1 introdução - Faculdade de Biomedicina

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
BRUNO JOSÉ MARTINS DA SILVA
ESTUDO DO EFEITO IMUNOMODULADOR DO EXTRATO AQUOSO
PROVENIENTE DA RAIZ DA PLANTA Physalis angulata SOBRE
CÉLULAS OBTIDAS DA MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS
BELÉM-PARÁ-BRASIL
2012
BRUNO JOSÉ MARTINS DA SILVA
ESTUDO DO EFEITO IMUNOMODULADOR DO EXTRATO AQUOSO
PROVENIENTE DA RAIZ DA PLANTA Physalis angulata SOBRE
CÉLULAS OBTIDAS DA MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS
Trabalho de conclusão de curso apresentado à
Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal
do Pará, como requisito parcial para a obtenção do
grau de Bacharel em Biomedicina.
Orientadora: Profª Drª Edilene Oliveira da Silva
BELÉM-PARÁ-BRASIL
2012
BRUNO JOSÉ MARTINS DA SILVA
ESTUDO DO EFEITO IMUNOMODULADOR DO EXTRATO AQUOSO
PROVENIENTE DA RAIZ DA PLANTA Physalis angulata SOBRE
CÉLULAS OBTIDAS DA MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS
Trabalho de conclusão de curso apresentado à
Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal
do Pará, como requisito parcial para a obtenção do
grau de Bacharel em Biomedicina.
_____________________________________________
Orientadora: Profª. Drª. Edilene Oliveira da Silva
Instituto de Ciências Biológicas – ( ICB - UFPA)
_____________________________________________
Membro: Prof. Dr. Antonio Carlos Rosário Vallinoto
Instituto de Ciências Biológicas – (ICB – UFPA)
______________________________________________
Membro: Prof. Dr. Marcelo de Oliveira Bahia
Instituto de Ciências Biológicas – (ICB – UFPA)
_______________________________________________
Suplente: Prof. Dr. Sergio Marcelo Rodríguez Málaga
Instituto de Ciências Biológicas – (ICB – UFPA)
Belém, PARÁ, 10 de dezembro de 2012.
i
“Se o conhecimento pode criar problemas, não
é através da ignorância que podemos
solucioná-los”
(Isaac Asimov)
ii
À Deus pelo discernimento concedido e por sempre
iluminar os meu passos nessa longa jornada.
Aos meus familiares, pela força nos momentos
mais difíceis, carinho e compreensão. OBRIGADO!
iii
AGRADECIMENTO
Primeiramente à Deus pela força, conforto e discernimento concedido ao longo
desses 4 anos de graduação.
A minha família, minha mãe Angelita, irmãs Ana Regina e Regiane, irmão Junior
e meus sobrinhos Yuri, Carol, Bianca e Gabriel por todo incentivo, amor e dedicação dados
nos momentos tristes e felizes dessa trajetória.
À minha orientadora Profª. Edilene Oliveira da Silva pela excelente orientação e
oportunidade concedida em participar desse grupo de pesquisa. Obrigado professora pelo voto
de confiança!
À Ana e o Luis pelas imensas, longas e demoradas montagens e discussões de
protocolos. As contribuições de vocês dois foram fundamentais e essenciais para a minha
formação e melhora na conduta técnica no grupo de pesquisa.
À Raquel a primeira pessoa com quem conversei no laboratório, e que posteriormente veio a se tornar minha supervisora e auxiliadora nos experimentos. Muito obrigado
Raquel pelo companheirismo e paciência em ajudar nos “milhões” de experimento que eu
queria realizar ao mesmo tempo.
À Amanda, pela imensa paciência de analisar minhas “poucas” amostras no citômetro. Amanda aprendi a ser mais calmo e paciente com você.
À Neide, obrigado por me ensinar a arte de se desesperar por antecipação...rsrsrs,
obrigado pelo companheirismo, pela companhia em alguns experimentos, pelas várias idéias
oferecidas para complementar o meu trabalho, e também por toda força e pelas bonitas palavras de conforto dadas em alguns momentos de tristezas e desânimo. Obrigado também pelos
convites em participar das feiras de ciências e palestras realizadas na escola MAC, elas foram
de imensa importância para o meu crescimento profissional.
À Carol, minha parceira de experimento, obrigado pelo companheirismo na obtenção das células da medula, por aturar a minha imensa chatice todas as segundas- feiras as 7
horas da manhã. Isso não é pra qualquer um, você é muito guerreira..rsrsrs...
À Paula, amiga desde o terceiro semestre do curso, fico feliz em ter conhecido você e poder participar do mesmo grupo de pesquisa. Obrigado pelo sua companhia, pelos vários momentos felizes e de muitas loucuras que tive ao seu lado. Muito obrigado Paula pela
sua amizade e de sempre estar por perto quando mais precisei, para fazer um cafezinho ou uns
favorzinhos..rsrsrs....
iv
À Lienne e o Jorge obrigado pela correção do TCC, suas dicas foram de suma importância para o enriquecimento do trabalho, e também obrigado pelos vários momentos de
descontração que tivemos ao longo desse ano.
Ao Rodrigo, Davi, Aprígio e Camila pela companhia e momentos descontraídos
no laboratório.
Ao Dr. José Antonio Picanço Diniz do Instituto Evandro Chagas, por permitir a
utilização do microscópio óptico do laboratório de miscroscopia.
À Fernanda por todo suporte oferecido na preparação dos fixadores utilizados.
Ao professor Chubert, pela ajuda no manuseio dos equipamentos do LBE.
A professora Suzane do Laboratório de Citogenética pela ajuda fornecida no manuseio no microscópio de imunofluorescência.
A CAPES, ao CNPq e ao INCT de Biologia Estrutural e Bioimagem (INBEB), pe-
lo apoio financeiro, que auxiliou na exceução desse trabalho.
E também não posso deixar de agradecer aos meus amigos camundongos, pois
sem as suas células a realização desse trabalho seria impossibilitada.
E por fim, a todos que contribuíram de alguma forma para a concretização desse
trabalho.
v
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS E FIGURAS.......................................................................................viii
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS.........................................................................x
RESUMO.................................................................................................................................xii
ABSTRAT...............................................................................................................................xiii
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
1.1 ASPECTOS GERAIS ...................................................................................................... 1
1.2 MEDULA ÓSSEA .......................................................................................................... 2
1.3 CÉLULAS DIFERENCIADAS ........................................................................................ 4
1.3.1 Eritrócitos ..................................................................................................................... 4
1.3.2 Linfócitos ...................................................................................................................... 5
1.3.3 Granulócitos .................................................................................................................. 6
1.3.4 Monócitos ..................................................................................................................... 7
1.3.5 Células Dendríticas ....................................................................................................... 9
1.3.6 Macrófagos ................................................................................................................. 10
1.4 IMUNOMODULADORES ............................................................................................ 13
1.5 GÊNERO PHYSALIS ..................................................................................................... 14
2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 16
2.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................................... 16
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 16
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 17
3.1 PREPARO DO EXTRATO AQUOSO DA PLANTA .................................................... 17
3.2 OBTENÇÃO E CULTIVO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA ........................... 17
3.3 CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS
............................................................................................................................................ 18
3.4 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA ............... 18
3.4.1 Método Thiazolyl Blue (MTT) .................................................................................... 18
3.4.2 Detecção de potencial da membrana mitocondrial (JC-1)...............................................19
3.5 CONTAGENS DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DO SOBRENADANTE .......... 20
3.6 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA TRATADAS
COM EAPa APÓS ADESÃO AO SUBSTRATO ................................................................ 20
3.6.1 Microscopia Óptica ..................................................................................................... 20
vi
3.7
IMUNOFENOTIPAGEM................................................................................................21
3.7.1 Detecção de marcadores de superfície celular por imunofluorescência .........................21
3.7.2 Detecção de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo...........................21
3.8 RESPOSTA MICROBICIDA DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA TRATADAS
COM EAPa .......................................................................................................................... 22
3.8.1 Dosagem da produção de óxido nítrico por células da medula tratadas com EAPa ....... 22
3.8.2 Dosagem da produção de radicais superóxidos pelas células da medula óssea tratada
com EAPa ............................................................................................................................ 22
3.8.3 Interação de Saccharomyces cerevisiae com células da medula tratadas com EAPa ..... 22
3.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................. 23
4 RESULTADOS ................................................................................................................ 24
4.1 CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGO 24
4.2 VIABILIDADE CELULAR ........................................................................................... 27
4.2.1 Método triazolyl blue (MTT) ....................................................................................... 27
4.2.2 Detecção do potencial de membrana mitocondrial (JC-1) ............................................ 28
4.3 CONTAGEM DAS CÉLULAS DO SOBRENADANTE ............................................... 29
4.4 ANÁLISE MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA ÓPTICA DAS CÉLULAS DA
MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS TRATADAS COM EAPA ............................... 30
4.4.1 Análise quantitativa das células aderidas cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas.............. 30
4.4.1.1 Linfócitos ................................................................................................................. 30
4.4.1.2 Polimorfonucleares ................................................................................................... 31
4.4.1.3 Célula com núcleo em anel ....................................................................................... 32
4.4.1.4 Monócitos ................................................................................................................ 33
4.4.1.5 Macrófagos residentes .............................................................................................. 34
4.4.1.6 Macrófagos ativados ................................................................................................. 35
4.4.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS CÉLULAS ADERIDAS ....................................... 36
4.4.2.1 Análise das células aderidas e cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas.............................37
a) Marcação com CD11b...................................................................................................... 41
b) Marcação com CD11c...................................................................................................... 44
4.4.4 CITOMETRIA DE FLUXO ........................................................................................ 47
a) Marcação com CD11b...................................................................................................... 49
b) Marcação com CD11c...................................................................................................... 48
4.4.5 RESPOSTA MICROBICIDA DAS CÉLULAS DA MEDULA TRATADAS COM
EAPa ................................................................................................................................... 49
vii
4.4.5.1 Dosagem da produção de óxido nítrico por células da medula tratadas com EAPa .... 49
4.4.5.2 Produção de radicais de oxigênio pelas células da medula tratadas com EAPa .......... 50
4.4.5.3 Interação de Sacharomyces cerevisiae com células da medula tratadas com EAPa ... 51
5 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 52
6 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 58
7 REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 59
8. ANEXO.................................................................................................................................67
viii
LISTA DE TABELAS E FIGURAS
Figura 1. Processo de diferenciação celular das células da medula óssea. ............................... 4
Figura 2. Processo de diferenciação de monócitos a partir de uma célula tronco ..................... 8
Figura 3. (A) Processo de diferenciação e maturação dos monócitos (B) As diferentes
denominações dos macrófagos nos vários tecidos do organismo...............................................9
Figura 4. Desenho esquemático da síntese do NO... .............................................................. 12
Figura 5. (a) Planta Physalis angulata (Pa). (b) fruto da planta Pa.. ..................................... 14
Figura 6. Caracterização das células da medula óssea. . ........................................................ 25
Figura 7. Viabilidade celular pelo método MTT em células da medula óssea mantidos em
cultivo e tratadas com EAPa por 24, 48, 72 e 96 hora ......................................................... 27
Figura 8. Análise do potencial de membrana mitocondrial das células da medula óssea cultivadas e tratadas com EAPa por 96 horas..................................................................................28
Figura 9. Análise das células dos sobrenadantes dos quatro grupos de estudo. ...................... 29
Figura 10. Contagem percentual do número de linfócitos em culturas de células da medula
óssea cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas. ........................................................................... 30
Figura 11. Contagem percentual do número de PMNs em culturas de células da medula óssea
cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas...................................................................................... 31
Figura 12. Contagem de CNA presentes em cultura de células da medula óssea de murino
mantidas em cultivo por 24, 48, 72 e 96 horas.. .................................................................... 32
Figura 13. Contagem dos MO aderentes presentes em cultura de células da medula óssea de
murino mantidas em cultivo por 24, 48, 72 e 96 horas. ......................................................... 33
Figura 14. Contagem do número de MR em culturas de células da medula óssea cultivadas
por 24, 48, 72 e 96 horas. ..................................................................................................... 34
Figura 15. Contagem percentual do número de MA em culturas de células da medula óssea
cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas...................................................................................... 35
Figura 16. Análise das células da medula tratadas por 24 horas. ........................................... 37
Figura 17. Análise das células da medula tratadas com EAPa por 48 horas. .......................... 37
Figura 18. Análise das células da medula tratadas por 72 horas. ........................................... 39
Figura 19. Análise das células da medula tratadas por 96 horas. ........................................... 39
Figura 20. Detecção do marcador de superfície CD11b em cultura de células da medula óssea
mantidas em cultura e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. ...... 42
Figura 21. Detecção do marcador de superfície CD11c em cultura de células da medula óssea
mantidas em cultura e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas...........................................................................................................................................................................45
ix
Figura 22. Detecção do marcador de superfície CD11b em cultura de células da medula óssea
mantidas em cultura e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. ...... 47
Figura 23. Detecção do marcador de superfície CD11c em cultura de células da medula óssea
mantidas em cultura e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas..............................................................................................................................................48
Figura 24. Gráfico da dosagem de NO de células tratadas com EAPa. .................................. 49
Figura 25. Quantificação das células marcadas positivamente com NBT. ............................. 50
Figura 26. Índice endocítico da interação de células da medula óssea com Saccharomyces
cerevisae tratadas com 100 µg/mL de EAPa......................................................................... 51
x
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ºC – Graus Celsius
µg/mL – Microgramas por mililitros
µL – Microlitros
µm – Micrometros
APC – Célula apresentadora de antígenos
BSA – Bovina serum albumin
CDs – Células dendríticas
CFU-GM – Unidade formadora de colônia grânulo-monocítica
CFU-M – Unidade formadora de colônia monocítica
CNA – Célula com núcleo em anel
CTH- Célula tronco hematopiética
DAPI – Diamino fenilindole
DMEM – Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
EAPA – Extrato aquoso de Physalis angulata
EPO - Eritropoietina
FEC’s – Fator estimulante de colônias
GM-CSF – Sigla inglesa para fator estimulante de colônia granulócito/macrófago/monócito
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
IgE –Imunoglobulina E
IL – Interleucina
INF-γ – Interferon –γ
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida
LB – Linfócitos B
LT – Linfócitos T
LPS - Lipopolissacarídeo
MA – Macrófagos ativados
M-CSF – Sigla inglesa para fator estimulante de colônia de macrófagos
M-CSFR – Sigla inglesa para receptor do M-CSF
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
mg/mL – Miligramas por mililitros
MO- Monócitos
xi
MR – Macrófagos residentes
MTT – Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatase hidrogenase
NH4Cl – Cloreto de amônio
NK – Natural killers
nm – Nanômetros
NO – Óxido nítrico
O2 – Íon superóxido
OH- – Radical hidroxila
PBS – Sigla inglesa para tampão fosfato salino
PMC – Progenitores Mielóide comum
ROS – Radicais de oxigênio
SBF – Soro bovino fetal
TGF-β – Sigla inglesa para fator modulador de crescimento
TNF-α – Sigla inglesa para fator de necrose tumoral
TCR – Sigla inglesa para receptor de célula T
xii
RESUMO
A medula óssea é um tecido hematopoiético abastecido pelos seios sinusóides, que na presença de citocinas e fatores de crescimento as células desse tecido sofrem o processo de proliferação e diferenciação gerando todas as células sanguíneas circulantes. Estas células são importantes para a proteção do organismo contra agentes patogênicos e para o estabelecimento
de uma resposta imune eficaz. Medicamentos com ação imunomoduladora são bastante utilizados para restabelecer um organismo com um sistema imune alterado, fazendo assim importante a busca de novas substâncias com ação imunomodulatória, que sejam de baixo custo, e
capazes de promover a proliferação e diferenciação das células da medula óssea sem causar
dano a mesma. Neste contexto se destaca a planta Physalis angulata, que é utilizado na medicina popular como analgésico, antireumático e antitérmico. Este trabalho tem como objetivo
avaliar ação do extrato aquoso da planta Physalis angulata (EAPa) sob as células da medula
óssea de camundongos. Estas células foram obtidas por lavagem dos fêmures, mantidas em
culturas e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL. Foi possível observar por microscopia óptica que EAPa estimula o processo de adesão celular, e na análise morfológica foi
observado que as células tratadas apresentaram maior espraiamento celular e maior volume
citoplasmático. Além disso, EAPa não promoveu a proliferação de linfócitos e polimorfonucleares, e nem o aumento do número de macrófagos ativados e residentes ao longo do tempo
de cultura. Na imunofenotipagem realizada por imunofluorescência e citometria de fluxo, a
marcação para CD11b, marcador específico de fagócitos mononucleares, revelou que EAPa
parece estimular o processo de diferenciação das células da medula óssea em macrófagos. A
imunofenotipagem para CD11c, marcador de células dendríticas, mostrou que EAPa não estimulou a diferenciação das células tratadas em células dendríticas. Alem disso, a análise da
resposta microbicida mostrou um aumento de células marcadas positivamente com Nitro Blue
Tetrazolium (NBT), mostrando que EAPa apresenta a capacidade promover ativação das células da medula via aumento da produção de radicais superóxidos, porém não foi observado
aumento da produção de óxido nítrico e nem da atividade fagocíticas das células tratadas. A
análise da viabilidade celular mostrou que EAPa não apresentou efeito citotóxico para as células da medula óssea. Os resultados demonstram que EAPa consegue promover a diferenciação
das células da medula em macrófagos e sua ativação em apenas 96 horas de cultivo. Desse
modo, a partir dos resultados obtidos é possível concluir que o extracto aquoso da planta
Physalis angulata pode ser usado como um agente imunomodulador.
Palavras-chave: Proliferação e diferenciação celular, Medula óssea, Physalis angulata
xiv
xiii
ABSTRACT
The bone marrow is a hematopoietic tissue supplied by capillary sinusoids in the presence of
cytokines and growth factors that tissue cells undergo the process of proliferation and differentiation generating all circulating blood cells. These cells are important to protect the organism against pathogens and for establishing an effective immune response. With immunomodulating medications are still widely used to restore a body with a defective immune system,
thus important to search for new substances with immunomodulatory action, which are inexpensive, and can promote the proliferation and differentiation of bone marrow cells without
damage the same in this context stands the plant Physalis angulata, which is used in folk
medicine as an analgesic, anti-inflammatory and antirheumatic. This study aims to evaluate
the action of the aqueous extract of the plant Physalis angulata (EAPa) in the bone marrow
cells of mice. These cells were obtained by flushing femurs, and maintained in cultures treated with EAPa at a concentration of 100 mg/mL. It was observed by optical microscopy that
EAPa stimulates the process of cell adhesion. The morphological analysis showed higher cell
spreading and increased cytoplasmic volume in treated cells. Furthermore, it not promotes the
proliferation of lymphocytes and polymorphonuclear leukocytes, nor the increased number of
activated macrophages and resident along the culture time. In immunophenotyping performed
by immunofluorescence and flow cytometry, labeling CD11b, a marker specific for mononuclear phagocytes revealed that EAPa seems to stimulate the differentiation of bone marrow
cells in macrophages. In immunophenotyping using the CD11c marker, specific of dendritic
cells, showed that EAPa did not stimulate differentiation of the treated cells into dendritic
cells. The microbicidal response analysis showed an increase of cells positively stained with
nitro blue tetrazolium (NBT). Thus, EAPa has the ability to promote activation of bone marrow cells via increased production of superoxide radicals.On the other hand, we did not observed the production of nitric oxide nor increased the phagocytic activity of the treated cells.
No cytotoxic effect was observed in cells treated with EAPa when compared to the untreated
control. Finally, these results demonstrate that EAPa can promote the differentiation of bone
marrow cells into macrophages with activation in just 96 hours of culture and can be used as
an immunomodulator agent.
Key words: Cell proliferation and differentiation, Bone marrow, Physalis angulata
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. ASPECTOS GERAIS
A medula óssea está localizada na cavidade medular dos ossos longos, esterno,
ossos ilíacos e nas costelas. Este tecido é irrigado por vasos sanguíneos de paredes finas, conhecidos como seios sinusóides (Alberts et al., 2012). Em um indivíduo adulto, a medula óssea é o local de geração de todas as células sangüíneas circulantes (Cesar et al., 2008). Essas
células têm origem comum, porém em função de estímulos específico, promovido por citocinas e fatores de crescimento, adquirem morfologia e funções distintas (Geissmann et al.,
2010). Um microambiente medular favorável para a realização da hematopoiese é constituído
por precursores das células sanguíneas, fibroblastos estromais, matriz extracelular, fatores de
crescimento e citocinas, sendo estas produzidas por macrófagos da medula óssea e pelas células estromais (Abbas et al., 2012).
As células tronco hematopoiéticas (CTH) presentes na medula óssea apresentam
extensivo potencial de auto-renovação e proliferação (Cesar et al., 2008). Estas células quando estimuladas por citocinas e fatores de crescimento, sofrem o processo de diferenciação/maturação, originando as células progenitoras mielóide e linfóide (Zanichelli et al.,
1995). Quando estimuladas, as células progenitoras mielóide, sofrem diferenciação e originam células dendríticas, células sanguíneas e macrófagos, enquanto que a linhagem linfóide
originará linfócitos T, linfócitos B, células natural killer (NK) e células dendríticas. (Zanichelli et al., 1995; Abdelhay et al., 2009).
Atualmente vários estudos vêm demonstrando que alguns produtos de origem natural são bastante eficazes na terapêutica de determinadas doenças e, são capazes de proporcionar uma resistência ao organismo frente algumas infecções, por promover o processo de proliferação e diferenciação das células da medula óssea (Pereira et al., 2004; Abud, 2006; Cesar,
2008; Guimarães et al., 2009; Luzakibanza et al., 2010). Desta forma, é importante a busca de
produtos naturais, de baixo custo, que possam ser utilizados em processos terapêuticos.
2
1.2. MEDULA ÓSSEA
A medula óssea é um tecido esponjoso, altamente irrigado por vários vasos sanguíneos, o que possibilita a locomoção dos precursores rumo a circulação (Abbas et al., 2012;
Alberts et al., 2004), estando localizada entre as trabéculas longas dos ossos longos. O espaço
existente entre as trabéculas é preenchido com células sanguíneas circulantes, fibroblastos
estromais e células gordurosas (Abbas et al., 2012). A medula óssea é dividida em três compartimentos de sistemas celulares: compartimento hematopoiético, epitelial e estromal (Deans
& Moseley, 2000; Owen, 1985). O sistema hematopoiético é composto pelos precursores das
células sanguíneas, tais células tem a capacidade de locomover-se rumo a circulação sanguínea após terem passado pelo processo de proliferação e diferenciação celular (Abbas et al.,
2012; Alberts et al., 2004).
O compartimento estromal é composto por macrófagos, fibroblastos, adipócitos, células endoteliais e reticulares. Alguns desses componentes, como macrófagos e fibroblastos
apresentam a capacidade de produzir várias citocinas hematopoiéticas, que juntamente com os
fatores estimulante de colônias (FEC’s) proporcionam um microambiente favorável para a
geração de todas as células circulantes, processo este denominado de hematopoiese (Owen,
1985; Zanichelli et al., 1995; Silveira, 2000; Abbas et al., 2012; Abdelhay et al., 2009). Este é
um processo complexo, que envolve fatores de crescimento e citocinas, resultando na geração
das células sanguíneas circulantes. No período intra-uterino o principal local de realização da
hematopoiese é o saco vitelínico, e com o avanço do desenvolvimento embrionário outros
órgãos começam a adquirir a capacidade de realização da hematopoiese. No período embrionário, fígado e baço já iniciam a fabricação das células sanguíneas e no quarto mês deste período, a medula óssea começa realizar a hematopoiese. Ao longo do período intra-uterino a
produção das células sanguíneas vai diminuindo no fígado e aumentando na medula óssea,
sendo que após o nascimento e durante toda vida do individuo esse tecido torna-se o principal
local de realização da hematopoiese (Silveira, 2000).
Como relatado anteriormente, a medula óssea é dividida em três compartimentos,
e um desses é o hematopoiético. O sistema hematopoiético comporta todos os tipos celulares
que participam do processo da hematopoiese, e esse sistema pode ser dividido em quatro
compartimentos de acordo com o grau de maturidade de cada tipo celular. No primeiro compartimento são encontradas as CTH, que compõe cerca de 0,01% da população total de células da medula óssea. As CTH são multipotentes, ou seja, podem gerar diferentes tipos celula-
3
res, apresentam a capacidade de promover auto-renovação, e podem gerar os progenitores
hematopoiéticos. Os progenitores correspondem a 0,5% das células residentes da medula e ao
contrário das CTH não podem realizar o processo de auto-renovação, porém são multipotentes, em alguns casos monopotentes, originando assim apenas um tipo celular e podem ser
classificados em mielóide e linfóide (Kondo et al., 1997; Mayani et al., 2007).
Os progenitores mielóides comuns (PMC) são originados por um processo que
ocorre na medula óssea denominado de mielopoese. PMC após amadurecimento se comprometem com uma linhagem de células específicas, esse comprometimento está relacionado
com o início da expressão de vários genes dentre os quais destacam-se: PU.1 , Hox , C / EBPa, C / C EBPb e / EPBe , RUNX1 e SCL. O aumento de expressão de um determinado gene
irá estimular a diferenciação dos progenitores mielóides a um tipo celular específico. Os progenitores mielóides vão dar origem aos neutrófilos, eosinófilos, basófilos (granulócitos), monócitos, plaquetas e eritrócitos, enquanto que os progenitores linfóides, originados através da
linfopoese, irão se diferenciar em linfócitos B, linfócitos T e células NK (Figura 1) (Zanichelli
et al., 1995; Mayani et al., 2007; Abdelhay et al., 2009; Abbas et al., 2012).
O terceiro compartimento é composto pelos precurssores das células sanguíneas, e
representam cerca de 90% da população total das células da medula óssea, e por fim, no quarto compartimento são encontradas células sanguíneas maduras, que irão se direcionar até a
circulação após completa maturação. Os neutrófilos se direcionam a circulação sanguínea
totalmente diferenciados, porém os monócitos só completam o processo de diferenciação
quando invadem os tecidos, onde se diferenciam em macrófagos ou células dendríticas (Mayani et al., 2007).
4
Figura 1: Processo de diferenciação celular das células da medula óssea (Modificado).
Fonte: Revista Scientific American- Edição especial ciência e saúde nª 3. 2006.
1.3. CÉLULAS DIFERENCIADAS
As células sanguíneas maduras são constituídas pelos eritrócitos, eosinófilos, basófilos, neutrófilos, linfócitos T (LT) e B (LB) e monócitos. Este último se diferencia em macrófagos ou células dendríticas nos diferentes tipos de tecidos.
1.3.1. Eritrócitos
Os eritrócitos, glóbulos vermelhos ou hemácias são originadas a partir dos precursores mielóides da medula óssea num processo conhecido como eritropoiese. Esse processo é
regulado positivamente por uma citocina denominada de eritropoietina (EPO). A EPO é sintetizada nos rins e em pequena quantidade no fígado, sendo responsável pelo processo de sobrevivência, proliferação e diferenciação dos percussores eritróides. Os ertitrócitos são caracterizados por serem um grupo de células bastante complexo, apresentam membrana celular e
citoplasma, porém não apresentam núcleo (Zago, 2001; Mayani et al., 2007) .
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Morfologicamente os eritrócitos são células com forma bicôncava, e medem em
média 7,5 µm de diâmetro por 2,6 µm de largura. Essas células são responsáveis por transportar a molécula de O2 devido apresentarem uma grande quantidade de hemoglobina em seu
citoplasma, e são encontradas em situações normais circulando no interior dos vasos sanguíneos, tendo uma vida útil de aproximadamente 120 dias (Junqueira & Carneiro, 2006).
Os eritrócitos maduros apresentam a expressão de proteínas na sua superfície como o TER-119 e o CD45, estes marcadores estão presentes nos eritrócitos desde estágio de
proeritroblasto (Kina et al., 2000).
1.3.2. Linfócitos
Os linfócitos são células sanguíneas formadas a partir dos precursores linfóides da
medula óssea, que além de se diferenciarem em LB e LT, também dão origem as células NK.
O processo de maturação e diferenciação dos linfócitos envolve a presença de várias citocinas
que vão atuar sobre os progenitores comprometidos estimulando a sua diferenciação e maturação. Durante este processo, várias citocinas estão envolvidas, como: IL-2, que participa da
maturação dos LB, LT e NK, a IL-4 e IL-6, participam da proliferação e maturação dos LB,
LT e a IL-7, estimula a proliferação dos LB (Roitt, 1999; Abbas et al., 2012)
Estas células são responsáveis por estabeler uma defesa imunológica do organismo, por meio da produção de anticorpos, sendo estes produzidos pelos LB e reconhecendo
diferentes antígenos ou agindo sobre as células infectadas por um agente agressor, mediado
pelos LT. Os linfócitos se diferem em relação ao local de maturação e função. As células T
ainda no estágio de células imaturas migram da medula óssea para o timo onde sofrem maturação. No fim desse processo apenas 5% dos linfócitos se tornam maduros expressando assim
em sua superfície moléculas CD4 ou CD8, tornando-se capaz de interagir com as células
apresentadoras de antígenos (APCs) e desenvolver a defesa imunológica. O processo de maturação dos LB ocorre na medula óssea, e após maduras migram para os órgãos linfóides secundários, onde são capazes de produzir anticorpos, fato esse que a torna uma célula importante
na participação da defesa imune humoral (Junqueira & Carneiro 2006; Mesquita-Junior et al.,
2010).
Uma etapa importante na maturação dos linfócitos é a formação dos receptores de
antígenos, feitos a partir de um processo de recombinação aleatória de DNA, envolvendo uma
enzima denominada recombinase V. Estes receptores que estão localizados na superfície dos
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linfócitos são diferentes para cada tipo celular, sendo os genes TCR expressos em LT, no qual
darão origem ao receptor TCR e os LB expressam genes de imunoglobulinas (Ig). Ambas as
células durante a formação desses receptores passam por um processo denominado de seleção
negativa, que é caracterizado pela eliminação dos linfócitos que apresentam receptores de
antígenos com alta afinidade para os antígenos do próprio organismo, evitando a autoimunidade (Roitt, 1999; Mesquita et al., 2010; Abbas., et al 2012).
Análise morfológica em microscopia óptica (MO) de campo claro mostra que linfócitos B e T apresentam pouco citoplasma, um núcleo grande com uma cromatina disposta
em grumos e poucas organelas citoplasmáticas. Morfologicamente os LB e LT não podem ser
diferenciados, porém técnicas de imunofenotipagem utilizando marcadores de proteinas de
superficies podem ser utilizados para realizar essa diferenciação (Lorenzi, 1999; Junqueira &
Carneiro, 2006).
1.3.3. Granulócitos
Os granulócitos são um grupo de células sanguíneas que apresentam grande diferença em relação a sua função e morfologia tendo origem a partir de um linagem formadora
de colônia grânulo-monocítica (CFU-GM). Após estímulos apropriados, geralmente proporcionados pelo fator estimulador de colônias de granulócitos/macrófago/monócito (GM-CSF), as
células imaturas vão se comprometer a uma linhagem específica e se diferenciar (Mayani et
al., 2007).
Os granulócitos são classificados em três tipos celulares: neutrófilos, eosinófilos e
basófilos. Os neutrófilos são polimorfonucleares (PMNs), apresentam em seu citoplasma um
número variável de núcleos, dois a cinco, unidos por ponte de heterocromatina. Estas células
são as primeiras a migrar para o local da infecção, realizando o processo de quimiotaxia. Os
PNNs são fagócitos profissionais e apresentam em seu citoplasma grânulos que podem ser
específicos e azurófilos, e apresentam enzimas que degradam agentes patogênicos, porém os
grânulos específicos também apresentam enzimas oxidantes e componentes essenciais para a
reposição da membrana plasmática (Falcão, 2001; Junqueira & Carneiro, 2008; Cruvinel et
al., 2010).
Os eosinófilos são granulócitos que apresentam em seu citoplasma grânulos que
coram em laranja-avermelhado, um núcleo com várias lobulações variando de 2 a 3 lóbulos.
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O seu número no sangue é aumentado em caso de infecções causadas por helmintos, em processos alérgicos e infecciosos (Rue, 2001; Savi, 2002).
Os basófilos são células que apresentam em seu citoplasma um rico conjunto de
grânulos eletro-densos e grandes, que quando corados adquirem uma cor preto-azulado. Diferente dos neutrófilos, os basófilos não são fagócitos profissionais, eles liberam no meio extracelular o conteúdo contido em seus grânulos. Esses grânulos são ricos em histamina, heparina
e fatores quimiotáticos para os neutrófilos e eosinófilos, e vale ressaltar que os basófilos expressam na superfície da sua membrana plasmática receptores FcεRI, sendo este ativado pelo
complexo imunogloubulina E (IgE) – antígeno. Este complexo apresenta uma importante contribuição em reações de hipersensibilidade imediata (Albert et al, 2004; Junqueira & Carneiro,
2008; Cruvinel et al., 2010).
1.3.4. Monócitos
Os monócitos são células pertencentes ao sistema de fagócitos mononucleraes,
constituem cerca de 3 a 8% dos leucócitos presentes no sangue e, morfologicamente, apresentam núcleo em forma de rim ou ferradura, citoplasma não volumoso apresentando finas granulações (Dickholt et al., 2010).
Trabalhos recentes na literatura mostraram que os monócitos circulantes apresentam capacidade de proteger o organismo contra patógenos através da fagocitose, aumento da
produção de radicais de oxigênio (ROS) e de nitrogênio (NO), aumento da produção da mieloperoxidade e de citocinas pró-inflamatórias, e em alguns casos, como em doenças autoimunes e em infecções graves apresentam atividade imunossupressora sobre as células T
(Serbina et al., 2008; Saha & Geissman, 2011).
Os monócitos apresentam um grupo de células bem heterogêneas, sendo divididos
em sub-grupos, levando em consideração seus marcadores de superfície CD14 e CD16, e
também existem trabalhos mostrando que os monócitos são caracterizados pela presença de
outro marcador, o Ly-6C, este é encontrado principalmente na superfície celular dos granulócitos. Os monócitos que expressam em sua membrana o Ly-6C (monócitos inflamatórios
GR1+), são recrutados mais rapidamente para o local da infecção e sofrem o processo de diferenciação e ativação celular. Esses monócitos diferenciados permanecem no local da inflamação por um período mais longo que os neutrófilos, sendo eficaz na eliminação do agente
agressor graças ao aumento da fagocitose, o qual estimula a liberação de citocinas, a produção
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de ROS e NO (Dale et al., 2008; Heitbrock et al., 2010; Geissman et al., 2010; Saha & Geissman., 2010). Em contraste, os monócitos que não expressam em sua superfície a proteína Ly6C não são recrutados no inicio da infecção e não estão associados com o desenvolvimento do
processo infeccioso (Figura 2) (Geissman et al., 2010).
PMNC
CD
TIP
Figura 2: Processo de diferenciação de monócitos a partir de uma Célula tronco hematopoiética (CTH), que origina
o precursor mielóide (MP) gerando os monócitos circulantes sanguíneos. Esses monócitos podem se diferenciar
nos diferentes tecidos em macrófagos ou células dendríticas. Vale evidenciar que os monócitos expressam em
superfície celular marcadores, o Ly-6c. Monócitos que apresentam esse marcador tem a capacidade de migrar mais
rapidamente para o local da infecção, chamado de monócito inflamatório, em contraste os monócitos que não apresentam Ly-6C não participam de imediato do processo inflamatório. Linhagem linfoide (LP), Linhagem mielóide
(LM), precursores de mononucleares (PMN), precursor de células dendríticas (PCD), pré-células dendríticas (PréCD), macrófagos (MØ), células supressoras derivadas da linhagem mielóide (CSDM) e CD que produzem mediadores inflamatórios (CDTIP).
Fonte: Geissmann et al. (2010) Modificado.
Os monócitos necessitam da presença de um fator de crescimento para poder se
desenvolver e circular pela corrente sanguínea. Esse fator de crescimento é denominado de
M-CSF (Fator estimulante de colônia de macrófagos), é produzido por macrófagos, monócitos e células dendríticas (CDs) (Auffray et al., 2009). Após três dias circulando no sangue, os
monócitos iniciam o processo de migração para os diversos tipos de tecidos, para assim, se
diferenciarem em macrófagos ou CDs. Esses macrófagos recebem denominações e funções
diferenciadas dependendo do tipo de tecido que eles se localizarão (Figura 3) (Trembicki et
al., 1984; Qureshi et al., 1995; Randolph et al., 2008).
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Figura 3: (A) Processo de diferenciação e maturação dos monócitos, resultando na diferenciação em macrófagos nos tecidos. (B) As diferentes denominações dos macrófagos nos vários tecidos do organismo.
Fonte: Mosser & Edwards, 2008 (Modificado).
1.3.5. Células Dendríticas
As células dendríticas são fagócitos mononucleares e APCs pertencente ao sistema imune inato. Essas células tem a capacidade de promover a ativação dos LT desencadeando assim o início da resposta imune (Steinman et al., 1974; Cella et al., 1997; Geissmann et
al., 2010). As CDs diferem nos tecidos em relação a sua localização, função, fenótipo dos
marcadores de superfícies, o qual diferenciam em seus estágios maturativos (Geissmann et al.,
2010).
As CDs são originadas a partir dos precussores linfoides ou mielóides, e necessitam de citocinas como a IL-4, TNF-α e do GM-CSF para assim sofrerem o processo de proliferação celular (Inaba et al., 1992; Sato, 2010).
As CDs são um grupo de células bastante heterogêneo, podendo ser encontradas
em diferentes localidades do organismo, dependendo do seu estágio maturativo. As células
precursoras pré - Células dencrítica são encontradas circulando pelos vasos linfáticos e sanguíneos, as imaturas são residentes em variados tipos de tecidos, apresentando nessas localidades atividade fagocítica, função importante na destruição de patógenos. Nos tecidos as CDs
ainda estão imaturas, não sendo capazes de estimular as células T, porém na invasão de qualquer patógeno, as CDs sofrem o processo de maturação/ativação tornando- se capaz de apre-
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sentar antígenos aos LT. As CDs maduras são encontradas nos tecidos linfóides secundários,
onde produzem uma quantidade elevada de citocinas (Cella et al., 1997; Banchereau &
Steinman, 1998; Geissmann et al., 2010; Sato, 2010).
As CDs maduras se diferem dos outros fagócitos mononucleares pela expressão
de diferentes marcadores em sua superfície, podendo destacar o CD1a, CD11c, CD40, CD80,
CD83, CD205, e não apresentam em sua superfície celular o CD114, sendo um excelente
marcador de exclusão para esse tipo celular (Reis, 2008).
1.3.6. Macrófagos
Os macrófagos são células fagocíticas originadas a partir da migração dos monócitos da corrente sanguínea para os diferentes tipos de tecidos do organismo. O monócito/macrófago é originado a partir da CFU-GM, o qual dará origem a unidade formadora de
colônia monocítica (CFU-M), e por fim culminará na geração dos fagócitos mononucleares
(Mayani et al., 2007). Para ocorrer essa longa cascata de diferenciação é necessário à presença
de citocinas e fatores de crescimento, onde se destacam a IL-3, IL-6, GM-CSF e o M-CSF,
sendo esse último o principal fator de crescimento que estimula a diferenciação dos macrófagos. O M-CSF se liga a um receptor de membrana das células fagocíticas mononucleares, o
CD115 (M-CSFR), que é uma glicoproteína de membrana, pertencente à família tirosinaquinase (CPK) e a classe de receptores III (Barreda et al., 2004; Mayani et al., 2007).
O M-CSF é sintetizado a partir de uma variedade de tipos celulares, como células
da medula óssea, fibroblastos, células endoteliais, estroma osteoblasto, dentre outras (Barreda
et al., 2004). Macrófagos e monócitos ativados, micróglias, fibroblastos, linfócitos B e T são
capazes de promover a síntese do M-CSF. A formação desse fator de crescimento por macrófagos e monócitos é realizada a partir de estímulos feitos por citocinas pró-inflamatórias (IL1, INF-γ, TNF-α) e, também, pelo GM-CSF (Barreda et al., 2004).
Durante e após o processo de diferenciação celular os macrófagos maduros começam a expressar proteínas em sua superfície, algumas exclusivas, e outras que são encontradas
em outros tipos celulares. A proteína EMRI F4/80, é uma molécula expressa somente na superfície dos macrófagos, porém atualmente ainda é desconhecida sua importância, e alguns
autores acreditam que essa proteína seja importante no processo de adesão, migração e sinalização celular (Khazen et al., 2002). A proteína CD11b/MAC-1 é encontrada em pequena
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quantidade na superfície célular dos linfócitos B e T, das células dendríticas e dos granulócitos e, em grande quantidade nos macrófagos e monócitos. Assim como a molécula F4/80 a
proteína CD11b também esta envolvida com o processo de adesão celular, e migração para o
local da invasão de um agente agressor (Brom et al., 1995).
Macrófagos são células fagocíticas com complexo de golgi bem desenvolvido, lisossomos abundantes e retículo endoplasmático proeminente, tendo como principal função a
destruição e eliminação dos agentes infecciosos (Smit et al., 2008; Abas et al., 2012). Ao entrar em contato com o agente infeccioso os macrófagos sofrem uma série de alterações, como
o aumento da atividade fagocítica, que ocorre devido a presença de vários receptores na superfície como o CR1, CR3, para manose e para LPS (CD14). Outros componentes importantes para a fagocitose são as moléculas sinalizadoras, das quais é importante ressaltar a fosfolipase C, fosfoinositídeo-3-quinase (PI3-quinase), e a proteína quinase C (PKC), que têm a capacidade de desencadear uma série de ações nos macrófagos, como a liberação de citocinas,
promovendo, assim, a ativação desse tipo celular, estabelecendo uma resposta inflamatória
que culminará na morte do agente agressor (Ambrosio & Reason, 2005; Resseti, 2009).
A ativação do macrófago pode ser classificada em tipo I (M1), tipo II (M2) e tipo
III. A M1 é caracterizada por ser estimulada por citocinas pró-inflamatórias (INF-γ, IL-1, IL2,
IL-6), e essa ativação induz a liberação de várias substâncias tóxicas, dentre elas a ROS,
ânions superóxidos (O2-), radicais hidroxila (OH -), peróxido de hidrogênio (H2O2) e NO (Das
et al., 2001; Gordon, 2003; Finaud et al., 2006; Stempin & Cerban, 2007; Mosser et al.,
2008). A formação de ROS, esta ligada a um complexo enzimático denominado nicotinamida
adenina dinucleotídeo reduzida (NADPH). Este processo decorre a partir de um estímulo externo, geralmente originado pela invasão de algum agente agressor. Após a invasão o complexo une as suas sete subunidades rapidamente, se ativando, e assim formando os ROS (El –
Benna et al., 2005).
Outra substância tóxica liberada pelos macrófagos ativados é o NO. Esse radical
de oxigênio é sintetizado pela enzima óxido nítrico sintase (iNOS), a qual utiliza como substrato o aminoácido L-arginina, originando o NO e L-citrulina (Figura 4) (Marleta, 1993). O
NO é um importante mediador inflamatório no combate de agente agressores, dificultando a
sua proliferação, impedindo a progressão de tumores, sendo importante no controle de doenças autoimunes e degenerativas (Resseti, 2009).
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Figura 4: Desenho esquemático da síntese do NO.
O aminoácido L-arginina é transpostado para o interior da célula com o auxílio de uma proteína transportador, e
no interior da célula é convertido pela enzima iNOS em L-citrulina e NO.
Além do aumento da fagocitose, liberação de espécies reativas, o macrófago pode
ser identificado como ativado através de análise por microscopia óptica de campo claro, microscopia eletrônica de transmissão (MET) e pela microscopia eletrônica de varredura
(MEV). Por microscopia óptica e MEV os macrófagos ativados apresentam características
como o aumento no padrão de espraiamento celular e aumento do volume citoplasmático. Por
microscopia óptica pode ser observado também a presença de vácuolos, núcleo grande e eucromatina bem evidente. Por MET podem ser visualizados com mais detalhes o aumento do
número de projeções citoplasmáticas, lisossomos contendo enzimas hidrolíticas, retículo endoplasmático e aparelho de golgi bem proeminente com várias cisternas (de Oliveira, 2006;
Cesar, 2008).
Outro processo de ativação descrito é o alternativo ou M2, que está relacionado
com imunossupressão, sendo desencadeado na presença de citocinas, como a IL-10, IL-13 e
pelo fator de transformação de crescimento β (TGF-β). Após ser ativado por esta via, o macrófago ainda não apresenta a maioria dos receptores de superfície citados acima, sendo encontrado principalmente receptor para manose. Outra característica importante na ativação
M2 seria que essas células não apresentam uma elevação na produção de ROS e NO, impedindo assim a eliminação dos agentes agressores do organismo (Gordon, 2003; Mosser,
2003). E por fim, a ativação do tipo III, é uma resposta imune anti-inflamatória, que resulta na
liberação de citocinas como IL-4, IL-10 e IL-12, sintetizada pelos linfócitos auxiliares, decorrente de um estímulo dos macrófagos. Nesse processo é observado liberação de TGF-β, citocina capaz de promover uma regulação negativa sobre o INF-γ, impedindo liberação de ROS
e NO (de Oliveira, 2006; Resseti, 2009).
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1.4. IMUNOMODULADORES
São substâncias que apresentam duas atividades diferenciadas sobre o organismo,
podendo potencializar a resposta imune, ou simplesmente atuar como imunossupressor. Esta
última resulta principalmente no impedimento da proliferação dos linfócitos, prejudicando
assim a produção de anticorpos e reconhecimento de antígenos. A importância da ação imunossupressora está ligada a não rejeição de órgãos após transplantes e, também, em doença
autoimunes, dificultando o seu desenvolvimento (Fischer et al., 2008).
Um imunomodulador que potencializa a resposta imunológica consegue promover
a proliferação, e a maturação de vários tipos celulares, atuando na medula óssea, principal
local de geração dessas células. Uma das principais células alvos são os macrófagos, onde o
imunomodulador tem a capacidade de estimular o seu recrutamento para local da invasão do
agente agressor, promovendo sua ativação, aumento da fagocitose e liberação de substâncias
tóxicas para destruir os diferentes patógenos (Fischer et al., 2008; de Oliveira et al., 2011).
Atualmente uma diversidade de produtos naturais vem se mostrando eficazes na
terapêutica de várias doenças, tornando o organismo capaz de impedir o desenvolvimento e
proliferação de vários agentes agressores, por agirem principalmente estimulando as células
da medula óssea (de Oliveira et al., 2011). Dentre os imunomoduldores destaca-se Silene nocturna, Nigella sativa, Matricaria Matricaria chamomilla (Ghonime, 2011) a Ipomoea obscura (Hamsa & Kuttan, 2010), que proporcionam aumento do número de células da medula óssea, o medicamento homeopático Canova (Sato et al., 2005), que favorece o aumento do número de leucócitos e linfócitos TCD4+ in vitro, ativação de macrófagos peritoneais e de células mononucleares da medula óssea (Pereira et al., 2005; Abud et al., 2006; Cesar et al.,
2008). Neste contexto se torna importante a pesquisa de produtos de origem natural com ação
imunomodulatória, principalmente substância oriundas de plantas, devido a imensa biodiversidade da Amazônia.
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1.7. GÊNERO PHYSALIS
O gênero Physalis pertence à família Solanaceae, e este gênero abrange cerca de
120 espécies, das quais 70 podem ser encontradas apenas no México (Li et al., 2008), e as
demais em regiões tropicais da África, Ásia, América Central e do Sul (Agata et al., 2010). O
gênero Physalis é o mais desenvolvido da família Solanaceae, quando se evidencia o seu nível de oxidação biogenética, e neste gênero são encontrados substâncias polioxigenadas denominadas vitaesteróides. Estas substâncias possuem a sua função lactônica em C-26, gerando assim oito grupos estruturais distintos os quais são: Vitanolidos, vitanolidos modificados,
vitafisalinas, acnistinas, ixocarpalactonas, perulactonas e as fisalinas (Tomassini et al., 1999),
sendo as fisalinas e o vitanolidos os compostos mais abundantes (Ray & Gupta, 1994).
Plantas do gênero Physalis são conhecidas por seu valor etnofarmacológico e são
utilizadas na medicina tradicional por todo o mundo (Hawkes et al., 1991). Na região Amazônica pode-se destacar a planta Physalis angulata (Pa) (Figura 5). A Pa é uma planta herbácea comum e amplamente distribuída em regiões tropicais e subtropicais no mundo, sendo na
região Amazônica muito utilizada na medicina popular devido seus efeitos diurético, antitérmico, analgésico e para tratamento de dor de garganta e abdominal (Magalhães et al 2006). É
conhecida popularmente por várias denominações como camapú, bucho-de-rã, joa-de-capote,
camambu, camaru, mata-fome, bate-festa e balão-rajado (Lorenzi & Matos, 2002).
a
b
Figura 5: (a) Planta Physalis angulata (Pa). (b) fruto da planta Pa.
Fonte: Guimaraes, 2005.
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Na literatura são mostrados vários trabalhos evidenciando a capacidade de Pa em
interferir no processo de proliferação de alguns agentes infecciosos, bem como a sua atividade
leishmanicida mostrada por Choudraly et al. (2006), na qual mostram que a fisalina H apresentou uma potente ação sobre as formas promastigotas de Leishmania major. Guimaraes et
al. (2009) mostraram uma potente ação leishmanicida das fisalinas B e F in vitro e in vivo
sobre as formas amastigotas do protozoário Leishmania amazonensis e Leishmania major.
Outras ações evidenciadas de Pa sobre patógenos foram: a ação microbiana da fisalina B sobre a bactéria Staphylococcus aureus (Silva et al., 2005), ação antimicobacteriana (Januário et
al.,2002) e antiplasmodial (Luzakibanza et al., 2010; Ruiz et al., 2011; SÁ et al., 2011).
A sua ação sobre células da resposta imune, como os linfócitos, foi mostrada por
Bastos et al. (2008), as quais observaram a ação inibitória de Pa sobre a proliferação dos linfócitos, especialmente as células T. Yu et al. (2010) mostraram que a fisalina H apresenta
uma ação imunossupressora, impedindo a proliferação dos linfócitos T. Em relação aos macrófagos, foi mostrado que as fisalinas B, F e G inibiram a produção de NO em macrófagos
previamente estimulados com LPS e INF-y (Soares et al., 2003), porém relatando ainda sobre
a resposta microbicida Lee et al. (2009) mostraram que Pa estimula a produção ROS em células cancerígenas da mucosa oral.
Resultados obtidos pelo nosso grupo (Laboratório de Parasitologia- ICB UFPA)
demonstraram pela primeira vez, que o extrato aquoso obtido da raiz da planta Physalis angulata (EAPa) na concentração de 100 µg/mL promoveu algumas alterações em macrófagos
peritoneais como, aumento do padrão de espraiamento celular, desorganização do citoesqueleto, aumento da vacuoalização e de projeções citoplasmáticas, e foi observado uma elevação da
produção de ROS. Foi observado também que EAPa não apresentou efeito citotóxico sobre a
célula hospedeira. Entretanto, ainda não é conhecido o efeito que EAPa pode exercer sobre o
processo de diferenciação e ativação celular em culturas de células provenientes da medula
óssea de camundongos, fazendo-se então necessário a realização deste estudo.
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2. OBJETIVOS:
2.1. OBJETIVO GERAL
Estudar os efeitos in vitro do extrato aquoso obtido da raiz da planta Physalis angulata
(EAPa) em células provenientes da medula óssea de camundongos.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Caracterização das células da medula óssea nos períodos de 24 horas e 7 dias;
2. Analisar a viabilidade das células da medula óssea tratadas com EAPa
3. Analisar a ação de EAPa sob células obtidas da medula óssea de camundongos;
4. Avaliar a morfologia das células da medula óssea tratadas in vitro com EAPa por
microscopia óptica;
5. Detectar a presença de marcadores de superfície por imunofluorescência e citometria de fluxo em células obtidas da medula óssea tratadas com EAPa;
6. Analisar a resposta microbicida através da detecção da produção de NO, ROS e verificar a capacidade fagocítica das células da medula tratada.
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3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. PREPARO DO EXTRATO AQUOSO DA PLANTA
A raiz da planta Physalis angulata (EAPa) foram coletadas no estado do Pará e
suas raízes foram cortadas para produção do extrato aquoso.
O EAPa foi preparado e cedido pela Drª Gilmara Nazaré Bastos do Laboratório de
Neuroinflamação do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará
(UFPA).
Análise cromatográfica revelou que EAPa apresenta em sua composição grande
quantidade de fisalinas D e F.
3.2. OBTENÇÃO E CULTIVO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA
Células da medula óssea foram obtidas a partir de fêmures de camundongos albinos (Mus musculus) machos com 6-12 semanas de idade. Os animais foram sacrificados por
deslocamento da coluna cervical e os fêmures dissecados no fluxo laminar e lavados com solução de PBS estéril. Após a lavagem, os ossos foram mantidos em PBS estéril A 4ºC. Em
seguida, as elipses dos fêmures foram retiradas com auxílio de pinça e tesoura esterilizadas
(Marim et al., 2010) e a medula removida com uma seringa contendo PBS. Posteriormente as
células foram homogeneizadas, diluídas em DMEM, contadas em câmara de Neubauer, transferidas para garrafas de cultura ou placas de 24 poços contendo lamínulas e incubadas em
estufa a 37ºC contendo 5% de CO2. Os animais foram sacrificados de acordo com as normas
do Comitê de Ética (processo nº BIO001-09 CEPAE/ICB/UFPA).
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3.3. CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGO
Células da medula óssea foram cultivadas, conforme descrito no item 3.2. As células foram mantidas em cultivo por 24 horas e durante sete dias, com a finalidade de analisar
quais células da medula iriam aderir ao substrato no período de 24 horas, e posteriormente
quais tipos celulares iriam permanecer aderidos após sete dias de cultivo. Após o término de
cada tempo de cultivo, as células foram fixadas em solução contendo: 3 % de paraformaldeído
em tampão PHEM (5mM cloreto de Magnésio, 70 mM cloreto de potássio, 10 mM EGTA, 20
mM HEPES, 60 mM PIPES), 0,1 M, pH 7,2 por um período de 30 minutos à temperatura ambiente e posteriormente coradas.
A coloração foi feita com Giemsa, diluído a 25 % em água tamponada, durante 25
minutos à temperatura ambiente. Após esse período, as células foram desidratadas em acetona
100% e passadas em misturas crescentes de acetona–xilol, até duas passagens finais em xilol
puro. As lamínulas foram, então, montadas em lâminas de vidro, tendo Entellan® como meio
de montagem. A captura das imagens e análise das lâminas foram realisadas em microscópio
Axiophot Zeiss com câmera digital Zeiss acoplada.
3.4. AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA
3.4.1. Método Thiazolyl Blue (MTT)
O MTT, é um sal tetrazolium solúvel em água, é convertido pelas desidrogenases
mitocondriais em cristais azuis de formazan, os quais são insolúveis em água. Esses cristais
por serem impermeáveis às membranas das células viáveis se acumulam no interior dessas
células, sendo posteriormente diluído em DMSO (Fotakis & Timbrell, 2006).
Células da medula óssea foram cultivadas como descrito no item 3.2 em placas de
96 poços e mantidas em cultura por 24, 48, 72 e 96 horas e tratados com EAPa na concentração de 100 µg/ml.
Após o término do tratamento, o sobrenadante foi retirado e os poços lavados com
PBS. Logo após a lavagem, foi adicionado 0,5 mg/mL de MTT diluído em PBS sendo, posteriormente, incubados à 37ºC em estufa contendo 5% de CO2 por 3 horas. Após o término de
19
incubação foi adicionado 200 μL DMSO em cada poço para solubilização dos cristais de formazan e a placa foi incubada em agitação por 10 minutos.
Posteriormente, a solução resultante foi lida em leitor de ELISA (BIO-RAD Model 450 Microplate Reader) em um comprimento de onda de 570 nm. Como controle negativo, as células foram mortas com solução de 15% de formol em PBS.
3.4.2. Detecção de potencial da membrana mitocondrial (JC-1)
O JC-1 é um marcador fluorescente que mensura o potencial da membrana mitocondrial (ΔΨ) das células. O potencial de membrana mitocondrial é um importante parâmetro
da função mitocondrial utilizado como indicador de viabilidade celular. A perda desse potencial é utilizada como indicador de apoptose.
O JC-1 possui vantagens sobre outros corantes fluorescentes, pois pode penetrar
na mitocôndria conforme variações no potencial de membrana. O JC-1 possui duas formas
conhecidas. O “J- agregados” que coram células viáveis com fluorescência vermelha intensa.
Por outro lado, células apoptóticas com baixo ΔΨ, permanecem na forma monomérica, apresentando apenas fluorescência verde (Cayman Chemical Company, 2009).
Células da medula óssea foram cultivadas em tubos falcons e submetidos ao tratamento por 96 hora com EAPa na concentração de 100 μg/mL. Após o tratamento, estas células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos e ressuspendidas em solução de PBS pH
7,2. Em seguida, essas células foram centrifugadas novamente a 1500 rpm por 10 minutos e
incubados por 30 min com 10 mM de JC-1 a 37°C. Posteriormente, foi feita uma nova centrifugação e as células ressuspendidas em PBS. A análise foi feita utilizando um citômetro de
fluxo BD FACSCantoII TM em comprimento de onda de excitação de 488 nm, sendo que os
monômeros de JC-1 emitem a 529 nm e os agregados a 590 nm. Os dados foram obtidos utilizando o software BD FACSDiva.
20
3.5. CONTAGENS DAS CÉLULAS MONONUCLEARES DO SOBRENADANTE
Células da medula óssea foram cultivadas, conforme descrito no item 3.2. As células foram divididas em quatro grupos, para assim realizar uma análise mais detalhada. O
primeiro grupo é o controle, sem tratamento, o segundo corresponde as células que foram
tratadas com 100 μg/mL de EAPa por 24, 48, 72 e 96 horas. O grupo três foi tratado com MCSF na concentração de 100 nM, e o grupo quatro foi tratado com EAPA + M-CSF. Após o
término de cada tratamento nos períodos de 24, 48, 72 e 96 horas uma alíquota do sobrenadante das culturas dos quatro grupos foi retirada e as células contadas em câmara de neubauer,
levando em consideração apenas as células redondas e brilhantes, com análise feita em microscópio de contraste de fase óptico Olympus BX41
3.6. ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA TRATADAS
COM EAPa APÓS ADESÃO AO SUBSTRATO
3.6.1. Microscopia óptica
Células da medula óssea foram cultivadas conforme descrito o item 3.2, e divididas em quatro grupos como foi mostrado no item 3.5. Após o término do tratamento as células
aderentes foram fixadas em solução contendo 3% de paraformaldeído em tampão PHEM 0,1
M, pH 7,2 por um período de 30 minutos a temperatura ambiente e, posteriormente coradas
com Giemsa, como descrito no iem 3.3. A mesma concentração de EAPa, M-CSF e AEPa +
M-CSF diluídos em DMEM e soro bovino fetal (SBF) foi adicionada às culturas a cada 24
horas até o final de cada ensaio.
Após a montagem das lamínulas com Entellan®, foi realizada contagem, sendo contadas 200 células por lamínula analisando alguns tipos celulares como Linfócitos, macrófagos
residentes e ativados, células com núcleo em anel, PMNs e monócitos. As células foram contadas em microscópio óptico Olympus BX41 e a captura de imagens foi feita em microscópio
Axiophot Zeiss com câmera digital Zeiss acoplada.
21
3.7. IMUNOFENOTIPAGEM
3.7.1. Detecção de marcadores da superfície celular por imunofluorescência
Células provenientes da medula óssea foram cultivadas como descrito no item 3.2
e tratadas com EAPa na concentração de 100 μg/mL por 96 horas. As células aderentes foram
fixadas em paraformaldeído 3% diluído em tampão PHEM 0,1 M por 30 minutos. Em seguida
as células foram lavadas no tampão PBS com 1% de Soro Albumina Bovina (PBS-BSA 1%)
por 20 minutos e incubadas por 40 minutos em PBS pH 8 contendo 50 mM NH4Cl. Após a
lavagem, as células foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com anticorpo primário CD11b (marcador de macrófagos/monócitos) e CD11c (marcador de células dendríticas).
Os anticorpos primários foram diluídos na proporção 1:50 em PBS/BSA 1%. Posteriormente,
uma segunda incubação foi realizada com anticorpo secundário fluorescente conjugada ao
fluorocromo ficoeritrina diluídos na proporção 1:50 em PBS/BSA 1% por 40 minutos. Os
núcleos foram marcados com DAPI (4,6 diamidino-2-phenylindole dihydroxychloride) (Molecular Probes, Eugene, OR EUA) e incubados por 30 minutos. As lamínulas foram montadas
em lâmina contendo o ProLong Gold antifade reagent (Molecular Probes Invitrogen®) e observadas em Microscópio de fluorescência Axiophot Zeiss. Como controle negativo foi feita
omissão do primeiro anticorpo.
3.7.2. Detecção de marcadores de superfície celular por citometria de fluxo
Células da medula óssea foram cultivadas em tubos falcons e submetidos ao tratamento com EAPa na concentração de 100 μg/mL por 96 horas. Após o tratamento, estas
células foram centrifugadas a 1500 rpm por 10 minutos e ressuspendidas em solução de PBS
pH 7,2. Em seguida, essas células foram centrifugadas novamente a 1500 rpm por 10 minutos
e incubadas com anticorpo primário CD11b e CD11c por 30 minutos. Os anticorpos primários
foram diluídos na proporção 1:50 em PBS a 37°C. Posteriormente, uma segunda incubação
foi realizada com anticorpo secundário fluorescente conjugada ao fluorocromo ficoeritrina
diluídos na proporção 1:50 em PBS pH 8 por 40 minutos, e por fim uma nova centrifugação
foi realizada e as células ressuspendidas em PBS pH 8, para assim a fluorescência das células
22
serem determinada por citometria de fluxo. As células foram analisadas em citômetro de fluxo
BD FACSCantoII. Os dados foram obtidos utilizando o software BD FACSDiva.
3.8. RESPOSTA MICROBICIDA DAS CÉLULAS DA MEDULA TRATADAS COM EAPa
3.8.1. Dosagem da produção de NO por células da medula óssea tratadas com EAPa
A dosagem da concentração de nitrito em meio de cultura é uma forma indireta de
se determinar a concentração NO produzido pelas células da medula óssea tratadas e não tratadas por 96 hora com 100 µg/mL de EAPa. Este procedimento foi realizado pelo método de
Griess, no qual consiste em adicionar 50 µl do reagente de Griess (sulfanilamida a 1% em
ácido fosfórico a 5% e Naftilenodiamina a 0,1% em água destilada) e 50 µl do sobrenadante
das células tratadas ou não com EAPa. A leitura foi feita leitor de ELISA sobre um comprimento de onda de 570 nm e a concentração de nitrito foi expressa em µM de acordo com a
curva padrão estabelecida.
3.9.2. Produção de ROS pelas células da medula óssea tratadas com EAPa
Células da medula foram cultivadas em placa de cultura de 24 poços como descrito no item 3.2 e mantidas em cultivo por um período de 96 horas. As células foram lavadas
com PBS pH 7.2 e incubadas com meio contendo 1 mg/mL de Nitroblue Tetrazolium (NBT).
Como controle positivo foi utilizado células da medula tratadas com M-CSF. Após 1 h a 37
ºC e em atmosfera de 5% de CO2, as células foram lavadas com PBS, pH 7.2, e fixadas em
paraformaldeído 3% por 30 minutos, desidratadas e montadas em lâminas de vidro, tendo
Entellan® como meio de montagem. Após a montagem as células foram analisadas e contadas em microscópio óptico Olympus BX41.
23
3.9.3. Interação de Saccharomyces cerevisiae com células da medula tratadas com EAPa
Para observar o efeito de EAPa sobre a capacidade fagocítica das células da medula óssea, as células foram cultivadas e tratadas por 96 hora. Em seguida, foi realizada a
interação com a levedura em uma proporção de (1:10) durante 2 horas a 37 ºC em atmosfera
de 5% de CO2. Após esse período, o sobrenadante foi desprezado e os células lavadas com
PBS, pH 7.2, por três vezes, para retirar as leveduras não internalizadas.
Em seguida, as células foram coradas com o corante Giemsa, como foi descrito no
item 3.3. Foram contadas 200 células por lamínula e o índice endocítico foi obtido calculando-se a porcentagem de células que endocitaram e a média de parasitas por células. As células
foram contadas em microscópio óptico Olympus BX41.
3.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram analisados utilizando o Graph Ped Prism Versão 5.0. O
teste usado foi a análise de variância, ANOVA, e Teste t de Student, com (*) p < 0,05, (**) p<
0,01, (***) p< 0,001.
24
4. RESULTADOS
4.1. CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS DA MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGO
As figuras 6-a1 e 6-a2 mostram as células da medula óssea cultivadas por 24 horas, onde foi possível observar células com núcleo em anel (CNA), precursoras dos monócitos
e granulócitos, estas apresentam um núcleo em forma de anel, com pouco ou nenhum citoplasma, os monócitos (MO) que são os precursores dos macrófagos, os MO morfologicamente apresentam pouco citoplasma e um núcleo em forma de rim ou ferradura, e os PMNs, são
células com dois ou mais núcleos. No período de 24 horas também foram visualizadas células
com núcleo apresentando uma cromatina condensada e pouco citoplasma, estas foram classificadas de linfócitos.
As figuras 6-b1 e 6-b2 mostram células mantidas em cultivo por sete dias sem tratamento, onde foi observado um número considerável de células com pouco citoplasma, um
núcleo redondo e central e pouco espraiamento celular, estas foram caracterizadas com macrófagos residentes (MR), e células com citoplasma bem volumoso, um núcleo redondo,
grande, com eucromatina bem evidente e um intenso espraiamento celular foram
caracterizados como macrófagos ativados (MA). A presença desses dois tipos celulares ao
longo do tempo de cultivo mostrou que as células que aderem ao substrato pertencem à linhagem de fagócitos mononucleares e esses macrófagos aderidos tendem a se ativar ao longo do
cultivo in vitro.
25
Figura 6: Caracterização das células da medula óssea. Em a1 e a2 células da medula óssea com 24 horas de cultivo sem
tratamento onde é possível observar a presença de células com núcleo em anel (CNA), polimorfonucleares (PMNs) e
monócitos (MO). Em b1 células da medula óssea com sete dias de cultivo, sem tratamento, mostrando macrófagos
ativados (MA) e em b2 macrófagos residentes (MR). (a1, a2 e b1 barra =10 µm e aumento de 100x, e em b2 barra = 50
µm e aumento de 40x).
26
Figura 6
27
4.2. VIABILIDADE CELULAR
Com objetivo de verificar se EAPa apresenta ou não efeito citotóxico para as células da medula, foi realizado o teste de viabilidade MTT e JC-1.
4.2.1. Método triazolyl blue (MTT)
O método MTT detecta a viabilidade das células tratadas através da análise da atividade das desidrogenases presentes na mitocôndria das células. No presente estudo não houve uma diminuição significativa de células viáveis (figura 7) após tratamento com EAPa nos
períodos de 24, 48, 72 e 96 horas quando comparados ao controle sem tratamento. Como controle negativo, as células foram incubadas com solução de 15% de formol em PBS.
Figura 7. Viabilidade celular pelo método MTT em células da medula óssea mantidos em cultivo e tratadas com
EAPa por 24, 48, 72 e 96 horas na concentração de 100 µg/mL. Foi utilizado ANOVA, t Student.
28
4.1.2 Detecção de potencial da membrana mitocondrial (JC-1)
O Potencial de Membrana Mitocondrial foi analisado pelo método JC-1. Foi observado que células tratadas com EAPa na concentração de 100 μg/mL mantiveram-se viáveis
mesmo após serem mantidas em cultivos por 96 horas, semelhantes ao grupo controle sem
tratamento (Figura 8). Indicando assim que EAPa não possui efeito citotóxico para as células
da medula óssea. Porém foi observado que as células tratadas com EAPa (78,25 %) apresentaram mais células viáveis que o grupo CTL (54,83 %).
a
b
Figura 8. Análise do potencial de membrana mitocondrial das células da medula óssea cultivadas e tratadas com
EAPa por 96 horas. A) CTL sem tratamento. B) Células da medula óssea tratadas com EAPa na concentração
de 100 μg/mL. Foi utilizado ANOVA, t Student.
29
4.3. CONTAGEM DAS CÉLULAS DO SOBRENADANTE
Após 24, 48, 72 e 96 horas de cultivo, os sobrenadantes dos grupos CTL, EAPa,
M-CSF e EAPa + M-CSF foram homogeneizados e contados em câmara de neubauer (Figura
9). No grupo tratado com EAPa e no grupo EAPa + M-CSF no período de 72 e 96 horas, foi
observado que ocorreu uma diminuição significativa do número de células do sobrenadante
quando comparadas aos períodos de 24 e 48 horas. Também foi possível observar uma diminuição significativa do número de células do sobrenadante nos períodos de 72 e 96 horas de
cultivo no grupo que foi tratado somente com M-CSF.
Figura 9: Análise das células dos sobrenadantes dos quatro grupos de estudo. As células foram contadas para determinar qual seria a ação da EAPa sobre as células nucleadas do sobrenadante. Foi observado uma redução no
número de células presentes nos sobrenadantes nos grupos tratados com EAPa, com M-CSF e com ambos. Foi
utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05, (**) p< 0,01, (***) p< 0,001.
30
4.4. ANÁLISE MORFOLÓGICA POR MICROSCOPIA ÓPTICA DAS CÉLULAS DA
MEDULA ÓSSEA DE CAMUNDONGOS TRATADAS COM EAPa
4.4.1. Análise quantitativa das células aderidas cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas
As células da medula foram cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas e analisadas por
microscopia óptica. Foram observados seis tipos celulares: os linfócitos, PMNs, CNA, MO,
MR e MA e posteriormente foram realizadas analises quantitativa.
5.4.1.1. Linfócitos
É possível observar que ocorreu uma diminuição significativa no número de linfócitos no grupo M-CSF e EAPa + M-CSF nos períodos de 48, 72 e 96 horas quando comparados ao controle e ao grupo EAPa. No período de 96 horas foi observado uma diminuição
significativa no número de linfócitos no grupo EAPa, quando comparados ao controle sem
tratamento (Figura 10).
Figura 10: Contagem percentual do número de linfócitos em culturas de células da medula óssea cultivadas
por 24, 48, 72 e 96 horas. Houve uma redução significativa no número de linfócitos no grupo EAPa no período de 96 horas quando comparado ao grupo controle. Foi utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05, (**) p<
0,01, (***) p< 0,001.
31
4.4.1.2. Polimorfonucleares
A análise quantitativa realizada por microscopia mostrou uma diminuição significativa dos PMNs no grupo M-CSF nos períodos de 24, 48, 72 e 96 horas quando comparados
ao grupo controle, nos períodos de 24 e 72 horas foi observado uma redução no número de
PMNs no grupo M-CSF quando comparados ao grupo tratado com EAPa e EAPa + M-CSF.
Não houve diferença significativa entre o grupo CTL e o grupo EAPa nos quatro tempos de
cultivo analisados (Figura 11).
Figura 11: Contagem percentual do número de PMNs em culturas de células da medula óssea cultivadas por
24, 48, 72 e 96 horas. Não houve diferença significativa no número de PMNs entre os grupo controle e o grupo
tratado com EAPa. Foi utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05, (**) p< 0,01, (***) p< 0,001.
32
4.4.1.3. Células com núcleo em anel
No período de 24 horas foi observado uma redução das CNA no grupo tratado
com M-CSF quando comparados aos grupos controle, tratado com EAPa e EAPa + M-CSF.
No período de 24, 48 horas foi observado uma diminuição destas células no grupo tratado
com AEPa + M-CSF quando comparados ao grupo controle. Nos períodos de 72 e 96 não foi
observada diferença significativa entre os grupos, sugerindo que a partir desse tempo de cult ivo as CNA estejam se diferenciando em MO em todos os grupos estudados (Figura 12).
80
***
***
CTL
EAPa
M -C S F
E A P a + M -C S F
***
***
N º d e c é lu la s
60
40
*
* *
**
20
6
9
2
7
8
4
2
4
0
Figura 12: Contagem de CNA presentes em cultura de células da medula óssea de murino mantidas em cultivo por
24, 48, 72 e 96 horas. Não houve diferença significativa entre o grupo tratado com EAPa e o controle durante os
quatro tempos de cultivo. Foi utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05, (**) p< 0,01, (***) p< 0,001.
33
4.4.1.4. Monócitos
A quantificação do número de monócitos mostrou que no período de 24 horas foi
observada uma redução significativa no número de monócitos no grupo M-CSF quando comparada aos grupos controle, EAPa e EAPa + M-CSF, e no período de 48 horas a redução deste
tipo celular foi observada no grupo tratado com M-CSF quando comparado ao grupo controle
(Figura 13).
80
** *
***
**
**
CTL
EAPa
M-CSF
EAPa+M-CSF
Nº de células
60
40
**
20
96
72
48
24
0
Figura 13: Contagem dos MO aderentes presentes em cultura de células da medula óssea de murino mantidas
em cultivo por 24, 48, 72 e 96 horas. Não houve diferença significativa entre os grupos tratados com EAPa e o
controle sem tratamento. Foi utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05, (**) p< 0,01, (***) p< 0,001.
34
4.4.1.5. Macrófagos residentes
No período de 72 e 96 horas foi observado uma diminuição significativa do número de macrófagos residentes nos grupos tratados com M-CSF, quando comparados aos grupos
EAPa + M-CSF, ao grupo controle e EAPa. Não foi observada diferença significativa entre os
grupos no período de 48 horas (Figura 14).
Figura 14: Contagem do número de MR em culturas de células da medula óssea cultivadas por 24, 48, 72 e 96
horas. Não houve diferença significativa entre o grupo tratado com EAPa e o controle sem tratamento. Foi utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05, (**) p< 0,01, (***) p< 0,001.
35
4.4.1.6. Macrófagos ativados
Nos períodos de 24, 48, 72 e 96 horas foi possível observar um aumento
significativo de MA no grupo M-CSF, quando comparado ao grupo controle, EAPa e EAPa +
M-CSF (Figura 15).
Figura 15: Contagem percentual do número de MA em culturas de células da medula óssea cultivadas por 24, 48,
72 e 96 horas. Não houve diferença significativa entre o grupo tratado com EAPa e o controle sem tratamento nos
períodos de cultivo. Foi utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05, (**) p< 0,01, (***) p< 0,001.
36
4.4.2. ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS CÉLULAS ADERIDAS
4.4.2.1. Análise das células aderidas e cultivadas por 24, 48, 72 e 96 horas
A análise morfológica das células aderidas revelou que as células tratadas com
EAPa desde período de 24 horas apresentaram maior padrão de espraiamento, maior volume
citoplasmático e tamanho celular, quando comparadas ao controle sem tratamento, apresentando características similares as das células tratadas com o M-CSF. Foi observado no grupo
EAPa + M-CSF um menor número de células aderidas e menor quantidade de macrófagos
ativados quando comparadas ao grupo M-CSF. Foi observado nas células tratadas com MCSF a partir do período de 72 horas um processo de fusão celular, com a forma de células
gigantes. Entretanto, este processo só foi observado no grupo EAPa + M-CSF após 96 horas.
37
Figura 16: Análise das células da medula tratadas por 24 horas. (a) Células controle sem tratamento, observar células redondas, com nenhum espraiamento celular (setas). (b) Células tratadas com EAPa, observar o espraiamento celular (setas).
(c) Células tratadas com M-CSF, observar a presença de MR em processo de ativação celular (setas). (d) células tratadas
com EAPa + M-CSF, observar os MR em processo de ativação (setas). Barra 10 µm.
Figura 17: Análise das células da medula tratadas por 48 horas. (a) Células controle sem tratamento. (b) Células tratadas
com EAPa, observar o espraiamento celular, aumento do volume citoplasmático (setas). (c) Células tratadas com M-CSF,
observar a presença de MA (setas). (d) células tratadas com EAPa + M-CSF, observar a presença de MA (setas). Barra 10
µm.
38
Figura 16
Figura 17
39
Figura 18: Análise das células da medula tratadas por 72 horas. (a) Controle sem tratamento. (b) Células tratadas com EAPa,
observar o espraiamento celular, aumento do volume citoplasmático e as células com características de MA (setas). (c) Células tratadas com M-CSF, observar a presença de MA (setas) e observar o processo de fusão celular (setas). (d) células tratadas com EAPa + M-CSF, observar os MA, observar também que o padrão de espraiamento é similar as das células tratadas
somente com EAPa e não foi observado o processo de fusão celular (setas).Barra 10 µm.
Figura 19: Análise das células da medula tratadas por 96 horas. (a) Células controle sem tratamento, observar os macrófagos
espraiados (setas). (b) Células tratadas com EAPa, observar o espraiamento celular, aumento do volume citoplasmático e as
células com características de MA (seta). (c) Células tratadas com M-CSF, observar a presença de MA (setas) e observar que
a maioria das células está sofrendo o processo de fusão celular (setas). (d) células tratadas com EAPa + M-CSF, observar os
MA (setas), observar também que as células estão iniciando o processo de fusão celular, sugerindo que EAPa não esteja
atuando em sinergia com o M-CSF (setas). Barra 10 µm.
40
Figura 18
Figura 19
41
4.4.3. DETECÇÃO DE MARCADORES DE SUPERFÍCIE (IMUNOFENOTIPAGEM)
4.4.3.1. Imunofluorescência
a) Marcação com CD11b
Após 96 horas de cultivo as células foram analisadas por microscopia óptica e foi
observado que a maioria das células aderentes eram macrófagos, e para confirmar se essas
células pertenciam ou não a linhagem monocítica foi feita a marcação para CD11b. Foi observado que a maioria das células do grupo EAPa apresentaram marcação positiva para CD11b
(Figura 20), mostrando que EAPa parece estimular o processo de diferenciação celular. Foi
possível observar que as células tratadas apresentaram maior padrão de espraiamento celular e
maior volume citoplasmático, características típicas de células ativadas.
42
Figura 20. Detecção do marcador de superfície CD11b (macrófagos) em cultura de células da medula óssea mantidas em
cultura e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. (a) Controle positivo de macrófagos peritoneais; (b) Controle sem tratamento; (c) Células da medula tradadas com 100 µg/mL de EAPa; (d) Células da medula óssea
tratadas com M-CSF. Observar que as células tratadas com EAPa apresentam marcação positiva para CD11b.
43
Figura 20
44
b) Marcação com CD11c:
A análise por microscopia de imunofluorescência mostrou um menor número de células marcadas positivamente para CD11c (Figura 21) no grupo EAPa, quando comparadas ao
resultado obtido com o marcador CD11b, mostrando que EAPa não estimula a diferenciação
das células da medula em células dendríticas.
45
Figura 21. Detecção do marcador de superfície CD11c (células dendríticas) em cultura de células da medula óssea mantidas
em cultura e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. (a) Controle sem tratamento; (b) Células da
medula tradadas com 100 µg/mL de EAPa.
46
Figura 21
a
a
b
47
4.4.3. CITOMETRIA DE FLUXO
a) Marcação com CD11b
Com a finalidade de verificar se EAPa estimular a diferenciação dos monócitos
em macrófagos foi feito a análise por citometria de fluxo (Figura 22), no qual mostrou que as
células tratadas com EAPa apresentaram uma porcentagem de 10,60% para o marcador
CD11b, marcação bem próxima das que foram observadas no grupo de macrófagos peritoneais e do grupo que foi estimulado com M-CSF. Porém, a porcentagem observada no grupo
EAPa é equivalente ao dobro do que foi encontrado pelo grupo controle sem tratamento.
Figura 22. Detecção do marcador de superfície CD11b em cultura de células da medula óssea mantidas em cultivo e
tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. (a) Controle positivo de macrófagos peritoneais;
(b) Controle sem tratamento; (c) Células da medula tradadas com 100 µg/mL de EAPa; (d) Células da medula óssea
tratadas com M-CSF. Foi observado um aumento significativo da marcação positiva de CD11b nas células tratadas
com EAPa quando comparadas ao controle sem tratamento. Foi utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05, (**) p<
0,01, (***) p< 0,001.
48
b) Marcação com CD11c
A análise por citometria de fluxo (Figura 23) mostrou que as células tratadas com
EAPa apresentaram uma porcentagem de 6,94 % para o marcador CD11c, marcação bem próxima das que foram observadas no grupo controle sem tratamento que foi de 7,04%. Mostrando assim que EAPa não estimula o processo de proliferação e maturação das células dendríticas.
Figura 23. Detecção do marcador de superfície CD11c em cultura de células da medula óssea mantidas em cultura
e tratadas com EAPa na concentração de 100 µg/mL por 96 horas. (a) Controle sem tratamento; (b) Células da
medula tradadas com 100 µg/mL de EAPa. Não foi observado diferença significativa entre o grupo CTL e EAPa.
Foi utilizado ANOVA, t Student.
49
4.4.5. RESPOSTA MICROBICIDA DAS CÉLULAS DA MEDULA TRATADAS COM
EAPa
4.4.5.1. Dosagem da produção de NO por células da medula tratadas com EAPa
Com o objetivo de detectar a produção de NO em culturas de células da medula
tratadas com EAPa foi realizado o método de Griess para análise de nitrito/nitrato. Foi possí
vel observar que não ocorreu a produção de NO em células cultivadas por 96 horas tratadas
com EAPa, quando comparadas com o controle sem tratamento e com controle positivo est imulado com M-CSF. Foi possível observar a redução da produção de NO no grupo de células
tratadas com EAPa e EAPa + M-CSF (Figura 24).
Figura 24. Gráfico da dosagem de NO de células tratadas com EAPa. Foi observado diferença significativa entre
o grupo controle e EAPa e os grupos M-CSF e EAPa + M-CSF.. Foi utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05,
(**) p< 0,01, (***) p< 0,001.
50
4.4.5.2 Produção de ROS por células da medula tratadas com EAPa
A detecção de ROS foi realizada através da reação citoquímica NBT. Foi possível
observar um aumento na produção desses radicais em células da medula tratadas com EAPa
na concentração de 100 µg/mL. Foi utilizado um controle negativo, células da medula óssea
sem tratamento e um controle positivo de células estimuladas com M-CSF para comprovar a
especificidade do teste (figura 25).
.
Figura 25. Quantificação das células marcadas positivamente com NBT. Foi observado um aumento significativo
no número de células marcadas positivamente pcom NBT no grupo EAPa quando comparados ao grupo controle.
Como controle positivo foi utilizado células da medula tratadas com M-CSF. Foi utilizado ANOVA, t Student. (*)
p < 0,05, (**) p< 0,01, (***) p< 0,001.
51
4.4.5.3. Interação de Saccharomyces cerevisiae com células da medula tratadas com EAPa
A análise da atividade fagocítica foi realizada utilizando células da medula tratadas com 100 μg/mL de EAPa por 96 hora e submetidos à interação com Saccharomyces cerevisiae. Posteriormente, foi realizada a contagem do número de partículas fagocitadas em microscópio óptico de campo claro. Não houve diferença significativa na atividade fagocítica
entre as células tratadas e as sem tratamento. Foram contadas 200 células por lamínula e o
índice endocítico foi obtido calculando-se a porcentagem de células que endocitaram e a média de levedura por células. As células foram contadas em microscópio óptico Olympus
BX41(Figura 26).
Figura 26. Índice endocítico da interação de células da medula óssea com Saccharomyces cerevisae tratados com
100 µg/mL de EAPa. Como controle positivo foi utilizado células da medula tratadas com M-CSF. Não foi observado diferença significativa entre o grupo CTL e EAPa. Foi utilizado ANOVA, t Student.
52
5. DISCUSSÃO
A medula óssea é um tecido hematopoiético responsável por gerar todas as células
sanguíneas circulantes, como neutrófilos, linfócitos e monócitos. Essas células são importantes para o combate de vários patógenos, na cura ou simplesmente para amenizar os sintomas
de várias patologias. Frente a importância dessas células na defesa do organismo humano, se
faz importante a busca de novos medicamentos que sejam capazes de promover a proliferação
e diferenciação das células da medula (Abud et al., 2006; Cesar et al., 2008), tornando assim,
importante os estudos utilizando bioprodutos, principalmente devido a imensa biodiversidade
da região Amazônica.
Este estudo demonstra, pela primeira, vez a ação do extrato aquoso da raiz da
planta Physalis angulata sobre as células da medula óssea de camundongos. Foi possível observar, após 72 horas de cultivo in vitro, que as células da medula óssea e tratadas com EAPa
apresentaram redução do número de células nucleadas no sobrenadante e aumento das células
aderidas ao substrato, mostrando assim que EAPa estimula o processo de adesão celular. Cesar (2008) mostrou que o medicamento imunomodulador homeopático Canova® também
estimula o processo de adesão celular, reduzindo o número de células nucleadas presentes no
sobrenadante.
No presente trabalho foi feita a caracterização da população de células da medula
óssea por microscopia óptica, onde foi observado vários tipos celulares, com morfologia típica de linfócitos, macrófagos, células com núcleo em anel, monócitos e PMNs. Devido à presença de diversos tipos celulares nas culturas foi realizada a quantificação dessas células. A
análise percentual do número de linfócitos mostrou que houve uma redução significativa desse tipo celular no grupo tratado com EAPa no período 96 horas quando comparado ao controle sem tratamento, mostrando que EAPa não estimula a adesão e proliferação desse tipo celular. Bastos et al. (2008) mostraram que EAPa, após ser injetada peritonealmente em ratos
Wistar nas concentrações de 1 mg/kg e 5 mg/kg, apresentou um efeito inibitório da proliferação de linfócitos, especialmente nas células T. Os resultados obtidos nesse estudo também
corroboram com aqueles observados por Yu et al. (2010), os quais, demonstraram que a fisalina H, obtida de P. angulata, apresentou uma atividade imunossupressora, impedindo assim
a proliferação das células T.
Na quantificação dos PMNs foi observado uma redução no número deste tipo celular no grupo tratado com M-CSF nos períodos de 24 e 72 horas quando comparados aos
53
grupos EAPa e EAPa + M-CSF, e não foi observado diferença significativa na quantificação
deste tipo celular entre o grupo CTL e o EAPa, mostrando que EAPa não estimula a proliferação dos PMN’s. Na literatura muitos trabalhos mostram a ação de extratos de plantas sobre os
PMN’s (Braga et al., 2012; Liz et al., 2012; Suzuki et al., 2012), porém estes trabalhos relatam apenas análise da viabilidade dos granulócitos, sobre sua resposta microbicida e ativação.
Entretanto, este trabalho mostra pela primeira vez a ação de um produto de origem natural
sobre o processo de diferenciação celular dos PMN’s.
Este estudo demonstrou a ação de EAPa sobre as células com núcleo em anel e os
monócitos, células estas precursoras dos macrófagos. Não foi observado uma redução significativa no grupo EAPa em relação ao número de células com núcleo em anel e de monócitos
quando comparados ao grupo controle sem tratamento, a diminuição desses dois tipos celulares no grupo tratado com M-CSF já era esperado, pois esse fator de crescimento estimula as
células da medula comprometidas com as linhagens de fagócitos mononucleares a se diferenciarem em macrófagos. Entretanto, foi observado que EAPa não esta atuando em sinergia
com o M-CSF, pois no período de 24 horas foi observado uma redução significativa no número de células com núcleo em anel e de monócitos no grupo M-CSF quando comparado ao
EAPa + M-CSF.
Na análise quantitativa, não foi observada diferença significativa no número de
macrófagos residentes e ativados entre os grupos EAPa e controle, porém foi observado um
aumento significativo no número de macrófagos ativados no grupo M-CSF quando comparado com o grupo tratado apenas com EAPa a partir do período de 24 horas. Além disso, foi
evidenciado também que EAPa não está atuando em sinergia com M-CSF, pois não foi observada uma maior quantidade no número de macrófagos ativados no grupo EAPa + M-CSF ao
longo do tempo de cultivo quando comparados aos grupos EAPa e o controle, como foi observado no grupo M-CSF.
A análise quantitativa do número de macrófagos ativados mostrou que não houve
diferença significativa entre as células tratadas com EAPa e as células do grupo controle, porém a análise morfológica por microscopia óptica mostrou que células tratadas com EAPa
apresentaram um maior padrão de espraiamento celular e maior volume citoplasmático, quando comparados com o grupo controle. Abud et al. (2006) e Cesar et al. (2008) mostraram que
células tratadas com o medicamento Canova® apresentaram uma maior quantidade de células
aderidas ao substrato, e um aumento do volume citoplasmático e do espraiamento celular,
características estas, típicas de células ativadas.
54
Por microscopia óptica foi mostrado que a maioria das células aderidas apresentavam morfologia típica de macrófagos, essas células apresentam algumas características peculiares que permitem a sua identificação por microscopia óptica, como o espraiamento celular,
forma do núcleo e vacuoalização citoplasmática, porém, para realizar uma análise mais segura
se faz necessário a utilização de marcadores de superfície específicos que são encontrados na
membrana desses fagócitos. Os macrófagos apresentam várias proteínas em sua superfície,
umas delas é a CD11b, essa proteína também pode ser encontrada em pequena quantidade na
superfície dos neutrófilos, células dendríticas e em linfócitos, porém a CD11b é expressa em
grande quantidade na superfície dos macrófagos (Brom et al., 1995).
Nesse trabalho a identificação dos macrófagos foi realizada utilizando o marcador
CD11b,e analisado por microspocia de imunofluorescência e citometria de fluxo. A marcação
da proteína de superfície CD11b por técnica de imunofluorescência mostrou que a maioria
das células aderentes e tratadas com EAPa eram pertencentes a linhagem monocítica, ou seja,
apresentaram marcação CD11b positiva. Cesar et al. (2008) mostraram em seu trabalho que o
tratamento com nedicmannto Canova® estimula a diferenciação das células da medula óssea
em macrófagos, pois a maioria das células aderentes e tratadas com medicamento Canova®
apresentavam marcação CD11b positiva.
A análise por citometria revelou que as células tratadas com EAPa apresentaram
um porcentagem de células marcadas positivamente para CD11b de 10,60%, sendo esta bem
próxima a do controle positivo composto por macrófagos peritoneais que foi de 12,18%, e
bem similar ao do grupo M-CSF que foi de 9,21% e muito superior a do grupo controle, no
qual apresentou uma porcentagem de 5,26%. Este resultado mostra que EAPa tem a capacidade de estimular a diferenciação das células da medula em macrófagos, sugerindo assim que
este extrato seja um potencializador da resposta imune inata, que é importante, pois é estabelecida logo no início da invasão do agente agressor (vírus, bactéria, protozoários, fungos), e os
macrófagos, são umas das células pertencentes ao sistema imune que migram para o local da
invasão, reconhecendo o agente agressor, fagocitando e eliminando o patógeno (de Oliveira et
al., 2011; Abbas et al., 2012).
Além disso, a análise por citometria mostrou que EAPa estimula a diferenciação
das células da medula em macrófagos, essas células são de suma importancia para a manuntenção de um resposta imune eficaz, e frente a essa grande importancia, atualmente muitos
estudos vem demonstrando a capacidade de diferentes bioprodutos em promover a ativação
dos macrófagos aumentando a sua atividade fagocítica, produção de ROS, e dentre outras
variadas vias, e nesses macrófagos ativados são observadas algumas características típicas
55
como aumento do volume citoplasmático, maior espraimento celular, aumento das organelas
citoplasmáticas, maior número de filopódios e vacúolos (Abud et al., 2006, Lopez et al, 2006;
Cesar et al., 2008, Mayti et a.l, 2009; Rodrigues et al., 2011). Nesse estudo foi mostrado que
EAPa promoveu a ativação dos macrófagos derivados da medula óssea através da produção
de ROS. Resultado similar também foi obtido por Lee et al. (2009), no qual eles mostraram
que o extrato de Physalis angulata apresenta a capacidade de estimular a produção de ROS
em células cancerígenas da mucosa oral.
Em relação a produção de NO, EAPa parece não estimular o aumento da produção
desses radicais. Foi observado uma redução no grupo EAPa na produção de NO quando comparado ao grupo controle sem tratamento. A ação inibitória de EAPa sobre a produção de NO
também foi observada nas células estimuladas com M-CSF e tratadas com EAPa. Resultado
similar foi observado por Soares et al. (2003), nos qual foi mostrado que as fisalinas B, F e G
na concentração de 2 µg/mL, inibiram a produção de NO em macrófagos previamente estimulados com LPS e INF-y. O extrato da planta Physalis alkekengi também inibiu a produção de
NO em macrófagos tratados nas concentrações de 50 e 100 µg/mL (Kang et al., 2011).
Assim como análise da produção de ROS e NO, a fagocitose também é uma forma de avaliação da ativação dos macrófagos, neste trabalho foi mostrado que células da medula óssea tratadas com EAPa não apresentaram um aumento na atividade fagocítica quando
comparado ao grupo contole. Esse resultado esta de acordo com o que foi realizado com os
extratos vimang e mangiferin que também não foram capazes de aumentar a atividade fagocítica dos macrófagos (Garcia et al., 2002).
Resultados prévios obtidos por no nosso grupo de pesquisa mostram que EAPa
apresenta a capacidade de ativar macrófagos de murinos. Por microscopia óptica, microscopia
eletrônica de varredura e microscopia de imunofluorescência foi observado que os macrófagos tratados apresentaram maior padrão de espraiamento celular, volume citoplasmático e
aumento no número de projeções citoplasmática, por microscopia óptica foi notável a elevação do número de vácuoloso citoplasmático, e a análise por microscopia eletrônica de transmissão mostrou que as organelas apresentavam características normais e não foi observados
estruturas apoptóticas nas células tratadas. EAPa não estimulou o aumento da produção de
NO e nem aumentou a atividade fagocítica dessas células, porém, no ensaio citoquímico NBT
foi mostrado que EAPa tem a capacidade promover um aumento de ROS nas células tratadas
com 100 µg/mL, e esse resultado foi confirmado pela contagem das células marcadas positivamente como o NBT. Esses resultados citados complemementam com os que foram obser-
56
vados nesse trabalho, mostrando a capacidade de EAPa em ativar as células mononucleares da
medula óssea mantidas em cultura in vitro.
EAPa se mostrou como uma substância capaz de estimular a diferenciação dos
monócitos da medula em macrófagos, porém, os monócitos quando migram para os tecidos
também podem se diferenciar em CDs, que também participam da resposta imunológica, atuando como uma célula apresentadora de antígeno (APc) (Geissmann et al., 2010). Os CDs,
são fagócitos que apresentam em sua superfície uma proteína denominada de CD11c, e para
verificar se EAPa estimula o processo de diferenciação dos monócitos em CDs foi feita a
marcação dessa proteína por imunofluorescência e análise por citometria de fluxo.
A marcação por imunofluorescência mostrou que poucas células apresentaram
marcação positiva para CD11c no grupo EAPa e no controle sem tratamento. In vitro as células da medula óssea se diferenciaram em CDs num período de duas semanas, e para tal diferenciação é necessário a presença do GM-CSF, IL-4 e TNF-α (Inaba et al., 1992; Citterio et
al., 1999). Devido a essa características pode ser sugerido que as células que marcaram positivamente com CD11c seja CDs imaturas, pois na ausência desses fatores de crescimento e
citocinas as CDs imaturas tendem a aderir (Citterio et al., 1999).
Por citometria foi verificado que não houve diferença significativa na marcação
positiva para CD11c no grupo EAPa (6,94%), quando comparado ao grupo controle sem tratamento (7,06%), mostrando que EAPa não estimula o processo de diferenciação e maturação
das células mononucleares da medula óssea em CDs. M8, uma substância altamente diluída,
apresentou ação similar a EAPa, pois essa substância também não estimulou o processo de
maturação e diferenciação das CDs (de Oliveira et al., 2011).
A anáise da viabilidade das células da medula tratadas e não tratadas mostrou que
o extrato não apresentou efeito citotóxico para as células da medula óssea durante os quatro
tempos de cultivo. Foi observado também que as células tratadas apresentavam mais células
viáveis que o controle, evidenciando mais uma vez a capacidade de EAPa em ativar macrófagos. Estas células ativadas tem a capacidade de secretar várias citocinas, como o TNF-α, que é
capaz estimular a liberação de agentes anti-apoptótico para o meio de cultura, impedindo que
as células monofagocíticas entrem em apoptose (Rusten et al., 1994). Este resultado corrabola
com os trabalhos realizados com IH, no qual mostraram que as células da medula óssea tratadas com IH conseguiam sobreviver por mais de três semanas em cultivo (Abud et al, 2006;
Cesar, 2008).
Aumento de células marcadas positivamente com CD11b, aumento da adesão celular, do padrão de espraiamento celular, do volume citoplasmático e de células marcadas
57
positivamente com NBT no grupo tratado somente com EAPa, são características típicas de
células ativadas. Vale ressaltar que os testes de viabilidade celular demonstraram que EAPa
não apresentou efeito citotóxico em células da medula óssea. Então, a partir dos resultados
citados é possível inferir que EAPa parece atuar como agente imunomodulador favorecendo
ativação de macrófagos.
58
6. CONCLUSÃO
Os resultados apresentados e discutidos permitem concluir que o extrato aquoso
da raiz da planta Physalis angulata:
1. Não apresentou efeito citotóxico para as células da medula óssea.
2. Foi capaz de estimular o processo de adesão celular.
3. Interferiu no processo de proliferação, diferenciação e adesão dos linfócitos e polimorfonucleares.
4. Promoveu alterções morfológicas nas células da medula óssea, uma vez que foi observado maior padrão de espraiamento celular e do volume citoplasmático, características
típicas de células ativadas.
5. Promoveu a diferenciação das células da medula óssea em macrófagos.
6. Não estimulou a produção de óxido nítrico e nem o aumento da atividade fagocítica.
7. Promoveu a ativação dos macrófagos, como foi observado pelo aumento da produção
dos radicais de oxigênio.
59
7. REFERÊNCIAS
ABBAS, A.K.; LIGTHMAN, A.H. & PILLAI, S. Biologia Celular e Molecular. Ed. Elsevier. Rio de Janeiro, 2012. 544p.
ABDELHAY, E. S.F.W.; BRAGA, F.H.P.;BINATO, R.; BOUZAS, L.F.S. Hematopoietic
stem cells: expansion and perspectives for therapeutic use. Rev. Bras. Hematol. Hemoter, 31: 2-8. 2000.
ABUD, A.P.R. Ação In Vitro do medicamento homeopático Canova em células de medula óssea de camundongos. Dissertação de mestrado. Curitiba. Universidade Federal do
Paraná, 2005. 99p.
ABUD, A.P.R.; CESAR, B.; CAVAZZANI, L.F.M.; OLIVEIRA, C.C.; GABARDO, J.; BUCHI, D.F. Activation of bone marrow cells treated with Canova in vitro. Cell Biology International, 30: 808-816. 2006.
AGATA, K.; KUSIAK. J.; STEPIÉN, B.; BERGIER, K.; KUŹNIAK, E. Bioaktywne metabolity wtórne roślin z rodzaju Physalis. Postepy Hig Med Dosw, 64: 665-673. 2010.
ALBERTS, B.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K.; WALTER, P. Biologia Molecular da Célula. Ed. Artmed. São Paulo, 2004. 1287p.
AMBROSIO, A.R.; DE MESSIAS-REASON, I.J.T. Leishmania (Viannia) braziliensis: Interaction of mannose-binding lectin with surface glycoconjugates and complement activation. An antibody-independent defence mechanism. Parasite Immunol, 27: 333 – 340.
2005.
AUFFRAY, C.; SIEWEKE, M.H.; GEISSMANN, F. Blood Monocytes: Development, Heterogeneity, and Relationship with Dendritic Cells. Rev. Furthe, 27: 669-692. 2009.
BANCHEREAU, J.; STEINMAN, R.N. Dendritic cell e the control of immunity. Nature,
392: 245-252. 1998.
BARREDA, D. R.; HANINGTON, P.C.; BELOSEVIC, M. Regulation of myeloid development and function by colony stimulating factors. Developmental and Comparative
Immunology, 28: 509-554. 2004.
BASTOS, G.N.T.; SILVEIRA, A.J.A.; SALGADO, C.G.; PICANÇO-DINIZ, D.L.W.; NASCIMENTO, J.L.M. Physalis angulata extract exerts anti-inflammatory effects in rats by
inhibiting different pathways. J Ethnopharmacol Jul, 118: 246–251. 2008.
BRAGA, P.C.; MARABINI, L.; WANG, Y.Y.; LATTUADA, N.; CALÒ, R., BERTELLI,
A.; FALCHI, M.; DAL SASSO, M.; BIANCHI, T. Characterisation of the antioxidant ef-
60
fects of Aesculus hippocastanum bark extract on the basis of radical scavenging activity,
the chemiluminescence of human neutrophil bursts and lipoperoxidation assay. EUR
REV MED PHARMACOL SCI, 3: 1-9. 2012.
BROM, J.; KOLLER, M.; SCHLUTER, B.; MULLER-LANGE, P.; ULRICH STEINAU, H.;
KONING, W. Expression of the adhesion molecule CD11b and polymerization of actin
by polymorphonuclear granulocytes of patients endangered by sepsis. Burns, 21: 427431. 1995.
CELLA, M.; SALLUSTO, F.; LANZAVECCHIA, A. Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cell. Curr opin Immunol, 9: 10-16. 1997.
CESAR, B. Avaliação do medicamento homeopático imunomodulador em células de medula óssea de camundongos tratados in vitro e in vivo. Dissertação de mestrado. Curitiba. Universidade Federal do Paraná, 2008. 105p.
CESAR, B.; ABUD, A.P.R.; OLIVEIRA, C.C.; CARDOSO, F.; GREMSKI, W.; GABARDO, J.; BUCHI, D.F. Activation of mononuclear bone marrow cells treated in vitro with
a complex homeopathic medication, Micron 39: 461–470. 2008.
CHOUDHARY, M.I.; YOUSUF, S.; SHAH, S.A.; AHMED, S.; ATTA-UR-RAHMAN. Biotransformation of physalin H and leishmanicidal activity of its transformed products.
Chem Pharm Bull, 54: 927-930. 2006.
CITTERIO, S., RESCIGNO, M., FOTI, M., GRANUCCI, F., AGGUJARO, D., GASPERI,C., MATYSZAK, M.K., GIROLOMONI, G.; RICCIARDI-CASTAGNOLI, P. Dendritic cells as natural adjuvants. Methods, 19: 142-147. 1999.
CRUVINEL, W.M.; MESQUITA-JINIOR, D.; ARAÚJO, J.A.P.; CATELAN, T.T.T.; de
SOUZA, A.W.S.; SILVA, N.P.; ANDRADE, L. E. C. Sistema Imunitário – Parte I Fundamentos da imunidade inata com ênfase nos mecanismos moleculares e celulares da
resposta inflamatória. Ver. Bras. Reumatol, 5: 434-461. 2010.
DALE, C. D; BOXER, L.; LILES, W.C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood,
112: 934-945. 2008.
DAS, M.; MUKHERJEE, S.B. & SHAHA, C. Hydrogen Peroxide apoptosis-like death in
Leishmania donovani promastigotes. Journal of Cell Science, 114: 2461-2469. 2001.
DEANS R.L.; MOSELEY A.B. Mesenchimal stem cell: Biology and potencial clinical use.
Exp Hematol, 28: 875-884. 2000.
DICKHOUT, J.G.; LHOTÁK, S.; HILDITCH, B.A.; BASSERI, S.; COLGAN, S.M.; LYNN,
E.G.; CARLISLE, R.E.; ZHOU, J.; SOOD, S.K.; INGRAM, A.J.; AUSTIN, R. C. Induction of the unfolded protein response after monocyte to macrophage differentiation aug-
61
ments cell survival in early atherosclerotic lesions. The FASEB Journal, 25: 1- 14.
2010.
EL−BENNA, MY−CHAN DANG. P.; GOUGEROT−POCIDALO, M.A.; ELBIM, C. Phagocyte NADPH oxidase: a multicomponent enzyme essential for host defenses. Arch
Immunol Ther Exp, 53: 199–206. 2005.
FALCÃO, R.P.; CALADO, R. T. Fundamentos e práticas. Produção, dinâmica e função
das células sanguíneas. Ed. Atheneu. São Paulo, 2001. 1090p.
FINAUD, J.; LAC, G.; FILAIRE, E.; EDITH, S. Oxidative Stress: Relationship with Exercise
and Training. Sports medicine, 36: 327-358. 2006.
FISCHER, S.O.; HÜBNER, G.D.; VARGAS, T. V. Imunomodulação pela própolis. Arq.
Inst. Biol, 75: 247-253. 2008.
FOTAKIS, G.; TIMBRELL, J. A. in vitro cytotoxicity assays: comparison of LDH, vermelho
neutro, MTT and protein assay in hepatoma cell lines following exposure to cadmium
chloride. Toxicol Lett, 160:171-77. 2006.
GARCIA, D.; DELGADO, R.; UBEIRA, F.M.; LEIRO, J. Modulation of rat macrophage
function by the Mangifera indica L. extracts Vimang and mangiferin. International
Immunopharmacology, 2: 797–806. 2002.
GEISSMANN, F.; MANZ, M.G.; JUNG, S.; SIEWEKE, M.H.; MERAD, M.; LEY, K. Dendritic Cells Development of Monocytes, Macrophages, and Dendritic Cells. Science 327:
656-661. 2010.
GHONIME, M.; ELDOMANY, R.; ABLELAZIZ, A.; SOLIMAN, H. Evaluation of immunomodulatory effect of three herbal plants growing in Egypt. Immunopharmacol
Immunotoxicol, 1:141-145. 2011.
GUIMARÃES, E. T.; LIMA, M.S.; SANTOS, L.A.; RIBEIRO, I.M.; TOMASSINI, T.B.C.;
dos SANTOS, R.R; dos SANTOS, W.L.C.; SOARES, M.P.B. Activity of physalins purified from P. angulata in in vitro and in vivo models of cutaneous leishmaniasis. Journal
of Antimicrobial Chemotherapy, 64: 84–87. 2009.
GORDON, S. Alternative actvation of macrophage. Nat. Ver. Immunol, 3: 23-25. 2003.
HAMSA, T.P.; KUTTAN, G. Ipomoea obscura ameliorates cyclophosphamide-induced toxicity by modulating the immune system and levels of proinflammatory cytokine and gsh.
CAN J PHYSIOL PHARMACOL, 11: 1042-53. 2011.
HAWKES, G. J.; LESTER, R. N., NEE, M. & ESTRADA, N. Solanaceae III: taxonomy
chemistry evolution. Ed. Royal Botanic Gardens. Londres, 1991. 492p.
62
HEITBROCK, L.Z.; ANCUTA, P.; CROWE, S.; DALOD, M.; GRAU, V.; HART, D.N.;
LEENEN, P.J.M.; LIU Y.J.; PHERSON, M.G.; RANDOLPH, G.J.;SCHERBERICH, J.;
SCHMITZ, J.; SHORTMAN, K.; SOZZANI, S.; STROBL, H.; ZEMBALA, M.; AUSTYN, J.M.; LUTZ, M.B. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Journal of the American Society of Hematology, 6: 74-80. 2010.
INABA, K; INABA, M.; ROMANI, N.; AYA, H.; DEGUCHI, M.; IKEHARA, S.; MURAMATSU, S.; STEINMANL, R. Generation of large numbers of dendritic cells from
mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colonystimulating factor. J. Exp. Med, 176: 1693-1702. 1992.
JANUÁRIO, A.H.; FILHO, E.R.; PIETRO, R.C.; KASHIMA, S.; SATO, D.N.; FRANÇA,
S.C. Antimycobacterial physalins from Physalis angulata L. (Solanaceae). Phytother
Res Aug, 16: 445-448. 2002.
JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica. Guanabara/Koogan. Rio de Janeiro, 2008. 507p.
KANG, H.; KWON, S.R.; CHOI, H.Y. Inhibitory effect of Physalis alkekengi l. var franchetii extract and its chloroform fraction on LPS or LPS/IFN-γtimulatedinflamatory response in peritoneal macrophages. J Ethnopharmacol, 24: 95-101. 2011.
KHAZEN, W.; M’BIKA, J.P.; TOMKIEWICZ, C.; BENELLI, C.; CHANY, C.; ACHOUR,
A.; FOREST, C. Expression of macrophage-selective markers in human and rodent adipo-cytes. FEBS letters, 579: 5631-5634. 2005.
KINA, T.; IKUTA, K.; TAKAYAMA, E.; WADA, K.; MAJUMDAR, A. S.; WEISSMAN, I.
L.; KATSURA, Y. The monoclonal antibody TER-119 recognizes a molecule associated
with glycophorin A and specifically marks the late stages of murine erythroid lineage.
British Journal of Haematology,109: 280-287. 2000.
KONDO, M.; WEISSMAN, I.L.; AKASHI, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell, 91: 661-672,.1997.
LEE, H.Z.; LIU, W.Z.; HSIEH,W.T.; TANG, F.Y.; CHUNG, J.G.; LEUNG, W.C. Oxidative
stress involvement in Physalis angulata-induced apoptosis in human oral cancer cells.
Food and Chemical Toxicology, 47: 561–570. 2009.
LI, Y.Z.; PAN Y.M.; HUANG X.Y.; WANG H. S. Withanolides from Physalis alkekengi var.
francheti. Helv. Chim. Acta,91: 2284-2291. 2008.
63
LIZ, R.; HORST, H.; PIZZOLATTI, M.G.; FRODE, T.S.; GIRARD, D. activation of human
neutrophils by the anti-inflammatory mediator Esenbeckia leiocarpa leads to atypical
apoptosis. Mediators inflamm, 20: 1982-1983. 2012.
LOPES, L.; GODOY, L.M.F.; OLIVEIRA, C.C.; GABARDO, J.; SCHADECK, R.J.G.; BUCHI, D.F. Phagocytosis, endosomal/lysosomal system and other cellular aspects of macrophage activation by Canova medication. Micron, 37: 277-287. 2006.
LORENZI, T.F. Manual de Hematologia – Propedêutica e Clínica. MEDSI – Editora Médica e Científica Ltda. 1999.
LORENZI, H.; MATOS, F.J.A. Plantas medicinais no Brasil nativas e exóticas. Ed.
Obessa. São Paulo, 2002, 512p.
LUSAKIBANZA, M.; MESIA, G.; TONA, G.; KAREMERE, S.; LUKUKA, A.; TITS, M.;
ANGENOT, L.; FRÉDÉRICH, M. In vitro and in vivo antimalarial and cytotoxic activity
of five plants used in congolese traditional medicine. Journal of Ethnopharmacology.
2010.
MAGALHÃES, H.I.; VERAS, M.L.; TORRES, M.R.; ALVES, A.P.; PESSOA, O.D.; SILVEIRA, E.R.; COSTA-LOTUFO, L.V.; DE MORAES, M.O.; PESSOA, C. In-vitro and
in-vivo antitumour activity of physalins B and D from Physalis angulata. J Pharm
Pharmacol Feb, 58: 235-41. 2006.
MAITY, P.C.; BHATTACHARJEE, S.; MAJUMDAR, S.; SIL, A.K. Potentiation by cigarette smoke of macrophage function against Leishmania donovani infection. Inflamm
Res, 58: 22–29. 2009.
MARIM, F.M.; TATIANA-SILVEIRA, N,; LIMA, S.D. JR.; ZAMBONI, D.S. A method for
generation of bone marrow-derived macrophages from cryopreserved mouse bone marrow cells. PLoS One, 5: 152-63. 2010.
MARLETTA, M.A. Nitric oxide synthase structure and mechanism. J.Biol.Chem, 17: 1993.
MAYANI, H.; FIGUEROSA, E.F.; PELAYO, R.; MONTESINOS, J.J.; GUZMÁN, P.F.;
GONZÁLEZ, A.C. Hematopoyesis. Cancelorogia, 2: 97-105. 2007.
MESQUITA-JUNIOR, D.; ARAÚJO, J.A.P.; CATELAN, T.T.T.; de SOUZA, A.W.S.;
CRUVINEL, W.M.; ANDRADE, L.E.C.; SILVA, N.P. Sistema Imunitário – Parte II
Fundamentos da resposta imunológica mediada por linfócitos T e B. Ver. Bras Reumatol 50: 552-580. 2010.
MOSSER, D.M. The many faces of macrophage activation. Journal of Leukocyte Biology,
73: 209-212. 2003.
64
MOSSER, D.M.; EDWARDS, J.P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat
Rev Immunol, 8: 958-969. 2008.
OLIVEIRA, C.C. alteração da expressão gênica e das respostas fisiológicas de macrófagos peritoneais de camundongos pelo canova. Tese de doutorado. Curitiba. Universidade Federal do Paraná, 2006. 115p.
OLIVEIRA, C.C.; ABUD, A.P.R.; de OLIVEIRA, S.M.; GUIMARÃES, F.S.F.; ANDRADE,
L.F.; DI BERNARDI, R.P.; COLLETO, E.L.O.; KUCZERA, D.; da LOZZO, E.J.;
GONÇALVES, J.; TRINDADE, E.S.; BUCHI, D.F. Developments on drug discovery
and on new therapeutics: highly diluted tinctures act as biological response modifiers.
BMC Complementary and Alternative Medicine, 11: 2011.
OWEN, M. Lineage of osteogenic cells and their relationship to the stromal system. ED.
Bone and mineral research, vol. 3. New York, 1985. 1–25p.
PEREIRA,W.K.V.; LONARDONI, M.V.C.; GRESPAN, R.; CAPARROZ- ASSEF, S.M.;
CUMAN, R.K.N.; BERSANI-AMADO, C.A. Immunomodulatory effect of Canova medication on experimental Leishmania amazonensis infection. Journal of Infection, 51:
157–164. 2004.
QURESHI, M.A.; DIETERT, R.R. Bacterial uptake and killing by macrophages. In: Burleson
GR, Dean J, Munson A. Methods in immunotoxicology, 2: 119-131. 1995.
RANDOLPH, G.J.; JAKUBZICK, C.; QU, C. Antigen Presentation by Monocytes and Monocyte-derived Cells. Curr Opin Immunol, 20: 52-60. 2008.
RAY, B.A.; GUPTA, M. In “Progress in the Chemistry of Organic Natural Products”,
Fortschr Chem Org Naturst, 63: 1-106. 1994.
REIS, E.S. Papel do sistema complemento no processo de diferenciação e maturação das
células dendríticas. Tese de doutorado. São Paulo. Universidade de São Paulo, 2008.
135p.
RODRIGUES, A. P. D.; CARVALHO, A.S.; SANTOS, A. S.; ALVES, C. N.; NASCIMENTO,
J.L.;
SILVA,
E.O.
Kojic
acid,
a
secundary
metabolite
from
from Aspergillus sp., acts as n inducer of macrophage activation. Cell Biol Int. abr, 1:
335-343. 2011.
ROITT, I.; BROSTOFF, J.; MALE, D. Imunologia, Editora Malone LTDA. São Paulo, 1999.
423p.
ROSSETI, A.S. da. Bortedella pertussis: Participação da arginase. TGF-ß e TRL-4 no
controle da síntase de óxido nítrico em macrófagos derivados da medula óssea murina. Dissertação de mestrado. São Paulo. Universidade de São Paulo, 2009. 51p.
65
RUE, M. L. Eosinofilia devido a parasitas. RBAC, 33(4): 221-223. 2001.
RUIZ, L., MARCO, M.; CABOS, M.; CHOQUEVILCA, A. L. G. & ROUMY, V. Plants
used by native Amazonian groups from the Nanay River (Peru) for the treatment of malaria. Journal of Ethnopharmacology, 133: 917-921. 2011.
RUSTEN, L.S; JACOBSEN, F.W; LESSLAUER, W; LOETSCHER, H; SRNELAND, E.B;
JACOBSEN F.W; LESSLAUER W; LOETSCHER H; SRNELAND E.B; JACOBSEN
S. E.W. Bifunctional Effects of Tumor Necrosis Factor α (TNFα) on the Growth of Mature and Primitive Human Hematopoietic Progenitor Cells: Involvement of p55 and p75
TNF Receptors. Blood,11: 3152-3159. 1994.
SÁ,
M.S.;
MENEZES,
M.N.; KRETTLI,
A.U.; RIBEIRO,
I.M.; TOMASSINI,
T.C.; RIBEIRO, R.S.; AZEVEDO, W.F.JR.; SOARES, M.B. Antimalarial activity of
physalins b, d, f, and g. J Nat. Prod, 10: 2269-2272. 2011.
SAHA, P.; GEISSMAN, F. Toward a functional characterization of blood monocytes.
Immunology and Cell Biology, 89: 2-4. 2010.
SAVI, L.A.; PALUDO, R.; MIRANDA, L.A.; HAAS, P. Colorações hematológicas utilizadas
em técnicas laboratoriais. Newslab, 51: 90-103. 2002.
SATO, D. Y. O.; WL, R.; OLIVEIRA, C.C.; CATTANEO, R.I.I.; MALVEZZI, M.;
GABARDO, J.; BUCHI, D. F. Histopathological and immunophenotyping studies on
normal and sarcoma 180-bearing mice treated with a complex homeopathic medication.
A homeopatia, 94: 26-32. 2005.
SATO, P.K. Estudos de células dendríticas derivadas de monócitos de pacientes com paracoccidiodomicose: Expressão de moléculas de superfície e secreção de citocinas.
Dissertação de mestrado. São Paulo, 2010. 134p.
SERBINA, N.V.; JIA, T.; HOHL, T. M.; PAMER, E.G. Monocytemediated defense against
microbial pathogens. Rev Immunol, 26: 421–452. 2008.
SOARES, M.B.P.; BELLINTANI, M.C.; RIBEIRO, I.M.; TOMASSINI, C.B.; SANTOS,
R.R. Inhibition of macrophage activation and lipopolysaccaride-induced death by secosteroids purified from Physalis angulata L. European Journal of Pharmacology, 459;
107– 112. 2003.
SILVA, M.T.G.; SIMAS, S.M.; BATISTA, T.G.F.M.; CARDARELLI.; TOMASSINI, C.B.
Studies on antimicrobial activity, in vitro, of Physalis angulata L. (Solanaceae) fraction
and physalin B bringing out the importance of assay determination. Mem Inst Oswaldo
Cruz, 100: 779-782. 2005.
SILVEIRA, A.P.A. Hematopoiese: Alguns aspectos. J. Bras Nefrol: 5-6. 2000.
66
SMIT, E.; PRETORIUS, E.; ANDERSON, R.; OOMMEN, J.; POTJO, M. Differentiation of
Human Monocytes in Vitro Following Exposure to Canova in the Absence of Cytokines.
Ultrastructural Pathology,32: 147–152. 2008.
STEINMAN, R.M.; LUSTIG, D.; COHN, Z. Identification of a novel cell type in peripheral
lymphoid organs of mice. The jornal of experimental medicine, 39: 1431-1445. 1974.
STEMPIN, C.C.; CERBAN, F.M. Macrofagos e induccion de arginase como mecanismo de
evasion de parasitos. Medicina, 67: 737-746. 2007.
SUZUKI,
K.; OHNO,
S.; SUZUKI,
Y.; OHNO.
Y.; OKUYAMA,
R.;
ARUGA,
A., YAMAMOTO, M.; ISHIHARA, K.O.; NOZAKI, T.; MIURA, S.; YOSHIOKA,
H.; MORI, Y. Effect of green tea extract on reactive oxygen species produced by neutrophils from cancer patients. anticancer res, 32: 2369-2375. 2012.
TOMASSINI, T.C.B.; BARBI, N.S.; RIBEIRO, I.M.; XAVIER, D.C.D. Gênero PhysalisUma revisão sobre vitaesteróides. Química Nova, 23: 47-57. 1999.
TREMBICK, K.A.; QURESHI, M.A.; DIETERT, R.R. Avian peritoneal exudate cells: a
comparison of stimulation protocols. Devel Comp Immunol, 8: 395-402. 1984.
ZAGO, M. A.; COVAS, D.T. Células-tronco, a nova fronteira da medicina. Ed. Atheneu.
São Paulo, 2006. 268p.
ZANICHELLI, M. A.; FURRER, A.A.; PEREIRA-FILHO, T.S.; VAZ, F.A.C. Hematopoiesis, growth factors and clinical application of erythropoietin in anemia of. prematurity.
Pediatria, 17: 123-142. 1995.
YU, Y.; SUN, L.; MA, L.; LI, J.; HU, L.; LIO, J. Investigation of the immunosuppressive
activity of physalin h on t lymphocytes. Int Immunopharmacol, 3: 290-297. 2010.
67
8. ANEXO
68