentam intensa absorção no UV-vis, exibindo duas bandas, a banda I (normalmente, 320-385 nm) referente à absorção do anel B e a banda II (normalmente, 250-285 nm) que corresponde a absorção do anel A. A subclasse dos flavonóis exibem duas bandas de maior absorção na região de 240-400 nm, referidas como banda I (normalmente de 352-385 nm) e banda II (normalmente em 240-280 nm). Vale ressaltar que grupos funcionais ligados à estrutura molecular dos flavonoides podem causar alterações na absorção do UV-vis. Dessa forma se torna importante adoção de métodos analíticos adicionais que possam melhor elucidar a estrutura variada desses metabólitos secundários (YAO et al., 2004). A B B A C 64 B Flavonol Flavanonas Chalconas Antocianidinas Flavonas Isoflavanonas Figura 12 - Estrutura química geral dos flavonoides. (A), estrutura química das principais subclasses dos flavonóis (B) (COOK e SAMMAN, 1996). 6.1.2 Análise da fração 46 por Espectrometria de Massas em Tandem com Ionização por Electrospray (ESI-MS/MS) (bomba de infusão direta) As Figuras 13 a 16 representam os espectros de fragmentação, por ESI-MS/MS, do íon m/z 299 sob diferentes energias de colisão (0, 10, 20 e 30 eV). 65 Intens. X 104 299.0623 4 3 2 1 200 400 600 800 1000 m/z Figura 13 - Espectro em ESI-MS/MS 0 eV do íon m/z 299 (bomba de infusão direta) da fração 46. Intens. X 104 299.0623 3,0 2,5 271.0681 2 1,5 165.0256 1 284.0386 0,5 240.0495 200 400 600 800 1000 m/z Figura 14 - Espectro em ESI-MS/MS 10 eV do íon m/z 299 (bomba de infusão direta) da fração 46. 66 Intens. X 104 271.0679 0,8 165.0258 0,6 284.0395 0,4 243.0742 256.0453 178.0339 0,2 212.0566 151.0112 100 125 150 175 200 299.0622 228.0510 225 250 275 300 325 m/z Figura 15 – Espectro em ESI-MS/MS 20 eV do íon m/z 299 (bomba de infusão direta) da fração 46. Intens. X 104 163.0102 0,4 256.0441 0,3 243.0739 271.0996 284.0402 228.0533 178.0337 0,2 151.0108 212.0578 0,1 200.0534 299.0816 100 125 150 175 200 225 250 275 300 325 m/z Figura 16 – Espectro em ESI-MS/MS 30 eV do íon m/z 299 (bomba de infusão direta) da fração 46. A partir da análise do perfil de fragmentação do íon m/z 299 [M-H] - sob diferentes energias de colisão (10, 20 e 30 eV) observa-se a presença dos fragmentos m/z 284 com redução de 15 u indicando a perda de uma metila [M-H-CH3] - e m/z 271 com redução de 28 u indicando a eliminação de CO [M-H-CO] -, fragmentos comumente encontrados na análise de flavonoides. Comparando o espectro em UV-vis obtido e os dados de massas com dados da literatura (SCIO et al., 2003, XU et al., 2006), propõe-se que o pico cromatográfico 67 com tempo de retenção de 17.4 min trata-se de um derivado O-metilado do flavonol Kaempferol, a 3,4',5-trihidroxi-7-metoxiflavona ou Rhamnocitrina (CAS n. 569-92-6), cuja estrutura química está representada a seguir (Figura 17): Figura 17 - Estrutura química da 3,4',5-trihidroxi-7-metoxiflavona ou Rhamnocitrina As Figuras 18 a 21 representam os espectros de fragmentação, por ESI-MS/MS, do íon 315 m/z sob diferentes energias de colisão (0, 10, 20 e 30 eV). Intens. 315.1538 1250 1000 750 500 250 767.3306 200 400 600 800 1000 m/z Figura 18 – Espectro em ESI-MS/MS 0 eV do íon m/z 315 (bomba de infusão direta) da fração 46. 68 Intens. 315.1538 3000 165.0233 2500 2000 1500 1000 192.0206 300.0316 500 767.3306 287.0687 256.0490 200 400 600 800 1000 m/z Figura 19 – Espectro em ESI-MS/MS 10 eV do íon m/z 315 (bomba de infusão direta) da fração 46. Intens. 165.0260 1500 1000 300.0696 500 766.5009 200 400 600 800 1000 m/z Figura 20 – Espectro em ESI-MS/MS 20 eV do íon m/z 315 (bomba de infusão direta) da fração 46. 69 Intens. 1200 165.0259 1000 800 600 400 300.0326 271.0326 200 200 767.3322 400 600 800 1000 m/z Figura 21 – Espectro em ESI-MS/MS 30 eV do íon m/z 315 (bomba de infusão direta) da fração 46. A partir da análise do perfil de fragmentação do íon m/z 315 [M-H] - em diferentes energias de colisão (10, 20 e 30 eV) observa-se a presença do fragmento m/z 300 com a eliminação de 15 u indicando a perda de uma metila [M-H-CH3] -, tal perfil é comumente encontrado na análise de flavonoides metilados derivados da quercetina. Comparando o espectro em UV-vis e os dados de massas obtidos em nosso estudo com aqueles depositados na literatura (KRENN et al., 2003 e PELLATI et al., 2011), propõe-se que o pico cromatográfico com tempo de retenção de 14.9 min trata-se de um derivado metilado do flavonol quercetina, a 3,3',4',5-tetrahidroxi-7-metoxiflavona ou 7-metil-quercetina (CAS n. 90-19-7), cuja estrutura química está representada a seguir (Figura 22): Figura 22 - Estrutura química da 7-O-metil-quercetina 70 6.2 Análise biológica do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 6.2.1 Leucograma dos voluntários da pesquisa Os valores médios dos parâmetros avaliados no leucograma dos doadores da amostra biológica estão listados na Tabela 4. Os resultados indicam que os parâmetros avaliados encontram-se dentro do intervalo de normalidade para indivíduos adultos. Tabela 4 – Média dos parâmetros avaliados nos leucogramas dos doadores da amostra biológica. Série Branca Valores dos Voluntários média ± desvio padrão Valores de referência* Leucócitos 5,5 ± 1,3 x 103 /mm3 3,5 – 11 x 103/ mm3 Neutrófilos 57,9 ± 4,9 40-70% Bastonetes 1,0 ± 0,7 0-5% Eosinófilos 3,0 ± 2,5 0-8% Linfócitos 36,6 ± 4,8 20-50% Basófilos 0,0 ± 0 0-3% Monócitos 2,5 ± 0,5 2-20% *: Valores de referência de acordo com Xavier et al., (2010) 6.2.2 Avaliação do efeito citotóxico do DMSO O DMSO [(CH3)2SO] é um composto orgânico, límpido, semi-oleoso, sem cheiro quando puro, altamente higroscópico que deriva da lignina, substância que dá rigidez às células vegetais. Este solvente possui um domínio altamente polar, caracterizado pelo grupo sulfinilo, e dois grupos metil apolares, o que confere a molécula características anfipáticas (CORNELL, 1986 MANJUNATH e SHIVAPRAKASH, 2013). Assim, o DMSO possui a capacidade de solubilizar substâncias polares e apolares e transpor barreiras hidrofóbicas, como a membrana plasmática. Tais características torna esse solvente útil na solubilização de drogas de aplicações terapêuticas, na criopreservação celular e na incorporação de componentes pouco solúveis em meios aquosos para ensaios biológicos in vitro (SANTOS et al, 2003; ABBRUZZESE et al., 2013). 71 Em virtude do DMSO ter sido o solvente de escolha para solubilização do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46, realizamos, primeiramente, experimentos visando determinar qual seria a concentração máxima (% v/v) possível para utilizarmos em culturas celulares, sem comprometimento da viabilidade das células. Para isso, PBMC foram incubadas por 8, 24 ou 120 horas, na presença de diferentes concentrações de DMSO, seguidas de análise de viabilidade pelo método de exclusão com azul de tripan (Figura 23). Os resultados indicaram que, após 8 h, a porcentual de células viáveis foi significativamente menor nas culturas tratadas com DMSO a 20% (v/v) quando comparado à cultura controle. Após 24 horas, houve redução da viabilidade em culturas tratadas com DMSO a 10% e 20% quando comparado às culturas não tratadas. Após 120 h, o DMSO reduziu a viabilidade das PBMC nas concentrações de 5 %, 10% e 20 % quando comparado à cultura controle. Figura 23 - Efeito do DMSO sobre a viabilidade celular em diferentes tempos de incubação. Porcentagem de PBMC (n=6) viáveis nas culturas celulares não tratadas com DMSO (controle) ou tratadas com o solvente nas concentrações de 1; 2,5; 5; 10 e 20% v/v. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. “a”, “b” e “c”: diferença estatisticamente significativa (p ≤ 0,05) em relação à cultura não tratada com DMSO nos tempos de incubações de 8, 24 e 120 horas, respectivamente. Teste estatístico utilizado nessa análise foi ANOVA seguida de Tukey. 72 Em concentrações iguais ou inferiores a 2,5 % (v/v), o DMSO não apresentou toxicidade às PBMC em nenhum dos tempos avaliados. Portanto, em ensaios in vitro para a análise da atividade do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 diluídos em DMSO, foram conduzidos de forma que a concentração deste solvente não ultrapassasse 2,5 %. 6.2.3 Análise da emissão de fluorescência do DMSO A Figura 24 ilustra a avaliação da emissão de fluorescência de células não tratadas (controle) e tratadas com DMSO à 0,5, 1 ou 2% (v/v), por 120 horas. Não houve deslocamento do pico de fluorescência para a direita em relação à cultura controle, em nenhum dos oito canais do citômetro BD FACSCanto II ™, viabilizando, portanto, a utilização de qualquer marcador fluorescente nessas condições, sem o comprometimento nas análises de proliferação de células tratadas com DMSO. Figura 24 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com DMSO e incubadas por 120 horas. Os histogramas acima representam as intensidades de fluorescência de PBMC captada nos oito canais do citômetro de fluxo BD FACSCanto II. Culturas celulares na ausência (CONT) ou na presença de DMSO nas concentrações de 0,5; 1 e 2% v/v permaneceram incubadas por 120 horas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. A Figura 25 ilustra a avaliação da emissão de fluorescência de células não tratadas (controle) e tratadas com DMSO a 1; 2,5; 5 e 10% v/v, por 8 horas. Não houve deslocamento 73 do pico de fluorescência nas culturas experimentais em relação aos picos da cultura controle, viabilizando, portanto, a utilização de qualquer marcador fluorescente nessas condições, sem o comprometimento na análise de produção de citocinas por células tratadas com DMSO. Figura 25 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com DMSO e incubadas por 8 horas. Os histogramas acima representam as intensidades de fluorescência de PBMC captada nos oito canais do citômetro de fluxo BD FACSCanto II. Culturas celulares na ausência (CONT) ou na presença de DMSO nas concentrações de 1; 2,5; 5 e 10% v/v permaneceram incubadas por 8 horas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. 6.2.4 Análise do efeito anti-proliferativo do solvente DMSO Visando avaliar o efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre a proliferação de linfócitos estimulados com PHA, inicialmente foi determinada a concentração máxima (% v/v) do solvente que poderia ser utilizada nas culturas celulares sem interferência na resposta proliferativa dessas células. Para isso, foi calculado o índice de proliferação (IP) da cultura estimulada com PHA e o valor obtido foi considerado como sendo 100% de proliferação. O índice de proliferação das demais culturas foi expresso em percentual tendo como referência a cultura estimulada com PHA, obtendo-se dessa forma o índice de proliferação relativo, como segue: (1) 74 sendo, IP(DMSO): índice de proliferação das culturas celulares estimuladas com o mitógeno PHA e tratadas DMSO e IP(PHA): índice de proliferação da cultura celular tratada apenas com PHA. De acordo com os resultados (Figura 26), o solvente DMSO, nas concentrações de 1 e 2% v/v reduziu o índice de proliferação relativo de linfócitos em comparação à cultura controle positivo (100 %). A mesma redução foi observada na cultura controle de inibição, tratada com ciclosporina (CsA). O DMSO não alterou o índice de proliferação relativo de linfócitos na concentração de 0,5% v/v quando comparado a cultura controle. Figura 26 – Efeito do DMSO sobre a proliferação de linfócitos. Índice de proliferação relativo de linfócitos (n=6) estimulados com PHA e tratados com DMSO nas concentrações de 0,5; 1 e 2% v/v ou com ciclosporina (CsA) na concentração de 5 µg/mL. Os resultados foram expressos em porcentagem média ± desvio padrão. a: diferença estatística em relação à cultura estimulada com PHA isoladamente (correspondente á 100% do índice de proliferação). Teste estatístico utilizado, Kruskal-Wallis com post hoc de Dunns. 6.2.5 Análise da inibição da produção de citocinas pelo DMSO sobre linfócitos humanos Foi determinada a concentração de DMSO (% v/v) que poderia ser utilizada nas culturas celulares, de forma que o solvente, por si só, não pudesse alterar a produção de 75 citocinas em linfócitos tratados com o extrato etanólico de A. fastigiatum e a fração 46. Como critério de comparação entre os grupos foi considerada como 100%, a produção de citocinas na cultura controle de estimulação, contendo apenas o PMA. Para as culturas experimentais foi calculada o percentual relativo (PR) de células positivas para as citocinas nas culturas contendo DMSO, tendo como referência a cultura estimula com PMA, como segue: (1) O solvente DMSO nas concentrações de 5% e 10% v/v reduziu a porcentagem de linfócitos totais, células CD4+ e CD8+ produtores de IFN-γ (Figura 27), TNF-α (Figura 28) e IL-2 (Figura 29). Na concentração de 2,5% v/v foi observado ainda uma redução significativa de linfócitos totais, células CD4+ e CD8+ positivos para a citocina IL-2. A redução da produção das três citocinas avaliadas, também foi observada para cultura controle de inibição contendo ciclosporina (CsA). Vale ressaltar que na concentração de 1% v/v, o DMSO não alterou o perfil de produção das citocinas avaliadas neste ensaio. 76 A Linfócitos totais 120 100 80 a 60 a 40 a % relativa de células IFN-γ + 20 0 B Linfócitos CD4+ 120 100 80 a a 60 40 a 20 0 C Linfócitos CD8 + 120 100 a 80 60 a 40 a 20 0 PBMC (1x106) PMA (25ng/mL) DMSO (% v/v) CsA (5μg/mL) + + + - + - + + 1 - + + 2,5 - + + 5 - + + 10 - + + + Figura 27 - Efeito do solvente DMSO sobre a produção de IFN-γ em populações linfocitárias. Análise da porcentagem relativa de linfócitos totais (A), CD4+ (B) e CD8+ (C) positivos para as citocinas IFN-γ em culturas celulares (n = 6) não estimuladas e não tratadas (Controle), estimuladas com PMA nas últimas 4 horas em um total de 8 horas de tratamento com DMSO à 1;2,5; 5 ou 10% v/v ou com ciclosporina (CsA) à 5 µg/mL. a: diferença estatística significativa, para p ≤ 0,05, em relação a cultura tratada apenas com PMA (100% de estímulo). Teste estatístico utilizado, ANOVA seguida de Tukey. 77 A Linfócitos totais 120 100 *a 80 60 40 a * % relativa de células TNF-α + 20 a* 0 B Linfócitos CD4+ 120 100 a * 80 60 a 40 * * a 20 0 C Linfócitos CD8 + 120 100 80 a 60 40 a 20 a 0 PBMC (1x106) PMA (25ng/mL) DMSO (% v/v) CsA (5μg/mL) + - + + - - - + + 1 - + + 2,5 - + + 5 - + + 10 - + + + Figura 28 - Efeito do solvente DMSO sobre a produção de TNF-α em populações linfocitárias. Análise da porcentagem relativa de linfócitos totais (A), CD4+ (B) e CD8+ (C) positivos para as citocinas TNF-α em culturas celulares (n = 6) não estimuladas e não tratadas (Controle), estimuladas com PMA nas últimas 4 horas em um total de 8 horas de tratamento com DMSO à 1;2,5; 5 ou 10% v/v ou com ciclosporina (CsA) à 5 µg/mL. a: diferença estatística significativa, para p ≤ 0,05, em relação a cultura tratada apenas com PMA (100% de estímulo). Teste estatístico utilizado, ANOVA seguida de Tukey. 78 A Linfócitos totais 100 80 a 60 40 a % relativa de células IL-2 + 20 a a a a 0 B Linfócitos CD4+ 100 80 a * 60 40 *a * 20 * 0 C Linfócitos CD8 + 100 80 a 60 40 a a a + + 5 - + + 10 - + + + 20 0 PBMC (1x106) PMA (25ng/mL) DMSO (% v/v) CsA (5μg/mL) + - + + - - - + + 1 - + + 2,5 - Figura 29 - Efeito do solvente DMSO sobre a produção de IL-2 em populações linfocitárias. Análise da porcentagem relativa de linfócitos totais (A), CD4+ (B) e CD8+ (C) positivos para as citocinas IL-2 em culturas celulares (n = 6) não estimuladas e não tratadas (Controle), estimuladas com PMA nas últimas 4 horas em um total de 8 horas de tratamento com DMSO à 1;2,5; 5 ou 10% v/v ou com ciclosporina (CsA) à 5 µg/mL. a: diferença estatística significativa, para p ≤ 0,05, em relação a cultura tratada apenas com PMA (100% de estímulo). Teste estatístico utilizado, ANOVA seguida de Tukey. 6.2.6 Avaliação do feito citotóxico do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 A fim de encontrar as concentrações não tóxicas do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) e da fração 46, foram avaliados a porcentagem de células viáveis após 8, 79 24 ou 120 horas de tratamento. Os resultados estão representados na Figura 30 e 31. Vale ressaltar que nesse ensaio todas as culturas celulares receberam extrato ETAF ou a fração 46, solubilizados em DMSO, cuja concentração final do solvente nas culturas foi de 1% v/v. Os resultados apontaram que nenhuma concentração do extrato ETAF comprometeu a viabilidade celular após 8 h de incubação quando comparado à cultura controle tratada apenas com DMSO a 1% v/v. Após 24 horas, houve redução da viabilidade em culturas tratadas com extrato ETAF 75 μg/mL quando comparado à cultura controle. Após 120 h, o extrato ETAF reduziu a viabilidade das PBMC nas concentrações de 25 μg/mL, 50 μg/mL e 75 μg/mL quando comparado à cultura controle. 100 8h a Células viáveis (%) 80 24h b 120 h 60 b 40 b 20 PBMC (5x105) + DMSO (1% v/v) + - - - - - ETAF (μg/mL) - 6,25 12,5 25 50 75 + + + + + Figura 30 - Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a viabilidade celular em diferentes tempos de incubação. Porcentagem de PBMC (n=6) viáveis nas culturas celulares tratadas apenas com DMSO a 1% v/v (controle) ou com extrato ETAF nas concentrações de 6,25; 12,5; 25; 50 e 75 μg/mL. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. “a” e “b”: diferença estatisticamente significativa (p ≤ 0,05) em relação à cultura não tratada com o extrato ETAF nos tempos de incubações de 24 e 120 horas, respectivamente. Teste estatístico utilizado nessa análise ANOVA seguida de Tukey. A Figura 31 ilustra a análise da viabilidade de PBMC incubadas por 8, 24 ou 120 horas frente a diferentes concentrações da fração 46. Os resultados indicam que em todos os tempos avaliados não foi observada redução da viabilidade celular em nenhuma das concentrações utilizadas, quando comparado às culturas controles. 80 100 8h 24h Células viáveis (%) 80 120 h 60 40 20 0 PBMC (5x105) + + + + + DMSO (1% v/v) + - - - - Fração 46 (μg/mL) - 1,25 2,5 5 10 Figura 31 - Efeito da fração 46 sobre a viabilidade celular em diferentes tempos de incubação. Porcentagem de PBMC (n=6) viáveis nas culturas celulares tratadas apenas com DMSO a 1% v/v (controle) ou com a fração 46 nas concentrações de 1,25; 2,5; 5 e 10 μg/mL. Os resultados foram expressos como média ± desvio padrão. Teste estatístico utilizado, Kruskal-Wallis com post hoc de Dunns. 6.2.7 Análise da emissão de fluorescência pelo extrato etanólico de A. fastigiatum e fração 46 A Figura 32 ilustra a avaliação da emissão de fluorescência de células tratadas com DMSO a 0,5% v/v (CONT) ou tratadas com extrato ETAF nas concentrações de 3,125; 6,25 e 12,5μg/mL, por 120 horas. Houve deslocamento do pico de fluorescência para a direita em relação à cultura controle no canal que corresponde aos fluorocromos PerCP Cy5.5 e PerCP (Band Pass-BP filter: 670 nm) do laser azul (488 nm). O extrato ETAF, nesse mesmo tempo de incubação, induziu o deslocamento do pico de fluorescência para direita em relação à cultura controle no canal que corresponde aos fluorocromos AmCyan (BP filter 510/50 nm) e Pacific blue TM (BP filter 450/50nm), ambos do laser violeta (405) (Figura 32). Nesses dois últimos canais foi observado o aumento do deslocamento do pico de fluorescência na medida em que aumentou a concentração do extrato ETAF. 81 Figura 32 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com extrato etanólico de A. fastigiatum. Os histogramas acima representam as intensidades de fluorescência de PBMC captada nos oito canais do citômetro de fluxo BD FACSCanto II. Culturas celulares na presença de DMSO à 0,5% (CONT) ou do extrato nas concentrações de 3,125; 6,25 e 12,5 permaneceram incubadas por 120 horas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. A Figura 33 ilustra a avaliação da emissão de fluorescência de células tratadas com DMSO a 0,5% v/v (CONT) ou tratadas com a fração 46 a 1,5; 2,5; 5 μg/mL, por 120 horas. Observamos deslocamento do pico de fluorescência para a direita em relação à cultura controle no canal que corresponde aos fluorocromos fluorocromo APC (BP filter 660/20 nm) do laser vermelho (633 nm) (Figura 33). 82 Figura 33 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com a fração 46 e incubadas por 120 horas. Os histogramas acima representam as intensidades de fluorescência de PBMC captada nos oito canais do citômetro de fluxo BD FACSCanto II. Culturas celulares na presença de DMSO a 0,5% (CONT) ou da fração 46 nas concentrações de 1,25; 2,5 e 5μg/ permaneceram incubadas por 120 (B) horas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. Não houve deslocamento do pico de fluorescência para a direita em relação a cultura controle no canal correspondente ao fluorocromo FITC (BP filter 530/30 nm) do laser azul (488 nm), canal que também capta a fluorescência emitida pelo CFSE, portanto, a análise da proliferação de células tratadas com o extrato ETAF e a fração 46 não foi prejudicada. A Figura 34 ilustra a avaliação da emissão de fluorescência de células tratadas com DMSO a 0,5% v/v, controle, ou tratadas com extrato ETAF nas concentrações de 12,5; 25; 50 e 75 μg/mL, por 8 horas. A Figura 35 ilustra a avaliação da emissão de fluorescência de células tratadas com DMSO a 0,5% v/v, controle, ou tratadas com a fração 46 a 2,5; 5 e 10 μg/mL também por 8 horas. Não houve deslocamento do pico de fluorescência nas culturas experimentais em relação aos picos da cultura controle, viabilizando a utilização de qualquer marcador fluorescente, nessas condições, sem o comprometimento na análise de produção de citocinas por células tratadas com o extrato ETAF ou a fração 46. 83 Figura 34 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com extrato etanólico de A. fastigiatum e incubadas por 8 horas. Os histogramas acima representam as intensidades de fluorescência de PBMC captada nos oito canais do citômetro de fluxo BD FACSCanto II. Culturas celulares na presença de DMSO à 0,5% (CONT) ou do extrato nas concentrações de 12,5; 25; 50 e 75μg/mL permaneceram incubadas por 8 horas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. Figura 35 – Análise da emissão de fluorescência de células tratadas com a fração 46 e incubadas por 8 horas. Os histogramas acima representam as intensidades de fluorescência de PBMC captada nos oito canais do citômetro de fluxo BD FACSCanto II. Culturas celulares 84 na presença de DMSO a 0,5% (CONT) ou da fração 46 nas concentrações de 2,5; 5 e 10μg/ permaneceram incubadas por 8 horas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. 6.2.8 Análise do efeito anti-proliferativo do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 Diante dos resultados sobre a proliferação de linfócitos frente a diferentes concentrações de DMSO, foi adotado nesse ensaio, a utilização do solvente como veículo para solubilização do extrato ETAF e da fração 46, na concentração de 0,5% v/v na cultura final. Para avaliar o efeito do extrato ETAF e da fração 46 sobre a proliferação de linfócitos estimulados com PHA, foi calculado o índice de proliferação (IP) relativo à cultura estimulada com o mitógeno PHA na presença de DMSO a 0,5% v/v, como segue: (2) sendo, IP(cultura experimental) : índice de proliferação das culturas celulares estimuladas com PHA mitógeno e tratadas com diferentes concentrações do extrato ETAF ou da fração 46 e IP (DMSO) : índice de proliferação da cultura celular na presença de PHA e DMSO a 0,5% v/v. Os resultados indicaram (Figura 36) que o extrato ETAF nas concentrações de 6,25 e 12,5 μg/mL reduziram o índice de proliferação relativo de linfócitos quando comparado à cultura controle, contendo PHA juntamente com DMSO a 0,5% v/v (100 %). A redução do índice de proliferação relativo também foi observado para cultura controle de inibição, tratada com ciclosporina (CsA). A cultura contendo o extrato ETAF na concentração de 3,125 μg/mL e a fração 46 nas três concentrações testadas não reduziu significativamente o índice de proliferação pelo mesmo critério de comparação (Figura 37). 85 Índice de proliferação relativo (%) 100 80 60 a 40 a 20 a 0 PBMC (5x105) PHA (1μg/mL) DMSO (0,5%) ETAF (μg/mL) CsA ( 5μg/mL) + - + + + - + + 3,125 - + + 6,25 - + + 12,5 - + + + Figura 36 – Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a proliferação de linfócitos. Índice de proliferação relativo de linfócitos (n=6) estimulados com PHA e tratados com extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) nas concentrações de 3,125; 6,25; 12,5 μg/mL ou com ciclosporina (CsA) na concentração de 5 µg/mL. Os resultados foram expressos em porcentagem média ± desvio padrão. a: diferença estatística em relação à cultura controle contendo PHA e DMSO a 0,5% v/v (correspondente á 100% do índice de proliferação). Teste estatístico utilizado, ANOVA seguida de Tukey. 86 Índice de proliferação relativo (%) 100 80 60 40 20 a 0 (5x105) PBMC PHA (1μg/mL) DMSO (0,5%) Fração 46 (μg/mL) CsA ( 5μg/mL) + - + + + - + + 1, 25 - + + 2, 5 - + + 5,0 - + + + Figura 37 – Efeito da fração 46 sobre a proliferação de linfócitos. Índice de proliferação relativo de linfócitos (n=6) estimulados com PHA e tratados com a fração nas concentrações de 1,25; 2,5 e 5 μg/mL ou com ciclosporina (CsA) na concentração de 5 µg/mL. Os resultados foram expressos em porcentagem média ± desvio padrão. a: diferença estatística em relação a cultura controle contendo PHA e DMSO a 0,5% v/v (correspondente á 100% do índice de proliferação). Teste estatístico utilizado, ANOVA seguida de Tukey. 6.2.9 Análise da inibição da produção de citocinas pelo extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 sobre linfócitos humanos Em virtude dos resultados obtidos na análise de citocinas em populações de linfócitos estimulados e tratados com diferentes concentrações de DMSO, foi adotada nesse ensaio, a utilização do solvente como veículo para solubilização do extrato ETAF e da fração 46 na concentração de 1% v/v na cultura final. Para determinar o efeito do extrato ETAF e da fração 46 sobre a produção de citocinas em linfócitos estimulados com PMA, como critério de comparação entre os grupos, foi considerada, como 100%, a produção de citocinas na cultura estimulada e na presença de DMSO na concentração de 1% v/v. Para as culturas experimentais foi calculada a porcentagem relativa (PR) de células positivas para as citocinas nas culturas extrato ETAF ou a fração 46, tendo como referência a cultura estimulada com PMA, como segue: 87 Como resultado, foi observado que o extrato ETAF na concentração de 50 e 75μg/mL reduziu significativamente a porcentagem de células CD8+ produtoras de TNF-α (Figura 39C) e IL-2 (Figura 40C), quando comparado às culturas controle. Foi observado ainda que, na concentração de 75 μg/mL o extrato ETAF reduziu a porcentagem de linfócitos totais positivos para a citocina IL-2 (Figura 40A). O extrato ETAF não foi capaz de reduzir a produção de IFN-γ em nenhuma população celular avaliada (Figura 38). Em todas as culturas celulares tratadas com ciclosporina, controle de inibição, houve redução significativa na produção das três citocinas avaliadas em todas as populações celulares (Figuras 38, 39 e 40). 88 A Linfócitos totais 120 100 80 60 a a 40 % relativa de células IFN-γ + 20 0 B Linfócitos CD4 + 120 100 80 60 aa 40 20 0 C Linfócitos CD8 + 120 100 80 60 a 40 a 20 0 PBMC (1x106) PMA (25ng/mL) DMSO(% v/v) ETAF (µg/mL) CsA (5μg/mL) + - + + 1 - - - + + + + + + + + 12,5 - 25 - 50 - 75 - + + + Figura 38 - Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a produção de IFN-γ em populações linfocitárias. Análise da porcentagem relativa de linfócitos totais (A), CD4+ (B) e CD8+ (C) positivos para as citocinas IFN-γ em culturas celulares (n = 6) não estimuladas e não tratada (Controle), estimuladas com PMA nas últimas 4 horas em um total de 8 horas de tratamento com DMSO a 1% v/v, ciclosporina (CsA) a 5 µg/mL ou extrato ETAF nas de concentrações de 12,5; 25; 50 ou 75μg/mL. a: diferença estatística significativa, para p ≤ 0,05, em relação a cultura estimulada com PMA e tratadas com DMSO a 1% (100% de estímulo). Teste estatístico utilizado, ANOVA seguida de Tukey ou Kruskall-Wallis seguido de Dunns. 89 A Linfócitos totais 100 80 60 40 % relativa de células TNF-α + 20 a a 0 B Linfócitos CD4 + 100 80 60 40 20 a a 0 C Linfócitos CD8 + 100 80 a a aa 60 40 20 aa 0 PBMC (1x106) PMA (25ng/mL) DMSO(% v/v) ETAF (µg/mL) CsA (5μg/mL) + - + + 1 - + + + + + + + + + + 12,5 - 25 - 50 - 75 - + Figura 39 - Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a produção de TNF-α em populações linfocitárias. Análise da porcentagem relativa de linfócitos totais (A), CD4+ (B) e CD8+ (C) positivos para as citocinas TNF-α em culturas celulares (n = 6) não estimuladas e não tratada (Controle), estimuladas com PMA nas últimas 4 horas em um total de 8 horas de tratamento com DMSO a 1% v/v, ciclosporina (CsA) a 5 µg/mL ou extrato ETAF nas de concentrações de 12,5; 25; 50 ou 75μg/mL. a: diferença estatística significativa, para p ≤ 0,05, em relação a cultura estimulada com PMA e tratadas com DMSO a 1% (100% de estímulo). Teste estatístico utilizado, ANOVA seguida de Tukey ou Kruskall-Wallis seguido de Dunns. 90 A Linfócitos totais 100 80 aa 60 40 % relativa de células IL-2 + 20 a a 0 B Linfócitos CD4 + 100 a a 80 60 40 20 a a 0 C Linfócitos CD8 + 100 a 80 a a 60 a a 40 20 a a 0 (1x106) PBMC PMA (25ng/mL) DMSO(% v/v) ETAF (µg/mL) CsA (5μg/mL) + - + + 1 - + + + + + + + + + + 12,5 - 25 - 50 - 75 - + Figura 40 - Efeito do extrato etanólico de A. fastigiatum (ETAF) sobre a produção de IL2 em populações linfocitárias. Análise da porcentagem relativa de linfócitos totais (A), CD4+ (B) e CD8+ (C) positivos para as citocinas IL-2 em culturas celulares (n = 6) não estimuladas e não tratada (Controle), estimuladas com PMA nas últimas 4 horas em um total de 8 horas de tratamento com DMSO a 1% v/v, ciclosporina (CsA) a 5 µg/mL ou extrato ETAF nas de concentrações de 12,5; 25; 50 ou 75μg/mL. a: diferença estatística significativa, para p ≤ 0,05, em relação a cultura estimulada com PMA e tratadas com DMSO a 1% (100% de estímulo). Teste estatístico utilizado, ANOVA seguida de Tukey ou Kruskall-Wallis seguido de Dunns. 91 Na avaliação da atividade da fração 46 sobre o perfil de produção de citocinas, foi observado que nenhuma concentração utilizada foi capaz de alterar o perfil de produção de citocinas nas populações de linfócitos avaliadas nesse estudo, conforme mostrado na Tabela 5, a seguir. Tabela 5 - Porcentagem média relativa de populações de linfócitos positivos para as citocinas IFN-γ, TNF-α e IL-2, tratados com a fração 46. Citocinas Porcentagem média relativa de linfócitos totais Porcentagem média relativa de linfócitos CD4+ Porcentagem média relativa de linfócitos CD8+ Culturas IFN-γ TNF-α IL-2 Controle 5,41 ± 8,27 0,21 ± 0,12 0,49 ± 0,24 DMSO 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 Fração 2,5μg/mL 109,0 ± 14,45 99,60 ± 0,40 100,8 ± 6,05 Fração 5μg/mL 95,76 ± 6,10 97,40 ± 2,45 104,5± 6,51 Fração 10μg/mL 92,65 ± 12,22 94,95 ± 7,64 92,56 ± 11,90 CsA 29,81 ± 9,66* 0,99 ± 0,53* 2,22 ± 1,64* Controle 0,2900 ± 0,1652 0,1117 ± 0,1295 0,23 ± 1,34 DMSO 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 Fração 2,5μg/mL 87,55 ± 40,67 97,21 ± 1,860 76,21± 103,4 Fração 5μg/mL 83,74 ± 23,92 93,11 ± 6,034 79,37± 103,2 Fração 10μg/mL 88,03 ± 23,66 93,00 ± 2,159 71,75 ± 106,7 CsA 48,24 ± 25,84* 1,214 ± 0,75* 1,13 ± 8,05* Controle 0,59 ± 0,85 0,36 ± 0,46 0,79 ± 0,35 DMSO 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 100,0 ± 0,0 Fração 2,5μg/mL 116,8 ± 22,33 100,5 ± 1,10 94,70 ± 5,53 Fração 5μg/mL 98,16 ± 12,72 90,86 ± 8,36 103,7 ± 14,49 Fração 10μg/mL 84,29 ± 30,48 84,17 ± 27,03 90,93 ± 10,19 CsA 24,80 ± 10,02* 1,21 ± 1,22* 1,41 ± 0,69* Resultados expressos em porcentagem média ± desvio padrão. *: diferença estatística significativa, para p ≤ 0,05, em relação à cultura estimulada com PMA e tratada com DMSO a 1% v/v (100% de estímulo). Teste estatístico utilizado, ANOVA seguida de Tukey ou Kruskall-Wallis seguido de Dunns. 92 93 7 DISCUSSÃO A discussão dos resultados será abordada em dois tópicos, sendo o primeiro contendo resultados referentes aos ensaios biológicos conduzidos com o solvente DMSO e o seguinte, resultados obtidos em ensaios fitoquímicos e biológicos conduzidos com o extrato etanólico de A. fastigiatum e a fração 46 identificada. 7.1 Ensaios biológicos conduzidos com o solvente DMSO Previamente às análises da atividade anti-inflamatória do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46, realizamos o ensaio de citotoxicidade do DMSO, veículo de escolha para solubilização e incorporação desses componentes em culturas de PBMC. Constatamos que o DMSO na concentração utilizada igual ou superior a 5% v/v reduziu a viabilidade de PBMC incubadas por 120 horas, em 24 horas o solvente foi tóxico na concentração igual ou superior a 10% v/v, já em 8 horas de incubação, o solvente causou citotoxicidade apenas na concentração mais alta testada, a 20% v/v. O mecanismo molecular básico sugerido por Notman e colaboradores (2006) que justifique o efeito citotóxico de DMSO, quando utilizado em altas concentrações (superiores a 10% v/v), é atribuído a alterações nas propriedades físicas na membrana fosfolipídica. Tendo em vista sua característica anfipática, o solvente interage inespecificamente com a membrana favorecendo a formação de poros que contribuem para perda da seletividade e aumento da permeabilidade celular (NOTMAN et al., 2006). Um estudo mostrou que na presença de 30% v/v de DMSO foram observadas severas alterações estruturais em fibroblastos, com formação de vesículas na membrana plasmática, as quais resultaram na dissociação entre a membrana e o citoesqueleto (MÉNORVAL et al., 2012). Estudos conduzidos com diferentes linhagens celulares demonstraram que em procedimento de criopreservação, fibroblastos foram mais sensíveis à presença de DMSO que células-tronco mesenquimais, já que, ao contrário das primeiras que tiveram percentual significativo de células viáveis em concentração igual ou inferior a 0,5% v/v, as células mesenquimais foram criopreservadas com até 5% de DMSO sem que houvesse redução da viabilidade celular (OCK et al., 2011; CHEN et al., 2013). Relatos que descrevem a toxicidade do DMSO, em diferentes concentrações, sobre células mononucleares do sangue periférico (PBMC) humano ainda permanecem limitados na literatura científica (KLOVERPRIS et al., 2010). Alguns estudos que mais se assemelham ao trabalho aqui descrito descrevem a utilização de DMSO em culturas de PBMC 94 na concentração igual ou inferior a 10% v/v por uma hora, a 0,5% e 1% v/v por 24 horas e a 1% v/v por 120 horas, nessas condições, todos apontaram ausência de citotoxicidade do solvente (KLOVERPRIS et al., 2010; AVELAR-FREITAS et al., 2015; SANTOS et al., 2015). Fundamentados na literatura e nos achados deste trabalho, determinamos a concentração de DMSO a ser utilizada no ensaio de avaliação do efeito citotóxico do extrato etanólico de A. fastigiatum e dos flavonoides identificados na fração 46. Sendo assim, para todas as culturas celulares a concentração final do solvente utilizada foi de 1% v/v. Embora o DMSO apresente baixa toxicidade, estudos têm revelado que em determinadas concentrações, o solvente mesmo não causando redução da viabilidade em ensaios in vitro (KLOVERPRIS et al., 2010; OCK et al., 2011; CHEN et al., 2013), pode provocar estresse celular, interferindo em mecanismos de ativação das células (FLORÃO et al., 2007; KLOVERPRIS et al., 2010). Sendo assim, determinamos, dentre as concentrações não citotóxicas de DMSO em 120 horas de incubação (inferiores a 2,5% v/v), aquelas que não alterariam a proliferação de linfócitos, já para 8 horas de incubação determinamos dentre as concentrações não tóxicas (igual ou inferior a 10% v/v), aquelas que não interfeririam no perfil de produção de citocinas pró-inflamatórias de linfócitos. Em culturas estimuladas com PHA, a presença de DMSO nas concentrações de 1 e 2% v/v reduziu consideravelmente o efeito proliferativo do mitógeno. Para a maior concentração, a atividade antiproliferativa do solvente representou cerca de 60% da atividade observada pelo fármaco ciclosporina. Corroborando com esses achados, trabalhos metodologicamente semelhantes a este atestaram o efeito do DMSO sobre a ativação de linfócitos. Florão e colaboradores (2007) observaram que o tratamento prévio e simultâneo com o solvente na concentração aproximada de 1 e 2% reduziu a proliferação de linfócitos humanos estimulados por PHA de forma dose-dependente. Utilizando a técnica de decaimento da fluorescência de CFSE, Kloverpris e colaboradores (2010) relataram que em longos períodos de exposição ao DMSO, nas concentrações entre 1 a 1,5%, a funcionalidade de células T foi comprometida. Nesse estudo foi constatado que a capacidade proliferativa de linfócitos T CD4+ e T CD8+ foi reduzida em 50% quando avaliadas após 7 dias sob estímulo de Enterotoxina Estafilocócica do tipo B (SEB). Por outro lado, Santos e colaboradores (2015) indicaram que a utilização simultânea de DMSO a 0,5% e PHA, não alterou o perfil de proliferação de linfócitos humanos totais, células CD4+ e CD8+. Existem evidências que relatam a redução do influxo do íon cálcio (Ca2+) em células de diferentes linhagens na presença de DMSO (CHOI et al., 1999; ZHANG; EYZAGUIRRE, 1999; SANTOS et al., 2003). Apoiados nessas evidências, juntamente aos nossos achados, é possível sugerir que a 95 interferência do DMSO, em determinadas concentrações, sobre a proliferação de linfócitos possa estar associada a alterações desse íon no citoplasma, haja vista que o Ca2+ funciona como importante mensageiro de iniciação de resposta celular a estímulos, de forma que pequeno incremento desse íon no citosol desempenha um importante sinal para iniciação de reações bioquímicas que desencadeiam na proliferação de linfócitos (LICHTMAN et al., 1980 e 1983; O'FLYNN et al., 1984) As citocinas importantes mediadores inflamatórios, responsáveis pela instauração, manutenção e resolução de reações inflamatórias (GIULIETTI, 2001; OPPENHEIM, 2001; BORIS; STEINKE, 2003; TURNER, 2014,), também foram alvo de investigação neste trabalho. As PBMC incubadas por 8 horas com diferentes concentrações de DMSO receberam nas últimas 4 horas o estímulo PMA, em seguida foram avaliadas quanto ao perfil de produção das citocinas pró-inflamatórias IFN-γ, TNF-α e IL-2. Observamos que o solvente nas concentrações de 5 e 10% v/v reduziu substancialmente todas as citocinas avaliadas, nas populações de linfócitos totais, células CD4+ e CD8+. Em especial na concentração de 10% v/v, o efeito de inibição sobre a produção de IFN-γ foi cerca de 5 vezes superior ao fármaco ciclosporina nas populações celulares avaliadas. Nessas mesmas populações, o DMSO em concentração igual ou superior a 2,5% v/v inibiu a produção de IL-2, sendo que a 10% v/v a redução de células positivas para essa citocina foi maior que aquela observada na cultura tratada com ciclosporina. Assim como encontrado nesse trabalho, Avelar-Freitas e colaboradores (2015) certificaram que concentração de até 1% v/v de DMSO não interferiu na produção de IFN-γ e TNF-α, quando avaliadas no citoplasma de linfócitos e neutrófilos humanos estimulados simultaneamente com PMA por 4 horas. Santos e colaboradores (2015) observaram que o DMSO até 0,5% v/v, incubado simultaneamente com PHA por 36 horas, não alterou a produção de IL-2 avaliada no sobrenadante de culturas de PBMC. Um aspecto importante a se destacar sobre o DMSO na supressão de citocinas pr´0-inflamatórias, é que o solvente pode ser capaz de promover a diferenciação e/ou ativação da função efetora de células T reguladoras (Treg : CD4+ CD25+ Foxp3+), células com participação decisiva na modulação da produção de citocinas. A atividade imunossupressora do DMSO foi constatada por Lin e colaboradores (2015), no qual, utilizando modelos in vivo e in vitro, determinaram que o tratamento com o solvente reduziu o percentual de linfócitos T produtores de IFN-γ e aumentou a porcentagem de células Treg. Apesar de não ter sido alvo de investigação no presente trabalho, essas células podem possuir papel importante na redução da síntese das citocinas pró-inflamatórias avaliadas, seja mediante contato célula-célula, reduzindo a coestimulação e a apresentação de antigênico ou através de mecanismos 96 dependentes de produção de fatores solúveis, tais como as citocinas IL-10,TGF-β e IL-37 e granzimas / perforinas que promovem, respectivamente, efeito supressor e apoptóticos sobre células T efetoras. Além do mais há trabalhos que descrevem a ação competitiva de células Treg por IL-2, tendo em vista que as mesmas expressam alta densidade de receptores de elevada afinidade (CD25+) para tal citocina em sua superfície (SHEVACH, 2009; BANCHEREAU et al., 2012; PETERSON, 2012; SHUAI et a., 2015). Em virtude da citotoxicidade e atividade imunomoduladora do DMSO observadas em determinadas concentrações, utilizamos quantidade do solvente em culturas celulares que não acarretaria comprometimento nos ensaios subsequentes. Neste contexto, de acordo com nossos resultados e evidências da literatura, determinamos que para avaliar o efeito antiinflamatório do extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 utilizaríamos DMSO a 1% v/v no ensaio de análise de produção de citocinas intracitoplasmáticas e a 0,5% v/v do solvente para culturas celulares submetidas à análise de proliferação celular. 7.2 Ensaios fitoquímicos e biológicos conduzidos com o extrato etanólico de A. fastigiatum e da fração 46 A planta A. fastigiatum, com uso bastante difundido na medicina popular do Vale do Jequitinhonha para o tratamento de quadros inflamatórios tem sido alvo de estudos fitoquímicos e bioprospecção para análise de seu efeito anti-inflamatório in vitro (AVELARFREITAS et al., 2013a; 2013b; 2015). Neste trabalho, com intuito de dar prosseguimento à investigação sobre a atividade biológica da planta foi realizado o fracionamento do extrato etanólico, dentre as frações obtidas uma delas foi escolhida por dois motivos: i) por apresentar perfil fitoquímico em cromatografia em camada delgada menos complexo, fato esse que favoreceria a identificação dos componentes majoritários na fração 46 por técnicas espectrométricas e ii) por apresentar características indicativas de flavonoides em sua constituição química, uma classe de metabólitos secundários com propriedades antiinflamatória e antioxidante já bastante conhecidas (KIM et al., 2004; FUNAKOSHI-TAGO et al., 2011; GONZÁLEZ et al., 2011; YE et al, 2012; DEVI et al., 2015; LI et al., 2016). Nesse contexto pressupomos que a atividade biológica atribuída à planta poderia esta associada à presença dos flavonoides no vegetal. Inicialmente foram identificados os constituintes químicos predominantes na fração 46, sendo que, para tal, utilizamos técnicas analíticas com alto grau de seletividade e sensibilidade empregando métodos instrumentais acoplados de separação, nesse caso a 97 cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e ao de detecção, a espectrometria de massas (MS) (PATEL, 2010). Os cromatogramas gerados pela CLAE-DAD-MS permitiu detectar a presença de flavonoides pertencentes à subclasse dos flavonóis na fração 46 do extrato etanólico de A. fastigiatum. Em virtude dos flavonoides sofrerem variações estruturais de acordo com grupo químico ligado à molécula, como por exemplo hidroxilas, oxigênio, grupos metil e hidratos de carbono (D- glicose, L-raminose, galactose e arabinose) a técnica de espectrometria de massas em tandem com Ionização por electrospray (ESI-MS/MS) foi utilizada como ferramenta adicional para elucidação das estruturas químicas majoritárias no extrato. Como resultado foram identificados dois derivados da subclasse dos flavonóis, o 3,4',5-trihidroxi-7-metoxiflavona, um derivado O-metilado do kaempferol, também conhecido por Rhaminocitrina e o 3,3',4',5-tetrahidroxi-7-metoxiflavona, um derivado metilado da quercetina, também denominado de 7-metil-quercetina. A planta A. conyzoides, espécie mais estudada do gênero Ageratum, foi alvo de investigações fitoquímicas que constataram a presença de flavonoides em extratos com diferentes polaridades, sendo a subclasse das flavonas a forma predominantemente citada (ADESOGAN e OKUNADE, 1979; VYAS e MULCHANDANI, 1986; NOUR et al., 2010; HOSSAIN et al., 2013; SINGH et al., 2013). Apesar de existir estudo de triagem fitoquímica que confirma a presença da classe dos flavonoides na planta A. fastigiatum (AVELAR-FREITAS, 2013b e 2015), este trabalho foi o primeiro a elucidar as moléculas supracitadas. Uma vez identificados os componentes majoritários na fração 46 do extrato etanólico de A. fastigiatum, buscamos avaliar se esses produtos vegetais causariam alterações sobre os parâmetros inflamatórios de proliferação linfocitária e produção de citocinas próinflamatórias em subpopulações de linfócitos. A possibilidade de efeitos citotóxicos causados pelos componentes químicos vegetais utilizados neste estudo, exigiu primeiramente um ensaio que certificasse quais concentrações poderiam ser utilizadas em cultura sem afetar a viabilidade celular. Verificamos que houve redução da viabilidade de PBMC tratados com extrato etanólico de A. fastigiatum em concentração igual ou superior a 25 µg/mL por 120 horas de cultura. Em 24 horas de incubação observamos efeito tóxico do extrato etanólico de A. fastigiatum apenas na concentração de 75 µg/mL. Para todas as concentrações avaliadas nesse ensaio, tanto para o extrato incubado por 8 horas, quanto para a fração 46 em todos os tempos de cultura, não foi observada redução da viabilidade celular. Frente aos resultados obtidos no ensaio de citotoxicidade, dentre as concentrações do extrato etanólico de A. fastigiatum utilizada para análise do potencial antiproliferativo, 98 tanto a concentração de 6,25 μg/mL quanto a de 12,5 μg/mL reduziram expressivamente a proliferação de linfócitos, sendo que a eficácia do extrato etanólico de A. fastigiatum nesse ensaio correspondeu à aproximadamente 24% quando comparado ao fármaco ciclosporina. Vários são os mecanismos que promovem a proliferação de linfócitos, dentre eles a ação da IL-2, citocina essa que desempenha um importante papel na resposta imune, principalmente através dos seus efeitos diretos sobre expansão de células T (LAN et al., 2008). Tendo em vista essa característica, a síntese de IL-2 foi investigada neste trabalho. Para tal, PBMC incubadas por 8 horas com diferentes concentrações do extrato etanólico de A. fastigiatum receberam nas últimas 4 horas o estímulo PMA, sendo que nas concentrações de 50 e 75 µg/mL o extrato reduziu a porcentagem de células CD8+ produtoras de IL-2 de forma dose-dependente o mesmo efeito foi observado em linfócitos totais quando incubados com extrato na maior concentração. Quando comparado a ciclosporina a eficácia do extrato etanólico de A. fastigiatum para ambas as populações citadas foi de aproximadamente 43%. Vale ressaltar que a ciclosporina reduziu a níveis praticamente basais a síntese de IL-2 na população de linfócitos totais, células CD4+ e CD8+. O mecanismo pelo qual a IL-2 inicia sua atividade ocorre através da ligação em seu receptor específico e, uma vez ligada essa citocina desencadeia uma cascata de sinalização intracelular que culmina na ativação da via das MAPK e Fosfoinositídeo 3quinase (PI3K), resultando na indução de linfócitos a entrarem no ciclo celular, além de aumentar a sobrevida e crescimento celular. Ao mesmo tempo, na via das Janus quinase Transdutor de sinal e ativador de transcrição (JAK-STAT), a proteína Transdutora de sinal e ativador de transcrição 5 (STAT5) se transloca para o núcleo onde ativa gens mitogênicos responsáveis pela proliferação celular, além de ativar gens promotores correspondentes à expressão da cadeia α de receptores de IL-2 (CD25), estabelecendo um circuito de retroalimentação positiva na sinalização dessa citocina (LAN et al., 2008; BOYMAN; SPRENT, 2012). Neste contexto, em virtude da considerável atividade da IL-2 sobre a proliferação celular, é possível inferir que parte do efeito causado pelo extrato etanólico de A. fastigiatum na redução da proliferação de linfócitos totais e de células CD8+ está relacionado à redução dos níveis de IL-2 sintetizado. As PBMC, submetidas às mesmas condições descritas para avaliação da atividade do extrato etanólico de A. fastigiatum sobre a produção de citocina IL-2, foram analisadas quanto à produção de TNF-α. Nas concentrações de 50 e 75 µg/mL houve redução da porcentagem de células CD8+ produtoras de TNF-α com eficiência de aproximadamente 22%, ao se comparar com a ciclosporina, fármaco cujo efeito imunossupressor foi semelhante ao 99 observado para IL-2, reduzindo a níveis basais a produção de TNF-α na população de linfócitos totais e em suas duas subpopulações pesquisadas. O TNF-α é um importante mediador inflamatório que, ao se ligar em seus receptores específicos ativam diretamente a cascata de sinalização celular com geração de fatores de transcrição NF-ҡB e MAPK p38 (BAZZONI; BEUTLER; 1996; BALDWIN, 1996). A redução da produção dessa citocina contribui para diminuição do recrutamento de células da resposta imune para o sítio inflamatório, devido a menor expressão e avidez de moléculas de adesão endotelial, aliado a menor síntese de quimiocinas no local. Considerando as ações do TNF-α sobre o endotélio e em leucócitos, a redução dessa citocina é crítica para controle da intensificação da resposta inflamatória (MEDZHITOV, 2008) Os resultados obtidos nesse trabalho apontam que o extrato etanólico de A. fastigiatum possui componentes ativos agindo sinergicamente ou de forma isolada que contribuem para atividade anti-inflamatória atribuída à planta em seu uso popular. Nas condições metodológicas assumidas neste trabalho, apesar de observamos alterações de alguns parâmetros inflamatórios, neste caso, redução da proliferação de linfócitos e da produção de IL-2 e TNF-α em populações de linfócitos tratados com extrato etanólico de A. fastigiatum, o mesmo resultado não foi sustentado pela fração 46. Isso, no entanto, não garante que a fração 46 não tenha atividade anti-inflamatória, haja vista que, outros trabalhos presumem tal atividade desempenhada por moléculas semelhantes estruturalmente a essas encontradas neste estudo. Um dos flavonoides identificados, o 7-O-metil-quercetina (Figura 22), é um derivado da quercetina (Figura 41), molécula essa que possui o potencial anti-inflamatório evidenciado em diferentes tipos de células, tanto em modelos animais quanto em humanos (KIM et al., 1998; MANJEET et al., 1999; CHIRUMBOLO, 2010; LEE et al., 2010; ENDALE et al., 2013; GARDI et al., 2015; LI et al., 2016). Figura 41 - Estrutura química da quercetina 100 A Isorhamnetina (Figura 42), um composto semelhante à 7-O-metil-quercetina (Figura 22), com diferença apenas na posição do grupo metil presente no carbono 3’ do anel aromático B, foi alvo de estudos que confirmaram seu efeito anti-inflamatório. A Isorhamnetina reduziu o edema de pata e a infiltração de células inflamatórias no local afetado, além da redução da expressão gênica das citocinas TNF-α, IL-1β e IL-6. Tal efeito foi associado à supressão de genes alvos dependentes da ativação via NF-ҡB (YANG et al, 2013). Outros estudos determinaram a ação antioxidante da Isorhamnetina no combate de espécies reativas de oxigênio (ROS), inibição de COX-2 (SEO et al., 2014) e redução da expressão da proteína óxido nítrico sintase induzível (iNOS) (HÄMÄLÄINEN et al., 2007). Figura 42 - Estrutura química da Isohamnetina Jnawali e colaboradores (2014) relataram que em macrófagos murinos estimulados com lipopolissacarídeo (LPS), o tratamento com Rhamnocitrina (99% de pureza) (Figura 17) na concentração máxima utilizada de 6,25 µg/mL, resultou na diminuição da síntese de NO, além da redução da expressão gênica de COX-2, TNF-α e Proteína inflamatória de macrófagos 2 (MIP-2), como consequência da supressão da sinalização de componente da via das MAPK, tais como: JNK, MAPK p38 e quinases reguladas por sinais extracelulares (ERK) (ROUX e BLENIS, 2004). Em modelo animal, Mondal e colaboradores (2013) relataram a regressão de edema subplantar induzido por carragenina e dextrano em camundongos tratados por via oral com a Rhamnocitrina. Comparando-se com o trabalho conduzido por Jnawali e colaboradores (2014), descrito acima, podemos supor que a falta de atividade da fração 46 nos parâmetros inflamatórios avaliados neste trabalho pode ser atribuída à pureza reduzida dos flavonoides, sendo, portanto, a quantidade dessas moléculas presentes nessa fração, insuficiente para desencadear uma resposta anti-inflamatória detectável neste trabalho. Como causa para possível pureza reduzida de flavonoides na fração 46 podemos sugerir perdas de massas durante processo de fracionamento do extrato etanólico de A. fastigiatum ou causa inerente à 101 biossíntese diminuída dos flavonoides pelo vegetal no período em que foi realizada a coleta, devido ao fator de sazonalidade (SKRZYPCZAK-PIETRASZEK; PIETRASZEK, 2014). Vale ressaltar que, limitados pela constatação de que em quantidades elevadas o DMSO pode interferir sobre a produção de citocinas e proliferação de linfócitos, não foi possível adicionar volumes mais elevados da fração 46 nas culturas celulares. 102 103 8 CONCLUSÃO Tendo em vista que produtos vegetais apresentam características variáveis de polaridade, o DMSO é o principal solvente de escolha para a solubilização e incorporação dessas substâncias por células em meio de cultura, devido às suas propriedades anfipáticas e capacidade de transpor membranas biológicas. Como descrito neste trabalho, a concentração de DMSO igual ou superior a 2,5% v/v, por 8 horas, e concentração igual ou superior a 1% v/v, por 120 horas, alteram produção de citocinas pró-inflamatórias e a proliferação de linfócitos, respectivamente. Sendo assim, o DMSO pode ser utilizado para os fins descritos, mas com cautela, haja vista que em pesquisas que avaliem atividade imunossupressora ou anti-inflamatória de substâncias, in vitro, concentrações elevadas e/ou longos períodos de exposição de células ao solvente podem gerar resultados equivocados. Na avaliação fitoquímica da fração 46 obtida do extrato etanólico de A. fastigiatum foram identificados os flavonóis 7-metil-quercetina e a Rhamnocitrina, moléculas nunca antes descritas na constituição química da planta. Os resultados obtidos da atividade do extrato etanólico de A. fastigiatum na redução da proliferação de linfócitos aliado a redução da produção das citocinas TNF- α em células CD8+ e IL-2 em linfócitos totais e células CD8+ sugerem que, pelo menos em parte, a atribuição do uso da planta na medicina popular, pode estar associada a componentes químicos presentes no seu extrato etanólico. 104 105 9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABBRUZZESE, L.; AGOSTINI, F.; DURANTE, C.; TOFFOLA, R. T.; RUPOLO, M.; ROSSI, F. M.; LLESHI, A.; ZANOLIN, S.; MICHIELI, M.; MAZZUCATO, M. Long term cryopreservation in 5% DMSO maintains unchanged CD34(+) cells viability and allows satisfactory hematological engraftment after peripheral blood stem cell transplantation. Vox Sanguinis, v. 105, n. 1, p. 77-80, 2013. ABENA, A. A.; KINTSANGOULA-MBAYA, G. S, DIANTAMA, J.; BIOKA, D. Analgesic effects of a raw extract of Ageratum conyzoides in the rat. Encephale, v. 19, n. 4, p. 329-332, 1993a. ADESOGAN E. K.; OKUNADE A. L. 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Sua participação no estudo consistirá em doar 15mL de sangue, que será coletado por punção venosa com tubos a vácuo (da mesma maneira que é coletado quando você faz algum exame de sangue), em data e horário a combinar. A partir do sangue serão obtidos os leucócitos para os experimentos em laboratório. Os riscos de sua participação incluem hematoma (roxo no local da coleta de sangue), dor, tontura, enjôo e de contaminação. A coleta será feita por pessoa treinada, em local limpo e reservado, equipado com maca, utilizando material estéril e descartável. Os seus dados serão mantidos em sigilo e sua identidade não será revelada. Só os pesquisadores envolvidos no projeto terão acesso aos dados, que serão utilizados apenas para fins de pesquisa e divulgação científica em congressos, livros e revistas. Não está prevista qualquer forma de remuneração pela sua participação no estudo e você não terá nenhuma despesa (portanto, não está previsto nenhuma forma de ressarcimento). Quaisquer dúvidas que possam surgir durante o andamento deste estudo por parte do voluntário poderão ser esclarecidas junto aos membros da equipe responsáveis pelo projeto, pessoalmente ou por telefone. Você poderá recusar e/ou deixar de participar deste estudo a qualquer momento, sem nenhum constrangimento ou prejuízo na sua relação com os pesquisadores e a UFVJM. Os pesquisadores responsáveis por este projeto podem decidir sobre a sua exclusão do estudo por razões científicas, a respeito das quais você deverá ser devidamente informado. Em caso de qualquer dúvida deverá e/ou poderá entrar em contato a qualquer hora com o pesquisador responsável Lucas de Abreu Costa ([email protected]) ou telefone (38) 992264447. Você também poderá entrar em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa – UFVJM (38) 35326060 para informações sobre a aprovação do projeto pelo comitê. . 128 Termo de livre consentimento pós-informado Eu discuti os riscos e benefícios da minha participação no estudo intitulado “Efeito do extrato etanólico de Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King Et H. Rob. E de sua fração sobre a produção de citocinas e proliferação de linfócitos humanos, in vitro.” com os pesquisadores envolvidos. Eu li e compreendi todos os procedimentos que envolvem esta pesquisa e tive tempo suficiente para considerar a minha participação no estudo. Eu perguntei e obtive as respostas para todas as minhas dúvidas. Eu sei que posso me recusar a participar deste estudo ou que posso abandoná-lo a qualquer momento sem qualquer constrangimento ou prejuízo. Eu também compreendo que os pesquisadores podem decidir a minha exclusão do estudo por razões científicas, sobre as quais eu serei devidamente informado. Não terei nenhuma remuneração e nenhum gasto por participar do projeto. Tenho uma cópia deste formulário, o qual foi assinado em duas vias idênticas e rubricadas. Portanto, aqui forneço o meu consentimento para participar do estudo intitulado “Efeito do extrato etanólico de Ageratum fastigiatum (Gardn.) R. M. King Et H. Rob. E de sua fração sobre a produção de citocinas e proliferação de linfócitos humanos, in vitro”, durante todos os testes realizados. Diamantina, ____ de _____________ de 20_____ Assinatura do voluntário:_____________________________________ Testemunha: _____________________________________________________ Testemunha: _____________________________________________________ 129 Declaro que expliquei todos os objetivos, benefícios e riscos deste estudo ao voluntário, dentro dos limites de meus conhecimentos científicos. Pesquisador responsável: ________________________________________________ Lucas de Abreu Costa (38) 9 92264447 [email protected] Comitê de Ética em Pesquisa da UFVJM Campus JK – Rodovia MGT 367 – Km 583 – nº 5000 – Alto da Jacuba CEP: 39.100-000 Diamantina - MG Coordenação: Profa. Dra. Thais Peixoto Gaiad Machado Vice-coordenação: Profa. Dra. Rosamary Aparecida Garcia Stuchi Secretária: Dione Conceição de Paula Telefone: (38) 3532-1240/3532-1200 E-mail: [email protected] 130 131 ANEXO D – APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
