(Kerodon rupestris): CITOARQUITETURA E
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE DELIMITAÇÃO DOS GRUPAMENTOS SEROTONINÉRGICOS/NÚCLEOS DA RAFE DO MOCÓ (Kerodon rupestris): CITOARQUITETURA E IMUNOISTOQUÍMICA PARA SEROTONINA NATAL-RN 2010 2 JOACIL GERMANO SOARES DELIMITAÇÃO DOS GRUPAMENTOS SEROTONINÉRGICOS/NÚCLEOS DA RAFE DO MOCÓ (Kerodon rupestris): CITOARQUITETURA E IMUNOISTOQUÍMICA PARA SEROTONINA Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de Pós-graduação em Psicobiologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como pré-requisito para obtenção do título de Mestre. Orientadora: Miriam Stela M O Costa NATAL-RN 2010 3 4 AGRADECIMENTOS Nada no mundo seria possível sem a grande contribuição de nossos Pais, o meu agradecimento e reconhecimento a Alzira Germano e Moacir Quintino, por todos os ensinamentos e por sempre colocar o conhecimento e os estudos em primeiro lugar, essa é a herança que levo pro resto de minha vida; A minha grande companheira e esposa Dora, teus olhos vão alem do horizonte e me guiam por esse mundo cheio de perturbações, sinceramente não sei o que seria de mim sem você. Te amo muito; A meus irmãos Júlia, Jáder, Janete, Jocélia e Juarez que sempre se mantêm unidos e apoiando uns a os outros, muito obrigado pela colaboração; A equipe da S.O.S Animais pela compreensão das ausências e principalmente a Dra. Ademilde pela cobertura e apoio durante esse período; A Professora Miriam Stela pela paciência, dedicação a neuranatomia – o que particularmente me deixa ainda mais eufórico em continuar nessa área, e pelos grandes ensinamentos que levarei comigo sempre; Ao professor Eulâmpio de quem há muito tenho grande admiração, não só por ter me encaminhado para bases da morfologia, mas também pela pessoa que é; A Médica Veterinária Professora Viviane Medeiros por mostrar o programa de pós graduação em Psicobiologia, essa considero minha madrinha de mestrado; A todos os meus colegas de mestrado pelo breve, mas caloroso convívio; A turma do LabNeuro: Twyla (Twylão), André (Deco), Rovena (Popotis), Janaína (Filé de Borboleta), Renata (Por motivos superiores vai ficar sem o apelido), Nayra (Nayrão), Kayo (Harvard), Paulo (Paulo Mesmo), Rayane (Bartirão), Rodolfo (Rô), Gilberto (Gil), Fausto (Fau), Katia, Alane (Olá enfermeira!), Adriana (Paciência do mundo todo), Francimar, Ana Carla, que fazem com que nossos momentos juntos se tornem insuperavelmente “acanalhados”; A Regina pelo preparo das soluções e tudo mais que cerca a diversão do LabNeuro; Aos professores Jeferson, Expedito, Judney e Ruthnaldo pela contribuição; Àquele que não é um todynho, mas é meu companheiro de aventuras, Leandro, muito obrigado pelos bons momentos de aventuras nas pegas sem sucesso dos mocós e por me dar a certeza que agora tenho outra casa em Natal. Pelo convívio com seus pais Luciano e Rosaura, e pelas longas e cansativas conversas com Laerte; Ao Ibama, pela autorização e licença para realização deste trabalho; 5 Ao CNPq pelo apoio financeiro; A Deus o ser superior que nos rege, por ter me dado todas essas pessoas acima que fazem dos meus sonhos realidade. . 6 RESUMO A serotonina ou 5-hidroxitriptamina (5-HT) é uma substância encontrada em muitos tecidos do organismo, inclusive no sistema nervoso como neurotransmissor, onde pode exercer ações pós-sinápticas variadas. Dentro do neuro-eixo, a localização dos neurônios 5-HT é quase absoluta nos núcleos da rafe do tronco encefálico, de tal maneira que 5-HT neuronal pode ser considerada um marcador dos núcleos da rafe. Os núcleos da rafe estão localizados no tronco encefálico, na linha média ou suas proximidades. Os grupamentos serotoninérgicos foram originalmente classificados alfanumericamente como B1 a B9 no sentido caudorrostral no rato e podem ser divididos em grupos superior e inferior. Neste trabalho a distribuição dos neurônios serotoninérgicos foi estudada com imunoistoquímica no cérebro do mocó (Kerodon rupestris), uma espécie de roedor endêmica da região Nordeste do Brasil. A localização citoarquitetônica dos neurônios serotoninérgicos foi estabelecida em séries de secções coronais e sagitais adjacentes submetidas a coloração pelo método de Nissl e imunoistoquímica para 5-HT. Assim, foram delimitados os núcleos da rafe linear rostral, linear caudal, dorsal, mediano, paramediano e pontino da rafe e grupamento B9, compondo o grupo rostral, e os núcleos interpósito, magno, obscuro e pálido, compondo o grupo caudal, comparável ao que já foi descrito para outras espécies de mamíferos. Palavras-chaves: imunoistoquímica, mocó, núcleos da rafe, roedor, serotonina, tronco encefálico. 7 ABSTRACT Serotonin or 5-hydroxytryptamine (5-HT) is a substance found in many tissues of the body, including as a neurotransmitter in the nervous system, in which may exert varied post-synaptic actions. Inside the neuro-axis, the location of 5-HT neurons is almost restricted to the raphe nuclei of the brainstem, such that 5-HT-immunoreactivity can be considered a marker of the raphe nuclei. The raphe nuclei are located in the brainstem, at or near the midline. The serotonergic groups were originally alphanumerically classified as B1 to B9 towards caudorrostral in rats and can be divided into upper and lower groups. In this study the distribution of serotonergic neurons was studied using immunohistochemistry in the brain of the rock cavy (Kerodon rupestris), a species of rodent endemic to Northeastern Brazil. The cytoarchitectonic location of serotonergic neurons was established in series of adjacent coronal and sagittal sections stained by the Nissl method and immunohistochemistry for 5-HT. Thus, we defined the raphe rostral linear, caudal linear, dorsal, median, and paramedian pontine raphe nuclei, and B9 cluster, constituting the rostral group, and the interpositus, magnus, obscure and palidus, constituting the caudal part of the group, comparable to which has been described for other mammalian species. Keywords: brainstem, immunohistochemistry, raphe nuclei, rock cavy, rodent, serotonin. 8 LISTA DE ABREVIATURAS 10N Núcleo do n. vago 12N Núcleo n. hipoglosso 3N Núcleo n. óculo motor 4N Núcleo n. troclear 4V Quarto ventrículo 5-HT Serotonina 5-HT IR Neurônios imunorreativos a serotonina 5N Núcleo do n. trigêmeo 6N Núcleo do n. abducente 7N Núcleo do n. facial AP Área postrema Aq Aqueduto B9 Região supralemniscal CLi Núcleo linear caudal da rafe cp Pedúnculo cerebral DRC Núcleo dorsal da rafe – parte caudal DRD Núcleo Dorsal da Rafe – Parte dorsal DRL Núcleo Dorsal da Rafe – Parte lateral DRV Núcleo Dorsal da Rafe – Parte ventral Dtg Núcleo tegmental dorsal dtgx Decussação tegmental dorsal Gi Núcleo reticular gigantocelular IC Colículo Inferior ifp Fascículo longitudinal da ponte 9 IO Complexo olivar IP Núcleo interpenducular mcp Peduculo cerebelar médio MG Núcleo Geniculado Medial ml Lemnisco medial mlf Fascículo longitudinal medial MnR Núcleo mediano da rafe NR Núcleo rubro PAG Substancia cinzenta periaquedutal PB Pós Bregma PBP Núcleo pigmentado parabraquial PDR Núcleo Dorsal da Rafe – Parte posterior PMnR Núcleo paramediano da rafe Pn Núcleo pontino PnC Núcleo reticular pontino PnR Núcleo potino da rafe Pr Núcleo prepósito py Trato piramidal R Núcleo Rubro RIP Núcleo interpósito da rafe RLi Núcleo linear rostral da rafe RMg Núcleo magno da rafe ROb Núcleo obscuro da rafe RPa Núcleo pálido da rafe RtTg Núcleo reticulo tegmental da ponte 10 SC Colículo Superior SGe Núcleo supragenual SN Substancia negra SolC Núcleo do tracto solitário tfp Fibras transversas da ponte Tg Núcleo tegmental ventral ts Tracto tecto espinal Tth Tracto trigeminotalâmico Tz Corpo trapezóide tz Corpo trapezóide Ve Núcleo vestibular vtgx Decussação tegmental ventral xscp Decussação do pedúnculo cerebelar superior 11 SUMÁRIO Conteúdo Página INTRODUÇÃO....................................................................................................... 11 JUSTIFICATIVA.................................................................................................... 20 OBJETIVOS............................................................................................................ 21 METODOLOGIA.................................................................................................... 22 Sujeitos............................................................................................................... 22 Procedimentos.................................................................................................... 22 Anestesia.................................................................................................. 22 Perfusão .................................................................................................. 22 Remoção dos encéfalos............................................................................ 23 Imunoistoquímica.................................................................................... 24 RESULTADOS....................................................................................................... 26 DISCUSSÃO........................................................................................................... 55 CONCLUSÕES..................................................................................................... 58 CONSIDERAÇÕES FINAIS.................................................................................. 22 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 61 ANEXOS................................................................................................................. 66 12 INTRODUÇÃO A serotonina ou 5-hidroxitriptamina, abreviadamente 5-HT foi reconhecida pela primeira vez como uma substância vasoconstritora encontrada no sangue. Da combinação de “serum” e “tonus”, derivou-se a palavra serotonina. A estrutura molecular da 5-HT foi desvendada em meados do século XX e em seguida foi identificada em vários tecidos, inclusive o sistema nervoso central de vertebrados e invertebrados e reconhecida como neurotransmissor (Twaroge e Page, 1953; Bogdansky et al., 1956; ver Jacobs e Azmitia, 1992). A 5-HT é sintetizada a partir da hidroxilação e descarboxilação do aminoácido triptofano pela enzima triptofano hidroxilase, cuja ação é limitada pelo teor de triptofano. Esta enzima adiciona um grupo hidroxila, produzindo 5-hidroxitriptofano (5-HTP). Em seguida a enzima aminoácido descarboxilase retira o grupo carboxila formando assim a 5HT. Como todo neurotransmissor aminérgico, a 5-HT é armazenada em vesículas sinápticas e liberadas por exocitose sob o controle do cálcio, ou pode estar associada a outros neurotransmissores, tais como dopamina, noradrenalina, acetilcolina, etc. A inativação da 5-HT ocorre por um mecanismo específico, que permite a recaptação da 5HT liberada a partir do espaço extracelular. Um mecanismo adicional para inativação da 5HT é sua degradação enzimática pela monoaminooxidase A (MAOA), de cuja ação resulta o ácido 5-hidroxi-indolacético (5-AHIA). Posteriormente sofre ação da enzima triptofano aldeido-desidrogenase, resultando em ácido 5-hidroxi-indólico (5-HIAA) (Von Bohlen und Halbach e Dermietzel, 2006). A localização de grandes neurônios formando agregados na linha média do tronco encefálico chamou a atenção de anatomistas desde o tempo de Ramón y Cajal, o qual descreveu estas células como grandes neurônios multipolares, de projeções indefinidas (Ramón y Cajal, 1911). Décadas depois, com base em estudo citoarquitetônico, os núcleos da rafe foram inicialmente descritos no gato, como um conjunto de 8 núcleos ao longo da linha média, do mesencéfalo à transição bulbo-espinal, assim denominados, do sentido rostral para caudal: núcleos lineares rostral e caudal da rafe, dorsal da rafe, central superior (ou mediano) da rafe, pontino da rafe, magno da rafe, pálido da rafe e obscuro da rafe (Taber et al., 1960). O interesse no estudo da morfologia e funções dos núcleos da rafe foi despertado após o surgimento da descrição de um sistema de neurônios monoaminérgicos no tronco encefálico do rato, evidenciados pela técnica de fluorescência induzida por formaldeído 13 (Falk et al., 1962; Dahlström e Fuxe, 1964; 1965). Embora fosse notada uma extensa superposição entre os neurônios supostamente produtores de 5-HT e os núcleos da rafe, os grupamentos serotoninérgicos então evidenciados foram designados como grupamentos B1 a B9 no sentido caudorrostral (Dahlström e Fuxe, 1964). Com a introdução da técnica imunoistoquímica, esta classificação foi integrada com a nomenclatura citoarquitetônica do sistema da rafe (Steinbush et al., 1978; Steinbush, 1981; Törk, 1985). Embora os principais grupos celulares do sistema serotoninérgico sigam as divisões citoarquitetônicas dos núcleos da rafe, essa superposição não é exata, considerando que numerosos neurônios 5HT-IR estão presentes em outros setores da formação reticular, além dos limites dos núcleos da rafe, embora aparentemente contínuos com os aglomerados de células 5-HT-IR, bem como alguns neurônios não serotoninérgicos estão presentes nos núcleos da rafe (Törk, 1985; Harding et al., 2004). Como outros neurotransmissores, a 5-HT pode exercer ações pós-sinápticas variadas, dependendo das características do receptor com o qual interage. Os primeiros registros da presença de receptores de 5-HT no sistema nervoso central datam dos anos 50, mas sua confirmação ocorreu quatro décadas mais tarde. Utilizando técnicas de biologia molecular, que utiliza os recursos de clonagem, com base nas suas características estruturais e farmacológicas, foram identificadas sete classes de receptores de 5-HT – 5HT1 a 5-HT7, com 14 subtipos identificados até agora. É sabido que a estrutura quaternária dos receptores de 5-HT consiste de pelo menos 3 constituintes: o transportador, o canal iônico acoplado ao ligante e o receptor acoplado a proteína G, este último compreendendo o grupo mais numeroso (Vergé e Calas, 2000; Hoyer et al., 2002; Von Bohlen und Halbach e Dermietzel, 2006, Pontes et al., 2010). A diversidade de receptores, associada à distribuição difusa da inervação serotoninérgica explica a variedade de funções em que a 5-HT está envolvida, incluindo regulação do ciclo sono-vigília, controle dos sonhos, alerta e atenção, memória e aprendizagem, controle do humor, comportamento alimentar, comportamento sexual, termorregulação, processamento sensorial nociceptivo, regulação circadiana, entre outras. Além disso, disfunção da 5-HT tem sido associada a variados processos neuropatológicos, tais como distúrbios do sono, ansiedade, depressão, agressividade, bulimia e anorexia, bem como doenças neurodegenerativas, como doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington (Jacobs e Azmitia, 1992; Vertes et al., 1999; Kandel, 2000; Vergé e Calas, 2000; Carlson, 2002; Takase e Nogueira, 2008). Conforme mencionado anteriormente, os neurônios serotoninérgicos no encéfalo 14 estão localizados predominantemente no tronco encefálico, ao longo da linha mediana ou próximo a ela, caracterizando os núcleos da rafe. Contudo, nem todos os neurônios da rafe contêm 5-HT, e a proporção de neurônios produtores de 5-HT dentro de cada núcleo varia consideravelmente (Törk, 1985; Harding et al., 2004). Entre outras substâncias encontradas nos núcleos da rafe, podem ser citadas substância P, hormônio liberador de tireotropina (TRH), noradrenalina e ácido gama-amino-butírico (GABA), podendo estar co-localizadas ou não com 5-HT (Jacobs e Azmitia, 1992; Charara e Parent, 1998). Além disso, alguns poucos neurônios serotoninérgicos estão fora dos núcleos da rafe, como por exemplo, em relação com o lemnisco medial, ou em setores da formação reticular (Jacobs e Azmitia, 1992; Charara e Parent, 1998). Por isso, os grupamentos serotoninérgicos foram originalmente classificados alfanumericamente como B1 a B9 no sentido caudo-rostral no rato (Dahlstrom e Fuxe, 1964), podendo ser correlacionados com os núcleos da rafe, os quais costumam ser divididos em grupos superior e inferior (Fig. 1). Figura 1. Grupamentos serotoninérgicos B1 a B9, segundo Dahlstrom e Fuxe, 1964. O grupo superior consiste de 4 núcleos principais: o núcleo linear caudal (CLN, B8), núcleo mediano da rafe (MRN, B8 e B5, previamente referido como núcleo central superior) e células deslocadas lateralmente no núcleo pontino centralis oralis, os neurônios laterais do B9 situando-se imediamente dorsal ao lemnisco medial e o núcleo dorsal da rafe (DRN, B7 e B6). O mais rostral dos núcleos da rafe, definido citoarquitetonicamente e designado núcleo linear rostral contém apenas raros neurônios serotoninérgicos, sendo predominantemente dopaminérgico (Törk, 1985). O grupo inferior consiste de 5 núcleos principais: núcleo obscuro da rafe (NRO, B2), núcleo pálido da rafe (NRPa, B1 e B4), 15 núcleo magno da rafe (NRM, B3), os neurônios do bulbo ventrolateral [núcleo paragigantocelular lateral (LPGN) e o núcleo reticular intermédio (IRN), B1/B3] e a área postrema (Brodal e Walberg, 1960; Brodal, 1984; Jacobs e Azmitia, 1992; Harding et al., 2004). A anatomia destes grupos foi revisada em muitas espécies, inclusive em rato (Parent, 1981; Lidov e Molliver, 1982; Takeuchi et al., 1982; Törk, 1985; Paxinos e Watson, 2007), coelho (Bjarkam et al., 1997), gato (Takeuchi et al., 1982; Jacobs et al., 1984), humanos (Törk, 1990) e macacos do Novo e Velho Mundo (Felten et al., 1974; Felten e Sladek, 1983; Azmitia e Gannon, 1983; Hornung e Fritschy, 1988). A sistematização mais recente dos núcleos da rafe (grupamentos serotoninérgicos) no cérebro do rato, de acordo com Paxinos e Watson (2007), indica a existência de 10 grupamentos nucleares da rafe, em sequência rostrocaudal: no mesencéfalo, os núcleos linear rostral da rafe (RLi), linear caudal da rafe (Cli), dorsal da rafe (DR), mediano da rafe (MnR) e paramediano da rafe (PMnR). Na ponte, os núcleos pontino da rafe (PnR) e interpósito da rafe (RIP). Por último, no bulbo, os núcleos magno da rafe (RMg), pálido da rafe (RPa) e obscuro da rafe (Rob) (Paxinos e Watson, 2007). Embora haja um número substancial de células não-serotoninérgicas nos núcleos da rafe, é reconhecido que as longas projeções ascendentes e descendentes são oriundas de neurônios serotoninérgicos (Jacobs e Azmitia, 1992; Charara e Parent, 1998; Halberstadt e Balaban, 2006). As fibras serotoninérgicas são finas, pouco mielinizadas e altamente colateralizadas. Parece haver uma tendência evolutiva, observando-se que nas espécies em escala evolutiva “superior”, como os primatas, além da localização mediana, surgem neurônios localizados mais lateralmente (lateralização) e uma grande parte das fibras serotoninérgicas são mielinizadas (Jacobs e Azmitia, 1992; Bjarkam et al., 1997). O estudo da hodologia dos núcleos da rafe é bastante complexo, considerando que esta longa cadeia de núcleos recebe aferentes de, bem como se projetam para, virtualmente todas as regiões do sistema nervoso central, embora com densidades variáveis (Törk, 1985; 1990; Jacobs e Azmitia, 1992; Harding et al., 2004). Diversos estudos em diferentes espécies revelaram um padrão de organização nas projeções dos núcleos serotoninérgicos, estabelecendo-se a divisão dessas eferências em três direções: projeções ascendentes, projeções para o tronco encefálico e cerebelo e projeções descendentes. As projeções ascendentes são dirigidas ao cérebro e provêm principalmente de neurônios dos núcleos serotoninérgicos rostrais, como o núcleo dorsal da rafe, o núcleo mediano da rafe, a região supralemniscal (B9) e áreas adjacentes. Praticamente todo córtex cerebral recebe inervação serotoninérgica, observando-se uma 16 maior densidade nos córtices perirrinal, occipital, córtex frontal, giro do cíngulo, área entorrinal, área amigdalóide e hipocampo. Entre as estruturas subcorticais recipientes de terminais serotoninérgicos destacam-se tubérculo e bulbo olfatórios, substância inominada, núcleos accumbens e pálido ventral, corpo amigdalóide, claustrum, núcleos septais e núcleo intersticial da estria terminal. No hipotálamo, os principais alvos das projeções serotoninérgicas são os núcleos supraquiasmático, pré-mamilares, supra-óptico e paraventricular, região infundibular e áreas pré-óptica lateral, hipotalâmica lateral e hipotalâmica posterior. No tálamo as projeções serotoninérgicas são distribuídas principalmente para os núcleos intralaminares e da linha média, incluindo o núcleo paraventricular, o médio-dorsal, núcleos anteriores e o complexo geniculado lateral dorsal, incluindo o folheto intergeniculado. No subtálamo, o núcleo subtalâmico é inervado e, no epitálamo, as projeções serotoninérgicas alcançam a glândula pineal, o órgão subcomissural e os núcleos habenulares. As projeções dos núcleos serotoninérgicos rostrais se estendem caudalmente até estruturas mesodiencefálicas, como a área pré-tetal, e mesmo mesencefálicas e pontinas, como o núcleo tegmentar látero-dorsal, a substância cinzenta central, a substância negra parte compacta, o locus ceruleus e outros núcleos da rafe (Azmitia e Segal, 1978; Kent e Sladek, 1978; Moore et al., 1978; Steinbusch, 1981; Törk, 1985; Imai et al, 1986; Vertes, 1991; Jacobs e Azmitia, 1992; Vertes e Kocsis, 1994; Baker e Halliday, 1995; Vertes et al., 1999, Cavalcante et al, 2002; Pinato et al, 2007). Embora haja uma certa superposição, uma distribuição diferencial da inervação serotoninérgica proveniente dos núcleos dorsal e mediano da rafe já havia sido sugerida em um estudo autorradiográfico (Azmitia e Segal, 1978) e melhor analisada em estudos de PHA-L (Vertes, 1991; Vertes et al., 1999). Assim, fibras do núcleo mediano da rafe distribuem-se principalmente para estruturas medianas e paramedianas, enquanto o dorsal da rafe se projeta primariamente para estruturas mais laterais e a área B9 parece projetar-se principalmente para o córtex frontal (Vertes, 1991; Vertes et al., 1999). Um outro exemplo de projeção diferencial é visto nos centros circadianos, em que o núcleo mediano da rafe se projeta para o núcleo supraquiasmático e o dorsal da rafe para o folheto intergeniculado (Meyer-Bernstein e Morin, 1996; Moga e Moore, 1997; Hay-Schmidt et al., 2003). Para o tronco encefálico e cerebelo as projeções provêm principalmente dos núcleos pontino e magno da rafe, embora também participem núcleos mais rostrais e caudais (Törk, 1985; Harding et al., 2004). Como exemplo de áreas rafe-recipientes no tronco encefálico temos: colículo superior, área tegmentar ventral, complexo interpeduncular, substância negra, locus ceruleus e núcleo olivar inferior. Incluem-se 17 também núcleos de nervos cranianos tais como os núcleos motores dos nervos facial e trigêmeo, núcleos sensitivos como do trato espinal do trigêmeo, núcleo do trato solitário, núcleos cocleares e núcleos vestibulares (Steinbusch, 1981; Brodal, 1984; Törk, 1985; Halberstadt e Balaban, 2003; 2006; Harding et al., 2004; Lee et al., 2008). No cerebelo os axônios serotoninérgicos atingem os núcleos centrais, bem como o córtex, e são provenientes principalmente do núcleo magno da rafe (Steinbusch, 1981; Brodal, 1984; Törk, 1985; Halberstadt e Balaban, 2003; 2006; Harding et al., 2004). A medula espinal recebe inervação serotoninérgica que incide nas colunas ventral e dorsal proveniente principalmente dos núcleos magno, pálido e obscuro da rafe (Steinbusch, 1981; Bowker et al., 1982; Brodal, 1984; Törk, 1985). A figura 1 é um esquema dos grupos serotoninérgicos segundo a nomenclatura alfa-numérica e dos núcleos da rafe e suas projeções para o SNC. Os núcleos dorsal e mediano da rafe recebem aferências de áreas muito amplas, principalmente dos córtices pré-frontal, cingulado anterior, insular, orbital lateral, orbital medial, orbital ventral, infralímbico, peduncular dorsal e tênia tecta, núcleo amigdalóide, prosencéfalo basal, núcleos habenulares, vários núcleos hipotalâmicos, tálamo, incluindo o núcleo paraventricular, zona incerta e núcleo subtalâmico (Törk, 1985; Peyron et al., 1998) e retina (Fite et al., 1999; 2003; Frazão et al., 2008). As conexões aferentes do núcleo obscuro da rafe provem principalmente da formação reticular e substância cinzenta periaquedutal (Törk, 1985; Jacobs e Azmitia, 1992; Nogueira et al., 1999). Em geral, a maior parte das conexões aferentes para os núcleos magno, obscuro e pálido da rafe provém da formação reticular e substância cinzenta central do mesencéfalo. O núcleo magno da rafe recebe adicionalmente projeções do grupamento B9, núcleos dorsal e mediano da rafe, e densa inervação de substância P e neurotensina. O núcleo pálido da rafe recebe aferências proveniente das áreas pré-ópticas medial, lateral e mediana, áreas hipotalâmicas anterior, dorsal, lateral e posterior, núcleos paraventricular e periventricular do hipotálamo, zona incerta, substância cinzenta central, formação reticular do tronco encefálico, núcleo do trato espinal do trigêmeo e medula espinal (Jacobs e Azmitia, 1992; Nogueira et al., 1999). 18 Figura 2. Esquema demonstrando as conexões eferentes dos núcleos da rafe. O sujeito experimental O mocó (Kerodon rupestris), Wied, 1820 é um roedor encontrado nos estados do Nordeste e norte de Minas Gerais, habitando preferencialmente a caatinga do semi-árido do Nordeste Brasileiro. Taxonomicamente, o mocó é classificado na superfamília Cavioidea, família Caviidae, subfamília Caviinae, gênero Kerodon, juntamente com Cavia, Galea e Microcavia (Cabrera, 1961; Lacher, 1981). Estudos morfológicos (Silva Neto, 2000) e de biologia molecular (Rowe e Honeycutt, 2002) firmaram o gênero Kerodon irmanado com a família Hydrochaeridae, à qual também pertence a capivara (Hydrochaeris) e estreitamente alinhado com a subfamília Dolichotinae. Animais da familia Caviidea são dotados de uma grande versatilidade de adaptação aos mais diversos tipos de ambientes, embora se caracterizem como mamíferos terrestres, podendo ser arborícolas, rupícolas e terrícolas. Com a dentição desprovida de caninos, costumam ser herbívoros. Os mais diversos tipos de placentação podem ser encontrados. Possuem três dedos nos membros pélvicos e cauda completamente atrofiada (Moojen, 1952). A subfamilia Caviinae é composta por quatro gêneros: Kerodon, Galea, Cavia e Microcavia. A este grupo pertencem pequenos animais já reconhecidamente domésticos, como a cobaia, ou porquinho da índia (Cavia porcellus). Geralmente vivem em pequenas colônias feitas em buracos na terra, ou usam cavidades nas bordas das rochas. Possuem hábitos gregários e diurnos (Crandall, 1964). 19 Os mocós, especificamente, pertencem ao gênero Kerodon, o qual possui muitas semelhanças com os gêneros Cavia e Galea. Seu ambiente é estritamente especializado, habitando locais rochosos com fendas e rachaduras, onde se abrigam dos predadores e passam boa parte do tempo. São excelentes saltadores, escalando rochas e galhos de árvores, de onde retiram sua alimentação, composta principalmente de cascas de árvores, ou na falta destas, gramíneas em geral, sendo as árvores mais procuradas o mufumbo (Cobretum leprosum), faveleira (Cnidoscolus phyllacanthus) e a parreira brava (Cissampelos pareira), ao contrário de outros caviinaes que possuem hábitos terrestres e comem relva (Carvalho, 1969; Lacher, 1981). O mocó tem coloração cinza clara com pelos pretos e amarelos ou esbranquiçados na região dorsal, castanho-ferruginoso na região caudal e um pouco acastanhada nas patas e branco na região cervical. Os adultos podem medir aproximadamente 40 cm e pesar até 1 quilograma de peso vivo (Moojen, 1952; Carvalho, 1969). As patas são dotadas de coxins calosos pouco excedidos pelas unhas rígidas que lhes dão habilidades de escalar e saltar (Moojen, 1952). Tem olfato e audição muito aguçados, podendo detectar seu predador a uma longa distância (Carvalho, 1969). Figura 3. Mocó (Kerodon rupestris) sobre galhos em ambiente natural. (fonte: internet) 20 O mocó atinge a idade adulta com 200 dias. A reprodução ocorre durante todo o ano, não apresentando sazonalidade, com exceção do período que vai de abril a junho. As fêmeas apresentam um cio pós-parto, podendo acasalar poucas horas após o parto. O mocó tem um período médio de gestação de 65 ± 1,34 dias, com um número médio de filhotes por gestação 1,28 ± 0,09, peso médio da matriz pós-parto 724,73 ± 13,08 g, sendo o índice de abortos de 6,89% (Pinheiro, 1985). Apesar das poucas crias por parto, o curto período gestacional garante uma elevada produção de crias durante o ano (Lacher, 1981). Mesmo sendo curto, esse período gestacional do mocó é o mais longo entre os caviinaes, além do que é o menor tamanho de ninhada, o mais baixo peso de filhotes e o mais longo tempo para maturidade sexual (Roberts et al, 1984) Os estudos de placentação em mocós indicam a presença de um útero bicórneo, uma placenta corioalantoidea discoidal e labiríntica, com barreira placentária hemocorial de subtipo hemomonocorial separando o fluxo sanguíneo materno-fetal do tipo contracorrente (Oliveira, 2007). Quanto ao padrão da sua atividade motora, registros de observações dão conta de que nos dias mais escuros o mocó sai para se alimentar pela manhã e à tarde, enquanto que nos dias mais claros sua atividade se concentra no período noturno, podendo também durar o dia inteiro quando da ocorrência de chuvas (Carvalho, 1969). Outras observações indicam atividade de forrageio ao longo do dia e da noite (Lacher, 1981). Em um estudo em condições controladas de laboratório, foi detectado que o mocó é ativo ao longo das 24 horas do dia, embora sua atividade seja intensificada nas fases do amanhecer e entardecer, sugerindo um comportamento predominantemente crepuscular (Sousa e Menezes, 2006). Alguns núcleos e projeções vêm sendo estudados nessa espécie, dentre eles destacam-se as projeções retinianas e caracterização imunoistoquímica do núcleo supraquiasmático e folheto intergeniculado, projeções aferentes para o núcleo médio dorsal do tálamo e projeções retinianas para o núcleo paraventricular do tálamo (Nascimento Jr, et al, 2008, 2010 e 2010). 21 JUSTIFICATIVA Levando-se em consideração a importância dos núcleos da rafe, enquanto o sistema neuronal que detém a maior concentração de 5-HT no encéfalo, atuando como relé de integração de vários sistemas, é de suma importância a sua caracterização anatômica numa espécie pouco estudada, abrindo um amplo campo de estudos e uma oportunidade única de desenvolver pesquisas tendo como modelo animal um roedor característico e muito próprio da região Nordeste do Brasil. Este estudo fornecerá a base para estudos posteriores nos aspectos hodológico e funcional do sistema nervoso. Melhor conhecer o sistema nervoso de uma espécie é melhor conhecer seu comportamento e, conseqüentemente, entender as devidas modificações que porventura tenham ocorrido para que este tenha se adaptado ao meio ambiente rústico ao qual pertence. E assim, permitir o desenvolvimento de técnicas de manejo que visem a criação em cativeiro ou que propicie melhores condições ao ambiente que permitam a conservação desta espécie. 22 OBJETIVOS Objetivo geral Identificar através de imunoistoquimica para 5-HT os núcleos da rafe no cérebro do mocó (Kerodon rupestris). Objetivos específicos 1. Identificar os núcleos da rafe, baseado no seu conteúdo em 5-HT, por comparação com outras espécies já estudadas, tomando como base para a nomenclatura o que fora descrito no rato; 2. Delimitar citoarquitetonicamente os núcleos da rafe; 23 METODOLOGIA Sujeitos: Foram utilizados 4 mocós adultos jovens, obtidos por meio de captura no município norterriograndense de Serra Negra do Norte, mediante autorização do IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renováveis, SISBIO no. 21440-1). O projeto foi aprovado no Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFRN, protocolo no. 043/2009. Todos os cuidados foram tomados no sentido de evitar dor e sofrimento aos animais, desde a captura aos procedimentos experimentais, seguindo estritamente as normas estabelecidas pelo National Research Council of the National Academy publicadas no livro “Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behavioral Research”. Uma versão em formato pdf está disponível gratuitamente no site da Sociedade de Neurociência e Comportamento (SBNeC) – http://www.sbnec.gov.br/links. Após a captura, os animais foram alojados no Centro de Biociências, UFRN, em um recinto de alvenaria e tela de arame, medindo 3,00 x 2,00 x 2,60 m, onde ficaram expostos a luminosidade, temperatura e umidade naturais, com água e comida ad libitum, permanecendo aí durante o gradativo período de utilização dos mesmos, tendo em vista que o contingente de animais não pode ser processado em um único dia. No dia anterior ao experimento os animais foram transferidos para gaiolas medindo 0,90 x 0,60 x 0,75m. Todos os procedimentos foram realizados no laboratório de Neuranatomia, departamento de Morfologia, UFRN, vinculado ao Programa de pós-graduação em Psicobiologia. Procedimentos: Anestesia Os animais receberam como medicação pré-anestésica cloridrato de tramadol e xilazina, ambos na dose de 5 mg/Kg por via intramuscular. O tramadol é um opióide necessário para potenciar o efeito da analgesia adequada ao procedimento. A xilazina é um relaxante muscular. Decorridos 10 minutos, os animais foram induzidos e mantidos em anestesia inalatória com isoflurano e oxigênio 100% administrado através de máscara, até atingir o plano anestésico, ou seja, terceiro plano do terceiro estágio de Guedel (Massone, 2008). Perfusão Ao atingir o plano anestésico, cada animal foi submetido a perfusão transcardíaca, que compreende os seguintes passos: 24 1. Posicionamento do animal em decúbito dorsal sobre tela de arame sob ponto de água. 2. Toracotomia, com incisão de pele, músculos e todas as costelas, sendo estes removidos em bloco, para exposição do coração. 3. Cardiopunção no ventrículo esquerdo, utilizando uma agulha de 16G (1,6 x 17 mm), a qual é direcionada para a artéria aorta, seguindo-se uma incisão no átrio direito. A agulha é conectada a uma bomba peristáltica (Cole-Parmer), passando-se 300 ml de solução salina a 0,9% em tampão fostato 0,1M, pH 7,4 com heparina (Parinex, Hipolabor, 2ml/1000 ml de solução salina), seguida de 700ml de solução de paraformaldeido 4%, glutaraldeído 0,05% e ácido pícrico 0,2% em tampão fostato 0,1M, pH 7,4 (Zamboni e De Martino, 1967). Remoção dos encéfalos e microtomia Concluída a perfusão, dois animais foram posicionados no aparelho estereotáxico para roedores. Depois de fazer uma incisão longitudinal na pele e rebatê-la lateralmente, fez-se a limpeza da superfície óssea, facilitando a visualização do bregma e do lambda, os quais foram nivelados na mesma altura dorsoventral, ajustando-se a barra dos incisivos, padronizando assim o plano de corte coronal para todos os animais. Após anotação das coordenadas do bregma e do lambda, o osso da calota Figura 4. Mocó (Kerodon rupestris) posicionado no aparelho estereotáxico. craniana foi removido com o uso de broca e trocater, expondo-se o encéfalo. Ainda no aparelho estereotáxico, o encéfalo foi seccionado em 3 blocos, através de 2 secções coronais: uma no no nível do bregma e outra no nível do lambda. Os encéfalos foram retirados delicadamente para evitar danos, preservando os olhos e nervos ópticos, e em seguida fotografados. Logo após, os três blocos foram armazenados em uma solução de sacarose Figura 5. Encéfalo de mocó (Kerodon rupestris) sendo seccionado em três blocos. a 30% em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4, a 4 ºC, até serem submetidos a microtomia. Os 25 encéfalos de 2 animais foram submetidos a uma secção no plano mediano, separando-se os 2 hemisférios cerebrais, direito e esquerdo, os quais foram seccionados no plano sagital. O encéfalo congelado por gelo seco foi seccionado em micrótomo de deslizamento, obtendo-se secções coronais ou sagitais com espessura de 30 µm. Estas foram distribuídas seqüencialmente em seis compartimentos, em um meio liquido contendo tampão fostato 0,1M, pH 7,4 , cada compartimento contendo 1 de 6 secções, mantendo a distância entre uma secção e a seguinte de aproximadamente 180 µm. Os cortes de uma série foram armazenados em tampão fostato 0,1M, pH 7,4 e imediatamente montados em lâminas gelatinizadas e submetidas a coloração pelo método de Nissl com corante Thionina, para facilitar a demarcação das estruturas. Os cortes das demais séries foram coletadas em solução anticongelante e conservadas a -20 ºC até a realização das reações imunoistoquímicas. a b Figura 6. Encéfalo de mocó (Kerodon rupestris) vista dosal (a) e ventral (b). Imunoistoquímica Cortes de uma série foram submetidas a imunoistoquímica para 5-HT. Após 3 lavagens de 10 minutos cada, em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 em agitador orbital, as secções foram submetidas ao pré-tratamento para abolição de artefatos e recuperação de antigenicidade com boridreto de sódio e água oxigenada. O próximo passo foi colocar as secções em contato com o anticorpo anti-5-HT obtido em coelho (Sigma) diluído em tampão fosfato contendo Triton X-100 a 0,4% a uma diluição de 1:5000, contendo soro normal de cabra a 2%, permanecendo em incubação por 12 a 72 horas em rotor com rotação lenta. Ao fim deste período os cortes foram colocados em contato com o anticorpo secundário anti-coelho obtido em cabra (Jackson Labs) diluído a 1:1000 no mesmo veiculo anterior, por 90 minutos à temperatura ambiente, sob agitação lenta, em rotor. Em seguida os cortes foram colocados na solução do complexo avidina- 26 biotina-HRP (Protocolo ABC, Kit elite da Vector), numa diluição de 1:100 em Triton X100 a 0,4%, contendo NaCl. Para visualização da reação, as secções foram postas em meio contendo peróxido de hidrogênio (H2O2), como substrato e a 3,3’,4,4’tetrahidrocloretodiaminobenzidina (DAB), utilizada como cromógeno. A H2O2 foi oferecida indiretamente, colocando-se na solução glicose oxidase e -D-glicose, provocando uma reação em que a primeira agindo sobre a segunda libera H2O2 (Itoh et al., 1979). Esta reação dura em torno de 15 minutos. Entre as etapas e ao final, os cortes foram lavados por 3 vezes em tampão fostato 0,1M, pH 7,4 em agitador orbital. Os cortes foram montados em lâminas gelatinizadas, as quais após secarem à temperatura ambiente, foram imersas em solução de tetróxido de ósmio a 0,05% para intensificar a reação. Após as etapas de desidratação, em baterias de álcool de graduação crescente até o álcool absoluto, e diafanização em xilol, foram montadas as lamínulas. As demais séries foram utilizadas para repetição de imunoistoquímica para 5-HT, ou utilizadas em outros projetos. As secções do tronco encefálico, coradas por Nissl e as imunocoradas para 5-HT foram examinadas ao microscópio óptico (Olympus BX41) em campo claro. Imagens digitais foram obtidas de secções representativas usando uma videocâmara digital (Nikon DXM1200). As imagens foram analisadas, corrigidas minimamente para brilho e contraste, e montadas usando o programa Adobe Photshop 7.0. Os resultados estão documentados em fotomicrografias e gráficos. 27 RESULTADOS No presente estudo a imunoistoquímica para 5-HT foi utilizada para, em consonância com a técnica de Nissl em secções adjacentes, delimitar os núcleos da rafe. Encontramos neurônios imunorreativos para 5-HT (5-HT-IR) ao longo de todo tronco encefálico, predominantemente na linha mediana, desde o nível da porção média do núcleo interpeduncular até a transição bulbo-espinal. No sentido rostrocaudal, os primeiros neurônios 5-HT-IR no encéfalo do mocó aparecem no nível de aproximadamente 6,7 mm posteriormente ao bregma (PB), em território mesencefálico, coincidindo com a presença do colículo superior, núcleo geniculado medial, substância negra, núcleo rubro e núcleo interpeduncular. Esses neurônios 5-HT-IR formam um pequeno grupamento situado ventralmente à substância cinzenta periaquedutal, núcleo do nervo óculo-motor (III par craniano) e fascículo longitudinal medial, mais precisamente localizado entre a decussação tegmental dorsal, dorsalmente, e a decussação tegmental ventral, ventralmente, através da qual se separa do núcleo interpeduncular (Fig. 7). Pela localização e relações, identificamos esse grupamento neuronal como o núcleo linear rostral da rafe (RLi), o qual se estende caudalmente até o nível 6,8 mm PB, nível no qual também tem início rostralmente o núcleo dorsal da rafe (DR), correspondendo a sua parte dorsal (DRD), do qual se separa pelo lemnisco medial, e ventralmente se encontra a decussação tegmental ventral. Coincide também com o aparecimento de outro aglomerado em forma de arco, de células 5-HT-IR, imersas entre as fibras do lemnisco medial, situado lateralmente ao núcleo interpeduncular, reconhecido como o grupamento B9 (núcleo supralemniscal) (Fig. 8). Mais caudalmente, a aproximadamente 7,2 mm PB, o RLi dá lugar a um grupamento mais vultoso de células 5-HT-IR, o núcleo linear caudal da rafe (CLi). Estas células estão dispostas de forma esparsa, sendo atravessadas pelas fibras da decussação do pedúnculo cerebelar superior. Lateralmente ao CLi estão as fibras do trato tecto-espinal. Dorsalmente encontra-se sucessivamente o fascículo longitudinal medial, o núcleo do nervo óculo-motor e o DR, já acrescido das porções lateral (DRL), ventral (DRV), e posterior (PDR). Ventralmente ao CLi está o núcleo interpeduncular, lateralmente ao qual encontra-se o grupamento serotoninérgico B9 (núcleo supralemniscal), caracteristicamente situado imerso no lemnisco medial (Fig. 9). Prosseguindo no sentido caudal, a aproximadamente 7,9 mm PB, o CLi é deslocado dorsalmente e entre ele e o núcleo interpeduncular, já reduzido de tamanho, 28 interpõe-se um outro aglomerado de neurônios 5-HT-IR, reconhecido como o núcleo mediano da rafe (MnR). De cada lado deste, neurônios 5-HT-IR, frouxamente organizados em coluna vertical, constituem o núcleo paramediano da rafe (PMnR). Neste nível, o grupamento B9 continua presente e o DR assume maiores dimensões, com todas as subdivisões encontradas na secção anterior (Fig. 10). No nível a seguir examinado, quando o núcleo interpeduncular é totalmente substituído pelos núcleos pontinos, na altura de aproximadamente 8,5 mm PB, o CLi não está mais presente, sendo todo espaço na linha média ventral ao DR e dorsal aos núcleos pontinos, ocupado pelos MnR e PMnR. Neste nível, que coincide com a presença do núcleo do nervo troclear (IV par craniano), o DR assume suas maiores dimensões. Dorso lateralmente ao lemnisco medial continua presente o grupamento B9 (Fig. 11). Num nível imediatamente caudal, a 8,8 mm PB, a configuração é bastante semelhante, exceto pelo reduzido tamanho de B9 (Fig. 12). A aproximadamente 9,2 mm PB, coincidente com o aparecimento dos núcleos tegmentais na substância cinzenta periaquedutal, o DR aparece reduzido com as divisões DRD e DRV, é seguido ventralmente pelos MnR e PMnR e ainda estão presentes raros neurônios 5-HT-IR compondo o B9 (Fig. 13). No nível do limite caudal dos colículos superiores, na altura de aproximadamente 9,4 mm PB, o DR ainda está presente, com as divisões DRD e DRV, e ventralmente a ele, localizam-se os MnR e PMnR (Fig. 14). Os MnR e PMnR estendem-se até aproximadamente 9,5 mm PB, juntamente com DRD e DRV (Fig. 15). Em nível pontino, tendo como referência a presença do núcleo do nervo abducente (VI par craniano), a aproximadamente 10,0 mm PB, encontramos ainda neurônios do DR, compondo sua porção caudal (DRC) e, ventralmente a este, na linha mediana, visualizamos um grupamento de neurônios 5-HT-IR, o qual identificamos como o núcleo pontino da rafe (PnR) (Fig. 16). Mais caudalmente, a aproximadamente 10,3 mm PB, na altura do núcleo prepósito, encontramos o pólo caudal do DRC e, ventralmente, surgem os aglomerados de neurônios 5-HT-IR que compõem os núcleos interpósito da rafe (RIP) e o magno da rafe (RMg) (Fig. 17). O RIP continua caudalmente até aproximadamente a 11,2 mm PB, juntamente com RMg (Figs. 17, 18 e 19). A aproximadamente 11,3 mm PB, o RMg aparece sozinho e mais vultoso (Fig.20). Dos níveis a 11,5 a 12,2 mm PB aproximadamente, quando se visualiza as fibras do nervo facial (VII par), a linha mediana da ponte é ocupada por uma dupla faixa vertical 29 de neurônios 5-HT-IR, correspondendo em sua maior extensão ao núcleo obscuro da rafe (ROb), dorsalmente, e em menor extensão, ainda o RMg, ventralmente (Figs. 21, 22 e 23). A partir do nível 12,0 mm PB (Fig. 22) o RMg apresenta extensões laterais de neurônios 5HT-IR, dorsalmente às pirâmides, atingindo o maior volume dos níveis 12,8 mm a 13,7 mm PB (Figs. 24, 25 e 26). Mais caudalmente, numa extensão que vai de aproximadamente 12,8 mm até 14,2 mm PB, além do ROb e do RMg, surge um pequeno grupamento de neurônios 5-HT-IR, interposto entre as pirâmides, reconhecido como o núcleo pálido da rafe (RPa) (Figs. 24 a 28). O RPa, juntamente com o ROb, ainda se estende até aproximadamente 15,3 mm PB (Fig. 29) e o ROb sozinho estende-se até a porção fechada do bulbo, em níveis de presença dos núcleos dos nervos cranianos hipogloso (XII par) e vago (X par), a aproximadamente 16,6 mm PB (Figs. 30 e 31). A figura 32 mostra os grupamentos serotoninérgicos distribuídos ao longo da linha mediana do tronco encefálico em uma secção sagital mediana. 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 DISCUSSÃO Pelo uso da técnica imunoistoquímica para revelar os neurônios produtores de 5HT no tronco encefálico do mocó, foi possível analisar a distribuição e topografia dos neurônios marcados. Além disso, a comparação direta com material corado por técnica de Nissl em secções alternadas, permitiu relacionar as células 5-HT-IR com os territórios citoarquitetônicos relativos ou não aos núcleos da rafe no tronco encefálico do mocó. Os resultados revelaram que a organização deste complexo nuclear foi essencialmente similar ao que tem sido previamente descrito em outros mamíferos. Por comparação com a organização do rato (Paxinos e Watson, 2007), com base nas referências citoarquitetônicas, identificamos no mocó, no sentido rostrocaudal os núcleos linear rostral da rafe, linear caudal da rafe, supralemniscal (B9), dorsal da rafe, mediano da rafe, paramediano da rafe, pontino da rafe, interpósito da rafe, obscuro da rafe e pálido da rafe. O sistema serotoninérgico em associação com os núcleos da rafe também foi estudado com imunoistoquímica para 5-HT no encéfalo de primatas como humano e Macaca fascicularis, tendo sido identificados no grupo rostral, o núcleo dorsal da rafe (B7 e B6), central superior (B8, B5 e parte de B7) e supralemniscal (B9) e o grupo caudal, consistindo dos núcleos magno da rafe (B3), obscuro da rafe (B2) e pálido da rafe (B1) (Azmitia e Gannon, 1986). No sagui também foram identificados os núcleos do grupo anterior – núcleos linear caudal , mediano da rafe, dorsal da rafe e pontino da rafe e os do grupo posterior – núcleos magno da rafe, obscuro da rafe e pálido da rafe, além de grupamentos serotoninérgicos extra-rafe, como o grupamento B9, em associação com o lemnisco medial, alguns neurônios serotoninérgicos no núcleo interpeduncular, um número substancial de células localizados lateral ao MnR na formação reticular no mesencéfalo caudal e ponte rostral, na formação reticular bulbar, núcleo prepósito do hipoglosso e outros (Hornung e Fritschy, 1988). A distribuição, morfologia e subdivisões nucleares também foram estudados com imuno-histoquímica para 5-HT, no sistema serotoninérgico nos encéfalos de um grande número de espécies africanas, tais com um grande roedor noturno, o rato cachorro (greater canerat) (Dwarika et al., 2008), a girafa (Badlangana et al., 2007), o gerbil africano (highveld gerbil, Tatera brantsii) (Moon et al., 2007), em duas espécies de toupeiras africanas (cape dune mole rat, Bathyergus suillus e highveld mole rat, Cryptomys hottentotus pretoriae) (Da Silva et al., 2006; Bhagwandin et al., 2008; Bux et al., 2010), 57 morcegos microchiroptera (Maseko e Manger, 2007; Kruger et al., 2010) e megachiroptera (Dell et al., 2010), rock hyrax (Maseko et al., 2007; Gravett et al., 2009), musaranho elefante, um mamífero da ordem Macroscelidea (Pieters et al., 2010). Nos encéfalos dessas espécies, os neurônios serotoninérgicos foram agrupados em um grupamento rostral, essencialmente mesencefálico-pontino e um grupamento caudal, essencialmente bulbar. No grupamento rostral foi incluído o núcleo linear caudal da rafe como o aglomerado mais rostral de células, não se referindo a existência de um núcleo linear rostral da rafe, seguido do grupo B9 (supralemniscal), o núcleo dorsal da rafe e o núcleo mediano da rafe. O núcleo dorsal da rafe é dividido em 6 subnúcleos distintos, designados dorsal, interfascicular, ventral, lateral, periférico e caudal. No grupamento caudal foi distinguido o núcleo magno da rafe, o núcleo pálido da rafe, o núcleo obscuro da rafe e os grupamentos bulbares ventrolaterais rostral e caudal. O sistema serotoninérgico também foi estudado em duas espécies de marsupiais, o gambá (Didelphis virginiana, Martin et al., 1985) e no wallaby (Macropus eugenii, Ferguson et al., 1999). Como em mamíferos eutérios foi visto que o tronco encefálico dessas espécies contém grupos de neurônios 5-HT-IR na linha média: o grupamento rostral, compreendendo os núcleos linear caudal, mediano, dorsal e pontino da rafe, e neurônios no núcleo interpeduncular, e o grupamento caudal, incluindo os núcleos magno, obscuro e pálido da rafe, bem como células situadas mais lateralmente, reunidas no grupamento B9, nas proximidades do núcleo tegmental pedúnculo-pontino e bulbo ventrolateral (Ferguson et al., 1999). Diferentemente dos autores acima citados, nós identificamos no tronco encefálico do mocó um pequeno grupo de neurônios 5-HT-IR localizados no pólo caudal do núcleo linear rostral da rafe. No nosso material, o núcleo dorsal da rafe pôde ser dividido em partes dorsal, lateral, ventral e posterior, por analogia com as divisões estabelecidas no núcleo dorsal da rafe do rato por Paxinos e Watson (2007). No que se refere à lateralização, é importante destacar que, além do grupamento B9, não evidenciamos outros aglomerados distanciados da linha média, sem continuidade com os grupamentos da linha média. Analisando os nossos resultados, em comparação com os dados da literatura, podemos constatar que a organização dos neurônios serotoninérgicos no tronco encefálico do mocó é muito similar à encontrada em outras espécies de roedores, assim como entre outros mamíferos, com algumas pequenas variações, muitas das quais podem ser atribuídas a critérios de nomenclatura. Isto reforça a sugestão de que o sistema serotoninérgico é um 58 sistema de neurotransmissores antigo e evolutivamente bem conservado (Parent, 1981). Estudos prévios examinaram espécies mais aproximadas da ordem Rodentia (Moon et al., 2007) mostrando que diferenças no fenótipo e história de vida também não levam a alterações na complexidade nuclear. Analisando-se a diversidade das espécies estudadas observa-se que a extensão da divergência evolutiva também não é um indicador das diferenças na complexidade nuclear dos sistemas em estudo dentro da mesma ordem de mamíferos. Assim, é possível concluir que para a ordem Rodentia, variações no fenotipo, história de vida, estilo de vida e tamanho cerebral não levam a alterações na complexidade nuclear do sistema serotoninérgico. Desta forma o presente trabalho representa uma contribuição sob a forma de fornecer subsídios para investigações futuras usando o mocó como modelo experimental voltadas para aumentar a compreensão do papel funcional do sistema serotoninérgico. 59 CONCLUSÕES Os resultados do presente trabalho, analisados à luz de trabalhos prévios, nos permitem chegar às seguintes conclusões com relação ao sistema serotoninérgico/núcleos da rafe do mocó: 1º. A imunoistoquímica para 5-HT foi eficiente para a marcação dos neurônios serotoninérgicos presentes na rafe do mocó e juntamente com a técnica de Nissl de seções adjacentes teve papel essencial na delimitação dos núcleos da rafe; 2º. O sistema serotoninérgico do mocó é composto de 11 núcleos, nomeados no sentido rostrocaudal de: linear rostral, linear caudal, dorsal da rafe, mediano, paramediano, supralemniscal (B9), pontino, interpósito, magno, pálido e obscuro; 3º. Os núcleos da rafe estão distribuídos ao longo da linha média do tronco encefálico, exceto o grupamento B9 que desloca lateralmente, desde o mesencéfalo caudal até o limite bulbo-espinal; 4º. De uma forma geral os núcleos da rafe serotoninérgicos se assemelham aos núcleos do mesmo nome encontrados em outros mamíferos já estudados, com exceção do linear rostral, o qual não é referido como um núcleo serotoninérgico nas espécies já estudadas. 60 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS O mocó (Kerodon rupestris) vem sendo utilizado como modelo experimental no Programa de pós graduação em Psicobiologia da UFRN desde 2003, sendo utilizado no Laboratório de Neuranatomia desde 2004. Estudos com o mocó foram realizados nas linhas de caracterização de ritmos circadianos, organização do sistema de temporização circadiana e projeções retinianos, tendo originado produtos como teses de doutorado, dissertações de mestrado e trabalhos de conclusão de curso e publicações em revistas científicas de indexação internacional. Atualmente estão em andamento uma tese de doutorado, abordando aspectos anatômicos do olho e neuroquímicos da retina, relacionados com o sistema de temporização circadiana, uma dissertação de mestrado, caracterizando o sistema dopaminérgico e a presente dissertação sobre o sistema serotoninérgico no mocó (Kerodon rupestris). Devemos levar em consideração que este é o primeiro trabalho que visa estudar o sistema serotoninérgico nesse modelo experimental, dando continuidade a uma serie de estudos que visam o mapeamento das estruturas cerebrais nessa espécie. Nosso trabalho mostra uma estreita relação com o sistema serotoninérgico de outras espécies de mamíferos já estudados, com poucas variações entre elas, o que mostra a constância na apresentação desses núcleos da rafe, que vem resistindo ao longo da evolução, e para a ordem Rodentia, variações de fenótipo e ambientais não interferem na complexidade da organização nuclear do sistema serotoninérgico. O presente trabalho se mostra como uma ferramenta essencial para estabelecer o mocó como sujeito experimental para o desenvolvimento de pesquisas que visem o sistema serotoninérgico, tanto nas suas bases fisiológicas, como na área de patologias que envolvem esse complexo sistema. Os mecanismos funcionais e a hodologia devem ser estudados a fim de compreender a fundo as inter-relações entre os neurotransmissores e estruturas anatômicas das varias espécies estudadas, sejam elas roedores, marsupiais, primatas humanos ou não humanos. Esse trabalho representa o inicio de uma linha de pesquisa voltada para o conhecimento dos centros serotoninérgicos no mocó e em outras espécies correlatas ou não, com o intuito de contribuir para esclarecimentos da anatomia e fisiologia de um dos maiores relés de integração nervosa. Dessa forma a continuidade desse estudo pode ocorrer 61 a partir de uma série de possibilidades, tais como: Caracterização neuroquímica de todos os núcleos da rafe; Estudo da morfometria dos núcleos da rafe e de suas células; Estudo funcional dos núcleos da rafe/grupamentos serotoninérgicos; Estudo hodológicos do sistema serotoninérgico/rafe; Estudos filogenéticos e ontogenéticos; Contribuir com o “Projeto Atlas” do mocó. 62 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS1 Azmitia, E.C., Gannon, P.J., 1983. The ultrastructural localization of serotonin immunoreactivity in myelinated and unmyelinated axons within the medial forebrain bundle of rat and monkey. J. Neurosci. 3, 2083-2090. Azmitia, E.C., Segal, M., 1978. An autoradiographic analysis of the differential ascending projections of the dorsal and median raphe nuclei in the rat. J. Comp. Neurol. 179, 641666. Badlangana, N.L., Bhagwandin, A,, Fuxe, K., Manger, P.R., 2007. 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Departments of Morphology and Physiology, Laboratory of Neuroanatomy, Bioscience Center, Federal University of Rio Grande do Norte, Natal, RN, Brazil With ____ pages and ____ figures. *Corresponding author: Joacil Germano Soares Department of Morphology/Laboratory of Chronobiology, Bioscience Center, Federal University of Rio Grande do Norte, 59072-970, Natal-RN, Brazil. Telephone Number: 55 84 32153431 Fax: 55 84 2119207 E-mail address: [email protected] 69 ABSTRACT Serotonin or 5-hydroxytryptamine (5-HT) is a substance found in many tissues of the body, including as a neurotransmitter in the nervous system, in which may exert varied post-synaptic actions. Inside the neuro-axis, the location of 5-HT neurons is almost restricted to the raphe nuclei of the brainstem, such that 5-HT-immunoreactivity can be considered a marker of the raphe nuclei. The raphe nuclei are located in the brainstem, at or near the midline. The serotonergic groups were alphanumerically in caudorostral direction classified as B1 to B9 groups in the rat. In this study the distribution of serotonergic neurons was studied in the brain of the rock cavy (Kerodon rupestris), a species of rodent endemic to Northeastern Brazil. The cytoarchitectonic location of serotonergic neurons was established in series of adjacent coronal and sagittal sections stained by the Nissl method and 5-HT immunohistochemistry. Thus, we defined the following nuclei: rostral linear raphe, caudal linear raphe, dorsal raphe, median raphe, paramedian raphe, pontine raphe nuclei, and B9 cluster, constituting the anterior group, and raphe interpositus, raphe magnus, raphe pallidus and raphe obscurus nuclei, constituting the inferior group, comparable to which has been described for other mammalian species. Keywords: brainstem, immunohistochemistry, raphe nuclei, rock cavy, rodent, serotonin. 70 INTRODUCTION The location of large neurons forming clusters at the midline of the brainstem has attracted the attention of anatomists since the time of Ramón y Cajal, who described these cells as large multipolar neurons, with uncertain projections (Ramon y Cajal, 1911). Decades later, based on cytoarchitectonic study, the raphe nuclei in the cat were first described as a set of eight nuclei along the midline, from the midbrain to the bulbospinal transition, so called from rostral to caudal direction: rostral linear nucleus of the raphe, caudal linear nucleus of the raphe, dorsal raphe nucleus, superior central (or median) raphe nucleus, pontine raphe nucleus, raphe magnus nucleus, raphe palllidus nucleus and raphe obscurus nucleus (Taber et al., 1960). The interest in studying the morphology and functions of the raphe nuclei was sparked after the description of a system of monoaminergic neurons in the rat brainstem, evidenced by the technique of formaldehyde-induced fluorescence (Falk et al., 1962; Dahlström and Fuxe, 1964; 1965). Although it had been noted a large overlap between putatively producing serotonin (5-HT) neurons and the raphe nuclei, the then evidenced serotonergic groups were designated as B1 to B9 groups from caudal to rostral direction (Dahlström and Fuxe, 1964; Fuxe, 1965). With the introduction of immunohistochemical techniques, this classification was integrated with the cytoarchitectonic nomenclature of the raphe system (Steinbusch et al., 1978; Steinbusch, 1981; Törk, 1985). While the main cell groups in the serotonin system follow the cytoarchitectonic divisions of the raphe nuclei, the overlap is not precise, since many neurons 5-HT-IR is present in other sectors of the reticular formation, beyond the boundaries of the raphe nuclei, although apparently continuous with the clusters of 5-HT-IR cells, as well as, some non-serotonergic neurons are present in the raphe nuclei (Törk, 1985, Harding et al., 2004). The diversity of receptors on which it operates, together with the widespread distribution of serotonergic innervation explains the variety of functions in which 5-HT is involved, including regulation of sleep-wake cycle, dream control, arousal and attention, memory and learning, mood control, feeding behavior, sexual behavior, thermoregulation, nociceptive sensory processing, circadian regulation, among others. Moreover, the 5-HT dysfunction has been associated with several neuropathological processes, such as sleep disturbances, anxiety, depression, aggression, anorexia and bulimia, as well as neurodegenerative diseases, such as, Alzheimer, Parkinson and Huntington diseases (Jacobs and Azmitia, 1992; Vergé and Calas, 2000; Cools et al., 2008; Takase and 71 Nogueira, 2008). As earlier mentioned, the serotonergic neurons in the brain are located predominantly in the brainstem along the midline or near to it, featuring the raphe nuclei. However, not all raphe neurons contain 5-HT, and the proportion of neurons that produce 5-HT in each location varies considerably (Törk, 1985; Harding et al., 2004). Among other substances found in the raphe nuclei may be cited substance P, thyrotropin-releasing hormone (TRH), norepinephrine and gamma-aminobutyric acid (GABA) and may be colocated or not with 5-HT (Jacobs and Azmitia , 1992; Charara and Parent, 1998). Moreover, a few serotonergic neurons are out of the raphe nuclei, as for example in the vicinity of the medial lemniscus, or sectors of the reticular formation (Jacobs and Azmitia, 1992; Charara and Parent, 1998). Therefore, serotonergic groups were originally alphanumerically classified as B1 to B9 from medulla to midbrain in the rat (Dahlstrom and Fuxe, 1964) and may be correlated with the raphe nuclei, which are usually divided into superior and inferior groups. The superior group consists of four main nuclei: the caudal linear raphe nucleus (CLi, B8), median raphe nucleus (MnR, B8 and B5, previously referred to as the central superior nucleus) and laterally displaced cells in the pontine nucleus centralis oralis, the lateral neurons of B9 group, located just dorsal to the medial lemniscus and the dorsal raphe nucleus (DR, B7 and B6). The most rostral of the raphe nuclei, as cytoarchitectonicly defined, is called rostral linear raphe nucleus and contains only rare serotonergic neurons, being predominantly a dopaminergic nucleus (Törk, 1985). The inferior group consists of five main nuclei: the raphe obscurus nucleus (ROb, B2), raphe pallidus nucleus (RPa, B1 and B4), raphe magnus nucleus (RMg, B3), neurons in the ventrolateral medulla, including nucleus lateral paragigantocelular and intermediate reticular nucleus (B1/B3) and area postrema (Brodal and Walberg, 1960; Jacobs and Azmitia, 1992, Harding et al., 2004). The anatomy of these groups has been reviewed in many species, including rats (Parent et al. 1981; Lidov and Molliver, 1982; Takeuchi et al., 1982; Törk, 1985; Paxinos and Watson, 2007), rabbit (Bjarkam et al ., 1997), cat (Takeuchi et al., 1982; Jacobs et al., 1984), humans (Törk, 1990; Hornung, 2003) and monkeys of the New and Old World (Felten et al. 1974; Felten and Sladek, 1983; Azmitia and Gannon, 1983; Hornung and Fritschy, 1988). The most recent systematization of the raphe nuclei (serotonergic groups) in the rat brain, according to Paxinos and Watson (2007), indicates the existence of 10 nuclear neuron clusters, in rostrocaudal sequence: in the midbrain, the rostral linear raphe nucleus (RLi), caudal linear raphe nucleus (CLi), dorsal raphe nucleus (DR), median raphe nucleus 72 (MnR) and paramedian raphe nucleus (PMnR). On the pons, the pontine raphe nucleus (PnR) and raphe interpositus nucleus (RIP). Finally, in the medulla, the raphe magnus nucleus (RMg), raphe pallidus nucleus (RPa) and raphe obscurus nucleus (ROb) (Paxinos and Watson, 2007). Although there are a substantial number of non-serotonergic cells in the raphe nuclei, it is recognized that the long ascending and descending projections from neurons are serotonergic (Jacobs and Azmitia, 1992; Charara and Parent, 1998; Halberstadt and Balaban, 2006). Serotonergic fibers are thin, barely myelinated and highly collateralized. There seems to be an evolutionary trend, noting that in primate species, in addition to the midline location, there are neurons located more laterally (lateralization) and a large proportion of serotonergic fibers are myelinated (Jacobs and Azmitia, 1992; Bjarkam et al., 1997). The rock cavy (Kerodon rupestris) is a rodent species found in the semi-arid caatinga of Northeast Brazil. According to traditional taxonomic classification based on morphological and behavioral aspects, the rock cavy is classified in the superfamily Cavioidea, Caviidae family, subfamily Caviinae, gender Kerodon along with Cavia, Galea and Microcavia (Cabrera, 1961; Lacher Jr, 1981; Silva Neto, 2000). Morphological (Silva Neto, 2000) and molecular biology (Rowe and Honeycutt, 2002) studies signed the gender Kerodon sistered with Hydrochaeridae family, to which also belongs the capybara (Hydrochaeris) and closely aligned with the Dolichotinae subfamily. Regarding the rock cavy motor activity pattern, records of field observations show that on dark days these animals out to feed in the morning and afternoon, while on bright days the activity is concentrated during the night. Other observations indicate foraging activity throughout the day and night (Lacher Jr, 1981). In a controlled laboratory conditions study, it was discovered that the rock cavy is active throughout the 24-hour day, although its activity is enhanced in sunrise and sunset phases, suggesting a predominantly crepuscular behavior (Sousa and Menezes, 2006). This study was carried out aiming to identify by 5-HT immunohistochemistry and cytoarchitecture by Nissl technique, the serotonergic neuronal groups associated to raphe nuclei in the brain of the rock cavy (Kerodon rupestris). This study will provide a basis for posterior studies on hodological and functional aspects on these neuronal groups in this species. 73 MATERIAL AND METHODS Four male and female young adult rock cavies, weighting from 300 to 400 g, from countryside municipalities of the state of Rio Grande do Norte, Brazil, were used. The animals were captured after permission from the Brazilian Environmental Agency (IBAMA, licenses 21440-1). Approval for the experiments was obtained from the local Animal Ethics Experimentation Committee and conformed to National Institutes of Health (NIH) guidelines. All efforts were made to minimize the number of animals and their suffering. The animals were housed in 3.00 x 2.00 x 2.60 m masonry cages, with four wire screen walls, ceramic tile ceiling and natural soil floor with creeping vegetation and rocks, simulating the animal’s natural habitat. The animals were exposed to environmental temperature, air humidity and light, with unlimited access to food and water. Each animal was pre-anesthetized with an intramuscular injection of tramadol chloridate and xylazine, both 5 mg/Kg and maintened with gas isofluoran and oxygen 100%. Upon deep anesthesia they were perfused using a cannula positioned in the aorta and connected to a peristaltic pump (Cole-Parmer) with 300 ml of 0.9% saline solution in 0.1M phosphate buffer, pH 7.4, containing heparin (Parinex, Hipolabor, Sabará, MG, Brazil, 2ml/1000ml of saline solution) for around 5 minutes. Next, 700 ml of a 4% paraformaldehyde, 2% picric acid and 0.05% glutaraldehyde in 0.1M phosphate buffer, pH 7.4 fixative solution (Zamboni and De Martino, 1967) was pumped, half of the solution with a 6.0 ml/minute flow rate and the other half 3.0 ml/minute, the entire procedure spending 30 minutes. After perfusion, two animals were placed in the stereotaxic frame and the incisor bar was adjusted until the lambda and bregma were at the same height. The skull bones were removed to expose the dorsal surface of the encephalon, which was sectioned into 3 blocks by means of two coronal sections: one at the bregma level and the other at the lambda level. Finally, the encephalon was removed from the skull, stored in 30% sucrose solution in 0.1M phosphate buffer, pH 7.4, for 24 to 48 hours, and then sectioned by dry ice freezing in sliding microtome, obtaining coronal sections of 30 µm. The brains of two animals were sectioned at the sagittal plane. In both cases, the sections were collected sequentially into 6 compartments, each one containing one of every 6 sections, thereby representing a serial sequence with a distance of 0.18 mm between the sections. Sections from on series were immediately mounted on gelatin coated glass slides and Nissl stained with thionin, to visualize the cytoarchitectonic delimitation of neuronal 74 groups. Sections from another series were submitted to immunohistochemistry to reveal 5HT. All the immunohistochemical procedures were performed at room temperature. The sections, previously submitted to pre-treatment with sodium borohydride and hydrogen peroxide (H2O2), were placed in contact with the antibody rabbit anti-5-HT (Sigma, 1:5000) and 2% of normal goat serum in 0,4% Triton X-100 in a rotator for 18 hours, followed by incubation in the secondary antibody, consisting of 1:1000 dilution of biotinylated goat anti-rabbit (Jackson Immunoresearch Labs.) under gentle shaking in a rotator, for 90 minutes. To visualize the reaction, the sections underwent a 90 minutes incubation in avidin-biotin- HRP complex (Vector Elite ABC kit). This was followed by the final reaction in medium containing H2O2 as substrate and diaminobenzidine (DAB) as chromogen. The H2O2 was offered indirectly, by placing oxidase glucose and ß-D glucose into the solution, causing a reaction in which the first acting on the second releases H2O2 (Itoh et al., 1979). At the beginning, between one step and another and at the end, the sections were thoroughly washed with 0.1M phosphate buffer, pH 7.4. The sections were mounted on previously gelatinized glass slides, which, after drying at room temperature, were submersed rapidly in a solution of 0.05% osmium tetroxide to intensify the reaction. As control for staining specificity, a number of sections were submitted to immunohistochemical reactions omitting the primary or secondary antibodies. The 5-HT-immunostained and Nissl-stained sections of the rock cavy brainstem were analyzed under optical microscope (Olympus BX41) on bright field. Digital images were obtained of representative sections using a digital video camera (Nikon DXM1200) coupled to the microscope. The images were analyzed, corrected minimally for brightness and contrast, and mounted using Adobe Photoshop 7.0 software. The results are documented in photomicrographs and diagrams. 75 RESULTS In this study, 5-HT immunohistochemistry was used to, in conjunction with the Nissl technique in adjacent sections, delimitate the raphe nuclei in the rock cavy. The distribution of 5-HT-IR neurons is shown in photomicrographs of Nissl and immunostained coronal and sagittal sections taken from a representative animal. We found 5-HT immunoreactive (5-HT-IR) neurons throughout the brainstem, predominantly in the midline, from the level of the middle portion of the interpeduncular nucleus to the spinomedullary transition. In the rostrocaudal direction, the first 5-HT-IR neurons in the rock cavy brain appear at the level of approximately 6.7 mm posterior to bregma (pb) in mesencephalic ground, coinciding with the presence of the superior colliculus, medial geniculate nucleus, substantia nigra, red nucleus and interpeduncular nucleus. These neurons 5-HT-IR form a small cluster located ventral to the periaqueductal gray, nucleus of the oculomotor nerve (cranial nerve III) and medial longitudinal fasciculus, more precisely located between the dorsal tegmental decussation, dorsally and the ventral tegmental decussation and the interpeduncular nucleus, ventrally (Fig. 1). Based in the location and the relationships, we identified this grouping as the rostral linear raphe nucleus (RLi), which extends caudally to the level 6.8 mm pb. This level is also marked by the beginning of the dorsal portion of the dorsal raphe nucleus (DR), incrusted in the ventral periaqueductal gray. It also coincides with the appearance of another arc shaped neuronal group of 5-HR-IR cells, immersed among the fibers of the medial lemniscus, lateral to the interpeduncular nucleus, recognized as the B9 group (supralemniscal nucleus) (Fig. 2). More caudally, approximately 7.2 mm bp, the RLi is replaced by a bulkier cluster of 5-HT-IR cells, the caudal linear raphe nucleus (CLi). These cells are arranged in a scattered way, being traversed by the fibers of the decussation of the superior cerebellar peduncle. Lateral to CLi are the fibers of the tectospinal tract. Dorsally is successively found the medial longitudinal fasciculus, the nucleus of the oculomotor nerve and the DR, at this point exhibiting the lateral (DRL), ventral (DRV) and posterior (DRP) portions. Ventral to the CLi is the interpeduncular nucleus, lateral to which is the serotonergic grouping B9 (supralemniscal nucleus), characteristically located immersed in medial lemniscus (Fig. 3). Proceeding caudally, approximately 7.9 mm pb, the CLi is displaced dorsally and between it and the interpeduncular nucleus, already reduced in size, bringing up another 76 cluster of 5-HT-IR neurons, recognized as the median raphe nucleus (MnR). On each side of this, 5-HT-IR neurons, loosely arranged in vertical columns, constitute the paramedian raphe nucleus (PMnR). At this level, the B9 group is still present and the DR assumes larger dimensions, with all the subdivisions found in the previous section (Fig. 4). At the next level, in which the interpeduncular nucleus is completely replaced by the pontine nuclei, at approximately 8.5 mm pb, the CLi is no longer present, and all space in the midline ventral to the DR and dorsal to the pontine nuclei, is occupied by MnR and PMnR. At this level, which coincides with the presence of the nucleus of trochlear nerve (cranial pair IV), the DR assumes its largest dimensions. Laterally, dorsal to the medial lemniscus, there remains the B9 group (Fig. 5). At approximately 8.8 mm pb level, the setting is very similar except for the small size of B9 (Fig. 6). At approximately 9.2 mm pb, coincident with the appearance of tegmental nuclei in the periaqueductal gray, the DR appears to be size reduced with the DRD and DRV divisions, is followed ventrally by MnR and PMnR, and rare 5-HT-IR neurons composing the B9 are still present (Fig. 7). At the caudal limit of the superior colliculi, around 9.4 mm pb, the DR is still present, with the divisions DRD and DRV, and ventrally to it, the MnR and PMnR are located (Fig. 8). The MnR and PMnR extend to approximately 9.5 mm pb, along with DRD and DRV (Fig. 9). At pontine level, with reference to the presence of the nucleus of the abducens nerve (cranial pair VI), approximately 10.0 mm pb, we found some neurons in the DR, making its caudal portion (DRC), and ventral to this, we noted in the midline, a cluster of 5-HT-IR neurons, which we identify as the pontine raphe nucleus (PnR) (Fig. 10). More caudally, at approximately 10.3 mm pb, at level of the prepositus nucleus, we found the caudal pole of the DRC and, ventrally, there were clusters of 5-HT-IR neurons nuclei that make up the raphe interpositus nucleus (RIP) and the raphe magnus nucleus (RMg) nuclei (Fig. 11). RIP continues caudally to approximately 11.2 mm pb, along with RMg (Figs. 11, 12 and 13). At approximately 11.3 mm pb, the RMg appears alone and bulkier (Fig. 14). Approximately from 11.5 to 12.2 mm pb levels, when viewing the fibers of the facial nerve (cranial pair VII), the midline of the pons is occupied by a double vertical band of 5-HT-IR neurons, corresponding to its greater extent to the raphe obscurus nucleus (ROb), dorsally, and to a lesser extent, also the RMg, ventrally (Figs. 15, 16 and 17). At 77 12.0 mm pb level (Fig. 16) the RMg shows lateral extensions of 5-HT-IR neurons, dorsally to the pyramids, reaching higher volume from 12.8 mm to 13.7 mm pb levels (Figs. 18, 19 and 20). More caudally, at a length ranging from approximately 12.8 mm to 14.2 mm pb levels, besides the ROb and RMg, there is a small cluster of 5-HT-IR neurons, interposed between the pyramids, recognized as the raphe pallidus nucleus (RPa) (Figs. 18 to 22). The RPa, along with ROb, even extends to approximately 15.3 mm pb (Fig. 23) and ROb alone extends to the closed portion of the medulla oblongata, levels corresponding to the presence of the nuclei of cranial nerves hypoglossal (XII cranial pair) and vagus (X cranial pair), at approximately 16.6 mm pb (Figs. 24 and 25). 78 DISCUSSION By use of immunohistochemical technique to reveal the 5-HT-producing neurons, it was possible to analyze the distribution and topography of labeled neurons. Moreover, direct comparison with Nissl stained material in alternating sections, allowed to associate 5-HT-IR cells with respect cytoarchitectonic territories related or not the raphe nuclei in the rock cavy brainstem. The results revealed that the organization of this nuclear complex was essentially similar to what has previously been described in other mammals. By comparison with the organization of the rat brain (Paxinos and Watson, 2007), based on cytoarchitectonic references, we identified in the rock cavy, in rostrocaudal direction, the rostral linear raphe nucleus, the caudal linear raphe nucleus, the supralemniscal group (B9), the dorsal raphe nucleus, the median raphe nucleus, the paramedian raphe nucleus, the pontine raphe nucleus, the raphe interpositus nucleus, the raphe pallidus nucleus, the raphe magnus nucleus and the raphe obscurus nucleus. The serotonergic system in association with the raphe nuclei was also studied using immunohistochemistry for 5-HT in the brain of human and Macaca fascicularis primates, in which were identified in the rostral group, the dorsal raphe nucleus (B6 and B7), superior central (B8, B5 and B7 in part) and supralemniscal (B9) and the caudal group, consisting of the raphe magnus nucleus (B3), the raphe obscurus nucleus (B2) and raphe pallidus nucleus (B1) (Azmitia and Gannon, 1986; Hornung, 2003). In the marmoset brain was also identified the nuclei of the anterior group - caudal linear raphe nucleus, median raphe nucleus, dorsal raphe nucleus and pontine raphe nucleus, and the posterior group - raphe magnus nucleus, raphe obscurus nucleus and raphe pallidus nucleus, in addition extra-raphe serotonergic groups, such as the supralemniscal B9 group, a few serotonergic neurons in the interpeduncular nucleus, a substantial number of cells located lateral to median raphe nucleus, in the reticular formation of the caudal midbrain and rostral pons, in the bulbar reticular formation, nucleus prepositus and others (Hornung and Fritschy, 1988). The distribution, morphology and nuclear subdivisions were also studied with 5HT immunohistochemistry in the serotonergic system in the brains of a large number of African species, such as a large nocturnal rodent, the dog rat (Greater canerat) (Dwarika et al ., 2008), giraffe (Badlangana et al., 2007), the African gerbil (highveld gerbil, Tatera brantsii) (Moon et al., 2007), in two species of African mole rat (Cape dune mole rat, and Bathyergus suillus highveld mole rat, Cryptomys hottentotus pretoriae) (Da Silva et al., 79 2006; Bhagwandin et al., 2008; Bux et al., 2010), microchiroptera bats (Maseko and Manger, 2007; Kruger et al., 2010) and megachiroptera bats (Dell et al., 2010), rock hyrax (Maseko et al., 2007; Gravett et al., 2009), elephant shrew, a mammal of the order Macroscelidea (Pieters et al., 2010). In the brains of these species, the serotonergic neurons were grouped in a rostral cluster, mesencephalic-pontine and a caudal cluster, essentially bulbar. In the rostral group were included the caudal linear raphe nucleus as the most rostral cluster of 5-HT-IR cells, not reporting the existence of a rostral linear raphe nucleus, followed by group B9 (supralemniscal), the dorsal raphe nucleus and median raphe nucleus. The dorsal raphe nucleus is divided into six distinct subnuclei, called dorsal, interfascicular, ventral, lateral, and peripheral ones. In the caudal group was recognized the raphe magnus nucleus, the raphe pallidus nucleus, the raphe obscurus nucleus and rostral and caudal ventrolateral medullary groupings. The serotonergic system was also studied in two species of marsupials, the opossum (Didelphis virginiana, Martin et al., 1985) and the wallaby (Macropus eugenii, Ferguson et al., 1999). As was seen in eutherian mammals, the brainstem of these species contains groups of 5-HT-IR neurons in the midline: the rostral cluster, comprising the caudal linear raphe nucleus, median raphe nucleus, pontine raphe nucleus and dorsal raphe nucleus, neurons in the interpeduncular nucleus, and the caudal cluster, including the raphe magnus nucleus, the raphe pallidus nucleus and the raphe obscurus nucleus, as well as cells located more laterally, met in the B9 group, others located near the pedunculopontine tegmental nucleus, and ventrolateral medulla (Ferguson et al., 1999). Unlike the aforementioned authors, we identified in the rock cavy brainstem a small group of 5-HT-IR neurons located in the caudal pole of the rostral linear raphe nucleus. In our material, the dorsal raphe nucleus could be divided into dorsal, lateral, ventral, posterior and caudal parts, by analogy with established divisions in the dorsal raphe nucleus of rats by Paxinos and Watson (2007). With regard to lateralization, it is important to note that besides the B9 grouping, no other clusters apart from the midline, without continuity with the groups from the midline were found. Analyzing our results in comparison with literature data, we note that the organization of serotonergic neurons in the brainstem of the rock cavy is very similar to that found in other rodent species and even among mammals. Some small variations, many of which can be attributed to nomenclature criteria could be detected. This reinforces the suggestion that the serotonergic system is an ancient system of neurotransmitters and evolutionarily well conserved (Parent, 1981). 80 Previous studies have examined closed species of the order Rodentia (Moon et al., 2007) showing that differences in phenotype and life history does not lead to changes in nuclear complexity. Analyzing the diversity of species it is worth to note that the extent of evolutionary divergence is also not an indicator of differences in complexity of nuclear systems under study within the same order of mammals. Thus it is possible to conclude that whithin the order Rodentia, variations in phenotype, life history, lifestyle and brain size do not lead to changes in nuclear complexity of the serotonergic system. Thus this work represents a contribution in providing foundations for future investigations using the rock cavy as an experimental model aimed at increasing our understanding on the functional role of the serotonergic system. The results of this study, analyzed in light of previous studies, allow to conclude that the serotonergic system of the rock cavy consists of 11 nuclei, named in the rostrocaudal direction: the rostral linear raphe nucleus, the caudal linear raphe nucleus, the dorsal raphe nucleus, the median raphe nucleus, the paramedian raphe nucleus, the supralemniscal group (B9), the pontine raphe nucleus, the raphe interpositus nucleus, the raphe magnus nucleus, the raphe pallidus nucleus and the raphe obscurus nucleus. The raphe nuclei are distributed along the midline of the brainstem, from the caudal midbrain to the bulbospinal limit, except the B9 grouping, laterally situated. In general, the serotonergic raphe nuclei resemble the homonime nuclei of already found in other rodents studied, except the rostral linear, which is not mentioned as a serotonergic nucleus. 81 REFERENCES Azmitia, E.C., Gannon, P.J., 1983. 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