1 - PIBIC/UNIR

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES
Nafto
Naftoquinonas
Antra
Antraquinonas
INPA
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
LABFITO
Laboratório de Fitoquímica
°C
Grau Celsius
m
Nanômetro
μm
Micrômetro

Diâmetro interno
RF
Fator de retardamento
cm
Centímetro
%
porcentagem
mL
mililitro
mm
Milímetro
M
Massa
g
Gramas
Kg
Kilogramas
min
Minutos
UV
Ultravioleta
o-
orto
p-
para
m-
meta
FE
Fase estacionária
HIV
Imuno Deficiência Adquirida
FM
Fase móvel
CC
Cromatografia em coluna
CCD
Cromatografia em camada delgada
DPPH
2,2 difenil-1-picril-hidrazil
CHCl3
Clorofórmio
MeOH
Metanol
EtOH
Etanol
CH2Cl2
Diclorometano
5
EtOAc
Acetato de Etila
SiO2
Sílica
Al2O3
Alumina
TBARS
Ácido tiobarbitúrico
(CH3CO)2O
Anidrido acético
H2SO4
Ácido sulfúrico
HCl
Ácido clorídrico
6
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURA
Pag.
Pag.
Tabela 1: Série de eluentes com ponto de ebulição baixo, em ordem
31
crescente de polaridade.
Tabela 2: Massa e porcentagem do material utilizado para a obtenção
45
do Extrato Etanólico.
Tabela 3: Coluna flash (teste) do extrato etanólico da C. paludosa
47
Tabela 4: Eluatos obtidos a partir do extrato etanólico
48
Tabela 5: Frações obtidas do fracionamento do eluato EtOAc através
50
das análises de CCD
Tabela 6: Frações obtidas do fracionamento do eluato CHCl3 através
51
das análises de CCD.
Tabela 7: Agrupamento de frações obtidas a partir da recromatografia
54
das frações 29-32 e 33-36
Tabela 8: Agrupamento de frações obtidas a partir da recromatografia
55
da fração 131-170
Tabela 9: Meios de cultivo de microrganismos
52
Tabela 10: Resultados obtidos para teste de classe de substâncias C.
59
paludosa
Tabela 11: Ponto de fusão das frações (44-47), (09-12), (21-25)
64
Tabela 12: Resultado das médias dos halos de inibição (em mm) do
60
ensaio de difusão em disco com extrato etanólico e substância isolada
7
Figura 1: Fotos da Cipura Paludosa Aubl.
16
Figura 2: Núcleo interfásico e metáfases mitóticas da Cipura paludosa
17
com 2n=14 e satélites no par menor (setas).
Figura 3: Estrutura molecular da Cipurina e Isocipurina isoladas do
19
extrato etanólico da C. paludosa.
Figura 4: Estrutura dos esteróides isolados e identificados do extrato
19
etanólico da C. paludosa.
Figura 5: Estrutura básica de um esteróides
21
Figura 6: Substância Criptolepina isolada de plantas leguminosas.
23
Figura 7: Flavona isoorientina, extraídos da Cecropia obtusifolia Bertol
24
Cecropiaceae.
Figura 8: Triterpenos isolados da Agarista mexicana.
25
Figura 9: Quinonas
26
Figura 10: Coluna cromatográfica
30
Figura 11: Cromatografia em camada delgada
32
Figura 12: Coluna flash
34
Figura 13: Bactéria Staphylococcus aureus
36
Figura 14: Bactéria Streptococcus sp.
37
Figura 15: Bactérias Bacillus cereus
38
Figura 16: Bactérias Escherichia coli
40
Figura 17: Bactéria Pseudomonas aeruginosa
41
Figura 18: Organograma dos métodos desenvolvidos preliminares
49
para estudo da C. paludosa.
Figura 19: Organograma com os procedimentos realizados para o
52
fracionamento do eluato de EtOAc.
Figura 20: Organograma com os procedimentos realizados para o
53
fracionamento do eluato de CHCl3.
Figura 21: Cromatografia em CCD da fração (44-47).
61
Figura 22: Cromatografia em CCD das frações (09-12) e (21-25)
62
Figura 23: Processo de recristalização das amostras F e G
63
Figura 24: Figura: Teste de difusão em disco para o extrato etanólico
67
8
Cipura paludosa frente Escherichia coli
Figura 25: Teste de difusão em disco para o extrato etanólico CPBC-1
68
da Cipura paludosa frente a Staphylococcus aureus resistente e
sensível a meticilina.
9
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me dado coragem, sabedoria e paciência para seguir em
frente e ultrapassar as dificuldades encontradas pelo caminho.
A minha mãe, Durcelina Feitosa Gaia e o meu pai João Nepomuceno
Souza que com muito amor e carinho sempre me incentivaram a estudar e lutar
pelo os meus objetivos.
A minha orientadora Drª. Mariângela Soares de Azevedo por ter acreditado
em mim e ter me concedido à oportunidade de desenvolver uma pesquisa
científica, espero estar correspondendo às expectativas.
.
A todos meus amigos do LABFITO: Evelin, Denny Vitor, Tainá, Elise
Marques, e os analistas do LABCOM: Danilo Andrade, Nilton Fagner, Luís
Fernando, Guiomar Baldez, Hiata Silva, pela ajuda e troca de conhecimentos.
Ao CNPQ pela bolsa de iniciação cientifica e a CAPES pelo apoio
financeiro.
10
RESUMO
O crescimento de adeptos a fitoterapia nas últimas décadas, tem levado a
comunidade científica em realizar estudos que comprovem o potencial terapêutico
de plantas utilizadas na medicina popular. A Cipura paludosa Aubl. é um exemplar
na medicina tradicional, é uma monocotiledônea pertencente à família Iridaceae,
possui caule subterrâneo (bulbo), e apresenta flores com coloração geralmente
azul pálida ou raramente branca. Conhecida popularmente como alho do mato,
cebolinha do campo, coqueirinho entre outros. Os bulbos desta planta são
utilizados pela população ribeirinha do estado de Rondônia, na forma de chá, no
combate a doenças renais, diarréias, inflamações e tratamento de ameba. Diante
destas informações surgiu o interesse de estudar esse potencial fitoterápico que a
espécie possui. Em estudos farmacológicos e fitoquímico anteriores a planta
apresentou
excelentes
resultados
mostrando
ser
altamente
ativa
como
antioxidante, antinociceptiva e facilitadora da memória em camundongos e ratos,
no estudo fitoquímico viabilizou o isolamento de substâncias inéditas identificadas
como cipurina e isocipurina e misturas de esteróides sendo estes importantes
para atividades farmacológicas. Em análises fitoquímica presentes, foram
utilizados os métodos de preparação de extrato bruto por percolação sob ação de
álcool etílico 95%, sendo posteriormente evaporado, e fracionado com coluna
cromatográfica. Os resultados dos testes para classes de substâncias revelaram a
presença de flavonóides, alcalóides, terpenos e quinonas no extrato etanólico. A
investigação química do bulbo da C.paludosa levou ao isolamento de substâncias
que apresentaram ponto de fusão diferente das substâncias isolada. Na avaliação
antibacteriana com o teste de difusão em disco do extrato etanólico, mostrou ser
eficaz contra as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, apresentando halos
de inibição considerável contra Staphylococcus aureus MRSA.
Palavras-chave:
Cipura
paludosa
Aubl.,
Análise
fitoquímica,
Atividade
antimicrobiana.
11
ABSTRACT
The growth of adepts the fitoterapia in the last few decades has taken the scientific
community in carrying through studies that prove the therapeutical potential of
plants used in the popular medicine. The paludosa Cipura Aubl. it is a unit in the
traditional medicine, is a pertaining monocotiledônea to the Iridaceae family, it
possesss caule underground (bulb), and presents flowers with pale or generally
rare white blue coloration. Known popularly as garlic of the weeds, chive of the
field, coqueirinho among others. The bulbs of this plant are used by the marginal
population of the state of Rondônia, in the form of tea, the combat the renais,
diarréias illnesses, inflammations and treatment of amoeba. Ahead of these
information the interest appeared to study this fitoterápico potential that the
species possesss. In previous farmacológicos studies and fitoquímico the plant
presented highly excellent resulted showing to be active as antirust,
antinociceptiva and facilitadora of the memory in mice and rats, in the fitoquímico
study it made possible unknown the substance isolation identified as cipurina and
isocipurina and mixtures of esteróides being these important ones for
farmacológicas activities. In analyses fitoquímica recent, the methods of rude
extract preparation had been used for percolating under etílico alcohol action 95%,
being later evaporated, and fracionado with chromatographic column.The results
of the tests for substance classrooms had disclosed the presence of flavonóides,
alkalis, terpenos and quinonas in the etanólico extract. The chemical inquiry of the
bulb of the C.paludosa led to the substance isolation that had presented point of
different fusing of substances isolated. In the antibacterial evaluation with the test
of diffusion in record of the etanólico extract, it showed to be efficient against the
Gram-positive and Gram-negative bacteria, presenting aureus halos of
considerable inhibition against Staphylococcus MRSA.
Word-key: Paludosa Cipura Aubl., Analyzes fitoquímica, antimicrobiana Activity
12
1
1.1
INTRODUÇÃO
Histórico
A história relata que há séculos o homem tem procurado alternativa para
eliminar seus males físicos, de forma empírica ou intuitiva (GRANDI, T.S.M.; &
SIQUEIRA, 1990).
Segundo LOZOYA, 1983 a partir da década de 70 começaram a questionar
uma nova definição do que seria saúde, conseqüentemente, aumentou também a
conscientização da importância da natureza no equilíbrio do homem, já utilizada
há séculos pelos orientais, estimulando a busca de alternativas mantenedoras de
saúde.
A utilização de plantas com fins medicinais é uma das mais antigas formas
de prática medicinal da humanidade, tornou-se uma alternativa para tratamento,
cura e prevenção de doenças, (AKERELE, O., 1993).
O Brasil é um país privilegiado, pois ocupa o primeiro lugar dentre os 17
países mais ricos do mundo em biodiversidade, detendo cerca de 20% do total de
espécie existentes no planeta (RATES, 2001). A imensa variedade de espécie de
plantas, animais e microrganismos existentes no ecossistema brasileiro, sem
dúvida apresentam um importante diferencial para o desenvolvimento de
medicamentos.
A flora brasileira é muito rica em espécies com propriedades terapêuticas e
as plantas têm sido amplamente utilizadas na medicina popular, no entanto,
muitas destas ainda não foram estudadas, não havendo comprovação científica
sobre sua eficiência.
Eticamente, o uso popular e mesmo tradicional não são suficientes para
validar as plantas como medicamentos eficazes e seguros. Assim, os efeitos
medicinais de um fitoterápico devem ser fundamentados em evidências
experimentais, comprobatórias de que o risco a que se expõe àqueles que a
utiliza seja suplantado pelos benefícios que possam advir (DASSOLER et al.,
2004).
Os remédios à base de plantas medicinais têm enorme vantagem em
relação às drogas sintéticas, pois os produtos naturais apresentam princípios
13
ativos que se encontram muitas vezes, biologicamente equilibrados pela presença
de substâncias complementares que, em geral, não se acumulam no organismo e
seus possíveis efeitos indesejáveis estão limitados (DASSOLER et al., 2004).
A transformação de uma planta em um medicamento deve visar à
preservação da integridade química e farmacológica do vegetal, garantindo a
constância de sua ação biológica e a sua segurança de utilização, além de
valorizar seu potencial terapêutico. Para atingir esses objetivos, a produção de
fitoterápicos requer, necessariamente, estudos prévios relativos a aspectos
botânicos,
agronômicos,
fitoquímicos,
farmacológicos,
toxicológicos,
de
desenvolvimento de metodologias analíticas e tecnológicas (MIGUEL, M. D.;
MIGUEL, G. O., 1999).
A grande quantidade de informações sobre o uso de centenas de plantas
como fitoterápicos em todo o mundo leva à necessidade de se avaliar
cientificamente o valor terapêutico de espécies vegetais, porém, a perda da
biodiversidade principalmente por interferências antrópicas e o acelerado
processo de mudança cultural acrescentam um censo de urgência em garantir o
registro dessas informações, inclusive para uso científico (SIMÔES et al., 2004).
O desenvolvimento de novas drogas provindas de vegetais destaca a
Química de Produtos Naturais, que representa dentro da área de pesquisa com
plantas medicinais, um ponto de grande importância e valor, na medida em que
somente por meio de métodos utilizados nessa área pode-se obter tanto o
isolamento quanto a purificação de novos compostos como a correta
determinação estrutural e posterior síntese total ou parcial, o que pode viabilizar
composto que possam vir a ser utilizados para ensaios farmacológicos e sua
possível industrialização (DI STASI, 1996).
Diante da enorme abundância de plantas com poder curativo, a região
Amazônica é considerada a maior reserva de plantas medicinais do mundo e
apesar da intensificação dos estudos dessas plantas apenas uma pequena
porcentagem dessas espécies foram estudadas e comprovadas como eficientes
fitoterápicos (DI STASI, 1996).
A
grande
incidência
de
infecções,
principalmente
em
indivíduos
imonocomprometidos, aumenta a importância da procura e descoberta de
compostos terapêuticos alternativos com atividades antimicrobianas (Bertini et al.,
14
2005), e antes mesmo da descoberta da existência dos micróbios, havia idéia de
que certas plantas possuíam potencial curativo, contendo o que se é chamado
atualmente de princípios antimicrobianos (Rios e Recio, 2005). Diante dessa
descoberta, varias plantas medicinais tornaram-se alvos de investigação científica
quanto a suas atividades biológicas (Duarte et al., 2004).
Plantas superiores e aromáticas apresentam amplo espectro de atividade e
inibição comprovada contra bactérias, fungos e parasitas. A maioria dessas
propriedades é conferida por produtos do metabolismo secundário, como
terpenóides e compostos fenólicos, que também na forma pura exibem atividade.
Extratos e óleos de várias espécies mostraram-se eficientes no controle de
fungos relacionados a infecções da pele, sobre bactérias patogênicas bucais, e
sobre uma variedade de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas.
Trabalhos recentes sobre a atividade antimicrobiana de extratos e óleos
essenciais mostram o grande potencial de aplicação de plantas nativas de
diversas regiões do mundo. No Brasil, estudos com a mesma finalidade são de
grande importância, uma vez que plantas medicinais são utilizadas em várias
áreas da saúde como forma alternativa de tratamento.
Os pesquisadores de áreas divergentes têm advertidos sobre o enorme
surgimento de bactérias multi-resistentes devido ao uso indiscriminado de
antibióticos. Esse fator agravante vem motivando a comunidade cientifica a
investigar plantas com atividade antibacteriana.
15
2
2.1
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Família Iridaceae
A família Iridaceae apresenta ampla distribuição no mundo, com 78
gêneros e 1750 espécies, mas com principal centro de diversidade no Continente
Africano com cerca de 46 gêneros e 1000 espécies (JUDD, W. S. et al., 1999).
Sendo que a região Neotropical é o segundo maior centro de diversidade da
família, com 30 gêneros e 250 espécies, dos quais 20 gêneros são endêmicos
(GOLDBLATT, P. 1987). No Brasil Estima-se a existência de 110 espécies e 14
gêneros, a família cariologicamente pouco conhecida (INNES, 1985).
Esta
família
é
composta
por
monocotiledôneas
com
distribuição
cosmopolita e com grande diversidade morfológica. Caracterizam-se por serem
ervas geralmente perenes com raízes fibrosas ou carnosas, folhas planas ou
cilíndricas e inflorescência cimosa, o caule é geralmente ereto e com folhas.
Apresentam flores com coloração variada e androceu com estames livres ou
unidos em coluna estaminífera, a qual pode apresentar em sua base tricomas
com glândulas especiais, denominadas elaióforos (MACHADO, 2004). Assim
como em outros gêneros de Iridaceae e em outras oito famílias, tais glândulas são
responsáveis por produzir óleos lipídicos como recompensa para seus
polinizadores (COCUCCI & VOGEL, 2001).
Plantas dessa família apresentam alcalóides e flavonóides em sua
composição e saponinas esteroidais presentes nas flores, cormos ou frutos.
Vários gêneros acumulam compostos fenólicos como às leucoantocianinas,
antraquinonas e taninos. Os cormos e rizomas acumulam carboidratos, como a
sacarose.
16
2.2
Cipura Paludosa Aubl
Cipura paludosa Aubl. é uma herbácea popularmente conhecida como alho
do mato, alho da campina, alho do campo, cebolinha do campo, coqueirinho,
coquinho e vareta (CORRÊA, 1994).
A planta é uma monocotiledônea, pertencente a família IRIDACEAE que
possui caule subterrâneo (bulbo), de aproximadamente 0,2cm de diâmetro.
Apresenta flores trímeras, com coloração geralmente azul pálida ou raramente
branca, dispostas sobre pedúnculo de 0,25cm de comprimento em hastes que
saem do meio de 2-3 folhas com o interior das pétalas apresentando néctar
amarelo. O bulbo é carnoso, compacto, coberto por brácteas interiormente
amarelo
pouco
aromático.
As
raízes
são
do
tipo
adventícias,
folhas
paralelinérveas, estreitas, glabras, do mesmo comprimento do pedúnculo florífero
e com sulcos longitudinais (CÔRREA, 1994; CELIS et al., 2003; LUCENA, 2005).
2A
2B
2C
Figura 1: Fotos da Cipura Paludosa: 2A bulbo, 2B bulbos e folhas, 2C flor.
Esta espécie apresenta 14 cromossomos, com tamanho variando entre 2,3
a 8,8μm, também possui cariótipo bimodal formado por um par metacêntrico
grande e outro submetacêntrico menor e os demais cromossomos pequenos,
sendo dois metacêntricos e três submetacêntricos. Os números cromossômicos
encontrados em C. paludosa (2n=14) coincidiram com dados de contagens
prévias para a espécie (GOLDBLATT, P. & TAKEI, M. 1997), inclusive pela
17
presença de um par de satélites no braço curto de um dos cromossomos
submetacêntricos. Como mostra a figura 1.
Figura 2: Núcleo interfásico e metáfases mitóticas da Cipura paludosa com 2n=14
e satélites no par menor (setas) ALVES & FELIX, 2007.
Este gênero extende-se do Paraguai e parte meridional do Brasil até a
parte central do México e Cuba e apresenta nove espécies: C. cubensis Griseb.,
C. formosa Ravenna, C. gigas Celis, Goldblatt & Betancur, C. inornata Ravenna,
C. insularis Ravenna, C. paludosa Aublet, C. paradisíaca Ravenna, C. rupicola
Goldblatt & Henrich e C. xanthomelas Mart. A C. paludosa é a espécie mais
amplamente distribuída enquanto que as outras são de localização restrita (CELIS
et al., 2003).
2.2.1 Estudo fitoquímico e farmacológicos anteriores
O interesse de estudar essa planta deu-se a partir de uma viagem
realizada a campo, no decorre da hidrovia do Rio Madeira, uma espécime desse
gênero foi encontrada no município de Cujubim Grande e Itapirema – Ro. Seus
bulbos são utilizados pela população tradicional ribeirinha, na forma de chá, no
combate a doenças renais, diarréias, inflamações e para a regulação da
menstruação (LUCENA, 2005).
18
Em ensaios preliminares do extrato etanólico da C. paludosa foi avaliado
quanto a sua atividade como agente antioxidante, em modelo de DPPH, utilizando
Ginko biloba como padrão, a planta apresentou-se altamente ativa como
antioxidante.
Os antioxidantes protegem o organismo da ação danosa dos radicais livres,
que estão intimamente relacionados a processos degenerativos, tais como o
câncer e o envelhecimento celular. Os flavonóides constituem um grupo de
substância natural que possuem atividades biológicas diversificadas, sendo muito
eficazes como agentes antioxidantes (ELLNAIN – WJTASZEK, 2003).
Pesquisa desenvolvida por LUCENAa et al (2007), reportou alta atividade
da C. Paludosa para dor, em modelos de nocicepção química, térmica e mecância
em camundongos e ratos, bem como alguns dos mecanismo envolvidos na sua
ação antinociceptiva em camundongos. Em outro trabalho LUCENA b et al (2007)
avaliou o extrato da C. paludosa na indução do Metil-mercúrio em ratos e
obeservou que a planta reduziu a ação desta substância no organismo.
Avaliou também o efeito antioxidante do extrato etanólico da planta no
modelo de TBARS e o efeito facilitador da memória, através do modelo de
esquiva inibitória em ratos. Os resultados mostraram marcante atividade
antioxidante e mostrou afetar positivamente a memória, sugerindo, ao menos em
parte, possuir um importante efeito em doenças neurodegenerativas que
envolvam a cognição e emoção (LUCENA, 2005).
Em estudo fitoquímico anterior da espécie, resultou no isolamento de
sustâncias inéditas como as piranonaftoquinonas, uma mistura racêmica
identificada
como
isocromeno-5,10-diona
(1S*,3S*)-3,4-dihidro-6-metóxi-1,3-dimetil-1H-benzo[g]
que
(1R*,3S*)-3,4-dihidro-6-metóxi-1,3-dimetil-1H-
benzo[g] isocromeno-5,10-diona que são respectivamente, cipurina e isocipurina,
e a mistura de esteróides (β-sitosterol, Estigmasterol, Campesterol) (CUNHA E
AZEVEDO, 2009) como mostram as figuras(3) e (4).
19
OMe O
OMe O
O
O H
Cipurina
H
O
H
H
O
Isocipurina
Figura 3: Estrutura molecular da Cipurina e Isocipurina isoladas do extrato
etanólico da C. paludosa.
HO
Estigmasterol
HO
Campesterol
HO
β-sitosterol
Figura 04: Estrutura dos esteróides isolados e identificados do extrato etanólico
da C. paludosa
Vários compostos que possuem estrutura química semelhante a das
piranonaftoquinonas isoladas, incluindo eleuterina, isoeleuterina, eleuterol,
isoeleuterol, elecanacina, hongconina, bem como antraquinonas e seus
20
glicosídeos já foram isolados dos bulbos das plantas desse gênero. Compostos
presentes neste gênero apresentam uma importante atividade biológica. HARA et
al (1997) descreve a eleuterina como formadora de um tipo de “complexo nãoclivável” com a Topoisomerase II com atividade inibitória seletiva e estérea
específica. Estes autores descrevem a atividade inibitória da eleuterina e
isoeleuterina contra a replicação do vírus HIV em H9 linfócitos. ALVES et al
(2003) isolou e identificou eleuterinona como componente fungitóxico.
β-sitosterol é o fitosterol predominante entre as espécies, comumente
encontrado no Reino Vegetal, o campesterol, estigmasterol, avenasterol e
brassicasterol
são
os
constituintes
encontrados
com
menor
freqüência
(CARRIERI & ELVIRI, 2001). Eles vêm sido reconhecidos como uma das
substâncias que possuem atividade biológica contra câncer. O β-sitosterol é
utilizado como antiinflamatório, anti-pirético, anti-neoplástico e modulador da
atividade imunológica. Além disso, este esteróide ajuda na redução do colesterol
existente no plasma dos seres humanos (GIESI, 2005).
2.3
Constituinte químico do metabolismo secundário em vegetais
Metabolismo é o conjunto de reação química que frequentemente ocorre
em cada célula. A presença de enzimas específicas garante certa direção a essas
reações, estabelecendo o que se denomina rotas metabólicas. Os constituintes
químicos formados, degradados são chamados de metabólitos e as reações
enzimáticas
envolvidas,
respectivamente,
são
denominadas
anabólicas
catabólicas ou de biotransformação (SIMÕES, 2002).
Os metabólitos secundários são assim chamados, em função de não estar
bem definido o seu papel no metabolismo de muitos organismos. Estudo mais
recente acredita-se que a maioria dos metabólitos secundários cumpre função de
defesa contra predadores e patógenos atuando como agentes alelopáticos, onde
os metabólitos são liberados para exercer efeitos sobre outras plantas e de atrair
polinizadores ou dispersores de sementes (SWAIN, 1973; LEVIN, 1976;
CRONQUIST, 1977)
Os grupos de metabólitos secundários tradicionalmente mais importantes
são os alcalóides, os terpenóides e os flavonóides. Entretanto, o grupo dos
21
esteróides e das quinonas vem destacando-se por suas propriedades biológicas
(SIMÕES, 2002).
2.4
Classe de substância
2.4.1 Esteróides
Os esteróides são uma classe de composto estruturalmente muito
semelhante. Possuem um esqueleto formado por quatro anéis fundidos, três de
seis membros e um de cinco membros, ilustrado na figura 5. O anel de cinco
membros pode estar ou não ligada uma cadeia de tamanho variável. A posição
três está oxidada, com um grupo hidroxila ou carbonila. Estes compostos estão
distribuídos nos organismos vivos e incluem os hormônios sexuais, a vitamina D e
os esteróis, tais como o colesterol e a digitalina, presentes na dedaleira
(SCHAEFFER, 2001).
Figura 5: Estrutura básica de um esteróides
Dentre os esteróides destacam-se as progestinas que têm sido
amplamente utilizadas como fármacos nas últimas décadas (LUZ, A. A. M. 2005).
A complexidade estereoquímica dos esteróides deriva do elevado número
de centros estereogênicos e da junção trans entre os anéis C e D presente na
maioria deles (COREY, E. J. et al., 1999).
biológicos
que
provocam
pronunciados
São importantes reguladores
efeitos
fisiológicos
sexuais,
22
adrenocorticóides, vitaminas D e outros capazes de provocar problemas
cardíacos. O Brasil os importa em larga escala para o controle de natalidade e de
várias doenças.
O colesterol, um dos esteróides mais importantes, é um composto de
membranas celulares, também em grande quantidade no cérebro e fígado,
porém, nem todas as suas funções biológicas são estabelecidas. A cortisona e
seus derivados estão envolvidos na manutenção do balanço eletrolítico em fluídos
do organismo.
Estudos apontam que a mistura de esteróides, estigmasterol, β-sitosterol,
Campesterol, encontrada em vegetal, contribuem para atividade antinociceptiva
(MEYRE-SILVA et al., 1999). O composto β-sitosterol tem sido associado á
atividade antitumoral (PARK et al., 2003; JU et al., 2004).
2.4.2 Alcalóides
Os alcalóides podem ser definidos como sendo bases nitrogenadas
orgânicas encontradas principalmente em plantas, porém em menor extensão em
animais e microorganismo. Um ou mais átomos de nitrogênio estão presentes,
sendo tipicamente classificados como aminas primárias, secundárias ou
terciárias, o que confere o caráter básico dos alcalóides, facilitando seu
isolamento e purificação.
Segundo a definição de PELLETIER (1988), é uma substância orgânica, de
origem natural, cíclica, contendo um nitrogênio em estado de oxidação negativo e
cuja distribuição é limitada entre os organismos vivos. . Apesar de vários outros
pesquisadores terem tentado definir essa classe de substâncias, ainda não se
chegou a uma definição perfeitamente abrangente.
O grau de basicidade varia extensamente, dependendo da estrutura do
alcalóide e da presença e localização de outros grupos funcionais (DEWICK,
2002). A figura 06 mostra exemplo de um alcalóide isolado de plantas
leguminosas (BIERER et al., 1998).
23
CH3
N
N
Figura 6: substância Criptolepina isolada de plantas leguminosas
Os alcalóides constituem-se num vasto grupo de metabólitos com grande
diversidade estrutural, comparável aos terpenóides, representando cerca de 20%
das substâncias naturais descritas. Esse grupo químico tem apresentado um
grande impacto através dos tempos na economia, medicina e em outros setores
sociais e políticos.
Devido ao elevado número de atividade biológica atribuída aos alcalóides,
estes continuam sendo objetos de estudos. Muitos outros alcalóides foram e
continuam sendo descritos e seu uso introduzido na terapêutica, como, por
exemplo, os alcalóides antitumorais isolados de Catharanthus roseus G. Don.
(HENRIQUES, KEBER et al., 1999). Este composto apresenta sempre ação
farmacológica ou tóxica quando administrado em animais
O amplo espectro de atividades biológicas reportadas aos alcalóides
pode ser relacionado com sua variedade estrutural (KUTCHAN, 1995).
2.4.3 Flavonóides
Os flavonóides são compostos fenólicos provenientes do metabolismo
secundário e compreendem uma das maiores classes de produtos naturais,
juntamente com isoprenóides e alcalóides (SHIRLEY, 1996). Eles podem estar
presentes em diferentes órgãos das plantas como nos frutos, onde são
particularmente abundantes (UGAZ, 1998).
São responsáveis, na planta, pela coloração das flores, também
denominados pigmentos. Estruturalmente, os flavonóides são caracterizados pelo
esqueleto de carbono C6-C3-C6 (PETERSON, DWYER, DSC, 1998), que
24
apresentam-se freqüentemente oxigenados nas posições 5, 7 e 4’. Um grande
número de esqueletos flavonoídicos apresenta ligações com moléculas de
açúcares. Esta forma é chamada de conjugada e também conhecida como
heterosídeo (UGAZ, 1998). A figura 7 mostra flavona isoorientina, exemplo de
flavonóide
que
possui
atividade
hipoglicemiante
(ANDRADE-CETTO,
WIEDENFELD, 2001).
Figura 7: Flavona isoorientina, extraída
da Cecropia obtusifolia Bertol
Cecropiaceae.
Nas plantas, os flavonóides desempenham diversas funções, tais como a
proteção dos vegetais contra a incidência de raios ultravioleta e luz visível, além
de proteção contra insetos, fungos, vírus e bactérias, a atração de animais com a
finalidade de polinização, antioxidantes, o controle da ação de hormônios
vegetais, o de agentes alotrópicos e inibidores de enzimas (HARBORNE e
WILLIAMS, 2000). Podem ser utilizados como marcadores taxonômicos, devido a
sua abundância relativa em quase todo reino vegetal, a sua especificidade em
algumas espécies, a relativa facilidade de identificação e estabilidade, o seu
acúmulo com menor influência do meio ambiente (HARBORNE, 1989).
25
2.4.4
Tepernos
Os terpenos pertencem à família mais ampla e diversificada de substâncias
naturais produzidas da maneira primária por uma grande variedade de plantas.
Quando os terpenos são modificados quimicamente, seja pela oxidação ou pelo
rearranjo da cadeia carbônica, os compostos resultantes são geralmente
chamados de terpenóides (PORTALFARMA, TERPENOS).
O verdadeiro precursor dos terpenos é o ácido mevalônico, que provém da
acetilcoenzima A. Em todo o caso a divisão da estrutura dos terpenos em
unidades do isopreno é útil e é muito utilizada (PORTALFARMA, TERPENOS).
Os compostos terpenóides representam a segunda classe com maior
número de constituintes ativos, assim como os alcalóides, estão subdivididos em
várias subclasses. Estes constituintes possuem uma composição molecular típica
C10H15 e são assim denominados devidos á sua origem na espécie Pistacia
terebinthus.
A figura 8 mostra exemplo de triterpenos isolados da espécie
Agarista mexicana (PEREZ-GUTIÉREZ, VARGAS, 2002).
.
Figura 8: Triterpenos isolados da Agarista mexicana.
Terpenos e os terpenóides são os principais componentes de óleos
essenciais, de muitas plantas e flores. As variações sintéticas desses compostos
naturais expandiram muito a variedade de aromas usados em perfumaria e em
temperos usados nos alimentos.
26
2.4.5 Quinonas
Quinonas são compostos orgânicos que podem ser considerados como
produtos da oxidação de fenóis; da mesma forma, a redução de quinonas pode
originar os correspondentes fenóis. Sua principal característica é a presença de
dois grupos carbonílicos que formam um sistema conjugado com pelo menos
duas ligações duplas C-C. Apenas algumas nafto-, antra- e fenantraquinonas
podem ser classificadas como substâncias com caráter aromático. As o- e pquinonas são 1,2- e 1,4 dicetonas cíclicas conjugadas; m- ou 1,3-quinonas não
existem (TOMSON, R. H 1997). A figura 9 mostra exemplos de quinonas.
Figura 9: Exemplos de quinonas
Estas substâncias representam uma ampla e variada família de metabólitos
de distribuição natural (TOMSON, R. H 1997 ; BARREIRO E. J 1996). Nos últimos
anos intensificou-se o interesse nestas substâncias, não só devido à sua
importância nos processos bioquímicos vitais, como também ao destaque cada
vez maior que apresentam em variados estudos farmacológicos.
27
Na natureza, estão envolvidas em etapas importantes do ciclo de vida de
seres vivos, principalmente nos níveis da cadeia respiratória e da fotossíntese,
como por exemplo as ubiquinonas (1a) e as plastoquinonas (1b) (GOODWIN, T.
W. et al., 1972). De um modo geral, as quinonas naturais mais representativas
são de vital importância para vegetais superiores, artrópodes, fungos, liquens,
bactérias, algas e vírus.
Em
estudos
farmacológicos
as
quinonas
mostram
variadas
biodinamicidades, destacando-se, dentre muitas, as propriedades microbicidas,
tripanossomicidas, viruscidas, antitumorais e inibidoras de sistemas celulares
reparadores, processos nos quais atuam de diferentes formas. Outra atividade
marcante destas substâncias, descoberta um tanto recentemente, é a inibição do
complexo das topoisomerases, ação que provoca o desencadeamento da
apoptose celular (suicídio celular) (DI STASI 1996).
Estes últimos anos foram isoladas quinonas com diversas atividades
biológica importantes, como exemplo as naftoquinonas trimérica conocurvona,
que apresenta atividade inibitória da replicação do vírus HIV (DECOSTERD et al.,
1993) e a naftoquinonas de Avicennia que demonstraram potente atividade
quimioprotetora contra carcinogênese.
2.5
Métodos de extração utilizados para isolamento de compostos ativos
A seletividade dos compostos ativos almejados durante o processo de
isolamento, vai depender, em grande parte, das operações de transformação da
matéria vegetal, técnicas de extração e, sobretudo, dos parâmetros de
solubilidade na relação solvente/soluto (MARTIN, A. e BUSTTAMANTE, P. 1993).
A extração inicial através de um processo de maceração com um solvente
de baixa polaridade consiste em um método, entre os usuais no âmbito de
produtos naturais, bastante utilizado para obtenção de compostos de caráter
lipofílico (ORTEGA, G. G. 2000). Frações de polaridades crescentes podem ser
obtidas por técnicas de particionamento, utilizando-se sistemas de líquidos
extratores de maior polaridade.
28
2.5.1 Maceração
A maceração é um processo estático, não exaustivo, fortemente
dependente do tipo de farmacógeno, da seletividade do líquido extrator e
solubilidade dos compostos-alvos. Realizada em temperatura ambiente, recipiente
fechado, durante um período pré-estabelecido, sob agitação ocasional e sem
renovação do líquido extrator. Pela sua natureza, não conduz ao esgotamento
total da matéria prima vegetal, seja devido, a saturação do líquido extrator ou ao
estabelecimento de um equilíbrio difusional entre o meio extrator e o interior da
célula (LIEBERMAN, N. H. A. et al., 1990).
Diversas variações desta operação podem ser realizadas com a intenção,
essencialmente, de aumentar a efetividade da extração como é o caso da
digestão (maceração a quente), maceração dinâmica (feita sob agitação
constante), maceração escalonada e remaceração (LIST, P. H.; SCHMIDT, P. C.
1989). Este processo fica restrito quando se trabalha com substâncias ativas
pouco solúveis e plantas com elevado índice de intumescimento e possíveis
proliferações microbianas.
2.5.2 Percolação
A percolação (extração a frio), ao contrário da maceração é um processo
dinâmico, onde se faz o arrastamento do princípio ativo pela passagem contínua
do líquido extrator, levando ao esgotamento da planta através o gotejamento lento
do material. Também permite obter soluções extrativas mais concentradas,
gradiente de polaridade, economia do líquido extrator e tempo relativamente curto
(VOIGT, R. 1993). A percolação é indicada em processos extrativos de
substâncias farmacologicamente, muito ativas, presentes em pequena quantidade
ou pouco solúveis (HOUGHTON, P. J. & RAMAN, A. 1998).
Esse processo é pouco recomendável para plantas com elevado teor de
substâncias solúveis e as que aumentam a viscosidade durante o processo. A
extração de Soxhlet, em nível laboratorial, também não deixa de ser um tipo de
percolação cíclica, com destilação simultânea e reaproveitamento do solvente
(SONAGLIO, D. et al., 2001).
29
Para uma única extração (a frio ou a quente) usa-se geralmente um
solvente polar (MeOH ou EtOH); para mais de uma extração utiliza-se três tipos
de solventes: apolar (hexano ou éter de petróleo), de polaridade moderada (CHCl 3
ou CH2Cl2) e polar (MeOH ou EtOH).
2.6
Métodos cromatográficos
Dentre os usuais métodos de análise, a cromatografia ocupa sem dúvida,
um lugar de merecido destaque no que concerne à separação, identificação e
quantificação de espécies químicas (SKOOG, D. A. 2002).
A cromatografia compreende um grupo diversificado que permite separar
componentes muitos semelhantes de misturas complexas, no qual a amostra é
transportada por uma fase móvel podendo ser um gás, um líquido ou um fluído
supercrítico. Essa fase móvel é então forçada através de uma fase estacionária,
imiscível e fixa. Como conseqüência dessas diferenças de mobilidade, os
componentes da amostra se separam em bandas ou zonas discretas que podem
ser analisadas qualitativa ou quantitativamente (HOSTETTMANN, K. et al., 1997).
Esse método de analise direciona o estudo fitoquímico para o isolamento,
purificação e caracterização específicas descritos previamente na literatura, para
as classes de substâncias.
Esta investigação preliminar de constituintes químicos representa, muitas
vezes, um estímulo motivador da curiosidade, já que possibilita o conhecimento
prévio dos extratos e indica a natureza das substâncias presentes, facilitando a
escolha de técnicas de fracionamento cromatográfico. As principais classes de
constituintes químicos de plantas que podem ser detectadas com a aplicação de
testes analíticos padrões são: ácidos graxos; terpenóides; esteróides; fenóis;
alcalóides; cumarinas e flavonóides (MATOS, F. J. A. et al., 1971).
2.6.1
Cromatografia em coluna (CC)
A Cromatografia em Coluna, uma das técnicas mais utilizadas, é um
processo de separação entre duas fases, uma sólida uma líquida, baseada na
30
capacidade de adsorção e solubilidade, onde o equilíbrio dinâmico é estabelecido
entre a concentração do soluto em duas fases. A mistura a ser separada é
submetida a um sistema crescente de polaridade (SKOOG, D. A. 2002).
O fluxo do solvente deve ser contínuo e os diferentes componentes da
mistura vão se deslocar com velocidades distintas dependendo da sua afinidade
relativa pelo adsorvente ou eluente (interação dos constituintes químicos com os
adsorventes e os eluentes). Assim a capacidade de um determinado eluente em
arrastar um composto adsorvido na CC depende quase diretamente da polaridade
do solvente em relação ao composto. Os compostos apolares passam através da
coluna, com uma velocidade maior do que os compostos polares, porque os
primeiros têm menor afinidade com a fase estacionária (HOUGHTON, P. J. &
RAMAN, A. 1998).
Fase móvel
(eluente)
Amostra
Fase
estacionária
(adsorvente)
Figura 10: Coluna cromatográfica
Os adsorventes (FE) empregados na cromatografia em coluna também são
usados na cromatografia em camada delgada. A diferença reside no tamanho das
partículas, da ordem de 63 a 200 m para a CC, e para a CCD é de 5 a 40 m. O
material utilizado para a esta fase, incluem Sílica (SiO2), de caráter fracamente
ácido e empregado na separação de compostos lipofílicos como, aldeídos, fenóis,
cetonas, ácidos graxos, alcalóides, terpenos, esteróides (HUIE. C. V. A. 2002). A
Alumina (Al2O3), é outra fase estacionária que pode ser usada, possui caráter
31
alcalino. O sephadex, que é outra fase estacionária usada com freqüência, onde a
separação se faz por diferença de peso molecular.
Os eluentes (FM) têm a função na cromatografia por adsorção, ou seja, é a
função solvente propriamente dito. As fases móveis devem ter baixo ponto de
ebulição (35-85 °C) para que sejam evaporadas facilmente. A segunda função é
promover o desenvolvimento dos componentes da mistura na coluna e remover
ou dessorver esses componentes dos adsorventes seletivamente; levando em
consideração as relações de solubilidade dos componentes da mistura a ser
cromatografada. Nesse caso, é dita eluente (BONATO, P. S. et al., 2006).
Os solventes são selecionados de acordo com o seu poder eluentes, isto é,
de acordo com a habilidade de dessorver do adsorvente as substâncias (o
adsorvato) nele fixadas. A tabela 01 mostra os eluente colocados em ordem
crescente de polaridade (série eluotrópica).
Tabela 01: Série de eluentes com ponto de ebulição baixo, em ordem crescente
de polaridade.
Eluentes em ordem crescente de polaridade
Hexano
Éter de petróleo
Cicloexano
Tolueno
Diclorometano
Clorofórmio
Éter etílico
Acetato de etila
Piridina
Acetona
Etanol
Metanol
Ácido acético
32
2.6.2 Cromatografia em camada delgada
Constitui
um
método
de
Cromatografia
planar
como
também
a
Cromatografia em Papel (CP) e Eletrocromatografia. A fase móvel desloca-se
através da fase estacionária por ação de capilaridade, algumas vezes assistida
por potencial elétrico ou gravitacional. A Figura 11 mostra um esquema da
cromatografia e cama delgada.
Placa cromatográfica
Solvente
Plote
Original
Plote
1,0
cm
0,5-1,0
cm
Solvente
Figura 11: Cromatografia em camada delgada
A CCD apesar de sua simplicidade, baixo custo, tem a vantagem de ser
rápida e de simples execução. É uma técnica eficaz que possibilita o
monitoramento e otimização durante a avaliação do perfil fitoquímico e
biossintético, possibilitando a observação dos compostos em isolamento
(CORDEL G. 1995). Alguns profissionais da área adotam a posição de que os
experimentos de camada delgada sempre devem preceder os experimentos de
cromatografia em coluna, porque, em termos teóricos os tipos de fases móvel e
estacionária e as aplicações da CCD e CC são notavelmente similares .
A preparação manual das placas cromatográfica consiste em uma mistura
de sílica e água destilada, esta mistura é espalhada com o emprego de um
espalhador em uma lamina de vidro. Como exemplo, Na preparação de 5 placas
33
20 x 20 cm como uma espessura da camada ao redor de 0,3 mm, misturam-se 30
g de sílica com 60-70 mL de água destilada.
As pré-fabricada, apesar de terem um custo bem mais elevados,
dispensam a fase de preparação e são bem mais uniformes e homogêneas, o
que, sem dúvida melhora a separação e torna os valores de RF (fator de
retardamento) mais reprodutíveis. A desvantagem desta técnica é a perda de
rendimento inerente à interação dos compostos com a fase estacionária
(BONATO, P. S. et al., 1998). A camada de adsorvente está depositada sobre
uma lâmina de material plástico (ácido politeraftálico), de alumínio ou de vidro.
São pré-cortada geralmente nos tamanhos 5 x 20 cm e 20 x 20 cm, e com a
espessura da camada de adsorvente variando entre 0,1 a 2,0 mm de espessura,
para fins preparativos.
O tempo e a temperatura utilizados para a ativação estão na dependência
do adsorvente utilizado e da atividade desejada. Temperatura mais elevadas, por
tempo prolongado, tornam a maioria dos adsorventes mais ativos. Sílicas, alumina
e terra diatomácea são ativadas a 105-110 °C por 30 a 60 minutos. A celulose
não deve ser aquecida por mais de 10 minutos a 105 °C. As placas podem ser
conservadas, prontas para uso, em ambientes secos como dessecadores ou
caixas semelhantes a estantes fechadas (BONATO, P. S. et al., 2006).
2.6.3
Cromatografia flash
A Coluna “flash” é um outro tipo de cromatografia de baixo custo e fácil
manuseio, similar a CC comum, por empregar a mesma sílica da CC de
granulometria fina, com a diferença de utilizar uma bomba de pressão para
promover a agilidade do processo. A coluna “flash” requer cuidados com
compostos sensíveis à contaminação (por ser lento o tempo de contato) e a
possibilidade de degradação de compostos pouco estáveis (BARTON, D.; OLLIS,
W. D. 1986). A figura 12 mostra um esquema de coluna flash.
34
Pastilha do extrato EtOH
+ o adsorvente
Adsorvente com eluente
Algodão
FiFigura 12: Coluna flash
2.7
Reveladores de cromatogramas
Após o desenvolvimento do cromatograma, as placas são secas e
reveladas. Essa última etapa consiste em tornar visíveis as substâncias incolores
presente na amostra. A visualização pode ser feita por meio de métodos físicos
ou químicos, podendo também ser biológicos, como no caso da utilização de
reações enzimáticas ou bacterianas.
Os reveladores, como vetores importantes para detecção de grupos
químicos devem ser representados pelos universais e específicos, ou aqueles já
consagrados classicamente como é o caso do anisaldeído sulfúrico, vapores de
iodo, solução de ácido sulfúrico, vanilina sulfúrica, lâmpadas de curto e longo
comprimento de ondas (254 –366 m), sulfato cérico, cloreto férrico (grupos
fenólicos), hidróxido de potássio 10% EtOH (cumarinas), Dragendorff (alcalóides),
Libermann- Bourchard (grupos esteroidais), ninhidrida (aminoácidos), reativo de
Mayer, indicadores fluorescentes, etc. (FARIAS, F. M. et al., 1984)
2.8
Processo de recristalização de sólidos orgânico
O processo de recristalização inclui, normalmente, a execução das
seguintes etapas seqüenciais: Dissolução da substância impura a uma
temperatura próxima do ponto de ebulição do solvente previamente selecionado;
35
Filtração da solução quente por gravidade de modo a eliminar qualquer impureza
insolúvel (BRENELLI, 2006).
Em geral, sólidos são mais solúveis em solventes à quente que em
solventes a frio. A quantidade máxima de sólido que se dissolverá por unidade de
volume de solvente (solubilidade) depende da temperatura. Quanto mais alta a
temperatura maior a quantidade de sólido que se dissolverá por volume de
solvente. Diminuindo-se a temperatura diminui a solubilidade do sólido no
solvente. Assim, se uma solução saturada quente é esfriada, o soluto em excesso
é forçado a precipitar (cristalizar) da solução. Se o processo for conduzido com os
devidos cuidados, o sólido recristalizado é mais puro do que era antes de
recristalização (BRENELLI, 2006).
Um bom solvente para recristalização deve: não reagir com o sólido
desejado ser facilmente removido do sólido desejado; dissolver uma quantidade
relativamente grande de sólido desejado a temperaturas altas (normalmente o
ponto de ebulição) ou não dissolver nada; dissolver impurezas em todas as
temperaturas ou não dissolver nada.
2.9 Bactérias Gram-positivas
A parede celular nas bactérias gram-positivas é constituída por camada
espessa, composta quase que completamente por peptídioglicano, é responsável
pela manutenção da célula e sua rigidez, essa estrutura é constituída por ácidos
teicóicos, que consistem principalmente em um álcool (como o glicerol ou ribitol) e
fosfato. Os ácidos teicóicos presentes nas bactérias gram-positivas podem ser
pertencentes a duas classes: ácido lipoteicóico, que atravessa a camada
peptidioglicana e está ligado à membrana plasmática, e ácido teicóico da parede,
que está ligado à camada de peptioglicana. Os ácidos teicóicos por sua vez,
fornecem a maior parte da especificidade antigênica da parede das bactérias
gram-positivas (TORTORA et al., 2005). O grau de virulência dessas bactérias
esta relacionado à exotoxina, composta pelo ácido lipoteicoico, tem como
característica principal a aderência.
36
2.9.1 Staphylococcus aureus
Os estafilococos ocorrem em grupos que se assemelham a cachos de uva,
constituem um dos principais grupos de cocos Gram-positivos (figura13). As
infecções por estafilococos podem ser desde triviais a rapidamente fatais. A
espécie estafilocócica mais importante para medicina é o Staphylococcus aureus,
sendo este mais virulento do gênero, denominado assim por causa da
pigmentação amarela das colônias (aureus = dourado). Os membros desta
espécie são anaeróbicos facultativos (TORTORA et al., 2005).
Fonte: www.thesahara.info/mrsa/staph-bio.jpg
Figura 13: Bactéria Staphylococcus aureus
As doenças causadas por este microrganismo podem ser classificadas
como somente superficiais, invasivas ou tóxicas (TRABULSI et al., 2005), sendo
que, quase todos os isolados desta espécie bacteriana secretam uma enzima
denominada coagulase, referidos de coagulase positiva (SCHAECHTER, 2002).
S. aureus produz muitas toxinas que contribuem para a patogenicidade das
bactérias, aumentando sua habilidade de invadir o corpo e danificar tecidos. A
infecção de cortes cirúrgicos por S. aureus é um problemas comum em hospitais;
37
e a habilidade de desenvolver resistência rapidamente aos antibióticos. Essa
espécie produz a toxina responsável pela síndrome do choque tóxico, uma
infecção grave caracterizada por febre alta e vômitos, alguma vezes ocasionando
a morte, também produz uma enterotoxina que causa vômitos e náusea quando
ingerida; esta é uma das causas mais comuns da intoxicação alimenta, e produz a
toxina esfoliativa, que causa a síndrome da pele escaldada em crianças (STROHL
et al., 2004).
2.9.2 Streptococcus sp.
Os membros do gênero Streptococus são bactérias gram-positivas
esféricas, que tipicamente ocorrem em cadeias ou pares (figura). A maioria
consiste em anaeróbicos facultativos, mas cresce fermentativamente mesmo na
presença de oxigênio. São grupos complexos, provavelmente responsáveis por
mais males e causando uma variedade maior de doenças que qualquer outro
grupo de bactérias. O principal patógeno no gênero é o S. pyogenes, as doenças
causadas por essa espécie são: a febre escarlatina, a faringite (dor de garganta),
erisipela, impetigo e febre reumática, a S. agalactiae é responsável pela
colonização do trato genital, resultando em sepse neonatal, S. penumoniae
responsável pela endocardite, pneumonia, otite e a menigite, dentre outras
(STROHL et al., 2004).
Fonte: www.microscopyconsulting.com
38
Figura 14: Bactéria Streptococcus sp.
Umas das características utilizadas para a classificação dos estreptococos
é sua ação sobre o agar-sangue. Os estreptococos alfa-hemolítica produzem uma
substância denominada alfa-hemolisina que reduz a hemoglobina (vermelha) à
metemoglobina (verde); esta redução causa o aparecimento de uma zona
esverdeada ao redor da colônia. Os estreptococos beta-hemolíticas, que
provocam a maioria das infecções estreptocócicas, produzem uma hemolisina
que forma uma zona de hemólise clara no agar-sangue. Algumas espécie não
têm nenhum efeito aparente sobre as células vermelhas do sangue, estas são
denominadas não-hemolíticas (TORTORA et al., 2005)..
2.9.3 Bacillus cereus
As bactérias do gênero Bacillus são tipicamente bastonetes que produzem
endósporos. Elas são comuns no solo e somente algumas são patogênicas para
humanos (figura 15). Diversas espécies produzem antibióticos (TORTORA et al.,
2005)..
Fonte: www.frilabo.pt/fcms/images/stories/bacillus.jpg
Figura 15: Bactérias Bacillus cereus
39
O bacilus cereus são bacterias Gram-positivos e anaeróbios facultativos,
responsável por doenças de origem alimentar. Os alimentos mais implicados em
provocar intoxicação são: alimentos com amido (arroz, batatas, legumes, feijão,
legumes cozidos, puré de batata), leite em pó, os cremes à base de leite e as
farinhas e pastelaria. O período de incubação varia entre 6 e 16 horas com um
início súbito de sintomas, diarreia aguda e vómitos ocasionais. Uma intoxicação
menos frequente pelo bacilo pode aparecer entre 1 e 6 horas após a ingestão do
alimento contaminado e manifesta-se por vómitos, náuseas e eventualmente
diarreia.
2.10 Bactérias Gram-negativas
A parede da célula Gram-negativa está composta por uma ou poucas
camadas de peptidioglicano e três outros componentes que a envolvem
externamente; lipoproteína, membrana externa e lipopolissacarídeo (figura). A
peptidioglicano esta ligada a lipoproteína na membrana externa e esta no
periplasma. As paredes celulares Gram-positivas não contêm ácidos teicóicos, e
possuem uma pequena quantidade de peptideoglicano, por essa razão essa
bactérias tornam-se suscetíveis ao rompimento mecânico Os lipopolissacarídeos
(LPS) que envolvem a membrana externa, atuam como antígenos bacterianos,
lipoproteínas e fosfolipídeos, e fornece um mecanismo de defesa a estas
bactérias, sendo uma barreira para certos antibióticos, enzimas digestivas,
detergentes entre outros. Entretanto, a membrana externa possui canais
protéicos, denominados de porinas, que permitem a passagem de moléculas
necessárias para o metabolismo bacteriano, sendo também a passagem para
alguns antibióticos (TORTORA et al., 2005).
2.10.1 Escherichia coli
A E. coli assume a forma de um bacilo e pertence à família das
Enterobacteriaceae. São aérobias e anaerobias facultativas. O seu habitat natural
é o lúmen intestinal dos seres humanos e de outros animais de sangue quente,
mas pode ser patogênica dentro ou fora do trato gastrointestinal (figura 16). E. coli
40
possui fímbrias ou pili que freqüentemente são importantes para a sua aderência
na superfície das mucosas do hospedeiro, e as diferentes cepas podem ser
móveis ou imóveis. A maioria das cepas de E. coli são capazes de fermentar a
lactose, sendo denominadas de lactose positiva. São todas anaeróbicas
facultativas, fermentam glicose e podem gerar energia por redução do nitrato a
nitrito (STROHL, 2004).
Fonte: www.fuga.ru/tok/2003/11/e-coli-small.jpg
Figura 16: Bactérias Escherichia coli
Essas bactérias podem causar infecções do trato urinário e de ferido,
certas linhagens produzem enterotoxinas que causam a diarréia, pneumonia em
pacientes imunossuprimidos hospitalizados e as meningites em neonatos são
outras formas comuns de infecções causadas por E. coli (KONEMAN et al., 2001).
Certas cepas de E. coli podem causar enterite ou gastroenterite por cinco
mecanismos diferentes que causam cinco síndromes distintas. As E. coli
diarreinogênicas podem ser denominadas de ETEC (E. coli enterotoxigênicas),
EPEC (E. coli enteropatogênica), EIEC (E. coli enteroinvasora), EHEC (E. coli
enterohemorrágica) e EEC (E. coli enteroagregativa) (KONEMAN et al., 2001).
41
2.10.2 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas se constituem de bastonetes gram-negativos aeróbicos que
se locomovem através de um único flagelo polar, ou por meios de tufos (figura17).
As Pseudomonas são muito comuns no solo e em outros ambientes naturais.
Cerca de 1/3 das amostras isoladas de casos clínicos é pigmentado e produz
colônias com uma cor verde ou verde-azulada característica, devido ao pigmento
hidrossolúvel piocianina (TODER, 2002).
Fonte: www.bookworld.com
Figura 17: Bactéria Pseudomonas aeruginosa
O patógeno humano P. aeruginosa, é amplamente distribuído na natureza
(figura 10). Pode colonizar seres humanos saudáveis sem causar doenças, mas
também é um patógeno oportunista significativo e uma causa importante de
infecções hospitalares, como a pneumonia, infecção do trato urinário, infecções
de feridas operatórias, infecções em queimaduras graves e em pacientes
recebendo quimioterapia para doenças neoplásicas (Strohl, 2004). A resistência
dessa bactéria à maioria dos antibióticos tem sido fonte de preocupação médica.
Essa resistência esta relacionado a produção de uma β-lactamase cromossomal,
42
a impermeabilidade da membrana, a capacidade de colonizar superfícies em
forma de biofilme, a presença de sistema de efluxo, a aquisição de plasmídeos de
resistência, entre outros, fazem com que poucos antibióticos sejam efetivos contra
esta espécie (TORTORA et al., 2005).
2.11 Teste de Difusão em Disco
Esse modelo experimental é um método qualitativo clássico para testar a
suscetibilidade de patógenos a antibióticos, também denominado de Método de
kirby Bauer de difusão em placa, neste teste observa-se o crescimento do
organismo (resistência a droga) ou a falta de crescimento (sensível a droga)
frente a antibióticos testes (STROHL et al., 2004).
43
3
3.1
OBJETIVO
OBJETIVOS GERAIS
 Realizar estudos químicos e testes antimicrobianos do extrato etanólico, e
substância isolada da Cipura Paludosa Aubl.
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Proceder à identificação das classes de substâncias presentes no extrato
etanólico e nas frações Acetato de etila e Clorofórmio da espécie em
estudo;
 Isolar e purificar os componentes químicos das frações Acetato de etila e
Clorofórmio provenientes do extrato etanólica;
 Submeter o extrato etanólico e substâncias isoladas, a avaliação da
atividade
antimicrobiana
frente
às
bactérias
Gram-positivas,
Staphylococcus aureus resistente a meticilina e Staphylococus aureus
sensível a meticilina, Streptococcus sp., Bacillus cereus, e Gram-negativas,
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.
44
4
MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi subdividido em várias fases, que se caracterizam
por coleta do material vegetal, confecção da exsicata, identificação botânica da
espécie utilizada para o estudo, secagem e maceração do material vegetal,
preparação do extrato etanólico, obtenção dos eluatos através de coluna filtrante,
isolamento de substâncias presentes no eluato EtOAc e CHCl3 , através de
colunas cromatográficas e processo de recristalização de sólidos.
4.1
Coleta e identificação botânica
A coleta do material vegetal ocorreu no dia 06 de dezembro de 2005, na
cidade de Porto Velho. Parte do material foi destinada à identificação e a outra
parte foi utilizada para a obtenção do extrato etanólico. A identificação foi
realizada no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e a exsicata da
planta foi depositada no herbário Dr. Ary Tupinambá Penna Pinheiro (Porto Velho
- RO) sob número 1782.
4.2
Obtenção do extrato etanólico
Preparação do extrato foi realizada no LABFITO (Laboratório de
Fitoquímica), conforme método descrito por Di Stasi (1996).
O material vegetal coletado foi devidamente lavado. Os bulbos, parte da
planta selecionada para a realização do estudo, foram cortados e pesados,
apresentando m=1.160g. O mesmo foi condicionado à estufa FANEM modelo
320-SE para secagem, onde permaneceu por 72 horas a temperatura constante
T=40°C, após este período o material vegetal seco foi novamente pesado
apresentando m=570g e em seguida macerado.
O extrato etanólico foi obtido através do processo de extração por
percolação (extração a frio), onde a parte da planta analisada foi posto em contato
com álcool etílico 95% (VETEC) por 07 dias, sendo posteriormente filtrado e
colocado em contato com o respectivo solvente por mais 14 dias. Após um
período de 21 dias foi possível obter o material filtrado. Este foi devidamente
45
evaporado através de um evaporador rotativo (FISATOM mod. 802A) e um
aparelho de banho-maria (BIOPAR). Após este procedimento foi obtido o extrato
etanólico cuja massa obtida foi 137,631Kg. (tabela 02).
Tabela 2: Massa e porcentagem do material utilizado para a obtenção do Extrato
Etanólico.
4.3
Material Coletado
Quantidade (g)
%
Material vegetal fresco
1.160
100
Material vegetal seco
570
49,13
Extrato etanólico
137,631
11,86
Teste para classe de substância
O extrato etanólico e os eluatos de
EtOAc CHCl3 foram submetidos a
testes específicos para as principais classes de substâncias que foram realizados
segundo procedimentos descritos por Merck (1972).
4.3.1 Esteróides e Terpenos
Dissolveu-se uma pequena quantidade do extrato etanólico em 1mL de
clorofórmio (CHCl3), na capela, adicionou-se 1,0mL de anidrido acético
(CH3CO)2O e 04 gotas de ácido sulfúrico (H2SO4). A coloração verde indica teste
positivo para esteróides e a coloração vermelha positivo para terpenos. O mesmo
procedimento foi realizado para o eluatos CHCl3, EtOAc.
4.3.2 Flavonóides
Foi utilizado 1,0mL de etanol para dissolver uma pequena quantidade do
extrato de Cipura paludosa, onde foi adicionado uma pequena porção de
magnésio em fitas e adicionou-se 0,5mL de ácido clorídrico concentrado (HCl). A
coloração avermelhada indica teste positivo para flavonóides. Para os eluatos
CHCl3, EtOAc a mesma metodologia foi utilizada.
46
4.3.3 Alcalóides
Uma pequena alíquota do extrato etanólico foi solubilizada em HCl,
posteriormente adicionou-se algumas gotas de solução de Dragendorff (solução
de iodeto de potássio e subnitrato de bismuto). A formação de um precipitado
semelhante à flocagem de coloração laranja indica teste positivo. O mesmo
processo foi utilizado com os eluatos CHCl3, EtOAc para possível identifição
dessa classe de substâncias no mesmo.
4.3.4 Saponinas
Uma pequena porção do extrato foi solubilizada em água destilada, agitouse o recipiente a fim de visualizar a formação de espuma. A formação de espuma
na solução indica teste positivo. Repetiu-se o teste para os eluatos CHCl3, EtOAc.
4.3.5 Quinonas
Uma pequena alíquota do extrato foi colocado em placa cromatográfica,
observou-se a coloração da substância à luz ultravioleta (UV). Em seguida, foi
borrifada um pouco de solução de amônia na placa. Se a coloração da amostra à
luz UV indicar uma coloração azul-violeta ou vermelha, indica teste positivo para
quinonas. O teste foi realizado também para os eluatos CHCl3, EtOAc.
4.4
Teste com extrato etanólico
O perfil cromatográfico preliminar do extrato foi realizado em CCD,
utilizando placa cromatográfica em gel de sílica ( m 2-25 sobre poliéster T –
6145 da Merck e da Sigma Chemical CO, Para visualização da fluorescência dos
compostos rastreados por CCD, utilizou-se de radiação ultravioleta na faixa de 24
m).
O extrato (m=0,0231g) foi solubilizado em MeOH, em seguida, com a ajuda
de um capilar, a solução do extrato etanólico foi aplicada a 1,0cm da base da
47
placa, de modo a obter uma mancha. Após esse procedimento a placa foi
colocada em uma câmara de eluição. Os solventes utilizados nas eluições
cromatográficas
foram:
Hexano,
CHCl3,
EtOAc
e
MeOH.
As
placas
cromatográficas foram submetidas à pulverização com revelador universal
(mistura de 80% etanol; 10% ácido acético; 10% ácido sulfúrico) afim de revelar
as substâncias adsorvidas na mesma.
Em seguida, fez-se uma coluna teste (Flash), com o objetivo de observar
uma possível reação da Sílica Gel, utilizada como fase estacionária em coluna
filtrante, com as substâncias presentes no extrato etanólico da C. paludosa.
Foi preparada uma pastilha do extrato, m=0,0548g, utilizando sílica gel 60
(0,063-0,200mm) (70-230MESH). Utilizou-se uma coluna de 2,0cm de diâmetro,
que foi preparada com Sílica gel 60 e hexano. Após a preparação da fase
estacionária, a pastilha, foi inserida na coluna, sendo eluída com solventes em
gradiente de eluição, sendo eles: Hexano, EtOAc:Hexano, EtOAc, MeOH:EtOAc e
MeOH. Foram obtidas as seguintes frações (tabela 3).
Tabela 3: Coluna flash (teste) do extrato etanólico da C. paludosa
Fração
Polaridade
%
0
Hexano
100
1-2
EtOAc:Hexano
50
3-4
EtOAc
100
5-7
MeOH:EtOAc
50
8-10
MeOH
100
Em seguida, fez-se CCD para observar a suposta decomposição das
substâncias do extrato com a sílica, que foi realizada utilizando cada fração
extraída da coluna teste, que posteriormente seriam comparadas com as análises
do extrato etanólico, que serviria como padrão. Assim sendo, os solventes
orgânicos utilizados nas eluições e o método de revelação foram os mesmos
utilizados com o extrato etanólico.
48
A cromatografia em CCD utilizada para verificar uma possível degradação
das substâncias junto à sílica gel não mostrou nenhuma interação entre uma e
outra, o que possibilitou dar continuidade ao trabalho.
4.5
Fracionamento do extrato etanólico
O procedimento de fracionamento do extrato bruto descrito é baseado em
Ferri (1996)*. O extrato bruto da C. paludosa, foi submetido à coluna filtrante,
onde em um funil de separação (1000 mL), contendo um tampão de algodão em
sua extremidade, foi utilizada como fase estacionária sílica gel (0,04-0,063mm)
(230-400 MESH), embebida em hexano, afim de obter uma homogeneidade no
preenchimento da coluna. Após assentamento da sílica foi adicionado
suavemente a pastilha. Em seguida, a eluição foi efetuada utilizando os seguintes
solventes: Hexano, CHCl3, EtOAc, Acetona e MeOH, seguindo um gradiente de
ordem crescente de polaridade. As frações foram coletadas em erlermeyers e
posteriormente foram evaporadas, utilizando evaporador evaporativo obtendo-se
assim os eluatos (Tabela 4).
Tabela 4: Eluatos obtidos a partir do extrato etanólico
Eluato (Fração)
Polaridade
Massa(g)
1-5
Hexano
0,4433
6-43
Clorofórmio
15,0065
44-70
Acetato de Etila
8,9366
71-90
Acetona
8,2922
91-97
Metanol
15,8147
O diâmetro da coluna cromatográfica e os solventes utilizados nos
processos de cromatografia em coluna dependeram da quantidade de material
utilizado no processo e a polaridade do mesmo. As frações coletadas através da
coluna cromatográfica foram analisadas por CCD, comparadas e reunidas
seguindo o critério de semelhança no perfil cromatográfico.
Diante dos bons resultados adquiridos pelo processo de analise
fitoquímicos anteriores da espécie Cipura paludosa Aubl. Damos continuidade na
49
pesquisa, com os eluatos EtOAc e CHCl3, com o objetivo de isolar e purificar os
composto químicos existente no extrato.
Coleta do material
Secagem e
maceração do
material material
Confecções e
exsicata
Identificação
Botânica
Extrato etanólico
Teste para classe
de substância
Eluato
Hexano
(C6H14)
Eluato
Clorofórmio
(CHCl3)
Eluato
Acetato
(EtOAc)
Eluato
Acetona
(C3H6O)
Eluato
Metanol
(MeOH)
Isolamento por
cromatografia
Figura 18: Organograma dos métodos desenvolvidos preliminares para estudo
da
4.6C. paludosa.
Fracionamento do eluato EtOAc
50
4.6
Fracionamento do eluato de EtOAc
A partir de 8,9366g da fração Acetato de Etila oriunda do extrato etanólico
do bulbo (raiz) da Cipura paludosa aubl. Foi macerado com sílica gel 60 (0,0630,200mm) (70-230MESH) afim de obter uma pastilha para ser inserida na coluna
cromatográfica. A coluna utilizada de diâmetro 6,0cm foi preparada com sílica gel
60 (0,063-0,200mm) (70-230MESH) e hexano. Após o assentamento da sílica na
coluna a pastilha foi inserida lentamente. A eluição foi feita com solventes
seguindo gradiente de ordem crescente de polaridade, Hexano, EtOAc:Hexano,
EtOAc) fornecendo 229 frações (tabela 5).
Tabela 5: Frações obtidas do fracionamento do Eluato EtOAc através das
análises de CCD
Frações
A – 01 – 04
M - 87 – 100
B – 05 – 13
N - 101 – 114
C – 14 – 21
O - 115 – 122
D – 22 – 28
P - 123 – 130
*E – 29 – 32
Q - 131 – 140
*F – 33 – 36
R - 141 – 149
G - 37- 46
S - 150 – 158
H - 47 – 49
T - 159 – 169
I - 50 – 58
U - 170 – 181
J - 59 – 71
V - 182 – 200
K – 72
X - 201 – 229
L – 73 - 86
4.7
__
Aplicação do método de cromatografia em CCD
A Metodologia descrita é baseada em Ferri (1996). As frações coletadas da
coluna cromatográfica foram analisadas por CCD, utilizando placa cromatográfica
em gel de sílica (24 m). Cada fração, separadamente, foi aplicada na placa
51
cromatográfica. Após esse procedimento a placa foi colocada em uma câmara de
eluição, utilizando nas eluições Hexano, EtOAc.
As frações obtidas e analisadas por CCD foram reunidas seguindo o
critério de semelhança no perfil cromatográfico, sendo reveladas por UV (254 m)
e/ou por pulverização com revelador universal seguido de aquecimento em estufa
a 100°C por aproximadamente 05 min.
4.8
Fracionamento do eluato CHCl3
O processo de fracionamento e perfil cromatográfico em CCD descrito para
o eluato EtOAc, foi o mesmo utilizado para o eluato de CHCl 3 sendo que foi
utilizada 15,0065g do eluato, e para a eluição no fracionamento utilizou os
seguintes solvente: Hexano, EtOAc:Hexano, EtOAc, acetona:Hexano, acetona e
MeOH, e Fornecendo as seguintes frações descritas na (tabela 6).
Tabela 6: Frações obtidas do fracionamento do Eluato CHCl3 através das
análises de CCD.
Frações
A - 01-22
N -507-528
B - 23-70
O - 529-539
C - 71-100
P - 540-552
D - 101-130
Q - 553-589
*E - 131-170
R - 590-610
*F - 171-190
S - 611-646
*G - 191-220
T - 647-659
H - 221-349
U - 660-671
I - 350-390
V - 672-692
J - 391-410
X - 693-728
K - 411-462
Z - 729-815
L - 463-483
Y - 816-900
M - 484-506
W - 901-988
52
Extrato Etanólico
Eluato
Hexano
(C6H14)
Eluato
Clorofórmio
(CHCl3)
Eluato
Acetato
(EtOAc)
Eluato
Acetona
(C3H6O)
Eluato
Metanol
(MeOH)
Coluna
Cromatográfica
B
A
O
C
P
D
Q
E
R
F
G
H
S
I
J
T
K
U
L
V
M
X
As frações 29-32; 33-36
Foram recromatografada.
Figura 19: Organograma com os procedimentos realizados para o fracionamento
do eluato de EtOAc.
53
Extrato Etanólico
Eluato
Hexano
(C6H14)
Eluato
Clorofórmio
(CHCl3)
Eluato
Acetato
(EtOAc)
Coluna
Cromatográfica
A
N
B
O
C
P
Eluato
Metanol
(MeOH)
26 Frações
D
Q
Eluato
Acetona
(C3H6O)
E
R
F
S
G
T
H
U
I
V
J
X
K
Z
L
Y
M
W
Fase de
recromatografia
aa
Fase de
purificação
Figura 20: Organograma com os procedimentos realizados para o fracionamento
do eluato de CHCl3.
54
4.9
Análise das frações do eluato de EtOAc.
As frações do eluato de EtOAc foram organizadas em ordem alfabética
sendo submetidas à cromatografia de camada delgada (CCD) e reveladas por UV
(254 m) e por pulverização com o revelador universal, seguido de aquecimento a
100°C, em seguida reunidas de acordo com a semelhança dos perfis. Observouse após o procedimento através do perfil cromatográfico mais de uma substância
e impurezas nas amostras.
As amostras E (29-32) e F (33-36) por terem apresentado formação de
cristais e perfil cromatográfico semelhantes, foram reunidas e submetidas a
métodos analíticos de isolamento com o processo de recromatografia.
As frações 29-32 e 33-36, depois de reunidas forneceram a m=0,4378g foi
recromatografada. Utilizou-se uma coluna de 3,0cm de diâmetro e sílica gel 60
(0,04-0,063mm) (230-400 MESH). Os solventes utilizados foram Hexano e EtOAc,
em gradiente de eluição, fornecendo 221 frações (tabela 7).
Tabela 7: Agrupamento de frações obtidas a partir da recromatografia da fração
29-32 e 33-36
Fração
01-20
83-100
21-25
101-121
26-30
122-130
31-38
131-142
39-43
143-152
44-47
151-169
48-55
170-190
56-64
191-211
65-71
212-221
72 - 82
__
As frações: 01-20, 21-25, 26-30, 26-30, 31-38, 39-43, 44-47, 48-55, 56-64,
65-71,
72-82
foram
reunidas
por
terem
apresentado
comportamento
cromatográfico semelhantes.
55
A fração 44-47 apresentou em seu perfil cromatográfico sinais de pureza.
Este foi submetido ao processo de recristalização.
4.10 Análise das frações do eluato de CHCl3.
As frações do eluato de CHCl3 também foram organizadas em ordem
alfabética, sendo submetidas ao mesmo processo em CCD e reveladores de
cromatograma, em seguida foram reunidas de acordo com perfil cromatográfico
semelhantes.
As amostras E (131-170); F (171-190); G (191-220) foram submetidas a
métodos analíticos de isolamento de substâncias. A primeira amostra foi
recromatografada a segunda e a terceira foram submetidas ao processo de
recristalização.
As frações 131-170 m=0,3185 foi recromatografada. Utilizou-se também
uma coluna de 3,0cm de diâmetro e sílica gel 60 (0,04-0,063mm) (230-400
MESH). Os solventes utilizados foram Hexano e EtOAc, em gradiente de eluição,
fornecendo 192 frações, que foram reunidas de acordo com seu comportamento
em CCD (tabela 8).
Tabela 8: Agrupamento de frações obtidas a partir da recromatografia da fração
131-170
Fração
01-05
59-68
06-10
69-82
11-15
83-95
16-20
96-115
21-25
116-132
26-30
133-151
31-35
152-164
36-42
165-183
43-58
184-192
56
Desta coluna as frações 9-12 e 21-25 foram reunidas por apresentarem
perfil cromatográfico semelhante e submetidas ao processo de recristalização.
As amostras F (171-190); G (191-220) foram submetidas a analise do perfil
cromatográfico e após o procedimento observou-se impureza. Para tentar eliminar
essas impurezas as amostras passaram por um processo lento de recristalização.
Os frascos que contém as amostras foram lacrados e envolvidos com papel
alumínio, para que os cristais fossem formados na ausência de luz, 10 dias depois
foi observado nos frascos a formação vários núcleos eqüidistantes e 07 dias
depois observou a formação de camadas sobre os núcleos, que possuem um
papel muito importante para a formação do cristal, pois selecionam as moléculas
corretas da solução resultando em cristais mais puros.
4.11 Teste antibacteriano
4.11.1 Microrganismos
Os microrganismos utilizados foram S. aureus sensível a meticilina, S.
aureus resistente a meticilina, Streptococcus sp. P. aeruginosa, E. coli e Bacillus
cereus. Todos cedidos pelo Laboratório de Microbiologia da Fundação Oswaldo
Cruz de Manaus.
Em todos os testes, um inóculo de cada cepa bacteriana foi suspendido em
5 mL de caldo de Soja-Tripticase (TSA/TSB) e incubados overnight a 37º C em
aparelho Shaker.
4.11.2 Preparo das Amostras Analisadas
Foram preparadas cinco soluções contendo massas variadas do extrato
etanólico, sendo, 30 mg, 60 mg, 90mg, 100 mg e 116 mg /mL de MeOH, para
substância isolada (CPBC-1) foi preparada as mesmas concentrações utilizando
CHCl3
– as quais foram vortexzadas durante 1 minuto
para uma adequada
diluição das amostras.
57
4.11.3 Meios de Cultura e de Crescimento Bacteriano Utilizados
O caldo de Soja-Tripticase (TSA/TSB) foi utilizado para o crescimento da
suspensão bacteriana em todos os testes realizados.
Os meios de cultura utilizados para o plaqueamento das suspensões
bacterianas no teste de difusão em disco foi Ágar Mueller Hinton (MH), o qual é
recomendado pela OMS (Organização Mundial da Saúde) para a realização das
provas de sensibilidade, como os antibiogramas.
Tabela 09 : Meios de cultivo de microrganismos
Meio Agar (Caldo) Tripticase de soja (TSA/TSB)
Composição
Quantidade
Peptona de caseína
17,0 g
Peptona de soja
3,0g
Cloreto de sódio
5,0 g
Fosfato dipotássio
2,5 g
Dextrose
2,5 g
Água destilada
1,0L
Meio Ágar Mueller Hinton
Composição
Quantidade
Extrato de carne hidrolisado de caseína
2,0 g
Ácido casamino – Difco ou equivalente
17,5 g
Amido solúvel
1,5 g
Água destilada
1,0 L
Agar
17,0 g
58
4.11.4 Teste de Difusão em Disco para o Extrato Etanólico e Substância
isolada (CPBC-1)
O modelo de difusão em disco de SALIE et al. (1996) foi adaptado para a
realização destes experimentos.
Foram utilizados discos de papel filtro de 9 mm de diâmetro nos quais
impregnou-se 0,03 mL de cada solução das amostras testes (extrato etanólico,
substância isolada (CPBC-1). Os discos contendo a amostra foram secados a
temperatura ambiente, até a evaporação do solvente. Após a evaporação do
solvente cada disco estéril contendo 0,9; 1,8; 2,7; 3,0 e 3,5mg/disco foram
colocados na superfície das placas de Ágar MH, nas quais foram vertidas por
alagamento de suspensões bacterianas de 1,5 x 10 8 ufc/mL de caldo de soja
padronizadas visualmente segundo escala de MacFarland1. Cada fração foi
testado em duplicata. Como controle positivo utilizou-se discos de antibióticos,
sendo o ciprofloxacina controle positivo para bactérias Gram-negativas e
linezolida para bactérias Gram-positivas. Foram utilizado Discos impregnados
com 0,03 mL de cada solvente MeOH e CHCl3, estes Discos serviram como
controle negativo, para verificar a não ação desses solventes sobre as bactérias.
As placas foram incubadas em estufa a 37º C e os resultados foram lidos
após 24 horas. A medida das zonas de inibição foram medidas em milímetros.
1
Soluções padrões a base de sulfato de bário para determinar através de visualização comparativa uma
determinada concentração bacteriana.
59
5
RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1
ESTUDO FITOQUÍMICO
5.1.1 Teste para classes de substâncias
Os resultados obtidos através dos testes para classe de substâncias,
esteróides, terpenos, flavonóides, alcalóides, saponinas e quinonas com o extrato
etanólico e os eluatos da C. paludosa estão apresentados na tabela 9. Estes
resultados ajudam nos teste farmacológico, ao identificarmos as classes de
substância existente no extrato, prevendo o seu potencial nas atividades, e
também na identificação dos compostos químicos presentes.
Tabela 10: Resultados obtidos para teste de classe de substâncias C. paludosa.
Classe de substância
Extrato etanólico
Eluato CHCl3
Eluato EtOAc
Esteróides
(-)
(-)
(-)
Flavonóides
(+)
(-)
(+)
Alcalóides
(+)
(-)
(-)
Quinonas
(+)
(+)
(+)
Terpenos
(+)
(+)
(+)
saponinas
(-)
(-)
(-)
Os metabólitos secundários despertam grande interesse, não só pelas
atividades biológicas produzidas pelas plantas em resposta aos estímulos do
meio ambiente, mas pela imensa atividade farmacológica desses compostos. A
riqueza desses metabólitos nas plantas é explicada pelo fato delas estarem
enraizadas no solo, não podendo se deslocar e, portanto, utilizar como resposta
ao meio ambiente as repostas possíveis dos animais (KINGSTON, F.G.I. 2000).
De acordo com os autores podemos observa através dos resultados
obtidos com os testes, a confirmação de fatores bastante citados na bibliografia
da família Iridaceae, mostrando que os flavonóides, alcalóides e terpenos estão
abundantemente presentes em plantas dessa família (DAHLGREN et al., 1985;
GOLDBLATT, P., 1987).
60
As quinonas e os constituintes químicos citados na família iridaceae são
considerados principais mebólitos secundário e têm recebido bastante atenção
nos últimos anos, devido às diversas propriedades farmacológicas apresentadas
por estas classes de substâncias (SIMÕES et al., 2004). As plantas produzem e
estocam grande número desses metabólitos em diversas partes (folhas, caules,
raízes, flores, sementes) que são liberados para o meio ambiente, sendo que
muitos deles apresentam ação alelopática (MALHEIROS et al., 2001). Devido a
isso, os resultados podem variar de acordo com a parte do vegetal selecionada
para o estudo, a idade ou aspectos químicos, tais como: solo, incidência solar,
região, clima, período de coleta, onde a quantidade desses compostos pode
variar ou até mesmo não serem evidenciados (MACIEL et al., 2002).
5.1.2 Fracionamento do eluato EtOAc.
O eluato EtOAc foi submetido a cromatografia em coluna, e as frações
fornecidas foram reunidas de acordo com seu comportamento cromatográfico
resultando 23 amostra sendo classificadas em ordem alfabética.
Das 23 amostras obtidas, apenas 02 foram submetidas a métodos
analíticos de isolamento de substância.
As amostras E (29-32) e F (33-36) apresentaram formação de cristais e
perfil cromatográfico semelhantes, foram reunidas obtendo a m=0,4378g foi
recromatografada. Utilizando hexano e EtOAc como fase móvel, fornecendo 221.
As frações: 01-20, 21-25, 26-30, 31-38, 39-43, 44-47, 48-55, 56-64, 65-71,
72-82 desta coluna, foram reunidas por terem apresentado comportamento
cromatográfico semelhantes. A fração 44-47 apresentou em seu comportamento
CCD sinais de pureza como descreve a figura (16). Esta amostra foi submetida ao
processo de recristalização que rendeu um por de coloração amarela, solúvel em
CHCl3 e EtOAc.
61
Sólido purificado
(44-47)
Solvente: 40%
EtOAc:Hexano
Figura 21: Cromatografia em CCD da fração (44-47).
As demais amostras não apresentaram formação de cristais com exceção
da amostra E (29 a 32) e F (33 a 36). Em seus perfis cromatográficos foram
observadas impurezas e mais de uma substância, que provavelmente estes
resultados são conseqüência dos seguintes fatores: o aumento rápido da
polaridade dos eluentes, causando sobreposição de banda das substâncias
(BONATO, P. S. et al., 2006); as substâncias existentes podem apresentar
polaridade semelhante dificultando a separação; erro de metodologia no
empacotamento da coluna cromatográfica com os adsorvente e eluente, sendo
que o primeiro e o segundo fator são responsáveis pelo ressecamento da coluna
permitindo a mistura dos componentes químicos. Estes fatores prejudicam no
processo de isolamento.
5.1.3 Fracionamento do eluato de CHCl3
Da mesma forma o eluato de CHCl3 foi submetido à cromatografia em
coluna, e as frações foram reunidas segundo ao seu comportamento em CCD e
organizadas em ordem alfabética resultando 26 amostras. Diferente do eluato de
EtOAc , este apresentou na maioria das amostras formação de cristais. As
amostras E(131-170); F(171-190): G(191-200) foram selecionadas para serem
submetidas a métodos analíticos de isolamento de substância.
62
As frações 131-170 com m=0,3185 foi recromatografada. Utilizando hexano
e EtOAc como fase móvel, fornecendo 192 frações, foram reunidas de acordo
com seu comportamento em CCD.
Desta recromatografia rendeu cristais de coloração incolor e branco
solúveis em CHCl3 EtOAc . As frações 9-12, 21-25 apresentaram em seus perfis
CCD sinais de pureza como descreve a figura (17), devido a semelhança no
comportamento estas frações foram reunidas resultando em duas amostra.
17a
Sólido purificado
(9-12)
Solvente: 30%
EtOAc:Hexano
17b
Sólido purificado
(21-25)
Solvente: 35%
EtOAc:Hexano
Figura 22: Cromatografia em CCD das frações (09-12) e (21-25)
As amostras F (171-190); G (191-220) apresentaram em seus perfis
cromatográficos impurezas. Para a eliminação das impurezas as amostras foram
submetidas ao processo de recristalização que forneceram cristais bem formados
de coloração marrom.
Este processo é o mais utilizado para purificação de substâncias sólidas e
se baseia na diferença de sua solubilidade em um dado solvente ou mistura de
solventes. Atualmente, essa técnica continua sendo o procedimento mais
adequado para a purificação de substâncias sólidas. Quando a temperatura de
uma solução é abaixada, o excesso de sólido se separa da solução constituindo
formas geométricas regulares chamadas cristais (SOARES G. et al., 1988 ) como
podem observa nas figuras abaixo. Os cristais perfeitos têm superfícies planas
que se encontra em ângulos definidos e cujas arestas são linhas retas, ilustrado
63
na figura 18e. Geralmente, um crescimento lento em soluções saturadas favorece
a formação de cristais grandes, ao passo que os cristais que se formam
rapidamente acabam tendo dimensões bem pequenas (VOGEL, A. 1980).
Durante o processo desta recristalização houve a formação de uma pequena
quantidade de óleo em lugar do produto cristalino observado nas figuras 18c e
18d. A formação desse óleo se deve, com freqüência á presença de impurezas
muito polares e/ou umidade .
Figura 18 a
Figura 18 c
Figura 18 b
Figura 18 d
64
Figura 18 e
Figura 23: Processo de recristalização das amostras F e G
5.1.4 Ponto de Fusão
Para as frações que apresentaram sinais de pureza no perfil em CCD, foi
realizado o ponto de fusão, obtendo os seguintes resultados tabela (0).
Tabela 11: Ponto de fusão das frações (44-47), (09-12), (21-25)
Fração (44-47)
Fração (09-12)
Fração (21-25)
PF = 202 – 206
PF = 200 – 202 °C
PF = 195 –197 °C
PF das substâncias isoladas: CPBC-1 PF = 174 – 177 °C; CPBC-3, mistura de
esteróides, PF = 129 – 131 °C
A
propriedade
de uma
substância
orgânica
sólida
que é
mais
freqüentemente usada como critério de pureza é o ponto de fusão. O ponto de
fusão de uma substância corresponde ao intervalo de temperatura em que a fase
sólida se transforma na líquida. Posto que freqüentemente acompanhado por
decomposição, o ponto de fusão pode não corresponder a uma temperatura de
65
equilíbrio, mas a uma temperatura de transição de sólido para líquido. Podemos
observa que os pontos de fusão das frações são diferentes das substâncias
isoladas da espécie em estudo, indicando que essas substância isoladas são
compostos diferentes.
A
propriedade
de uma
substância
orgânica
sólida
que é
mais
freqüentemente usada como critério de pureza é o ponto de fusão. O ponto de
fusão de uma substância corresponde ao intervalo de temperatura em que a fase
sólida se transforma na líquida. Posto que freqüentemente acompanhado por
decomposição, o ponto de fusão pode não corresponder a uma temperatura de
equilíbrio, mas a uma temperatura de transição de sólido para líquido. A maioria
dos compostos orgânicos funde abaixo de 350°C.
O ponto de fusão de um sólido puro deve ocorrer sempre à mesma
temperatura. Na prática, entretanto, equilíbrio entre sólido e líquido quase nunca é
atingido, devido a fatores como quantidade da amostra, tamanho do cristal, razão
de aquecimento, tipo de equipamento usado, etc. Em geral, podemos dizer que
um composto puro tem um ponto de fusão bem definido (a substância funde-se
inteiramente dentro da faixa de 1 a 2°C), enquanto uma substância impura tem o
ponto de fusão indefinido e, portanto, funde-se lenta e gradualmente numa faixa
de vários graus. Por isso, o procedimento de determinação do ponto de fusão de
um composto impuro deverá ser repetido após purificação, normalmente, a
recristalização. É importante lembrar que alguns compostos orgânicos muito
polares, como aminoácidos, sais de ácidos ou aminas, carboidratos, etc. fundem
com decomposição num intervalo de temperatura considerável, mesmo estando
puros.
5.2 Teste antibacteriano
Pode-se observar os resultados obtidos (tabela:12) para o teste de difusão
em disco com extrato etanólico e a CPBC-1, com 5 concentrações diferentes (0,9;
1,8; 2,7; 3,0 e 3,5mg/por disco) frente as bactérias S. aureus, Streptococcus sp.,
P. aeruginosa, E. coli, Bacillus cereus..
66
Tabela 12: Resultado das médias dos halos de inibição (em mm) do ensaio de difusão em disco
com extrato etanólico e substância isolada
C. paludosa
Aubl.
Média do diâmetro dos halos de inibição em mm
Microrganismos
Sas
Sar
Ssp
Bc
Pas
Ec
Concentração
mg/disco
0,9
16,5 ± 0,0a
19,0 ± 0,0a
*
*
*
10,0 ± 0,0a
1,8
19,0 ± 0,0a
21,0 ± 0,0a
*
*
*
12,5 ± 0,0a
2,7
21,0 ± 0,0a
23,5,0 ±
*
*
*
17,0 ± 0,0a
EE
0,0a
3,0
23,5 ± 0,7a
25,5 ± 0,0a
*
*
*
18,0 ± 0,0a
3,5
25,0 ± 0,5a
27,5 ± 0,0a
4,0±
*
*
20,0 ± 0,0a
0,9
12,5 ± 0,4a
10,0 ±0,0a
*
*
*
1,8
13,5 ± 1,2a
12,0 ± 0,0a
*
*
*
2,7
14,5 ± 2,1a
14,0 ± 0,0a
*
*
*
3,0
15,0 ± 1,7a
15,0±0,0a
*
*
*
3,5
16,5 ± 0,8a
16,0 ± 0,0a
*
*
*
---
---
---
---
30 ± 0,0a
22,5 ± 0,0a
34,0 ± 0,0a
38,0 ± 0,0a
24 ± 0,0a
20 ± 0,0a
---
---
Controle MeOH
*
*
*
*
*
Controle
*
*
*
*
*
CPBC-1
Controle Ciprofloxacina
Controle Linezolida
*
Legenda: EE= extrato etanólico; CPBC-1 = substância isolada; Sas= Staphylococcus aureus
sensível a Meticilina; Sar= Staphylococcus aureus resistente a Meticilina; Ssp= Streptococcus sp.;
Pas= Pseudomonas aeruginosa; Bc= Bacillus cereus; Ec= Escherichia coli; * = ausência de halos;
----= controle não utilizado; a= diâmetro da zona de inibição incluindo o diâmetro do disco de 9mm;
Através desse antibiograma, obteve-se grau de sensibilidade das bactérias
Gram-positivas e Gram-negativas frente a espécie vegetal analisada, onde o
extrato etanólico (EE) nas concentrações de 0,9; 1,8; 2,7; 3,0 e 3,5 mg/disco,
apresentou alto grau de inibição contra S. aureus resistente a meticilina (MRSA) e
S. aureus sensível a meticilina (figura 25), com a formação do maiores halos 25
mm e 27,5 mm nas concentração de 3mg/disco. Frente a E. coli o extrato
apresentou também elevado grau de inibiação resultando na formação do maior
67
halo 20 mm na concentração de 3,5 mg/disco (figura 24). Para a espécie
Streptococus sp não obteve um resultado significativo, mais apresentou uma
pequena inibição com halo de aproximadamente 4 mm para as maiores
concentrações. Estes resultados foram os melhores do teste de difusão em disco.
Os resultados obtidos para a CPBC-1 foram positivos somente para S.
aureus resistente e o sensível em todas as concentrações, (figura 25) com a
formação do maior halo de inibição com 16,5 mm em uma concentração de 3,5
mg/disco.
Paras as outras bactérias, Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa, em
todas a concentrações (0,9;1,8; 2,7; 3,0; 3,5 mg/disco) das frações etanolicas não
foi observado inibição do crescimento.
O MeOH e CHCl3, o qual foi utilizado como controles negativo, também não
demonstrou inibição do crescimento bacteriano, sendo assim as inibições
produzidas pelo extrato etanólico e a CPBC-1 estão vinculadas as substâncias
presentes nos mesmos e não ao MeOH e CHCl3 que foram os solventes utilizados
para diluir os extratos vegetais.
Figura 24: Figura: Teste de difusão em disco para o extrato etanólico Cipura
paludosa frente Escherichia coli
68
Figura 25: Teste de difusão em disco para o extrato etanólico CPBC-1 da Cipura
paludosa frente a Staphylococcus aureus resistente e sensível a meticilina.
Os resultados desse teste são demonstrados através das medidas dos
halos de inibição. Não há um padrão em relação ao tamanho de halos para os
compostos biologicamente ativos de vegetais para considerá-los ativos,
parcialmente ativos ou inativos. SMÂNIA et al (1995), consideraram halos de
inibição < 9 mm, compostos inativos; de 9 – 12 mm, parcialmente ativos; 13 – 18
mm ativos. IBRAHIM E OSMAN (1995) classificaram as zonas de inibição < 10
mm, como inativo, e > 10 mm, como ativo. No entanto, outros trabalhos levam em
consideração apenas a positividade e a negatividade para a formação de halos,
não caracterizando os diâmetros dos mesmos (LOPEZ et al., 2001).
69
A avaliação da atividade antibacteriana de C. paludosa Aubl estar sendo
um trabalho pioneiro, pois não há relatos na literatura sobre a avaliação de
atividades antimicrobianas da espécie vegetal. É interessante notar que houve
inibição do crescimento bacteriano de espécies Gram-positivas, S. aureus, e
Gram-negativas, E. coli, para as demais bactérias não houve inibição .
Bactérias Gram-negativas são geralmente consideradas mais resistentes
aos antimicrobianos do que as Gram-positivas, onde a membrana externa destas
bactérias pode agir como uma barreira contra as substâncias ativas presentes nos
extratos vegetais (SILVEIRA et al., 2005), no entanto, inúmeros estudos com
extratos vegetais e substâncias derivadas de plantas demonstraram atividade
antibacteriana tanto para bactérias Gram-positivas como para Gram-negativas
(CHAUDHARY et al., 2006)
O extrato etanólico da espécie em estudo
apresentou atividade
considerada contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, indicando que
essa planta possui substâncias importantes para atividade antimicrobiana. A
Cipura paludosa Aubl. pertence a família Iridaceae e, de acordo com a literatura, é
rica em alcalóides, flavonóides e terpenos, visto que são constituinte
biologicamente ativo que podem ser a fonte principal para os tratamento
quimioterápicos das infecções neste novo período gravemente necessitado de
novos agente antibacterianos e matéria-prima para a produção de vários
fármacos com diferentes aplicações. Em estudos fitoquímicos anterior da espécie
testada, resultou no isolamento de substâncias inéditas, mistura racêmica de
piranonaftoquinonas e
mistura
de
esteróides
(β-sitosterol,
Estigmasterol,
Campesterol).
Devido a presença dessas classes de substância, o extrato etanólico inibiu
o crescimento de Staphylococcus de ultima geração, o MRSA, que são resistente
a antibióticos, como no caso a meticilina. Tanto o extrato como a CPBC-1
apresentaram bons resultados de inibição contra essa bactéria sendo ela
resistente ou sensível, indicando que essa planta inibi qualquer espécie de
Staphylococcus.
A MRSA é a sigla inglesa para Staphylococcus Aureus Resistente à
Meticilina, nome de uma bactéria da família da Staphylococcus Aureus. Essa
espécie surgiu no inicio da década de 60 como um patógeno nosocomial e se
70
tornaram um grave problema de saúde pública mundial20. Atualmente, os MRSA
são importantes agentes de infecções hospitalares e comunitárias. No Brasil, 40 a
60% dos Staphylococcus aureus isolados de amostras provenientes de pacientes
hospitalizados são resistentes à meticilina (MICHELIM, L. et al., 2005).
As infecções das MRSA normalmente não se desenvolvem em pessoas
saudáveis, sendo mais comuns em pessoas hospitalizadas, que geralmente têm
um ponto de entrada para a bactéria poder entrar no organismo, por exemplo, um
ferimento cirúrgico ou um tubo intravenoso.
As bactérias MRSA propagam-se através do contacto com alguém que tem
uma infecção causada pelas mesmas ou que esteja colonizado. Também podem
propagar-se através do contato com objetos que alguém com a bactéria MRSA
tenha tocado. As pessoas que correm mais risco de apanhar MRSA são aquelas
que têm feridas abertas, queimaduras ou golpes, doenças de pele graves como
psoríase, um sistema imunitário enfraquecido (pessoas idosas ou com doenças
crónicas como cancro), aquelas que têm cateteres e quem foi recentemente
operado. Embora as infecções por MRSA se desenvolvam normalmente em
pessoas hospitalizadas, é possível os funcionários ou visitas ao hospital ficarem
infectados se enquadrarem nos grupos de risco acima mencionados (SOUZA &
FIGUEIREDO, 2008).
Os resultados preliminares do teste antibacteriana da C.paludosa
demonstra que o aprofundamento do estudo dessa atividade é pertinente, Sendo
assim, a piranonaftoquinonas (CPBC-1) isolada e os eluatos proveniente do
extrato etanólico da espécie seguiram com essa avaliação, sendo testadas com
outras concentrações.
71
6
Conclusão
O presente trabalho realizado com a C. paludosa teve como objetivo de
testar a eficácia terapêutica apontada pela medicina tradicional popular,
viabilizando a investigação farmacológica de extratos e eluatos, e isolamento com
processos analíticos de purificação dos constituintes da planta.
Pesquisas anteriores realizada pelo grupo nas áreas farmacológicas e
Fitoquímica, a planta apresentou excelentes resultado. O seu extrato etanólico
nos
ensaios
farmacológicos
revelou
grande
eficácia
nas
atividades
antinociceptiva, antiinflamatória, antioxidante e facilitadora da memória. Na
analise fitoquímica resultou em substâncias isoladas inéditas para a espécie
vegetal, que foram identificadas como uma mistura racêmica, a 3-S Eleuterina (9metóxi-1(R),3(S)-dimetil-3,4-dihidro-1H-benzo[g]isocromeno-5,10-diona) e a 3-R
Eleuterina
(9-metóxi-1(R),3(R)-dimetil-3,4-dihidro-1H-benzo[g]isocromeno-5,10-
diona), e mistura de esteróides β-sitosterol, campesterol, estigmasterol que
apresentam importantes atividades biológica contra o câncer , e ajudam na
redução do colesterol existente no plasma do seres humano.
Em analise fitoquímica utilizando os eluatos EtOAc e CHCl3 resultaram em
substâncias isoladas que apresentaram pontos de fusão diferente da CPBC-1 e
CPBC-3, indicando que essas substâncias isoladas possa ser um outro composto
com princípio ativo diferente. Nos testes de classe de substância, foi identificado
constituintes químicos de grande importância para as atividades farmacológicas,
indicando que a planta possui grande potencial fitoterápico.
Para o teste
antibacteriano a espécie mostrou através das frações do extrato etanólico ser
eficaze contra as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, apresentado halos
de inibição considerados contra os Staphylococcus Aureus resistente e sensível à
Meticilina e Escherichia coli.
Investigações futuras serão realizadas para obtenção de mais dados, com
a realização de métodos cromatográficos para isolamento de outros princípios
ativos que posteriormente serão testados farmacologicamente a fim de identificar
os compostos responsáveis pela atividade apresentada pela planta.
72
7
REFERÊNCIAS
ANDRADE-CETTO, A.; WIEDENFELD, H.; REVILLA, M. C.; SERGIO, I. A.;
Hypoglycemic
effect
of
Equisetum
myriochaetum
aerial
parts
on
streptozotocin diabetic rats. J. Ethnopharmacol., v. 72, p. 129-133, 2000.
ALVES, L. I. F. & FELIX, L. P.; Citogenética de Espécies de Iridaceae Ocorrentes
no Nordeste do Brasil. Revista Brasileira de Biociências, v.5(1): 141 - 143 2007.
ALVES, T. M. A.; KLOOS, H.; ZANI, C. L.; Eleutherinone, a novel fungitoxic
naphtoquinone from Eleuterine bulbosa (Iridaceae). Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz, v. 98(5): 709 – 712, 2003.
AKERELE, O.; Herbal Gram, p. 28, 13, 1993.
BARREIRO, E. J.; SILVA, J. E. M.; FRAGA, C. A. M.; Quim. Nova 1996, 19, 641.
BONATO, P. S.; COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L. In: Introdução a Métodos
Cromatográficos. 5 ed., Ed. Unicamp, Campinas, São Paulo. 1993.
BARTON, D.; OLLIS, W. D.; Advances in medicinal phytochemistry., Ed. John
Libbey, 1986.
BIERER, D. E.; DUBENKO, L. G.; ZHANG, P.; LU, Q.; IMBACK, P. A.;
GAROFALO, A. W.; PHUAN, P. W.; FORT, D. M.; LITVAK, J.; GERBER, R. E.;
SLOAN, B.; LUO, J.; COOPER, R. REAVEN, G. M.; Antihyperglycemic
activities of cryptolepine analogues: na ethnobotanical lead structure
isolated from Cryptolepis sanguinolenta. J. Med. Chem., v. 41, p. 2754 2764,
1998.
BRENELLI, Eugênia Cristina Souza. Guia de Laboratório, Química Orgânica
Experimental I. Rio de Janeiro: UFF, 2006. p. 39-44. cap. IV.
73
CUNHA, Elise M. F. e AZEVEDO, Mariangela S. Estudo Químico da Cipura
paludosa Aubl. (IRIDACEAE). Disponível em:
<http://www.pibic.unir.br/pdf/EXATAS%20E%20DA%20TERRA/Elise%20Marq
ues%20Freire%20Cunha%20RES.pdf> Acesso em: 25 jan. 2009.
COCUCCI, A. R. & VOGEL, S.; Oil-producing of Sisyrinchium species
(Iridaceae) and their pollinators in southern South America. Flora, 196: 26 46.
2001.
CORRÊA, M. P. Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas.
Rio de Janeiro: Imprensa Nacional, v.1, p.78, 1994.
CELIS, M.; GOLDBLATT, P.; BETANCUR, J.; A new species of Cipura (Iridaceae)
from Colombia and Venezuela. Novon 13: 419-422, 2003.
CORDEL
G.;
Changing
strategies
in
natural
products
chemistry.
Phytochemistry, v. 40, n.6, p. 1585- 1612, 1995.
CARRIERI, M. & ELVIRI, L.; Liquid Chromatography – UV determination and liquid
chromatography – atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry
characterization of sitosterol and stigmasterol in soybean oil. Journal of
Chromatography A, v.935: 2489 - 257, 2001.
Corey, E. J.; Huang A. X.; j. Am.; Chem. Soc. 1999, pág. 121, 710.
CRONQUIST, A.; On the taxonomic significance of secondary metabolites in
angiosperms. Plant Systematics and Evolution, v.1, p.179, 1977.
CHAUDHARY, P.; KUMAR, R.; VERMA, A. K.; SINGH, D.; YADAV, V.;
CHHILLAR, A. L. K.; SHARMAB, G. L.;
CHANDRA, R.; Synthesis and
Antimicrobial Activity of N-alkyl and N-aryl Piperazine Derivatives. Bioorganic &
Medicinal Chemistry, 14, 1819 – 1826, 2006.
74
CHRISTOFILOGIANNIS,
P.,
Current
Inoculation
Methods
in
MIC
Determination. Aquaculture. 196, 297 – 302, 2001.
DAHLGREN, R. M. T.; CLIFFORD, H. T. & YEO, P. F. The Families of the
Monocotyledons: Structure, Evolution and Taxonomy. Springer-Verlag, Berlin
Heidel berb, 1985.
DASSOLER,
M.;
SCHWANZ,
M.;
BUSSETO,
F.;
MOREIRA,
E.A.;
GUTIERREZ, L. Perfil Fitoquímico e Ensaio Farmacológico de Averrhoa
carambola L. (Oxalidaceae). Jornal Brasileiro de Fitomedicina, v.2 n.1-4, p.4-8,
2004.
Di STASI, L. C.; Plantas Medicinais: arte e ciências – Um guia de estudo
interdisciplinar. São Paulo: UNESP, p.115,125, 1996.
DEWICK, P. M.; Medicinal Natural Products – A Biosynthetic Approach.
England: JOHN WILEY & SONS LTD, v.1. 2002. 515 p.
DELAMARE A.P.L.; COSTA S.O.P.; Echeverrigaray S. Pathogenicity factors and
antimicrobial
resistance
of
Staphylococcus
epidermidis
associated
with
nosocomial infections occurring in intensive Care units. Brazilian Journal of
Microbiology 36:17-23, 2005.
DUARTE, M. C. T.; FIGUEIRA, G. M.; PEREIRA, B.; MAGALHÃES, P. M.;
DELARMELINA, C.; Atividade Antimicrobiana de Extratos Hidroalcólicos de
Espécies da Coleção de Plantas Medicinais CPQBA/UNICAMP. Revista
Brasileira de Farmacognosia, 14, 06 – 08, 2004.
DESCORTERD, L.A.; PARSONS, I. C.; GUSTAFSON, K. R.; CARDELINA II, J.
H.;MCMAHON, J. B.; CRAGG, G. M.; MURATA, Y; PANNEL, L.K.; STEINER, J.
R.;CLARDY, J.; BOYD, M. R.; Structure, absolute stereochemistry and synthesis
of conocurvone, a potent, novel HIV-inhibitory naphtoquinone trimer from a
75
Conospermum sp. Journal of American Chemical Society, v. 48(1): 42 - 46,
1997.
ELLANAIM-WOJTASZEK, M.; KRUCZYNSKI, Z.; KASPRZAK, J.; Investigation
of the free radical scavenging activity of Ginkgo biloba L. leaves. Fitoterapia,
74, 1-6p, 2003.
FARIAS, F. M. .; BARREIRO, E. J.; COELHO, F. A. S.; COSTA, P. R. R.;
Análogos de prostaglandinas, síntese de novos prostanóides a partir do safrol.
Quim. Nova, v. 7, p.111, 1984.
FERRI, P. H. Química de produtos naturais: métodos gerais. In: DI STASI,
L.C. (Org.) Plantas Medicinais: arte e ciências – Um guia de estudo
interdisciplinar. São Paulo: UNESP. 1996. 230p.
GEISE, S. O.; Estudo da composição química dos óleos florais de Byrsomina
brachybotrya (Malpighiaceae). [Mestrado] Universidade Federal de Paraná,
UFPR: Curitiba, 2005.
GRANDI, T. S. M.; & SIQUEIRA, D. M.; Flora medicinal de Belo Horizonte:
pesquisa dos ervários. In: Congresso de Botânica, 25°, Manaus, 1984. Anais.
Brasília, 1990. p. 125-37.
GOLDBLATT, P.; Chromosome Cytology in Relation to Suprageneric Systematics
of Neotropical Iridaceae. Systematic Botany, 7: 186-198, 1982.
GOLDBLATT, P.; Phylogeny and classification of Iridaceae. An. Missouri. Bot.
Gard. 74:333-340, 1987.
GOLDBLATT, P. & JOHNSON, D. E. (Eds.).; Index to plant chromosome
numbers. 1988-1989. Saint Louis, Missouri Botanical Garden. 238p, 1991.
76
GOLDBLATT, P. & TAKEI, M.; Chromosome Cytology of Iridaceae: Patterns of
variation, determination of ancestral base numbers, and modes of karyotype
change. Annals of the Missouri Botanical Garden, 84: 285-304, 1997.
GOOWIN, T. W.; MERCER, E. I.; Introduction to Plant Biochemistry, Pergamon
Press: New York, 1972
HARBORNE, J. B. (ed.). Methods in plant biochemistry. Plant phenolics.
London: Academic, 1989.
HARBORNE, J. B.; WILLIANS, C. A.; Advances in flavonoid research since
1992. Phytochemistry, v.55, p.481-504, 2000.
HENRIQUES, A. T.; KERBER, et al.; Alcalóides: generalidades e aspectos
básicos. Porto Alegre/Florianópolis.: Editora da Universidade UFRGS/Editora da
UFSC. 1999
HOSTETTMANN,
K.;
MARSTON,
A.;
HOSTETTMANN,
M.;
Preparative
chromatography techniques. New York: Verlag Berlim Heidelberg, 1997.
HUIE. C. V.; A review of modern sample preapration techniques for the extraction
and analysis of medicinal plantas. Anal Bional. Chem, v. 373, p. 23 30, 2002.
HOUGHTON, P. J. & RAMAN, A.; Laboratory handbook for the fractionation of
natural extracts. London: Chapman & Hall, 1998, p.49-86.
HARA, H.; MARUYAMA, N.; YAMASHITA, S.; HAYASHI, Y.; LEE, KUO HSIUNG;
BASTOW, K. F.; CHAIRUL, R. M.; IMAKURA, Y.; Elecanacin, a novel new
naphthoquinone
from
the
bulb
of
Eleutherine
Americana.
Chemical
&
Pharmaceutical Bulletin, v.45 (10): 1714 – 1716, 1997.
INNES, C.; The world of Iridaceae. Holly Gate International. Sussex, Reino
Unido, 1985.
77
IBRAHIM, D.; OSMAN, H.; Antimicrobial Activity of Cassia alata from Malaysia.
Journal of Ethnopharmacology, 45, 151 – 156, 1995.
JUDD, W. S.; CAMPBELL, C.S.; KELLOGG, E. A. & STEVENS, P. F.; Plant
Systematics. A Phylogenetics Approach. Massachusetts, Sinauer Associates.,
p. 464, 1999.
JU, Y. H.; CLAUSEN, L. M.; ALLRED, K. F.; ALMADA, A. L.; HELFERICH, W. G.;
beta-Sitosterol, beta-Sitosterol Glucoside, and a Mixture of beta Sitosterol
and beta-Sitosterol Glucoside Modulate the Growth of Estrogen-Responsive
Breast Câncer Cells In Vitro and in Ovariectomized Athymic Mice. J. Nutr.,
v.134, p. 1145-1151, 2004.
KINGSTON, F. G. I.; Recente advances in chemistry of taxol. Journal of Natural
Products, v. 63, n. 5, p. 726-734, 2000.
KONEMAN, E. W.; ALLEN, S. D.; JANDA, W. M.; SCHRECKENBERG, P. C.;
WINN, W. C. J.; Diagnóstico Microbiológico. 5ª ed, 2001.
KUTCHAN, T.; Alkaloid biosynthesis – the basis for metabolic engeneering of
medicinal plants. Plant Cell, v.7, p.1059-1070, 1995.
LUCENA, G. M. R. S. Estudo farmacológico do extrato etanólico da Cipura
paludosa Aubl. Atividade antinociceptiva, antiinflamatória, facilitadora de memória
e antioxidante. Dissertação (Mestrado em Biologia Experimental) Universidade
Federal de Rondônia, UNIR: Porto Velho, 2005.
aLUCENA,
G. M. R. de S.; FRANCO, J. L.; RIBAS, C. M.; AZEVEDO, M. S. de,
MEOTTI, F. C.; GADOTTI, V. M.; DAFRE, A. L.; SANTOS, A. R. S.; FARINA, M.;
Cipura paludosa Extract Prevents Methyl Mercury-Induced Neurotoxicity in Mice.
Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, v.101: 127 – 131, 2007.
78
bLUCENA,
G.M.R.S.; GADOTTI, V.M.; MAFFIA, L.C.; SILVA, G.S.; AZEVEDO,
M.S.A.; SANTOS, A.R.S. Antinociceptive and anti-inflammatory properties from
the bulbs of Cipura paludosa Aubl. Jornaul of ethnopharmacology, v. 112, p.
19, 2007
LUZ, A. A. M.; Estudos visando a obtenção de intermediários versáteis de
progestinas, Dissertação de Mestrado, UNB, 2005.
LEVIN, D.; The chemical defenses of plants to pathogens and herbivores.
Annualb Review of Ecology and System, v. 7, p.121, 1976.
LIEBERMAN, N. H. A.; LACHMAN, L.; SCHWAZTZ, J. B. (eds.). Pharmaceutical
dosage forms. 2 ed. New Yok: Maecel de Kiker 1990, v. 2, p.30-57.
LOZOYA, X.; A escola do futuro é o passado. Saúde do Mundo, (junho): p, 5 7,
1983.
LOPEZ, A.; HUDSON, J. B.; TOWERS, G. H. N.; Antiviral and Antimicrobial
Activies of Colombian Medicinal Plants. Journal of Ethnopharmacology, 77, 189 –
196, 2001.
LIST, P. H.; SCHMIDT, P. C.; Phytopharmaceutical Technology. London:
Heyden, 1989, 200 p.
MALHEIROS, A.; PERES, M. T. L. P.; Alelopatia interações químicas entre
espécie. In: YUNES, R.A.; CALIXTO, J.B.; Plantas medicinais sob a ótica da
moderna química medicinal. Chapecó: Argos, 2001. p. 504-523.
MIGUEL, M. D.; MIGUEL, G. O.; Desenvolvimento de fitoterápicos. São Paulo:
Robe, 1999.
MACHADO, I. C.; Oil-collecting bees and related plants: a review of the studies in
the last twenty years and case histories of plants occurring in NE Brazil. In:
FREITAS, B. M. & PEREIRA, J. O. P. (Eds) Solitary bees: conservation, rearing
79
and management for pollination. Fortaleza: Imprensa Universitária, p. 255 280,
2004.
MARTIN A. & BUSTTAMANTE, P.; Physical Pharmacy. Philadelphia: Lea e
Febiger, 1993.
MERCK, E. Reactivos de Coloración para Cromatografia em capa fina y em
papel. Darmstadt, Alemanha. 1972.
MEYRE S. C.; YUNES, A. R.; SANTOS, A. R. S.; MAGRO, D. J.;
DELLEMONACHE, F.; CECHINEL FILHO, V.; Isolation of a C-Glicoside
flavonoid with antinociceptive action from Aleurites moluccana Leaves.
Planta Med., p. 65, 1999.
ORTEGA, G. G.; Tecnologia de Produção Aplicada de Fitoterápicos (curso
ministrado). Farmapolis: Florianópolis, SC, 2000.
Pharmacological Society. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, V.
101, p. 127, 2007.
PETERSON, J.; DWYER, J.; DSC, R. D.; Flavonoids: dietary occurrence and
biochemical activity. Nutrition Research, V. 18: p. 1995-2018, 1998.
PORTALFARMA, TERPENOS;
http://www.portalfarma.com/pfarma/taxonomia/general/gp000011.nsf/voD
cumentos/4DE2A2030B26B6F0C1256A790048D68C/$File/web_terpenos.m
acessado em 06/01/09
PEREZ GUTIÉRREZ, R. M.; VARGAS, R. S.; Triterpenos from Agarista
mexicana as potential antidiabetic agents. Phytother. Res., v. 16, p. 55-58,
2002
PELLETIER, S. W.(ed.). Alkaloids chemical and biological perspectives, v.1-6.
New York: Wiley, 1983-1988.
80
PARK, K, Y.; CHO, E. J.; RHEE, S. H.; JUNG, K. A.; YI, S. J.; JHUN, B. H.; Kimchi
and na active component, beta sitosterol, reduce oncogenic. H – Rãs (v12) –
induced DNA synthesis. Med Food, Fall; V.6, p. 151-156, 2003.
RATES, S. M. K.; Promoção do uso racional de fitoterápico: uma abordagem no
ensino de farmacognosia. Revista Brasileira de Farmacognosia, v. 11, n. 2, p.
57, 2001.
RIOS, J. L.; RECIO, M. C.; Medicinal Plants and Antimicrobial Activity. Journal of
Ethnopharmacology, 100, 80 – 84, 2005.
SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; MELO, J. C. P.; PETROVICK, P. R.;
Farmacognosia: da planta ao medicamento, 2ªEd. UFRGS/UFSC, Porto
Alegre/Florianópolis, 2002.
SIMÕES, C.M.O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J.C.P.; MENTZ, L.
A.; PETROVICK, P.R. Farmacognosia: da planta ao medicamento. 5ª.ed. rev.
Ampl; Primeira reimpressão. pág. 13-29. Porto Alegre/Florianópolis: Editora da
UFSC/ Editora da UFRGS. 2004.
SOARES G.; Bluma; SOUZA, A. N. e PIRES X.; Dário - Teoria e Técnica de
Purificação e Identificação dos Compostos Orgânicos. Editora Guanabara,
Rio de Janeiro, pag. 198. 1988.
SHIRLEY, W. B.; Flavonoid biosynthesis: “new” function for an “old” pathway.
Trends in Plant Scince, 1: 377-81, 1996.
SONAGLIO, D.; ORTEGA, G. G.; PETROVICK, P. R. et al.; Desenvolvimento
Tecnológico e Produção de Fitoterápicos. In: SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL,
E. P.; GOSMANN. G. et al Org. FARMACONOSIA: da planta ao medicamento, 3
ed.. Porto Alegre, UFRGS/EDUSC. 2001, cap. 13, p. 228-54.
81
SKOOG, D. A.; Princípios de análise instrumental. 5 ed. Porto Alegre:
Bookmann. 2002, p.621-47.
SCHAEFFER, A.; BRONNER, R.; BENVENISTE, P.; SCHALLER H.; The ratio
Campesterol to sitosterol that modulates growth in Arabidopsis is controlled by
Sterol Methyl Transferase 2;1. The Plant Journal, v.25(6): 605 - 615, 2001.
SWAIN, T.; Chemistry in Evolution and Systematics, Butterworth, Londres,
1973.
SALIE, F.; EAGLES, P. F. K.; LENG, H. M. J.; Preliminary Antimicrobial Screening
of Four South African Asteraceae species. Journal of Ethnopharmacology, 52,
27 – 33, 1996.
SCHAECHTER, M. Introdução às Bactérias Patogênicas. In: SCHAECHTER, M.;
ENGLEBERG, N. C.; EISENSTEIN, B. I.; MEDOFF, G.; Microbiologia:
Mecanismos das Doenças Infecciosas. 3ª ed, Guanabara Koogan, Rio de
Janeiro, 2002.
SILVEIRA, C. S.; PESSANHA, C. M.; LOURENÇO, M. C. S.; JUNIOR, N. I.;
MENEZES, F. S.; KAPLAN, M. A. C.; Atividade Antimicrobiana dos frutos de
Syagrus oleracea e Mauritia vinifera. Revista Brasileira de Farmacognosia, 15,
143 – 148, 2005
SMÂNIA, A.; MONACHE, F. D.; SMÂNIA, E. F. A.; GIL, M. L.; BENCCHETRIT, L.
C.; CRUZ, F. S.; Antibacterial Activity Substance Produced by the Fungus
Pycnoporus sanguineus (Fr.) merr. Journal of Ethnopharmacology, 45, 177 –
181, 1995.
SOUZA, L.B.G de; FIGUEIREDO, B. B. de, Prevalência de Infecções
Nosocomiais Provocadas por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina
(M.R.S.A.), no Hospital Universitário Regional de Maringá, vol. 40(1): 31-34,
Paraná, 2008
82
MICHELIM L.; LAHUDE M.; ARAÚJO P.R.; GIOVANAZ D.S.H.; MÜLLER G.;
STROHL, W. A.; ROUSE, H.; FISHER, B. D.; Microbiologia Ilustrada. Porto
Alegre: Artmed, 2004.
THOMSON, R. H.; Em Naturally Occuring Quinones IV: Recents Advances;
Champman & Hall: London: Acadedemic, 1997.
TODER,
D.
S.;
Pseudomonas
aeruginosa:
um
patógeno
ubíquo.
In:
SCHAECHTER, M.; ENGLEBERG, N. C.; EISENSTEIN, B. I.; MEDOFF, G.;
Microbiologia: Mecanismos das Doenças Infecciosas. 3ª ed, Guanabara
Koogan, Rio de Janeiro, 2002.
TRABULSI, L. R.; TEIXEIRA, L. M.; BUERIS, V.; Staphylococcus aureus. In:
Trabulsi, L. R. (org.). Microbiologia. 4 ed. São Paulo: Atheneu, 2005.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L.; Microbiologia. 8ª ed, Porto Alegre:
Artmed, 2005.
UGAZ, O. L.; Investigación fitoquímica, Métodos en el estudio de produtos
naturales. Lima, Pontifica Universidad Catolica Del Peru, 1998. 213p.
VOGEL, A.; Análise Orgânica Qualitativa. In: Química Orgânica. Rio de Janeiro,
Ao Livro Técnico e Científico, Vol.s, p. 1, 2 e 3. 1980.
VOIGT, R.; Pharmazeustische Technologie. Ausgabe, Berlim: Ullstein Mosby,
1993.
83
ANEXO 1
Soluções utilizadas para teste de classe de substância
84
Solução Utilizada
Reagente de Dragendorff:
Solução A:
Nitrato de bismuto (III)
Ácido tartárico
Água destilada
1,7g
20g
80 mL
Solução B
Iodeto de potássio
Água destilada
16g
40 mL
Reagente: misturam-se partes iguais de A e B.
Reagente de Liebermann-Burchard
Anidrido acético
Ácido sulfúrico concentrado
1,0 mL
4 gotas
Reagente para teste de flavonóides
Porção de magnésio em fitas
Ácido clorídrico
0,5 mL
85