avaliação da expressão imuno-histoquímica de marcadores

1
MARCELO GADELHA VASCONCELOS
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE
MARCADORES DE HIPÓXIA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE
DE LÍNGUA
NATAL/RN
2011
2
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE
MARCADORES DE HIPÓXIA EM CARCINOMA EPIDERMÓIDE
DE LÍNGUA
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de PósGraduação em Patologia Oral da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte-UFRN, como parte
dos requisitos para obtenção do Título de Doutor em
Patologia Oral.
Doutorando: Marcelo Gadelha Vasconcelos
Orientadora: Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz
NATAL/RN
2011
3
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Vasconcelos, Marcelo Gadelha.
Avaliação da expressão imuno-histoquímica de marcadores de hipóxia em carcinoma epidermóide
de língua / Marcelo Gadelha Vasconcelos. – Natal, RN, 2011.
161 f. : il.
Orientadora: Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da
Saúde. Departamento de Odontologia. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.
1. Carcinoma de células escamosas – Tese. 2. Anóxia – Tese. 3. Imuno-histoquímica – Tese.
4. Biomarcadores –Tese. I. Queiroz, Lélia Maria Guedes. II. Título.
RN/UF/BSO
RN/UF/BSO
Black D61
Black D74
4
“Nunca deixe que lhe digam que não vale a pena acreditar no
sonho que se tem.”
(Renato Russo)
DEDICATÓRIA
5
Dedico a concretização deste sonho, aos meus pais, meus irmãos, a toda minha
família pela contribuição e apoio dado a essa conquista.
Aos meus pais, fonte de sabedoria, conselheiros dos momentos decisivos,
símbolos de paciência e tolerância, meus maiores e melhores amigos, mestres e guias
da minha formação moral, meu sincero e eterno obrigado por me ensinarem e
ajudarem a viver e acreditarem nos meus ideais. Amo vocês!
6
“Agradeço todas as dificuldades que enfrentei; não fosse por elas, eu
não teria saído do lugar. As facilidades nos impedem de caminhar.
Mesmo as críticas nos auxiliam muito.”
(Chico Xavier)
AGRADECIMENTOS
7
Obrigado meu Deus, por mais uma etapa de minha vida conquistada;
Obrigado, porque naqueles momentos em que fraquejei; que não tinha mais forças para
caminhar, tu me ergueste com tua própria vida;
Obrigado porque naquele momento de desânimo lembrei que tu és meu Pai;
Quero agradecer ao Senhor e a Nossa Senhora Auxiliadora por todos os sonhos que
eu tive ousadia em sonhar; por todos os passos que tive coragem em dar; por todas as
decisões que eu resolvi tomar; por todos os obstáculos que enfrentei; pelo meu desejo
de superação; pela minha esperança em querer sempre tentar....
Toda minha gratidão ao amigo que posso sempre, eternamente, contar: DEUS !
8
À minha Orientadora;
A Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz, exemplo de sabedoria, dedicação,
seriedade, ética e, sobretudo, de amor pela profissão, agradeço a sua contribuição, aos
seus ensinamentos, por todo entusiasmo e incentivos prestados a mim;
Obrigado por todo tempo a mim despendido, pela tolerância e paciência...
Obrigado por guiar minhas mãos durante esse percurso de quatro anos de Doutorado,
pela insistência em ensinar, quando por vezes, eu pensava em desistir....
Obrigado por ser meu Mestre, minha professora Amiga....
Obrigado por me compreender, me estimular e me enriquecer com sua presença e seu
saber!
Obrigado por acreditar em mim e me fazer sentir importante, demonstrando-me que
posso fazer a diferença.
Enfim, juntos vencemos!
Meus sinceros agradecimentos...
9
À coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral-UFRN;
Profª. Drª. Roseana de Almeida Freitas, toda a minha sincera gratidão por
repartir seus conhecimentos, princípios e experiências que grandemente contribuíram
para minha formação. Ao seu exemplo magnífico, pelo carinho com que orienta seus
aprendizes e pela dedicação desmedida a esta Escola, a minha homenagem e
admiração.
Aos professores;
Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, Prof. Dr. Angelo Giuseppe Roncalli da
Costa Oliveira, Profª. Drª. Ana Miryam Costa de Medeiros, Profª. Drª.
Éricka
Janinne Dantas da Silveira, Profª. Drª. Hébel Cavalcanti Galvão, Prof. Dr. Heitel
Cabral Filho, Profª. Drª. Lélia Batista de Souza, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto e a
Profª. Drª. Márcia Cristina da Costa Miguel.
Aos senhores, que quando deveriam ser simplesmente professores, foram meus
mestres, transmitindo seus conhecimentos e experiências de vida; que quando deveriam
ser mestres foram meus amigos e em sua amizade me compreenderam e me
incentivaram a seguir o melhor caminho, expresso os meus maiores agradecimentos e o
meu profundo respeito, que sempre serão poucos diante do muito que foi oferecido.
Aos caros e inesquecíveis amigos da Patologia Oral-UFRN;
Agradeço a todos vocês a esse período de convivência e aprendizado que
passamos juntos... Na verdade, posso dizer que foram momentos de muita
compreensão, amizades, risos e lágrimas, de angústias e expectativas, tropeços e
vitórias que jamais serão esquecidos! Meus sinceros agradecimentos pela contribuição
e o apoio prestados a mim durante essa jornada.
“Aqueles que passam por nós não vão sós, não nos deixam sós.
Deixam
um
pouco
de
si,
levam
um
pouco
de
nós.”
(Felipe Cortelline Roque)
10
Aos funcionários da Disciplina de Patologia Oral-UFRN,
Francisco Canindé de Macedo, Hévio Lucena, Idelzuite de Souza, Lourdes Souza,
Maria das Graças Galvão, Ricardo Kleiber Lima Silva e Sandovânnia Oliveira, agradeço ao
apoio, a paciência, ao auxilio e a disponibilidade que me prestaram ao longo dessa caminhada
para a concretização desse trabalho. Obrigado pelas manifestações de carinho e confiança!!
Sou grato a todos vocês!!
À Marinha do Brasil;
Nesse momento de comemoração, dedico e agradeço à Marinha do Brasil por mais
uma etapa de minha vida conquistada.
Obrigado por me compreenderem, me estimularem e me enriquecerem com seus
valores, mostrando que a Hierarquia e Disciplina são a base institucional das Forças
Armadas....
Agradeço ao Hospital Naval de Natal, em especial a Odontoclínica, pela oportunidade
de desenvolvimento e amadurecimento profissional e pessoal que contribuíram de
forma significativa para obtenção deste título.
Agradeço por confiarem e respeitarem os meus pensamentos e sonhos, obrigado
por estarem sendo presentes em minha vida!
Ao Hospital Dr. Luiz Antonio, Natal-RN, agradeço por ter permitido a utilização de
espécimes teciduais arnazenados nos arquivos do seu Serviço de Anatomia Patológica
para obtenção da amostra investigada neste trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq, agradeço
pela oportunidade e pelo apoio financeiro proporcionado para elaboração deste ensaio
científico.
11
“Porque um dia é preciso parar de sonhar, tirar os planos
das gavetas e de algum modo começar.”
(Amyr Klink)
RESUMO
12
RESUMO
A hipóxia tumoral modula uma série de mudanças genéticas adaptativas relacionadas ao
desenvolvimento, invasão e metástase de diversos cânceres humanos, dentre os quais o
carcinoma epidermóide de língua (CEL). O objetivo do presente trabalho foi realizar uma
análise clínica, morfológica e imuno-histoquímica através da expressão do HIF-1α, GLUT-1 e
da CA-IX em 57 casos de CEL, correlacionando essa expressão à parâmetros clínicos e
morfológicos. Após uma análise descritiva dos dados referentes ao sexo, faixa etária, raça e
hábitos dos pacientes, constatou-se que os resultados encontrados foram condizentes com a
literatura. Os parâmetros clínicos e morfológicos analisados e a expressão desses marcadores de
hipóxia foram submetidos à análise estatística (teste do Qui2), verificando-se que os mesmos
podem ser utilizados como indicadores do comportamento biológico do CEL. Dentre os
resultados da presente pesquisa, observou-se que a intensidade de expressão para o HIF-1α,
localizada na maioria dos casos no citoplasma e núcleo, correlacionou-se estatisticamente com o
estadiamento clínico (p = 0,011) e gradação histológica (p = 0,002). Quanto à relação entre a
distribuição de marcação para o HIF-1α e metástase, o teste qui-quadrado (Qui2) demonstrou
haver diferenças estatisticamente significativas entre os grupos analisados (p = 0,040). Dos
75,8% da amostra que tinham metástase, constatou-se a o predomínio da marcação difusa. A
imunoexpressão citoplasmática/membranar do GLUT-1 exibiu uma correlação estatisticamente
significativa com o estadiamento clínico (p = 0,002) e gradação histológica (p = 0,000). Em
relação à localização de marcação para o GLUT-1 na ilha tumoral, evidenciou-se predomínio da
marcação periférica na maioria dos espécimes de baixo grau (78,6%). Na amostra de alto grau,
prevaleceu a localização centro/periferia (55,8%). De acordo com o teste qui-quadrado (Qui2), a
localização na ilha tumoral (p = 0,025) demonstrou haver diferenças estatisticamente
significativas com a gradação histológica. A imunoexpressão da CA-IX, localizada na maioria
dos casos na membrana e citoplasma, exibiu uma correlação estatisticamente significativa com a
gradação histológica (p = 0,005). Com base nestes resultados, pode-se concluir uma ampla
participação desses marcadores de hipóxia na carcinogênese oral, bem como a sua possível
utilização como marcadores do comportamento biológico e da progressão tumoral em CEL.
Palavras-chave: carcinoma de células escamosas, anóxia, imuno-histoquímica, biomarcadores.
13
"Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a
vitória é o desejo de vencer!"
(Mahatma Gandhi)
ABSTRACT
14
ABSTRACT
The tumor hypoxia modulates a series of genetic changes related to adaptive
development, invasion and metastasis of various human cancers, among which squamous cell
carcinoma of the tongue (SCCT). The objective of this study was to analyze clinical,
morphological and immunohistochemical expression by HIF-1α, GLUT-1 and CA-IX in 57
cases of CEL and correlated this expression to clinical parameters and morphological. After a
descriptive analysis of data on gender, age, race, and habits of patients, it was found that the
results were consistent with the literature. The clinical and morphological parameters analyzed
and the expression of these markers of hypoxia were subjected to statistical analysis (Qui2 test),
verifying that they can be used as indicators of the biological behavior of CEL. Among the
results of this study, we observed that the intensity of expression for HIF-1α, in most cases
located in the cytoplasm and nucleus, statistically correlated with clinical staging (p = 0.011)
and histological grading (p = 0.002). As for the relationship between the distribution of labeling
for HIF-1α and metastasis, the chi-square (Qui2) showed that there was statistically significant
differences between the groups (p = 0.040). 75.8% of the sample who had metastases, there was
the predominance of diffuse marking. The immunoexpression cytoplasmic/membrane GLUT-1
showed a statistically significant correlation with the clinical stage (p = 0.002) and histological
grading (p = 0.000). Concerning the location of markings for GLUT-1 tumor on the island, there
was a predominance of peripheral marking specimens in most low-grade (78.6%). In the sample
of high-grade, prevailed the location center/periphery (55.8%). According to the chi-square
(Qui2), the location on the island of the tumor (p = 0.025) showed statistically significant
difference in histological grading. The immunoreactivity of CA-IX, in most cases located in the
membrane and cytoplasm, exhibited a statistically significant correlation with histological
grading (p = 0.005). Based on these results, we can conclude a broad participation of these
markers of hypoxia in oral carcinogenesis and its possible use as markers of biological behavior
and tumor progression in CEL.
Keywords: oral squamous cell carcinoma, anoxia, immunohistochemistry, biomarkers.
15
"Se não puder se destacar pelo talento, vença pelo esforço."
(Dave Weinbaum)
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
16
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Quadro 1. Sistema de estadiamento TNM para o CEO. Fonte: Adaptado do
Neville et al. (2009).................................................................................
46
Quadro 2. Categorias de estadiamento clínico TNM para o CEO. Fonte: adaptado
do Neville et al. (2009)............................................................................
47
Quadro 3. Sistema de gradação de malignidade recomendado por Bryne
(1998)......................................................................................................
85
Quadro 4. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e
tempo de incubação dos anticorpos primários a serem utilizados no
estudo......................................................................................................
88
Quadro 5. Quadro evidenciando as variáveis analisadas, bem como sua
classificação e categorização...................................................................
90
Figura 1. Representação esquemática das proteínas que constituem as duas
subunidades do HIF-1 humano. Fonte: Semenza (2000)........................
56
Figura 2. Representação esquemática do mecanismo de regulação da expressão
gênica do HIF-1α sob condições de normóxia. Fonte: Höpfl;
Ogunshola; Gassmann (2004).................................................................
58
Figura 3. Representação esquemática do mecanismo de regulação da expressão
gênica do HIF-1α sob condições de hipóxia. Fonte: Höpfl; Ogunshola;
Gassmann (2004).....................................................................................
60
Figura 4. Estrutura bidimensional da proteína transportadora de glicose por
difusão facilitada (GLUT). Fonte: Machado, Schaan, Seraphim
(2006)......................................................................................................
67
Figura 5.
Proteína kinase WNK1 promove expressão do GLUT-1 na superfície
celular pela regulação da fosfoproteína TBC1D4. Fonte: Mendes et al.
(2010)......................................................................................................
68
Figura 6. CEL de baixo grau de malignidade exibindo ninhos e cordões
tumorais com pérolas de ceratina permeados por intenso infiltrado
inflamatório mononuclear (H/E-200X)...................................................
109
17
Figura 7. CEL de baixo grau de malignidade evidenciando ninhos tumorais com
proeminente ceratinização e com pouco pleomorfismo celular e
nuclear (H/E-400X)................................................................................
109
Figura 8. CEL de alto grau de malignidade exibindo cordões e pequenos grupos
de células malignas invadindo músculo e vasos sanguíneos (H/E200X).......................................................................................................
110
Figura 9. CEL de alto grau de malignidade exibindo células malignas com
demarcado pleomorfismo celular e nuclear, nucléolos volumosos e
hipercromáticos (H/E-400X)...................................................................
110
Figura 10. Expressão imuno-histoquímica do HIF-1α nas células malignas e no
estroma do CEL (Advance HRP-200X)..................................................
111
Figura 11. Intensa expressão imuno-histoquímica do HIF-1α no núcleo e
citoplasma das células neoplásicas do CEL (Advance HRP-400X).......
111
Figura 12. Expressão imuno-histoquímica do GLUT-1 predominantemente na
periferia da ilhas tumorais do CEL (Advance HRP-200X).....................
112
Figura 13. Intensa expressão imuno-histoquímica do GLUT-1 na membrana e
citoplasma das células neoplásicas do CEL (Advance HRP-400X).......
112
Figura 14. Expressão imuno-histoquímica da CA-IX nas células neoplásicas e no
estroma do CEL (LSAB-200X)...............................................................
113
Figura 15. Intensa expressão imuno-histoquímica da CA-IX na membrana e
citoplasma das células neoplásicas do CEL (LSAB-400X)....................
113
18
"A maior vitória na competição é derivada da satisfação interna de
saber que você fez o seu melhor e que você obteve o máximo daquilo
que você deu."
(Howard Cosell)
LISTA DE TABELAS
19
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1.
Tabela 2.
Tabela 3.
Tabela 4.
Tabela 5.
Tabela 6.
Tabela 7.
Tabela 8.
Tabela 9.
Tabela 10.
Tabela 11.
Tabela 12.
Tabela 13.
Tabela 14.
Tabela 15.
Distribuição dos casos de CEL com relação ao sexo, raça, faixa etária
e hábitos dos pacientes. Natal, RN-2011.................................................
92
Distribuição das variáveis TNM, desfecho e metástases em números
absolutos (n) e relativos (%). Natal, RN-2011........................................
93
Relação entre estadiamento clínico e desfecho da doença.
Significância obtida pelo teste Qui2. Natal- RN, 2011............................
96
Relação entre metástase e desfecho da doença. Significância obtida
pelo teste Qui2. Natal, RN-2011..............................................................
96
Relação entre metástase e estadiamento clínico. Significância obtida
pelo teste Qui2. Natal, RN-2011..............................................................
97
Relação entre gradação histológica e desfecho da doença.
Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.............................
97
Relação entre gradação histológica e estadiamento clínico.
Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.............................
98
Relação entre gradação histológica e metástase. Significância obtida
pelo teste Qui2. Natal, RN-2011..............................................................
98
Relação entre as variáveis do HIF-1α e o desfecho da doença.
Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.............................
99
Relação entre as variáveis do HIF-1α e a metástase. Significância
obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011...................................................
100
Relação entre as variáveis do HIF-1α e o estadiamento clínico.
Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.............................
101
Relação entre as variáveis do HIF-1α e a gradação histológica de
malignidade. Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.......
102
Relação entre as variáveis do GLUT-1 e o desfecho da doença.
Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.............................
102
Relação entre as variáveis do GLUT-1 e a metástase. Significância
obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011...................................................
103
Relação entre as variáveis do GLUT-1 e o estadiamento clínico.
Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.............................
104
20
Tabela 16.
Relação entre as variáveis do GLUT-1 e a gradação histológica de
malignidade. Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011......
Tabela 17.
Relação entre as variáveis da CA-IX e o desfecho da doença.
Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.............................
105
Relação entre as variáveis da CA-IX e a metástase. Significância
obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011...................................................
106
Relação entre as variáveis da CA-IX e o estadiamento clínico.
Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.............................
107
Relação entre as variáveis da CA-IX e a gradação histológica de
malignidade. Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.......
108
Tabela 18.
Tabela 19.
Tabela 20.
104
21
"O sucesso é ter o que você deseja e a felicidade é ter o que
você já tem."
(Warren Buffet)
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
22
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4E-BP
Do inglês 4E-binding protein 1, traduzido como proteína 1 ligante 4E.
Ahr
Do inglês aryl hydrocarbon receptor, traduzido como receptor de aril
hidrocarbono.
AKT
Refere-se a via da proteína quinase B.
AP-1
Do inglês activator protein-1, traduzido como proteína ativadora-1.
ARD1
Do inglês arrest-defective-1, traduzido como parada-defeito 1.
ARNT
Do inglês aryl receptor nuclear translocator, traduzido como translocador
nuclear receptor aril hidrocarbono.
ATP
Do inglês adenosine triphosphate, traduzido como adenosina trifosfato.
Bak
Do inglês Bcl-2 homologous antagonist/killer, refere-se à proteína Bak.
Bax
Do inglês Bcl-2-associated X protein, refere-se à proteína Bax.
Bcl-2
Do inglês B-cell CLL/lymphoma 2, refere-se à proteína Bcl-2.
Bcl-xL
Do inglês B-cell lymphoma-extra large, refere-se a proteína Bcl-xL.
bHLH
Do inglês basic-helix-loop-helix, traduzido como domínio básico-hélice-loophélice.
BSA
C
CA
Do inglês, bovin serum albumin, traduzido como albumina de soro bovino.
Do inglês cytosine, traduzido como citosina.
Do inglês carbonic anhydrase, traduzido como anidrase carbônica.
CA-I
Do inglês carbonic anhydrase I, traduzido como anidrase carbônica I.
CA-II
Do inglês carbonic anhydrase II, traduzido como anidrase carbônica II.
CA-III
Do inglês carbonic anhydrase III, traduzido como anidrase carbônica III.
CA-IV
Do inglês carbonic anhydrase IV, traduzido como anidrase carbônica IV.
CA-IX
Do inglês carbonic anhydrase IX, traduzido como anidrase carbônica IX.
CARP-VIII
Refere-se à anidrase carbônica VIII.
CARP-X
Refere-se à anidrase carbônica X.
CARP-XI
Refere-se à anidrase carbônica XI.
CA-V
Do inglês carbonic anhydrase V, traduzido como anidrase carbônica V.
23
CA-VI
Do inglês carbonic anhydrase VI, traduzido como anidrase carbônica VI.
CA-VII
Do inglês carbonic anhydrase VII, traduzido como anidrase carbônica VII.
CA-XII
Do inglês carbonic anhydrase XII, traduzido como anidrase carbônica XII.
CA-XIII
Do inglês carbonic anhydrase XIII, traduzido como anidrase carbônica XIII.
CA-XIV
Do inglês carbonic anhydrase XIV, traduzido como anidrase carbônica XIV.
CBP/p300
CD-31
CE
Refere-se à proteína ligante ao CREB.
Do inglês cluster of differentiation 31, traduzido como grupamento de
diferenciação 31.
Refere-se ao carcinoma epidermóide.
CEL
Refere-se ao carcinoma epidermóide de língua.
CEO
Refere-se ao carcinoma epidermóide oral.
c-Myc
CO2
COOH
CpG
CREB
Cul2
Refere-se ao gene homólogo ao oncogene mielocitomatose viral (v-Myc).
Do inglês carbon dioxide,traduzido como dióxido de carbono.
Refere-se à extremidade carboxi-terminal.
Refere-se a um dinucleotídeo.
Do inglês protein binding to cAMP responsive element, traduzido como
proteína ligante ao elemento responsivo cAMP.
Refere-se a culina 2.
CYP1A1
Refere-se uma subfamília do citocromo p450 (CYP).
CYP1B1
Refere-se uma subfamília do citocromo p450 (CYP).
DNA
Do inglês deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido desoxirribonucléico.
E6
Do inglês protein E6, refere-se ao gene E6 ou à proteína E6.
E7
Do inglês protein E7, refere-se ao gene E7 ou à proteína E7.
EPA-1
Do inglês endothelial protein -1,traduzido como proteína endotelial -1.
EPAS1
Refere-se ao domínio PAS da proteína endotelial 1.
EPOR
Do inglês erythropoietin receptor, traduzido como receptor de eritropoietina.
ERK
Do inglês extracellular signal regulated kinase, traduzido como quinase
regulada por sinal extracelular.
ERO
Do inglês oxygen reactive species,traduzido como espécie reativa de oxigênio.
24
Ets-1
Do inglês protein C-ets-1, traduzido como proteína C-ets-1.
FGFb
Do inglês basic fibroblastic growth factor, traduzido como fator de
crescimento fibroblástico básico.
FIH
G
GLUT
GLUT-1
GP
Do inglês factor inhibiting HIF, traduzido como fator inibidor de HIF.
Do inglês guanine, traduzido como guanina.
Do inglês glucose transporter, traduzido como transportador de glicose.
Do inglês glucose transporter-1, traduzido como transportador de glicose-1.
Refere-se ao granuloma piogênico.
GSK-3
Do inglês glycogen synthase kinase-3, traduzido como glicogênio sintase
quinase-3.
GTPase
Do inglês guanidine triphosphate enzyme activity, traduzido como guanidina
trifosfato com atividade enzimática.
GTPaseRab8A
Do inglês guanidine triphosphate enzyme activity Rab8A, traduzido como
guanidina trifosfato com atividade enzimática Rab8A.
H+
Do inglês anion hydrogen, traduzido como anion de hidrogênio.
H2O
Do inglês water, traduzido como água.
HBS
Do inglês binding site of HIF-1, traduzido como sítio de ligação ao HIF-1.
HCO3-
Do inglês ion bicarbonate, traduzido como íon bicarbonato.
HEM
Refere-se ao hemangioma.
HIF-1
Do inglês hypoxia-inducible factor-1, traduzido como fator-1 induzível por
hipóxia.
HIF-1α
Do inglês hypoxia-inducible factor-1α, traduzido como fator-1α induzível por
hipóxia.
HIF-1β
Do inglês hypoxia-inducible factor-1β, traduzido como fator-1β induzível por
hipóxia.
HIF-2α
Do inglês hypoxia-inducible factor-2α, traduzido como fator-2α induzível por
hipóxia.
HIF-3α
Do inglês hypoxia-inducible factor-3α, traduzido como fator-3α induzível por
hipóxia.
hif-a
HMIT
Refere-se ao gene do HIF-1α.
Do inglês H+/myo-inositol co-transporter, traduzido como transportador
H+/ligado ao mio-inositol.
25
HNF4
Do inglês hepatocyte nuclear factor 4, traduzido como fator 4 nuclear de
hepatócito.
HPH
Do inglês prolyl hydroxylase HIF, traduzido como prolil hidroxilase do HIF.
HPV
Do inglês human papillomavirus, traduzido como papiloma vírus humano.
HRE
Do inglês hypoxia-response element, traduzido como elemento responsivo de
hipóxia.
ID
Do inglês HIF-1α inhibitory domain, traduzido como domínio inibitório do
HIF-1α.
IDH
Do inglês isocitrate dehydrogenase, traduzido como isocitrato desidrogenase.
IGF-1
Do inglês growth factor 1 insulin, traduzido como fator 1 de crescimento de
insulina.
INCA
Refere-se a Instituto Nacional do Câncer.
iNOS
Do inglês inducible nitric oxide synthase, traduzido como óxido nítrico sintase
indizível.
JNK
Do inglês c-Jun NH2-terminal kinase, traduzido como c-Jun NH2-terminal
quinase.
kDa
Do inglês kilodalton, traduzido como quilodálton.
Ki-67
Refere-se ao antígeno celular Ki-67 ou anticorpo anti-Ki-67.
LDHA
Do inglês, lactate dehydrogenase A, traduzido como lactato desidrogenase A.
LSAB
Do inglês labeled streptavidin
estreptoavidina-biotina.
MAPK
Do inglês mitogen-activated protein kinase, traduzido como proteína-quinase
ativada por mitógeno.
biotin,
traduzido
como
conjugado
MEC
Refere-se à matriz extracelular.
MEK1
Do inglês activating MAPK kinase 1, traduzido como quinase 1 ativadora de
MAPK.
mTOR
Do inglês mammalian target of rapamycin, traduzido como alvo mamífero da
rapamicina.
MV
MVD
NADPH
Refere-se à malformação vascular.
Do inglês microvessel density, traduzido como densidade microvascular.
Do inglês nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, traduzido como
nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato.
26
NH2
Refere-se à extremidade amino terminal.
NLS-C
Do inglês nuclear localization signal carboxy terminal, traduzido como sinal
de localização nuclear carboxi terminal.
NLS-N
Do inglês nuclear localization signal amino terminal, traduzido como sinal de
localização nuclear amino terminal.
O2
ODD
Do inglês oxygen, traduzido como oxigênio.
Do inglês oxygen dependent degradation domain, traduzido como domínio de
degradação dependente de oxigênio.
p53
Do inglês protein 53, refere-se ao gene p53 ou à proteína p53.
PAS
Do inglês per, ahr/arnt, sim, traduzido como domínio comum encontrado nos
genes per, ahr/arnt, sim.
PCR
Do inglês polymerase chain reaction, traduzido como reação em cadeia da
polimerase.
PDGF
Do inglês platelet-derived growth factor, traduzido como fator de crescimento
derivado de plaqueta.
PFK
Do inglês phosphofructokinase, traduzido como fosfofrutoquinase.
PGK
Do inglês phosphoglycerate kinase, traduzido como fosfoglicerato quinase.
PHD
Do inglês prolyl hydroxylase, traduzido como prolil hidroxilase.
PI3K
Do inglês phosphatidylinositol-3-kinase, traduzido como fosfatidilinositol-3quinase.
pRb
Do inglês retinoblastoma protein, refere-se ao gene pRb ou à proteína pRb
PSTB
Do inglês stability domain protein rich in proline-serine-threonine, traduzido
como domínio de estabilidade da proteína rico em prolina-serina-treonina.
PTEN
Do inglês phosphatase and tensin homolog, traduzido como fosfatase
e homólogo da angiotensina.
R
Rab8A
Ras
Refere-se adenina ou guanina.
Do inglês ras-related protein Rab-8A, traduzido como ras proteína
relacionada Rab-8A.
Do inglês rat sarcoma vírus, traduzido como vírus do sarcoma de rato.
REF-1
Do inglês redox factor-1, traduzido como fator redox-1.
RNA
Do inglês ribonucleic acid, traduzido como ácido ribonucléico.
SGHM
Refere-se ao sistema de gradação histopatológica de malignidade.
27
SGLT
Do inglês sodium-dependent glucose transport, traduzido como transportador
de glicose ligado ao íon sódio.
SLC2A1
Refere-se ao gene do GLUT-1.
Smad-3
Do inglês receptor-regulated Smad-3, traduzido como receptor regulado Smad
3.
Src
SRC-1
T
Do inglês rous sarcoma virus, traduzido como vírus do sarcoma rous.
Do inglês steroid receptor coactivator 1, traduzido como coativador 1 do
receptor de esteróide.
Do inglês thymine, traduzido como timina.
TAD-C
Do inglês carboxy terminal transactivation domain,traduzido domínio de
transativação carboxi terminal.
TAD-N
Do inglês amino terminal transactivation domain,traduzido domínio de
transativação amino terminal.
TBC1D4
Do inglês TBC1 domain family member 4, traduzido como TBC1 membro da
família de domínio 4.
TGF-β
Do inglês transforming growth factor-β, traduzido como fator transformador
de crescimento-β.
Tie-2
Do inglês intermediary factor 2 transcription,traduzido como fator
intermediário 2 da transcrição.
TNF
Do inglês tumor necrosis factor, traduzido como fator de necrose tumoral.
TNM
Do inglês, tumor-node-metastasis, refere-se ao sistema de estadiamento clínico
que avalia o tamanho do tumor, envolvimento do linfonodo regional e
envolvimento por metástase à distância.
TRIS-HCL
Refere-se à tris-hidroximetil-aminometano.
TRX
Do inglês thioredoxin, traduzido como tioredoxina.
UV
Refere-se à ultravioleta.
VEGF
Do inglês vascular endothelial growth factor, traduzido como fator de
crescimento endotelial vascular.
VHL
Do inglês Von Hippel Lindau factor, traduzido como fator de Von Hippel
Lindau.
WNK1
Do inglês lysine deficient protein kinase 1, traduzido como proteína
quinase lisina deficiente 1.
28
XRE
Do inglês xenobiotic responsive element, traduzido como elemento responsivo
a xenobiótico.
α-CA
Refere-se ao gene α da anidrase carbônica.
β-CA
Refere-se ao gene β da anidrase carbônica.
γ-CA
Refere-se ao gene γ da anidrase carbônica.
29
"Quando você quer alguma coisa, todo o Universo conspira
para que você realize o seu desejo."
(Paulo Coelho)
SUMÁRIO
30
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 32
2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................... 35
2.1 Carcinoma Epidermóide Oral ....................................................................................... 36
2.2 Fator 1 Induzível por Hipóxia - HIF-1......................................................................... 54
2.3 Transportador de Glicose - GLUT................................................................................. 65
2.4 Anidrase Carbônica - CA .............................................................................................. 74
3 PROPOSIÇÃO ............................................................................................................... 80
4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 82
4.1 Caracterização do Estudo ....................................................................................... 83
4.2 População ............................................................................................................... 83
4.3 Amostra .................................................................................................................. 83
4.3.1 Critérios de Inclusão da Amostra ............................................................. 84
4.3.2 Critérios de Exclusão da Amostra ............................................................ 84
4.4 Estudo Clínico......................................................................................................... 84
4.5 Estudo Morfológico ............................................................................................... 84
4.6 Estudo Imuno-histoquímico .................................................................................. 85
4.7 Análise do Perfil Imuno-histoquímico ................................................................... 88
4.8 Análise Estatística .................................................................................................. 89
4.8.1 Delineamento da Análise ........................................................................ 89
4.8.2 Variáveis Estudadas ................................................................................ 90
31
4.8.3 Definição do Teste Estatístico ................................................................ 90
4.9 Implicações Éticas ................................................................................................. 90
5 RESULTADOS............................................................................................................... 91
5.1 Análise Descritiva dos Aspectos Clínicos.............................................................. 92
5.2 Análise Descritiva dos Aspectos Morfológicos...................................................... 93
5.3 Análise Descritiva da Imuno-histoquímica do HIF-1α, GLUT-1 e CA-IX............ 94
5.3.1 HIF-1α...................................................................................................... 94
5.3.2 GLUT-1.................................................................................................... 94
5.3.3 CA-IX....................................................................................................... 95
5.4 Resultado da Análise Estatística............................................................................. 95
5.4.1 Análise Estatística dos Aspectos Clínicos................................................. 95
5.4.2 Análise Estatística da Expressão Imuno-histoquímica do HIF-1α........... 99
5.4.3 Análise Estatística da Expressão Imuno-histoquímica do GLUT-1........ 102
5.4.4 Análise Estatística da Expressão Imuno-histoquímica da CA-IX........... 105
6 DISCUSSÃO.................................................................................................................. 114
7 CONCLUSÕES............................................................................................................. 137
REFERÊNCIAS .............................................................................................................. 139
APÊNDICES .................................................................................................................... 154
ANEXOS........................................................................................................................... 157
32
"É justamente a possibilidade de realizar um sonho que torna
a vida interessante."
(Paulo Coelho)
INTRODUÇÃO
33
1 INTRODUÇÃO
O carcinoma epidermóide oral (CEO) é uma neoplasia maligna de
origem epitelial que corresponde a mais de 90% dos cânceres que ocorrem em cavidade
oral, constituindo-se em um grave problema de saúde pública em determinados lugares
do mundo (GORSKY et al., 2004). Sua etiologia é multifatorial, onde diversos fatores
intrínsecos tais como alterações genéticas, deficiências nutricionais e imunossupressão e
fatores extrínsecos como radiação solar, tabaco, álcool e vírus têm sido apontados
dentre os agentes relacionados à sua etiopatogenia (AL-RAWI; TALABANI, 2008;
ANDISHEH-TADBIR; MEHRABANI; HEYDARI, 2010).
Esta neoplasia ocorre mais frequentemente em indivíduos do gênero
masculino, entre a sexta e oitava década de vida, sendo a localização mais acometida,
relatada pela maioria dos estudos, a língua, seguida do assoalho bucal, lábio e palato
(ARIYOSHI et al., 2008; GARAVELLO et al., 2008; RIBEIRO et al., 2009). Dentre
estas localizações anatômicas, os casos diagnosticados em língua demonstram algumas
peculiaridades. São lesões de caráter mais infiltrativo, com curso clínico mais agressivo,
prognóstico desfavorável, altas taxas de morbidade e mortalidade e com grande
probabilidade de desenvolver metástase para os linfonodos regionais, ainda que em
pequenos diâmetros (RUSTHOVEN et al., 2010).
Várias condições estão associadas ao potencial de agressividade do CEO,
sendo considerados as mais significativas: o grau histológico de malignidade, tamanho
do tumor, comprometimento dos tecidos vizinhos, presença de metástase no momento
do diagnóstico e localização anatômica (ALVES et al., 2011). Entretanto, segundo
Wang et al. (2006) e Le et al. (2007), parâmetros clínicos e patológicos ainda são
insuficientes para a determinação do comportamento biológico do CEO, pois pacientes
com tamanho equivalente de tumor, mesmo com o estadiamento clínico e diferenciação
tumoral semelhantes, podem diferir no curso clínico da doença e tempo de sobrevida.
Assim, a identificação de outros fatores relacionados ao desenvolvimento da neoplasia
pode levar à descoberta de ferramentas que indiquem ou expliquem o potencial maligno
dessa doença.
A hipóxia tumoral é a uma das características das neoplasias malignas que
encontra-se associada à resistência as modalidades terapêuticas como a quimioterapia e
34
a radioterapia, devido a uma série de mudanças genéticas adaptativas que ocorrem no
ambiente hipóxico que visam favorecer o mecanismo de crescimento e proliferação
celular, resultando em células com alto poder de invasão e metástase, com um fenótipo
mais agressivo e indivíduos com pior prognóstico (CHOI et al., 2008; TANAKA et al.,
2008).
O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um regulador central da resposta à
mudanças na concentração de O2, agindo por exemplo, em mecanismos exercidos
pelos membros de transporte da glicose (GLUT) e na anidrase carbônica (CA), os quais
então envolvidos no papel da regulação do metabolismo energético, angiogênese,
viabilidade e proliferação celular, apoptose, migração e adesão celular (SEMENZA,
2006; SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008).
Sendo assim, pesquisas têm sido realizadas com o intuito de avaliar e elucidar o
papel dos marcadores de hipóxia na patogênese e progressão em muitos tipos de
neoplasias e lesões não-neoplásicas, incluindo as de cabeça e pescoço, com objetivo de
auxiliar na estimativa do prognóstico e na escolha da terapêutica adequada (TANAKA
et al., 2008; OHBA et al., 2010).
Diante do exposto, este trabalho teve como proposição avaliar a expressão
imuno-histoquímica de marcadores de hipóxia, utilizando os anticorpos anti-HIF-1α,
anti-GLUT-1 e anti-CA-IX em uma série de casos de carcinoma epidermóide de língua
(CEL) na tentativa de estabelecer uma correlação entre a expressão dessas proteínas e o
comportamento biológico do tumor.
35
“O poder está dentro de você enquanto você acreditar.”
(Fernando Lapolli)
REVISÃO DE LITERATURA
36
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Carcinoma Epidermóide Oral
As lesões malignas que acometem os tecidos orais representam em seu conjunto
o sexto tipo de câncer mais comum e uma das principais causas de morbidade e
mortalidade em todo mundo. O câncer oral é um grave e crescente problema de saúde
pública no Brasil, correspondendo a 4 % de todos os tipos de câncer, ocupando o oitavo
lugar entre os tumores que acometem o homem e o décimo primeiro entre as mulheres
(MASSANO et al., 2006).
Segundo dados fornecidos pelo do Instituto Nacional do Câncer – (INCA), a
estimativa de ocorrência de câncer oral no Brasil para o ano de 2010 é de 14.120 casos,
dos quais 10.330 devem acometer o sexo masculino e 3.790 o feminino. No Nordeste,
estima-se 2.810 novos casos de câncer oral, sendo a segunda região mais acometida. No
Rio Grande do Norte, para cada 100.000 habitantes, 210 seriam acometidos por tal
lesão, sendo 60 deles em Natal (INCA, 2010).
Nascimento et al. (2005), em análise de 2.147 casos de lesões bucomaxilofaciais
diagnosticadas no Laboratório de Patologia Bucal da Universidade de Pernambuco,
constataram que 5% (109 casos) de todas as lesões analisadas tinham natureza maligna
e, deste percentual, aproximadamente 37% (40 casos) correspondiam a casos de CEO,
que foi a neoplasia mais comumente diagnosticada nesse serviço, correspondendo 1,8%
de todos os casos estudados.
O CEO, também chamado de carcinoma espinocelular ou de carcinoma de
células escamosas, representa cerca de 90 a 95% das neoplasias malignas de mucosa
oral que atinge mais os homens do que as mulheres em uma proporção de 2:1,
principalmente acima dos cinqüenta anos de idade (AL-RAWI; TALABANI, 2007;
REGEZI; SCIUBBA; JORDAN, 2008). Esta neoplasia ocorre principalmente em língua
e lábio inferior, podendo afetar outros sítios como assoalho bucal, mucosa jugal,
gengiva e palato (NEVILLE et al., 2009).
Amorim, Amorim e Freitas (2002), investigando 85 casos de CEO, constataram
que o palato foi a localização mais afetada (22,3%), seguido pelo rebordo alveolar
37
(21,1%) e assoalho bucal (14,1%). Identificaram, ainda, uma pequena diferença entre a
incidência do sexo masculino (51,7%) e o sexo feminino (48,3%).
Em estudo de 1.287 casos de CEO realizado no período de 1979 a 1999 nos
serviços de Anatomia Patológica de Aracaju, Hora et al. (2003) verificaram uma
freqüência da lesão de 62,2% em pacientes do sexo masculino e 32% em pacientes do
sexo feminino, numa relação de 1,9:1. Os demais casos (5,8%) corresponderam àqueles
com informações ignoradas. A faixa etária prevalente foi de 60 a 69 anos, com a idade
média de 58,2 anos para o sexo masculino e 60,5 anos para o sexo feminino. Nos
homens, a língua foi a localização anatômica de maior freqüência com 31,5% dos casos,
seguida do lábio inferior (25,7%) e do assoalho (14,4%). Para as mulheres evidenciouse que a língua representou 29,1% dos casos, o lábio 19,2% e o palato 16,3%.
Dedivitis et al. (2004), avaliando o perfil de pacientes portadores de CEO,
evidenciaram uma proporção de homem-mulher de 3,35:1. As idades variaram de 46 a
91 anos, com mediana de 62 anos.
Tromp et al. (2005) evidenciaram 134 neoplasias orais em uma série de 306
carcinomas de cabeça e pescoço. A faixa etária variou de 34 a 89 anos, com média de
62 anos. Os homens foram cerca de duas vezes mais afetados do que as mulheres.
Conforme a pesquisa conduzida por Ariyoshi et al. (2008) em 1816 casos de
câncer oral, os autores relataram que 88,7% de todos os casos eram de CEO, os quais
59,2% acometiam o sexo masculino com a média de idade de 65,2 anos. O sítio mais
freqüente foi a língua (40,2%), seguida pela gengiva (32,7%), mucosa jugal (10,1%) e
assoalho bucal (9,0%).
Segundo Santos et al. (2009), em uma pesquisa de 396 casos de CEO no Estado
de Alagoas, observaram que a maioria dos pacientes era do sexo masculino (62,7%),
com média de idade de 61,95 anos, sendo a língua o sítio anatômico preferencialmente
afetado, seguido pelo assoalho de boca.
Marocchio et al. (2010), objetivando detectar possíveis diferenças nos dados
epidemiológicos do CEO na cidade de São Paulo nos últimos 40 anos, analisaram 1564
casos da lesão entre os anos de 1960 e 2008, os quais foram divididos em quatro
períodos de tempo (1961-1980, 1981-1990, 1991-2000, 2001-2008). Os autores
38
puderam constatar que o sexo masculino, no geral foi o mais afetado que o sexo
feminino (3:1), entretanto quando, comparados entre o primeiro e o último período de
tempo, a proporção diminuiu significativamente (5,8:1 para 2,8:1). Um aumento
relevante na taxa de CE em pacientes acima de 80 anos foi observada nos períodos
iniciais. Quanto à localização, a gengiva foi à região mais acometida, contudo, a
freqüência de ocorrência no lábio inferior aumentou no último período de tempo. Com
relação ao tamanho da lesão no momento do diagnóstico, houve uma diferença
significativa entre o primeiro e o último período. As lesões menores foram encontradas
nos últimos anos do estudo o que suporta uma visão otimista na detecção precoce do
cancer oral em São Paulo.
Alguns estudos indicam um maior envolvimento do CEO em pacientes de raça
branca, chegando a representar aproximadamente 80% dos casos, ao passo em que
outros estudos demonstram ser mais comum na raça negra. Estas discrepâncias podem
estar relacionadas à ampla miscigenação da população brasileira e da conseqüente
dificuldade em se enquadrar determinados indivíduos em uma raça pré-estabelecida
(SOARES, 2005; ALVES et al., 2011).
O CEO pode exibir várias apresentações clínicas, incluindo formas
leucoplásicas, eritroplásicas, eritroleucoplásicas ou ulceradas, assim como três padrões
de crescimento: exofítico, endofítico e verrucoso (NEVILLE et al., 2009). Segundo
Izarzugaza, Esparza e Aguirre (2001), tais aspectos clínicos não tendem a exibir
variações nas diferentes idades e podem demonstrar a presença de diversos sinais e
sintomas, tais como: dor em diferentes graus e até mesmo ausência de sintomatologia;
hiperceratose,
ulceração,
crescimento
exofítico
ou
infiltrativo,
friabilidade,
sangramento; halitose, nódulos cervicais, submandibulares e submentais palpáveis, e até
alteração na fonação e na deglutição quando localizado em língua e orofaringe. A
apresentação típica desta enfermidade é de uma lesão com área central necrótica
delimitada por borda elevada e endurecida. No entanto, em algumas situações, a lesão
pode ser indistinguível de condições orais inflamatórias inócuas, sendo imprescindível a
realização de uma biópsia para correto estabelecimento do diagnóstico e conseqüente
tratamento (PORTE; WAUGH, 2005; AL-RAWI; TALABANI, 2007).
O desenvolvimento da neoplasia está intimamente relacionado com alterações na
estrutura e na regulação genética. Essas alterações podem ser mutações espontâneas ou
39
provocadas por fatores externos como diversos agentes carcinógenos físicos, químicos e
biológicos. Sua etiologia é complexa pelo fato de ter um caráter multifatorial, sendo
apontados fatores extrínsecos (fumo, álcool, radiação solar e vírus) e intrínsecos
(alterações genéticas, deficiências nutricionais e imunossupressão) relacionados com a
etiopatogenia (MASSANO et al., 2006; NEVILLE et al., 2009).
Kosomara et al. (2005) descrevem que para um determinado nível de exposição
a um carcinógeno, apenas parte dos indivíduos expostos desenvolverá o câncer, pois
grande parte das substâncias carcinogênicas requer ativação metabólica no organismo
antes de se tornarem efetivamente cancerígenas. A susceptibilidade individual ao câncer
parece depender, em parte, da capacidade, determinada geneticamente, de metabolizar e
eliminar essas substâncias do organismo de forma eficiente.
Regezi, Sciubba e Jordan (2008) relataram que o denominador comum para
todos os fatores etiológicos do câncer oral é a sua habilidade para alterar
permanentemente o genoma dos ceratinócitos da mucosa. Estes fatores, através de
mutação, amplificação ou ativação dos oncogenes e inativação de genes supressores de
tumor podem comandar os fenômenos da carcinogênese. Conforme Bettendorf, Piffko e
Bánkfalfi (2004), a carcinogênese oral é um processo multifásico que requer a
desestabilização de vários sistemas de controle e reparo que coordenam o
comportamento celular, existindo, portanto, rupturas na sinalização celular, reparo de
DNA e ciclo celular, que são fundamentais para homeostase tecidual.
Abbas, Lichtman e Pillai (2008) e Siveira et al. (2010) ressaltam que após
aquisição do fenótipo maligno, as células cancerosas necessitam evadir-se do sistema
imune do hospedeiro para sobreviver e, assim, formar a massa tumoral. Por essa razão, a
imunossupressão tem sido implicada como fator de risco para o desenvolvimento de
diversas neoplasias humanas, dentre as quais o CEO (Neville et al., 2009).
O fumo e o álcool representam os principais fatores envolvidos na etiologia do
CEO. O tabaco fumado ou mascado pode atuar isoladamente ou em sinergismo com o
álcool, estando bem documentado que o risco para o desenvolvimento do câncer
aumenta proporcionalmente à quantidade de cigarros consumidos ou álcool ingerido,
havendo efeito multiplicativo quando ambos são utilizados em conjunto (BATISTA et
al., 2010).
40
Dedivitis et al. (2004) evidenciaram que pacientes com CEO e da orofaringe
tiveram significativa exposição ao tabagismo e etilismo, em um casuística onde os
pacientes tinham uma idade acima dos 40 anos. Observaram que o hábito do tabagismo
estava presente em 77% dos pacientes com carcinoma oral, sendo que 35% consumiam
até 40 cigarros por dia, enquanto o etilismo foi registrado em 74% dos pacientes.
Ribeiro et al. (2009) observaram 46 casos de CEO em jovens brasileiros, com
média de idade abaixo de 45 anos, 70% desses jovens eram etilistas e tabagistas e 65%
foram diagnosticados em estadiamento clínico III e IV. Todavia, O’Regan et al. (2006)
relacionaram o desenvolvimento do CEO em jovens ao uso de drogas, infecções virais e
dieta, pois a maioria desses pacientes não relataram o hábito de fumar.
O mecanismo molecular básico da carcinogênese decorrente da exposição aos
constituintes do tabaco resulta da formação de adutos eletrolíticos no DNA nas células
expostas a tais constituintes. A grande maioria dos componentes do tabaco relacionada à
carcinogênese oral é enquadrada como carcinógenos químicos da classe dos
hidrocarbonetos
policíclicos
aromáticos,
tais
como
o benzo(α)pireno. Esses
carninógenos precisam de ativação metabólica, através de enzimas dependentes do
citocromo p-450 (CYP1A1 e CYP1B1), para causar efeito deletério por meio de
espécies moleculares reativas que levam à formação de adutos no DNA da célula, que
podem acarretar a mutações em genes relacionados à proliferação, diferenciação e
apoptose (KUMAR; ABBAS; FASTO, 2008).
O álcool etílico é a droga mais consumida no mundo e seu consumo abusivo
relaciona-se ao aumento na incidência de cânceres da cavidade oral, faringe, esôfago,
fígado e, provavelmente, mama (KUMAR; ABBAS; FASTO, 2008). Essa droga não é
um carcinógeno direto, necessitando ser metabolizado em várias formas de aldeídos que
tem propriedades carcinogênicas. Esta reação bioquímica pode ser feita tanto pelo
próprio organismo de quem consome essa droga como também por bactérias comensais
da cavidade oral (SCULLY; BAGAN, 2009). Kurkivuori et al. (2007) verificaram em
seu trabalho que cepas de Streptococcus salivarius, Streptococcus intermedius e
Streptococcus mitis quando incubadas em etanol eram capazes de produzir altas
concentrações de acetaldeído, além de apresentarem alta atividade da enzima
desidrogenase alcoólica, que é responsável pela metabolização do etanol em seus
derivados carcinogênicos.
41
Alquati (2011) afirma que os mecanismos pelos quais o álcool pode agir na
etiopatogênese do câncer oral não estão definitivamente esclarecidos, podendo ser
sugeridos o aumento da permeabilidade das células da mucosa aos agentes
carcinogênicos, devido ao efeito solubilizante do álcool, a presença de substâncias
carcinogênicas nas bebidas alcoólicas, o dano celular produzido pelos metabólitos do
etanol (aldeídos), bem como deficiências nutricionais decorrentes do consumo crônico
do álcool.
A exposição excessiva ou a longo prazo à radiação solar é a principal causa do
câncer em lábio inferior, evidenciado especialmente em pessoas de pele clara com
tendência a se bronzear facilmente, sendo mais comum em trabalhadores rurais (LUNAORTIZ et al., 2004; NEVILLE et al., 2009). Kumar, Abbas e Fausto (2008) afirmam
que o grau de risco depende do tipo de radiação ultravioleta (UV), da intensidade de
exposição e da quantidade de agentes protetores naturais presentes na pele. Os raios UV
têm a capacidade de inibir a divisão celular, inativar vias enzimáticas, induzir mutações
e morte celular. Adicionalmente, as lesões no DNA são decorrentes do acúmulo de
dímeros de piridina e, caso não sejam reparadas pelo sistema enzimático de excisão
nucleotídica, podem originar mutações com potencial carcinogênico.
Nos dias atuais, muita atenção é reservada ao possível papel do papiloma vírus
humano (HPV) no potencial oncogênico na carcinogênese oral. Os subtipos 16, 18, 31 e
33 do HPV são as cepas mais intimamente relacionadas à displasia e ao carcinoma de
células escamosas. Os mecanismos básicos pelos quais acredita-se que o HPV contribua
para a carcinogênese oral envolvem principalmente duas proteínas codificadas pelo
vírus: E6 que promove a degradação do produto do gene supressor tumoral p53 e o E7
que atua na degradação do produto do gene supressor tumoral pRb (NEVILLE et al.,
2009).
Conforme Oliveira et al. (2003), apesar do aprimoramento das técnicas de
detecção do HPV nas lesões de mucosa oral, seu envolvimento direto com os
carcinógenos orais não foi ainda devidamente comprovado. Determinados subtipos,
particularmente o HPV-16 e o -18, estão relacionados ao câncer da cérvice uterina e,
como afirmam diversas investigações, ao câncer oral (ANDREWS; SEAMAN;
WEBSTER-CYRIAQUE, 2009; SALEM, 2010). Todavia sua ação sinérgica, logo após
sua integração irreversível ao DNA da célula infectada, com outros carcinógenos
42
químicos e físicos, em determinados casos, parece ser o caminho mais correto para
explicar a ação do HPV na carcinogênese oral (OLIVEIRA et al., 2009; SALEM, 2010).
A desnutrição, resultante de problemas socioeconômicos e/ou distúrbios
metabólicos, têm sido relacionada à carcinogênese oral por ocasionar alterações
epiteliais, tornando a mucosa oral mais susceptível aos agentes cancerígenos. A carência
de antioxidantes e dietas inadequadas funciona como fontes de radicais livres que
seriam responsáveis por alterações no DNA celular, tornando-o mais vulnerável ao
desenvolvimento de neoplasias (NEVILLE et al., 2009; SCULLY; BEGAN, 2009;
INCA, 2010).
Com relação ao tratamento, o estadiamento clínico da doença conduz à
terapêutica adotada no câncer oral, que consiste na excisão cirúrgica ampla, radioterapia
ou na combinação de cirurgia e radioterapia. A localização do tumor pode influenciar o
plano de tratamento, onde as lesões orofaríngeas geralmente recebem radioterapia.
Outras indicações para radioterapia incluem a presença de margens cirúrgicas exíguas
ou comprometidas, metástase regional, características histopatológicas de alto grau e
invasão perineural ou angiolinfática. A quimioterapia tipicamente é administrada em
conjunto
com
a
radiação,
como
quimioterapia
de
indução
seguida
por
quimioradioterapia concomitante ou como terapia paliativa (NEVILLE et al., 2009;
ALVES et al., 2011).
Para carcinomas intraorais de pequenas dimensões, uma única modalidade de
tratamento é geralmente escolhida. Pacientes com lesões maiores ou que apresentem
linfonodos clinicamente palpáveis requerem terapia combinada. Além disso, pacientes
com CEL no estágio inicial (estágio I e II), mas profundamente invasivos com espessura
maior que 3 ou 4 mm, são de risco aumentado para metástase subclínica para linfonodo
e, dessa forma, devem receber irradiação pós-operatória em pescoço ou dissecção
cervical eletiva (NEVILLE et al., 2009).
A pesquisa conduzida por Montoro et al. (2008) em 45 casos de CEO,
evidenciou que a taxa de sobrevida foi menor em pacientes com metástase linfonodal
regional (p = 0,017), aqueles que apresentavam com margens da lesão comprometidas
(p = 0,004) e naqueles que foram submetidos a radioterapia-pós operatória (p = 0,056),
a qual não apresentou ser estatisticamente relevante. Os autores ressaltam que é
43
provável que a taxa de sobrevivência de 5 anos de somente 39% tenha sido devido ao
elevado número de pacientes com metástase (52%) e pelo fato da amostra ser
basicamente de CEL e assoalho da boca (82%), os quais são os mais difíceis de
controlar devido ao comportamento agressivo.
Wang et al. (2009), em uma análise de 227 pacientes com CEL no estágio I e II,
verificaram que a taxa de recorrência foi menor nas lesões bem diferenciadas (19,3%) (p
= 0,004) do que as moderadamente e pobremente diferenciadas (28%) (p = 0,014) e
significantemente mais baixa nos pacientes que receberam a radioterapia combinada a
cirurgia (15%), do que aqueles que submeteram-se a exicisão cirúrgica. A taxa de
sobrevida de 3 e 5 anos nos grupos com e sem recorrência foi de 40,7% contra 87,3% e
25,9% contra 80,3%, respectivamente (p = 0,000). Além disso, os autores investigaram
que a taxa de sobrevida era significantemente mais baixa nos pacientes acima de 45
anos (p = 0,021) e naqueles que não se submeteram ao esvaziamento cervical (p =
0,023).
Rusthoven et al. (2010) avaliaram a sobrevida e os padrões de recidivas em uma
série de casos de CEL tratados cirurgicamente entre os anos de 1999 e 2007. Durante
este tempo de análise, 38 pacientes apresentaram um novo CEL logo após a ressecção
cirúrgica inicial. Esses pacientes foram mais uma vez tratados através da cirurgia e/ou
radioterapia com quimioterapia adjuvante. Após acompanharem aproximadamente 29
meses os pacientes, observaram que o controle locorregional e à distancia exibiu taxa
livre de doença em dois anos de 58% e 83%, respectivamente. Assim, os autores
enfatizam que embora a terapia para esses casos tenha sido agressiva, os pacientes com
CEL tiveram uma baixa taxa de controle local e de sobrevida, especialmente entre os
pacientes no estágio I-II da doença.
Adicionalmente, Liu et al. (2011), propondo avaliar se o esvaziamento cervical
eletivo poderia melhorar a taxa de sobrevida no estágio I do CEL, 131 pacientes
realizaram a cirurgia do sítio primário da lesão, sendo que desses; 88 casos foram
submetidos a esvaziamento cervical seletivo, incluindo o nível esvaziamento I-III em 49
pacientes e o nível esvaziamento cervical I-V em 39 pacientes. Com isso, os autores
constataram que após 4 anos, as taxas de controle regional em pacientes com apenas o
tratamento cirúrgico do sítio primário, os pacientes submetidos ao esvaziamento
cervical nível I-III e aqueles tratados com o esvaziamento nível I-V foram 81%, 83,6%
44
e 89,1%, respectivamente. Assim, na análise multivariada, observaram que o
esvaziamento cervical eletivo não era um fator independente para aumentar a taxa de
sobrevida livre da doença ou taxa de sobrevida global, pois não evidenciaram uma
melhora no controle regional da doença no estágio I, havendo com isso, a necessidade
de métodos precisos e válidos para selecionar pacientes que se beneficiem do tratamento
eletivo.
Choi et al. (2006) relatam que a taxa de sobrevida de 5 anos é de somente de
35% a 50% para os pacientes acometidos pelo CEO, afirmando que isso pode estar
correlacionado com a falha na resposta ao tratamento, apresentação tardias das lesões e
falta de marcadores fidedignos para detecção precoce, tornando a neoplasia umas das
mais difíceis de se estabelecer um controle adequado. A maioria dos portadores de CE
são diagnosticados com a doença no estágio avançado, exibindo lesões primárias, bem
como metástases em linfonodos regionais no momento do diagnóstico, interferindo
dessa forma, na taxa de sobrevida do paciente, mesmo com o avanço nas modalidades
terapêuticas nos últimos 10 anos.
De acordo com Neville et al. (2009), o CE de lábio inferior é uma lesão de bom
prognóstico, devido ao seu alto grau de diferenciação e baixa freqüência de metástases
em linfonodos regionais. Todavia quando a metástase em linfonodo regional é
detectada, existe uma diminuição da sobrevida do paciente. Já o CEL geralmente
apresenta pobre diferenciação histológica e evolução clínica rápida, com metástases
precoces, sendo uma lesão de prognóstico reservado quando comparados ao CE de
outros sítios orais (IZARZUGAZA; ESPARZA; AGUIRRE, 2001; MIRANDA, 2002;
VARTANIAN et al. 2004).
Segundo Nithya et al. (2003), a língua é o sítio mais acometido pelo CEO, bem
como a mais relacionada à baixa taxa de sobrevida e a altas incidências de
desenvolvimento de metástases para linfonodos cervicais, pois de 34% a 50% dos
pacientes com tumores de pequenas dimensões e cerca de 62,3% dos pacientes,
acometidos por tumores de proporções maiores, desenvolviam metástases, sendo
constatado que esse parâmetro foi um forte indicador de sobrevida e prognóstico em
pacientes acometidos por CEL.
45
Conforme, Sturgis et al. (2005), dentre as localizações anatômicas do CEO, a
língua é uma que mais resulta em seqüelas pós tratamento, devido ao comprometimento
cirúrgico desse órgão e do esvaziamento cervical que na maioria dos protocolos
oncológicos é feito na tentativa de se evitar metástases locorregionais e à distância. Por
conseguinte, diversas pesquisas tentam elucidar meios de melhorar a sobrevida dos
pacientes, minimizar os efeitos deletérios sob a função oral e estética facial através da
redução da extensão da glossectomia e dissecção cervical e do uso prolongado da
radioterapia e quimioterapia.
Corroborando com os achados de Amaral et al. (2004), Garavello et al. (2008),
propondo avaliar a participação independente do gênero como fator de prognóstico em
câncer oral em 71 mulheres e 142 homens, constataram também que a freqüência de
recidiva foi semelhantes nos dois grupos de estudo (p = 0,25) ocorrendo em 46% no
sexo feminino e 78% no sexo masculino. Alem disso, não houve diferenças
estatiscamente relevante com relação ao número de óbitos por câncer em mulheres e
homens os quais foram de 32% e 39%, respectivamente.
De acordo com Bettendor, Piffkò e Bànkafalvi (2004), o curso clínico dos
pacientes acometidos por câncer oral é influenciado principalmente pelo rápido
crescimento e pelo potencial metastático das células tumorais. Os autores afirmaram que
crescimento tumoral resulta de um desequilíbrio entre proliferação e apoptose os quais
são influenciados pela angiogênese, enquanto que o potencial metastático sofre
influência de alterações célula/célula e célula/matriz.
Segundo Mc Cawley e Matrisian (2000), a metástase é um processo complexo,
de múltiplas etapas no qual as células normais sofrem mudanças genéticas, tornando-as
capazes de invadir e de se espalhar para sítios distantes. O crescimento das células
neoplásicas no tecido invadido conta com a destruição das interações célula-célula e
célula–matriz. As células neoplásicas migram para além do tumor primário e o processo
de metástase é caracterizado, sendo definido o fenótipo metastático em função da
expressão de moléculas envolvidas na adesão célula-célula e célula–matriz
(CHRISTOFORI, 2003).
Mareel e Leroy (2003) afirmam que é fator determinante para o crescimento e
invasão tumoral o estabelecimento de interações satisfatórias como seu hospedeiro, pois
46
alterações genéticas e distúrbios na expressão gênica presentes nos tumores não
implicariam grandes conseqüências caso estes não viabilizassem mecanismos para
explorar as falhas e/ou driblar as respostas no sistema de defesa do hospedeiro.
A forma de avaliação mais difundida para analisar clinicamente o prognóstico
dos tumores malignos e o planejamento do tratamento é através do sistema TNM
(CARINCI, 1998). O tamanho do tumor e a extensão da disseminação metastática do
CEO são os melhores indicadores do prognóstico do paciente. A quantificação destes
parâmetros clínicos é chamada estadiamento da doença, onde o parâmetro “T” refere-se
ao tamanho em centímetros do tumor primário; “N” indica a presença ou ausência de
metástase tumoral em linfonodos regionais e “M” refere-se à presença ou não de
metástase a distância (Quadro 1). A avaliação destas três variáveis permite a
classificação das lesões em estágios de I a IV (Quadro 2), quanto maior o estágio, pior o
prognóstico (NEVILLE et al., 2009).
TAMANHO DO TUMOR PRIMÁRIO (T)
Nenhuma informação disponível sobre o tumor primário
Nenhuma evidência de tumor primário
Apenas carcinoma in situ em estágio primário
Tumor com menos de 2 cm em seu diâmetro maior
Tumor com cerca de 2 a 4 cm em seu diâmetro maior
Tumor com mais de 4 cm em seu diâmetro maior
Tumor invade através da cortical óssea, para o interior da musculatura profunda
extrínseca da língua, seio maxilar ou pele da face. Tumor passível de ressecção cirúrgica.
Tumor envolve espaço mastigatório, lâminas do proceso pterigóide ou base do
T4b
crânio e/ou envolve completamente a artéria carótida interna. Tumor não passível de
ressecção cirúrgica.
ENVOLVIMENTO DE LINFONODO REGIONAL (N)
linfonodos não puderam ser ou não foram identificados
NX
Nenhum linfonodos clinicamente positivo
N0
Um único linfonodos homolateral clinicamente positivo com menos de 3 cm de
N1
diámetro
N2a - Um único linfonodo homolateral clinicamente positivo com 3 a 6 cm de
N2
diâmetro
N2b - Múltiplos linfonodos homolaterais clinicamente positivos, nenhum com
mais de 6 cm de diâmetro.
N2c – linfonodos bilaterais ou contralaterais, nenhum maior do que 6 cm em seu
maior diâmetro
Metástase em um linfonodo maior que 6 cm em seu maior diâmetro
N3
ENVOLVIMENTO POR METÁSTASES A DISTÂNCIA (M)
Metástases à distância não foram identificadas
MX
Nenhuma evidência de metástase à distância
M0
Metástase à distância presente
M1
Quadro 1. Sistema de estadiamento TNM para o CEO. Fonte: Adaptado do Neville et al. (2009).
TX
T0
T1S
T1
T2
T3
T4a
47
ESTÁGIO
CLASSIFICAÇÃO TNM
TAXA DE SOBREVIDA
RELATIVA DE 5 ANOS
I
T1 N0 M0
68%
II
T2 N0 M0
53%
III
T3 N0 M0 ou T1, T2 ou T3, N1 M0
41%
IVA- T4aN0 ou N1M0 ou T1, T2, T3 ou
T4aN2M0
IV
IVB- Qualquer TN3M0 ou T4b, qualquer NM0
27%
IVC- Qualquer lesão M1
Quadro 2. Categorias de estadiamento clínico TNM para o CEO. Fonte: adaptado do Neville et al.
(2009).
Garavello, Spreafico e Gaini (2007) realizaram uma pesquisa correlacionando
pacientes com CEL com idade ≤ 40 anos a pacientes mais velhos, pareados por
diagnóstico, sexo e TNM. As análises demonstraram que a freqüência de recorrências e
morte em decorrência do câncer foi significativamente mais alta nos pacientes mais
jovens. A curva de sobrevida definiu-se na dependência da idade dos pacientes, sendo
menor para os pacientes com idade abaixo dos 40 anos. Assim, os autores puderam
concluir que os pacientes mais jovens com CEL têm um pior prognóstico quando
comparado com os mais velhos.
Entretanto, segundo relatos de Van Heerden, Raubenheimer e Le Roux (1995),
tumores com o mesmo estadiamento clínico demonstram diferentes padrões de
crescimento, sendo necessário o uso de outros métodos de avaliação de tumores, como o
sistema de gradação histopatológica de malignidade (SGHM) e uso de marcadores
tumorais. De acordo com Martins Neto (1999), o SGHM do CEO é um recurso
microscópico que visa classificar a lesão de acordo com o grau de diferenciação celular,
no intuito de fornecer subsídios que possibilitem a interpretação da agressividade do
tumor.
Em uma pesquisa de revisão de literatura, Woolgar (2006) ressaltou a relevância
dos dados histopatológicos do tumor primário e da metástase como fatores indicativos
do prognóstico do CEO e orofaringe, recomendando, dessa forma, a padronização na
avaliação histopatológica e na cuidadosa documentação dos dados, pois se observou que
48
a metástase linfonodal regional era diagnosticada histologicamente em 59-64% dos
CEL.
Diversos aspectos clínicos e morfológicos podem ser relevantes para a
necessidade do esvaziamento cervical eletivo após a identificação de metástase oculta
no estágio tumoral N0 através da biópsia do linfonodo sentinela. Com isso, Goerkem,
Braun e Stoeckli (2010), em uma análise de 78 pacientes com CEO no estágio T1/T2
submetidos à biópsia linfonodal cervical, evidenciaram que o grau de diferenciação
celular (p = 0,002), invasão linfática (p = 0,001) e modo de invasão (p = 0,001) eram
estatiscamente significantes para predizer a metástase oculta em linfonodos. A
profundidade média do tumor de 6,45 mm (variando de 0,72 a 15,15 mm) e a espessura
tumoral média de 7,2 mm (variando de 0,72 a 15,15 mm) não foram capazes de predizer
a doença oculta. Os autores defendem que os pacientes com CEO no estágio N0 devem
ser submetidos à biópsia do linfonodo sentinela, independente da profundidade e
espessura tumoral. Portanto, carcinomas pouco diferenciados, com comprometimento
de vasos linfáticos e carcinomas com um modo dissoluto de invasão podem caracterizar
uma alta probabilidade de linfonodo positivo.
Histopatologicamente, o CEO caracteriza-se por ilhas e cordões invasivos de
células epiteliais malignas, na qual a invasão é representada pela extensão irregular do
epitélio lesional através da membrana basal para o interior do tecido conjuntivo
subepitelial. Essa invasão celular pode se estender profundamente para o interior dos
tecidos adiposo, muscular e ósseo subjacente. Freqüentemente, existe uma resposta
inflamatória ao epitélio em invasão e áreas focais de necrose podem estar presentes. As
células neoplásicas geralmente exibem um citoplasma eosinofílico abundante com
nucléolos volumosos e hipercromáticos e uma relação núcleo-citoplasma aumentada.
Graus variados de pleomorfismo celular e nuclear, assim como a presença de focos
arredondados de camadas concêntricas de células ceratinizadas, pérolas de ceratina, e
mitoses atípicas podem ser evidenciadas no interior do epitélio lesional (NEVILLE et
al., 2009).
O CEO mostra diversos aspectos microscópicos, conforme supracitados, que
somados aos achados clínicos, podem ser utilizados para traçar o comportamento
biológico do tumor e mesmo, graduá-lo de acordo com padrões morfológicos de
malignidade, em uma classificação que varia de bem diferenciado a indiferenciado
49
(MIRANDA, 2002). No tocante a este fato, pode ser citado desde a classificação de
Broders (1920), passando por Wahi (1971), Jakobsson et al. (1973), Anneroth, Batsakis
e Luma (1986) até uma das mais atuais como proposta por Bryne et al. (1989) a qual foi
aperfeiçoada em 1998 (BRYNE et al., 1998).
Broders (1920) foi o primeiro a elaborar uma classificação histológica do CEO,
tentando correlacionar as células do tumor com as células do epitélio normal, e assim
comparar o grau de diferenciação das células tumorais com o prognóstico. Um novo
método para gradação do CEO foi proposto por Wahi (1971), baseado na presença de
pérolas córneas, ceratinização individual, evidência de pontes intercelulares, figuras de
mitose, células neoplásicas gigantes multinucleadas, pleomorfismo celular e nuclear.
Para o referido autor, o prognóstico do CEO primário deveria ser estabelecido levandose sempre em consideração a gradação histológica, a localização do tumor e sua fase de
evolução.
Martins Neto (1999) utilizando o sistema proposto por Wahi (1971) verificou
que 65 casos de CEO não evidenciavam uma associação estatisticamente significativa
entre o estadiamento clínico, TNM e a gradação histológica. Por sua vez, Costa et al.
(2002) conduziram
um estudo correlacionando o sistema TNM com este mesmo
método de gradação histológica e localização anatômica do tumor em 120 casos de
CEO, observando uma correlação significativa entre o TNM, SGHM e a localização
anatômica do tumor.
Bell et al. (2007), em um estudo retrospectivo de 215 casos de CEO, avaliaram o
real significado da relação entre localização anatômica e o prognóstico dos pacientes.
Assim, para esse estudo, os autores dividiram os casos em dois grupos: CEL e
carcinoma em outros sítios orais. A partir dos resultados, puderam concluir que a
gradação histológica proposta por Wahi e o estadiamento clínico tumoral (TNM)
estavam correlacionados à predição da sobrevida dos pacientes com CEO e que a
localização primária não interferiu no prognóstico dos pacientes. Os autores acreditam
que as diferentes modalidades de tratamento para o câncer oral talvez influenciem muito
mais no tempo de sobrevida do que a localização anatômica primária do tumor.
Coaracy et al. (2008), avaliando 90 casos de CEO, constataram que não houve
uma
relação esttística significativa entre a classificação clinica TNM e o SGHM
50
desenvolvida por Wahi. Todavia, houve relação significante entre a referida gradação
histológica e o tamanho do tumor primário.
Jakobsson et al. (1973) idealizaram um sistema de gradação histológica
multifatorial para o CE, baseado nas características morfológicas das células
neoplásicas e na relação tumor-hospedeiro, aplicando escore numéricos a essas
características, os quais variavam de 1 a 4 pontos. Esse sistema mostrou maior
influência na determinação do prognóstico do paciente com CE de glote do que o
sistema de estadiamento clínico TNM.
Anneroth, Batsakis e Luna (1986) realizaram uma ampla revisão de literatura
sobre o SGHM do CEO, considerando haver uma controvérsia entre os dados oferecidos
quanto à correlação destes sistemas de gradação de malignidade com o TNM e com o
prognóstico tumoral, desenvolvendo, dessa forma, um novo sistema baseado no grau de
ceratinização, pleomorfismo nuclear, número de mitoses, padrão de invasão, estágio de
invasão (profundidade) e intensidade de infiltrado inflamatório (marcante, moderada e
discreta). Assim, os autores inferiram que esse método é eficiente em classificar
histologicamente o CEO, por ser um sistema quantitativo objetivo e por mostrar uma
correlação significativa com o comportamento clínico e com prognóstico tumoral,
refletindo, com fidedignidade, o comportamento biológico do tumor.
Propondo avaliar a inter-relação entre a classificação TNM, o SGHM proposto
por Anneroth, Batsakis e Luna (1986) com diagnóstico de CEL, Dantas et al. (2003)
avaliaram 16 casos da doença. A análise dos dados demonstrou uma clara relação entre
o sistema TNM e prognóstico, mas não entre este último e o escore histológico de
malignidade, inferindo-se que a classificação TNM é uma ferramenta útil para predizer
o prognóstico de CEL.
No intuito de identificar os fatores que podem influenciar a sobrevida dos
pacientes com CEO, Kademani et al. (2005) analisaram 215 casos. Observaram que,
após cinco anos, 56% dos pacientes estavam vivos, sendo que 58% estavam livres da
doença. O estadiamento clínico e a gradação histológica baseada em Anneroth, Batsakis
e Luna (1986) foram os fatores que influenciaram na sobrevida desses pacientes. Os
fatores idade, sexo, raça e sítio tumoral não demonstraram afetar na sobrevida de cinco
anos dos pacientes.
51
Em 1989, Bryne et al. propuseram um SGHM para o CEO, aplicado as biópsias
incisionais, com base no sistema preconizado por Anneroth, Batsakis e Luma (1987),
sendo excluído o estágio de invasão. Morfologicamente, foram considerados o grau de
ceratinização celular, pleomorfismo nuclear, número de mitoses, padrão de invasão e
reação inflamatória, sendo emitidos valores numéricos de 1 a 4 para estes cinco
critérios. O escore total foi dado pela soma dos escores e os tumores que mostraram
pontuação de 5 a 10 foram classificados como grau I ou de baixo escore de malignidade
e grau II ou alto escore os que demonstraram pontuação superior a 10.
Em 1991, Bryne fez uma revisão do valor prognóstico de várias características
celulares e moleculares do CEO, bem como comparou os resultados obtidos no estudo
utilizando o método proposto por ela e colaboradores em 1989 com outros estudos
publicados anteriormente. A autora considerou seu método como sendo um fator
prognóstico suplementar à classificação clínica TNM, mas que, também, podia ser
utilizado isoladamente como um bom indicador de prognóstico.
Em 1998, Bryne recomendou um SGHM, a ser empregado priorizando o front
de invasão tumoral, baseado na análise semiquantitativa dos seguintes parâmetros
morfológicos: grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, padrão de invasão e
resposta do hospedeiro. O escore para cada parâmentro deve ser somado para obtenção
do escore total de malignidade, onde elevado escore corresponde ao alto grau de
malignidade, representando pobre prognóstico. Nesse sistema, o parâmetro número de
mitoses é omitido porque segundo a autora, este parâmetro pode variar muito de acordo
com a espessura do corte que está sendo avaliado (BRYNE et al., 1998).
Bryne et al. (1998) e Noguchi et al. (2002) afirmaram que as características
histopatológicas do front de invasão tumoral são essenciais para a metástase e
prognóstico, sendo responsáveis pelo comportamento clínico do tumor e importantes na
escolha da terapia para o CEO, um vez que tais células são menos diferenciadas e
apresentam alto grau de dissociação celular quando comparadas com as de outras áreas
do tumor.
Adicionalmente, sabe-se ainda, que vários eventos moleculares de importância
para o crescimento e disseminação tumoral como: alterações das moléculas de adesão,
52
secreção de enzimas proteolíticas, aumento da proliferação celular e angiogênese,
ocorrem na interação tumor-hospedeiro (front de invasão) (BRYNE, 1998).
Dantas et al. (2003) afirmaram que o padrão de invasão, a espessura do tumor e
o infiltrado inflamatório presente na lesão podem ser indicadores importantes da
agressividade tumoral, considerando que essas variáveis refletem a relação da
população celular com o hospedeiro, ratificando a importância da visualização
histológica do front de invasão e bordas tumorais.
No intuito de investigar a reprodutibilidade do sistema de gradação do front de
invasão, Sawair et al. (2003) analisaram 102 casos de CEO e observaram que o padrão
de invasão tumoral estava associado com a presença de metástase, sendo classificados
como os casos de maior risco aqueles com padrão de invasão em pequenos grupos de
células e com células dissociadas. Assim, os autores confirmaram o potencial valor
prognóstico do sistema de gradação do front de invasão para os pacientes com CEO,
sugerindo que o padrão de invasão parece ser importante no planejamento terapêutico
ao auxiliar na identificação dos pacientes com maior risco de metástase.
Reiterando a relevância da análise do front de invasão, Kurokawa et al. (2005)
com o intuito de determinar os fatores indicativos para metástase nodal e prognóstico,
realizaram um ensaio retrospectivo sobre os dados clínicos e patológicos dos CEL e
constataram que as taxas de sobrevida de 5 anos diferiram significativamente conforme
os fatores clínico-patológicos: tamanho do tumor, estadiamento clínico, profundidade
tumoral, aspecto microscópico, metátase nodal, invasão microvascular e escore total de
malignidade no front de invasão. A análise multivariada revelou que a profundidade
tumoral ≥ 4mm, estágio do front de invasão ≥ 8 e a presença de metástase nodal
diminuíam a sobrevida dos pacientes, sendo que o estágio do front de invasão ≥ 11
apresentava valor indicativo para metástase nodal em CEL. Assim, os autores
concluíram que o alto escore de malignidade no front de invasão apresentava elevado
valor de prognóstico para os CEL.
Costa, Araújo e Ramos (2005) analisaram 38 casos de CEO, quanto à
classificação clínica TNM e às características histológicas nas áreas mais profundas da
lesão como descrito por Bryne em 1998, e encontraram uma correlação significativa
entre estadiamento clínico TNM e os escores histológicos de malignidade e com
53
parâmentros histológicos isolados (pleomorfismo nuclear e grau de ceratinização).
Houve também uma correlação significativa entre infiltrado linfoplasmocitário e
pleomorfismo nuclear com a classificação TNM, quando agrupado em duas séries: com
e sem metástase. Concluíram que as áreas invasivas podem ser primariamente
responsáveis pelo comportamento clínico do tumor, pois avalia características
fundamentais do câncer como extensão local, disseminação regional e metástases à
distância, e isso pode ser imprescindível para escolha da terapia para a lesão.
Adversamente, Silveira et al. (2007) afirmaram, após análises de 30 casos de
CEL, que a presença de metástases, o estadiamento TNM e a marcação imunohistoquímica para filamentos de citoqueratinas são melhores indicadores prognósticos
que a gradação histológica proposta por Bryne em 1998.
Conforme Bànkfalvi e Piffkó (2000), a análise de parâmetros moleculares e
histopatológicos na interface tumor-hospedeiro poderá refletir melhor o comportamento
biológico do câncer e de forma mais pontual, predizer resultados e respostas clínicas a
tipos diferentes de terapia.
Apesar de inúmeras pesquisas desenvolvidas sobre o diagnóstico e o tratamento
de neoplasias malignas, ainda existe uma busca incessante de parâmetros para melhoria
no prognóstico tumoral e do índice de sobrevida dos pacientes portadores da referida
lesão. O CEO apresenta marcada heterogeneidade em seu comportamento biológico,
sendo observado que pacientes com o mesmo estágio clínico da doença poderão
responder diferentemente ao mesmo tratamento (WANG et al., 2006).
Deste modo, o delineamento do comportamento biológico agressivo do CEO
tem sido baseado não somente na avaliação dos aspectos clínicos, mas no potencial de
proliferação celular e invasão tumoral, na perda da expressão das moléculas de adesão
das células epiteliais neoplásicas, bem como na expressão de moléculas induzíveis a
condição de hipóxia celular (LE et al., 2007).
54
2.2 Fator 1 Induzível por Hipóxia - HIF-1
O fator 1 induzível por hipóxia (HIF-1) é um regulador central da resposta à
mudanças na concentração de O2 e tem um papel importante nos processos fisiológicos
e patológicos em humanos, incluindo a regulação do metabolismo energético,
homeostasia do ferro, viabilidade e proliferação celular, angiogênese, invasão e
metástase, isquemia cerebral e do miocárdio, o retardo do crescimento fetal e a
hipertensão arterial (SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008; UEHARA, et al., 2009;
LIANG et al., 2011).
O HIF-1 é um fator de transcrição nuclear que funciona na forma de
heterodímero, pertencente a família de fatores de trascrição basic-helix-loop-helix-PAS
(bHLH-PAS), sendo composto pelas subunidades HIF-1α e HIF-1β (conhecida como
translocador nuclear receptor aril hidrocarbono, ARNT). Cada subunidade tem dois
domínios PAS, designados PAS-A e PAS-B. O domínio PAS foi designado como uma
região comum encontrado no gene per de drosophila, um gene componente do ciclo
circadiano, arnt humano e no sim de drosophila, um gene da regulação do sistema
nervoso central (FILLIES et al., 2005; PATIAR; HARRIS, 2006; SEMENZA, 2006;
SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008).
Além do HlF-1α, existem dois membros adicionais da superfamília bHLH-PAS,
HIF-2α, referido como o domínio PAS da proteína endotelial 1 (EPAS1) e HIF-3α.
Essas isoformas têm similaridade estrutural e são classificadas como família bHLHPAS (TIAN; MCKNIGHT; RUSSEL, 1997).
O gene hif-a humano que codifica a proteína HIF-1α possui 2.478 pares de base
e a proteína consiste de 826 aminoácidos, com uma massa molecular que varia de 104 a
116 kDa. O hif-a encontra-se no cromossomo 14 e consiste de 15 exons interrompidos
por 14 introns. O exon 2 codifica o domínio bHLH, essencial para dimerização e ligação
da proteína com DNA, enquanto a região que vai dos exons 3 ao 8 codifica o domínio
PAS. A região carboxi-terminal, que compreende os domínios responsáveis pela
ativação e estabilidade da proteína, é codificada nos exons 9 a 15. O HIF-1α contém
dois domínios de transativação, um N-terminal (TAD-N) que sobrepõe com o domínio
de degradação dependente de oxigênio (ODD) e outro na região C-terminal (TAD-C) da
proteína que é capaz de interagir com coativadores transcricionais tais como CBP/p300.
55
Ambos os domínios estão conectados um ao outro por um domínio inibitório
(SEMENZA, 2006; FERREIRA et al., 2007) (Figura 1).
O gene arnt humano localiza-se na região q21 do cromossomo 1 e possui 22
exons. O gene processado que codifica para o ARNT possui 2.367 pares de base e a
proteína consiste de 789 aminoácidos com uma massa molecualr de 94 kDa. O arnt
possui duas formas variantes de processamento do RNA. O exon 5, o qual possui 45
nucleotídeos é um exon alternativo e pode ser processado, resultando assim em um
transcrito com 2.322 pares de base o qual codifica para uma proteína de 774
aminoácidos. Esse processamento acontece em cerca de 50% dos arnt transcritos e essa
proporção não parece variar muito entre os diferentes tecidos. Apesar do ARNT possuir
duas formas variantes, nenhum efeito diferenciado nas células foi observado na forma
onde o exon 5 foi omitido (FERREIRA et al., 2007). O ARNT é uma proteína nuclear
constitutivamente expressa que também participa na resposta transcricional a agentes
xenobióticos. O ARNT é capaz de formar outro complexo com o receptor de aril
hidrocarbono (Ahr). Este complexo se liga ao elemento responsivo a xenobióticos
(XRE), encontrado em muitos genes, tais como o gene CYAP1A1 que codifica o
citocromo P450 com atividade hidrocarbono hidroxilase e NADP(H):oxiredutase. A
ativação desses genes depende primariamente da ligação do Ahr a ligantes xenobióticos,
incluindo 2,3,7,8-tetraclorodibenzeno-p-dioxina (dioxina) e benzo(a)pireno. Enquanto o
ARNT contém um domínio de ativacão transcricional, HIF-1α têm dois domínios de
transativação, TAD-N e TAD-C (JIANG et al., 1996; GIACCIA et al., 2003;
SEMENZA, 2006) (Figura 1).
56
Figura 1. Representação esquemática das proteínas que constituem as duas subunidades do HIF-1 humano. Os domínios de
importância funcional das subunidades HIF-1α e ARNT estão indicados da seguinte forma: bHLH, domínio helix-loop-helix
básico; NLS-N e NLS-C, sinais de localização nuclear amino e carboxi-terminal; PAS, domínio de homologia Per-ARNT-Sim
com repetições A e B; PSTD, domínio de estabilidade da proteína rico em prolina-serina-treonina; TAD-N e TAD-C,
domínios de transativação amino e caborxi-terminal; ODD, domínio de degradação dependente de oxigênio; ID, domínio
inibitório; REF-1, TRX, p300/CBP, indicam as regiões do HIF-1α onde o fator 1 redox, a tioredoxina e os coativadores
p300/CBP se ligam. Os números indicam os resíduos de aminoácidos que delimitam as regiões funcionais das duas
subunidades do HIF-1 humano. Fonte: Semenza (2000).
O mecanismo de transativação pelo HIF-1 envolve a ligação do complexo HIF1α/ARNT aos motivos HREs (elementos responsivos à hipóxia) localizados nos
promotores e enhancers dos genes alvos. Para a ativação dos genes alvos, vários
coativadores são recrutados se ligando ao complexo do HIF-1, tais como o complexo
CBP (proteína ligante ao CREB)/p300. Em adição ao CBP/p300, HIF-1 interage com o
coativador SRC-1 (coativador 1 do receptor de esteróide) e com o Tie-2 (fator
intermediário 2 da transcrição). Essa interação aumenta o potencial transcricional do
HIF-1 de uma maneira dependente de O2 e produz um efeito sinérgico com CBP. Esse
efeito é fortemente potencializado pela proteína regulatória do estado redox Ref-1 (fator
redox 1), uma proteína que tem atividade redutora de cisteína (GIACCIA et al., 2003;
FERREIRA et al., 2007). Ref-1 interage fisicamente com ambos os domínios TAD-C e
TAD-N, levando a uma transativação mais potente. Adicionalmente, a ligação do HIF-1
aos HREs não é suficiente para indução de muitos genes pela hipóxia. Tem-se
verificado cooperações sinérgicas entre HIF-1α e outros fatores de transcrição, tais
como Smad-3, fator 4 nuclear de hepatócito (HNF4), ATF1/CREB1, proteína 1
ativadora (AP1) e Ets-1 (BRACKEN et al., 2003).
57
A estabilidade e a atividade do HIF-1α são reguladas por modificações póstraducionais, tais como fosforilação, hidroxilação, nitrosilação e acetilação (SEMENZA,
2003; FEREIRA et al., 2007). O óxido nítrico promove a estabilização do HIF-1α,
ligação ao DNA e a sua transativação sob condições de normóxia o que favorece o
acúmulo HIF-1α; já sob condições de hipóxia, o óxido nítrico desfavorece o acúmulo de
HIF-1α (FEREIRA et al., 2007).
Em relação à fosforilação, vários genes/oncogenes supressores de tumor influenciam
ou são constituintes de cascatas de fosforilação e assim afetam os níveis de expressão do
HIF-1α independente do O2. Essas cascatas podem ser iniciadas após a ligação dos
fatores de crescimento aos receptores de tirosina quinases que, por sua vez, ativam os
alvos posteriores da via. Existem duas vias principais de fosforilação envolvidas na
ativação do HIF-1, vias da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e da
fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) (FERREIRA et al., 2007).
As três grandes sub-famílias das vias das MAPK, denominadas c-Jun NH2-terminal
quinases (JNKs), p38 MAPKs e as quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs)
mostraram ser reguladoras do HIF-1α (ALFRANCA et al., 2002). Sugere-se que a via
de MAPK estaria envolvida somente na atividade de transativação através da
fosforilação, não influenciando a estabilização ou habilidade de ligação do HIF-1 ao
DNA (HUR et al., 2001). Entretanto, foi verificado que inibidores de MEK1(quinase 1
ativadora de MAPK) ou p38 MAPK bloqueiam a expressão gênica mediada por HIF-1,
demostrando assim a importância da via da MAPK na funcionalidade do HIF-1α
(RICHARD et al., 1999).
A cascata de sinalização pela PI3K representa outra via de fosforilação do HlF-1α.
A proteína quinase que é ativada posteriormente à ativação de PI3K, conhecida como
AKT, tem alguns alvos envolvidos na apoptose, no ciclo celular e no crescimento
celular (VIVANCO; SAWYERS, 2002). Um dos alvos é a proteína associada a
rapamicina/FKBP (FRAP; também conhecida como mTOR). FRAP fosforila a proteína
regulatória da tradução 4E-BP que, por sua vez, aumenta os níveis transcricionais
(GINGRAS et al., 2001). Essa via é também regulada por PTEN, uma proteína
supressora de tumor; pelo glicogênio sintase quinase-3 (GSK-3); envolvida na
estabilização do HIF-1α em condições de hipóxia por mecanismos ainda desconhecidos
58
(MOTTET et al., 2003); e pela proteína Ras um oncogene multifuncional que pode
estimular ambas as vias da MAPK e do PI3K (POUYSSEGUR; LENORMAND, 2003).
Sob condições de normóxia, o HIF-1α é constitutivamente expresso e
subsequentemente hidroxilado por uma HIF prolil-hidroxilase (HPH), levando-o a uma
rápida degradação mediada pelo proteassoma. Essa degradação envolve a ação de um
complexo ubiquitina-ligase contendo o fator Von Hippel Lindau, uma proteína
supressora de tumor (pVHL) que faz parte de um complexo de proteínas, constituído
pela elonguina B e C e culina 2 (SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008). A pVHL
reconhece os resíduos de prolina hidroxilados (Pro402 and Pro564) presentes no
domínio ODD do HIF-1α (BRUICK; MCKNIGHT, 2001). A prolil-hidroxilase é uma
dioxigenase que usa O2 e 2-oxoglutarato como substratos. Essa enzima transfere um
átomo de O2 para os resíduos de prolina e o segundo átomo de O2 reage com o 2oxoglutarato gerando o succinato. Ela também requer ferro como cofator, o qual se liga
ao O2 quando mantido no estado ferroso pelo ácido ascórbico. Sua atividade é
suprimida pelo decréscimo na tensão de O2. Quando HPH é inibida, a via de degradação
do HIF-1α é bloqueada, levando assim ao acúmulo dessa proteína e sua migração para o
núcleo, onde ela ativa genes responsivos à hipóxia. (Figura 2) (BRUICK; MCKNIGHT,
2001).
Fe+2
Ácido
ascórbico
2-oxoglutarato
Succinato
Figura 2. Representação esquemática do mecanismo de regulação da expressão gênica do HIF-1α. Sob condições de normóxia
o HIF-1α é hidroxilado pelas hidroxilases nos resíduos de asparagina e prolina, as quais usam como substratos o O2 e 2oxoglutarato. O reconhecimento dos resíduos de prolina hidroxilados da subunidade HIF-1α sob condições de normóxia se dá
pela proteína supressora de tumor Von Hippel Lindau (VHL). O HIF-1α é ubiquitinado e em seguida degradado pelo
proteassoma. Fonte: Höpfl; Ogunshola; Gassmann (2004).
59
Existem três HPH, 1, 2 e 3, conhecidas também como proteínas contendo o domínio
de prolil-hidroxilase (PHD) 3, 2 e 1, respectivamente. As PHDs hidroxilam prolinas
específicas dentro de um domínio altamente conservado com a seguinte sequência de
aminoácido: LXXLAP (onde X indica qualquer aminoácido; P, indica a prolina
receptora do grupo hidroxila, L, leucina e A, alanina) (BRUICK; MCKNIGHT, 2001).
Quanto à localização celular, a PHD1 encontra-se exclusivamente no núcleo, PHD2 no
citoplasma e PHD3 é encontrada em ambos os citoplasma e núcleo, com predominância
no citoplasma. Somente os níveis dos mRNA de PHD2 e PHD3 são induzíveis por
hipóxia, enquanto os níveis de expressão do mRNA de PHD1 independem da hipóxia
(METZEN et al., 2003).
A interação do complexo CBP/p300 com o HIF-1α é sensível aos níveis de O2,
sendo inibida após a hidroxilação de um resíduo de asparagina (As803) no domínio
TAD-C do HIF-1α por uma asparagil hidroxilase, também conhecida como fator
inibidor de HIF-1 (FIH). Similar às prolil-hidroxilases, FIH pertence à superfamília das
dioxigenases dependentes de 2-oxoglutarato cuja atividade requer O2 como substrato
(Figura 2). A hidroxilação do resíduo de asparagina não leva à degradação do HIF-1α e,
portanto não está diretamente envolvida no mecanismo sensor de O2. Assim, a inibição
da hidroxilação do resíduo de aminoácido Asn803 permite que o TAD-C interaja com o
domínio rico em cisteína e histidina dos cofatores de transcrição, CBP/p300 (LANDO et
al., 2002; SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008).
Em condições de hipóxia, há o recrutamento do coativador CPB/p300, em seguida,
HIF-1α transloca-se para o núcleo, formando o heterodímero com o ARNT, onde se
ligam ao motivo HRE dos genes alvos. Chilov et al. (1999) mostraram que o acúmulo
de HIF-1 α no núcleo em células submetidas à hipóxia é uma característica intrínsica
desse fator de transcrição, já que ele é independente da presença do ARNT. Sob
condição de hipóxia, HIF-1α não é degradada e assim seus genes alvos são expressos e
uma resposta fisiológica à concentração de O2 é ativada (Figura 3).
60
Poro nuclear
Figura 3. Representação esquemática do mecanismo de regulação da expressão gênica do HIF-1α. Sob
condições de hipóxia: ocorre a heterodimerização das subunidades HIF-1α fosforilada e HIF-1β (ARNT) que
se ligam à uma sequência de consenso de DNA que está contida dentro da sequência conhecida como HRE,
exixtente nos genes alvos. Fonte: Höpfl; Ogunshola; Gassmann (2004).
Em relação ao mecanismo da acetilação, foi verificado que o resíduo do aminoácido
lisina 532 (K532) localizado no domínio ODD do HIF-1α é acetilado por uma
acetiltransferase chamada arrest-defective-1 (ARD1). A acetilação da K532 favorece a
interação do HIF-1α com o pVHL e assim desestabiliza o HIF-1α. A atividade das
acetiltransferases não é alterada pelos níveis de O2, mas os níveis do mRNA do ARD1
(e conseqüentemente da proteína) diminuem sob condições de hipóxia, levando a um
menor nível de acetilação do HIF-1α do que sob normóxia (JEONG et al., 2002).
Cerca de 70 genes alvos do HIF-1 são conhecidos, incluindo genes envolvidos com
o suprimento de O2, genes do metabolismo celular, genes que regulam a proliferação e
sobrevivência celular, motilidade e estrutura do citoesqueleto, tônus vascular,
adipogênese, desenvolvimento dos linfócitos B e resistência a drogas (FERREIRA et
al., 2007).
A identificação de genes alvos do HIF-1 tem sido realizada usando-se várias
estratégias, incluindo: identificação de genes que contem os motivos de ligação do HlF
(HREs); comparação dos padrões de expressão gênica entre células tipo-selvagem para
a expressão do HIF-1α com células que não expressam essa proteína ou ainda através de
técnicas de RNA de interferência; varredura dos níveis aumentados de expressão gênica
61
usando células que não expressam VHL ou células transfectadas com vetores que
expressam a subunidade HIF-1α. Os genes transcricionalmente ativados pelo HIF-1
participam de diversos processos celulares e codificam proteínas que residem em
diferentes compartimentos celulares, por exemplo, fatores transcricionais nucleares,
proteínas ligadas à membrana, proteínas citosólicas e fatores de crescimento
(SEMENZA, 2003).
Sob condições severas de hipóxia, a geração de ATP a partir da fosforilação
oxidativa é substituída pela geração menos eficiente de ATP através da glicólise
anaeróbica. Dessa forma, o fornecimento de ATP para a síntese de proteínas pode cair
até 7% em relação às células expostas a condições de normóxia. Para compensar o
decréscimo de ATP normalmente fornecido pela fosforilação oxidativa, HIF-1 ativa
genes-chaves envolvidos no mecanismo da glicólise e no transporte da glicose, tais
como o GLUT-1 e 3, fosfofrutoquinase L (PFK), fosfoglicerato quinase 1 (PGK1) e
lactato desidrogenase-A (LDHA) (SEMENZA, 2003). Muitos fatores pró-angiogênicos
como o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator transformador de
crescimento-β2 (TGF-β2), receptor do VEGF, fator de crescimento básico de
fibroblasto (FGFb) e fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) são induzidos
por HIF-1 para promover a angiogênese (SEMENZA, 2003; SEMENZA, 2006;
FERREIRA et al., 2007).
Adicionalmente, Wenger et al. (2005) estimam que existam pelo menos 200 genes
de mamíferos regulados por HIF-1, embora aparentemene nem todos eles sejam
regulados diretamente pelo motivo HRE em suas regiões promotoras. Nesse caso,
outros fatores de transcrição regulados por O2 e que sejam dependentes ou
independentes do HIF podem ser responsáveis pela indução da transcrição pela hipóxia.
O HIF-1 se liga aos genes alvos em sítios contendo o centro de reconhecimento 5'RCGTG-3' (onde R indica adenina ou guanina; C, citosina; G, guanina; T, tiamina)
(SEMENZA, 2006). A presença dos sítios de ligação do HIF-1 (HBS) é necessária, mas
não suficiente para a expressão dos genes em resposta à hipóxia, indicando que o HIF-1
deve interagir com outros fatores de transcrição ligados a sítios adjacentes (FERREIRA
et al., 2007).
62
Embora o HIF-1 tenha sido inicialmente descrito como o fator de transcrição
regulado pela hipóxia, existem crescentes evidências de que essa molécula é também
responsiva a uma variedade de estímulos não hipóxicos. Entre esses estímulos podemos
citar a insulina, PDGF, fator transformador de crescimento-β3 (TGF-β3), fator 1 de
crescimento de insulina (IGF-1), trombina, peptideos vasoativos tais como angiotensina
II, citocinas pró-inflamatórias, carbacol que ativa os receptores de acetilcolina
muscarínicos. Além disso, foi mostrado que essa proteína é ativada por metais tais
como, cobalto, cromo, níquel e arsênio, como também por estresse mecânico. No
entanto, os mecanismos pelos quais esses estímulos não hipóxicos induzem esse fator de
trascrição não são completamente conhecidos, embora algumas evidências apontam
para o papel dos EROs (espécies reativas de oxigênio) como mensageiros regulando a
atividade do HIF-1 (FERREIRA et al., 2007).
Portanto, com relação ao estudo da carcinogênese, considerando a necessidade
atual do descobrimento de novos parâmetros clínicos e patológicos e/ou ferramentas
diagnósticas que possam agilizar o reconhecimento precoce do câncer oral e melhorar o
prognóstico dos pacientes, a alteração e a superexpressão do HIF-1α vem sendo
detectada em uma variedade de tumores sólidos, incluindo mama, rim, fígado,
endométrio, ovário, pulmão e tumores de cabeça e pescoço (BEASLEY et al., 2001;
UEHARA, et al., 2009), os quais tem sidos correlacionados com a gradação histológica,
metástase linfonodal, espessura tumoral, aspectos clínicos, taxa de sobrevida e
prognóstico (LIN et al., 2008; CHEN et al., 2009). Além disso, pôde-se ainda verificar a
forte expressão dessa molécula em uma série de casos de condições pré-malignas como,
por exemplo, na fibrose submucosa oral (TILAKARATNE et al., 2008).
Kyzas et al. (2005) investigando a correlação do VEGF e o HIF-1α com os
parâmetros clínico-patológicos e prognóstico em 81 casos de CE de cabeça e pescoço,
constataram uma associação estatisticamente significativa entre a expressão do VEGF e
do HIF-1α nos tumores localizados no lábio inferior e na laringe. Entretanto, a
expressão do HIF-1α não foi significativamente correlacionada com a taxa de sobrevida,
enquanto a expressão do VEGF esteve correlacionada ao pior prognóstico. Os autores
suportam que a angiogênese tumoral poderia estar relacionada, mas não estritamente
dependente do ambiente hipóxico tumoral.
63
Chen et al. (2009) observaram em 54 casos de CE esofágico que 46% dos
espécimes imunomarcados intensamente pelo do HIF-1α estavam correlacionados com
a profundidade da invasão, metástase linfonodal e estágio clínico.
Burrows et al. (2010), buscando perspectivas para determinação prognóstica e
para a terapêutica tumoral em carcinoma de tireóide, verificaram que uma intensa
expressão do HIF-1α, principalmente nas lesões desdiferenciadas, estava relacionada
com pior taxa de sobrevida. Outrosim, ressaltaram que umas das principais vias de
fosforilação envolvidas na ativação do HIF-1 seria pela sinalização da via PI3K, a qual
poderia ser um alvo promissor para o tratamento das lesões de cabeça e pescoço,
devido a uma forte associação do HIF-1α com o fenótipo da agressividade e resistência
à terapêutica.
Sasabe et al. (2005) analisando os mecanismos de sobrevivência de linhagens de
células de CEO em condições de hipóxia, descreveram que a superexpressão do HIF-1α
inibia a apoptose por impedir a liberação do citocromo c pelas mitocôndrias, acarretar a
não formação de EROs e por diminuir a concentração de íons de cálcio no meio
intracelular, resultando, dessa forma, na inativação das caspases 9 e 3. Além disso,
moléculas antiapoptóticas (Bcl-2 e Bcl-xL) e pró-apoptóticas (Bax e Bak) estariam em
níveis aumentados e diminuídos, respectivamente pela superexpressão desse marcador
de hipóxia. Os autores ressaltam, ainda, que o HIF-1α estaria associado, em virtude
desse mecanismo, a um pior prognóstico, menor taxa de sobrevida e resistência à
quimioterapia.
Na pesquisa conduzida por Fillies et al. (2005), com 85 casos de CE de assoalho
oral,
observou-se
que
a
superexpressão
do
HIF-1α
estava
correlacionada
significantemente com a taxa sobrevida de cinco anos livre de doença, independente do
tamanho do tumor e envolvimento dos linfonodos cervicais, sendo assim, um fator
favorável para prognóstico em pacientes com o estadiamento clínico T1/T2.
Conforme o estudo realizado por Lin et al. (2008), em 57 casos de CEO, 41
espécimes de displasia epitelial oral (12 leves, 17 moderadas e 12 severas) e 14
amostras de mucosa oral normal, verificou-se que a imunoexpressão nuclear do HIF-1α
era mais fortemente evidenciada nas neoplasias orais, principalmente próximo a regiões
necróticas, áreas de ceratinização e de infiltração tumoral quando comparadas com a
64
mucosa oral normal e displasias epiteliais. Constatou-se, ainda, que a imunomarcação
dessa proteína nos casos CEO apresentou uma relação estatisticamente significativa de
acordo com o tamanho do tumor, metástase para linfonodos cervicais e estadiamento
clínico da lesão, sugerindo, assim, que a expressão do HIF-1α exerce um papel
importante na carcinogênese oral, podendo ser utilizado como um recurso adjuvante na
predição da taxa de sobrevida e da progressão tumoral.
Uehara et al. (2009), demonstraram, em 57 casos de CEO, que a
intensa
imunoexpressão do HIF-1α estava associada com a metástase linfonodal, quando
comparado com pacientes sem metástase, interferindo, assim com o pior prognóstico.
Avaliando a expressão do HIF-1α em 82 casos de CEO, Erket et al. (2010a)
relataram que nos pacientes com tumores ausentes de marcação ou que foram
fracamente imunomarcados, a taxa de sobrevida foi 80% superior a 5 anos, quando
comparada com as lesões que apresentaram moderada a forte marcação, cuja
sobrevivência diminuiu para 33,6%. Evidenciaram, ainda, que o risco de óbitos foi 3,5
vezes maior nas lesões fortemente imunomarcadas (p = 0,016) por essa molécula.
Ryu et al. (2010) analisando culturas de células de CEO, demonstraram que a
hipóxia aumentava a concentração do HIF-1α, quando comparado com o estado de
normóxia, alterando a expressão da integrina α5 e fibronectina as quais encontram-se
envolvidas no mecanismo de crescimento e invasão tumoral.
Adionalmente, com objetivo de avaliar o mecanismo funcional do HIF-1α, HIF2α, GLUT-1 e CA-IX em CEO, Zhu et al. (2010) avaliaram a imunoexpressão dessas
moléculas de acordo com as características clínico-patológicas em 97 pacientes.
Linhagens de células malignas transfectadas com lentivírus, que codificavam um
fragmento de RNA, o qual inibia a ação do HIF-1α/2α, foram também utilizadas para
investigar os genes alvo dependentes dos HIF-1α/2α. Em seguida, as linhagens de
células foram inseridas em camundongos com o intuito de estabelecer uma correlação
com o crescimento tumoral, angiogênese, proliferação e apoptose. Assim, de acordo
com o resultados, observaram que a expressão de HIF-1α foi significativamente
associada com o estadiamento T (p = 0,004), comprometimento linfonodal (p = 0,006),
diferenciação histológica (p = 0,013) e densidade microvascular (p = 0,014), enquanto
que o HIF-2α foi associada com o estádio T (p = 0,011) e densidade microvascular (p =
65
0,005). Adicionalmente, pacientes com marcação nuclear para o HIF-1α obtiveram uma
taxa de sobrevida global e taxa sobrevida livre de doença (p < 0,001) significativamente
pior (p < 0,001), do que aqueles com resultados negativos a essa imunomarcação.
Quando as células foram cultivadas a 5% de O2, apenas HIF-2α influenciou para a
expressão do VEGF. Já em 1% O2, o VEGF era regulado tanto pela expressão do HIF1α e como pelo HIF-2α. Entretanto, o GLUT-1 e CA-IX eram regulados somente pelo o
HIF-1α. Ademais, investigaram que a inibição da ação do HIF-1α e HIF-2α impedia o
crescimento e angiogênese na linhagem de células enxertadas nos camundongos.
Liang et al. (2011) evidenciaram, em uma amostra de 89 casos de CEL, que a
superexpressão do HIF-1α foi de 49,44% dos espécimes, estando, dessa forma,
associada com a menor taxa de sobrevida livre de doença (p = 0,003) e pior prognóstico.
Com relação aos fatores etiológicos do câncer oral, estudos evidenciaram que o
tabaco e o álcool podem elevar a expressão do HIF-1α no organismo (JEONG et al.;
2005; LI et al., 2006). Recentemente, a expressão do HIF-1α em CEO demonstrou uma
significativa associação com o hábito de fumar e de ingerir bebida alcoólica em Taiwan
(LIN et al., 2008). No entanto, há informações limitadas sobre a regulação da expressão
dessa molécula em CEO relacionado com o hábito de mascar betel.
Assim, em um estudo conduzido por Lee et al. (2010), em 25 casos de CEO em
pacientes com o hábito de mascar betel e em 10 espécimes de tecido oral normal, foi
detectado que a expressão do HIF-1α era significantemente mais forte nas lesões orais,
quando comparado com o tecido normal. Descreveram, também, que o alcalóide,
arecolina, quando inserida em linhagens de células orais de acordo com o tempo e a
dose, aumentava a síntese dessa proteína in vitro (p < 0,05), entretanto, a adição de
fatores reguladores pós-traducionais do HIF-1 como o precursor da glutationa N-acetilL-cisteína, AP-1 curcumina, o inibidor de proteína de sinal extracelular regulado
PD98059 e a proteína quinase C estaurosporina foram capazes de inibir a expressão do
HIF-1α, contribuindo com a não progressão e transformação maligna das células da
mucosa oral.
Portanto, a hipóxia tumoral é um fenômeno comum nos tumores sólidos e o
conhecimento de marcadores teciduais que se correlacionam com os resultados dos
66
tratamentos aplicados em diversas neoplasias de cabeça e pescoço são necessários para
prever sua utilidade como método auxiliar na terapia contra o câncer (LE et al., 2007).
2.3 Transportador de Glicose - GLUT
Em mamíferos, a oxidação da glicose é responsável pela maior fonte de energia
metabólica celular. A membrana plasmática é impermeável a moléculas polares como a
glicose, necessitando assim de proteínas carreadoras para transportá-las para o meio
intracelular (BELL et al., 1990; OLSON; PESSIN, 1996; BROWN, 2000).
A glicose entra na célula através de dois tipos de proteínas carreadoras: os
transportadores de glicose ligados ao íon sódio (SGLT) e os facilitadores de transporte
de glicose (GLUT). Os SGLT transportam glicose acoplando sua captura com a do
sódio (BELL et al., 1990; SCHEEPERS et al., 2004). O GLUT funciona regulando o
movimento bilateral da glicose entre os espaços extra e intracelular, assegurando que
um suprimento constante de glicose circulante esteja disponível para o metabolismo
através de difusão facilitada (OLSON; PESSIN, 1996). A difusão facilitada é uma
forma de transporte passivo no qual a proteína carreadora facilita a passagem de
moléculas, se prendendo quimicamente a elas e transportando-as através da membrana
(GUYTON; HALL, 1996).
A família do GLUT é composta por 14 tipos: GLUT-1 ao GLUT-12,
transportador H+/ligado ao mio-inositol (HMIT) e o GLUT-14. Essas proteínas diferem
entre si na expressão tecidual, na função, na especificidade de substrato, nas
características cinéticas e apresentam mecanismos de regulação diferentes (ZHAO;
KEATING, 2007). Todas as isoformas possuem 12 segmentos transmembrana,
hidrofóbicos, inseridos na porção lipídica da membrana plasmática, cujos aminoácidos
formam alfa hélices. Os segmentos transmembrana estão ligados por alças de conexão e
as terminações amino (NH2) e carboxi-terminal (COOH) localizam-se no meio
intracelular. Nos GLUTs, as seqüências transmembrânicas são muito homólogas,
enquanto as alças de conexão e as terminações são altamente heterólogas, determinando
as especificidades de cada isoforma (Figura 4) (MACHADO; SCHAAN; SERAPHIM,
2006).
67
Membrana
plasmática
Figura 4. Estrutura bidimensional da proteína transportadora de glicose por
difusão facilitada (GLUT). Fonte: Machado, Schaan, Seraphim (2006).
O GLUT-1 é uma proteína de 45-55 kD, localizada no cromossomo 1 (1p35p31.3) que apresenta um modelo conformacional de doze segmentos transmembrana αhélice, um amino e um carboxi-terminal intracelular, um grande “loop” intracelular e
um sítio de N-glicolisação no primeiro “loop” extracelular (KLEPPER; VOIT, 2002).
A expressão deste gene é supra-regulada por uma variedade de agentes e
condições: fatores séricos e de crescimento, transformação oncogênica, ionóforos de
cálcio, hormônio da tireóide; e em resposta a redução na concentração externa de
glicose, hipóxia e inibição da fosforilação oxidativa (BEHROOZ; ISMAIL-BEIGI,
1999; BURSTEIN et al., 2006).
Mendes et al. (2010) relataram que a expressão do GLUT-1 na superfície celular
pode ser mediada pela porção NH2-terminal de uma proteína kinase, WNK1, a qual é
responsável pela fosforilação e interação com a fosfoproteína TBC1D4. Em seguida, o
complexo formado se liga a proteína 14-3-3, resultando na inativação da
GTPaseRab8A. Uma vez a atividade GTPase inativada, observa-se a ativação da
proteína Rab8A indicando, portanto, um maior estímulo para atividade glicolítica e
crescimento celular, por estimular à uma maior liberação de GLUT-1 do endossoma
para o meio intracelular (Figura 5).
68
Membrana plasmática
Compartimento
de armazenagem
Ativação da
Figura 5. Proteína kinase WNK1 promove expressão do GLUT-1 na
superfície celular pela regulação da fosfoproteína TBC1D4. Fonte:
Mendes et al. (2010).
O GLUT-1 é normalmente expresso em eritrócitos, perineuro, microvasos do
cérebro (barreira hemato-encefálica), centros germinativos de tecidos linfóides reativos,
células trofoblásticas e microvasos da placenta e túbulos renais. (YOUNES et al., 1997).
Todavia, a sua superexpressão tem sido observada em uma série de lesões tumorais
(mama, pulmão, fígado, estômago, ovário, pele, cabeça e pescoço) como passível de
utilização para informação diagnóstica e prognóstica (KUNKEL et al., 2003; MORI et
al., 2007).
Segundo Luo, Zhou e Fan (2010), as opções de tratamento para o carcinoma da
laringe consistem de radioterapia, cirurgia, quimioterapia ou uma combinação dos dois.
Entretanto, o tratamento do carcinoma de laringe representa, ainda, um desafio
considerável por causa de sua resistência à quimioterapia e radioterapia e sua tendência
à recorrência local. Encontrar alternativas de inibir o fornecimento de energia aos
tumores malignos de cabeça e pescoço está se tornando uma proposição cada vez mais
investigada. Com isso, o GLUT-1, codificado pelo gene SLC2A1, é o principal
transportador de glicose em carcinomas sólidos e vem se tornando um foco de estudo.
Recentemente, foi demonstrado que a expressão aumentada de SLC2A1 em carcinomas
de cabeça e pescoço estava correlacionada com metástase linfonodal, à baixa taxa de
sobrevida e estágio clínico elevado. Assim, os autores propõem a supressão da
expressão desse gene como um novo alvo terapêutico para o carcinoma da laringe.
69
A forte expressão do GLUT-1 em neoplasias é observada em condições em que
as células necessitam da via glicolítica anaeróbica como fonte de energia durante a
isquemia ou hipóxia tecidual que ocorrem como conseqüência de um fornecimento
insuficiente de O2 pelo sangue, resultante de uma rede vascular tumoral desestruturada.
Portanto, a hipóxia tumoral induz uma superexpressão de genes específicos associados
ao crescimento e progressão tumoral, como o GLUT-1, CA-IX e o VEGF os quais
podem ser controlados pelo HIF-1 (AIRLEY et al., 2003; KUNKEL et al., 2003;
AHOBA et al., 2010 ).
Como já relatado, o HIF-1α, GLUT-1 e CA-IX podem ser considerados como
marcadores intrínsecos de hipóxia para diversas lesões tumorais. Entretanto, têm sido
identificada a superexpressão do GLUT-1 induzida pelos oncogenes Ras e Src (FLIER
et al., 1987), não estando, portanto, relacionado diretamente à hipóxia. Consistente com
estes últimos achados, Pedersen et al. (2001), relataram o efeito independente de
hipóxia do GLUT-1 sobre a resistência a radiação em pequenas células de câncer de
pulmão, devido ao papel fundamental da glicose na regulação da sobrevivência celular
e apoptose.
Mineta et al. (2002), analisando 99 casos de carcinoma hipofaringeal
evidenciaram uma forte imunoexpressão do GLUT-1 em 46% dos espécimes, os quais
estavam correlacionados com a taxa de sobrevida de 5 anos nas lesões que se
encontravam estágio III e IV, porém não foi possível estabelecer uma associação
estatisticamente significativa com gênero, gradação histológica, tamanho do tumor e
estágio linfonodal.
No ensaio realizado por Kato et al. (2002), foram evidenciados que dos 95 casos
estudados de carcinoma esofágico, 51,6% (> 30% das células neoplásicas
imunomarcadas) dos espécimes imunoexpressos pelo GLUT-1 revelaram uma
correlação com o estágio tumoral (p < 0,0001), estágio linfonodal (p < 0,005), metástase
à distância (p < 0,01) e gradação histológica (p < 0,0001). Adicionalmente, nas lesões
que apresentaram imunoreatividade positiva, os pacientes alcançaram uma taxa de
sobrevida menor, quando comparado com os tumores não imunoreativos. Assim, os
autores inferem que o GLUT-1 pode ser um marcador útil para análise de agressividade
e como critério de prognóstico nos carcinomas esofágicos.
70
Adicionalmente, Tohma et al. (2005) asseguraram, em um ensaio de 63 casos de
carcinoma esofágico, que a taxa de sobrevida em 5 anos para pacientes com forte
imunoexpressão para o GLUT-1 foi significativamente menor do que em pacientes com
fraca expressão (p < 0,01). A análise estatística revelou que o risco relativo de morte
para pacientes com forte marcação era 2,02 vezes maior que em pacientes com fraca
expressão (p = 0,064), sugerindo, com isso, um possível valor preditivo independente
do GLUT-1 para prognóstico.
Li et al. (2008), ressaltando a importância da expressão do GLUT-1 como
preditor de prognóstico em 25 casos de CE de cabeça e pescoço, constataram que a
expressão imuno-histoquímica dessa molécula era significantemente mais fraca nas
lesões primárias e bem diferenciadas quando comparada com os tumores recorrentes (p
= 0,03) e indiferenciados (p = 0,02).
De forma consensual, Ogane et al. (2010), analisando 96 casos de carcinoma
esofágico, constataram que a intensa imunoexpressão membranar e nuclear do HIF-1α e
do GLUT-1, respectivamente, estavam correlacionados com a taxa de sobrevida livre de
doença, taxa de sobrevida global e com a metástase linfonodal regional. Os autores
ressaltam que esses marcadores de hipóxia poderiam ser úteis para prever o desfecho
clínico dos carcinomas esofágicos.
Analisando a imunoexpressão do GLUT-1, -2, -3 e 4 em 24 espécimes de
displasias epiteliais em graus variados, 19 casos com metástase linfonodal e 40
espécimes de CE de cabeça e pescoço, Reisser et al. (1999) evidenciaram a forte
expressão do GLUT-1 nos estágios avançados de displasia, em carcinoma in situ e
metástase linfonodal. A imunoexpressão era fortemente evidenciada na periferia das
ilhas tumorais dos carcinomas e ausente no centro, onde havia uma maior quantidade de
células diferenciadas e ricas em glicogênio. Em contrapartida, houve ausência de
marcação do GLUT-2, -3 e 4 em todas as lesões analisadas. Os autores constataram que
o GLUT-1 poderia ser um marcador confiável de prognóstico em lesões potencialmente
malignas da região orofaríngea.
Johann et al. (2007), buscando o diagnóstico diferencial entre o hemangioma
(HEM) para a malformação vascular (MV) e o granuloma piogênico (GP), investigaram
a imunoexpressão do GLUT-1 em 14 casos de HEM, 48 GP e 17 MV, observaram que
71
nenhum dos casos de lesões vasculares benignas da cavidade oral foi imuno-positivo
para GLUT-1. Os 19 casos diagnosticados inicialmente como HEM de cavidade oral
mostraram negatividade para GLUT-1, sendo reclassificados como GP ou MV. A
análise histológica não foi suficiente para concluir o diagnóstico de HEM pelo fato de
nenhum desses ser HEM verdadeiro. Todos os casos com classificação inicial de GP e
MV foram imuno-negativos para esta proteína, o que demonstrou a eficácia da análise
histológica para estas lesões orais. Portanto, os autores asseguraram que o GLUT-1 é
um marcador efetivo para auxiliar no diagnóstico das lesões vasculares benignas da
cavidade oral.
Mori et al. (2007), avaliaram que o nível de GLUT-1 mRNA, detectado pela
técnica
RT-PCR,
nos
tumores
de
glândulas
salivares
benignos
(38)
foi
significantemente menor em relação as lesões malignas (49). Nos tumores malignos, a
expressão do GLUT-1 estava relacionada com o tamanho do tumor (p < 0,002) e
metástase à distância (p < 0,007). Já a taxa de sobrevida estava vinculada com metástase
para os nódulos linfáticos (p < 0,042) e a expressão do GLUT-1(p < 0,022). Portanto,
esses resultados sugerem que esse marcador de hipóxia pode auxiliar na informação
prognóstica dos pacientes acometidos por carcinomas de glândulas salivares.
Sallas et al. (2008), analisando a aplicabilidade do GLUT-1 nas lesões de nervos
periféricos da cavidade oral, utilizando uma amostra de 15 casos de neuromas
traumáticos, 11 neurofibromas, 4 neurilemomas e 4 lesões malignas da bainha de
nervos periféricos, evidenciaram que as lesões benignas foram positivas na imunohistoquímica para GLUT-1, exceto em dois (18,2%) casos de neurofibromas. No
neuroma
traumático,
o
perineuro
foi
imumnopositivo
para
GLUT-1.
Nos
neurofibromas, a imunorreatividade foi heterogênea, sendo verificada nos níveis de
54,5% na periferia da lesão, 9,1% no centro e 18,2% em ambos. O neurilemoma
demonstrou imunopositividade na cápsula. Apenas um caso do tumor maligno
apresentou marcação homogênea positiva nas ilhas tumorais, incluindo as estruturas
perineurais. Os autores suportam que o GLUT-1 poderia ser útil como marcador de
células perineurais, bem como ser incluído para auxíliar no correto diagnóstico de
lesões da bainha de nervos periféricos.
Demasi et al. (2010), buscando uma perspectiva para o entendimento do
metabolismo energético celular de 26 casos de carcinoma mucoepidermóide, através da
72
utilização de imunomarcadores associados com a glicólise e a fosforilação oxidativa,
relataram que a peroxiredoxina I foi expressa na maioria dos casos, independente da
gradação histológica das lesões. Em contra partida, o GLUT-1 foi significantemente
mais fortemente expresso nas neoplasias com comportamento mais agressivo. Estes
resultados sugerem que a fosforilação oxidativa poderia contribuir para o fornecimento
de ATP em todos os estágios da lesão e que a glicólise anaeróbica atuaria no
crescimento tumoral em uma baixa concentração de O2 pelo mecanismo de ação do
GLUT-1, o qual é estimulado em condições de hipóxia. Além disso, a peroxiredoxina I
poderia fornecer uma proteção às células malignas contra ERO, os quais são oriundas da
fosforilação oxidativa e do ciclo hipóxia-reoxigenação. Outrossim, os autores acreditam
que o GLUT-1 e a peroxiredoxina I constituem uma das estratégias adaptativas para o
crescimento e progressão tumoral em um ambiente com grande instabilidade de
oxigenação.
Kunkel et al. (2003), enaltecendo o mecanismo do metabolismo da glicose no
crescimento e desenvolvimento tumoral em 118 espécimes de CEO, concluíram que a
imunoexpressão do GLUT-1 era mais fraca nos indivíduos com taxa de sobrevida
superior a 138 meses quando comparado com os pacientes com taxa de 60 meses (p =
0,0034). Além do mais, aqueles pacientes que apresentaram uma resposta negativa a
radiação pós-operatória obtiveram uma forte expressão, constatando, portanto, uma alta
atividade glicolítica nessas lesões.
Corroborando com seus achados, Kunkel et al. (2007) avaliando a correlação da
expressão imuno-histoquímica do GLUT-1 com a radioresistência em CEO
constataram, em 40 espécimes teciduais, que os tumores que apresentaram uma
imunomarcação superior a 65% eram resistentes a radiação (p = 0,023) e a taxa de
sobrevida era maior naquelas lesões que evidenciaram uma fraca expressão,
confirmando, assim o valor significativo de prognóstico do GLUT-1 na radioresistência
tumoral.
Oliver et al. (2004), objetivando correlacionar os aspectos clínicos de 54 casos
de CEO tratados cirurgicamente, através da imunoexpressão do GLUT-1, verificaram
que a forte expressão dessa proteína estava associada com a alta taxa de recidiva (p =
0,032), metástase linfonodal (p = 0,005), bem como com o número de mortes
relacionado a doença. Os autores acreditam que a intensa marcação do GLUT-1 poderia
73
ser utilizada para predizer a necessidade de quimioradioterapia nos pacientes
acometidos pelo CEO.
Choi et al. (2007), objetivando analisar a importância do GLUT-1 como
adjuvante no critério de diagnóstico e na estratégia de tratamento do CEL verificaram,
em sua pesquisa de 60 casos, que a forte imunoexpressão do GLUT-1 estava associada
com a localização primária da lesão, metástase para os linfonodos regionais e estágio
tumoral (p < 0,05). Evidenciaram, ainda, que o marcador de proliferação celular, Ki-67,
estava correlacionado com a expressão do GLUT-1 e que a taxa de sobrevida dos
grupos com imunomarcação forte foi inferior, quando comparado com as lesões
fracamente marcadas.
Eckert et al. (2008) observaram, em uma amostra de 42 casos de CEO, que 32
lesões tiveram uma fraca ou ausência de marcação para o GLUT-1, enquanto que 10
amostras obtiveram uma expressão de moderada a forte. Assim, na análise multivariada,
os pacientes cujos tumores tiveram uma moderada a forte expressão para o GLUT-1
possuíam um risco 4,9 vezes maior de morte relacionada ao tumor, em comparação com
os outros pacientes.
Adicionalmente, Ohba et al. (2010) investigaram a expressão imunohistoquímica do GLUT-1 em 24 casos de CEO e observaram que a intensa marcação
estava associada a áreas de front de invasão, profundidade do tumor (p < 0,023) e a taxa
de sobrevida, sugerindo um pior prognóstico (p < 0,046), porém os autores não puderam
inferir uma relação da expressão dessa proteína com os parâmetros idade, gênero,
tamanho do tumor e estágio linfonodal.
Segundo Ayala et al. (2010), analisando as características clínico-patológicas de
142 casos de CEO de acordo com o padrão de expressão do GLUT-1 e GLUT-3,
verificaram que a expressão do GLUT-1 apresentou uma associação significativa com o
consumo de álcool (p = 0,004) e um padrão de marcação membranar forte em 50,3%
dos casos. Por sua vez, a expressão nuclear foi observada em 49,7% dos casos
analisados. A expressão do GLUT-3 foi detectada em 21,1% dos casos e sua marcação
membranar estava associada com o avanço do estadiamento clínico dos tumores (p =
0,005), com a menor taxa de sobrevida livre de doença (p = 0,021), bem como com a
embolização vascular (p = 0,005). Assim, inferiram que as expressões das proteínas
74
GLUT-1 e GLUT-3 são, significativamente, as indicadoras de pior prognóstico em
CEO, provavelmente devido ao maior metabolismo glicolítico das células neoplásicas.
2.4 Anidrase Carbônica - CA
A anidrase carbônica (CA) é uma família das metaloenzimas que contém um
átomo de zinco em sua composição, apresentando 14 diferentes isoformas, atuando na
hidratação do dióxido de carbono e na desidratação do ácido carbônico (H2O + CO2 =
H+ + HCO3-), sendo o seu substrato natural o dióxido de carbono. Algumas dessas
isoformas são citosólicas (CA-I, CA-II, CA-III, CA-IV, CA-XIII) e outras são
transmembranosas (CA-IV, CA-IX, CA-XII, CA-XIV), enquanto a CA-V é
mitocondrial e a CA-VI é secretada pelo leite e pela saliva. Ainda, são conhecidas três
formas acatalíticas como CARP-VIII, CARP-X e CARP-XI (PASTOREKOVA et al.,
2004; TANAKA et al., 2008).
As anidrases carbônicas, codificadas pelos genes α-CA, β-CA e γ-CA, estão
envolvidas em uma série de mecanismos fisiológicos, incluindo manutenção do pH,
diferenciação celular, regulação do equilíbrio iônico, nos mecanismos da respiração,
calcificação, na formação do humor aquoso e dos fluidos cérebro-espinhal, atuando
também na composição da saliva e suco gástrico (BEASLEY et al., 2001).
Adicionalmente, o gene da CA-IX, localizado na região p12-p13 do
cromossomo 9, possui 11 exons e está bastante expresso em diversas lesões malignas,
favorecendo na manutenção do pH ácido do meio extra-celular, criando, assim, um
ambiente favorável para o crescimento, proliferação e metástase tumoral (PARKKILA
et al., 2000) e por conseguinte têm sido associada a um pobre prognóstico, em pacientes
acometidos pelo câncer de mama, pulmão, ovário, cérebro e rim, e com forte resistência
a quimioterapia e radioterapia nas neoplasias de cabeça e pescoço (BRENNAN et al.,
2006; HAAPASALO et al., 2006; KALUZ et al., 2009).
Liao, Lerman e Stanbridge (2009) afirmaram que a forte expressão da CA-IX em
lesões tumorais está intimamente associada à participação da subunidade heterodimérica
do HIF-1(HIF-1α) em um ambiente com baixa tensão de O2. Os autores ressaltaram que
durante o mecanismo de transativação pelo HIF-1, observa-se uma ligação do complexo
75
HIF-1α/ARNT aos motivos HRE, localizados no promotor e enhancer do gene da CAIX e que a via de fosforilação/PI3K, envolvida na ativação do HIF-1, seria uma das
principais formas de expressão da CA-IX. Contudo, Kaluz et al. (2009) sugeriram que
mecanismos epigenéticos, como a metilação do sítio CpG, próximo ao promotor e/ou
modificações pós-transducionais de histonas da CA-IX poderiam inibir a expressão
dessa molécula.
Conforme o estudo realizado por Liao, Lerman e Stanbridge (2009) em tecido
fetal e tecido humano pós-natal, evidenciou-se que a co-localização da CA-IX e do HIF1α estava limitada a certos tipos de células embrionárias e no início do desenvolvimento
do tecido fetal. Essas células eram do mesênquima primitivo ou envolvidas na
condrogênese e no desenvolvimento da pele. A expressão da CA-IX limitou-se a tecidos
imaturos de origem mesodérmica, da pele e células ependimárias. Os únicos tecidos que
persistentemente expressavam a CA-IX eram o epitélio celômico (mesotélio) e seus
remanescentes, o epitélio do estômago e vias biliares, glândulas e células das criptas do
duodeno e do intestino delgado e as células localizadas nesses sítios, previamente
identificados por abrigar células-tronco adultas. A expressão da CA-XII era restrita as
células envolvidas na absorção e secreção de água, como as parientais do estômago, aos
ácinos das glândulas salivares e pâncreas, epitélio do intestino grosso e túbulos renais.
Pastorekova et al. (2004) e Vullo et al. (2005) afirmam que a CA-IX pode ser
um alvo da terapia antitumoral em carcinomas humanos, através do tratamento com
inibidores de CA-IX, incluindo as classes das sulfonamida ou sulfamato. Potentes
inibidores da CA derivados da acetazolamida, etoxizolamida e benzenosulfonamida
demonstraram inibir o crescimento de várias linhagens de células tumorais que
expressam a CA-IX e a CA-XII. Os autores corroboram que a superexpressão da CA-IX
em neoplasias malignas pode ser uma importante ferramenta de diagnóstico para um
adequado tratamento em carcinomas humanos.
Segundo Beasley et al. (2001), a expressão da CA-IX em linhagens de células de
CE de cabeça e pescoço foi superexpressa nas áreas de necrose (p = 0,001), nas porções
de maior MVD (p = 0,02) e nos estágios avançados de desenvolvimento tumoral (p =
0,033), sugerindo que esse marcador de hipóxia seria responsável na manutenção do pH
extra-celular ácido, contribuindo para que as células tenham uma maior taxa de
sobrevida e uma resistência as modalidades terapêuticas.
76
Koukourakis et al. (2001), analisando a relação da expressão imunohistoquímica da CA-IX com a MVD pelo CD-31 em 75 espécimes de CE de cabeça e
pescoço tratados com quimioradioterapia em pacientes com câncer inoperável
localmente avançado (estágio Tx/N2b-3, T3-4/Nx), constataram que a forte expressão
membranar/citoplasmática da CA-IX estava correlacionada com tumores que
apresentavam uma menor MVD (p < 0,001). Observou-se, ainda, uma forte expressão
da CA-IX em focos de necrose, bem como foi possível correlacionar a superexpressão
da CA-IX com a menor taxa de sobrevida e com a radioquimioresistência. Os autores
discorrem que o baixo suprimento sanguíneo correlacionado com a forte expressão da
CA-IX estaria associado ao meio hipóxico que ativaria a via HIF-1 induzindo, assim a
transcrição da CA-IX. Entranto, a baixa MVD associada a uma fraca expressão da CAIX em alguns casos se justificaria pelo fato daquele ambiente vascular apresentar uma
tensão de O2 suficiente para manter a progressão tumoral. Adicionalmente, a alta MVD,
associada à forte expressão pela CA-IX poderia consistir em uma falha no metabolismo
celular ou um colapso do suprimento sanguíneo, o que tornaria o ambiente hipóxico,
ativando, com isso fatores pró-angiogênicos, como o VEGF (NIGEL et al., 2001) e
moléculas que favoreceriam um baixo pH extracelular para invasão e metástase tumoral.
Em uma pesquisa conduzida por Hui et al. (2002), em 90 casos de carcinoma
nasofaringeo, verificou-se que o HIF-1α foi expresso em 58% dos casos, o HIF-1β em
7%, o VEGF em 60% e a CA-IX foi imunomarcada em 90% dos espécimes. A
superexpressão do HIF-1α estava correlacionada como a elevada expressão da CA-IX (p
= 0,008) e do VEGF (p = 0,003), os quais se encontravam associados com o pior
prognóstico e menor taxa de sobrevida. Os autores inferem que os marcadores de
hipóxia poderiam ser uma alternativa para guiar o tratamento de neoplasias de cabeça e
pescoço.
Conforme a pesquisa realizada por Jonathan et al. (2006), em 58 pacientes com
carcinomas de cabeça e pescoço, constatou-se que a forte expressão do GLUT-3 estava
associada ao menor controle loco-regional da lesão. Em relação ao GLUT-1, a forte
intensidade estava associada a alta taxa metástase à distância e uma menor taxa de
sobrevida global. Foram encontradas, também, diferenças estatiscamente significativas
para o controle loco-regional (p = 0,04) e ausência de metástase regional (p = 0,02) para
aqueles pacientes que obtiveram intensa expressão da CA-IX.
77
Schrijvers et al. (2008) analisando a imunoexpressão de marcadores de hipóxia
endógeno em 91 espécimes de CE de laringe nos estágios T1 e T2, os quais foram
tratados apenas por radioterapia, puderam constatar que a superexpressão do HIF-1α
nos carcinomas de glote estava associada a uma menor taxa de sobrevida global (p =
0,016) e a recidiva local (p = 0,021). A CA-IX estava significantemente correlacionada
com o pior controle do crescimento tumoral (p = 0,02). Todavia, não se evidenciou
associação da imunomarcação do GLUT-1 com os parâmetros de evolução clínica.
Além do mais, os tumores com o perfil não-hipoxêmicos, que mostravam uma fraca
marcação para o HIF-1α e a CA-IX, tiveram uma taxa de controle local
significativamente melhor (p = 0,013). Os autores afirmaram que os carcinomas de
laringe nos estágios iniciais que apresentam uma baixa expressão para HIF-1α e a CAIX são altamente curáveis com a radioterapia. No entanto, quando há a superexpressão
dessas moléculas o tratamento cirúrgico deve ser realizado.
No estudo realizado por Tanaka et al. (2008), em 127 espécimes de carcinoma
esofágico, observou-se que a superexpressão da CA-IX estava associada a um pobre
prognóstico e aos aspectos clínico-patológicos, incluindo metástase linfonodal a
distância (p = 0,0077), metástase linfonodal regional (p = 0,0031), estágio tumoral (p <
0,0001), tamanho da lesão (p = 0,0235), grau de invasão (p < 0,0001) e invasão vascular
(p = 0,006). Os autores sugerem que o controle da expressão desse marcador endógeno,
que se encontra intimamente associado aos mecanismos de hipóxia, poderia ser
adjuvante na efetividade da quimioterapia e radioterapia nas lesões de cabeça e pescoço.
Brockton et al. (2011) observaram em um estudo de 55 casos de CE de cabeça e
pescoço que a intensa marcação estromal da CA-IX em tumores HPV-16 negativos
estava correlacionada com a redução da taxa de sobrevida global (p = 0,03). Os autores
relatam que embora os pacientes HPV positivos estejam relacionados com um bom
prognóstico e sejam responsivos ao tratamento radioquimioterápico, quando
comparados a outros fatores etiológicos extrínsecos do câncer como o fumo e o álcool,
fatores endógenos de hipóxia poderiam auxiliar a elucidar a taxa global de sobrevida
desfavorável em pacientes HPV negativos.
Analisando a imunoexpressão do Ki-67 e da CA-IX em 60 casos de CEL, Kim et
al. (2007), verificaram que a forte marcação dessas proteínas estava associada a um
pobre prognóstico e curto período de tempo livre da doença. Os autores asseguraram
78
que o marcador de proliferação celular e a CA-IX podem ser úteis na análise do
comportamento clínico-patológico e na escolha da estratégia terapêutica adequada para
o CEL.
Choi et al. (2008) descrevem que dos 117 casos de CEO, 58,1% apresentaram
uma surperexpressão da CA-IX, sendo significantemente correlacionada com a
recorrência (p < 0,05) e taxa de sobrevida de 5 anos (p < 0,02). Contudo, apesar de não
se observar uma significância estatística, pôde-se certificar uma associação da expressão
desse marcador com o sexo feminino, metástase em nódulos linfáticos e história de
consumo de tabaco.
Roh et al. (2009) reportaram em um ensaio imuno-histoquímico de 43 casos de
CEL (T2), tratados por ressecção cirúrgica, que a espessura tumoral estava associada
com a imunomarcação para a CA-IX.
Para o GLUT-1, sua marcação estava
significativamente relacionada com a espessura tumoral e comprometimento linfonodal.
Outrossim, a análise multivarada identificou que a forte expressão do HIF-1α e do
EPOR estava relacionada com menor taxa de sobrevida.
Eckert et al. (2010b), avaliando a expressão da CA-IX e do HIF-1α em 80 casos
de CEO, investigaram que a fraca e a forte expressão das ambas proteínas estava
correlacionadas com uma média de sobrevida de 54,8 e 37,6 meses respectivamente,
afirmando, dessa forma, que essas moléculas poderiam contribuir na terapia contra o
câncer oral.
Kondo et al. (2011) verificando a expressão imuno-histoquímica da CA-IX, Ki67, GLUT-1 e p53 em 107 casos de CEO, de acordo com os parâmetros clínicopatológicos, observaram que a expressão da CA-IX estava presente em 96% dos casos,
onde a taxa de sobrevida foi menor nos indivíduos que apresentavam 50% ou mais das
células imunomarcadas (p < 0,05). Pacientes nos estágios tumorais IV que exibiam altas
taxa (≥ 50%) de imunomarcação tiveram um pior prognóstico, quando comparados com
os tumores que apresentavam baixa expressão. A expressão do GLUT-1 foi evidenciada
em 98% dos casos, porém não houve uma correlação significativa da expressão dessa
proteína com a taxa de sobrevida global da doença. No entanto, os indivíduos com
metástases linfonodais tiveram significativamente maior expressão do GLUT-1,
demonstrando que esse marcador poderia ser um indicador de metástase ganglionar. Já
79
o Ki-67, se expressou em 92% da amostra, sendo que nenhuma correlação com os
parâmetros analisados foi observada. A expressão da p53 foi observada em 78% dos
espécimes, entretanto nenhuma correlação entre a proteína e evolução clínica foi
verificada.
Portanto, apesar de existirem vários parâmetros clínicos e morfológicos
relacionados com agressividade do CEO, muitos aspectos ainda são desconhecidos no
tocante a progressão e comportamento clínico desta neoplasia. Com isso, através de
ensaios prévios vêm se sugerindo a utilização de marcadores de hipóxia para o
entendimento da instabilidade genética, invasibilidade tumoral e metástase de diversas
neoplasias que acometem a região de cabeça e pescoço, principalmente o CEL, o qual
apresenta uma maior propensão para metástase regional cervical (TANAKA et al.,
2008; ROH et al., 2009).
80
“O valor das coisas não está no tempo em que elas duram,
mas na intensidade com que acontecem.
Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e
pessoas incomparáveis.”
(Fernando Pessoa)
PROPOSIÇÃO
81
3 PROPOSIÇÃO
Este trabalho teve como objetivos principais:
 Avaliar e correlacionar à incidência de dados clínicos e morfológicos em uma
série de casos de CEL.
 Avaliar a expressão imuno-histoquímica dos anticorpos anti-HIF-1α, antiGLUT-1 e anti-CA-IX em uma série de casos de CEL, com variada gradação
histológica de malignidade, com a finalidade de correlacionar a expressão destas
proteínas com o estadiamento clínico TNM, presença de metástase, desfecho da
doença e características morfológicas.
82
“Uma vida sem desafios não vale a pena ser vivida.”
(Sócrates)
MATERIAL E MÉTODOS
83
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Caracterização do Estudo
O presente estudo caracterizou-se como uma pesquisa descritiva constituída pela
observação, análise e registro da intensidade e distribuição de marcação obtida a partir
da análise qualitativa e quantitativa respectivamente das células neoplásicas e do
estroma imunomarcados pelos anticorpos anti-HIF-1α, anti-GLUT-1 e anti-CA-IX em
uma série de casos de CEL. Constituiu-se, também, de uma investigação comparativa
das variáveis independentes com a imunomarcação por esses anticorpos, visando obter
informações que contribuíssem para o entendimento do papel dessas proteínas no
comportamento biológico das células epiteliais neoplásicas em CEL.
4.2 População
A população objeto deste estudo foi constituída por casos de CEL registrados e
diagnosticados no serviço de Patologia Cirúrgica do Hospital Dr. Luiz Antonio, NatalRN, no período de 1995 a 2007.
4.3 Amostra
A amostra selecionada para a realização desta pesquisa foi constituída por 57
espécimes teciduais de CEL emblocados em parafina, que foram oriundos do serviço de
Patologia Cirúrgica do Hospital Dr. Luiz Antonio, Natal-RN, onde foram obtidos os
dados clínicos a partir de análises dos prontuários, como sexo, idade, raça estadiamento
clínico (TNM), presença ou não de metástase e desfecho da doença. Esses dados foram
anotados em uma ficha clínica previamente elaborada para esta finalidade (Apêndice 1).
Utilizou-se na pesquisa 57 espécimes teciduais pelo fato deste número possibilitar uma
boa distribuição e dispersão dos dados da amostra. Os pacientes portadores das lesões
incluídas neste estudo ou o responsável legal foram esclarecidos quanto à pesquisa e
assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo 2) elaborado para
este estudo.
84
4.3.1 Critérios de Inclusão da Amostra
Os casos de CEL constantes nesta pesquisa foram àqueles provenientes de
tratamentos cirúrgicos, os quais tinham um acompanhamento clínico de no mínimo 5
anos, que não tinham sido submetidos à quimioterapia ou radioterapia prévia e que as
respectivas fichas clínicas continham todos os dados necessários para realização do
estudo clínico. Além. Disso, todos os espécimes selecionados apresentavam quantidade
suficiente de material biológico para a realização do estudo imuno-histoquímico.
4.3.2 Critérios de Exclusão da Amostra
Foram excluídos da amostra todos os casos de CEL que não foram provenientes
de biópsia excisional e/ou àqueles sem o devido acompanhamento clínico e com
extensas áreas de necrose. Também foram excluídos da pesquisa, os casos em que o
material biológico era insuficiente para a realização do estudo imuno-histoquímico e
todos os casos que não se conseguiram os Termos de Consentimento Livre e
Esclarecido.
4.4 Estudo Clínico
Dos prontuários analisados, foram obtidas informações em relação ao sexo do
paciente, idade, raça, estadiamento clínico (TNM) da lesão, presença ou não de
metástase e desfecho da doença (remissão ou óbito).
4.5 Estudo Morfológico
O exame histopatológico foi realizado em microscopia de luz, em cortes de 5μm
de espessura e corados pela técnica de Hematoxilina e Eosina. Em seguida, foi efetuada
uma análise descritiva das características anátomo-patológicas e gradação histológica de
malignidade no front de invasão das lesões. A avaliação histomorfológica das áreas de
invasão foi realizada com base nos critérios de malignidade, conforme o sistema de
gradação histológica proposta por Bryne (1998) e adaptado por Miranda (2002) (Quadro
3).
85
Escore de Malignidade
Aspectos
Morfológicos
1
2
3
Altamente
Moderadamente
Mínima
Grau de
ceratinizado
ceratinizado (20
ceratinização (5
Nenhuma ceratinização (0
Ceratinização
(mais de 50%
a 50% das
a 20% das
a 5% das células)
das células)
células)
células)
Pouco
Moderado
Abundante
pleomorfismo
pleomorfismo
pleomorfismo
Pleomorfismo nuclear
nuclear (mais de
nuclear (50 a
nuclear (25 a
extremo (0 a 25% de
75% de células
75% de células
75% de células
células maduras)
maduras)
maduras)
maduras)
Pleomorfismo
Nuclear
Padrão de
Invasão
Infiltrado
Inflamatório
Bordas
4
Pequenos grupos
Dissociação celular difusa
Cordões, bandas
ou cordões de
e pronunciada, em
e/ou trabéculas
células
pequenos grupos e/ou
sólidas
infiltrativas
células individuais
(n > 15)
(n < 15)
Escasso
Ausente
infiltrativas bem
delimitadas
Intenso
infiltrativas
Moderado
Quadro 3. Sistema de gradação de malignidade recomendado por Bryne (1998).
Para este sistema, a análise dos parâmetros morfológicos foi realizada no front
invasão e, para cada parâmetro, foi emitido um escore variando de 1 a 4, de acordo com
o previsto no referido sistema, sendo posteriormente, somado em cada caso. Os casos
que obtiveram pontuação total de 4 a 8 pontos, foram classificados em baixo grau de
malignidade, enquanto que aqueles com mais de 8 pontos foram considerados de alto
grau de malignidade. Os dados desta análise morfológica foram anotados em fichas
individuais especialmente preparadas para os CEL (Apêndice 2).
4.6 Estudo Imuno-histoquímico
Todos os espécimes de CEL fixados em formol a 10% e emblocados em
parafina, referentes aos casos previamente selecionados para este estudo, foram
submetidos a cortes histológicos de 3μm de espessura, os quais foram estendidos em
base de 3-aminopropyltrietoxi-silano (Sigma Chemical Co, St Louis, Mo, USA).
86
Posteriormente, os referidos cortes foram submetidos aos métodos da imunoperoxidase
pela técnica da estreptoavidina-biotina (LSAB), utilizando o anticorpo primário antiCA-IX e o método da imunoperoxidase pela técnica baseada em polímeros de dextrano
(ADVANCETM HRP, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), utilizando
anticorpos monoclonais anti-HIF-1α e anti-GLUT-1, seguindo os passos laboratoriais
descritos a seguir:
 Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos cada);
 Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:

Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

Álcool etílico 95°GL (5 minutos);

Álcool etílico 80°GL (5 minutos);
 Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°,
à temperatura ambiente (10 minutos);
 Lavagem em água corrente (10 minutos)
 Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
 Recuperação antigênica (Quadro 4);
 Lavagem em água corrente (10 minutos);
 Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
 Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% 10 volumes,
em proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual (10 minutos
cada);
 Lavagem em água corrente (10 minutos);
 Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);
 Duas passagens em solução tampão TRIS-HCl (Sigma Chemical Co., St. Louis,
MO, USA) pH 7,4 (5 minutos cada);
 Incubação dos cortes com anticorpos primários (Quadro 4), em solução diluente
(Antibody diluent with background reducing components, Dako North America Inc.,
Carpinteria, CA, USA);
 Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos
cada);
87
 Incubação com o anticorpo secundário (Biotinylated link universal, Dako North
America Inc., Carpinteria, CA, USA, quando se utiliza o anticorpo primário anti-CA-IX
ou ADVANCETM HRP Link, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA, quando
se utiliza os anticorpos monoclonais anti-HIF-1α e anti-GLUT-1), em diluição 1:200, à
temperatura ambiente (30 minutos);
 Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos
cada);
 Incubação com o complexo estreptoavidina-biotina HRP (Dako North America Inc.,
Carpinteria, CA, USA), à temperatura ambiente (30 minutos) quando se utiliza o
anticorpo primário anti-CA-IX ou Incubação com anticorpo polimerizado à peroxidase
quando se utiliza os anticorpos monoclonais anti-HIF-1α e anti-GLUT-1 (ADVANCETM
HRP Enzyme, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA), à temperatura
ambiente (30 minutos);
 Duas passagens em solução tampão TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada);
 Revelação da reação com solução cromógena de diaminobenzidina (3,3diaminobenzidina, Liquid DAB+ Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA,
USA) (10 minutos);
 Lavagem em água corrente (10 minutos);
 Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);
 Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (10 minutos);
 Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:

Álcool etílico 80°GL (2 minutos);

Álcool etílico 95°GL (2 minutos);

Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

Álcool etílico absoluto III (5 minutos);
 Duas passagens em xilol (2 minutos cada);
 Montagem em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA).
88
Especificidade
Clone
HIF-1α
H1α67
Fabricante
Diluição
Santa Cruz
Recuperação Antigênica
Incubação
Tris/EDTA, pH 9,0
Overnight
Pascal, 3 min
(18 horas)
1:200
Biotechnology
Citrato, pH 6,0
GLUT-1
SLC2A1
Gene Tex
1:400
60 min
Pascal, 3 min
Citrato, pH 6,0
Santa Cruz
CA-IX
H-120
1:200
Biotechnology
120 min
Pascal, 3 min
Quadro 4. Especificidade, clone, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos
anticorpos primários a serem utilizados no estudo.
4.7 Análise do Perfil Imuno-histoquímico
Foram realizadas análises de forma descritiva, qualitativa e quantitativa e os
resultados apresentados em forma de tabelas, tanto em valores absolutos quanto em
percentuais.
A análise qualitativa e quantitativa foi realizada considerando a intensidade de
marcação e distribuição, respectivamente, da expressão dos antígenos correspondentes
aos anticorpos utilizados, segundo a metodologia proposta por Choi et al. (2007),
Tanaka et al. (2008) e Andersen et al. (2010), verificando o tipo celular imunoexpresso
(estroma ou parênquima), bem como a localização desta marcação nas células
(membrana, citoplasma, núcleo) e na periferia e/ou no centro das ilhas tumorais. A
avaliação foi realizada por dois observadores em dois momentos diferentes, em caso de
discordância entre os avaliadores o caso foi reavaliado até chegar a um consenso, sendo
os achados anotados em ficha previamente elaborada para posterior análise dos
resultados obtidos. Na avaliação da intensidade de marcação foram atribuídos escores
de 0 a 2 onde, 0 representou ausência de marcação; 1, marcação fraca e 2, marcação
forte. Foram definidos como casos positivos, aqueles que exibiram mais do que 10%
das células imunomarcadas (KIM et al., 2007; ANDERSEN et al., 2010); já a
distribuição de marcação foi avaliada de forma quantitativa de acordo com os seguintes
critérios adaptados da metodologia proposta por Lee et al. (2010): focal (< 50% das
células imunomarcadas) e difusa (> 50% das células imunomarcadas) (Apêndice 3).
89
Como controle positivo para o HIF-1α e CA-IX foram utilizados cortes de
adenocarcinoma de cólon. Para o GLUT-1 foi empregado como controle positivo os
eritrócitos. Como controle negativo os anticorpos primários foram substituídos por
albumina de soro bovino a 1% (BSA - bovine serum albumin).
4.8 Análise Estatística
Uma vez realizadas as análises morfológicas e imuno-histoquímicas, os
resultados obtidos foram submetidos a testes estatísticos adequados, com o intuito de
testar as hipóteses de correlação dos dados clínicos como estadiamento clínico,
desfecho, metástase, SGHM e a expressão do HIF-1α, GLUT-1 e CA-IX. Para as
demais variáveis clínicas, como sexo, hábitos, faixa etária e raça, foi realizada apenas
uma análise descritiva.
4.8.1 Delineamento da Análise
Os dados foram digitados originalmente em uma planilha eletrônica do
programa de Excel (Microsoft Office 2007®) e posteriormente exportados para formato
DBF (Data Base Format), para poder ser lido pelo programa Statistical Package for
Social Science (versão 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA), onde foram feitas as
análises estatísticas.
90
4.8.2 Variáveis Estudadas
Variável Dependente
Classificação
Categorias
Estadiamento clínico
Categórica
I, II, III, IV
Metástase
Categórica
Sim, Não
Desfecho
Categórica
Óbito, Remissão
Gradação histológica
Categórica
Baixo grau, Alto grau
Variável Independente
Classificação
Categorias
Intensidade de marcação
Categórica
Fraca, Forte, Ausente
Tipo celular marcado
Categórica
Estroma, Parênquima
Localização de marcação
Categórica
Membrana, Citoplasma, Núcleo
Categórica
Centro, Periferia, Centro/periferia
Categórica
Focal, Difusa
Localização de marcação na ilha
tumoral
Distribuição de marcação
Quadro 5. Quadro evidenciando as variáveis analisadas, bem como sua classificação e categorização.
4.8.3 Definição do Teste Estatístico
Considerando que, tanto as variáveis dependentes quanto as independentes são
do tipo categórica, optou-se por uma análise bivariada, tendo como teste de escolha o
qui-quadrado (Qui2) de Pearson, sendo o nível de significância adotado para os casos
estudados foi de 95% (p < 0,05).
4.9 Implicações Éticas
O presente estudo foi submetido à apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN) segundo protocolo nº
029/10, CAAE: 0033.0.051.000-10 (Anexo 1), onde os sujeitos desta pesquisa
assinaram os termos de consentimento livre e esclarecido (Anexo 2) tornando-se ciente,
dessa forma, de sua participação no estudo. Ressalta-se, ainda, que o presente trabalho
foi executado com espécimes teciduais, emblocados em parafina, pertencentes ao
arquivo do serviço de Patologia Cirúrgica do Hospital Dr. Luiz Antonio, Natal-RN.
91
“Por mais longa que seja a caminhada o mais importante é
dar o primeiro passo.”
(Vinícius de Moraes)
RESULTADOS
92
5 RESULTADOS
5.1 Análise Descritiva dos Aspectos Clínicos
Frente aos dados clínicos referentes à caracterização da amostra estudada,
observou-se que a maioria dos indivíduos (70,2%) acometidos pelo CEL eram do sexo
masculino, sendo a faixa etária mais freqüente entre 61 a 70 anos, perfazendo 35,1% da
amostra. A raça leucoderma foi à predominante, totalizando 32 casos (56,2%) da
amostra total. Dos hábitos analisados, o tabagismo associado ao etilismo foi o mais
prevalente (42,1%), seguido com 31,6% quando relacionado somente ao tabagismo
(Tabela 1).
Tabela 1. Distribuição dos casos de CEL com relação ao sexo, raça, faixa etária e hábitos dos pacientes.
Natal, RN-2011.
N
(%)
Masculino
40
70,2%
Feminino
17
29,8%
Melanoderma
14
24,5%
Feoderma
11
19,3%
Leucoderma
32
56,2%
Faixa Etária 31 a 40 anos
03
5,3%
41 a 50 anos
06
10,5%
51 a 60 anos
18
31,6%
61 a 70 anos
20
35,1%
71 a 80 anos
07
12,3%
81 a 90 anos
03
5,2%
18
31,6%
24
42,1%
01
1,8%
14
24,5%
Sexo
Raça
Hábitos Tabagista
Tabagista e Etilista
Não Tabagista e Não
Etilista
Não Relatado
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
93
No que concerne ao estadiamento clínico (TNM), o estágio III foi o mais
freqüente com 38,6% dos casos, seguidos dos estágios I, IV e II. Em relação ao
desfecho, 77,2% da amostra houve a remissão da lesão, sendo que 57,9% dos pacientes
apresentaram metástase (Tabela 2).
Tabela 2. Distribuição das variáveis TNM, desfecho e metástase em números absolutos (n) e relativos
(%). Natal, RN-2011.
N
(%)
I
14
24,6%
II
10
17,5%
III
22
38,6%
IV
11
19,3%
Remissão
44
77,2%
Óbito
13
22,8%
Ausência
24
42,1%
Presença
33
57,9%
Estadiamento Clínico
Desfecho
Metástase
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
5.2 Análise Descritiva dos Aspectos Morfológicos
Em relação aos aspectos histopatológicos dos casos de CEL avaliados neste
trabalho, observou-se uma proliferação desordenada em direção ao tecido conjuntivo de
células epiteliais malignas na forma de ninhos, cordões e/ou lençóis sólidos exibindo
alterações celulares anaplásicas, tais como pleomorfismo celular e nuclear, perda da
relação núcleo-citoplasma, disceratose, hipercromatismo nuclear, presença de nucléolos
numerosos e proeminentes, mitoses atípicas e/ou bizarras e formação de pérolas
córneas. Graus variados de infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear em
proximidade ao epitélio lesional e áreas focais de necrose e ulceração também foram
visualizados.
A observância dos achados microscópicos supracitados permitiu a definição da
gradação histológica de malignidade dos casos analisados, de acordo com o sistema
94
proposto por Bryne (1998) e adaptado por Miranda (2002), sendo verificado que os
casos de alto grau foram mais prevalentes (n = 43; 75,4%) (Figuras 8 e 9) quando
comparados com os de baixo grau (n = 14; 24,6%) (Figuras 6 e 7).
5.3 Análise Descritiva da Imuno-histoquímica do HIF-1α, GLUT-1 e CA-IX
A expressão dos referidos marcadores foi avaliada com relação a presença ou
ausência de marcação, o grau de intensidade, distribuição, os tipos celulares marcados,
bem como a localização dessa marcação nas células neoplásicas (membrana,
citoplasma, núcleo).
5.3.1 HIF-1α
Na análise qualitativa, verificou-se que o anticorpo anti-HIF-1α reagiu
imunopositivamente em 100% dos casos de CEL estudados, tanto no parênquima como
nas
células
estromais.
A
expressão
localizou-se
predominantemente
no
núcleo/citoplasma das células neoplásicas (n = 44; 77,2%), seguido do núcleo (n = 12;
21,1%) e citoplasma (n = 1; 1,8%), independemente do seu pleomorfismo e/ou grau de
diferenciação celular. Além disso, a maior parte da amostra exibiu uma distribuição de
marcação difusa no epitélio proliferante (n = 48; 84,2%), verificando uma distribuição
focal predominantemente nas regiões perinecróticas (n = 9; 15,8%).
Com relação à intensidade de marcação, 68,4% (n = 39) da amostra
apresentaram uma marcação forte, enquanto 31,6% (n = 18), expressão fraca.
Adicionalmente, a expressão no front de invasão exibiu uma localização tanto na
periferia como no centro das ilhas e/ou lençois tumorais em 100% dos casos (Figuras 10
e 11).
5.3.2 GLUT-1
A expressão do GLUT-1 nos casos de CEL localizou-se em 100% dos casos,
independente dos aspectos histopatológicos, no citoplasma e membrana das células
malignas, as quais exibiram uma distribuição de marcação difusa em todos os casos.
Entretanto, a localização de marcação no estroma se deteve predominantemente nas
hemácias e em áreas focais do revestimento interno de alguns vasos sanguíneos de
calibres variados.
95
A maioria dos casos exibiu uma imunoexpressão forte (n = 44; 77,2%), enquanto
que 22,8% (n = 13) evidenciaram marcação fraca.
No que concerne a localização de marcação nas ilhas do epitélio proliferante, o
GLUT-1 foi mais expresso na periferia (n = 30; 52,6%) quando comparado com a
localização centro/periferia (n = 27; 47,4%) (Figuras 12 e 13).
5.3.3 CA-IX
Na
análise
qualitativa,
observou-se
que
o
anticorpo
CA-IX
reagiu
imunopositivamente em 100% dos casos de CEL estudados, tanto no parênquima como
nas
células
estromais.
A
expressão
localizou-se,
predominantemente,
na
membrana/citoplasma das células neoplásicas (n = 49; 86%), seguido da
membrana/citoplasma/núcleo (n = 8; 14%), independemente do grau histopatológico de
malignidade. Além disso, a maior parte da amostra exibiu uma distribuição de marcação
difusa no epitélio proliferante em 89,5% (n = 51) dos casos.
Com relação à intensidade de marcação, 66,7% (n = 38) da amostra exibiu uma
marcação forte, enquanto 33,3% (n = 19), expressão fraca. Adicionalmente, a expressão
no front de invasão apresentou uma localização significantemente no centro/periferia
dos ninhos e/ou lençóis (n = 53; 93%) quando correlacionado com a localização
periférica (n = 4; 7%) (Figuras 14 e 15).
5.4 Resultado da Análise Estatística
5.4.1 Análise Estatística dos Aspectos Clínicos
Na análise da relação entre o estadiamento clínico e desfecho da doença
evidenciou-se que 100% e 85,7% dos casos que se encontravam no estágio II e I,
respectivamente, obtiveram a remisão da lesão. Com relação ao número de óbitos,
constatou-se o predomínio no estágio IV, seguidos com menores freqüências os estágios
III e I. Entretanto, o teste qui-quadrado (Qui2) demonstrou não haver diferenças
estatisticamente significativas entre as variáveis analisadas (p = 0,072) (Tabela 3).
96
Tabela 3. Relação entre estadiamento clínico e desfecho da doença. Significância obtida pelo teste Qui2.
Natal- RN, 2011.
Desfecho
Estadiamento
Clínico
Total
Qui2
p
6,986
0,072
Remissão
Óbito
I
12 (85,7%)
2 (14,3%)
14 (100%)
II
10 (100%)
0 (0%)
10 (100%)
III
16 (72,7%)
6 (27,3%)
22 (100%)
IV
6 (54,5%)
5 (45,5%)
11 (100%)
Total
44 (77,2%)
13 (22,8%)
57 (100%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Na correlação entre metástase e desfecho da doença, observou-se que houve uma
associação estatisticamente significativa entre as variáveis analisadas de acordo com o
teste qui-quadrado (Qui2) (p = 0,000), onde os 24 casos (100%) com ausência de
metástase obtiveram remissão da doença. Todavia, dos 33 casos que apresentaram
metástase, menos de 40% dos pacientes foram a óbito (Tabela 4).
Tabela 4. Relação entre metástase e desfecho da doença. Significância obtida pelo teste Qui2. Natal, RN2011.
Desfecho
Metástase
Total
Qui2
p
12,248
0,000
Remissão
Óbito
Ausência
24 (100%)
0 (0%)
24 (100%)
Presença
20 (60,6%)
13 (39,4%)
33 (100%)
Total
44 (77,2%)
13 (22,8%)
57 (100%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Levando em consideração a relação entre metástase e estadiamento clínico da
doença, verificou-se que nos estágios mais avançados (III e IV) houve uma maior a
probabilidade no desenvolvimento de metástase. Quanto à ausência de metástase,
97
grande parte da amostra encontrava-se no estágio II, seguido do estágio I. O teste quiquadrado (Qui2) demonstrou diferenças estatisticamente significativas entre as variáveis
estudadas (p = 0,001) (Tabela 5).
Tabela 5. Relação entre metástase e estadiamento clínico. Significância obtida pelo teste Qui2. Natal,
RN-2011.
Estadiamento Clínico
Total
Qui2
p
17,613
0,001
I
II
III
IV
Ausência
8
(57,1%)
9
(90%)
6
(27,3%)
1
(9,1%)
24 (100%)
Presença
6
(42,9%)
1
(10%)
16
(72,7%)
10
(90,9%)
33 (100%)
Total
14
(24,5%)
10
(17,5%)
22
(38,6%)
11
(19,3%)
57 (100%)
Metástase
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Conforme a tabela 6, observou-se que não houve correlação estatisticamente
significativa entre a gradação histológica de malignidade e o desfecho da doença (p =
0,887). Entretanto, verificou-se nos casos de baixo grau o predomínio de um desfecho
favorável.
Tabela 6. Relação entre gradação histológica e desfecho da doença. Significância obtida pelo teste Qui 2.
Natal, RN-2011.
Desfecho
Gradação
Histológica
Total
Qui2
p
0,020
0,887
Remissão
Óbito
Baixo
11 (78,6%)
3 (21,4%)
14 (100%)
Alto
33 (76,7%)
10 (23,3%)
43 (100%)
Total
44 (77,2%)
13 (22,8%)
57 (100%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
98
Na análise da relação entre a gradação histológica e o estadiamento clínico,
evidenciou-se uma maior freqüência de casos de baixo grau de malignidade nos estágios
I e II, seguidos dos estágios III e IV. Em relação aos casos de alto grau, constatou-se a
prevalência dos estágios III e IV, com menor frequência para os estágios II e I,
respectivamente.
O
teste
qui-quadrado
(Qui2)
demonstrou
haver
diferenças
estatisticamente significativas entre as variáveis analisadas (p = 0,006) (Tabela 7).
Tabela 7. Relação entre gradação histológica e estadiamento clínico. Significância obtida pelo teste Qui2.
Natal, RN-2011.
Estadiamento Clínico
Gradação
Histológica
Total
Qui2
p
12,443
0,006
I
II
III
IV
Baixo
8 (57,1%)
3 (21,4%)
2 (14,3%)
1 (7,1%)
14 (100%)
Alto
6 (14%)
7 (16,3%)
20 (46,5%)
10 (23,3%)
43 (100%)
Total
14 (24,6%)
10 (17,5%)
22 (38,6%)
11 (19,3%)
57 (100%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Na tabela 8, foi observada uma distribuição relativamente similar entre gradação
histológica de malignidade e metástase. Contudo, a presença de metástase foi verificada
em sua maioria nos casos de alto grau de malignidade. Todavia, o teste qui-quadrado
(Qui2) demonstrou não haver diferenças estatisticamente significativas entre os grupos
analisados (p = 0, 948) (Tabela 8).
Tabela 8. Relação entre gradação histológica e metástase. Significância obtida pelo teste Qui 2. Natal,
RN-2011.
Metástase
Gradação
Histológica
Total
Qui2
p
0,004
0,948
Ausência
Presença
Baixo
6 (42,9%)
8 (57,1%)
14 (100%)
Alto
18 (41,9%)
25 (58,1%)
43 (100%)
Total
24 (42,1%)
33 (57,9%)
57 (100%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
99
5.4.2 Análise Estatística da Expressão Imuno-histoquímica do HIF-1α
De acordo com a imunoexpressão do HIF-1α nos casos analisados, o teste quiquadrado (Qui2) demonstrou não haver diferenças estatisticamente significativas entre o
desfecho e a intensidade (p = 0,543), distribuição (p = 0,964) e localização celular (p =
0,849). Destaca-se, no entanto que dos 61,5% da amostra relacionada a intensidade; e
84,6% dos casos associado a distribuição; correspondentes aos pacientes que foram a
óbito, apresentaram marcação forte e difusa, respectivamente. Adicionalmente, dos 18
(31,6%) casos que exibiram marcação fraca, 13 (22,8%) obtiveram remissão da lesão
(Tabela 9).
Tabela 9: Relação entre as variáveis do HIF-1α e o desfecho da doença. Significância obtida pelo teste
Qui2. Natal, RN-2011.
Desfecho
Intensidade
Distribuição
Localização
Celular
Total
Qui2
p
0,369
0,543
0,002
0,964
0,328
0,849
Remissão
Óbito
Fraco
13 (29,5%)
5 (38,5%)
18 (31,6%)
Forte
31 (70,5%)
8 (61,5%)
39 (68,4%)
Focal
7 (15,9%)
2 (15,4%)
9 (15,8%)
Difusa
37 (84,1%)
11 (84,6%)
48 (84,2%)
Núcleo/Citoplasma
34 (77,3%)
10 (76,9%)
44 (72,2%)
Núcleo
9 (20,5%)
3 (23,1%)
12 (21,1%)
Citoplasma
1 (2,3%)
0 (0%)
1 (1,8%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Na tabela 10, verificou-se que a localização celular e intensidade de marcação
para o HIF-1α não exibiram correlação estatisticamente significativa com a metástase.
Contudo, observou-se que 72,7% dos casos que apresentaram metástase, demonstraram
marcação forte. Quanto a relação entre a distribuição de marcação e metástase, o teste
qui-quadrado (Qui2) demonstrou haver diferenças estatisticamente significativas entre
os grupos analisados (p = 0,040). Dos 75,8% da amostra que tinham metástase,
constatou-se a o predomínio da marcação difusa.
100
Tabela 10. Relação entre as variáveis do HIF-1α e a metástase. Significância obtida pelo teste Qui2.
Natal, RN-2011.
Metástase
Intensidade
Distribuição
Localização
Celular
Total
Qui2
p
9 (27,3%)
18 (31,6%)
0,673
0,412
15 (62,5%)
24 (72,7%)
39 (68,4%)
Focal
1 (4,2%)
8 (24,2%)
9 (15,78%)
4,212
0, 040
Difusa
23 (95,8%)
25 (75,8%)
48 (84,2%)
Núcleo/Citoplasma
21 (87,5%)
23 (69,7%)
44 (72,2%)
5,131
0,077
Núcleo
2 (8,3%)
10 (30,3%)
12 (21,1%)
Citoplasma
1 (4,2%)
0 (0%)
1 (1,8%)
Ausência
Presença
Fraco
9 (37,5%)
Forte
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Pode se observar na tabela 11 que a intensidade marcação para o HIF-1α exibiu
correlação estatisticamente significativa com o estadiamento clínico (p = 0,011). Dos
18 (31,6%) casos que exibiram marcação fraca, 13 (22,8%) estavam associados aos
estágios iniciais da doença (estágio I e II). Todavia, para as lesões que se encontravam
nos estágios avançados, houve o predomínio da marcação forte para o estágio III,
seguido do estágio IV. As demais variáveis, distribuição e localização celular, não
demonstraram significância estatística com o estadiamento clínico. A maior parte dos
espécimes que apresentava marcação difusa ou focal e que exibia localização no
núcleo/citoplasma ou núcleo encontrava-se nos estágios III e IV.
101
Tabela 11. Relação entre as variáveis do HIF-1α e o estadiamento clínico. Significância obtida pelo teste
Qui2. Natal, RN-2011.
Estadiamento Clínico
Intensidade
Distribuição
Localização
Celular
Total
Qui2
p
11,049
0,011
3,084
0,379
8,582
0,198
I
II
III
IV
Fraco
8
(57,1%)
5
(50%)
2
(9,1%)
3
(27,3%)
18
(31,6%)
Forte
6
(42,9%)
5
(50%)
20
(90,9%)
8
(72,7%)
39
(68,4%)
Focal
2
(14,3%)
0
(0%)
4
(18,2%)
3
(27,3%)
9
(15,8%)
Difusa
12
(85,7%)
10
(100%)
18
(81,8%)
8
(72,7%)
48
(84,2%)
Núcleo/Citoplasma
10
(71,4%)
9
(90%)
19
6
44
(86,4%) (54,5%) (72,2%)
Núcleo
3
(21,4%)
1
(10%)
3
5
12
(13,6%) (45,5%) (21,1%)
1
0
(0%)
Citoplasma
(7,1%)
0
(0%)
0
(0%)
1
(1,8%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Na análise da relação entre a gradação histológica e intensidade de marcação
para o HIF-1α, evidenciou-se uma maior freqüência de casos de alto (79,1%) e baixo
grau (64,3%) de malignidade exibindo marcação forte e fraca, respectivamente. Em
relação aos casos com marcação fraca (31,6%), constatou-se uma similaridade de
expressão entre os espécimes classificados de baixo e alto grau. O teste qui-quadrado
(Qui2) demonstrou haver diferenças estatisticamente significativas entre essas variáveis
analisadas (p = 0,002). As demais variáveis, distribuição e localização celular, não
demonstraram significância estatística com a gradação histológica. A maior parte dos
espécimes que apresentava marcação difusa ou focal e que exibia localização no
núcleo/citoplasma ou núcleo encontrava-se no alto grau de malignidade (Tabela 12).
102
Tabela 12. Relação entre as variáveis do HIF-1α e a gradação histológica de malignidade. Significância
obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.
Gradação Histológica
Total
Qui2
p
9 (20,9%)
18 (31,6%)
9,188
0,002
5 (35,7%)
34 (79,1%)
39 (68,4%)
Focal
1 (7,1%)
8 (18,6%)
9 (15,8%)
1,044
0,307
Difusa
13 (92,9%)
35 (81,4%)
48 (84,2%)
Núcleo/Citoplasma
11 (78,6%)
33 (76,7%)
44 (77,2%)
3,480
0,176
Núcleo
2 (14,3%)
10 (23,3%)
12 (21,1%)
Citoplasma
1 (7,1%)
0 (0%)
1 (1,8%)
Intensidade
Distribuição
Localização
Celular
Baixo Grau
Alto Grau
Fraco
9 (64,3%)
Forte
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
5.4.3 Análise Estatística da Expressão Imuno-histoquímica do GLUT-1
De acordo com a imunoexpressão do GLUT-1 nos casos analisados, o teste quiquadrado (Qui2) demonstrou não haver diferenças estatisticamente significativas entre o
desfecho e a intensidade (p = 0,468), bem como com a localização na ilha tumoral (p =
0,464 ). Destaca-se, no entanto que dos 84,6% da amostra relacionada à intensidade; e
61,5% dos casos associado à localização; correspondentes aos pacientes que foram a
óbito, exibiram imunomarcação forte e localização periférica nas ilhas tumorais,
respectivamente (Tabela 13).
Tabela 13. Relação entre as variáveis do GLUT-1 e o desfecho da doença. Significância obtida pelo teste
Qui2. Natal, RN-2011.
Desfecho
Intensidade
Localização
na Ilha
Tumoral
Total
Qui2
p
0,527
0,468
0,536
0,464
Remissão
Óbito
Fraco
11 (25%)
2 (15,4%)
13 (22,8%)
Forte
33 (75%)
11 (84,6%)
44 (77,2%)
Periferia
22 (50%)
8 (61,5%)
30 (52,6%)
Centro/Periferia
22 (50%)
5 (38,5%)
27 (47,4%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
103
Na tabela 14, verificou-se que a localização na ilha tumoral e intensidade de
marcação para o GLUT-1 não exibiram correlação estatisticamente significativa com a
metástase. Contudo, observou-se que 81,8% dos casos que apresentaram metástase,
demonstraram marcação forte. Constatou-se, ainda, que a maioria dos 52,6% da amostra
que exibiu marcação periférica, bem como dos 47,4% dos casos que apresentaram
localização centro/periferia, a presença e ausência de metástase eram de 36,8 e 26,3%,
respectivamente.
Tabela 14. Relação entre as variáveis do GLUT-1 e a metástase. Significância obtida pelo teste Qui2.
Natal, RN-2011.
Metástase
Intensidade
Localização na
Ilha Tumoral
Total
Qui2
p
6 (18,2%)
13 (22,8%)
0,952
0,329
17 (70,8%)
27 (81,8%)
44 (77,2%)
Periferia
9 (37,5%)
21 (63,6%)
30 (52,6%)
3,807
0,051
Centro/Periferia
15 (62,5%)
12 (36,4%)
27 (47,4%)
Ausência
Presença
Fraco
7 (29,2%)
Forte
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Pode se verificar na tabela 15 que a intensidade marcação para GLUT-1 exibiu
correlação estatisticamente significativa com o estadiamento clínico (p = 0,002). Dos
13 (22,8%) casos com marcação fraca, 11 (19,3%) estavam associados aos estágios
iniciais da doença (estágio I e II). Todavia, para as lesões que se encontravam nos
estágios avançados, houve o predomínio da marcação forte para o estágio III, seguido
do estágio IV. A variável localização da ilha tumoral, não apresentou significância
estatística com o estadiamento clínico (p = 0,144). No entanto, na maior parte dos
espécimes que se econtrava nos estágios III e IV, evidenciou-se a marcação periférica.
104
Tabela 15. Relação entre as variáveis do GLUT-1 e o estadiamento clínico. Significância obtida pelo
teste Qui2. Natal, RN-2011.
Estadiamento Clínico
Intensidade
Localização
na Ilha
Tumoral
Total
Qui2
p
15,270
0,002
5,418
0,144
I
II
III
IV
Fraco
8
(57,1%)
3
(30%)
2
(9,1%)
0
(0%)
13
(22,8%)
Forte
6
(42,9%)
7
(70%)
20
(90,9%)
11
(100%)
44
(77,2%)
Periferia
9
(64,3%)
2
(20%)
13
(59,1%)
6
(54,5%)
30
(52,6%)
Centro/Periferia
5
(35,7%)
8
(80%)
9
(40,9%)
5
(45,5%)
27
(47,4%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Na análise da relação entre a gradação histológica e intensidade de marcação
para GLUT-1, evidenciou-se uma maior freqüência de casos no alto (90,7%) e baixo
grau (64,3%) de malignidade exibindo marcação forte e fraca, respectivamente. No
tocante a localização de marcação na ilha tumoral, evidenciou-se predomínio da
marcação periférica na maioria dos espécimes de baixo grau (78,6%). Já na amostra de
alto grau, prevaleceu a localização centro/periferia (55,8%). De acordo com o teste quiquadrado (Qui2), a intensidade (p = 0,000) e a localização na ilha tumoral (p = 0,025)
demonstraram haver diferenças estatisticamente significativas com a gradação
histológica (Tabela 16).
Tabela 16. Relação entre as variáveis do GLUT-1 e a gradação histológica de malignidade. Significância
obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.
Gradação Histológica
Intensidade
Localização na
Ilha Tumoral
Total
Qui2
p
18,136
0,000
5,009
0,025
Baixo Grau
Alto Grau
Fraco
9 (64,3%)
4 (9,3%)
13 (22,8%)
Forte
5 (35,7%)
39 (90,7%)
44 (77,2%)
Periferia
11 (78,6%)
19 (44,2%)
30 (52,6%)
Centro/Periferia
3 (21,4%)
24 (55,8%)
27 (47,4%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
105
5.4.4 Análise Estatística da Expressão Imuno-histoquímica da CA-IX
De acordo com a imunoexpressão da CA-IX nos casos analisados, a intensidade
(p = 0,823), localização celular (p = 0,097 ) e localização na ilha tumoral (p = 0,179)
relação ao teste qui-quadrado (Qui2), não haver diferenças
demonstraram, com
estatisticamente significativas com o desfecho da doença. Verificou-se, ainda, que
apesar do valor de p < 0,05, o teste Qui2 não se aplicou na correlação entre desfecho e
distribuição de marcação. Destaca-se, no entanto que a maioria dos pacientes que foi a
óbito, 69,2% dos casos apresentaram expressão forte e distribuição difusa. Quanto à
localização
celular,
todos
os
casos
com
imunoexpressão
na
membrana/citoplasma/núcleo observou-se a remissão da lesão. Adicionalmente, dos 53
(93%) casos que tiveram marcação centro/periferia, 73,7% das lesões obtiveram um
desfecho favorável (Tabela 17).
Tabela 17. Relação entre as variáveis da CA-IX e o desfecho da doença. Significância obtida pelo teste
Qui2. Natal, RN-2011.
Desfecho
Qui2
p
0,050
0,823
a
0,007
2,750
0,097
1,807
0,179
Remissão
Óbito
Fraco
15 (34,1%)
4 (30,8%)
19 (33,3%)
Forte
29 (65,9%)
9 (69,2%)
38 (66,7%)
Focal
2 (4,5%)
4 (30,8%)
6 (10,5%)
Difusa
42 (95,5%)
9 (69,2%)
51 (89,5%)
Membrana/Citoplasma/Núcleo
8 (18,2%)
0 (0%)
8 (14%)
Membrana/Citoplasma
36 (81,8%)
13 (100%)
49 (86%)
Periferia
2 (4,5%)
2 (15,4%)
4 (7%)
Centro/Periferia
42 (95,5%)
11 (84,6%)
53 (93%)
Intensidade
Distribuição
Localização
celular
Total
Localização
na Ilha
Tumoral
a.Teste Qui2 não se aplica.
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
7,327
106
Na tabela 18 revela que a intensidade (p = 0,255), distribuição (p = 0,182),
localização celular (p = 0,776) e localização de marcação na ilha tumoral (p = 0,472)
para a CA-IX não exibiram correlação estatisticamente significativa com a metástase. A
maior parte da amostra que apresentava ausência ou presença de metástase exibia
marcação difusa, localização na membrana/citoplasma e com predomínio da
imunoexpressão no centro/periferia. Contudo, observou-se que 72,7% dos casos que
apresentaram metástase, demonstraram marcação forte. Com relação aos casos de
marcação fraca (33,3%), houve um discreto predomínio da ausência de metástase.
Tabela 18. Relação entre as variáveis da CA-IX e a metástase. Significância obtida pelo teste Qui2. Natal,
RN-2011.
Metástase
Intensidade
Distribuição
Localização
celular
Localização
na Ilha
Tumoral
Total
Qui2
p
9 (27,3%)
19 (33,3%)
1,295
0,255
14 (58,3%)
24 (72,7%)
38 (66,7%)
Focal
1 (4,2%)
5 (15,2%)
6 (10,5%)
1,780
0,182
Difusa
23 (95,8%)
28 (84,8%)
51 (89,5%)
Membrana/Citoplasma/Núcleo
3 (12,5%)
5 (15,2%)
8 (14%)
0,081
0,776
Membrana/Citoplasma
21 (87,5%)
28 (84,8%)
49 (86%)
Periferia
1 (4,2%)
3 (9,1%)
4 (7%)
0,516
0,472
Centro/Periferia
23 (95,8%)
30 (90,9%)
53 (93%)
Ausência
Presença
Fraco
10 (42,7%)
Forte
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
107
Pode-se observar na tabela 19 que as variáveis analisadas, de acordo com a
imunoexpressão para a CA-IX, não apresentaram correlação estatisticamente
significativa com o estadiamento clínico. No entanto, dos 19 (33,3%) casos com
marcação fraca, 10 (17,52%) estavam associados aos estágios iniciais da doença
(estágio I e II). Para as lesões que se encontravam nos estágios avançados, houve o
predomínio da marcação forte para o estágio III, seguido do estágio IV. A maior parte
dos espécimes que apresentava marcação difusa ou focal, que exibia localização na
membrana/citoplasma/núcleo ou membrana/citoplasma e com predomínio de marcação
centro/periferia encontrava-se nos estágios III e IV. Ressalta-se, ainda que em todos os
casos que se encontravam nos estágios I e II demonstraram imunoexpressão no
centro/periferia.
Tabela 19. Relação entre as variáveis da CA-IX e o estadiamento clínico. Significância obtida pelo teste
Qui2. Natal, RN-2011.
Estadiamento Clínico
Intensidade
Distribuição
Localização
Celular
Localização
na Ilha
Tumoral
Total
Qui2
p
2,959
0,398
2,740
0,434
2,889
0,409
3,361
0,339
I
II
III
IV
Fraco
7
(50%)
3
(30%)
7
(31,8%)
2
(18,2%)
19
(33,3%)
Forte
7
(50%)
7
(50%)
15
(62,8%)
9
(81,8%)
38
(66,7%)
Focal
1
(7,1%)
0
(0%)
4
(18,2%)
1
(9,1%)
6
(10,5%)
Difusa
13
(92,9%)
10
(100%)
18
(81,8%)
10
(90,9%)
51
(89,5%)
Membrana/Citoplasma/Núcleo
1
(7,1%)
2
(20%)
2
(9,1%)
3
(27,3%)
8
(14%)
Membrana/Citoplasma
13
(92,9%)
8
(80%)
20
(90,9%)
8
(72,7%)
49
(86%)
Periferia
0
(0%)
0
(0%)
3
(13,6%)
1
(9,1%)
4
(7%)
Centro/Periferia
14
(100%)
10
(100%)
19
(86,4%)
10
(90,9%)
53
(93%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
108
Verifica-se na tabela 20 que as variáveis analisadas; distribuição, localização
celular e localização na ilha tumoral; de acordo com a imunoexpressão para a CA-IX,
não apresentaram correlação estatisticamente significativa com a gradação histológica.
No entanto, na análise da relação entre a gradação histológica e intensidade de
marcação, evidenciou-se uma maior freqüência de casos de alto grau (76,7%) e de baixo
grau (64,3%) de malignidade exibindo marcação forte e fraca, respectivamente. O teste
qui-quadrado (Qui2) demonstrou haver diferenças estatisticamente significativas entre
essas variáveis analisadas (p = 0,005). Ademais, a maior parte dos espécimes que
apresentava marcação difusa ou focal, que exibia localização na membrana/citoplasma e
com predomínio de marcação na periferia ou centro/periferia estava classificada em alto
grau de malignidade.
Tabela 20. Relação entre as variáveis da CA-IX e a gradação histológica de malignidade. Significância
obtida pelo teste Qui2. Natal, RN-2011.
Gradação Histológica
Intensidade
Distribuição
Localização
celular
Localização
na Ilha
Tumoral
Total
Qui2
p
8,001
0,005
0,226
0,635
3,030
0,082
0,000
0,983
Baixo Grau
Alto Grau
Fraco
9 (64,3%)
10 (23,3%)
19 (33,3%)
Forte
5 (35,7%)
33 (76,7%)
38 (66,7%)
Focal
1 (7,1%)
5 (11,6%)
6 (10,5%)
Difusa
13 (92,9%)
38 (88,4%)
51 (89,5%)
Membrana/Citoplasma/Núcleo
0 (0%)
8 (18,6%)
8 (14%)
Membrana/Citoplasma
14 (100%)
35 (81,4%)
49 (86%)
Periferia
1 (7,1%)
3 (7%)
4 (7%)
Centro/Periferia
13 (92,9%)
40 (93%)
53 (93%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
109
Figura 6. CEL de baixo grau de malignidade exibindo ninhos e cordões tumorais com pérolas
de ceratina permeados por intenso infiltrado inflamatório mononuclear (H/E-200X).
Figura 7. CEL de baixo grau de malignidade evidenciando ninhos tumorais com proeminente
ceratinização e com pouco pleomorfismo celular e nuclear (H/E-400X).
110
Figura 8. CEL de alto grau de malignidade exibindo cordões e pequenos grupos de células
malignas invadindo músculo e vasos sanguíneos (H/E-200X).
Figura 9. CEL de alto grau de malignidade exibindo células malignas com demarcado
pleomorfismo celular e nuclear, nucléolos volumosos e hipercromáticos (H/E-400X).
111
Figura 10. Expressão imuno-histoquímica do HIF-1α nas células malignas e no estroma do
CEL (Advance HRP-200X).
Figura 11. Intensa expressão imuno-histoquímica do HIF-1α no núcleo e citoplasma das células
neoplásicas do CEL (Advance HRP-400X).
112
Figura 12. Expressão imuno-histoquímica do GLUT-1 predominantemente na periferia da ilhas
tumorais do CEL (Advance HRP-200X).
Figura 13. Intensa expressão imuno-histoquímica do GLUT-1 na membrana e citoplasma das
células neoplásicas do CEL (Advance HRP-400X).
113
Figura 14. Expressão imuno-histoquímica da CA-IX nas células neoplásicas e no estroma do
CEL (LSAB-200X).
Figura 15. Intensa expressão imuno-histoquímica da CA-IX na membrana e citoplasma das
células neoplásicas do CEL (LSAB-400X).
114
“Sonhar é de graça, mas realizá-lo custa muito.”
(Roberto Shinyashiki)
DISCUSSÃO
115
6 DISCUSSÃO
O Ministério da Saúde, por meio do Instituto Nacional de Câncer (INCA),
estima que no biênio 2010/2011 ocorram 489.270 novos casos de câncer no Brasil. No
panorama nacional, essa doença se apresenta como um grave desafio para a saúde
pública, em virtude da sua elevada incidência, que se contrapõe às possibilidades de
prevenção (INCA, 2010).
Dentre todos os cânceres que incidem na região de cabeça e pescoço, 40%
ocorrem na cavidade oral. Dados do INCA demonstraram que o câncer oral ocupa o
quinto lugar de incidência entre todos os tipos de câncer nos homens e o sétimo entre as
mulheres em um total de 14.120 novos casos. Vale salientar que essa relação de
incidência foi mantida, apesar das discretas reduções, ao se comparar as estimativas do
INCA de 2008 e 2010, revelando uma diminuição de taxa bruta de 11,004 para 10,641
entre homens e de 3,884 para 3,761 entre as mulheres (INCA, 2010).
Ademais, dentre todas as malignidades capazes de acometer a mucosa oral, o
CEO é, inquestionavelmente, a de maior relevância em função de sua alta incidência,
representando cerca de 90 a 95% dos tumores malignos diagnosticados nessa localidade,
ocorrendo principalmente em língua, na qual apresenta um alto potencial de invasão e
grande probabilidade de desenvolver metástase para os linfonodos regionais (ALRAWI; TALABANI, 2007; GARAVELLO et al., 2008; RIBEIRO et al., 2009).
No presente estudo, frente aos dados clínicos referentes à caracterização da
amostra, observou-se que a maioria dos indivíduos (70,2%) acometidos pelo CEL eram
do sexo masculino, sendo a faixa etária mais freqüente entre 61 a 70 anos, perfazendo
35,1% da amostra (Tabela 1), corroborando os resultados encontrados por Amorim,
Amorim e Freitas (2002), Hora et al. (2003), Dedivitis et al. (2004), Tromp et al.
(2005), Ariyoshi et al. (2008) e Santos et al. (2009), estando assim dentro da média
mundial para ocorrência do CEO (NEVILLE et al., 2009).
Adicionalmente, evidenciou-se, ainda na amostra analisada, que a relação entre
homem:mulher foi de 2,3:1 (Tabela 1), encontrando-se em consonância com perfil
epidemiológico atual do CEO, que independente de sua localização anatômica, tem
apresentado um significativa diminuição desta relação, devido ao maior número de
casos afetando o sexo feminino (KADEMANI, 2005; SCULLY; BAGAN, 2009).
116
Diante disso, afirma-se que é evidente o aumento da proporção de mulheres;
especialmente as mais jovens, acometidas pelo CEO, na maioria dos casos localizados
na língua, o que pode ser explicado pelas modificações dos hábitos culturais e sociais
em diversas regiões, aproximando os comportamentos masculino e feminino, fazendo
com que certas práticas consideradas masculinas, provavelmente relacionadas à
etiologia da doença, tenham sido adotadas pelas mulheres (GARAVELLO et al., 2009).
Entretanto, neste estudo a ocorrência do CEL em indivíduos jovens, abaixo dos
40 anos de idade foi menos freqüente (5,3%) (Tabela 1), apesar de ter sido relatado por
O’Regan et al. (2006) e Ribeiro et al. (2009) um aumento da sua incidência em adultos
jovens. Sherin et al. (2008) analisando 606 casos de CEO no período de 2002 a 2007,
observaram que a cada ano o número de casos em pacientes com idade inferior a 40
anos aumentava, chegando a somar 44 (7,5%) casos do total da amostra estudada. Em
face destes resultados, acredita-se que a incidência em pacientes mais jovens possa ter
relação com o aumento de consumo de derivados do tabaco e álcool etílico ou ao uso de
drogas, infecções virais e dieta (KADEMANI, 2005; SCULLY; BAGAN, 2009).
Com relação à etnia, no estudo realizado por Ribeiro et al. (2009) de 46 casos de
CEO, houve predomínio de pacientes da raça melanoderma (78%), seguido pela raça
branca (22%). Em nosso estudo, contrapondo a essa pesquisa, a raça leucoderma foi à
predominante, perfazendo 56,2% dos casos, seguido pela melanoderma (24,5%) e
feoderma (19,3%) (Tabela 1).
De forma consensual, Amorim Filho et al. (2003)
descrevem que a raça branca foi a mais prevalente com 81,7% dos casos de CEL,
acompanhado pela raça negra (17,6%) e amarela (0,7%). Entretanto, esses achados não
corroboram em parte com os resultados descritos por Alves et al. (2011), onde
observou-se a prevalência da raça melanoderma (41,5%), com menores freqüências para
os leucodermas (35,4%) e feodermas (23,1%). Sugere-se que estas discrepâncias de
resultados podem estar associadas aos parâmetros de inclusão dos indivíduos em cada
uma das raças, além de fatores como localização geográfica, colonização, atividades
econômicas e culturais (SOARES, 2005; ALVES et al., 2011).
No tocante aos aspectos etiopatogênicos, o CEO baseia-se em três principais
fatores: o estilo de vida, fatores ambientais e a susceptibilidade individual. A
carcinogênese oral é um evento dependente de vários fatores extrínsecos e intrínsecos
onde uma série de alterações no genoma de uma única célula dos tecidos orais,
117
decorrente, principalmente, de injúrias provocadas por carcinógenos presente no tabaco,
associado a outros fatores como o álcool, desnutrição, má higiene oral e fatores
biológicos, tais como infecções virais e bacterianas, resulta no descontrole do
crescimento e diferenciação dessa célula alterada que, conseqüentemente, prolifera e dá
origem a uma massa tumoral contendo ou não clones aptos ao estabelecimento de
metástases (MASSANO et al., 2006; SCULLY; BAGAN, 2009; NEVILLE et al.,
2009). Neste estudo, dos 57 casos de CEL analisados, observou-se que 24 pacientes
(42,1%) eram tabagistas e etilistas e 18 pacientes (31,6%) eram tabagistas (Tabela 1).
Confirmando, assim, a importância desses fatores na gênese dessa neoplasia.
Sabe-se que em todo mundo, o consumo de tabaco, nas suas variadas formas de
utilização, é considerado o principal fator de risco para o desenvolvimento do CEO,
estando o álcool nesse contexto, potencializando ou atuando de forma sinérgica com o
fumo (KUMAR; ABBAS; FASTO, 2008; ALQUATI, 2011). Assim, tal afirmação
poderia elucidar, no presente trabalho, a maior prevalência de pacientes com CEL
descritos na categoria tabagista/etilista. Do mesmo modo, Amorim Filho et al. (2004),
analisando 290 casos de CEL, verificaram que a maioria dos indivíduos (83,8%)
fumava e bebia, havendo poucos casos em que estes hábitos estavam ausentes, estando
em conformidade com os resultados da nossa amostra (Tabela 1).
Diversos trabalhos têm afirmado haver uma relação entre localização anatômica
e o prognóstico dos pacientes com CEO (NITHYA et al., 2003; NEVILLE et al., 2009;
WANG et al., 2009; ALVES et al., 2011). Segundo estas pesquisas, os CEL exibem
algumas peculiaridades, sendo comumente lesões mais agressivas, infiltrativas, menos
diferenciadas, com elevado potencial metastático e prognóstico desfavorável, enquanto
as lesões em outras localizações, como o lábio, apresentam melhor prognóstico,
diferenciação histopatológica e baixa freqüência de disseminação metastática
(VARTANIAN et al., 2004; MONTORO et al., 2008; RUSTHOVEN et al., 2010).
Diante disso, em relação à amostra analisada, o perfil dos pacientes com CEL é coerente
com os descritos na literatura (BARROS, 2006; RUSTHOVEN et al., 2010), estando à
maioria inserida nos estágios mais avançados da doença; III e IV, correspondendo
juntos a 57,9% dos casos, acompanhados de uma maior incidência de metástase. No
entanto, em 77,2% dos casos, constatou-se a remissão da lesão (Tabela 2).
118
Alguns estudos apontam fatores que influenciam no prognóstico e sobrevida dos
pacientes portadores do CEO, destacando-se: tamanho e localização do tumor primário,
comprometimento de linfonodos regionais, presença de metástase à distância e o grau
histológico de malignidade (MASSANO et al., 2006). Destes, Okada et al. (2003)
consideraram que a presença de metástase em linfonodos cervicais é o melhor indicador
de prognóstico em pacientes portadores dessa neoplasia.
A utilização dos SGHM do CEO, segundo Amorim Filho et al. (2004), não
possui aceitação consensual. Em face disso, atualmente, o estadiamento tumoral por
meio do sistema TNM tem sido considerado o método mais relevante para a predição do
prognóstico dos pacientes com CEO. O TNM é um sistema de estadiamento anatômico,
proposto pela União Internacional Contra o Cancer, que descreve a extensão local do
tumor primário, bem como o envolvimento de linfonodos regionais e sítios distantes.
Após a quantificação desses parâmetros anatomopatológicos, os tumores são
classificados na literatura em estágios que variam de I a IV e já é bem estabelecido na
literatura que os CE de cabeça e pescoço classificados no estágio I exibem melhor
prognóstico que aqueles no estágio IV (CARINCI, 1998; ARAÚJO JÚNIOR; COSTA;
RAMOS, 2006; NEVILLE et al., 2009; ALVES et al., 2011; LIU et al., 2011).
Neste estudo, realizando a análise estatística através do teste Qui2, entre o
desfecho e metástase, verificou-se haver uma correlação estatisticamente significativa
entre essas variáveis, onde os 24 casos (100%) com ausência de metástase obtiveram
remissão da doença. Todavia, dos 33 casos que apresentaram metástase, menos de 40%
dos pacientes foram a óbito (Tabela 4), estando assim os resultados consoantes com as
afirmações de Dantas et al. (2003), Araújo Júnior, Costa e Ramos (2006), Choi et al.
(2006), Bell et al. (2007) e Alves et al. (2011) de que o sistema TNM é eficaz como
parâmetro de prognóstico.
Adicionalmente, corroborando os trabalhos supracitados e levando em
consideração a relação entre metástase e estadiamento clínico da doença, verificou-se,
no estudo ora realizado, que nos estágios mais avançados (III e IV) havia uma maior
probabilidade estatisticamente significativa no desenvolvimento de metástase (Tabela
5). De forma consensual, Araújo et al. (2008), investigando a existência de correlação
entre localização anatômica, sistema TNM e prognóstico de CEO, evidenciaram a
119
presença de associação significativa entre os fatores avaliados, em que os CEL nos
estágios III e IV apresentavam piores prognóstico.
Portanto, notou-se na amostra analisada que a metástase exibiu correlação
estatisticamente significativa, de acordo com o teste Qui2, com o desfecho da doença (p
= 0,000) e estadiamento clínico (p = 0,001), constituindo, dessa forma, como um bom
indicador de progressão tumoral e conseqüentemente, influenciando diretamente no
controle regional da doença e na taxa de sobrevida (BETTENDOR; PIFFKÒ;
BÀNKAFALVI, 2004; BARROS, 2006).
Diante dessas considerações, embora o estadiamento clínico TNM seja
considerado um fator associado à predição de prognóstico (STURGIS et al., 2005;
BELL et al., 2007; GARAVELLO et al., 2008), no presente trabalho não foi possível
demonstrar uma relação estatisticamente significativa entre estadiamento clínico e
desfecho da doença, apesar de ter sido evidenciado que 100% e 85,7% dos casos que se
encontravam no estágio II e I, respectivamente, tiveram a remissão da lesão, tendo ainda
o predomínio do número de óbitos no estágio IV (Tabela 3).
Entretanto, Araújo Júnior, Costa e Ramos (2006) observaram em 130 casos de
CE uma relação estatisticamente positiva entre o sistema TNM e a localização do tumor
com o prognóstico, sendo os estágios III e IV relacionados com um maior índice de
óbito e a língua, sítio mais comum, relacionada aos estágios mais avançados da doença.
No que concerne aos achados morfológicos verificados nos casos de CEL
analisados neste estudo, todos estão alicerçados e concordantes com as citações de
Bryne et al. (1998), Noguchi et al. (2002), Dantas et al. (2003), Woolgar (2006), Bell et
al. (2007) e Neville et al. (2009), onde verificaram diversas alterações morfológicas,
dependendo do grau de diferenciação celular, como pleomorfismo celular e nuclear,
hipercromatismo, perda da relação núcleo-citoplasma, citoplasma eosinofílico
abundante, mitoses atípicas, nucléolos volumosos e formação de pérolas de ceratina. De
modo adicional, graus variados de infiltrado inflamatório predominantemente
mononuclear em proximidade ao epitélio lesional e áreas focais de necrose e ulceração
também foram observados (Figuras 6-9).
Nesse contexto, apesar de existirem vários parâmetros clínicos relacionados à
agressividade do CEO, como citados anteriormente, muitos aspectos ainda são
120
desconhecidos no tocante a progressão e comportamento clínico desta neoplasia,
principalmente com relação às características morfológicas, visto que este aspecto
configura um ponto controverso na literatura (LIM et al., 2004; COSTA; ARAÚJO
JÚNIOR; RAMOS, 2005; BELL et al., 2007; SILVEIRA et al., 2007). Kurokawa et al.
(2005) ressaltam que as características histopatológicas das neoplasias são importantes
porque refletem a relação imunológica entre o tumor e o hospedeiro. Atualmente
encontram-se na literatura diversos SGHM para os CEO como citados nessa pesquisa,
objetivando fornecer subsídios morfológicos para uma interpretação quanto à
agressividade tumoral.
Barros (2006) e Alves et al. (2011) relataram que por mais que se tente tornar
mais objetivo um SGHM, através da utilização de escores fundamentados em dados
matemáticos, a análise dos parâmetros morfológicos se baseia na subjetividade dos
achados, o que pode levar a resultados conflitantes. Diante destes fatos, pode-se
constatar que a utilização de sistemas de gradação histológica representa uma
informação adicional para o estabelecimento do prognóstico do CEO.
Assim, dentre todos os SGHM, pode-se destacar o preconizado por Bryne em
1998, onde segundo a autora, os principais eventos moleculares relacionados à
disseminação tumoral como alterações das moléculas de adesão, secreção de enzimas
proteolíticas, aumento da proliferação celular e iniciação da angiogênese ocorrem na
interface tumor-hospedeiro (front de invasão). Conseqüentemente, a autora propõe um
sistema de gradação restringindo a avaliação morfológica ao front de invasão. Este
método, na verdade, representa uma adaptação de um sistema proposto por Bryne e sua
equipe (1989), retirando-se nesta nova gradação o critério número de mitoses e
permanecendo o grau de ceratinização, pleomorfismo, padrão de invasão tumoral e
reação inflamatória.
Ademais, Bryne et al. (1998) e Noguchi et al. (2002) reportam que as células
do front de invasão são menos diferenciadas e apresentam elevado grau de dissociação
celular quando comparadas com outras áreas do tumor. Infere-se, em vista disso, que o
front de invasão consiste um dos caminhos para melhor entender o comportamento
biológico do tumor, fornecendo informações adicionais na escolha das estratégias
terapêuticas para pacientes com CEO, visto que o instrumento para melhor entender o
121
comportamento invasivo e metastático das células neoplásicas reside na análise das
margens invasivas.
Adotou-se neste trabalho o SGHM preconizado por Bryne (1998), por ser um
método rápido, de fácil realização e valor prognóstico demonstrados em pesquisas
anteriores (BRYNE, 1998; BÀNKFALVI; PIFFKÓ, 2000; BARROS, 2006; ALVES et
al., 2011), onde para classificação das lesões com relação o grau de malignidade, optouse pela modificação proposta por Miranda (2002).
Assim, na presente pesquisa, observou-se que a maioria dos casos foi definida
como de alto grau (75,4%), não apresentando associação estatística com o desfecho e
metástase, apesar de verificar descritivamente que a maioria dos casos de baixo e alto
grau estava correlacionada com a remissão e a presença de metástase, respectivamente
(Tabelas 6 e 8), estando em consonância em parte com a pesquisa desenvolvida por
Alves et al (2011), onde verificaram uma inexistência entre o SGHM e o desfecho da
doença.
A despeito do tipo de SGHM utilizado, nossos resultados corroboram em parte
os de Dantas et al. (2003) e Silveira et al. (2007) que também não evidenciaram
associação entre os respectivos sistemas de gradação proposto por Anneroth, Batsakis e
Luna (1986) e Bryne (1998) e o comportamento clínico dos CEL, sendo verificado que
o estadiamento clínico TNM apresentou-se como melhor indicador de prognóstico para
esta neoplasia.
Em contrapartida, na análise da relação entre a gradação histológica e o
estadiamento clínico, evidenciou-se estatisticamente (p = 0,006) uma maior freqüência
de casos de baixo e alto grau de malignidade nos estágios iniciais (I e II) e avançados
(III e IV), respectivamente (Tabela 7). Tais considerações são condizentes com os
estudos conduzidos por Costa, Araújo Junior e Ramos (2005) e Kurokawa et al. (2005),
onde reportam que a gradação histológica no front de invasão tem um valor prognóstico
para o CEO, embora outros parâmetros relacionados ao sistema TNM possam exibir
resultados estatisticamente mais significativos.
Constata-se, portanto, no corrente estudo, que a metástase constituiu-se como
um indicador do comportamento biológico nos casos de CEL, visto que esta variável
relacionou-se diretamente com o desfecho da doença (óbito/remissão) e com o
122
estadiamento clínico, enquanto que o SGHM se correlacionou estatisticamente apenas
com o estadiamento clínico.
Sendo assim, de posse desses resultados quanto aos parâmetros clínicohistopatológicos, acreditamos que os sistemas TNM associado ao SGHM também
podem ser uma ferramenta preditiva para informação dos altos índices de recorrência e
baixa sobrevida e tempo livre de doença do CEL, contribuindo sobremaneira com o
entendimento do comportamento clínico dessa neoplasia.
Contudo, diante do exposto, apesar da grande aceitação mundial, o sistema
TNM, bem como o SGHM não fornecem informações biológicas precisas em relação
aos componentes celulares das neoplasias malignas. Assim, visando um melhor
conhecimento das características biológicas das células malignas que compõem o CEO,
vários trabalhos se baseiam nas técnicas de imuno-histoquímica e de biologia molecular
para identificar marcadores biológicos do comportamento tumoral e, por conseguinte,
predizerem o prognóstico dos pacientes desde o exame anatomopatológico inicial
(WANG et al., 2006; LE et al., 2007).
A respeito desse contexto, a hipóxia tumoral é a uma das caracteristicas das
neoplasias malignas que se encontra associada a resistência às modalidades terapêuticas
como a quimioterapia e a radioterapia, devido a uma série de mudanças genéticas
adaptativas que ocorrem no ambiente hipóxico que visam favorecer o mecanismo de
crescimento e proliferação celular, resultando em células com alto poder de invasão e
metástase, com um fenótipo mais agressivo e indivíduos com pior prognóstico (CHOI et
al., 2008; TANAKA et al., 2008).
Segundo a literatura, o CEO é basicamente caracterizado por um desvio nos
mecanismos de controle que regem a divisão e a diferenciação celular. As células que
sofrem transformação neoplásica dividem-se descontroladamente e formam tumores que
podem comprimir, ou invadir, estruturas normais adjacentes. Embora o crescimento
tumoral seja acompanhado por uma ativa vascularização, comumente a divisão celular
ocorre mais rapidamente do que a angiogênese, de modo que o fornecimento sangüíneo
em grandes tumores sólidos se torna desestruturado e ineficiente. Grandes distâncias
intercapilares, variação de fluxo e obstrução ou compressão de vasos sanguíneos devido
ao crescimento tumoral contribuem para o surgimento de regiões pouco oxigenadas.
123
Deste modo, tem-se que a parte externa do tumor é suficientemente vascularizada,
passando por uma região de hipóxia, com uma pressão parcial de O2 entre 5-10 mmHg,
e atingindo por conseguinte uma condição de anóxia e/ou necrótica no seu interior
(FERREIRA et al., 2007; SMITH; ROBBINS; RATCLIFFE, 2008; UEHARA, et al.,
2009; LIANG et al., 2011).
Adicionalmente, as células expostas a essas condições limitantes de O2,
normalmente ajustam seus níveis de expressão gênica. Essas mudanças permitem que as
células se adaptem e sobrevivam sob condições de déficit de O2 e energia. Quando
mecanismos protetores estão ausentes, o dano à célula e subseqüente morte celular
podem ocorrer. Assim, muitos estudos têm demonstrado a participação do HIF-1,
regulador central da resposta à mudanças na concentração de O2, em processos
fisiológicos, na progressão de tumores e outros processos patológicos, através do
controle transcricional de grupos de genes tais como aqueles que codificam para fatores
angiogênicos, transportadores de glicose (GLUT-1), reguladores do pH (CA-IX),
enzimas glicolíticas e fatores de sobrevivência celular (SEMENZA, 2006; SMITH;
ROBBINS; RATCLIFFE, 2008).
Por meio disso, através de ensaios prévios vêm se sugerindo a utilização de
marcadores de hipóxia para o entendimento da instabilidade genética, invasibilidade
tumoral e metástase de diversas neoplasias que acometem a região de cabeça e pescoço,
principalmente o CEL, o qual apresenta uma maior propensão para metástase regional
cervical (ROH et al., 2008; TANAKA et al., 2008; OHBA et al., 2010).
Portanto, considerando-se a necessidade atual do descobrimento de novos
parâmetros clínicos e patológicos e/ou ferramentas diagnósticas que possam agilizar o
reconhecimento precoce do CEO e melhorar o prognóstico dos pacientes, na presente
pesquisa também se avaliou a expressão imuno-histoquímica do HIF-1α, GLUT-1 e
CA-IX em 57 casos de CEL, procurando correlacionar à intensidade e a localização de
marcação e os tipos celulares marcados com o grau de diferenciação das células
tumorais, desfecho da doença, metástase e estadiamento clínico.
Os resultados encontrados nesta pesquisa em relação à expressão do HIF-1α
demonstraram uma correlação estatisticamente significativa entre a intensidade de
marcação nas células neoplásicas e o estadiamento clínico (p = 0,011). Dos 18 (31,6%)
124
casos que exibiram marcação fraca, 13 (22,8%) estavam associados aos estágios iniciais
da doença (estágio I e II). Todavia, para as lesões que se encontravam nos estágios
avançados, houve o predomínio da marcação forte para o estágio III, seguido do estágio
IV. Dos 39 casos (68,4%) que apresentaram marcação forte, 28 (49,1%) encontravam-se
nos estágios III e IV (Tabela 11). Em conjunto tais achados estão fundamentados nas
considerações descritas por Sasabe et al. (2005), Lin et al. (2008), Uehara et al. (2009),
Zhu et al. (2010) e Liang et al. (2011). Os autores ressaltam que a superexpressão do
HIF-1α nos CEO em estágios tumorais mais avançados da doença estaria associada a
um pior prognóstico, menor taxa de sobrevida e a resistência aos tratamentos
antineoplásicos.
Em vista disso, com base nos achados supracitados, acredita-se que a expressão
do HIF-1α exerce um papel importante na carcinogênese oral, podendo ser utilizado
como um recurso adjuvante na predição da taxa de sobrevida e da progressão tumoral
(BEASLEY et al., 2001; KYZAS et al., 2005; UEHARA et al., 2009; OGANE et al.,
2010).
Em consonância com assertiva anterior, Chen et al. (2009); analisando CE
esofágico, e Burrows et al. (2010); avaliando casos de carcinoma de tireóide,
evidenciaram uma forte associação da expressão do HIF-1α com o fenótipo da
agressividade e resistência terapêutica, assim como uma correlação com a profundidade
da invasão, metástase linfonodal e estadiamento clínico. Porém, verificou-se, no estudo
ora realizado, que a intensidade de marcação não demonstrou correlação
estatisticamente significativa com a metástase, apesar dos 72,7% dos casos com
metástase, evidenciarem marcação forte (Tabela 10).
Entretanto, Kyzas et al. (2005) demonstraram que a expressão do HIF-1α não foi
significativamente correlacionada com a taxa de sobrevida, enquanto a expressão do
VEGF esteve correlacionada ao pior prognóstico. Todavia, os autores suportam que a
angiogênese tumoral poderia estar relacionada, mas não estritamente dependente do
ambiente hipóxico tumoral, uma vez que essa hipóxia micro ambiental poderia induzir a
expressão de componentes chaves das cascatas de sinalização angiogênica e apoptótica,
da via glicolítica e várias proteínas do controle do ciclo celular (SEMENZA, 2003;
SEMENZA, 2006; FERREIRA et al., 2007).
125
Contrariando aos resultados da presente pesquisa, Fillies et al. (2005), com 85
casos de CE de assoalho oral, observaram que a superexpressão do HIF-1α estava
correlacionada significantemente com a taxa sobrevida de 5 anos livre de doença, sendo
assim, um fator favorável para prognóstico em pacientes com o estadiamento clínico
T1/T2.
Os
autores
especulam
que
a expressão
do
HIF-1α não
estaria
diretamente relacionada à hipóxia tumoral e, por conseguinte com agressividade
tumoral, mas devido às diversas alterações em oncogenes ou genes supressores
de tumor. Assinalam, ainda que a aplicação de radioterapia pós-operatória causaria
alterações celulares significativa, explicando, pelo menos em parte, seus resultados
divergentes.
Considerando a relação entre intensidade e desfecho da doença para a
imunoexpressão do HIF-1α, verificou-se estatisticamente que os resultados do corrente
estudo não são consoantes com os achados de Erket et al. (2010a) em CEO, onde
identificaram que o risco de óbitos foi 3,5 vezes maior nas lesões fortemente
imunomarcadas (p = 0,016) por essa molécula. Destaca-se, no entanto, de forma
descritiva, que dos 61,5% dos pacientes que foram a óbito, apresentaram marcação forte
(Tabela 9).
No que concerne na análise da relação entre a gradação histológica e intensidade
de marcação para o HIF-1α, evidenciou-se estatisticamente na presente pesquisa uma
maior freqüência de casos de alto e baixo grau de malignidade exibindo marcação forte
e fraca, respectivamente (Tabela 12). Tais achados estão em conformidade com os
resultados encontrados por Burrows et al. (2010) em carcinomas de tireóide, e Zhu et al.
(2010) em CEO, verificando que as lesões mais desdiferenciadas estavam
correlacionadas com a pior taxa de sobrevida. Resultados semelhantes, também foram
encontrados por Lin et al. (2008), relatando que a imunoexpressão do HIF-1α era mais
fortemente evidenciada nas neoplasias orais, principalmente próximo a regiões
necróticas, áreas de ceratinização e de infiltração tumoral quando comparadas com a
mucosa oral normal e displasias epiteliais.
Quanto a localização celular, verificou-se que a expressão do HIF-1α foi
predominantemente no núcleo/citoplasma, seguido do núcleo e, com um único caso, no
citoplasma, corroborando com os achados de Uehara et al. (2009) e Liang et al. (2011),
onde encontraram uma maior expressão no núcleo e/ou citoplasma em CEO. Já Beasley
126
et al. (2001), Fillies et al. (2005), Lin et al. (2008) e Zhu et al. (2010) verificaram uma
predominância da expressão nuclear. Entretanto, Chen et al. (2009); em carcinoma
esofágico, evidenciaram uma maior expressão no citoplasma das células neoplásicas.
Diante do exposto, pode-se inferir que a expressão nuclear da tal molécula
constatada na maioria dos estudos está alicerçada pelo fato que o ambiente hipóxico
tumoral acarreta, na maioria das vezes, no translocamento do HIF-1α para o núcleo
formando um heterodímero com o ARNT, onde se ligam ao motivo HRE dos genes
alvos, os quais estão envolvidos, por exemplo, com o suprimento de O2, metabolismo
celular, crescimento celular e apoptose (SEMENZA, 2003; WENGER et al., 2005;
SEMENZA, 2006; FERREIRA et al., 2007). Ademais, reporta-se na referente pesquisa
que as variáveis analisadas (desfecho, metástase, estadiamento clínico e histológico) não
exibiram correlação estatisticamente significativa com a localização celular (Tabelas 912).
Corroborando com os achados de Fillies et al. (2005) e Lin et al. (2008) a
maioria da amostra do estudo em questão expressou marcação difusa para o HIF-1α,
estando a marcação focal em áreas circunvizinhas necróticas. Verificou-se ainda, uma
relação estatisticamente significativa com a metástase. Dos 84,2% da amostra que
tinham marcação difusa, 43,8% estava associada à presença de metástase (Tabela 10).
As demais variáveis (desfecho, estadiamento clínico e histológico) não exibiram
correlação estatística com a distribuição de marcação (Tabelas 9, 11 e 12).
Segundo Fillies et al. (2005) e Semenza (2006), a expressão predominantemente
difusa do HIF-1α em lesões tumorais não estaria correlacionada diretamente ao
ambiente hipóxico, mas também a alterações em oncogenes, genes supressores de tumor
e pela falta da expressão do GLUT-1 e CA-IX, tendo em vista que grande parte da
distribuição difusa dessa molécula no epitélio normal encontrava-se mais nas camadas
profundas quando associada as áreas ceratinizadas, acreditando que a ação do HIF-1α
nesse contexto teria uma ação mais fisiológica no processo de diferenciação celular ao
invés de um efeito carcinogênico.
É importante salientar que o anticorpo anti-HIF-1α reagiu imunopositivamente
em 100% dos casos de CEL estudados, tanto no parênquima como nas células
estromais. Diante disso, diversos trabalhos têm provido evidências plausíveis de que a
127
relação estabelecida entre células malignas e o estroma interfere no desenvolvimento e
progressão clínica tumoral (CHRISTOFORI, 2003; AMORIM FILHO, 2004;
BARROS, 2006; LE et al., 2007; KUMAR; ABBAS; FASTO, 2008).
Têm-se reportado que embora a função primordial da matriz extracelular (MEC)
relacione-se à manutenção do arcabouço tecidual, intermediando as inter-relações entre
os diversos tecidos que compõem o organismo, a MEC constitui-se em um reservatório
para uma grande quantidade de moléculas de funções biológicas diversas, que no
âmbito da tumorigênese podem se relacionar a funções pró e anti-neoplásicas. Por esta
razão, o perfil funcional do estroma tem sido classificado como estroma pró-tumor ou
anti-tumor (BARROS, 2006; LE et al., 2007).
Neste tocante, destaca-se que as células malignas são capazes de produzir
diversas proteases ou ainda induzir as células do estroma a secretar tais enzimas e assim
iniciar toda a cascata de eventos relacionados à invasão e metástase tumoral (LE et al.,
2007; KUMAR; ABBAS; FASTO, 2008; UEHARA et al., 2009).
Segundo Barros (2006) e Uehara et al. (2009), um componente crítico para
adaptabilidade das células tumorais a um ambiente hipóxico reside destas remodelarem
a MEC intersticial dos tecidos do hospedeiro e tal capacidade decorre, principalmente,
da atuação de uma série de proteases, que têm como principais representantes as
mataloproteinases da MEC, as quais têm a capacidade de degradar, processar, ativar ou
inativar praticamente todos os componentes da MEC, facilitando, assim, a migração
celular por esse microambiente.
Tais informações são congruentes com os achados de Ryu et al. (2010), onde
verificaram em culturas de células de CEO que o estado de hipóxia aumentava a
expressão do HIF-1α, comprometendo a expressão da integrina α5 e fibronectina, as
quais encontram-se envolvidas no mecanismo de crescimento e invasão tumoral.
Portanto, estas considerações são indicativas que a hipóxia tumoral é capaz de
modular a expressão de proteases em CEO, podendo ser responsável para o reforço
da invasão das células tumorais, bem como a metástase, resultando, conseqüentemente,
em um mau prognóstico.
128
No que concerne na intensidade de expressão do GLUT-1 na amostra estudada,
observou-se uma associação estatisticamente significativa com o estadiamento clínico
(p = 0,002). Na maioria das lesões que exibiram marcação fraca e forte, encontrava-se
nos estágios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) da doença, respectivamente (Tabela
15), corroborando com as afirmações de Kato et al. (2002); em carcinomas esofágico,
Mineta et al (2002); em carcinomas hipofaringeal, Choi et al. (2007); em CEL, Ayala et
al. (2010); em CEO e Luo, Zhou e Fan (2010); em carcinoma de laringe, onde ressaltam
a importância da relação desse imunomarcador com o estágio tumoral, sendo portanto,
passível de utilização para informação diagnóstica e prognóstica. Contudo, Schrijvers et
al. (2008) analisando casos de CE de laringe constataram que os parâmetros de evolução
clínica não estavam associados com a intensidade de marcação do GLUT-1.
Considerando a relação entre intensidade e desfecho da doença para a
imunoexpressão do GLUT-1, verificou-se estatisticamente que os resultados do corrente
estudo não são concordantes (Tabela 13) com os resultados de Kunkel et al. (2003),
Oliver et al. (2004), Kunkel et al. (2007) e Eckert et al. (2008), onde revelaram que o
risco relativo de morte para pacientes com CEO exibindo forte marcação para o GLUT1 era maior que em pacientes com fraca expressão, sugerindo, com isso, um possível
valor preditivo independente deste marcador para prognóstico e taxa de sobrevida.
Destaca-se, no entanto, na análise dos dados descritivos, que dos 84,6% dos
pacientes que foram a óbito, apresentaram marcação forte para o GLUT-1 (Tabela 13),
estando em consonância aos achados de Tohma et al. (2005) e Ogane et al. (2010). Os
autores reportam que esse marcador de hipóxia poderia ser útil para prever o desfecho
clínico dos carcinomas esofágicos que exibem forte expressão.
Ainda no ponto de vista clínico, Kato et al. (2002), Oliver et al. (2004), Jonathan
et al. (2006), Roh et al. (2009), Choi et al. (2010) e Kondo et al. (2011), analisando CE
de cabeça e pescoço, evidenciaram que a intensidade de marcação do GLUT-1 estava
associada com a metástase linfonodal regional e pior prognóstico. Todavia, verificou-se,
no estudo ora realizado, que a intensidade de marcação não demonstrou correlação
estatisticamente significativa com a metástase, apesar dos 81,8% dos casos com
metástase, apresentarem marcação forte (Tabela 14).
129
Conforme Gillies e Gatenby (2007), Demasi et al. (2010) e Ahoba et al. (2010)
a hipóxia tumoral, poderia provocar um ambiente ácido devido a uma maior atividade
da glicólise anaeróbica, resultando, dessa forma, uma superexpressão do GLUT-1 para
compensar e aumentar o fornecimento de glicose a célula, contribuindo, portanto com a
invasão celular, degradação da MEC e angiogênese. Diante disso, os tumores de baixo
grau não passariam por esse tipo de “pressão ambiental”, pelo fato de que as células
malignas ainda poderem recorrer predominantemente à fosforilação oxidativa para
fornecimento de energia, não necessitando, assim, a forte expressão dessa molécula na
superfície da membrana plasmática.
No entanto, Garber (2004), Vander Heiden, Cantley e Thompson (2009) e
Gogvadze,
Zhivotovsky e Orrenius (2010) destacam que as células tumorais
potencialmente invasivas, comumente, apresentam uma atividade metabólica alterada,
decorrente de uma disfunção bioenergética nas mitocôndrias, acarretando, com isso, um
comprometimento da fosforilação oxidativa e, conseqüentemente, um desvio do
mecanismo da respiração celular mitocondrial para uma intensa produção de lactato,
independentemente da disponibilidade de O2, sendo este fenômeno chamado de
glicólise aeróbica ou efeito de Warburg.
Assim, a persistência deste microambiente ácido mesmo sob condições de
normóxia e sua correlação com a agressividade do tumor indicam que o fenótipo
glicolítico confere uma vantagem proliferativa significante durante a evolução do CEO,
devendo, portanto, ser um componente crucial do fenótipo maligno (GILLIES;
GATENBY, 2007).
Diversos mecanismos têm sido propostos para elucidar o aumento da regulação
da glicólise anaeróbica, principalmente aqueles que envolvem a ativação de oncogenes
e/ou inativação de genes supressores de tumores, que incidem na atividade glicolítica. O
gene c-Myc, por exemplo, é conhecido por ativar a maioria dos genes de enzimas
glicolíticas, como a LDHA e, também, o GLUT-1, para aumentar a produção de lactato
e melhorar a captação de glicose, respectivamente (MACHEDA; ROGERS; BEST,
2005).
Segundo Gillies e Gatenby (2007) e Vander Heiden, Cantley e Thompson
(2009), mutações com perda de função nas enzimas desidrogenase succínica e fumarato
130
hidratase, ambas pertencentes ao ciclo de Krebs, causam acumulação no citoplasma de
succinato e fumarato, respectivamente, os quais são responsáveis pela inibição da prolilhidroxilase (PHD) que catalisa a hidroxilação do HIF-1α, permitindo, dessa forma, o
aumento da concentração dessa proteína e a sinalização de “emergência” do efeito
Warburg, podendo refletir, dessa forma, uma maior expressão do GLUT-1 nas células
malignas. Do mesmo modo, mutações no isocitrato desidrogenase (IDH) do tipo 1
(IDH1 citoplasmático) e 2 (IDH2 mitocondrial), atuariam como redutases capazes de
catalisar a redução do α-cetoglutarato em 2-oxoglutarato, contribuindo, também, na
ativação constitutiva do HIF-1α. Tais afirmações alicerçam que a expressão do GLUT-1
poderia está associada a complexas interações que ocorrem entre as vias de
metabolização da glicose com os mecanismos da hipóxia tumoral, os quais são
imprescindíveis para o crescimento e proliferação celular.
Com base nestas considerações, pode-se salientar que a hipóxia tumoral estaria
associada a resistência à radioterapia e quimioterapia, fenótipo mais agressivo e maior
propensão para metástase, podendo em parte explicar o mau prognóstico conferido pela
expressão do GLUT-1 em lesões malignas de cabeça e pescoço (OLIVER et al., 2004;
KUNKEL et al., 2007; AYALA et al., 2010; LUO; ZHOU; FAN, 2010).
Frente a este fato, no que diz respeito à quimioterapia, a pouca eficiência se
justifica, primeiramente, pela dificuldade do fármaco em chegar às células em hipóxia
devido a uma deficiente vascularização. Além disso, muitos agentes antineoplásicos
requerem O2 para atuar, a partir da formação de radicais livres, gerados por incidência
de radiação através de tratamento radioterápico concomitante. A baixa concentração de
O2 também retardaria a divisão celular de modo que agentes quimioterápicos que atuam
no ciclo celular sejam menos efetivos no combate às células em hipóxia. Já com relação
à radioterapia, o ambiente com baixa tensão de O2 tornaria as células mais resistentes ao
tratamento, devido uma menor quantidade de radicais livres formados, os quais
atuariam degradando ou desativando moléculas envolvidas na carcinogênese
(BUSTAMANTE et al., 2009).
Analisando a relação entre a gradação histológica e intensidade de marcação
para o GLUT-1, evidenciou-se estatisticamente na presente pesquisa uma maior
freqüência de casos de alto e baixo grau de malignidade exibindo marcação forte e
fraca, respectivamente (Tabela 16). De forma consensual, Kato et al. (2002); em
131
carcinoma esofágico, Li et al. (2008); em CE de cabeça e pescoço e Ohba et al. (2010);
em CEO, constataram que a expressão imuno-histoquímica dessa molécula era
significantemente mais fraca nas lesões primárias e bem diferenciadas quando
comparada com os tumores recorrentes e indiferenciados, sugerindo que o GLUT-1
poderia ser utilizado como alvo molecular para diagnóstico, prognóstico e escolha
terapêutica adequada em CE de cabeça e pescoço. Por sua vez, Mineta et al. (2002),
analisando casos de carcinoma hipofaringeal, verificaram que a imunoexpressão do
GLUT-1 não estava associada estatisticamente com o gênero, gradação histológica,
tamanho do tumor e estágio linfonodal, observando apenas a relação da expressão com
o estadiamento clínico.
No tocante a expressão de marcação do GLUT-1 nas ilhas do epitélio
proliferante, observou-se a predominância da marcação periférica quando comparado no
centro/periferia, corroborando com os achados de Ohba et al. (2010). Adicionalmente,
evidenciou-se ainda, uma correlação estatisticamente significativa entre a localização na
ilha tumoral e a gradação histológica, destacando que nas lesões de alto grau,
predominou a marcação centro/periferia (Tabela 16). Entretanto, não foi possível
identificar tal correlação com desfecho, metástase e estadiamento clínico. Ressalta-se
ainda, de forma descritiva, contrariando os achados referentes ao grau histológico de
malignidade, que a maioria da amostra relacionada ao número de óbitos, metástases e
estágios avançados (III e IV), evidenciou-se marcação periférica (Tabelas 13-15).
Assim, em conjunto, estes resultados parecem apenas refletir a necessidade de mais
estudos correlacionando a imunomarcação dessa proteína nas ilhas tumorais com a
agressividade tumoral.
Pesquisas demonstram que o GLUT-1 é predominantemente expresso na
periferia do tumor, enquanto é ausente no centro da lesão devido uma maior presença de
glicogênio e de células bem diferenciadas (REISSER et al., 1999; OHBA et al., 2010).
Evidencia-se, dessa forma, que a expressão do GLUT-1 é inversamente proporcional a
quantidade de glicogênio armazenada nas células. Consistentes a esses achados,
Grobholz et al. (1993) afirmam que a baixa estocagem de glicogênio e a forte expressão
do GLUT-1 e 2 estavam correlacionados com a hepatocarcinogênese em ratos.
Diante desse contexto, infere-se que as células da periferia do front de invasão
tumoral necessitam de alta atividade glicolítica para os mecanismos de diferenciação,
132
invasão e metástase. Em contra partida, o centro dessas ilhas, apesar de estar inserido
em um ambiente hipóxico, a estocagem de glicogênio no interior das células
diferenciadas, bem como a tensão mínima ótima de O2, são suficientes para manter uma
respiração aeróbica satisfatória, observando, por conseguinte uma fraca ou ausência de
marcação para o GLUT-1. Portanto, acredita-se que GLUT-1 constitui uma das
estratégias adaptativas para o crescimento e progressão tumoral em um ambiente com
grande instabilidade de oxigenação (REISSER et al., 1999; AIRLEY et al., 2003;
KUNKEL et al., 2003; AHOBA et al., 2010; DEMASI et al., 2010).
Quanto a localização celular, verificou-se que a expressão do GLUT-1 localizouse no citoplasma e membrana das células neoplásicas em 100% dos casos de CEL
estudados, consoantes com os achados de Choi et al. (2007) e Kunkel et al. (2007), onde
encontraram uma maior expressão na membrana e/ou citoplasma de CEO. Já Li et al.
(2010) e Ogane et al. (2010), verificaram uma predominância da expressão membranar
em CE de cabeça e pescoço. Entretanto, Demasi et al. (2010); em carcinoma
mucoepidermóide e Ohba et al. (2010); em CEO, evidenciaram uma maior expressão no
citoplasma das células neoplásicas. Assim, pode-se deduzir que durante o mecanismo de
crescimento e proliferação celular ocorreria uma maior transcrição do GLUT-1, o qual
seria armazenado nos endossomas intra-citoplasmáticos e, por conseguinte, dependendo
da necessidade de uma maior captação de energia pela célula neoplásica, esse carreador
de glicose passaria ser expresso na superfície da membrana plasmática (MENDES et al.,
2010).
Reporta-se na literatura que o significado da indução de expressão do GLUT-1
na transformação neoplásica do epitélio não está ainda bem estabelecido. Oliver et al.,
(2004), Schrijvers et al. (2008) e Zhu et al. (2010) demonstraram a co-expressão de
GLUT-1 e do HIF-1α em amostras de CE de cabeça e pescoço, suportando a hipótese de
que o GLUT-1 é uma proteína expressa em resposta à hipóxia tecidual. Por outro lado,
Flier et al. (2001) e Pedersen et al. (2007) levantam a hipótese da expressão de GLUT-1
ser uma característica constitutiva do fenótipo maligno, cuja expressão seria induzida
pelos oncogenes Ras e Src. Ademais, Behrooz e Ismail-Beigi, (1999) e Burstein et al.
(2006) discorrem que outros fatores, tais como fatores séricos e de crescimento,
ionóforos de cálcio, hormônio da tireóide, pH alcalino e inibição da fosforilação
oxidativa, contribuiriam para superexpressão do GLUT-1.
133
Considerando a análise estatística da relação entre a gradação histológica e
intensidade de marcação para CA-IX no referido estudo, evidenciou-se uma maior
freqüência de casos de alto (76,7%) e de baixo grau (64,3%) de malignidade exibindo
marcação forte e fraca, respectivamente (Tabela 20), estando em conformidade com as
pesquisas conduzidas por Kim et al. (2007); em CEL, Schrijvers et al. (2008); em CE de
laringe e Tanaka et al. (2008); em carcinoma esofágico, onde evidenciaram que as
lesões mais indiferenciadas estavam correlacionadas a uma intensa marcação e com a
pior taxa de sobrevida, assegurando, dessa forma, que a CA-IX poderia ser uma
importante ferramenta auxiliar de diagnóstico para um adequado tratamento em
carcinomas de cabeça e pescoço.
Com relação aos aspectos clínicos, Beasley et al. (2001), Koukourakis et al.
(2001), Kim et al. (2007), Schrijvers et al. (2008) e Tanaka et al. (2008) constataram
que a intensidade de marcação da CA-IX estava associada a um estágio clínico elevado
da doença e pior prognóstico em carcinoma de cabeça e pescoço, sugerindo com isso,
que esse marcador de hipóxia seria responsável na manutenção do pH extra-celular
ácido, contribuindo para que as células tenham uma maior taxa de sobrevida e uma
resistência as modalidades terapêuticas. Tais evidências não corroboram com os
resultados encontrados nesta pesquisa. No entanto, na análise descritiva, certificou-se
que a maior parte das lesões que exibiam marcação fraca e forte se encontrava nos
estágios iniciais (I e II) e avançados (III e IV) da doença, respectivamente para a CA-IX
(Tabela 19).
É válido ressaltar, de modo geral, que durante a análise da expressão do HIF-1α,
GLUT-1 e CA-IX constatou-se que casos de CEL classificados de baixo grau ou em
estágios iniciais (I e II), assim como casos de alto grau ou em estágios tardios (III e IV)
da doença exibiram uma forte e fraca expressão, respectivamente para esses marcadores
de hipóxia. Com esses resultados, as evidências apresentadas dão suporte à hipótese de
que durante o mecanismo da carcinogênese verifica-se uma grande flutuação no fluxo
sangüíneo, caracterizando ciclos intermitentes de hipóxia/anóxia e normóxia tecidual,
onde essas variações, dependendo do estágio da angiogênese tumoral, podem durar
alguns minutos, horas ou dias (GILLES; GATENBY, 2008; DEMASI et al., 2010).
Assim, partindo dessa premissa, e considerando o intervalo de tempo em que os
134
espécimes teciduais foram extraídos, é justificável a observância de tais achados em
parte da amostra analisada.
No que concerne na relação entre intensidade e desfecho da doença para a
imunoexpressão da CA-IX, verificou-se estatisticamente que os resultados do corrente
estudo não são concordantes (Tabela 17) com os resultados de Kim et al. (2007), Hoh et
al., (2009) e Kondo et al. (2011), onde revelaram que o risco relativo de morte para
pacientes com CEL exibindo forte marcação era maior do que em pacientes com fraca
expressão, sugerindo, com isso, que essa molécula poderia contribuir na terapia contra o
câncer oral. Entretanto, na amostra analisada, constatou-se que na maioria do pacientes
que foi a óbito, 69,2% dos casos apresentaram expressão forte e uma distribuição de
marcação difusa.
É notável que um fator importante para determinação do prognóstico de
pacientes portadores de CE de cabeça e pescoço é a presença de metástase. A relevância
é tão grande que esse parâmetro tem sido utilizado para testar a eficiência de possíveis
marcadores de hipóxia na agressividade tumoral (SEMENZA, 2006; FERREIRA et al.,
2007; CHOI et al., 2010; KONDO et al., 2011). Tais considerações são alicerçadas nos
estudos conduzidos por Choi et al. (2008); em CEO e Tanaka et al. (2008); em
carcinoma esofágico. Os autores sugerem que o controle da expressão da CA-IX, que se
encontra intimamente associado aos mecanismos de hipóxia, poderia ser adjuvante na
efetividade da quimioterapia e radioterapia nas lesões de cabeça e pescoço. Porém, no
corrente estudo não foi possível observar estatisticamente a relação dessa variável com a
intensidade de marcação, apesar dos 72,7% dos casos que apresentavam metástase,
expressarem marcação forte (Tabela 18).
Em relação à localização celular, verificou-se que a expressão da CA-IX foi
predominante na membrana/citoplasma, corroborando com os achados de Choi et al.
(2008), Kim et al. (2007), Roh et al. (2009) e Eckert et al. (2010b) onde encontraram
uma maior expressão na membrana e/ou citoplasma em CEO. Contudo, Beasley et al.
(2001), Jonathan et al. (2006) e Tanaka et al. (2008) verificaram uma predominância da
expressão membranar em CE de cabeça e pescoço. Adicionalmente, na presente
pesquisa não se verificou uma correlação estatisticamente significativa da expressão
desse marcador na célula, bem como na ilha tumoral com o desfecho, metástase,
estadiamento clínico e gradação histológica (Tabelas 17-20).
135
Quanto à análise de marcação nas células estromais, evidenciou-se que a CA-IX
reagiu imunopositivamente em 100% dos casos de CEL estudados. Nesse contexto,
Brokton et al. (2011) ressaltam que a expressão da CA-IX no microambiente estromal
poderia contribuir na manutenção do pH ácido do meio extra-celular, exercendo, dessa
forma, um papel dinâmico e efetivo para o crescimento, proliferação e metástase
tumoral, uma vez que esta acidose ativaria uma série de proteases com a capacidade de
degradar, processar e inativar componentes da MEC, bem como comprometeria os
diversos mecanismos de adesão celular, facilitando a migração das células por este
microambiente.
Segundo Parkkila et al. (2000), Beasley et al. (2001) e Liao, Lerman e
Stanbridge (2009), durante o mecanismo de hipóxia evidencia-se no interior da célula
neoplásica a prevalência da glicólise anaeróbica, gerando um pH intracelular ácido em
virtude de uma grande produção de ácido lático. Entretanto, para que a célula mantenhase viável, o fator de transcrição HIF-1 é ativado, mediando, nesta condição, a expressão
da CA-IX, no intuito de manter o pH intra celular em níveis normais e
conseqüentemente evitar a apoptose. Ademais, é durante esse mecanismo de hidratação
do dióxido de carbono e desidratação do ácido carbônico, mediada pela CA-IX,
ocorrendo entre o meio intra e extracelular, que se verifica a neutralização do pH intra
celular e diminuição do pH extra celular o qual contribuirá para degradação da MEC,
migração e invasão das células tumorais, bem como na indução da expressão de fatores
de crescimento.
No entanto, apesar de diversos trabalhos destacarem a importância da expressão
do HIF-1α, GLUT-1 e da CA-IX no estroma, auxiliando na invasão e metástase
tumoral, geralmente a avaliação da agressividade desses marcadores de hipóxia é feita
somente nas células neoplásicas (BEASLEY et al., 2001; JOHANN et al., 2007; LE et
al., 2007; KUMAR; ABBAS; FASTO, 2008; LIAO; LERMAN; STANBRIDGE, 2009;
UEHARA et al., 2009). Alguns estudos apenas citam se houve ou não expressão de
determinadas moléculas pelas células estromais, mas não mencionam contagem de
células positivas ou outra técnica de quantificação.
Em face do exposto, constata-se que a importância da hipóxia tumoral no
crescimento e desenvolvimento de CE de cabeça e pescoço é inquestionável. Os
resultados encontrados nesta pesquisa, portanto, sustentam a relevância da expressão
136
imuno-histoquímica do HIF-1α, GLUT-1 e da CA-IX na agressividade tumoral, como
também a tendência apresentada pela literatura disponível (BEASLEY et al., 2001;
SEMENZA, 2006; FERREIRA et al., 2007; JOHANN et al., 2007; LIAO; LERMAN;
STANBRIDGE, 2009; ROH et al., 2009; UEHARA et al., 2009; KONDO et al., 2011)
de considerar importante a participação desses marcadores de hipóxia na patogênese do
CEO.
Ressalta-se que conhecer o comportamento biológico do CEO é essencial para
adoção das medidas terapêuticas mais indicadas para cada caso, evitando que o paciente
seja submetido a um tratamento mais rigoroso que o necessário ou que a escolha de
procedimentos inadequados venha a aumentar os riscos de desenvolvimento de lesões
recorrentes ou metastáticas.
Portanto, acredita-se que os dados obtidos neste experimento possam contribuir
para a construção de um conhecimento sólido sobre o CEL. Todavia, é importante que
outros estudos, seguindo metodologia semelhante, sejam desenvolvidos com o objetivo
de avaliar se estes marcadores podem ser um parâmetro seguro a ser utilizado como
ferramenta na identificação do potencial biológico tumoral e como adjuvante das
técnicas terapêuticas disponíveis.
137
"Realize o seu próprio sonho. Você mesmo vai ter de fazer isso... eu
não posso acordar você. Você é quem pode se acordar."
(John Lennon)
CONCLUSÕES
138
7 CONCLUSÕES
Com base nos resultados clínicos, morfológicos e imuno-histoquímicos desta
pesquisa, pode-se concluir que:
1. Em relação ao sexo, raça, faixa etária acometida e hábitos, os achados dessa
pesquisa corroboram os dados encontrados na literatura.
2. O estadiamento clínico (TNM) e a presença de metástase mostraram uma boa
efetividade como parâmetro indicador de prognóstico.
3. O sistema de gradação histológica de malignidade (SGHM) correlacionou-se
com o estadiamento clínico, podendo ser utilizado como parâmetro indicador do
comportamento biológico dos CEL estudados.
4. Os níveis de expressão dos marcadores de hipóxia (HIF-1α, GLUT-1 e CA-IX)
influenciam consideravelmente no perfil clinico-patológico do CEL.
5. A expressão imuno-histoquímica do HIF-1α e GLUT-1 correlacionou-se de
forma significativa com o estadiamento clínico e gradação histológica, podendo
ser utilizada como um recurso adjuvante na predição da taxa de sobrevida e da
progressão tumoral do CEL.
6. A localização da expressão do GLUT-1 nas ilhas tumorais, bem como a forma
de distribuição da expressão do HIF-1α pode estar associada com o grau de
agressividade tumoral, podendo ser utilizada como indicador de comportamento
biológico do CEL.
7. A expressão imuno-histoquímica da CA-IX correlacionou-se estatisticamente de
forma significativa com a gradação histológica, podendo ser utilizada como
marcador de progressão e comportamento biológico do CEL.
139
"Só uma coisa torna um sonho impossível: o medo de fracassar."
(Paulo Coelho)
REFERÊNCIAS
140
REFERÊNCIAS1
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia Celular e Molecular. 6
ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008.
AIRLEY, R. E. et al. GLUT-1 and CAIX as intrinsic markers of hypoxia in carcinoma
of the cervix: relationship to pimonidazole binding. Int. J. Cancer, v. 104, n. 1, p. 8591, 2003.
ALFRANCA, A. et al. c-Jun and hypoxia-inducible factor 1 functionally cooperate in
hypoxia-induced gene transcription. Mol. Cell Biol., v. 22, n. 1, p. 12-22, 2002.
ALQUATI, R. A. B. Câncer bucal-fatores predisponentes. Disponível em
<www.saudevidaonline.com.br>. Acesso em 07 jan 2011.
AL-RAJHI, N. et al. Early stage carcinoma of oral tongue: prognostic factors for local
control and survival. Oral Oncol., v. 36, n. 6, p. 508-14, 2000.
AL-RAWI, N. H.; TALABANI, N. G. Squamous cell carcinoma of the oral cavity: a
case series analysis of clinical presentation and histological grading of 1,425 cases from
Iraq. Clin. Oral Investig., v. 12, n. 1, p. 8-15, 2008.
ALVES, P. M. et al. Significance of galectins-1, -3, -4 and -7 in the progression of
squamous cell carcinoma of the tongue. Pathol. Res. Pract., v. 207, n. 4, p. 236-40,
2011.
AMARAL, T. M. P. et al. Predictive factors of occult metastasis and prognostic of
clinical stage I and II squamous cell carcinoma of the tongue and floor of the mouth.
Oral Oncol., v. 40, n. 8, p, 780-6, 2004.
AMORIM FILHO, F. S. et al. Estudo clínico-epidemiológico do carcinoma
epidermóide da base da língua. Rev. Bras. Otorrinolaringol., v. 69, n. 2, p. 175-9,
2003.
AMORIM FILHO, F. S. et al. Paradigma da disseminação local do carcinoma
epidermóide da base de língua. Rev. Bras. Otorrinolaringol., v. 70, n. 4, p. 471-77,
2004.
AMORIM, A. G.; AMORIM, R. F. B.; ALMEIDA, R. A. Estudo epidemiológico do
carcinoma epidermóide oral: análise de 85 casos. Odontol. Clín. Cient., v. 1, n. 1, p.
41-7, 2002.
ANDERSEN, S. et al. Diverging prognostic impacts of hypoxic markers according to
NSCLC histology. Lung Cancer, v. 72, n. 3, p. 294-302, 2011.
1
Segundo a normalização realizada pela Associação Brasileira de Normas e Técnicas (ABNT-NBR 6023/2002).
141
ANDISHEH-TADBIR, A.; MEHRABANI, D.; HEYDARI, S. T. Sociodemographic
and etiological difeffrences of head and neck squamous cell carcinoma in young and old
patients in southern Iran. J. Craniofac. Surg., v. 21, n. 1, p. 126-8, 2010.
ANDREWS, E.; SEAMAN, W. T.; WEBSTER-CYRIAQUE, J. Oropharyngeal
carcinoma in non-smokers and non-drinkers : a role for HPV. Oral Oncol., v. 45, n. 6,
p. 486-91, 2009.
ANNEROTH, G.; BATSAKIS, J.; LUNA, M. Malignancy grading of squamous cell
carcinoma in the floor of the mouth related to clinical evaluation. Eur. J. Oral Sci., v.
94, n. 4, p. 347-56, 1986.
ARAÚJO JÚNIOR, R. F. et al. Prognostic significance of the anatomical location and
TNM clinical classification in oral squamous cell carcinoma. Med. Oral Patol. Oral
Cir. Bucal, v. 13, n. 6, p. 344-7, 2008.
ARAÚJO JÚNIOR, R. F., COSTA, A. L. L., RAMOS, C. C. F. Clinical-pathological
parameters as prognostic indicators in oral squamous cell. Pes. Bras. Odontoped. Clin.
Integr., v. 6, n. 2, p. 125-30, 2006.
ARIYOSHI, Y. et al. Epidemiological study of malignant tumours in the oral and
maxillofacial region: survey of member institutions of the japanese society of oral and
Maxillofacial Surgeons, 2002. Int. J. Oncol., v. 13, n. 1, p. 220-8, 2008.
AYALA, F. R. et al. GLUT1 and GLUT3 as potential prognostic markers for oral
squamous cell carcinoma. Molecules, v. 15, n. 4, p. 2374-87, 2010.
BÀNKFALVI, A.; PIFFKÓ, J. Prognostic and predictive factors in oral cancer: the role
of the invasive tumour front. J. Oral Pathol. Med., v. 29, n. 7, p. 291-8, 2000.
BARROS, S. S. L. V. Expressão imuno-histoquímica de metaloproteinases em
carcinoma epidermóide de lábio inferior e língua. 2006. 128 f. Tese (Doutorado em
Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2006.
BATISTA, A, C. et al. Distinctive clinical and microscopic features of squamous cell
carcinoma of oral cavity and lip. Oral. Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol.
Endod., v. 109, n. 3, p. 74-9, 2010.
BEASLEY, N. J. et al. Carbonic anhydrase IX, an endogenous hypoxia marker,
expression in head and neck squamous cell carcinoma and its relationship to hypoxia,
necrosis, and microvessel density. Cancer Res., v. 61, n. 13, p. 5262-7, 2001.
BEHROOZ, A.; ISMAIL-BEIGI, F. Stimulation of glucose transport by hypoxia:
signals and mechanisms. News Physiol. Sci., v. 14, n. 3, p. 105-10, 1999.
BELL, G. I. et al. Molecular biology of mammalian glucose transporters. Diabetes
Care, v. 13, n. 3, p. 198-208, 1990.
142
BELL, R. B. et al. Tongue cancer : is there a difference in survival compared with other
subsites in the oral cavity ? J. Oral Maxillofac. Surg., v. 65, n. 2, p. 229-36, 2007.
BETTENDORF, O.; PIFFKÒ, J.; BÀNKAFALVI, A. Prognostic and predictive factors
in squamous cell cancer: important tools for planning individual therapy? Oral Oncol.,
v. 40, n. 2, p. 110-9, 2004.
BOURNE, J. A. Handbook of immunoperoxidase staining methods. Santa Bárbara:
Dako Corporation, 1983.
BRACKEN, C. P.; WHITELAW, M. L.; PEET, D. J. The hypoxia-inducible factors:
key transcriptional regulators of hypoxic responses. Cell Mol. Life Sci., v. 60, n.7, p.
1376-93, 2003.
BRASIL. Ministério da Saúde. INCA. Estimativa
<http://www.inca.gov.br> Acesso em: 15.11.2010.
2010.
Disponível
em:
BRENNAN D. J. et al. CA IX is an independent prognostic marker in premenopausal
breast cancer patients with one to three positive lymph nodes and a putative marker of
radiation resistance. Clin. Cancer Res., v. 12, n. 21, p. 6421-31, 2006.
BROCKTON, N. et al. High stromal carbonic anhydrase IX expression is associated
with decreased survival in p16-negative head-and-neck tumors. Int. J. Radiat. Oncol.
Biol. Phys., v. 80, n. 1, p. 249-57, 2011.
BRODERS, A. C. Squamous cell epithelioma of the lip. A study of five hundred and
thirty-seven cases. J. Am. Med. Assoc., v. 74, n. 10, p. 656-64, 1920.
BROWN, G. K. Glucose transporters: structure, function and consequences of
deficiency. J. Inherit. Metab. Dis., v. 23, n. 3, p. 237-46, 2000.
BRUICK, R. K.; MCKNIGHT, S. L. A conserved family of prolyl-4-hydroxylases that
modify HIF. Science (Wash.), v. 294, n. 5545, p. 1337-40, 2001.
BRYNE, M. et al. New prognostic grading is a better prognostic indicator than Broder`s
grading in oral squamous cell carcinomas. J. Oral Pathol. Med., v. 18, n. 8, p. 432-7,
1989.
BRYNE, M. Is the invasive front of on oral carcinoma the most important area for the
prognostication? Oral Dis., v. 4, n. 2, p. 70-7, 1998.
BRYNE, M. Pronostic value of various molecular and cellular features in oral
squamous cell carcinomas: a review. J. Oral Pathol. Med., v. 20, n. 9, p. 413-20, 1991.
BURROWS, N. et al. Expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha in thyroid
carcinomas. Endocr. Relat. Cancer., v. 17, n. 1, p. 61-72, 2010.
BURSTEIN, D. E. et al. Immunohistochemical detection of GLUT-1, p63 and
phosporylated histone H1 in head and neck squamous intraepithelial neoplasias:
143
evidence for aberrations in hypoxia-related, cell cycle and stem-cell regulatory
pathways. Histopathology, v. 48, n. 6, p. 708-16, 2006.
BUSTAMANTE, F. L. S. et al. Complexos ativados por hipóxia: uma estratégia para o
combate ao câncer. Rev. Virtual Quim., v.1, n. 2, p. 138-48, 2009.
CARINCI, F. et al. A compararison between TNM and TANIS stage grouping for
predicting prognosis of oral and oropharyngeal cancer. J. Oral Maxillofac. Surg., v.
56, n. 7, p. 832-6, 1998.
CHEN, Y. et al. Beclin-1 expression is a predictor of clinical outcome in patients with
esophageal squamous cell carcinoma and correlated to hypoxia-inducible factor (HIF)1α expression, Pathol. Oncol. Res., v. 15, n. 3, p. 487-93, 2009.
CHILOV, D. et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1
(HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of
HIF-1alpha. J. Cell Sci., v. 112, n. Pt 8, p. 1203-12, 1999.
CHOI, K. K. et al. Independent prognostic factors of 861 cases of oral squamous cell
carcinoma in Korean adults. Oral Oncol., v. 42, n. 2, p. 208-17, 2006.
CHOI, SUNG-WEON et al. Epression of carbonic anhydrase IX is associated with
postoperative recurrence and poor prognosis in surgically treated oral squamous cell
carcinoma. Hum. Pathol., v. 39, n. 9, p. 1317-22, 2008.
CHOI, Y. S. et al. Glucose transporter-1 expression in squamous cell carcinoma of the
tongue. Cancer Res. Tret., v. 39, n. 3, p. 109-15, 2007.
CHRISTOFORI, G. Changing neighbours, changing behaviour: cell adhesion moleculemediated signaling during tumour progression. EMBO J., v. 22, n. 10, p. 2318-23,
2003.
COARACY, A. E. V. et al. Correlation between the clinical and histologic data of oral
squamous cell carcinoma from Instituto Maranhense de Oncologia Aldenora Bello, in
São Luís, MA, Brazil. J. Bras. Patol. Med. Lab., v. 44, n. 1, p. 31-35, 2008.
COSTA, A. L. L. et al. Correlação entre a classificação TNM, gradação histológica e
localização anatômica em carcinoma epidermóide oral. Pesq. Odontol. Bras., v. 16, n.
3, p. 216-220, 2002.
COSTA, A. L. L.; ARAÚJO JÚNIOR, R. F.; RAMOS, C. C. F. Correlation between
TNM classification and malignancy histological feature of oral squamous cell
carcinoma. Rev. Bras. Otorrinolaringol., v. 71, n. 2, p. 181-7, 2005.
COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; COLLINS, T. Robbins: patologia estrutural e
funcional. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.
DANTAS, D. D. L. et al. Clinical-pathollogical parameters in squamous cell carcinoma
of the tongue. Braz. Dent. J., v. 14, n. 1, p. 22-5, 2003.
144
DE VISSCHER, J. G. A. M. et al. Epidemiology of cancer of the lip in the Netherlands.
Oral Oncol., v. 34, n. 5, p. 421-6, 1998.
DEDIVITIS, R. A. et al. Clinic and epidemiologic characteristics in the with squamous
cell carcinoma of the mouth and oropharynx. Rev. Bras. Otorrinolaringol., v. 70, n. 1,
p. 35-40, 2004.
DEMASI, A. P. et al. Glucose transporter protein 1 expression in mucoepidermoid
carcinoma of salivary gland: correlation with grade of malignancy. Int. J. Exp. Pathol.,
v. 91, n. 2, p. 107-13, 2010.
ECKERT A. W. et al. Expression of Glut-1 is a prognostic marker for oral squamous
cell carcinoma patients. Oncol. Rep., v. 20, n. 6, p. 1381-5, 2008.
ECKERT, A. W. et al. Co-expression of Hif1alpha and CAIX is associated with poor
prognosis in oral squamous cell carcinoma patients. J. Oral Pathol. Med., v. 39, n. 4, p.
313-7, 2009.
ECKERT, A. W. et al. HIF-1alpha is a prognostic marker in oral squamous cell
carcinomas. Int. J. Biol. Markers, v. 25, n. 2, p. 87-92, 2010.
FERREIRA, T. C. et al. The yeast genome may harbor hypoxia response elements
(HRE). Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol., v. 146, n. 1/2, p. 255-63,
2007.
FILLIES, T. et al. HIF1-alpha overexpression indicates a good prognosis in early stage
squamous cell carcinomas of the oral floor. BMC Cancer, v. 5, n. 84, p. 1-9, 2005.
FLIER, J. S. et al Elevated levels of glucose transport and transporter messenger RNA
are induced by ras or src oncogenes. Science; v. 235, n. 4795, p. 1492–5, 1987.
GARAVELLO, W. et al. Prognostic influence of gender in patients with oral tongue
cancer. Otolaryngol. Head Neck Surg., v. 138, n. 6, p. 768-71, 2008.
GARAVELLO, W.; SPREAFICO, R.; GAINI, R. M. Oral tongue cancer in young
patients: a matched analysis. Oral Oncol., v. 43, n. 9, p. 894-7, 2007.
GARBER, K. Energy boost: the Warburg effect returns in a new theory of cancer. J
Natl. Cancer Inst., v. 96, n. 24, p. 1805-6, 2004.
GIACCIA, A.; SIIM, B. G.; JOHNSON, R. S. HIF-1 as a target for drug development.
Nat. Rev. Drug Discov., v. 2, n. 10, p. 803-11, 2003.
GILLIES, R. J.; GATENBY, R. A. Adaptive landscapes and emergent phenotypes:
why do cancers have high glycolysis? J. Bioenerg. Biomembr., v. 39, n. 3, p. 251–257,
2007.
145
GINGRAS, A. C.; RAUGHT, B.; SONENBERG, N. Regulation of translation initiation
by FRAP/mTOR. Genes Dev., v. 15, n. 7, p. 807-26, 2001.
GOERKEM, M.; BRAUN, J.; STOECKLI, S. J. Evaluation of clinical and
histomorphological parameters as potential predictors of occult metastases in sentinel
lymph nodes of early squamous cell carcinoma of the oral cavity. Ann. Surg. Oncol., v.
17, n. 2, p. 527-35. 2010.
GOGVADZE, V.; ZHIVOTOVSKY, B.; ORRENIUS, S. The Warburg effect and
mitochondrial stability in cancer cells. Mol. Aspects Med., v. 31, n. 1, p. 60-74, 2010.
GORSKY, V. M. et al. Carcinoma of the tong: a case series analysis of clinical
presentation, risk factors, staging and outcome. Oral Surg. Med. Oral Pathol. Oral
Radiol. Endod., v. 98, n. 5, p. 546-52, 2004.
GROBHOLZ, R. et al. Reduction in the expression of glucose transporter protein
GLUT2 in preneoplastic and neoplastic hepatic lesions and reexpression of GLUT-1 in
late stages of hepatocarcinogenesis. Cancer Res., v. 53, n. 18, p. 4204–11, 1993.
GUYTON, A. C.; HALL, J. E. Transporte de íons e de moléculas através da membrana
celular. In: GUYTON, A. C.; HALL, J. E. Tratado de fisiologia médica. 9. ed. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan S. A., 1996. cap. 4, p. 41-52.
HAAPASALO, J. A. et al. Expression of carbonic anhydrase IX in astrocytic tumors
predicts poor prognosis. Clin. Cancer Res., v. 12, n. 2, p. 473-7, 2006.
HÖPFL, G.; OGUNSHOLA, O.; GASSMANN, M. HIFs and tumors-cause and
consequences. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., v. 286, n. 4, p. R60823, 2004.
HORA, I. A. A. et al. Estudo epidemiológico do carcinoma epidermóide de boca no
estado de Sergipe. Cienc. Odontol. Bras., v. 6, n. 2, p. 41-48, 2003.
HUR, E. et al. Mitogen-activated protein kinase kinase inhibitor PD98059 blocks the
trans-activation but not the stabilization or DNA binding ability of hypoxia-inducible
factor-1alpha. Mol. Pharmacol., v. 59, n. 5, p. 1216-24, 2001.
IZARZUGAZA, M. I.; ESPARZA, H.; AGUIRRE, J. M. Epidemiological aspects of
oral and pharyngeal cancers in the Basque Country. J. Oral Pathol., v. 30, n. 9, p. 5216, 2001.
JAKOBSSON, P. A. et al. Histologic classification and grading of malignancy in
carcinoma of the larynx. Acta Radiol., v. 12, n. 1, p. 1-8, 1973.
JEONG, H. J. et al. Ethanol induces the production of cytokines via the Ca2+, MAP
kinase, HIF-1α, and NF-jB pathway. Life Sci., v. 77, n. 17, p. 2179–92, 2005.
JEONG, J. W. et al. Regulation and destabilization of HIF-1alpha by ARD1-mediated
acetylation. Cell, v. 111, n. 5, p. 709-20, 2002.
146
JIANG, B. H. et al. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of
hypoxia-inducible factor 1. J. Biol. Chem., v. 271, n. 30, p. 17771-8, 1996.
JOHANN, A. C. et al. GLUT-1 in oral benign vascular lesions. Oral Dis., v. 13, n. 1, p.
51-5, 2007.
JONATHAN, R. A. et al. The prognostic value of endogenous hypoxia-related markers
for head and neck squamous cell carcinomas treated with ARCON. Radiother. Oncol.,
v. 79, n. 3, p. 288-97, 2006.
JORDAN, R. C. K. et al. Advanced diagnostic methods in oral and maxillofacial
pathology. Part II: immunohistochemical and immunofluorescent methods. Oral Surg.
Oral Med. Oral Pathol., v. 93, n. 1, p. 56-74, 2002.
KADEMANI, K. et al. Prognostic factors in intraoral squamous cell carcinoma: the
influence of histologic grade. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 63, n. 11, p. 1599-605,
2005.
KALUZ, S. et al. Transcriptional control of the tumor- and hypoxia-marker carbonic
anhydrase 9: A one transcription factor (HIF-1) show? Biochim. Biophys. Acta, v.
1795, n. 2, p. 162-72, 2009.
KATO, H. et al. Glut-1 glucose transporter expression in esophageal squamous cell
carcinoma is associated with tumor aggressiveness. Anticancer Res., v. 22, n. 5, p.
2635-9, 2002.
KIM, S. J. et al. Prognostic value of carbonic anhydrase IX and Ki-67 expression in
squamous cell carcinoma of the tongue. J. Clin. Oncol., v. 37, n. 11, p. 812-9, 2007.
KLEPPER, J.; VOIT, T. Facilitated glucose transporter protein type 1 (GLUT1)
deficiency syndrome: impaired glucose transport into brain- a review. Eur. J. Pediatr.,
v. 161, n. 6, p. 295-304, 2002.
KONDO, Y. et al. Clinicopathological significance of carbonic anhydrase 9, glucose
transporter-1, Ki-67 and p53 expression in oral squamous cell carcinoma. Oncol. Rep.,
v. 25, n. 5, p. 1227-33, 2011.
KOSOMARA, R. et al. p53 mutations and human papillomavirus infection in oral
squamous cell carcinomas: correlation with overall survival. Braz. J.
CranioMaxillofac. Surg., v. 33, n. 5, p. 342-8, 2005.
KOUKOURAKIS, M. I. et al. Hypoxiaregulated carbonic anhydrase-9 (CA9) relates to
poor vascularization and resistance of squamous cell head and neck cancer to
chemoradiotherapy. Clin. Cancer Res., v. 7, n. 11, p. 3399–403, 2001.
KUMAR, V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO. N. Robbins e Cotran. Patologia: bases
patológicas das doenças. 8. ed. Rio de Janeiro: Saunders Elsevier, 2008.
147
KUNKEL, M. et al. Overexpression of GLUT-1 and increased glucose metabolism in
tumors are associated with a poor prognosis in pacients with oral squamous cell
carcinoma. Cancer, v. 3, n. 4, p. 1015-24, 2003.
KUNKEL, M. et al. Overexpression of GLUT-1 is associated with resistance to
radiotherapy and adverse prognosis in squamous cell carcinoma of the oral cavity. Oral
Oncol., v. 43, n. 8, p. 796-803, 2007.
KURKIVUORI, J. et al. Acetaldehy de production from ethanol by orl streptococci.
Oral Oncol., v. 43, n. 2, p. 181-6, 2007.
KUROKAWA, H. et al. The high prognostic value of the histologic grade at the deep
invasive front of the tongue squamous cell carcinoma. J. Oral Pathol. Med., v. 34, n. 6,
p. 329-33, 2005.
KYZAS, P. A. et al. Hypoxia-induced tumor angiogenic pathway in head and neck
cancer: an in vivo study. Cancer Lett., v. 225, n. 2, p. 297-304, 2005.
LANDO, D. et al. FIH-1 is an asparaginyl hydroxylase enzyme that regulates the
transcriptional activity of hypoxia-inducible factor. Genes Dev., v. 16, n. 12, p. 146671, 2002.
LE, Q. T. et al. Expression and prognostic significance of a panel of tissue hypoxia
markers in head and neck squamous cell carcinomas. Int. J. Radiat. Oncol., v. 69, n. 1,
p. 167-75, 2007.
LEE, S. S. et al. Hypoxia inducible factor-1α expression in areca quid chewingassociated oral squamous cell carcinomas. Oral Dis., v. 16, n. 7, p. 696-701, 2010.
LI, L. et al. Is the hypoxia-inducible factor-1a mRNA expression activated by ethanolinduced injury, the mechanism underlying alcoholic liver disease? Hepatobil. Panc.
Dis. Int., v. 5, n. 4, p. 560–3, 2006.
LI, S. J. et al. Expression of Glut-1 in primary and recurrent head and neck squamous
cell carcinomas, and compared with 2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose accumulation in
positron emission tomography. Br. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 46, n. 3, p. 180-6,
2008.
LIANG, X. et al. Hypoxia-inducible factor-1 alpha, in association with TWIST2 and
SNIP1, is a critical prognostic factor in patients with tongue squamous cell carcinoma.
Oral Oncol., v. 47, n. 2, p. 92-7, 2011.
LIAO, S. Y.; LERMAN, M. I.; STANBRIDGE, E. J. Expression of transmembrane
carbonic anhydrases, CAIX and CAXII, in human development. BMC Dev. Biol., v. 9,
n. 22, p. 1-16, 2009.
LIN, P. Y. et al. Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha is significantly
associated with the progression and prognosis of oral squamous cell carcinomas in
Taiwan. J. Oral Pathol. Med., v. 37, n. 1, p. 18–25, 2008.
148
LIU, T. R. et al. Elective neck dissection in clinical stage I squamous cell carcinoma of
the tongue: Does it improve regional control or survival time? Oral Oncol., v. 47, n. 2,
p. 136-41 2011.
LUNA-ORTZ, K. et al. Lip cancer experience in México. An 11-year retrospective
study. Oral Oncol., v. 40, n. 10, p. 992-9, 2004.
LUO, X. M.; ZHOU, S. H.; FAN, J. Glucose transporter-1 as a new therapeutic target
in laryngeal carcinoma. J. Int. Med. Res., v. 38, n. 6, p. 1885-92, 2010.
MACHADO, U. F.; SCHAAN, B. D.; SERAPHIM, P. M. Glucose transporters in the
metabolic syndrome. Arq. Bras. Endocrinol. Metab., v. 50, n. 2, p. 177-89, 2006.
MACHEDA, M. L.; ROGERS, S.; BEST, J, D. Molecular and cellular regulation of
glucose transporter (GLUT) proteins in cancer. J. Cell Physiol., v. 202, n. 3, p. 654-62,
2005.
MAREEL, M.; LEROY, A. Clinical, cellular and molecular aspects of cancer invasion.
Physiol. Rev., v. 83, n. 3, p. 337-76, 2003.
MAROCCHIO, L. S. et al. Oral squamous cell carcinoma: an analysis of 1,564 cases
showing advances in early detection. J. Oral Sci., v. 52, n. 2, p. 267-73, 2010.
MARTINS NETO, M. Sistemas de graduação histopatológica de malignidade (SGHM)
do carcinoma espinocelular. Revisão de literatura e sua importância dentro do contexto
da estomatologia. Rev. Odonto Ciênc., v. 28, p. 97-106, 1999.
MASSANO, J. et al. Oral squamous cell carcinoma: review of prognostic and predictive
factors. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., v. 102, n. 1, p. 6776, 2006.
Mc CAWLEY, L.; MARTRISIAN, L. M. Matrix metallo-proteinase:multifunctional
contributors to tumor profression. Mol. Med. Today, v. 6, n. 4, p. 149-56, 2000.
MENDES, A. I. et al. Protein kinase WNK1 promotes cell surface expression of glucose
transporter GLUT1 by regulating a Tre-2/USP6-BUB2-Cdc16 domain family member 4
(TBC1D4)-Rab8A complex. J. Biol. Chem., v. 258, n. 50, p. 39117-26, 2010.
METZEN, E. et al. Intracellular localization of human HIF-1α hydroxylases :
implications for oxygen sensing. J. Cell Sci., v. 116, n. 7, p. 1319-26, 2003.
MINETA, H. et al. Prognostic value of glucose transporter 1 expression in patients with
hypopharyngeal carcinoma. Anticancer Res., v. 22, n. 6B, p. 3489-94, 2002.
MIRANDA, J. L. Expressão das proteínas da matriz extracelular em carcinomas
epidermóides de língua e lábio inferior. 2002, 110f. Tese (Doutorado em Patologia
Oral) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2002.
149
MONTORO, J. R. M. C. et al. Prognostic factors in squamous cell carcinoma of the oral
cavity. Rev. Bras. Otorrinolaringol., v. 74, n. 6, p. 861-6, 2008.
MORI, Y. et al. Glucose transporter type expression are associated with poor prognosis
in patients with salivary gland tumors. Oral Oncol., v. 43, n. 6, p. 563-9, 2007.
MOTTET, D. et al. Regulation of hypoxia-inducible factor-1alpha protein level during
hypoxic conditions by the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase
3beta pathway in HepG2 cells. J. Biol. Chem., v. 278, n. 33, p. 31277-85, 2003.
NASCIMENTO, G. J. F. et al. Estudo epidemiológico de 2.147 casos de lesões
bucomaxilofaciais. Rev. Bras. Patol. Oral, v. 4, n. 2, p. 1-8, 2005.
NEVILLE, B. W. et al. Patologia Oral & Maxilofacial. 2. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2009. 798p.
NITHYA, C. S. et al. Patterns of cervical metastasis from carcinoma on the tongue.
Wold J. Surg. Oncol. (Online), v. 1, n. 1, p. 10-5, 2003.
NOGUCHI, M. et al. Invasive front in oral squamous cell carcinoma: image and flow
cytometric analysis with clinopathologic correlation. Oral Surg. Oral Med. Pathol.
Oral Radiol. Endod., v. 93, n. 6, p. 682-87, 2002.
O’REGAN, E. M. et al. Squamous cell carcinoma of the head and neck in young Irish
adults. Br. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 44, n. 3, p. 203-6, 2006.
OGANE, N. et al. Clinicopathological implications of expressions of hypoxia-related
molecules in esophageal superficial squamous cell carcinoma. Ann. Diagn. Pathol., v.
14, n. 1, p. 23-9, 2010.
OHBA, S. et al, Overexpression of GLUT-1 in the invasion front is associated with
depth of oral squamous cell carcinoma and prognosis, J. Oral Pathol. Med., v. 39, n.1,
p. 74-9, 2010.
OKADA, Y. et al. An analysis of cervical lymph nodes metastasis in oral squamous cell
carcinoma. Relationship between grade of histopathological malignancy and lymph
nodes metastasis. Int. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 32, n. 3, p. 284-8, 2003.
OLIVEIRA, N. C. et al. HPV e carcinogênese oral: revisão de bibliografica. Res. Bras.
Otorrinolaringol., v. 64, n. 4, p. 553-9, 2003.
OLIVER, R. J. et al. Prognostic value of facilitative glucose transporter Glut-1 in oral
squamous cell carcinomas treated by surgical resection; results of EORTC Translational
Research Fund studies. Eur. J. Cancer, v. 40, n. 4, p. 503-7, 2004.
OLSON, A. L.; PESSIN J. E. Structure, function, and regulation of the mammalian
facilitative glucose transporter gene family. Annu. Rev. Nutr., v. 16, p. 235-56, 1996.
150
PAIVA, M. D. E. B. et al. A retrospective study of oral complications of cancer therapy
in patients of the Napoleão Laureano Hospital. Odontol. Clín. Cientic., v. 6, n. 1, p. 5155, 2007.
PARKKILA, S. et al. Carbonic anhydrase inhibitor suppresses invasion of renal cancer
cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., v. 97, n. 5, p. 2220-24, 2000.
PASTOREKOVA, S. et al. Carbonic anhydrases: current state of the art, therapeutic
applications and future prospects. J. Enzyme Inhib. Med. Chem., v. 19, n. 3, p. 199229, 2004.
PASTOREKOVA, S.; PASTOREK, J. Cancer-related carbonic anhydrase isozymes and
their inhibition. In: Supuran CT, Scozzafava A, Conway J, editors. Carbonic anhydrase
its inhibitors and activators. Boca Raton, FL: CRC Press; p. 255-81. 2004.
PATIAR, S.; HARRIS, A. L. Role of hypoxia-inducible factor-1alpha as a cancer
therapy target. Endocr. Relat. Cancer, v. 13, n. 1, p. S61–75, 2006.
PEDERSEN, M. W. et al Coregulation of glucose uptake and vascular endothelial
growth factor (VEGF) in two small-cell lung cancer (SCLC) sublines in vivo and in
vitro. Neoplasia, v. 3, n. 1, p. 80–7, 2001.
PORTER, S.; WAUGH, A. Comment on: oral cancer in young adults. Br. Dent. J., v.
188, n. 7, p. 366, 2000.
POUYSSEGUR, J.; LENORMAND, P. Fidelity and spatio-temporal control in MAP
kinase (ERKs) signalling. Eur. J. Biochem., v. 270, n. 16, p. 3291-9, 2003.
REGEZI, J. A.; SCIUBBA, J. J.; JORDAN, R. C. K. Patologia bucal: Correlações
clínicopatológicas. 5ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. 417p.
REISSER, C. et al. Expression of facilitative glucose transport proteins during
development of squamous cell carcinomas of the head and neck. Int. J. Cancer, v. 80,
n. 2, p. 194-8. 1999.
RIBEIRO, A. C. P. et al. Clinical and histopathological analysis of oral squamous cell
carcinoma young people a descriptive study in Brazilians. Br. J. Oral Maxillofac.
Surg., v. 47, n. 2, p. 95-8, 2009.
RICHARD, D. E. et al. p42/p44 mitogen-activated protein kinases phosphorylate
hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) and enhance the transcriptional activity of HIF-1.
J. Biol. Chem., v. 274, n. 46, p. 32631-7, 1999.
ROH, J. L. et al. The prognostic value of hypoxia markers in T2-staged oral tongue
cancer. Oral Oncol.¸ v. 45, n. 1, p. 63-8, 2009.
ROH, J. L. et al. The prognostic value of hypoxia markers in T2-staged oral tongue
cancer. Oral Oncol., v. 45, n. 1, p. 63-8, 2009.
151
RUSTHOVEN, K. E. et al. Survival and patterns of relapse in pacients with oral tongue
cancer. J. Oral maxillofac., v. 68, n. 3, p. 584-9, 2010.
RYU, M. H. et al. Hypoxia-inducible factor-1alpha mediates oral squamous cell
carcinoma invasion via upregulation of alpha5 integrin and fibronectin. Biochem.
Biophys. Res. Commun., v. 393, n. 1, p. 11-5, 2010.
SALEM, A. Dismissing links between HPV and aggressive tongue cancer in young
patients. Ann. Oncol., v. 21, n. 1, p 13-7, 2010.
SALLA, J. T. et al. Immunohistochemical study of GLUT-1 in oral peripheral nerve
sheath tumors. Oral Dis., v. 14, n. 6, p. 510-3, 2008.
SANTOS, L. C. O. et al. Oral cancer: population sample of the state of Alagoas at a
reference hospital. Braz. Dent. J., v. 75, n. 4, p. 524-9, 2009.
SASABE, E. et al. Mechanism of HIF-1alpha-dependent suppression of hypoxiainduced apoptosis in squamous cell carcinoma cells. Cancer Sci., v. 96, n. 7, p. 394402, 2005.
SAWAIR, F. et al. Invasive front grading: reliability and usefulness in the management
of oral squamous cell carcinoma. J. Oral Pathol. Med., v. 32, n. 1, p. 1-9, 2003.
SCHEEPERS, A.; JOOST, H. G.; SCHURMANN, A. The glucose transporter families
SGLT and GLUT: molecular basis of normal and aberrant function. JPEN J. Parenter.
Enteral. Nutr., v. 28, n. 5, p. 364-71, 2004.
SCHRIJVERS, M. L. et al. Overexpression of intrinsic hypoxia markers HIF1alpha and
CA-IX predict for local recurrence in stage T1-T2 glottic laryngeal carcinoma treated
with radiotherapy. Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys., v. 72, n. 1, p. 161-9, 2008.
SCULLY, C.; BAGAN, J. V. Oral squamous cell carcinoma: overview of current
understanding of aetiopathogenesis and clinical implications. Oral Dis., v. 15, n. 6, p.
388-99, 2009.
SEMENZA, G. L. Development of novel therapeutic strategies that target HIF-1.
Expert. Opin. Ther. Targets, v. 10, n. 2, p. 267–80, 2006.
SEMENZA, G. L. Expression of hypoxia-inducible factor 1: mechanisms and
consequences. Biochem. Pharmacol., v. 59, n. 1, p. 47-53, 2000.
SEMENZA, G. L. Trageting HIF-1 for cancer teraphy. Nat. Rev. Cancer, v. 3, n. 10, p.
721-32, 2003.
SHERIN, N. et al. Changing trends in oral cancer. Indian J. Cancer, v. 45, n. 3, p. 936, 2008.
152
SILVEIRA, E. J. D. et al. Analysis of local immunity in squamous cell carcinoma of the
tongue and lower lip. Exp. Mol. Pathol., v. 88, n. 1, p. 171-5, 2010.
SILVEIRA, E. J. D. et al. Correlation of clinical, histological and cytokeratin profiles of
squamous cell carcinoma of the tongue with prognosis. Int. J. Surg. Pathol., v.15, n. 4,
p. 376-83, 2007.
SMITH, G. T.; ROBBINS, P. A.; RATCLIFFE, P. J. The human side of hypoxiaiducible factor. Br. J. Haematol., v. 141, n. 3, p. 325-34, 2008.
SOARES, C. P. et al. Presence of human papillomavirus in malignant oral lesions. Rev.
Soc. Med. Trop., v. 35, n. 5, p. 439-44, 2002.
SOARES, H. A. Manual de câncer bucal. 1. ed. São Paulo: Serrano Ltda, 2005. 67p.
STURGIS, E. M. et al. Neoadjuvant chemotherapy for squamous cell carcinoma of the
oral tongue in young adults: a case series. Head Neck, v. 27, n. 9, p. 748-56, 2005.
TANAKA, N. et al. Expression of carbonic anhydrase 9, a potential intrinsic marker of
hypoxia, is associated with poor prognosis in oesophageal squamous cell carcinoma.
Br. J. Cancer, v. 99, n. 9, p. 1468-75, 2008.
TIAN, H.; MCKNIGHT, S. L.; RUSSEL, D. W. Endothelial PAS domain protein 1
(EPAS1), a transcription factor selectivell expressed in endothelial cells. Genes Dev., v.
11, n. 1, p. 72-82, 1997.
TILAKARATNE, W. M. et al. Upregulation of HIF-1a in malignant transformation of
oral submucous fibrosis. J. Oral Pathol. Med., v. 37, n. 6, p. 372–77, 2008.
TOHMA, T. et al. Overexpression of glucose transporter 1 in esophageal squamous cell
carcinomas: a marker for poor prognosis. Dis. Esophagus, v. 18, n. 3, p. 185-9, 2005.
TROMP, D. M. et al. Patient and tumour factors associated with advanced carcinomas
of the head and neck. Oral Oncol., v. 41, n. 3, p. 313-9, 2005.
UEHARA, M. et al. Hypoxia-inducible factor 1 alpha in oral squamous cell carcinoma
and its relation to prognosis. Oral Oncol., v. 45, n. 3, p. 241-6, 2009.
VAN HEERDEN, W. F. P.; RAUBENHEIMER, E. J.; LE ROUX, R. Lack of
correlation between DNA ploidy, Langerhans cell population and grading in oral
squamous cell carcinoma. J. Oral Pathol. Med., v. 24, n. 2, p. 61-5, 1995.
VANDER HEIDEN, M. G.; CANTLEY, L. C.; THOMPSON, C. B. Understanding the
Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science, v. 324, n.
5930, p. 1039-33, 2009.
VARTATIAN, J. G. et al. Predictive factors and distribution of lymph node metastasis
in lip cancer patients and their implications on the treatment of the neck. Oral Oncol.,
v. 40, n. 2, p. 223-7, 2004.
153
VIVANCO, I.; SAWYERS, C. L. The phosphatidylinositol 3-Kinase AKT pathway in
human cancer. Nat. Rev. Cancer, v. 2, n. 7, p. 489-501, 2002.
VULLO, D. et al. Carbonic anhydrase inhibitors. Inhibition of the transmembrane
isozyme XII with sulfonamides-a new target for the design of antitumor and
antiglaucoma drugs? Bioorg. Med. Chem. Lett., v. 15, n. 4, p. 963-9, 2005.
WAHI, P. M. Tipos histológicos de tumores orales y orofaringeos. Ginebra:
Organizacion Mundial de La Salud, 1971.
WANG, X. et al. Intratumor genomic heterogeneity correlates with histological grade of
advanced oral squamous cell carcinoma. Oral Oncol., v. 42, n. 7, p. 740-44, 2006.
WANG, Y. et al. Reasons for recurrence and prognostic analysis of early stage
squamous cell carcinoma of the oral tongue. Ai Zheng, v. 28, n. 5, p. 524-7, 2009.
WENGER, R. H.; STIEHL, D. P.; CAMENISCH, G. Integration of oxygen signalling at
the consensus HER. Sci. STKE, n. 306, re 12, 2005.
WOOLGAR, J. Histophatological prognosticators in oral and oropharyngeal squamous
cell carcinoma. Oral Oncol., v. 42, n. 3, p. 229-39, 2006.
YOUNES, M. et al. Overexpression of Glut1 and Glut3 in stage 1 nonsmall cell lung
carcinoma is associated with poor survival. Cancer, v. 80, n. 6, p. 1046-51, 1997.
ZHAO, F.Q.; KEATING, A. F. Functional properties and genomics of glucose
transporters. Curr. Genomics, v. 8, n. 2, p. 113-28, 2007.
ZHU, G. Q. et al. Hypoxia inducible factor 1{alpha} and hypoxia inducible factor
2{alpha} play distinct and functionally overlapping roles in oral squamous cell
carcinoma. Clin. Cancer Res., v. 16, n. 19, p. 4732-41. 2010.
154
“Para realizar um sonho é preciso esquecê-lo, distrair dele a atenção.
Por isso realizar é não realizar.”
(Fernando Pessoa)
APÊNDICES
155
APÊNDICE 1
Dados clínicos a partir de análises dos prontuários, como sexo, idade, raça, TNM,
metástase e desfecho
Caso N°
Sexo
Idade
Raça
TNM
Metástase
Desfecho
APÊNDICE 2
Ficha de avaliação da gradação histológica de malignidade do CEL
Caso Nº
Grau de
Pleomorfismo
Padrão de
Infiltrado
Escore
Gradação
ceratinização
nuclear
invasão
inflamatório
total
histológica
156
APÊNDICE 3
Ficha de avaliação da expressão imuno-histoquímica dos anticorpos anti-HIF-1α, antiGLUT-1 e CA-IX em CEL.
Anticorpo__________
Tipo celular
Loc. celular
Parênquima
Loc. na ilha
Distribuição
tumoral
Estroma
Focal
Parênq. Estroma Centro Periferia
Nº
Caso
Intensidade
Difusa
0
1
2
157
“Só existe dois dias no ano que nada pode ser feito. Um se chama
ontem e o outro se chama amanhã, portanto hoje é o dia certo para
amar, acreditar, fazer e principalmente viver.”
(Dalai Lama)
ANEXOS
158
Anexo 1
159
160
Anexo 2
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Este é um convite para você participar da pesquisa “Marcadores de hipóxia em
carcinoma epidermóide de língua", sob a orientação da Profª. Drª. Lélia Maria
Guedes Queiroz. Sua participação é voluntária (você só participa, se quiser), o que
significa que você poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento,
sem que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade. Essa pesquisa procura avaliar
proteínas (substâncias) presentes em câncer de boca com a finalidade de entender o
desenvolvimento e a progressão desta doença (forma como a doença se comportará).
Caso você decida aceitar o convite, não irá passar por nenhum tratamento clínico nem
fará nenhuma cirurgia, sendo assim os riscos e o desconforto da sua participação serão
mínimos. Iremos utilizar o material que já foi removido da sua boca durante biópsia
(cirurgia para retirada de tumor). Sua participação é muito importante, pois assim
podemos conhecer mais sobre essa doença e caso exista alguma mudança no seu
diagnóstico, você será comunicado e será providenciado o seu tratamento. Todas as
informações colhidas ficarão guardadas em local seguro e seu nome não será
identificado em nenhum momento.
161
Se você tiver algum gasto que seja devido à sua participação na pesquisa, você
será ressarcido. Se você sofrer algum dano, comprovadamente decorrente desta
pesquisa, terá direito a indenização.
Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a
respeito desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para, Profª. Drª. Lélia Maria
Guedes Queiroz no Departamento de Odontologia da UFRN, no endereço Av. Sen.
Salgado Filho, nº 1787, Lagoa Nova, Natal – RN ou pelo telefone (84)3215-4138.
Dúvidas a respeito da ética dessa pesquisa poderão ser questionadas ao Comitê de Ética
em Pesquisa da UFRN, localizado no Campus Universitário da UFRN, ou pelo telefone
(84)3215-3135.
Consentimento Livre e Esclarecido
Eu,_____________________________________________________________,
declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e
benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa
“Marcadores de hipóxia em carcinoma epidermóide de língua”.
__________________________________________________________
Assinatura do Participante
__________________________________________________________
Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz
Pesquisadora Responsável
Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787. Lagoa Nova, Natal/RN. CEP – 59056-000
Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN (Tel: 84-32153135)
162