Avaliação do Perfil de Resistência à Terapia

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMÁCIA
LORENA BOMFIM FREIRE
CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS
DE ENTEROBACTÉRIAS ISOLADAS DE INFECÇÕES DA CORRENTE
SANGUÍNEA EM UM HOSPITAL PÚBLICO DE SALVADOR, BAHIA.
SALVADOR
2015
LORENA BOMFIM FREIRE
CARACTERIZAÇÃO DO PERFIL DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS
DE ENTEROBACTÉRIAS ISOLADAS DE INFECÇÕES DA CORRENTE
SANGUÍNEA EM UM HOSPITAL PÚBLICO DE SALVADOR, BAHIA.
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Farmácia, da Faculdade de Farmácia
da Universidade Federal da Bahia, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profa. Dra. Joice Neves Reis Pedreira
Salvador
2015
Sistema de Bibliotecas - UFBA
Freire, Lorena Bomfim.
Caracterização do perfil de resistência aos antimicrobianos de enterobactérias isoladas de
infecções da corrente sanguínea em um hospital público de Salvador, Bahia / Lorena Bomfim
Freire. - 2016.
82 f.: il.
Inclui anexo e apêndices.
Orientadora Profª. Drª. Joice Neves Reis Pedreira.
Dedico a minha mãe, minha irmã e meu pai (in memoriam) por sempre me apoiarem e
incentivarem as minhas escolhas e decisões.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por te me conduzido durante essa jornada, com sabedoria, paciência,
determinação e me guiando à fim de eu superar os obstáculos.
À minha mãe, Genyse Bomfim, e minha irmã, Camila Bomfim por me apoiarem e
compreenderem sempre, dando amor e carinho. Sem vocês eu não conseguiria concluir mais
uma etapa da minha vida.
Ao meu pai, Francisco, hoje um espírito de luz que está eternamente ao lado, me guiando,
que sempre me deu amor, carinho e que sempre apoiou as minhas decisões. Obrigada por
tudo!!!!
À minha orientadora, professora Drª Joice Reis, por ter me aceitado como orientanda,
pelos ensinamentos e aprendizados, paciência, confiança, compreensão, incentivos. Obrigada
por tudo!
Aos meus familiares, tios e primos, obrigada pelo acolhimento, incentivo, compreensão e
carinho.
Aos meus amigos e colegas de equipe: Soraia Machado, Ana Paula Menezes, Milena
Soares, Jailton Azevêdo, Cláudia Alves, Eduardo Viana, Maira Silva, Mariela Correia, Márcia
Azevedo, Larissa Romã, Angélica pelos anos de convívio, amizade, e por cada contribuição.
Aos meus amigos e colegas do LPMC pelo acolhimento, amizade e companheirismo.
Ao Hospital Ana Nery, especialmente às bioquímicas Silvia Cruvinel e Débora Alves, e
suas equipes, obrigada pela atenção e gentileza. Vocês foram peças-chave.
Aos meus amigos do PPGFAR, pelo coleguismo, companheirismo, pelos momentos de
alegria e tristeza. Sem vocês esse caminho seria mais comprido.
À Drª Maria Goreth Barberino, pelos ensinamentos, confiança e incentivo. Seu apoio foi
de suma importância para a execução desse trabalho.
À todos os meus amigos por sempre confiarem, apoiarem e me compreenderem.
Ao Programa de Pós-graduação em Farmácia da UFBA (PPGFAR).
A Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal do Nível Superior (CAPES) pela Bolsa
concedida
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) pelo apoio financeiro
concedido através do Edital 030/2013 e termo de outorga nº SUS0024/2014
“Para um ensinar, dois tem que aprender”
(Provérbio budista)
RESUMO
As infecções da corrente sanguínea (ICS), ou seja, uma invasão da corrente sanguínea por
bactérias são uma das principais causas de morbi-mortalidade em todo o mundo. A
emergência de micro-organismos multi-drogas resistentes que limita as opções terapêuticas,
aumenta os custos e reduz a sobrevida dos pacientes, tem contribuído para a gradivdade destas
infecções. As enterobactérias constituem o grupo dos principais patógenos causadores de ICS
além de possuírem diversos mecanismos de resistência aos antibióticos, tais como: aquisição
de enzimas (β-lactamase de espectro estendido e carbapenemases), alteração de
permeabilidade de membrana e aquisição de bombas de efluxo. O objetivo desse estudo foi
caracterizar o padrão de resistência e perfil de genes de resistência de isolados de
enterobactérias em casos de ICS, no período de maio de 2013 a abril de 2014, em um hospital
público de Salvador, Bahia. Os isolados bacterianos foram identificados através dos aparelhos
BD Phoenix® e Vitek 2 ®. O teste de susceptibilidade aos antimicrobianos foi feito pela
técnica de Kirby-Bauer. Para os isolados resistentes aos carbapenêmicos foram realizados o
Teste de Hodge Modificado, Teste de inibição pelo ácido fenilborônico e EDTA.
Posteriormente, os isolados que apresentaram positividade no teste de detecção para ESBL
e/ou resistência à pelo menos um carbapenêmicos foram testados por PCR multiplex para
detecção de genes de resistência TEM, SHV, OXA-1-like, CTX-M-grupo 1, CTX-M-grupo 2
e CTX-M-9, codificadores de ESBL, e IMP, VIM e KPC, codificadores de carbapenemases.
No período estudado foram identificados 118 casos de ICS por enterobactérias, sendo as mais
frequentes: K.pneumoniae (33,3%), E.cloacae (19,7%), S.marcecens (17,1%) e E.coli
(11,1%). O perfil de multiresistência por ESBL foi identificado em 44 isolados e a resistência
aos carbapenêmicos em tês, dos quais apenas um apresentou-se positivo no Teste Modificado
de Hodge e Teste de inibição pelo ácido fenilborônico. A PCR multiplex identificou 31%
(13/44) de isolados com o gene OXA-1-like e variantes, 29% (12/44) CTX-M-1 e 22% (9/44)
SHV. A PCR detectou gene IMP em dois isolados de K.pneumoniae ESBL positivos porém
sensíveis aos carbapenêmicos, sendo que apenas um destes isolados apresentou o gene KPC.
A presença de enterobactérias produtoras de carbapenemases, não parece ser um problema
clínico em Salvador, mas medidas de precauções devem ser mantidas em todas a unidades de
saúde, porque K. pneumoniae produtora de carbapenemase foi identificada no local do estudo.
Palavras-chave: infecção da corrente sanguínea; multi-droga resistência; β-lactamase de
espectro estendido; carbapenemase.
ABSTRACT
The bloodstream infection (BSI), i.e., an invasion of the bloodstream by bacteria is a
major cause of morbidity and mortality worldwide. The emergence of multi-drug resistant
microorganisms limiting the therapeutic options, increases costs and reduces the survival of
patients, has contributed to the severity of the BSI infections. Enterobacteriaceae are the
group of the main pathogens ICS besides having different mechanisms of resistance to
antibiotics, such as: acquisition of enzymes (β-lactamase extended and carbapenemases
spectrum), changes in membrane permeability and acquisition of efflux pumps. The aim of
this study was to characterize the resistance patterns and resistance gene profile in BSI
Enterobacteriaceae isolates, from May 2013 to April 2014, in a public hospital in Salvador,
Bahia. Bacterial isolates were identified by BD Phoenix® and Vitek 2 ®. The antimicrobial
susceptibility test was made by the Kirby-Bauer method. Isolates resistant to carbapenems
were submitted to Hodge Test Modified, inhibition test by phenylboronic acid and EDTA.
Subsequently, the isolates that showed positivity in the detection test for ESBL and / or
resistance to at least one carbapenems were tested by multiplex PCR to detect resistance
genes TEM, SHV, OXA-1-like CTX-M group 1 CTX-M-2 group and CTX-M-9, ESBL
encoders and IMP, VIM and KPC, carbapenemases encoders. In the period studied were
identified 118 cases of BSI by Enterobacteriaceae, the most common: K. pneumoniae
(33.3%), E. cloacae (19.7%), S. marcecens (17.1%) and E. coli (11.1%). The multidrug
pattern for ESBL was detected in 44 isolates and carbapenem resistance in three cases, of
which only one was positive in Hodge Test Modified and in the phenylboronic acid inhibition
test. The multiplex PCR identified 31% (13/44) isolates with the OXA-1-like gene and
variants, 29% (12/44) CTX-M-1 and 22% (9/44) SHV. The PCR detects IMP gene in two
isolates of K. pneumoniae ESBL positive but sensitive to carbapenems in Kirby Bauer test
and, only one of these isolates presented the KPC gene. The presence of Enterobacteriaceae
producing carbapenemase, does not seem to be a clinical problem in Salvador, but precautions
measures should be maintained in all health units, since we have identified K. pneumoniae
producing carbapenemase in the study
Keywords: bloodstream infection; multi-drug resistance; ESBL; carbapenemase.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fluxograma dos testes de detecção de resistência realizados nas enterobactérias
isoladas de hemocultura no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um Hospital de
salvador, Bahia. ........................................................................................................................ 37
Figura 2: Esquema para aplicação de discos de antimicrobianos para detecção de
carbapenemases. ....................................................................................................................... 39
Figura 3: Teste de Hodge Modificado ...................................................................................... 39
Figura 4 - Teste de fenotípico para detecção de ESBL em Klebsiella pneumoniae................. 49
Figura 5 - Teste fenotípico de detecção de ESBL em Klebsiella pneumoniae resistente à todos
carbapenêmicos testados........................................................................................................... 49
Figura 6 - Teste de triagem fenotípica para KPC em Klebsiella pneumoniae. ........................ 53
Figura 7 - Teste de Hodge com isolados de Klebsiella pneumoniae ........................................ 53
Figura 8 - Gel de agarose 1,5% dos produtos de amplificação de PCR Multiplex para detecção
dos genes OXA, SHV e TEM em enterobactérias causadoras de infecção da corrente
sanguínea no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de
Salvador, Bahia......................................................................................................................... 54
Figura 9 - Gel de agarose 1,5% de produtos de amplificação de PCR Multiplex para detecção
dos genes CTX-M grupo 1, grupo 2 e grupo 9 em enterobactérias causadoras de infecção da
corrente sanguínea no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na
cidade de Salvador, Bahia. ....................................................................................................... 55
Figura 10 - Gel de agarose 1,5% de produtos de amplificação de PCR Multiplex para detecção
dos genes IMP, KPC e VIM em enterobactérias causadoras de infecção da corrente sanguínea
no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador,
Bahia. ........................................................................................................................................ 56
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Frequência de enterobactérias isoladas em hemoculturas por unidade de
internamento no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade
de Salvador, Bahia. ................................................................................................................... 48
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Características das unidades de internamento e leitos do Hospital Ana Nery na
cidade de Salvador, Bahia. ....................................................................................................... 34
Tabela 2 - Critérios de interpretação da Disco Difusão para cada antibiótico. ........................ 38
Tabela 3 - Caracterização dos pares de primers e concentração na reação da PCR multiplex
para detecção dos genes codificadores de ESBL e carbapenemases. ....................................... 42
Tabela 4 - Cepas controle e os respectivos genes de resistências utilizados nas PCR multiplex
.................................................................................................................................................. 44
Tabela 5 - Espécies de enterobactérias identificadas em corrente sanguínea no período de
maio de 2013 a abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia, de acordo
com o sistema automatizado de identificação. ......................................................................... 45
Tabela 6 - Frequência de enterobactérias isoladas de hemoculturas no período de Maio de
2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia. ......................... 46
Tabela 7 - Características dos pacientes com infecção da corrente sanguínea por
enterobactérias no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na
cidade de Salvados, Bahia. ....................................................................................................... 47
Tabela 8 - Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos por espécies de enterobactérias
causadoras de infecções da corrente sanguínea no período de Maio de 2013 a Abril de 2014
em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia. ............................................................ 51
Tabela 9: Caracterização dos pares de primers e concentração na reação da PCR multiplex
para detecção dos genes TEM, SHV e OXA-1-like. E variantes codificadores de ESBL. ..... 58
Tabela 10: Frequência de óbitos por espécie de enterobactérias causadoras de infecção da
corrente sanguínea no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na
cidade de Salvador, Bahia. ....................................................................................................... 60
Tabela 11 - Frequência de óbitos por genes identificados em enterobactérias causadoras de
infecção da corrente sanguínea no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital
público na cidade de Salvador, Bahia. ...................................................................................... 60
LISTA DE ABREVIATURAS
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC
American Type Culture Collection
CDC
Center for Disease Control and Prevention
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
ESBL
Extended spectrum beta-lactamase
EUA
Estados Unidos da América
ICS
Infecção da corrente sanguínea
IRAS
Infeção relacionada à assistência de saúde
LPMC
Laboratório de Pesquisa em Microbiologia Clínica
MBL
Metalo β-lactamase
MDR
Micro-organismo multidroga-resistente
NNIS
National Nosocomial Infections Surveillance
PBPs
Penicillin-binding proteins
PCR
Polymerase chain reaction
ONU
Organização das Nações Unidas
Q.S.P
Quantidade Suficiente Para
SCN
Staphylococcus coagulase negativo
TSA
Ágar triptona de soja
UTI
Unidade de terapia intensiva
UCO
Unidade coronariana
UPC
Unidade pós cirúrgica
WHO
World Health Organization
SUMÁRIO
1.
Introdução.......................................................................................................................... 16
2.
Referencial teórico ............................................................................................................ 17
2.1 Infecções Relacionadas aos Serviços de Saúde ................................................................ 17
2.2 Infecções da corrente sanguínea................................................................................19
2.3 Enterobactérias...........................................................................................................20
2.4 Mecanismos de resistência aos antimicrobianos........................................................20
2.4.1 Resistência intríseca ou natural.........................................................................21
2.4.2 Resistência adquirida........................................................................................21
a) Alterações de afinidade pelos alvos da droga.........................................................21
b) Alteração de permeabilidade..................................................................................22
c) Bombas de efluxo...................................................................................................22
d) Degradação de antimicrobianos pela ação enzimática...........................................22
· Enzimas da classe β-lactameses........................................................................23
β-lactameses de espectro estendido (ESBL) .........................................24
AMPc β-lactameses...............................................................................25
Carbapenemases....................................................................................25
2.5 Métodos de detecção fenotópicos............................................................................28
2.6 Métodos de detecção genotípicos............................................................................29
3.
Justificativa........................................................................................................................30
4
Objetivos............................................................................................................................32
4.1 Objetivos gerais........................................................................................................32
4.2 Objetivos específicos................................................................................................32
5.
Materiais e métodos...........................................................................................................33
5.1 Período e tipo de estudo............................................................................................33
5.2. Critério de inclusão...................................................................................................33
5.3 Local de esudo..........................................................................................................33
5.4 Coleta de dados.........................................................................................................33
5.5 Procedimentos microbiológicos...............................................................................33
a) Hemoculturas.................................................................................................33
b) Isolamento de bactérias.................................................................................34
c) Identificação de bactérias ............................................................................34
d) Testes de detecção de resistência..................................................................35
Preparo de amostras...................................................................................35
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos................................................35
Detecção fenotípica da produção de ESBL................................................35
Testes inibidores e potencializadores para detecção de carbapenemases..36
Teste fenotípico de detecção da produção de carbapenemase do tipo não
MBL..........................................................................................................................................36
Teste fenotípico de detecção de carbapenemase do tipo MBL...................39
Testes genotípicos de detecção de resistência.............................................40
Seleção de amostras...............................................................................40
Extração de DNA...................................................................................40
PCR multiplex para detecção de genes de genes que codificam ESBL e
carbapenemases.........................................................................................................................40
a) Eletroforese em gel.........................................................................41
5.6 Análise estatística......................................................................................................41
5.7 Limitações.................................................................................................................41
6. Resultados ............................................................................................................................45
6.1 Resultados gerais.........................................................................................................45
6.2 Características do paciente...........................................................................................46
6.3 Resultados fenotípicos................................................................................................48
6.4 Resultados genotípicos.................................................................................................53
7. Discussão..............................................................................................................................61
8. Conclusão..............................................................................................................................65
Referências................................................................................................................................66
Anexo........................................................................................................................................74
Anexo A: Documento de aprovação no Comitê de Ética..............................................74
Apêndice...................................................................................................................................78
Apêndice A: Formulário para coleta de dados pessoais de pacientes portadores de
infecções da corrente sanguínea causadas por enterobactérias.................................................78
Apêndice B: Formulário para coleta de dados epidemiológicos de pacientes portadores
de infecções da corrente sanguínea causadas por enterobactérias............................................79
16
1.
Introdução
As infecções da corrente sanguínea (ICS) são uma das principais causas de morbi-
morlidade no mundo e estão diretamente relacionada ao aumento do tempo de internamento
do paciente e de custos associados com o período de permanência no hospital (MOEHRING;
ANDERSON, 2014). Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária, as ICS possuem
causas multifatoriais cujo critérios de diagnósticos bem como fisopatologia, implicações
terapêuticas, prognósticas e preventivas são distintas. O tratamento dessas infeções é realizado
após a avaliação clínica do paciente, considerando os sinais e sintomas sistêmico, foco de
origem primário e presença ou ausência de dispositivos vasculares (ANVISA, 2009). Há
alguns anos vêm-se observando a emergência de patógenos multiresistêntes aos
antimicrobinaos relacionados com essas infecções, os quais dificicultam o tratamento,
favorecendo, consequentemente ao agravamento do quadro clínico e caracterizado como
problema mundial (LAUPLAND, 2013).
Inseridas nesse contexto estão as enterobactérias, as quais constituem uma das principais
causas de infecções da corrente sanguínea, atrás apenas do S.aureus e SCN (MOEHRING,
ANDERSON, 2014). Essas bactérias detém diversos mecanismos de resistência além dos
intrínsecos, tais como: aquisição de bombas de efluxo, alteração de permeabilidade das
porinas, presença de enzimas que degradam antibióticos (TENOVER, 2006).
Hoje, a aquisição de enzimas tais como beta-lactamase de espectro estendido e
carbapamenases são de grande preocupação mundial. Essas enzimas degradam antibióticos de
última geração, restringindo as opções de tratamento, tornando-o, muitas vezes, limitado à
polimixina e tigeciclina (NORDMANN; NAAS; POIREL 2011).
Assim, a identificação dos mecanismos de resistência aos antimicrobianos em bactérias
causadoras de infecção da corrente sanguínea é de suma importância para traçar o perfil
epidemiológico local, bem como direcionar o tratamento empírico, aperfeiçoar as medidas de
controle de infecção, reduzir custos associados com o internamento e aumentar a sobrevida do
paciente.
17
2. Referencial teórico
2.1 Infecções Relacionadas aos Serviços de Saúde
Em 1989 o CDC introduziu o conceito de infecção nosocomial no mundo como sendo a
infecção adquirida após 48 horas de admissão em um hospital, ou que não estavam no período
de incubação no momento da admissão do paciente (GARNER et al., 1988). Atualmente
utiliza-se o termo infecções relacionadas aos serviços de saúde (IRAS) devido à proporção de
tal problema, ou seja, extrapolou os hospitais e atingiu outras unidades de saúde, tais como,
home care e ambulatórios, os quais executam técnicas de diagnóstico e tratamentos
endovenosos, pequenas intervenções cirúrgicas, hemodiálises e afins (HORAN et al, 2008).
Essas infecções são responsáveis por elevadas taxas de mobi-mortalidade em todo o mundo
além de contribuírem para o aumento dos custos associados ao internamento (PUJOL;
LIMÓN ,2013; SCOTT, 2009).
Desde a década de 1970 estudos são realizados a fim de avaliar frequência, os principais
sítios e patógenos relacionados com as IRAS. Segundo o Center for Disease Control and
Prevention (CDC), as IRAS ocorrem em 1 a cada 25 pacientes internados, totalizando
722.000 casos por ano, dos quais 75.000 vão á óbito. A pneumonia e infecções do sítio
cirúrgico são as infecções mais prevalentes, representando 21,8% dos casos, seguidos de
infecções gastrointestinais (17%), ITU (12,8%) e infecções da corrente sanguínea (10%)
(MAGILL et al. 2014).
O National Healthcare Safety Network, entre os anos de 2007 e 2008, detectou nos EUA
que de a partir de 47.582 IRAS relatadas, as bacteremias e as ITUS associadas a cateteres
foram as mais frequentes representando 39,2% dos casos, seguidas de pneumonias (24,9%),
infecções em sítio cirúrgico (22,7%) e associadas à ventilação mecânica 13,2%. Entre 2009 e
2010, o número de casos reportados aumentou para 69.475 e a infecção mais frequente
continuou sendo a bacteremia (40%) (SIEVERT et al, 2013). De forma geral, observa-se que
nos Estados Unidos os principais sítios de infecções associados aos serviços de saúde são
basicamente os mesmos, alterando a ordem de prevalência de acordo o período, o tipo de
unidade hospitalar e a localidade.
Na Europa a frequência de IRAS não difere muito do que se encontra nos EUA, ou seja, 5
a 10% dos pacientes que são admitidos em hospitais adquirem uma IRA (HUMPHREYS et al
2008; SIEVERT et al, 2013; SMYTH et al, 2008; WHO, 2010; ZARB et al, 2012). Um
estudo realizado nos países britânicos em 2006 detectou que as IRAS mais comuns foram:
18
gastrointestinais (20,6%), ITUs (19,9%), em sítios cirúrgicos (15,5%), pneumonias (14,1%),
na pele (10,4%) e infecções na corrente sanguínea primária (7%), (SMYTH et al. 2008). Zarb
e colaboradores (2012) verificaram que na Espanha a ITR foi a infecção mais frequente
(26%), seguida de infecções no sítio cirúrgico, responsáveis por 19% das IRAS e ITU, por
17%.
No Brasil, entre os anos 1997 a 1999 o programa de vigilância de resistência bacteriana
de abrangência mundial denominado SENTRY verificou a ocorrência de 3728 casos de
infecções nosocomiais em 12 hospitais brasileiros. As infecções da corrente sanguínea foram
responsáveis por 54% do total desses casos, seguido de infecções do trato respiratório inferior
(22%), em pele ou tecidos (21%) e ITUs (23%) (SADER et al 2001). Segundo dados da
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) as principais IRAS relatadas no Brasil
são: infecção respiratória (48%), urinária (20%), da corrente sanguínea (14%) e da pele e
tecidos moles (12%). (SANTOS et al., 2005). De acordo a Organização das Nações Unidas
(ONU) A prevalência de IRAS no Brasil no período de 1995 a 2010 foi de 14%, dado este
superior ao encontrado em países Europeus, tais como Finlândia, Inglaterra, Holanda, França
e Espanha; Paises Africanos (Senegal e Gana), e América do Norte (Canadá e EUA) (WHO,
2010).
Em 2007 no município de Ponta Grossa, Paraná, de 768 infecções tratadas em um
hospital de alta complexidade, 63,2% foram de origem hospitalar, das quais 16,3% ocorreram
em UTI neonatal, 27,8% em UTI adulto e 55,9% em enfermarias. Os principais patógenos
identificados foram Escherichia coli (23,2%); Staphylococcus aureus (15,5%); Pseudomonas
aeruginosa (11,8%); Klebsiella pneumoniae (10,3%); Staphylococcus coagulase-negativo
(10,0%); Enterobacter aerogenes (10,0%) (GASPAR et al, 2012). Posteriormente, no período
de 2000 a 2010, um estudo avaliou as IRAS na cidade de São Paulo tendo identificado que as
infecções da corrente sanguínea foram responsáveis por 23% dos casos, seguido das infecções
cutâneas e de tecidos (9,2%), associadas a feridas cirúrgicas e gastrointestinais (5,7%). Os
bastonetes Gram-negativos foram os patógenos mais comuns, representando 49,9% dos
isolados, dentre os quais os predominaram Acinetobacter baumanii (11,5%), K. pneumoniae
(10,5%), Enterococcus spp.(8%) e P. aeruginosa (6,9%) (MACIEL et al., 2014).
Na Bahia, segundo o Relatório Anual dos Indicadores de Infecção, em 2010 as infecções
hospitalares tiveram uma taxa de episódios de 2,7% cuja letalidade foi de 6,3%. Os principais
tipos de infecções foram: respiratórias (25,3%), ICS (20,2%), ITU (18%) e infecções em sítio
cirúrgico (16,9%) (BAHIA, 2010).
19
Sendo assim, diversos fatores contribuem para a variação da frequência das IRAS: local
de aquisição, sazonalidade, características do serviço, presença de co-morbidades e patógenos
circulantes (MOEHRING; ANDERSON, 2014). As principiais espécies isoladas se alternam
entre: S.aureus, E.coli, Staphylococcus coagulase-negativos, Klebsiella spp., P.aeruginosa e
Enterococcus spp (BEREKET et al. 2012; SIEVERT et al, 2013; ZARB et al. 2012).
2.2 Infecções da corrente sanguínea
Infecções da corrente sanguínea, ou seja, a presença de bactérias viáveis no sangue por
um longo período causando problemas ao indivíduo podendo ser proveniente de
procedimentos médicos, odontológicos ou outras infecções é uma importante causa de morbimortalidade (MOEHRING; ANDERSON, 2014). O aumento dessas infecções associado ao
isolamento de patógenos resistentes a diferentes antimicrobianos está caracterizado como um
importante problema de saúde pública mundial, uma vez que uma terapia inapropriada
possibilita o agravamento do quadro clínico do paciente e eleva custos com o internamento e
com medidas de controle e erradicação, aumento da gravidade do estado de saúde e o tempo
de permanência na unidade de saúde (LAUPLAND, 2013; MOEHRING; ANDERSON,
2014). Portanto, a vigilância e o conhecimento da epidemiologia dessas infecções fornecem
dados importantes para as intervenções de prevenção e garantia de segurança ao paciente que
utiliza os serviços de saúde (COSGROVE, 2006).
Há muitos anos a problemática das IRAS é estudada e sua vigilância é realizada em
diversos países. Entre os anos de 1986 e 2003 National Nosocomial Infections Surveillance
(NNIS) relatou a distribuição dos bacilos Gram-negativos em unidades intensivas para os
principais sítios de infecções relacionadas aos cuidados de saúde nos EUA. Registou-se
33,2% de bacteremia associada a tais patógenos em 1986 foi e em 2003, 23,8%, ou seja,
houve uma redução a qual pode ser devido à implementações e conscientização de boas
práticas de controle de infecções no decorrer dos anos. No ano de 2003, espécies de
Enterobacter foi o patógeno mais frequente, representando 4,4% de todos os microorganismos isolados e 18,5% dos bacilos Gram-negativos. Outras espécies de enterobactérias
mais comuns foram: K. pneumoniae (4,2%), E.coli (3,3%) e Serratia marcescens (2,3%)
(GAYNES; EDWARDS, 2005).
No decorrer dos anos, as infecções causadas por enterobactérias tornou-se uma
preocupação de saúde em todo o mundo, pois essas bactérias além de deterem mecanismos de
resistência intrínsecos, adquiriram outros mecanismos de resistência aos antimicrobianos, os
20
quais somados reduzem as opções terapêuticas para um limitado número de drogas
antimicrobianos. Diversos estudos relacionam as enterobactérias multirresistentes com surtos
de infecções associadas aos serviços de saúde (ALMEIDA et al, 2013; CABRAL et al, 2012;
CAMPANA, et al 2013; GALES et al, 2003; GIAKKOUPI et al, 2003; LEVERSTEIN-VAN
HALL, 2010; NORDMANN; NAAS; POIREL, 2011; PEIRANO et al, 2009; STUART,
2011).
2.3 Enterobactérias
Enterobactérias são bacilos Gram-negativos, fermentadores de glicose, anaeróbios
facultativos e oxidase negativos. São ubíquas e constituem a microbiota intestinal dos
animais, incluindo o homem. As espécies que constituem a microbiota humana são Proteus
mirabilis, K. pneumoniae E.coli, Citrobacter freudii e Enterobacter spp. (PATERSON,
2006).
Apesar de constituírem a microbiota humana, essas bactérias são importantes patógenos
causadores de infeções quando atingem outros sítios corpóreos. E.coli, por exemplo, é o
principal patógenos em ITUs; Klebsiella spp. e Enterobacter spp. são importantes agentes
causadores de pneumonias; gastrointerites normalmente são causadas por Salmonella spp. ou
Shiguella spp. e todas as espécies estão associadas à ICS, infecções intra-abdominais,
peritonites. Há algumas décadas essas bactérias são estudadas quanto à aquisição de
mecanismos de resistências aos antibióticos: carbapenêmicos, cefalosporinas de 3ª e 4ª
geração, quinolonas, aminoglicosídeos, dentre outros (PATERSON, 2006).
2.4 Mecanismos de resistência antimicrobiana
Diversos mecanismos de resistência bacteriana aos antibióticos já são esclarecidos,
inclusive, algumas espécies apresentam resistência natural a determinadas classes de
antibióticos. O surgimento de micro-organismos multirresistentes (MDR) tem ocorrido em
diversos países tanto como patógenos de infecções comunitárias quanto nas hospitalares,
como consequência do uso indiscriminado de antimicrobianos, mutações e recombinações
gênicas (ASHLEY et al., 2011).
Os casos mais relevantes são aqueles relacionados com a resistência adquirida, cujas
bactérias inicialmente sensíveis ao antimicrobiano, torna-se resistente. Dentre os mecanismos
de resistências estão: aquisição de bombas de efluxo; produção de enzimas, tais como as betalactamases de espectro estendido e as carbapenemases; mutação espontânea da proteína-alvo;
21
e alterações nos canais de porina das membranas (TENOVER, 2006). Atualmente a hidrólise
dos antibióticos beta-lactâmicos é o mecanismo de resistência mais comum entre as
enterobactérias e a associação de mais de um mecanismo tem sido cada vez mais comum
(BUSH; JACOBY, 2010; DJAHMI et al. 2014).
2.4.1 Resistência intrínseca ou natural
A resistência intrínseca é uma característica natural de um micro-organismo, que ocorre
sem uma exposição prévia ao antibiótico. O conhecimento da resistência intrínseca das
diferentes espécies ajuda a escolher as estratégias de tratamento empírico. A resistência
natural das bactérias a determinados antibióticos deve-se a três possíveis razões: a) A ausência
de um processo metabólico influenciável pelo antibiótico; b) Existência de enzimas que
apresentem a capacidade de inativar o antibiótico; c) Presença de particularidades inerentes à
morfologia bacteriana. (COX; WRIGHT, 2013).
Um exemplo clássico de espécie que possui uma ampla resistência intrínseca é a
Stenotrophomonas maltrophilia, um bastonete Gram-negativo, não fermentador de lactose
com susceptibilidade apenas ao levofloxacino e ao sulfametoxazol-trimetropim (CLSI, 2014).
Tal artifício restringe as opções de tratamento e, quando associado aos mecanismos de
resistência adquiridos, torna-se um sério problema de saúde pública (COX; WRIGHT, 2013).
2.4.2 Resistência adquirida
Existem quatro grandes mecanismos de resistência aos antibióticos que são: a alteração
do local de ação, a alteração da permeabilidade, a bomba de efluxo e o mecanismo enzimático
que altera a estrutura química do antibiótico
a) Alterações do local de ação
Este tipo de resistência caracteriza-se pela diminuição ou mesmo ausência de afinidade
do antibiótico ao local de ligação. Esta ocorre por alteração da estrutura do peptidoglicano,
interferência na síntese de proteínas ou na síntese de DNA. As PBP’s, ou seja, grupo de
proteínas-alvo de penicilinas podem ter alterações que resultam em redução na afinidade com
estes antimicrobianos. As principais alterações são: substituição da sequência de aminoácidos,
hiperprodução e/ou aquisição de novas PBP’s e recombinação de genes que codificam essas
proteínas
gerando
novas
que
não
possuem
afinidade
com
o
antibiótico
(GEORGOPAPADAKOU; LIU, 1982). Temos como exemplo, a resistência aos beta-
22
lactâmicos; resistência aos glicopeptídeos; resistência aos macrolideos, lincosamida e
estreptogramina B;resistência a oxazolizonas e a tetraciclinas.
b) Alteração da permeabilidade
As bactérias Gram-negativas são constituídas por duas membranas celulares, interna e
externa, constituídas por fosfolipídeos e lipídeos, respectivamente. Tal constituição favorece a
penetração lenta do fármaco, a qual é realizada por meio da difusão pelos canais de porina e
bicamada lipídica. A permeabilidade da membrana celular, cuja modificação pode ser
ocasionada por alterações estruturais, pelo número, seletividade ou tamanho das porinas, é
fundamental para que o antibiótico atue de forma desejável sob o micro-organismo
(DECOUR, 2009).
c) Bombas de efluxo
Bombas de efluxo são partes integrantes da membrana plasmática bacteriana
responsáveis pelo transporte ativo de substâncias para o exterior da célula. Elas são
codificadas por elementos genéticos localizados em cromossomos e em algumas espécies elas
têm sido detectadas em plasmídeos, o que pode facilitar a propagação dos genes de efluxo,
contribuindo para a resistência intrínseca e adquirida, permitindo à bactéria sobreviver em
ambientes hostis, como, por exemplo, na presença de antibióticos e desinfetantes.
(MAHAMOUD et al., 2007)
A hiperexpressão dessas bombas de efluxo, contribuem para a redução da concentração
da droga no interior da célula, lançando o antibiótico para fora da membrana. As bombas de
efluxo estão presentes tanto em bactérias Gram-negativas quanto em Gram-positivas, sendo
mais frequentes em Gram-negativos (MAHAMOUD et al., 2007)
d) Degradação de antimicrobianos pela ação enzimática
O mecanismo enzimático de resistência devido a inativação do fármaco resulta na
produção, pela bactéria, de enzimas que degradam ou inativam o antibiótico. Existem três
principais mecanismos, tais como, hidrólise, transferência de um grupo ou processo redox. A
forma mais comum são as amidases hidrolíticas, isto é, as β-lactamases, que quebram o anel
β-lactâmico das penicilinas e cefalosporinas.
23
·
Enzimas da classe β-lactamases
As β-lactamases são enzimas capazes de catalisar a hidrólise do anel β-lactâmico
impossibilitando assim sua atividade antimicrobiana. Este é o principal mecanismo de
resistência das bactérias Gram-negativas aos β-lactâmicos, uma vez que inativa tais
antibióticos diminuindo a habilidade destes de alcançarem o sítio ativo, as proteínas ligadoras
de penicilina (PBPs). As β-lactamases atuam via éster de serina em que o anel β-lactâmico é
atacado pela hidroxila livre da cadeia lateral do resíduo de serina que ativa o sítio da enzima,
produzindo um éster acil covalente. O anel β-lactâmico é rompido em sua cadeia lateral pelo
radical hidroxil livre do resíduo de serina da β-lactamase (sítio ativo da enzima). Após a
hidrólise do éster ocorre a liberação da enzima ativa e da droga inativada (BUSH, 1983)
As bactérias Gram-negativas apresentam a produção de β-lactamases como o principal
mecanismo de resistência aos antibióticos β-lactâmicos e o mais disseminado mundialmente
(HALL; BARLOW, 2005). Tais enzimas foram primeiramente descritas por Ambler (1980), o
qual propôs duas classificações moleculares segundo a sequência de aminoácido: Classe A,
representada pelas serinas proteases, e Classe B, metalo-β-lactamases que requerem íons
bivalentes no sítio ativo, sendo o mais comum o zinco. Posteriormente duas novas classes
foram descobertas: Classe C, ampC β-lactamases que apesar de serem serinas possuem uma
origem evolutiva distinta das primeiras descritas, e Classe D, oxacilina β-lactamase as quais
contém poucas semelhanças com as classes A e C apesar de ser uma serina protease
(JAURIN; GRUNDSTRÖM, 1981; OUELLETTE et al. 1987).
A prática clínica utiliza com mais frequência uma outra classificação que considera as
características funcionais dessas enzimas. Elas são classificadas de acordo com a
especificidade e a sensibilidade ao ácido clavulânico em quatro grupos. Grupo 1 - hidroliza
cefalosporinas e não são inibidas pelo ácido clavulânico. Grupo 2 corresponde às
penicilinases, ESBL, cefalosporinases dentre outros mecanismos que são inibidos pelo ácido
clavulânico. Grupo 3, metalo-β-lactamases, é resistente ao ácido clavulânico, entretanto, sua
principal característica é a necessidade da presença de íons zinco para serem ativadas sendo,
portanto, sensíveis aos agentes quelantes de zinco tal como o EDTA. Grupo 4, foi
primeiramente representado por penicilinases sensíveis ao ácido clavulânico e posteriormente
foi excluído do esquema. Hoje, esse grupo é composto pelas oxacilinases cuja característica é
a resistência a todos os inibidores das demais enzimas: ácido clavulânico, tazobactam,
sulbactam e EDTA (BUSH 1989; BUSH et al. 1995; BUSH; JACOBY, 2010).
24
β-lactamase de espectro ampliado (ESBL)
As β-lactamases de espectro estendido (ESBL) são enzimas mediadas por plasmídeos
com a propriedade de degradarem β-lactâmicos de espectro estendido, tais como
cefalosporinas de 3ª e 4ª geração, monobactâmicos e penicilinas e por serem sensíveis à
cefoxitina e, principalmente, aos inibidores específicos (ácido clavulânico, sulbactam e
tazobactam). Essas enzimas são representantes da classe A de Ambler e do grupo 2be e 2d da
classificação de Bush e Jacob (AMBLER, 1980; BUSH; JACOBY, 2010).
A primeira ESBL foi identificada em 1983 após a descoberta de uma cepa de
K.pneumoniae resistente à cefoxitina, cefuroxima e cefamandol (KNOTHE et al., 1983).
Posteriormente foi identificado o gene SHV, denominado como “sulphydryl variable” devido
às suas propriedades bioquímicas (BRADFORD, 2001). Desde então a distribuição desses
genes aumentou e hoje existem diversos outros envolvidos nesse mecanismo, tais como,
CTX-M, BES, BEL, PER, VEB e subtipos que embora se distinguem em uma sequência de
aminoácido comportam-se de forma semelhante (BUSH; JACOBY, 2010). Hoje já existem
mais de 200 variantes dos genes que codificam enzimas com potencial de atividade sob a
hidrólise de oxi-imino cefalosporinas e a benzilpeniclina e são de grande relevância mundial
devido à ampla disseminação em diversas espécies de enterobactérias (BUSH et al, 2014).
Atualmente o grupo de genes que codificam ESBL mais frequentes no mundo são do tipo
CTX-M (cefotaximases) com cerca de 160 subtipos relatados, conhecidas por sua capacidade
de hidrolisar a cefotaxima mais efetivamente do que ceftazidima, podendo ter ação também
sobre a cefepime (RAWAT; DEEPTHI, 2010). Essa enzima foi inicialmente descrita em 1990
a partir de um isolado de E.coli com alto nível de resistência à cefotaxima (BAUERNFEIND
et al., 1990). A distribuição dessas ESBL é geograficamente distinta, sendo CTX-M-14 e
CTX-M-15 as mais frequentes em isolados clínicos (CASTANHEIRA et al. 2013; ZHAO;
HU, 2013).
No Brasil as ESBL do tipo CTX-M são as mais relatadas, chegando a representar 91% do
total das ESBL identificadas. Os subtipos mais comuns são CTX-M-2, CTX-M-8 e CTX-M9, contudo, casos de CTX-M-15 já foram relatados (CARVALHO-ASSEF et al. 2014;
MINARINI et al. 2009; SEKI et al. 2013;). Outros genes de resistência para ESBL também já
foram encontrados no Brasil tais como TEM, SHV, GES, BES diversas variantes incluindo
(BONNET et al. 2000; DROPA et al. 2009; MARRA et al. 2011; PICÃO et al. 2010;
RIBEIRO et al. 2010).
25
AmpC β-lactamase
De acordo a classificação de Ambler e a de Bush, a Classe C e Grupo 1 das β-lactamases,
respectivamente, são representadas pelas enzimas do tipo Amp C, as quais podem ser de
origem cromossomal ou plasmidial. Apesar de possuírem semelhanças com as ESBLs quanto
ao perfil de resistência aos β-lactâmicos e serem serina-proteases, a Amp C difere em relação
à resistência ao ácido clavulânico ou outro inibidor de β-lactamase, os quais, muitas vezes,
atuam como indutor da enzima (BUSH; JACOBY, 2010).
O primeiro gene para AmpC descrito foi denominado de CMY-1 (cefamicinase) devido a
capacidade hidrolítica as cefamicinas, em 1988 após o isolamento de uma cepa de
K.pneumoniae resistente a penicilinas, cefalosporinas de todas as gerações cefamicinas,
aztreonam, tigeciclina, clorafenicol e sulfonamidas, surgiu a ideia acerca da possibilidade de
transferência de genes de resistência via plasmídeos (BAUERNFEIND et al. 1989). Hoje,
existem diversos genes tais como DHA, MOX e FOX dentre outros, com disseminação
mundial, sendo o CMY o mais identificado (BUSH; JACOBY 2010; JACOBY, 2009;
PHILIPPON et al., 2002 ).
Em espécies dos gêneros Citrobacter, Enterobacter, Serratia e Providencia expressão da
AmpC é pequena, entretanto, é induzida pela exposição aos β-lactâmicos, havendo muitas
vezes divergência entre o resultado do antibiograma e a resposta terapêutica, ou seja, a
resposta in vitro muitas vezes não prediz a resposta in vivo (BUSH; JACOBY, 2010). A partir
da transferência de genes cromossomais via plasmídeos, diversas espécies tais como E.coli,
K.pneumoniae e Salmonella spp. atualmente são relatadas com tal perfil de resistência
(JACOBY, 2009; PHILIPPON et al. 2002).
No Brasil, onde a maioria dos estudos se limitam à região Sudeste, a presença de genes
que codificam AmpC em diversas espécies de enterobactérias foram identificados. O gene
CMY-2, assim como em outras partes do mundo, são os mais frequentes (CAMPANA et al.
2013; DIAS et al. 2008; JACOBY, 2009; PAVEZ et al. 2008).
Carbapenemases
As carbapenemases, ou seja, β-lactamases que hidrolisam carbapenêmicos além de
cefalosporinas e penicilinas, são inseridas em três grupos da classificação de Ambler: A,B e
D. Na classificação funcional, por sua vez, essas enzimas pertencem ao subgrupo 2f e 3
(BUSH; JACOBY, 2010). Essas enzimas constituem uma das maiores preocupações no
âmbito da resistência bacteriana uma vez que as opções terapêuticas para o tratamento de
26
infecções por bactérias produtoras de carbapenemases muitas vezes ficam limitados ao uso de
tigeciclina e polimixina, os quais possuem alta toxicidade, contribuindo para a elevada
letalidade (18 a 69%) de infecções por bactérias que expressam este mecanismo de
resistência. (MONTEIRO et al., 2009; NORDMANN; NAAS; POIREL, 2011; PEIRANO et
al, 2009; SEIFFERT et al. 2014; STUART; 2011;).
As carbapenemases do grupo A são representantes das serinas proteases, cromossomais
ou plasmidiais, caracterizadas pela fraca susceptibilidade ao ácido clavulânico, tazobactam e
sulbactam. Inseridas nesse grupo estão as enzimas codificadas pelos genes GES e KPC
mediados por plasmídeos, totalizando 57 variantes ( BUSH et al, 2014; BUSH; JACOBY,
2010;) sendo a KPC de predominância mundial. O primeiro caso de KPC foi identificado na
Carolina do Norte em 2001 em uma cepa de K.pneumoniae, justificando sua nomenclatura
(Klebsiella pneumoniae carbapenemase) (YIGIT et al., 2001). Atualmente existem inúmeros
relatos de clones produtores dessas enzimas em diversas espécies de enterobactérias
associados à surtos em todo o mundo sendo as variantes KPC-2 e KPC-3 as mais frequentes
(BUSH; JACOBY, 2010; DJAHMI et al., 2014).
No Brasil o primeiro caso de KPC foi identificado em 2008 na cidade de Recife após uma
análise de quatro isolados de K. pneumoniae resistentes aos carbapenêmicos. Além da
presença da KPC-2 foram encontrados nos isolados outros genes de multirresistência: CTXM-2, SHV e TEM (MONTEIRO et al., 2009). Após este, outros casos foram relatados em
diversas regiões do Brasil, associados a diversas espécies de enterobactérias (PEIRANO et al.,
2009 e SEKI et al 2013).
As integrantes da classe B de Ambler ou Classe 3 de Bush, por sua vez, denominadas de
Metalo-β-lactamases (MBLs) apresentam como principal característica a presença de Zn+2 no
seu sítio ativo. Essa propriedade torna-as susceptíveis aos agentes quelantes, tal como EDTA
e sensíveis apenas à monobactâmicos e polimixina (AMBLER, 1980; HALL; BARLOW,
2005; BUSH et al., 1995; BUSH; JACOBY, 2010).
Em 1995, foi identificada a primeira MBL, denominada IMP (imipnemase), isolada de
Serratia marcecens no Japão (ITO et al. 1995). Posteriormente ocorreu a descoberta da VIM
(Verona imipenase) com 31,4% de similaridade com a IMP, esta enzima predispõe uma
redução da susceptibilidade para penicilinas e cefalosporinas, e representa o tipo mais
frequente de MBL relatados em todos os continentes. (LAURETTI et al. 1999; MALTEZOU,
2009). As MBLs, hoje, possuem cerca de 100 variantes detectadas em cepas de
enterobactérias e em bactérias não-fermentadores de glicose no mundo todo, inclusive no
27
Brasil (BUSH; JACOBY, 2010; GIAKKOUPI et al. 2003; MARTÍNEZ et al., 2014;
MIRIAGOU et al. 2003; SADER et al. 2005; VOURLI et al., 2006; WIRTH et al., 2009 ).
Em 2008 foi identificada uma nova enzima a New Deli Metalo-betalactamase (NDM)
isolada de K.pneumoniae, identificada de um paciente hospitalizado em Nova Deli, Índia.
Desde então, a presença dessa enzima em enterobactérias tem sido descrita em todo o mundo
tanto em casos isolados quanto em surtos. Atualmente, existem 12 variantes de NDM sendo a
Índia o principal país de origem (BUSH et al, 2014; CARVALHO-ASSEF et al., 2013;
GONÇALVES et al. 2009; SEIFFERT et al. 2014; TADA et al. 2014; YONG et al., 2009;).
No Brasil já foram identificadas MBLs do tipo VIM, IMP, SPM e NDM. A SPM, São
Paulo metalo-β-lactamase, é de origem brasileira, inicialmente identificada em São Paulo em
2002. Essa enzima foi associada a surtos e manteve-se restrita ao país por um período até ser
detectada em outros países (ALMEIDA et al. 2013; GALES et al., 2003; FEHLBERG et al.
2012; PELLEGRINO et al. 2006; RIZEK et al. 2014; SALABI et al. 2010; SILVA et al.
2014; TOLEMAN, 2002;).
No Brasil, o primeiro caso de NDM foi detectado no Rio Grande do Sul, em uma cepa de
Providência rettgeri, isolada de um paciente com doença vascular periférica com um quadro
de “pé diabético” (CARVALHO-ASSEF et al. 2013). Outros casos surgiram posteriormente,
entretanto a maioria das espécies reportadas foram de bacilos Gram-negativos nãofermentadores de glicose (CAMPANA et al. 2013; CARVALHO-ASSEF et al. 2014;
FRANCO et al. 2010; GONÇALVES et al.; 2009; POLOTTO et al. 2012).
A classe D das carbapenemases, ou seja, do grupo das oxacilinases compreende da OXA23 e OXA-48 como principais representantes as quais são frequentemente encontradas em
Acinetobacter baumanii. Esse grupo de enzimas detém a particularidade de não possuir
inibidores, ou seja, tanto o EDTA quanto os inibidores de β-lactamases são inativos
(DJAHMI et al. 2014; NORDMANN; NAAS; POIREL, 2011; PEIRANO et al, 2009;
STUART; 2011;).
As OXA carbapenemases bem como as demais genes que codificam carbapenemases
estão emergindo no mundo e muitas vezes, outros mecanismos de resistência antimicrobiana
estão presentes, como por exemplo: outros tipos de enzimas, alteração de canais de porinas e
aquisição de bombas de efluxo, dificultando o tratamento, limitando-o à polimixina e
tigeciclina, constituindo um sério problema nas instituições de saúde (CABRAL et al, 2012;
CARVALHO-ASSEF et al. 2014; DAIKOS et al. 2009; DJAMDJIAN et al. 2011;
JASKULSKI et al. 2013; MONTEIRO et al. 2009; RIZEK et al. 2014 SEKI et al., 2013;).
28
2.5 Métodos de detecção fenotípicos
Diante dessa problemática mundial o diagnóstico clínico e a correta identificação do
perfil de resistência antimicrobina é essencial para auxiliar o tratamento, bem como o manejo
do paciente infectado com bactéria MDR. Sendo assim, é fundamental a realização de testes
fenotípicos a fim de identificar os mecanismos de resistência. Os laboratórios clínicos
encontram suporte para a execução destes métodos nos docuemntos emitidos pelo CLSI, que
padroniza o teste de disco aproximação como forma de avaliar fenotipicamente a presença de
ESBL em P.mirabilis, K.pneumoniae, K.oxytoca e E.coli. Recomenda-se a inicialmente
utilização de cefalosporinas de 3ª geração (ceftazidima, cefotaxima, e ceftriaxona) e
aztreonam. Para fins confirmatórios o documento orienta o uso de ceftazidima ou cefotaxima
isolado e em associação com ácido clavulanico (CLSI, 2014).
Outra técnica para detecção fenotípica de ESBL é a disco aproximação. Nessa técnica
utiliza-se um disco de amoxacilina associado com ácido clavulânico no centro da placa de
petri. Ao redor desse disco, numa distância de dois mm coloca-se três discos de
cefalosporinas de 3ª ou 4ª geração, como por exemplo cefepime, ceftriaxona, ceftazidima e
cefotaxima, e um disco de monobactâmico, como o aztreonam. Após a incubação observa-se
a presença de uma zona de inibição entre os discos testados e a amoxicilina/ácido clavulânico
ou distorção de halos de pelo menos uma cefalosporina ou o monobactâmico. Esse resultado
indica a positividade para o feste fenotípico.
A ANVISA (2013) preconiza como detecção fenotípica de carbapenemase o teste com
ácido fenilborônico e cloxacilina para possíveis KPC e com EDTA para MBLs. Para ambos
testes utiza-se em meio Muller-Hinton um disco de um carbapenemêmico, imipenem ou
meropenem como e sem o aditivo. Após a incubação de 18 a 24 horas compara os halos
formados. Para detecção de KPC, se houver uma diferença de 5mm no halo do disco com
ácido fenilborônico e não tiver alteração no tamanho do halo com a cloxacilina o resultado é
para uma possível KPC. Para MBLs, a leitura é similar, uma vez que o resultado positivo é a
presença de uma diferença de 5mm no halo do disco com o EDTA para o sem aditivo. Para
resultados positivos em ambos os casos, é recomendado a identificação do gene de resistência
por biologia molecular.
Outro teste fenotípico para detecção de carbapenemase é o Teste de Hodge Modificado,
no qual utiliza-se um inóculo de uma cepa de referência, normalmente E.coli ATCC 25922,
que não seja resistente a algum carbapenêmico. Em seguida um disco de carbapenêmico é
inserido no centro da placa e a cepa suspeita é sobreposta com uma estria do centro do disco
29
para a extremidade da placa. Após a incubação de 18 a 24 horas se houver crescimento da
cepa de referência com distorção no halo de inibição o resultado é considerado positivo
(CLSI, 2014).
2.6 Métodos de detecção genotípicos
As técnicas moleculares também são importantes epidemiologicamente, para se
determinar qual enzima é mais prevalente em determinada região. Além disso, há casos em
que um mesmo isolado clínico expressa múltiplas enzimas, sendo necessário a utilização de
técnicas moleculares para detectar quais enzimas estão presentes (PITOUT; LAUPLAND,
2008).
30
3. Justificativa
Luzzaro e colaboradores (2002) avaliaram a prevalência de bactérias Gram-negativas em
bacteremia de 16 hospitais da Itália durante dois anos, no período de 1999 e 2000, e
encontraram os seguintes micro-organismos: E. coli (76%), K. pneumoniae (5.4%), Proteus
mirabilis (4,2%) e Enterobacter spp (3,7%). Na Espanha, um estudo realizado em um hospital
universitário em 2011 detectou que 72% dos isolados de K. pneumoniae eram ESBL
(ALEGRÍA et al. 2011).
Micek e colaboradores (2012) em um estudo realizado em Washinton, EUA, no período
de 2002 a 2006 detecaram 754 pacientes com infecção da corrente sanguínea por bactérias
Gram-negativas. E.coli, K.pneumoniae, Enterobacter spp., P.mirabilis e S.marcecens foram
as espécies de enterobactérias mais frequentes, 30,8%, 23,2%10,1%, 4,9% e 4%
respectivamente. Entretanto, esse estudo não avaliou o perfil de multirresistência dos
patógenos.
No Brasil as infecções da corrente sanguínea também possuem como principais
patógenos as enterobactérias, contudo, os estudos são limitados. Em estudo realizado em São
Paulo no período de 2000 a 2001, essas infecções por bactérias Gram-negativas representaram
34% do total de 150 hemoculturas positivadas. Os micro-organismos mais frequentes foram
K.pneumoniae (23,5%), E.coli (21,6%), Pseudomonas aeruginosa (17,6%) e espécies de
Enterobacter (15,7%) as quais apresentaram fenótipos de resistências aos antimicrobianos
variados, com uma taxa de 23,5% de ESBL e de 17,6% e de AmpC (RIBAS et al, 2007).
Por sua vez, entre 2007 e 2010, um estudo nacional de vigilância, que agregou 16
hospitais, baseado no SCOPE (Vigilância e Controle de Patógenos de Importância
Epidemiológica) brasileiro avaliou que as bacteremias nosocomiais foram causadas
principalmente por bactérias Gram-negativas, representando cerca de 58,5% dos casos,
seguido das Gram-positivas (35,5%). Dentre os patógenos, a K.pneumoniae foi a
enterobactéria mais frequente (13,2%), cujos testes de sensibilidade antimicrobiana
detectaram resistência para diversas classes inclusive carbapenêmicos. Entretanto, não foram
realizados testes moleculares para identificação do gene de resistência envolvido. A taxa de
mortalidade dos pacientes infectados por enterobactérias variou entre 0 a 50% dos casos
dependendo da espécie. As unidades intensivas foram as responsáveis pelas maiores taxas de
isolamento e de mortalidade associada com as bacteremias estudas (MARRA et al. 2011).
Com o aumento do uso de antimicrobianos de amplo espectro associado à presença de
mutações espontâneas e transmissão horizontal de genes, os relatos de desenvolvimento de
31
MDR estão em crescente aumento. No Brasil, a maioria dos dados sobre multi-resistência são
das regiões sul e sudeste, sendo que a Bahia requer de estudos que avaliem o perfil de MDR.
Diante do exposto, podemos afirmar, a perceptível importância da identificação das cepas de
bactérias Gram-negativas causadoras de bacteremia, tanto em ambiente hospitalar quanto na
comunidade, bem como a caracterização molecular e do perfil de resistência à terapia
antibacteriana em Salvador a fim de poder direcionar a terapia antimicrobiana mais
apropriada.
32
4. Objetivos
4.1. Objetivo geral
Caracterizar o perfil de resistência aos antimicrobianos em enterobactérias em casos de
infecções da corrente sanguínea, em um hospital público de Salvador, Bahia.
4.2. Objetivos específicos
a. Determinar a frequência de espécies de enterobactérias implicadas em infecções da
corrente sanguínea.
b. Determinar o perfil de sensibilidade antimicrobiana destes patógenos;
c. Caracterizar os principais mecanismos de resistência antimicrobiana através de
métodos fenotípicos e genotípicos.
33
5. Materiais e Métodos
5.1.Período e tipo do estudo
Estudo prospectivo conduzido no Hospital Ana Nery na cidade de Salvador (HAN),
Bahia no período de Maio de 2013 a Abril de 2014.
5.2.Critério de inclusão
Foram incluídos no estudo indivíduos admitidos no hospital Ana Neri que foram
diagnosticados com ICS causadas por enterobactérias no período de Maio de 2013 a Abril de
2014. Após detecção de hemocultura positiva por bacilos Gram-negativos, os isolados foram
enviadas para o Laboratório de Pesquisa de Microbiologia Clínica (LPMC) da Faculdade de
Farmácia, Universidade Federal da Bahia (UFBA).
5.3.Local de estudo
O estudo foi realizado no HAN na cidade de Salvador, vinculado à Universidade Federal
da Bahia, que presta serviços de média e alta complexidade e cujas especialidades são:
cirurgia vascular, cardiologia e nefrologia. O HAN possui 175 leitos distribuídos entre 6
enfermarias, 4 unidades intensivas, pronto atendimento e nefrologia (Tabela 1). Os dois
últimos são considerados unidades fechadas bem como as demais, uma vez que os pacientes
são internados por meio do sistema de regulação estadual e podem permanecer alguns dias.
5.4. Coleta de dados
Os dados demográficos e clínicos e outras informações necessárias para a realização do
estudo foram coletados retrospectivamente, apesar dos isolados serem prospectivos, através
de revisão de prontuários, utilizando um formulário com abordagens sobre dados gerais do
paciente, sintomas, tratamento, história clínica, internação, fontes e fatores de risco e uso
prévio de antibióticos (Apêndice A, Apêndice B). Contudo, foram coletados apenas os
seguintes dados: idade, tempo e motivo de internamento, e desfecho clínico, devido à
dificuldade de acesso aos prontuários na instituição.
5.5. Procedimentos Microbiológicos
a) Hemoculturas
34
As hemoculturas foram coletadas pelos funcionários do laboratório do Hospital Ana Nery
conforme a solicitação médica. Em seguida foram encaminhados para o setor de
microbiologia do laboratório do hospital onde os frascos Bact-Alert® contendo as amostras
foram incubadas no aparelho com o mesmo nome por até 5 dias.
b) Isolamento das bactérias
Após a sinalização do aparelho para a positividade da amostra, foi realizado um Gram
direto, e, posteriomente, a amostra foi semeada em ágar Mac Conkey e ágar Chocolate,
incubada por 18 a 24 horas em estufa com 5% CO2, no laboratório de análises clínicas do
HAN.
Tabela 1- Características das unidades de internamento e leitos do Hospital Ana Nery na
cidade de Salvador, Bahia.
Unidades
N° de leitos
Unidades intensivas
26
UCO
8
UPC
7
UTI
6
UTI pediátrica
5
Enfermarias
118
Cardiologia
21
Cirurgia cardiológica
23
Cardiopediatria
13
Clínica cirúrgica A
26
Clínica cirúrgica B
18
Clínica Médica
17
Nefrologia
23
Pronto Atendimento
8
Fonte: A autora
c) Identificação de bactérias
Os isolados foram identificados através do aparelho de automação Phoenix BD® no
laboratório de análises clínicas do HAN. Posteriormente, no LPMC as identificações das
espécies E.cloacae, E.aerogenes, Citrobacter freuddi, Morganella morganii, Proteus spp,
Klebsiella spp, Klebsiella oxytoca, Salmonella spp foram confirmadas por testes bioquímicos
através dos cartões de identificação do Vitek 2® no Laboratório de microbiologia do Hospital
35
Universitário Professor Edgard Santos (Hospital das Clínicas/UFBA). Adicionalmente, os
isolados K.pneumoniae, E.coli e Serratia marcecens foram confirmados a partir do perfil de
resistência intrínseca. Em casos de dúvidas esses isolados foram confirmado pelo Vitek 2®.
Para as bactérias, com discordância na identificação, foram considerados os resultados do
Vitek 2® devido à probabilidade de correta identificação ser superior à 90%.
Após a identificação as bactérias foram congeladas em criotubos contendo BHI + 20% de
glicerol em freezer de -80ºC, para análise posterior dos perfis de resistência.
d) Teste de detecção de resistência
·
Preparo das amostras
A partir de uma amostra bacteriana crescida em TSA a 35-37 °C por 16-18 horas,
suspensões bacterianas foram preparadas de acordo com a escala 0,5 de McFarland (~108
UFC/mL) em solução salina estéril. Posteriormente, essas suspensões foram semeadas em
placas contendo meio de Mueller-Hinton (Difco), com o auxílio de swabs estéreis.
· Teste de sensibilidade Antimicrobiana
Foram realizados testes de susceptibilidade aos antimicrobianos pelo método de discodifusão (Kirby-Bauer), segundo as recomendações do CLSI (2014), para os seguintes
antimicrobianos:
ampicilina,
amicacina,
amoxacilina/ácido
clavulânico,
aztreonam,
ceftazidima, cefotaxima, ceftriazona, cefepime, cefoxitina, ciprofloxacino, gentamicina,
ertapenem, imipenem, meropenem, polimixina, tigeciclina e sulfametoxazol/trimetropim
(Tabela 2).
Os discos de papel filtro impregnados com os antimicrobianos Bio-rad® foram aplicados
sobre o meio de cultura. Posteriormente, as placas foram então incubadas a 37 °C por 20-24
horas. Como controles foram utilizadas as cepas E. coli ATCC 25922. Os resultados foram
interpretados segundo o CLSI 2014. Os critérios de interpretação para polimixina e tigeciclina
foram os recomendados pela ANVISA (2013). A partir do perfil observado foram feitos testes
de triagem fenotípicos para detecção de mecanismos de multirresistência (Figura 1).
· Detecção fenotípica da produção de ESBL
A produção de ESBL foi investigada pelo método de disco aproximação. Este teste foi
realizado conforme descrito no CLSI 2014. Após a inoculação bacteriana com auxílio de
swab estéril em ágar Mueller-Hinton, foram adicionados à superfície do meio um disco de
cefotaxima, ceftazidima, aztreonam, ceftriaxona e um disco de amoxacilina/ácido clavulânico
36
no centro da placa, observando uma distância de dois milímetros entre cada disco. As culturas
foram então incubadas a 37 °C por 20-24 horas. A observação de distorção dos halos ou zona
confluência entre os discos foi indicativo da produção de ESBL. Para os micro-organismos
em que a distorção do halo não foi clara, a distância dos discos foi reduzida a para 1,5mm em
relação à amoxacilina/ácido clavulânico, ficando, dessa forma, evidente a presença da zona de
distorção. A cepa de referência utilizada para controle positivo foi a E.coli ST 127.
· Testes com inibidores e potenciadores para detecção de carbapenamses
Para os isolados resistentes à pelo menos um carbapenêmico, foi feita a suspensão
bacteriana e, posteriormente a semeadura de forma uniforme em Ágar Muller Hinton. Discos
de Meropenem, Imipenem e Ertapenem foram inseridos com e sem adição de 10µL de
solução de ácido fenilborônico 40mg/mL Sigma®, 10µL de solução de cloxacilina 75mg/mL
Sigma® e 10µL ml de EDTA 0,1M., de acordo o preconizado pela ANVISA (2013). As
culturas foram então incubadas a 37 °C por 20-24 horas (Figura 2). A interpretação desse teste
permite a identificação de carbapenamses do tipo KPC e MBL ou AmpC plasmidiais.
· Teste fenotípico de detecção da produção de carbapenemases do tipo não MBL
Teste Modificado de Hodge, segundo a CLSI (2014) - Uma suspensão de E.coli ATCC
25922 foi preparada com turvação equivalente a escala 0,5 de McFarland (~108 UFC/mL) em
solução salina estéril. Posteriormente, essa suspensão foi semeada em placas contendo meio
de Mueller-Hinton (Difco), com o auxílio de swabs estéreis. Após a inoculação bacteriana
com auxílio de swab estéril em ágar Mueller-Hinton, foi adicionado à superfície do meio no
centro da placa de petri um disco de ertapenem. Em seguida foram feitas linhas
perpendiculares ao disco com o micro-organimso teste (Figura 3). As placas foram incubadas
a 37 °C por 20-24 horas. Os resultados foram considerados positivos para produção de
carbapenemase, se a presença de reentrância em forma de trevo foi observada no halo do
ertapenem em contato com a amostra teste. Para controle positivo e negativo foram utilizadas
as cepas K.pneumoniae ATCC 1705 e ATCC 1706, respectivamente.
37
Figura 1 - Fluxograma dos testes de detecção de resistência realizados nas enterobactérias isoladas de hemocultura no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um
Hospital de salvador, Bahia.
Bactéria
Suspensão na escala 0,5 Mc Farland
Semeadura em Ágar Muller Hinton e inserção dos discos de antibiótico e realização do teste de
detecção fenotípica de ESBL
Teste de detecção fenotípica para ESBL
positiva ?
Sim
Resistência à algum carbapenêmico?
Não
Teste de detecção fenotípica para
detecção de carbapenemases positivo
Não
PCR multiplex para detecção
genes codificadores de ESBL
Teste fenotípico para
detecção de KPC
Teste de Hodge
modificaado
Teste fenotípico para
detecção de MBL
PCR multiplex para detecção genes codificadores de
carbapenemases e ESBL
38
Tabela 2 - Critérios de interpretação da Disco Difusão para cada antibiótico.
Antibiótico
Concentração
Critério de interpretação da
do disco (µg)
zona de diâmetro (mm)
Sensível
Não sensível
Amicacina
30
≥17
≤16
Ampicilina
10
≥17
≤16
20/10
≥18
≤17
Aztreonam
30
≥21
≤20
Cefepime
30
≥25
≤24
Cefotaxima
30
≥26
≤25
Cefoxitina
30
≥18
≤17
Ceftazidima
30
≥21
≤20
Ceftriaxona
30
≥23
≤22
Ciprofloxacino
5
≥21
≤20
Ertapenem
10
≥22
≤21
Imipenem
10
≥23
≤22
Gentamicina
10
≥15
≤14
Meropenem
10
≥23
≤22
Polimixina1
10
≥12
≤11
25/23,75
≥16
≤15
15
≥18
≤17
Amoxacilina/Ácido
clavulânico
Sulfametoxazol/ trimetropim
Tigeciclina1
1.
Dados utilizados conforme ANVISA (2013).
Fonte: A autora
39
Figura 2: Esquema para aplicação de discos de antimicrobianos para detecção de carbapenemases.
Fonte: Adaptado de ANVISA, 2013.
Figura 3: Teste de Hodge Modificado
E.coli ATCC 25922
Halo de inibição formado pela E.coli ATCC 25922 ao
ter contato pelo carbapenêmico.
Crescimento da E.coli ATCC 25922 após a inativação do
carbapenêmico pela K.pneumoniae ATCC 1705
1.K.pneumoniae ATCC 1705 – Resultado positivo
2. K.pneumoniae ATCC 1706 – Resultado negativo
3. Isolado clínico – Resultado positivo.
Fonte: Adaptado de CLSI, 2014.
· Teste fenotípico de detecção de carbapenemase do tipo Metalo-β-lactamase
A detecção da produção de MBLs foi investigada pelo método de disco-aproximação.
Este teste foi realizado segundo ANVISA, 2013. As suspensões bacterianas foram obtidas
como já descrito anteriormente. Após a inoculação bacteriana com auxílio de swab estéril em
40
ágar Mueller-Hinton, foram adicionados à superfície do meio dois discos de meropenem a
uma distância, de centro a centro dos discos, de 20 mm. A um dos discos foi adicionado 10µL
ml de EDTA 0,1M. A restauração da sensibilidade pelo imipenem com EDTA foi identificada
através da observação de uma diferença de diâmetro do halo de pelo menos 5mm em relação
ao carbapenêmico sem EDTA. A cepa utilizada como controle positivo foi E.cloacae CCBH
10892 a qual possui o gene NDM-1 e para controle negativo a K.pneumoniae ATCC 1705
· Testes genotípicos para detecção de genes de resistência
Seleção de amostras
Todas as amostras que apresentaram resultados positivos nos testes fenotípicos de
identificação de resistência foram submetidas ao teste de PCR multiplex, segundo DALENE,
(2010) para identificação dos genes codificadores de ESBL: TEM (TEM-1 e TEM-2 e
variantes), SHV (variantes SHV, incluindo SHV-1) OXA-1-like (variantes OXA-1, OXA-4 e
OXA-30) e CTX-M (grupo 1, grupo 2 e grupo 9); e carbapenemases: KPC, VIM e IMP
Extração do DNA:
As bactérias identificadas como produtoras de ESBL e as resistentes a pelo menos um
carbapenêmico foram subcultivadas em TSA e incubadas durante 16 – 18h, à 35 – 37ºC.
Posteriormente, foi realizada uma suspensão de cinco colônias em 100 µL de água miliQ
estéril em eppendorf de 1,5mL. Incubou-se em banho-maria a 95ºC por 10 minutos e
centrifugou a 12000 rpm por dois minutos. Em seguida o sobrenadante foi transferido para
outro eppendorf de 1,5mL e armazenado à -20ºC.
PCR Multiplex para detecção de genes que codificam ESBL e carbapenemases
Um total de 3 reações de PCR multiplex foram realizadas, duas para detecção de genes de
resistência codificadores de ESBL (Tabela 3) e uma para carbapenemase, segundo a descrição
de (DALLENE et al, 2010).
Para cada PCR multiplex foi preparado uma mistura de 25 µL contendo 12,5 µL de
GoTaq Colorless Master Mix®, Promega, 2 µL de DNA da amostra teste, uma concentração
variável de primers (Tabela 3) e água para PCR q.s.p. As reações para ESBL foram
executadas no termociclador Mastercycler gradient®, Eppendorf, sob as seguintes condições:
desnaturação inicial 94ºC por 10 minutos; 30 ciclos de 94ºC por 40 segundos, 60ºC por 40
41
segundos e 72ºC por 1 min; e extensão final à 72ºC por 7 minutos. Para as carbapenemases, a
temperatura de amplificação foi de 55ºC e utilizou-se o terminociclador MyCyler®, Bio-rad.
Para todas as reações cepas de referência foram empregadas como controle positivo (Tabela
4) exceto para OXA-1-like e variantes e CTX-M grupo 9.
a) Eletroforese em gel
Para a visualização e intrepretação dos perfis genotípicos os produtos da amplificação
foram submetidos a uma eletrofose em gel de de agarose 1,5% (Fisher) em TBE 1x, à 100V e
100A por 1 hora e 30 minutos. Foram utilizados 10 µL de cada amostra com adição de 2 µL
de tampão de corrida (New England Biolabs). O marcador de peso molecular de 100kb
(Tridye®, New England Biolabs) foi adicionado no primeiro e último poço de cada gel.
Posteriormente o gel foi corado em solução contendo brometo de etídio 0,5µg/mL por 30
minutos e descorado em água por 30 minutos. A visulaização dos fragmentos amplificados e a
captura de imagem em formato (.tif) foi realizada no fotodocumentador L-Pix EX.
5.6. Análise Estatística
A associação entre o perfil de resistência, a cepa e o desfecho clínico foi realizada através
do teste estatístico de qui-quadrado, sendo os valores de p>0,05 considerados estatisticamente
significantes. O armazenamento e a análise de dados foram feitos no programa Epi-Info
versão 3.5.1. A identificação dos genes de resistência antimicrobiana foi estratificada de
acordo com a espécie bacteriana isolada.
5.7 Limitações
Acesso aos prontuários: a dificuldade de acessar os dados dos pacientes com ICS por
enterobactérias impossibilitou verificar associações da infecção com fatores e fontes de risco,
utilizações prévia e profiláticas de antimicrobianos e histórico de infecções anteriores.
42
Tabela 3 - Caracterização dos pares de primers e concentração na reação da PCR multiplex para detecção dos genes codificadores de ESBL e carbapenemases.
Gene
Primer
Sequência
[]
pmol/µL
Amplicon
(bp)
800
MULTIPLEX I – genes codificadores de ESBL
TEM – variantes TEM-1 e TEM-2 e
variantes
SHV – variantes SHV, incluindo SHV-1
OXA-1-like – OXA-1, OXA-4 e OXA-30
MultiTSO-T_for
CATTTCCGTGTCGCCCTTATTC
0,4
MultiTSO-T_rev
CGTTCATCCATAGTTGCCTGAC
0,4
MultiTSO-S_for
AGCCGCTTGAGCAAATTAAAC
0,4
MultiTSO-S_rev
ATCCCGCAGATAAATCACCAC
0,4
MultiTSO-O_for
GGCACCGATTCAACTTTCAAG
0,4
MultiTSO-O_rev
GACCCCAAGTTTCCTGTAAGTG
0,4
713
564
MULTIPLEX II – genes codificadores de ESBL do tipo CTX-M
Grupo 1 – incluindo variantes CTX-M-1, MultiCTXMGp1_for
CTX-M-3 e CTX-M-15
MultiCTXMGp1-2_rev
Grupo 2 – incluindo CTX-M-2
Fonte: A autora
TTAGGAARTGTGCCGCTGYA*
0,4
CGATATCGTTGGTGGTRCCAT*
0,2
MultiCTXMGp2_for
CGTTAACGGCACGATGAC
0,2
MultiCTXMGp1-2_rev
CGATATCGTTGGTGGTRCCAT*
0,2
688
404
43
Continuação Tabela 3: Caracterização dos pares de primers e concentração na reação da PCR multiplex para detecção dos genes TEM, SHV e OXA-1-like. E variantes
codificadores de ESBL
Grupo 9
MultiCTXMGp9_for
TCA AGC TGC CAT CGG T
0,4
MultiCTXMGp9_rev
TGA TTC TCG CCG CTG AAG
0,4
561
MULTIPLEX III – genes codificadores de carbapenemases.
Variantes IMP, exceto: IMP-9, IMP-16,
IMP-18, IMP-22 e IMP-25
Variantes VIM, incluindo VIM-1 e
VIM-2
* Y=T ou C; R=A ou G, D=A ou G ou T; Y=T ou C.
Fonte: A autora
MultiIMP_for
TTGACACTCCATTTACDG*
0,5
MultiIMP_rev
GATYGAGAATTAAGCCACYCT*
0,5
MultiVIM_for
GATGGTGTTTGGTCGCATA
0,5
MultiVIM_rev
CGAATGCGCAGCACCAG
0,5
139
390
44
Tabela 4 - Cepas controle e os respectivos genes de resistências utilizados nas PCR multiplex
Cepas controle para PCR multiplex
Genes codificadores
E.coli ST 127
TEM-1 e CTX-M-2
E.coli ST 998
CTX-M-15
K.pneumoniae ATCC 1705
KPC
K.pneumoniae ATCC 700603
SHV-18
P.fluorescens CCBH 11805
VIM
K.pneumoniae Derivada BR-01
IMP
Fonte: A autora.
45
6. Resultados
6.1 Resultados gerais
No período de maio de 2013 a abril de 2014 foram realizadas 2417 hemoculturas no
HAN, das quais 491 foram positivas para algum patógeno. Destas 268 foram bactérias Grampositivas, 205 Gram-negativas e as demais foram leveduras. Os patógenos mais frequentes
foram: os SCN (38,8%), K.pneumoniae (8,5%), S.aureus (8,5%) e P.aeruginosa (6,2%).
Do total das hemoculturas positivas para bactérias Gram-negativas, 138 foram
enterobactérias, das quais foram possíveis avaliar neste estudo 117 (84,7%) uma vez que
algumas bactérias perderam a viabilidade durante o processo de transporte. Um total de 41,
35% do total de isolados tiveram a identificação confirmada pelo sistema VITEK 2®, destas
12 (28,6%) foram distintas da identificação realizada pelo Phoenix BD® (Tabela 5).
Tabela 5 - Espécies de enterobactérias identificadas em corrente sanguínea no período de maio de 2013 a abril
de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia, de acordo com o sistema automatizado de
identificação.
BD Phoenix ®
Espécie
E.cloacae
Enterobacter spp.
C.freudii
E.aerogenes
K.oxytoca
Klebsiella spp.
Morganella morganii
Proteus peneri
Proteus vulgaris
Proteus spp.
S.liquefaciens
Salmonella spp.
TOTAL
Fonte: A autora
Vitek 2
N
Espécie
18 E.cloacae
E.coli
1 E.cloacae
3 C.freudii
E.cloacae
M.morganii
4 E.aerogenes
K.pneumoniae
3 K.oxytoca
C.freudii
1 K.pneumoniae
1 M.morganii
1 P.mirabilis
2 P.peneri
M.morganii
1 Proteus vulgaris
3 K.pneumoniae
E.cloacae
3 Salmonella enterica
41
N
17
1
1
1
1
1
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
2
1
3
41
46
Das 117 enterobatérias identificadas, as espécies mais frequentes foram: K.pneumoniae e
E.cloacae, correspondendo a 33,3% e 19,7% dos casos, respectivamente (Tabela 6). Desse
total, 14 (12%) foram provenientes de pacientes cujo período de internamento foi inferior a 72
horas, sendo caracterizadas como infecções adquiridas na comunidade ou associadas a outros
serviços de saúde. Os patógenos neste tipo de infecção foram: 42,8% E.coli (n=6) , 35,7 %
K.pneumoniae (n=5) e 7% S.marcecens, P.mirabilis e Salmonella entérica (n= 1 para cada
espécie). Dentre as 103 enterobactérias causadoras de ICS após as 72 horas de internamento,
as espécies identificadas foram: K.pneumoniae 31% (n=32), E.cloacae 21,4% (n=22),
S.marcecens 18,4% (n=19), E.coli 6,8% (n=7) e um total de 20 isolados foram de outras
espécies.
Tabela 6 - Frequência de enterobactérias isolaem hemoculturas no período de maio de 2013 a abril de 2014
em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
Espécie
K.pneumoniae
E.cloacae
S.marcecens
E.coli
Outras*
Total
Total (n)
39
22
19
13
22
117
Frequência (%)
33,3
19,7
17,1
11,1
18,8
100
*P.mirabilis (n=8), Proteus peneri (n=1), Salmonella enterica (n=3), C.freuudii (n=2), E.aerogenes
(n=2), K.oxytoca (n=2) e M.morganii (n=4).
Fonte: A autora
6.2 Características do paciente
As enterobactérias foram provenientes de 110 pacientes distintos, assim, 7 casos de
infecções da corrente sanguínea ocorreram em pacientes reincidentes. O sexo mais frequente
foi o masculino, representando 54,5% dos pacientes. A faixa etária com maior número de
casos foi entre os maiores de 60 anos e entre 31 a 60 anos, correspondendo a 44,% e 38,2%,
respectivamente A mediana do período de internamento foi de 38 dias, sendo o tempo mínimo
2 dias e máximo 206, entretanto, cinco casos não foram possíveis de analisar o prontuário
para saber o tempo de hospitalização (Tabela 7).
Nesse estudo foram identificados dois casos de infecções poli-microbiana por Gramnegativos. Ambos ocorreram em crianças menores de um ano, internadas na UTI pediátrica,
sendo identificadas K.oxytoca e P.aeruginosa como patógenos do primeiro caso e E.cloacae e
P.aeruginosa no segundo. Ao relacionar o número de isolados por unidade de internamento
47
verificou-se que a maioria dos casos foram oriundo de pacientes internados em unidades
intensivas, das quais a
Unidade Coronariana foi o setor que com maior número
de
hemoculturas positivas para os patógenos estudados. As unidades intensivas juntas
apresentaram 46% do total de hemoculturas positivas para enterobactérias. A K.pneumoniae
foi a espécie mais frequente, representando 37% dos casos (Gráfico 1).
Tabela 7 - Características dos pacientes com infecção da corrente sanguínea por enterobactérias no período
de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvados, Bahia.
Nº de
Características
pacientes
Sexo
Feminino
Masculino
Faixa etária (anos)
<2
2 a 15
16 a 30
31 a 60
>60
Motivos de internamento
Cardiopatias e suas complicações
Nefropatias
Angiopatias e suas complicações
Outras*
Não especificado
*Foram consideradas: doenças
Leishimaniose visceral e infecções.
Frequência (%)
110
50
60
110
10
3
45,5
54,5
9,1
2,7
6
42
49
110
59
23
9
18
1
gastrointestinais,
doenças do
5,4
38,2
44,6
53,6
20,9
8,2
16,4
0,9
trato
respiratório,
neoplasias,
Fonte: A autora.
Através da avaliação dos prontuários dos pacientes foi possível identificar que sete
pacientes tiveram bacteremias por enterobacterias em dois momentos distintos e um paciente
teve três episódios de bacteremia no período do estudo. Nesses casos os micro-organismos
mais frequentes foram S. marcecens (n= 8) e K. pneumoniae e E.cloacae, ambas com três
isolados (17,6%). Desse total 76% (13 infecções) ocorreram em unidades intensivas.
48
Gráfico 1: Frequência de enterobactérias isoladas em hemoculturas por unidade de internamento no período de
Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
Fonte: A autora
6.3 Resultados fenotípicos
Ao analisar o perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos, 83% dos isolados
apresentaram resistencia a ampilicina, uma vez que muitas espécies de enterobactérias
possuem resistência intrínseca a tal antibiótico. Do total de patógenos estudados 44 (37,6%)
foram positivos no teste de deteção fenotípica para ESBL, ou seja, resistentes às
cefalosporinas de 3ª geração e 4ª geração e ao aztreonam (Figura 4)
Um total de três isolados (K.pneumoniae ) foram resistentes ao imipenem, meropenem e
ertapenem. Os patógenos resistentes aos carbapenêmicos não apresentaram distorção do halo
ou zona de confluência no teste de fenotípico para ESBL, sendo resistentes, inclusive, para
amoxacilina/ácido clavulânico (Figura 5). Este perfil de resistência foi verificado em todas as
unidades de internamento, sendo que as intensivas abrigaram a maior parte dos casos, 56,8%,
das quais a UTI cirúrgica e UCO tiveram 18% de todos os isolados de ESBL, isso demonstra
que a distribuição de bactérias ocorre praticamente de maneira uniforme no hospital.
49
Figura 4 - Teste de fenotípico para detecção de ESBL em Klebsiella pneumoniae.
A
B
A: Teste com 2mm de distância em relação ao Amoxacilina/Ácido clavulânico.
B: Teste com 1,5mm de distância em relação à Amoxacilina/Ácido Clavulânico
No centro de ambas um disco de Amoxacilina/Ácido Clavulânico e nas extremidades cefotaxima,
ceftazidima, aztreonam, ceftriaxona
Fonte: a Autora.
Figura 5 - Teste fenotípico de detecção de ESBL em Klebsiella pneumoniae resistente à todos
antimicrobianos testados
Fonte: A autora.
O teste fenotípico de Hodge foi realizado para todos as 44 enterobactérias que foram
positivas no teste de detecção de ESBL, incluindo as resistentes aos carbapenêmicos. Dessas,
apenas uma (K. pneumoniae) foi positivo no no teste fenotípico de detecção de
carbapenemases com o ácido fenilborônico e teste modificado de Hodge (Figura 6 e Figura 7).
50
Todas as outras bactérias resistentes aos carbapenêmicos foram negativas para o teste
fenotípico de detecção de MBL e para o teste de detecção de AmpC plasmidial.
51
K.pneumoniae
E.cloacae
S.marcecens
E.coli
P.mirabilis
Outros*
Total
39
22
19
17
6
14
117
S
82
77
90
100
100
86
86
NS
18
23
10
14
14
S
5
5
5
23
33
28
12
NS
95
95
95
77
67
72
88
S
69
100
90
90
100
93
87
NS
31
10
7
13
S
36
59
85
82
83
79
62
NS
64
41
15
3
17
21
38
S
36
59
85
82
83
79
62
NS
64
41
15
18
17
21
38
S
36
59
85
82
83
79
62
S: Sensível
NS: Não sensível. Considerado os isolados resistentes ou intermediário aos antimicrobianos testados.
* P.peneri (n=1), S.enterica (n=3), C.freuudii (n=2), E.aerogenes (n=2), K.oxytoca (n=2) e M.morganii (n=4).
** Um isolado de M.morganii foi sensível dose dependente.
*** Espécies com resistência intrínseca ao antibiótico testado.
Fonte: A autora
NS
64
41
15
18
17
21
38
S
36
59
85
81
83
79
62
Ciprofloxacino
(%)
Cefepime (%)
Cefotaxima (%)
Ceftriaxona (%)
Ceftazidima (%)
Aztreonam (%)
Amicacina (%)
n
Ampicilina (%)
Espécie
Amoxacilina/
clavulonato (%)
Tabela 8 - Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos por espécies de enterobactérias causadoras de infecções da corrente sanguínea no período de Maio de 2013 a
Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
NS
64
41
15
18
17
21
38
S
36
64
85
88
83
86
62
R
64
6
15
22
17
14
38
S
44
64
85
65
83
57
60
NS
56
6
15
35
17
43
40
52
K.pneumoniae
E.cloacae
S.marcecens
E.coli
P.mirabilis
Outros*
Total
39
22
19
17
6
14
117
S
92
100
100
100
100
100
97
NS
8
3
S
92
100
100
100
100
100
97
NS
8
3
S
92
100
100
100
100
100
97
NS
8
3
S
61
64
84
88
50
43
67
NS
39
36
16
12
50
47
33
S
NS
S
NS
82
18
100
14 86*** 100
84 16*** - 100***
94
6
100
100
- 100***
71 29*** 71 29***
71
29
76
34
S: Sensível
NS: Não sensível. Considerado os isolados resistentes ou intermediário aos antimicrobianos testados.
* P.peneri (n=1), S.enterica (n=3), C.freuudii (n=2), E.aerogenes (n=2), K.oxytoca (n=2) e M.morganii (n=4).
** Um isolado de M.morganii foi sensível dose dependente.
*** Espécies com resistência intrínseca ao antibiótico testado.
Fonte: A autora.
S
98
91
100
100
100
100
97
NS
2
9
3
S NS
47 53
68 32
84 16
64 36
33 67
64 36
61 39
ESBL + (%)
Sulfametoxazol/
trimetropim (%)
Tigeciclina (%)
Colistina (%)
Cefoxitna (%)
Gentamicina (%)
Imipnem (%)
n
Ertapenem (%)
Espécie
Meropenem (%)
Continuação Tabela 8 - Perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos por espécies de enterobactérias causadoras de infecções da corrente sanguínea no período de
Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
64
41
16
16
17
21
38
53
Figura 6 - Teste de triagem fenotípica para KPC em Klebsiella pneumoniae.
A: Disco de Meropenem sem aditivo
B: Disco de Meropenem com ácido fenilborônico
C: Disco de Meropenem com cloxacilina.
Fonte: A autora.
Figura 7 - Teste de Hodge com isolados de Klebsiella pneumoniae
A
B
A: Teste de Hodge Modificado positivo
B: Teste de Hodge Modificado negativo
Fonte: A autora.
6.4 Resultados genotípicos
Para as 44 enterobactérias que apresentaram perfil fenotípico positivo para ESBL foram
realizadas três reações distintas de PCR multiplex, afim de detectar os principais genes
envolvidos nos mecanismos de resistência bem como a presença de genes que codificam
carbapenemases (Figura 8, Figura 9, Figura 10). Dessas, apenas dois isolados, um
K.pneumoniae e um E.cloacae foram negativos para todos os genes pesquisados. Das 42
54
enterobactérias remanescentes 71,4% apresentaram genes OXA, 64,3% CTX-M-1, 50% SHV,
45% TEM, 21,4%CTX-M-2 e 2,4% CTX-M-9.
Os genes que codificam carbapenemases, por sua vez, só foram identificados em três
isolados de K. pneumoniae, sendo identificado o gene IMP e em um caso o gene KPC.
Entretanto, apenas o micro-orgnamismo que continha o gene KPC demonstrou resistência a
pelo menos um carbapenmêmico e positividade para o teste fenotípico com ácido
fenilborônico e Teste de Hodge Modificado.
Figura 8 - Gel de agarose 1,5% dos produtos de amplificação de PCR Multiplex para detecção dos genes
OXA, SHV e TEM em enterobactérias causadoras de infecção da corrente sanguínea no período de Maio de
2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13
14 15
Produtos de PCR
correspondentes ao gene
TEM
1000kb
900kb
800kb
700kb
600kb
500kb
400kb
Produtos de PCR
correspondentes ao gene
SHV
300kb
Produtos de PCR
correspondentes ao gene
OXA-1-like e variantes
200kb
100kb
Poços 1 e 16: marcador de100kp.
Poço 2: E.coli 300 – controle positivo para TEM (800kb).
Poço 3: K.pneumoniae ATCC 700603 – controle positivo para SHV (713kb).
Poços 4 a 13: Amostras positivas no teste fenotípico de detecção de ESBL.
Poços 14 e 15: Controles negativos da extração e da PCR, respectivamente.
Não houve controle positivo para o OXA-1-like (564kb).
Fonte: A autora.
16
55
Figura 9 - Gel de agarose 1,5% de produtos de amplificação de PCR Multiplex para detecção dos genes
CTX-M grupo 1, grupo 2 e grupo 9 em enterobactérias causadoras de infecção da corrente sanguínea no período
de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
11
12 13
14 15
Produtos de PCR
correspondentes ao gene
CTX-M grupo 1
1000kb
900kb 800kb
700kb
600kb
500kb
400kb
300kb
Produtos de PCR
correspondentes ao gene
CTX-M grupo 2
200kb
100kb
Poços 1 e 15: Marcador de 100kb.
Poço 2: E.coli 300 - controle positivo CTX-M grupo 2 (404kb).
Poço 3: E.coli 455: controle positivo CTM-M grupo 1 (688kb).
Poços 4 a 12: Amostras positivas no teste fenotípico de detecção de ESBL.
Poços 13 e 14: controles negativos da extração e da PCR, respectivamente.
Fonte: A autora.
Ao avaliar a presença de mais de um gene em um mesmo patógeno a combinação SHV,
OXA e, CTX-M-1 foi a mais frequente, sendo 13,6 % (8 de 44) isolados de K.pneumoniae e
2,2% (1 de 44) de S.marcecens. Do total de 44 micro-organimos apenas 6 apresentaram um
único gene de resistência, sendo o OXA o mais comum, representando 33,3% desses casos
(Tabela 9)
Do total das amostras analisadas os genes de resistência (ESBL e/ou carbapenemases)
foram identificados em 42 isolados. A origem dos pacientes com infecção por estes isolados
foi: 18,1% provenientes da UTI cirúrgica e da UCO, 15,9% da UTI geral, 11,3% do Pronto
atendimento, 4,5% da UTI pediátrica e as demais das enfermarias, exceto da nefrologia, a
qual não obteve nenhum caso (Tabela 9).
56
Figura 10 - Gel de agarose 1,5% de produtos de amplificação de PCR Multiplex para detecção dos genes
IMP, KPC e VIM em enterobactérias causadoras de infecção da corrente sanguínea no período de Maio de 2013
a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17
1000kb
Produtos de PCR
correspondentes ao gene
KPC
Produtos de PCR
correspondentes ao gene
VIM
900kb
700kb
Produtos de PCR
correspondentes ao gene
IMP
800kb
600kb
500kb
400kb
300kb
200kb
100kb
O primeiro poço e o 17 representam o marcador de 100kb.
Poço 2: P.fluorescens CCBH 11805 – controle positivo para VIM (390bp).
Poço 3: K.pneumoniae ATCC 1705 – controle positivo para KPC (530bp).
Poço 4: K.pneumoniae Derivada BR-01 - controle para IMP (139bp).
Poços 5 ao 14: amostras do Hospital Ana Nery que deram positivas para o teste fenotípico de ESBL mas
negativa aos genes analisados nessa reação. A amostra do poço 6 foi a única positiva no Teste Modificado
de Hodge e com o ácido fenilborônico.
Poços 15 e 16: controles negativo da extração de DNA e da PCR, respectivamente.
Fonte: A autora
Os isolados que continham genes codificadores de carbapenemases (IMP, KPC) foram
isolados de pacientes distintos, admitidos para tratamento de cardiopatias. Os isolados que
continham o gene IMP foram identificados em uma criança menor de 2 anos, com período de
internamento na UTI pediatrica de 47 dias, e o outro de uma idosa de 68 anos, internada por
38 dias na UCO, sem histórico de infecção da corrente sanguínea no período estudado e que
foi a óbito após dois dias após a realização da hemocultura. Por sua vez, o portador da
enterobactéria produtora de carbapenemase do tipo KPC foi identificada de um homem de 39
anos, internado por 57 dias com histórico de dois episódios de infecções na corrente
sanguinea anterior ao período do estudo, sendo um por P.aeruginosa e outro por
K.pneumoniae não produtora de carbapenamase com um desfecho clínico de melhora.
Ao se avaliar o desfecho clínico, 32,7% dos pacientes (36/110) com infecções da corrente
sanguínea por enterobactérias foram à óbito em um período de até 30 dias após a infecção
57
(Tabela 10). Desses, 44,4% foram por K.pneumoniae, 19,4% E.coli, 11,1% S.marcecens,
8,3% E.cloacaee 16,7% outras espécies. Enterobactérias produtoras de ESBL foram
identificadas em 36,1% dos pacientes que foram a óbito. A combinação dos genes SHV,
OXA, CTX-M-1 foi a única identificada em 2 casos que foram a óbito. Dos três pacientes que
tinham infecção por enterobactérias positivas para os genes que codificam resistência aos
carbapenêmicos, apenas um foi à óbito (Tabela 11). As unidades intensivas, juntas, abrigaram
61% do número de óbitos, sendo a UTI adulta a mais frequente, com 45,4%. Ao analisar os
casos de óbitos entre as unidades de internamento foi verificado uma relação de dependência
com unidades intensivas, cujo p-valor foi <0,05. Entretanto, o mesmo resultado não
encontrado entre os óbitos e os perfis de multirresistência analisado no estudo.
58
Tabela 9: Caracterização dos pares de primers e concentração na reação da PCR multiplex para detecção dos genes TEM, SHV e OXA-1-like. E variantes codificadores de
ESBL.
IMP
IMP
KPC
-
Pronto atendimento
Laboratório
Cardiopediatria
Cardiologia
Cardiologia cirúrgica
TEM
OXA, CTX-M-2
SHV, CTX-M-1
CTX-M-1
SHV, OXA, CTX-M-1
SHV, OXA, CTX-M-2
SHV, OXA, CTX-M-1, CTX-M-2
SHV, OXA, TEM, CTX-M-1
SHV, OXA, TEM, CTX-M-1, CTX-M-2
TEM, OXA
TEM, SHV, CTX-M-1
TEM
TEM,SHV
-
Clínica cirúrgica
1
1
1
1
9
1
1
3
3
1
1
1
1
1
Clínica médica
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
K.pneumoniae
Genes
carbapenemases
Unidade coronariana
Genes ESBL
UTI cirúrgica
N
UTI pediátrica
Espécie
UTI geral
Unidade de Internamento
1
1
1
1
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
59
Continuação Tabela 9: Caracterização dos pares de primers e concentração na reação da PCR multiplex para detecção dos genes TEM, SHV e OXA-1-like. E
variantes codificadores de ESBL
E.cloacae
E.cloacae
E.cloacae
E.cloacae
E.coli
E.coli
E.coli
S.marcecens
S.marcecens
S.marcecens
P.mirabilis
P.mirabilis
C.freudii
M.morganii
K.oxytoca
TOTAL
Fonte: A autora
1
2
4
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
44
OXA
OXA, CTX-M-1
TEM, OXA, CTX-M-1
CTX-M-9
CTX-M-2
OXA
SHV, OXA, CTX-M-1
TEM, CTX-M-2
TEM, SHV, CTX-M-2
OXA, CTX-M-1
TEM, OXA
TEM, OXA, CTX-M-1
-
Pronto atendimento
Laboratório
Cardiopediatria
Cardiologia
Cardiologia cirúrgica
Clínica cirúrgica
Clínica médica
Genes
carbapenemases
Unidade coronariana
Genes ESBL
UTI cirúrgica
N
UTI pediátrica
Espécie
UTI geral
Unidade de Internamento
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
7
2
8
8
2
1
4
2
1
3
2
3
60
Tabela 10: Frequência de óbitos por espécie de enterobactérias causadoras de infecção da corrente sanguínea no
período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
Nº de óbitos (n)
K.pneumoniae
E.coli
S.marcecens
E.cloacae
Outros*
Total
16
7
4
3
6
33
Nº de óbitos
(%)
44,4
19,4
11,1
8,3
16,7
*P.mirabilis (n=3), E.aerogenes (n=1) e M.morganii (n=1)
Fonte: A autora.
Tabela 11 - Frequência de óbitos por genes identificados em enterobactérias causadoras de infecção da
corrente sanguínea no período de Maio de 2013 a Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador,
Bahia.
Genes
TEM
OXA
CTX-M-9
SHV, OXA, CTX-M-1
SHV, OXA, CTX-M-1 e CTX-M-2
SHV, OXA, TEM, CTX-M-1
SHV, OXA, TEM, CTX-M-1 e CTX-M-2
TEM, OXA, CTX-M-1
TEM, OXA, IMP
TEM, SHV, CTX-M-2
Negativo
Total
Fonte: A autora.
Nº de
óbitos
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
2
13
61
7. Discussão
Atualmente a emergência de bactérias multirresistentes é um problema mundial, o qual
atinge tanto os
países desenvolvido quanto
os
subdesenvolvidos
e emergentes
(LAXMINARAYAN et al., 2013). No Brasil, não obstante dos demais países, tal
problemática é motivo de preocupação na saúde, apesar dos estudos se concentrarem
principalmente nas regiões sul e sudeste. Nesse estudo foi identificado que as principais
bactérias causadoras de ICS foram SCN, S.aureus, P.aeruginosa e K.pneumoniae, sendo esta
a enterobactéria mais frequente, seguida da E.cloacae, S.marcecens e E.coli. Estes resultados
se assemelham aos relatados em outras partes do mundo e no próprio país há alguns anos
(DANTAS, 2011; GIROMETTI et al., 2014; MOEHRING, ANDERSON, 2014; RIBAS et al.
2007;).
Semelhante ao estudo realizado por Dantas (2011), ocorreu pouca variação entre os casos
de ICS por enterobactérias em unidades intensivas e os demais setores do hospital. Entretanto,
ao correlacionar com os casos de multiresistência, as 3 UTIs juntas abrigaram 56,8% dos
isolados produtores de β-lactamase de espectro estendido. As unidades intensivas são setores
críticos nos quais os pacientes são mais debilitados e possuem quadros clínicos mais
complicados e, consequentemente, são imunosuprimidos. Assim, devido a quantidade de
unidades intensivas no HAN o número de enterobactérias multiresistentes superior, apesar de
distinto dos estudos anteriores realizados no Brasil, condiz com o esperado uma vez que os
aqueles ocorreram em instituições com apenas uma unidade intensiva (DANTAS, 2011;
FERNANDES et al., 2011).
Nesse estudo 44 (34%) isolados foram resistentes aos β-lactâmicos de espectro estendido,
sendo a K.pneumoniae a mais incidente, totalizando 56,8% dos casos. Em 2014 na Itália,
Falcone e colaboradores (2014) observaram 253 episódios de ICS causadas por
enterobactérias, das quais 31,1% foram positivas no teste fenotípico para ESBL. Dessas
64,9% foram E.coli, 27,6% foram K.pneumoniae, 4,2% foram P.mirabilis e 3,1%
Enterobacter spp. Recentemente, Abdallah e colaboradores (2015) verificaram que a
frequência de espécies de enterobactérias produtoras de β-lactamase de espectro estendido foi:
54,5% (30/55) E . coli , 66,66% (10/15) K.pneumoniae , 35,71% (5/14) Enterobacter spp, e
um isolado de M.morganii. No Brasil, um estudo semelhante realizado por Ribas e
colaboradores em 2007 detectou que as enterobactérias causadoras de infecções da corrente
sanguínea ESBL positivas representaram 23,5% dos isolados, das quais 41,7% foram
K.pneumoniae. De forma semelhante, estudos posteriores realizados no mundo e no Brasil
62
registraram a K.pneumoniae foi a espécie que mais apresentou tal mecanismo (DANTAS,
2011; FERNANDES et al, 2011; GIROMETTI et al., 2014).
A super-expressão de genes de resistência bem como a presença simultânea de
mecanismos de resistência não enzimáticos, tais como alteração dos canais de porina e
produção de bombas de efluxo podem estar presentes em enterobactérias ESBL positivas,
dificultando a identificação deste perfil, dificultam a detecção fenotípica deste perfil de
multirestência em muitos casos. Tal problemática pode justificar a presença de quatro isolados
de K.pneumoniae resistentes à amoxacilina/ácido clavulânico, além das cefalosporinas de 3ª
geração utilizados e aztreonam. Entre esses isolados ESBL positivos as taxas de resistência ao
ciprofloxacino e gentamicina foi alta, fenômeno este descrito tanto na literatura estrangeira
bem como na nacional, impondo restrição sobre as opção terapêuticas para o tratamento
dessas infecções (LAXMINARAYAN et al., 2013; SEKI et al, 2013).
A análise molecular para os principais genes de resistência codificadores de ESBL mais
frequentes foram OXA, CTX-M-1 e SHV, respectivamente presentes em 31 (70%), 29 (65%)
e 22 (50%) patógenos do total de 44 isolados pesquisados. Como citado anteriormente é
comum a identificação de mais de um gene de resistência para codificar ESBL
(CASTANHEIRA et al, 2013; SEKI, et al, 2013). Dos 44 isolados que foram realizados a
biologia molecular 34 apresentaram mais de 1 gene codificador de ESBL.
De uma forma geral, mudanças na frequência dos principais genes codificadores de
ESBL é perceptível no Brasil e no mundo. Apesar de não existirem estudos que correlacionam
a frequência de genes OXA em enterobactérias causadoras de ICS para poder equiparar com
nossos achados, os genes OXA-1 e variantes são identificados em isolados clínicos de
diversos sítios, principalmente associado à outros genes que codificam β-lactamase de
espectro estendido, tal como CTX-M grupo1 (POIREL et al., 2010).
Em Portugal, uma pesquisa que caracterizou os genes que codificam ESBL em
enterobactérias causadoras de infecções em ambiente hospitalar detectou que o tipo CTX-M
foi o mais frequente (47%) seguido do SHV e TEM, ambos identificados em 22% dos
isolados (GONÇALVES, 2010). Posteriormente na Itália foi identificado que 47,7% das
enterobactérias causadoras ICS com fenótipo ESBL positivas apresentaram gene CTX-M,
37.5% foram positivas para TEM e 15.2% para SHV (FALCONE et al., 2014). Diferentes
genes do grupo CTX-M têm sido reportados no mundo, inclusive no Brasil devido ao uso
prévio de cefalosporinas. No nosso estudo esses genes foram mais frequentes do que os genes
SHV e TEM, dado este semelhante ao encontrado por Marra e colaboradores (2011), cuja
63
frequência de genes CTX-M em K.pneumoniae causadoras de ICS foi de 91,4%, TEM 89,3%
e SHV 72,3%.
Ao relacionar os genes CTX-M e suas variantes identificados nesse estudo observou-se
uma similaridade em outras partes do mundo, inclusive no Brasil. O gene CTX-M grupo 1,
que inclui a variante CTX-M-15 é o mais frequente no mundo e no Brasil em isolados clínicos
de enterobactérias (ZHAO; HU, 2013). Castanheira e colaboradores (2013), detectaram os
principais genes codificadores de β-lactamase de espectro estendido em isolados de
enterobactérias causadoras de infecção da corrente sanguínea em 26 hospitais norteamericanos. De um total de 175 espécimes clínicas 43,6% carreavam os genes CTX-M, dos
quais 33,8% foi do tipo CTX-M-15, sendo mais comum em E.coli e K.pneumoniae,
respectivamente. Em 2013, no Rio de Janeiro, 91% das enterobactérias produtoras de ESBL
causadoras de ICS apresentaram gene CTX-M, dos quais 49% foram K.pneumoniae, 42%
E.cloacae e 15% E.coli. Neste estudo não foi possível distinguir qual a variante do CTX-M
grupo mais frequente nos isolados, estudos posteriores devem ser realizados a fim de
distinguir os genes (SEKI et al, 2013).
Em contrapartida ao alto índice de ESB, apenas 3 isolados foram resistentes aos
carbapenêmicos, sendo todos K.pneumoniae. Desses, 2 foram negativos nos testes fenotípicos
e genotípicos. Isso pode ocorrer devido ao fato dos Teste modificado de Hodge e inibição
com ácido fenilborônico não possuírem 100% de precisão bem como a possibilidade de haver
outros dos genes codificadores de carbapenemase não analisados neste estudo, regiões de
codificação do primer pouco específica ou à outro mecanismo de resistência aos
carbapenêmicos distinto da produção de carbapenemase tais como: alteração de
permeabilidade da membrana e presença de bombas de efluxo (DOYLE et al.; 2012;
NORDMANN; NAAS; POIREL, 2011).
A identificação de apenas um isolado de K. pneumoniae portador do gene KPC pode ser
reflexo do tipo de atendimento oferecido na instituição: hospital sem emergência que atende
apenas pacientes agendados para a realização de procedimentos cirúrgicos e/ou transferidos
de outras instituições. No Brasil, a KPC-2 é a mais frequente, representando
aproximadamente 22% dos isolados resistentes à carbapenêmicos (TAVARES et al., 2015).
Entretanto, este estudo não avaliou separadamente a variante de KPC presente nos isolados de
enterobactérias causadoras de infecção da corrente sanguínea.
Existe relato de presença de genes codificadores carbapenemase em espécies com perfil
de resistência ESBL porém com sensibilidade in vitro aos carbapenêmicos (SEKI et al.,
2013). Nesse estudo 2 (4,9%) isolados apresentaram tal características, ou seja, foi
64
identificado, em ambos casos, o gene IMP porém susceptibilidade aos carbapenêmicos
testados. As IMP carbapenemase, juntamente com as demais metalo-β-lactamases emergem
no cenário mundial e resultados similares à esses são de grande preocupação e relevância
clínica, uma vez que o paciente pode ser tratado com carbapêmico, podendo haver falha
terapêutica e, consequentemente, aumentando os custos com internamento e agravando o
quadro clínico do paciente.
Posteriormente, uma análise similar deve ser realizada a fim de pesquisar a presença tanto
de genes que codificam tanto ESBL quanto carbapenemases nos isolados que foram
susceptíveis às cefalosporinas de 2ª e 3ªgeração, monobactâmicos e penicilinas com o
objeitvode traçar um perfil molecular das enterobactérias no hospital estudado. Apesar da
importância de se conhecer a epidemiologia dos micro-organismos multiresistêntes a fim de
otimizar as políticas de controle de infecção e tratamento, bem como reduzir os danos ao
paciente, há pouco registro de estudos similares à esse na cidade de Salvador.
65
8. Conclusões
·
No Hospital Ana Nery, no ano de 2013 foram identificados 118 casos de
hemoculturas positivas para enterobactérias sendo que a espécie mais frequente foi
K.pneumoniae (33,3%), seguido de E.cloacae (19,7%).
·
O teste fenotípico de identificação de ESBL foi positivo em 37% (44/118) dos
isolados. Sendo mais comum em K. pneumoniae (25/44);
·
Os genes que codificam resistência antimicrobiana mais frequentes foram: OXA-1like (71,4%), CTX-M grupo 1( 64,3%), SHV (50%) e TEM(45%);
·
Três isolados de K.pneumoniae foram resistentes aos carbapenêmicos, porém
apenas um apresentou positividade tanto nos testes fenotípicos quanto genotípicos,
sendo detectado o gene KPC.
·
Dois isolados, sensíveis aos carbapenêmicos, porém ESBL positivos, foram
positivos para a pesquisa do gene IMP.
66
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ANEXO
Anexo A: Aprovação Comitê de ética
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APÊNDICE
Apêndice A - Formulário para coleta de dados pessoais dos pacientes portadores de
infecção da corrente sanguínea causada por enterobactérias no período de Maio de 2013 a
Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
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Apêndice B - Formulário epidemiológico para coleta de dados dos pacientes portadores
de infecção da corrente sanguínea causada por enterobactérias no período de Maio de 2013 a
Abril de 2014 em um hospital público na cidade de Salvador, Bahia.
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