Em Foco - Ano XI • nº 22 • 2014

ANTIBIOSE DE Streptomyces aureus FRENTE A
MICRORGANISMOS DE INTERESSE CLÍNICO
Andresson Fernandes Pontes1
Silvia Katrine Silva Escher2
Resumo
As actinobactérias produzem vários compostos com propriedades antimicrobianas, além de contribuir com a
produção de enzimas de uso industrial e vitaminas. O gênero Streptomyces, se destaca por contribuir com cerca de
70 a 80% do total de fármacos com propriedade antimicrobiana oriundos do seu metabolismo secundário. O objetivo
deste estudo foi avaliar a antibiose da bactéria Streptomyces aureus frente aos patógenos Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp e Candida sp. Previamente ao teste
antimicrobiano, foram realizados o estudo da macro e micromorfologia do Streptomyces aureus e por ma avaliação
antimicrobiana da actinobactéria através da metodologia do bloco de gelose. Na análise macromorfológica de
Streptomyces identicou-se o aspecto pulverulento das colônias assim como a presença característica do micélio
aéreo, e em análise micromorfológica, foi evidente a presença predominante de conídios esféricos em cadeia e a
visualização de lamentos bacterianos ramicados. O ensaio de antibiose descreveu atividade antimicrobiana
seletiva para Staphylococcus aureus, caracterizando sua intensidade de inibição como moderada, com halo de
inibição de crescimento de 11 mm. Diante do estudo realizado e do contexto teórico, podemos evidenciar que as
actinobactérias são microrganismos com grande potencial biotecnológico, e que através da produção de seus
metabólitos secundários, apresenta atividade antibacteriana frente a diversos microrganismos patogênicos,
principalmente contra cocos gram positivos.
Palavras-chaves: Actinobactérias. Streptomyces aureus. Antibióticos.
Abstract
The actinomycetes produce multiple compounds with antimicrobial properties, and contribute to the production of
industrial enzymes and vitamins use. The genus Streptomyces , stands by to contribute about 70-80 % of the drugs
coming with antimicrobial property of their secondary metabolism . The aim of this study was to assess the antibiosis
of the bacterium Streptomyces aureus forward to pathogens Escherichia coli , Staphylococcus aureus ,
Pseudomonas aeruginosa , Salmonella sp and Candida sp . Prior to the antimicrobial test, the study of macro-and
micromorphology of Streptomyces aureus and finally the evaluation of antimicrobial actinobacteria through the
methodology of agar block were performed . In Streptomyces macromorfológica analysis identified the powdery
aspect of the colonies as well as the characteristic presence of aerial mycelium , and micromorphological analysis , it
was apparent the predominant presence of spherical conidia chain and visualization of bacterial branched filaments .
The assay described antibiosis selective antimicrobial activity against Staphylococcus aureus, characterizing its
intensity as moderate inhibition, with a halo of growth inhibition of 11 mm. Before the study and theoretical context, we
show that the actinomycetes are microorganisms with great biotechnological potential, and through the production of
their secondary metabolites, have antibacterial activity against several pathogenic microorganisms, especially
against cocci gram-positive.
Keywords: Actinomycetes, Streptomyces aureus.Antibiotics.
1
Farmacêutico, pós graduando lato sensu em Análises Clínicas no Instituto Esperança de Ensino Superior-IESPES, estagiário no Laboratório de
Microbiologia da UFOPA/IBEF, [email protected]
2
Bióloga e Doutoranda no Programa de Ciências Farmacêuticas na Universidade Federal de Pernambuco – UFPE. Professora Assistente II na
UFOPA. Coordenadora do Laboratório de Microbiologia-UFOPA/IBEF.
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INTRODUÇÃO
As actinobactérias são constituídas por um grupo
variado de bactérias lamentosas, que morfologicamente são caracterizadas como gram positivas, aspecto microscópico comum entre elas, além de possuírem
alto conteúdo de G+C (guanina e citosina) em seu ácido
desoxirribonucléico (DNA), variando o percentual desse
conteúdo entre os gêneros. Podem ser aeróbicas, anaeróbicas ou microaerólas. Morfologicamente se desenvolvem semelhante aos fungos, na forma de hifas, porém estas estruturas apresentam diâmetros menores,
se assemelhando de forma siológica com as bactérias
(LACAZ et al., 2002; SULTAN et al., 2002).
De acordo com o Bergey's Manual ofDeterminativeBacteriology, as actinobactérias são classicadas dentro do Filo e Classe Actinobacteria, Subclasse Actinobacterideae, compreendendo 6 Ordens (Actinomycetales, Coriobacterales, Bifidobacteriales, Acidimicrobiales, Sphaerobacterales e Rubrobacterales), 39 Famílias, 139 Gêneros e centenas de espécies. O gêneroStreptomyces ocorre abundantemente no solo, atingindo
4
7
habitualmente 10 a 10 Unidades Formadoras de Colônia por grama(UFC/g) de solo seco, estando distribuído
não somente na forma de esporos como também na forma vegetativa(VENTURA et al., 2007; LACAZ et al.,
2002).
Dentre as várias características que esse grupo de
bactérias apresenta, a capacidade de produzir metabólitos secundários é a principal delas, despertando interesse e atenção principalmente da indústria farmacêutica. As moléculas bioativas oriundas do mactérias têm sido estudadas quanto às propriedades antimicrobianas,
antiviral, citotóxica, anti-hipertensiva, antinamatórias,
antitumorais e antiparasitárias. Produzem também várias enzimas de uso industrial, vitaminas como, tiamina, riboavina e vitamina B12 (HONGJUAN et al., 2006).
Grande parte destes metabólitos secundários bioativos são produzidos pela ordem Actinomycetales, queabrange mais de 80 gêneros, incluindo o gênero Streptomyces que contribui signicativamente com a produção desses compostos, essencialmente compostos antimicrobianos (GOODFELLOW; FIEDLER, 2010;
BRAKHAGE; SCHROECKH, 2011).
Vários antibióticos são sintetizados pelo gênero
Streptomyces entre eles, a Anfotericina B produzido por
Streptomyces nodosus, a Eritromicina produzida por
Streptomyces erytheus, a Neomicina produzidas por
Streptomyces fradiae, a Tetraciclina, oriunda do Streptomyces rimosus e a Gentamicina produzida por Streptomyces tenebrarius (SAADAUN; GHARAIBEH, 2003).
O estudo com organismos produtores de metabólitos capazes de combater as infecções, tanto de origem
fúngica quanto bacteriana, tem se desenvolvido em todo o mundo, com o propósito de se produzir drogas ino-
vadoras, com alto poder farmacológico, capazes de combater a multirresistência microbiana. Com isso, o uso da
ecologia microbiana do solo e plantas tem sido bastante
estudada, proporcionando um melhor entendimento das
relações invivoe in vitrodestes metabólitos (STROBEL;
DAISY, 2003; WIYAKRUTTA et al., 2006; LI et al., 2005).
Neste contexto, este estudo objetivou avaliar a relação
antagônica da actinobactéria Streptomyces aureus frente às bactérias de interesse clínico.
METODOLOGIA
Isolado de Actinobactéria
A linhagem de Streptomyces aureus ATCC 3309 utilizada neste estudo pertence à Coleção de Cultura do
Departamento de Antibióticos da Universidade Federal
de Pernambuco(DAUFPE). Esta actinobactéria é proveniente de solo rizosférico do bioma da caatinga.
Figura 1 - Culturas de Streptomyces aureus utilizadas no estudo.
Fonte: Os pesquisadores (2013)
Caracterização Morfológica da Actinobactéria
Análise macromorfológica do isolado de Streptomyces
O microrganismo foi cultivado em placas de Petri
contendo International Streptomyces Project nº 2(ISP2) (constituído de g/L: 4 g de Glicose; 4 g de Extrato de
Levedura; 10 g de Extrato de malte e 20 g de Ágar), durante 10 dias a 30 °C para manutenção e posteriormente realização da macroscopia das colônias de Streptomyces aureus.
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Análise micromorfológica do isolado de Streptomyces
Os procedimentos adotados para a análise microscópica foram realizados de acordo com a metodologia
proposta por Shirling e Gottlieb (1968), onde foi inserida
parcialmente no meio de cultura semeado com Streptomyces aureus, uma lamínula em posição inclinada para obtenção do crescimento de hifas sobre a superfície
da mesma. Após o período de 7 dias de incubação, a lamínula foi retirada e colocada sobre uma lâmina de microscopia contendo uma gota de solução salina e posteriormente analisada ao microscópio óptico com o aumento de 400 vezes.
Caracterização da Atividade Antimicrobiana
Cepas patogênicas utilizadas no teste de antagonismo
Foram testados a bactéria Gram positiva Staphylococcus aureus ATCC 25923; Gram negativas, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853 e Salmonella sp, além da levedura Candida sp
pertencem a Coleção de Cultura do Laboratório de Microbiologia do Instituto de Biodiversidade e Florestas da
Universidade Federal do Oeste do Pará (UFOPA).
Ensaio em meio sólido
O teste de atividade antimicrobiana foi realizado segundo a metodologia descrita por Ichikawa, Ishikura &
Ozaki (1971), onde ocorre a aplicação de blocos de ágar
contendo a colônia do microrganismo com potencial antimicrobiano, sobre um meio de cultura previamente inoculado com o microrganismo teste. A técnica é conhecida como “Método do Bloco de Gelose”, e tem como objetivo analisar se o microrganismo do bloco de ágar possui
ou não ação antagônica sobre o patógeno, indicando assim que este produza compostos com propriedade antimicrobiana.
Figura 2 - Esquemado teste antimicrobiano pelo método do bloco de
gelose.
FONTE: Os pesquisadores (2013)
Posteriormente, as placas preparadas foram incubadas em estufa respeitando as características siológicas de cada microrganismo teste, 35°C quando bactérias, e a 28ºC, quando leveduras, por 24 e 48 horas, respectivamente. Este ensaio foi realizado em duplicata correspondendo a placas numeradas com R1 e R2.
Para o controle do ensaio, foram utilizados blocos
do meio ISP-2 (sem os microrganismos isolados), os
quais foram dispostos sobre as placas de petri contendo
o patógeno. Após o período de incubação, o diâmetro do
halo de inibição de cada bloco foi medido (em mm), utilizou-se a escala sugerida por Matsuura (2004) para a
classicação dos resultados, ilustrada na tabela 1.
Tabela 1 – Classificação da atividade antimicrobiana
sugerida por Matsuura
Tipo de inibição
Tamanho do Halo de
Inibição
Intensidade da
Inibição
Ausente
0
-
Baixa
7,0 10,0 mm
+
Moderada
11,0 – 14,0 mm
++
Alta
> 14,0 mm
+++
Avaliação in vitro da Atividade Antimicrobiana
Para a realização do ensaio, necessitou-se do preparo de suspensões microbianas, na qual estas foram
ajustadas a 0,5 da Escala de McFarland, que determina
a concentração dos microrganismos de acordo com a
absorbância, encontrada por meio da espectrofotometria, correspondendo a 108 células/ml e 104 células/mL,
de bactérias e fungos, respectivamente.
A realização da atividade antimicrobiana está esquematizada na gura 2. Para semeadura foram aliquotados 100 µL da suspensão microbiana em placa de petri de 145 mm de diâmetro contendo Ágar MüellerHinton e Ágar Sabouraud Dextrose, para bactérias e fungos, respectivamente. Foi retirado bloco de ágar circular
de 8 mm de diâmetro do meio de cultura contendo Streptomyces aureus, o qual foi transferido para a placa previamente semeada com o patógeno teste.
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Fonte: Matssura (2004)
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Caracterização Morfológica da Actinobactéria
Análise macromorfológica do isolado de Streptomyces
O isolado de Streptomyces aureus obteve excelente crescimento após período de incubação, no qual, como pode ser observado na gura 3, evidenciou-se aspecto miceliano aéreo, pulverulento e ramicado, características estas, das colônias de Actinobactérias, especialmente do gênero Streptomyces.
Caracterização da Atividade Antimicrobiana
Os resultados da atividade antimicrobiana de Streptomyces aureus estão dispostos na tabela 2. Foi observada apenas a sensibilidade de Staphylococcus aureus,
revelando um halo de inibição de 11 mm, descrevendo intensidade moderada. Os demais patógenos pertencentes ao grupo de bactérias gram negativas, assim como o
fungo selecionado para o ensaio, não apresentaram sensibilidade à espécie de Streptomyces.
Tabela 2 - Avaliação da atividade antimicrobiana de
Streptomyces aureus frente às cepas de S. aureus,
E. coli, P. aeruginosa, Salmonella sp e Candida sp
Streptomyces aureus
Figura 3 - Macromorfologia do Streptomyces aureus.
FONTE: Os pesquisadores (2013)
Análise micromorfológica do isolado de Streptomyces
As características micromorfológicas do Streptomyces aureus se assemelham com as demais espécies do gênero. Através de análise por micromorfologia foi
evidenciada a presença predominante de conídios esféricos em cadeia e ramicações de hifas septadas, caracterizando o aspecto miceliano desse gênero, como
mostra a gura 4.
Figura 4 - Microscopia óptica doStreptomyces aureus, ilustrando
inúmeros conídios.
FONTE: Os pesquisadores (2013)
Cepas
24h
48h
Média
Referência
S. aureus
11 mm
11 mm
11 mm
++
E. coli
0 mm
0 mm
0 mm
-
P. aeruginosa
0 mm
0 mm
0 mm
-
Salmonella sp
0 mm
0 mm
0 mm
-
Candida sp
0 mm
0 mm
0 mm
-
Fonte: Os pesquisadores
Não foi encontrado nos trabalhos pesquisados, registros de ensaios com a nalidade de avaliar a atividade antimicrobiana do Streptomyces aureus, porém vários pesquisadores vêm dando ênfase em suas pesquisas sobre a importância e o potencial antimicrobiano de
outros isolados de Streptomyces sp.
No seu livro intitulado, Guide to the Classification
and Identification of the Actinomycetes and their Antibiotics, Waksman e Lechevalier (1953), fazem correlação
das substâncias produzidas pelo Streptomyces aureus,
como tendo propriedades antifúngicas, capazes de inibir vários fungos, porém algumas cepas produzem substâncias que apresentam propriedades antibacterianas,
com ecácia frente a bactérias gram positivas. Neste ensaio antimicrobiano, observou-se apenas a atividade antibacteriana.
Ao avaliar a atividade antimicrobiana de Actinobactérias isoladas do solo frente a oito microrganismos teste, Lins e Araújo (2011) observaram antibiose dos isolados frente a algum patógeno, sendo que um dos microrganismos-alvo que apresentaram sensibilidade foi o
Staphylococcus aureus. Ferreira (2012), ao avaliar o potencial antimicrobiano de sete isolados de Streptomyces
sp, registrou atividade de apenas três isolados para algum dos microrganismos testados no estudo, sendo
que nenhum apresentou capacidade antimicrobiana
contra bactérias gram-negativas, corroborando como os
dados desse estudo antimicrobiano.
De acordo com Bomm (2010), vários são os estudos relacionados com a avaliação do potencial antimicrobiano das Actinobactérias que demonstram por parte
destas pouco antagonismo frente às bactérias gramnegativas, porém apresentam alta atividade antibacteri-
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ana contra bactérias gram-positivas, como pode ser evidenciado no estudo realizado com 337 isolados de Actinobactérias, onde Gonzálezet al. (2005) evidenciou que
dos isolados que apresentaram atividade antimicrobiana (27%), grande parte foi contra bactérias grampositivas (23%), em seguida contra Candida albicans
(10,7%) e por último representando menor atividade contra gram-negativas. Ao contrário desse último estudo,
no ensaio realizado não houve atividade antifúngica.
Vários estudos já relatam fenômenos de resistências fúngicas, principalmente ao gênero Candida em quadros clínicos de doenças oportunistas, disseminando
principalmente em pacientes imunodeprimidos. Neste
contexto, a busca por compostos antifúngicos efetivos
têm sido um dos grandes objetivos da indústria biotecnológica.
O patógeno Staphylococcus aureus, mesmo sendo
um dos microrganismos que mais apresenta multirresistência aos antibióticos de uso na rotina clínica, propriedade microbiana correlacionada com fatores como a capacidade de produção das betalactamases e transferência do material genético entre as espécies, por ser
uma bactéria gram-positiva permite com que haja maior
facilidade de penetração e efeito do fármaco quando
comparada com as bactérias gram-negativas, que além
da composição de peptidioglicano em sua parede celu-
lar, apresenta membrana externa, o que acaba dicultando a penetração do fármaco na célula, conferindo maior probabilidade de resistência por essas bactérias, como é o caso de E. coli, Salmonella sp e P. aeruginosa,
que não apresentaram sensibilidade no ensaio realizado (TRABULSI; ALTERTHUM, 2005; NOBRE, 2008).
CONCLUSÕES
Diante do estudo realizado e do contexto teórico, podemos evidenciar que as actinobactérias são microrganismos com grande potencial biotecnológico, e que através da produção de seus metabólitos secundários, apresenta atividade antibacteriana frente a diversos microrganismos patogênicos, principalmente contra cocos
gram positivos, como foi demonstrado na pesquisa.
Estudos voltados a essa linha de pesquisa estão em andamento, com a nalidade de obter o isolamento das actinobactérias do próprio solo Amazônico.
AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal do Oeste do Pará (UFOPA),
por ter concedido o espaço do Laboratório de Microbiologia do Instituto de Biodiversidade e Florestas para o desenvolvimento da pesquisa.
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