Dissertação_Gizele Torres Clímaco de Araujo

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, CONSERVAÇÃO E BIOLOGIA
EVOLUTIVA
Isolamento, caracterização de locos microssatélites e estimativa da
variabilidade genética de Brycon amazonicus (Spix & Agassiz, 1829)
(Characidae: Bryconinae) em ambiente natural e cativeiro
GISELE TORRES CLÍMACO DE ARAUJO
Manaus, Amazonas
Março, 2012
GISELE TORRES CLÍMACO DE ARAUJO
Isolamento, caracterização de locos microssatélites e estimativa da
variabilidade genética de Brycon amazonicus (Spix & Agassiz, 1829)
(Characidae: Bryconinae) em ambiente natural e cativeiro
Orientadora: Dra. Vera Maria Fonseca de Almeida e Val
Coorientadora: Dra. Daniele Aparecida Matoso
Apoio financeiro: INCT/ADAPTA N: 573976/2008-2.
Dissertação apresentada ao Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia
como parte dos requisitos para obtenção
do título de Mestre em Genética,
Conservação e Biologia Evolutiva.
Manaus, Amazonas
Março, 2012
A663i
Araujo, Gisele Torres Clímaco de
Isolamento, caracterização de locos microssatélites e estimativa
da variabilidade genética de Brycon amazonicus (Spix & Agassiz,
1829) (Characidae: Bryconinae) em ambiente natural e cativeiro /
Gisele Torres Clímaco de Araujo. --- Manaus: [s.n.], 2012.
---, --- f.. : il. color.
Dissertação (Mestrado) --- INPA, Manaus, 2012.
Orientador : Vera Maria Fonseca de Almeida e Val
Coorientador: Daniele Aparecida Matoso
Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia
Evolutiva
1.Matrinxã - Manaus. 2.Microssatélite. 3.Variabilidade. I.Título
CDD 597.5
Sinopse:
O matrinxã (Brycon amazonicus) é uma importante espécie de
peixe utilizada comumente nos criatórios na região amazônica em
virtude de sua rusticidade e boa adaptação ao cativeiro. Além disso,
também é comumente pescada pelos ribeirinhos ao longo dos rios da
região. Porém não se sabe o perfil genético desse animal quando se
compara o ambiente natural e em cativeiro. Nesse sentido, o objetivo
desse trabalho foi isolar e desenvolver microssatélites, uma
ferramenta capaz de acessar a diversidade genética diretamente na
molécula de DNA, bem como verificar se há estrutura genética
ocorrendo nesses dois ambientes: cativeiro e natureza. Nesse trabalho,
observou-se uma moderada diferenciação genética nos grupos
estudados.
Dedico
Ao meu esposo e à minha filha, minhas vidas:
Izaías Filho
Maria Eduarda
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus por me prover sabedoria para que pudesse
alcançar êxito, por ter me sustentado nos momentos difíceis e por me abençoar a cada
dia, devido à Sua grande misericórdia.
“Bem aventurado o homem que acha sabedoria, e o homem que adquire
conhecimento” (Provérbios 3, 13).
Aos meus pais, Raimundo e Zuleide, por todo amor dedicados a mim, todo
empenho na minha educação e confiança acima de tudo. Sempre mantive forte em mim
toda a sabedoria que me foi transmitida e tudo isso cooperou para que meus objetivos
fossem alcançados.
Ao meu irmão, Francisco, pela torcida sincera, por acreditar e me impulsionar a ir
sempre em frente. Por toda vibração que sempre fez nas pequenas e grandes vitórias.
Ao meu esposo, Izaías Filho, principalmente pela paciência e compreensão nas
inúmeras vezes em que fui ausente. Obrigada por suportar minhas falhas, meu estresse
e, muitas vezes, minha falta de esperança. Agradeço muito mais por saber como reagir,
estimulando-me a perseverar diante das dificuldades. Com certeza, essa conquista é
dedicada a você, meu querido! Obrigada por tudo!! E a minha filha, ainda no ventre, que
me estimula a crescer. Por ela e pra a ela, sempre o melhor de mim.
À minha orientadora, Vera Val, por toda colaboração dispensada no decorrer da
minha jornada. Obrigada pelas orientações, sempre tentando melhorar meu trabalho.
À minha coorientadora, Dra. Daniele Matoso, pelas contribuições científicas nos
artigos.
A Nazareth, que sempre consegue retirar ―água de pedra‖. Intrépida mulher que
faz a máquina LEEM funcionar e seguir. Não só o meu trabalho, mas de muitos alunos
do laboratório dependeram fortemente da ação e reação da Naza. Meus mais sinceros
agradecimentos.
Eu estaria certamente sendo injusta se não dissesse o quanto foi importante a
participação do Dr. Carlos Henrique nesse projeto. Portanto, agradeço profundamente
toda sua dedicação em me ajudar, principalmente na parte estatística – uma parte tão
delicada e ao mesmo tempo imprescindível para dar valor científico a qualquer trabalho
de pesquisa.
Na verdade, posso dizer que o grupo de microssatélites do LEEM está de
parabéns pela união que agrega força ao grupo. E nesse grupo tenho que citar nomes
que
fizeram
toda
a
diferença
para
mim,
tanto
de
forma
pessoal,
como
profissionalmente, que são as alunas de PIBIC Rosalina Pinheiro e Priscila Roberta e a
doutoranda Carol Fernandes. Meninas, obrigada pelo tempo de vocês dedicado para
me ajudar. Fico feliz, pois conseguimos envolver o aprendizado com a amizade que
tecemos ao longo desses anos de convivência.
Outros amigas do laboratório com os quais desfrutei de momentos de grande
felicidade (principalmente na hora do cafezinho da tarde feito pela inesquecível D.
Sônia) e são amigos que sempre estarão no meu coração: Luciana Fé, Adriana
Tatikawa, Brenda Moraes, Renato Lemgruber, Daniel Fagundes, Ronildo, Karen,
Valéria, Vivian, Kinny, Tariana, Nayara, Fernanda, Derek, Rafael, Hellen, Daiani e
tantos outros.
Aos amigos de turma, principalmente a Eliane Carvalho, Giselle Moura e Suellen
Dias. ―Existem amigos mais chegados que irmãos‖. Nossas lutas em disciplinas e nos
eventos que organizamos fortaleceram nossos laços e sei que esse sentimento é
recíproco para cada uma de nós.
Ao pessoal do Laboratório Temático de Biologia Molecular, nas pessoas da Dra.
Jaqueline Batista, meu amigo Antônio Saulo e novamente a Giselle Moura que me
ajudaram e muito nas estatísticas, no uso de equipamentos e tantos outros favores.
Meu agradecimento eterno a vocês.
A Claudinha, Raquel e D. Rai, por sempre ceder aos pedidos de ajuda quando
as procurei e pelo excelente trabalho na secretaria do LEEM.
Ao Sr. José Baracho, gerente do Centro de Tecnologia, Treinamento e Produção
em Aquicultura (MPA/SEPROR) de Balbina, e ao Msc. Alexandre Honczaryk,
pesquisador do Centro de Pesquisa em Aquicultura do INPA, por permitir as coletas de
matrinxãs nos seus estabelecimentos.
Ao INPA, pela possibilidade de estudar em um grande instituto de pesquisa, que
busca principalmente a conservação da nossa linda Amazônia.
Agradeço profundamente ao PPG-GCBEv, em particular à Dra. Eliana Feldberg,
que sempre foi muito solícita quando precisei. Aos professores que transmitiram seu
conhecimento. Às secretarias Alessandra e Elci por toda dedicação e empenho no
trabalho realizado.
Ao Projeto ADAPTA, pelo custeio das coletas e reagentes imprescindíveis para
realização desse trabalho.
Ao CNPq, pela concessão da bolsa.
A todos que acreditaram em meu potencial e me incentivaram para o fim de mais
um capítulo da minha história, o meu muito obrigada!
“Todas as grandezas desse mundo não valem um bom amigo.”
Voltaire
Epígrafe
―Na vida, não vale tanto o que temos, nem tanto importa o que somos. Vale o que
realizamos com aquilo que possuímos e, acima de tudo, importa o que fazemos de
nós‖.
(Chico Xavier)
RESUMO
A pesca e aquicultura são atividades econômicas de grande importância para a Região
Amazônica, tanto para fins de subsistência como para fins comerciais. Dentre as
espécies nativas de exploração na aquicultura, o matrinxã (Brycon amazonicus)
destaca-se por apresentar bom ganho de peso e boa taxa de crescimento em cativeiro,
aceitar as rações comerciais com facilidade e conseguir bons resultados na reprodução
induzida. Entretanto, é importante saber como se encontra o perfil genético desse peixe
na natureza e em cativeiro; principalmente se considerarmos que a variabilidade
genética é um importante parâmetro para garantir a sobrevivência de uma espécie
frente à alguma perturbação ambiental. Uma ferramenta capaz de revelar a diversidade
genética de procariotos e eucariotos é o marcador molecular microssatélite. Os
microssatélites são marcadores altamente polimórficos, de natureza multialélica,
herança mendeliana e facilmente detectados por PCR (Reação em Cadeia da
Polimerase). O objetivo desse trabalho foi verificar os níveis de variabilidade genética
de três populações de matrinxã: duas provenientes de estações de piscicultura e uma
de ambiente natural, visando à conservação dos recursos genéticos desse animal, por
meio de marcadores microssatélites. Para tanto, foram isolados 31 locos de
microssatélites por meio da construção de uma biblioteca genômica enriquecida de
microssatélites de acordo com a metodologia de Billote (1999). A caracterização foi
realizada em 32 indivíduos provenientes da natureza (população selvagem – lago
Catalão, Manaus, Amazonas (3:09‘51,5‖S; 59:54‘22,8‖O). Como resultado, foram
obtidos 16 locos polimórficos que foram utilizados para verificar a existência de
estruturação entre as populações desse estudo. As análises estatísticas revelaram que
há carência de heterozigotos (f > 0) em todas as populações estudadas. Também foi
observado que há diferenciação genética entre as populações (FST = 0,1169; RST =
0,129). A Análise Molecular de Variância revelou que as populações estão
diferenciadas, ou seja, estão com tendência a se tornarem grupos distintos. Além disso,
as correlações entre distância genética (Nei, 1972) e identidade genética revelaram que
as populações de Balbina e Rio Preto da Eva possivelmente são originárias de uma
população comum, mas, com o tempo passaram a divergir geneticamente dos
exemplares selvagens. Esse resultado pode ser confirmado pelo dendograma de
UPGMA obtido a partir dos dados de distância genética com 100.000 bootstraps, no
qual foram observados dois grupamentos distintos: o primeiro possui as duas
populações de cativeiro no mesmo clado, enquanto a população da natureza
isolada em outro grupo.
está
Uma análise Bayesiana foi realizada através do software
Structure (Pritchard et al., 2000) com modelo que admite misturas entre as populações.
Os
resultados
revelaram
que
as
populações
estudadas
estão
estruturadas
geneticamente em três grupos distintos, ou seja, populações de Rio Preto da Eva,
Balbina e Catalão. Cinco locos microssatélites mais polimórficos foram suficientes para
determinar a relação de pais e filhos na população proveniente de Rio Preto da Eva.
Essa medida pode cooperar com os programas de cruzamento seletivo. A estruturação
observada nas populações estudadas indica que um novo rodízio de reprodutores deve
ser realizado nas pisciculturas, visando o incremento nos níveis de produção. Em
relação à população natural, a sobrepesca pode estar contribuindo para a baixa
variabilidade genética detectada, porém novos estudos em outras populações ao longo
do Rio Negro são necessários para se obter um melhor perfil genético para essa
espécie na natureza.
Abstract
Fisheries and aquaculture are important economic activities in the Amazon region, both
for subsistence and for commercial purposes. Among the native species in aquaculture
farm, matrinxã (Brycon amazonicus) stands out for its good weight gain and good
growth rate in captivity, and its acceptance for commercial food, getting good results on
induced spawning. However its genetic profile in the wild and captivity is still unknow.
Particularly when you consider that genetic variability is an important parameter to
ensure the survival of a species before some environmental disturbance it is important to
measure genetic variability. A tool to verify the genetic diversity of prokaryotes and
eukaryotes is the microsatellite marker, because these markers are highly polymorphic
in nature, multiallelic, present Mendelian inheritance, and are easily detected by PCR
(Polymerase Chain Reaction). Therefore, the main goal of this study was to assess the
genetic variability three populations of matrinxã: two from fish farms and one from a
natural environment, with the aim of for conservation of genetic resources of this specie.
For this purpose, 31 loci were isolated by constructing a genomic library enriched
microsatellite according to the methodology Billote (1999). The characterization was
performed using 32 individuals from nature (the wild population - Lake Catalan, Manaus,
Amazonas). As a result, we obtained 16 polymorphic loci that were used to verify the
existence of structuring among populations of this study. Statistical analyzes revealed
that there is a lack of heterozygotes (f > 0) in all populations studied. It was also
observed that there is a genetic differentiation (FST = 0.169; RST = 0.129). Molecular
Analysis of Variance showed that populations are differentiated, i.e., with a tendency to
become distinct groups. In addition, there was a correlation between genetic distance
(Nei, 1972) and genetic identity, revealing that populations of Balbina and Rio Preto da
Eva possibly originated from a common population, and over time began to divergent
genetically from wild specimens. This result can be confirmed by the UPGMA
dendrogram obtained using genetic distance with 100,000 bootstraps, which was
observed in two separate groups: the first has two captive populations in the same
clade, while the population is isolated from nature in another group. A Bayesian analysis
was performed using the software Structure (Pritchard et al., 2000) with a model that
allows mixing of populations. The results revealed that the populations are genetically
structured in three distinct groups, ie, populations of Rio Preto da Eva, Balbina and
Catalão. Five polymorphic microsatellite loci were sufficient to determine the relationship
between parents and offspring in the population from Rio Preto da Eva. This measurent
may cooperate with the programs of selective breeding. The structure observed in the
studied populations indicates that a new rotation of parents must be done on fish farms,
in order to increase the production levels. In relation to the wild population, overfishing
may be contributed to the low genetic variability, but further studies in other populations
along the Rio Negro are required to obtain a better genetic profile for this species in the
nature.
SUMÁRIO
Lista de figuras.........................................................................................................14
Lista de abreviaturas................................................................................................17
I – Introdução........................................................................................................... 18
1. Aquicultura como atividade sustentável e fonte de renda para a Região
Amazônica............................................................................................... 19
2. Considerações sobre a ordem Characiformes........................................ 21
3. Conservação de recursos genéticos pesqueiros através da Genética
Molecular ................................................................................................. 23
4. Marcadores microssatélites na detecção dos polimorfismos inter e intra
populacionais........................................................................................... 28
IV – Objetivos ..........................................................................................................32
V – Material e métodos .......................................................................................... 34
1. Obtenção das amostras ......................................................................... 35
2. Extração de DNA .................................................................................... 37
3. Construção de biblioteca genômica enriquecidas de microssatélites .... 37
4. Desenho e gradiente de temperatura dos oligonucleotídeos.................. 38
5. Análises dos dados..................................................................................39
VI – Resultados e Discussão................................................................................... 42
,1. Capítulo 1:
―Desenvolvimento e caracterização de marcadores microssatélites em
Brycon amazonicus (Spix & Agassiz, 1829) – um importante peixe
migratório da Região Amazônica‖........................................................... 43
2. Capítulo 2
―Estrutura genética e análise de parentesco de Brycon amazonicus (Spix
& Agassiz, 1829) em ambiente natural e cativeiro.................................... 50
VII – Considerações finais....................................................................................... 72
VIII - Referências bibliográficas .............................................................................. 74
IX – Anexos..............................................................................................................86
Lista de Figuras
Introdução
Figura 1
Produção de Pesca e Aquicultura no Brasil. Fonte: MPA.....................
19
Figura 2
Exemplar de Brycon amazonicus.........................................................
22
Material e métodos
Figura 3
Localidades que foram amostradas: natureza (Lago Catalão) e
pisciculturas (Rio Preto da Eva e Balbina). Fonte: Google Earth.........
Figura 5
Esquema da construção de biblioteca enriqueça de microssatélites
segundo a metodologia de Billote et al., 1999. (Copiado de Souza,
2010).....................................................................................................
36
Capítulo 2
Figura 1
Localização geográfica dos pontos de coleta de amostras de Brycon
amazonicus no estado do Amazonas, Brasil........................................
Figura 2
Dendograma construído usando UPGMA
genéticas
54
baseado nas distâncias
(DS, Nei, 1972) pairwise entre populações de Brycon
amazonicus computados a partir de sete locos microssatélites com
100.000 bootstraps...............................................................................
Figura 3
65
Análise de estruturação genética com inferência Bayesiana (Structure
v.2.3.1 Pritichard, 2000) de três populações de Brycon amazonicus
oriundos de cativeiro e natureza na Amazônia brasileira através de
sete marcadores microssatélites, assumindo K = 3 (em que: 1,
Balbina; 2, Rio Preto da Eva; 3, Selvagem (Catalão).endogamia; n*,
número
de
locos
que
está
fora
do
Equilíbrio
de
Hardy-
Weinberg..............................................................................................
Figura 4
66
Componente de Análise Fatorial (FCA) das populações de cativeiro
e selvagem de
Brycon amazonicus com base em sete locos
14
microssatélites......................................................................................
Figura 5
67
Identificação de parentesco através de locos microssatélites para o
casal 2 e 3, referente à coleta de piscicultura em Rio Preto da Eva.....
68
15
Lista de Tabelas
Material e Métodos
Tabela 1
Localidades, número de amostras de reprodutores e larvas de
Brycon amazonicus coletados no Estado do Amazonas....................... 36
Capítulo 1
Tabela 1
Características dos 16 locos microssatélites para o
amazonicus:
nome
do
locus,
número
de
acesso
Brycon
GenBank,
sequências dos primers (F: primers forward; R: primer reverse),
motivo de repetição do clone sequenciado, heterozigosidade
esperada (HE) e observada (HO), índice de fixação (f), Conteúdo de
Informação de Polimorfismo (PIC), valores de P para o Equilíbrio de
Hardy-Weinberg.....................................................................................
49
Capítulo 2
Tabela 1
Origem das amostras coletadas de Brycon amazonicus e período de
coleta....................................................................................................
53
Tabela 2
Diversidade genética em três populações de Brycon amazonicus .....
58
Tabela 3
Diversidade alélica e genética em populações de Brycon amazonicus
provenientes da Amazônia
brasileira através de marcadores
microssatélites ......................................................................................
Tabela 4
59
Valores médios para as estatísticas F de Wright (1951), índice de
diferenciação genética segundo Slatkin (1995) e Conteúdo de
Informação de Polimorfismo para as populações de Balbina e Rio
Preto
da
Eva
(cativeiro)
e
natureza
(Catalão).
Valores
estatisticamente diferentes p < 0,05....................................................
Tabela 5
Resultados para a Análise Molecular de Variância para as três
populações de matrinxã (Brycon amazonicus).....................................
Tabela 6
63
64
Correlação entre a distância genética (Nei, 1972) (diagonal abaixo) e
16
a identidade
genética (diagonal acima) entre as populações de
cativeiro (Balbina e Rio Preto da Eva) e selvagem no Estado do
Amazonas...........................................................................................
65
17
Introdução
18
1 – Aquicultura como atividade sustentável e fonte de renda para a Região
Amazônica
A aquicultura continua a ser o setor de produção de alimentos com crescimento
mais rápido e ultrapassa o crescimento populacional (FAO, 2012). Além disso, segundo
a mesma fundação, a aquicultura tem, cada vez mais, contribuído para a segurança
alimentar, redução da pobreza e equidade social.
O Brasil apresenta um grande potencial para o desenvolvimento da aquicultura
uma vez que detém uma área territorial de aproximadamente 8,5 milhões de
quilômetros quadrados, possuindo cerca de 12% da água doce disponível no planeta
(Secretaria Especial de Aquicultura e Pesca - SEAP, 2007).
Aproveitando-se do seu potencial, a produção do Brasil de pescado aumentou
25% nos últimos oito anos passando de 990.899 toneladas anuais para 1.240.813
toneladas no ano de 2009, conforme observado na Figura 1 (Ministério da Pesca e
Aquicultura – MPA, 2009). De fato, o aumento na produção de alimento deve ser
proporcional ao aumento populacional. Nesse ínterim, a relevância da participação dos
produtos pesqueiros no contexto da alimentação humana fica claramente evidenciada
quando se reconhece que os mesmos já contribuem com mais de 16% do total de
proteína animal consumida pela população mundial (Crepaldi et al., 2006).
Figura 1 – Produção de Pesca e Aquicultura no Brasil. Fonte: MPA.
19
Segundo as estatísticas do MPA (2009), a piscicultura foi responsável pela
produção de 337.353 toneladas. Em relação à Região Norte, houve uma produção de
35.782,3 toneladas, que significa 10,6% da produção da aquicultura continental. O
Estado do Amazonas é responsável pela produção de 10.234,7 toneladas.
As potencialidades sustentáveis das bacias hidrográficas brasileiras e em
particular da Amazônia, são ainda pouco conhecidas/exploradas, apesar de oferecerem
alternativas sócioambientais e econômicas frente a severos indicadores sociais e ao
acúmulo e variedade de impactos atuantes na rede hidrográfica e seus habitantes e
usuários diretos. A atividade da aquicultura na Amazônia, até pouco tempo atrás, era
vista como desnecessária devido à abundância de pescado existente naturalmente e à
falta de expertise disponível. O primeiro programa de governo – do estado do
Amazonas - voltado para o desenvolvimento da aquicultura ocorreu na década de 80.
Desde então, buscando cada vez mais alinhar-se aos preceitos da produção
responsável, a atividade cresceu e vem se consolidando em todos os estados do norte.
A região tem uma vocação plenamente natural para a aquicultura e maricultura
sustentáveis, devido à abundância de recursos aquáticos e de uma estonteante
diversidade aquática, que facilita a coleção de matrizes selvagens para o cultivo dos
peixes e outros organismos, como algas, crustáceos, jacarés e quelônios (Plano
Amazônia Sustentável).
O Estado do Amazonas dispõe de todos os recursos necessários para o
desenvolvimento da atividade de piscicultura. Seus parâmetros ecológicos e biológicos
são altamente favoráveis, reunindo as condições climáticas e a biodiversidade
necessárias para a criação de peixes. Outro fator que favorece a execução da atividade
são os recursos hídricos existentes na região. Trata-se de um conjunto de águas doces
e de lagos com vales interiores, que fornece as condições ideais para a criação de
peixes. Além disso, existem as espécies nativas que oferecem bom desempenho
quando cultivadas, incluindo-se, entre estas, os peixes de produção alimentar e
também os ornamentais (Lima, 2005). Outro fator positivo em relação à piscicultura
no Amazonas é que essa atividade pode contribuir para a redução da pobreza, uma
vez que abre postos de trabalho e promove a diluição da pressão sobre os estoques
naturais, permitindo a recuperação dos ambientes aquáticos (Teixeira et al., 2003).
20
Além dos recursos favoráveis acima mencionados, a piscicultura é uma
atividade que permite o equilíbrio entre o interesse econômico e a exploração racional
da natureza, pois apresenta uma considerável produtividade por hectare (entre 2.500 e
10.000 kg/ha/ano), utilizando menos superfície de terra, em comparação com outras
atividades, como, por exemplo, a pecuária, cuja produtividade está em torno de
70kg/ha/ano, representando menos de 3% da produtividade alcançada na piscicultura
(Lima, 2005).
A piscicultura vem sendo testada na Amazônia de diferentes maneiras, incluindo
tanques artificiais, represamento de nascentes, fechamento de trechos de igarapés,
gaiolas flutuantes e até repovoamento de lagos e lagoas, embora ainda existam
obstáculos que precisem ser superados para que ela se desenvolva plenamente e
possa enfrentar a concorrência do pescado natural, quase sempre mais apreciado e
acessível a menor preço nos mercados locais (Santos e Santos, 2005).
Os sistemas de piscicultura mostram-se eficientes para as espécies comumente
criadas em cativeiro no Amazonas (Chagas et al., 2003). A criação de peixes usando
tanques escavados é uma alternativa que pode ser explorada por grandes, médios e
até pequenos produtores rurais, organizados em associações ou cooperativas, uma
vez que o investimento inicial é elevado, mas o retorno é garantido. Esse tipo de
piscicultura é desenvolvido, em sua maior parte, em propriedades de pequenos e
médios portes, como importante alternativa de geração de renda e emprego (Ayroza et
al., 2002).
2 - Considerações sobre a ordem Characiformes
Dentre as espécies de peixes compatíveis com a atividade aquícola, aquelas
pertencentes à ordem Characiformes tem se destacado. Neste Ordem, há pelo menos
1.674 espécies recentes válidas e distribuídas em 270 gêneros (Nelson, 2006).
Tradicionalmente, o número de famílias de Characiformes varia entre 14 (Géry, 1977),
16 (Greenwood et al., 1996), ou 18 (Buckup, 1998; Nelson, 2006). Essa diferença devese principalmente a diferentes delimitações da família Characidae, um grupo
reconhecidamente não monofilético (Moreira, 2008). A subfamília Bryconinae,
pertencente à ordem Characiformes, é composta por 43 espécies, que são subdivididas
21
em três gêneros, entre os quais o gênero Brycon (Müller et Troschel, 1844) é o mais
diverso com 41 espécies até agora (Mariguela et al., 2010).
A crescente busca por espécies do gênero Brycon para cultivo em ambientes
controlados deve-se principalmente a: 1) fácil adaptação em cativeiro em todo o Brasil;
2) fácil aceitação do alimento de origem animal e vegetal, já que as principais espécies
deste gênero são onívoras; 3) rápido crescimento para alcançar o tamanho comercial;
4) fácil comercialização; 5) aceitação do pescado em ―pesque e pague‖; 6) carne muito
apreciada pelos consumidores; 7) potencial para cultivo em sistemas intensivos
(Zaniboni Filho, 2006).
O Brycon amazonicus (Figura 2) é espécie nativa da Bacia Amazônica
considerada ideal para criação em cativeiro em função das suas características
zootécnicas, que incluem: hábito voraz, que lhe confere esportividade na pesca; fácil
aceitação da ração artificial; rápido crescimento e carne de qualidade (Gomes e
Urbinati, 2005).
Figura 2 – Exemplar de Brycon amazonicus
Ao longo de sua vida, o matrinxã alcança porte máximo de três a quatro kg de
peso, apresenta cerca de 40 cm de comprimento e atinge maturação sexual aos três
anos de idade. Possui dentes multicuspidados em três a quatro fileiras na maxila
superior e duas na maxila inferior; coloração cinza amarelado, mais clara no ventre;
escamas com as bordas escuras, formando linhas contínuas sinuosas, mais evidentes
22
na porção terminal do corpo, onde aparecem em forma de zigue-zague (Santos et al.,
2006).
O matrinxã faz migração reprodutiva no início da enchente, quando desce os
afluentes para desovar nos rios de água branca e realiza também migração trófica,
quando sobe os rios para se alimentar na floresta alagada. Além disso, essa espécie
faz deslocamentos de dispersão, quando deixa as áreas que estão secando para
penetrar no leito dos rios, que são ambientes menos inóspitos nessa época do ano. Os
alevinos e os jovens são criados em áreas de várzea, no período que vai da enchente
até a seca; os adultos e jovens recrutados das áreas de várzea fazem ―arribação‖, isto
é, dispersam rio acima no período de seca, para realizar a pré-desova, que
corresponde à fase de repouso e início da maturação gonadal. Nessa fase do
desenvolvimento o comprimento padrão médio está em torno de 32 cm (Santos et al.,
2006).
A exemplo das demais espécies da família, no ambiente natural, alimenta-se
preferencialmente de frutos e sementes. Por isso, em algumas regiões brasileiras, o
desmatamento ciliar, o barramento dos rios e a poluição industrial, são considerados os
principais fatores responsáveis pelo desaparecimento dos Brycon, como a quase
extinção da piracanjuba (Brycon orbignyanus) na região Sudeste e da piabanha
(Brycon acuminatus) no Rio Paraíba do Sul (Baldisseroto, 2002).
3- Conservação de recursos genéticos pesqueiros através de Genética
Molecular
Os recursos genéticos animais têm sofrido gravíssimas ameaças na Região
Amazônica, não só pelo mau uso, mas pelo desconhecimento do comportamento e
biologia das espécies. Esses recursos são de grande importância e representam
alternativas para a produção de proteínas nobres a baixo custo. Com a implantação de
grandes projetos agropecuários na região, associados à agricultura itinerante, à
mineração e à exploração da madeira, as áreas de florestas vêm sendo substituídas
por áreas que rapidamente atingem sérios estágios de degradação. Essa devastação,
ocorrida nas últimas décadas, têm contribuído para a erosão genética de espécies da
região, causando, também, sérios prejuízos ao desempenho e sobrevivência das
espécies introduzidas (Marques et al., 2008).
23
Nesse contexto, é de suma importância o investimento em tecnologias que
venham a contribuir para a conservação das espécies de exploração zootécnica como
o matrinxã. Porém, para iniciar qualquer manejo conservacionista é preciso conhecer a
biologia da espécie, bem como sua estrutura genética e níveis de variabilidade.
Atualmente, diversos métodos biotecnológicos têm sido aplicados na piscicultura
visando tanto o aumento da produtividade dos organismos aquáticos, como a
conservação dos seus recursos genéticos.
Estudos conduzidos no âmbito da biologia em geral, e da biotecnologia em
particular, têm desempenhado papel significativo no rápido desenvolvimento da
piscicultura nas últimas décadas. Entretanto, conceitos básicos sobre criação animal
ainda são pouco aplicados à piscicultura local e pouco se sabe sobre a herança das
principais características de importância econômica dos peixes produzidos em
confinamento. Dessa maneira, são fundamentais o aperfeiçoamento dos métodos e o
aprofundamento dos estudos nas áreas de biologia e genética de peixes para que
sistemas mais adequados de manejo genético de estoques em cativeiro e das
populações naturais possam ser desenvolvidos e aplicados (Baldisseroto, 2002).
Já em 1981, a FAO recomendava o monitoramento da variabilidade genética de
estoques de peixes cultivados e de populações selvagens, visando a manutenção dos
recursos genéticos pesqueiros. A variabilidade genética é importante na medida em
que permite que as populações se adaptem a um ambiente em transformação. A
quantidade de variabilidade genética em uma população é determinada pelo número de
genes em seu pool genético e pelo número de alelos para cada gene polimórfico
(Primack e Rodriges, 2001). Os estudos sobre variabilidade genética devem ser
associados, tanto quanto possível, às investigações das alterações induzidas
artificialmente que produzem variações genéticas e são importantes para o estudo de
endogamia.
A endogamia (inbreending) é o cruzamento entre indivíduos aparentados e
acontece tanto em grandes, como em pequenas populações. Em grandes populações,
a endogamia pode ocorrer por cruzamento não aleatório devido a autofertilização ou
por uma tendência de indivíduos relacionados para cruzar uns com os outros. Por outro
24
lado, endocruzamentos podem ocorrer substancialmente em acasalamentos aleatórios
em pequenas populações, simplesmente porque todos, ou a maioria dos indivíduos,
podem ser geneticamente relacionados.
Para que os programas de conservação e produção de peixes apresentem
resultados satisfatórios imediatos e de longo prazo, é necessário realizar o
monitoramento genético das populações de peixes visando evitar a endogamia
(Lopera-Barrero et al., 2002). Nesse sentido, um importante parâmetro de análise
populacional é a variabilidade genética, que fornece subsídios sobre a tendência de
distribuição e comportamental dos diferentes alelos de um mesmo gene variar entre si
numa dada população.
A variabilidade genética é fundamental para a implantação de programas de
criação seletiva comercial, que tenham como objetivo a produção de peixes de
crescimento rápido, com melhores índices de conversão alimentar e resistentes a
doenças. Estudos demonstram que a diminuição da variabilidade genética em estoques
de pisciculturas ocorre principalmente por manejo reprodutivo inadequado (Frost et al.,
2006), deficiência no número efetivo de reprodutores (Aho et al., 2006) e seleção não
intencional. O resultado dessas ações pode causar problemas de endogamia,
adaptabilidade e sobrevivência das progênies (Povh et al., 2008).
As práticas de aquicultura podem, inadvertidamente, diminuir a variabilidade
genética presente em estoques em cativeiro pela seleção e cruzamento de indivíduos
geneticamente relacionados ou pelo uso de um pequeno número de pais (parentais)
como reprodutores e, a menos que os registros genéticos sejam mantidos, há uma alta
probabilidade de aumentar o endocruzamento. A gestão atual da aquicultura do
matrinxã é amplamente baseada nas análises de densidades de estoques,
alimentação, nutrição, fisiologia, comportamento e reprodução induzida. Contudo, a
informação baseada na estrutura genética é ainda escassa, a respeito de sua
importância na elaboração de estratégias adequadas para a gestão e conservação da
biodiversidade desta espécie de peixe neotropical (Wasko et al., 2004).
Vários estudos vêm sendo desenvolvidos voltados à aquicultura e ao cultivo de
25
peixes, buscando a caracterização e a identificação de espécies, populações e híbridos
(Silva, 1993; Hrbek et al., 2005; Melo et al., 2006), determinação de estruturas
populacionais (Usmani et al., 2003), determinação da variação genética em populações
selvagens e cultivadas (Santos et al., 2012) e localização de marcadores ligados a
genes envolvidos com caracteres de interesse econômico (Reid et al., 2005).
O advento dos marcadores genéticos baseados em DNA, e em particular, os
microssatélites, simplificou a quantificação da diversidade genética (Frost, 2006). Esses
marcadores constituem importantes instrumentos para estudos nas áreas de biologia
evolutiva, ecologia e biologia da conservação. O conhecimento da estrutura das
populações pode fornecer valiosas diretrizes para estratégias de conservação e
manejo. Além disso, o monitoramento genético é importante para auxiliar no manejo
genético nas pisciculturas de forma a minimizar a endogamia e maximizar a
variabilidade genética (Wasko et al., 2004).
No que tange ao desempenho de um indivíduo, é importante, ainda, conhecer a
sua ascendência, sendo particularmente relevante em condições de aquicultura
identificar as famílias e os cruzamentos que produziram descendência com a presença
de um determinado fenótipo (Conceição et al., 2009). Alguns marcadores moleculares,
tais como os microssatélites, permitem inferir paternidades e traçar os perfis genéticos
dos indivíduos. Os microssatélites têm sido os marcadores de seleção para este tipo de
estudos devido aos elevados níveis de variabilidade que apresentam (Liu e Cordes,
2004). Dessa forma, é aconselhável acompanhar a diversidade genética e os níveis de
consanguinidade dos reprodutores selecionados para evitar cruzamentos entre
indivíduos aparentados, de forma a prevenir a erosão genética do estoque e as
consequências negativas de cruzamentos consanguíneos (Gallardo et al., 2004). Por
isso, os marcadores moleculares podem ser utilizados num programa de rotina para
monitorizar a diversidade genética (Conceição et al., 2009).
Nos últimos anos, houve um grande aumento nas metodologias baseadas em
genética molecular e em suas aplicações para resolver problemas e o aumento da
eficiência dos programas de conservação. Além disso, com o advento das tecnologias
modernas da genética e da biologia molecular, surgiram diversos tipos de marcadores
26
A disponibilidade de marcadores genéticos moleculares tem sido claramente
uma importante força motriz da expansão do papel que a genética desempenha na
conservação. O número e o tipo de disposição dos marcadores moleculares influencia
a maneira como são tratadas as questões cruciais para a conservação (Allerdorf e
Luikart, 2007).
O incremento tecnológico na área de marcadores moleculares tem sido
fascinante e extremamente rápido. A tecnologia de DNA recombinante e o
desenvolvimento da amplificação de segmentos de DNA via PCR (Polimerase in Chain
Reaction ou reação em cadeia da polimerase) abriram caminho para uma mudança de
paradigma: da genética básica da inferência do genótipo a partir do fenótipo, da qual
Mendel foi pioneiro, para a análise genética da variação na sequência de DNA
(Ferreira e Grattapaglia,1998). De fato, a maior vantagem dos marcadores foi
determinada pela invenção da PCR. Pela primeira vez, algumas regiões poderiam ser
amplificadas e analisadas em muitos indivíduos sem o requerimento de clonagem ou
isolamento de DNA genômico ultrapuro em larga escala (Schlötterer, 2004).
Apesar
das
características
morfométricas
(marcadores
morfológicos)
apresentarem resultados que possibilitam a análise da diversidade e a vantagem de
indicar o valor adaptativo dos genótipos em um determinado ambiente, tais
características são, em geral, altamente influenciadas por fatores ambientais, além de
serem suscetíveis à pleiotropia e controladas por vários genes simultaneamente
(Shimizu et al., 1980).
Um marcador genético ideal deve apresentar os seguintes atributos: a) alto nível
de polimorfismo; b) estabilidade em diferentes ambientes; c) grande número de locos
não ligados; e d) ser de herança simples. Outras características desejáveis é que eles
sejam encontrados em todo o genoma e que sua detecção seja fácil, rápida, robusta e
barata (Milach, 1998; Matioli, 2001).
Os marcadores moleculares têm sido aplicados em muitas questões biológicas,
variando do mapeamento gênico à genética de populações, reconstrução filogenética,
testes de paternidade e análises forenses (Schlötterer, 2004). Em populações de
peixes, eles têm sido amplamente utilizados na identificação das relações filogenéticas
27
entre espécies e na verificação da segregação reprodutiva entre populações isoladas,
mesmo quando pertencentes ao mesmo estoque de exploração pesqueira em zona de
alimentação comum. Também podem auxiliar na caracterização dos estoques nos
programas de melhoramento genético de peixes (Martins et al., 2002).
4- Marcadores microssatélites na detecção dos polimorfismos inter e
intrapopulacionais
Os microssatélites (Sequências Simples Repetidas; SSR) consistem de um a
seis nucleotídeos repetidos em tandem e têm sido detectados nos genomas de
eucariotos e procariotos (Levinson e Gutman, 1987; Litt e Luty, 1989; Schlotterer e
Tautz, 1992; Field e Willis, 1998). São encontrados em frequências muito mais
elevadas do que se previu puramente por razões de composição de bases (Li et al,
2002). Esses marcadores podem ser encontrados em regiões codificantes e não
codificantes e são caracterizados por altos níveis de polimorfismo (Zane et al., 2002).
Comparando-se os microssatélites com outros marcadores moleculares,
constata-se que estes apresentam uma série de vantagens sobre os demais: são
abundantes, cobrem extensivamente o genoma, possuem natureza multialélica,
necessitam de pequenas quantidades de DNA para análise, são de fácil detecção por
PCR, têm herança do tipo mendeliana e são expressos como alelos codominantes
(Melo et al., 2008).
Os microssatélites são classificados de acordo com o tipo de sequência
repetida,
como
perfeitos,
imperfeitos,
interrompidos
ou
compostos.
Em um
microssatélite perfeito, a sequência repetida não é interrompida por alguma base não
pertencente ao motivo (p. ex.: TATATATATATATATA), enquanto em um microssatélite
imperfeito há um par de bases entre os motivos repetidos que não corresponde com o
motivo da sequência (p. ex.: TATATACATATATA). Os microssatélites imperfeitos são
definidos por repetições interrompidas por nucleotídeos que não correspondem ao
motivo (p. ex.: TATATACGTGTATATATATA), por outro lado, em um microssatélite
composto, a sequência contém duas sequências repetidas distintas uma ao lado da
outra (p. ex.: TATATATATAGTGTGTGTGT) (Weber, 1990; Goldstein e Schlotterer,
1999)
28
Esses marcadores genéticos podem ainda ser classificados conforme o número
de repetições como mononucletídeos (T)n,
dinucleotídeos (TA)n,
trinucleotídeos
(TAC)n, tetranucleotídeos (GACA)n, pentanucleotídeos (TGCAT)n e hexanucleotídeos
(GACTAG)n.
A origem e evolução dos locos microssatélites ainda não está bem
compreendida, porém já existem alguns modelos que são utilizados quando se
analisam os microssatélites. São eles:
1) Modelos de Alelos Infinitos (IAM – Infinite Allele Model) – neste modelo, cada
mutação aleatória origina novos alelos. Aplicando esses modelos aos locos
microssatélites, quando há uma mutação, ela irá alterar o número de repetições. Este é
o modelo clássico de Wright (1931), no qual ele usa a estatística F (Kimura e Crow,
1965);
2) Modelo de Mutação Escalonada ou Passo a Passo (SMM – Stepwise Mutation
Model) – este modelo sugere que uma mutação pode adicionar ou retirar uma
repetição. Isso significa que dois alelos que diferem somente por um motivo são mais
relacionados que alelos que diferem por muitas repetições (Kimura e Otha, 1978).
Slatkin (1995) propôs a medida de diferenciação genética (RST), que é similar ao FST de
Wright (1951) e ao GST de Nei (1973), porém baseado no modelo SMM. O modelo
SMM é comumente preferido quando são estimadas as relações entre indivíduos e
estrutura das populações, exceto quando há presença de homoplasia.
3) Modelos de Duas Fases (Two Phase Model) – este modelo surgiu como uma
extensão do modelo SMM e postula que diversos eventos mutacionais resultam em um
aumento ou diminuição de uma unidade repetida, embora também ocorram alterações
de um grande número de repetições, ainda que menos frequentemente (DiRienzo et
al., 1994)
4) Modelo KA – Proposto por Crow e Kimura (1970); esse modelo assume que se
existem k alelos possíveis em um certo loco, então a probabilidade de ocorrer uma
mutação em certo alelo é µ/k – 1, onde µ é a taxa de mutação.
29
Os microssatélites apresentam um alto índice mutacional, que varia entre 10 -6 a
10-2 por geração e pode ser significantemente mais alto que as taxas de substituição de
bases nitrogenadas. Existem dois mecanismos que explicam as altas taxas de mutação
nos locos microssatélites. O primeiro tem sido chamado de ―DNA slippage‖, no qual
ocorre um deslizamento das fitas de DNA durante a replicação. O segundo envolve
recombinação entre moléculas de DNA, isto é, ocorre uma elevada taxa de crossingover desigual entre cromossomos homólogos imperfeitamente alinhados ao longo das
repetições dos microssatélites (Schlöterer, 2000). Ambos os mecanismos levam a uma
constante inserção e deleção de seqüências simples no genoma e os erros de reparo
que podem ocorrer durante a replicação geram a diversidade de microssatélites,
caracterizados como polimorfismos, facilmente detectados pela reação em cadeia da
polimerase (PCR) utilizando-se primers específicos às sequências flanqueadoras
(Tautz e Renz, 1984).
Os
marcadores
microssatélites têm sido
usados
exaustivamente
para
mapeamento gênico (Knapik et al., 1998; Kocher et al., 1999; Sakamoto et al., 2000)
análise forense (Jones et al., 2000) e genética populacional (Melo et al., 2008; Sousa
et al. 2009; Santos et al., 2009). Além disso, eles provaram ser uma importante
ferramenta para conservação e manejo de recursos biológicos (Farias et al., 2003;
Salgueiro et al., 2003).
Hrbek et al., (2005) realizaram um estudo populacional em Araipama gigas por
meio de marcadores microssatélites com amostras coletadas no Estado do Pará e
Amazonas visando formular e implementar o manejo conservacionista para essa
espécie e sugeriram que esta espécie se encontra em gargalo de garrafa, necessitando
de manejo na natureza. Outra abordagem foi utilizada por Moreira et al.(2007), no qual
os níveis de variabilidade genética de duas variedades de tilápia nilótica (Oreochromis
niloticus) e de suas progênies submetidas a programas de melhoramento genético em
sistemas de cultivo intensivo foram analisados e os resultados mostraram uma alta
variabilidade genética, resultante de baixos níveis de endogamia observados no
plantel, sugerindo que o manejo desses plantéis vêm sendo realizados corretamente.
30
Os loci microssatélites também têm sido aplicados para identificação de animais,
na determinação de parentesco ou avaliação de recursos genéticos (Moreira et al.,
2001). Essas medidas têm por objetivo o incremento na produção de animais com bom
perfil zootécnico para evitar a fixação de características indesejáveis causadas pelo
endocruzamento.
31
Objetivos
32
II - OBJETIVOS
1. Objetivo Geral
O presente trabalho tem, como objetivo geral, estimar a variabilidade genética
em estoques de matrinxã (Brycon amazonicus) disponíveis em diferentes estações de
piscicultura e em ambiente natural do Estado do Amazonas, utilizando marcadores
moleculares microssatélites, com a finalidade de subsidiar políticas de manejo para
essa espécie.
2. Objetivos Específicos
2.1 Isolar e caracterizar marcadores microssatélites para a espécie B. amazonicus.
2.2 Realizar a caracterização genética dos plantéis de matrinxã provenientes de
pisciculturas e do ambiente natural.
2.3 Verificar a existência de estruturação genética nas populações estudadas de B.
amazonicus.
2.4 Analisar a paternidade a partir das progênies dos matrinxãs (Brycon
amazonicus) oriundos das pisciculturas.
33
Material e Métodos
34
IV - MATERIAL E MÉTODOS
1. Obtenção das amostras
As amostras de Brycon amazonicus foram coletadas em duas estações de
piscicultura do Estado do Amazonas e também no Lago Catalão, representando a
população selvagem. (Tabela 1). O Lago Catalão, localizado no município de Iranduba,
é um lago de várzea de planície de inundação do rio Solimões, situado próximo à
confluência deste com o rio Negro (Brito, 2006). As localidades estão determinadas no
mapa ilustrado na Figura 3.
No Lago Catalão, foram coletados fragmentos de nadadeira caudal de cada
exemplar de matrinxã, perfazendo um total de 32 indivíduos (Coordenada geográfica:
3⁰ 09‘51,5‖S / 59⁰ 54‘22,8‖ O). Essas amostras foram usadas para caracterizar o banco
de microssatélites, bem como para estabelecer um comparativo com as populações de
cativeiro nas análises populacionais.
Os tipos de tecidos amostrados foram fragmentos de nadadeira caudal do
matrinxã e larvas obtidas após indução hormonal, conforme metodologia descrita por
Woynarovich e Horváth (1983). Nas pisciculturas foram escolhidos três casais (geração
parental) e dez larvas de cada casal (geração F1). Ambos os tipos de amostras foram
depositados em microtubos de 1,5 mL e conservados em etanol 95%. O material obtido
foi transportado para o Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular (LEEM) do
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, onde foram realizadas as análises.
Portanto, para esse projeto foram analisados 32 indivíduos da natureza e 60
indivíduos advindos de piscicultura. Para a validação dos locos microssatélites, foram
usados animais do Lago Catalão e para análise de estrutura, além dos indivíduos da
população selvagem, utilizou-se também aquelas animais de cativeiro.
35
Tabela 1 – Localidades, número de amostras de reprodutores e larvas de Brycon
amazonicus coletados no Estado do Amazonas
Tecido
Origem
Localidade
Coordenadas
Geográficas
Nadadeira
Larvas
caudal
(Geração F1)
(Parentais)
Piscicultura
Balbina
1°53'53.00"S
59°28'28.00"O
6
30
Piscicultura
Rio Preto da
Eva
2:43’40,651,76”S
59:28’19,883,68”O
6
30
Balbina, Amazonas
População de cativeiro
Rio Preto da Eva, Amazonas
População de cativeiro
Manaus, Amazonas
Lago Catalão, Amazonas
População natural ou selvagem
Figura 3 – Localidades que foram amostradas:
natureza (Lago Catalão); e
pisciculturas (Rio Preto da Eva e Balbina). Fonte: Google Earth
36
2. Extração de DNA
Para extração do DNA de nadadeira caudal e larva foi utilizado o protocolo
descrito por Sambrook (2007), com modificações (em anexo). Em seguida, foi
verificada sua viabilidade em gel de agarose 1% e quantificado no espectrofotômetro
NanoDrop 2000 (ThermoCientific).
3. Construção de biblioteca genômica enriquecida de microssatélites
A construção da biblioteca genômica enriquecida para a espécie Brycon
amazonicus foi desenvolvida segundo a metodologia de Billotte et al. (1999) com
algumas modificações, descrita a seguir. A amostra utilizada foi proveniente da
piscicultura de Rio Preto da Eva, Amazonas.
O DNA genômico (250 ng/ɥL) foi digerido com a enzima de restrição RsaI
(GT↓AC) para gerar fragmentos de tamanhos variando entre 300 – 1200 pb. Após a
digestão, os fragmentos de DNA foram visualizados em gel de agarose a 1,0% corado
com GelRed™. Os fragmentos de DNA genômico digerido foram ligados a dois
adaptadores
-
Rsa
21
(5'-CTCTTGCTTACGCGTGGACTA-3')
e
Rsa
25(5'-
TAGTCCACGCGTAAGCAAGAGCACA-3') - de forma que tivessem uma terminação
comum conhecida. Em seguida, foi realizada uma pré-amplificação via PCR (Reação
em Cadeia de Polimerase) para obtenção de uma quantidade suficiente do fragmento
de interesse. Após a amplificação, o produto de PCR foi purificado e os fragmentos
contendo os microssatélites foram selecionados utilizando simultaneamente duas
sondas biotiniladas, sendo uma as sequências dCT8 e a outra com dGT8. Os
fragmentos com microssatélites foram capturados por estreptavidina ligadas a esferas
magnéticas, e, em seguida, foram selecionados e amplificados por PCR e seus
produtos foram ligados em um vetor pGEM-T com transformação em XL1-Blue (células
de E. coli) para proporcionar a amplificação do inserto. As células transformadas foram
cultivadas em placas de ágar LB contendo 50 mg.mL -1 de ampicilina de acordo com o
protocolo padrão de Sambrook et al. (1989). O DNA plasmidial foi purificado e os
clones positivos foram sequenciados em um analisador automático de DNA ABI 3130xl
(ABI BIOSYSTEMS) utilizando o Kit Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing (ABI
37
BIOSYSTEMS) e os primers T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ') e SP6 (5'GATTTAGGTGACACTATAG-3'). Após a obtenção das sequências as mesmas foram
analisadas utilizando o software BIOEDIT 7.0.5 (Hall, 1999).
4. Desenho e gradiente de temperatura dos oligonucleotídeos
A
partir
das
sequências
obtidas,
foram
desenhados
16
pares
de
oligonucleotídeos com auxílio do programa OLIGO EXPLORER 1.5 (GeneLink, Inc).
Os critérios adotados para o desenho dos primers foram: tamanho variando entre 18 e
22 pb; faixa de temperatura de anelamento dos primers variando de 45 a 60 :C;
diferença de temperatura entre os primers forward e reverse foi de até 3 :C; faixa de
conteúdo CG será de > 30%; ausência de autoanelamentos, loops e hairpins. Em cada
primer forward foi adicionada uma cauda M13 na região 5‘ que permitiu a detecção de
fluorescência segundo protocolo de Schuelke (2000).
Com o objetivo de obter a faixa de variação de temperatura dos primers, foi
realizada a validação dos oligonucleotídeos por meio de PCR em gradiente em
termociclador Veriti Thermal Cycler (ABI BIOSYSTEMS) utilizando amostras de DNA
de matrinxãs originárias da natureza. Foram aplicados 35 ciclos para PCR de
gradiente utilizando as seguintes temperaturas: temperatura inicial de incubação a
94°C por 1 minuto, desnaturação a 94°C por 20 segundos, anelamento a 45 - 60°C por
20 segundos (gradiente de temperatura), extensão a 72°C por 30 segundos e uma
extensão final de 72°C por 5 minutos.
5. Caracterização dos locos microssatélites e estudos populacionais
Para a validação dos locos de microssatélites foram utilizados 30 matrinxãs da
natureza. Os quais foram usados também para as análises de estrutura populacional
somados com mais 60 indivíduos de cativeiro. Perfazendo, portanto, um total de 90
peixes analisados. As reações de PCR para genotipagem constaram dos seguintes
reagentes (volume final de 10 µL): 60 ng de DNA template, 0,4 μM primer forward, 0,8
μM primer reverse, PCR Master Mix (2x) (Fermentas) contendo 0,5 U Taq DNA
Polimerase, 4,0 mM MgCl2 e 0,4 mM de cada dNTP.
38
A amplificação dos fragmentos foi em um termociclador Veriti Termal Cycler
(Applied Biosystems) usando as seguintes condições de ciclagem: primeira ciclagem 94°C por 1 minuto; 94°C por 20 segundos, 45-60°C por 20 segundos (temperatura
especifica do primer), 68°C por 30 segundos (25 ciclos para anelamento dos primers),
segunda ciclagem - 94°C por 20 segundos, 53°C por 20 segundos (temperatura
especifica da cauda M13), 68°C por 30 segundos e 72°C por 3 minutos (20 ciclos para
anelamento da cauda com fluorescência FAM). Logo após, foram inclusos 30 minutos
de extensão ao final da ciclagem para minimizar a formação de stutters.
Para genotipagem foi utilizado 1 µL do produto de PCR diluído (1:10), 0,3 µL de
LIZ e 8,7 µL de formamida Hi-Di (Applied Biosystems) aplicado em um sequenciador
3130xl (Applied Biosystems) e o tamanho dos fragmentos foi analisado utilizando o
software GeneMapper v 4.0 (Applied Biosystems).
6. Análises dos dados
6.1 Caracterização dos locos de microssatélites – Primeiro capítulo
Os parâmetros genéticos calculados foram: número de alelos por locos (A),
heterozigosidade observada (HO) e esperada (HE), e índice de endogamia (FIS,)
utilizando o programa GENETIX v. 4.05. (Belkhir et al., 2004). Foi utilizado o programa
MICRO-CHECKER v. 2.2.3 (van Osterhout et al., 2004) para identificar os locos que
apresentassem alelos nulos e para identificar e corrigir erros de genotipagem em dados
de microssatélites. Além disso, foi usada a correção de Bonferroni (Rice, 1989) para
reduzir os erros tipo I. Foi calculado o Conteúdo de Informação de Polimorfismo (PIC)
utilizando o programa CERVUS v.3.0.3 (Marshall et al., 1998). Além disso, foi aplicado
o teste do Equilíbrio de Hardy-Weinberg e desequilíbrio de ligação utilizando o
programa FSTAT v.2.9.3.2 (Goudet, 2002).
6.2 Análise de estrutura populacional – Segundo capítulo
Da mesma maneira que para validação dos locos microssatélites, nas análises
populacionais, os parâmetros básicos de genética populacional calculados foram
frequências alélicas, genotípica, número de alelos, riqueza alélica, diversidade
39
genética, heterozigosidade observada e esperada (HO, HE), utilizando os programas
FSTAT v.2.9.3.2 (Goudet, 2002) e GENETIX v.4.0.5 (Belkhir et al., 2004). O programa
MICRO-CHECKER v.2.2.3 (van Osterhout et al., 2004) foi utilizado para identificar e
corrigir erros de genotipagem em dados de microssatélites. Além disso, foi usada a
correção de Bonferroni (Rice, 1989). Foi, também, calculado o Conteúdo de Informação
de Polimorfismo (PIC), as frequências de alelos nulos e o Equilíbrio de Hardy-Weinberg
(EHW), utilizando o programa CERVUS v.3.0.3 (Marshall et al., 1998)
Ainda foi aplicado o teste exato de Fisher para as frequências. O teste de
Fisher é um teste de aderência às proporções do Equilíbrio de Hardy-Weinberg,
sugerido por Weir (1996), que utiliza o programa TFPGA v.1.3 (Miller, 1997). A
estatística F de Wright - FIT, FIS e FST - (Wright, 1951) foi aplicada pelos programas
ARLEQUIN 3.1.1, FSTAT 2.9.3.2 e GENETIX v.4.0.2. O nível de significância de FIS e
de FST, bem como os diferentes tipos de distâncias genéticas, incluindo Nei's, também
foram calculadas por estes softwares. Foi calculado o valor de RST, que é um análogo
da estatística F de Wright (1951), utilizando o programa RstCalc v.2.2 (Goodman,
1997). A estatística de RST avalia dados moleculares gerados por locos microssatélites,
pois o processo mutacional desse tipo de marcador não está de acordo com o
assumido no modelo de alelos infinitos com baixas taxas de mutação.
Além disso, foi aplicado o procedimento Bayesiano clustering, capaz de
identificar o K (desconhecido) de origem dos indivíduos amostrados para atribuir a
estes grupos. Para isso, foi utilizado o programa STRUCTURE v. 2.3.1 (Pritchard et al.,
2000). Esse procedimento permitiu avaliar as misturas ou separações entre as
populações e detectar ancestrais de populações especiais.
O programa STRUCTURE (Pritchar et al., 2000) utiliza uma abordagem
bayesiana para determinar possíveis populações existentes (K) na amostragem,
considerando apenas os genótipos dos indivíduos amostrados. Com base nas
frequências alélicas, o individuo é colocado dentro de uma possível população,
probabilisticamente avaliada através de um teste chamado ―assingment test‖ (teste de
atribuição), quando as populações são misturadas (Rossini, 2000).
40
Para esse trabalho, foi adotada a
hipótese ―admixture‖ com frequências
correlacionadas. Para tanto, foram testados os índices de K variando de 1 a 6. Para
cada índice de K foram realizadas 5 repetições, 100.000 burn-ins e 500.000 simulações
de Monte Carlo via Cadeia de Markov (MCMC). O número real de K foi selecionado a
partir dos índices de ∆K, seguindo a metodologia descrita por Evanno et al., (2005). A
partir dessa metodologia, o valor ideal de K foi determinado.
Com o programa GENETIX v.4.0.2 foram realizadas as Análises de
Correspondência Fatorial – FCA (Benzécri, 1973), útil para comparar populações. Foi
construída uma árvore de identidade genética utilizando o programa MEGA v.4.0
(Tamura et al., 2007). O grau de parentesco entre os pares de indivíduos dos estoques
de reprodutores e de larvas foi analisado utilizando o programa Cervus v.3.0 (Marshall
et al., 1998).
41
Resultados e Discussão
42
CAPÍTULO 1
Desenvolvimento e caracterização de marcadores microssatélites em Brycon
amazonicus (Spix & Agassiz, 1829) – um importante peixe migratório da Região
Amazônica
Gisele Torres Clímaco*£, Carlos Henrique dos Anjos dos Santos£, Priscila Roberta
Mendonça do Nascimento£, Marcos Prado Lima†, Maria N. Paula Silva£, Daniele
Aparecida Matosoc, Vera Maria Fonseca de Almeida e Val £
£
Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular, Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia, Manaus, 69060-001, Brasil. †Instituto de Ciência e Tecnologia das Águas,
Universidade Federal do Oeste do Pará, Santarém, PA, 68135-110, Brazil.
†
Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM, 69077000, Brazil.
*Corresponding author: Gisele Torres Clímaco
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Laboratório de Ecofisiologia e
Evolução Molecular (LEEM), Aleixo, Manaus, AM, Brazil. CEP 69060-001.
E-mail: [email protected]
Phone: 55-92-3643-3188/3190
FAX: 55-92-3643-3186
Os resultados que constam no presente capítulo foram publicados na revista Conservation Genetics
Resources durante o desenvolvimento da presente Dissertação (APÊNDICE A).
O presente capítulo seguiu as regras de formatação e estilo da referida revista.
43
Resumo:
O matrinxã (Brycon amazonicus) é um importante peixe migratório nativo da Bacia
Amazônica. Estudos envolvendo populações de B. amazonicus são de grande
importância para a conservação e manejo dessa espécie. 16 locos microssatélites
foram desenvolvidos e caracterizados para investigar a variabilidade genética de 32
indivíduos coletados no Lago Catalão, localizado na confluência do rio Solimões com o
rio Negro. O número de alelos por loco variou de 4 a 21, com média de 10,4. As
heterozigosidades observada e esperada variaram de 0,039 a 0,906 e 0,442 a 0,887,
respectivamente. O valor do FIS (f) variou de –0,290 a 0,927 (média de 0,320). Oito
locos (Tabela 1) desviaram significativamente do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE)
depois da correção de Bonferroni (P:<0,003). Não foi detectado desequilíbrio de
ligação. Esses marcadores microssatélites poderão contribuir em diversos estudos
sobre a diversidade genética e conservação do Brycon amazonicus.
Palavras-chave: Brycon amazonicus, diversidade genética, conservação de vida
selvagem, marcadores microssatélites.
44
Desenvolvimento e caracterização de marcadores microssatélites em Brycon
amazonicus (Spix & Agassiz, 1829) – um importante peixe migratório da Região
Amazônica
O matrinxã (Brycon amazonicus) é um teleósteo de água doce da Amazônia e é
considerado um dos principais peixes migratórios da Amazônia Brasileira. Essa espécie
apresenta uma grande importância econômica no Médio Amazonas e Amazônia
Central devido ao seu uso na pesca de subsistência e comercial (Batista et al. 2000,
2003; Ferreira et al. 1996). Por possuir excelente sabor, altas taxas de crescimento e
boa aceitação por rações comerciais na sua dieta, o matrinxã se tornou uma espécie
ideal para aquicultura no Brasil (Scorvo-Filho et al. 1999), especialmente para a região
Norte. Neste contexto, o acesso à diversidade genética nas populações de cativeiro e
selvagens de B. amazonicus na Bacia Amazônica é de grande importância, por que,
através dela, serão implementadas medidas que poderão cooperar com o manejo e
caracterizados dessa espécie. Para isso, foram isolados marcadores microssatélites
que são ferramentas informativas para estudos em genética de populações.
Os locos microssatélites foram desenvolvidos a partir de uma biblioteca
genômica enriquecida seguindo o protocolo descrito por Bilotte et al. (1999). O
protocolo usado para extração de DNA foi descrito por Sambrock et al. (1989). O DNA
total purificado concentrado em 250 ng/ɥL foi digerido com Rsa I e enriquecido com
repetições (CT)8 e (GT)8. Fragmentos enriquecidos foram amplificados via Reação em
Cadeira da Polimerase (PCR), ligados a um vetor de clonagem
pGem-T Easy
(Promega) e então transformados em células competentes com Escherichia coli XL-1
Blue. Os clones positivos foram selecionados usando o gene da β-galactosidase e
cresceram em meio LB com ampicilina overnight, O plasmídeo foi purificado e 96
clones foram sequenciados usando os primers T7 e SP6, bem como o kit Big Dye
Terminator v. 3.1 (PerkinElmer Applied Biosystems) com auxíllio de sequenciador
automático ABI 377 (Applied Biossystems). Um total de 16 pares de primers foram
desenhados usando o programa OligoExplorer v.1.5 (Gene Link, Inc.) e uma cauda
M13 foi adicionada na extremidade 5‘ em cada primer forward para permitir o
45
pareamento com a fluorescência de acordo com o protocolo sugerido por Schuelke
(2000).
Esses locos foram caracterizados em 32 indivíduos de B. amazonicus coletados
no Lago Catalão (Rio Negro) próximo à cidade de Manaus (Projeto ADAPTA). Os
fragmentos de microssatélites foram amplificados por PCR com volume final de 10 ɥL,
contendo 60 ng de DNA genômico template, 0,4 µM de primer forward; 0,8 µM primer
reverse e PCR Master Mix (2x) (Fermentas), que é composto de 0,05 U Taq DNA
Polimerase, 4,0 mM de MgCl2 e 0,4 mM de cada dNTP. As amplificações foram
realizadas em Termociclador Veriti (Applied Biosytems) de acordo com os seguintes
ciclos: início a 94°C por 1 min seguido por 25 ciclos de desnaturaçao a 94°C for 20 s,
em continuidade com a temperatura específica de anelamento de cada primer por 20 s
(Tabela 1), e extensão a 68°C por 30 s; o passo de anelamento da cauda M-13
consistiu de 20 ciclos de desnaturação a 94°C por 20 s, anelamento a 53°C por 20 s e
extensão a 68°C por 30 s; a extensão final foi feita a 72°C por 3 minutos. Os produtos
de amplificação foram observados em gel de eletroforese a 1% contendo 0,1 mg de
brometo de etídio/mL em tampão TBE 1x (pH 8,0). Os produtos de PCR (1,0ɥL) foram
analisados em sequenciador automático ABI 3130 xl (Applied Biosystems, Inc.) e os
tamanhos dos alelos foram obtidos usando o marcador de peso molecular GeneScan500 LIZ (Applied Biosystems, Inc.) e observados no software GeneMapper versão 4.0
(Applied Biosystems, Inc.).
Dos 31 marcadores microssatélites desenvolvidos, oito foram polimórficos (Tabela 1).
O número de alelos, a heterozigosidade observada (HO) e esperada (HE) e o índice de
fixação foram calculados usando o Genetix v. 4.05.2 (Belkhir et al. 2004). O teste para
conformidade para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) e Desequilíbrio de Ligação
(DL) entre os pares de locos foram calculados usando o GDA v.1.1 (Lewis e Zaykin,
2000). O Conteúdo de Informação de Polimorfismo (PIC) foi calculado usando o Cervus
v. 3.0.3 (Kalinowski et al. 2007). Os níveis de significância foram obtidos com a
correção de Bonferroni (Rice, 1989). O número de alelos por loco variou de 6 a 17,
com média de 11,1 (Tabela 1). O Conteúdo de Informação de Polimorfismo (PIC)
calculado variou de 0,419 a 0,876, com média de 0,776. Esse índice informa o quanto
um marcador é informativo. As heterosigozidades observadas (HO) e esperadas (HE)
46
variaram de 0,654 a 0,906 (média 0,676) e 0,527 a 0,887 (média 0,792),
respectivamente. O valor do FIS variou de – 0,018 a 0,239, com média de 0,038. Não foi
observado desequilíbrio de ligação (DL) entre os pares de locos. Provavelmente esse
desvio ocorreu devido a presença de alelos nulos, como sugerido pelo programa Microchecker v. 2.3 (vanOosterhout et al. 2004). Uma possível razão para o desvio do EHW
pode ser o efeito de Wahlund. Não foi observado Desequilíbrio de Ligação (DL) nos
pares de locos. Esses locos microssatélites polimórficos são ferramentas importantes
para o estudos genéticos em populações de B. amazonicus.
Agradecimentos
Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas (FAPEAM) e o
Conselho Nacional de Pesquisas (CNPq) pela ajuda financeira. . O Programa para
Cooperação Acadêmica (PROCAD) entre INPA/UNICAMP/UFRGS foi financiado pela
CAPES (n.: 023/2006/CAPES). GTC é bolsista nível mestrado CNPq. CHAS é bolsista
nível de pós-doutorado CNPq. VMFAV é pesquisadora de produtividade CNPq. Esse
trabalho é parte do INCT ADAPTA, coordenado pelo Adalberto Luis Val.
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48
Tabela 1 – Características dos oito locos microssatélites para o Brycon amazonicus: nome do locus, número de acesso GenBank, sequências dos primers (F: primers forward; R:
primer reverse), motivo de repetição do clone sequenciado, heterozigosidade esperada (HE) e observada (HO), índice de fixação (f), Conteúdo de Informação de Polimorfismo
(PIC), valores de P para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg, testes de significância ajustados de acordo com a correção de Bonferroni (P-HWE): (P5%< 0,003). *não significante.
SSR
Locus
BAM_06
GenBank
Accession no.
JQ993449
Primer sequences
(5’- 3’)
FAM
F: TTCTCCCAGCTAATCTTCC
R:TAGTGTTCTGTATAGGGTTCTTG
BAM_10
JQ993450
F:
GCACAGCAGCGCAGTCAAA
R:TGCCCTTCACGGATAACACAAT
BAM_11
JQ993451
F: GCTGTTGGCTGGTGGACTATTCTC
R:GCCTCCTTTCACCCTGTTCTTCA
BAM_14
JQ993453
F: AATCAGGTCCAAGTTTCAA
R:ACGAGGTGTATCAGCAGAGA
BAG_22
JQ993454
F: TGTAGTAGTTCTGTCTGCTG
R:TGGAGTTGTTGGTGTGAATC
BAG_25
JQ993457
F: CTGTATGCTGGTGTGTATGC
R:GTGTGTGAGTGTGAGAGGTG
BAG_27
JQ993459
F: CACAGACACAGTCCCTCATT
R:CACACCCCAGAAAGAATGAC
BAG_31
JQ993462
F: CAAGACAAACCAGGGAAACC
R:GCTAGATCCAGCAGATGTAG
Repeat
motif
(CAT)4CCA(CAT)4
Ta (°C)
N
A
HE
HO
f
PIC
10
Allele
size (pb)
300-376
53
29
0,750
F(Null
)
-0,018
P value*
HWE
NS
0,666
0,780
0,806
-0,018
FAM
(CA)5CG(CA)2
53
32
17
136-206
0,830
0,750
0,112
0,818
0,060
0,078
NS
FAM
(TG)18
60
32
11
180-214
0,820
0,719
0,139
0,797
0.064
0,066
NS
FAM
(GA)14
52
29
13
152-194
0,845
0,906
-0,057
0,830
-0,051
0,881
NS
FAM
(GA)14
60,5
30
10
314-332
0,826
0,875
-0,044
0,808
-0,037
0,811
NS
FAM
(CA)19
55
30
10
134-216
0,826
0,654
0,224
0,839
0.093
0,012
NS
FAM
(CA)5GA(CA)4
63,1
28
6
186-236
0,442
0,067
0,854
0,419
-0.171
1,000
NS
FAM
(GT)12GA(GT)4
51
32
12
130-156
0,887
0,690
0,239
0,876
0.090
0,005
NS
49
CAPÍTULO 2
Estrutura genética e análise de parentesco de Brycon amazonicus (Spix &
Agassiz, 1829) em ambiente natural e cativeiro
Gisele Torres Clímaco, Carlos Henrique dos Anjos dos Santos Priscila Roberta Mendonça do
Nascimento, Daniele Aparecida Matoso, Maria Nazareth Paula-Silva,Vera Maria Fonseca de Almeida e
Val
O presente capítulo seguiu as regras de formatação e estilo da Acta Amazonica.
50
Resumo
O matrinxã (Brycon amazonicus) é uma espécie de interesse econômico para a Região
Amazônica, sendo bastante utilizado em pisciculturas por suas características
zootécnicas. Pouco se sabe sobre a estrutura genética desse peixe na natureza ou em
cativeiro. Os marcadores microssatélites são ferramentas úteis para analisar a
diferenciação genética dos peixes em diferentes habitats. Portanto, o objetivo desse
estudo foi verificar a variabilidade genética do B. amazonicus em duas estações de
piscicultura (Rio Preto da Eva e Balbina) e na natureza por meio de sete marcadores
do tipo microssatélites.
As análises revelaram que as populações encontram-se
estruturadas, formando três grupos distintos. Além disso, cinco marcadores
microssatélites foram utilizados eficientemente para verificar as relações de parentesco
na população de Rio Preto da Eva. Sugerimos que, para melhorar os níveis de
produção das pisciculturas, novos reprodutores devem ser adicionados às pisciculturas.
Abstract
The Matrinxã (Brycon amazonicus) is an important economically fish specie for the
Amazon region and is widely raised in fish farms due to their husbandry characteristics.
Little is known about its genetic structure in the wild and captivity. The microsatellite
markers is an useful tool to analyze genetic differentiation of fish in different habitats.
Therefore, the objective of this study is to assess the genetic variability of B.
amazonicus at two farms stations (Rio Preto da Eva and Balbina) through seven
microsatellite markers compared to one wild population. The analyzes showed that the
three populations are structured, forming three distinct groups. In addition, five
microsatellite markers were used effectively to assess the relationships of kinship in the
population of Rio Preto da Eva. To improve the production levels of fish farms, new
parental must be added to fish farms.
51
Introdução
O matrinxã (Brycon amazonicus) é um teleósteo migrador de água doce da
Amazônia com grande potencial para aquicultura (Howes, 1982). A grande importância
econômica e potencial entre as espécies cultivadas no Brasil decorre do excelente
sabor de sua carne, características desejáveis para o cultivo de peixes, incluindo a alta
taxa de crescimento e boa aceitação de rações comerciais (Scorvo-Filho, 1999). Além
disso, esta espécie apresenta um perfil ideal para reprodução em cativeiro (ZaniboniFilho et al., 2006). A espécie B. amazonicus tem distribuição ao longo do Rio SolimõesAmazonas e seus tributários, na bacia do rio Orinoco e no rio Essequibo na Venezuela
(Lima, 2005). Sua importância na pesca da Amazônia Central é grande em termos
comerciais (Batista e Petrere, 2003) e na pesca de subsistência (Batista et al., 2000),
assim como ocorre no Médio Amazonas (Ferreira et al., 1996), sendo, que atualmente,
é a segunda espécie mais produzida em piscicultura no Amazonas (IBAMA, 2007).
Atualmente, pouco se sabe sobre a diversidade e estrutura genética do
matrinxã na Bacia Amazônica. E, com o advento da genética molecular, é possível
obter informações diretamente da molécula do DNA, utilizando marcadores
moleculares. Dentre os marcadores mais utilizados em peixes, os marcadores
microssatélites são uma excelente ferramenta por disponibilizar uma grande gama de
informações que vão direcionar as práticas de manejo relacionadas com a conservação
das espécies e também garantir bons índices de produção para animais de cativeiro
(Piorski et al., 2008).
Os microssatélites vêm sendo amplamente utilizados para verificar a diversidade
de peixes por apresentarem distribuição abundante, alto grau de polimorfismo, herança
mendeliana (Selkoe e Toonen, 2006); (Barroso et al., 2005; Matsumoto e Hilsdorf,
2009; Barroca et al., 2012). Além disso, são usados em análises de estrutura
populacional de peixes (Hatanaka et al., 2006; Carvalho-Costa et al., 2008; Sanches et
al., 2012; Barroca et al., 2012).
Uma outra abordagem que vem sendo atribuída aos marcadores microssatélites
é a análise de parentesco (Hara e Sekino, 2003). O conhecimento de uma geração
parental de uma determinada prole auxilia o produtor na escolha das matrizes, uma vez
52
que, dessa forma, pode-se evitar o cruzamento consanguíneo, responsável pela
endogamia.
Diante do exposto, esse trabalho tem o objetivo de verificar a variabilidade
genética de uma população selvagem (Lago Catalão)
e de duas populações de
cativeiro (Balbina e Rio Preto da Eva), bem como realizar a análise de parentesco
destas. por meio de marcadores microssatélites.
Material e métodos
Amostras biológicas
Um total de 60 larvas foi coletado de duas pisciculturas (Balbina e Rio Preto da
Eva) localizadas no estado do Amazonas obtidas a partir da indução hormonal de
reprodutores de matrinxã (Brycon amazonicus). Para a análise de parentesco, foram
coletadas amostras de nadadeira caudal dos pais (geração parental). Adicionalmente,
30 amostras de fragmentos de nadadeira caudal de matrinxã foram coletadas em
ambiente natural (Lago Catalão, Manaus, Amazonas) para comparação com os
indivíduos obtidos em cativeiro, perfazendo um total de 90 amostras para análise
populacional (Tabela 1). A Figura 1 mostra a localização geográfica dos pontos de
coleta das amostras do matrinxã no estado do Amazonas. Todas as amostras foram
depositadas em microtubos contendo etanol 95% e depois armazenadas em freezer 80 :C para posterior análise.
Tabela 1- Origem das amostras coletadas de Brycon amazonicus e período de coleta
POPULAÇÕES
Natureza
Fragmentos de
nadadeira caudal
Larvas
30
Rio Preto da Eva
Balbina
6 (matrizes)2
6 (matrizes)2
301
301
36
36
Larvas
Total
301
1 – Amostras utilizadas para análise populacional; 2 – Amostras para análise de parentesco.
53
Balbina, Amazonas
Rio Preto da Eva, Amazonas
Manaus, Amazonas
Lago Catalão, Amazonas
Figura 1 – Localização geográfica dos pontos de coleta de amostras de Brycon
amazonicus no estado do Amazonas, Brasil. Coordenadas geográficas: Balbina
(1°53'53.00"S; 59°28'28.00"O) e Rio Preto da Eva (2:43‘40,651,76‖S;9:28‘19,883,68‖O)
e da natureza – Lago Catalão (3:09‘51,5‖S; 59:54‘22,8‖O)
Extração de DNA e genotipagem
A extração de DNA das amostras foi realizada utilizando o protocolo de Sambrok et al.
(1989) com modificações. A larva inteira ou cerca de 100 mg de nadadeira caudal do
matrinxã adulto foram colocadas em um microtubo para maceração juntamente com
330 ɥL de tampão de extração (1 M tris-HCl pH 8,0; 1 M NaCl; 10% SDS; 0,5 M EDTA,
pH 7,5). Para digestão do tecido, foram adicionados 10 ɥL de Proteinase K 10 mg/mL
(Fermentas) e 10 uL de RNAse A (Invitrogen). As amostras foram incubadas a 60 :C
por uma hora ou até digestão total de tecido. Em seguida, as amostras foram lavadas
54
com Fenol-Clorofórmio-Alcool Isoamílico (25:24:1). Para precipitação, inicialmente
foram adicionados 420 ɥL de isopropanol gelado, obtendo um pellet, que, em seguida,
foi lavado com etanol 70% e a secagem do mesmo foi realizada em fluxo laminar. Para
ressuspensão do DNA extraído, foi adicionado ao pellet 50 ɥL de água deionizada livre
de DNAse. A integridade da molécula de DNA foi observada em gel de agarose a 1%
corado com GelRed® (Invitrogen) e revelado em um transluminador L-PIX Image
(Locos Biotecnologia). A quantificação do DNA foi realizada em espectofotômetro
NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).
Para caracterização molecular foram selecionados sete marcadores moleculares
desenvolvidos por Clímaco et al. (2012) (BAM_01; BAM_06; BAM_10; BAM_11;
BAM_14; BAG_22; BAG_27). As Reações em Cadeia da Polimerase (PCR) foram
realizadas em volume final de 10 ɥL, contendo 50 ng de DNA template; 0,4 ɥM de
primer forward; 0,8 ɥM de primer reverse; 0,4 ɥM de primer marcado com fluorescência
6-FAM de acordo com protocolo sugerido por Schuelke (2000) e 5,0 ɥL de Master Mix
2x (Fermentas) composta de Taq DNA polimerase (0,05U), MgCl2 (4,0 mM) e dNTPs
(0,4 mM, cada).
As PCR‘s foram feitas em Termociclador Veriti™ 96-well Thermal Cycler (Applied
Biosystems, Inc.) de acordo com o seguinte programa de ciclos: para desnaturação: 94
°C por três minutos e 20 ciclos de 94 °C por 20 segundos; temperatura de anelamento
por 20 segundos e 68 °C por 30 segundos; anelamento da cauda M13: 25 ciclos de 94
°C por 20 segundos, 53 °C por 20 segundos; extensão por 68 °C por 30 segundos e
uma extensão final de 72 °C por 10 minutos. A qualidade da amplificação foi observada
em eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado com GelRed® (Invitrogen) e
revelado em um transluminador L-PIX Image (Locos Biotecnologia)
A genotipagem foi realizada em sequenciador automático ABI 3130xl Genetic Analyzer
(Applied Biosystems, Inc.) utilizando 0,7 ɥL de produto de PCR diluído (1:5); 0,3 ɥL de
Genescan-500 LIZ (-250)
(Applied Biosystems,
(Applied Biosytems, Inc.) e 8,7
μL de formamida Hi-Di
Inc.). As análises dos fragmentos foram feitas através do
programa GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems, Inc.).
55
Análise estatística
A diversidade genética de cada loco foi estimada pelo cálculo dos seguintes
parâmetros: o número de alelos por loco (A), heterozigosidade observada (Ho) e
esperada (HE) foram conseguidas utilizando o programa FSTAT v2.9.3.2 (Goudet,
2002. O coeficiente de endogamia (FIS) de cada loco foi estimado utilizando o algoritmo
postulado por Weir e Cockerham (1984) através do FSTAT v. 2.9.3.2. O número de
alelos privados e o desequilíbrio de ligação foi calculado com o software GDA v 1.1
(Lewis e Zaykin, 2000). O conteúdo de informação de polimorfismo (PIC) e o cálculo do
Equilíbrio de Hardy-Weinberg foi obtido com o programa CERVUS v3.0.3 (Kalonowski
et al. 2007). O programa MICRO-CHECKER v 2.3 (van Oosterhout et al. 2004) foi
utilizado para testar a possível presença de alelos nulos. Para minimizar os erros tipo I,
foi calculada a correção de Bonferroni visando corrigir as comparações múltiplas
simultâneas. O nível de significância utilizando foi de α = 0,05.
Para os cálculos de diferenciação genética, foram obtidas as estatísticas F de Wright
(FIT, FIS e FST; Weir e Cockeham, 1984) com os programas FSTAT v2.9.3.2 (Goudet,
2001) e ARLEQUIN v3.5 (Excoffier e Lischer, 2010). O RST, índice de estruturação
genética similar ao FST que assume o modelo mutacional escalonado (SMM, Kimura e
Otha, 1978), foi calculado considerando que esse modelo é melhor adequado aos
microssatélites. A análise de variância molecular (AMOVA) foi realizada para as três
populações estudadas através do programa ARLEQUIN v3.5 (Excoffier e Lischer,
2010) baseado em resultados do FST.
Com o objetivo de identificar o K (desconhecido) de origem dos indivíduos amostrados
para atribuir aos grupos, aplicou-se o procedimento Bayesiano clustering, por meio do
STRUCTURE 2.3.1 (Pritchard et al., 2000). Foi testado o modelo de ―no admixture‖
com índices de K variando de 2 a 5, sendo que para cada K foram realizadas cinco
repetições, 100.000 burn-ins e 500.000 simulações de Monte Carlo via Cadeia de
Markov (MCMC). O número real de K foi selecionado a partir dos índices de ΔK,
seguindo a metodologia descrita por Evanno et al., (2005).
56
Com o programa GENETIX 4.5.2 foram realizadas as Análises de Correspondência
Fatorial – FCA (Benzécri, 1973), para comparar populações.
Com o auxílio do programa GDA v 1.1
(Lewis e Zaykin, 2000), foi obtido um
dendograma de UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using na Arithmetic Average)
para verificar os possíveis agrupamentos baseado nos valores de Distância Genética
(DS) de Nei (1973). A árvore foi construída com confiança de 100.000 bootstraps sobre
os locos.
Para verificar o grau de parentesco entre os casais de matrinxã provenientes de
piscicultura, utilizou-se o programa Cervus 3.0 (Marshall et al., 1998).
Resultados e Discussão
Diversidade alélica e genotípica
Neste trabalho, foram testados sete locos microssatélites desenvolvidos para o
Brycon amazonicus (Clímaco et al., 2012) em três populações: duas provenientes de
cativeiro (Rio Preto da Eva e Balbina) e uma população natural (Lago Catalão). O
Equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado para cada população através do programa
Genepop 3.3 (Raymond e Rousset, 1995) com os seguintes parâmetros pelo método
de cadeia de Markov: 10.000 desmemorizações, 1.000 lotes e 10.000 interações por
lote. Os níveis de significância estatística foram ajustados através da correção de
Bonferroni (α/número de loci = 0,0071) (Rice, 1989).
Alguns locos apresentaram-se fora do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), tais
como o BAM_14, BAG_22 e BAG_31 para a população de Balbina; BAM_10 e BAG_27
para Rio Preto da Eva e BAM_31 para a população da natureza, Lago Catalão (Tabela
2). O desvio do EHW pode indicar que eventos microevolutivos estejam ocorrendo
nessas populações, sejam eles - migração, seleção, acasalamentos não-casuais e,
principalmente, deriva genética – que podem ocorrer mais comumente em populações
de cativeiro. Por outro lado, somente um loco na população natural desviou-se do
EHW, indicando que o há grande tamanho efetivo populacional (Ne).
A diversidade genética num loco é caracterizada pela heterozigosidade
esperada, heterozigosidade observada e diversidade alélica (Frankhan, 2008). Além
57
destas, a riqueza alélica é uma medida complementar valiosa da variação genética,
porque é mais sensível à perda de variação genética por causa do pequeno tamanho
da população do que a heterozigosidade; é uma medida importante do potencial de
longo prazo evolutivo das populações.
Tabela 2 – Diversidade genética em três populações de Brycon amazonicus.
Locos
Cativeiro
Balbina
BAM_06
HE
HO
FIS
RA
A
EHW
BAM_10
HE
HO
FIS
RA
A
EHW
BAM_ 11
HE
HO
FIS
RA
A
EHW
BAM_ 14
HE
HO
FIS
RA
A
EHW
BAG_22
HE
HO
FIS
RA
A
EHW
BAG_27
HE
HO
FIS
RA
A
EHW
BAG_31
HE
HO
FIS
RA
Natureza
Rio Preto da Eva
0,743
0,567
0,253
5,983
6
0,008
0,679
0,640
-0,078
9,502
6
0,023
0,833
0,785
-0.045
9,565
10
0,031
0,834
0,615
0,280
11,000
11
0,015*
0,840
0,583
0,325
15,704
9
0,000*
0,823
0,733
0,126
15,743
17
0,034
0,485
0,689
-0,407
3,786
11
0,021
0,417
0,440
-0,033
9,997
4
0,038
0,821
0,700
0,164
10,141
11
0,009
0,854
0,821
0,061
9,848
10
0,000*
0,734
0,769
-0,029
12,308
9
0,007
0,846
0,900
-0,047
12,398
13
0,162
1,000
0,655
-0,512
4,926
5
0,000*
0,475
0,565
-0,167
9,759
4
0,1162
0,825
0,866
-0,033
9,800
10
0,015
0,555
0,629
-0,016
5,804
4
0,222
0,136
0,035
0,745
3,999
4
0,001*
0,519
0,667
-0,027
5,765
6
0,797
0,612
0,464
0,259
5,852
0,701
0,643
0,102
11,705
0,889
0,679
0,254
11,775
58
A
6
5
12
EHW
0,000*
0,034
0,001*
HE, heterozigozidade esperada; HO, heterozigosidade observada; FIS, índice de
fixação, RA, riqueza alélica; A, número de alelos; EHW, valores do Equilíbrio de
Hardy-Weinberg com teste exato de Fisher p = 0,00238.
O número médio total de alelos obtido nas populações estudadas variou de 43
alelos (Rio Preto da Eva) a 73 alelos (Catalão), de acordo com a Tabela 3. Nesta
tabela, também pode-se observar que houve um total de 52 alelos privados, sendo que
a população selvagem foi a que mais apresentou tais alelos. Os alelos privados são
aqueles que somente podem ser encontrados em uma subpopulação (Hartl e Clark,
2010)
Outro parâmetro importante para nas estratégias para o manejo da conservação
das espécies é a riqueza alélica (R.A.), uma vez que identifica principalmente o número
de alelos segregando em uma população (Melo, 2008). Pode fornecer informações
sobre quais populações devem ser priorizadas nos programas de manejo e
conservação (Melo, 2008). A Tabela 3 possui os valores médios de R.A. para as
populações estudadas e é possível observar que dentre elas, na Natureza houve o
maior índice (10,741). Consequentemente, as populações de cativeiro carecem de
maiores enfoques visando sua conservação e diversidade.
A Tabela 2 e 3 possuem os valores de heterozigosidade esperada, na qual
observa-se que o maior valor foi alcançado foi para a população selvagem (0,793). A
população de Balbina atingiu uma valor próximo (0,726) enquanto que a população de
Rio Preto da Eva obteve o menor valor (0,569). Nei (1987) referiu-se à esta medida
como diversidade genética e esse índice pode ser pensado como a proporção média
de heterozigotos por loco em uma população de acasalamento ao acaso ou a
proporção esperada de locos heterozigotos em um indivíduo escolhido aleatoriamente
(Allendorf e Luikart, 2007). Os valores de heterozigosidades observadas também foram
maiores para a população do Catalão. Em contrapartida, os indivíduos de Rio Preto da
Eva apresentou o menor valor.
59
No entanto, observou-se na Tabela 2 que as heterozigosidades observadas
foram menores que as heterozigosidades esperadas para as três populações, exceto
para os locos BAM_14 e BAG_22 em Rio Preto da Eva. Isso significa que de modo
geral ocorreu um aumento do número de homozigotos. Tal fato também foi observado
no estudo conduzido por Souza 2012 ao utilizar microssatélites em análise de
variabilidade genética de piracanjuba (Phractocephalus hemioliopterus) provenientes
do Rio Araguaia e seu tributário, Rio das Mortes.
Tabela 3. Diversidade alélica e genética em populações de Brycon amazonicus
provenientes da Amazônia brasileira através de marcadores microssatélites
Diversidade alélica
Diversidade genetic
Origem
Populações
N
NTA
NMA
NAP
RA
ĤE
ĤO
F
Cativeiro
Balbina
30
53
5,75
8
6,493
0,726
0,634
0,012(4*)
R. Preto da
Eva
30
41
5,85
10
5,990
0,569
0,525
0,123(2*)
Catalão
30
79
11,28
32
9,446
0,793
0,761
0,056(1*)
Selvagem
N, o número de indivíduos testados; NTA, o número total de alelos; NMA, o número médio de alelos; NAP, o número
de alelos privados; RA, a riqueza alélica; HE, a heterozigosidade esperada em Equilíbrio de Hardy-Weinberg; HO, a
heterozigosidade observada; f, o índice de endogamia; n*, número de locos que está fora do Equilíbrio de HardyWeinberg.
Os valores dos índices de endogamia intrapopulacional (f) observados para as
amostras (Tabela 2 e 3) estudadas foram muito próximos de zero ou positivos,
indicando que há carência de heterozigotos para todas as populações estudadas. O
índice de fixação descrito por Wright (1921) quantifica o efeito do endocruzamento da
subdivisão populacional. Esse índice é muito útil para identificar a diferenciação
genética, pois permite uma comparação objetiva do efeito geral da estrutura
populacional entre diferentes organismos, sem entrar em detalhes de frequências
alélicas e níveis observados de heterozigosidade (Hartl e Clark, 2010).
A partir desses resultados, observou-se que a população selvagem quando
comparada com as de cativeiro, apresentou melhores índices de diversidade alélica e
genotípica, apesar de haver carência de heterozigoto também nesta população. Isso
pode estar associado ao baixo número de reprodutores no plantel das pisciculturas,
60
ocasionando os cruzamentos consanguíneos, que resultam em endogamia. Já na
população natural, esse déficit de heterozigotos pode ser atribuído a ações antrópicas,
como a sobrepesca, poluição, intensa captura e sedimentação (Panarari-Antunes et al.,
2012).
A endogamia pode levar à fixação de alelos deletérios, dificultando a
sobrevivência das progênies. A ocorrência de variabilidade genética herdável em
características adaptativas fornece uma plasticidade fenotípica às populações, o que
permite uma maior chance destas em resistirem a mudanças estacionais ou temporais,
aumentando, portanto, a capacidade de sobrevivência destas diante de mudanças
ambientais (De Paula, 2006).
Em piscicultura, a manutenção de bons índices de variabilidade genética garante
que o plantel consiga suportar as mudanças no ambiente, bem como afirma bons
níveis de produção. Nesse quesito, os marcadores microssatélites são importantes
ferramentas por serem altamente polimórficos, e isso pode cooperar para o
melhoramento genético do matrinxã, uma vez que é possível associar as
características de interesse, por exemplo, ganho de peso, com os marcadores
microssatélites.
Moreira et al (2010) testaram cinco locos microssatélites em duas variedades de
tilápias nilóticas (Oreochromis niloticus), Chitralada e Red Stirling, e em suas progênies
submetidas a programas de melhoramento genético, em sistemas intensivos de cultivo
por meio de marcadores microssatélites. Como resultado, foi observado que as
progênies apresentaram alta variabilidade genética e bons níveis de vigor híbrido. Além
disso, os autores enfatizaram que a técnica de marcadores moleculares é uma
ferramenta útil para avaliar plantéis de reprodutores em piscicultura. A base de dados
genéticos, gerada pelos microssatélites, permite tomar decisões importantes em
relação ao manejo reprodutivo e à intensidade de seleção que se pode aplicar sobre o
plantel, e manter-se, com isto, níveis baixos de endogamia nas progênies produzidas,
evitando-se a médio e longo prazos os efeitos negativos sobre a produção decorrentes
da depressão por endogamia.
61
Wasko et al (2004) analisaram populações selvagens e de cativeiro de Brycon
cephalus por meio de marcadores moleculares RAPD (Random Amplification of
Polimorphic DNA). Como resultado, observaram níveis distintos de variabilidade
genética entre as quatro populações estudadas, sendo que os três estoques cultivados
apresentaram diversidade genética mais baixa do que os estoques selvagens,
semelhante ao que observamos no presente trabalho com o marcador microssatélite
quando compara-se as populações selvagem e a de Rio Preto da Eva.
Considerando o grande número de espécies existentes, os casos de
sobrexploração na Amazônia parecem ser, na realidade, pontuais. As espécies hoje
que ameaçadas têm, em comum, o fato de serem muito apreciadas para o consumo,
por atingirem tamanhos relativamente grandes. Além de serem exploradas muito
intensamente, tais espécies possuem uma baixa taxa de crescimento, de maneira que
a reposição dos seus estoques adultos é relativamente demorada. O primeiro sinal do
efeito da pesca é a diminuição dos exemplares maiores da população e a captura de
indivíduos cada vez mais jovens. A ―sobrepesca de crescimento‖ acontece quando as
mortes causadas pela captura excessiva superam a capacidade de crescimento dos
indivíduos restantes na população, ou seja, os peixes são capturados antes de que
possam crescer substancialmente à biomassa de estoque (Isaac e Barthem, 1995).
Santos Filho e Batista (2009) verificaram a dinâmica populacional do matrinxã
(Brycon amazonicus) com base no desembarque total e dados de biometria obtidos
entre 1994 e 2002 e suas análises não revelaram superexploração, diferente do que foi
observado nos resultados apresentados. No presente estudo, o local de coleta deve ser
considerado, uma vez que tem sido alvo de uma crescente busca por atividade humana
e ecoturismo.
Estrutura genética
A Tabela 4 apresenta os índices de fixação segundo Wright (1951) e Slatkin
(1995). O índice de fixação intrapopulacionais médio (f) para as três populações foi
0,018 (f >1), indicando que há um déficit de heterozigotos nas populações estudadas
quando comparadas entre si. Os valores observados para FST (FST = 0,1169) indicam
que há baixa diferenciação genética entre essas populações. O modelo mutacional de
62
alelos infinitos adotado por Wright (1951) não admite a alta taxa mutacional que ocorre
com os microssatélites. Dessa forma, também foi calculado o RST, uma estatística
análoga ao FST 77de Wright, mas que considera a alta taxa de evolução desse
marcador. Para as populações estudadas, verificou-se que o valor do RST foi similar ao
FST, que confirma a diferenciação genética para essa população.
O Conteúdo de Informação de Polimorfismo (PIC) para os locos estudados
variou de 0,430 a 0,896, sendo que o mais polimófico foi o Loco BAM_ 06. O PIC para
um determinado marcador refere-se à porção da progênie em que é possível
determinar exatamente a transmissão de alelos parentais. Esse índice depende do
número de alelos/locos e das frequências dos alelos (Bolstein et al., 1980).
Outra forma de verificar a variabilidade genética entre as populações é por meio
do cálculo da Análise Molecular de Variância (AMOVA), que testa a significância da
variabilidade em níveis hierárquicos (Tabela 5). Diante das limitações do FST quando
avalia locos com altos níveis de variação, como são os locos microssatélites (Allendorf
e Luikart, 2007).
Tabela 4 – Valores médios para as estatísticas F de Wright (1951), índice de
diferenciação genética segundo Slatkin (1995) e Conteúdo de Informação de
Polimorfismo para as populações de Balbina e Rio Preto da Eva (cativeiro) e natureza
(Catalão). Valores estatisticamente diferentes p < 0,05
FIT
FIS
FST
RST
PIC
BAM_ 06
0,145*
0,099*
0,051*
0,049
0,805
BAM_10
0,232*
0,065*
0,179*
0,165
0,896
BAM_11
0,107*
0,070*
0,040
0,020
0,605
BAM_14
0,023*
0,034
-0,011*
-0,007
0,875
BAG_22
-0,145
0,015
0,153*
0,134
0,723
BAG_ 27
-0,169
0,043
0,122*
0,133
0,430
BAG_ 31
0,354*
0,135*
0,284*
0,232
0,815
0,078
0,065
0,1169
0,129
0,735
MÉDIA
* indica diferença estatística
63
A análise molecular de variância utilizada revelou que a maior parte da variância
foi observada significativamente dentro das populações (87,6%), com FST = 0,124 de
acordo com o software Arlequin v3.5 (Excoffier e Lischer, 2010), indicando
diferenciação genética intermediária.
O método AMOVA ajuda variados tipos de matrizes de entrada fornecida por
diversos tipos de marcadores moleculares e diferentes tipos de pressuposições
evolutivas, sem modificar a estrutura básica da análise. A AMOVA possibilita produzir
estimativas de componentes de variância das análogas estimativas F, chamada pelos
autores de estatística ɸ, refletindo a correlação da diversidade dos haplótipos em
diferentes níveis de subdivisão hierárquica (Brandão, 2005).
Tabela 5. Resultados para a Análise Molecular de Variância (AMOVA) para as três
populações de matrinxã (Brycon amazonicus) (p 5% = 0,109)
Fonte de
Soma dos
Componente
Percentagem
Variação
Quadrados
de variação
de variação
Entre as
42,970
0,33453
12,4
397,115
2,43261*
87,6
440,085
2,77714
populações
Dentro das
Populações
Total
*Significativo a 5%
No trabalho realizado por Suganuma (2008), no qual verificou-se a diversidade
genética
em
populações
de
Pacu
(Piaractus
mesopotamicus)
no
Pantanal
Matogrossense através de microssatélites e, ao realizar a AMOVA, observou também
que houve uma maior diverdade genética dentro das populações, apesar do FST ter
sido baixo, como observado nesse artigo.
A divergência genética entre os estoques foi analisada através da distância
genética de Nei (1972). As frequências alélicas de sete locos polimórficos foram
usadas para construir uma matrix de distância genética (Tabela 6) e esses dados foram
usados para obter um dendograma usando o algoritmo UPGMA com 100.000
64
bootstraps (Figura 2). Esses dados revelam que as populações de Balbina e Rio Preto
da Eva podem ter sido provenientes de uma mesma população, porém começaram a
se divergir geneticamente dos exemplares selvagens.
Tabela 6 – Correlação entre a distância genética (Nei, 1972) (diagonal abaixo) e a
identidade genética (diagonal acima) entre as populações de cativeiro (Balbina e Rio
Preto da Eva) e selvagem no Estado do Amazonas
Balbina
Rio Preto da Eva
Selvagem
-
0,6428
0,7138
Rio Preto da Eva
0,4419
-
0,7301
Selvagem
0,3370
0,3145
-
Balbina
Uma análise similar foi realizada por Santos et al. (2012), que fez a comparação
entre populações de tambaqui (Colossoma macropomum) provenientes de cativeiro
(Itacoatira, Jaboticabal e Pentecoste) e da natureza através de isozimas. Os resultados
revelaram dois agrupamentos: Itacoatira e Natureza formando um cluster; e Pentecoste
e Jaboticabal formando outro. Isso significa que há indivíduos comuns entre os grupos
formados.
A
B
Figura 2 – Dendograma construído usando UPGMA baseado nas distâncias genéticas (DS, Nei,
1972) pairwise entre populações de Brycon amazonicus computados a partir de sete locos
microssatélites com 100.000 bootstraps.
O software Structure (Pritchard et al., 2000) foi utilizado para análise da estrutura
populacional, que considera uma inferência Bayesiana. A partir dessa metodologia, o
valor ideal de K obtido foi de 3 populações (Figura 3). Também foi possível observar
que as três populações estudadas estão estruturadas, embora seja possível notar que
os indivíduos de diferentes clusters podem ser encontrados misturados entre si. Isso
65
denota que alguns indivíduos do Catalão serviram de matrizes para as duas
populações em cativeiro do presente estudo.
Santos (2011) verificou a variabilidade genética de sete populações de pirarucu
(Araipama gigas) (duas provenientes da natureza e cinco, de cativeiro) e identificou que
ocorre um excesso de heterozigotos nessas populações. Segundo o autor, isso está
relacionado com a redução de tamanho populacional devido ao efeito fundador nas
estações de piscicultura. Através do Structure (Pritchard et al., 2000), foi possível
observar a formação dos sete clusters, indicando que as populações não estão
misturadas, diferente do que foi observado nesse estudo.
Figura 3. Análise de estruturação genética com inferência Bayesiana (Structure
v.2.3.1 Pritichard, 2000) de três populações de Brycon amazonicus oriundos de
cativeiro e natureza na Amazônia brasileira através de sete marcadores
microssatélites, assumindo K = 3 (em que: 1, Balbina; 2, Rio Preto da Eva; 3,
Selvagem (Catalão)).
O agrupamento obtido pelo Componente de Análise Fatorial apresentou
variação total de 4,46% para o primeiro componente e 5,73% para o segundo
componente. O gráfico de dispersão para os dados obtidos estão na Figura 4, na qual é
possível observar que houve uma tendência de separação entre as populações de
cativeiro e a população da natureza (selvagem). Esses resultados corroboram com o
dendograma UPGMA obtido neste estudo.
66
Balbina
Selvagem
Rio Preto da Eva
Figura 4- Componente de Análise Fatorial (FCA) das populações de cativeiro e
selvagem de Brycon amazonicus com base em sete locos microssatélites.
Análise de parentesco nas populações de cativeiro
Os marcadores microssatélites ‗permitem a determinação de identidade entre
indivíduos baseado em estimativas formais derivadas da frequência alélica. Esses
marcadores são considerados o método mais eficiente para resolver problemas de
identificação (Kirst et al., 2005).
A análise de parentesco é um método de determinar os pais de um indivíduo ou
de um grupo de indivíduos usando informação genética combinada com métodos
estatísticos (Manel et al., 2005). O método clássico é baseado na probabilidade de
exclusão onde todos ou um par de pais candidatos podem ser excluídos baseados em
genotipagem multi locos de uma geração. Contudo, a ocorrência de erros de
genotipagem e alelos nulos podem conduzir à falsas exclusões. O outro método,
baseado na comparação par a par, foi desenvolvido para atribuir a prole aos pais não
excluídos ou ao par com alta verossimilhança.
67
Para determinar os pais mais prováveis nas populações de Rio Preto da Eva foi
utilizado o programa Cervus (Kalinowski et al., 2007; Marshall et al., 1998), que atribui
filhos aos seus pares de pais baseado na comparação par a par (Tabela 6).
Os cinco marcadores microssatélites (BAM_6; BAM_10; BAM_11; BAM_14 e
BAG_22) foram suficientes para determinar a relação de parentesco entre os três
casais utilizados e os 30 filhos (larvas) utilizados nesse estudo. A escolha dos locos
SSR levou em consideração os maiores de PIC, ausência de alelos nulos e erros de
genotipagem, pois esses fatores podem reduzir a acurácia dos marcadores para essa
análise (Karaket e Poompuang, 2012).
A identificação da relação entre pais e prole numa piscicultura torna-se
importante quando há interesse em programas de cruzamento seletivo visando o
melhoramento genético do plantel. O incremento de animais com características de
interesse como ganho de peso, resistência a doenças e rendimento de carcaça pode
cooperar com melhores níveis de produção em pisciculturas.
Figura 5 – Identificação de parentesco através de locos microssatélites para o casal 2 e
3 provenientes de Rio Preto da Eva, Am.
68
Estratégias de conservação e manejo
Os resultados revelaram, de forma geral, que ocorre uma moderada
variabilidade genética nas populações de cativeiro, quando comparadas com a
população selvagem. Isso também pode estar relacionado com a amostragem, uma
vez que foram utilizadas larvas provenientes do cruzamento de poucos casais. Diante
das características reprodutivas do matrinxã (alta fecundidade, alta precocidade) e o
tamanho populacional pequeno, a perda da variabilidade genética está condicionada
por uma falha no manejo dos reprodutores.
Em relação às populações de cativeiro, novos reprodutores devem ser obtidos
de forma a incrementar o plantel com novos alelos e assim, assegurar melhor
variabilidade genética para as progênies. É importante que essa medida seja realizada
para evitar problemas de mortandade entre os matrinxãs dessas pisciculturas,
decorrentes principalmente de doenças de cunho microbiológico. Plantéis inteiros
podem ser dizimados por uma bacteriose se esses indivíduos não apresentarem genes
polimórficos que sejam responsáveis pela imunidade.
A população selvagem apresentou déficit de heterozigotos talvez pelo
descumprimento do período de defeso do matrinxã, que compreende o período de 15
de novembro a 15 de março do ano subsequente (Portaria n.: 48 do Instituto Brasileiro
do Meio Ambiente e de Recursos Naturais Renováveis – IBAMA). O período do defeso
visa assegurar que não haja pesca durante o período da migração reprodutiva de
alguns peixes, como o Pirapitinga, Mapará, Sardinha, Pacu, Aruanã e Matrinxã.
Apesar da abundância de peixes que ocorrem nos rios amazônicos, é preciso
considerar esse resultado como um alerta, principalmente diante das atuais mudanças
climáticas que vem ocorrendo. Com o déficit de heterozigotos de matrinxã na natureza,
a adaptação às condições adversas de ambiente fica comprometida.
Entre os anos de 1994 a 2002, foi analisada a dinâmica populacional de Brycon
amazonicus baseada no desembarque total e dados de biometria registrados nos
principais portos de desembarque de Manaus. Desse estudo, constatou-se unidades
populacionais diferenciadas e diversificadas estratégias de pesca. Como medida de
69
manejo sugerida para conservação dos estoques pesqueiros de matrinxã foi proposta a
restrição de pesca no período de dispersão migratória, em vez de restrições durante o
período reprodutivo (Santos Filho e Batista, 2009).
Uma análise feita por Mota e Farias (2008) na calha do rio Amazonas e
tributários utilizou primers da região codificante da ATPase 6 e 8 do DNA mitocondrial
em B. amazonicus. Foi observado que, de acordo com a Análise Molecular de
Variância (AMOVA), a maior parte da variabilidade genética encontra-se distribuída
dentro das populações, indicando que as populações encontram-se estruturadas
geneticamente. Entretanto, as comparações de FST evidenciaram fracas estruturações
genéticas entre as localidades, as quais não foram significantes.
Utilizando o marcador molecular RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA ),
Wasko et al. (2004) realizou o monitoramento da variabilidade genética do Brycon
cephalus em ambiente natural e em três estações de piscicultura. Os resultados
revelaram que a população de cativeiro possui variabilidade genética mais baixa do
que a população natural. Esse resultado está relacionado ao baixo número de matrizes
para reprodução nas pisciculturas.
Mais estudos são necessários em populações naturais de matrinxã localizadas
em diferentes pontos ao longo dos rios amazônicos com o objetivo de avaliar a
variabilidade genética desses peixes de forma mais ampla.
70
Considerações Finais
71
VII - Considerações Finais
Os marcadores microssatélites são ferramentas indicadas para estudos que
visam à conservação de recursos genéticos de peixes. Esses marcadores moleculares
podem cooperar com estratégias de manejo tanto em ambiente natural, como em
cativeiro para o Brycon amazonicus.
Na natureza, a sobrepesca deve ser veementemente combatida, visando a
manutenção das novas gerações de matrinxãs. Além disso, o período de defeso
precisa ser obedecido. Essas medidas em conjunto podem ajudar a restabelecer a
variabilidade genética do matrinxã. Porém, mais estudos sobre a estruturação genética
devem ser feitos para avaliar melhor o estado de outras populações daquele peixe em
diferentes pontos ao longo dos rios amazônicos.
Em cativeiro, o pequeno número de reprodutores coopera para o excesso de
homozigotos observados nas duas populações. Um rodízio de matrizes deve ser
adotado para acrescentar novos alelos no plantel e incrementar o perfil genético
desses peixes. Dessa forma, a endogamia poderá ser dizimada e melhores níveis de
produção poderão ser obtidos em cativeiro.
De forma geral, os estudos genéticos em peixes agregam à produção em
cativeiro, uma vez que é possível selecionar animais com caracteres desejáveis,
mantendo bons índices na população. Do mesmo modo, pode-se também extinguir
algum fator que possa depreciar a produção pesqueira. Mais estudos devem ser
realizados nesse sentido, visando o melhoramento genético dessa importante espécie
amazônica, a matrinxã.
72
Referencial bibliográfico
73
VIII – REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO
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84
Anexos
85
VII – ANEXO
1 - Artigo referente ao Capítulo 1 publicado no períodico Molecular Ecology Resources
– Vol. 13, 341-343, em 2013.
Isolation of microsatellite markers for matrinxã (Brycon amazonicus, Spix & Agassiz,
1829), an important freshwater migratory fish of the Amazon
Gisele T. Clímaco*₤, Carlos Henrique dos A. dos Santos₤, Priscila Roberta M.
Nascimento₤, Marcos P. Lima†, Maria N. Paula-Silva₤, Daniele A. Matosoffi, Vera Maria
F. Almeida-Val₤
₤
Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular, Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia, Manaus, AM, 69060-001, Brazil. †Instituto de Ciência e Tecnologia das
Águas, Universidade Federal do Oeste do Pará, Santarém, PA, 68135-110, Brazil.
ffi
Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM, 69077-
000, Brazil.
*Corresponding author: Gisele Torres Clímaco
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Laboratório de Ecofisiologia e
Evolução Molecular (LEEM), Aleixo, Manaus, AM, Brazil. CEP 69060-001.
E-mail: [email protected]
Phone: 55-92-3643-3188/3190
FAX: 55-92-3643-3186
86
Running title: Microsatellite markers for Brycon amazonicus
Abstract
Brycon amazonicus is an important freshwater migratory fish in the Amazon Basin.
Studies involving populations of B. amazonicus are of great importance for the conservation and
management of this species. We developed 16 microsatellite loci and applied them to
investigate the genetic variation of 32 wild individuals from Catalan lake of the Black river. The
number of alleles per locus ranged from 4 to 21, with an average of 10.4. The observed and
expected heterozygosity values ranged from 0.039 to 0.906 (average 0.557) and from 0.442 to
0.887 (average 0.706), respectively. The value of f ranged from -0.290 to 0.927 (average
0.320). Eight locus (Table I) significantly deviated from Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) after
Bonferroni correction (P: (5%) < 0.003). No significant linkage disequilibrium was detected.
These microsatellite loci will contribute towards studies of genetic diversity and conservation of
B. amazonicus.
Keywords: Brycon amazonicus, genetic diversity, wildlife conservation, microsatellite markers.
87
The matrinxã (Brycon amazonicus) is a freshwater teleost fish that occurs in the Amazon
basin and is considered one of the main migratory fish in the Brazilian Amazon. This species
presents a great economic importance in the Middle Amazon and Central Amazonian due to
commercial and subsistence fishing (Batista et al. 2000, 2007; Ferreira et al. 1996). Owing
excellent meat taste, high growth, and high acceptance of commercial food in its diet, matrinxã
has been adopted as a keystone species for aquaculture in Brazil (Scorvo-Filho et al. 1999),
specially to Northern Brazil. In this context, the assessment of genetic diversity in captive and
wild populations of B. amazonicus in the Amazon basin are of great importance because it
means we will implement measures that would see the management and conservation of this
species. Therefore, we isolated microsatellite markers that are crucial tools for population
genetic studies.
Microsatellite loci were developed from a genomic enriched library following the protocol
described by Billotte et al. (1999). The protocol used for total genomic DNA extraction was
described by Sambrook et al. (1989). The 250 ng/ɥL purified total DNA was digested with Rsa I
and enriched for (CT)8 and (GT)8 repeats. Enriched fragments were amplified by Polymerase
Chain Reaction (PCR), ligated into a pGem-T Easy vector (Promega) and then transformed into
competent XL1-Blue Escherichia coli cells. The positive clones were selected using the βgalactosidade gene and grown overnight in an HM/FM medium with ampicillin. Plasmid DNA
was purified and 96 positive clones were sequenced using T7 and SP6 primers as well as the
v3.1 Big Dye terminator kit (PerkinElmer Applied Biosystems) with an ABI 377 automated DNA
sequencer (Applied Biosystems). A total of 31 primer pairs were designed using the program
88
Oligo Explorer v1.2 (Gene Link, Inc.) and a M13 sequence tail was added in the 5` end of each
forward primer in order to permit the fluorescent labeling protocol suggested by Schuelke
(2000).
These loci were characterized in 32 individuals of B. amazonicus collected in Catalan
lake (Black river) near the city of Manaus (ADAPTA Project). The microsatellite fragments were
amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR) in 10 µl containing 60 ng of genomic DNA
template, each forward and M13 Label primer (FAM) at 0.4 µM, reverse primer at 0.8 µM, PCR
Master Mix (2x) (Fermentas) – 0.05 units/µl Taq DNA Polymerase in reaction buffer (10 mM
Tris-HCl, pH 8.5 and 50 mM KCl), 4 mM MgCl2, 0.4 mM dATP, 0.4 mM dCTP, 0.4mM dGTP and
0.4 mM dTTP. PCR was carried out with two steps: denaturation (94°C, 1min) followed by 25
cycles of 20 s at 94°C, 20 s at specific annealing temperature, Table 1, and 30s at 68°C; the
second step consisted of 20 cycles with the following time and temperature profile: 20 s at 94°C,
20 s at 53°C, 30 s at 68°C, and a final extension at 72°C for 3 min. Amplifying products were
checked by electrophoresis on 1% agarose gels containing 0.1 mg ethidium bromide/ml in 1x
TBE buffer (pH 8.0). The products from each PCR (1.0 µl) were analyzed on an ABI 3130xl
Sequencer and sized using the GeneScan-500 LIZ internal size standard and scored using
GeneMapper version 4.0 (Applied Biosystems) software.
Out of 31 microsatellite loci developed for B. amazonicus, 16 were polymorphic (Table I).
The number of alleles, the observed (HO) and expected (HE) heterozygosity and fixation index (f)
were calculated using Genetix v4.05.2 (Belkhir et al., 2004). The test for conformity to the
Hardy-Weinberg expectation (HWE) and Linkage Disequilibrium (LD) between all pairs of loci
were calculated using GDA v1.1 (Lewis and Zaykin, 2000). The polymorphism information
content (PIC) was calculated using Cervus v3.0.3 (Kalinowski et al., 2007). Significance levels
were adjusted to the number of simultaneous tests using sequential Bonferroni correction (Rice
1989). The number of alleles per locus ranged from 4 to 21, with an average of 10.4 alleles per
89
locus (Table I). Polymorphism information content (PIC) ranged from 0.419 to 0.893 (average
0.692). Observed heterozygosity (HO) and expected heterozygosity (HE) ranged from 0.037 to
0.906 (average 0.557) and 0.442 to 0.887 (average 0.706), respectively. Values of f ranged
from -0.290 to 0.927 with average of 0.320. Eight loci (Table I) showed significant deviation from
the Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) after Bonferroni correction (P: (5%) < 0.003), and
probably this deviation occurred due to the presence of null alleles as suggested by the program
Micro-Checker (van Oosterhout et al. 2004). A possible reason for the deviation from HWE
might be the Wahlund effect. No significant linkage disequilibrium (LD) was detected among all
pairs of loci. These 16 polymorphic microsatellite loci are potential tools for genetic studies of
wild populations of B. amazonicus.
Acknowledgments
The authors would like to thank Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas (FAPEAM) and Conselho
Nacional de Pesquisa (CNPq) for financial support. The Program for Academic Cooperation
PROCAD between INPA/UNICAMP/UFRGS was supported by CAPES (no.023/2006/CAPES).
GTC is the recipient of a Master fellowship from CNPq. CHAS is the recipient of a Post-Doctoral
fellowship from CNPq. VMFAV is the recipient of a research fellowship from CNPq. This work is
part of INCT ADAPTA, coordinated by Adalberto Luis Val.
90
91
Tabela 1 – Characteristics of the 16 (sixteen) Brycon amazonicus microsatellite loci: locus name, GenBank acession number, primer sequence (F: forward primer, R: reverse
primer), repeat motif from a sequence clone, annealing temperature (Ta), number of alleles (A), product size range in base pairs, expected (HE) and observed heterozygocity (HO),
fixation index (f), polymorphism information content (PIC), P values for the HWE test, significance threshold adjusted using Bonferroni correction (P-HWE) : (P:5% ≤ 0.005). NS not
significant and * significant.
SSR
Locus
BAM_06
GenBank
Accession no.
JQ993449
Primer sequences
(5’- 3’)
FAM
F: TTCTCCCAGCTAATCTTCC
R:TAGTGTTCTGTATAGGGTTCTTG
BAM_10
JQ993450
F:
GCACAGCAGCGCAGTCAAA
R:TGCCCTTCACGGATAACACAAT
BAM_11
JQ993451
F: GCTGTTGGCTGGTGGACTATTCTC
R:GCCTCCTTTCACCCTGTTCTTCA
BAM_14
JQ993453
F: AATCAGGTCCAAGTTTCAA
R:ACGAGGTGTATCAGCAGAGA
BAG_22
JQ993454
F: TGTAGTAGTTCTGTCTGCTG
R:TGGAGTTGTTGGTGTGAATC
BAG_25
JQ993457
F: CTGTATGCTGGTGTGTATGC
R:GTGTGTGAGTGTGAGAGGTG
BAG_27
JQ993459
F: CACAGACACAGTCCCTCATT
R:CACACCCCAGAAAGAATGAC
BAG_31
JQ993462
F: CAAGACAAACCAGGGAAACC
R:GCTAGATCCAGCAGATGTAG
Repeat
motif
(CAT)4CCA(CAT)4
Ta (°C)
N
A
HE
HO
f
PIC
10
Allele
size (pb)
300-376
53
29
0,750
F(Null
)
-0,018
P value*
HWE
NS
0,666
0,780
0,806
-0,018
FAM
(CA)5CG(CA)2
53
32
17
136-206
0,830
0,750
0,112
0,818
0,060
0,078
NS
FAM
(TG)18
60
32
11
180-214
0,820
0,719
0,139
0,797
0.064
0,066
NS
FAM
(GA)14
52
29
13
152-194
0,845
0,906
-0,057
0,830
-0,051
0,881
NS
FAM
(GA)14
60,5
30
10
314-332
0,826
0,875
-0,044
0,808
-0,037
0,811
NS
FAM
(CA)19
55
30
10
134-216
0,826
0,654
0,224
0,839
0.093
0,012
NS
FAM
(CA)5GA(CA)4
63,1
28
6
186-236
0,442
0,067
0,854
0,419
-0.171
1,000
NS
FAM
(GT)12GA(GT)4
51
32
12
130-156
0,887
0,690
0,239
0,876
0.090
0,005
NS
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94
2 - PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA
1- Colocar em um microtubo um pouco de tecido macerado.
2- Adicione 330 uL de tampão de extração e posteriormente 80 uL de SDS 10%.
200 uL antes de macerar
130 uL após macerar
3- Adicione 10 uL de solução de proteinase K + 15 uL de RNAse.
Pode ser usada no fim da extração.
4- Adicione 10 uL de DTT 1M.
5- Incubar a 60º C durante a 1 hora ou até digestão total do tecido.
6- Adicionar Fenol-Clorofórmio-Álcool Isoamílico (25 uL:24 uL:1 uL)
7- Centrifugar por 5 minutos a 13.000 ou 14.000 rpm em temperatura ambiente.
8- Transferir o sobrenadante para um novo tubo, descartando o tubo com o pellet.
Não verter, retirar o sobrenadante e dispensar o pellet.
9- Adicionar 50 uL de acetato de sódio 1M
10- Misturar por inversão (+ ou – 50X)
11- Centrifugar por 5 minutos a 13.000 ou 14.000 rpm.
12- Transferir o sobrenadante para um novo tubo, descartando o pellet.
Uso da pipeta, deixando só um pouco de líquido no fim do tubo.
13- Adicionar 420 uL de isopropanol gelado e homogeneizar.
14- Centrifugar por 5 minutos a 13.000 ou 14.000 rpm.
15- Descartar o sobrenadante bruscamente – o DNA está em forma de pellet.
16- Lavar o pellet adicionado 250 uL de etanol 70% (adicionar suavemente).
17- Centrifugar por 5 minutos a 14.000 rpm.
18- Remover o sobrenadante (bruscamente).
19- Repetir a lavagem do passo 14 (se necessário).
20- Secar o pellet na capela de fluxo (+ ou – menos 50 min).
21- Ressuspender o pellet em 30 uL de TE ou água deionizada.
22- Realizar a eletroforese em gel de agarose 0,8 % ou 1%.
95