dengue sorotipo 3 isolado de um caso fatal de

DENGUE SOROTIPO 3 ISOLADO DE UM CASO FATAL DE DENGUE VISCERAL INDUZ
RESPOSTA INFLAMATÓRIA E APOPTOSE EM CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE
MONÓCITOS
Claudia N. Duarte dos Santos1*, Juliano Bordignon1*, André Báfica5, Christian M. Probst4, Cyntia
Vasquez3, Norma Coluchi3, Ana Luiza P. Mosimann1, Adriana Delfraro1,2, Florência Meyer1# e
Guilherme F. Silveira1
1Laboratório de Virologia Molecular, 4Laboratório de Genômica Funcional, Instituto Carlos Chagas, FIOCRUZ, Curitiba, PR, Brazil; 2Laboratório de Virologia, Universidad de La Republica,
Montevidéo, Uruguai; 3Laboratorio Central de Salud Publica, Servicio de Pediatria, Hospital Central, Instituto de Previsión Social, Asuncion, Paraguay; 5Laboratório de Imunologia e Doenças
Infecciosas, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, SC, Brazil; #Current Adrress: Nebraska Center for Virology - University of Nebraska, Lincoln, NE.
*Corresponding author: [email protected], [email protected].
Introdução: Atualmente, a dengue representa um dos mais importantes problemas de saúde pública mundial, com aproximadamente 80 milhões de casos/ano, 550.000 hospitalizações/ano, 25.000 óbitos/ano, em mais de 100
países diferentes. O vírus da dengue esta dividido em 4 sorotipos e causa um espectro de doença que varia de uma doença febril com sintomas inespecíficos (febre da dengue – FD), até uma forma mais severa com hemorragias,
e eventualmente óbito por choque (febre hemorrágica da dengue – FHD/síndrome do choque da dengue – SCD). As células dendríticas representam o primeiro alvo da infecção após a introdução do vírus pelo mosquito, além
disso, são as mais eficientes células apresentadoras de antígenos sendo importantes na ativação da resposta imune adaptativa. Objetivos: o objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta de mdDCs frente a uma cepa de
DENV3 (genótipo III – Sri Lanka) isolada em 2007 em Lambaré, no Paraguai. Metodologia: células dendríticas derivadas de monócitos (mdDCs - CD14-/CD1a+/HLA-DR+) foram geradas a partir de sangue periférico de doadores
saudáveis (Protocolo aprovado no CEP/Fiocruz com número. As mdDCs foram infectadas com as cepas DENV3/5532 isolada no Paraguai de um caso fatal de dengue visceral e com a cepa DENV3/290 isolada de um caso de FD no
Rio de Janeiro em 2002. Os parâmetros analisados foram: número de células infectadas (FACS), titulação viral por ensaio de foco, expressão gênica (para a cepa DENV3/5532), apoptose de mdDCs, níveis de citocinas próinflamatórias e quimiocinas por ensaio de CBA, e o papel do TNF-α e da replicação viral na indução da apoptose e secreção de citocinas/quimiocinas. Resultados: o padrão de expressão gênica de mdDCs infectadas com a cepa
DENV3/5532 em 6h, 12h, 24h e 48h pós-infecção (hpi) demonstrou uma modulação significativa de genes envolvidos na resposta imune inata, principalmente, na resposta inflamatória (Figura 1). Adicionalmente, um maior
número de células infectadas foram detectadas na infecção com a cepa DENV3/5532 comparada a cepa DENV3/290 após 72hpi. Um maior progênie viral e porcentagem de células em apoptose foi também observada na
infecção de mdDCs com a cepa DENV3/5532 comparativamente a cepa DENV3/290. Além disso, a infecção com a cepa DENV3/5532 também induziu uma maior secreção de citocinas pró-inflamatórias, como, TNF-α, IL-6 e IL-8.
Não foi observada diferença significativa nos níveis de quimiocinas entre as cepas virais. O papel do TNF-α na indução da apoptose e da infecção também foi avaliado. O TNF-α parece prevenir a apoptose sem afetar os níveis de
células infectadas. Este resultado nos levou a indagar o papel da replicação viral mais eficiente da cepa DENV3/5532 na indução da apoptose e na secreção das citocinas inflamatórias. Para testar esta hipótese mdDCs foram
infectadas com as duas cepas virais nativas e inativadas por radiação gama (IPEN/SP). Os resultados demonstraram claramente uma relação de dependência entre a replicação viral, e a apoptose e/ou síntese de citocinas próinflamatórias. Conclusões: A cepa viral DENV3/5532 isolada de um caso fatal de dengue no Paraguai é capaz de replicar com maior eficiência em mdDCs e desta forma, induzir uma maior taxa de apoptose de mdDCs, bem como,
a maior secreção de citocinas pró-inflamatórias, quando comparado com a cepa DENV3/290 (FD). O fenótipo observado em mdDCs infectadas com DENV3/5532 é dependente da replicação viral e o tratamento com o TNF-α
parece proteger as mdDCs da apoptose.
Tabela 1: Asubstituições de aminoácidos entre as cepas DENV3/5532 e DENV3/290.
Proteína
DENV3/5532 x DENV3/290
C
K(35)R
pre-M
R(86)H
T(266)I
N(302)K*
E
H(345)Y*
E(360)D*
T(471)I
NS2b
I(105)V
L(27)R
I(50)T
NS5
V(181)I
N(835)D
*Mutações localizadas no domínio III da proteína E (Modis et al., 2003 and 2005).
Figura 1: (A) Clusterização hierárquica (Cluster 3.0) dos 124 genes modulados
na infecção de mdDCs com DENV3/5532 (super-expressos em amarelo e
suprimidos em azul). (B) Anotação Funcional dos 124 genes utilizando-se os
softwares Expander, e os bancos de dados NCBI Entrez e Gene Ontology. (C)
Análises de PCR quantitativo para os genes OAS2, IFIT1 and EIF2AK2 em mdDCs
após a infecção com DENV3/5532 (barras brancas), DENV3/290 (barras cinza) e
mock (barras pretas). Os valores representam a média de 4 doadores saudáveis
mais o desvio padrão.
Figure 4: Níveis de TNF-α, IL-6 e IL-8 no sobrenadante de mdDCs infectadas
com DENV3/5532 (barra branca), DENV3/290 (barra cinza) e mock (barra
preta). Altos níveis de TNF-α e IL-6 em células infectadas com DENV3/5532
comparado ao DENV3/290 e mock, (72hpi). Análises estatísticas realizadas com
Two-way ANOVA seguido do teste de Bonferroni, p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) and
p < 0.001 (***).
Figura 2: Estrutura secundária de RNA da região 3’UTR das cepas DENV3/5532
and 290. Predição da estrutura secundária da região 5’UTR orealizada com o
programa mfold (Zuker et al, 1999), disponível em Mobyle@pasteur server
(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py).
Figure 5: Papel do tratamento com TNF-α na infectividade e apoptose.
Porcentagem de mdDCs infectadas (A), mdDCs em apoptose (B) e níveis de
TNF-α (C) após 72hpi de infecção com DENV3/290 (barras cinza), DENV3/5532
(barras branca) e mock (barras pretas) e tratamento com: meio RPMI (grupo
não-tratado), TNF-α (10 ng/oríficio), anticorpo neutralizante anti-TNF-α e
controle isotípico. Os valores representam a média ± SD para 3 doadores
diferentes. Análise estatística com o método Two-way ANOVA seguido do teste
de Bonferroni, p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) and p < 0.001 (***).
Figure 3: Procentagem de células infectadas, progênie viral e células em
apoptose após infecção com as cepas DENV3/290 (barras cinza), DENV3/5532
(barras brancas) e mock (barras pretas). (A) Porcentagem de mdDCs infectadas.
(B) Progênie viral no sobrenadante de mdDCs. Resultados expressos em log10 de
unidades formadoras de foco de infecção (ffu) em células C6/36. (C)
Porcentagem de mdDCs em apoptose definidas pelo ensaio de AnnexinV por
citometria de fluxo. Análises estatítsticas foram realizadas com Two-way ANOVA
seguidos do teste Bonferroni, p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) and p < 0.001 (***).
Figure 6: Papel da replicação viral na produção de vírus, apoptose e secreção
de citocinas pró-inflamatórias. Porcentagem de mdDCs infectadas (A),
progênie viral (B), mdDCs em apoptose (C), níveis de TNF-α (D), IL-6 (E) e IL-8
(F) após 72hpi com as cepas DENV3/290 (barras cinza), DENV3/290 inativado
(barras cinza com linhas horizontais), DENV3/5532 (barras brancas),
DENV3/5532 inativado (barras brancas com linhas horizontais) e mock
(barras pretas). Os valores representam e média ± SD de 3 doadores
diferentes. Análise estatística realizada com One-way ANOVA seguida do teste
de Donnutt, p < 0.05 (*), p < 0.01 (**) and p < 0.001 (***). # p < 0.05 quando
comparado cada cepa viral com seu par inativado.