Tese Jamille sétima versão
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS Efeitos do treinamento em natação sobre parâmetros celulares, estruturais e mecânicos do ventrículo esquerdo de ratos hipertensos Jamille Locatelli Ouro Preto – MG 2016 Jamille Locatelli Efeitos do treinamento em natação sobre parâmetros celulares, estruturais e mecânicos do ventrículo esquerdo de ratos hipertensos Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação de Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração Bioquímica Metabólica e Fisiológica. Orientador: Prof. Dr. Mauro César Isoldi Coorientador: Prof. Dr. Antônio José Natali II Trabalho desenvolvido no Laboratório de Hipertensão da Universidade Federal de Ouro Preto, em parceria com o Laboratório de Biologia do Exercício da Universidade Federal de Viçosa, com auxílio financeiro do CNPQ, PROPP-UFOP. III Dedico este trabalho a Deus e aos meus familiares. IV AGRADECIMENTOS A Deus e a Maria, pelas bênçãos e força de todos os dias. Aos meus pais, Pedro e Zilda, que são exemplo de luta. Sem vocês nada disso seria possível. Muitos dias foram difíceis e sempre encontrei apoio em vocês para continuar na batalha. Vamos comemorar mais essa vitória! Aos meus amados avós, em especial ao meu avô Bianor, a quem dedico essa vitória. Onde ele estiver certamente estará feliz. Ao Rodolpho, pela compreensão, incentivo e companheirismo. Ao meu orientador, prof. Dr. Mauro César Isoldi, pelos ensinamentos e oportunidade e, em especial, ao meu coorientador, prof. Dr. Antônio José Natali, por todas as oportunidades, pela confiança, respeito e pelo exemplo de pesquisador. Meu sincero OBRIGADA! Às profas. Dra. Cláudia Martins Carneiro e Dra. Andréia Grabe-Guimarães, pela colaboração, orientação e ajuda nos trabalhos de eletrocardiograma. À profa. Dra. Paula Melo de Abreu Vieira, pela orientação nas análises de colágeno. À Sara, ao Giovanni e à Fernanda pela colaboração nos experimentos. Vocês foram pessoas fundamentais nesse processo. À Lidiane, pela amizade em todos os momentos. À Quênia, por me apresentar e me orientar no eletrocardiograma. À Nívia Carolina, pelos ensinamentos, pela amizade e pela ajuda nos experimentos. V À equipe do Laboratório de Biologia do Exercício (UFV), em especial à Cláudia, ao Miguel, ao Victor e ao Luís Henrique pelo apoio e prontidão. Aos colegas do Laboratório de Hipertensão. Aos funcionários do Centro de Ciência Animal da UFOP, pela amizade e pelo cuidado com os animais. Aos secretários do NUPEB, pela dedicação e prontidão. Aos animais, que inocentemente sacrificaram suas vidas pela ciência. VI “Nós não somos o que gostaríamos de ser; nós não somos o que ainda iremos ser; mas, graças a Deus, não somos mais quem nós éramos.” (Martin Luther King) VII RESUMO Introdução: a hipertensão arterial é considerada um grave problema de saúde pública, pois, na maioria das vezes, está associada a outras doenças crônico-degenerativas que afetam negativamente a qualidade de vida do indivíduo. Objetivo: avaliar os efeitos do treinamento aeróbico em natação sobre parâmetros celulares, estruturais e mecânicos do ventrículo esquerdo (VE) de ratos com hipertensão espontânea (SHR). Materiais e métodos: ratos Wistar e SHR (4 meses de idade) foram distribuídos nos grupos experimentais Sed (sedentário) e Ex (exercitado), sendo que os grupos Wistar foram considerados como controles normotensos (Sed e Ex). Os animais dos grupos Ex foram submetidos a um protocolo de natação (1h/dia, 5x/semana, durante 6 semanas). Após esse período foram avaliados os seguintes parâmetros: in vivo, a pressão arterial média basal (PAM) e a frequência cardíaca (FC) (em repouso e acordados); o índice QTc em ratos anestesiados; post mortem, o diâmetro das fibras cardíacas, o número de células inflamatórias e a área de colágeno no VE; in vitro, o comprimento, a largura e o volume dos cardiomiócitos isolados do VE; tempo para o pico de contração, porcentagem de amplitude do pico de contração e tempo para 50% do relaxamento de cardiomiócitos isolados estimulados a 1 e 3 Hz. Resultados: O treinamento atenuou a PAM em ratos acordados e a FC de ratos acordados no grupo SHR Ex, em relação a SHR Sed (164 ± 2 vs. 189 ± 4 mmHg e 384 ± 3 vs. 448 ± 10 bpm, respectivamente). O índice QTc também diminuiu em SHR Ex (92,89 ± 3,12 vs. 110,9 ± 3,61 ms). Os grupos SHR apresentaram redução na massa corporal e aumento na massa do coração e nas massas total e relativa do VE, em relação aos grupos normotensos. O treinamento aumentou o comprimento de cardiomiócitos Wistar, diminuiu o diâmetro das fibras cardíacas (19,88 ± 0,22 vs. 22,3 ± 0,41 µm) e também o número de células inflamatórias em SHR (107 ± 6 vs. 136 ± 2 µm2). O treinamento impediu a substituição do colágeno do tipo III pelo tipo I, protegendo o VE da deposição de colágeno. Em relação à função ventricular, o treinamento aeróbico provocou redução no tempo para o pico de contração em cardiomiócitos de SHR Ex em ambas as frequências de estimulação, em relação a SHR Sed (F1: 372 ± 9 vs. 446 ± 13 ms; F3: 296 ± 5 vs. 320 ± 5 ms). Em relação ao tempo para 50% do relaxamento, o exercício provocou redução em SHR apenas na frequência de 3 Hz (185 ± 8 vs. 218 ± 7 ms). Em ambas as frequências o exercício diminuiu a amplitude VIII para o pico de contração, comparada a SHR Sed (F1: 2,22 ± 0,17 vs. 4,2 ± 0,35%; F3: 2,96 ± 0,24 vs. 4,14 ± 0,32%). Conclusões: o treinamento em natação pode ter provocado a diminuição do tônus simpático e da atividade do sistema renina-angiotensinaaldosterona e melhorias da função elétrica ventricular, além de ter protegido o ventrículo esquerdo do remodelamento cardíaco patológico em SHR; o treinamento induziu hipertrofia fisiológica em animais normotensos e pode ter provocado adaptações benéficas nas funções sistólica e diastólica de ratos espontaneamente hipertensos. Palavras-chave: natação; hipertensão; função ventricular; remodelamento cardíaco; ratos espontaneamente hipertensos. IX ABSTRACT Introduction: Hypertension is considered a serious public health issue because it is associated to other chronic and degenerative diseases that affect negatively individual quality of life. Objective: To evaluate the effects of aerobic swimming training on left ventricle (LV) histologic parameters and on cardiomyocytes mechanic properties of nonhypertensive rat (Wistar) and spontaneously hypertensive rat (SHR). Methods and materials: Wistar rat and SHR (age 4 months) were distributed into experimental groups Sed (sedentary) and Ex (trained), in which Wistar groups were considered as control groups (Sed and Ex). The rats were submitted to an initial swimming protocol (1 hour a day, 5 times a week, for 6 weeks) after which the following parameters were assessed: in vivo, medium base blood pressure (MBP) and heart rate (HR) were measured (during awake resting), using direct register; QTc index in sedated rats were obtained after an electrocardiogram; post mortem, diameter of cardiac fibers, the number of inflammatory cells and the LV content of collagen by histologic analysis; in vitro, length, width and volume of LV cardiomyocytes, using isolation and morphologic measure techniques; time-to-peak contractions, contraction peak amplitude percentage and half-relaxation time by stimulating cardiomyocyte with 1 and 3 hertz through cell contractility assay technique. Results: Exercise decreased MBP and HR in awake SHR Ex compared to SHR Sed (164± 2 vs. 189 ± 4 mmHg and 384 ± 3 vs. 448 ± 10 bpm, respectively). QTc index also decreased in SHR Ex (92,89 ± 3,12 vs. 110,9 ± 3,61 ms). SHR groups had a reduction in body mass and increased heart mass, LV total mass and relative mass, compared to Wistar groups at the end of training protocol. Training increased cardiomyocyte length in Wistar and decreased the number of inflammatory cells (107 ± 6 vs. 136 ± 2 µm2) and the diameter in SHR (19,88 ± 0,22 vs. 22,3 ± 0,41 µm). The exercise training prevented the replacement of type III colagen into type I collagen, protecting LV from collagen deposition. Aerobic training caused reduction on time-topeak contractions in SHR Ex in relation to ventricle function in both frequency stimuli (F1: 372 ± 9 vs. 446 ± 13 ms; F3: 296 ± 5 vs. 320 ± 5 ms). Exercise caused reduction in half-relaxation time in SHR only in 3Hz frequency (185 ± 8 vs. 218 ± 7 ms). In both frequencies exercise diminished contraction peak amplitude percentage comparaed to SHR Sed (F1: 2,22 ± 0,17 vs. 4,2 ± 0,35%; F3: 2,96 ± 0,24 vs. 4,14 ± 0,32%). X Conclusions: Swimming training may have triggered a decrease in sympathetic tonus and activity of the renin-angiotensin-aldosterone system and improvements in left ventricular eletric function and protected the left ventricle from pathologic cardiac remodeling in SHR; exercise training induced physiologic hypertrophy in normotensive rats and may have triggered beneficial adaptations in systolic and diastolic function of spontaneously hypertensive rats. Keywords: swimming; hypertension; ventricle function; cardiac remodeling; spontaneously hypertensive rats. XI LISTA DE FIGURAS Figura 1: Representação do programa utilizado na aquisição das imagens e dos registros das contrações das células cardíacas (Ionoptix, EUA) ...................................................176 Figura 2: Representação de uma contração celular e os parâmetros avaliados ..............177 Figura 3: Valores do índice QTc de ratos Wistar e SHR anestesiados ..........................198 Figura 4: (A) Frequência cardíaca de repouso de ratos acordados; (B) Frequência cardíaca de repouso de ratos anestesiados e (C) Pressão arterial média de ratos acordados ...........................................................................................................................................19 Figura 5: (A) Número de células inflamatórias no ventrículo esquerdo; (B) Diâmetro de cardiomiócitos do VE de ratos Wistar e SHR..................................................................211 Figura 6: Fotomicrografias de cortes histológicos do ventrículo esquerdo de ratos normotensos e hipertensos ...............................................................................................222 Figura 7: (A) Conteúdo de colágeno do tipo I e (B) Conteúdo de colágeno do tipo III no ventrículo esquerdo de ratos Wistar e SHR .....................................................................233 Figura 8: Fotomicrografias de cortes histológicos do ventrículo esquerdo de ratos normotensos e hipertensos ...............................................................................................244 Figura 9: (A) Comprimento e (B) Relação comprimento/largura de cardiomiócitos do ventrículo esquerdo de ratos Wistar e SHR .....................................................................277 Figura 10: Função contrátil de cardiomiócitos de ratos Wistar e SHR estimulados a 1 Hz. (A) tempo para o pico de contração e (B) amplitude de contração ...................................28 Figura 11: Amplitude de contração de cardiomiócitos de ratos Wistar e SHR estimulados a 3 Hz. (A) tempo para o pico de contração; (B) Tempo para %0% de relaxamento e (C) amplitude de contração. .....................................................................................................29 XII LISTA DE TABELAS Tabela 1: Massa corporal, massa do coração, massa dos ventrículos esquerdo e direito e massas relativas dos grupos experimentais ......................................................................266 XIII LISTA DE ABREVIATURAS °C Graus Celsius µl Microlitro µm Micrômetro µm/seg Micrômetro por segundo Ang (1-7) Angiotensina (1-7) Ang II Angiotensina II ANOVA Análise de variância bpm Batimento por minuto Ca2+ Cálcio CaCl2 Cloreto de cálcio cm Centímetro DMSO Dimetilsulfóxido ECG Eletrocardiograma EGTA Ácido tetracético etilenoglicol EPM Erro padrão da média ET-1 Endotelina 1 Ex Exercitado FC Frequência cardíaca Fig Figura FLB Fosfolamban g Grama g/l Grama por litro HE Hematoxilina/eosina HEPES Ácido etanosulfônicohidroxietil piperazina Hz Hertz IGF-1 Fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 KCl Cloreto de potássio Kg Quilograma M Molar XIV MCI Massa corporal inicial MCF Massa corporal final MC Massa do coração MEC Matriz extracelular mg Miligramas MgCl2 Cloreto de magnésio min Minuto ml Mililitro mm Milímetro mM Milimolar mmHg Milímetro de mercúrio ms Milisegundos MV Massa do ventrículo MVD Massa do ventrículo direito MVE Massa do ventrículo esquerdo NaCl Cloreto de sódio NaH2PO4 Fosfato monossódico NCX Trocador de sódio/cálcio NE Noraepinefrina NF-ƘB Fator nuclear kappa B O2 Oxigênio PA Pressão arterial PAD Pressão arterial diastólica PAM Pressão arterial média PAP Pressão arterial pulsátil PAS Pressão arterial sistólica PE Polietileno pH Potencial hidrogeniônico pL Picolitro RNAm Ácido ribonucléico mensageiro RS Retículo sarcoplasmático XV RyR Receptor de rianodina Sed Sedentário Ser Serina SERCA Ca2+ ATPase do retículo sarcoplasmático SHR Rato espontaneamente hipertenso SNS Sistema nervoso simpático SRAA Sistema renina-angiotensina-aldosterona TGF-β Fator de crescimento tumoral beta Thr Treonina TNF-α Fator de necrose tumoral alfa V Volts VD Ventrículo direito VE Ventrículo esquerdo VEGF Fator de crescimento vascular endotelial VO2máx Volume máximo de oxigênio vs Versus XVI SUMÁRIO RESUMO ............................................................................................................................ VIII ABSTRACT ............................................................................................................................. X LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................... XII LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... XIII LISTA DE ABREVIATURAS .......................................................................................... XIV 1.0. INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1 2.0. OBJETIVOS..................................................................................................................... 9 2.1 Geral: ................................................................................................................................... 9 2.2 Específicos: .......................................................................................................................... 9 3.0. METODOLOGIA .......................................................................................................... 10 3.1 Animais .............................................................................................................................. 10 3.2 Protocolo de exercício físico.............................................................................................. 10 3.3 Confecção de cânulas vasculares para registro de sinais cardiovasculares ....................... 11 3.4 Obtenção dos sinais cardiovasculares em ratos anestesiados ............................................ 12 3.5 Registro direto da frequência cardíaca e pressão arterial média em ratos acordados ........ 11 3.6 Retirada do coração ........................................................................................................... 12 3.7 Análise histológica ............................................................................................................. 12 3.8 Massa do coração e dos ventrículos ................................................................................... 13 3.9 Isolamento dos cardiomiócitos .......................................................................................... 14 3.9.1 Soluções de isolamento ...............................................................................15 3.9.2 Solução de perfusão tampão HEPES ...........................................................15 3.10 Contratilidade celular ....................................................................................................... 15 3.11 Análise estatística ............................................................................................................ 17 4.0. RESULTADOS ............................................................................................................... 18 XVII 4.1 Valores do índice QTc em ratos anestesiados ................................................................... 18 4.2 Níveis basais de FC e PAM em ratos acordados e anestesiados ................................... 1918 4.3 Avaliação morfológica do tecido cardíaco ........................................................................ 20 4.4 Massa corporal, massa do coração e massa dos ventrículos .............................................. 25 4.5 Dimensões dos cardiomiócitos .......................................................................................... 26 4.6 Contratilidade de cardiomiócitos ....................................................................................... 27 5.0. DISCUSSÃO.................................................................................................................... 30 6.0. CONCLUSÕES ............................................................................................................... 40 7.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................................................... 41 ANEXO I – Protocolo de aprovação do Comitê de Ética em Uso Animal........................64 XVIII 1.0. INTRODUÇÃO A hipertensão arterial é uma doença crônica determinada por níveis de pressão arterial sistólica de repouso ≥ 140 mmHg e/ou pressão arterial diastólica ≥ 90 mmHg (International Society of Hypertension Writing Group, 2003). É considerada um grave problema de saúde pública, por estar associada ao aparecimento de outras doenças crônico-degenerativas que afetam negativamente a qualidade de vida de indivíduos (SBC, 2010). Nessa desordem, o remodelamento patológico leva à disfunção cardíaca, causada, parcialmente, pela alteração na expressão gênica e no fenótipo molecular no coração (Beisvag et al., 2009). A mortalidade por doenças cardiovasculares aumenta progressivamente com a elevação da pressão arterial (PA) a partir de 115/75 mmHg, de forma linear, contínua e independente (Lewington et al., 2002). Estudos clínicos demonstraram que a detecção, o tratamento e o controle da hipertensão arterial sistêmica são fundamentais para a redução de eventos cardiovasculares (SBC, 2006; Rosário et al., 2009). Uma meta-análise de 354 estudos clínicos revelou que a redução da morbidade e mortalidade é proporcional à queda da PA, tanto sistólica, quanto diastólica, podendo reduzir em até 46% a ocorrência de infartos do miocárdio, e em 63% o número de acidentes vasculares encefálicos (Law et al., 2003). A hipertrofia do ventrículo esquerdo (VE) e a disfunção diastólica são as primeiras manifestações de danos cardíacos em pacientes com hipertensão arterial (Fu et al., 2014). O coração do indivíduo com hipertensão sofre um processo de remodelamento estrutural e funcional. Além da hipertrofia dos cardiomiócitos, esse processo consiste também no aumento na deposição de colágenos intersticial e perivascular, além do remodelamento de arteríolas intramurais (Schwartzkopff et al., 1995; Sano et al., 1998) e outros componentes. A fase de hipertrofia ventricular é associada ao acúmulo progressivo de fibras colágenas no VE. Esse fenômeno de fibrose progressiva inicia-se mesmo na ausência de morte celular, sendo uma resposta adaptativa que preserva a capacidade de geração de força contrátil. Mais tarde, persistindo o estímulo pressórico, surge a fibrose reparativa, em resposta à morte celular. Todavia, com ou sem perda celular, a fibrose leva ao 1 enrijecimento tecidual, com diminuição na complacência e alteração na geometria do ventrículo (Weber, 1989; Chancey et al., 2002). No coração de mamíferos, a função cardíaca é regulada por interações dinâmicas entre dois tipos celulares predominantes: cardiomiócitos e fibroblastos cardíacos, que juntos, totalizam 90% do total de células do miocárdio (Porter e Turner, 2009). Os cardiomiócitos, ainda que em menor número, ocupam o maior volume no miocárdio. Já os fibroblastos correspondem a aproximadamente 70% do total de células do coração humano e são os principais componentes do tecido conjuntivo, que é formado também por colágenos dos tipos I e III (secretados pelos fibroblastos), elastina, fibrilina, proteínas adesivas e proteoglicanos (Wilson e Spinalle, 2001). A eficiência mecânica do músculo cardíaco depende das propriedades contráteis dos cardiomiócitos, associados ao tecido conjuntivo (Wilson e Spinalle, 2001). Os fibroblastos produzem colágenos do tipo I e III, além de fibronectina, proteoglicanos, metaloproteinases e seus inibidores; já os cardiomiócitos e células endoteliais são responsáveis por sintetizar colágeno dos tipos IV e VI (Janicki et al., 2006). O colágeno é responsável pela integridade funcional do miocárdio, que permite a interdigitação e a transmissão da força entre cardiomiócitos na contração (Mukherjee e Sen, 1993). Já se sabe que a produção de colágeno sofre influência do aumento da sobrecarga de pressão (Weber e Brilla, 1991). O aumento no conteúdo de colágeno leva a prejuízos na capacidade do coração de bombear o sangue para o corpo. Apesar de diversos tipos de colágenos serem expressos transitoriamente durante o desenvolvimento embrionário e participarem diretamente na migração, diferenciação e organização das estruturas cardíacas, o colágeno dos tipos I e III são os principais colágenos do tipo fibrilar presentes em coração de adultos (Medugorac, 1982); entretanto, durante a instalação do processo de fibrose cardíaca ocorre a predominância de colágeno fibrilar do tipo I, que altera as propriedades elásticas do coração (Shahbaz et al., 2010). A linhagem de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) vem sendo utilizada como modelo experimental de hipertensão arterial, pois as alterações fisiopatológicas encontradas nesses animais se assemelham às observadas na hipertensão humana essencial. Outra vantagem desse modelo é a possibilidade de se estudar a progressão da hipertensão, conforme em humanos, sendo caracterizadas 3 fases: pré-hipertensão, 2 desenvolvimento e sustentação dos níveis pressóricos (Risler et al., 2005). Os animais SHR são pré-hipertensos entre 5 e 8 semanas de vida, com a PA sistólica em torno de 100 a 120 mmHg (Adams et al., 1989 apud Fazan Jr et al., 2001), apresentando um nível pressórico que pode ser considerado como hipertensão arterial espontânea entre a 7a e a 15a semanas. Fazan Jr e colaboradores (2001) consideram ainda que o ápice pressórico deve ser atingindo entre a 20a e 28a semanas de vida, não havendo influência sexual nesse desenvolvimento. Nesse modelo de hipertensão, os animais desenvolvem insuficiência cardíaca e disfunção renal (Conrad et al., 1991; Frohlich et al., 1994; Linz et al., 2015). Além disso, apresentam aumento na atividade do sistema nervoso simpático (SNS), evidenciado pelo aumento da atividade simpática renal (Trippodo e Frohlich, 1981; Jiang et al., 2012). Alguns autores defendem que esse aumento da atividade simpática é uma das características dos diferentes tipos de hipertensão arterial (Donohue et al., 1988; Guyenet, 2006; Levick et al., 2010). A efetividade dos β-bloqueadores na redução da hipertrofia induzida por hipertensão sugere que a hiperatividade simpática tem um papel fundamental na hipertrofia e nos danos cardíacos na hipertensão arterial (Agarwal et al., 2009). Além disso, a norepinefrina (NE) induz a produção de citocinas próinflamatórias nos cardiomiócitos (Fu et al., 2004), contribuindo para o aumento do quadro inflamatório observado no modelo SHR. Agarwal e colaboradores (2009) mostraram que os níveis circulantes de NE (um marcador indireto da atividade simpática) foram maiores em SHR, comparados a Wistar Kyoto e que o treinamento em esteira diminuiu significativamente esses valores. O aumento da atividade local do sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) no VE pode explicar também o aumento na massa cardíaca encontrada em modelos de hipertensão arterial. Schunkert e colaboradores (1990) encontraram aumento na atividade da enzima conversora de angiotensina no VE, mas não no ventrículo direito (VD) de ratos com hipertrofia cardíaca. Alguns autores sugerem que SHRs apresentam hipertrofia concêntrica, aumento no tempo de contração e relaxamento de cardiomiócitos, além de aumento da concentração de cálcio intracelular (Brooksby et al., 1992; McCrossan et al., 2004). Nessa linhagem também se observam alterações nos parâmetros do eletrocardiograma 3 (ECG), tais como, o prolongamento do potencial de ação e do intervalo QT (Klimas et al., 2012; Lee et al., 2013). O prolongamento do intervalo QT do ECG é um marcador não específico de cardiotoxicidade de fármacos, drogas e de patologias cardíacas associadas ao risco aumentado de doença cardíaca e morte súbita (Crumb e Cavero, 1999). A cardioproteção pode ser demonstrada experimentalmente pela redução do prolongamento do intervalo QT ou pela capacidade em evitar o seu prolongamento em condições de hiperatividade cardíaca (Baillard et al., 2000). O prolongamento do intervalo QT também pode ser utilizado como uma forma de avaliar a repolarização cardíaca (Klimas et al., 2008; Kmecova e Klimas, 2010). Na hipertensão, o prolongamento do potencial de ação e a presença de arritmias podem levar a prejuízos no mecanismos de contração do cardiomiócito. A fibrose miocárdica é uma alteração patológica multifatorial que envolve o remodelamento da matriz extracelular (MEC) e de seus componentes celulares (Mindan e Panizo, 1993; Jellis et al., 2010). Isso resulta no remodelamento do ventrículo esquerdo, o que causa anormalidade na função cardíaca, em especial, o prejuízo no relaxamento diastólico (Slama et al., 2002) e hipertrofia acompanhada de insuficiência cardíaca. Em nível molecular, o remodelamento da MEC é mediado pela ativação de sistemas neurohumorais, dentre eles, o SRAA e pelo fator de crescimento tumoral β (TGF-β) (Rosenkranz, 2004). Alguns estudos já mostraram que a angiotensina II (Ang II), o principal peptídeo do SRAA pode influenciar na síntese e degradação da MEC no miocárdio, estimulando a expressão de colágeno miofibrilar, via ativação do receptor AT1 (Weber et al., 1994). Sun e colaboradores (1998) mostraram também que esse peptídeo estimula a fibrose em ratos infartados, através da ativação de TGF-β. Um estudo utilizando tecido cardíaco de humanos com e sem insuficiência mostrou um aumento nos níveis de TGF-β naqueles com insuficiência. Isso foi acompanhado de elevação nos níveis de colágeno tipo I e III (Sivakumar et al., 2008). Em modelo animal, se observa que a inibição do TGF-β melhora os efeitos prófibróticos dessa citocina (Kuwahara et al., 2002). A sobrecarga mecânica exerte efeitos predominantemente pró-fibróticos em fibroblastos cardíacos. A expressão de citocinas e fatores de crescimento estimulada pelos fibroblastos é responsiva ao estiramento; este, por sua vez, leva ao aumento da 4 expressão gênica do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (Yokoyama et al., 1999; Sato et al., 2003), endotelina 1 (ET-1) (Pikkarainen et al., 2006) e TGF-β (Lindahl et al., 2002) em ratos. A Ang II induz a expressão de citocinas pró-inflamatórias (TGF-β, TNFα, interleucina-6), peptídeos (ET-1 e peptídeos natriuréticos dos tipos A e B) e fatores de crescimento (por ex., VEGF) em fibroblastos cardíacos (Chintalgattu et al., 2003; Sato et al., 2003; Rosenkranz, 2004; Makino et al., 2006). Ela também atua nos fibroblastos cardíacos, estimulando a síntese de colágeno dos tipos I e III e fibronectina, através da ativação do receptor AT1 em roedores e humanos com insuficiência cardíaca (Agocha et al., 1997; Hafizi et al., 1998; Staufenberger et al., 2001). A hipertensão arterial pode provocar diversas alterações morfológicas nos miócitos cardíacos e disfunções progressivas nas funções do miocárdio, dependentes do tipo e do tempo da instalação do processo hipertensivo. Dentre as disfunções que ocorrem no coração, McMullen e Jennings (2007), enumeram as disfunções mecânicas durante a contração e o relaxamento e a dilatação do ventrículo esquerdo, provocando a insuficiência cardíaca. Em relação às propriedades mecânicas, muitos trabalhos mostram aumento do tempo de relaxamento do coração em modelos de hipertensão (McCrossan et al., 2004; Kemi et al., 2008; Carneiro-Júnior et al., 2013). Em contrapartida, os resultados sobre amplitude do pico de contração são controversos. Yelamarty e colaboradores (1992) mostraram que, em animais com hipertensão renovascular, a amplitude de contração não foi alterada. Já Brown (2003) mostrou aumento na amplitude do pico em cardiomiócitos de SHR estimulados a 0,5 Hz, corroborando com os resultados apresentados por Brooksby et al. (1992) e Kobayashi et al. (1995). O potencial de ação ventricular de SHR também é prolongado, quando comparado ao de animais WistarKyoto (Cerbai et al. 1994). Por sua vez, Li e colaboradores (2005), avaliaram SHR com 12 meses de idade e mostraram diminuição na amplitude do pico, após estimularem cardiomiócitos isolados a 0,5 Hz. A hipertensão também provoca diminuição nas velocidades de contração e de relaxamento de miócitos isolados e aumento do tempo para o pico de contração (Carneiro-Júnior et al., 2013). 5 O exercício físico é recomendado como uma terapia não farmacológica importante no controle da hipertensão e na prevenção e atenuação do remodelamento cardíaco induzido pela sobrecarga crônica de pressão (Mancia et al., 2013; Yancy et al., 2013; Locatelli et al., 2014). Também tem sido reportado que o exercício de baixa intensidade atrasa o início da insuficiência cardíaca e melhora a sobrevida em SHR com quadro de insuficiência já instalado (Emter et al., 2005). O treinamento físico regular também melhora a sensibilidade dos baroreceptores em animais normotensos e SHR, favorecendo o controle da PA (Brum et al., 2000; Moraes-Silva et al., 2010). Além disso, observa-se no modelo SHR, redução na atividade da renina plasmática, após a prática de exercício físico (Hayashi et al., 2000; Zamo et al., 2004). Em diferentes modelos de lesão cardíaca o exercício atenua a dilatação do ventrículo, a hipertrofia dos miócitos, a fibrose do miocárdio, a disfunção mitocondrial, as alterações na mobilização do cálcio, a simpatoexcitação, a disfunção cardíaca e melhora o perfil inflamatório do tecido cardíaco (Rossoni et al., 2011; Llewellyn et al., 2014; Locatelli et al., 2014; Melo et al., 2014). A hipertrofia induzida pelo treinamento é uma importante adaptação fisiológica, que envolve a via do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1) (Opie, 2004). Em modelos animais, o exercício leva ao aumento das dimensões dos cardiomiócitos numa média de 17 a 23% (Kemi et al., 2002). O crescimento do coração em resposta ao exercício necessita de uma estrutura vascular compatível com o aumento da demanda funcional. O fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) é fundamental no processo de angiogênese (Taimeh et al., 2013). O exercício, através do aumento do sheer stress e/ou do estímulo bioquímico nos vasos, contribui para a ativação da cascata de sinalização de VEGF, estimulando a angiogênese (Brown, 2003). Em modelos animais e humanos, o treinamento de resistência estimula o crescimento de artérias coronárias, melhorando a capacidade de transporte e o fluxo sanguíneo no coração (Kozakova et al., 2007; Duncker e Bache, 2008). Atualmente acredita-se que o coração mantenha sua capacidade de renovação pela formação de novos cardiomiócitos advindos de células progenitoras, de células 6 tronco cardíacas e proliferação de cardiomiócitos preexistentes (Porrello et al., 2011; Senyo et al., 2013). Um grande número de modelos animais para induzir a hipertrofia cardíaca tem sido desenvolvido e diversos tipos de treinamento também são reconhecidos por induzir a hipertrofia cardíaca fisiológica em animais, dentre eles, os protocolos envolvendo treinamento em esteira e natação e a prática da corrida voluntária (Evangelista et al., 2003; Medeiros et al., 2004; Locatelli et al., 2014). Nesse sentido, o treinamento em natação parece ser tão efetivo quanto os demais programas para induzir a hipertrofia cardíaca em ratos (Wang et al., 2010), provocando aumento significativo no volume diastólico final em ratos (Dorn, 2007). Já é bem estabelecido que a hipertensão provoca disfunções na mobilização do cálcio (Ca2+) no coração de animais com hipertensão (Carneiro-Júnior et al., 2014; Locatelli et al., 2014). Alterações nos níveis de Ca2+-ATPase do retículo sarcoplasmático (RS) (SERCA) e trocador de sódio-cálcio (NCX) levam à diminuição no pico de contratilidade, diminuição na remoção do cálcio intracelular e prolongamento na duração do ciclo cardíaco (Houser et al., 2000). É possível que a redução na expressão de SERCA e elevação nos de fosfolamban (FLB) e NCX sejam responsáveis pela alteração na função contrátil em casos de hipertensão arterial. Collins e colaboradores (2005) mostraram que SHR com idade entre 12 e 16 semanas apresentam diminuição na expressão de FLB e aumento nos níveis de RNAm de NCX. Em ratos com hipertensão renovascular, Locatelli e cols. (2014) obtiveram os mesmos resultados, com diminuição também dos níveis protéicos de SERCA2. Todavia, o treinamento aeróbico tem sido efetivo em alterar o padrão de expressão dessas proteínas, melhorando a função cardíaca, a sensibilidade ao cálcio e a contratilidade dos cardiomiócitos (Carneiro-Júnior et al., 2013). Garciarena e cols. (2009) mostraram que o treinamento em natação (90 min/dia, 5 dias/semana, 60 dias) aumentou a expressão da SERCA2, mas não influenciou a expressão dos canais NCX em cardiomiócitos de ratos SHR exercitados. MacDonnell e colaboradores (2005) demonstraram que, em ratas espontaneamente hipertensas submetidas ao treinamento de baixa intensidade em esteira, houve aumento na fosforilação nos canais de rianodina do tipo 2 (RyR2) e em 2 sítios de fosfolamban (Ser16 e Thr17). 7 Entretanto, até o momento, pouco se sabe sobre os efeitos do treinamento em natação com duração de 6 semanas sobre a deposição de colágeno, inflamação, diâmetro de células do ventrículo esquerdo e propriedades mecânicas de cardiomiócitos de animais espontaneamente hipertensos estimulados às frequências de 1 e 3 Hz. Sabendo que o treinamento aeróbico de baixa intensidade é recomendado como terapia não farmacológica no tratamento da hipertensão arterial sistêmica (Pescatello et al., 2004) e que sua prática regular pode causar benefícios ao coração (Kolwicz et al., 2007; Carneiro-Júnior et al., 2013; Locatelli et al., 2014), o objetivo principal desse estudo foi investigar os efeitos do treinamento em natação de baixa intensidade sobre os parâmetros morfológicos e sobre as propriedades mecânicas de cardiomiócitos de ratos normotensos e hipertensos. 8 2.0. OBJETIVOS 2.1 Geral: Investigar os efeitos do treinamento aeróbico em natação sobre parâmetros celulares, estruturais e mecânicos do ventrículo esquerdo (VE) de ratos com hipertensão espontânea (SHR). 2.2 Específicos: Avaliar se o treinamento aeróbico em natação afeta os seguintes parâmetros em ratos com hipertensão espontânea (SHR): • respostas eletrocardiográficas; • pressão arterial média e frequência cardíaca; • a massa do coração e ventrículos; • células inflamatórias e diâmetro das fibras cardíacas; • conteúdo de colágeno; • dimensões, amplitude de contração, tempo para o pico de contração e tempo para metade do relaxamento de cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo; 9 3.0. METODOLOGIA 3.1 Animais Para a realização dos experimentos foram utilizados ratos das linhagens Wistar e SHR, machos (Rattus norvegicus), com 4 meses de idade, provenientes do Centro de Ciência Animal da Universidade Federal de Ouro Preto. Os experimentos se iniciaram com um total de 80 animais e ocorreram perdas amostrais durante a realização de algumas técnicas. Os animais foram mantidos em caixas de polietileno, com no máximo 4 ratos por caixa, receberam água e ração convencional ad libitum, em ambiente com ciclo claro/escuro de 12 horas. Todos os protocolos realizados foram devidamente aprovados pelo Comitê de Ética em Uso Animal (protocolo número 2012/54). 3.2 Protocolo de exercício físico Cada linhagem foi dividida em dois grupos experimentais: ratos sedentários (Sed) e ratos submetidos ao exercício físico (Ex) (natação sem carga) e todos os animais foram pesados antes do início do protocolo de treinamento e ao final da última sessão de treino do protocolo. Os animais foram submetidos ao treinamento de natação sem carga, por este ser considerado um modelo descrito na literatura de indução de hipertrofia cardíaca fisiológica em ratos (Locatelli et al., 2014). No primeiro dia, os animais exercitados foram submetidos à natação por 20 minutos, no segundo dia, por 40 minutos e do terceiro ao trigésimo dia, por 60 minutos, 5 vezes por semana. A natação foi realizada em um tanque adaptado com 12 divisórias de 38 por 60 cm de largura e 50 cm de profundidade e a temperatura da água era mantida em 30 ± 2ºC, através do uso do termostato. Os grupos de animais sedentários foram colocados em baldes (4 ratos por balde) com água rasa (±15 cm de altura, em temperatura de 30±2ºC), para que os mesmos fossem semelhantemente manipulados e expostos às condições de estresse dos grupos exercitados (Locatelli et al., 2014). O protocolo de natação foi realizado no Centro de Ciência Animal da UFOP. 10 3.3 Confecção de cânulas vasculares para registro de sinais cardiovasculares Cânulas foram confeccionadas a partir de 4 cm de tubos de polietileno (PE) 10, polimerizados por aquecimento e 16 cm de PE 50. O interior das cânulas foi preenchido com uma solução salina (NaCl, 0,9%) e a extremidade livre de PE 50 foi fechada com um oclusor metálico antes das canulações. 3.4 Obtenção dos sinais cardiovasculares em ratos anestesiados A 1ª etapa dos experimentos foi realizada na Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais dos grupos Wistar e SHR foram anestesiados com uma mistura de ketamina e xilazina (50 mg/kg e 10 mg/kg, ip, respectivamente), por via intraperitoneal. Após a anestesia foram realizadas a tricotomia e assepsia da região inguinal esquerda; uma pequena incisão para exposição do feixe femoral foi realizada. Para obtenção do sinal da pressão arterial foi inserido um catéter de PE na artéria femoral. Após a cateterização, a extremidade mais fina (PE10) se localizava na aorta abdominal, abaixo das artérias renais. A extremidade PE50 do catéter inserido na artéria femoral foi, então, acoplada a um transdutor de pressão TruWave® (Edwards Lifescience, Canadá) para aquisição do sinal de PA. Para possibilitar a medição da diferença de potencial relativa à derivação DII do eletrocardiograma (ECG), agulhas hipodérmicas de aço inoxidável foram inseridas no tecido subcutâneo dos animais. A derivação DӀӀ mediu a diferença de potencial entre duas agulhas hipodérmicas posicionadas no membro inferior esquerdo e superior direito do animal. Os registros tiveram duração de 2 minutos. Os sensores de ECG e o transdutor de PA foram acoplados a um sistema condicionador, que fornece sinais em tempo real, a uma frequência de 1200 Hz, processados por uma placa conversora analógico-digital (DaqBoard/2001, EUA). Os registros digitais dos experimentos foram convertidos pelo software Matlab 7.0 (MathWorks, EUA) e os sinais foram analisados por inspeção visual do registro com o auxílio do software WinDaq/EX Playback and Analysis (DATAQ Instruments, USA). Foram selecionados 3 segmentos de 2 segundos, que foram gravados para posterior obtenção dos parâmetros cardiovasculares (Maciel, et al., 2010). Foram extraídos os seguintes parâmetros cardiovasculares: PA sistólica (PAS) e diastólica (PAD), frequência cardíaca (FC) obtida a partir do intervalo RR do ECG, o intervalo QT do 11 ECG e ainda o QTc (intervalo QT corrigido pelo índice de Fridericia, (1920): QTc = QT/(RR)1/3), recomendado para intervalos RR menores que 500 ms. A PAM foi calculada pela seguinte equação: PAM = PAD + 1/3 (PAS – PAD) (Guyton e Hall, 2006). 3.5 Registro direto da frequência cardíaca e pressão arterial média em ratos acordados A avaliação dos diferentes parâmetros cardiovasculares (PAM e FC) foi realizada 24 horas após a realização do ECG. As cânulas arteriais foram acopladas ao sistema computadorizado de aquisição de dados (Powerlab). Heparina foi injetada nas cânulas antes da conexão junto ao transdutor. A PA foi monitorada por um transdutor de pressão modelo Gould, conectado a um amplificador (PM-1000, CWE). O sinal de pressão arterial pulsátil foi derivado para um cardiotacômetro (PM-1000,CWE) para se obter a FC. A PAP e a FC foram continuamente amostradas por um sistema de conversão analógico/digital de 12 bits (Powerlab 4/20), a uma frequência de 800 Hz e armazenados em disco rígido. Posteriormente, o sinal foi processado por um software (Powerlab 4/20) para se obter a PAM, as características temporais e as alterações máximas dos parâmetros desejados. Simultaneamente, a PAM e a FC foram calculadas a partir de pulsos de PA. Essas variáveis foram apresentadas simultaneamente em canais distintos no monitor e armazenadas em disco rígido do computador. 3.6 Retirada do coração Ao término dos experimentos in vivo, os animais foram submetidos à eutanásia por decapitação, submetidos a uma laparotomia mediana para ressecção do coração. 3.7 Análise histológica Para as análises histológicas do ventrículo esquerdo, fragmentos não excedentes a 1 cm de espessura dos tecidos foram fixados em Metanol 80% + Dimetilsulfóxido (DMSO) 20% (Gava et al., 2012) e mantidos em geladeira -4°C até serem processados. Nesse processo foram desidratados, diafanizados, embebidos e emblocados em parafina. Secções parafinadas de aproximadamente 4µm de espessura foram obtidas através de técnicas de microtomia, fixadas em lâminas de vidro. As lâminas obtidas 12 foram coradas pelas técnicas de Hematoxilina e Eosina (HE) ou Picrosirius Red para avaliações das principais alterações estruturais. Foram realizadas avaliações quantitativas por técnicas de morfometria digital. Para isso, foram obtidas 10 imagens aleatórias do tecido cardíaco (Cabanelas et al., 2012) com ocular de 10X e objetiva de 40X no microscópio Leica DM5000 acoplado a câmera digital (Leica DFC 300 FX), com auxílio do software de captura de imagens Leica Application Suite. As imagens foram analisadas no software Leica Qwin V.3.2.1 (Leica Switzerland). Para a avaliação do quadro inflamatório cardíaco, o número total de células presentes no campo microscópico foi determinado pela contagem semiautomática de núcleos celulares (Ferreira Júnior et al., 2015). Além disso, no coração também foi avaliada a espessura das fibras miocárdicas, através de medidas interativas, pelo desenho de uma reta ligando os limites celulares superior e inferior na região do núcleo. Somente fibras com núcleos e limites celulares visíveis foram incluídas, com total de cem cardiomiócitos analisados para cada animal. Para a análise quantitativa do colágeno dos tipos I e III foi utilizada a coloração de Picrosirius Red (Junqueira et al., 1979) e contagem das fibras em microscópio ótico de luz polarizada, por meio de análise digital de birrefringência. Foram obtidas 20 imagens aleatórias do tecido cardíaco com objetiva de 20X no microscópio Leica DM5000 acoplado a câmera digital (Leica DFC 300 FX) utilizando o software de captura de imagens Leica Application Suite. A luz polarizada possibilita distinguir três cores: a coloração verde, característica das fibras colágenas finas, reticulares do tipo III e o espectro de cor amarela até a cor vemelha, que indica fibras colágenas densas do tipo I. As imagens foram analisadas com o auxílio do software Leica Qwin V.3.2.1 (Leica Switzerland). Todas as análises histológicas foram realizadas no setor de microscopia do Laboratório Multiusuários do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da UFOP. 3.8 Massa do coração e dos ventrículos Na segunda etapa dos experimentos, que foi realizada na Universidade Federal de Viçosa, foram avaliadas a massa do coração e dos ventrículos. Setenta e duas horas após a última sessão do treinamento, os animais foram pesados, e em seguida, foi realizada a eutanásia por decapitação em dois animais por dia, alternando os grupos 13 (sedentário e treinado). O coração foi removido através da toracotomia, lavado em solução contendo 750 mM de CaCl2, para retirar o excesso de sangue, e, imediatamente pesado em balança de precisão (Gehaka – Brasil, modelo AG 200). Após a perfusão com as soluções de isolamento, os ventrículos direito e esquerdo foram separados dos átrios e pesados. O índice de hipertrofia cardíaca foi calculado pela razão entre a massa do coração (mg) e a massa corporal (g). Em contrapartida, o índice de hipertrofia ventricular foi calculado pela razão entre a massa do ventrículo (mg) e a massa corporal (g). 3.9 Isolamento dos cardiomiócitos Após a eutanásia, o coração foi removido e lavado para retirar o excesso de sangue, antes da perfusão das soluções de isolamento. Em seguida, a artéria aorta ascendente foi canulada e o coração isolado foi colocado em um sistema de perfusão. A solução de isolamento contendo 750 mM de CaCl2 (solução 1), foi perfundida, em fluxo constante, até que os vasos coronarianos estivessem limpos. Logo após, foi trocada a perfusão para a solução livre de cálcio, contendo 0,1 mM de ácido tetracético etilenoglicol (EGTA) (solução 2), durante 4 a 6 minutos, para destruição dos discos intercalares e quelação do Ca2+. Em seguida, o coração foi perfundido com uma solução contendo 1mg.ml-1 de colagenase tipo 2 (Worthington, EUA) e 0,1mg.ml-1 de protease (solução 3), durante 10 a 15 minutos, para destruição da matriz extracelular e fibras de colágeno. Durante o isolamento, todas as soluções foram oxigenadas (O2 100% - White Martins, Brasil) e mantidas em temperatura de 37º C. Após a perfusão, os ventrículos (direito e esquerdo) foram separados dos átrios. O ventrículo esquerdo foi aberto na região do septo interventricular. Os músculos papilares e o tecido conjuntivo foram removidos manualmente de sua superfície. Fragmentos finos (< 1mm) foram obtidos dos ventrículos esquerdo e direito. As amostras foram identificadas e colocadas em solução contendo 5 ml de solução enzimática (colagenase) e protease. Os frascos foram agitados durante 5 minutos, em banho-maria, à temperatura de 37º C, com oxigenação dos tecidos (O2 100% - White Martins, Brasil). A seguir, o conteúdo dos frascos foi filtrado e centrifugado (3000 rpm) por 30 segundos. O sobrenadante foi removido e os cardiomiócitos suspendidos na solução 750 mM de CaCl2. Os processos de agitação e filtração foram repetidos. Os 14 cardiomiócitos foram armazenados em placas de Petri em refrigerador (5ºC), até serem utilizados. 3.9.1 Soluções de isolamento As soluções utilizadas para o isolamento dos cardiomiócitos foram feitas utilizando-se uma solução básica com água deionizada ultrapura (Milli-Q) e a seguinte composição (em mM): NaCl – 7,6 g/l; MgCl2 – 0,28 g/l; KCl – 0,4 g/l; ácido etanosulfônicohidroxietil piperazina (HEPES) – 1,2 g/l; glicose – 1,8 g/l; taurina – 2,5 g/l; creatina – 1,3 g/l; pH = 7,3; temperatura ambiente. Solução 1: Para se fazer a solução de isolamento contendo Ca2+, foram adicionados 375 µl de CaCl2 (1M) em 500 ml da solução básica. Solução 2: Para a solução de isolamento livre de Ca2+, foram adicionados 200 µl de EGTA (100 mM) em 250 ml da solução básica. Solução 3: Para a solução enzimática de isolamento, foram adicionados 30 mg de colagenase e 3 mg de protease em 30 ml da solução básica. 3.9.2 Solução de perfusão tampão HEPES Durante as análises da contratilidade celular, os cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo foram banhados com uma solução fisiológica contendo (em mM): solução estoque: NaCl– 80 g/l; HEPES– 23,8 g/l; NaH2PO4– 0,51 g/l; MgCl2 – 5 g/l; KCl – 4,25 g/. Para fazer um litro da solução de perfusão tampão HEPES, foram adicionados 100 ml da solução estoque, 1 g de glicose e 1,8 ml de CaCl2 em 800 ml de água deionizada ultrapura (Milli-Q). Esta solução foi equilibrada para um pH = 7,4 e mantida em temperatura ambiente. 3.10 Contratilidade celular As contrações dos cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo foram medidas através da técnica de alteração do comprimento das células, utilizando-se o 15 sistema de detecção de bordas (Ionoptix, EUA) montado num microscópio invertido (Nikon Eclipse – TS100, EUA), equipado com uma lente objetiva de imersão em óleo (S Fluor, 40x, Nikon, EUA). Para as análises das contrações foram utilizados somente as células que estavam em boas condições, com as bordas e estriações sarcoméricas bem definidas, relaxadas, sem apresentarem contrações involuntárias. Os cardiomiócitos isolados foram acomodados em uma câmara experimental giratória com a base de vidro montada no microscópio, e banhados pela solução de perfusão tampão HEPES (item 6.3.2) em temperatura ambiente (~ 25ºC). As células foram visualizadas em um monitor através de uma câmera (Myocam, Ionoptix, EUA), acoplada ao microscópio invertido, utilizando-se um programa de detecção de imagens (Ionwizard, Ionoptix, EUA) com uma frequência de 240 Hz. Os cardiomiócitos foram estimulados externamente à frequência de 1 e 3 Hz (20 V, duração de 5 ms) utilizando-se um par de eletrodos de aço, acoplado nos dois lados internos da câmara, através de um estimulador elétrico (Myopacer, Field Stimulator, Ionoptix, EUA). As bordas dos cardiomiócitos foram identificadas com duas janelas (direita e esquerda) e definidas através do ajuste do contraste (preto e branco) gerado pela qualidade da imagem projetada dos cardiomiócitos. As contrações dos cardiomiócitos após a estimulação elétrica foram capturadas pelo sistema de detecção de bordas (Ionwizard, Ionoptix, EUA) (Figura 1) e armazenadas para análise posterior. Figura 1: Representação do programa utilizado na aquisição das imagens e dos registros das contrações das células cardíacas (Ionoptix, EUA). As projeções dos picos verde e vermelho representam as definições das bordas direita e esquerda de um cardiomiócito, respectivamente. A partir dos registros obtidos, foram analisadas a amplitude de contração (variação do comprimento celular de repouso, %), o tempo para o pico de contração e o tempo para metade (50%) do relaxamento. Esses parâmetros foram determinados 16 utilizando um software desenvolvido em plataforma MatLab. Os principais parâmetros avaliados são demonstrados na Figura 2. Figura 2: Representação de uma contração celular e os parâmetros avaliados (adaptado de Carneiro-Júnior, 2013). 3.11 Análise estatística Para análise dos dados utilizamos o teste estatístico ANOVA two-way (Wistar X SHR - fator hipertensão; Sedentários X Exercitados - fator exercício), seguido do pósteste de Bonferroni para os fatores que apresentaram interação. Para as comparações entre as médias de massa corporal inicial e final foi utilizado o teste t de Student pareado. Todas as análises foram realizadas pelo software GraphPad Prism 5. Foram consideradas diferenças significativas para p < 0,05. 17 4.0. RESULTADOS 4.1 Valores do índice QTc em ratos anestesiados É importante esclarecer que, ao iniciar os experimentos da 1ª etapa, o número de animais em cada grupo era de 15. A nossa perda amostral ocorreu devido ao fato de que alguns animais morreram após a canulação e, na segunda etapa dos experimentos, muitas vezes a decapitação não foi realizada de maneira correta para a retirada do coração com um prolongamento adequado da aorta para a canulação e o animal não era utilizado. Os dados foram analisados através da ANOVA two way e para os valores de QT não houve interação entre os fatores. Contudo, houve efeito principal do fator exercício (F(1,31)=30,73), mas não houve distinção de grupos onde esse efeito foi significativo. O fator hipertensão também foi significativo (F(1,31)=5,28), sem identificação dos grupos onde houve efeito principal. Na figura 3 estão apresentados os valores do intervalo QT corrigido (QTc) dos animais Wistar (n=9 para cada grupo) e SHR (n=11 para o grupo SHR Sed e n=8 para o grupo SHR Ex) anestesiados. A ANOVA two way mostrou que houve interação entre os fatores (F(1,30)=4,93) e efeito principal do fator exercício (F(1,30)=41,3). Após a análise do pós-teste de Bonferroni, observou-se que os grupos treinados (Wistar Ex e SHR Ex) apresentaram valores significativamente menores para o índice QTc, em relação aos seus controles, mostrando que o treinamento provocou melhoria da atividade elétrica ventricular. O valor apresentado pelo grupo SHR Sed foi menor, em relação ao grupo Wistar Sed (110,9 ± 3,61 vs. 125,2 ± 5,39 ms). Figura 3: Índice QTc de ratos Wistar e SHR anestesiados. Dados expressos como média ± EPM. * diferente em relação a Wistar Sed. + diferente em relação a SHR Sed. 18 4.2 Níveis basais de frequência cardíaca e pressão arterial média em ratos acordados e anestesiados Os resultados da FC de ratos acordados e anestesiados e a PAM de ratos acordados, obtidos após o protocolo de treinamento em natação, estão apresentados na figura 4. Figura 4: (A) Frequência cardíaca de repouso de ratos acordados; (B) Frequência cardíaca de repouso de ratos anestesiados e (C) Pressão Arterial Média de ratos acordados. Dados expressos como média ± EPM.* diferente em relação a Wistar Sed. # diferente em relação a Wistar Ex. + diferente em relação a SHR Sed; n=6. A análise através da ANOVA two way mostrou interação entre os fatores para os dados de FC em animais acordados (F(1,20)=10,95) e efeitos principais do exercício (F(1,20)=59,15) e da hipertensão (F(1,20)=80,78). Após a análise do pós-teste, observamos que no grupo Wistar Ex houve redução nos valores de FC em animais acordados, em relação ao grupo Wistar Sed. Da mesma forma, o grupo SHR Ex também apresentou valores significativamente menores de FC, quando comparados aos valores do grupo SHR Sed (384 ± 3 vs. 448 ± 10 bpm). Em contrapartida, mesmo após o exercício, o 19 grupo SHR Ex manteve elevados os valores de FC, em relação aos grupos Wistar Ex (384 ± 2 vs. 323 ± 3 bpm) (figura 4A). Houve interação entre os fatores na análise dos dados de FC de repouso de ratos anestesiados (F(1,33)=27,94) e efeitos principais do exercício (F(1,33)=17,61) e da hipertensão (F(1,33)=87,72). Os resultados do pós-teste mostraram que o grupo Wistar Ex apresentou redução nos valores após o treinamento, em relação a Wistar Sed. Os grupos SHR apresentaram valores significativamente menores de FC, em relação aos seus respectivos controles (SHR Sed: 220 ± 3 vs. Wistar Sed: 189 ± 4 bpm; SHR Ex: 228 ± 6 bpm vs. Wistar Ex: 261 ± 10 bpm). Contudo, não houve diferença significativa entre os grupos hipertensos (figura 4B). Em relação aos valores de PAM de ratos acordados, observamos que houve interação (F(1,20)=4,51) e efeitos principais do exercício (F(1,20)=30,8) e da hipertensão (F(1,20)=233,4). O pós-teste mostrou que os animais SHR Sed apresentaram maiores valores de PAM, em relação a Wistar Sed (189 ± 4 vs. 124 ± 1 mmHg). Ao final de 6 semanas de natação, o grupo SHR Ex apresentou valores significativamente menores de PAM, em relação ao SHR Sed (164 ± 2 vs. 189 ± 4 mmHg) (figura 4C). Ao analisarmos os valores de PAM em animais anestesiados, observamos que não houve interação entre os fatores (F(1,33)=4,02). Contudo, houve efeito principal do fator hipertensão (F(1,33)=83,7), mas não houve distinção de grupos onde esse efeito foi significativo. O fator exercício também foi significativo (F(1,33)=6,33), sem identificação dos grupos onde houve efeito principal. 4.3 Avaliação morfológica do tecido cardíaco Em relação à avaliação histológica, as análises mostraram interação entre os fatores, tanto no número de células inflamatórias (F(1,20)=14,93), quanto no diâmetro das fibras cardíacas (F(1,20)=117,1). Na análise do número de células inflamatórias observamos que houve efeito do fator hipertensão (F(1,20)=5,73), mas não do fator exercício. O pós-teste mostrou que o treinamento aumentou o número de células inflamatórias no grupo Wistar Ex, em comparação a Wistar Sed (118 ± 13 vs. 89 ± 4 células/77.040µm2). A hipertensão arterial provocou aumento da inflamação no grupo Sed, comparado a Wistar Sed (136 ± 20 2 vs. 89 ± 4 células/77.040µm2). Em contrapartida, após 6 semanas de natação o grupo SHR Ex apresentou melhora no perfil inflamatório tecidual (107 ± 6 vs. 136 ± 2 células/77.040µm2) (figura 5A). A figura 5B representa os valores do diâmetro das fibras cardíacas. Tanto o fator exercício como o fato hipertensão tiveram efeitos principais (F(1,20)=188,1 e F(1,20)=36,91, respectivamente). Após o exercício, o grupo Wistar Ex apresentou maior diâmetro das fibras, em relação a Wistar Sed (18,4 ± 0,32 vs. 9,8 ± 0,84 µm). O grupo de animais hipertensos sedentários também apresentou maiores valores no diâmetro da fibra cardíaca, em relação ao grupo normotenso sedentário (22,3 ± 0,41 vs. 9,8 ± 0,84 µm). Em contrapartida, o protocolo de natação provocou redução nesses valores no grupo SHR Ex, em relação ao grupo SHR Sed (19,8 ± 0,22 vs. 22,3 ± 0,41 µm). Na figura 6 estão representados cortes histológicos do ventrículo esquerdo de ratos Wistar e SHR, corados com hematoxilina/eosina. Em (a) se observa aspecto histológico compatível com a normalidade, demonstrando ausência de processo inflamatório; em (b) há processo inflamatório discreto de caráter difuso e hipertrofia de grau leve; já em (c) um processo inflamatório moderado se apresenta, com caráter multifocal e hipertrofia de grau moderado e na figura (d) há representação de um processo inflamatório discreto de caráter multifocal e hipertrofia de grau leve. Figura 3: (A) Número de células inflamatórias no ventrículo esquerdo; (B) Diâmetro de cardiomiócitos do VE de ratos Wistar e SHR. Dados expressos como média ± EPM. * diferente em relação a Wistar Sed.+ diferente em relação a SHR Sed. 21 a Sedentário b Exercício Wistar c Sedentário d Exercício SHR Figura 4: Fotomicrografias de cortes histológicos do ventrículo esquerdo de ratos normotensos e hipertensos. (a) Aspecto histológico compatível com a normalidade demonstrando ausência de processo inflamatório e cardiomiócitos com diâmetros variando entre 7 e 11 µm em animais Wistar Sed; (b) processo inflamatório discreto de caráter difuso e hipertrofia de grau leve em animais Wistar Ex; (c) processo inflamatório moderado de caráter multifocal e hipertrofia de grau moderado em SHR Sed; (d) processo inflamatório discreto de caráter multifocal e hipertrofia de grau leve em SHR Ex. Hematoxilina-Eosina. Barra = 50µm. 22 A análise de colágenos dos tipos I e III mostrou interação entre os fatores (F(1,19)=29,48 e F(1,20)=21,07, respectivamente). Também houve efeito principal dos fatores exercício e hipertensão (tipo I: F(1,19)=65,25 e F(1,19)=42,16; tipo III F(1,20)=99,73 e F(1,20)=10,81). Animais hipertensos sedentários (SHR Sed) apresentaram aumento significativo nas áreas de deposição de colágeno do tipo I (Figura 7A) e do tipo III (Figura 7B), em relação aos animais Wistar Sed (tipo I: 8,28 ± 915 vs. 2,04 ± 356 µ 2; tipo III: 8,89 ± 519 vs. 5,32 ± 386 µ 2). Adicionalmente, foi possível observar que o treinamento físico diminuiu a deposição de colágeno, reduzindo as áreas tanto de colágeno do tipo I (1.192 ± 187 vs. 8.283 ± 915 µ 2) quanto de colágeno do tipo III (2.293 ± 574 vs. 8.898 ± 519 µ 2) em animais hipertensos (Figuras 7A e 7B). As fotomicrografias representadas na figura 8 mostram a ocorrência de colágeno dos tipos I e III em ventrículo esquerdo de ratos normotensos e hipertensos. Em (“a” e “e”) há presença de fibras reticulares (colágeno tipo III, cabeça de seta); em (“b” e “f”) há aspecto histológico compatível com a normalidade, demonstrando ausência de processo de deposição de colágeno; as figuras (“c” e “g”) mostram deposição de colágeno, com aumento expressivo de fibras reticulares (colágeno tipo III, cabeça de seta) e de fibras colágenas tipo I (seta) e em (“d” e “h”) há aspecto histológico compatível com a normalidade, demonstrando ausência de deposição de colágeno. Figura 5: (A) Conteúdo de colágeno do tipo I e (B) Conteúdo de colágeno do tipo III no ventrículo esquerdo de ratos Wistar e SHR. Dados expressos como média ± EPM. * diferente em relação a Wistar Sed. + diferente em relação a SHR Sed. 23 a b c d e f g h Sedentário Exercício Wistar Sedentário Exercício SHR Figura 6: Fotomicrografias de cortes histológicos do ventrículo esquerdo de ratos normotensos e hipertensos; (a, e) Presença de fibras reticulares (Colágeno tipo III, cabeça de seta) em animais Wistar Sed; (b, f) Aspecto histológico compatível com a normalidade demonstrando ausência de processo de deposição de colágeno em animais Wistar Ex; (c, g) Deposição de colágeno com aumento expressivo de fibras reticulares (colágeno tipo III, cabeça de seta) e de fibras colágenas tipo I (seta) em SHR Sed; (d, h) Aspecto histológico compatível com a normalidade demonstrando ausência de processo de deposição de colágeno em SHR Ex. Picrosirius Red. Barra = 50µm. 24 4.4 Massa corporal, massa do coração e massa dos ventrículos Na Tabela 1 estão apresentados os resultados referentes à massa corporal inicial e final, massa do coração, massa dos ventrículos, massa relativa dos ventrículos, massa do ventrículo esquerdo, massa relativa do ventrículo esquerdo, massa do ventrículo direito e massa relativa do ventrículo direito dos ratos Wistar e SHR. Conforme esperado, todos os animais aumentaram a massa corporal até o fim do protocolo de treinamento. Os animais SHR apresentaram menor massa corporal ao final de 6 semanas, quando comparado ao grupo Wistar. A massa dos ventrículos se apresentou maior nos grupos hipertensos, em relação aos animais normotensos sedentários. Os animais hipertensos submetidos ao treinamento demonstraram valores ainda maiores, quando comparados ao grupo Wistar Ex. Da mesma maneira, os grupos SHR apresentaram aumento na massa relativa do ventrículo esquerdo, em relação aos grupos Wistar. Isso mostra que a hipertensão arterial promoveu a hipertrofia dos ventrículos. Já em relação à massa total dos ventrículos e à massa total e relativa do ventrículo direito, não foram observadas alterações significativas provocadas nem pela hipertensão, nem pelo treinamento aeróbico. 25 Tabela 1: Massa corporal, massa do coração, massa dos ventrículos esquerdo e direito e massas relativas dos grupos experimentais Wistar Sed Wistar Ex SHR Sed SHR Ex MCI (g) 330,5 ± 7 336,1 ± 8 286,3 ± 5*# 284,1 ± 3*# MCF (g) 382,7 ± 6+ 363,5 ± 8+ 314,2 ± 4*#+ 303,4 ± 3*#+ MC (g) 1,17 ± 0,03 1,18 ± 0,02 1,32 ± 0,04*# 1,39 ± 0,03*# MC/MCF 3,17 ± 0,13 3,38 ± 0,06 4,34 ± 0,12*# 4,58 ± 0,13*# MV (g) 1,47 ± 0,12 1,64 ± 0,04 1,66 ± 0,04 1,72 ± 0,08 MV/MCF 3,95 ± 0,23 4,71 ± 0,12* 5,48 ± 0,15* 5,66 ± 0,3*# MVE (g) 0,78 ± 0,02 0,81 ± 0,02 0,97 ± 0,04*# 0,95 ± 0,04*# MVE/MCF 2,11 ± 0,03 2,32 ± 0,09 3,2 ± 0,15*# 3,13 ± 0,14*# MVD (g) 0,27 ± 0,03 0,32 ± 0,02 0,25 ± 0,02 0,31 ± 0,03 MVD/MCF 0,72 ± 0,06 0,94 ± 0,07 0,84 ± 0,07 1,02 ± 0,11 (mg/g) (mg/g) (mg/g) (mg/g) Dados expressos como média ± EPM. MCI, Massa Corporal Inicial. MCF, Massa Corporal Final. MC, Massa do Coração. MV, Massa do Ventrículo. MVE, Massa do Ventrículo Esquerdo. MVD, Massa do Ventrículo Direito. * diferente em relação a Wistar Sed, comparando a mesma variável. # diferente em relação a Wistar Ex, comparando a mesma variável. + diferente em relação ao valor inicial dentro do mesmo grupo; n=5. 4.5 Dimensões dos cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo Na figura 9 estão representados graficamente os valores do comprimento e da relação comprimento/largura de cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo de ratos Wistar e SHR. A análise da ANOVA two way mostrou interação entre os fatores, tanto no comprimento (F(1,175)=0,71), quanto na relação comprimento/largura (F(1,175)=4,35). O pós-teste mostrou que o treinamento em natação induziu aumento no comprimento celular (figura 9A) de cardiomiócitos de Wistar Ex, em relação a Wistar Sed (122 ± 2,75 vs. 111,2 ± 3,22 µm), o que também ocorreu na relação comprimento/largura (4,43 ± 016 vs. 3,55 ± 0,18 µm) (figura 9B). 26 Em relação à largura dos cardiomiócitos, só houve efeito principal do exercício (F(1,176)=4,25), sem interação entre os fatores. Após a análise dos dados de volume dos cardiomiócitos não houve interação e nem efeito principal do exercício, tampouco da hipertensão. Figura 7: (A) Comprimento e (B) Relação comprimento/largura de cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo de ratos Wistar e SHR. Dados expressos como média ± EPM. * diferente em relação a Wistar Sed. n=50 células. 4.6 Contratilidade de cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo Os parâmetros para avaliação da contratilidade dos cardiomiócitos foram analisados após a estimulação das células nas frequências de 1(F1) e 3 (F3) Hz (Figuras 10 e 11, respectivamente). A análise de variância mostrou que houve interação entre os fatores para os dados da variável tempo para o pico de contração (F(1,149)=10,41) em F1. Os fatores exercício e hipertensão também tiveram efeitos principais (F(1,149)=10,41 e F(1,149)=32,34, respectivamente). No pós-teste, verificamos que o tempo para o pico em SHR Sed foi maior do que em Wistar Sed (446 ± 13 vs. 344 ± 11 ms). O treinamento aeróbico provocou a redução desses valores em SHR Ex (372 ± 9 vs. 446 ± 13 ms) (figura 10A). A variável tempo para 50% do relaxamento mostrou efeito principal apenas para o fator hipertensão (F(1,149)=36,38). Como não houve interação entre os fatores, não pudemos identificar em quais grupos esse efeito foi maior. Em relação à amplitude do pico, observamos que houve interação entre os fatores (F(1,149)=16,54) e que o fator exercício apresentou efeito principal (F(1,149)=8,18). 27 Em SHR Sed os valores foram maiores, quando comparados a Wistar Sed (4,2 ± 0,35 vs. 2,6 ± 0,21 %). No grupo SHR Ex, observamos que houve redução nesses valores, quando comparados aquele de SHR Sed (2,22 ± 0,17 vs. 4,2 ± 0,35%) (Figura 11B). Figura 8: Função contrátil de cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo de ratos Wistar e SHR estimulados a 1 Hz. (A) Tempo para o pico de contração e (B) Amplitude de contração. Dados expressos como média ± EPM. * diferente em relação a Wistar Sed. + diferente em relação a SHR Sed; n=50 células. As mesmas variáveis foram estudadas na frequência de 3 Hz. A ANOVA two way mostrou que houve interação entre os fatores (F(1,140)=1,13). Também houve efeito principal dos fatores exercício (F(1,140)=7,37) e hipertensão (F(1,140)=20,98). O tempo para o pico foi maior em SHR Sed, em relação a Wistar Sed (320 ± 5 vs. 284 ± 7 ms). Em contrapartida, o treinamento diminuiu esses valores no grupo hipertenso (296 ± 5 vs. 320 ± 5 ms) (figura 11A). Ao analisarmos a variável tempo para 50% do relaxamento também verificamos interação entre os fatores (F(1,140)=0,53). Houve efeito principal dos fatores exercício (F(1,140)=12,55) e hipertensão (F(1,140)=25,13). O pós-teste mostrou que o grupo SHR Sed apresentou maiores valores de tempo do que Wistar Sed (218 ± 7 vs. 173 ± 8 ms). Todavia, o treinamento provocou redução nesses valores no grupo com hipertensão (185 ± 8 vs. 218 ± 7 ms) (figura 11B). A ANOVA two way mostrou que também houve interação entre os fatores na variável amplitude de contração (F(1,140)=5,19). Entretanto, os fatores exercício e hipertensão não mostraram efeitos principais isolados. O pós-teste mostrou que os animais com hipertensão exercitados apresentaram amplitude do pico de contração menor do que SHR Sed (2,96 ± 0,24 vs. 4,14 ± 0,32) na F3 (figura 11C). 28 Figura 9: Função contrátil de cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo de ratos Wistar e SHR estimulados a 3 Hz. (A) Tempo para o pico de contração; (B) Tempo para 50% do relaxamento e (C) Amplitude de contração. Dados expressos como média ± EPM. * diferente em relação a Wistar Sed. # diferente em relação a Wistar Ex. + diferente em relação a SHR Sed; n=50 células. 29 5.0. DISCUSSÃO Os resultados obtidos no presente estudo, em síntese, mostraram que o treinamento em natação com duração de 6 semanas melhorou os parâmetros morfológicos do tecido cardíaco, além de promover a redução da PAM e FC de ratos espontaneamente hipertensos. Em se tratando da função ventricular, o exercício provocou melhora nas funções sistólica e diastólica, representadas, respectivamente, pela diminuição do tempo para o pico de contração e diminuição do tempo para metade do relaxamento. Os resultados desse estudo mostraram que o treinamento em natação reduziu os níveis de PAM em animais hipertensos acordados. Acreditamos que essa redução esteja relacionada à diminuição do tônus simpático e da atividade do sistema reninaangiotensina-aldosterona no coração, sem desconsiderar a atuação de mecanismos periféricos, tais como a atenuação da resistência periférica total (provocada pela diminuição da ativação simpática) e o aumento da produção de óxido nítrico, potente vasodilatador. Uma metanálise mostrou que indivíduos com hipertensão arterial que realizaram exercício aeróbico regular tiveram reduções médias de 6,9/4,9 mmHg na PAM (Cornelissen e Fagard, 2005). Dentre as principais recomendações que contribuem para essa redução, podemos citar a prática de exercícios que envolvam grandes grupos musculares, com intensidade entre 40 e 60% do VO2pico e volumes de treinamento maiores (com maior frequência semanal e/ou maior duração das sessões) (Alves e Forjaz, 2007). Diversos fatores podem estar associados à diminuição da PA basal após o treinamento físico, tais como a diminuição do tônus vasomotor simpático, da reatividade vascular, da atividade do sistema renina-angiotensina-aldosterona e do estresse oxidativo, além da diminuição da resistência periférica (Kadowaki, 2000; Amaral e Michelini, 2011). A normalização do tônus simpático, que se encontra aumentado na hipertensão, pode estar associada à bradicardia de repouso observada em animais treinados em registros sem efeito de anestesia, já demonstrada em outros estudos com animais espontaneamente hipertensos treinados (Gava et al., 1995; Véras-Silva et al., 1997). A 30 resposta bradicárdica ocorre tanto em humanos (Sandercock et al., 2005) quanto em animais (Medeiros et al., 2004; Evangelista et al., 2005; Locatelli et al., 2014). Essa redução pode estar associada ao aumento da atividade parassimpática (Robergs e Roberts, 1997; Medeiros et al., 2004) e/ou redução no tônus simpático. Quando anestesiados, os valores de FC foram menores nos grupos SHR, comparados aos grupos Wistar. Isso pode ser explicado pelo uso da associação de ketamina e xilazina, que, segundo Bencze e colaboradores (2013), provoca redução na atividade simpática em SHR. Alguns autores também sugerem que a redução nos níveis de PAM esteja relacionada à diminuição do débito cardíaco (Seals e Reiling, 1991; Véras-Silva et al., 1997), que pode ser atribuída tanto à redução do volume sistólico, quanto da FC. O SRAA modula a progressão da hipertensão em SHR (Zamo et al., 2010). Ao utilizar inibidores da enzima conversora de angiotensina e bloqueadores dos receptores de Ang II, observa-se que há redução nos níveis de PA, o que sugere que esse modelo é dependente desse sistema para manter elevados os níveis de PA (Lundie et al. 1997; Paull e Widdop, 2001). O treinamento aeróbico também provoca redução nos níveis de PA nesse modelo experimental (Hayashi et al., 2000). Zamo e colaboradores (2011) mostraram que o treinamento em natação com duração de 8 semanas reduziu os valores de PA em SHR, com uma diminuição na atividade do SRAA no coração. Nos resultados do presente estudo houve diminuição do índice QTc após o treinamento em natação, mostrando que o exercício pode ter contribuído para reduzir as possíveis alterações na repolarização cardíaca verificadas no modelo de hipertensão estudado (Klimas et al., 2012) e melhorar a atividade elétrica ventricular desses animais. Os mecanismos compensatórios que ocorrem no coração com sobrecarga de pressão inicialmente trazem benefícios ao órgão, mas, com o passar do tempo, o aumento da massa do ventrículo e o estado crônico de sobrecarga aumentam o colágeno no interstício e reduzem a densidade capilar, além de provocar apoptose no tecido cardíaco (Pontes e Leães, 2004; Matsubara et al., 2006). Ao analisar os resultados do presente estudo, observamos que a massa do VE em modelo SHR foi maior, quando comparada aos valores dos grupos Wistar. A hipótese é de que o SRAA esteja envolvido no desenvolvimento da hipertrofia no modelo de hipertensão utilizado nesse estudo. O aumento do diâmetro das fibras cardíacas 31 associado ao aumento no número de células inflamatórias e conteúdo de colágeno apoia a hipótese de que o padrão de hipertrofia descrito se aproxima, em suas características, de um perfil patológico, que, por sua vez, pode levar à disfunção ventricular. A Ang II por si só estimula a hipertrofia dos cardiomiócitos e a proliferação de células do músculo liso vascular (Crowley et al., 2006; Castoldi et al., 2007). O aumento da expressão gênica de componentes do SRAA no coração e na aorta de SHR mostra que a ativação local pode contribuir para a hipertrofia cardíaca e para remodelamento arterial (Li et al., 2008). Na fase inicial da hipertensão em SHR, um aumento na densidade de receptores α1-adrenérgicos parece estar envolvido no desenvolvimento da hipertrofia cardíaca (Imai et al., 1995). Já está bem estabelecido que o SNS também participa do desenvolvimento da hipertrofia nesse modelo de hipertensão (Folkow, 1972; Adams et al., 1989). Lee e colaboradores (1987), por sua vez, mostraram que o bloqueio da via simpática previne completamente o aparecimento de hipertensão e, consequentemente, a hipertrofia cardíaca. Estudos já mostraram que os cardiomiócitos de SHR são maiores, quando comparados à linhagem Wistar (Brooksby et al., 1992; 1993; Tsutsui et al., 1999) e apresentam um padrão de hipertrofia concêntrica (McCrossan et al., 2004). Isso caracteriza uma resposta compensatória para normalizar o aumento do estresse na parede ventricular, provocado pela elevação da PA (Anversa et al., 1983). Além disso, Sun e colaboradores (2006) mostraram a evolução do processo inflamatório no coração de animais dessa linhagem, através do aumento da expressão de citocinas próinflamatórias e marcadores de inflamação, confirmando a ideia de desenvolvimento de hipertrofia patológica nessa linhagem. A Ang II estimula diversas vias de sinalização que ativam a via do fator nuclear kappa B (NF-ƘB), que tem um papel importante na regulação transcricional de diversos genes pró-inflamatórios (Kranzhofer et al., 1999; Brasier et al., 2000; Savoia et al., 2006). Alguns autores têm mostrado que essa via participa de processos inflamatórios em diversos tecidos, dentre eles o vascular, o renal e o cardíaco, em diferentes modelos de hipertensão arterial (Gonzalez et al., 2000; Muller et al., 2000). Por sua vez, a Angiotensina (1-7) (Ang 1-7) é considerada um importante peptídeo do SRAA, pois a maioria de suas ações apresenta efeitos cardioprotetores em 32 relação aos provocados pela Ang II. Dentre seus efeitos benéficos, pode-se citar a diminuição do crescimento de cardiomiócitos (Talland et al., 2005) e a inibição da síntese de colágeno (Iwata et al., 2005; Grobe et al., 2006). Filho e colaboradores (2008) mostraram que o treinamento em natação com 5% de carga aumentou a concentração de Ang (1-7), acompanhada do aumento da expressão de seu principal receptor (Mas) no VE de SHR. Além disso, os autores reportaram diminuição na concentração de Ang II plasmática em ratos treinados. Isso mostra que o treinamento aeróbico é capaz de modular o SRAA após instalação do processo de hipertensão arterial e que a Ang (1-7) apresenta efeitos cardioprotetores nesse modelo. Adicionalmente, no sistema vascular, a Ang (1-7) também regula a ativação da via NF-ƙβ, com consequente atuação também na inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias (Bihl et al., 2015). No presente estudo, o grupo SHR Sed mostrou número de células inflamatórias e área de colágeno maiores, em relação a Wistar Sed. Esses resultados estão de acordo com os encontrados na literatura e anteriormente citados, comprovando que os animais com 22 semanas já apresentam padrão de hipertrofia patológica definido. Em contrapartida, o treinamento aeróbico em animais hipertensos diminuiu a proporção de células inflamatórias, em relação ao grupo SHR Sed. Baseados na literatura apresentada acredita-se que o treinamento em natação modulou a produção e atividade da Ang 1-7, provocando melhoria dos parâmetros morfológicos encontrados em nosso estudo. Além disso, observou-se também maior deposição de colágeno dos tipos I e III no grupo SHR Sed. Por sua vez, o exercício diminuiu a deposição de colágeno III e preveniu a transformação do colágeno tipo III em tipo I, tanto em ratos Wistar quanto em SHR. Nosso estudo é pioneiro em avaliar o efeito de um protocolo de treinamento em natação sem carga com duração de 6 semanas sobre a deposição de colágeno, diâmetro das fibras e número de células inflamatórias do VE de SHR. Da Costa Rebelo e colaboradores (2012) também mostraram que a expressão de marcadores pró-fibróticos, como por exemplo, TGF-β1 e colágeno III, foi atenuada após protocolo de corrida voluntária em SHR. Os presentes resultados mostram que o exercício aeróbico contribuiu para o remodelamento cardíaco fisiológico encontrado nos animais hipertensos treinados. 33 Estudando o modelo SHR, Sano e colaboradores (1998) mostraram que a Ang II, além de estimular a hipertrofia, também causa fibrose no tecido cardíaco. Em fibroblastos cardíacos de SHR a síntese basal de colágeno é cerca de 1,6 vezes maior do que em Wistar-Kyoto, com idade de 10 semanas. Os níveis de Ang II, de RNAm de renina e de angiotensinogênio em fibroblastos também foi maior no grupo hipertenso (Sano et al., 1998). Os padrões de remodelamento cardíaco são determinados pelas sobrecargas de pressão ou de volume, podendo ser classificados como concêntricos ou excêntricos. De maneira geral, o treinamento aeróbico promove hipertrofia excêntrica, caracterizada pelo crescimento do cardiomiócito, com a inserção de sarcômeros em série e poucas alterações da matriz intersticial (Mill e Vassallo, 2001). A hipertrofia cardíaca promovida pelo treinamento em natação ocorre em resposta a diversos estímulos, tais como o aumento no volume sistólico e no débito cardíaco (Raquel et al., 2013). No presente estudo, a massa total dos ventrículos relativa à massa corporal foi maior em ratos Wistar Ex, em relação a Wistar Sed, apesar de não ser observado aumento na massa do VE no mesmo grupo. Também houve aumento no comprimento dos cardiomiócitos do VE em Wistar, após treinamento. Em contrapartida, as análises histológicas mostraram aumento no diâmetro das fibras do VE em ratos Wistar Ex, justificado como uma adaptação fisiológica ao treinamento aeróbico. Um estudo do nosso laboratório mostrou que o protocolo de natação utilizado nesse trabalho foi capaz de estimular o desenvolvimento da hipertrofia cardíaca excêntrica em ratos com hipertensão renovascular (Locatelli et al., 2014), levando a crer que os resultados morfológicos do presente estudo se aproximam do perfil fisiológico de hipertrofia. A relação comprimento/largura também foi maior em animais treinados na linhagem Wistar, mostrando que o treinamento aeróbico melhora parâmetros morfológicos dos cardiomiócitos. Moore e colaboradores (1993) mostraram que o aumento da dimensão interna das câmaras ventriculares que ocorre em processos de hipertrofia fisiológica está associado ao aumento do comprimento dos cardiomiócitos. Essas afirmações apoiam que o protocolo de treinamento utilizado nesse estudo foi eficiente em estimular a hipertrofia fisiólogica do VE. A hipertrofia cardíaca representa uma resposta compensatória importante do miocárdio ao aumento de sobrecarga de longa duração. Ela está associada com algumas 34 alterações na contratilidade de cardiomiócitos, atribuídas às disfunções na mobilização do cálcio no retículo sarcoplasmático (RS). Sabe-se que o cálcio intracelular tem um papel fundamental na regulação das funções sistólica e diastólica do coração. Alguns autores já mostraram que ocorrem alterações na expressão de SERCA2, na FLB e nos canais de RyR2 em SHR (Shorofsky et al., 1999; Carneiro-Júnior et al., 2014). Ainda são controversos os resultados dos estudos que investigaram a função ventricular esquerda no modelo SHR. Com 10 meses de idade, a função sistólica em fêmeas com hipertensão espontânea mostra sinais de deterioração, conforme observado por Renna e colaboradores (2007). Em contrapartida, nessa mesma fase, Cingolani e colaboradores (2003) observaram melhora da função sistólica, com comprometimento da função diastólica. Na idade entre 2 e 3 meses se observou piora, tanto da função sistólica, quanto da diastólica, avaliadas através de ecocardiograma (Kokubo et al., 2005). Sabe-se que a fibrose miocárdica é a principal responsável pelo aumento da rigidez do coração, que pode alterar as propriedades diastólicas do VE (Diez et al., 2002). No presente estudo observou-se aumento do tempo para o pico de contração em cardiomiócitos de animais hipertensos sedentários, que se apresentou menor em animais treinados nas análises da frequência de 1 e 3 Hz. Estes resultados corroboram com aqueles apresentados por Carneiro-Júnior e colaboradores (2013), num estudo onde ratos espontaneamente hipertensos com 4 meses de idade foram submetidos ao treinamento em esteira com duração de 8 semanas. Os autores mostraram que, após estimulação a 1 Hz, os animais treinados apresentaram diminuição no tempo para o pico de contração, quando comparados ao grupo SHR Sed. Já são bem estabelecidos os benefícios do exercício físico para o sistema cardiovascular e melhora nas funções sistólica e diastólica, em modelos animais normotensos (Moore et al., 1999). Em animais hipertensos, Carneiro-Júnior e colaboradores (2010) mostraram que o treinamento aeróbico em esteira é eficaz em aumentar as velocidades de contração e relaxamento de cardiomiócitos de SHR. Contudo, não há registros na literatura que avaliem o efeito do protocolo de treinamento em meio aquático com duração de 6 semanas sobre a função ventricular de SHR. Sabe-se que a hipertensão provoca disfunções nos mecanismos de contração e relaxamento das células cardíacas, causadas pela alteração na expressão de proteínas 35 envolvidas na mobilização do cálcio no coração. Os canais de liberação de Ca2+ do RS (RyR2) são componentes fundamentais no mecanismo de excitação-contração do músculo cardíaco. Eles são ativados pelo influxo de Ca2+ através dos canais de Ca2+ do tipo L. A liberação do Ca2+ advindo do RS através dos canais de RyR2 inicia o processo de contração do coração. Na hipertensão arterial ocorre aumento desordenado na liberação de Ca2+ do RS, causando desarranjo na contração das células, que pode ser devido ao aumento da expressão e da atividade dos canais de RyR2 (Chen-Izu et al., 2007). Tais disfunções encontradas em animais hipertensos também foram demonstradas por Carneiro-Júnior e cols. (2014), que encontraram níveis elevados de RNAm de proteínas envolvidas na liberação de cálcio do RS em SHR. Os autores mostraram também que o treinamento em esteira restaurou os níveis de expressão de canais de RyR2 e da proteína FKPB12.6, que se liga aos canais para regular sua função. No presente estudo acredita-se que o treinamento aeróbico em natação tenha provocado a diminuição dos níveis dessas proteínas, em relação aos animais hipertensos sedentários, otimizando a dinâmica de liberação de cálcio e, consequentemente, diminuindo o tempo para o pico de contração em ratos hipertensos. Esses resultados contribuem para a melhora da função sistólica em animais espontaneamente hipertensos. Para analisar a função diastólica, utilizou-se como parâmetro o tempo para 50% do relaxamento das células cardíacas. Os resultados do presente estudo mostraram que SHR apresentaram maiores valores de tempo para o relaxamento celular. Essa disfunção diastólica também pode ser associada a alterações na expressão gênica de proteínas envolvidas na mobilização do cálcio no RS. Em particular, uma diminuição nos níveis de SERCA2a pode contribuir para a disfunção diastólica apresentada nesse modelo, aumentando a sobrecarga de cálcio intracelular. Outros estudos têm mostrado que em SHR ocorrem alterações moleculares na SERCA2a no ventrículo esquerdo em diferentes fases da hipertensão arterial (Arata et al., 1999; Yao et al., 2009; Velez Rueda et al., 2012). Contudo, nesse estudo não foi avaliada a expressão dessa Ca2+-ATPase do RS. Um estudo do nosso laboratório avaliou os efeitos do mesmo protocolo de treinamento sobre a expressão de proteínas reguladoras de Ca2+ no ventrículo direito de 36 ratos com hipertensão renovascular (Locatelli et al., 2014). Demonstramos que a hipertensão diminuiu os níveis proteicos de SERCA e FLB e que o treinamento provocou reestabelecimento desses parâmetros em animais hipertensos. Em contrapartida, ao analisarmos a expressão gênica de NCX1 (isoforma predominante no coração), observamos que houve aumento na expressão no grupo hipertenso sedentário. Ao final de 6 semanas de treinamento, mostramos que houve normalização nesses índices. A diminuição na expressão de SERCA e de canais de RyR2, associada ao aumento na expressão de NCX1 têm sido relacionadas a disfunções na função contrátil do coração (Arai et al., 1993; Dash et al., 2001). Em SHR, estudos mostram redução nos níveis de SERCA2a e fosfolamban fosforilada (Yao et al., 2009; Dupont et al., 2012), enquanto a expressão de RNAm e da proteína NCX1 parecem aumentar nesse modelo (Li et al., 2005). Considerando que o treinamento aeróbico restaura os níveis de proteínas reguladoras de cálcio no coração, os resultados desse estudo podem ser justificados pela adaptação provocada pelo exercício nesses parâmetros, que, em conjunto com os benefícios morfológicos apresentados, contribuem para a melhoria da função diastólica em animais treinados. O presente estudo mostrou também que a hipertensão arterial aumentou a amplitude de contração em cardiomiócitos de SHR estimulados a 1Hz. Brooksby e colaboradores (1992) demonstraram que a amplitude de contração de células de SHR estimuladas a 0,3, 1, 2 e 3 Hz foi maior, quando comparada a de Wistar. O mesmo resultado foi encontrado por McCrossan e colaboradores (2004), utilizando a frequência de estimulação de 1Hz. Diversas investigações que utilizaram modelos de camundongos e ratos mostraram que o treinamento aeróbico aumenta a amplitude de contração dos cardiomiócitos, fornecendo evidências dos efeitos benéficos do exercício físico sobre o músculo cardíaco (Kemi et al., 2004; Kemi et al., 2007). Todavia, nesse estudo, o treinamento aeróbico provocou redução nesses valores, quando comparados a SHR Sed, após a estimulação de 1 e de 3 Hz. Os resultados aqui apresentados corroboram com os encontrados por Zhang e colaboradores (2002), que também observaram a diminuição na amplitude de contração 37 de cardiomiócitos de ratos normotensos estimulados a 1 Hz. Os animais foram submetidos a um treinamento intervalado de alta intensidade em esteira e, após a estimulação elétrica, os autores obervaram também a diminuição nas velocidades de contração e de relaxamento, que pode estar relacionada à redução da atividade e da expressão de NCX, verificadas no mesmo estudo. Isso aumentaria o tempo de permanência de Ca2+ intracelular. Em contrapartida, os resultados mostraram que não houve alteração nos níveis de SERCA2 nos miócitos dos animais treinados. Todavia, outros trabalhos que também utilizaram treinamento intervalado de alta intensidade mostraram aumento na amplitude de contração em ratos normotensos (Wisloff et al., 2001; Kemi et al., 2007). Já Carneiro-Júnior e colaboradores (2010) mostraram que, SHR treinados durante 8 semanas em esteira não apresentaram alterações na amplitude do pico de contração. De maneira geral, os resultados encontrados na literatura são controversos, em relação à resposta da amplitude do pico de contração ao treinamento aeróbico. É possível que a duração do protocolo de treinamento do presente estudo tenha sido ineficiente em promover alterações na amplitude de contração, mostradas por autores supracitados. Outro fator a se considerar é diminuição da sensibilidade dos miofilamentos ao Ca2+ provocada pela hipertensão (Sumida et al., 1998). Em contrapartida, o treinamento aeróbico de alta intensidade parece aumentar essa sensibilidade (Kemi et al., 2004), melhorando a capacidade de encurtamento da célula cardíaca. Dessa maneira, a intensidade do protocolo de treinamento utilizado em nesse estudo pode não ter sido eficaz em melhorar a sensibilidade dos miofilamentos contráteis ao Ca2+, tanto em animais normotensos, quanto hipertensos. O conjunto dos resultados do presente estudo sugere a importância do treinamento aeróbico de baixa intensidade no tratamento da hipertensão arterial. Além disso, o exercício traz diversos benefícios ao tecido cardíaco, como a diminuição da fibrose e do número de células inflamatórias, promovendo o remodelamento cardíaco. O treinamento aeróbico pode interferir em diversas vias celulares envolvidas nessas respostas, de diferentes maneiras; porém, acredita-se que haja uma forte correlação entre o sistema renina-angiotensina-aldosterona e esses mecanismos. Ademais, o treinamento em natação provocou melhorias na função ventricular, representadas pela 38 diminuição do tempo para metade do relaxamento e do tempo para o pico de contração de cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo de SHR. O presente estudo apresentou algumas limitações metodológicas: a função ventricular in vivo não foi avaliada pela técnica de ecocardiograma; os componentes do sistema renina-angiotensina-aldosterona e a atividade do sistema nervoso simpático também não foram avaliados para indicar a possível influência sobre as respostas encontradas. Além disso, nenhuma investigação foi feita acerca da expressão de proteínas mobilizadoras de cálcio, que podem provocar alterações na função ventricular. Nesse sentido, mais investigações devem ser realizadas, a fim de elucidar as vias envolvidas e possíveis respostas da pressão arterial e da função ventricular ao treinamento aeróbico em animais com hipertensão espontânea. 39 6.0. CONCLUSÕES Em síntese, os resultados do presente estudo permitem concluir que o treinamento aeróbico em natação com duração de seis semanas: • pode ter provocado a diminuição do tônus vasomotor simpático e da atividade do sistema renina-angiotensina-aldosterona em ratos com hipertensão espontânea; • pode ter contribuído para a melhora na atividade elétrica ventricular, diminuindo o risco de arritmias em ratos hipertensos; • provocou remodelamento cardíaco em SHR e hipertrofia fisiológica em animais Wistar; • pode ter contribuído para a melhora da função ventricular de ratos hipertensos. 40 7.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Adams, M. A., A. Bobik, P. I. Korner (1989). 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