Plantas

56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Desenvolvimento e otimização de pares de primers
para a amplificação de locos microssatelites nucleares
e cloroplastidiais em Mikania glomerata
Pavanelli, JC1; Monteiro, M1; Cavallari, MM1; Pinheiro, JB2; Zuchi, MI1
APTA – Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios
Escola Superior de Agricultura “Luis de Queiroz” – ESALQ/USP – Departamento de Genética. Laboratório de Diversidade Genética e
Melhoramento
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mikania glomerata; marcadores moleculares; SSR; cpSSR; otimização
O gênero Mikania possui mais de 430 espécies e distribui-se pelas regiões tropicais da África, Ásia e América do Sul.
O guaco (Mikania glomerata Spreng.) é uma das inúmeras plantas com potencial medicinal, que está submetida à
forte pressão extrativista. Este trabalho teve como objetivo a construção de uma biblioteca genômica desta espécie
enriquecida em microssatélites (SSRs) e a otimização dos pares de primers obtidos, bem como a otimização de
primers microssatélites cloroplastidias (cpSSRs) disponíveis na literatura. A biblioteca genômica para M. glomerata
foi enriquecida com seqüências CT/GT e CA/GT, utilizando o protocolo descrito por Billote et al.(1999). Os
softwares utilizados para a análise das sequências de nucleotídeos obtidas foram: BioEdit versão 7.0.9.0 (Hall, 1999),
para análise da qualidade dos cromatogramas e edição das sequências; MEGA4 (Tamura et al., 2007), identificação
de sequências redundantes; eTROLL (Castelo et al., 2002), identificação dos SSRs. Três pares de primers com
motivos (AC)7, (CT)6 e (CT)5, foram desenhados e sintetizados e a região microssatélite foi amplificada via PCR.
Para estabelecer a melhor temperatura de anelamento foi realizado um gradiente de temperatura variando de
60 a 70º. Observou-se que para dois primers a temperatura de melhor anelamento foi 65ºC, sendo que o terceiro
primer apresenta a temperatura de anelamento de 66ºC como ideal. Para os cpSSR foram sintetizados os primers
ccpm 02, 03 e 05 descritos por Weising e Gardner, 1999. Foram aplificados via PCR utilizando-se um gradiente de
temperatura de 50 a 60ºC, onde a melhor temperatura para todos os primers testados foi 60ºC. Os produtos de PCR
obtidos variam de 110 a 250 pb dependendo do par de primers utilizado. Com base nos resultados pode-se verficar
que os primers aqui otimizados são eficientes em amplificar as regiões SSR e cpSSR em Mikania spp, podendo ser
utilizados em estudos de diversidade genética e conservação de germoplasma.
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Isolamento de marcadores microssatélites em
Pilosocereus machrisii (Cactaceae)
Perez, MF­­;­ Moraes, EM
Laboratório de Diversidade Genética e Biologia Evolutiva, Universidade Federal de São Carlos, Campus Sorocaba
[email protected]
Palavras-chave: Pilosocereus machrisii, marcadores moleculares, campos rupestres, microssatélites, variabilidade genética
Pilosocereus machrisii é uma Cactaceae com distribuição naturalmente fragmentada no leste do Brasil, restrita aos
enclaves de vegetação de campos rupestres ou de afloramentos rochosos no domínio Cerrado. As características
florais nessa espécie são compatíveis com a síndrome de polinização por morcegos e beija-flores, enquanto pássaros
e formigas podem ser dispersores importantes. O nível e a distribuição da variabilidade genética nas populações de
P. machrisii podem ser determinados pelo seu padrão de distribuição disjunta e por fatores demográficos históricos.
O uso de marcadores microssatélites permite estimar o nível de conexão entre as populações e a estrutura genética
com bastante confiança, além de fornecer informações sobre a história evolutiva da espécie, como associações
históricas entre populações atualmente isoladas. O objetivo deste trabalho consistiu em isolar loci de DNA
microssatélite específicos para P. machrisii a partir da construção de uma biblioteca genômica parcial enriquecida.
A obtenção de DNA foi realizada utilizando-se fragmentos de raízes de um indivíduo coletado no município de
Brotas (S22°17’22,5’’; W47°57’57,9’’), por meio do protocolo comercial Dneasy Plant Mini Kit (Qiagen), o qual foi
modificado para aumentar a produção. O DNA obtido foi digerido com a enzima XmnI, ligado a adaptadores e
amplificado por PCR com o iniciador Super SNX24 Forward, de sequência complementar ao adaptador. Os
fragmentos que apresentaram sequências repetitivas foram selecionados com o uso das sondas biotiniladas
CA(10), TC(10) e GA(10) e capturados por partículas magnéticas ligadas a estreptavidina. O DNA enriquecido com
repetições microssatélites foi novamente amplificado e os produtos de PCR foram clonados por meio do protocolo
comercial TOPO TA Cloning (Invitrogen). Esse procedimento possibilitou isolar 273 colônias com insertos, das
quais 94 (34%) tiveram os insertos seqüenciados. Entre essas sequências foram encontradas 42 regiões repetitivas
(45%), das quais 19 apresentaram regiões flanqueadoras que permitiram o desenho de pares de iniciadores (20%
do total sequenciado) com o auxílio do programa Primer3. O sucesso de amplificação utilizando esses iniciadores
foram testados e os resultados verificados em gel de poliacrilamida 7% não-desnaturante. No total, 11 pares de
iniciadores apresentaram sucesso na amplificação dos loci de microssatélite isolados, produzindo fragmentos com
tamanho compatível com o esperado, Esses pares de iniciadores também apresentaram sucesso na amplificação
dos mesmo loci em indivíduos de outras 7 populações de P. machrisii. Esses iniciadores serão utilizados para a
genotipagem automatica de ao menos 20 indivíduos de uma localidade de ocorrência da espécie. Com base nos
genótipos obtidos serão estimados o número de alelos em cada locus, a heterozigosidade esperada e observada,
além de serem realizados testes para ocorrência de desequilíbrio de ligação e alelos nulos. A partir dos resultados
obtidos, pretende-se avaliar a utilidade dos loci obtidos para a realização de estudos populacionais em P. machrisii.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Construção de biblioteca genômica enriquecida com
microssatélites de Plathymenia foliolosa (Leguminosae)
Oliveira, FA1; Tarazi, R1; Menezes, IPP1; Tsai, SM2; Gaiotto, FA1
Laboratório de Genética Molecular Aplicada – Centro de Biotecnologia e Genética – UESC
Laboratório de Biologia Celular e Molecular (CENA/USP)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Vinhático, Mata Atlântica, Bahia, SSR, Primer.
Platymenia foliolosa Benth. é uma espécie arbórea típica de dossel, popularmente conhecida como vinhático, com
distribuição na Mata Atlântica e no Cerrado. Esta árvore tem sido, atualmente, uma das espécies mais suprimidas
da Mata Atlântica do sul da Bahia para fins madeireiros. Apresenta grande valor ecológico e econômico, com alto
potencial de regeneração em áreas degradadas. Estudos de estrutura genética, fluxo gênico e taxa de cruzamento
podem auxiliar na conservação da espécie por longo prazo. Para isso, os marcadores microssatélites (SSR) são
considerados ideais, por serem codominantes e altamente informativos. O desenvolvimento de primers SSRs
específicos para a espécie constitui-se no primeiro passo para tais estudos. Assim, objetivou-se construir uma
biblioteca enriquecida de SSRs para futura caracterização genética do vinhático. O material vegetal foi coletado
num fragmento de Mata Atlântica no município de Ilhéus, BA, a fim de se obter o DNA genômico total. O
protocolo de Billotte et al. (1999), com modificações para construção da biblioteca constituiu-se nas seguintes
etapas: digestão do DNA genômico com a enzima RsaI; ligação dos adaptadores Rsa21 e Rsa25; pré-amplificação
com o primer Rsa21; seleção de fragmentos contendo SSR por hibridização de sondas biotiniladas (CT)n e (GT)
e magnetização; amplificação dos fragmentos selecionados, clonagem e transformação; amplificação dos
n
insertos clonados contendo SSRs, seleção e sequênciamento dos clones positivos. Dos 96 clones sequenciados,
16 sequências foram descartadas por apresentarem ambiguidade no cromatograma. Das 80 sequências
analisadas com o programa SSRLocator, foram detectadas 42 contendo microssatélites, apresentando um índice
de enriquecimento das colônias de 52,50%. Foram detectadas 48 SSRs, dessas 33% foram classificadas como
Classe I (>20pb) e 77% como Classe II (entre 12 a 20 pb). Numa segunda classificação, 19% eram imperfeitos
e 81% perfeitos. Destes 48 SSRs, foram desenhados 27 pares de primers, com o auxílio do aplicativo Primer 3.
Apoio: UESC, CAPES e CNPq.
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Transferibilidade de marcadores microssatélites entre
espécies do gênero Dalbergia (Leguminosae)
Chicata, FSL; Buzatti, RSO; Ribeiro, RA; Lovato, MB
Universidade Federal de Minas Gerais; Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e
Palavras-chave: dalbergia, microssatélite, SSR, transferibilidade, genotipagem
As seqüências das regiões que flanqueiam os microssatélites ou SSRs (Sequências Simples Repetidas; de um a seis
nucleotídeos, in tandem) são conservadas em indivíduos da mesma espécie. Os SSRs são amplamente distribuídos
em todo genoma de eucariotos e podem ser amplificados por iniciadores específicos sintetizados a partir dessas
regiões flanqueadoras. Neste estudo, testou-se a transferibilidade de 17 loci de microssatélites previamente isolados e
caracterizados – dez deles para Dalbergia nigra e sete para D. monticola - para as espécies congenéricas D. decipularis, D.
ecastaphyllum, D. elegans, D. frutescens, D. miscolobium e D. sissoo. Com exceção de D. sissoo, as demais espécies são
nativas do Brasil, várias com madeira de boa qualidade e algumas ameaçadas de extinção devido à ampla e histórica
exploração da madeira. Dos loci testados, 15 deles (88%) apresentaram amplificação bem sucedida em pelo menos
duas espécies, e as condições de reação da polimerase em cadeia (PCR) foram testadas e otimizadas para cada
locus e espécie. As espécies testadas apresentaram entre 8–12 loci de microssatélites transferidos. Para a espécie D.
miscolobium, foi realizada a genotipagem de 10 indivíduos, observando-se polimorfismo para os loci transferidos
genotipados. A transferibilidade representa uma fonte potencial de marcadores co-dominantes para estudos
genéticos e evolutivos, tendo implicações na conservação das espécies do gênero Dalbergia. Estes marcadores estão
sendo atualmente utilizados para análise da estrutura genética espacial e genética da paisagem de D. miscolobium.
Apoio financeiro: FAPEMIG
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Desenvolvimento e caracterização de locos
microssatélites para buriti (Mauritia flexuosa, Arecaceae).
Olivatti, AM1; Rabelo, SG1; Brondani, RPV2; Collevatti, RG1
Laboratorio de Genética e Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, CP 131. Goiânia, Goiás Brasil
74001-970. e-mail: [email protected]
2
Laboratorio de Biotecnologia, EMBRAPA-CNPAF
[email protected]
1
Palavras-chave: Vereda, Cerrado, Mauritia flexuosa, microssatélite, shotgun.
O buriti (Mauritia flexuosa, Arecaceae) é uma palmeira que ocorre nas regiões alagadas e úmidas do Bioma Cerrado,
denominadas veredas. Tem importância ornamental, farmacológica, alimentícia e estratégica na preservação
da fauna, uma vez que seus frutos são fonte de alimentos para várias aves e mamíferos. Nas ultimas décadas,
a pressão do extrativismo associado à fragmentação e perda de habitat vem influenciando na dinâmica das
populações de buriti. O estudo da estrutura genética e dinâmica populacional das espécies do Cerrado é de suma
importância na elaboração de programas de manejo e conservação desse Bioma. O objetivo desse trabalho é o
desenvolvimento de primers microssatélites que possam ser utilizados posteriormente para estudos de estrutura
genética e fluxo gênico de buriti e outras palmeiras. Para o desenvolvimento dos microsatélites foi obtida uma
biblioteca genômica shotgun utilizando o vetor plasmidial pMOS Blue para clonagem. A transformação das E. coli
competentes foi feita por choque térmico e a seleção das células transformadas positivas foi feita utilizando XGAL/
IPTG. Os insertos foram extraídos por meio de lise alcalina e seqüenciados utilizando o iniciador U-19 e o kit de
sequenciamento DYEnamic ETerminator, em seqüenciador automático ABI3100. Os fragmentos que possuíam
microssatélites foram identificados pelo programa Websat e os primers foram desenhados utilizando o software
Primer 3. Para a caracterização foram utilizados 32 indivíduos de uma população. Os produtos da amplificação
dos locos desenvolvidos foram submetidos à eletroforese vertical em gel desnaturante de poliacrilamida 6% e
corados com nitrato de prata. Foram seqüenciados 1440 clones sendo que somente oito apresentaram sequências
microsatélites de tamanho adequado para desenho de primers, cujos motivos de repetição variaram de dois
a cinco pares de bases. Dos oito locos desenvolvidos, apenas um apresentou polimorfismo para os indivíduos
analisados, com três alelos e heterozigosidade observada e esperada de 0,75 e 0,52, respectivamente. O coeficiente
de endocruzamento não foi significativo (p > 0,05). No momento, os primers estão sendo testados com indivíduos
de outras populações para verificar o polimorfismo, e outra biblioteca foi construida para busca de mais primers.
Apoio financeiro: FAPDF, CNPq
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Seleção de marcadores microssatélites em populações
de mapeamento de Hevea brasiliensis
Mantello, CC1; Suzuki, FI1; Souza, LM1; Souza, AP1,2
Laboratório de Análise Genética Molecular - Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genétic (CBMEG)- Instituto de Biologia, UNICAMP
2
Departamento de Botânica – Instituto de Biologia – UNICAMP
[email protected]
1
Palavras-chave: Hevea brasiliensis, seringueira, marcador molecular, microssatélite,mapeamento genético
A espécie Hevea brasiliensis também conhecida como seringueira (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell-Arg. é a espécie de
maior importância econômica dentro do gênero Hevea por ser a maior fonte de borracha natural do mundo.Apesar
do Brasil ser o centro de origem e diversidade genética para esta cultura, atualmente ele responde por apenas 1% da
produção mundial. A seringueira por ser uma planta perene, ela possui um longo ciclo de melhoramento, que leva
de 20 a 30 anos para se concretizar. Tendo em vista o atual cenário da heveicultura no Brasil, técnicas de biologia
molecular podem diminuir o tempo do melhoramento genético e otimizar as avaliações para essa cultura. Dentre
as técnicas mais utilizadas, os marcadores moleculares do tipo microssatélites (Simple Sequence Repeats-SSRs)
devido a sua codominância e alto nível de polimorfismo tornaram-se uma importante ferramenta em programas de
melhoramento. Neste trabalho foi avaliado o polimorfismo dos marcadores de microssatélites nos genótipos GT1,
RRIM 701, PB235, CMB104, CMB114, PR255, PB217, PB260 e RO38 que são parentais das seguintes populações de
mapeamento: GT1 x RRIM 701, GT1 x PB 235, CMB104 X CMB114, PR255 X PB217, PB260 X RO 38, cujo objetivo é
determinar quais marcadores poderão ser utilizados na futura construção de mapas genéticos dessas populações.
Até o momento foram testados 191 marcadores, sendo 111 desenvolvidos na UNICAMP e mais 80 cedidos pelo
Instituto Agronômico de Campinas (IAC). Dos 111 marcadores testados que foram desenvolvidos na UNICAMP,
98 amplificaram e destes marcadores que amplificaram e que podem ser utilizados para mapeamento foram
encontrados 44 (44,9 %) para o cruzamento GT1 x PB235, 45 (45,9 %) para GT1 x RRIM 701, 48 (49,0 %) para PR255
x PB217, 54 (56,1 %) para PB260 x RO38 e 56 (58,2%) para CMB104 x CMB114. Já dos marcadores desenvolvidos
pelo IAC, foram testados 80, dos quais 61 amplificaram. Destes, foram encontrados 37 (60,75) marcadores
polimórficos que podem ser utilizados para mapeamento no cruzamento GT1 x PB235, 38 (62,8%) para GT1 x
RRIM 701, 42 (68,9%) para PR255 x PB217, 49 (80,3%) para PB260 x RO38 e 45 (73,8%) para CMB104 x CMB114.
Apoio Financeiro: Fapesp
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Caracterização de regiões repetitivas no genoma de
Eugenia klotzschiana (BERG.)
Costa, CF1; Boni, TA1; Resende, LV1; Brondani, RPV2; Alvarez, PA3; Telles, MPC1;
Laboratório de Genética & Biodiversidade, DBG/ICB/Universidade Federal de Goiás
Laboratório de Biotecnologia, EMBRAPA
3
Departamento de Ciência da Computação, Universidade de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cerrado, perinha, STR, Shotgun, motivos de repetição.
As seqüências de DNA cujos nucleotídeos estão arranjados em tandem, contendo combinações de motivos
de repetição compostos de um a seis pares de bases, são denominadas regiões microssatélites. Em função de
algumas características, como serem regiões hipervariáveis e amplamente distribuídos no genoma de eucariotos,
estas regiões são utilizadas como marcadores moleculares eficientes. Além disso, por apresentarem alta taxa
de mutação e alto índice de polimorfismo, são amplamente utilizados em estudos de genética de populações.
Dentre as espécies de frutíferas do cerrado Eugenia klotzschiana Berg., pertencentente à família Myrtaceae,
destaca-se por ser uma espécie endêmica do cerrado brasileiro que produz um fruto de sabor agradável e aroma
muito intenso, com grande potencial de utilização. Também apresenta características ecológicas e de biologia
reprodutiva bastante peculiares, intrigantes e pouco conhecidas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho é
levantar e caracterizar as regiões repetitivas presentes no genoma de Eugenia klotzschiana, e disponibilizá-las para
o desenvolvimento de iniciadores de marcadores microssatélites, ainda inexistentes para essa espécie, para futuros
estudos populacionais. O DNA foi extraído a partir do tecido vegetal, utilizando o protocolo CTAB, da folha de um
indivíduo de E. klotzschiana. Após a quantificação o DNA foi clivado por sonicação para obtenção de fragmentos
entre 500pb e 1Kb, e depois inseridos no vetor pMOSBlue para a clonagem das bibliotecas shotgun. Em seguida, o
DNA dos clones foram extraídos (miniprep) e sequenciados (ABI3100). As seqüências geradas foram preparadas no
site “http://citosina.biomol.unb.br/papirus” para que as buscas das regiões repetitivas fossem realizadas no software
WebSat. As buscas das regiões repetitivas foram feitas para um mínimo de 6 repetições nos mononucleotídeos e
quatro para os di, tri, tetra, penta e hexanucleotídeos. Foram geradas 54.042 seqüências com valores de Phred ≥20,
onde foi possível encontrar 460 regiões microssatélites com diferentes motivos de repetição. Das 460 regiões, 445
continham mononucleotídeos (96,74%), 4 dinucleotídeos (0,87%), 7 trinucleotídeos (1,52%), 3 tetranucleotídeos
(0,65%) e 1 hexanucleotídeos (0,21%). Dentre os mononucleotídeos, o mais abundante foi T(n), seguido do G(n), A(n)
e C(n), representando 40%, 32%, 20% e 8%, respectivamente. Como o esperado, os motivos de repetição maiores
apresentaram uma freqüência bem mais baixa de ocorrência. Estavam presentes os dinucleotídeos GA(n), TC(n) e TA(n);
os trinucleotídeos TAA(n), TTA(n), AAG(n), GAA(n), AGG(n) e AGA(n); os tetranucleotídeos CCGA(n), CCCT(n) e TTTC(n); e
o hexanucleotídeo CCTAAA(n). Embora o fato de existirem regiões repetitivas não garanta o desenho de iniciadores
nas regiões flanqueadoras, e utilização dos mesmos como marcadores microssatélites, foi possível detectar boas
sequências em três regiões contendo os seguintes motivos e quantidades de repetição: TC(17), GA(8), AGG(7). Este
tipo de caracterização é importante tanto para o conhecimento da estrutura do genoma quanto para disponibilizar
ferramentas moleculares que possibilitarão futuros estudos genético-populacionais da espécie E. klotzschiana.
Apoio financeiro: PRONEX/CNPq/FAPEG.
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Identificação rápida de marcadores SSR polimórficos
em Coffea arabica
Ferreira, RV1; Santos, MA1; Charmetant, P12; Marraccini, P2; Leroy, T2; Vieira, LGE1, Sera, T1; Pereira, LFP13;
Pot, D2
IAPAR AMG Biotecnologia, Caixa Postal 481, CEP 86047-902, Londrina, PR, Brasil
CIRAD Systèmes Biologiques, TA 96/03 34398 Montpellier Cedex 5
3
Embrapa Café AMG Biotecnologia, Caixa Postal 481, CEP 86047-902, Londrina, PR, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Coffea arabica, microssatélites, Bulk Segregant Analysis, polimorfismo, germoplasma
Marcadores moleculares SSR são ferramentas importantes nos estudos de diversidade e caracterização de bancos
de germoplasma de plantas cultivadas. Entretanto, a identificação de um conjunto mínimo de SSR úteis para
discriminar os diferentes genótipos pode implicar na análise de um grande número de marcadores. Em Coffea
arabica a maioria desses marcadores apresentam um baixo padrão de polimorfismo, o que constitui um dos
principais gargalos para os estudos de caracterização genotípica do germoplasma da espécie. O objetivo deste
trabalho foi desenvolver uma metodologia de avaliação rápida de SSR visando identificar marcadores polimórficos
com um número mínimo de processos de genotipagem. A metodologia empregada constitui numa adaptação
da técnica BSA (Bulk Segregant Analysis) utilizada comumente para identificar associações entre marcadores e
genes qualitativos em populações biparentais. Para identificar os SSRs polimórficos de uma população de 130
genótipos da Etiópia, centro de origem de C. arabica, foram constituídos, com base em dados de diversidade
fenotípica, três grupos para análise: um com 6 plantas representando genótipos do leste, outro com 8 plantas
representando genótipos do oeste do Vale do Rift e um terceiro grupo representado por um único genótipo. Para
cada marcador SSR foram realizadas três reações de amplificação a partir de “pools” formados pelo material
genético dos grupos. Em uma única placa de 96 poços foi possível avaliar o polimorfismo de 32 marcadores.
Os marcadores que apresentaram um padrão polimórfico entre os grupos foram então avaliados no painel de
genótipos em estudo. Para efeitos de comparação entre a genotipagem padrão e a adaptação proposta neste
trabalho foram estimados o número de reações de amplificação e de géis de poliacrilamida gastos para a avaliação
de 100 SSR em um painel de 24 genótipos considerando uma margem de 10% de marcadores polimórficos. Pelo
processo normal de genotipagem, seriam necessários 2400 reações de amplificação e 100 géis de poliacrilamida (24
amostras por gel) enquanto que, utilizando a estratégia dos grupos foram necessários 540 reações de amplificação
e 33 géis de poliacrilamida, o que representou uma redução de 4.4 vezes no número de reações e de 3 vezes no
número de géis além de um ganho considerável no tempo necessário para realizar as análises. Esta abordagem
utilizando a formação de grupos é uma estratégia viável para identificação de marcadores polimórficos em
populações para as quais se tenham informações prévias como dados de origem, dados fenotípicos como é o
caso da coleção de acessos da Etiópia de C. arabica existente no banco do IAPAR-PR fornecendo informações
rápidas e de maneira mais econômica para os estudos de diversidade e mapeamento associativo da coleção.
Apoio financeiro: CNPq, CIRAD, IAPAR, INCT
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Identificação de marcadores SNPs em genes
relacionados à síntese de proteínas de reserva em arroz
Oliveira, ZR1; Cruzeiro, GAV2; Borba, TCO3; Brondani, RPV3; Brondani, C3
Química Agroindustrial – Instituto Federal de Goiás
Instituto de Ciências Biológicas – Universidade Federal de Goiás
3
Laboratório de Biotecnologia – Embrapa Arroz e Feijão
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Análise de associação, Teor protéico, marcadores SNP, Oryza sativa, proteínas de reserva
O arroz é considerado como alimento primordial para alimentação humana por ser fonte de carboidratos.
Contudo, as proteínas de reserva de arroz possuem oito aminoácidos essenciais, com destaque para a lisina, e
quando combinadas com as do feijão, resultam em uma mistura de alto valor protéico. A proteína de reserva do
arroz é constituída por quatro frações: albuminas, globulinas, prolaminas e glutelinas. A busca por sequências
expressas envolvidas nas rotas de síntese da proteína de reserva de arroz pode facilitar a identificação de
genótipos que apresentem maior teor protéico ou valor nutricional. O objetivo deste trabalho foi o de identificar
associações entre polimorfismos do tipo SNP com o teor de proteína total em acessos de arroz. Foram
desenvolvidos quatro marcadores capazes de identificar SNPs (single-nucleotide polymorphism) nas sequências
dos transcritos Prolamin NM001064258.1, Globulin NP001045333.1, Globulin NP001045333.1B e Albumin
A3AR560RYSJ-R. Foram identificados SNPs nos três últimos transcritos, após o sequenciamento dos produtos de
PCR dos 24 acessos mais divergentes da Coleção Nuclear de Arroz da Embrapa. A substituição mais frequente
foi a T/G. Foram identificadas três associações significativas entre teores de proteína total e SNPs. Dois SNPs
identificados no marcador Globulin NP001045333.1, ambos substituições T/G, explicaram 48% (p<0.005) e 43%
(p<0.02) da variação no teor protéico. Um SNP, identificado no marcador Albumin A3AR560RYSJ-R, baseado na
substituição A/C, apresentou associação significativa para o teor de proteína e explicou 22% (p<0.05) da variação.
Marcas moleculares associadas a caracteres de interesse, como o teor protéico, são ferramentas essenciais para
a aplicação da seleção assistida por marcadores. Avaliações complementares para validação dos marcadores
SNPs estão sendo realizadas. A partir da confirmação desta associação espera-se aplicá-la prontamente pelo
programa de melhoramento genético do arroz para o desenvolvimento de cultivares com maior valor nutricional.
Apoio Financeiro: MCT/Finep
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MALDI-TOF analysis of storage proteins from two
Brazilian rice (Oryza sativa) cultivars
Silveira, RDD1,2; Santos, KFEN1,2; Didonet, CCGM3; Brondani, C1
Embrapa Arroz e Feijão
Universidade Federal de Goiás
3
Universidade Estadual de Goiás
[email protected]
1
2
Keywords: Protein, Amino acids, Oryza sativa, Cultivars, Rice.
Approach: Rice (Oryza sativa) has a grain with high content of carbohydrates, containing in addition proteins that
have essential amino acids for the human diet. Objectives: a) Obtain reference grain proteome for two Brazilian
cultivars, representatives of the indica and japonica subspecies; b) Compare the protein profile of the two cultivars;
c) Determine the difference of the amino acid sequences of some peptides from the two genotypes. Methods: The
total protein extracts of BRS Formoso (indica cultivar) and BRS Bonança (japonica cultivar) were separated with
2D-PAGE and protein spots were digested with trypsin and analyzed on MALDI-TOF MS. To map the position
of these proteins in one gel for each cultivar, called “reference gels”, three different experimental gels, on the
pH range of 3-11, for each genotype, were analyzed. Results: A reference proteomic map was obtained for each
cultivar, containing all protein spots detected on the cultivars. In the reference proteomic map of BRS Formoso,
92 spots were detected, from which 28 (30.7%) were analyzed for mass spectrometry (MALDI-TOF). From these,
eight showed peptide sequences homologous to proteins described in the NCBI databank. In the reference map
of BRS Bonança, 119 spots were detected, from which 40 (33.6%) were analyzed for mass spectrometry, and 19
spots showed peptide sequences homologous to proteins described at NCBI. Based on the reference proteomic
map of both cultivars, it was possible to obtain a putative proteomic map of rice grain storage proteins for indica
and japonica, resulting from the superposition of the maps. The proteomic map showed 96 spots, considering
both differential and similar spots between the two cultivars. Interestingly, there were more differences than
similarities between indica and japonica, and BRS Bonança showed a greater number of spots when compared to
BRS Formoso. Forty seven proteins showed no similarity with protein sequences deposited in the NCBI, revealing
the low representation of current proteomic databases for rice grain proteins. This work allowed the identification
of storage proteins (28%); proteins associated with cell metabolism (16%); proteins involved in stock-storage of
sugar in the form of starch (36%) and proteins with unknown functions (20%).Conclusion: There were marked
differences between indica and japonica storage protein maps, which can be explored by rice breeding programs
in order to increase the nutritional value of rice cultivars due to the differential content of essential amino acids.
Supported by FINEP/MCT.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Utilização de marcadores moleculares do tipo
microssatélite a partir de ESTs em um cruzamento biparental de cana-de-açúcar
Costa, EA1; Balsalobre, TWA1; Marconi, TG1; Garcia, AAF2; Pinto, LR3; Landell, MGA3; Souza, AP1,4
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-UNICAMP, Campinas-SP
Depto. de Genética – ESALQ/USP, Piracicaba-SP
3
Instituto Agronômico de Campinas- Centro de Pesquisa em Cana, Ribeirão Preto-SP
4
Depto. de Biologia Vegetal – IB/UNICAMP, Campinas-SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cana-de-açúcar, EST-SSRs, polimorfismo
A matriz energética do Brasil tem, atualmente, a cana-de-açúcar (Saccharum spp.) como a segunda principal
fonte de energia primária, assim, esta se apresenta como uma das mais importantes culturas do país. Porém a
complexidade do genoma juntamente com a natureza multigênica e/ou multialélica das principais características
agronômicas tornam o melhoramento clássico da espécie uma árdua tarefa. Para atender de forma rápida e
precisa às necessidades de aumento da produção em cana, necessita-se aprimorar as técnicas de melhoramento
genético. Uma alternativa viável é a utilização de ferramentas dos marcadores moleculares que possibilitem a
identificação das regiões genômicas que controlam estas características e fornecem a melhor estimativa da
diversidade genética, pois são independentes de efeitos ambientais. A construção de mapas genéticos de ligação,
utilizando marcadores moleculares, pode auxiliar na elaboração de estratégias moleculares a serem introduzidas
nos programas de melhoramento de forma a acelerar o desenvolvimento de novas variedades. Tendo em vista
os avanços que serão alcançados no melhoramento genético da cana-de-açúcar com a construção de um mapa
genético funcional a partir dos ESTs de interesse, este trabalho teve por objetivo realizar análise preliminar para
o mapeamento genético da população de cana-de-açúcar oriunda do cruzamento bi-parental entre as variedades
IAC SP 95-3018 e IAC SP 93-3046, contrastantes para os componentes de produção, percentual de Brix e para
resistência a doenças, através de marcadores microssatélites. Oito locos SSR-EST (SCB 378, SCB 381, SCB 404,
SCB 423, SCB 428, SCB 435, SCB 436 e SCB 457) foram escolhidos entre 100 desenvolvidos anteriormente, os
fragmentos foram amplificados e genotipados nos indivíduos da população de mapeamento, permitindo, assim,
a análise da segregação dos marcadores, sendo a média de alelos por loco de 5,75. A segregação observada nos
alelos polimórficos de cada loco foi verificada utilizando o teste de Qui-quadrado com nível de significância
de 5% ajustado com a correção de Bonferroni para múltiplos testes. O cálculo do p-valor para cada teste foi
realizado utilizando o software R. As segregações dos marcadores foram analisadas em dose única nas duas
formas, usualmente, consideradas para cana-de-açúcar, 1:1 ou 3:1. Todos apresentaram marcas polimórficas e
significativas para segregação 1:1 ou para a segregação 3:1. Das 46 marcas polimórficas verificadas nos 8 locos
analisados na população de mapeamento, 52,17% (24 marcas) apresentaram segregação 1:1 e 17,39% (8 marcas)
apresentaram segregação 3:1. O loco SCB 423 foi o mais informativo dos analisados, apresentando todas as 13
marcas polimórficas e significativas, sendo 8 marcas na segregação 1:1 e 5 na segregação 3:1. Seria necessário
um número maior de locos e marcas polimórficas para a construção de um mapa de ligação que possibilitasse o
estudo da associação dos marcadores com características agronômicas de interesse segregantes na população.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Desenvolvimento de SNPS a partir dE EST (SUCEST)
em cana-de-açúcar utilizando a plataforma
Sequenom® MALDI-TOF
Marconi, TG1; Costa, EA1; Balsalobre, TWA1; Santos-Garcia, MO1; Mollinari, M2; Garcia, AAF2; Pinto, LR3;
Landell, MGA3; Souza, AP1,4
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética - UNICAMP, Campinas-SP
Depto. de Genética – ESALQ/USP, Piracicaba-SP
3
Instituto Agronômico de Campinas- Centro de Pesquisa em Cana, Ribeirão Preto-SP
4
Depto. de Biologia Vegetal – IB/UNICAMP, Campinas-SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, EST-SNPs, SNP, MALDI-TOF, Polimorfismo
A cana-de-açúcar (Saccharum sp.) faz parte de um complexo poliplóide pertencente à tribo Andropogoneae, família
Poaceae. A importância econômica desta cultura esta cada vez mais tomando espaço no cenário internacional,
visto que é uma fonte de matéria-prima para a produção de açúcar e biocombustíveis. Estima-se para o Brasil, uma
produção de 664,3 milhões de toneladas de cana-de-açúcar na safra 2010/2011 representando um acréscimo de
9,9% em relação à safra anterior, uma área total de 8 milhões de hectares com uma produtividade média de 82 ton/
hec. Os programas de melhoramento genético de cana-de-açúcar têm concentrado esforços para o lançamento
de novas variedades com características agronômicas que atendam a demanda do setor sucroalcooleiro.
Entretanto, a complexidade genética da cana-de-açúcar decorrente de seu alto nível de ploidia e aneuploidia,
aliada à natureza multigênica e/ou multialélica da maioria dos caracteres agronômicos, tem dificultado o
melhoramento genético desta cultura. O desenvolvimento de marcadores moleculares e a construção de mapas
genéticos podem auxiliar na elaboração de estratégias a serem introduzidas nos programas de melhoramento
de forma a acelerar o desenvolvimento de novas variedades. Dessa forma, diferentes tipos de marcadores estão
sendo utilizados para a construção de um mapa genético mais bem detalhado. O presente trabalho teve como
objetivo o desenvolvimento e análise de marcadores moleculares SNP a partir de seqüências expressas contidas no
banco de dados SUCEST (Sugarcane Expressed Sequence Tag) e genotipagem utilizando uma nova ferramenta de
espectrometria de massa MALDI-TOF, em uma plataforma compacta chamada SEQUENOM®. Foram selecionadas
2.908 seqüências no qual possuem diferencial de expressão, utilizando o programa QualitySNP para a descoberta
dos SNPs e o programa MassArray Assaydesign® para o desenho dos iniciadores de seqüência, foi possível o
desenvolvimento de 943 SNPs. Os marcadores foram genotipados em uma população de mapeamento derivada
do cruzamento bi-parental de variedades comerciais, IACSP 95-3018 como parental feminino e IACSP 93-3046
como parental masculino, e uma progênie de 220 indivíduos. Inicialmente os marcadores foram genotipados nos
parentais da população de mapeamento juntamente com 13 indivíduos da progênie para a avaliação quanto ao
polimorfismo. Do total, 790 (84%) dos SNPs foram amplificados com sucesso e destes 245 (31%) apresentaram
polimorfismo entre os parentais da população de mapeamento e foram genotipados no restante da progênie.
Todos os marcadores desenvolvidos foram analisados em relação à segregação na progênie e serão utilizados
para a construção de um mapa genético juntamente com outros marcadores previamente desenvolvidos.
Apoio financeiro: CNPQ, FAPESP, IAC-Cana.
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Desenvolvimento de marcadores moleculares microssatélites
para estudo conservacionista de Anadenanthera colubrina:
uma espécie que ocorre em alta densidade em pequenas
populações no interior do estado de São Paulo
Feres, JM1,2; Zucchi, MI3; Monteiro, M4; Pinheiro, JB4; Mestriner, AM1; Alzate-Marin, AL1
PPG-Genética, FMRP/USP
Laboratório de Genética Vegetal, Depto. de Genética, FMRP/USP, Av. Bandeirantes 3900, 14049-900, Ribeirão Preto, SP, Brasil
3
Instituto Agronômico de Campinas, Av. Barão de Itapura, 1481 – Botafogo, Campinas - SP, 13020-902
4
USP, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Departamento de Genética. Av. Pádua Dias, 11
Vila Independência13400-970 - Piracicaba, SP – Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Angico, Marcadores Moleculares Microssatélites, Conservação Genética Florestal
Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan é uma espécie da família Mimosaceae, comumente conhecida como angico,
angico branco entre outros. Ocorre desde o sul da Bolívia até o norte da Argentina, destacando-se por apresentar valor
ecológico, medicinal e econômico, além de figurar como uma importante espécie a ser utilizada em reflorestamentos
heterogêneos. Nas últimas décadas, o foco das pesquisas tem sido direcionado para o contexto genético da conservação da
biodiversidade, pois atualmente as ferramentas científicas permitem quantificar a diversidade genética com o objetivo de
responder questões práticas em ecologia. Visando disponibilizar uma ferramenta que permita realizar estudos genéticos de
A. colubrina, este trabalho teve como objetivo desenvolver marcadores moleculares microssatélites (SSR) para esta espécie.
Amostras de tecido foliar de um indivíduo de A. colubrina foram coletadas em um remanescente florestal em Ribeirão
Preto. O DNA foi extraído e digerido com enzima de restrição RsaI. Os fragmentos gerados foram ligados a adaptadores com
sequências conhecidas e pré-amplificados (PCR). Os fragmentos ricos nas repetições complementares foram selecionados
por meio de hibridazação com oligonucleotídeos biotinilados (GT8 e CT8) e moléculas de streptavidina associadas a
partículas magnéticas. Posteriormente, fez-se a amplificação, a clonagem em células competentes (E. coliXL1-Blue)
e a seleção das colônias recombinantes. Duas dessas bibliotecas enriquecidas para microssatélites (GA)n e (CA)n foram
construídas. A escolha dos locos SSR foi feita conforme o número de repetições e suas posições no trecho sequenciado,
sendo os pares de primers desenhados nas regiões flanqueadoras usando o programa GeneRunner 3.05. Os marcadores
obtidos foram amplificados via PCR sendo testadas 10 temperaturas de amplificação (47–56oC) com uma amostra de 5
indivíduos. Os fragmentos amplificados foram separados em gel de poliacrilamida 10%, corados com nitrato de prata e o
tamanho dos alelos estimado por comparação com marcador de peso molecular 10pb (invitrogen). Da primeira biblioteca,
96 clones foram sequenciados e apenas 8 deles apresentaram mais de cinco repetições in tandem e foram selecionados para
o desenho de primers. Como consequência do baixo enriquecimento observado na primeira biblioteca, 78 clones foram
sequenciados da segunda biblioteca, dos quais 41 (52,6%) apresentaram SSR e 12 foram selecionados para o desenho e sintese
de primers, totalizando 20 marcadores. Entre os 20 pares de primers testados, 16 apresentaram produtos de amplificação
consistentes e polimórficos, 2 foram monomórficos para as amostras testadas e 3 não amplificaram. As condições de
PCR para esses marcadores SSR estão sendo otimizadas com a finalidade de escolher os 10 melhores para os estudos
genéticos nas populações de angico de interesse. O desenvolvimento desses novos marcadores fornecerá uma ferramenta
genética útil para investigar questões refinadas do sistema reprodutivo, fluxo gênico e estrutura populacional de angico,
auxiliando nas estratégias conservacionistas da espécie e no entendimento da dinâmica florestal tropical como um todo.
Apoio Financeiro: CAPES, FAPESP, CNPq, FAEPA, Programa de Pós-Graduação genética USP/RP.
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Polimorfismos de conformação de fita simples em
locos microssatélites de Passiflora alata
Diniz, AL; Pereira, GS; Penha, HA; Vieira, MLC
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Maracujá-doce, Marcadores moleculares, SSCP, SSR, Mutação.
Introdução: Marcadores microssatélites (ou SSRs) tem sido amplamente utilizados em estudos de caracterização
da diversidade e de mapeamento genético. Todavia, o baixo nível de polimorfismo desses marcadores em algumas
espécies limita a sua utilização, como é no caso do maracujá-doce (Passiflora alata Curtis). O polimorfismo de
conformação de fita simples (SSCP) decorre das interações nucleotídicas em amplicons desnaturados, fazendo
com que as fitas migrem distintamente em géis de alta resolução, nos casos em que há mutações. Objetivo:
Detectar mutações de ponto em locos microssatélites de P. alata por meio da técnica SSCP. Métodos: O DNA dos
genitores de uma população de mapeamento de maracujá-doce foi utilizado em PCRs com 209 pares de primers
de SSRs desenvolvidos para P. alata. Os produtos da PCR foram desnaturados, submetidos à eletroforese (em gel
de poliacrilamida não-desnaturante 10% com glicerol 5% durante 14 h a 7 W e 21,0±0,5 °C), e corados com nitrato
de prata. As sequências nucleotídicas flanqueadas pelos pares de primers foram analisadas quanto ao tamanho, à
porcentagem de CG e à temperatura de melting (Tm) pelo software OligoCalc. A predição das estruturas secundárias
originadas a partir das fitas simples de DNA foi realizada com auxílio do software Mfold, que também forneceu o
número de estruturas possíveis e a variação de energia livre (ΔG) em cada uma das estruturas. Fragmentos de cada
genitor para seis locos foram sequenciados diretamente, sendo analisados e alinhados no software CodonCode
Aligner. Resultados: Cento e sessenta e seis pares de primers resultaram em amplificação positiva; 40 destes
originaram amplificação de mais de um loco, os quais foram excluídos das análises in silico dos fragmentos. A
avaliação dos 126 primers com amplificação específica permitiu a separação dos mesmos em dois grupos quanto
à resolução das bandas em gel: (i) 74 locos sem definição (exibindo rastros), e (ii) 52 locos com padrão de bandas
facilmente distinguíveis, sendo 34 destes polimórficos entre os acessos de P. alata. Os conjuntos de dados de ambos
os grupos não diferiram estatisticamente para os valores de tamanho, porcentagem de CG, Tm, número de estruturas
preditas e ΔG. Para os seis locos seqüenciados, três exibiram bandas nítidas. A identificação de mutação possibilitou
estabelecer relações entre as estruturas preditas e a existência de polimorfismo em gel. Conclusões: Há uma
tendência de os fragmentos com menos estruturas preditas e menores ΔG exibirem bandas mais nítidas. A técnica
SSCP demonstrou ser eficiente para a detecção de polimorfismos em locos monomórficos de SSRs nos acessos
de P. alata utilizados, revelando sua potencial utilização em estudos de mapeamento genético e de diversidade.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Isolamento de lócus de marcadores microssatélites
para Dyckia distachya Hassler (Bromeliaceae), uma
espécie ameaçada de extinção
Janke, A¹; Paggi, GM²; Zanella, CM¹; Reis, MS³; Bered, F¹
¹ Laboratório de Genética Molecular Vegetal, Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul
² Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul
³ Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Santa Catarina
[email protected]
Palavras-chave: biblioteca genômica, bromélia, SSR
Dyckia distachya Hassler é uma bromélia rara e endêmica do rio Uruguai. A espécie ocorre exclusivamente em
ambientes reofíticos, estando sujeita às forças das corredeiras nos períodos de cheia e a secas extremas nos
períodos de vazante. As pressões antrópicas impostas nesses ambientes, principalmente o desmatamento e a
construção de represas, ameaçam a existência de algumas espécies endêmicas. As políticas de aproveitamento
hidrelétrico do rio Uruguai acarretaram a construção de várias usinas hidrelétricas, alagando os locais de ocorrência
de D. distachya. Como consequência, essa bromélia tornou-se uma integrante da lista das espécies ameaçadas
de extinção do IBAMA. Este trabalho foi realizado com o objetivo de desenhar primers de microssatélites para
serem utilizados em análises da diversidade genética de D. distachya. Para a construção dos microssatélites, o
DNA genômico total foi extraído de folhas frescas de um indivíduo de D. distachya. O isolamento do marcador
envolveu a construção de uma biblioteca genômica enriquecida com repetições (CT)n e (GT)n. A metodologia
baseou-se na sequência de oligonucleotídeos biotinilizados vinculados a partículas magnéticas ligadas a
estreptavidina. Os fragmentos de DNA enriquecidos com microssatélites foram inseridos em um vetor pGEM
T-easy (Promega) e, posteriormente transformados utilizando-se células competentes de Escherichia coli DH5a.
Foram selecionadas 48 colônias recombinantes e sequenciadas com o auxílio de kits Dye-terminator (Applied
Biosystems) no sequenciador de DNA ABI PRISM 377 (Applied Biosystems). A presença de SSR foi analisada
no software Chromas versão 2.32 e os pares de primers foram desenhados no programa primer3 online. Foram
desenhados ao todo 21 pares de primers específicos para D. distachya. A temperatura média de anelamento dos
primers variou entre 54 ºC a 59 ºC, com diferença máxima de 3 ºC na temperatura de anelamento entre cada
primer do par, e o conteúdo de GC entre 40% e 52%. Dos 21 microssatélites que tiveram os primers desenhados
12 foram perfeitos, seis compostos e três imperfeitos. Do total de microssatélites, a classe de dinucleotídeos foi a
mais frequente (92,11%), provavelmente em virtude das sondas utilizadas (CT e GT). Também foram encontrados
mononucleotídeos, tetranucleotídeos e hexanucleotídeos todos com a mesma frequência (2,63% cada). Brevemente,
os primers desenhados serão testados em diferentes indivíduos de D. distachya, visando à validação dessa
biblioteca genômica e posterior utilização dos mesmos em estudos de diversidade genética na espécie analisada.
Apoio financeiro: CNPq
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Desenvolvimento e caraterização de locos
microsatélite para Lychnophora ericoides (Asteraceae),
uma espécie do cerrado ameaçada de extinção
Rabelo, SG1; Teixeira, CF1; Brondani, RPV2; Telles, MPC1; Collevatti, RG1
Laboratorio de Genética e Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, CP 131. Goiânia, Goiás.
Brasil. 74001-970. e-mail: [email protected]
2
Laboratorio de Biotecnologia, EMBRAPA-CNPAF
[email protected]
1
Palavras-chave: cerrado rupestre, Cerrado, Lycnhophora ericoides, arnica, microsatélites.
O gênero Lychnophora (Asteraceae), exclusivo do Cerrado, possui cerca de 25 espécies restritas à Serra do
Espinhaço em Minas Gerais, Bahia e em habitats similares em Goiás e Distrito Federal. São arbustos endêmicos de
campo rupestre, campo limpo e campo cerrado, com distribuição agregada formando populações bem definidas
espacialmente. Lychnophora ericoides (arnica) ocorre em Goiás, Distrito Federal e em Minas Gerais, em elevações
entre 950 a 1800m. É bastante explorada na medicina popular devido a propriedades antiinflamatórias. No
presente trabalho, apresentamos os resultados do desenvolvimento, otimização e caracterização de marcadores
microsatelites, que serão utilizados posteriormente para estudos de estrutura genética e fluxo gênico. Os
microsatélites foram desenvolvidos a partir de uma biblioteca genômica enriquecida cortada com enzima SAU 3AI
para a unidade de repetição AG/TC. Após enriquecimento utilizando contas magnéticas, a biblioteca foi clonada
em plasmídeo PGEMT que foram inseridos em E. coli DH5α. Os clones foram cultivados em meio solido LB mais
ampicilina e IPTG/XGAL para selecão e posterior hibridização com sonda (AG/TC)13 em membrana Hybond H
(GE Healthcare) para confirmação da presença da região repetitiva. Foram obtidos 213 clones positivos que foram
sequenciados e geraram trinta e oito fragmentos com região microsatélites com caracteristicas desejáveis para o
desenho de primers. As sequência foram analisadas no site Websat e os primers foram desenhados utilizando o
programa Primer3. Dos 38 pares de primers desenhados e sintetizados 26 foram otimizados a temperaturas que
variou entre 40 a 56°C. Destes 26, quatro já foram caracterizados utilizando 55 indivíduos de L. ericoides escolhidos
ao acaso. Após amplificação por PCR, o polimorfismo foi detectado em géis desnaturantes de poliacrilamida 6%
corados com nitrato de prata. O tamanho dos alelos foi determinado por comparação com um padrão de DNA
Ladder 10 pb. Dos quatro primers caracterizados três apresentaram polimorfismo (Lyc11, Lyc13, Lyc27), sendo o
número de alelos igual a 7, 4 e 5, respectivamente. A heterozigosidade esperada para estes foi de 0,843; 0,280; 0,703
e a observada foi de 0,343; 0,318; 0,289, respectivamente. Todos os locos estão em equilíbrio de Hardy Weinberg (p
> 0,012) e todos os pares de locos estão em equilíbrio de ligação (p>0,008). Atualmente os primers já otimizados
estão sendo caracterizados para serem utilizados em um posterior trabalho de estrutura genética e fluxo gênico.
Apoio financeiro: FAPEG/CNPq (Pronex), CNPq
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Desenvolvimento e caracterização de novos
marcadores moleculares para a gramínea forrageira
Brachiaria humidicola
Alleoni, GC2; Vigna, BBZ2; Jungmann, L1; Valle, CB do1; Souza, AP2
Laboratório de Biotecnologia de Plantas, Embrapa Gado de Corte, CP 154, CEP 79.002-970. Campo Grande, MS, Brasil
CBMEG, Universidade Estadual de Campinas, CP 6010, CEP 13.083-875, Campinas, SP, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Brachiaria humidicola, forrageiras, braquiária, microssatélites, marcador molecular
Atualmente, o Brasil possui posição de destaque no mercado mundial de carne bovina, figurando como principal
exportador e segundo maior produtor. A base para a bovinocultura no país são as plantas forrageiras, ocupando
uma área de 172 milhões de hectares e sustentando um rebanho de quase 170 milhões de bovinos. Dentre as
forrageiras utilizadas no país, as gramíneas do gênero africano Brachiaria são predominantes. Brachiaria humidicola
apresenta diversas características de interesse agronômico e está incluída no programa de melhoramento de
forrageiras tropicais da Embrapa Gado de Corte - Campo Grande/MS. Os programas de melhoramento têm
mostrado uma necessidade de maiores informações genéticas, que podem ser geradas através de marcadores
moleculares. Nesse trabalho são apresentados o desenvolvimento e caracterização de 116 pares de primers de
microssatélites para B. humidicola. A partir de uma biblioteca enriquecida em microssatélites para essa espécie
foram analisados 384 clones e os insertos obtidos variaram entre 300 e 1.600 pares de bases. Estes clones tiveram
seus plasmídeos extraídos e submetidos a reações de seqüenciamento utilizando primes direto e reverso. As
reações de seqüenciamento foram feitas utilizando-se ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Foram
analisados 768 reads, utilizando-se o programa SeqMan (DNASTAR Inc.). Esta análise resultou em 393 clusters
(229 singlets + 164 contigs) onde foi feita uma busca por motivos repetitivos através da ferramenta computacional
Simple Sequence Repeat Identification Tool - SSRIT (www.gramene.org). Dos clusters avaliados, 68,9% apresentaram
microssatelites. Foram desenhados 216 pares de primers através do programa Primer Select (DNASTAR Inc.), dos
quais 100 foram previamente caracterizados. Para os testes de determinação das condições de amplificação dos
116 microssatélites deste trabalho, foram utilizados oito genótipos, sendo dois os parentais de uma população F1
segregante e os outros seis híbridos dessa população. 47 (40,5%) pares de primers amplificaram satisfatóriamente
em temperaturas específicas. Os demais serão testados em programa de Touchdown. Os marcadores caracterizados
nesse trabalho serão utilizados para o mapeamento da apomixia nesta população, bem como para estudos de
diversidade e identificação de híbridos, sendo aplicados diretamente no programa de melhoramento desta espécie.
Apoio Financeiro: Fapesp, Embrapa, CNPq, Unipasto e Fundect-MS
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Desenvolvimento de marcadores TRAP direcionados
a genes de resistência e EST-SSR para fins de
mapeamento genético em cana-de-açúcar
Rodrigues, TB1; Palhares, AC1; Maccheroni, W2; Vieira, MLC1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
CanaVialis S.A
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sporisorium scitamineum, cana-de-açúcar, mapeamento genético, marcadores moleculares.
Introdução: O carvão (Sporisorium scitamineum) é uma das principais doenças das lavouras de cana-de-açúcar,
podendo causar perdas de até 100% na produtividade das variedades suscetíveis. O conhecimento sobre a
herança da resistência é fundamental para a seleção de genótipos em um programa de melhoramento. Os genes
de resistência codificam proteínas que apresentam domínios altamente conservados e isto tem implicações no
desenvolvimento de marcadores moleculares direcionados a locos de resistência e para a clonagem desses genes
baseada em mapas de ligação. Marcadores genéticos capazes de amostrar a variação em regiões transcritas do
genoma, tais como microssatélites derivados de sequências expressas (EST-SSR) e polimorfismos de amplificação
de regiões alvo (TRAP) possibilitam identificar marcas associadas à expressão dos genes de resistência em
populações segregantes. Neste contexto, este trabalho tem por objetivo gerar marcas TRAP e EST-SSR e alocálas no mapa de ligação da população (F1), oriunda do cruzamento entre os genitores ‘IAC66-6’ (suscetível ao
carvão) e ‘TUC71-7’ (resistente) e identificar regiões genômicas que contenham locos de resistência quantitativa
(QTL). Métodos: O material vegetal consistiu dos dois genitores e da população de mapeamento composta de 188
indivíduos. A amplificação das bandas de TRAP foi conduzida segundo Hu & Vick (Plant Mol. Biol. Rep., 2003),
usando combinações de três primers aleatórios e seis fixos, desenhados para regiões LRR, NBS/LRR e S/T Kinase, já
caracterizados em cana-de-açúcar (Rossi et al., Mol Gen Genomics, 2003) e aqui avaliados em gel de poliacrilamida
desnaturante 5%. Para a amplificação das bandas de EST-SSR, utilizaram-se primers previamente caracterizados,
marcados com fluorescência 6-FAM e NED, sendo os alelos foram detectados no sistema MegaBACE 1000 (GE
Healthcare Life Sciences) e analisados pelo programa Fragment Profiler versão 1.2 (Amersham Biosciences).
Resultados: Aproximadamente 570 fragmentos TRAP foram amplificados, com tamanho variando entre 85 a
1.100 pb; destes, 107 apresentaram-se polimórficos entre os genitores, sendo que a esse polimorfismo pôde ser
associado ao domínio protéico avaliado. Um total de 118 alelos foi detectado para 17 locos EST-SSR; destes, 57
apresentaram segregação em dose única após correção de Bonferroni para α-0,05, sendo que 43 foram alocados no
mapa de ligação da população em estudo, permitindo a identificação de parte dos cromossomos homeólogos da
cana. Conclusão: A tecnologia TRAP é uma importante ferramenta para a amplificação de regiões que codificam
proteínas de resistência e detecção do polimorfismo. As marcas obtidas (TRAP e EST-SSR) agregaram informações
ao mapa de ligação e serão úteis no mapeamento de locos quantitativos associados à resistência ao S. scitamineum.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e CanaVialis S.A.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Desenvolvimento e análise de uma biblioteca de CDNA
de painel de seringueira (Hevea brasiliensis)
Da Silva, CC1; Campos, T1; Gonçalves, PS2; Maluf, MP3; Souza, AP4
Laboratório de Análise e Genética Molecular - Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, CBMEG/UNICAMP
Programa Seringueira – IAC/EMBRAPA
3
Centro de Café Alcides Carvalho - IAC/EMBRAPA.
4
Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, UNICAMP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: seringueira, Hevea brasiliensis, biblioteca de cDNA.
A seringueira [Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell-Arg.], espécie nativa da Amazônia, pertencente à
família Euphorbiaceae, é a maior fonte de borracha natural do mundo. A despeito de o Brasil ser o centro de origem
e de diversidade da espécie, em 2005, o país contribuiu apenas com 1% da produção mundial e importou-se 2/3 da
borracha consumida no país. Programas de melhoramento genético da seringueira têm sido fundamentais para o
aumento de produção e obtenção de outros caracteres desejáveis. Entretanto, o ciclo de melhoramento genético da
seringueira é muito longo (cerca de 30 anos). Portanto, torna-se fundamental o desenvolvimento de novas técnicas
de avaliação precoce, como a utilização da biologia molecular, para tornar mais eficiente e rápida a obtenção de
novos cultivares. A clonagem de cDNA é uma das mais importantes ferramentas em biologia molecular e as ESTs
são uma ferramenta poderosa para a identificação de genes que são preferencialmente expressos em certos tecidos
ou tipos celulares. Neste trabalho, o painel (casca) foi utilizado devido à sua importância na extração do látex para
produção de borracha. Seis clones com boa produção de borracha (PB 217, PR 255, GT 1, RRIM 701, PB 235 e IAN
873) foram utilizados para extração de RNA total. Foi utilizado um protocolo com precipitação por LiCl, o qual
apresentou-se eficiente também na extração de RNA de outros tecidos, como folha, látex e flores. O RNA total dos
clones foi misturado em quantidades equimolares e 5µg do pool de RNAs foi usado na construção de uma biblioteca
de cDNAs enriquecida para transcritos completos (SMARTer cDNA Cloning kit- Clontech), e aproximadamente
três mil clones foram obtidos até o momento. Os clones estão sendo seqüenciados e a análise das sequências
apresenta o perfil de transcrição dos tecidos do painel. Com a produção de ESTs, será possível a identificação de
genes relacionados com características economicamente importantes, além de proporcionar uma valiosa fonte de
marcadores moleculares que poderão ser usados na genotipagem e mapeamento molecular funcional em seringueira.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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Caracaterização de marcadores moleculares do tipo
microssatélite para Hevea brasiliensis e estudo de
transferibilidade em espécies do mesmo gênero
Suzuki, FI1; Mantello, CC1; Souza, LM1; Souza, AP1,2
1
2
Laboratório de Análise Genética Molecular - Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genétic (CBMEG)- Instituto de Biologia, UNICAMP
Departamento de Botânica – Instituto de Biologia – UNICAMP
Palavras-chave: Hevea brasiliensis, biblioteca genômica, microssatélites, caracterização, transferibilidade O gênero Hevea pertence a família euphorbiaceaea e as plantas desse gênero podem se apresentar como árvores
ou arbustos. Dentro do gênero a espécie Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell-Arg, caracterizada como
espécie de comportamento anfidiplóide, é a de maior importância econômica dentro do gênero por ser a maior
fonte de borracha natural do mundo. O Brasil é o centro de origem e diversidade genética desta cultura sendo que
no final século XIX foi o principal produtor e exportador de borracha natural e hoje, responde por apenas 1% da
produção mundial. No entanto, apesar do Brasil centro de origem da espécie e diversidade, e a região Amazônica
oferecer ótimas condições para o desenvolvimento da cultura, o fungo Microcyclos ulei, também conhecido como
SALB (South American leaf bligtht), é causador de uma doença conhecida como o mal-das-folhas, que limita a
produção de borracha nessa região e por isso a heveicultura tem se expandido para áreas de escape. Como o ciclo de
melhoramento genético da seringueira, leva de 20 a 30 anos para se concretizar, as técnicas de biologia molecular
possibilitam a diminuição e otimização das avaliações para essa cultura. Os marcadores moleculares do tipo
microssatélites (Simple Sequence Repeats-SSRs) devido a sua codominância e alto nível de polimorfismo tornaramse uma importante ferramenta em programas de melhoramento. Este trabalho teve como objetivo a caracterização
de marcadores moleculares do tipo microssatélite em Hevea brasiliensis, bem como testar a transferibilidade destes
mesmos em outras espécies do gênero. Os marcadores obtidos foram caracterizados em genótipos contrastantes de
H. brasiliensis e a transferibilidade desses marcadores foi testada em mais sete espécies do gênero Hevea (H. guianensis,
H. rigidifolia, H. pauciflora (112 CNSG e 116 CNSG), H. nitida, H. benthamiana, H.camargoana. Até o momento foram
testados 41 marcadores, nos quais os valores de PIC variam de 0,37 à 0,82. Já os valores de heterozigosidade observada
e esperada variaram de 0,34 a 0,83 e de 0,38 a 0,85, respectivamente. Dos 41 marcadores testados 35 amplificaram
em H. guianensis, 31 em H. camargoana, 35 em H. pauciflora 112 CNSG, 33 em H pauciflora 116 CNSG, 36 em H.
benthamiana, 34 em H. rigidifolia e 37 em H. nítida. Esta alta porcentagem de transferibilidade pode ser explicada
pois o gênero Hevea é considerado um complexo de espécies, ou seja, há ausência de barreira reprodutiva entre elas.
Apoio financeiro: FAPESP
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Desenvolvimento e caracterização de marcadores
microssatélite a partir de sequências expressas em
cana-de-açúcar
Cardoso-Silva, CB1; Costa, EA1; Mancini, MC1; Balsalobre, TWA1; Souza, AP1,2
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-UNICAMP, Campinas-SP
Depto. de Genética Vegetal – IB/UNICAMP, Campinas-SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bioinformática, EST-SSRs, GenBank, Saccharum sp., polimorfismo.
A cana-de-açúcar (Saccharum sp.) é considerada umas das culturas de maior importância econômica no
mundo. No Brasil, é a principal fonte da produção sucroalcooleira. Com a crescente necessidade de aumentar a
produtividade, os programas de melhoramento geram, constantemente, novas variedades comerciais. Porém, esse
processo é demorado e consome vários anos até o seu lançamento. O desenvolvimento de marcadores genéticos,
PCR específicos, como os microssatélites (SSR), pode acelerar significativamente este processo. O projeto de
sequenciamento de ESTs (Expressed sequence Tags) da cana-de-açúcar (SUCEST) já identificou cerca de 43 mil
clusters que representam genes relacionados com características de interesse econômico. Um total de 2005 destes
clusters possuem regiões microssatélites, sendo potenciais para o desenvolvimento destes marcadores genéticos.
Tendo por base essas informações, o presente trabalho teve por objetivo o desenvolvimento e a caracterização
de marcadores EST-SSRs em cana de açúcar. Em busca de homologias, as sequências de ESTs foram comparadas
com sequências do GenBank utilizando o algoritmo Blastx. Para aquelas sequências que se identificou homologia,
fez-se a ontologia utilizando o software Gene Ontology. Para o desenvolvimento dos primers, foram selecionados
64 clusters de EST-SSRs oriundas do SUCEST, e desenhados com o auxílio do software Primer3Plus. Os primers
desenhados foram avaliados para a determinação da temperatura ótima de anelamento, com gradiente de
temperaturas variando entre 50ºC e 65ºC. Os produtos de amplificação, para o teste de gradiente, foram
analisados em gel de agarose 3% e corados com brometo de etídeo. O potencial de gerar polimorfismo, destes
marcadores, foi testado em uma amostra de 18 clones de cana-de-açúcar, incluindo três espécies de Saccharum
(S. officinarum, S. barberi, S. sinense). Os EST-SSRs selecionados foram submetidos à análise de polimorfismo em
gel de poliacrilamida 6% e corados com nitrato de prata. Os géis foram genotipados, tomando por base presença
e ausência de amplicons, com a ajuda de um transluminador. Para cada EST-SSR, analisou-se o número de alelos,
o conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) e o poder discriminatório (PD). Para análises de diversidade
genética utilizou-se o programa NTSYS v2.1. Do total de clusters analisados, 54(84%) apresentaram homologia com
sequências de proteínas depositadas no GenBank. Sendo que, 36(66,7%) destas proteínas já foram identificadas, e
18(33,3%) são proteínas ainda desconhecidas. Das proteínas identificadas, 26(72%) apresentou função molecular
e/ou o processo biológico nas quais estariam envolvidas, descritas. As análises de diversidade permitem
afirmar que os marcadores selecionados serão úteis em sua aplicação em programas de mapeamento genético.
Apoio Financeiro: FAPESP, BIOEN
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Otimização de iniciadores (primers) de microssatélites para
o cajueiro-do-campo, Anacardiumhumile (Anacardiaceae)
Oliveira, GCX1; Grando, C1; Monteiro, M2; Zucchi, MI2
Departamento de Genética. Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP
Instituto Agronômico de Campinas, Campinas, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microssatélites, primers, otimização, genética de populações, genética ecológica
O sucesso na obtenção de iniciadores de microssatélites para uso como marcadores moleculares depende da
otimização das concentrações de reagentes e de DNA, bem como da temperatura, em reações de PCR. Apesar de ser
uma etapa onerosa devido ao número normalmente elevado de reações necessárias para avaliar todas as variáveis
envolvidas, a otimização é fundamental para garantir maior precisão e eficiência da replicação, pois permite maior
especificidade na associação entre os marcadores moleculares e as sequências alvo de DNA, resultando na produção
de quantidades maiores de produtos da amplificação. Assim, este trabalho teve como objetivo a otimização de
quinze pares de iniciadores de Anacardiumhumile, uma espécie de caju de importância alimentícia e medicinal
do cerrado brasileiro. Os iniciadores, desenvolvidos por Grando et al. (2009) a partir de uma biblioteca genômica
enriquecida de microssatélites, foram primeiramente submetidos à otimização de quatro concentrações de DNA
(não diluído, 1:10, 1:50, 1:100), em reações de PCR com cinco temperaturas de reassociação entre 48 e 55°C, sendo
utilizado o DNA de quatro indivíduos de A. humile. Posteriormente, foram otimizadas as concentrações de cloreto
de magnésio (1,5mM; 2,5 mM; 3,5mM) em esquema de PCR touchdown, nas seguintes condições de amplificação:
um ciclo de desnaturação a 95°C por 5 min; 11 ciclos correspondentes ao touchdown, com 45s a 94°C, 45s a 62°C (- 1°C
por ciclo) e 45s a 72°C; 40 ciclos de reação com 45s a 94°C, 45s com 11 temperaturas de reassociação entre 48 e 62°C,
e 45s a 72°C; e um ciclo final de extensão a 72°C por 15 min. As amplificações foram visualizadas em gel de agarose
1% (p/v) em 45 min de corrida, utilizando-se um marcador de peso molecular de 100pb. Os iniciadores mostraram
melhor amplificação com o DNA na concentração de 1:100 e com o cloreto de magnésio, em sua maioria, em
1,5 mM. Um dos pares de iniciadores não mostrou amplificação em nenhuma das temperaturas de reassociação
escolhidas, o que indica a qualidade dos parâmetros adotados para o desenho dos demais. Treze iniciadores
amplificaram no intervalo entre 48 a 62°C de temperatura de reassociação, enquanto o iniciador AHPID09 somente
apresentou bandas nas temperaturas de 60 e 62°C, mas com padrão complexo. As temperaturas de reassociação
dos iniciadores observadas nas reações diferiram das temperaturas de reassociação preditas teoricamente
quando do seu desenvolvimento, o que mostra a importância da etapa de otimização. Futuramente, os iniciadores
otimizados serão utilizados para a caracterização genética de populações naturais de Anacardiumhumile.
Apoio financeiro: CNPq
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Desenvolvimento e validação de marcadores genéticos
baseados na técnica NBS-profiling, otimizada para
feijão e cana-de-açúcar
Vieira, MLC1; Santini, L1; Palhares, AC1; Van Sluys, M-A2; Hanai, LR1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: marcadores moleculares, genes de resistência, retrotransposons, feijão, cana-de-açúcar.
Introdução: A contribuição dos mapas de ligação para o melhoramento genético de plantas é evidente; no entanto,
grande parte dos marcadores usados é anônima. Com o advento da Genômica, foi possível o desenvolvimento
de marcadores provenientes de sequências caracterizadas, enriquecendo as informações genéticas contidas
nos mapas de ligação. Várias técnicas têm sido empregadas visando à obtenção de tais marcadores, entre
elas NBS-profiling (Van der Linden et al. Theoret App Gen, 209: 384-393, 2004), que se baseia na detecção de
polimorfismos gerados em duas etapas, restrição e amplificação do DNA alvo. Este trabalho teve como objetivo
a otimização da metodologia NBS-profiling para a obtenção de marcadores associados a regiões genômicas de
interesse em feijão-comum (Phaseolus vulgaris) e cana-de-açúcar (Saccharum spp.). Os materiais usados foram
duas populações segregantes de feijão (“Bat93” x “EEP558” e “Carioca” x “Flor de Mayo”) e uma de cana-deaçúcar (“IAC 66-6” x “TUC 71-7”). Igual procedimento foi adotado na etapa de restrição do DNA; no entanto,
em feijão, na etapa de amplificação, foram utilizados “primers” RGA (Resistance Genes Analogs) e, em cana-deaçúcar, “primers” direcionados às sequências do retrotranposon SURE (SUgarcane REtrotransposon). Para a
validação dos marcadores, uma seleção de fragmentos (100 a 800 pb), seguida por clonagem e seqüenciamento,
foi realizada. As sequências obtidas foram comparadas àquelas presentes no banco de dados do NCBI usando
o algoritmo BLAST (Basic Local Alignment). Para a validação dos locos RGAs, foi utilizada a ferramenta BLASTx
(direcionada a proteínas) e para os locos derivados de retrotransposons, a ferramenta BLASTn (direcionada aos
nucleotídeos). Resultados: Um total de 32 sequências foi obtido para feijão, sendo que 11 sequências alinharam
com proteínas conhecidas, das quais 73% foram similares a proteínas relacionadas à resistência a patógenos. Para
a cana-de-açúcar, foram obtidas 27 sequências, das quais 18 alinharam com sequências nucleotídicas conhecidas,
sendo que 83% destas foram similares ao retrotransposon SURE. Conclusão: A metodologia NBS-profiling é
extremamente eficiente para a amplificação de regiões alvo em espécies vegetais, independente do grau de
ploidia, mostrando-se uma ferramenta importante para a identificação de regiões associadas a genes de interesse.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES e Fapesp.
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Desenvolvimento de marcadores microssatélites
a partir de biblioteca genômica enriquecida para a
orquídea Cattleya coccinea
Novello, M1; Pinheiro, F2; Koehler, S3
Laboratório de Ecologia Evolutiva e Genética Aplicada, Departamento de Genética/ ESALQ, Universidade de São Paulo
Instituto de Botânica de São Paulo
3
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Microssatélites, variabilidade genética, conservação, Orchidaceae, coccinea.
Os efeitos da fragmentação de habitat causados principalmente pela ação do homem têm sido um fator decisivo
para a perda da diversidade genética em populações naturais da Mata Atlântica. Marcadores moleculares do tipo
microssatélites constituem ferramentas importantes para avaliar os efeitos da fragmentação de habitats sobre
a diversidade e estrutura genética das populações. A espécie Cattleya coccinea ocorre principalmente na Serra
do Mar entre os estados de Espírito Santo e Rio Grande do Sul, geralmente acima de 800 m.s.m. O objetivo desse
estudo foi desenvolver marcadores microssatélites para a espécie Cattleya coccinea - uma orquídea característica
de altitudes elevadas, mas que apresenta populações muito reduzidas devido à coleta indiscriminada e redução
da cobertura vegetal. A construção do banco foi realizada no Laboratório de Análise Genética e Molecular do
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG) da UNICAMP. Em uma primeira etapa foi realizada
a digestão do DNA genômico e ligação dos adaptadores, seguida da seleção de fragmentos através da hibridização
de oligonucleotídeos conjugados à biotina complementares aos motivos (CT)n e (GT)n. Após a amplificação
dos fragmentos enriquecidos, realizou-se a clonagem em vetor pGEM-T e transformação em células XL1-BLUE
competentes. A identificação de clones positivos e verificação da eficiência do procedimento de enriquecimento
e clonagem foi realizada através da amplificação dos insertos diretamente das colônias obtidas. Um total de
288 clones foram seqüenciados. As sequências produzidas foram analisadas através do programa Chromas Lite.
Sequências complementares foram combinadas com auxílio do programa Seq Man Pro. Em seguida foi realizada a
seleção das sequências contendo microssatélites, com auxílio do programa Web Sat, sendo os pares de iniciadores
desenhados com auxílio do programa PRIMER3. Dos 66 pares de iniciadores desenhados, 18 (27%) foram
sintetizados para testes, sendo 17 dinucleotídeos simples e um composto imperfeito. A próxima etapa consistiu da
otimização de cada par de iniciador a fim de obter produtos de amplificação de boa qualidade. As reações foram
ajustadas considerando a temperatura de anelamento, concentração de dinucleotídeos, cloreto de magnésio e do
DNA molde. A otimização foi bem sucedida para 15 dos 18 pares de iniciadores sintetizados. Em uma próxima
etapa, será avaliado o polimorfismo desses marcadores dentro e entre populações de C. coccinea. As orquídeas
constituem uma das famílias de angiospermas com maior número de espécies, apresentando uma diversidade
surpreendente nos neotrópicos. Entretanto, o potencial de microssatélites em estudos de genética evolutiva ainda
é pouco explorado, sendo a maioria dos estudos disponíveis para espécies de orquídeas de regiões temperadas.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Caracterização da diversidade e estrutura genética em
populações de Apuleia leiocarpa (Vogel) Macbride (Grápia)
visando sua conservação no Estado de Santa Catarina
Fernandes, CD1; Seo, HLS1; Loch, DSS1; Figueiredo, LGU1; Montagna, T1; Bittencourt R1,2; Reis, MS1,2
Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Universidade Federal de Santa Catarina
Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Alozimas, Conservação in situ, Diversidade Genética, Fabaceae, Floresta Estacional Decidual.
A Grápia - Apuleia leiocarpa - é uma espécie arbórea caducifólia pertencente à família das Fabaceae. Sua madeira
foi largamente explorada pela indústria madeireira, principalmente em construções de estruturas externas. Devido
à grande pressão que a espécie sofreu no passado e que vem sofrendo suas populações remanescentes e por ser
uma das espécies características da Floresta Estacional Decidual, ocupando o estrato emergente da mesma, a
espécie foi incluída para caracterização da diversidade genética no âmbito do Inventário Florístico e Florestal
de Santa Catarina. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi de caracterizar a diversidade genética interna e
a estrutura genética de populações de Grápia no Estado de Santa Catarina. Foram coletadas amostras foliares
de indivíduos adultos em cinco populações buscando um tamanho amostral de 50 indivíduos por população.
Outras nove populações ainda serão avaliadas. Para a genotipagem dos indivíduos foi utilizada a técnica de
eletroforese de isoenzimas em gel de amido (13%). Os sistemas isoenzimáticos utilizados foram PGM, ME, PGI,
IDH, G6PD, GOT, DIA, MDH, PRX, GTDH, LAP e SKDH em tampão Tris-citrato, revelando 15 locos passíveis de
interpretação. Todos os locos apresentaram polimorfismo em ao menos uma população. Foram encontrados
alelos exclusivos em três populações. A diversidade genética média (He) das 5 populações foi de 0,340, variando
de 0,369 a 0,282 na população PALM. O índice de fixação médio para as 5 populações foi de 0,341, variando de
0,290 até 0,393. Estes valores demonstram que a espécie apresenta uma diversidade genética alta, porém, os
índices de fixação obtidos denotam que as populações apresentam uma grande fragilidade devido à endogamia e
eventual perda de alelos dentro das populações. Além disso, os resultados indicarm uma estruturação moderada
entre as populações (FST = 0,134) e vários alelos exclusivos, reforçando a idéia de fragmentação e redução do
tamanho efetivo populacional pela superexploração. As estratégias de conservação in situ para a espécie devem
contemplar mecanismos que favoreçam a ampliação da conectividade entre as populações da espécie na região.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESC/ Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina
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Análise da variabilidade genética em populações
naturais de canjerana (Cabralea canjerana) do Rio
Grande do Sul através de marcadores ISSR
Bandeira, AJ1,2; Leão, GB1,2; Deimling, LI2; Georg-Kraemer, JE1,2,3
Curso de Ciências Biológicas – ULBRA
Laboratório da Biodiversidade Vegetal – ULBRA
3
Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada – ULBRA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: espécie nativa, marcadores ISSR, diversidade genética, fragmentação, conservação.
Cabralea canjerana é uma espécie arbórea pertencente à família Meliaceae. Ocorre naturalmente na região
neotropical desde a Costa Rica até o Nordeste da Argentina. No Brasil ocorre em todas as regiões, mas com forte
presença a partir de Minas Gerais até o Rio Grande do Sul. É considerada uma das madeiras mais valiosas do Sul
do Brasil, tendo excelente resistência contra insetos e intempéries e de fácil manuseio. Sua utilização estendese também nas áreas de perfumaria e farmacologia. Possui grande valor ecológico pela abundante frutificação
fornecendo alto teor nutricional à fauna. Devido à crescente degradação e fragmentação de florestas da Região
Noroeste Colonial do Rio Grande do Sul, espécies nativas que antes mantinham suas populações em níveis
adequados, hoje se encontram reduzidas, o que pode levar a perda de variabilidade genética, e até mesmo a extinção
destas espécies. Este trabalho tem como objetivo estudar a variabilidade intrapopulacional e o grau de diferenciação
entre populações de canjerana, uma das espécies incluídas em um projeto maior chamado “Reflorestamento com
Espécies Ameaçadas de Extinção de 32 Municípios do Noroeste Colonial do Rio Grande do Sul”. Este projeto
pretende conhecer a diversidade genética de espécies florestais vulneráveis ao processo de fragmentação, gerando
informações para um programa que visa à formação de bancos de germoplasma e a criação de parques florestais
na região. As sementes avaliadas em nosso estudo são provenientes de coletas de fragmentos florestais naturais
dos municípios de: Campo Novo, Coronel Bicaco, Condor, Bozano e Jóia. Foi considerado cada local de coleta
como uma população. De cada população foram coletadas sementes (indivíduos) de polinização aberta, de árvores
femininas designadas como planta-matriz. Estas sementes foram germinadas e quando as plântulas alcançaram 10
cm foram coletadas folhas de 5 indivíduos (progênie) de aproximadamente 5 plantas-matrizes de cada população,
totalizando 125 indivíduos. A técnica de extração de DNA utilizada é a descrita por DOYLE & DOYLE (1987) com
adição de proteinase K. Para a análise da variabilidade genética da canjerana, foi escolhido o marcador ISSR (Inter
Simple Sequence Repeats), por ser um marcador universal, além de apresentar rápida e fácil manipulação, baixo
custo e alta reprodutibilidade. Foram testados onze primers (UBC 807, 809, 810, 811, 825, 834, 835, 836, 841, 855,
857), para diferentes condições de reação e amplificação conforme LEI, et al. (2006), RIZZA et al. (2007) e YAO et al.
(2008). Todos os primers apresentaram polimorfismo. Os primers 807 e 841 já estão sendo amplificados para a análise
dos 125 indivíduos. Os produtos da PCR estão sendo visualizados em gel de agarose 1,5% corados com brometo de
etídeo. Ao final das análises dos ISSR, medidas de variabilidade genética intra e inter-populacional serão calculadas.
Apoio financeiro: CNPQ e ULBRA.
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Variabilidade genética para caracteres silviculturais em
mudas de progênies de uma população de Ceiba speciosa
Silva, ECB1; Manoel, RO1; Kubota, TYK1; Moraes, MA1; Alves, PF1; Mores, SMB1; Mores, MLT1; Sebbenn, AM2
Laboratório de Genética de populações e Silvicultura, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, SP
Instituto Florestal, São Paulo, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: melhoramento florestal; conservação genética; REML/BLUP.
Introdução: Com a crescente fragmentação das florestas naturais, torna-se de suma importância o estudo da
variabilidade genética das populações das espécies arbóreas remanescentes para a sua conservação. Entre as
muitas espécies arbóreas que se encontram nesta situação, destaca-se a paineira (Ceiba speciosa - A. St. Hill. –
Ravena (Malvaceae). Objetivo: Estudar a variação genética para caracteres quantitativos em um teste de progênies
de polinização aberta da C. speciosa. Métodos: O teste de progênies foi estabelecido com sementes coletadas de
30 árvores matrizes de uma população de C. speciosa, localizada na região noroeste do Estado de São Paulo, à
margem da rodovia SP-310, no trecho compreendido entre Poloni e Ilha Solteira. Foram medidos os caracteres
altura de plantas (ALT) e o diâmetro médio do colo (DMC) em mudas de 30 dias após semeadura. O teste de
progênies foi estabelecido no delineamento experimental de blocos completos casualizados, com 20 repetições, 30
progênies e uma planta/parcela, assumindo as progênies com grau de parentesco de meios-irmãos. Os parâmetros
genéticos foram estimados com base na metodologia da máxima verossimilhança restrita e melhor predição
linear não viciada (REML/BLUP), utilizando o programa SELEGEN. Resultados: A altura média das plantas e o
diâmetro médio, respectivamente, foram de 20,85 cm e 3,90 mm. Foram detectadas diferenças significativas entre
as progênies para ambos os caracteres. A estimativa de herdabilidade média entre as progênies, para a ALT e
DMC, respectivamente, foram de 0,03 e 0,92 e o coeficiente de variação genética foi de 22,9% e 31,6%, indicando
que estes caracteres estão sob forte controle genético, em especial o DMC e existe alta variabilidade genética
na população para os caracteres estudados. A acurácia seletiva foi de baixa magnitude para a altura (0,16) e alta
para o diâmetro médio do colo (0,96), indicando neste último caráter, reais possibilidades de ganhos genéticos e
precisão na seleção de progênies superiores. Conclusões: A população possui substancial variação genética para
os caracteres estudados, o que indica a sua utilização em programas de conservação e melhoramento genético.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Caracterização da diversidade e estrutura genética de
populações de Podocarpus lambertii Klotzsch ex Endl
(pinho-bravo) visando sua conservação no Estado de
Santa Catarina
Loch, FASS1; Montagna, T1; Fernandes, CD1; Milanesi, LS12; Altrak, G1; Bittencourt, R12; Reis, MS12
Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Universidade Federal de Santa Catarina
Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Alozimas; Conservação in situ; Floresta Ombrófila Mista; Podocarpaceae; Diversidade genética
Podocarpus lambertii Klotzsch ex Endl (Podocarpaceae) é conhecida popularmente como pinheiro-bravo ou
pinho-bravo. Ocorre no sul do Brasil na Floresta Semidecidual de Altitude e Floresta Ombrófila Mista. O pinheirobravo é comumente usado na recuperação de ecossistemas degradados por sua capacidade de proteger e
enriquecer o solo, de abrigar e alimentar a fauna, recompor a paisagem e restabelecer o regime de água no solo.
Devido à importância da espécie para a funcionalidade dos ecossistemas naturais, o pinheiro-bravo foi incluído
no âmbito do Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina para a caracterização de sua diversidade genética.
Este estudo teve por objetivos caracterizar a diversidade e estrutura genética de populações de P. lambertii no
estado de Santa Catarina. Foram coletadas folhas de 50 indivíduos adultos em cada uma das 12 populações
avaliadas. Para acessar os níveis e a distribuição da diversidade genética, utilizaram-se 10 sistemas enzimáticos
(ME, MDH, DIA, PGI, IDH, 6PGDH, PGM, GTDH, G2DH e G6PDH) em tampão Tris-citrato (TC). Os 10 sistemas
enzimáticos analisados revelaram 11 locos com um total de 32 alelos (A =1,76 ± 0,16). As populações de P. lambertii
apresentaram baixa diversidade genética (P95% = 28,05 ± 9,86; HO = 0,049 ± 0,021; HE = 0,078 ± 0,020). As frequências
genotípicas das populações apresentaram desvios significativos das esperadas sobre panmixia, evidenciando
um alto déficit de heterozigotos (f = 0,371). A presença de alelos raros nas populações e uma diferenciação
genética interpopulacional significativa (FST = 0,293) indicam a necessidade de ações para conservação in
situ das populações de P. lambertii. Entre estas ações, sugerem-se estratégias para ampliação da conectividade
entre as populações e criação de Unidades de Conservação que abriguem distintas populações da espécie.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESC/ Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina
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Caracterização da diversidade e estrutura genética
de populações naturais de Butia eriospatha Mart. Ex
Drude (Butiá) visando sua conservação no Estado de
Santa Catarina
Oliveira, IB1; Nazareno, AG12; Silva, JZ12; Steiner, F12; Bez Birolo, B1; Bittencourt, R12; Reis, MS12
Nucleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Universidade Federal de Santa Catarina
Programa de Pós Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Espécie Ameaçada, Conservação in situ, Alozimas, Floresta Ombrófila Mista e Diversidade Genética
Butia eriospatha, conhecido popularmente como butiazeiro, é uma espécie da família Arecaceae, nativa da Mata
Atlântica do sul do Brasil, ocorrendo nos estados do Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Por ser uma
palmeira imponente, produtora de frutos de paladar agradável e resistente a baixas temperaturas, esta espécie
vem sendo intensamente utilizada como ornamental. Além das pressões sofridas pelo seu uso, o butiazeiro
concorre com as atividades de reflorestamento e pecuária nos campos em que habita. Nestes locais, o pastoreio
do gado e a realização de práticas agriculturais impactantes como as queimadas, vêm há muito tempo limitando
sua regeneração natural. Devido a estas ameaças e sua condição de vulnerável a extinção (Red List IUCN), a
espécie foi selecionada para caracterização da diversidade genética no âmbito do Inventário Floristico-Florestal
de Santa Catarina. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade e estrutura genética
de populações naturais da espécie em Santa Catarina, visando esstabelecer estratégias de conservação Foram
realizadas coletas de material foliar em 9 populações, amostrando-se, no mínimo, 50 indivíduos adultos por
população. Os tampões selecionados foram Tris-citrato e Histidina, e os sistemas enzimáticos PGM, G2DH,
PRX, SKDH, ME, e G6PDH para o primeiro tampão, e NADHDH, LAP, PGI e 6PGDH para o segundo tampão. A
caracterização genética das populações revelou a presença de 28 alelos distribuídos em 13 locos, sendo 9 deles
polimórficos. O número médio de alelos por loco (A) foi de 1,47 (variando de 1,2 a 1,8). O percentual de locos
polimórficos (P95%) foi de 24% (variando de 7,7% a 46,2%) e a diversidade genética média (He) de 0,095 (0,036 a 0,167).
O índice de fixação (F) foi de 0,117 (variando de -0,027 a 0,233) . Quanto à estrutura genética, os dados indicam uma
forte estrturução na espécie (Fit = 0,41; Fst = 0,34; Fis= 0,11). Os resultados obtidos até o momento indicam uma
grande fragmentação nas populações da espécie, com reduzido fluxo gênico histórico e alta fragilidade. Outras 11
populações ainda serão avaliadas. As estratégias de conservação devem contemplar mecanismos de ampliação
da conectividade entre as populações e Unidades de Conservação que contemplem grande número de populções.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESC/ Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina.
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Análise filogenética dos gêneros Aureliana e Athenaea, e
seu posicionamento na subtribo Withaninae (Solanaceae)
Castro, L1; Zamberlan, PM1; Stehmann JR2; Bonatto SL3; Freitas LB1
Laboratório de Evolução Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Laboratório de Sistemática Vegetal, Universidade Federal de Minas Gerais
3
Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: filogenia, trnL-trnF, Aureliana, Atheneae, Solanaceae
A subtribo Withaninae ( família Solanaceae) é composta por apenas sete gêneros e cerca de 40 espécies. Entretanto,
distribui-se de maneira quase cosmopolita, com representantes na Ásia, África, Europa e América. Aureliana e
Athenaea, com 8 e 7 espécies, respectivamente, são endêmicos da Mata Atlântica. A relação filogenética entre
os gêneros da subtribo ainda é incerta, e o relacionamento entre as espécies de Aureliana e Athenaea nunca foi
investigado. Para elucidar estas questões, estão sendo conduzidas análises filogenéticas do grupo. Até o momento
foram coletadas na natureza amostras de 13 espécies de Aureliana e Athenaea. Amostras dos demais gêneros foram
obtidas por doação e cultivo de sementes. Em laboratório, o DNA foi extraído com o kit Nucleo Spin Plant II
(Macherey-Nagel) e quantificado com espectrofotômetro NanoDrop1000 (Thermo Scientific). O espaçador plastidial
trnL-trnF foi amplificado através de PCR e os produtos, sequenciados em equipamento automático MegaBACE1000
(GE Healthcare). As sequências foram alinhadas com o programa ClustalW, implementado no software MEGA4.1,
resultando em um alinhamento de 951pb. Sequências de 18 espécies da subtribo Withaninae foram utilizadas
para a construção de uma árvore filogenética. O modelo evolutivo determinado pelo programa MrModeltest foi
o GTR. A filogenia foi construída através de análise bayesiana com o programa MrBayes e Physalys carpenteri foi
utilizada como grupo externo. A árvore filogenética obtida evidenciou a formação de três grupos independentes
dentro da subtribo Withaninae, todos suportados por valores de probabilidade posterior 1. O primeiro é composto
por representantes dos gêneros Discopodium (endêmico da região equatorial da África), Nothocestrum (endêmico
do Havaí) e Tubocapsicum (China), sendo os dois últimos agrupados entre si com valor de suporte 0,97. O segundo
grupo une duas espécies do gênero Withania, o mais especioso e amplamente distribuído da subtribo. O terceiro
agrupamento é formado pelas 13 espécies de Aureliana e Athenaea. Os ramos deste clado são bastante curtos e não
foram detectados grupos correspondentes a cada um dos gêneros. A formação de três agrupamentos de espécies
independentes dentro da subtribo Withaninae, aliada ao fato da América do Sul ser o centro de diversidade da
família Solanaceae, suporta a hipótese de que os gêneros Aureliana e Athenaea tenham surgido a partir de um
ancestral que sobreviveu por longo período no continente, e que os demais gêneros tenham se originado após
eventos de dispersão a longa distância. Um evento de radiação recente, possivelmente associado à formação da
Mata Atlântica, pode ter levado ao surgimento das espécies dos dois gêneros. Espera-se que a inclusão de sequências
de evolução mais rápida em nossa análise revele detalhes desta radiação. A amplificação e sequenciamento da
região plastidial ndhf está em andamento para todas as amostras, e outros marcadores estão sendo otimizados.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERGS, PROPESQ-UFRGS
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DNA Barcoding de floras locais: Um estudo de caso
com Leguminosae
Paladino, MWE2,3; Maia, VH1,2; Lima, HC2; Cardoso, SRS2; Ferreira, PCG1,2 Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil
Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Diretoria de Pesquisa Científica, Rua Pacheco Leão 915, cep. 22460-030, Rio
de Janeiro, RJ, Brasil
3
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
1
2
Palavras-chave: DNA barcoding, Leguminosae, Mata Atlântica, matK
A Mata Atlântica está entre os biomas mais diversos e também mais ameaçados do planeta. Os domínios da
Mata Atlântica foram drasticamente reduzidos a cerca de 8% da cobertura original, devido ao extrativismo,
expansão das fronteiras agropecuárias e da urbanização. Estima-se que a Mata Atlântica cobria 98% do Estado
do Rio de Janeiro. A cobertura atual não chega a 16% do território fluminense. Por isso, é importante enriquecer
o conhecimento taxonômico das espécies que compõem esses remanescentes. Neste contexto, foi proposto
o DNA barcoding que visa identificar espécies pela sequência de um trecho do DNA padronizado. Esta técnica
aceleraria a identificação de espécies, possuindo aplicações que vão desde estudos ecológicos ao combate
à biopirataria. Apesar dos avanços, ainda não foi alcançada tal eficácia discriminatória em plantas com os
marcadores moleculares propostos. No presente estudo, é proposta a identificação de espécies de leguminosas
arbóreas por DNA barcoding, objetivando testar sua capacidade discriminatória em floras locais da Mata
Atlântica do Estado do Rio de Janeiro. Foram selecionadas dez áreas representativas das formações florestais do
Estado do Rio de Janeiro. A distribuição das espécies de leguminosas arbóreas nestas áreas foi obtida através
de dados coletados em trabalhos de campo, literatura e coleções de herbário. A distância genética K2P foi
aplicada para comparar as sequências do gene cloroplastidial matK das espécies presentes em cada uma das
áreas. A distância média entre as sequências foi de 0,105. Foi possível discriminar 96% das espécies, considerando
um mínimo de 2% de divergência entre as sequências para distinção das espécies. Considerando que em floras
locais os gêneros botânicos não são frequentemente representados por muitas espécies, estes resultados
demonstram a alta capacidade discriminatória do gene matK como DNA barcode para este tipo de abordagem.
Apoio Financeiro: CNPQ
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Caracterização de populações de O. glumaepatula
nativas de Tocantins e Roraima por marcadores SSR
Rosa, TM1,2; Borba, TCO2; Brondani, RPV2; Rangel, PHN2; Brondani, C2
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás
Laboratório de Biotecnologia, Embrapa Arroz e Feijão
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Oryza glumaepatula, variabilidade genética, marcadores SSR, recursos genéticos.
No Brasil são encontradas quatro espécies silvestres de arroz, e dentre estas somente Oryza glumaepatula (genoma
AA) é capaz de produzir descendentes férteis em cruzamento com o arroz cultivado (O. sativa). A maioria das
populações de O. glumaepatula encontra-se em áreas isoladas, e são uma fonte potencial de genes úteis para o
melhoramento do arroz. O objetivo deste trabalho foi o de caracterizar a diversidade genética de populações de
O. glumaepatula através de marcadores microssatélites. As 19 populações de O. glumaepatula foram obtidas de
coletas realizadas nos Estados de Roraima (oito), no ano de 2005, e Tocantins (onze), no ano de 2006. Um total de
180 indivíduos foi amostrado e o número de indivíduos por população variou de um a doze. Da caracterização
molecular, conduzida com seis marcadores microssatélites, obteve-se um PIC médio de 0,67, variando de 0,48
a 0,91, número de alelos/marcador médio de 11,3, variando de 4 a 24. Foram identificados 68 alelos, dos quais
32 foram encontrados em um único indivíduo. A diversidade gênica variou entre as populações com valores de
zero a 0,52, com média de 0,24. A distância genética média de Rogers modificado por Wright entre todas as 19
populações foi de 0,67. Foi possível identificar a formação de dois grupos distintos a partir da Análise Fatorial de
correspondência, e a subdivisão encontrada foi compatível com os locais de coleta, porém não foi encontrada
evidência de estruturação populacional. A partir das estatísticas de F de Wright foi possível identificar uma alta
diferenciação entre as populações coletadas (Fst =0,62). O valor de Fit foi de 0,72 e o índice de fixação (Fis) médio
entre as populações foi de 0,25. A caracterização molecular das populações de O. glumaepatula permitiu avaliar
detalhadamente o nível da variabilidade genética existente entre diferentes pontos de coleta, em duas Unidades
de Federação que ainda não haviam sido estudadas até o momento. Os dados obtidos neste trabalho hoje fazem
parte de um banco de dados que reúnem mais de 200 populações brasileiras de Oryza sp., correspondendo a um
acervo de grande importância para conservação destas espécies silvestres, e como fonte de variabilidade genética
para o arroz cultivado.
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Filogenia molecular do clado ‘Christensonella
ferdinandiana - C. paranaensis’ (Orchidaceae):
Delimitação de espécies baseada em ISSR e
sequências de cloroplasto não-codificadoras
Valadão, GS1; Novello, M1; Koehler, S2
Laboratório de Ecologia Evolutiva e Genética Aplicada, Departamento de Genética/ESALQ, Universidade de São Paulo
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Filogenia, delimitação de espécies, marcadores moleculares, orquídeas, ISSR.
A região neotropical concentra grande parte da diversidade da família Orchidaceae, sendo o Brasil um dos
países com maior número de espécies. Contudo, há uma grande demanda por estudos filogenéticos em níveis
taxonômicos inter- e infraespecíficos em orquídeas brasileiras. Isso porque a divergência recente de linhagens
implica na ocorrência de complexos de espécies cuja delimitação de unidades taxonômicas é complicada devido
a ausência de caracteres morfológicos diagnósticos. A compreensão de padrões de variação e a definição de
unidades taxonômicas estáveis é fundamental para a conservação de espécies e compreensão de eventos de
especiação. Neste contexto, o uso de marcadores moleculares para delimitação de espécies torna-se extremamente
útil, pois estes proporcionam um grande número de caracteres e são seletivamente neutros. Entretanto, em
plantas, as sequências de DNA nuclear e plastidial tradicionalmente utilizadas em estudos filogenéticos nem
sempre apresentam variação suficiente. Nesses casos, marcadores como ISSRs constituem uma alternativa por
apresentarem grande variação entre espécies e populações. O clado ‘Christensonella ferdinandiana-C. paranaensis’
constitui um complexo de duas espécies claramente distintas quanto a morfologia. Entretanto, estudos prévios
com sequências de DNA nuclear e plastidial não suportam a distinção de duas unidades taxonômicas. Além disso,
populações de C. paranaensis apresentam grande variação morfológica, caracterizando a ocorrência de, pelo
menos, três morfotipos. O presente estudo buscou complementar estudos filogenéticos e taxonômicos prévios
neste clado, a fim de determinar o número de espécies a ser reconhecido e avaliar a necessidade de descrever
unidades taxonômicas infraespecíficas. Para tal foram realizadas análises filogenéticas baseadas em marcadores
ISSR e sequências não-codificadoras de plastídeos, com alta variabilidade. Para as análises foram utilizados 17
indivíduos, representando a diversidade morfológica do grupo, além de três indivíduos como grupo externo.
Para a obtenção de ISSRs foram testados 20 iniciadores, sendo otimizados nove. Dos 14 iniciadores de regiões
plastidiais não-codificadoras testados, 12 foram otimizados. Até o momento foram analisados os dados obtidos
para seis iniciadores ISSR. As amostras foram analisadas quanto à presença e ausência de bandas e as filogenias
inferidas através do algoritmo neighbor-joining e pelo critério de parcimônia máxima. Em ambas as análises, as
espécies atualmente reconhecidas não são suportadas como monofiléticas. Adicionalmente, os morfotipos de C.
paranaensis também não constituem grupos monofiléticos. A amostragem de iniciadores ISSR complementares,
bem como a inclusão de sequências plastidiais estão em andamento para confirmação dos resultados obtidos.
Apoio financeiro: FAPESP
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Phylogenetic analizes of ABAP1 (Armadillo BTB
Arabidopsis Protein 1) gene in plants
Madeira, AG.; Hemerly, AS; Masuda, HP
Centro de Ciências Naturais e Humanas, CCNH, Universidade Federal do ABC
Lab. Bio. Mol. Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ
[email protected]
Keywords: ABAP1, armadillo BTB proteins, cell cycle, gene duplication, molecular evolution.
The cell cycle control must be strongly regulated in plants since any problem during this process can affect the
integrity of its daughter cells. Because plant cells do not move, cell differentiation must be coordinated to the spatial
and temporal control of cell division to yield an organism of the correct form. We have recently described a new
plant protein that interacts with both pre-replication complex (pre-RC) and transcription factors and negatively
regulates the DNA replication in Arabidopsis. This new protein was called ABAP1 (acronym for Armadillo BTB
Arabidopsis protein 1) because it harbors repetitions of the Armadillo domain and a BTB/POZ domain. ABAP1
gene can be found as two to several copies in the genomes of various plant species. In Arabidopsis genome, ABAP1
is duplicated and the gene ARIA is the ABAP1 homologue presenting 60% identity in the aa sequence. Here, we
see how the copies of several plant species are evolutionarily related, compared with the two copies of Arabidopsis.
We collected 29 nucleotide sequences from 16 plant species using Phytozome tool. Alignments were performed in
ClustalX2 and phylogenetic trees were constructed in MEGA4, by the Minimum Evolution method. Interestingly,
ABAP1 gene is exclusive of Green Plants and is found in basal plants such as the green algae Chlamydomonas
reinhardtii, the moss Physcomitrella patens and the fern Selaginella moellendorffii. All Eudicots represented in this
study had at least two copies of the protein, one related to ABAP1 and another related to ARIA, indicating that this
major duplication occurred in the basis of Eudicots. Different from the other Monocots, Zea mays have two copies
of ABAP1 in its genome suggesting that ABAP1 gene duplication in maize is probably a secondary event. Analysis
of selection pressure is being performed and might give more clues about the evolutionary history of the protein.
Financial support: CNPq, FAPESP.
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Diversidade genética em capim-gordura (Melinis
minutiflora), uma espécie apomítica invasora do
Cerrado Brasileiro e de ilhas do Havaí
Lima, YP1; Lins, TCL2; Pivello, VR3; Sampaio, AB4; Daehler, C4; Ferreira, ME5
Universidade Católica de Brasília
Embrapa Cerrados
3
Departamento de Ecologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
4
Universidade do Hawaii
5
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
[email protected] e [email protected]
1
2
Palavras-chave: RAPD, cabelo-de-negro, ecótipos, polimorfismo, similaridade
Espécies exóticas são consideradas ameaças em áreas protegidas devido à sua alta capacidade competitiva, que
interfere na conservação da biodiversidade. Melinis minutiflora (capim-gordura), é uma gramínea invasora apomítica
facultativa, originária da África subsaariana introduzida no Brasil no período colonial que, por possuir alto poder
competitivo e por ser particularmente inflamável, ameaça o desenvolvimento de espécies nativas do Cerrado
e outros biomas mundiais onde foi introduzida, como as Ilhas do Havaí. A avaliação da variabilidade genética
de espécies invasoras é um importante parâmetro para investigar sua capacidade de competição com plantas
nativas, ajudando também na compreensão do seu processo evolutivo. Marcadores moleculares amplificados
ao acaso (RAPD) permitem a análise de polimorfismo de DNA, e possibilitam a análise genética de espécies de
conhecimento genômico limitado. O objetivo deste trabalho foi identificar a existência de ecótipos e avaliar a
similaridade genética entre acessos de capim-gordura isolados geograficamente: Cerrado Brasileiro (Goiás) e Havaí
(EUA). Para isso, foi extraído DNA de 36 acessos de M. minutiflora naturalmente dispersos nas duas áreas, além
de 4 indivíduos utilizados como controle (outgroups) das espécies Brachiaria brizantha cv Marandu, Andropogon
gayanus cv Planaltina, Brachiaria mutica e Oryza sativa, totalizando 40 amostras. A similaridade genética entre os
acessos foi estimada pelo coeficiente de Dice (D) com base no polimorfismo de DNA observado em 60 locos RAPD.
O método UPGMA foi utilizado para o agrupamento por similaridade genética dos acessos analisados. O valor de
D entre as plantas de M. minutiflora foi 0.87, entre as plantas provenientes do cerrado Brasileiro foi 0.84 e entre as
do Havaí foi 0.91. Não foi observado polimorfismo de DNA entre alguns acessos coletados no Havaí, corroborando
o comportamento apomítico da espécie. No entanto, apesar do polimorfismo restrito, nenhum acesso do Cerrado
é idêntico aos demais acessos analisados. Todos os acessos havaianos foram agrupados em dois subgrupos, que
formam agrupamentos independentes das amostras coletadas no Cerrado. Outros dois subgrupos incluem a maioria
dos acessos coletados no Cerrado. Contudo, alguns acessos brasileiros não são incluídos nesses subgrupos, como
um acesso da variedade Roxo, divergente dos demais. A diversidade genética dos acessos coletados no Cerrado
é relativamente maior do que a observada nos acessos havaianos, indicando a presença de possíveis ecótipos.
Apoio financeiro: CNPq/FAPESP
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36
Caracterização da diversidade e estrutura genética em
populações de Cedrella fissilis Vellozo (cedro) visando
sua conservação no Estado de Santa Catarina
Duarte, RI1; Fernandes, CD1; Montagna, T1; Loch, FASS1; Nazareno, AG1,2; Bittencourt, R1,2; Reis, MS1,2
Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Universidade Federal de Santa Catarina.
Programa de Pós Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Espécie Ameaçada, Conservação in situ, Alozimas, Diversidade genética, Cedro.
Cedrella fissilis Vellozo (Cedro) é uma espécie arbórea da família Meliaceae. Nativa da flora brasileira, sua área de
ocorrência vai do Rio Grande do Sul até Minas Gerais, sendo encontrada nas formações de Floresta Ombrófila
Densa, Floresta Ombrófila Mista, Floresta Estacional Decidual e Floresta Estacional Semidecidual. Produz madeira
de alta qualidade e devido a alta demanda de mercado por madeiras nobres, foi explorada intensamente. Em
conseqüência da grande exploração madeireira, encontra-se na lista de espécies ameaçadas da UCN, estando na
categoria “Em Perigo”. Por ser uma espécie de grande importância, foi incluída para caracterização da diversidade
genética no âmbito do Inventário Florístico e Florestal de Santa Catarina. Diante disso, este trabalho teve como
objetivo caracterizar a diversidade e a estrutura genética de populações da espécie com ocorrência na Floresta
Estacional Decidual. Para a caracterização dos indivíduos utilizou-se a eletroforese de isoenzimas em gel de amido
(13%), sobre material foliar, amostrando-se no mínimo 50 indivíduos adultos por população. Até o momento
foram caracterizadas seis populações, outras nove ainda serão avaliadas na região. Os tampões selecionados
foram Tris-citrato e Citrato-morfolina, e os sistemas enzimáticos foram: DIA, PRX, PGM e ME, para o primeiro
tampão e 6PGDH, MDH, PGI e IDH, para o segundo tampão. A caracterização genética das populações revelou
a presença de 45 alelos, distribuídos em 14 locos passíveis de interpretação, sendo todos polimórficos. O número
médio de alelos por loco (A) foi de 2,3 (2,1 a 2,6); o percentual de locos polimórficos (P95%) de 71,4% (57,1% a
85,7%) e a diversidade genética média (He) de 0,233 (0,191 a 0,288). O indice de fixação (F) foi de 0,315, (0,211 a
0,415), evidenciando que as populações apresentam elevado grau de endogamia. Quanto à estrutura genética, as
estatísticas F revelaram uma forte estruturação (Fit = 0,48; Fst = 0,26; Fis= 0,30) nas populações avaliadas. Além
disso, foram encontrados alelos exclusivos em quatro das seis populações estudadas. Os resultados indicam
que as populações remanescentes apresentam-se fragmentadas, possuem reduzido fluxo gênico histórico e alta
fragilidade. As estratégias de conservação devem contemplar mecanismos que favoreçam a conectividade entre as
populações remanescentes e criação de Unidades de Conservação que contemplem grande número de populações.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESC/ Inventário Florístico Florestal de Santa Catarina
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Estudo da diversidade genética de Arbutus unedo L.
utilizando marcadores ISSR e RAPD
Lopes, L1,2; Sá, O1; Pereira, JA1; Baptista, P1
CIMO / Escola Superior Agrária de Bragança, Instituto Politécnico de Bragança, Bragança, Portugal
Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Medronheiro, diversidade genética, marcadores moleculares, coeficiente de Jaccard, conservação.
Introdução: O Arbutus unedo L., espécie mediterrânico-atlântica da família Ericaceae, é popularmente conhecido
em Portugal como medronheiro. Classificado como uma planta perene de porte mediano que cresce em forma de
arbusto ou árvore, A. unedo possui importância ornamental, medicinal e económica, residida principalmente na
produção de aguardente de medronho. Em Portugal, a área ocupada pelo medronheiro tem diminuído sobretudo
devido a incêndios e à substituição deste por espécies florestais. Uma vez que não se conhece qualquer estudo no
âmbito da avaliação da variabilidade genética do medronheiro, esta reveste-se assim de grande importância para o
delineamento de programas de manejo e conservação da espécie. O objetivo desse trabalho foi estudar a diversidade
genética de A. unedo no interior norte e centro de Portugal utilizando marcadores ISSR (Inter Simple Sequence
Repeats) e RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA). Para tal foi extraído DNA de folhas de 38 indivíduos
distribuídos em 9 populações (Bragança, Vinhais, Mirandela, Vila Real, Régua, Viseu, Braga, Lamego e Fundão). As
reações de amplificação foram efetuadas com 9 sequências iniciadoras de RAPD e 12 de ISSR. Os dendogramas
foram construídos pelo algoritmo UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic averages) utilizando o
coeficiente de Jaccard, no programa computacional FreeTree. A correlação entre as distâncias genéticas obtidas pelos
RAPD e ISSR foi calculada pelo teste de Mantel. Do total de iniciadores utilizados na análise RAPD e ISSR, seis e doze
mostraram ser polimórficos, respectivamente. O elevado polimorfismo observado, com um número pequeno de
marcadores, pode resultar do fato desta planta não ser domesticada. Os dendrogramas obtidos mostraram que existem
indivíduos geneticamente distintos, não sendo possível contudo agrupá-los de acordo com a sua origem geográfica.
Este aspecto foi sobretudo notório na análise RAPD. Verificou-se ainda que a correlação entre os dados RAPD e ISSR
foram relativamente baixos. Os resultados obtidos serão úteis, visando a conservação e preservação da espécie.
Apoio financeiro: CIMO/IPB
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Filogenia de Bignonia (Bignonieae, Bignoniaceae)
Zuntini, AR1; Lohmann, LG1
1
Laboratório de Sistemática Vegetal, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected], [email protected]
Palavras-chave: Bignonia, Bignoniaceae, filogenia, lianas.
Introdução: Bignonia é um gênero com 28 espécies Neotropicais. Sua circunscrição atual engloba todos os
representantes dos gêneros Clytostoma, Cydista, Macranthisiphon, Mussatia, Phryganocydia, Potamogamus,
Roentgenia e Saritaea, bem como a espécie Tanaecium nocturnum. Bignonia é caracterizado pelos ramos
quadrangulares, com crista interpeciolar, pelas folhas 2-folioladas e pela corola achatada dorso-ventralmente, com
guias de nectar proeminentes. A ampla variação encontrada no gênero, associadas e sua ampla distribuição tornam
Bignonia um grupo interessante para o teste de hipóteses associadas aos processos que levaram à diversificação
de plantas na região neotropical. Objetivos: Reconstruir a filogenia do gênero Bignonia, utilizando dois marcadores
plastidiais (ndhF e trnL-rpl32) e um marcador nuclear (pepC). Métodos: O DNA foi extraído a partir de folhas
secas em sílica-gel e de espécimes depositados em herbários. As regiões de interesse foram amplificadas seguindo
protocolos estabelecidos por Lohmann (2006) e Shaw (2007) e sequenciadas em sequenciador automatico
(Macrogen Inc.). As sequências foram editadas manualmente no programa Geneious 4.7 e alinhadas com o
programa Muscle; gaps foram codificados utilizando o algoritmo 2xread. Critérios de Parcimônia e Inferência
Bayesiana foram utilizados para análises de reconstrução filogenética. Resultados e Conclusões: Até o momento
2/3 das espécies de Bignonia foram amostradas para os três marcadores de interesse. Resultados provenientes dos
três marcadores são congruentes, corroborando o monofiletismo do gênero e a atual classificação do grupo. Uma
análise combinada de todos os marcadores indica que Bignonia capreolata é irmão das demais espécies de Bignonia.
Este clado, por sua vez, inclui dois grandes clados: Um constituído pelas espécies tradicionalmente incluídas em
Clytostoma e Roentgenia, e outro contendo as espécies tradicionalmente incluídas em Mussatia e Phryganocydia.
Apoio financeiro: FAPESP
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Delimitação de espécies no complexo Cattleya
coccinea - C. mantiqueirae (Orchidaceae) baseada em
marcadores moleculares ISSR
Rodrigues JF1; Oliveira GCX1; Koehler, S2
Laboratório de Ecologia Evolutiva e Genética Aplicada, Departamento de Genética-ESALQ, Universidade de São Paulo
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Delimitação de espécies, filogenia molecular, ISSR.
As espécies Cattleya coccinea e C. mantiqueirae são tradicionalmente consideradas como distintas de acordo
com caracteres morfológicos ( forma do pseudobulbo e morfologia foliar), com a época de floração (março-abril/
julho-setembro x janeiro-fevereiro/setembro-outubro) e com a distribuição geográfica (Serra do Mar x Serra da
Mantiqueira). Entretanto, o reconhecimento dessas duas espécies como distintas é claramente problemático
devido à variação contínua de caracteres morfológicos diagnósticos, assim como não há um isolamento temporal
de floração entre as duas espécies. Além disso, observações realizadas em campo e em material cultivado sugerem
que não existe uma separação morfológica clara entre populações da Serra do Mar e da Serra da Mantiqueira. O
objetivo desse estudo foi reavaliar a atual delimitação entre as espécies C. coccinea e C. mantiqueirae de acordo
com a inferência de relações filogenéticas baseadas em marcadores moleculares ISSR. Para as análises foram
realizadas coletas em seis localidades da região Sudeste, sendo três na Serra do Mar e três na Serra da Mantiqueira.
Foram testados 20 iniciadores, dos quais 13 foram otimizados para obtenção de dados. Os géis de ISSR gerados
foram utilizados para construção de uma matriz binária representando a presença/ausência de fragmentos
amplificados obtidos a partir de sete iniciadores. A matriz contendo 158 indivíduos e 120 caracteres foi analisada
com algoritmo de neighbor-joining e o critério de parcimônia máxima para obtenção de hipóteses filogenéticas.
Os resultados indicam que as espécies tradicionalmente reconhecidas não constituem grupos monofiléticos
e, portanto, não podem ser reconhecidas como espécies distintas de acordo com o conceito filogenético de
espécies. Os resultados também apontam que as populações amostradas são monofiléticas, sugerindo uma forte
estruturação das populações amostradas. Análises complementares considerando os seis iniciadores restantes
e cinco espécies do grupo externo estão em andamento para corroborar os resultados obtidos. Adicionalmente
serão realizados testes de correlação entre distância filogenética e geográfica, bem como análises de variância
molecular e aplicação de métodos de agrupamento baseados em modelos para descrever apropriadamente
a estrutura das populações amostradas. Somente com a conclusão das análises, considerando o conjunto de
dados completo, será possível compreender padrões de diversificação no complexo C. coccinea-C. mantiqueirae.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP, ESALQ-USP.
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Sistemática e Filogenética Molecular do gênero
Hexachlamys (Myrtaceae) através do uso de
marcadores plastidiais e nucleares
Cruz, F1,2; Veto, NM2; Turchetto-Zolet, AC1,2; Mondin, CA3; Margis, R1,2,4
Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular,Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Centro de Biotecnologia,Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
4
Pesquisador CNPq
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hexaclhamys Berg, Sistemática, Filogenética Molecular, Marcadores Plastidiais e Marcadores Nucleares.
Introdução: A família Myrtaceae inclui mais de 3.800 espécies de árvores e arbustos, distribuídas principalmente
nas regiões tropicais e subtropicais do mundo. Representantes da família Myrtaceae possuem grande importância
para os ecossistemas florestais, além de serem importantes economicamente por apresentar espécies que são
utilizadas na indústria farmacêutica, alimentícia, cosmética e de perfumaria. A família está dividida em duas
grandes subfamílias: Myrtoideae e Leptospermoideae e sua sistemática é bastante complexa. O gênero Hexachlamys
Berg (Myrtaceae) apresenta cerca de 10 espécies distribuídas no Brasil, pelas regiões Sul e Sudeste, no Paraguai,
Argentina, Bolívia e Uruguai e, desde 1968 foi considerado independente. Distingue-se morfologicamente do gênero
Eugenia por apresentar flores pentâmeras ou hexâmeras e radícula exserta e, como muitos gêneros e espécies da
família Myrtaceae, exibe uma complexidade na sua classificação taxonômica. Objetivos: Gerar dados moleculares
e realizar uma análise filogenética dentre as espécies pertencentes ao gênero Hexachlamys (Myrtaceae), através
do uso de marcadores plastidiais e nucleares, possibilitando auxiliar na sistemática e taxonomia do mesmo.
Métodos: Foram coletadas amostras de folhas (de exsicatas e de amostras coletadas a campo) das espécies do
gênero Hexachlamys, procurando acessar todas as espécies descritas, conforme indicação de herbários. O DNA
genômico total foi extraído utilizando o protocolo baseado no detergente CTAB (Doyle & Doyle 1987). Um conjunto
de marcadores plastidiais (trnL-F, trnL-intron, ycf5, accD, rbcLa, psbA-trnH, rpoB, rpoC1, ndhJ, RPS16 e matK) e
a região ITS foram testadas através de reações de PCR para a detecção de regiões polimórficas, as quais serão
utilizadas para as análises filogenéticas. Os produtos de PCR foram seqüenciados em seqüenciador ABI PRISM
3100 e as sequências foram alinhadas no Alignment Explorer/CLUSTALW (MEGA4). Resultados: Até o momento,
foi possível amplificar e sequênciar 3 regiões do cloroplasto (ndhJ, rpoB e rpoC1) para 8 espécies de Hexachlamys e
2 espécies de Eugenia. A análise desses marcadores não mostrou polimorfismos entre as espécies de Hexachlamys,
entretanto, vários polimorfismos foram observados nas espécies entre os dois gêneros. Testes com os demais
marcadores utilizando amostras coletadas a campo estão sendo realizados. Conclusões: Os resultados desse
trabalho contribuirão para a sistemática e taxonomia do gênero Hexachlamys, possibilitando investigar as relações
filogenéticas dentro do gênero e seu relacionamento com outros membros da subfamília Myrtoideae, além de
disponibilizar informações que possam colaborar e orientar programas de conservação destas espécies e seu habitat.
Apoio Financeiro: CNPq
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Polimorfismos de microssatélites-EST em população
de Theobroma cacao L visando mapeamento de genes
de resistência a Ceratocystis cacaofunesta
Branco, SMJ¹; Silva, DV¹; Araújo, IS²; Corrêa, RX¹
¹Laboratório de Genética Molecular Aplicada, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA. ²Universidade Federal Rural do SemiÁrido, Mossoró, RN.
[email protected]
Palavras-chave: SSR-EST, Theobroma cacao L., Ceratocystis cacaofunesta, Resistência, TSH 1188, CCN 51.
Introdução: A doença murcha-de-Ceratocystis do cacaueiro (Theobroma cacao L.) causada pelo fungo Ceratocystis
cacaofunesta foi detectada em forma epidêmica em países das Américas do Sul, Central e nas ilhas do Haiti e
Trinidad, e, mais recentemente, em 1997 e 1998, em enxertos de cacaueiros adultos na região sul da Bahia.
Desde a sua constatação nesta região, a doença tem ocasionado perdas significativas nas plantações seriamente
comprometidas com a doença vassoura-de-bruxa. Atualmente, a doença ocorre de forma endêmica, podendo
agravar a crise da lavoura cacaueira, dificultando ainda mais esta atividade agrícola na região. A busca de variedades
mais resistentes a Ceratocystis cacaofunesta é a ferramenta mais viável para o controle da doença, já que é menos
agressiva ao meio ambiente e principalmente menos onerosa. Objetivo: Selecionar marcadores microssatélites-ESTs
polimórficos entre os genótipos contrastantes TSH 1188 e CCN 51, visando posterior aplicação no mapeamento
de genes de resistência à Ceratocystis cacaofunesta. Método: Os DNAs dos genótipos TSH 1188 e CCN 51 foram
extraídos utilizando o protocolo de Doyle & Doyle (1990), quantificados em gel de agarose a 0,8%, diluídos para
a concentração de 10 ng e amplificados com um volume final de 20 µL. As reações de amplificação foram feitas
com 10 mM (pH 8,3) de Tris-HCl, 50 mM de (NH4)2SO4, 1,5 mM de MgCl2, 200uM de cada dNTP, 0,1 μM de cada
um dos 24 diferentes primers SSR-EST específicos foward e reverse, 0,4 U de Taq DNA polimerase e 10 ng de DNA.
O programa utilizado no termociclador automático foi o seguinte: 94 °C por 4 min + 40 ciclos de 94 °C por 30 seg,
50°C por 1 min, 72 °C por 1 min + um ciclo final de extensão de 72°C por 7 min e redução a 15 °C. As amostras
amplificadas foram submetidas a eletroforese em gel de agarose a 2% para visualização do produto da PCR, e
posteriormente submetidas a eletroforese em gel de acrilamida a 6%, corado com nitrato de prata, para analisar
o resultado da PCR. Resultados: Dos 24 primers SSR-EST utilizados, 10 (42%) foram polimórficos após análise em
gel de acrilamida. Estes primers selecionados serão de fundamental importância para o mapeamento de genes de
resistência a Ceratocystis cacaofunesta. Conclusão: Há polimorfismo entre os genitores revelado nas amplificações
com SSR-EST e a genotipagem com esses 10 primers será informativa nesta população de mapeamento.
Apoio financeiro: UESC, CNPq, FAPESB e MARS - Centro de Ciências do Cacau.
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42
Perda de dados no índice de Jaccard e agrupamentos
de UPGMA e Vizinho mais próximo
Senra, JFB1; Ferreira, MFS2; Nascimento, M3; Ferreira, A4
Graduando em agronomia pela Universidade Federal do Espírito Santo Centro de Ciências Agrárias
[email protected]
2
Universidade Federal do Espírito Santo, Alto Universitário, s/nº, CEP 29500-000 Alegre, ES
3
Universidade Federal de Viçosa (UFV), Departamento de Estatística, Avenida P.H. Rolfs, s/nº, CEP 36571-000 Viçosa, MG
[email protected]
4
Universidade Federal do Espírito Santo, Alto Universitário, s/nº, CEP 29500-000 Alegre, ES
[email protected]
1
Palavras-chave: diversidade genética, biometria, genética quantitativa, genética molecular, variabilidade genética.
Introdução: A variabilidade genética é fator primordial em programas de melhoramento genético e para a
sua quantificação podem ser realizadas análises de dissimilaridade e normalmente, após a averiguação da
dissimilaridade faz-se a utilização de métodos de agrupamentos para averiguação dos genótipos mais contrastantes
para serem utilizados nos programas de melhoramento. Deste modo, para que não haja sérias implicações em
todo o processo de um programa torna-se primordial que as inferências da similaridade e do agrupamento não
apresentem equívocos. Objetivo: Investigar a precisão do Índice de Jaccard e dos métodos de agrupamentos de
UPGMA e Vizinho mais próximo (VMP) em diferentes níveis de perdas de dados moleculares. Metodos: Para
obtenção dos dados das populações utilizou-se o módulo “simulação” do programa GENES. Foram simulados os
pais, com 100 marcas dominantes, a partir dos quais se obteve uma F1 e posteriormente cinco retrocruzamentos,
contendo 10 indivíduos cada. Todos os retrocruzamentos foram agrupados formando a população base. Formada
a população base executou-se a perda de dados (ao acaso), utilizando o programa GQMOL, com níveis de: 10,
20, 30, 40 e 50%, obtendo assim mais cinco populações. Em todas as populações, com e sem perdas de dados,
estimou-se a dissimilaridade pelo índice de Jaccard e os agrupamentos pelos métodos de UPGMA e VMP. Após
avaliou-se o número de grupos formados em todas as populações nos níveis de cortes de 50, 65 e 80%. Resultados:
A perda de dados, independente do agrupamento, proporcionou uma grande variação do número de grupos
formados comparado à população sem perda. Ao corte de 50% no agrupamento de VMP a diferenciação foi muito
maior que a com UPGMA. Já com cortes de 65% e 85% foi verificado o inverso, tendo o VMP sido mais adequado
que o UPGMA. Um fato interessante observado foi que: a variação em ambos os métodos de agrupamento
não apresentaram um padrão correlacionado ao nível de perda, independente do nível de corte. Conclusões:
o índice de Jaccard foi sensível à perda de dados; o método de agrupamento VMP apresentou-se ligeiramente
mais robusto às perdas de dados que UPGMA. Desta forma, são necessários estudos mais abrangentes quanto
aos diferentes índices de dissimilaridade e métodos de agrupamentos em diferentes níveis de perdas de dados. Apoio Financeiro: CNPq
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Caracterização genômica de Tibouchina papyrus
(pau-papel)
Barbosa, ACOF1; Resende, LV1; Peixoto, FP1; Alvarez, PA2; Collevatti, RG1; Coelho, ASG3; Telles, MPC1
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, CP 131, Goiânia, GO. Brasil.
74001-970
2
Departamento de Ciência da Computação, Universidade de Brasília. 3Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade
Federal de Goiás
[email protected]
1
Palavras-chave: bioinformática, caracterização genômica, cerrado, pau-papel, shotgun, Tibouchina papyrus.
A espécie Tibouchina papyrus, da família Melastomataceae, pertence ao mesmo gênero das quaresmeiras e
manacás. É uma espécie endêmica dos campos rupestres do Cerrado goiano, cuja distribuição é disjunta e
restrita às Serras Dourada, dos Pirineus em Goiás e de Natividade no Tocantins. O endemismo é um fator de
risco para a manutenção da variabilidade genética das espécies, as quais podem apresentar acentuada erosão
genética, serem ameaçadas de extinção ou até mesmo serem extintas. Ainda são poucos os estudos realizados
para a maior parte das espécies vegetais nativas do Cerrado goiano, incluindo a espécie T. papyrus. O uso de
sequenciamento por amostragem a partir de biblioteca tipo shotgun tem permitido a caracterização de sequências
de diversas espécies. Considerando esse tipo de abordagem podem ser obtidas informações como, por exemplo,
conteúdo nucleotídico, regiões promotoras, ORFs (genes e pseudogenes), tRNAs, microssatélites e elementos
genéticos móveis. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as sequências obtidas de uma biblioteca genômica
construída por fragmentação randômica de DNA (shotgun). A biblioteca genômica de T. papyrus foi obtida pela
técnica de fragmentação aleatória de DNA (shotgun), os fragmentos obtidos foram sequenciados utilizando
analisador automático de fragmentos ABI-3100 (Applied Biosystems) e as sequências obtidas foram parcialmente
caracterizadas através do uso de ferramentas de Bioinformática. Foram submetidas 1070 reads à etapa de
base calling, sendo que, desse total, 927 reads foram aceitos segundo critérios de qualidade pré-estabelecidos,
o que corresponde a 86,6% do total de sequências submetidas. Posteriormente, as sequências aceitas foram
submetidas a uma etapa de assembly, na qual foram obtidos 77 contigs e 775 singlets. Foram encontrados um
total de 144 ORFs, sendo 134 ORFs em singlets e 10 ORFs em contigs. Dentro das sequências analisadas foram
encontrados 345 regiões repetitivas simples, contendo diferentes motivos de repetição. Destas, 288 eram
mononucleotídeos (83,48%), 23 dinucleotídeos (6,67%), 30 trinucleotídeos (8,70%), 3 tetranucleotídeos (0,86%) e
1 pentanucleotídeo (0,29%). Nenhum hexanucleotídeo foi encontrado. O uso da técnica de sequenciamento por
amostragem a partir de biblioteca tipo shotgun permitiu a caracterização de sequências genômicas de T. papyrus.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq (471492/2007-8), Naturae Consultoria Ambiental Ltda.
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Elucidando a origem evolutiva da petúnia-de-jardim
Fregonezi, AMCR1; Segatto, ALA1; Fagundes, NJR1; Kuhlemeier, C2; Bonatto, SL3; Freitas, LB1
Depto de Genética, Instituto de Biociências, UFRGS
Institute of Plant Science, Unibe
3
Centro de Biologia Genômica e Molecular, PUCRS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Petunia hybrida, Petunia integrifolia, variabilidade genética, hibridação, Solanaceae
O gênero Petunia Juss (Solanaceae) é nativo do Brasil e conhecido mundialmente através do híbrido artificial Petunia
hybrida. Sabe-se que as duas espécies parentais P. integrifolia e P. axilaris são nativas do Rio Grande do Sul. Porém,
P. integrifolia é formada por um complexo de espécies semelhantes na estrutura floral, mas diferentes no habitat e
distribuição. O objetivo deste trabalho é contribuir para um melhor detalhamento da origem da espécie comercial
P. hybrida e determinar a variabilidade genética nas espécies e subespécies do grupo integrifolia e variedades de
Petunia hybrida. Para isto foram analisados 214 indivíduos que incluem amostras das cinco espécies e subespécies
nativas do grupo Petunia integrifolia e amostras de Petunia hybrida utilizando marcadores plastidiais e nucleares
CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences). O DNA foi amplificado por PCR utilizando primers específicos
para os espaçadores intergênicos plastidiais trnS-trnG e trnH-psbA. Os produtos de PCR foram seqüenciados em
equipamento automático, sendo as seqüências alinhadas no programa GeneDoc. Os haplótipos obtidos foram
comparados com os das outras 14 espécies do gênero Petunia pelo método de Median Joining Network no programa
Network 4.5. Foram utilizados dois marcadores CAPS, localizados nos genes EPF1 e MYB60, os quais estão relacionados
à características florais em Petunia. A amplificação foi feita com primers específicos e os fragmentos foram clivados
com enzima de restrição adequada. A genotipagem foi realizada através da visualização do padrão de bandas em
gel de agarose 2,5%. As freqüências alélicas foram determinadas com o auxílio do programa Genepop 4.0.10. Os
resultados obtidos até o momento para os espaçadores plastidiais mostraram que das 22 variedades comerciais
analisadas, 11 compartilham haplótipos com P. integrifolia, 10 com P. axilaris e uma variedade mostrou um haplótipo
encontrado em populações da espécie P. altiplana, que ocorre nos campos mais altos do Rio Grande do Sul e Santa
Catarina. Como estes marcadores são de herança materna, é possível detectar somente o parental que contribuiu
com o óvulo para a formação dos híbridos. A existência de uma variedade comercial com haplótipo de P. altiplana
pode ser explicada pelo compartilhamento de polimorfismo ancestral, uma vez que as espécies do gênero são muito
próximas geneticamente. Os marcadores nucleares até o momento analisados não foram capazes de discriminar
as espécies nativas, nem as variedades comerciais. Foram encontrados dois alelos para cada loci, sendo que em um
dos loci (EPF1) as freqüências alélicas permitiram diferenciar a espécie P. bajeensis do restante do complexo. Está em
andamento a análise de microssatélites nucleares específicos na tentativa de melhor elucidar a origem de P. hybrida.
Apoio financeiro: CNPQ; FAPERGS; PROPESQ-UFRGS
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45
Uso de marcadores AFLP na caracterização molecular
de subamostras de Coffea canephora
Ferrão, LFV1; Souza, FF2; Caixeta, ET2; Zambolim, EM1; Sakiama, NS1; Zambolim, L1
Laboratório de Biotecnologia do Cafeeiro (BIOCAFE), Instituto de Biotecnologia aplicado a agropecuária (BIOAGRO), Universidade Federal de Viçosa
2
Embrapa
[email protected]
1
Palavras-chave: café, banco de germoplasma, diversidade genética, marcadores moleculares.
A espécie Coffea canephora originou-se no centro-oeste africano, é uma espécie diplóide (2n=22), alógama e autoincompatível. Com produção anual de 10 milhões de sacas, o Brasil destaca-se como o segundo maior produtor,
permitindo que o agronegócio da cultura atue de forma importante no desenvolvimento social e econômico. Visando
atender às exigências do consumidor e garantir maior retorno socioeconômico para a cafeicultura, diferentes
programas de melhoramento têm sido conduzidos no país. No entanto, o sucesso desses programas depende,
primeiramente, da existência de variabilidade genética na população de base. Para isso, os bancos de germoplasma
(BAGs) apresentam papel de destaque já que visam à manutenção dos recursos genéticos e a disponibilização dessa
variabilidade para os melhoristas. Dado a importância dos BAGs, esse trabalho objetivou o estudo preliminar da
diversidade genética entre subamostras de C. canephora, usando marcadores AFLP. Avaliaram-se 93 subamostras
conservadas na Estação Experimental da Embrapa Rondônia, em Ouro Preto do Oeste-RO, provenientes dos
BAGs de várias instituições brasileiras de pesquisa, e de coletas no Estado de Rondônia. A análise molecular
foi realizada no Laboratório de Biotecnologia do cafeeiro/UFV, utilizando as seguintes combinações de primers:
E-CTC / M-AGC; E-CTC / M-AGT; E-CAT / M-AGT e E-CGC / M-ATA. As marcas obtidas foram convertidas em
dados binários, com os quais se obteve uma matriz de dissimilaridade, usando o complemento algébrico do índice
de Jaccard. O dendrograma foi construído por meio do método UPGMA, utilizando o programa computacional
NTsys. Foi obtido um total de 117 marcas, sendo 87% polimórficas. O agrupamento resultou na formação de dois
grupos principais, que correspondem aos tipos varietais Conilon e Robusta. No primeiro grupo, observaram-se três
subgrupos, sendo, dois compostos por acessos de Conilon, dos BAGs do Instituto Agronômico de Campinas e da
Embrapa, e o terceiro por híbridos espontâneos entre Conilons e Robustas, coletados em Rondônia. Dessa forma,
conclui-se que o AFLP apresentou polimorfismo satisfatório, possibilitando uma boa compreensão da diversidade
genética do germoplasma avaliado. Os resultados obtidos serão utilizados para manutenção e utilização dos BAGs
pelos programas de melhoramento de C.canephora.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Caracterização da diversidade e estrutura genética em
populações de Myrocarpus frondosus Freire Allemão
(Cabreúva) visando sua conservação no Estado de
Santa Catarina
Steiner, F1,2; Fernandes, CD1; Figueiredo, LGU1; Nazareno, AG1,2; Loch, FASS1; Bittencourt, R1,2; Reis, MS1,2
Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Universidade Federal de Santa Catarina
Programa de Pós Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Alozimas, Conservação in situ, Diversidade Genética, Espécie Ameaçada, Floresta Estacional Decidual.
A cabreúva é uma espécie florestal bastante conhecida no Sul do Brasil devido a utilização da sua madeira e
por suas propriedades medicinais. Ocorre na Floresta Estacional Decidual stricto sensu do Sul da Bahia ao Rio
Grande do Sul em altitudes entre 60 e 1000 m. Devido à super-exploração histórica da espécie e à redução do
seu habitat, a cabreúva foi incluída no âmbito do Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina para a
caracterização de sua diversidade genética. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a diversidade
e a estrutura genética de populações naturais de M. frondosus no estado de Santa Catarina. Foram coletadas
folhas de 50 indivíduos reprodutivos em cada uma das cinco populações avaliadas. Outras nove populações
serão ainda avaliadas. Para acessar os níveis e a distribuição da diversidade genética, utilizaram-se 12 sistemas
enzimáticos (ME, MDH, ACP, NADHDH, DIA, LAP, PGI, IDH, 6PGDH, PGM, SKDH e G6PDH) em tampao Tris-citrato.
Os 12 sistemas enzimáticos analisados revelaram 13 locos e um total de 38 alelos (2,42 ± 0,16). As populações
de M. frondosus apresentaram alta diversidade genética (P95% = 70,76 ± 14,76; HO = 0,278 ± 0,04; HE = 0,301 ±
0,04). As frequências gênicas das populações apresentaram desvios significativos das esperadas em panmixia,
evidenciando déficit de heterozigotos (f = 0,063). A presença de alelos exclusivos em quatro das populações e
uma diferenciação genética interpopulacional significativa (FST = 0,127) indicam a necessidade da ações
efetivas para a conservação in situ das populações remanescentes de M. frondosus no estado de Santa Catarina.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESC/ Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina
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Does Sao Francisco river acts as a geographic barrier
to gene flow in Tabebuia ochracea?
Moreira, PA1; Fernandes, GW1; Collevatti, RG2
Laboratório de Ecologia Evolutiva & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Laboratório de Genética e Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás
[email protected]
1
2
Keywords: ipê-amarelo, gene flow, genetic diversity, Bignoniaceae, tropical dry forest.
Understanding the processes and patterns of gene flow and local adaptations requires a detailed knowledge of how
landscape features structure populations. The interaction among landscape characteristics and microevolutionary
processes, such as gene flow, has implications for ecology, evolution and conservation biology. Many landscape
features, such as mountains, gradient of humidity, rivers, act as geographic barrier to gene flow promoting a genetic
discontinuity. There are studies which found rivers as an effective barrier to gene flow, however, most of these
studies were with animals and little were about plants. We report the genetic structure and gene flow of T. ochracea
over both banks of Sao Francisco River in a seasonally dry tropical forest in the north of Minas Gerais State. Our
working hypothesis was that the river acts as a geographic barrier to gene flow of this species. ). For the genetic
analysis, three populations were sampled: two populations were on the left bank of the river (MSSP 1 and MSSP 2) at
Mata Seca State Park, where we collected 142 individuals, juveniles and adults, of T. ochracea. The third population
was on the right bank of the river (LCSP 1) at Lagoa do Cajueiro State Park, where we collected 70 individuals,
juveniles and adults. Seven microsatellite loci developed for Tabebuia aurea were used to genotype the 212 plants
sampled. All populations did not differ in any estimated parameter. MSSP 1, MSSP 2 and LCSP exhibited low levels
of polymorphism and genetic diversity and high levels of inbreeding. Also, no differentiation among populations
was detected by Bayesian analyses performed with STRUCTURE software (K=1), gene flow estimated by genetic
diversities between populations was high for all pairwise populations (>1) and relatedness among individuals
belonging populations from the same bank of the river was not significantly higher than relatedness among those
belonging populations from different bank, suggesting that gene flow occurs between these populations and that
Sao Francisco river does not act as an effective geographic barrier to gene flow between T. ochracea populations.
Tabebuia ochracea is pollinated by bees of Centris and Bombus genres and Bombus bees can fly for up to 12 km away.
Thus, the pollinating bees of T. ochracea can migrate between populations for foraging and promote the exchange
of genes among individuals, even those separated by the river. In addition, T. ochracea has its seeds dispersed
by wind, their seeds have morphological adaptations to this end, their seeds are winged, small, lightweight and
produced in large quantity. These factors facilitate the dispersal of seeds by wind and can reach long distances.
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Diversidade e estrutura genética do Jacarandá-daBahia (Dalbergia nigra – Fabaceae): avaliação dos
impactos da fragmentação da Mata Atlântica
Resende, LC1; Ribeiro, RA2; Lovato, MB1
Laboratório de Genética de Populações, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Minas Gerais
2
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde – Diamantina, Universidade Federal dos Vales do
Jequitinhonha e Mucuri
[email protected]
1
Palavras-chave: fragmentação de habitats, Mata Atlântica, microssatélites, Dalbergia nigra, espécie ameaçada.
O desmatamento e fragmentação da Mata Atlântica representam uma importante ameaça à sua biodiversidade.
A análise dos efeitos da fragmentação sobre a diversidade genética é fundamental para compreender os impactos
sofridos pelas populações e guiar estratégias efetivas para a conservação e manejo de espécies raras. O jacarandáda-Bahia, Dalbergia nigra, é uma árvore endêmica e ameaçada da Mata Atlântica, cuja biologia ainda é pouco
conhecida. Com o objetivo de avaliar os efeitos da fragmentação de habitats sobre a diversidade e estrutura genética
de D. Nigra, 235 indivíduos da espécie foram amostrados em cinco populações: duas localizadas dentro do Parque
Estadual do Rio Doce-MG (PERD), o maior remanescente de Mata Atlântica de Minas Gerais, e três em fragmentos
próximos ao Parque. A distância média entre fragmentos e populações do PERD é 19,73km. Cada população foi
subdividida em grupos de indivíduos adultos (DAP>11,8cm) e jovens (DAP<9cm), com o número de indivíduos em
cada população variando entre 20 e 30 por classe de tamanho. O DNA das amostras foi extraído usando o método
CTAB com algumas modificações. Seis loci microssatélites foram genotipados em sequenciador automático
MegaBACE 1000. Os programas FSTAT, ARLEQUIN e FREENA foram utilizados para avaliar a diversidade genética
e a ocorrência de estruturação populacional. O teste de isolamento por distância foi realizado no GenAlEx. Todos
os loci apresentaram polimorfismo, com número total de alelos variando entre seis e 24 e número médio de alelos
por locus igual a 15,5. O número médio de alelos por classe de tamanho dos indivíduos variou entre 6,33 e 9,00, e a
riqueza alélica (AR) variou entre 6,15 e 8,24. As heterozigosidades esperada (HE) e observada (HO) médias para as
classes variaram de 0,702 a 0,844 e 0,540 a 0,736, respectivamente. De uma forma geral a população Campolina, a
mais preservada localizada dentro do PERD, apresentou valores significativamente maiores para HE e AR do que as
outras populações, o que indica a maior capacidade dessa população em manter a diversidade de D. nigra. Valores
de FST par a par foram significativos para todas as comparações excluindo as comparações feitas entre diferentes
classes de tamanho da mesma população, variando entre 0,027 e 0,152. Entretanto, FST obtido para indivíduos
jovens (FST=0,056) foi menor que o obtido para adultos (FST=0,088), sugerindo uma inesperada diminuição da
estruturação aproximadamente uma geração após o início da fragmentação. Não foi detectado isolamento por
distância (teste de Mantel não significativo). A estruturação genética encontrada entre as populações, associada
à existência de vários alelos exclusivos nas áreas fragmentadas, revelam a grande importância dos fragmentos
florestais na manutenção da diversidade genética de D. nigra e apontam para a necessidade de sua preservação.
Apoio financeiro: CAPES, FAPEMIG e CNPq
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Diversidade genética e taxa de endogamia em
populações endogâmicas de tamanho reduzido:
modelagens do efeito do isolamento reprodutivo
Costa, LS¹; Stefenon, VM¹; Tatsch, GL¹
¹ Universidade Federal do Pampa – Campus São Gabriel
[email protected]
Palavras-chave: diversidade genética, endocruzamentos, heterozigosidade, geração, fragmentação florestal.
Introdução: A partir da última década intensificaram-se os estudos genético-ecológicos em populações de
espécies florestais, que apontam o efeito das ações antrópicas em florestas não perturbadas, matas secundárias e
fragmentos. A principal conseqüência da fragmentação florestal juntamente com os efeitos aleatórios de muitas
gerações é a significativa redução do tamanho efetivo populacional, favorecendo a ocorrência de deriva genética e
aumento da taxa de endogamia, afetando diretamente a continuidade e evolução da mesma. Objetivo: Determinar
o efeito de várias gerações de acasalamento entre populações endogâmicas e de pequeno tamanho efetivo, no
índice de diversidade genética e na taxa de endogamia, até atingirem o equilíbrio genético. Métodos: Foram
simuladas 100 populações endogâmicas (taxa de autofecundação=5,0%) com 50, 100, 500 e 1000 indivíduos cada
(totalizando 400 populações) e determinou-se a diversidade genética (Ht’) e a taxa de endocruzamentos (Gis),
para cada população após 5, 10, 50, 100, 500 e 1000 gerações (totalizando 2.400 simulações). Resultados: A análise
revelou que para a estimativa de heterozigosidade (Ht’) de Nei, as médias não divergiram significativamente em
todas as populações, conforme verificado ao aplicar-se o Teste Tukey ao nível de significância de 0,05%, sendo
que a maior diferença encontrada entre as médias foi de 0,045. Na estimativa da taxa de endogamia para 5
gerações de cruzamentos, obteve-se Gis=0,264, Gis=0,281, Gis=0,292, Gis=0,294, para populações com tamanho
inicial 50, 100, 500 e 1000 indivíduos, respectivamente. Para 10 gerações de cruzamentos, verificou-se um valor
mínimo de 0,306 na população com tamanho inicial de 100 indivíduos e valor máximo de 0,321 na população
de 1000 indivíduos, obtendo-se um valor médio de Gis=0,314. Para 50 gerações o valor médio foi Gis=0,319,
variando de 0,308 a 0,324. Para 100, 500 e 1000 gerações, a estimativa da taxa de endocruzamentos não sofreu
significativa variação, apresentando valores médios de 0,31525; 0,31525 e 0,31425; respectivamente, independente
do tamanho populacional. Conclusões: O conceito de geração é muito relativo e complexo, sendo que a definição
mais apropriada para uma geração é o intervalo de tempo da germinação até a primeira fecundação de uma
planta. Os resultados indicam que a heterozigosidade mantêm-se estável independentemente do tamanho
efetivo populacional ou do número de gerações de cruzamentos. No entanto, os resultados de Gis sugerem que
somente após 50 gerações de cruzamentos endogâmicos as populações atigem o equilíbrio genético. Esses
dados podem ser usados no planejamento de programas de recuperação/enriquecimento de áreas degradadas,
assim como programas de melhoramento genético baseados em populações base para coleta de sementes.
Apoio: FAPERGS, CNPq e UNIPAMPA.
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Relações filogenéticas do transposon Tip100 entre
espécies do gênero Ipomoea
Christoff, AP²; Loreto, ELS¹; Sepel, LMN¹
¹ Laboratório de Biologia Molecular, LabDros, Curso de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Maria
² Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Maria
[email protected]
Palavras-chave: Transposon, Tip100, Ipomoea, ITS, Morning Glory
Introdução: Elementos transponíveis (TEs) são conhecidos como “genes saltadores” por moverem-se no genoma
de uma célula possuindo significativa influência sobre a evolução dos genomas. O transposon TIP100, pertence
à superfamília hAT (classe II) dos transposons. Este elemento foi descrito inicialmente para a espécie Ipomoea
purpurea associado ao gene da Chalcona Sintase (CHS), sendo responsável pelo padrão variegado observado nas
flores de algumas linhagens. Considerável atenção tem sido dada para as plantas do gênero Ipomoea (Morning Glory)
por causa da versatilidade experimental de sua biologia floral, incluindo a genética da variação floral, biossíntese de
flavonóides, e, mutações induzidas por transposons. Para estudos evolutivos de elementos transponíveis, tornamse extremamente necessárias análises de sistemática molecular que possam auxiliar no esclarecimento de como
ocorreu a evolução das espécies estudadas, e, relacionar com a distribuição do transposon nas mesmas. Objetivos:
Investigar quais espécies de Ipomoea possuem o elemento transponível Tip100, analisar o grau de semelhança
entre os elementos encontrados e, inferir a evolução dos mesmos neste gênero. Métodos: As amostras de DNA
foram extraídas do tecido foliar de dez espécies de Ipomoea e de cinco variedades comerciais. Em seguida foram
realizadas reações de PCR tanto para o transposon Tip100, quanto para espaçadores internos transcritos, ITS,
que compreendem parte da região ribossomal 18S-5.8S-16S. Os fragmentos obtidos para o transposon foram
clonados, sequenciados, analisados e submetidos a análises filogenéticas. Para ITS, o produto de PCR foi purificado
e sequenciado e, em seguida, realizadas análises filogenéticas. Resultados: O transposon Tip100 foi encontrado
em quatro espécies (I. alba, I. indica, I. nil, I. purpurea) e em quatro variedades (I. purpurea ‘Kniolas Black Knight’,
I. purpurea Light Blue Star, I. purpurea Split Personality e em I. Tricolore Candy Pink). Os fragmentos obtidos
apresentam em média 900pb e correspondem a sequências parciais do elemento, sendo 94% a 100% semelhante
ao elemento já descrito. A análise de divergência entre as sequências de Tip100 mostra-se maior entre I. alba e
as demais (15% em média), enquanto que as diferenças entre Tip100 de outras espécies comparadas entre si são
inferiores a 2,8%. A análise bayesiana deste elemento apresentou uma filogenia bem suportada. Os espaçadores
internos transcritos (ITS) mostraram um padrão evolutivo de acordo com o esperado para o gênero Ipomoea onde as
espécies e variedades que apresentam o transposon fazem parte de um grupo restrito dentro do gênero. Conclusões:
O elemento transponível Tip100 apresenta-se conservado entre as espécies analisadas, principalmente na região
inicial que codifica a transposase. A filogenia resultante para o transposon concorda com a topologia apresentada
na filogenia de ITS, indicando uma provável transferência vertical do elemento entre este grupo restrito de espécies.
Apoio financeiro: CNPq e FAPERGS
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Análise da diversidade nucleotídica intra e
interespecífica de Coffea spp
Yanagui, K¹,²; Vieira, LGE²; Pereira, LFP4; Pot, D5
¹Universidade Estadual de Londrina
2
Laboratório de Biotecnologia Vegetal – IAPAR
3
Embrapa Café
4
CIRAD, UMR DAP
[email protected]
Palavras-chave: SNP, INDEL, Coffea, marcadores, polimorfismo
Os bancos de dados de ESTs do gênero Coffea têm auxiliado os estudos de identificação de marcadores moleculares.
Entre estes trabalhos, foi desenvolvido um pipeline para busca de polimorfismos que resultou na identificação
de 23.062 SNPs e INDELS presentes em dois genótipos de C. arabica e quatro de C canephora. Devido a baixa
representatividade genotípica dos dados de ESTs, esse trabalho buscou validar os polimorfismos detectados
pelo pipeline e avaliar a frequência dos mesmos em um painel maior de genótipos, representativo da diversidade
de C. arabica (12 genótipos) e C. canephora (oito genótipos). Também foram avaliados os polimorfismos entre
estas duas espécies com C. eugenioides, C. racemosa e Psilanthus bengalensis. Para a análise foram selecionados
oito genes envolvidos na biossíntese de diterpenos e açúcares, importantes compostos relacionados à qualidade
da bebida, bem como um gene mitocondrial e um cloroplastídico, que permitem também a inferência sobre
a história evolutiva dos genes analisados. Fragmentos dos respectivos genes foram amplificados por PCR e os
produtos foram sequenciados. O alinhamento das sequências e a detecção manual dos polimorfismos foram
realizados pelo programa Codon Code Aligner. Aproximadamente 7,6 kb foram explorados para identificação de
465 polimorfismos incluindo 416 SNPs, 18 INDELs e 31 SSR. Uma frequência de 6,1 SNP foi observada a cada
100 pb. Quando todos os polimorfismos foram considerados, verificou-se que 110 correspondem a diferenças
entre Psilanthus e Coffea e 360 correspondem a diferenças entre as espécies de Coffea; destes 266 são intra ou
inter específicos para C. canephora e C. eugenioides, espécies ancestrais de C. arabica. Em C. arabica foram
encontrados 134 SNPs, sendo que aproximadamente 87% destes correspondem a polimorfismos entre os parentais
da espécie e apenas 13% correspondem a diferenças intraespecíficas, sendo que maioria dos polimorfismos
intraespecíficos verificados não é fixada na população. A partir dos resultados inferiu-se que a análise realizada
pelo pipeline foi relevante para identificar alguns polimorfismos que diferenciam os genomas dos ancestrais
de C. arabica, mas apresenta limitações na detecção de SNPs intraespecíficos importantes; por outro lado, o
painel diverso de genótipos, permitiu a detecção de vários polimorfismos ainda não identificados, importantes
para o mapeamento genético, análises de diversidade e de evolução molecular ao nível intraespecífico.
Os dados obtidos poderão ser utilizados tanto nos programas de mapeamento genético de C. arabica e C.
canephora, como para aplicações práticas de genotipagem ou no melhoramento através de seleção assistida por
marcadores (SAM), além de serem úteis para estudos evolutivos e possibilitarem a escolha de genes candidatos
para estudos de associação e de expressão diferencial de haplótipos relacionada à plasticidade fenotípica.
Apoio Financeiro: Consórcio Pesquisa Café, CNPq
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Diversidade genética em germoplasma de feijoeiro
comum oriundo do Estado do Paraná mediante análise
com marcadores RAPD e microssatélites
Romani, I1,2; Gonela, A3; Molina, JC1; Conrado, TV1; Gonçalves-Vidigal, MC3; Lacanallo, GF3
Pós-graduação (Mestrado/Doutorado) em Genética e Melhoramento Vegetal – Universidade Estadual de Maringá (UEM)
Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular – UFPR – Campus Palotina
3
Departamento de Agronomia – Universidade Estadual de Maringá (UEM)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, variabilidade genética, marcador molecular RAPD, SSR, melhoramento genético vegetal, germoplasma.
Os grãos do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) constituem um dos produtos agrícolas de maior expressão
econômica e social do Brasil, sendo reconhecidamente uma importante fonte protéica e energética da população
brasileira. O Brasil é o segundo maior produtor mundial desta cultura, entretanto sua produtividade não é muito
alta, sendo aproximadamente de 852,3kg ha-1 (safra de 2006/2007). O incremento da produtividade pode ocorrer por
meio da utilização dos programas de melhoramento genético do feijoeiro. Estes programas são fundamentados na
utilização da diversidade genética para a criação e seleção de novas cultivares com alto potencial produtivo. Desta
forma, este trabalho objetivou avaliar a diversidade genética entre 37 genótipos de feijoeiro comum coletados
no Estado do Paraná mediante análise conjunta com os marcadores moleculares RAPD e Microssatélites. Após
a extração do DNA total dos 37 genótipos foram utilizados nas análises 11 primers decâmeros RAPD (Operon
Technologies, A18, AS13, C8, F5, F6, F10, G19, H20, I3, M12 e X11) e 18 pares de primers microssatélites (BMd2, BMd-9, BMd- 10, BMd-12, BMd-15, BMd-16, BMd-17, BMd-25, BMd-26, BMd-33, BMd-36, BMd-40, BMd-42,
BMd-45, BMd-46, BMd-52, BMd-53 e PVBR 128) desenhados para a espécie e, os produtos amplificados foram
visualizados em gel de agarose e poliacrilamida, respectivamente. Após a determinação dos tamanhos dos alelos
com o programa Image Aide as análises estatísticas foram conduzidas por meio dos programas GenAIEx 6 e SAS.
A análise com os primers RAPD gerou um total de 92 fragmentos, os quais variaram de 400pb a 2072pb, com
100% de polimorfismo. Os loci SSR analisados foram todos polimórficos (100%) apresentando uma variação de
dois (BMd-2) a oito (BMd-12 e BMd-17) alelos, com média de 4 alelos por locus. O dendograma obtido por meio
da análise conjunta dos dois marcadores moleculares utilizando o programa SAS evidenciou a presença de dois
grandes grupos. O primeiro grupo foi formado por 16 genótipos que consistiam de acessos tradicionais coletados
na região de Toledo, Paraná, sendo a maioria de origem Andina. O segundo grupo foi formado por 21 genótipos,
sendo a maioria de origem Mesoamericana. Treze genótipos deste grupo constituem linhagens que fazem parte
de programas de melhoramento do feijoeiro comum e, os oito genótipos restantes são acessos tradicionais
coletados em outras regiões do Estado do Paraná. A partir desses dois grandes grupos foi possível separar os 37
genótipos analisados em 12 subgrupos distintos. Os resultados obtidos com base na análise conjunta dos dois
marcadores moleculares evidenciaram a presença de grande variabilidade genética entre os 37 genótipos de
feijoeiro comum analisados, a qual poderá vir a ser explorada em programas de melhoramento genético da espécie.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPQ e Fundação Araucária.
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Variabilidade genética e determinação da origem de
uma erva invasora (Senecio madagascariensis Poir.)
na América do Sul subtropical
Mäder, G1; Bonatto, SL2; Freitas, LB1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
[email protected] – www.ufrgs.br/lem
1
2
Palavras-chave: Senecio madagascariensis, variabilidade genética, espécies invasoras, genética de populações, ITS.
Introdução: Estudos que investigam a variabilidade genética de espécies invasoras são importantes para melhor
compreendermos a dinâmica das invasões biológicas e termos uma perspectiva ecológica e evolutiva. Análises
filogeográficas e de genética populacional podem fornecer importantes contribuições sobre a dinâmica das
invasões biológicas por permitir a elucidação da origem geográfica e provável rota de dispersão de determinadas
espécies. Senecio madagascariensis (Asteraceae) é nativa de Madagascar, Ilhas Mascarenhas e sul da África.
Hoje em dia, provavelmente através do tráfego portuário, esta espécie pode ser encontrada como invasora em
diversas regiões do planeta (Austrália, Havaí, Colômbia e Argentina), sendo que no Brasil foi encontrada pela
primeira vez em 1998. Essa espécie compete fortemente com a flora local por luz, umidade e nutrientes do solo,
levando à deterioração das pastagens onde foi introduzida. Além disso, como muitas outras espécies de Senecio,
produz alcalóides pirrolizidínicos que podem levar à morte quando ingeridos pelo gado, problema observado
na Austrália. A região dos espaçadores internos transcritos do nrDNA (ITS1 e ITS2) foi utilizada para inferir
as relações entre populações de S. madagascariensis provenientes de diversas origens. Os espaçadores ITS são
os marcadores nucleares mais utilizados em estudos evolutivos em plantas e têm sido utilizados com sucesso
para inferir relacionamentos dentro de outras espécies Senecio. O objetivo deste trabalho é investigar a origem
das populações invasoras de S. madagascariensis no Brasil e Uruguai. Métodos: Foram utilizadas seqüências
de ITS de populações do Havaí, África do Sul, Suazilândia e Madagascar (obtidas do Genbank) e de duas
populações no Rio Grande do Sul e uma do Uruguai obtidas através de sequenciamento. O DNA foi extraído a
partir de folhas jovens usando CTAB. As análises populacionais foram realizadas nos programas Network e
Arlequim a partir do conjunto de 30 seqüências obtidas. Resultados: O alinhamento das seqüências de ITS
apresentou 665 pb com 15 sítios polimórficos. Os valores dos índices de diversidade haplotípica e nucleotídica
foram de respectivamente 0,830 (±0,005) e 0,006 (±0,003). Na network foi observada uma clara separação entre
as seqüências das amostras coletadas em Madagascar e Suazilândia. As seqüências das populações onde S.
madagascariensis é considerada invasora mostraram-se relacionadas com as seqüências das populações da
África do Sul indicando que esse pode ter sido o ponto de partida para a espécie colonizar outros continentes.
Esse resultado pode ser explicado pelo fato da África do Sul ter importante atividade portuária desde o início
das grandes navegações e, com isso, acidentalmente, S. madagascariensis pôde colonizar outros continentes.
Conclusões: A variabilidade de seqüências encontradas no sul do Brasil e Uruguai, e o compartilhamento com
as da África do Sul e Havaí, indicam que a variabilidade observada surgiu ainda na África, antes das invasões.
Apoio financeiro: CNPQ, PROTAX (MCT/CNPQ/CAPES), CAPES, FAPERGS E PR
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Genetic variability in natural populations of
Petunia exserta (Solanaceae)
Segatto, ALA1; Fagundes, NJR1; Lorenz-Lemke, AP2; Bonatto, S3; Kuhlemeier, C4; Freitas, LB1
Departamento de Genética, UFRGS
Departamento de Biologia, UFMS
3
Laboratório de Biologia Genômica e Molecular, PUCRS
4
Institute of Plant Science, UniBe
[email protected]
1
2
Keywords: population genetics, hybridization, introgression, flower color variation, and Petunia.
Introduction: To enable the management and conservation of one species is essential to understand the
evolutionary processes involved in its population structure. Petunia exserta is an endemic specie from Serra
do Sudeste (RS- Pampa biome) region. Beyond its restrict distribution, this specie also shows strong habitat
requirements. The plants grow in shady cracks resembling small caves in large sandstones rocks where they do
not receive light and rain directly. In places where population of Petunia axillaris grows near the caves where P.
exserta grows, individuals with intermediate floral morphology were found, suggesting interspecific hybridization.
Data from a previous work, using chloroplast markers, corroborate this hypothesis. Objective: To contribute to
understand the population structure of the specie P. exserta as part of the phylogeography analysis and knowledge
of the Pampa biome, using chloroplast and nuclear markers CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences)
together with observation of the plant lifestyle and morphology. Methods: Were analyzed 322 individuals of P.
exserta from 39 populations and 333 individual of P. axillaris from 82 populations. The plastidial spacers trnS/
trnG and trnH/psbA were amplified and sequenced in automatic equipment. The haplotypes were detected using
the program DnaSP 4.10.9. The evolutionary relationships were inferred by the method Median Joining Network
implemented in the program Network 4.5. The genetic differentiation among the populations was estimated
using the Analysis of Molecular Variance (AMOVA) carried out in the program Arlequin 3.11. To infer possible
events of expansion or population reduction the neutral tests Tajima’s D and Fu’s Fs were used. The six CAPS
markers used were amplified with specific primers and reaction conditions. After the amplification each fragment
was digested with a adequate restriction enzyme and genotyped from the visualization of the band pattern in
one agarose gel 2,5%. The allele frequency and number of alleles per locus were determined using the program
Genepop 4.0.10 and the program STRUCTURE 2.3.1 was used to estimate the degree of genetic mixture between
the two species. Results: The P. exserta flowers show a wide color variation that seen not always related with
hybridization events. Hybrid individuals were uncommon, suggesting some selection mechanism. Besides this,
hybridization events should not occur in all breeding seasons, but occur throughout the known distribution of
the specie. Petunia exserta does not have haplotypes and alleles exclusives, these are a subset of those found in P.
axillaris, which allow us to infer that the first specie is probably derived from the second. Conclusions: The specie
P. exserta has habitat constraints and low genetic variability in the populations and the degree of genetic mixture
seems do not compromise the species integrity, and its preservation depends on the preservation of its habitat.
Financial support: CNPq, FAPERGS, PROPESQ-UFRGS, NCCR “Plant Survival”.
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Caracterização de acessos de arroz de sequeiro
japonês por meio de análises multivariadas
Nascimento, WF1; Veasey, EA1;Silva, EF2; Martins, GV2
Laboratório de Ecologia e Genética Aplicada, Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade
de São Paulo.
2
Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco
[email protected]
1
Palavras-chave: Oryza sativa L., germoplasma, conservação ex situ, variabilidade genética. análise de componentes principais.
A manutenção da variabilidade genética em bancos de germoplasma, como medida de redução dos impactos
decorrentes da erosão genética presente em diversos cultivos, tem sido uma das estratégias de conservação ex situ
mais utilizada, pois permite disponibilizar, de forma quase imediata, o germoplasma conservado para utilização
em programas de melhoramento. Nesse sentido, a coleção de germoplasma de arroz de sequeiro (Oryza sativa L.)
tem uma aplicação estratégica na valorização dos recursos genéticos, além de proporcionar dados básicos que são
necessários ao melhoramento da cultura. O objetivo deste trabalho foi caracterizar 146 acessos japoneses de arroz de
sequeiro, mantidos na coleção de germoplasma da Universidade Federal Rural de Pernambuco, com base em análises
multivariadas de 30 descritores morfoagronômicos, sendo 14 caracteres qualitativos e 16 caracteres quantitativos.
O experimento foi conduzido de março a julho de 2007, em Recife, Pernambuco. O delineamento utilizado foi o de
blocos ao acaso, com três repetições e as parcelas foram constituídas de uma linha com seis plantas espaçadas a 0,15
m. Em relação às análises de componentes principais das características qualitativas verificou-se que os acessos,
apesar depossuírem grande dispersão, não apresentaram a formação de grupos distintos. Entretanto, considerando
as características quantitativas verificou-se que os acessos Mitsukasane, Mie, Tomoemochi, Oobakirishima
eNourinmochi 6 foram os genótipos que mais se destacaram. Na análise de agrupamento a partir de caracteres
qualitativos,observou-se a formação de dois grupos, enquanto que a partir dos caracteres quantitativos observouse a formação de três grupos, sendo o número de espiguetas por panícula o caráter que teve maior influência na
formação dos agrupamentos. Os resultados mostraram que os acessos mantidos na coleção de germoplasma da
UFRPE apresentam considerável variabilidade genética a ser utilizada nos programas de melhoramento do arroz.
Apoio financeiro: UFRPE
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56
Caracterização da diversidade e estrutura genética em
populações naturais de Ocotea porosa (Imbuia) visando
sua conservação no Estado de Santa Catarina
Bittencourt, R1,2;Loch, DSS1; Oliveira, IB1; Sant`Anna, CS12;Montagna, T1; Silva, JZ1,2; Mantovani, A3; Reis, MS1,2
Nucleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Universidade Federal de Santa Catarina
Programa de Pós Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina
3
Centro Agro-veterinário, Universidade do Estado de Santa Catarina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Espécie Ameaçada, Conservação in situ, Alozimas, Lauraceae, Floresta Ombrófila Mista
A imbuia (Ocotea porosa - Lauraceae) é uma espécie arbórea com ocorrência natural na Floresta Ombrófila Mista
(FOM). Devido a qualidade da sua madeira foi intensamente explorada, sendo considerada a segunda espécie
mais explorada do Estado de Santa Catarina. Essa forte pressão fez com que a imbuia figure como espécie
“Vulnerável”na RedList da IUCN. Devido ao atual quadro de ameaça e à importância ecológica da espécie, a mesma
foi incluída para a Caracterização da Diversidade Genética no âmbito do Inventário Florístico-Florestal de Santa
Catarina. Portanto, o objetivo deste trabalho foi caracterizar a diversidade e estrutura genética de populações de
imbuia distribuídas ao longo da FOM no Estado de Santa Catarina. Para tanto foram avaliadas 11 populações
naturais da espécie onde buscou-se coletar 50 indivíduos por população, sendo estes distanciados entre si por ao
menos 50 metros. Outras quatro populações ainda serão avaliadas. Os indivíduos coletados foram genotipados
através de marcadores alozímicos submetidos a eletroforese em gel de amido. Os sistemas utilizados foram
MDH, SOD, PRX, SKDH, PGM, DIA, GOT, EST, PGI e ACP e revelaram 15 locos interpretáveis. Todos os locos
apresentaram polimorfismo e foi detectado somente um alelo exclusivo. A diversidade genética (He) obtida para
as 11 populações foi de 0,280 e o Ht de 0,336. O índice de fixação para as 11 populações foi de 0,206, sendo que
três populações apresentaram F não diferente de zero (-0,053, -0,059 e 0,137), enquanto que as outras populações
apresentaram F significativamente maior que zero. Este alto índice de F indica que há desvio das frequências
de heteozigotos do esperado no Equilíbrio de Hardy-Weinberg. A medida de diferenciação de Hedrick (Gst`)
foi de 0,309 denotando que as populações apresentam forte estruturação decorrente da deriva genética. Este
resultado sugere que as estratégias para conservação in situda espécie devem contemplar ações que favoreçam o
aumento da conectividade entre as populações e Unidades de Conservação com grande número de populações.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESC/ Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina
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Filogeografia e distribuição disjunta de Tibouchina
papyrus (Melastomataceae): uma espécie endêmica de
cerrado rupestre
Castro, TG1,2; Telles, MPC1; Collevatti, RG1
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás CP 131. Goiânia, Goiás.
Brasil. 4001-970
2
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Genética, Pontifícia Universidade Católica de Goiás
[email protected]
1
Palavras-chave: Filogeografia, Tibouchina papyrus, pau-papel, Cerrado, cpDNA.
Tibouchina papyrus (Melastomataceae) é uma árvore endêmica de cerrado rupestre, restrita às Serras Dourada
(SD) e dos Pirineus (SP), em Goiás, e Natividade (NT) em Tocantins. O presente trabalho teve como objetivo
estudar a filogeografia de T. papyrus, baseada no polimorfismo de regiões não codificantes do DNA de cloroplasto.
Foram amostradas 16 indivíduos em seis subpopulações de T. papyrus nas três localidades de ocorrência da
espécie. Os indivíduos foram sequenciados para as regiões intergênicas psbA/trnH, trnC/ycf6 e trnS/trnG,
cujos fragmentos apresentaram 268 pb, 294pb e 580 pb, respectivamente. Para os 96 indivíduos estudados,
foram encontrados 11 diferentes haplótipos para as três regiões sequenciadas combinadas. Serra dourada
apresentou maior diversidade genética (h = 0,837; π = 0,0012 ± 0,0008), seguida de Pirineus (h = 0,762, π = 0,0012
± 0,0009) e Natividade (h = 0,591, π = 0,0013 ± 0,0009). A análise no programa Network mostrou agrupamentos
geograficamente distintos, sem compartilhamento de haplótipos entre localidades, e a análise de variância
mostrou uma alta diferenciação entre as subpopulações (ΦST = 0,684; p < 0,001). Este resultado foi corroborado
pela análise de coalescência (programa Lamarc), que indicou ausência de migração entre as localidades (2Nm
< 0,03). Não há sinal de retração recente no tamanho das subpopulações seguido por expansão (Tajima D e
Mismatch Distribution). A análise de coalescência (Lamarc) indicou também que as subpopulações estão em
crescimento exponencial (SD, g = 825,356; SP, g = 717,563; NT, g = 818,093). As estimativas de tempo de coalecência
(programa BEAST) mostram que o ancestral comum mais recente divergiu em dois clados há cerca de 293.430
anos antes do presente (yBP) (TMRCA), um contendo o MRCA das subpopulações de SD, e outro contendo o
MRCA das subpopulações de SP e NT. Posteriormente, houve divergência entre as duas subpopulações de SD
(237.668 yBP), e mais recentemente entre as subpopulações de SP e NT (201.081 yBP). A distribuição disjunta deve
representar uma relíquia climática resultado da expansão da distribuição devido a condições mais secas e frias
que prevaleceram durante a glaciação de Kansan. Apesar da alta diversidade genética e da expansão populacional
indicada neste trabalho, as subpopulações de T. papyrus estão historicamente isoladas e sua expansão é restrita
pela distribuição do habitat favorável, o que representa um risco a persistência em longo prazo das subpopulações.
Apoio Financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda, CNPq e CAPES.
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58
Utilidade de segmentos do cpDNA para estudos intra
e interespecíficos no grupo Pilosocereus aurisetus
(Cactaceae)
Bonatelli, IAS; Moraes, EM
Laboratório de Diversidade Genética e Biologia Evolutiva, Universidade Federal de São Carlos, Campus Sorocaba
[email protected]
Palavras-chave: Cactaceae , Pilosocereus, cpDNA, filogeografia, filogenia
O gênero de cactaceae Pilosocereus compreende aproximadamente 40 espécies, sendo que a maioria delas ocorre no
leste do Brasil. Dentro deste gênero, o grupo de espécies relacionadas a Pilosocereus aurisetus é constituído por oito
espécies de cactos colunares (P. aurisetus, P. machrisii, P. vilaboensis, P. aureispinus, P. bohlei, P. parvus, P. pusillibuccatus
e P. jauruensis), as quais possuem distribuição disjunta associada aos enclaves de vegetação seca ou de afloramento
rochoso no domínio Cerrado. Esse padrão fragmentado de distribuição pode indicar conseqüências importantes
na distribuição da variabilidade genética e no processo de diferenciação das populações. Populações de cactaceae
fora do domínio da caatinga podem representar fragmentos remanescentes de populações mais amplamente
distribuídas no passado. Esta suposição é apoiada por evidências de climas mais secos que ocorreram na região
amazônica durante o Pleistoceno e também por dados palinológicos que indicam a expansão da vegetação xerófita
em áreas atualmente ocupadas por vegetação adaptada a condições de alta umidade. Sequências nucleotídicas
do genoma do cloroplasto (cpDNA) podem ser aplicadas em estudos filogeográficos para testar a influência de
eventos demográficos históricos na distribuição da variabilidade genética das espécies relacionadas a P. aurisetus,
bem como podem auxiliar no conhecimento das relações filogenéticas entre espécies do grupo. O presente estudo
teve por objetivo analisar a utilidade de quatro espaçadores intergênicos [trnH-psbA (HA), trnL –trnT (LT), trnStrnG (SG) e trnL-trnF (LF)] e um íntron [trnL (LL)] do cpDNA em estudos intra e interespecíficos em quatro espécies
do grupo P. aurisetus, totalizando 2.812 bp. Foram analisados de 3 a 10 indivíduos de seis populações: P. machrisii
(Altinópolis–SP; Delfinópolis-MG e Cristalina-GO), P. aurisetus (Cardeal Mota-MG), P. vilaboensis (PirenópolisGO) e P. aureispinus (Ibotirama-BA). Para amplificação dos segmentos, foram utilizados primers descritos na
literatura em conjunto com primers desenvolvidos neste estudo para amplificação do segmento SG em duas
porções, denominadas SG1 e SG2. Os resultados mostraram a existência de variação intra e interespecífica para os
segmentos LT e SG2 e interespecíficas para os demais segmentos. A maior parte da variação observada consistiu
de inserções-deleções (indels), enquanto que o segmento SG2 apresentou apenas substituições de sítio. De acordo
com a quantidade e a qualidade da variação observada, os segmentos SG2 e LT se mostraram úteis para aplicação
em estudos filogeográficos, como evidenciado pela rede de haplótipos com 95% de parcimônia para cada um desses
segmentos. A análise Neighbour-joining mostrou que nenhum dos segmentos isoladamente apresenta resolução
filogenética para separar cada espécie. Essa resolução pôde ser obtida pela análise em conjunto dos segmentos
SG1 e SG2 ou dos segmentos LT e SG2. Na primeira combinação P. vilaboensis é indicada como espécie irmã de P.
machrisii, enquanto que na análise com os segmentos LT e SG2 essa condição é assumida pela espécie P. aurisetus.
Apoio financeiro: FAPESP; CNPq
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59
Análise genotípica e fenotípica de biótipos Sul
Americanos de Paspalum notatum
Cidade, FW1; Souza-Chies, TT2; Souza, FHD3; Dall’Agnol, M4; Zucchi, MI5; Souza, AP1,6
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), Instituto de Biologia, UNICAMP
Programa de Pós Graduação em Botânica, Departamento de Botânica, UFRGS
3
Embrapa Pecuária Sudeste, EMBRAPA
4
Departamento de Plantas Forrageiras e Agrometeorologia, Faculdade de Agronomia, UFRGS
5
Pólo Regional Centro Sul – Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios/APTA
6
Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, UNICAMP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Caracterização fenotípica; Diversidade genética; Microssatélites; Paspalum; Paspalum notatum.
Paspalum notatum Flüggé é uma importante gramínea forrageira, reconhecida como um dos maiores constituintes
das pastagens nativas do Continente Americano. Populações naturais estão distribuídas desde o México até a
Argentina. Formalmente há duas variedades botânicas reconhecidas para a espécie. P. notatum var. saurae, é diplóide
sexual auto-incompatível, o qual habita naturalmente uma área restrita da América do Sul. Essa variedade apresenta
uma importante cultivar comercial, reconhecida como capim Pensacola. Por sua vez, P. notatum var. notatum, é
autotetraplóide e apomítica, amplamente distribuída no continente Americano. Há relatos de fluxo gênico entre
estes dois grupos quando em simpatria. Dentre os apomíticos, diversos biótipos são reconhecidos informalmente.
Neste contexto, este trabalho teve como finalidade estabelecer as relações genéticas entre os diferentes biótipos
de P. notatum, bem como a correlação entre os dados morfológicos, moleculares e geográficos. Para tanto, foram
utilizados nove descritores morfológicos, incluindo oito características quantitativas e uma qualitativa, 30 locos
microssatélites, e os dados de origens geográficas para gerar as matrizes de distância e similaridade. Seis grupos
foram formados a partir da análise dos dados morfológicos e as características que mais influenciaram nesta
separação foram comprimento e largura da lâmina foliar. A correlação entre dados morfológicos e moleculares
foi de 0,42, mostrando correlação baixa entre as matrizes de distância e dissimilaridade. No entanto, o grupo que
contribui para que essa correlação não fosse mais alta foi um grupo de indivíduos coletados na região litorânea
do Rio Grande do Sul. Esse grupo apresentou muitas marcas moleculares exclusivas e uma maior variabilidade
morfológica comparativamente aos outros grupos. A maior diferença morfológica encontrada para esse grupo foi
a presença constante de lâminas foliares pubescentes, o que pode ser adaptação ao ambiente litorâneo. Contudo,
esse caráter não é discriminante, pois pode apresentar influência ambiental. A análise de inferência Bayesiana foi
feita utilizando o programa Structure e o número de grupos estimado foi oito. Esses grupos apresentaram uma
estruturação relacionada a características morfológicas apresentadas pela espécie. A partir da AMOVA observouse que os grupos, em geral, estão bem estruturados, com FST de 0,5, provavelmente devido ao fato de que muitas
populações de P. notatum são compostas por genótipos apomíticos. Por outro lado, o grupo que apresentou menor
estruturação genética foi o composto pelos indivíduos diplóides, os quais são alógamos e auto-incompatíveis.
Não houve correlação entre a distribuição geográfica e a estruturação genética da espécie (r= -0,0583), entretanto,
constatou-se uma relação genética mais próxima entre um grupo morfológico amplamente distribuído e P.
notatum var. saurae (cv. Pensacola), indicando uma possível influência mais recente dessa última sobre as
populações naturais tetraplóides. Em geral, observa-se que P. notatum apresenta estruturação genética relacionada
a morfologia, provavelmente devido à fixação de genótipos apomíticos adaptados aos diferentes ambientes.
Apoio Financeiro: CNPq; FAPESP.
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60
Estrutura populacional e diversidade genética de
Butia eriospatha (Arecaceae), uma espécie ameaçada
de extinção
Nazareno, AG1; Savisck, F1; Montagna, T2; Peroni, N3; Reis, MS2
Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos, Universidade Federal de Santa Catarina
Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Universidade Federal de Santa Catarina
3
Departamento de Ecologia e Zoologia – CCB, Universidade Federal de Santa Catarina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Diversidade genética, Dinâmica populacional, Extinção Local, Isoenzimas, Recurso genético
Butia eriospatha (Martius ex Drude) Beccari é uma palmeira (Arecaceae) nativa da Mata Atlântica e encontra-se
vulnerável à extinção. O risco de ameaça é devido à perda de habitat, à venda ilegal de espécimes, à exploração de seus
frutos e à presença do gado em suas populações. Embora pouco seja conhecido da autoecologia de B. eriospatha, há
um consenso de que as populações estão em declínio. Neste contexto, estratégias de conservação são necessárias
para a espécie. No entanto, para serem efetivas, são fundamentais a compreensão da dinâmica populacional e o
conhecimento do nível e da distribuição da diversidade genética existentes em B. Eriospatha. Haja vista o risco
de ameaça e a intenção de estabelecer estratégias de conservação, este estudo teve por objetivos investigar a
estrutura demográfica, avaliar a regeneração natural, quantificar a herbivoria e elucidar os níveis e a distribuição da
diversidade genética de B. eriospatha. Foram estudadas quatro populações naturais de B. eriospatha, localizadas no
Planalto Oeste de Santa Catarina. O censo foi realizado nas populações e as plantas foram identificadas e mapeadas.
Sessenta parcelas circulares de 2 m de raio foram instaladas em duas das populações para avaliar a regeneração
natural e a taxa de herbivoria. Para os estudos de genética populacional, foram coletadas amostras foliares de
cinqüenta indivíduos reprodutivos das populações estudadas. Para acessar o nível e a distribuição da diversidade
genética, foram usados dez marcadores enzimáticos. A porcentagem de locos polimórficos (P95%), a riqueza alélica
(A), o número de alelos raros e privativos e o índice de diferenciação genética (FST) foram calculados com auxílio do
programa Genepop 3.1b. Populações de B. eriospatha apresentaram estrutura demográfica polarizada, constituída
por indivíduos senis e plântulas. Altas taxas de herbivoria (> 77%) foram registradas, indicando que a estrutura
demográfica observada é resultado da ação do gado sobre o componente regenerante. Baixos níveis de diversidade
genética (P95% = 14,3 ± 0,5; A = 1,85 ± 0,17) foram observados nas populações de Butia eriospatha estudadas. Dos
14 locos analisados, 12 foram monomórficos, dos quais 10 apresentaram alelos fixados em todas as populações.
A presença de alelos raros e privativos e a diferenciação genética entre as populações de B. eriospatha (FST = 0,40;
P < 0,05) atestam a necessidade de conservação in situ da variabilidade genética ainda existente. Os resultados
demonstraram o alto risco de extinção local e a urgente necessidade de se estabelecer estratégias de conservação
para a espécie. Mapear e monitorar as populações remanescentes, combater o comércio ilegal e impedir a entrada do
gado nas populações de B. eriospatha são ações imprescindíveis para evitar que este recurso genético seja perdido.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESC (IFFSC)
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Estrutura genética espacial intrapopulacional e história
de vida em espécies de árvores do Cerrado: inferências
para conservação
Lima, JS1,2; Collevatti, RG1; Soares, TN1; Telles, MPC1
1
2
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Departamento de Biologia, UFG
Programa de pós-graduação em Ecologia e Evolução, Universidade Federal de Goiás
Palavras-chave: autocorrelação espacial, Cerrado, estrutura intrapopulacional, microssatélite, parentesco
Estrutura genética espacial intrapopulacional (EGEI) é a distribuição não aleatória de genótipos dentro de
uma população resultante da interação entre fluxo gênico, deriva genética e seleção, além de ser afetada pelas
características de história de vida, incluindo a variação do sistema reprodutivo, como modo de dispersão
de sementes e pólen. Em um contexto de conservação biológica a fragmentação do habitat pode alterar a
estrutura genética espacial devido à interrupção em processos ecológicos, tal qual a reprodução em plantas.
O Cerrado, que é um hotspot importante de biodiversidade, possui espécies vegetais que apresentam diversas
combinações das características ecológicas e de história de vida, o que pode ter implicações diferentes na
estruturação da variabilidade genética intrapopulacional. Uma hipótese possível é a de que em espécies com
auto-incompatibilidade e dispersão pelo vento não haverá EGEI devido ao fluxo gênico causado pela dispersão
de pólen em longas distâncias. O objetivo deste trabalho foi avaliar, de maneira comparativa, a estrutura genética
espacial intrapopulacional de Caryocar brasiliense, Dipteryx alata e Tibouchina papyrus, que são espécies do
Cerrado que apresentam diferentes características de história de vida. As análises se basearam no polimorfismo
de locos microssatélites. Foi encontrado um fraco padrão de autocorrelação espacial para as três espécies.
Entretanto, nas espécies que possuem sementes dispersas por mamíferos (C. brasiliense e D. alata) observou-se
um maior valor de SP (intensidade de EGEI) (0,0116 e 0,172), em relação ao encontrado para T. papyrus (0,0085),
que é dispersa pelo vento. A análise comparativa sugeriu que algumas características do sistema de cruzamento
parece não afetar a EGEI, pois espécies autocompatíveis apresentaram padrões contrastantes, tais como: C.
brasiliense apresentou alto coeficiente de endogamia (f), 0,131 em contraste à T. papyrus que também é autocompatível, mas com f negativo (-0,168). Ao contrário das expectativas, a espécie D. alata que é auto-incompatível
apresentou maior intensidade de EGEI do que C. brasiliense, que apresentou alta taxa de autofecundação,
apesar de ser polinizada por morcegos (animais que potencialmente podem promover fluxo de pólen a maiores
distâncias). Os resultados revelaram diferentes padrões nas três espécies avaliadas. É provável que a dispersão
de sementes seja decisiva para determinação de tais diferenças. As três espécies podem ser altamente afetadas
pela fragmentação, especialmente T. papyrus, por ser uma espécie endêmica e localizada em ambientes vulners.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, PRONEX/CNPq/FAPEG, Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda.
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62
Elevada diversidade genética de acessos brasileiros
de pinhão-manso (Jatropha curcas L.), detectada por
marcadores ISSR
Grativol, C1; Lira-medeiros, CF2; Hemerly, AS1; Ferreira, PCG1
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Avenida
Brigadeiro Trompowski, Ed. CCS Bl.H, 21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
2
Diretoria de Pesquisa Científica, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, Rua Pacheco Leão 915, 22460-030, Rio de
Janeiro, RJ, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Jatropha curcas, ISSR, diversidade genética, marcadores moleculares, biodiesel, melhoramento de plantas.
Jatropha curcas L. (pinhão-manso) é encontrado em todas as regiões tropicais e tem atraído muita atenção
por seu potencial como fonte de biodiesel.Como o pinhão-manso é uma planta que ainda está em processo de
domesticação, o interesse em melhorar as suas características agronômicas tem aumentado, numa tentativa de
selecionar variedades mais produtivas, visando à utilização sustentável desta planta para a produção de biodiesel.
Sendo a América do Sul considerada como um dos possíveis centros de diversidade do pinhão-manso, o estudo
da diversidade genética em diferentes acessos de pinhão-manso no Brasil constitui um passo necessário nos
programas de melhoramento desta espécie. O sistema de marcadores moleculares ISSR é baseado em motivos de
microssatélites e tem sido utilizados para avaliar a diversidade genética em muitas espécies vegetais cultivadas
como o arroz, sorgo e cevada. Como a escolha do sistema de marcadores moleculares depende da informação
genética que eles podem detectar, é extremamente importante saber se o sistema de marcadores moleculares
escolhido é a ferramenta adequada para estimar a variabilidade genética de determinada espécie de uma
forma confiável. Neste estudo foram utilizados marcadores ISSR para acessar a variabilidade genética de 332
acessos de pinhão-manso em oito estados do Brasil que produzem sementes para a comercialização. Para uma
avaliação crítica do potencial de marcadores ISSR em fornecer estimativas confiáveis de diversidade genética de
pinhão-manso no Brasil, foram contabilizados os marcadores obtidos e analisados os parâmetros conteúdo de
informação polimórfica (PIC), índice do marcador (MI) e poder de resolução (RP) dos oligonucleotídeos utilizados.
Sete oligonucleotídeos ISSR amplificaram um total de 21.253 marcadores, dos quais 19.472 marcadores (91,6%)
mostraram polimorfismo. Entre os marcadores polimórficos foram identificados 275 marcadores raros (presentes
em menos de 15% dos acessos), que são úteis na identificação de um grupo de acessos em particular. Os parâmetros
PIC, MI e RP apresentaram valores médios de 0,26, 17,86 e 19,87 por oligonucleotídeo utilizado, respectivamente,
demonstrando a alta eficiência e confiabilidade do sistema de marcadores utilizados. A análise do número de loci
polimórficos e diversidade genética mostraram que acessos brasileiros possuem alto polimorfismo (94,23% de loci
polimórficos) e alta diversidade genética (0,4340). A análise de relacionamento genético entre os acessos através do
fenograma-UPGMA e MDS mostrou que os acessos de pinhão-manso brasileiros estão estreitamente relacionados,
indicando que o material veio de uma mesma fonte, mas sofreu segregação. Em conjunto, os resultados mostram
que acessos de pinhão-manso brasileiros possuem um elevado nível de diversidade genética em comparação
aos acessos de outros países, sendo os acessos provenientes de Natal (RN) os mais diversos, possuindo alto
valor como fonte de diversidade genética para programas de melhoramento do pinhão-manso no mundo.
Suporte financeiro: CNPq
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Estudo da variabilidade genética de acessos
asiáticos de Oryza sativa L. do Banco Ativo de
Germoplasma da Embrapa
BENICIO, CG1,3; BORBA, TCO1,2; VIANELLO, RP1,2; BRONDANI, C1,2
Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Arroz e Feijão
²Pesquisador Embrapa Arroz e Feijão
3
Estudante de Mestrado
[email protected]
1
Palavras-chave: Oryza sativa, variabilidade genética, marcadores SSR, coleções nucleares, recursos genéticos vegetais.
No Brasil, o arroz é cultivado em todo território e ocupa posição de destaque sócio-econômico entre as culturas
anuais. Estima-se que existam mais de 400.000 acessos de arroz em bancos de germoplasma do mundo todo.
Grande parte destes enfrenta problemas relacionados ao tamanho e dificuldade para sua organização. Logo, seus
propósitos de conservação e utilização da diversidade genética por programas de melhoramento são obstruídos.
Assim, idealizou-se a criação de coleções nucleares, representando aproximadamente 70% da variabilidade original
dos bancos, em um número reduzido de acessos. Uma das características mais importantes das coleções nucleares é
sua dinamicidade, permitindo a incorporação ou exclusão de acessos mesmo após seu estabelecimento e validação.
Entre as ferramentas disponíveis para caracterização de acessos de germoplasma encontram-se os marcadores
moleculares. Dentre as classes disponíveis, encontram-se os SSR (Simple Sequence Repeats), considerados ideais à
caracterização molecular de recursos genéticos, por serem codominantes, abundantes, multialélicos e altamente
polimórficos. Em 2002 foi estabelecida a Coleção Nuclear de Arroz da Embrapa (CNAE), composta por 550 acessos
representativos da variabilidade genética de 10.000 acessos do Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa. Como
parte do esforço rotineiro de avaliação de germoplasma de arroz da Embrapa, o objetivo deste trabalho foi determinar
a variabilidade genética de um conjunto de acessos provenientes do International Rice Research Institute (IRRI).
Foram caracterizados, através de 24 marcadores SSR fluorescentes, 146 acessos asiáticos de arroz do Banco Ativo
de Germoplasma da Embrapa. Cada acesso foi representado por um bulk de quatro plantas. Um total de 320 alelos
foi identificado, 23% deste total representaram alelos presentes em um único acesso (alelos privados). O marcador
que detectou o maior número de alelos privados foi o RM257 com nove. Os alelos privados foram identificados em
34% dos acessos analisados, com o acesso DON LAI apresentando o maior número (6). O número médio de alelos/
marcador foi de 13,4 e o valor médio de PIC foi de 0,78. Estes dados são bastante expressivos e indicativos da alta
variabilidade genética do grupo de acessos avaliado. Foram identificados 40 acessos heterogêneos (27%), ou seja,
acessos que apresentaram mais de dois alelos/marcador. Entre os acessos heterogêneos merecem destaque especial
IR65251-19-1-B, IR53236-275-1 e ICOXI-B-34-7-CK-S-TB-2, com três marcadores heterogêneos cada. A distância
genética média de Rogers modificada por Wright foi 0,79 e a probabilidade de identidade combinada 1,5x10-23.
No conjunto de 146 acessos não foi identificada estruturação populacional, além de não terem sido identificados
pares de genótipos idênticos. A utilização de SSR permitiu a determinação da relação genética entre os acessos,
além disso, possibilitou que importantes parâmetros genéticos fossem estimados. Estes valores, juntamente com
os dados de caracterização agronômica, serão utilizados para selecionar fontes de variabilidade genética para o
programa de melhoramento e para a CNAE.
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Genetic structure and characterization of olive
germplasm using microsatellite molecular markers
Val, ADB do1; Cançado, GM de A2; Ferreira, JL2; Breves, SS2; Fontes-Soares, BD2; Pasqual, M1; Vieira Neto, J3;
Borem, A4
Departamento de Agricultura, Universidade Federal de Lavras. Lavras – MG
Laboratório de Biotecnologia Vegetal. Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais. Caldas – MG
3
Núcleo Azeite e Azeitona. Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais. Maria da Fé – MG
4
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa. Viçosa - MG
[email protected]
1
2
Keywords: SSR, Genetic Structure, Genetic Diversity, germplasm evaluation, DNA Fingerprinting.
In Brazil there are still many uncertainties about names of olive varieties (Olea europeae L.), since it can be found
different names for the same genotype (synonymy) or the same names for different genotypes (homonyms). Faced
with this reality and the limitations of morphological markers in the identification of olive genotypes, this study
aimed characterizing and studying the genetic diversity and structure of 60 olive accessions. This constitutes an
important tool in the certification process of this specie, in addition to support the genitor selection in Brazilian
breeding programs. Tissue samples for DNA isolation were harvested from adult plants in EPAMIG germplasm
banks located in Experimental Farms of Caldas and Maria da Fé, MG, Brazil. DNA was extracted by CTAB method
described by SAGHAI-Marrof et al. (1984) with minor modifications. For genetic analysis, we used four pairs of
primers previously reported for microsatellite studies in O. europeae (GAPU 101, GAPU 11 e 17, UDO 99-009, and
UDO99-019). The four markers used allowed differentiation of most of the 60 olive accessions. We identified 22
alleles with an average of 5.5 alleles per locus, confirming the efficiency of the markers for the detection of genetic
polymorphisms. The values of polymorphic information content (PIC) were GAPU 101 (0.8121), GAPU 11 e 17
(0.6959), UDO 99-009 (0.5149) and UDO99-019 (0.1860). Considering the four loci analyzed, the probability of identity
has reached a relatively low value (0.001), demonstrating the high efficiency of these loci for genetic differentiation of
varieties. An unrooted cladogram was generated by the index of dissimilarity CS Chord (1967), using the clustering
method Neighbor Joining Tree. These results showed the broad span of divergence time among the genotypes used in
this work. In the analysis of principal coordinates, two distinct groups were formed. However, the Bayesian analysis,
performed with the Structure 2.3.3 software, has structured the 60 genotypes in three distinct groups. Hence, the
SSR markers used were efficient for characterization and detection of genetic structure in these germplasm banks.
Financial support: IFS, FAPEMIG, CNPq, CAPES, FINEP and EMBRAPA.
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Caracterização da diversidade e estrutura genética de
populações naturais de Araucaria angustifolia (Pinheiro
Brasileiro) visando sua conservação no Estado de
Santa Catarina
Sant`Anna, CS1,2; Schüssler, G1,2; Zechini, AA1,2; Duarte, RI1; Steiner, F1,2; Bittencourt R1,2; Mantovani A3;
Reis, MS12
Nucleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Universidade Federal de Santa Catarina
Programa de Pós Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina.3Centro Agro-veterinário,
Universidade do Estado de Santa Catarina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Espécie Ameaçada, conservação in situ, diversidade genética, Floresta Ombrófila Mista, Araucária.
O processo de exploração da araucária no Sul do Brasil reduziu drasticamente suas populações naturais, produzindo
uma situação de ameaça de extinção. Por estes motivos à espécie se encontra na Red List da IUCN e também na
lista de espécies da flora ameaçada de extinção publicada em setembro de 2008 pelo Ministério do Meio Ambiente.
Devido à esta grande pressão que a espécie sofreu e por ser uma espécie característica da Floresta Ombrófila Mista,
ocupando o estrato emergente da mesma, a Araucária foi selecionada para a etapa de caracterização da diversidade
genética do Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi caracterizar
a diversidade e a estrutura genética de populações da espécie no Estado de Santa Catarina visando estabelecer
estratégias de conservação e manejo. Buscou-se coletar um número mínimo de 50 indivíduos respeitando a
distância mínima de 50m entre as plantas. Foram amostradas 13 populações. Para a genotipagem dos indivíduos
foi utilizada a técnica de eletroforese de isoenzimas em gel de amido. Os sistemas isoenzimáticos utilizados foram
6PGDH, SKDH, MDH, PGM, PGI, ACP, α-EST, PRX, ME, LAP, IDH e GOT. A diversidade genética (He) encontrada
para estas populações foi de 0,14, variando de 0,095 a 0,181. O índice de fixação médio para as 13 populações foi alto
(0,236), indicando grande número de cruzamentos entre aparentados. Foi observada também grande quantidade
de alelos raros e exclusivos. A alta divergência genética entre as populações (FST=0,27) é um fator que denota a
importância da conservação destes remanescentes visto que uma parte significativa da diversidade genética é
encontrada entre populações. A presença de alelos raros e exclusivos e a alta divergência genética observada entre
as populações indicam a necessidade de estratégias de conservação que favoreçam a ampliação da conectividade
entre as populações remanescentes, bem como a criação de Unidades de Conservação com várias populações.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESC/ Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina
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Simulação do efeito Wahlund e de situações de
equilíbrio do Teorema de Hardy-Weinberg
Sene, FM1,2; Manfrin, MH1; Silva, GAR2
Depto.Biologia da FFCLRP-USP; 2 Depto.Genética da FMRP-USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Hardy-Weinberg; efeito Wahlund.
Esta prática de simulação para o equilíbrio de Hardy-Weinberg difere das práticas usuais por utilizar DADOS, ou
seja, cubos de 6 faces, que permitem simular cinco configurações de frequências gênicas iniciais. A análise dos
resultados de cada uma das configurações permite o entendimento do equilíbrio estudado e a análise conjunta
destas cinco configurações, consideradas como subpopulações de uma população grande, permite a simulação
do efeito Wahlund. Para esta prática montam-se 5 caixas, com 2 cubos cada uma, com a seguinte composição: caixa 1: 2 cubos com 5 lados marcados com a letra A (maiúscula), representando o alelo A ( freq.=0,833) e 1 lado
com a letra a (minúscula), representando o alelo a ( freq.=0,167); - caixa 2: 2 cubos com 4 lados marcados com A
( freq.=0,0,667) e 2 com a ( freq.=0,333); - caixa 3: 2 cubos com 3 lados com A ( freq.=0,5) e 3 com a ( freq.=0,5); - caixa
4: 2 cubos com 2 lados com A ( freq.=0,333) e 4 com a ( freq.=0,667); - caixa 5: 2 cubos com 1 lado com A ( freq.=0,167)
e 5 com a ( freq.=0,833). Os alunos devem ser divididos em grupos e, dependendo do número de alunos em sala
e do tamanho de cada grupo, podem ser feitas réplicas de cada configuração. Simulação da formação de zigotos:
cada grupo receberá uma caixa; os 2 cubos devem ser jogados simultaneamente, 100 vezes, e os resultados, AA
ou Aa ou aa devem ser anotados. Relatório e análises a serem feitas com os valores obtidos: Parte 1 - análise dos
valores obtidos por cada grupo: a)- cálculo da frequência esperada dos genótipos na geração 1; b)- teste de X2 para
verificar se os valores obtidos estão de acordo com o esperado. Parte 2 – efeito Wahlund: a)- colocação dos valores
de cada grupo em uma tabela geral da sala; b)- suposição de que as cinco caixas representam uma população
grande e que cada caixa representa uma subpopulação desta população. Em seguida: 1.- calcular a frequência
gênica desta população grande; 2.- calcular a frequência genotípica esperada para a geração 1 desta população
grande; 3.- aplicar teste de X2 para verificar se os valores obtidos estão de acordo com o esperado nesta população
grande. Comentário: embora a frequência genotípica esperada para esta população grande seja AA=025; Aa=0,50;
aa=0,25 (p=05; q=05), a soma dos esperados das cinco caixas é significativamente diferente destes valores, ou seja,
0,3056, 0,3888, 0,3056 respectivamente, com excesso de homozigotos, conforme previsto pelo efeito Wahlund.
Apoio financeiro: CNPQ
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Hibridação entre as variedades de Casearia sylvestris
Sw. (Flacourtiaceae / Salicaceae): evidências a partir
do gene matK
Cavallari, MM1; Monteiro, M1; Pavanelli, JC1; Abreu, AG1, Pinheiro, JB2; Zucchi, MI1
Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, Pólo Centro Sul
Laboratório de Diversidade Genética e Melhoramento, Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luis de Queiroz”,
Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Casearia sylvestris, hibridação, DNA cloroplastidial, matK, genética de populações.
Casearia sylvestris Sw. (Flacourtiaceae / Salicaceae), popularmente conhecida como guaçatonga, é uma espécie
arbórea de ampla distribuição no Cerrado e Mata Atlântica. As propriedades farmacológicas desta espécie têm
despertado o interesse de diversos grupos de pesquisa, tanto no Brasil como no exterior. São reconhecidas
duas variedades botânicas, C. sylvestris var. lingua e C. sylvestris var. sylvestris, sendo bastante problemática
sua distinção. Uma pesquisa recente com marcadores microssatélites nucleares sugeriu que as variedades
de C. sylvestris comportam-se como unidades evolutivas distintas que trocam informações genéticas apenas
em zonas de contato, onde são encontrados indivíduos de morfologia intermediária (possíveis híbridos).
Para melhor esclarecer as relações entre estes dois taxons, sequenciou-se o gene matK do DNA cloroplastidial
de 94 indivíduos de três populações onde ocorrem as duas variedades e possíveis híbridos (zonas de contato),
além de amostras de quatro populações onde ocorre apenas uma ou outra variedade. Para a amplificação
do gene alvo foram desenhados dois pares de primers com base nas seqüências do gene matK de C. javitensis
e C. nítida disponíveis no GenBank. Obteve-se a seqüência completa de 697 pares de base do gene matK de
indivíduos pertencentes às duas variedades e seus híbridos. Para o alinhamento das seqüências foi usado o
programa BioEdit7.0. Os dados foram analisados através dos programas Arlequin 2.0, PHYML, TNT e Network
4.1.1.1. Observou-se que existe uma tendência geral de agrupamento dos híbridos com a var. lingua, e que os
indivíduos da var. sylvestris estavam nos grupos mais externos do dendrograma. A análise conjunta de dados
obtidos em estudo anterior com marcadores microssatélites nucleares, e dos dados aqui obtidos, sugere que os
indivíduos de morfologia intermediária são híbridos das duas variedades de C. sylvestris e que a variedade lingua
é o principal genitor feminino dos mesmos, pois estes apresentam o genoma cloroplastidial daquela variedade.
Apoio finaceiro: FAPESP
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Estrutura genética de jacarandá-da-bahia (Dalbergia
nigra - Fabaceae) por meio de marcadores SSR
Barreto, MA; Santana, MB; Menezes, IPP; Silva-Miller, JG; Gaiotto, FA; Corrêa, RX
Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Biotecnologia e Genética, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: Dalbergia nigra, Marcadores Microssatélites, Bayesiana, Conservação.
Introdução: Jacarandá-da-bahia (Dalbergia nigra (Vell.) Allem. ex. Benth.) é uma leguminosa típica da Mata
Atlântica, de elevado valor econômico para indústria, motivo pelo qual foi explorada para produção de madeira
e tornou-se uma espécie ameaçada de extinção na categoria vunerável. Objetivou-se nesse trabalho analisar a
diversidade genética dessa espécie visando subsidiar a elaboração de estratégias que permitam a sua conservação,
o uso racional e discutir efeitos da fragmentação de habitats na estruturação genética. Método: Duas populações
com 35 indivíduos adultos provenientes dos municípios de Barro Preto (BA) e Arataca (BA) foram genotipadas
com sete primers microssatélites recentemente desenvolvidos para a espécie. A reação em cadeia da polimerase
(PCR) foi realizada empregando-se três iniciadores por reação PCR: iniciador forward específico com cauda
M13(-16) na extremidade 5’, iniciador específico reverse e iniciador M13(-16) marcado com fluorescência 6-FAM,
HEX ou TET. A genotipagem foi realizada com auxílio do sequenciador automático de DNA ABI 377/ Applied
Biosystems. Os parâmetros de diversidade genética foram estimados com uso do programa GDA, FSTAT,
STRUCTURE e MEGA4. Resultados: Os sete locos revelaram altos níveis de polimorfismos, com número médio
de alelos por loco Â=13. Os valores médios do índice de fixação de alelos estimados para os sete locos analisados
foram significativamente positivos e diferentes de zero, indicando excesso de homozigotos, o que revela um efeito
de endogamia nas populações analisadas. A estimativa média do parâmetro genético de diversidade genética,
He=0,70, foi maior quando comparado com a heterozigozidade observada, Ho=0,54. As estimativas da aderência
ao equilíbrio de Hardy-Weinberg mostram que as populações não se encontram em equilíbrio em seu habitat
natural. Elevados valores para a endogamia intrapopulacional foram observados neste estudo FIS=0,23, sendo que
os níveis de subdivisão interpopulacional (FST=0,22, RST=0,40 e GST´=0,72) foram também expressivos, contribuindo
para a endogamia total da espécie (FIT=0,39). O fluxo genético histórico obtido a partir do RST foi baixo, Nm=0,38.
Esses resultados são semelhantes aos detectados em outras espécies tropicais: pau-brasil, andiroba e Oryza
glaumaepatula. A análise Bayesiana revelou que todos os indivíduos tiveram probabilidade a posteriori de
atribuição máxima nas respectivas populações com base no pool genético, resultado que foi confirmado pela
estatística ΔK. O dendrograma gerado pelo método Neighbor joining a partir da diferença dos pares de genótipos
com base na proporção de alelos comuns revelou que existem duas populações, confirmando os dados bayesianos.
Os dados obtidos revelam a grande importância dos fragmentos florestais na manutenção da diversidade genética
do jacarandá-da-bahia e apontam para a necessidade de sua preservação. Conclusão: A diversidade genética do
jacarandá-da-bahia está seriamente ameaçada devido à fragmentação e, ou ao uso indiscriminado da espécie.
Apoio financeiro: FAPESB
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Consequências genéticas da fragmentação do cerrado
em Tabebuia aurea
Silva, MC1,2; Tarazi, R3; Moreno, MA1; Ferraz, EM1;Ibañes, B1,2; Kageyama, PY1
Laboratório de Reprodução e Genética de Espécies Arbóreas (LARGEA), Departamento de Ciências Florestais, ESALQ, USP, São Paulo, Brasil
Pós-graduanda em Recursos Florestais, ESALQ, USP; 3Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, Bahia, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tabebuia aurea; SSR; diversidade genética; tamanho efetivo; Cerrado.
O desmatamento e o avanço das fronteiras agrícolas têm alterado a dinâmica populacional de muitas espécies
do Cerrado, tornando imprescindível a geração de informações sobrea variabilidade genética para a manutenção
do potencial evolutivo das espécies deste bioma. O objetivo deste estudo foi analisar as conseqüências genéticas
geradas pela fragmentação de hábitatnuma população isolada deTabebuia. aureano Cerrado de Assis, SP, utilizandose oito locos microssatélites(SSR). T. aurea (Bignoniaceae) é uma árvore nativacom ampla distribuiçãono Cerrado,
cujo número de indivíduos e populações foi reduzido pela ação antrópica. Para conhecer o estado de conservação
da espécie foram mapeadas, numeradas e genotipadas todas as 90 árvores em uma área de 1838 ha. Além da
baixa densidade da espécie (0,05 indivíduo por hectare), os indivíduos apresentaram uma alta agregação espacial,
subdivididos em três reboleiras distantes em média 7,2 km entre si. Para verificar se as reboleiras foram originadas
através de propagação vegetativa foi utilizado o programa GENCLONE 2.0. Para verificar uma dispersão restrita de
sementes foi utilizado o programa SPAGEDI, que analisa a estrutura genética espacial. Para detecção de um gargalo
genético devido à ação antrópica foi utilizado o programa BOTTLENECK. Outras análises descritivas referentes
à diversidade genética foram realizadas com o programa FSTAT. Também calculou-se o tamanho efetivo (Ne) e a
área mínima viável para conservação (AMV). No presente estudo não foram encontrados clones, indicando que a
agregação de indivíduos foi resultado de uma dispersão restrita de sementes, já que foi evidenciada uma estrutura
genética espacial de até 75 m. A população também apresentougargalos genéticos devido à fragmentação. Apesar
dos efeitos gerados pela fragmentação, foram encontrados altos valores para o número de alelos por loco( Â )
e de diversidade genética ( Ĥ e ), 18,4 e 0,877, respectivamente. Contudo, a heterozigosidade observada( Ĥ o
ˆ
) foi moderada(0,635) conduzindo para um alto e significativo índice de fixação ( f i = 0,277). O alto índice de
fixação e o moderado grau de parentesco encontrado até 75 m resultaram num baixo tamanho efetivo (Ne = 21).
Esse valor é muito menor do que o esperado (Ne = 50) para a manutenção da endogamia a curto prazo. Além
disso, a AMV foi de 50 ha, área muito maior do que a encontrada para os 90 indivíduos, pois apenas 6,4 ha de
1838 ha apresentavam cerrado. O restante da área era utilizado para o cultivo de cana-de-açúcar. O aumento da
sobrevivência de T. aurea em fragmentospoderá ser alcançado com a implementação de corredores ecológicos
através da criação de novas unidades de conservação, além do aumento do tamanho dos fragmentos através
da diminuição das interferências antrópicas no seu entorno, contribuindo assim para sua regeneração natural.
Apoio financeiro: FAPESP
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Nas asas da evolução: fluxo gênico contemporâneo de
Hymenaea stigonocarpa (Fabaceae – Caesalpinioideae)
Moreno, MA1; Tarazi, R2; Gandara, FB1; Ibañes, B1; Defavari, GR3; Silva, MC1; Ferraz, EM1; Kageyama, PY1
Laboratório de Reprodução e Genética de Espécies Arbóreas (LARGEA), Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz da Universidade
de São Paulo (ESALQ/USP)
2
Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC)
3
Universidade Federal da Paraíba
[email protected]
1
Palavras-chave: jatoba-do-cerrado; SSR; fluxo gênico; cerrado; conservação.
Hymenaea stigonocarpa, popularmente conhecida como Jatobá-do-cerrado, é uma árvore que ocupa formações
abertas do Cerrado. H. stigonocarpa tem grande potencial econômico, podendo ser utilizada em diversos fins:
madeireiro, medicinal, alimentício, paisagístico e empregado em recuperação de áreas degradadas. H. stigonocarpa
apresenta flores hermafroditas e sua polinização é realizada por morcegos. Com o objetivo de conhecer a distância
que percorre o pólen e subsidiar estratégias de conservação genética em H. stigonocarpa, foram utilizados oito
pares de iniciadores microssatélites. A população estudada localiza-se na Estação Ecológica de Itirapina (EEI), no
domínio do Cerrado no Estado de São Paulo. Dentro da EEI foi realizado um censo em 680 ha, onde foram mapeados,
marcados e genotipados 68 indivíduos adultos e 71 sementes coletadas diretamente das árvores que frutificaram.
Inferências sobre o fluxo gênico contemporâneo na população da EEI foram realizadas através da análise do genitor
mais provável, utilizando o método de alocação categórica através do programa CERVUS 3.0. Para determinar os
possíveis genitores, todas as árvores foram utilizados como candidatos. A paternidade foi determinada utilizando a
estatística Δ. Para encontrar o valor crítico de Δ para cada intervalo de confiança na análise de paternidade, foram
realizadas simulações utilizando o programa CERVUS 3.0. Para estas simulações foram utilizadas 100.000 repetições,
com uma proporção de 0,01 de erro de genotipagem por loco, um intervalo de confiança restrito de 99%. Das 71
sementes coletadas diretamente das matrizes e analisadas, 41 (57,54%) tiveram doadores de pólen presentes na área
amostrada e 6 (8,50%) foram geradas por autofecundação. A distância média de polinização foi de 2325 m variando
de 0,35 m a 3570 m. A área efetiva de polinização (AEP) foi de 1283 ha. A distância de polinização é compatível com
a área de forrageamento dos morcegos polinizadores de H. stigonocarpa. Para a manutenção do potencial evolutivo
de H. stigonocarpa e de seus polinizadores há necessidade de se conservar no mínimo uma área equivalente a AEP.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Estrutura genética espacial em duas espécies de
ipê de Floresta Estacional Semidecidual: Tabebuia
impetiginosa e Tabebuia serratifolia
Estolano, R12; Collevatti, RG2
1 Mestranda em Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Montes Claros, UNIMONTES-MG
2 Laboratorio de Genética e Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, CP 131. Goiânia, Goiás.
Brasil. 4001-970
[email protected], [email protected]
Palavras-chave: Cerrado, Bignoniaceae, Floresta Estacional Semidecidual, conservação, microssatélites.
No Cerrado, a família Bignoniaceae é amplamente representada pelos gêneros Tabebuia, Tecoma e Jacaranda.
Embora o gênero Tabebuia, conhecido popularmente como ipê, possua ampla distribuição e alto valor econômico,
as espécies mais estudadas do gênero são as da floresta amazônica,sendo pouco ainda os estudos sobre genética
desse gênero nas Florestas Estacionais do Cerrado.Tabebuia impetiginosa e Tabebuia serratifolia são espécies
utilizadas de forma não sustentável e comercial em diversas áreas, como nas indústrias farmacêuticas e,
principalmente, madeireira. A fragmentação e destruição de habitats têm levado a diminuição das populações
e extinção local das mesmas. A estrutura genética espacial está diretamente relacionada a história de vida da
planta, e pode ser afetada tanto por processos ecológicos quanto por processos demográficos e genéticos. Este
trabalho visa o estudo da estrutura genética espacial de duas espécies de Tabebuia, com o objetivo de dar subsídioa
para sua conservação e manejo. No Parque Estadual Altamiro de Moura Pacheco-PEAMP, remanescente de
Floresta Estacional Semidecidual, sul de Goiás, foram mapeados e amostrados 31 indivíduos de T. impetiginosa
e de 63 indivíduos de T. serratifolia. Todos os indivíduos foram genotipados utilizando 6 locos microssatélites.
T. impetiginosa apresentou uma média de 11,3 alelos por loco com variação de 6 ( TAU 21) a 16 ( TAU 28)
alelos. Já T. serratifolia apresentou uma média de 4.3 alelos por loco variando de 2 ( TAU 21 e TAU 31) a 8 alelos
( TAU 15). T. impetiginosa apresentou maior diversidade genética (He = 0,804) que T. serratifolia (He = 0,475).
O coeficiente de endogamia (f) não foi significativo para nenhuma das duas espécies (p > 0,00833) e todos os
locos estão em equilíbrio de ligação (p > 0,003333). Ambas as espécies apresentaram autocorrelação espacial
significativa (b = -0,0387, p < 0,001). Entretanto, o parentesco diminui fortemente e foi significativo somente até
20 metros para T. impetiginosa e até 15 m de distância para T. serratifolia. Assim, a estrutura genética espacial
é significativa, porém fraca (Sp = 0,062 para T. impetiginosa e 0,046 para T. serratifolia). A vizinhança genética,
estimada pela estrutura genética espacial, foi ligeiramente maior para T. serratifolia (Nb=23,61) que para T.
impetiginosa (Nb=16,34). Nossos resultados mostram que, apesar das espécies estudadas serem dispersas pelo
vento, esta dispersão está limitada a pequenas distâncias originando uma população cada vez mais aparentada.
Financiamento: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Análise de variabilidade genética em populações
naturais de Cereus hildmannianus por meio de DNA
cloroplastidial
Silva, GAR1; Moraes, EM2; Sene, FM1,3; Manfrin, MH1,3
Laboratório de Genética Evolutiva, Depto. de Genética, Programa de Pós-Graduação em Genética, FMRP-USP
Programa de Pós-Graduação em Diversidade Biológica e Conservação, UFSCar-Campus Sorocaba
3
Laboratório de Genética Evolutiva, Dpto. de Biologia, FFCLRP-USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Filogeografia, DNA cloroplastidial, Cereus hildmannianus, Variabilidade, População.
A vegetação xerófita na América do Sul está distribuída basicamente ao longo de uma diagonal seca entre as
florestas tropicais Amazônica e Atlântica. A fitogeografia de cactos sugere expansão e retração de Florestas
Tropicais Sazonalmente Secas (FTSS) para explicar as alterações históricas na região neotrópica. Desta forma,
estudos filogeográficos em espécies de Cactaceae, com base em variações de regiões intergênicas do DNA
cloroplastidial (cpDNA) pode auxiliar no entendimento da história evolutiva destas espécies e acrescentar
informações sobre a dinâmica destas áreas secas na América do Sul. Essas regiões de cpDNA têm sido utilizadas
em estudos filogeográficos para diversos grupos de angiospermas. Primers universais foram descritos na literatura
e a amplificação de sequências de cpDNA mostraram regiões intergênicas adequadas para prover informações
inter e intrapopulacionais. Neste trabalho, nosso objetivo foi avaliar a variação genética e estrutura populacional
por meio de sequências de cpDNA de Cereus hildmannianus, uma Cactaceae que ocorre no núcleo de Missiones
e nos sistemas dos rios da bacia do Paraná-Paraguai. A escolha das sequências foi feita de acordo com o
número de PICs (Caracteres Potencialmente Informativos) e a taxa de evolução de cada região não codificante
de cpDNA, sendo elas: trnS-trnG-trn-G, trnL-trnT, trnHGUG-psbA, trnL-trnL-trnF, psbJ-petA, atpI-atpH, ndhF-rpl32,
rpl32-trnL e 3’rps16-5’trnK. Espécimes amostradas neste estudo foram coletadas nas cidades de Itatiba-SP,
Cianorte-PR, Penha-SC, Florianópolis-SC, Laguna-SC, Viamão-RS, Mostardas-RS, Caçapava do Sul-RS, JaguariRS e Santiago-RS. A extração de DNA foi realizada a partir de tecidos da raiz utilizando Dneasy Plant Mini Kit
(Qiagen) e as sequências não codificantes de cpDNA foram isoladas para amplificação por meio da técnica de
reação em cadeia da polimerase (PCR). As reações de sequenciamento foram realizadas em um volume de 30
µL contendo 1 µL de DNA genômico (5–80ng), tampão de reação 1X, 200 µmol/L de cada dNTP, 0,1 µmol/L de
cada primer, 1U de Taq DNA polimerase e 2 mmol/L de MgCl2. As condições da reação foram denaturação inicial
de 80ºC a 5’, 40 ciclos de 95ºC a 1’, 62ºC a 1’, 65ºC a 5’ com extensão final de 65ºC a 1’, alterado conforme os
pares de primers utilizados. Os produtos da PCR foram purificados com ExoSap e as reações de sequenciamento
seguiram as mesmas condições da PCR, sendo o produto de ambas as fitas utilizados na formação de contigs,
analisados com auxílio do programa “Chromas Lite 2.0” e para o alinhamento das sequências, o programa
“CLUSTAL W 1.8”. Entre as populações de C. hildmannianus estudadas, a análise das regiões intergênicas de
cpDNA sugere que as populações do interior dos estados de São Paulo, Paraná e Rio Grande do Sul apresentam
diferenças haplotípicas em relação às populações coletadas no litoral de Santa Catarina e Rio Grande do Sul.
Apoio financeiro: CAPES, Programa de Pós-Graduação em Genética-FMRP-USP.
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Estudo da diversidade genética de Byrsonima
cydoniifolia (Malpighiaceae) através da fAFLP
Bizão, N1; Murakami, DM2; Lemos, EG de M3; Pereira Jr, HA4
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso
Instituto de Ciências Exatas e da Terra, Universidade Federal de Mato Grosso
3
Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, Departamento de Tecnologia, Universidade Estadual Paulista.
4
Laboratório de Genética Molecular, Diagnósticos Moleculares, Ribeirão Preto
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Byrsonima cydoniifolia, similaridade, agrupamento, UPGMA, vizinho mais próximo.
No bioma cerrado, o murici Byrsonima cydoniifolia tem grande representatividade como alimento para a fauna
(aves, peixes e outros animais), além do homem que também a utiliza na medicina popular como cicatrizante,
anti-inflamatória, diurética e antidiarréica. Esta espécie é explorada de forma extrativista havendo pouquíssimas
informações na literatura sobre a mesma. A caracterização da diversidade genética do murici constitui importante
informação para sua domesticação, seleção e melhoramento genético. O objetivo deste trabalho foi avaliar,
através do marcador molecular fAFLP, a diversidade genética de uma amostra de 120 plantas provenientes de
quatro populações nativas de Byrsonima cydoniifolia provenientes da região do Médio Araguaia, existentes nas
proximidades do município de Barra do Garças – MT. Folhas saudáveis de trinta plantas de cada população
foram colhidas, acondicionadas em caixa de isopor com gelo e transportadas até o Laboratório de Bioquímica
de Microorganismos e de Plantas do Departamento de Tecnologia da UNESP, Campus de Jaboticabal. A extração
do DNA foi realizada conforme Ferreira & Grattapaglia (1996). As reações e procedimentos de fAFLP foram
executadas segundo Grilli et al. 2007. As imagens da eletroforese foram geradas no sequenciador automático ABI
Prisma 377-18 da marca Perkin Elmer sendo salvas como figuras e suas bandas lidas manualmente. Do total de 24
combinações de primers testados, quatro foram selecionados e utilizados, sendo três da JOE/verde – EcoRI/Mse
(ACG/CAC; AAG/CAA; ACG/CTC) e uma da FAM/azul – EcoRI/Mse (ACA/CAC) que produziram 140 bandas.
Medidas de dissimilaridades foram estimadas a partir do complemento da similaridade de Jaccard utilizando
o programa Genes (Cruz, 1997). Duas técnicas de agrupamento – vizinho mais próximo e UPGMA - foram
empregadas para se analisar a diversidade genética entre e dentro de populações. Na técnica de agrupamento
UPGMA, não houve formação de grupos distintos entre e dentro das populações. Na técnica de agrupamento
do vizinho mais próximo, houve a formação de oito grupos distintos em que, no grupo I, se encontravam 113
indivíduos provenientes de todas as quatro populações; nos outros sete grupos, cada grupo foi constituído por
apenas um único indivíduo proveniente de duas populações. Conclui-se que as populações nativas de murici da
espécie Byrsonima cydoniifolia possui grande variabilidade entre e dentro de populações de modo que qualquer
uma das populações pode ser utilizada para a obtenção de sementes para fins de sua seleção, domesticação
e melhoramento, sendo necessário grande número de indivíduos para representatividade da espécie.
Apoio: CNPq
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Análise da diversidade genética, entre e dentro, de
quatro populações nativas de murici (Byrsonima
cydoniifolia – Malpighiaceae) via RAPD
Murakami, DM1; BIZÃO, N2; LEMOS, EG de M3; Campanharo, JC3
Instituto de Ciências Exatas e da Terra, Universidade Federal de Mato Grosso
Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Mato Grosso
3
Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas, Departamento de Tecnologia, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Byrsonima cydoniifolia, similaridade, agrupamento, UPGMA, vizinho mais próximo.
O murici (Byrsonima cydoniifolia A. Juss) é árvore de pequeno porte do bioma cerrado que apresenta múltiplas
potencialidades na produção de alimentos, de lenha e na medicina popular. Sua exploração é basicamente
extrativista, praticamente inexistindo plantações comerciais. Pesquisas sobre sua domesticação e cultivo são
incipientes no Brasil; destaca-se, deste modo, a importância de se conhecer a diversidade genética desta espécie para
fins de sua conservação, domesticação e melhoramento. O objetivo deste trabalho foi avaliar, através do marcador
molecular RAPD, a diversidade genética, entre e dentro, de quatro populações nativas de murici da espécie Byrsonima
cydoniifolia provenientes da região do Médio Araguaia, existentes nas proximidades do município de Barra do Garças
– MT. Folhas saudáveis de trinta plantas de cada população foram colhidas, acondicionadas em caixa de isopor
com gelo e transportadas até o Laboratório de Bioquímica de Microorganismos e de Plantas do Departamento de
Tecnologia da UNESP, Campus de Jaboticabal. A extração do DNA foi realizada conforme Ferreira & Grattapaglia
(1996). As reações de RAPD foram executadas utilizando-se oito primers da Operon obtendo-se 65 bandas. Medidas
de dissimilaridades foram estimadas a partir do complemento da similaridade de Jaccard utilizando o programa
Genes (Cruz, 1997). Duas técnicas de agrupamento – vizinho mais próximo e UPGMA - foram empregadas para
se analisar a diversidade genética entre e dentro de populações. Nas duas técnicas, não houve formação de
grupos distintos entre as populações havendo indivíduos dispersos nos dendrogramas de modo aleatório. Esses
resultados permitem afirmar que qualquer uma das populações pode ser utilizada para a obtenção de sementes
para fins de sua seleção, domesticação e melhoramento. Conclui-se que as populações nativas de murici da espécie
Byrsonima cydoniifolia possui grande variabilidade entre e dentro das mesmas e, portanto, é importante que um
número significativo de indivíduos seja utilizado para início dos programas de domesticação e seleção da espécie.
Apoio: CNPq
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Diversidade genética em Ipomoea batatas no programa
de melhoramento genético vegetal para a produção de
álcool da UFT - TO
Martins, ECA1; Lima, ER1; Teles, AJM1; Santiago, LC1; Santos, RR1; Silveira, MA2; Oliveira-Junior, WP1
Laboratório de Biotecnologia - LABIOTEC, Universidade Federal do Tocantins
Laboratório de Sistemas de Produção de Energia a Partir de Fontes Renováveis - LASPER, Universidade Federal do Tocantins
[email protected]
1
2
Palavras-chave: batata-doce; energia renovável; RAPD; variabilidade genética; DNA vegetal.
A elevada demanda energética mundial faz necessária a busca por fontes renováveis e menos agressivas ao meio
ambiente. O etanol pode ser produzido de várias matérias-primas agrícolas, desde que contenham carboidratos
fermentescíveis (açúcares e amido). Como estratégia de segurança para a matriz energética, é necessário o uso de
outras matérias-primas para a produção de etanol. Culturas amiláceas, como a batata-doce, podem ser matériasprimas alternativas à cana-de-açúcar. Semelhante a outras raízes e tubérculos, a batata-doce contem alta umidade
resultando em um índice relativamente baixo de matéria seca (30%). Aproximadamente 80 a 90% dessa matéria
seca (24 a 27% do peso úmido) é composta de carboidrato, o qual é constituído principalmente de amido. O teor de
amido é o fator mais significativo por proporcionar maior potencial para uso como substrato para fermentação. A
elevada variabilidade genética existente na cultura, associada à falta de estudos e pesquisadores envolvidos, acaba
por reforçar a necessidade de uma melhor exploração de processo mais criterioso para seleção de acessos com
elevado teor de amido de forma a ser utilizado no processo de obtenção de etanol. Dessa forma, o conhecimento da
divergência genética constitui uma tarefa de grande importância para a cultura da batata-doce, por evitar o plantio
de formas genômicas semelhantes e o conseqüente estreitamento genético da espécie. O melhor conhecimento e a
maximização dos ganhos genéticos têm sido objetivos dos melhoristas de plantas do mundo todo e novas maneiras
de conseguir isso constituem a principal busca dos mesmos. Assim, surge o interesse nas tecnologias moleculares
como a de marcadores de DNA. Este estudo envolveu 50 acessos de batata-doce do Banco de Germoplasma novos
clones da UFT e teve por objetivo caracterizar a divergência genética buscando identificar um perfil via marcadores
moleculares, associado a um maior teor de amido. O emprego de 15 primers arbitrários na amplificação RAPDPCR permitiu avaliar a eficiência dos protocolos na extração do DNA genômico total, o padrão de bandas de DNA
gerado e o cálculo do índice de similaridade. Foi construído um dendograma UPGMA baseado no coeficiente de
similaridade de Jaccard. Na análise dos fragmentos amplificados foram revelados 181 fragmentos, com tamanhos
entre 150 a 3000pb. Os resultados moleculares mostraram uma divergência média de 67,58%. Os marcadores
moleculares RAPD mostraram-se eficientes na detecção do polimorfismo de DNA, tornado-se possível seu emprego
em estudos posteriores no germoplasma de batata-doce e para alocar os genótipos em grupos heteróticos distintos.
Apoio financeiro: CAPES e UFT
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Evidências de estruturação genética em populações
de Cyperus odoratus L. e C. ligularis L. (Cyperaceae),
para fins de conservação de recursos naturais em
fragmentos urbanos da Floresta Atlântica, Recife-PE
Cruz, GAS1; Pinangé, DSB1; Oliveira, RCG1; Alves, MV2; Torres, RA3; Benko-Iseppon, AM1
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Genética, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50732-970, Recife – PE
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Botânica, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50732-970, Recife – PE
3
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB, Zoologia, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50732-970, Recife- PE
E-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chave: Bioindicadores, DAF, Marcador Molecular, Gst/Nm, Efeito fundador.
Um importante aspecto contemporâneo é a preocupação com a situação ambiental, aspecto fundamental para
a qualidade de vida das pessoas, especialmente considerando que a presença de coberturas vegetais urbanas
e periurbanas impedem a formação de ilhas de calor, favorecendo o bem estar da população. Neste contexto,
a família Cyperaceae apresenta grande valor por incluir espécies pioneiras, importantes mantenedores e
regeneradores do entorno destas coberturas florestais. O presente estudo visou analisar a diversidade genética
e o fluxo gênico entre populações de Cyperus ligularis (4) e C. odoratus (1) coletadas em uma Reserva de Floresta
Atlântica em Recife (totalizando 40 indivíduos) através do marcador DAF (DNA Amplification Fingerprinting).
Foram observadas 172 bandas polimórficas a partir das quais foi obtido um fenograma pelo método de Neighbor
Joining, sendo calculados valores estatísticos de diversidade genética (Gst) e fluxo gênico (Nm). Apesar das espécies
analisadas apresentarem características biológicas próximas e serem simpátricas, o fenograma demonstrou clara
separação genética entre as espécies revelando diversidade genética significativa (Gst=0,3632) entre as mesmas,
com baixo fluxo gênico médio (Nm=0,8766). Embora todos os indivíduos de C. odoratus tenham sido coletados
em quadrantes próximos e apenas em uma única área de preservação ambiental (Reserva de Dois Irmãos, Recife,
PE), observou-se maior diversidade genética entre estes quando comparados aos indivíduos de C. ligularis, que
por sua vez, ocorreram em terrenos baldios e áreas degradadas, apresentando baixos índices de diversidade
genética, agrupando-se aleatoriamente no fenograma, independente da população de origem, sugerindo a
formação de uma metapopulação. Adicionalmente, os espécimes de C. ligularis geralmente apresentam maior
índice de reprodução vegetativa em relação a C. odoratus podendo esta característica ter contribuído mais
significativamente para os índices de diversidade genética observada. A menor diversidade genética em C.
ligularis sugere a influência de efeito fundador na capacidade de ocupar várias áreas urbanas, limitada a uma
combinação específica de fatores genéticos, a despeito da diversidade de locais e áreas amostrados. A associação
destes dados com observações de campo e de biologia reprodutiva devem enriquecer o entendimento da
dinâmica das populações analisadas bem como do papel destas plantas nos processos sucessionais e na formação
do complexo ecológico da Floresta Atlântica. Desta forma, estes resultados podem contribuir para um melhor
direcionamento de medidas conservacionistas dos recursos naturais existentes nessa conformação vegetacional.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES
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Caracterização molecular e variabilidade genética de
cultivares brasileiras de trigo, obtidas por marcadores
microssatélites
Silva, AL1; Vieira, ESN2; Schuster, I2
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia Aplicada a Agricultura, Universidade Paranaense (UNIPAR)
Núcleo de Biotecnologia, Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola (Coodetec)
[email protected]
1
2
Palavras-chave:,Triticum aestivum, proteção de cultivares, diversidade genética, análise de agrupamento, genealogia.
A caracterização de cultivares de várias espécies, incluindo o trigo, com base em descritores morfológicos, tem
se tornado cada vez mais difícil em função do grande número de cultivares já descritas. Embora o Brasil não
ocupe posição de destaque na produção mundial de trigo, a cultura é uma das mais importantes na região Sul do
país. Conhecer a variabilidade genética existente entre as variedades brasileiras de trigo é de grande importância
para os programas de melhoramento. Este trabalho teve como objetivos realizar a caracterização molecular de
cultivares de trigo, utilizando marcadores microssatélites detectados em sequenciador automático. Foi utilizado
um grupo de 32 cultivares brasileiras de trigo. Vinte e três marcadores microssatélite (SSR) marcados com diferentes
fluorescências (6-FAM, PET, VIC e NED) foram utilizados. A amplificação dos locos SSR ocorreu em singleplex
e a eletroforese capilar em multiplex, em sequenciador automático ABI3130xl. A genotipagem das cultivares foi
realizada com o auxílio do programa Gene Mapper versão 4.0. Vinte e um marcadores foram polimórficos, e
revelaram de 2 a 8 alelos por loco, com média de 4,29. Os valores de PIC variaram de 0,219 (Xgwm165) a 0,842
(Xgwm44), com média de 0,593. Todas as cultivares puderam ser caracterizadas com probabilidade de exclusão
da identidade ao acaso mínima de 99,9999%, utilizando-se de seis a 11 marcadores por cultivar. Um conjunto de
15 marcadores foi selecionado para caracterizar todo o grupo de 32 cultivares com 99,9999% de probabilidade de
exclusão da identidade ao acaso. A análise de agrupamento foi consistente com os dados da genealogia para a maior
parte das cultivares. Os resultados obtidos demonstraram a eficiência dos locos SSR em caracterizar cultivares de
trigo e conseqüente conhecimento do perfil genético para fins de registro e proteção de cultivares baseado na
informatividade dos marcadores microssatélites, além da avaliação da diversidade genética entre cultivares de trigo.
Apoio financeiro: Coodetec
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Amplificação de iniciadores microssatélites
cloroplastidiais universais em Croton floribundus
Spreng. (Euphorbiaceae) para a obtenção da proporção
de fluxo de pólen e semente em uma espécie pioneira
Cordasso, V1; Silvestrini, M2; Zucchi, MI1; Santos, FAM2
Centro Regional Pólo Sul, Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios –APTA
Departamento de Biologia Vegetal - Instituto de Biologia, Universidade Estadual de campinas - UNICAMP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNA cloroplastidial, florestas tropicais, estrutura genética, microssatélites.
A espécie arbórea Croton floribundus é considerada pioneira, autocórica e polinizada por moscas e vento. A
avaliação do fluxo gênico entre populações, mais especificamente da proporção de fluxo de pólen e semente, pode
tornar mais claros os fatores que determinam os padrões de diversidade e estrutura genética nesta espécie. Tais
informações são essenciais para o delineamento de estratégias de conservação de C. floribundus, bem como para
avanços nos estudos de genética populacional de espécies arbóreas tropicais. O fluxo gênico pode ser estimado
indiretamente por meio de marcadores moleculares. Comparando-se os diferentes padrões de marcadores
nucleares e cloroplastidiais, há a possibilidade de estimar a proporção do fluxo de pólen e semente. Neste sentido,
o presente trabalho teve como objetivo testar e otimizar a amplificação de dez iniciadores microssatélites
cloroplastidiais (cpSSR) considerados universais em C. floribundus. Para isso, o DNA total foi extraído de folhas
jovens, utilizando-se CTAB como detergente. Variações na adstringência da reação de PCR foram testadas,
utilizando-se gradientes de temperatura entre 60°C e 50°C, concentrações de MgCl2 de 2,0 mmol.L-1, 1,5 mmol.L-1 e
1,0 mmol.L-1; e quantidades de DNA total de 20 ηg e 40 ηg. Os produtos de PCR foram analisados em eletroforese
de gel de agarose 2% e posteriormente em géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata. As condições
ótimas de amplificação dos locos cpSSR em C. floribundus foram as seguintes: 40ηg de DNA total, 1x tampão,
0,1mM dNTP, 2mM MgCl2, 10ρmol de cada iniciador, 1 unidade de Taq DNA polimerase para um volume final
de 25µL. O programa de amplificação foi constituído por um ciclo inicial de 5 minutos de desnaturação (95ºC);
seguido por 30 ciclos de 1 minuto de desnaturação (95ºC), 1 minuto de anelamento na temperatura específica
de cada iniciador e 1 minuto de extensão (72ºC); e um ciclo final de 10 minutos de extensão (72ºC). Os pares de
iniciadores ccmp01, ccmp08 e ccmp09 não amplificaram em C. floribundus. O par de iniciador ccmp06 apresentou
amplificações inespecíficas sob todas as condições de PCR testadas. Os locos ccmp02, ccmp03, ccmp04, ccmp05,
ccmp07 e ccmp10 amplificaram fragmentos de tamanhos esperados em temperaturas de anelamento que
variaram de 55oC a 58oC. Dos dez iniciadores cpSSR avaliados, seis mostraram amplificação adequada e podem
ser utilizados na determinação da razão de fluxo pólen e semente em populações naturais de C. floribundus.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Conectividade genética e diversidade populacional
em Chamaesyce hirta L. e C. thymifolia Millsp.
(Euphorbiaceae) ocorrentes em fragmentos urbanos de
Recife (Brasil) através de Fingerprinting de DNA
Pinangé, DSB1; Cruz, GAS1; Santana, KCB1; Torres, RA2; Araújo, MF3; Alves, MV3; Benko-Iseppon, AM1
Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, CCB
1
Depto. de Genética, Av. Prof. Moraes Rego, 1235, CEP 50.670-420, Recife – PE
2
Depto. de Zoologia, Recife – PE (Brasil)
[email protected]
Palavras-chave: Floresta Atlântica, Gst, Nm, DAF, bioindicadoras, polimorfismos.
A Floresta Atlântica nordestina constitui-se em um cenário de extinção local e global de espécies, especialmente
quando considerada a riqueza em endemismos regionais e seu estado progressivo de fragmentação. Muitos desses
fragmentos estão localizados em centros urbanos, com consideráveis níveis de antropização. O gênero Chamaesyce
Gray. (Euphorbiaceae) destaca-se pela presença de espécies-chave nos processos iniciais de regeneração da mata,
especialmente na recuperação de solos, apresentando membros com grande plasticidade adaptativa a diferentes
ambientes, inclusive aqueles com níveis de antropização significativos. Analisaram-se populações urbanas e periurbanas de duas espécies herbáceas (Chamaesyce hirta e C. thymifolia) no entorno de fragmentos de Mata em Recife.
Para isso foi utilizada a metodologia de DAF, aplicando-se 10 primers em 30 indivíduos (15 por espécie), distribuídos
em duas populações do entorno da Reserva de Dois Irmãos. A análise dos polimorfismos gerados incluiu a geração
de um fenograma (método Neighbor-Joining com Bootstrap de 1.000 replicações), bem como cálculo de Gst. A matriz
revelou 258 loci polimórficos. Em C. hirta, o Gst foi de 0.1815 e Nm igual a 2.2547, diferindo dos valores encontrados para
C. thymifolia, que apresentou 183 loci polimórficos e valores respectivos de Gst e Nm de 0.2977 e 1.1777. O fenograma
gerado apresentou dois grupos principais, sendo os indivíduos separados coerentemente em níveis específicos,
porém com diferenças populacionais para C. hirta. Nesta última espécie, observou-se uma maior ramificação no
fenograma e consequente não estruturação das populações, confirmando dados populacionais obtidos. Os valores
de diversidade e fluxo gênico obtidos em Chamaesyce, quando comparados com os padrões (Gst ≥ 0,25 e Nm ≥
1), denotaram diferenças no modelo de conexão das populações nas duas espécies, com níveis de estruturação
distintos. A metodologia de DAF mostrou-se eficiente para a análise de diversidade e estrutura populacional de
espécies naturais, acentuando-se o uso desse marcador na geração de dados genéticos para fins de conservação.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Variabilidade genética molecular entre e dentro
de famílias de polinização aberta de Stylosanthes
guianensis
Ferreira, RCU¹; Simeão, RM²; Chiari, L1; Leguizamon, GOC1
Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Embrapa Gado de Corte
Área de Melhoramento Genético Vegetal, Embrapa Gado de Corte
[email protected]
1
2
Palavras-chave: agrupamento, genética vegetal, leguminosa forrageira, melhoramento, RAPD.
Nas três últimas décadas constatou-se um incremento significativo na área de pastagens cultivadas no Brasil,
estimada em 135 milhões de hectares. Entretanto, estima-se que cerca de 80% dessas áreas de pastagens nos
cerrados apresentam algum grau de degradação, causada pelo baixo nível de nitrogênio nos solos da região,
entre outros fatores. A utilização da leguminosa forrageira Stylosanthes guianensis atende a demanda de espécies
adaptadas às condições de solos de baixa fertilidade e com estação seca bem definida nos cerrados e é indicada
como a alternativa menos onerosa no processo de reposição de nitrogênio do solo, auxiliando no processo de
recuperação das pastagens. Além disso, promove ganhos significativos de peso em animais em cultivo consorciado
com gramíneas. O programa de melhoramento da espécie baseia-se na avaliação e seleção de populações, famílias e
indivíduos e depende, para seu sucesso, do conhecimento da distribuição da variabilidade genética disponível nesses
três níveis. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi analisar a variabilidade genética dentro e entre famílias de
S. guianensis por meio de marcadores RAPD. Para tanto, extraiu-se o DNA de 38 indivíduos de 10 famílias, sendo
que 8 delas com 4 plantas e 2 com 3 plantas. O DNA foi quantificado em gel de agarose 0,8% corado com brometo
de etídio. As amplificações foram realizadas em termociclador PTC 100 (MJ Research) utilizando-se nove primers,
AN10, BA01, BA03, D03, G02, G03, G07, G17 e J16. Os resultados foram visualizados em luz UV, fotodocumentados
em sistema digital e analisados como variáveis binárias, ou seja, valor “0” para ausência da banda e “1” para sua
presença. Foram amplificados 86 marcadores com os 9 primers utilizados. Utilizando-se o Programa Genes na
análise dos dados obteve-se uma matriz de dissimilaridade genética por meio do coeficiente de Distância Binária
de Sokal. Os indivíduos foram agrupados pelos métodos UPGMA e de otimização de Tocher. A dissimilaridade
entre os indivíduos variou de 0 (Família 26 planta 4 e Família 40 planta 2) a 0,761 (Família 4 planta 3 e Família
51 planta 2), com média de 0,472. Na composição dos grupos apenas as progênies das famílias 7, 17 e 40 ficaram
alocadas em um mesmo agrupamento. As progênies das outras famílias foram alocadas em diferentes grupos. As
famílias 4 e 51 foram as mais similares (d=0,34) e as famílias 26 e 29 as menos similares (d=0,64). A variabilidade
genética entre esses indivíduos e famílias pode ser considerada alta, com base nos índices de dissimilaridade
obtidos, e está disponível para novos ciclos de seleção e obtenção de ganhos no melhoramento genético da espécie.
Apoio financeiro: CNPq, Fundect e Unipasto
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Filogeografia do Buriti (Mauritia flexuosa L.f,
Arecaceae): uma palmeira restrita a regiões alagáveis
no Brasil Central
Rabelo, SG1; de Lima, NE1; Collevatti, RG1
Laboratorio de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, CP 131. Goiânia, Goiás.
Brasil. 4001-970
[email protected]
1
Palavras-chave: Mauritia flexuosa L.f, Buriti, Brasil Central, Veredas, Filogeografia
Mauritia flexuosa L.f, (Arecaceae), conhecida popularmente como buriti, é uma palmeira amplamente distribuída que
ocorre em áreas alagadas denominadas veredas, na região do Cerrado no Brasil Central, e ainda na região Amazônica
cis-Andeana na Colombia e Venezuela, em regiões alagadas conhecidas como morichales, e no Peru, nos aguajales.
O registro fóssil mostra que as flutuações climáticas do Terciário/Quaternário afetaram a distribuição geográfica
do buriti e, potencialmente, o padrão filogeográfico. O buriti tem importante valor econômico para as populações
locais, na elaboração de alimentos e de artesanatos, além de ser fonte de alimento e de local para nidificação para
a fauna do Cerrado. A destruição do seu habitat devido à expansão da fronteira agrícola pode representar uma
importante ameaça à persitência a longo prazo das populações. O estudo da filogeografia e da estrutura genética
do buriti nas veredas do Brasil Central pode contribuir para o melhor entendimento da sua evolução e dos efeitos
da fragmentação e destruição de habitat na espécie e nas veredas, gerando subsídios para a conservação e manejo
da espécie. Neste trabalho apresentamos resultados da filogeografia do buriti, baseada no sequenciamento das
regiões intergênicas cloroplastidiais, trnD-trnT, psbA-trnH e ycf6-trnC. Como a distribuição de M. flexuosa é restrita
a regiões associadas a cursos d’água, nós testamos a hipótese que as principais Bacias Hidrográficas representam
quebras filogeográficas à distribuição das linhagens maternas. Foram amostrados um total de 208 indivíduos em 13
populações de M. flexuosa, distribuídos em todo o Brasil Central e nas Bacias Hidrográficas Amazônica, Araguaia/
Tocantins, Paraná e São Francisco. O sequenciamento da região trnT-trnD gerou fragmentos de 404pb, a região
psbA-trnH 379pb e a região ycf6-trnC, 267pb. Para os 60 indivíduos já sequenciados, foram encontrados 5 diferentes
haplótipos para as regiões trnT-trnD, 5 haplótipos para psbA-trnH e 2 haplótipos para ycf6-trnC. A diversidade
genética, considerando todos os individuos amostrados, foi alta para todas as 3 regiões sequenciadas (trnT-trnD,
h = 1,000; π = 0.0141 +/- 0.0095; psbA-trnH, h = 0.861, π = 0.0043 +/- 0.0031; ycf6-trnC, h = 0,222, π = 0.0033 +/0.0029). Embora alguns agrupamentos distintos por localidade tenham sido identificados na análise filogenética
(programa Network), a relação filogenética entre os haplótipos não suporta nossa hipótese que as principais bacias
formam quebras filogeográficas importantes para a distribuição das linhagens maternas. Além disso, não há sinal
de retração recente no tamanho das subpopulações seguido por expansão (Tajima D e Mismatch Distribution).
Apesar da alta diversidade genética indicada neste trabalho, as populações de M. flexuosa são restritas devido
à distribuição do habitat favorável, o que representa um risco a persistência em longo prazo das populações.
Apoio financeiro: FAPEG/CNPq (Pronex), CNPq, FAP-DF
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O uso do marcador cloroplástico rpl32-trnL para
estudos filogeográficos em Bromelia balansae Mez.
(Bromeliaceae)
Medeiros, LR1; Romero, GQ2; Carareto, CMA1
Laboratório de Evolução Molecular de Insetos – UNESP, São José do Rio Preto, SP
Departamento de Zoologia – UNICAMP, Campinas, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Filogeografia, Bromelia balansae, rpl32-trnL, marcador molecular.
A maioria dos estudos filogeográficos de plantas apresentam dificuldades em encontrar marcadores moleculares
cloropláticos apropriados. A escolha de uma região polimórfica pode nos levar a encontrar um marcador em
potencial para estes estudos. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a variabilidade genética do marcador
molecular cloroplástico rpl32-trnL (855pb) em populações de Bromelia balansae provenientes de diversas regiões
geográficas, visando a realização de análises filogeográficas futuras. Bromelia balansae é uma espécie que pode
ser considerada um bom modelo para estudos filogeográficos, pois tem ampla distribuição geográfica, ocupa
diversas regiões e diferentes tipos de vegetação. Suas flores são visitadas por beija-flores e suas sementes são
dispersas por aves e mamíferos, portanto, espera-se que o fluxo gênico entre as populações seja intenso. Foram
utilizadas de duas a 10 bromélias por população, de 25 populações, sendo cinco do estado de São Paulo, 10
do Mato Grosso do Sul, uma de Goiás, quatro do Mato Grosso, uma do Paraná, uma de Santa Catarina e uma
do Rio Grande do Sul (n = 151 indivíduos). Além do rpl32-trnL, também investigados os marcadores trn-H –
psb-A, trnQ-R – trnQ-F, trnT(UGU)-trnF (GAA) para algumas populações, no entanto, estes marcadores foram
fortemente conservados nessas populações. A diversidade da sequências do marcador rpl32-trnL foi avaliada
por meio da estimativa do número de haplótipos (h) e da diversidade haplotípica (Hd), do número médio de
diferenças nucleotídicas (K) e de índices de diversidade nucleotídica (π), usando o programa DNAsp. A distância
genética foi correlacionada com distância geográfica entre populações com teste de Mantel, usando o software
Arlequin. Redes de haplótipos foram construídas no software Fluxus network, usando o método median-joining
network. Entre as populações analisadas foram encontrados 14 sítios do marcador rpl32-trnL polimórficos,
sendo h=16, π = 0,00098, Hd= 0,629 e K= 0,827, havendo forte correlação entre distância genética e geográfica
(Mantel: r = 0,271; P = 0,005). A análise da rede de haplótipos mostra que as populações estão estruturadas
geograficamente, estando a maioria dos haplótipos do centro-oeste separados daqueles do sul e sudeste. Estes
resultados indicam que o marcador cloroplástico rpl32-trnL é favorável para estudos geográficos de B. balansae,
podendo ser eficiente para a compreensão da estrutura genética e evolução das populações desta espécie.
Apoio financeiro: CAPES E FAPESP
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Estudo da estruturação genética das espécies
de mangue, Laguncularia racemosa e Avicennia
schaueriana, através de marcadores dominantes ISSR
Campos, LCT1; Fernandes, RA1; Lira-Medeiros, CF1
Diretoria de Pesquisa Científica, Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, Brasil
1
Palavras-chave: diversidade genética, manguezal, ISSR, conservação, estruturação genética.
Os manguezais são considerados um dos ecossistemas mais complexos do ambiente marinho devido às suas
relações ecológicas e diversidade funcional. A sua conservação depende das forças evolutivas que agem sobre
as populações, e conseqüentemente de estudos genéticos nesta área. No Brasil existem três gêneros de plantas
exclusivas de mangue, Rhizophora, Laguncularia e Avicennia. A Laguncularia racemosa e a Avicennia schaueriana
foram selecionadas para este trabalho devido a sua ocorrência em todo litoral do estado do Rio de Janeiro. As
análises de diversidade genética foram obtidas através dos marcadores Inter Simple Sequence Repeat (ISSR).
Baseado nessas análises poderão ser definidas ações conservacionistas prioritárias de manutenção e conservação
mais eficientes para tais ecossistemas. Foram analisadas sete populações de A. schaueriana e seis de L. racemosa do
litoral fluminense. O DNA das plantas adultas foi extraído utilizando MATAB 2%, amplificado via PCR e analisado
em gel de Agarose 2% TAE. Até o momento, foram utilizados quatro primers para cada espécie: 813, 822, 840
e 841 para A. schaueriana; 834, 836, 841 e 842 para L. racemosa. Foram analisados 35 loci de 96 indivíduos de
A. schaueriana e 28 loci de 113 indivíduos de L. racemosa. Foram calculados pelo programa POPGENE: índices
de diversidade de Nei e Shannon, número de lócus polimórficos, índice de diversidade dentro das populações
(HS), índice de diversidade total (HT) e índice de diferenciação genética (GST). Para L. racemosa encontramos a
menor diversidade genética na população de Guaratiba (0.0762 e 0.1146, Nei e Shannon respectivamente) e a maior
na população de Paraíba do Sul (0.2131 e 0.3111, Nei e Shannon respectivamente). A diversidade total (HT) de L.
racemosa foi 0.2193, e a HS foi relativamente baixa: 0.1568. O GST foi 0.2852. Por outro lado, a espécie A. schaueriana
apresentou índices de diversidade genética mais altos do que a Laguncularia. O maior deles foi encontrado em
Rio das Ostras (0.4067 e 0.5836, Nei e Shannon respectivamente) e o menor deles em Guaratiba (0.2142 e 0.3097,
Nei e Shannon respectivamente). Os valores de HT e HS foram 0.4132 e 0.3305 enquanto o GST foi 0.2001. A baixa
diversidade da região de Guaratiba, para ambas as espécies, deve-se a sua posição geográfica que dificulta a entrada
e saída de propágulos, e a baixa capacidade destes se estabelecerem na região. As populações mais diversificadas
estão localizadas em meios mais conservados e abertos, como é observado nas populações de Paraíba do Sul.
Portanto, apesar de serem espécies adaptadas às mesmas condições e que possuem estratégias de dispersão
semelhantes, os seus índices de diversidade e diferenciação variam conforme a história evolutiva de cada espécie.
Apoio financeiro: FAPERJ, CNPq
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Estudo da diversidade genética entre espécies
de Brugmansia suaveolens através do uso de
marcadores RAPD
Neiverth, W1; Furlan, F2; Sereniski, RM3; Montanucci, CAR1; Romani, I4; Vendrusculo, ECG4
Programa de Pós-Graduação em Agronomia pela Universidade Estadual do Oeste do Paraná
Ciências Biológicas. Universidade Paranaense – Campus Toledo
3
Curso Superior em Tecnologia em Biotecnologia – Universidade Federal do Paraná – Campus Palotina
4
Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular – Universidade Federal do Paraná – Campus Palotina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Brugmansia suaveolens, Diversidade genética, RAPD, Alcalóides, Melhoramento genético.
Introdução: Brugmansia suaveolens é uma planta arbustiva, grande e ereta, pertencente à família Solanaceae
da tribo Datureae. Há indícios de que o centro de origem do gênero seja a Amazônia Andina, porém como não
existem registros em coletas na região, este grupo é considerado por muitos botânicos como uma planta de cultivo,
sendo assim uma espécie subespontânea em toda a América do Sul. Popularmente é conhecida como trombeteira
ou trombeta de anjo, podendo atingir de 1 a 3m de altura, tendo folhas grandes e alternas, com uma única flor
grande de corola branca (pode também apresentar cores amarela e salmão), tubular, pêndula ou inclinada. São
produtoras de alcalóides como a hiosciamina, escopolamina e atropina que atuam como compostos de defesa
principal, podendo ser encontrados como metabólitos secundários em vários outros gêneros desta família e
isolados a partir de suas folhas, sementes e raízes. São utilizadas na produção de fármacos na forma de antibióticos,
sedativo, anestésicos, anticolinérgicos, entre outros. Objetivo: Estudar a diversidade genética entre plantas de
Brugmansia suaveolens do município de Palotina, região oeste do Paraná, através da utilização de marcadores
moleculares RAPD. Metodologia: Primeiramente, coletaram-se folhas jovens de 20 plantas diferentes, seguido de
extração de DNA com base no protocolo estabelecido por Stein et al (2001). As amplificações foram feitas com
oligonucleotídeos decâmeros de sequência aleatória (primers) da Operon Technologies. As reações de PCR foram
realizadas em termociclador onde cada reação consistiu de um ciclo de 94°C por 5 minutos, 35°C por 1 minuto e
72°C por 2 minutos, seguindo-se 45 ciclos de 94°C por 30 segundos, 37°C por 45 segundos e 72°C por 1 minuto, e,
finalmente, uma extensão a 72°C por 5 minutos. Os produtos de amplificação foram separados por eletroforese
horizontal em gel de agarose 0,8%, contendo 3µL de brometo de etídeo e submerso em tampão SB 1X, sob corrente
elétrica constante de 90 volts por 01h40min. Após a eletroforese, as bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta
e fotodocumentadas. Resultados: A análise molecular nos permite preliminarmente dizer que existe variabilidade
entre os genótipos de Brugmansia suaveolens obtidos nas coletas no município de Palotina – PR. Esta variabilidade
é de extrema importância para pesquisas futuras que envolvam a utilização destes genótipos para o melhoramento
desta espécie, objetivando a obtenção de exemplares com elevada produção de alcalóides tropânicos e subsequente
para a elaboração de metodologias e produção destes alcalóides em grande escala, utilizando-se biofábricas.
Apoio financeiro: COODETEC e UFPR.
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Diversidade e variabilidade genética em Iridaceae no
sul do Brasil: aspectos citogenéticos
Kaltchuk-dos Santos, E1; Brisolara-Corrêa, L1,2; Moraes, AP1; Picolli, PB1; Marasini, A B1; Tacuatiá, LO1,2;
Eggers, L3; Chauveau, O4; Nadot, S4; Pustahija, F4; Siljak-Yakovlev, S4; Souza-Chies, TT2
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(UFRGS)
2
Laboratório de Sistemática Molecular, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, UFRGS
3
Laboratório de Angiospermas, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, UFRGS
4
Laboratoire d’Ecologie, Evolution et Systématique, Université Paris-Sud, Orsay, France
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, Conteúdo de DNA, Poliploidia, Taxonomia, Iridaceae.
Introdução: Iridaceae está entre as maiores famílias da ordem Asparagales e possui dois principais centros de
diversidade, um no sul do continente africano e o outro nas Américas do Sul e Central. Uma grande diversidade
morfológica tem sido evidenciada em Iridaceae gerando permanentes variações na classificação de seus grupos
internos. Um exemplo de instabilidade taxonômica é evidente nas espécies do gênero Sisyrinchium, e igualmente
em representantes da tribo Tigridieae. A poliploidia constitui um importante mecanismo evolutivo em Iridaceae,
sendo evidenciada pela grande variação no conteúdo de DNA (2C) ao nível infrafamiliar, com valores elevados
em Tigridieae, e ao contrário, modestos em Sisyrinchieae. Objetivo: Obter dados citogenéticos e genômicos
que auxiliem na caracterização dos táxons de Tigridieae e Sisyrinchieae, cujas espécies apresentam problemas
taxonômicos decorrentes da ampla variabilidade morfológica. Metodologia: Estudos meióticos - botões florais
foram fixados em 3:1 (etanol: ácido acético) cujas anteras foram esmagadas em carmim propiônico. Análises
mitóticas - pré-tratamento das raízes em 8HQ e fixação em 3:1, com coloração pelo método de Feulgen. Conteúdo
de DNA - mediante citometria de fluxo, utilizando-se folhas frescas. Resultados: No gênero Sisyrinchium, foram
investigados os complexos S. vaginatum, S. micranthum e S. palmifolium. Para S. palmifolium e S. vaginatum,
todos os indivíduos/populações analisados apresentaram número cromossômico diplóide (2n = 18). Contudo,
considerando que o valor 2C é bastante variável (2,07 a 6,43pg para S. palmifolium e 2,52 a 7,77pg para S. vaginatum)
em populações distintas destes táxons, é provável a ocorrência de poliploidia em ambos. Em S. micranthum há
uma série poliplóide com citótipos 2n = 16, 32 e 48, todos com meiose regular e valor 2C variando de 1,05 a 3pg.
Em Tigridieae, vários gêneros foram analisados quanto ao número cromossômico, sendo os números básicos x
= 7 e x = 9. Três espécies de Cypella foram analisadas, todas com 2n = 14. Em Herbertia foram encontradas duas
espécies diplóides com 2n = 14 e três poliplóides com 2n = 28, 42 e 56. Os gêneros monoespecíficos Kelissa e Onira
possuem invariavelmente 2n = 14, no entanto para Kelissa, o conteúdo de DNA é consideravelmente elevado. O
pequeno número cromossômico e alto conteúdo de DNA em Kelissa brasiliensis nos levam à investigação de maior
número de populações para a verificação de diferentes níveis de ploidia para esta espécie. As quatro espécies
de Calydorea analisadas apresentaram 2n = 14. Foram analisadas ainda Gelasine coerulea (2n=14), Neomarica
candida (2n=18) e Trimezia spathata (2n=28). Poucos estudos têm sido desenvolvidos com espécies de Iridaceae
da América do Sul. Das 20 espécies estudadas, 13 tiveram seu número cromossômico determinado pela primeira
vez, sendo estes dados relevantes para a compreensão da grande diversidade da família na região sul do Brasil.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e UFRGS
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Filogeografia e delimitação de taxa intra-específico de
Petunia axillaris (Solanaceae)
Turchetto, C1; Fagundes, NJR1; Lorenz-Lemke, AP2; Stehmann, JR3; Bonatto, SL4, Freitas, LB1
PPG Genética e Biologia Molecular, Dep. Genética, UFRGS
Dep. Biologia, UFMS; 3Dep. Botânica, UFMG; 4Lab. Biologia Genômica e Molecular, PUCRS
e-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chave: Filogeografia, Pampa, Petunia, especiação, cpDNA, Morfologia.
O Bioma Pampa é um dos seis grandes biomas brasileiros, estendendo-se também para a Argentina e o Uruguai.
Em termos geomorfológicos, é uma região complexa, pois inclui diversas unidades geradas em contextos
tectônicos e paleogeográficos distintos, sendo bem conhecida a continuidade geológica entre o Uruguai e RS.
A conservação dos campos tem sido negligenciada e ameaçada pelo aumento das áreas usadas na agricultura
e silvicultura. O gênero Petunia tem uma longa história de cruzamentos artificiais, sendo os híbridos de P.
axillaris e P. integrifolia mundialmente disseminados como plantas ornamentais conhecidas como petúnias-dejardim. Petunia axillaris possui ampla distribuição geográfica, ocorrendo em todo Bioma Pampa, geralmente em
afloramentos rochosos em beiras de estradas. Através de caracteres morfológicos da flor, a espécie é dividida em
três subespécies alopátricas: P. axillaris ssp. axillaris, P. axillaris ssp. parodii e P. axillaris ssp. subandina. O objetivo
deste trabalho foi caracterizar a variabilidade genética da espécie, comparando-a com uma análise da variação
morfológica e ecológica para um melhor entendimento das relações evolutivas entre as três subespécies, bem
como da distribuição geográfica das linhagens evolutivas. Foram realizadas análises moleculares, morfológicas
e ecológicas, através do sequenciamento dos espaçadores plastidiais trnS-trnG e trnH-psbA, da medida de
cinco caracteres florais e da utilização de dados climáticos. O trabalho foi realizado com populações naturais
abrangendo toda a área de distribuição da espécie. Os limites geográficos das subespécies são equivalentes entre
os critérios morfológicos e ecológicos; para as subespécies axillaris e parodii, os dados suportam os dois grupos,
já em relação às subespécies axillaris e subandina, esta separação é fraca, porque apesar de serem ecologicamente
distintas, essas populações não são morfologicamente distintas uma da outra. Os dados de cpDNA não suportam
os diferentes grupos, visto que as subespécies compartilham haplótipos, o que sugere divergência recente e
retenção de polimorfismo ancestral. Apesar da falta de resolução genealógica e de apresentar estruturação
geográfica pouco definida, os dados de cpDNA fornecem informações relevantes em relação à biogeografia da
espécie, a qual teria tomado uma vasta proporção geográfica durante os períodos frios e secos do Quaternário,
quando houve a expansão dos campos. Os padrões de variação em P. axillaris, principalmente em relação à
morfológica, são congruentes com a continuidade geológica entre RS e Uruguai. Mais estudos, com outras espécies,
serão relevantes para determinar se existe um padrão geográfico de distribuição das espécies nessa região.
Apoio Financeiro: CNPQ, PROTAX, FAPERGS, PROPESQ-UFRGS, PROSUL-CNPq
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Análise bayesiana de parâmetros genéticos para
sobrevivência e crescimento de eucalipto,
no semi-árido do Chile
Mora, F1; Cané-Retamales, C1; Vargas-Reeve, F1; Contreras-Soto, R1; Santos, AI1
Facultad de Ciencias Forestales, Universidad de Concepción, Victoria 631, Barrio Universitario, Concepción, Chile
[email protected]
1
Palavras-chave: Ambientes áridos, Algoritmo de Gibbs, Avaliação Genética, Herdabilidade, Predição Bayesiana
Introdução: Eucalyptus cladocalyx é uma espécie de comprovada capacidade para crescer em ambientes
áridos. No Chile, as zonas áridas e semi-áridas atingem cerca de 30 milhões de ha; 40% da área total do país.
Objetivo: Avaliar o controle genético da sobrevivência e o crescimento em 49 famílias de meio-irmãos de E.
cladocalyx, cultivadas na parte sul do deserto de Atacama, no Chile. Métodos: Um modelo de predição Bayesiano
foi utilizado na estimação de componentes de variância, herdabilidade e a predição de valores genéticos
individuais, por meio do algoritmo de Gibbs. Um modelo de limiar foi ajustado aos dados de sobrevivência, a
qual foi considerada uma variável discreta de resposta binária. Resultados: A sobrevivência média (medida oito
anos após o plantio; no ano 2009) foi alta (91,76%) e variou de 66,7% a 100% (média familiar). A sobrevivência e
o crescimento do diâmetro à altura do peito (DAP; medido aos oito anos) foram moderadamente herdáveis com
médias a posteriori e intervalos de credibilidade de h2=0,17 (0,13-0,29) e h2=0,34 (0,19-0,54), respectivamente. O
valor da média a posteriori da correlação genética entre DAP e sobrevivência foi positiva (r=0,46) e de acordo
com o intervalo de credibilidade, foi significativamente diferente de zero (0,06-0,81) indicando que a seleção
baseada unicamente no crescimento teria um impacto positivo sobre a sobrevivência. Conclusões: A alta taxa
de sobrevivência encontrada no presente estudo confirma a capacidade das árvores de E. cladocalyx para
crescer sob condições ambientais semi-áridas do Chile. A significativa variabilidade genética encontrada
sugere uma oportunidade para melhorar a produtividade das árvores na parte sul do deserto de Atacama.
Fonte Financiadora: FONDECYT, Chile
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Autocorrelação espacial em uma população natural de
Hymenaea stigonocarpa Mart ex Hayne (Leguminosae)
Kubota, TYK1; Silva, AM1; Moraes, MA1; Silva, ECB1; Moraes, SMB1; Moraes, MLT1
Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: estrutura espacial, variação genética, jatobá-do-cerrado, conservação, melhoramento genético.
Introdução: O conhecimento sobre a estrutura espacial populacional é importante, ainda, quando populações de
plantas são coletadas para conservação ou selecionadas para uso em programas de melhoramento. Isto deve ser
considerado a fim de estabelecerem-se estratégias de amostragem de populações naturais, conseguindo-se assim,
maximizar a diversidade populacional ou da espécie. Desse modo, o objetivo do presente estudo foi determinar
o padrão espacial de uma população natural de jatobá-do-cerrado (H. stigonocarpa) com base em caracteres
morfológicos. Métodos: Foram identificadas 63 árvores de polinização livre de H. stigonocarpa, com alto grau
de perturbação antrópica, localizada na região nordeste do Estado do Mato Grosso do Sul, entre as cidades de
Aparecida do Taboado e Selvíria. As árvores matrizes, desta população, foram georreferênciadas com auxílio de
um aparelho GPS (Global Position System) e posteriormente foram feitas mensurações dos caracteres silviculturais
CAP (perímetro à altura do peito) e ALT (altura total da planta). O padrão espacial para cada um dos caracteres
morfológicos foi avaliado a partir dos procedimentos de autocorrelação espacial com base no Índice I de Moran,
utilizando o programa SAAP. A análise da distribuição espacial a partir do índice I de Moran permitiu conhecer
a autocorrelação dentro de cada classe de distância, isto é, a extensão em que a autocorrelação é significativa
com a avaliação dessas classes. Resultados: Dividiram-se as distâncias em 10 classes, observou-se que ocorreu a
estruturação. Para ALT esse fato ocorreu na classe: 5 (-0,12), no CAP foram as classes: 1 (0,21); 2 (0,18), 7 (-0,23), 9
(-0,28) e 10 (0,04). Os índices positivos significam que os indivíduos pareados são idênticos e os índices negativos
pareados são diferentes. Conclusões: A presença de estruturação detectada com base nos caracteres ALT e CAP é
um indicativo de que o fluxo gênico é restrito, sugerindo a ocorrência de cruzamentos entre indivíduos aparentados,
o que requer cautela na coleta de sementes, desta população, para fins de conservação e melhoramento genético.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e FAPESP
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Diversidade genética entre variedades crioulas de
milho através de caracteres agronômicos
Matiello, RR1; Gardingo, JR1; Molin, D2; Alferes, AC3; Lacerda, MB3; Torrecija, M3; Biezus, F3; Nakashima,
W de C3; Oliveira, CA3
Departamento de Fitotecnia e Fitossanidade - Laboratório de Melhoramento Vegetal, Universidade Estadual de Ponta Grossa
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva
3
Acadêmicos do Curso de Agronomia – UEPG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Germoplasma, rendimento de grãos, adaptação, ciclo reprodutivo, caracteres agronômicos.
As variedades crioulas constituem importante fonte de variação genética ainda pouco conhecida e explorada pelos
programas de melhoramento. A conservação deste germoplasma bem como a caracterização agronômica representa
uma forma interessante de explorar futuramente estes acessos em programas de pré-melhoramento. Os objetivos
foram estudar diferentes variedades crioulas de milho oriundas do Rio Grande do Sul e do Paraná com relação a sua
adaptação, características agronômicas e ao potencial de rendimento de grãos almejando a prospecção de novos
genes de interesse. O experimento foi implantado na Fazenda Escola na safra 2009/2010, no delineamento de blocos
casualizados com 3 repetições. As parcelas foram compostas por 2 linhas de 5m de comprimento por 0,9m na
entrelinha. Os tratamentos consistiram de 48 variedades crioulas conservadas no banco de germoplasma da UEPG.
As variedades foram caracterizadas com relação a estatura de planta, ciclo masculino e feminino, altura de inserção
de espiga, número de folhas e rendimento de grãos. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias
dos tratamentos comparadas por Scott-Knott a 5% no programa SASM-Agri (Canteri et al., 2001). Os coeficientes
de herdabilidade foram estimados através da esperança matemática dos quadrados médios da análise de variância
(Vencovsky e Barriga, 1992). Para todas as variáveis procedeu-se a análise de correlação de Pearson no programa SAS
(1994). A análise de variância revelou diferenças significativas (p<0,01) para todas as variáveis estudadas entre as
variedades, o que demonstra presença de variabilidade genética para as características. Os coeficientes de variação
foram baixos e adequados para estudos fitotécnicos em milho. As variedades crioulas apresentaram estatura média
elevada de 2,62m, com amplitude de 2,02 a 3,07m da mesma forma para a altura de inserção da espiga principal. O
número total de folhas variou de 14 a 18 entre as variedades, sendo os resultados deste caráter associados com a
estatura de planta, ou seja, variedades crioulas com maior estatura apresentaram maior nº de folhas e vice-versa.
Com relação ao ciclo masculino e feminino algumas variedades demonstraram potencial para redução do ciclo, com
amplitude de 56 até 62 dias (masculino) e de 60 a 66 dias ( feminino). De maneira geral, os genótipos apresentaram
protandria ou seja, florescimento masculino anterior ao feminino, com média de 3 dias. Para o rendimento de
grãos, a análise demonstrou a formação de 5 grupos estatísticos, com amplitude de 1353 a 5173 kg ha-1. Das 48
variedades analisadas, 7 destacaram-se com rendimento superior a 4273 kg ha-1 dentre elas: Nutricional, Asteca,
Pintadinho FE 129, Milho Grande, Carioca, Milho Caiano e Milho Palha Roxa. Os coeficientes de herdabilidade
para todas as características foram elevados (> 90%), indicando diferenças genéticas muito pronunciadas entre
os genótipos bem como a presença de variância genética favorável entre as variedades crioulas analisadas.
Apoio Financeiro: Fundação Araucária Processo nº 15520
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Genetic diversity analysis of twenty seven grapevine
accessions using microsatellite markers
Sant’Ana, GC1,2; Souza, RAV1; Ferreira, JL1; Fontes – Soares, BD1; Borém, A2; Pasqual, M3; Cançado, GMA1
Plant Biotechnology Laboratory, Agricultural Research Agency of Minas Gerais (EPAMIG)
Plant Science Department, Universidade Federal de Viçosa. 3Plant Science Department, Universidade Federal de Lavras
[email protected]
1
2
Keywords: Vitis spp., SSR, Genetic diversity, DNA fingerprinting, Genetic structure.
Introduction: The grapevine is a perennial fruit of greater economic importance worldwide. Brazil, although
not among the world’s largest producer, has been showing a growing development in the industry, and also has
increased markedly your production area with the renovation of the vineyards and new plantings. The correct
identification and the knowledge about the genetic diversity are fundamental for rational management and
use of grapevine germplasm. Objective: To analyze the genetic diversity of main grapevine varieties cultivated
in Minas Gerais, Brazil. Methods: The DNA of 27 grapevines was extracted by the CTAB method, scanned with
7 highly polymorphic microsatellite markers, and run at 6% denaturing poliacrilamide gels. Results: Among
the 27 cultivars examined, 26 different SSR profiles were detected. In this study were identified 101 alleles in
7 loci analyzed with average of 14.43 alleles per locus, confirming the high power of these markers for genetic
polymorphism detection. The expected heterozygosity ranged from 0.832 to 0.9205 with average 0.8873, whereas
the observed heterozigosity ranged from 0.7692 to 1.000 with average of 0.8943. The high number of heterozygous
individuals might be due the breeding selection followed by genotype maintenance through vegetative
propagation. Grapevine is known to be very sensitive to inbreeding depression and the higher performance is
mainly observed in heterozygous individuals. The loci with highest polymorphisms information content (PIC)
were VVS2 (0.92), VVMD27 (0.918) and VrZAG62 (0.918), while the loci with lowest values of PIC were VVMD25
(0.832) and VrZAG79 (0.845). Considering the 7 loci analyzed the PI accumulation was very low (1.27 x 10-12)
indicating the high efficiency of these loci for grapevine genotypes differentiation. The phylogenetic analysis
showed four main groups and they were in agreement with the genetic similarity (pedigree) of these varieties. In
the principal coordinate analysis, the group formed for 4 Americans varieties showed the highest level of genetic
structuration. No clear division was observed between vinifers and rootstocks groups during the structuration,
the results indicate a tendency of clustering among the varieties belonging to the same group. Conclusion: The
seven microsatellite markers used were efficient in analyze the genetic diversity of the EPAMIG grapevine panel.
Financial support: IFS, FAPEMIG, CNPq, CAPES, FINEP, and EMBRAPA
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Nível de homozigose de acessos da coleção de
germoplasmas do Centro Mars de Ciências do Cacau
Aboboreira, EMC¹; Lopes, UV²; Motamayor, JC³; Machado, RCR¹; Costa, MGC4
¹ Centro Mars de Ciências do Cacau, MCCS
² Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira, Ceplac/Cepec
³ MARS
4
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa Cruz
5
Estudante do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
Palavras-chave: Heterose, Linhagens homozigotas, Theobroma cacao, homozigose
Introdução: A maioria dos programas de melhoramento do cacaueiro tem como objetivo o desenvolvimento
de híbridos interclonais. Infelizmente, o uso de clones altamente heterozigotos, levam a híbridos com alta
variabilidade. Como exemplo, há citações de em alguns híbridos, 20% das plantas produzindo até 80% da
produção total. Hibridação entre linhagens homozigotas pode minimizar tal problema. Neste contexto, o MCCS
em colaboração com a CEPLAC e a UESC, vem desenvolvendo projetos no sentido de obter linhagens homozigotas
de cacau, através de cultura de anteras, e também buscando identificar clones que naturalmente são homozigotos.
Objetivo: O presente trabalho reporta parte desse projeto, em particular no que diz respeito à caracterização do
nível de homozigose em clones da coleção de germoplasms do MCCS . Métodos: O nível de homozigose de 278
acessos da coleção de germoplasmas do Centro Mars de Ciências do Cacau (MCCS), foi estimado utilizandose 13 primers SSR (mTcCir1, mTcCir3, mTcCir6, mTcCir9, mTcCir12, mTcCir15, mTcCir17, mTcCir18, mTcCir19,
mTcCir21, mTcCir24, mTcCir25, mTcCir26). As análises foram efetuadas utilizando-se o programa SAS. Resultados:
O nível de homozigose entre os acessos analisados variou de 0 a 100 %. Os clones Be-10, EEG-27, SPEC-541, P-1B
e LX-31 apresentaram os mais elevados níveis de homozigose (> 91.7%), enquanto os clones UF-12 e 612, EET-19,
58 e 95 e ICS-6 os mais baixos níveis (0%), nos locos avaliados. De modo geral o nível de homozigose dos clones
avaliados foi baixo (37% em média), como esperado para uma planta com elevada taxa de alogamia, como é o
caso do cacaueiro. Este baixo nível de homozigose, também, pode justificar a alta variabilidade observada em
progênies envolvendo tais germoplasmas como pais. Conclusões: Embora clones com baixo alto de homozigose
podem ser encontrados em coleções de germoplasmas para uso como pais de híbridos, de modo geral, na espécie
o mais comum é um alto baixo nível. Portanto, estratégias, como o cultivo de anteras visando a produção de
linhagens homozigotas, apresentam elevado potencial como suporte aos programas de melhoramento visando o
desenvolvimento de híbridos interclonais.
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Citogenética de duas espécies frutíferas nativas do
Cerrado: Mangaba (Hancornia speciosa Gómez) e
Gabiroba (Campomanesia adamantium)
Amaro, CL2; Silva, TR2; Duarte, DM2; Marinho, RC3; Morelli, S1; Oliveira-Júnior, RJ1,2
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
Universidade Estadual de Goiás, UnU-Ipameri
3
Instituto de Biologia, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mangaba; Gabiroba; Contagem cromossômica; Nucléolo; Citogenética.
O bioma Cerrado é a savana com maior biodiversidade vegetal do planeta, no entanto devido ao desmatamento
acelerado e ao extrativismo descontrolado o grande banco de germoplasma presente no Cerrado pode entrar
em extinção sem nem mesmo ser caracterizado. Muitas espécies frutíferas nativas do Cerrado possuem grande
potencial econômico, podendo ser transformadas em produtos finais bastante lucrativos. A citogenética é uma
ferramenta de grande importância na caracterização da variabilidade entre as diferentes populações vegetais,
podendo também ser utilizada em programas de melhoramento vegetal. O objetivo do presente trabalho foi
realizar a caracterização citogenética das populações de Hancornia speciosa Gómez e Campomanesia adamantium
presentes no Cerrado da região de Ipameri-GO. Foram obtidas células de tecido meristemático em intensa divisão
célular, com o intuito de obter células em metáfase. O ciclo celular foi bloqueado com PDB. As células foram fixadas
em lâminas e analisadas no microscópio óptico. As melhores metáfases foram contadas para a determinação
do número e ploidia cromossômica. Os cromossomos mitóticos foram submetidos à técnica de detecção das
regiões organizadoras do nucléolo, afim de uma melhor caracterização cromossômica. O número cromossômico
de Mangaba (Hancornia speciosa Gómez) apresentou 2n=20 cromossomos, um índice CTC de 59,5 µm (± 2). A
população de Gabiroba (Campomanesia adamantium) apresentou 2n=22 cromossomos, um índice CTC de 62,2
µm (± 2). Não foi possível detectar as marcações de NORs nos cromossomos mitóticos em nenhuma das duas
espécies, mas todos os núcleos apresentaram um ou dois nucléolos quando impregnados por nitrato de prata,
sugerindo que pode se tratar de sistema de NOR simples para as duas espécies em questão. O presente trabalho
descreve pela primeira vez o número cromossômico de mangaba, uma vez que não foram encontradas referências
e o número cromossômico da espécie não se encontra no Index to Plant Chromosome Numbers (IPCN). O número
cromossômico de gabiroba obtido no presente trabalho corrobora com o número cromossômico básico encontrado
em espécies da família Myrtaceae e também foi encontrado em outras três populações de Campomanesia
adamantium de outras regiões (Serra do Cipó, São Tomé das Letras e Brasília DF). Os resultados obtidos poderão
auxiliar no estudo da evolução cariotípica da espécie e até mesmo em estudos de eventuais processos de especiação.
Apoio Financeiro: CAPES; UFU; UEG; FAPEMIG; CNPq
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Comparison of the Coffea canephora and Coffea
congensis karyotypes based on chromosomal morphology
Machado, EP1; Carvalho, CR1; Clarindo, WR2
Laboratório de Citogenética e Citometria, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, 36570-000 Viçosa, MG, Brazil
Laboratório de Microscopia, Departamento de Produção Vegetal, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo,
29500-000 Alegre, ES, Brazil
1
2
Keywords: Coffea canephora, Coffea congensis, cell aggregate suspensions, genome evolution, chromosome.
Discrimination and pairing of homologous chromosomes and the ensuing accurate assembly of the Coffea karyogram
have been hampered by chromosomal length and similarity. These facts also have hindered karyotype comparisons
between Coffea species. Hence, the main objectives of this work were: (a) to establish C. canephora and C. congensis
cell aggregates as source of biological material for chromosome obtention, and (b) to compare the karyotype of these
species from morphological data. The in vitro tissue culture conditions promoted the formation of a large collection
of cells in division, yielding the cell aggregate suspensions, fundamental for Coffea cytogenetic approaches. The
aggregates, in association to cytogenetic protocol, provided Coffea metaphases and prometaphases showing wellspread chromosomes without cytoplasm background, chromatin damages or overlaps. These chromosomal aspects
were imperative for observation of primary and secondary constrictions, pairing of homologues and assembly of
the C. canephora and C. congensis mitotic karyograms. C. canephora karyograms displayed 2n = 22 chromosomes, of
which two pairs are metacentric (4, 9), nine submetacentric (1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 10 and 11) and one showing the secondary
constriction in the short arm (6). C. congensis karyograms showed 2n = 22 chromosomes, being four metacentric (4,
7, 8 and 9), seven submetacentric (1, 2, 3, 5, 6, 10 and 11) and one exhibiting the secondary constriction in the short
arm (6). Therefore, the two species showed chromosomes morphologically identical (4 and 9 – metacentric; 1, 2, 3,
5, 6, 10 and 11 – submetacentric). These species also possess only one chromosome with secondary constriction
in the short arm of the chromosome 6. In accordance to others approaches, this study provided evidences that the
C. canephora and C. congensis karyograms are similar. In addition, the cell aggregate suspension in liquid medium
system, in association with adequate cytogenetic protocol, was considered an alternative source of biological material
that yields prometaphasic and metaphasic chromosomes with suitable resolution for chromosomal discrimination.
financial support: FAPEMIG, CNPQ, FAPES
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Viabilidade de grãos de pólen e de sementes em
populações naturais de Crotalaria spectabilis L
Braz, GT¹; Marques-de-Resende, KF1; Torres, GA1; Mondin, M2; Silva, N de ST1
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
Laboratório de Citogenética Molecular de Plantas, Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Alexander, Carmin Acético, Tetrazólio, FDA, Utetheisa lotrix.
Crotalaria spectabilis possui cultivares utilizadas como adubo verde em sistemas de rotação de culturas, devido à
capacidade de fixação de nitrogênio, para cobertura do solo e combate à erosão. Entretanto, pouco se sabe sobre
sua biologia da reprodução. Estudos sobre seu comportamento meiótico revelaram alta incidência de diferentes
irregularidades, as quais poderiam estar associadas a baixa viabilidade polínica demonstrada por testes de coloração
e de germinação in vitro. Por ser uma espécie cultivada, é de fundamental importância conhecer a variabilidade
interpopulacional para o comportamento meiótico irregular, avaliando seu efeito sobre a produção de sementes. Para
início dos estudos foi avaliada a viabilidade de grãos de pólen e de sementes de cinco populações de C. spectabilis, com
ocorrência no sul de Minas Gerais. Foram determinadas a viabilidade polínica por testes de coloração (Alexander,
Carmin, Trifenil cloreto de tetrazólio e Diacetato de fluoresceína) e a porcentagem de sementes viáveis por vagem
em dez indivíduos por população. A viabilidade polínica, não mostrou diferença significativa, a 5% de probabilidade,
entre as populações e entre os diferentes tipos de testes dentro de cada população. O coeficiente de variação foi
de 3,43% e a média geral foi de 96% de grãos de pólen viáveis. A viabilidade de sementes, apresentou diferença
significativa, a 1% de probabilidade, entre as populações e entre indivíduos dentro das populações. O coeficiente de
variação foi de 59,89% e a média geral foi 52% de sementes viáveis. O alto valor de CV pode ser associado ao ataque
da lagarta Utetheisa lotrix, a qual se alimenta das sementes nas vagens. Portanto, a porcentagem de sementes
inviáveis pode estar superestimada em decorrência deste ataque. A população 1 teve a maior média de sementes
viáveis (63%), enquanto as populações 5, 2 e 3 formaram um segundo grupo com 54%, 52% e 48%, respectivamente.
A população 3 apresentou a menor média (35%). No entanto, as populações 2, 4 e 5 foram as mais afetadas nesta
ordem, enquanto as populações 3 e 1 foram as menos afetadas. A produção de sementes nestas populações de C.
spectabilis aparentemente pode estar sendo influenciada por comportamento meiótico irregular, não detectado
por estes testes de viabilidade polínica, ou por alterações pós-meióticas, sendo estas últimas as causas mais
prováveis. A viabilidade polínica revelada por testes de coloração não variou entre ou dentro de populações, sendo
alta em todos os testes. Existe variabilidade intra e interpopulacional para a produção de sementes de C. spectabilis.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Avaliação de métodos de preservação de amostras
de folhas para a quantificação de DNA por
Citometria de Fluxo
Gomes, SSL¹; Oliveira, CE1; Marques, JS1; Zanette, RSS1; Campos, JMS¹; Viccini, LF1
¹Laboratório de Genética e Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora-MG
[email protected]
Palavras-chave: Citometria de Fluxo, preservação de folhas, Lippia, Pisum sativum, tampão LB01.
Introdução: A Citometria de Fluxo é uma técnica rápida e precisa para estimar o conteúdo de DNA de células
vegetais. Apesar das dificuldades para preservação das amostras em materiais coletados no campo, são raros os
estudos comparando a eficiência das metodologias de conservação de material foliar. O uso de amostras frescas
é ideal para a quantificação de DNA, visto que nessa condição, a perda dos ácidos nucléicos por morte celular é
mínima. Todavia, nos estudos com plantas silvestres, isso nem sempre é possível. Geralmente, as plantas ocorrem
em locais distantes dos centros de pesquisa e seu cultivo em casas de vegetação pode ser inviável em experimentos
que estudam espécies em condições naturais. Portanto, faz-se necessária uma metodologia eficiente de preservação
de folhas que evite, por tempo considerável, a morte dos tecidos. O gênero Lippia, bastante representado no Brasil,
abriga várias espécies com propriedades medicinais. No presente trabalho, foram utilizadas as espécies L. alba e L.
rotundifolia como modelos. Outra espécie utilizada foi Pisum sativum, por ser um padrão confiável para Citometria
de Fluxo. Objetivos: Comparar a integridade do DNA analisado a partir de amostras foliares mantidas em diversas
condições de preservação e diante dos resultados indicar a metodologia mais adequada para futuros experimentos
envolvendo Citometria de Fluxo. Métodos: As espécies citadas foram cultivadas na Estação Experimental de
Plantas/ICB/UFJF. O preparo da suspensão de núcleos em tampão LB01 ocorreu conforme Dolezel et al. (2007).
Para a preservação, as folhas foram coletadas simultaneamente. As metodologias testadas foram: folhas frescas;
não preservadas; algodão umedecido com água; algodão umedecido com água e mantido na geladeira; geladeira;
algodão umedecido com água e mantido no gelo; isopor com gelo; congelador; nitrogênio líquido. Em todos os
tratamentos as amostras encontravam-se em sacos plásticos e nos casos em que foi usado algodão, este também
ficou dentro dos sacos. As amostras foram submetidas à citometria imediatamente após coleta e seguidas 24,
48, 72 e 96 horas. Resultados: A quantidade de DNA das três espécies manteve-se mais próxima do esperado
quando a preservação ocorreu em algodão úmido. Os coeficientes de variação foram L. alba 2,12 e 2,53; L.
rotundifolia 1,98 e 2,79; P. sativum 1,75 e 2,27 para o 1º e o 5º dia respectivamente. Já o pior resultado foi observado
nos tratamentos com gelo. Conclusões: Diante dos resultados, é possível afirmar que uma das mais eficientes
metodologias de conservação de folhas é com o emprego de algodão umedecido, pois este mantém a umidade
dos tecidos e retarda a morte celular. A preservação com o algodão na geladeira também se mostrou satisfatória.
Apoio financeiro: Capes, CNPq e FAPEMG
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Estudo da eliminação cromossômica em híbridos de
capim-elefante e milheto (Pennisetum sp. Schum.,
Poaceae) através da hibridização in situ genômica
Reis, GB¹; Andrade-Vieira, LF¹; Davide, LC¹; Torres, GA¹; Oliveira, AR²; Brasileiro-Vidal, AC²; Pereira, AV³
Laboratório de Citogenética, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Pernambuco
3
Laboratório de Genética Vegetal, Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pennisetum, comportamento genômico, eliminação cromossômica, hibridização in situ, mixoploidia
O capim-elefante (P. purpureum) e o milheto (P. glaucum) destacam-se por sua importância econômica como
forrageiras de elevado potencial de produção, sendo cultivadas nas regiões tropicais do planeta e empregadas na
obtenção de híbridos interespecíficos em programas de melhoramento genético. No entanto, o maior problema em
relação a utilização dos híbridos é a esterilidade causada por sua condição triplóide (2n = 3x = 21 cromossomos).
Logo, tem-se procurado restaurar a fertilidade do híbrido interespecífico por meio da duplicação cromossômica.
Alguns protocolos de indução de poliploidia mostraram-se eficientes, produzindo plantas hexaplóides, no entanto,
freqüentemente são observadas plantas mixoplóides com células contendo número cromossômico variando de 14
a 42. Dessa forma, o objetivo do trabalho foi estudar a eliminação cromossômica em híbridos de capim-elefante
e milheto submetidos a duplicação cromossômica, utilizando como ferramenta a hibridização in situ genômica
(GISH), a fim de identificar se há eliminação preferencial de cromossomos de um dos parentais após indução
de poliploidia. A GISH foi realizada em metáfases dos híbridos, as quais foram desnaturadas com formamida
70% a 85ºC por 1,5 minutos. A sonda do DNA genômico de milheto foi marcada com biotina, desnaturada a
75ºC por 10 minutos e detectada com avidina-Fluoresceína. As metáfases foram contra-coradas com DAPI e
avaliadas em microscópio epifluorescente nos comprimentos de onda de excitação/emissão de 358/461 (DAPI)
e 490/525 (Fluoresceína). Foi observada grande variação cromossômica entre e dentre as células somáticas
dos híbridos analisados. Para dois híbridos (Paraíso e H-89) foi encontrada maior freqüência de células com 38
cromossomos, sendo 12 cromossomos de milheto e 26 de capim-elefante. Já nos híbridos H40 e H42 a maioria
das células apresentou 28 cromossomos (10 de milheto e 18 de capim-elefante). A eliminação cromossômica é
casual, podendo ser encontradas as mais diversas combinações cromossômicas entre os híbridos em questão.
Ademais, alguns híbridos tendem a se estabilizar com 28 cromossomos, enquanto outros tendem a perder menos
cromossomos, se estabilizando com número cromossômico próximo a 42. Este trabalho representa o primeiro
estudo realizado a respeito da identificação dos cromossomos parentais eliminados nos híbridos mixoplóides
resultantes do cruzamento de capim-elefante e milheto, seguido de indução de duplicação cromossômica.
Apoio financeiro: Fapemig e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
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Avaliação da frequência de embriões zigóticos em
sementes de laranja doce com uso de marcadores
moleculares TRAP
Cunha, T1; Lanza, RM2; Latado, RR3
UNIARARAS.
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz/USP
3
Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: laranja, zigótico, nucelar, semente, marcador molecular
Introdução: Apesar do melhoramento genético via hibridação controlada ser uma das principais formas de
obter variabilidade nos citros, existem duas grandes barreiras biológicas que dificultam os cruzamentos, a
poliembrionia nas sementes e o longo período juvenil de plantas provenientes de sementes. Numa avaliação
da taxa de poliembrionia de sementes de 650 variedades de laranja doce, presentes no Banco de Germoplasma
do Centro APTA Citros/IAC, foram selecionadas 15 variedades que apresentaram baixa taxa de poliembrionia
e frutos contendo número adequado de sementes. Estas variedades possuem o potencial para serem utilizadas
como genitoras femininas em programa de cruzamentos, desde que apresentem elevada frequência de embriões
zigóticos nas sementes pois, no caso de cruzamentos controlados, a produção de embriões nucelares (com
genótipo idêntico a planta-mãe) não é desejada. Uma das formas de se identificar plantas zigóticas ou nucelares
de citros é por meio do uso de marcadores moleculares. Os marcadores moleculares TRAPs são dominantes,
multi-loci e possuem grande capacidade de discriminação molecular. Objetivo: Avaliar a freqüência de plântulas
zigóticas em seis variedades de laranja doce, obtidas a partir de sementes oriundas de frutos de polinização livre,
com uso de marcadores moleculares TRAP’s. Métodos: As variedades utilizadas neste estudo foram a Lanceta
amarga (CV49); Agrodoce (CV125); Pêra-de-abril (CV148); Feijão-cru (CN07); Grosse sanguine (CN72) e Amber
sweet (CN1428). Foram germinadas 50 sementes de cada variedade e, após 60 dias de semeadura, foram extraídos
os DNAs genômicos de 30 plântulas de acordo com a metodologia descrita por Machado et al. (1996). As reações de
PCR foram realizadas em volume de 12,5 μL com os componentes DNA (30-50 ng μL-1), tampão Taq (1X), MgCl2 (25
mM), dNTPs (2,5 mM de cada), primers arbitrário e fixo (10 μM) e Taq DNA polimerase (0,5 U). O programa para a
amplificação foi composto por um ciclo de 94°C/2min.; seguido de 5 ciclos de 94°C/45s, 35°C/45s e 72°C/1min; 35
ciclos de 94°C/45s, 50°C/45s e 72°C/1min; e um ciclo final de 72°C/7min. Após as reações de amplificação, 12,5μL
de tampão de desnaturação [10mL formamida, 0,001mg azul bromofenol, 0,001mg xilenocianol e 200μL EDTA
0,5M pH 8,0] foram adicionadas à cada reação, seguido de desnaturação à 94oC/3min. A eletroforese foi realizada
em gel de seqüenciamento, com poliacrilamida denaturante à 5%, com potência constante (1.100V) por 2 h, em
cuba vertical. Os géis foram revelados pelo método de nitrato de prata Resultados: A variedade que apresentou a
maior porcentagem de embriões zigóticos nas sementes foi a Pêra-de-abril (60,7%), seguido da laranja Feijão-cru
(35,1%), Grosse sanguine (34,4%). A que apresentou a menor porcentagem de embriões zigóticos foi a Agrodoce
(2,3%). Conclusões: As variedades apresentaram distintas porcentagens de embriões zigoticos em sementes e,
as melhores neste quesito serão testadas como genitoras femininas, em cruzamentos envolvendo laranjas.
Apoio: CNPq e FAPESP, pelas bolsas de estudo de IC.
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Meiotic irregularities in Euterpe oleracea Mart
Rodrigues, MS¹; Oliveira, LC¹; Torres, GA¹; Lima, GO¹; Davide, LC¹; Techio, VH¹; Oliveira, MSP²
¹ Cytogenetic Laboratory – Biology Department, Lavras Federal University
² Molecular Genetic Laboratory – Agroforestry Research Centre of Oriental Amazon, Brazilian Enterprise of Agricultural Research
Corresponding author: [email protected]
Keywords: Acai, Euterpe, meiosis, cytogenetics.
The level of fertility of plants is directly related to meiotic behaviour, being generally observed negative correlation
between fertility and division irregularities. Such information is useful for the breeding involving Euterpe oleracea,
developed to obtain more productive cultivars with thicker stalk for palm heart production. Thus, the objective of
this work was to characterize the meiotic behaviour of Euterpe oleracea to enrich the breeding of this species. After
the harvest, the flower buds of three individuals from the Agricultural Research Centre of Humid Tropic (CPATU)
germplasm collection were fixed in Carnoy (3 ethylic acohol:1 acetic acid) and stored at -20º C. The slides were
prepared using the smear technique and stained with propionic carmine (1%). The Meiotic Index calculation was
done through the equation: (% MI = [number of normal tetrads / total of analysed tetrads] x 100). From a total of
13,780 meiocytes analysed, 62.7 % were under meiosis I, where 1% of them presented irregularities – especially
related to segregation such as early migration of chromosomes in metaphases and/or delays in anaphases. The
other 37.3 % of meiocytes were under meiosis II, from which 16.8 % presented some sort of irregularity – especially
related to irregular position of meiotic spindle. In some cells, there were observed metaphase II with chromosomes
arranged in parallel spindle, with or without chromosomes under early ascension. There were also observed
irregularities related to laggard chromosomes in cells under anaphase and to the asynchronous division of the
nuclei between metaphase and anaphase. Such meiocytes have presented three nuclei, a typical characteristic of
tripolar spindle, apparently under metaphase and other two under more advanced division process – a possible
cause for the triad formation. Despite the irregularity rates, the meiotic index was 90.0 %. This evidences that
chromosome that arrived early or late in the poles may have been included in the nuclei where there were formed
normal meiotic products. Conclusions: Despite the irregularities found, the species may be considered stable,
cytologically, since the meiotic index was high. The highest irregularity rate in the meiosis II suggests further
investigation in details regarding a possible involvement of mutant genes related to spindle and to non-disjunction.
Financial support: Embrapa, CNPq and FAPEMIG.
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Karyotype structure on populations of two species of
Hypochaeris (H.catharinensis and H. lutea), Asteraceae
from South Brazil
Vidotto, T; Ruas, EA; Fiorin, FG;Ruas, PM; Vanzela, ALL; Ortiz, MA; Talavera, S; Stuessy, T; Urtubey, E;
Tremetsberger, K; Matzenbacher, NI; Ruas CF
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Londrina, 86051-990, Londrina, PR
[email protected] Keywords: Asteraceae, CMA3, Hypochaeris, karyotype evolution, polyploidy
Karyotypes were investigated in ten populations of H. catharinensisand five populations of H. lutea using Feulgen
staining, fluorochrome banding (CMA and DAPI) and FISH. The study revealed the typical asymmetrical and
bimodal karyotypes with 2n = 8 chromosomes that characterize the South American species of Hypochaeris.
One population of H. lutea was entirely polyploid adding up a novel cytotype for this species.CMA banding
showed strong signals on both arms of chromosomes 3 and 4 of H. catharinensis, besides many dispersed but
less intense signals, revealing a novel pattern in the distribution of GC-rich heterochromatin in Hypochaeris.
Except for one population, the CMA banding in H. luteavalidates the pattern already described for this species.
DAPI banding was detected the first time in Hypochaeris revealing a weak signal in H. catharinensis and absence
of signals in H. lutea. FISH with rDNA inH. catharinensisrevealed a unique locus of 5S rDNA at intercalary
position on short arm of pair 2 and a terminal 45S rDNA locus on short arm of pair 3. The presence of unusual
large blocks of GC-rich heterochromatin suggests that significant chromosome rearrangements, related to
dispersion of heterochromatin, are taking place in the karyotype of H. catharinensis. The novel polyploidcytotype
identified in H. luteasuggests that polyploidization is an active process of chromosome evolution in Hypochaeris.
Financial support: CAPES, CNPQ.
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Estabilidade genômica em Lippia mantida por cultura
de tecidos avaliada por citometria de fluxo
Zanette, RSS1; Gomes, SSL1; Oliveira, CE1; Marques, JS1; Campos, JMS1; Peixoto, PHP2; Viccini, LF1
Laboratório de Genética e Biotecnologia, Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora - MG
Laboratório de Fisiologia Vegetal, Departamento de Botânica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora - MG
1
2
Palavras-chave: Lippia, estabilidade genômica, in vitro, BAP, ANA, citometria de fluxo
Introdução: Técnicas in vitro tem sido rotineiramente utilizadas em vegetais para preservação de germoplasma
por longos períodos. Entretanto, a cultura de tecidos tem sido frequentemente associada com eventos de
instabilidade genômica devido à ação de reguladores de crescimento. Entre estes eventos, mudanças de ploidia e
perda ou ganho de cromossomos são os mais comuns. A citometria de fluxo é útil na detecção dessas alterações,
uma vez que auxilia o estudo de estabilidade genômica e a identificação de protocolos de cultura in vitro que
permitem a estabilidade do germoplasma. Métodos: Espécies de Lippia (L. rotundifolia, L. diamantinensis, L.
filifolia, L. martiana) foram mantidas in vitro com hormônios de crescimento ANA ou BAP. Três indivíduos
de cada espécie foram avaliados por citometria de fluxo (mantidos em casa de vegetação – controle; ANA ou
BAP). Para estimativa das quantidades de DNA nuclear, aproximadamente 20-30mg de tecido foliar jovem
das espécies de Lippia juntamente com folha do padrão interno de referência (Pisum sativum, 9,09pg) foram
macerados com auxílio de uma lâmina cortante em uma placa de Petri contendo 1mL de tampão (LBO1) para
liberação dos núcleos em suspensão. As amostras foram filtradas e coradas com iodeto de propídeo, sendo
posteriormente analisadas no citômetro de fluxo. As estimativas de quantidade de DNA foram analisadas por
análise de variância seguida de teste de Tukey (p>0,05). Resultados: A análise por citometria de fluxo não mostrou
variações significativas no conteúdo de DNA nuclear e na ploidia das espécies de Lippia mantidas in vitro.
A variação máxima para quantidade de DNA foi observada em L. diamantinensis mantida em ANA (7,39%; NS
p>0,05). A menor variação foi observada para a espécie L. filifolia mantida em BAP (2,20%; NS p>0,05). Para todas
as espécies analisadas não foram observadas células poliplóides, sendo relatados apenas os picos característicos
de G1 e G2. Os percentuais de células em G1 e G2 seguiram um padrão convencional para uma população de
células ativas. Em todas as análises os coeficientes de variação estiveram abaixo de 5%, não evidenciando grande
variação nas estimativas de quantidade de DNA entre as células em G1, o que permite supor a não existência
de aneuploidias. Conclusões: Os protolocos de cultura in vitro não demonstraram efeitos sobre a estabilidade
genômica das plantas. Mudanças significativas nas quantidades de DNA analisadas não foram observadas.
Apoio financeiro: Capes, CNPq e Fapemig
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Caracterização citogenética de Mimosa caesalpiniifolia
Benth (Sansão-do-campo): dados morfométricos,
Bandas DAPI /CMA3 e cromossomos B
Reis, AC1; Sousa, SM1; Viccini, LF1
1 Departamento de Biologia, Universidade Federal de Juiz de Fora
[email protected]
Palavras-chave: citogenética, Mimosa caesalpiniifolia, Sansão-do-campo, cariótipo, bandeamento cromossômico.
Introdução: O gênero Mimosa é composto por cerca de 480 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais
da América, constituindo importantes centros de diversidade o Brasil, México, Paraguai, Uruguai e Argentina. M.
caesalpiniifolia, vulgarmente conhecida como Sansão-do-campo, destaca-se por ser empregada no campo como
cercas-vivas, feno para gados e por possuir uma madeira forte e densa, própria para uso externo, dentre outras
características. No entanto, poucos relatos se referem ao número cromossômico, sendo inéditos na literatura
estudos que evidenciam e caracterizem o cariótipo da espécie. Objetivo: Dessa maneira, o objetivo do trabalho
foi analisar morfometricamente os cromossomos e determinar o padrão de bandeamento DAPI e CMA3 em M.
caesalpiniifolia. Métodos: Sementes de M. caesalpiniifolia foram germinadas a 28°C e os meristemas radiculares
tratados com solução de 8-hidroxiquinoleína 3mM durante 4 horas, para a obtenção de cromossomos metafásicos.
Após o bloqueio, houve a fixação das raízes em etanol e ácido acético (3:1) por pelo menos 24 horas. Para a retirada
da parede celular, a solução enzimática Pectinase (4%) Celulase (40%) foi utilizada por 6 horas a 37°C. As lâminas
foram confeccionadas pelo método de dissociação celular com secagem ao ar e coradas em Giemsa 5%. Para
coloração com fluorocromos, as lâminas foram tratadas com CMA3 (0,5mg/mL) por 1 hora e com DAPI (2µg/mL)
durante 30 minutos, seladas após a adição de 30µL de meio glicerol e armazenadas em câmara escura. A análise foi
realizada em microscópio de fluorescência utilizando os filtros adequados para cada fluorocromo. Resultados: O
número cromossômico encontrado para o M. caesalpiniifolia foi de 2n=26, como o esperado. Em relação ao cariótipo,
foram observados cromossomos metacêntricos e submetacêntricos, evidenciando um cariótipo simétrico com
comprimento médio de cada cromossomo de 1,49μm. O bandeamento com fluorocromos revelou bandas DAPI
negativas e CMA3 positivas para as regiões organizadoras de nucléolo em dois pares de homólogos e bandas
intersticiais em outro par. Além disso, foi possível observar um estiramento das constrições secundárias, que se
mostraram heteromórficas em tamanho. Cromossomos B também foram observados, variando, de acordo com
os indivíduos, de 1-3. Conclusão: O número cromossômico 2n=26 de M. caesalpiniifolia repete-se com freqüência
em várias espécies de Mimosoideae, evidenciando um caráter uniforme dentro da subfamília e principalmente
dentre os representantes da tribo Mimoseae. O número básico sugerido para o gênero é x = 13, sendo a maioria
das espécies diplóides. O tamanho reduzido dos cromossomos é observado em outros táxons e a variação no
número de cromossomos B pode ser devido a distribuição aleatória durante a formação dos gametas, já que tais
cromossomos comportam-se de forma não Mendeliana durante a disjunção cromossômica nas células germinativas.
Apoio Financeiro: CAPES, FAPEMIG, CNPq
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Viabilidade polínica nas variedades de Casearia
sylvestris Sw. (Salicaceae)
Oliveira, AS1; Pinto-Maglio, CAF2; Torres, RB1; Cavallari, MM3; Zucchi, MI3
Núcleo de P&D do Jardim Botânico IAC, Campinas-SP
Centro de P&D de Recursos Genéticos Vegetais IAC Campinas-SP
3
Centro de P&D de Recursos Genéticos IAC, APTA - Pólo Centro Sul, Piracicaba-SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Casearia sylvestris, biologia da reprodução, viabilidade polínica, planta medicinal.
Casearia sylvestris Sw. (Salicaceae) é uma espécie de ampla distribuição geográfica, ocorrendo do México à Argentina
nos mais diferentes ambientes, sendo bastante utilizada na medicina popular. Atualmente suas propriedades
terapêuticas como antiofídica, antifúngica e até mesmo anti-cancerígena, têm sido comprovadas em estudos
químicos e farmacológicos. São reconhecidas duas variedades para a espécie, C. sylvestris var. sylvestris e C. sylvestris
var. lingua, que diferem em aspectos morfológicos, químicos e nos ambientes preferenciais de ocorrência. O objetivo
deste trabalho foi avaliar aspectos da biologia da reprodução em duas populações da espécie, em dois ambientes:
uma área de mata ciliar e outra de cerrado, ambas no Parque Estadual de Porto Ferreira (SP, Brasil). Foram marcados
um total de 112 indivíduos das duas variedades, bem como supostos híbridos. Visitas regulares foram realizadas
durante o período de floração e frutificação. Botões florais de seis indivíduos (dois de cada variedade e dois com
aspecto morfológico intermediário) foram coletados para uma estimativa da viabilidade polínica através de testes
de coloração. Lâminas foram preparadas a partir da maceração de anteras, que foram coradas com o corante
Alexander. As análises sugerem que os grãos de pólen da var. lingua, em geral, têm maior taxa de esterilidade (grãos
com diferentes tamanhos, vazios e não corados ou pouco corados) decorrente provavelmente de irregularidades
na divisão meiótica. Na var. sylvestris observou-se maior quantidade de pólen de tamanho regular e citoplasma
corado. As observações de campo indicam maior taxa de pegamento de frutos na var. lingua. Os resultados
auxiliam na compreensão dos mecanismos biológicos que regem os eventos reprodutivos entre as duas variedades.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP
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Diferença cariomorfometrica e polimórfica em
cromossomos de Mamona (R. commulis L.)
Barbosa, JVC1; Barbosa, S2; Rocha, LC1; Nani, TF3; Vargas, DP4; Santos, BR2
Laboratório de Biotecnologia e Genética Vegetal (ICN/UNIFAL-MG)
Instituto de Ciências da Natureza (UNIFAL-MG)
3
Laboratório Citogenética - (DBI/UFLA)
4
Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas (DBI/UFLA).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mamona, Morfometria cromossômica, Cariótipo.
Introdução: A mamoneira (Ricinus communis L.) é uma oleaginosa de destacada importância socioeconômica,
pois possui em torno de 48 a 50% de óleo utilizado na indústria de biodiesel. Embora seja uma espécie de excelente
potencial industrial, grande parte do material cultivado no país ainda é ruderal e de baixa capacidade produtiva.
Programas de melhoramento vêm sendo desenvolvidos, visando o aperfeiçoamento dos cultivares tornando-os
mais produtivos. As técnicas de citogenética têm contribuído para a identificação de polimorfismos genéticos
importantes na caracterização de genótipos, subsidiando a preservação de materiais silvestres (ruderais) e
programas de melhoramento genético auxiliando na caracterização de germoplasma, no entendimento das relações
filogenéticas e na identificação da origem das populações. Objetivos: Averiguar o comportamento do complemento
cromossômico de genótipos silvestres e cultivados, subsidiando programas de melhoramento, a conservação do
germoplasma e estudos evolutivos. Métodos: Foram utilizados os cultivares Mirante e IAC-80 e genótipos silvestres
coletados nas cidades de Alfenas (S01) e Lavras (S02), Minas Gerais. Sementes foram germinadas em papel
GermitesteÒ em B.O.D. a 30ºC sob luz continua. As pontas de raiz foram tratadas com colchicina 0,05% e fixadas
em Carnoy. As lâminas foram confeccionadas pela técnica de esmagamento, previamente hidrolisadas em HCL 1N
a 60ºC e coradas com Giemsa. Resultados: As análises dos genótipos cultivados e silvestres revelaram metáfases
com 20 cromossomos (2n=20), todos metacêntricos. Os genótipos Mirante e S-02 apresentaram o primeiro par
cromossômico satelitado, o S-01 teve o 1º e 2º pares com satélite. Para IAC-80 esse marcador não foi observado. O
comprimento total do lote haplóide (CTLH) dos genótipos IAC-80 e Mirante apresentaram valores 20,34 µm e 26,05
µm e dos genótipos S-01 e S-02 19,43 µm e 23,81 µm. No comprimento relativo, observou-se em média que o maior e
o menor par de cromossomos de S-01 representaram 13,63 % e 7,47% do CTLH, para S-02 o maior e menor par foram
12,44% e 7,66%, para Mirante 14,51% e 7,44% e para o IAC-80 12,40% e 7,80%. Conclusões: Para os genótipos analisados
foram observadas diferenças estruturais e morfométricas entre o CTLH e o maior e menor cromossomo indicando a
existência de polimorfismo cariotípico entre populações silvestres e cultivadas de mamoneira. Análises envolvendo
técnicas de bandeamento e citometria de fluxo associadas a inclusão de outros genótipos são etapas previstas
para ampliar o espectro de informações para que se possa inferir sobre a evolução cariotípica dessas populações.
Apoio financeiro: FAPEMIG
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Duplicação cromossômica em Brachiaria ruziziensis
Pereira, RC¹; Timbó, ALO¹; Costa, PN¹; Davide, LC¹; Pinto, JEBP¹; Nunes, JD; Sobrinho, FS²
¹Laboratório de Citogenética Vegetal – Departamento de Biologia - Universidade Federal de Lavras - MG
²Embrapa Gado de Leite –Juiz de Fora –MG.
[email protected]
Palavras-chave: Brachiaria, colchicina, citometria de fluxo, melhoramento genético e indução de poliploidia.
No Brasil, as espécies de Brachiaria mais cultivadas são B. decumbens, B. brizantha, B. humidicola e B. ruziziensis,
sendo que todas apresentam limitações como susceptibilidade a cigarrinha das pastagens ou pouca tolerância a
solos ácidos, mal drenados e pobres. Assim, é necessário que essas características sejam combinadas, em novas
cultivares, por meio de hibridações interespecíficas. A Brachiaria ruziziensis é diplóide e sexual e as cultivares
comerciais de B. brizantha e B.decumbens, que são as espécies mais difundidas no Brasil, são tetraplóides e apomíticas.
Para possibilitar as hibridações interespecíficas é necessário a tetraploidização artificial da B. ruziziensis. Assim, o
objetivo deste trabalho foi a obtenção de genótipos duplicados de B. ruziziensis do Programa de Melhoramento da
Embrapa Gado de Leite. Para isso, sementes germinadas de Brachiaria ruziziensis foram imersas em 5 mL de solução
de colchicina a 0,1% por um período de exposição de 2 e 3 horas. Foram avaliadas 4 repetições por tratamento e 150
sementes/repetição. A determinação do nível de ploidia foi realizada pela citometria de fluxo. Não houve diferença
entre os tratamentos, a taxa de sobrevivência foi de 8% sendo obtidos 11 genótipos tetraplóides e 18 mixoplóides.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPEMIG
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Chromosome number of acai palm (Euterpe oleracea
Mart.)
Oliveira, LC¹; Lima, GO¹; Rodrigues, MS¹; Torres, GA¹; Davide, LC¹; Oliveira, MSP²
¹ Cytogenetic Laboratory – Biology Department, Lavras Federal University
² Molecular Genetic Laboratory – Agroforestry Research Centre of Oriental Amazon, Brazilian Enterprise of Agricultural Research
[email protected]
Keywords: Acai, Euterpe, chromosome number, cytogenetics, breeding.
Acai palm (Euterpe oleracea Mart.), a tropical palm from Amazon, is known internationally due to its berries
and palm heart. The chromosomal complement of this species is controversial and little understood, presenting
a chromosomal variation between 26 and 36 chromosomes. This information is crucial for preservation,
use and manipulation of the germplasm in genetic conservation and breeding programs – especially for the
obtention of intra and inter-specific hybrids. Thus, the aim of this work was to determine the chromosomal
number of E. oleracea by counting the mitotic and meiotic chromosomes. The seeds and rachillae used in the
analyses were collected from plants available at the germplasm bank of Agricultural Research Centre (CPATU)
at Embrapa Amazônia Oriental in Belém, Pará state, Brazil. For the obtention of mitotic metaphase, the seeds
were germinated under germination paper constantly moistened with distilled water in BOD at 30º C and with
12-hour photoperiod. After the germination, the radicles were pre-treated with 2mM 8-hydroxyquinoline for 5
hours under refrigeration for inhibiting the mitotic fuse. Afterwards, it was used Pectinase/Celulase 50/100U
at 37 oC for 5 hours to digest the cell wall. The slides were prepared using the smear technique in acetic acid
(45%) and stained with Giemsa (5%). For the meiotic analysis, the rachillae were fixed in ethanol:acetic acid
(3:1) and stored at -20º C. The slides were prepared using the smear technique and stained in propionic-carmine
(1%). The mitotic metaphases confirmed 2n=36 chromosomes, which were distinguished by their length and
the centromere position. Such counting was corroborated by the twenty-five meiocytes observed during the
diakinesis as they have presented 18 bivalents. Conclusion: Euterpe oleracea Mart. has 2n=36 chromosomes.
Financial support: Embrapa, CNPq and FAPEMIG
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Número cromossômico, meiose e viabilidade polínica
em espécies de Senna Mill. (Caesalpinioideae –
Fabaceae)
Marques-de-Resende, KF1; Torres, GA1; Sousa, SM2; Carvalho, IV3; Davide, LC1
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora
3
Laboratório de Agentes Recombinantes, Departamento de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: comportamento meiótico, cromossomos, disploidia, paleopoliploidia, número básico.
O gênero Senna Mill. compõe, juntamente com os gêneros Cassia sensu stricto e Chamaecrista Moench, o
gênero Cassia sensu lato. Investigações taxonômicas com caracteres morfológicos, vegetativos e reprodutivos,
características ontogenéticas, sistemática molecular e citogenética têm suportado esta segregação do gênero
Cassia sensu lato. No entanto, as relações filogenéticas entre os gêneros ainda permanecem indefinidas. Alguns
trabalhos têm descrito o número cromossômico, a cariomorfologia e o comportamento meiótico de algumas
espécies do gênero Senna. Entretanto, não há estudos comparativos envolvendo as diferentes espécies ou
populações da mesma espécie, com relação a estas características. O objetivo foi caracterizar e comparar o
número cromossômico, o comportamento meiótico e viabilidade polínica de onze espécies do gênero Senna Mill.
incidentes no sul de Minas Gerais. Meiócitos em diferentes fases foram analisados em lâminas preparadas pelas
técnicas de esmagamento e suspensão celular com secagem ao ar. Foram avaliados o número cromossômico na
diacinese e a regularidade do processo meiótico, sendo calculado o índice meiótico. A viabilidade polínica foi
determinada por testes de coloração (Alexander, Trifenil cloreto de tetrazólio e Diacetato de Fluoresceína) e de
germinação in vitro. As espécies apresentaram n = 12, 13, 14, e 28 cromossomos, com o comportamento meiótico
de S. alata, S. siamea, S. silvestres bifaria e S. spectabilis sendo descritos pela primeira vez. Acessos com n=14 e
n=28 foram identificados em S. rugosa. Esses valores sugerem a ocorrência de disploidia no processo evolutivo
do gênero. S. macranthera macranthera, S. splendida splendida, S. cernua, S. alata, S. siamea e S. silvestres bifaria
apresentaram pareamento normal de bivalentes na diacinese e segregação cromossômica regular nas anáfases I
e II. Univalentes e quadrivalentes, cromossomos atrasados e/ou perdidos foram observados nas outras espécies
analisadas. A existência de quadrivalentes em S. corymbosa, S. pendula, S. multijuga, S. spectabilis, e S. rugosa
evidencia a homeologia entre cromossomos deste complemento, sugerindo ciclos prévios de poliploidização
e, portanto, ocorrência de paleopoliploidia no gênero. A hipótese é fortalecida no caso da última espécie pela
observação de acessos com n=14 e n=28 cromossomos. Para sete espécies estudadas foram encontrados índices
meióticos e viabilidade polínica superiores a 90%. Apesar de algumas destas espécies apresentarem irregularidades
meióticas, estas não afetaram a produção gametofítica. As demais espécies apresentaram variação com relação à
porcentagem de viabilidade polínica encontrada nos outros testes de coloração e germinação. Assim, o número
básico sugerido para o gênero Senna é x=7, destacando-se a importância da autopoliploidização e disploidia na
evolução do gênero. Com exceção de S. rugosa não há variação intraespecífica de número cromossômico para
estas espécies de Senna, quando comparadas às respectivas espécies do estado do Pará e do sul do Brasil. A
maioria das espécies mostraram comportamento meiótico regular, alto índice meiótico e alta viabilidade polínica.
Apoio financeiro: FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Estudo do núcleo interfásico de Piper hispidinervum e
Piper aduncum
Goulart, JC¹; Silva, N de ST e1; Torres, GA¹
¹Laboratório de Citogenética Vegetal – Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
[email protected]
Palavras-chave: Piper, núcleo interfásico, cromatina, volume nuclear, óleo essencial
Introdução: A pimenta longa (Piper hispidinervum) é uma espécie rica em safrol e típica de ambientes abertos
e a pimenta de macaco (Piper aduncum), rica em dilapiol e típica de áreas de vegetação secundária. Em função
do elevado valor comercial dos compostos encontrados no óleo essencial dessas espécies, elas tem sido alvo de
esforços para implementação de sistemas de produção em escala comercial e programas de melhoramento para
obtenção de cultivares. Um problema enfrentado na manipulação do germoplasma da espécie mais promissora (P.
hispidinervum) em programas de melhoramento genético é a controvérsia taxonômica a respeito do seu status de
espécie, existindo a hipótese de que seja, na realidade, uma variedade de P. aduncum, ou um quimiotipo. Objetivo:
Caracterizar o núcleo interfásico dessas espécies no sentido de contribuir assim para a definição taxonômica
das espécies de Piper presentes no Banco de Germoplasma da EMBRAPA – Acre. Métodos: As sementes foram
colocadas para germinar e as radículas foram fixadas em Carnoy (álcool etílico:ácido acético 3:1). Para o preparo
das lâminas as radículas passaram por um banho de 20 segundos em acetona PA e foram digeridas com solução
enzimática de pectinase/celulase (40/4%), a 37ºC, por 4 horas. Foram então submetidas a hidrólise ácida com
HCl 5N a temperatura ambiente por 15 minutos e coradas com Reativo de Schiff por 1 hora, para uma melhor
visualização do meristema. As lâminas foram montadas em ácido acético 60% pelo método de esmagamento, e
coradas com Giemsa 10% por 3 minutos. Os núcleos interfásicos foram classificados em função da organização
da cromatina e tiveram volume calculado a partir da medida do diâmetro dos núcleos. Os resultados foram
submetidos à análise de variância, sendo as médias avaliadas pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade.
Resultados: Quanto à classificação dos núcleos interfásicos, Piper hispidinervum e Piper aduncum apresentaram
núcleos intefásicos semi-reticulados, com retículo cromatínico medianamente corado. O volume nuclear das duas
espécies diferiram entre si a 5% de probabilidade sendo que Piper hispidinervum apresentou um volume maior em
relação à Piper aduncum, indicando alguma distinção na estrutura da cromatina já que a organização se mostrou
a mesma. O uso de bandeamento cromossômico deve revelar possíveis diferenças na quantidade e distribuição
da heterocromatina nas duas espécies. Conclusões: O tipo de núcleo interfásico não permite diferenciar
Piper hispidinervum e Piper aduncum, mas a estrutura da cromatina das duas espécies parece ser distinta.
Apoio financeiro: CNPq, EMBRAPA
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108
Análise da viabilidade polínica em cultivares de
Phaseolus Vulgaris L.
Dalla Nora, G1; Frescura, VD1; Pastori, T1; Tedesco, SB1; Ribeiro, ND2
Laboratório de Citogenética Vegetal e Genotoxicidade – Departamento de Biologia, Centro de Ciências Naturais e Exatas, Universidade
Federal de Santa Maria
2
Setor de Melhoramento Genético – Departamento de Fitotecnia, Centro de Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria
[email protected]
1
Palavras-chave: Feijão comum, Iapar 44, Guapo Brilhante, BRS Expedito, Guateian 6662.
Introdução: O feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), leguminosa pertencente a Família Fabaceae, é um alimento
protéico amplamente consumido pela população brasileira, sendo o cultivo do feijoeiro de grande interesse sócioeconômico, sobretudo porque é uma planta cultivada, preferencialmente, por agricultores de pequeno e médio
porte, constituindo alimento protéico básico para a classe de baixa renda no Brasil. O feijão comum tem grande
importância na geração de renda e trabalho principalmente para a agricultura familiar. O melhoramento genético do
feijão tem priorizado o aumento da capacidade de produzir sementes e a resistência a doenças. Porém, recentemente,
maior atenção tem sido dada ao melhoramento da qualidade nutricional e tecnológica, produtividade e resistência
a doenças dos grãos de feijão, no intuito de disponibilizar um alimento com composição química adequada para
minimizar os problemas de carências nutricionais na alimentação, uma maior produtividade e um baixo custo na
produção. Objetivos: Analisar a viabilidade polínica em quatro cultivares de feijão comum, sendo elas: Iapar 44, Guapo
Brilhante, BRS Expedito e Guateian 6662. Métodos: As amostras utilizadas foram botões florais de 02 acessos de
cada cultivar, coletados em vasos mantidos em casa de vegetação no Departamento de Fitotecnia da Universidade
Federal de Santa Maria. Para o estudo da viabilidade polínica, os botões florais foram fixados em etanol-ácido acético
(3:1), mantidos em temperatura ambiente por 72 horas. Posteriormente, o material foi transferido para o álcool
70% e conservado sob refrigeração. O preparo das lâminas foi realizado pela técnica de esmagamento das anteras.
Foram feitas 01 lâmina de cada acesso por cultivar e contados 300 grãos de pólen. A coloração utilizada foi orceína
acética 2%, onde foram considerados inviáveis os grãos de pólen que apresentaram coloração fraca e/ou ausente e
viáveis os grãos de pólen bem corados. Todos os grãos de pólen foram analisados com auxílio de um microscópio
com objetiva de 40x. Resultados: Os estudos mostraram que a viabilidade polínica foi alta, acima de 97,6 % para
todos os acessos de todas as cultivares analisadas, não apresentando diferença significativa entre as mesmas.
Apoio financeiro: CAPES
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Número de cromossomos de Gochnatia polymorpha
(Less.) Cabrera (Asteraceae) do Rio Grande do Sul,
Brasil
Machado, DFM1; Frescura, VD2; Tavares, AP1; Tedesco, SB2; Silva, ACF1
Laboratório de Interação Planta-microrganismo – Departamento de Biologia, Universidade Federal de Santa Maria
Laboratório de Citogenética Vegetal – Departamento de Biologia, Universidade Federal de Santa Maria
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Gochnatia polymorpha, Asteraceae, número cromossômico, citogenética; plantas medicinais
Introdução: O potencial econômico de espécies medicinais no Brasil é imenso, tanto que tais espécies são
consideradas uma riqueza a ser preservada e utilizada. A caracterização citogenética das plantas medicinais amplia
as perspectivas de conservação da diversidade vegetal de espécies comumente utilizadas na medicina popular.
Gochnatia polymorpha (cambará) é uma espécie arbórea da família Asteraceae que possui propriedades medicinais
sendo que suas folhas têm sido usadas na medicina popular para o preparo de chás e xaropes que são usados contra
gripes, resfriados, tosse e outras afecções do sistema respiratório. Além disso, é recomendada para reconstituição
de ecossistemas degradados, e é uma espécie ornamental. Para otimizar a utilização dos recursos medicinais
nativos de uma país são indispensáveis estudos de caracterização do germoplasma de uma espécie. Objetivos:
Este trabalho foi desenvolvido para determinar o número cromossômico de indivíduos de Gochnatia polymorpha
nativa do Rio Grande do Sul, já que não foram encontrados relatos na literatura a respeito de contagens do número
cromossômico desta espécie. Métodos: Foram coletadas sementes de cambará no município de Santa Maria-RS,
em seu ambiente natural, as quais foram colocadas para germinar em ambiente controlado. Após a germinação, as
pontas de raízes foram coletadas e submetidas a um pré-tratamento a frio durante dezesseis horas, foram fixadas
em álcool absoluto:ácido acético glacial (3:1) por 24h a temperatura ambiente e, posteriormente, conservadas
em álcool 70% no refrigerador até o seu uso. A análise do número cromossômico foi feita a partir da confecção
de lâminas das pontas das raízes, sendo que para o preparo das lâminas utilizou-se a técnica do esmagamento,
hidrólise em HCl 1N por 10 min, esmagamento das pontas de raízes e coloração com orceína acética a 2%. As
lâminas com metáfases apropriadas foram analisadas e fotografadas. Resultados: Os dados obtidos para o número
de cromossomos somáticos de Gochnatia polymorpha mostraram que todas as células analisadas apresentaram
2n=32 cromossomos, determinados pela primeira vez, o que sugere ser esse o número diplóide da espécie.
Apoio financeiro: REUNI, PPG Agrobiologia
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Tamanho do genoma nuclear de Bromelia balansae
Mez (Bromeliaceae)
Nunes, ACP1; Damasceno, S2; Carvalho, CR3; Clarindo, WR4
Estudante do curso de Engenharia Florestal, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo
Estudante do curso de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo
3
Departamento de Biologia geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Viçosa
4
Departamento de Produção Vegetal, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo
e-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chave: Bromeliaceae, genoma nuclear, citometria de fluxo, Bromelia balansae, valor 2C.
Introdução: A família Bromeliaceae, representada por três subfamílias; Bromelioideae, Tillandsioideae e
Pitcairnioideae; engloba 56 gêneros e 3270 espécies, sendo 50% dessas espécies encontradas no Brasil, principalmente
nas regiões de Mata Atlântica e Restinga. A determinação da quantidade de DNA nuclear tem grande importância
para taxonomia, ecologia, biodiversidade e evolução das bromélias. Ela pode ser feita pelo método de citometria
de fluxo, o qual analisa as partículas em suspensão individualmente, em alta velocidade, fornece os sinais
acumulados de cada partícula em tempo real e não necessita de células em divisão. A literatura tem reportado
trabalhos com essa técnica na família Bromeliaceae para análise de aneuploidia e obtenção de informações
sobre biologia reprodutiva. Objetivos: Determinar a quantidade de DNA nuclear da Bromelia balansae por meio
da citometria de fluxo, visando ampliar as informações acerca do genoma dessa espécie. Métodos: Fragmentos
foliares de B. balansae (amostra) e Raphanus sativus (padrão, 2C = 1,11 pg) foram retalhados simultaneamente
em tampão Otto I. A suspensão nuclear foi corada com Otto I:Otto II suplementando com iodeto de propídeo e
analisada em citômetro de fuxo Partec PAS (Partec Gmbh). Os histogramas gerados foram usados para mensurar
o tamanho do genoma nuclear de B. balansae, por meio da comparação dos picos correspondentes aos estágios
de G0/G1 relativos ao DNA nuclear do padrão e da amostra. Resultados: Os picos representando os núcleos em
G0/G1 apresentaram coeficiente de variação (CV) oscilando de 3,79 a 4,90, valores considerados aceitáveis em
análises envolvendo citometria de fluxo (5%). O baixo CV pode ser explicado pelo uso do tampão Otto, o qual
possui compostos como ácido cítrico. Esse composto atua na integridade da estrutura da cromatina favorecendo
a coloração estequiométrica do DNA nuclear. A partir dos valores obtidos em cada uma das seis repetições, com
aproximadamente 10 mil núcleos analisados em cada, foi constatado que o tamanho do genoma nuclear médio de
B. balansae é 2C = 0,85 pg, e o desvio padrão foi de ±0,0141. O valor 2C = 0,85 pg é relativamente baixo se comparado
ao da maioria das Angiospermas. No entanto, para a família Bromeliaceae as poucas bibliografias relatam valores
2C inferiores a 1,48 pg. Conclusões: A metodologia aplicada na citometria fluxo foi adequada, uma vez que
gerou núcleos bem estequiometricamente corados e intactos para análise, resultando em histogramas com alta
resolução com CV inferiores a 5%. Constatou-se que o genoma nuclear de Bromelia balansae apresenta 2C = 0.85 pg.
Apoio financeiro: CNPq, FAPES, UFES
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Determinação do conteúdo de DNA nuclear de
Canistropsis billbergioides (Schultes f.) Leme por
citometria de fluxo
Marques, AM1; Nogueira, EU2; Carvalho, CR3; Clarindo, WR4
Estudante do curso de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo
Estudante do curso de Mestrado em Produção Vegetal, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo
3
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Viçosa
4
Departamento de Produção Vegetal, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo
e-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chave: Bromeliaceae, genoma nuclear, citometria de fluxo, Canistropsis billbergioides, valor C.
Introdução: A família Bromeliaceae apresenta maior ocorrência na zona tropical e subtropical do continente
Americano, com 50% das espécies nativas do Brasil. Estas se distribuem especialmente na Mata Atlântica e na
Restinga, ocorrendo também na região Amazônica, na Caatinga e Cerrado, tão bem quanto em locais de campos
elevados. Visto o interesse econômico, botânico e evolutivo, o genoma das Bromeliáceas vem sendo caracterizado
por meio de ferramentas moleculares, citogenéticas e de citometria de fluxo. Essa última foi aplicada em apenas
oito espécies visando gerar subsídios para os estudos evolutivos na família. Objetivos: O presente estudo tem
como objetivo adaptar metodologia e, consequentemente, mensurar, em picogramas (pg) e pares de base (pb), o
tamanho do genoma nuclear de Canistropsis billbergioides por meio da citometria de fluxo. Métodos: Folhas jovens
de C. billbergioides (amostra) e de Raphanus sativus L. (padrão, 2C = 1,11 pg) foram retalhadas simultaneamente
em placa de Petri contendo o tampão de extração nuclear, Otto I, à 40C, e em seguida foi filtrado. Posteriormente,
a suspensão foi centrifugada e o sobrenadante descartado, e novamente adicionou-se OTTO I levando ao vortex.
Após acrescentou-se o tampão de coloração OTTO I:OTTO II (1:2) contendo idodeto de propídeo. A suspensão
nuclear foi analisada em citômetro de fluxo Partec PAS flow cytometer (Partec Gmbh), para quantificação do
conteúdo de DNA nuclear. Resultados: Os histogramas apresentaram picos dos núcleos em G0/G1 com coeficiente
de variação (CV) oscilando entre 2,98% a 3,42%. Esse resultado indica que o procedimento de extração e coloração
nuclear possibilitou a produção de suspensões contendo núcleos intactos, isolados e estequiometricamente
corados. Comparando os picos referentes aos núcleos G0/G1 de R. sativus e C. billbergioides, verificou-se, com base
nas seis repetições, que o conteúdo de DNA nuclear médio da Bromeliácea foi 2C = 1,26 pg e o desvio padrão 0,0234.
Conclusão: A metodologia utilizada possibilitou verificar que o genoma nuclear de C. billbergioides possui 1,23 x 109 pb.
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Determinação do número de cromossomos de
Pitcairnia flammea Lind
Mitre, LM1; Carvalho, CR2; Machado, EP2; Clarindo, WR3
Estudante do curso de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Viçosa
3
Departamento de Produção Vegetal, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bromeliaceae, Pitcairnia flammea, citogenética clássica, cariótipo, poliplóide.
Introdução: A família Bromeliaceae está presente nas regiões tropicais e subtropicais das Américas,
compreendendo cerca de 3000 espécies. A única exceção é Pitcairnia feliciana, encontrada na África. Cerca
de 50% do total das espécies podem ser encontradas no Brasil e a P. flammea é uma das que apresenta maior
variação na sua morfologia, ocorrendo no bioma Mata Atlântica do nordeste ao sul do Brasil. Uma vez que a
família apresenta uma acentuada e crescente importância econômica, bromélias foram estudadas sob diversos
aspectos botânicos, ecológicos e evolutivos. A existência de estudos de citogenética, no entanto, inclui cerca de
12% das espécies conhecidas, e os trabalhos pioneiros revelaram grande variação em números de cromossomos e
um desentendimento no número básico. Objetivo: Estabelecer o número de cromossomos de P. flammea por meio
da citogenética clássica, visando ampliar as informações acerca do cariótipo da espécie. Métodos: Meristemas
radiculares, oriundos de plântulas cultivadas in vitro, foram submetidos ao tratamento de bloqueio com uma
solução de APM. Posteriormente, as raízes foram fixadas em solução de metanol: ácido acético. Na etapa de
maceração enzimática, as raízes foram transferidas para tubos de microcentrífuga contendo a solução enzimática
de pectinase. Após a maceração, as mesmas foram lavadas em água destilada, novamente fixadas e armazenadas.
As lâminas receberam o meristema apical, que foi dissociado e as mesmas foram secadas ao ar, e coradas com
solução de Giemsa 5%. Resultados: O tratamento de bloqueio, fixação, maceração enzimática, dissociação celular e
secagem ao ar, proporcionaram a obtenção de metáfases com cromossomos morfologicamente preservados, pouco
sobrepostos e com constrições primárias bem definidas. Esse fato possibilitou verificar que P. flammea possui
2n = 50 cromossomos. Outros autores reportaram dificuldades no estabelecimento do número cromossômico
para espécies da família Bromeliaceae, na maioria dos casos justificada pelo tamanho diminuto e número
relativamente elevado de cromossomos (geralmente 2n = 50) e dificuldade na obtenção de um bom espalhamento
cromossômico. O número básico n = 25, foi relatado por diversos autores, sugerindo-se a poliploidia, associada à
hibridização, como o mecanismo evolutivo mais provável para sua origem. Conclusão: A metodologia utilizada
proveu preparações citogenéticas apresentando cromossomos metafásicos com morfologia adequada para
análise. Assim como para a maioria das espécies da família Bromeliaceae, P. flammea possui 2n = 50 cromossomos.
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Viabilidade do pólen e meiose de Plectranthus
neochilus
Nani, TF1; Davide, LC1; Goulart, JC1; Barbosa, S2
Laboratório de Citogenética, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
Laboratório de Biotecnologia e Genética Vegetal, Instituto de Ciências da Natureza Departamento de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Alfenas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Boldo, irregularidades meióticas, inviabilidade polínica, corante de Alexander, carmim propiônico.
Plectranthus neochilus é uma espécie pertencente à família Lamiaceae, empregada popularmente no tratamento
de doenças gastrointestinais. Suas folhas frescas são utilizadas como infusão ou extrato aquoso, sendo suas
potencialidades medicinais atribuídas à constituição química. O melhoramento genético de espécies medicinais
pode proporcionar melhor exploração de seus recursos. A viabilidade do pólen é um dos parâmetros utilizados
em programas de melhoramento e em estudos botânicos, além de gerar subsídios para a compreensão do tipo
de reprodução da espécie. Neste contexto, estudos meióticos agregam valor e fundamento para resultados de
viabilidade do pólen. O objetivo deste trabalho foi estimar a viabilidade polínica de P. neochilus por meio de diferentes
corantes, além de correlacioná-la com os eventos da meiose. A estimativa da viabilidade do pólen foi feita a partir
de inflorescências de espécime coletado no Horto de Plantas Medicinais da UFLA, as quais foram fixadas por no
mínimo 24 horas, a 4ºC, em solução de álcool etílico: ácido propiônico (3:1). Para avaliação meiótica, as lâminas
foram feitas pela técnica de esmagamento e coradas com orceína propiônica 2%. A viabilidade do pólen foi avaliada
pela capacidade de coloração de polens maduros utilizando-se os corantes de Alexander e Carmim propiônico,
sendo que para o primeiro foram considerados como viáveis os que apresentavam coloração roxa e inviáveis
aqueles corados de verde; para o segundo foram considerados viáveis, os corados, e inviáveis, os não corados. A
porcentagem de viabilidade do pólen baseou-se em 1000 grãos de pólen em 5 repetições, ou seja, 200 polens por
lâmina. Os resultados foram interpretados segundo a análise de variância utilizando as ferramentas do solftware
Sisvar 5.0 e a comparação de médias foi realizada pelo teste de Scott Knott com 5% de probabilidade. As estimativas
das médias para viabilidade do pólen de P. neochilus foi de 1,95%, para o corante carmim propriônico, e 2,05% para
o de Alexander. Não houve diferença estatística significativa entre os corantes. Além disso, os resultados indicam
baixa viabilidade pelos testes realizados. A presença de irregularidades meióticas é um fator responsável pela baixa
porcentagem de polens viáveis. Nesta espécie, foram encontrados cromossomos perdidos e com ascensão precoce
durante a meiose I, pontes e cromossomos atrasados na anáfase I, desalinhamento e fusão de placas metafásicas na
meiose II, cromossomos perdidos, fuso tripolar na anáfase II, resultando na formação de díades, tríades, tétrades com
células de tamanhos desiguais, além de políades. Nesse sentido, a baixa taxa de viabilidade do pólen decorrente de
irregularidades meióticas parece interferir na formação de sementes, o que explica a dificuldade em sua obtenção.
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Processo de tuberização em raízes de Viguiera
arenaria (Asteraceae): padrão de metilação de citosina
e conteúdo de DNA
Lucena, LRF1; Andrade, LM1; Mondin, M1; Appezzato-da-Glória, B2; Vieira, MLC1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
Departamento de Ciências Biológicas, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Viguiera arenaria; Asteraceae; tuberização; metilação de DNA; endopoliploidia
Evidências experimentais indicam que a metilação de citosina em eucariotos superiores evoluiu como um sistema de
defesa do genoma contra elementos transponíveis e ataques de vírus, estando relacionada à regulação da expressão
gênica durante a ontogênese. Por sua vez, a endorreduplicação, processo que o núcleo passa por ciclos de síntese
de DNA sem ocorrer citocinese, resultando em células endopoliplóides, ocorre durante a diferenciação celular.
Particularmente, tecidos vegetais altamente especializados, como elementos vasculares, e células com altas taxas
metabólicas, como as do endosperma sofrem endorreduplicação. Viguiera arenaria é uma Asteraceae de Cerrado
que apresenta formação de raízes tuberosas. A tuberização é um processo que ainda carece de mais estudos quanto
aos mecanismos moleculares e epigenéticos envolvidos. Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar o padrão de
metilação de citosina e o conteúdo de DNA em células cambiais de raízes tuberizadas em V. arenaria que possam
estar relacionadas com o processo de tuberização desta espécie. Para isso, raízes tuberizadas e não-tuberizadas de
V. arenaria foram coletadas na Estação Ecológica de Itirapina (22°13’S e 47°54’W), fixadas em FAA50, desidratadas
em série alcoólica crescente e infiltradas em resina de meta-acrilatoglicol (Leica). Os blocos foram seccionados
(10 µm) e as lâminas coradas com anticorpos fluorescentes contra 5-metilcitosina e contracoradas com DAPI. As
imagens foram capturadas em microscópio de fluorescência Axiophot (Zeiss) e analisadas com auxílio do software
ImageJ para determinar a área dos núcleos, a proporção das regiões metiladas e a intensidade da fluorescência
emitida pelo DAPI e pelos anticorpos. A densidade integrada do DAPI indicou um aumento de, aproximadamente,
três vezes no conteúdo de DNA nas células cambiais de raízes tuberizadas relativamente às não-tuberizadas. Visto
que o aumento do conteúdo de DNA pela endorreduplicação obedece a uma progressão aritmética de base 2 (2C, 4C,
8C etc.) e por conta desta diferença entre os dois tipos de núcleos ser de três vezes, sugere-se haver um mosaico de
células endopoliplóides, por exemplo, 4C e 8C, cuja média é 6C. A relação área metilada/área do núcleo apresentou
uma redução média de 15% nas células de raízes tuberizadas relativamente às não-tuberizadas. Porém, houve um
aumento de 2,5 vezes na densidade integrada da fluorescência dos anticorpos nestas células de raízes tuberizadas,
indicando que o aumento na quantidade de regiões metiladas acompanhou, parcialmente, o aumento do conteúdo
de DNA. Conclusão: Em V. arenaria, as células cambiais radiculares apresentam mudanças no padrão de metilação
do DNA e um aumento de aproximadamente três vezes no conteúdo de DNA durante a tuberização das raízes.
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Distribuição de microssatélites no genoma de
leguminosas mediante hibridização in situ fluorescente
Bortoleti, KCA1,2; Benko-Iseppon, AM1; Belarmino, LCS1; Oliveira, ARS1; Abdelnoor, RV3; Nascimento IR4;
Brasileiro-Vidal, AC1
Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
Colegiado de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Vale do São Francisco
3
Embrapa Soja.4Universidade Federal Rural de Pernambuco
[email protected]
1
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Palavras-chave: FISH, oligonucleotídeos, Leguminosas, análise in silico, DNA repetitivo
Os microssatélites consistem em unidades de repetição (1 a 5pb) distribuídas em tandem, que podem estar
dispersas ao longo dos genomas ou associadas a regiões heterocromáticas. Tais características têm permitido sua
utilização na construção de mapas cromossômicos mediante hibridização in situ fluorescente (FISH), auxiliando
no entendimento da organização genômica entre espécies proximamente relacionadas. O presente trabalho
caracterizou a distribuição de oligonucleotídeos sintéticos (AG)8, (AAG)5, (ACC)5, (CTC)5 e (TGA)6 em Phaseolus
vulgaris, P. lunatus, Vigna unguiculata, V. radiata e Glycine max, identificando marcas cromossômicas para a
comparação destas leguminosas. Lâminas foram hibridizadas com sondas de oligonucleotídeos e rehibridizadas
com DNAr 5S e 45S, provenientes de Lotus japonicus e Arabidopsis thaliana, respectivamente. Em soja, esta análise
estendeu-se a uma investigação genômica, a partir de sequências disponibilizadas no banco de dados SoyBase
(http://www.soybase.org/), usando o programa BLASTN com os seguintes parâmetros: formato de saída de
alinhamentos sem lacunas, matriz de comparação blossum62, valor W padrão, e-value 0.1 ou menor e filtro de
baixa complexidade desligado. Os oligonucleotídeos [(AAG)5]10, [(AAC)5]10, [(AG)8]15, [(CTC)5]10 e [(TGA)6]10 foram
utilizados como sondas, adotando como ponto de corte valores de identidade de pareamento inferiores a 77%,
objetivando caracterizar número, tamanho e localização destas unidades de repetições no genoma. A FISH com
oligonucleotídeos evidenciaram marcações pericentroméricas e proximais, embora um padrão de distribuição
disperso tenha prevalecido ao longo dos cromossomos das espécies analisadas, com exceção de (AG)8 em
soja que não revelou marcações visíveis. O oligonucleotídeo (AAG)5 revelou uma marcação pericentromérica
evidente em P. lunatus, tratando-se de um marcador cromossômico para tal espécie. Na hibridização com
(ACC)5 notou-se a presença de seis marcações fortes em V. unguiculata, estando uma delas localizada no par
cromossômico 10, portador do sítio de DNAr 45S. O microssatélite (TGA)6 revelou uma marcação bem evidente
no cromossomo 10 de P. lunatus, identificado pela presença de DNAr 5S. Algumas divergências observadas no
padrão de distribuição e na intensidade dos sinais entre os genomas das espécies confirmam a hipótese de que
as sequências de DNA repetitivo apresentam uma composição heterogênea. Na análise genômica de soja, foram
observados 92, 84, 83, 142 e 103 sítios de repetições para os oligonucleotídeos (AG)8, (AAG)5, (ACC)5, (CTC)5 e
(TGA)6, respectivamente, de tamanhos variáveis entre 30 a 454 pb, localizados, principalmente, em regiões de
alta a moderada densidade gênica, por vezes associados a genes e elementos transponíveis. Considerando o
pequeno tamanho, fica evidente que estas sequências não correspondem aos sítios observados pela FISH, uma
vez que esta técnica evidencia apenas sequências com comprimentos acima de 1-3kb. Sugere-se que as marcações
localizadas por FISH estejam associadas a regiões de heterocromatina e que sejam constituintes dos mais de
1.000 scaffolds existentes no sequenciamento da soja, não sendo, por essa razão, detectadas pela análise in silico.
Apoio financeiro: CNPq, Embrapa, UFPE
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Distribuição de retroelementos em cromossomos de
Coffea L. (Rubiaceae)
Yuyama, PM1; Pereira, LFP2; Sera, T3; Vilas-Boas, LA1; Vanzela, ALL1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, EMBRAPA-Café
3
Instituto Agronômico do Paraná, IAPAR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNAr, FISH, heterocromatina, retroelemento e Ty3-gypsy-like.
Introdução: O gênero Coffea L. (Rubiaceae) possui mais de 100 espécies, nativas das florestas tropicais da África e
Madagascar. Coffea arabica é a espécie mais importante economicamente, autocompatível e a única tetraplóide
do gênero com 2n = 44. As demais espécies são diplóides com 2n = 22 e autoincompatíveis. Estudos moleculares
e de hibridação genômica in situ revelaram que as espécies de Coffea apresentam elevada similaridade genômica,
podendo ser consequência da presença de famílias de DNA repetitivo em comum. Objetivos: Isolar e caracterizar
elementos repetitivos em C. arabica variedade typica para utilizá-los como sondas em experimentos de hibridação
in situ (FISH) em outras seis espécies do gênero, como C. canephora, C. eugenioides, C. kapakata, C. liberica var.
dewevrei, C. racemosa e C. stenophylla. Métodos: Foram feitas análises citogenéticas das sete espécies de Coffea.
Para confecção das lâminas, raízes foram digeridas em celulase/pectinase e esmagadas em ácido acético 60%. No
bandamento C-CMA/DAPI, as lâminas foram tratadas em ácido acético 45%, Ba(OH)2 e 2×SSC, e coradas com
CMA e DAPI. Para o isolamento de DNA repetitivo, o DNA genômico de C. arabica var. typica foi usado como
molde para a reação de DOP-PCR. Os fragmentos gerados foram inseridos nos vetores, clonados e caracterizados
a partir do sequenciamento. Resultados: O bandamento cromossômico mostrou predomínio de bandas terminais
e intersticiais com diferenças no tamanho, número, distribuição e composição de bases. Coffea arabica e C.
canephora mostraram bandas CMA+ e DAPI+ intersticiais próximas ao centrômero na maioria dos cromossomos,
enquanto as outras espécies mostraram poucas bandas. As bandas CMA+ foram encontradas nas regiões terminais,
associadas ou não à RON, e intersticiais próximos ao centrômero. As bandas DAPI+ foram encontradas somente
nas regiões intersticiais próximos ao centrômero, exceto em C. liberica var. dewevrei e C. racemosa. A FISH com
a sonda de DNAr 45S mostrou dois e quatro sítios de hibridação, com exceção de C. arabica, com seis sítios. A
partir da DOP-PCR, foram feitos o isolamento e a caracterização de dois retroelementos: i) fragmento de grupo
indeterminado com 292 pb (pCa21) e ii) fragmento do retroelemento Ty3-gypsy-like com 775 pb (pCa06). Esses
clones foram utilizados como sondas na FISH, mostrando blocos e sinais dispersos na maioria dos cromossomos.
Foram observados sinais co-localizados para os dois clones e alguns sinais específicos em determinadas regiões
para cada clone, sugerindo que pCa21 e pCa06 sejam elementos diferentes. Conclusões: A distribuição das regiões
heterocromáticas, sítios de DNAr 45S e dos retroelementos indicam que as famílias de DNA repetitivo se acumularam
de modo independente na formação cariotípica dessas espécies. Este estudo mostrou que a elevada similaridade
genômica entre estas espécies podem em parte ser explicada pela ocorrência comum desses retroelementos.
Órgão financiador: CNPq, ProPPG-UEL e Instituto Agronômico do Paraná
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Isolamento e caracterização citomolecular de um DNA
satélite amplificado recentemente no feijão comum
(Phaseolus vulgaris L.)
Santos, TRB; Santos, KGB; Fonsêca, A; Pedrosa-Harand, A
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: DNA satélite, Phaseolus vulgaris, conjunto gênico mesoamericano, FISH, Southern Blot.
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma das espécies mais importantes do ponto de vista econômico
e nutricional. Entretanto, informações referentes à fração repetitiva do seu genoma são escassas, apesar desta
constituir uma considerável fração do genoma eucariótico. Neste trabalho uma nova sequência repetitiva do
feijão comum foi isolada e caracterizada, sendo a sua distribuição analisada em diferentes acessos e duas espécies
relacionadas. Os DNAs utilizados foram isolados de BACs (cromossomos artificiais de bactéria), plasmídeos e folhas
jovens. As análises citológicas foram realizadas em cromossomos mitóticos por hibridização in situ fluorescente
(FISH) e as moleculares por meio de Southern blot e PCR. A sequência repetitiva foi isolada do BAC 255F18,
recentemente mapeado no cromossomo 11 do feijão comum e que revelou também um bloco de DNA repetitivo
no cromossomo 7. O DNA deste BAC foi digerido com diferentes enzimas de restrição e um fragmento repetido de
1,7 kb, gerado após digestão com HindIII, foi subclonado. De um total de 35 subclones, quatro foram sequenciados.
Um deles, o subclone PvMeso-31, foi utilizado como sonda em FISH na cultivar BAT93 e mostrou a marcação
esperada, um bloco terminal no braço longo do cromossomo 7, confirmando a clonagem do fragmento repetitivo
presente no BAC 255F18. Quando utilizado em diferentes acessos pertencentes aos dois maiores conjuntos gênicos
do feijão comum (Mesoamericano e Andino) e outras duas espécies do gênero (P. acutifolius e P. leptostachyus), um
padrão de hibridização similar foi observado apenas nos acessos do conjunto mesoamericano. Da mesma forma,
em experimento de PCR, utilizando primers para uma região interna da sequência, um amplicon foi obtido apenas
nesses mesmos acessos. O subclone possui 1.705 pb e um conteúdo de CG de 35,6 %. As análises de sequência
revelaram ausência de repetições internas e uma alta identidade (superior a 98%) entre os 4 diferentes subclones.
Nenhuma homologia significante foi encontrada com outras sequências já descritas. Quando utilizado em
experimento de Southern Blot com DNAs genômicos de P. acutifolius, P. leptostachyus e dos diferentes acessos de P.
vulgaris e DNA do BAC 255F18, PvMeso-31 hibridizou num fragmento de 2,5 kb em todos os DNA analisados, porém
com diferentes intensidades. Apenas nos DNAs do BAC 255F18 e dos acessos mesoamericanos esse fragmento
marcou intensamente, e quando os mesmos foram digeridos com EcoRV e HindIII, duas outras bandas (1,7 e 3,4
kb) apresentaram forte hibridização. O padrão observado sugere que a sequência presente no subclone PvMeso-31
represente a unidade de repetição de 1,7 kb de uma sequência organizada em tandem. A presença de poucas bandas
no DNA genômico, associada ao forte bloco presente no cromossomo 7 dos acessos mesoamericanos, sugerem que
PvMeso seja um DNA satélite amplificado recentemente, após a separação dos conjuntos gênicos do feijão comum.
Apoio financeiro: CNPq e FACEPE
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Architecture of nucleolar chromatin suggest a
epigenetic control of major and minor 45S rDNA sites
Andrade, LM¹; Mondin, M¹
¹Laboratório de Citogenética Molecular de Plantas - Departamento de Genética- ESALQ-USP
[email protected]
Keywords: 45S rDNA, nucleolus, DNA methylation, FISH, additional loci.
The genes of rRNA (18S-5.8S-26S) are tandemly array organized, and should appear, at least, in one chromosome
pair and in this case obligatorily functional. However it is common in a complement more than one 45S rDNA
region and in this case only one should be functional and the other one could be inactive or not. The absence of
secondary constriction in the minor sites don’t necessarily mean complete gene inactivity, but a short time of
activity during initial stages of the cell cycle only; allowing a normal pattern of condensation. The activation and
silencing of rRNA genes are controlled by epigenetic factors, as it is demonstrated by molecular genetics, otherwise
few reports have been showed this process at a chromatin level. Using Crotalaria juncea as a model, we studied
the 45S rDNA chromatin organization for a major and minor site that is activated during restricted cell cycle
phase. This minor site was mapped at long arm of chromosome 4 adjacent to a centromeric heterochromatin.
Synchronized root tip cells treated with 1.25 mM Hydroxyurea were used to determine the cells cycle phases of
a minor site activity by Ag-NOR banding. Immunocytochemistry of DNA methylation (CpG sites) by polyclonal
antibody against 5’-methylcytosine and FISH used to investigate main epigenetic marks those play a role in
the minor site activity, reveals during its activity an open chromatin configuration with low methylation levels,
while during this repression a significant deposition of the antibody was observed. Quantitative analysis of
nucleolar expression during the cell cycle showed that the 45S rDNA main locus begins its activity even in
telophase with the formation of 2 nucleoli those later merges in one. In many cells was possible distinguish
the major and minor nucleolus. FISH pattern in the locus of chromosome 4 showed a difference in size of 45S
rDNA arrangement leading to nucleolar dominance, probably because the transcription machinery has a
preference for larger arrays. Chromosome pair 1 is the main nucleolus organizer showed an equal size 45S rDNA
array, however their can present a differential expression reflecting in differences on the extension of secondary
constriction. It was also observed that the fiber of rDNA in the nucleolus has heterochromatic regions, so they
are methylated between active regions where the rDNA is active. Both homologous 45S rDNA of the chromosome
1 have distinct position inside the nucleolus, occupying opposite sides, thus not randomly arranged, but
forming a nucleolar territory. These results contribute to the understanding of genetic and epigenetic control of
nucleolar expression and serving as a model for the study of the mechanism of differentiation and development.
Financial support: CAPES
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Distribuição dos genomas de capim-elefante e
milheto (Pennisetum sp. Schum., Poaceae) em híbrido
interespecífico
Costa Santos, FM¹; Reis, GB¹; Andrade-Vieira, LF¹; Davide, LC¹; Pereira, AV²
Laboratório de Citogenética, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras.
Laboratório de Genética Vegetal, Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pennisetum, eliminação cromossômica, hibridização in situ genômica, mixoploidia, híbrido interespecífico
O capim-elefante (P. purpureum) e o milheto (P. glaucum) são forrageiras economicamente importantes. A
produção de híbridos entre essas duas espécies é uma estratégia utilizada nos programas de melhoramento
visando à obtenção de cultivares com maior produção de forragem e melhor qualidade nutritiva. A condição
triplóide do híbrido (2n = 3x = 21 cromossomos) causa esterilidade, considerada um problema na utilização
dos mesmos. A duplicação cromossômica tem sido empregada como forma de restaurar a fertilidade do
híbrido interespecífico, obtendo-se plantas hexaplóides. No entanto, freqüentemente são observadas plantas
mixoplóides com células contendo número variável de cromossomos (14 a 42). A mixoploidia nos híbridos de
capim-elefante e milheto é ocasionada por eliminação cromossômica. Estudos a respeito da identificação dos
cromossomos parentais eliminados nos híbridos mixoplóides, resultantes do cruzamento de capim-elefante
e milheto, seguido de indução de duplicação cromossômica já foram realizados, utilizando como ferramenta
a hibridização in situ genômica (GISH). Nestes estudos, observou-se que a eliminação cromossômica é casual,
podendo ser encontradas as mais diversas combinações cromossômicas. Desta forma, o objetivo do presente
trabalho foi verificar a distribuição dos genomas de capim-elefante e milheto no núcleo interfásico do híbrido
interespecífico submetido a duplicação cromossômica, para melhor entendimento do fenômeno de eliminação
cromossômica. Foram avaliados 100 núcleos interfásicos da cultivar Paraíso através da hibridização in situ
genômica (GISH). Os genomas dos parentais foram localizados nos núcleos interfásicos através do uso da sonda
do DNA genômico de milheto. A área ocupada pelo genoma do milheto na periferia do núcleo foi, em média, de
39,53 µm², correspondendo a 55,72% do genoma total no núcleo. A área média ocupada pelo genoma do capimelefante na periferia do núcleo foi 44,72 µm², o equivalente a 47,24% do genoma de capim-elefante. Ambos os
genomas estão distribuídos na periferia (cerca de 50% do genoma de cada um dos parentais) e na região central
do núcleo. Estes resultados indicam que os genomas de capim-elefante e milheto distribuem-se de forma
semelhante no núcleo interfásico, o que favorece a eliminação cromossômica aleatória dos cromossomos de
cada um dos parentais, não havendo preferência de eliminação do genoma de uma espécie em relação à outra.
Apoio financeiro: Fapemig e CNPq
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120
Número cromossômico de Annona crassiflora Mart.
Ribeiro, LR1; Davide, LC2
Centro Universitário de Formiga - UNIFOR-MG
Laboratório de Citogenética – Departamento de Biologia – Universidade Federal de Lavras
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Annonaceae, Araticum, Cerrado, Citogenética, Marolo.
Incluso na lista dos 25 hotspots mundiais de biodiversidade, o bioma do Cerrado está fortemente ameaçado pelo
extrativismo descontrolado e pela expansão das fronteiras agrícolas, o que reforça a necessidade da caracterização
e conservação de suas espécies. Annona crassiflora Mart., conhecida como araticum ou marolo, é uma espécie
frutífera endêmica do Cerrado Brasileiro pertencente à família Annonaceae de grande importância por suas
propriedades alimentícias e medicinais. Apesar de sua relevância tanto em termos de biodiversidade quanto
sócio-econômicos e culturais, estudos citogenéticos são inexistentes para a espécie. Nesse sentido, o objetivo
deste trabalho é determinar o número cromossômico de Annona crassiflora Mart., ainda não relatado na literatura.
As sementes coletadas de frutos maduros de três populações do interior de Minas Gerais foram imersas em
solução de ácido giberélico 500mM por seis dias e colocadas para germinar sobre areia autoclavada em caixas
gerbox a 23°C. As radículas de sementes germinadas foram pré-tratadas com solução aquosa de hidroxiquinoleína
0,029M por 10h e posteriormente fixadas em álcool etílico e ácido acético (3:1 v./v). As preparações citológicas
foram obtidas pelo método de esmagamento e a coloração foi realizada com Giemsa a 2% por 10 minutos.
Conclusões: As observações citogenéticas revelaram um número cromossômico de 2n=2x=14 para as três
populações de Annona crassiflora analisadas, confirmando o número cromossômico típico do gênero Annona que
varia de 2n=2x= 14 ou 2n=2x=16 entre suas espécies, exceto para Annona glabra que é uma espécie tetraploide.
Apoio financeiro: FAPEMIG e UNIFOR-MG
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Copia-like retrotransposons in the Eucalyptus genome:
a preliminary genome-wide analysis
Marcon, HS1; Domingues, SD2; Marino, CL1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
Laboratório de Biotecnologia Vegetal, IAPAR, Londrina
[email protected]
1
2
Keywords: Retrotransposons, Transposable Elements, Genome evolution, Eucalyptus.
Eukaryotic genomes consist largely of repetitive DNA, most of which corresponds to transposable elements (TEs)
that are able to move and replicate within their host genome. Retrotransposons (RTEs or class I TEs) replicate
through a “copy-paste” mechanism that depends on reverse transcription and integration. Retrotransposons
therefore have an important impact on the host genome size and organization through their ability to provide
a “genomic plasticity”. Retrotransposons can account for >50% of plant genomes and may occur even in generich regions. Retrotransposons can be broadly classified based on the absence or presence of long terminal
repeats (LTRs) up and downstream of the corresponding open-reading frame. Copia-like retrotransposons are
widely distributed in plants and have been extensively studied in crop species. Eucalyptus trees are an important
component of the Brazilian commercial forestry industry and have a wide variety of uses. Most genetic studies of
Eucalyptus have focused on various aspects of tree breeding, such as cellulose production and wood development,
with few studies on the genome composition, structure and evolution of this genus. Few reports have described
the characterization of Eucalyptus TEs, with most findings being derived from global analyses of private genomic
databases. In this work, we used an in silico approach to identify copia-like retrotransposons expressed in Eucalyptus
and deposited in public genomic databases. LTR copia-like retrotransposon sequences from dicots were used
as queries to identify Eucalyptus EST sequences deposited in GenBank. In this initial search, we identified four
sequences expressed in vascular tissues of Eucalyptus gunnii: three were from a xylem cDNA library and one was
from phloem. These RTE-related ESTs were also analyzed by comparison with a database of repetitive sequences.
Eucalyptus ESTs encoding copia-like retrotransposons fragments were then used to identify complete copies of
copia-like retrotransposons in a recently released draft of the Eucalyptus grandis genome. Our analysis identified
four retrotransposons families that preliminary analyses suggested had different copy numbers in the Eucalyptus
genome. Eucalyptus elements related to the Arabidopsis ATCopia43 and ATCopia78 RTE families had more than
500 copies whereas elements related to the Atara and ATCopia11 families had only 45 copies. Phylogenetic
analyses of these elements showed that they were members of the Ale, Maximus and Ivana evolutionary lineages.
These initial results indicate the existence of a large universe of retrotransposons in the Eucalyptus genome and
stress the need for additional studies on the diversity and impact of copia-like retrotransposons in this genus.
Financial support: Capes
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Variabilidade de locos de DNAr 45S em duas espécies
de Smilax (Smilacaceae)
Pizzaia, D1; Aguiar-Perecin, MLR1; Appezzato-da-Glória, B2; Martins, AR2
Laboratório de Citogenética Molecular de Plantas, Departamento de Genética, ESALQ/USP
Laboratório de Anatomia Vegetal, Departamento de Ciências Biológicas, ESALQ/USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Smilax, DNAr 45S, FISH, cromatina, nucléolo.
O gênero Smilax (Smilacaceae) possui importância medicinal, conta com 394 espécies reconhecidas e dispersas por
todo o mundo, com distribuição tropical e subtropical, sendo 14 exclusivas do Brasil. Os dados da literatura se limitam
a contagens do número de cromossomos (2n=32, 2n=64) e a algumas descrições dos cariótipos, que em geral são
assimétricos, sendo que constrições secundárias não têm sido identificadas. Em investigação anterior feita em nosso
laboratório, utilizando-se a coloração pelo método de Feulgen, não foram identificadas constrições secundárias em
S. fluminensis e S. rufescens, com exceção de um par heteromórfico mostrando uma constrição secundária e satélite
em um dos homólogos. A técnica de coloração por nitrato de prata (Ag-RON) evidenciou a presença de um a quatro
nucléolos em núcleos interfásicos de S. fluminensis, sugerindo a presença de quatro sítios de DNA ribossomal nesta
espécie. Nesta comunicação, relatamos observações resultantes da aplicação da hibridização in situ fluorescente
(FISH) para a localização de sítios de DNAr 45S em S. fluminensis e S. rufescens, dentro de um programa cujo objetivo
é a investigação de mecanismos de evolução cariotípica em espécies de Smilax. Em S. fluminensis, foram localizados
sítios de DNAr 45S nas extremidades dos braços curtos de dois pares de cromossomos de tamanho intermediário,
observando-se também que um dos pares apresentava maior distensão da cromatina contendo o sinal da FISH, e que
um dos homólogos mostrava a cromatina muito mais descondensada, sugerindo que o mesmo seria mais ativo. Os
dados são coerentes com as observações de quatro nucléolos corados por Ag-RON em núcleos interfásicos. Nesta
espécie, a FISH revelou núcleos interfásicos com apenas um nucléolo contendo a cromatina da região organizadora
do nucléolo distendida, bem como núcleos contendo mais dois pequenos nucléolos com cromatina mostrando
sinais da FISH. Isto evidenciou que os sítios menores podem ser ativos. Em S. rufescens foram localizados seis
sítios de DNAr 45S nas extremidades dos braços curtos de 3 pares de cromossomos de tamanhos intermediário
e pequeno. A FISH revelou um loco maior de DNAr 45S no par cromossômico de tamanho intermediário, que
também apresentava a cromatina mais distendida que nos outros dois pares, inclusive mais descondensada em
um dos homólogos, em algumas metáfases. Os resultados revelam a ocorrência de variabilidade no número de
sítios de DNA ribossômico na diversificação destas espécies, e mostram que a dificuldade em se observarem
constrições secundárias nas preparações coradas pelo Feulgen se deve à posição das RONs nas extremidades
dos braços curtos dos respectivos cromossomos, e também, devido à maior descompactação da cromatina do
cromossomo mais ativo, que aparentemente seria o cromossomo satelitado observado em preparações de Feulgen.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
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Caracterização da cromatina centromérica de Costus
spiralis (Jacq.) Roscoe (Costaceae)
Feitoza, L; Guerra, M
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: 5-metilcitosina, histonas modificadas, cromatina, centrômero, Costus spiralis
Os cromossomos mitóticos de Costus spiralis apresentam um padrão de condensação profásico bem definido,
formando grandes blocos de cromatina condensada proximal, uma região terminal descondensada e uma
pequena banda DAPI+ na região do centrômero. Entretanto, em mitose não foi possível confirmar se essa banda
DAPI+ correspondia ao centrômero propriamente. Neste trabalho, foi analisada a relação entre a banda DAPI+ e
o centrômero em cromossomos paquitênicos, onde toda a cromatina é mais distendida e mais fácil de analisar.
A coloração da heterocromatina centromérica foi feita com CMA/DAPI. A região centromérica foi reconhecida
pela distribuição de H3S10f, uma marca epigenética que ocorre na cromatina pericentromérica, mas não no
centrômero. A imunocoloração com anti-H3S10f revelou que na região proximal, apenas o bloco DAPI+ não foi
marcado, sugerindo que o centrômero de C. spiralis conteria o bloco heterocromático. A localização da banda
DAPI+ no centrômero foi confirmada em metáfase-anáfase I, onde a extremidade polar dos cromossomos
homólogos foram CMA-/DAPI+. Para caracterizar a cromatina centromérica foram utilizados anticorpos contra
modificações típicas de eucromatina (H4K5ac e H3K4me2) e de heterocromatina (H3K9me2 e anti-5-metilcitosina).
Para isso, meiócitos de C. spiralis foram imunodetectados com anticorpos primários contra H4K5ac, H3K4me2,
H3K9me2, H3S10f e metilcitosina e anticorpos secundários conjugados com FITC e TRITC. As histonas H4K5ac
e H3K4me2 foram detectadas na eucromatina terminal descondensada dos braços cromossômicos, enquanto
a cromatina DAPI+ centromérica foi fortemente marcada com anti-H4K5ac, mas não com anti-H3K4me2.
Uma marcação forte com anti-H3K9me2 e anti-5-metilcitosina foi observada na região proximal condensada,
enquanto a heterocromatina centromérica não foi marcada e a eucromatina terminal foi apenas fracamente
marcada. Espécies como arroz e cevada também apresentam centrômeros fortemente acetilados em H4K5. Em
outras espécies como Arabidopsis e milho, observa-se que o DNA do centrômero é hipometilado e com uma
significativa redução da H3K9me2. Em C. spiralis, a heterocromatina DAPI+ é aparentemente atípica, tanto por
ocorrer no centrômero quanto por ser hiperacetilada e hipometilada, contrariamente ao observado em outras
heterocromatinas. Entretanto, essa região centromérica preserva modificações de histonas e DNA comumente
encontradas nos centrômeros de plantas e animais. A presença de uma heterocromatina DAPI+ no centrômero de
C. spiralis sugere que a estrutura do centrômero pode ser mais variável do que o observado em organismos modelo.
Apoio financeiro: FACEPE /CNPq
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124
Avaliação citogenética de espécies do gênero
Crotalaria L. ocorrentes em Três Lagoas, estado de
Mato Grosso do Sul
Bento, ES1; Batalhão, IG1; Ferreira, MAMM1; Guedes, TA1; Souza, CP1
Laboratório de Citogenética Vegetal - Departamento de Ciências Naturais. Campus de Três Lagoas - UFMS
[email protected]
1
Palavras-chave: Fabaceae, Citogenética Vegetal, Número Cromossômico
O gênero Crotalaria L. ocorre principalmente em regiões tropicais e subtropicais, com aproximadamente 600
espécies descritas, sendo muitas destas usadas como plantas forrageiras, pois atenuam os problemas de erosão e
melhoram a fertilidade do solo. A despeito do grande número de representantes e de sua reconhecida importância
para a agricultura, poucas espécies foram analisadas sob o aspecto citogenético, sendo estes estudos limitados
à contagem do número de cromossomos e a descrição de cariótipos. O presente estudo teve por objetivo avaliar
espécies do gênero Crotalaria L. ocorrentes em Três Lagoas, MS. Foram avaliadas as espécies C.incana e C. pallida
com metodologias de coloração convencional (Feulgen e Giemsa) e C. stipularia, com as metodologias de coloração
convencional, bandamento-C e impregnação com íons de prata. As preparações cromossômicas foram obtidas
a partir de meristemas radiculares, pré-tratados com 8-hidroxiquinolina a 300ppm, por 4 horas a temperatura
ambiente para todas as espécies. Em seguida, as raízes foram fixadas em solução Carnoy 3:1 (álcool etílico: ácido
acético, respectivamente), por 12 horas à temperatura ambiente e, posteriormente, estocadas no “freezer”. Os
meristemas radiculares foram amaciados em uma solução contendo 2% de celulase e 20 % de pectinase a 37ºC, por
20 minutos e posteriormente esmagada em uma gota de ácido acético 45% e as lamínulas removidas em nitrogênio
líquido. Em C.incana e C. pallida foi observado número cromossômico 2n=14 e 2n=32, respectivamente. C.stipularia
apresentou 2n=32, sendo também observado a presença de RON positivas em dois pares de cromossomos
e bandas-C presentes na região pericentromérica do cromossomo maior, algumas marcações intercalares
e alguns cromossomos com bandas-C distais. Mais estudos com o objetivo de avaliar espécies de Crotalaria L.
com diferentes métodos de citogenética (bandamento-C, bandamento com fluorocromos e hibridização in situ),
são importantes para contribuir com os estudos de evolução cariotípica e do genoma de espécies deste gênero.
Apoio financeiro: UFMS
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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125
Número cromossômico de espécies gênero Mimosa L.
presentes em áreas do Cerrado
Batalhão, IG1; Bento, ES1; Ferreira, MAMM1; Guedes, TA1; Souza, CP1
Laboratório de Citogenética Vegetal - Departamento de Ciências Naturais. Campus de Três Lagoas - UFMS
[email protected]
1
Palavras-chave: Fabaceae, Citogenética Vegetal, Cromossomos
Mimosa L. é o segundo maior gênero da subfamília Mimosoideae, pertencente à família Fabaceae, com cerca de
500 espécies, sendo 189 encontradas em áreas de Cerrado. Várias espécies de Mimosa L. são economicamente
importantes sendo exploradas para diversos fins tais como produção de madeira para construção, em programas
de restauração e conservação ecológica; sendo que algumas atuam como forrageiras ou para extração de compostos
secundários e na medicina popular. Apesar do elevado número de espécies e de sua importância, menos de 5%
das espécies já tiveram seu número cromossômico determinado. A determinação do número cromossômico
associada a metodologias que permitam caracterizar linearmente os cromossomos, são ferramentas importantes
para estudos taxonômicos e evolutivos de espécies com cariótipos similares. Portanto, o presente trabalho teve
por objetivo determinar o número de cromossomos de espécies de Mimosa L. presentes em fragmentos de cerrado
próximo ao Campus da UFMS, de Três Lagoas. Para determinação do número cromossômico, as sementes foram
escarificadas manualmente, germinadas e as raízes pré-tratadas com 8-hidroxiquinolina a 300 ppm, por 2 horas e 30
minutos à temperatura ambiente, fixadas em solução de Carnoy 3:1 (álcool etílico: ácido acético, respectivamente),
por 12 horas à temperatura ambiente e mantidas em freezer a 4°C, até a preparação das lâminas. As lâminas
foram preparadas com hidrólise dos meristemas radiculares em HCl 5N por 20 minutos a temperatura ambiente,
e então esmagadas em uma gota de ácido acético 45%. As lamínulas foram removidas em nitrogênio líquido e
coradas com Giemsa 2% . O método de Feulgen também foi usado. A espécie Mimosa setosa Beth, apresentou
2n=52 cromossomos (tetraplóide), e Mimosa polycarpa Kunth, 2n=26 cromossomos (diplóide). Para uma melhor
avaliação e compreensão das espécies e do posicionamento taxonômico que estas ocupam, novos estudos com
outras metodologias (bandamento-C, bandamento com fluorocromos e hibridização in situ) deverão ser realizados.
Apoio financeiro: UFMS
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126
Herança do número de óvulos por ovário em genótipos
de cacau
Bahia, R de C1; Corrêa, RX1; Santos, RC2; Machado, RCR3; Luz, EDN2; Araújo, IS4; Ahnert, D1
Universidade Estadual de Santa Cruz, Dep. de Ciências Biológicas, Rod. Ilhéus-Itabuna, km 16, CEP 45662-000 Ilhéus, BA
Centro de Pesquisas do Cacau, Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira, Seção de Genética, Caixa Postal 07, CEP 45600970 Itabuna, BA
3
Almirante Centro de Estudos de Cacau, Caixa Postal 55, CEP 45630-000 Itajuípe, BA. (4)Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró, RN
[email protected] , [email protected]
1
2
Palavras-chave: Theobroma cacao, descritores quantitativos, herdabilidade, recursos genéticos, melhoramento genético.
O número de óvulos por ovário (NO) é um dos sete descritories relacionados com flor presente na lista de 27
descritores relativos a flor, folhas, frutos e características agronômicas adotadas em cacau (Theobroma cacao). Essa
caracterterística também está presente entre os 29 descritores propostos para cupuaçu (T. grandiflorum). O NO
mostra-se consistente dentro de cada acesso de cacau, sofrendo baixa influencia ambiental e pode ser utilizado
para estimar o número de sementes por fruto, um importante componente de produção. Neste trabalho, foram
caracterizados o NO em plantas de cacau originadas do cruzamento entre os clones CCN 51 e TSH 1188 (progênie
segregante) e determinada a herdabilidade dessa característica, visando selecionar plantas com elevados NO. O NO
foi calculado como a média de 10 flores por planta, variando de 44,8 a 58,6 entre os seis clones controle (dois genitores
e 4 progenitores da população). Na progênie (n = 209 plantas), o NO apresentou média de 54,3 (44,1 a 67,8). O NO
apresentou distribuição contínua entre as plantas da progênie, indicando que essa característica é condicionada por
poligenes. Sua herdabilidade estimada (67,7%) é consistente com a natureza multifatorial observada. As 32 plantas
com NO superior ao genitor CCN 51 (o que apresentou maior NO entre os clones-controle), foram selecionados para
uso em programa de melhoramento. Esses resultados comprovam que esta população é adequada para mapeamento
genético dessa característica, identificação de marcadores moleculares e seleção de genótipos superiores.
Apoio financeiro: CAPES, UESC, CNPq, FAPESB e MARS - Centro de Ciências do Cacau
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Análise da instabilidade cromossômica e capacidade
de regeneração de plantas em cultivos celulares
imortalizados de milho
Fluminhan, AF1; Gonçalves, PR1; Soares, FAS1
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE)
[email protected]
1
Palavras-chave: Anormalidades mitóticas, variação somaclonal, Zea mays L., imortalização celular, embriogênese somática, regeneração de plantas, cultivo in vitro.
Existem diversas hipóteses para explicar o fenômeno de redução na totipotência celular e na capacidade de
regeneração em cultivos in vitro de longa duração de células vegetais. A influência do envelhecimento celular
e o papel desempenhado pelos radicais livres são freqüentemente listados, uma vez que ambos podem ser
conseqüências cumulativas das reações do metabolismo e que contribuem para a oxidação dos componentes
celulares. A presente pesquisa teve por objetivo estudar as variações nas freqüências de anormalidades mitóticas
observadas durante o cultivo in vitro de células de milho (Zea mays L.), utilizando-se como parâmetro a análise
da freqüência da ocorrência de anormalidades na separação de cromátides irmãs durante as anáfases. Para tanto,
foram analisadas culturas celulares altamente friáveis e embriogênicas estabelecidas e subcultivadas há mais de
90 meses. A análise citogenética envolveu o levantamento da ocorrência de anomalias mitóticas em fragmentos
de calos coletados na superfície das culturas. Foi analisada a freqüência de ocorrência de pontes cromossômicas,
atraso na separação de cromátides irmãs, formação de fragmentos de cromátides e micronúcleos na telófase,
entre outras anormalidades. Foram avaliadas as alterações nas freqüências destas figuras mitóticas, em função
da presença ou ausência de diversos compostos protetores celulares, tais como: arginina, prolina, vitaminas B1
(tiamina), B6 (piridoxina), C (ácido ascórbico), inositol, ácido aspártico, glicina, glutamina e ácido nicotínico. A
avaliação da ocorrência de alterações nos níveis de metilação do DNA das culturas imortalizadas foi realizada em
amostras de DNA total extraídas de calos embriogênicos, após cerca de 60 dias de manutenção em meios com
diferentes composições. Para tanto, foram realizados experimentos com enzimas de restrição sensíveis ao grau de
metilação em sítios de clivagem específicos no DNA. Foi verificado que as taxas de ocorrência de anormalidades
cromossômicas não sofreram alterações significativas com o tempo em cultivo. Entretanto, foram notadas
variações significativas no grau de metilação do DNA das células cultivadas por longos períodos. Embora a taxa
de regeneração tenha se mantido uniforme, foi verificada uma sensível redução no vigor das plantas regeneradas
e na taxa de sobrevivência e aclimatação das mesmas ao ambiente externo ao cultivo in vitro. Pretende-se
determinar quais os efeitos que a adição dos componentes do meio de cultura podem causar na estabilidade
mitótica das culturas, assim como os fatores que podem influenciar a ação de radicais livres, de modo a estabelecer
um método para o retardo do processo de envelhecimento celular ou inibição parcial da sua ocorrência.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, UNOESTE
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Ocorrência e distribuição cromossômica de
retroelemento Ty1-copia-like em espécies dos gêneros
Vigna Savi e Phaseolus L. mediante hibridização in situ
fluorescente
Bortoleti, KCA1,2; Brasileiro-Vidal, AC1; Amorim, LLB1; Vasconcelos, EV1; Benko-Iseppon, AM1
Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
Colegiado de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Vale do São Francisco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: FISH, Ty1-copia-like, feijão-caupi, feijão comum, marcador cromossômico
Os gêneros Vigna Savi e Phaseolus L. (Fabaceae) têm sido bastante utilizados em estudos citomoleculares
visando à construção de mapas cromossômicos através da hibridização in situ fluorescente (FISH). Diferentes
classes de DNA repetitivo vêm sendo caracterizadas, entre elas, os retrotransposons, os quais possuem um
mecanismo de amplificação e dispersão, via RNA intermediário, resultando geralmente em uma localização
dispersa ao longo dos cromossomos. Nesse sentido, o presente trabalho objetivou caracterizar a distribuição
cromossômica de um retroelemento Ty1-copia-like em V. unguiculata cv. BR14-Mulato, V. radiata, P. vulgaris
cv. BRS Esplendor e P. lunatus cv. Vermelhinha, visando identificar marcas cromossômicas que auxiliem na
construção de mapas físicos comparativos para essas espécies. Sequência do retrotransposon Ty1-copia-like
(domínio RT) foi amplificada a partir do DNA genômico de V. unguiculata utilizando os primers degenerados (5’GAGAATTCACNGCNTTYYTNCAYGG-3’/5’-GAGGATCCATRTCRTCNACRTANAR-3’), descritos anteriormente
na literatura para V. radiata. Obteve-se um fragmento com aproximadamente 270 pb, o qual foi purificado pelo kit
GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare). Posteriormente, esse fragmento foi reamplificado,
marcado por digoxigenina-11-dUTP por PCR e utilizado como sonda na FISH. As lâminas foram rehibridizadas
com DNAr 5S (D2) e 45S (R2), provenientes de Lotus japonicus e Arabidopsis thaliana, respectivamente, para
identificação cromossômica. A FISH evidenciou um padrão de distribuição disperso ao longo dos cromossomos
das quatro espécies analisadas; entretanto, algumas marcações mais fortes foram observadas em V. unguiculata,
P. vulgaris e P. lunatus. Em V. unguiculata, sinais mais evidentes foram notados nas regiões subterminais, próximos
aos sítios de DNAr 45S. Por sua vez, V. radiata apresentou uma marcação mais dispersa em todo seu complemento
cromossômico. Em P. vulgaris e P. lunatus, a distribuição de Ty1-copia-like evidenciou sítios proximais mais
fortes. Todavia, na última espécie, tais sinais mostraram-se em maior intensidade, destacando-se o cromossomo
10, portador do sítio DNAr 5S. Possivelmente, essas diferenças estão relacionadas com o número de repetições
do retroelemento Ty1-copia-like nos genomas das referidas espécies. Os resultados observados indicam uma
homologia entre domínios conservados de Ty1-copia nas diferentes espécies analisadas, identificando marcadores
cromossômicos úteis em estudos de evolução genômica e relações filogenéticas na subfamília Papilionioideae
Apoio financeiro: CNPq e UFPE
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Desenvolvimento metodológico para determinação
da relação AT/CG em genomas de Capsicum spp. por
citometria de fluxo
Silva, TCR1; Carvalho, CR1
Laboratório de Citogenética e Citometria – Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
Palavras-chave: Capsicum, Citometria de fluxo, Valor 2C, composição de bases.
O gênero Capsicum spp. (2n = 24) abrange cerca de 27 espécies originárias das Américas do Sul e Central, e é
um gênero economicamente importante dado as propriedades flavorizantes contidas nos óleos essenciais e
oleorresinas, que conferem sabor, aroma e cor típicos. Na literatura, há relatos da aplicação da citometria de fluxo
como ferramenta de quantificação do conteúdo de DNA de Capsicum; no entanto, a relação AT/CG de algumas
espécies ainda não foi estabelecida. Tal informação é importante para complementar a caracterização genômica
dessa planta, contribuindo, principalmente, para os estudos taxonômicos e filogenéticos, análise comparativa da
estrutura genômica, programas de melhoramento, projetos de sequenciamento e mapeamento genético. O objetivo
deste estudo foi reavaliar o conteúdo de DNA nuclear e estabelecer metodologia para determinação da relação AT/
CG dos genomas de C. annuum (acesso Ca2), C. frutescens (BGH 5106), C. chinense (BGH 1723) e C. baccatum (BGH
1739) por meio da citometria de fluxo. Fragmentos foliares foram processados pela técnica de padrão interno,
utilizando Pisum sativum (2C = 9,09 pg, AT: 61,4%, CG: 38,6%) como padrão. Para determinação do conteúdo 2C
de DNA, os núcleos foram isolados em tampão de extração e corados com solução tampão e iodeto de propídeo,
e para a determinação da relação AT/CG, utilizou-se o mesmo tampão, mas com o fluorocromo DAPI para as
avaliações do percentual de AT. Os histogramas gerados com o iodeto de propídeo apresentaram picos de núcleos
em G0/G1 com CV’s de 1,65 – 3,74%. Com base nestes picos, tanto do padrão quanto das amostras, determinou-se
os valores médios do conteúdo de DNA nuclear das espécies, que variaram de valor 2C = 7,10 – 8,13 pg. Enquanto
histogramas gerados com DAPI possibilitaram calcular o percentual de bases A e T. Os picos apresentaram CV’s
entre 1,27 – 3,90%. Os conteúdos AT foram de 62,95 (C. annuum) a 66,83% (C. baccatum). Concluiu-se que a espécie
C. baccatum apresenta, aproximadamente, 14,4% de conteúdo de DNA a mais que o das outras espécies, como
também relação AT/CG superior. Destacou-se o potencial da resolução metodológica que possibilitou essa
discriminação. Considerando os resultados obtidos nessas espécies de Capsicum, cujos números cromossômicos
são idênticos, poderão ser aplicadas ferramentas moleculares que permitirão identificar as diferenças.
Apoio Financeiro: Fapemig, CNPq
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130
Cariologia de Duranta repens L. (Verbenaceae)
Sousa, SM; Reis, AC; Silva, PS; Viccini, LF
Laboratório de Genética, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Juiz de Fora
[email protected]
Palavras-chave: cariótipo, citogenética, mitose, Duranta repens, núcleo interfásico, Verbenaceae
O gênero Duranta (Verbenaceae) possui cerca de 20 espécies distribuídas por todo o continente americano. Dentre
estas, D. repens é a mais amplamente distribuída, ocorrendo desde a Flórida (EUA) até a Argentina, sendo muitas
vezes considerada uma espécie sinônima de D. erecta. Entretanto, vários estudos citogenéticos indicam que estas
espécies apresentam diferentes números cromossômicos. Para D. erecta existem vários números descritos como
2n = 16, 24 ou 32, enquanto que para D. repens a literatura indica um número cromossômico 2n = 34. Embora estes
números existam, são simplesmente contagens de cromossomos meióticos, não havendo descrição do cariótipo para
a maioria das espécies de Duranta. Com o objetivo de enriquecer o conhecimento citológico do gênero, o presente
trabalho descreve a morfologia dos cromossomos de D. repens. Para isso foram coletadas sementes de 3 populações
de D. repens em Juiz de Fora MG. As sementes foram induzidas a germinar em temperatura ambiente e para a obtenção
de cromossomos mitóticos, raízes foram tratadas com 8-hidroxiquinoleína a 4°C, fixadas em etanol: ácido acético
(3:1) por 24h e digeridas em solução enzimática contendo 4% de celulase e 40% pectinase a 37°C por 6h. As lâminas
foram preparadas segundo a metodologia de dissociação celular seguida de secagem ao ar e coradas em Giemsa
5%. Todos os indivíduos analisados apresentaram um número cromossômico 2n=34, com um cariótipo simétrico
contendo cromossomos metacêntricos e submetacêntricos. Os núcleos interfásicos foram classificados como semireticulados e apenas um par de constrições secundárias foram observadas. Adicionalmente ao complemento normal
de cromossomos, foram observadas também algumas metáfases com minúsculos cromossomos B, geralmente 2
ou 3, quando observados. Conclusões: Os dados obtidos aqui, confirmam um número cromossômico 2n=34, como
descrito previamente, não corroborando desta forma com a hipótese de sinonímia entre D. repens e D. erecta.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e FAPEMIG
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Citogenética molecular comparativa no grupo
Corniculatus do gênero Lotus L. (Fabaceae)
Mendes, S1; Ferreira, JBMM1; Dall’Agnol, M2; Pedrosa-Harand, A1
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Botânica, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Plantas Forrageiras e Agrometereologia, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNAr 5S e 45S, DNA satélite, LJTR1, FISH, evolução cariotípica.
O gênero Lotus L., e particularmente o grupo Corniculatus da seção Lotus, tem se destacado pela importância
forrageira de algumas espécies e pelo fato de L. japonicus, desse mesmo grupo, ter sido escolhida como
leguminosa modelo. Para dois ecótipos de L. japonicus e duas outras espécies do grupo Corniculatus, L. burttii
e L. filicaulis, já foram estabelecidos mapas cromossômicos comparativos. Apesar de marcadores de sequência
cópia única mostrarem a presença de translocações e inversões entre essas espécies, os sítios de DNAr 5S e 45S
apresentaram-se praticamente conservados. O objetivo deste trabalho foi expandir a análise citogenética dentro
do grupo, a fim de melhor entender os eventos envolvidos na evolução cariotípica no gênero. Foram realizadas
hibridizações in situ fluorescentes (FISH) com sondas para o DNA satélite LJTR1, descrito anteriormente para
o ecótipo ‘Miyakojima’ de L. japonicus, e para DNAr nas espécies L. corniculatus (2n = 4x = 24), L. glaber (2n =
2x = 12) e L. krylovii (2n = 2x = 12), todas pertencentes ao grupo Corniculatus. As três espécies apresentaram o
mesmo padrão de DNAr descrito na literatura para L. japonicus, com pequenas variações na intensidade relativa
dos sinais: um sítio proximal de DNAr 5S adjacente a um sítio distal maior de DNAr 45S no homeólogo ao par
cromossômico 2 e um outro sítio de DNAr 45S mais fraco no par 6, sendo este padrão duplicado no tetraplóide
L. corniculatus. Um diminuto sítio de DNAr 45S posicionado no par 5 de L. japonicus, que mesmo nessa espécie
dificilmente é visualizado, não foi observado. O DNA satélite LJTR1 foi suficientemente conservado no grupo,
permitindo sua localização por FISH, com padrões de distribuição similares, nas três espécies analisadas.
Esses resultados sugerem uma relativa conservação na distribuição de sequências repetitivas, geralmente
a fração mais variável do genoma, apesar das divergências cariotípicas causadas por alterações estruturais.
Apoio: CAPES, CNPq
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Determinação do conteúdo de DNA nuclear, da
composição de bases e do cariótipo de macaúba
(Acrocomia aculeata)
Carvalho, GMA1; Abreu, IS1; Carvalho, CR1; Motoike, SY2
Laboratório de Citogenética e Citometria, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Biocombustível, citogenética vegetal, citometria de fluxo, valor 2C, composição de bases.
Acrocomia aculeata, popularmente conhecida como macaúba, é considerada a palmeira de maior dispersão
em território brasileiro. A macaúba pode se tornar uma oleaginosa de grande importante comercial, dado
seu destacado potencial na produção de biocombustíveis, com produção podendo exceder 5.000 Kg de óleo/
hectare em plantações naturais. O presente trabalho se propõe a caracterizar o genoma da espécie A. aculeata
quanto: (I) aos aspectos citométricos com quantificação do conteúdo de DNA e a determinação da composição
de bases; (II) aos aspectos citogenéticos com montagem do cariograma. Para a quantificação do conteúdo de
DNA, suspensões nucleares da amostra e do padrão, Glicine max (2C = 2,73 pg), foram obtidas a partir de folhas
submetidas aos procedimentos de chopping utilizando os tampões OTTO e coloração com iodeto de propídeo.
Para a determinação da composição de bases as suspensões nucleares da amostra e do padrão, Glicine max (63,7%
AT e 36,3% CG), foram obtidas de forma similar e coradas com 4’,6’-diamino-2-fenilindole. As suspensões foram
então analisadas em citômetro de fluxo Partec PAS®. Para as análises citogenéticas, metáfases foram obtidas de
meristemas radiculares e as lâminas foram preparadas pela técnica de dissociação celular e secagem ao ar. O
conteúdo do DNA nuclear de A. aculeata foi estimado, sendo 2C = 5,81 pg, e o percentual de bases apresentada
pela espécie foi igual a 58,3% AT e 41,7% CG. O número de cromossomos determinado com a montagem do
cariótipo de A. aculeata foi de 2n = 30. Tais resultados servem como ferramentas para estudos taxonômicos e
filogenéticos, além de servirem de base para o desenvolvimento de programas de melhoramento e de biotecnologia.
Apoio financeiro: Fapemig e CNPq
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Pendões
imaturos e calos embriogênicos como tecido
alvo para transformação genética de linhagens, híbridos
e variedade de milho via Agrobacterium tumefaciens
Silva, MR1; Castro, BL1; Grando, MF1; Yamazaki-Lau, E2; Kazmirski, T1; Suzin, M1; Schons, J1; Denardin, ND1;
Almeida, VO1
PPGAgro, Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Laboratório de Virologia e Laboratório de Bacteriologia da Faculdade de Agronomia e
Medicina Veterinária (FAMV) da Universidade de Passo Fundo. Passo Fundo, RS
2
Embrapa Trigo. Passo Fundo, RS
[email protected]
1
Palavras-chave: Engenharia genética, Zea mays L., explantes, genótipos, Seleção in vitro.
Introdução: O Milho (Zea mays L.) é um dos três cereais mais importantes em nível de produção no mundo, sendo
ainda considerado uma planta modelo de liliopsidas para os estudos de genética, genômica e biologia molecular. A
transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens tem sido empregada de forma eficiente em alguns
genótipos de milho. Os pontos críticos para utilização desta tecnologia se referem ao uso de genótipos responsivos
in vitro, explantes com capacidade morfogenética, utilização de estirpes de A. tumefaciens competentes para
transformação e condições de cultivo in vitro. A maioria dos experimentos de transformação genética em milho tem
sido realizada com embriões imaturos do genótipo modelo Hi-II. Transformar outros genótipos e outros explantes
de milho com Agrobacterium tem sido um desafio. Objetivos: avaliar a possibilidade de transferência de genes em
segmentos de pendão imaturo e calos embriogênicos de cinco genótipos de milho pré-selecionados in vitro (L2,
L20, H3MT-1, H3MT-2 e V4). Métodos: O experimento foi desenvolvido nos Laboratórios de Biotecnologia Vegetal,
Virologia e Bacteriologia da FAMV/UPF. Os explantes foram inoculados com a estirpe EHA 105 de Agrobacterium
tumafaciens, contendo o plasmídeo pCambia 3301 (contendo o gene reporter gus e gene marcador bar controlados
pelo promotor 35S). Para a transformação foi utilizado o protocolo adaptado de Vega et al. (2008), sendo utilizado
concentração bacteriana OD600 = 0,5 e período de infecção de 20 minutos. Os explantes infectados foram mantidos
no co-cultivo por 3 dias e em meio de descanso por 7 dias, sendo em seguida transferidos para o meio seletivo
contendo o herbicida BASTA. Para avaliação da transferência do T-DNA foi utilizado o ensaio histoquímico para
GUS, 10 dias após a infecção e amplificação do gene gus por PCR após cultivo de 2 meses dos explantes em meio
seletivo. Resultados: Dos pendões imaturos co-cultivado com Agrobacterium tumefaciens 91,2% apresentaram a
coloração azul. Como os explantes controles apresentaram um background de coloração azul clara, foi avaliado
a intensidade de cor azul para comparar os tratamentos. Os pendões do genótipo H3MT-1 apresentaram
intensidade superior ao controle e 53% dos pendões infectados deste genótipo apresentaram alta intensidade
da cor azul. A porcentagem de calos do genótipo L2 que apresentaram coloração azul intensa foi superior ao
controle e ao genótipo L20. A variedade V4 apresentou intensidade de coloração semelhante ao seu controle.
A transformação foi confirmada por PCR em pendões dos híbridos H3MT-1 e H3MT-2 e calos embriogênicos
da variedade V4. Conclusão: Os dados sugerem que foi possível transferir genes via Agrobacterium tumefaciens
em pendões imaturos dos híbridos H3MT-1 e H3MT-2 e em calos embriogênicos da variedade V4 de milho.
Apoio financeiro: FAPERGS
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Estabilidade genômica em explantes triploides e
eliminação cromossômica após indução de poliploidia
– Implicações para a duplicação cromossômica em
Pennisetum
El-Aouar Filho, RA1; Paula, CMP2; Nunes, JD2; Azevedo, ALS2; Pereira, AV2; Davide, LC3; Campos, JMS1
Laboratório de Genética e Biotecnologia, Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de
Fora-MG
2
Laboratório de Genética Vegetal, Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora-MG
3
Laboratório de Citogenética, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras-MG
[email protected]
1
Palavras-chave: Pennisetum, duplicação cromossômica, poliploidia, citometria de fluxo, eliminação cromossômica, citogenética
Introdução: Pennisetum é um dos importantes gêneros da família Poaceae, sendo as espécies P. purpureum (capim
elefante, 2n=4x=28 cromossomos) e P. glaucum (milheto, 2n=2x=14 cromossomos) amplamente utilizadas como
forrageiras. Uma das estratégias de melhoramento de Pennisetum é o cruzamento entre essas espécies e a obtenção
de um híbrido triploide (2n=3x=21 cromossomos). A esterilidade desse híbrido dificulta o seu emprego nos métodos
de melhoramento e a duplicação cromossômica in vitro representa uma opção para a obtenção de hexaploides.
Em híbridos e poliploides recém formados, frequentemente são observadas inúmeras modificações genômicas,
tais como eliminação de sequências genômicas e cromossomos. Neste trabalho, a estabilidade genômica de
embriões triploides e de plantas obtidas por duplicação cromossômica foi avaliada por abordagem citogenética
e de citometria de fluxo. Métodos: Embriões triploides de Pennisetum foram avaliados com 10 a 30 dias após a
polinização através de metodologia citogenética e de citometria de fluxo. Para análise citogenética, os embriões
foram retirados, fixados e submetidos a digestão enzimática em pectinase/celulase. As lâminas foram preparadas
por dissociação celular/secagem ao ar sendo posteriormente coradas com Giemsa. Alterações citogenéticas/
celulares relacionadas à instabilidade genômica foram quantificadas. Procedimento de obtenção dos núcleos
em tampão LB01 foi utilizado para análise por citometria, seguido da coloração com iodeto de propídeo. Para
duplicação cromossômica, sementes triploides foram submetidas a tratamentos com colchicina 0; 0,05; 0,10 e
0,20% por 12, 24 e 36h. O percentual de seedlings sobreviventes foi avaliado aos 60 dias e as plantas poliploides
identificadas por citometria de fluxo. Resultados: Reduções nas quantidades de DNA nos embriões triploides
foram observadas em uma resposta tempo dependente, evidenciando uma provável eliminação de sequências
genômicas em resposta ao evento de hibridação. Nas análises citogenéticas realizadas, não foram evidenciadas
eliminação de cromossomos, entretanto anormalidades relacionadas à eliminação de sequencias genômicas foram
observadas, tais como extravasamento de cromatina e presença de micronúcleos. O tratamento mais eficiente
para duplicação cromossômica foi o de colchicina 0,10% por 12h de exposição, onde foi possível observar em
média 17,38% das plantas poliploides. Nas 23 plantas recuperadas como hexaploides, a variação na quantidade
de DNA foi de 7,80pg a 9,23pg (com valor esperado de 9,30pg), sugerindo a ocorrência de rearranjos genômicos
também após o evento de poliploidização. Conclusões: Instabilidade genômica após os eventos de hibridação
e poliploidização ocorrem em híbridos de Pennisetum, assim como já relatado para vários outros híbridos na
literatura. Essas variações geradas tanto apresentam implicações para a obtenção de plantas hexaploides estáveis,
como para a geração de variabilidade genética nos híbridos, que pode ser útil para o melhoramento de Pennisetum.
Apoio financeiro: Capes, CNPq, Fapemig e Unipasto
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Número cromossômico em diferentes populações de
Eriotheca gracilipes (K.Schum.) A. Robyns (Malvaceae Bombacoideae)
Marinho, RC¹; Mendes-Rodrigues, C¹; Yamagishi-Costa, J²; Oliveira, PE²
Laboratório de Morfologia Vegetal e Imagens¹, Instituto de Biologia - Universidade Federal de Uberlândia², Uberlândia, Minas Gerais,
Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Cerrado, Citótipos, Populações, Poliploidia, Cromossomos.
Eriotheca gracilipes (K. Schum.) A. Robyns é uma espécie arbórea frequentemente encontrada no bioma Cerrado.
Na caracterização do número cromossômico da espécie há documentado um padrão diplóide com 2n=2x=92
cromossomos. Em Eriotheca pubescens foram documentados três citótipos diferentes 2n=3x=138, 2n=4x=184
e 2n=6x=276 o que pode indicar que esteja ocorrendo um processo de diferenciação entre as populações da
espécie. Para verificar se pode haver citótipos diferentes também em E.gracilipes este trabalho tem como
objetivo descrever o número cromossômico de duas populações da espécie. A coleta dos indivíduos foi realizada
em Uberlândia – Minas Gerais e outra população em Cristalina – Goiás, que apresenta algumas diferenças
morfológicas da primeira população. As radículas de sementes germinadas sobre vermiculita foram coletadas
e pré-tratadas em três tipos de tratamentos diferentes: PDB por 4 h à 16 - 18 ºC, 8-hq por 4 h à 16 - 18 ºC ou
24 h à 4 oC. As radículas foram fixadas em solução Carnoy (etanol:ácido acético 3:1 v/v) por pelo menos 24 h
e armazenadas em etanol 70%. As radículas foram hidrolisadas com HCl 5N, maceradas em ácido acético 45%
e para montagem das lâminas foi utilizada a técnica de esmagamento e a coloração foi realizada de acordo
com o método de Giemsa. A diferenciação das duas populações de E. gracilipes é claramente visualizada na
ocorrência de diferentes citótipos para as duas populações. Foram obtidos 2n=2x=92 cromossomos para todos
os indivíduos da população de Uberlândia. A caracterização da população de Cristalina mostrou indivíduos em
que este padrão diplóide não se repetiu com todos os indivíduos hexaplóides (2n=6x=276 cromossomos). Não é
possível afirmar se a origem do citótipo hexaplóide foi por autopoliploidia ou por alopoliploidia, já que não foram
encontrados citótipos tetraplóides ou triplóides que pudessem evidenciar um possível mecanismo de origem
do citótipo hexaplóide. O fenômeno de poliploidização observado nos citótipos de E. gracilipes é amplamente
documentado para espécies vegetais e considerado um dos principais mecanismos evolutivos em angiospermas
que pode explicar alterações morfológicas e refletir em processos de diferenciação entre as populações.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG
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Caracterização citogenética de Sapindus saponaria L.
de Ipameri-GO
Oliveira-Júnior, RJ12; Mamedes, TC2; Macedo, LP3; Camacho, GS3; Marinho, RC3; Morelli, S1; Arruda, AS2
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
Universidade Estadual de Goiás, UnU-Ipameri
3
Instituto de Biologia, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Saboneteira, Contagem cromossômica, Nucléolos, Cerrado, Citogenética.
A saboneteira (Sapindus saponaria L.) conhecida popularmente como “sabão-de-soldado”, saboeira, sabãode-macaco é uma espécie arbórea pertencente à família Sapindaceae com altura entre 5 a 9 metros, utilizada
em reflorestamento de áreas degradadas e de preservação permanente, é também utilizada na construção civil
por apresentar tronco cilíndrico, apresenta grande potencial para ser utilizada no paisagismo; seus frutos são
empregados pela população como sabão, no banho e no combate a úlceras, feridas na pele e inflamações. Espécies
de Sapindus têm sido pesquisadas como fonte de saponinas para uso cosmético, por suas propriedades tensoativas
como também para uso farmacológico. Os recursos genéticos vegetais são o componente o componente da
biodiversidade necessário ao desenvolvimento sustentável da agricultura e da agroindústria. Esses recursos são
estratégicos para o Brasil e, para que esta riqueza seja corretamente preservada e utilizada, colaborando para o
desenvolvimento tecnológico e econômico, são necessários esforços para conhecê-las. Para tanto, a caracterização
citogenética é uma das ferramentas disponíveis. Pode ser aplicada como ferramenta para a avaliação de plantas
regeneradas in vitro e de plantas transformadas, em estudos de evolução e citotaxonomia. O presente estudo
teve como objetivo realizar a contagem cromossômica e caracterizar os nucléolos de Sapindus saponaria L da
região de Ipameri. Foram obtidas células do meristema radicular, as quais tiveram o ciclo celular bloqueado com
PDB. As células foram fixadas em lâminas e analisadas no microscópio óptico. As melhores metáfases foram
contadas para a determinação do número cromossômico. As células foram submetidas à técnica de impregnação
com nitrato de Prata para uma melhor caracterização. A contagem cromossômica revelou número diplóide de
28 cromossomos, corroborando com outros estudos, nos quais os números básicos mais freqüentes na família
Sapindaceae são x= 14, 15 e 16, estando presentes em 90% dos gêneros que apresentam contagem cromossômica
até o momento. Não foi possível visualizar os cromossomos portadores da NOR, mas a impregnação com
nitrato de Prata revelou a presença de 1 ou 2 nucléolos, sugerindo a existência de um sistema de NOR simples.
O presente trabalho é importante para a determinação do número diplóide da população de Sapindus saponaria
L. da região de Ipameri e novos estudos poderão caracterizar melhor a estrutura cromossômica da mesma.
Apoio financeiro: CAPES; UFU; UEG; FAPEMIG; CNPq
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Avaliação de metodologias de extração protéica
em gramíneas forrageiras visando aplicação em
proteômica
Nascimento, DC do1; Meireles, KGX2; Robles, CS3; Costa, PPOL da4
Acadêmica de Ciências Biológicas da Uniderp/Anhanguera, estagiária na Embrapa Gado de Corte, [email protected]
Pesquisadora da Embrapa Gado de Corte
3
Bióloga, bolsista AT na Embrapa Gado de Corte; (4) Acadêmico de Engenharia Agronômica da Uniderp/Anhanguera, estagiário na Embrapa Gado de Corte
1
2
Palavras-chave: proteômica, brachiaria, extração, eletroforese bidimensional, extratos proteicos.
Introdução: A Proteômica dedica-se ao estudo funcional do conjunto de proteínas (proteoma) expresso pelo genoma
de uma célula, tecido ou organismo em determinado ambiente. Em plantas, a análise do proteoma inclui basicamente
o isolamento de proteínas em géis bidimensionais, seguido da seleção das moléculas de interesse, que são submetidas
à digestão enzimática e analisadas por espectrometria de massa, para a determinação de sua seqüência e função.
As etapas mais críticas em estudos proteômicos de plantas concentram-se na extração e preparação da amostra,
pois, de maneira geral, tecidos vegetais são ricos em proteases e materiais que interferem na separação e análise das
proteínas, incluindo polissacarídeos, lipídios, compostos fenólicos e produtos secundários. Estes contaminantes
representam um grande inconveniente para as etapas seguintes do fluxograma metodológico, especialmente para
a eletroforese bidimensional. Géis 2D produzidos a partir de amostras impuras são caracterizados por borrões
verticais e horizontais, e elevado resíduo do corante, que reduzem significativamente o número de proteínas isoladas
e identificadas. Objetivo: Este estudo visa avaliar metodologias de extração de proteínas de Brachiaria, visando
indicar aquela que proporciona a obtenção de extratos protéicos mais concentrados e livres de contaminantes
para análise proteômica. Métodos: Proteínas totais de B. brizantha foram extraídas de 2g de folhas, de acordo com
três abordagens frequentemente utilizadas para tecidos vegetais: Hurkman & Tanaka (1986) com modificações de
Saravanan & Rose (2004), Mot & Vanderleyden (1989) e Wang et al. (2003; 2006). Os extratos de proteínas foram
quantificados de acordo com Bradford e os perfis protéicos resultantes dos protocolos testados serão discriminados
em gel de poliacrilamida, a fim de verificar a qualidade das extrações. Resultados: A quantificação apresentou os
seguintes resultados: Método A: 4,071; Método B: 3,261; Método C: 2,773; como se pode observar, de acordo com a
quantificação o método que proporcionou melhor rendimento foi o método convencional. Atualmente, o trabalho
encontra-se na etapa de eletroforese bidimensional, na qual as moléculas são primeiramente separadas por seu
ponto isoelétrico, seguida da resolução pelo seu peso molecular. Os géis 2D serão digitalizados e analisados pelo
software Image Master 2D Platinum, visando identificar o número de spots isolados de acordo com cada abordagem.
A metodologia que proporcionar, conjuntamente, maior rendimento na extração, perfis protéicos livres de rastros
e degradação e, também, um número significativo de proteínas adequadamente focalizadas e visualizadas em
géis 2D, será adotada como procedimento de rotina nos experimentos proteômicos com gramíneas forrageiras.
Apoio financeiro: FUNDECT, MP3/EMBRAPA
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Análise genética por características multicategóricas
em goiabeiras
Nogueira, AM¹; Mangaravite, E¹; Ferreira, MFS¹; Ferreira, A¹
¹Departamento de Produção Vegetal, Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
Palavras-chave: Psidium guajava, dissimilaridade, Tocher modificado, vizinho mais próximo, UPGMA.
Introdução: A goiabeira (Psidium guajava L.) é amplamente cultivada em regiões tropicais e subtropicais no
mundo. Seu fruto apresenta alto valor nutricional e sua cultura fortalece a agricultura familiar. O cultivo amplo de
poucas variedades comerciais remete à preocupação quanto à vulnerabilidade genética de pomares homogêneos.
Objetivo: Avaliar a diversidade genética, por meio de descritores multicategóricos, em acessos de goiabeiras
nativas e da cultivar Paluma. Métodos: Foram coletadas amostras de folhas e de frutos entre novembro de 2009
e março de 2010 nos municípios de Alegre-ES, Guaçuí-ES, Cachoeiro de Itapemirim-ES e Caparaó-MG. Para a
caracterização morfológica dos 48 acessos utilizaram-se 13 descritores da International Union for the Protection of
New Varieties of Plants (UPOV) que foram: duas variáveis de caule (coloração do tronco e distribuição de galhos),
cinco de folha (intensidade da coloração antocianina, forma da folha, da base, do ápice e do talo final) e seis de
fruto ( forma do fruto e da base do pedúnculo, coloração externa e do mesocarpo, uniformidade da cor externa e
textura superficial). Foram estimadas as distâncias euclidianas médias padronizadas e realizados três métodos de
agrupamento (Tocher modificado, vizinho mais próximo e UPGMA). Resultados: Pelo método Tocher modificado,
formaram-se sete grupos de genótipos. Considerando o corte a 80% de dissimilaridade, foram formados 20 grupos
de genótipos pelo método do vizinho mais próximo e 18 pelo método UPGMA. Os métodos de agrupamento
utilizando estas características formaram grupos ligeiramente diferenciados, entre o método de Tocher modificado
e os hierárquicos, principalmente entre os acessos nativos. Conclusões: Os acessos nativos foram bastante
divergentes. As plantas da cultivar Paluma reuniram-se em um mesmo grupo. A diferença encontrada entre os
acessos nativos indica grande variabilidade fenotípica e potencialidade para uso em programas de melhoramento.
Apoio financeiro: UFES e FAPES
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Busca de marcadores moleculares RAPD ligados à
apomixia em Panicum maximum Jacq
Bluma-Marques, AC¹; Jank, L²; Chiari, L²; Leguizamon, GOC²; Nascimento, DC do³
¹Universidade Católica Dom Bosco
²Embrapa Gado de Corte
³Universidade para o Desenvolvimento do Estado e da Região do Pantanal
[email protected]
Palavras-chave: Apomixia, Panicum maximum, Polimorfismos de DNA, Melhoramento vegetal.
Introdução: A apomixia é um processo de clonagem natural por meio de sementes, que gera embriões sem
fecundação, ou seja, geneticamente iguais à planta mãe. Panicum maximum é uma gramínea forrageira de
importância econômica que se reproduz por apomixia aposporica facultativa. Nos programas de melhoramentos
da espécie, genótipos apomíticos são utilizados como doadores de pólen à genótipos que se reproduzem
sexuadamente, geralmente diplóides que foram tetraploidizados artificialmente, visando à introdução de
características agronômicas interessantes. Atualmente a avaliação do modo de reprodução é feita pela análise
de sacos embrionários em microscopia de contraste de interferência, que é uma técnica laboriosa e somente
pode ser aplicada à planta adulta após seu florescimento. A descoberta de marcadores moleculares ligados à
essa característica possibilitará uma rápida e precoce identificação de progênies apomíticas. Objetivos: Buscar
marcadores moleculares RAPD ligados à apomixia em Panicum maximum. Métodos: Para esse trabalho foram
selecionados 14 plantas sexuais e 23 apomíticas do banco de germoplasma de P. maximum, da Embrapa
Gado de Corte. O DNA foi extraído e amplificado com 64 primers de RAPD. Os produtos amplificados foram
analisados em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio. Resultados: Até o momento, nenhum
marcador foi identificado exclusivamente nas plantas apomíticas e ausente nas plantas sexuais, sugerindo
ligação com esta característica. Novos marcadores RAPD e, também, alguns SSR (microssatélites) serão testados
nesses indivíduos e populações estão sendo geradas a fim de buscar marcadores ligados à apomixia nessa
espécie. Conclusões: Os 64 primers de RAPD testados não amplificaram nenhuma marca ligada à apomixia.
Apoio financeiro: Embrapa, CNPq e Unipasto
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Caracterização molecular de genótipos de cana de
açúcar através de marcadores microssatélites
Barreto, FZ1; Balsalobre, TWA2; Dalgê, MN1; Severino, VL1; Souza, AP2; Garcia, AFF3; Hoffmann, HP1; Vieira,
MAS1; Carneiro, MS1
Depto. de Biotecnologia Vegetal - CCA/UFSCar, Araras-SP
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-UNICAMP, Campinas-SP
3
Depto. de Genética - ESALQ/USP, Piracicaba-SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cana-de-açúcar, marcadores moleculares, painel genótipos.
O melhoramento clássico tem sido responsável pelo aumento do potencial produtivo das variedades modernas
de cana, através de ferramentas clássicas de estudo da variabilidade genética existente. A construção de mapas
genéticos de ligação, utilizando marcadores moleculares, pode auxiliar na elaboração de estratégias a serem
introduzidas nos programas de melhoramento, de forma a acelerar o desenvolvimento de novas variedades.
Embora os mapas bi-parentais sejam eficazes no mapeamento de QTLs de interesse, eles só podem identificar
os alelos presentes nos genitores do cruzamento estudado, e grande parte da variação genética presente nas
populações de melhoramento permanece não detectada. O mapeamento por associação surgiu como um poderoso
método para geração de informação genética a partir de populações não estruturadas compostas por genótipos
derivados de diversas genealogias. O presente trabalho teve como objetivo a análise preliminar da diversidade
genética de clones de cana de açúcar através de marcadores microssatélites funcionais. A caracterização do
polimorfismo revelado pelos EST-SSRs foi feita com base em uma amostra de 56 clones comerciais de cana-deaçúcar. Estes genótipos foram derivados do Painel Brasileiro de Genótipos de Cana-de-Açúcar (PMGCA) que
reuniu 154 genótipos oriundos de diversas regiões do mundo, e que constituíram a base genética dos programas
de melhoramento genético brasileiros de cana. Dos 15 marcadores EST-SSRs analisados foram obtidos 148
locos. Devido à natureza poliplóide da cana-de-açúcar, a maioria dos EST-SSRs selecionados produziram mais
de dois alelos por indivíduo, variando de 18 (SCA09) a 4 (SCB99) alelos. Com o auxílio do programa NTSYS
(versão 2.1), analisou-se a diversidade genética existente entre os 56 clones de cana-de-açúcar, obtendo-se um
agrupamento com 17 grupos distintos. Os resultados iniciais indicam uma estimativa da variabilidade genética
preliminar do subconjunto dos 56 clones cana do PMGCA. No entanto, devido a complexidade do genoma da
cana-de-açúcar, um número maior de marcadores deverão ser adicionados para avaliar melhor o polimorfismo.
Apoio financeiro: CNPq, INCT Bioetanol
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Identificação de linhagens de feijão como potenciais
diferenciadoras dentro da raça 65 de Colletotrichum
lindemuthianum
Costa, LC1; Ishikawa, FH1; Ramalho, MAP1; Souza, EA1
Laboratório de Resistência de Plantas a Doenças, Setor de Genética e Melhoramento de Plantas, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras , Cx. P. 3037, CEP 37200-000, Lavras – MG
[email protected]
1
Palavras-chave: Melhoramento do feijoeiro, antracnose, variabilidade genética, Colletotrichum lindemuthianum, Phaseolus vulgares.
Introdução: Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro e se caracteriza pela alta
variabilidade genética e patogênica. Estudos de levantamento de raças utilizando as cultivares diferenciadoras
propostas pelo CIAT, vêm demonstrando a predominância das raças 65, 73 e 81 no Brasil, principalmente no estado
de Minas Gerais. No entanto, existem evidências da variabilidade dentro de raças, como é o caso da raça 65 e que tem
dificultado o desenvolvimento de cultivares com resistência durável. Um exemplo é o que ocorreu com a cultivar
comercial BRSMG Majestoso, selecionada a priori como resistente a raça 65, no entanto, nos últimos levantamentos
de raças é a que tem ocorrido com maior freqüência nesta cultivar. Objetivo: Identificar cultivares de feijão que
discriminem a variação dentro da raça 65 para serem utilizadas como complementares ao conjunto de cultivares
diferenciadoras do CIAT. Materiais e Métodos: Foram inoculados dez isolados provenientes de diferentes regiões
produtoras de feijão de Minas Gerais, todos classificados como raça 65, em doze cultivares de feijoeiro adaptadas
as condições climáticas da região (Ouro Negro, Majestoso, Pérola, Talismã, Valente, Madrepérola, Supremo, Estilo,
Cometa, Esplendor, Ouro Vermelho e União). Resultados: Pela reação das linhagens aos 10 isolados foi possível
observar 5 padrões diferentes de reação, ou seja, são classificadas em 5 raças. O isolado LV 120 foi o mais agressivo
infectando sete cultivares (Ouro Negro, Majestoso, Pérola, Supremo, Estilo, Cometa e União). Os isolados LV 131, LV
134, LV 136 e LV 140 apresentaram reação compatível com seis cultivares (Ouro Negro, Majestoso, Pérola, Supremo,
Estilo, Cometa). Esses isolados foram coletados em um mesmo local, em diferentes pontos do campo experimental,
indicando que pertencem a uma mesma raça. Já os isolados LV 114, LV 115 e LV 148 foram compatíveis com apenas
duas linhagem (Pérola e União). O isolado LV 111 foi compatível com cinco linhagens (Ouro Negro, Majestoso, Pérola,
Estilo, Cometa) e o LV 117 foi compatível com três linhagens (Pérola, Estilo e União). Quatro linhagens poderão
ser utilizadas para diferenciação: ‘Estilo’ que foi suscetível a sete isolados; ‘Ouro Negro’, ‘Majestoso’ ou ‘Cometa’ que
tiveram mesma reação de susceptibilidade a seis isolados; e as linhagens ‘União e Supremo’, ambas suscetíveis a
cinco isolados, mas que diferiram entre eles. Conclusões: Essa metodologia permitirá a diferenciação de isolados
classificados como pertencentes a “mesma” raça e poderá auxiliar na escolha dos isolados mais virulentos. Desta
forma, será possível o desenvolvimento de cultivares resistentes à antracnose mais duráveis, já que permitem
uma maior discriminação da variabilidade existente, assim como na identificação de novas fontes de resistência.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPEMIG
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Retrocruzamento assistido por marcadores de DNA
para resistência de feijão ao mofo branco a partir de
duas fontes de resistência
Lara, LAC1; Antonio, RP1; Santos, JB; Alves, FC1; Gonçalves, PRC1
Laboratório de Genética Molecular – Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
[email protected]
1
Palavras-chave: Sclerotinia sclerotiorum, retrocruzamento, similaridade genética, marcadores de DNA, feijão.
O objetivo deste estudo foi utilizar marcadores de DNA para seleção de plantas do primeiro e segundo
retrocruzamento de duas populações distintas, portadoras de QTLs para resistência ao mofo branco para
identificar plantas mais semelhantes aos genitores recorrentes. Foram obtidas as populações de RC1: GV {[G122
(resistente) x VC3 (suscetível=recorrente)] x VC3} e EM {[EX Rico (resistente) x M20 (suscetível = recorrente)]
x 2*M20}. A RC1-GV com 53 plantas foi genotipada com RAPD e o SCAR Phs para resistência ao mofo branco.
Obteve-se a população RC2-EM que foi avaliada para resistência ao mofo branco, por meio dos primers RAPD
O12.1600 e O15.1800 e também para resistência a C. lindemuthianum (M20 portadora do alelo Co-42) por meio do
primer L04. Em ambas as populações foram estimadas o coeficiente de similaridade genética (Dice) entre cada
planta da RC e o recorrente, bem como a percentagem de alelos (GR%) RAPD do recorrente (RC1-GV) e de alelos
microssatélites do recorrente (RC2-EM). As similaridades genéticas das plantas RC1 da população GV e 2das plantas
RC2 da população EM foram correlacionadas com as respectivas GR%. Entre as 53 plantas RC1 26 ( ³ = 0,02; P =
0,89) foram selecionadas pelo SCAR Phs e destas treze apresentaram similaridade acima de 75,00%. A média de
recuperação do recorrente nas RC1 foi de 73,87%, variando de 64,29 a 80,53%. A semelhança dos resultados dos dois
procedimentos é corroborada pela correlação (r=0,95**) entre as similaridades genéticas das plantas RC1 com o
recorrente e suas respectivas proporções de alelos do recorrente. O primer L04 para resistência a C. 2lindemuthianum
2
foi eficiente em identificar as plantas portadoras do alelo Co-4
, pois, das 170 plantas RC2 135 ( ³ = 1,76; P = 0,99)
2
apresentaram o marcador. Entre as 170 plantas RC2 36 ( ³ = 1,32; P = 1,00) foram selecionadas pelo primer RAPD
O15 e destas quatro apresentaram similaridade acima de 87,50% e também foram selecionadas pelo primer L04.
A média de recuperação do recorrente nas RC2 foi de 87,28%, variando de 73,81 a 98,72%. A correlação entre as
similaridades genéticas das plantas RC2 com o recorrente e suas respectivas proporções de alelos do recorrente
foi de 0,80**. Constata-se que a SAM deve contribuir para reduzir o programa em pelo menos uma geração.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG e EMBRAPA
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143
Divergência genética de seringueira através de
marcadores microssatélites
Romão, LRC¹; Cardoso, JMK²; Mondego, JMC2; Gonçalves, P de S³; Rubiano, LB2
¹Instituto de Biologia, UNICAMP
²Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Recursos genéticos Vegetais, Instituto Agronômico de Campinas(IAC)
³ Programa Seringueira, Instituto Agronômico de Campinas(IAC)
[email protected]
Palavras-chave: H. brasiliensis, EST-SSRs, Structure, UPGMA, diversidade genética
A seringueira [Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell-Arg.] é a maior fonte de borracha natural do mundo. O
trabalho teve como objetivo estimar a divergência genética através de microssatélites gênicos e genômicos e assim,
discriminar os melhores locos futuros estudos de associação. Microssatélites genômicos foram desenvolvidos a partir
de seqüências depositadas em bancos de dados e uma análise estruturada de bioinformática foi realizada. Ao todo,
45 clones do programa seringueira foram coletados e, juntamente com sete espécies selvagens, foram genotipados.
Optou-se primeiramente por utilizar EST-SSRs oriundos de seqüências expressas publicadas em literatura para a
genotipagem e análise da diversidade genética. A estrutura genética dos clones foi avaliada segundo as distâncias
genéticas modificadas de Rogers, e o agrupamento foi realizado pelo coeficiente de UPGMA (dendrograma).
A diversidade genética também foi obtida e confirmada pela análise de coordenadas principais e pela análise
bayesiana com programa Structure. A informatividade dos SSRs calculada pelo conteúdo de informação polimórfica
(PIC) foi alta e indicou considerável variabilidade entre os acessos. De acordo com a análise de agrupamento dos
genótipos com microssatélites gênicos, os genótipos foram divididos em dois grandes grupos, um formado por
genótipos brasileiros (IAC e Amazônicos, Grupo 01) e outro grupo formado por genótipos malaios. Esta separação
em grupos pode indicar que os programas de melhoramento genético desenvolvidos aqui no Brasil e na Malásia
devem estar promovendo um distanciamento genético entre estes clones por praticarem pressões de seleção
diferentes em seus programas. Os resultados foram promissores para recomendar genótipos mais divergentes
em futuros cruzamentos abreviando o tempo necessário para avaliação de combinações gênicas superiores.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
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144
Análise do polimorfismo molecular em variedades
de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) por meio de
marcadores moleculares
Costa, MLM1; Amorim, LLB2; Benko-Iseppon, AM2; Melo, LJOT3; Carvalho, R1
Laboratório de Genética-Bioquímica e Sequenciamento de DNA, Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco
Laboratório de Genética Vegetal, Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
3
Estação Experimental de Cana-de-Açúcar do Carpina, Universidade Federal Rural de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cana-de-açúcar, ISSR, DAF, marcador molecular, melhoramento genético.
Introdução: As variedades de cana-de-açúcar são alvo de uma degenerescência que atinge a capacidade
produtiva no decorrer do tempo. Por este motivo, há necessidade de se utilizar diferentes técnicas de pesquisa
a fim de contribuir com o processo de lançamento de novas variedades, selecionadas via cruzamento, e que
possibilitem a manutenção do processo produtivo com aumento da produtividade agrícola e industrial. Neste
sentido, a tecnologia de marcadores moleculares apresenta-se como uma ferramenta útil na seleção de parentais
contrastantes com potencial a serem utilizados em programas de melhoramento genético. Objetivos: Analisar
o polimorfismo em variedades de cana-de-açúcar através do uso de marcadores moleculares dominantes.
Métodos: No presente estudo foram utilizadas 4 variedades de cana-de-açúcar (RB763710, RB863129, SP79-1011
e SP70-1143) provenientes da Estação Experimental de Cana-de-Açúcar do Carpina, localizada no Município de
Carpina, Estado de Pernambuco. O DNA genômico foi extraído a partir de folhas jovens utilizando o método de
CTAB 2%. Nas reações de amplificação (PCR) foram empregados 11 primers DAF e 11 primers ISSR. Resultados:
Os marcadores apresentaram 92,9% e 78,4% de polimorfismo para análise de DAF e ISSR, respectivamente. Os
dendrogramas gerados a partir do método UPGMA, para os primers DAF e ISSR, dividiram as variedades em dois
grupos. O primeiro composto pelas variedades RB (RB763710, RB863129), e o segundo pelas SP (SP79-1011 e SP701143), aumentando a confiabilidade dos dados, já que se tratam de variedades oriundas do mesmo programa de
melhoramento genético. Na presente análise, os marcadores DAF e ISSR revelaram polimorfismos suficientemente
distintivos entre as variedades, sendo apontados como ferramentas úteis para o estudo e exploração da diversidade
genética em cana-de-açúcar.
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145
Caracterização de variedades de laranja doce quanto
ao número de sementes e a taxa de poliembrionia
Lanza, RM1; Cunha, T2; Latado, RR3.
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz/USP
UNIARARAS
3
Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: laranjas, semente, embrião, poliembrionia
Introdução: A instalação de programas de melhoramento de laranjeiras com uso de cruzamentos controlados
é dificultada principalmente pela existência de grande número de variedades que apresentam alta taxa de
poliembrionia nas sementes e pela presença de plantas com ciclo juvenil longo, o que ocasiona muito tempo
para a conclusão dos ciclos de recombinação e seleção de plantas. Objetivos: Visando a seleção de variedades
de laranjeiras que possuam potencial para serem usadas como genitores em cruzamentos controlados, foram
avaliadas anualmente, durante quatro anos, a taxa de poliembrionia em sementes, o número médio de embriões
por semente e número médio de sementes por fruto de 650 variedades de laranja doce do Banco de Germoplasma
do Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC. Métodos: Anualmente 12 frutos de cada variedade foram coletados
para a contagem de sementes. A seguir, 20 sementes de cada variedade tiveram o número de embriões avaliados
utilizando-se o método de contagem direta do numero de cotilédones. O número de embriões de cada semente
era representado pelo número de cotilédones dividido por dois. A taxa de poliembrionia das sementes de cada
variedade foi avaliada na forma de porcentagem de sementes contendo mais de um embrião. Resultados:
Após a realização de análises estatísticas dos dados de quatro anos, foram identificadas quinze variedades que
apresentaram as menores taxas médias de poliembrionia de sementes: Amber sweet, Pêra mel, Cometa, Tarocco
rio–2, Dieberger-9, Pêra-de-abril, Lanceta amarga, Mediterrânea, Sanguino, Mediterrânea (xiloporose), Boa vista,
Monte Parnazo (navel), Pera CENA-4, Valência precoce e Lamb summer (entre 0 e 45% de taxa de poliembrionia),
sendo que as variedades Amber sweet e Pêra mel foram as mais monoembriônicas, com 0% e 2,5% de taxa de
poliembrionia, respectivamente. As duas variedades apresentaram também baixo número médio de embriões por
semente (média de 1,0) e frutos com média de 7,6 e 18,9 sementes, respectivamente. As laranjeiras Cometa a Tarocco
Rio-2 também apresentaram taxa de poliembrionia mas com a característica indesejável para uso como genitoras
femininas, a produção de poucas sementes por fruto (0,4 e 0,9 semente cada). Outras variedades com baixa taxa
de poliembrionia foram as laranjeiras Dierberger-9 e Pêra-de-abril (22,5 e 27,5%) e boa produção de sementes (9,8
e 4,5). O número de embriões das 650 variedades variou entre 1,0 ± 0 e 4,8 ± 1,9 embriões por sementes, para as
variedades Amber sweet e Bahia IPEAL-14, e o número de sementes variou de 62 ± 43,8, na laranjeira cleópatra,
e 0,0 ± 0, para a Bahia sanguinea. Já a taxa de poliembrionia em sementes variou de 0 a 100%. Conclusões: As
variedades que apresentaram sementes altamente monoembriônicas e frutos com grande número de sementes
por fruto serão utilizadas como genitoras femininas no programa de cruzamentos envolvendo laranjas doces.
Apoio: FAPESP e CNPq, pelas bolsas de estudo de IC
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146
Variação genética para os teores de óleo em sementes
de uma população natural de Tabebuia impetiginosa
(Mart. DC.)
Cornacini, MR¹; Silva, JR¹; Senna, SN¹; Moraes, MA1; Moraes, SMB1; Rodrigues, CJ2; Moraes, MLT1
Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, SP
CESP, Três Lagoas, MS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: espécies florestais nativas, população natural e parâmetros genéticos.
Introdução: O Brasil possui grande número de espécies florestais nativas, sendo que as sementes de algumas
delas revelaram-se boas fontes de nutrientes e óleo que servem de alimento para a fauna e são de fundamental
importância na estratégia de sobrevivência da espécie. Assim, a composição química das sementes é bastante
variável, sendo que o ambiente onde crescem as plantas, a adubação e muitos outros fatores são capazes de alterar
esta constituição, aumentando ou diminuindo a quantidade de certos componentes. Entretanto, esta composição
é definida geneticamente, podendo ocorrer influência de fatores ambientais. A espécie em estudo, Tabebuia
impetiginosa, conhecida vulgarmente como ipê-roxo-de-bola, pertencente à família Bignoniaceae, apresenta
habitat característico de Floresta Estacional Semidecidual e Decidual, sendo muito utilizada para recuperação de
áreas degradadas. Objetivos: Estimar a variação genética para o teor de óleo em sementes de árvores matrizes de
uma população natural de Tabebuia impetiginosa. Métodos: As sementes foram coletadas em 30 árvores matrizes
de polinização livre, em fragmentos florestais, na região de Ilha Solteira-SP. A partir delas foram feitas as análises
dos teores de óleos pelo método Soxhlet, com solvente éter de petróleo. Adotou-se o delineamento inteiramente
casualizado com 30 tratamentos (árvores matrizes) e 2 repetições. As análises dos parâmetros genéticos foram
estimadas a partir do programa GENES. Resultados: As sementes apresentaram média de teor de óleo de 10,8%
e um coeficiente de variação experimental de 25,6%. O coeficiente de variação genética foi considerável (27,8%)
e a herdabilidade média foi de 0,70. A razão CVg/CVe foi de 1,1 e o teste-F foi significativo a 5% de probabilidade.
Conclusões: A variação genética para o teor de óleo, nesta população natural Tabebuia impetiginosa, é expressiva,
o que permite a utilização deste caráter em um programa de melhoramento genético, o que proporcionará
mudas mais vigorosas e com maior probabilidade de sobrevivência dos indivíduos desta população.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e UNESP
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147
Uso de marcadores moleculares para avaliação de
fontes de resistência à Xanthomonas axonopodis pv.
malvacearum, agente causal da mancha angular do
algodoeiro
Lucena, MG1,2; Oliveira, TS2; Silva, RA1,2; Coutinho, WM2; Hoffmann, LV3; Giband, M2,4
Universidade Estadual da Paraíba, Campina Grande, PB
Embrapa Algodão, Campina Grande, PB
3
Núcleo de P, D & I do Cerrado, Embrapa Algodão, Goiânia, GO
4
CIRAD – BIOS, UMR DAP, Montpellier, França
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Marcador SSR, Gossypium hirsutum, Xanthomonas campestris pv. malvacearum, Variabilidade genética, bacteriose
Introdução - A mancha angular, causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. malvacearum (Xam), é uma
das principais doenças do algodoeiro. Essa doença não tem controle curativo, sendo a resistência genética a forma
mais adequada de manejo. Até o presente, foram relatados 22 genes, conferindo diferentes níveis de resistência –
completa ou parcial – à 20 raças específicas da bactéria por meio de interação gene a gene. As combinações dos
genes B2B3 e B9LB10L foram as mais utilizadas em programas de melhoramento de algodoeiro, visando a resistência a
mancha angular. Essas combinações conferem a resistência total à maioria de raças específicas de Xam (até a raça
19) nos países produtores de algodão; entretanto, uma nova raça de Xam (HV1, raça 20) tem superado a resistência
resultante da combinação desses genes, sendo o gene B12 o único eficaz contra essa nova raça. Recentemente, um
marcador molecular do tipo SSR associado ao gene B12 foi relatado. Objetivos: Investigar as relações genéticas entre
fontes de resistência à Xam por meio do genotipagem de acessos de algodoeiro usando um marcador SSR associado
ao loco de resistência B12. Métodos: Foram escolhidos 10 acessos de algodoeiro portadores de diversas combinações
gênicas para avaliação com o marcador SSR CIR 246, associado a loco de resistência B12: S-295 (B12), 101-102B
(B2B3BSm) Empire WR (BSm), Empire WRB4 (B4BSm), Empire WRB2B6 (B2b6BSm), Empire WRB2B3B6 (B2B3b6BSm),
Mebane B1 (B2), Tamcot SP37 (B2B3B7), Reba B50 (B9LB10L) e Acala 44 (suscetível, sem genes de resistência), além de
um conjunto de variedades comerciais resistentes ou suscetíveis às raças de Xam presentes no Brasil – raças 3, 8, 10,
18 e 19 (DeltaOpal, Fibermax 966, CD-401, Guazuncho-2, Acala 90 e BRS 286). O DNA genômico total foi extraído de
sementes pelo método SDS e amplificado por PCR, usando primers de microsatélites. Os produtos de amplificação
foram aplicados em gel de poliacrilamida para avaliação do tamanho dos alelos amplificados. Resultados: Como
esperado, no acesso S-295 foi amplificada uma banda de 146 pb associada ao gene B12. Todos os acessos suscetíveis
até a raça 19 apresentaram bandas de 156 e/ou 166 pb, associadas à suscetibilidade. Diferentemente do que foi
relatado na literatura, em acessos resistentes até a raça 19 de Xam, e que possuem combinações gênicas diferentes do
gene B12, foi também amplificada uma banda de 146 pb. Conclusões: A banda de 146 pb, amplificada pelo marcador
CIR 246 e previamente associada ao gene de resistência B12, foi também amplificada em acessos portadores das
combinações gênicas B2B3 e B9LB10L. Esse marcador molecular, embora não permitindo diferenciar os genes de
resistência presentes nos acessos, é útil para selecionar genótipos resistentes de algodoeiro até a raça 19 de Xam.
Apoio: CNPq, Universidade Estadual da Paraíba, Embrapa
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148
Caracterização molecular dos acessos de feijoeiro
comum que compõem os ensaios de Valor de Cultivo e
Uso (VCU) dos anos de 2009/2010
Veiga, MMA¹,3; Valdisser, PAMR1,4; Brondani, RPV1,³; Cieslak, JF1,3 ; Pereira, HS2; Melo, LC2; Borba, TCO1,2
Laboratório de Biotecnologia da Embrapa Arroz e Feijão
²Pesquisador Embrapa Arroz e Feijão
3
Estudante de Graduação, Analista B da Embrapa Arroz e Feijão4
[email protected]
1
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris, marcadores moleculares, melhoramento, microssatélites, diversidade genética
A demanda constante por cultivares de feijoeiro comum com características morfo-agronômicas favoráveis é
contínua e guia o programa de melhoramento do feijoeiro da Embrapa Arroz e Feijão, sempre buscando novidades
para atender os setores produtivos e consumidor. Todas as cultivares, para fins de registro e comercialização, devem
ser avaliadas quanto ao seu valor intrínseco para a agricultura e para os consumidores através do teste de VCU.
Ao final do ensaio, são identificadas as linhagens que apresentam desempenho superior às cultivares de referência
incluídas no teste. O emprego de ferramentas moleculares, como os marcadores microssatélites (SSR), visam a
caracterização molecular dos genótipos que compõem o ensaio, possibilitando estimar a extensão da variabilidade
genética do conjunto de linhagens, bem como na determinação da identidade genética de cada material. Nesse
estudo, o objetivo foi o de caracterizar a variabilidade genética de linhagens de feijoeiro comum que compõem
experimentos de VCU conduzidos nos anos de 2009/2010. Foram analisados 23 linhagens de feijoeiro comum (10
do grupo preto, 12 do grupo carioca, uma do grupo especial), oito cultivares comerciais e três materiais controle
para integração de dados. Cada linhagen e cultivar comercial foram representadas por três plantas para possibilitar
a avaliação de dentro de cada material. Para as análises moleculares foram utilizados 14 marcadores microssatélites
fluorescentes, porém três (BM138, PV251 e BM 157) foram removidos das análises posteriores por apresentarem
padrão monomórfico de amplificação. Um total de 66 alelos foi identificado, com média de 5,7 alelos/marcador.
Entre os alelos identificados 19 foram classificados como alelos privados, ou seja, presentes em um único indivíduo.
O marcador que detectou o maior número de alelos privados foi o PV163 com oito. Os alelos privados foram
identificados em nove linhagens, com a linhagem CNFC11966 apresentando o maior número (três). O valor médio
de PIC (Polymorphism Information Content) foi de 0,62 e a distância genética média de Rogers modificada por Wright
foi de 0,7. A probabilidade de identidade (P.I.) foi de 4,9x10-7 e foram encontradas duas linhagens geneticamente
idênticas para os marcadores avaliados (CNFC11952 e CNFP11976). Entre as linhagens, foram identificadas seis
(CNFP11994, CNFC11948, CNFC11956, CNFP11985, CNFC11952, CNFC11954) com plantas heterozigotas para pelo
menos um marcador. A utilização de marcadores SSR permitiu a determinação da relação genética entre as linhagens
avaliadas nos ensaios de VCU, além disso, possibilitou que importantes parâmetros genéticos fossem estimados. A
junção das informações agronômicas das linhagens com os dados moleculares permite que a seleção das linhagens
seja conduzida de maneira mais eficaz, pois evita o desenvolvimento de cultivares comerciais com alto parentesco.
Apoio financeiro: Embrapa Macroprograma
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Distribuição espacial da variabilidade genética
intrapopulacional em Dipteryx alata Vog. (Fabaceae)
Sant’Ana, LL1; Melo, DB1; Soares, TN1; Chaves, LJ2; Telles, MPC1
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás
Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, Setor de Melhoramento, Universidade Federal de Goiás
[email protected]
1
2
Palavras-chave: autocorrelação espacial, baru, Cerrado, fluxo gênico, marcadores moleculares.
A estrutura genética intrapopulacional corresponde à forma como a variabilidade genética está distribuída
espacialmente dentro das populações. Essa estruturação, nas plantas, é afetada pelos padrões de dispersão e
polinização além da ação dos da deriva genética, endogamia e seleção local. D. alata é uma árvore hermafrodita,
auto-incompatível que apresenta polinização por abelhas. A dispersão de sementes é do tipo zoocórica, sendo
realizada principalmente por morcegos e macacos. O objetivo deste trabalho foi avaliar a estrutura genética espacial
dentro de duas populações situadas nas margens (Mato Grosso e Goiás) do Rio Araguaia, utilizando marcadores
microssatélites. Foram utilizadas folhas de 190 plantas, sendo 95 de cada margem/população, que foram avaliadas
com base em seis locos microssatélites, cinco desenvolvidos para o barueiro e um transferido do feijoeiro comum.
Os produtos de PCR foram separados em gel de poliacrilamida 6% e corados com nitrato de prata. Da matriz de
genótipos resultante da análise dos géis, foram estimados os parâmetros genéticos de diversidade e a presença
de autocorrelação espacial, com base no I de Moran médio (Iq). Estas análises foram conduzidas nos programas
TFPGA 1.0 e SGS para cada população. O número de alelos por loco variou entre 2 e 12. As heterozigozidades
observadas foram iguais a 0,3363 e 0,3672 e as esperadas 0,3888 e 0,3465 para MT e GO respectivamente. Os valores
de índice de agregação (0,128 para MT e 0,154 para GO) indicam que as plantas se distribuem de modo agregado
nestas populações. As distâncias máximas entre as plantas foram de 78 km e 39 km para as populações MT e
GO, respectivamente. A análise de autocorrelação espacial detectou uma estrutura genética espacial positiva e
significativa nas duas primeiras classes de distância (até 15,6 km) e negativa e significativa a partir da quinta
classe de distância (39 km) até a última para a população MT. O correlograma da população GO apresentou
valor de autocorrelação positivo e significativo somente na primeira classe de distância e valores negativos e
significativos na sexta e oitava classes de distância. De modo geral o correlograma de MT exibiu um padrão clinal
de variação que se associa ao modelo de fluxo gênico de isolamento por distância. A população de GO apresenta
um correlograma com padrão que sugere uma distribuição aleatória dos genótipos, ou seja, não dependente
da posição geográfica das plantas. Ressalta-se que, embora as populações avaliadas neste estudo tenham
apresentado valores de diversidade genética muito similares, a distribuição espacial das plantas está numa escala
muito diferente, onde a distância máxima da população de GO equivale à escala geográfica de não significância
da população de MT, o que pode explicar a ausência de padrão espacial significativo na população de GO.
Apoio financeiro: CAPES, PRONEX/CNPq/FAPEG
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Seleção de cultivares de mamona adaptadas às
condições edafoclimáticas da região Oeste Paulista e
avaliação das propriedades físico-químicas do óleo de
suas sementes
Almeida, BMS1; Santos, RLC1; Melo, NTK2; Fluminhan, A1
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE)
Laboratório de Química Orgânica, Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Melhoramento genético, Ricinus communis L., cultivo mecanizado, produção de biodiesel, óleo vegetal
A mamona tem sido comumente considerada uma das espécies vegetais mais adaptadas ao clima tropical e
promissora para a produção de biodiesel, uma vez que apresenta as características de: fácil cultivo, fácil adaptação
às diferentes condições de clima e solo, e relativa resistência ao estresse hídrico, alto teor de óleo em sua sementes,
elevada produtividade por unidade de área, entre outros aspectos. Entretanto, para que esta espécie possa ser
utilizada em sistemas de produção em larga escala, sabe-se que há a necessidade de desenvolvimento de cultivares
adaptadas ao cultivo mecanizado. A presente pesquisa teve por objetivos a produção de uma população de plantas
de mamona selecionada para o cultivo mecanizado, a avaliação das principais características morfológicas das
plantas que possam estar relacionadas ao rendimento de óleo desta espécie, e a análise das propriedades do óleo
extraído de suas sementes. É relatada, neste trabalho, a obtenção de genótipos altamente promissores, do ponto
de vista agronômico, e que foram selecionados a partir de uma população de plantas submetida a um contínuo
processo de seleção. A população original, formada por plantas da cultivar AL-Guarany 2002, foi submetida a um
processo de seleção recorrente para as características mais vantajosas ao cultivo mecanizado, tais como: porte baixo
das plantas, diâmetro estreito de caule, grande número de inflorescências, pequena proporção de flores masculinas
nos cachos, bem como um elevado produção de sementes por planta, resistência ao ataque de pragas e doenças,
e arquitetura da planta adequada, com porte ereto e poucas ramificações. Após cada ciclo de seleção, as plantas
selecionadas foram continuamente submetidas ao intercruzamento aleatório, e os cachos novamente avaliados
individualmente para a seleção das novas sub-populações. Após três ciclos de seleção, já foi possível a produção
de uma população homogênea e cujas características agronômicas têm sido nitidamente favoráveis. A avaliação
das características morfológicas das plantas mencionadas revelou diferenças significativamente superiores em
comparação com a população original, indicando que foi possível a produção de genótipos mais adaptados ao
cultivo mecanizado. Amostras de óleo foram extraídas de sementes destas sub-populações, e os resultados das
análises físico-químicas revelaram que há um elevado potencial para a sua utilização em sistemas economicamente
viáveis de produção de biodiesel. Estas observações indicam a viabilidade do método de melhoramento empregado
na espécie em questão, e que os resultados poderão ser ampliados com o avançar das gerações de seleção.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, UNOESTE
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Utilização de marcadores moleculares em seleção
assistida para tolerância ao alumínio em sorgo
Oliveira, BCFS1,3; Hufnagel, B2,3; Moura, PMA1,3; Júnior, SCF1,3; Caniato, FF3; Guimarães, CT 3; Schaffert, RE3;
Magalhães, JV3
UNIFEMM, Av. Marechal Castelo Branco, 2765, Sete Lagoas – MG
UFMG, Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais.
3
Embrapa Milho e Sorgo, CP151, CEP 35701-970, Sete Lagoas – MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: sorgo, gene AltSB, marcadores moleculares; tolerância ao alumínio; seleção assistida.
O Sorgo (Sorghum bicolor L. Moench), gramínea africana que possui maior adaptação às condições de estresses ambientais;
situa-se, atualmente, em quinto lugar entre os cereais mais plantados no mundo, sendo superado apenas pelo trigo, pelo
arroz, pelo milho e pela cevada. A toxidez causada pelo alumínio (Al) é um dos fatores que mais restringem o crescimento
e o desenvolvimento das culturas em solos ácidos. Um gene de efeito maior na tolerância ao alumínio em sorgo, AltSB, foi
identificado via clonagem posicional. Esse gene codifica um transportador de citrato localizado na membrana plasmática
das células dos ápices radiculares, e confere tolerância por meio de um mecanismo fisiológico baseado na exsudação
de citrato ativada pelo alumínio na rizosfera. A tolerância ao Al é uma característica relativamente rara em sorgo,
ocorrendo em uma frequência de aproximadamente 5%, o que dificulta a identificação de novas fontes de tolerância ao
Al pelo melhorista. Existe um crescente interesse na seleção de plantas tolerantes que possam ser utilizadas em áreas
que apresentam problemas de toxidez de alumínio e com o rápido avanço das tecnologias e a, simplificação e a redução
dos custos, os marcadores de DNA vêm-se tornando de uso rotineiro nos programas de melhoramento genético de
plantas. O uso dos marcadores moleculares tem o potencial de aumentar a eficiência dos programas de melhoramento,
proporcionando maiores ganhos genéticos nas principais culturas de interesse econômico. Para a introgressão assistida
para a tolerância ao alumínio em sorgo foram utilizadas fontes de tolerância advindas de duas populações, uma
proveniente do Centre de Cooperation Internationale em Researche Agronomique pour Le Developpement – (CIRAD França) e do International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics (ICRISAT – Índia), e outra do Institute National
de la Researche Agronomique du Niger (INRAN). Linhagens doadoras altamente tolerantes ao Al do painel CIRAD foram
cruzadas com o parental recorrente susceptível ao alumínio tóxico, BR007, uma linhagem elite procedente da Embrapa
Milho e Sorgo (Sete Lagoas, MG, Brasil) e retrocruzamentos sucessivos foram conduzidos até a obtenção de progênies
RC3F3, fixadas para os respectivos alelos doadores. A linhagem 90SN-7, proveniente do painel INRAN e altamente sensível
ao Al, foi cruzada com o cultivar tolerante, SC566-14, sendo geradas progênies RC1F1 por meio de retrocruzamento com
o parental recorrente, 90SN-7. A introgressão da tolerância ao Al foi conduzida com base em quatro marcadores STS que
flanqueiam o gene AltSB na seguinte configuração CTG29-S17-AltSB-S73-M181, cobrindo uma distância genética < 1cM.
Além disso, foi utilizado um marcador gene-específico para o gene AltSB, SbMATE_I2_6083pb, construído com base em
um SNP associado à tolerância ao alumínio. Esses marcadores foram utilizados para reações de PCR (Polymerase Chain
Reaction) e os respectivos produtos de amplificação foram resolvidos em géis de agarose 1% (S17 e S73) e 1,5% (SbMATE_
I2_6083pb) corados por brometo de etídio, ou em géis de poliacrilamida utilizando o sequenciador automático de DNA,
ABI 377, para o caso dos marcadores fluorescentes (CTG29 e M181). Conclusões: Quinze linhagens do Painel CIRAD
encontram-se em RC3F3 até o presente momento. O retrocruzamento proveniente da 90SN-7 alcançou a geração RC1F1.
As linhagens semi-isogênicas serão fenotipadas para a tolerância ao Al, de maneira a selecionar os melhores alelos doadores,
evitando-se o confundimento causado por comparações entre materiais de background genético distinto. Marcadores SSR
distribuídos aleatoriamente no genoma estão também sendo utilizados para acelerar a recuperação do genoma recorrente.
Apoio Financeiro: Generation Challenge Programme; FAPEMIG, CNPq, Embrapa.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Marcadores TRAPs e construção de mapas de ligação
de limão Cravo e Poncirus trifoliata
Missiato, A¹; Yaly, MC¹; Bastianel, M¹; Machado, MA¹
Centro de Citricultura Sylvio Moreira/IAC, Cordeirópolis, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: mapeamento, citros, marcadores moleculares, TRAP, QTL
As variedades limão Cravo e Poncirus trifoliata são importantes porta-enxertos para a citricultura brasileira. O
primeiro é o porta-enxerto mais utilizado e o segundo possui vários genes de interesse quanto à resistencia a doenças
que afetam os porta-enxerto de citros tais como gomose de Phytophthora e tristeza causada pelo Citrus tristeza virus
(CTV). A construção de mapas de ligação é de fundamental importância em programas de melhoramento, permitindo
a associação de regiões genômicas às características de interesse agronômico. Neste sentido, o objetivo do presente
trabalho foi a construção de mapas de ligação de limão Cravo (Citrus limonia) x Poncirus trifoliata. Foram genotipados
56 híbridos, com “primers” TRAP (target region amplification polymorphism) obtidos a partir de sequências ESTs
do banco de dados do CitEST (Citrus EST). Esses marcadores foram integrados aos mapas através do programa
JoinMap v. 3.0. Para o limão Cravo, foram gerados 7 grupos de ligação com 93 marcadores e, para Poncirus, 102
marcadores se ligaram em 8 grupos. A saturação dos mapas com marcadores microssatélites ou SSR (Single Sequence
Repeats) e novos primers TRAPs está em andamento e os mapas obtidos serão utilizados para o mapeamento
de QTL (Quantitative Trait Loci) para resistência à gomose e tristeza nos genomas de P. trifoliata e limão Cravo
Apoio Financeiro: Fapesp e CNPq
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153
Caracterização da diversidade e estrutura genética
em 27 populações de Dicksonia sellowiana (Xaxim)
visando sua conservação no Estado de Santa Catarina
Altrak, G1; Montagna, T1; Silva, JZ12; Bez Birolo, B1; Steiner, F1,2; Bittencourt, R1,2; Mantovani, A3; Reis, MS1,2
Núcleo de Pesquisas em Florestas Tropicais, Universidade Federal de Santa Catarina
Programa de Pós Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina
3
Centro Agro-veterinário, Universidade do Estado de Santa Catarina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Espécie Ameaçada, Conservação in situ, Alozimas, Floresta Ombrófila Mista, Dicksoniaceae.
O xaxim (Dicksonia sellowiana (Presl.) Hooker) é uma pteridófita da familia Dicksoniaceae que encontra-se
ameaçada de extinção (vulnerável – Red List IUCN). A espécie foi alvo de intensa exploração para a produção de
vasos e substratos confeccionados a partir de seu cáudice para o cultivo de plantas ornamentais. Seu habitat natural
encontra-se bastante reduzido e fragmentado em decorrência, principalmente, da exploração de madeira de espécies
como a araucária (Araucaria angustifolia) e imbuia (Ocotea porosa). Assim, a espécie foi incluída para caracterização
da diversidade genética no âmbito do Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina. Neste contexto, este trabalho
visa caracterizar a distribuição da diversidade genética de populações de D. sellowiana no estado de Santa Catarina.
Foram coletadas amostras de frondes de 50 indivíduos reprodutivos por população nas 27 populações avaliadas.
Para acessar os níveis e a distribuição da diversidade genética, utilizaram-se sete sistemas enzimáticos (6PGDH,
PGM, PGI, IDH, SKDH, α-EST e ACP) em tampão Tris-citrato. Os sistemas enzimáticos analisados revelaram 8
diferentes locos. D. sellowiana apresentou moderada diversidade genética nas populações estudadas (P95% = 48,61
± 14,01; HO = 0,124 ± 0,06; HE = 0,148 ± 0,05). As frequências genotípicas das populações apresentaram desvios
significativos das esperadas para panmixia, evidenciando um déficit de heterozigotos nas populações (f = 0,135). A
presença de alelos raros e exclusivos nas populações e uma diferenciação genética interpopulacional significativa
(FST = 0,502) indicam a necessidade e importância da conservação das populações remanescentes de D. sellowiana
no estado de Santa Catarina. As estratégias para conservação in situ devem contemplar ações que favoreçam
a conectividade entre as populações e Unidades de Conservação que incluam grande número de populações.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESC/ Inventário Florístico-Florestal de Santa Catarina
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Cartão FTA facilita a coleta de DNA de feijão a campo
Pereira, TP1; Almeida, CB1; Barili, LD1; Andrade, LRB1; Guidolin, AF1; Coimbra, JLM1
Laboratório de Análises Genéticas da UDESC, Instituto de Melhoramento e Genética Molecular (IMEGEM), Departamento de Agronomia,
Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC)
[email protected]
1
Palavras-chave: Microssatélites, Extração de ácidos nucléicos, Cartão FTA®, Doyle e Doyle, Phaseolus vulgaris L.
O cartão FTA® é uma tecnologia desenvolvida com a finalidade de facilitar a coleta, armazenamento, transporte
e extração de ácidos nucléicos retidos no papel. Consiste em uma matriz quimicamente tratada que possui a
capacidade de lisar a membrana celular das amostras, imobilizar os ácidos nucléicos nas fibras do cartão, e ainda,
proteger o DNA contra degradação. Deste modo, o DNA de amostras biológicas como sangue, células bucais,
secreções e tecidos pode ser armazenado na matriz do cartão e analisado a curto ou longo prazo. A extração de DNA
de células vegetais por meio do método tradicional Doyle e Doyle é eficiente para obtenção de DNA. Entretanto, a
coleta e purificação de DNA a partir do cartão FTA® podem propiciar um maior rendimento operacional, além de,
auxiliar na conservação das amostras já no momento de coleta a campo. Este trabalho teve por objetivo identificar
a viabilidade da utilização de cartões FTA® para a obtenção de DNA de feijão e sua eficácia comparativamente
ao procedimento padrão Doyle e Doyle (1990). Para tanto, foram coletadas folhas jovens dos genitores e de cinco
progênies, oriundas dos cruzamentos IAC Carioca Aruã x SCS Guará e IAC Carioca Pyatã x Pérola. As folhas para
a extração de DNA por meio do método padrão foram transferidas para tubos e acondicionadas em nitrogênio
líquido e as demais foram maceradas no FTA® PlantSaver Card diretamente no campo. As amostras de DNA
obtidas pelos dois métodos foram submetidas a reação em cadeia da polimerase com cinco pares de iniciadores
microssatélites. Os produtos da PCR foram analisados no ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
As amostras de DNA do cartão FTA® foram eficientes para a amplificação com os marcadores utilizados. Isto pode
ser verificado na análise dos amplicons onde não houve a presença de bandas inespecíficas, indicando assim, sua
eficácia. Evidenciou-se que o DNA retido na matriz do cartão foi devidamente conservado e apresentou quantidade
suficiente para as reações. Estes resultados são idênticos quando comparados com os obtidos pelo método já
estabelecido Doyle e Doyle. Conclusão: A metodologia do cartão FTA® foi eficiente para obtenção de DNA de feijão,
bem como, propiciou uma maior agilidade na coleta a campo e uma otimização dos procedimentos laboratoriais.
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Seleção simultânea para caracteres silviculturais em
progênies de polinização livre de duas procedências de
Copaifera langsdorffii
Manoel, RO1; Moraes, MA1; Moraes, SMB1; Freitas, MLM2; Moraes, MLT1; Sebbenn, AM2
Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP
Instituto Florestal de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: índice de seleção; ganho na seleção; melhoramento florestal.
Introdução: Copaifera lansgsdorffii é uma espécie arbórea tropical que ocorre em todo o território Brasileiro,
principalmente no bioma cerrado. Tem sido muito explorada para ornamentação e principalmente pelas
indústrias farmacêutica, de cosméticos e vernizes. Objetivos: O objetivo deste estudo foi estimar ganhos genético
a partir da seleção simultânea das progênies de C.langsdorffii, para os caracteres diâmetro médio do colo (DMC)
e altura (ALT), utilizando-se o índice de seleção com base na soma de postos ou ranks. Métodos: Os dados foram
medidos oito meses após a semeadura em um teste de procedências e progênies implantado em Selvíria-MS,
sendo 20 progênies originadas do Bosque Municipal de São José do Rio Preto-SP, e 15 progênies coletadas ao longo
da rodovia estadual Feliciano Salles Cunha. O teste foi instalado no delineamento experimental inteiramente
casualizado, com quatro repetições e uma planta/parcela. As estimativas dos parâmetros genéticos e, em especial
o índice baseado na soma de postos ou ranks, foram estimadas utilizando o programa GENES. Resultados:
As médias para DMC e ALT foram 2,68 cm e 11,41 cm para o bosque e de 2,57 cm e 10,24 cm para a rodovia,
respectivamente. O coeficiente de variação experimental foi baixo para DMC e ALT em ambas as procedências
bosque (8,9% e 8,5%) e rodovia (11,8% e 8,9%), sugerindo alta precisão experimental. Já o coeficiente de variação
genético foi alto para DMC e ALT na procedência bosque (5,4% e 9,2%) e rodovia (12,6% e 11,3%), evidenciando
a existência de variação genética entre as progênies dentro das procedências. A herdabilidade média para ambas
as procedências bosque e árvores isoladas foi alta para ALT (0,82, 0,87) e DMC (0,59, 0,82), o que evidência um
forte controle genético dos caracteres. Os ganhos genéticos na seleção foram estimados com base na seleção
de 30% das plantas (5 e 4 progênies na procedências bosque e rodovia, respectivamente). Os ganhos estimados
foram altos em ambas as procedências bosque (67,6% para ALT; 73,5% para DMC) e rodovia (80,9% para ALT
e 78,3% para DMC). Conclusão: As procedências de C.langsdorffii apresentam comportamentos semelhantes
nas duas condições estudadas em termos de médias de crescimento, variação genética e herdabilidades. As
estimativas de ganhos na seleção sugeriram alto potencial do material testado para o melhoramento genético.
Apoio financeiro: FAPESP
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Validação in silico de locos RGA (Resistance Genes Analogs)
mapeados em duas populações de Phaseolus vulgaris
Santini, L¹; Hanai, LR¹; Melo, LC²; Santos, JB³; Camargo, LEA4; Vieira, MLC¹
¹ Departamento de Genética, ESALQ, Universidade de São Paulo
² Embrapa Arroz e Feijão
³ Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
4
Departamento de Fitopatologia e Nematologia, ESALQ, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Genes de resistência, Marcadores moleculares, RGA, Análises de sequências, Feijoeiro-comum.
Introdução: Um dos principais fatores limitantes da qualidade e da produtividade do feijoeiro-comum (Phaseolus
vulgaris) é a incidência de doenças. Assim, estudos sobre genes de resistência a patógenos são imprescindíveis
e norteiam os programas de melhoramento genético. Como as proteínas codificadas por genes de resistência
apresentam domínios característicos e motivos conservados, foi possível o desenvolvimento de marcadores
moleculares análogos a tais genes (RGA - Resistance Gene Analogs). Inicialmente, locos RGA foram mapeados em
duas populações de P. vulgaris, sendo uma delas, a população núcleo de mapeamento “Bat93” x “Jalo EEP 558”
(BJ) e a outra, a população brasileira “Carioca” x “Flor de Mayo” (CFM). Objetivo: Validar in silico os locos RGA
mapeados nos grupos de ligação referentes às populações BJ e CFM. Métodos: Setenta e dois marcadores RGA
foram previamente mapeados em P. vulgaris, sendo 32 na população BJ (Hanai et al., Molecular Breeding, 25:25-45,
2010 ) e 40 na população CFM (Santini, Teses USP, 2009). Para a sua validação, foram selecionados fragmentos com
tamanhos estimados entre 200 e 700 pb, que foram reamplificados, clonados e sequenciados. O limiar adotado
para a aceitação das sequências foi o valor de Phred igual a 20. As sequências obtidas foram analisadas por
BLASTx e por BLAST especializado de domínios conservados (BLASTcd). As sequências similares a uma mesma
proteína foram alinhadas pelo software Clustal X para Windows. Resultados: Foram obtidas 32 sequências com
valor de Phred igual ou superior a 20. Onze delas apresentaram similaridade com proteínas conhecidas; sendo oito
com proteínas relacionadas à resistência e identificadas em P. vulgaris, Glycine max e Medicago truncatula; duas
similares a poliproteína gag-pol, característica de retrotransposons; e uma similar à polinucleotidil transferase
de M. truncatula. Dentre os RGA similares às proteínas de resistência de soja, três mostraram-se altamente
conservados. Além disso, dos oito RGA similares às proteínas de resistência, sete apresentaram domínios
relacionados à resistência em plantas. Conclusões: foi possível a validação in silico de 25% dos RGA sequenciados e a
conservação dessas sequências foi confirmada. As informações obtidas pelo seqüenciamento aliadas aos dados de
mapeamento sugerem a existência de duplicação e da possível transposição dessas regiões no genoma de P. vulgaris.
Apoio financeiro: FAPESP e CAPES.
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Extração de proteínas e eletroforese bidimensional de
castanhas de caju (Anacardium occidentale L.) para
análise proteômica
Alves Filho, JG1,3; Soares, maa2; Moreira, CG2; Moreira, RF2; Cunha, RMS1,3.; Cavada, BS1,4
Laboratório de Genética Molecular - Núcleo de Biotecnologia de Sobral
Universidade Estadual Vale do Acaraú
3
Universidade Federal do Ceará
4
Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas
1
2
Palavras-chave: cajueiro, eletroforese bidimensional, proteômica, proteínas de reserva, castanha do caju.
O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma espécie nativa do Brasil de grande importância no setor
agroindustrial, especialmente para os estados do Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte. Entre os subprodutos do
cajueiro de importância econômica destacam-se o pedúnculo, a amêndoa e o líquido da castanha do caju. As
amêndoas da castanha do caju contem proteínas de alta qualidade nutricional, e é considerada uma fonte de
proteínas de baixo custo. Apesar da grande importância econômica, poucos estudos têm sido feitos no sentido
de caracterizar as proteínas da amêndoa da castanha de caju, restringindo-se mais a caracterização de alérgenos.
Na atual era pós-genômica, estudos envolvendo proteômica permitem a identificação de centenas de proteínas
em um curto espaço de tempo graças ao auxílio das técnicas de eletroforese bidimensional e espectrometria de
massa. Tal abordagem pode auxiliar na identificação de um grande número de proteínas de reserva permitindo
a identificação de marcadores moleculares e a elucidação de vias metabólicas. O presente trabalho tem como
objetivo a obtenção de proteínas de sementes de cajueiro de qualidade para análise em géis bidimensionais.
As proteínas totais foram extraídas a partir da farinha da semente delipidada e liofilizada (20mg) acrescido de
PVPP e tampão piridina-SDS na proporção de 1:2:40. As proteínas foram ressuspensas em 100µL de uréia/tiouréia
9M, quantificadas pelo método de Bradford e analisadas em SDS-PAGE para verificação da integridade. Para a
focalização isoelétrica, usou-se 250 µg de proteína total em tiras IPG de 11 cm (pH 4-7) e 13 cm (pH 3-10) utilizando
o equipamento IPGphor III. A segunda dimensão foi realizada em géis de poliacrilamida a 15% no sistema Hoefer
SE 600 Ruby™. Os géis foram corados com PhastGel™ Blue-R e descorados com ácido acético 10% e metanol 40%.
As imagens dos géis 2D foram captadas em ImageScannerIII, editada e analisada pelo software ImageMaster 2D
Platinum 6.0. Os spots foram identificados utilizando a ferramenta TagIdent do Expasy (www.expasy.ch/). A
concentração das proteínas totais das amêndoas do cajueiro comum foi de 30 µg/L. A SDS-PAGE mostrou
bandas íntegras e livres de degradação. As proteínas totais de cajueiro gigante foram submetidas à eletroforese
bidimensional permitindo a visualização de mais de 200 spots com qualidade. Os spots mais intensos foram
analisados no TagIdent com base nos seus valores de massa e ponto isoelétrico permitindo a identificação de várias
proteínas de reserva. Muitos dos spots abundantes no gel não foram encontrados no banco de dados. Atualmente
estamos selecionando os spots mais abundantes com intuito de seqüenciar as proteínas por espectrometria de
massa. Este é o primeiro trabalho envolvendo caracterização de proteínas utilizando abordagem proteômica.
Apoio: Funcap
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Análise fenotípica da resistência à vassoura-de-bruxa
em almofadas florais de Theobroma cacao L. visando
ao mapeamento de genes de resistência
Silva, DV¹; Araújo, IS²; Branco, SMJ¹; Corrêa, RX¹
¹ Laboratório de Genética Molecular Aplicada, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, BA
² Universidade Federal Rural do Semi-Árido, Mossoró, RN
[email protected]
Palavras-chave: Cacau, Moniliophtora perniciosa, Resistência, Almofadas florais, População.
Introdução: O Theobroma cacao L. é uma espécie de grande relevância econômica, já que a matéria prima para a
produção do chocolate advém das suas amêndoas. O sul da Bahia se destaca no cenário nacional na produção do
cacau, onde ainda existem municípios com a economia baseada nesta monocultura. Diversas enfermidades assolam
o cacaueiro, dentre elas, destaca-se a vassoura-de-bruxa causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophtora perniciosa.
Esta patologia possui fase saprofítica e parasítica causando alterações tanto em frutos, quanto em lançamentos
foliares e em almofadas florais. Quando infectadas pelo fungo, as flores sofrem hiperplasia e muitas vezes se agrupam,
sendo os tecidos posteriormente necrosados, tornando-as inviáveis para a produção dos frutos. Objetivos: Analisar
uma população de Theobroma cacao L., composta por 600 plantas provenientes do cruzamento entre os genótipos
contrastantes TSH 1188 e CCN 51, quanto à resistência a vassoura-de-bruxa em almofadas florais; e padronizar
uma metodologia apropriada para avaliar este fenótipo em condições de campo. Métodos: As almofadas florais de
todos os indivíduos da população foram analisadas em condições naturais de campo, e sob condições de inoculação
artificial utilizando vassouras secas com basidiocarpos (vassoureiros) como fonte de inóculos. Na primeira
condição foram avaliadas 16.219 almofadas florais e detectada a segregação nas plantas da população quanto à
resistência a vassoura-de-bruxa. Na segunda condição, com o aumento do contato das plantas com os esporos do
fungo, foram avaliadas 8.064 almofadas florais e identificados grupos segregantes de resistência e suscetibilidade
à vassoura-de-bruxa. A metodologia foi executada por um período de dois anos. Resultados: As 24.283 almofadas
florais analisadas foram significativas quanto à seleção dos grupos segregantes quanto à resistência a vassoura-debruxa na população. O método empregado mostrou-se satisfatório, já que a segunda condição de análise corrobora
os resultados obtidos nas avaliações feitas na primeira condição. Sendo assim, a complementaridade das análises
atuou como fator determinante para a veracidade e formação dos grupos segregantes, os quais posteriormente serão
utilizados no mapeamento de genes de resistência. Conclusão: Este estudo com almofadas florais em Theobroma
cacao L visa melhor compreender os motivos pelos quais significativas perdas ocorrem na produção, decorrentes das
necroses das flores. Com este entendimento, a seleção de genótipos superiores resistentes a vassoura-de-bruxa em
almofadas florais poderá ser viabilizada. A população em estudo apresentou-se segregante e, portanto favorável as
posteriores análises na identificação e no mapeamento de genes relacionados com a resistência a esta enfermidade.
Apoio financeiro: CAPES, UESC, CNPq, FAPESB e MARS - Centro de Ciências do Cacau.
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A high-density sub-centiMorgan integrated DArT/
microsatellite genetic linkage map for species of
Eucalyptus based on 2,980 markers
Petroli, CD1,2; Sansaloni, CP1,2; Kilian, A3; Steane, DA4; Myburg, AA5; Pappas, GJ1,6; Faria, DA1; Vaillancourt,
RE4; Grattapaglia, D1,2,6
EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology - EPqB, 70770-910 Brasilia, Brazil
Dep. Cell Biology, Universidade de Brasilia – 70910-900 Brasília – DF, Brazil
3
Diversity Arrays Technology Pty Ltd, 1 Wilf Crane Crescent, Yarralumla, ACT 2600, Australia
4
School of Plant Science, University of Tasmania, Private Bag 55, Hobart, Tasmania 7001, Australia
5
Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria, Pretoria, 0002, South Africa
6
Genomic Sciences Program - Universidade Católica de Brasília - SGAN, 916 modulo B, 70790-160 Brasília – DF, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: Eucalyptus, molecular marker, DNA arrays, linkage, MAS
Eucalypts have played a significant role in the shift of plantation forestry from the northern hemisphere to the
tropics supplying sustainable woody biomass for pulp, paper, sawn wood and energy that would otherwise come
from native tropical forests. Genomics assisted breeding will become increasingly important to improve wood
quality and increase productivity per unit land area. Improved marker density, throughput and transferability
across species are key aspects to increase resolution and speed for a variety of genomic applications in Eucalyptus.
We report the development of a sub-centiMorgan density integrated linkage map for Eucalyptus based on a scaffold
of microsatellites and over 2,700 markers generated with a standardized DArT high-throughput genotyping
platform of high transferability for species of the genus. A large proportion (4,997/7,680 = 65%) of the DArT
markers displayed a Mendelian behavior indicating that they sample single copy regions and provide markers
that can be used for genetic analysis. At LOD >15.0, a total of 2,980 markers were assembled in the expected 11
linkage groups, 168 being anchor microsatellites. A framework map with high likelihood support was assembled
with 1,032 markers (864 DArTs and 168 microsatellites) yielding a genome coverage of 1,176 cM and average
consecutive intermarker distance of 1.15 cM. DArT marker sequencing resulted in 56% clone uniqueness and
BLAST against nr returned 31% significant hits. Besides contributing to the ordering of metacontigs during the
assembly of the upcoming Eucalyptus genome, this mapping density will provide unprecedented opportunities
for comparative mapping, QTL analysis and molecular breeding applications across species of the genus. This
the highest resolution linkage map for Eucalyptus built to date and possibly for any forest tree. We have shown
that DArT provides somewhere between 2,000 and 3,000 transferable segregating markers in a mapping
population and reach a map density around 1 cM with high ordering support in typical size pedigrees. The use
of a standardized high-throughput genotyping platform for the genus will allow precision QTL mapping and
validation across pedigrees, implementation of genome-wide selection strategies and positional cloning efforts by
integratiing high-resolution linkage mapping data with the upcoming reference genome sequence for Eucalyptus.
Financial support: Brazilian Ministry of Science and Technology (CNPq Projects 474645/2007-9 and 577047-20086); Australian Research Council (Grant DP0770506).
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160
A high-throughput Diversity Arrays Technology (DArT)
microarray based on 7,680 markers for genome-wide
genotyping in Eucalyptus
Sansaloni, CP1,2; Petroli, CD1,2; Carling, J3; Hudson, CJ4; Steane, DA4; Myburg, AA5; Vaillancourt, RE4; Kilian,
A3; Grattapaglia, D1,2,6
EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology - EPqB, 70770-910 Brasilia, Brazil
Dep. Cell Biology, Universidade de Brasilia – 70910-900 Brasília – DF, Brazil
3
Diversity Arrays Technology Pty Ltd, 1 Wilf Crane Crescent, Yarralumla, ACT 2600, Australia
4
School of Plant Science, University of Tasmania, Private Bag 55, Hobart, Tasmania 7001, Australia
5
Department of Genetics, Forestry and Agricultural Biotechnology Institute (FABI), University of Pretoria, Pretoria, 0002, South Africa
6
Genomic Sciences Program - Universidade Católica de Brasília - SGAN, 916 modulo B, 70790-160 Brasília – DF, Brazil.
[email protected]
1
2
Keywords: Eucalyptus, molecular marker, DNA arrays, Genomic Selection, GWS
A number of molecular marker technologies have allowed important advances in the understanding of the
genetics and evolution of Eucalyptus, a genus that includes over 700 species, some of which are used worldwide in
plantation forestry. Nevertheless, the average marker density achieved with current technologies remains at the
level of a few hundred markers per population. Furthermore, the transferability of markers produced with existing
technology across species and pedigrees is usually very limited. High throughput, combined with wide genome
coverage and high transferability are necessary to increase the resolution, speed and the utility of molecular
marker technology in eucalypts. We report the development of a high-density DArT genome profiling resource and
demonstrate its potential for genome-wide diversity and linkage mapping in several species of Eucalyptus. After
testing several genome complexity reduction methods we identified the PstI/TaqI method as the most effective
for Eucalyptus and developed 18 genomic libraries from PstI/TaqI representations of 64 different Eucalyptus
species. A total of 23,808 cloned DNA fragments were screened and 13,300 (56%) were found to be polymorphic
among 284 individuals. After a redundancy analysis, 6,528 markers were selected for the operational array and
these were supplemented with 1,152 selected clones taken from a library made from the E. grandis tree whose
genome is being sequenced. A high-density array with 7,680 markers was therefore constructed. Performance
validation for diversity studies revealed 4,752 polymorphic markers in a test set of 174 individuals. Additionally,
5,013 markers showed Mendelian segregation when screened using six inter-specific mapping pedigrees, with
an average of 2,211 polymorphic markers per pedigree and a minimum of 859 polymorphic markers that were
shared between any two pedigrees. This operational DArT array will deliver close to 2,500 polymorphic markers
for linkage mapping population in most eucalypt pedigrees and thus provide high genome coverage. This array
will also provide a high-throughput platform for population genetics and phylogenetics in Eucalyptus. The
transferability of DArT across species and pedigrees is particularly valuable for a large genus such as Eucalyptus
and will facilitate the transfer of information between different studies. The flexibility and expandability of the
DArT technology opens the possibility of further enriching the current array with additional polymorphic
markers by simply screening additional sets of clones. Furthermore, the DArT marker array will provide a highresolution link between phenotypes in populations and the recently completed Eucalyptus reference genome.
Financial support: Brazilian Ministry of Science and Technology (CNPq Projects 474645/2007-9 and 577047-20086); Australian Research Council (Grant DP0770506).
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Iniciadores conjugados com M13: uma alternativa para
genotipagem de feijão
Almeida, CB1; Pereira, TP1; Vale, NM1; Arruda, B1; Guidolin, AF1; Coimbra, JLM1
Laboratório de Análises Genéticas da UDESC, Instituto de Melhoramento e Genética Molecular (IMEGEM), Departamento de Agronomia,
Universidade do Estado de Santa Catarina
[email protected]
1
Palavras-chave: Microssatélites, Triplex de iniciadores, Iniciador universal, Iniciador fluorescente, Phaseolus vulgaris L.
Com o aumento na disponibilidade de iniciadores para as diversas espécies e a rapidez proporcionada pelo uso
de sequenciadores automáticos, o estudo do genoma com marcadores microssatélites tem apresentado um
considerável incremento. Contudo, a automatização das análises requer a síntese de iniciadores fluorescentes,
o que resulta em um expressivo acréscimo nos custos e um limitante para pesquisas que envolvem um grande
número de marcadores. Uma alternativa é a utilização de um tríplex de iniciadores na reação de amplificação,
que consiste na síntese de um dos iniciadores específicos a região alvo do genoma com uma cauda adicional
na extremidade 5’. Esta cauda corresponde exatamente a sequência do iniciador universal, sendo este, o único
marcado com fluoróforo. Esta metodologia possibilita uma efetiva redução dos custos, pois apenas um iniciador
é marcado. Além do que, o iniciador universal pode ser utilizado em combinação com qualquer outro iniciador
que possua a sequência adicional, permitindo que um maior número de marcadores sejam analisados. Entretanto,
a verificação quanto a homologia entre a sequência do iniciador universal e o genoma da espécie em estudo é
de suma importância, devido a possível ocorrência de múltiplas bandas e falsos alelos, que induzem a erros de
genotipagem. Deste modo, objetivou-se verificar a viabilidade da conjugação da sequência M13 em iniciadores
microssatélites para Phaseolus vulgaris L. e sua utilização em seqüenciador automático. Foram utilizados onze
genótipos de feijão, sendo 6 cultivares (IPR Chopim, Diamante Negro, BRS Horizonte, SCS Guará, BRS Supremo e
BRS Valente) e 5 acessos do Banco Ativo de Germoplasma de Feijão da UDESC (BAF 07, BAF 09, BAF 35, BAF 50 e
BAF 97). Nove pares de iniciadores microssatélites dinucleotídeos foram usados na análise molecular, sendo que,
um iniciador de cada par foi sintetizado com 19 nucleotídeos adicionais (5’- CACGACGTTGTAAAACGAC - 3’),
referentes a sequência M13. As amostras de DNA foram extraídas de folhas jovens pelo método Doyle e Doyle
(1990), e submetida a PCR com os iniciadores caudados e o iniciador universal 6-FAM+M13. Os amplicons foram
avaliados no analisador genético ABI PRISM® 3130 (Applied Biosystems). Os iniciadores caudados apresentaram
amplificações satisfatórias e alta especificidade, sem ocorrência de múltiplas bandas. Logo, a conjugação manteve
a fidelidade dos iniciadores a região alvo. Para a maioria dos iniciadores houve variação no tamanho dos alelos
entre genótipos, indicando que os mesmos são polimórficos e informativos. Entretanto, os amplicons são definidos
com 19 nucleotídeos a mais, em virtude, da incorporação da sequência M13 nos fragmentos sintetizados a partir do
iniciador conjugado. Deste modo, há necessidade de subtração desse adicional no tamanho dos alelos. Conclusão:
O uso de iniciadores com a extensão M13 demonstrou ser eficiente e viável, sendo assim, o tríplex pode ser aplicado
para análise de microssatélites em genótipos de feijão.
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Desenvolvimento de sistema de genotipagem molecular,
baseado em marcadores microssatélites, para
determinar a identidade genética de cultivares de tabaco
Ribeiro, CAG1; Tanure, JPM2; Maciel, TEF2; Vilaça, ST2; Marcelino, FC3; Barros, EG2
Universidade Federal de Viçosa – UFV
Laboratório de Análises Genéticas – AgroGenética, Viçosa/MG
3
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Embrapa Soja
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Nicotiana tabacum, genotipagem molecular, identidade genética, SSR, fingerprinting
O desenvolvimento de sistemas de identificação molecular para determinar e rastrear a identidade genética de um
cultivar vegetal representa um grande desafio frente aos sistemas de certificação e proteção de variedades utilizados
no país, até então fundamentados em descritores fenotípicos. Além disso é uma questão estratégica para empresas
detentoras de germoplasma, interessadas no desenvolvimento de ferramentas que permitam o monitoramento de
pureza varietal e o rastreamento de materiais ao longo da cadeia produtiva e comercial. Entretanto, a utilização de
análises de DNA para a proteção varietal ainda é limitada pela inexistência de sistemas padronizados e robustos de
avaliação molecular para a maioria das espécies, a exemplo do que acontece para cultivares de tabaco (Nicotiana
sp.). Esse trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de sistema de genotipagem molecular, baseado em
marcadores microssatélites, para a determinação de identidade genética de cultivares de tabaco de interesse
comercial para a agroindústria. Foram selecionados 32 marcadores microssatélites na literatura, de acordo com seu
índice de informatividade alélica e da cobertura do genoma da espécie, sendo selecionados tanto a partir do genoma
nuclear quanto do cloroplasto. Para a seleção dos marcadores mais informativos, foram testados 49 genótipos de
Nicotiana tabacum, dos grupos Burley e Virginia. Para assegurar boa representatividade da diversidade alélica de
cada cultivar, foram analisadas 1350 amostras, com uma média de 27,5 indivíduos para cada genótipo, analisados
em bulk. O DNA foi extraído pelo método do CTAB modificado, a partir de material foliar. Os produtos de PCR
foram visualizados em géis de poliacrilamida corados com brometo de etídeo, e foram utilizados marcadores de
tamanho molecular para monitoramento do número e tamanho dos alelos de cada genótipo. Para os marcadores
polimórficos foram calculados o Conteúdo de Informação de Polimorfismo (PIC). Para compor um sistema de
genotipagem molecular robusto e informativo, foram selecionados aqueles marcadores que apresentaram padrões
consistentes de amplificação e interpretação e que evidenciaram polimorfismos alélicos bem definidos entre os
genótipos. Assim, dez microssatélites foram selecionados para o grupo de cultivares analisados. Tais marcadores
apresentaram de 2 a 3 alelos e um PIC que variou de 0,078 a 0,5487, com média de 0,3412. Do total de marcadores
analisados foi possível selecionar um grupo que evidenciou alto padrão de polimorfismo entre os genótipos
testados, além de garantir uma ampla cobertura do genoma de Nicotiana tabacum. A partir do grupo de marcadores
selecionados, análises de agrupamento por similaridade genotípica, de genealogia e identidade genética inequívoca
de cultivares poderão ser realizadas para genótipos de interesse, fornecendo uma ferramenta estratégica em
processos de certificação de pureza genética, propriedade intelectual e rastreabilidade ao longo da cadeia produtiva.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
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Impacto do tamanho amostral na estimativa de
diversidade genética a partir de sequências de DNA
Costa, LS¹; Stefenon, VM¹; Tatsch, GL¹
¹ Universidade Federal do Pampa – Campus São Gabriel
[email protected]
Palavras-chave: marcadores moleculares, polimorfismo, DNA, coalescência, variabilidade genética.
Introdução: Os avanços tecnológicos desde o início do século permitiram, através da implementação dos marcadores
moleculares, uma grande evolução nos estudos que visam acessar a variabilidade genética em populações de
plantas. A maioria desses estudos objetiva estabelecer um padrão molecular para uma determinada espécie em
questão, geralmente através de marcadores SSR e SNPs, devido ao seu alto grau de polimorfismo. No entanto,
para que sejam obtidas estimativas mais próximas da realidade, torna-se necessário estabelecer um número
mínimo de indivíduos a serem analisados. Existem poucos estudos disponíveis a respeito do número mínimo de
plantas que devem ser analisadas para evitar o estabelecimento de um padrão molecular que não represente a
diversidade genética da espécie em estudo, pois mesmo em espécies que se reproduzem por autofecundação é
comum encontrar variabilidade. Objetivo: Analisar o impacto do tamanho amostral na estimativa do número de
sítios segregantes (Theta_S) e do número médio de diferenças par-a-par (pi) em sequências de DNA. Métodos: Uma
população constituída de 10.000 indivíduos alógamos foi simulada utilizando-se o programa Simcoal. Amostrouse aleatoriamente sub-sets com 25, 50, 100 e 500 indivíduos (100 repetições para cada sub-set) e estimativas de
Theta_S e de pi foram calculadas a partir de sequências de 300 bases de cada indivíduo, utilizando o software
Arlequim. Resultados: A população total (10.000 indivíduos) apresentou valores de pi=49,39 e de Theta_S=30,65.
Estas estimativas representam os valores reais da população. O valor médio das 100 amostragens independentes
de cada sub-set para as estimativas foram: pi=48,84 e Theta_S=46,11 para 25 indivíduos amostrados; pi=49,35 e
Theta_S=49,44 para 50 indivíduos amostrados; pi=49,35 e Theta_S=51,18 para 100 indivíduos amostrados e;
pi=47,18 e Theta_S=44,17 para o sub-set de 500 indivíduos amostrados. Conclusões: Os resultados sugerem que
estimativas de pi não são influenciadas de forma significativa pelo tamanho amostral. Em conformidade com
a literatura especializada, que demonstra que o aumento no tamanho amostral não é proporcional ao aumento
no número de sítios polimórficos, estimativas de Theta_S oscilaram bastante, sendo a estimativa obtida com
500 indivíduos mais próxima do valor real que a estimativa obtida com 50 indivíduos. Este fato demonstra a
necessidade de cautela ao se analisar a diversidade genética populacional baseado no número de sítios segregantes.
Apoio: FAPERGS, CNPq e UNIPAMPA.
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Avaliaçao de marcadores moleculares diagnósticos de
alelos de resistência a Magnaporthe oryzae em arroz
(Oryza sativa)
Crispim, BCF1,2; Borba, TCO2; Breseghello, F2; Filippi, MCC3; Mello, RN2
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento, Universidade Federal de Goiás
Laboratório de Biotecnologia, Embrapa Arroz e Feijão
3
Laboratório de Fitopatologia, Embrapa Arroz e Feijão
[email protected]
1
2
Palavras-chave: seleção assistida por marcadores; brusone; Pi1; Pi2; Piz
A brusone do arroz, causada pelo fungo Magnaporthe oryzae, é uma doença devastadora e para a qual ainda se
utiliza o controle químico como principal medida de controle, embora a resistência genética seja considerada
a estratégia de controle mais econômica e de menor impacto para o ambiente. Isto se dá pela oferta limitada de
cultivares resistentes, uma vez que alterações frequentes na população do patógeno tornam ineficientes os genes
de resistência utilizados. Para contornar esta dificuldade, os programas de melhoramento utilizam piramidação
gênica e multilinhas com o fim de acumular genes de resistência complementares e assim ampliar o número de
patótipos contra as quais uma cultivar pode resistir. Tanto na piramidação gênica quanto nas multilinhas, a seleção
assistida por marcadores moleculares é uma etapa crítica que reduz o tempo e os custos envolvidos em seleções
fenotípicas nem sempre acuradas. Há dezenas de genes de resistência a M. oryzae descritos na literatura e para
muitos destes há marcadores moleculares potencialmente úteis para a seleção assistida. O presente trabalho teve
o objetivo de avaliar a capacidade de marcadores moleculares dos tipos SSR, SNP e InDel descritos na literatura
em identificar alelos associados a resistência à M. oryzae. Para tanto, foi extraído o DNA genômico de cinco
plantas reunidas em bulk para cada um dos 74 acessos de arroz de origens diversas, utilizando o método CTAB. A
qualidade do DNA extraído foi avaliada por amplificação com o marcador OG106. Foram testados 12 marcadores
publicados na literatura como associados a dez genes de resistência (Pi1, Pi2, Pib, Pik, Pik-m, Pik-p, Pit, Pita/Pita2,
Piz e Piz-t). Os produtos de PCR foram visualizados por eletroforese em géis de poliacrilamida 6% e corados com
prata ou em géis de agarose 3% e corados com brometo de etídio. Somente os marcadores para os genes Pi1, Pi2,
Pib e Piz apresentaram o padrão de amplificação esperado para os controles. No entanto, quando testados para 74
acessos de origens diversas, os dois marcadores SSR para o gene Pi1 (RM1233*I e RM224) apresentaram padrões de
amplificação de bandas distintos daqueles descritos pelo autor, indicando que eles não são apropriados para seleção
assistida. Além dos controles positivos, o marcador STS NBS2-Pi9 (gene Pi2) apresentou amplificação positiva para
dez dos 74 acessos e o marcador SNP z565962 (Piz) apresentou amplificação positiva para 36 acessos. Os marcadores
para o gene Pib (SNP b213 e STS Pib) apresentaram congruência de resultados para a maioria dos 74 acessos.
Os marcadores NBS2-Pi9, z565962, b213 e Pib serão agora testados com linhagens e cruzamentos do programa
de melhoramento da Embrapa Arroz e Feijão para confirmar sua adequação à seleção assistida por marcadores.
Apoio financeiro: EMBRAPA/MONSANTO, CNPQ
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Variabilidade e estrutura genética populacional de
Tibouchina papyrus
Peixoto, FP1; Lima, JS1,2; Collevatti, RG1; Soares, TN1; Telles, MPC1
Laboratório de Genética & Biodiversidade, DBG/ICB, Universidade Federal de Goiás
Programa de pós-graduação em Ecologia e Evolução, Universidade Federal de Goiás
[email protected]
1
2
Palavras-chave: divergência genética, microssatélite, pau-papel, cerrado, estrutura genética.
Tibouchina papyrus, popularmente chamada de pau-papel é uma espécie de Melastomataceae endêmica do
Cerrado, com importância ecológica, ornamental e cultural. Possui distribuição restrita aos campos rupestres e
suas populações são disjuntas com ocorrência restrita às regiões de Serra Dourada (Mossâmedes-Goiás), Serra dos
Pireneus (Pirenópolis-Goiás) e Serra de Natividade (Natividade-Tocantins). Essas características tornam importante
um melhor conhecimento dos padrões filogeográficos, de fluxo gênico e a compreensão da estruturação genética
entre as populações dessa espécie. Desse modo, este trabalho teve como objetivo caracterizar a diversidade
genética de populações oriundas das três localidades, utilizando marcadores microssatélites desenvolvidos para
T papyrus. Para tanto, foram utilizados 12 primers em 96 indivíduos, sendo 32 de cada população. Os produtos de
amplificação foram separados em gel de poliacrilamida 6% e posteriormente corados com nitrato de prata. O 12
locos avaliados apresentaram entre 1 (Tpap 2 e Tpap 9) e 6 (Tpap 12) alelos, com uma média de 2,83 alelos por
loco. A análise de desequilíbrio de ligação mostrou que todos os pares de locos segregam independentemente
nas populações. A diversidade genética, medida pelas heterozigosidades médias observada (Ho) e esperada
(He), para cada população, foi respectivamente igual a 0,24 e 0,31 para população 1, 0,22 e 0,33 para população
2 e 0,46 e 0,42 para população 3. O coeficiente de endogamia (f) foi não significativo para as três populações. A
avaliação da estrutura genética resultou em um q igual a 0,723, indicando uma elevada diferenciação entre as
populações avaliadas. A análise de divergência genética, a partir das distâncias de Nei (1972) indicou que as
populações 2 e 3 são mais similares geneticamente entre si, com valor de distância genética igual a 0,37, do que
quando comparadas com a população 1, que é mais diferente geneticamente das populações 2 (0,74) e 3 (0,76).
Como base nestes resultados é possível sugerir que estas populações estão evoluindo independentemente,
provavelmente com ausência de fluxo gênico atual. Esta hipótese deve ser testada aliando estes dados
aos de uma avaliação dos padrões filogeográficos das linhagens cloroplastidiais e análise de coalescência.
Apoio Financeiro: CNPq (Proc. 471492/2007-8), PRONEX (66.0015/2003-0).
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Determinação de perfis genéticos de cultivares de soja
desenvolvidos pela Embrapa
Passianotto, AL de L1,2; Silla, PR2; Marin, SRR3; Kuwahara, MK3 Nepomuceno, AL3; Binneck, E3; Abdelnoor,
RV3; Gonela, A1; Marcelino, FC3
Universidade Estadual de Maringá
Universidade Estadual de Londrina
3
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa-Soja
1
2
Palavras-chave: soja, marcadores microssatélites, sequenciamento automático, SNPC, embrapa
A proteção de cultivares de soja hoje no Brasil, sob responsabilidade do Sistema Nacional de Proteção de Cultivares
(SNPC), baseia-se em descrições morfológicas, fisiológicas e bioquímicas. Em se tratando de uma espécie autógama
que apresenta baixa variabilidade genética, a distinção entre as cultivares utilizando apenas descritores fenotípicos
demanda muito esforço e apresenta grandes limitações, principalmente porque tais características são sensíveis
a variações ambientais. Neste sentido, uma forma de se realizar a caracterização de um modo mais eficiente
consiste na análise direta do DNA. Os marcadores moleculares atuam como ferramentas ideais para se realizar
este tipo de abordagem, pois não são influenciados pelo ambiente e podem ser utilizados em qualquer estádio de
desenvolvimento da planta. Dentre os marcadores moleculares, os microssatélites são distribuídos ao longo de
todo genoma, são altamente específicos, multialélicos e co-dominantes. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi
desenvolver um sistema de genotipagem semi-automatizado com base em seqüenciador automático e caracterizar
o perfil genotípico de cultivares de soja desenvolvidas pela Embrapa, visando a disponibilização destes dados na
forma de um banco de dados. Para tanto, 30 cultivares de soja foram selecionadas no Banco de germoplasma da
Embrapa-Soja e 16 sementes de cada genótipo foram semeadas em vasos e mantidas em casa de vegetação até o
surgimento do primeiro trifólio (estádio V3), os quais foram coletados e armazenados a -80ºC. O DNA das amostras
foi extraído e, posteriormente, analisado utilizando 23 pares de primers microssatélites marcados com diferentes
fluoróforos fluorescentes. Os perfis genotípicos foram avaliados no sequenciador automático ABI PRISM Genetic
Analyser® 3100 (Applied Biosystem). As fitas senso dos primers selecionados foram marcadas com três fluorescências
diferentes 6FAM, HEX, e NED. A análise dos fragmentos gerados foi realizada através do software GeneMapper®
que permite a visualização exata dos alelos. Os eletroferogramas obtidos permitiram a identificação dos loci mais
informativos e de seus respectivos alelos. Os loci Sat_038, Satt612, Satt181, Satt540, Satt009 e Satt005 foram capazes
de diferenciar todo o grupo de cultivares de soja estudadas, sendo denominados de loci diferenciadores. Com base
nesses loci foi possível realizar a identificação e diferenciação dos genótipos e, conseqüentemente, a elaboração
das etiquetas genéticas de identificação de cada cultivar estudado. Os loci mais polimórficos observados
foram o Sat_038 e Satt009, com 12 alelos cada, seguido pelo Satt612, Satt005 , Satt181, Satt540 com 11, 10, 9 e 8
alelos respectivamente, para o grupo de cultivar. Os perfis genéticos deste grupo inicial de cultivares estudado,
caracterizado com 23 loci SRR, serão depositados em um Banco de Dados, que será alimentado continuamente à
medida que novas cultivares foram sendo caracterizadas. Tal sistema poderá ser utilizado para a caracterização de
novas cultivares, auxiliando na proteção destas, bem como nos casos de análise de pureza genética de sementes.
Apoio financeiro: EMBRAPA/CNPQ
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Seleção de isolinhas de feijões preto e vermelho resistentes
a doenças por meio de marcadores moleculares
Silva, LC1,2; Nogueira, JA4; Mayrink, GO1,2; Ribeiro, LE1,2; Moreira, MA2,3; Barros, EG1,2
Departamento de Biologia Geral
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO)
3
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular;
4
Departamento de Fitotecnia-Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: seleção de isolinhas, marcador molecular, resistência a doenças, feijão preto e vermelho, melhoramento genético.
O feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma importante leguminosa amplamente utilizada como fonte de
carboidratos e proteínas e, sendo bem adaptada ao clima brasileiro, é cultivada em quase todo o país. Contudo
é comum a ocorrência de perdas significativas na produção devido à incidência de doenças de origem fúngica,
bacteriana e viral. A utilização de cultivares resistentes a doenças é um importante componente no manejo
integrado do feijoeiro. Neste contexto o Programa de Melhoramento do Feijoeiro do BIOAGRO-UFV, por meio
deste trabalho, tem como objetivo a avaliação de isolinhas de feijão contendo alelos de resistência à antracnose,
ferrugem e mancha-angular, incitadas, respectivamente, por Colletotrichum lindemuthianum, Uromyces
appendiculatus e Pseudocercospora griseola, e o intercruzamento destas isolinhas, obtendo assim plantas com
maior espectro de resistência. Para isso, foram avaliadas quanto à presença de alelos que conferem resistência
às doenças citadas, as populações de plantas RC2F4 (Ouro Vermelho x Rudá “R1”) e RC2F6 (Ouro Vermelho x Rudá
“R1”), ambas possuidoras de grãos vermelho, sendo a última de porte ereto. A população RC2F4 (contendo marcas
para os alelos Co-42, Co-5, Co-10 e Ur-ON) foi selecionada e cruzada com plantas da isolinha Rudá R3 (contendo
marcas para os alelos Co-4, Co-10, Phg-1, Phg-4 e/ou Phg-52, Phg-62 e Ur-ON) e com plantas da família RC3F6 (Pérola x
Ouro Negro) (contendo marcas para os alelos Co-10, Phg-ON, Ur-ON), ambas possuidoras de grãos do tipo carioca.
Plantas da família F5 [RC3F2 (DN x Rudá “R”) x Rudá R1] (contendo marca para os alelos Co-5, Co-10, Ur-ON, Phg-1,
I e bc-3), possuidoras de grãos pretos, também foram selecionadas e cruzadas com as plantas de grãos carioca.
Foi possível obter 117 plantas F1, cuja natureza híbrida foi confirmada com marcadores moleculares. Estas foram
avançadas até a geração F2 e estão sendo avaliadas com os marcadores dos alelos de resistência de interesse e, uma
vez selecionadas, serão retrocruzadas com os respectivos genitores recorrentes para a recuperação da cor do grão.
Apoio Financeiro: FAPEMIG e CNPq
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Avaliação de variedades de alface tipo americana em
adubação a base de soqueira de algodão, em duas
épocas de plantio, no município de Nova Xavantina- MT
Takamori, LM1,2; Carneiro Junior, AG1,2; Arruda, MCC1,3
Universidade do Estado de Mato Grosso
Departamento de Agronomia
3
Departamento de Biologia, Campus de Nova Xavantina, Rod BR 158 KM148, Cx.P. 08, Nova Xavantina, MT, CEP 78690-000, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Alface, Diversidade genética, Interação genótipo-ambiente, Soqueira de algodão, Variedades de alface.
Introdução: O freqüente lançamento de inúmeras variedades de alface (Lactuca sativa, L.) no mercado de sementes
no Brasil e a introdução de novas variedades com comportamentos desconhecidos impossibilitam a identificação
de variedades geneticamente próximas, com diferentes respostas fenotípicas frente às mudanças das condições
ambientais, resultando em comportamentos distintos dos genótipos das variedades, o que caracteriza a interação
genótipo-ambiente. Objetivo: O presente estudo foi realizado na Chácara Goiano, localizada no Município de Nova
Xavantina - MT, na Região do Médio Araguaia, Brasil, com o objetivo de avaliar variedades de alface tipo americana
por meio de análises morfológicas, verificando a cultivar que apresentou melhor produtividade nas condições
edafoclimáticas do município. Métodos: As mudas foram produzidas em bandejas de 128 células contendo substrato
comercial e a semeadura realizada em duas épocas distintas: chuvosa (outubro) e seca (abril). O transplante das
mudas, em canteiros com adubação a base de soqueira de algodão, foi realizado quando as plântulas exibiam
quatro folhas definitivas, coincidindo com os 30 dias após a semeadura (DAS). O método de amostragem dos dados
morfológicos foram por delineamento de blocos casualizados, composto com cinco tratamentos (variedades:
Hanson,Gloriosa ,Grandes Lagos, Crespa Repolhuda e Rafaela) e cinco repetições. As variedades Hanson, Grandes
Lagos e Crespa Repolhuda foram avaliadas aos 60 DAS; enquanto a avaliação das variedades Rafaela e Gloriosa
foram realizada aos 70 DAS, tendo como parâmetros agronômicos analisados: diâmetro da cabeça (DC), número
de folhas (NF), peso total de massa fresca (PMFT) e seca (PMST). Os dados obtidos das avaliações foram tratados
estatisticamente, utilizando-se o programa Sisvar, versão 4.3 (UFLA) e os gráficos performados pelo programa Systat,
para Windows, versão 11. Resultados: A utilização de soqueira de algodão como matéria orgânica foi vantajoso,
pois o mesmo apresentava capacidade de retenção de água, mantendo os canteiros umedecidos, além de contribuir
como fonte de nutrientes para as plantas. A variedade Gloriosa apresentou de DC 42,67, PMFT 380,20, NF 28,23 e
PMST 15,30, enquanto que a Hanson obteve de DC 36,20, PMFT 229,47, NF 28,00 e PMST 11,97, no período chuvoso.
No período de seca as média obtidas para Gloriosa e Hanson foram: de DC 32,73, PMFT 120,16, NF 18,46 e PMST
7,80 e, de DC 32,30, PMFT 101,36, NF 16,30 e PMST 6,50 respectivamente. Conclusão: A alface Gloriosa apresentou
desenvolvimento superior às demais variedades em relação aos parâmetros analisados, sendo recomendado o seu
plantio aos produtores locais, enquanto que, a variedade Hanson obteve um resultado não satisfatório sob as
condições edafoclimáticas da região e, portanto não sendo viável a sua produção no município. Novos estudos
incluirão análises moleculares de diversidade genética entre as variedades de alface tipo americana utilizadas
pelos horticultores do estado de Mato Grosso, em parcerias estabelecidas entre as instituições UNEMAT e UFMT.
Apoio Financeiro: Chácara Goiano, Fazenda Nova Canaã e UNEMAT.
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Quantificação de polissacarídeos não-amidícos (PNAs)
em soja (Glycine max (L.) Merrill), utilizando a técnica
cromatográfica CLAE
Bueno, RD1; Borges, LL1; Teixeira, AI1; Rodrigues, JIS1; Piovesan, ND1; Good-God, PIV2; Barros, EG1;
Moreira, MA1
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO), Universidade Federal de
Viçosa
2
Universidade Federal de Viçosa, Campus de Rio Paranaíba
[email protected]
1
Palavras-chave: polissacarídeos não-amidícos, soja, fator antinutricinal.
A alimentação de animais monogástricos representa em média 75% do custo total da produção. O grão de soja é
a principal fonte protéica para esses animais, entretanto, a soja apresenta em sua parede celular, além da porção
amídica, polissacarídeos não-amídicos (PNAs), que apresentam função quase que exclusivamente estrutural nas
plantas, existindo sob várias formas na natureza. Dependendo da solubilidade dos seus constituintes, os PNAs
são classificados em solúveis e insolúveis. As propriedades antinutricionais dos PNAs residem principalmente na
porção solúvel. Em geral os PNAs solúveis possuem a capacidade de interagir com uma grande quantidade de água,
aumentando significativamente a viscosidade do fluido intestinal e consequentemente interferindo na difusão dos
nutrientes, das enzimas digestivas e diminuindo as interações com a mucosa intestinal. Os constituintes dos PNAs
são extraídos e quantificados utilizando principalmente duas técnicas cromatográficas, CLAE (Cromatografia
Líquida de Alto Desempenho) e CG (Cromatografia gasosa). Este trabalho teve como objetivo testar e adaptar uma
metodologia para quantificar polissacarídeos não-amídicos em grãos de soja, com base na técnica cromatográfica
CLAE, visando a precisão e a otimização do processo de quantificação de PNAs. Para isto, foram utilizados seis genótipos
de soja cultivados no Município de Mineiros-GO, no ano agrícola 2006/2007. Os experimentos foram conduzidos
em blocos casualizados, com duas repetições. Para a determinação dos PNAs totais e PNAs insolúveis, foram
utilizados 300 mg de soja moída e seca para cada fração, os quais foram divididas em sub-amostras representativas
(A e B). O PNA solúvel foi determinado pela diferença entre o PNA total e o PNA insolúvel. Primeiramente as
amostras passaram por um processo de delipidação, seguida por duas hidrolises enzimáticas. Posteriormente as
duas sub-amostras (A e B) foram submetidas a diferentes tratamentos para extração dos PNAs totais e PNAs
insolúveis, seguidas por hidrolise ácida. Os monossacarídeos foram separados e quantificados utilizando a técnica
cromatográfica CLAE, equipado com uma coluna de troca iônica como fase estacionária, acopladas com detector
de pulso amperométrico. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do aplicativo computacional em
genética e estatística, Programa GENES. Entre os seis genótipos analisados no presente trabalho, a glicose foi o
principal monossacarídeo, entretanto concentrações significativas de galactose, ácidos urônicos, xilose e arabinose
foram encontradas nos PNAs totais, PNAs insolúveis e PNAs solúveis, estes resultados estão de acordo com
outros trabalhos disponíveis na literatura, os quais utilizam outros métodos de quantificação. Foi demonstrado
que a metodologia testada e adaptada para quantificar fatores antinutricionais termoestáveis, tais como, os
Polissacarídeos não-amídicos em soja, utilizando a técnica cromatográfica CLAE, se mostrou de boa precisão.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq
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Diversidade e estrutura genética em populações de
Tabebuia aurea (Bignoniaceae)
Rosa, FF1; Braga, AC2; Telles, MPC1; Collevatti, RG1
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, CP 131, Goiânica, GO, Brasil
Ciências Biológicas, Universidade Católica de Brasília, Brasilia, DF
[email protected]
1
2
Palavras-chave: caraibeira, Cerrado, fluxo gênico, microssatélite, variabilidade genética.
Tabebuia aurea (Bignoniaceae), conhecido popularmente como caraibeira, é uma árvore amplamente distribuída
no Cerrado, ocorrendo, sobretudo em áreas de cerrado sensu stricto e em áreas alagadas, em formação de
cerrado parque no Pantanal Matogrossense, no Pantanal do Araguaia e Pantanal Goiano, no vale do Paraña. A
fragmentação do Cerrado pela expansão da fronteira agrícola e o aumento da matriz urbana, somado ao aumento
da freqüência de fogo causada por práticas de agricultura têm afetado a dinâmica populacional das espécies do
Cerrado. A fragmentação e isolamento das populações podem reduzir a variabilidade genética devido ao efeito
gargalo e deriva gênica. A redução de fluxo gênico e o aumento dos níveis de endocruzamento podem levar a
fixação de alelos deletérios o que pode comprometer a persistência das populações em longo prazo. O objetivo
desse trabalho foi estudar a diversidade e estrutura genética de populações de T. aurea. Foram analisados 190
indivíduos de T. aurea de 11 populações coletados em toda a distribuição geográfica da espécie. Os indivíduos
foram genotipados para 11 locos microsatélites no sequenciador automático de DNA ABI 3100. Os resultados até o
momento mostraram que T. aurea possui alta diversidade genética, com heterozigosidade variando de 0,941 a 0,832.
A área de conservação amostrada, Estação Ecológica de Águas Emendadas, DF, não apresentou maior diversidade
genética que as outras áreas, todas em fragmentos em matriz agrícola, provavelmente porque a amostragem foi
composta de indivíduos adultos. Entretanto, o coeficiente de endogamia foi maior nas áreas mais afetadas por
distúrbios antrópicos (variação de f de 0,235 a 0,567, p < 0,0004) que na área de reserva (f = 0,087, p = 0,0008). A
diferenciação entre populações é baixa, porém significativa (q = 0,084, p = 0,0001), com altos valores de F (0,303)
e f (0,239), indicando que acasalamentos não aleatórios dentro e entre populações devem ser os responsáveis
pela estrutura genética em T. aurea. Estes resultados também indicaram que as populações são diferenciadas
por isolamento por distância, padrão que é esperado para uma espécie com distribuição ampla como T. aurea.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq
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Identificação de SNPs na população F2 SCA6 x
ICS1para obtençao de marcas associadas à resistência
do cacaueiro a vassoura-de-bruxa
Lemos, LSL1; Gramacho, KP1; Santos, RMF1 ; Clement, D1,3 ; Santos, SF1; Ganem, RS1; Lima, L1; Sousa, LA1;
Braz, NGR1; Gesteira, AS2 ; Pires, JL1; Micheli, F2, 3
CEPEC, CEPLAC
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz
3
CIRAD-BIOS, UMR DAP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Microssatélites, polimorfismo, EST-SSR, SSR genômicos, Theobroma cacao
A vassoura-de-bruxa causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa é a doença de maior impacto na cacauicultura
no Brasil. Sua principal forma de controle é a utilização de clones resistentes, porém é preciso aumentar a base
genética nos plantios comerciais para que se tenha uma resistência mais duradoura. O principal objetivo do
Programa de Melhoramento do Cacaueiro do CEPEC/CEPLAC é a piramidação de diferentes genes de resistência,
visando aumentar a eficiência e a durabilidade da resistência (PIRES et al., 1996). O objetivo deste estudo foi a
busca de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) em genes de resistência a vassoura-de-bruxa, com o intuito
de aplicar o mais diretamente possível o resultado dos estudos moleculares à seleção de cacaueiros duravelmente
resistentes a M. perniciosa. Os SNPs são resultantes de mutações pontuais e se definem como um loco para o qual
encontramos dois alelos em uma freqüência mínima de 1%. A partir de 153 genes de resistência identificados na
biblioteca de TSH1188, foram desenhados 73 primers para identificação e validação de SNPs na população F2 SCA6
x ICS1 por seqüenciamento do produto de PCR amplificado. Inicialmente foi feita à otimização da temperatura
de 38 primers. Esses primers foram amplificados e seqüenciados nos progenitores SCA6 e ICS1, na F1 TSH516
e no TSH1188. Dos 38 primers,16 foram seqüenciados, sendo 9 monomórficos e 7 polimórficos. O resultado do
seqüenciamento foi analisado através do programa CLUSTAL W, onde foi possível a obtenção de 286 SNPs; uma
proporção de aproximadamente 51 SNPs para cada gene de resistência onde foi detectado SNP. Foram encontrados
SNPs em importantes genes de defesa, como o Cf9_Rapidly Elicited protein, Disease resistance protein, Beta 1,3
– glucanase, e o maior numero de SNPs foi encontrado no gene Pathogenesis-related protein 4B, com 112 SNPs.
Este resultado é bastante promissor considerando que SNPs identificados por sequenciamento, normalmente já
se encontram validados. Conclui-se que a identificação de SNPs em Theobroma cacao mostra-se uma ferramenta
promissora para a geração de marcas relacionadas à resistência a vassoura-de-bruxa.
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Identificação de SNPs potencialmente relacionados ao
conteúdo de óleo em soja
Teixeira, AI1; Sant’anna, IC1; Prata, IO1; Bueno, RD1; Miranda, FD2; Piovesan, ND1; Moreira, MA1; Barros, EG1
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO), Universidade Federal de Viçosa
Departamento de produção Vegetal, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: marcador molecular, genes candidatos, indels, seqüenciamento, triacilgliceróis.
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) são variações de um único nucleotídeo ou pequenas inserções/deleções
(indels) encontradas entre fragmentos homólogos de DNA. SNPs apresentam diversas vantagens quando
comparados a outros tipos de marcadores moleculares, principalmente em virtude da sua abundância no genoma
e de permitir análises automatizadas em larga escala. A identificação de SNPs em soja foi grandemente facilitada
com a conclusão do seqüenciamento do genoma desta leguminosa em 2009. Neste trabalho foram selecionados
12 genes candidatos, que codificam enzimas da via biossintética dos triacilgliceróis, bem como fatores de
transcrição envolvidos na regulação desta via, e também genes envolvidos no direcionamento e no transporte
de moléculas em sementes de soja ou em outras espécies. As sequências parciais dos referidos genes ou de genes
homólogos foram obtidas a partir do GenBank. As sequências gênicas completas foram obtidas no banco de dados
do seqüenciamento do genoma da soja (Phytozome) por meio do algoritmo BLAST. Foram desenhados primers,
usando o programa Primer3, para amplicar as regiões codificadoras e as regiões 3’ e 5’ UTR destes genes. Um total
de 47 regiões gênicas diferentes foram amplificadas via PCR em 10 genótipos de soja contrastantes para o teor de
óleo na semente. Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1,7% e aqueles que apresentaram
uma única banda foram purificados e seqüenciados. As sequências obtidas foram editadas e posteriormente
alinhadas usando o programa ClustalW. Foram obtidos aproximadamente 156 kb de boa qualidade, sendo
identificados 79 SNPs e 15 indels, os quais serão testados em populações segregantes para teor de óleo na semente.
Apoio Financeiro: CNPq/CAPES, FINEP
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Performance of SNPs assayed by the Golden Gate
technology for linkage mapping in Eucalyptus and
construction of integrated SNP/microsatellite maps
Lima, BM1,2; Silva-Junior, OB1; Faria, DA1; Mamani, EMC1; Pappas, GJ1,3; Kirst, M4; Grattapaglia, D1,3
EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF, Brasil
Departmento de Genética - Universidade de São Paulo – ESALQ/USP, Piracicaba, SP, Brasil
3
Genomic Sciences Program - Universidade Católica de Brasília, Brasília, DF, Brasil
4
School of Forest Resources and Conservation, Genetics Institute, University of Florida, Gainesville, USA
[email protected]
1
2
Keywords: molecular breeding, linkage maps, single-nucleotide polymorphism (SNP), Eucalyptus.
SNP development in plants is still in its early stages but has gained momentum in recent years. While in silico SNP
identification studies abound in the plant literature, the same cannot be said for actual SNP genotyping panels,
exception made for a few mainstream crop plants and a small number of forest and fruit trees. A number of SNP
genotyping technologies were developed in recent years, mostly geared toward assaying human SNP variation.
The Golden Gate assay developed by Illumina has consistently been reported as the most reliable technology,
displaying high levels of SNP conversion rate. Large scale SNP development by amplicon resequencing in highly
heterozygous genomes is technically laborious due to the very high levels of nucleotide diversity and additional
variation due to indels. Direct SNP development from large in silico sequence resources developed by combining
reduced representation libraries and short read sequencing will likely be the most efficient approach in these cases.
Eucalyptus are among the organisms with the highest frequency of SNPs with up to 1 SNP every 16 bp. While
a bonus for overall SNPs identification, such a high nucleotide diversity, could represent a significant obstacle
for the development of robust and polymorphic sets of Golden Gate assayable SNPs. In this work we assessed
SNP inter-specific transferability and the performance of a 768 SNP panel for linkage map construction in two
inter-specific segregating populations of Eucalyptus, population IP (E. grandis x E. urophylla) and DGUGL [(E.
dunnii x E.grandis) x (E. urophylla x E. globulus)]. CTAB extracted DNA was picogreen quantified and used for
SNP genotyping on an Illumina BeadStation 500 GX. SNP data were analyzed with GenomeStudio V2009.1 and
individual SNPs re-checked manually. A GeneTrain score cutoff of 0.25 and call rate ≥0.95 was initially applied to
the whole dataset. A total of 239 informative SNPs from the 768 panel (31%) could be positioned on a genetic map
for the IP population previously built with 227 microsatellites. The majority of these SNPs (162) segregated 1:1 while
a smaller number (77) segregated 1:2:1. Similar results were obtained for a second mapping population with 170
markers at 1:1 and 38 at 1:2:1. Only 48% of the markers were informative in both populations showing that more
SNPs can be positioned by using several mapping populations. Consensus SNP/microsatellite map versions were
constructed using Onemap and Joinmap with 444 markers (214 microsatellites and 230 SNPs) on the expected
11 linkage groups. Total recombination distance varied significantly in the two map versions with a much larger
total size in the map provided by Onemap. Markers of the two classes were randomly interspersed suggesting
that SNPs will provide an improved genome coverage of the Eucalyptus genome for multiple applications.
Financial support: Brazilian Ministry of Science and Technology (CNPq Projects 474645/2007-9 and 577047-20086) and EMBRAPA Macroprogram 2 project grant 02.07.01.004.
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Identificação de SNPs putativos e indels em
sequências de AFLPs visando à integração de mapas
genéticos em Passiflora alata
Pereira, GS; Diniz, AL; Nunes, ES; Hanai, LR; Vieira, MLC
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Maracujá-doce, Mapeamento genético, F1 segregante, Marcadores moleculares, Sequenciamento.
Introdução: A geração de mapas genéticos em espécies auto-incompatíveis, como o maracujá-doce (Passiflora
alata Curtis), baseia-se em populações F1 derivadas de cruzamento entre genitores não-endogâmicos. Por isso,
os marcadores genéticos podem segregar em quatro classes: (A) 1:1:1:1, (B) 1:2:1, (C) 3:1 e (D) 1:1. A estratégia
denominada duplo pesudocruzamento-teste utiliza exclusivamente marcadores uniparentais dominantes (D) e
apresenta o inconveniente de gerar mapas separados, um para cada genitor. Já marcadores biparentais dominantes
(C) ou codominantes (A e B, geneticamente mais informativos) possibilitam gerar um mapa integrado da população
F1. Um mapa de ligação integrado foi gerado com base na análise de marcas AFLP e microssatélites em uma
população F1 (180 indivíduos) oriunda do cruzamento entre dois acessos de maracujá-doce (Nunes, Teses USP,
2010). Devido ao baixo nível de polimorfismo dos marcadores microssatélites, SNPs putativos e indels podem ser
utilizados para o suprimento de informação codominante ao mapa. Na ausência de sequências de DNA disponíveis
para a espécie em bancos de dados públicos, informação genômica pode ser obtida a partir do sequenciamento de
bandas de marcadores tipicamente dominantes, como AFLPs. Objetivo: Obter marcas codominantes baseadas na
busca de SNPs putativos e indels a partir da análise das sequências de AFLPs previamente obtidas para o maracujádoce. Métodos: Os locos de AFLP foram originados a partir da digestão do DNA de ambos os genitores, utilizando
um par de enzimas (EcoRI/MseI) e posterior amplificação com dez combinações de primers dos adaptadores com
três bases seletivas. Bandas do tipo C e D foram selecionadas e sequenciadas diretamente. As sequências foram
analisadas e alinhadas utilizando o software CodonCode Aligner. Resultados: Sessenta e quatro bandas foram
selecionadas para o alinhamento (valor de Phred > 20). Dez dos 16 pares de marcas C formaram contigs, revelando
bases em heterozigose em sete pares; em dois pares, apenas variações de base em homozigoze foram observadas;
e em um par, não existiam mutações. Devido à presença de indels, três pares de sequências de marcadores D
foram detectados como sendo alelos entre os genitores; para estes locos, testes estatísticos (c2) validaram as
proporções para leitura codominante (A). Ainda, seis contigs reuniram, numa análise conjunta, 22 bandas C e/
ou D de diferentes combinações de primers. Conclusões: Sequências de bandas AFLPs de P. alata permitiram a
identificação de: (i) indels para a conversão de locos D em A; (ii) SNPs putativos em heterozigose para a conversão
de locos C em B em futuros ensaios de PCR alelo-específico; (iii) porções de sequências nucleotídicas em comum
entre fragmentos oriundos de combinações diferentes. Ainda, para as sequências D, primers específicos poderão
ser desenhados visando à amplificação de locos correspondentes no outro genitor e à busca por mutações.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Análise fenotípica quanto à resistência a mancha
angular em população segregante de feijão comum
(Phaseolus vulgaris L.)
Almeida, GV1,2; Oblessuc, PR1,3; Silva, GMB1; Chiorato, AF4; Carbonell, SAM4; Ito, MF5; Rubiano, LB1
¹ Centro de Pesquisa & Desenvolvimento em Recursos Genéticos Vegetais (C. de P. & D. em Recursos Genéticos Vegetais), Instituto
Agronômico de Campinas (IAC)
2
Pontifícia Universidade Católica de Campinas (PUC-CAMPINAS)
3
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
4
Centro de Pesquisa & Desenvolvimento de Grãos e Fibras, Instituto Agronômico de Campinas (IAC)
5
Centro de Pesquisa & Desenvolvimento de Fitossanidade, Instituto Agronômico de Campinas (IAC)
[email protected]
Palavras-chave: Pseudocercospora griseola, Feijoeiro, Fenotipagem, Cultivares, RIL.
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é o legume mais consumido em todo o mundo. Sua produtividade pode
ser afetada por diversos fatores, sendo a ocorrência de doenças um dos principais. A mancha angular, causada
pelo fungo Pseudocercospora griseola (Sacc.) Crous & U. Braun, acarreta perdas de até 80% na produção de
feijão e é provavelmente uma das doenças mais importantes da parte aérea do feijoeiro. O melhoramento do
feijoeiro busca ferramentas que agilizem a transferência de genes de resistência a doenças para cultivares em
desenvolvimento. Assim, o objetivo deste trabalho foi fenotipar a população segregante UC do tipo RIL, obtida
a partir do cruzamento entre as linhagens IAC-UNA x CAL-143, quanto à susceptibilidade a mancha angular, no
intuito de, posteriormente, mapear locos de resistência utilizando o mapa genético UC, previamente desenvolvido.
Para tanto, duas repetições dos experimentos fenotípicos de resistência à mancha angular nas 352 linhagens da
população UC foram conduzidas em casa de vegetação. O delineamento experimental utilizado foi em blocos
casualizados, com seis plantas por linhagem, as quais se encontravam em estágio V3. As RILs foram inoculadas com
raça do fungo P. griseola obtida em condições naturais de infecção em campo (Fazenda Santa Elisa, IAC, Campinas
- SP). A raça deste novo isolado foi determinada pela avaliação das cultivares diferenciadoras. As avaliações foram
feitas pela escala de notas do CIAT de 1 a 9, atribuídas aos indivíduos de acordo com a quantidade e tamanho
das lesões características da mancha angular. A fenotipagem das linhagens diferenciadoras revelou a raça 0-39
(Mesoamericana - avirulência para todos os seis cultivares Andinos) como sendo a raça em uso na avaliação dos
sintomas de mancha angular na população UC. O contraste entre os genitores pôde ser observado através de sua
distribuição binomial (resistência / susceptibilidade), sendo que para o genitor IAC-UNA foi atribuída a nota 5,63 de
doença, demonstrando sua susceptibilidade à mancha angular. Por outro lado, o genitor CAL-143 revelou possuir
um alto nível de resistência, com nota 1,45, indicando possuir alelo(s) de resistência. A população de mapeamento
UC também apresentou contrastes acentuados de suscetibilidade à P. griseola, com amplo espectro de notas. O
coeficiente de variação observado pela ANOVA foi de 64,5%, o que confirma a variação fenotípica observada. Teste
de segregação monogênico da resistência (1:1), via χ², também foi realizado. O resultado obtido indica que mais de
um gene deve estar envolvido na resistência (poligênica), uma vez que o χ² foi significativo (χ² = 44,34; α = 0,05),
rejeitando a hipótese nula. Estes resultados reforçam a importância de se conhecer todos os genes envolvidos, para
que se possa obter uma resistência horizontal duradoura, interessante para aplicação no melhoramento da cultura.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Análise da segregação de locos microssatélites em
uma população F1 segregante de Brachiaria humidicola
hexaplóide
Vigna, BBZ1; Jungmann, L2; Alleoni, GC1; Valle, CB do2; Feijó, GLD2; Garcia, AAF3; Souza, AP1,4
CBMEG, Universidade Estadual de Campinas, CP 6010, CEP 13.083-875, Campinas, SP, Brasil
Laboratório de Biotecnologia de Plantas, Embrapa Gado de Corte, CP 154, CEP 79.002-970. Campo Grande, MS, Brasil
3
Departamento de Genética, Escola de Agricultura Luiz de Queiroz, CP 83, Piracicaba,SP, 13400-970, Brasil
4
Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Depto. de Biologia Vegetal, CP6109, Campinas, SP, CEP 13083-970, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Brachiaria humidicola, poliploidia, marcadores moleculares, mapa de ligação, forrageiras
As gramíneas do gênero Brachiaria representam 80% dos cerca de 177 milhões de hectares plantados com
pastagens nativas e cultivadas no Brasil. A espécie Brachiaria humidicola ocorre em áreas com solos inférteis
e pouco drenados ou com inundação sazonal, como o cerrado brasileiro. Dessa forma, tem sido explorada nos
trópicos como opção a outras gramíneas forrageiras, que em sua maioria são adaptadas à ambientes secos.
Espécies poliplóides possuem mais de duas cópias de cada cromossomo homólogo por célula, os quais se pareiam
aleatoriamente durante a meiose em grupos de homologia. Quando são analisados marcadores moleculares
em indivíduos poliplóides, só é possível reconhecer presença ou ausência de bandas em um gel de eletroforese.
Cada dosagem de uma marca resulta em um distinto padrão de segregação na população. Ainda que existam
evidências de alopoliploidia em espécies de Brachiaria, é razoável assumir autopoliploidia para a espécie em
questão devido à formação de bivalentes durante a meiose, além de tri até hexavalentes. Dessa forma, para este
trabalho, vamos trabalhar com um modelo para autopoliplóides. Em se tratando de uma espécie autohexaplóide,
as razões esperadas entre presença e ausência de marcas são 1:1, 3:1, 4:1 e 19:1. Neste trabalho, usamos o teste de
aderência de qui-quadrado para verificar o padrão de segregação dos dados de microssatélites em 279 híbridos de
uma progênie F1 de Brachiaria humidicola hexaplóide. De um total de 239 locos microssatélites isolados para esta
espécie por nosso grupo de pesquisa, 38 foram genotipados na população de mapeamento em questão. Foi obtido
um total de 163 marcas, sendo encontradas de duas a dez marcas em um só loco, com média de cinco marcas por
loco. Dentre todas as marcas, 62 (38%) seguem as razões de segregação esperadas. Esta baixa proporção de locos
seguindo a segregação esperada pode estar ocorrendo devido à grande complexidade do genoma desta espécie e
do método de análise destes dados. Mais microssatélites estão sendo genotipados na população e novos modelos
para estimativas de dosagem de alelos de locos em poliplóides estão sendo desenvolvidos por nosso grupo de
pesquisa. Estes dados serão utilizados na construção de um mapa genético desta importante forrageira tropical.
Apoio Financeiro: Fapesp, Embrapa, CNPq, Unipasto e Fundect-MS
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Construção de um mapa de ligação entre um
cruzamento bi-parental em cana-de-açúcar
Mancini, MC1; Pinto, LR2; Perecin, D3; Landell, MGA2; Souza, AP1,4
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-UNICAMP, Campinas-SP
Instituto Agronômico de Campinas (IAC), Ribeirão Preto-SP
3
Universidade Estadual Paulista (UNESP), Jaboticabal-SP
4
Depto. de Biologia Vegetal – IB/UNICAMP, Campinas-SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: marcadores moleculares, poliploidia, melhoramento genético, cana-de-açúcar, mapeamento.
A cultura de cana-de-açúcar exerce grande influência econômica para o Brasil, figurando como maior produtor
mundial. A principal estratégia para aumentar a produtividade da cana-de-açúcar é o uso de variedades melhoradas
geneticamente, mas o alto nível de ploidia aliado a aneuploidia dificultam o melhoramento genético. A fim de
diminuir o tempo despendido para obtenção de novas variedades de cana-de-açúcar, os marcadores moleculares
se tornam valiosas ferramentas. O mapeamento genético de organismos poliplóides só tornou-se possível através
da análise de segregação dos marcadores em dose única (MDU). A partir dos mapas de ligação é possível conhecer
a organização do genoma e identificar os marcadores que estão ligados a características que são agronomicamente
importantes. Este trabalho teve por objetivo construir um mapa de ligação em uma população de mapeamento
do Programa Cana IAC oriunda de um cruzamento bi-parental. Para tal, foram utilizados 220 indivíduos (clones)
tomados ao acaso da progênie derivada de um cruzamento bi-parental entre o clone elite IACSP95-3018 (genitor
feminino) e a cultivar IACSP93-3046 (genitor masculino). Foram utilizados 121 marcadores moleculares (EST-SSR,
SSR genômicos e AFLP) para as reações de PCR. Os genitores foram genotipados com base na presença (1) e
ausência (0) do marcador, e aplicado o teste estatístico qui-quadrado (c2) para avaliar a distorção de segregação
em relação às proporções dos MDUs 1:1 (presente em apenas um dos genitores) e 3:1 (presente em ambos os
genitores) ao nível de significância p<0,05, seguida da correção de Bonferroni para múltiplos testes. O mapa de
ligação foi construído utilizando o programa JoinMap, com LOD mínimo de 3, para a ligação entre marcadores e
ordenação das marcas e fração máxima de recombinação (r) de 0,40. Foram obtidos 710 marcadores segregantes
nas progênies, com 410 segregando em dose única. Destes 231 (56%) apresentaram-se ligados, distribuindo-se
em 72 grupos de ligação (GL) sendo que as 179 (44%) marcas remanescentes permaneceram não ligadas. Os GLs
foram reagrupados em 10 grupos de homologia. Todos os marcadores juntos (AFLP, SSR genômicos e EST-SSR)
apresentaram uma cobertura de 2436 centiMorgans (cM), com distância média entre marcas de 10,55 cM, mas a
distribuição ao longo dos cromossomos foi irregular. O comprimento do GL variou entre 1 cM (GL17) a 96 cM (GL16).
Existem regiões no mapa com espaços entre as marcas superiores a 40 cM, que pode ser atribuído a poucas marcas
segregando em dose única nesta região, havendo a necessidade de adicionar mais marcas para que haja uma maior
cobertura do genoma. Fica evidente que o mapa não está completamente saturado, sugerindo o uso de uma maior
quantidade de marcadores moleculares bem como a utilização dos marcadores que segregam em outras doses.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP, Programa Cana IAC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Construção de um mapa genético-molecular para
Hevea brasiliensis
Souza, LM1; Mantello, CC1; Suzuki, FI1; Souza, AP1,2
Laboratório de Análise Genética Molecular - Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG)- IB, UNICAMP
Departamento de Biologia Vegetal Botânica – IB – UNICAMP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Microssatélites, seringueira, mapeamento genético.
A seringueira (Hevea brasiliensis) é uma espécie alógama e o ciclo de melhoramento genético, que vai do cruzamento
até o final da produção, pode demorar aproximadamente 30 anos para se concretizar, dificultando a obtenção
de populações de mapeamento convencionais, portanto usam-se populações F1 para a construção dos mapas
genéticos. O objetivo deste estudo foi o desenvolver o primeiro mapa genético brasileiro de seringueira utilizando
a população de mapeamento proveniente do cruzamento entre PB217 e PR255 e constituída por 270 indivíduos.
Foram avaliados 526 marcadores microssatelites dos quais (68%) apresentaram polimorfismo entre os genitores da
população de mapeamento. Já foram genotipados, até o presente momento, um total de 135 marcadores polimórficos.
Desses marcadores, 11 foram desenvolvidos no nosso laboratório e 21 são EST-SSR e foram genotipados em gel de
acrilamida 6% e corados com prata. Os outros locos microssatelites foram genotipados no CIRAD em Montpellier
– França e a genotipagem foi realizada no seqüenciador 43000 LI-COR DNA Analyzer. Para a construção do mapa
foi utilizado o software Onemap (Margarido et al. Hereditas.144(3):78-79, 2007) que usa a metodologia proposta por
Wu et al. (Theo. Pop. Biology. 61:349–363,2002). As freqüências de recombinação foram transformadas em distância
de mapa (cM) através da função de mapeamento de Kosambi (Ann. Of Eugenetics,12:172-175 1944). O mapa foi
construído a partir da análise de 135 locos segregantes e destes apenas 10 locos não foram alocados no mapa final.
O mapa foi constituído de 125 marcas, distribuídas em 21 grupos de ligação (GL), com comprimento 2012,4 cM. Dos
21 grupos de ligação formados alguns foram muito pequenos com apenas 2 ou 3 marcadores e cobrindo poucos cM,
provavelmente isto ocorre pois o genoma ainda não esta saturado e apresentou regiões de mesmo cromossomo
que ainda não conseguem ser unidas. O número de cromossomos aceito, atualmente, para a maioria das espécies
de Hevea (2n=36) Com isso espera-se com a saturação do mapa obter 18 grupos de ligação, este trabalho continua
sendo desenvolvido e após a saturação do mapa será realizado o mapeamento das características fenotípicas.
Apoio financeiro: FAPESP
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Caracterização de uma seqüência de cDNA homóloga
a ciclofilina (LeCYP) em tomateiro
Estevam, RKS1; Sousa, IAL1; Peres, L2; Scortecci, KC1
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Biologia Celular e Genética, UFRN
Departamento de Ciências Biológicas, ESALQ/USP
[email protected], [email protected]
1
2
Palavras-chave: Floração, LeCyp, Cassetes de super-expressão, Relações Filogenéticas, qPCR.
A floração é marcada pela conversão do meristema apical vegetativo em reprodutivo, devido a interações entre
diversos fatores, tanto internos quanto externos à planta. Tem sido observado que o gene Cyp é essencial para a
biossíntese de esteróis que servem como precursores de moléculas bioativas, tal como os brassinosteróides e são,
portanto, importante no processo de desenvolvimento da planta. O objetivo deste trabalho foi caracterizar in silico e
funcionalmente um cDNAs homólogo a ciclofilina (LeCYP) prospectado anteriormente em bibliotecas subtrativas
construídas utilizando ápices meristemáticos de Lycopersicon esculentum cv Micro-Tom e L.pimpinellifolium.
A análise in silico foi realizada utilizando os bancos de dados (NCBI, TAIR, TIGR, SGN) com E-value <1.0x10-15
como critério de exclusão. Os alinhamentos múltiplos foram realizados utilizando o programa ClustalW, com a
caracterização de domínios funcionais. Como resultado, foi observado uma conservação no domínio Cyclophilin_
ABH_like (Cyclophilin A, B and H-like cyclophilin-type peptidylprolyl cis- trans isomerase - PPIase). A relação
filogenética sugere uma dispersão entre os grupos de mono e dicotiledôneas, com prováveis duplicações no grupo
das dicotiledôneas, nas quais um ramo está agrupado na família Brassicaceae, porém as famílias Fabaceae e
Solanaceae também estavam presentes no clado. Numa segunda etapa, foi analizado a expressão desta seqüência.
Os dados de qPCR foram analizados utilizando o programa REST2009 e todos os dados foram normalizados
contra os valores de expressão obtidos em S. lycopersicon. Assim, foi encontrado um aumento da expressão em
segmentos caulinares quando comparado com folhas em S. pimpinellifolium. A expressão no ápice meristemático
foi analisada comparando-se ápices meristemáticos não induzidos versus induzidos à floração em S. lycopersicon
e S. pimpinellifolium. Observou-se um aumento na expressão nos ápices meristemáticos induzidos em ambas as
espécies. Outra comparação realizada neste software foi a expressão em ápices meristemáticos induzidos de S.
lycopersicon contra S. pimpinellifolium. Nesta análise, foi observado um aumento de expressão em S. pimpinellifolium.
Estes resultados sugerem que o gene LeCYP possa estar envolvido na indução floral em S. pimpinellifolium. Com
base nestes resultados, foram realizadas construções de cassetes de super-expressão em orientação senso e antisento para posterior transformação em plantas. Para esta etapa, foi utilizado o promotor forte CaMV35S presente
num vetor intermediário pBC(Stratagene). A orientação do cDNA (senso ou anti-senso) em relação ao promotor foi
determinada por meio de enzimas de restrição e seqüenciamento dos potenciais clones. Em seguida, este cassete foi
transferido para o vetor binário pPZP211 com o auxílio das endonuclease de restrição KpnI e SacI. Os clones obtidos
foram confirmados pelo padrão de restrição utilizando diferentes enzimas de restrição. Numa próxima etapa,
estes cassetes serão transformados na Agrobacterium tumefaciens LBA4404 e plantas de S. lycopersicon cv. MicroTom serão transformadas de modo a caracterizarmos funcionalmente esta seqüência em plantas de tomateiro.
Apoio financeiro: CNPq
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Contribuição genética dos ancestrais da soja às
cultivares brasileiras
Wysmierski, PT1; Vello, NA1
Laboratório de Genética Aplicada a Espécies Autógamas, Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Glycine max (L.) Merrill, base genética, coeficiente de parentesco, genealogia, vulnerabilidade genética.
A soja é uma oleaginosa de grande importância na economia mundial e brasileira, visto que o complexo agroindustrial
da soja movimenta por ano aproximadamente 30 bilhões de dólares no Brasil e 215 bilhões de dólares no mundo.
Dada esta importância estratégica da cultura, uma preocupação relevante é sua estreita base genética. A base
genética de uma cultura é definida como o número de ancestrais e a contribuição relativa de cada um deles a um
determinado conjunto de linhagens. Já o coeficiente de parentesco (CP) entre as linhagens e os ancestrais mede a
probabilidade de dois indivíduos apresentarem alelos idênticos por descendência em locos homólogos e também
pode ser usado para estimar a base genética de uma cultura. Um estudo realizado em 1986 determinou que a
base genética de cultivares brasileiras de soja é estreita. Foram encontrados, dentre as 69 cultivares analisadas,
apenas 26 ancestrais, sendo somente quatro ancestrais responsáveis por 48,16% da base genética. O objetivo
deste trabalho foi estimar a contribuição genética relativa (CGR) dos ancestrais para 131 cultivares brasileiras de
soja, abrangendo o período entre 1965 e 2003. As genealogias das 131 cultivares foram analisadas para identificar
todos os ancestrais. Em seguida, foram calculados os CP entre os ancestrais e as cultivares analisadas, adotandose duas premissas: a) todos os ancestrais são independentes (apresentam CP nulo); b) a cada cruzamento 50%
dos genes provêm de cada genitor. Foram encontrados 40 ancestrais no total, ou seja, 14 a mais do que relatado
anteriormente. No entanto, os quatro ancestrais com maior CGR representam 54,33% da base genética e os 12
ancestrais com maior CGR respondem por 90,69% da base genética. Os 26 ancestrais com menor CGR contribuem
com menos de 6,50% coletivamente para a base genética, sendo que todos os ancestrais inéditos estão contidos
nesta categoria. Os quatros ancestrais mais importantes foram, respectivamente: PI 71569 (CNS) (17,99%), Nanking
(Roanoke) (13,54%), Illini (S-100) (12,50%) e PI 8424 (Tokyo) (10,30%). Estes quatro primeiros ancestrais foram os
mesmos encontrados no estudo de 1986, sendo que a diferença neste estudo é que o ancestral Illini e o ancestral
PI 8424 inverteram as posições. Além disso, o principal ancestral em ambos os estudos (PI 71569) apresentou
um aumento da CGR, passando de 15,37%, em 1986, para 17,99%. Conclusões: Este estudo preliminar indica que
houve um aumento no número de ancestrais da base genética brasileira, mas os novos ancestrais incorporados
apresentam baixa contribuição. Apesar deste aumento, a base genética da soja parece estar ainda mais estreita,
sendo que a contribuição dos quatros primeiros ancestrais passou de 48,16% para 54,33%. Análises de mais de
400 cultivares já estão em progresso para esclarecer melhor a base genética dessa importante cultura no Brasil.
Apoio financeiro: CAPES
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Avaliação genotípica de linhagens e cultivares brasileiras
e introduzidas da coleção nuclear de arroz da Embrapa
por meio da caracterização agronômica e molecular
Bueno, LG1; Brondani, C2; Coelho, ASG1; Borba, TCO2; Oliveira, JP2
Setor de Melhoramento de Plantas, Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás
Laboratório de Biotecnologia, Embrapa Arroz e Feijão
[email protected]
1
2
Palavras-chave: germoplasma, diversidade genética, caracterização agronômica, caracterização molecular, SSR.
Introdução: A Coleção Nuclear de Arroz da Embrapa (CNAE) foi concebida para representar a coleção ativa de
germoplasma de arroz da Embrapa, em uma amostra contendo a maior parte de sua variabilidade genética. A
eficiência de utilização dos acessos de bancos de germoplasma das culturas de importância econômica, como o
arroz, pode ser incrementada ao serem agregadas informações detalhadas de seus respectivos desempenhos para
características de interesse agronômico. Para tanto deve-se considerar não somente a variabilidade presente no
genoma de cada acesso, a qual tem permitido determinar com precisão o nível de similaridade entre genótipos,
mas também avaliar a expressão dessa variabilidade a campo, que para a cultura do arroz, sensível ao fotoperíodo,
possui diferenças fenotípicas marcantes quando um acesso é cultivado em diferentes ambientes. Objetivo: Avaliar a
diversidade genética de Linhagens e Cultivares Brasileiras (LCB) e do exterior (LCI) da CNAE, por meio de caracteres
agronômicos e marcadores moleculares SSR. Métodos: Foram utilizados 133 acessos pertencentes ao sistema
de cultivo sequeiro da CNAE, para os quais foram consideradas as avaliações de cinco caracteres agronômicos,
em nove experimentos distribuídos pelo Brasil e a caracterização com 86 marcadores SSR. Resultados: O caráter
que mais contribuiu para a divergência genética do grupo de acessos avaliados foi a produtividade de grãos
(34,9%). Pela análise de componentes principais dos acessos, 76,9% da variância total pode ser explicada pelos
três primeiros componentes. Observou-se que a partir da distância euclidiana média houve a formação de dez
grandes grupos considerando-se uma distância correspondente a 50% da maior distância entre grupos de acessos.
As estimativas das distâncias genéticas com base nos dados agronômicos variaram de 0,03 a 4,31. As maiores e
menores distâncias verificadas foram para os pares de acessos CNA0003005 e CNA0006030, e IAC_201 e IAPAR_63,
respectivamente. Com base nos resultados obtidos via marcadores moleculares, não houve a formação de grupos
homogêneos até uma distância correspondente a 60% da maior distância entre acessos, evidenciando a não
ocorrência de redundância entre eles. A análise comparativa entre as matrizes de distâncias genéticas molecular e
fenotípica apresentou pelo teste Z de Mantel uma correlação de 0,04, (P<0,05). Conclusões: A análise comparativa
agronômica e molecular mostrou que existe certo grau de relacionamento entre medidas de diversidade de distintos
conjunto de dados, sendo coincidente em alguns casos, acessos que apresentam maiores distâncias genéticas,
também apresentarem maiores distâncias fenotípicas. Os marcadores moleculares propiciam novas informações
acerca da estrutura genética da CNAE, no entanto, o maior aproveitamento da variabilidade encontrada entre
acessos, pelos programas de melhoramento vegetal, depende de quanto ela se correlaciona com a variabilidade
fenotípica para características de interesse. Este trabalho sugere a realização inicialmente da caracterização
molecular para selecionar os acessos mais divergentes, para em seguida serem caracterizados agronomicamente.
Apoio financeiro: Embrapa Arroz e Feijão, CNPq.
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Towards a high-density DArT (Diversity Arrays
Technology) microarray for high-throughput genotyping
of Pinus taeda and closely related species
Alves-Freitas, DMT1,2; Kilian, A3; Grattapaglia, D1,2,4
EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology - EPqB, 70770-910 Brasilia, Brazil
Dep. Cell Biology, Universidade de Brasilia – 70910-900 Brasília – DF, Brazil
3
Diversity Arrays Technology Pty Ltd, 1 Wilf Crane Crescent, Yarralumla, ACT 2600, Australia
4
Genomic Sciences Program - Universidade Católica de Brasília - SGAN, 916 modulo B, 70790-160 Brasília – DF, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: Pinus taeda, DArT, Linkage map, Cot-1 DNA.
Pinus (Pinaceae) is the largest extant genus of conifers, with over 100 widely recognized species. Economically,
pines are an important source of wood, paper, resins among others. Genome-wide, high-throughput, and costefficient marker are needed to allow genome-wide selection approaches focusing purely on prediction of
performance, precluding gene-trait association discovery. To this end we are developing a high-throughput DNA
genotyping platform based on the microarray based DArT technology (Diversity Arrays Technology). Population
samples of 16 species of Pinus, 24 provenances of Pinus taeda L. and two mapping populations were used as
starting material. Genome complexity of pooled genomic samples was reduced by restriction enzyme digestion
with PstI as the primary cutter and BstNI as a frequently and secondary cutter followed by ligation of adaptors
to PstI overhangs and PCR amplification of intact PstI fragments. Genomic representations (targets) generated
by PCR amplification were cloned into six separate libraries. A total of 7,680 clones were randomly picked being
2,304 clones from the 16 species libraries and 4,608 clones from P. taeda only libraries. A first test panel of 96
individuals was used to screen the 7,680 probes for polymorphic markers. Markers were declared reliable and
polymorphic at a cutoff of 80% call rate, 95% reproducibility, and polymorphism information content >0.1. A
total of 856 and 930 markers were found polymorphic in samples of 24 individuals of each one of two mapping
populations, while 1,776 DArT markers were polymorphic in a panel of 16 species, two individuals per species
and 16 Pinus taeda provenances, one individual per provenance. A significant number of markers could not be
adequately scored due to background signal due to the presence of highly repetitive DNA sequences that the
complexity reduction with PstI/BstNI could not remove in the very complex 23 pg Pinus genome. Cot-1 DNA,
i.e. genomic DNA highly enriched for repetitive elements was therefore isolated from P. taeda L. DNA using
two methods. The first method was based on a digestion with BSP1286I, followed by DNA denaturing and slow
cooling and the other method by shearing genomic DNA in autoclave, followed by DNA denaturing and reannealing and S1 nuclease to degrade linear single-stranded DNA. Using the Cot-1-DNA to quench repetitive
probes, both methods increased the recovery of assayable DArT markers by 40% with the S1 nuclease method
showing slightly better results. A new round of DArT probe picking and marker screening coupled to Cot-1 DNA
use will provide the target number of 7,680 polymorphic probes for Pinus genotyping. Haploid megagametophyte
tissue samples of 96 seeds for each one of five trees will be genotyped with a framework of microsatellite
markers and the optimized DArT array to construct a high-density consensus genetic map for Pinus taeda.
Financial support: Brazilian Ministry of Science and Technology (CNPq Projects 474645/2007-9 and 577047-20086) and EMBRAPA Macroprogram 2 project grant 02.07.01.004.
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Mapeamento de características poligênicas de
interesse agronômico em feijoeiro
Sforça, DA1,2; Campos, T1,2; Oblessuc, PR1,2,3; Sousa, ACB1,2; Rubiano, LB3; Carbonell, SAM3; Chioratto, AF3;
Garcia, AAF4; Souza, AP1,5
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Departamento de Genética e Evolução e Bioagentes – Instituto de Biologia (IB), UNICAMP
3
Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Recursos Genéticos Vegetais, Fazenda Santa Elisa, IAC
4
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), Universidade de São Paulo (USP)
5
Departamento de Biologia Vegetal – Instituto de Biologia (IB), UNICAMP.
[email protected]
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Palavras-chave: Feijoeiro, Mapas Genéticos, QTLs, Características Poligênicas, Microssatélites.
O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), leguminosa mais cultivada no mundo e muito apreciada na América Latina, é
uma planta propícia a estudos genéticos por possuir características de plantas modelo, como autogamia e diploidia
(2n = 2x = 22), além do genoma de tamanho relativamente pequeno. A maioria das características fenotípicas
de importância econômica em plantas é de caráter poligênico e apresentam alto grau de interação genótipo x
ambiente (GxE). Este trabalho teve como objetivo o mapeamento genético de dez características quantitativas em
uma população de mapeamento (RIL - Recombinant Inbred Lines - geração F11) composta por 380 indivíduos. Um
mapa genético desenvolvido com marcadores microssatélites foi utilizado para a localização dos novos QTLs. Os
dados foram obtidos através do plantio da população de mapeamento em quatro ambientes. Foram avaliadas as
características (1) número de dias para florescimento; (2) número de dias para maturidade; (3) altura da planta; (4)
largura e (5) comprimento da vagem; (6) número de sementes por vagem; (7) comprimento, (8) largura e (9) espessura
da semente; e (10) massa de dez sementes. Dessas, apenas as características 1, 2, 3, 6 e 10 já foram mapeadas por
outros autores. Foram utilizadas 10 plantas de cada RIL, das quais 5 foram avaliadas aleatóriamente quanto à altura
(3); 5 vagens foram tomadas ao acaso e avaliadas quanto a características de vagem e semente (4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10),
gerando 5 estimativas de cada. Para 1 e 2, as observações ocorreram diariamente, quando mais de 80% das plantas
de cada RIL floresceram ou atingiram a maturidade. O método de mapeamento utilizado foi o MIM (Mapeamento
por Intervalo Múltiplo) que considera múltiplos intervalos simultaneamente, incorpora parâmetros de epistasia no
modelo, permite maior eficiência e precisão na identificação dos QTL’s e que os efeitos sejam estimados sem viés.
Todas as características já foram avaliadas, resultando em um total de aproximadamente 16.000 plantas utilizadas,
onde 7.600 plantas foram avaliadas quanto à altura (3), 7.600 vagens para as características de vagem (4, 5 e 6) e 40.850
sementes quanto a características relacionadas a semente (7, 8, 9 e 10). Para a verificação do modelo estatístico
associado à distribuição dos dados de cada característica, foi utilizada a análise do resíduo da variância. A distribuição
normal foi observada para todas as características, exceto para a 1, que seguiu a distribuição de Poisson. A análise de
variância, as interações Genótipo x Ambiente e QTL x Ambiente, o mapeamento por MIM e análise das interações
epistáticas entre os QTLs estão sob análise. Espera-se com esse trabalho contribuir para o conhecimento genético
da cultura frente ao melhoramento genético, através da identificação de marcadores candidatos ligados a poligenes.
Apoio Financeiro: FAPESP E CNPq.
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Mapeamento de QTLs de características sob influência
da ferrugem asiática da soja
Santos, JVM dos1,3; Passianotto, ALL1,3; Yamanaka, N2; Arias, CAA1,3; Abdelnoor, RV1,3
Programa de Mestrado e Doutorado em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Londrina – UEL
Japan International Research Center for Agricultural Sciences - JIRCAS, Japão
3
Laboratório de Biotecnologia Vegetal e Bioinformática, Empresa Brasileira de Pesquisa em Agropecuária - Embrapa Soja
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Glycine max, Phakopsora pachyrhizi, resistência poligênica, mapa genético, microssatélites, grupos de ligação.
Introdução: A ferrugem asiática da soja, causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi (Syd. & P.Syd.), é um dos
principais fatores bióticos causadores de prejuízos de redução do potencial sobre a cultura da soja, podendo causar
redução de produtividade superiores a 75%. Hoje, sabe-se que uma das formas mais eficazes de controle da doença
é através da resistência genética. Devido à baixa durabilidade de genes de resistência vertical, estudos para o
desenvolvimento de linhagens com genes de resistência horizontal são de extrema importância. Assim, objetivouse nesse trabalho identificar QTLs em soja para características agronômicas sob influência da ferrugem asiática.
Métodos: 83 marcadores de microssatélites e 2 marcadores morfológicos foram utilizados para a construção de um
mapa genético em uma população de linhagens endogâmicas recombinantes (RILs) Ao mesmo tempo, foram feitas
avaliações fenotípicas para várias características correlacionadas a doença nas RILs sob ação do patógeno em campo
experimental da Embrapa Soja e em fitotron no Japão, a fim de buscar QTLs relacionados à resistência horizontal ao
patógeno, e também para verificar a existência de linhagens com maior nível de resistência à doença. Resultados: Uma
cobertura parcial de 1.023,5 cM do genoma da soja foi obtida em 19 grupos de ligação. Foram detectados 17 QTLs que
possam estar contribuindo para a resistência horizontal à doença, sendo a maior parte deles localizados no grupo
C2 e L. Grande parte dos QTLs observados possui efeito pleiotrópico para mais de uma característica analisada, fato
constatado através de análises de correlação entre as características estudadas. Foram selecionadas 16 linhagens
que apresentaram as melhores características sob ação da ferrugem asiática da soja. Para algumas características,
verificou-se a existência de segregação transgressiva, já que neste caso os genes estavam dispersos entre os
parentais. Conclusão: Os dados gerados poderão contribuir para o programa de melhoramento contra a doença,
O mapa gerado também pode servir para detecção de outros QTLs relacionados a outras características de grande
interesse agronômico, já que ambas as cultivares que foram cruzadas possuem resistência a várias outras doenças.
Apoio Financeiro: Embrapa, JIRCAS, Capes e Finep.
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Marcador microssatélite associado a resistência ao
nematóide de galhas
Vinholes, PS12; Oliveira, L2; Vieira, ESN2; Schuster, I2; Borém, A1
Departamento de Fitotecnia - Universidade Federal de Viçosa
Núcleo de Biotecnologia da Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola – COODETEC
[email protected]
1
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Palavras-chave: Soja, Meloidogyne incognita, Seleção Assistida por Marcadores (SAM), Satt358.
As doenças, destacando-se as causadas por nematóides fitoparasitas, estão entre os fatores que mais limitam a
obtenção de altos rendimentos de produção para a cultura da soja. O ataque de fitonematóides, particularmente
as espécies Meloidogyne incognita e Meloidogyne javanica, são de ampla ocorrência e responsáveis por perdas
significativas em lavouras de soja. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi identificar marcadores moleculares
do tipo microssatélite promissores para o uso em Seleção Assistida por Marcadores (SAM) ao nematóide de
galhas. A população utilizada para este estudo foi obtida a partir de duas cultivares contrastantes para o caráter
resistência ao nematóide de galhas. Foram realizados cruzamentos entre a cultivar BRS 133 (susceptível) com a
cultivar CD 201 (resistente). Foi realizada análise fenotípica em casa de vegetação, sob condições controladas na
Cooperativa Central de Pesquisa Agrícola – COODETEC, em Cascavel/PR. As plantas foram inoculadas e após
trinta dias foi atribuída uma nota para cada planta, em função do número de galhas formadas nas raízes: nota
1: 0-8; nota 2: 9-16; nota 3: 17-24; nota 4: 25-32 e nota 5: ³33 de galhas formadas. Amostras de folhas das plantas
F2 foram coletadas, congeladas em nitrogênio líquido, e em seguida armazenadas em ultra-freezer (-80 ºC) até
o momento da extração de DNA. Foram testados 38 primers nos pais. Desses, quatro foram polimórficos, sendo
aplicada a estratégia de análise de extremos para o screening dos marcadores polimórficos na população. Vinte
e três plantas de cada grupo (resistente e suscetível) e mais as duas amostras dos progenitores, foram avaliadas
com cada marcador, e a associação marcador/QTL foi testada com este conjunto de dados fenotípicos. Entre
estes quatro marcadores, apenas um, o Satt358 apresentou uma associação significativa com QTLs quando
testado com toda a população de 160 indivíduos. Os dados estatísticos foram obtidos com auxilio do programa
Genes. Os resultados indicam que esta característica tem 85,7% de herdabilidade e que há uma correlação de
10% do marcador associado com o caráter resistência ao nematóide de galhas. O marcador Satt358 esta no
braço O do Mapa de Ligação da soja. Mais marcadores precisam ser testados especialmente próximos ao Satt358
para se encontrar marcadores mais correlacionados ao um dos genes de resistência para nematóide de galhas.
Apoio financeiro: COODETEC; CNPq; FAPEMIG.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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186
Mapa de ligação integrado em cana-de-açúcar baseado
em marcadores AFLP, SSR e de retrotransposons
Palhares, AC1; Rodrigues, TB1; Domingues, DS2; Mollinari, M1; Margarido, GRA1; Maccheroni, W3; Van
Sluys, M-A2; Garcia, AAF1; Vieira, MLC1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
3
CanaVialis S.A.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cana-de-açúcar; retrotransposons; marcadores moleculares; mapa de ligação; AFLP
Introdução: A cana-de-açúcar é a cultura mais complexa do ponto de vista genômico em que o melhoramento
genético tem sido aplicado. O acesso a ferramentas de análises genéticas, tais como os marcadores moleculares
usados para a construção de mapas de ligação, bem como a disponibilidade de sequências expressas para
a cultura, pelo projeto SUCEST (www.sucest-fun.org), tem possibilitado refinar o entendimento sobre a sua
complexidade genética e permitido o conhecimento do seu conteúdo genômico, respectivamente. Recentemente,
dois retrotransposons foram isolados e caracterizados em cana-de-açúcar a partir de dados do SUCEST. Estes
retrotransposons apresentam padrões distintos de amplificação no genoma e foram denominados SURE (SUgarcane
REtrotransposon) e Garapa (Domingues, DS., Tese Dr., IB/USP, 2009). Objetivos: gerar um mapa de ligação
integrado de cana-de-açúcar com base em marcadores AFLP e desenvolver marcadores direcionados à sequências
dos retrotransposons SURE e Garapa para serem alocados no mapa, de modo a complementar os estudos sobre o
número de cópias e a distribuição desses elementos no genoma da cana. Métodos: A população de mapeamento
foi constituída de 188 indivíduos (F1) oriundos do cruzamento entre os genitores ‘IAC 66-6’ e ‘TUC 71-7’, que são
contrastantes para resistência ao carvão (Sporisorium scitamineum) e para caracteres de produção. Esse material
foi genotipado para locos de AFLP, cuja técnica foi adaptada para a cana-de-açúcar, e para locos direcionados a
sequências dos retrotransposons SURE e Garapa, desenvolvidos com base nos princípios da técnica NBS-profiling.
A segregação das marcas foi verificada pelo teste do qui-quadrado para as proporções 1:1 e 3:1, correspondentes
às esperadas para marcas em dose única. O mapa foi construído usando-se o software OneMap (Margarido et
al., Hereditas, 2007). Para o estabelecimento dos grupos de ligação, foram usados LOD score ≥5,0 e fração de
recombinação ≤0,35. Resultados: Excelentes padrões de AFLP e de marcas direcionadas ao retrotransposon SURE
foram obtidos; entretanto, para o Garapa, ainda são necessários ajustes na técnica. Um total de 600 marcadores
de dose única foi obtido a partir de 22 combinações de enzimas de restrição/primers de AFLP e 6 combinações
otimizadas para amplificar marcas direcionadas ao SURE. Junto a esses dados, 57 locos SSR foram adicionados para
as análises de ligação. Construiu-se um mapa com 107 grupos de ligação, com tamanho de 4.316,5 cM e densidade
de 8,74 cM/marcador. O mapeamento dos marcadores direcionados ao retrotransposon SURE (56) revelou que
esses não estão uniformemente distribuídos nos grupos de ligação e confirmou o seu baixo número de cópias
no genoma da cana. Conclusões: Locos de AFLP servem como arcabouço para alocação de marcas em mapas de
ligação de espécies poliplóides, gerados com base em populações F1. Marcadores direcionados ao retrotransposon
SURE não se distribuem de forma uniforme nos grupos de ligação, sugerindo a sua organização em clusters.
Apoio Financeiro: CNPq e CanaVialis S.A.
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Validação de marcadores moleculares para os genes Lr34
e Lr21 de resistência à ferrugem da folha do trigo, visando
sua utilização em programa de melhoramento genético
Castro, BL1; Grando, MF1; Barcellos, AL2; Valério, IP2; Denardin, N1; Didoné, DA.1
PPGAgro, Laboratório de Biotecnologia Vegetal e Laboratório de Bacteriologia da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária
(FAMV) da Universidade de Passo Fundo. Passo Fundo, RS
2
OR Melhoramento de Sementes Ltda. Passo Fundo, RS
[email protected]
1
Palavras-chave: resistência durável, Puccinia triticina, marcadores moleculares, Triticum aestivum, caracterização molecular.
Introdução: O fungo que causa a ferrugem da folha, Puccinia triticina, é muito adaptável e rapidamente evolui
para novas raças, virulentas a cultivares de trigo anteriormente resistentes. É constante o desafio de melhoristas
de trigo para desenvolver novas cultivares do cereal com resistência efetiva e durável, devido à importância
econômica e social. Controle baseado em genes de resistência é mais adequado à preservação do meio ambiente
e mais rentável do que soluções alternativas como o uso de fungicidas. O melhoramento para resistência é
dificultado pela duração do processo de identificação e seleção dos genes. É rotina mundialmente, em programas
de melhoramento de trigo, seleção assistida por meio de marcadores de DNA. Esta tecnologia permite rápida e
acurada identificação, no genoma de plantas, da presença ou não de genes de resistência, como os amplamente
utilizados, Lr34 e Lr21. Marcador molecular para o gene Lr34 foi desenvolvido por Lagudah et al. (2006) e Talbert
et al. (1994) desenvolveram marcadores para o gene Lr21. Objetivo: Este trabalho objetivou validar marcadores
moleculares associados a genes de resistência à ferrugem da folha, Lr34 e Lr21, em 18 genótipos de trigo com
conhecida presença ou ausência desses alelos, visando sua utilização rotineira em programa de melhoramento
genético no Brasil. O DNA foi extraído pelo método CTAB. Para o gene Lr34 foram empregados os ‘primers’
Forward csLV34F GTTGGTTAAGACTGGTGATGG e Reverse csLV34R TGCTTGCTATTGCTGAATAGT (Lagudah
et al.,2006), utilizando protocolo descrito por Seah et al. (1998), com temperatura de anelamento de 55°C. Os
produtos do PCR foram analisados em gel de agarose 3%. O gene Lr21 foi amplificado com primers Forward Ksu-D14
CGCTTTTACCGAGATTGGTC e Reverse Lr21 ATATTGGAGTGACATCTCCGG, (Talbert et al.,1994), seguindo
protocolo de Huang e Gill (2001), com temperatura de anelamento de 50°C. As bandas foram analisadas em gel de
agarose 2%. Resultados: Todos os genótipos já caracterizados pela presença do alelo Lr34 apresentaram uma banda
de 150 pares de bases (pb), enquanto que os genótipos suscetíveis, apresentaram uma banda de 229 pb. Referente
ao marcador Lr21, os genótipos conhecidos como portadores deste alelo de resistência apresentaram uma banda
de 1020 pares de base (pb), enquanto que aos suscetíveis correspondeu um produto de amplificação de 885 pb.
Os genótipos Thatcher Lr13, Lr34 e Thatcher Lr21 apresentaram as duas bandas (1020pb e 885pb), sugerindo a
heterozigose para este loco. Os produtos de amplificação indicando a resistência e a suscetibilidade dos genótipos
aos genes avaliados coincide com os descritos na literatura. Conclusões: Os marcadores para os genes Lr34 e Lr21
foram validados com sucesso, sendo eficientes na identificação de plantas portadoras destes genes, e podem
ser empregados na seleção assistida em programa de melhoramento de trigo, nas nossas condições brasileiras.
Apoio financeiro: OR Melhoramento de Sementes Ltda.
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Coffea nutriome: minding the gap among genomics,
biotechnology and fertilization practices
Domingues, DS1; Meda, AR1; Santos, TB1; Vespero, EB1; Sitta, RB1; Pereira, LFP1,2; Vieira, LGE1
1
2
Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Instituto Agronômico do Paraná
Embrapa Café
Keywords: coffee, genomics, plant nutrition, nitrogen, boron
Since the Green Revolution, productivity in agriculture has largely increased by improving management practices,
including fertilization. Due to its fundamental importance in agriculture, fertilizers consumption is growing
in a much faster pace than food production, with great impact in environment and in agricultural costs. This
impact is clearly observed in coffee production, with Brazil as the world’s largest producer and exporter, by the
fact that fertilizers represent a great share in the total production cost and coffee breeding programs are not
focused in plant nutrient efficiency. In order to reduce management costs and environmental impact, genotypic
variation in mineral nutrient requirements must now be considered in Coffea breeding. In this context, this
work presents the initial steps to understand Coffea nutriome based in two approaches: evaluation of Coffea
genotypes from IAPAR germplasm collection for the accumulation of mineral nutrients in leaves and fruits, as
well as the characterization of candidate genes involved in mineral nutrient uptake and transport, with a focus
in nitrogen and boron, two important macro and micronutrient for coffee production. The initial evaluation of
fifteen genotypes from IAPAR germplasm identified C. arabica varieties with differential boron accumulation
in leaves, what was strongly correlated with plant vigour. We also identified Expressed Sequence Tags of C.
arabica and C. canephora related to genes involved in nitrogen and boron uptake and transport. In silico analysis
displayed different expression patterns among these transporters in Coffea, depending on the tissue and growth
conditions. Other experiments are in progress to understand gene-phenotype association. Taken together, these
data will provide the opportunity to help Coffea breeding programs in three ways: 1) identification of genotypes
more efficient in nitrogen and boron utilization; 2) characterization of molecular targets for genetic engineering
in Coffea; 3) understand molecular mechanisms involved in nutrient transport and utilization in coffee plants,
providing biotechnological tools to support a better management of fertilization practices in this perennial crop.
Finnancial support: Fundação Araucária, CAPES, CNPq and CBP&D/Café.
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189
Reação de genótipos de soja à ferrugem asiática e a
doenças de final de ciclo
Medeiros, AG¹; Vello, NA²; Pinheiro, JB2; Dias, CTS³
Laboratório de Genética, Embrapa Semiárido
² Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ/USP)
³ Departamento de Ciências Exatas, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ/USP)
[email protected]
1
Palavras-chave: Glycine max, Phakopsora pachyrhizi, Septoria glycines, Cercospora kikuchii, melhoramento genético, resistência genética
Introdução: Entre as doenças fúngicas de maior importância para a cultura da soja, destacam-se a ferrugem
asiática, a mancha parda ou septoriose e o crestamento foliar de cercospora, estas últimas consideradas como
o “complexo de doenças de final de ciclo” (DFC). A obtenção de cultivares resistentes ou tolerantes, através do
melhoramento genético, apresenta-se como a medida mais viável do ponto de vista econômico e ambiental e ainda, de
importância estratégica no controle destas doenças, possibilitando a redução do número de aplicações de fungicidas.
Objetivos: avaliar a reação de genótipos de soja à ferrugem asiática e as doenças de final de ciclo, visando à prática
de seleção para genótipos resistentes/tolerantes a estas doenças. Métodos: Os experimentos foram conduzidos
em 2007/08 em áreas experimentais do Departamento de Genética, ESALQ/USP, Piracicaba, SP. Utilizaram-se
três grupos de genótipos: 1) quatro genótipos exóticos e resistentes à ferrugem asiática: PI 200487 (Kinoshita),
PI 471904 (Orba), PI 459025A (Bing nan) e PI 200526 (Shira Nuhi); 2) cinco cultivares adaptadas e suscetíveis à
ferrugem: IAC-100, MGBR 46 (Conquista), BRSMT (Pintado), BRS-154, BRS-232; 3) três cultivares adicionais: BR16, IAS-5 e OC-4. Foram avaliados três experimentos, sendo um destes protegido com aplicações dos fungicidas
Impact Duo & Opera para controle da ferrugem asiática e das DFC; o segundo recebeu apenas o fungicida Derosal
para controle das DFC, e no terceiro, o Controle, não houve aplicação de fungicidas. O contraste do Impact Duo
& Opera vs Derosal forneceu uma estimativa da reação à ferrugem (RF), enquanto que o contraste entre Derosal
e Controle estimou a reação as DFC (RFDC), em termos de produtividade de grãos. A reação à ferrugem também
foi avaliada por meio de uma escala diagramática. Realizaram-se cinco avaliações, a primeira aos 90 dias após
a semeadura e as demais avaliações em intervalos de sete dias. Resultados: pelas estimativas de RF e RFDC
constatou-se que o grupo dos genótipos exóticos apresentou a maior resistência entre os grupos, enquanto que
os genitores adaptados mostraram-se os mais suscetíveis. Os genitores IAC-100 e Shira Nuhi destacaram-se por
apresentarem-se mais resistentes à ferrugem, e a cultivar IAS-5, por apresentar tolerância à ferrugem. OC-4 foi a
mais tolerante as DFC. Destaca-se o genótipo Orba, por ter apresentado resistência à ferrugem e as DFC. Pelas
notas de severidade da ferrugem, as cultivares antigas foram as mais suscetíveis e o grupo dos genótipos exóticos
os mais resistentes. Conclusões: a estratégia de se usar diferentes tipos de fungicidas mostrou-se eficiente para
estimar a reação das plantas à ferrugem e as DFC, considerando a produtividade de grãos, e a partir disso foi
possível a identificação de fontes de resistência/tolerância à ferrugem e a DFC entre os genótipos estudados.
Apoio financeiro: CAPES e CNPq.
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190
Validação de marcadores moleculares SNP para
lipoxigenase 2 de sementes de soja
Silva, DF3; Castro, AG1; Cunha, PS3; Teixeira, AD2; Barros, EG2,3; Moreira, MA1,3
Departamento de Bioquímica e Biologia molecular, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Viçosa
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Viçosa
3
Centro de Biotecnologia aplicado à agropecuária – BIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Soja, lipoxigenase 2, SNP, Marcador molecular, Melhoramento vegetal.
A degradação oxidativa dos ácidos graxos de reserva da soja, ocorrida durante o processamento dos grãos, é
a principal responsável pelo sabor de feijão cru também denominado “beany flavor”. A enzima lipoxigenase
(linoleato: O2 oxirredutase, EC 1.13.11.12), catalizadora dessa reação, está presente nas sementes de soja sob a
forma de três isoenzimas codificadas pelos genes dominantes, LOX1, LOX2 E LOX3. Os produtos da ação dessas
enzimas são hidroperóxidos, que ao serem degradados originam compostos carbonílicos, responsáveis pela
palatabilidade indesejada dos produtos à base de soja. A seleção assistida por marcadores moleculares é uma
área que possui grande impacto dentro dos programas de melhoramento. Recentemente, uma nova classe
de marcadores moleculares baseados em polimorfismos de um único nucleotídeo - SNP (Single Nucleotide
Polymorphism) vem sendo utilizada. Estes se baseiam na detecção de polimorfismos resultantes da variação de
uma única base num dado loco, considerando o genoma de vários indivíduos em uma população. A identificação
de marcadores moleculares contidos nos genes que codificam as lipoxigenases poderá auxiliar a seleção de
alelos que determinam a ausência dessas enzimas na semente, acelerando assim o processo de melhoramento
da soja. Os objetivos desse trabalho foram a confirmação da presença de SNPs, previamente descritos como
marcadores para o caráter presença/ausência de LOX 2, entre variedades de origem genética distintas, utilizadas
no Programa de Melhoramento da Qualidade da Soja-BIOAGRO/UFV e validação desses polimorfismos como
marcadores moleculares. Um par de iniciadores para LOX2 foi utilizado para amplificar uma região intrônica deste
gene descrita por conter marcadores SNPs. As seqüências foram obtidas a partir do seqüenciamento direto dos
produtos de PCR de cinco variedades LOX 2 dominante (LOX 2+): Cristalina normal, C594731, CAC 1, UFV 16 e
Hartwig; e uma variedade LOX 2 recessiva (LOX2-): Cristalina Triplo nula. Posteriormente, uma população de
cinqüenta e três indivíduos F8 contrastantes para LOX 2, derivados do cruzamento entre as variedades Hartwig
(LOX 2+) x Y23 (LOX 2-) foram utilizadas para a validação desses polimorfismos como marcadores. Esses SNPs
se caracterizaram em duas transições, uma Timina para Citosina em um loco e a outra de uma Guanina para
Adenina em outro, sendo as primeiras bases pertencentes ao alelo dominante e as últimas pertencentes ao
alelo recessivo. O método de genotipagem usado foi o seqüenciamento direto dos fragmentos que continham os
polimorfismos em estudo. Os dois SNPs co-segregaram completamente com o caráter presença/ausência de LOX 2
nos indivíduos da população F8, constituindo dois haplótipos. Vinte e oito indivíduos fenotipicamente dominantes
continham o haplótipo TG e vinte e cinco indivíduos recessivos apresentaram o haplótipo CA. Dessa forma, esses
SNPs são ferramentas potenciais, para auxiliarem o melhoramento da soja assistido por marcadores moleculares.
Apoio financeiro: Fapemig, CNPq e Capes
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191
A set of 768 SNP for the highly heterozygous genome
of Eucalyptus: factors affecting SNP polymorphism and
reliability with the Golden Gate Genotyping Technology
Silva-Junior, OB1; Lima, BM1,2; Pappas, GJ1,3; Kirst, M4; Grattapaglia, D1,3
EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF, Brasil
Departmento de Genética - Universidade de São Paulo – ESALQ/USP, Piracicaba, SP, Brasil
3
Genomic Sciences Program - Universidade Católica de Brasília, Brasília, DF, Brasil
4
School of Forest Resources and Conservation, Genetics Institute, University of Florida, Gainesville, USA
[email protected]
1
2
Keywords: molecular markers, DNA sequencing, EST, single-nucleotide polymorphism (SNP), Eucalyptus.
High-throughput, high-density genotyping has become an essential requirement for gene discovery, molecular
breeding and population genomics. SNPs have been increasingly developed for these purposes in the main crop
species, and a growing interest exists to use this technology in less-domesticated plants. Irrespective of the method to
identify SNPs - amplicon resequencing or strict in silico mining - difficulties are faced in later steps when attempting to
convert queried SNPs into high-quality genotypes for highly heterozygous genomes. Particularly for the widely used
Golden Gate Genotyping Technology (GGGT) specific constraints are recommended on the sequences flanking the
target SNP. We used a 1.2 million mixed EST dataset including Sanger and 454 sequences from multiple Eucalyptus
species and individuals to develop the first collection of genome-wide SNPs for Eucalyptus and assess the effect
of increasingly stringent in silico SNP identification and design parameters on the reliability and polymorphism
of SNP genotyping using the GGGT. A general SNP pipeline was developed based on the software MIRA 2 with
enhanced 454 and Illumina support and SNP prediction using PolyBayes (pPrior= 0.01; pSNP > 0.99). To evaluate
the effect of increasingly stringent in silico SNP selection parameters on SNP conversion rate and polymorphism,
five sequentially cumulative filtering steps were applied involving in silico estimated minor allele frequency, SNP
flanking sequences context , species origin and number of EST reads in the contig. The effect of these variables was
later bench validated by the GGGT assay of a set of randomly sampled SNPs in five Eucalyptus species. Reliability
was quantified by the GenCall score (GC50), and polymorphism by a MAF (Minimum Allele Frequency) ≥ 0.05 for
each species separately. For a set of 696 genome-wide SNPs queried, 674, 666, 671, 654 and 495 SNPs were declared
reliable respectively in population samples of E. grandis E. globulus E. urophylla, E. camaldulensis and E. nitens. The
number of polymorphic SNPs varied from a maximum of 319 (46%) for E. grandis to a minimum of 136 (20%) for E.
globulus. SNP reliability and rate of polymorphism significantly improved (p<0.001) when constraints were applied
to the SNP flanking sequences, i.e. a minimum of 20 bases flanking the SNP on each side without any additional SNPs
in the contig. When this constraint was increased to 60 bases an additional improvement was observed. Logistic
regressions showed that the number of reads and the distance to the next nearest SNP were positively correlated
with SNP reliability and polymorphism while the phred quality of the major allele base was inversely related
to polymorphism. These results now allow us to optimize larger-scale SNP development efforts for Eucalyptus
and should provide key leads to develop SNP for other highly heterozygous plant species such as tropical trees.
Financial support: Brazilian Ministry of Science and Technology (CNPq Projects 474645/2007-9 and 577047-20086) and EMBRAPA Macroprogram 2 project grant 02.07.01.004.
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Realized accuracies of Genomic Selection for volume
growth in tropical Eucalyptus: marker assisted
selection coming to reality in forest trees
Grattapaglia, D1,2; Sansaloni, CP1,3; Petroli, CD1,3; Resende Jr, MFR4; Faria, DA1; Missiaggia, AA5; Takahashi,
EK6; Zamprogno, KC7; Kilian, A8; Resende, MDV9
EMBRAPA Genetic Resources and Biotechnology – EPqB, 70770-910, Brasilia, DF, Brazil
Universidade Catolica de Brasília- SGAN, 916 modulo B, Brasilia, DF, 70790-160, Brazil
3
Universidade de Brasilia – Campus Darcy Ribeiro Brasília, DF, 70910-900, Brazil
4
Universidade Federal de Viçosa – Bioagro, Viçosa MG, 36570-000, Brazil
5
FIBRIA, Rod. Aracruz/Barra do Riacho, km 25, Aracruz, ES, 29197-900, Brazil
6
CENIBRA Celulose Nipo Brasileira S.A, Belo Oriente, MG, 35196-000, Brazil
7
VERACEL Celulose S.A., Eunápolis, BA, 45820-970, Brazil
8
DArT - Diversity Arrays Technology, POB 7141, Yarralumla, ACT, Australia 2600
9
EMBRAPA Forestry Research, Colombo, PR, 83411-000, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: Genomic Selection, MAS, Eucalyptus
Genomic selection (GS) involves selection decisions based on genomic breeding values estimated as the sum of the
effects of genome-wide markers capturing most QTLs for the target trait(s). GS is revolutionizing breeding practice
for complex trait in domestic animals. The same approach and concepts can be readily applied to forest tree breeding.
Trees also have long generation times and late expressing traits. However the application of GS in forest trees has
additional advantages: (1) large even-aged “discovery” populations can be easily assembled and accurately phenotyped;
and (2) effective population sizes (Ne) can be tailored to specific breeding programs. Differently from association
genetics that aims at dissecting complex traits in their discrete components, GS precludes the discovery of individual
marker-trait associations and focuses on prediction of performance. We initially carried out a deterministic study to
assess the impact of linkage disequilibrium (modeled by Ne and inter-marker distance), the size of the training set, trait
heritability and the number of QTL on the predicted accuracy of GS (Grattapaglia and Resende, 2010). Results indicate
that GS has the potential to radically improve the efficiency of tree breeding. The benchmark accuracy of conventional
BLUP-based phenotypic selection (0.68) is reached by GS even at a marker density ~2 markers/cM when Ne ≤30, while
up to 10 markers/cM are necessary for larger Ne. Shortening the breeding cycle by 50% with GS provides an expected
increase ≥100% in selection efficiency. To validate these results we then carried out a large multi-population proof-ofconcept study of GS in tropical Eucalyptus. De-regressed breeding values for height and DBH and genotypes at 3,129
DArT markers (a marker density of 2.4 marker/cM) were collected for 856 trees randomly sampled from a progeny trial
with 58 full sib-families and Ne = 11. Discovery and validation were carried out with 700 and 156 individuals respectively.
Average realized selection accuracies of 0.67 for height and 0.69 for DBH were obtained. Recent results from the analysis
of a second independent population with a larger Ne (Ne=120), second generation hybrid composition, genotyped for
>3,500 DArT markers, confirmed these very encouraging results. Realized accuracies of 0.60 were obtained for growth
traits and wood density. In this scenario, gain in selection efficiency evaluated as the ratio of GS and phenotypic
selection exceeds 350% by reducing breeding generation time from 8 to 2 years with early flower induction. To our
knowledge these are the first experimental results of GS in forest trees and among the first public ones in plants
in general. With the technological advances and declining costs of genotyping methods, our cautiously optimistic
outlook is that GS has true potential to be implemented operationally and revolutionize tree breeding practice.
Financial support: CNPQ E EMBRAPA
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Ausência de ardor em pimenta causada por SNPs
detectados no gene Pun1 de Capsicum annuum
Ohse, BJG1; Fuscaldi, JL1,2; Buso, GSC1; Carvalho, SIC3; Reifschneider, FJB3; Ferreira, ME4
Laboratório de Genética Vegetal – Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Universidade Federal de Viçosa
3
Embrapa Hortaliças
4
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: SNP, polimorfismo, mutação, acil-transferase, capsaicina
O ardor das pimentas é causado pelo alcalóide capsaicina (N(-4-hidroxi-3-metoxiobenzil)-8-metil-trans-6nonenamida), sintetizado na epiderme da placenta do fruto. Os programas de melhoramento genético têm interesse
no desenvolvimento de variedades de pimenta ardida, com alto teor de capsaicina, bem como de variedades doces,
sem capsaicina, destinadas ao mercado de condimentos secos para tempero, como páprica. Na rotina dos programas
de melhoramento, a detecção do ardor através da experimentação dos frutos pelo melhorista não é eficiente, visto que
a degustação continuada de pimentas causa alteração da sensibilidade das fibras nervosas dos sensores periféricos
de dor das papilas bucais. Um sistema de diagnóstico precoce de plantas que produzem frutos ardidos e doces
com base na análise de DNA poderia potencialmente diminuir os custos e aumentar a eficiência dos programas
de melhoramento. O objetivo deste trabalho foi avaliar o controle genético do ardor da pimenta e desenvolver um
sistema de seleção precoce de plantas ardidas e doces de Capsicum annuum. A evidência do papel do gene Pun 1 do
cromossomo 2 de C. annuum no controle da síntese de capsaicina em pimentas tem sido corroborada por diferentes
estudos. Assim, polimorfismo de DNA na região do gene Pun 1 foi inicialmente avaliado para a detecção de variantes
alélicos com uma bateria de iniciadores de PCR desenhados para cobrir a região promotora e codificante do gene.
Foram genotipados 193 acessos doces e 10 acessos ardidos de Capsicum annuum do Banco de Germoplasma
de Pimentas e Pimentões, mantido pela Embrapa Hortaliças. Foi otimizado um sistema PCR que possibilita a
detecção de uma macro-deleção cobrindo a região promotora e grande parte do éxon 1 do gene Pun 1. Cerca de 90%
dos acessos com frutos doces de C. annuum possuem esta macro-deleção, que explica o fenótipo pela inativação
do gene. Contudo, 10% dos acessos testados não possuem a macro-deleção e apresentam frutos doces. O gene,
portanto, está aparentemente intacto nesses acessos. O re-sequenciamento do gene Pun1 e a análise da sequência
protéica desses acessos possibilitou a detecção adicional de três mutações no éxon 1 (posições 40, 609, 631) e uma
no éxon 2 (posição 1099) que alteram a sequência de aminoácidos da acil-transferase codificada pelo gene. Os alelos
identificados representam, além da macro-deleção, novas causas potenciais da ausência de picância em C. annuum.
Apoio financeiro: Embrapa Macroprograma 2
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Caracterização genealógica dos acessos do banco de
germoplasma de cana-de-açúcar da Ridesa
Martins, ACFS1; Nunes, CMC1; Santana, JRO1; Pantalião, GF1; Reis, AJS1; Coelho, ASG1
Setor de Melhoramento de Plantas, Escola de Agronomia e Engenharia de Alimentos, Universidade Federal de Goiás
[email protected]
1
Palavras-chave: Saccharum, genealogia, Ridesa, banco de germoplasma, UPGMA.
Introdução: A caracterização e o conhecimento da variabilidade genética que está disponível ao melhorista
são informações essenciais para o planejamento de um programa de melhoramento. Teoricamente, devem ser
escolhidos genitores com a maior divergência genética possível, a fim de se produzir combinações híbridas de
maior efeito heterótico. Além disso, os genótipos utilizados nos cruzamentos devem ser selecionados de forma que
as populações geradas a partir dos seus cruzamentos tenham genótipos superiores àqueles em uso comercial. O
estudo da genealogia dos acessos de um banco de germoplasma apresenta-se, desse modo, como uma estratégia de
escolha de genitores, por permitir a avaliação do grau de parentesco existente entre eles. Nesse contexto, o objetivo
do presente trabalho foi obter a genealogia dos 3314 acessos do banco de germoplasma da Rede Interuniversitária
para o Desenvolvimento do Setor Sucroalcooleiro (Ridesa), situado na Estação de Floração e Cruzamento da Serra
do Ouro, no município de Murici, no Estado de Alagoas. Com isso, procura-se contribuir para a caracterização deste
banco de germoplasma, indicando-se o grau de parentesco entre os acessos disponíveis, subsidiando a tomada de
decisão relativa ao planejamento de cruzamentos futuros. Métodos: Para obtenção da genealogia foi utilizado o
pacote “kinship” do software R, pelo qual se obteve uma matriz de parentesco baseada no coeficiente de parentesco
de Malècot. Essa matriz foi transformada em uma matriz triangular inferior para que pudesse ser utilizada no
software NTSYS, pelo qual, para melhor visualização da genealogia, se obteve um dendrograma através do método de
agrupamento “Unweighted Pair-Group Method using Arithmetic Average” (UPGMA). Com a análise do dendrograma,
pode-se perceber que 350 indivíduos não apresentaram nenhum grau de parentesco conhecido; 1875 indivíduos com
aproximadamente 0,25 de parentesco; e o restante do banco com outros valores de parentesco, incluindo valores
entre 0,50 e 0,75. Conclusões: Com base na análise do dendrograma, o coeficiente de parentesco entre os pares de
acesso variou de 0 a 0,5625, com valor médio de 0,0722. O parentesco de cada acesso consigo mesmo também variou,
tendo valores de, aproximadamente, 0,5 e 0,75. Acredita-se que os acessos que tiveram 0,75 de parentesco consigo
mesmo sejam oriundos de autofecundações sucessivas. Observou-se ainda que algumas espécies de Saccharum,
como Saccharum barberi, S. officinarum, S. spontaneum e, até mesmo, um genótipo do gênero Miscanthus e outro
do gênero Erianthus apresentaram coeficiente de parentesco de 0,25 com algumas variedades presentes no banco.
Apoio financeiro: Ridesa/UFG, Capes.
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Variabilidade alélica de populações de soja
contrastantes para conteúdo de óleo
Stabellini, NS1; Priolli, RHG1; Santos, FRC2; Zucchi, MI2; Pinheiro, JB1; Vello, NA1
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
Agência Paulista de Tecnologia do Agronegócio
[email protected]
1
2
Palavras-chave: oleaginosas, microssatélites, marcadores moleculares, caracteres fenotípicos, ácido oléico.
A soja tem sido a melhor alternativa dentre as demais oleaginosas para a produção e extração de óleo vegetal, pois
é cultivada em uma ampla área, possui ciclo curto e tem uma ampla rede de indústria de esmagamento e produção
de óleo disponível pelo país. Pesquisas que proporcionem informações sobre linhagens de soja promissoras
tornam-se, nesse aspecto, informações fundamentais para o melhoramento que vise o aumento da quantidade e
qualidade de seu óleo. O presente trabalho teve por objetivo estimar a diversidade de um conjunto de 94 acessos ou
linhagens de soja plantadas no campo experimental da ESALQ/USP por meio de locos microssatélites e caracteres
fenotípicos. Os acessos foram previamente selecionados pela divergência do conteúdo de óleo em suas sementes,
sendo classificadas como alto óleo (acima de 22%) e baixo óleo (abaixo de 17%) com base em informações do
website da USDA GRIN. A análise multivariada e de agrupamento de 14 caracteres fenotípicos resultou em 29
grupos, com o maior contendo 22 dos acessos e 13 deles, um só acesso. Os caracteres massa de cem sementes,
número de dias de florescimento e valor agronômico representaram 71,36% da variabilidade acumulada, sendo
que os teores de óleo total e ácido oléico apenas 3%. Em relação aos marcadores moleculares, todos os locos
foram polimórficos e entre as populações consideradas, a maior média foi de 7,50, detectado na população baixo
óleo contra 6,42 na população alto óleo. A média de diversidade genética de maior valor, 0,716, foi observada
também na população de baixo óleo, variando de 0,344 (Satt230) a 0,888 (Satt226), ao passo que na população
alto óleo, foi 0,630, variando de 0,251 (Satt063) a 0,842 (Satt226). O teste exato para diferenciação gênica entre as
duas populações indicou que a distribuição alélica de todos os locos não foi idêntica em todas as populações.
A alta variabilidade apresentada aliada ao polimorfismo molecular sugeriu boas perspectivas de estudos de
associação destes acessos a marcadores microssatélites em um programa que vise o conteúdo de óleo em soja.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Genotipagem molecular para caracterização de
linhagens de milho
Abreu, CS1; Santos, FAD1; Pena, GC1; Parentoni, SN2; Guimarães, PEO2, Pacheco, CAP2, Guimarães, LJM2;
Guimarães, CT2; Jardim-Belicuas, SN2
UNIFEMM, Av. Marechal Castelo Branco, 2765, Sete Lagoas – MG
Embrapa Milho e Sorgo, CP 151, CEP 35701-970, Sete Lagoas – MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: milho, microssatélites, multiplex, linhagem elite, diversidade.
Introdução: O avanço genético de espécies cultivadas como o milho é alcançado por meio do melhoramento
genético onde características desejáveis e herdáveis são selecionadas e devidamente combinadas. A base do
melhoramento é a variabilidade genética, que precisa ser caracterizada e organizada dentro do germoplasma
elite de forma a gerar combinações híbridas interessantes. O uso de técnicas moleculares para a caracterização
de cultivares vem sendo fortalecido em função do alto grau de precisão que pode ser obtido pela genotipagem
molecular. A genotipagem molecular permite a diferenciação inequívoca entre genótipos, o que possibilita a
análise da distância genética entre cultivares em um tempo mais curto, favorecendo o programa de melhoramento.
Os marcadores moleculares microssatélites, já descritos em milho são bastante polimórficos, e possuem grande
potencial de utilização em estudos genéticos. Objetivos: Avaliar a diversidade genética entre linhagens elite de
milho do programa de melhoramento da Embrapa Milho e Sorgo utilizando marcadores microssatélite SSR e
obter um perfil genético detalhado das mesmas para fins de proteção de cultivares. Métodos: A partir do DNA
genômico de 100 linhagens elite foi realizada a genotipagem com 21 marcadores microssatélites fluorescentes
em reações multiplex, no aparelho ABI377. A variação genética de cada loco foi medida em termos do número de
alelos por loco e conteúdo de informação polimórfica (PIC). As estimativas da similaridade genética entre cada
par de genótipos foram calculadas empregando-se o coeficiente de Jaccard. A análise de diversidade foi realizada
com o complemento do índice de similaridade entre cada par de linhagens, utilizando o método hierárquico
UPGMA (Unweight Pair-Group Method Arithmetic Average). Resultados: Os 21 locos SSR avaliados em milho
foram polimórficos nas linhagens estudadas, amplificando um total de 370 alelos. O número de alelos por loco
variou de oito (umc1771) a 36 (bnlg1006), indicando ampla diversidade genética entre os genótipos avaliados. Os
valores de PIC para os 21 locos SSR de milho variaram de 0,65 (bnlg589) a 0,96 (bnlg1006). A partir da análise de
agrupamento foi gerado um dendrograma que mostrou o alto grau de diversidade entre os materiais avaliados,
informação útil ao programa de melhoramento em algumas de suas etapas, como na alocação de genótipos
em grupos heteróticos e na seleção de genitores com maior nível de divergência genética para a geração de
híbridos. Conclusões: Os marcadores SSR foram eficientes na caracterização das linhagens de milho podendo
ser utilizados como descritores moleculares nos processos de proteção de cultivares e na avaliação da pureza
genética. Observou-se a existência de uma grande diversidade genética no germoplasma elite do programa de
melhoramento da Embrapa Milho e Sorgo, que pode ser explorada visando à obtenção de cruzamentos superiores.
Apoio Financeiro: Fapemig, Embrapa CNPMS.
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Introgressão assistida por marcadores moleculares
para a resistência ao mosaico comum em milho
Santos, FAD1; Pena, GC1; Abreu, CS1; Lana, UGP2; Sabato, EO2; Guimarães, PEO2; Pacheco, CAP2; Guimarães, LJM2; Parentoni, SN2; Guimarães, CT2; Souza, IRP2; Jardim-Belicuas, SN2
UNIFEMM, Av. Marechal Castelo Branco, 2765, Sete Lagoas – MG
Embrapa Milho e Sorgo, CP151, CEP 35701-970, Sete Lagoas – MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: milho, mosaico, resistência a doenças, mapeamento de QTL, marcador molecular.
Introdução: O milho é atualmente o cereal de maior importância econômica no mundo, sendo cultivado para a
alimentação humana e animal, e para a produção de biocombustível. A crescente demanda mundial por milho coloca
o Brasil em situação privilegiada uma vez que é um país com forte vocação agrícola. Dentre os fatores que afetam
a produtividade dessa cultura encontra-se a suscetibilidade a doenças, com destaque para o mosaico comum, no
Brasil causado por espécies do vírus do mosaico da cana-de-açúcar (Sugarcane mosaic virus, SCMV). Os sintomas
típicos manifestam-se pela presença, nas folhas, de manchas verdes entremeadas por manchas amareladas, em
padrão de mosaico. Por ser a transmissão do vírus não persistente por vetores afídeos, o controle da doença é
ineficiente por meios químicos e a utilização de cultivares resistentes tem se mostrado como alternativa eficiente
no controle da doença, evitando assim as perdas na produção. Objetivos: Validar a seleção assistida por marcadores
para a resistência ao mosaico em milho por meio da introgressão da característica em uma linhagem susceptível
a partir de retrocruzamento com uma linhagem resistente. Métodos: Marcadores microssatélites detectados
na região do bin 3.04, associados com a resistência ao mosaico na literatura foram empregados na avaliação
de uma população de retrocruzamento (RC3F1 L18 x L19). Cento e cinquenta progênies desta população foram
inoculadas artificialmente em campo. O escore da resistência foi obtido pela fórmula: R score = (número de plantas
resistentes/ número total de plantas por fileira) x 100. Resultados: Foram avaliados 10 marcadores microssatélites
na região do bin 3.04 do genoma de milho. Com o auxílio do programa GGT foram identificados alelos de três
marcadores microssatélites no bin 3.04 que co-segregaram com a resistência ao mosaico na população RC3F1 L18
x L19. Esses marcadores poderão ser empregados para a introgressão da característica em outros materiais do
programa de melhorament da Embrapa Milho e Sorgo. Conclusões: Foram identificados três locos que co-segregam
com a resistência ao mosaico comum em milho no bin 3.04 e estes marcadores poderão ser empregados em um
programa de seleção assistida por marcadores por meio de introgressões a partir do material fonte da resistência.
Apoio Financeiro: Fapemig, Embrapa.
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Mapeamento de QTLs e estudo da interação entre
QTLs, locais e cortes em cana-de-açúcar, usando a
abordagem de modelos mistos
Pastina, MM1; Malosetti, M4; Gazaffi, R1; Mollinari, M1; Margarido, GRA1; Oliveira, KM2; Souza, AP3; Garcia,
AAF1; van Eeuwijk, FA4
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, SP, Brazil
Centro de Tecnologia Canavieira – CTC, Piracicaba, SP, Brazil
3
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – CEBMEG, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
4
Biometris, Wageningen University, Wageningen, The Netherlands
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Poliplóides; Progênie de irmãos completos;Mapa genético integrado; Análise multiponto; Mapeamento por intervalo; QTL × E
Os programas de melhoramento da cana-de-açúcar demandam aproximadamente 12 anos para a obtenção de
um novo cultivar. Assim, os marcadores moleculares podem ser usados como uma ferramenta valiosa, uma vez
que possibilitam o estudo da arquitetura genética de caracteres quantitativos, ajudando a reduzir este tempo.
Embora a cana-de-açúcar seja uma cultura perene, para a qual o desempenho genotípico é avaliado através de
ensaios estabelecidos ao longo de diferentes locais e cortes, a maior parte dos estudos de mapeamento de QTLs
ignora a existência de interação entre QTLs, corte e local (QTL × H × L). Neste contexto, o presente trabalho
apresenta uma estratégia que foi desenvolvida para a detecção de QTLs em cana-de-açúcar, com base em modelos
mistos e mapeamento por intervalo, considerando diferentes estruturas de (co)variância que permitem supor
heterogeneidade de variâncias genéticas e existência de correlações genéticas entre cortes e locais. A metodologia
de modelos mistos foi aplicada aos dados de uma população segregante obtida a partir do cruzamento entre dois
cultivares pré-comerciais de cana-de-açúcar, constituída por 100 indivíduos avaliados em dois locais (Piracicaba
e Jaú, SP, Brasil) e em três cortes para produção (toneladas de cana por hectare, TCH), produção de açúcar
(toneladas de Pol por hectare, TPH), porcentagem de fibra e Pol (teor de sacarose). A análise fenotípica resultou
na seleção do modelo não-estruturado, que assume heterogeneidade de variâncias e existência de correlação
genética específica para cada combinação de corte e local, para todos os caracteres avaliados. Na análise de
mapeamento, foram detectados 50 QTLs, incluindo 14 QTLs para TCH, 15 para TSH, 10 para Pol e 11 para Fibra.
Além disso, os resultados mostram que os efeitos das interações entre QTL e corte (QTL × H), QTL e local (QTL
× L) e QTL, corte e local (QTL × H × L) foram importantes para todos os caracteres avaliados. Do total de QTLs
identificados, 33 (66 %) apresentaram algum tipo de interação e apenas 17 (34 %) mostraram mesmo efeito entre as
diferentes combinações de corte e local. Estes resultados fornecem informações importantes para o entendimento
da base genética de caracteres quantitativos relacionados com produção e teor de sacarose em cana-de-açúcar.
Apoio financeiro: CNPq
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Identificação e mapeamento de QTL para a resistência
ao míldio em milho
Pena, GC1; Santos, FAD1; Abreu, CS1; Souza, IRP2; Costa, RV2; Cota, LV2; Parentoni, SN2; Lana, UGP2;
Jardim-Belicuas, SN2
UNIFEMM, Av. Marechal Castelo Branco, 2765, Sete Lagoas – MG
Embrapa Milho e Sorgo, CP151, CEP 35701-970, Sete Lagoas – MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: milho, míldio, resistência a doenças, mapeamento de QTL.
Introdução: Uma das doenças mais severas que acometem o milho é o míldio, causado pelo oomiceto
Peronosclerospora sorghi (Weston e Uppal) CG Shaw. Inicialmente observado no Brasil no início da década de 70,
tem sido problema na cultura de milho principalmente nos três estados da região sul do Brasil. É uma doença
de grande potencial destrutivo pois causa esterilidade quando as plantas são infectadas nos primeiros estádios
de desenvolvimento, acarretando perda total na produção. Plantas sistematicamente atacadas apresentam-se
cloróticas e ocasionalmente exibem folhas com estrias e faixas brancas mais estreitas e eretas em relação às plantas
sadias. Dentre as estratégias de manejo de doenças o uso de resistência genética é considerada a mais eficiente. A
herança da resistência ao míldio em milho é descrita como uma característica quantitativa controlada por poucos
genes, e já foram descritos QTL para essa característica nos cromossomos 1, 2, 3, 6, 7, 9 e 10 de milho. Marcadores
moleculares fortemente ligados aos locos de resistência podem diminuir a necessidade das avaliações fenotípicas
para identificar e selecionar plantas resistentes, o que contribuiria para aumentar a eficiência de um programa
de melhoramento genético. Objetivos: Identificar e mapear QTL de resistência ao míldio em milho para posterior
emprego em um programa de seleção assistida por marcadores. Métodos: O mapeamento de QTL para a resistência
ao míldio foi realizado pela metodologia de intervalo composto implementada pelo programa QTL Cartographer, a
partir de dados obtidos da população segregante F2:3 L18 x L19. A avaliação da resistência ao míldio desta população
foi realizada por meio de inoculação natural na Estação Experimental da Embrapa Milho e Sorgo em Sete Lagoas,
MG em novembro de 2009. O escore da resistência foi obtido pela fórmula: R score = (número de plantas resistentes/
número total de plantas por fileira) x 100. Um total de 500 marcadores microssatélites foram avaliados entre as
linhagens parentais e o híbrido F1 para a identificação de polimorfismos, sendo posteriormente aplicados na
população de mapeamento. Resultados: Pelo método de mapeamento por intervalo composto foram identificados
dois QTL para resistência ao míldio na população F2:3 L18 x L19, um no cromossomo 8 e outro no cromossomo 9 com
base no índice fenotípico R score. Juntos estes QTL explicam mais de 24% da variância fenotípica, sugerindo que eles
podem ser considerados alvos para estudos mais detalhados. Com a disponibilidade crescente de informações sobre
o genoma do milho, em um futuro próximo, será possível identificar quais os genes destas regiões estão associados
com QTL e assim ter uma melhor compreensão da base genética dessa característica. Conclusões: A resistência
ao míldio apresentou variabilidade significativa na população de mapeamento, além de distribuição normal e
alta herdabilidade, confirmando que essa característica em milho possui herança quantitativa. Foram mapeados
dois QTL de resistência ao míldio nesta população explicando 24% da variância fenotípica da característica.
Apoio Financeiro: Fapemig, Embrapa CNPMS.
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Caracterização de genótipos de soja para podridão
vermelha das raízes
Oliveira, IJ1; Leopoldino, BM1; Spagnol, N2; Priolli, RHG1,2; Vello, NA1
Setor de Genética Aplicada às Espécies Autógamas, ESALQ, Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Piracicaba – SP
Laboratório de Diversidade Genética e Melhoramento, ESALQ, Departamento de Genética, Universidade de São Paulo, Piracicaba – SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: marcadores moleculares, Fusarium solani f.sp. glycines, seleção assistida, microssatélites, podridão vermelhas das raízes
A demanda por óleos vegetais tem sido promissora nos últimos anos principalmente para a utilização como
fonte de energia renovável na forma de biodiesel. Somando-se a isso, a podridão vermelha das raízes da soja
(PVR), causada pelo fungo Fusarium solani f.sp. glycines, tornou-se uma doença preocupante para os sojicultores,
técnicos e pesquisadores, sendo uma estratégia recomendada a adoção de um sistema de controle integrado em
que a utilização de cultivares resistentes torna-se um componente indispensável. Diante disto, o objetivo desse
trabalho foi caracterizar por meio de marcadores microssatélites 14 genótipos de soja sendo sete escolhidos
pela resistência a PVR e os outros sete pelo alto teor de óleo. Sementes de cada acesso foram semeadas em casa
de vegetação até o estágio V4 em que foram coletadas folhas jovens. A extração de DNA foi realizada a partir
de folhas liofilizadas do bulk de dez indivíduos segundo o protocolo CTAB modificado. Sete locos SSR (Satt
038, Satt 307, Satt 309, Satt 239, Satt 387, Satt 226 e Satt 166) associados à resistência a PVR foram selecionados
segundo o website da soja. As amplificações foram realizadas em programa touchdown adicionando-se 30ng
do DNA, 0,16 μM do primer F, 0,20 uM do R, 0,13 uM do primer M13 (IRDye 700 ou IRDye 800), 250 μM de
cada desoxirribonucleosídeo trifosfato (dNTP), 0,2 uM de BSA, 1X solução tampão de PCR, 2,0 mM de MgCl2 e
uma unidade da enzima Taq DNA-polimerase em um volume total de 20 uL. Os produtos de amplificação foram
separados sob condições desnaturantes em seqüenciador automático 4300 DNA Analyser (Li-cor Corporate) e por
meio de programas computacionais específicos (SAGA Lite e SAGA MX Generation) os locos foram retidos para
a realização de análises. Em média, 4,47 alelos foram encontrados por loco em um total de 31 alelos observados
e um coeficiente de diversidade genética de 0,621 ± 0,05. A análise Bayesiana sobre a estrutura do grupo de
genitores indicou a subdivisão deste em dois grupos, um com 11 genótipos (USP 14-10-38, USP 14-01-20, USP
14-07-05, USP 14-13-16, PI 520.733, M-SOY 8001, USP 70.006, USP 70.057, USP 70.004, USP 70.080 e USP 70.123)
e outro com 3 dos genótipos (IAC 100, USP 70.109 e A 7002). O grupo maior reuniu quase todas as linhagens
separadas pela resistência a PVR (exceto IAC100), além de cinco das linhagens separadas pelo alto conteúdo
de óleo, fato que não as excluem também de apresentar a característica de resistência. Os resultados obtidos
sugeriram que os marcadores microssatélites foram eficientes na caracterização de genótipos associados PVR e
podem constituir eficientes ferramentas para a seleção assistida desse caráter, ademais, os genótipos associados
a PVR podem vir a ser genitores num programa de melhoramento genético para resistência a essa doença.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq.o: FAPERGS, CNPq e UNIPAMPA.
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201
A four-species consensus linkage map for Eucalyptus
based on a large set of genomic and EST-derived
microsatellites
Faria, DA1; Mamani, EMC1; Sena, JS 1; Alves, AA 1; Falcão, CL1; Lourenço, RT1; Pappas, GJJr2; Grattapaglia, D2
Laboratório de Genética Vegetal - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
[email protected]
1
Keywords: EST-SSR, gene mapping, consensus map
Improved marker density, throughput and transferability across species are key aspects to increase resolution and
speed for a variety of genomic applications in Eucalyptus. By tagging gene sequences, microsatellites developed
from ESTs (Expressed Sequence Tags), may represent functional molecular markers and aid in identification of
associations of specific genes with important traits. Furthermore EST-SSRs are more conserved than randomly
sampled microsatellites, and thus more transferable between species. Finally, dense microsatellite genetic map
provides a solid framework upon which thousands of higher throughput markers such as Single Nucleotide
Polymorphisms (SNPs) and Diversity Array Technology (DArT) markers can be placed. This work reports the
development of a large set of novel EST-SSRs for Eucalyptus. These markers were characterized for genetic
information content in population samples of the two most important species (E. globulus and E. grandis) and used
to build consensus map involving tree different pedigrees and four species of the genus. A total of 22,298 unigenes
were mined for microsatellite discovery using MREPS software. After SSRs identification, primers pairs were
designed and screened for robust amplicon generation, transferability and polymorphism. Selected microsatellites
were mapped on two unrelated pedigrees and used to construct a consensus map using Joinmap. Capillary
electrophoresis and fluorescent detection was carried out on a ABI3100XL. Characterization of information
content parameters in E. grandis and E. globulus was carried out using Cervus and GenAlex 6.2. A total of 1,765
perfect microsatellites were detected in 22,298 unigenes, and for 1,261 of them primer pairs could be designed.
Identified microsatellites were mostly di- and tri-nucleotide repeats, with repeat motifs AG and CGG the most
abundant. A consensus linkage map was constructed by integrating 142 newly developed EST-SSR markers with
316 previously developed microsatellites. A medium density map with 458 microsatellites was obtained covering
1,505 cM on eleven linkage groups. The linkage group with the largest number of markers had 70 markers and
the smallest had 27. The Polymorphism information content (PIC) for a set of 180 characterized markers ranged
from 0.062 to 0.907, with an average of 0.560 for E. grandis and 0.059 to 0.891 with average of 0.556 for E. globulus. A
similar average number of alleles at these microsatellite markers was found for E. grandis (4.63) and for E. globulus
(4.86). Conclusions: This report describes the development of a novel set of EST-SSRs and the construction of
a consensus linkage map involving four different Eucalyptus species. The generalized use of increasingly larger
sets of interspecific transferable markers and consensus mapping information will allow faster and more detailed
investigations of QTL synteny among species, validation of expression-QTL across variable genetic backgrounds
and positioning of a growing number of candidate genes to be tested in association mapping experiments.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, MCT
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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202
Mapeamento de locos de resistência à antracnose em
feijoeiro
Rubiano, LB1; Baroni, RM1; Oblessuc, PR1,2,3; Silva, GMB1; Sforça, DA2,3; Campos, T2,3; Chioratto, AF1; Garcia, AAF4; Souza, AP3,5; Carbonell, SAM1.
Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Recursos Genéticos Vegetais, Fazenda Santa Elisa, Instituto Agronômico (IAC)
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
3
Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes - Instituto de Biologia (IB), UNICAMP
4
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ), Universidade de São Paulo (USP)
5
Departamento de Biologia Vegetal - Instituto de Biologia (IB), UNICAMP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Phaseolus vulgaris L., microssatélites, mapeamento genético, Colletotrichum lindemuthianum e QTL.
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) é de grande importância sócio-econômica. Por isso, busca-se agregar
características de resistência às doenças e produtividade. A antracnose é umas das mais importantes doenças do
feijoeiro, causando grandes perdas na produção em todo o mundo, principalmente no Brasil, devido a sua ocorrência
nas três épocas de cultivo. Neste contexto, o presente projeto teve por objetivo saturar o mapa genético ‘IAC-UNA’
/ ‘CAL 143’ (UC) e mapear locos de resistência à antracnose. O mapa genético UC foi primeiramente construído
final de 2008 com 198 microssatélites ligados usando LOD mínimo de 3,0 e fração de recombinação máxima de
0,40. Com esse trabalho, 46 novos microssatélites foram integrados ao mapa UC que agora tem um total de 244
SSR. O comprimento total de mapa passou de 1864,2cM para 2098,4cM distribuídos em onze grupos de ligação.
Entretanto, a distância entre os marcadores diminuiu de 9,4cM para 8,6cM. A fenotipagem foi feita usando dados
das raças 04, 38, 55 e 2041 do fungo causador da antracnose, C. lindemuthianum Sacc & Magnus. A avaliação da
severidade foi efetuada entre 7 a 10 dias após a inoculação, pela escala de notas do CIAT (Cali, Colômbia). A análise
de mapeamento foi feita pelo método de Mapeamento por Intervalo Composto (CIM). Ao todo, vinte e três locos
ligados à resistência à antracnose foram identificados. Para a raça 04, foram localizados sete QTL sendo, um em cada
um dos grupos de ligação (GL) B1, B2, B4, dois no B7, um no B8a e um no B9. Quatro QTL foram identificados para
a raça 38, distribuídos nos grupos B2, B7 (dois) e B9. Nos GL B1, B2, B3, B5, B6 e B7 (dois) foram identificados sete
QTL para a raça 55. Para a raça 2041, cinco QTL foram posicionados nos grupos B1 (dois), B5, B6 e B9. Os resultados
obtidos neste trabalho apontam para o controle de vários genes na resistência à antracnose, revelando QTL de
menor efeito, porém fortemente envolvidos na expressão do fenótipo de resistência. Estudos de identificação de
genes de resistência são muito importantes no melhoramento de plantas, especialmente para o feijão comum, onde
a doença contribui para grandes perdas de produtividade. Tendo sido identificação de marcadores microssatélites
ligados a locos de resistência à antracnose, essas informações poderão ser usadas no programa de melhoramento
do feijoeiro na seleção de genótipos elites e na introgressão de resistência em cultivares de alta produtividade.
Apoio financeiro: FAPESP
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203
Novas fontes de resistência à antracnose provenientes
do banco de germoplasma do feijoeiro da UFLA
Abreu, MJ de1; Costa, LC1; Ramalho, MAP1; Souza, EA1; Ishikawa, FH1
Laboratório de Resistência de Plantas a Doenças, Setor de Genética e Melhoramento de Plantas, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras , Cx. P. 3037, CEP 37200-000, Lavras – MG
[email protected]
1
Palavras-chave: melhoramento vegetal, variabilidade genética, Colletotrichum lindemuthianum,germoplasma., Phaseolus vulgaris.
Introdução: Os programas de melhoramento de plantas apresentam algumas centenas de acessos em seus bancos
de germoplasma. Esses são oriundos de coletas realizadas em regiões produtoras e também linhagens/ cultivares
desenvolvidas pelos programas de melhoramento. Portanto, essas linhagens apresentam melhor adaptação
que o germoplasma introduzido, além de possuírem alelos de resistência aos patógenos prevalecentes no país.
Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro, uma das principais doenças desta
cultura. Esse patógeno se caracteriza pela alta variabilidade genética e patogênica. Estudos de levantamento de raças
no Brasil vêm demonstrando a ocorrência das raças 65, 73, 81 e 89. Objetivo: Identificar no banco de germoplasma
da UFLA, linhagens de feijão que possuam resistência as principais raças que ocorrem no Brasil, para a utilização no
melhoramento genético visando resistência à antracnose. Materiais e Métodos: Foram inoculados quatro isolados
das raças 65, 73, 81 e 89 na concentração de 1,2 x 106 conídio. ml-1 em 92 linhagens de feijoeiro. Foram semeadas
oito sementes de cada linhagem em bandejas de isopor de 128 células, sendo utilizadas duas repetições (bandejas)
por isolado. As cultivares Pérola, Talismã e Ouro Negro foram utilizadas como testemunhas. Resultados: Das 92
linhagens avaliadas, 35,8% foram resistentes as quatro raças inoculadas. Quando analisado para cada tipo de grão,
das 36 linhagens com grão tipo carioca, 52,7% foram totalmente resistentes. Já para as linhagens que possuem grão
tipo preto (43), 30,2% foram resistentes. Das doze linhagens que possuem grão tipo jalo apenas uma apresentouse resistente a todas as raças. A linhagem Ouro também se demonstrou totalmente resistente. Conclusão: A
identificação dessas linhagens com bom nível de resistência às principais raças de Colletotrichum lindemuthianum
que ocorrem no país permitirá sua utilização direta nos programas de melhoramento visando resistência, uma
vez que são linhagens mais adaptadas e podem acelerar o processo de obtenção de novas cultivares melhoradas.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPEMIG
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Desenvolvimento de protocolo para reação de PCR
duplex na detecção dos virus citrus sudden death
associated virus (CSDaV) e citrus tristeza virus (CTV)
Toloy, RS1; Nagata, T2; Wulff, NA1
Departamento Científico, Fundo de Defesa da Citricultura - Fundecitrus, Araraquara, SP
Departamento de Biologia Celular, Universidade de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: porta enxerto, morte súbita dos citros.
A Morte Súbita dos Citrus (MSC) é uma doença de combinação copa/porta enxerto afetando laranjeiras doces e
algumas tangerineiras enxertadas sobre limoeiro cravo e limoeiro volkameriano. O relato da ocorrência de plantas
com sintomas relacionados a MSC ocorreu no final da década de 1990. A MSC causa a morte de plantas cítricas da
combinação suscetível, sendo desconhecido o vetor e o agente causal. Desta forma, os postulados de Koch não foram
cumpridos. Atualmente a MSC afeta 34 municípios das Regiões Norte e Noroeste do estado de São Paulo e Sul do
estado de Minas Gerais. Como não sabemos qual o agente causal, a MSC é diagnosticada através do amarelecimento
e espessamento na região interna da casca do porta-enxerto, juntamente com o aspecto pálido das folhas. O CTV
é um vírus onipresente na citricultura brasileira e pode ser encontrado em praticamente todas as plantas cítricas.
Em 2005 foi relatada a associação de um novo marafivírus nas plantas sintomáticas, denominado de Citrus Sudden
Death associated Vírus (CSDaV). A detecção de ambos os vírus através de RT-PCR (reverse transcribed PCR) é
uma necessidade nos trabalhos de transmissão do agente etiológico da MSC. O desenvolvimento de uma reação
de PCR duplex aumenta a rapidez na detecção dos vírus, desta forma diminuindo a demanda de tempo e o custo
da análise. A extração de RNA total das amostras vegetais de pomares comerciais, plantas de experimentos e
insetos foram realizadas com Trizol LS e posteriormente feita a síntese de cDNA com a enzima Improm II. A
reação de PCR duplex é obtida com a utilização dos primers Esp C1 for/Geno rev para CSDaV e CN119/CN120
para CTV, empregando a DNA polimerase Phire. A especificidade dos primers foi testada com o seqüenciamento
dos produtos da PCR: com os primers CN119 e CN120 para CTV, obteve-se uma similaridade de 97 % com o gene
p25, que codifica a proteína da capa protéica. O produto dos primers Esp C1 for/ Geno rev obteve uma similaridade
de 96% com o gene codificador da poliproteina do CSDaV (YP_224292.1) Este protocolo foi aplicado em amostras
de transmissão de CTV e CSDaV por afideos, em plantas sintomaticas e assintomáticas, em plantas tolerantes, de
regiões endêmicas ou livres de MSC. O protocolo duplex é específico aos alvos CTV e CSDaV, sendo uma importante
ferramenta na detecção dos vírus associados a MSC, tendo como vantagem a rapidez e eficiência do resultado.
Apoio Financeiro: Fundecitrus
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205
Otimização e caracterização de marcadores AFLPs EM
feijão comum (Phaseolus Vulgaris L.)
Silva, GMB; Cardoso, JMK; Rubiano, LB
Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Recursos Genéticos Vegetais, IAC, Campinas
[email protected]
Palavras-chave: Phaseolus vulgar, marcador molecular, mapeamento genético, antracnose, mancha angular.
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L) é uma leguminosa diplóide (2n=2x=22) de grande importância para o
consumo humano direto, uma vez que fornece ricas quantidades de proteínas, ferro, cálcio, vitaminas do complexo
B, lisina, fibras e carboidratos. O conhecimento genético dessa leguminosa tem contribuído significativamente
para o desenvolvimento de cultivares resistentes a fatores bióticos e abióticos. Os marcadores AFLPs apresentam
polimorfismos baseados na distribuição dos sítios de restrição e na amplificação diferencial de fragmentos. O presente
trabalho teve como objetivo utilizar a técnica de AFLPs para genotipar a população de mapeamento UC (IAC-UNA x
CAL143, RIL), já anteriormente mapeada com microssatélites, visando saturar o mapa genético e refinar a localização
de locos de resistência à antracnose e mancha-angular, duas importantes doenças que atacam o feijoeiro. O DNA dos
dois genitores e de quatro linhagens F12 foi digerido utilizando-se duas enzimas de restrição, uma de corte freqüente
(MseI) e uma de corte raro (EcoRI). O produto da digestão foi observado em gel de agarose 1%, seguido da ligação
dos adaptadores à 16ºC por 16h. A pré-amplificação e as amplificações seletivas foram realizadas a fim de testar 18
combinações de primers, os quais foram visualizados em gel de poliacrilamida 7%, corado com nitrato de prata. Do
total de combinações testadas, 12 amplificaram e exibiram alto grau de polimorfismo, contendo em média 250 locos
polimórficos. Outras combinações ainda serão testadas e as melhores serão utilizadas. O polimorfismo encontrado
demonstra a viabilidade do uso de AFLPs na saturação do mapa genético UC, o que certamente trará grande
contribuição para o mapeamento de características agronômicas de interesse para o melhoramento do feijoeiro.
Apoio financeiro: CAPES e FAPESP
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206
Identification and expression analysis of genes
associated with the early berry development in the
seedless grapevine (Vitis vinifera L.) cultivar Sultanine
Costenaro-da-Silva, D1,2; Passaia, G1,2; Henriques, JAP1; Margis, R1; Pasquali, G1; Revers, LF2
PPG Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, P.O. Box 15.005, CEP 91.501970, Porto Alegre, RS, Brazil
2
Laboratório de Biologia Molecular Vegetal, Embrapa Uva e Vinho, Rua Livramento, 515, P.O. Box 130, CEP 95700-000, Bento Gonçalves,
RS, Brazil
[email protected]
1
Keywords: Berry development; Gene expression; Grapevine; RDA; Real-time PCR; Vitis vinifera
Sultanine grapevine (Vitis vinifera L.) is one of the most important commercial seedless table-grape varieties and
the main source of seedlessness for breeding programs around the world. Despite its commercial relevance, little
is known about the genetic control of seedlessness in grapes, remaining unknown the molecular identity of genes
responsible for such phenotype. Actually, studies concerning berry development in seedless grapes are scarce at the
molecular level. We therefore developed a Representational Difference Analysis (RDA) modified method named Bulk
Representational Analysis of Transcripts (BRAT) in the attempt to identify genes specifically associated with each of
the main developmental stages of Sultanine grapevine berries. A total of 2,400 transcript-derived fragments (TDFs)
were identified and cloned by RDA according to three specific developmental berry stages. After sequencing and in
silico analysis, 1,554 (64.75%) TDFs were validated according to our sequence quality cut-off. The assembly of these
expressed sequence tags (ESTs) yielded 504 singletons and 77 clusters, with an overall EST redundancy of approximately
67%. Amongst all stage-specific cDNAs, nine candidate genes were selected and, along with two reference-genes,
submitted to a deeper analysis of their temporal expression profiles by reverse transcription-quantitative PCR. Seven
out of nine genes proved to be in agreement with the stage-specific expression that allowed their isolation by RDA.
Financial Support: CAPES, CNPq & FAPERGS
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207
QTL mapping in sugarcane using composite interval
mapping considering an integrated genetic map
Gazaffi, R1; Margarido, GRA1; Mollinari, M1; Pastina, MM1; Oliveira, KM2; Souza, AP3; Garcia, AAF1
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, USP, Brazil
Centro de Tecnologia Canavieira - CTC, Brazil; 3Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, UNICAMP, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: Outbred; Single dose markers; Segregation patterns; Multipoint probabilities; Collinearity
Sugarcane (Saccharum spp) has a very complex genome due to its high ploidy level and also aneuploidy, which
complicates QTL mapping. A widely used approach is to obtain genetic maps considering molecular markers
that segregates in a single dose (1:1 fashion), using methodologies proposed initially for diploid species. There are
methods that propose to obtain genetic maps with molecular markers that segregates in different patterns (e.g. 1:1
and 3:1 fashion) through multipoint approach. However, QTL mapping methods are still scarce, under this scenario.
In this study, we develop a QTL mapping approach for full-sib family based on Composite Interval Mapping on a
integrated genetic map. Assuming four differents genotypes in the progeny, the model were considered under three
orthogonal contrasts to estimate additive (one in each parental) and dominance effects for the alleles in the QTL.
Cofactors are also included in the model to control the variation caused by QTL located outside the mapping
interval, increasing the statistical power. However, it is not always possible to use the model with three genetic effects
due to lack of informativeness to estimate independently four genotype classes, by collinearity problems on the
multipoint probabilities. In this case, the model was adapted for those situations and applied in a sugarcane full-sib
family data. That populations has 100 individuals and it was considered the following traits: TSH - tons of sugar per
hectare, TCH - tons of cane per hectare, POL, grams of sucrose per Kg per 100 g of fresh cane and Fiber content(%).
QTL mapping were performed on first year (plant cane) and second year ( first ratoon). Briefly, 39 QTL were mapped,
21 for the first year (TSH, 6; POL, 7; TCH, 5; Fiber, 3) and 18 for the second year (TSH, 4; POL, 5; TCH, 4 e Fiber, 5).
Among the QTL mapped, only one showed 1:1:1:1 fashion, three were 1:2:1, four segregated 3:1 and 31 showed 1:1
pattern. The gene action for the traits were mostly additive, but it was also observed QTL with dominance effect. In
general, the methodology was superior to the usual approaches used for QTL mapping, since QTL were detected
with higher power and several segregation patters were able to be mapped, which cannot be done in other approach.
Apoio financeiro: FAPESP
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208
Predição de ganhos genéticos utilizando índices de
seleção para teor de óleo e proteína em população F2:3
de soja
Matta, LB1,2; Pereira, PHS1,2; Lima, AM1,2; Rodrigues, JIS1,2; Arruda, KMA1,2; Good-God, PIV1; Piovesan,
ND1,2; Barros, EG1,2; Moreira, MA1,3
Instituto de Biotecnologia Aplicada a Agropecuária (BIOAGRO)
Departamento de Biologia Geral/UFV, 3Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular/UFV
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Glycine max, melhoramento, teor de proteína e óleo.
Na semente de soja os teores de proteína variam de 32 a 44% e os óleos de 17 a 24% em variedades comerciais.
A existência de uma correlação genética negativa entre teor de óleo e proteína dificulta a seleção de genótipos
de interesse para o melhoramento e torna necessário o emprego de procedimentos biométricos que permitam
minimizar os efeitos antagônicos desta correlação. Para tanto, os índices de seleção podem ser utilizados para
obter ganhos favoráveis para estas características em populações segregantes de soja. Neste contexto, o presente
trabalho teve como objetivo predizer os ganhos genéticos para teor de óleo e proteína em duas população F2:3
oriundas dos cruzamentos entre UFV20 x A7002 (1) e CD219RR x Suprema (2). A determinação dos teores de óleo
e proteína foram realizadas simultaneamente em espectrômetro de infra-vermelho próximo (FT-NIR, Antaris II)
utilizando-se sementes inteiras. A partir desses dados foram estimados os valores de herdabilidade e ganho de
seleção direta para óleo e indireta para teor de proteína nas populações F2:3. A herdabilidade no sentido amplo para
os teores de proteína e óleo foram de 43,62% e 25,70% na população 1 e de 57,42% e 46,47% na população 2. Nas
populações 1 e 2 as correlações genotípicas foram de -0,52 e -0,65 e a fenotípica de -0,84 e -0,93, respectivamente. Os
ganhos de seleção direto para o teor de óleo foi 2,85% e 4,81% (µs - média dos selecionados 21,57% e 23,12%) levando
a um ganho indireto de -1,21% e -2,51% (µs 38,77% e 37,74%) para proteína nas populações 1 e 2, respectivamente.
Utilizando o índice de seleção clássico verificou-se que os ganhos obtidos para óleo e proteína foram 3,41% (µs
21,97%) e -1,68% (µs 38,56%) na população 1, e 5,23% (µs 23,04%) e -1,66% (µs 38,72%) na população 2. Com base
no índice de soma de postos ou ranks verificou-se que os ganhos obtidos para óleo e proteína foram 3,06% e
-0,33% (µs 21,71% e 39,8%) na população 1, e 5,22% e -1,61% (µs 23,04% e 38,75%) na população 2, respectivamente.
Portanto, a adoção do índice de seleção permite a obtenção de ganhos mais equilibrados para teores de óleo
e proteína. O índice baseado na soma de postos revelou-se mais adequado nas condições deste trabalho.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG e COODETEC
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209
Variação genética dos teores protéicos em sementes
de uma população natural de Caryocar brasiliense em
duas condições distintas de ocorrência
Justus, RAP1; Pereira, MC1; Apolloni, LB1; Senna, SN1; Moraes, MA1; Moraes, SMB1; Moraes, MLT1
Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: parâmetros genéticos, composição química, cerrado, variabilidade genética, conservação.
Introdução: O pequi (Caryocar brasiliense Camb.) é uma espécie arbórea nativa do cerrado brasileiro, pertencente
à família Caryocaraceae, cujos frutos são utilizados na alimentação humana e na indústria caseira para extração
de óleos e produção de licores. Assim, a composição das proteínas de reserva, nas sementes, passa a ser um
fator determinante não só para a utilização in natura como também na sobrevivência ou não dos indivíduos
descendentes de uma determinada árvore matriz; pois a quantidade e a velocidade com que as proteínas de
reserva são desdobradas podem, ou não, garantir o estabelecimento da plântula. Objetivos: Estimar a variação
genética a partir dos teores de proteínas em sementes de uma população natural de Caryocar brasiliense em duas
condições: i) sob um povoamento de eucalipto (TALHÃO) e ii) em um fragmento de cerrado, correspondente a
uma Reserva Legal (RL). Métodos: A coleta dos frutos foi feita em dezembro de 2008, nos dois locais de estudo
em que esta população ocorre (TALHÃO e RL), na região de Três Lagoas-MS. Em seguida as sementes foram
extraídas dos frutos e a partir delas foram obtidas as proteínas de reserva: albumina, globulina, prolamina e
glutelina, sendo as mesmas extraídas de acordo com sua solubilidade. Adotou-se o delineamento inteiramente
casualizado com 22 tratamentos (árvores matrizes) e 4 repetições; para cada uma das condições estudadas. Sendo
as análises dos parâmetros genéticos estimadas com o uso do programa GENES. Resultados: As estimativas
médias dos teores de proteínas, das sementes oriundas do TALHÃO e da Reserva Legal foram respectivamente:
29,4 e 23,9 mg.g-1 (albumina); 20,8 e 28,8 mg.g-1 (globulina); 2,1 e 1,7 mg.g-1 (prolamina) e 93,9 e 79,9 mg.g-1(glutelina).
O coeficiente de variação experimental variou de 9,9% (glutelina) a 10,8% (prolamina) no TALHÃO e de 11,1%
(glutelina) a 14,5% (prolamina) na Reserva Legal. Já o coeficiente de variação genética foi expressivo, encontrandose no intervalo de 22,3% (prolamina) a 26,5% (globulina) no primeiro caso e entre 21,2% (glutelina) a 29,0%
(globulina) no segundo. Por fim, a herdabilidade média foi alta; estando em ambos os casos nas proximidades
de 0,98; com exceção da prolamina da Reserva Legal cujo valor foi 0,95. A razão (CVg/CVe) foi de 3,7 (glutelina) a
6,3 (prolamina) no TALHÃO e de 2,2 (globulina) a 4,6 (glutelina) na RL. O teste-F apresentou significância, tanto
no TALHÃO como na Reserva Legal. Conclusão: Verifica-se, que esta população natural de Caryocar brasiliense
apresenta comportamento semelhante nas duas condições estudadas, ou seja, alta expressão da variação
genética para os teores de proteínas nas sementes, o que permite inferir que o plantio do eucalipto no entorno
das árvores matrizes ainda não proporcionou nenhuma alteração neste caráter nas sementes desta espécie.
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Análise e variação genética do teor de óleo em
sementes de progênies de uma população natural de
Myracrodruon urundeuva
Senna, SN1; Silva, JR1; Cornacini, MR1; Moraes, MA1; Moraes, SMB; Sebben, AM2; Moraes, MLT1
Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, SP
Instituto Florestal, São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: variabilidade genética, aroeira, teor de óleo , sementes, população natural.
Introdução: Dentre muitas espécies arbóreas destaca-se a Myracrodruon urundeuva Fr. Allem. (Anacardiaceae),
conhecida popularmente como aroeira. Em função de sua grande utilização em propriedades rurais a espécie
encontra-se em risco de extinção, sendo proibido o seu corte por lei federal. Assim, surge como opção à utilização
de outros produtos que não seja a madeira desta espécie, como é o caso do óleo contido em suas sementes. Para
tanto, se faz necessário investigar qual é a variação genética para este caráter. Objetivo: Estimar o teor e a variação
genética para o teor de óleo em progênies de uma população natural de Myracrodruon urundeuva localizada em
Aquidauana-MS, para fins de conservação e melhoramento genético. Métodos: Para atingir este objetivo utilizouse o delineamento experimental inteiramente casualizado com 30 tratamentos (árvores matrizes) e 2 repetições.
O teor de óleo foi determinado pelo método Soxhlet, utilizando como solvente o éter de petróleo. As análises
dos parâmetros genéticos foram estimadas utilizando-se do programa GENES. Resultados: A estimativa da média
do teor de óleo das sementes foi de (9,36%), e o coeficiente de variação experimental foi de (11,2%). O teste F
foi significativo a 5% de probabilidade. As estimativas do coeficiente de variação genética e da razão (CVg/CVe)
foram de 28,3% e 2,5, respectivamente, indicando que o caráter tem potencial para a seleção. O coeficiente de
herdabilidade em nível de média de progênies foi alto (0,92), sugerindo forte controle genético em nível de progênies
e a possibilidade de obterem-se ganhos genéticos consideráveis pela seleção em progênies desta população.
Conclusão: A população natural de M. urundeuva apresenta em suas progênies variação genética para o teor de óleo
em sementes, que permite a sua utilização em programas de conservação e melhoramento genético para este caráter.
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Variação genética e seleção simultânea para os
teores de proteínas de reserva em sementes de uma
população natural de Caryocar brasiliense em um
fragmento de cerrado sem perturbação antrópica
Apolloni, LB1; Justus, RAP1; Pereira, MC1; Cornacini, MR1; Silva, JR1; Moraes, SMB1; Moraes, MA1; Moraes,
MLT1
Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: índice de seleção, composição química, cerrado, pequi, proteína.
Introdução: De ocorrência comum no cerrado brasileiro, Caryocar brasiliense Camb., mais conhecido como pequi
ou piqui, pertence à família Caryocaraceae, é uma árvore frutífera de grande importância econômica para as
populações que dependem dos seus frutos, pois elas os comercializam e utilizam como fonte de alimento. O fruto
divide-se em polpa e amêndoa, na qual a última é pouco explorada e a partir dela pode-se obter a composição de
proteínas. A presença de proteínas nas sementes está relacionada à fonte de reservas e na participação de enzimas
que auxiliam na decomposição química do amido durante o crescimento do embrião na germinação, como por
exemplo, as hidrolíticas. Objetivos: Estimar a variação genética e simular a seleção simultânea para os teores das
proteínas de reserva em uma população de C. brasiliense existente em um fragmento de cerrado, sem perturbação
antrópica, na região de Três Lagoas-MS. Métodos: Utilizou-se o delineamento inteiramente casualisado com
21 tratamentos (árvores matrizes distribuídas de forma aleatória no fragmento) e 4 repetições. Os teores das
proteínas de reserva foram obtidos com base na solubilidade de cada uma: albumina (água), globulina (NaCl),
glutelina (NaOH) e prolamina (álcool etílico). As análises dos parâmetros genéticos foram estimadas utilizando-se
do programa GENES. Resultados: Os resultados evidenciaram a presença das seguintes proteínas de acordo com
seus grupos de solubilidades e de seus respectivos teores médios, em miligrama por grama de semente (mg.g -1):
albumina (23,9), globulina (28,8), glutelina (79,9) e prolamina (1,7). Os coeficientes de variação experimental e de
variação genética foram altos, pois variaram respectivamente em 11,07% (glutelina) a 14,49% (prolamina) e 21,15%
(glutelina) a 28,97% (globulina). Houve significância entre as árvores matrizes para todos os tipos de proteínas. A
seleção simultânea (28,6%) para as seis árvores matrizes (3, 12, 16, 19, 21 e 4), que apresentaram os melhores índices
proporcionou ganhos da ordem de 32,1% (glutelina), 19,9% (globulina), 4,1% (prolamina) e -15,1% (albumina).
Conclusão: A variação genética para os teores de proteínas de reserva nesta população natural de C. brasiliense
é considerável e a utilização do índice de seleção permite uma melhor combinação de ganhos para os teores
de globulina, prolamina e glutelina, mas não proporciona ganhos positivos em relação aos teores de albumina.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e UNESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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212
Variação genética em progênies de Myracrodruon
urundeuva utilizando delineamento sistemático tipo
“leque”
Moraes, MA1; Manoel, RO1; Kubota, TYK1; Silva, ECB1; Moraes, SMB1; Moraes, MLT1; Freitas, MLM2; Sebbenn, AM2
Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, SP
Instituto Florestal, São Paulo, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: espaçamentos florestais, teste de progênies, parâmetros genéticos, REML/BLUP, implantação florestal.
Introdução: A definição sobre o material genético a ser utilizado e o espaçamento inicial entre as árvores é uma
das decisões mais importantes na implantação de um reflorestamento. Essa decisão afeta os tratos culturais,
a qualidade da madeira, a colheita florestal e os custos de produção. Entretanto, os estudos de espaçamentos
florestais são caracterizados por ocuparem grande área, sendo muitas vezes, inviável. Desse modo, torna-se
importante utilizar um delineamento que permita o estudo da resposta de um grande número de progênies em
diferentes espaçamentos numa área compacta. Objetivos: Avaliar o comportamento e a variação genética para
os caracteres: altura de plantas, diâmetro médio do colo (DMC) e sobrevivência, aos 24 meses após o plantio,
submetidos a diferentes espaçamentos. Métodos: Foi instalado um teste de progênies de Myracrodruon urundeuva,
em 06/11/2006, na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão da FEIS/UNESP, localizada em Selviria-MS. Utilizouse o delineamento sistemático tipo “leque”, disposto em um sistema de 30 raios concêntricos, com uma progênie
por raio, distribuídas de forma aleatória, em ângulos de 12o. As plantas foram dispostas, nos raios, em progressão
geométrica, de razão 1,21; correspondendo a nove espaçamentos por planta: 1,95 m2; 2,86 m2; 4,18 m2; 6,12 m2;
8,96 m2; 13,12 m2; 19,21 m2; 28,13 m2 e 41,19 m2. As estimativas dos parâmetros genéticos foram obtidas a partir
do procedimento REML/BLUP (Máxima verossimilhança restrita/Melhor preditor linear não viciado), utilizandose o programa SELEGEN (Modelo 95). Resultados: A sobrevivência observada foi de 91% e a média geral para
altura de plantas foi de 3,43 m e 4,41 cm para o DMC, indicando boa adaptação da espécie na região estudada.
A acurácia estimada para a altura (0,85) e DMC (0,72) foram altas. A variação entre as progênies foi expressiva,
ficando evidente no coeficiente de variação genética para a altura (15,57%) e no DMC (10,88%). As estimativas da
herdabilidade foram de 0,73 para a altura e de 0,53 para o DMC. Houve variação entre os espaçamentos estudados.
Assim, a melhor performace das progênies, para a altura foi no espaçamento de 6,12 m2 por planta (2 x 3 m) e para
o DMC foi de 13,12 m2 por planta (3,5 x 3,5 m). Conclusões: Dessa forma, verificou-se que a variabilidade genética
presente nesta população de M. urundeuva, para os caracteres estudados é expressiva e que o delineamento
utilizado permite a escolha do espaçamento em que as progênies expressam a sua melhor performace.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e UNESP
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Resposta diferencial e herança de resistência a
Ramularia areola de cultivares do algodoeiro
Novaes, TG; Zandoná, CC1; Barbosa, J; Séleri, A; Almeida, WP; Mehta, YR
Iapar – Instituto Agronômico do Paraná, Rod. Celso Garcia Cid, Km 375, Bairro Três Marcos, CEP: 86047-902, Londrina, PR
[email protected]
Palavras-chave: Ramularia, Gossypium hirsutum.
A mancha-de-ramularia do algodoeiro causada por Ramularia areola, é uma das doenças economicamente
importantes para o Brasil. Os sintomas iniciam-se com lesões esbranquiçadas pequenas e angulares e, em fase
avançada, causa desfolhamento precoce afetando a produção do algodão. Dentre as alternativas de controle,
o uso de cultivares resistentes é o mais indicado. O objetivo deste trabalho foi testar o grau de resistência de
70 cultivares de algodoeiro à R. areola e selecionar as cultivares mais resistentes para condução de trabalhos de
herança de resistência. Doze plantas de cada cultivar foram inoculadas artificialmente em casa de vegetação
e a severidade de infecção foi avaliada 15 dias após a inoculação utilizando-se uma escala visual de área foliar
infectada. As cultivares foram agrupadas segundo a severidade de infecção através de análise estatística. O
grau de resistência das cultivares foi variável. Para verificar a herança de resistência à R. areola foram avaliadas
populações derivadas do cruzamento entre a linhagem mais resistente FMT 02102996 e uma cultivar suscetível
FMT 701. A análise de qui-quadrado da reação das populações F2 e das populações de retrocruzamento
indicou que, a herança de resistência é monogênica. Este fato pode auxiliar o planejamento dos programas de
melhoramento do algodoeiro na incorporação da resistência a R. areola em cultivares agronomicamente desejáveis.
Apoio financeiro: IAPAR
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Influência do genótipo e estádio de maturação de laranjas
sanguíneas no acúmulo de antocianinas no suco
Voigt,V1; Nascimento, LM2; Latado, RR2
Universidade Federal de São Carlos
Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: laranja, sanguínea, maturação, antocianina, incremento.
As laranjas sanguíneas são caracterizadas pela coloração vermelha intensa da polpa e do suco, devido à produção
de antocianinas, quando cultivadas em regiões de clima frio, regiões com alta amplitude térmica diária ou por
meio de armazenamento dos frutos em câmara fria após a colheita. O objetivo foi avaliar o efeito de genótipos
e de diferentes estádios de maturação de frutos, na capacidade de acúmulo de antocianinas no suco, durante o
armazenamento de frutos em baixa temperatura. Realizou-se a coleta de 70 frutos das laranjeiras Palazelli (CN44);
Moro Acireale (CN45); Moro Acireale-2 (CN46), Moro Acireale-3 (CN47); Tarroco (CN67), Malta Blood-Argentina
(CN75), Moro cv–IPEACS (CN432) e Pêra Rio (controle), em três épocas de colheita (maio, julho e setembro) do
ano de 2009. Em seguida, realizou-se o armazenamento dos frutos em câmara fria à 10oC, durante 60 dias. No dia
da colheita e a cada 15 dias foi retirada uma amostra de dez frutos de cada variedade para a quantificação de
antocianinas no suco dos frutos e para a avaliação dos parâmetros químicos teor de sólidos solúveis totais (SST),
acidez e ratio. Os dados foram analisados estatisticamente. Verificou-se que as todas as variedades de laranja
sanguínea apresentaram diferenças significativas nos parâmetros químicos de suco (SST, acidez ou ratio) entre
duas ou mais colheitas, o que demonstra que os frutos apresentavam-se em diferentes estádios de maturação.
Nas análises em cada data de colheita, pôde-se observar a existência de diferenças entre genótipos com relação
à capacidade de acumular antocianinas nos frutos durante o armazenamento no frio, com melhores resultados
para a variedade Moro cv–IPEACS (CN432), com valores entre 116,4 a 224,3 mg de antocianinas por litro de
suco, seguidas das outras Moros (CN47, 44, 46 e 45). A variedade Malta Blood-Argentina (CN75) foi a que menos
acumulou antocianinas no suco. Nas análises de cada variedade em separado, nas datas de colheita, pôde-se
verificar que, após 60 dias de armazenamento, apenas as variedades CN46, 67 e 75 apresentaram maior incremento
de antocianinas na colheita realizada em setembro, em relação a colheita realizada em maio, o que comprova a
hipótese de que frutos colhidos em estádio mais avançado de maturação conseguem acumular mais antocianinas
durante o armazenamento pós-colheita em câmara fria. Conclui-se que as variedades Moro apresentaram maior
acúmulo de antocianinas durante o armazenamento. Para algumas variedades, a colheita de frutos em estádio mais
avançado de maturação resulta no maior acúmulo de antocianinas durante o armazenamento em câmara fria.
Apoio: FAPESP
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Seleção simultânea para o teor de proteínas em uma
população natural de Caryocar brasiliense que se
encontra no interior de um povoamento de eucalipto
Pereira, MC1; Apolloni, LB1; Justus, RAP1; Cornacini, MR1; Senna, SN1; Moraes, SMB1; Moraes, MA1;
Moraes, MLT1
Laboratório de Genética de Populações e Silvicultura, Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira – UNESP, Ilha Solteira, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: pequi, índice de seleção, cerrado, proteína, parâmetros genéticos.
Introdução: Caryocar brasiliense (Caryocaraceae) é uma planta perene encontrada em todo o cerrado brasileiro,
ocorrendo, tanto em formações pioneiras como em primárias e secundárias. É considerada uma árvore frutífera com
importância relevante, pois seus frutos são utilizados na alimentação humana e na medicina popular. Objetivos:
Selecionar as melhores árvores matrizes de uma população natural de C. brasiliense, com base no teor de proteínas
das sementes, utilizando a seleção simultânea por meio do índice com base em soma de postos (ou “ranks”). Métodos:
Os teores protéicos foram obtidos a partir de sementes colhidas em janeiro de 2008, em uma população natural de
C. brasiliense localizada na região de Três Lagoas – MS. Os indivíduos desta população encontram-se no interior
de um povoamento de eucalipto, já que o corte de C. brasiliense é proibido por lei federal. Para tanto, utilizou-se
um delineamento inteiramente casualizado com 21 tratamentos (árvores matrizes) e 4 repetições. Os parâmetros
genéticos e em especial o índice baseado em soma de postos ou “ranks”, foram estimados utilizando-se do programa
GENES. As proteínas foram obtidas de acordo com a sua solubilidade, ou seja, albumina (água), globulina (NaCl),
glutelina (NaOH) e prolamina (álcool etílico). Resultados: As estimativas de médias para os teores de proteínas,
em miligrama por grama de semente, foram: albumina (29,4), globulina (20,8), glutelina (93,9) e prolamina (2,1).
O coeficiente de variação experimental variou de 9,9% (glutelina) a 10,8% (prolamina), o que dá boa precisão às
estimativas. Houve variação significativa entre as árvores matrizes, pelo teste-F, o que pode ser verificado pelos
altos coeficientes de variação genética encontrados: 22,3% (prolamina) a 26,5% (globulina). A utilização do índice
de seleção, com base na soma de postos ou ranks, para 30% das árvores matrizes analisadas, ou seja, 6 árvores (18,
6, 15, 3, 12 e 16), possibilitou ganho na seleção de 30,9% (albumina), - 20,1% (globulina), - 0,6% (prolamina) e 4,8%
(glutelina) em relação ao teor médio de proteínas contidas nas sementes. Conclusão: A população de C. brasiliense
apresenta considerável variação genética para o teor de proteínas, o que permite a sua utilização em programas de
conservação e melhoramento genético. O índice de seleção proporciona uma melhor combinação de ganhos para os
teores de albumina e glutelina, mas não possibilita ganhos positivos em relação aos teores de globulina e prolamina.
Apoio financeiro: CAPES e CNPq
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Organogênese e transformação genética de Pinhãomanso (Jatropha curcas L.)
Zakir-Pereira, ACV1; Rogalski, M1; Tanaka, SM1; Chaddad, MM1; Carrer, H1
Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Departamento de Ciências Biológicas, Av. Pádua Dias 11,
C.P. 9, 13418-900, Piracicaba, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Jatropha, cultura de tecidos, fitohormônios, transformação genética, Agrobaterium, glufosinato de amônio.
Pinhão-manso (Jatropha curcas L.) pertence à família Euphorbiacea e ocorre naturalmente na América do
sul. Esta espécie oleaginosa apresenta grande potencial para a produção de biodiesel por não competir com
oleaginosas comestíveis e se adpatar a várias condições ambientais. No entanto, o uso dessa espécie em escala
comercial depende da domesticação, caracterização de genótipos e melhoramento genético. A aplicação de
ferramentas biotecnológicas, como a técnica de cultura in vitro de tecidos, pode permitir a propagação e clonagem
massal de genótipos elite e auxiliar nas técnicas de engenharia genética visando a adição de características de
interesse (e.g. quantidade e teor de óleo, resistência a fatores bióticos e abióticos). Com isso, o objetivo deste
trabalho foi desenvolver um método eficiente de regeneração, via organogênese a partir de tecido foliar, para a
transformação genética de Pinhão-Manso via Agrobacterium. Para a organogênese, sementes de pinhão-manso
foram germinadas in vitro em meio com sais e vitaminas MS suplementado com 0,0; 1,0 e 2,0 mg.L-1 de thidiazuron
(TDZ) em combinação com 0,0 e 0,5 mg.L-1 de ácido-indol-3-butírico (AIB). Seguimentos foliares das plântulas
obtidas foram cortadas em pedaços de 5 x 5 mm e transferidas para o meio de regeneração suplementado com
2,0 mg.L-1 de TDZ e 0,5 mg.L-1 de AIB. A presença de fitorreguladores durante a germinação induziu a formação
de calos e gemas em várias regiões das plântulas. Explantes foliares provenientes de plântulas germinadas in
vitro na presença de TDZ (2,0) e AIB (0,5 mg.L-1) produziram os mais altos índices de regeneração, com uma
taxa de formação de gemas de 96,36%, de formação de brotos de 63,7% e uma média de 128 brotações por
explante responsivo. As brotações regeneradas nos diferentes tratamentos foram alongadas em meio MS líquido
suplementado de BAP (0,05 mg.L-1) e GA3 (1,0 mg.L-1). Brotações com tamanho ≥ 2 cm foram enraizadas em MS
suplementado com AIB (4,0 mg.L-1). Explantes foliares obtidos de plântulas germinadas na presença de TDZ (2,0
mg.L-1), foram submetidos a transformação genética via Agrobacterium com o vetor pKD7 que possui o gene bar
marcador seletivo. Os explantes estão sendo selecionados em presença de 1 mg.L-1 de glufosinato de amônio.
Nossos resultados, até o momento, mostram que dos 143 explantes foliares inoculados com agrobactéria, 86,9%
apresentaram formação de calos. Destes 35,5% apresentam formação de gemas e 35% foram perdidos por oxidação.
Apoio financeiro: FAPESP
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Implicações da cultura de tecido no padrão de
metilação do DNA em sete acessos de Lippia alba (Mill)
NE Brown (Verbenaceae)
Campos, FV; Mainenti, JLL; Reis, AC; Ribeiro, PCC; Sousa, SM; Campos, JMS; Santos, MO; Viccini, LF;
Coelho, CM
Laboratório de Genética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora
Palavras-chave: Metilação, cultura de tecido, aclimatação, Lippia, ISSR.
Introdução: O Brasil é uma das principais zonas de ocorrência e diversificação de plantas do gênero Lippia. Entre
as espécies mais bem estudadas encontra-se Lippia alba. Devido à importância medicinal dos óleos essenciais de
Lippia alba diferentes estudos vem sendo realizados. Muitos desses estudos envolvem a propagação por estaquia.
Este processo pode ser otimizado pela micropropagação e pode ocasionar o fenômeno da habituação devido
ao cultivo por tempo prolongado in vitro. Vários estudos têm reportado que a cultura de tecidos vegetais pode
ativar vias metabólicas de resposta ao estresse, que ficaria retido na chamada memória do estresse. Processos
epigenéticos constituem uma opção de retenção de memória do estresse por longos períodos de tempo.
Assim, o estresse pode induzir mudanças na expressão gênica através de hipometilação ou hipermetilação do
DNA que, por sua vez, podem indicar que modificações na cromatina podem mediar respostas ao processo
de aclimatação.Objetivo: Avaliar o padrão de metilação do DNA genômico de diferentes acessos de L. alba,
entre plantas cultivadas in vitro por mais de dois anos e plantas oriundas do cultivo in vitro após o período de
aclimatação. Métodos: DNA genômico foi extraído do tecido foliar de 7 acessos de Lippia alba através do método
modificado de hexadeciltrimetil brometo de amônia. Para avaliar o padrão de metilação do DNA dos acessos
cultivados in vitro e depois de aclimatados, o DNA genômico foi digerido com duas enzimas de restrição que
reconhecem a mesma sequência de DNA, mas com sensibilidade diferente à metilação. Os fragmentos foram
amplificados através de PCR, com primers complementares a microssatélites e visualizados em gel de agarose
corado com Sybergreen. Somente amplicons reproduzíveis foram analisados. Resultados: Um total de 44 locos
foi amplificado, sendo 32 monomórficos. Como foram analisados acessos da mesma espécie era esperado
alto número de locos monomórficos. Sem considerar padrão diferencial de metilação do DNA, 4 locos foram
polimórficos entre os acessos, mostrando variação intra-específica. Esses dados corroboram com estudos prévios
que demonstraram quantidade de DNA e número cromossômico diferentes entre os acessos. Houve padrão de
amplificação diferencial para um mesmo acesso submetido à cultura de tecido e ao período de aclimatação para
5 locos. O padrão de metilação diferencial do DNA foi observado apenas para dois locos de dois dos 7 acessos
estudados. Conclusão: Apesar da cultura de tecido influenciar o padrão de metilação do DNA, o número de locos
diferencialmente metilados não foi elevado para os acessos de Lippia alba analisados. É importante mencionar
que estudos de outras marcas epigenéticas seriam necessárias para melhor compreensão do efeito do cultivo
in vitro de plantas na estrutura da cromatina. Além disso, o curto período após aclimatação pode ainda ter
contribuído por não reverter completamente alteração dos fenômenos epigenéticos ocasionados pelo estresse.
Auxílio financeiro: FAPEMIG, CAPES, CNPq
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Propagação in vitro de Cattleya violaceae em
diferentes concentrações de ágar em meio de cultura
simplificado
Furlan, F1; Neiverth, W1; Neiverth, A1; Vendruscolo, ECG1
Laboratório de Bioquímica e Genética, Universidade Federal do Paraná (UFPR), 2153, 85950-000, Palotina, PR, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: orchidaceae; micropropagação; regeneração de plantas, crescimento, meio de cultura.
A família Orchidaceae apresenta distribuição cosmopolita, incluindo cerca de 850 gêneros e 20.000 espécies
(incluindo híbridos artificiais), sendo a maior família de angiospermas em número de espécies. Economicamente,
são plantas de grande importância, pois movimentam um comércio em torno de US$ 126 milhões (USDA, 2008).
Este trabalho teve com objetivo avaliar a propagação in vitro da Cattleya violácea com diferentes concentrações
de ágar, em meio de cultura simplificado e obter um protocolo de propagação eficiente. Foram utilizados os
meios de cultura MS modificado (5mL de macronutrientes) e MS modificado com metade da concentração dos
macronutrientes (2,5 mL de macronutrientes) e com diferentes concentrações de ágar ( 4,5; 5,5 e 6,5 g/L) totalizando
6 tratamentos. Após 4 meses de cultivo foram quantificados os seguintes parâmetros: comprimento da maior raiz,
o número de raízes e número de brotos obtidos. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com
5 repetições contendo 8 plântulas por repetição totalizando 240 plântulas. Os dados foram analisados utilizando o
programa GENES (CRUZ et al, 2008). Como resultados, observou-se que os tratamentos de 1 a 4 (4,5g/L e 5,5g/L de
ágar) foram os de melhor performance para número médio de raízes e número de brotos por explante, obtendo-se
em média, 4,8 raízes e 14,4 brotos por plântula e, os tratamentos com maiores concentrações de ágar (Tratamentos
5 e 6 – 6,5g/L) originaram as menores médias para número de brotos por plântula, número médio de raízes,
porém obtiveram o maior comprimento médio de raízes: 2,33. Tais resultados permitem concluir que as menores
concentrações de ágar são as mais eficientes para a propagação in vitro desta espécie.
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Regulação do miR319 em cana-de-açúcar submetida a
baixa temperatura
Thiebaut, F1; Rojas, CA1; Almeida, KL1; Hemerly, AS1; Ferreira, PCG1
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Avenida Brigadeiro Trompowski, Ed. CCS Bl.H, 21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: estresse abiótico, microRNAs, planta, regulação gênica
A cana-de-açúcar é uma cultura de grande importância na economia mundial, sendo que o Brasil detém a maior
produção de cana no mundo. Grandes investimentos têm sido feitos no melhoramento desta cultura. Entre as
estratégias utilizadas no melhoramento desta cultura podemos citar o emprego de ferramentas biotecnológicas.
Uma das prioridades é o desenvolvimento de variedades com maior tolerância a estresses ambientais, entre
eles o frio. Nos últimos anos, um novo mecanismo de regulação gênica vem sendo desvendado, o mecanismo
de RNA de interferência. Um dos componentes principais deste processo de regulação é uma molécula de RNA
de fita simples, o microRNA. Em estudos iniciais os microRNAs foram associados exclusivamente à regulação
do desenvolvimento, especialmente em vegetais. No entanto, atualmente, tem sido relatado o envolvimento de
microRNAs em processos de estresse biótico e abiótico. Em trabalhos anteriores realizados pelo nosso grupo de
pesquisa foi relatado que o miR319 é regulado em cana-de-açúcar cultivada “in vitro” submetidas a estresse por
baixa temperatura (4°C). No presente trabalho foi analisado a expressão deste miRNA de cana-de-açúcar sob
estresse por frio em diferentes tecidos (raiz e parte aérea) e em genótipos contrastantes com relação a tolerância
ao frio. No primeiro experimento, foram utilizadas plantas SP70-1143, cultivadas “in vitro”, expostas a 4°C em
diferentes tempos (0h, 12h, 24h e 48h), sendo raiz e parte aérea coletadas separadamente. O segundo experimento
utilizou duas variedades de cana (TAMBO FEPAGRO – tolerante, e RB931011 – sensível) germinadas a partir
de toletes e cultivadas em casa de vegetação. Essas plantas foram submetidas a 4°C em diferentes tempos (0h,
24h e 48h). Para cada tempo dos experimentos, foram coletadas plantas controle expostas a 26°C. Em ambos
os experimentos foi analisado a expressão do miR319 pelo método de “stem-loop” RT-PCR e foi verificado o
perfil de expressão dos alvos (PCF6 e GAMYB) deste miRNA por PCR em tempo real. O resultado do primeiro
experimento apresentou um aumento da expressão do miR319 em plantas expostas ao frio por 12 e 24h em ambos
os tecidos, porém a indução foi maior na raiz (aproximadamente 2,5X). Além disso, foi observada repressão
dos alvos em ambos os tecidos. A regulação destes genes alvos pelo miRNA foi confirmada por RACE 5’, sendo
mapeado o sítio de clivagem do miR319. No segundo experimento, foi observado a indução do miR319 em ambas
as variedades. Porém, somente o alvo GAMYB apresentou perfil de expressão inverso ao miR319, enquanto o PCF6
foi induzido em ambas as variedades. Entretanto, a regulação do miR319 foi mais tardia na variedade tolerante.
Esse resultado nos mostra que existe diferença na intensidade da regulação do miR319 entre as variedades
analisadas. Desta forma, este resultado poderá contribuir para seleção de cana-de-açúcar tolerante ao frio.
Apoio financeiro: CNPq e FINEP
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Regeneração de plantas a partir de calos
embriogênicos e discos foliares visando transformação
genética de cana-de-açúcar (Saccharum spp.)
Barbosa, AL1; Lembke, CG2; Oliveira, ET; Farinha TB; De Martin, VF; Souza GM2 Carrer, H1
Departamento de Ciências Biológicas, Escola Superior de Agronomia “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo
[email protected]
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Palavras-chave: Reguladores de crescimento; cultura de tecidos; co-transformação; Biolística; COMT
A cana-de-açúcar é uma monocotiledônea poliplóide, alógama que possui baixa taxa reprodutiva devido às
dificuldade de florescimento. Devido estas características genéticas e fisiológicas os programas de melhoramento
são longos e laboriosos. Alternativamente, modernas aplicações da biotecnologia visam contribuir com o
desenvolvimento de novos cultivares com características agronômicas específicas. Neste trabalho estudou-se a
metodologia de cultura de tecidos a partir de discos de folhas imaturas para o estabelecimento da cultura de
calos embriogênicos e regeneração de plantas a partir dos calos embriogênicos e diretamente a partir de discos de
folhas imaturas. O objetivo principal foi contribuir para o desenvolvimento de métodos para produção de plantas
transgênicas pelo método de biolística a partir de calos e folhas imaturas, considerando-se a necessidade de produção
de novos cultivares. Foram utilizadas as variedades RB835089 e RB855156 como fonte de explantes, os discos de
folhas imaturas. Os reguladores 2,4-D e cinetina foram testados em meio MS para induzir a desdiferenciação celular
e estabelecer a cultura de calos embriogênicos foliares antecedendo a regeneração de plantas. Calos embriogênicos
com 12 a 20 semanas de cultivo produziram em média 3 a 5 plantas. Regeneração de plantas diretamente a partir
de discos foliares testados em diferentes concentrações de 2,4-D (5, 8 e 10 mg/l) incubados em diferentes períodos
no escuro seguido da transferência para meio MS na luz resultaram em média 23 plantas por explante utilizando 8
mg/l de 2, 4-D durante 8 dias no escuro no total de 7 semanas. Alternativamente, pré-tratamentos dos discos foliares
com 3 mg/l de 2, 4-D e 0,1 mg/l de cinetina (meio MS3K) mantidos durante 14, 21 e 28 dias no escuro anteriormente à
transferência em meio MS na luz resultaram em média 40 plantas por disco foliar no total de 10 semanas. A redução no
tempo para obtenção de plantas aliado ao aumento na média de plantas obtidas é a base para aumentar a eficiência
de transformação genética de plantas. Experimentos de co-transformação dos genes neo e COMT(AS), realizados
pelo método de biolística utilizando-se discos de folhas imaturas resultaram na incorporação do gene marcador
neo em 90% das plantas em meio seletivo com geneticina (30 mg/L), Destas, 38% também foram confirmadas a
incorporação da COMT(AS). Fragmentos de PCR foram sequenciadas e analises in silico no banco de dados do NCBI
confirmaram a inserção do fragmento de 535 pb do gene COMT(AS) no genoma das plantas. Os resultados obtidos
mostram que a cultura de discos de folhas imaturas para o processo de transformação genética por biolística
é uma metodologia viável, rápida e menos onerosa, quando comparada com a cultura de calos embriogênicos.
Apoio financeiro: CNPq
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Estabelecimento de protocolo de regeneração de
plantas de Trombeteiro (Brugmansia suaveolens) a
partir de embriões maduros
Zadinelo, IV1; Romani, I2; Vendruscolo, ECG2
Curso Superior em Tecnologia em Biotecnologia – Universidade Federal do Paraná – Campus Palotina
Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular – Universidade Federal do Paraná – Campus Palotina
[email protected]
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Palavras-chave: cultura de tecidos, regeneração, Brugmansia suaveolens.
Introdução: O trombeteiro (Brugmansia suaveolens) é uma pequena árvore nativa do sul da America com folhas
grandes, ovaladas, com flores vistosas e de diferentes colorações, com frutos longos e fusiformes, pertencente à
família Solanaceae, gênero Datura. Esta planta vem despertando grande interesse econômico, principalmente na
área farmacêutica pelo motivo destas produzirem como forma de defesa, dois importantes alcalóides tropânicos:
escopolamina e atropina. Objetivo: Estabelecer um protocolo de regeneração de plantas a partir de embriões
maduros. Métodos: Sementes do trombeteiro foram coletadas e tiveram seu tegumento retirado mecanicamente.
Subsequentemente foram submetidas à assepsia em álcool 70% por 5 minutos e hipoclorito de sódio 2% com 2
gotas de Tween 80, por 20 minutos. Após o tratamento asséptico as sementes foram lavadas três vezes em água
autoclavada destilada. Os embriões foram excisados e inoculados em meio de cultura contendo meio 1/2 MS
suplementados com 2,4D e Cinetina (KIN) combinados um a um obtendo-se 9 tratamentos, em três fases distintas:
indução (0; 0,5; 1 mg.L-1), manutenção (0; 0,25; 0,5 mg.L-1) e regeneração (0 mg.L-1). Cada tratamento foi constituído
de 10 repetições e cada repetição contendo 5 embriões. A cada 21 dias realizaram-se as coletas de dados, que
foram analisados utilizando o programa GENES (CRUZ et al, 2008). Resultados: A análise de variância para estes
tratamentos foi significativa para a variável resposta: número de calos, tamanho de calo e número de embrióides.
Para a característica número e tamanho de calos, os tratamentos que combinam diferentes concentrações de 2,4D
e KIN, simultaneamente, foram superiores. Em relação à característica número de embrióides, o tratamento T6 (0,5
mg.L-1 de 2,4D + 0,5 mg.L-1 KIN) e T8 (1mg.L-1 de 2,4D + 0,5mg.L-1 KIN) foram superiores em relação aos demais.
Em relação ao número de plantas regeneradas, o protocolo proposto não apresentou diferenças significativas entre
os tratamentos. Desta forma, este protocolo deverá ser aperfeiçoado de modo a obter o maior número de plantas
regeneradas para viabilizar a utilização de técnicas biotecnológicas.
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Partenogênese in situ em variedades de laranja doce
Garbin, JF1; Cardoso, JC1; Martinelli, AP2; Latado, RR1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira/IAC
Departamento de Biotecnologia Vegetal, Centro de Energia Nuclear na Agricultura/USP
[email protected]
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Palavras-chave: Citrus sinensis, pólen, irradiação, óvulos, embriogênese, haplóide
Introdução: O gênero Citrus compreende aproximadamente 162 espécies, no qual a laranja doce (Citrus sinensis)
é uma das mais importantes economicamente. A produção de linhagens homozigóticas em programas de
melhoramento genético de citros é difícil e demorada, devido principalmente aos problemas de poliembrionia,
ciclo juvenil longo, alto nível de heterozigosidade e auto-incompatibilidade. A técnica de partenogênese in situ
consiste na obtenção de embriões haplóides ou duplo-haplóides a partir do desenvolvimento de óvulos estimulados
pela polinização com grãos de pólen estéreis, o que resulta na não-fertilização dos óvulos. Objetivo: Obter plantas
haplóides de laranja doce por meio da técnica de partenogênese in situ. Métodos: Flores das variedades Pêra-deabril e Sanguinelli Marrocos foram polinizadas com grãos de pólen da própria variedade, previamente irradiados
com diferentes doses de raios gama: 0, 250, 500 e 1.000 Gy. As duas variedades utilizadas apresentam sementes
com reduzida taxa de poliembrionia. Sementes abortadas e sementes desenvolvidas, obtidas de frutos de todos
os tratamentos e do controle, foram coletadas aproximadamente 90 dias após a polinização das flores e foram
cultivadas in vitro em meio composto por sais de MS, suplementado com 50gL-1 de sacarose, 500mgL-1 de extrato
de malte e 6.0gL-1 de Ágar. O pH do meio foi ajustado para 5,8±0,1. Em todos os tratamentos foram avaliados a
porcentagem de frutos desenvolvidos e o número de sementes abortadas e sementes desenvolvidas, mas com
tamanho pequeno ou grande. Aos 90 dias de cultivo in vitro foi avaliado o número de sementes germinadas de
cada tipo. A ploidia das plântulas obtidas foi avaliada em citômetro de fluxo. Resultados: A laranjeira Pêra-deabril apresentou redução na taxa de pegamento de frutos quando usados grãos de pólen irradiados, sendo 21,6%,
13,2%, 18,4% e 14,8% de pegamento de frutos nos tratamentos 0, 250, 500 e 1.000 Gy, respectivamente. O mesmo foi
observado para o número de sementes grandes e pequenas obtidas nos frutos resultantes de polinização com pólen
irradiado. O contrário ocorreu para o número de sementes abortadas, que foi maior nos tratamentos com 500 e
1.000 Gy. Ao final do processo foram obtidas 2, 0, 3 e 2 plântulas germinadas dos tratamentos 0, 250, 500 e 1.000 Gy,
respectivamente. Para a laranjeira Sanguinelli Marrocos, a taxa de pegamento de frutos foi maior nos tratamentos
com grãos de pólen irradiados, sendo obtidas quatro sementes grandes e cinco pequenas, no tratamento com dose
de 250 Gy. O número de sementes abortadas também aumentou em função do uso de grãos de pólen irradiados,
sendo obtidas 10, 5, 7 e 2 plântulas germinadas. Foram avaliadas 11 plântulas por citometria de fluxo, sendo 10
plantas consideradas como diplóides e uma, da laranjeira Sanguinelli Marrocos, com menor ploidia em relação às
plantas controle.
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Análise morfológica das fibras de plantas de Nicotiana
tabacum transformadas com genes relacionados à
qualidade da madeira em Eucalyptus
Sousa, AO1; Nascimento, LF1; Silva, GO1; Costa, MGC1; Pasquali, G2; Cascardo, JCM1
Centro de Biotecnologia e Genética, UESC, Ilhéus-BA
Centro de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre-RS
[email protected]
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Palavras-chave: xilema, celulose, estudo funcional, transgenia, microscopia.
O Eucalyptus grandis (EuGr) e o Eucalyptus globulus (EuGl) são consideradas espécies contrastantes para a qualidade
da madeira usada pela industria de papel e celulose. Análises de dados de microarranjos e RT-qPCR permitiram
identificar genes diferencialmente expressos em xilemas destas duas espécies. Dois destes genes, o EuGl05 similar à
proteína PHI-1 (BAD17079.1) e o EuGr16 homólogo à proteína F1N21.6 (AAG00239.1), foram selecionados e usados
para transformar Nicotiana tabacum visando a caracterização funcional dos mesmos. Sabe-se que a morfologia das
fibras do xilema representa padrões importantes para o processamento da polpa de celulose e produção do papel.
Assim este trabalho teve como objetivo avaliar a morfologia dos elementos fibrilares das plantas transgênicas
NT05 e NT16 que super-expressam os genes EuGl05 e EuGr16, respectivamente. Para tanto amostras do tecido
xilemático de plantas transformadas e controle não transformado foram coletadas e mantidas em solução de ácido
acético glacial e peróxido de hidrogênio (1:1) por 48 horas a 60 ºC. O material fibroso resultante foi lavado com água
destilada, corado com safranina e usado para a confecção de lâminas. Estas foram então analisadas por microscopia
óptica e a partir das imagens obtidas foram realizadas medidas de comprimento (C), largura (L), diâmetro do lúmen
(D) e da espessura da parede (E) das fibras xilemáticas. O comprimento da fibra representa o valor médio das
medidas feitas para 225 fibras por genótipo. Os demais valores representam a média das medidas de 135 fibras por
genótipo. Todas as medidas foram feitas usando o software Image tool versão 3.0 e os valores obtidos foram usados
para calcular alguns índices de importância para qualidade da celulose e papel: índice de Runkel (2xE/D); fração da
parede das fibras (2xL/Dx100) e coeficiente de flexibilidade (100xE/L). Todos os genótipos transgênicos analisados
apresentaram fibras mais compridas que as do controle. As plantas NT05 possuem maior L e E, além apresentar
índice de Runkel e fração da parede com valores mais elevados que os do controle. Para as plantas NT16 foi observado
o contrário, menor L e E, e ainda índice de Runkel e fração da parede com valores inferiores aos do controle. Já para
o coeficiente de flexibilidade, os valores observados em NT16 são maiores que os vistos para NT05 e controle.
Diante disto, é possível perceber que as plantas NT05 e NT16 apresentam fibras com características distintas
entre elas e entre o controle. Isto pode refletir a função dos genes em estudo que derivam de espécies de eucalipto
contrastantes para a qualidade da madeira. Tais dados ressaltam a importância dos estudos funcionais dessas
seqüências para melhoramento das características da madeira que são desejáveis pela indústria de papel e celulose.
Apoio financeiro: CNPq, FINEP, CAPES, Projeto Woodgenes
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Morfogênese in vitro e potencial de transformação de
genótipos de cana-de-açúcar IAC via Agrobacterium
tumefaciens
Martins, APB1,2; Festucci, CDS2; Molinari, HBC3; Goldman, MHS1; Landell, MGA2; Creste, S2
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas – Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo
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Instituto Agronômico de Campinas – Centro de Cana
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Embrapa Agroenergia
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Palavras-chave: Saccharum, transformação genética, Agrobacterium, micropopagação, gene bar, GUS
Introdução: O cultivo de cana-de-açúcar geneticamente modificada ainda é um grande desafio para os programas
de melhoramento, porém apresenta-se como uma grande oportunidade para sustentabilidade e eficiência do setor
sucroalcooleiro, uma vez que deverá permitir ganhos não alcançados pelo melhoramento convencional. Nesse
sentido, a otimização de técnicas de cultivo in vitro, como a embriogênese somática, aliada à padronização dos
procedimentos envolvidos na transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens, são imprescindíveis
para viabilizar esta tecnologia. Neste trabalho, objetivou-se avaliar a capacidade de regeneração e morfogênese
in vitro de três cultivares de cana pertencentes ao Programa Cana IAC. Métodos: Foram avaliadas a capacidade
de regeneração e morfogênese in vitro dos cultivares IACSP96-2042, IACSP96-3060 e IACSP95-5000, submetidas
à infecção com Agrobacterium tumefaciens. Como fontes de explantes, foram utilizados cortes transversais
provenientes da base de plântulas de cada um dos genótipos mantidos in vitro. Os explantes foram inoculados
com as linhagens C58C1 e EHA-105 portando os vetores binários pSoup e pBract304, os quais contêm os genes
BAR (pat) e GUS (uidA). Três densidades ópticas (ODs) foram avaliadas em cada combinação genótipo-cepa:
O.D.600 0.4, 0.6, e 0.8. Os frascos contendo os explantes em meio de cultura seletivo ( fosfinotricina - PPT) foram
transferidos para a câmara de germinação e incubados em condições adequadas de luminosidade e temperatura
para regeneração dos explantes. Resultados: As maiores taxas de regeneração (58%) foram obtidas com o cultivar
IACSP96-3060, inoculado com a cepa C58C1, em uma O.D.600 = 0.4, e em uma pressão de seleção de 1mg/L
(PPT) no meio de cultura. As menores taxas (~ 4%) foram obtidas com esse mesmo cultivar, a linhagem EHA105 em uma O.D.600 = 0.8, sob as mesmas condições de seleção descritas anteriormente. Em relação às taxas
de transformação, dados preliminares indicam o desenvolvimento de brotos resistentes a PPT (6mg/L) e GUSpositivos, com uma freqüência variável entre 6,6% a 33%. Conclusões: Os resultados permitem concluir que muitos
fatores afetam a eficiência da transformação genética via Agrobacterium tumefaciens em cana-de-açúcar. Sem
dúvida, o genótipo tem sido apontado por diversos autores como um dos fatores determinantes no sucesso da
transformação genética nesta cultura. Além disso, a origem do explante, o tipo de cepa, e as ODs bacterianas
utilizadas parecem ser fatores relevantes para uma boa eficiência na transformação de cana-de-açucar.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP e FUNDAG
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Regeneração de Passiflora suberosa em suspensão
celular
Karasawa, MMG1; Dantas, HD2; Santana, JRF de3; Junghans, TG4
Laboratório de Biologia Molecular para Estudo da Biodiversidade, Universidade Federal de Alfenas/MG
Graduando da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
3
Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, Universidade Estudal de Feira de Santana/BA
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Embrapa de Mandioca e Fruticultura Tropical de Cruz das Almas/BA
[email protected]
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Palavras-chave: Maracujá, regeneração de plantas, reguladores de crescimento, extrato de malte, extrato de levedura
O gênero Passiflora é o maior e o mais importante da família Passifloraceae por abrigar as principais espécies
exploradas comercialmente no mundo. Muitas espécies são cultivadas para a produção de sucos, consumo in
natura, extração de substâncias de interesse farmacológico e fins ornamentais, mas a presença de patógenos
de solo que vêm dizimando os cultivos. Uma alternativa é a hibridação interespecífica, ou seja, cruzamentos
convencionais, de seleção ou cultivares comerciais, com as espécies silvestres na produção de porta-enxertos
resistentes, porém esses híbridos sexuais quando obtidos têm apresentado baixa fertilidade. Desta forma, uma
alternativa viável é a produção de porta-enxertos tetraplóides com genes de resistência aos patógenos pela
técnica da hibridação somática. Contudo, para isto são necessários protocolos eficientes de regeneração das
espécies parentais diplóides a patir de células individuais. Assim, o objetivo desse trabalho foi estabelecer um
protocolo de regeneração de plantas a partir de células em suspensão da espécie de P. suberosa. Para tanto, calos
MR13 BIO oriundos da Embrapa de Mandioca e Fruticultura Tropical de Cruz das Almas/BA foram submetidos
ao meio de cultura MS (Murashige e Skoog) suplementado com os reguladores de crescimento BAP 1,0 mg/L
ou 2,0 mg/L; KIN 1,0 mg/L ou 2,0 mg/L para a obtenção de calos friáveis no Laboratório de Cultura de Tecidos
Vegetais da unidade experimental Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana/BA. O melhor
resultado, BAP 2,0 mg/L, foi submetido aos testes contendo balanço de fitorreguladores: MS + BAP 2,0 mg/L +
ANA 0,5 mg/L + Kin 1,0 mg/L ou MS + AIA 2,5 mg/L + ANA 0,5 mg/L +Kin 1,0 mg/L, suplementado com agar
6% e, ao teste de culturas de células em suspensão, na ausência de luz, em meio MS na metade da concentração
dos sais, suplementados pelos compostos orgânicos (extrato de malte ou extrato de levedura) e mantidos sob
140 rpm de agitação contínua num volume final de 100 mL em frascos erlenmeyers de 250 mL de capacidade.
As células colocadas em suspensão no meio líquido suplementado com extrato de malte foram capazes de
regenerar de plantas inteiras de P. suberosa, a partir de células diplóides, num prazo de 60 dias na ausência de luz.
Apoio financeiro: FAPESB/CNPq
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Extraction of high quality genomic DNA from
strawberry genotypes by using the freeze-drying
method
Nunes, CF1; Cançado, GM de A1; Fontes-Soares, BD1; Fernandes, MCN1; Ferreira, JL1; Pasqual, M2; Borem, A3
Laboratório de Biotecnologia Vegetal – Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais/EPAMIG
Departamento de Agricultura – Universidade Federal de Lavras/UFLA
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Departamento de Fitotecnia – Universidade Federal de Viçosa/UFV
[email protected]
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Keywords: Fragaria x ananassa, DNA purification, DNA purity, dehydration process, polymerase chain reaction.
Several extraction methods of genomic DNA for identification and characterization of genetic diversity in different
plant species are routinely applied during molecular analysis. However, the presence of undesirable compounds such
as polyphenols and polysaccharides is one of the biggest problems encountered during the isolation and purification
of high quality DNA in plants. Therefore, fast and accurate methods of DNA extraction are necessary to produce
pure samples, preventing inhibition or interference during enzymatic reactions. Leaves of strawberry genotypes
(Fragaria x ananassa) have high levels of polysaccharides and polyphenols which increase the sample viscosity
and decrease the DNA quality, reducing the PCR performance. Thereby, this study aimed evaluating the quality
and quantity of genomic DNA from leaves of strawberry genotypes, using freeze-drying (lyophilized) tissue for the
sample extraction. Leaves were collected from the apex and the base of five strawberry plants kept in greenhouse of
the Laboratory of Plant Biotechnology - EPAMIG. For DNA extraction, it was used the CTAB method described by
SAGHAI-Marrof et al. (1984) with modification, in which the plant material was freeze-dried for a period of 20h for
plant tissue dehydration. After this step, we used 70 mg of material lyophilized. For homogenization, the material
was macerated in a porcelain crucible containing 0.04 g of PVP in presence of liquid nitrogen. The results showed
the efficiency and reliability of the method indicating which the previous step of tissue lyophilization improve
the quality and quantity of the DNA, reducing the risk of contamination with polysaccharides and polyphenols.
This work was carried out with financial support of IFS, FAPEMIG, CAPES, FINEP and EMBRAPA
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Avaliação de três métodos de extração de DNA
genômico de Diospyros hispida Alph. D.C. (Caqui-doCerrado) a partir de folhas
Ibañes, B1,2; Moreno, MA2; Silva, MC2; Souza, RGVC2; Ferraz, EM2; Gandara, FB2; Tarazi, R3; Furlan, E4;
Kageyama, PY2
Pós–Graduanda pela Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz
Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz. Departamento de Ciências Florestais, Laboratório de Reprodução e Genética de Espécies Arbóreas (LARGEA). Av. Pádua Dias 11, Agronomia, CEP: 13418-900 - Piracicaba, SP - Brasil - CaixaPostal: 09
3
Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus – BA
4
Instituto Florestal – IF
[email protected]
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Palavras-chave: Diospyros hispida, extração de DNA, métodos, Cerrado, Caqui-do-Cerrado.
A biodiversidade do Cerrado é elevada, com aproximadamente 11.627 espécies vegetais vasculares. O Cerrado
é considerado um “hotspot”, rico em biodiversidade, endemismo e altamente ameaçado por atividades
antrópicas. Informações sobre a autoecologia de espécies e da estrutura genética permitem subsidiar estratégias
para conservação e uso dos recursos genéticos nativos do cerrado. A espécie Diospyros hispida, popularmente
conhecida como caqui-do-cerrado, é um recurso genético vegetal que ocorre em fisionomias campestres
de cerrado, cerrado típico e cerradão, com ampla distribuição pelo bioma. Devido aos diversos fatores que
provocam estresse nas plantas em ambientes savânicos, muitas plantas apresentam compostos primários
e secundários que dificultam a extração de DNA genômico total, e consequentemente, inviabilizando estudos
relacionados com a estrutura genética. Para contornar esse problema é necessária a utilização de métodos
precisos de extração do DNA, visto que o co-isolamento de polissacarídeos, fenóis e compostos secundários é
o principal problema encontrado no isolamento e purificação de DNA vegetal. Apesar de simples, esta etapa
é demorada e onerosa para pesquisa. O presente trabalho teve como objetivo testar três métodos de extração
de DNA: Tai e Tansley (1991), Faleiro et. al (2002) e Doyle e Doyle (1990) com modificações. Após a extração,
realizou-se a quantificação do DNA presente nas amostras por meio da análise comparativa de cada amostra
com amostras de DNA de concentração conhecida (DNA l), submetidos à eletroforese durante 30 minutos em gel
de agarose a 1% corado com brometo de etídio e visualizado sob luz ultravioleta. O melhor método de extração
foi o de Doyle & Doyle (1990) com modificações, apresentando 200 ng de DNA, quatro vezes mais material
do que os de Tai e Tansley (1991) e Faleiro et. al (2002), além de estarem livres de rastro de oxidação e RNAse.
APOIO: CNPq/ESALQ
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Indução e proliferação de embriões somáticos de soja
a partir de cotilédones imaturos
Tanaka, SM1; Rogalski, M1; Zakir-Pereira, ACV1; Carrer, H1
Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Departamento de Ciências Biológicas, Av. Pádua Dias 11,
CP. 9, 13.418-900, Piracicaba, São Paulo, Brasil
[email protected]
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Palavras-chave: Glycine max; embriogênese somática; cultura de tecidos.
A soja (Glycine max L.) é um dos maiores recursos de proteína e óleo vegetal utilizados para consumo humano
e animal, podendo ser utilizada também na produção do biodiesel. Em função de seu valor econômico e de sua
potencialidade de cultivo, essa leguminosa tem sido submetida a um intenso programa de melhoramento genético.
No entanto, estudos mostram que a base genética da soja é bastante estreita e os programas convencionais de
melhoramento têm se mostrado pouco eficientes. Desse modo, estratégias biotecnológicas podem ser utilizadas para
inserção de características de interesse para obtenção de ganhos genéticos mais expressivos. O desenvolvimento
de métodos eficientes para a regeneração de plantas de soja in vitro amplia as oportunidades para a manipulação
genética e para seleção de novos genótipos. Estudos preliminares relativos à herança da capacidade embriogênica
em soja evidenciaram que tal característica é de natureza quantitativa e mostraram que o genótipo influencia
significativamente na resposta embriogênica in vitro. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial embriogênico
in vitro das cultivares de soja BRS155, Stwart, Jack e IAS5. Para isso sementes de soja foram germinadas e conduzidas
em casa de vegetação até a fase de produção de sementes. Vagens imaturas contendo sementes com cotilédones
com tamanho aproximado de 3 a 5mm, foram colhidas e desinfestadas. Os cotilédones foram excisados e colocados
com sua parte abaxial em contato com o meio de indução MSD40 [sais MS, vitaminas B5, 6% de sacarose, 40
mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), 0,2% de Phytagel e pH ajustado para 5.8]. Após 7 semanas, com
subculturas aproximada de 3 semanas, em meio de indução, os explantes foram avaliados quanto ao percentual
de cotilédones com resposta embriogênica e o número médio de embriões globulares por cotilédone. Observou-se
uma taxa de indução de 22,96% para a cv. IAS5; de 24,58% para a cv. BRS155, de 37,62% para a cv. Stwart e de 33,18%
para a cv. Jack. Os resultados mostraram uma média de 3,23; 4,26; 5,26; e 3,26 embriões para as variedades IAS5,
BRS155, Stwart e Jack, respectivamente. Após a fase de indução, os explantes embriogênicos foram transferidos
para o meio de proliferação MSD20 (20 mg/L de 2,4-D e 3% de sacarose), com subculturas aproximada de 3
semanas. Em meio de proliferação, as variedades apresentaram aumento na quantidade de embriões por explante
responsivo. As médias foram de 8,26 (IAS5); 8,97 (BRS155); 10,74 (Stwart); 5,98 (Jack). Os resultados mostraram que
o potencial embriogênico é dependente do genótipo e que as variedades BRS155 e Stwart, quando comparadas
com as variedades clássicas utilizadas na maioria dos trabalhos, possuem um bom potencial para estudo de
embriogênese somática in vitro e para desenvolver protocolos de regeneração visando transformação genética.
Apoio: FAPESP, CNPq, CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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229
Otimização do protocolo de regeneração e brotamento
de morango (Fragaria ananassa e Fragaria vesca)
advindos de transformação genética via Agrobacterium
Pinto, NA; Haiter, JAC; Aragão, FJL; Tavares, LS
Laboratório de Genética, Universidade Federal de Juiz de Fora - MG
[email protected]
Palavras-chave: transformação genética, Fragaria, regeneração,brotamento,OXDC.
Crescimento e regeneração in vitro são fenômenos complexos e influenciados por vários fatores ambientais e
genótipo da espécie estudada. Como cada espécie parece ter seus próprios requerimentos, existem vários relatos
sobre as substâncias e as condições que ajudam as células a se diferenciar. No caso das espécies de morango
ocorrem ploidias variadas de origens diferentes, criando variações nos processos de regeneração que dificultam
a seleção de plantas transgênicas. A transformação genética é uma alternativa atrativa para programas de
melhoramento de Fragaria e outras espécies, porque mantém a integridade do cultivar enquanto adiciona uma
característica específica. As dificuldades de cruzamento entre cultivares de morangueiro devido à sua natureza
poliplóide limitam as transformações genéticas ao cultivar desejado. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o
melhor sistema de regeneração para a cultivar Dover (cultivar livre de proteção intelectual) de Fragaria ananassa
e Fragaria vesca (comercial Feltrin), cocultivados com Agrobacterium. Para este fim foram testados meios de
cultura contendo duas citocininas, BAP (benzil aminopurina) e TDZ (thiadizurom) nas espécies Fragaria ananassa
(Dover) e Fragaria vesca. Os explantes foliares foram cocultivados com uma linhagem de Agrobacterium contendo
o plasmídio pC 1390-OXDC por 30 minutos e posteriormente cultivados em meio MS contendo phytagel (2 - 2,5%),
glicose (2%), higromicina (1 mg/L), timentin (200 mg/L) para eliminar a bactéria e hormônios. Um dos tratamentos
incluía a utilização dos hormônios BAP (3 mg/L) e AIB (0,5 mg/L) e o outro incluía TDZ (2 mg/L) e AIB (0,5 mg/L).
Conclusões: O maior número de regenerações e brotamentos foi obtido em meio com TDZ para ambas as espécies.
Estes meios foram testados na regeneração e brotamento das duas espécies provenientes de experimentos de
transformação genética com gene da oxalato descarboxilase contendo o gene da higromicina como agente seletivo.
Novamente, para ambas as espécies o melhor meio de produção de calos transformados foi aquele contendo
TDZ. Assim, este meio vem sendo utilizado na regeneração de plantas transgênicas para resistência a fungos.
Apoio: CNPq; FAPEMIG
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Otimização da micropropagação in vitro de morango
(Fragaria ananassa) advindos de estolão
Haiter, JAC; Pinto, NA; Tavares, LS; Santos MO
Laboratório de Genética, Universidade Federal de Juiz de Fora – MG
[email protected]
Palavras-chave: micropropagação, morango,TDZ BAP, regulador crescimento.
A produção de morango (Fragaria spp) no Brasil tem aumentado significativamente nos últimos anos e é estimada
em 40 mil toneladas, em uma área em torno de 1500 hectares, sendo o Estado de São Paulo o principal produtor,
seguido de Minas Gerais, principalmente na região da Mantiqueira, e Rio Grande do Sul. O morango é produzido e
apreciado nas mais variadas regiões do mundo, sendo a espécie do grupo de pequenas frutas de maior apreciação e
grande retorno econômico. É propagado vegetativamente através de estolhos e também através de micropropagação,
técnica que apresenta diversas vantagens, como produção de mudas em larga escala e curto espaço de tempo,
além da possibilidade de eliminação de patógenos causadores de doenças. O presente trabalho teve como objetivo
avaliar o fenômeno da habituação e vitrificação em plantas de F. ananassa (Dover) micropropagados em frascos de
baby food. Inicialmente as plantas foram mantidas em meio de sais MS sem regulador por um período de 60 dias,
onde se observou uma maior intensidade de necrose. Foi então adicionado BAP (0,5 mg/L) ao meio de cultura,
com intuito de diminuir a necrose e aumentar a quantidade de brotos. Porém neste período, foi observado que
as plantas apresentaram um elevado índice de vitrificação (hiperhidricidade). Com intuito de minimizar tais
danos foram feitos testes com quatro tipos de tratamentos. Os quais incluíam a utilização de sais de MS sem
regulador de crescimento em duas concentrações de agar (6,5 mg/L e 7 mg/L) e MS com BAP (0,5 mg/L) também
em duas concentrações de agar (6,5 mg/L e 7 mg/L). Nos tratamentos as plantas eram cultivadas continuamente
em apenas um dos meios, bem como alternando os meios de cultura a cada 30 dias, ficando 30 dias em meio sem
regulador, e 30 dias em meio com regulador de crescimento com as diferentes concentrações de agar. Conclusões:
Foi observado que as plantas de Fragaria ananassa tratadas com agar 7 mg/L tiveram um alto nível de vitrificação
e senescência. Observou-se também que o BAP atrapalha o alongamento das plantas, mas em contrapartida
aumenta o número de multi-brotos. Portanto o melhor protocolo a ser seguido é o que utiliza o meio com agar
6,5 mg/L e onde as plantas são alternadas em meio com e sem regulador de crescimento (BAP) a cada 30 dias.
Apoio: CNPq; FAPEMIG
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Curva de morte dos calos embriogênicos de uma
linhagem brasileira de milho utilizando diferentes
concentrações do agente seletivo Bialaphos
Grando, MF1; Castro, BL1; Silva, MR1; Yamazaki-Lau, E2; Kazmirski, T1; Suzin, M1; Alves, FL1.
PPGAgro, Laboratório de Biotecnologia Vegetal. Universidade de Passo Fundo. Passo Fundo, RS
Embrapa Trigo. Passo Fundo,RS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cultura de tecidos, Transformação genética, seleção in vitro, Zea mays L., plantas transgênicas.
Introdução: Durante o processo de transformação genética, são utilizados vetores que, além do gene de interesse,
contenham um gene marcador que permita a seleção de tecidos transformados e permita a regeneração de
plantas transgênicas. O gene bar tem sido o marcador mais utilizado em liliopsidas e o herbicida fosfinotricina
(ppt) (glufosinato de amônio ou Bialaphos) tem sido empregado como agente seletivo. Bialaphos é um herbicida
que atua na inibição da enzima glutamato sintase, resultando em morte celular pelo acúmulo de amônia. A
determinação da concentração ideal para induzir a morte de calos é um fator importante para sucesso na
obtenção de plantas transgênicas. Frame et al. (2006) utilizaram 3 a 5 mg.L-1 de Bialaphos e Vega et al. (2008)
utilizaram 1,5 mg.L-1 na seleção de tecidos transformados do genótipo modelo de milho Hi-II. Objetivo: Avaliar
o efeito da dose crescente de Bialaphos na morte dos calos embriogênicos da linhagem brasileira L2 de milho,
selecionada por apresentar uma alta resposta in vitro e adequada para uso em experimentos de transformação
genética. Método: O experimento foi desenvolvido no Laboratório de Biotecnologia Vegetal da Universidade de
Passo Fundo. Calos embriogênicos obtidos de pendão imaturo da linhagem L2 de milho foram inoculados em meio
de manutenção de calos contendo diferentes concentrações do herbicida Bialaphos (0; 2,5; 5,0; 10,0; 15,0 mg.L-1). A
unidade experimental foi uma placa de petri 20 calos embriogênicos de 5 mm de diâmetro, com cinco repetições
por tratamento. Aos 60 e aos 80 dias os calos foram pesados em balança analítica para a verificação da indução
da morte dos calos embriogênicos medidas através da redução da massa fresca, comparado ao controle (sem
herbicida). Os dados foram submetidos à ANOVA e a diferença das médias comparadas pelo teste de Duncan a
5%. Resultado: Quanto à massa fresca dos calos aos 60 dias, todas as concentrações de Bialaphos foram superiores
ao controle na indução de morte dos calos embriogênicos, porém elas não diferiram entre si. A massa fresca dos
calos crescidos na ausência de Bialaphos foi de 9,46g, em contraste com a média de 2,48g dos calos crescidos
na presença do herbicida. Já aos 80 dias as concentrações: 5, 10 e 15mg. L-1 de Bialaphos formam superiores ao
controle e à concentração 2,5 mg.L-1, sendo que esta concentração também foi superior ao controle na indução
de morte dos calos embriogênicos. Conclusões: Aos 60 dias todas as concentrações de bialaphos utilizadas se
mostraram eficientes na indução da morte de calos embriogênicos. Já aos 80 dias somente as concentrações 5,
10 e 15mg/L mostraram-se eficientes para induzir a morte dos calos. A concentração 5mg/L é a mais indicada
para uso em meio seletivo em experimentos de transformação genética da linhagem brasileira L2 de milho.
Apoio financeiro: FAPERGS
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Análise de morte celular programada em raízes de
Genipa americana L. (Rubiaceae) induzida por cádmio
Souza, VL1; Souza, JS1; Almeida, A-AF1; Cascardo, JCM1; Silva, DC1
Centro de Biotecnologia e Genética – Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
1
Palavras-chave: apoptose, metal pesado, fitorremediação, TUNEL, raízes
O cádmio (Cd), quando em excesso, pode estimular nos vegetais a formação de radicais livres e de espécies reativas
de oxigênio, resultando em severo estresse oxidativo. Esse distúrbio do controle redox da célula desencadeia uma
seqüência de reações, levando a inibição do crescimento, ao estímulo do metabolismo secundário, a lignificação
e a morte celular. Este trabalho teve como objetivo analisar indicadores de alterações celulares característicos de
morte celular programada (MCP) induzida por Cd em raízes de Genipa americana cultivada em solução nutritiva,
para subsidiar estudos futuros de sua utilização como planta tolerante e,ou fitorremediadora desse elemento
metálico. Plantas de G. americana foram submetidas a diferentes concentrações de Cd (4, 8, 16 mg L-¹), juntamente
com o controle por 120 h. Posteriormente foram realizadas coletas do ápice radicular para análise de MCP. Após
inclusão em parafina e obtenção dos cortes histológicos, as amostras foram sondadas com o kit para detecção de
fragmentação do DNA “In situ Cell Death Detection Kit, AP” (Boehringer Mannheim; TUNEL assay) de acordo com as
recomendações do fabricante. Os cortes sondados com TUNEL foram observados em microscópio de fluorescência
Leica DM RXA2, equipado com câmera digital. As células do ápice radicular positivas para a reação TUNEL foram
contadas em cinco áreas de 1 mm2 e os dados foram submetidos ao teste de Tukey (P< 0,05). A reação TUNEL, realizada
em secções transversais de raízes de G. americana, demonstrou um aumento no número de células com núcleos
TUNEL positivos com o aumento da concentração de Cd em solução nutritiva. A análise do padrão morfológico das
células evidenciou, para as concentrações 8 e 16 mg Cd L-1, a perda da arquitetura nuclear, com exibição de núcleos
com formatos elípticos. Concluiu-se que o Cd disparou o processo de MCP nos tecidos radiculares de G. americana.
Apoio financeiro: FAPESB e CNPq
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Análise de metilação do DNA em células
embriogênicas e embriões somáticos de Acca
sellowiana O. Berg (Burret) Myrtaceae
Cristofolini, C; Pescador, R; Moretto, G; Damiani, M.
Laboratório de Biotecnologia e Micropropagação vegetativa – Laboratório de Genética, Departamento de Ciências Naturais, Universidade
Regional de Blumenau
[email protected]
Palavras-chave: Acca sellowiana, metilação do DNA, embriões somáticos, anomalias, 2,4-D.
A embriogênese somática em plantas pode ocorrer de duas formas, através do sistema direto, no qual os embriões
somáticos originam-se dos tecidos matrizes sem a formação de estágios intermediários de calos e o indireto, no
qual ocorrem alterações morfogenéticas que envolvem a formação de um estágio intermediário de calo entre o
explante original e o pró embrião. Para a obtenção de embriões somáticos de Acca sellowiana utiliza-se o 2,4-D,
o qual pode exercer grande influência nas alterações do cariótipo nas células pró embrionária ou de embriões
somáticos, provocando um crescimento desordenado das estruturas celulares, com consequente surgimento de
embriões com anomalias ou ainda, a metilação do DNA, causando silenciamento e/ou ativação de genes podendo
acarretar em anomalias na morfogênese. O objetivo do presente estudo foi verificar a metilaçao do DNA de células
de embriões pelos sistemas direto e indireto. Assim, submeteu-se os embriões aos tratamentos da via direta: meio de
cultura Lpm com a presença contínua de 20mM do 2,4-D, via indireta: meio de cultura Lpm com 15 dias na presença
de 20mM do hormônio 2,4-D e tratamento controle com sementes e folhas de plântulas em meio de cultura Lpm
na ausência do hormônio. A metilação do DNA foi analisada através da extração do DNA seguida de digestão e
amplificação através de 6 primers: OPL-4, OPL-7, OPL-11, OPL-13, OPBB-09 e OPBB-18. A metilação do DNA ocorreu
em praticamente todas as amostras, entre 600 a 1.350 pares de bases. Tanto os embriões somáticos normais quanto
os anômalos apresentaram os mesmos níveis de metilação do DNA, enquanto que em amostras de células de
folhas de plântulas e sementes não ocorreu amplificação, mostrando a não metilação. Sendo assim, apesar de o 2,4D ser essencial na indução dos embriões somáticos, os resultados indicam que ele está ligado a metilação do DNA,
podendo ser responsável pela formação de embriões anômalos e incapacidade deste na formação de plântulas.
Apoio financeiro: PIBIC/CNPq
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Clonagem por meio de estaquia em Nim Indiano
(Azadirachta indica A. Juss) variando concentrações de
AIB e posições da estaca no ramo
Delmonte, KO2; Neri, SCM2; Silva, TR2; Morelli, S1; Arruda, AS2; Oliveira-Júnior, RJ1,2
1
2
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
Universidade Estadual de Goiás, UnU-Ipameri
Palavras-chave: Margosa, Propagação assexuada, Fitormônios, AIB, Posição no ramo.
O nim ou margosa (Azadirachta indica A. Juss) é uma espécie arbórea da família Meliaceae. O principal
produto é o óleo retirado das sementes, que contém inúmeros compostos ativos com ação inseticida, sendo a
azadiractina o mais importante. Sua madeira é amplamente utilizada e a espécie também possui propriedades
medicinais, sendo utilizada como fitoterápico para diversas doenças. A espécie iniciam seu estágio reprodutivo
de desenvolvimento a partir de 3 a 5 anos de idade, mas não atingem o pico máximo de produtividade antes de
10 anos de idade. Desta maneira, a propagação assexuada é uma alternativa para a produção de mudas desta
espécie. A propagação vegetativa possui lugar especial no setor florestal, onde o seu uso econômico é justificado
quando há disponibilidade de genótipos de alta produtividade e ou, se as sementes são insumo limitado. Nestas
condições, um programa de melhoramento que utiliza a propagação vegetativa pode distribuir com maior rapidez
e eficiência os ganhos adquiridos pelo melhoramento genético, capturando o componente genético total, o que
resulta em maiores ganhos dentro de um mesmo ciclo de seleção. O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade
da propagação vegetativa via estaquia, a influência da posição da estaca no ramo e do hormônio AIB processo de
propagação clonal de Nim. Os indivíduos utilizados no experimento foram coletados na fazenda experimental
da UEG UnU-Ipameri com idade de 9 anos. Foram produzidas estacas de 12 centímetros provenientes de
diferentes posições no ramo (basal, mediana e apical). As estacas foram submetidas a diferentes concentrações
de AIB (0, 375, 750, 1500 e 3000 mg/L). As análises foram realizadas após 45 dias e os resultados indicaram haver
uma interação significativa ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F entre as concentrações hormonais e as
posições no ramo. Tanto as emissões de brotações como o enraizamento demonstraram maior efetividade na
posição basal e medial do ramo, assim como observado em outras espécies lenhosas, nas concentrações de
AIB de 0 e 375 mg/L. Tal resultado é explicado pelo gradiente de juvenilidade dos ramos. Na posição mediana,
houve um incremento de brotações com o aumento da concentração de AIB. Os resultados indicam que é
viável a propagação clonal do Nim e experimentos futuros poderão trazer respostas acerca da concentração
hormonal ideal para o melhor enraizamento das estacas da espécie. As informações relacionadas à propagação
vegetativa do Nim poderão trazer informações valiosas para programas de melhoramento genético da espécie.
Apoio financeiro: CAPES; UFU; UEG; FAPEMIG; CNPq
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Propagação in vitro de Ricinus communis L.
Dias, ACC1; Borges, NA1; Mendes, MG1; Londe, LN 2; Kerr, WE1; Bonetti, AM1
Universidade Federal de Uberlândia - Instituto de Genética e Bioquímica - Laboratório de Genética
EPAMIG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: mamona, cultura de tecido vegetal, Ricinus comunis, reguladores de crescimento, propagação.
Diante da elevada demanda energética mundial, bem como da necessidade da busca por fontes renováveis e
menos agressivas ao meio ambiente, a mamoneira (Ricinus communis) destaca-se como excelente alternativa.
O estabelecimento por meio de cultura de tecido vegetal é essencial para a micropropagação, germinação in
vitro e programas de melhoramento da espécie. Nesse trabalho, o objetivo foi estabelecer a propagação in vitro e
avaliar o comportamento de Ricinus communis L. mediante os reguladores de crescimento ácido naftalenoacético
(ANA) e 6-benzilaminopurina (BAP). Na desinfestação dos expalntes foi empregado o hipoclorito de sódio a
2,5% de cloro ativo e etanol (100%). Explantes de gemas apicais foram cultivados em meio MS acrescido de ácido
ascórbico (800 mg/L), carvão ativado ( 3g/L), agar (6g/L) com pH ajustado para 6,0 antes da autoclavagem. O
delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC) em esquema fatorial (4x4), 16 tratamentos com 4
repetições, sendo 4 tubos por parcela. Após 30 dias de cultivo foram avaliados: taxas de contaminação e oxidação
e comprimento das brotações. As taxas de contaminação e oxidação total do experimento foram de 28,1% e
de 31% respectivamente. A média do comprimento das brotações foi de 0,55cm por explante. O protocolo de
desinfestação realizado foi adequado, pois as taxas de contaminação e oxidação atingiram valores satisfatórios
quando comparado com dados da literatura. O meio MS acrescido de ANA e BAP propiciou a brotação dos
explantes sendo indicado para utilização nos processos de melhoramento da espécie via cultura de tecido vegetal.
Apoio financeiro: UFU; CAPES; FAPEMIG; CNPq
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Tratamento de plantas de cana-de-açúcar a condições
de estresse hídrico e construção de bibliotecas
subtrativas
Melo, ALJO1; Silva, HC1; Silva, RL1; Vasconcelos, RRR1; Ferreira, ACF1; Barreto, KFM1; Scortecci, KC1
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica – Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte.
[email protected]
1
Palavras-chave: cana-de-açúcar, estresse hídrico, biblioteca subtrativa, morfologia, gene.
Introdução: A cana-de-açúcar é uma das culturas agrícolas mais importantes do Brasil, por ser utilizada como
matéria prima para a produção de açúcar e etanol. A seca é um dos fatores mais cruciais do estresse ambiental,
limitando a produção de cana no mundo inteiro, principalmente em áreas áridas e semi-áridas. A escassez de água
pode induzir um estresse hídrico, que resulta em alterações morfológicas e bioquímicas na planta, dentre elas a
redução da área foliar, crescimento do sistema radicular e fechamento dos estômatos. As estratégias adotadas pelas
plantas para suportar estresses abióticos dependem da expressão de genes que estão envolvidos em sinalização e as
vias de regulação. Objetivos: estabelecer um protocolo para cultivo de cana em salas de crescimento com condições
controladas, submissão das plantas a condições de estresse hídrico e a construção de bibliotecas subtrativas,
com o intuito de prospectar genes diferencialmente expressos nessas condições. Metodologia: as plantas foram
cultivadas em areia ou vermiculita, de modo a analisar a germinação e desenvolvimento nesses substratos. Em
outro experimento foi os colmos foram selados com parafina nas extremidades, de modo a avaliar a melhoria na
germinação e desenvolvimento destas plantas. Determinada a melhor metodologia de cultivo, a próxima etapa foi
realizado o estresse hídrico, no qual foram utilizadas variedades resistente e sensível à seca. Para a construção das
bibliotecas subtrativas, foram isoladas raízes e folhas para a extração de RNA. A biblioteca foi construída utilizando
os kits da Clontech: Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis e o PCR-Select TM cDNA Subtraction. Em seguida, o material
obtido foi clonado no vetor pGEM T-easy (Promega) e as colônias brancas obtidas em E.coli foram seqüenciadas.
Resultados: Foi observado em condições de sala de crescimento que a utilização de vermiculita como substrato e o
isolamento dos colmos com parafina mostrou-se mais eficientes para o manejo das plantas. Em relação ao tratamento
de estresse hídrico foi observado que o genótipo sensível não suportou mais de dez dias de tratamento, enquanto
que o genótipo resistentes a estresse hídrico só apresentou modificações morfológicas como amarelecimento e
fechamento das folhas após o 15º dia de tratamento. Com o RNA extraído de folhas das plantas controle e das
plantas submetidas a 10 de estresse hídrico foram construídas duas bibliotecas subtrativas (foward e reverse). Foram
obtidos 400 clones de cada biblioteca, destes foram selecionou-se 30 clones de cada biblioteca para serem digeridos
com a endonuclease de restrição EcoRI. Foram observados fragmentos entre 400-600pb. Conclusões: o protocolo
estabelecido permitiu realizar o tratamento do estresse hídrico em condições controladas onde foram observadas
alterações morfológicas e fisiológicas. As duas bibliotecas subtrativas de cDNA provavelmente apresentam
diferentes fragmentos uma vez que a faixa obtida foi de 400-600pb, o esperado para as bibliotecas subtrativas.
Auxílio financeiro: CNPq
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Sugar signaling on the regulation of the CBL/CIPK
network in sugargane contrasting sugar amount
varieties
Ribeiro, C¹; Felix, JM¹; Menossi, M¹
¹ Plants Functional Genomics Laboratory- Biology Institute- Genetics and Evolution Departament- University of Campinas- UNICAMP
[email protected], [email protected]
Keywords: sugarcane, sugar signaling, CBL-CIPK.
In plants, sugar has an important role controlling vegetable’s growth and development. However the information
about the signaling pathways and its correspondent molecular mechanisms of sugar regulation are scarce,
especially in sugarcane, which has a formidable capacity of sucrose accumulation. Previous results identified
a gene from a protein kinase, denominated ScCIPK8 (Sugarcane CBL-interacting protein kinase 8) that could
participate in signal transduction pathways, that was already differentially expressed in a contrastant population
with higher amount of sugar in sugarcane in microarrays experiments. Other results has detected that it´s
suppression in trangenics sugarcane caused an increase in the sucrose amount at the leaves. The CBL/CIPK
network is involved in diverse signaling pathways, which uses calcium as second mensenger, and at carbohydrates
metabolism. At this point, the main objective of this project was the identification if the different sugar
signaling and its analogues influence the expression of the genes CIPK8 and the 6 sugarcane´s CBLs identified
through datamining at the SUCEST data bank. Through the results obtained it was possible to verify that the
expression of the CIPK8 and the sugarcane´s CBLs genes show alterations in it´s genic expression in response
to sugar treatments. This response varies between the high and low Brix varieties, as the genes in the high Brix
plants are mostly induced for these treatments. Besides, it has been evidenced that the CBL-CIPK network is
not regulated through the hexokinases dependent pathways, because the hexoses were recognized and has
altered the genic expression profile in the present study but without the metabolization. This was the first step
aiming to clarify the way of action of sugar as signaling molecules inside the CBL/CIPK network in sugarcane.
Financing support: FAPESP
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Análise in sílico de um cDNA homólogo a proteína
SEC14 em cana-de-açúcar
Nascimento, AKL; Souza, VDS; Scortecci, KC
LBMG laboratório, Depto de Biologia Celular e Genética, DBG, UFRN
[email protected]
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, florescimento precoce, análise in sílico, SEC14, genótipos.
A cana-de-açúcar constitui uma importante fonte para a economia brasileira, sendo o Brasil responsável por mais
de 25% da produção mundial. O Nordeste brasileiro vem contribuindo com uma menor parcela de 13 % neste
setor econômico, verificando-se uma redução de até 60% na produção de açúcar e álcool devido as condições
edafo-climáticas e florescimento precoce. O presente trabalho tem o objetivo de caracterizar in silico alguns
cDNAs prospectados anteriormente em experimentos de biblioteca subtrativa. Foi realizada uma análise in
silico utilizando ferramentas da bioinformática como os programas G-blocks, ClustalW, Expansy, CDD, PAUP
4.0 e Tree View. O banco de sequências gerado no desenvolvimento do trabalho utilizou os seguintes bancos de
dados: TIGR, TAIR, DFCI, NCBI. Na busca de domíneos foi encontrado os domínios SEC14-like e CRAL_TRIO,
o primeiro trata de um domínio lipídico vinculativo, encontrado em proteínas secretoras, como a proteína de
transferência de fosfatidilinositol (PI) em S. cerevisiae, além de participar no metabolismo de fosfoinositídeos
durante a transdução de sinal e tráfego vesicular. Estudos indicam que SEC14 é importante para regulação do
metabolismo de fosfatidilcolina (PC) e para assegurar que diacilglicerol esteja disponível no Golgi para a formação
de vesículas. O domínio CRAL_TRIO parece ser o local de ligação aos fosfoinositídeos. Os resultados das análises
in sílico demonstraram uma similaridade da proteína SEC14 com as de arroz entre 67 a 100%, com as de Medicago
truncatula entre 67 a 68%, com a de sorgo 96%, com a de milho 94%, com as de Lotus japonica entre 69 e 73% e
com as de Arabidopsis thaliana entre 64 a 67%. A relação filogenética destas seqüências, mediante construção da
árvore filogenética, indicou que o domínio SEC14 encontra-se conservado em todas as espécies comparadas e que
houve uma separação entre monocotiledôneas e dicotiledôneas em dois ramos distintos. O padrão de expressão
deste cDNA para os dois genótipos precoce e tardio de cana-de-açúcar foi análisado por PCR em tempo real
durante o período de agosto de 2007 a fevereiro de 2008. Foi observado uma variação entre os dois genótipos,
entretanto um nível de expressão maior no genótipo com floração precoce. Como base nesses resultados este
cDNA foi escolhido para uma caracterização funcional por meio da construção de cassetes de super-expressão.
Auxílio financeiro: CNPq
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239
Ação gênica na detecção de Oligogenic Trait Loci em
população de RIL com 500 indivíduos
Mangaravite, E¹; Ferreira, MFS¹; Ferreira, A¹
¹Departamento de Produção Vegetal, Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
Palavras-chave: Mapeamento, OTL, simulação, RILs, locos gênicos
Introdução: Características oligogênicas apresentam herança governada por poucos genes e são importantes
para espécies vegetais, destacando-se a resistência a doenças. A natureza discreta e a interação epistática destas
características geram um padrão de herança que não deve ser interpretado pelos métodos tradicionais de
detecção de QTL. A busca por métodos que permitam melhor interpretação da informação genética produzida
durante a recombinação tem sido realizada através de mapeamento e identificação de locos controladores de
características oligogênicas (OTLs - Oligogenic Trait Loci). Objetivo: Verificar o efeito de locos com diferentes ações
gênicas, na detecção de OTL em populações de linhagens endogâmicas recombinantes (RILs - Recombinates
Inbred Lines) simuladas de 500 indivíduos. Métodos: Utilizando o programa GQMOL foram simuladas três
características, C1, C2 e C3 em um genoma de quatro grupos de ligação. Cada característica foi simulada em
100 populações de RILs de 500 indivíduos cada. Para a característica C1 simularam-se três locos, com ação de
50%, 20% e 10% cada. Para C2, dois locos com 50% e 30% de ação cada. E para a característica C3 dois locos
simulados com ação de 50% cada. A partir destes dados realizou-se o Método de Mapeamento de Características
Oligogênicas (MMCO) em cada uma das populações simuladas. Resultados: Os números de OTLs encontrados
nos grupo de ligação (GL) simulados, de acordo com a ação de cada loco, foram: 49, 39 e 44 OTLs em C1; 87 e 32
OTLs em C2; e 58 e 41 em C3. Assim, as populações, em geral, apresentaram baixa obtenção de OTL utilizando a
metodologia MMCO, sendo apenas dois locos com mais de 50% de OTLs obtidos. Alguns OTLs foram encontrados
no GL simulado. Mas, geralmente encontraram-se posicionados em intervalo incorreto. Conclusões: A ação
gênica dos locos não influenciou a detecção de OTL em população de RIL com 500 indivíduos. Evidenciouse que a metodologia MMCO não foi eficiente para a detecção de OTLs em RILs. Estudos adicionais, mais
abrangentes, são necessários para avaliar a utilização ou não da metodologia MMCO em populações de RIL.
Apoio financeiro: UFES e FAPES
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240
Caracterização in silico de cDNA homólogo a
OSMOTINA, identificado em bibliotecas subtrativas de
tomateiro
Sousa, IAL¹; Estevam, RKS¹; Scortecci, KC¹
¹Laboratório de Biologia Molecular e Genômica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte; Departamento de Biologia Molecular e
Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
Palavras-chave: tomateiro, floração, OSMOTINA, análise in silico, árvore filogenética.
Introdução: Os diversos tipos de tomate (Solanum lycopersicon) comercializados são resultados de autofecundações
sucessivas que almejam o desenvolvimento de linhagens com características comercialmente aceita. O tomateiro
apresenta um genoma pequeno (950Mb) e um ciclo rápido de desenvolvimento em aproximadamente 70 a 90
dias, a espécie L. pimpinelifolium é conhecida por possuir inflorescência com abertura simultânea de 15-30 flores,
contendo desta forma, maior número de flores em relação ao cultivado Micro-Tom (L. esculentum) e conseqüente,
maior produção de frutos. Considerando a grande importância econômica do tomate, tornam-se importantes
estudos genéticos sobre quais genes possam estar associados com o processo da floração. Anteriormente, foram
construidas oito bibliotecas subtrativa de cDNA e, foram identificados diversos genes possivelmente ligados ao
processo de floração em tomateiro dentre eles o cDNA homólogo a proteína OSMOTINA. Objetivo: Caracterização
in silico do cDNA com homologia a OSMOTINA. Metodologia: Utilizando a sequência previamente identificada nas
bibliotecas subtrativas foram procuradas sequências com homologia a proteína OSMOTINA. A análise in silico
utilizou as ferramentas da bioinformática como os programas G-blocks, ClustalW, Expansy,CDD, PAUP 4.0 e Tree
View. O banco de sequencias gerado no desenvolvimento do trabalho utilizou os seguintes bancos de dados: TIGR,
TAIR, SGN, Wheat genome database, NCBI. Resultados: Os resultados da análise in sílico permitiram observar
13 domínios protéicos funcionais sendo todos da super-família taumatina. A proteína OSMOTINA de tomateiro
apresentou identidade entre 70% e 41% com proteínas de Arabidopsis thaliana, de 44% e 39% com proteínas de
Solanum tuberosum, 65% e 63% de identidade protéica com Medicago Trunculata, 65% com Triticum aestivum e,
por fim, identidades de 63% e 48% com Zea mays. Na árvore gerada não houve separação entre as proteínas de
monocotiledônea e de dicotiledôneas, nem mesmo entre as famílias, indicando uma possível evolução do gene
através de duplicações antes mesmo de haver a separação entre estes grupos. A OSMOTINA mostrou-se como grupo
irmão da proteína de Arabidopsis thaliana com a qual possuía 70% de identidade. E o clado formado por ambas
está inicialmente associado ao clado composto pela proteína de Z. mays e a de T. aestivum, essa diversificação em
diferentes ramos aponta para prováveis caminhos evolutivos alternativos. Conclusões: OSMOTINA e a taumatina
fazem parte do grupo PR5, composto pelas proteínas relacionadas ao metabolismo de defesa vegetal, o que corrobora
com a homologia entre os domínios apesar de sua a conservação não ser de 100%. A maior proximidade filogenética
com uma das sequências protéicas da A.thaliana condiz com estudos anteriores que demonstram homologias
funcionais entre diversos genes dessas duas plantas, inclusive de floração, e como essa proteína foi obtida através
de bibliotecas subtrativas de ápices meristemáticos é interessante realizar a sua caracterização funcional in vivo.
Apoio financeiro: CNPq e PROPESQ-UFRN
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241
Análise da expressão do gene SERK em Milho (Zea
mays L.) submetido a estresse salino
Madeira, LRT¹; Freitas, RM¹; Tavares, LS²; Santos, MO³
Graduandos em Ciências Biológicas do Departamento de Biologia, ICB, UFJF
Professora do Departamento de Biologia, ICB, UFJF
3
Professor do Departamento de Biologia, ICB, Grupo de Pesquisa Genética e Biotecnologia Vegetal, UFJF
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Estresse salino, Expressão, PCR, ZmSERK, SHS 3031
Introdução: A crescente salinização de áreas agricultáveis é um dos problemas enfrentados por produtores de
regiões áridas e semi-áridas de todo o mundo. No Brasil a região nordeste é a mais atingida, em razão, principalmente
da intensa evapotranspiração, baixas precipitações e irrigação.(Silveira et al., 2001). A salinidade do solo é um
dos mais importantes fatores ambientais limitantes do crescimento e desenvolvimento de plantas. Estudar o
mecanismo de tolerância ao sal em plantas no nível molecular, pode oferecer interessantes genes candidatos e
informações valiosas para melhorar a tolerância salina. (Li et al., 2009). A sinalização celular tem um importante
papel no metabolismo celular principalmente no crescimento e na resposta defensiva. Nesse processo, o padrão de
expressão do SERK (somatic embryogenesis receptor kinase) em culturas sugere que ele é uma parte dos caminhos
de sinalização mediados por mudanças de desenvolvimento em resposta as condições do meio de cultura (Santos
e Aragão, 2009). Objetivos: Verificar os padrões de expressão do gene SERK em plantas submetidas a tratamentos
alternados (0h, 24h, 48h) possibilitando a compreensão das respostas a diferentes tipos de estresse. Métodos:
Foram utilizadas sementes da linhagem comercial hibrida SHS 3031. A germinação foi feita em placas de Petri com
filtro e água. Cinco dias após a protusão das radículas as plantas foram submetidas aos tratamentos com meio MS
na concentração salina (NaCl) de 300mM por 0, 24 e 48h, logo após as raízes de cada tratamento foram extraídas
e imediatamente armazenadas em nitrogênio líquido. Em seguida foi feita a extração de RNA total, tratado com
enzima DNase para a remoção DNA contaminante, posteriormente foi feita síntese do cDNA.O RT-PCR foi feito
com primers desenhados para amplificar os segmentos alvo do cDNA. O material foi analisado por corrida em gel
de agarose TBE 1%. Resultados: O gene SERK apresentou um pico de expressão nas plantas tratadas com 300mM de
NaCl por 24h, em contrapartida as plantas tratadas por 0h (controle) e 48h não apresentaram esse pico. Conclusões:
A análise dos resultados permite-nos inferir que a expressão do gene é influenciada por fatores bióticos e abióticos,
porém essa influência não parece ser duradoura. A queda da expressão após um curto período demonstra que
esse é um mecanismo inicial de resposta. Sendo as raízes os primeiros locais de percepção e lesão pela salinidade.
Apoio financeiro: FAPEMIG
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242
Transformação genética de nós cotiledonares de soja
via Agrobacterium tumefaciens para silenciamento
gênico, via interferência por RNA (RNAi), do inibidor de
protease do tipo Bowman-Birk A
Silva, WG1,2; Barros, BA2,3; Moreira, MA1,2; Barros, EG2,3
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Instituto de Biotecnologia Aplicada à Agropecuária (BIOAGRO)
3
Departamento de Biologia Geral - Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Transformação genética, Soja, Agrobacterium tumefaciens, Bowman-Birk, Cultura de tecidos.
A soja apresenta destacada importância no cenário econômico mundial devido às suas características agronômicas
e pela composição das frações lipídica e protéica presentes no grão. No entanto, essa leguminosa também apresenta
fatores antinutricionais, como inibidores de proteases e fatores alergênicos, que limitam a sua disponibilidade
a um grande número de consumidores. Dentre estes fatores estão a proteína alergênica P34 e os inibidores de
proteases do tipo Bowman-Birk. O objetivo deste trabalho foi o de transformar nós cotiledonares de soja via
Agrobacterium tumefaciens, contendo cassetes para silenciamento do gene que codifica o inibidor de protease do
tipo Bowman-Birk A. Sementes da variedade CAC-1 foram desinfestadas em câmara de cloro e germinadas em
meio de cultura. Os cotilédones foram feridos na região do nó cotiledonar e incubados por 30 min em suspensão
de Agrobacterium tumefaciens (KYRT1) contendo o cassete para silenciamento gênico do inibidor BBI-A em soja.
O excesso de suspensão foi retirado com o auxílio de papel filtro estéril e os explantes inoculados em meio de
co-cultivo por 5 dias no escuro. Em seguida, os explantes foram cultivados em meio para indução de brotos por
14 dias e, então, subcultivados no mesmo meio contendo 3 mg/L de glufosinato de amônio para a seleção de
transformantes. O alongamento dos brotos foi induzido por 28 dias (14 dias com e 14 dias sem o agente seletivo)
e os brotos alongados foram transferidos para o meio de enraizamento. Após a regeneração, as plântulas foram
aclimatadas em substrato, sob um sistema de nevoeiro e posteriormente mantidas em casa de vegetação. Foram
utilizados 555 explantes, sendo 60 controles, obtendo-se até o momento 4 plantas possivelmente transformadas, 1
planta controle e 4 plantas em processo de aclimatação. Os eventos de transformação deverão ser confirmados por
meio de PCR convencional e os níveis de expressão do gene de interesse serão verificados por PCR em tempo real.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG
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243
DNA shuffling e Phage Display produzindo diversidade
de variantes de inibidores de α-amilases com
potencial para o controle de insetos bruquídeos
Oliveira, UA1,3; Sarto, RP2; Macedo, LLP3; Lourenço, IT1,2; Oliveira-Neto, OB1; Coutinho, MV1; Albuquerque,
EVS1; Grossi de Sá, MF1; Silva, MCM1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF
Departamento de Biologia Celular-Universidade de Brasília-DF
3
Universidade Católica de Brasília -DF
1
2
Palavras-chave: Inibidores de α-amilases, DNA shuffling, insetos bruquídeos.
Para se defender do ataque de insetos-praga as plantas podem confiar somente em seu sistema inato de defesa.
Vários compostos podem ser constitutivamente produzidos durante o desenvolvimento da planta ou induzido após
um ferimento causado pelo ataque de insetos. Entre esses compostos estão os inibidores de enzimas hidrolíticas
(proteases ou glicosidases) que atuam na quebra de macromoléculas e liberação de elementos essenciais para o
desenvolvimento do inseto. Vários estudos já relataram o efeito dos inibidores de α-amilases (αAIs) sobre algumas
α-amilases de insetos causadores de perdas econômicas para a produção agrícola. O potencial desses inibidores
foi mostrado em sementes de feijão comum (Phaseolus vulgaris) e também em algumas plantas transgênicas. Os
αAIs isolados de feijão comum, denominados α-AI1 e α-AI2 têm sido caracterizados como moléculas inseticidas.
Apesar de ambas isoformas apresentarem alta identidade de sequência de aminoácidos (78%), suas atividades
inibitórias são extremamente específicas. O α-AI1 é capaz de inibir α-amilases de insetos coleópteros como os
carunchos do feijão-caupi (Callosobruchus maculatus), do feijão Azuki (C. chinense), além de inibir as α-amilases
de saliva de humanos e de pâncreas de porco. No entanto, o α-AI2 inibe as α-amilases dos carunchos de feijão
mexicano (Zabrotes subfasciatus) e de ervilha (Bruchus pisorium), mas não inibe a α-amilase de mamíferos. No
presente estudo apresentamos uma estratégia para gerar e selecionar novos αAIs com potencial para inibir as
α-amilases de insetos bruquídeos. O procedimento incluiu uma mistura de dois genes (codificadores para α-AI1
e α-AI2), os quais foram recombinados pela técnica de DNA shuffling. O produto dessa recombinação foi aplicado
na técnica de Phage display e possibilitou a geração de uma biblioteca combinatória contendo 107 genes variantes.
Vários genes foram selecionados durante o procedimento de biopanning por apresentar afinidade por α-amilases
extraídas de larvas de insetos que atacam feijão. Quatro entre os dez variantes introduzidos e expressando a
proteína recombinante, em planta modelo (Arabidopsis thaliana), indicaram interessante variabilidade nos
níveis de atividade inibitória em testes sobre a α-amilase de Z. subfasciatus. Visando identificar os elementos
envolvidos em diferença de especificidade, as sequências dos novos inibidores foram determinadas e utilizadas
nos estudos estruturais incluindo modelagem molecular e interação proteína-proteina. Os resultados indicaram
a eficiência da estratégia, que combinou as técnicas de DNA shuffling e Phage display para disponibilizar
grande diversidade gênica e possibilitou a seleção de genes candidatos, que após completa caracterização
poderão ser usados na produção de plantas transgênicas, objetivando auxiliar no controle de insetos.
Apoio financeiro: Embrapa, CNPq, FAPDF
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244
Análise da expressão gênica de MAPK de Eucalyptus
grandis e em plantas transgênicas de tabaco
Kirch, RP1; Körbes, AP1,2; Margis, R1; Bodanese-Zanettini, MH2; Pasquali, G1
Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Instituto de Biociências, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK), Eucalyptus grandis, tabaco, RT-qPCR, tolerância a estresse.
Estresses como frio, calor, luminosidade, excesso e falta de água, presença de patógenos e alterações nos níveis
hormonais provocam uma série de modificações morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e moleculares nas
plantas. Para contornar as adversidades ocasionadas nestas situações, as plantas devem ser capazes de gerar
respostas adaptativas que irão garantir a sua sobrevivência. Para tanto, elas contam com mecanismos eficientes
de transdução de sinais, responsáveis por perceber estímulos e transportá-los até o núcleo celular. É desta maneira
que atua a cascata das proteína-quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), pela qual o estímulo percebido na
superfície da célula é transmitido até o nível da transcrição gênica. Devido à sua importância para as células, a
MAPK5, que pertence ao subgrupo A das MAPKs, teve sua expressão quantificada em plântulas de E. grandis
submetidas a diversas condições de estresse e em plantas de Nicotiana tabacum SR1 transformadas com
Agrobacterium tumefaciens contendo o plasmídeo pCAMBIA2300::35S-mapk5-3’nos. Um total de 15 linhagens de
tabaco foi obtido após a transformação. A condição transgênica das plantas foi comprovada por PCR específica
e RT-qPCR para o gene mapk5. O perfil de segregação do gene foi avaliado pela resistência das plantas à
canamicina (Kan). As plantas que demonstraram mais alta resistência a este antibiótico (4 plantas transformadas
+ controle) foram selecionadas para bioensaios com cloreto de sódio (NaCl), ácido abscísico e manitol em solo.
Também foi realizado bioensaio para a seca. Além disso, as plantas transgênicas foram submetidas a ensaios
de germinação em meio MS e em meio MS acrescido de NaCl. Os níveis de MAPK5 de eucalipto aumentaram
quando as plântulas foram tratadas com quinetina e NaCl. Todas as plantas transgênicas analisadas por RTqPCR mostraram uma super-expressão do gene em comparação com a planta controle. O ensaio de germinação
mostrou que não há diferença significativa na taxa de germinação entre plantas transgênicas e não transgênicas,
mas que o desenvolvimento das plantas transformadas é mais acelerado do que o das não transformadas, o que
também ocorreu na presença de NaCl. Atualmente estão sendo realizados ensaios de quantificação de clorofila
e avaliação do peso fresco/peso seco das plantas transformadas e não transformadas. Conclusões: de acordo
com o perfil de expressão apresentado pelas plântulas de eucalipto frente aos tratamentos aplicados, pode-se
sugerir que a MAPK5 tem participação importante em processos como sinalização do crescimento e geração de
respostas de defesa ao estresse salino; a germinação das sementes e o desenvolvimento das plantas transgênicas
é mais acelerado em comparação com as não-transgênicas, mesmo na presença de NaCl, o que permite
inferir que a MAPK5 de E. grandis é um regulador positivo da tolerância a vários tipos de estresses abióticos.
Apoio: CAPES/MEC; CNPq/MCT; MCT e Projeto GENOLYPTUS
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Análise In silico e construção de cassete de super
expressão de cDNA homólogo ao fator de transcrição NAC
Souza, VDS; Silva, FL; Nascimento, AKL; Ferreira, ACF; Scortecci, KC
Laboratório LBMG. Depto de Biologia Celular e Genética, DBG, UFRN
[email protected], [email protected]
Palavras-chave: floração, cana-de-açúcar, NAC, analise in silico RT-PCR
A produção de combustível a partir de fontes renováveis é interesse crescente em todo o mundo em resposta à
redução das reservas de combustíveis fósseis e aumento da liberação de material particulado pela combustão
desses na atmosfera. A cana-de-açúcar, além de permitir a obtenção do combustível é fonte para a extração
do açúcar, produto que se destaca na economia brasileira. A produção de açúcar e etanol a partir da cana-deaçúcar é uma atividade econômica de grande importância para o Brasil, que contribui com 45% da produção
mundial, sendo o maior produtor da cana no mundo. Entretanto a região norte/nordeste contribui com apenas
13% de toda a produção nacional. O florescimento precoce é um processo indesejável em culturas comerciais por
resultar em isoporização do colmo e pode ser antecipado em condições edafoclimáticas como as apresentadas
pela região nordeste. As perdas na produção podem atingir até 60%. O objetivo desse trabalho foi de analisar
in silico um cDNA homólogo ao fator de transcrição NAC e construir cassetes de super-expressão para sua
caracterização funcional. A análise in silico foi realizada contra os bancos de dados de plantas NCBI, TIGR e
COMPBIO e TAIZ utilizando diferentes ferramentas de bioinformática (G-blocks, ClustalW, Expansy, PAUP 4.0
e Tree View). O fator de transcrição NAC corresponde a uma família de fatores de transcrição únicos de plantas.
Plantas transgênicas que superexpressam a forma ativa de NTL8, exibem atraso no início da floração, bem como
redução do crescimento, e apresentam pequenas folhas enroladas. Os resultados das análises in sílico mostrou
que o cDNA NAC de cana-de-açúcar apresentou 57% de similaridade a uma sequencia de Oryza sativa, e 37% de
similaridade a uma sequência de Arabidopsis thaliana e 89% de similaridade a uma sequência de Sorghum. Dados
da árvore filogenética apontaram separação entre monocotiledôneas e dicotiledôneas. O padrão de expressão
deste cDNA para os dois genótipos precoce e tardio de cana-de-açúcar foi análisado por PCR em tempo real
durante o período de agosto de 2007 a fevereiro de 2008. Foi observado uma variação entre os dois genótipos,
sugerindo que esta sequencia possa ter um papel inibidor no processo de florescimento. Como base nesses
resultados, este cDNA foi escolhido para uma caracterização funcional por meio da construção de cassetes de
super-expressão. Esta seqüência foi amplificada por PCR e clonada no vetor pGEM-Teasy (Promega) e depois foi
transferida para um vetor intermediário contendo o promotor 35S. Este cDNA foi clonado na orientação senso e
anti-senso. Estas construções foram confirmadas a partir da análise do padrão de restrição utilizando diferentes
endonucleases de restrição. Em seguida, os cassetes 35S::NAC foram transferido para o vetor binário pZP211, que
posteriormente foram transformadas em Agrobacterium tumefaciens LBA4404, para transformação das plantas.
Apoio: CNPq, CAPES
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246
O uso do intron trnL (UAA) como DNA barcoding de
plantas e como ferramenta na análise de dieta de
roedores herbívoros
Heidtmann, LM1; Silva Filho, PJS2; Lopes, CM1,3; Freitas, TRO1.3
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Departamento de Botânica, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
3
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: marcadores moleculares, Ctenomys, gramíneas, espécies vegetais, alça P6.
Diferentes marcadores moleculares têm sido propostos como DNA barcoding em plantas, dentre eles o íntron
trnL (UAA) do cloroplasto. Este íntron, apesar de curto, é bastante informativo, sendo amplamente utilizado para
reconstrução de filogenias entre plantas proximamente relacionadas, o que vem aumentando gradativamente a
disponibilidade destas sequências em bancos de armazenamento de genes, e por consequência permitindo seu
uso como ferramenta para a análise da dieta de herbívoros. Os principais objetivos deste trabalho são: validar o
íntron trnL (UAA) como DNA barcoding para diferentes espécies vegetais dos campos sulinos, principalmente
gramíneas, que possuem sobreposição na área de ocorrência com as diferentes espécies de roedores herbívoros
do gênero Ctenomys no Sul do Brasil; e organizar uma base de dados de sequências deste íntron para
posteriormente comparar com amostras de fezes e conteúdos estomacais destes roedores subterrâneos, a fim
de analisar a composição de suas dietas. Até o momento 22 amostras de plantas foram analisadas, destas 19
são de espécies diferentes, distribuídas em 9 famílias, e as outras 3 amostras são da mesma espécie. Os primers
c e d foram utilizados para a amplificação e sequenciamento do íntron trnL (UAA). As análises das sequências
foram realizadas no programa Mega 4.1. Em média, 549pb foram amplificados, variando entre 460 e 615pb. A
diferença no tamanho destas sequências se deve às inúmeras inserções e deleções ao longo do íntron comparando
as diferentes espécies. Dos sítios analisados, 255 são conservados e 379 variáveis, dentre os quais 259pb são
parsimoniosamente informativos e 119 constituem singletons. Uma pequena região de aproximadamente 93pb,
correspondente a alça P6, localizada próxima da extremidade 5’ do íntron, apresentou-se bastante variável
sendo flanqueada por regiões bem conservadas, podendo ser utilizada como ferramenta na análise de fezes e
conteúdos estomacais das diferentes espécies de Ctenomídeos no Sul do Brasil. As 3 amostras da mesma espécie
apresentaram o mesmo haplótipo. A comparação das sequências das 19 espécies demonstrou que cada uma
apresenta um haplótipo distinto, permitindo a diferenciação entre as espécies e demonstrando a eficácia do
íntron trnL (UAA) como DNA barcoding das espécies vegetais analisadas até o momento. Além disso, a região
conhecida como alça P6 possui as características necessárias para a análise da dieta dos herbívoros em questão.
Apoio financeiro: Capes, FAPERGS, CNPq, Departamento de Genética/UFRGS
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247
Análise global do transcriptoma de híbridos de citros
resistentes e suscetíveis a clorose variegada dos
citros (CVC)
Diogo, JA1; Boava, LP1; Yaly, MC1; Coletta, HD1; Souza, AA1; Machado, MA1
1
Centro de Citricultura Sylvio Moreira/IAC, Cordeirópolis, SP, Brasil
Palavras-chave: microarranjos, citros, QTL, resistência a doenças, pool.
As variedades de laranjas doce, as mais cultivadas no Brasil, são as mais suscetíveis a clorose variegada dos citros
(CVC) o que acarreta em grandes prejuízos econômicos numa das mais importantes culturas agrícolas do país.
Dentre os genótipos resistentes a esse patossistema, destacam-se de tangores (Citrus sinensis x C. reticulata),
o que deu suporte a um programa de melhoramento genético com a população de híbridos de laranja Pêra e
tangor Murcott. Para identificar genes diferencialmente expressos em resposta a CVC, um pool de quatro híbridos
altamente resistentes e quatro altamente suscetíveis de uma população obtida a partir do cruzamento entre
tangor Murcott (C. sinensis x C. reticulata) e laranja Pêra (C. sinensis) foram avaliados por análise de microarranjos.
A fim de definir os híbridos resistentes e suscetíveis, as plantas da progênie de 264 híbridos foram infectadas
por borbulhas contaminadas com a bactéria causadora da CVC, Xylella fastidiosa, e os sintomas foram avaliados
após 18 meses. Após a avaliação dos sintomas, folhas de cada híbrido selecionado como resistente e suscetível
foram coletadas para a extração de RNA. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso com quatro
repetições. A lâmina de microarranjos foi projetada utilizando UniGenes selecionados do banco de dados
CitEST (Citrus EST), submetidos ao NCBI (números de acesso GenBank EY649559 para EY842485). A lâmina do
microarranjo contém 32.121, 18.873 e 12.873 unigenes de laranja doce cv. Pêra, tangerina Ponkan (C. reticulata)
e Poncirus trifoliata, respectivamente. A lâmina e as hibridizações foram realizados pela Roche NimbleGen. Um
total de 163 unigenes em diversas categorias funcionais foram detectados como diferencialmente expressos
(Fold> 2) entre os pools de híbridos resistentes e suscetíveis com a análise dos microarranjos. A classificação
funcional dos transcritos induzidos revelou genes candidatos envolvidos com resistência a doenças e que podem
estar envolvidos na resistência à CVC. Treze genes foram selecionados devido ao interesse biológico baseado
em sua função de acordo com o banco de dados CitEST, entre eles, os genes que codificam enzimas da via
dos fenilpropanóides e genes de resistência (genes R). Ensaios de RT-qPCR foram realizados para validação de
quatro genes candidatos nos pools de híbridos resistentes e suscetíveis. Os genes identificados como induzidos
nos genótipos resistentes estão sendo utilizados para o trabalho de mapeamento eQTL (QTLs de expressão).
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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248
Análise da expressão gênica de terpeno sintase em
Lippia
sidoides
Rettore, JVP ; Amaral, DLAS ; Santos, MO ; Tavares, LS
1
1
1
1
Laboratório de Genética e Biotecnologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Juiz de Fora
1
[email protected]
Palavras-chave: Lippia Sidoides, Terpeno Sintase, Timol.
Devido ao uso indiscriminado e irracional de antibióticos, muitos patógenos humanos e animais vêm se tornando
resistentes a agentes antimicrobianos usuais. Soma-se a isso o fato de nenhuma nova classe de antibiótico ter
sido descoberta nos últimos anos, e assim, neste contexto, a busca por novas substâncias antimicrobianas a
partir de fontes naturais, incluindo plantas, tem ganhado importância no mundo acadêmico. Lippia sidoides é
um arbusto do nordeste do Brasil, popularmente conhecido como alecrim-pimenta que tem demonstrado
promissora atividade antimicrobiana. Contendo em sua composição um óleo essencial rico em terpenos como
timol e carvacrol, com propriedades bactericida e fungicida, tem o timol como seu principal constituinte.
Armazenados nas folhas, flores, frutos, caules e raízes de muitas plantas, os terpenos são hidrocarbonetos que
ocorrem como múltiplos de uma unidade estrutural básica, o isopreno, tendo fórmula geral (C5H8)n. O objetivo
deste estudo é analisar a expressão gênica de uma terpeno sintase putativa em três estágios foliares de dois
quimiotipos de Lippia sidoides. As amostras de DNA foram extraídas dos dois quimiotipos pela técnica CTAB,
quantificadas por espectrofotometria e utilizadas como template para o PCR, usando primers degenerados em
gradiente de temperatura. Os fragmentos candidatos foram clonados em pGMTeasy e seqüenciados, e a partir
destas seqüências foram desenhados primers específicos. O RNA total foi extraído usando RNeasy (Qiagen),
quantificado por espectrofotometria e em seguida usado para a síntese do cDNA, usando MMULRV (Invitrogen).
Subseqüentemente foram realizadas reações de PCR semi quantitativas utilizando o primer do 18S como controle
interno. Houve diferença na expressão gênica da terpeno sintase entre os estágios foliares, sendo que no estágio
mais jovem houve uma maior expressão, diminuindo gradativamente no segundo e terceiro estágios. Tal diferença
foi evidenciada em ambos os quimiotipos e confirmada pelo controle interno do gene 18S. Este resultado difere de
outras espécies de Lippia, que em geral apresentam maior expressão de terpenos sintases no estágio intermediário.
Assim, pensando-se na produção de antimicrobianos a partir de fontes vegetais, evidencia-se a importância de
estudos de expressão gênica para escolha do melhor estágio de desenvolvimento da planta a fim de conseguir
um melhor rendimento em extrações do princípio ativo e a melhor fase para indução dos genes relacionados.
Apoio financeiro: FAPEMIG; CNPq
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249
Identificação de GmERD 15 como um novo fator
de transcrição que controla a expressão do gene
GmNRP-B em soja
Moreira, FF1; Alves, MS1; Reis, PAB1; Fontes, EPB1; Fietto, LG2
¹ Laboratório de Biologia Molecular de Plantas/ BIOAGRO, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de
Viçosa
² Laboratório de Biotecnologia Molecular, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: Estresse, GMERD15, Mono-híbrido, Soja, Transfator.
Recentemente foi demonstrado que a proteína GmNRP-B (Asparagine Rich Protein) está envolvida no
desencadeamento do processo de morte celular em resposta a ativação de uma nova via que integra os sinais
de resposta aos estresses osmótico e do RE em plantas de soja. A determinação de fatores de transcrição que
controlam a expressão do gene GmNRP-B permitirá um melhor entendimento bioquímico dos sinais que integram
a resposta a estresses e a morte celular programada em plantas. Este trabalho teve como objetivo principal a
identificação e caracterização de fatores de transcrição que controlam a expressão de GmNRP-B. Para tanto o
promotor deste gene foi clonado de forma a controlar a expressão em leveduras do gene repórter LacZ, que codifica
uma β-galactosidase. Posteriormente, foi realizada triagens de possíveis cDNAs que codificassem transfatores
pelo sistema do mono-híbrido, resultando em um clone positivo. O sequenciamento do DNA do clone positivo
e a comparação de sua sequência com o banco de dados do Phytozome identificou um gene que codifica uma
proteína similar a ERD15 de Arabidopsis. O gene de soja identificado foi denominado GmERD15 e a sequência de
aminoácidos deduzida mostrou que a proteína possui um domínio conservado de interação com proteínas que
se ligam à cauda poli A de mRNAs (PABP). A busca por sequências similares no banco de dados do Phytozome
mostrou que o gene encontra-se duplicado no genoma da soja e que além dos dois genes outros 4 constituem esta
família gênica em soja. A análise do agrupamento destas proteínas mostrou que esta família pode ser subdividida
em pelo menos 3 subfamílias. Nossos resultados indicam que GmERD15 atua no controle da expressão do gene
GmNRP-B revelando uma nova família de transfatores, que atuam no controle da expressão de genes em plantas.
Apoio: FAPEMIG, CNPq (Genosoja)
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250
Caracterização do papel de AtTCP24 no
desenvolvimento de Arabidopsis thaliana
Mendonça, CF 1; Hemerly, AS2; Cabral, LM 1,2
Universidade Federal Fluminense, Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia. Campus Valonguinho- Centro
Niterói - RJ CEP 24210-130
2
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, CCS - Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941590, Rio de Janeiro, RJ, Brazil
1
Palavras-chave: desenvolvimento vegetal, ciclo celular, biomassa, fator de transcrição, diferenciação
Em organismos multicelulares, a organogênese requer um controle preciso do balanço entre divisão e diferenciação
celular. Pouco se conhece, no entanto, sobre os mecanismos moleculares que atuam no desenvolvimento,
interpretando sinalizações internas e estímulos externos, levando a um controle correto de proliferação celular. Nosso
grupo identificou uma nova rede regulatória do desenvolvimento de folhas, na qual a proteína ABAP1 (Armadillo
BTB Arabidopsis protein 1) desempenha um papel chave, interagindo com membros do complexo pré-replicativo e
com fatores de transcrição, dentre os quais AtTCP24. O objetivo desse trabalho é investigar o papel de AtTCP24 no
desenvolvimento de Arabidopsis, bem como determinar a importância de sua interação com ABAP1. A sequência
consenso de ligação de fatores de transcrição TCP ao DNA foi identificada nas regiões promotoras de AtCDT1a e
AtCDT1b, dois membros do complexo pré-replicativo. Experimentos de EMSA mostraram que AtTCP24 reconhece e
se liga às regiões promotoras desses genes, enquanto PCR em tempo real de protoplastos superexpressando AtTCP24
mostraram uma diminuição nos níveis de expressão desses genes. A repressão da expressão gênica por AtTCP24 foi
confirmada in vivo em plantas superexpressando AtTCP24 (AtTCP24OE) , aonde se observa a redução na expressão
de AtCDT1a e AtCDT1b. A superexpressão de AtTCP24, também resultou em plantas com folhas menores do que o
controle. Essa redução é devido à diminuição nos níves de divisão celular, conforme indicam análises de cinemática.
Experimentos de imunoprecipitação de cromatina das plantas AtTCP24OE mostram uma menor presença de
MCM7 do que em plantas controle, sugerindo a ocorrência de problemas na formação do complexo pré-replicativo.
Essas plantas apresentam ainda cerca de 80% de tricomas com ramificação dupla, comparado com 8% em plantas
controle. Nós acreditamos que AtTCP24 atue como um regulador negativo da divisão celular em folhas, mas
também tenha papel na diferenciação de tricomas. A análise fenotípica de plantas com níveis reduzidos de AtTCP24,
bem como a identificação de proteínas parceiras podem indicar possíveis mecanismos de atuação de AtTCP24.
Financiado por: CNPq, FAPERJ e CAPES
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251
Papel da auxina na promoção de crescimento radicular
de cana-de-açúcar durante a associação com
bactérias diazotróficas endofíticas
Carvalho, TLG1; Bomfim, ACJS1; Pragana, MLF1; Vicentini, R3; Baldani, JI2; Hemerly, AS1
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, Centro de Ciências da Saúde, UFRJ, 21941-590, Rio de
Janeiro, RJ, Brasil
2
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brazil
3
Embrapa Agrobiologia, BR465, Km47, 23851-970, Seropédica, RJ, Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: desenvolvimento radicular, cana-de-açúcar, bactérias diazotróficas
A cana de açúcar tem assumido grande importância econômica e social para o Brasil graças ao fornecimento
da matéria prima para a produção do biocombustível etanol. Inicia-se então uma busca pela melhoria da
produtividade desta cultura que pode ser obtida através da promoção do crescimento vegetal. Em alguns
modelos já foi demonstrado que a manipulação do desenvolvimento radicular pode ser uma ferramenta para o
aumento de produtividade e biomassa. O desenvolvimento e a arquitetura do sistema radicular são processos
controlados pelo programa genético e modulados por uma variedade de sinais endógenos e do ambiente. Vários
estudos demonstraram os efeitos positivos da inoculação com bactérias diazotróficas endofíticas na promoção de
crescimento radicular, e em particular na formação de raízes laterais. O objetivo do trabalho é realizar uma análise
ampla dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento radicular de cana-de-açúcar bem como na promoção de
crescimento radicular induzida pela associação com bactérias diazotróficas endofíticas. A arquitetura radicular
de cana-de-açúcar foi analisada em dois genótipos contrastantes: SP70-1143 (de alta Fixação Biológica de
Nitrogênio - FBN) e Chunee (de baixa FBN). O genótipo SP70-1143 apresentou desenvolvimento radicular mais
pronunciado quando comparado com Chunee, principalmente pelo maior número de raízes laterais. A inoculação
com as bactérias diazotróficas promoveu crescimento do sistema radicular nos dois genótipos, sendo este mais
marcante em SP70-1143. Essas diferenças fenotípicas podem justificar, pelo menos em parte, a melhor resposta do
genótipo de alta FBN à associação com os endofíticos. Amostras de RNA de raiz dos dois genótipos contrastantes
foram utilizados para construção do RNA-Seq Illumina. A análise do transcriptoma mostra que genes envolvidos
na regulação positiva do desenvolvimento radicular são mais expressos em SP70-1143, enquanto os repressores
são mais expressos em Chunee. Um fitohormônio chave na regulação do desenvolvimento de raiz é a auxina.
Foi observado que tanto os níveis de auxina quanto sua distribuição são modificados em plantas durante a
associação. Vários genes regulados por auxina se mostraram diferencialmente expressos entre os genótipos
contrastantes quanto a FBN e em raízes de plantas inoculadas com as bactérias endofíticas. Nossos dados
sugerem que a sinalização por auxina é regulada durante a associação com as bactérias diazotróficas endofíticas
e que a promoção de crescimento é, pelo menos em parte, resultado da modulação da via desse fitohormônio.
Apoio financeiro: FAPERJ, CNPq, INCT, CAPES
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252
Análise in silico da expressão gênica de citocromo p450
relacionada ao metabolismo de diterpenos em Coffea
Ivamoto, ST1,3; Pot, D2; Ferreira, LP3; Alves, LC4; Domingues, DS4; Vieira, LGE4; Pereira, LFP5
Programa de Mestrado em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PR
Centre de Coopération Internationale em Recherche Agronomique pour le Développement (CIRAD), Montpellier-França
3
Centro de Genética Biologia Molecular e Fitoquímica, Instituto Agronômico de Campinas, Campinas-SP
4
Laboratório de Biotecnologia Vegetal, Instituto Agronômico do Paraná, Londrina-PR
5
EMBRAPA-Café, Brasília-DF
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Coffea, diterpenos, cafestol, caveol, Cyt P450
O Brasil é o maior produtor e exportador de café mundial, além de possuir o segundo maior mercado consumidor.
Estudos para melhorar geneticamente a qualidade da bebida e resistência da planta são cada vez mais frequentes
e de fundamental importância. Os diterpenos presentes na fração lipídica do grão de café, como o cafestol e o
caveol, estão diretamente ligados tanto a propriedades nutracêuticas da bebida como a mecanismos de defesa da
planta. O estudo dos genes que controlam a biossíntese dos diterpenos são importantes para compreender as vias
metabólicas e as enzimas que controlam o acúmulo/degradação dos mesmos. Os genes da cyt P450 são de uma família
multigênica, cujos muitos membros estão envolvidos no metabolismo secundário das plantas, inclusive na síntese
de diterpenos. O presente trabalho visa identificar e caracterizar in silico genes de citocromo P450 (Cyt P450) a partir
de seqüências ESTs disponibilizadas em projetos de transcriptoma do cafeeiro, com ênfase na identificação de genes
candidatos envolvidos no metabolismo de cafestol e caveol. Foram selecionadas 1396 seqüências, provenientes do
projeto brasileiro Genoma Café, disponibilizado no banco de dados do LGE Campinas (http://www.lge.ibi.unicamp.
br/cafe) e da Universidade de Cornell (LIN et al., 2005). Foram formados 92 contigs e 65 singlets, utilizando-se o
programa Codon Code Aligner. Os 92 contigs analisados por BLAST X contra bancos de dados de seqüências públicos
(GenBank e HarvEST Coffea), confirmando-se para 91 contigs sua identidade com genes de Cyt P450. A análise in
silico por Northen eletrônico revelou níveis e perfis de expressão específicos para cada um dos contigs, permitindo
assim a seleção de alguns genes candidatos para análises transcricionais baseados nas diferenças de expressão
entre bibliotecas de cDNA com diferentes tecidos ( flor, fruto, folha, raiz, etc), e também sob diferentes condições
fisiológicas (estressados e não estressados). O presente estudo serve de plataforma para a análise de expressão de
cyt P450 candidatas em amostras de RNA de tecidos contrastantes para acúmulo de caveol e cafestol, além de frutos
tratados com metil jasmonato, por diferentes metodologias, como o microarranjo (NimbleGen) e por RT-PCR.
Apoio financeiro: CNPq e CBP&Café
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253
Expression of zebrafish genes to produce long chain
polyunsaturated fatty acids in transgenic plastids
Rogalski, M1; Zakir-Pereira, ACV1; Tanaka, SM1; Carneiro, ALG1; Ramiro, DA1; Bock, R2; Carrer, H1
Departamento de Ciências Biológicas, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, Brasil
Department of organelle biology and biotechnology, Max Planck Institute of molecular plant physiology, Germany
[email protected]
1
2
Keywords: fatty acids, genetic transformation, elongase, desaturase, chloroplasts
The main sources of oils and fats in the human diet are oilseed crop plants. However, the most fatty acids produced
in these major commercial oilseeds comprise low amounts of essential fatty acids such as linoleic acid (LA)
and α-linolenic (ALA), and completely lack from long chain polyunsaturated fatty acids (LCPUFAs). LCPUFAs
ω-3 and ω-6 (e.g. docosahexaenoic acid and arachidonic acid) are valuable commodities that are essential in
various aspects of human physiological and pathophysiological processes. The natural sources of LCPUFAs for
human health and nutrition are mainly marine fishes. However fish stocks are in severe decline due to decades of
overfishing and also most fish oils are contaminated by accumulation of toxic compounds such as heavy metals,
dioxins and plasticizers. The conversion of native plant fatty acids such as LA and ALA to LCPUFAs requires the
sequential action of two distinct enzyme families, fatty acid desaturases and elongases. Although expression
of transgenes in plastid genome has several potential advantages over nuclear transformation (e.g. high-level
transgene expression and increase in transgene containment provided by the maternal mode of chloroplast
inheritance in most crop plants), very few attempts have been made to change fatty acid biosynthesis by using
this technology. This work aims at the production of ω-6/ω-3 LCPUFAs in a model plant (Nicotiana tabacum) by
plastid transformation with zebrafish (Danio rerio) genes (Δ5/Δ6 desaturase and ω-3 elongase). These two enzymes
have a broad spectrum of activity and can reduce the number of enzymes needed to engineer LCPUFAs in plants.
Zebrafish Δ5/Δ6 desaturase can convert linoleic acid (18:2) and α-linolenic acid (18:3) to their corresponding
Δ6 desaturated products, γ-linoleic acid (18:3) and stearidonic acid (18:4). However, in presence of a Δ6 elongase
it can convert di-homo-γ-linoleic acid (20:3) and eicosatetraenoic acid (20:4) to arachidonic acid (20:4) and
eicosapentaenoic acid (20:5), respectively. ω-3 elongase is able to lengthen the chain of a range of C18, C20, and
C22 polyunsaturated fatty acids, indicating that one elongase enzyme can perform all three elongation steps
required for this pathway. The zebrafish genes (AF309556 and AF532782) were cloned into pRB96 transformation
vector which contains the expression cassette PatpI/Trps16. The homoplasmic state of 3 (Δ5/Δ6 desaturase)
and 5 (ω-3 elongase) transplastomic plants was confirmed by PCR assays. The expression level of the genes is
being analyzed by real-time PCR. Changes in fatty acid composition in leaves are being analyzed by GC-MS.
Financial supports: FAPESP, CNPq
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254
Análise transcricional in silico de cana-de-açúcar para
identificação de genes de resposta à seca
Santana, MO1; Pestana-Calsa, MC1; Castro, RC1; Manso, TC1; Figueira, A2; Calsa Jr, T1
Laboratório de Genômica e Proteômica, Departamento de Genética, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife/PE
2
Laboratório de Melhoramento de Plantas, Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba/SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Saccharum, estresse hídrico, SAGE, tags, anotação.
O cultivo de cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é de grande importância econômica para o Brasil pela produção
de açúcar e etanol, sendo o déficit hídrico um dos principais fatores limitantes do crescimento e produtividade
desta cultura. A crescente demanda por biocombustíveis tem exigido o desenvolvimento de variedades de canade-açúcar geneticamente melhoradas mais eficientes no uso da água. A partir de dados SAGE de cana-de-açúcar
previamente anotados, oriundos de bibliotecas de amostras de parênquima de colmo de plantas cultivadas em
campo, e contrastantes para época chuvosa ou seca, foram identificados in silico transcritos potencialmente
associados a respostas ao estresse hídrico. A frequência das tags das bibliotecas C2 (estação chuvosa) e S5 (estação
seca) foi normalizada em tags por mil (TPT), para comparação em planilha Microsoft Excel 2007. As tags foram
analisadas conforme a razão de variação (ratio) da frequência entre bibliotecas S5/C2, de modo que valores
de ratio ≤ 0,5 foram considerados inibidos pela seca; entre 0,5 e 2,0 indicando sem variação ligada ao estresse
hídrico; e ≥ 2,0 considerados como induzidos pela seca. Vinte genes foram selecionados em quatro categorias: i)
tags sem anotação presumível e que mostraram maiores ratios de indução e menores ratios de inibição na seca;
ii) tags com anotação e ontologia gênica relacionadas ao estresse hídrico (ex. deidrinas, proteínas de estresse
oxidativo e de aclimatação) e que também exibiram ratio de indução ou inibição na seca; iii) tags conhecidas
induzidos ou inibidos na seca, mas que tiveram anotação e ontologia gênica associadas a regulação de genes
de resposta ao estresse hídrico (proteínas de choque térmico, fatores de transcrição); e iv) tags sem variação em
ratio, potencialmente de referência e úteis como normalizadores em PCR em tempo real (RT-qPCR). Da coleção
de 46.536 tags distintas analisadas, 45,0% mostraram-se inibidas pela seca, 6,3% induzidos pela seca, e 48,7% não
apresentaram variação de ratio significativa (0,5 < ratio < 2,0). Foram selecionados 20 transcritos para validação
experimental, como potencialmente responsivos ao estresse hídrico, distribuídos em: 4 tags sem anotação
presumível, 6 de anotação relacionada à seca, 8 de anotação associada a regulação da tolerância à seca, e 2
potenciais transcritos de referência (housekeeping). Dentre os tags escolhidos, os de maior e menor ratio (18,5 e 0,03
, respectivamente) não apresentaram anotação presumível. As tags selecionadas foram alinhadas com clusters
de cDNA de cana-de-açúcar do Gene Index / TIGR http://compbio.dfci.harvard.edu/cgi-bin/tgi/Blast/index.cgi e
utilizadas para desenho de iniciadores específicos para validação via RT-qPCR dos transcritos correspondentes.
A identificação in silico de transcritos potencialmente associados com respostas à seca e sua validação favorecem
a identificação de genes para maior tolerância ao estresse hídrico, os quais podem ser úteis em programas de
melhoramento genético para o desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar mais tolerantes à seca.
Apoio financeiro: CNPq e FACEPE
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Comparative analysis of proteins expressed under
water stress in cactus pear (Opuntia cochenillifera)
Reis, MBA1; Tancredi, L1; Rocha, TL1; de Souza, BA; Firmino, AAP 1,2; Romano, E1; Grossi-de-Sá, MF1
1
2
EMBRAPA – Recursos Genéticos e Biotecnologia
Centro de Biotecnologia, UFRGS - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Keywords: Opuntia cochenillifera., Drought stress. Comparative proteomics
The search for alternatives to solve the problems caused by environmental stresses is considered one of the major
challenges of the national agribusiness. The analysis of responses to stress in plants is an important route for
discovering genes that confer stress tolerance and use them in breeding programs. Use of proteomics techniques,
provide a broad overview of plant responses to stress at the protein level. Among the various plant species studied, the
palm Opuntia cochenillifera Salm - Dyck. A comparison of two-dimensional gels allowed the identification by MALDI
TOF / TOF of protein common to both treatments and proteins that are differentially expressed between treatments.
In this study, 20 protein spots were identified with differential expression and were classified in the following
categories according to their possible physiological function in plants is divided into the following categories: 1)
these related to photosynthesis. 2) these related to energy storage, 3) glycolytic pathway, 4) Antioxidants proteins,
5) these involved in signal transduction, 6) Signaling, and 7) hypothetical or putative proteins with no described
function. Our results strongly suggest that were first identified proteins involved in response to water stress in cactus
financial support: CNPQ/CAPES
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256
Expressão gênica de Aquaporina e LEA em genótipos de
cana-de-açúcar contrastantes para tolerância à seca
Frigel, LTM1,2; Sousa, LFA2; Perecin, D2; Nebó, JF3; Brito, MS4; Festucci, CS1; Landell, MGA1; Creste, S1
Instituto Agronômico de Campinas (IAC) - Centro de Cana, Ribeirão Preto – SP
FCAV- Unesp, Jaboticabal – SP
3
Centro de Energia Nuclear na Agricultura –CENA/USP – Piracicaba – SP
4
FMRP/USP - Departamento de Genética, Ribeirão Preto – SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: gene de referência, polietilenoglicol, qPCR, sensível, tolerante.
A cana-de-açúcar possui extensa variabilidade genética em relação à tolerância ao déficit hídrico, sendo alguns
genótipos capazes de tolerar períodos longos de seca e mesmo assim, completar o seu ciclo, enquanto outros não
sobrevivem ou sofrem danos severos na produtividade. Esta variabilidade é uma ferramenta muito importante para
o desenvolvimento de novas cultivares tolerância à seca. No entanto, a avaliação de campo pode não refletir a real
resposta da planta ao estresse, visto que diversos fatores ambientais podem interferir direta ou indiretamente. A
aplicação de polietilenoglicol (PEG) em plantas cultivadas in vitro vem sendo utilizada em diversas culturas como um
meio indireto para simulação do déficit hídrico, por aumentar da osmolaridade do meio. Neste trabalho, avaliou-se a
expressão dos genes codificadores de aquaporina PIP2 (plasma membrane intrinsic protein) e LEA (late embriogenesis
abundant protein) em dois genótipos de cana-de-açúcar com comportamentos contrastantes para tolerância à
seca, sendo: IACSP94-2094 (tolerante) e IACSP97-7065 (sensível). As plantas foram cultivadas in vitro e expostas ao
PEG 6000 15% (m:v), e amostras foram coletadas nos tempos 0h (controle), 24h, 72h e 120h para extração do RNA e
posterior análises por qPCR. Como controle endógeno, utilizou-se o gene Ubiquitina2. Os resultados demonstraram
que no genótipo tolerante, a expressão de PIP2 foi reduzida em 50% após 24h em relação ao controle. Por outro lado,
um aumento gradativo na expressão foi observado ao longo dos tempos (80% em 72h e 90% em 120h) em relação
ao controle, refletido provavelmente pela necessidade da planta em manter a homeostase e o turgor inicial. Em
relação a cultivar sensível, a expressão de PIP2 foi oito vezes maior após 24h quando comparado ao controle, porém,
ocorreu redução de 30% e 75% nos tempos 72h e 120h em relação ao controle. Para o gene LEA observou-se aumento
gradativo de expressão na cultivar tolerante durante os tempos 24h e 72h, alcançando expressão máxima de 200
vezes no tempo 120h. Por outro lado, nenhuma variação na expressão foi observada para LEA na cultivar sensível.
Os resultados evidenciam que os genes avaliados estão envolvidos com a tolerância a seca em cana-de-açúcar
e mostram-se potenciais candidatos para o desenvolvimento de cultivares de cana geneticamente modificada.
Apoio Financeiro: CNPq
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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257
Estudo da rede regulatória do gene AIP1
Brasil, JN1; Cabral, LM12; Hemerly, AS1
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, CCS - Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590,
Rio de Janeiro, RJ, Brazil
2
Universidade Federal Fluminense, Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia. Campus Valonguinho- Centro
Niterói - RJ CEP 24210-130
[email protected]
1
Palavras-chave: ciclo celular, Arabidopsis, ABAP1
ABAP1 (Armadillo BTB Arabidopsis Protein 1) é uma proteína regulatória, identificada pelo nosso grupo, que
está envolvida no controle de dois processos vitais – a replicação e a transcrição do DNA. Ela participa de uma
rede de sinalização que controla a progressão do ciclo celular na fase G1/S em plantas, pela integração de sinais
do desenvolvimento com processos de controle da replicação e transcrição. A identificação de ABAP1 leva ao
questionamento se essa rota de sinalização está envolvida em estratégias específicas do desenvolvimento de plantas.
ABAP1 provavelmente tem diferentes funções no desenvolvimento, dependendo da sua interação com diferentes
proteínas. Observamos que ABAP1 se associa com membros do pré-RC, possivelmente regulando sua utilização.
Ela também se liga a fatores de transcrição e regula negativamente a transcrição de genes essenciais ao pré-RC.
Em organismos multicelulares, além da variedade de famílias de fatores de transcrição que atuam no controle
transcricional, a estrutura da cromatina também está intimamente ligada a este processo. Além disso, o silenciamento
epigenético e a repressão hereditária da transcrição são importantes para o padrão de expressão gênica, mantendo
a estabilidade genômica e a determinação celular. Nosso grupo identificou uma provável proteína remodeladora
de cromatina que interage com ABAP1 chamada de ABAP1 interacting protein 1 (AIP1). AIP1 possui repetições do
domínio Agenet pertencente a Royal Family, bem conhecida por envolvimento com remodelamento de cromatina,
e também interage com LHP1, proteína que se liga a caudas de histonas metiladas. Neste trabalho, fazemos uma
ampla análise in sílico do padrão de expressão de AIP1 e seus ligantes, tentando identificar subcomplexos aonde
AIP1 participe e processos de controle do desenvolvimento vegetal onde essas redes regulatórias possam atuar.
Nossos dados preliminares sugerem que AIP1 é uma proteína que pode atuar como remodeladora da cromatina com
envolvimento na integração de controles do ciclo celular e sinalização que modula o desenvolvimento de plantas.
Apoio financeiro CNPq, CAPES e FAPERJ
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258
Caracterização da atividade transcricional dos sítios
de DNA ribossomal através da metilação do DNA
cromossômico em espécies de Citrus
Marques, A1,2; Houben, A2; Guerra, M1
Laboratório de Citogenética Vegetal, Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco
Laboratório de Estrutura e Função Cromossômica, IPK-Gatersleben, Alemanha
[email protected]
1
2
Palavras-chave: atividade transcricional, Citrus, DNA metilado, DNA ribossomal, heterocromatina
Introdução: As espécies do gênero Citrus são caracterizadas citologicamente por apresentarem 2n = 18, com grande
quantidade de blocos heterocromáticos CMA+, compostos principalmente pela sequência satélite CsSat181 e sítios
de DNA ribossomal (DNAr). Muitas espécies do gênero derivam de cruzamentos interespecíficos, gerando uma
grande variedade cariotípica, com variações no número e posição dos sítios ribossomais. Entretanto, pouco se
sabe sobre o comportamento de atividade trancricional desses sítios. Em geral, metilação de DNA e modificações
de histonas são responsáveis pela regulação da expressão do DNAr, que em híbridos é normalmente evidenciado
pela dominância nucleolar. Objetivo: Neste trabalho, foi analisada a distribuição dos sinais anti-5-metil citosina
(5mC) no genoma de Citrus, com foco nos sítios de DNAr, a fim de comparar os níveis de atividade transcricional
desses sítios em diferentes espécies do gênero. Material e Métodos: Preparações cromossômicas de C. clementina,
C. paradisi, C. sinensis e um híbrido Ortanique - C. reticulata x C. sinensis, foram submetidas primeiramente à
coloração CMA/DAPI, seguida pelos procedimentos de FISH, com a sonda do DNAr 45S, e imunodetecção anti5-metil citosina. Resultados: Foi observada uma correlação positiva entre o estado de condensação dos sítios
ribossomais e o nível de metilação dos mesmos. Os sítios completamente condensados foram fortementemente
metilados, enquanto os mais descondensados foram hipometilados. Adicionalmente, foi observado um número
de sítios trancricionalmente ativos mais ou menos constante. Em C. clementina e C. sinensis, que apresentaram
três sítios de DNAr, apenas dois sítios foram encontrados hipometilados. Em C. paradisi, que mostrou cinco sítios,
apenas dois a três foram encontrados hipometilados. No híbrido Ortanique foi observado apenas dois sítios
ribossomais e ambos sofreram descondensação e hipometilação. Adicionalmente, sinais de anti-5-metil citosina
foram encontrados na maioria dos blocos heterocromáticos CMA+ e na região centromérica. Conclusões: Esses
resultados sugerem que a metilação de DNA é importante na regulação da atividade trancricional dos sítios
ribossomais e apesar do número de sítios ribossomais variar entre espécies o nível de atividade trancricional
por genoma parece ser mais constante. Adicionalmente, a metilação de DNA também parece importante na
formação da heterocromatina de Citrus, tanto nas porções CMA positiva como na heterocromatina centromérica.
Apoio financeiro: Leibniz Institute of Plant Genetics and Crop Plants Research (IPK-Gatersleben)
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259
Análise de genes diferencialmente expressos em
Phaseolus vulgaris sob condições de déficit hídrico
Müller, BSF1,2; PAPPAS JR, GJ3; PEREIRA, M 2; Guimarães, CM1; Zambuzzi-Carvalho, PF2; Silveira, RDD1;
Brondani, C1; Brondani, RPV1
EMBRAPA Arroz e Feijão, Goiânia, GO
ICB, UFG, Goiânia, GO
3
EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, DF
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Feijoeiro comum, tolerância a seca, ESTs, leguminosa, Genoma.
Os fatores climáticos, como a seca e as altas temperaturas, são alguns dos principais problemas para o cultivo
do feijoeiro comum e comprometem a produção em mais de 1,5 milhões de hectares do cultivo no mundo. A
deficiência hídrica ocorre geralmente na maioria das regiões produtoras do feijão no Brasil, ocasionando constantes
frustrações de safra, sendo a floração a fase mais vulnerável. Frente a esses grandes desafios, ênfase crescente tem
sido dada à integração de tecnologias genômicas aos programas de melhoramento genético, visando auxiliar no
desenvolvimento de novas variedades com maior potencial produtivo e estabilidade de produção em condições
ambientais adversas. Com o intuito de ampliar o conhecimento dos mecanismos genéticos envolvidos na tolerância
à seca, esse estudo prevê a criação de um banco de sequências gênicas e a identificação de genes-candidatos
envolvidos na resposta ao déficit hídrico, utilizando as cultivares BAT 477, como genitor tolerante, e Pérola, como
susceptível. O experimento para a obtenção do tecido vegetal e RNA foi conduzido em casa de vegetação na presença
e ausência de déficit hídrico na fase de florescimento das plantas. Foram construídas duas bibliotecas subtrativas
de cDNA baseadas em RDA. As sequências obtidas foram então avaliadas para qualidade, considerando um
número mínimo de 250 pares de base com phred>20. Os reads foram comparados com as sequências do GenBank
através do algoritmo Blast nr. Foram submetidas ao banco de dados 4.880 sequências, das quais 3.624 foram válidas,
totalizando 82% de aproveitamento médio dos clones para a cultivar BAT477 e de 74% para Pérola. Análises in
silico da presença diferencial de sequências entre as bibliotecas revelaram a identidade de um número importante
de genes, provavelmente responsáveis pelas diferenças entre os genótipos e sua resposta ao déficit hídrico. Destas
seqüências, 70% se mostraram similares a sequências de genes com função desconhecida; 10% correspondem
a genes envolvidos em processos de energia, outros 10% estão envolvidos na defesa celular e virulência; 2,5%
estão associadas ao ciclo celular e processamento do DNA e 2,5% estão relacionados com a transcrição. Foram
identificadas regiões genômicas contendo genes de grande interesse econômico, como por exemplo, fragmentos
relacionados à repressão da auxina, às respostas a desidratação e à resposta ao estresse oxidativo, potencialmente
envolvidos na resposta a esse estresse no feijoeiro comum. Em adição, uma mineração do banco de dados em
desenvolvimento, indicou a presença de marcadores microssatélites e SNPs entre os genótipos contrastantes para
a tolerância à seca. Os perfis de expressão gênica dos genes diferencialmente expressos serão agrupados e validados
por RT-PCR quantitativo. Todos os dados gerados estão sendo integrados e compilados no banco de dados de
Phaseolus, indicando alvos potenciais a serem explorados nos programas de melhoramento do feijoeiro comum.
Recursos financeiros: Macroprograma Embrapa/Monsanto
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260
Utilização de plantas modelo para teste de promotores
tecido específico de cafeeiros
Canesin, LEC1; Pereira, LFP2; Vieira, LGE1
Instituto Agronômico do Paraná, Área de Melhoramento e Genética, Laboratório de Biotecnologia Vegetal;
EMBRAPA Café, Instituto Agronômico do Paraná, Área de Melhoramento e Genética, Laboratório de Biotecnologia Vegetal
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Lycopersicon esculentum, Agrobacterium tumefaciens, transformação in vivo, transformação in vitro, Coffea
O Brasil é o maior produtor mundial de café e assim, tem tradição em estudos de melhoramento desta cultura,
buscando a melhora da qualidade de bebida. A biotecnologia representa uma ferramenta valiosa para auxiliar o
melhoramento e introduzir novas características no cafeeiro. Porém, o café é uma espécie perene e a obtenção das
plantas transgênicas pode levar até quatro anos. Assim, genes e promotores específicos devem ser testados em
plantas-modelo como o tomate (Lycopersicon esculentum), uma planta com alta capacidade de regeneração in vitro,
compatibilidade com sistemas de transformação via Agrobacterium e ciclo de vida curto. Portanto, este trabalho
tem como objetivo aperfeiçoar protocolos de transformação genética na planta-modelo tomate cv. Microtom
para testar genes e promotores de interesse potencial de utilização em cafeeiros. Neste trabalho foi utilizado para
transformação um vetor contendo o promotor endosperma-específico do gene CrLTP1, que codifica proteínas
de transferência de lipídeos (LTP) em cafeeiro. Visando a otimização de protocolos de transformação, foram
testados dois protocolos: transformação in vivo de flores; e transformação in vitro de cotilédones de tomateiro. O
protocolo in vivo consistiu na imersão dos botões florais de tomate perfurados com agulha estéril em uma solução
de Agrobacterium tumefaciens, contendo o vetor pC1305.1, em sacarose 30%. Após sua maturação, os frutos foram
colhidos para análise da transformação, através da germinação das sementes em meio seletivo. Não foi observado
evento de transformação, possivelmente em decorrência da oxidação das flores quando perfuradas com a agulha.
Para o protocolo de transformação in vitro foi construído um cassete de expressão com o vetor pCAMBIA 1381,
cujo promotor crltp1 foi clonado à montante do gene uidA (codificante para β-glucoronidase). Foram utilizados
cotilédones de tomate germinados in vitro, que foram imersos em uma solução de Agrobacterium em meio líquido
com 100µM de acetoseringona e 10µM de 2-mercaptoetanol. Os explantes foram transferidos para meio sólido
com hormônios indutores de calogênese. A regeneração dos explantes transformados encontra-se em andamento.
Órgão Financiador: Fundação Araucária
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261
Perfil de transcrição, clonagem e superexpressão do
gene Celulose Sintase 3 de Eucalyptus globulus em
Arabidopsis thaliana
Marques, WL1; Salazar, MM1; Camargo, ELO1; Lepikson-Neto, J1; Pereira, GAG1
Universidade Estadual de Campinas/UNICAMP
[email protected]
1
Palavras-chave: Celulose, Eucalipto, Transgênico, EgCesA3, Superexpressão gênica
O Brasil é o maior produtor e exportador de celulose de eucalipto. A biossíntese da celulose se dá através do
complexo enzimático Celulose Sintase. As isoformas dos genes Celulose Sintase atuam em conjunto de forma
não redundante e algumas delas estão relacionadas com a síntese da parede primária e outras, da parede
secundária. Neste último grupo encaixa-se o gene EgCesA3 de eucalipto, descrito recentemente como sendo
o gene celulose sintase de maior expressão durante a xilogênese e imprescindível na formação de madeira.
Em vista disso, este trabalho tem como principal objetivo avaliar o efeito da superexpressão do gene EgCesA3
na planta modelo Arabidopsis thaliana. Para tanto, realizou-se a análise da expressão do gene EgCesA3 em
tecidos de folha e xilema de três espécies diferentes de eucalipto via Real-Time PCR e Northern-blot. Os
resultados permitiram concluir que o gene em questão é verdadeiramente mais expresso em xilema do que
em folha. Além disso, a expressão desse gene é diferenciada entre as espécies. Tal resultado corrobora com a
teoria de que o EgCesA3 esteja diretamente relacionado à síntese da parede celular secundária e sua expressão
diferencial entre espécies pode explicar a variação da quantidade de celulose encontrada entre as espécies
estudadas. Diante desse cenário, o gene EgCesA3 foi clonado de modo a formar um cassete de expressão no
qual se inclui: o promotor constitutivo 35SCMV, o gene EgCesA3 e uma porção sinalizadora para o término da
transcrição. Esse cassete foi inserido num vetor binário que, em seguida, foi utilizado na transformação genética
das plantas modelo. As plantas transformadas estão em fase de cultivo para posterior avaliação fenotípica.
Apoio financeiro: FAPESP
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262
Caracterização molecular do desenvolvimento da
corona em flores do gênero Passiflora (Passifloraceae)
Aizza, LCB¹; Dornelas, MC¹
¹Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
[email protected]
Palavras-chave: Passiflora, flores, desenvolvimento, corona, MADS-box
Durante a evolução vegetal, diversas inovações incorporadas na estrutura floral promoveram a otimização da
reprodução nas angiospermas. Passiflora é um exemplo de diversidade e complexidade floral. A característica mais
marcante do gênero é a presença de uma corona de filamentos entre o androginóforo e o perianto, cuja principal
função parece ser a atração de polinizadores. Diante da diversidade morfológica associada aos sistemas de polinização
em espécies do gênero Passiflora e tendo como premissas as diferentes interações entre os produtos dos genes
MADS-box propostas pelo modelo ABC para a determinação da identidade dos órgãos florais em plantas-modelo
como Arabidopsis, o objetivo deste trabalho foi elucidar a ontogenia da corona em quatro espécies e um híbrido
interespecífico artificial, representando os dois maiores subgêneros: P. edulis var flavicarpa Deg, P. coccinea Aubl., P.
‘Lady Margaret’ (híbrido P. edulis x P. coccinea) pertencentes ao subgênero Passiflora, P. tulae Urban e P. suberosa L. do
subgênero Decaloba. Para a descrição morfo-anatômica comparativa empregou-se microscopia de luz e eletrônica
de varredura. Adicionalmente, por meio de análises de bioinformática, prováveis ortólogos dos genes MADS-box
em P. edulis foram selecionados e identificados a partir do banco de dados do Projeto PASSIOMA. Sequências de
aminoácidos deduzidas dos contigs das etiquetas de genes expressos (ESTs) foram alinhadas com sequências de
proteínas MADS de Arabidopsis, indicando uma alta similaridade entre as sequências de Passiflora e as dos fatores
de transcrição MADS-box APETALA1, PISTILLATA e AGAMOUS. A análise de expressão dos homólogos de Passiflora
destes genes do modelo ABC foi realizada por RT-PCR em diferentes tecidos e por hibridização in situ em botões
florais de P. edulis, revelando a expressão diferencial dos genes durante o desenvolvimento da corona. Os resultados
obtidos indicaram uma conservação evolutiva dos elementos moleculares responsáveis pela identidade dos órgãos
florais entre Arabidopsis e Passiflora, incluindo o recrutamento de novos padrões de expressão que poderiam explicar
a formação de estruturas consideradas “novidades evolutivas” durante o desenvolvimento floral em angiospermas.
Órgãos financiadores: FAPESP/ CAPES /CNPq
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263
Estudo da expressão de genes MADS-box durante o
desenvolvimento floral em Coffea arábica
Oliveira, RR1; Dornelas, MC1
Departamento de Biologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas - Unicamp.
[email protected]
1
Palavras-chave: Desenvolvimento floral, Coffea arabica, genes MADS-box, RT-PCR.
Em plantas, o desenvolvimento reprodutivo é estreitamente controlado por elementos moleculares evolutivamente
conservados. A maioria dos genes relacionados à determinação da identidade dos órgãos florais pertence à família
MADS-box. Os fatores de transcrição da família MADS possuem domínios altamente conservados, permitindo sua
identificação. A partir de estudos envolvendo mutantes dos genes MADS-box em Arabidopsis thaliana, um modelo
composto por três fatores: A, B e C, foi proposto para explicar a determinação da identidade dos órgãos florais. O
presente trabalho teve como objetivo identificar em Coffea arabica os prováveis ortólogos aos genes APETALA1
(AP1; Fator A), APETALA3 (AP3; Fator B), PISTILATA (PI; Fator B) e AGAMOUS (AG; Fator C) e estudar seus padrões
de expressão relacionando-os às alterações anatômicas ocorridas durante o desenvolvimento floral. Para tal, foram
identificados no Banco de Dados do Projeto Genoma Brasileiro do Café (CAFEST), 23 ESTs correspondentes a
homólogos putativos de genes da família MADS-box. Determinou-se o padrão de expressão de genes do modelo
ABC em diferentes tecidos por RT-PCR. Estes e outros genes MADS de cafeeiro que mostraram transcritos
preferencialmente em tecidos reprodutivos tiveram seus padrões de expressão analisados em maior detalhe. As
alterações anatômicas que ocorrem durante o desenvolvimento floral de cafeeiro foram relacionadas aos padrões
de expressão observados. Os resultados obtidos servirão de base para o entendimento do estabelecimento dos
órgãos florais em Coffea arabica e dessa forma, auxiliarão na elucidação da dinâmica de seu ciclo reprodutivo.
Apoio financeiro: FAPESP
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264
Expression profiling of sugarcane varieties differing in
their tolerance to drought stress
Dal-Bianco, M1; Nishiyama-Jr, MY1; Silva, GL1; Endres, L2; Menossi, M3; Souza, GM1
Instituto de Química - Departamento de Bioquímica, Universidade de São Paulo
Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal de Alagoas
3
Instituto de Biologia – Departamento de Genética, Universidade de Campinas
[email protected]; [email protected]
1
2
Keywords: Drought stress, microarray, physiology, sugarcane, bioethanol
Sugarcane is a highly productive C4 grass used for centuries as the main source of sugar and recently to produce
ethanol, a renewable bio-fuel energy source. Sugarcane originated from crosses of Saccharum species and is noted
for its unique capacity to accumulate high amounts of sucrose in its stems. Environmental stresses limit enormously
sugarcane productivity and are the main cause of losses in agriculture worldwide. Little is known about the molecular
and physiological basis of drought tolerance in sugarcane and several evidences indicate that this variability has
a genetic component. Our goals are to unravel the physiological changes resulting from drought in contrasting
sugarcane varieties and identify the molecular basis of tolerance through a focus on transcriptomics. For this study,
we selected six genotypes for an evaluation of drought responses: RB855536, RB855113, RB72454 (possibly more
sensitive to drought) and SP79-1011, RB867515, RB92579 (possibly more tolerant). The experiment was conducted
in a randomized complete block design with four biological replicates in 2 experimental fields under irrigation and
drought conditions in Campo Alegre-AL. Samples were collected after 7 months of planting. Physiological studies
in these six genotypes were conducted to define the most tolerant and sensitive varieties which were further
profiled for transcriptome alterations through microarray experiments using a Custom 44K oligo array (Agilent).
The most sensitive variety was RB855536, but there was no difference that distinguished what was the best tolerant
variety. RB857515 was profiled based on its high yield under drought conditions and for its commercial importance
since it is the variety with the largest area planted in Brazil. A total of 392 SAS (Sugarcane Assembled Sequences)
were found to have differential expression. Of these, 11 SAS were differentially expressed in both varieties, and 37
had an antisense transcript differentially expressed. A total of 253 SAS were differentially expressed in RB855536
and 128 in RB867515. We found several genes involved in general drought responses as seen in other studies,
but this was the first time that physiological data was correlated with molecular data to describe varieties with
different tolerance levels. Collectively these results are valuable information that can guide further studies for
the development of improved sugarcane varieties and can be used as molecular markers in breeding programs.
Funding: CNPq, FINEP and FAPESP.
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265
Caracterização fisiológica e expressão de genes
relacionados à resistência ao déficit hídrico em soja
Gomes, WS1,2; Dias, DF1; Loureiro, ME2; Borém, A1
Departamento de Biologia Vegetal, Laboratório de Fisiologia Molecular de Plantas - Universidade Federal de Viçosa - MG - Brasil,
CEP: 36570 000
2
Departamento de Fitotecnia, Universidade Federal de Viçosa - MG - Brasil, CEP: 36570 000
[email protected]
1
Palavras-chave: Enzimas Antioxidantes, PCR em tempo Real, estresse hídrico, soja, expressão gênica.
Tolerância à seca em plantas é uma característica complexa, resultado de um conjunto de mecanismos que
trabalham para evitar ou tolerar períodos de déficit hídrico. O estresse hídrico é um dos mais importantes fatores
ambientais que induz mudanças fisiológicas, como diminuição do potencial de água na célula, o fechamento dos
estômatos e o desenvolvimento de processos oxidativos mediante a formação das espécies reativas de oxigênio
(EROs). As enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD) e Peroxidase (POX) são eficientes eliminadores das
EROs. Nesse contexto, esse trabalho teve como objetivo identificar e caracterizar genes diferencialmente expressos
da família de Cinases de SnRK, por meio da técnica de PCR em Tempo Real, em dois genótipos de soja submetidos a
diferentes condições de déficit hídrico, bem como, caracterizar fisiologicamente o estresse oxidativo nos genótipos
em cada potencial hídrico aplicado. Para isso foi feito a coleta de folhas destacadas de soja, de dois genótipos
diferentes, um resistente ao estresse hídrico (BR-48) e outro susceptível (BR-16), em três potenciais hídricos:
ψma= -3,0MPa, -1,5MPa e -0,5MPa. A caracterização fisiológica, para o estresse oxidativo, demonstrou diferenças
significativas entre os genótipos analisados. Houve aumento considerável na peroxidação de lipídios no genótipo
sensível, enquanto que, no tolerante, a quantidade de MDA (aldeído malônico) formado foi significativamente
igual ao controle irrigado. O aumento da atividade das enzimas antioxidativas, SOD e POX, foi significativo apenas
no genótipo suscetível, nos potenciais hídricos de ψma=- 1,5MPa, para a primeira e -3,0MPa para a segunda. Para
os ensaios de PCR em tempo real, a partir do cDNA de cada genótipo submetido aos três potenciais hídricos, para
os genes de interesse, OST1, SnRK2.2, SnRK2.3 e SnRK2.4, e analisados por meio da expressão relativa (método
comparativo de CT) e como controle endógeno o RNA ribossomal que codifica o gene β-actina, demostrou que
o genótipo BR-16, quando submetido ao estresse hídrico, teve aumento significativo de expressão gênica para os
genes OST1, SnRK2.2 e SnRK2.3. Em contrapartida, o genótipo Embrapa 48 não demonstrou alteração nos níveis de
expressão para nenhum dos quatro genes testados. Pode-se concluir que as duas variedades de soja respondem de
diferentes formas ao estresse hídrico e que os genes OST1 e SnRK3 participam ativamente na tentativa de combater
o estresse hídrico no genótipo suscetível BR–16, e que, a tolerância do BR-48, se deve provavelmente a outros
fatores enzimáticos e não enzimáticos aqui não estudados. Isso indica a necessidade de compreendermos melhor
os processos bioquímicos, fisiológicos e moleculares envolvidos na tolerância desse genótipo ao déficit hídrico.
Apoio Financeiro: MCT/CNPq/CT-Agronegócio – GENOSOJA, CAPES e CNPq.
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266
Isolamento e Caracterização de Promotores TecidoEspecífico de Flor de Gossypium hirsutum para
controle do Bicudo-do-Algodoeiro
Artico, S1; Nardeli, MS1; Alves-Ferreira, M1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: Gossypium hirsutum, bicudo-do-algodoeiro, expressão gênica, promotores, elementos cis.
O bicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis) é a praga de maior incidência na cultura do algodão (Gossypium
hirsutum) no Brasil e com maior potencial de dano. Este inseto se caracteriza por atacar botões florais de algodão
que são os preferidos para sua alimentação e oviposição. Além das técnicas usuais de controle, como aplicação
de inseticidas, o desenvolvimento de plantas transgênicas expressando toxinas específicas para insetos têm sido
extremamente eficiente no combate a pragas. No entanto, o desenvolvimento de plantas resistentes a insetos não
depende só da identificação e caracterização de toxinas para insetos, mas também na caracterização de promotores
de expressão de genes que tenham uma atividade forte e específica para os tecidos onde a planta é atacada. Assim,
o presente trabalho tem como objetivo isolar e caracterizar funcionalmente as sequências promotoras completas
adjacentes à região codificadora de genes caracterizados como específicos de botão floral de G. hirsutum. No
presente trabalho foram realizadas análises in silico a partir das informações disponíveis no Banco de Dados de
EST do Genoma do Algodão, visando identificar genes altamente expressos e cuja expressão estava restrita em
bibliotecas de flores, óvulos ou frutos. Inicialmente 19 genes foram selecionados em Gossypium raimondii e foram
comparados com a sequência dos genes de G. hirsutum do Cotton Genome Database usando o programa tBLASTN.
Com a sequência destes 19 genes foi realizado um BLASTn no Banco de Dados de Arabidopsis com objetivo de
encontrar seus possíveis ortólogos, os quais foram então analisados na plataforma Genevestigator que permitiu
selecionar nove genes que apresentaram elevada expressão em tecidos florais e foram então, os escolhidos para
estudo de expressão gênica em G. hirsutum. As análises desses genes por qPCR identificaram GhPGSF1, GhPGFS2,
GhPGFS4 e GhPGFS8 como genes altamente expressos em flores de algodão principalmente em botões florais de 6
mm e em tecidos florais como estames, pétalas e carpelos. As regiões imediatamente a montante dos ESTs validados
foram isoladas via genome walking e fragmentos de 342 pb (gene GhPGFS1), 376 pb (gene GhPGFS2), 350 pb (gene
GhPGFS4) e 514 pb (gene GhPGFS8) foram obtidos. Vários elementos regulatórios foram identificados em ambas
sequências amplificadas, incluindo elementos envolvidos no controle da expressão tecido-específica em pólen e
frutos. Os promotores isolados estão sendo fusionados ao gene repórter uidA e estas construções serão utilizadas para
transformação de Arabidopsis thaliana. Caso os promotores escolhidos tenham uma atividade predominante em
tecidos florais de A. thaliana, eles poderão ser um importante instrumento para o controle do bicudo-do-algodoeiro
quando utilizados em conjunto com genes que codificam proteínas tóxicas em plantas transgênicas de G. hirsutum.
Financiadores: CNPq e Facual
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267
Uso de Anotação funcional probabilística para a
anotação do transcritoma da Seringueira
(Hevea brasiliensis)
Salgado, LR¹; Waldemarin, RC¹; Vencio, RZN¹
¹Laboratório de Processamento de Informações e Dados Biológicos (LabPIB) – FMRP/USP, Ribeirão Preto
[email protected]
Palavras-chave: Anotação funcional probabilística, Hevea Brasiliensis, SIFTER
Introdução: Hevea brasiliensis (Willd. ex Adr. de Juss.) Muell.-Arg. conhecida popularmente como Seringueira
pertence ao gênero das Euphorbiaceae e é considerada como a espécie mais importante do gênero . No
melhoramento de plantas ferramentas biotecnologicas são um passo importante para aumentar a produtividade
dos seringais.Na lista das ferramentas, destaca-se o estudo do genoma expresso da Hevea brasiliensis, o transcritoma.
A caracterização de genes permitirá o melhoramento de vários aspectos agronômicos da planta. A aquisição
de dados genômicos através de técnicas de seqüenciamento de DNA vem crescendo em uma velocidade sem
precedentes levando a um acúmulo gigantesco de potenciais informações biológicas . A caracterização funcional
destes genes é conhecida como anotação funcional. Como a utilidade de genes não anotados é bastante limitada,
muito se vem investindo no desenvolvimento de modelos analíticos computacionais para a anotação de genomas.
Atualmente as técnicas automáticas utilizadas para a anotação computacional baseiam-se na semelhança
entre as sequencias nucleotídicas ou de aminoácidos, não considerando em geral e explicitamente as relações
filogenéticas entre os genes. Alternativamente um método mais avançado chamado SIFTER – Statistical Inference
of Function Through Evolutionary Relationships – que permite a caracterização probabilística e automatizada
de genomas mostra-se bastante superior aos outros métodos de anotação computacional de genes em diversos
já que este método leva em consideração todas informações disponíveis sobre os genes, desde sequencias
nucleotídicas a relaçoes filogenéticas. Objetivo: No presente trabalho temos como objetivo a anotação in silico
preliminar de genes pelo método SIFTER para posterior utilização em transcritos de Hevea brasiliensis. Este se
enquadra no contexto do projeto de doutorado, onde o LabPIB-FMRP participa como integrante da equipe de
Bioinformática do projeto Seqüenciamento do transcriptoma da Hevea brasiliensis. Métodos: Utilizando dos
mesmos dados utilizados por Engelhardt, B.E e colaboradores (2006) foi realizado um teste piloto para certificar-se
da instalação e do manuzeio do programa. Posteriormente, utilizando-se de genes já anotados do transcritoma
de Seringueira depositados no banco de dados The Natural Rubber EST database (NRESTdb) que possuam
inferencia por teste funcionais e que possuiam apenas inferencia eletronica, realizou-se a anotação funcional
dos genes via SIFTER. Resultados: Após a implementação do sistema nos computadores do LabPIB-FMRP, o
teste piloto foi realizado e os resultado foram obtidos se mostraram o mesmo do artigo original (Engelhardt et
al. 2006). O gene escolhido, UT - cn108, que possuia inferência funcional retirada do NRESTdb concordou em
100% com os resultados do SIFTER e os que possuiam apenas anotação por BLAST retornou com resultados
de caracterização funcional. Conclusão: A metodologia de Inteligência Artificial na qual o método SIFTER se
baseia conhecida como Redes Bayesianas agregado a utilização de dados filogeneticos para a construção de
uma rede Bayesiana resultando devolvendo uma maior quantidade de informações para inferência funcional .
Apoio financeiro: CAPES, por meio de bolsa de doutorado; CNPq por meio do projeto PROSul
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268
Caracterização funcional de AQUITÃ: um gene
pleiotrópico responsável pela estrutura corporal padrão
em Arabidopsis thaliana
Arongaus, AB1; da Silva, AJR2; Meyerowitz, E3; Alves-Ferreira, M1
Laboratório de Genética Molecular Vegetal, Dept. de Genética, UFRJ, RJ
Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais, UFRJ, RJ
3 California Institute of Technology, Pasadena, USA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: parede celular, domínio proteico DC1, auxina, degradação protéica, estresse abiótico e biótico.
As plantas apresentam uma grande variação na sua estrutura corporal, incluindo em sua forma e tamanho. Tal
plasticidade no desenvolvimento das plantas varia em função dos fatores ambientais, sendo um pré-requisito à sua
sobrevivência, uma vez que se trata de um organismo séssil e sofre grandes pressões das oscilações nas condições
ambientais. Esse trabalho visou à caracterização de aquitã (aqt), um mutante pleiotrópico de Arabidopsis thaliana
que possui diversas alterações na estrutura corporal típica como o tamanho reduzido, o aumento no comprimento
e diâmetro da raiz principal, um número reduzido de raízes laterais e uma parede celular, aparentemente, menos
espessa. O mutante aqt é resultado de uma inserção no gene At1g55430, que codifica para uma proteína com motivos
DC1 e C1-like. Na ausência da proteína AQT, as plantas apresentam respostas diferenciadas ao hormônio auxina
que podem ser devidas a problemas na síntese ou transporte do mesmo. Apesar do processo de vascularização
ser dependente da síntese e transporte de auxina, não foram observadas alterações significativas no padrão de
vascularização de raízes e cotilédones do mutante. No entanto a linhagem marcadora utilizada, ATHB8::GUS,
indicou uma variação na atividade GUS em pecíolos em aqt. Uma análise dos componentes da parede celular revelou
que aqt apresenta um menor conteúdo de celulose e metabólitos secundários, o que pode levar o mutante a ter
uma maior sensibilidade a diversas substâncias, como isoxaben, sacarose e NaCl, como foi observado. Essa parede
celular mais frágil pode também ser responsável pela maior sensibilidade à infecção pela bactéria Xanthomonas
campestris como também foi observado neste trabalho. A maior sensibilidade ocorre independente da produção
de ROS que se encontra aumentada no mutante. A análise dos dados de expressão global do mutante revelou que
a via de degradação protéica se apresenta muito alterada, o que pode ser responsável pela característica mais
marcante de aqt, seu tamanho reduzido. O papel de AQT dentro deste processo ainda não pode ser esclarecido.
Essa proteína poderia atuar no processo de formação da parede celular e as alterações encontradas poderiam levar,
indiretamente, a uma menor atividade do proteassoma 26S. Ainda, AQT poderia atuar como um componente da
cascata de sinalização para degradação protéica via 26SP diretamente e as características observadas na parede
serem secundárias. Assim, a melhor caracterização de At1g55430 pode ajudar a elucidar etapas e componentes ainda
desconhecidos ou até mesmo um novo mecanismo de sinalização hormonal e sua relação com a degradação protéica.
Apoio Financeiro: CNPQ, IFS
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269
SCI1 is a component of the nuclear signal transduction
pathway engaging cell division/differentiation control
and auxin signaling in upper pistil
De Paoli, HC1,2,5; Brito, MS1,2; Quiapim, AC1; Teixeira, SP3; Goldman, GH3; Dornelas, MC4; Zhao, Y5
Goldman, MHS1
Department of Biology, FFCLRP/ University of São Paulo, Brazil 14040-901
Department of Genetics, FMRP/University of São Paulo, Brazil 14040-900
3
Department of Pharmaceutical Sc., FCFRP/University of São Paulo, Brazil 14040-903
4
Department of Plant Physiology, UNICAMP, Brazil 13083. 5Department of Cell and Developmental Biology, University of California - San
Diego, USA 92093
[email protected]
1
2
Keywords: stigma/style, SCI1, cell cycle, auxin signaling, plant development.
The success of plant reproduction depends on the appropriate development of the reproductive organs that involve
specific regulatory networks. We have undertaken the characterization of an unknown gene identified in a N. tabacum
stigma/style (S/S) subtracted cDNA library. This gene encodes a small lysine-rich protein which we showed, by qRTPCR and in situ hibridization, to be pistil-specific and transcribed in the reproductive specialized tissues: stigmatic
secretory zone and stylar transmitting tract. The conceptual translated protein has two putative cyclin interaction
domains, 15 predicted phosphorylation sites (p≥96%) and a putative nuclear localization signal, which was confirmed
by GFP fusion protein localization to be in the interchromatin/nuclear bodies. The highest transcript levels occur at
the very early stages of flower development, in which the S/S is differentiating. To get insight on gene function, we
built transgenic tobacco RNAi and overexpression (OE) plants, which showed stigmas with remarkably enlarged and
reduced areas, respectively. Transversal sections of the mature S/S clearly showed that this change in size occurs as a
consequence of the alteration in cell number that is increased in RNAi plants and decreased in OE plants. Combined
with the in vivo interaction of this protein with cyclinA1:1, revealed by biomolecular fluorescence complementation
(BiFC), we conclude this protein is a negative cell cycle regulator, which we denominated SCI1 (Stigma/style Cellcycle Inhibitor 1). Furthermore, differentiation of the stigmatic papillary cells was advanced in RNAi plants and
delayed in OE plants, suggesting that SCI1 influences differentiation probably through cell proliferation control.
Based on the phenotypic similarity between our RNAi and the Arabidopsis pistils treated with an inhibitor of auxin
polar transport (NPA), we analyzed the expression of three auxin related genes, NtARF8, NtAux/IAA13 and NtAux/
IAA19, in four independent RNAi and OE plants. The expression of all three genes were significantly altered, showing
that SCI1 influences the transcriptional regulation of some early auxin responsive genes. The characterization of
the Atsci1-1 (sci1) mutant, an Arabidopsis T-DNA insertion line, also revealed enlarged stigmas due to increased cell
number, like the tobacco RNAi plants. The sci1 pistils are very similar to those of the yuc2yuc6 double mutants, which
lack proper auxin synthesis on this tissue. Longitudinal sections and DIC images showed the yuc2yuc6 enlarged
stigmatic tissue, as well as the enlarged stigmas of the auxin signalers pid336 and npy1 mutants, are all consequences
of the increased cell number. Coherently, the AtSCI1 gene is down-regulated on yuc2yuc6, pid336 and npy1 mutants.
Furthermore, genetic interactions tests showed that sci1, npy1 and sci1npy1 have very similar pistil structures,
while sci1 showed synergistic interaction with yuc2yuc6 and pid336. Together, our results consistently define SCI1
as a molecular effector of the auxin signalling pathway controlling cell division during upper pistil development.
Financial support: CNPq/FAPESP/CAPES/FMRP/FAEPA/NIH.
Número Resumo : 29392
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HPx: uma nova heme peroxidase de plantas essencial
para a homeostase do sistema redox
Lazzarotto, F1; Rosa, SB1; Teixeira, FK2; Silveira, JAG3; Margis, R4; Margis-Pinheiro, M1
Laboratório de Genética Vegetal, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Laboratório de Genética Molecular Vegetal, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
3
Laboratório de Metabolismo do Estresse de Plantas, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Ceará
4
Laboratório de Genomas e Populações de Plantas, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: HPx, estresse oxidativo, APx, heme peroxidases, localização subcelular.
As peroxidases atuam regulando os níveis intracelulares de peróxido de hidrogênio através da redução destes
compostos à água. Estas enzimas estão presentes em todos os clados, sendo de fundamental importância para
o desenvolvimento dos organismos, atuando desde a proteção contra o estresse oxidativo até a regulação de vias
de sinalização, nas quais as espécies reativas de oxigênio atuam como mensageiros. Em plantas, estas enzimas
são geralmente codificadas por famílias multigênicas originadas a partir de eventos de duplicação gênica e/ou
cromossômica. Através de análises em bancos de dados, identificamos uma nova heme-peroxidase (HPx) ainda
não descrita na literatura. Esta proteína, exclusiva de plantas superiores, apresenta sequência nucleotídica e
estrutura proteica muito semelhantes às de ascorbato peroxidase (APx), apesar de não poder ser classificada como
tal em decorrência de uma série de mutações, inclusive na região do sítio ativo. Grande parte destas mutações
se mostrou conservada em todas as espécies analisadas, indicando que a manutenção de HPx foi assegurada ao
longo da evolução. HPx apresenta-se como gene cópia-única em todos os genomas analisados e cópias extras
deste gene parecem ser selecionadas negativamente em regiões duplicadas do genoma. Em arroz (Oryza sativa
L.), planta modelo para as monocotiledôneas, OsHPx localiza-se no cromossomo 8 e codifica uma proteína de 331
aminoácidos. Plantas de arroz silenciadas para o gene OsHPx foram obtidas através de transformação de calos
embriogênicos via Agrobacterium tumefaciens. Estas plantas mostraram alteração nas atividades de enzimas do
sistema antioxidante em comparação com plantas selvagens de mesma idade sob condições normais de cultivo.
A expressão de OsHPx em plantas selvagens de arroz (Oryza sativa L. ssp. Nipponbare) se mostrou modulada em
resposta a estresses com seca, radiação UV-C, alumínio e frio, indicando que HPx participa da defesa antioxidante
das plantas nas condições testadas. A localização subcelular de HPx foi predita através de transformação de
protoplastos de parte aérea de arroz com uma construção contendo cDNA de OsHPx fusionado ao da proteína
repórter YFP. Assim, observamos que HPx localiza-se no cloroplasto e mitocôndria, ambos locais de intensa
formação de espécies reativas de oxigênio, dentre as quais o peróxido de hidrogênio Em conclusão, OsHPx
codifica uma proteína funcional, relacionada com o sistema antioxidante e necessária nas respostas contra os
estresses oxidativos testados, provavelmente atuando na proteção das estruturas do cloroplasto e da mitocôndria.
Apoio financeiro: CNPq, ICGEB, UNESCO, FAPERGS.
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271
Influência de um endofítico bacteriano na expressão
gênica em folhas de cacau (Theobroma cacao)
Oliveira Jr, GP1; Falcão, LL2; Silva-Werneck, JO2; Gesteira, AS3; Argout, X4; Cascardo, JCM5; Micheli, F4;
Marcellino, LH2
Universidade Católica de Brasília
Laboratório de Regulação Gênica, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
3
Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical
4
CIRAD, França.
5
Universidade Estadual de Santa Cruz
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Endofítico, Moniliophthora perniciosa, Theobroma cacao, Expressão Gênica, Interação Planta/Microrganismo.
Introdução: A cultura do cacau é uma atividade de grande importância econômica e social para Brasil. O maior
problema para esta cultura no país é a doença Vassoura-de-Bruxa (VB), causada pelo fungo Moniliophthora
perniciosa, de difícil controle. Além das interações planta-patógenos, também devem ser considerados os
microrganismos endofíticos, que podem contribuir para o controle da doença através de indução de genes de
resistência, antagonismo ou através do aumento do vigor da planta. Objetivo: a) avaliar uma bactéria endofítica
(Bacillus subtilis ISO SF63) isolada de cacau resistente quanto à sua capacidade de colonização da planta e
atividade antifúngica contra M. perniciosa in vitro b) investigar a influência da interação Theobroma cacao/B.
subtilis ISO SF63 na expressão gênica. Materiais e métodos: Plântulas de cacau foram inoculadas com o isolado B.
subtilis ISO SF63. Após 40 dias de crescimento, fragmentos de folha, caule, raiz e meristema foram desinfestados e
colocados em meio de cultura BDA (batata, dextrose e ágar). Para determinação da atividade antifúngica, discos
de micélio foram crescidos na presença do endofítico e o crescimento avaliado. Para a análise da expressão gênica,
cDNA total de folhas de plantas inoculadas e não inoculadas com o endofítico foram hibridizados a membranas
de Macroarranjo contendo aproximadamente 1300 EST de cacau. Resultado: O isolado foi recuperado de todos
os tecidos testados e prevaleceu sobre outros microrganismos. Além disso, foi possível observar redução no
crescimento micelial. A análise das membranas mostrou genes diferencialmente expressos nas condições testadas.
Foram observados genes induzidos e genes reprimidos indicando que o isolado foi capaz de influenciar a expressão
gênica em cacau. Conclusão: B. subtilis ISO SF63 mostrou grande potencial de colonização e atividade antifúngica e
se mostrou capaz de interagir com a planta alterando o padrão de expressão de genes. O estudo destes genes pode
abrir caminhos para o entendimento das bases moleculares da complexa interação planta/endofítico/patógeno.
Apoio financeiro: Embrapa; Cirad; Fapesb
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272
Localização sub-celular de duas proteínas
metiltransferase reguladas ao longo do desenvolvimento
e específicas do pistilo de Nicotiana tabacum
Toledo-Filho, LAA1,2; Avanci, NC1; Angelo, PCS1; Quiapim, AC1; De-Paoli, HC1,2, Pranchevicius, MC1;
Dornelas, MC3; Goldman, GH4; Goldman, MHS1,2
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – FFCLRP
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – FMRP-USP
3
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP
4
Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade de São Paulo – FCFRP-USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pistilo, Localização sub-celular, Metiltransferase, GFP, Confocal
Diferentes órgãos possuem padrões distintos de expressão gênica, incluindo o órgão reprodutor feminino das
angiospermas (pistilo), formado de estigma/estilete e ovário. Através do “screening” diferencial de uma biblioteca
de cDNAs de estigma e estilete de Nicotiana tabacum isolou-se o cDNA PA3. O alinhamento (Blast) demonstrou
alta similaridade da proteína codificada pelo cDNA PA3 com metiltransferases da família SABATH. Essas enzimas
podem estar envolvidas com a metilação dos ácidos benzóico, salicílico e jasmônico. Os ésteres metilados destes
ácidos estão envolvidos com processos importantes em plantas, como defesa contra patógenos, atração de
polinizadores, desenvolvimento e sinalização. Experimentos de northern blot com RNA total de diferentes órgãos
(raiz, caule, folha, sépala, pétala, estame, estigma/estilete e ovário), utilizando o cDNA PA3 como sonda, revelou 4
bandas específicas do pistilo. Outro northern blot, com RNA total de estigmas/estiletes e ovários dos 12 estádios
desenvolvimentais da flor de N. tabacum, demonstrou um nível menor de expressão nos estádios iniciais, com
o aumento nos estádios próximos à antese, revelando uma regulação desenvolvimental da expressão gênica.
Hibridização in situ, usando o cDNA PA3 como sonda em cortes longitudinais de estigma/estilete, mostrou a
presença destes transcritos na zona secretória do estigma e no tecido transmissor, tecidos atravessados pelo tubo
polínico durante a polinização. Em cortes transversais do ovário houve hibridização no tecido vascular e nos óvulos.
A análise das 3 bibliotecas de cDNA de estigmas/estiletes de N. tabacum do nosso laboratório (TOBEST, TOBSH1
e TOBSH2) resultou na identificação de 28 cDNAs desta metiltransferase, porém com diferentes combinações
de éxons, sugerindo a ocorrência de processamento alternativo de éxons. Para examinar a possibilidade
das proteínas codificadas por diferentes cDNAs serem destinadas para diferentes localizações subcelulares,
2 cDNAs (PA3 e 46B11) foram fusionados com a sequência da GFP, nas extremidades N- em C-terminal. As 4
construções obtidas foram introduzidas em folhas de N. tabacum por infiltração com Agrobacterium tumefasciens.
A microscopia confocal revelou localização citossólica para ambas as proteínas, quando a GFP encontra-se na
extremidade N-terminal da proteína de fusão (GFP-cDNA). Porém, surpreendentemente, ambas as proteínas,
quando fusionadas na extremidade C-terminal com a GFP (cDNA-GFP), apresentaram acumulação em estruturas
vesiculares e/ou agregadas. Uma possibilidade é que a existência de um sinal de direcionamento na porção
N-terminal das duas metiltransferases tenha sido encoberto pela GFP na fusão N-terminal. Inacessíveis para
interações na porção N-terminal, necessárias para a correta compartimentalização, as proteínas permaneceriam
no citossol. Outra possibilidade é que a localização correta destas proteínas seja o citossol e suas fusões C-terminal
resultem em proteínas mal dobradas, que são aprisionadas em vesículas para degradação. Experimentos de
imunolocalização estão em andamento para esclarecer a correta localização subcelular destas proteínas.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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273
Caracterização e Mineração de Alelos do Gene de
Tolerância ao Alumínio AltSB em Sorgo
Hufnagel, B1,2; Guimarães, CT2; Schaffert, RE2; Caniato, FF2; Magalhães, JV2
Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Embrapa Milho e Sorgo, Rod. MG 424, Km 45 - Sete Lagoas, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: SNP, seleção assistida por marcadores, sorgo, estresse abiótico, melhoramento de plantas.
A toxidez causada pelo alumínio é um dos principais fatores que afetam o crescimento e o desenvolvimento das
culturas em solos ácidos, que ocupam grandes extensões de terras agricultáveis no mundo. Um gene de efeito maior na
tolerância ao alumínio em sorgo, AltSB, foi identificado via clonagem posicional. Esse gene codifica um transportador
de citrato localizado na membrana plasmática das células dos ápices radiculares, e confere tolerância por meio de um
mecanismo fisiológico baseado na exsudação de citrato ativada pelo alumínio na rizosfera. A tolerância ao Al é uma
característica relativamente rara em sorgo, ocorrendo em uma frequência de aproximadamente 5%, o que dificulta
a identificação de novas fontes de tolerância ao Al pelo melhorista. Em trabalhos prévios, o gene AltSB foi submetido
a uma análise associativa que revelou 10 polimorfismos associados a características relacionadas à tolerância ao
alumínio. No presente trabalho, sete desses polimorfismos foram convertidos em marcadores do tipo Amplification
Refractory Mutation System (ARMS), que são marcadores de fácil genotipagem e de baixo-custo, e utilizados para
a identificação de alelos do gene AltSB que conferem tolerância ao Al. Em dois painéis de sorgo, os marcadores
permitiram a recuperação de 7 e 9 acessos tolerantes. Na genotipagem de um dos painéis de melhoramento foi
aplicada uma estratégia de pooling de DNA que aumentou a eficiência do processo, resultando em uma economia
de 54% das reações de PCR necessárias para genotipar todo o painel. Estudos fisiológicos e moleculares posteriores
confirmaram que parte dos acessos identificados possui alelos funcionais do gene AltSB, sendo, consequentemente,
tolerantes ao Al. Entretanto, análises de expressão do gene AltSB, de acúmulo de alumínio nos ápices radiculares e
de exsudação de citrato pela raiz indicaram que um dos acessos identificados possui genes de tolerância distintos
do gene AltSB. Esse(s) gene(s), possivelmente, controlam um mecanismo de detoxificação interna de Al, mecanismo
esse totalmente distinto dos já descritos em sorgo até o momento. Com os marcadores gerados nesse trabalho podese agora buscar na diversidade genética da espécie, de forma eficiente, acessos de sorgo altamente tolerantes ao Al.
Apoio Financiero: Generation Challenge Programme; FAPEMIG.
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Estudo de genes da família MtN3/saliva expressos no
pistilo de Nicotiana tabacum L
Amorim, MFA1,2; Del Bem, LEV3; Quiapim, AC2; Brito, MS2; daSilva, LLP4; Goldman, GH5; Goldman, MHS2
Depto de Genética, Fac. Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo (USP)
Depto de Biologia, Fac. Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP
3
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – UNICAMP
4
Depto de Biol. Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Fac. Medicina de Ribeirão Preto – USP
5
Depto de Ciências Farmacêuticas, Fac. Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: MtN3, pistilo, Nicotiana tabacum, reprodução.
O pistilo (estigma/estilete e ovário) tem importância central na reprodução de plantas e genes expressos exclusiva/
preferencialmente nesse órgão podem estar associados à função reprodutiva. Análise por macroarray, com clones
de uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes de Nicotiana tabacum (TOBEST), revelou o contig TOBC23B06.
Experimentos de RT-PCR em tempo real, com RNAs de raiz, caule, folha, sépala, pétala, estame, estigma/estilete
e ovário, confirmaram uma expressão exclusiva no estigma/estilete. Experimentos adicionais mostraram que a
expressão ocorre nos últimos estádios do desenvolvimento floral, próximos à antese. Seqüenciamento do cDNA
23B06 e a análise pelo Blast mostraram que a proteína codificada tem similaridade com proteínas MtN3/saliva.
Algumas proteínas MtN3 já descritas (RPG-1, Os8N3 e NEC1) estão envolvidas na reprodução, mostrandose importantes para o desenvolvimento do pólen, deiscência da antera e desenvolvimento da inflorescência.
Entretanto, pouco se conhece sobre como atuam as MtN3. Uma busca por MtN3s na biblioteca do TOBEST
evidenciou a existência de 6 contigs/genes adicionais. Uma busca (Blast) nos genomas já seqüenciados de
Arabidopsis thaliana e Populus trichocarpa revelou as sequências de maior similaridade, nestas espécies, às
MtN3 do pistilo, cujas proteínas foram alinhadas pelo MAFFT. Uma árvore filogenética foi construída pelo
PhyML3(aLTR), o que permitiu determinar 5 possíveis grupos de ortólogos nessas três espécies. Também foi
possível definir genes homeólogos em N. tabacum: TOBC023B06 e TOBC047C06; e TOBC48E05 e TOBC17D07. Os
6 genes de Arabidopsis, revelados como ortólogos das MtN3 do pistilo de N. tabacum, possuem expressões elevadas
em estruturas relacionadas à reprodução: estames, pólen, pistilo e sementes/embrião, como verificado nos dados
de microarray disponíveis em Bio-Array Resource. Em Populus, foi possível encontrar os dados de alguns ortólogos,
os quais revelaram elevadas expressões em inflorescências. Para entender o papel que as MtN3 desempenham
no pistilo, o cDNA 023B06 foi usado para a construção de genes quiméricos, os quais foram introduzidos em N.
tabacum via Agrobacterium. Foram obtidas 16 plantas transgênicas independentes de superexpressão e 19 de
silenciamento (RNAi), as quais serão analisadas quanto ao fenótipo. Análises in silico indicam que a proteína
023B06 é localizada em membrana, possuindo 7 porções hidrofóbicas intramembranares e uma porção
C-terminal intracelular. Experimentos iniciais de expressão transiente, com a fusão prom35S::023B06-GFP em
folhas e protoplastos, sugerem uma localização subcelular em vesículas. Uma busca no banco de sequências
de Solanaceae revelou uma sequência genômica parcial do gene TOBC023B06. A análise do promotor pelo
PlantCARE evidenciou a presença de elementos cis-regulatórios envolvidos na resposta ao ABA e expressão no
endosperma. Esses mesmos elementos foram encontrados no promotor do seu ortólogo At5g13170, que apresenta
expressão elevada em sementes e responde ao tratamento com ABA. O padrão de expressão de TOBC023B06 e dos
ortólogos das MtN3 do pistilo de N. tabacum evidencia a importância dessas proteínas em estruturas reprodutivas.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES e CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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275
Mineração de Sequências, Análises Filogenética e de
Expressão Gênica de Fatores de Transcrição Dof em
Eucalyptus grandis
Breton, MC1; D´Almeida, GS2; Pasquali, G1
Programa de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Discente do curso de Biomedicina, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: fatores de transcrição Dof, eucalipto, Eucalyptus grandis, filogenia molecular, expressão gênica, RT-qPCR
Introdução: Descritas como proteínas estruturalmente variadas, dotadas de um ou mais domínios Dof e que
apresentam estrutura semelhante a zinc fingers, a família Dof de proteínas compreende fatores de transcrição
exclusivos de organismos vegetais. Estas proteínas, que podem agir tanto como ativadores quanto repressores,
parecem estar envolvidas na regulação de processos vitais característicos de plantas como a assimilação
fotossintética de carbono, a regulação pela luz, o acúmulo de proteínas em sementes, a germinação, a dormência,
a resposta a fitormônios e a regulação do florescimento. O domínio Dof parece ter se mantido conservado ao longo
da evolução, sendo possível observar o aumento do número de genes correspondentes a proteínas dessa família em
paralelo com o aumento da complexidade das espécies vegetais. Objetivos: Minerar sequências do banco genômico
e de cDNA de Eucalyptus grandis, utilizando o domínio conservado da família de fatores de transcrição Dof de outras
seis espécies de plantas como molde, validar o padrão de expressão por RT-qPCR e correlacionar filogeneticamente
com fatores de transcrição Dof já descritos na literatura. Métodos: As seqüências foram mineradas por tBlastX
local no banco do Genoma de Eucalyptus e no banco de cDNA do Projeto Genolyptus; anotadas utilizando o banco
de dados do NCBI e seu domínio conservado confirmado pelo banco de dados de proteínas Pfam. As análises
filogenéticas das seqüências preditas como fatores de transcrição Dof de E. grandis foram realizadas utilizando
as ferramentas Phylogeny.fr e ITOL. O alinhamento dos domínios Dof foi realizado com auxílio dos programas
MUSCLE e MEME. Para a avaliação da expressão, foram utilizados cDNAs oriundos de RNA total de flores, folhas
e tecidos vasculares de E. grandis; além de plântulas com três meses de idade, cultivadas in vitro e tratadas com
ácido abcísico, ácido naftalenoacético, quinetina, cloreto de sódio, frio, seca, além dos controles. Foram projetados
primers para 13 seqüências preditas como fatores de transcrição Dof em E. grandis e, como condições da reação,
diluição de cDNA 1:50, duplicatas biológicas e quadruplicatas experimentais, para todas as amostras analisadas.
O método de cálculo utilizado foi o 2-ΔΔCt. Resultados e Conclusões: Foram encontradas 20 sequências contendo
o domínio conservado Dof nas análises in silico e estas foram agrupadas em uma árvore juntamente com as
seqüências de Arabidopsis thaliana e Populus trichocarpa, demonstrando-se o grau de conservação e permitindo
a identificação de sequências parálogas e ortólogas. Os domínios comuns encontrados nestas proteínas foram
identificados e representados graficamente. As análises de expressão de 13 sequências preditas como fatores
de transcrição Dof em E. grandis, demonstraram ampla variação na expressão entre órgãos e os tratamentos
avaliados, corroborando seu papel de regulação em diversos processos biológicos em plantas. Estudos adicionais
estão sendo conduzidos no sentido de elucidar a essencialidade dos fatores ao desenvolvimento de E. grandis.
Apoio financeiro: CAPES & CNPq.
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276
Identificação e caracterização do gene M6PR de
Coffea spp
Silva, NV1,2 ; Cação, SB1,2; Santos, TB1,2; Pereira, LFP1,3; Vieira, LGE1
1
Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), Londrina, PR.
Universidade Estadual de Londrina (UEL) - Londrina, PR
3
Embrapa – Café, Brasília,DF
e-mail: [email protected]
2
Palavras-chave: C.arabica, Manitol, Cromossomo Artificial de Bactéria (BAC), estresse abiótico, M6PR
Devido às mudanças climáticas a tolerância a estresses abióticos, como estresse hídrico e salino, têm tido cada vez
maior importância na agricultura. Plantas com alta produção de manitol apresentam elevado grau de tolerância
a esses estresses abióticos. Em plantas superiores, a enzima chave na produção de manitol é a manose -6- fosfato
redutase dependente de NADPH (M6PR), que converte manose- 6 fosfato em manitol-1-fosfato. Este trabalho visa
a identificação e caracterização in silico e in vivo de genes de M6PR, em Coffea spp,.bem como a identificação deste
gene em uma biblioteca BAC de Coffea arabica. Através da comparação da expressão dos reads e contigs intra
e inter bibliotecas utilizando a ferramenta Norther Eletrônico-Teste Exato de Fischer (https://alanine.cenargen.
embrapa.br/) foi observado que o gene M6PR apresenta uma maior expressão em bibliotecas submetidas a estresse
hídrico e salino. Foram clusterizadas 350 sequências de ESTs do banco de dados do Projeto Genoma Café que
permitiram identificar 2 haplótipos de M6PR em C. arabica e 1 haplótipo em C. canephora. Análise da seqüência
deduzida apresentou uma proteína com tamanho, ponto isoelétrico, peso molecular e domínio semelhante
ao encontrados em M6PR de Apium graveolens. Para produção de sonda visando hibridizações de Southern
e Northern Blot, o gene M6PR foi amplificado, clonado no vetor PCR 2.1–TOPOâ cloning, (Invitrogen™, Life
Technologies) e seqüenciado. Iniciou- se também a identificação de clones de Cromossomo Artificial de Bactéria
(BAC), contendo gene de M6PR. Foi utilizada uma biblioteca BAC de café contendo 55.000 clones representando
5X o genoma do Coffea arabica. A identificação de clones BACs na biblioteca foi feita através da seleção por PCR
de pools de BACs e posteriormente por hibridização em filtros de membrana de colônia. Os clones identificados
foram submetidos a PCR individualmente e confirmaram a presença do gene. Os BACs positivos e DNA genômico
de C.canephora e C. eugeniodes estão sendo seqüenciados a fim de confirmar a presença de dois haplótipos em
C. arabica. Análises de expressão por Northern Blot em condições de estresse hídrico, salino e térmico em C.
arabica e C. canephora possibilitou detectar maiores níveis de expressão quando submetido à estresse hídrico
moderado ( - 2.39 MPa) e severo (- 4.5 MPa). Também foi observada expressão durante estresse salino em plantas
irrigadas com solução de NaCl 150 mM por 25 dias). Não foi observada expressão em plantas submetidas ao
estresse térmico. A caracterização e identificação do M6PR possibilitará compreender melhor o papel do acúmulo
de manitol em condições de estresses abióticos em Coffea spp. Através da identificação de BACs de C. arabica
contendo genes de M6PR será possível realizar a caracterização genômica do gene, e auxiliar o mapeamento
físico desta espécie para características de interesse agronômico como a tolerância a estresses abióticos.
Apoio Financeiro: CNPq, Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café.
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Avaliação da regulação gênica em plantas durante
o estresse causado pelo petróleo: estabelecimento
do desenho experimental e análise da expressão por
qPCR de genes envolvidos no metabolismos oxidativo
Nardeli, SM¹; Caetano, VS¹;2; Reinert, F2; Alves-Ferreira, M¹
¹ Lab. de Genética Molecular Vegetal, Dept. de Genética, UFRJ
2
Lab. de Anatomia, Dept. de Botânica, UFRJ
[email protected]
Palavras-chave: Arabidopsis, petróleo, estresse oxidativo, qRT-PCR, genes de referência
A utilização do petróleo apresenta elevados riscos para o meio ambiente, desde o processo de extração até o
consumo dos derivados. Os maiores danos registrados ocorrem por vazamentos em oleodutos ou navios petroleiros.
No Brasil, devido à magnitude das reservas e o estado atual de exploração, a mineração de petróleo e gás natural
representa grande potencial de impacto para o ambiente marinho e costeiro e até 2009 foram registrados mais
de cinqüenta acidentes envolvendo contaminação ambiental por petróleo. Todos esses incidentes apontam para
a necessidade de investimentos não só para prevenção de derramamentos e remediação das áreas afetadas,
como para estudos dos efeitos dessa poluição sobre diferentes espécies e ecossistemas. A incorporação destes
compostos reduz a tolerância dos vegetais a outros estresses, fragilizando os ecossistemas naturais. Arabidopsis
tem sido utilizada como modelo em diversos estudos como os de respostas desencadeadas pela exposição a
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos. Esses hidrocarbonetos estão presentes no petróleo e seus derivados e
possuem alta toxicidade. O primeiro mecanismo de resposta ao estresse nos vegetais é a sensibilização do aparato
antioxidativo. Uma das espécies reativas de oxigênio é o H2O2 (peróxido de hidrogênio), produzido nos tecidos
vegetais como resposta a muitos fatores bióticos e abióticos e se difunde através da membrana causando danos
como inativação de proteínas. As enzimas catalase e ascorbato peroxidase reduzem os níveis celulares de H2O2
através da quebra deste em água e oxigênio. Neste trabalho, selecionamos os genes catalase2 (CAT2) e ascorbato
peroxidase1 (APX1) para uma avaliação, através da análise do padrão de expressão gênica por qPCR, do efeito da
fração aquosa do óleo MF-380 (WSF-380) no metabolismo oxidativo vegetal sob diferentes tempos de exposição
ao poluente. A técnica qPCR necessita de normalização para uma leitura adequada dos dados de expressão. Para
a normalização, é necessária a identificação dos chamados genes de referência que são genes que apresentam
níveis de expressão semelhante nas condições avaliadas. Assim, selecionamos nove possíveis genes de referência
em Arabidopsis, baseados em dados da literatura. A estabilidade de expressão destes genes foi avaliada sob
diferentes tempos de exposição ao WSF-380 e na condição controle. O algoritmo Normfinder identificou os genes
At2g28390, At5g08290 e At5g15710 como a melhor combinação de genes a ser utilizada em estudos de expressão
gênica nesta condição de estresse. A análise inicial da expressão dos genes envolvidos no metabolismo oxidativo
de Arabidopsis mostrou aumento da expressão dos genes CAT2 e APX1 sob 24 horas de exposição à WSF-380 em
relação aos tempos inicial e após 12 horas de exposição. A expressão destes genes, assim como de genes para a
enzima superóxido dismutase será avaliada em outros tempos de exposição à WSF-380, para entender o estresse
oxidativo em resposta à contaminação por petróleo.
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278
Differentially expressed genes between contrasting
lignin content sugarcane cultivars
Ferreira, SS1; Dal-Bianco, M1; Silva, GL1; Nishiyama-Jr, MY1; Loureiro, ME2; Barbosa, M3; Souza, GM1
Instituto de Química – Departamento de Bioquímica – Universidade de São Paulo.
Departamento de Biologia Vegetal – Universidade Federal de Viçosa.
3
Departamento de Fitotecnia – Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sugarcane, microarray, lignin, cell wall, cellulosic ethanol
Sugarcane is the primary source of sugar and ethanol in Brazil. In recent years, there is increasing interest in the
development of bioethanol production using the lignocellulosic residues of sugarcane bagasse to produce cellulosic
ethanol. This would increase ethanol production significantly, but the technology is not yet mature and economic.
In attempts to improve this technology and make it viable, studies regarding lignin biosynthesis, an aromatic
component of plant cell wall, attract great attention, since lignin is one of the main barriers to cellulosic ethanol
production, avoiding the polysaccharides degrading enzymes to have access to cellulose and hemicelluloses to
release fermentable sugars. Preliminary studies indicate that the sugarcane ancestor, S. spontaneum, has altered
lignin content and deposition pattern when compared with the commercial cultivar RB867515, which has the
largest planted area in Brazil. To investigate alterations in gene expression that can be associated with this lignin
contrast and also to identify target genes for transgenic studies, we performed two color microarray experiments
using customized cDNA oligo arrays (Agilent) comprising 14000 sugarcane assembled sequence (SAS). We
hybridized internode 1 and internode 4 samples from S. spontaneum against RB867515. We identified 229 (56 up
and 173 down) and 325 (136 up and 189 down) differentially expressed SAS for internode 1 and 4, respectively.
About 58% of all SAS identified were classified as “unknown genes” or “no match” with public data bases. Cell
wall associated genes were down regulated in S. spontaneum. These genes include probable genes of lignin
biosynthesis pathway, lignin assembly, cell wall polysaccharides biosynthesis, and transcription factors involved in
cell wall biosynthesis and assembly. The preliminary results suggest that lignin biosynthesis may be differentially
regulated at the transcription level in these genotypes. The analysis was carried out with immature internodes
and intermediately mature internodes and the transcriptome needs to be further evaluated in mature internodes
and leaves. These transcriptomic studies are de first designed to understand lignin biosynthesis in sugarcane
and point to interest targets for sugarcane transgenic improvement to produce the so-called Energy Cane.
Apoio financeiro: CNPq, Fapesp.
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279
Análise do perfil de expressão de genes de estresse e
defesa na interação Hevea brasiliensis – Microcyclus ulei
Koop, DM1,3; Conceição, L2; Cardoso, SEA2; Silva, DC3; Cascardo, JCM1; Garcia, D1,4
Centro de Biotecnologia e Genética/ LGBM/ UESC, CEP 45.662-000, Ilhéus, BA, Brasil
Plantações Michelin da Bahia
3
Centro de Microscopia Eletrônica/ UESC, Ilhéus, BA.
4
CIRAD/ UMR-DAP, Montpellier, França
[email protected]
1
2
Palavras-chave: seringueira, resistência, Mal-das-Folhas, apoptose, expressão gênica.
O “Mal-das-folhas”, causado pelo fungo Microcyclus ulei, é a principal doença da seringueira (Hevea brasiliensis)
e representa uma grande ameaça para a produção mundial de borracha natural. Portanto, a identificação das
vias de sinalização da resistência e dos genes associados representa uma informação relevante aos programas de
melhoramento. O objetivo deste trabalho foi analisar o perfil de expressão de genes de estresse e defesa de dois
genótipos clonais de seringueira: MDF180 (parcialmente resistente a todos os isolados de M. ulei) e PB314 (altamente
suscetível a todos os isolados), e comparar estes resultados com análises histológicas e de fragmentação do DNA.
Para isto, foram utilizados macroarranjos constituídos de 2575 produtos de PCR a partir dos clones bacterianos das
bibliotecas SSH da interação. Para histologia e fragmentação do DNA, folhas de MDF180 e PB314 foram inoculadas
com esporos de Microcyclus ulei e coletadas em diferentes tempos. Folhas não infectadas foram também coletadas.
Para a confecção de lâminas histológicas, as amostras foram incluídas em historesina Leica, seccionadas (3µm)
e coradas com Ácido periódico-Reativo de Shiff e Naphthol Blue Black. Na detecção de fragmentação do DNA
foi utilizado o kit “In Situ Cell Death Detection” (Roche Applied Science). Dentro do grupo funcional de estresse e
defesa, foram encontrados genes com alto nível de expressão em MDF180, dos quais as prováveis funções estão
associadas a R-gene – NBS-LRR e Cf5, à via de síntese das ligninas – cinnamoyl CoA reductase, enolase, alcohol
dehydrogenase e peroxidase, à atividade inibidora de proteases – cistatina, a proteínas PR e à regulação do nível
de espécies reativas de oxigênio (EROs) – thioredoxine dependent peroxidase que protege células e tecidos contra
danos oxidativos. Aumentos mais tardios da expressão foram observados em PB314 para os genes LRR disease
resistant, proteínas PR, quitinase, MnSOD, peroxidase, enolase e inibidor de protease. Genes como Bax inhibidor
e defender against cell death like molecule não apresentaram variações significativas entre MDF180 e PB314.
As análises histológicas, além de confirmar pela primeira vez a localização intercelular do micélio, permitiram
comparar o nível de degradação dos tecidos infectados nos três clones e relacioná-lo com a resistência dos mesmos.
Núcleos com reação TUNEL-positivos foram observados apenas em PB314, 7 dias após inoculação. Em conclusão,
morte celular programada (MPC) pode ocorrer em PB314, na fase tardia da infecção, fortalecendo a hipótese
que M. ulei seria hemibiotrófico. A MPC também pode estar associada à latência na expressão de genes R e dos
genes relacionados com detoxificação de EROs e via de síntese de ligninas. Já em MDF180, os tecidos apareceram
pouco degradados apesar da presença do micélio e as reações de MPC não foram detectadas. A redução das
EROs por aumento de expressão de enzimas de detoxificação pode ser responsável pela integridade dos tecidos.
Apoio Financeiro: Capes e Plantações Michelin da Bahia
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Sinalização por etileno: papel no estabelecimento
de uma associação eficiente entre arroz e bactérias
diazotróficas endofíticas
Vargas, L1; Baldani, JI2; Hemerly, A1
Instituto de Bioquímica Médica, Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, CCS - Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941590, Rio de Janeiro, RJ, Brazil
2
EMBRAPA Agrobiologia, BR465, Km47 23851-970, Seropédica, RJ, Brazil
[email protected]
1
Palavras-chave: Oryza sativa, receptores de etileno, desenvolvimento radicular, bactérias diazotróficas endofíticas, expressão gênica.
Arroz (Oryza sativa) e outras gramíneas são naturalmente colonizados por diversos tipos de bactérias diazotróficas
endofíticas. Essas bactérias conferem uma série de benefícios à planta hospedeira, como Fixação Biológica de
Nitrogênio (FBN) e produção de hormônios vegetais, que aumentam a produtividade agrícola. O envolvimento
do etileno na interação entre gramíneas e bactérias endofíticas foi primeiramente estudado em cana-de-açúcar,
onde se observou que genes da via de resposta ao etileno poderiam estar envolvidos no estabelecimento da
associação. Este trabalho propõe estudar a expressão dos receptores de etileno em plantas com diferentes níveis
de eficiência na associação com endofíticos. Para estudar a expressão gênica durante a associação com bactérias
diazotróficas endofíticas, sementes de arroz das cultivares IR42 (maior eficiência na associação) e IAC4440 (menor
eficiência) foram germinadas e inoculadas com as bactérias diazotróficas endofíticas Azospirillum brasilense
sp245 ou Burkholderia brasilensis M130. Três e 10 dias após a inoculação, o fenótipo das plântulas foi analisado, a
colonização da planta por endofíticos e a expressão gênica de RE foram determinadas por PCR em tempo real. Os
resultados sugerem que a colonização das bactérias endofíticas, em ambos os experimentos, é maior em IR42 do
que em IAC4440. Plântulas IR42 e IAC4440 inoculadas com A. brasilense tiveram aumento expressivo no número de
raízes laterais, enquanto que plantas inoculadas com B.brasilensis não apresentaram alteração fenotípica durante
o período analisado. Associado com o aumento de raízes laterais durante a associação entre IR42 e A.brasilense,
notou-se uma resposta maior e mais rápida de indução de expressão do RE pela inoculação com A. braziliense do
que , com B.brasilensis . Em IAC4440, os RE parecem pouco responsivos à interação com endofíticos. . Os dados da
colonização e da indução da expressão dos receptores de etileno sugerem que o sucesso da interação com diazotrofos
endofíticos pode promover melhorias no sistema radicular vinculado à inativação da via de sinalização do etileno
nos primeiros dias após a inoculação, e que tanto o genótipo da bactéria quanto o genótipo da planta parecem ser
importantes para determinar o estabelecimento de uma associação eficiente e o padrão de resposta da planta.
Apoio financeiro: FAPERJ, CNPq, INCT, CAPES
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281
Análise do acúmulo de transcritos de ω-3dessaturases em genótipos de soja contrastantes para
o teor de ácido linolênico
Pinto, MO1; Good-God, PIV2; Marcelino, FC3; Silva, DF4; Piovesan, ND4; Moreira, MA4; Barros, EG1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa
Universidade Federal de Viçosa, Campus Rio Paranaíba
3
EMBRAPA Soja, Londrina. 4 Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Expressão gênica, FAD3, Estabilidade oxidativa, Cromatografia gasosa, Ácidos graxos.
Os ácidos graxos poliinsaturados, como linoléico e linolênico, são os principais responsáveis pela alta instabilidade
oxidativa a altas temperaturas do óleo destinado a frituras e à fabricação de biodiesel. A biossíntese de ácidos
graxos poliinsaturados é catalisada pelas dessaturases. A ω-6-dessaturase converte ácido oléico (18:1∆9) a linoléico
(18:2∆9,12) e a ω-3-dessaturase produz ácido linolênico (18:3∆9,12,15) a partir de 18:2∆9,12. Três genes principais
(GmFAD3A, GmFAD3B e GmFAD3C) foram caracterizados como responsáveis pela produção de ω-3-dessaturase
em soja. Os mecanismos precisos de regulação da produção de ácido linolênico ainda não são muito claros, o
que dificulta o processo de obtenção de genótipos com baixo conteúdo desse ácido graxo. A análise molecular de
mutantes de soja com baixo conteúdo de ácido linolênico poderá ajudar a elucidar tais mecanismos. Os objetivos
principais deste trabalho foram determinar os níveis de mRNAs das principais ω-3-dessaturases, correlacionando-os
com as concentrações relativas de ácidos linolênico durante a ontogenia da semente de soja em genótipos normais
e mutantes. Para isso, foram utilizados três genótipos contrastantes para essa característica: A29, (~1% 18:3∆15,12,9);
N85-2176 (~3% 18:3∆15,12,9) e Tucunaré (Variedade comercial, ~8% 18:3∆15,12,9). As plantas foram cultivadas em casa
de vegetação e suas sementes foram coletadas separadamente em 5 estádios de desenvolvimento de acordo com o
peso úmido da semente: 1º estádio: 0 a 125 mg; 2º estádio: 126 a 250 mg; 3º estádio: 251 a 375 mg; 4º estádio: superior
a 376 mg; 5 º estádio: semente madura. Os teores de ácidos graxos na fração óleo das sementes nos cinco estádios de
desenvolvimento foram determinados por cromatografia gasosa e a expressão gênica, por PCR quantitativo, utilizando
como o controle endógeno o gene da GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase). De modo geral, o conteúdo
de 18:3∆9,12,15 decresceu drasticamente nos estádios iniciais em todos os genótipos. No entanto, não foi observada
expressão diferencial entre os genes GmFAD3A, GmFAD3B e GmFAD3C, que pudessem explicar tais alterações. O
genótipo A29, seguido de N85-2176, apresentou a menor concentração de 18:3∆9,12,15 durante todo o desenvolvimento
da semente. Estes genótipos apresentaram expressão praticamente nula do gene GmFAD3A. Além disso, A29
apresentou expressão reduzida do gene GmFAD3B. Assim, pelo menos em parte, os níveis de transcritos dos genes
GmFAD3A e GmFAD3B explicam as diferenças na concentração de ácidos graxos da fração óleo em A29 e N85-2176.
Apoio financeiro: CNPq e CAPES.
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Aspectos evolutivos das diacilglicerol
aciltransferases (DGAT): enzima chave na rota de
síntese de lipídios neutros
Turchetto-Zolet, AC1,2; Cagliari, A1; Loss, G2; Maraschin, F1; Margis-Pinheiro, M1; Margis, R1,2
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: triacilgricerol, DGAT1, DGAT2, história evolutiva, análise filogenética.
Os triglicerídios (TAG) representam a maior forma de depósito de energia nos eucariotos e em algumas bactérias.
Em plantas, os TAG são componentes importantes das sementes, correspondendo a recursos valiosos para
o consumo alimentar e no uso industrial, especialmente para a fabricação de biocombustíveis. Os TAGs são
formados primariamente a partir de reações da enzima acil-CoA diacilglicerol aciltransferase (DGAT, EC:2.3.1.20),
a qual pode ser um dos passos limitantes na formação de TAG durante o desenvolvimento da semente, sendo
considerada uma enzima chave na síntese de TAG. Duas formas enzimáticas de DGAT (DGAT1 e DGAT2) foram
identificadas em uma grande variedade de eucariotos. Apesar de sua aparente redundância funcional, essas
enzimas não são semelhantes ao nível de sequência de DNA ou sequência protéica, fazendo parte de famílias
gênicas distintas. Os genes que codificam DGAT1 apresentam homologia de sequência com a enzima AcilCoA:colesterol aciltransferase (ACAT, EC: 2.3.1.26), enquanto genes que codificam DGAT2 apresentam homologia
de sequência com a enzima acil-CoA monoacilglicerol aciltransferase (MGAT, EC:2.3.1.22) e acil-CoA “wax” álcool
aciltransferase (AWAT, EC:2.3.1.75). O objetivo deste trabalho foi determinar os eventos evolutivos das enzimas
DGAT1 e DGAT2 para entender a sua origem e seu relacionamento com ACAT, MGAT e AWAT. Para isso, sequências
nucleotídicas e protéicas dessas enzimas foram adquiridas dos bancos de dados para um grande número de
taxa, incluindo levedura, fungos, animais e plantas. As sequências protéicas e nucleotídicas foram alinhadas e
utilizadas para a realização de análises filogenéticas, através dos métodos de distância e baiesiana. As enzimas
DGAT1 e DGAT2 foram identificadas em todos os níveis taxonômicos, com a exceção da DGAT1 que não está
presente em leveduras. As análises filogenéticas revelaram que DGAT1 está mais proximamente relacionada com
ACAT1 e ACAT2 do que com DGAT2 e esta última apresentou maior relacionamento com MGAT e AWAT. Esses
resultados indicam que DGAT1 e DGAT2 evoluíram independentemente e que podem ter tido diferentes origens.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, MCT, FAPERGS, FINEP.
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283
Modulation of the steady-state levels of gene
expression by the sugarcane circadian clock
Hotta CT1; Nishiyama-Jr, MY1; Souza GM1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Bioquímica, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: sugarcane, transcriptome, circadian clock
The circadian clock is a signaling network that provides organisms with an internal timekeeping mechanism. This
mechanism allows the organisms to anticipate rhythmic environmental changes, which confers them with survival
advantage. Plants with a circadian clock period that is similar to the period of environment rhythms fix more carbon
and have higher water use efficiency than plants with circadian periods that do not match with the environment.
Sugarcane is a high productivity C4 monocot that has high capacity to store sucrose in their shoots. The aim of this
work is to identify genes that have their steady-state gene expression modulated by the sugarcane circadian clock.
METHODOLOGY: we have grown sugarcane in soil in a 12 h light/ 12 h dark photoperiod for 3 months. The plants
were transfered to a constant light conditions for 24 h and their leaves ere harvested every 4 h for the next 48 h. The
expression levels were estimated using a customized Agilent oligo array containing 21902 elements of which 7380 are
specific for the antisense sequences sugarcane ESTs. A mix of the mRNA from all time points was used as reference.
The expression dynamics of each element was analyzed using the COSOPT algorithm and a Fisher G-test. The genes
that had a p < 0.05 in both tests were considered circadian. RESULTS: We have identified a total of 2555 circadian
elements of which 2354 are in the sense orientation (16.2% of all sense elements) and 201 are in the antisense
orientation (2.7% of all antisense elements). Of the 1380 sugarcane EST that had probes in both sense and antisense
orientation, 24,8% had a positive correlation between the expression levels of both elements. We have identified
genes with all possible phases using K-median cluster. As an example, The CLOROPHYL A/B BINDING PROTEIN gene
family all peak between 4 h and 8h after the subjective dawn. The phase of the genes associated to the core oscillator,
such as CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) and GIGANTEA (GI) match their described phase in Arabidopsis.
Financial Support: FAPESP
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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284
Expressão do gene Osr40c1-like em milheto
(Pennisetum glaucum) submetido ao estresse hídrico
Falcão, LL1; Silva-Werneck, JO1; Vilarinho, BR2; Marcellino, LH1
Laboratório de Regulação Gênica I – Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Universidade de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Estresse hídrico, osr40c1, Gramínea, Expressão gênica, Milheto
Introdução: Estresses abióticos, como a seca, podem reduzir significativamente o rendimento das lavouras e
restringir áreas agricultáveis. Previsões ambientais sinalizam para o aumento do aquecimento global nas próximas
décadas, assim, o desenvolvimento de tecnologias de plantas tolerantes a períodos prolongados de estiagem
será importante na manutenção da produção agrícola brasileira e mundial. Neste contexto, procuramos isolar e
caracterizar genes que estejam envolvidos na resposta a estresse hídrico, para posterior utilização em programas
de melhoramento de plantas via transgenia. Para tal, selecionamos o milheto (Pennisetum glaucum), uma gramínea
com alta adaptação a condições adversas de clima e solo, como fonte deste tipo de gene. Neste trabalho apresentamos
um estudo a respeito da expressão de um gene com alta similaridade (90%) ao Osr40c1 de arroz, responsivo ao
ácido abscísico (ABA) e ao estresse salino, condição normalmente associada à resposta das plantas ao estresse
hídrico. Objetivo: Avaliar a expressão de Osr40c-like de milheto submetido a regime de seca. Métodos: A análise da
expressão foi realizada por Northern blot, utilizando RNA total de folhas e raízes de plantas de milheto crescidas em
casa de vegetação e submetidas à seca pela suspensão da irrigação. Resultados: Houve um aumento na expressão
do gene em raiz já no primeiro estágio de suspensão de irrigação. Este aumento também foi observado em folhas,
porém ocorre nos estágios mais avançados de seca. Conclusão: O gene Osr40c-like de milheto é responsivo a seca. A
indução da expressão é mais proeminente em raiz e ocorre nos primeiros estágios de suspensão de água, diferente
do que acontece em folha, onde a indução ocorre em condições mais severas de seca. Uma análise complementar
desta expressão será feita através de Real-time PCR para validar os resultados iniciais. O gene avaliado tem
potencial de uso em programas de melhoramento vegetal visando o aumento da resistência à seca em gramíneas.
Apoio financeiro: Embrapa
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285
Comparação de dois métodos para extração de RNA de
folhas de Passiflora edulis SIMS
Luz, AC1,2; Paiva,CL2; Pretti, IR1,2; Batitucci, MCP1,2
Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal- PPGBV – Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Humanas e
Naturais, Universidade Federal do Espírito Santo
2
Laboratório de Genética Vegetal e Toxicológica – Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Humanas e Naturais,
Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
1
Palavras-chave: extração RNA, TRIzol® Reagent, Concert™ Plant RNA Reagent, Passiflora edulis SIMS, maracujazeiro.
O maracujazeiro, Passiflora edulis SIMS, é uma importante cultura para o Brasil, sendo que o Estado do Espírito
Santo é o segundo maior produtor dessa frutífera. Diferentes regiões produtoras de maracujá, no Estado, sofrem
os efeitos negativos de secas. O déficit hídrico desencadeia uma série de respostas nas plantas, desde a percepção,
a ativação de rotas de sinalização e as alterações em nível de expressão gênica, provocando, consequentemente,
uma síntese diferencial de proteínas e RNA mensageiro. Para estudo da expressão de genes de plantas sob
déficit hídrico é indispensável que o RNA extraído seja íntegro. Folhas de P. edulis, são ricas em flavonóides,
alcalóides, glicosídeos cianogênicos, monoterpenóides e saponinas, que dificultam o processo de extração de
RNA, principalmente por desencadearem processos oxidativos. Desta forma, este estudo objetivou analisar dois
métodos de extração de RNA: TRIzol® Reagent (Invitrogen) e Concert™ Plant RNA Reagent (Invitrogen) - produtos
comerciais específicos para extração de RNA, e indicar qual o mais eficaz para uso em folhas de maracujazeiro.
As extrações foram conduzidas segundo especificações do fabricante. Os extratos resultantes foram analisados
em espectrofotômetro NanoDrop 3300 Termo Scientific (260nm e a 280nm) e em gel de agarose (1%) corado com
GelRedTM, visualizado em transiluminador-UV. O RNA obtido com Concert apresentou razão A260/A280 média
de 1,91 e concentração de RNA de aproximadamente 1269,70 ng/µL, já o resultante da reação com TRIzol, razão
média de 1,73 e concentração de RNA de 731,19 ng/µL. A eletroforese em gel permitiu observar banda nítida de
DNA em todos os extratos obtidos pelo método Concert, o que não foi observado com método TRIzol. Devido à
razão A260/A280 satisfatória e a menor contaminação com DNA, o RNA proveniente de amostras submetidas a
tratamento com TRIzol foi utilizado para a RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction), tendo
como referência o gene constitutivo 18S ribossomal, para teste de amplificação. A síntese de cDNA deu-se
através do Kit Superscript III First Strand Synthesis (Invitrogen). O gel de agarose (1%), corado com GelRedTM
e visualizado em transiluminador-UV, apresentou boa definição dos fragmentos amplificados. Dessa forma,
considerou-se o TRIzol como método preferencial, dentre os testados, para extração de RNA em folhas de P. edulis.
Apoio: CNPq, FACITEC, UFES e PPGBV.
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286
Expressão heteróloga da proteína GmERD15 em
sistema bacteriano
Dadalto, SP1; Cerqueira, DM1; Alves, MS 1,2; Moreira, FF2; Fontes, EPB2; Fietto, LG1
Laboratório de Biotecnologia Molecular, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa.
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Estresse, GmERD15, Expressão heteróloga, Soja, Fatores de Transcrição.
Fatores de transcrição são proteínas que controlam a expressão de vários genes ao mesmo tempo e podem ser
o ponto de integração entre vias de sinalização que controlam a resposta a diferentes estresses. Desta forma,
os fatores de transcrição estão entre os principais alvos da engenharia genética para o aumento da tolerância
a estresses em plantas. Análises de expressão gênica demonstraram um sinergismo no aumento da expressão
do gene GmNRP-B quando plantas de soja (Glycine max) foram submetidas aos estresses osmótico e do retículo
simultaneamente, indicando que a expressão deste gene responde a uma integração das vias de resposta a estes
estresses. Utilizando o sistema do mono-híbrido e o promotor do gene GmNRP-B como isca foi identificada a
proteína GmERD15 (Early Responsive to Dehydration15) como um possível fator de transcrição que controla
a expressão de GmNRP-B. Neste trabalho, nós expressamos a proteína GmERD15 em sistema bacteriano
com o objetivo de obter um antisoro policlonal para estudos bioquímicos de interação proteína-proteína e de
localização subcelular. Para isto, cepas de E.coli Bl21 pLys foram transformadas com o plasmídeo pDEST17GmERD15. Os transformantes positivos foram testados quanto à capacidade de expressar a proteína GmERD15.
O clone que apresentou maior expressão foi escolhido para expressão e purificação da proteína recombinante.
As etapas da purificação foram analisadas qualitativamente por SDS-PAGE e quantificadas pelo método de
Bradford. Como resultado, obteve-se a proteína GmERD15 purificada em uma concentração de 1,92 mg/
ml. A proteína obtida foi utilizada para imunização de um coelho para obtenção de um antisoro policlonal
anti-GmERD15. A especificidade e o título do antisoro produzido estão em análise em nosso laboratório.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq e CAPES
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287
Isolamento e caracterização de um gene WRKY de citros
Martins, PK1; Freitas-Astúa, J1,2; Silva-Pinhati, ACO1; Kishi, LT1; Machado, MA1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC, Cordeirópolis-SP; 2. Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Cruz das Almas–BA.
[email protected]
1
Palavras-chave: SAR, fatores de transcrição, CitEST, W-box, citros
As plantas têm uma variedade de mecanismos de defesa para se protegerem da infecção por patógenos. A
resposta de defesa é resultado da ativação transcricional de um grande número de genes durante a infecção. As
proteínas WRKY têm sido descritas como reguladores transcricionais na resposta de defesa das plantas incluindo
a ativação da via SAR (Systemic Acquired Resistance). Vários genes de regulação da defesa da planta, inclusive
genes regulatórios NPR1 e diversas PR (Pathogenesis-related proteins), têm elementos W-box em seus promotores
que são especificamente reconhecidos pelas proteínas WRKY, também necessárias para indução da expressão.
Assim, o presente trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar o gene CitWRKY de citros, identificado na
biblioteca de Citrus reticulata infectada com Xylella fastidiosa do banco CitEST. Após uma primeira análise in silico,
primers específicos foram desenhados e utilizados em reações de PCR para o isolamento do gene. O fragmento
de cDNA obtido, com 1.098 pb, foi sequênciado. A análise e a caracterização da sequência mostraram que a
ORF codifica uma proteína de 363 amino ácidos com todas as características de proteínas da família WRKY de
fatores de transcrição zinc finger. Entre elas o domínio WRKY identificado por uma região de aproximadamente 60
amino ácidos contendo a sequência conservada WRKYGQK adjacente ao motivo zinc finger. Ambas as regiões são
necessárias para alta afinidade na ligação aos elementos W-box. A análise filogenética realizada com as sequências
de amino ácidos dos 74 genes WRKY de Arabdopsis thaliana depositadas no TAIR mostrou que o CitWRKY
pertence ao grupo IId caracterizado pelos domínios HARF e o de ligação à calmodulina. Esses dois domínios
são completamente conservados em CitWRKY sugerindo uma função similar ao AtWRKY7. Entre os membros
do grupo IId, alguns são altamente expressos após infecção com patógeno ou tratamento com ácido salicílico,
enquanto outros não são induzidos. Assim, a função de regulação positiva ou negativa de CitWRKY deverá ser
investigada em plantas transgênicas superexpressando CitWRKY e infectadas com patógenos que afetam a espécie.
Apoio Financeiro: Convênio Embrapa-Monsanto e INCT Citros – FAPESP e CNPq
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288
Análise Comparativa do Padrão de Expressão dos
Genes Relacionados ao Déficit Hídrico em Soja
Através de qRT-PCR
Guimarães-Dias, F¹; Neves-Borges, AC2; Cruz, F¹; Giovanella-Kampmann, L¹; Loureiro, M E3; Alves-Ferreira, M1
Laboratório de Genética Molecular Vegetal. Departamento de Genética, UFRJ
²Laboratório Integrado de Biologia Vegetal II. Departamento de Botânica, UniRio
3
Departamento de Biologia Vegetal, Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
¹
Palavras-chave: Déficit hídrico, Expressão gênica, PCR quantitativo em tempo real, Soja
A soja (Glicine max) é uma leguminosa que possui grande importância na agricultura e economia mundial.
Contudo, no Brasil, em 2009, o déficit hídrico provocou expressiva redução na produção de soja (Usda 2009).
De fato, sua produção tem sido frequentemente comprometida, devido a ocorrência de oscilações climáticas
que levam à longos períodos de seca. Assim, investigações sobre o mecanismo de tolerância à seca tornam-se
imprescindíveis para busca e produção de cultivares mais tolerantes. Neste trabalho, após extensiva revisão da
literatura foram selecionados aproximadamente 200 genes de Arabidopsis thaliana que respondem à seca. A busca
de possíveis ortólogos destes genes em soja foi realizada através de análises de Blastp no site Phytozome. O uso
das informações obtidas a partir dos respectivos Unigenes permitiu investigar o padrão de expressão desses genes
em diferentes órgãos em situações controle. Desta forma, foi possível identificar genes que apresentam baixa
expressão em todos os órgãos e que poderiam ser fortemente induzidos durante o estresse hídrico, como os genes
WRKY5, WRK62, GBL3, CANTA e CCAAT. O padrão de expressão destes genes foi avaliado através da técnica de
qRT-PCR em duas variedades de soja, BR16 e EMBRAPA48, sensível e resistente à seca, respectivamente. Para tal,
foram analisadas amostras foliares destas plantas apresentando diferentes níveis de estresse hídrico (-1,5 MPa e
-3,0 MPa). Análises do padrão de expressão dos genes CANTA, CCAAT, GATA, GBL3 e WRKY5 demonstraram que
estes genes não sofreram grandes variações nos níveis de expressão nas condições analisadas de déficit hídrico
em ambas cultivares, sensível e tolerante. Entretanto, o gene WRKY62 foi fortemente induzido apenas no cultivar
tolerante em -3,0 MPa, indicando um possível papel deste gene na tolerância ao estresse hídrico. Estes resultados
apontam que o WRKY62 pode ser um alvo nos estudos posteriores de tolerância a seca. Estudo de genes relacionados
ao mecanismo de tolerância à seca em soja será de grande importância para a seleção e o desenvolvimento
de variedades de soja que tenham maior capacidade de tolerância a períodos prolongados de déficit hídrico.
Apoio Financeiro: CNPq
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289
Transformação genética de Citrus reticulata com o
gene p5cs
Boscariol-Camargo, RL1; Malosso, A1; Machado, MA1
Laboratório de Biotecnologia - Centro de Citricultura Sylvio Moreira/IAC
[email protected]
1
Palavras-chave: porta-enxerto, prolina, tangerina, estresse hídrico, transgenia
A citricultura no Brasil é uma das mais importantes agroindústrias, respondendo por um faturamento anual da
ordem de 1,5 bilhões de dólares, com exportação de suco concentrado e subprodutos da laranja. O Estado de São
Paulo é o principal produtor, processador e exportador, onde grande parte dessa produção é feita em áreas não
irrigadas, através do uso do porta-enxerto limão Cravo, pois ele apresenta, entre outras características desejáveis,
tolerância à seca. No entanto, a diversificação genética de porta-enxertos nos pomares é desejável frente ao
grande número de doenças que afetam a cultura. As tangerinas Cleópatra e Sunki são porta-enxertos promissores,
pois possuem tolerância ao vírus da tristeza, a xiloporose, ao declínio e à morte súbita, porém são suscetíveis
à deficiência hídrica. Os vegetais possuem vários mecanismos para suportar estresses ambientais, como por
exemplo, o acúmulo de prolina. O acúmulo deste aminoácido ocorre através da ação da enzima ∆1-pyrrolina5-caboxylate synthetase (P5CS), que possui um papel crucial na produção de prolina. Estudos relacionados
ao acúmulo de prolina durante deficiência hídrica indicam que plantas com uma maior concentração desta
substância apresentam tolerância ao déficit hídrico. O presente trabalho teve como objetivo a obtenção de
porta-enxertos geneticamente modificados das tangerinas Cleópatra e Sunki, contendo o gene p5cs isolado de
Citrus sinensis. A transformação genética foi realizada via Agrobacterium tumefaciens, estirpe EHA-105, contendo
o gene de p5cs sob o controle do promotor 35S, além do gene repórter uidA (Gus) e o gene seletivo nptII, que
confere resistência à canamicina. Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro foram inoculados
com suspensão bacteriana durante 20 minutos e, em seguida, cultivados em meio EME contendo BAP durante
3 dias, a 27oC. Após este período, os explantes foram transferidos para meio seletivo até o desenvolvimento
de brotos. Os brotos regenerados foram avaliados pelo teste histoquímico de Gus e por PCR para confirmar a
transformação genética. A eficiência de transformação genética dos experimentos variou de 0,8 a 2%, sendo
obtido um total de 10 plantas transgênicas. Estas plantas foram transferidas para casa de vegetação, onde
serão avaliadas por Southern e Northern blots e posterior análise da resposta fisiológica ao estresse hídrico.
Apoio financeiro: FAPESP
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290
Estudos in vivo e in vitro demonstram a liberação
de jasmonatos produzidos por metiltransferases
específicas dos pistilos de Nicotiana tabacum L
Avanci, NC1,2; Pranchevicius, MCS1,3; Cardoso, SA4; Quiapim, AC1,2; Goldman, GH5; Barkman, TJ6; Moraes, LAB7;
Goldman, MHS1
Depto de Biologia, FFCLRP – Universidade de São Paulo (USP), Brasil
PPG em Biologia Comparada, FFCLRP – Universidade de São Paulo (USP), Brasil
3
Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Tocantins
4
Depto de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, FMRP – Universidade de São Paulo (USP), Brasil
5
Depto de Ciências Farmacêuticas, FCFRP - Universidade de São Paulo (USP), Brasil
6
Departament of Biological Sciency, Western Michigan University, USA
7
Depto de Química, FFCLRP – Universidade de São Paulo (USP), Brasil
1
2
Palavras-chave: metiltransferase, pistilo, jasmonato, reprodução sexual de plantas, compostos voláteis
Experimentos de “screening” diferencial, northern blot e RT-PCR permitiram a identificação de clones de cDNA,
entre eles MT1 e 134B02, correspondendo a transcritos produzidos provavelmente por processamento alternativo,
a partir de um único gene específico do pistilo de Nicotiana tabacum. Estes transcritos codificam proteínas com
alta similaridade a metiltransferases da família SABATH, capazes de atuar sobre os ácidos salicílico, benzóico,
jasmônico e dihidro jasmônico. Os respectivos compostos metilados, voláteis, estão envolvidos em processos
fisiológicos cruciais para as plantas, tais como, desenvolvimento, polinização, respostas de defesa e sinalização
química. Através de micro-extração em fase sólida (MEFS), compostos voláteis de flores de N. tabacum no estádio
11 do desenvolvimento floral foram coletados. Análises por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de
massas (CG-EM) mostraram que apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa foram identificados, nos três períodos
de amostragem (manhã , tarde e noite). O cDNA MT1, contendo todos os exons (1 a 8), foi clonado nos vetores
pDEST17 e pETSUMO, gerando as construções pEXP17-MT1 e pETSUMO-MT1, que produziram, respectivamente,
as proteínas recombinantes rMT1 e rS-MT1. A proteína rMT1 foi utilizada em ensaios enzimáticos in vitro, na
presença dos diferentes substratos (ácidos salicílico/benzóico/jasmônico/dihidro jasmônico), em quantidades
equimolares (10mM). Análises por CG-EM, nos ensaios com rMT1, em meio de cultura, mostraram a produção
predominante de metiljasmonato (MeJa), mas também de MeBa e MeSa em menores quantidades. A proteína
rS-MT1, purificada em resina de níquel, foi capaz de produzir apenas os compostos MeJa e dihidroMeJa, como
demonstrado pelas análises por CG-EM. Ensaios de ELISA e western blot, de proteínas totais extraídas dos
estigmas/estiletes, ovários e folhas, usando o anticorpo policlonal contra a proteína rMT1, evidenciaram a
presença de metiltransferases apenas nos tecidos do pistilo. O cDNA 134B02, contendo apenas os exons 1,
6 e 8, foi clonado no vetor pET28a, e a proteína r134B02 produzida foi utilizada para a produção de anticorpo
policlonal. Análises de western blot de proteínas totais extraídas do pistilo e folha, usando o anticorpo antir134B02, demonstraram a presença de metiltransferases com massas variando de 18kDa a 40kDa, apenas
no pistilo. Em ensaios com meio de cultura, a proteína r134B02 foi capaz de produzir Meja, mas não MeBa ou
MeSa. Buscas pelo TBlastX, no banco de dados TOBEST (Tobacco ESTs), identificaram cDNAs para as enzimas
LOX, AOC, 12-OPR e fosfolipases do tipo A2, cruciais para a biossíntese do ácido jasmônico. Em conjunto,
os resultados evidenciam a importância dos jasmonatos na reprodução sexual de plantas de N. tabacum.
Apoio Financeiro: CAPES, FAPESP, CNPq
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291
Microarray analysis of the response of Murcott tangor
and Pera sweet orange to Citrus leprosis virus
Kubo, KS1,2; Mafra, V1,2; Stuart, RM1,2; Alves, MR3; Cristofani-Yaly, M1; Kishi, L1; Costa, FM1,5; Freitas-Astúa,
J1,4; Bastianel, M1; Machado, MA1
Centro de Citricultura “Sylvio Moreira”, CP4, 13490-970, Cordeirópolis-SP, Brazil
Institute of Biology, CP 6109, State University of Campinas – UNICAMP, 13083-970, Campinas, SP, Brazil
3
Centro de Desenvolvimento Tecnológico em Saúde(CDTS), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), 21040-900. Rio de Janeiro, RJ, Brazil
4
Embrapa Cassava and Tropical Fruits, 44380-000, Cruz das Almas, BA, Brazil
5
Department of Agronomy, Universidade Federal Rural de Pernambuco, 52171-900, Recife, PE, Brazil.
1
2
Keywords: CiLV, disease resistance, microarray, leprosis, eQTL
Citrus leprosis, caused by Citrus leprosis virus C (CiLV-C), induces the appearance of chlorotic and necrotic
localized lesions in leaves, stems and fruits, and represents the most important viral disease of citrus in Brazil.
In order to better understand CiLV-C – citrus interaction, leaves of the tolerant ‘Murcott’ tangor (Citrus sinensis
x C. reticulata) and susceptible ‘Pera’ sweet orange (C. sinensis) genotypes were infested with non-viruliferous or
viruliferous Brevipalpus phoenicis mite vector for CiLV-C. Samples were collected 48 hours post infestation for
whole transcriptome analysis. Hybridizations were conducted by Roche Nimblegen facility using a chip with 385K
density containing 32.121, 18.873 and 12.873 unigenes from ‘Pera’ sweet orange, ‘Ponkan’ mandarin (C. reticulata)
and Poncirus trifoliata, respectively. These unigenes were obtained from the Citrus EST database (CitEST)
of Centro de Citricultura Sylvio Moreira. Interaction between mite’s feeding and CiLV-C main effects yielded
80 differentially expressed genes in a two-way ANOVA (p-value ≤ 0.1 and fold-change ≥ 2). The majority of the
upregulated genes were related to cellular communication/signal transduction mechanism and transcription;
the few genes related to cell rescue, defense and virulence will be validated by RT-qPCR. The genes that we have
identified as upregulated across the resistant genotype will be valuable for ongoing work in eQTL mapping.
Financial support: CNPq and FAPESP
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292
Análise estrutural e funcional da região promotora de
scMUTM2
Trindade, AS; Medeiros, SRB; Agnez-Lima, LF; Scortecci, KC
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Biologia Celular e Genética, UFRN
[email protected]
Palavras-chave: FPG/MUTM, cana-de-açúcar, promotor, PCR semi-quantitativo, reparo.
A lesão do tipo 8-oxodG ocorre nas plantas como resultado do estresse oxidante. É importante remover essas
lesões devido à possibilidade de haver transversões do tipo G-C para T-A. Já foi demonstrado que os cDNAs da
cana-de-açúcar scMUTM1 e scMUTM2 apresentam homologia ao gene MUTM de Arabidopsis thaliana (AtMMH),
e que apresentam a capacidade de reparo de DNA por ensaios de complementação bacteriana. No entanto,
ainda não está claro como se dá a regulação desse gene. O objetivo desse trabalho foi de analisar o padrão de
expressão destes dois cDNAs e clonar e subclonar a possível região promotora do cDNA scMUTM2. Ensaios
de expressão por meio de PCR semi-quantitativo mostraram que o padrão de expressão do cDNA scMUTM1
ocorre mais em tecidos em proliferação como ápice meristemático e flores, enquanto para o cDNA scMUTM2
foi observado uma expressão praticamente em todos tecidos analisados como raízes, ápice meristemático, folhas
e flores. Por meio da metodologia de PCR foi obtida uma sequência de 880pb a montante do cDNA scMUTM2
denominada de PMM2. Nessa sequência foram encontrados vários elementos reguladores de resposta à luz,
elementos de resposta às moléculas antioxidantes e ao ácido abscísico, o que indica uma possível relação do
PMM2 com o reparo de DNA causado por estresse oxidante. Alguns destes reguladores foram encontrados na
sequencia do gene em Arabidopsis, entretanto outras foram especificar da cana-de-açúcar. Com o intuito de
caracterizar quais regiões são importantes para a expressão, foram realizadas deleções crescentes por PCR, na
qual dez tipos de deleções foram obtidos pelo desenho de oligonucleotídeos iniciadores (primer) para diferentes
posições de anelamento. O fragmento PMM2 foi fusionado ao gene repórter glucuronidase (GUS). Os clones
obtidos desta fusão foram confirmados por digestão com endonuclease de restrição e sequenciamento. Depois, as
construções serão utilizadas para os experimentos de bombardeamento para caracterizar esta região promotora.
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293
Subclonagem e superexpressão do cDNA PKCI
(Protein kinase C inibitor) envolvidos na floração em
cana-de-açúcar
Silva, FL; Souza, VDS; Bezerra, DB; Agnez-Lima, LF ; Scortecci, KC
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, Departamento de Biologia Celular e Genética.
[email protected]
Palavras-chave: cana-de-açúcar, floração, superexpressão, PKCI, isoporização
A transição do meristema apical para o meristema floral é uma fase crucial na vida da planta. A indução da floração
precocemente em cana-de-açúcar na região nordeste produz um efeito drástico com a redução da produção de
açúcar e alccol em até 60%. Considerando a variabilidade genética existente nos diferentes genótipos de canade-açúcar foram construidas bibliotecas subtrativas utilizando um genótipo com florescimento precoce e outro
tardio. Com isto foram prospectados vários cDNAs que podem ser associados com o processo de transição floral.
Assim, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar in silico e funcionalmente um dos cDNAs prospectados
anteriormente nas bibliotecas subtrativas. Este cDNA apresenta homologia ao gene PKCI (Protein kinase C inhibitorlike). Inicialmente, foi realizada uma análise in silico utilizando ferramentas da bioinformática como os programas
G-blocks, ClustalW, Expansy,PAUP 4.0 e Tree View. O banco de sequencias gerado no desenvolvimento do trabalho
utilizou os seguintes bancos de dados: TIGR, TAIR, DFCI, NCBI. Os resultados das análises in sílico demonstraram
poucas seqüências homólogas de plantas ao cDNA PKCI de cana-de-açúcar. No entanto, o cDNA PKCI apresentou 94
% de similaridade a uma sequencia de Zea mays e Oryza sativa, e 87% de similaridade a uma sequência de Arabidopsis
thaliana e 70% de similaridade a uma sequência de Medicago truncatula. A árvore filogenética apresentou grupos
divergentes entre monocotiledôneas e dicotiledôneas. O padrão de expressão deste cDNA para os dois genótipos
precoce e tardio de cana-de-açúcar foi análisado por PCR em tempo real durante o período de agosto de 2007 a
fevereiro de 2008. Foi observada uma variação entre os dois genótipos. Como base nesses resultados e os dados da
biblioteca subtrativa, este cDNA foi escolhido para uma caracterização funcional por meio da construção de cassetes
de super-expressão. Para isto, este cDNA foi amplificado por PCR, clonado no vetor pGEM T-easy. Em seguida, este
cDNA foi transferido para um vetor intermediário contendo o promotor forte CaMV35S. Este cDNA foi transferido
tanto na orientação senso e anti-senso. Depois da confirmação, estes dois cassetes foram transferidos para o vetor
binário pZP211 e transformados na Agrobacterium tumefaciens LBA4404. Das plantas obtidas, foram confirmadas
14 plantas com a presença dos cassetes de super-expressão, sendo 6 na orientação senso e 8 na orientação
antisenso. As plantas apresentaram desenvolvimento normal até o momento. A segregação das plantas está sendo
analisada e ensaios fisiológicos com os transgênicos serão realizados para caracterizar a função do gene PKCI.
Apoio financeiro: CNPq
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Expressão de genes SOD e PG em milho BRS 4154
submetidos à hipoxia na presença e ausência do cálcio
Porto, BN1; Alves, JD1; Campos, NA1; Souza, KRD1; Santos, MO1; Magalhães, MM1
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas - Departamento de Biologia, Setor de Fisiologia Vegetal / Universidade Federal de Lavras.
[email protected]
1
Palavras-chave: Milho Saracura, Mesocótilo, Parede Celular, Alagamento, PCR em Tempo Real.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar os níveis de expressão dos genes SOD e PG, em plântulas de milho
BRS 4154 (Saracura), relacionados com o seu mecanismo de tolerância à hipoxia, na presença e ausência de cálcio,
por meio de PCR em Tempo Real. A germinação foi realizada em papel germitest embebidos em água ou solução
de CaCl2 (0,75% p/v), em câmara de germinação úmida a 25 ± 2°C, no escuro, por quatro dias. Após esse período,
o alagamento foi realizado pela submersão das plântulas em tubos de PVC com tampão contendo ou não CaCl2
(0,75% p/v), borbulhando-se nitrogênio gasoso por três minutos. Os tubos foram vedados e mantidos no escuro por
quatro, cinco, seis e sete dias. Para os controles (não alagados), os rolos foram mantidos na câmara de germinação.
Após cada período, parte dos mesocótilos foram coletados em nitrogênio líquido e armazenados em freezer a -80°C
para análises moleculares, ao mesmo tempo outra parte foi acondicionada em FAA e para as análises anatômicas,
e o restante foram fixados em Karnovsky para as análises de microscopia eletrônica de transmissão. A adição de
cálcio exógeno retardou o aparecimento da constrição no mesocótilo, prolongando a sobrevivência. Esse aspecto foi
observado na microscopia fotônica pelo retardamento no aparecimento de aerênquimas na região do mesocótilo
em relação às amostras sem esse cátion no tampão de alagamento. Sendo, nesse caso, a origem do aerênquima
esquizógena. Os dados relativos à microscopia eletrônica de transmissão mostraram a total desestruturação da
parede celular após seis dias de hipoxia na ausência de cálcio. No entanto, a presença do cálcio contribuiu para
a manutenção da integridade da parede celular em mesocótilos de plântulas submetidas a sete dias de hipoxia.
Paralelamente, nessa fase a expressão do gene PG por PCR em Tempo Real foi mais elevada devido à parede
celular ainda se apresentar intacta, e consequentemente disponibilizar substrato suficiente para essa enzima. Na
ausência do cálcio o pico da expressão dessa enzima foi numa fase anterior, devido ao aparecimento precoce
da constrição. Tanto na presença do cálcio quanto na ausência a expressão do gene SOD ocorre possivelmente
porque o produto desse gene atua no sequestro de radicais livres formados em períodos de estresse mais intenso.
Apoio financeiro: CAPES
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295
Aquitã, um mutante de Arabidopsis thaliana, apresenta
alterações na parede celular e é mais suscetível a
bactéria Xanthomonas campestris
Arongaus, AB1; Moura, SM1; Meyerowitz, EMb; Alves-Ferreira, M1
1
2
Laboratório de Genética Molecular Vegetal – Departamento de Genética, Instituto de Biologia – UFRJ
California Institute of Technology, Pasadena, USA
Palavras-chave: parede celular, estresse oxidativo, Arabidopsis thaliana, Xhantomonas campestris,Aquitã
As células vegetais apresentam parede celular e isso é das principais diferenças entre plantas e outros organismos
eucarióticos. A importância da parede está relacionada com a percepção dos sinais internos e externos,
apresentando variações de sua composição e estrutura em resposta a esses sinais. Um dos estímulos mais
freqüente está relacionado à interação com patógenos, uma vez que a parede funciona como uma barreira física
para bactérias e fungos. Trabalhos anteriores do grupo mostraram que um mutante de Arabidopsis, aqt, apresenta
uma parede celular mais frágil, com problemas na deposição de celulose e compostos secundários importantes
para o enrijecimento da parede. Essa característica pode levar o mutante a apresentar uma resposta diferenciada
na interação com patógenos bacterianos. Assim, esse trabalho visa à caracterização do padrão de resposta na
interação de Xanthomonas campestris com aqt. A interação foi realizada com bactérias Xanthomonas campestris
crescidas por 16h em meio King`s B e, em seguida, em uma solução salina de MgSO4 5mM até atingirem uma
DO de 0,2. Essa solução foi diluída 10X e inoculada na superfície adaxial de duas folhas da roseta. Após 48h uma
das folhas inoculadas foi coletada para testes histoquímicos e após 6 dias foram coletados 2 discos foliares de
4mm de diâmetro da outra folha inoculada e de uma folha não inoculada. Esses discos foram macerados em
solução MgSO4 5mM e foi realizada uma diluição seriada, afim de determinar a titulação das bactérias. Foram
realizados testes histoquímicos para visulização de morte celular através da coloração com azul de tripano
e da produção de H2O2 através da coloração com DAB, para caracterização do estresse oxidativo. Os testes de
interação com patógeno mostraram que aqt é realmente mais suscetível, apresentando os primeiros sintomas
de necrose após 48h, enquanto o tipo selvagem só manisfesta após 96h. No entanto, não foram encontradas
diferenças significativas na capacidade de proliferação das bactérias na folha inoculada de plantas aqt e tipo
selvagem. Porém, X. Campestris só obteve sucesso em estabelecer uma infecção sistêmica no mutante. Testes
histoquímicos também demostraram a maior sensibilidade de aqt que apresentou um maior estresse oxidativo e
um maior número de células mortas pelo ataque bacteriano. O mutante aqt apresentou sintomas mais severos nos
diferentes testes realizados após a inoculação com X. campestris que o tipo selvagem. Essa maior suscetibilidade
pode ser devida as características da parede celular observados no mutante. Para comprovar os resultado até
então obtidos, serão feitos experimentos adicionais com outras linhagens de patógenos, tanto bacterianas
quanto de fungos, para caracterizar o padrão de resposta de aqt a estresses bióticos. Esses experimentos
poderão fornecer dados importantes que expliquem a função do gene AQT na relação planta-microorganismo.
Apoio financeiro: CNPQ , FIS
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Efeito do metil jasmonato no acúmulo de transcritos de
terpeno sintases putativas de Lippia alba
Guedes, FAF1; Tavares, LS1; Santos, MO1
Laboratório de Genética, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Juiz de Fora
[email protected]
1
Palavras-chave: Lippia alba, metil jasmonato, terpeno sintases, terpenóides, linalol
Introdução: Os jasmonatos são substâncias conhecidas por sua participação em respostas ao estresse e ataques
de patógenos, podendo ainda afetar o metabolismo secundário das plantas. A aplicação destas substâncias em
diferentes partes de várias espécies vegetais tem mostrado efeitos nos níveis de transcritos de terpeno sintases
e também na produção de diferentes terpenóides, como monoterpenos e sesquiterpenos que compõem o
óleo essencial. Dentre os compostos cuja produção é estimulada pela aplicação de jasmonatos podemos
citar o linalol, composto de interesse industrial e presente no óleo essencial de Lippia alba. Assim, o objetivo
deste trabalho foi avaliar o efeito do metil jasmonato sobre o acúmulo de transcritos de três terpeno sintases
putativas de Lippia alba, denominadas TPS12, TPS23 e TPS25. Métodos: Foi aplicado uma solução de MeJA
(metil jasmonato) 1mM, álcool 1%, triton 1% em uma planta mantida em casa de vegetação, em condições
ambientais controladas. Foram coletadas folhas jovens do quarto nó apical após 0h, 24h e 48h da aplicação do
metil jasmonato. A partir do RNA total, foi sintetizado o cDNA que foi utilizado para as reações de PCR com
primers específicos para cada terpeno sintase. O gene constitutivo 18S foi usado como controle interno.
Resultados: Os resultados obtidos mostraram aumento nos níveis de transcritos de TPS12, TPS23 e TPS25 após
48 horas da indução. Conclusões: Desta forma, podemos concluir que, como outras espécies vegetais, a espécie
medicinal Lippia alba respondeu a indução por metil jasmonato, possivelmente por modificações no controle
da expressão gênica das terpeno sintases, aumentando a quantidade de RNA codificador destas enzimas.
Apoio financeiro: FAPEMIG
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Análise global da expressão gênica de laranja doce
(Citrus sinensis L. Osbeck) infectada com Candidatus
Liberibacter americanus, bactéria causadora do
huanglongbing no Brasil
Locali-Fabris, EC1; Mafra, VS1; Ribeiro-Alves, M2; Coletta-Filho, HD1; Freitas-Astúa, J1,3; Francisco, CS1;
Kishi, LT1; Martins, PK1; Machado, MA1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC, Cordeirópolis-SP
Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Cruz, Centro de Desenvolvimento Tecnológico em Saúde, FIOCRUZ, Rio de Janeiro-RJ
3
Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Cruz das Almas–BA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microarranjo de DNA, expressão gênica, citros, HLB, greening
O huanglongbing ou greening é atualmente a doença mais devastadora dos citros e no Brasil está associada a duas
bactérias fastidiosas limitadas ao floema – Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. Liberibacter americanus. As
bactérias são transmitidas naturalmente pelo psilídeo Diaphorina citri e, até o momento, não existem genótipos
de citros resistentes a estes patógenos. Com o objetivo de investigar os mecanismos moleculares de resposta
da planta hospedeira à infecção pela espécie Ca. Liberibacter americanus foram utilizados tecidos de folhas
de plantas de laranja doce cultivar ‘Pêra’ (Citrus sinensis L. Osbeck) infectadas com a bactéria e plantas não
infectadas como controle. As análises de expressão gênica foram realizadas por meio da técnica de microarranjo
de DNA usando um chip contendo informação de 32.121 genes únicos de C. sinensis (Roche Nimblegen). Após as
etapas de hibridização e pré-processamento, os dados normalizados foram avaliados no programa R e o pacote
limma (Bioconductor) onde análises de qualidade e estatísticas foram desenvolvidas. Para identificar os genes
diferencialmente expressos (DE) entre plantas com a presença do patógeno em relação ao grupo controle, foi
aplicado um limite de corte de logFC ( fold change) ≥2 e false discovery rate (FDR) ≤ 0,05, o que resultou em
uma lista com aproximadamente 650 genes candidatos, sendo 419 deles induzidos e 215 reprimidos. Em uma
análise preliminar da função putativa destes grupos, foram encontrados transcritos diferencialmente expressos
de genes que codificam proteínas associadas principalmente com o metabolismo, resposta de defesa, fatores
transcricionais, proteínas de transporte e localização sub-celular. As próximas etapas do trabalho consistem na
validação dos genes diferencialmente expressos por RT-qPCR em tempo real usando alguns genes DE e em análises
mais minuciosas buscando integrar os dados para identificar elementos-chave e vias metabólicas reguladas ou
desreguladas na presença da bactéria que deverá permitir maior detalhamento no processo de patogenicidade.
Apoio Financeiro: INCT Citros – FAPESP e CNPq, FCPRAC (Flórida) e convênio Embrapa-Monsanto.
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298
Uso da predição da estrutura secundária no
agrupamento funcional de membros da família WAK de
cinases de plantas
de Ross, BCF1; Oliveira, LFV2; Margis, R²,3
Curso de graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS
PPG em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS
3
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS
1
2
Palavras-chave: Oswak, atwak, estrutura secundária, agrupamento funcional, filogenia.
Receptor-Like Cinase (RLK) são proteínas envolvidas na comunicação da célula. As cinases associadas a paredes
(Wall Associated Kinase ou WAK) compõem uma família gênica, pertencente ao grupo RLK, que estão envolvidas
com crescimento celular e a resposta a estresses bióticos e abióticos. Em Arabidopsis thaliana, 5 WAK (AtWAK 1-5)
e 20 WAK-Like (AtWAKL 1-20) foram identificadas, sendo AtWAK1 o gene melhor caracterizado funcionalmente
da família WAK. Em Oryza sativa, foram identificadas 125 WAK (OsWAK), porém pouco se sabe sobre seu papel
nesta espécie. Esta expansão que ocorreu em arroz dificulta a busca por genes que poderiam exercer funções
parecidas em ambas as espécies. O presente trabalho tem como objetivo identificar os prováveis ortólogos entre
AtWAK(e AtWAKL) e OsWAK, através de abordagens filogenéticas, utilizando sequências de aminoácidos e dados
das estruturas secundárias.As sequências de aminoácidos para AtWAK foram obtidas no TAIR (http://www.
arabidopsis.org), e para OsWAK foram obtidas no TIGR (http://rice.plantbiology.msu.edu). Pelo arroz possuir
OsWAKs incompletas, sem domínio cinase ou domínios EGF, caracterizamos os domínios existentes em cada
gene AtWAK e OsWAK utilizando o software SMART (http://smart.embl-heidelberg.de), e selecionamos para
nossas análises apenas genes que possuíam tanto domínio cinase quanto domínio EGF. O programa ClustalX foi
utilizado para alinhar sequências de aminoácidos e estruturas secundárias preditas. Nas análises filogenéticas com
o programa MEGA 4 e método de Neighbor-joining, utilizamos duas abordagens: (i) reconstrução filogenética foi
baseada no alinhamento dos aminoácidos respectivos ao domínio cinase ou (ii) reconstrução filogenética com
o alinhamento dos aminoácidos baseados no alinhamento das estruturas secundárias respectivos ao domínio
cinase. Dos 25 genes AtWAK, 23 apresentaram ambos os domínios Cinase e EGF. Já para os 125 genes identificados
em arroz apenas 67 apresentaram os dois domínios. Em ambas as filogenias, os genes OsWAK53b e OsWAK50
permaneceram agrupados com os genes AtWAK1-AtWAK5, sendo esses os possíveis ortólogos deste grupo em
arroz, porém na filogenia utilizando a estrutura secundária foi maior o bootstrap (74/59). Os genes OsWAK2 e
OsWAK25 agruparam com AtWAKL2 e AtWAKL14, sem diferença entre o suporte estatístico das duas abordagens.
As demais AtWAKL permaneceram agrupadas entre si sem a presença de OsWAK nas duas abordagens. Nos
demais grupos ocorreram algumas incongruências entre os grupamentos das OsWAK quando comparado as duas
abordagens. A utilização da estrutura secundária como base para o alinhamento insere na análise um viés funcional
com informações adicionais e padrões de agrupamento distinto, tornando este uma ferramenta adicional para
estudos de famílias gênicas muito grandes, assim como o caso das WAK, não obstante outros métodos filogenéticos
precisam ser testados para verificar o comportamento dos diferentes agrupamentos e suporte estatístico das duas
abordagens e, com isso, aumentar a confiabilidade na identificação dos possíveis ortólogos entre as duas espécies.
Suporte financeiro: CNPq
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299
Análise de miRNAs envolvidos na regulação de
estresse salino em cana-de-açúcar
Carnavale-Bottino, M1; Thiebaut, F1; Rojas, CA1; Hemerly, A1; Ferreira, PCG1
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro. Avenida
Brigadeiro Trompowski Ed. CCS, 21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
1
Palavras-chave: miRNAs, cana-de-açúcar, estresse salino, RT-PCR, regulação
O crescimento, metabolismo e produtividade vegetal são afetados de maneira negativa quando as plantas são
expostas a diversos estresses ambientais. A obtenção de cana-de-açúcar tolerante a esses estresses é muito
importante para expandir a plantação desta cultura. O aumento da salinidade do solo causa prejuízo no metabolismo
primário de carbono, no crescimento e desenvolvimento da planta por toxidade iônica, deficiência nutricional,
déficit hídrico e estresse oxidativo. Recentemente, foi descrito que os microRNAs estão envolvidos na regulação
da expressão do seu mRNA alvo pela sua clivagem ou repressão da tradução em plantas. Essa regulação é essencial
para o crescimento e desenvolvimento normal da planta e para a adaptação a condições de estresse. Com isso,
um melhor entendimento sobre a regulação gênica mediada pelos miRNAs pode resultar em um melhoramento
na produção, qualidade da planta, além de, resistência a vários fatores bióticos e abióticos. O experimento para
identificar os miRNAs expressos em cana-de-açúcar em resposta a tratamentos de estresse salino foi realizado
utilizando múltiplos pontos de coleta (0h, 6h, 12h e 24h). A variedade de cana-de-açúcar utilizada no experimento
foi RB931011, esta é uma variedade considerada como tolerante a seca. Toletes pré-germinados foram cultivados em
casa de vegetação em vasos contendo areia e vermiculita e regados regularmente durante seis semanas. O estresse
salino foi induzido regando-as com 1L de NaCl (0,34 M). Para cada ponto de coleta um conjunto de três plantas foi
submetido ao estresse e outras três plantas foram utilizadas como controle (regadas apenas com água). Raiz, folha no
início do desenvolvimento e folha madura foram coletadas e congeladas separadamente para verificar a expressão
diferencial dos microRNAs. O RNA total foi extraído e a análise dos microRNAs maduros foi realizada pelo método de
“stem-loop pulsed” RT-PCR. Para validar o tratamento, foi verificado o perfil de expressão do gene SsNAC23 descrito
na literatura como envolvido na resposta a estresses abióticos, apresentando uma indução de resposta nessas
condições. Após ter sido validado o experimento, foi analisado o perfil de expressão de três miRNAs anteriormente
descritos em monocotiledônias como estando envolvidos na regulação por estresse salino. Foi observada
repressão de até 60% no período de 6h nos três tecidos analisados, sendo que a maior redução ocorreu em folha
jovem indicando que processos importantes de tolerância a salinidade podem estar sendo regulados neste tecido.
Financiamento INCT Fixação Biológica de Nitrogênio
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300
Seleção de genes-referência para estudos de expressão
gênica utilizando PCR quantitativa em macieiras
Perini, P1; Pasquali, G2; Margis-Pinheiro, M3; Revers, LF4
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Centro de Biotecnologia, UFRGS
Laboratório de Biologia Molecular Vegetal, Centro de Biotecnologia, UFRGS
3
Núcleo de Genômica Funcional de Plantas, Departamento Genética, UFRGS
4
Laboratório de Genética Molecular Vegetal, EMBRAPA Uva e Vinho
[email protected]
1
2
Palavras-chave: pomicultura, Malus spp., genes referência, RT-qPCR, expressão gênica
A macieira (Malus x domestica) é uma das mais importantes frutíferas do mundo, e sua produção tem destaque na
região sul do Brasil. As pesquisas para o melhoramento genético de suas cultivares abrangem resistência a doenças,
enxertia, exigência de frio, sabor e compostos nutracêutricos do fruto. Comparações entre padrões de expressão
gênica de diferentes cultivares selvagens, comerciais e em desenvolvimento constituem ferramenta de alto valor
científico para o melhoramento genético das macieiras. A técnica de PCR quantitativa precedida de transcrição
reversa (RT-qPCR) oferece um recurso robusto para quantificar, de forma precisa, alterações na expressão de genes,
sendo específica e sensível para mRNAs pouco abundantes. Contudo, a acurácia na avaliação é dependente de genes
de referência estáveis para a normalização dos dados, validados antecipadamente à análise das amostras. A escolha
de controles inapropriados pode resultar no desvio dos perfis de expressão gênica, declarações de significâncias
estatísticas indevidas e caracterizações ou conclusões incorretas. Pelo presente trabalho, têm-se o objetivo de
selecionar os melhores genes a serem usados como referências para estudos de expressão gênica via RT-qPCR em
macieiras. Foram avaliados tecidos vegetativos e reprodutivos da cultivar Gala, amostrados durante o ciclo sazonal
de crescimento e dormência da macieira. Com base na literatura e nas sequências anotadas para Malus x domestica,
primers para os seguintes genes sugeridos como constitutivos foram projetados: ACT2, ACT11, ACTfam ( família
gênica), EF1α, EF1β, GAPDH, MDH, PP2-A1, PP2A-A3, SAND, TUBα5, TUBβ6 e UBC10. Os ensaios de RT-qPCR foram
realizados no StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems). A estabilidade dos genes foi determinada
por diferentes descritores estatísticos, dentre eles geNorm e NormFinder. Como principais resultados e conclusões,
todos as combinações de primers testadas permitiram amplificações específicas. Foram calculadas as eficiências
para todas as reações. Inferências preliminares a partir da avaliação via geNorm indicaram os genes ACT2, MDH,
PP2A-A3 e SAND como os principais candidatos a genes normalizadores em diferentes tecidos de macieira.
Apoio financeiro: CAPES, FINEP, EMBRAPA
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301
Análise da expressão do gene SERK em Milho
(Zea mays L.) submetido a estresse salino
Madeira, LRT¹; Freitas, RM¹; Tavares, LS²; Santos, MO³
Graduandos em Ciências Biológicas do Departamento de Biologia, ICB, UFJF;
Professora do Departamento de Biologia, ICB, UFJF
3
Professor do Departamento de Biologia, ICB, Grupo de Pesquisa Genética e Biotecnologia Vegetal, UFJF
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Estresse salino, Expressão, PCR, ZmSERK, SHS 3031
Introdução: A crescente salinização de áreas agricultáveis é um dos problemas enfrentados por produtores de
regiões áridas e semi-áridas de todo o mundo. No Brasil a região nordeste é a mais atingida, em razão, principalmente
da intensa evapotranspiração, baixas precipitações e irrigação.(Silveira et al., 2001). A salinidade do solo é um
dos mais importantes fatores ambientais limitantes do crescimento e desenvolvimento de plantas. Estudar o
mecanismo de tolerância ao sal em plantas no nível molecular, pode oferecer interessantes genes candidatos e
informações valiosas para melhorar a tolerância salina. (Li et al., 2009). A sinalização celular tem um importante
papel no metabolismo celular principalmente no crescimento e na resposta defensiva. Nesse processo, o padrão de
expressão do SERK (somatic embryogenesis receptor kinase) em culturas sugere que ele é uma parte dos caminhos
de sinalização mediados por mudanças de desenvolvimento em resposta as condições do meio de cultura (Santos
e Aragão, 2009). Objetivos: Verificar os padrões de expressão do gene SERK em plantas submetidas a tratamentos
alternados (0h, 24h, 48h) possibilitando a compreensão das respostas a diferentes tipos de estresse. Métodos:
Foram utilizadas sementes da linhagem comercial hibrida SHS 3031. A germinação foi feita em placas de Petri com
filtro e água. Cinco dias após a protusão das radículas as plantas foram submetidas aos tratamentos com meio MS
na concentração salina (NaCl) de 300mM por 0, 24 e 48h, logo após as raízes de cada tratamento foram extraídas
e imediatamente armazenadas em nitrogênio líquido. Em seguida foi feita a extração de RNA total, tratado com
enzima DNase para a remoção DNA contaminante, posteriormente foi feita síntese do cDNA.O RT-PCR foi feito
com primers desenhados para amplificar os segmentos alvo do cDNA. O material foi analisado por corrida em gel
de agarose TBE 1%. Resultados: O gene SERK apresentou um pico de expressão nas plantas tratadas com 300mM de
NaCl por 24h, em contrapartida as plantas tratadas por 0h (controle) e 48h não apresentaram esse pico. Conclusões:
A análise dos resultados permite-nos inferir que a expressão do gene é influenciada por fatores bióticos e abióticos,
porém essa influência não parece ser duradoura. A queda da expressão após um curto período demonstra que
esse é um mecanismo inicial de resposta. Sendo as raízes os primeiros locais de percepção e lesão pela salinidade.
Apoio financeiro: FAPEMIG
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302
O efeito de estresses abióticos no padrão de expressão
de genes da família WAK em Oryza sativa
Oliveira, LFV¹; de Ross, BCF2; Margis-Pinheiro, M13; Margis, R¹
PPG em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS
Curso de graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS
3
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS
4
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS
1
2
Palavras-chave: WAK, Estresse abiótico, Oryza sativa, Oswak, Arroz.
Estresses abióticos em plantas refere-se a qualquer modificação nas condições de crescimento, dentro do habitat
natural das plantas, que altere ou perturbe a homeostasia metabólica. A habilidade de receber e processar
informações através de receptores da superfície celular é propriedade básica de todos os organismos vivos. Os
genes da família WAK, são receptores associados a cinase do grupo das RLK (Receptor-Like Kinase). Os genes
WAK estão envolvidos em diversos processos celulares, que vão desde o crescimento e expansão celular até a
respostas a estresses bióticos e abióticos. Em Arabidopsis thaliana, 5 WAK (AtWAK 1-5) e 20 WAK-Like (AtWAKL
1-20) foram identificadas, O gene AtWAK1 foi o melhor caracterizado funcionalmente na família. Em Oryza
sativa, foram identificadas 125 WAK (OsWAK), porém pouco se sabe sobre seu papel nesta espécie. O presente
trabalho tem como objetivo avaliar o padrão de expressão de genes da família OsWAK sob o efeito de estresses
abióticos. Dos 125 OsWAK, utilizando análises filogenéticas entre AtWAK e OsWAK, foram selecionados 31 genes
para caracterização do perfil de expressão em condições de frio 4ºC durante 24horas, e após tratamento por 8
horas em concentrações de 150 µM e 450 µM de alumínio. Em ambas as condições, foram utilizados plantas
de 12 dias da subespécie japonica (Nipponbare), e os tecidos vegetais foram separados entre raiz e folha. Para
o padrão de expressão, foi utilizado o PCR em tempo Real (qRTPCR). Os genes OsWAK apresentaram um perfil
variado de resposta nas condições testadas, sugerindo estarem de alguma forma associados com a resposta
nos dois estresses. Padrões de respostas diferentes também foram verificados em folha e raiz. No frio, genes
como OsWAK6, OsWAK22 e OsWAK25 foram induzidos em folha, porém em raiz, OsWAK6 e OsWAK25 foram
reprimindo, sendo que OsWAK22 não foi detectado nestas condições. Em alumínio, com exceção de OsWK25,
todos os genes ou estão reprimidos, ou não possuem um aumento significativo em folha. Porém em raiz, o
perfil de resposta é muito variado entre os genes e entre as concentrações. OsWAK55 foi induzido por 150 µM, e
reprimido por 450 µM. Esta variação no padrão de expressão em raiz pode estar associada ao fato do tratamento
ocorrer direto na raiz, onde é necessário uma reposta com maior eficiência. Utilizando análises de agrupamento
dos padrões de expressão, foi possível encontrar dentro dos dois modelos experimentais, genes que possuem
respostas semelhantes para ambos os tratamentos. Como por exemplo, OsWAK22, OsWAK24, OsWAK73 e
OsWAK75 estão induzidos em frio, e reprimidos nas duas concentrações de alumínio. Em comparação aos genes
AtWAK, onde por exemplo, em condições de tratamento com alumínio AtWAK1 envolvida na resposta tanto
raiz quando na folha positivamente, em O. sativa parece que a expansão dessa família tornou a resposta mais
complexa, uma vez que existem vários genes respondendo tanto positivo quanto negativamente dependendo
do tecido e das condições. Para uma maior compreensão da ação destes receptores será necessária uma
posterior integração de seus padrões de expressão com a de seus genes alvos nas diversas condições de estresse.
Suporte financeiro: CNPq
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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303
Estabelecimento de um protocolo de extração de
proteínas para análise proteômica utilizando diferentes
tecidos de cana-de-açúcar
Barreto, KFM; Ferreira, ACF; Uchôa, AF; Scortecci, KC
Laboratório LBMG. Depto de Biologia Celular e Genética, DBG, UFRN.
[email protected]
Palavras-chave: cana-de-açúcar, estresse oxidativo, extração de proteínas, proteômica
O gênero Saccharum apresenta grande importância economica, sendo o Brasil responsável por mais de 25% da
produção mundial. A região Norte-Nordeste é responsável apenas por 13% da produção devido às condições
edafo-climáticas como solo, regime de chuvas, temperatura. Estas condições promovem um estresse oxidativo
e consequentemente um florescimento precoce, que acarreta numa redução da produção em até 60%. Assim,
se faz necessário a aplicação do conhecimento proteômico de modo a prospectar proteínas que possam estar
associados a este processo. Este trabalho tem como objetivo geral prospectar proteínas associadas ao estresse
oxidativo por meio de geis bidimensionais. Neste trabalho o objetivo foi de padronizar as condições de extração
de modo a obter quantidade, qualidade e reprodutibilidade utilizando diferentes tecidos de cana-de-açúcar
( folha, ápice meristemático e raízes). É conhecido que existem variações de protocolos decorrentes ao tecido e
a planta utilizada devido à presença de pigmentos e metabólicos secundários que podem afetar a integridade, a
separação e a identificação dos peptídeos. Por isso, esta etapa de padronização é de extrema importância para a
proteômica. Os resultados obtidos em gel SDS-PAGE no primeiro protocolo utilizado (Tampão: Uréia 7M; Tiouréia
2M; DTT 25mM; glicerol 10% e triton X-100 1%) permitiram observar um padrão de extração eficiente apenas para
o apice meristemático, enquanto para os tecidos: folhas e raiz foi observado uma alta concentração de proteínas,
entretanto o padrão de migração foi de arrasto, provavelmente decorrente a algum metabólico presente. O
segundo protocolo testado com os três tecidos utilizou o tampão: Fenol 0,1M; Tris-HCl pH8.8; EDTA 10mM e 0,4%
2-mercaptoetanol. Neste protocolo foi observado um padrão de migração uniforme para os tecidos meristema
apical e folha, sendo observado algumas bandas em torno de 37-51 kDa. Entretanto, no tecido raiz foi observada
um rastro muito fraco. É importante ressaltar que os tecidos alvos para análise proteômica para prospecção de
proteínas associadas ao estresse oxidativo são folhas e raiz. Devido a isto, foi realizado um terceiro protocolo
onde o tampão de extração foi: PMSF 1mM; Tris-Hcl 40 mM pH 7,5; sacarose 250mM; EDTA 10mM; DTT 3mg;
triton X-100 1% e 2-mercaptoetanol 2%. O material foi separado em gel SDS-PAGE. Este gel mostrou um padrão
de migração uniforme para todos os três tecidos, com bandas variando desde 19 kDa até 202 kDa. Este protocolo
foi reproduzido mais uma vez obtendo-se o mesmo padrão. O material foi quantificado, e comparando-se o
tecido de raiz foi verificado que a concentração de proteínas obtidas foi três vezes maior que o segundo protocolo
utilizado. Além disto, a amostra obtida apresentou um menor índice de degradação e impurezas. Este método para
cana-de-açúcar se mostrou eficiente e reprodutivo para as análises proteômicas futuras em gel bidimensionais.
Auxílio Financeiro: CNPq
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304
Orthologous relationships among grasses – a
metabolic and other biological processes catalogue
Vicentini, R1; Del Bem, LEV2; Vincentz, M2,3
Laboratório de Bioinformática e Biologia de Sistemas – Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – Universidade Estadual de
Campinas – Campinas, SP, Brasil.
2
Laboratório de Genética de Plantas – Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – Universidade Estadual de Campinas –
Campinas, SP, Brasil.
3
Departamento de Biologia Vegetal – Instituto de Biologia – Universidade Estadual de Campinas – Campinas, SP, Brasil.
[email protected]
1
Keywords: orthology, grasses, MapMan, metabolic pathways, evolution
The adaption of evolutionary-related species to different environmental conditions is essentially due to the interplay
of mutational induced diversification of an ancestral gene pool and natural selection. Orthologous genes are largely
believed to retain the same ancestral function across different species. Thus, identification of orthologs is critically
important for gene function prediction in newly sequenced genomes and for gene information transfer between
species. Within a scenario of ever growing number of completed genomes and ESTs projects, bioinformatics tools
that allow large-scale reconstruction of evolutionary relationship should be extremely useful. We describe here the
development of strategies for large scale orthology establishment and to transfer grasses unigenes to the MapMan
BIN system. In order to achieve these tasks we build the Phylexpress software to determine all putative groups of
orthologues (PoGOs) between grasses and Arabidopsis thaliana. Phylogenetic and orthology analysis of grasses
genes was done by constructing phylogenetic trees containing the corresponding most similar plant sequences. A
blastx search with the grasses (barley, fescue, maize, rice, rye, sorghum, sugarcane, switchgrass and wheat) unigenes
sequences (1,067,417 in total) were analyzed against a green plants data set including 365,187 proteins obtained
from several green plants completed genomes (Arabidopsis thaliana, Populus trichocarpa, Oryza sativa, Sorghum
bicolor, Selaginella moellendorffii and Physcomitrella patens). For each grass unigene, the first 20 best matches
were selected for further analysis. The conserved regions found among the 20 selected sequences were aligned
using MAFFT to produce ungapped alignments. The phylogenetic relationship of these aligned sequences was then
constructed using the maximum likelihood program PhyML with aLTR statistic. This process allowed identifying
18,350 probable PoGOs between grasses and arabidopsis, with more than 70% PoGOs identified in more than half of
the grass species analyzed. Finally, these PoGOs were organized in functional classes using the MapMan ontology
(TAIR 9). This ontology was initially developed for Arabidopsis, has a low level of redundancy, and can provide
a biologically structured overview of changes of transcripts, metabolites and enzyme activities. Many PoGOs
assigned to carbohydrates biosynthesis, lipid and cell wall breakdown and biotic and abiotic stress were detected.
Supported by FAPESP
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305
Comparative analysis of expression profiles changes in
response to sugars in angiosperms
Vessali, NCR; Vicentini, R
Laboratório de Bioinformática e Biologia de Sistemas – Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – Universidade Estadual de
Campinas – Campinas, SP, Brasil.
[email protected] and [email protected]
Keywords: sugar sensing, signaling, angiosperm, gene expression, network
The carbohydrates produced by photosynthesis are widely described for their role in the development and
metabolism in plants, but these sugars also play an important role as a signal compound, that can affecting a
variety of physiological processes and can involves the coordinated regulation of genes and enzymes at the
level of transcription, translation, post-translational modification and protein turnover. In this study we are
evaluating the degree of conservation of gene expression of genes involved in SPS regulatory network in response
to exogenously supplied sugars. In order to establish the experiments for comparative analysis of gene expression
patterns in angiosperms, we germinated seeds of Arabidopsis thaliana (Col-0), rice (Oryza sativa ssp. Japonica),
sorghum (Sorghum bicolor) and sugarcane (Saccharum spp.), which in the seedling stage without the epicotyls were
acclimated for 24 hours in 10 ml liquid culture medium without carbohydrate, with constant light and controlled
temperature of 28°C. After carbohydrates starvation the treatments were done separately with the carbohydrates
glucose, fructose, sucrose, trehalose and 3-O-Methylglucose ( final concentration 167 mM) for 0h and 2 hours. The
osmotic effects were evaluated by comparing the above treatments and mannitol (167 mM) for the same time
points. These genes were obtained through a phylogenetic and orthology analyses by constructing phylogenetic
trees containing the corresponding most similar plant sequences. A tblastn search with the bait proteins against
sugarcane, sorghum, rice and Arabidopsis genes was performed. In a second step the selected genes were compared
against a green plant protein data set including 365,187 sequences obtained from several genomes (Arabidopsis
thaliana, Populus trichocarpa, Oryza sativa, Sorghum bicolor, Selaginella moellendorffii and Physcomitrella patens).
For each prey gene, the first 100 best matches were selected for further analysis. The conserved domains found
among the 100 selected sequences were aligned using MAFFT to produce ungapped alignments. The phylogenetic
relationships of these aligned sequences were then constructed using the maximum likelihood program PhyML
with aLTR statistic. All analyses were conducted in the Phylexpress software developed by our team. This process
allowed identifying the most probable orthologous in sugarcane, sorghum, rice and Arabidopsis genes of the bait
proteins involved in the regulation of SPS enzyme. These genes include many kinases and phosphatases, 14-3-3
like proteins, SNF1-related proteins and Serine/threonine phosphatases 2 (PP2C and PP2A). The comparison of
the transcript profiles regulated by sugars should shed light on the diversification of adaptive responses to sugar
supply in angiosperms and special attention will be given to these genes in the context of orthologous relationship.
Supported by FAPESP
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306
Caracterização in silico e funcional de um cDNA
homólogo ao gene 14-3-3 em cana-de-açúcar
Medeiros, ALM; Agnez-Lima, LF; Scortecci, KC
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica, DBG, UFRN.
[email protected]
Palavras-chave: cana-de-açúcar, floração, 14-3-3
Introdução: Atualmente, o Brasil apresenta uma área cultivada de quase nove milhões de hectares e contribui
com 45% da produção mundial de cana-de-açúcar. No estado do Rio Grande do Norte, observa-se uma redução
na produtividade de 40% quando comparada com a obtida na região sudeste. Este fenômeno ocorre devido ao
reduzido índice pluviométrico, que causa o estresse hídrico e o conseqüente florescimento precoce que promove
a isoporização dos colmos, reduzindo seu teor de açúcar. De modo a prospectar genes que estejam associados ao
processo de florescimento precoce, foram construídas bibliotecas subtrativas utilizando dois genótipos diferentes
de cana-de-açúcar quanto ao florescimento -precoce e tardio- e nos momentos fisiológicos não induzido e induzido.
Com isso, foram identificados vários cDNAs, entre eles uma sequência homóloga à sequência 14-3-3. Em plantas,
14-3-3 apresenta importantes funções em muitos sistemas metabólicos, mas o seu envolvimento relacionado ao
desenvolvimento está começando a ser elucidado. Objetivo: Caracterizar in silico e funcionalmente o cDNA 14-3-3
identificado previamente nas bibliotecas subtrativas construídas com as variedades cultivadas no estado do Rio
Grande do Norte. Métodos: A análise in sílico foi realizada utilizando várias ferramentas da bioinformática como
G-blocks, ClustalW, Expansy, PAUP 4.0 e Tree View; e os bancos de dados de plantas: Rice Genome Annotation,
TAIR, NCBI, DFCI. Foram extraídos RNAs de ápices meristemáticos durante o período de outubro de 2007
a fevereiro de 2009 para ambos os genótipos de cana-de-açúcar. O cDNA foi amplificado utilizando o kit high
capacity amplification (Applied Biosystem) e foram realizados PCR e qPCRs com estes cDNAs. Resultados: Os
resultados das análises in silico demonstraram que dentro das sequências obtidas com homologia a 14-3-3 foram
encontradas nove cópias em Arabidopsis thaliana (e-values: 3.2e-80 a 1.8e-57), sete em arroz (e-values: 2.9e-128
a 3.5e-10), quatro em sorgo (e-values: 3.1e-64 a 2.0e-50), duas em milho (e-values: 1.8e-164 e 2.6e-107) e três em
trigo (e-values: 2.1e-154 a 4.5e-103) A árvore filogenética apresentou grupos divergentes entre monocotiledôneas
e dicotiledôneas. O padrão de expressão deste cDNA para os dois genótipos de cana-de-açúcar foi analisado
por PCR em tempo real durante o período de agosto de 2007 a fevereiro de 2008. Foi observado uma variação
entre os dois genótipos, mas esta não foi tão significativa. Como base nos resultados da biblioteca subtrativa que
sugerem um potencial papel no processo de floração, e considerando as diferentes isoformas encontradas para
esta proteína, foram desenhados primers para quatro isoformas. Os resultados obtidos indicam que existe uma
variação significativa no padrão de expressão das diferentes isoformas nos dois genótipos e que este padrão foi
variável durante o desenvolvimento das plantas. Conclusão: Os resultados obtidos sugerem que o cDNA homólogo
a proteína 14-3-3 em cana-de-açúcar possa ter um papel no processo de florescimento atuando como um inibidor.
Auxílio financeiro: CNPq
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307
Estudo da regulação de microRNAs em cana-deaçúcar em resposta a bactérias patogênicas
Rojas, CA; Almeida, KL; Torres, S; Thiebaut, F; Lanfranco PM; Hemerly AS; Ferreira, PCG
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, CCS, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590,
Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: cana-de-açúcar, patogênese, microRNAs, Solexa.e Acidovorax.
A cana-de-açúcar possui enorme importância não só pela produção de açúcar, como porque é a base da produção
de biocombustíveis no país. No entanto, a cultura da cana enfrenta diversos problemas para obtenção de maiores
rendimentos, entre os quais figuram diversos estresses abióticos (seca, frio, solos ácidos) e as doenças causadas
por microorganismos, tais como o raquitismo da soqueira (Leifsonia xili), escaldadura da folha (Xanthomonas
albilineans), estria vermelha (Acidovorax avenae), vírus do mosaico (vírus SMV) e ferrugem laranja (Puccinia
melanocephala). Embora de extrema importância, pouco se sabe dos mecanismos moleculares que acontecem
no estabelecimento destas doenças e das alterações patológicas decorrentes. Estudando as diferentes respostas
em variedades contrastantes enquanto a susceptibilidade ou resistência é possível evidenciar estratégias
biológicas bem sucedidas no combate aos microorganismos patogênicos. Recentemente pequenas moléculas de
RNA denominadas microRNAs têm sido descritas como importantes reguladoras de outros genes, em diversas
situações biológicas. Adicionalmente, a literatura sugere que estas moléculas poderiam estar envolvidas também
em situações de patogênese. O objetivo geral deste projeto é entender os mecanismos moleculares envolvidos na
interação que acontece entre a cana-de-açúcar e bactérias patogênicas. Para este fim, foram utilizadas plantas
de cana-de-açúcar da variedade SP 70-1143 crescidas in vitro, as quais foram inoculadas com Acidovorax avenae
ou Xanthomonas albilineans e mantidas durante uma semana. Após este tempo as plantas foram avaliadas
fenotipicamente a fim de quantificar os sintomas da doença. Posteriormente foi extraído o RNA total das
plantas, o qual foi utilizado para o estudo da expressão gênica dos microRNA da cana-de-açúcar. O RNA total
de plantas tratadas e plantas controle foi extraído e seqüenciado mediante tecnologia Illumina, a fim de obter
um panorama genômico da expressão diferencial entre plantas doentes vs. sadias. Vários microRNAs tiveram
a sua expressão modulada na presença de bactérias patogênicas. Utilizando PCR em tempo real a modulação
destes microRNAs foi confirmada. Mediante ferramentas bioinformáticas foi construída uma lista de genes
alvo de regulação dos microRNAs modulados. Estes resultados sugerem que bactérias patogênicas em cana-deaçúcar provocam a resposta da maquinaria de silenciamento gênico responsável pela produção de microRNAs.
Apoio financeiro: FAPERJ, CNPq e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Fixação Biológica de Nitrogênio.
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308
Caracterização do papel de DESC1, uma nova proteína
que interage com ABAP1, no desenvolvimento de
Arabidopsis thaliana
Iurif, VC1;Cabral, LM1,2; Santoro, AB2; Hemerly, AS2
Universidade Federal Fluminense, Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia. Campus Valonguinho- Centro
Niterói - RJ CEP 24210-130 2 Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, CCS - Universidade Federal
do Rio de Janeiro, 21941-590, Rio de Janeiro, RJ, Brazil
1
Palavras-chave: Ciclo celular, Biotecnologia, Desenvolvimento vegetal, Biomassa, Divisão celular.
Em organismos multicelulares, a organogênese requer um controle preciso do balanço entre divisão e diferenciação
celulares. Vias de sinalização devem conectar esses dois processos celulares, associando-os e adaptando-os aos
controles genéticos do desenvolvimento das plantas e às respostas ao ambiente aonde ela cresce. Nosso grupo
descreveu uma nova rede regulatória do desenvolvimento de folhas, na qual a proteína ABAP1 (Armadillo/BTB
Arabidopsis Protein 1), atuando em conjunto com o fator de transcrição TCP24 regula negativamente a divisão celular.
Nós acreditamos que a ação de ABAP1 no controle do ciclo celular está correlacionado com as associações proteicas
que essa proteína estabelece em diferentes etapas do desenvolvimento vegetal, de forma que diferentes parceiros
determinem diferentes funções biológicas. Uma das proteínas com a qual ABAP1 interage foi chamada DESC1, cuja
função biológica ainda é desconhecida. O objetivo desse trabalho é compreender a função de DESC1, bem como de
sua interação com ABAP1, no desenvolvimento vegetal. Estudos de localização da expressão de DESC1 mostraram
que ela possui expressão distribuída por toda a planta e em diversos estágios do desenvolvimento, estando mais
presente durante a germinação da semente, e em siliquas maduras. Análises da expressão de GUS mostram alta
expressão em raízes. Para estudar a função biológica desse gene, foram obtidas plantas com níveis alterados de
DESC1: plantas DESC1KO (“knock-out”do gene, obtidas no banco de mutantes Salk) e DESC1OE (superexpressando
DESC1, geradas no nosso laboratório). Embora a presença de níveis aumentados de DESC1 não tenha causado
alterações fenotípicas, plantas com níveis reduzidos de DESC1 (DESC1KO) apresentam folhas e raízes maiores do
que plantas controle. Experimentos de cinemática mostraram que o tamanho aumentado das folhas em plantas
DESC1KO é devido a um aumento nas taxas de divisão celular. Além disso, as raízes apresentam desde o início do
desenvolvimento uma quantidade aumentada de primórdios de raízes laterais. Plantas DESC1KO apresentam também
aproximadamente 30% a mais de inflorescências do que plantas controle. Nossos dados sugerem que DESC1 atua
em um mecanismo que controla negativamente as taxas de divisão celulares, tanto no desenvolvimento de raízes
como de folhas e inflorescências. As características fenotípicas que plantas mutantes para DESC1 apresentam,
indicam que ela possa ser usada como ferramenta para promoção do crescimento vegetal e aumento de biomassa.
Financiado por: CNPq, FAPERJ e CAPES
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Sequências expressas no pequizeiro, Caryocar
brasiliense Cambess
Londe, LN1; Mendes, MG2; Dias, ACC2; Vieira, CU2; Kerr, WE2; Bonetti, AM2
Empresa de Pesquisa Agropecuária de Minas Gerais / EPAMIG, Laboratório de Biotecnologia, Rodovia MGT Km 155, Fazenda Experimental do Gorutuba, Nova Porteirinha-MG
2
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética, Campus Umuarama, 2E33, Uberlândia-MG.
[email protected]
1
Palavras-chave: pequizeiro, Caryocar brasiliense (Cambess), pequi com e sem espinho, sequências genéticas, cDNA.
O pequizeiro, Caryocar brasiliense Cambess, é uma espécie nativa do Cerrado Brasileiro, tem grande importância
na cadeia alimentar e, atualmente, é considerado fonte para a produção de bicombustível. No Mato Grosso foi
encontrada, por W. E. Kerr, uma planta produzindo frutos sem espinho no caroço. Com o objetivo de identificar, no
pequizeiro que produz frutos com espinho no caroço, sequências relacionadas à produção do fruto (para posterior
comparação com a planta que produz fruto sem espinho) foi construída biblioteca de cDNA, com o KIT Clone MinerTM
cDNA Library Construction (INVITROGEN). Foram geradas, em MegaBace, 972 sequências com tamanho médio
de 452 bp que, analisadas em comparação com sequências depositadas em banco específico de plantas, mostraram
relação com proteção contra estresse oxidativo, fatores de transcrição e resistência à patógenos. O objetivo final
desta pesquisa é identificar produtos gênicos envolvidos com a produção de frutos (pequi) sem espinho no caroço.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG
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310
Transformação genética em espécies de Passiflora,
subgênero Decaloba, seção Xerogona (Passifloraceae)
Sampaio, NMV1; Monte Bello, CC1; Dornelas, MC1
Departamento de Fisiologia Vegetal, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP.
[email protected]
1
Palavras-chave: Passiflora, transformação, Agrobacterium, desenvolvimento flora, gene marcador.
O gênero Passiflora L. é o maior da família Passifloraceae. É subdividido em quatro subgêneros, sendo os subgêneros
Passiflora e Decaloba os mais ricos em números de espécies, que apresentam ampla diversidade de caracteres
morfológicos, principalmente florais. O estudo dos mecanismos genéticos e moleculares relacionados à geração da
diversidade floral no gênero Passiflora L. pode ser feito pela manipulação de genes relacionados ao desenvolvimento
desses caracteres via transformação genética. Para que isso seja possível, faz-se necessário o desenvolvimento
de protocolos eficientes de transformação destas espécies. Dessa forma, objetivou-se estabelecer e otimizar
protocolos de transformação genética de 3 espécies do gênero Passiflora, Subgen. Decaloba, Seção Xerogona (Raf.)
Killip.: P. sanguinolenta Mast., P. citrina MacDougal e P. capsularis L. Para o processo de transformação utilizou-se
Agrobacterium tumefaciens cepa GV 3850, contendo um vetor para superexpressão dos genes repórteres GUS ou
GFP. Os experimentos realizados envolveram explantes foliares provenientes de folhas jovens diretamente de casa de
vegetação ou em diferentes estágios de cultivo prévio in vitro. Foram obtidas células transformadas de P. capsularis, P.
citrina e P. sanguinolenta expressando o gene repórter GUS. Calos expressando GFP foram obtidos para P. capsularis
e P. citrina. A maior eficiência na transformação foi observada em explantes provenientes de cultura de tecidos.
Apoio financeiro: FAPESP
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311
Evolutionary history of Arabidopsis thaliana aminoacyltRNAsynthetase dual-targeted proteins
Brandão, MM¹;Silva-Filho, MC¹
¹ Departamento de Genética – ESALQ / USP, Piracicaba
Palavras-chave: Duplo direcionamento protéico, Filogenia, Arabidopsis thaliana, AminoaciltRNAsintetase, Bioinformática.
Aminoacyl-tRNAsynthetases (aaRS) are key players in translation and act early in protein synthesis by mediating
the attachment of amino acids to their cognate tRNA molecules. In plants, protein synthesis may occur in three
subcellular compartments (cytosol, mitochondria and chloroplasts), which requires multiple versions of the
protein to be correctly delivered to its proper destination. The organellaraaRS are nuclear-encoded and equipped
with targeting information at the N-terminal sequence, which enables them to be specifically translocated to
their final location. Most of the aaRS families present organellar proteins that are dual-targeted to mitochondria
and chloroplasts. Here, we examine the dual targeting behavior of aaRS from an evolutionary perspective. Our
results show that Arabidopsis thalianaaaRS sequences are a result of a horizontal gene transfer event from bacteria.
Some of the aaRS appear to be residual from the original host cell, some have proteobacterial characteristics
and others are akin to cyanobacteria. However, there is no evident bias that indicates one single (chloroplast or
mitochondria) ancestor of either Cyanobacteria or Proteobacteria. Furthermore, in all aaRS families studied, a
dual-targeted protein member appears to be related to a cytosolic counterpart, which indicates the occurrence of
gene duplication. This observation suggests that organelle localization of dual-targeted encoded gene products is
derived from a neo-functionalization process. The dual-targeted aaRSphylogenetic relationship was characterized
into two different categories, depending on the phyla ancestral state recovered for both dual-targeted and cytosolic
proteins, the paralogs, includes all dual-targeted proteins from the cRS, gRS, hRS, nRS, and sRS families and, the
homologs, which present a different ancestor for cytosolic and dual-targeted aaRS proteins, even if it is not one of
the common plastid or mitochondria ancestors. This category is represented by the aRS, dRS, eRS,fRS, kRS, mRS,
pRS, tRS, wRS and yRS families.Our results indicate that the dual-targeted aaRS condition is a function gained by
gene duplication, which is usually followed by a loss in one of the duplicated copies. In conclusion, dual-targeted
encoding gene-products are not derived from a unique endosymbiont genome; rather, these genes have a variety of
endosymbiont origins. Natural selection may have maintained the original function in at least one of the aaRS genes
as the additional copies have diverged. ParalogousaaRS share common interacting proteins, a finding that supports
their monophyletic origins, whereas homolog aaRS interact with specific proteins that support their distinct origins.
Apoio Finaceiro: CNPq
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312
The use of microRNAs as universal reference genes in
quantitative PCR
Kulcheski, FR1; Marcelino, FC2; Nepomuceno, AL2; Abdelnoor, RV2; Margis, R1
1
2
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, UFRGS
EMBRAPA Soja, Rodovia Carlos João Strass, Distrito de Warta, CEP 86001-970, Londrina, PR, Brazil
Keywords: Soja, Microrna, RT-qPCR, Expressão gênica, Real time PCR.
Reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR) is a robust and widely applied technique used
to investigate gene expression. However, for correct analysis and interpretation of results, the choice of a
suitable gene to use as an internal control is a crucial factor. These genes, such as housekeeping genes, should
have a constant expression level in different tissues and across different conditions. The advances in genome
sequencing have provided high-throughput gene expression analysis and have contributed to the identification
of new genes, including microRNAs (miRNAs). The miRNAs are fundamental regulatory genes of eukaryotic
genomes, acting on several biological functions. In this study, miRNA expression stability was investigated
in different soybean tissues and genotypes as well as after abiotic or biotic stress treatments. The present
study represents the first investigation into the suitability of miRNAs as housekeeping genes in plants. The
transcript stability of ten miRNAs was compared to those of six previously reported housekeeping genes for the
soybean. In this study, we provide evidence that miRNA expression stability can be greater than the expression
stability of protein-coding genes. In addition, we conclude that miRNAs are optimal reference genes not only
Suporte financeiro: CNPq, MCT
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Análise da expressão gênica em cacau da série
Parinari (Pa) portador do gene letal ‘Luteus-Pa’
Rehem, BC1; Almeida, A-AF1; Figueiredo, GSF1; Gesteira, AS2; Santos, SC1; Corrêa, RX1; Yamada, MM3;
Valle, RR3.
Centro de Biotecnologia e Genética, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz.
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical (Cruz das Almas - BA).
3
Centro de Pesquisas do Cacau (CEPEC), Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC).
[email protected]
1
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Palavras-chave: Biblioteca subtrativa, fator letal, Mutante natural, PCR em tempo real, Theobroma cacao.
Introdução: O caráter recessivo letal ‘Luteus – Pa’ é verificado em genótipos de cacau (Theobroma cacao) da série
Parinari (Pa) e se caracteriza por expressar clorose foliar em plântulas, levando-as, posteriormente, à morte. Vários
genótipos da série Pa são portadores de genes responsáveis pela expressão do caráter ‘Luteus – Pa’, que pode ser
usado como ferramenta para determinação de relações entre genótipos pertencentes a esse grupo. Métodos: Para
avaliar esse fenômeno, foram realizadas análises da expressão diferenciada de genes entre as plântulas mutantes e
selvagens híbridas, visando elucidar os possíveis mecanismos letais do caráter homozigoto recessivo ‘Luteus – Pa’.
Foram realizadas coletas de folhas de plântulas selvagens e mutantes, em diferentes épocas (5, 10, 15, 20, 25 e 30
dias após a emergência – DAE das plântulas) , para confecção de biblioteca subtrativa e análise quantitativa de
PCR em tempo real. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com oito tratamentos
(dois híbridos e quatro épocas), cinco repetições e uma plântula por unidade experimental para a construção da
biblioteca subtrativa. As análises de PCR em tempo real foram constituídas de 12 tratamentos (dois híbridos e
seis épocas), três réplicas biológicas, em triplicatas. Resultados: As 649 sequências obtidas da biblioteca subtrativa
apresentaram comprimento médio de 500 pb, destas foram formados 409 contigs. As prováveis proteínas
encodadas foram agrupadas em 10 categorias funcionais e duas proteínas, a PsbO e PsbA, são expressas de forma
defeituosa nas plântulas mutantes. Conclusões: Os dados dos ESTs permitiram identificar genes associados
à Rubisco, às peroxidases, a outras proteínas e enzimas relacionadas a assimilação do carbono, à respiração e
ao fotossistema 2 da fase fotoquímica da fotossíntese. As plântulas mutantes se caracterizam por sintetizar as
proteínas PsbO e PsbA de forma defeituosa, apresentando assim uma maior expressão destas, aos 15 e 20 DAE.
Apoio financeiro: FAPESB/UESC
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Análise da expressão de genes envolvidos nas vias
de sinalização de tangerina poncan (Citrus Reticulata
Blanco) em resposta a Xylella fastidiosa em diferentes
fases de infecção
Rodrigues, CM1,2; Takita, MA1; Coletta-Filho, HD1; Souza, AA1; Machado MA1
Centro APTA Citros Sylvio Moreira-IAC; 2Universidade Estadual Paulista-Unesp- Campus Botucatu.
[email protected]
1
Palavras-chave: vias de sinalização, etileno, ácido salicílico, CVC, RT-qPCR.
A citricultura brasileira responde por 85% das exportações de suco concentrado do mundo, mesmo enfrentando
graves problemas de ordem fitossanitárias. Dentre as doenças que mais afetam esse setor encontra-se a clorose
variegada dos citros (CVC), causada pela Xylella fastidiosa (Xf). Contudo, as tangerinas são consideradas tolerantes
à CVC visto que não é observado o desenvolvimento dos sintomas mesmo sendo possível detectar as bactérias
nessas plantas. Resultados prévios do nosso grupo sugerem que a resistência pode estar envolvida com a ativação
de algumas vias de sinalização, pois após 30 dias de inoculação foi observada a expressão de genes envolvidos
na via de sinalização do ácido salicílico (AS), ácido jasmônico (AJ), etileno e outras (De Souza et al., 2009). Porém
não se sabe como essas vias são ativadas nas fases iniciais da planta. Desta forma, o trabalho objetivou avaliar
intervalos mais curtos após infecção com o patógeno, com o intuito de detectar qual a via de sinalização regulatória
é disparada na planta nos estágios iniciais. Foram avaliados os genes CC-NBS-LRR, pad4, npr1, pr1 e ERF1,
envolvidos com resistência a patógenos, síntese do AS, indutor de proteínas-PR, proteína-PR e sinalização celular,
respectivamente. Os RNAs de poncan infectadas ou não com a bactéria, nos diferentes tempos (1, 7, 14 e 21 dias),
foram extraídos de um pool de três repetições biológicas. Foram realizadas as sínteses dos cDNAs e estes foram
utilizados para as análises de expressão gênica através do RT-qPCR. Como resultado, o ERF1 não mostrou nenhuma
expressão em qualquer tempo medido. Esse gene está envolvido na via de sinalização do etileno que também
participa de respostas de defesa das plantas a estresses bióticos e abióticos. O gene CC-NBS-LRR apresentou maior
indução após um dia de inoculação o que sugere seu envolvimento na percepção de algum sinal molecular da
bactéria que desencadeia uma cascata de sinalização para expressão de genes de defesa. Provavelmente a via de
sinalização envolvida é a do AS, visto a indução do pad4 após um e quatorze dias. Corroborando esse resultado,
o aumento no nível de AS provoca a ativação da resistência sistêmica adquirida (SAR) (Sticher et al., 1997) que é
caracterizada pela ativação de vários genes que codificam proteínas-PR, tais como pr1 que também apresentou
indução após um, sete e quatorze dias de inoculação. Outro gene também induzido foi o npr1 após um e quatorze
dias. Existem evidências, que sob indução de SAR, a NPR1 é translocada para o núcleo da célula, onde interage
com fatores de transcrição que estão envolvidos na ativação de genes PR dependentes de AS (Kinkema et al.,
2000). O estudo desses genes poderá conduzir ao melhor entendimento de mecanismos resistência a X. fastidiosa.
Apoio financeiro: Fapesp.
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O papel de ABAP1 no desenvolvimento reprodutivo em
Arabidopsis thaliana
Cabral, LM1,3; Masuda, HP2; Hemerly, AS3
Universidade Federal Fluminense, Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia, Niterói – RJ,
Centro de Ciências Naturais e Humanas, UFABC, Santo André,SP
3
Laboratório de Biologia Molecular de Plantas, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
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Palavras-chave: Ciclo celular, Desenvolvimento vegetal, Diferenciação celular, Complexo pré-replicativo, Biomassa.
Divisão e diferenciação celular atuam em conjunto para promover a organogênese em vegetais. Ambos devem
ser coordenados com sinais intra e extracelulares, convergindo para a ocorrência de planos de desenvolvimento
adequados. Nosso grupo identificou uma proteína que conecta as maquinarias de replicação do DNA e transcrição
gênica, chamada ABAP1 (Armadillo BTB Arabidopsis protein 1). Em um trabalho prévio, demonstramos que ABAP1
atua como regulador negativo da divisão mitótica proliferativa em folhas, durante o desenvolvimento vegetativo da
planta, através da interação com membros do complexo pré-replicativo e com fatores de transcrição. No entanto,
a expressão de ABAP1 em diversos tecidos reprodutivos e durante o desenvolvimento embrionário, evidenciadas
tanto por experimentos de PCR em tempo real como por fusão de seu promotor com GUS, sugerem um papel para
ABAP1 também no desenvolvimento reprodutivo. Nessa fase, ocorrem divisões celulares especializadas, como as
que geram os gametas, e as divisões formativas que ocorrem após a fertilização, durante a formação do embrião.
Para investigar o envolvimento de ABAP1 nessas divisões celulares em Arabidopsis thaliana , plantas com níveis
alterados de ABAP1 foram analisadas, e os resultados indicam um papel para ABAP1 na gametogênese masculina
e feminina, além do desenvolvimento embrionário. Plantas com níveis reduzidos de ABAP1 apresentam problemas
nas primeiras etapas de divisão celular pós-fertilização, comprometendo todo seu desenvolvimento. A expressão
ectópica de ABAP1 (ABAP1OE) durante a gametogênese leva a produção de 50% de óvulos com defeito na fusão
dos núcleos polares, provavelmente afetando a fertilização e o posterior desenvolvimento do embrião. Essas
plantas apresentam ainda cerca de 17% de pólens defeituosos, que não conseguem fazer as divisões mitóticas
necessárias durante seu processo de maturação. Para entender os mecanismos moleculares envolvidos nessas
alterações, o perfil de expressão gênica em botão floral de plantas ABAP1OE foi analisado através de experimento de
microarranjo. A maior parte dos genes regulados são reprimidos, e cerca de 17% atuam em processos reprodutivos.
Nossos dados indicam que o mecanismo de ação deABAP1 controla não só as divisões mitóticas proliferativas
durante o desenvolvimento da folha, mas também as mitoses formativas que ocorrem na embriogênese e na
formação do gameta masculino. ABAP1 pode estar também envolvido no controle da diferenciação celular,
como no caso da gametogênese feminina, indicando que o papel de ABAP1 no desenvolvimento de tecidos
reprodutivos de A. thaliana é diferente do mecanismo já descrito para sua atuação em tecidos vegetativos. |
Apoio financeiro: CNPq, FAPERJ E CAPES
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Diversidade genética entre populações de coqueiro
gigante do Brasil por meio de marcadores
microssatélites (SSR)
Ribeiro, FE1; Baudouin, L2; Lebrun, P2; Chaves, LJ3; Brondani, C4; Zucchi, MI5; Vencovsky, R5
Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju-SE, 2CIRAD, Amélioration Cocotier, BP 5035, 34032, Montpellier, Cedex 01, France.3Universidade
Federal de Goiás (UFG).4Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antônio de Goiás-GO.5APTA - Pólo Centro Sul, Piracicaba-SP.
[email protected]
1
Palavras-chave: Estrutura populacional, Variabilidade genética, Marcadores moleculares.
O coqueiro (Cocos nucifera L.) é constituído de uma só espécie e de duas variedades principais, a gigante (Typica)
e a anã (Nana) e o sudeste asiático é o provável centro de origem da espécie. A variedade gigante foi introduzida
no Brasil em 1553, proveniente da Ilha de Cabo Verde. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a diversidade
genética entre e dentro de populações de coqueiro gigante do Brasil por meio de marcadores microssatélites
(SSR). Foram coletadas amostras de 195 indivíduos de dez populações distribuídas no litoral da Região Nordeste
do Brasil: Santo Inácio (MA), Luís Correia (PI), Baía Formosa (RN), Georgino Avelino (RN), São José do Mipibu
(RN), Santa Rita (PE), Merepe (PE), Japoatã (SE), Pacatuba (SE) e Praia do Forte (BA). A diversidade genética foi
avaliada utilizando 13 locos SSR (Baudouin & Lebrun, 2002). Foram avaliados os níveis de polimorfismos nas
populações de coqueiros e detectados um total de 68 alelos, com média de 5,23, variando de 2 a 13 alelos por loco.
A diversidade gênica de Nei (D) média foi de 0,459 e a heterozigosidade observada média de 0,443. O valor de qP
médio estimado, que reflete o grau de diferenciação genética entre as populações, foi de 0,160. A taxa estimada de
cruzamento aparente (ta) foi 92%. O que confirma o comportamento da espécie como preferencialmente alógama.
As estimativas de distância genética entre as populações variaram de 0,034 a 0,390. Com base nestas distâncias e
no dendrograma correspondente, propôs-se a formação de dois grupos, o primeiro formado pelas populações de
Baía Formosa, Georgino Avelino e São José do Mipibu e o segundo pelas populações de Japoatã, Pacatuba e Praia do
Forte, com as demais populações individualizadas. A correlação matricial entre as distâncias genéticas de Nei e as
distâncias geográficas, foi positiva (r = 0,598) e significativa a 1% de probabilidade (p = 0,0027) pelo teste de Mantel.
Estes resultados sugerem uma estruturação espacial da variabilidade genética entre as populações, com maior
similaridade entre as populações mais próximas geograficamente e a diversidade encontrada nessas populações
mostra-se de alta magnitude. A variabilidade genética entre populações de coqueiro gigante do Brasil detectada
pelos marcadores microssatélites (SSR) foi de 16%.
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Desenvolvimento, caracterização e uso de marcadores
microssatélites no mapeamento genético do cajueiro
(Anacardium occidentale)
Lamas, N1; Ferreira, MA1; Cavalcanti, JJV2; Buso, GSC1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília – DF
Embrapa Agroindústria tropical – CE
[email protected]
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Palavras-chave: Anacardium occidetale, Marcadores microssatélites, mapeamento, caracterização, biblioteca enriquecida.
O cajueiro é uma planta cultivada em várias partes do mundo tropical direcionada para produção de amêndoa, e
no nordeste brasileiro, apresenta importância econômica em estados como Ceará, Piauí e Rio Grande do Norte.
Adicionalmente, representa movimentação de 157 milhões de dólares em exportações de amêndoas, geração de
empregos nas etapas de produção, industrialização e comercialização. Apesar da importância socio-econômica
da cajucultura, esta exploração tem empregado poucas tecnologias, além de possuir fatores que prejudicam sua
plantação, como a ocorrência de pragas em várias fases do desenvolvimento. O uso da biotecnologia pode ser de
grande valia, pela possibilidade de aumento da produtividade e qualidade dos seus produtos, pois até o momento,
poucas são as informações a respeito de marcadores moleculares e genes que controlam caracteres de importância
econômica neste gênero. Este trabalho visa desenvolver e disponibilizar uma bateria de locos microssatélites para
A. occidentale a partir da construção de bibliotecas genômicas enriquecidas. O DNA foi extraído de folhas frescas,
segundo o protocolo CTAB 2%. Cerca de 50μg de DNA foram digeridos com a enzima de restrição Mse I. Os fragmentos
entre 200 e 800pb foram recuperados e purificados do gel e ligados aos adaptadores específicos à enzima. Foi feito o
enriquecimento e posterior reação de PCR com os fragmentos recuperados; Em seguida, os mesmos foram ligados
ao plasmídio pGEM-T e transformados em E. coli, cepa XL 1-Blue. Das 5472 colônias positivas, 540 foram utilizadas
para sequenciamento. Foram encontrados 117 microssatélites com mais de seis repetições, mostrando um
rendimento de 21%, sendo que 103 evidenciaram regiões para desenho de pares de primers pelo programa Primer 3.
Destes, 39 foram selecionados pela presença de polimorfismo nos parentais para serem caracterizados e utilizados
na saturação do mapeamento já existente de população F1 segregante de caju, com 85 acessos, originando um total
de 21 grupos de ligação, totalizando 1044 cM. Treze pares de marcadores foram selecionados para caracterização
quanto ao PIC, heterozigozidade esperada e observada. Os resultados representam ferramenta importante
para os estudos genéticos do cajueiro, área promissora tanto para exportação quanto para o mercado interno.
Apoio financeiro: Embrapa Cenargen, CAPES.