EFEITOS DE ALGUNS TENSOATIVOS SOBRE A VIABILIDADE

UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
NAIDILENE CHAVES AGUILAR
EFEITOS DE ALGUNS TENSOATIVOS SOBRE A
VIABILIDADE CELULAR DE LINHAGENS
CELULARES DE CÂNCER DE PULMÃO.
VITÓRIA
2011
NAIDILENE CHAVES AGUILAR
EFEITOS DE ALGUNS TENSOATIVOS SOBRE A
VIABILIDADE CELULAR DE LINHAGENS
CELULARES DE CÂNCER DE PULMÃO.
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia
da
Universidade
Federal do Espírito Santo, como
requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Biotecnologia, na
área de concentração em Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Ian Victor Silva.
VITÓRIA
2011
2
“Bom mesmo é ir a luta com determinação,
Abraçar a vida com paixão,
perder com classe e vencer com ousadia,
porque o mundo pertence a quem se atreve
e a vida é muito boa para ser insignificante.”
(Charles Chaplin)
3
AGRADECIMENTOS
Á Deus, companhia constante em minha vida, que me consola me guia e me faz
acreditar no caminho que escolho a cada dia, me ensinando o silêncio da razão,
equilibrando minha emoção e fortalecendo minha fé. Obrigada meu Deus por
nunca facilitar minha caminhada, me ensinando a saltar pelos obstáculos.
Aos meus pais, Vicente e Nadia, amor inexplicável, á minha irmã Layla, pelas
diferenças somos partes iguais, te amo muito. Aos meus avós Antônio, Davina e
Julia, por esse amor grandioso que me aquece e faz de mim continuidade. A
sempre presente tia Lilian por nunca me faltar, você é especial.
As minhas amigas irmãs, que escolhi não por afinidade, mas pelas divergências,
não foram poucas as vezes que discordamos umas das outras, mas é a
individualidade de vocês que me completa, a Shiara, Fernanda, Cybelle, Izabella e
Joyce, distantes, mas nunca ausentes obrigada meninas, cada lágrima, cada
sorriso, cada dúvida foi com vocês que eu dividi, amo vocês.
Aos grandes amigos Viviane e Renan que conviveram comigo os momentos
difíceis dessa caminhada tornando meus dias mais suaves e divertidos, juntos
aprendemos que convivência e cooperação constroem a amizade que se confia,
obrigada pela paciência.
A todos que fizeram parte desses últimos dois anos e que fazem parte das minhas
melhores lembranças, a minha amiga Tamires a todos os amigos do laboratório,
Priscila e Gabriela e ao professor Ian que me recebeu de braços abertos, muito
obrigada por tudo. Sem todos vocês essa vitória não teria o mesmo significado.
4
RESUMO
O carcinoma de pulmão (CP) representa um grande desafio à saúde mundial,
configurando-se como a principal causa mortis por câncer entre homens e
mulheres no Brasil. A história natural da doença inclui elevada letalidade e
evolução agressiva, quase sempre com o paciente chegando ao médico quando a
doença já se encontra em fase avançada. A incidência desta doença tem o seu
auge entre as idades de 55 e 65 anos. A ocorrência do câncer de pulmão está
intrinsecamente associada à exposição a agentes carcinogênicos, de forma que
90% dos casos estão associados ao fumo ativo. Neste sentido, este trabalho
avaliou a viabilidade de linhagens tumorais frente a testes com quatro tipos de
drogas diferentes.
Recentemente, várias experiências foram realizadas com fármacos que inibem
seletivamente a disseminação de células tumorais, mas não têm nenhum efeito
sobre o crescimento primário (ROSSO et al.,1969). A presente comunicação esta
de acordo com experimentos realizados para estudar o efeito anti metastático de
algumas drogas na disseminação do tumor. Sendo assim, nosso estudo
experimenta
utilizar os
tensoativos, Triton®
X-100
(Sigma), Tween®
20
(BioAgency), SDS (Vetec) e CDs (Sigma) em concentrações variadas, com
objetivo de avaliar a viabilidade celular. Nesse estudo utilizamos duas linhagens
celulares tumorais a H460 e A549, classificadas respectivamente como carcinoma
de células grandes e adenocarcinoma. A triagem das substâncias com potencial
efeito citotóxico foi feita através do teste colorimétrico utilizando MTT (3 - (4, 5dimetil-2-y1) 2, 5-difenil brometo de tetrazólium), descrito por Mosmann (1983).
Os resultados demonstraram variações na viabilidade celular apresentadas pelas
linhagens em estudo quando tratadas com os diferentes tipos de drogas,
resultando numa viabilidade proporcional ao tipo e concentração da droga. Foi
levado em consideração as diferentes classes e estruturas químicas das
5
substâncias testadas para discutir os diferentes resultados encontrados bem como
as diferentes linhagens. O SDS destacou se com maior efeito citotóxico e a CD
com o menor ou nenhum efeito nas mesmas condições, o Tween 20 e o Triton
X-100 obtiveram efeitos semelhantes com o Triton X-100 acarretando maior
redução da viabilidade celular.
Palavras-chave: Carcinoma de Pulmão. MTT. Tensoativos. Viabilidade celular.
6
ABSTRACT
The Lung Carcinoma (LG) represents the major challenge to the global health,
becoming the leading cause of death by cancer among men and women in Brazil.
The natural history of the disease includes high mortality rates and aggressive
evolution, often with the patient coming to the doctor when the disease is already
advanced. The incidence of this disease has its peak between the ages of 55 and
65 years old. The occurrence of lung cancer is intrinsically linked to the exposure
to carcinogens, so that 90% of the cases are associated with active smoking. Thus,
this study evaluated the feasibility of tumor lines through tests with four types of
drugs of different classes.
Recently, several experiments were performed with drugs that selectively inhibit
the spread of tumor cells but have no effect on primary growth (Ross et al., 1969).
This communication is in agreement with experiments performed to study the effect
anti-metastatic of some drugs on the tumor spread. Thus, our study experiments to
use the surfactants, Triton® X-100 (Sigma), Tween® 20 (BioAgency), SDS (Vetec)
and CDs (Sigma) in varying concentrations, in order to evaluate cell viability. In this
study we used two tumor cell lines, the H460 and A549, respectively classified as
large cell carcinoma and adenocarcinoma. The screening of the substances with
potential cytotoxic effect was done by the colorimetric test using MTT (3 - (4, 5dimethyl-2-y1) 2, 5-diphenyl tetrazolium bromide), as described by Mosmann
(1983).
The results showed variations in cell viability shown by the strains under study
when treated with different types of drugs resulting in a viability proportional to
the type and concentration of the drug. He was taken into consideration the
different classes and chemical structures of the substances tested to discuss the
different results and different strains. The SDS showed greater cytotoxic effect and
the CD
with the
lowest or
no
effect
under
the
same
7
conditions, Tween 20 and Triton X-100 had similar
effects,
with
Triton
X-
100 getting a greater reduction in cell viability.
Keywords: Lung carcinoma. MTT. Surfactants. Cell viability.
8
LISTA DE SIGLAS
AJCC - “American Joint Committee on Cancer”
ATCC - “American Type Culture Collection”
CP - “Carcinoma de pulmão”
CMC - “Concentração Micelar Critica”
CAS - “Chemical Abstract Service”
CDs - “Ciclodextrinas”
EGFR - “Epidermal Growth Factor Receptor”
FDA - “United States Food and Drug Administration”
FHIT - “Fragile histidine Triad”
INCA - “Instituto Nacional de Câncer”
NSCLC - “Non-Small Cell Lung Cancer”
NCI - “National Cancer Institute”
PBS - “Phosphate Buffered Saline”
SDS - “Dodecil Sulfato de Sódio”
SCLC - “Small Cell Lung Cancer”
TX-100 - “Triton X - 100”
TW-20 – “Tween-20”
9
LISTA DE FUGURAS
FIGURA 01- Estrutura química do Triton X- 100.
FIGURA 02- Estrutura química do Tween 20.
FIGURA 03- Estrutura química do Dodecil Sulfato de Sódio.
FIGURA 04- Estrutura química das α, β e γ ciclodextrinas.
FIGURA 05- Placa com as linhagens de células antes do tratamento com as
substâncias.
FIGURA 06- Resultado da viabilidade celular da linhagem H460 tratadas com
Tween 20 e Triton X-100.
FIGURA 07- Resultado da viabilidade celular da linhagem H460 tratadas com CDs
e SDS.
FIGURA 08- Resultado de viabilidade celular da linhagem A549 tratadas com
Triton – 100 e SDS.
FIGURA 09- Resultado de viabilidade celular da linhagem A549 com tween 20 e
CDs.
10
LISTA DE TABELAS E GRÁFICOS
TABELA 01- Definição do sistema de estadiamento TNM.
TABELA 02- Estadiamento do câncer de pulmão.
TABELA 03- Descrição das condições de tratamento dentro da placa.
TABELA 04- Descrição das condições de tratamento do ensaio de Bradford dentro
da placa.
TABELA 05- Avaliação da variância entre as concentrações de tratamento com
CD na linhagem H460.
TABELA 06- Avaliação da variância entre as concentrações de tratamento com
Tween 20 na linhagem H460.
TABELA 07- Avaliação da variância entre as concentrações de tratamento com
TX-100 na linhagem H460.
TABELA 08- Avaliação da variância entre as concentrações de tratamento com
SDS na linhagem H460.
TABELA 09- Avaliação da variância entre as concentrações de tratamento com
CD na linhagem A549.
TABELA 10- Avaliação da variância entre as concentrações de tratamento com
Tween 20 na linhagem A549.
TABELA 11- Avaliação da variância entre as concentrações de tratamento com
TX-100 na linhagem A549.
TABELA 12- Avaliação da variância entre as concentrações de tratamento com
SDS na linhagem A549.
GRÁFICO 01- Modelo de viabilidade em função da concentração de droga na
linhagem H460.
GRÁFICO 02- Modelo de viabilidade em função da concentração de droga na
linhagem A549.
GRÁFICO 03- Médias de todas as concentrações entre H460 e A549.
GRÁFICO 04- Médias dos índices de tratamentos na linhagem H460.
GRÁFICO 05- Médias dos índices de tratamentos na linhagem A549.
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................13
2 REVISÃO DE LITERATURA...............................................................................16
2.1 CARCINOMA DE PULMÃO..............................................................................16
2.2 ESTADIAMENTO DE NSCLC..........................................................................26
2.3 TESTES DE MTT, VIABILIDADE E PROLIFERAÇÃO CELULAR ..................30
2.4 AVALIAÇÕES DAS SUBSTÂNCIAS UTILIZADAS...........................................32
2.4.1 Triton X-100 ..................................................................................................32
2.4.2 Tween 20 ......................................................................................................34
2.4.3 Dodecil sulfato de sódio (SDS) .....................................................................35
2.4.4 Ciclodextrinas (CDs) .....................................................................................37
3 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................39
4 RESULTADOS....................................................................................................49
5 DISCUSSÃO........................................................................................................60
6 CONCLUSÕES....................................................................................................67
7 REFERÊNCIAS...................................................................................................69
12
1 INTRODUÇÃO
O câncer de pulmão é o mais comum de todos os tumores malignos, apresentando
um aumento de 2% por ano na sua incidência mundial. Na maioria dos casos
diagnosticados está associado ao consumo de derivados de tabaco representando
uma das neoplasias mais frequentes na atualidade, (INCA, 2010) sendo responsável
pela maior taxa de mortalidade por malignidade em ambos os gêneros. Nos EUA,
constitui a principal causa de morte por neoplasia (representa cerca de 28% das
mortes por neoplasia/ano). Em Portugal, estima-se uma incidência de 34/100.000,
com 28/100.000 para o gênero masculino e 6/100.000 para o gênero feminino. A
incidência desta doença tem o seu auge entre as idades de 55 e 65 anos. A
ocorrência do câncer de pulmão está intrinsecamente associada à exposição a
agentes carcinogênicos, de forma que 90% dos casos estão associados ao fumo
ativo ou passivo. Boa parte do percentual restante deriva da exposição ocupacional
a carcinógenos, como o asbesto, metais pesados, alcatrão, dentre outros. Isso faz
deste tipo de câncer uma doença essencialmente evitável pelo combate à prática do
tabagismo ou da proteção ocupacional adequada (ALBERG et al., 2007).
O CP apresenta índices de sobrevida e cura dos mais baixos quando comparados a
tumores que acometem outros órgãos (JEMAL et al., 2009), o que se deve, em
parte, à ausência de ferramentas de diagnóstico precoce (HIRSCH et al., 2002).
Apesar de ser menos frequente que os cânceres de próstata e mama, o câncer de
pulmão apresenta uma letalidade muito superior a esses tipos de tumor, com
sobrevivência de apenas 16% dos pacientes após 5 anos do diagnóstico, contra
95% e 90% de sobrevida dos tumores de próstata e mama, respectivamente
(JEMAL et al., 2009). Em contrapartida, cerca de 76% dos pacientes de câncer de
pulmão são diagnosticados em estágios avançados da doença, contra 5% do câncer
de próstata, por exemplo, o que denota uma forte relação entre a dificuldade de
diagnóstico precoce e a mortalidade da doença (HIRSCH et al., 2002; JEMAL et al.,
2009).
Assim, muito frequentemente, os pacientes quando diagnosticados já se
encontram em estágios avançados da doença, não podendo ser submetidos à
cirurgia curativa, dado a extensão do comprometimento do aparelho respiratório,
restando-lhes a radio ou a quimioterapia, cujos benefícios, por vezes, não
13
compensam os
riscos, colocando
esses
pacientes
fora
de possibilidades
terapêuticas.
Embora exista um grande número de agentes quimioterápicos, a eficácia destes
agentes para o tratamento do câncer ainda está distante de ser alcançada. Vários
fatores como: a heterogeneidade da doença que compreende cerca de 100 tipos de
cânceres e a resistência intrínseca ou adquirida aos quimioterápicos depois de
pouco tempo de tratamento dificultam o uso de apenas um agente quimioterápico
(COZZI et al., 2004). Um dos grandes desafios do tratamento do câncer deriva do
fato da doença ser causada por células do próprio organismo, que fugiram ao
controle homeostático. Isso dificulta o desenvolvimento de terapias que sejam
seletivamente tóxicas às células tumorais (ALBERTS et al., 2008). Assim,
alternativas terapêuticas seguras e eficazes devem ser intensivamente buscadas
para preencher essas lacunas.
Recentemente, várias experiências foram realizadas com fármacos que inibem
seletivamente a disseminação de células tumorais, mas não têm nenhum efeito
sobre o crescimento primário (ROSSO et al.,1969). A presente comunicação esta de
acordo com experimentos realizados para estudar o efeito anti metastático de
algumas drogas na disseminação do tumor. Sendo assim, nosso estudo experimenta
utilizar os tensoativos, Triton® X-100 (Sigma), Tween® 20 (BioAgency), SDS (Vetec)
e CDs (Sigma) em concentrações variadas, com objetivo de avaliar a viabilidade
celular tumoral das linhagens celulares H460 e A549, classificadas respectivamente
como carcinoma de células grandes e adenocarcinoma.
A triagem das substâncias com potencial efeito citotóxico foi feita através do teste
colorimétrico utilizando MTT( 3 - (4, 5-dimetil-2-y1) 2, 5-difenil brometo de
tetrazólium), descrito por Mosmann (1983). O teste de MTT tem sido amplamente
utilizado como um método rápido e sensível para a triagem de drogas anticâncer,
bem como para a avaliação da citotoxicidade de materiais. A reprodutibilidade do
teste de MTT foi estudada neste trabalho em primeiro lugar nas comparações das
amostras onde foram realizadas tanto dentro das placas, como entre as mesmas. O
teste de significância é utilizado para analisar os dados e as diferenças estatísticas
14
entre todas as linhagens comparadas. O número de células viáveis nos poços da
microtitulação pode ser lido por um leitor de ELISA, que oferece grandes vantagens
na velocidade, simplicidade, custo e segurança (DENIZOT & LANG, 1986). O MTT
foi demonstrado como método sensível, preciso, conveniente, rápido e econômico
por muitos outros estudos (MOSMANN, 1983).
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CARCINOMAS DE PULMÃO
Hoje, o câncer do pulmão é uma doença neoplásica comum e a mais mortal em todo
o mundo. É o mais frequente tipo de câncer e sua incidência continua aumentando,
principalmente entre as mulheres. É a principal causa de morte, por neoplasia, entre
homens e mulheres, em todo o mundo. (ZAMBONI, 2002)
O número estimado de novos casos de câncer de pulmão no Brasil em 2010 foi de
17.800 entre homens e de 9.830 mulheres (risco estimado de 18 casos novos a
cada 100 mil homens e 10 a cada 100 mil mulheres). (INCA, 2010) O CP entre os
homens é o segundo mais frequente no Sul (35/100.000), Sudeste (21/100.000) e
Centro-Oeste (16/100.000). Nas regiões Nordeste (9/100.000) e Norte (8/100.000) é
o terceiro mais comum. Entre as mulheres, é o quarto mais frequente no Sul,
Sudeste, Centro-Oeste e Norte. (INCA, 2010) O CP ocorre, na maioria dos casos,
em indivíduos idosos, por volta de dois a cada três pacientes diagnosticados com
CP possui idade superior a 65 anos, ao passo que menos de 3% de todos os casos
ocorrem em pessoas com menos de 45 anos. (AMERICAN CANCER SOCIETY,
2010)
Para o planejamento terapêutico torna se determinante subdividir o câncer de
pulmão em carcinoma pulmonar de células não pequenas (NSCLC, “non-small cell
lung cancer”) e carcinoma pulmonar de células pequenas (SCLC, “small cell lung
cancer”.) (ALVES & SILVA, 2008; SOTTO-MAYOR, 2001) Caso o tumor apresente
características de ambos os tipos histológicos é então denominado “carcinoma misto
de células pequenas/células grandes” (“mixed small cell/large cell cancer”), fato
bastante incomum (AMERICAN CANCER SOCIETY, 2010). No CP de SCLC, as
células aparecem pequenas e redondas quando vistas sob o microscópio, é o
menos comum, ocorrendo em 15% de todos os casos.
Cerca de 85-90% das pessoas diagnosticadas com câncer de pulmão tem NSCLC
(AMERICAN CANCER SOCIETY, 2008) que é definido como um grupo histológico
(tipos de tumores diferenciados pela estrutura celular). Os tipos histológicos mais
16
comuns em NSCLC são escamosas (ou epidermóides), adenocarcinoma e o
carcinoma de grandes células. (STRAUSS et al., 2007)
No NSCLC o adenocarcinoma é o tipo mais comum de câncer de pulmão
contabilizando 40% dos casos de CP com crescente incidência. É mais comum entre
mulheres e não fumantes. Ele tende a originar ao longo das bordas exteriores do
pulmão nas vias aéreas menores, muitas vezes se espalhando para os espaços
entre os pulmões e a parede torácica, e sua localização típica facilita a detecção
precoce. (NCI, 2008) Em relação ao carcinoma de células escamosas, este é
geralmente encontrado nas células centrais dos brônquios, nos ramos maiores da
árvore brônquica. É responsável por 30% dos CP, mais comumente associado aos
homens e fumantes. É o mais fácil de detectar precocemente, uma vez que suas
células distintas são susceptíveis de aparecer nos testes das amostras de muco, ele
se espalha de forma relativamente lenta e muitas vezes não se espalhou para fora
dos pulmões no momento do exame. (NCI, 2008). O carcinoma de grandes células
apresentam células anormais que tendem a se originar ao longo das bordas
externas dos pulmões. É o tipo menos comuns de CP de NSCLC contabilizando 1015% dos casos de CP. No entanto, este tipo de tumor tem uma forte tendência a se
espalhar para os nódulos linfáticos próximos e distantes. (NCI, 2008) mas sua
frequência tem declinado, em parte, devido a melhores técnicas de diagnóstico, em
que passa a ser categorizado em adenocarcinoma ou carcinoma de células
escamosas.
O CP de SCLC é a forma mais agressiva da doença, é também chamado de câncer
da célula de aveia, pois, sob um microscópio, as suas células se assemelham a
grãos de aveia. Como o CP de células escamosas, esse tipo de câncer geralmente
origina nos grandes brônquios centrais. Ele se espalha rapidamente, muitas vezes
antes que os sintomas apareçam, tornando-se particularmente ameaçador. Na
verdade, até 75% dos pacientes com este tipo de câncer têm doença metastática no
momento em que é diagnosticado. Ele frequentemente se espalha (metastatiza)
para o fígado, ossos e cérebro. Embora a resposta à quimioterapia, o CP de
pequenas células raramente possui cura, pois geralmente não é descoberto antes
que espalhe. (Revisado em WALKER, 2008)
17
O CP é a principal causa de morte por câncer em homens e mulheres nos Estados
Unidos, apesar de sua incidência ser menor do que o câncer de próstata nos
homens e o câncer da mama nas mulheres. Com 166.000 óbitos em 2008, a soma
total de mortes por CP ultrapassa os de câncer de próstata, mama e cólon
combinado (JEMAL et al., 2008). Próstata, mama e carcinoma colo retal,
demonstraram melhora significativa na sobrevida em 5 anos ao longo do tempo e
estão atualmente em 99, 88, e 64%, respectivamente. Em contraste, a taxa de
sobrevida em 5 anos para o câncer de pulmão manteve-se relativamente estável em
15%. Há várias explicações possíveis para a disparidade entre a sobrevivência de
câncer de pulmão e de outros tumores comuns, incluindo a detecção tardia e a
heterogeneidade histológica. Atualmente, mais de 75% dos diagnósticos de câncer
de pulmão são feitos em pacientes apresentando metástase distal ou regional.
(JEMAL et al., 2006) Histologicamente, carcinomas da próstata, mama e colo-retal
são uniformemente adenocarcinoma e o tratamento é essencialmente determinado
pela fase clínica, às vezes modificada através dos resultados de testes moleculares
(PAIK et al., 2004; ROMOND et al.,2005). Em contraste, apenas 40% dos
carcinomas de pulmão é adenocarcinoma. No entanto até recentemente, os
cânceres de NSCLC (escamoso, de grandes células e adenocarcinoma) eram
tratados da mesma forma, independentemente da heterogeneidade biológica
associados com a histologia.
É provável que o pobre histórico de resposta do CP ao tratamento, em parte, seja
atribuído a uma abordagem relativamente homogênea de uma doença heterogênea.
Os esforços em curso estão em andamento para identificação clinica de relevantes
propriedades biológicas dos tumores que facilitará a individualização do tratamento
do CP.
Por 40 anos, o tratamento cirúrgico padrão para o câncer de pulmão em estágio
inicial era a lobectomia sempre que possível. (CHURCHILL et al.,1950) Terminada a
lobectomia, 80% dos pacientes com NSCLC em estágios iniciais experimentavam
sobrevida de 5 anos, livres do câncer. (THOMAS et al., 1990) Em uma tentativa de
preservar a função pulmonar, em 1973 Jensik e colegas (JENSIK et al., 1973) foram
18
os primeiros a sugerir que a ressecção (segmentectomia) poderia ser uma opção
adequada para este estágio da doença, sendo defendida a ressecção como o
tratamento
adequado
para
pacientes
com
NSCLC.(JENSIK
et
al.,
1979;
PASTORINO et al., 1991) As vantagens teóricas das quais o procedimento pretendia
alcançar incluem a preservação da função pulmonar, diminuição da mortalidade e
morbidade cirúrgicas, e a capacidade do paciente de se submeter a ressecções
mais no futuro, se um segundo CP vier a desenvolver. (JACOBSON et al., 1976)
Portanto o tratamento mais eficaz disponível atualmente para NSCLC ainda é a
ressecção cirúrgica, contudo, mais de 70% dos pacientes possuem doença
avançada com metástases nodais e/ ou viscerais no momento do diagnóstico, o que
impossibilita a ressecção. (Revisado em LANTUÉJOUL et al., 2009) Dessa forma,
para que a taxa de sobrevivência de pacientes com CP aumente, faz-se necessário
um maior entendimento dos eventos moleculares que levam ao surgimento do CP,
buscando identificar marcadores genéticos implicados na progressão tumoral, e
assim possibilitar a detecção precoce com o desenvolvimento de estratégias
terapêuticas específicas, permitindo um tratamento mais individualizado.
O CP se desenvolve através de etapas sequenciais morfológicas, com o acúmulo de
várias alterações genéticas e epigenéticas que afetam ambos os genes, supressores
tumorais e oncogenes. A progressão do ciclo celular precisa ser devidamente
regulada, para isso, as células têm mecanismos internos complexos e minuciosos,
como pontos de controle do ciclo celular, para manter a integridade do genoma.
(OSADA & TAKAHASHI, 2002) As anormalidades genéticas inclui ainda a perda de
heterozigose, alterações em microssatélites (WISTUBA et al., 1997), amplificação de
MYC (GAZZERI et al., 1994), expressão de Bcl2 (JIANG et al., 1996; revisado em
Kirkin; Joos; Zörnig, 2004), mutações em oncogenes RAS, em p53 (Revisado em
HECHT, 2008), RB (BURKE et al., 2005), p16 (Revisado em BRAMBILLA, et al.
2009) genes supressores tumorais FHIT (KIM et al., 2006, JOANNES et al., 2010),
expressão da atividade de telomerase (HIYAMA et al., 1995), dentre outros. Entre
45-75% de NSCLCs apresentam mutação em p53 (HAINAUT; PFEIFER, 2001), um
gene supressor tumoral considerado “o guardião do genoma”. Uma vez que o gene
p53 esteja mutado ou deletado, as células tornam-se suscetíveis ao dano no DNA e
ao descontrole do crescimento celular. É amplamente reconhecido que substâncias
19
cancerígenas presentes no cigarro estão profundamente envolvidas nestas múltiplas
alterações genéticas, principalmente através da formação do DNA. (OSADA &
TAKAHASHI, 2002) Dentre as alterações dos supressores tumorais, a mutação do
gene p53 é o evento genético mais frequente (GREENBLATT et al., 1994; SOUSSI
et al., 2000). Alterações nesse gene e consequente aumento do produto do mesmo
em canceres, incluindo o de pulmão, mama, cólon, esôfago e câncer de pele, é
considerado uma das características genéticas comuns entre os canceres.
(STARZYNSKA et al., 1992; ISOLA et al., 1992; MOCH et al., 1997) A mutação no
p53 esta associada ao domínio altamente conservado de ligação ao DNA, deixando
a célula suscetível ao descontrole do crescimento e proliferação, assim como
também impedindo o reparo do DNA, morte celular programada, e outras reações de
proteção ao estresse celular e danos ao DNA. As causas das mutações desse gene
incluem tanto
fatores
endógenos
quanto
exógenos, como
a
exposição
a
mutagênicos e radiação. O erro genético de p53 em NSCLC, como resultado de uma
superexpressão da proteína p53 ou mutação do gene p53 (SUZUKI et al.,1992;
TAKESHIMA et al.,1994) é fortemente correlacionada com a gravidade do tumor e
pode prever mal prognóstico (VAHAKANGAS et al., 1992; SOZZI et al.,1992;
SUNDARESAN et al.,1992).
Outra alteração também avaliada no CP é a inativação do gene p16, um alvo
importante na carcinogênese, perdendo em frequência apenas para o gene
supressor tumoral p53. O p16 é um gene supressor tumoral inibidor da cíclica, que
ao perder sua expressão determina a fosforilação irregular da proteína Rb,
(Revisado em SEKIDO; FONG; MINNA, 2003; BURKE et al., 2005 e BRAMBILLA, et
al. 2009) provocando a liberação do E2F, fator de transcrição de genes essenciais à
síntese de DNA, desencadeando então a replicação do DNA e progressão da fase
G1 para a fase S. (SALCEDO et al., 2008) A alteração no p16 o torna incapaz de
prevenir a progressão do ciclo celular e a divisão celular incontrolada.(SWAFFORD
et al 1997; BELINSKI et al., 1998) O p16 é silenciado de pelo menos três maneiras:
A deleção homozigótica, silenciamento epigenético e mutações pontuais. Os dois
primeiros mecanismos são os mais frequentes nos eventos de inativação da maioria
dos tumores. (Revisado em SEKIDO; FONG; MINNA, 2003; BURKE et al., 2005 e
BRAMBILLA, et al. 2009)
20
Outro gene estudado de grande importância no grupo de supressores tumorais é o
gene FHIT (Fragile histidine Triad), verificando que cerca de 80% dos SCLC e 40%
dos NSCLC revelam alterações desse gene. (SOZZI et al., 1996,1999) Sua perda
pode provocar a estimulação da síntese e da proliferação do DNA, deste modo o
gene FHIT poderá representar um dos potenciais genes supressores tumorais
localizados no cromossomo 3p que estão envolvidos na patogênese do SCLC e do
NSCLC. Dada a sua especial susceptibilidade a alterações induzidas pelos produtos
químicos do fumo e do tabaco (SALGIA & SKARIN, 2000; SOZZI, 1999) o gene
FHIT parece ser um alvo preferencial da agressão tabácica a nível molecular (ROM
et al.,2000), podendo vir a ser utilizado como marcador de lesão precoce em grupo
de risco para o CP como nos grandes fumantes e constituir fontes futuras de
intervenção com fins terapêuticos a semelhança a que já esta sendo estudado com
o p53. (FLEISCHHACKER et al.,1999; ROTH et al., 2001; ROTH et al.,1996)
(Revisado em SOTTO-MAYOR, 2002) Em análises mais recentes, foi observado que
a co-hipermetilação de p16 e dos genes FHIT em pacientes com NSCLC no estágio
I está associada a um aumentado risco de recorrência da doença (KIM et al., 2006),
além de ter sido observado que uma baixa expressão de FHIT está associada a um
fenótipo de maior invasividade de células tumorais pulmonares. (JOANNES et al.,
2010)
Alguns
oncogêneses
avaliados
no
CP
exercem seus
efeitos
através
da
hiperprodução de proteínas codificadoras normais, o que sugere um defeito
regulatório na transcrição do gene ou na amplificação gênica. Os genes e produtos
proteicos que comumente atuam desta forma são os proto-oncogenes c-erbB-1 e o
c-erbB-2, ambos receptores de tirosinas-cinases. O primeiro é mais frequentemente
encontrado no NSCLC, especialmente no carcinoma escamoso (65% a 90%). O
proto-oncogene c-erbB-2 é mais frequentemente encontrado nos adenocarcinomas
(MICKE et al., 2001). O c-erbB-1, quando ligado à membrana, codifica o receptor do
fator de crescimento epidermal (“epidermal growth factor receptor”) EGFR. O c-erbB2 está relacionado estruturalmente ao c-erB-1 e sua proteína codificadora, chamada
HER2/neu, também é expressa em células epiteliais das vias aéreas do pulmão
normal. A HER2, que é uma proteína transmembrana, possui atividade tirosinacinase, é co-produzida com o receptor para fator de crescimento epidérmico em
21
muitos adenocarcinomas e o seu nível sérico correlaciona-se com a carga tumoral.
Ela encontra-se em níveis mais elevados (> 22U/ml) nos tumores IIIB e IV do
NSCLC (notadamente adenocarcinoma), promovendo pior prognóstico. A expressão
aumentada de c-erB-2 é rara no SCLC (< 5%), porém pode ser encontrada em 25%
no NSCLC. (ROM et al., 2000; NIKLINSKI et al., 2001; MICKE et al., 2001)
O uso de anticorpos monoclonais humanizados anti-HER2 foi testado em câncer de
mama com resultados promissores, e vem sendo avaliado em estudos com NSCLC
(HIRSCH et al., 2002). Além disso, moléculas inibidoras de tirosina cinase de nome
químico,4-Quinazolinamine,N-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-[3-(4
morpholinyl)propoxy]-,hydrochloride
e
o
N-(3-ethynylphenyl)-6,7-bis(2-
methoxyethoxy) quinazolin-4-amine (gefitinib e erlotinib respectivamente)
têm sido
empregadas no tratamento de pacientes que expressam EGFR, sendo que gefitinib
já teve o uso aprovado pelo FDA (“United States Food and Drug Administration”)
para pacientes com NSCLC. Já a família dos oncogenes RAS em particular o K-ras
pode
ser
ativada
quando
há
mutações
nos
códons
12,13
ou
61
em
aproximadamente 20 a 30% dos CP de NSCLC, com 90% da mutação RAS nos
adenocarcinomas. Vale ressaltar que a mutação do KRAS é rara em SCLC.
(PULMÃO S.A, 2010). As proteínas codificadas participam da transdução de sinais.
(ROM et al., 2000;NIKLINSKI et al.,2001; KIM et al., 2003) Esta mutação resulta em
uma única modificação no aminoácido da proteína que uma vez adquirida,
permanece estável, tanto no tumor primário quanto nas metástases. A presença de
mutações no códon 12 do oncogene K-ras pode conferir um pior prognóstico nos
pacientes com CP. (ROM et al., 2000; NIKILINSKI et al., 2001;BROERMANN et al.,
2002; SLEBOS et al., 1990) Mutações no oncogene K-ras associam-se fortemente
ao tabagismo. Comumente, a mutação K-ras em um adenocarcinoma é fator de pior
prognóstico, inclusive no NSCLC completamente ressecado. (GROSSI et al., 2003)
Mutações em outros membros da família ras (N-ras e Hras) ocorrem com menor
frequência no NSCLC e são raras no CP. Mutações no gene K-ras têm sido
detectadas em biópsias brônquicas de indivíduos fumantes sem evidências de CP,
podendo ainda ser encontradas no escarro antes do diagnóstico da malignidade,
atuando como marcadores de pré-malignidade. (BROERMANN et al., 2002;
SLEBOS et al., 1990)
22
Outra proteína relacionada a apoptose e implicada no CP é a Bcl-2. Algumas células
normais produzem níveis de Bcl-2 relativamente altos. Esta Bcl-2 preserva as células
cuja perda poderia ser maléfica ao organismo. Aquelas mesmas células podem,
talvez, levar a tumores agressivos quando se tornam cancerosas. Protegidas pela
Bcl-2, elas estão menos sujeitas à morte do que outras células cancerosas,
consequentemente, tais células podem ser mais capazes de se desenvolver como
metástases nos tecidos que não fornecem os fatores de crescimento produzidos em
seus
tecidos
de
origem.
(LUCHS
&
PANTALEÃO,
2010)
Os
membros
antiapoptóticos da família Bcl-2, atuam, predominantemente, prevenindo que os
membros pró-apoptóticos Bax (Bcl-2-associated X protein) e Bak (Bcl-2 relative bak)
se liguem e perturbem a integridade de membranas intracelulares, em particular a
membrana externa das mitocôndrias, ocasionando liberação de citocromo c e morte
celular. (ADAMS & CORY, 2007) Bcl-2 e p53 estão ambas relacionadas à morte
programada da célula ou apoptose e, assim, sua relação é de grande interesse. No
CP de NSCLC, Bcl-2 e p53: foram detectáveis através da técnica de imunohistoquímica em cerca de 60% e 70% dos casos, respectivamente, são
inversamente
associados, e
fornecem informações
sobre
aparecimento
de
metástases e probabilidade de sobrevida. Em particular, no CP de NSCLC, a
superexpressão de Bcl-2 foi relacionada com uma melhor sobrevida global.
(PEZZELLA et al., 1993a) Esta superexpressão de Bcl-2 parece ser capaz de induzir
uma menor agressividade no fenótipo do tumor. A razão para isso continua a ser
esclarecida.
Em grupos de pacientes com pouca progressão tumoral foi observado presença de
Bcl-2-positivos sugerindo que nestes tumores a expressão de Bcl-2 é provável de
ocorrer como uma primeira alteração a um comportamento menos agressivo do
tumor. Isto está de acordo com a relação inversa entre Bcl-2 e p53, que
encontramos em uma série de cânceres, apoiando a hipótese de que um ou o outro
é suficiente para modificar a apoptose em NSCLC. Evidencias indicam, por um lado
à relação inversa entre Bcl-2 e p53 e por outro lado, um significado inverso no
prognóstico destas variáveis no comportamento em NSCLC. A perda da expressão
de Bcl-2 é, na verdade associado à redução da sobrevida global, desenvolvimento
metastático, enquanto o p53 positivo aparece como marcador de mau prognóstico.
(FONTANINI, VIGNATI, BIGINI et al., 1995)
23
O CP é o mais comum de todos os tumores malignos, apresentando um aumento
por ano de 2% na sua incidência mundial. Em 90% dos casos diagnosticados está
associado ao consumo de derivados de tabaco. Os sintomas mais comuns do CP
são a tosse e o sangramento pela via respiratória. Nos fumantes, o ritmo habitual da
tosse é alterado e aparecem crises em horários incomuns para o paciente. Além
disso, uma pneumonia de repetição pode, também, ser a apresentação inicial da
doença. (INCA, 2010)
A maneira mais fácil de diagnosticar o CP é através de um raio-X do tórax
complementado por uma tomografia computadorizada. A broncoscopia (endoscopia
respiratória) deve
ser realizada para avaliar a árvore traqueobrônquica e
eventualmente, permitir a biópsia. É fundamental obter um diagnóstico de certeza,
seja pela citologia ou patologia. Uma vez obtida à confirmação da doença, é
realizado o estadiamento que avalia o estágio de evolução, ou seja, verifica se a
doença está restrita ao pulmão ou disseminada por outros órgãos. O estadiamento é
feito através de vários exames de sangue e radiológicos, como dosagens
enzimáticas e ultrassonografia, respectivamente. (INCA, 2010)
Independentemente do tipo celular ou subcelular, o tabagismo é o principal fator de
risco do CP, sendo responsável por 90% dos casos. Outros fatores relacionados são
certos agentes químicos (como o arsênico, asbesto, berílio, cromo, radônio, níquel,
cádmio e cloreto de vinila, encontrados principalmente no ambiente ocupacional),
fatores dietéticos (baixo consumo de frutas e verduras), doença pulmonar obstrutiva
crônica (enfisema pulmonar e bronquite crônica), fatores genéticos (que predispõem
à ação carcinogênica de compostos inorgânicos de asbesto e hidrocarbonetos
policíclicos aromáticos) e história familiar de câncer de pulmão. (INCA, 2010) Os
tumores de localização central provocam sintomas como tosse, sibilos, estridor
(ronco), dor no tórax, escarros hemópticos (escarro com raias de sangue), dispnéia
(falta de ar) e pneumonia. Os tumores de localização periférica são geralmente
assintomáticos. Quando eles invadem a pleura ou a parede torácica, causam dor,
tosse e dispnéia do tipo restritivo, ou seja, pouca expansibilidade pulmonar.
24
O tumor localizado no ápice pulmonar (Tumor de Pancoast) geralmente compromete
o oitavo nervo cervical e os primeiros nervos torácicos, levando à síndrome de
Pancoast, que corresponde à presença de tumor no sulco superior de um dos
pulmões e dor no ombro correspondente, que se irradia para o braço. Nos fumantes,
o ritmo habitual da tosse é alterado, podendo existir crises em horários incomuns
para o paciente. Uma pneumonia de repetição pode ser também um sintoma inicial
do CP. (INCA, 2010) A mais importante e eficaz prevenção do CP é a primária, ou
seja, o combate ao tabagismo. A ação permite a redução do número de casos e de
mortalidade. Do ponto de vista terapêutico existem três alternativas: cirurgia,
radioterapia e quimioterapia. Estes métodos podem ser associados para obter o
melhor resultado. Tumores restritos ao pulmão devem ser operados e removidos –
estágios I e II, com chance de cura de até 75%. Nos outros estágios, uma
associação de quimioterapia e radioterapia, com eventual resgate cirúrgico, é a
abordagem que mostra os melhores resultados, com uma chance de cura de 30%.
No estágio IV a quimioterapia é o tratamento de escolha, porém as chances de cura
são extremamente reduzidas. Até o momento não existe benefício comprovado com
imunoterapia. Os pacientes operados se beneficiam de quimioterapia complementar,
dita adjuvante, que reduz as chances de reaparecimento da doença, com exceção
naqueles cujo estadiamento é muito inicial (IA e IB). (INCA, 2010)
25
2.2 ESTADIAMENTO DE NSCLC
A necessidade de se classificar os casos de câncer em estádios baseia-se na
constatação de que as taxas de sobrevida são diferentes quando a doença está
restrita ao órgão de origem ou quando ela se estende a outros órgãos. (NOVAIS et
al., 2008) O tratamento do câncer de pulmão, quando o tumor ainda se encontra
localizado, sem disseminação para fora do pulmão, é cirúrgico. Tumores restritos ao
pulmão, nos estágios I e II, devem ser operados e removidos. (NATIONAL
COMPREHENSIVE CANCER, 2008) Nestes casos, a chance de cura é grande e a
sobrevida em cinco anos é de 67, 57, 55 e 39%, respectivamente, para os estádios
IA, IB, IIA e IIB. (MOUNTAIN, 1997)
Estadiar um caso significa avaliar o seu grau de disseminação. O estádio de um
tumor reflete não apenas a taxa de crescimento e a extensão da doença, mas
também o tipo de tumor e sua relação com o hospedeiro.
O sistema de estadiamento mais utilizado é o denominado Sistema TNM (tumor,
nódulo e metástase) do “American Joint Committee on Cancer” (AJCC) (TABELAS 1
e 2). Este sistema baseia-se na extensão anatômica da doença, levando em conta
as características do tumor primário (T), as características dos linfonodos das
cadeias de drenagem linfática do órgão em que o tumor se localiza (N), e a presença
ou ausência de metástases (M). Estes parâmetros recebem graduações, geralmente
de T0 a T4, de N0 a N3 e de M0 a M1, respectivamente. Além das graduações
numéricas, as categorias T e N podem ser subclassificadas em graduações
alfabéticas (a, b, c). Tanto as graduações numéricas como as alfabéticas expressam
o nível de evolução do tumor e dos linfonodos comprometidos. O símbolo "X" é
utilizado quando uma categoria não pode ser devidamente avaliada.
Quando as categorias T, N e M são agrupadas em combinações pré-estabelecidas,
ficam distribuídas em estádios que, geralmente, variam de I a IV. Estes estádios
podem ser subclassificados em A e B, para expressar o nível de evolução da
doença.
26
ESTADIAMENTO TNM
TUMOR
DESCRIÇÃO
TX
O tumor primário não pode ser avaliado ou é detectada a
presença de células malignas em escarro ou lavado bronquial,
mas o tumor não pode ser visualizado por imagem ou
broncoscopia.
T0
Não há evidências de tumor primário.
Tis
Carcinoma in situ.
T1
Tumor com 3 cm ou menos em maior dimensão, rodeado por
pulmão ou pleura visceral, sem evidência broncoscópica de
invasão mais proximal do que o brônquio lobar.
T2
Tumor com quaisquer dessas características de tamanho ou
extensão: mais que 3 cm na maior dimensão; envolvimento do
brônquio principal, 2 cm ou mais distal da carina; e invade a
pleura visceral. Associado com atelectasia ou pneumonite
obstrutiva que se estende à região hilar, mas não envolve o
pulmão inteiramente.
T3
Tumor de qualquer tamanho que invada diretamente: parede
torácica, diafragma, pleura mediastinal, pericárdio parietal; ou
tumor no brônquio principal menor que 2 cm distal à carina,
mas sem envolvimento da carina; ou atelactasia associada ou
pneumonite obstrutiva de todo o pulmão.
T4
Tumor de qualquer tamanho que invada: mediastino, coração,
grandes vasos, traquéia, esôfago, coluna vertebral, carina; ou
nódulos tumorais separados no mesmo lobo; ou tumor com
efusão pleural maligna.
27
LINFONODOS
DESCRIÇÃO
REGIONAIS
NX
Linfonodos regionais não podem ser avaliados.
N0
Não há metástase nos linfonodos regionais.
N1
Metástase no peribrônquio ipsilateral e/ou linfonodo hilar
ipsilateral, e nódulos intrapulmonares incluindo envolvimento
por extensão direta do tumor primário.
N2
Metástase
no
mediastino
ipsilateral,
hilar contralateral,
escaleno contralateral ou ipsilateral, ou linfonodos supra
claviculares.
METÁSTASE
DESCRIÇÃO
DISTANTE
MX
Metástase distante não pode ser avaliada.
M0
Não há metástase distante.
M1
Presença de metástase distante.
TABELA 1 - Definição do sistema de estadiamento TNM
Fonte: AJCC Cancer Staging Handbook (6 ed., p.197)
Nota: Tradução nossa.
28
ESTADIAMENTO
ESTÁGIO
TUMOR
NÓDULO
METÁSTASE
Carcinoma oculto
TX
N0
M0
Estágio 0
Tis
N0
M0
Estágio IA
T1
N0
M0
Estágio IB
T2
N0
M0
Estágio IIA
T1
N1
M0
Estágio IIB
T2
N1
M0
T3
N0
M0
T1
N2
M0
T2
N2
M0
T3
N1
M0
T3
N2
M0
Qualquer T
N3
M0
T4
Qualquer N
M0
Qualquer T
Qualquer N
M1
Estágio IIIA
Estágio IIIB
Estágio IV
TABELA 2 - Estadiamento do câncer de pulmão
Fonte: AJCC Cancer Staging Handbook (6 ed., p.198)
O estadiamento pode ser clínico e patológico. O estadiamento clínico é estabelecido
a partir dos dados do exame físico e dos exames complementares pertinentes ao
caso. O estadiamento patológico baseia-se nos achados cirúrgicos e no exame
anatomopatológico da peça operatória. É estabelecido após tratamento cirúrgico e
determina a extensão da doença com maior precisão. O estadiamento patológico
pode ou não coincidir com o estadiamento clínico e não é aplicável a todos os
tumores. O conhecimento do diagnóstico histopatológico do tumor não é prérequisito para seu estadiamento. (INCA, 2011) Em consulta de primeira vez,
suspeitado o diagnóstico de neoplasia maligna, o médico deve, a partir do
conhecimento da história natural do tumor, identificar queixas e buscar sinais que se
associam ao mesmo, procurando assim avaliar a extensão da doença.
29
As evidências clínico-diagnósticas podem sugerir forte suspeita de neoplasia
maligna, sendo a confirmação histopatológica obtida no decorrer da avaliação
clínica, ou após a mesma. Às vezes, o estadiamento só pode ser estabelecido
através de procedimentos cirúrgico-terapêuticos, como, por exemplo, nos casos de
tumor de ovário, no qual é indicada cirurgia para ressecção do tumor e inventário da
cavidade abdominal. O estadiamento do CP de NSCLC requer, por parte do médico,
conhecimentos básicos sobre o comportamento biológico do tumor que se estadia e
sobre o sistema de estadiamento adotada A indicação terapêutica do CP depende
do estadiamento da doença. Assim é que um estadiamento bem conduzido leva a
condutas terapêuticas corretamente aplicadas. (INCA, 2011)
2.3 TESTES DE MTT, VIABILIDADE E PROLIFERAÇÃO CELULAR.
A quantificação do crescimento celular, incluindo proliferação e viabilidade, tornou se
uma ferramenta essencial em qualquer trabalho de laboratório em estudos baseados
em células. Tais técnicas permitem não só a otimização das condições de cultura de
células, mas também a determinação do fator de crescimento e atividade das
citocinas. Ainda mais importante, a eficácia de agentes terapêuticos na seleção da
droga, o potencial de compostos anticancerígenos em testes de toxicologia, e
toxicidade mediada por células podem ser avaliados quando quantificado o
crescimento celular. O primeiro passo para qualquer experimento é a decisão para
testar os parâmetros da proliferação celular ou viabilidade, dependendo do objetivo
de um estudo. Estes parâmetros são medidos por ensaio para "funções vitais", que
são característicos de células saudáveis ou em crescimento. Medições de
viabilidade celular avaliam as células saudáveis em uma amostra. Isso pode ser feito
tanto por ação direta da contagem do número de células saudáveis ou medindo um
indicador para as células saudáveis em populações de células (por exemplo, em um
ensaio de microplaca). Se as células estão dividindo ativamente ou quiescente não
se distingue. Um aumento na viabilidade celular indica o crescimento celular,
enquanto uma diminuição na viabilidade pode ser interpretada como o resultado de
um efeito tóxico dos compostos /agentes ou das condições de cultura de qualidade
inferior. Em contraste com a análise de viabilidade celular, a avaliação da
proliferação celular é definida como a medida da atividade de divisão celular em uma
30
amostra. Ela pode ser expressa como o número real ou a proporção de proliferação
em cultura de células, tecidos ou como valores relativos, em ensaios de populações
de células. Células quiescentes “non growing” saudáveis
não são detectadas por
ensaios de proliferação celular.
A proliferação celular também pode ser medida usando parâmetros indiretos. Com
essas técnicas, as moléculas que regulam o ciclo celular são quantificadas pela
medida de sua atividade (por exemplo, os ensaios da quinase ciclina-dependente)
ou por quantificação direta (por exemplo, Western blot, ELISA ou imunohistoquímica). A maioria dos testes de viabilidade são baseados em uma das duas
características/parâmetros: a atividade metabólica ou integridade da membrana
celular das células saudáveis. Normalmente, a atividade metabólica é medida em
populações de células através de incubação com sal tetrazólium (por exemplo, MTT,
XTT, WST-1) que é clivado em um produto, o formazan colorido, por células
metabolicamente ativas. O ATP das células pode também ser analisado indicando a
capacidade de energia celular e, portanto, a viabilidade. O segundo tipo de ensaio também denominado ensaio de exclusão de corante - aproveita a capacidade das
células saudáveis, descomprometido com a integridade da membrana citoplasmática
de excluir corantes como azul de tripan. As células mortas serão células coradas, e
as células saudáveis podem ser contadas diretamente. (PERES et al., 2008)
O teste do MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolina) é um
teste usado para avaliar viabilidade celular. O MTT, quando incubado com células
vivas, tem seu substrato quebrado por enzimas mitocondriais, transformando-se de
um composto amarelo em um composto azul escuro (formazan). A produção de
formazan reflete o estado funcional da cadeia respiratória (RACUSEN et al.,1999).
Desde a descrição original do teste do MTT por Mosmann, o mesmo tem sido
utilizado em experimentos com cultura de células (SOLEZ et al., 2007). Ferrera e
colaboradores mostraram que o teste do MTT pode ser usado como instrumento de
avaliação da viabilidade celular de biópsias. Os resultados são expressos como
densidade óptica x 1.000. (PERES et al., 2008) O uso de um teste preditivo de
sensibilidade às drogas poderia ter um impacto sobre o manejo de pacientes com
câncer de pulmão. De fato, um ensaio clínico no CP de SCLC, comparando á
31
seleção empírica da quimioterapia à seleção com base nos resultados dos testes de
sensibilidade química, sugere que as taxas de resposta podem ser melhoradas por
esta abordagem (GAZDAR et al., 1990). O ensaio clonogenico provou ter utilização
prática limitada uma vez que testes de sensibilidade às drogas podem ser realizados
em apenas uma minoria dos casos de câncer de pulmão (De VRIES et al, 1987),
embora melhorias das técnicas de cultura resultarem em maiores taxas de sucesso
(KANZAWA et al., 1987). As principais vantagens do ensaio de MTT são sua
velocidade e simplicidade. Como a maioria das etapas são automatizadas, é
possível realizar teste de múltiplas drogas, cada uma com diversas concentrações. A
análise automatizada de dados é essencial tendo em vista as grandes quantidades
de dados que podem ser gerados. Como os resultados são disponíveis dentro de
três dias, essas informações podem ser de valor em terapia clínica. Além disso, um
ensaio de curta duração minimiza os efeitos das variáveis de proliferação celular e
morte celular durante o período de ensaio. (CAMPLING et al., 1991)
Estes ensaios são ferramentas importantes não só na investigação oncológica de
base, mas também na prática clínica para avaliar a sensibilidade das células
tumorais de pacientes. (PETTY, D. et al., 1995)
2.4 AVALIAÇÕES DAS SUBSTÂNCIAS UTILIZADAS
2.4.1 Triton X-100
Como um tensoativo não iônico, que também pode ser usado como detergente, o
Triton X-100 é considerado 100% ativo e biodegradável em forma líquida. Tem
inúmeros usos gerais como um agente umectante emulsificante, ou mesmo como
um detergente suave.
O tensoativo não iônico Triton X-100 (Polyoxyethylene t –octylphenol ) tem muitas
aplicações em um amplo leque de utilizações diferentes. Como um agente
umectante no laboratório de microscopia e histologia, na forma de soluções diluídas,
é usado como um agente umectante para efetuar certos protocolos de coloração e
também é usado como um agente umectante para a limpeza das lâminas de
32
diamante. Na indústria eletrônica, é usado como um agente umectante em wafers, a
fim de reforçar e acelerar certos procedimentos e operações (HIPFNER et al.,1994).
Nas ciências da vida, é muitas vezes usado como um auxílio para a dissolução da
protease em água, porém ele deve ser usado na menor concentração possível para
não contaminar a amostra. Também é comumente usado em algumas formulações
para polimerização em emulsão.
FIGURA 1- Estrutura química doTriton X-100.
Os tensoativos são amplamente utilizados na biologia para extração de proteínas
das membranas das células, na cristalização de proteínas, para estabilização e
desnaturantes, e como agentes de permeabilização da membrana. Triton X-100 é
um dos mais utilizados tensoativos não iônico para lisar as células extraindo
proteínas e outras organelas celulares ou para permeabilizar a membrana da célula
viva em transfecção. (HIPFNER et al.,1994; RAJAGOPAL et al.,2002;GENNUSO et
al. 2004) No entanto, se grandes quantidades forem adicionados, ou as células
forem sujeitas a uma exposição prolongada a TX-100, estas podem morrer (BENOIT
et al.,1988; BORNER et al.,1994). Esta toxicidade das moléculas ao TX-100 surge
por causa da ação de interromper seu grupo polar sobre as presentes ligações de
hidrogênio, levando à destruição da compacidade e da integridade da membrana. A
inserção do monômero de detergente na membrana lipídica começa em baixas
concentrações. Isto leva a uma ruptura da estrutura celular sobre a permealizaçao
eventual da membrana da célula, em concentrações acima da concentração micelar
crítica (CMC) a partir da transição da bicamada-micela. A viabilidade celular é
extremamente
tensoativos,
sensível dentro de uma estreita faixa de concentrações de
especialmente
perto
da
CI50,
sendo
necessário
controlar
a
concentração TX-100 para transfecção. Introduzir espécies hidrófilas, sem danificar
33
as células, é difícil. Além disso, o colesterol ou similares domínios de membrana são
relatados para ser mais tolerante para com os detergentes, tais como moléculas
TX100 em comparação com outras partes da bicamada lipídica. (LONDON &
BROWN, 2000; MAIRE et al., 2000; NYHOLM & SLOTTE, 2001)
2.4.2 Tween 20
O Tween é um tensoativo não iônico, pouco tóxico para as membranas biológicas
(Rege et al., 2002), constituído por ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitol
(FIGURA 2). Estimula a secreção de proteínas em microrganismos (Stutzenberger,
1992), além de alterar a morfologia e a superfície da parede celular tanto de
bactérias (Van Boxtel et al., 1990) como de fungos (Domingues et al.,2000).
O Tween é um composto emulsionante do tipo filme monomolecular, uma molécula
ao lado da outra, diminuem a tensão superficial a zero distribuindo se na interfase e
formando um filme, é um emulsionante não iônico como o TX 100, porem, bem
tolerados pela pele.
FIGURA 2- Estrutura química do Tween 20
A linha Tween é composta por ésteres de sorbitan etoxilados. A característica
hidrofílica da cadeia de polioxietileno faz dos produtos da linha Tween, tensoativos
hidrofílicos, geralmente solúveis ou dispersíveis em água e empregados para obter
emulsões do tipo óleo em água (O/A), como dispersantes ou solubilizantes de óleos
e como co-tensoativos em shampoos. Estas características da linha Tween são
determinantes para suas aplicações em cosméticos, cremes e loções. A presença
34
de grupos hidrofílicos e lipofílicos nas moléculas dos produtos da linha Tween
promove redução da tensão interfacial entre os componentes da formulação,
permitindo a obtenção de emulsões estáveis. Em shampoos infantis seu baixo grau
de irritabilidade, permite sua aplicação como co-tensoativo em formulações que
tenham como apelo a suavidade.
Os tensoativos do tipo Tween são compostos que apresentam emprego muito
variado devido as suas propriedades, ao contrario da maioria dos detergentes, não
desnaturam proteínas podendo dessa forma ser usado para solubilização e
caracterização de proteínas de membranas em estado nativo (NEUGEBAUER,
1988). Quanto ao emprego terapêutico e farmacológico dos detergentes Tween,
(CRISPENS & SORENSON, 1988) demostraram a ação anti carcinogênica do
Tween 80 no tratamento de sarcomas de células reticulares de camundongos,
(PARRIS et al.,1987), demostraram que o Tween 80 em combinação com algumas
drogas quimioterápicas podia aumentar a atividade citotóxica desses medicamentos
in vitro. Estudando a ação de uma droga anti epiléptica, SAMAHA e GADALLA
(1987) descobriram que Tween 20,40, 60, 80 e 85 podiam aumentar sua solubilidade
e eficácia, esses detergentes são usados também como agentes estabilizadores
para medicamentos injetáveis (SKAKED et al., 1988) e em combinação com
antibióticos, AL-NAJJAR (1989) demostrou que o Tween era capaz de reduzir a
concentração mínima inibitória de pelo menos quinze antibióticos usados contra a
infecção cutânea ocasionadas por Staphilococcus aureous.
2.4.3 Dodecil sulfato de sódio (SDS)
O Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) é um tensoativo iônico do tipo aniônico. Este
tensoativo promove a lise da maior parte das células, desnatura algumas proteínas e
inibe a atividade enzimática, é um bom exemplo da natureza ambígua dos
compostos tensoativos. O SDS apresenta uma longa cadeia alquílica, praticamente
insolúvel em água, ligada covalentemente a um grupo iônico, o sulfato de sódio. Esta
particularidade
na
estrutura
química
dos
surfactantes
é
responsável pelos
35
fenômenos de atividade na tensão superficial de interfaces, pela micelização e
solubilização de membranas.
FIGURA 3 – Estrutura química do Dodecil sulfato de sódio.
Nas últimas décadas, a interação entre surfactantes aniônicos e polímeros neutros
hidrossolúveis tem sido tema de intensa investigação com finalidade de identificar
em solução as propriedades físicas acompanhadas de possíveis mecanismos que
interpretem a associação dos surfactantes ao polímero. (GENNE, 1990; BLOOR et
al., 1995; HOFF et al., 2001)
O lauril sulfato de sódio, designação genérica empregada para o Dodecil Sulfato de
Sódio, é um composto orgânico devidamente registrado no Chemical Abstract
Service (CAS). Estes compostos vêm sendo usado ao longo dos anos para
diferentes finalidades e usos distintos, a saber, banhos de espuma, cremes
emolientes, cremes depilatórios, loções para mãos, shampoos, além de produtos
saneantes (detergentes domissanitários). Este uso tem sido motivado em razão das
suas propriedades detergente, molhante, espumógena, emulsificante e solubilizante.
Cabe ressaltar que estas características são comuns a todos os tensoativos. Alguns
tensoativos apresentam potencial de irritação à pele, no entanto, em formulações
cosméticas, essas características podem ser atenuadas em função da concentração
utilizada bem como das características da formulação pretendida para o produto
final. (ANVISA, 2003)
Na eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), o detergente dodecil sulfato de
sódio (SDS) é usado para desnaturar as proteínas. Desta forma, moléculas
anfifílicas, como o SDS, interferem nas interações hidrofóbicas que normalmente
estabilizam as proteínas. A carga negativa que o SDS transfere mascara a carga
intrínseca da proteína, como resultado as proteínas tratadas com SDS possuirão
36
formas similares e razões carga/massa parecidas. Em consequência disso, a SDSPAGE separa as proteínas de acordo com a massa molecular. (VOET e VOET,
2005) Devido á sua natureza química, esses compostos são capazes de interagir
com os principais componentes da membrana celular, as proteínas e os lipídeos,
desestruturando os sistemas de membranas e enfraquecendo as estruturas de
proteção dos organismos (Braga, 2002). Devido ao fato da toxicidade do SDS ser
bem conhecida, este surfactante é frequentemente utilizado como substância de
referência em ensaios de toxicidade, avaliando a sensibilidade dos organismos
teste.
2.4.4 Ciclodextrinas (CDs)
As ciclodextrinas, também conhecidas como cicloamiloses ou ciclomalto-oligoses,
foram isoladas por Villiers em 1891, ciclodextrinas (CDs) são oligossacarídeos
cíclicos formados por moléculas de D-glicose unidas por ligações glicosídicas
produzidas pela ação da enzima ciclomaltodextrina-glucano-transferase (CGTase)
sobre o amido. As CDs mais conhecidas são as α, β e γ-ciclodextrinas, constituídas
por 6, 7 e 8 unidades de glicose, respectivamente. Elas apresentam uma estrutura
tridimensional com um exterior hidrófilo e uma cavidade hidrófoba, que possibilita a
formação de complexos de inclusão hidrossolúveis com uma grande variedade de
moléculas, alterando suas propriedades físicas. A inclusão normalmente aumenta a
estabilidade das moléculas inclusas contra a hidrolise, oxidação, foto decomposição
e
desidratação, diminuindo
odor e
sabores desagradáveis da substância,
aumentando sua solubilidade e biodisponibilidade. Essas propriedades criam a
oportunidade para muitas aplicações industriais das CDs em alimentos, cosméticos,
fármacos,
produtos
agrícolas,
separações
cromatográficas,
processos
biotecnológicos e muitas outras (Szejtli, 1990; Sa Barreto e Cunha-Filho, 2008).
37
FIGURA 4- Estruturas das α-, β-, γ-ciclodextrinas (Biwer et al.,2002;Szejtli, 1990)
Considerando que uma das áreas de importância em biotecnologia e bioengenharia
é o fenômeno de complexação molecular, que é útil na seleção, separação e
solubilização de várias biomoléculas, as CDs tornam-se compostos vantajosos pela
capacidade de formação destes complexos (MORIWAKI et al., 2007). Essa
encapsulação pode mudar as propriedades físicas e químicas das moléculas
envolvidas, permitindo uma variedade de usos para indústria alimentícia, de
cosméticos e farmacêuticos. (BONILHA et al.,2006)
38
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 CULTURAS DE CÉLULAS
3.1.1 Linhagens celulares
As linhagens celulares empregadas nesse estudo foram A549 e H460. Segundo a
“American Type Culture Collection” (ATCC), tais células apresentam morfologia
epitelial e crescem de maneira aderente em cultura. Quanto à histologia, ambas as
linhagens são oriundas de carcinoma de pulmão do tipo NSCLC de células
imortalizadas; mais especificamente, a linhagem A549 é classificada como
adenocarcinoma, ao passo que H460 configura-se como carcinoma de células
grandes.
3.1.2 Descongelamento
As alíquotas das linhagens celulares armazenadas em freezer -80ºC foram
descongeladas bruscamente a 37ºC. O conteúdo armazenado no microtubo de 1,5
mL foi transferido para um tubo Falcon de 50 mL estéril e livre de DNase e RNase
com 10 mL de meio RPMI-1640 (Gibco/Invitrogen, Nova York, EUA) acrescido de
soro fetal bovino a 10% v/v (SFB, Gibco/Invitrogen, Nova York, EUA), solução
estabilizada de Penicilina-Streptomicina numa concentração de 10000 unidades de
Penicilina e 10 mg de Streptomicina por mL (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) e
Fungizone - Anfotericina B a 250 µg/mL (Gibco/Invitrogen, Nova York, EUA). Em
seguida, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos a 1162 g e break zero a
27ºC. Após a centrifugação, foi observado um pellet no fundo do tubo, e o
sobrenadante foi descartado. As células foram então ressuspensas em 15 mL de
RPMI com SFB, antifúngico e antibiótico, e transferido para uma garrafa de cultura
de 75 cm², que foi incubada em estufa com 5% de CO2.
39
3.1.3 Cultivo
As linhagens foram cultivadas em garrafas de 75 cm², com adição de 15 mL de meio
RPMI-1640 suplementado com 10% de SFB, 1% de solução estabilizada de
Penicilina-Streptomicina (10000 unidades de Penicilina e 10 mg de Streptomicina
por mL) e 0,5% de Fungizone - Anfotericina B a 250 µg/mL. O cultivo deu-se em
estufa a 37ºC e com atmosfera de 5% de CO2 até a subconfluência. Diariamente as
garrafas foram analisadas em microscópio óptico de luz invertida, para avaliar o
aspecto do meio e das células em cultivo, bem como sua taxa de crescimento e
confluência.
O conteúdo das garrafas era desprezado sempre que o meio RPMI-1640
apresentava-se com a cor amarelada. Essa alteração é decorrente da acidificação
do meio, e é visualizada pela alteração da cor do indicador vermelho de fenol,
presente na composição do meio RPMI-1640. Em seguida, as células, aderidas em
monocamada no fundo da garrafa, foram lavadas com solução de PBS 1X (medica
de concentração) (“phosphate buffered saline”) por três vezes. Posteriormente, novo
meio foi adicionado, e as garrafas, após terem sido fechadas, foram novamente
incubadas na estufa de CO2. Dessa forma, as garrafas eram lavadas numa
frequência média de três vezes por semana, sempre sendo avaliadas as condições
do meio.
3.1.4 Criopreservação
As garrafas de cultivo com as linhagens celulares subconfluentes foram lavadas com
solução de PBS 1X por três vezes. Adicionaram-se 3 – 5 mL de solução de tripsina
às garrafas, e essas agitadas fortemente, com o intuito de promover o
desprendimento das células aderidas ao fundo da garrafa. Em seguida, foram
acrescentados aproximadamente 3 mL de meio RPMI para bloquear a ação da
tripsina, e a solução transferida para um tubo Falcon de 50 mL. As amostras foram
centrifugadas por 10 minutos a 1162 g, com break zero. Após a centrifugação, o
sobrenadante foi descartado, mantendo o pellet no fundo do tubo, e adicionado 3 mL
da solução de criopreservação (soro fetal bovino com 10% de glicerol,solução
40
adotada pelo laboratório), homogeneizando com a pipeta. Em seguida, transferiu-se
1 mL da solução para cada microtubo de 1,5 mL, totalizando três alíquotas por
amostra. As alíquotas foram então mantidas durante 30 minutos a 0 ºC, em seguida
duas horas a -20 ºC e finalmente armazenadas a -80ºC.
3.1.5 Plaqueamento
As duas linhagens celulares foram cultivadas em garrafas de 75 cm² até a
subconfluência para cada um dos tratamentos listados no tópico seguinte.
Adicionaram-se 3 – 5 mL de solução de tripsina e a garrafa foi fortemente agitada
com as mãos para o total desprendimento das células aderidas. Em seguida, foram
adicionados 10 mL de RPMI suplementado.
Para a contagem do número de células, foi utilizada a câmara de Neubauer.
Encostou-se a ponta da pipeta na borda da lamínula, e a câmara foi então
cuidadosamente preenchida com a suspensão preparada. Após as células
sedimentarem por 2 minutos, a câmara de Neubauer foi levada ao microscópio
óptico e a área demarcada foi focalizada com a objetiva de menor aumento, e
contaram-se as células nas quatro áreas de um lado da câmara. A seguinte fórmula
foi usada para o cálculo do número total de células:
Nº total de células
Nº de células/mL = _______________________x Fator de diluição (5) x 10000
Nº de quadrantes contados (4)
O valor encontrado, referente ao número de células por mL, era empregado numa
nova equação:
Concentração desejada/mL (10 5)
Volume final = Volume inicial x _______________________________
Nº de células/mL da suspensão inicial
41
Em placas de 96 poços, na concentração de 7,5 x 10 5 células por mL. Cada poço
recebeu 200 microlitros da suspensão de células + meio de cultura na concentração
supracitada. Alguns poços receberam somente meio de cultura (branco). As placas
foram mantidas em estufa com 5% de CO2 por 72 horas.
3.1.6 Tratamentos
3.1.6.1 Avaliação da viabilidade celular
Utilizaram-se placas de noventa e seis poços para a execução dos tratamentos com
as diluições de Triton® X-100 (Sigma), Tween® 20 (BioAgency), SDS (Vetec) e CDs
(Sigma), após o plaqueamento, cada poço continha 200µl de células e meio de
cultura. Decorridas 72 horas do plaqueamento, o meio de cultura das placas foi
retirado e foram adicionados 90 microlitros de meio em cada poço e 10 microlitros
das substâncias usadas no tratamento. As placas foram mantidas em estufa com 5%
de CO2 por 24 horas. Esses tratamentos foram efetuados para ambas as linhagens
do estudo: A549 e H460 de CP de NSCLC.
As drogas testadas foram diluídas em água destilada e filtrada na proporção de 1%
(v/v) para o TX-100 e Tween 20,1% (m/v) para o CD e 1,56% (m/v) para o lauril
sulfato de sódio, designação genérica empregada para o SDS. Dessa diluição
adicionavam-se as placas alíquotas que correspondiam as concentrações propostas
para os testes.
Para avaliar a viabilidade celular e evolução de proliferação, foi utilizada a análise
colorimétrica com o corante de MTT. Este corante na forma oxidada possui
coloração amarela na qual quando reduzido passa a cor azul em células ditas
viáveis. Essa coloração surge nas mitocôndrias produzidas pelas desidrogenases
mitocondriais, após o tratamento das linhagens celulares e incubação das mesmas
com as drogas do teste, 24 horas após os tratamentos, foi descartado o
sobrenadante dos poços e foram adicionados 15 microlitros de MTT 5 mg/mL em
cada poço. Após 4 horas de incubação em estufa, foram adicionados 70 microlitros
de SDS 10% nos poços. As placas foram mantidas em estufa por cerca de 16 horas.
Posteriormente, é medida a absorbância no comprimento de onda em 595 nm.
42
% Viabilidade Celular = Abs. das células das amostras – Abs. do Branco x 100
Abs. das células do controle positivo – Abs. do Branco
Amostras
A
B
C
D
Amostras
E
CTR
A
B
C
D
E
CTR
BRANCO
Células não Tratadas
FIGURA 5 – Placa com as linhagens celulares H460 de A1 a A5, A549 de A7 a A11
e MTT.
Para verificar a resposta celular frente aos extremos, outros dois grupos foram
inseridos, grupo CTR (controle de célula) o qual as células não foram expostas a
nenhuma solução teste e B (branco), sem células, apenas meio RPMI e solução
teste e MTT.
43
PLACA COM LINHAGENS H460 E A549
POÇOS
CONDIÇÕES
A-1 a A-5
Meio RPMI e cels+10µl solução teste a 0,4
B-1 a B-5
Meio RPMI e cels+10µl solução teste a 0,2
C-1 a C-5
Meio RPMI e cels+10µl solução teste a 0,1
D-1 a D-5
Meio RPMI e cels+10µl solução teste a 0,05
E-1 a E-5
Meio RPMI e cels+10µl solução teste a 0,025
F-1 a F- 5
Meio RPMI e cels+10µl solução teste a 0,0125
G-1 a G-5
Meio RPMI e cels+10µl solução teste a 0,006
H-1 a H-5
Meio RPMI e cels+10µl solução teste a 0,003
TABELA 3 - Descrição das condições dos tratamentos na placa.
As células H460 e A549 foram semeadas em microplacas de 96 cavidades
(excetuando-se as extremidades) no volume de 200μL em seus respectivos meios
de cultura e mantidas por 72 horas em estufa a 36,5 ± 0,5ºC com 5% de CO2.
Depois, os meios de cultura foram trocados e adicionado 10μL das diluições préestabelecidas das amostras. Após 24h de incubação em estufa, a 36,5 ± 0,5ºC com
5% de CO2, todo o conteúdo de meio existente nas microplacas foi descartado e em
seguida adicionado 15µl de MTT(5mg/ml).
Após 4 horas de incubação na estufa o corante foi, então, eluído ao se adicionar
70μL de dodecil sulfato de sódio (SDS) 10% em cada cavidade, deixando agir
overnight. Então, a D.O. foi medida em espectrofotômetro a 595nm.Uma curva inicial
foi obtida com oito concentrações de cada tensoativo diluído (0,4; 0,2; 0,1; 0,05;
0,025; 0,0125 e 0,006 e 0,003mg/mL). A concentração em que se obteve nessa
curva a redução de 50% na absorbância, quando comparada às células não tratadas
(controle), foi considerada a concentração de efeito citotóxico IC50 ou concentração
inibitória 50%. O valor de IC50 para cada substância testada foi calculado pela
média da triplicata de todos os ensaios independentes de cada substância testada.
44
3.1.6.2 Avaliação da citotoxidade pela dosagem de proteínas totais.
Com o objetivo de analisar possíveis alterações na biossíntese das proteínas, foi
realizada a dosagem de proteína total pelo método de Bradford. A dosagem de
proteína das linhagens H460 e A549, após o tratamento com as diluições das drogas
do teste, foram comparadas a uma curva padrão de dosagem de proteína.
PLACA COM LINHAGENS H460 E A549
POÇOS
CONDIÇÕES
A
Meio RPMI e cels+10µl solç. teste a 0,4 + Reagente Bradford
B
Meio RPMI e cels+10µl solç. teste a 0,2 + Reagente Bradford
C
Meio RPMI e cels+10µl solç. teste a 0,1 + Reagente Bradford
D
Meio RPMI e cels+10µl solç. teste a 0,05 + Reagente Bradford
E
Meio RPMI e cels+10µl solç. teste a 0,025+Reagente Bradford
F
Meio RPMI e cels+10µl solç. teste a 0,0125+Reagente Bradford
G
Meio RPMI e cels+10µl solç. teste a 0,006+ Reagente Bradford
H
Meio RPMI e cels+10µl solç. teste a 0,003+ Reagente Bradford
TABELA 4 - Descrição das condições dos tratamentos no ensaio de Bradford.
Para o ensaio de citotoxicidade foi utilizada a mesma quantidade de células/poço
que no teste de MTT, realizando o mesmo tratamento com as substâncias teste e
prosseguindo com a incubação da placa. Após o período de incubação, foi
adicionado a cada poço o reagente de Bradford, para que ocorresse a reação de
ligação do corante a proteína. Ao deslocar o equilíbrio para forma aniônica a
amostra absorve luz em 595nm no leitor de ELISA. A leitura da absorbância das
amostras possibilitou a determinação do potencial citotóxico, quanto a alterações na
biossíntese proteica, causada pela ação das substâncias testadas, em relação às
células do controle não tratado. O branco utilizado foi o SDS 10%, usado também
para diluição da cultura de célula.
45
Os ensaios foram realizados em triplicatas, e cada experimento repetido três vezes,
foi utilizado também células controle para verificação da eficácia do ensaio. A
dosagem de proteína total foi calculada multiplicando-se a absorbância do teste pelo
fator de calibração. Após a avaliação da citotoxicidade, as substâncias com maior e
menor atividade citotóxica foram selecionadas e avaliadas.
3.2.1 Técnicas
3.2.2 ensaio de MTT
PROCEDIMENTO
O ensaio do MTT para viabilidade celular é baseada na conversão do MTT a
formazan de cor púrpura por células metabolicamente ativas. Para a maioria das
células, essa reação leva de 3 a 5 horas. O formazan produzido é solubilizado e a
solução resultante de cor que é quantificada por um leitor de microplacas.
O estudo da proliferação celular e viabilidade das células requer a exata
quantificação do número de células viáveis em cultura. Por isso, os ensaios para o
cálculo de viabilidade celular são necessários para otimizar as condições da cultura,
avaliando fatores de crescimento celular e os nutrientes, descobrindo novos
antibióticos e drogas anticâncer, avaliando os efeitos tóxicos dos poluentes
ambientais e toxicidade mediada por células e estudar a morte celular programada
(apoptose). O kit colorimétrico para o ensaio de viabilidade celular dispõe de
sensibilidade e é confiável para determinar o número de células viáveis em uma
dada cultura. O ensaio colorimétrico homogêneo é baseado na conversão do MTT
sal de tetrazólium, um substrato amarelo pálido, ao formazan, um corante roxo. Esta
reação de redução celular envolve a piridina nucleotídeo cofatores NADH / NADPH e
só é catalisada por células vivas. O produto formazan tem uma baixa solubilidade
em água e está presente como cristais roxos. Utilizando um tampão para
solubilização dos cristais de formazan é possível à quantificação adequada da
formação do produto. A intensidade da cor do produto, medido a 550-620 nm, é
diretamente proporcional ao número de células vivas em cultura.
46
O teste do MTT foi utilizado na avaliação da viabilidade celular, conforme
preconizado por Ferrera e colaboradores. As incubações foram feitas sob uma
atmosfera de 5% de CO2. As células foram transferidas num volume total de 200µL
de células e meio de cultura RPMI 1640, mantidos em uma pré-incubação de 30
minutos a 37ºC em 5% CO2. Em seguida, o meio foi substituído para uma segunda
incubação de 24 horas realizada com as drogas de interesse. Após esse período, o
meio foi substituído por 15µL de solução de MTT, e permaneceu em incubação de
24 horas a 37ºC. A seguir, o meio foi substituído por 70µL de SDS 10%, depois, foi
feito leitura em espectrofotômetro Micronal B242 II em comprimento de onda de
595nm. Os resultados foram expressos como densidade óptica x 1.000 por
miligrama de células para permitir comparações entre as diferentes concentrações
das drogas utilizadas. A solução de SDS 10% foi utilizada para zerar o equipamento.
Para realização do teste de viabilidade e proliferação celular é preciso preparar uma
solução de 5mg/ml de MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium
bromide).
3.2.3 Ensaio de BRADFORD
O método de Bradford (1976) é uma técnica para a determinação de proteínas totais
que utiliza o corante de “Coomassie brilhante blue” BG-250. Este método é baseado
na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de proteínas que contém
aminoácidos de cadeias laterais básicas ou aromáticas. No pH de reação, a
interação entre a proteína de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o
deslocamento do equilíbrio do corante para a forma aniônica, que absorve luz
fortemente em 595 nm. O método de Bradford (1976) é mais rápido e sensível que o
de Lowry e cols.(1951) e tem sido utilizado para a determinação de proteínas totais
em diversos meios: plasma ou soro sanguíneo (HUNN, 1990), líqüor (MACART &
GERBAUT, 1982), saliva humana (JENSANO et al, 1986), produtos alimentícios
(RICHARD & PAQUIN, 1990) leite humano (KELLER & NEVILLE, 1986), tecidos de
plantas (MARKS et al, 1985), suspensões de células (GOGSTAD & KRUTNES,
47
1982), avidina e estreptavidina (SHARMAS & TIHON, 1988), urina (GOREN & LI,
1986) e detergentes (ROSENTHAL & KOUSSALE, 1983).
Para a preparação do reagente de Bradford, dissolveu-se 100mg de Coomassie
Brilliant Blue G-250 em 50mL de etanol 95% e, em seguida, adicionou-se 100mL de
ácido fosfórico 85%. A solução assim obtida foi avolumada para 1L com água
deionizada. Após filtração em papel de filtro quantitativo (Whatman n°1), a solução
foi mantida em geladeira.
Uma solução mãe de albumina bovina de 1mg/mL foi preparada e, a partir desta
solução,
prepararam-se
cinco
diluições
com o
SDS
10% nas
seguintes
concentrações: 1mg/mL, 0,75mg/mL, 0,5mg/mL e 0,25mg/mL para preparo da curva
padrão. Em seguida, a absorbância foi determinada em espectrofotômetro,
utilizando-se SDS 10% em lugar de solução padrão para o branco.
3.3. Análise dos Resultados
Cada uma das substâncias testadas em quintuplicata, na microplaca, teve sua
análise realizada em triplicata. Dessa forma, obtivemos três valores de viabilidade
celular para cada amostra analisada, o que nos permitiu a obtenção do valor médio
com seu respectivo desvio padrão. Para determinar o efeito anti-proliferarivo das
drogas, foram feitos grupos com concentrações diferentes para cada tipo de droga.
Após os tratamentos, a viabilidade foi quantificada conforme descrito no item 3.1.6.1
e os resultados expressos em porcentagem.
Os dados foram normalizados e uma vez obtido os valores para cada teste tais
dados são plotados no software GraphPad Prism 5 para Windows.
48
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As análises estatísticas foram efetuadas usando o Teste à priori, uma Análise de
Variância para verificar se há diferença entre as médias dos índices das
concentrações, dentro de cada tratamento com significância de 5%. Em seguida,
utilizamos os Testes de Comparação Múltipla de Tukey. O programa usado para os
cálculos estatísticos foi o GraphPAd Prism 5 para Windows (versão 5.00.288).
4.0 RESULTADOS
4.1 Avaliação da viabilidade celular, teste de viabilidade MTT.
Foram testadas 4 substâncias químicas para as linhagens H460 e A549 de CP de
NSCLC, o Triton® X-100 (Sigma), Tween® 20 (BioAgency), SDS (Vetec) e CDs
(Sigma).
Na FIGURA 06, a microplaca de 96 poços possui células de CP da linhagem H460
tratadas com diferentes concentrações de Tween 20 e Triton- X 100. Cada
concentração foi realizada em quintuplicata, sendo o controle feito em 12 poços
(células sem tratamento com SDS) e o branco em 4 poços( SDS e MTT).
É visualmente perceptível (FIGURA 6) a diferenças entre os dois tratamentos e entre
as diferentes concentrações testadas. Levando em consideração que a coloração
púrpura está presente nos poços em que temos células metabolicamente ativas,
consideramos que aqueles que se mantiveram na mesma coloração do reagente de
MTT (3-(4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide), amarelo pálido,
representa o grupo de células onde as mitocôndrias não possuíam mais a
capacidade de metabolização do reagente indicando a apoptose ou baixa da
viabilidade, dados comprovados pelo (GRAFICO 1).
49
[ ]%
Figura 6 – Viabilidade celular da linhagem H460 com os tensoativos Tween 20 e
Triton X-100.
Através dos experimentos, constatamos também grandes disparidades entre os dois
tensoativos de mesma classe quanto à queda na viabilidade causada pelos
mesmos. Através da observação das placas e GRAFICO 1 do teste entre Tween 20
e TX-100 para a linhagem de H460 podemos dizer que dois tensoativos não iônicos
proporcionaram efeito de dose resposta bastante diferentes,uma vez que na
concentração de 0,1% o Tween 20 reduziu a viabilidade para 60% enquanto que o
Triton X-100 reduziu para 40%, o que poderia ter sido causado pelas estruturas
químicas ou pelo mecanismo de ação diferenciado.
Apesar de visualmente não ser possível perceber, diante dos resultados expressos
no GRAFICO 1, notamos que mesmo que menos agressivo que o TX-100, o Tween
20 demostra atividade inibitória sobre as células quanto à atividade metabólica das
mesmas, porém, menos expressivo que os resultados inibitórios do Triton. Veremos
mais adiante que esses resultados vão diferir entre as linhagens.
50
Na FIGURA 7, a microplaca de 96 poços possui células de CP da linhagem H460
tratadas com diferentes concentrações de CD e SDS. Cada concentração foi
realizada em quintuplicata, sendo o controle feito em 12 poços (células sem
tratamento com SDS e o branco em 4 poços( SDS e MTT). Neste segundo
tratamento os resultados demonstram também uma grande diferença citotóxica
causada pelas substâncias teste. Porem, se tratando agora da (CD) e um tensoativo
iônico do tipo aniônico (SDS).
[ ]%
FIGURA 7- ensaio de viabilidade celular com a linhagem H460 utilizando as
substancia CD e SDS.
A partir da análise da viabilidade, o SDS foi selecionado como substância teste de
maior potencial citotóxico na concentração de 0,025%, em um período de incubação
de 4 horas (GRAFICO 1). A análise da microplaca (FIGURA 7) revela também essa
atividade inibitória do SDS representada pela maioria de poços de coloração
amarelo pálido de 0,4% a 0,025%.
51
Viabilidade em função da concentração na linhagem H460
Viabilidade
celular %
[ ]%
GRAFICO 1- Modelo de viabilidade da absorbância em função da concentração da
droga na linhagem H460.
Para modelar a viabilidade de absorbância em função da concentração, define-se por
viabilidade e por
YDroga a
X concentração da droga.
Assim como nos experimentos para as células da linhagem H460, as substâncias de
interesse foram testadas nas mesmas condições e concentrações para a linhagem
A549 de CP de NSCLC. Os experimentos foram repetidos e dessa vez utilizando na
mesma placa o T X-100 e o SDS, tensoativo não iônico e iônico respectivamente,
sendo possível a comparação entre classes diferentes de tensoativos nesse
momento. A microplaca de 96 poços seguiu a mesma metodologia quanto aos
volumes e substâncias utilizadas sendo modificada apenas a linhagem celular.
52
[ ]%
FIGURA 8 - ensaio de viabilidade celular com a linhagem A549 utilizando os
tensoativos T X-100 e SDS.
Vários estudos têm demonstrado que há uma correlação entre a estrutura química
do tensoativos e suas propriedades. Um tensoativo típico possui uma estrutura do
tipo R-X, onde R é o grupo apolar e X é o grupo polar. A parte hidrofóbica é uma
cadeia de hidrocarbonetos variando de 8 a 18 átomos de carbono, sendo que a
parte hidrofílica é quem determina se um tensoativo é não iônico no caso do T X-100
ou
aniônico que o caso do SDS. Dessa forma podemos atribuir a diferença na
estrutura quimica dos tensoativos ao fato de causar maior ou menor dano a
viabilidade celular aqui visualizada e comprovada pelo Grafico 2.
A maior característica de um tensoativo está no fato dele possuir um grupo polar e
um grupo não polar, conforme já citado anteriormente. Tal característica faz com que
os surfactantes, em solução, se acumulem na superfície de um líquido, diminuindo a
sua tensão superficial (PORTER, 1994).
A adsorção do tensoativo na superfície
celular (interface Agua/membrana) e a solubilizaçao parcial da mesma depende da
53
concentração do tensoativo na solução, o que pode causar o aumento da
solubilidade das membranas celulares e consequentemente queda da viabilidade, o
que é demostrado pela mudança de cor amarelo palido a púrpuro a medida que a
concentração dos tensoativos diminuiem e a viabilidade celular aumenta. Em baixas
concentrações, as moléculas do tensoativo se distribuem na superfície da
membrana
celular,
ficando
paralelamente
orientadas. Com o
aumento
da
concentração de tensoativos, diminui a área disponível em relação ao número de
moléculas e, conseqüentemente, tem início uma ligeira ordenação das mesmas em
relação à superfície celular até que comece a formar micelas em suas CMC.
Conhecer a interação dos surfactantes com as membranas biológicas é mui to
importante para definir possíveis aplicações dessas moléculas. Vários autores têm
investigado essa interação no que diz respeito à hemólise. Isomaa e col. (1986)
estudaram as alteraçoes induzidas por anfifílicos com diferentes comprimentos de
cadeia alquilica, em eritrócitos humanos. Tragner e Csordas,(1987) observaram um
efeito bifásico (proteção e hemólise) na interação dos tensoativos da série Tritron
com membranas de eritrócitos.
No próximo teste com a linhagem A549 observamos o comportamento do Tween 20
e do CD quanto a viabilidades dessas células, comparando nesse momento um
tensoativo não ionico com o CD. O Tween 20 apresenta nesse experimento um
comportamento diferente do observado com a linhagem H460, demonstrado pelo
aumento da toxicidade causada na linhagem A549 que foi possivel visualizar na
analise da microplaca, percebemos que nesse estudo a coloraçao amarelo palido,
não observado anteriormente para essas mesmas concentraçoes de Tween 20
aparece de forma expressiva.
54
[ ]%
FIGURA 9 - ensaio de viabilidade celular com a linhagem A549 utilizando as
substancia Tween 20 e CD.
Observamos que a concentração do Tween 20 necessaria para saturação da
membrana celular da linhagem A549 é menor do que para a linhagem H460 e que
apesar de ser um tensoativo não-iônico, pouco tóxico para as membranas biológicas
(Rege et al., 2002), proporcionou uma queda significativa da viabilidade celular nas
mesmas concentraçoes utilizadas em testes anteriores, o que nós faz questionar os
diferentes constituintes estruturais entre as linhagens que proporciona maior
resistencia ou facilita a dissoluçao das membranas em diferentes linhagens de
celulas.
Assim como no teste com as celulas de CP da linhagem H460, as CDs não
demostrou alteraçoes significantes na viabilidade celular das celulas A549, as
moléculas de ciclodextrinas são relativamente grandes e com uma superfície exterior
hidratada. Em condições normais as moléculas de ciclodextrinas permeiam as
membranas biológicas com considerável dificuldade.
55
Podemos considerar que, apesar das CDs apresentarem a capacidade de, sob
determinadas
condições
específicas,
extraírem
componentes
lipófilos
das
membranas biológicas causando danos a mesma e alterando a viabilidade, é
improvável que acarrete a ruptura da barreira biológica. O perfil de segurança das
três mais comuns ciclodextrinas naturais e alguns dos seus derivados tem sido
recentemente revisto. Em geral, as ciclodextrinas naturais e os seus derivados
hidrofílicos, podem somente permear membranas biológicas lipofílicas, tais como a
córnea do olho, com considerável dificuldade. Mesmo tendo um carácter lipofílico a
β-ciclodextrina metilada aleatoriamente não permeia membranas lipofílicas embora
interaja mais prontamente com membranas do que os outros derivados de
ciclodextrinas hidrofílicas. Todos os estudos de toxicidade têm demonstrado que as
ciclodextrinas administradas oralmente são praticamente atóxicas devido a não
absorção pelo trato gastrintestinal. Além disso, um número de avaliações de
segurança têm demostrado que a γ-ciclodextrina, a 2-hidroxipropil-β-ciclodextrina, a
sulfobutileter β-ciclodextrina, o sulfato β-ciclodextrina e a maltosil β-ciclodextrina
apresentam
segurança
mesmo
quando
administradas
pela
via
parenteral.
Entretanto, os estudos toxicológicos têm mostrado que a α e a β-ciclodextrina e βciclodextrina metilada não são apropriadas para administração parenteral (Del Valle,
2004).
Viabilidade em função da concentração na linhagem A549
Viabilidade
celular %
[ ]%
GRAFICO 2- Modelo de viabilidade da absorbância em função da concentração da
drogas na linhagem A549. Considere YDroga viabilidade e X concentração da droga.
56
COMPARAÇÕES
ENTRE
AS
CONCENTRAÇÕES
NOS
DIFERENTES
TRATAMENTOS E LINHAGENS.
Para as comparações entre os índices gerados por diferentes concentrações foi
utilizada, à priori, uma Análise de Variância para verificar se há diferença entre as
médias dos índices das concentrações, dentro de cada tratamento.
Havendo significância, ou seja, existindo diferença em pelo menos uma média de
concentração, o teste Tukey foi utilizado para identificar as concentrações com
médias que não diferem significativamente.
Análise de Variância significativa, p=0,000
CONCENTRAÇÕES
0,4
0,2
0,1
0,05
0,025
0,0125
0,006
0,003
Significância
GRUPOS
,8970
,9288
,9310
,9914
,059
,9914
1,0790
,098
1,0790
1,1090
1,1714
,069
1,1714
1,2204
,722
TABELA 5 - Comparações entre as concentrações na linhagem H460 e tratamento CD
Análise de Variância significativa, p=0,000
CONCENTRAÇÕES
0,4
0,2
0,1
0,05
0,025
0,0125
0,006
0,003
Significância
GRUPOS
,7050
,7224
,7284
,999
,7224
,7284
,8638
,056
,7284
,8638
,8710
,053
,8638
,8710
,9176
,922
,8710
,9176
1,0116
,058
1,2006
1,000
TABELA 6- Comparações entre as concentrações na linhagem H460 e tratamento TW20
57
Análise de Variância significativa, p=0,000
CONCENTRAÇÃO
0,2
0,4
0,1
0,05
0,025
0,0125
0,006
0,003
Significância
GRUPOS
,4380
,4684
,4866
,6136
,705
,6136
,9116
,122
,9116
,9610
,9762
1,0530
,874
TABELA 7- Comparações entre as concentrações na linhagem H460 e tratamento TX100
Análise de Variância significativa, p=0,000
CONCENTRAÇÕES
0,2
0,4
0,1
0,05
0,025
0,0125
0,006
0,003
Significância
GRUPOS
,0450
,0460
,0560
,1620
,884
,1620
,3600
,358
,3600
,4740
,5760
,5940
,178
TABELA 8- Comparações entre as concentrações na linhagem H460 e tratamento SDS
Análise de Variância não foi significativa, p=0,815
CONCENTRAÇÕES
0,003
0,4
0,05
0,025
0,1
0,2
0,0125
0,006
Significância
GRUPO
,1928
,2120
,2260
,2260
,2280
,2320
,2420
,2432
,769
TABELA 9 - Comparações entre as concentrações na linhagem A549 e tratame nto CD
58
Análise de Variância significativa, p=0,000
CONCENTRAÇÕES
0,4
0,2
0,1
0,05
0,025
0,0125
0,006
0,003
Significância
GRUPOS
,2534
,3006
,3270
,3006
,3270
,3496
,117
,3270
,3496
,4016
,562
,4016
,4632
,4720
,108
,4632
,4720
,5272
,240
,151
TABELA 10- Comparações entre as concentrações na linhagem A549 e tratamento TW20
Análise de Variância significativa, p=0,000
CONCENTRAÇÕES
0,1
0,2
0,4
0,05
0,025
0,0125
0,006
0,003
Significância
GRUPOS
,0598
,0630
,0682
,0878
,2340
,3188
,3356
,840
1,000
,3356
,3846
,236
,988
TABELA11- Comparações entre as concentrações na linhagem A549 e tratamento TX100
Análise de Variância significativa, p=0,000
CONCENTRAÇÕES
0,4
0,1
0,05
0,2
0,025
0,0125
0,006
0,003
Significância
GRUPOS
,0440
,0500
,0504
,0520
,0860
,1100
,271
,0860
,1100
,1640
,119
,1640
,2220
,426
TABELA 12- Comparações entre as concentrações na linhagem A549 e tratamento SDS
59
4.2 Dosagem de proteinas totais.
O teste de dosagem de proteínas totais não demostrou nenhuma alteração na
biossintese das proteínas, por esse motivo não foi utilizado para avaliação de
alterações citotóxicas das células.
5.0 DISCUSSÃO
As drogas utilizadas atualmente no tratamento anticâncer apresentam os mais
variados mecanismos de ação e são administradas sozinhas ou combinadas a
outros tratamentos como radioterapia e cirurgia. Porém, estes tratamentos ainda
apresentam efeitos nocivos que podem variar entre os indivíduos e, em alguns tipos
de câncer, são insuficientes. Partindo da necessidade de minimizar estes efeitos e
de aumentar as possibilidades de cura, vários estudos têm apresentado novas
substâncias com possíveis atividades antitumorais ou que possam implementar as
terapias já existentes. Para avaliar o potencial antitumoral de um composto,
inicialmente este deve ser testado em laboratório utilizando testes in vitro e in vivo
em animais, e caso tenha ação comprovada, este é testado em seres humanos. No
presente
trabalho, avaliamos
a capacidade de substâncias tensoativas de
promoverem a morte celular utilizando testes in vitro com linhagens tumorais de CP
de NSCLC do tipo H460 e A549. O CP aqui estudado é caracterizado pelo acúmulo
sequencial de alterações genéticas e morfológicas que levam à modificação na
evasão da apoptose, estabilidade e reparo do DNA, invasão tecidual, metástase e
angiogênese.
Até
recentemente,
carcinomas
classificados
como
NSCLC
(adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células grandes)
eram tratados de maneira similar, apesar da heterogeneidade biológica consequente
das diferenças histológicas. É provável que a pobre resposta aos tratamentos
observada para pacientes com NSCLC se deva, em parte, ao emprego de terapias
relativamente homogêneas frente a uma doença com características heterogêneas.
A mensuração da viabilidade e proliferação celulares forma a base de numerosos
testes in vitro que procuram entender a resposta de uma população celular a fatores
60
externos. Nos nossos ensaios optamos por usar o MTT por ser uma metodologia já
empregada no laboratório de Biologia celular do envelhecimento, onde este trabalho
foi desenvolvido. No ensaio, o MTT é reduzido nas células metabolicamente ativas
gerando cristais de formazan, de coloração púrpura, que são solubilizados e
quantificados através de espectrofotometria. A intensidade da atividade metabólica
indica o grau de viabilidade das células, quanto maior a citotoxicidade promovida
pelas substâncias menor será a intensidade metabólica e consequentemente menor
será a absorbância da solução (Berridge et al., 2005). O SDS 10% (Dodecil sulfato
de sódio) foi utilizado para solubilizar os cristais de formazan.
O efeito da maioria das drogas sobre o organismo resulta de suas interações com
macromoléculas, muitas das quais componentes da membrana plasmática (Benet et
al.,1996). A capacidade de um composto químico interagir com as membranas
biológicas é determinante para a sua absorção, distribuição, biotransformação e
excreção, bem como para o estabelecimento de sua atividade. Neste trabalho
estudamos a interação de tensoativos com as membranas celulares de CP.
Tensoativos apresentam efeito concentração dependentes sobre membranas,
podendo proteger ou solubilizar as mesmas. Termodinamicamente os tensoativos
operam reduzindo a tensão superficial de uma interface e aumentando sua área de
contato, sob pressão e temperaturas constantes. Devido a esta propriedade, os
tensoativos naturais, como os produtos do metabolismo do colesterol (ácidos
biliares), surfactante pulmonar e os surfactantes sintéticos, como o dodecil sulfato de
sódio (SDS), Triton X-100 e Tween 20 aqui estudados tem sido largamente
empregados em pesquisas bioquímicas.
O SDS é um tensoativo considerado biodegradável, no entanto, provoca efeitos
físicos e bioquímicos nas células, principalmente na estrutura da membrana
plasmática. Devido ao fato da toxicidade do SDS ser bem conhecida, este tensoativo
é frequentemente utilizado como substância de referência em ensaios de toxicidade,
avaliando a sensibilidade dos organismos. Em nosso estudo foi o tensoativo que
acarretou maior dano celular, reduzindo à viabilidade a zero GRAFICO 1. É de
compreensão geral que a formação de microssuperfícies de agregados que contêm
anfifílicos é induzida primeiramente por efeitos hidrofóbicos dos componentes no
61
caso do SDS a parte iônica. A organização de componentes em superfícies de
membranas biológicas depende das interações específicas entre íons e estas
superfícies.
Os tensoativos com cabeça não iônica aqui avaliados como o T X-100 e o Tween 20
não contem carga, sendo suas propriedades hidrofílicas devidas aos seus grupos
polioxietileno ou açucares. Quanto ao tipo de porção hidrofóbica, em se tratando de
detergentes
usados
em
pesquisa
bioquímica
encontrarmos
hidrocarbonetos
alifáticos. As cadeias de hidrocarbonetos alifáticos são mais flexíveis, enquanto que
as de esteróides são mais rígidas. Apesar da interação de detergentes com
membranas não ser completamente descrita, tem sido proposto um mecanismo
genérico de quatro passos (NEUGEBAUER, 1988), para a interação de detergentes
com membranas. O detergente se liga a membrana ocorrendo a desintegração da
mesma que é solubilizada na forma de complexos mistos de detergente-lipídioproteína. Os complexos de detergente-lipídio-proteína se reorganizam formando
complexos
detergente-lipídio
e
detergente-proteína.
Nessa
interação
entre
tensoativos e membrana os tensoativos da classe dos não iônicos tem demonstrado
ser os menos danosos para as membranas (LICHTENBERG et al.,1983), o que
podemos também confirmar pelos resultados obtidos em nossos estudos quanto
comparado os tensoativos não iônicos com o iônico SDS. Observamos que a
concentração do Tween 20 necessaria para saturação da membrana celular da
linhagem A549 é menor do que para a linhagem H460 e que apesar de ser um
tensoativo não-iônico, pouco tóxico para as membranas biológicas (Rege et al.,
2002), proporcionou uma queda significativa da viabilidade celular nas mesmas
concentraçoes utilizadas em testes anteriores, o que nós faz questionar os
diferentes constituintes estruturais entre as linhagens que proporciona maior
resistencia ou facilita a dissoluçao das membranas em diferentes linhagens de
celulas.
Entre os tensoativos não iônicos foi possível perceber uma grande diferença entre a
redução da viabilidade celular causada pelos dois tensoativos de mesma classe, o
Tween 20 é um tensoativo que forma micelas do tipo óleo/agua sendo a parte
dispersante da solução que ira interagir com a membrana é a agua e por esse
62
motivo não possui grande toxicidade a célula, já o Triton X-100 por apresentar
característica agua/óleo, a parte dispersante que entra em contato com a membrana
é o óleo semelhante aos fosfolipídios de membrana o que aumenta a viscosidade da
mesma desestruturando o arcabouço membranar e causando a redução da
viabilidade dessas células. Os tensoativos não iônicos permitem avaliar as
interações
hidrofóbicas
entre
seus
monômeros
ou agregados
(micelas) e
membranas porque não estabelecem ligações eletrostáticas com os componentes
(Attwood & Florence, 1983). Quando água é adicionada a uma solução de TritonX100 em tolueno, o tensoativo orientar moléculas para formar micelas com suas
cadeias de alcano hidrofóbica voltada para fora, para o solvente, e suas cadeias de
polietileno glicol hidrofílicas voltadas para dentro, "dissolvida" em uma pequena
quantidade de água. Vários outros componentes podem ser adicionados ao coquetel
em pequenas quantidades, que regulam o tamanho das micelas.
Quanto à ciclodextrinas (CDs), podemos dizer delas que são oligossacarídeos
cíclicos, constituídos por um número variável de unidades de glucose e que se
obtêm por ação da enzima ciclodextrina-α-glicosiltransferase (CGTase) sobre o
amido
(Szejtli, 1994). As
ciclodextrinas são conhecidas por permitirem o
encapsulação molecular de fármacos com características hidrofóbicas, alterandolhes a solubilidade, aumentando a estabilidade e, em alguns casos, melhorando a
biodisponibilidade. As ciclodextrinas têm sido reconhecidas como um novo grupo de
excipientes farmacêuticos úteis (Loftsson e Brewster, 1996). As ciclodextrinas e os
seus complexos de inclusão podem ser utilizados na preparação de formas
farmacêuticas sólidas, líquidas e semi-sólidas com aplicação nas vias de
administração oral, parentérica, pulmonar, nasal, bucal, sublingual, retal, ocular e
dérmica (Mosher e Thompson, 2002).
Em consequência da conformação em cadeira das unidades de glicopiranose, todos
os grupos hidroxílicos estão orientados para o exterior da molécula, com os grupos
hidroxilo primários localizados no lado mais estreito e os secundários no lado mais
largo da estrutura, conferindo-lhe hidrofilia (Loftsson e Brewster, 1996; Saltão e
Veiga, 2001).
63
A
cavidade
apresenta
características
hidrófobas
devido
ao
caráter apolar
determinado pelos dois anéis dos grupos C-H e pelo anel de átomos de oxigénio
incluídos
nas
ligações
glicosídicas.
Esta
estrutura
molecular
confere
as
ciclodextrinas propriedades únicas. São largamente utilizadas como agentes
complexantes uma vez que apresentam numerosas vantagens possuem estrutura
química bem definida com possibilidades de serem modificadas quimicamente;
existem CDs de diferentes tamanhos de cavidades permitindo a inclusão de
moléculas de diferentes dimensões, apresentam reduzida atividade farmacológica e
toxicológica. Este tipo de estrutura química demonstrada pelas CDs explica a alta
viabilidade expressa pelas células após o tratamento com as diluições da mesma,
sendo a parte externa das moléculas de CDs mais hidrofílicas, estas não vão
interagir com a superfície das membranas não causando maiores dano, porem essa
avaliação é de grande importância para estudos posteriores do CDs como complexo
de inclusão de fármacos anticâncer.
A heterogeneidade histológica do CP de NSCLC pode esclarecer um pouco as
diferentes respostas entre as duas linhagens GRAFICO 3. Como mencionado
anteriormente é provável que o pobre histórico de resposta do CP ao tratamento, em
parte, seja atribuído a uma abordagem relativamente homogênea de uma doença
heterogênea. Os esforços em curso estão em andamento para identificação clinica
de relevantes propriedades biológicas dos tumores que facilitará a individualização
do tratamento do CP. Se faz necessario questionar os diferentes constituintes
estruturais entre as linhagens que proporciona maior resistencia ou facilita a
dissoluçao das membranas em diferentes linhagens de celulas, direcionando o
tratamento e tornado o mesmo mais eficaz.
64
Comparações entre concentrações e linhagens
Viabilida
de celular
[ ]%
GRAFICO 3 - Todas as médias das concentrações são diferentes significativamente
(p=0,000) entre as linhagens. Na linhagem (H460) as médias são superiores.
COMPARAÇÕES ENTRE TRATAMENTOS E LINHAGENS
O teste de Kolmogorov Smirnov indicou que os índices gerados têm distribuição
Normal com significâncias superiores a 10%. Admitindo, então, distribuição normal
para os índices gerados, o teste t-Student foi utilizado para comparar os diferentes
tratamentos nas diferentes linhagens.
Médias dos índices dos tratamentos na linhagem H460
GRAFICO 4- tratamento das linhagens H460.
65
Na linhagem H460, não há diferença apenas entre os tratamentos TW20 e TX10 a
1,0% de significância. Se considerarmos significância de 5,0%, todos os tratamentos
diferem significativamente entre si.
Médias dos índices dos tratamentos na linhagem A549
GRAFICO 5- tratamentos da linhagem A549
Na
linhagem
A549,
os
tratamentos
Tween
20
e
TX100
não
diferem
significativamente, com significância p=0,172. As demais comparações indicaram
diferenças entre as médias dos índices a 5% de significância.
66
6. CONCLUSÕES
Partindo da necessidade do desenvolvimento de um tratamento anticâncer mais
eficaz, propomos aqui a investigação sobre a viabilidade e citotoxicidade celular
causada por alguns tensoativos e dos possíveis mecanismos de ação dos mesmos,
que poderiam ajudar de alguma forma na associação com a membrana celular no
estudo sobre duas linhagens de células de CP.
A partir da análise feita, constatamos que todos os tensoativos testados
apresentaram algum tipo de atividade inibitória na viabilidade celular das duas
linhagens, embora com diferentes significâncias e de diferentes formas, de linhagem
para linhagem. Entretanto, a classe das substâncias mais promissoras quanto a
danos celulares, observando à utilização no tratamento, foi o tensoativo do tipo
iônico SDS. Este promoveu menor viabilidade celular de linhagens tumorais
utilizando teste de viabilidade por MTT (capaz de avaliar a atividade mitocondrial). A
análise através dos dados estatísticos obtidos se ajustou de forma satisfatória e
permitiu obter a IC50 de cada teste, o que nos permite afirmar o efeito do SDS e T
X-100 como maiores citotoxicidades podendo chegar à zero de viabilidade em
algumas concentrações, enquanto o Tween 20 apresentou dano celular que foi
calculado como moderado a leve e o CMD de baixo a nenhum. Das quatro
substâncias testadas não foram observadas alterações na síntese proteica quanto à
dosagem de proteínas totais.
A linhagem H460 apresentou maior resistência comparando com as células do tipo
A549 a todos os agentes tensoativos testados, resistência esta que deve estar
relacionada às diferentes características dos respectivos tipos histológicos. Sendo
que as células do tipo H460 são representantes do carcinoma de grandes células,
enquanto a linhagem A549 é caracterizada como adenocarcinoma mais frequente
tipo histológico de CP de NSCLC. Estudos posteriores quanto a diferenças
estruturais de membrana dessas duas linhagens faz-se necessário para possível
averiguação quanto à resistência da mesma.
67
Avanços no entendimento da biologia molecular e bases da biologia do câncer de
pulmão sugere otimismo para o futuro da terapia do CP no novo milênio. Há
atualmente agentes quimioterápicos mais efetivos do que existia no passado, e um
número de novos agentes baseados na biologia molecular e biologia do câncer de
pulmão traz promessa para mais progressos no futuro.
As drogas utilizadas mostraram que podem ser de grande valia para melhoras no
tratamento anticâncer, interagindo com as membranas biológicas por mecanismos
diferentes, o que propõe estudos posteriores quanto a entrega de substancias na
superfície das células e formas seletivas de solubilização das membranas.
68
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