SELEÇÃODE FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE Tabebuia sp.

SELEÇÃODE FUNGOS ENDOFÍTICOS ISOLADOS DE Tabebuia sp.
I. M. SOUZA1, S. B. N AGOSTINI1, A. A. MENDES1, J. H. H. LUIZ1 e D. B. HIRATA1
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Universidade Federal de Alfenas, Instituto de Química
E-mail para contato: [email protected]
RESUMO – Fungos endofíticos isolados do ipê rosa podem ser uma fonte para possível
obtenção de lipases, sendo este o objetivo principal deste trabalho. Foram avaliados 148
fungos endofíticos isolados a partir das folhas e dos pecíolos da espécie Tabebuia sp. A
avaliação da atividade lipolítica foi realizada a partir da cultura fresca dos fungos em
placa contendo ABD. Uma suspensão de esporos em solução salina foi preparada e as
placas inoculadas e incubadas à temperatura de 28ºC em estufa BOD por uma semana.
Após esse prazo foi realizada a leitura das placas. Quatro fungos endofíticos se
destacaram por sua resposta positiva e foram utilizados em ensaios para produção de
lipase via fermentação submersa. Amostras foram retiradas de 12 em 12 horas para
análise de atividade lipolítica, pH e concentração celular. Dois fungos obtiveram
atividades relevantes dentre os meios de cultura avaliados e são candidatos promissores
a etapa de otimização do meio de produção.
1. INTRODUÇÃO
As espécies de Tabebuia são nativas de floresta tropical úmida e são capazes de biossintetizar
diversos produtos a partir de suas cascas sendo conhecidas popularmente como “taheebo”, “lapacho”,
“pau d’darco” ou “ipê”. Na medicina tradicional extratos de Tabebuia sp. são empregados para
tratamento de úlcera, sífilis, desordens gastrointestinais, câncer e alergias. Na literatura, os principais
constituintes químicos relatados nas cascas são as quinonas e os flavonóides (Budni et al., 2007).
Dentre os micro-organismos, os fungos são considerados o segundo maior grupo de organismos
no mundo, após os insetos, e se encontram mais frequentemente associados às plantas (Corrêa, 2010).
Há evidências da influência desses micro-organismos em diversas características expressas pela
planta, dentre as quais são citadas: a produção de hormônios de crescimento e antibióticos, a proteção
contra herbivoria (pela produção de alcalóides), entre outros. Há alguns anos, não se imaginava a
grande potencialidade dos endofíticos e por isso, apesar da descoberta desses micro-organismos no
interior das plantas, pouca importância foi dada a esse grupo. Hoje, além de se descobrir importantes
características envolvendo esses micro-organismos, sabe-se que aparentemente todas as plantas são
habitadas por uma comunidade endofítica, composta principalmente por fungos e bactérias. Esses
micro-organismos endofíticos colonizam praticamente todas as espécies de plantas, sendo potenciais
fontes de estudo das propriedades de interesse fora e dentro da planta. Além dos aspectos econômicos,
o estudo de micro-organismos endófitos tem forte interesse acadêmico, na descoberta de novas
espécies microbianas (Azevedo et al., 2000).
A vantagem de se trabalhar com micro-organismos é a possibilidade de se controlar os
processos operacionais de um modo relativamente simples. Os fungos crescem mais rapidamente e
utilizam um espaço menor para isso, quando comparado às plantas. Além disso, as condições de
cultivo (pH, temperatura, agitação, nutrientes, etc.) podem ser alteradas a fim de aumentar e/ou
direcionar a produção de metabólitos de interesse (Guimarães et al., 2006). Outras vantagens podem
ser citadas, tais como a possibilidade de estocagem das culturas por longos períodos de tempo, o
cultivo em grandes tanques de fermentação, podendo produzir uma grande quantidade de metabólitos
com atividade e a possibilidade de serem modificados geneticamente (Kharwar et al., 2011).
Além da grande habilidade em produzir metabólitos secundários, os fungos endofíticos
apresentam capacidade de produzir enzimas extracelulares como amilases (Sumita et al., 2012),
lipases (Torres et al., 2003) e proteases (Li et al., 2013), as quais são amplamente utilizadas nos
setores industriais e tecnológicos (Silveira et al, 2016). Recentemente muitos pesquisadores voltaram
sua atenção para estudos destes fungos produtores de enzimas que apresentam inúmeras aplicações
(Corrêa, et al., 2014). Considerando os motivos expostos, a busca por lipases, produzidas por fungos
endofíticos, é de grande interesse e constitui o objetivo do presente trabalho.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Amostra vegetal
As folhas maduras de Handroanthus impetiginosus, (Mart. ex DC) Mattos foram coletadas
depois de iniciada a floração. A identificação da planta foi efetuada pela profa. Dra. Lúcia G.
Lohmann, do Departamento de Botânica, do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo.
Coletou-se material de um exemplar na zona rural (S21o18’49.15’’, W45o57’28.53’’), no município
de Alfenas–MG. Foi depositada exsicata no herbário da Universidade Federal de Alfenas, sob número
de registro 2650. Procurou-se selecionar folhas aparentemente saudáveis e sem estarem danificadas
por insetos.
2.2. Isolamento dos fungos endofíticos
Todo o procedimento de desinfecção da amostra e inoculação inicial foi adaptado a partir das
preconizações feitas por Araújo (2010). As folhas e os pecíolos foram bem lavados sob água corrente
e postos para secar a sombra e temperatura ambiente.
Em ambiente estéril, sob fluxo laminar, procedeu-se a desinfecção do material, com a finalidade
de se eliminar os micro-organismos epifíticos. As folhas e pecíolos foram mergulhados
suscetivelmente em álcool 70°, durante 1 minuto, em solução comercial de hipoclorito de sódio,
durante 6 minutos e em um recipiente contendo álcool 70°, por mais 1 minuto. Em seguida foram
agitados brevemente em 2 recipientes contendo água destilada estéril, para remoção das soluções de
desinfecção. Uma alíquota de 100 µL da última água de lavagem foi inoculada em ágar batata
dextrose (ABD) acrescido de cloranfenicol 0,1 g.L-1 e incubada em estufa BOD a 28°C, para servir
como controle da eficácia da desinfecção.
O excesso de água foi removido do material e com auxílio de bisturi estéril, as folhas foram
cortadas de forma a serem obtidos fragmentos de 0,5 x 0,5 cm aproximadamente. Os pecíolos foram
cortados transversalmente, resultando em fragmentos circulares de 2-3 mm de espessura. Foram
obtidos 140 fragmentos, os quais foram então transferidos para placas de Petri contendo ágar batata
dextrose acrescido de cloranfenicol 0,1 g.L-1, onde previamente havia sido feita a identificação dos
pontos que receberiam os fragmentos. As placas foram incubadas em estufa BOD a 28°C.
No quinto dia de incubação foi realizado o primeiro repique das colônias crescidas a partir dos
fragmentos. Cada colônia foi repicada para um tudo inclinado contendo ágar batata dextrose e os
tubos foram incubados a 28°C. Diariamente os tubos foram observados para verificar se apenas uma
colônia havia crescido. Nos tubos em que houve o crescimento de mais de uma colônia, a colônia
mais próxima ao local de inóculo foi novamente repicada para tubo inclinado contendo o mesmo
meio, e assim, sucessivamente, até a obtenção de colônias isoladas e purificadas.
2.3. Seleção de fungos produtores de lipase
A verificação da capacidade de produzir lipases foi realizada para todos os fungos endofíticos
isolados a partir das folhas e dos pecíolos da planta. Uma suspensão de esporos em solução salina foi
preparada a partir da cultura fresca dos fungos em placa contendo meio ABD. Cinco microlitros da
suspensão de esporos, foram inoculados na superfície de meio próprio para pesquisa de atividade
lipolítica, constituído por peptona (1% m/v), NaCl (0,5% m/v), CaCl2 (0,1% m/v), ágar (1,5% m/v),
tween 20 (1,0% v/v) e o volume completado para 1L de água destilada. As placas inoculadas foram
incubadas à temperatura de 28ºC em estufa BOD por uma semana. O procedimento descrito foi
realizado em triplicata. Após esse tempo, realizou-se a leitura do halo formado pelos fungos
produtores de lipase nas placas e a atividade enzimática foi determinada por meio do cálculo de Pz,
sendo os resultados classificados em amostras negativas (Pz=1), amostras com atividade moderada
(Pz maiores que 0,64) e amostras altamente positivas (Pz menores que 0,64). Isto é, quanto menor o
valor Pz, maior a atividade lipolílica do fungo. Os fungos que apresentaram os menores valores de Pz
foram selecionados para a etapa de fermentação submersa.
2.4. Etapa de fermentação submersa
O processo fermentativo ocorreu em shaker por 72h, 28°C e 250 rpm. As amostras foram
retiradas em duplicata de intervalos de 12h para a análise da atividade hidrolítica da lipase produzida,
concentração celular e pH. O meio de cultivo foi constituído por um meio basal contendo uma fonte
de carboidrato, nitrogênio e sais minerais: peptona (2% m/v), MgSO4 (0,05% m/v), extrato de
levedura (0,1% m/v) e óleo de oliva (1,5% m/v).
A atividade lipolítica da enzima foi determinada pelo método de hidrólise do azeite de oliva
emulsificado (SOARES et al., 1999).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Na etapa de isolamento foram obtidos 148 fungos endofíticos isolados a partir das
folhas e dos pecíolos do ipê-rosa.
Todos os fungos isolados foram submetidos ao teste em placa para verificação da
capacidade dos mesmos em produzir lipases. Assim, os 148 fungos isolados foram
devidamente classificados de acordo com a presença, tamanho ou ausência do halo em volta
da colônia. Verificou-se que 75 fungos apresentaram atividade lipofílica moderada, 69 não
apresentavam halos e somente quatro fungos apresentaram alta atividade lipolítica (C.1.5.a,
A.26.3.b, C.5.3.b e C.8.4.a), sendo estes selecionados para a etapa de fermentação submersa.
A fermentação submersa foi realizada no intuito de se verificar a capacidade dos
micro-organismos selecionados para a produção de lipases extracelulares. Foi utilizando
um meio de cultivo basal, contendo carboidrato, nitrogênio e sais minerais, já em utilização
no Laboratório de Bioprocessos (UNIFAL-MG) para a produção de lipase por fermentação.
Para os quatros fungos testados, apenas dois deles foram capazes de produzir
lipases extracelulares para o meio de cultivo utilizado (Figura 1).
O maior valor de atividade hidrolítica de 3,9 U/mL foi obtido em 60 h de
fermentação para o fungo C.1.5.a (Figura 1a). Verificou-se que o perfil de crescimento
celular acompanhou o perfil de produção da lipase, significando que a produção da enzima
está associada ao crescimento do micro-organismo. Isto já era esperado uma vez que a
única fonte de carbono presente no meio era também o indutor de lipase, o óleo de oliva.
Observou que o pH aumentou ao longo da fermentação, em decorrência da
degradação das fontes de nitrogênio presentes no meio de cultivo.
O fungo C.5.3.b apresentou uma atividade hidrolítica de 1,42 U/mL em 48 h de
fermentação. A concentração celular aumentou ao longo da fermentação, embora a
atividade hidrolítica detectada no meio de cultivo tenha sido baixa. Neste caso pode-se
deduzir que o micro-organismo é produtor de mais de um tipo de lipase, uma extracelular e
outra na membrana celular, pois ele foi capa de hidrolisar o óleo de oliva para o
crescimento celular (Torres et al., 2003)
Os outros fungos testados não apresentaram bons resultados para a produção de
lipase extracelular com o meio de cultivo utilizado, obtendo-se atividade lipolítica
insignificante. Entretanto, ambos foram capazes de metabolizar o óleo de oliva para
crescimento celular, demostrando desta forma que o micro-organismo produz lipases na
membrana celular (Torres et al., 2003).
A identificação por DNA dos quatro fungos já se encontra em andamento e assim
espera-se que isto venha a facilita a otimização dos componentes do meio de cultivo para as
linhagens isoladas C.1.5.a e C.5.3.b.
Figura 1 – Perfil de concentração celular (g/L) (●), atividade hidrolítica (U/mL) (■) e pH (Δ) para
fermentação submersa ao longo do tempo a 28°C e 250 rpm. (a) C.1.5.a; (b) C.5.3.b; (c) A.26.3.b, (d)
C.8.4.a
4. CONCLUSÃO
Obteve-se 148 fungos isolados do ipê-rosa, entretanto apenas quatro apresentaram uma elevada
atividade lipolítica para os testes de produção de lipase realizados em placa. Dentre esses quatro
fungos apenas duas espécies obtiveram um bom desempenho em fermentação submersa para a
produção de lipases extracelulares. Para estes, um estudo de otimização do meio de cultivo deverá ser
realizado visando aumentar a quantidade de enzimas produzidas.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à FAPEMIG, a UNIFAL-MG, ao CNPq (Processo 232522/2014-6) pelas
bolsas concedidas e ao CNPq (Processo 455845/2014-0) pelo suporte financeiro.
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