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Universidade Federal de Pernambuco
Centro de Ciências Biológicas
Programa de Pós-graduação em Inovação Terapêutica/PPGIT
Aline Stamford Henrique da Silva Guerra
Estudo das Atividades Anti-inflamatória e Antinociceptiva dos Derivados
Indol-imidazolidínicos 5-(1H-Indol-3-il-metileno)-2-tioxo-imidazolidin-4ona (LPSF/NN-56) e 3-(4-Bromo-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-2tioxo-imidazolidin-4-ona(LPSF/NN-52)
UFPE – Recife
2011
Aline Stamford Henrique da Silva Guerra
Estudo das Atividades Anti-inflamatória e Antinociceptiva dos Derivados
Indol-imidazolidínicos 5-(1H-Indol-3-ilmetileno)-2-tioxo-imidazolidin-4ona (LPSF/NN-56) e 3-(4-Bromo-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-2tioxo-imidazolidin-4-ona(LPSF/NN-52).
Dissertação apresentada ao programa de PósGraduação em Inovação Terapêutica da
Universidade Federal de Pernambuco, como
requisito para obtenção do título de Mestre em
Inovação Terapêutica. Área de concentração:
Desenvolvimento Pré-clínico de Produtos
Bioativos.
ORIENTADORA:
Profa. Dra. Teresinha Gonçalves da Silva
UFPE – Recife
2011
Estudo das Atividades Anti-inflamatória e Antinociceptiva dos Derivados
Indol-imidazolidínicos 5-(1H-Indol-3-ilmetileno)-2-tioxo-imidazolidin-4ona (LPSF/NN-56) e 3-(4-Bromo-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-2tioxo-imidazolidin-4-ona(LPSF/NN-52).
Aline Stamford Henrique da Silva Guerra
Aprovada em: 18/03/2011
Banca examinadora:
____________________________________________________
Profª Drª. Teresinha Gonçalves da Silva – UFPE
Orientadora – Membro interno
____________________________________________________
Profª Dra. Vláudia Maria Assis Costa – UFPE
Membro externo
____________________________________________________
Profª Dra. Leônia Maria Batista – UFPB
Membro externo
RECIFE
2011
DEDICATÓRIA
A minha mãe, Darlyx, que foi minha primeira mestra, guiou
e orientou meus passos. Despertou em mim a curiosidade para
aprender, a perseverança para lutar e o incansável desejo de
perpetuar meus conhecimentos. Obrigada mainha por seu amor
e dedicação, pela paciência e confiança e por me ajudar a
realizar meus sonhos me incentivando e apoiando.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me proporcionar a vida e todas as experiências maravilhosas que passei,
por me iluminar e abençoar minhas escolhas e por me dar força através da minha fé para
sempre seguir em frente e obter sucesso.
À minha orientadora, Profa. Drª Teresinha Gonçalves da Silva, pela oportunidade que
me foi dada, pela dedicação, orientação e amizade. Seus valiosos conhecimentos
contribuem para minha formação e futuro.
Aos meus pais, Walter e Darlyx, pelo amor, carinho e educação que me prestaram.
Obrigada pelo incentivo e palavras de consolo. Por vocês eu cheguei até aqui e para
vocês que continuarei a seguir.
As minhas irmãs lindas, que por muitas vezes pude recorrer e sempre tive amparo.
Muito obrigada Alix, Amanda e Andreza, pelo carinho e companhia.
Aos meus familiares por apoiarem, por falarem de mim com orgulho e carinho. Vocês
também são responsáveis por minhas conquistas, pois nunca deixaram me faltar nada.
Ao meu amigo, amor e companheiro Philipe, por sempre demonstrar interesse pelos
meus planos, acompanhar minhas conquistas e alimentar meus sonhos.
As amigas Cecília Brito e Ana Patrícia por fazerem parte da minha história e pelo
carinho e amizade. Vocês fazem parte do meu alicerce.
A minha amiga e orientadora de iniciação científica Maria do Carmo de Caldas Dias
Costa, pelas horas de dedicação e carinho, por me transmitir conhecimentos valiosos e
por me inserir no Departamento de Antibióticos da UFPE.
A Técnica em Laboratório Suzete Mendonça, pelo seu carinho, companheirismo, por
está sempre disposta a ajudar.
A Técnica em Laboratório Maria Rodrigues, pela paciência e disposição para me
ensinar as técnicas de ensaio in vitro com cultura de Células
A Professora Silene Carneiro, pela amizade, carinho e por me inserir no Departamento
de Antibióticos da UFPE.
A minha amiga e companheira de Laboratório Diana Malta, por ser solícita, por dividir
experimentos, material de estudo, por me ajudar na execução das minhas tarefas no
laboratório e, por estar presente nos momentos de descontração, sorrir comigo e me
passar conhecimento valiosos.
Aos doutorandos do LBPF André Barros, Jaciana Aguiar e Thiago Lins, pela paciência,
amizade, colaboração nos experimentos, consultoria de informática e horas de muitas
risadas.
Aos Mestrandos do LBPF, em especial Larissa Corrêa, Fernanda Mota, Sandrine
Arruda e Tatiana Bezerra pela amizade, colaboração nos experimentos e análise dos
resultados.
Aos alunos de iniciação científica do LBPF Carlson Carvalho, Luana Laranjeira e
Adamares Santana, pela colaboração no desenvolvimento deste trabalho, pela amizade,
apoio e incentivo, pela companhia e ajuda nos finais de semana e feriados, pelos
almoços, jantares, lanches, horas e horas de convívio.
Ao veterinário e amigo Eryvelton Franco, por me ajudar a implantar uma nova
metodologia de atividade anti-inflamatória que contribuirá para a pesquisa dos alunos
do LBPF.
Aos Professores Ivan da Rocha Pitta, Suely Lins Galdino e Maria do Carmo Alves de
Lima, do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos/ Grupo de Pesquisa e
Inovação Terapêutica – LPSF/GPIT, Departamento de Antibióticos, da Universidade
Federal de Pernambuco, por fornecer as moléculas de estudo deste trabalho.
A todos que fazem parte do Departamento de Antibióticos, por ceder o espaço para minha
pesquisa.
Aos meus colegas PPGITeanos, pelo convívio agradável, por compartilhar conhecimentos e
por fazerem parte da minha formação acadêmica.
A todos que fazem parte do Programa de Pós-graduação em Inovação Terapêutica pelo
convívio e disponibilidade em atender minhas solicitações.
À Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco (FACEPE),
pelo incentivo e apoio financeiro.
A todos, muito obrigada!
"Mestre não é quem sempre ensina, mas
quem de repente aprende."
João Guimarães Rosa
RESUMO
A inflamação é uma resposta vital provocada por patógenos, danos físicos, isquemia,
injúrias tóxicas ou auto-imunes com o objetivo de proteger o organismo. É um processo
complexo, incluindo atividades de vários tipos de células e dezenas de mediadores
protéicos e lipídicos. A fase inicial da inflamação inclui mudanças no fluxo sanguíneo
local e acumulação de várias células inflamatórias (neutrófilos, células dendríticas,
monócitos, mastócitos e linfócitos). Posteriormente, patógenos, debris celulares e
células inflamatórias precisam ser removidas e a integridade e funcionamento normal do
tecido restaurado. Apesar do avanço no conhecimento da fisiopatologia da inflamação,
os medicamentos atuais ainda apresentam sérios efeitos adversos. Neste estudo, nos
propomos a avaliar a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva de derivados indolimidazolidínicos (LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56) e determinar as concentrações do TNFα e IL-1β no exsudato inflamatório de animais tratados com os compostos em estudo.
Para a avaliação da atividade anti-inflamatória, foram utilizados testes da fase aguda
como, bolsão de ar subcutâneo, peritonite e pleurisia induzidos por carragenina e
permeabilidade vascular induzida por ácido acético. Para avaliação do efeito
antinociceptivo foram realizados os ensaios da nocicepção induzida por ácido acético,
formalina e placa quente. No teste do bolsão de ar os melhores resultados foram obtidos
com o LPSF/NN-52 (10mg/kg) e LPSF/NN-56 (3mg/Kg) com inibição da migração
leucocitária de 72 e 81%, respectivamente em relação ao grupo controle. A
indometacina (10mg/kg; 87% de inibição) foi usada como fármaco de referência. Na
peritonite, os compostos LPSF/NN-52 (10mg/kg) e LPSF/NN-56 (3mg/kg) inibiram a
migração leucocitária em 56 e 55%, respectivamente, em relação ao controle. O
fármaco padrão indometacina apresentou inibição de 58%. Em relação à avaliação das
citocinas pró-inflamatórias em ambos os testes, as substâncias em estudo diminuíram a
concentração de TNF-α e IL-1β. No teste da pleurisia, as substâncias também inibiram a
migração leucocitária LPSF/NN-52 (49%) e LPSF/NN-56 (39%) em relação ao grupo
controle, porém sua inibição foi inferior aos padrões dexametasona (71%) e
indometacina (65%). Os compostos testados diminuíram a permeabilidade vascular
induzida por ácido acético. Na nocicepção induzida por ácido acético, as substâncias
apresentaram diminuição no número de contorções abdominais em relação ao grupo
controle, onde o LPSF/NN-52 inibiu a nocicepção em 52% e LPSF/NN-56 inibiu 63%.
O padrão para este teste foi o diclofenano (68%). No teste da formalina, os compostos
testados apresentaram efeitos apenas na segunda fase. No teste da Placa quente nenhum
dos derivados apresentou inibição da nocicepção. Desta forma, os resultados indicam
que os derivados indol-imidazolidínicos testados apresentaram atividade antiinflamatória e antinociceptiva promissoras, provavelmente através da modulação do
sistema imune. Sugere-se que a atividade antinociceptiva dos derivados indolimidazolidínicos seja decorrente de mecanismos periféricos, atuando apenas na dor
inflamatória.
Palavras-chave:
Imidazolidinas.
Atividade
Anti-inflamatória,
Atividade
Antinociceptiva,
ABSTRACT
Inflammation is a vital response caused by pathogens, physical damage, ischemia, or
toxic insults autoimmune diseases in order to protect the body. It is a complex process,
including activities of various kinds of cells and dozens of protein and lipid mediators.
The initial phase of inflammation include changes in the flow local blood cells and
accumulation of several inflammatory (neutrophils, dendritic cells, monocytes,
lymphocytes and mast cells). Subsequently, pathogens, cellular debris and inflammatory
cells need to be removed and the integrity and functioning restored normal
tissue. Despite the advances in knowledge of the pathophysiology of inflammation,
current drugs also have serious effects adverse. In this study, we propose to evaluate the
anti-inflammatory activity and antinociceptive of derived indole-imidazolidine
(LPSF/NN-52 and LPSF/NN- 56) and determine the concentrations of TNF-α and IL-1β
in exudates of animals treated with compounds. To evaluate the anti- inflammatory
activity, were used air pouch, peritonitis and pleurisy induced by carrageenin and
vascular permeability induced by acetic acid. For evaluation of the antinociceptive,
assays performed were the nociception induced by acetic acid, formalin and hot plate. In
test air pocket the best results were obtained with the LPSF/NN-52 (10mg/kg) and
LPSF/NN-56 (3 mg / kg) with inhibition leukocyte migration of 72 and 81%,
respectively compared to control group. Indomethacin (10mg/kg; 87% inhibition) was
used as reference drug. In peritonitis, the compounds LPSF/NN-52 (10mg/kg) and
LPSF/NN-56 (3mg/kg) inhibited leukocyte migration in 56 and 55% respectively,
compared to control. The standard drug indomethacin showed inhibition of
58%. Regarding the assessment of pro-inflammatory cytokines in both tests,
the substances under study decreased the concentration of TNF-α and IL-1β. In the test
of pleurisy, the substances also inhibited leukocyte migration LPSF/NN-52 (49%) and
LPSF/NN-56 (39%) compared to control group, but was inferior to its
inhibition patterns dexamethasone (71%) and indomethacin (65%). The compounds
tested decreased vascular permeability induced by acetic acid. In nociception
induced acetic acid, substances decreased the writhing in relation to group control,
where the LPSF/NN-52 inhibited nociception in 52% and LPSF/NN-56 inhibited
63%. The standard for this test was diclofenac (68%). In the formalin test, the
compounds presented effects only in the second phase of inflammation. In the hot
plate test, the derivatives did not inhibit nociception. Thus, the results indicate that the
indole-imidazolidine derivatives tested showed anti-inflammatory and antinociceptive
activity promising, probably through modulation of the immune system. It is suggested
that the activity antinociceptive of indole-imidazolidine derivatives is due to peripheral
mechanisms, acting in only inflammatory pain.
Keywords: Anti-inflammatory activity, antinociceptive activity, indol-imidazolidines.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mecanismo específico da dor nociceptiva (A) e dor inflamatória
(B) adaptado (WOOLF, 2004).
31
Figura 2 : Cascata da inflamação e atuação dos antiinflamatórios
32
Figura 3: Hidantoína (imidazolidina-2,4-diona).
34
Figura 4: Estrutura
imidazolidin-4-ona.
básica
dos
derivados
5-benzilideno-2-tioxo
35
Figura 5: Estrutura geral dos derivados 3-(3-alkil-2,6-diarilpiperina-4
ilidena)-2-tioxoimidazolidina-4-onas.
36
Figura 6: 2,4-dioxi-1,3-difenil-7,8-benzo-6-etil-9-(2-feniletil)-1,3,6,9tetrazaspiro[4.4]nonano.
36
Figura 7: Esquema de síntese dos derivados 5-arilideno hidantoína.
38
Figura 8: (Z)-3-(4-cloro-benzil)-5-(4-nitro-benzilideno)-imidazolidina2,4-diona.
38
Figura 9: (1) (Z)-5-((1-Benzil-5-metil-1H-indol-3-yl)metileno)imidazolidina-2,4-diona e (2) (Z)-5-((1-Benzil-5-metil-1H-indol-3-yl)metileno)
imidazolidina-2,4-diona.
39
Figura 10: (1) 1-[4-oxo-8-(3-clorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1c][1,2,4]triazin-3-il]
;
(2)
1-[4-oxo-8-(3,4-diclorofenil)-4,6,7,8tetrahidroimidazol[2,1 c][1,2,4]triazin-3-il].
39
Figura 11: Esquema reacional dos derivados indol-imidazolidínicos
LPSF/NN-52 e LPFS/NN-56.
44
Figura 12: Concentração de TNF-α (A) e IL-1β (B) em exsudato no teste
de Bolsão de Ar.
56
Figura 13: Concentração de TNF-α (A) e IL-1β (B) em exsudato no teste
de peritonite induzida por carragenina.
58
Figura 14: Efeito dos compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 no teste da
permeabilidade vascular induzida por ácido acético.
60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Nome químico e características físico-químicas dos derivados
indol-imidazolidínicos LPSF/NN-56 e LPSF/NN-52
45
Tabela 2: Evolução do peso corporal, consumo de ração, água e índice
dos órgãos dos animais tratados com os derivados indol-imidazolidínicos
LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 em relação ao grupo controle.
54
Tabela 3: Total de Leucócitos polimorfonucleares - PMNL (média 
desvio padrão) e percentual de inibição da inflamação dos grupos controle e
tratados com os derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e
LPSF/NN-56.
55
Tabela 4: Número de PMNL e percentual de inibição da inflamação pelos
derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 no teste da
peritonite induzida por carragenina.
57
Tabela 5: Avaliação do total de Leucócitos polimorfonucleares - PMNL e
percentual de inibição da inflamação dos grupos controle e tratados com
NN-52 e NN-56 no teste de Pleurisia induzida por carragenina.
59
Tabela 6: Número de contorções abdominais e percentual de inibição dos
derivados indol-imidazolidínicos no teste de contorções abdominais
induzidas por ácido acético.
60
Tabela 7: Tempo de latência ao estímulo térmico no teste da placa quente
após tratamento oral com os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56.
61
Tabela 8: Efeito dos derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e
LPFS/NN-56 no teste de nocicepção induzida por formalina.
62
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
A549
Adenocarcinoma de células alveolar humana
AINES
Anti-inflamatórios não Esteroidais
ANVISA
Agencia Nacional de Vigilância Sanitária
CCR5
Receptor do tipo 5 para quimiocinas
CD4
“Cluster” de diferenciação 4
CI50
Concentração que produz 50 % de inibição no crescimento celular
COX
Cicloxigenase
DL50
Dose letal (50%)
DMSO
Dimetil sulfóxido
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
H 460
Linhagem celular de adenocarcinoma de efusões pleurais
HIV
Vírus da imunodeficiência Humana
HSF
Células fibroblásticas epitelial humana
IASP
Associação Internacional do Estudo da Dor
IFN- γ
Interferon γ
IL
Interleucina
L 1210
Células de leucemia murina
LPS
Lipopolissacarídeo
LS 180
Linhagem celular de adenocarcinoma de cólon
MCF-7
Linhagem celular de adenocarcinoma de mama humano
MDA-231
Linhagem celular de adenocarcinoma de mama humano
MIC
Concentração Inibitória Mínima
MTT
([brometo de (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazólio])
NK
Células Natural Killer
NKA
Neurocina A
NO
Óxido nítrico
OECD
Organization for Economic Cooperation and Development
PBS
Solução tampão fosfato
PGE2
Prostaglandina E2
PGG2
Prostaglandina G2
PGH2
Prostaglandina H2
PGI2
Prostaciclina
PMNLs
Leucócitos Polimorfonucleares
PPARr
Receptores Ativados Por Proliferadores De Peroxissomos
Pt
Platina
RDC 48
Resolução da Diretoria Colegiada de número 48
SiHa
Linhagem celular de câncer de útero
scPTZ
Pentilenotetrazol subcutâneo
T 470
Linhagem celular de carcinoma de mama
TGF
Fator Transformador de Crescimento
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral alfa
TXA2
Tromboxano A2
TZDs
Tiazolidinadionas
SUMÁRIO
RESUMO
ABSTRACT
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
1 INTRODUÇÃO
20
2 JUSTIFICATIVA
23
3 REVISÃO DA LITERATURA
24
3.1 Fisiopatologia da Inflamação
25
3.1.1 Inflamação Aguda
25
3.1.2 Inflamação Crônica
26
3.1.3 Resposta Imune e Inflamação
27
3.1.4 Citocinas
28
3.2 Fisiopatologia da Dor
28
3.2.1 Dor inflamatória
30
3.3 Anti-inflamatórios esteroidais e não-esteroidais
31
3.4 Propriedades Biológicas das Imidazolidinas
34
3.4.1 Atividades Anti-inflamatórias
34
3.4.2 Atividade Antifúngica
35
3.4.3 Atividade antibacteriana
36
3.4.4 Atividade esquistossomicida
37
3.4.5 Atividade Citotóxica
38
3.5 Propriedades Biológicas dos derivados indólicos
40
4 OBJETIVOS
42
4.1 Geral
42
4.2 Específicos
42
5 MATERIAIS
44
5.1 As Substâncias
44
5.2 Equipamentos
45
5.3 Material de Consumo
45
5.4 Animais Experimentais
46
6 MÉTODOS
46
6.1 Procedimentos Éticos
47
6.2 Toxicidade
47
6.3 Atividade Anti-inflamatória
47
6.3.1 Método do Bolsão de Ar Subcutâneo
48
6.3.2 Peritonite Induzida por Carragenina
48
6.3.3 Pleurisia Induzida por Carragenina
49
6.3.4 Determinação dos Níveis de Citocinas (TNF-α e IL-1β)
49
6.3.5 Permeabilidade Vascular Induzida por Ácido Acético
49
6.4 Atividade Antinociceptiva
50
6.4.1 Nocicepção Induzida por Ácido Acético
50
6.4.2 Método da Placa Quente
50
6.4.3 Nocicepção induzida por formalina
51
6.5 Variáveis Analisadas
51
6.6 Análise dos Dados
52
7 RESULTADOS
54
7.1 Toxicidade Aguda
54
7.2 Método do Bolsão de Ar Subcutâneo
7.2.1 Dosagem das Citocinas TNF-α e IL-1β (Método do Bolsão de Ar)
7.3 Peritonite Induzida por Carragenina
7.3.1 Dosagem das Citocinas TNF-α e IL-1β (Método da Peritonite)
54
55
57
57
7.4 Pleurisia Induzida por Carragenina
58
7.5 Permeabilidade Vascular Induzida por Ácido Acético
59
7.6 Nocicepção Induzida por Ácido Acético
60
7.7 Teste da Placa Quente
61
7.8 Nocicepção induzida pela formalina
61
8 DISCUSSÃO
64
9 CONCLUSÕES
71
REFERÊNCIAS
ANEXOS
APÊNDICES
INTRODUÇÃO
20
1. INTRODUÇÃO
A inflamação pode ser classificada na dinâmica de sua resposta como aguda ou
crônica. Cada fase tem um perfil celular característico: neutrófilos, células dendríticas e
macrófagos na fase aguda, e na fase crônica, mononucleares tais como macrófagos,
linfócitos e mastócitos são predominantes. Inflamações como hepatite aguda, mordida
de insetos ou reações na pele são caracterizadas por uma resposta inicial imediata, onde
após a detecção de antígenos e/ou danos, neutrófilos são imediatamente recrutados para
o sítio por sinais quimioatraentes, seguido pela invasão de monócitos/macrófagos que se
torna o principal tipo de células após 48 horas (GARCIA-PASTOR et al.,1999;
FRÖDE; MEDEIROS, 2001; KIRVESKARI et al., 2003; RANKIN, 2004).
O papel dos neutrófilos é fagocitose de antígenos que são degradados dentro das
células através de processos enzimáticos. A ativação de neutrófilos leva a secreção de
citocinas que amplifica a resposta inflamatória e resulta num infiltrado linfocitário e
também em mudanças vasculares, edema e destruição enzimática. O objetivo da fase
aguda é a eliminação total dos antígenos. Entretanto, a definição começa já durante a
fase inicial da resposta inflamatória. Granulócitos migram no sítio inflamado e
promovem a ativação do ácido araquidônico e metabólitos dos leucotrienos pela
lipoxina. Outros mediadores lipídicos tais como as resolvinas e protectinas iniciam a
apoptose dos neutrófilos. Macrófagos que eliminam neutrófilos apoptóticos também
estimulam a resolução pela liberação de citocinas anti-inflamatórias, tais como o TGFbeta. Se o balanço entre inflamação e resolução é quebrado, pode levar a inflamação
crônica (FRÖDE; MEDERIROS, 2001; BERGER; MOLLER, 2002; SZÉLES;
TÖRÖCSIK; NAGY, 2007).
No processo inflamatório, células como leucócitos, plaquetas, células do
endotélio vascular, mastócitos e células do sistema nervoso periférico produzem uma
série de substâncias endógenas, também denominadas de mediadores químicos da
inflamação: serotonina, produtos da cascata do ácido araquidônico, adenosina,
histamina, neuropeptídios como a susbstância P e citocinas. Estes mediadores
promovem uma alteração no mecanismo de transdução periférica do estímulo
nociceptivo, que por sua vez, aumenta a sensibilidade de transdução dos nociceptores,
com conseqüente redução no limiar de percepção do estímulo doloroso e aumento da
21
sensibilidade a dor (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998; BONICA; YAKSH;
LIEBESKIND, 1990; MEYER; CAMPBELL; RAJA, 1994).
Os compostos hidantoínicos (que possuem o anel imidazolidínico) despertam
grande interesse devido, sobretudo, à sua ocorrência na natureza, por sua reatividade
química, tendo consequente afinidade por biomacromoléculas e por apresentar inúmeras
propriedades biológicas importantes para o desenvolvimento de fármacos. Modificações
estruturais no anel imidazolidínico, conferem a molécula uma variedade de atividades
farmacológicas tais como: anti-inflamatória, antifúngica, antibacteriana, hipoglicêmica,
esquistomicida, citotóxica entre outras (OLIVEIRA, et al., 2008; MALTA, 2005;
REDDY et al., 2010).
Apesar da eficácia clínica dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINES), os
seus efeitos colaterais como intolerância gástrica, toxicidade renal e aumento da
incidência de doenças cardiovasculares representam um grande obstáculo na terapêutica
(SIMONS; WAGNER; WESTOVER, 2000; VOGIAGIS et al., 2001; PATRONO;
ROCA, 2009). Encontrar substâncias eficazes e com baixa toxicidade levam os
pesquisadores a uma busca incansável por novos fármacos. Entre os métodos de
pesquisa, os processos de modificação molecular são os mais promissores (BARREIRO
et al., 2002; AMARAL; MONTANARI, 2002).
Portanto, o presente trabalho teve como objetivo avaliar o potencial antiinflamatório a antinociceptivo de derivados indol-imidazolidinicos como novos
protótipos para o desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios a analgésicos.
JUSTIFICATIVA
23
2. JUSTIFICATIVA
Os anti-inflamatórios são fármacos utilizados no tratamento e alívio dos
sintomas de uma série de doenças inflamatórias, tais como artrite reumatóide, febre
reumática, osteoartrite, artrite psoriática, lúpus eritomatoso, dentre outras. O mal que as
doenças inflamatórias crônico-degenerativas causam a população e os relatos na
literatura que atribuem efeitos adversos a alguns anti-inflamatórios não esteroidais
justificam a importância de buscar novos fármacos anti-inflamatórios.
O desenvolvimento na área da síntese orgânica proporcionou o aumento de
substâncias sintéticas que são utilizadas na terapêutica no combate, prevenção e controle
de doenças, infecciosas, e crônico-degenerativas, prevenindo assim seu agravamento, e
proporcionando o aumento do tempo da sobrevida em caso de doenças terminais
(GORDON et al., 1994).
Os compostos que possuem o anel imidazolidínico despertaram interesse por
apresentar grande reatividade química e afinidade por biomacromoléculas. Estas
características lhes conferem uma gama de propriedades que inclui: atividade antiinflamatória, antinociceptiva, atividade antifúngica, antibacteriana e esquistomicida
(OLIVEIRA et al., 2008).
Por outro lado, o núcleo indol faz parte de uma classe importante de fármacos
anti-inflamatórios não-esteroidais que tem como protótipo a indometacina, que é
potente e eficaz no combate a inflamação, entretanto apresenta vários efeitos colaterais,
dentre eles a intolerância gástrica.
Neste contexto podemos ressaltar a importância da síntese de compostos
híbridos, tendo como base o núcleo indol-imidazolidínico como candidato a protótipo
para desenvolvimento de fármacos para o alívio ou tratamento dos sintomas da
inflamação e da dor.
REVISÃO DE
25
LITERATURA
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1. Fisiopatologia da Inflamação
O processo inflamatório é um dos mecanismos mais antigos que existe no organismo
animal para sua defesa quando há uma invasão de microrganismos patogênicos. Celsius (30
a.C. – 38 d.C.) propôs os quatro sinais clássicos da inflamação: rubor, tumor, calor e dor.
Muitos anos depois, Virchow (1821-1902), descreveu o quinto sinal clássico da inflamação,
que é a perda de função do órgão ou tecido inflamado (WEISSMAN, 1992; HEIDLAND et
al., 2006).
A resposta inflamatória é uma propriedade essencial para a sobrevivência de um
organismo. Esta capacidade dos seres vivos em responder defensivamente a estímulos lesivos
ocorre de forma cada vez mais complexa, à medida que aumenta a especialização biológica
(CUZZOCREA, 2005). Uma inflamação pode ocorrer a partir de diversas injúrias: traumas no
tecido, invasão de bactérias, vírus ou parasitos, presença de complexos imunes, entre outros
(CUNHA et al., 2003). Para que haja resposta do organismo lesionado a estas diversas
injúrias, mediadores bioquímicos são sintetizados, como: histamina, serotonina, enzimas
lisossomais, prostaglandinas, leucotrienos, fatores ativadores de plaquetas, citocininas, óxido
nítrico, o sistema complemento, bradicininas, os fatores de coagulação e fibrinólise)
(CUZZOCREA, 2005; WANG; ALJAROUDI; NEWBY, 2005; SARKAR; FISHER, 2006).
A inflamação poderá ser aguda ou crônica dependendo do tempo de permanência do processo
inflamatório no organismo.
3.1.1. Inflamação Aguda
A inflamação aguda é a reação imediata do organismo frente a um estimulo físico,
químico ou biológico, onde mediadores de defesa são sintetizados e direcionados ao local da
lesão. Essa resposta geralmente é breve, podendo durar alguns minutos, horas, ou até mesmo
26
alguns dias. O principal objetivo da reação inflamatória é possibilitar ao tecido lesado o
acesso de células, proteínas e outros elementos originários do sangue para que haja reparação
do tecido lesionado. Segundo Contran et al. (2005), o processo inflamatório agudo pode ser
dividido em uma sequência de eventos. Primeiramente há uma lesão em um organismo,
fazendo com que este produza mediadores inflamatórios. Depois há um aumento do fluxo
sanguíneo local, devido à retração de células endoteliais, promovendo a vasodilatação. Assim
estes mediadores inflamatórios podem ter acesso à região inflamada. Posteriormente o
extravasamento de macromoléculas plasmáticas, devido o aumento da pressão oncótica local,
promovendo a evasão de água e levando a formação do edema. Por ultimo a quimiotaxia de
leucócitos, caracterizando o processo inflamatório. (MAJNO, PALACE, 1961; SUFFREDINI
et al., 1999; MCDONALD; THURSTON; BALUK, 1999; COLLINS, 1999).
3.1.2. Inflamação Crônica
Algumas doenças crônicas se originam de inflamações agudas que evoluem em seus
sintomas, como por exemplo, infecções por microrganismos, tais como o Mycobacterium
tuberculosis, agentes de baixo grau de toxicidade, como sílica, algumas viroses e reações
auto-imunes. Uma inflamação é denominada crônica quando ocorre a persistência do estimulo
agressor, ocasionando uma destruição contínua dos tecidos e há tentativas de cicatrização por
reparo fibroso além de respostas auto-imunes (RODRIGUEZ-VITA; LAWRENCE, 2010;
COSSEUNS; WERB, 2002; DE MARZO et al., 2007).
Outro importante exemplo de inflamação crônica é o reumatismo, conjunto que
compreende mais de 150 doenças e síndromes que são em geral progressivas e associadas
com a dor. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), estima-se que no Brasil
existam mais de 15 milhões de pessoas acometidas por diversos tipos de doenças reumáticas.
A artrite reumatóide é uma doença que afeta as juntas, tendões, músculos e tecidos fibrosos,
ocasionando dores. Sua incidência é maior entre as mulheres com faixa etária de 20 a 40 anos
de idade (WHO, 2010).
A inflamação crônica se prolonga por períodos bem mais extensos que a inflamação
aguda e está associada com alguns processos específicos de alteração histológica como
fibrose e necrose do tecido afetado, proliferação de vasos sanguíneos e, principalmente, a
participação de linfócitos e macrófagos (FERREIRA; LORENZETTI; POOLE, 1993).
27
3.1.3. Resposta Imune e Inflamação
O sistema imune é responsável pelos processos de reparo tecidual como também pela
defesa do organismo. Os leucócitos atuam em momentos distintos da reposta imune. A
resposta imune pode ser classificada em imunidade não-específica (inata) e a específica
(adquirida) onde estes dois tipos de imunidade atuam de maneira independente. Na imunidade
inata
as
células
atuantes
são
principalmente
células
fagocitárias
mononucleares
(macrófagos/monócitos) e os granulócitos (ex. neutrófilos). No caso da imunidade adquirida,
além das células efetoras, há atuação dos linfócitos (linfócitos T e linfócitos B)
(KIRVESKARI et al., 2003).
Na imunidade inata, os macrófagos entram em ação secretando diversos mediadores,
tais como óxido nítrico (NO), citocinas (IL-1, IL-6, IL-12, TNF-α), quimiocinas (IL-8) entre
outros (KONSMAN et al., 2002). A indução para a ativação dos macrófagos pode ser tanto
pelo estímulo lesivo, agente infectante ou pela ação de outras citocinas, principalmente
interferon gama (IFN-γ) que são liberadas por linfócitos (WALKER et al., 1999; MARTÍNFONTECHA et al., 2004). Dentre estes mediadores que atuam como vasodilatadores e
contribuem para a migração leucocitária está a bradicinina. Esta também estimula a produção
de uma cascata de citocinas pró-inflamatorias (TNF-α, IL-8, IL-6 e IL-1β) como também a
liberação de prostaglandinas e aminas simpaticomiméticas que induzem a hipernocicepção e a
dor (CUNHA et al., 1992; VERRI et. al, 2007).
Na imunidade adquirida as células em atuação são os linfócitos. Estas células são
primeiramente produzidas no timo ou na medula óssea, depois sofrem amadurecimento nos
órgãos linfóides periféricos (baço, linfonodos e amigdalas), para então serem liberadas
durante a resposta imune (WALKER et al., 1999; MARTÍN-FONTECHA et al., 2004). Os
linfócitos T efetores (maduros), quando chegam ao local da injúria liberam diversas citocinas
(IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, TNF-α) e quimiocinas. Estas são responsáveis pela ativação de células
B, quimiotaxia de leucócitos, ativação dos macrófagos, deposição de fibrina e dor
(WATKINS et al., 1995).
28
3.1.4. Citocinas
As citocinas são um imenso grupo de moléculas que atuam regulando a resposta
inflamatória e imunológica, entre outros processos. São produzidas principalmente por
macrófagos após estimulação, por toxinas, lesão mecânica ou mediadores inflamatórios
(ZHANG, 2008).
Existem interleucinas anti-inflamatórias e pró-inflamatórias: as interleucinas IL-4, IL10, IL-13, IL-1ra (antagonista da interleucina-1) e o TGF-β1 (fator transformador de
crescimento-β1) são anti-inflamatórias, pois inibem a liberação de citocinas pró-inflamatórias
e reduzem a expressão da COX-2 (CUNHA, 2003). Já as interleucinas IL-6, IL-8, TNF-α e
IL-1β são pró-inflamatórias, migram e atuam na área lesionada, sinalizando a inflamação.
Estas interleucinas também estão associadas com a indução e manutenção da dor aguda e
crônica (CUNHA, et al., 2000; VALE et al., 2003)
Um dos principais papéis da IL-1β é aumentar a expressão das ciclooxigenases (COX1 e COX-2), induzindo a produção de prostaglandinas. Estas sensibilizam os nociceptores,
resultando em hipernocicepção/dor (VERRI et al., 2006). O uso de inibidores da
ciclooxigenase como a indometacina inibe o seu efeito álgico (DINARELLO et al., 1999).
O TNF-α é sintetizado e liberado no local da lesão a partir de diversas células, como:
macrófagos, linfócitos Th1, mastócitos, neutrófilos, eosinófilos, astrócitos, células natural
killers (NK) e células do sistema nervoso (MEYERS; ALBITAR; ESTEY, 2005). Além de
estar envolvido com o processo inflamatório e hipernocicepcao/dor, o TNF-α está relacionado
com a anorexia e outros sintomas (OMOIGUI, 2007; SACHS et al., 2002).
3.2. Fisiologia da Dor
Em 1996, a Associação Internacional para o Estudo da dor (IASP) definiu a dor como
"uma experiência sensorial e emocional desagradável associada a dano tecidual real ou
potencial, ou descrito nos termos de tal dano". A dor é uma experiência subjetiva, que não
pode ser facilmente medida. Ao descrever a dor como uma "experiência", podemos
29
diferenciá-la de nocicepção uma vez que a nocicepção é um processo neural que envolve a
transdução e transmissão de um estímulo nocivo para o cérebro, enquanto a dor é o resultado
de uma complexa interação entre sistemas de sinalização e a percepção única do indivíduo a
um estímulo (STEEDS, 2009).
A dor é o resultado de uma resposta física e psicológica a uma lesão. Um conjunto
complexo de vias transmite mensagens de dor a partir da periferia, através das fibras aferentes
primárias, para o sistema nervoso central (STEEDS, 2009). Os receptores nociceptivos são
representados pelas terminações nervosas livres presentes nas fibras mielínicas A-δ e
amelínicas C. A atividade dos nociceptores é modulada pela ação de substâncias algiogênicas
(SMIDERLE, 2008). Estas são responsáveis pela hiperalgesia termomecânica e pela
vasodilatação observada em lesões mecânicas, inflamatórias e isquêmicas.
Existem três mecanismos básicos para a percepção da dor: 1 ) transdução, que é o
processo de ativação dos nociceptores através da transformação de um estímulo nóxico
mecânico, térmico ou químico; 2) transmissão, conjunto de vias que permitem a propagação
do impulso nervoso, gerado ao nível de nociceptor, ao sistema nervoso central; 3) A
modulação, que é o processo de supressão da dor ativadas pelas próprias vias nociceptivas
(VANDERMEULEN, 2000)
Entre os receptores periféricos e o cérebro, existem duas vias mediadoras dos
estímulos dolorosos: a via neoespinotalâmica e a via paleoespinotalâmica (LÜLLMANN et
al., 2000). Através da via neoespinotalâmica, as sensações térmicas e dolorosas são trazidas
dos membros e do tronco do lado oposto ao do estímulo. Esta via medeia a sensação de dor
rápida e localizada (somatotropia) (ROCHA et al., 2007). Ao contrário da via
neoespinotalâmico, a via paleoespinotalâmico não tem organização somatotrópica, assim ela é
responsável pela dor profunda do tipo crônica, correspondendo à chamada dor em queimação
(LÜLLMANN et al., 2000).
A dor nociceptiva está relacionada à lesão de tecidos ósseos, musculares ou
ligamentares e ocorre por ativação fisiológica de receptores ou da via dolorosa (Figura 1 A).
Já a dor neuropática é o resultado da ativação anormal da via nociceptiva. É iniciada por uma
lesão ou disfunção do sistema nervoso. As principais doenças relacionadas a dor neuropática
são: diabetes mellitus, neuralgia pós-herpética, neuralgia trigeminal, dor regional complexa,
acidente vascular encefálico, esclerose múltipla, lesão medular, entre outros (BENETT et al.,
2006). As dores nociceptiva e neuropática muitas vezes podem coexistir, contudo, a dor
neuropática requer abordagens analgésicas específicas, diferentes das abordagens analgésicas
destinadas às dores nociceptivas (SMIDERLE, 2008).
30
3.2.1. Dor inflamatória
As células envolvidas no processo inflamatório produzem uma série de mediadores
químicos como bradicinina, serotonina, histamina; mediadores lipídicos como os produtos da
cascata do ácido araquidônico, além de citocinas. Estes mediadores promovem a
sensibilização dos nociceptores e consequentemente há diminuição no limiar de percepção do
estímulo doloroso (Figura 1 B) (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998; BONICA; YAKSH;
LIEBESKIND, 1990; MEYER; CAMPBELL; RAJA, 1994)
A estimulação de nociceptores produz um reflexo axônico local, resultando na
liberação de neuropeptídios (substância P (SP) e neurocinina A (NKA), o que contribui para o
aumento do processo inflamatório e da hiperalgesia. Os neuropeptídeos liberados provocam a
vasodilatação, aumento da produção de enzimas lisossômicas, liberação de prostaglandinas e
interleucinas além da síntese do óxido nítrico (NO), estimulando e sensibilizando os
nociceptores (RANG et al., 2007).
Analgésicos periféricos também podem apresentar propriedades anti-inflamatória,
antipirética e antiagregante plaquetária, sendo denominados como agentes anti-inflamatórios,
uma vez que inibirem a liberação de prostaglandinas (RANG et al., 2007). Os antiiflamatórios não esteroidais, inibem o sistema enzimático COX, responsável pela síntese
de alguns eicosanóides (PGD2, PGE2, PGI2, TXA2), que medeiam o processo inflamatório
(BRUM-JÚNIOR, 2006).
31
A. Dor Nociceptiva
Estímulos nociceptivos
Dor
Resposta autonômica
Reflexo de retirada
Calor
Frio
Mecânica
Força
Química
Irritantes
Nociceptor
sensorial
Cérebro
Medula espinhal
B. Dor Inflamatória
Inflamação
Dores expontâneas
Dor hipersensitiva
Reduzir o limiar: alodinia
Aumento da resposta
Macrófagos
Mastócitos
Neutrófilos
Granulócitos
Dano Tecidual
Nociceptor
sensorial
Cérebro
Medula espinhal
Figura 1: Mecanismo específico da dor nociceptiva (A) e dor inflamatória (B) adaptado (WOOLF, 2004).
3.3. Anti-inflamatórios esteroidais e não-esteroidais
Os anti-inflamatórios esteroidais, também denominados de glicocorticóides ou
corticosteróides, fazem parte de um grupo de hormônios cujo mecanismo clássico de ação
envolve a interação com um receptor de glicocorticóides e a regulação da expressão de
proteínas (CASTRO; GODINHO, 2003). As drogas anti-inflamatórias esteroidais bloqueiam
a liberação de prostaglandinas pela inibição da atividade de fosfolipase A , que interfere na
2
cascata do ácido araquidônico. Assim, indivíduos que utilizam este tipo de anti-inflamatório
por períodos prolongados ficam predispostos a infecções por seus efeitos imunossupressores
(MILLER, STANTON; DERERY, 2001). Segundo Castro e Godinho (2003) o uso
prolongado de derivados da cortisona também promove o aumento da pressão arterial devido
à retenção de sódio além de está relacionado com úlceras gástricas devido à inibição da
produção de prostaglandinas. As principais drogas desta classe são a dexametasona,
hidrocortisona, predinisolona e predinisona.
32
Os anti-iflamatórios não esteroidais (AINES) estão entre os mais utilizados dentre
todos os agentes terapêuticos, devido a suas três principais ações farmacológicas: antiinflamatória, analgésica e antipirética. Na atualidade, já existem mais de 50 AINES diferentes
no mercado, contudo, nenhum deles se apresenta como fármaco ideal no controle e/ou na
modificação dos sinais e sintomas do processo inflamatório, principalmente aqueles que
ocorrem nas doenças articulares inflamatórias comuns (BOVILL, 2002; RANG et al., 2007).
Os AINES clássicos são aqueles que tratam o processo inflamatório através da inibição
não seletiva da enzima COX e tem mecanismo de ação além de estruturas químicas
completamente diferentes dos fármacos anti-inflamatórios esteroidais (Figura 2). Nesta classe
estão inclusos diversos grupos: salicilatos (está incluída a aspirina, o primeiro e mais popular
dos antiinflamatórios); derivados indolacéticos (indometacina e diclofenaco); derivados do
ácido propiônico (ibuprofeno e naxoprofeno); os fenamatos (ácido flufenâmico); alcanonas
(nabumetona); pirazolonas (fenilbutazona); oxicans (piroxican e meloxican); entre outros
(PALASKA et al., 2002).
Estímulo
traumático
Fosfolipídeos
Corticóides
Fosfolipase A2
Ácido araquidônico
Lipoxigenase
Leucotrienos
Cicloxigenase
COX-1
AINES
COX-2
Prostaglandinas
Prostaciclinas
Tromboxanos
Figura 2 : Cascata da inflamação e atuação dos antiinflamatórios
COXIB’s
33
Entretanto, estudos apontam uma série de reações adversas para os AINES, como por
exemplo: toxicidade gastrintestinal, alterações na função renal, “rashes” cutâneos, efeitos no
sistema nervoso central e infiltrados pulmonares (HAWKEY, 2001). Inicialmente pensou-se
que essas reações fossem apenas devido a efeitos locais e diretos dos AINES na mucosa
gatrointestinal, uma vez que o ácido aracdônico produz a desestabilização nos fosfolipídios de
membrana promovendo lesões gástricas por retrodifusão. Posteriormente observou-se efeitos
indiretos sob a cadeia da inibição da síntese das prostaglandinas (PGs) pelos AINES que
promove a diminuição na produção de PGE pela mucosa gastrintestinal, tendo como resultado
o aumento da secreção gástrica e a diminuição da produção de fatores protetores na barreira
mucosa superficial, gerando o processo de ulceração. Estudos apontam que 80 % das úlceras
gástricas estão associadas à infecção crônica com o Helicobacter pilori ou uso de AINES,
com ambos prejudicando as defesa gastrointestinais e persiste a acidez e outros fatores
nocivos que causem danos à mucosa (PÉREZ et al., 2002; MINCIS, 2003; CHAN;
GRAHAM, 2004).
Os efeitos adversos dos AINES, tanto os gástricos como os extragástricos, ocorrem
provavelmente devido às mesmas ações biológicas que os tornam anti-inflamatórios, ou seja,
a inibição da COX. Investimentos feitos na última década relacionados à elucidação das duas
isoformas COX-1 e COX-2, com a presença da COX-1, envolvida nos processos fisiológicos,
e COX-2 mais relacionada à produção induzida e exagerada de PGs, contribuiu de forma
efetiva para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos em doenças inflamatórias e
degenerativas, aumentando o interesse da indústria farmacêutica na busca de novos fármacos
antiinflamatórios (TURINI; DUBOIS, 2002).
O meloxican, AINE não específico, possui a habilidade de inibir a COX-2 dez vezes
mais que a COX-1, quando comparamos com o diclofenaco, piroxicam e naproxeno. Esse
AINE apresentou boa atividade analgésica e anti-inflamatória, alem de maior tolerabilidade
gástrica (RIOJA et al., 2002). A partir de estudos com este fármaco, surgiram os coxibs,
AINEs seletivos para a COX-2. Estes foram desenvolvidos com o intuito de prevenir os
efeitos adversos gastrintestinais dos AINEs clássicos, uma vez não há redução total de
prostaglandinas gastroprotetoras oriundas da COX-1, mantendo-se a eficácia anti-inflamatória
(SINGH et al., 2004).
Entre os coxibs, encontram-se os celecoxibe, rofecoxibe, eterocoxibe, lumiracoxibe,
paraminofenol, glicosaminoglicano, entre outros. Apesar da eficácia anti-inflamatória e da
baixa toxicidade gastrintestinal, estudos demonstraram que os inibidores seletivos da COX-2
podem induzir ou agravar hipertensão arterial, uma vez que promovem retenção de sais como
34
o sódio. O rofecoxibe, celecoxibe e valdecoxibe foram recolhidos do mercado por aumentar
os riscos cardiovasculares através de enfarte do miocárdio (RAO, CHEN; KNAUS, 2006;).
3.4. Propriedades Biológicas das Imidazolidinas
Os compostos que possuem o anel imidazolidínico são denominados quimicamente de
imidazolidina-2,4-diona ou apenas hidantoína. Esta molécula despertou grande interesse,
devido, sobretudo à sua ocorrência na natureza (DUTCHER, JOHNSON, BRUCE, 1945;
OLIVEIRA et al, 2008). A imidazolidina-2,4-diona sintetizada pela primeira vez por Klason
em 1890 está estruturalmente associada a 2-tioxo-imidazolidina-4-ona, sendo consideradas
bioisósteras, ou seja, ambas possuem atividade biologia semelhantes (Figura 3). As
hidantoínas e seus derivados estão sendo amplamente pesquisados desde sua descoberta por
Bayer, em 1861, (BATEMAN,1980) pois, apresentam inúmeras propriedades farmacológicas
importantes o que os coloca como potenciais novos fármacos.
H
Y
HN
5
4
3
2
H
1 NH
X
(a) X= O, Y=O
Figura 3: Hidantoína (imidazolidina-2,4-diona).
Por sua reatividade química e consequente afinidade por biomacromoléculas, são
atribuídas ao núcleo hidantoínico diversas atividades biológicas. Os efeitos biológicos dos
derivados hidantoínicos, produzidos pelas modificações estruturais no anel imidazolidínico,
possuem uma enorme diversidade tais como, anti-inflamatória (UNANGST et. al., 1993;
MALTA et. al., 2005), antifúngica (CARVALHO et al., 1989), antibacteriana (LEACH et al.,
1947; COURVALIN et al., 1990; LIMA et al., 1992), regulador seletivo dos receptores
androgênicos (ZANGH, et al, 2006), esquistomicida (PITTA, et al., 2006; OLIVEIRA, et al.,
2004), hipoglicêmica (ROY et al., 1960), herbicida (CEGAN; VECERA, 1984), citotóxica
(REDDY et al., 2010), tuberculostática (KIEC-KONONOWICZ;
SZYMANSKA, 2002)
entre outras. O núcleo imidazolidínico também está presente em medicamentos que fazem
parte da relação de Medicamentos Essenciais da Organização Mundial de Saúde (World
35
Health Organization, 1999) e também da Relação Nacional de Medicamentos Essenciais
(BRASIL, 1999), como hipnóticos e anticonvulsivantes, pois estes possuem o análogo
estrutural fenitoína (5-etil-5-fenil-3-metil-imidazolidina-2,4-diona), amplamente utilizado na
terapêutica por suas propriedades antiepilépticas, conhecido comercialmente como Nirvanol®,
(OZKIRIMLI; HAMALI, 1995).
Serão apresentados a seguir alguns estudos recentes que relatam os efeitos
farmacológicos das hidantoínas destacando seu potencial como núcleo base para o
desenvolvimento de novos fármacos.
3.4.1. Atividades Anti-inflamatórias
Malta, em 2005, avaliou a atividade biológica de novos derivados bioisósteros das
séries 3-(4-bromo-benzil)-5-benzilideno-2-tioxo-imidazolidin-4-ona e 5-benzilideno-3-[2oxo-2-(4-bromo-fenil)-etil]-2-tioxo-imidazolidina-4-ona (Figura 4). Foram realizados testes
para a avaliação da atividade anti-inflamatória através das metodologias de edema de pata
induzido por carragenina e bolsão inflamatório, além da atividade antinociceptiva realizada
utilizando os testes de contorções abdominais induzidas por ácido acético, formalina e placa
quente. Os resultados obtidos mostraram que as moléculas testadas apresentam significativa
atividade anti-inflamatória e antinoceciptiva.
O
H
N
N
CH
S
H
R
Figura 4: Estrutura básica dos derivados 5-benzilideno-2-tioxo-imidazolidin-4-ona (MALTA, 2005)
3.4.2. Atividade Antifúngica
Thanusu et al. (2010), desenvolveram uma nova série de bi-hidridos heterocíclicos a
partir da junção dos núcleos piperidina e tioidantoina, 3-(3-alquil-2,6-diarilpiperina-4-ilidena)-2-tioxoimidazolidina-4-onas (Figura 5), e sua atividade antifúngica foi avaliada frente
36
aos microrganismos Aspergillus flavus, Candida albicans, Candida 6 e Candida 51. Os
compostos sintetizados apresentaram resposta antifúngica efetiva em comparação ao
fluconazol (50 µg/mL) que foi utilizada como fármaco padrão. A concentração inibitória
mínima (MIC) em µg/mL, apresentou valores distintos para cada produto, estando a variação
de concentração das substâncias entre 6.25 e 100 µg/mL.
O
N
HN
N
1
R
S
2
R
N
H
X
X
Figura 5: Estrutura geral dos derivados 3-(3-alkil-2,6-diarilpiperina-4-ilidena)-2-tioxoimidazolidina-4-onas
(THANUSU, 2010).
Uma nova série de derivados benzimidazol foi sintetizada por Küçükbay et al., (2003).
Os compostos foram avaliados quanto à atividade antifúngica in vitro frente à cepas de
Candida albicans e Candida tropicalis. Nove dentre os dezessete novos compostos
sintetizados indicaram inibição no crescimento das cepas. Entre os compostos testados, a 2,4dioxi-1,3-difenil-7,8-benzo-6-etil-9-(2-feniletil)-1,3,6,9-tetrazaspiro[4.4]nonano (Figura 6) foi
o composto mais eficaz com MIC = 50 µg/mL frente à C.albicanis e C. tropicalis.
Ph
PhCH2CH2
N
N
PhCH2CH2
O
N
N
O
Ph
Figura 6: 2,4-dioxi-1,3-difenil-7,8-benzo-6-etil-9-(2-feniletil)-1,3,6,9-tetrazaspiro[4.4]nonano (KÜÇÜKBAY et
al., 2003)
3.4.3. Atividade antibacteriana
Szymanska et al. (2002), sintetizaram uma série de derivados 5-arilideno
hidantoína (Figura 7) com diversas substituções 5-cloroarilideno-2-amino e seu potencial
37
antimicrobiano foi avaliado. Estes pesquisadores obtiveram seus melhores resultados frente as
bactérias: Mycobacterium tuberculosis, Moraxella catarrhalis e Streptococcus pneumoniae .
Os derivados 2-Cloro- e 2,4-diclorobenzilideno mostraram-se inibidores do M. tuberculosis
(100% e 96%, respectivamente). O derivado hidantoínico 2,6-diclorobenzilideno apresentou
atividade significativa contra o M. catarrhalis com MIC = 20 µg/mL em comparação ao ácido
nalidíxico, que obteve MIC = 39 µg/mL. Os derivados hidantoínicos 2,6-dicloroarilideno
obtiveram resultados positivos frente ao S. pneumoniae.
Observou-se que as moléculas
sintetizadas que não possuiam um substituinte amina houve uma redução de atividade
antibacteriana frente as cepas testadas.
O
R1
O
R1
CH
CH
HN
NH
CH3 J
NH
HN
Na, EtOH
SCH3
S
2
1
R1
O
CH
NH
N
R2
HN
(CH2)n
3a- y
Figura 7: Esquema de síntese dos derivados 5-arilideno hidantoina (SZYMANSKA et al., 2002).
3.4.4. Atividade esquistossomicida
Pitta et al. (2006) avaliaram a atividade esquistossomicida de derivados
imidazolidínicos. Os resultados in vitro com o S. mansoni mostram que os vermes foram mais
sensíveis aos derivados 3-benzil-5-(4-cloro-arilazol) -4-tioxo-imidazolidina-2-ona, numa
concentração de 58µM, que matou 100% dos vermes após 24 h de contato, causando
alterações na superfície do tegumento dos vermes com a formação de bolhas e “peeling”.
38
Na procura de novos compostos esquistossomicidas, Oliveira et al. (2004),
sintetizaram uma série de quimioterápicos derivados imidazolidínicos: (Z)-3-benzil-5benzilideno-imidazolidin-2,4-dionas, (Z)-3-benzil-5-benzilideno-2-tioxo-imidazolidin-4-onas
e
(Z)-5-benzilideno-3-(2-oxo-2-fenil-etil)-2-tioxo-imidazolidin-4-onas,
que
possuem
substituintes diferentes na posição para dos anéis aromáticos. Este estudo mostrou que entre
os
derivados
testados
o
composto
(Z)-3-(4-cloro-benzil)-5-(4-nitro-benzilideno)-
imidazolidina-2,4-diona (Figura 8), que contém um substituinte nitro no anel benzilideno foi a
molécula o que obteve a melhor atividade esquistossomicida in vitro.
O
N
CH
N
CH2
Cl
O
H
NO2
Figura 8: (Z)-3-(4-cloro-benzil)-5-(4-nitro-benzilideno)-imidazolidina-2,4-diona (OLIVEIRA, et al., 2004).
3.4.5. Atividade Citotóxica
Reddy e colaboradores, em 2010, sintetizaram uma série de compostos hidantoínicos
com substituição (Z) -5 - (N-3-benzilindol ilmetileno) imidazolidina-2,4-diona (Figura 9), que
é um análogo estrutural da aplisinopsina, e que incorporam uma variedade de substituintes
indol e N-benzil. A aplisinopsina é um derivado indol proviniente de algas marinhas e é um
potente agente citotóxico frente a diversas linhagens de células. Estes análogos foram
avaliados quanto à sua atividade anti-proliferativa frente a MCF-7 e MDA-231, que são
linhagens de células cancerígenas da mama, como também frente a A549 e H460, que são
linhagens celulares cancerígenas de pulmão. Dentre os análogos, (Z)-5-((1-(2-Bromobenzil)1H-indol-3-yl)metileno)-imidazolidina-2,4-dione
e
(Z)-5-((1-Benzil-5-metil-1H-indol-3-
yl)metileno) imidazolidina-2,4-diona apresentaram valores IC50 de 4,4 e 5,2 µM,
respectivamente, em comparação com 5-fluorouracil (IC50 = 15,2 µg/lm) frente a linhagem
célular MCF-7. O que caracteriza os novos derivados hidântoínicos como candidato a drogas
anti-neoplásicas.
39
O
O
NH
CH3
HN
NH
CH3
HN
O
O
N
N
H
H
H
Br
2
1
Figura 9: (1) (Z)-5-((1-Benzil-5-metil-1H-indol-3-yl)metileno) imidazolidina-2,4-diona e (2) (Z)-5-((1-Benzil5-metil-1H-indol-3-yl)metileno) imidazolidina-2,4-diona (REDDY, et al., 2010)
Sztanke, et al. (2006), sintetizaram compostos hidantoínicos a partir do 1-(4-oxo-8aril-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1-c][1,2,4]triazin-3-il] (Figura 10). Foram avaliados em
relação a sua atividade antitumoral frente às linhagens LS180 (células de adenocarcinoma de
cólon), SiHa (células de câncer de útero) e T47D (células de carcinoma de mama). O
composto 1-[4-oxo-8-(3-clorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1-c][1,2,4]triazin-3-il] foi o
que obteve melhor resultado frente a linhagem SiHa, com inibição do crescimento equivalente
a 41 e 52%, nas concentrações de 10 e 50 μgmL–1, respectivamente. Já o composto 1-[4-oxo8-(3,4-diclorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1 c][1,2,4]triazin-3-il] apresentou o maior
potencial para reduzir o crescimento das linhagens LS180 e SiHa apenas na dose mais elevada
(50 mg/ mL-1). Foi observado que a razão de inibição de células cancerígenas é duas vezes
maior em relação à inibição de linhagens normais HSF (células fibrobláticas epitelial humana)
e Vero, (células do epitélio renal do macaco verde africano).
Cl
Cl
Cl
N
N
N
N
N
N
N
N
O
COOC2H5
O
(1)
COOC2H5
(2)
Figura 10: (1) 1-[4-oxo-8-(3-clorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1-c][1,2,4]triazin-3-il] ; (2) 1-[4-oxo-8(3,4-diclorofenil)-4,6,7,8-tetrahidroimidazol[2,1 c][1,2,4]triazin-3-il] (KRZYSZTEF, et al., 2006).
40
3.5. Propriedades Biológicas dos derivados indólicos
Moléculas que possuem o núcleo indol tem sido amplamente estudadas por
apresentarem propriedades biológicas como: anti-inflamatória (MOHAMAD et al., 1994;
MISRA et al., 1996; UCHÖA et al., 2004), anticonvulsivante (EL-GENDY et al, 1993),
cardiovascular (KUMAR, 1986), antibacteriano (DANDIA; SEHGAL; SING, 1993) entre
outras. O núcleo indol também está presente na Indometacina, medicamentos amplamente
utilizados na terapêutica por suas propriedades anti-inflamatória e antinociceptiva
reconhecidas.
OBJETIVOS
42
4. OBJETIVOS
4.1. Geral
Avaliar as atividades anti-inflamatória e antinociceptiva dos derivados indolimidazolidínicos 5-(1H-Indol-3-il-metileno)-2-tioxo-imidazolidin-4-ona (LPSF/NN-56) e 3(4-Bromo-benzil)-5-(1H-indol-3-il-metileno)-2-tioxo-imidazolidin-4-ona
(LPSF/NN-52)
comonovos protótipos para o desenvolvimento de fármacos anti-inflamatórios e analgésicos.
4.2. Específicos

Realizar uma triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50 dos
compostos LPSF/NN-52 e LSPF/NN-56.

Avaliar a atividade anti-inflamatória dos derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e
LPSF/NN-56, utilizando modelos experimentais de inflamação aguda como bolsão de
ar, peritonite e pleurisia induzidas por carragenina e permeabilidade vascular induzida
por ácido acético;

Determinar as concentrações do TNF alfa e IL-1β no exsudato inflamatório de animais
tratados com os compostos em estudo nos modelos experimentais de bolsão de ar e
peritonite induzida por carragenina;

Avaliar a atividade antinociceptiva dos derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e
LPSF/NN-56 nos modelos experimentais de nocicepção induzida por ácido acético,
nocicepção induzida por formalina e teste da placa quente.
MATERIAL E MÉTODOS
44
5. MATERIAL
5.1. Substâncias
Os derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foram fornecidos
pelos colaboradores do Laboratório de Planejamento e Síntese de Fármacos da UFPE. Os
compostos foram obtidos através do esquema reacional mostrado na figura 11. As
características físico-químicas dos compostos estão descritas na tabela 1.
O
N
N
H
CN
S
N
H
H
O
CH
H
N
S
N
H
N
H
NN-56
Br
O
CH
N
H
CH C C OCH 2CH 3
O
N
CH 2 Cl
CH 2
N
Br
S
H
NN-52
Figura 11: Esquema reacional dos derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPFS/NN-56
45
Tabela 1: Nome químico e características físico-químicas dos derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-56 e
LPSF/NN-52.
Código
LSPF
NN-56
LSPF
NN-52
Nome Químico
5-(1H-indol-3-ilmetileno)-4-tioxoimidazolidin-2-ona
3-(4- bromo-benzil)5-(1H-indol-3-ilmetileno)-4-tioxoimidazolidin-2-ona
Massa
243
410,02
Ponto de
fusão
285-287ºC
Índice de
Retenção
0,46 sistema
de eluição nhexano/AcOet
(7:3)
217-218ºC 0,51 sistema
de eluição
CHCl3/MeOH
(95/05)
Rendimento
(%)
96%
89%
Fonte: BRANDÃO et al., 2007
5.2. Equipamentos
Balança analítica, câmara de fluxo laminar, câmara de CO2, centrífuga, analisador
hematológico, aparelho de ELISA e placa quente (INSIGHT).
5.3. Material de consumo
Kit de citocinas: Kit Mouse TNF-α Elisa (eBioscience) e Kit Mouse IL-1β Elisa
(eBioscience); Reagentes: éter etílico (Reagente Analítico Dinâmica), ácido acético glacial
C2H4O2 (VETEC), citrato de fentanila (Cristália), heparina sódica 5.000 ul/ml (Cristália),
evans blue (Sigma), HEMSTAB EDTA 15gl/dl (Labtest), cloridrato de ketamina (Vetbrands),
cloridrato de xilazina (Vetbrands); álcool iodado, álcool 70%, solução salina 9%, PBS, placas
de 96 poços; vidraria; seringas; agulhas; bisturis; luvas; máscaras; óculos de proteção.
46
5.4. Animais Experimentais
Foram utilizados camunongos albinos swiss (Mus musculus), pesando entre 20 e 25g provenientes do Biotério do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de
Pernambuco. Os animais foram acondicionados em gaiolas de polietileno com grades de aço
inoxidável e maravalha como cobertura, tendo acesso livre à água e ração balanceada,
mantidos num ambiente com temperatura de 22°C  2 e luminosidade controlada,
proporcionando um ciclo claro-escuro de 12 horas. Todos os animais foram submetidos a
jejum, com a retirada da ração cerca de 4 horas antes do início do experimento. Durante o
experimento os animais tiveram livre acesso à ingestão de água. Os animais forão mantidos de
acordo com as normas internacionais do Conselho de Laboratório de Animais Experimentais
(ICLAS).
6. MÉTODOS
6.1. Procedimentos éticos
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas sugeridas pelo
Colégio Brasileiro para Experimentação Animal (COBEA) e com as normas estabelecidas
pelo National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals. Este projeto
foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal de
Pernambuco (CEUA-UFPE), sob protocolo de número 23076.017928/2010-25. Este projeto
encontra-se em concordância com as normas vigentes no Brasil, especialmente a Lei 9.605art. 32 e decreto 3.179- art. 17, de 21/09/1999, que trata da questão do uso de animais para
fins científicos.
47
6.2. Toxicidade
Para a avaliação da toxicidade dos derivados LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foi utilizada
a metodologia recomendada pela Organisation for Economic Cooperation and Development
(OECD, 2001).
O teste de toxicidade aguda consistiu na administração da dose de 2000 mg/kg dos
derivados em estudo. Foram utilizados 3 grupos, cada um contendo três animais (fêmeas),
totalizando 9 animais para o experimento. Este procedimento foi realizado em duplicata. Não
havendo morte dos animais, a amostra não será considerada tóxica. Os derivados indolimidazolidínicos foram solubilizados em uma mistura de solução salina e Cremophor numa
concentração de 5% da solução e um grupo recebeu apenas o veículo. Após a administração
os animais foram observados continuamente nas primeiras duas horas e depois a cada 24
horas diariamente durante 14 dias, para a verificação de qualquer alteração comportamental
ou nas atividades fisiológicas. Os animais foram avaliados pelo método de screening
hipocrático, o qual verifica qualquer comprometimento do animal como: o estado de
consciência, disposição, atividade e coordenação do sistema motor e tônus muscular,
atividade do sistema nervoso central e autônomo do animal. Também foram observados o
consumo de água, ração e o peso dos órgãos (Fígado, Rim e Baço).
6.3. Atividade Anti-inflamatória
Para a avaliação da atividade antiinflamatória dos derivados indol-imidazolidínicos
LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foram utilizados os ensaios de Bolsão de ar subcutâneo,
peritonite e pleurisia induzidos por carragenina. Os parâmetro avaliados foram a migração
celular e a concentração de citocinas no exsudato inflamatório. O teste da permeabilidade
vascular foi feito para determinar a exsudação plasmática.
48
6.3.1. Método do Bolsão de Ar Subcutâneo.
Inicialmente foi feita a indução de uma bolsa de ar no dorso dos animais através da
injeção de ar estéril. No primeiro dia, injetou-se 2,5 mL de ar estéril no dorso do animal,
repetindo-se o procedimento após 72 horas. No sétimo dia do ensaio os animais receberam,
por via oral, os derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 na, dose de 3mg/kg,
10mg/kg e 30mg/kg, estad doses foram determinada por Carmino e colaboradores, em 2008.
Foi administrado também por via oral indometacina (10mg/Kg) e um grupo controle recebeu
veículo (salina contendo 5% de cremophor). Após sessenta minutos, 1mL de uma solução de
carragenina a 1% foi injetado dentro da bolsa de ar. Decorridas 6 horas após a aplicação do
agente flogístico, os animais foram eutanasiados em câmara de CO2 e as bolsas lavadas com 3
mL de solução salina contendo EDTA como líquido de arraste. A contagem de leucócitos
totais foi realizada em analisador hematológico ABX micros 60 (KIM et al., 2006). Os
exsudatos foram centrifugados e uma alíquota do sobrenadante guardado a -20ºC para análise
das citocinas.
6.3.2. Peritonite Induzida por Carragenina
Os animais receberam os derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas
doses de 10mg/kg e 3mg/kg, respectivamente. Estas doses foram escolhidas de acordo com
ensaios prévios. A indometacina, droga anti-inflamatória não esteroidal, foi administrada via
oral na dose de 10mg/Kg. O grupo controle recebeu veículo (salina contendo 5% de
cremophor). Uma hora após o tratamento, a inflamação foi induzida por aplicação
intraperitoneal de 0,1 mL/10 g do agente flogístico carragenina (1% em salina). Quatro horas
após a indução da inflamação os animais foram eutanasiados em câmara de CO2, sendo
injetado na cavidade peritoneal 2 mL de solução salina contendo EDTA. A contagem de
leucócitos totais foi realizada em analisador hematológico micros 60 (PRASAD e GUPTA,
2005). Os exsudatos foram centrifugados e uma alíquota do sobrenadante guardado a - 20ºC
para análise das citocinas
49
6.3.3. Pleurisia Induzida por Carragenina
Os animais foram pré-tratados por via oral com LPSF/NN-52 (10mg/kg), LPSF/NN56 (3mg/kg), dexametasona (0,5mg/kg), indometacina (10mg/kg) ou veículo. Após uma hora,
os animais foram anestesiados com uma solução associada de Cloridrato de Ketamina e
Cloridrato de Xilazina, numa proporção de 1:1. A pleurisia foi induzida pela injeção
intrapleural de 0.1 mL de carragenina (1%) como previamente descrito (FRÖDE;
MEDEIROS, 2001). Após 4 h os animais foram sacrificados, o tórax aberto e a cavidade
pleural foi lavada com 1.0 mL de uma solução tampão fosfato estéril contendo heparina (20
IU/mL). A contagem total de leucócitos foi feita em analisador hematológico ABX micros 60.
6.3.4. Determinação dos Níveis de Citocinas (TNF-α e IL-1β)
Os exsudatos recolhidos do bolsão de ar subcutâneo e peritonite foram armazenados
em um freezer -20ºC para a determinação dos níveis de citocinas. A quantificação de IL-1β e
TNF-α desses exsudatos foi determinada pela técnica de ELISA sanduíche, utilizando Kits
específicos para camundongos, de acordo com as instruções do fabricante (eBioscience, San
Diego, Califórnia, EUA).
6.3.5. Permeabilidade Vascular Induzida por Ácido Acético.
Os efeitos das substâncias testes no aumento da permeabilidade vascular induzida por
ácido acético em camundongos foram determinados de acordo com o método descrito por
Whittle, 1964. Cada amostra em estudo foi administrada por via oral. Para os animais
pertencentes ao grupo controle, foi administrado o veículo. Uma hora após, cada animal foi
anestesiado com uma solução associada de ketamina e xilazina, numa concentração de 8:2,
por via intraperitoenal. Imediatamente foi injetado no plexo retro-orbital 0,2mL/camundongo
do corante Azul de Evans a 1% (Sigma, St. Louis, Missouri, USA). Em seguida, administrouse 0,5mL da solução de ácido acético (1%) na cavidade peritoneal. Após um intervalo de 30
50
minutos, os camundongos foram eutanasiados em câmara de CO2, a cavidade peritoneal foi
lavada com 2mL de salina, o exsudato foi coletado e centrifugado a 2000rpm durante 10min.
A absorbância do sobrenadante foi lida em filtro de 610nm com um leitor de ELISA (thermo
plate).
6.4. Atividade Antinociceptiva
Para a avaliação da atividade antinociceptiva dos derivados imidazolidínicos
LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foram utilizados os ensaios de nocicepção induzida por ácido
acético, nocicepção induzida por formalina e placa quente.
6.4.1. Nocicepção induzida por ácido acético
Os animais receberam o tratamento via oral com os derivados imidazolidínicos
LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas doses de 10mg/Kg e 3mg/Kg, respectivamente; diclofenaco
na dose de 30 mg/Kg (substância padrão) e o grupo controle recebeu o veículo. Após uma
hora, o ácido acético 1% foi injetado (0,1mL/10g do peso do animal) na cavidade peritoneal
dos animais para induzir contrações da musculatura abdominal e/ou alongamento dos
membros posteriores. Dez minutos após a aplicação do ácido, os camundongos foram
colocados em gaiolas de polietileno transparentes, onde foram observados e registrou-se o
número de contorções abdominais durante 20 minutos. A porcentagem de inibição das
contorções abdominais foi calculada comparando a média de contorções do grupo tratado com
o a média de grupo controle (KOSTER, 1959).
6.4.2. Método da placa quente.
Vinte e quatro horas antes de se iniciar o teste, os animais foram submetidos ao
estímulo, sendo colocados sobre uma placa de alumínio aquecida à temperatura fixa (55±1°C)
para se determinar o cut-off. Os animais selecionados para o experimento foram aqueles que
levaram até 20s para manifestar resposta ao estímulo térmico. Esta resposta corresponde ao
51
ato de lamber as patas, pular ou sapatear. Os camundongos aptos a avaliação da atividade
antinociceptiva foram tratados, por via oral, com veículo ou com os derivados LPSF/NN-52 e
LPSF/NN-56 (nas doses de 10 mg/kg e 3mg/kg, respectivamente). O fentanil, escolhido como
padrão, foi administrado por via subcutânea no dorso dos animais. Uma hora após a
administração das substâncias, os animais foram submetidos ao estímulo térmico. As medidas
de latência foram realizadas nos tempos de 0, 60, 120 e 180 minutos após o tratamento oral
(IRWIN, 1968).
6.4.3. Nocicepção induzida por formalina
Para a avaliação da nocicepção induzida pela formalina os animais receberam por via
oral os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas doses de 10 mg/kg e 3 mg/kg,
respectivamente, por via oral. Um grupo controle recebeu o veículo. O fentanil, utilizado
como padrão, foi administrado por via subcutânea no dorso dos animais. Quinze minutos após
a administração das subtâncias, foi injetado 20µL de formalina a 2,5% (formaldeído 0,92%
diluído em salina) na área subplantar da pata traseira direita dos animais. O tempo acumulado
em segundos que os animais permaneceram lambendo a pata foi medido em duas fases
distintas, sendo de 0 a 5 min (primeira fase) e 15 a 30 min (segunda fase), após a injeção de
formalina (VAZ et al, 1996; HUNSKAAR; HOLE, 1987).
6.5. Variáveis Analisadas
Neste estudo, foi analisada a migração de leucócitos polimorfonucleares (PMNL) e a
produção de citocinas pró-inflamatórias nos testes de avaliação da atividade anti-iflamatória.
Nos testes de atividade antinociceptiva, os animais foram submetidos a estímulos químicos e
térmicos no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético e no teste da placa
quente, respectivamente. Para a atividade antinociceptiva, foi analisado o número de
contorções abdominais, o tempo de latência e de lambida na pata do animal.
52
6.6. Análise dos Dados
Os dados experimentais foram estatisticamente avaliados por meio da análise de
variância (ANOVA) de uma via, seguido pelo teste de Bonferroni com intervalo de confiança
de 95%, utilizando-se o software Graph Pad prism. 5.0. Valores de “p” menores que 0,05
(p<0,05) foram considerados como indicativos de significância.
RESULTADOS
54
7. RESULTADOS
7.1. Toxicidade aguda.
Neste experimento os animais receberam doses de 2000 mg/kg (v.o.) dos
derivados indol-imidazolidínicos. Durante a avaliação do screening hipocrático, os
grupos que receberam o tratamento apresentaram piloereção, ptose e sonolência, logo
após a gavagem, (na primeira hora de observação), entretanto, nenhum animal veio a
óbito em 24 horas. Não foi observada nenhuma variação significativa no peso, consumo
de ração e água em relação aos animais dos grupos controles durante 14 dias de
observação. Não houve diferença no peso dos órgãos e na análise macroscópica dos
mesmos. Os resultados indicam que os derivados em estudo apresentaram baixa
toxicidade, tendo o valor da DL50 estimado em 2500 mg/kg, sendo considerada segura.
Os resultados deste teste estão representados na tabela 2.
Tabela 2: Evolução do peso corporal, consumo de ração, água e índice dos órgãos (média ± desvio
padrão), dos animais tratados com os derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 em
relação ao grupo controle.
Grupos
Dose
Consumo
Consumo de Peso dos Animais
Índice dos órgãos
(mg/Kg) de ração (g)
água (mL)
Inicial/Final (g)
Baço
Fígado Rim
LPSF/NN-52
2.000
12,5 ± 1,3
29 ± 2,9
20,13 - 25,6
0,007
0,060
0,006
LPSF/NN-56
2.000
15,0 ± 1,6
31 ± 4,7
21,03 - 30,6
0,011
0,069
0,006
17,7 ± 1,1
30 ± 8,3
20,60 - 29,0
0,006
0,061
0,006
Controle
*p < 0,05. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Bonferroni com
intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina + cremophor 5%).
7.2. Bolsão de Ar Subcutâneo
Para a avaliação da atividade anti-inflamatória pelo método do bolsão de ar
subcutâneo, os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 foram administrados, por via
oral, nas doses de 3, 10 e 30 mg/kg para ambas as substâncias com finalidade de definir
qual seria a melhor dose para a avaliação das demais metodologias. Os resultados da
atividade anti-inflamatória para este teste encontram-se na tabela 3. Todos os compostos
apresentaram atividade anti-inflamatória indicada por uma diminuição significativa na
migração celular quando comparados ao controle. Os resultados mostraram que para o
55
composto LPSF/NN-56 a melhor dose foi 3mg/kg inibindo 80,8% da migração celular.
Este composto não apresentou diferença significativa em relação ao fármaco utilizado
como padrão, indometacina (86,7% de inibição). O LPSF/NN-52 na dose de 10mg/kg
(72,1%), também apresentou inibição significativa da migração, contudo, foi inferior em
relação à inibição da indometacina (86,7%).
Tabela 3: Total de Leucócitos polimorfonucleares - PMNL (média  desvio padrão) e
percentual de inibição da inflamação dos grupos controle e tratados com os derivados
imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56.
Tratamento
Dose (mg/kg)
N° de PMNL/mL (x106)
Inibição %
LPSF/NN-52
3
6,88 ± 1,30*
56
10
4,36 ± 0,77*
72
30
6,24 ± 0,55*
60
3
3,00 ± 0,71*
81
10
5,36 ± 0,66*
66
30
6,70 ± 1,32
57
Indometacina
10
2,08 ± 0,46*
87
Controle
-
15,64 ± 1,9
-
LPSF/NN-56
*p < 0,05. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Bonferroni com
intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina + cremophor 5%).
7.2.1. Dosagem das citocinas TNF-α e IL-1β (Bolsão de ar)
A dosagem de citocinas TNF-α e IL-1β do exsudato inflamatório do teste do
bolsão de ar foi realizada através da técnica do ELISA sanduíche. Ambos os compostos
apresentaram uma diminuição significativa da produção de TNF-α, LPSF/NN-52
(488,32 pg/mL) e LPSF/NN-56 (218,70 pg/mL), quando comparados ao controle
(1096,47 pg/mL). O fármaco utilizado como padrão, indometacina, apresentou uma
concentração de TNF-α de 575,43 pg/mL. O exsudato do grupo tratado com o
LPSF/NN-56 (3mg/Kg) apresentou maior atividade na diminuição da concentração de
56
TNF-α em relação ao fármaco padrão utilizado neste estudo (Figura 12A). O LPSF/NN56 foi mais eficaz na redução do TNF-α que a indometacina.
Com relação à produção de IL-1β, ambos os compostos também diminuíram
a produção desta citocina quando comparados ao controle (870,96 pg/mL), onde o
LPSF/NN-52 apresentou concentração de 619,33 pg/mL e LPSF/NN-56 apresentou
concentração de 402,32 pg/mL. O fármaco utilizado como padrão, indometacina,
apresentou uma concentração de IL-1β de 134,89 pg/mL. O LPSF/NN-56 apresentou-se
mais ativo na diminuição da produção de ambas as citocinas do que o LPSF/NN-52
(Figura12B).
A
1200
Controle
Indometacina 10mg/Kg
LPSF/NN-52 10mg/Kg
LPSF/NN-56 3mg/Kg
TNF- (pg/mL)
1000
800
*
600
*
400
*
200
0
Grupos
B
1000
Controle
Indometacina 10mg/Kg
LPSF/NN-52 10mg/Kg
LPSF/NN-56 3mg/Kg
IL-1 (pg/mL)
800
*
600
*
400
200
*
0
Groups
Figura 18: Concentração de TNF-α (A) e IL-1β (B) em exsudato no teste de Bolsão de Ar. *p < 0,05.
Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Bonferroni com intervalo
de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina + cremophor 5%).
57
7.3. Peritonite Induzida por Carragenina
Para avaliar a possível participação de magrófagos residentes na resposta
mediada pelos derivados indol-imidazolidínicos foi feito o teste da peritonite induzida
por carragenina. Os resultados obtidos no teste da peritonite induzida por carragenina
estão representados na tabela 4. A análise dos dados demonstra que os compostos
LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas doses de 10mg/kg e 3mg/kg, respectivamente,
causaram uma redução significativa na migração de leucócitos polimorfonucleares. Não
houve diferença estatísticamente significante entre os dois derivados testados. O
fármaco de referência, indometacina inibiu a migração celular em 58%. A análise
estatística demonstra que os derivados indol-imidazolidínicos avaliados seguiram um
perfil semelhante ao da indometacina, não havendo diferença significativa na inibição
da migração celular entre eles.
Tabela 4: Número de PMNL (média  desvio padrão) e percentual de inibição da inflamação pelos
derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 no teste da peritonite induzida por carragenina.
Tratamento
Dose (mg/kg)
N° of PMNL/mL
(x106)
Inibição %
LPSF/NN-52
LPSF/NN-56
Indomethacina
10
3
10
4.80 ± 0.7 *
4.96 ± 0.9*
4.62± 0.3*
56
57
58
Controle
-
10.93± 1.6
-
*p < 0,005. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Bonferroni
com intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina + cremophor 5%).
7.3.1. Dosagem das citocinas TNF-α e IL-1β (Peritonite induzida pela carragenina)
A dosagem de citocinas TNF-α e IL-1β do exsudato inflamatório do teste da
peritonite foi realizada através da técnica do ELISA sanduíche. Ambos os compostos
apresentaram uma diminuição significativa da produção de TNF-α LPSF/NN-52 (91,1
pg/mL) e LPSF/NN-56 (144,3 pg/mL) quando comparados ao controle (794,3 pg/mL).
O fármaco padrão, indometacina, apresentou uma concentração de TNF-α de 1122.01
pg/mL, não inibindo a produção em relação ao controle (Figura 19A).
Com relação à produção de IL-1β, ambos os compostos também diminuíram a
produção desta citocina quando comparados ao controle (870,96 pg/mL), onde o
58
LPSF/NN-52 apresentou concentração de 274,15 pg/mL e LPSF/NN-56 apresentou
concentração de 167,49 pg/mL. O LPSF/NN-56 apresentou-se mais ativo na diminuição
da produção da citocina IL-1β do que o LPSF/NN-52 (Figura 19B).
A
1200
*
Control
Indometacin
LPSF/NN-52 10mg/Kg
LPSF/NN-56 3mg/Kg
TNF- (pg/mL)
1000
800
600
400
200
*
0
*
Groups
B
1200
*
Control
Indometacin 10mg/Kg
LPSF/NN-52 10mg/Kg
LPSF/NN-56 3mg/Kg
IL-1 (pg/mL)
1000
800
600
400
*
200
0
*
Groups
Figura 13: Concentração de TNF-α (A) e IL-1β (B) em exsudato no teste de peritonite induzida por
carragenina. *p < 0,05. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de
Bonferroni com intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina +
cremophor 5%).
7.4. Pleurisia Induzida por Carragenina
Os resultados da atividade anti-inflamatória pelo método da pleurisia induzida
por carragenina encontram-se na tabela 5. Todos os compostos apresentaram atividade
anti-inflamatória indicada por uma diminuição significativa na migração celular quando
comparados ao controle negativo. Não há diferença significante entre os dois derivados
imidazolidínicos. Os compostos LPSF/NN-52 na dose de 10mg/kg (49% de inibição) e
59
LPSF/NN-56 na dose de 3mg/kg (39% de inibição) apresentaram atividade inferior ao
padrão utilizado (indometacina na dose de 10mg/kg; 65% de inibição).
Tabela 5: Total de Leucócitos polimorfonucleares - PMNL (média  desvio padrão) e
percentual de inibição da inflamação dos grupos controle e tratados com NN-52 e NN-56 no
teste de Pleurisia induzida por carragenina.
Tratamento
Dose (mg/kg)
N° de PMNL/mL (x106)
Inibição %
LPSF/NN-52
10
4,34 ± 0,8*
49
LPSF/NN-56
3
5,22 ± 0,4*
39
Indometacina
10
3,02 ± 0,6*
65
Dexametasona
0,5
2,52 ± 0,5*
71
Controle
-
8,57 ± 0,7
-
*p < 0,05. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Bonferroni com
intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle (salina + cremophor 5%).
7.5. Permeabilidade Vascular Induzida por Ácido Acético
Com o intuito de avaliar a participação de aminas vasoativas na resposta antiinflamatória dos derivados foi feito o teste de permeabilidade vascular. Os compostos
LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 produziram uma significativa inibição da permeabilidade
vascular induzida por ácido acético em relação ao grupo controle. Os derivados não
apresentaram diferença significativa entre si, porém apresentaram inibição da
permeabilidade inferior a da indometacina (Figura 14).
60
Absorbance (nm)
1000
control
Indometacina (10mg/Kg)
LPSF/NN-52 (10mg/Kg)
LPSF/NN-56 (3mg/Kg)
800
600
400
*
*
*
200
0
1
Groups
Figura 14: Efeito dos compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 no teste da permeabilidade vascular
induzida por ácido acético. *p < 0,005. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguido
pelo teste de Bonferroni com intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle.
7.6. Nocicepção induzida por ácido acético
O teste do ácido acético é muito utilizado como triagem na avaliação de
compostos com atividade antinociceptiva. Os resultados da atividade antinociceptiva
dos derivados indol-imidazolidínicos no teste de nocicepção induzida por ácido acético
estão demonstrados na tabela 6. As substâncias testadas, LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56,
nas doses de 10mg/kg e 3mg/kg, respectivamente, promoveram redução significativa no
número de contorções abdominais em comparação ao grupo controle.
Tabela 6: Número de contorções abdominais (média  desvio padrão) e percentual de inibição dos
derivados indol-imidazolidínicos no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético .
Tratamento
Dose (mg/kg)
Contorções abdominais
(nº/20min)
Inibição
%
LPSF/NN-52
10
40.0  3.5*
52
LPSF/NN-56
3
30.8  5.9*
63
Diclofenaco
30
26.8  4.9*
68
Controle
-
83.54.8
-
*p < 0,005. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Bonferroni com
intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle.
61
7.7. Teste da placa quente.
Para verificar a participação de efeitos centrais na antinocicepção apresentada
pelos derivados indol-imidazolidínicos, foi feito o ensaio da placa quente. Os resultados
expressos na tabela 7 demonstram que apenas os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN56 nas doses testadas não apresentaram efeito antinociceptivo neste experimento.
Tabela 7: Tempo de latência (média  desvio padrão) ao estímulo térmico no teste da placa quente após
tratamento oral com os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56.
Tempo de Latência (Minutos)
Compostos
Dose(mg/Kg)
LPSF/NN-52
3
LPSF/NN-56
Fentanil
Controle (salina)
0
9,2 ±1,83
60
10,7±0,7
120
7,12 ±1,17
180
8,26±0,51
3
9,14 ± 0,65
10,66±1,75
11,28 ±01,69
10,88± 0,58*
0,2
9,54 ± 1,72
18,1±0,6*
11,3±0,9*
8,8±1,1
-
9,30 ± 0,49
9,7 ± 1,42
8,84 ± 1,31
8,58 ± 1,48
*p < 0,005. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Bonferroni com
intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle.
7.8. Nocicepção induzida pela formalina
Para confirmar os resultados anteriores, foi feito o teste da formalina, que
evidencia 2 fases: 0-5 mim (dor de origem central) e 15-30 mim (dor de origem
inflamatória). Os resultados expressos na tabela 8 indicam que os animais que
receberam tratamento oral com os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56
apresentaram redução significativa do tempo de lamber a pata quando comparados ao
grupo controle.
62
Tabela 8: Efeito dos derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPFS/NN-56 no teste de nocicepção
induzida por formalina.
Grupo
Dose
Tempo de Lambida (s)
(media ± desvio padrão)
Inibição %
(mg/Kg)
0–5 min
15–30 min
0–5 min
15–30 min
LPSF/NN-52
10
46,5 ± 7,4
6,65 ± 3,9*
19,5
96
LPSF/NN-56
3
38,9 ± 5,6*
22,60 ± 14,2*
32,6
87
Fentanil
0,2
4,1±0,4*
5,8±0,5*
93,0%
97%
Controle
___
57,8±4,1
177,9±13,9
____
____
*p < 0,005. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Bonferroni com
intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle.
DISCUSSÃO
64
8. DISCUSSÃO
Nos últimos anos, moléculas contendo os núcleos imidazolidínico e indol foram
apontadas como drogas promissoras para o tratamento da inflamação e da dor (MALTA,
2005; UCHÔA et al., 2009). Neste trabalho, os derivados indol-imidazolidínicos
LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 mostraram atividades anti-inflamatória e antinociceptiva
promissoras. No testes da toxicidade aguda, utilizando uma dose de 2.000 mg/kg, não
houve óbito dos animais.
Os animais foram avaliados pelo método de screening
hipocrático, onde foi observado ptose, piloereção e sonolência na primeira hora de
observação dos animais. Não houve alteração significativa no consumo de água,
alimento, peso corporal e peso dos órgãos dos animais em relação ao grupo controle.
Este resultado sugere que as subtâncias em estudo possuem baixa toxicidade.
Nossos resultados estão de acordo com os estudos realizados por Malta (2005)
na avaliação da toxicidade aguda de uma série de derivados imidazolidínicos 5benzilideno-3-(4-bromo-benzil)- e 5-benzilideno-3-(4-bromo-fenacil)-2-tioxoimidazoli
din-4-onas na dose de 1000 mg/kg. Os animais apresentaram alguns sinais de
toxicidade, entretanto nenhum animal veio a óbito. De acordo com o Guia 423 (OECD,
2001), quando não ocorre óbito de nenhum animal ao ser administrada a dose de 2000
mg/kg, o valor da DL50 (dose suficiente para matar 50% dos animais) é dito acima de
2000 mg/kg ou entre 2000 e 5000 mg/kg, sendo considerada praticamente atóxica. O
mesmo protocolo não aconselha a realização do teste de toxicidade aguda utilizando a
dose de 5000 mg/kg, uma vez que é difícil a solubilização da substância e
administração, protegendo assim a vida do animal. Deve-se utilizar a dose de 5000
mg/kg, caso seja necessário em um estudo para garantir a qualidade da saúde humana.
Litchfield e Wilcoxon (1949) sugeriram que a DL50 para substâncias puras, seja
determinada quando a dose letal aproximada (DLA) for inferior a 2000 mg/kg.
A carragenina, agente flogístico utilizado em todos os modelos de atividade antiinflamatória destes estudo, é um polissacarídeo sulfatado, derivado de algumas espécies
de algas. Esta substância é amplamente utilizada em diversos estudos experimentais por
induzir a migração de neutrófilos e por ter uma intensa ação quimiotática (SZABÓ;
BECHARA; CUNHA et al., 2005). Ela desencadeia uma inflamação aguda associada à
hiperalgesia envolvendo liberação sequencial de vários mediadores inflamatórios, como
por exemplo a histamina, serotonina, cininas, prostaglandinas e tromboxanos
(OLIVEIRA, 2002; CARVALHO, 2008; DAMAS et al., 1990). Testes realizados em
65
ratos comprovam que a sensibilização das articulações com carragenina aumentou a
nocicepção, o edema e a resposta inflamatória celular, indicando que a esta substância
ativa um mecanismo endotelinérgico (DAHER, 2004).
O experimento do bolsão de ar subcutâneo é o modelo animal que mimetiza a
artrite reumatóide. Este teste é utilizado como triagem para potenciais candidatos a
fármacos no tratamento da artrite. A bolsa de ar previamente inoculada no dorso do
animal forma uma membrana com características semelhantes à membrana sinovial
inflamada de pacientes com artrite reumatóide (SEDGWICK; LEES, 1986). Os
compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56, apresentaram atividade anti-inflamatória
significativa neste ensaio, e esta atividade não foi dose-dependente. Com base neste
resultados, sugere-se que estas substâncias podem ser potencias candidatas a fármacos
anti-artríticos. A indometacina, fármaco padrão deste teste, é um anti-inflamatório não
esteroidal (AINES) derivado do ácido indolacético, que inibe a atividade da enzima
cicloxigenase, diminuindo também a síntese de prostaglandinas e tromboxanos a partir
do ácido araquidônico (JURNAR; BRUNE, 1990). Experimentos de bolsão de ar
realizados por Sayar e Melli (2005) comprovam que a indometacina é capaz de diminuir
a migração leucocitária.
O teste da peritonite tem por finalidade avaliar a migração leucocitária por meio
da contagem total de leucócitos que são liberados durante o processo da inflamação
aguda. Esse processo ocorre após a inoculação do agente flogístico via administração
intraperitoneal. Vários mediadores pró-inflamatórios estão envolvidos neste tipo de
inflamação aguda, como neuropeptídeos, prostaglandinas, NO e citocinas (DE
CASTRO FRANCA et al., 2007). As citocinas pró-inflamatórias atuantes neste modelo
são IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α (PEREIRA, MEDEIROS, FRODE, 2006). A análise dos
dados neste experimento demonstra que os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas
doses de 10mg/kg e 3mg/kg provocaram uma redução significativa na migração de
leucócitos polimorfonucleares. Segundo Szabó e colaboradores (2005), dentre os
modelos utilizados em estudos experimentais, a indução na migração de neutrófilos com
uso de carragenina por via intraperitoneal é modelo consagrado na investigação do
processo inflamatório agudo, por utilizar uma substância com intensa ação quimiotática.
Sabe-se que os AINES, como a indometacina, ao inibir a síntese de prostaglandinas, que
são substâncias vasodilatadoras, acarretam a redução de fluxo sanguíneo de forma a
comprometer a migração de PMNL para a região da inflamação.
66
A avaliação dos níveis de citocina foi realizada nos exsudatos obtidos nos testes
de bolsão de ar e peritonite induzida por carragenina. Os compostos em estudo
diminuíram a concentração de TNF-α e IL-1ß nos exutados inflamatórios. A IL-1ß
promove a expressão de moléculas de adesão, migração de leucócitos e aumento da
permeabilidade vascular, indicando que IL-1ß é um importante mediador próinflamatório (HALLEGUA; WEISMAN, 2002). O TNF- α é uma citocina chave para a
resposta imune inata. O aumento da concentração desta citocina no organismo está
vinculada a uma série de doenças auto-imunes, como a artrite reumatóide. Com base
nos resultados obtidos podemos sugerir uma relação entre a diminuição da migração
celular e a redução na liberação destas citocinas pró-inflamatórias. Estudos descritos por
Yu et al. (2010), indicam que compostos hidantoínicos associados ao Zinco são potentes
inibidores da enzima precursora do TNF- α, o que torna o núcleo imidazolidínico um
alvo de pesquisa para novos anti-inflamatórios orais.
Estudos realizados por Das et al. (1998), descrevem a diferença entre os métodos
de bolsão de ar e peritonite induzida por carragenina. No método do bolsão de ar, os
neutrófilos são o tipo de célula em maior abundância. Estes são responsáveis pela
quimiotaxia. Na peritonite induzida pela carragenina existe uma quantidade elevada de
macrófagos e mastócitos. Estas células são atraídas ao local da inflamação pelas
citocinas pró-inflamatórias, principalmente IL-1β e TNF-α. Os resultados deste estudo
corroboram a utilização dos dois métodos distintos para avaliação da inflamação aguda;
podemos inferi que os compostos em estudo inibem a produção de mediadores por
neutrófilos e macrófagos, uma vez que apresentou ação nos testes do bolsão e peritonite,
respectivamente.
O modelo da pleurisia induzida por carragenina e caracterizado por duas fases
inflamatórias, uma aguda (4h) e uma crônica (48h), com diferentes mediadores
envolvidos. Ambas as fases estão associadas a uma acentuada reação inflamatória, nas
vias respiratórias, semelhante a que ocorre na asma humana (DALMARCO e FRÖDE,
2007). Estudos realizados por Frode, em 2000, comprovam que neste modelo
experimental existe a participação de citocinas com efeitos pró-inflamatórios (TNF-α,
IL-1β, IL-8) e anti-inflamatórios (IL-6, IL-10), com base nos resultados de que tanto
anticorpos-policlonais como citocinas-recombinantes, administrados diretamente na
cavidade pleural juntamente com a carragenina, reproduziram parcialmente seus efeitos
pró-inflamatórios ou antiinflamatórios. O influxo de leucócitos do sangue ao local da
inflamação desempenha um importante papel na modulação da resposta inflamatória
67
(SALEH, et. al., 1996; PENIDO, et al., 2006). Os resultados obtidos neste trabalho
mostraram que os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 apresentaram efeito antiinflamatório na fase aguda da pleurisia induzida por carragenina, inibindo a migração
leucocitária. Os derivados imidazolidínicos apresentaram atividade inferior à
Dexametasona, substância conhecida por seu efeito imunossupressor e fármaco padrão
relatado na literatura como eficaz para este tipo de experimento como também inferiores
a indometacina. (PERREIRA et al., 2006; DALMARCO, et al., 2009; FRÖDE, et al.,
2009).
Com a finalidade de avaliar a ação dos derivados imidazolidínicos deste estudo
na liberação de aminas vasoativas (histamina, bradicinina, serotonina) e formação de
edema, utilizou-se o teste de permeabilidade vascular induzida por ácido acético. Os
derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 produziram uma
significativa inibição da permeabilidade vascular. Este efeito provavelmente envolve a
diminuição na liberação de aminas vasoativas, com conseqüente redução do edema. A
indometacina, que também contém o núcleo indol, é eficaz em reduzir a permeabilidade
vascular e liberação de aminas vasoativas.
O ácido acético age liberando mediadores endógenos que estimulam os
neurônios nociceptivos. Em camundongos provoca, em nível peritoneal, um aumento
nos níveis de PGE2 e PGF2á, serotonina, histamina (DERAEDT et. al., 1980), liberação
de bradicinina e citocinas, como TNF-α e IL-8 (RIBEIRO et al., 2000). Deste modo
provoca comportamentos estereotipados que são caracterizados por contorções
abdominais, redução e incoordenação da atividade motora (LE BARS; GOZARIU;
CADDEN, 2001). Os resultados indicam que os derivados indol-imidazolidínicos deste
estudo reduziram significativamente o número de contorções abdominais em
comparação ao grupo controle. Ambas as susbtâncias apresentaram efeito semelhante ao
diclofenaco, fármaco de referência. Segundo Daher (2004) os AINES como
indometacina, diclofenaco e ibuprofeno são capazes de diminuir as respostas sensoriais
do sistema nociceptivo por uma ação central. Pode-se então sugerir que o mecanismo de
ação dos compostos utilizados neste estudo pode estar ligado à inibição da liberação de
aminas, prostaglandinas e consequentemente da cicloxigenase e inibição da liberação de
citocinas pró-inflamatórias como o TNF-á e IL-1â. Malta (2005), avaliou o potencial
anti-nociceptivo do derivado imidazolidínico 3-(4-bromo-fenacil)-5-(4-dimetilaminabenzilideno)-2-tioxo-imidazolidin-4-ona (LPSF/NN-165), pelo método de contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético. Os resultados indicam que a substância inibiu
68
de maneira eficaz as contorções em relação ao grupo controle com percentual de inibição
de 52 % na dose de 10 mg/kg.
O teste de contorções abdominais pelo ácido acético, apesar de ser um ensaio
bastante utilizado para triagem de drogas analgésicas, não distingue fármacos que atuam
por mecanismo central ou periférico. Para ter indícios do mecanismo de ação, foi
realizado o teste da placa quente. Este teste é um modelo animal para avaliação do perfil
de atuação de fármacos com atividade antinociceptiva de ação central. As respostas
comportamentais exibidas pelos animais neste ensaio como lamber as patas e pular, são
de nível supra-espinhal, sendo, portanto utilizado para verificação do efeito
antinociceptivo central (LE BARS; GOZARIU; CADDEN, 2001; RINALDI et al.,
2009).
Na avaliação da atividade antinociceptiva pelo método da placa quente, os
resultados demonstram que nos tempos de análise nenhum dos derivados testados
apresentou ação quando comparados ao controle. O fentanil não apresentou efeito
antinociceptivo no tempo de 180 minutos após o tratamento, pelo fato de este fármaco
ser um anestésico de curta duração (HONET et al., 1992). Este experimento
complementa os resultados obtidos no teste das contorções abdominais induzidas por
ácido acético, o que nos permitem concluir que o mecanismo de ação dos derivados
testados não está relacionado à ação central, estando provavelmente relacionado com a
capacidade das substâncias testadas de reduzir os níveis de TNF-α e IL-1, assim como
com a provável inibição da produção de prostaglandinas.
Na indução do estimulo doloroso pela formalina se distingue duas fases, onde a
primeira fase é indicativa de dor neurogênica (primeiros 5 minutos) e a segunda fase é
indicativa de dor inflamatória (15 a 30 minutos) depois da administração da formalina.
O composto LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 não apresentaram inibição da dor na primeira
fase do teste, entretanto, na segunda fase que é indicativa de dor inflamatória, houve a
inibição eficaz da dor inflamatória. Segunda García et al. (2004), os fármacos que agem
na primeira fase têm ação central como os narcóticos. A inibição ocorrida na segunda
fase do teste da formalina indica uma ação periférica semelhante aos AINES e os antiinflamatórios esteroidais. Os dados obtidos neste experimento reforçam os achados no
teste da placa quente, confirmando que estes compostos atuam por mecanismo
periférico. Malta, em 2005, ao avaliar o potencial antinociceptivo utilizando a mesma
metodologia para a substância 3-(4-bromo-fenacil)-5-(4-dimetilamina-benzilideno)-2-
69
tioxo-imidazolidin-4-ona (LPSF/NN-165), obteve resultados apenas na segunda fase, o
que caracteriza uma ação dos derivados imidazolidínicos na dor inflamatória.
Em conjunto, os dados obtidos nos experimentos mostram que os compostos
indol-imidazolidínicos
testados
antinociceptiva promissoras.
apresentam
propriedades
anti-inflamatórias
e
A atividade anti-inflamatória foi evidenciada pela
diminuição da migração celular em vários modelos experimentais, e esta diminuição
provavelmente se deve a uma modulação do sistema imune, através da diminuição de
TNF-α e IL-1β. O efeito antinociceptivo apresentado pelo composto parece envolver
mecanismos periféricos, atuando na dor inflamatória.
CONCLUSÕES
71
9. CONCLUSÕES
De acordo com os resultados obtidos neste estudo podemos concluir que:

Os derivados indol-imidazolidínicos em estudo apresentaram baixa toxicidade,
tendo o valor da DL50 estimado em 2500 mg/kg, sendo considerada segura;

Os compostos o LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56, apresentaram atividade antiinflamatória frente aos experimentos de bolsão de ar subcutâneo, peritonite e
pleurisia induzidos por carragenina, com redução significativa da migração
leucocitária;

Na avaliação dos níveis de citocinas, os compostos em estudo diminuíram a
concentração de TNF-α e IL-1ß nos exutados inflamatórios;

Os
derivados
indol-imidazolidínicos
em
estudo
também
inibiram
significativamente a permeabilidade vascular induzida por ácido acético.

Os resultados nos testes de ácido acético e placa quente indicam que os
compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 possuem atividade antinociceptiva;

Os resultados obtidos nos testes da placa quente e formalina sugerem que os
compostos em estudo atuam por mecanismos periféricos, atuando na dor
inflamatória.
REFERÊNCIAS
73
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APÊNDICES