Seleção purificadora em linhagens ameríndias do vírus da hepatite

56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
1
Seleção purificadora em linhagens ameríndias do vírus
da hepatite B (HBV) e sua influência em estudos de
datação molecular
Fagundes, NJR1,2; Alvarado-Mora, MV3; Pinho, JRR3
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto Nacional de Genética Médica Populacional (INAGEMP)
3
Instituto de Medicina Tropical, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Relógio Molecular, Seleção purificadora, Datação molecular, HBV, Nativos Americanos.
O vírus da hepatite B (HBV) é um vírus de DNA distribuído em todas as populações humanas e apresenta uma forte
estrutura geográfica, com diferentes “genótipos” virais sendo característicos de determinadas regiões geográficas.
Em povos Nativos Americanos, o genótipo F (HBV-F) é o mais prevalente, especialmente na América do Sul. A
datação dos genótipos do HBV, entretanto, é complicada pela grande amplitude de taxas evolutivas propostas,
algumas das quais compatíveis com uma origem surpreendentemente recente para o HBV-F, de menos de 100 anos.
Porém, sabe-se que o ponto de calibragem pode ser determinante para esses resultados. Para testar se os ramos
antigos e recentes da filogenia de HBV-F foram afetados de modo homogêneo pela seleção natural, 54 genomas
completos de HBV-F foram obtidos no GenBank e suas relações filogenéticas determinadas por parcimônia. As
substituições foram mapeadas ao longo dos ramos e classificadas como sinônimas ou não-sinônimas. Todos os
ramos contidos dentro dos quatro “sub-genótipos” atualmente reconhecidos foram classificados como ramos
recentes, enquanto que os ramos mais profundos, que conectam diferentes subgenótipos, foram considerados
ramos antigos. A hipótese nula de homogeneidade entre a taxa de substituições não-sinônimas/sinônimas nos
ramos recentes ou antigos foi testada usando qui-quadrado e teste exato de Fisher. Mais de 1500 substituições
foram mapeadas, e a hipótese nula de homogeneidade entre as taxas foi fortemente rejeitada (P=1,6x10-9), sendo a
taxa de substituições não-sinônimas/sinônimas cerca de duas vezes maior nos ramos recentes. Quando realizada
separadamente para cada ORF, a análise revela a mesma tendência, sendo significativa para três das quatro ORFs.
Para o gene PreC/C, por exemplo, nenhuma substituição não-sinônima foi mapeada nos ramos antigos da filogenia.
Tomados em conjunto, os resultados são compatíveis com um cenário onde a seleção purificadora é a principal
força evolutiva para a fixação de novas mutações no genoma do HBV. Nos ramos recentes, o excesso de substituições
não-sinônimas deve-se ao fato de não ter havido tempo suficiente para a eliminação das mutações deletérias.
Taxas evolutivas calibradas com referências populacional, ou baseadas em estudos de transmissão dentro de um
pedigree serão superestimadas, causando uma subestimativa dos tempos de coalescência. Esse viés é semelhante
àquele relatado para o DNA mitocondrial em humanos. Esses resultados sugerem que novos pontos de calibragem
devem ser usados para a datação de eventos temporais profundos na filogenia do HBV. Eventos antropológicos
conhecidos, como o tráfico de escravos africanos para as Américas, por exemplo, são bons candidatos para este fim.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
2
Patterns of diversity at the copy number variable
beta-defensin locus in Native American populations:
Evolutionary and biomedical implications
Zuccherato, LW1; Hardwick, RJ2; Zamudio-Zea, R1; Gilman, RH3,4; Hollox EJ2; Tarazona-Santos, E1
Laboratório de Diversidade Genética Humana, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Brazil
Department of Genetics, University of Leicester, UK
3
Universidade Peruana Cayetano Heredia, Perú
4
Johns Hopkins School of Public Health, Johns Hopkins University, USA
[email protected]
1
2
Keywords: beta-defensins, copy number variation, Paralogue Ratio Test, Native American populations, innate immune system.
Copy number variable regions are segments of DNA greater than 1 kilobase in length that vary in their number of
copies relative to a reference genome. It is estimated that up to 12% of the human genome shows copy number
variation (CNV), and so represents a major component of human genetic variation. CNVs can also have clinical effects,
and may account for susceptibility to some common and rare diseases. Beta-defensins are small cationic peptides
that have a multifunctional role in the innate immune system. A cluster of at least seven beta-defensins located on
chromosome 8p23.1 shows CNV, with 2-12 copies per genome. One of these genes, DEFB4, shows a correlation with
mRNA expression levels and with the level of its circulating protein in the serum of healthy individuals. Although
recent studies testing the association of beta-defensin copy number with Crohn’s disease have produced conflicting
results, the literature strongly supports an important role of beta-defensins in mucosal defense of the gut, and a
higher copy number of the beta-defensin genes are associated with an increased risk of psoriasis. The genomic
structure of beta-defensins has been studied in European and African populations, but Native Americans have not
been analyzed for these loci. We measured the copy number of the beta-defensin cluster on chromosome 8p23.1
in individuals from two Native American populations settled between the Andean and the Amazonian regions of
Peru: Shimaa (n=89), from the ethnic group Matsiguenga, and Ashaninka families (n=150) from Ashaninka ethnic
groups, using the Paralogue Ratio Test (PRT) technique. PRT is a development of quantitative PCR, and uses a single
primer pair to amplify both a test locus ( for which the number of copies need to be determined) and a reference
locus (that has a known number of copies), leading to an accurate copy number determination. For the betadefensin locus, the Ashaninka population shows a distribution of diplotypes more similar than observed in African
and European populations, with 3 and 4 copies being more common (30.7% and 35.3% respectively). Although the
Shimaa shows 3 and 4 copies as the most common diplotypes (29.2% and 33.7%), 7 copies were commonly found
in this population (12.4%) when compared to African, European and Ashaninka populations. The role of betadefensin genes in the innate immune system can allow us to infer the evolutionary processes that have shaped
the diversity of these loci in South Amerindians in the context of global human genome diversity. These results can
also allow us to assess the implications of the genetic structure of these loci in order to perform epidemiological
studies in the future. We are extending this study, quantifying CNV loci for CCL3, CCL4, FCGR3 and FCGR2
genes, and investigating methodological issues related with CNV quantification, also using real-time PCR assays.
Financial Support: FAPEMIG, EMBO, CAPES and Medical Research Council (UK)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
3
Investigação dos polimorfismos do gene da Calpaina-10
no grupo indígena Parakanã – Apyterewa, PA
Almeida, NCA1; Diniz, IG1; Silva, ANLM1; Queiroz, MG1; Matos, BS1; Guerreiro, JF1
Laboratório de Epidemiologia Molecular - Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: Calpaína10, Diabetes Mellitus tipo 2, Apterewa.
O Diabetes mellitus é um distúrbio metabólico crônico, caracterizado por níveis elevados de glicemia, relacionados
à deficiência e/ou resistência à insulina. Na forma poligênica do DM2, existe uma clara interação dos fatores
externo-ambientais e genéticos. A Calpaína 10 pertence à família das cisteínas proteases não lisossomais, sendo
ativada pelo cálcio e encontrada em diversos tecidos. A Calpaína 10 coordena a ativação ou inibição de inúmeras
proteínas envolvidas na sinalização intracelular e é essencial à sinalização e regulação intracelular do cálcio. Está
também envolvida na proliferação, diferenciação (incluindo adipocítica) e nos mecanismos de secreção de insulina.
O gene da Calpaína 10 (CAPN10) localiza-se no cromossomo 2 (2q37.3), possuindo 15 éxons dispostos em 31kb
que codificam uma protease de 672 aminoácidos. O gene CAPN10 é expresso primeiramente no fígado, músculo
esquelético e ilhotas pancreáticas. O primeiro estudo indicando relação entre Diabetes mellitus tipo 2 e CAPN10
foi realizado em americanos de origem mexicana, sendo identificados três polimorfismos, UCSNP-43 (G/A),
UCSNP-19 (in/del 32 pb) e UCSNP-63 (C/T), responsáveis por haplótipos e diferentes combinações haplotípicas.
Os haplótipos são montados de acordo com o tipo de alelo apresentado pelo indivíduo (UCSNP-43, alelo 1, G,
alelo 2, A; UCSNP-19, alelo 1, 2 repetições de 32pb, alelo 2, 3 repetições de 32pb; UCSNP-63, alelo 1, C, alelo 2, T).
O presente trabalho teve como objetivo investigar as freqüências genotípicas e alélicas do gene da Calpaina-10
na população indígena da aldeia Apyterewa, etnia Parakanã, localizada no municípios de Altamira e São Félix
do Xingú, no Estado do Pará. O polimorfismo CAPN43 foi genotipado, por meio de PCR em Tempo Real (RTPCR). O polimorfismo CAPN19 foi genotipado por PCR convencional. O polimorfismo CAPN63 foi genotipado
por PCR-RFLP. As frequências haplotípicas foram calculadas pelo programa Mlocus. Foram identificados sete
haplótipos diferentes: 112 (0,464), 121 (0,098), 122 (0,069), 211 (0,070), 212 (0,058), 221 (0,226) e 222 (0,014). Estudos
populacionais sugerem que haplótipo 111 é provavelmente o ancestral em todas as populações, enquanto o
haplótipo 112 teria sido selecionado em populações Africanas, os haplótipos 121 e 221 selecionados em populações
fora da África no processo de migração para a Europa, Ásia e América. Além disso, os dados disponíveis revelam
que os quatro principais haplótipos (111, 112,121 e 221) ocorrem em nativos americanos e que recentes misturas
entre populações não teria contribuído para tanto. Portanto, apenas o haplótipo ancestral 111 não foi identificado
entre os Parakanã.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
4
Diversidade da região 3´UTR do gene HLA-G na
população urbana do estado de São Paulo e indígenas
da Amazônia brasileira
Cagnin, NF1; Martelli-Palomino, G2; Wiezel, CEV1; Donadi, EA2; Simões AL1
Laboratório de Genética e Bioquímica, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Divisão de Imunologia Clínica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: HLA-G, região 3’UTR, polimorfismos, genética de populações, ameríndios.
Introdução: O gene HLA-G é predominantemente expresso na interface materno-fetal, e tem sido associado com
a tolerância materna ao feto através da inibição dos linfócitos T citotóxicos e da função citolítica das células NK. A
estrutura genética da região 3’UTR do gene HLA-G foi completamente descrita recentemente, e pelo menos duas
variantes nesta região, o polimorfismo deleção/inserção de 14pb e o SNP +3142C/G, já foram associados aos níveis
de expressão HLA-G sendo assim relacionados com risco de abortos espontâneos. As freqüências alélicas dos loci
polimórficos em 3’UTR ainda não são conhecidas em todas as populações. Objetivo: O presente trabalho teve
por objetivo identificar diferenças nas frequências alélicas entre uma amostra populacional de 136 indígenas da
Amazônia brasileira e uma amostra urbana de 132 indivíduos provenientes da região de Ribeirão Preto-SP, com base
na caracterização de um polimorfismo de deleção/inserção de 14pb e 7 SNPs na região 3’UTR do gene HLA-G, e nos
haplótipos formados por eles. Métodos: A amostra de cada indivíduo foi amplificada para a região de interesse por
PCR e o produto amplificado foi diretamente sequenciado em ABI310 Genetic Analyzer. A montagem dos haplótipos
foi feita pelo software SNPex. Resultados: As frequências alélicas dos oito loci polimórficos nas amostras indígena e
urbana foram respectivamente: deleção de 14pb: 0.56 e 0.56; inserção 14pb: 0.34 e 0.34; +3003T: 1,00 e 0.91; +3003C: 0
e 0.09; +3010G: 0.25 e 0.42; +3010C: 0.75 e 0.58; +3027A: 0.004 e 0.06; +3027C: 0.996 e 0.94; +3035C: 0.69 e 0.85; +3035T:
0.31 e 0.15; +3142G: 0.75 e 0.61; +3142C: 0.25 e 0.39; +3187A: 0.76 e 0.76; +3187G: 0.24 e 0.24; +3196C: 0.86 e 0.69; +3196G:
0.14 e 0.31. A partir destas freqüências constatou-se que o alelo T do SNP +3003 encontra-se fixado na amostra
indígena, enquanto que na amostra urbana são encontrados ambos os alelos T e C. A amostra populacional indígena
encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg para todos os loci enquanto a amostra urbana está em desequilíbrio
para os loci del/ins 14pb, +3010, +3027, +3035, justificando-se por deficiência de heterozigotos. Na amostra urbana
foram encontrados 10 haplótipos UTR, sendo que o mais freqüente foi UTR-2 e na amostra indígena encontrouse somente 7 destes, sendo que os igualmente mais frequentes foram UTR-3 e UTR-5. O valor de Fst entre as
populações foi significativo para todos os loci. Conclusão: As diferenças encontradas entre as populações estudadas
são significativas, mostrando que cada população tem um perfil particular para a região 3’UTR do gene HLA-G.
Apoio financeiro: CNPq, FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
5
Estrutura e diferenciação populacional em populações
Nativas da Amazônia
Nunes K1; Santos EJM2; Meyer D1
Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo.2. Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1.
Palavras-chave: Ameríndios, Diferenciação Populacional, Estrutura Populacional, Microssatélites, STR.
As populações ameríndias apresentam uma história evolutiva peculiar, com padrões demográficos distintos em
relação as demais populações do mundo. Estudos anteriores sugerem que elas possuem baixa diversidade genética
intra-populacional e alta diversidade inter-populacional em relação às demais populações. Além disso, foram
observados maiores níveis de variabilidade intra-populacional e menores níveis de variabilidade genética interpopulacional nas populações que vivem na porção oeste da América do Sul, em comparação às populações do
leste do continente. Contudo, esses achados são baseados em estudos que apresentam uma deficiência amostral
para populações ameríndias das terras do baixo rio Amazonas. O presente estudo tem como objetivo suprir
essa deficiência amostral e contribuir para melhor esclarecer esse cenário demográfico. Para tanto, analisamos
16 microssatélites autossômicos (D1S551, D4S3248, D5S816, D6S1040, D7S821, D7S3061, D8S2324, D9S301,
D9S922, D10S1426, D13S317, D16S539, D18S535, D19S559, D20S482, D21S1437) em 184 indivíduos provenientes
de 10 populações Amazônicas (Arara do Laranjal, Katuena, Zoé, Parakanã, Awá-Guajá, Assurini, Urubu-Kaapor,
Areweté e Kayapó Krokraiomo e Xikrin). A diferenciação populacional foi estimada através da medida Fst,
implementada nos pacotes do programa Arlequin e a estrutura populacional foi inferida através do programa
Structure. Foi possível observar estruturação em populações como Arara do Laranjal, Urubu-Kaapor e Areweté.
As análises revelaram um Fst para a região amazônica na ordem de 7,9. Esse valor é praticamente a metade do
valor estimado em outro estudo que incluiu cinco populações do leste da América do Sul (Fst = 14,9). Isso é um
indicativo de que o alto valor de Fst anteriormente encontrado reflete o pequeno número de populações analisadas
na porção leste da América do Sul e o fato de alguma delas (como Suruí, Karitiana e Ache) serem extremamente
endocruzadas. Apesar da menor diferenciação inter-populacional encontrada no presente estudo, as populações
do leste ainda apresentam maior variabilidade genética inter-populacional que as populações do oeste da
América do Sul (Fst = 5.7), o que reflete na estruturação observada em Arara do Laranjal, Urubú-Kaapor e Areweté.
Apoio Financeiro: FAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
6
Dinâmica evolutiva dos genes do complexo NADPH
oxidase do fagócito e inferências sobre seleção natural
Machado, M1; Redondo, R1; Chanock, S2; Tarazona-Santos, E1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Minas Gerais
National Cancer Institute (NCI), National Institutes of Health (NIH), US
[email protected]
1
2
Palavras-chave: NADPH oxidase, Granulomatosa crônica, SNP, seleção natural, PAML.
A NADPH oxidase do fagócito é um complexo enzimático responsável pela explosão respiratória que desempenha
um papel crítico na resposta imune inata. Ela catalisa a redução do oxigênio molecular para O2- gerando espécies
reativas de oxigênio (ROS) responsáveis pela atividade microbicida dos fagócitos. Esse complexo enzimático
inclui duas subunidades membranares, gp91-phox e p22-phox (codificadas por CYBB e CYBA) e três subunidades
citoplasmáticas, p40-phox, p47-phox e p67-phox (codificados por NCF4, NCF1 e NCF2). Mutações nestes genes
podem resultar na doença Granulomatosa Crônica, uma imunodeficiência primária e polimorfismos comuns
podem determinar variações sutis na expressão ou função desses genes, contribuindo tanto para doenças
infecciosas como a tuberculose e a malária bem como para fenótipos inflamatórios, tais como a doença de
Crohn. O objetivo desse trabalho é inferir se o padrão de diversidade dos genes da NADPH oxidase do fagócito
refletem a ação de diferentes tipos de seleção natural imposta por patógenos durante a evolução dos mamíferos
e dos humanos. Para isso, analisamos as regiões codificantes de CYBB, CYBA, NCF2 e NCF4 em 11 espécies de
mamíferos e utilizamos o método de máxima verossimilhança implementado no software PAML para estimar o
parâmetro ω (razão de substituições sinônimas e não-sinônimas) em diferentes domínios e códons específicos.
Considerando a escala temporal dos mamíferos, as regiões codificantes dos genes CYBA, NCF2 e NCF4 têm
evoluído impulsionadas por uma combinação de diferentes níveis de seleção purificadora com poucos códons
sob evolução quase neutra em NCF2 (ω = 0.809) e NCF4 (ω = 1.159). Porém, nosso resultado mais surpreendente
diz respeito à evolução do CYBB, o componente mais crítico para a integridade da explosão respiratória, como
evidenciado por mais de 70% dos pacientes com granulomatosa crônica que tem mutações nesse gene. Durante
a evolução dos mamíferos, os episódios de seleção natural adaptativa têm impulsionado a evolução do CYBB e
quase todos esses eventos estão concentrados na pequena porção extracelular da proteína. Curiosamente, não
há explicação funcional evidente para essa observação, o que deve promover estudos estruturais e funcionais
para entender a sua base biológica. Entretanto, a proximidade desses episódios inferidos de seleção natural
positiva para sítios de glicosilação da gp91 é notável, considerando a importância da glycome na imunidade.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPEMIG, NIH-USA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
7
Investigação dos polimorfismos UCSNP-43, UCSNP-19
e UCSNP-63 no gene da calpaína 10 na comunidade
indígena Gavião no estado do Pará
Cunha, DA; Silva, ANLM1; Diniz, IG1; Queiroz, MG1; Peres, PVG1; Almeida, NCA1; Matos, BS1; Guerreiro, JF1
Laboratório de Epidemiologia Molecular - Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: Calpaína 10, Gavião-Kyikatêgê, UCSNP43, UCSNP19, UCSNP63.
As calpaínas compreendem uma superfamília de proteases citosólicas de cisteínas dependentes de Ca2+ e atuam
em diversos processos fisiológicos como atividade endoproteolítica de componentes do citoesqueleto, quinases,
fosfatases e fatores de transcrição. Dentre estas, a calpaína 10 é considerada uma calpaína atípica devido a
alterações em um de seus domínios, incluindo alguns resíduos importantes para a ligação ao cálcio, diferindo
no seu mecanismo de ativação dependente de Ca2+. O gene da calpaína 10 (CAPN 10) localiza-se no cromossomo
dois (2q37.3) e é expresso em oito isoformas diferentes por splicing alternativo em diversos tecidos. Nas células
β-pancreáticas, uma das principais funções desta protease reside em regular a secreção de insulina. Por este
motivo alterações em sua atividade bintrônicos no gene da CAPN-10, UCSNP43 (G>A), UCSNP (INS/DEL) e
UCSNP (C>T), os quais formam haplótipos, têm sido descritos como um dos fatores de susceptibilidade à DM2.
A combinação de haplótipos 112/121, definidos pela presença (1) e ausência (2) dos polimorfismos nucleotídicos
simples (UCSNP-43[G/A], UCSNP-19[del/ins] e UCSNP-63[C/T]) no gene CAPN10 foi descrito como associado a
DM2 em indivíduos Mexicano-Americanos, mas esse efeito não foi observado em amostras da Corea, Japão, Reino
Unido, Polônia, México e Samoa. Por outro lado, dois novos diplótipos, incluindo 111/121 e 121/121, demonstraram
estar associados a diabetes tipo 2 em coreanos e europeus.O presente trabalho teve como objetivo investigar as
freqüências haplotípicas correspondentes aos polimorfismos UCSNP43 (G/A), UCSNP19 (INS/DEL) e UCSNP63
(C/T) do gene da calpaína 10, em 81 indivíduos do grupo indígena Gavião-Kyikatêgê, localizados na Reserva Indígena
Mãe Maria, BR-222, Km 24, município de Bom Jesus do Tocantins, Estado do Pará. A genotipagem foi realizada feita
por meio de PCR em Tempo Real (RT-PCR) e PCR convencional. Foram identificados cinco haplótipos diferentes,
dos quais o 112 foi o mais comum (41,92%), seguido dos haplótipos 221 (38,27%), 121 (11,67%), 111 (6,84%) e 122
(1,29%). As combinações haplotípicas 112/121, 111/121 e 121/121, mais comumente associadas ao DM2, foram
enontradas com freqüências baixas entre Gavião-Kyikatêgê (6,2%, 2,5% e 3,7%, respectivamente), o que pode sugerir
uma menor suscetibilidade ao DM2 conferida pelos polimorfismos da calpaína-10 entre os Gavião-Kyikatêgê.
Apoio financeiro: CNPq e UFPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
8
Polymorphism of HLA-G, SLC11A1 and CASP8 genes in
Amerindian Populations
Maia, AL; Takeshita, LYC; Vasconcelos, JM; Pedroza, LSRA; Santos, SEB; Guerreiro, JF; Sena, LS; Santos, EJM
Laboratório de Genética Humana e Medica. Instituto de Ciências Biológicas-Universidade Federal do Pará
[email protected]
Keywords: Genetic variability, Amerindian, HLA-G, SLC11A1, CASP8.
The immune system usually combines innate and adaptive branches to fight against pathogens in order to
eliminate them from the organism. However, because of the complexity involved in the etiology of most diseases,
polymorphic genetic markers either directly or indirectly related to the immune response have been considered
as putative risk factors for diseases. Studies of such genetic markers in Amerindian populations have been
scarce, but might be of importance in evaluating the genetic factors involved in susceptibility/resistance in a
population that have been living in a distinct environment. The aim of this study was to investigate the frequency
of polymorphisms found on HLA-G (a non-classic major histocompatibility complex class I molecule), SLC11A1
(involved in macrophage activation and cytokine synthesis) and CASP8 (implicated in apoptosis regulation) genes
in Amazonian Amerindians. A total of 74 individuals belonging to eight Amerindian tribes - Arara (16), Arawete (8),
Asurini (11), Mapuera-Katuena (7), Awa-Guaja (5), Waiampi (6), Urubu-Kaapor (6) e Xicrin (15) - were genotyped,
using the polymerase chain reaction, for the following polymorphisms: (i) the 14 bp insertion/deletion at the exon
8 of HLA-G gene; (ii) the 4 bp (GTGT) insertion/deletion at the 3’ untranslated region, 55 bases downstream of
the last codon in the exon 15 of the SLC11A1 gene; and (iii) the 6 bp insertion/deletion at the promoter region of
the CASP8 gene. Gene frequencies for the three polymorphisms varied widely among Amerindian tribes, which
included no polymorphisms at all. However, when results are taken as representative of the Amerindians as a
whole, HLA-G, SLC11A1, and CASP8 insertion frequencies have shown 52,7%, 84,4% and 87,8%; respectively.
There was no apparent relationship of allele frequencie distributions of the three loci with linguistic similarity or
geographic distances. This is not uncommon, because this relationship is not apparent for the major of studied loci
in Amerindian populations. The HLA-G locus varied more widely (0-94%). SLC11A1 was the unique polymorphic
locus for all Amerindian tribes. The other loci had fixed alleles in some tribes. Just Arara and Awa-Guaja tribes had
HLA-G gene frequencies similar to other worldwide population (HLA-G*I: 50% in both tribes; 48% in India), and
were also the only tribes to differ from the world gene frequencies range for SLC11A1 polymorphism (SLC11A1*D:
1-19% in world populations; 28% in Arara and 40% in Awa-Guaja). Except Mapuera-Katuena tribe, whose allele
frequency was similar to Europeans, all tribes had CASP8*D allele frequencies lower than frequencies found
in Asians and Europeans. The studied polymorphisms, that are relevant for being associated with pathological
conditions, showed themselves polymorphic in Amerindians, supplying material to the action of selective pressures,
whether they had occurred or will occur in these populations.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
9
Variabilidade do gene HLA-E na população brasileira
Veiga-Castelli, LC1; Castelli, EC1; Deghaide, NHS1; Silva Júnior, WA2; Moreau, P3; Donadi, EA1
Divisão de Imunologia Clínica, Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São
Paulo (USP), Ribeirão Preto-SP, Brasil
2
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USPl
3
Commissariat à l’Energie Atomique / DSV /I2BM / Service de Recherches en Hémato-Immunologie, IUH, Hôpital Saint-Louis, 75010
Paris. [email protected]
[email protected]
1
Palavras-chave: HLA-E, polimorfismo, populações.
O gene HLA-E, um gene não-clássico de classe I do complexo principal de histocompatibilidade humano (HLA),
apresenta poucos sítios polimórficos em relação aos outros locos MHC-I, exibindo apenas nove alelos codificando
três proteínas diferentes. Além de seu já conhecido papel na imunidade inata, a HLA-E tem sido relatada como
um ligante para células T e inibidor das respostas de células T e NK, com potencial atuação em transplantes.
Devido à sua origem histórica, a população brasileira é um rico repositório de variação genética. Dado isso, 52
amostras de doadores normais de medula óssea, selecionadas ao acaso, foram avaliadas quanto à variabilidade
presente em cerca de 1200pb do gene HLA-E, compreendendo a porção final do íntron 2, íntron 3 e éxons 3 e 4.
Quatro SNPs previamente descritos foram avaliados alem da sequência genômica como um todo, nas posições
+756, +887, +906 e +1691 em relação ao éxon 1. Desses, apenas um (+756 G/A) se mostrou polimórfico em nossa
amostra, apresentando uma frequência de 0.6630 para o alelo A, que por sua vez, exclui a presença dos alelos
E*01:03:03, *01:03:04 e *01:04 nesta amostra. Mais de 42% da população se mostrou homozigota para alelos que
codificam a variante protéica E*0101 (A na posição +756). Além disso, dois novos SNPs foram detectados, sendo
um no intron 2 e um no íntron 3, que serão oficializados. Em relação aos estudos de desequilíbrio de ligação
(LD) com genes vizinhos (HLA-E, G e A), foi observado um alto LD (p = 0.0000 para ambos) entre A e G (região
codificadora e 3’UTR); no entanto, o SNP no lócus HLA-E não estava em LD com o gene HLA-A (p = 0.2031) ou
com o HLA-G (0.6294), o que pode ser um reflexo da presença de um gene altamente polimórfico como o HLA-A
entre HLA-G e HLA-E, ou a maior distância física entre HLA-E e HLA-A do que entre HLA-A e HLA-G. Concluindo,
mesmo em uma população heterogênea como a brasileira, o gene HLA-E apresenta uma baixa variabilidade,
apresentando apenas um ponto de variação atingindo frequência maior que 1% em mais de 1200pb avaliados.
Auxílio financeiro: CNPq processos 475670/2007-8 e 150175/2009-4, CAPES/COFECUB processo 653/09 e FAPESP
processo 07/58420-4
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
10
Ausência de correlação entre desvios de neutralidade
e a distribuição dos alelos endêmicos de HLA-B nas
populações nativas das américas
Francisco, RS1; Labuda, D2; Petzl-Erler, ML3; Ruiz-Linares, A4; Santos, EJM5; Meyer, D1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo
1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva da Universidade de São Paulo
2
Departamento de Pediatria da Universidade de Montreal
3
Laboratório de Genética Molecular Humana da Universidade Federal do Paraná
4
Laboratório Galton da Universidade College London
5
Laboratório de Genética Humana e Médica da Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: HLA-B, Ameríndios, Turnover alélico, Seleção Natural e História Demográfica.
O produto do gene HLA-B tem como função a apresentação de peptídeos antigênicos aos linfócitos T CD8+ e
interação com os receptores KIR das células natural killers. Há forte evidência de que o gene HLA-B está evoluindo
sob ação da seleção natural. Populações nativas da América do Sul possuem alelos endêmicos de HLA-B em
freqüências elevadas. Como explicação para essa distribuição alélica foi proposto o modelo de turnover alélico.
Segundo este modelo, os alelos endêmicos sul-americanos alcançaram freqüências elevadas devido à seleção
dirigida por patógenos. Para testar essa hipótese nós analisamos a variação do gene HLA-B em 474 indivíduos
pertencentes a 26 populações nativo-americanas (6 norte-americanas, 3 centro-americanas e 17 sul-americanas)
e aplicamos os testes Ewens-Watterson e D de Tajima para verificar a presença de desvios da hipótese nula de
neutralidade e equilíbrio populacional. Nós observamos uma correlação positiva entre a distância do Estreito de
Bering e uma maior freqüência de alelos endêmicos (r2 = 0,351, p < 0,01), corroborando o resultado de que há um
aumento da freqüência desses alelos em direção ao sul do continente americano. Dentre as populações analisadas,
11 (duas norte-americanas, uma centro-americana e 8 sul-americanas) apresentaram valores de D de Tajima
significativamente positivos (p < 0,05), entretanto, não encontramos uma correlação significativa entre os desvios
captados pelo teste D de Tajima e a freqüência de alelos endêmicos (r2 = 0,073, p > 0,10). Apenas uma população
norte-americana, onde não observamos alelos endêmicos, apresentou desvio significativo para o teste de EwensWatterson. Os desvios que captamos com o teste D de Tajima são compatíveis com a atuação de seleção balanceadora
em um período anterior à ocupação do continente americano, conclusão corroborada pelo nosso resultado com
o teste Ewens-Watterson (um teste menos sensível a eventos antigos que o D de Tajima). De acordo com nossos
resultados, não podemos associar o aumento de freqüência dos alelos endêmicos nas populações sul-americanas
com eventos seletivos ou demográficos extremos, pois a variação que observamos é compatível com a neutralidade.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
11
Padrões de desequilíbrio de ligação e de diversidade
genética no cromossomo X em populações ameríndias
e não-ameríndias
Amorim, CEG1; Wang, S2; Marrero, AR1; Ruiz-Linares, A2; Salzano, FM1; Bortolini, MC1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular e Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Caixa Postal 15053, 91501-970, Porto Alegre, RS, Brasil
2
The Galton Laboratory, Departament of Biology, University College London, Londres, Reino Unido
[email protected]
1
Palavras-chave: Ameríndios, deriva genética, mistura genética, STRs.
Introdução: A compreensão dos padrões de desequilíbrio de ligação (DL), i.e. a associação não aleatória de alelos
em dois ou mais loci, é a base para o mapeamento de genes e para o planejamento de estudos de associação.
Objetivo: Analisar os padrões de diversidade genética e de DL no cromossomo X em populações americanas.
Metodologia: Cinco populações foram investigadas (N=132 cromossomos), entre elas três populações ameríndias
da Colômbia (Kogi, Wayuu e Zenu) e duas não-ameríndias (Vale Central da Costa Rica e gaúchos brasileiros). Foram
utilizados para as análises 47 loci de microssatélites distribuídos ao longo de todo cromossomo X. Resultados
e Discussão: As populações ameríndias apresentaram menor diversidade genética e maior proporção de loci
em DL do que as não-ameríndias. O padrão observado em nativos americanos está associado principalmente
a fenômenos de natureza estocástica e demográfica durante a entrada no continente, bem como a eventos de
fissão-fusão na propagação das populações, ocorridos posteriormente. A reduzida proporção de loci em DL
nas populações não-ameríndias é inesperada visto que populações mestiças apresentam normalmente altos
índices de DL. No entanto, os resultados podem ter ocorrido devido à baixa heterogeneidade genética entre
os estoques parentais nos loci considerados. Dois blocos haplotípicos foram encontrados, ambos restritos às
populações ameríndias. O primeiro, presente nas três populações, envolveu os marcadores DXS8051 e DXS7108,
localizados em Xp22.22 e Xp22.3 respectivamente. O segundo bloco haplotípico, encontrado somente entre os
Kogi, envolve oito marcadores (DXS993, DXS8080, DXS8083, DXS1055, DXS1039, DXS991, DXS1216 e DXS986)
entre Xp11.4 e Xq21.1, para qual uma árvore haplotípica foi construída. Conclusões: Em concordância com outros
trabalhos, populações relativamente isoladas, como as populações ameríndias analisadas, parecem ser ideais
para a implementação de estudos de associação devido à grande extensão de DL observada entre seus loci. Os
blocos haplotípicos encontrados constituem uma potencial ferramenta para estudos evolutivos; no entanto,
sua aplicação demanda análises adicionais envolvendo um número maior de populações nativo-americanas.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERGS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
12
Implementação de metodologias para a análise de
variabilidade genética em populações humanas da
Baixada Santista
Corraini, NR1; Oliveira, MA1
UNESP, Campus Experimental do Litoral Paulista – CLP
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Genética de populações; STRs; VNTRs; D-loop;Cromossomo Y.
A região da Baixada Santista, inicialmente colonizada por populações nativo-americanas recebeu após o período
pré-cabralino diversos fluxos populacionais relacionados aos ciclos econômicos brasileiros e a mão-de-obra
necessária ao suprimento dos mesmos, de forma a conceber uma população altamente miscigenada envolvendo
índios, europeus, africanos, e posteriormente, provenientes de fluxos migratórios internos, populações das
diferentes regiões do país atraídas pelas ofertas de emprego decorrentes modernização da região, atualmente
denominada metropolitana. Objetivando a análise da extensão e variabilidade genética destes habitantes,
ressaltando processos de deriva genética, bem como o fluxo gênico entre comunidades distribuídas ao longo do
litoral, este estudo buscou implementar métodos de caracterização populacional, uma vez que apesar da região da
Baixada Santista possuir grande importância econômica e cultural carece de estudos populacionais que abordem
a dinâmicas populacionais utilizando marcadores moleculares. Com a finalidade de padronizar metodologias para
análises de regiões hiper-variáveis de DNA autossômicos (D1S80, APOB e ACE), pertencentes ao cromossomo
Y (DYS119) e regiões polimórficas mitocondriais foram testadas metodologias de extração de DNA utilizando o
método swab, bem como a padronização das condições experimentais de amplificação e detecção das regiões
hiper-variáveis supracitadas. Acreditamos que os esforços iniciais implementados por este trabalho serão de grande
importância para estudos de caráter genético das populações da Baixada Santista que visam a determinação do
grau de miscigenação da população local. Estudos deste tipo também poderão ser aplicados em caracterizações de
populações indígenas presentes na região, abordagem ainda escassamente utilizada em comunidades do tronco
Tupi-Guarani.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
13
Correlação entre alelos do SNP rs250417 do gene
SLC45A2 e cor de olhos, cabelos e pele na população
de Ribeirão Preto – SP
Andrade, CCF1; Fracasso, NCA1; Wiezel, CEV2, Simões, AL1; Mendes-Junior, CT2
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14049-900, Ribeirão Preto-SP, Brasil
Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, 14040-901, Ribeirão
Preto-SP, Brasil
1
2
Palavras-chave: Pigmentação, SNPs, SLC45A2, Genética de populações.
A pigmentação de pele, olhos e cabelos é definida pela produção de melanina nas células. Mais de 100 genes
podem estar envolvidos nesse processo. O gene SLC45A2 está localizado na região p13.3 do cromossomo 5. O
produto do SLC45A2 é uma proteína de transporte associada à membrana (MATP) e que participa do transporte
de proteínas melanossomais. Em populações com descendência européia, a análise de SNPs do SLC45A2 tem
mostrado associação com a cor de pele, olhos e cabelos. O objetivo do presente estudo foi analisar o SNP rs250417,
localizado na região codificadora do gene SLC45A2, com intuito de verificar a correlação entre alelos deste SNP e
a pigmentação de cabelos, olhos e pele. Foram analisados 150 indivíduos saudáveis e não relacionados do interior
do estado de São Paulo. O DNA foi extraído pelo método salting-out. Os genótipos para o SNP rs250417 foram
analisados através da técnica de PCR posteriormente submetida à clivagem por enzimas de restrição (PCR/
RFLP). O produto da reação de restrição foi analisado em gel de poliacrilamida 10% corado com nitrato de prata.
Foram encontradas associações significativas entre os alelos do SNP analisado e as seguintes características:
cabelos pretos ou castanhos, olhos castanho-claro ou castanho-escuro, e também para pele clara. A presença do
alelo C gerou uma tendência 2,569 vezes maior para a ocorrência de cabelos pretos (p = 0,002) Já para cabelos
castanhos, a presença do alelo G aumenta em 1,983 vezes a susceptibilidade para esta característica (p =
0,031). Padrões semelhantes foram identificados para a ocorrência de olhos castanho-claros. Para a ocorrência
de olhos escuros, foi observado que o alelo C confere quase 2,466 vezes mais susceptibilidade(p = 0,003). A
ocorrência de pele clara foi a característica que apresentou maior correlação como SLC45A2: sua possibilidade de
ocorrência foi aumentada em 4,107 quando o alelo C estava presente (p = 0,0004). Para as outras características
de pigmentação dos cabelos, olhos e pele não foi encontrada correlação significativa com o gene SLC45A2.
Auxílio financeiro: CAPES, CNPq, e FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
14
Analysis of Human Phenotypic Genetic Markers:
Association with Hair, Skin and Eyes Pigmentation
Neitzke-Montinelli, V¹; Ürményi, TP¹; Rondinelli, E¹; Moura-Neto, RS2; Silva, R¹
¹Laboratório de Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro – Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2
Laboratório de Biologia Molecular Forense – Instituto de Biologia - UFRJ
[email protected]
Keywords: polymorphism; mc1r; melanin; allelic frequency; forensic.
Currently in biology several genetic targets are been used for forensic analysis. A new class of genetic polymorphism
is starting to come into evidence: the phenotypic markers. Many genes have been identified associated with the
phenotype particularly the ones involved on melanogenesis pathway. The first gene described was the melanocortin-1
receptor gene (mc1r) which participates in regulation of melanin synthesis. Some polymorphisms were identified
in mc1r promoting the loss-of-receptor function, resulting in a red hair and fair skin phenotypes. This receptor has
an antagonist, agouti signaling protein (ASIP) which inactivates the mc1r. It was also seen an association of a Single
Nucleotide Polymorphism (SNP) on this antagonist with dark skin. This study aimed to provide association of
polymorphisms in the promoter and coding regions of the MC1R gene, and the region corresponding to the 3’UTR
of the asip gene with the natural variation of the color of hair, skin and eyes. We have selected a group of people
assembled according the phenotype characters (submitted to ethical committee). Preliminary results obtained
with 100 people have shown that one polymorphism in the promoter region is strongly associated to skin and
hair color and tanning ability (p < 0.0001), eyes color and freckles (p = 0.0167 and p = 0.0083, respectively). Another
SNP on the same region achieved the same result differing in significance for eyes (p = 0.0139), hair (p = 0.0002)
and no association with the presence of freckles. In the coding region, on the other hand, we have confirmed 16
polymorphisms described in the the literature and identified three new SNPs. Finally, the SNP present at the ASIP
3‘UTR is associated with the phenotype of skin color (p = 0.0044), hair (p = 0.0025)and tanning ability (p = 0.0109).
Supported by CNPq, Faperj
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
15
Análise de polimorfismos do gene MC1R em
uma amostra brasileira revela associação com
características de pigmentação em humanos
Marano, LA¹; Simões, AL¹; Donadi, EA²; Mendes-Junior, CT³.
¹ Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
² Divisão de Imunologia Clínica, Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
³ Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: pigmentação, SNPs, MC1R, genética de populações, genética forense.
Dentre os genes conhecidos por influenciarem a variação normal de pigmentação de olhos, pele e cabelos em
humanos, o gene MC1R (receptor de melanocortina 1) é o mais bem caracterizado até o momento. A atuação do
MC1R ocorre pela produção de uma proteína transmembrana nos melanócitos, responsável pela regulação da
produção de melanina nos mesmos. Sabe-se que a atuação do MC1R determina a proporção entre eumelanina
(coloração castanha/preta) e feomelanina (coloração amarela/vermelha) presente nos melanócitos. O presente
trabalho tem como objetivo analisar os SNPs conhecidos do gene MC1R com o propósito de se avaliar a influência
da diversidade deste gene em características como a presença de sardas e variação da pigmentação dos olhos, pele e
cabelos em humanos. Foram analisados 28 SNPs conhecidos da região codificadora do gene MC1R em 131 indivíduos
da região de Ribeirão Preto, SP. A extração do DNA foi feita pela técnica de salting-out. A região codificadora do gene
MC1R (951pb) foi amplificada em uma única reação de PCR, a qual foi seqüenciada em um analisador genético
ABI-PRISM 310 por eletroforese capilar, utilizando-se os mesmos primers empregados para a amplificação. Dos 28
SNPs avaliados, apenas 16 mostraram variação nas amostras estudadas, sendo que três deles demonstraram estar
associados a características de pigmentação (rs1805005, rs1805007 e rs3212367). A presença do alelo T (60Leu)
no locus do SNP rs1805005 está associada a presença de olhos verdes (p=0,048; OR=4,30) e pele clara (p=0,027
OR=4,784). Já o alelo C (151Arg) no SNP rs1805007 se apresentou associado com a pigmentação escura (castanha e
preta) dos cabelos (p=0,021; OR=15,42), enquanto o alelo T (151Cys) do mesmo locus associa-se com a pigmentação
loira (p=0,021 OR=15,42). A ocorrência do alelo T (300Phe-mutação sinônima) no SNP rs3212367 associou-se a
presença de olhos castanho-escuros (p=0,043 OR=11,01). Embora a reconstrução dos haplótipos envolvendo os
28 SNPs permitiria obter-se um maior poder para detecção de associações entre as variações do gene MC1R e as
características de pigmentação, tal procedimento ainda não foi realizado em virtude da ausência de dados completos
em boa parte dos indivíduos, o que reduziria drasticamente o tamanho amostral. Ainda assim, o presente trabalho
apresenta associações significativas entre SNPs individuais e pigmentação de olhos, cabelos e pele. Os dados
obtidos confirmam que tal gene desempenha papel relevante na variação de pigmentação na população Brasileira.
Apoio financeiro: CNPq, FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
16
Diversidade de regiões cis-reguladoras de genes HLA
em humanos: uma meta análise
Maia, MHT1; Francisco, RS1; Bitarello, BD1; Meyer, D1
Laboratório de Biologia Evolutiva e Conservação de Vertebrados. Instituto de Biociências. Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: HLA, cis-reguladoras, VEGA, evolução, diversidade.
Regiões reguladoras de transcrição apresentam, em geral, sinais de diversidade elevados que são sempre
relacionados à variabilidade fenotípica ou ao nível de expressão tecido-específica de genes. Para os genes do
Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC), o conhecimento dos fatores que dirigem a diversidade
de seus promotores é, em grande parte, desconhecido. A maioria dos estudos aponta para um sinal de seleção
diversificadora nessas regiões, o que condiz com a função dinâmica que possuem na modulação da resposta
imune. Com o intuito de avançar na compreensão da diversidade das regiões reguladoras dos genes do MHC, este
estudo tem como objetivo descrever a diversidade de regiões cis-reguladoras dos genes HLA clássicos (HLA-A, -B,
-C, -DRB1, -DQB1 e DPB1). Para esse estudo foram utilizadas as seqüências dos oito haplótipos divergentes de MHC
disponíveis no banco de dados VEGA (Vertebrate Genome Annotation). As regiões de interesse para o estudo foram:
500pb a montante do gene, 3’ UTR (untranslated). Os introns 1 e 2 também foram analisados para comparação
com a diversidade das regiões cis-reguladoras. Foram estimados os valores de diversidade nucleotídica (π) para
cada região do gene e esses valores foram comparados entre si. Os resultados apontam primeiramente para um
aumento de diversidade nos 500pb a montante dos genes, com exceção do HLA-DPB1 (π=0,0). Entre os genes de
classe I, o HLA-B (π= 0, 02698) foi o que apresentou maior diversidade e em classe II, o HLA-DRB1 (π= 0,05336).
Para a região 3’ UTR, os genes que se destacaram foram HLA-C (π= 0,02153) e HLA-DRB1(π= 0,079). Quando
comparadas as regiões entre si, a diferença mais marcante foi a entre região 3’ UTR e 500 pb a montante e intron
1 para todos os genes de classe II (p<0,002). Quando as regiões cis-reguladoras de classe I e II foram comparadas
no geral, observou-se uma diferença significante (p=0, 002). O aumento da diversidade em classe II em relação à
classe I pode ser explicado pela importância que nível de expressão daqueles genes possui na ativação de resposta
Th1 ou Th2. Já a variabilidade na região 3; UTR do gene HLA-C pode estar relacionada com seu papel na resposta
imune inata já que a molécula HLA-C, interage com diferentes receptores KIR e diferenças na expressão dessa
molécula pode resultar em diferentes respostas de células NK. Além disso, as diferenças observadas nos padrões de
variação entre regiões cis-reguladoras e intron 1 podem ser uma evidência de que as regiões reguladoras não estão
evoluindo de maneira neutra. Ainda que apenas exploratórios e limitados pelo tamanho amostral e pelo haplótipos
divergentes, tais resultados servem como guia para futuros estudos de regiões cis-reguladoras de genes HLA.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
17
Variabilidade e estrutura haplotípica das regiões
reguladoras do gene HLA-G na população brasileira
Castelli, EC1; Mendes-Junior, CT2; Veiga-Castelli, LC1, Moreau, P3; Donadi, EA1
Divisão de Imunologia Clínica, Departamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP), Universidade de São
Paulo (USP), Ribeirão Preto-SP, Brasil
2
Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP, Ribeirão Preto-SP, Brasil
3
Commissariat à l’Energie Atomique / DSV /I2BM / Service de Recherches en Hémato-Immunologie, IUH, Hôpital Saint-Louis, 75010 Paris
[email protected]
1
Palavras-chave: HLA-G, MHC, polimorfismo, expressão
O gene HLA-G é um loco não clássico de histocompatibilidade de classe I (HLA), predominantemente expresso
na interface materno-fetal e associado com a tolerância materna e inibição das funções citolíticas das células
T e Natural Killer (NK). Evidências indicam que polimorfismos nas regiões 5’ reguladoras e 3’não-traduzidas
podem influenciar diretamente o nível de expressão deste gene. Contrastando com a região codificadora do
HLA-G, as regiões reguladoras se mostram muito polimórficas, apresentando diversos SNPs em locais de ligação
de fatores de transcrição. Considerando que a população brasileira é um rico repositório de variação genética,
a variabilidade da região 5’ promotora e 3` não-traduzida foi avaliada em 90 indivíduos saudáveis doadores
de medula óssea do sudeste brasileiro. Os sítios polimórficos foram detectados por sequenciamento direto
do produto de PCR e haplótipos foram obtidos por inferências probabilísticas. Vinte e cinco sítios de variação
foram detectados na região promotora proximal do gene HLA-G em uma região de aproximadamente 1350-pb
antecedentes ao éxon 1, todos apresentando frequências superiores a 2% com exceção de apenas um SNP na
posição -443, com uma frequência de 0,5% para o alelo menos frequente. Estes SNPs estão arranjados em 12
haplótipos com frequências variando entre 0,5% e 32,7%. A região 3’ não-traduzida também se mostrou muito
polimórfica, com 8 pontos de variação em apenas 350-pb, todos apresentando frequência superior a 2%. Estes sítios
de variação estão arranjados em 8 haplótipos distintos, com frequências entre 0,5% e 27,2%. Ainda, um elevado
desequilíbrio de ligação foi observado entre os sítios de variação nas regiões promotoras e 3` não-traduzida,
indicando que os efeitos de cada sitio de variação no padrão de expressão de HLA-G não são independentes.
Apoio financeiro: CNPq processos 475670/2007-8 e 150175/2009-4, CAPES/COFECUB processo 653/09 e FAPESP
processo 07/58420-4
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
18
O polimorfismo -13910 C>T e a persistência da
enzima lactase na população brasileira
Friedrich, DC1; Santos, SEB2; Santos, AKR2; Salzano, FM1; Petzl-Erler, ML3; Tsuneto, LT3; Hutz, MH1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Laboratório de Genética Humana e Médica, Universidade Federal do Para, 3Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná
[email protected]
1
2
Palavras-chave: persistência da lactase, gene LCT, gene MCM6, polimorfismos
A enzima lactase é secretada pelas células do epitélio intestinal e é a responsável pela quebra do açúcar lactose,
presente no leite, em glicose e galactose. A lactase é codificada pelo gene LCT, localizado no cromossomo 2q.21,
possuindo alta expressão em recém-nascidos. Após o período de lactação, a expressão da enzima lactase diminui e
os adultos perdem a capacidade de metabolizar a lactose. Porém, alguns adultos mantêm essa capacidade, sendo
esta uma condição dominante, chamada de persistência da enzima lactase (PL). A PL surgiu no norte da Europa a
partir de mutações no gene MCM6, adjacente ao gene LCT, numa região que atua como um enhancer da expressão da
lactase. Em europeus, o polimorfismo associado com a PL e intolerância a lactose é o -13910 C>T, sendo que o alelo
-13910T determina a PL. O objetivo deste estudo foi determinar a freqüência do alelo -13910T na população brasileira.
Foram incluídos no estudo 1197 indivíduos, distribuídos da seguinte forma: 182 afro-brasileiros do Rio Grande do
Sul (RS), 337 descendentes de europeus do RS, 200 miscigenados de Belém (PA), 263 miscigenados de Recife (PE), 72
índios Kaingang, 59 índios Guaranis-Ñandeva e 84 Guaranis-Kaiowá. A genotipagem foi realizada através de PCRRFLP. Inicialmente, um fragmento de 216 pares de base (pb), contendo a região -13910, foi amplificado por PCR.
Este fragmento foi clivado com a enzima BsmFI, gerando 2 fragmentos, de 121 pb e 95 pb, quando o alelo T estava
presente na posição -13910. Os fragmentos gerados foram visualizados em gel de agarose 2,5%. As frequências do
alelo -13910T obtidas foram: 18,41% em afro-brasileiros do RS; 29,53% em descendentes de europeus do RS; 17,5%
em Belém; 20,53% em Recife; 4,86% nos Kaingangs; 7,63% nos Guaranis-Ñandeva e 0,6% nos Guaranis-Kaiowá. As
frequências alélicas diferem significativamente entre afro-brasileiros do RS e descendentes de europeus do RS, assim
como entre os afro-brasileiros do RS e os ameríndios (p<0,000001 para todas as comparações). Os descendentes de
europeus do RS também diferem significativamente das populações de Belém, Recife e das 3 populações indígenas
(p<0,000001 para todas as comparações). As populações de Belém e Recife ainda diferem dos Kaingangs e Guaranis
(p<0,000001 para todas as comparações). Entre as populações ameríndias, os dois subgrupos Guaranis diferem
entre si (p<0,000001). O alelo -13910T surgiu na Europa e é ausente em diversas populações africanas estudadas.
Dessa forma, sua frequência maior na população de descendentes de europeus do RS está de acordo com o
esperado. Por outro lado, os achados na população afro-brasileira poderiam ser explicados pela miscigenação, assim
como a observação desse alelo nas populações indígenas estudadas. A contribuição de europeus na constituição
das populações de Belém, Recife e afro-brasileiros do RS é semelhante, quando o alelo -13910T é analisado.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
19
Determinação da composição de mistura racial de
duas amostras populacionais urbanas em Porto Velho,
Rondônia
Farias, JD1,2; Lafontaine, R3; Guimarães, MS1,2; Krauze, A2,3; Andrade-Casseb; A2; Engracia, V1,2
Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais – IPEPATRO
Universidade Federal de Rondônia – UNIR
3
Centro de Pesquisa em Medicina Tropical – CEPEM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Marcadores Genéticos, Migração, Mistura racial, Populações Amazônicas, Rondônia
A população do Brasil, formada por uma extensiva mistura entre ameríndios, europeus e africanos, é uma das
mais variada no mundo. No entanto, a contribuição tri-racial brasileira segue padrões distintivos entre as diversas
regiões do país, sendo isto um reflexo de uma migração distinta ao longo de vários anos de colonização brasileira.
Estudos de origem das populações Amazônicas e a determinação do padrão de contribuição de genes africanos,
europeus e ameríndios podem contribuir para uma melhor compreensão de sua estrutura populacional, e também
no desenvolvimento das doenças que afligem essa região, bem como doenças infecciosas, uma das principais
causas de morbidades nesta região. Rondônia foi colonizado por várias ondas migratórias de diversas regiões
do país, e a estrutura populacional é heterogênea, reproduzindo o caráter miscigenado da população brasileira.
Estudos de genética de populações têm sido realizados em nossa região para a determinação a composição racial
das populações que aqui vivem. Amostras de sangue periférico foram coletadas na maternidade do Hospital de
Base da cidade de Porto Velho, Rondônia, sendo analisados 600 cromossomos de parturientes, e 600 de recémnascidos (sangue de cordão umbilical). Na determinação do grau de mistura racial foram utilizados os marcadores
CCR5 (C-C Receptor de Quimiocinas tipo 5), ACP1 ( fosfatase ácida locus 1), CYP2E1 (Citocromo P450 2E1),
GSTP1 (Glutationa S-Transferase classe Pi). A estimativa dos componentes de miscigenação mostrou que as
contribuições de africanos, ameríndios e europeus na amostra de parturientes foram 0.6564 ± 0.0606, 0.2886 ±
0.0567, e 0.0550 ± 0.0616, e para recém-nascidos 0.6617 ± 0.0027, 0.1713 ± 0.0023, e 0.1670 ± 0.0030, respectivamente.
Estes resultados podem não refletir a composição racial da cidade de Porto Velho, desde que o Hospital de Base
de Porto Velho recebe pessoas de baixo poder aquisitivo tanto da capital como do interior do estado, além de
prestar atendimento a pacientes oriundos de Humaitá, cidade próxima a Porto Velho, mas pertencente ao estado
do Amazonas que se caracteriza por apresentar um alto índice de mistura indígena já que é um estado que
envolve grande parte da Amazônia Ocidental Brasileira. Vale ressaltar ainda que o Hospital de Base, no período
de coleta, era o único hospital público responsável pelo atendimento de parturientes da capital, com um centro
especializado em atendimento neonatal e realizando praticamente todos os atendimentos de pessoas de baixa
renda. Não foram observadas diferenças significantes na distribuição do polimorfismo dos sistemas analisados
quando comparados com outras populações brasileiras, sendo assim, observado o reflexo da miscigenação
ocorrida em Rondônia como resultado das diversas ondas migratórias recebidas durante a formação deste estado.
Agradecimento: Hospital de Base Dr. Ari Pinheiro, Porto Velho-RO
Agência Financiadora: IPEPATRO, FIOCRUZ, FNS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
20
Polimorfismo do Y-GATA C4 na população brasileira e
associação com linhagens do cromosomo Y de origem
subsaariana
Palha, TJBF1; Ribeiro-Rodrigues, EM1; Ribeiro-dos-Santos, A1; Santos, S1
Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: Y-STR; GATA C4; YHRD; População Brasileira; África Subsaariana.
O Y-STR GATA C4, também conhecido como DYS635, apresenta elevada variabilidade nas diversas populações
do mundo e é comumente usado em estudos populacionais e análises forenses. Atualmente, 14 alelos já foram
descritos, sendo que o alelo C4*17 foi descrito somente em populações da África subsaariana e em algumas
populações afrodescendentes de outros continentes. Por este motivo, o alelo C4*17 tem sido descrito por alguns
autores como um bom marcador de ancestralidade africana. Diversos trabalhos, utilizando diferentes marcadores
genéticos, já foram publicados relatando a contribuição de linhagens africanas subsaarianas na formação da
população brasileira, historicamente formada por uma mistura de europeus, africanos e indígenas. Com o objetivo
de identificar a presença (ou não) do C4*17 na população brasileira nós analisamos 1948 indivíduos das cinco
regiões do Brasil: 878 indivíduos da região Norte, 285 da Nordeste, 139 da Centro-Oeste, 458 da Sudeste e 188 da
região Sul. As amostras de DNA foram obtidas por extração orgânica com fenol/clorofórmio. A amplificação foi
feita por PCR multiplex desenvolvida no Laboratório de Genética Humana e Médica da UFPA, e foi conjunta com
outros loci Y-STR, comumente utilizados em análises forenses. As eletroforeses ocorreram no seqüenciador capilar
ABI 3130 (Applied Biosystems) usando como amostra controle o DNA 007 (Applied Biosystems). A determinação
do tamanho dos fragmentos e a designação dos alelos foi feita no programa GeneMapper v. 3.2. Na população
brasileira foram observados 9 diferentes alelos para o marcador GATA C4, com diversidade genética estimada
em 77%. Os alelos variaram entre C4*17 e C4*26, sendo que C4*18 não foi observado em nenhum indivíduo da
população. Os alelos mais freqüentes foram C4*23 (33%) e C4*24 (23%). O C4*17 foi observado em apenas seis
indivíduos da população brasileira (0,3%), sendo um da região nordeste, dois no centro-oeste, e três do sudeste.
Essas amostras que apresentaram o C4*17 foram seqüenciadas confirmando a presença de 17 unidades de
repetições. Realizamos uma busca no banco de dados YHRD (www.yhrd.org – acesso em 08/06/10), e dos 23.137
haplótipos depositados, apenas 33 apresentaram C4*17: 27 descritos em populações da África subsaariana e 6 em
populações afrodescendentes. Embora tenha sido comprovada a associação entre haplótipos Y-STRs e haplogrupos
definidos por SNPs, devido à alta taxa de mutação dos Y-STRs nem todos podem definir um haplogrupo. De
acordo com alguns autores, é provável que C4*17 tenha sido originado por um evento de mutação único, sendo
que as associações obtidas no YHRD indicam que a presença do C4*17 no haplótipo Y-STR significa pertencer ao
haplogrupo E, subclado E1b1a (M2), mais comum na África subsaariana. A presença desse alelo específico confirma
a contribuição da linhagem africana subsaariana, pela análise do Y-DNA, na formação da população brasileira.
Apoio financeiro: FINEP, UFPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
21
Frequência do polimorfismo do gene ACTN3 em atletas
de elite do futebol mineiro
Rosse, IC¹; Mendonça, EP²; Coelho, DB²; Melo, ALO¹; Figueredo, DNG¹; De-Paz, JAF3; Silami-Garcia², E;
Carvalho, MRS¹
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil
Departamento de Fisiologia do Esporte, Escola de Educação Física e Terapia Ocupacional, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte, MG, Brasil
3
Sección de Tercer Ciclo Y Postgrado, Universidad de Léon.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ACTN3, R577X, fisiologia e genética do esporte, frequência alélica, futebol.
O gene da alfa-actinina-3 (ACTN3) codifica uma proteína do disco Z de fibras musculares que tem sido associada
a esportes de força e velocidade. O alelo X do polimorfismo R577X no gene ACTN3 resulta em um stop codon
prematuro, que leva a perda completa da proteína nos indivíduos homozigotos para o alelo X. Esse polimorfismo
não está relacionado a doenças, porém dependendo do genótipo, alguns indivíduos podem se beneficiar de
estratégias de treinamento e de recuperação pós-jogo específicas. Pressupostos teóricos indicam que os indivíduos
com genótipo RR são mais rápidos e fortes. Ainda não temos a frequência desse polimorfismo para os atletas
brasileiros. A frequência do alelo X é de 16%, na população africana, e de 18% nos europeus. Com o objetivo de
estimar a frequência desse polimorfismo nos atletas de elite do futebol mineiro foi coletado sangue periférico
de 298 jogadores (distribuídos nas categorias infantil, juvenil, júnior e profissional). Após a extração de DNA, um
fragmento contendo a sequência do exon 16 do gene da ACTN3 foi amplificado. Os alelos R577X (códons CGA e
TGA) foram distinguidos pela presença (alelo X) ou ausência (alelo R) de um sítio de restrição da enzima DdeI. As
frequências genotípicas encontradas em cada categoria foram analisadas através do teste de X² na planilha de
Excel. Teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg e análise de diferenciação genotípica foi realizado com o software
GENEPOP versão 4.0.10. Não foram encontradas diferenças quando se comparou simultaneamente as frequências
genotípicas observadas em todas as categorias (p=0,3373). Entretanto, observa-se uma tendência à frequência
mais baixa do genótipo XX entre os profissionais. Na comparação par a par foi encontrada diferença entre as
categorias Amador x Profissional (p=0,0245), evidenciando que a frequência do genótipo XX diminui na categoria
profissional. As frequências alélicas e genotípicas estão em Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p=0,2582). A análise de
diferenciação genotípica não evidenciou diferenças significantes (p = 0.71641, S.E. = 0.00906). Esse estudo fornece
as primeiras análises de frequência do polimorfismo em atletas do futebol mineiro. Nosso próximo passo será a
genotipagem de indivíduos controles e posteriormente um estudo de associação do genótipo com a performance
dos atletas. Isto nos ajudará a entender melhor as variações individuais em características importantes para a
prática esportiva e de que maneira adaptar os treinamentos às individualidades dos atletas de alto rendimento.
Apoio financeiro: FAPEMIG/CNPq/Pronex/CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
22
Polimorfismo no intron 4 do gene Sintetase do
Oxido Nítrico Endotelial - NOS3 em uma amostra
populacional do município de Porto Velho (RO)
Fiorese, MHH1,2; Dantas, DSS2; Martins, HHO1,2; Pires, CRD1,2; Moura, MMF1,2; Pagotto, RC1,2
1
2
Laboratório de Genética do Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnologia - Universidade Federal de Rondônia
Departamento de Biologia da Universidade Federal de Rondônia
Palavras-chave: (NO) óxido nítrico, eNOS (sintetase do óxido nítrico endotelial), polimorfismos da eNOS, disfunção endotelial, células do endotélio
O óxido nítrico (NO) é considerado como um importante fator para a homeostase vascular, estando presente nas
células do endotélio. Sua biosíntese é catalisada pela enzima eNOS, codificada pelo gene sintetase do oxido nítrico
endotelias (NOS3), localizado no cromossomo 7q35.36. O gene NOS3 contém 26 éxons e 25 íntrons. Devido a essa
importância biológica que o óxido nítrico apresenta, várias pesquisas tentam encontrar uma correlação entre os
polimorfismos da eNOS e doenças pulmonares e cardiovasculares. Dentre os vários polimorfismos encontrados no
NOS3, três polimorfismos são mais relevantes, em especial o polimorfismo do íntron 4, cujo alelo eNOS*4a têm sido
associado à uma redução da biodisponibilidade de óxido nítrico e que leva ao desenvolvimento de um processo
conhecido como disfunção endotelial. O objetivo do estudo foi determinar as freqüências gênicas e genotípicas
para o polimorfismo no intron 4 do gene NOS3 (eNOS 4) em uma amostra populacional do município de Porto
Velho (RO), visando determinar parâmetros locais para comparação futura com as freqüências descritas em grupos
de pacientes com pneumopatias. O DNA foi purificado pelo método de precipitação de proteínas e amplificado
por iniciadores que flanqueiam a sequência dos 27 pares de base no eNOS4. Até o momento foram analisados
43 indivíduos. As freqüências alélicas foram, respectivamente, 0,128 e 0,872 para os alelos eNOS4*A e eNOS4*B,
tendo sido encontrado 74,4% de indivíduos homozigotos para o alelo B e nenhum indivíduo com o genótipo AA
(X2= 0,313 ; p>0,576). Nossos resultados são semelhantes aos encontrados em outros estudos realizados em outras
populações brasileiras.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
23
Influencia da heterogeneidade da população brasileira em
polimorfismos dos genes SLCO1B1, SLCO1B3 e ABCB1
Sortica, VA1; Ojopi, EB2; Genro, JP1; Suarez-Kurtz, G3; Moraes, MO4; Pena, SDJ5; Ribeiro-Dos-Santos, AKC6;
Romano-Silva, MA7, Hutz, MH1
Departamento de genética, Universidade Federal de Rio Grande do Sul
Laboratório de Neurociências, Instituto de Psiquiatria, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo
3
Divisão de Farmacologia, Instituto Nacional do Câncer (INCA)
4
Unidade de Farmacologia Clínica, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina do Ceará
5
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade Federal de Minas Gerais
6
Laboratório de Genética Humana e Médica, Universidade Federal do Pará
7
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Medicina Molecular, Universidade Federal de Minas Gerais
1
2
Palavras-chave: SLCO1B1, SLCO1B3, ABCB1, Farmacogenética, Ancestralidade
Os genes SLCO1B1, SLCO1B3 e ABCB1 codificam transportadores de membrana responsáveis pela captação e
efluxo de diversos substratos. Polimorfismos desses genes influenciam a farmacocinética de diferentes fármacos
podendo alterar a resposta ao tratamento ou contribuir para o aparecimento de efeitos adversos. A população
brasileira é formada por diferentes graus de miscigenação entre três grupos parentais (ameríndios, africanos
e europeus) apresentando grande heterogeneidade em sua composição genética. O objetivo do trabalho foi
determinar a influencia da heterogeneidade da população brasileira na distribuição de polimorfismos de interesse
farmacogenético dos genes SLCO1B1, SLCO1B3 e ABCB1. No estudo, foram utilizadas amostras de DNA de 1039
voluntários de quatro regiões brasileiras (Norte, Nordeste, Sudeste e Sul). Os voluntários se autoclassificaram
como brancos (n = 342), pardos (n = 352) ou pretos (n = 345) em relação à “cor/raça” de acordo com os critérios do
IBGE. Em 934 amostras, foi determinado um índice individual de ancestralidade ameríndia, africana e européia
através de um conjunto de 40 marcadores do tipo inserção/deleção previamente validados. Os genótipos dos
polimorfismos 388A>G, 521T>C e 463C>A do gene SLCO1B1; 334T>G e 699G>A do gene SLCO1B3; e 1236C>T,
2677G>T/A e 3435C>T do gene ABCB1 foram determinados por discriminação alélica em PCR em tempo real.
Durante a análise da distribuição dos polimorfismos do gene SLCO1B1 em relação às regiões geográficas e a “cor/
raça”, constatamos que os genótipos do polimorfismo 388A>G, estão associados com a “cor/raça”, a região e com
a interação cor*região (p >0,001, 0,003 e 0,034; respectivamente), e os genótipos do polimorfismo 521T>C estão
associados com a “cor/raça” (p = 0,014). Quando analisamos a distribuição dos polimorfismos do gene do SLCO1B3,
constatamos que os polimorfismos 334T>G e 699G>A estão associados com a “cor/raça” e a região (p >0,001 e
0,028, respectivamente). Na análise do gene ABCB1, verificamos que os genótipos do polimorfismo 1236C>T
estão associados com a “cor/raça” e a região (p >0,001 e 0,011, respectivamente), os genótipos do polimorfismo
2677G>T/A estão associados com a “cor/raça”, a região e com a interação cor*região (p >0,001, >0,001 e 0,004;
respectivamente), e os genótipos do polimorfismo 3435C>T estão associados com a “cor/raça” e a região (p >0,001
e 0,008, respectivamente). Na análise com os índices de ancestralidade, verificamos que os alelos 388A, 463A, 334G,
699A, 1236T, 2677NonG e 3435T estão associados com a ancestralidade européia (p >0,001 exceto para 463A com
p = 0,023). Os alelos 388G, 334T, 699G, 1236C, 2677G e 3435C estão associados com a ancestralidade africana (p
>0,001). Os resultados do presente trabalho demonstram que a heterogeneidade da população brasileira influencia
na distribuição de polimorfismos dos genes SLCO1B1, SLCO1B3 e ABCB1, e por isso, dados de ancestralidade
devem ser considerados em estudos de farmacogenética no Brasil que incluam os genes desses transportadores.
Apoio Financeiro: FINEP, CNPq e FAPERGS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
24
Study of the Peroxisome Proliferator-Activated
Receptor Gamma (PPARγ2) Pro12Ala Polymorphism in
healthy individuals
Costa, APP ; Chernishew, ACA2; Azuma, CM2; Cunha. RAF1; Yamamoto, YI1,2
1
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Presbiteriana Mackenzie, São Paulo, SP
Laboratório de Análises Clinicas e Toxicológicas, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Presbiteriana Mackenzie, São
Paulo, SP
[email protected]
1
2
Keywords: PPARγ2 gene, Pro12Ala polymorphism, genetic diversity, diabetes, insulin resistance, Lipid metabolism.
Peroxisome-proliferator-activated receptors (PPARs) are members of the nuclear receptor super family of ligandactivated transcription factors that consists of three subtypes: PPAR-α, PPAR-β and PPAR-γ. It has been shown that
PPAR-γ is a transcription factor that plays a key role in activation of adipocyte differentiation and is an important
modulator of gene expression in a number of specialized cell types, and has been suggested as a candidate gene for
obesity, insulin resistance, and dyslipidemia Cytosine to guanine single nucleotide polymorphism in PPARγ2 gene
resulting in a proline to alanine substitution at codon 12, which has been found to modulate the transcriptional
activity of the gene, and associated with altered insulin sensitivity. Since this amino acid substitution may cause
a reduction in the transcriptional activity of PPARγ, this polymorphism may be associated with decreased insulin
resistance and decreased risk of type 2 diabetes. Although most studies have shown a statistically significant Type2 diabetes mellitus (T2DM) risk reduction given by Ala variant, some others have not, suggesting variability in
the contribution of this variant to the risk of T2DM. The objective of this study was to investigate the potential
association of the most common variant substitution of the PPARγ2 gene with fasting plasma glucose, plasma
total cholesterol, LDL and HDL cholesterol, and plasma triglyceride in subjects treated in the CCBS/UPM Clinical
Analysis Laboratory. The genotype and allele frequencies of PPARγ2 Pro12Ala polymorphism were determined
in a no-diabetic type 2 group. Biochemical parameters were also measured. The three genotype groups of the
Pro12Ala polymorphism, Pro12Pro (77%), Pro12Ala (21%) and Ala12Ala (1,8%) were found. We found an allelic
frequency similar to previous studies. The allelic frequency of the Ala-allele was 12% and the Pro-allele was
88%. All genotype frequencies are in Hardy Weinberg equilibrium (χ2=5,022, p≥0,05). The frequency of subjects
bearing the Ala12 allele was higher in the plasma total cholesterol, triglycerides and glucose lower levels subjects
group than Pro12 allele. The data pointed to a putative relation of PPARγ2 Pro12Ala polymorphism variants
and a decreased risk of T2DM. This is the initial gathering of data and further studies will be accomplished to
investigate this possible association and the protection of individuals with this polymorphism from type 2 diabetes.
Supported by: Fundo MackPesquisa, CCBS, UPM
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
25
ABO, RH E Hemoglobinas variantes em estudantes do
ensino médio da rede publica de Porto Velho (RO)
Santos Jr, SC 1,2; Assunção-Silva, AC1; Pagotto, RC1,2
Laboratório de Genética do Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnologia da Universidade Federal de Rondônia
(CIBEBI-UNIR)
2
Departamento de Biologia-Núcleo de Ciência e Tecnologia da Universidade Federal de Rondônia
[email protected]
1
Palavras-chave: grupos sanguíneos, hemoglobinopatia, freqüência alélica, Amazônia.
O estado de Rondônia é jovem e pouco se conhece sobre a dinâmica dos genes em suas populações, excetuandose as populações malarígenas, sobre as quais são encontrados alguns relatos de freqüências gênicas. Os sistemas
sanguíneos ABO e Rh, bem como as variantes de hemoglobina devem ser rotineiramente determinados logo após
o nascimento. Entretanto, tal rotina foi implantada, de fato, nas unidades de saúde somente na última década, de
forma que há grande desconhecimento por parte da população jovem e adulta, de suas características sangüíneas
como ABO e Rh, assim como da possibilidade ou não de serem portadores de hemoglobinopatias. O presente
estudo faz parte de um projeto de ação integrada de pesquisa e extensão realizado pelo laboratório de genética
do CIBEBI-UNIR que visa ao mesmo tempo divulgar aplicações da genética a estudantes do ensino médio e,
concomitantemente, contribuir para o conhecimento da estrutura genética da população de Porto Velho (RO).
Analisou-se 102 estudantes do terceiro ano do ensino médio da rede publica estadual de Porto Velho (RO) que
participaram de livre e espontânea vontade da pesquisa. O sangue foi colhido por punção digital e analisado com
anticorpos monoclonais para a identificação dos sistemas ABO e RhD. Cerca de 200 microlitros de sangue foi
coletado em capilares com heparina e encaminhados para o laboratório de genética do CIBEBI-UNIR para screening
de variantes hemoglobínicas por eletroforese em ágar-amido em pH alcalino, teste de resistência osmótica em NaCl
0,36% e, quando necessário, a eletroforese em agarose em pH acido (6,2). As freqüências gênicas e fenotípicas foram
obtidas pelo uso do Programa ABO (programoteca GENIOC) cujos valores observados são: grupo A = 33,7%; grupo
B = 7,2%; grupo AB = 2,4% ; grupo O = 56,6%; grupo RhD positivo = 88% ; RhD negativo= 12%. As freqüências alélicas
foram ABO*A= 0,2 ; ABO*B = 0,05 ; ABO*O = 0,75; RH*D = 0,65 (n=83; p=0,4).; RH*d = 0,35. Para as hemoglobinas
(n=102). encontrou-se 5,8% de indivíduos variantes (todos heterozigotos); Os testes para detectar os polimorfismos
protéicos de HB permitiram apenas confirmar que existe polimorfismo, não sendo determinados quais os variantes
encontrados. Tais dados são similares aos encontrados na literatura para populações urbanas da região norte.
Apoio: Pró-reitoria de Cultura, Extensão e Assuntos estudantis da Universidade Federal de Rondônia
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
26
Caracterização genotípica da deficiência da glicose6-fosfato desidrogenase em afro-descendentes de
Saracura, no estado do Pará
Silva, ANLM1; Takahashi, SY1; Cardoso, GL1; Queiroz, MG1; Guerreiro, JF1
Laboratório de Epidemiologia Molecular - Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: G6PD, afro-descendentes, q-PCR, enzimopatia, Santarém-PA.
A primeira reação da Via das Pentoses – fosfato é catalisada pela enzima glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD),
que irá produzir NADPH, que atua como coenzima de agentes antioxidantes. Na maioria das células, a via das
pentoses - fosfato é ativada respondendo ao estress oxidativo, sendo a única fonte de NADPH nos eritrócitos,
e dessa maneira exercendo atividade crucial na proteção das proteínas de membrana, que uma vez oxidadas
alteram a forma desta célula, e da hemoglobina, onde tais alterações levam à lise celular. A produção desta
enzima (G6PD) é controlada por um gene localizado no braço longo do cromossomo X, o que torna a deficiência
da G6PD como uma doença de caráter recessivo, sendo mais freqüente em homens do que em mulheres. Essa
deficiência é a enzimopatia mais freqüente, apresentando elevadas freqüências gênicas, chegando até 25 %, na
África tropical, Oriente Médio e algumas regiões do Mediterrâneo. Mais de 400 variantes já foram descritas, a
maioria com atividade deficiente, sendo a variante africana, também chamada de A- (G202A) a responsável pela
maioria dos casos dessa deficiência no Brasil. O presente trabalho teve como objetivo investigar as freqüências
genotípicas e alélicas da variante A- em uma população de remanescentes quilombolas no município de
Santarém (Saracura), no Estado do Pará. Foram genotipados, por meio de PCR em Tempo Real (q-PCR), noventa
e nove indivíduos e as freqüências genotípicas e alélicas foram estimadas por simples contagem. O teste de c2
foi utilizado para comparar as distribuições de freqüências genotípicas observadas nas amostras investigadas
no presente trabalho com outros trabalhos anteriormente descritos. Do total dos indivíduos genotipados, 93%
apresentaram o genótipo normal. Entre as mulheres, 6% foram heterozigotas (GA) e 1% homozigota mutante
(AA), nenhum homem foi hemizigoto mutante. A freqüência gênica para o alelo A- foi de 6,9%. O numero de
indivíduos portadores desse alelo (A-), na população estudada apresentou-se significativamente semelhante
quando comparado a um estudo realizado em recém-nascidos negros da população de Campinas (7,07%).
As semelhanças entre essas freqüências alélicas podem sugerir que os fundadores desse antigo quilombo no
Pará, e os afro-descendentes de Campinas devam ter vindo de regiões da África onde a variante A- é freqüente.
O presente trabalho contribuiu para a ampliação do conhecimento acerca da distribuição geográfica desse
alelo, relacionando com o perfil da composição étnica dos remanescentes quilombolas de nossa população.
Apoio financeiro: CNPq e UFPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
27
Mutações ∆F508 e R334W Em diferentes grupos
populacionais de Rondonia, Amazônia ocidental brasileira
Guimarães, MS1, 2 ; Alves, PH2 ; Farias, JD1,2 ; Krauze, A1,3 ; Andrade - Casseb, A2; Jano, M1; Delani, D1; Engracia, V1,2
Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais – IPEPATRO
Universidade Federal de Rondônia – UNIR
3
Centro de Pesquisa em Medicina Tropical - CEPEM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fibrose Cística, mutação, mistura racial, ∆F508, R334W.
Fibrose Cística é uma doença de herança autossômica recessiva, considerada a doença genética letal mais
freqüente em caucasianos Representa uma das principais causas de doença pulmonar crônica na faixa etária
pediátrica afetando entre 1/2.000 nascidas vivas. No Brasil, sua incidência é de 1/10.000 de nascimentos vivos,
sendo mais elevada na região Sul do Pais, que se aproxima ao de populações européia. Analisamos, através de
técnicas moleculares, amostras de 747 indivíduos, coletados aleatoriamente, em regiões de Rondônia, estado
brasileiro situado na Amazônia Ocidental. O objetivo foi rastrear mutações no gene CFTR, numa população
de composição étnica miscigenada. Foram utilizados 5 µl de sangue periférico, ou células bucais, de indivíduos
cujas amostras encontram-se estocadas no Laboratório de Genética do IPEPATRO, sob Registro CONEP
13356, para análise das mutações ∆F508 e R334W. O DNA foi extraído segundo método descrito por Higuchi
et al. (1989), com algumas modificações, seguindo-se amplificação por Reação em Cadeia da Polimerase
(Saiki, R.K et. al, 1985), utilizando-se primers descritos na literatura. Para a mutação R334W, a PCR foi seguida
de digestão pela enzima MnlI, seguindo métodos descritos na literatura.A visualização do produto da PCR
e da digestão ocorreu em PAGE 10%. Dos 1594 cromossomos analisados, obtivemos resultados apenas em
heterozigose, sendo que a freqüência alélica para ΔF508 foi de vinte indivíduos heterozigotos (0,0125) e para
mutação R334W foram encontrados dois heterozigotos (0,0013). Esta freqüência baixa das duas mutações
pode ser explicada historicamente pela formação da população do estado de Rondônia, que foi alvo de várias
ondas migratórias, oriundas de diversas regiões do Brasil, e do mundo (na ocasião da construção da Ferrovia
Madeira-Mamoré, no começo do século XX). A composição étnica de Rondônia segue os padrões brasileiros,
sendo que nesta região o componente indígena e africano são relativamente elevados. Estimativa feita por um
de nós (Farias JD) revelou no estado de Rondônia dos componentes de mistura racial mostrou que contribuições
de africanos, ameríndios e europeus na amostra de foram 0.6564 ± 0.0606, 0.2886 ± 0.0567, respectivamente.
Apoio Financeiro: Ipepatro/FIOCRUZ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
28
Análise do marcador STR TH01 nas populações de Vitória
e de descendentes pomeranos do Espírito Santo-ES
Pagel, UR¹; Pozatto, EN¹; Reis, RS¹; Silva, BC; Louro, ID¹; de Paula, F¹
¹Núcleo de Genética Humana Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
Palavras-chave: STR, TH01, freqüências alélicas, identificação genética, pomeranos.
O ES abriga a terceira maior comunidade Pomerana do mundo. Apresentam comportamento de casamento seletivo,
mantendo características de subpopulação distinta fenotipicamente da população brasileira. A população brasileira
é, em geral, muito miscigenada e a população de Vitória-ES é exemplo desta mistura. A variação étnica pode refletir
alterações em freqüência gênica de variantes polimórficas. Marcadores STR são amplamente utilizados em testes de
identificação genética. Os parâmetros forenses e de paternidade se baseiam em dados de distribuição alélica destes
marcadores na população. Esses dados são importantes para confirmar o poder estatístico dos testes de identificação
genética em grupos de constituição étnica peculiares. Assim, esta pesquisa teve como objetivo(i)estimar a freqüência
alélica do marcador STR TH01 por meio de PCR e eletroforese em gel desnaturante na população de Vitória-ES e
na população Pomerana do ES,(ii)avaliar os parâmetros estatísticos associados aos testes de identificação genética
para este marcador nas populações analisadas e(iii)compará-los com dados da população do noroeste da Polônia,
antiga Pomerânia. Foi analisada amostra de 169 indivíduos de Vitória-ES e 109 indivíduos pomeranos do ES. O
DNA foi extraído, amplificado por PCR, submetido à eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida e corado
com nitrato de prata. Foram utilizados os softwares PowerStats v12,Arlequin v3.11 e BioStat v4.0 para as análises
estatísticas. O alelo10 não pôde ser discriminado do alelo microvariante9.3 por diferirem em apenas uma base,
assim, foram identificados como alelo9.3/10. Os resultados das freqüências alélicas foram: alelo9.3/10=0,237e0,236;
alelo9=0,184e0,205 ; alelo8=0,158e0,188; alelo7=0,257e0,188; alelo 6=0,16e0,184 nas populações de vitória-ES e
Pomerana, respectivamente. O teste de Qui-Quadrado não mostrou diferença significativa(p=0,7260) entre as
freqüências alélicas das populações em questão, mas indicou diferença significativa(p=0,0299) entre as freqüências
alélicas deste marcador na população Pomerana e população do Noroeste da Polônia. Os resultados dos testes
estatísticos para população Pomerana e de Vitória foram, respectivamente:Matching probability=0,080e0,076;poder
de discriminação=0,920e0,924;PIC=0,76e0,77;poder de exclusão=0,533e0,510;índice de paternidade típica=2,11e2
,00;heterozigosidade observada(Ho):0,7702e0,77027, heterozigosidade esperada(He):0,79822e0,79936;p-valor do
equilíbrio de Hardy-Weinberg(HW):0,85733e0,33228. Os resultados de Poder de Discriminação, PIC e Ho foram
maiores que 0,75 em ambas as populações sugerindo que o STR TH01 é um marcador genético informativo em
testes de identificação genética nestas populações. Além disto, pode-se observar que o resultado do parâmetro
Poder de Discriminação foi maior na população de Vitória do que na Pomerana, resultado compatível com o
esperado, pois, provavelmente, a população de Vitória possui maior grau de miscigenação do que a população de
descendentes Pomeranos. O lócus analisado encontra-se em equilíbrio de HW. São necessários estudos comparativos
com outros marcadores STR para corroborar os resultados de inferência sobre o comportamento genético da
população Pomerana do ES, contudo, os resultados desta pesquisa sugerem que esta população não se comporta
como um isolado genético, provavelmente, porque há miscigenação de indivíduos entre as duas populações.
Agencias Financiadoras: FAPES e UFES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
29
Polimorfismo de inserção/deleção do gene da enzima
conversora de angiotensina I (ECA) em amostra
populacional do município de Porto Velho (RO)
Martins, HHO1,2,3; Fiorese, MHH1,2,3; Dantas, DSS1,3; Pires, CRD1,2,3; Souza, CHN4; Cavalheiro, D4; Bijella,
MFB4; Moura, MMF1,3; Pagotto, RC1,3
Laboratório de Genética do Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnologia da Universidade Federal de Rondônia
PIBIC/CNPq-UNIR
3
Departamento de Biologia da Universidade Federal de Rondônia
4
Faculdades Integradas Aparício de Carvalho
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ECA; Polimorfismo; Rondônia; Porto Velho; Frequência
O gene da ECA localiza-se no cromossomo 17 e possui 26 éxons. O polimorfismo possui dois alelos (D e I),
possibilitando os genótipos DD, DI e II, sendo que o genótipo DD é responsável por maiores níveis séricos de
ECA. Estudos mostraram que há um risco maior de desenvolvimento de DPOC entre os fumantes que carregam
o genótipo DD, devido a vários fatores fisiológicos. Não existem relatos na literatura de estudos determinando
as freqüências alélicas e genotípicas para estes sistema no Estado de Rondônia. O presente trabalho teve por
objetivo determinar as freqüências gênicas e genotípicas para os alelos do polimorfismo de inserção/deleção
no gene da ECA em uma amostra populacional de Porto Velho (RO). Tal determinação servirá como base para
o desenvolvimento de projetos de estudos de susceptibilidade a pneumopatias. A população amostrada tratase de 126 adultos saudáveis moradores na cidade de Porto Velho (RO) que, após lerem e assinarem termo de
consentimento livre e esclarecido doaram sangue ou células da mucosa bucal para posterior extração e purificação
do DNA pelo método de Aljanabi. O DNA foi amplificado pela técnica de PCR, utilizando-se iniciadores descritos
na literatura. O produto da amplificação foi visualizado em gel de poliacrilamida 8%, corado com nitrato de
prata. Os cálculos de freqüências gênicas e genotípicas e teste para Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) foram
efetuados utilizando-se o programa FREGEN da programoteca GENIOC. Encontrou-se uma frequencia alélica
(D=0,794) superior a descrita para populações brasileiras e, embora tenha sido demonstrado que os dados
apresentam aderência ao modelo de EHW (p=0,198), sugere-se a necessidade de confirmação de homozigotos
DD através da realização de uma segunda PCR específica para amplificação da sequencia de inserção.
Apoio financeiro: CNPq; PIBIC/CNPq-UNIR; UNIR
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
30
Freqüência Alélica do Polimorfismo Thr399Ile do TLR-4 em
Amostras da Região do Médio Solimões, Coari-Amazonas
Costa, AG1; Jano, M2; Santos, JD1; Tomé da Conceição, JK1; Andrade-Casseb, A2,3; Heckmann, MIO1
Laboratório de Genética Molecular Humana – Instituto de Saúde e Biotecnologia – UFAM
Laboratório de Genética – Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais, IPEPATRO
3
Universidade Federal de Rondônia – UNIR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: TLR4, Polimorfismo Thr399Ile, Médio Solimões, Coari, Amazonas.
Os Toll-Like Receptors (TLRs) foram primeiramente identificado em Drosofilas no final do século XX. Os TLRs são
receptores provenientes de uma família gênica (composta por 11 membros) os quais são expressos em células
do sistema imune inato, como macrófagos e células dendríticas. Entre estes se destaca o TLR4, que reconhece
vários componentes microbianos como os Lipopolissacarídeos (LPS) presentes em bactérias gram-negativas e
as âncoras de Glicosil-fosfatil-linositol (GPI) de parasitas como o Plasmodium falciparum e o Trypanosoma cruzi.
O gene humano que codifica a proteína formadora do receptor TLR4 foi mapeada no cromossomo 9 (9q, q32-33).
A partir deste mapeamento foi possível identificar duas alterações polimórficas, sendo uma delas a substituição
do aminoácido Treonina (Thr) por uma Isoleucina no resíduo 399 (Thr399Ile), que pode atenuar a resposta
imune a esses componentes. Desse modo o objetivo do presente estudo é descrever a freqüência polimórfica
do polimorfismo (Thr399Ile) em amostras de 100 indivíduos residentes em Coari-AM. O DNA foi extraído
segundo o protocolo de Higuchi, seguido de PCR para a amplificação do fragmento de DNA e visualizado em
PAGE a 6% corados com AgNO. Após confirmada a amplificação o fragmento foi submetido a digestão com a
Enzima Hinf-I e posteriormente visualizados. Os cálculos das freqüências gênicas foram determinados através
do teorema de Hardy-Weinberg através do programa GENIOC com níveis de significância de 5%. Os resultados
revelaram que 15% dos indivíduos estudados (0,15) são heterozigotos portadores do polimorfismo Thr399Ile
do TLR4. Quando aplicado o teste de χ2 os resultados indicam que as freqüências alélicas e gênicas estão em
equilíbrio de Hardy-Weinberg (χ2=0,699; p=0,5970). A freqüência observada foi maior que a encontrada em
populações Africanas (2%) e Indo-Européias (7%) e similar a da região dos Bascos (18%). Vale Ressaltar que em
outros estudos com populações das Américas, este polimorfismo está praticamente ausente ou foi encontrado
isoladamente. Em conclusão, foi observado que a freqüência desta variação polimórfica é maior que em
outras populações, entretanto, futuras análises deverão ser realizadas a fim de refinarmos o presente estudo.
Apoio: CNPq; IPEPATRO; UFAM
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
31
Diversidad de linajes amerindios del ADN mitocondrial en
poblaciones del centro de Argentina (provincia de San Luis)
García, A1; Bravi, CM2; Demarchi, DA1
Museo de Antropología, FFyH, Univiversidad Nacional de Córdoba. CONICET
IMBICE-CCT-CONICET, La Plata
[email protected]
1
2
Palabras clave: ADN mitocondrial, Región Hipervariable I, Amerindios, San Luis, Argentina
La construcción del pasado indígena de las poblaciones que ocupan el faldeo occidental de las sierras de
Comechingones, en la provincia de San Luis, Argentina, ha sido tradicionalmente tratada como parte del mismo
proceso evolutivo sufrido por las poblaciones de Córdoba, considerando siempre a San Luis como un apéndice. En
el presente trabajo nos propusimos caracterizar los linajes maternos presentes en una muestra de 86 habitantes
criollos de poblaciones rurales del centro del país ubicadas a lo largo del Valle de Conlara, (Concarán, Santa Rosa
de Conlara, Tilisarao y La Toma) (provincia de San Luis). Puntualmente, se analizó la variabilidad de la Región
Hipervariable I del ADN mitocondrial, a partir de la cual es posible hacer inferencias sobre el pasado evolutivo y
diferenciación genética de esas poblaciones. Los individuos analizados fueron previamente asignados a uno de
los cuatro haplogrupos amerindios a partir de análisis de RFLP. Se identificaron 39 linajes distintos, definidos
por 71 sitios variables. La diversidad nucleotídica en la muestra de San Luis fue similar al promedio observado
para el resto de las poblaciones sudamericanas (Π = 0.017). El resultado del análisis molecular de la variancia
(AMOVA), considerando cada una de las cuatro poblaciones de San Luis por separado, mostró que el 97,8% de
la variabilidad genética se distribuye dentro de las poblaciones, correspondiendo a la diferenciación intergrupal
solamente el 2,2%. Para establecer las relaciones genéticas entre las poblaciones estudiadas de San Luis y
otras provenientes de distintas regiones geográfico-ecológicas de Sudamérica, se estimaron los coeficiente de
diferenciación interpoblacional (FST) de a pares, incluyendo un total de 28 poblaciones tomadas a partir de
datos publicados en la literatura. Cabe destacar que el FST entre San Luis y Córdoba fue alto y estadísticamente
significativo (FST = 0,266, P = 0,009). Es interesante remarcar que a pesar de las cortas distancias geográficas
que separan estas poblaciones, existe una marcada heterogeneidad genética, lo que sugiere un panorama
evolutivo bastante complejo y/o un origen genético diferente para las poblaciones del centro de Argentina.
Apoyo financiero: ANPCyT PICT 2007
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
32
Perfil haplotípico mtDNA humano de indivíduos
africanos e afro-descendentes HTLV-1 positivos:
inferência da origem africana da infecção no Brasil
Iniguez, AM1; Otsuki, K1; do Nascimento, LB2; Motta, M1; Martins, R M2; Vicente, ACP1
Laboratório de Genética Molecular de Microrganismos. Instituto Oswaldo Cruz. Fiocruz, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública. Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: haplogrupos mtDNA humano, HTLV-1, África, Brasil, quilombo.
Durante o período entre os séculos XVI-XIX aproximadamente 4 milhões de africanos foram trazidos para o Brasil
como escravos. Atualmente a freqüência de haplótipos (mtDNA) africanos no Brasil é de 28%, oscilando entre 12%44%, dependendo da região geográfica analisada. O retro-oncovírus HTLV-1, agente causal da desordem neurológica
PET e da leucemia grave ATL, é transmitido verticalmente, principalmente, via aleitamento materno. Brasil é um
dos paises onde esta infecção é altamente prevalente e endêmica. A principal hipótese sobre a introdução do HTLV1 no Brasil é a origem pós-colombiana através do trafico de escravos. O propósito deste estudo é determinar o perfil
haplotípico mtDNA de indivíduos HTLV-1 positivos da África e do Brasil, incluindo quilombolas, para aferir a possível
relação entre os perfis haplotípicos dos infectados na África e Brasil. Amostras de sangue total foram submetidas à
extração de DNA usando QIAamp DNA Blood Mini kit (Qiagen) e o fragmento que abrange o segmento 15996-16401
da região hipervariable I (HVS-I) do mtDNA humano foi recuperado e seqüenciado. As seqüências da mtDNA foram
classificadas em haplogrupos em concordância com os polimorfismos HVS-I previamente descritos. Resultados
preliminares revelaram que indivíduos moçambicanos HTLV-1 positivos pertencem ao macrohaplogrupo africano
L, incluindo os haplótipos sub-saharianos L1a, L1c, de L2a, de L3d nas freqüências 47,05%, 5,88%, 35,29%, e 11.76%.
Este perfil haplotípico, com os sub-haplogrupos L1a e o L2a com as mais elevadas freqüências, estão de acordo
com estudos da população geral de Moçambique, diferentemente de outras regiões da África. Portanto, a coorte de
HTLV-1 moçambicana seria representante da população geral do país. Considerando, indivíduos HTLV-1 positivos,
quilombolas, Kalungas do Brasil, foram identificados os haplotipos L1c e L2. Uma análise mais ampla mostrou que os
haplótipos mtDNA de L1a (Loa2), L2a1, identificados em Mozambique, estão presentes na população geral do Brasil.
Apoio financiero: IOC/FIOCRUZ e UFG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
33
Análise comparativa de quatro populações ribeirinhas
no estado de Rondonia, amazonia ocidental – Brazil,
estimada a partir da região controle do DNA mitocondrial
Nunes, ACS1; Domingues, DCN1; Silva, DA2; Carvalho, EF2; Moura, MM3
Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnologia /CIBEBI/UNIR
Laboratório de Diagnostico por DNA - Universidade do Estado do Rio de Janeiro - UERJ
3
Departamento de Biologia, Universidade Federal de Rondônia/UNIR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNA mitocondrial, Haplogrupos, População Ribeirinha.
O DNA mitocondrial em populações humanas em particular nas regiões HVI e HVII tem sido cada vez mais alvo
de estudos filogenéticos. Isso se deve ao fato de o genoma mitocondrial possuir diversas propriedades, como
ausência de recombinação, alta taxa de mutação, grande numero de cópias por célula e herança exclusivamente
materna. A análise do DNA mitocondrial é imprescindível para confirmar o percentual de contribuição alélica
do sexo feminino nas populações européias, africanas e ameríndias, assim como, para a investigação no campo
antropogenético e forense. Foi realizado um estudo de diversas populações do estado de Rondônia: Indivíduos
nascidos em Porto Velho em terceira geração, ribeirinhos de Cujubim e São Miguel e Santo Antônio do
Guaporé com origem quilombola. As amostras foram extraídas com Chelex 100, posteriormente quantificadas
em gel de agarose a 2%, em seguida foram realizadas as técnicas de PCR, purificação e seqüenciamento. Os
produtos purificados pelo método SEPHADEX G-50 (SIGMA-ALDRICH), foram seqüenciados por meio do
método cíclico de terminação de cadeia, com o Kit BigDye (version 3.0 – ABIPRISM) e através do seqüenciador
automático de fluorescência ABI310 Applied Biosystems. Conclusão: Foi possível determinar a partir do banco
de dados forense em DNA mitocondrial disponível na página http://mtmanager.yonsei.ac.kr o percentual de
90% de origem africana para a população de Santo Antônio do Guaporé, e de 47, 36% e 18,42% para Cujubim
e Porto Velho, respectivamente. Os haplogrupos, característicos de linhagens ameríndias, foram observados
em maior freqüência nas populações de São Miguel e Cujubim com 87,5% e 52,64%, respectivamente. Porto
Velho apresentou um percentual de 52,63% de contribuição de povos europeus. A presença do haplogrupo
ameríndio em proporções significativas corrobora com dados históricos da região Amazônica. A partir destes
dados verifica-se a diferença de origem étnica por parte feminina destas quatro populações de Rondônia,
indicando que a freqüência de etnias foi diferente para diversos grupos formadores da população rondoniense.
Apoio financeiro: CAPES e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
34
Os nativos sul-americanos vistos sob o olhar do DNA
mitocondrial
Bisso-Machado, R1; Bravi, CM2; Coble, MD3; Marrero, AR4; Salzano, FM1; Bortolini, MC1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto Multidisciplinario de Biología Celular, CONICET, La Plata, Argentina
3
The Armed Forces DNA Identification Laboratory, Rockville, EUA
4
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: mtDNA, HVS, ameríndios, origem, evolução.
O desenvolvimento científico nos fez conhecer aspectos importantes sobre a colonização do continente americano.
No entanto, estamos longe de entender detalhes a respeito desse evento e como se deram posteriormente as
migrações internas. A dispersão dos ameríndios ao longo da América do Sul, bem como suas conseqüências,
tem motivado alguns trabalhos envolvendo o DNA mitocondrial (mtDNA). Neste estudo foram investigados 160
indivíduos pertencentes a 10 tribos sul-americanas: Arara, n = 19; Cinta-Larga, n = 8; Gorotire, n = 11; Jamamadi,
n = 13; Kuben-Kran-Kegn, n = 19; Mekranoti, n =24; Munduruku, n =14; Pacaás Novos, n = 30; Parakanã, n = 19;
Xikrin, n =3), pertencentes a 5 grupos lingüísticos distintos (Arawa, Carib, Chapacura-Wanham, Ge, Tupi).
O estudo envolveu o sequenciamento da região controladora do mtDNA (HVS-I: da posição 16.024 até 16.569,
e HVS-II: da posição 001 até 576, bem como a região imediatamente 5’ à região controladora). Somente os 4
haplogrupos característicos de nativos sul-americanos (A, B, C e D) foram encontrados, o que denota que não há
fluxo gênico mediado por mulheres não-indígenas para as aldeias. Ao analisar a distribuição desses haplogrupos
ao longo da América do Sul foram adicionados dados anteriormente publicados de 55 outras populações nativas
americanas. Certos padrões puderam ser evidenciados: baixa freqüência do haplogrupo A na América do Sul
como um todo, presença preponderante dos haplogrupos D e C na Amazônia e extremo sul do continente,
enquanto a presença do haplogrupo B é marcante somente na região andina e centro-brasileira. Partindo dessa
análise buscou-se verificar como se dava as distribuições entre os grupos Ge e os Tupi, dois dos mais importantes
troncos lingüísticos do continente americano. Os indígenas do tronco Ge mostram os haplogrupos B e A como
sendo os mais freqüentes, enquanto que nos Tupi esses haplogrupos apresentam freqüências mais elevadas
apenas em regiões bastante restritas. Entre os Tupi, o haplogrupo D é o mais freqüente. Cabe salientar que o
haplogrupo C apresenta freqüência muito baixa tanto para os Ge quanto para os Tupi, sendo que freqüências
um pouco mais elevadas estão quase que geograficamente opostas, ficando no sul do Brasil para os Ge e no
norte para os Tupi. Esses resultados mostram padrões de diferenciação entre os sul-ameríndios, principalmente
entre os Ge e Tupi, que até então não haviam sido evidenciados. Esse fato pode estar evidenciando diferentes
padrões demográficos e evolutivos envolvendo as tribos pertencentes a ambos os estoques lingüísticos.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
35
Avaliação de polimorfismos na região HV3 do DNA
mitocondrial em uma amostra da população brasileira
Fridman, C;Gonzalez, RS
Laboratório de Imuno-Hematologia Forense e Psicopatologia Forense (LIM40), Departamento de Medicina Legal, Ética Médica e Medicina
Social e do Trabalho, FMUSP
[email protected]
Keywords: DNA mitocondrial, HVIII, população Brasileira, identificação humana
Introdução: O interesse pelo DNA mitocondrial (mtDNA) no contexto das ciências forenses surgiu em função de
características como a presença de regiões altamente polimórficas, herança exclusivamente materna e elevado
número de cópias por célula. Apesar do mtDNA não ser um identificador exclusivo de indivíduos, o acúmulo
de mutações e a grande variabilidade nas regiões não codificadoras resultam em diferenças substanciais entre
os indivíduos que não são relacionados pela linhagem materna.Muitos dos polimorfismos encontradosna região
HV3 parecem ser os mesmos nas diferentes populações estudadas, principalmente a presença de heteroplasmias
de comprimento (adição de Cs entre os nt568 e 573, ou acréscimo de (CA)s entre os nt515 e 524) e das deleções
nas posições 523 e 524.Apesar de não mostrar um alto poder de discriminação, a região HV3 vem sendo utilizada
em diferentes estudospara caracterização de diversas populações. Objetivo: Avaliar os tipos e frequência dos
polimorfismos de HV3 em uma amostra de 101 indivíduos brasileiros, já que não existem muitos dados descritos
na nossa população. Resultados: Treze haplótipos (12,9%) se mostraram únicos e 88 (87,1%) foram comuns a mais
de um indivíduo. Dos 101 indivíduos, 41 (39,6%) apresentaram deleções nas posições 523 e 524. Das substituições
observadas, 100% foram do tipo transições.Seis polimorfismos encontrados (455.1T, 456T; 463.1C; 498T; 522T e
526A) foram observados apenas uma vez em diferentes indivíduos.Os polimorfismos 526A e 463.1C não foram
encontrados em nenhum outro trabalho da literatura, nem no banco de polimorfismos do MITOMAP, podendo
representar uma característica exclusiva da nossa população, ou o pequeno número de estudos que avaliam HV3.
Heteroplasmia de comprimento no segmento515-524 foi observada em 7 indivíduos, sendo que 4 apresentaram
adição de umCA, resultando em CA6 e 3 mostraram adição de 2 CAs, resultando em CA7. Na região C-Stretch
(segmento 568-573) 3 indivíduos apresentaram inserções de 1,2 e 5 Cs, respectivamente. Conclusão: A análise
da região HV3 vem sendo incorporada nos estudos filogenéticos, auxiliando muitas vezes na classificação dos
haplogrupos mitocondriais. De todos os polimorfismos encontrados no presente estudo, apenas dois (497T e
499A) são específicos e utilizados para classificação de haplogrupos. O 497T caracteriza o haplogrupo K e o 499A,
o haplogrupo B4b; os demais polimorfismos são encontrados em diferentes etnias.A caracterização da região HV3
em termos populacionais é importante para que se tenha dados disponíveis em momentos onde se faz necessário a
comparação de amostras em situações de identificação. Entretanto, o número de indivíduos analisados ainda é baixo
e um aumento dessa amostra será importante para confirmar a distribuição dos polimorfismose apresentar uma real
caracterização da população brasileira, que tem como característica principal a miscigenação de diferentes etnias.
Suporte financeiro: HC-LIM, FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
36
Determinação dos haplogrupos A, B, C e D de DNA
mitocondrial, na busca da ancestralidade genética da
população urbana de Porto Velho estado de Rondônia
Cantanhêde, LM2; Krauze, A1,2; Casseb, AA2,3; Farias, JD2,3; Guimarães, MS2,3; Delani, D2; Alves, PH3;
Simões, AL4; Engracia, V2,3
Centro de Pesquisa em Medicina Tropical – CEPEM
Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais – IPEPATRO
3
Universidade Federal de Rondônia – UNIR
4
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: mtDNA, Haplogrupo, Frequência, Marcadores, Populações.
A constituição populacional da cidade de Porto Velho teve seu início a partir das instalações ferroviárias da Estrada
de Ferro Madeira-Mamoré, com crescimento através de ondas migratórias, na exploração da borracha, da cassiterita,
do ouro. Nos últimos dois anos há um fluxo intenso de pessoas que vêm principalmente devido à construção de
hidrelétricas no rio Madeira. As seqüências nucleotídicas do genoma mitocondrial podem apresentar pequenas
variações entre indivíduos, que geralmente compreendem mutações não-deletérias do tipo SNPs (single nucleotide
polymorphisms). O polimorfismo encontrados no MtDNA são fruto único e exclusivamente de mutações que
ocorreram ao acaso ao longo do tempo. As mutações ocorridas ao longo da evolução geram, portanto, as variações
que servem como marcadores de linhagens. Estas características permitem estudos sobre a história matrilinear,
das populações humanas. A análise de marcadores moleculares do MtDNA é importante nesse sentido devido
à sua herança uniparental e ausência de recombinação. Para determinação da estrutura populacional, e de sua
formação histórica, analizamos o MtDNA de 184 indivíduos recém nascidos na maternidade do Hospital de Base
na Cidade de Porto Velho, Capital do estado de Rondônia. Foram analisados quatro haplogrupos (A, B, C e D) do
DNA mitocondrial, cuja extração foi realizada utilizando-se o Kit QIAamp DNA Mini Kit® (QIAGEN® Cat. n° 51304).
As reações de PCR foram feitas separadamente para cada marcador de MtDNA, com primers e enzimas específicos
para os haplogrupos analisados. A visualização deu-se por PAGE a 8% corados por nitrato de prata 20 %. A freqüência
de cada haplogrupo de MtDNA foi estimada pelo método de contagem direta, de acordo com a equação: Pi = ni /n,
em que ni é o número de ocorrências do haplogrupo i na amostra e n é o número total de indivíduos amostrados.
Foram encontrados os quatro haplogrupos de MtDNA característicos de Ameríndios sul-americanos: A (+663
HaeIII), B (deleção 9-bp), C (-13259 HincII) e haplogrupo D (-5176 AluI), com freqüências iguais a 0,2228 , 0,3207,
0,3043 e 0,1521, respectivamente. A freqüência do haplogrupo A foi menor do que a encontrada para população
geral brasileira e nordesde brasileiro (0,30, e 0,37, respectivamente) e maior do que a encontrada para a região
norte do Brasil (0,15). A frequencia do haplogropo B, semelhante a encontrada na população geral brasileira, norte
e nordeste (0,29, 0,31 e 0,27, respectivamente). O haplogrupo C apresentou freqüência superior que a população
geral do Brasil, menor que a da região norte e maior que nordeste brasileiro (0,24, 0,38, 0,09, respectivamente).
O haplogruo D apresentou freqüência semelhante à população geral brasileira e do norte do Brasil, porém com
frequência inferior a do nordeste brasileiro (0,16, 0,15, 0,27). As frequências de todos os haplogrupos estudados
são semelhantes (diferença igual ou inferior a 5 %) as frequencias encontradas na região sul (0,27. 0,27, 0,27, 0,18).
Apio financeiro: CEPEM, CNPq, IPEPATRO
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
37
Painel de INDELs informativos de ancestralidade no
braço longo do cromossomo 5 – estudo de populações
mundiais e brasileiras
Kehdy, FSG1; Pena, SDJ1,2
Laboratório de Genética Bioquímica, Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Minas Gerais
2
GENE -Núcleo de Genética Médica
[email protected]
1
Palavras-chave: estrutura genética, INDELs, CEPH/HGDP, população brasileira
Iniciamos uma investigação sistemática da viação da estrutura populacional de polimorfismos de inserçãodeleção (INDELs) em um painel internacional de amostras e em populações brasileiras com uma bateria de 40
locos distribuídos em todo o genoma humano. Agora avaliamos um painel de 31 INDELs com ampla variação
de freqüência alélica entre África e Europa (δ médio = 0,46), em uma única região cromossômica, abrangendo
90Mb do braço longo do cromossomo 5.Primeiramente genotipamos o painel de diversidade do CEPH/HGDP
(1045 indivíduos de 52 populações mundiais, distribuídas em 7 regiões geográficas) para os 31 INDELs. A análise
de variância molecular (AMOVA) demonstrou que, dentro das populações, a diferença entre indivíduos equivale a
aproximadamente 81% da variabilidade genética, enquanto que a diferença entre as regiões geográficas constitui
cerca de 16%. Uma representação gráfica (escalonamento multidimensional) da matriz de distância baseada em
Fst (distância de Reynolds) com as 52 populações revelou cinco claros agrupamentos correspondentes às cinco
grandes regiões geográficas: África, Oceania, Leste Asiático, Américas e Eurásia (Europa, Ásia Central e Oriente
Médio). Nossos resultados corroboram os estudos prévios com locos espalhados no genoma. Em seguida, a fim de
inferir a origem ancestral de fragmentos cromossômicos e caracterizar o padrão de mistura da população brasileira,
estudamos os 31 INDELs em 261 indivíduos não aparentados, autoclassificados de acordo com o IBGE como
pretos (n=104) e brancos (n=157) da cidade de São Paulo. Utilizando as populações parentais como referência,
a provável origem ancestral de cada loco foi estimada para cada cromossomo de cada indivíduo brasileiro. Os
resultados mostraram que, em média, cada indivíduo preto de SP apresenta 25% da região cromossômica
analisada de origem européia, 53% de origem africana e 22% de origem ameríndia, enquanto para os brancos,
estas porcentagens foram de 60%, 16% e 24%, respectivamente. Entretanto, os dados individuais apresentaram
uma ampla variabilidade, de acordo com resultados prévios. Uma correlação significativa entre o número de
locos de uma mesma origem ancestral entre os dois cromossomos 5 homólogos de um mesmo indivíduo foi
encontrada tanto para os pretos (p<0,000001) quanto para os brancos (p<0,000001). Uma possível explicação para
esses achados é o casamento assortativo de acordo com a cor, mas independente da ancestralidade genômica.
Apoio financeiro: CNPq e CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
38
Padrões de Desequilibrio de Ligação no cromossomo
X e identificação de Haplótipos Informativos de
Ancestralidade
Resque, RL; Ribeiro-Rodrigues, EM; Freitas, NSC; Santos, NPC; Santos, AKC; Santos, SEB
Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: Desequilibrio de Ligação, Haplótipos, Ancestralidade, População brasileira, Cromossomo X.
Desequilíbrio de ligação (DL) é um termo comumente empregado para definir associações não aleatórias de alelos
em dois ou mais loci. Padrões de DL podem variar em função da população investigada e da região do genoma
investigada. Entre autossomos, as regiões cromossômicas em DL podem variar de poucos Kbp até 100 Kbp de extensão.
Como a taxa de recombinação no cromossomo X é a metade da observada entre autossomos, este cromossomo
apresenta intervalos de DL maiores, formando haplótipos relativamente mais antigos e estáveis na população.
Neste trabalho, nós investigamos a variabilidade presente entre doze marcadores bialélicos do tipo INDEL, todos
eles ligados ao cromossomo X, em uma amostra de 461 indivíduos de populações ancestrais que deram origem
a atual população brasileira (103 europeus, 140 africanos e 218 nativos americanos). Todos os marcadores foram
escolhidos de maneira a formar três prováveis grupos de ligação nos quais, a maior distância entre dois marcadores
não ultrapassasse 250 Kb: Grupo I (MID3780, M448804, MID3703, MID218 e MID3774- distância máxima 173 Kb),
Bloco II (MID3705, MID 3706, M304737 e MID3692- 142.6 Kb) e Bloco III (MID358, MID3763 e MID3728- 224 Kb).
Nosso objetivo principal foi o de identificar possíveis Haplótipos Informativos de Ancestralidade (HIA), para que
possam ser utilizados para obter estimativas mais precisas de mistura interétnica em populações miscigenadas. A
amplificação do DNA foi realizada em uma única PCR multiplex seguida de eletroforese capilar. As medidas de DL
e frequências haplotípicas foram determinadas empregando o programa Arlequin v. 3.1. Após análise, três blocos
de ligação foram identificados (MID3703, MID218 e MID3774; MID3706, M304737 e MID3692; MID358, MID3763 e
MID3728) e as freqüências haplotípicas foram estimadas em cada população. No primeiro bloco de ligação foram
identificados um HIA européia, um HIA indigena e um haplótipo exclusivo de populações africanas. Para o segundo
bloco de ligação foram encontrados um HIA africana, um HIA européia, um HIA indígena e dois haplótipos exclusivos
da população africana. Para o terceiro grupo de ligação, identificamos dois HIA africana e dois haplótipos exclusivos
da população africana. De um modo geral, todos os blocos têm distribuição diferente de haplótipos, em populações
parentais distintas. Os HIA aqui identificados são de grande valia, e podem ser empregados em estudos posteriores
envolvendo investigações antropológicas e estimativas de mistura interétnica em populações miscigenadas.
Apoio financeiro: CNPq, FADESP e UFPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
39
Ancestralidade Genômica em Brasileiros
Caracterizados Fenotipicamente como Brancos, Negros
e Japoneses
Bomfim, TF1,2; Machado, TMB1,2; Acosta, AX1,3; Meyer, R2; Galvão-Castro, B1,4; Abé-Sandes, K1, 2, 5
Laboratório Avançado de Saúde Pública – LASP/CPqGM/FIOCRUZ
Instituto de Ciências da Saúde – Universidade Federal da Bahia – ICS/UFBA
3
Faculdade de Medicina da Bahia - Universidade Federal da Bahia – FAMEB/UFBA
4
Escola Baiana de Medicina e Saúde Pública/ Fundação Baiana para o desenvolvimento das Ciências - EBMSP/FBDC
5
Departamento de Ciências da Vida – Universidade do Estado da Bahia – UNEB
[email protected] / [email protected]
1
2
Palavras-chave: AIM; Ancestralidade; Mistura genética.
A migração é um fator evolutivo que pode resultar na alteração das frequências alélicas e genéticas das populações,
favorecendo a miscigenação e consequentemente a diversidade genética. O Brasil recebeu contingentes
populacionais de diversas etnias e regiões geográficas do mundo, os quais contribuíram diferencialmente
na formação da nossa população, cuja caracterização principal é sua extensa variabilidade genética. Para
avaliar esta miscigenação e entender como a mesma ocorreu, foram analisados nove Marcadores Informativos
de Ancestralidade (AIM) - AT3-I/D, APO, SB19.3, PV92, FYnull, LPL, CKMM, GC-F, GC-S (pela técnica da PCR e
PCR em tempo real). A amostra foi composta por 261 indivíduos, sendo 109 afrodescendentes de SalvadorBA, 60 descendentes de japoneses e 92 descendentes de europeus de Ribeirão Preto-SP, todos caracterizados
fenotipicamente e por ancestralidade referida (não referiram mistura nos quatro avós). As freqüências alélicas
encontradas nos descendentes de africanos e descendentes de europeus foram similares às encontradas nas
populações ancestrais. Os dados obtidos com marcadores autossômicos foram comparados com marcadores
uniparentais (cromossomo Y e DNA mitocondrial). Foram encontradas 21,45% de matrilinhagens africanas e 12,8%
de matrilinhagens ameríndias nas amostras dos brancos, enquanto que a patrilinhagem foi predominatemente
européia (82%), já nos negros, foram encontradas 40% de cromossomos Y típicos de europeus e 4% de Y ameríndio,
mas a matrilinhagem era predominantemente africana (85,8%). Esses dados confirmam a mistura observada com
os marcadores autossômicos, uma vez que os negros apresentaram contribuições européia e ameríndia de 22% e
5% respectivamente e os brancos, contribuições africana e ameríndia de 5% e 9%, respectivamente. A população
japonesa apresentou 100% de cromossomo Y e 92,5% de mtDNA típicas de asiáticos, além de menor diversidade
intrapopulacional, não revelando portanto, mistura com outros grupos. A miscigenação detectada pelos marcadores
autossômicos nos japoneses pode ser atribuída ao uso de população nativo americana como ancestral. A
comparação entre marcadores uniparentais e autossômicos ratificam a miscigenação e confirmam dados históricos
e biológicos sobre a assimetria entre a contribuição masculina e feminina na formação da população brasileira.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde; Labimuno; CPqGM/FIOCRUZ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
40
Associação entre fenótipos metabólicos e
ancestralidade genética em idosas brasileiras
Lins, TCL1,5; Pires, AS2; Vieira, RG1; Paula, RS2; Moraes, CF2,3; Nobrega, OT2,3; Pereira, RW1,4,5
Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília, Brasília, DF
Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Gerontologia, Universidade Católica de Brasília, Taguatinga, DF
3
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Universidade de Brasília, Brasília, DF
4
Programa de Pós Graduação em Educação Física, Universidade Católica de Brasília, DF
5
Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, Universidade de Brasília, Brasília, DF
1
2
Palavras-chave: miscigenação, distúrbios metabólicos, associação espúria, obesidade, triglicérides.
Hipertensão, obesidade e diabetes são condições patológicas resultantes da interação entre fatores genéticos e
ambientais que ultrapassam os limites geográficos e sociais. No entanto, grupos continentais como Europeus,
Asiáticos e Africanos possuem variações epidemiológicas que as tornam susceptíveis em maior ou menor grau.
A estratificação populacional é uma grande preocupação em estudos de associação genética realizados em
populações miscigenadas. Com objetivos de explorar o componente fenotípico de características do metabolismo
de lipídeos, hipertensão, obesidade e diabetes, correlacionamos a eles, as diferenças na ancestralidade genética em
uma amostra de idosas Brasileiras. Os resultados das estimativas usando SNPs informativos de ancestralidade são
consistentes com o perfil genético heterogêneo da população Brasileira, com uma grande contribuição Européia
(57.60%), seguido por Ameríndios (25.65%) e Africano (16.75%). A ancestralidade Européia foi correlacionada
com o índice de massa corporal (IMC) (r = 0.165, p = 0.037) e diferença média (dm) do IMC entre obesos foi
estatisticamente diferente (dm = 5.3%, p = 0.042). A ancestralidade Africana foi correlacionada com níveis de LDL
(r = 0.159, p = 0.035), e negativamente correlacionada com VLDL (r = -0.185, p = 0.014). A diferença média da
proporção de ancestralidade Africana foi estatisticamente diferente entre status positivo/negativo das categorias
de hipertrigliceridemia (dm = 6.4%, p = 0.003) e dislipidemia (dm = 4.8%, p = 0.026). Para ancestralidade Ameríndia,
foi encontrada correlação com os níveis de triglicérides (r = 0.150, p = 0.047) e, conseqüentemente, com o status
de hipertrigliceridemia (dm = 4.5%, p = 0.039). A ancestralidade genética aparenta ter um papel fundamental na
etiologia das doenças relacionadas com a regulação metabólica em mulheres idosas miscigenadas. Esses achados
abrem caminho para o mapeamento de genes por desequilíbrio de ligação e também alertam sobre a correção da
estratificação em estudos de associação genética de doenças complexas em populações miscigenadas.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
41
Ancestralidade genômica em comunidades
remanescentes de quilombos brasileiras
Wiezel, CEV1; Luizon, MR2; Mendes-Junior, CT3; Simões AL1
Departamento de Genética e
Departamento de Farmacologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP
3
Departamento de Química, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ancestralidade, remanescentes de quilombos, populações afro-derivadas, estratificação populacional, marcadores genéticos
Introdução: As comunidades remanescentes de quilombo brasileiras apresentam contribuições heterogêneas
dos componentes africano, europeu e ameríndio em suas formações. Marcadores informativos de ancestralidade
(AIMs) apresentam alelos com altos diferenciais de freqüência entre as populações ditas parentais e são, portanto,
amplamente aplicados em estimativas de ancestralidade populacional e individual. A precisão destas estimativas
é diretamente proporcional à magnitude da diferença das freqüências alélicas dos marcadores utilizados.
Portanto, estimativas de ancestralidade mais fidedignas das comunidades remanescentes de quilombo podem
ser obtidas a partir dos AIMs. Objetivo: Determinar as freqüências de 12 AIMs (FY, RB, LPL, AT3, Sb19.3, APO,
PV92, CKMM, DRD2, MID93, MID52 e MID575) e as estimativas de ancestralidade populacional e individual em
três comunidades remanescentes de quilombos do Estado do Piauí (Mimbó, Sítio Velho e Gaucinha) e em uma
amostra urbana de Teresina. Estas populações foram previamente analisadas por vários marcadores genéticos;
proteínas, grupos sanguíneos, STRs autossômicos e ligados ao cromossomo X e Y. Os genótipos dos 12 AIMs
também foram obtidos para 50 Ameríndios da Amazônia Brasileira. Os genótipos de Africanos e Europeus
foram obtidos da literatura. Métodos: O DNA amplificado por PCR e/ou PCR-RFLP foi analisado por PAGE 6%
não desnaturante e 12% desnaturante, seguida de coloração com nitrato de prata. Para as análises estatísticas
foram empregados os programas GENEPOP, MVSP, STRUCTURE, Prism5 e ADMIX2. Índices de ancestralidade
africana (IAA) individuais foram obtidos a partir do programa STRUCTURE, determinados como a porcentagem
inferida ao grupo Africano sobre a soma das demais porcentagens de Europeus e Ameríndios. Os IAA foram
transformados em log10 e as medianas das distribuições dos pares de populações foram comparadas pelo teste
de Kruskall-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn. Resultados e Discussão: A análise de componente principal
(PCA) indica que o primeiro componente agrupa os remanescentes e a população africana (maior peso FY), e o
segundo agrupa as mesmas com Ameríndios (maior peso Sb19.3). Embora as medianas das distribuições dos IAA
não sejam diferentes entre as comunidades remanescentes, é clara a heterogeneidade dos IAA dentro e entre estas
populações. As estimativas dos componentes africano e ameríndio nas comunidades foram, respectivamente,
de 64±3,4% e 36±3,4%% em Mimbó (R2=0,92), 58±3% e 42±3% em Sítio Velho (R2=0,95) e 79±3,5% e 21±3,5%
em Gaucinha (R2=0,77). O componente europeu não foi detectado nas comunidades remanescentes, mas foi
preponderante em Teresina, 70±6%, seguido do africano, 30±6% (R2=0,92). A estimativa do componente africano
em Sítio Velho, Gaucinha e Teresina foram mais precisas que as obtidas a partir de marcadores STRs autossômicos
(48±12,3%, 38±11% e 24±1%, respectivamente). Estes achados evidenciam a maior eficiência dos AIMs para tal
propósito, uma vez que o aumento dos valores observados não foi generalizado e provavelmente não viciado.
Apoio Financeiro: CNPq, FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
42
Marcadores Informativos de Ancestralidade autossômicos
e do Cromossomo Y em Doenças Genéticas
Machado, TMB1,4; Bomfim, TF1,4; Acosta, AX1,3; Meyer, R4; Abé-Sandes, K1,2
Laboratório Avançado de Saúde Pública – LASP/CPqGM/FIOCRUZ
Departamento de Ciências da Vida – Universidade do Estado da Bahia –UNEB
3
Faculdade de Medicina da Universidade Federal da Bahia – FAMEB
4
Instituto de Ciências da Saúde – Universidade Federal da Bahia – ICS/UFBA
[email protected] / [email protected]
1
2
Palavras-chave: cromossomo Y; Doenças Genéticas; Ancestralidade; AIMs; Migração.
Doenças genéticas raras foram identificadas com elevada frequência no município de Monte Santo, Bahia. Com
objetivo de identificar a origem ancestral das mutações causadoras destas doenças, analisamos cinco marcadores
informativos de ancestralidade (AIM): AT3-I/D, APO, SB19.3, PV92 e CKMM (por PCR e PCR em tempo real) e
os marcadores M9, M34, PN2, PN3, 92R7 e YAP do cromossomo Y (por PCR, PCR/RFLP e Sequenciamento).
A amostra foi composta por 6 afetados por Fenilcetonúria (PKU), 9 com Mucopolissacaridose do tipo VI
(MPSVI), 55 com Surdez hereditária não sindrômica (SHNS), 4 com Síndrome de Treacher-Collins (STC), 7
com Hipotireoidismo Congênito (HC) e 4 com Osteogênese Imperfeita (OI). Dentre estas amostras foi utilizado
apenas 1 afetado de cada núcleo familiar e, sendo este do sexo feminino, a análise do cromossomo Y foi feita
no pai do afetado. A contribuição autossômica ancestral encontrada para a população dos afetados como um
todo foi 59,7% de contribuição européia, 18,0% africana e 22,3% ameríndia. Ao estratificarmos por doença a
contribuição européia continuou predominante na maioria dos grupos, variando de 21 a 96%, sendo que a
maior contribuição foi encontrada nas amostras com STC e a menor em OI. Com relação aos marcadores do
cromossomo Y, até o momento foi possível identificar os haplogrupos DE, E, K e P, com as seguintes frequências:
12,8%, 14,9%, 4,3% e 42,5%, respectivamente. Os indivíduos que apresentaram o haplogrupo E (africano) são todos
do grupo com SHNS. A frequência dos haplogrupos encontrados mostram pequena contribuição ameríndia
(representada pelo haplogrupo K) e africana (haplogrupo E) e possível maior contribuição paterna de origem
européia, sugerida pela elevada freqüência do haplogrupo P. Os resultados deste estudo corroboram achados
anteriores onde a contribuição paterna ameríndia e africana ocorrem em pequenas proporções. Entretanto,
para os AIMs observou-se discordância com os resultados obtidos para a população da Bahia e de Salvador,
onde a contribuição africana foi predominante. Estes resultados sugerem estruturação da população baiana e
maior probabilidade que as mutações causadoras destas doenças nesta população, sejam de origem européia.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde; Labimuno/ICS/UFBA; CPqGM/FIOCRUZ.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
43
Freqüência alélica dos marcadores D14S1434,
D22S1045 e D10S1248 no Sudeste do Brasil
Castro-Magalhães, M1; SANTOS, LL1,3; Oliveira, PCR3; Lima, MJM4; Lopes, DO3; Assis, JB2; Reis, AHO2;
Carvalho, MRS1; Zorlan, PAL2; Vaintraub, P2
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
GENETICENTER - Centro de Genética e Reprodução
3
Laboratório de Biologia Molecular, Campus centro-oeste Dona Lindu, Universidade Federal de São João Del-Rei
4
Instituto de Criminalística do Estado de Minas Gerais, Divisão de Laboratório
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Freqüência alélica, D14S1434, D22S1045, D10S1248, Brasil.
Introdução: O sistema CODIS (Com­­­­bined DNA Index System), desenvolvido pela polícia federal norte-americana
(FBI) conta com 13 marcadores (STR - Short Tandem Repeat) que permitem a comparação de perfis genéticos
sendo amplamente utilizados em testes de paternidade e identificação humana. Entretanto, o conjunto de
marcadores CODIS nem sempre oferece poder discriminatório suficiente nas análises de parentesco complexas,
nos testes de paternidade onde há deficiência de indivíduos ou entre indivíduos de parentesco próximo. Portanto,
outros marcadores devem ser acrescentados a estas análises a fim de aumentar o poder de discriminação do
teste. Objetivo: Estabelecer as freqüências alélicas de três loci STRs, D14S1434, D22S1045 e D10S1248, para os
quais não há estudos na população brasileira, a fim de aumentar o número de marcadores disponíveis para
testes de paternidade e análises forenses no país. Métodos: Foram genotipados 134 indivíduos não aparentados,
oriundos de casos de investigação de paternidade realizados no Geneticenter – Centro de Genética e Reprodução
(Minas Gerais, Brasil). O DNA foi extraído de sangue ou swab bucal com Chelex 100. Os alelos foram separados
em géis de poliacrilamida desnaturante 6% e visualizados por coloração com nitrato de prata. Como padrão de
referência utilizou-se o DNA K562 comercialmente disponível. Uma escada alélica foi construída com todos os
alelos encontrados, facilitando a designação dos alelos de cada amostra. O tamanho dos fragmentos amplificados
foi confirmado no GenBank, através do programa BLAST. Foi desenvolvido um sistema de PCR multiplex para os
três STRs reduzindo tempo e custos. A heterozigosidade observada (HO), o conteúdo de informação polimórfica
(PIC), o poder de discriminação (PD), e o poder de exclusão (PE) foram estimados para cada locus. O equilíbrio
de Hardy-Weinberg foi testado pelo teste exato de Fisher utilizando o programa GENEPOP. Resultados: O locus
D14S1434 apresentou oito alelos com freqüências entre 0,004 e 0,388; HO 0,716; PD 0,853; PE 0,454; PIC 0,66 e p
values 0,2224. O locus D22S1045 apresentou dez alelos com freqüências entre 0,004 e 0,351; HO 0,739; PD 0,899; PE
0,491; PIC 0,71 e p values 0,9553. O locus D10S1248 apresentou oito alelos com freqüências entre 0,004 e 0,276; HO
0,821; PD 0,902; PE 0,638; PIC 0,74 e p values 0,3993. Conclusão: Pode-se concluir que o alto conteúdo informativo,
a facilidade de execução do ensaio e a não existência de desvios no equilíbrio de Hardy-Weinberg, sugerem que
esse sistema é apropriado para uso em investigações forenses e de paternidade na população do sudeste brasileiro.
Apoio financeiro: FAPEMIG, GENETICENTER
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
44
Análise genética e populacional do STR TPOX na
população de Vitória e na Comunidade Pomerana do
Espírito Santo
Reis, RS1; Pozzatto, EN1; Pagel, UR1; Paula, F1
Núcleo de Genética Humana e Molecular (NGHM) – Instituto de Ciências Humanas e Naturais – Departamento de Ciências Biológicas –
Universidade Federal do Espírito Santo (UFES)
[email protected]
1
Palavras-chave: Freqüência alélica, Marcadores STR, TPOX, Vitória-ES, Pomeranos.
Os marcadores moleculares STR, Short Tandem Repeats, são constituídos de 3-7 nucleotídeos que se repetem
em série no DNA, sendo que cada alelo é diferenciado pelo número de cópias de uma dada sequência repetida.
São considerados como ferramentas moleculares úteis em questões legais e civis, como testes de paternidade
e identificação de suspeitos de crimes. Uma vez que populações distintas apresentam características genéticas
distintas, os loci STR podem possuir padrões de distribuição não equivalentes de uma população para outra,
tornando-se mais ou menos informativos em certas situações. Neste contexto, objetivou-se estudar as distribuições
alélicas do marcador STR TPOX na população de Vitória e na comunidade pomerana do Espírito Santo a fim de
verificar sua eficiência na interpretação de testes genéticos na população capixaba. As amostras de DNA foram
extraídas segundo o protocolo de precipitação salina, compreendendo 157 indivíduos residentes em Vitória e 102
de ascendência pomerana do ES. A amplificação foi feita pela técnica de PCR, seguida por corrida eletroforética
em gel desnaturante de poliacrilamida e posterior coloração por nitrato de prata. Por fim, as freqüências alélicas
e dados estatísticos foram gerados pelos softwares Arlequin 3.1 e Powerstats V12. Os valores da freqüência
alélica na população de Vitória e da comunidade pomerana foram, respectivamente: alelo 6 (0,023810 e 0,004950)
alelo 7 (0,017007 e 0), alelo 8 (0,459184 e 0,574257), alelo 9 (0,129252 e 0,089109), alelo 10 (0,071429 e 0,054455) e
alelo 11 (0,261905 e 0,252475). Os dados estatísticos calculados em Vitória e na comunidade pomerana foram,
respectivamente: Heterozigosidade Observada (0,65986 e 0,64356), Poder de Exclusão (0,332 e 0,286), Índice de
Paternidade (1,44 e 1,29), Conteúdo de Informação Polimórfica (0,62 e 0,51), Matching Probability (0,177 e 0,244)
e Poder de Discriminação (0,831 e 0,759). A alta freqüência dos alelos 8 e 11 em ambas as populações capixabas
é verificada em populações vizinhas, como Rio de Janeiro, e em outras populações brasileiras. Os alelos 5, 12 e 13
encontrados em algumas regiões não foram detectados em nossa população. A comparação entre as distribuições
alélicas da população capixaba com as das principais populações parentais permite estabelecer maior proximidade
com populações européias, em detrimento das africanas ou ameríndias. As diferenças verificadas entre indivíduos de
Vitória e pomeranos podem ser, em parte, explicadas como reflexo da origem polonesa destes últimos. Os resultados
desta pesquisa sugerem que o lócus avaliado realmente não é suficiente, sozinho, para determinar identidade
genética nesta população, mas tem perfil adequado para este uso, em conjunto com outros loci STR usados em
identificação genética. Desta forma, este trabalho contribuiu para o estudo do marcador TPOX como ferramenta
molecular na população capixaba, bem como na inferência de padrões genéticos distintos nesta população.
Apoio financeiro: FAPES, UFES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
45
Caracterização do perfil genético de 10 X-STR na
população do Rio de Janeiro (Brasil)
Martins, JA1; Costa, JC1; Paneto, GG1; Figueiredo, RF1; Gusmão, L2; Sánchez-Diz, P3; Carracedo, A3;
Cicarelli, RMB1
Laboratório de Investigação de Paternidade, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Unesp - Universidade Estadual Paulista, Brasil
IPATIMUP, Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, Portugal
3
Instituto de Medicina Legal, Grupo de Medicina Genômica, Universidade de Santiago de Compostela, A Coruña, Espanha
[email protected]
1
2
Palavras-chave: X-STR, Frequências alélicas, Identificação humana, Rio de Janeiro, Brasil.
Introdução: Os marcadores STR (Short Tandem Repeat) polimórficos são os mais utilizados para a identificação
humana e se classificam em STRs autossômicos, do cromossomo Y e do cromossomo X. Estes últimos são de
utilização recente e têm complementado a análise autossômica em casos complexos de vínculo biológico
(exp.: quando suposto pai não está disponível, quando os supostos pais são relacionados, etc), pois suficiente
poder estatístico é obtido com poucos marcadores X-STR. Assim, é de grande importância a caracterização
desses marcadores na população brasileira para posterior utilização na rotina forense. Objetivos: Determinar
as frequências alélicas e os parâmetros estatísticos de interesse forense para 10 X-STRs (DXS8378, DXS9902,
DXS7132, DXS9898, DXS6809, DXS6789, DXS7133, GATA172D05, GATA31E08 e DXS7423) na população
do Rio de Janeiro, bem como avaliar se existe diferença genética significativa entre tal população e outros
grupos relatados na literatura. Métodos: Em papel FTA (Whatman) foi coletada a amostra sanguínea de 261
indivíduos não aparentados e residentes no Rio de Janeiro. O DNA foi extraído pela técnica FTA, amplificado
em uma reação decaplex e submetido à eletroforese em analisador genético ABI377 (Applied Biosystems). A
determinação alélica foi feita com o programa GeneScan (Applied Biosystems) e os programas Excel e Arlequin
foram utilizados para análise estatística. Resultados: Não houve diferença significativa entre as frequências
alélicas obtidas para mulheres e homens, sendo que nestes últimos todos os haplótipos obtidos foram únicos.
Não foi observado Desequilíbrio de Ligação entre os X-STR e nem desvio do Equilíbrio de Hardy–Weinberg. O
poder de discriminação variou de 0,6838 (DXS8378) a 0,8366 (DXS6809) e 0,8376 (DXS8378) a 0,9536 (DXS6809)
em homens e mulheres, respectivamente. O poder de discriminação combinado foi de 0,9999995 em homens
e 0,99999999997 em mulheres e a chance de exclusão significativa foi de 0,99989 em duo e 0,9999981 em trio.
Comparações genéticas revelaram diferenças significativas do Rio de Janeiro com São Paulo e Paraná, bem como
com populações de Portugal, Espanha, América Latina e África. Conclusões: Os 10 X-STR apresentam diferenças
significativas entre diferentes populações e é altamente informativo para a população do Rio de Janeiro, Brasil.
Apoio financeiro: PADC/FCF-UNESP, FAPESP, CAPES, CNPq, Programa Isidro Parga Pondal-INCITE, Fundação
para a Ciência e a Tecnologia - POCI
Agradecimentos: ao HEMORIO pelo auxílio na coleta de amostras
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
46
Análise genética de marcadores STRs do cromossomo X
(X-STRS) na população brasileira
Rodrigues, EMR1,2; Palha, TJBF1,2; dos Santos, SEB1
Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Genética Humana e Médica da Universidade Federal do Pará
Centro de Perícias Científicas Renato Chaves
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cromossomo X, X-STRs, População Brasileira, Freqüências, Análises Forense
Nos últimos anos, tem aumentado a utilização dos marcadores do Cromossomo X (especialmente X-STRs)
para resolver casos forenses. Os marcadores do X-DNA possuem características únicas, como seu modo de
transmissão particular (mãe para filhos e filhas e pai somente para as filhas), o que permite complementar, de
forma muito eficiente, os marcadores autossômicos em casos especiais de investigação de vínculo genético,
principalmente naqueles casos em que o suposto pai é falecido. Para utilização mais adequada de marcadores
X-STRs em populações miscigenadas, como a população brasileira, é necessário, conhecer a distribuição de
seus alelos nas diferentes populações sob investigação. Isto se deve ao fato conhecido de que as freqüências
alélicas dos marcadores STRs podem variar muito entre populações de continentes geográficos distintos. Nós
desenvolvemos este projeto de forma a estimar as freqüências alélicas de 12 X-STRs comumente empregados
em genética forense (DXS7132, DXS7423, DXS133, GATA172D05, DXS7130, DXS6800, GATA31E08, HPRTB,
DXS6789, DXS9898, DXS9895 e DXS10011), em uma amostra de 2150 indivíduos que representam as populações
de 16 Estados brasileiros, distribuídos nas cinco regiões geopolíticas do país. Nosso objetivo principal foi o de
avaliar o poder estatístico deste painel de marcadores X-STRs, e testar se as populações de diferentes regiões
geográficas (ou de diferentes Estados) são (ou não) diferentes entre si. Responder esta questão permitirá decidir
sobre a necessidade de usar um banco de dado único (ou múltiplos bancos de dados) nas análises estatísticas
forenses para a população brasileira, empregando estes marcadores genéticos. Foram analisados 2150 indivíduos
não aparentados das cinco regiões geopolíticas brasileiras: Norte (1000 indivíduos), Nordeste (300), Centrooeste (150), Sudeste (500) e Sul (200). Todos os 12 X-STRs foram analisados em uma única reação de PCR (PCR
multiplex), segundo as condições descritas por Ribeiro-Rodrigues et al. (2009). As análises estatísticas foram
realizadas utilizando-se o programa Arlequim v3.1. Os parâmetros de eficiência forense foram calculados de
acordo com Desmarais et al. (1998). Foi observada uma elevada diversidade genética para todos os marcadores
X-STRs, nas cinco regiões analisadas. As análises de subestruturação populacional (RST) e de Diferenciação entre
populações, não permitiu identificar diferenças estatísticas significativas, quando se compara as populações dos
diferentes Estados ou das diferentes Regiões brasileiras. Os parâmetros de eficiência forense demonstraram que
esses marcadores permitem estimativas muito elevadas de Poder de Discriminação acumulado (0.9999999971);
da probabilidade de Exclusão do Trio (0,999999972) e da Probabilidade de Exclusão Motherless (0,9999996). Em
conclusão, todos os dados estatísticos aqui obtidos comprovam a utilidade desse painel de marcadores X-STRs em
análises forenses no Brasil e indicam que é possível empregar (nas análises estatísticas de diferentes laboratórios
espalhados pelo Brasil) um banco de dado único, que possa ser representativo de toda a população brasileira.
Apoio financeiro: UFPA, CNPq, FINEP, CPC-RC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
47
Polimorfismos de Inserção/deleção: Aplicação em
identificação humana por DNA
Caiafa, AR1; Manta, FSN1; Bernardo, S1; Aquino, JG; Silva, DA1; Gusmão, L2; Amorim, A2; Pereira, R2; Carvalho, EF1
Departamento de Ecologia, Laboratório de Diagnósticos por DNA - Instituto de Biologia – Universidade do Estado do Rio de Janeiro
IPATIMUP – Universidade do Porto, PT
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Indels, Inserção/deleção, Forense, Identificação humana.
Introdução: Atualmente os polimorfismos de DNA mais utilizados na identificação humana são os STR (“Short
Tandem Repeats”). Em casos onde amostras de restos mortais são as únicas fontes de DNA para a obtenção do perfil
genético de indivíduo não identificado por técnicas convencionais, se faz necessária a aplicação de metodologias
que elevem a chance de amplificação do DNA. Em geral, o DNA encontra-se altamente degradado, a PCR para
marcadores STR não amplifica satisfatoriamente um número de regiões condizente com a identificação humana
pretendida. Recentemente, estudos envolvendo polimorfismos de Inserção/Deleção (Indels) vêm possibilitando
avanços nessa área. Objetivo: Os avanços científicos no campo da identificação humana por DNA estão relacionados
com a construção e validação de sistemas multiplex PCR. O objetivo deste trabalho consiste em testar a eficiência
do multiplex Indel-plex ID (sistema capaz de amplificar 38 indels bi-alélicos de cromossomos autossômicos) em
amplificar DNA cuja tipagem em loci STR se mostrara negativa. Metodologia: Preparações de DNA de amostras
biológicas controle (sangue periférico) e de restos mortais (ossos e dentes) foram extraídas pelas técnicas de chelex e
fenol-clorofórmio, respectivamente. Em seguida, alíquotas dos DNA foram submetidas à amplificação por PCR com
o sistema Indel-plex ID. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese capilar (ABI 3130 - Applied Biosystems)
e analisados pelo software GeneMapper v3.2 (Applied Biosystems). Conclusão: Os resultados obtidos demonstram
o potencial dos indels na amplificação de DNA de restos mortais humanos resistentes à amplificação em loci STR.
Apoio: Capes, Programa de DNA – UERJ/ Tribunal de Justiça do Rio de Janeiro
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
48
Padrões de desequilíbrio de ligação de um painel com
33 marcadores X-INDEL em populações indígenas da
Amazônia
Freitas, NSC; Resque, RL; Ribeiro-Rodrigues, EM; Santos, NPC; Ribeiro-dos-Santos, AKC; Santos, SEB
Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
Palavras-chave: INDEL, polimorfismo, cromossomo X, desequilíbrio de ligação, indígenas.
Desequilíbrio de Ligação (DL) pode ser definido como uma associação não aleatória de alelos em diferentes loci.
Compreender os padrões de DL é a base para o mapeamento de genes humanos e para estudos de associação,
onde os marcadores que se encontram em DL apresentam-se como as melhores opções para o mapeamento
gênico fazendo com que o número de marcadores utilizados para a identificação de um alelo possa ser
reduzido. Os polimorfismos do tipo Inserção/Deleção (INDELs) são marcadores bialélicos com características
que potencializam seu uso em diversas áreas da genética, entre elas destacamos: a possibilidade de analisar
marcadores com tipos de herança especial, como aqueles ligados ao cromossomo X, a simplicidade dos métodos
de análise laboratorial e a possibilidade de PCR multiplex. Nosso objetivo foi analisar marcadores do tipo INDEL
no cromossomo X, próximos (em blocos), que estejam em DL e analisar este DL entre os blocos. Foram analisados
185 indivíduos de tribos indígenas da Amazônia brasileira. As amostras de DNA foram extraídas pela técnica
de fenol-clorofórmio e posteriormente quantificadas. A genotipagem foi realizada por meio de PCR multiplex
de 33 marcadores X-INDELs (MID2047, MID3712, MID357, MID356, MID3780, M448804, MID3703, MID218,
MID3774, MID3705, MID3706, M304737, MID3692, MID1445, MID2694, MID2657, MID1326, MID2600, MID2610,
MID184, M197147, MID3754, MID3756, MID1705, MID3764, M284601, M103547, MID193, MID358, MID3763,
MID3728, MID1540, MID2652). A eletroforese foi realizada em sequenciador capilar. Para as análises estatísticas
utilizamos o programa Arlequin v3.1, onde os dados obtidos foram empregados para testar DL entre todos os
pares de marcadores, dentro dos grupos de ligação (pares de marcadores com distância máxima de 250 K pb).
Os resultados demonstram que dentre os marcadores, somente doze pares apresentaram DL significativo. A
distância física entre esses doze pares de marcadores com significante p value é variável: entre 4,5 K pb (MID3705MID3706) e 123,9 K pb (MID3754-MID3756). Seguindo este critério, identificamos sete blocos de ligação que
incluem: Bloco I (MID357-MID356); Bloco II (MID3780-M448804); Bloco III (MID218-MID3774); Bloco IV
(MID3705-MID3706-M304737); Bloco V (MID3754-MID3756); Bloco VI (MID3763-MID3728; Bloco VII (MID358MID3763). Os resultados obtidos para o DL nas tribos indígenas diferem dos encontrados para a população de
Belém visto que as populações ameríndias apresentam baixa diversidade genética intra-populacional e diferentes
modelos de mistura podem criar padrões de DL diferentes de acordo com a população estudada. Ao final de
nossas análises encontramos 24 marcadores, sendo 17 polimorfismos não ligados e sete grupos de ligação
contendo dois e três polimorfismos cada, onde cada grupo pode formar até oito haplótipos e cada haplótipo se
comportará como um alelo de ligação. O emprego deste conjunto de marcadores pode fornecer novas ferramentas
para estudos populacionais que poderão ser investigadas futuramente além de aplicações de âmbito forense.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FINEP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
49
Population data of 11 STR loci of the X chromosome in a
sample of São Paulo with application in forensic cases
Auler-Bittencourt, E1; Rodrigues, EMR2; Sousa, MLAPO1; Silva, SEB2; Iwamura, ESM3; Silva, IDCG4
Laboratório de DNA - Núcleo de Biologia e Bioquímica - Instituto de Criminalística de São Paulo, SP, – Brasil
Laboratório de Genética Humana e Médica do Departamento de Patologia - Universidade Federal do Pará, Belém, Brasil
3
Departamento de Patologia da Escola Paulista de Medicina da Universidade Federal de São Paulo, SP, Brasil
4
Laboratório de Ginecologia Molecular do Departamento de Ginecologia Universidade Federal de São Paulo,SP, Brasil
1
2
Keywords: X-STR, polymorphism, population frequency, criminal cases, forensic analysis.
The analysis of X-STR polymorphisms is very suitable for the investigation of parentage in cases where the family
configuration is not complete, such as the lack of the presumed father or mother, as well as the involvement of
other relatives such as grandparents, and cases of crimes gender-related. These markers can very efficiently help
autosomal and Y chromosome STR systems, defining more clearly the issues of biological kinship. The X-STR has
been validated for forensic use, however, little is known about the variations of these polymorphisms in Brazilian
populations. We performed the analysis of biological samples from unrelated individuals from the São Paulo State
using a multiplex PCR of 11 STR markers on chromosome X (DXS7132, DXS7432, DXS7133, DX7130, DXS6800,
DXS6789, DXS9898, DXS9895, DXS10011, GATA31E08 and HPRTB). This system was developed by the staff of the
Laboratory of Human and Medical Genetics, Federal University of Para, being highly polymorphic, together provide
an ability to discriminate in an order of 0, 999999. We obtained samples from unrelated individuals: 105 males and
142 females of the population of São Paulo. Blood samples were collected via capillary and venous puncture. DNA
extraction was performed by the method of Chelex and organic by phenol-chloroform and analysis conducted in
3130 sequencer (Applied Biosystems). This paper presents the results of genotyping obtained from a sample of
247 individuals of the population of Sao Paulo state. The data of frequency of X-STR population of São Paulo are
extremely valuable, since many criminal cases can be solved using this tool, increasing the power of discrimination,
providing security and confidence in preparing the conclusion of the technical report.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
50
Estudo de SNPs associados a características físicas,
como cor de olhos, pele e cabelos para uso em
investigações forenses
Favaro, EC; Francischini, CW; Sumita, DR; Whittle, MR
Genomic Engenharia Molecular – São Paulo – Brasil
[email protected]
Palavras-chave: identificação humana, identificação fenotípica, SNPs, SNaPshot, investigação forense.
Introdução: A predição da aparência física baseada em análise genética é uma perspectiva atrativa para
investigações forenses. O sequenciamento do genoma humano e a determinação de milhões de polimorfismos
de nucleotídeo único (SNP) possibilitaram o estudo da associação entre variantes genéticas a características
fenotípicas particulares. A cor da pele, cabelos e olhos, por exemplo, são traços físicos complexos que resultam
da interação de provavelmente mais de 120 genes. Combinados com influências ambientais, os polimorfismos
presentes em suas regiões codificadoras ou regulatórias afetam a produção e a deposição de melanina, assim como
a formação, maturação e transporte dos melanócitos. Mutações em MATP, ASIP, SLC24A5, TYRP1 mostraramse importantes para a variação normal da pigmentação humana. Da mesma forma, HERC-2 e OCA-2 podem ser
correlacionados a cor da íris (claras ou escuras). Os genes TPCN2 e MC1R também apresentam polimorfismos
que são associados à cor de cabelos, este a cabelos vermelhos. Variações em EDAR promovem mudanças quanto
à espessura dos fios de cabelo, sendo um fator importante de distinção de pessoas de origem asiática. Métodos:
Neste trabalho, polimorfismos nos genes supracitados foram analisados quanto à capacidade de identificação
de tipos físicos característicos, como pele branca ou negra e olhos claros ou escuros, em indivíduos brasileiros,
não levando em consideração a sua origem ancestral. Além disso, foi estudada a correlação dos genes MC1R e
EDAR em indivíduos ruivos e orientais, respectivamente. A técnica de análise desses marcadores foi o SNaPshot.
Resultados: Os SNPs selecionados para cor de olhos apresentaram maior taxa de associação, com 91,8%
para íris claras e com 98,2% para íris escuras. Resultados semelhantes foram obtidos com as mutações nos
genes relacionados à cor de pele e a pessoas de origem asiática. Conclusão: A utilização de SNPs em genes da
própria cascata de produção de melanina contribui para a identificação de características físicas, mesmo numa
população tão variável quanto à brasileira, mostrando-se como uma ferramenta promissora no campo forense.
Apoio Financeiro: FINEP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
51
Aplicabilidade forense e associação de SNPs do gene
SLC45A2 com a pigmentação humana
Fracasso, NCA¹; Andrade, CCF²; Wiezel, CEV²; Simões, AL²; Mendes-Junior, CT³
¹Centro Universitário Barão de Mauá, Ribeirão Preto-SP
²Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
³Departamento de Química, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: pigmentação, SNPs, SLC45A2, genética de populações, genética forense
A cor de cabelos, olhos e pele são características morfológicas humanas muito complexas, variáveis e facilmente
reconhecíveis, por isso sua predição é de grande valor nas Ciências Forenses. Até agora, apenas uma fração dos
genes relacionados com a pigmentação humana foram identificados. Dentre eles, o gene SLC45A2 mostrou-se
um dos maiores determinantes da pigmentação em humanos e em outros vertebrados. Localizado na região
cromossômica 5p13.3, este gene codifica uma proteína transportadora associada à membrana (MATP) que tem
um importante papel na diversidade da cor da pele humana por estar envolvida em processos intracelulares e
tráfico de proteínas melanossomais. Mutações patogênicas na MATP se mostraram a causa do albinismo óculocutâneo do tipo 4 (OCA 4), enquanto que outros polimorfismos neste gene são conhecidos por participarem da
variação normal da pigmentação. Sendo assim, foram analisadas as frequências alélicas de dois polimorfismos
de nucleotídeo único (SNPs) do gene SLC45A2, rs732740 (intron 1 T>C) e rs3776549 (intron 2 G>A), em
uma amostra populacional da região de Ribeirão Preto, Estado de São Paulo. Foram coletadas amostras de
sangue de 150 indivíduos não relacionados e o DNA foi extraído pela técnica salting-out. Os genótipos foram
identificados através da técnica de PCR seguida de clivagem com enzima de restrição específica e posterior
eletroforese em gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata. O SNP rs732740 se apresentou
monomórfico e não mostrou associação significativa com nenhuma das características estudadas. Uma única
cópia do alelo C foi encontrada em um indivíduo caracterizado por fenótipos de pigmentação clara, com pele
clara, olhos verdes e cabelos loiros. Quanto ao SNP rs3776549, o alelo G está associado à ocorrência de cor de
olhos verdes (p = 0,0323; OR = 9,4599) ou verdes/azuis (p = 0,0585; OR = 5,7763). Dessa forma, ainda que um
dos SNPs tenha mostrado associação com a pigmentação dos olhos, são necessários estudos mais abrangentes
para avaliar a influência de polimorfismos do gene SLC45A2 na pigmentação humana e sua aplicação forense.
Auxílio financeiro: CNPq e FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
52
In silico mining of 744 new pentanucleotides X-STR
and validation of relevant markers for medical and
forensic genetics purposes
Nogueira, TLS1; Machado, FB2; Moura-Neto, RS1; Siva, R1; Medina-Acosta, E2
Laboratório de Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Universidade Federal
do Rio de Janeiro
2
Núcleo de Diagnostico e Investigação Molecular, Centro de Biociências e Biotecnologia, Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro
[email protected]
1
Keywords: Microsatellite, STR, X chromosome, In silico mining, Pentanucleotídeos.
Over the last decade it has been established a group of autosomal markers that are widely used today in forensic
practice. Genotyping of microsatellite markers located on chromosome X (X-STRs), can efficiently complement
the analysis of autosomes and Y chromosome markers. Despite the advances, in silico methodologies for
identification and characterization of microsatellites, genetic analysis of forensic human X sex chromosome
is restricted to a group of 39 markers, of which 10.3% were trinucleotide and 89.7%, tetranucleotide. The high
discrimination power, the occurrence of few microvariants and low levels of stutter products of microsatellite,
pentanucleotides repeats are elegible as an ideal marker for forensic analysis. Objectives: This study aimed to
make the detection and validation of microsatellite markers in the human X chromosome predicted in silico
as potentially informative. Through the program Tandem Repeat Finder (TRF), a scan was performed in all the
nucleotide sequences of three genomes of reference of the X chromosome, NC_000023, AC_000066 and AC_000155,
available at NCBI, in search of STR markers. Then, these sequences were aligned for each microsatellite locus using
the online program CLUSTALW Multiple Sequence Alignment to identify allelic variants. Results: The number of
microsatellite was variable depending on the stringency of mining parameters adopted. The number of markers
found was 889 tetranucleotides and 744 pentanucleotides. There is a growing need, nationally and internationally,
to develop accurate tests, but faster for typing exceptionally informative markers located on chromosome X.
There are very few kits available and, besides being expensive, are based on a maximum of 12 X-STR markers,
which exhibit various rates of heterozygosity and power of discrimination values in different populations. The
discovery of new markers paves the way for the experimental study, allowing to expand the panel of microsatellites
on the X chromosome, especially in forensic practice. Therefore, STR typing with tetra and pentanucleotides
and allowed the unequivocal determination, accurate, allele frequencies in different human populations.
Supported by FAPERJ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
53
Utilização de SNPs como marcadores auxiliares na
investigação de vínculo genético
Francischini, CW; Favaro, EC; Sumita, DR; Whittle, MR
Genomic Engenharia Molecular – São Paulo – Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Identificação humana, STRs, SNPs.
Introdução: O estudo da variação genética através de polimorfismos de DNA distribuídos ao longo do genoma
permitiu o desenvolvimento de um sistema de marcadores genéticos de grande utilidade na identificação de
indivíduos. Além disso, esses marcadores vem sendo uma importante ferramenta para a compreensão da história
da diversidade da população humana. Atualmente, a análise de STRs (short tandem repeats) é o método padrão
de investigação de vínculo genético, sendo largamente utilizado no campo forense, pois, permite poder de
discriminação adequado para a solução da maioria dos problemas de identificação humana. A maior dificuldade
na utilização desses marcadores é encontrada em casos onde o material genético se encontra parcialmente
degradado, uma vez que os fragmentos de DNA amplificados para a análise são superiores a 200 pb. Em
adição, a alta taxa de mutação nos STRs pode dificultar o resultado final da análise. Os SNPs (single nucleotide
polymorphisms) são polimorfismos pontuais comuns na sequência genômica que apresentam ocorrência estimada
em 1 a cada 400 pares de base. As vantagens desses marcadores em relação aos STRs são a baixa taxa de mutação,
a possibilidade de utilização de produtos de PCR inferiores a 100 pb, fato que contribui para casos forenses,
ausência de artefato de bandas fantasmas (stutter bands) e ausência de amplificação preferencial de alelos.
Métodos: Foi selecionado um conjunto de 70 SNPs com alta taxa de heterozigozidade nas diferentes populações
e a técnica de análise desses marcadores foi o SNaPshot. Resultados: Neste trabalho, foram analisados vários
casos de investigação de vínculo genético, realizados com STRs, que apresentaram dificuldades na conclusão,
como por exemplo, baixos índices de paternidade e presença de mutações, mesmo com o uso locos adicionais.
Isoladamente ou associados aos STRs, índices de paternidade satisfatórios foram obtidos. Conclusão: Os SNPs
se mostraram excelente ferramenta auxiliar em casos de confirmação da inclusão ou exclusão dos periciandos.
Apoio financeiro: FINEP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
54
Analysis of lysyl oxidase expression in gliomas
Dos Santos, WG1,2; Fernando, J2; Van Meter, TE2; Fillmore, HL2; Broaddus, WC2
Laboratório de Genética, Campus Avançado de Jataí, Universidade Federal de Goiás, Jataí, GO - Brazil
Department of Neurosurgery, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia, USA
[email protected]
1
2
Keywords: lysyl oxidase, gliomas, extracellular matrix, invasion, metastasis
Lysyl oxidases (LOX) are enzymes that play an important role in modulating extracellular matrix by catalyzing cross
linkage of collagen and elastin. LOX family members are known to be highly expressed in reproductive tissues and
recently it has also been shown to be present in some tumor cells and associated to invasiveness. The transition
from a localized tumor to an invasive and metastatic tumor represents a landmark in the development of malignant
disease and it is usually associated with worse prognosis. Malignant gliomas are among the most invasive tumors
whose mechanism is still not well understood. Since the expression of lox genes in this type of tumor has not yet
been fully addressed, we investigated the expression of LOX in rodent and human glioma cells grown in culture
or isolated from tumor brain tissue obtained from rats previously implanted with these cells. Experiments were
approved by VCU research ethical committee. Presence and levels of LOX expression were determined by microarray
analysis and western blot/immunohistochemistry, using specific antibodies to the LOX-L2 family member. Our
results demonstrated higher levels of LOX expression in brain tumor tissue such as anaplastic astrocytomas,
oligodendrogliomas, ependimomas, pylocytic astrocitoma and glioblastoma multiforme than in normal brain.
Microarray analysis showed differential expression in rat glioma cells exposed to different doses of radiation
treatment. Imunohistochemistry demonstrated strong staining surrounding the tumor. Detection of lysyl oxidases
preferentially on the edge of the tumor tissue suggests a possible role of this protein in the invasion of malignant gliomas.
Support: MCV Foundation
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
55
Dado genético de 10 X-STR na população de Belo
Horizonte-MG (Brasil)
Martins, JA1; Costa, JC1; Paneto, GG1; Figueiredo, RF1; Gusmão, L2; Sánchez-Diz, P3; Carracedo, A3; Cicarelli, RMB1
Laboratório de Investigação de Paternidade, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Unesp - Univ Estadual Paulista, Brasil
IPATIMUP, Instituto de Patologia e Imunologia Molecular da Universidade do Porto, Portugal
3
Institute of Legal Medicine, Genomics Medicine Group, University of Santiago de Compostela, CIBER for Rare Diseases (CIBERER),
Santiago de Compostela, A Coruña, Spain
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cromossomo X, STR, Frequências alélicas, Identificação humana, Belo Horizonte-MG.
Introdução: Os marcadores mais utilizados em genética forense são os STR (Short Tandem Repeats) autossômicos,
seguidos pelos STR do cromossomo Y. A análise de STR do cromossomo X (X-STR) é recente e tem se tornado
de grande importância em casos complexos de relações biológicas. Os dados genéticos brasileiros para
marcadores autossômicos e do cromossomo Y já estão bem estabelecidos, porém, em se tratando de X-STR,
poucos trabalhos estão disponíveis na literatura. Assim, a ampliação desses dados faz-se necessária para
posterior utilização dos X- STR na rotina forense brasileira. Objetivos: Determinar as frequências alélicas e os
parâmetros estatísticos de interesse forense para 10 X-STR (DXS8378, DXS9902, DXS7132, DXS9898, DXS6809,
DXS6789, DXS7133, GATA172D05, GATA31E08 e DXS7423) na população de Belo Horizonte-MG e avaliar
se existe diferença genética significativa entre tal população e outros grupos relatados na literatura. Métodos:
Amostras sanguíneas foram coletadas de 245 indivíduos não aparentados, residentes em Belo HorizonteMG. O DNA foi extraído pela técnica FTA, amplificado em uma reação decaplex e submetido à eletroforese em
analisador genético ABI377 (Applied Biosystems). A determinação alélica foi feita com o programa GeneScan
(Applied Biosystems) e os programas Excel e Arlequin foram utilizados para análise estatística. Resultados:
Não foi observado desvio ao Equilíbrio de Hardy–Weinberg para qualquer um dos loci estudados. O poder de
discriminação variou de 0,6829 (DXS8378) a 0,8355 (GATA172D05) e 0,8331(DXS8378) a 0,9512 (GATA172D05)
em homens e mulheres, respectivamente. O poder de discriminação combinado foi de 0,9999995 em homens e
0,99999999996 em mulheres e a probabilidade de exclusão a priori foi de 0,99990 em duos e 0,999998 em trios.
Comparações genéticas revelaram diferenças significativas entre Belo Horizonte e São Paulo, bem como entre
Belo Horizonte e populações de Portugal, Espanha, América Latina e África. Conclusões: Os 10-XTRs constituem
uma poderosa ferramenta para a prática forense e testes de paternidade na população de Belo Horizonte-MG.
Apoio
financeiro:
PADC/FCF-UNESP,
FAPESP,
CAPES,
CNPq,
Programa
Isidro
Parga
Pondal-INCITE (Xunta de Galicia), Fundação para a Ciência e a Tecnologia – POCI.
Agradecimentos: ao HEMOMINAS pelo auxílio na coleta de amostras
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
56
Obtenção de perfil de DNA humano em vestígio
previamente tratado com peróxido de hidrogênio (H2O2)
Silva, SC2; Brasil, SMV1; Cavalcanti, IA1; Rocha, TCL1; Sobreira, ACM1; Ramos, AT3; Oliveira, DM2
Laboratório de DNA Forense do Estado do Ceará, Perícia Forense do Ceará
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Universidade Estadual do Ceará
3
Laboratório de Bioquímica e Cultura de Células, Universidade Estadual do Ceará
[email protected]
1
2
Palavras-chave: genética forense, DNA vestigial, ranhuras de projétil, extração de DNA, perfil genético
Amostras vestigiais, tais como pontas de cigarro, saliva e bulbos capilares, são fontes importantes de DNA na
genética forense, desde que sejam preservadas e analisadas de forma adequada, evitando-se degradação e
contaminação exógena das amostras. A presença de elementos contaminantes e/ou interferentes pode implicar
na não amplificação destas amostras. Dentre as substâncias que podem interferir diretamente na extração e
amplificação do DNA existente encontra-se o peróxido de hidrogênio (H2O2), que quando utilizado nos vestígios a
serem analisados atua como um poderoso agente oxidante danificando a molécula de DNA, dificultando, assim, a
obtenção de um perfil genético adequado. Com isso a detenção da cadeia de custódia das amostras forenses faz-se
necessária, pois estas podem ser submetidas a procedimentos para outras técnicas forenses onde seja necessária
a utilização de substâncias lesivas ao DNA. O Laboratório de DNA Forense do Estado do Ceará recebeu, como
amostra questionada, um projétil de arma de fogo proveniente do Núcleo de Balística Forense. Antes da análise
balística, a amostra foi submetida a procedimento de limpeza com H2O2 10V. O objetivo pericial aqui reportado
foi a determinação dos perfis genéticos da amostra questionada e amostra referência a fim de, por comparação,
estabelecer eventual relação de verossimilhança. Ao dar entrada no Laboratório de DNA Forense, o projétil não
apresentava vestígio visível, sendo este armazenado em ambiente com temperatura adequada e livre de contato
com qualquer contaminante exógeno. A coleta do vestígio ocorreu através do uso de swab úmido passado em
toda a superfície do projétil e deixado secar para se iniciar a extração de DNA. Esta foi baseada na utilização de
resina de troca iônica Chelex (Coombs, 2003). A amplificação do DNA ocorreu por PCR (Polimerase Chain Reaction),
utilizando o sistema Powerplex 16, da Promega Corporations, totalizando 16 loci genéticos. A leitura das sequências
foi feita em Analisador Automático ABI 3130 da Applied Biosystems. Ao final de todo procedimento obteve-se, na
amostra questionada, perfil genético completo cujos alelos nos loci analisados apresentaram compatibilidade com
a amostra referência. Foram realizados Cálculos estatísticos de acordo com o Manual de Padronização de Perícias
Criminais (SENASP/2006), baseado na razão de verossimilhança. A frequência encontrada foi de 01 em cada
29.568.314.427.135.600 indivíduos. Considerando os resultados relatados, pode-se concluir que, mesmo passando
por procedimentos inadequados para preservação do DNA, a amostra analisada ainda permitiu a recuperação de
DNA. Isto provavelmente se deu pela permanência do material genético nas ranhuras que se formam no projétil
após o disparo. Destarte, a preservação de quantidades ínfimas de tecido humano em superfície irregular, como
a ora relatada, foi suficiente para permitir uma identificação genética inequívoca por obtenção de perfil genético
completo e convencional.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
57
Estimativa dos perfis isoenzimáticos de Pediculus
capitis em Manaus-AM
Bezerra, FC1; Moroni, RB2 ; Santos, JMM3; Maia, JF 3
Universidade Federal do Amazonas
Laboratório de Imunologia, Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas
3
Laboratório de Malária e Dengue, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Isoenzimas, Pediculus capitis, Manaus.
A pediculose da cabeça é dos problemas de saúde pública. A prevalência e os níveis de infestação estão
relacionados com fatores culturais, sociais, genéticos e a resistência do piolho aos inseticidas químicos. Tal
resistência geralmente resulta de mudanças genéticas afetando a síntese de enzimas como: acetil-colinesterase,
monooxigenases e esterases não específicas. O trabalho verificou a estimativa do perfil eletroforético de Pediculus
capitis utilizando os sistemas isoenzimáticos (Esterase, Fosfoglicomutase, Isocitrato desidrogenase, Fosfoglicose
isomerase, Hexoquinase, Malato desidrogenase e Enzima málica). Foram analisados os locos isoenzimáticos
(EST 1, EST 2, IDH, PGI, PGM, HK, MDH e ME), de adultos de P. capitis, em eletroforese horizontal, utilizando géis
de amido (12,5%) e amido-agarose (2% e 1%,respectivamente), com tampões e colorações específicas. Os perfis
eletroforéticos da esterase apresentaram a ocorrência de duas zonas de atividade eletronegativas denominadas
EST1 e EST2. Os locos não apresentaram variação sendo codificados respectivamente pelos alelos EST1 e EST2.
Para fosfoglicomutase foi detectado uma zona de atividade, eletronegativa, denominada de PGM1. Os indivíduos
heterozigotos para este loco mostraram um fenótipo constituído por duas bandas com igual intensidade de
coloração, sugerindo estrutura monomérica da proteína. A variação observada sugere que esta região é controlada
por dois alelos dominantes: PGM1 *100 e PGM1 *80. A hexoquinase e a enzima málica apresentaram um perfil
eletroforético constituído de uma zona de atividade, eletronegativa e de caráter monomórfico. Os locos foram
denominados HK e ME respectivamente. Os alelos apresentados por estes sistemas são respectivamente HK1 e
ME1. Os sistemas isocitrato desidrogenase, fosfolicose isomerase e malato desidrogenase foram constituídos cada
um por uma única zona de atividade denominadas IDH1, PGI1, MDH1, respectivamente, de coloração moderada.
Os sistemas foram monomórficos para todos os indivíduos analisados, apresentando os alelos: IDH1, PGi1, MDH1. O
perfil eletroforético detectado para a maioria dos sistemas isoenzimáticos foram monomórficos, constituídos de
uma única região de atividade, eletronegativa e de coloração moderada, com exceção do sistema esterase, onde foi
detectado variação no número de alelos por loco. Tais resultados revelaram embasamento para pesquisas futuras,
com a finalidade de verificar a estrutura genética das populações de P. capitis também na região Amazônica.
Apoio financeiro: CNPq (edital MCT-Amazônia/2006)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
58
Caracterização molecular dos tipos de papilomavírus
humano (HPV), no Município de Porto Velho-RO Período
2008-2009
dos Santos, JC1; Cezar, MRS2; Lisboa, MR3; Holanda, FJ4; Moura, MMF5
Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnologia CIBEBI, Biólogo e discente do Programa de Pós-Graduação em
Biologia Experimental-PGBIOEXP/doutorado da Universidade Federal de Rondônia-UNIR
2
Professora Mestre em Doenças Tropicais do departamento de Medicina DEPMED, do núcleo de Saúde NUSAU, da Universidade Federal de Rondônia e médica ginecologista e obstetrícia
3
Professora do departamento de Medicina DEPMED, do núcleo de Saúde NUSAU, da Universidade Federal de Rondônia, médica ginecologista e mastologista de oncologia
4
Bióloga e discente do Programa de Pós-Graduação nível doutorado da Universidade Federal do Amazonas UFAM
5
Professora Dra. em Genética, Chefe do Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnologia CIBEBI, Docente do departamento de Biologia DBIO, Núcleo de Ciências e Tecnologia-NCT da Universidade Federal de Rondônia UNIR
[email protected]
1
Palavras-chave: Câncer uterino, HPV, Grau Oncogênico, Papilomavírus, PCR/RFLP
Introdução: O Papilomavírus pertence à família Palillomaviridae, subfamília Papilomavirinae e ao gênero
Papilomavírus. Existem mais de 100 tipos virais de HPVs descritos até o momento e, destes, aproximadamente
35 são encontrados no trato anogenital. Os tipos (16 e 18) são os mais comuns encontrados em câncer cervical
e precursor de lesões. A infecção por HPV cervical é encontrada em 5-40% das mulheres assintomáticas na
idade reprodutiva, bem como 75% dos adultos podem eventualmente ser infectados. Objetivo: Caracterização
dos tipos de Papilomavírus Humanos (HPV), no período de agosto de 2008 a agosto de 2009, em mulheres
que realizam preventivo no Centro de Referência da Saúde da Mulher-CRSM, localizado nas dependências da
Policlínica Rafael Vaz e Silva no Município de Porto Velho, Rondônia-RO. Métodos: O material genético viral (DNA/
HPV) do Papilomavírus humano foi confirmado por PCR com a utilização dos primers universais MY09/MY11.
A visualização do fragmento de 450pb correspondente a região conservada do gene L1 foi realizada em gel de
agarose a 1,5%, corado com brometo de etidio. Os amplicons foram submetidos à (RFLP) com endonucleases:
Bam H I, Dde I, Hae III, Hinf I, Pst I, Rsa I e Sal 3AI. O perfil eletroforético dos tipos de HPVs foi visualizado em gel
de agarose a 1,5%. Os resultados moleculares foram relacionados com os da citologia, disponibilizado no próprio
laboratório do CRSM, que segue os critérios do sistema de Bethesda (2001). Resultados: Em nossos estudos
com 334 mulheres, foi confirmado o DNA/HPV em 29% nas amostras analisadas por PCR. Entretanto o método
citológico revela alteração celular com indicativo para HPV em apenas 3% das lâminas analisadas. A correlação
dos métodos utilizados revela que apenas 10% de mulheres com HPV são detectadas por métodos citológicos.
Em relação ao perfil eletroforético dos HPVs, foi possível verificar a existência de sete (07) tipos distintos de
Papilomavírus humano. Os 96 HPVs observados encontram-se distribuídos em dois grupos os HPVs-16, 18, 33
e 58 pertencentes ao grupo de alto risco oncogênico e os HPVs-11, 42 e 53 no grupo de baixo risco oncogênico.
Conclusão: O sistema PCR/RFLP demonstrou a existência de HPVs de alto e baixo risco oncológico circulante
na população de Porto Velho e resultados falsos negativos nos exames de citologia realizados na população
estudada. Por ser uma técnica específica que garante uma maior precisão no diagnóstico para a HPV sua utilização
nos laboratórios é de fundamental importância no combate de prevenção ao surgimento do Câncer uterino.
Apoio financeiro: CIBEBI / UNIR
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
59
A ancestralidade européia está associada
positivamente com alto risco para HBOC na Bahia
Abe-Sandes, K1,3; Machado, TMB1; Abe-Sandes, C1,2; Toralles, MBP4; Nascimento, L1,6; Romeo, M4; Campinho, AC4; Freire, SM1; Garicochea, B5; Meyer, R1; Nascimento, ILO1
Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular, Universidade Federal da Bahia - UFBA, Salvador, BA
Universidade Católica do Salvador
3
Departamento de Ciências da Vida, Universidade do Estado da Bahia, UNEB, Salvador, BA
4
Serviço de Oncogenética, Hospital Universitário Professor Edgar Santos, UFBA, Salvador, BA
5
Departamento de Medicina Interna, Faculdade de Medicina, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, PUC, RS
6
Faculdade de Tecnologia e Ciências, FTC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Breast cancer; Ancestry; Ancestry informative markers; Hereditary cancer
O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais frequente no mundo e o mais comum entre as mulheres.
Dados epidemiológicos mostram que as mulheres brancas apresentam maior risco de desenvolver câncer de
mama em comparação a mulheres negras e hispânicas. Na Bahia, a proporção de afro-descendentes é de 77,5%, e
em Salvador a proporção de pardos e pretos é de 79,8%, segundo IBGE, 2000. O objetivo deste estudo foi estimar
a ancestralidade de pacientes com câncer de mama e/ou ovário, com história familiar positiva, atendidas no
Ambulatório de Oncogenética do Hospital Universitário Professor Edgar Santos (HUPES-UFBA) e verificar a
existência de associação com ancestralidade européia. A amostra analisada foi composta por 86 pacientes. Todas
foram avaliadas pelo geneticista clínico, pelo psicólogo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.
Foram obtidas informações sobre a origem dos ancestrais de todas as pacientes (ancestralidade referida). O
DNA genômico, foi extraído de sangue periférico, utilizando o Gentra Blood Kit® segundo as recomendações do
fabricante. Foram genotipados sete marcadores informativos de ancestralidade (AIMs): AT3, APO, Sb19.3, PV92,
CKMM, FYnull e LPL, por PCR convencional e PCR em tempo real. A estimativa da ancestralidade genômica foi
avaliada utilizando o programa ADMIX. A média de idade ao diagnóstico de câncer, nesta amostra, foi de 41,5
anos. Quanto à ancestralidade referida, 49% das pacientes informaram origem latino-americana (ancestrais
conhecidos nascidos em países da América Latina), 38% origem européia e 5,5% origem africana. Em relação à
ancestralidade genômica os resultados encontrados foram 71,1% de contribuição européia, 22,6% africana e 6,4%
ameríndia. O grupo que referiu ancestralidade latino-americana (49%), conhecia apenas o local de nascimento
dos pais e avós, mas não a origem ancestral, portanto os indivíduos que compõem este grupo podem ter
ancestrais europeus, africanos ou ameríndios, não referidos pelos mesmos por desconhecimento. Isto explicaria
as diferenças observadas entre os resultados obtidos para ancestralidade referida quando comparado com os da
ancestralidade genômica. Os dados da ancestralidade genômica revelam alta contribuição européia, concordante
com os dados epidemiológicos que mostram que o câncer de mama é mais prevalente em mulheres brancas.
Entretanto são discordantes dos achados prévios para ancestralidade genômica na população da Bahia, onde
a contribuição africana observada foi maior (47%), quando comparada com a contribuição européia (37%) e
ameríndia (16%). Embora a população da Bahia apresente grande contribuição africana, as pacientes com alto
risco para HBOC apresentaram maior contribuição ancestral européia, corroborando os achados epidemiológicos.
Apoio financeiro: CNPq; FAPEX; FINEP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
60
TNFa polymorphism frequencies in HPV-associated
cervical dysplasia in women with squamous
intraepithelial lesions
Maia, MMD1; Lima Júnior, SF1; Fernandes, MCM1; Heráclio, SA2; Amorim, MMR2; Souza, PRE1
1
2
Departamento de Biologia –Genética/UFRPE;
IMIP-PE
Keywords: Polimorfismo, HPV, Displasia Cervical, TNFALFA, Cancer
Some estimates indicate that several groups of viruses, including Human Papilomavirus are associated to human
cancer and it was proved that cervical cancer is the best example of how a viral infection may progress to cancer.
Cervical cancer is initiated by high-risk human papillomaviruses (such as HPV16 and HPV18) but an immune
response may control the progression of this disease. Tumor necrosis factor-a (TNFa) is a pro-inflammatory cytokine
that has been implicated in several cancers. The aim of this study was evaluate the association between the TNFa
promoter polymorphism and the risk for cervical dysplasia. The group was composed by 110 women of Recife-PE
presenting squamous intraepithelial lesions (SIL). The positively to HPV was based in the technique of Nested PCR
using friestly universal primers MY09 and MY11 followed by second reaction amplification with interns primers
GP5 and GP6. The genotyping for the human cytokines TNFa, was analyzed by PCR–RFLP technique. The HardyWeinberg equilibrium was used to verify whether the observed allelic and genotypic frequencies were according with
the expected in the studied population. The results for TNF analysis shown that the genotypic frequencies observed
in the group of NIC I patients was 16.7% (AA), 56.7% (AG) and 26.7% (GG). In the NIC II/III group, the frequency
genotypic was found 15.7% (AA), 61.4% (AG) and 22.8% (GG). However, there were not significant differences
between analyzed groups (p= 0.0985). In conclusion, ours results suggest that the presence of -308 allele wasn’t
conferred susceptibility to progression of this disease. However, these results need to be replicated in larger series.
This study was supported by CNPq and Departamento of Biologia/ UFRPE
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
61
Avaliação funcional de variantes do tipo missense
de BRCA1: aperfeiçoamento do ensaio de ativação
transcricional
De Gregoris, G1,2; Abreu, RBV1,2; Mesquita, RD2; Monteiro, ANA3; Carvalho, MA1,2
Divisão de Farmacologia, Instituto Nacional de Câncer – INCA; 2Instituto Federal do Rio de Janeiro – IFRJ; 3H. Lee Moffit Cancer Center &
Research Institute, Tampa, Flórida
[email protected]
1
Palavras-chave: BRCA1; câncer; variantes missense; transativação transcricional.
Introdução. O câncer de mama constitui um problema de saúde pública para o Brasil, sendo a principal causa
de mortalidade por câncer em mulheres no país. As neoplasias da mama podem ser esporádicas ou hereditárias,
sendo que a maioria dos casos hereditários está associada a mutações nos genes BRCA1 e BRCA2. BRCA1 atua
em mecanismos de transcrição, no controle do ciclo celular e na resposta ao dano de DNA. O aconselhamento
genético baseado na detecção de mutações em BRCA1 pode auxiliar indivíduos afetados a adotarem procedimentos
preventivos. No entanto, existe ainda grande impasse quanto à associação de variantes a malignidade. Os estudos
funcionais das proteínas variantes constituem uma estratégia que permite, em parte, contornar essa limitação.
A avaliação da capacidade de ativação transcricional (TA) de BRCA1 já foi validada por nosso grupo como um
sistema confiável para classificação de variantes restritos à região dos exons 13 a 24 (aminoácidos 1395 a 1863 da
proteína) – BRCA1 13/24. O ensaio correlaciona a capacidade TA e a integridade estrutural da região C-terminal
da proteína, essencial para sua função supressora de tumor. Objetivo. Validar o modelo de ensaio funcional TA a
uma porção estendida da proteína de estudo, compreendendo o final do exon 11 ao exon 24 (aminoácidos 1315
a 1863) – BRCA1 11/24. Determinar a funcionalidade de variantes missense naturais não-classificados (UCV) de
BRCA1 situados na nova região de estudo. Metodologia. Os mutantes foram gerados por mutagênese sítio-dirigida
e adequadamente clonados em vetores para expressão em leveduras (S. cerevisiae) e células animais (HEK293T).
BRCA1 fusionado a um domínio heterólogo de ligação ao DNA pode induzir a transcrição de um gene repórter,
se estabelecendo uma relação com a funcionalidade da proteína. Para validação do método realizou-se o ensaio
com variantes naturais de comportamento conhecido, já descritos na literatura, tanto em construções de BRCA1
13/24 como em BRCA1 11/24, além de variantes não-naturais de comportamento preditivo situados na região de
extensão do modelo (aminoácidos 1315-1395). A avaliação do comportamento de UCVs selecionados para o estudo
foi conduzido em paralelo aos controles naturais no contexto BRCA1 11/24. Resultados. No ensaio, a atividade dos
variantes controles no contexto BRCA1 11/24 se mostrou equivalente ao contexto BRCA1 13/24. Além disso, o
comportamento dos variantes não-naturais avaliados até o momento sugere a condição predita, validando o método.
A avaliação da atividade dos UCVs e predição de seus perfis (neutro/deletério) está em andamento. Conclusão. O
ensaio TA de BRCA1 tem se mostrado um modelo confiável de predição do comportamento de UCVs, inclusive
em sítios mais distais à região C-terminal, mas ainda requer melhor análise. Este modelo pode ser tido como uma
ferramenta de apoio à avaliação de risco ao câncer, em conjunto a outros modelos de análise in silico e clínicos.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERJ, IFRJ e INCA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
62
Análise de expressão da proteína DNA polimerase eta
em células primárias
Lerner, LK1; Soltys, DT1; Francisco, G 2; Chammas, R2; Menck, CFM1
Laboratório de Reparo do DNA, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
Laboratório de Oncologia Experimental , Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Xeroderma Pigmentosum, XP-V, Polimerase eta, luz UV, Reparo por Excisão de Nucleotídeos
Xeroderma Pigmentosum (XP) é uma doença autossômica recessiva rara, descrita em 1874. Os principais sintomas
são sensibilidade à luz solar, fotofobia, alterações na pigmentação da pele e subseqüente desenvolvimento de
neoplasias nas áreas expostas. As anormalidades cutâneas dos pacientes XP são causadas pela deficiência no reparo
das lesões induzidas pela luz ultravioleta (UV), principalmente dímeros de pirimidina (CPDs) e (6,4)-fotoprodutos
(6,4-PPs). Os pacientes XP apresentam mutações em genes participantes do reparo dessas lesões, a via de Reparo por
Excisão de Nucleotídeos (NER); assim, eles podem ser associados a sete grupos de complementação, com mutações
nos genes XP-A a XP-G. Mutações no gene codificante para a polimerase POLH estão associadas à forma variante
de XP (XP-V), uma vez que esses pacientes não apresentam deficiência em NER. Os pacientes XPV representam
20% dos XPs, e apresentam sintomas mais brandos, assim como aparecimento mais tardio de neoplasias. POLH
pertence à família Y de polimerases translesão; essa enzima apresenta menor fidelidade na síntese de DNA íntegro,
porém replica fielmente DNA danificado por luz UV, devido à sua capacidade de inserir nucleotídeos corretos na
presença de CPDs, reduzindo os efeitos mutagênicos da luz UV. Neste trabalho apresentamos a caracterização
molecular, através de ensaios funcionais, de uma cultura primaria de fibroblastos de um paciente de Minas Gerais,
estabelecida através de uma biópsia de pele não-exposta. A biópsia foi enviada ao laboratório para confirmação do
diagnóstico da dermatologista. Os sintomas cutâneos brandos, assim como a ausência de sintomas neurológicos,
levaram a suspeita do paciente pertencer ao grupo XP-V. Experimentos de sobrevivência celular, através de
ensaios de XTT, após irradiação das células com 0, 10 e 20 J/m2 UVC, mostraram um aumento da sensibilidade
das células do paciente, quando comparada com fibroblastos normais (FHN). Ensaios subseqüentes associando
luz UVC com cafeína (1 mM) mostraram um maior aumento na sensibilidade. Ensaios de Western Blot (WB)
para a proteína XPV indicaram uma ausência completa da proteína no paciente. Esses resultados preliminares
indicam que esse paciente pertença ao grupo XP-V; para confirmação do diagnóstico, serão realizados ensaios
de Unscheduled DNA Synthesis (UDS) e seqüenciamento do gene XPV. Os ensaios de WB também indicaram uma
possível indução da proteína XPV em células normais (FHN) e deficientes em NER (AS440, XP-G) após 5 e 24
horas de irradiação com doses equitóxicas de UVC. Além disso, ensaios com linhagens de melanoma selvagens
(SK-Mel 37) e mutadas (SK-Mel 28)em p53, 8 e 24 horas após tratamento com cisplatina (12,5 mM) e UVB (120 J/
m2) , indicam que a indução possa ser mediada por p53, uma vez que ela não ocorre nas células mutadas. Esses
resultados são preliminares e novos ensaios com outras linhagens celulares serão feitos para confirmação dos dados.
Apoio financeiro: Fapesp, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
63
Expressão e processamento alternativo do RNAm do
gene NLRP12 em pacientes de pênfigo e em indivídos
não afetados
Piovezan, BZ1; Malheiros, DF1; Petzl-Erler, ML1
Laboratório de Genética Molecular Humana, Setor de Ciências Biológicas, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná
[email protected]
1
Palavras-chave: processamento alternativo, NLRP12, pênfigo.
Os membros da família gênica NLR, como NLRP12, aparentemente atuam de maneira semelhante no organismo.
Seus produtos pertencem a um conjunto de moléculas conhecidas como receptores de reconhecimento de
patógenos, as quais participam da modulação das respostas imunes. Os receptores NLR são capazes de detectar
estruturas moleculares derivadas de microrganismos como, por exemplo, lipopolissacarídeos ou peptidoglicanas
e, de, induzir uma série de moléculas coestimuladoras e respostas fisiológicas. Já foram caracterizados cinco
transcritos do gene NLRP12. Quatro deles variam quanto ao número de repetições dos domínios ricos em
leucina (pelo número de repetições, formas R3, R4, R5 e R6) e um (aqui chamado de C) quanto ao início de
transcrição. Entretanto, as funções desse gene e o significado de suas isoformas são pouco compreendidos. Para
a caracterização dos diferentes transcritos do gene NLRP12 foi extraído o RNA de células mononucleares de
sangue periférico (PBMC) e de linfócitos T CD4+ circulantes de pacientes de pênfigo foliáceo e vulgar, doenças
autoimunes da epiderme (PBMC, n=22; T CD4+, n=27), e de indivíduos livres de doença (PBMC, n=62; T CD4+,
n=9). Foi realizada a retrotranscrição, seguida de amplificação por PCR com oligonucleotídeos iniciadores
que hibridam em regiões compartilhadas que flanqueiam a porção variável entre transcritos. Desse modo,
os fragmentos resultantes têm comprimentos que diferem conforme o transcrito presente, permitindo sua
identificação. Após amplificação, os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% e
corados com brometo de etídio para posterior visualização. Todos os transcritos foram encontrados em amostras
de PBMC tanto de pacientes como de indivíduos não afetados. Pouca diferença foi observada entre indivíduos
quanto aos transcritos presentes. As isoformas R3, R4, R5, e R6 estão presentes em todos os indivíduos, sendo
que apenas o transcrito C não esteve sempre presente. Em linfócitos T CD4+, 6 de 27 pacientes e 3 de 9 indivíduos
não afetados não apresentaram qualquer expressão aparente de NLRP12. Os demais pacientes apresentaram de
um a quatro transcritos e, mesmo considerando apenas os indivíduos com expressão de NLRP12, nenhum deles
esteve sempre presente. Já entre os não afetados a isoforma C não foi encontrada e R6 esteve sempre presente
nos indivíduos em que RNAm de NLRP12 foi detectado. Essa variação entre indivíduos sugere que a transcrição
e o processamento desse gene são regulados de forma sensível e que as diferentes isoformas são necessárias em
momentos distintos. Ainda podemos supor que essa variação seja causada, ao menos em parte, pela presença
de subpopulações de células T CD4+ que se encontram em diferentes estágios de diferenciação e/ou atividade.
Por outro lado, a aparente homogeneidade observada em PBMC pode ser explicada pela heterogeneidade desse
conjunto de células. Trata-se de um estudo pioneiro e outros deverão seguir para compreensão desse quadro.
Apoio financeiro: CNPq, Fundação Araucária
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
64
Transcrito alternativo de RECK é regulado
negativamente por quercetina em células de glioma
humano U373MG
Amstalden, HG1; Sene, RV2; Jacomasso, T1; Kenski, JCN1; Valdameri, G1; Lima, MT3; Sogayar, MC3; Martinez, GR1; Winnischofer, SMB1
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular – Universidade Federal do Paraná
Departamento de Genética – Universidade Federal do Paraná. 3Departamento de Bioquímica – Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: RECK, MMPs, TIMPs, Quercetina, glioma.
O processo invasivo é uma característica importante de diversas neoplasias malignas, relacionado diretamente
com o prognóstico dos pacientes. O estabelecimento da invasão celular inclui a capacidade das células em
remodelar o espaço extracelular. Os gliomas possuem essa característica, e devido à complexidade anatômica
desse tecido a média de sobrevida para pacientes com o grau mais agressivo desse tipo de tumor (grau IV) é de 12
– 15 meses. A invasividade, em geral, é facilitada pela ação das metaloproteases de matriz (MMPs), que degradam
a matriz extracelular, favorecendo a invasão. Entre os elementos que podem regular a atividade de MMPs está
RECK, uma glicoproteína ancorada à membrana celular. A quercetina, um flavonóide de ocorrência natural
na dieta, possui a propriedade de inibir a atividade de MMPs, e desta forma tem potencial para a terapêutica
anti-tumoral ou ação quimioprotetora. Neste trabalho foi avaliado o efeito da quercetina em células de glioma
humano (U373MG) em relação aos níveis de RNAm de RECK (e seus transcritos alternativos de splicing), MMPs
e TIMPs e aos processos de viabilidade, proliferação e morte celular. Foi verificado (por coloração com cristal
violeta e análises de citometria de fluxo) que o tratamento das células U373MG com quercetina promoveu a
diminuição da proliferação celular de maneira dose e tempo dependentes. Especificamente, o tratamento destas
células com 50 µmol/L de quercetina por 48h promoveu um aumento do número de células na fase G1 do ciclo
celular e diminuição de células na fase G2-M (p<0,001), com concomitante aumento de células em apoptose
(p<0,01). A análise dos perfis de expressão gênica foi investigada através de ensaios de PCR quantitativo em
Tempo Real. Os resultados indicaram que o tratamento com quercetina levou a uma diminuição na expressão
do transcrito alternativo de RECK (RECK-B) (p=0,0259) e uma tendência de aumento dos níveis de RNAm de
RECK-A ( forma canônica). MMP-2 teve sua expressão diminuída (p=0,044) e uma tendência de diminuição de
MMP-9 e MT1-MMP. Em relação às TIMPs, ocorreu um aumento da expressão para o tipo 1 (p=0,076) e uma
tendência de aumento para o tipo 2. Em conjunto, nossos resultados indicam que o tratamento com quercetina
é capaz de reduzir a proliferação de células U373MG, levando à parada de ciclo celular em G1 e indução de
morte por apoptose, e sugerem que o gene RECK e seus transcritos alternativos possam ser alvos moleculares
importantes modulados por quercetina capaz de contribuir para os efeitos benéficos deste flavonóide.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, Fundação Araucária, INCT Redoxoma
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
65
Expressão de gama-sinucleína e seu papel na
progressão do melanoma
Monteiro, AC; Souza, CF; Jasiulionis, MG
Laboratório Multidisciplinar de Ontogenia e Epigenética, Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Epigenética, Melanoma, Gama-sinucleína.
Introdução: Epigenética é definida como padrões de expressão gênica transmitidos que não incluem alterações na
sequência de nucleotídios do DNA. Um dos eventos de regulação epigenética mais bem estudados é a metilação do
DNA, sendo que vários trabalhos mostram que padrões aberrantes dessa metilação estão relacionados com diversas
patologias, como o câncer. É sabido que o promotor do gene γ-sinucleína humana (SNCG) apresenta metilação
reduzida em diversos tipos tumorais associado a sua superexpressão. Estudos mostraram que essa superexpressão
de γ-sinucleína é encontrada principalmente em estágios avançados dos tumores e está fortemente relacionada
com indução da proliferação celular, aumento na mobilidade celular, aumento de invasão e metástase. Assim,
essa proteína apresenta-se como potencial alvo terapêutico como biomarcador de agressividade. Um dos cânceres
agressivos de alta incidência mundial e que possui poucos tratamentos eficientes disponíveis no momento é o
melanoma. O melanoma metastático é muito agressivo e resulta na mortalidade de 90% dos pacientes. Porém não
há até o momento estudos sobre a expressão de γ-sinucleína e perfil de metilação de seu promotor em melanomas.
Objetivos: Determinar possíveis alterações na expressão e perfil de metilação de γ-sinucleína ao longo da gênese do
melanoma e seu possível papel no fenótipo maligno. Métodos: Foram utilizadas as linhagens de melanócitos murinos,
melan-a, de melanócito pré-maligno, 4C, de melanoma não metastático, 4C11- e de melanoma metastático, 4C11+.
As amostras de RNA das linhagens foram extraídas pelo método Trizol e, após sua conversão em cDNA, foram
utilizadas em reações de RT-PCR em Tempo Real. A migração celular foi avaliada pelo ensaio de cicatrização em
monocamadas confluentes. Resultados: A expressão de γ-sinucleína está significativamente aumentada (p<0.05)
em amostras de melanoma, principalmente metastático, em comparação com amostras de melanócitos não
tumorigênicos e pré-malignos. O tratamento com 5-aza-2’-desoxicitidina (Aza), um agente desmetilante e tricostatina
A (TSA), um inibidor de desacetilases de histonas causou a re-expressão de SNCG em todas as linhagens, mas de
forma mais significativa nas linhagens pré-maligna e tumorigênica não metastática. As linhagens tumorigênicas
mostraram grande aumento da capacidade de migração em relação às demais linhagens, sendo a 4C11+ ainda
mais migratória. Conclusões: A elevada expressão de γ-sinucleína em células de melanoma correlaciona com
fenótipo migratório, metastático e altamente proliferativo (in vitro e in vivo) e pode ser considerada um potencial
biomarcador de agressividade deste tipo de tumor. Além disso, a utilização de drogas epigenéticas no tratamento de
tumores deve considerar a possibilidade de indução da expressão de genes pró-metastáticos, como a γ-sinucleína.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
66
Análise da expressão gênica do Fator de Elongação
(EF1A) em amostras de tecidos de pacientes com
câncer de próstata e hiperplasia prostática benigna
Alves, PT1; Araújo, TG1; Neves, AF2; Marangoni, K1; Goulart, LR1; Ueira-Vieira, C1
Laboratório de Nanobiotecnologia, Instituto de Genética e Bioquímica – Universidade Federal de Uberlândia - MG
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás – GO
[email protected]
1
2
Palavras-chave: EF1A, câncer de próstata, hiperplasia benigna prostática, PCR-tempo real, expressão gênica.
O Câncer de Próstata (CaP) tem emergido como uma das principais causas de morte entre homens mais velhos e
sua etiologia permanece obscura com tumores variando desde a forma indolente, com baixas taxas de evolução,
para formas extremamente agressivas, com rápidas taxas de crescimento. O retardo no diagnóstico tem favorecido
a ocorrência de tumores com alta capacidade de invasão local e disseminação tornando-se necessários esforços
destinados ao melhor entendimento dos complexos mecanismos moleculares envolvidos na ontogênese e
progressão da doença. Mudanças na expressão do Fator de Elongação 1A(EF1A), uma proteína nucleotídica
que liga GTP e tRNA aminoacil têm sido relacionadas a fenótipos transformados, inclusive na carcinogênese. O
presente estudo objetivou analisar a expressão do gene EF1A e sua relação com o adenocarcima prostático. Foi
extraído o RNA total de 38 tecidos de pacientes com CaP e 14 de pacientes com HPB. As médias de idade dos
indivíduos com CaP e HPB foram de 65 e 68 anos, respectivamente. A expressão dos genes EF1A e do endógeno
B2M foram calculadas por RT-PCR quantitativa em tempo-real utilizando Syber Green. Os níveis transcricionais
do gene alvo, normalizados com a expressão do endógeno através da fórmula 2-∆∆Ct, foram comparados entre
pacientes com câncer e hiperplasia com posterior correlação com os dados clinico patológicos. Para o controle
endógeno não houve diferenças estatisticamente significativas entre os Cts (cycle threshold) das amostras de
pacientes com câncer de próstata e hiperplasia prostática benigna, o que corrobora sua utilização como controle
endógeno de reação. Foi observada diferença significativa na expressão relativa desse gene entre os tecidos
acometidos e os não acometidos pela doença. A média dos níveis relativos dos transcritos de EF1A foi 1.56 vezes
maior no câncer do que na doença benigna apresentando uma chance de ocorrência da doença 6 vezes maior em
pacientes com níveis de expressão ≥1.0 (p<0.05). Foi verificada uma baixa, porém significativa correlação (p<0.05)
entre os dados de expressão e a idade dos pacientes com CaP. Não houve correlação entre os resultados obtidos
e os dados histopatológicos ou entre os resultados e os valores de PSA. Conclusões: A maior expressão do gene
EF1A em amostras com CaP evidencia sua correlação com a gênese da doença, uma vez que o fator de elongação
encontra-se envolvido na organização do citoesqueleto e fuso mitótico. Portanto, novos estudos são necessário
para melhor elucidar o real impacto dessa molécula no surgimento do CaP e na evolução metastática da doença.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
67
Perfil da expressão dos genes MMP9 e seu regulador
TIMP1 no Câncer de Próstata
Reis, ST*¹; Pontes Jr., J¹; de Sousa-Canavez, JM²; Antunes, AA¹; Viana, NI¹; Timoszczuk, LMS¹; Dall’Oglio,
MF¹; Srougi, M¹; Leite, KRM¹
1 - Laboratório de Investigação Médica da Disciplina de Urologia – LIM 55, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
2 - Genoa Biotecnologia, São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Câncer de próstata, Metaloproteinases da Matriz, Marcadores moleculares, Diagnóstico, Prognóstico
Introdução: O câncer de próstata (CaP) é o tumor mais freqüente do homem no Brasil. As ferramentas disponíveis
para o diagnóstico e prognóstico do CaP não são eficazes, portanto a busca de novos marcadores é crucial. As
Metaloproteinases da matriz (MMP) são enzimas proteolíticas, e já foram associadas com neoplasias, são classificadas
de acordo com critérios estruturais e funcionais, sendo as mais estudadas as gelatinases que compreendem MMP2
e MMP9. Todas as MMP são inibidas por proteínas, denominadas inibidores tissulares de MMP (TIMP). TIMP1
inibe especificamente a MMP9 e o objetivo deste trabalho é avaliar a expressão dos genes da MMP9 e TIMP1 e
correlacionar com o diagnóstico e fatores prognósticos do CaP. Material e Métodos: Foram analisadas amostras
de 66 pacientes com CaP e 11 pacientes com HPB utilizadas como controle. O RNA total foi extraído com uso do
kit Aqueous®, e o cDNA sintetizado para análise da expressão quantitativa do mRNA através de PCR em tempo
real, utilizando sonda TaqMan®. Utilizamos o método DDCT para calcular a expressão dos 2 genes alvo nos tecidos
tumorais em relação a HPB. A mudança na expressão gênica em vezes foi calculada como 2-ΔΔCT. Resultados: O gene
da MMP9 se mostrou superexpresso em 54 (81,8%) casos e o TIMP1 se mostrou subexpresso em 47 (71,2%) casos. A
expressão mediana de MMP9 e TIMP1 foi 4,6 x 100 e 7,4 x 10-1, respectivamente. A diferença de expressão entre os dois
genes apresentou significância estatística (p<0,0001). Considerando os fatores prognóstico, a expressão de MMP9
foi associada com PSA pré operatório >10 (p=0,03), podendo ser um marcador de pior prognóstico no CaP. Além
disso, quando avaliamos a recidiva bioquímica dos pacientes, a média de expressão de MMP9 nos pacientes que
recidivaram foi de 12,6x, enquanto que os pacientes que não recidivaram a média de expressão foi de 5,6x (p=0,09).
Conclusão: Demonstramos que no CaP o gene da MMP9 está superexpresso e o seu regulador principal TIMP1
está subexpresso na maioria dos casos, sugerindo que estes genes são potenciais marcadores para diagnóstico
desta neoplasia. Além disso, demonstramos uma correlação da expressão do gene da MMP9 com pacientes
que apresentavam PSA≥10 e recidiva bioquímica, sendo este gene um potencial marcador de pior prognóstico
podendo ser também uma ferramenta importante para identificar pacientes susceptíveis a recidiva bioquímica.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
68
Associação entre o polimorfismo R497K do gene EGFR
e variáveis histopatológicas em câncer de mama
Leite, MS1,2; Vianna-Jorge, R1,2
1 - Programa de Pós-graduação em Farmacologia e Química Medicinal – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio
de Janeiro
2 - Grupo de Farmacologia Clínica e Assistência Farmacêutica - Centro de Pesquisa, Instituto Nacional do Câncer
[email protected]
Palavras-chave: Polimorfismos genéticos, EGFR, câncer de mama, perfil histopatológico, prognóstico.
O câncer de mama é o mais freqüente entre as mulheres, correspondendo a 20% dos casos novos de câncer no
Brasil. Nos estádios mais avançados, o tratamento tende a ser mais agressivo, aumentando, assim, o risco de
complicações. Polimorfismos genéticos em processos fisiológicos podem contribuir para a variabilidade no
desenvolvimento e na progressão da doença, bem como na resposta clínica ao tratamento antineoplásico. O
Receptor do Fator de Crescimento Epidermal (EGFR) tem papel crucial na proliferação tumoral, diferenciação e
motilidade de células normais e tumorais. O polimorfismo R497K, Arg497Lys (rs rs11543848) do gene EGFR parece
contribuir para diminuição da fosforilação e da ativação deste receptor e está associado a melhor prognóstico em
carcinoma colorretal (menor envolvimento linfonodal, menor ocorrência de metástases) e em câncer avançado
de pulmão (melhor sobrevida). O presente estudo tem como objetivo avaliar a ocorrência de associação entre
o polimorfismo R497K e variáveis histopatológicas com valor prognóstico em câncer de mama. A população do
estudo foi composta de uma coorte prospectiva de mulheres com câncer de mama em acompanhamento clínico
no HC3/INCA (N = 153; CEP-INCA #129/08). Foi realizado um estudo transversal para caracterização do perfil
histopatológico dos tumores no momento do diagnóstico e as variáveis analisadas foram: tipo histológico (ductal
ou lobular; invasivo ou in-situ), grau histológico (1-bem diferenciado, 2-moderadamente diferenciado, 3-pouco
diferenciado), tamanho do tumor (com base na maior dimensão), número de linfonodos axilares acometidos,
status de expressão (positivo ou negativo) de receptores hormonais (estrogênio e progesterona) e status de
expressão (positivo ou negativo) de HER-2. Os dados foram obtidos a partir dos prontuários eletrônicos. Amostras
de DNA foram extraídas de sangue periférico e analisadas por técnicas de biologia molecular (reação em cadeia
da polimerase e digestão por enzima de restrição) para caracterização genotípica do polimorfismo de interesse. A
freqüência do alelo variante Lys foi de 0,196 (IC95%= 0,1553 – 0,2444 ), com a distribuição genotípica em equilíbrio
de Hardy-Weinberg (p = 0,334). Foi observada uma associação negativa entre a presença do alelo variante Lys e o
status HER-2 positivo (OR = 0,253 e IC95% = 0,080 - 0,806 p = 0,016). Os resultados parciais sugerem que a presença
do polimorfismo R497K possa estar associada a um prognóstico favorável quanto à evolução do câncer de mama.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERJ, CAPES, FAF, INCA-MS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
69
Avaliação de Sobrevida e expressão de c-erbB-2 em
pacientes com câncer de mama
Ferreira, FA1a; Stival, RA1b; Paganini, J1a; Neto Filho, JL1b; Mühlbeier, DFM1c; Caixeta, GN2,3; Silva, RC1a,2;
Paula, EC2; Saddi, VA1ac,2; Ayres, FM1a,3,4
Pontifícia Universidade Católica de Goiás – aMestrado em Genética, bDepartamento de Medicina e cDepartamento de Biomedicina
Associação de Combate ao Câncer em Goiás – Hospital Araújo Jorge – Setor de Anatomia Patológica
3
Universidade Federal de Goiás – Programa de Pós-Graduação em Biologia
4
Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: imuno-histoquímica, fator prognóstico, HER-2/neu, carcinoma, metástase.
O câncer de mama é o segundo tipo mais freqüente de câncer no mundo e o mais comum entre mulheres,
respondendo por 22% dos casos novos ao ano. Esses tumores são heterogêneos quanto a evolução e resposta
terapêutica. A terapia é norteada por fatores prognósticos e preditivos, sendo a expressão da proteína c-erbB-2 um
fator auxiliar de pior prognóstico. Neste estudo, prontuários de 287 pacientes do sexo feminino com carcinoma
de mama atendidas no Hospital Araújo Jorge (Associação de Combate ao Câncer em Goiás), entre 1979 e 2002,
tiveram os dados coletados e tabulados juntamente com os dados de marcação por imuno-histoquímica para
detecção da proteína c-erbB-2. A média de idade das pacientes foi 53 anos, variando de 23 a 90 anos. Os tipos
histológicos identificados incluíram os carcinomas in situ (0,3%), mucinoso (0,7%), medular (1%), lobular (5,6%),
ductal infiltrante (89%) e outros/sem descrição (3,4%). Os estadiamentos clínicos foram relatados como zero (1%),
I (10%), II (48%), III (22%), IV (5,6%) e não descritos (13,4%). O grau de anaplasia foi classificado como I (4%), II (5%),
III (65%), IV (18%) ou não teve classificação relatada (8%). A expressão c-erbB-2 foi considerada positiva em 47 (16%)
casos, sendo que dois casos foram inconclusivos. A sobrevida, após cinco anos de seguimento, foi de 51% para as
pacientes que não apresentaram expressão da proteína no tecido tumoral analisado e de 63% para as pacientes sem
expressão. Quando agrupadas por estadiamento e detecção de c-erbB-2, as taxas de sobrevida variaram de 100 a
38% para pacientes com estadiamentos I a III. Na ausência de expressão da proteína, as taxas de sobrevida variaram
de 58 a 36% também nos estadiamentos I a III. Entre pacientes com estadiamento IV, caracterizado por metástase
a distância, a taxa de sobrevida foi zero para casos c-erbB-2 positivos e 42% para os casos c-erbB-2 negativos.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás, PUC-GO, UEG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
70
Avaliação da resposta celular à doxorrubicina, pela
expressão das enzimas GSH-px e GSTpi, em cultura
celular primária de carcinoma mamário
Jardim, BV1,2; Leonel, C1,2; Moschetta, MG2; Castro, R2; Gelaleti, GB1,2; Regiani, VR2; Zuccari, DAPC1,2
Programa de Pós-Graduação em Genética – IBILCE – UNESP campus de São José do Rio Preto
Centro de Estudos no Prognóstico do Câncer - CEPC – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: quimioterapia, GSH-Px, GSTpi, câncer de mama, cultura celular.
A resistência à quimioterapia é um grande obstáculo na eficiência ao tratamento de pacientes com câncer de
mama. A expressão de marcadores específicos se aplica à elucidação dos mecanismos de resposta às drogas.
Entre os mecanismos envolvidos na resistência, destacam-se enzimas responsáveis pelo estado redox da célula.
A Glutationa Peroxidase (GSH-Px) reduz moléculas de H2O2 pela oxidação da Glutationa (GSH). As Glutationa S
transferases (GSTs) são uma família de enzimas intracelulares responsáveis pela eliminação de toxinas. Considerase que a superexpressão dessas enzimas aumente a capacidade antioxidante, garantindo às células tumorais,
resistência aos quimioterápicos e vantagem proliferativa sobre as células do tecido sadio. Assim, avaliou-se a
expressão da GSH-Px e GSTpi em resposta à agressão pela doxorrubicina em 11 tumores mamários cultivados
in vitro. As células obtidas de mulheres atendidas no Hospital de Base da FAMERP/SJRP foram cultivadas em
meio RPMI 1640 e expostas a 34µL de cloridrato de doxorrubicina 50 mg. A expressão gênica foi determinada
antes e após a exposição ao quimioterápico. A origem epitelial foi comprovada imunohistoquimicamente pelos
anticorpos anti-citoqueratina (Dako, 1:150) e anti-vimentina (Dako, 1:100). As reações de PCR foram realizadas
utilizando o aparelho PCR Real-Time 7500 (Applied Biosystems). As análises dos resultados foram realizadas
utilizando o método 2Ct, onde o Ct é a diferença entre o cycle threshold das amostras de interesse e dos
controles endógenos (genes HPRT1 e LOC) e
Ct é a diferença entre a média das amostras de interesse e das
amostras calibradoras. A curva de crescimento foi confeccionada para as células tumorais e amostras-controle. O
gene GST-pi mostrou-se subexpresso em 63% das amostras quando comparado à sua expressão antes da exposição
ao quimioterápico. Estudos realizados in vitro mostraram que a presença dessa enzima em células mamárias
neoplásicas pode promover a eliminação do quimioterápico, levando à diminuição da eficácia desta modalidade
terapêutica. Sendo assim sua baixa expressão pode ser sinal de efetividade da droga utilizada. Ao contrário, o gene
GSH-Px apresentou alta expressão após a agressão com o quimioterápico em 82% das amostras. Considerando
seu perfil protetor, a superexpressão da GSH-Px mostrou a atividade antioxidante imprimida pós agressão pelo
quimioterápico o que se traduz pela tentativa de resistência das células alvo. A avaliação conjunta destes com
outros marcadores pode identificar a melhor conduta qumioterápica pois esta terapia, além de não obter a
resposta esperada, pode induzir à alteração da expressão gênica nas células neoplásicas e com isso favorecer o
crescimento do tumor primário e das metástases. Sendo assim, a análise da expressão gênica pode evidenciar
as vias de resistência e com isso direcionar para uma melhor escolha terapêutica. Além disso, futuramente, será
possível alterar a expressão destes genes alvo para induzir uma resposta mais efetiva das células a este tratamento.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
71
O silenciamento de HJURP (Holliday Junction
Recognition Protein) causa parada no ciclo celular e
apoptose em células de glioblastoma em cultura
Valente, V1,3; Oba-Shinjo, SM2; Marie, SKN2; Paçó-LarsonM ML3; Carlotti Jr, CG1
Departamento de Cirurgia e Anatomia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Departamento de Neurologia, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo
3
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: glioblastoma, células T98G, HJURP, silenciamento gênico e apoptose.
Os gliomas malignos são os tumores primários mais comuns do sistema nervoso central. Estes tumores variam
bastante no grau de diferenciação e na malignidade, sendo classificados numa graduação de II a IV. Todos
eles, entretanto, apresentam um fenótipo inicial invasivo e uma alta resistência à radiação e a uma variedade
de drogas, o que compromete a eficácia dos tratamentos utilizados atualmente. Os glioblastomas multiformes
(GBMs) são os gliomas mais malignos e freqüentes, normalmente levando os pacientes à óbito em menos de
um ano após o diagnóstico. Através de RT-PCR quantitativo, demonstramos que HJURP (Holliday Junction
Recognition Protein), uma nova proteína que atua no reparo do DNA e também na formação da cromatina
centromérica, é altamente super expressa em gliomas de diferentes graus de malignidade. Vimos ainda que
os seus níveis de expressão são preditivos do prognóstico de sobrevida dos pacientes, pois aqueles indivíduos
acometidos com tumores que expressam menores níveis de HJURP têm maior chance de sobrevida superior a
18 meses. Através de experimentos de silenciamento de HJURP (transfecção com siRNAs) em células de GBM
em cultura (linhagem T98G), demonstramos que uma redução de cerca de 80-90% nos níveis de expressão desta
proteína ocasiona uma marcante parada no ciclo celular. Observamos que no terceiro dia após a transfecção
houve um aumento de aproximadamente 40% na quantidade de células nas fases G2-M. Demonstramos
também que as células silenciadas para HJURP não se recuperam desta interrupção no ciclo celular e entram
em processo de apoptose, apresentando uma marcação positiva para anexina quatro vezes maior do que as
células controle no quinto dia após a transfecção. Estes resultados suportam a hipótese de que HJURP poderia
ter um papel de proteção contra os efeitos deletérios de um nível excessivo de instabilidade genômica e apontam
seu potencial como alvo terapêutico para o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento para gliomas.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
72
Análise de expressão de genes alterados na
carcinogênese gástrica e em lesões precursoras
Duarte, MC1; Babeto, E1; Miyazaki, K2; Borim, AA2; Fracassi, MTM3; Rahal, P1; Silva, AE1
Departamento de Biologia, IBILCE/ UNESP, Campus de S. J. Rio Preto, SP
Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, SP
3
Laboratório de Patologia do Hospital Sírio-Libanês, São Paulo, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer gástrico, metaplasia intestinal, úlcera gástrica, expressão gênica, expressão protéica
Introdução: O desenvolvimento do câncer gástrico (CG) está associado a vários fatores genéticos e ambientais, e
geralmente é precedido por lesões pré-cancerosas como a metaplasia intestinal (MI) e a úlcera gástrica (UG). O
estudo de tais lesões pode auxiliar na compreensão do processo carcinogênico e assim contribuir para estratégias
de prevenção futuras. Objetivos: Considerando-se a ocorrência de mudanças nos padrões de expressão gênica
durante o processo carcinogênico avaliamos a expressão do RNAm e proteínas dos genes TERT, COX-2, NOS2, HGF,
MET e KRAS, em CG, MI e UG, comparadas com suas respectivas mucosas normais (MN). Material: A expressão
relativa do RNAm foi avaliada por PCR em tempo real e as proteínas por imuno-histoquímica em 22 amostras
de CG, 37 de MI e 30 de UG e respectivas MN. Resultados: Os níveis médios de RNAm foram aumentados em CG
comparado com MN para TERT (17,3x), COX-2 (27,6x), NOS2 (12,8x), HGF (1,8x), MET (3,5x) e KRAS (1,7x). A imunohistoquímica mostrou positividade (moderada/forte) em 54,5%, 81,8%, 30% e 70% das amostras de CG para TERT,
COX-2, NOS2 e KRAS, respectivamente. No grupo de MI, os níveis de expressão gênica não diferiram do grupo CG
para TERT (2x), NOS2 (13,6x), HGF (2,6x) e MET (2,8x), mas diferiu estatisticamente para a expressão de COX-2 (2,1x;
P=0,0290). A expressão das proteínas TERT, COX-2 e NOS2 foi positiva em 38,2%, 79,4% e 92,6% dos casos de MI,
respectivamente, enquanto para KRAS a expressão mostrou-se fraca/ausente em 100%dos casos. Os níveis de RNAm
em UG foram aumentados para TERT (2,7x), COX-2 (2,5x), NOS2 (4,5x), MET (2,8x) e KRAS (2,6x) e normal para HGF
(1,0x). Houve diferença estatística entre UG e CG apenas para o gene MET (P=0,0001). A análise protéica revelou
positividade em 39,1%, 26,1%, 61,5% e 38,5% das amostras de UG para TERT, COX-2, NOS2 e KRAS, respectivamente.
Conclusão: Considerando estes resultados, sugerimos que MI e UG compartilham alterações no padrão de
expressão gênica em comum com CG, evidenciada principalmente nos níveis de expressão gênica e protéica de
TERT, COX-2, NOS2, HGF e MET. Em úlcera, as alterações nos níveis de expressão gênica podem estar relacionadas
com atividades de proteção e reparação da mucosa danificada, pelos processos de proliferação e migração celular.
Contudo, não podendo desconsiderar a hipótese de iniciação do câncer gástrico a partir de UG, pois alterações de
expressão destes genes também estão associadas com os mesmos processos envolvidos na progressão maligna.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
73
Correlação do perfil de expressão das
metiltransferases EZH1 e EZH2 em linhagens de
câncer humano e linhagens não tumorais
Estrela, MS1; Sakamoto, LHT2; Pittella Silva, F1,3
Laboratório de Farmacologia Molecular. Faculdade de Ciências da Saúde. Universidade de Brasília
Secretaria de Estado de Saúde do Distrito Federal, Hospital de Apoio de Brasília, Núcleo de Genética
3
Faculdade de Ceilândia, Universidade de Brasília; Brasília, Distrito Federal, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer, epigenética, metiltransferases, EZH1, EZH2
O Brasil classifica-se entre os países com maior incidência de câncer de mama, o segundo tipo de câncer mais
freqüente no mundo e o mais comum entre as mulheres. O número de casos novos de câncer de mama esperados
para o Brasil, em 2010, será de 49.240. Este dado reflete a importância na investigação das alterações que levam
à carcinogênese na mama. Processos epigenéticos, como acetilação, metilação, ubiquitinização e fosforilação
estão relacionados com o padrão de expressão gênica observado nas células. A desregulação epigenética da
expressão gênica está emergindo como um mecanismo-chave para a tumorigênese. Enzimas metiltransferases
desempenham um papel epigenético importante neste padrão de expressão. Os genes EZH1 e EZH2 constituem
a família EZH - enhancer of zeste homolog (Drosophila), família de metiltransferases que metilam especificamente
resíduos de lisinas na extremidade de histonas, com um papel relacionado à repressão da transcrição gênica,
silenciando diferentes genes nos organismos. O gene EZH1 está localizado no cromossomo 17 (17q21.1-q21.3),
e é um componente do Polycomb Complexo Repressivo 2 (PRC2). O gene EZH2 está localizado no cromossomo
7 (7q35-q36) e codifica um membro da família Polycomb-group (PcG). Os genes EZH1 e EZH2 codificam
proteínas homônimas, que atuam na di e trimetilação da lisina 27 da histona H3. Estas proteínas possuem
dois domínios conservados: o domínio SET e o domínio EZH2_WD-Binding. O domínio SET é responsável pela
interação proteína-proteína e pela atividade enzimática de metiltransferase. O domínio EZH2_WD-Binding é
um domínio de reconhecimento altamente conservado em eucariotos, e se liga ao domínio rico em repetições
de triptofano (W) e ácido aspártico (D) de EED. EED é um componente do complexo PRC2 que está envolvido
com a expressão gênica. Neste trabalho, portanto, investigamos o perfil de expressão das metiltransferases EZH1
e EZH2 em 10 diferentes linhagens celulares, dentre as quais duas pareadas provenientes de tecido tumoral e
sua contra-parte não tumoral de uma mesma paciente. Para as análises de expressão, cultivamos as linhagens,
extraímos o RNAtotal e sintetizamos o cDNA. Desenhamos primers e sondas específicas para a amplificação
dos genes de interesse e analisamos a expressão por PCR em tempo real e PCR semi-quantitativa. O gene EZH1
apresentou-se com expressão aumentada em 50% das linhagens em relação ao controle, enquanto o gene EZH2
apresentou-se super expresso em 70% das linhagens. Na amostra pareada da mesma paciente com câncer de
mama, EZH1 estava com expressão elevada, enquanto EZH2 estava downregulado na amostra cancerígena em
relação à normal. Estes resultados indicam a desregulação na expressão de tais genes em linhagens cancerígenas
e podem servir como plataforma para análise mais aprofundada em amostras clínicas no intuito de indicar
novos alvos marcadores moleculares e potenciais alvos para intervenção terapêutica no câncer de mama.
Apoio financeiro: CNPq, UnB, FINATEC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
74
Efeito da sincronização celular na análise do
transcriptoma de culturas celulares de pacientes
portadores de fissura lábio-palatina
Kobayashi, GS; Sunaga, DY; Bueno, DF; Cruz, LA; Ferreira, SG; Passos-Bueno, MR
Laboratório de Genética do Desenvolvimento
Centro de Estudos do Genoma Humano
Instituto de Biociências – USP
[email protected]
[email protected]
Palavras-chave: sincronização celular, fissura lábio-palatina, expressão gênica, microarray, células-tronco
A análise de perfil de expressão gênica possui grande potencial para ser utilizada no estudo de doenças complexas.
Com esta metodologia, é possível identificar padrões de co-expressão gênica e identificar vias biológicas associadas
à patogenia dessas doenças. Com o intuito de esclarecer tais aspectos relacionados à fissura lábio-palatina (FLP),
uma doença complexa e de alta relevânca dada a sua alta prevalência e morbidade, nosso grupo de pesquisa
vem utilizando culturas celulares derivadas de pacientes acometidos por essa condição. Neste contexto, pouco
se sabe sobre a relevância do método de sincronização celular para os ensaios de microarray. A obtenção das
células em um determinado estágio do ciclo celular pode possibilitar uma maior homogeneidade de expressão,
onde o transcriptoma de todas as células se torna referente a apenas um estágio, diminuindo ruídos de expressão
associados a outras fases do ciclo. Contudo, os efeitos deste tratamento sobre a análise do perfil de expressão
gênica no estudo de doenças complexas, mais especificamente das FLPs, são desconhecidos. Com o objetivo de
averiguar tais efeitos, estabelecemos 25 culturas de células-tronco adultas de polpa dentária (12 controles e 13
FLP). Submetemos 6 culturas de pacientes e 6 controles à sincronização celular por carenciamento de soro (t=12).
As culturas restantes (6 controles e 7 FLP) foram cultivadas normalmente. O RNA total foi extraído de culturas
em 80% de confluência utilizando o kit NucleoSpin II (MACHEREY-NAGEL) e hibridado em chips Human Gene
1.0 ST de microarray da Affymetrix. Os dados foram normalizados com o método RMA. Os genes diferencialmente
expressos (GDEs) foram selecionados por 2 métodos distintos: SAM e RankProd, ambos com p-valor < 0.05 ajustados
por FDR. Clusters de expressão foram construídos com o método k-means. O tratamento de sincronização celular
resultou em 87 GDEs pelo método RankProd e nenhum identificado pelo SAM. A análise de clustering resultou
em 9 clusters, onde somente 4 apresentavam alta taxa de homogeneidade (> 0,7). Além disso, algumas amostras
de pacientes apresentaram perfil de expressão semelhante ao dos controles. Em contrapartida, na análise das
amostras não-carenciadas o método RankProd identificou 211 GDEs (com p-valor mais estringente, < 0.01) e o
método SAM identificou 126 GDEs. Estes resultados indicam maior distinção entre os grupos controles e afetados,
o que possibilitou a identificação de 13 clusters, 11 deles com homogeneidade > 0,7. Vários genes pertencentes
à mesma família gênica foram agrupados nestes clusters, sugerindo co-regulação em células de pacientes. Esses
resultados preliminares apontam o tratamento de sincronização do ciclo celular por carenciamento como
fator limitante na obtenção e análise de perfis de expressão gênica para o estudo das FLPs. A validação de 10
genes por PCR em tempo real de cada uma das análises será importante para a obtenção das conclusões finais.
Apoio: CEPID/FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
75
Análise do perfil de expressão das metiltransferases da
família NSD (WhSC) em linhagens de câncer de mama
Moreira, JRL1,3; Henrique, BVM1,3; Diniz, JSV1; Sakamoto, LHT2; Pittella Silva,F1.3
Laboratório de Farmacologia Molecular. Faculdade de Ciências da Saúde. Universidade de Brasília
Secretaria de Estado de Saúde do Distrito Federal, Hospital de Apoio de Brasília, Núcleo de Genética
3
Faculdade de Ceilândia, Universidade de Brasília; Brasíla, Distrito Federal, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer de mama, epigenética, metiltransferases, NSD1, NSD2, NSD3
A epigenética refere-se a mudanças reversíveis no genoma que não alteram a sequência de nucleotídeos do DNA.
Entre os principais mecanismos da epigenética estão as modificações nas histonas que têm um importante papel
na regulação da estrutura da cromatina e atividades transcricionais. As enzimas metiltransferases são enzimas
que transferem um grupo metil (CH3) da S-adenosil metionina, (SAM) que é o doador universal do grupo metila
para os aminoácidos presentes nas histonas (lisinas e arginina). As modificações por metilaçao das lisinas nas
caudas das histonas podem resultar na ativação ou repressão da transcrição de genes específicos dependendo do
local onde ocorre a modificação. O aumento ou diminuição da expressão de uma metiltransferase pode interferir
diretamente nos mecanismos epigenéticos que mantém a homeostase celular, resultando em um processo
patológico. Neste estudo analisamos o perfil de expressão das metiltransferaes de lisina da família NSD (WHSC)
que compreendem três genes, NSD1, que atua como regulador transcricional bifuncional e contém vários domínios
protéicos entre eles o domínio SET encontrado em praticamente todas as metiltransferases de lisina. NSD2
(WHSC1) que interage com o sítio de ligação de DNA no receptor de androgênio via HMG e pode ser o responsável
por promover carcinogênese em casos de alta expressão e NSD3 (WHSC1L1) que é encontrado junto com o NUP98
em alguns casos de leucemia aguda mielóide e é amplificado em alguns casos de câncer de mama. Analisamos a
expressão destes genes em um painel de sete linhagens de câncer de mama e 3 linhagens não cancerígenas, dentre
as quais 1 linhagem de carcinoma ductal da mama e sua contraparte não cancerígena de uma mesma paciente.
Para tanto, obtivemos o RNA total de cada linhagem e sintetizamos o cDNA correspondente. Desenhamos e
sintetizamos primers e sondas específicas para cada um dos genes, que foram utilizadas nas análises de expressão
por PCR semi-quantitativo e por PCR em tempo real. Como resultado, observamos um aumento na expressão
do gene NSD1 nas amostras cancerígenas em relação às amostras não cancerígenas. Já os genes NSD2 e NSD3
se comportaram de maneira oposta, com uma redução na expressão nas linhagens cancerígenas em relação às
linhagens não cancerígenas. Estes resultados evidenciam a desregulação da expressão dos genes da família NSD
nas diversas linhagens cancerígenas e mostram a importância da realização de um estudo mais abrangente no
envolvimento de tais genes no processo da carcinogênese da mama. Esperamos que nossos resultados possam
servir como base para estudos mais aprofundados em relação aos mecanismos que levam à expressão desregulada
de tais enzimas no câncer de mama, visando a identificação de novos alvos terapêuticos e diagnósticos.
Apoio financeiro: CNPq, UnB, FINATEC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
76
Evaluation of EpCAM expression in papillary carcinoma
of thyroid and thyroid benign nodule
Silva, MM1a; Caixeta, GN2a,3; Soares, RBA1ab,2b; Silva, RC1a,2a; Cunha, BCR1c; Leal, CBQS1c; Saddi, VA1ac,2a;
Ayres, FM1a,3,4
Pontifícia Universidade Católica de Goiás – aMestrado em Genética, bDepartamento de Medicina e cDepartamento de Biomedicina
Associação de Combate ao Câncer em Goiás – Hospital Araújo Jorge – aSetor de Anatomia Patológica e bLaboratório de Oncogenética e
Radiobiologia
3
Universidade Federal de Goiás – Programa de Pós-Graduação em Biologia
4
Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas
[email protected]
1
2
Keywords: immunohistochemistry, epithelial cell adhesion, endocrine tumor, EpCAM, papillary carcinoma of thyroid.
Papillary carcinoma of thyroid (PCT) is follicular tumor that constitutes 60% of the endocrine tumors. Besides, thyroid
benign nodules are tumors of difficult diagnosis and therapeutic protocol. Almost 40% of the thyroid benign nodules
are undiagnosed before thyroidectomy. Molecular and genetic markers for prognostic evaluation and cytological
diagnosis of these tumors remain an unusual resource. The protein EpCAM is an important marker for epithelial
tissue, which signaling pathway is positively correlated with cell proliferation and negatively correlated with cell
differentiation, cell adhesion by caderin, and potential tumor dissemination. EpCAM is a 40KDa transmembrane
glycoprotein down reagulated in the basolateral cell membrane of normal epithelia, pseudostratify or of transition.
In order to evaluate the immune expression of EpCAM in PCT (n = 9) and in thyroid benign nodules (n = 42),
immunohistochemistry was performed in paraffin-embedded specimens using ESA antibody (VU-1D9). EpCAM
was low and moderately expressed in 80% and 20% of colloid goiter samples, respectively. In follicular adenomas,
expression was moderate in 67% of the samples. Most of the thyroid benign nodules associated with chronic
thyroiditis showed EpCAM hyper expression. There was no Ep-CAM expression in about 90% of PCT samples.
Acknowledgment: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás, PUC-GO, UEG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
77
Avaliação da expressão do gene SLC34A2 em linhagens
de carcinoma de pulmão do tipo NSCLC (A549) em
resposta ao tratamento com 17-Beta-estradiol
Cerri, MF1; Rezende, LCD1; Lyra-Júnior, PCM1; Paes, MF1; Silva, D1; Sirtoli, GM1; Tommasi, BO2; Silva, IV3;
Rangel, LBA4
1Programa de Pós graduação em Biotecnologia/RENORBIO, Universidade Federal do Espírito Santo
2
Instituto Tommasi de Pesquisa e Desenvolvimento
3
Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Espírito Santo
4
Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
Palavras-chave: Carcinoma de Pulmão, SLC34A2, NaPi-IIb, 17-Beta-Estradiol.
O carcinoma de pulmão (CP) representa um grande desafio à saúde mundial, configurando-se como a principal
causa mortis por câncer entre homens e mulheres. No Brasil, são estimados 27.630 novos casos de cânceres
de pulmão, traquéia e brônquio no ano de 2010, sendo 500 casos (170 mulheres e 330 homens) esperados para
o estado do Espírito Santo. SLC34A2 é um membro da família de genes carreadores de soluto e codifica uma
proteína membranar de multi-passagem composta por 690 aminoácidos, o transportador de fosfato do tipo
IIb (NaPi-IIb). Tal transportador utiliza o gradiente eletroquímico de íons sódio para realizarem co-transporte
de sódio e fosfato e é expresso fisiologicamente em uma variedade de tipos celulares, dentre as quais as células
pulmonares alveolares do tipo II. Quanto à importância de NaPi-IIb para o CP, já foi reportado que o gene SLC34A2
tem expressão reduzida em até dez vezes em amostras de câncer de pulmão quando comparada ao pulmão
normal. O estrogênio endógeno e o exógeno são reconhecidos fatores de risco ao CP em mulheres, e possivelmente
desempenham um papel no desenvolvimento do CP, particularmente, adenocarcinomas. Adicionalmente
estudos recentes têm proposto uma possível relação entre a ação estrogênica e a superexpressão de NaPi-IIb
em células não cancerosas. Para tal estudo foi utilizada a linhagem de CP A549. Foram testadas 4 concentrações
de 17-Beta-Estradiol (100pg/ml; 500pg/ml; 1000pg/ml; 5000pg/ml), além de um controle tratado apenas com
o veículo. As células foram lisadas diretamente nas placas de cultura com o reagente TRIZOL e em seguida o
RNA foi extraído seguindo protocolo da empresa. O RNA extraído foi utilizado para síntese o DNA complementar
(cDNA) empregando-se o High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. A expressão gênica foi analisada
pela técnica de qRT-PCR utilizando equipamento 7.300 Real Time PCR Systems e empregando SYBR Green
PCR Master Mix como sistema de detecção. A quantificação relativa da expressão gênica foi realizada através
do cálculo do delta-delta Ct utilizando dois genes housekeepings: GAPDH e Beta-Actina. Observamos nesse
estudo uma expressão baixa de NaPi-IIb na linhagem A549 e ainda uma tendência de diminuição da expressão
do gene SLC34A2 em resposta ao tratamento com 17-Beta-Estradiol. Tal tendência é oposta ao que foi descrito
na literatura para o tratamento de células intestinais com estrogênio. Todavia, já foi descrito que a diminuição
da expressão de NaPi-IIb está associada à transformação maligna no pulmão, e os dados coletados sugerem
que a diminuição da expressão de NaPi-IIb pode estar associada à ação pró-carcinogênica do estrogênio no CP.
Apoio financeiro: FAPES, FACITEC, CNPq, CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
78
Avaliação da expressão do receptor de leptina como
candidato a marcador de agressividade tumoral em
pacientes com carcinoma epidermóide de boca e
orofaringe
Silva, AMA1,2; Alves, LU3; Mercante, AMC2; Carvalho, MB2
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras do Centro Universitário Fundação Santo André, Santo André, SP – Brasil
Hospital Heliópolis, Heliópolis, São Paulo – Brasil
3
Bolsista do programa de iniciação científica (PIIC 2008-2009) – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras do Centro Universitário Fundação Santo André, Santo André, SP - Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Carcinoma epidermóide de boca e oroaringe, Receptor de Leptina, Leptina, Imunohistoquímica.
Introdução: O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço representa 90% dos tumores das vias aerodigestivas
superiores, relacionado principalmente ao etilismo e tabagismo associados à susceptibilidade genética. Visto a
agressividade tumoral desse tipo de carcinoma, o grupo de pesquisa do Projeto Genoma Clínico de Câncer de
Cabeça e Pescoço selecionou da lista de genes mais expressos em tumores menos agressivos, através da técnica
de microarray, o gene LEPR que codifica o receptor de leptina, responsável pela sensação de saciedade e gasto
de energia quando ativado por seu ligante, a leptina. O produto do gene LEPR é um receptor de citosina classe 1
que está envolvido na ativação da trancrição gênica, através de diversas vias de sinalização (STAT, MAPK e P13K).
A LEPR junto ao seu ligante atua como mitógeno em diversos tipos de células, como em células neoplásicas e
normais epiteliais, de colo de útero e da mama. Atua também no processo de formação de novos vasos sanguíneos
em tecidos normais e neoplásicos atuando como promotora na expressão de genes que promovem a angiogênese.
Estão também associados com a aparição de diversas outras neoplasias como o câncer de mama, colo, fígado,
próstata, pâncreas, rins, estômago e leucemias. Eles estão também associados aos processos de resposta
imunológica e inflamatória, reprodução, formação dos ossos, cicatrização dentre outras funções ainda em estudo.
Objetivos: Avaliar a expressão do produto do gene LEPR através da técnica de imunohistoquímica em carcinoma
epidermóide de boca e orofaringe. Relacionar a expressão do gene LEPR com a agressividade tumoral medida pelo
TNM e histologia. Relacionar a expressão do gene LEPR com a sobrevida global e livre de doença nos pacientes
com carcinoma epidermóide de boca e orofaringe. Materiais e Métodos: O estudo histológico analisou 85 lâminas
contendo material neoplásico proveniente de pacientes com carcinoma epidermóide de boca e orofaringe. As
lâminas foram coradas com hematoxilina-eosina e analisadas ao microscópio óptico para a avaliação das
características histopatológicas do tecido. O estudo imunohistoquímico contou com a confecção de uma lâmina,
através da técnica de tissue micro array, contendo o material tumoral de todos os pacientes. Os materiais foram
submetidos ao anticorpo anti-Lepr e analisados no microscópio óptico para avaliação da intensidade e abrangência
da marcação. Conclusões: Apesar de diversos trabalhos evidenciarem relação entre o receptor de leptina e diversos
tipos de neoplasias, no presente estudo não foi encontrada relação entre agressividade tumoral medida pelo TNM,
o estado clinicopatológico do paciente e a sobrevida global e livre de doença com a expressão da LEPR. Novos
resultados podem ser obtidos se, em estudos posteriores forem analisados a expressão do receptor de leptina na
margem tumoral, livre de doença, dos pacientes com o carcinoma e ou aumentado o número de casos do estudo.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
79
Estudo in vivo de expressão do gene alfa-L-Iduronidase
em modelo murino de mucopolissacaridose I utilizando
o sistema phiC31.
Stilhano, RS1; Matsumoto, PK1; Melo, SM1; Silva, FH1; Pereira, VG2; D’Almeida, V2 e Han, SW1
Departamento Biofísica – CINTERGEN, UNIFESP, São Paulo/SP
Departamento de Pediatria, UNIFESP, São Paulo/SP
1
2
Palavras-chave: alfa-l-iduronidase, mucopolissacaridose tipo i, phic31, hidrodinamica, terapia genica
Introdução e objetivo: A mucopolissacaridose do tipo I (MPSI) é uma doença lisossomal, sem tratamento eficaz até
o momento, causada por mutações no gene que codifica a enzima α-L-iduronidase (IDUA). Dessa forma o objetivo
do trabalho foi desenvolver um novo sistema de transferência do gene IDUA para obter alta expressão da enzima em
longo prazo em camundongos C57Bl/6, utilizando a integrase phiC31. Métodos e Resultados: Foram construídos
os seguintes vetores: uP-IDUA (expressa IDUA sob controle do promotor CMV completo), uP-attB-IDUA (uP-IDUA
com o sítio attB), p-attB-CAG-IDUA (expressa IDUA sob controle do promotor CAG), uP-INT (expressa a integrase).
Foi feito um ensaio de transferência gênica, utilizando injeção hidrodinâmica na veia da cauda em camundongos
C57Bl/6 selvagens tratados ou não com ciclofosfamida (CTX). Nos animais que receberam os plasmídeos uP-INT
e uP-attB-IDUA ou p-attB-CAG-IDUA observou-se que a atividade da IDUA caia para 10 U/mL sete dias após a
injeção no grupo não tratado com CTX. Nos animais tratados com os plasmídeos uP-INT e p-attB-CAG-IDUA e o
imunossupressor a atividade da IDUA permaneceu por 30 dias após a injeção. Os plasmídeos p-attB-CAG-IDUA
e uP-INT e a imunossupressão foram testados em 7 animais nocautes para o gene IDUA (KO-IDUA), 15 dias após
a injeção a maior parte dos animais apresentaram níveis basais de IDUA, sendo que um animal apresentou a
dosagem de 2U/mL 21 dias após a injeção, níveis similares a de um animal heterozigoto. Conclusão: Os nossos
resultados indicam que a expressão de IDUA duradoura em animais depende principalmente de dois fatores: do
promotor/enhancer do vetor e da resposta imune. O promotor CAG conseguiu sustentar a expressão de IDUA in
vivo bem melhor do que o promotor puramente do CMV, mas ainda não se sabe causas da diferença de resposta
por estes promotores. A necessidade de pré-tratamento com CTX para manter a expressão in vivo longamente,
sugere que as células transfectadas poderão ser alvo de ataque pelo sistema imune do animal. Acredita-se que
a resposta imune seja contra a proteína IDUA, mas não se descarta da reação contra o plasmídeo ou da phiC31
recombinase. Investigações estão em andamento para entender estes resultados.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
80
Avaliação da expressão de antígenos Câncer/Testículo
(CTAs) em carcinoma epidermóide de cabeça e
pescoço
Zamuner, FT1; Karia, BTR1; Carvalho, AL2; Vettore, AL1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital do Câncer de Barretos
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço, antígenos câncer/testículo, imunoterapia.
Entre os dez cânceres mais freqüentes encontram-se os cânceres de cabeça e pescoço com mais de 500.000 novos
casos diagnosticados anualmente no mundo, sendo a maioria (90%) representada pelos carcinomas epidermóides
(CECP). Apesar das inúmeras estratégias no tratamento utilizadas para o CECP, a taxa de sobrevida global em 5
anos encontra-se próxima a 50%, sendo que, o desenvolvimento de recorrências loco-regionais é a principal razão
para a falha no tratamento. As cirurgias de CECP são, geralmente, mutilantes e requerem extensiva reconstrução.
O desenvolvimento de novas terapias e sua integração nas atuais formas de tratamento (incluindo cirurgia,
radioterapia e quimioterapia) é de grande interesse para a melhoria da eficácia terapêutica. A imunoterapia pode
prover uma alternativa ao modelo estabelecido de tratamento, uma vez que a resposta imune natural pode ser
estimulada por uma intervenção imunoterapêutica ativa a qual pode auxiliar no controle da progressão tumoral e
das recaídas. Um pré-requisito para o desenvolvimento de abordagens imunoterapêuticas baseadas em antígenos
tumorais específicos é a identificação de produtos gênicos imunogênicos expressos predominantemente nas
células tumorais. Os antígenos câncer/testículo (CTAs) formam um grupo de peptídeos cuja expressão esta restrita
a tumores e células da linhagem germinativa. Portanto, os CTAs são candidatos ideais para o desenvolvimento
de imunoterapia mediada por anticorpos ou linfócitos T citotóxicos, pois ocasionam uma resposta imuneespecífica onde os alvos são as células cancerígenas, que expressam os CTAs, poupando células normais, que não
os expressam (ou apresentam baixos níveis de expressão). O estudo proposto teve como finalidade determinar os
níveis de expressão de 30 CTAs em 27 amostras de carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) e em 10
amostras de mucosa normal, de indivíduos sem diagnóstico de câncer. Assim, se pretende selecionar possíveis
antígenos câncer/testículo que apresentaram altas freqüências de expressão em CECP, e correlacionar esta
expressão com os dados clínico-laboratoriais dos pacientes. A expressão foi avaliada através de experimentos de
RT-PCR e os produtos obtidos foram visualizados em eletroforese em gel de agarose. Os CTAs MAGEA4, SPANX,
MAGEA3/6, MAGEB2 e HORMAD apresentaram especificidade de 100% quando avaliados nas amostras normais,
e alta sensibilidade, MAGEA4 (67%), SPANX (59%), MAGEA3/6 (56%), MAGEB2 (52%) e HORMAD (52%). O passo
seguinte será avaliar a expressão destes CTAs em cerca de 150 casos de CECP e verificar se existe uma correlação
entre as características clínico-patológicas destes pacientes e a expressão destes antígenos. Estes resultados
poderão servir de base para a elaboração de estratégias de imunoterapia para o tratamento desta doença maligna.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
81
Estudo da expressão de genes relacionados a
pluripotencialidade e à exclusão de drogas em câncer oral
Oliveira, SM1; Paula, VHFMS1; Nascimento, LA2; Motoyama, AB1
1.Laboratório de Farmacologia Molecular, Faculdade de Ciências da Saúde
2.Hospital Universitário de Brasília (HUB), Universidade de Brasília (UnB)
[email protected]
Palavras-chave: células-tronco tumorais, genes de pluripotencialidade, transportadores ABC, nanog,oct4.
As células-tronco (CT) tumorais foram funcionalmente definidas como aquelas com capacidade de originar
novos tumores, sendo assim denominadas pelas suas similaridades com as cognatas normais, sobretudo em:
pluripotencialidade e capacidade de exclusão de drogas e corantes. Acredita-se que a pluripotencialidade em
células normais possa ser mantida e/ou re-adquirida pela expressão de genes relacionados à primitividade,
como os “ fatores de Yamanaka - oct4, klf4, nanog e c-myc” (Takahashi et al 2007), cuja expressão forçada conferiu
pluripotencialidade a células já diferenciadas ( fibroblastos humanos). Postula-se que a exclusão de drogas
observada em uma reduzida subpopulação (“side population”) se deva à expressão desregulada de canais da família
ABC (“ATP-biding cassette”), dos quais o gene mdr-1 (multiple drug resistance-1), é um membro. Embora a relação
causa-efeito entre as características de CTs e o aparecimento de tumores ainda seja controverso, tal hipótese
tem enormes implicações clínicas. A pluripotencialidade favoreceria o aparecimento de novos tumores, mesmo
após remoção cirúrgica ou ablação química da massa tumoral detectável, enquanto a capacidade de exclusão
de drogas impediria que as CTs tumorais fossem eliminadas com tratamentos convencionais; característica
favorável ao aparecimento de recidivas e metástase. Dessa forma, o conhecimento dos padrões de expressão dos
genes de pluripotencialidade e de membros da família ABC possibilitaria o diagnóstico precoce e um prognóstico
mais preciso; algo extremamente relevante sobretudo em tipos tumorais cujos marcadores para a detecção
molecular são ainda escassos, como o câncer oral. Para ele, formas terapêuticas não avançaram muito nas última
décadas, fato atestado pela alta taxa de mortalidade (cerca de 50% dos pacientes sucumbem em até 5 anos pósdiagnóstico). A forma terapêutica mais comumente empregada é radioterapia adjuvante após a remoção cirúrgica,
que frequentemente resulta em perdas funcionais e estéticas. Diante da necessidade da correta identificação
das CTs a nível molecular, o presente projeto teve como objetivo investigar a expressão de genes envolvidos
na pluripotencialidade (oct4, nanog, rex1, sox2, notch3, klf4, c-myc) e de canais transmenbrânicos (abcb1,abcc1
e abcg2) em células tumorais. A expressão desses genes foi analisada em linhagens de carcinoma oral (SCC-3,
SCC-4 e SCC-25) e em amostras de 4 pacientes do Hospital Universitário de Brasília (HUB/UnB) por RT-PCR.
Resultados preliminares sugerem que gene notch3 parece estar super-expresso em algumas amostras, enquanto
que a maioria dos demais genes investigados parece não ter sua expressão alterada em tumores orais. É necessário
um maior número de amostras para que se possa avaliar se os genes relacionados a pluripotencialidade e os que
codificam para canais de exclusão de drogas podem servir como marcadores para a presença de CTs tumorais.
Apoio financeiro: CNPq e Finatec
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
82
Quantificação relativa dos níveis transcricionais do
gene TLR4 em pacientes com câncer de próstata
Araújo, TG1; Neves, AF2; Marangoni, K1; Alves, PT1; Ueira-Vieira, C1; Goulart, LR1
Laboratório de Nanobiotecnologia, Instituto de Genética e Bioquímica – Universidade Federal de Uberlândia
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás – GO
[email protected]
1
2
Palavras-chave: TLR4, câncer de próstata, expressão gênica, sangue periférico, hiperplasia benigna
Atualmente, o câncer de próstata (CaP), é o segundo mais diagnosticado após o câncer de pele não melanoma
e estima-se, para 2010, cerca de 52 mil novos casos de tumores de próstata no Brasil. Pesquisas têm mostrado
que o sistema imunológico pode ser iniciado, nos tumores, por duas vias, sendo a primeira em resposta contra
os antígenos associados ao tumor (TAA), e a segunda contra os antígenos específicos ao tumor modificando a
estrutura ou expressão de proteínas próprias. A ativação diferencial de TLR4 por ligantes naturais induz uma série
de mecanismos subseqüentes que envolvem a expressão de genes inflamatórios e o controle da proliferação e
apoptose celulares, mecanismos envolvidos na gênese e progressão em diversos cânceres. Diante do exposto, o
presente trabalho objetivou avaliar os níveis transcrionais do gene TLR4 e sua associação com o desenvolvimento
e/ou progressão do CaP. Foi extraído o RNA total do sangue periférico de 54 pacientes com CaP, 23 com hiperplasia
prostática benigna (HPB) e em 78 indivíduos jovens (controles saudáveis). A idade dos indivíduos com CaP e HPB
variou de 44 a 85 anos, com média de 62 anos e dos controles saudáveis de 18 a 30 anos, com média de 23 anos.
A expressão relativa desse gene foi calculada por PCR em tempo real utilizando-se o método Ct comparativo.
Os resultados obtidos mostraram que a expressão de TLR4 foi significativamente maior nos indivíduos com
hiperplasia do que com câncer ou controles saudáveis. A média dos níveis relativos dos transcritos foi 1.64 vezes
maior na doença benigna do que no câncer. Foi verificada uma baixa, porém significativa correlação (p<0.05)
entre os dados de expressão e os valores de Gleason. Não houve correlação entre os resultados obtidos e os
dados de estadiamento dos tumores ou entre os resultados e os valores de PSA. Conclusões: A maior detecção
do gene TLR4 na hiperplasia benigna revela a presença de mecanismos moleculares distintos envolvidos na
gênese e desenvolvimento do câncer de próstata e das alterações benignas do órgão. O estudo de seu papel na
biologia do tumor e sua participação em mecanismos de sinalização intracelulares pode auxiliar a compreender
os multifatores envolvidos na doença. Portanto, pesquisas adicionais são necessárias a fim de identificar seus
ligantes e produtos e correlaciona-los com as alterações moleculares e biomarcadores até então identificados.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
83
Avaliação da expressão do gene SLC34A2 em
linhagens de Carcinoma de Pulmão do tipo NSCLC
(A549 e H460) em resposta ao tratamento com
moduladores das vias de sinalização de PKC e PKA
Cerri, MF1; Rezende, LCD1; Paes, MF1; Lyra-Junior, PCM1; Silva, D1; Sirtoli, GM1; Coitinho, LB1; Tommasi,
BO2; Silva, IV3; Rangel, LBA4
1Programa de Pós graduação em Biotecnologia, Universidade Federal do Espírito Santo
2
Instituto Tommasi de Pesquisa e Desenvolvimento
3
Departamento de Morfologia, Universidade Federal do Espírito Santo
4
Departamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
Palavras-chave: Carcinoma de Pulmão, SLC34A2, NaPi-IIb, PKC, PKA, Calfostina C.
O carcinoma de pulmão (CP) representa um grande desafio à saúde mundial, configurando-se como a principal
causa mortis por câncer entre homens e mulheres. No Brasil, são estimados 27.630 novos casos de CP, traquéia
e brônquio no ano de 2010, sendo 500 casos (170 mulheres e 330 homens) esperados para o estado do Espírito
Santo. SLC34A2 é um membro da família de genes carreadores de soluto que codifica uma proteína membranar
de multi-passagem composta por 690 aminoácidos, o NaPi-IIb. É sabido que sua expressão alterada ocorre em
cânceres de origem epitelial. SLC34A2 tem função conhecida no pulmão, e é expresso de maneira gradativamente
maior durante o desenvolvimento pulmonar, e com padrão de expressão gênica com tendência oposta à observada
durante o desenvolvimento pulmonar fetal. Assim SLC34A2 tem expressão reduzida em até dez vezes em amostras
de CP quando comparada ao pulmão normal. Devido à alta especificidade e à expressão gênica no câncer, tem sido
sugerido que SLC34A2 pode representar um marcador tumoral clinicamente útil, contudo ainda carecemos de
dados no CP. Sabendo do papel central das isoenzimas de PKC na carcinogênese e aliado a estudos que demonstram
que a administração de AMPc estimula a expressão de mRNA de NAPi-IIb em células alveolares tipo II de ratos
adultos, propusemos a avaliação da correlação entre PKA (mediador de AMPc) e PKC e os níveis de expressão de
NaPi-IIb nas células de CP humanas. Para cada linhagem celular empregada (A549 e H460), foram testadas as ações
de reagentes com ação ativadora ou inibitória sobre PKC ou PKA na expressão de NaPi-IIb. Para tanto, utilizou-se
PMA, Calfostina C, dB AMPc e KT 5720. As células foram lisadas diretamente nas placas de cultura, em seguida o
RNA foi extraído com o reagente TRIZOL, com posterior quantificação. Sintetizou-se o DNA complementar (cDNA)
do RNA extraído das linhagens celulares estudadas através do mecanismo de transcrição reversa, empregando-se o
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit. A técnica de qRT-PCR foi feita com o equipamento 7.300 Real Time
PCR Systems, utilizando-se o SYBR Green PCR Master Mix como sistema de detecção. Em nossas análises, notamos
que PKC e PKA não influenciaram a expressão de SLC34A2/NaPi-IIb nas linhagens de NSCLC avaliadas. Observouse, contudo, um aumento considerável na expressão desse gene quando tratado com Calfostina C, provavelmente,
por um mecanismo independente de seu papel clássico na inibição de PKC. Sabe-se que Calfostina C pode induzir
apoptose em algumas linhagens celulares tumorais por mecanismos que ainda não foram completamente elucidados.
Dessa forma, sugerimos um possível envolvimento de NaPi-IIb nessa via pró-apoptótica, que corrobora o fato de
tumores do tipo NSCLC apresentarem expressão reduzida de NaPi-IIb quando comparados ao pulmão normal.
Apoio financeiro: FAPES, FACITEC, CNPq, CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
84
Avaliação da expressão dos genes Bcl2 e FN1 em
pacientes com câncer de pele submetidos ao tratamento
com terapia fotodinâmica no Distrito Federal
Matos, LG¹; Carmo, NG¹,²; Soares, SKP²,4; Morais, PC²; Testeco, AC³; Lacava, ZGM²; Andrade, RV¹
¹Laboratório de Ciências Genômicas e Biotecnologia - Universidade Católica de Brasília
²Universidade de Brasília.³Universidade de Ribeirão Preto.4Hospital Regional da Asa Norte – HRAN
[email protected]
Palavras-chave: câncer de pele, neoplasias não melanoma, terapia fotodinâmica, expressão gênica.
Dentre todos os tipos de câncer, o câncer de pele é o que ocorre em maior número e aquele cuja incidência
mundial tem aumentado rapidamente nas últimas décadas, correspondendo a aproximadamente 25% de
todos os tumores registrados no Brasil. Entretanto, a escolha do tratamento depende do tipo histológico da
neoplasia, localização, idade, condições clínicas, número de tumores encontrados em um mesmo indivíduo
e das condições e equipamentos da unidade de saúde onde o paciente será tratado. Na maioria das vezes, o
tratamento de escolha para o câncer de pele é a exérese cirúrgica. Outras modalidades terapêuticas foram
desenvolvidas, uma vez que muitos pacientes apresentam mais de um tumor e, dependendo do tipo de neoplasia
e localização, as mutilações podem ser grandes. Soma-se o fato do câncer de pele incidir preferencialmente em
uma população idosa, em que, devido às condições clínicas do paciente, a cirurgia tradicional é muitas vezes
contra-indicada. Neste contexto, a terapia fotodinâmica vem como proposta terapêutica para casos inoperáveis
e pacientes sem condições cirúrgicas. Esta se baseia na aplicação tópica na lesão cutânea de um pró-fármaco,
o ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), seguida, após um período de oclusão de aproximadamente 3 horas, pela
iluminação da lesão com uma luz com comprimento de onda na região da janela terapêutica, por exemplo, em 630
nm. No local da aplicação, por meio de uma série de reações bioquímicas celulares, o 5-ALA é enzimaticamente
convertido em um agente fotossensibilizante endógeno ativo, a protoporfirina IX (PPXI), que sensibiliza as células
neoplásicas à ação da luz, desencadeando um processo de apoptose. Assim, o presente trabalho tem como
objetivo a análise da expressão dos genes Bcl-2 e FN1, por qRT-PCR, em lesões neoplásicas e pré-neoplásicas
de pacientes com doença de Bowen e carcinoma basocelular antes e após a aplicação da terapia fotodinâmica.
Os resultados obtidos mostram uma alteração significativa na expressão destes genes no pós-tratamento
semelhante à expressão do tecido não comprometido, sugerindo que tanto na análise molecular como na análise
clínica a terapia fotodinâmica representa uma terapêutica promissora para o tratamento do câncer de pele.
Apoio financeiro: HRAN, FAP-DF, UCB, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
85
Clinical implication of EpCAM expression in breast
ductal carcinoma
Caixeta, GN1a,2; Soares, RBA1b,3ab; Mühlbeier, DFM3a; Silva, RC1a,3a; Fraga Jr., AC1a; Paula, EC1a; Saddi,
VA1a,3ac; Ayres, FM2,3a,4
Associação de Combate ao Câncer em Goiás – Hospital Araújo Jorge – aSetor de Anatomia Patológica e bLaboratório de Oncogenética e
Radiobiologia
2
Universidade Federal de Goiás – Programa de Pós-Graduação em Biologia
3
Pontifícia Universidade Católica de Goiás – aMestrado em Genética, bDepartamento de Medicina e cDepartamento de Biomedicina
4
Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas
[email protected]
1
Key-words: cancer, immunohistochemistry, epithelial cell adhesion, prognosis, metastasis, survivall.
Breast cancer is the second most common tumor in the world and the first among women. In the past two decades,
several breast cancer studies focused on the expression and on the possible routes of cellular signaling for the
epithelial cell adhesion molecule (EpCAM). This protein was found overexpressed in many malignant tissues of
epithelial origin, including breast cancer. The role of EpCAM protein in tumor cells remains controversial. It is
hypothesized that cell adhesion by EpCAM reduces metastasis. Although, if the strong cell adhesion by caderin
were replaced by the weak homophilic adhesion of EpCAM, it may promote tissue invasion and metastasis.
Our study aimed to investigate the clinical implications of EpCAM in breast ductal carcinoma. By immunohistochemistry, we found no EpCAM expression in 10 cases (10,2%), low EpCAM expression in 45 cases (45,9%)
and overexpression in 43 cases (43,9%). No correlation was found between EpCAM protein overexpression and
the five-year overall survival of breast cancer patients, even for those with axillary lymph node involvement.
Similarly, there was no correlation between EpCAM protein expression and classical prognostic factors,
including tumor size, axillary lymph node involvement, hormone receptors, c-erbB-2 overexpression and
p53 immunedetection. Also, no correlation was found for distant metastasis and EpCAM overexpression
Acknowledgment: CAPES, CNPq, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás, PUC-GO, UEG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
86
Expressão do gene PCA3 envolvendo os exons 3 e 4
em amostras de pacientes com câncer de próstata por
RT-PCR convencional e por tempo real
Neves, AF1; Araújo, TG2; Marangoni, K2; Goulart, LR2.
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás – GO
Laboratório de Genética Molecular, Instituto de Genética e Bioquímica – Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: PCA3/DD3, RT-PCR, expressão gênica, câncer de próstata, hipertrofia prostática benigna.
Introdução: O câncer de próstata (CaP) é o segundo mais comum em homens, e seus índices de incidência
aumenta a cada ano. Até o momento, o PCA3 é o marcador mais específico para o CaP. O gene PCA3 apresenta
em sua estrutura transcricional quatro exons, sofrendo processamento alternativo do exon 2 em cerca de 95%
dos transcritos provenientes de tecidos prostáticos. Os eventos de poliadenilação alternativa podem ocorrer em
três diferentes posições do exon 4 (4a, 4b e 4c). O clone de cDNA mais frequentemente encontrado contém os
exons 1, 3, 4a and 4b. Contudo, os dados quanto à constituição de exons do PCA3 que está associada ao CaP tem
sido controversos. Alguns autores consideram que a região do PCA3 associada à próstata envolve uma variante
contendo o exon 4, enquanto outros tem demonstrado que a expressão deste gene é superexpressa e específica de
tumores prostáticos humanos utilizando primers localizados nos exons 1 e 3. Objetivo: Diante do exposto, o presente
estudo foi realizado a fim de avaliar a utilização clínica de diferentes sequências do PCA3 para diagnóstico do CaP.
Métodos: A RT-PCR convencional-Nested foi utilizada em 34 amostras de sangue periférico de pacientes com CaP
(N= 24) e hiperplasia benigna (HPB, N= 10) e a quantificação fluorescente por RT-PCR em Tempo-Real foi realizada
em 38 amostras de biópsia prostática (CaP N= 30 e HPB N= 8). No sangue periférico foram testadas as combinações
de primers que se anelam nos exons 1 e 4; e exons 1 e 3, gerando produtos de 277 e 90-pb, respectivamente; enquanto
no tecido prostático foi testada a combinação exons 1 e 3. A escolha de um amplicon menor do PCA3 nas reações
por Tempo-Real foi realizada com intuito de favorecer a performance da reação pelo uso de sondas fluorescentes
TaqMan, com dupla marcação 5’-FAM e 3’-TAMRA. Resultados: No sangue periférico, quatro dos 24 pacientes
de CaP foram PCA3 positivos enquanto todos os casos de HPB foram PCA3 negativos, apresentando completa
concordância de resultados entre as sequências geradas pelas combinações contendo o exon 3 ou o exon 4. No
tecido prostático, o PCA3 foi superexpresso nos casos de CaP comparado à HPB. Discussão: O trabalho apresentado
confirma que ambos, os exons 3 e 4 são regiões do PCA3 próstata específicas e o RNA deste gene é específico
do CaP podendo apresentar expressão aumentada de forma independente de qual sequencia foi amplificada.
Conclusão: Desta forma, tanto a RT-PCR Nested realizada no sangue periférico, como a RT-PCR por Tempo Real
realizada em fragmentos prostáticos para amplificação de cDNA a partir de oligos desenhados nos exons 3 ou 4
do gene PCA3 são valiosas ferramentas moleculares para diagnóstico do CaP em importantes amostras biológicas.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG. No. resumo: 29215
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
87
Análise de expressão comparativa de genes da família
MLL codificadores de metiltransferases em carcinomas
de mama
Almeida, CLV1.2.; Henrique, BVM1,2. ; Diniz, JSV1; Pittella Silva, F1,2.
Laboratório de Farmacologia Molecular. Faculdade de Ciências da Saúde. Universidade de Brasília
Faculdade de Ceilândia, Universidade de Brasília, Brasília, Distrito Federal. Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: epigenética, câncer de mama, MLL(ALL-1), MLL2, MLL3, MLL4, MLL5, expressão gênica.
O conhecimento e o estudo da epigenética são importantes para a verificação da regulação de expressão gênica.
As alterações epigenéticas são as alterações da cromatina e do DNA que não alteram a seqüencia dos nucleotídeos
e são estáveis nas divisões celulares. A família de genes MLL (Mixed-Lineage Leukemia) é composta por cinco
membros: MLL(ALL-1), MLL2, MLL3, MLL4 e MLL5. Desses cinco, quatro possuem atividade de metiltransferase
de lisina, metilando a histona H3 da lisina 4, exceto o MLL5 cuja atividade ainda não foi elucidada. A família MLL
tem como característica um domínio SET (suppressor-enhancer of zeste trithorax) conservado em todos os genes.
A análise de genes codificadores de metiltransferase assume papel importante para um maior aprofundamento
da relação entre a metilação das histonas com a expressão gênica, com controle epigenético e conseqüentemente
com doenças como o câncer. Neste trabalho analisamos o perfil de expressão dos cinco genes da família em
linhagens de câncer de mama em comparação com linhagem não cancerígena. Para verificar a expressão gênica
da família MLL codificadoras de metiltransferase em carcinomas de mama, foram cultivadas linhagens de
carcinoma mamário e linhagens normais. A partir dessas culturas, foi extraído o RNA total dessas células que
foi utilizado para síntese de cDNA com transcriptase reversa. Para os ensaios de expressão foram desenhados
primers específicos para cada gene da família MLL. A expressão comparativa de cada gene foi realizada por PCR
semi-quantitativo e confirmadas por PCR em tempo real. Verificamos alterações nos padrões de expressão de cada
gene dependendo da linhagem analisada. Avaliando-se a expressão geral dos cinco genes, a maioria está com a sua
expressão diminuída em linhagens cancerígenas em comparação com as linhagens não cancerígenas. Essa análise
comparativa de expressão dos genes da família MLL em linhagens de câncer de mama são de relevada importância
para estudos dessa nova classe enzimática nos fenômenos que levam à carcinogênese. Os dados obtidos neste
trabalho servirão de base para a análise de expressão em amostras clínicas de pacientes e sua provável correlação
com a carcinogênese mamária.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
88
Expressão dos genes DNMT1, DNMT3A e DNMT3B em
glioblastoma
Moreno, DA1; Queiroz, RGP1; Scrideli, CA1; Tone, LG1
1
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP
Palavras-chave: Glioblastoma, câncer, metilação, DNMTs, expressão gênica
Introdução: O glioblastoma é um dos tipos de tumor do sistema nervoso central de comportamento mais agressivo
e de pior prognóstico. Apesar dos avanços nas estratégias atuais de tratamento, a sobrevida de pacientes é
extremamente baixa. Uma das características deste tumor é a instabilidade genômica que pode ser provocada
por alterações no padrão normal de metilação do DNA. A hipometilação representa um evento importante na
transformação maligna promovendo reativação de elementos transponíveis e surgimento de aneuploidias
comprometendo a estabilidade genômica. Esses eventos podem resultar de mutações ou expressão anormal
dos genes das DNA metil-transferases (DNMTs) que estão envolvidos no processo de metilação do DNA. Muitos
trabalhos têm associado alterações na expressão dos genes das DNMTs a instabilidade genômica em diversos tipos
de neoplasias, entretanto pouco se sabe a respeito da atividade desses genes em glioblastomas.O objetivo deste
trabalho foi analisar o perfil de expressão dos genes DNMT1, DNMT3a e DNMT3b em linhagens de glioblastoma.
Foram utilizadas 6 linhagens de glioblastoma e uma amostra de substância branca não-neoplásica. A quantificação
do mRNA foi realizada através da técnica de PCR em tempo real pelo método TaqMan. Foram utilizados 2 genes
de referência (HPRT e TBP) e uma amostra de substância branca não-neoplásica como calibrador das reações. Foi
observada uma expressão relativa menor dos genes DNMT1 (0,49) e DNMT3A (0,09) nas linhagens de glioblatoma
(U87; U343; SF188; T98G; LN319 e U251) comparando-se com a amostra de substância branca não neoplásica.
A expressão do gene DNMT3B variou de 0,27 a 4,22 entre as linhagens e a média foi de 2,45 vezes em relação à
substância branca. Os resultados deste trabalho sugerem que a expressão dos genes das DNMTs pode estar associada
ao desenvolvimento do glioblastoma e que podem representar um alvo importante para o estudo desta patologia.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
89
Seleção de peptídeos específicos para o futuro
desenvolvimento de biomarcadores para câncer de
próstata
Fujimura, PT1; Capparelli, FE1; Priuli, AS1; Reis, CF1; Siquieroli, ACS1; Campos, TA1; Goulart, LR1; UeiraVieira,C1
1
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
Palavras-chave: Phage display, marcadores tumorais, microesferas, câncer de próstata, motivo FPWL
O câncer de próstata é a segunda causa de óbitos por tumor em homens, sendo superado apenas pelo câncer
de pulmão. Atualmente, o único marcador sérico na avaliação clínica é o PSA. Assim, identificação de novos
antígenos ou genes específicos do câncer de próstata, o estudo sobre o reconhecimento molecular em câncer,
e a inovação dos diagnósticos, pode prover o desenvolvimento de novos biomarcadores, de terapias específicas,
e bem como, fornecer resultados de diagnósticos mais rápidos a fim de auxiliar os médicos. Neste trabalho, foi
executada uma seleção de peptídeos a partir de um repertório de anticorpos circulantes associados ao tumor
por meio da metodologia de Phage Display, e padronizou-se o acoplamento dos fagos à microesferas para o
desenvolvimento de uma plataforma de diagnóstico. Foram isolados peptídeos reconhecidos por anticorpos
purificados a partir do soro de pacientes com câncer de próstata para a obtenção de biomarcadores ou na
descoberta de novas etiologias para o tumor. Para seleção dos peptídeos foi realizado um bioppaning subtrativo,
seguida de uma seleção positiva utilizando uma biblioteca de peptídeos Ph.D.-C7C expressa na superfície do
fago filamentoso M13. O DNA dos fagos selecionados foi seqüenciado, traduzido, e os diversos clones foram
submetidos aos ensaios de ELISA e bioinformática. A análise das seqüências de clones selecionados apresentou
um motivo comum FPWL, os quais, relacionavam com o estadiamento do tumor pT1 e pT2, e especificamente
com câncer associado a neoplasia intra-epitelial prostática. Um clone com a seqüência diferente reconheceu
o tumor e estadiamento T4 nenhum para pT3. Dessa forma, explorar a resposta humoral diferencial do câncer
pode sugerir, através de marcadores e alvos moleculares, a intervenção diagnóstica e terapêutica adequada.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CAPES, CNPq, UFU
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
90
Hiper-expressão de genes específicos em margens
cirúrgicas de pacientes com carcinoma epidermóide de
cabeça e pescoço: correlação com o desenvolvimento
de recidiva local e segundos tumores primários
de Carvalho, AC1; Soares, FA2; Kowalski, LP4; de Carvalho, TG1; Carvalho, AL3; Vettore, AL1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo
Departamento de Patologia, Hospital A.C. Camargo
3
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital do Câncer de Barretos
4
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital A.C. Camargo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Carcinoma Epidermóide de Cabeça e Pescoço, Margens cirúrgicas, Expressão gênica, Segundo tumor primário, Recidiva local
O carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) é uma doença com alta incidência e mortalidade. O
desenvolvimento de recorrências loco-regionais é a principal razão para a falha no tratamento e a presença de
tumor microscópico nas margens cirúrgicas contribui com o aumento da taxa de recorrência local e redução da
sobrevida global. Por isso, a obtenção de margens cirúrgicas livres de tumor é de extrema importância para a
sobrevida livre de doença destes pacientes. A extensão da ressecção cirúrgica é determinada durante a cirurgia
através de exame histológico de tecido congelado corado com Hematoxilina-Eosina (H&E) cuja baixa sensibilidade
não permite a detecção de alterações moleculares que não impliquem em alterações histológicas nas margens. Uma
vez que as alterações genéticas precedem as alterações histológicas, marcadores moleculares podem ser úteis para
identificar células que já tenham iniciado o processo de transformação maligna sem que ainda tenham causado
alterações histológicas. Assim, este estudo verificou a utilidade de marcadores “específicos” para o CECP em
detectar alterações moleculares em 61 margens cirúrgicas com histologia negativa, através de estudo de expressão
gênica por PCR em Tempo Real. Os genes LGALS1, MMP9, MET, PTHLH e TACSTD1 mostraram níveis aceitáveis de
especificidade quando avaliados em amostras normais e estavam frequentemente hiper-expressos nas amostras
tumorais. A análise das amostras de margem cirúrgica encontrou estes genes hiper-expressos em 31%, 25%, 18%,
13% e 10% das amostras avaliadas, respectivamente. Pacientes com hiper-expressão do gene MMP9 nas margens
cirúrgicas desenvolveram, mais frequentemente, segundos tumores primários, enquanto que pacientes que
apresentaram hiperexpressão do gene PTHLH tiveram diminuição significativa da sobrevida livre de doença local.
Estes resultados mostram a possível utilidade da análise molecular das margens cirúrgicas como uma ferramenta
para identificar e monitorar subgrupos de pacientes com um risco elevado de desenvolvimento de segundos
tumores primários e de recidivas locais, assim como para a escolha do tratamento adjuvante mais adequado.
Apoio financeiro: Fapesp
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
91
Avaliação da expressão das Polo-like quinases e
inibição com o BI2536 em Gliomas
Pezuk, JA1; Brassesco, MS2; Morales, AG1; Oliveira, JC1; Queiroz, RP2; Suazo, VK2; Machado, HR3; Carlotti
Jr, CG3; Scrideli, CA2; Tone, LG1,2
Departamento de Genética
Departamento de Puericultura e Pediatria
3
Departamento de Cirurgia e Anatomia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Email: [email protected]
1
2
Palavras-chave: Gliomas, Polo-like quinase, expressão gênica, ciclo celular, linhagem celular.
Os gliomas são os tumores mais comuns do sistema nervoso. Segundo a Organização Mundial de Saúde estão
subdivididos em Astrocitoma Pilocítico (grau I), Astrocitoma Difuso (grau II), Astrocitoma Anaplásico (grau
III) e Glioblastoma (grau IV). Esta classificação reflete o comportamento biológico do tumor e estima o grau de
severidade do mesmo. Os gliomas de alto grau estão caracterizados por uma alta heterogeneidade celular e genética,
e ausência de delimitação anatômica o que faz destes tumores uns dos mais difíceis de tratar. As Polo-like quinases
(PLK1, PLK2, PLK3 e PLK4) pertencem a uma família de quinases serina/treonina, as quais desempenham papéis
fundamentais no controle da progressão do ciclo celular. O objetivo deste trabalho foi determinar a expressão
das PLKs em 9 linhagens celulares (7 Grau IV, 1 grau II e 1 grau I) e 8 amostras de pacientes (5 grau IV e 3 grau I)
comparando-as com um pool de 4 substâncias brancas extraídas de tecido não neoplásico. Concomitantemente, foi
analisado o efeito do inibidor especifico de PLKs, o BI2536, na eficiência da formação de colônias e na proliferação
celular em combinação ou não com temozolomida em 2 linhagens celulares (T98G e SF188). A avaliação da
expressão das PLKs foi analisada pela técnica de PCR em tempo real. O teste de proliferação foi realizado utilizando
o método XTT em quatro tempos (24, 48, 72 e 96hs) e o ensaio clonogênico foi obtido por meio da coloração com
Giemsa. Todos os genes PLKs apresentaram expressão alterada em todas as linhagens e amostras estudadas. O
gene PLK1 foi encontrado com expressão aumentada (mais de 5 vezes) em todas as linhagens e amostras. PLK2
estava hiperexpresso em 5 linhagens e hipoexpresso em 2 amostras. O Plk3 teve sua expressão aumentada somente
em 1 amostra, mas foi encontrado diminuído em 5 linhagens e 3 amostras. PLK4 apresentou hiperexpressão em 3
linhagens e 1 amostra. Os resultados in vitro, mostraram que BI2536 inibe a proliferação celular em concentrações
tão baixas quanto 50nM (p<0.001) em todos os tempos, e que em combinação com temozolomida (250µM) o efeito
de inibição foi maior (p<0.001). A inibição com BI2536 reduziu a formação de colônias em concentrações de 5 nM
(p<0.001). Estes resultados sugerem que as PLKs poderiam ser utilizadas como alvos terapêuticos em combinação
ou não com outras drogas, com o intuito de melhorar o tratamento destas neoplasias. No entanto, mais estudos
devem ser realizados para validar estes dados.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
92
Perfil de expressão do gene GDF15 em linhagens
celulares de glioblastoma
Andrade, AF1; Moreno, DA1; Silveira, VS2; Queiróz, RGP2; Scrideli, CA2; Tone, LG1, 2
Departamento de Genética
Departamento de Puericultura e Pediatria, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP,
Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: glioblastoma, RQ-PCR, GDF15, expressão gênica, linhagens celulares
Tumores astrocíticos são os tumores cerebrais mais frequentes em crianças e adultos e representam um grupo
heterogêneo de neoplasias que podem diferir em sua progressão e localização dentro do sistema nervoso central,
assim como em seu potencial de crescimento e invasão. O glioblastoma multiforme (astrocitoma grau IV de
acordo com a Organização Mundial de Saúde) pode se desenvolver sem nenhuma evidência de lesões precursoras
(primário) ou a partir de astrocitomas de grau II ou III (secundário) e acomete mais frequentemente adultos.
Apesar dos esforços para o desenvolvimento de novos modelos terapêuticos, o glioblastoma apresenta um
comportamento extremamente maligno, bem como uma alta taxa de mortalidade, com média de sobrevivência
que raramente excede 12 meses. O padrão de expressão gênica pode fornecer informações importantes
relacionadas com as alterações moleculares que levam ao estabelecimento e à progressão desses tumores,
permitindo assim a identificação de novos alvos terapêuticos. Em estudos preliminares, nosso grupo descreveu
o perfil de expressão gênica de diversos genes em amostras de glioblastoma primário e dentre eles destacou-se
o gene GDF15 que apresentou-se hiperexpresso quando comparado com o controle (substância branca normal).
Outros estudos descritos pela literatura indicam a possível associação entre a expressão do gene GDF15 e o
processo de tumorigênese, demonstrando sua hiperexpressão em diversos tipos de neoplasias como câncer de
mama, coloretal e principalmente em câncer de próstata. Além disso, a hiperexpressão do gene tem sido associada
com alterações genéticas clássicas como a deleção do PTEN e TP53 e a hiperexpressão do gene EGFR. Tendo em
vista a importância do gene GDF15, o presente trabalho teve por objetivo avaliar a sua expressão em diversas
linhagens celulares de glioblastoma (LN319, SF188, T98G, U251, U343 e U87) e meduloblastoma pediátrico
(UW402 e UW473). As linhagens celulares foram cultivadas em meio HAMF10 suplementado com SBF (10%) e
posteriormente submetidas à extração de RNA e à síntese de cDNA. A análise do perfil de expressão foi realizada
por RT-PCR quantitativa, utilizando-se o reagente SYBR GREEN®. Como gene de referência endógena foi utilizado
o gene HPRT e como calibrador foi utilizado uma amostra de substância branca normal. A análise demonstrou um
perfil de hiperexpressão do gene GDF15 nas linhagens SF188, T98G, U251 e U343, que apresentaram uma expressão
média de 170 vezes maior em relação à amostra controle. Estes resultados reafirmam os dados encontrados
anteriormente e agrega conhecimentos fundamentais sobre o perfil de expressão deste gene nas linhagens celulares
estudadas. Além disso, esses dados contribuem para a realização de ensaios subseqüentes in vitro, que poderiam
esclarecer a participação do gene GDF15 nos mecanismos moleculares envolvidos na patogênese do glioblastoma.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP e FAEPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
93
Expressão de genes de antígenos tumorais em células
tímicas epiteliais medulares (mTECs)
Rostock, ACM1; Macedo, C1; Passos, GAS1
Laboratório de Imunogenética Molecular - Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: expressão gênica, timo, antígenos tumorais, câncer, células tímicas epiteliais medulares.
Introdução: Os dois subconjuntos de células tímicas epiteliais (TECs) que são as corticais (cTECs) e as medulares
(mTECs), definem dois compartimentos do timo : córtex e a medula. A medula tímica impõe a tolerância das
células T ao repertório nascente por meio da seleção negativa de timócitos auto-reativos. O timo é o principal
local de indução de tolerância aos antígenos relacionados a tecidos (TRAs) cuja função está relacionada à expressão
gênica promíscua desses TRAs. Neste processo, os timócitos são apresentados aos TRAs pelas células mTECs, e os
clones auto-reativos são eliminados por apoptose, o que leva à tolerância imunológica ao próprio. Mas as células
mTEC também podem expressar genes de antígenos tumorais. O nível de expressão desses genes no timo pode ter
conseqüências na tolerância/reatividade imune contra o câncer. Os objetivos desse estudo é o de avaliar se células
tímicas mTEC expressam genes de antígenos tumorais. Os resultados contribuirão com um melhor entendimento
das bases genético-moleculares da tolerância ou resposta imune contra o câncer. Métodos: Células murinas mTEC
3.10 foram cultivadas até a confluência em meio RPMI-1640 10% SFB em atmosfera de 5% CO2 a 37OC. O RNA total
foi extraído com o kit mirVana PARIS ® (Ambion) e o controle de qualidade foi realizado por espectrofotometria UV
e micro-eletroforese num bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies). As amostras serviram como molde
para síntese de cDNA utilizando a enzima transcriptase reversa SuperScript (Invitrogen). Os genes que codificam
antígenos tumorais no camundongo M. musculus selecionados foram: Cav1, Igf1r, Folh1, Trip6 e Mmp11 além dos
constitutivos Hprt e Gapdh. Os primers reverse e forward para reações de qRT-PCR foram desenhados com o uso do
software Primer 3 (http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi) observando a localização em éxons
diferentes. As reações de qRT-PCR foram realizadas em triplicata amostral num equipamento 7500 Real Time PCR
System (Applied Biosystems) utilizando SYBR® Green. O teste estatístico One-way ANOVA foi utilizado para a análise
da significância estatística dos dados usando o programa estatístico GrphPad Prism 4.0 (http://graphpad.com/prism/
prism.htm). Resultados: Observamos expressão significativa em células mTEC 3.10 dos genes de antígenos tumorais
Trip6, Mmp11, Cav1 e Igf1R com exceção do gene Folh1 que não é expresso nessas células. Comparativamente, o
gene Trip6 apresentou o maior nível de expressão, seguido pelo gene Cav1. Os genes com menores níveis de expressão
foram Igf1R e Mmp11, respectivamente. Conclusões: Células tímicas mTEC apresentam expressão diferencial de
genes que codificam antígenos tumorais. O perfil diferencial observado pode ter conseqüências na eliminação
de clones de timócitos auto-reativos e conseqüentemente na tolerância ou reatividade imune contra o câncer.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
94
miR-142-3p expression is associated with imatinib
resistance and c-flip anti-apoptotic gene expression in
chronic myeloid leukemia patients
Ferreira, AF1; Simões, BP2; da Silva Júnior, WA3; Silva, IT4; Zanichelli, MA5; Colassanti, MD5; Hamerschlak,
N6; Covas, DT2;4; Kashima, S4; de Souza, AM1; de Castro, FA1
DACTB-Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP
Departamento de Clínica Médica-FMRP-USP
3
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP
4
Centro Regional de Hemoterapia de Ribeirão Preto-HCFMRP-USP
5
Hospital Brigadeiro, São Paulo
6
Sociedade Beneficente Israelita e Brasileira Hospital Albert Einstein, São Paulo
[email protected]
1
2
Keywords: microrna, leucemia mielóide crônica, BCR-ABL, apoptose, mesilato de imatinibe
BACKGROUND: Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative disease characterized by the presence
of the Philadelphia chromosome and Bcr-Abl oncoprotein. Bcr-Abl is a tyrosine kinase (TK) with a deregulated
activity which results in leukemic cells proliferation and apoptosis resistance. miRNAs are small non-protein-coding
molecules which regulate gene expression at the translational level and have essential roles in cell differentiation,
proliferation and apoptosis. c-flip is an antiapoptotic gene, member of Bcl-2 family, that has been reported as miR142-3p target. This microRNA is also observed underexpressed in myeloid lineages, indicating the significance of
miRNAs in human hematopoetic diseases. AIMS: 1) To verify miR-142-3p and c-flip expression in healthy subjects
(controls), CML patients in different phases of the disease, in patients who achieved complete cytogenetic response
(CCR) and imatinib (IM) resistant. 2) To correlate c-flip mRNA levels with miR-142-3p expression in CML patients.
METHODS: CML patients’and healthy subjects’ peripheral blood mononuclear cells (PMBC) were submitted to
RNA extraction by trizol method and reverse transcription was performed with specified primers RT stem loop
for miR-142-3p. TaqMan Universal PCR master mix kit was used for miR-142-3p expression assay at ABIPRISM
7500 Real Time PCR. SYBR Green PCR master mix kit was used for c-flip expression assay. The miR-142-3p and
c-flip expressions were given as 2-ddCt. Kruskal-Wallis (Dunns post-test) and Mann-Whitney tests were used for
statistical analysis. RESULTS: CML patients, in chronic (median=0.95) and advanced phases (median=1.08)
presented lower miR-142-3p expression when compared to control group (median=3.48). However, no difference in
miRNA levels was observed among patients in chronic and advanced phases of disease. miR-142-3p was decreased
in CML patients resistant to IM (median=0.66) when compared to patients who achieved CCR (median= 1.48);
(p=0.04). c-flip mRNA levels were higher in CML patients (median=6.77 and 3.00, in chronic and advanced phases,
respectively) in comparison to control group (median=1.00). CONCLUSIONS: miR-142-3p might be regulated by
Bcr-Abl once its expression was lower in CML patients than in controls. miR-142-3p expression was associated
with IM response. We speculate that miR-142-3p can modulate c-flip expression in IM resistant CML patients.
Supported by FAPESP: 06-50094-8 and 08-52049-5
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
95
Sequence analysis to find microRNAs binding sites in
HLA-G 3´UTR region
Navarro, FN1; Evangelista, AF1; Massaro, JD2; Martelli-Palomino, G2; Castelli, E2; Passos, GAS1; Guiliatti, S3;
Donadi, EA2
Molecular Immunogenetics Group, Department of Genetics, Faculty of Medicine USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil
Division of Clinical Immunology, Department of Medicine, School of Medicine USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil
3
Laboratory of Bioinformatics, Department of Genetics, Faculty of Medicine USP, Ribeirão Preto, SP, Brazil
[email protected]; [email protected]
1
2
Keywords: HLA-G, Bioinformatic, microRNAs, 3’ untranslated region, MFE <= -30kcal/mol
HLA-G is a non-classical molecule of MHC complex, which is envolved in several developmental and pathogenic
processes. It has been previously reported by our group that microRNAs have allele-specific targeting for the 3’
untranslated region (3’UTR) of the HLA-G. MicroRNAs represent a novel class of endogenous ~22-nucleotide
non-coding RNAs that negatively regulate gene expression by inhibiting translation of target mRNAs. Given that
HLA-G has immunomodulatory properties, the understanding of the HLA-G gene regulation spanning a larger
downstream region from, and including it, HLA-G 3’UTR is necessary. The objective of this study was to perform a
sequence analysis of 2Kb downstream from stop codon, including HLA-G 3’UTR region, to find the binding sites of
microRNAs. The methodology used was (i) Retrieved the sequences from NCBI and EBI databases. (ii) Databases:
Miranda, Pictar, miRBase, Mirtarget2, Tarbase and Targetscan to find microRNAs targeting HLA-G. (iii) By using
these microRNAs and other previously found by our group, we used the RNAhybrid software for alignment. We
have selected only microRNAs with MFE <= -30kcal/mol. (iv) MySQL database curate results returned the best 92
microRNAs including hsa-miR-324-3p, hsa-miR-483, hsa-miR-518b, hsa-miR-370, hsa-mir-296 and hsa-miR-324-5p,
which can bind to HLA-G 3’UTR. Finally microRNAs were positioned in their respective binding sites considering
polymorphic and non-polymorphic HLA-G regions.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
96
Expressão do miRNA no desenvolvimento do câncer
de próstata. Da neoplasia intra-epitelial prostática a
metástase
Piantino, C1; Tomiyama, A1; Reis, ST1; Sousa-Canavez, J2; Sañudo, A1; Dall’Oglio, M1; Pontes Jr., J1; Srougi,
M1; Leite, KRM1
Laboratório de Investigação Médica da Disciplina de Urologia – LIM 55, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Genoa Biotecnologia, São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer de próstata, miRNA, Marcadores Moleculares, Prognóstico
Introdução – O processo de carcinogênese do câncer de próstata (CaP) tem sido estudado há muitos anos, e
algumas anormalidades tem sido descritas. A metilação de GSTP1, translocação de TMPRSS2-ETS e a reativação da
telomerase são descritas na transição da neoplasia intra-epitelial prostática de alto grau para o câncer invasivo. Outros
genes comumente alterados na maioria dos cânceres atuam somente em estágios avançados do CaP como PTEN,
p53, c-myc e Her2/neu. miRNAs são pequenas moléculas não codificantes responsáveis pelo controle da expressão
de mais de um terço dos genes humanos. Eles estão em sua maioria, localizados em locais do DNA suscetíveis a
amplificação, deleção e translocação. O objetivo deste trabalho é identificar o perfil dos miRNAs relacionados com o
desenvolvimento do CaP a partir da neoplasia intra-epitelial prostática de alto grau para o câncer invasivo. Materiais
e Métodos – Foram analisadas 15 amostras de pacientes com neoplasia intra-epitelial prostática de alto grau, 14
com CaP de baixo risco (Gleason ≤6, pT2), 34 com CaP de alto risco (GS≥7, pT3), 6 metástases e linhagens celulares
de CaP . O nível de expressão de 14 miRNAs foi avaliado através de PCR em tempo real . Os miRNAs analisados foram
os seguintes: miR-100, miR-143, miR-145, miR-146a, miR-15a, miR-16, miR-191, miR-199, miR-206, miR-21, miR-218,
miR-25, miR-32 and miR-let7c. Resultados – Alterações significantes na expressão dos miRNAs, miR-100, miR-146,
miR-16 e miR-21 foram observadas nas amostras de neoplasia intra-epitelial prostática de alto grau e nas de CaP de
baixo risco. Observou-se superexpressão na neoplasia intra-epitelial prostática de alto grau e sub-expressão durante
a transição do CaP de alto risco para o metastático. miR-143, miR-145 e miR-let7c mostraram-se progressivamente
subexpresso na transição do CaP de alto grau para o metastático. Somente miR-206 apresentou alterações na
expressão do CaP de baixo para alto risco e do CaP de alto risco para o metastático. Conclusão – Demonstramos
diferentes perfis de expressão dos miRNAs na carcinogênese do CaP, a maior delas durante a transição da neoplasia
intra-epitelial prostática de alto grau para o CaP de baixo risco, e do CaP de alto risco para o metastático. A
identificação de genes-alvos controlados por esses miRNAs pode esclarecer importantes eventos responsáveis pelo
desenvolvimento e progressão do CaP permitindo a descoberta de novos marcadores de prognóstico e terapia-alvo.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
97
RNAs não-codificadores intrônicos longos
correlacionados com carcinogênese e sobrevida em
câncer de rim
Fachel, AA1; Tahira, AC1; Maracajá-Coutinho, V1; Gimba, ERP2; Vignal, GM2; Campos, FS2; Louro, R1; Reis,
EM1; Verjovski-Almeida, S1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, SP
Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro, RJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: RNAs não-codificadores de proteína, transcritos intrônicos, expressão gênica, microarranjos, câncer de rim, marcadores moleculares.
Modificações transcricionais associadas à carcinogênese e à progressão do câncer de rim ainda não foram
completamente elucidadas. Além dos oncogenes e genes supressores de tumor, RNAs não-codificadores (ncRNAs)
recentemente foram apontados como importantes reguladores da expressão gênica em humanos, e podem ter um
papel importante na transformação maligna do câncer de rim. O carcinoma de célula renal (RCC) subtipo célula clara
é o câncer mais letal e prevalente do sistema urinário. O diagnóstico deste tipo de câncer frequentemente é tardio
em conseqüência da falta de sintomas perceptíveis aos pacientes. Para analisar a expressão gênica de ncRNAs e de
genes codificadores para proteína foram utilizados dois microarranjos desenvolvidos por nosso grupo, enriquecidos
em sondas para ncRNAs. Uma das plataformas possui 4 mil sondas de cDNA, das quais 822 sondas são para
ncRNAs mapeando em regiões intrônicas. Outra possui 44 mil elementos e combina sondas de oligonucleotídeos
(60-mer) intrônicas e exônicas de um mesmo locus genômico. Análises estatísticas foram feitas com a ferramenta
Significance Analysis of Microarrays (q ≤ 0,05) combinadas ou com a técnica de “patient leave-one-out” (genes com
presença em 100% dos subconjuntos), ou alternativamente com o teste discriminante de Golub (p ≤ 0,01 ou p < 0,05).
Com a plataforma de 4 mil sondas foram estudadas 28 amostras de tecido renal de 14 pacientes com RCC subtipo
célula clara. Um conjunto de 35 ncRNAs foi identificado como diferencialmente expresso entre amostras tumorais
e não-tumorais. Uma assinatura de 208 genes codificadores de proteínas foi identificada, indicando possíveis
novos marcadores moleculares. Uma análise estatística supervisionada com dados de 16 pacientes identificou
uma assinatura de ncRNAs correlacionada com sobrevida de 5 anos, formada por 27 ncRNAs com significativa
expressão alterada em pacientes livres da doença em comparação com pacientes que morreram em função da
doença. Uma assinatura de 64 genes codificadores de proteínas também foi identificada como significativamente
correlacionada com o acompanhamento clínico dos pacientes. Com a plataforma de 44 mil sondas foram analisados
17 pacientes, com amostras pareadas de tecido renal tumoral e não-tumoral agrupadas em 8 pools, sendo 4 de
amostras tumorais e 4 de não-tumorais. Um conjunto de 66 ncRNAs parcialmente intrônicos antisenso e outro de
52 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso foram identificados como diferencialmente expressos. Identificamos
um subconjunto de 28 ncRNAs totalmente intrônicos antisenso e senso cuja expressão do gene codificador de
proteína do mesmo locus estava simultaneamente alterada. Estes dados apontam para possíveis redes de regulação
da expressão gênica dos ncRNAs em câncer. A extensa lista de ncRNAs e de genes codificadores para proteína
identificados neste estudo podem ser promissores marcadores moleculares de carcinoma renal subtipo célula clara.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
98
MicroRNA let-7b is downregulated in the retina of
diabetic rats
Sousa, TA1; Silva, VAO1; Mitsuo, K2; Paula-Gomes, S1; Tragante, V1; Zanon, NM1; Wang M2; Kettelhut, IC1;
Natarajan R2; De Lucca, FL1;
Faculdade de Medicina-USP, Ribeirão Preto, SP
Beckman Research Institute of City of Hope, Duarte, CA, USA
[email protected]
1
2
Keywords: microRNA, Diabetes mellitus, Diabetic retinopathy, let-7b, Akt.
Introduction and objective: MiRNAs are endogenous non-coding RNAs (21-25 nucleotides) that regulate gene
expression via specific sites at the 3’-untranslated region (3’-UTR) of target mRNAs, causing translational repression
or mRNA degradation. It has been estimated that miRNAs regulate approximately 30% of human genes. During
recent years, miRNAs have emerged as important regulators of a variety of biological processes as well as human
diseases. It is known that diabetes mellitus is a chronic condition that can lead to complications over time. Diabetic
retinopathy is one of the most common complications of diabetes, but the molecular mechanisms underlying this
ocular pathology are only partly understood. The serine/threonine protein kinase Akt is involved in a variety of
cellular processes including cell proliferation, survival, metabolism and gene expression. In the retina, Akt promotes
vascular endothelial growth factor (VEGF)-mediated angiogenesis contributing for the establishment of retinopathy.
Our in silico analysis indicated that Akt1 is a potential target of let-7b. Thus, we investigate the expression of let7b in the retina of diabetic rats and we also carried out experiments to validate Akt1 as a mRNA target. Methods:
Retinas were obtained from normal and diabetic rats (n=6) at 1, 6, 10, 15, 22, 28 and 35 days after intravenous
injection of streptozotocin (STZ). Expression of mature let-7b was evaluated by real-time RT-PCR. The luciferase
assay was performed using a psiChek-2 vector with the Akt1 3’UTR (or Akt1 3’UTR mutated at seed region) cloned
downstream Renilla luciferase gene before poliA site. Rat myoblast cells (L6) were used for transfection experiments.
The endogenous expression of Akt of L6 cells transfected with let-7b mimic was evaluated by Western blot and realtime PCR. Results and conclusions: We found that let-7b is downregulated (>50%) in the retina of diabetic rats after
22 and 28 days of STZ injection when compared with control animals. The results of luciferase assay indicate that
let-7b interacts directly with the 3’UTR of Akt-1 mRNA, demonstrating that Akt-1 is a direct target of let-7b. This
relevant finding was confirmed by inhibition of Akt-1 endogenous expression in the L6 cells transfected with let7b mimic. Our results suggest that let-7b acts protecting against VEGF-mediated angiogenesis in diabetic retina
and the intravitreal injection of let-7b mimic could be a novel therapeutic strategy for the diabetic retinopathy.
Supported by: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
99
SRC (Small RNA para Cancer): banco de dados de
pequenos RNA não-codificante relacionados ao
desenvolvimento do câncer em humano
Cruz, AMP1,2; Paradela, LS1; Ribeiro-dos-Santos, A1,2; Darnet, S1
Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
Laboratório de Biologia Computacional, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
2
Palavras-chave: pequenos RNA não codificantes, classes, banco de dados, câncer.
Inúmeros estudos experimentais e computacionais vêm revelando diversos transcritos que não codificam
proteínas (ncRNA). Precursores de RNA não codificantes de pequeno tamanho estão envolvidos em funções
importantes como no desenvolvimento e diferenciação celular, na expressão gênica e na patogênese de algumas
doenças, como o câncer. Nos últimos dois anos, com o desenvolvimento de plataformas de análises genéticas de
nova geração, o acesso as análises do transcriptoma completo de humano permitiu quantificar a expressão dos
RNA de pequeno tamanho, bem como identificar novas classes destes expressos. Nestas entidades, há cerca de
40.000 seqüencias com expressão diferencial entre tecidos normais e tumorais. Paralelo ao estudo funcional dos
RNAs de pequeno tamanho, surgiu a necessidade de catalogar entidades e suas classes, bem como comparar sua
distribuição nos tecidos humanos, uma vez que os bancos de dados disponíveis encontram-se desatualizados
ou incompletos. No presente trabalho, pretende-se estabelecer um banco de dados atualizado destinado ao
conhecimento e localização de pequenas entidades de ncRNA nos diversos tecidos humanos. Para isso os dados
foram minerados nos bancos de dados de bioinformática pré-existente (NONCODE V.2, RNAdb, miRBase ), na
literatura e em análise de seqüenciamento em plataformas de nova geração. Como resultado, observou-se 37
classes de ncRNA catalogadas nos bancos de dados em 2007, sendo acrescidas nos últimos três anos, de mais 11
novas classes validadas experimentalmente e descritas na literatura e duas (2) subclasses pertencentes a snoRNA.
Embora estas novas categorias de RNAs de pequeno tamanho tenham sido identificadas, seus papéis ainda
permanecem desconhecidos na carcinogênese.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
100
Efeito do hormônio andrógeno sobre a transcrição
de RNAs não codificadores intrônicos em linhagem
tumoral de próstata
Beckeddorff, FC; Moreira,YB; Oliveira, ACA; Verjovski-Almeida, S
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, 05508-900 São Paulo, SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: regulação da expressão gênica, RNA não-codificador, próstata, microarray, andrógeno.
Trabalhos recentes têm revelado que uma porção significativa das mensagens transcritas dos organismos superiores
é composta por longos RNAs que tem pouco ou nenhum potencial codificador. Estes são denominados RNAs nãocodificadores (ncRNAs) e muitos deles são transcritos de regiões intrônicas e intergênicas do genoma. Tem sido
postulado que, possivelmente, desempenham papéis específicos na célula, mas até agora pouco elucidados. Assim,
neste trabalho nós investigamos o perfil de expressão temporal de alguns ncRNAs intrônicos regulados por andrógeno,
em uma linhagem de adenocarcinoma de próstata metastático (LNCaP), através de hibridização do RNA extraído
das células em cultura em oligoarrays intron-exon de 44k. Foi realizado o tratamento com o hormônio (teste) ou seu
veículo (controle), cada um em duas culturas independentes de LNCaP, e uma validação do tratamento foi realizada
por qRT-PCR utilizando primers específicos para transcritos codificadores e não-codificadores de proteínas, já
descritos na literatura como regulados por andrógeno. A hibridização foi realizada com 7 tempos selecionados (0,
1, 3, 6, 12, 18 e 24 hrs), totalizando 28 amostras. Nas análises, encontramos 869 genes diferencialmente expressos
usando SAM (Significance Analysis of Microarrays), com taxa de falsos positivos menor ou igual a 0,5%. Destes,
771 (88,7%) e 98 (11,3%) são transcritos que mapeiam no genoma em regiões de genes codificadores de proteínas e
ncRNAs intrônicos, respectivamente. A fim de encontrar possíveis ncRNAs candidatos reguladores da transcrição
do gene codificador de mesmo lócus, buscamos por transcritos codificadores de proteína e não codificadores
diferencialmente expressos com expressão oposta no mesmo lócus. Interessantemente encontramos uma fração de
21 pares de transcritos com direção oposta, o que aponta para uma possível regulação do gene codificador de proteína
pelo ncRNA. Alguns trabalhos, na literatura e em nosso grupo, têm indicado que ncRNAs intrônicos antisenso ao
gene codificador de proteína podem afetar a regulação do splicing alternativo no mesmo lócus como aqui indicado.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
101
Comparação do Padrão da Expressão Gênica em
Linhagens Celulares Leucêmicas com e sem o
Fenótipo de Resistência a Múltiplas Drogas
Bagni, C1,2; Pinho, MB3; Pinto-Silva, FE4; Rumjanek, VM4; Moreira, MAM1
Divisão de Genética, Centro de Pesquisa, INCA, RJ
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ, RJ
3
Laboratório de Bioinformática e Biologia Computacional, Divisão de Pesquisa Clínica, Centro de Pesquisa, INCA, RJ
4
Instituto de Bioquímica Médica, UFRJ, RJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: expressão gênica, resistência a múltiplas drogas, MDR, microarray, linhagens leucêmicas.
O fenótipo de Resistência a Múltiplas Drogas (MDR) confere às células mecanismos de resistência simultânea a
diferentes agentes citotóxicos não relacionados, resultando na incapacidade da droga em induzir a morte celular,
permitindo que células tumorais sobrevivam, afetando a resposta dos pacientes ao tratamento quimioterápico.
Existem múltiplos mecanismos que contribuem para este fenótipo: falha na regulação da apoptose, aumento
na detoxificação intracelular, alteração no reparo de danos ao DNA, e ativação ou superexpressão de proteínas
transportadoras de drogas. Neste trabalho procuramos compreender os mecanismos de desenvolvimento de
resistência a múltiplas drogas de maneira global, utilizando a metodologia dos microarranjos de DNA. Foi feita uma
análise comparativa da expressão global entre três linhagens celulares leucêmicas: duas linhagens MDR (Lucena,
selecionada com vincristina e FEPS, selecionada com daunorubicina) e uma linhagem sensível parental (K562).
Utilizando a plataforma Affymetrix, o RNA total das linhagens foi hibridado em microarranjos de oligonucleotídeos
e os dados de expressão gênica foram analisados através do programa R e a classificação da ontologia gênica
pelo software Ingenuity Pathway Analysis. Quando comparadas à linhagem parental, Lucena apresentou 130
genes diferencialmente expressos (65 induzidos e 65 reprimidos) e FEPS apresentou 932 genes diferencialmente
expressos (288 induzidos e 644 reprimidos). Ao comparar as linhagens resistentes entre si, cultivadas na presença e
ausência de droga, nenhum gene mostrou-se diferencialmente expresso. Entre Lucena e FEPS foi possível observar
1211 genes diferencialmente expressos, 459 induzidos e 752 reprimidos em FEPS. O gene diferencialmente
expresso com maior valor absoluto de expressão nas comparações entre as linhagens MDR e a linhagem parental
foi MDR1, o gene que codifica Pgp, principal mecanismo relacionado ao fenômeno MDR, confirmando os
fenótipos das linhagens resistentes já descritos na literatura. As vias funcionais que mais se destacaram entre os
genes diferencialmente expressos em Lucena e FEPS foram: morte celular (apoptose), desenvolvimento celular,
crescimento celular e proliferação, e ciclo celular, que são vias relacionadas à viabilidade e sobrevivência celular.
Apoio Financeiro: Ministério da Saúde, CNPq, FAPERJ, FAF, Convênio INCA/FIOCRUZ e Swiss Bridge Foundation.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
102
Perfil da Expressão Gênica Global em
Leiomiossarcomas e Sarcomas Pleomórficos
Villacis, RAR1; Silveira, SM1; Cunha, IW2; Soares, FA2; Rogatto, SR1,3
Departamento de Pesquisa, Fundação Antonio Prudente, Hospital AC Camargo, São Paulo, SP
Departamento de Anatomia Patológica, Fundação Antonio Prudente, Hospital AC Camargo, São Paulo, SP
3
Departamento de Urologia, FMB, UNESP- Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sarcoma pleomórfico, leiomiossarcoma, expressão gênica, microarrays, marcadores moleculares.
Os sarcomas pleomórficos (SP), anteriormente denominados de “Fibrohistiocitomas Malignos” (FHM), são
neoplasias raras que apresentam comportamento altamente agressivo, com taxas elevadas de recorrência
e metástase. O diagnóstico destes tumores é realizado por exclusão e, atualmente considera-se que os SP não
representam uma entidade tumoral única, mas um grupo heterogêneo de tumores pobremente diferenciados sem
uma linhagem específica, que inclui variantes de leiomiossarcomas (LM), lipossarcomas e fibrossarcomas. A despeito
disso, dados citogenéticos e moleculares se mostram inconsistentes, limitando sua utilização na identificação de
marcadores genéticos em SP. O objetivo deste estudo foi avaliar o perfil de expressão gênica em larga escala em
um grupo de sarcomas com características histológicas semelhantes (sarcomas pleomórficos e leiomiossarcomas)
e correlacionar os resultados da pesquisa com os achados clínico-patológicos a fim de identificar marcadores
prognósticos e diagnósticos. O perfil de expressão gênica foi avaliado utilizando-se a plataforma Whole Human
Genome 4x44K (Agilent) em 12 amostras de LM e oito de SP. O teste estatístico Significance Analysis for Microarray
(SAM) com 1000 permutações e FDR=0 foi utilizado para identificar os genes diferencialmente expressos entre os
grupos tumorais. Para avaliação de agrupamentos utilizou-se o Hierarchical Clustering com suporte, utilizando a
Correlação de Pearson. Análises supervisionadas e não supervisionadas dos dados mostraram dois grupos distintos,
entretanto, quatro sarcomas pleomórficos foram agrupados entre os LM. Desses quatro sarcomas pleomórficos,
um provavelmente correspondia a uma mestástase de LM também avaliado neste estudo, e que pela análise de
expressão gênica mostrou padrão semelhante. Dois SP apresentaram morfologia de padrão mixóide e não com
característica pleomórfica e o último apresentou uma morfologia mais típica e ficou agrupado entre os SP. A
análise supervisionada mostrou 25 genes diferencialmente expressos que separavam o grupo composto apenas de
SP do grupo composto de SP e LM. Destes genes, 12 têm como função zinc ion binding e um está relacionado com
diferenciação muscular (TPM3). Todos os genes que diferenciavam os dois grupos fazem parte de vias relacionadas
a câncer. Estes achados poderão contribuir para a descoberta de novos marcadores diagnósticos ou terapêuticos .
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
103
Fatores de transcrição identificados por metanálise de
microarranjos de cDNA em glioblastoma
Donaires, FS1; Puthier, D3,4; Sakamoto-Hojo, ET1,2
Departamento de Genética – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
Departamento de Biologia – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP., Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil
3
Inserm U928, TAGC, Parc Scientifique de Luminy, Marseille
4
ESIL, Université de Provence et de la Méditerranée, Marseille, França
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microarranjos, metanálise, assinaturas de expressão, glioblastoma, fatores de transcrição.
A tecnologia de microarranjos de cDNA tem sido amplamente aplicada a diversas situações experimentais em
escala genômica, nas quais se pretende estudar os níveis de expressão de milhares de genes simultaneamente,
incluindo o estudo de doenças como o câncer, gerando grande quantidade de dados. Nesse contexto, análises
integrativas, como a metanálise, em que vários experimentos de microarranjos são analisados conjuntamente,
proporcionam uma nova abordagem capaz de extrair informações complementares dos dados. Algumas análises
integrativas têm por alvo o estabelecimento de relações entre os genes diferencialmente expressos, associando-os,
por exemplo, a fatores de transcrição (FTs) que são reguladores comuns desses genes. Essa abordagem aplicada ao
câncer permite reduzir assinaturas complexas de expressão em pequenos números de elementos transcricionais
ativados, auxiliando a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento neoplásico, além de fornecer alvos
potenciais de intervenção terapêutica. Assim, o objetivo deste trabalho foi realizar uma metanálise a partir de um
conjunto de dados de glioblastoma (obtido no GEO, uma base de dados pública de experimentos de microarranjos
do NCBI – identificador GSE4290), comparando-o a um banco de dados e associando os genes significativamente
modulados a FTs em comum. O conjunto de dados utilizado refere-se a um estudo comparativo entre diferentes
tipos de glioma. Utilizou-se as amostras de glioblastoma (81 amostras) e um grupo controle (constituído por
23 amostras de tecido cerebral de pacientes com epilepsia). O método estatístico SAM foi aplicado aos dados,
gerando uma lista de 1830 genes diferencialmente expressos (p ≤ 0,05). Essa lista de genes foi utilizada para a
realização de uma análise enriquecida. Por meio do teste exato de Fisher, a lista de genes foi comparada com toda
a base de dados (incluindo experimentos com outros tipos de tumores e doenças), com o intuito de encontrar as
assinaturas de expressão mais relacionadas à lista inicial. Foram obtidas 7913 assinaturas (p ≤ 0,01), centenas das
quais eram provindas de conjuntos de dados de diferentes tipos de câncer, incluindo glioblastoma. A metanálise
dessas assinaturas foi realizada, focalizando a identificação dos sítios de ligação de FTs comuns aos genes de cada
assinatura. Diversos FTs foram relacionados às assinaturas, dentre eles o HNF1A (já relacionado na literatura a
diabetes e cancer), o IRF7 (relacionado ao processo de resposta imune), e o E2F1 e E2F4 (participantes no controle
do ciclo celular, também apontados como relacionados a diversos tipos de cancer, inclusive glioma), além de
outros FTs como ELK1, GABPA, IRF1, IRF2, ELF1, MYC e XBP1. Os FTs preditos nessa análise podem desempenhar
um importante papel nos mecanismos moleculares envolvidos nas respostas celulares do glioblastoma, sendo
potenciais biomarcadores para a doença. Esses resultados apresentam-se relevantes e podem fornecer subsídio
para estudos futuros relacionados principalmente à validação de biomarcadores e intervenção terapêutica.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP, FAEPA (FMRP-USP).
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
104
Superoxide anion modulates dnmt1 level via Ras/MEK/
ERK pathway during melanocyte malignant transformation
associated with sustained anchorage blockade
Molognoni, F1; Melo, FHM1; Morais, AS1; Batista, W2; Monteiro, HP2; Jasiulionis, MG1
Disciplina de Farmacologia
Centro Interdisciplinar de Terapia Gênica; Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Superoxide anion, DNA methylation, Ras, oxidative stress, DNMT1
A transformation model of murine melanocytes was developed in our laboratory. In this model, melanoma cell
lines were obtained after submitting a nontumorigenic melanocyte lineage, melan-a, to sequential cycles of
anchorage blockade. Our group has already showed increased global DNA methylation as well increased dnmt1
(DNA methyltransfase 1) protein levels few hours after melan-a anchorage blockade. Additionally, this increase
seems to be related with high amounts of superoxide anion produced during this process (Campos et al., 2007).
One of the key regulators of oxidative stress is Ras oncogene, once Rac 1, one of its downstream regulators, makes
part of NADPH oxidase multienzymatic complex, one of the superoxide anion sources. Previous works have related
Ras activation with DNA methylation, suggesting that ras activation could silence genes through DNA methylation
(Macleod et al., 1995; Esteller et al., 2000). Therefore, the aim of this work is to study the relation among RAS/MEK/
ERK signaling pathway, oxidative stress and DNA methylation during melan-a anchorage blockade. We showed
that RAS and Erk are already activated 3 hours after melan-a anchorage blockade and treating melan-a cells during
this process with FTI ( farnesil transferase inhibitor) or U0126 (Erk inhibitor) abrogates superoxide anion increase.
Furthermore, global DNA methylation levels decrease during melan-a deadhesion after treating cells with anion
superoxide scavenger (MnTBAP) or FTI. Moreover, dnmt1 protein levels are also decreased after treating melan-a
cells during anchorage blockade with FTI or U0126. RAS/MEK/ERK signaling pathway seems to be regulated
by and regulates superoxide anion production during melan-a anchorage blockade and its activation could be
responsible for the high dnmt1 protein level and changes in global DNA methylation during the loss of cell adhesion.
This aberrant signaling seems to have a significant impact in epigenetic alterations and melanoma genesis in our
model since no malignant transformation is observed when melanocytes pre-treated with the demethylating agent
5AzaCdR before each deadhesion cycle are submitted to sequential cycles of anchorage blockade.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
105
Identificação de perfis diferenciais de metilação do
DNA na endometriose por microarranjos de ilhas CpG
Zimbardi, D1; Fabro, AT2; Monteiro, JP1; Silva, A3; Poppe, AC3; Rogatto, SR4; Abrão, MS3; Rainho, CA1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP – Botucatu
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP – Botucatu
3
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, USP – São Paulo
4
Laboratório Neogene, Departamento de Urologia, Faculdade de Medicina, UNESP - Botucatu e Hospital do Câncer A.C. Camargo, São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: endometriose, epigenética, microarray, ilha CpG, metilação
A endometriose constitui uma doença de etiologia incerta, caracterizada pela presença de tecido endometriótico
fora da cavidade uterina. É uma causa comum de morbidade, atingindo 5 a 10% das mulheres em idade
reprodutiva. A metilação anormal na região promotora de genes específicos e os níveis de expressão alterados
das DNA metiltransferases (DNMTs) compõem o conjunto de evidências recentes indicando a endometriose
como uma doença epigenética. O presente estudo propôs a investigação do perfil diferencial de metilação
do DNA na endometriose, utilizando uma abordagem genômica de alta resolução baseada na metodologia de
microarrays. Foram selecionadas dez amostras pareadas de endométrio eutópico e de endometriose intestinal
profunda: cinco casos foram submetidos ao enriquecimento das sequências não metiladas (digeridos com a
enzima de restrição dependente de metilação McrBC) e nove ao enriquecimento das sequências metiladas
(digeridos com um coquetel de enzimas sensíveis à metilação do DNA AciI, HinP1I, HpyCH4IV e HpaII). Os
ensaios foram realizados em duplicatas totalizando 28 hibridações independentes na plataforma disponível
comercialmente Human CpG Island ChIP-on-Chip Set 244K (Agilent Technologies). Um total de 925 genes
apresentou metilação diferencial (843 hipermetilados e 82 hipometilados), sendo que 55 foram recorrentes em
dois ou mais casos. Vários destes genes exercem funções relacionadas a fatores de transcrição (MSX1, EMX2,
HOXB13, HOXD8 e HOXD9), remodeladores da cromatina (MAD1L1, WDR5 e BCOR) ou regulação do ciclo
celular e/ou apoptose (BMP4). Estes dados indicam que alterações na metilação do DNA são adquiridas durante
o desenvolvimento da endometriose e podem levar à identificação de novos biomarcadores para a doença.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
106
Avaliação do perfil de metilação do gene CLDN7 em
carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço
Nagado, AA; de Carvalho, AC; Carvalho, AL; Vettore, AL
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Paulo
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Hospital do Câncer de Barretos
[email protected]
Palavras-chave: metilação, CECP, CLDN7, MSP, hipermetilação
Introdução: Os carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço (CECP) encontram-se entre os dez tipos
mais freqüentes de neoplasias malignas. A identificação de marcadores moleculares pode contribuir para a
maior compreensão das alterações biológicas associadas a estes tumores. Claudinas (CLDN) são proteínas
transmembrânicas responsáveis pela adesão célula-célula em tecidos epiteliais com expressão alterada em
diversos carcinomas. Análises por IHQ e PCR em tempo real mostraram a proteína CLDN7 hipoexpressa em CECP.
O tratamento de uma linhagem celular com o agente desmetilante 5-aza-citidina levou a re-expressão de CLDN7,
sugerindo que o mecanismo de metilação aberrante pode estar envolvido com a hipoexpressão de CLDN7 em
CECP. Objetivo: O objetivo do presente estudo é avaliar o perfil de metilação do gene CLDN7 em CECP. Resultados:
Através de estudos com linhagens celulares, demonstramos que a metilação do gene CLDN7 está diretamente
associada à perda de expressão gênica. Além disto, análises preliminares, mostraram o CLDN7 metilado em
29% (26/90) das amostras de CECP e em 0% (0/10) das amostras de mucosa normal avaliadas. Conclusão: Estes
resultados sugerem que a metilação aberrante de CLDN7 participa do processo de carcinogênese destes tumores.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
107
Análise do padrão de metilação da região DMRH19 em
pacientes com síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS)
e/ou Tumor de Wilms (TW): comparação entre amostras de
DNA provenientes de sangue periférico e de tumor fresco
Pereira, HS1; Cardoso, LCA1,2; Vargas, FR1,3
Divisão de Genética – Instituto Nacional de Cãncer/INCA
Universidade Federal do Rio de Janeiro/UFRJ
3
Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro/UniRio
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tumor de Wilms, imprinting, metilação, domínio H19, enzimas de restrição.
O TW, tumor renal maligno mais frequente na infância, tem incidência de 1:10.000 afetados. É uma doença
primordialmente esporádica, e que pode se associar a malformações congênitas tais como: síndrome de WAGR,
síndrome de Denys-Drash e BWS. As frequentes alterações de BWS envolvem mudanças no status do imprinting
dos genes IGF2 e H19, presentes em 11p15. Nesta região há um domínio telomérico que apresenta os genes que
sofrem imprinting IGF2, que codifica um fator de crescimento fetal e é expresso somente no alelo paterno, e H19 que
codifica um RNA cuja função ainda é incerta e é expresso somente no alelo materno. A expressão desses genes é
regulada pelo domínio diferencialmente metilado H19 (DMRH19), geralmente metilado somente no alelo paterno.
A perda de imprinting de IGF2 resulta numa aberrante ativação do alelo materno, normalmente não expresso. Esta
ativação ocorre devido à hipermetilação da região DMRH19. A perda da heterozigosidade ou a perda do imprinting
em 11p15 é observada em cerca de 40% dos TWs. Neste trabalho, epimutações constitutivas e somáticas, da região
DMRH19 foram investigadas a partir de ensaio com a enzima de restrição sensível a metilação HpaII em pacientes
com TWs e/ou BWS. Para isso, o padrão de metilação alelo-específico foi avaliado pela presença do RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism) de HhaI após a digestão do DNA proveniente de sangue periférico e tumor com a
enzima HpaII e amplificação por PCR. Os alelos foram visualizados a partir da eletroforese em gel de agarose 2%.
O estudo de metilação foi desenvolvido em 49 amostras controle, 57% delas mostraram-se heterozigotas, ou seja,
informativas para o RFLP de HhaI, enquanto 43% foram não informativas. Foi feita uma análise comparativa da
metilação, de amostras de DNA provenientes tanto de sangue periférico, quanto de tumor em 12 pacientes. Sete dos
12 casos mostraram-se não informativos para o RFLP, tanto no DNA proveniente de sangue periférico, quanto no
tumoral. No entanto, o paciente 11, apresentou uma hipermetilação na sua amostra tumoral e heterozigose no DNA
oriundo do sangue periférico. Já o paciente 13, que é heterozigoto para o RFLP em sua amostra proveniente de sangue,
mostrou homozigose no tumor. As amostras de DNA (sangue e tumor) do paciente 17 indicaram hipermetilação
desta região. Desse modo, pode-se concluir que, mesmo a maioria dos casos sendo não informativa para o RFLP, as
diferenças observadas auxiliam na compreensão das alterações constitutivas e somáticas nos pacientes. O método
empregado é eficiente e rápido, porém a análise quantitativa, que será feita pela técnica de PCR em tempo real
associada a ensaios com a enzima de restrição HpaII, é importante para desvendar possíveis metilações parciais
da DMRH19. Esta pesquisa certamente ampliará a acuidade diagnóstica no processo do aconselhamento genético.
Órgão Financiador: Ministério da Saúde; FAPERJ; CNPq; CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
108
Análise epigenética integrada: expressão gênica,
metilação do DNA e imunoprecipitação da cromatina na
caracterização de genes supressores tumorais em 3p21.3
Prando, EC1; Aguiar, G1; Cavalli, LR2; Rainho, CA1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP - Botucatu, SP
Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University Medical Center - Washington DC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de mama, regulação epigenética, genes supressores tumorais, RASSF1, PCR em tempo real, ChIP.
Alterações epigenéticas, incluindo as alterações da metilação do DNA e as modificações das histonas, são eventos
frequentes em células tumorais e estão associadas às mudanças da estrutura da cromatina e dos níveis de expressão
gênica. A perda da expressão do gene supressor tumoral RASSF1, localizado em 3p21.3, constitui um dos principais
exemplos de genes inativados tanto por mecanismos genéticos quanto epigenéticos em vários tipos de cânceres
humanos. Este gene codifica uma proteína com domínio de associação a RAS com função na regulação da fase G1/S
do ciclo celular, transdução de sinal, trocas e transporte de íons, apoptose e morte celular. A hipermetilação da ilha
CpG presente na sua região promotora foi detectada em até 90% dos carcinomas mamários. Com a finalidade de
investigar a provável regulação epigenética de um agrupamento gênico contendo outros prováveis supressores
tumorais mapeados upstream ao gene RASSF1 (SEMAB3, HYAL3, HYAL1, HYAL2 e TUSC2) e downstream (ZMYND10A,
TUSC4, TMEM115 e CACNA2D2) foram analisados seus níveis de expressão em 10 linhagens celulares derivadas
de carcinomas mamários (MDA-MB-134 IV, MDA-MB-453, MDA-MB-157, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MCF7,
BT-549, BT-483, Hs 578T e SK-BR-3), uma linhagem celular não-tumorigênica (MCF-10A) e 2 linhagens celulares
derivadas de tecido mamário normal (184A1 e 184B5). Os níveis de expressão destes dez genes foram quantificados
utilizando a técnica de qRT-PCR (quantitative real time Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), nas 13
linhagens celulares tratadas ou não com as drogas 5-aza-2’-desoxicitidina, um agente desmetilante, e tricostatina
A (TSA), um inibidor das desacetilases de histonas. Os genes GAPDH e PPIA foram utilizados como controles
endógenos e a quantificação relativa foi obtida pelo método ∆∆Ct. Os dados de expressão foram comparados com
a análise do padrão de metilação do gene RASSF1 em cinco linhagens celulares (MDA-MB-134 IV, MDA-MB-453,
MDA-MB-231, MCF7 e SK-BR-3) não submetidas à ação das drogas e a imunoprecipitação da cromatina (ChIP)
com os anticorpos para se detectar a acetilação e a metilação da lisina 9 da histona H3 (H3K9ac e H3K9me3)
da região promotora do gene RASSF1, na linhagem MDA-MB-231. Após o tratamento com Aza seguido ou não
do tratamento com TSA observou-se um aumento da expressão do gene RASSF1 positivamente correlacionada
com a re-expressão dos genes TUSC2, TUSC4, TMEM115 e ZMYND10 (correlação não-paramétrica de Spearman,
p<0,05). Adicionalmente, a linhagem MDA-MB-231 foi a que mostrou os maiores níveis de metilação do DNA
e de metilação H3K9 e baixos níveis de acetilação deste aminoácido. Em conjunto, esses dados preliminares
sugerem a inativação epigenética dos genes localizados próximos ao gene RASSF1 em carcinomas mamários.
Apoio Financeiro: FAPESP e Capes
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
109
Metilação global do DNA e metabolismo do folato em
mães de indivíduos com síndrome de Down
Mendes, CC1; Biselli, JM1; Zampieri, BL1; Eberlin, MN2; Haddad, R2; Riccio, MF2; Carvalho, VM3; Vannucchi,
H4; Goloni-Bertollo, EM1; Pavarino-Bertelli, EC1
Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular - UPGEM, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP
Laboratório Thomson de Espectrometria de Massas, Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP
3
Centro de Medicina Diagnóstica Fleury, São Paulo
4
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: síndrome de Down, metilação de DNA, polimorfismo genético, folato.
A síndrome de Down (SD) é resultante, em 95% dos casos, da não-disjunção meiótica materna. Estudos sugerem que
a ocorrência da SD independente da idade materna está relacionada à hipometilação do DNA como consequência
do metabolismo anormal do folato. Esse estudo teve como objetivo detectar e comparar o conteúdo de metilação
global do DNA entre mães de indivíduos com SD (n=10) e mães com filhos sem a síndrome (n=10), bem como
avaliar a associação desta variável com o polimorfismo Metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) C677T e as
concentrações de homocisteína (Hcy) e ácido metilmalônico (MMA) plasmáticos e folato sérico. A quantificação
da metilação global do DNA foi realizada por meio do Imprint Methylated DNA Quantification Kit (Sigma Aldrich).
O polimorfismo MTHFR C677T foi investigado por meio da Reação em Cadeia da Polimerase – Polimorfismos de
Comprimentos de Fragmentos de Restrição (PCR-RFLP). As concentrações de folato sérico foram determinadas
por imunoensaio competitivo, e de Hcy e MMA plasmáticos por cromatografia líquida/espectrometria de massas
seqüencial. O conteúdo de metilação global do DNA não diferiu entre os grupos (p=0,19) e esta variável não foi
associada com o polimorfismo MTHFR C677T e com as concentrações de Hcy, MMA e folato (p>0,05). Para o nosso
conhecimento, esse é o primeiro estudo que avalia o conteúdo de metilação global do DNA na etiologia da SD e
estudos como esse contribuem para o melhor entendimento dos fatores de risco materno associados à síndrome.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, FAMERP/FUNFARME.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
110
Padrão de metilação do gene CDKN2B em
meningiomas na população paraense
Bastos, CEMC1,3; Borges, BN4; Pieczarka, JC1,2; Brito, JR5; De Oliveira, EHC2,6; Nagamachi, CY1,2; Anselmo, NP4
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista CNPq de doutorado em Neurociências e Biologia Celular
4
Laboratório de Biologia Molecular, ICB, UFPA; 5Hospital Ofir Loyola; 6Instituto de Ciências Exatas e Naturais, UFPA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: meningioma, metilação, CDKN2B; p15; câncer.
Meningiomas estão entre as neoplasias mais comuns do sistema nervoso central, compreendendo cerca de 25%
de todos os tumores primários intracranianos e com uma incidência anual estimada em seis em cada cem mil
indivíduos, com predominância em mulheres. A maioria dos meningiomas tem perfil benigno e crescimento lento.
Estudos recentes têm demonstrado a importância das alterações epigenéticas no processo da tumorigênese, com
ênfase na metilação aberrante das ilhas CpG na região promotora dos genes. A hipermetilação dessas regiões
mostrou estar associada com o silenciamento gênico, resultando na inativação de importantes genes supressores
tumorais. O gene CDKN2B, também conhecido como p15, é um supressor de tumor que induz a parada do
ciclo celular pela inibição da atividade das cinases dependente de ciclina 4 e 6 em fosforilar a proteína RB.
Hipermetilação das ilhas CpG na região promotora desse gene tem sido descrita para diversos tipos de tumores
e linhagens celulares. Esse trabalho teve como objetivo analisar o padrão de metilação no promotor do gene
CDKN2B em meningiomas. Amostras de tecidos tumorais de 28 pacientes atendidos no Hospital Ophir Loyola
(Belém – Pará) foram coletadas, e seu DNA genômico foi obtido usando a digestão convencional com proteinase
K e o método de extração com fenol/clorofórmio. Para análise do padrão de metilação do gene foi utilizada a
técnica do bissulfito com kit comercial. O gene então foi amplificado com iniciadores específicos, e seqüenciado
pelo método de terminação de cadeia. Foi obtido um fragmento de 210 pares de bases, contendo 17 sítios
CpG. Apesar da metilação da região promotora do CDKN2B ter sido relatada como um fenômeno importante
na tumorigênese em alguns tipos tumorais, como nos tumores ependimais e leucemias, as análises qualitativas
dos estudos descritos na literatura mostram uma tendência à hipometilação desta região em meningiomas,
variando de 2% na população alemã a 4% na população chinesa e 5% na americana. Em nossa análise
quantitativa das ilhas CpG da região promotora do CDKN2B, nenhum sítio apresentou-se metilado nas amostras
analisadas, corroborando assim com os dados descritos anteriormente na litaratura. Esse resultado indica que,
se houver uma inativação do CDKN2B, esta não ocorra pelo processo de hipermetilação, e que o silenciamento
deste gene não parece ser um evento essencial na tumorigênese e/ou progressão tumoral em meningiomas.
Apoio Financeiro: CNPq e UFPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
111
Análise da inativação da via ARF-MDM2-p53 no
Linfoma não Hodgkin B Pediátrico
Robaina, MCS1; Arruda, VO1; Machado, ASCM1; Apa, AG2; Rezende, LMM3; Klumb CE1,2
Laboratório de Hemato-Oncologia Celular e Molecular – Programa de Pesquisa em Hemato-Oncologia Molecular – CGTC
Serviço de Hematologia – Hospital do Câncer I – Instituto Nacional de Câncer – INCA
3
Divisão de Patologia – Instituto Nacional de Câncer – INCA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: metilação do DNA, P16INK4a, P14ARF, TP53, Linfoma não Hodgkin B pediátrico.
Introdução: Os Linfomas não Hodgkin B (LNH-B) constituem um grupo de neoplasias agressivas de origem linfóide.
Na infância, os subtipos prevalentes são: Linfoma de Burkitt (LB) (65%) e Linfoma Difuso de Grandes Células B
(LDGCB) (24%). O LB é caracterizado pela ativação do oncogene MYC que resulta no aumento da proliferação
celular. A presença do vírus Epstein Barr (EBV) também contribui como co-fator para a patogênese do LB. Durante
a fase inicial da gênese do tumor ocorre a ativação de MYC com indução da expressão de ARF e p53 e aumento
da apoptose. Em sequência a via ARF-MDM2-p53 é inativada. Alterações dos genes P14 ARF e P16 INK4a, que estão
nesta via de ativação têm sido investigadas no LB. Ambos os genes são codificados pelo mesmo lócus (INK4a/
ARF). A proteína p14 liga-se à MDM2, impedindo que a mesma degrade p53. A proteína p16 atua como supressor
tumoral, regulando a progressão da fase G1 para S no ciclo celular. A inativação de p14 e p16 pode ocorrer por
mutação, deleção ou metilação da região promotora em vários tipos de câncer e inclusive nos linfomas. Metilação
do DNA acarreta alteração na conformação da cromatina, podendo inibir ou ativar a expressão gênica. Objetivos:
Avaliar o status de metilação de genes envolvidos na via ARF/MDM2-p53 e a associação com o EBV em pacientes
com LNH-B da infância. Material e Métodos: Foram utilizadas amostras tumorais de 19 pacientes do Serviço
de Hematologia do Hospital do Câncer I no Rio de Janeiro. Após a extração, o DNA tumoral foi quantificado e
tratado com bissulfito de sódio (Epitect Bissulfit Kit, Qiagen). O status de metilação foi avaliado pela reação de
PCR específica para metilação (MSP). Ambas as análises de mutação de TP53 e da presença do EBV nas amostras
tumorais foram realizadas previamente. Resultados: De 19 amostras analisadas para o gene P14 ARF, cinco (35%)
encontravam-se metiladas e 14 (65%) não metiladas. Já para o P16 INK4a, 10/12 (83,3%) das amostras analisadas
apresentavam metilação. Em relação à presença de mutação de TP53 o percentual observado foi de 31,2%, 5/16.
A positividade do EBV nas amostras tumorais foi de cerca de 35%, 6/17. Apenas oito pacientes foram estudados
nos três pontos da via: mutação de TP53, metilação de P14 ARF e metilação de P16 INK4a e deste grupo, apenas
um paciente não apresentou alteração em nenhum dos três pontos. Conclusões: Nossos dados preliminares
indicam que a inativação de p16 por metilação parece ter um importante papel na tumorigênese dos LNH-B. Por
outro lado, a inativação de p14 por metilação provavelmente não está associada à patogênese desses linfomas.
Apoio financeiro: Capes, Ministério da Saúde, Swiss-Bridge Foundation, INCT.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
112
Genes differentialy expressed due to aberrant
epigenetic patterns along melanoma genesis
Morais, AS1; Molognoni, F1; Jasiulionis, MG1 Departamento de Farmacologia - UNIFESP [email protected]
1
Palavras-chave: Epigenetic, DNA methylation, histone, melanoma, methylight
Introduction: Cutaneous melanoma represents the most dangerous form among the skin cancers. Although the
early diagnosis allows treatment with high potential of cure, the clinical extreme, metastatic melanoma, detains
the worst prognosis being a chemoresistant form. It is known that the loss of homeostatic balance between
keratonocytes and melanocytes has effective participation in the appearance of melanoma. Hypotheses for this
disturbance deal with not only specific genetic events, but also environmental influences. Recently, it has been
suggested that epigenetic events under interference of microenvironment could play an important role in melanoma
genesis. Epigenetic regulation has extreme importance in development of the organism, and besides the dynamic
and reversible ability to change this program makes it viable target for interventions. In general, hipermethylation
of certain genes is tissue- or tumor-specific, being able to be more easily detected than genetic changes and, in
this way, the identification of DNA methylation patterns in different types of cancer might be used as molecular
markers and might be valuable in the diagnosis and prognosis of melanoma. Objective: To identify genes aberrantly
expressed along melanocyte malignant transformation due aberrant epigenetic patterns. Methodology: Patterns
of methylation in some gene promoters were evaluated by Methylight technique in cells representing different
phases of murine melanocyte malignant transformation. To validate expression genes with significant alterations
in promoter methylation along the tumor progression were used RT- PCR and Real-time PCR assays from cells
treated or not with demethylating agent, 5-Aza-CdR, and histone deacetylase inhibitor, Trichostatin A. Results:
For the most of selected genes, like Cdkn2a, Cbs, Chd1, Snai1, the expression level validation by RT PCR and Real
Time PCR confirmed the results obtained by Methylight assay. The next step will be analyze the methylation
pattern of CpG islands in these genes by bisulfite sequencing. Conclusion: Analysis of these results may bring
relevant information about epigenetic alterations associated with malignant transformation and melanoma
progression, revealing also great instruments for diagnosis and treatment of this neoplasia. Supported by FAPESP.
Organ donor: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
113
Avaliação do perfil de metilação como marcador
molecular para o diagnóstico precoce de recidivas em
pacientes com tumores de cabeça e pescoço
Longo, ALB1; Rettori, M1; Cavalare, M1; Carvalho, AL2; Kowalski, LP3; Vettore, AL1
Laboratório de Biologia Molecular do Câncer - Universidade Federal de São Paulo
Hospital do Câncer de Barretos
3
Hospital do Câncer AC Camargo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Metilação, câncer, Carcinoma Epidermóide de cabeça e Pescoço, epigenética.
Os cânceres de cabeça e pescoço encontram-se entre os dez tipos mais freqüentes, sendo que a variante mais
comum é o carcinoma epidermóide localizado em vias aerodigestivas superiores. As estratégias terapêuticas para
o carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECP) baseiam-se fundamentalmente na localização do tumor
e no sistema de estadiamento TNM. Entretanto, em muitos casos, tumores com mesmo estadiamento clínico
e localização, tratados pelo mesmo método, apresentam padrões de recorrência e riscos de óbito diferentes. A
presença de hipermetilação nas regiões promotoras dos genes está associada à supressão da expressão gênica e
tem sido considerada como um potencial marcador molecular para vários tipos tumorais, incluindo os CECP. Por
essa razão, o presente trabalho tem por objetivo avaliar o perfil de metilação de genes freqüentemente metilados
em CECP em amostras de tumor e de escovados da lesão primária coletadas antes do ato cirúrgico, logo após
o ato cirúrgico e nas consultas semestrais pós-tratamento. Desta forma, se pretende avaliar se um método
pouco invasivo, simples e econômico de diagnóstico pode ser uma ferramenta útil para a detecção precoce de
recidivas tumorais. Foi avaliado o perfil de metilação de 25 genes em amostras de escovado de mucosa normal e
de escovado da lesão primária. Desses 25 genes, foram identificados e selecionados 12 genes com valores elevados
de especificidade, que foram analisados em 102 amostras de escovado coletadas no momento do diagnóstico.
Desses resultados foram selecionados 5 genes, CCNA1, DCC, TIMP3, THBS1 e MGMT que apresentaram elevados
valores de sensibilidade e especificidade, sugerindo bons candidatos para um painel de metilação. Esses genes
selecionados foram analisados em mais 68 amostras de tumor, 98 amostras coletadas após o último tratamento
curativo e 96 amostras de escovado da cicatriz da lesão coletadas nos retornos semestrais.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
114
Avaliação do padrão de metilação da região promotora
do gene ESR2 na endometriose
Meyer, JL1; Zimbardi, D1; Fabro, AT3; Silva, A2; Poppe, AC2; Rogatto, SR4; Abrão, MS2; Rainho, CA1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, UNESP – Botucatu
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, USP – São Paulo
3
Faculdade de Medicina, Departamento de Patologia, UNESP – Botucatu
4
Laboratório Neogene, Departamento de Urologia, Faculdade de Medicina, Unesp - Botucatu e Hospital do Câncer A.C. Camargo, São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: endometriose, epigenética, metilação do DNA, MSP-PCR
A endometriose é uma doença inflamatória estrógeno-dependente que afeta de 5 a 10% das mulheres em idade
reprodutiva. É caracterizada pela presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina e está associada à
dismenorréia, dor pélvica e infertilidade. Embora a etiologia e o exato mecanismo para o seu desenvolvimento
sejam incertos, evidências recentes sugeriram o envolvimento de alterações epigenéticas. Os níveis de receptores
nucleares SF1 ( fator esteroidogênico 1) e dos receptores de estrógeno α, β e de progesterona estão alterados
no tecido endometriótico comparado ao endométrio normal. Essas diferenças podem ser determinadas, em
parte, por alterações na metilação do DNA, que ocorre preferencialmente nas ilhas CpG presentes nas regiões
promotoras destes genes. Estudos prévios relataram que os genes SF1 e ESR2 (receptor de estrógeno β) são
altamente metilados e assim silenciados em células endometriais normais sendo que a perda da metilação do
gene ESR2 na endometriose foi associada com níveis aumentados de expressão desse receptor nuclear. Com
base nesses fatos, o presente trabalho avaliou o padrão de metilação da região promotora do gene ESR2 em
sete amostras pareadas de endométrio eutópico e ectópico de mulheres portadoras de endometriose profunda
intestinal pela análise de MSP-PCR (methylation-specific PCR). Esta abordagem consiste na modificação
do DNA pelo bissulfito de sódio, convertendo citosinas não metiladas em uracila. A região de interesse foi
posteriormente amplificada por PCR utilizando-se oligonucleotídeos específicos para alelos metilados ou não
metilados. O padrão de metilação foi analisado com base na presença e/ou ausência do produto detectado após
eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e coloração com nitrato de prata. A média das idades das pacientes
foi de 37,85 anos (±9,57). Quatro pacientes apresentavam estadiamento grau 4, duas estadiamento grau 1 e uma
grau 2. Em todas as amostras foram observados a presença de alelos metilados e não metilados, não havendo
diferença no padrão de metilação entre o endométrio eutópico e tecido endometriótico pareado. Esses achados
estão de acordo com um modelo recentemente proposto no qual fatores genéticos ou ambientais levariam a
mudanças na metilação no DNA durante a diferenciação embrionária do trato genital feminino e promoveriam
o aparecimento de um fenótipo alterado predispondo ao desenvolvimento da endometriose na idade adulta.
Apoio: CAPES e FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
115
Caracterização da expressão da proteína Anexina-1
(ANXA1) na inflamação e tumorigênese gástrica
Jorge, YC1,2,3; Rossi, AFT1,3; Araujo, LP2,3; Fazzio, CSJ4; Oliani, SM2,3; Silva, AE1,3
Laboratórios de Citogenética e Biologia Molecular Humana
Laboratório de Imunomorfologia
3
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista, UNESP- São José do Rio
Preto, SP
4
Serviço de Patologia e Medicina Legal, Hospital de Base de São José do Rio Preto, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Expressão protéica, Anexina, Imuno-histoquímica, inflamação, câncer gástrico.
A inflamação crônica tem sido apontada como fator preponderante na carcinogênese e, muitas neoplasias surgem
a partir de locais de irritação crônica e inflamação. O microambiente mantido pelas células inflamatórias parece
ser um componente importante no processo neoplásico, uma vez que nele ocorrem processos como a proliferação,
sobrevivência e migração celular. A carcinogênese do estômago pode progredir por meio de uma cascata de lesões
precursoras, iniciando-se pela inflamação da mucosa gástrica em associação com a bactéria Helicobacter pylori. Na
resposta inflamatória à infecção pela bactéria ocorre a expressão de proteínas anti-inflamatórias como a Anexina-1
(ANXA1), a qual tem sido associada com a progressão tumoral, sugerindo um papel na regulação da migração/
invasão das células epiteliais. Contudo, no câncer de estômago, ainda há poucos estudos, sendo os resultados
discordantes e, em lesões precursoras como a gastrite crônica, tais estudos são inexistentes. Desse modo, o
presente estudo caracterizou a expressão protéica da ANXA1 por método imuno-histoquímico em dez amostras
de câncer gástrico-CG, vinte de gastrite crônica-GC e dez de mucosa gástrica normal-MN. Nessa reação utilizamos
o anticorpo policlonal rabbit anti-ANXA1 (Zymed Laboratories, Cambridge, UK) na diluição de 1:2000 em BSA
1% e, após, coloração com Hematoxilina de Harris. A análise qualitativa evidenciou imunomarcação positiva
para ANXA1 no endotélio vascular; neutrófilos; plasmócitos; células parietais e as porções finais das glândulas
foveolares de modo semelhante para os três grupos. Contudo, evidenciamos expressão diferencial nos grupos CG
e GC aumentada para o epitélio e o estroma em relação a MN, cuja imunomarcação foi menos acentuada. Outro
resultado importante foi imunomarcação da ANXA1 nas células tumorais no citoplasma, núcleo e membrana
plasmática. Portanto, os resultados indicam que a proteína ANXA1 apresenta expressão baixa em mucosa
gástrica normal e elevada no processo inflamatório da gastrite e no câncer gástrico, sugerindo uma mudança
no padrão de expressão dessa proteína na carcinogênese do estômago. Esses dados sugerem que essa proteína
pode exercer um papel importante na progressão tumoral como proliferação, migração, angiogênese e apoptose.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
116
Epigenetic pattern and protein expression of
E-cadherin and Caveolin-1 in gastric adenocarcinoma
Gigek, CO1; Leal, MF1; Silva, PNO1; Lisboa, LCF1; Lima, EM2; Calcagno, DQ3; Borges, BN3; Assumpção, PP4;
Burbano, RR3; Smith, MAC1
Disciplina de Genética, Departamento de Morfologia e Genética, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP
Departamento de Biologia, Campus Ministro Reis Velloso/Parnaíba, Universidade Federal do Piauí, Parnaíba, PI
3
Laborátorio de Citogenética Humana, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, PA
4
Serviço de Cirurgia, Hospital Universitário João de Barros Barreto, Universidade Federal do Pará, Belém, PA
[email protected]
1
2
Keywords: E-cadherin, Caveolin-1, protein expression, CDH1, CAV1, methylation, epigenetic, gastric cancer.
Plasma membrane proteins are potential drug targets and diagnostic markers. E-cadherin is a member of calciumdependent adherins and contributes to cell-cell adhesion and Caveolin-1 is an integral membrane protein
in caveolae, which are invaginations in the plasma membrane. The E-cadherin gene (CDH1) is one of the most
important tumor suppressor genes in gastric cancer. Genetic alterations such as mutations and chromosomal
deletions as well as epigenetic modifications have been reported to be involved in CDH1 inactivation. The Caveolin-1
gene (CAV1) has shown that exons 1 e 2 are embedded within CpG islands, being potential sites for epigenetic
regulation by DNA methylation Epigenetic modifications have a central role in several types of cancer, including
gastric adenocarcinoma. Gastric adenocarcinoma has poor prognosis and high mortality, therefore remaining
a health issue. This study aimed to evaluate E-chaderin and Caveolin-1 protein expression and to elucidate the
epigenetic mechanism involved in these genes’ regulation in gastric adenocarcinoma. Immunohistochemistry
was analyzed in 58-57 gastric cancer and in 20-18 normal gastric mucosa samples. CpG island methylation was
investigated through methylation specific PCR in 43-106 gastric samples, including tumor and normal adjacent
gastric tissue. Lack of E-cadherin was associated with gastric carcinogenesis and with metastasis, whereas
Caveolin-1 expression was associated with gastric cancer and with H. pylori infection in diffuse type gastric
cancer. CDH1 and CAV1 methylation patterns did not differ between gastric cancer and normal mucosa. Our data
showed an inverse relationship between E-cadherin and Caveolin-1 expression. E-cadherin was associated with
gastric cancer and with a metastatic phenotype and Caveolin-1 seems to have a role as a pro-tumorigenic factor.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
117
Avaliação do padrão de metilação da DMR do gene
H19 em carcinomas uroteliais
Ramos, PMM1; Negraes, PD1; Camargo, JLV2; Rainho, CA1
1
2
Departamento de Genética, Instituto de Biociências - IBB UNESP- Botucatu-SP
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina - FMB UNESP - Botucatu-SP
Palavras-chave: imprinting genômico, metilação do DNA, gene H19, marcador prognóstico
O gene H19 é regulado por imprinting, está localizado em 11p15.5 adjacente ao gene IGF2 (insulin-like growth
factor 2 – somatomedin A) e codifica um transcrito não codificador de proteínas (micro RNA miR-675). Uma DMR
(Differentially Methylated Region) atua na determinação do imprinting recíproco e na expressão mutuamente
exclusiva destes genes. Sob condições normais, a metilação da DMR no homólogo paterno atuaria como um
centro de inativação que “silenciaria” a expressão do gene H19, enquanto a ausência da metilação no cromossomo
materno permitiria a ligação da proteína CTCF e a expressão do mesmo. Estudos anteriores sugeriram que
somente o sexto sítio de ligação do fator CTCF apresenta metilação parental específica e que a perda do imprinting
do gene H19 estava associada com a hipometilação do alelo paterno em tumores de bexiga. No presente estudo,
o padrão de metilação do gene H19 foi determinado em duas regiões distintas: no sexto sítio de ligação do fator
CTCF contido na DMR (análise de qMSP ou quantitative real time Methylation Specific Polymerase Chain Reaction)
e no primeiro éxon do gene H19 (abordagem de MSP-CTPP ou Methylation Specific Polymerase Chain Reaction
with Confontring Two Pair-Primers). Foram analisadas 52 amostras pareadas de tecidos normais e tumorais de
carcinoma de bexiga, provenientes de 51 pacientes, coletadas junto ao Serviço de Urologia do Hospital Amaral
Carvalho de Jaú-SP. A metilação bialélica do sexto sítio de ligação do fator CTCF foi detectada em duas amostras
tumorais, sendo que em uma delas, este padrão também estava presente no tecido normal. A análise conjunta
dos dados revelou uma tendência a níveis maiores de metilação desta região no tecido tumoral em comparação
ao normal. Estes dados sugerem hipermetilação do sexto sítio de ligação da proteína CTCF em um subgrupo de
carcinomas de bexiga. Este estudo também detectou variação inter-individual no padrão de metilação no éxon 1 do
gene H19: seis amostras mostraram metilação bialélica, cinco mostraram metilação monoalélica e em apenas uma
amostra houve discordância entre o tecido tumoral (metilação monoalélica) e normal (metilação bialélica). Novos
estudos são necessários para se investigar o efeito dos padrões de metilação nos níveis de expressão do gene H19.
Auxílio Financeiro: CAPES, FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
118
Avaliação in silico de mutações no gene RB1 e suas
prováveis implicações na estrutura da proteína RB em
pacientes com retinoblastoma
Barbosa, RH1,2; Aguiar, FCC1,2; Bittar, CM5; Prolla, PA5; Vargas, FR1,3; Bonvicino, CR1,4; Seuanéz, H1,5
Programa de Genética, Coordenação de Pesquisa - Instituto Nacional de Câncer
Programa de pós-graduação - Instituto Nacional de Câncer
3
Departamento de Genética - Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
4
Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres Reservatórios, Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ
5
Departamento de Genética - Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: gene RB1, mutações, pRB, retinoblastoma, modelagem molecular
A proteína Retinoblastoma (pRB) é o produto do gene RB1, um supressor tumoral fundamental na regulação
do ciclo celular. O RB1 contem 27 éxons em 180kb e codifica uma fosfoproteína de 110kD (pRB) composta de
928 aminoácidos. A pRB age como supressor da proliferação celular atuando durante a fase G1 do ciclo celular
interagindo com fatores de transcrição da família E2F. O fenômeno da supressão está vinculado ao grau de
fosforilação da pRB. Quando hipofosforilada é capaz de ligar-se aos fatores de transcrição E2F, impedindo a
transcrição de genes específicos. Quando fosforilada torna-se inativa, liberando o fator de transcrição possibilitando
a proliferação celular. Mutações no RB1 podem causar a perda da função de pRB em células retinianas imaturas, e
o desenvolvimento do Retinoblastoma, um tumor ocular maligno que acomete crianças menores que sete anos de
idade. Os objetivos deste trabalho foram: detectar mutações no RB1 em pacientes portadores de retinoblastoma
e familiares; analisar in silico de que forma as mutações patogênicas afetam a pRb em seu plano estrutural e/ou
sua interação com E2F e efetuar uma correlação genótipo-fenótipo nestes indivíduos. Foi realizado o rastreamento
de mutações no RB1 através do sequenciamento dos 27 éxons e regiões intrônicas adjacentes em DNA genômico,
isolado a partir de sangue periférico dos portadores de retinoblastoma e familiares. Para analisar os efeitos das
mutações na estrutura da pRB foi utilizado o programa Deep View - Swiss Pro, no qual foi inserida uma estrutura
tridimensional da pRB utilizada como molde para inferir mutações detectadas no genoma dos pacientes.
Foram analisados 100 pacientes com retinoblastoma e familiares dentre os quais, 67 apresentaram 29 diferentes
mutações constitutivas. Destas, 6 foram do tipo missense: D287N, K447E, I524F, e D856N A525G, R661W sendo as
4 primeiras não descritas na literatura. Nestes casos a troca de aminoácido ocorreu em regiões críticas da pRB,
acarretando em modificações nas ligações de hidrogênio, alterações significativas no potencial eletrostático
e da superfície molecular, que provavelmente interfere na interação da proteína com fatores de transcrição,
afetando de forma negativa sua atividade biológica. Estas mutações afetaram, em sua maioria, pacientes com
retinoblastoma bilateral na forma mais agressiva. A triagem de mutações no RB1, além de servir como subsídio
para o aconselhamento genético das famílias acometidas, é uma fonte de estudos para a modelagem e dinâmica
molecular. A modelagem molecular por homologia da pRB com as mutações acima descritas mostrou-se
eficaz na visualização das alterações com a finalidade de verificar de que forma elas afetam a proteína em seu
plano estrutural. E ainda, demonstrar a importância da integração dos dados experimentais e in silico para um
melhor entendimento das alterações moleculares associadas a doenças decorrentes de mutações genéticas.
Apoio Financeiro: CAPES ; Ministério da Saúde - MS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
119
Análise molecular de mutações complexas no gene
RB1 em pacientes com retinoblastoma
Sena, PP1,2; Aguiar, FCC2; Barbosa, RH2; Bonvicino, CR2,3; Vargas, FR1,2
Departamento de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro
Programa de Genética, CPQ, Instituto Nacional de Câncer
3
Lab. Biol. Parasitol. Mam. Reserv. Silv., IOC, FIOCRUZ, Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Retinoblastoma, RB1, mutações germinativas, MLPA, anomalias genéticas.
Retinoblastoma é um tumor infantil de incidência anual estimada em 1 caso a cada 15.000/20.000 nascidos vivos.
O principal gene relacionado à neoplasia é o RB1, supressor tumoral em 13q14, que apresenta 27 éxons. Portadores
de mutações germinativas patogênicas no gene tendem a desenvolver retinoblastoma bilateral e/ou multifocal.
Cerca de 15% dos portadores de tumor unilateral também são portadores de mutações germinativas. Devido
a não detecção por sequenciamento de mutações constitutivas no gene RB1 em alguns pacientes, esse estudo
objetivou pesquisar, através da utilização da metodologia “SALSA MLPA KIT P047 RB1”, a presença de anomalias
genéticas que pudessem ser classificadas como o primeiro evento mutacional que levou ao desencadeamento do
tumor. Quatro amostras de ADN de portadores de retinoblastoma, com sequenciamento negativo para mutações
pontuais, já estavam disponíveis no laboratório. Além dessas, foi isolado ADN de sangue de outras quatro
amostras de pacientes pela técnica de extração por sal. As amostras foram submetidas à reação em cadeia da
polimerase, sendo realizadas inicialmente as três primeiras etapas de amplificação do gene, que compreendem
16 dos 27 éxons. As amostras amplificadas foram purificadas e seqüenciadas em seqüenciador automático.
Paralelamente ao sequenciamento foi aplicada a técnica de MLPA, que permite a análise de todos os éxons do
gene RB1 em uma só reação. O sequenciamento dos oito pacientes não apresentou alterações e a análise por
MLPA revelou a deleção de todo o gene RB1 e regiões flanqueadoras em dois pacientes e uma provável deleção
do éxon 22 em um paciente. A padronização e aplicação da técnica de MLPA às amostras dos pacientes, cujas
seqüências não revelaram mutações pontuais, foram importantes para elucidar a primeira mutação constitutiva
(quando presente) ocorrida no gene RB1 dos mesmos. A aplicação desta técnica aumenta o espectro de mutações
detectáveis, o que melhora, portanto, a compreensão de parte da via de eventos que culmina na formação do tumor.
Apoio Financeiro: CNPq/PRONEX.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
120
Amplificação dos Oncogenes NMYC, MDM2 e
MDM4 em Amostras Tumorais de Pacientes com
Retinoblastoma
Reis, AHO1; Bonvicino, CR1; Seuanez, HN1,2; Vargas, FR1
Instituto Nacional de câncer (INCA), Divisão de Genética
Universidade Federal do rio de Janeiro (UFRJ), Departamento de Genética
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Retinoblastoma, MDM2, MDM4, NMYC, amplificação, tumor
O retinoblastoma é um tumor maligno intra-ocular infantil originado de retinoblastos. A incidência estimada é de
um caso para cada 15.000/20.000 nascidos vivos. As formas hereditária e esporádica da doença são causadas por
mutações no gene RB1. Além do gene RB1, outros genes foram propostos de estarem envolvidos na progressão
do retinoblastoma, tais como MDM2 e MDM4, que regulam negativamente o gene RB1 e o gene TP53, envolvidos
na supressão tumoral e NMYC, que codifica um fator que regula a transcrição de genes envolvidos na supressão
tumoral. Dada a importância de se caracterizar outros fatores envolvidos no retinoblastoma, a amplificação dos
oncogenes MDM2, MDM4 e NMYC foi pesquisada em amostras tumorais. A metodologia de Hibridização in situ por
fluorescência (FISH) foi realizada, com sondas para os genes MDM2, MDM4 e NMYC, em núcleos interfásicos de
amostras tumorais emblocadas em parafinas, obtidas de 33 pacientes com retinoblastoma, enucleados no Instituto
Nacional de Câncer. Estes pacientes foram previamente analisados quanto à presença ou ausência de mutações
constitucionais no gene RB1, sendo encontradas mutações em 20 deles. Foram encontradas amplificações para
o gene MDM2 em um paciente, para o gene NMYC em 6 pacientes e um paciente apresentou amplificação em
ambos os genes. Para o gene MDM4 não foram encontradas amplificações. Após a análise das características
histopatológicas dos tumores observamos que a amplificação do gene NMYC parece não estar associada à invasão
das câmaras anterior e posterior do globo ocular pela neoplasia e que a presença concomitante de amplificação
dos genes MDM2 e MDM4 pode estar relacionada a lesão exofítica. A ausência de amplificação do gene MDM4 pode
indicar a não associação deste gene com a neoplasia, enquanto que a regulação de TP53 é exercida pelo gene MDM2.
Outros pacientes estão sendo investigados para aumentar a representatividade da amostra. O conhecimento dos
dados cito-moleculares por FISH é de grande importância visto que no caso de outros tipos de câncer como o
neuroblastoma, a amplificação de NMYC é utilizada, internacionalmente, para a escolha do tratamento adequado.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde, INCT para controle do câncer (FAPERJ/CNPq)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
121
Alterações epigenéticas nos genes p15INK4B e p16INK4A
em síndrome mielodisplásica primária na infância
Seixas, TSF1; Rodrigues, EF1; Mencalha, A1; Fernandez, CS2; Santos-Rebouças, CB3; Pimentel, M3; Tavares,
RC1; Dobbin, J1; Sobral, E4; Bouzas, LF 1; Abdelhay, E1
Instituto Nacional de Câncer, INCA
Instituto de Matemática,Universidade Federal Fluminense (UFF)
3
Departamento de Genética Humana, UERJ.
4
Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPMG),UFRJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: síndrome mielodisplásica, infância, epigenética.
A síndrome mielodisplásica primária (SMD) é uma doença clonal de célula tronco hematopoética, que ocorre
predominantemente em idosos, sendo rara na infância. Alterações epigenéticas em genes supressores de tumor,
incluindo p15INK4B e p16INK4A, têm sido descritas desempenhando um papel importante no desenvolvimento da
SMD, no entanto a maior parte destes estudos foi baseada em pacientes adultos, existindo poucos estudos em
SMD na infância. Este trabalho apresentou como objetivo analisar a frequência de metilação na região promotora
dos genes p15INK4B e p16INK4A em crianças com SMD, correlacionar com a evolução da doença para leucemia
mielóide aguda (LMA) e verificar a significância estatística desses dados. Foram analisadas amostras de medula
óssea de 47 pacientes, com idade entre 5 meses-18 anos, que apresentaram o diagnóstico de SMD primária. A
presença de metilação dos genes p15INK4B e p16INK4A foi realizada qualitativamente pela técnica de reação em
cadeia da polimerase específica para metilação (MSP) e confirmada por sequenciamento. Para as amostras
positivas para metilação foi realizada uma análise quantitativa utilizando as metodologias: “combined bisulfite
restriction analysis” (COBRA) e “quantitative methylation specific-PCR” (QMS-PCR). A análise estatística dos
resultados envolvendo a metilação do gene p15INK4B foi realizada pelo método do X2 e dos resultados envolvendo
a metilação do gene p16INK4A foi realizada pelo método do X2 com a correção de Yates. A análise estatística da
correlação entre os níveis de metilação e os subtipos da doença foi feita pelo teste de ANOVA. A análise molecular
revelou que 15 pacientes (32%) apresentaram metilação para o gene p15INK4B e apenas 4 (8 %) para o gene p16INK4A.
A distribuição da metilação do gene p15INK4B de acordo com a classificação de SMD na infância foi: CR (5/30);
AREB (5/9), AREB-t (5/8). A metilação do gene p16 esteve presente em AREB (2/9) e AREB-t(2/8). A metilação
nos genes p15INK4B e p16INK4A esteve presente com maior frequência nos subtipos mais avançados da doença
(AREB, AREB-t), sendo p<0,003 e p<0,05, respectivamente. Evolução da doença foi verificada em 17 (36%) dos 47
pacientes. Verificamos uma forte associação entre a presença de metilação no gene p15INK4B e a evolução da doença
(p<0,008). Das 4 crianças apresentando metilação no gene p16INK4A,, todas apresentaram evolução da doença
(p<0,05). Conclusão: Nossos resultados sugerem que a presença de metilação em p15INK4B e p16INK4A está associada
com mau prognóstico, sendo estas alterações epigenéticas, marcadores biológicos de evolução da doença.
Apoio Financeiro: Ministério da Saúde e FAPERJ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
122
Nova t(7;12)(p11.1;q11.1) e i(12)(q10) durante crise
blástica linfóide de paciente com leucemia mielóide
crônica Ph+
Leite-Cueva, SD1,3; Oliveira, FM2,3; Palma, LO2; Costa, LD2; Falcão, RP2,3; Fontes, AM3;Simões, BP2
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto- USP
Departamento de Clínica Médica, FMRP USP
3
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia Celular
1
2
Palavras-chave: LMC, crise blástica, citogenética, SKY.
A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa, resultante de uma expansão clonal na
célula tronco hematopoética, que compreende 15-20% das leucemias adultas. Na fase inicial caracteriza-se pela
presença do cromossomo Philadelphia (Ph), resultante da translocação t(9;22)(q34;q11.2). Durante sua progressão
pode manifestar-se com fenótipo mielóide ou linfóide. Na fase acelerada alterações cromossômicas adicionais são
freqüentes, como i(17q) e +8, as quais estão associadas a um prognóstico geralmente desfavorável. A LMC tratada com
busulfan está associada à alta incidência de +8 quando comparadas com pacientes tratados com hidroxiuréia. Nesta
investigação descrevemos um paciente com LMC e associação de crise blástica linfóide para uma nova anormalidade
cromossômcia, t(7;12)(p11.1;q11.1) identificada pelas técnicas clássicas e moleculares da citogenética. Trata-se de
um homem de 27 anos com manifestações de fadiga, leucocitose e esplenomegalia. Os parâmetros hematológicos
inicialmente foram: hemoglobina 13.1g/dl, leucócitos 199.000/mm3, 2% de blastos, plaquetas 220.000/mm3, medula
óssea apresentava proliferação das três linhagens hematopoéticas e ausência de infiltração por blastos. Análise de RTPCR para BCR/ABL1 foi positiva e citogenética clássica confirmou a t(9;22)(q34;q11) em 11/20 metáfases analisadas.
O paciente foi submetido ao tratamento com mesilato de imatinib e após um mês obteve resposta hematológica
completa. Posteriormente, apresentou crise blástica linfóide. Parâmetros hematológicos foram: hemoglobina 10.2g/
dl, leucócitos 20.300/mm3 com 73% de blastos e plaquetas 63.000/mm3. A medula óssea apresentava-se infiltrada
por blastos (80%). Imunofenotipagem apresentou blastos positivos para CD10, CD19, CD38, CD45, CD79a, TdT e
HLA-DR e negativo para CD2, CD3, cCD3, CD11b, CD33, CD34, CD42a, CD117, kappa, Lambda e MPO. A análise
citogenética revelou cariótipo: 46,XY,t(7;12)(p11.1;q11.1),t(9;22)(q34;q11.2),i(12)(q10)[14]/46,XY[6][cp14]. A validação
dos achados citogenéticos foram realizadas por SKY e CGH que confirmou os desequilíbrios genômicos associados
à t(7;12)(p11.1;q11.1) e i(12)(q10). O paciente apresentou refratariedade ao tratamento anterior e foi submetido a
um protocolo de tratamento para LLA, com adição de dasatinibe. Após um ano de tratamento ainda apresenta
BCR/ABL1 positivo, porém, com resposta hematológica e citogenética completa. Anormalidades secundárias são
geralmente consideradas por conferirem uma vantagem proliferativa na LMC. A trissomia do 8 está associada com
a hiperexpressão do gene MYC, localizado em 8q24. Deleção do 17p, antecede a formação do i(17q), sugere que
ambas anormalidades tenham papel importante na progressão da LMC. Defeito na regulação do ciclo celular pode
permitir acúmulo de eventos citogenéticos adicionais e sobrevida das células malignas, contribuindo para evolução
e complexidade da doença.Anormalidades cromossômicas do paciente são inéditas e sem significado claro, quando
comparadas às anormalidades comumente vistas durante transformação da LMC. Entretanto, pode-se inferir que a
presença destas pode está condicionada a refratariedade ao tratamento com mesiltado de imatinibe e transformação
linfóide, dado que há relatos na literatura da presença da t(7;12)(p11.1;q11.1) em neoplasias linfóides.
Apoio Financeiro: FAPESP, INCTC (Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-Tronco e Terapia Celular)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
123
Polimorfismos de enzimas de fase 1 e 2 do
metabolismo de fármacos em pacientes portadores de
Linfoma Difuso de Grandes Células B
Levy, D1; Oliveira-Souza, P1; Maciel, FVR2; Xavier, FD2; Pereira, J2; Bydlowski, SP1
Laboratório de Genética e Hematologia Molecular – Lim 31 da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
Laboratório de Imunopatologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Linfoma Difuso de Grandes Células B; metabolismo de fármacos; Polimorfismos; GSTM, NQO, MDR; CYP, PON1
O LNH é a quinta forma mais comum de neoplasia maligna no Brasil, sendo o subtipo difuso de grandes células B
(LDGCB) o mais comum. O LDGCB é uma doença agressiva com considerável heterogeneidade biológica e clínica,
totalizando quase 40% de todos os LNH. O objetivo é avaliar a relação entre polimorfismos do CYP3A5 (A6986G),
CYP2B6 (G516T e A785G), MDR1 (C3435T e C1236T), PON1 (Q192R), NQO1 (C609T), GSTP1 (A105G e C114T),
GSTT1 (+/-) e GSTM1 (+/-) e a variabilidade na resposta farmacológica a quimioterapia CHOP e R-CHOP em
pacientes portadores de LDGCB. Foram estudados 122 pacientes diagnosticados LDGCB, de ambos os sexos, com
idade entre 16 e 95 anos tratados com quimioterapia CHOP e R-CHOP. O DNA genômico foi extraído dos leucócitos
do sangue periférico, utilizando o método de precipitação com solução saturada de NaCl conforme descrito por
Miller et al. (1988) modificado. Os polimorfismos foram analisados através de PCR-RFLP. Pacientes GSTM1 positivos
apresentaram maior chance de resposta ao tratamento R-CHOP (OR=12.02777; IC95%= 2.59-55.85), enquanto
pacientes GSTM1 negativos apresentaram maior chance de resposta ao tratamento CHOP (OR=0.143454; IC95%=
0.04-0.517). Para GSTP1 (A105G), foi observado que homozigotos (AA) apresentam mais chance de remissão da
doença quando comparado aos heterozigotos (AG) (OR=0.262; IC50%= 0.103-0.663) e homozigotos (GG) (OR=0.080;
IC95%=0.016-0.406) em relação ao tratamento R-CHOP. Para MDR1 (C3435T), indivíduos homozigotos (CC)
apresentam maior chance de remissão da doença quando comparado aos heterozigotos (CT) (OR=0.101; IC95%=
0.023-0.435) e homozigotos (TT) (OR=0.048; IC95%= 0.008-0.299) em relação ao tratamento R-CHOP. O mesmo
foi observado para MDR1 (C1236T) (CC/CT OR=19.401 e IC50%= 3.998-94.147; CC/TT OR=46.997 e IC50%=5.848377.507). Em relação ao NQO1, indivíduos homozigotos (CC) apresentam menor chance de remissão da doença
quando comparado aos heterozigotos (CT) (OR=6.112 IC50%= 2.53-14.762). Porém os pacientes heterozigotos
apresentaram pior sobrevida global dos que os indivíduos homozigotos para o NQO1 (p>0.001). Indivíduos que
apresentam sítios extranodal envolvidos têm menos chance de remissão da doença quando comparado aos
indivíduos sem esse envolvimento (OR= 0.247; IC50%=0.097-0.629). Outro resultado é sugestivo de que o sexo
masculino tem maior chance de remissão da doença em relação ao sexo feminino (OR=1.87; IC50%=0.83-4.216),
embora não tenha sido encontrada associação entre sexo e resposta. Com esse estudo foi possível observar que
os polimorfismos nos genes das enzimas metabolizadoras de fármacos apresentam importante papel na resposta
ao tratamento quimioterápico. Esses resultados mostram uma importante relação dos SNPs e o tratamento do
LDGCB.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
124
Avaliação do genótipo de virulência CagA da
Helicobacter pylori em lesões gástricas
Mataruco, MM1; Jorge, YC1; Duarte, MC1; Silva, AE1
Laboratório de Citogenética Humana e Biologia Molecular, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual
Paulista-UNESP, São José do Rio Preto, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Lesões gástricas, Carcinogênese gástrica, Helicobacter pylori, Fator de virulência, CagA.
Introdução: A bactéria Helicobacter pylori infecta cerca de 50% da população mundial e está associada como principal
fator de risco de lesões gástricas como a gastrite crônica, úlcera péptica, linfoma MALT e câncer gástrico. Neste
processo são considerados os fatores genéticos do hospedeiro, fatores de virulência da bactéria e fatores de estilo
de vida. O fator de virulência CagA, presente em cerca de 60 a 70% das cepas de H. pylori, tem sido destacado como o
principal fator da bactéria associado com a carcinogênese gástrica. CagA provoca proliferação anormal, motilidade e
mudanças citoesqueléticas nas células epiteliais gástricas, assim como induz a produção de interleucinas e citocinas
e altera a expressão de proto-oncogenes. Diferenças populacionais na ocorrência desta cepa conjuntamente com
outras cepas de virulência já descritas como VacA, IceA e BabA podem estar relacionadas com maior risco de
progressão do câncer gástrico. Objetivos: Investigar a ocorrência de infecção pela H. pylori em pacientes com lesões
gástricas (gastrite crônica, úlcera gástrica e metaplasia intestinal) e a frequência do genótipo CagA nas amostras H.
pylori positivas. Métodos: Foram coletadas biópsias da mucosa gástrica durante exame endoscópico (região do antro
e corpo) de 81 pacientes com lesões gástricas (27 gastrites crônicas-GC, 36 úlceras gástricas-UG e 18 metaplasias
intestinais-MI). Destes pacientes, 47% são do sexo masculino e 53% do sexo feminino com idade média de 57±13
anos. O DNA foi extraído utilizando kit comercial (Trizol) e amplificado por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
para os genes HpX da bactéria e CYP1A1 (gene constitutivo humano) que resultam em fragmentos de 150 pb e 226
pb, respectivamente. As amostras positivas para o gene bacteriano (Hp+) foram submetidas à nova amplificação
para o gene CagA, resultando em um fragmento de 348 pb. Resultados: Das 81 amostras de lesões gástricas
analisadas cerca de 47% (38/81) eram H. pylori positivas. Para o genótipo CagA, cerca de 58% (22/38) das amostras
apresentaram o genótipo de virulência da bactéria, sendo 6/10 (60%) das gastrites, 10/21 (48%) das úlceras e 6/7
(86%) das metaplasias. Conclusão: Os resultados confirmam a infecção da H. pylori como prevalente na população
estudada e sugerem uma variação na frequência do genótipo CagA nas diferentes lesões gástricas, com maior
frequência nas metaplasias, que corresponde às etapas mais avançadas da progressão de lesões pré-cancerosas ao
câncer gástrico. Portanto, destaca-se o papel importante deste fator de virulência na carcinogênese do estômago.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
125
Carcinoma Papilífero de Tireóide Familiar: Um estudo
de caso
Azevedo, BM¹; Silva, GPC¹; Nogoceke, LC¹; Alexandre, RB¹; Faucz FR¹
¹ Laboratório de Genética Humana da Pontifícia Universidade Católica do Paraná
[email protected]
Palavras-chave: BRAF, mutação, câncer de tireóide, família, neoplasia.
Geralmente, carcinomas diferenciados da tireóide são esporádicos. Porém, para este trabalho foram coletadas
amostras de 31 indivíduos da mesma família, sendo que 6 destes tem histórico de nódulos na tireóide, relatando
uma forma rara da doença, a forma familiar. Para este estudo foi utilizado um gene que tem se apresentado
frequentemente associado a carcinoma papilífero de tireóide esporádico, o gene BRAF. Este gene esta localizado
no cromossomo 7 na posição 7q34, possui 18 éxons e é responsável pela produção de uma proteína serina/treonina
quinase. A mutação estudada no gene BRAF envolve uma translocação de timina para adenina na posição 1799 do
éxon 15 (c.1799T>A), que leva a substituição na posição 600 do aminoácido valina por ácido glutâmico (p.V600E).
Foi realizada extração de DNA genômico, PCR e seqüenciamento direto para a análise de todo o grupo amostral. Os
resultados mostraram que a probabilidade desta mutação estar relacionada com Cacinoma Papilífero de Tireóide
Familiar para este grupo é inferior a 5%. Dados de exames clínicos dos afetados relataram as condições hormonais
antes e após a cirurgia de retirada total e parcial da tireóide e indicaram a associação da forma maligna com
outras patologias da tireóide. Os familiares dos afetados também apresentaram outras patologias da tireóide como
tireoidite de Hashimoto, hipotireoidismo e hipertireoidismo. Assim, este trabalho pode vir a colaborar com outros
estudos, visto que na literatura não há um gene mais frequentemente associado com esta doença.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
126
Avaliação do potencial fitoterápico da Euphorbia
tirucalli no tratamento do câncer de cabeça e pescoço
Cunha, BR1; Pereira, MC2; Rodrigues-Lisoni, FC2
Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP, São Paulo, Brasil
Departamento de Biologia e Zootecnia, FEIS/UNESP, Ilha Solteira, SP, Brasil, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço, tratamento fitoterápico, Euphorbia tirucalli, avelóz.
O câncer de cabeça e pescoço inclui as neoplasias que surgem na cavidade oral, faringe e laringe e a maioria é do
tipo histológico espinocelular. Mundialmente, este é o sexto tipo de câncer mais comum, e compreende cerca de
6% entre todos os tipos de câncer. Mais de 500.000 casos novos e cerca de 300.000 óbitos por tumores de cabeça
e pescoço são estimados por ano. O tratamento para câncer de cabeça e pescoço inclui cirurgia, terapia por
irradiação e quimioterapia. Quando a doença está avançada, o tratamento é normalmente com quimioterapia,
ou cirurgia seguida de radio-quimioterapia. A cirurgia é o método mais antigo utilizado como tratamento do
câncer, mas é um método altamente invasivo, podendo causar lesões estéticas irrecuperáveis, com um significativo
comprometimento funcional. Em função disso, algumas plantas vêm sendo utilizada no tratamento do câncer
e uma delas tem despertado interesse científico, a Euphorbia tirucalli L. (E. tirucalli), conhecida popularmente
como avelóz, utilizada no tratamento fitoterápico de asma, úlceras, verrugas e tumores em geral. Em função da
importância da atividade antitumoral do látex da E. tirucalli, incluindo seus elementos químicos, foi proposto
o presente trabalho que teve como objetivo geral avaliar a influência desse fitoterápico nas células neoplásicas
sobre a morfologia, progressão e a metastatização do câncer. Para isso foram utilizadas duas linhagens celulares
de carcinoma epidermóide de laringe e faringe (Hep-2 e Fadu) e analisadas a morfologia e o índice de proliferação
celular após o tratamento com a E. tirucalli. Realmente, o fitoterápico diminui em quase 50% a proliferação celular
em carcinomas epidermóides de laringe e faringe, porém não foram observadas alterações na morfologia celular.
Em função dos resultados obtidos com o tratamento da E. tirucalli nas células neoplásicas novos ensaios tornam-se
fundamentais para o entendimento dos mecanismos pelos quais esse fitoterápico atua, inclusive os mecanismos
genéticos e suas interações nas diferentes cascatas de sinalização.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
127
Antiproliferative effects of Tubi-bee propolis in
glioblastoma cell lines
Borges, KS1*; Brassesco, MS2; Scrideli, CA2; Soares, AEE1; Tone, LG1,2
Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil
Division of Pediatric Oncology, Department of Pediatrics, School of Medicine of Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto,
SP, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: propolis, glioblastoma, U251, U343, treatment.
Propolis is resine formed by a complex chemical composition that bees collect from plants. Since ancient
times propolis has been used in folk medicine, due to tits biological properties, that include antimicrobial, antiinflammatory, antioxidant, antitumoral and immunomodulatory activities. Glioblastoma (GBM) is the most
common human brain tumor. Despite the improvements in GBM standard treatment (surgery followed by
radiotherapy with adjuvant chemotherapy with temozolomide (TMZ), a DNA alkylating agent), patients’ prognosis
is still very adverse. The aim of this work was to evaluate in vitro the Tubi-bee propolis effects on human GBM
(U251 and U343) and fibroblast (MRC) cell lines. Proliferation, clonogenic capacity and apoptosis were analyzed
after treatment with 1mg/mL and 2mg/mL propolis concentrations for different time periods. Data showed an
antiproliferative effect of tubi-bee propolis against glioblastoma and fibroblast cells, in a dose- and time dependent
manner, although the time-dependence effect was less intense in the fibroblast cell line. Combination of propolis
with TMZ caused a synergic effect. Moreover, propolis caused decrease in colony formation glioblastoma cell
lines. Propolis treatment had no effects on apoptosis, demonstrating a cytostatic action. Further investigations are
needed to elucidate the molecular mechanism of the antitumor effect of propolis and the study of its individual
constituents may reveal specific molecules with antiproliferative capacity.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
128
Percepção de risco para câncer e comportamentos
preventivos em uma amostra de usuários de um
ambulatório de aconselhamento genético oncológico
Alvarenga, LM¹; Silva, TBC¹; Júnior, LC²; Ferraz, VEF³; Nascimento, LC4; Flória-Santos, M4
¹ Mestrandos pelo Programa de Enfermagem em Saúde Pública da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo (EERP/USP)
² Graduando de Enfermagem da Faculdade de Medicina de Marília (FAMEMA)
³ Professor Doutor da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (FMRP/USP) e chefe do Ambulatório de
Aconselhamento Genético do Câncer da Unidade de Genética Médica do Hospital das Clínicas da FMRP/USP
4
Professoras Doutoras do Departamento Materno Infantil e Saúde Pública da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade
de São Paulo (EERP/USP)
[email protected]
Palavras-chave: risco, neoplasias, predisposição genética para doença, enfermagem.
O presente estudo investigou a percepção de risco para o desenvolvimento de neoplasias e os comportamentos
preventivos em indivíduos com suspeita de síndromes neoplásicas hereditárias. Teve como objetivos: descrever a
percepção de risco e causas das principais neoplasias relacionadas a síndromes de câncer hereditário em usuários
de um serviço de aconselhamento genético para câncer; associar comportamentos adotados para prevenção
de tumores e história familiar dessa patologia; traçar um panorama da realização de exames preventivos e do
acesso a informações sobre os mesmos na população estudada; e descrever o interesse desses indivíduos em
ações educativas, no aconselhamento genético e na realização de testes genéticos preditivos para síndromes
neoplásicas hereditárias. Foi selecionada uma amostra de conveniência, constituída de 51 usuários atendidos
junto ao Ambulatório de Aconselhamento Genético do Câncer da Unidade de Genética Médica do Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Os dados foram coletados por
meio de um instrumento desenvolvido para ser utilizado junto a população latina norte-americana, adaptado
culturalmente para a realidade brasileira. A maioria da amostra foi composta por sujeitos do sexo feminino (68,6%),
com idade variável ente 18 e 40 anos. Os respondentes consideraram seu risco de câncer igual ao da população em
geral, independente da história pessoal e/ou familiar dessa patologia. Os fatores emocionais/psicológicos foram
apontados como a principal causa de câncer, seguido pela hereditariedade e o tabagismo, sendo que as mulheres
consideram que a genética exerce um forte efeito sobre o risco da doença (c2=5,38, p=0,02). Não foi encontrada
associação estatisticamente significativa entre a realização de exames preventivos e a história familiar de
malignidades. A maior parte da amostra (n=38) relatou não ter as informações que necessita sobre o rastreamento
de tumores e todos expressaram interesse em obter mais orientações sobre o seu risco pessoal para desenvolver
câncer. A busca por esclarecimentos demonstra a preocupação dos clientes acometidos por neoplasias familiais ou
hereditárias em compreender melhor os aspectos genéticos de sua doença. Os achados desse estudo evidenciam
a necessidade de intervenção dos profissionais de saúde, em especial do enfermeiro, o qual pode desenvolver
atividades educativas junto a essa clientela, como um dos componentes essenciais para o cuidado de enfermagem
em oncogenética.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
129
NMR as a tool for predicting the outcome of patients
treated for acute lymphoblastic leukemia
Melo, CPS1,2,3; Brandalise, SR1; Yunes, JA1,3; Zeri, AC2,3
Laboratório de Biologia Molecular, Centro Infantil Boldrini
Laboratório Nacional de Biociências, Centro Nacional de Pesquisas em Energia e Materiais
3
Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Metabolomic, Acute Lymphoblastic Leukemia, Chemotherapy Resistance, NMR, Asparaginase
Early response to therapy has consistently shown independent prognostic significance in pediatric Acute
Lymphoblastic Leukemia (ALL) and can be attributed primarily to the intrinsic resistance/sensitivity of leukemic
lymphoblasts to chemotherapy. A metabolomic approach, combining Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
(NMR) and multivariate statistic analysis, may become an important tool for the earlier identification of ALL
resistance to chemotherapy. Objectives: To investigate whether resistance/sensitivity to asparaginase (ASP), which
is a major component of ALL therapy, is somehow reflected by specific NMR metabolic signatures, in a retrospective
study. Methods: Viable ALL primary cells from 16 patients were cultured in RPMI 1640 medium plus 10% FBS,
supplemented or not with ASP (0.8IU/ml), in a concentration of 2 x 108 cells/ml. After 24hs, samples were centrifuged
and the medium was kept for NMR analysis. Cells survival was accessed by flow cytometry assay. 1H spectra of samples
were acquired using a 500 MHz Varian NMR spectrometer. Data treatment and quantitative analyses were done with
Chenomx NMR Suite 4.6 software (Chenomx Inc., Edmonton, Canada). Principal Component Analysis (PCA) and
Partial Least Squares for Discriminant Analysis (PLS-DA) were done in Pirouette 4.0 (Infometrix Inc., Washington,
USA). Results: PCA, an unsupervised data analysis, showed a slight separation between patients who relapsed versus
those in continuous remission. Through the loading plots of PLS-DA analysis, we selected peaks that contributed
more for this separation while eliminating noisy information. These peaks were identified and their concentrations
were then used to make a new PCA. Scores plot of these new PCA showed, in addition to the former separation,
one related to the immunophenotype of ALL cells (B vs T). Independent analysis of B-derived ALL revealed that
the group of patients who relapsed was characterized by higher levels of dimethylamine, among other compounds.
This compound can be found in human urine and has the ability to undergo nitrosation to dimethylnitrosamine,
a potent carcinogen, traces of which are excreted in normal human urine. In the other hand, the group of patients
who did not relapse presented higher levels of pyroglutamate, whose elevated blood levels is somehow associated
with problems in glutamine or glutathione metabolism. Glutamine is a very important amino acid to tumor
cells survival and its synthesis was suggested to be related with resistance of sarcoma cells to ASP. Conclusion: A
possible NMR metabolic signature associating in vitro ALL cell resistance to asparaginase and patients’ prognostic
was identified. Experiments will be recapitulated to increase the number of samples. This methodology may have a
great potential in the ALL patients’ classification into risk groups avoiding wrong and unnecessary chemotherapy.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
130
Há um aumento no número de cópias de sequências
de DNA (copy number variation – CNV) em famílias
com predisposição a câncer?
Rosenberg, C1; Gonçalves, A2; Santos, EMM2; Capelli, L2; Costa, S1; Achatz, MIW2; Brentani, RR2; Krepischi,
ACV2
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, IB-USP, São Paulo, Brasil
Fundação Antonio Prudente, Hospital A.C. Camargo, São Paulo, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: array-CGH, cancer familial, CNV, síndrome Li-Fraumeni, câncer de mama e ovário hereditária
Variações raras ou únicas no número de cópias de segmentos de DNA (Copy number variations – CNVs) podem conter
genes de susceptibilidade em famílias com predisposição a câncer. Exemplos já foram descritos para neuroblastomas
e tumores de mama, próstata e pâncreas. Por outro lado, indivíduos dessas famílias podem apresentar aumento
no número de CNVs como resultado de mutações em genes relevantes para câncer. Especificamente, um trabalho
recente documentou que o número de CNVs em pacientes com síndrome de Li-Fraumeni é três vezes maior do que
em controles normais. Para determinar a quantidade e conteúdo gênico das CNVs constitutivas em pacientes com
predisposição a câncer, nós investigamos por array-CGH usando uma plataforma com ~180.000 oligonucleotídeos
(4x180K Agilent) as CNVs germinativas (em DNA de sangue periférico) em 130 probandos não relacionados de
famílias com diagnóstico clínico de predisposição a câncer: 60 indivíduos de câncer de mama e ovário hereditário
e 70 de famílias Li-Fraumeni e Li-Fraumeni like. Esses dados foram comparados com os de uma amostra de 100
indivíduos controle. Os probandos das famílias de câncer de mama e ovário hereditário foram previamente testados
para mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 gene, enquanto os indivíduos de famílias Li-Fraumeni foram testados para
mutações no gene TP53; indivíduos com mutações em qualquer desses genes foram excluídos. As CNVs detectadas
nesse estudo foram subdivididas em “comuns” e “raras”, sendo consideradas raras aquelas que estão documentadas
≤ 3 vezes no Database Genome Variants (DGV), o que corresponde a ~15% dos eventos de detecção de CNVs. Os
resultados iniciais sugerem um aumento modesto do número médio de CNVs por indivíduo em pacientes com câncer
(8.2 para câncer hereditário de mama e ovário e 9.3 para Li-Fraumeni), quando comparado à média de controles (6.8).
Ademais, os dados preliminares da categoria designada como “alterações raras” indicam uma diferença maior entre os
grupos, ocorrendo aproximadamente duas vezes mais em pacientes de câncer familial (média 0.96±1.28 por indivíduo)
do que em controles (média 0.42±0.67 por indivíduo). Alguns dos genes contidos nessas CNVs foram previamente
descritos como alterados em tumores, embora não linhagem constitutiva. Concluindo, nossos resultados indicam
uma freqüência de CNVs constitutivas um pouco aumentada em pacientes com câncer em relação a controles, com
um efeito mais acentuado notado na categoria de “CNVs raras”.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
131
Avaliação do risco em mulheres com e sem história
familiar para câncer de mama
Paleari, RG¹; Peres, RMR¹; Heinrich, JKR¹; Sarian, LOZ²
¹ Laboratórios Clínicos Especializados -Área de Citogenética - Centro de Atenção Integral à Saúde da Mulher, Universidade Estadual de
Campinas
² Departamento de Tocoginecologia - Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
Palavras-chave: Câncer de mama, Cálculo de risco, Teste molecular, Aconselhamento genético, Ferramenta seletiva
Introdução: A etiologia do câncer de mama é multifatorial, sendo o resultado da interação de fatores genéticos com
o estilo de vida, hábitos reprodutivos e o meio-ambiente. Acredita-se que 5% a 10% dos casos tenham componentes
hereditários. Vários softwares, com modelos estatísticos de predição de risco a suscetibilidade genética, estimam
a probabilidade de haver uma mutação através da história familiar e de outros fatores de risco pessoais. Objetivo:
Calcular os escores de risco individual de mulheres com câncer de mama e avaliar estes valores frente à presença
ou ausência de história familiar para a doença. Métodos: Após o diagnóstico de carcinoma invasivo da mama,
aplicou-se um questionário sobre fatores reprodutivos e história familiar para a doença a 85 mulheres, submetidas
a tratamento no Ambulatório de Mastologia do Hospital da Mulher (CAISM) da UNICAMP. O cálculo do risco
individual foi realizado através do software IBIS Breast Cancer Risk Evaluation Tool. Resultados: De 85 mulheres,
24 (28%) apresentaram história familiar para a doença. A idade média das mulheres com história foi de 58 anos,
variando de 27 a 84, enquanto para o grupo de mulheres sem história foi de 62 anos, com uma variação de 27
a 88. Da amostra total, 12% mulheres eram nuliparas, 26% tiveram menarca antes dos 12 anos e 26% estavam
na pré menopausa. Quanto à exposição hormonal exógena, 60% mulheres usavam ou já usaram contraceptivos
hormonais e 20% realizavam ou já realizaram terapia hormonal. A média do escore de risco de desenvolver a
doença durante a vida para mulheres com história familiar foi de 14%, variando de 1,7% a 79,8%. Já a média do
escore para mulheres sem história familiar foi de 7,7%, variando de 0,4% a 46,2%. Conclusões: Modelos de predição
de risco podem fornecer suporte para que opções preventivas sejam utilizadas além do aconselhamento genético
individual e familiar, mesmo quando não se tem a possibilidade de realizar o teste para investigação das mutações.
Paralelamente, torna-se uma ferramenta seletiva eficaz para auxiliar na proposta de protocolos para a implantação
de testes moleculares em serviços de mastologia que não possuem requisitos financeiros necessários para
disponibilizá-los a todos os pacientes, no contexto do atendimento assistencial.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
132
Investigação de marcadores moleculares em
carcinoma de pênis
Candido, NM1; Babeto, E1; Calmon, MF1; Tasso, M1; Peitl, P1; Bonilha, JL2; Cunha, IW3; Soares, FA3; Vassalo,
J4; Rahal, P1
Laboratório de Estudos Genômicos, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, São José do Rio Preto
2
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina, FAMERP, São José do Rio Preto
3
Departamento de Patologia, Fundação Antonio Prudente, Hospital AC Camargo, São Paulo
4
Departamento de Patologia, Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Estadual de Campinas, Campinas
[email protected]
1
Palavras-chave: Carcinoma de pênis, RaSH, PCR em tempo real, Expressão gênica, ANX1.
O carcinoma de pênis (CP) é um tumor epitelial invasivo de considerável variação geográfica em relação à sua
prevalência e incidência, representando mais de 10% dos tumores malignos em homens em alguns países em
desenvolvimento, principalmente no Brasil. Diversos fatores socioeconômicos e a falta de acesso aos sistemas
de saúde podem contribuir para discrepâncias na incidência desta enfermidade. Sem tratamento, os pacientes
com CP geralmente morrem dentro de dois anos após o diagnóstico da lesão primária por conseqüência de um
descontrole locorregional ou de metástases distantes. Devido à falta de padronização das condutas clínicas,
aos diferentes sistemas de estadiamento e à ausência de estudos prospectivos que permitam estabelecer os
procedimentos mais adequados nos diversos estádios da enfermidade, pode-se verificar a necessidade de melhor
caracterização molecular para esse tipo tumoral. Dessa forma, o estudo procurou identificar potenciais marcadores
moleculares em CP. Para isso, foram utilizadas amostras tumorais e normais a partir das quais foi extraído o RNA
e, logo após, obteve-se o cDNA por meio da transcriptase reversa. Posteriormente, a metodologia de RaSH (Rapid
Hybridization Subtraction) foi realizada afim de encontrar genes diferencialmente expressos. A partir desta técnica
foram revelados 57 genes diferencialmente expressos, sendo 30 genes na amostra tumoral e 27 genes no tecido
normal. Dentre os genes diferencialmente expressos em tumor de pênis, enfatizamos o gene PBEF1 (pre-B-cell
colony enhancing factor 1) e a ANX1 (annexin 1), que estão associados à regulação positiva da proliferação celular e a
efeitos anti-apoptóticos, respectivamente. Além disso, o gene RPL6 (ribossomal protein L6) está relacionado com a
regulação da transcrição e tradução protéica e o gene KIAA1033 codifica proteína com função ainda desconhecida,
representando um possível alvo para estudos futuros. A biblioteca reversa também mostrou genes diferencialmente
expressos nas amostras normais e que se encontram supostamente reprimidos nas amostras de CP. Nessa
biblioteca foi destacado o gene p16 (INK4α), um importante supressor tumoral que está frequentemente mutado
ou deletado em vários tipos de tumores, consequência esta de possíveis mecanismos envolvidos na supressão deste
gene. Finalmente, a expressão dos genes selecionados foi confirmada pela técnica de PCR em tempo real. Todas
as reações foram normalizadas com o gene endógeno α-TUB e somente a ANX1 foi validada com superexpressão
em 80% das amostras. Portanto, os resultados obtidos são capazes de revelar diferenças nos padrões de expressão
gênica entre os tecidos tumoral e normal, sugerindo que tais genes possam estar correlacionados à carcinogênese
contribuindo para a progressão tumoral. Estas informações contribuirão para diagnósticos e prognósticos
mais eficazes, facilitando o desenvolvimento de terapias dirigidas contra a ANX1, possível marcador molecular
para CP. Além disso, mais estudos são necessários para melhor caracterização molecular desse tipo tumoral.
Apoio financeiro: CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
133
Association of CDKN1B gene with sporadic prostate
cancer in Southern Brazilian Population
Accordi, ED1; Alexandre, RB1; Azevedo, B1; Silva, GPC1; Horvath A2; Faucz, FR1,2
Laboratory of Molecular Genetics, Core for Advanced Molecular Investigation (NIMA), Center for Health and Biological Sciences (CCBS),
Pontificia Universidade Católica do Paraná (PUCPR), Curitiba – PR – Brazil
2
Section of Endocrinology and Genetics, Program on Developmental Endocrinology & Genetics (PDEGEN), Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), Bethesda, MD, USA
[email protected]
1
Keywords: Prostate, cancer, CDKN1B, SNP, Brazilian Population.
A multigenic model of prostate cancer susceptibility has been proposed, in which common polymorphic
variants of genes, such as the androgen and vitamin D receptor, contribute to tumorigenesis. The discovery of
additional genetic factors involved in the prostate cancer predisposition is essential for the development of new
diagnostic and therapeutic molecular tools. We examined a single nucleotide polymorphic variants in codon
109 of CDKN1B [c.326T>G (p.V109G) rs2066827] for association with sporadic prostate cancer in a Southern
Brazilian population. Fifty-two cases and 110 controls were analyzed using PCR amplification and Single Strand
Conformation Polimorphysm (SSCP) analysis; to characterize the patterns initially, a direct sequencing was
applied on 15% of the samples using the MegaBACE™ 1000 sequencer (GE Healthcare). The CDKN1B genotype
was scored as T/T, T/G, or G/G. The T allele showed association with an increased risk of sporadic prostate
carcinoma (p=0.015, OR 1.84, 95% confidence interval, 1.09-3.09). An association between CDKN1B T/T genotype
and advanced prostate carcinoma has been reported in the context of androgen-independent disease, suggesting
that a restricted group of advanced cases might be informative to explore the above association. The complete
analysis of CDKN1B genotypes, in a more deep way, might determine the patients that are at risk for developing
advanced prostate carcinoma and therefore provide a previous screening, prophylaxis, and early treatment.
Apoio Financeiro: SETI - Secretaria de Estado da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
134
Polimorfismo do gene da MMP2 é associado com o
prognóstico de Câncer de Próstata
Timoszczuk, LMS¹; Reis, ST¹; Pontes Jr., J¹; Antunes, AA¹; Silva, IA¹; Ribeiro-Filho, LA¹; Dall’oglio, MF¹;
Abe, DK¹; Srougi, M¹; Leite, KRM¹
Laboratório de Investigação Médica da Disciplina de Urologia – LIM 55, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Câncer de próstata, Metaloproteinases da Matriz, Marcadores Moleculares, Diagnóstico, Prognóstico
Introdução: O Câncer de Próstata (CP) é o tumor mais freqüente do homem no Brasil. Polimorfismos de
Nucleotídeo Único (SNP) foram demonstradas na região promotora de genes da metaloproteinases de matriz
(MMP) e têm sido associados com o desenvolvimento e a progressão de alguns tipos de câncer. Neste estudo,
nosso objetivo foi investigar uma possível relação entre o polimorfismo da região promotora do gene MMP2 (1526
C/T) e parâmetros prognósticos clássicos no câncer de próstata. Material e Métodos: O DNA genômico foi extraído
utilizando protocolos convencionais de extração a partir de 100 pacientes submetidos à prostatectomia radical
para o tratamento de CP localizado e de sangue de um total de 100 homens, sem evidência de CP como controle. A
seqüência de DNA contendo o sítio polimórfico foi amplificado por Real-Time PCR, utilizando sondas fluorescentes
(Taqman ®). Os espécimes de prostatectomia radical foram analisados em Toto pelo mesmo uropatologista para
a determinação do escore de Gleason e estágiamento do tumor (TNM 2002). Resultados: O alelo polimórfico do
gene MMP2 (C1526T) foi mais freqüente em tumores estadiados pT3 (p = 0,026) e escore de Gleason ≥ 7 (p = 0,042).
Conclusões: Demonstramos que o polimorfismo de MMP2 está relacionado ao Cp com características patológicas
desfavoráveis do CP que poderiam ser usados para identificar pacientes com pior prognóstico. Nossos resultados
ilustram o uso potencial de SNP no gene da MMP2 como um marcador molecular para esta neoplasia.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
135
Features of genomic architecture close to PTEN
may facilitate acquisition of somatic genomic
rearrangements and deletions in prostate cancer
Squire, JA1; Ludkovski, O2; Evans, A2; Sircar, K3; Bismar, T4; Nuin, P1; Yoshimoto, M1
Dept. of Pathology, Queen’s University, Kingston, Ontario, Canada
Dept. Pathology, Princess Margaret Hospital, Toronto
3
MD Anderson Cancer Center, Texas, USA
4
Dept. Pathology, University of Calgary, Alberta, Canada
[email protected]
1
2
Keywords: prostate cancer, PTEN, rearrangement, microdeletion, genomics.
Genomic interstitial microdeletions of several hundred kb and focal rearrangements close to the PTEN locus at
10q23 are frequent and strongly associated with both initiation and progression in prostate cancer (CaP). However,
the genomic mechanism leading to PTEN losses in this region of chromosome 10 are poorly understood. We
propose that genomic architecture and clusters of sequence identity in this region of the chromosome may form
recombinational hotspots that facilitate genomic rearrangements and loss of PTEN as part of CaP tumorigenesis.
To investigate this hypothesis, the present study examines the role of segmental duplications (SD), copy number
variations (CNV) and fragile sites in the vicinity of PTEN and flanking loci to determine whether significant regions
of microhomologies could facilitate non-allelic homologous recombinational repair errors and initiate deletion
events. We mapped the breakpoint regions associated with PTEN deletions in CaP by FISH (n=330) and available
online SNP databases (n=117). FISH analyses showed that 41% of tumors had an interstitial genomic deletion of
PTEN with a maximum size of 2Mb. Mapping the size of copy number transitions based on SNP array data indicated
that interstitial deletions always centered on PTEN and typically encompassed ~700kb within this cytoband. Within
this deleted region there were a rare fragile site (FRA10A), and at least three clusters of nonredundant regions of
microhomology neighboring the deleted region by paired intrachromosomal SDs with sequence homology >95%
and alignment >10kb in length. Thus, the most remarkable findings of this study were the location of high-density
regions of SDs and CNVs flanking the genomic region frequently involved in CaP-associated breaks. Phylogenetic
analysis of these SDs clusters when compared to other species might indicate these genomic regions are evolutionary
conserved. Thus the model being developed suggests that somatic defects of a homology-dependent repair pathways
in undifferentiated prostate cancer progenitors utilizes tracts of microhomology to trigger the initial genomic
rearrangements that lead to PTEN genomic losses in tumor initiating cells. Collectively these data highlight the role
of sequence microhomology clusters surrounding PTEN locus on genomic stability in CaP in the predisposition to
deletion events that lead to the decreased gene dosage of pten, essential for CaP initiation and clinical progression.
Grant support from Canadian Cancer Society.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
136
O polimorfismo de microssatélite (STR) (TA)n do gene
do receptor de estrogênio alfa (REα) e o câncer de
ovário (OVCA)
Coitinho, LB; Araújo, KL; Almeida, LS; Cerri, MF; Rangel, LBA; Silva, IV
Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
Palavras-chave: câncer de ovário, polimorfismo, microssatélite, receptor de estrogênio alfa, estrogênio
O OVCA representa a 8ª malignidade entre as mulheres, porém a 5ª causa de morte por câncer entre elas. A relação
de polimorfismos genéticos do ESR1 com o risco de doenças geram grande interesse, pois tal receptor parece estar
ligado às doenças associadas ao envelhecimento da mulher. Acredita-se que o tamanho do STR (TA)n (n=n° de
repetições), localizado na região promotora do REa, tenha relevância fisiológica por afetar o uso do promotor. O
STR (TA)n mostrou exercer influência em doenças cardiovasculares, na osteoporose, na endometriose e tem sido
recentemente associado ao risco de desenvolvimento de câncer de mama e próstata. O objetivo deste estudo é
investigar a influência do STR (TA)n no OVCA. Através do HUCAM, do HSRC, Vitória/ES e do INCa, Rio de Janeiro/
RJ, 53 pacientes foram selecionadas e as respectivas amostras de ovário parafinadas foram resgatadas do setor
de Patologia desses hospitais. Essas pacientes apresentaram as seguintes medianas de idade (em anos): OVCA
55,5; tumor borderline (BOR) 48,5; adenoma (ADE) 39 e ovário normal (OVNO) 41. Entre as pacientes com OVCA,
61% apresentaram estadiamento 3 e 4 na data do diagnóstico. Dessas mulheres, 82% foram ao óbito ( sobrevida
= 13 meses), enquanto que nenhuma com ADE ou BOR sucumbiu. As amostras parafinadas forneceram DNAs
degradados, com sucesso da amplificação em 28 delas, fornecendo fragmentos de aproximadamente 100pb. A
maioria das amostras mostrou grande variação alélica dos fragmentos amplificados quando observadas em gel
de agarose 2%. Algumas amostras (n=10) foram sequenciadas (CENARGEN) e os OVCA apresentaram média de
9 repetições TA, enquanto OVN apresentou 7 repetições. Corroborando com os dados mundiais, as mulheres no
climatério foram as mais acometidas pelo OVCA e apresentaram baixa sobrevida. A presença de dois fragmentos
amplificados revelados no gel de agarose 2% denota que as amostras estudadas possuem grande variação alélica
do tamanho da repetição (TA)n. Apesar das evidências que o STR (TA)n exerce influência em diversas doenças,
nossos resultados ainda não são conclusivos para o OVCA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
137
Possível associação de combinações específicas
de genótipos e haplótipos de p16ink4a com lesão
intraepitelial de alto grau e câncer cervical
Vargas-Torres, SL1; Portari, EA2; Gayer, CRM1; Pinto, AC1; Santos-Rebouças, CB3; Camargo, MJ4;
Russomano, FB4; Macedo, JMB1
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, UERJ
Departamento de Patologia e Laboratórios, Faculdade de Ciências Médicas, UERJ
3
Serviço de Genética Humana, Departamento de Genética, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, UERJ
4
Laboratório de Patologia Cervical, Instituto Fernandes Figueira, FIOCRUZ
1
2
[email protected]
Palavras-chave: gene p16, polimorfismo, neoplasias cervicais.
O câncer de colo do útero é o segundo carcinoma mais frequente em mulheres no mundo e, acompanhando a
estimativa mundial, é um dos cânceres femininos mais prevalentes no Brasil. Tem sido demonstrado que a
infecção pelo papilomavírus humano (HPV) se mostra necessária mas não suficiente para a progressão do
câncer cervical, o que sugere que outros fatores, incluindo os de natureza genética, sejam determinantes para
o desenvolvimento da doença. A proteína p16INK4a, codificada pelo gene p16INK4a, participa da via ciclina D-CDK/
INK4/pRb/E2F, que se mostra importante no controle do ciclo celular. Em lesões pré-malignas e malignas do
colo do útero, tem sido observado um aumento considerável da sua expressão, possivelmente devido à presença
de oncoproteínas virais. Na literatura, não há descrição de qualquer estudo envolvendo alterações estruturais
no gene p16INK4a em neoplasias cervicais. No entanto, alguns poucos polimorfismos já foram identificados,
destacando-se p16 540C>G e p16 580C>T, ambos localizados na região 3’ não traduzida (3’UTR), que está
envolvida na regulação pós-transcricional da expressão gênica. O objetivo deste estudo foi avaliar as possíveis
associações entre as variantes polimórficas do gene p16INK4 e lesões cervicais. Para isso, foram coletadas amostras
de sangue em um grupo de 252 mulheres residentes no Rio de Janeiro, submetidas ao exame de colposcopia
no Instituto Fernandes Figueira (Fiocruz) por terem apresentado citologia cervical alterada. Após extração do
DNA genômico e amplificação da região de interesse por PCR (Polymerase Chain Reaction), os polimorfismos
p16 540C>G e p16 580C>T foram analisados, respectivamente, por MspI e HaeIII RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism). Os produtos da digestão com as endonucleases foram analisados por eletroforese em
gel de poliacrilamida 8% corado com brometo de etídeo. O grupo de estudo obedeceu ao princípio de HardyWeinberg. As distribuições genotípica e haplotípica se mostraram diferentes entre o grupo composto por mulheres
com lesão intraepitelial de alto grau (HSIL), carcinoma escamoso e adenocarcinoma em comparação ao grupo
formado por mulheres com lesão intraepitelial de baixo grau (LSIL) (p=0,03084 e p=0,03308, respectivamente). Os
resultados preliminares sugerem que mulheres com combinação genotípica C/G C/C e combinação haplotípica
C-C/G-C apresentam aproximadamente 2,5 maior chance de desenvolver HSIL e câncer cervical (OR=2,47; IC95%
1,17-5,28; p 0,0096 e OR=2,54; IC95% 1,21-5,43; p=0,0073, respectivamente) quando comparadas às mulheres
com LSIL. A análise da expressão da proteína p16 nas amostras de colo do útero está em andamento e será
considerada, juntamente com inúmeros fatores de risco clássicos para neoplasias cervicais, em análises futuras.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e UERJ.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
138
Micronucleus as a biomarker to evaluate the risk of
malignant transformation in uterine cervix
Aires, GMA1; de Oliveira, PC1; Oliveira, JL1; Meireles, JRC2; Cerqueira, EMM2
Laboratory of Toxicological Genetics. University of Feira de Santana
Department of Biological Science. Laboratory of Toxicological Genetics. University of Feira de Santana
[email protected]
1
2
Keywords: cervical cancer, micronucleus, apoptosis.
This study aimed to evaluate the micronucleus occurrence in women presenting normal smear and women with
different kinds of cervical alterations: inflammatory process; low and high grade squamous intraepithelial lesions
(LSIL and HSIL).The sample included sixty nine women attended in a public medical service for cervical cancer
prevention of Feira de Santana-Bahia-Brazil. Diagnosis was established by cytological, colposcopic and when
indicated histhopatological examination. Cytogenetic analysis was done in two thousand cells and included the
compute of micronucleus and nuclear degenerative alterations indicative of apoptosis (karyorrhexis, pyknosis
and condensed chromatin). Micronucleus frequency was significantly higher in women with HSIL as compared
with women without cervical alterations or inflammatory process (p<0.001) or women with LSIL (p<0.005).
Apoptosis occurrence was similar in women without cervical alterations and women presenting HSIL (p>0.50)
and significantly lower in these women when compared with those presenting inflammatory process or LSIL
(p<0.0001). These results indicate that MN analysis, beside Papanicolaou cervical cytology, may be utilized to
screening women under risk to cervical cancer development. The results also suggest that the compute of nuclear
degenerative alterations indicative of apoptosis increase the sensibility of this test.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
139
Análise por citometria de imagem da ploidia de DNA
em núcleos de epitélio cervical uterino suspeitos de
malignidade: relato de caso
Duarte, CEM1; Carvalho, CR1; Silva-Filho, AL2
Laboratório de Citogenética e Citometria, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brasil
Faculdade de Medicina – Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: citometria de imagem, ploidia de DNA, diagnóstico, câncer de colo uterino, valor C
O câncer de colo uterino é o segundo tipo de tumor mais comum entre as mulheres em todo o mundo, com cerca de
500.000 novos casos e 250.000 mortes a cada ano. A citometria de imagem (CI) tem sido utilizada com sucesso em
mais de 40 países, como metodologia adjuvante, principalmente por apresentar alta especificidade e sensibilidade
na detecção de lesões pré-malignas em diferentes tecidos. No presente relato, pretendeu-se analisar por meio
da CI um caso clinico suspeito de malignidade. A paciente havia sido previamente diagnosticada pela citologia
convencional como portadora de lesão intra-epitelial de alto grau. A avaliação histológica identificou um carcinoma
cervical microinvasor. A análise da ploidia de DNA foi executada sem o conhecimento prévio dos resultados da
citotopatologia. Para a execução da análise via CI, três lâminas de suspensão celular da amostra foram preparadas
via citocentrifugacão, contendo em cada uma delas células de referência do epitélio oral em regiões opostas da
mesma lâmina. O material foi submetido à reação de Feulgen. As imagens dos núcleos foram digitalizadas pelo
sistema de análise de imagens Image Pro® Plus 6.1 e os valores das densidades ópticas de cada núcleo processados
automaticamente pelo algoritmo do software e convertidos em densidades ópticas integradas (DOI). Esses valores
foram reescalonados em termos de conteúdo relativo de DNA (valor C) a partir dos quais foram plotados histogramas
para visualização e avaliação estatística dos picos G0/G1 e G2/M. No total, 644 núcleos foram analisados, detectouse 21 células com conteúdo de DNA excedente a 5C (5cEE) e uma célula excedente a 9C (9cEE). O coeficiente de
variação da razão entre a MODA da DOI das células de referência e das células não-patológicas G0/G1 obtido foi
de 1,5%, adequando-se ao limiar de 5%, internacionalmente proposto pela European Society for Analytical Cellular
Pathology. A detecção de células com conteúdo de DNA > 5C corresponde a uma ploidia anormal, e a presença de pelo
menos um 9cEE, qualifica a lesão como aneuplóide, prospectivamente maligna. Tem sido reportada que eventos
excedentes a 9C estão associados exclusivamente com infecção por papilomavírus de alto risco. Os resultados obtidos
ratificam a utilidade da citometria de imagem como ferramenta adjuvante para o diagnóstico de lesões cervicais.
Órgão Financiador: CNPq, UFV
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
140
Análise da inserção Alu c.156_157insAlu e de
ancestralidade em pacientes com síndrome de câncer
de mama e/ou ovário hereditário na Bahia
Abe-Sandes, C1,2; Abe-Sandes, K1, 3; Machado, TMB; Toralles, MBP1, 4; Meyer, L1,6; Romeo, M4; Canguçú,
AKF4; Freire, SM1; Garicochea, B5; Meyer, R1; Nascimento, I1
Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular, Universidade Federal da Bahia - UFBA, Salvador, BA
Universidade Federal da Bahia
3
Departamento de Ciências da Vida, Universidade do Estado da Bahia, UNEB, Salvador, BA
4
Serviço de Oncogenética, Hospital Universitário Professor Edgar Santos, UFBA, Salvador, BA
5
Departamento de Medicina Interna, Faculdade de Medicina, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, PUC, RS
6
Faculdade de Tecnologia e Ciências, FTC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: inserção Alu, câncer de mama; câncer hereditário, ancestralidade, BRCA2
Cerca de 5 a 10% dos casos de câncer de mama são hereditários e 80% destes são devido a mutações germinativas
pontuais e/ou grandes rearranjos genômicos, nos genes BRCA1 e BRCA2. Os grandes rearranjos representam de
8% a 40% de todas as mutações no gene BRCA1, mas apenas sete rearranjos foram descritos no BRCA2 em famílias
com história para câncer de mama e/ou ovário hereditários. Estima-se que uma em 600 mutações causadoras
de doenças são inserções Alu. A inserção Alu c. 156_157insAlu no gene BRCA2, é o rearranjo mais frequente em
pacientes portugueses com câncer de mama e ovários hereditários e foi considerada por Machado et. al. 2007
como uma mutação fundadora portuguesa. Com objetivo de identificar a inserção Alu c. 156_157insAlu e estimar
a ancestralidade genômica 86 pacientes com câncer de mama e/ou ovário e com história familiar positiva,
atendidas no Ambulatório de Oncogenética do Hospital Universitário Professor Edgar Santos (HUPES-UFBa)
foram analisadas. Todas as pacientes foram avaliadas pelo geneticista clínico, pelo psicólogo e assinaram o termo
de consentimento livre e esclarecido, antes da coleta do material biológico. O DNA genômico, foi extraído a
partir de 5 ml de sangue periférico, com o auxílio do Gentra Blood Kit® segundo as recomendações do fabricante e
estocado à temperatura de -20ºC. A mutação c.156_157insAlu foi analisada por PCR (Polimerase Chain Reaction)
utilizando primers específicos para a inserção. Para estimar a ancestralidade foram estudados sete marcadores
informativos de ancestralidade – AIMs (AT3, APO, Sb19.3, PV92, CKMM, FYnull e LPL) e o cálculo realizado no
programa ADMIX. A estimativa de mistura mostrou 71,1% de contribuição européia, 22,6% africana e 6,4%
ameríndia. Apesar da contribuição européia predominante e de 32,53% das pacientes terem referido ancestralidade
portuguesa não encontramos esta mutação em nenhuma das amostras analisadas. A ausência da inserção Alu
possivelmente é devido à região de origem dos migrantes portugueses que vieram para a Bahia e/ou efeito fundador.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPEX
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
141
Estudo do polimorfismo do gene MTHFR e sua relação
com o câncer de mama e câncer de ovário
Maia, LM1; Louro, ID1
Laboratório de Genética Humana e Molecular - Núcleo de Genética Humana e Molecular, Departamento de Ciências
Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
1
[email protected]
Palavras-chave: Câncer de Mama, Câncer de Ovário, gene MTHFR, Polimorfismo C677T, PCR-RFLP.
Introdução: Em todo mundo mulheres são acometidas por malignidades, entre elas pode-se destacar o câncer
de mama e o câncer de ovário. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o
mais comum entre as mulheres. Além de ser muito freqüente constitui um grave problema de saúde pública. É,
provavelmente, o câncer mais temido pelas mulheres, devido à possível mutilação pelo tratamento, afetando a
sexualidade e a imagem pessoal. O câncer de ovário é a oitava neoplasia maligna mais diagnosticada em mulheres
no Brasil, consiste no segundo tipo de câncer ginecológico mais comum e representa a principal causa de morte
entre todos os tipos de tumores ginecológicos, isto ocorre porque muitos poucos cânceres de ovário são detectados
em uma fase precoce. Acredita-se que a variação da expressão normal de um gene desempenha um papel central
na susceptibilidade a doenças, como exemplo pode–se destacar o MTHFR que acredita estar relacionado com
o desenvolvimento tanto do câncer de ovário quanto do câncer de mama. Objetivos: Verificar a presença do
polimorfismo C677T do gene MTHFR em pacientes com câncer de mama e de ovário, estimando a freqüência do
polimorfismo nestes tumores e analisar a possível associação desse polimorfismo com o desenvolvimento das
neoplasias analisadas. Materiais e Métodos: O DNA das amostras de tecido tumoral de mama e ovário foram
extraídas a partir de blocos de parafina ou tecido fresco seguindo o protocolo de fenol-clorofórmio ou pelo Kit
QIAamp ® DNA mini kit, respectivamente. Análise do polimorfismo foi através do processo de PCR-RFLP, no
qual o produto de PCR foi digerido com a enzima de restrição HINF I em banho-maria a 37ºC overnight. Os
produtos resultantes foram submetidos à eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 7% em 220 volts por um
período de 1 hora e 30 minutos, corado com nitrato de prata 0,1% para visualização de bandas. Resultados: Das
12 amostras analisadas até o presente momento, para o câncer de mama foi observado o seguinte resultado: 58,
33% das amostras analisadas, não possuíam o polimorfismo enquanto que 41,67% das amostras apresentavam
o polimorfismo, sendo que não foi encontrada nenhuma paciente homozigota para o polimorfismo.Para as 9
amostras de câncer de ovário, analisadas até o presente momento, observou-se a seguinte distribuição: 88, 89% das
amostras não apresentavam o polimorfismo, enquanto que 11,11% das amostras o polimorfismo estava presente,
sendo que não foi encontrada nenhuma paciente homozigota para o polimorfismo.Conclusão: Pode-se supor
uma baixa associação entre o polimorfismo C677T do gene MTHFR com o desenvolvimento tanto do câncer de
mama quanto do câncer de ovário, porém o estudo continuará para se obter um resultado mais exato e confiável.
Apoio Financeiro: UFES.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
142
Avaliação clínica e imunoistoquímica de pacientes com
neoplasia mamária – estudo retrospectivo
Castro, R1; Regiani, VR2; Leonel, C2; Gelaleti, GB2; Jardim, BV2; Moschetta, MG2; Bertollo, EMG1; Zuccari,
DAPC2
Unidade de Pesquisas Genéticas e Biologia Molecular – Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – SP
Centro de Estudos no Prognóstico do Câncer - CEPC/FAMERP-– Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer de mama, Imunoistoquímica, Neoplasia mamária, Laminina-5, Caveolina-1, Interleucina-8, Maspin.
A cada ano, 22% dos casos novos de câncer em mulheres são de mama. No Brasil, o câncer de mama é o que
mais causa mortes entre as mulheres desde 1979 com progressivo aumento. O carcinoma invasivo de mama
é definido como um grupo de tumores epiteliais malignos caracterizados por invadir o tecido adjacente, com
marcada tendência à metástase tanto local, quanto a distância, favorecida pela angiogênese tumoral. Para
auxiliar na eficácia do tratamento e do diagnóstico precoce da doença, o estudo da expressão de marcadores
prognósticos e preditivos do câncer de mama têm se revelado importante ferramenta de trabalho na rotina
diagnóstica e de pesquisa. Um estudo retrospectivo foi realizado com 88 pacientes de carcinoma mamário e
quatro marcadores (Lm-5; Cav-1, IL-8 e Maspin) pela técnica de Imunoistoquímica. A expressão destas proteínas
foi avaliada juntamente com características e evolução clínica. Não houve significância estatística quando
relacionados à expressão dos marcadores estudados com a sobrevida, tipo histológico ou reposição hormonal
(p>0,05). Foi verificada significância quando relacionados os fatores metástase local/óbito e quimioterapia/
sobrevida (p<0,004). Com isso percebemos que a busca por novos marcadores que possam auxiliar em um bom
diagnóstico ou sinalizadores para um rápido tratamento de neoplasias mamárias se faz cada vez mais necessária.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
143
Perfil genômico de metástases mamárias no
linfonodo sentinela
Torresan, C1,2; Ribeiro, EMSF1; Santos, SC1; Silveira, RL3; Urban, C3; Wall, R4; Haddad, BR2; Cavalli, IJ1;
Cavalli, LR2
Departamento de Genética-Universidade Federal do Paraná
Lombardi Comprehensive Cancer Center, Georgetown University, Washington DC, EUA
3
Serviço de Oncologia do Hospital Nossa Senhora das Graças, Curitiba, Paraná
4
Serviço de Anatomia Patológica do HC da UFPR, Curitiba, Paraná.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de mama, linfonodo sentinela, marcadores moleculares, CGH, CGH-array, FISH
O câncer de mama é considerado uma das principais doenças potencialmente letais em mulheres. O linfonodo
sentinela (LNS) é o primeiro linfonodo da cadeia linfática axilar, e o primeiro a apresentar células malignas nos
cânceres de mama que metastatizam. A presença de células tumorais no LNS é um indicativo para a dissecção
axilar completa. Apesar dos avanços metodológicos para detecção de células tumorais neste sítio, ainda existe
um significativo número de casos falso-negativos, principalmente no caso de micrometástases. Portanto, há a
necessidade do desenvolvimento de métodos com maior poder resolutivo, baseados em marcadores moleculares,
para a detecção com alta sensibilidade e seguranca de células tumorais no LNS. Neste trabalho, utilizamos CGH
(Hibridização Genômica Comparativa) (12 amostras pareadas) e array-CGH (Agilent 44K) (9 amostras pareadas)
para caracterizar metástases em LNS quanto à presença e ao padrão de alterações genéticas, comparando-as com
as encontradas nos correspondentes tumores primários (TP). A validação de dois genes que estão associados ao
desenvolvimento de metástases mamárias linfonodais (BP1 e HER2/NEU) foi realizada em 14 amostras pareadas
utilizando o método de FISH (Hibridização in situ por Fluorescência). As análises iniciais revelaram alterações de
número de cópias de DNA em todos os casos analisados. Uma grande similaridade foi observada entre os perfis
genômicos do LNS e do TP de um mesmo paciente, apesar de uma grande heterogeneidade genética ser observada
entre os casos. Ganhos de regiões cromossômicas foram mais frequentes que perdas e envolveram 1p, 1q, 3q, 6p, 8q,
9q, 11p, 13q, 16p, 17q e Xp nos TP, e 3p, 5p, 5q, 6q, 8q, 9p, 13q e Xq nos LNS. A análise dos mesmos casos por arrayCGH revelou tanto deleções como amplificações de regiões cromossômicas, envolvendo 1p (genes KLHL17, NOC2L,
PPIAL4), 9q (ANKRD20A, COL5A), 11p (PSMD13, SIRT3), 17q (BP1, HER2/NEU, TOB1, HOXB), 19p (MUC16, AZU1) e
20q (PSMA7). A análise por FISH dos genes BP1 e HER2/NEU validou os resultados de array-CGH em 60% dos casos.
A validação dos demais genes significantemente alterados está sendo realizada por TaqMan-Copy Number Assays
(Applied Biosystems). Alterações do número de cópias de DNA nos LNS podem representar as alterações genômicas
iniciais envolvidas no processo de metastatização mamária, contribuindo para a identificação de pacientes de risco.
Apoio financeiro: CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
144
Associação entre os polimorfirmos GLY388ARG
(FGFR4), C282Y (HFE), H63D (HFE), C677T (MTHFR) e o
câncer de mama
Gomide, NC1; Batschauer, AP1; Fonseca, FC1; Santos, IR1; Alves, MT1; Fernandes, AP1; Oliveira, VC3; Maia,
AM3; Ferreira, ACS3; Torres, PORT3; Carvalho, MG1; Gomes, KB1,2
Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais
Colégio Técnico da Universidade Federal de Minas Gerais
3
Departamento de Genética Humana do Hermes Pardini
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer de mama, FGFR4 , MTHF, HFE, PCR-RFLP
Introdução: O câncer de mama é uma doença em que fatores ambientais e genéticos se correlacionam e desencadeiam
uma série de alterações moleculares, envolvendo complexos mecanismos de regulação celular. Polimorfismos como
Gly388Arg no gene FGFR4, que codifica um receptor transmembrânico para fator de crescimento de fibroblastos;
C282Y e H63D no gene HFE, envolvidos no aumento do ferro sérico; e C677T no gene MTHFR, responsável pela
síntese da enzima metilenotetraidrofolato redutase envolvida na metilação do DNA, têm sido relacionados ao
desenvolvimento, bem como a um pior prognóstico de inúmeras neoplasias, dentre elas o câncer de mama.
Objetivo: Avaliar a associação entre os polimorfismos Gly388Arg no gene FGFR4, C282Y e H63D no gene HFE e
C677T no gene MTHFR com o desenvolvimento de câncer de mama e a ocorrência de metástases ou óbito. Materiais
e Métodos: Foram avaliadas 68 mulheres com diagnóstico clínico e histológico de câncer de mama, e um grupo
controle formado por 85 mulheres sem o histórico da doença. Todas as mulheres eram naturais de Santa Catarina
– Brasil. A detecção dos polimorfismos foi realizada através da técnica de PCR-RFLP com enzima de restrição
BstNI para Gly388Arg; BclI para H63D, RsaI para C282Y e HinfI para C677T.Os fragmentos, após eletroforese, foram
visualizados pela coloração com nitrato de prata. A comparação entre o grupo de pacientes e controle quanto à
presença/ ausência do polimorfismo foi realizada através do teste de qui-quadrado e a análise de regressão múltipla
foi realizada para avaliar a associação com metástase/óbito. Resultados: Não foi encontrada diferença significativa
na freqüência dos polimorfismos entre os dois grupos estudados - Gly388Arg (p= 0,78); C282Y (p=0,34); H63D (p=
0,50); C677T (p= 0,23). Utilizando a análise de regressão logística múltipla para avaliar a associação independente
entre os polimorfismos e a ocorrência de metástase ou óbito, observou-se que apenas o polimorfismo FGFR4
está associado significativamente à ocorrência desses eventos (p= 0,01; OD = 4,44; IC = 1,40-14,17). Exceto para o
polimorfismo C282Y, em que nenhum homozigoto foi observado nos grupos estudados, os polimorfismos podem
influenciar individualmente na ocorrência de metástase ou óbito com a seguinte probabilidade: 30,91% para FGFR4;
17,55% para MTHFR; 12,95% para H63D e quando associados (MTHFR+FGFR4+H63D) a probabilidade foi de 58,32
%. Conclusão: Os dados encontrados sugerem que não existe associação entre os polimorfismos Gly388Arg no
gene FGFR4, C282Y e H63D no gene HFE e C677T no gene MTHFR com o desenvolvimento de câncer de mama.
Porém, a presença do polimorfismo Gly388Arg no gene FGFR4 pode estar relacionada ao pior prognóstico da
doença, com uma probabilidade de 30,91% de ocorrência de metástase ou óbito. Já a associação dos polimorfismos
aumenta a probabilidade de ocorrência de metástase/óbito em 58,32% nas mulheres com câncer de mama.
Apoio Financeiro: FAPEMIG; PROGRAD - UFMG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
145
Caracterização Funcional de Alterações na Região
Promotora do Gene BRCA1 em Pacientes com Câncer
de Mama Hereditário
Fernandes, LR1,2; Costa , ECB2; Moreira MAM1
Divisão de Genética, Coordenação de Pesquisa, Instituto Nacional de Câncer
Departamento de Genética, Instituto de Biologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer de mama hereditário; BRCA1; Região Promotora; 5’UTR; Regulação da transcrição e tradução.
Mutações germinativas no gene BRCA1 podem ser identificadas por sequenciamento direto em aproximadamente
64% das famílias que apresentam síndrome de predisposição ao câncer de mama e/ou ovário. Outros fatores
associados ao desenvolvimento do câncer de mama e/ou ovário hereditários são alterações que não afetam a função
do gene BRCA1, mas sua expressão. A região promotora do gene BRCA1 possui dois promotores, promotor Alfa e
promotor Beta, além de dois primeiros éxons alternativos, denominados 1A (5’UTR-a) e 1B (5’UTR-b), que codificam
regiões que são transcritas mas não são traduzidas. A estrutura da região 5’UTR-b do gene BRCA1 revela mecanismos
potenciais a regulação de sua expressão. Outro elemento capaz de regular a expressão de BRCA1 é o estrogênio,
principalmente através de Erα. A relação entre as vias de BRCA1 e ERα forma uma intrincada rede envolvida
na proliferação celular e estabilidade genômica, mantendo um balanço entre dois efeitos opostos: oncogênico e
supressor de tumor. Recentemente foram descritas assinaturas ou perfis de expressão gênica com valor clínico
para o prognóstico adequado ou para a caracterização preditiva de pacientes ou de tumores. Apesar do padrão de
expressão de BRCA1 já ter sido proposto como um novo e útil marcador de prognóstico em casos câncer de mama
esporádico, nenhuma alteração na região promotora desse gene que afetasse seu padrão de expressão foi descrita em
casos de câncer de mama hereditário. O objetivo desse estudo é a avaliação da influência de variações na sequência
da região promotora de BRCA1 na transcrição e tradução de genes repórteres em linhagem celular eucariótica. Para
isso, as regiões promotoras e UTRs variantes, assim como as selvagens, foram clonadas em vetor pGL3-Basic ou
pEGFP-N1. Os plasmídeos recombinantes foram transfectados em linhagem celular MCF7, na presença e ausência
de estrogênio. A análise do perfil de expressão dos transfectados com os plasmídeos recombinantes contendo
as 5’UTRs (pEGFP-N1) foram analisados através de citometria de fluxo. Já os transfectados com os plasmídeos
contendo as regiões promotoras (pGL3-Basic) foram analisados através de ensaios de bioluminescências. Ambos
transfectados foram analisados através de PCR quantitativo. Através desses ensaios observamos que o estrogênio
é capaz de estimular a expressão de BRCA1 através da regulação positiva da transcrição e não da tradução. Além
disso, a tradução de BRCA1 pode ser inibida pela 5’UTR-b, de forma independente da ativação de sua transcrição.
Por fim, reiteramos que a regulação da expressão de BRCA1 ocorre tanto na transcrição e quanto na tradução e
que o transcrito contendo 5’UTR-a apresenta tradução três vezes mais eficiente que o contendo 5’UTR-b in vivo.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, FAPERJ, Convênio INCA-FIOCRUZ e MS.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
146
Triagem mutacional do gene TP53 em tumores de ovário
Tovar, TT1; Aguiar, VRC1; Sartori, MPD1; Louro, ID1
Nucleo de genética humana e molecular, Universidade Federal do Espírito Santo
[email protected]
1
Palavras-chave: Triagem mutacional, Tumor, Ovário, TP53, p53, DGGE, Mutação.
O câncer de ovário é o câncer ginecológico mais difícil de ser diagnosticado precocemente, o que resulta em
alta letalidade. É freqüentemente chamado de “assassino silencioso” por causar poucos sintomas até que tenha
metastizado para dentro da cavidade peritonial, momento no qual a chance de cura é drasticamente reduzida.
Fatores hormonais, ambientais e genéticos estão relacionados com o aparecimento desses tumores, sendo a história
familiar o fator de risco isolado mais importante. Há dois tipos de genes envolvidos no processo de carcinogênese:
oncogenes e genes supressores de tumor. Em relação ao câncer de ovário, o gene supressor de tumor TP53 tem
sido muito estudado no que diz respeito ao prognóstico e a predição da resposta clínica à quimioterapia. Mutações
neste gene conferem um mau prognóstico e estão presentes em aproximadamente 50% dos casos avançados
de carcinomas de ovário. Sua detecção é rotineiramente realizada através de técnicas de imunocoloração, que
apresetam alto índice de resultados falso positivo e falso negativo ou através da técnica de Conformação de Fita
Simples (SSCP), que possui baixo potencial de detecção de mutações em fragmentos com tamanho superior a
200pb. Com base nestes fatos, o presente trabalho propõe a utilização da técnica de Eletroforese em Gel com
Gradiente Desnaturante (DGGE) para análise da frequência mutacional dos éxons 6 a 8 do gene TP53 em
tumores de ovário, por ser uma técnica com maior sensibilidade e especificidade do que as técnicas de triagem
rotineiramente utilizadas. As amostras de DNA foram extraidas pela técnica de fenol-clorofórmio a partir de 134
amostras de tumores de ovário incluídos em blocos de parafina, provenientes do Instituto Nacional do Câncer
(Rio de Janeiro-RJ) e do Hospital Santa Rita de Cássia (Vitória-ES). A frequência de alterações genéticas detectada
nos éxons estudados foi de: 14,9% para o éxons 6; 3,3% para o éxon 7 e 16,2% para o éxon 8. Conclusão: A triagem
mutacional do gene TP53 em tumores de ovário é uma interessante pesquisa de base na identificação do potencial
agressivo do tumor e quando realizada por técnicas de triagem sensíveis, como o DGGE, conferem um resultado
mais apurado da freqüência mutacional.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
147
Associação entre polimorfismos do gene da
ciclooxigenase-2 (PTGS2) e o perfil histopatológico de
tumores de mama
Festa-Vasconcellos, JS1,2; Piranda, DN1,2; Murta, L1; Vianna-Jorge, R1,2
Divisão de Farmacologia/ CPQ/ INCA
Instituto de Ciências Biomédicas/ UFRJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ciclooxigenase-2; polimorfismos; câncer; dados histológicos; expressão
A enzima ciclooxigenase-2 (COX-2) tem sua expressão aumentada em diversos tipos de tumores e, em câncer
de mama, está associada a parâmetros de agressividade, incluindo tamanho tumoral, status nodal positivo
e menor sobrevida. A COX-2 é codificada pelo gene PTGS2, que apresenta polimorfismos na região promotora
(RP), próximos a sítios de ligação para fatores de transcrição, e na região 3’-não traduzida (3´-UTR), responsável
pelo controle da estabilidade do RNAm. Tais variantes genéticas podem contribuir para maior transcrição ou
maior estabilidade do RNAm, modulando a expressão da enzima. Nosso grupo caracterizou a freqüência dos
polimorfismos PTGS2 na população brasileira e realizou um estudo caso-controle para avaliação do impacto
dos quatro polimorfismos mais frequentes (três localizados na RP: -1290AG, -1195AG, -765GC e um na região 3´UTR: 8473TC) sobre o risco de câncer de mama. Nossos resultados sugeriram um aumento do risco de câncer
de mama associado ao polimorfismo 8473TC (OR = 1,44; IC95% = 1,01-2,06; P = 0,043). O presente estudo tem como
objetivos analisar a associação entre os quatro polimorfismos PTGS2 (e seus diferentes haplótipos) e: 1) parâmetros
histopatológicos com valor prognóstico sobre a evolução clínica do câncer de mama; 2) expressão de COX-2 no
tecido tumoral. A população do estudo foi composta das pacientes do estudo caso-controle prévio (N = 229; CEPINCA #116/07) e de uma coorte prospectiva de mulheres com câncer de mama em acompanhamento clínico
no HC3/INCA (N = 198; CEP-INCA #129/08). Foi realizado um estudo transversal para caracterização do perfil
histopatológico dos tumores no momento do diagnóstico e as variáveis analisadas foram: tipo histológico (ductal
ou lobular; invasivo ou in-situ), grau histológico (1-bem diferenciado, 2-moderadamente diferenciado, 3-pouco
diferenciado), tamanho do tumor (com base na maior dimensão) e número de linfonodos axilares acometidos.
Os dados foram obtidos a partir dos prontuários eletrônicos. A expressão de COX-2 no tecido tumoral foi
analisada por imunohistoquímica em espécimes parafinadas e o grau de expressão foi definido pela área e pela
intensidade de marcação. Com relação à distribuição das características histopatológicas, houve predominância
de carcinoma ductal invasivo (94,8%), com comprometimento linfonodal em 70,9% das pacientes e tamanho
superior a 2cm em 69,1 % dos tumores. Em relação ao grau histológico, houve 14,2% de grau 1; 41% de grau 2 e
44,8% de grau 3. A presença dos polimorfismos PTGS2 (analisados isoladamente) não alterou a distribuição das
variáveis histopatológicas no momento do diagnóstico. A avaliação de associação entre os diferentes haplótipos
PTGS2 e o perfil histopatológico ou o padrão de expressão tumoral de COX-2 encontra-se em andamento, tendo
sido realizada análise imunohistoquímica de 58 amostras até o momento. Os resultados parciais sugerem que
os polimorfismos PTGS2 não afetam a caracterização do prognóstico quanto à evolução do câncer de mama.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPERJ, FAF, MS-INCA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
148
Avaliação da associação de polimorfismos dos genes
MDR-1, TP53, CYP17, CYP1B1, CYP1A1 e COMT com
câncer de mama
Carvalho, FP1; Andrade ES2; Massaro, JD2; Santos, RA1; Mayorano, MB1; Carrara, HHA3; Andrade, JM3;
Takahashi, CS1,4
Laboratório de Citogenética e Mutagênese, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Laboratório de Genética Bioquímica, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
3
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
4
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: polimorfismos, câncer de mama, CYP1B1, associação, marcador preditivo.
Introdução: O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o mais comum entre as
mulheres. No Brasil, a incidência é de 51 casos a cada 100 mil mulheres. Polimorfismos como os Single Nucleotide
Polimorphisms (SNPs) em genes envolvidos no reparo do DNA, controle do ciclo celular ou apoptose (como o
TP53), em genes participantes da via metabólica do estrógeno (CYP17, CYP1B1, CYP1A1 e COMT) ou ainda em
genes envolvidos no metabolismo e eliminação de drogas (como o MDR-1), causam alterações que resultam em
proteínas modificadas que podem influenciar o desenvolvimento do câncer e a resposta a agentes terapêuticos.
Objetivo: Verificar a existência de associação dos SNPs: C3435T em MDR-1, Arg72Pro em TP53, T1931C em CYP17,
Val432Leu em CYP1B1, Iso432Val em CYP1A1 e Val158Met em COMT com a susceptibilidade ao câncer de mama,
por meio da comparação de amostras de 59 pacientes com carcinoma ductal invasivo e 89 controles. Métodos: O
DNA foi extraído a partir de amostras de sangue periférico utilizando-se o kit de extração WIZARD®. Em seguida
foi realizada a técnica de PCR-RFLP (com digestão por endonucleases). Os produtos de amplificação foram
visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida 10% não-desnaturante e corados em nitrato de prata. As
análises estatísticas foram realizadas com o uso dos softwares GENEPOP (Freqüências alélicas, Diferenciação
gênica e genotípica e Equilíbrio de Hardy-Weinberg), Arlequin (Diversidade genética, FST e Desequilíbrio de Ligação)
e Fstat (Heterozigose). Resultados: As freqüências alélicas não diferiram entre as pacientes e o grupo controle, com
exceção do gene CYP1B1, no qual o alelo selvagem (58,4%) foi mais freqüente que o alelo mutante (41,6%) no grupo
controle. Este mesmo SNP foi o único, dentre os estudados, capaz de diferenciar os dois grupos (p = 0,0357) quanto
às freqüências genotípicas. Os demais genes estudados não apresentaram diferenciação gênica ou genotípica.
Dois SNPs apresentaram desvios em relação ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg: um no gene TP53 (desequilíbrio
no grupo controle devido à deficiência de heterozigotos, p = 0,0359) e outro no gene CYP1B1 (desequilíbrio no
grupo controle decorrente do excesso de heterozigotos, p = 0,0004). A heterozigose variou de 0,311 (CYP1A1)
a 0,487 (CYP1B1) no grupo controle e de 0,347 (CYP1A1) a 0,503 (CYP1B1) nas pacientes. A heterozigose total
(considerando-se conjuntamente os dois grupos) variou de 0,327 (CYP1A1) a 0,506 (CYP1B1). Conclusão: Embora
não tenha sido observada nenhuma associação alélica entre os genes estudados, o polimorfismo Val432Leu no
gene CYP1B1 pode ser um marcador preditivo para indicar pacientes com susceptibilidade ao câncer de mama,
uma vez que apresentou diferenças nas freqüências alélicas e genotípicas entre os dois grupos analisados.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, FAEPA e CAPES.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
149
Polimorfismo no gene CYP17 em mulheres com padrão
mamográfico sugestivo de normalidade, atendidas em
serviço de referência de Cuiabá-MT
Lucca, RMR¹; Almeida, S²; Mariotto, LCR²; Gonçalves, MC²; Araujo, DF³; Carvalho, HAU4; Santo, GE5;
Moreno Neto, FC6; Galera, BB7
Mestrando em Ciências da saúde UFMT-FCM
Biólogas UNIC
3
Mestranda em Biologia molecular UNIFESP
4
Médica Radiologista Clínica Mamorad
5
Cirurgião Oncológico UNIC
6
Graduando em medicina UNIC
7
Professora do Departamento de Ciências Básicas e da Saúde UFMT-FCM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: polimorfismo, CYP17, câncer de mama, mamográfia, estradiol
O câncer de mama (CM) é a neoplasia mais freqüente no mundo entre as mulheres, sendo que os principais fatores
de risco incluem a menarca precoce, menopausa tardia, histórico familiar, tabagismo, etilismo, terapias hormonais,
exposição aos poluentes ambientais e predisposição genética. Para um diagnostico rápido, a mamografia tem sido
amplamente utilizada na identificação de neoplasias, tornando-se um método importante no rastreio de CM. Grande
maioria dos casos de CM é esporádica, muitas vezes aparecendo em mulheres com estilo de vida sadio. O polimorfismo
em alguns genes tem sido apontado como fatores predisponentes para esta neoplasia e muitas outras. Os polimorfismos
são variações em um gene que se encontra em proporção maior a 1% na população que podem ou não alterar o fenótipo
do individuo. As pesquisas que utilizam de polimorfismos genéticos como fatores de risco para doenças têm sido
amplamente realizadas visando um aprimoramento no diagnóstico e prevenção de diferentes condições nosológicas
principalmente do câncer, um bom exemplo seria os genes BRCA1 e BRCA2 relacionados ao CM hereditário. A biossíntese
e metabolização do estrogênio desempenham um importante papel na carcinogênese e na progressão do CM, sendo
assim, genes relacionados a esta função; como o CYP17; auxiliariam de forma expressiva no desenvolvimento desta
neoplasia. O polimorfismo A2 do gene CYP17 pode influenciar significativamente a biodisponibilidade de estradiol,
aumentando consequentemente o risco do desenvolvimento de CM. O objetivo do presente trabalho foi definir a
prevalência do polimorfismo A2 do gene CYP17 em 254 mulheres atendidas em um Serviço de Diagnóstico Imagenológico
de Cuiabá em relação a algumas variáveis. As mulheres incluídas no estudo não apresentavam CM observado pela
avaliação clínica e exames radiográficos. Todas foram submetidas a uma entrevista para coleta de variáveis do estudo.
As mulheres tiveram amostras de sangue periférico coletadas para extração de DNA que foram utilizadas para técnica
de PCR-RFLP do gene CYP17 e posterior genotipagem. Em um total de 254 mulheres com média de idade de 49,6 anos, O
polimorfismo A2 do CYP17 foi encontrado em 41,73% das mulheres somando-se os homozigotos (A2A2) e heterozigotos
(A1A2) dentre estas encontrou-se 24,4% de raça negra, 25% da raça branca e 50,6% marcaram outras opções; quanto ao
tabagismo 86,22% disseram não fazer uso de tabaco; em relação ao etilismo, as que não consumiam bebida alcoólica
eram de 92,91%; 88,18% das mulheres pesquisadas não apresentava histórico familiar de CM. Quanto à característica da
densidade mamográfica, foi observado que grande parte das mulheres (41,73%) apresentava mamas gordurosas com
tecido fibroglandular remanescente. Um diagnostico precoce e um acompanhamento clínico mais criterioso tem sido
proposto para estas mulheres em Cuiabá, assim como um possível aconselhamento genético e uma mudança do seu
estilo de vida evitando possivelmente o desenvolvimento desta neoplasia.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
150
Armadilha genética: A presença de instabilidades nos
DNAs nuclear e mitocondrial em tecidos tumorais
mamários esporádicos provenientes de mulheres do
estado do Rio de Janeiro
Costa, GS5; Moreira, CC5; Paradela, ER; Figueiredo, ALS; Avvad, E3; de Vitto, H4; Rumjanek, FD4; de Moura
Gallo, CV5; Góes, AC1
Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia, Departamento de Ensino de Ciências e Biologia, Rio de Janeiro, Brasil
Instituto Fernandes Figueira, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brasil
4
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, Rio de Janeiro, Brasil
5
Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia, Departamento de Genética, Rio de Janeiro, Brasil
[email protected]
1
3
Palavras-chave: Câncer de mama, instabilidade em microssatélite, perda de heterozigose, STR, forense, heteroplasmia, instabilidade mitocondrial.
Amostras arquivadas de tecidos tumorais podem ser utilizadas como fonte de informação genética para fins de
análise forense, como testes de paternidade ou identificações, na ausência de outras fontes. Entretanto, essas
amostras podem gerar um falso resultado devido às instabilidades genéticas. Neste estudo, foram analisados 67 pares
de amostras, provenientes de biópsia de tecido mamário fresco congelado (tumoral e não-tumoral) com o intuito de
determinar a freqüência de instabilidade genética em carcinomas mamários. Para a análise do DNA nuclear, foram
tipados 7 dos loci STR recomendados pelo CODIS: D16S539, D3S1358, D7S820, D13S317, FGA, TH01, TPOX e para a
análise do DNA mitocondrial foi seqüenciada a região HVI. Dos 67 pacientes, 17 (25%) apresentaram instabilidades
no DNA nuclear. O locus TPOX não apresentou alterações, já o locus D13S317, apresentou a maior freqüência
(17,3% LOH e 3,0% MSI) de instabilidade genômica. 21 pacientes (31,3%) apresentaram instabilidade no DNA
mitocondrial, sendo 14 heteroplasmias e 7 mutações em amostras tumorais. A instabilidade no DNA mitocondrial
em amostras de carcinomas mamários provenientes da população brasileira está ligeiramente associada (p=0,0669)
ao haplogrupo Europeu. Não foi verificada associação entre as instabilidades nuclear e mitocondrial. Apesar
dos DNAs provenientes de biópsias tumorais usualmente não serem empregados em testes de paternidade e de
identificação humana, os nossos resultados ratificam a atenção especial que se deve ter na utilização destas amostras.
Apoio financeiro: FAPERJ, CAPES.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
151
Análise da perda de heterozigose nas regiões 3p e 9p
em tumores Phyllodes primários e recorrentes e em
fibroadenomas mamários
Torrezan, GT¹; Lima, RS²; Urban, CA²; Ribeiro, EMSF¹; Cavalli, IJ¹.
Laboratório de Citogenética Humana e Oncogenética, Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná.
Hospital nossa Senhora das Graças, Curitiba/PR.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fibroadenoma, tumor Phyllodes, LOH, 3p, 9p.
Tumores Phyllodes são neoplasias fibroepiteliais mamárias histologicamente semelhantes aos fibroadenomas,
mas com um componente estromal neoplásico, monoclonal e com um amplo espectro de comportamento
clínico, podendo ser localmente agressivos e malignos. As características genéticas e moleculares destes tumores
não foram elucidadas. A inativação de genes supressores de tumor é um evento importante na carcinogênese
e muitas vezes envolve a mutação de um alelo e perda de um segmento cromossômico contendo o outro alelo.
Perdas de heterozigose (LOH) em alguns loci podem estar associadas com a progressão patológica em tumores
phyllodes e fibroadenomas. Este estudo teve como objetivo determinar a frequência de LOH em 6 tumores
phyllodes e 146 Fibroadenomas em sete marcadores microssatélites em 3p (D3S1274, D3S1079, D3S1300, D3S1581,
D3S1286, D3S1263 e D3S1307) e cinco em 9p (D9S1749, D9S1748, D9S171, D9S169 e D9S200). Foram utilizadas
amostras de sangue periférico (referência normal) e de tecido tumoral. As análises foram realizadas através de
amplificação por PCR com iniciadores fluorescentes e corrida eletroforética em sequenciador de capilar Megabace
1000. Teste de Qui-quadrado, teste exato de Fisher e teste t foram usados para analisar a associação entre LOH e
parâmetros clínicos e histopatológicos das pacientes (idade, tamanho do tumor e número de nódulos). Não houve
associação entre as frequências de LOH e os parâmetros clínicos e histopatológicos. Em tumores phyllodes, a LOH
foi frequente e extensa, uma vez que 50% (06/03) dos tumores apresentaram LOH em três ou mais marcadores.
Em contraste, apenas 15% (22/146) dos fibroadenomas apresentaram LOH em um ou mais marcadores. Com
base na baixa frequência de LOH observada nos fibroadenomas, nossos resultados sugerem que LOH nas
regiões 3p e 9p não são alterações importantes na etiologia desses tumores. Não houve homogeneidade entre
os locais de perda de tumores phyllodes de pacientes diferentes. Em um caso com tumor primário e recorrência
da mesma paciente foram encontradas regiões comuns de LOH, indicando uma origem comum das lesões.
Em contraste, a maioria dos casos dos fibroadenomas metacrônicos (n = 9) tinha padrões de LOH diferentes.
Apenas em uma paciente encontramos o mesmo padrão de LOH em duas lesões ipsilaterais, o que poderia
indicar que uma pequena proporção de fibroadenomas pode ter componentes de origem clonal e compartilhada.
Apoio Financeiro: Capes e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
152
Caracterização de um grupo de pacientes em risco
para câncer de mama e cólon hereditários quanto à
prevalência da deleção 1100C no gene CHEK2
Koehler-Santos, P1; Abud, J1; Ewald, IP1; Cossio, SL1; Rossi, C1; Vargas, FR2; Moreira, MA2; Achatz, MIW3;
Palmero EI4; Ashton-Prolla, P1,5; Prolla, JC6.
Laboratório de Medicina Genômica, Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS.
Instituto Nacional de Câncer, Rio de Janeiro, RJ.
3
Hospital do Câncer A C Camargo, São Paulo, SP.
4
Laboratorio de Oncologia Molecular, Hospital de Câncer de Barretos, SP.
5
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS.
5
Programa de Pós-Graduação em Ciências Gastroenterológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer Hereditário, Câncer Colorretal, Câncer de Mama, Gene CHEK2.
Introdução: Estima-se que cerca de 5% a 10% de todos os cânceres estejam associados à predisposição hereditária.
O reconhecimento do caráter hereditário da neoplasia intestinal é de grande importância, pois geralmente
predispõem à ocorrência de mais de um tipo de câncer em um mesmo indivíduo e estão associados a um maior
risco para outros familiares. O Rio Grande do Sul (RS) tem uma das maiores taxas de incidência de câncer de
mama e mortalidade de todo o País, sendo uma das principais causas de morte entre mulheres jovens (30-49
anos). Em famílias com câncer de mama e cólon, um gene freqüentemente alterado é o gene CHEK2. Esse gene
é um supressor tumoral que codifica uma proteína quinase envolvida no controle dos pontos de checagem do
ciclo celular. Objetivos: O presente estudo transversal tem por objetivo determinar a prevalência da deleção 1100C
no gene CHEK2 em uma amostra de conveniência composta por indivíduos brasileiros com diagnóstico clínico
de síndrome de predisposição hereditária ao câncer de mama e cólon (HBCC). Metodologia: Extração de DNA
genômico foi realizada por precipitação com sais a partir de sangue periférico. A região de interesse foi amplificada
utilizando metodologia de PCR de longo alcance com a enzima Elongase® (estratégia para eliminar amplificação
de pseudogenes), seguida de segunda amplificação em torno do exon 10 de CHEK2 onde se encontra a deleção. Os
fragmentos foram submetidos a seqüenciamento automatizado para detecção da mutação específica 1100delC
conforme protocolos já estabelecidos. Resultados e Conclusão: 59 pacientes não-relacionados foram estudados.
Apesar de apenas um indivíduo apresentar a mutação 1100delC no gene CHEK2, foi identificada uma outra
alteração do exon 10 em 23,7% dos pacientes (14/59) não descrita anteriormente. Esta variante provoca mudança
no quadro de leitura, correspondendo mais provavelmente a uma deleção ou inserção de um pequeno número de
bases. Estudos adicionais de caracterização desta variante e análise de regiões adjacentes estão em andamento.
A caracterização de famílias com múltiplos casos de câncer de mama e cólon é fundamental para direcionar as
estratégias de aconselhamento genético e manejo dos indivíduos em risco. A caracterização da nova mutação
identificada poderá resultar na identificação de um fator de risco particularmente freqüente para a população
brasileira.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
153
Síndromes Genéticas de Predisposição ao Câncer - relato
de caso de paciente com critérios clínicos para Síndrome
de Li Fraumeni-Like (LFL), Síndrome de câncer de mama
e ovário hereditário (HBOC) e Síndrome de Predisposição
ao câncer de mama e câncer colorretal (HBCC)
Beserra, BA1; Ewald, IP1,2; Bittar, C3; Giacomazzi, J1,2; Cossio, SL1,4; Netto, CBO3; Prottas, J2,5; Goldim, JR5;
Ashton-Prolla, P1
Laboratório de Medicina Genômica, Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clinicas de Porto Alegre.
PPG em Medicina: Ciências Médicas, UFRGS.
3
Serviço de Genética Médica, Hospital de Clinicas de Porto Alegre.
4
Pós-doutorado INaGemp.
5
Laboratório de Bioética e Pesquisa, Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: oncogenética, BRCA1, BRCA2 e TP53.
Introdução: As síndromes genéticas de predisposição ao câncer de mama estão associadas a mutações
germinativas em genes supressores de tumor de alta penetrância e são herdadas de forma autossômica dominante.
Entre as principais podemos citar a Síndrome de Li-Fraumeni e suas variantes (Li Fraumeni-Like,LFL), associada
a mutações germinativas no gene TP53 e a Síndrome de Câncer de Mama e Ovário Hereditário (HBOC), associada
a mutações germinativas em BRCA1 ou BRCA2. Objetivos: Descrever a investigação clínica e molecular em uma
família que preenche critérios clínicos de HBOC, LFL e HBCC. Materiais e Métodos: A avaliação clínica foi feita
em consulta de aconselhamento genético no Hospital de Clínicas de Porto Alegre. Heredograma e confirmação
da história de câncer com laudos anatopatológicos, demonstraram critérios para HBOC, HBCC e LFL. DNA
genômico foi extraído a partir de sangue periférico para realização das análises moleculares de BRCA1, BRCA2
e TP53. As análises realizadas incluiram MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) utilizando os
kits P002B e P045 (MRC-Holland); PCR para a identificação da mutação fundadora c.156_157insAlu no exon 3 do
gene BRCA2 sequenciamento completo bi- direcional de BRCA1, BRCA2, e TP53. Resultados preliminares: Apesar
da forte história familiar da paciente (3 familiares com câncer de mama: aos 55 anos, aos 56 anos e aos 46 anos, e
1 familiar com múltiplos tumores _ próstata, rim e melanoma aos 66, 73 e 74 anos, respectivamente) as análises
preliminares realizadas até o momento não evidenciaram mutação germinativa na probanda. Estas incluíram
seqüenciamento de toda sequencia codificadora e analise de rearranjos de BRCA1 e BRCA2, e análise de rearranjos
de TP53. Conclusão: Este caso ilustra a complexidade da investigação molecular em oncogenética e ressalta a
necessidade de investigação molecular ampla, considerando o envolvimento de mais de um gene de predisposição
ao câncer no diagnostico diferencial de uma família.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
154
Detecção e tipagem molecular de Papilomavírus
humano em Carcinomas de Hipofaringe
Carvalho, BP1; Vilanova-Costa, CAST1,2; Pereira, FC1; da Silva, CC2,3; Curado, MP4; da Cruz, AD 2,3,4
Laboratório de Genética Molecular e Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás - UFG, Goiânia,
Goiás, Brasil;
2
Núcleo de Pesquisas Replicon, Departamento de Biologia, Pontifícia Universidade Católica de Goiás – PUC-GO, Goiânia, Goiás, Brasil;
3
LaGene-Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular,SuLeide, SES-GO, Brasil;
4
Registro de Câncer de Base Populacional, Associação de Combate ao Câncer em Goiás, Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: Papilomavírus humano, oncogênese, genotipagem viral, carcinomas, hipofaringe.
Estudos desenvolvidos desde o início da década de 1980 até a atualidade, apesar de extensos e aprofundados,
ainda não nos permitem definir com total precisão qual o possível papel do HPV na carcinogênese de cabeça e
pescoço. Dentre os fatores que geram controvérsias, podemos destacar o achado freqüente de variados tipos de
HPV em mucosa oral normal, numa incidência que varia de 0% a quase 100% em diversos estudos. A importância
da infecção pelo HPV na carcinogênese de células epiteliais é suportada pela capacidade dos HPVs de alto risco,
principalmente os tipos 16 e 18, de imortalizar os queratinócitos orais, quando em análise in vitro. O processo de
imortalização pode envolver a desativação de proteínas supressoras de tumores pré-formadas pelas oncoproteínas
virais, o bloqueio da transcrição de genes supressores de tumores como resultado da inserção do oncogene do
HPV, ou a estimulação da transcrição do oncogene celular pela inserção de seqüênci­as ativadoras de transcrição
derivadas do próprio genoma do HPV. No presente estudo, o grupo amostral foi constituído de 24 pacientes
diagnosticados com carcinoma de hipofaringe. Os casos foram obtidos do Registro de Câncer de Base Populacional
de Goiânia/GO da Associação de Combate ao Câncer em Goiás. Todos os pacientes considerados foram
diagnosticados como carcinomas de hipofaringe (CID-O: C12.0 a C13.9). Todas as amostras foram submetidas a
uma PCR com os primers genéricos MY09/11 e GP05/06 para detecção em amplo espectro do genoma de HPV.
Posteriormente, utilizou-se a mesma abordagem, com os primers tipo-específico para HPVs 6, 11, 16, 18, 33, 35,
45 e 58. Em 9 das 24 amostras utilizadas, foi observada amplificação com os primers genéricos, identificandose o genoma de HPV em 37,5% (6/24) dos casos. Em 67% (6/9) das amostras, o genoma viral foi detectado por
MY09/11 e em 33% (3/9) pelos primers GP05/06. As amostras positivas foram então submetidas a uma segunda
PCR para a genotipagem dos HPVs, tendo sido observados os tipos 16, 18 e 45. Os tipos virais mais associados ao
câncer da hipofaringe, no presente estudo, foram os HPV 16 e 18, presentes em 6 amostras e o HPV45, encontrado
em 1 amostra. Em um paciente foi observada a co-infecção de tipos virais de HPVs 16 e 18. Contudo, mesmo
diante de tantas pesquisas realizadas, há muito para ser explorado, apesar de uma hipótese possível para a
carcinogênese ser a interação sinérgica de carcinógenos químicos, virais, oncogenes e genes supressores de tumores.
Apoio financeiro: NPR / PUC-GO / LaGene / ACCG / IARC / CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
155
Efeito antiproliferativo da proteína anexina A1 mediada
pelo receptor FPRL1 nos neutrófilos do carcinoma
epidermóide de laringe humano
Gastardelo, TS1; Cury, PM2; Maniglia, JV3; Tajara, EH4; Oliani, SM 1,5
Pós-graduação em Morfologia – Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brasil.
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil;
3
Departamento de Otorrinolaringologia, Faculdade de Medicina, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil;
4
Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina, São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil;
5
Departamento de Biologia – Universidade Estadual Paulista (UNESP), São José do Rio Preto, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Anexina A1, receptor FPRL1, cancer, inflamação, neutrófilos
Várias evidências demonstram que o desenvolvimento e a progressão do câncer dependem não somente de suas
características genéticas, mas também de interações das células tumorais e inflamatórias. No desenvolvimento
tumoral, a proteína anti-inflamatória anexina A1 (ANXA1) tem sido associada com a progressão em alguns tumores
invasivos, sugerindo um papel na regulação da migração/invasão das células neoplásicas. Recentes estudos,
propostos para entender a terapia anti-inflamatória, têm sugerido que a ação regulatória da ANXA1 pode ser
mediada por meio dos receptores para peptídeos formilados (nFPRs). Com essas considerações, nós investigamos o
papel dos neutrófilos no câncer e a expressão intracelular da ANXA1 e do receptor FPRL1 nessas células. As análises
morfológicas e quantitativas dos neutrófilos foram realizadas em amostras controle, peritumoral e tumoral de vinte
pacientes com carcinoma epidermóide de laringe humano. Nessas amostras, realizamos reações imunocitoquímicas
com os anticorpos anti-ANXA1 e anti-FPRL1 e analisadas no Microscópio Eletrônico de Trasmissão. Nas laringes
controle e peritumoral, observamos poucos neutrófilos, na sua maioria, intravasculares. Enquanto, no tecido
tumoral, estas células estavam em maior número e extravasados no estroma. As reações imunocitoquímicas
ultra-estruturais mostraram alta expressão da ANXA1 e do receptor no citoplasma e núcleo, e baixa na membrana
plasmática. O aumento da expressão dessas moléculas foi significativo nas amostras tumorais em relação às controle
e peritumorais. As co-localizações ANXA1/FPRL1 observadas na membrana, citoplasma e núcleo não apresentaram
diferenças significativas entre as amostras estudadas. Nossos dados sugerem que os neutrófilos, células efetoras
da resposta inflamatória, apresentam um importante papel regulatório na proliferação das células tumorais,
possivelmente por meio da interação funcional entre a ANXA1 e o seu receptor FPRL1. Os mecanismos de ação
pelos quais a ANXA1 atua na biologia tumoral são pouco conhecidos e, considerando o seu papel nos processos antiinflamatórios/antiproliferativos, novos estudos poderão ocasionar terapias alternativas no tratamento do câncer.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
156
Avaliação do polimorfismo 3’ UTR do gene TS em
câncer gástrico na população paraense
Araújo, MD1; Harada, ML1.
Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará.
[email protected]
1
Palavras-chave: Câncer gástrico, TS e polimorfismo.
O câncer gástrico é uma importante causa de morte no Brasil. Em 2010, segundo o INCA, são previstos 21.500 novos
casos, destes 650 no Estado do Pará. Este tipo de câncer é uma doença influenciada por fatores intrínsecos, como
fatores genéticos e infecção por H. pylori e extrínsecos, como alimentação e uso de cigarro. A enzima codificada pelo
gene Timidilato Sintase, TS, está envolvida no metabolismo do folato, podendo influenciar no processo de síntese e
reparo do DNA. Este gene possui diversos polimorfismos, dentre eles uma deleção/inserção de 6pb na região 3’ não
traduzida, sendo a deleção relacionada com a baixa expressão intratumoral in vivo e diminuição da estabilidade in
vitro do mRNA. Em diversos estudos este polimorfismo tem sido relacionado com a susceptibilidade ao câncer. O
presente trabalho teve como objetivo analisar o polimorfismo da região 3’ UTR do gene da TS, relacionando-o com
características histopatológicas . Amostras de 44 pacientes submetidos à gastrectomia e de um grupo controle de
84 pessoas foram analisadas a partir da extração de DNA, seguida de amplificação por PCR. O produto de PCR
foi digerido com a enzima de restrição Dra I e a identificação genotípica foi realizada em gel de poliacrilamida a
10%. As análises estatísticas foram realizadas no programa Biostat 4.0, usando os testes de Qui-quadrado e Oddsratio. A frequência dos alelos del6 e ins6 foram, respectivamente, 0.39 e 0.61 nas amostras tumorais e 0.43 e 0.57
no grupo controle. Estas freqüências estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg. A análise comparativa revelou que
indivíduos com genótipo del6/ins6 possuem risco de aproximadamente 2.5 vezes maior de desenvolver câncer
gástrico do tipo difuso quando comparados com homozigotos del6 e ins6. Graziano et al. (2004) encontraram uma
associação entre o genótipo del6/ins6 e o risco de desenvolver a carcinogênese gástrica bem como uma presença
significativamente maior do alelo del6 em paciente com câncer do tipo difuso, semelhante aos resultados obtidos
no presente estudo,o que sugere o envolvimento do polimorfismo 3’UTR na susceptibilidade ao câncer gástrico.
Apoio financeiro: FAPESPA, CNPq e UFPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
157
Estudo da imunorreatividade da proteína p53
e de mutações do gene TP53 em amostras de
adenocarcinoma gástrico dos Estados do Pará e Ceará
Seabra, AD1; Araújo, TMT1; Mello Junior, FAR1,Lima, GNF1; Rabenhorst, SHB2; de Assumpção, PP3
Burbano, RR1; Khayat, AS1
Laboratório de Citogenética Humana, Universidade Federal do Pará.
Laboratório de Genética Molecular, Universidade Federal do Ceará.
3
Hospital Universitário João de Barros Barreto, Universidade Federal do Pará.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer gástrico, TP53, Mutação, Imunohistoquímica e Sequenciamento.
Introdução: No Brasil, o câncer gástrico é a terceira neoplasia em taxa de óbito e frequência entre os homens, e a
quinta entre mulheres. Dentre os genes que, quando acometidos por alterações, venham a implicar em processos
carcinogênicos, o TP53 é encontrado modificado em 50% das neoplasias humanas. Esse gene é responsável por
mecanismos, entre outros, de bloqueio de ciclo celular e de apoptose. Por meio de estudos com imunohistoquímica
podemos evidenciar a potencial insuficiência funcional da proteína p53, observada como uma superexpressão
protéica. Esta superexpressão protéica se deve ao fato da p53 não ter sido degradada durante o período tido como
padrão das células somáticas, sendo esta degradação intermediada pela mdm2, que tem função ubiquitinadora sobre
a p53. Esta degradação, que ocorre por indução da p53 à transcrição de MDM2, pode ser inviabilizada por alterações
no TP53 que impeçam a indução desta transcrição ou que alterem o sítio de ligação na p53, onde a mdm2 faria sua
ligação. Objetivo: Assim, este trabalho visa pesquisar a sequência nucleotídica do TP53, codificante do domínio de
ligação ao DNA – éxons 5 ao 9, correlacionando os resultados com dados imunohistoquímicos e clínico-patológicos.
Material e métodos: Foram analisadas 50 amostras de câncer gástrico, de ambos os tipos histológicos de Lauren e
abrangendo todos os estádios patológicos e localizações anatômicas. As sequências nucleotídicas foram obtidas
por sequenciamento direto em sequenciador ABI 3130 (Apllied Biosystems, CA - USA). A expressão da proteína p53
foi avaliada por imunohistoquímica, com uso do anticorpo DO-7 (DakoCytomation, UK). Resultados e discussão: Os
resultados evidenciaram a presença de mutações de sentido trocado T150K, A161T, P177L, G185S, T230A, G244S,
G286L, E286K, P295H, P295R e H296N, assim como mutações silenciosas R248R e E286E, sendo estas mutações já
observadas por outros autores. Foram encontradas também algumas mutações, ainda não descritas nos principais
bancos de dados existentes. A correlação entre os aspectos clínico-patológicos, os resultados imunohistoquímicos
e as análise do sequenciamento não evidenciou significâncias estatísticas. Algumas das alterações nucleotídicas
observadas no gene TP53, como a troca de glicina por serina no códon 244, podem vir a gerar um sítio de fosforilação.
Este novo sítio de fosforilação pode ter potencial para levar a modificações severas na atividade protéica, e até
mesmo inativá-la. Assim, alterações nestas regiões podem ter papéis fundamentais no aumento da expressão
protéica nuclear, além de poderem estar relacionadas com o inicio ou progressão da carcinogênese gástrica.
Apoio financeiro: CNPq e UFPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
158
Citocinas pró e anti-inflamatórias: TNF-b e IL-10 e
risco para gastrite crônica e câncer gástrico
Oliveira, JG1; Nascimento, PP; Silva, AE1
Laboratório de Citogenética e Biologia Molecular Humana - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia,
Universidade Estadual Paulista, UNESP Campus de S.J. Rio Preto.
[email protected]
1
Palavras-chave: câncer gástrico, gastrite, polimorfismo, citocinas.
O câncer gástrico é uma doença caracterizada como multifatorial associada a fatores ambientais e genéticos.
A carcinogênese do estômago pode progredir de uma inflamação crônica da mucosa gástrica, resultante
da infecção pela bactéria Helicobacter pylori que ativa a resposta inflamatória do hospedeiro. Assim, tem-se
avaliado a associação de polimorfismos gênicos de fatores envolvidos no processo inflamatório, os quais podem
modular o padrão de resposta imune do hospedeiro, como as citocinas, implicadas no processo carcinogênico.
Neste estudo, avaliou-se a associação de lesões gástricas (gastrite crônica e câncer gástrico) e fatores ambientais
( fumo, etilismo e infecção pela H. pylori) com dois polimorfismos, TNFB+252A/G e IL-10-592 C/A (rs1800872) em
genes de citocinas pró- e anti-inflamatórias, respectivamente.Os polimorfismos foram genotipados pela técnica
de PCR- RFLP (Polymerase Chain Reaction/Restriction Fragment Length Polymorphism), avaliando-se o padrão
eletroforético a partir de DNA de sangue periférico, em cerca de 675 indivíduos (200 com câncer gástrico-CG;
229 com gastrite crônica-GC e 246 controles-C). O SNP (Single Nucleotide Polymorphism) TNFB+252A/G não
foi associado com risco de gastrite crônica ou câncer gástrico, não sendo observadas diferenças significantes
das frequencias dos alelos TNFβ+252 A e G entre os grupos: 0,68 e 0,32 no grupo CG, 0,65 e 0,35 no GC e 0,70
e 0,30 no C, respectivamente. Da mesma forma as frequencias genotípicas foram similares entre os grupos
casos e controle para os genótipos TNFβ+252 A/A, A/G e G/G respectivamente (grupos CG: 51,2%, 37,8% e 11%;
GC: 44%, 41,5% e 14,5% e C: 51,2%, 37,8%, e 11%). Entretanto, para o SNP IL-10-592C/A as frequencias alélicas
e genotípicas foram significantemente diferentes no grupo CG em comparação ao grupo C (p<0,01) e entre os
grupos GC e C (p<0,01), respectivamente. As frequencias alélicas IL-10-592 C e A foram 0,70 e 0,30 em ambos
grupos CG e GC e 0,84 e 0,16 no grupo C, enquanto as freqüências genotípicas IL-10-592 C/C, C/A e A/A foram
respectivamente 50,5%, 40% e 9,5% no grupo CG; 46,3%, 46,3% e 7,4% em GC e 70%, 27% e 3% no grupo C. As
análises da regressão logística multivariada mostraram que o sexo masculino (OR=2,56; 95% IC= 1,60-4,08; p<0,01),
o hábito etilista (OR= 3,09; 95% IC=1,91-5,00; p<0,01) e o alelo polimórfico IL-10-592A (OR=2,52; 95% IC=1,64-3,88;
p<0,01) estavam associados com maior suscetibilidade ao risco de desenvolvimento do câncer gástrico. Também
foi observada associação positiva no grupo de GC com o polimorfismo IL-10-592C/A (OR= 2,77; 95%IC=1,87-4,11;
p= 0,00) em relação ao grupo C. Conclusões: Assim, a variante polimórfica IL-10-592A pode estar associada ao risco
aumentado para gastrite crônica e câncer gástrico nesta amostra da população brasileira, considerando que este
polimorfismo pode reduzir o nível de expressão do gene e conseqüentemente menor atividade anti-inflamatória.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
159
Estudo dos polimorfismos PIN3 e PEX4 do gene TP53
em amostras de câncer gástrico
Araújo, TMT1; Mello Jr; FAR1; Lima; GNF1; Seabra; AD1; Paiva, SC2; dos Santos, NPC2; Burbano, RR1;
Khayat, AS1.
Laboratório de Citogenética Humana, Universidade Federal do Pará.
Laboratório de Genética Humana e Médica, Universidade Federal do Pará.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Câncer gástrico, TP53, Polimorfismo, PEX4, PIN3, Sequenciamento.
Introdução: O câncer gástrico é a quarta causa mais frequente de câncer no mundo. O Estado do Pará possui uma
alta incidência desta neoplasia e sua capital Belém já esteve na 11ª posição, em frequência, entre todas as cidades
do mundo. Dentre os genes que, quando acometidos por alterações, estão envolvidos em processos carcinogênicos,
o TP53 é o que se encontra alterado em 50% das neoplasias humanas. Há relatos de que um polimorfismo no
gene TP53, o PIN3 ins16pb (rs17878362), que consiste em uma inserção de 16pb (alelo A2) no íntron 3, tenha
influência nos efeitos carcinogênicos de algumas neoplasias, sendo observado no aumento de risco em câncer
de mama e por outro lado, a ausência da inserção (alelo A1) foi associada ao aparecimento precoce de neoplasias
em indivíduos com Síndrome de Li-Fraumeni. Outro polimorfismo, no códon 72 (rs1042522) do éxon 4 (PEX4 ou
P72R) deste mesmo gene, é considerado como fator de risco para as principais doenças neoplásicas em humanos.
Suas variantes, Arg e Pro, supostamente afetam diferencialmente a sobrevida em diferentes neoplasias. Portanto,
estes dois polimorfismos muito comuns têm demonstrado contribuir para a suscetibilidade e comportamento
tumoral. Objetivo: O propósito deste estudo é avaliar a frequência do PEX4 e PIN3 em amostras de adenocarcinoma
gástrico, bem como realizar um estudo correlativo entre estes polimorfismos e os aspectos clinico-patológicos
destas neoplasias. Material e métodos: Foram analisadas 50 amostras de tumores gástricos primários submetidos
à ressecção cirúrgica. A análise do polimorfismo PEX4 foi realizada utilizando a técnica de sequenciamento
direto e a análise do polimorfismo PIN3 foi realizada empregando a técnica de PCR, genotipado no sequenciador
ABI3130 utilizando o programa GeneMapper ID v3.2 (Applied Biosystems). Resultados e discussão: Foi observada
uma frequência de 60% do genótipo Arg-Arg/A1A1, 20% do Pro-Pro/A1A1, 16% do Arg-Pro/A1A1, 2% do Arg-Arg/
A1A2 e 2% do Pro-Pro/A2A2. Apesar da baixa frequência, a presença do alelo A2 foi observada em estadiamentos
avançados. As frequências alélicas achadas neste estudo estão de acordo com os dados descritos em populações
de hígidos, embora não corroborem com achados de outras neoplasias, como o câncer de mama. Conclusão:
Não foi observada correlação estatística entre o aparecimento das variantes polimórficas em PIN3 e PEX4, assim
como entre estes polimorfismos e os aspectos clínico-patológicos das amostras de câncer gástrico estudadas.
Apoio Financeiro: CNPq e UFPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
160
Genética de populações de IL8 e seus receptores e
susceptibilidade genética ao câncer gástrico
Pereira, L; Lyon-Freire, F; Zamudio, R; Tarazona-Santos, E
Laboratório de Diversidade Genética Humana, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Minas Gerais
Palavras-chave: IL8, IL8RB, câncer gástrico, susceptibilidade genética, polimorfismos.
O câncer gástrico, principalmente o adenocarcinoma, é uma neoplasia com grande incidência e mortalidade no
Peru. Vários fatores estão relacionados com esta patologia, como infecção por H. pylori, dieta e polimorfismos
genéticos. A infecção da mucosa gástrica por H. pylori resulta em inflamação e como consequência os níveis de
proliferação e angiogênese aumentam. Em um tecido normal durante a inflamação são produzidas citocinas próinflamatórias, como a interleucina 8 (IL8) e após a recuperação do tecido são produzidas citocinas anti-inflamatórias
para cessar a reação inflamatória. Se o tecido não for recuperado, como acontece em uma inflamação crônica, as
células continuam a proliferação, ficam mais expostas a agentes carcinogênicos e podem sofrer uma transformação
maligna. As células tumorais produzem citocinas, essas citocinas recrutam leucócitos e os leucócitos produzem
mais citocinas mantendo o processo inflamatório. A identificação de polimorfismos em genes envolvidos no
processo inflamatório pode ser importante na identificação de indivíduos com maior predisposição ao câncer
gástrico. Com o objetivo de avaliar a susceptibilidade genética ao câncer gástrico na população peruana, nós
realizamos uma análise do padrão de diversidade da região promotora de IL8 e seus receptores IL8RA e IL8RB.
Foram incluídos 125 peruanos miscigenados (78 com câncer gástrico e 47 controles) e 25 ameríndios (Peru – grupo
étnico Quéchua), além de dados de sequências do SeattleSNP de duas populações parentais (24 africanos e 23
europeus). Foram sequenciados 721 pb do gene IL8 (promotor, 5´UTR) e 931 e 921 pb dos promotores dos genes
IL8RA e IL8RB, respectivamente. A partir das análises das sequências foram calculadas frequências genotípicas e
haplotípicas e análise de desequilíbrio de ligação de 7 SNPs do gene IL8 e 5 SNPs do gene IL8RB. Todos os SNPs estão
em equilíbrio de Hardy-Weinberg, exceto 1 SNP no IL8. As frequências genotípicas de 2 SNPs (rs3890158 - IL8RB e
rs4073 - IL8) encontradas nas amostras de ameríndios, casos e controles foram muito diferentes das frequências nas
populações africana e européia. Foram inferidos 7 haplótipos em IL8 e 11 em IL8RB. Análise da diversidade interpopulacional mostrou que os indivíduos peruanos miscigenados (casos e controles) possuem maior semelhança
com a população ameríndia, e provavelmente recebeu maior contribuição do pool gênico dessa população parental
para sua formação. Testes de Neutralidade realizados com dados de sequenciamento mostraram que a diversidade
observada na população do estudo pode ser explicada pelo equilíbrio mutação-deriva. A análise das sequências do
gene IL8RA está sendo finalizada. A partir desses resultados os SNPs rs3890158 e rs4073 estão sendo estudados em
uma amostra maior de indivíduos (389 casos e 314 controles) para um estudo de associação com o câncer gástrico.
Apoio financeiro: FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
161
Polimorfismo na região reguladora do gene TNF-α
–857C/T e risco de câncer gástrico.
Nizato, DM1; Oliveira, JG1; Silva, AE1
Laboratório de Citogenética Humana e Biologia Molecular, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual
Paulista- UNESP, São José do Rio Preto, SP.
[email protected]
1
Palavras-chave: polimorfismo genético, câncer gástrico, gastrite, TNF-α –857, citocinas
Introdução: A carcinogênese do estômago pode ser ativada por processo inflamatório iniciado a partir da gastrite
crônica desencadeada pela infecção por Helicobacter pylori. O aumento do risco de progressão maligna está associado
ainda com fatores ambientais, como a dieta, o tabagismo e o etilismo. Durante a resposta do hospedeiro ao processo
inflamatório induzido pela H. pylori ocorre a participação de um conjunto de citocinas pró e anti-inflamatórias,
que modulam a resposta imune e as quais também podem estar implicadas no processo carcinogênico. Portanto a
interação entre fatores ambientais e variantes genéticas polimórficas de genes de citocinas pode determinar maior
suscetibilidade ao desenvolvimento desta neoplasia. Objetivos: Avaliar a ocorrência de associação da variante
–857C/T da região promotora do gene da citocina pró-inflamátoria TNF-α ao maior risco de desenvolvimento da
carcinogênese do estômago, comparando para isso, grupos de pacientes com câncer gástrico-CG e gastrite crônicaGC ao grupo de indivíduos saudáveis-C. Além disso será investigada a ocorrência de interação desse polimorfismo
com fatores ambientais como tabagismo, etilismo e infecção pela H. pylori. Material: Foi utilizado DNA de sangue
periférico de 614 indivíduos (160 com CG, 224 com GC e 230 C) para genotipagem do polimorfismo pela técnica de
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction/Restriction Fragment Length Polymorphism), e posterior avaliação do padrão
eletroforético. Resultados: O polimorfismo não foi associado com o risco de gastrite ou câncer gástrico, não sendo
observadas diferenças significantes das frequências dos alelos C e T entre os grupos: 0,78 e 0,22 no grupo CG, 0,80
e 0,20 no grupo GC e 0,80 e 0,20 no grupo C, respectivamente. As frequências genotípicas nos grupos CG, GC e C
para TNF-α C/C, C/T e T/T, também não mostraram diferenças estatisticamente significantes entre os grupos
(grupos CG: 59,37%; 35,63% e 5,00%; GC: 65,18%; 30,80% e 4,02%; C: 69,13%; 23,04% e 1,83%, respectivamente). No
grupo CG, a análise de regressão logística multivariada evidenciou que o etilismo (OR=4,19; 95% IC = 2,05 - 8,56; p =
0,0001) está associado a uma maior suscetibilidade ao desenvolvimento da neoplasia gástrica. Conclusão: Apesar
da indicação de que polimorfismos na região reguladora da citocina pró-inflamatória TNF-α leva ao aumento
de atividade transcricional, podendo estar envolvida na patogênese e progressão do câncer, os resultados não
evidenciaram associação do polimorfismo -857C/T com risco aumentado de câncer gástrico na população avaliada.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
162
Avaliação da instabilidade de microsatélites em
indivíduos com câncer coloretal de Minas Gerais
Caxito, FA1; Rasuck, CG1,2; Leite, SMO3; Oliveira, VC1,2; Gomes, KB2,4
Hermes Pardini – Belo Horizonte, MG;
Pós-Graduação em Genética, ICB/UFMG – Belo Horizonte, MG;
3
Santa Casa de Belo Horizonte – Belo Horizonte, MG;
4
COLTEC/UFMG – Belo Horizonte, MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer coloretal, genes de reparo, instabilidade de microssatélite, HNPCC, reparo
Introdução: O câncer coloretal (CCR) corresponde ao terceiro tipo de câncer mais comum no mundo ocidental,
sendo o segundo em número de mortes. O CCR pode ser divido em: esporádico, onde o paciente não possui
histórico familiar e corresponde à 85% das neoplasias coloretais; e o câncer hereditário, que corresponde
de 10 a 15% do total de casos. O HNPCC (Hereditary nonpolyposis colorectal câncer), ou Síndrome de Lynch,
constitui a principal síndrome hereditária de predisposição ao câncer coloretal, e se devolve em decorrência de
mutações em genes de reparo - MMR (Mismacht Repair). Estes genes são responsáveis pela correção dos erros na
replicação do DNA e, quando mutados, perdem sua função ativa. A presença de metilação na região promotora ou
mutações em regiões codificadoras dos MMR’s pode ser avaliada através da instabilidade de microsatélites. Essa
instabilidade é classificada como alta (MSI-High) quando mais de 40%, de no mínimo cinco marcadores do tipo
microsatélite analisados, apresentam instabilidade. O uso de critérios clínicos (Amsterdam II e Bethesda), que
foram criados com o intuito de aumentar a sensibilidade do diagnóstico de pacientes com HNPCC, nem sempre
são claros, recomendando-se assim, análise de instabilidade de microsatélites. Objetivo: avaliar a instabilidade de
microsatélites em pacientes de Minas Gerais diagnosticados, pelos critérios de Amstredam II e Bethesda, como
HNPCC. Materiais e métodos: Foram analisadas amostras de 79 pacientes com HNPCC, onde o tecido tumoral
foi comparado ao tecido normal de cada paciente, utilizando-se 6 marcadores microsatélites: BAT25, BAT26,
BAT40, D2S123, D17S250 e APC. Resultados: Dentre os casos analisados, 21,5% dos pacientes apresentaram alta
instabilidade de microsatélites. O marcador BAT25 apresentou a maior frequência de instabilidade (26,6% dos
pacientes classificados como MSI-High), sendo, portanto o mais sensível, enquanto o marcador APC apresentou
a menor frequência de instabilidade (15,2%). Conclusão: Como em todo tipo de câncer, a possibilidade de
diagnosticar previamente a doença relaciona-se diretamente com uma porcentagem mais alta de sobrevivência.
Assim, a análise da instabilidade de microsatélites é de extrema importância para diagnosticar o HNPCC. No
entanto, estudos visando à validação de novos marcadores genéticos são necessários, uma vez que a análise de
microsatélites não apresenta sensibilidade para diagnosticar o HNPCC em todos os casos.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
163
Estudo da mutação V600E no gene BRAF no
rastreamento do câncer colorretal hereditário:
resultados preliminares
Macedo, GS1,4; Koehler-Santos, P1,2; Maia, ALS3; Ashton-Prolla, P1,2,4,5
Laboratório de Medicina Genômica, Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
Programa de Pós Graduação em Ciências Médicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Programa de Pós Graduação em Endocrinologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
4
Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
5
Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer colorretal, síndrome de lynch, BRAF, V600E, câncer hereditário
Mutações germinativas em genes de reparo do malpareamento do DNA (MMR – Mismatch Repair) são causadoras
da Síndrome de Lynch, uma síndrome hereditária de predisposição ao câncer. Perda de expressão de alguma
das proteínas deste sistema de reparo leva a uma instabilidade em regiões repetitivas do genoma, evento esse
conhecido como instabilidade de microssatélites (IMS). IMS é encontrada em aproximadamente 90% dos casos
de pacientes com Síndrome de Lynch, e ocorre em 15-20% dos casos esporádicos de câncer colorretal. Devido
às implicações no tratamento e manejo dos pacientes, e seus familiares, a correta identificação da etiologia do
tumor (esporádico x hereditário) se faz necessária. Recentemente, mutações no oncogene BRAF têm sido descritas
em vários tipos de câncer. BRAF é uma proteína quinase serina/treonina que faz parte de uma via de sinalização
envolvida na proliferação, diferenciação, secreção e morte celular. Mutações no gene BRAF, predominantemente
no códon 600 (troca de uma valina por glutamato), têm sido encontradas em aproximadamente 10% dos cânceres
de cólon. Esta mutação ocorre quase que exclusivamente em tumores que apresentam hipermetilação do
promotor de hMLH, e raramente estão associadas a mutações germinativas nos genes MMR. Alguns trabalhos
têm sido publicados mostrando que tumores colorretais positivos para BRAF V600E seriam esporádicos e esse
achado poderia excluir a indicação de pesquisa de mutações em genes MMR. Sendo assim, o presente estudo
tem por objetivo estimar a frequência da mutação V600E no oncogene BRAF em uma amostra de pacientes
com câncer colorretal e verificar se a sua ocorrência, especialmente nos casos sem expressão colônica normal
de hMLH1 e/ou com metilação do promotor de hMLH1, corresponde à descrita na literatura. Até o momento,
foram incluídos 75 indivíduos com diagnóstico clínico de câncer colorretal esporádico (tumor diagnosticado
acima de 60 anos de idade e ausência de história familiar de câncer, 23 casos) e câncer colorretal hereditário
(critérios de Amsterdam e Bethesda, 18 e 34 casos, respectivamente). A análise da alteração V600E do gene BRAF
foi realizada em DNA genômico de tumor emblocado em parafina por PCR, seguido de seqüenciamento direto da
região de interesse. A análise foi concluída para os primeiros 37 casos (5/18 Amsterdam, 12/34 Bethesda e 20/23
dos CCR esporádicos), não sendo identificada a mutação (V600E-BRAF) em nenhum dos casos analisados. Este
resultado negativo pode estar relacionado ao pequeno tamanho amostral até o momento, fenótipo hereditário
de um número significativo dos casos ou então, a mutação pode ser menos prevalente em nossa série de casos.
Além disso, no único caso de CCR desta série que apresentou metilação da região promotora do gene hMLH1, a
mutação em BRAF não foi identificada. Outras 100 amostras de tumores esporádicos serão incluídas no estudo.
Fomento: FIPE-HCPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
164
Associação entre o polimorfismo do gene da proteína
catiônica eosinofílica e a eosinofilia tecidual associada
aos tumores em carcinomas espinocelulares de boca
Pereira, MC1,2; Oliveira, DT1; Olivieri, EHR3; Rogatto, SR4; Carvalho, AL5; Landman, G6; Kowalski, LP7
Faculdade de Odontologia de Bauru – Universidade de São Paulo,
Universidade Federal de São João Del Rei – Campus Centro-Oeste Dona Lindu,
3
Departamento de Genética – Instituto de Biociências – Universidade Estadual Paulista e Hospital do Câncer A.C. Camargo,
4
Departamento de Urologia – Faculdade de Medicina – Universidade Estadual Paulista e Hospital do Câncer A.C. Camargo,
5
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço – Fundação Pio XII – Hospital do Câncer de Barretos,
6
Departamento de Patologia - Hospital do Câncer A.C. Camargo,
7
Departamento de Cirurgia de Cabeça e Pescoço - Hospital do Câncer A.C. Camargo.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Carcinoma espinocelular, Eosinófilos, Polimorfismo genético, Proteína catiônica eosinofílica, Prognóstico.
Introdução: A proteína catiônica eosinofílica (ECP) presente nos grânulos específicos dos eosinófilos apresenta
atividade citotóxica, particularmente para células tumorais, entretanto a função exata dos eosinófilos e de seus
produtos nas neoplasias malignas continua obscura. Objetivos: Investigar a prevalência do polimorfismo 434(G>C)
do gene ECP em pacientes com carcinoma espinocelular (CEC) de boca e sua correlação com a eosinofilia tecidual
associada aos tumores (TATE), bem como com as características demográficas, clínicas e microscópicas. Métodos:
O genótipo 434 do gene ECP em 165 pacientes saudáveis e em 157 pacientes com CEC de boca, tratados no
Hospital do Câncer A.C. Camargo entre 1984 a 2002, foi detectado pela clivagem da seqüência específica de DNA
amplificada com a enzima de restrição PstI e análise dos produtos de clivagem pela eletroforese em gel de agarose.
A TATE foi determinada por análise morfométrica. A associação entre os genótipos, a intensidade da TATE e as
variáveis demográficas, clínicas e microscópicas foi avaliada pelo teste qui-quadrado ou teste exato de Fisher. As
análises das sobrevidas global, livre de doença e específica por câncer foram feitas pelo estimador limite de KaplanMeier e a comparação das curvas de sobrevida foi realizada utilizando-se o teste log-rank. Resultados: Notou-se
uma predominância dos indivíduos heterozigotos para o polimorfismo 434(G>C) do gene ECP. Nenhuma diferença
estatística significativa foi obtida entre os diferentes genótipos, a intensidade da TATE e as variáveis demográficas,
clínicas e microscópicas. Uma maior freqüência de esvaziamento cervical bilateral, recidiva local, embolização
vascular, comprometimento das margens cirúrgicas e realização de radioterapia pós-operatória foi observada nos
pacientes com CEC de boca, TATE intensa e genótipos 434GC/CC. Não houve correlação estatística significativa entre
os diferentes genótipos 434 do gene ECP e as sobrevidas global, livre de doença e específica por câncer. Conclusões:
Houve uma tendência de os pacientes com CEC de boca, intensa eosinofilia tecidual e genótipos 434GC/CC do gene
ECP apresentarem uma evolução clínica desfavorável, quando comparados aos indivíduos com genótipo 434GG,
provavelmente pela presença de uma variante genética dessa proteína com propriedades citotóxicas alteradas.
Apoio financeiro: FAPESP e Capes.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
165
Busca de marcadores de agressividade em carcinomas
de cabeça e pescoço: uma abordagem proteômica
Tajara, EH1,6; Polachini, GM1; Vidotto, A1; Mercante, AMC2; Leopoldino, AM3; Henrique, T1; Kuramoto, ACK4;
Cunha-Neto, E4; Kalil, J4; GENCAPO, HNGP5
Faculdade de Medicina, São José do Rio Preto;
2
Hospital Heliópolis, São Paulo;
3
Faculdade de Ciências Farmacêuticas, USP, Ribeirão Preto;
4
Instituto do Coração - INCOR, USP, São Paulo; 5http://ctc.fmrp.usp.br/clinicalgenomics/cp/group.asp;
6
Instituto de Biociências, USP, São Paulo; SP, Brazil
[email protected]
Palavras-chave: carcinoma de cabeça e pescoço, proteômica
Os carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço estão fortemente relacionados ao consumo de tabaco
e álcool e possuem taxas elevadas de mortalidade. A presença de metástase em linfonodos regionais é o fator
prognóstico mais importante, mas nem sempre passível de detecção por análises clínica e laboratorial. Esse fato
enfatiza a necessidade de identificação de biomarcadores que possam efetivamente contribuir para diagnóstico
precoce e previsão da progressão tumoral. No presente estudo, analisamos o perfil protéico de 245 amostras
de carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço com (N+) ou sem (N0) metástases linfonodais e de suas
mucosas adjacentes normais, bem como 32 amostras de linfonodos e amostras de saliva e soro de 22 pacientes
e 32 controles saudáveis. Para atingir o objetivo proposto, realizamos eletroforeses uni e bidimensional, DIGE,
espectrometria de massas, Western blot e imuno-histoquímica. Na comparação de tumores N+ e N0 e tecido
normal, foram observadas proteínas diferencialmente expressas, incluindo anexina A1, calgranulinas, cofilina,
galectina, glutationa S-transferase P e alguns tipos de citoqueratina. Essas proteínas estão envolvidas em
sinalização, resposta inflamatória, apoptose, adesão, diferenciação e proliferação celulares. Os perfis de tumores
pequenos, mas já metastáticos, e de tumores grandes não-metastáticos foram similares, mas não idênticos,
com diferenças de expressão de algumas proteínas que podem estar relacionadas ao fenótipo agressivo. Os
linfonodos N+ e N0 também mostraram alteração de expressão de proteínas associadas a desenvolvimento da
epiderme, proliferação celular, migração, adesão, apoptose e resposta inflamatória, algumas delas também
alteradas nos tecidos tumorais, como glutationa S-transferase P, galectinas e citoqueratinas, além de outras como
calreticulina, transtirretina, profilina e FABP. Os dados sobre enzimas do metabolismo glicolítico sugeriram um
efeito do microambiente sobre a reprogramação metabólica da célula neoplásica. Em relação a saliva e soro, os
perfis protéicos de pacientes foram distintos daqueles observados em controles, com mudanças de expressão
de componentes da resposta inflamatória e da adesão celular. Do nosso conhecimento, este é o primeiro estudo
proteômico de linfonodos em carcinomas de cabeça e pescoço que também avaliou tecido tumoral, saliva e soro.
Seus resultados podem ajudar no entendimento dos mecanismos de agressividade desses carcinomas em nível
molecular e, somados aos dados de fluidos corporais, auxiliar no desenvolvimento de novos testes diagnósticos .
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq, FINEP, CAPES.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
166
Investigação de polimorfismos dos genes TC2, BHMT,
MTHFD1, MTHFR, CBS, RFC1 e MTR envolvidos no
metabolismo do folato e a suscetibilidade ao câncer de
cabeça e pescoço
Silva, LMRB1; Galbiatti, ALS1; Ruiz, MT1,3; Biselli-Chicote, PM1; Fernandes, GMM1; Raposo, LS2;
Pavarino-Bertelli, EC1,3; Goloni-Bertollo, EM1,3
Unidade de Pesquisa em Genética e Biologia Molecular – UPGEM, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
Departamento de Otorrinolaringologia e Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
3
Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – FAMERP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: câncer de cabeça e pescoço, polimorfismos, metabolismo do folato, genes, suscetibilidade
O carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço é considerado um dos tumores mais freqüentes em países em
desenvolvimento e tem como principais fatores de risco o consumo de tabaco e de álcool, seguidos de uma dieta
inadequada e infecções virais. Alterações no metabloismo do folato resultam em modificações na metilação
do DNA e na estabilidade genômica, podendo contribuir para o processo de carcinogênese. Polimorfismos em
genes que codificam enzimas envolvidas na via do folato podem interferir nas concentrações de homocisteína,
S-adenosilmetionina e outros produtos do metabolismo, importantes para a síntese de DNA e reações de
metilação celular. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência de nove polimorfismos da via do folato
TC2 C776G, TC2 A67G, BHMT G742A, MTHFD1 G1958A, CBS 844ins68, MTR A2756G, RFC1 A80G, MTHFR
A1298C e MTHFR C677T no risco para o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço, e verificar a associação
entre estes polimorfismos, os parâmetros clínicos e fatores de risco. Foram analisados os dados epidemiológicos
como gênero, idade, tabagismo e etilismo de 645 indivíduos (191 pacientes com a doença e 454 indivíduos sem
história de neoplasia). As técnicas de PCR-RFLP e PCR em Tempo Real foram utilizadas para análise molecular.
A comparação entre os grupos e a associação dos fatores de risco e parâmetros clínicos com os polimorfismos foi
realizada pelo teste estatístico de regressão logística múltipla. Os resultados entre os grupos mostraram que as
variáveis fumo (OR:2,91; IC95%=1,77-4,79), idade acima de 42 anos (OR:30,05; IC95%=12,53-72), gênero masculino
(OR:2,44; IC95%=1,31-4,53), e o polimorfismo RFC1A80G (OR:1,90; IC95%=1,18-3,06), estão associadas com o
risco para o câncer de cabeça e pescoço (p<0,05). A análise dos fatores de risco e dos polimorfismos, mostrou
associação entre: o hábito de fumar e MTR A2756G (OR:2,16; IC95%=1,17-3,98) e RFC1 A80G (OR:2,18; IC95%=1,213,94); o gênero masculino e MTHFR A1298C (OR:1,80; IC95%=1,09-2,96) e RFC1 A80G (OR:2,20; IC95%=1,283,77); e a idade superior a 42 anos e MTR A2756G (OR:1,77; IC95%=1,10-2,83) e RFC1A80G (OR:1,84; IC95%=1,162,92) (p<0,05). Quanto aos parâmetros clínicos o polimorfismo TC2 A67G esteve em menor proporção em
pacientes que apresentaram a faringe como sítio primário (OR:0,13; IC95%=0,03-0,48) (p<0,05). Em conclusão,
há associação entre polimorfismos da via do folato e o risco para o carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP; apoio - FAMERP/FUNFARME
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
167
Polimorphism analysis of GSTP1 gene in patients with
carcinoma squamous cell carcinoma of larynx
Amancio, AP¹; Silva, DC¹; Reis, AAS1; Melo, COA1; da Cruz, AD1
¹Pontifícia Universidade Católica de Goiás – Departamento de Biologia - Núcleo de Pesquisas Replicon
[email protected]
Palavras-chave: susceptibility, xenobiotics, larynx, carcinoma e GSTP1.
Squamous cell carcinoma of the larynx is one of the most common tumors of head and neck, damaging important
functions such as speech, swallowing, breathing and protecting the lower airways. This incidence is related to
exogenous factors such as smoking, alcoholism and even individual genetic susceptibility. Polymorphism of the gene
encoding the enzymatic phase of detoxification of carcinogens may modify the biometabolismo of these agents. In
this study we compared the allelic frequency of the GSTP1 gene in case-control groups and investigate the degree of
susceptibility of patients diagnosed with squamous cell carcinoma of the larynx by the Serviço de Cabeça e Pescoço
do Hospital Araújo Jorge. We analyzed 50 patients with laryngeal cancer and 50 individuals with no history of previous
neoplasia. Genomic DNA was extracted and subjected to PCR, generating a fragment of 176pb. Subsequently, PCR
products were subjected to Enzymatic Restriction. For the evaluation of the case group, the genotypes (Ile / Ile)
were 52%, for genotypes (Val / Val) were 14% and (Ile / Val) had 34%, while the control group patients for genotype
(Ile / Ile) were 56% for genotype (Val / Val) were 04% and (Ile / Val) were 40% respectively. Conclusions, there were no
statistically significant associations of variants of GSTP1 gene genotype with squamous cell carcinoma of the larynx,
and additional studies would promote a better statistical analysis involving the enzymes encoded by this gene.
Apoio: FAPEG; PROPE/PUC-GO
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
168
Correlação clínica do polimorfismo do códon 72 do
gene TP53 em pacientes com câncer colorretal
Lima, FCC1a; Mota, ED2; Ferreira, FA1a; Silva, ER2; Leal, CBQS1b; Cunha, BCR1b; Saddi, VA1ab,2; Ayres, FM1a,3
Pontifícia Universidade Católica de Goiás – aMestrado em Genética e bDepartamento de Biomedicina.
Associação de Combate ao Câncer em Goiás – Hospital Araújo Jorge – Setor de Anatomia Patológica.
3
Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: sobrevida, fator prognóstico, metástase, genótipo, tabagismo, etilismo.
O câncer colorretal (CCR) é o terceiro mais incidente no mundo e o segundo mais freqüente em países desenvolvidos.
Mais de 50% dos casos atinge pessoas acima de 60 anos, sendo 20 a 50% mais incidente em homens. A sobrevida
global média em 5 anos varia entre 40 e 50%. No Brasil, o CCR é a quinta causa de morte em ambos os sexo, com
taxas de mortalidade crescentes nas últimas décadas. Aqui, nós investigamos o polimorfismo do códon 72 do gene
TP53, dados clínicos e de estilo de vida de 80 pacientes com CCR atendidos entre 1998 e 2002 pela Associação
de Combate ao Câncer em Goiás. Esse polimorfismo é caracterizado por um alelo codante de prolina (TP53
Pro) e outro de arginina (TP53 Arg). O TP53 Arg apresenta alta resistência a malignização devida à eficiência
mitocondrial pró-apoptótica. Enquanto o homozigoto TP53 Pro/Pro foi relacionado ao desenvolvimento de
doenças malignas e maior tempo de vida. Desses 80 pacientes, 48% era do sexo feminino e 52% do sexo masculino,
34% era fumante, 28% era etilista. As frequências genotípicas foram 76, 21 e 3% para TP53 Arg/Arg, Arg/Pro e Pro/
Pro, respectivamente. A média de idade dos pacientes foi de 60 anos, variando de 25 a 87 anos. A relação de risco de
desenvolvimento do CCR por idade e por genótipo não foi significante. Entretanto, pacientes com genótipo TP53
Pro/Pro desenvolveram CCR mais tardiamente que os pacientes com genótipos TP53 Arg/Arg e TP53 Arg/Pro.
Os estadiamentos clínicos foram classificados como I (28%), II (11%), III (36%), IV (15%) ou não foram descritos
(10%). A genótipo TP53 Arg/Arg foi o mais frequente em todos os estadiamentos, variando de 67 a 83%. As taxas
de sobrevida dos pacientes, em 5 anos, foram 24, 15 e 50% para os genótipos TP53 Arg/Arg, Arg/Pro e Pro/Pro,
respectivamente. Diferença estatística não foi observada entre as curvas de sobrevida para os diferentes genótipos,
bem como para o histórico familiar. Esses resultados foram contrastados com os dados de 85 controles considerados
saudáveis, sem que relevância fosse observada entre os dois grupos quanto aos fatores sexo, etilismo e tabagismo.
Apoio financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
169
Investigação de sete marcadores INDEL, em genes
associados a diversos tipos de câncer, na população de
Belém
Paiva, SC1; Santos, NPC1; Alencar, DO1; Santos, S1
Universidade Federal do Pará, Instituto Ciências Biológicas, Laboratório de Genética Humana e Médica.
[email protected]
1
Palavras-chave: neoplasia, INDEL, TP53, XRCC1, CYP2E1
As neoplasias malignas são responsáveis por praticamente 17% dos óbitos de causa conhecida. No Pará, estimase cerca de 7.720 novos casos de neoplasias para o ano de 2010, e assim como na população brasileira, o Estado
apresenta o câncer de pele não melanoma como o mais prevalente (2.010 novos casos), seguido do câncer de
colo do útero (790); do câncer de próstata (700); câncer gástrico (650) e outros (3.570). Atualmente, o controle e a
prevenção do câncer estão entre os maiores desafios lançados à ciência e à gestão pública. O acúmulo de mutações
no genoma e mudanças epigenéticas, que desregulam o controle feito por alguns genes, são consideradas as
principais causas de câncer. Nos últimos anos, polimorfismos de inserção/deleção (INDEL) tem sido o foco de
diferentes pesquisas de associações com doenças e já foram relatados vários INDEL associados com a predisposição
ao câncer, e ao risco elevado de desenvolver esta patologia. No presente estudo, investigamos a presença de
polimorfismos bialélicos (INDEL) presentes em sete genes (CASP8; TP53; XRCC1; CYP19A1; TYMS; CYP2E1 e IL1α;), todos eles associados com o maior risco de desenvolver diferentes tipos de câncer, com o objetivo de conhecer
a distribuição destes marcadores na população de Belém do Pará. A amostra foi constituída de 100 indivíduos
da população de Belém. De cada indivíduo foram coletadas amostras de 5mL de sangue periférico. O DNA foi
extraído segundo método fenol-clorofórmio, descrito por Sambrook (1989). As amostras foram genotipadas após
uma única reação de PCR multiplex. Os fragmentos de DNA foram separados utilizando-se o analisador genético
ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems) e analisados com o programa GeneMapper ID v3.2 (Applied Biosystems).
A partir do grupo de indivíduos estudados foram obtidas as freqüências alélicas, por simples contagem. Desta
maneira, as freqüências dos alelos com a deleção, nos genes investigados, são demonstradas a seguir: 82% do
gene TP53, 33% do TYMS, 26% do XRCC1, 59% do CYP19A1, 39% do IL-1α, 41% do CASP8 e 92% do CYP2E1.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, UFPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
170
Polimorfismo +61A/G e nível sérico de EGF em
pacientes com glioma tratados com álcool perílico
Lopes, BA¹; Silveira, FCA²; Lázaro-Silva, DN¹; Teixeira, FO¹; Caetano, RLO¹; Da Fonseca, CO³;
Quirico-Santos, TF¹; Amorim, LMF¹
¹ Departamento de Biologia Celular e Molecular,
² Pós-Graduação em Neurociências,
³ Departamento de Cirurgia Geral e Especializada, Universidade Federal Fluminense.
[email protected]
Palavras-chave: EGF, polimorfismo, glioma, álcool perílico, glioblastoma.
Gliomas são tumores cerebrais e sua progressão está relacionada a fatores de crescimento, como a proteína
EGF. Estudos mostraram que o polimorfismo na região não-traduzida do gene EGF (substituição de G por A na
posição +61) leva a uma variação na expressão deste gene, onde homozigotos GG produzem mais EGF do que
heterozigotos e homozigotos AA. Neste sentido, procuramos relacionar o polimorfismo no gene EGF com risco de
desenvolvimento de glioma, além de correlacionar o polimorfismo e os níveis de EGF com a progressão e resposta
ao tratamento ao álcool perílico (POH), droga em fase de estudo que vem sendo utilizada como alternativa no
tratamento de tumores cerebrais. Objetivos: Avaliar e relacionar a frequência do polimorfismo +61 A/G no gene
EGF (rs4444903) com o risco de desenvolvimento de gliomas e os níveis séricos de EGF. Métodos: Os pacientes
incluídos no ESTUDO FASE II DO MONOTERPENO ÁLCOOL PERÍLICO EM PACIENTES COM GLIOBLASTOMA
MULTIFORME (CONEP registro 9681 nº 25000.009267/2004-25, 12 de julho, 2004) doaram 5 mL de sangue para
extração de DNA seguindo metodologia descrita por Salazar (Clin. Chem.44:1748, 1998). A região do polimorfismo
foi amplificada por PCR e o produto digerido pela enzima AluI. A classificação genotípica dos pacientes foi realizada
após separação dos fragmentos digeridos em gel de agarose 2,5% seguida de visualização em transiluminador
UV. Para a reação imunoenzimática foi realizado ensaio de ELISA para detecção de hEGF, segundo protocolo da
PreproTech. Resultados: Um total de 84 controles sem câncer com idade média de 42,6 anos (± 10,5) e 55 pacientes
com idade média de 53,1 anos (± 18,0) foram genotipados. Os pacientes foram diagnosticados como portadores de
GBM (76%), Oligodendroglioma (9 %) e Astrocitoma grau II (15%), sendo 30 do sexo masculino e 25 do sexo feminino.
Para os pacientes, a frequência genotípica foi 38,2 % para A/A, 43,6% para A/G e 18,2 para G/G e a frequência alélica
53,2% e 46,8% para os alelos A e G, respectivamente. Ao camparar a frequência entre casos e controles foi possível
observar que pacientes tinham maior frequência do genótipo AA (p=0,0026). Os níveis séricos de EGF em pacientes
(n=47) com gliomas antes do início do tratamento com álcool perílico são maiores para o genótipo homozigoto
AA e heterozigoto, quando comparados com o homozigoto GG (p=0,0453 e 0,0234 respectivamente). Conclusões:
No presente trabalho o alelo A foi relacionado como fator de risco para o desenvolvimento de gliomas em nossa
população, além de apresentar maior produção de EGF. Análises estão sendo realisadas com o objetivo de avaliar
se o polimorfismo ou o nível de EGF pode ser relacionado com sobrevida ou resposta ao tratamento com POH.
Apoio Financeiro: FAPERJ, PROPPi/UFF.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
171
MMP-9 e o prognóstico em Câncer de Bexiga
Viana, NI*¹; Reis, ST¹; Pontes Jr, J¹; Piovesan, LF¹; Silva, IA¹; Sousa-Canavez, JM²; Antunes, AA¹;
Dall’Oglio, MF¹; Abe, DK¹; Nesrallah, AJ¹; Srougi, M¹; Leite, KRM¹
¹ Laboratório de Investigação Médica da Disciplina de Urologia –LIM 55, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. ² Genoa
Biotecnologia, São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Câncer de Bexiga, Metaloproteinases da Matriz, Marcadores moleculares, Prognóstico.
Introdução: O câncer de bexiga é um problema de saúde mundial, com 375 mil casos estimados em 2009. Existem
muitos marcadores associados com a progressão do carcinoma da bexiga, e os mais importantes são o estágio do
tumor, invasão angiolinfática e grau histológico da neoplasia. No entanto, nem sempre esses marcadores estão
discriminados nos resultados do tumor. Os marcadores moleculares têm se mostrado importantes na determinação
da progressão do tumor, sendo o mais importante a perda de genes supressores de tumor, principalmente p53 e
Rb. As metaloproteinases da matriz (MMP) são uma família de endopeptidades que são capazes de degradar a
maioria dos componentes da matriz extracelular (MEC). Entre eles, a gelatinase B (MMP-9) é capaz de degradar
proteínas da matriz extracelular, incluindo colágeno tipo IV. MMP-9 tem sido relacionada à invasão celular e
ao desenvolvimento de metástases. O presente estudo foi realizado para avaliar o valor prognóstico da MMP-9
através da sua expressão gênica em câncer de bexiga. Métodos: O nível de expressão de MMP-9 foi analisado por
QRT-PCR em amostras de tumor fresco congelado, coletado de 23 pacientes com câncer de bexiga, submetidos à
ressecção transuretral de tumor de bexiga. A idade média dos pacientes foi de 73.9 anos, variando de 62 a 85 anos.
Onze pacientes (47.8%) tiveram carcinoma urotelial de baixo grau e doze pacientes (52.2%) tiveram de alto grau.
Dezoito (78.3%) possuíam estádio PTA ou pT1 e os cinco restantes (21.7%) possuíam estádio pT2. Apenas quatro
pacientes (17.4%) tinham invasão neoplásica microvascular. O grupo controle consistiu de tecido normal da
bexiga de cinco pacientes submetidos à prostatectomia transvesical para tratar a hiperplasia benigna da próstata
(HPB). Resultados: MMP-9 apresentou subexpressão (1.35 x 10¹), no câncer de bexiga quando comparados com os
controles normais. O gene MMP-9 foi subexpresso em tumores de alto grau, com média de 17.61 (SD35.20-10.16)
quando comparados aos tumores de baixo grau, com média de 0.31 (SD 0.41-1.14) (p = 0.002). Não houve diferença
na expressão gênica considerando o estádio patológico (p = 0.25) ou invasão neoplásica microvascular (p = 0.21).
Conclusão: Demonstramos que a expressão do gene MMP-9 está relacionado ao grau de tumor em carcinoma de
bexiga. Não houve diferença na expressão gênica considerando o estádio patológico ou invasão microvascular.
Maior número de pacientes deve ser estudado, a fim de confirmar nossos resultados.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
172
Detecção de micrometástase na medula óssea de
pacientes com câncer colorretal por meio de metilação
tumor-específica
Asprino, PF1; Habr-Gama, A2,3; Parmigiani, RB1; Quevedo, BS1; Felicio, NM2; Moura, RP1; Perez, RO3,4;
Camargo, AA1; Gama-Rodrigues, J 2,3
Laboratório de Biologia Molecular e Genômica – Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer,
Hospital Alemão Oswaldo Cruz,
3
Instituto Angelita & Joaquim Gama ,
4
Faculdade de Medicina USP
1
2
Palavras-chave: micrometástase, metilação, medula óssea, coloretal, câncer
A principal forma de tratamento de tumores primários colorretais é a ressecção cirúrgica que pode ou não ser
seguida de tratamento adjuvante. O uso da terapia adjuvante depende de análises histopatológicas para definição
do estadiamento do tumor removido e da classificação proposta pela UICC que divide a doença em 4 estádios.
Ainda assim, pacientes classificados em estádios iniciais (UICC I e II) não são submetidos a terapia adjuvante no
entanto apresentam recorrência da doença ou desenvolvem metástase em cerca de 30% dos casos. Esta alta taxa
de recorrência evidencia a atual limitação do método de prognose utilizado para estes tumores.Muitos estudos
têm procurado melhorar a detecção de doença residual mínima através da busca por células tumorais circulantes
ou residentes na medula óssea de pacientes e, para tal, fazem uso de metodologias como imunohistoquímica e
PCR. Estas abordagens, entretanto, apresentam limitações técnicas intrínsecas, como baixa sensibilidade e falta
de especificidade ao tumor. A metilação do DNA também tem sido usada em diferentes estudos para a detecção
de células tumorais circulantes, com a vantagem de ser um método altamente sensível e específico. Este trabalho
objetiva usar o padrão de metilação identificado em amostras de tumor colorretal para a localização micrometástases
na medula óssea destes pacientes. Até o momento contamos com amostras de tumor primário e medula de 284
pacientes. Um painel de genes frequentemente metilados em diversos tipos de tumor foi padronizado por PCR em
tempo real. Inicialmente analisamos o padrão de metilação destes genes em 12 amostras de linfócitos de indivíduos
sadios e 12 amostras de cólon normal para confirmar que a metilação destes genes é um evento tumor-específico.
Dez genes não apresentaram metilação em nenhuma das amostras e passaram a constituir nosso painel final:
ADAM23, MINT1, MINT2, MINT31, MLH1, MLH1, RASSF1, RBP1, RUNX3, THBS. Em seguida, o painel foi avaliado
em 10 amostras de tumor primário de cólon e 80% dos pacientes apresentaram metilação em pelo menos 1 gene. São
pacientes como estes que terão suas medulas analisadas na próxima etapa.A capacidade de detecção de moléculas
de DNA metiladas em meio a moléculas não metiladas é algo de grande importância. Para os primers escolhidos
esta capacidade variou entre 0,2-5%, confirmando a alta sensibilidade desta metodologia. Estamos iniciando a
análise de metilação nas amostras de medula para posteriormente comparar com os dados clínicos dos pacientes.
Com esta abordagem esperamos detectar de maneira mais robusta, sensível e específica micrometástases
na medula óssea e, com isso, aprimorar o prognóstico e o tratamento de pacientes acometidos pela doença.
Apoio Financeiro: Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer, Hospital Alemão Oswaldo Cruz e Instituto Angelita
e Joaquim Gama.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
173
Prevalência da mutação TP53 p.R337H em crianças
com carcinoma adrenocortical no Hospital de Clínicas
de Porto Alegre
Giacomazzi, J1,2; Paskulin, DD2,3; Netto, C4; Rossi, C2,5; Roth, D6; Selistre, SG7; Greggianin, L7; Bezerra, BA2;
Koehler dos Santos, P1,2; Achatz, MIW8; Goldim, JR9; Camey, SA10; Hainaut, P11; Ashton-Prolla, P1,2,3,4;
Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas, UFRGS;
Laboratório Medicina Genômica, Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clinicas de Porto Alegre;
3
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, UFRGS;
4
Serviço de Genética Médica, Hospital de Clinicas de Porto Alegre;
5
Faculdade de Medicina, UFRGS;
6
Programa de Pós-Graduação em Medicina: Pediatria, UFRGS;
7
Serviço de Oncologia Pediátrica, Hospital de Clinicas de Porto Alegre;
8
Hospital do Câncer AC Camargo;
9
Laboratório de Bioética, Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clinicas de Porto Alegre;
10
Instituto de Matemática, Departamento de Estatística, UFRGS;
11
Laboratório de Carcinogênese Molecular, International Agency for Research on Cancer (IARC).
1
2
Palavras-chave: carcinoma adrenocortical; mutação TP53 p;R337H; Síndrome de Li-Fraumeni/Li Fraumeni-Like.
A exata contribuição das mutações germinativas no gene TP53 para o risco de diversos tipos de câncer está
parcialmente compreendida. Estudos envolvendo a população brasileira demonstraram que a mutação germinativa
TP53 p.R337H, associada à Síndrome de Li-Fraumeni/Li Fraumeni-Like, apresenta penetrância incompleta e está
presente em cerca de 1 em cada 300 indivíduos da população geral, uma prevalência significativamente superior
à de qualquer outra mutação germinativa já descrita neste gene. As evidências existentes são provenientes de
estudos em poucas famílias portadoras de mutações comuns e altamente penetrantes no gene TP53. Objetivos:
avaliar a prevalência da mutação germinativa TP53 p.R337H e de polimorfismos modificadores de risco, e
verificar a presença de alelo fundador em crianças com carcinoma adrenocortical (comumente encontrado
em famílias com estas síndromes) no Serviço de Oncologia Pediátrica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
Metodologia: o DNA genômico foi extraído de sangue periférico. As análises genotípicas foram realizadas
por qPCR usando o ensaio taqman, por PCR-RFLP e por seqüenciamento bi direcional. Todos os casos estão
sendo genotipados para os polimorfismos modificadores MDM2-SNP309 e 3 polimorfismos no gene TP53:
G/C no intron 2, uma duplicação de 16 no intron 3 e p.R72P. A haplotipagem com 29 Tag SNPs será realizada
para determinar a presença de alelo fundador p.R337H. Resultados: até o momento foram incluídas no estudo
10 crianças com carcinoma adrenocortical com idades entre 4 meses e 17 anos. Destas, 8 são portadoras da
mutação TP53 p. R337H, sendo 7 heterozigotas AG para TP53 p.R337H e 1 homozigota AA para TP53 p.R337H.
Análises dos heredograma indicaram que 6/10 probandos preenchem critérios clínicos para Li FraumeniLike - Chompret e Chompret Modificado e 4/10 preenchem critérios para Li-Fraumeni-Like - Eeles 1, Chompret
e Chompret Modificado. Conclusão: análises preliminares dos pacientes incluídos demonstraram uma alta
freqüência da mutação TP53 p.R337H em casos de carcinoma adrenocortical. Nesse estudo encontrou-se um caso
de uma portadora homozigota AA para TP53 p.R337H, até então, não descrito na literatura. Estudos adicionais
estão em andamento para definição do risco para esses pacientes com base nas análises de polimorfismos
modificadores e no acompanhamento dos pacientes e familiares em risco para outros tipos de tumores.
Apoio financeiro: FAPERGS; FIPE-Hospital de Clínicas de Porto Alegre, GlaxoSmithKline.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
174
Investigação do polimorfismo MTHFR C677T em
portadoras da Síndrome de Turner como fator de risco
a não-disjunção
Bispo-Brito, AVS1; Silva, HA1,2; Santos, LO1; Burégio-Frota, P1,3; Lourenço, SFG1; Leal, GF3; Resende, AD3;
Muniz, MTC2,4; Santos, N1.
Departamento de Genética/CCB/UFPE – Recife,PE
Centro de Oncohematologia Pediátrica de Pernambuco/HUOC/UPE– Recife, PE
3
Serviço de Genética Médica, Instituto de Medicina Integral Prof. Fernando Figueira (IMIP) – Recife, PE
4
Departamento de Fisiologia/ICB/UPE – Recife, PE
[email protected]
1
2
Palavras-chave: aneuploidia; metilação do DNA; metilenotetrahidrofolato redutase; síndrome de Turner; não-disjunção.
Folatos são vitaminas essenciais do complexo B requeridos em processos celulares biossintéticos e epigenéticos.
Disfunções no metabolismo do folato podem resultar em mutações de ponto, quebras cromossômicas, alterações
no padrão de metilação do DNA e segregação anormal dos cromossomos. Dessa forma, polimorfismos genéticos
que alteram enzimas envolvidas neste metabolismo, como metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR), têm sido
considerados uma possível causa de não-disjunção cromossômica por hipometilação. A síndrome de Turner (ST)
é um importante modelo para investigar a associação entre polimorfismos do gene MTHFR e não-disjunção devido
à alta frequência de mosaicismo cromossômico entre as pacientes com esta síndrome. O objetivo deste estudo
foi verificar a associação entre o polimorfismo C677T do gene MTHFR em portadoras da ST com a não-disjunção
somática. Foram analisadas 33 pacientes com ST, sendo 22 com monossomia do X e 11 mosaicos, e o grupo-controle
formado de 56 indivíduos do sexo feminino e faixa etária semelhante. A análise molecular foi realizada pela técnica
de PCR-RFLP e os resultados avaliados estatisticamente pelo Teste G. A frequência dos genótipos CC, CT e TT do
gene MTHFR nas portadoras ST foram 67,74%, 25,81% e 6,45%, respectivamente. No grupo controle a distribuição
genotípica foi de 32,14% CC, 58,93% CT e 8,93% TT. As frequências genotípicas foram significativamente diferentes
entre pacientes e controles (Teste G= 10.29 / p=0,0058), sendo esta diferença atribuída a maior prevalência do
genótipo 677CC nas portadoras da ST. Diversos estudos têm sido publicados com o objetivo de elucidar a função
dos polimorfismos do MTHFR no risco das aneuploidias cromossômicas, mas os resultados são frequentemente
conflitantes, principalmente devido ao tamanho da amostra. Neste trabalho não foi possível estabelecer uma
associação entre o polimorfismo C677T do gene MTHFR e a aneuploidia cromossômica, demonstrando que esta
mutação pode não representar uma importante contribuição para os mecanismos de não-disjunção somática na ST.
Auxílio Financeiro: FACEPE
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
175
Identificação dos polimorfismos MTHFR A1298C e
MTR A2756C do metabolismo do folato em pais de
indivíduos com síndrome de Down
Cordeiro, FB; Naves, LL; Navarro, GC; Silva-Grecco, RL; Balarin, MAS.
Disciplina de Genética Humana – Laboratório de Citogenética Humana e Molecular, Universidade Federal do Triângulo Mineiro.
[email protected]
Palavras-chave: síndrome de Down, polimorfismo, MTHFR A1298C, MTR A2756G, folato.
As cromossomopatias podem ser pré-zigóticas ou pós-zigóticas. Cerca de 15% a 20% das concepções humanas
são cromossomicamente anormais e conseqüentes a não-disjunção meiótica. Dentre as cromossomopatias a
Síndrome de Down é a causa genética mais comum de deficiência mental. Os mecanismos moleculares envolvidos
na não-disjunção meiótica e que levam à trissomia do cromossomo 21 são ainda pouco compreendidos, e um
mecanismo proposto consiste em defeitos na metilação do DNA com consequente hipometilação centromérica.
Dos fatores genéticos que podem estar relacionados à hipometilação centromérica estão as variantes polimórficas
de enzimas na via metabólica da metionina/homocisteína, tais como metilenotetraidrofolato redutase - MTHFR
e metionina sintase – MTR, que podem indicar uma predisposição à não disjunção cromossômica e ser um fator
de risco de um filho com Síndrome de Down. O objetivo do presente estudo foi avaliar as freqüências destes dois
polimorfismos indicados e associar estas freqüências ao risco de se ter um filho com síndrome de Down. O grupo
de estudo foi composto por 45 indivíduos, entre homens e mulheres e o controle por 17 casais (34 indivíduos). Para
o polimorfismo MTHFR A1298C as freqüências dos genótipos A/A, A/C e C/C foram, respectivamente, 64,4%; 29,0%;
e 6,6% no grupo de estudo e 44,1%; 50,0% e 5,9% no controle. Para o polimorfismo MTR A2756G as freqüências dos
genótipos A/A, A/G e G/G foram, respectivamente, 69,0%; 26,6% e 4,4% no grupo de estudo e 70,6%; 29,4% e 0%. Não
houve diferença estatisticamente significativa entre o grupo de estudo e o controle. Entretanto, para o polimorfismo
do gene MTHFR A1298C o genótipo AA foi mais frequente no grupo de estudo. Devido à importância do folato no
metabolismo e divisão celulares e o envolvimento de vários genes nesta via metabólica, outros polimorfismos
poderiam ser analisados e possivelmente correlacionados com a predisposição a não disjunção cromossômica.
Apoio financeiro: FAPEMIG.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
176
O polimorfismo C1858T no gene PTPN22 e o risco
de desenvolvimento de inibidores em pacientes com
hemofilia A grave
Rosset, C2; Agostini, D1; Leiria, LB1; Salzano, FM1,2; Bandinelli, E2.
1
2
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Palavras-chave: Hemofilia A, inibidores, fator VIII, PTPN22, polimorfismo
Introdução: A hemofilia A é uma das doenças hemorrágicas mais frequentes da cascata de coagulação sanguínea.
Ela é causada pela redução da atividade do fator VIII da coagulação, devido a alterações no gene desse fator. O
tratamento envolve terapia de reposição do fator VIII, e é efetivo na maioria dos casos. Entretanto, 25-30% dos
pacientes graves desenvolverão anticorpos contra o fator infundido, denominados inibidores. Esses inibidores
tornarão o tratamento ineficaz e representam a complicação mais severa apresentada por esses pacientes.
Tanto fatores genéticos quanto não-genéticos influenciam a suscetibilidade ao desenvolvimento de inibidores.
Em particular, o tipo de mutação no gene do FVIII parece contribuir consideravelmente para o risco, sendo as
inversões dos introns 1 e 22 as mais associadas com o quadro. O genótipo HLA e de outros genes que regulam o
sistema imune também têm papel importante no desenvolvimento dos anticorpos. O gene da proteína tirosina
fosfatase não receptora tipo 22 (PTPN22) codifica uma proteína tirosina fosfatase hematopoiética, conhecida por
regular a sinalização através do receptor de células T, atenuando a ativação das mesmas. Polimorfismos nesse gene
podem afetar a resposta imune. Entre eles, o SNP C1858T causa uma substituição de aminoácido na proteína, de
arginina para triptofano, podendo levar a respostas patogênicas dependentes de células T, aumentando a chance
de desenvolver inibidores. Há relatos de associação do polimorfismo com várias doenças autoimunes. O objetivo
do estudo é avaliar se o polimorfismo C1858T no gene PTPN22 pode conferir suscetibilidade ao desenvolvimento
de inibidores em pacientes hemofílicos A graves. Materiais e métodos: Foram estudados 171 pacientes
eurodescendentes, provenientes do HEMOCENTRO-RS e previamente genotipados para as inversões nos introns
1 e 22, dentre os quais 53 com inibidores. O DNA genômico foi extraído de amostras de sangue por um método de
salting-out. O polimorfismo foi genotipado por PCR/RFLP. O teste de χ2 foi utilizado para comparar as freqüências
alélicas do polimorfismo em pacientes com e sem inibidores, e análise de regressão logística foi empregada para
estimar o risco de desenvolvimento de inibidores. Resultados: A distribuição dos genótipos está em equilíbrio de
Hardy-Weinberg. Nos grupos com inibidores e sem inibidores a frequência do alelo 1858T foi, respectivamente, 0,13
e 0,12. As diferenças nessas frequências não foram significativas (p = 0,27). Além disso, não houve interação entre
o polimorfismo e a presença das inversões no desenvolvimento de inibidores (p = 0,29), e, considerando somente
os pacientes com inversões, o polimorfismo também não influenciou o desenvolvimento de inibidores (p = 0,08).
Conclusão: Nosso estudo não encontrou associação entre o polimorfismo no gene PTPN22 e o desenvolvimento
de inibidores em pacientes hemofílicos A graves do sul do Brasil, corroborando com os resultados de um estudo
prévio realizado na Itália.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
177
Estudo da associação do polimorfismo TGFA/Taq I e
fatores ambientais nas fissuras orais não sindrômicas
Souza, LT1, 3; Kowalski, TW1; Vanz, AP2; Giugliani, R2,3,4; Félix, TM1,2.
Laboratório de Medicina Genômica, Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clinicas de Porto Alegre
Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre
3
Programa de Pós Graduação em Medicina: Ciências Médicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Brasil
4
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fissuras orais, Fatores ambientais, Polimorfismo TGFA/TaqI, Fissura de palato, Fissura de lábio e palato
A Fissura oral (FO) é uma malformação craniofacial comum na espécie humana. Tem uma prevalência mundial
geral de 1 a cada 600 nascidos vivos, variando segundo a região geográfica. Ocorrem devido à formação incompleta
do lábio e/ou palato no processo da embriogênese facial. Ocorrem por etiologia multifatorial associando fatores
genéticos e ambientais. Crianças afetadas precisam de cuidados multidisciplinares. Clinicamente, os pacientes
têm dificuldades na alimentação, fala, audição, deglutição, respiração e problemas odontológicos, além de sequelas
sociais e psicológicas durante a vida adulta. Um dos primeiros genes estudados demonstrando associação com FO
foi gene TGFA (alelo C2 no sítio de restrição da Taq I). Sua relevância biológica como candidato para FO é amparada
por seu padrão de expressão em tecidos palatinos, especialmente na junção mediana e mesênquima subjacente
palatino, principalmente no momento da fusão dos tecidos, pois promove a síntese de matriz extracelular e migração
de células mesenquimais. O gene TGFA parece ter um papel importante em alguns grupos, principalmente quando
associado a fatores ambientais, principalmente uso de álcool e fumo durante idade gestacional. O objetivo deste
estudo foi avaliar o papel do polimorfismo TGFA/ TaqI e fatores ambientais em fissuras orais não sindrômicas.
Foram incluídas neste estudo pacientes da Unidade Craniofacial do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) e
seus pais, no total foram 175 núcleos familiares sendo que 96 trios completos (propósito, pai e mãe) quando foram
coletos dados clínicos e amostras de DNA. Para identificação do polimorfismo foi utilizada a técnica de PCR/
RFLP com a enzima de restrição TaqI. 52 % dos propósitos 52% eram do sexo masculino. As Fissuras de lábio e/
ou palato (FL/P) foram mais frequente no sexo masculino (56,5%) enquanto que fissura de palato isolado (FPI) foi
mais frequente no sexo feminino. Foi também observada maior proporção de FL/P (147 casos) comparado com
FPI (28 casos). Neste estudo nós não encontramos associação do polimorfismo TGFA/TaqI com fissuras orais, pois
o teste de desequilíbrio de transmissão (TDT) não foi estatisticamente significativo (p=0,335). Quando comparado
os fatores ambientais (exposição ao álcool e ao fumo durante o período gestacional) com o genótipo e o fenótipo
do propósito, nós também não encontramos diferença significativa entre os grupos de propósitos expostos e não
expostos. Portanto, concluímos que o polimorfismo TGFA/TAQI não tem papel relevante nas FO no Sul do Brasil.
Apoio Financeiro: CAPES, FIRCA/NIH.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
178
Análise do SNP rs987525 (8q24.21) e susceptibilidade
à fissura labial e/ou palato não-sindrômica na
população brasileira
Silva, CBF1; Brito, LA1; Rocha, KM1; Schlesinger, D1; Meyer, D1; Cruz, LA1; Kobayashi, LB1; Aguena, M1;
Bueno, DF1; Bertola, D2; Alonso, N2; Passos-Bueno, MR1
1
2
Universidade de São Paulo
Hospital das Clínicas - São Paulo
Palavras-chave: SNP, Fissura Labial, Marcadores de ancestralidade, Admixture Mapping, 8q24.21 A fissura lábio palatina não-sindrômica (FL/P NS) é uma doença complexa, de herança multifatorial. É a malformação
facial mais freqüente, com uma incidência de 1:1000 nascimentos em populações européias, mas que varia de
acordo com o grupo étnico, geográfico e sócio-econômico. Recentemente, foi encontrada associação entre o SNP
rs987525, mapeado em 8q24, e FL/P NS. Esse SNP, localizado em um deserto gênico, consiste de uma troca A/C,
sendo A o alelo de risco nas populações estudadas. O objetivo deste projeto é testar a associação entre o SNP e a FL/P
NS na população brasileira, que, por ser miscigenada, recomenda-se abordagens como Admixture Mapping e casocontrole corrigido para estrutura populacional. Para tanto, foram genotipados 611 pacientes de 5 localidades do
Brasil (Rio de Janeiro-RJ, n=116; Maceió-AL, n=107; Barbalha-CE, n=63; Fortaleza-CE, n=234 e Santarém-PA, n=91)
e 284 controles provenientes do Hospital das Clínicas (FMUSP, São Paulo-SP) para 40 marcadores de ancestralidade
do tipo indel, além do SNP rs987525. A genotipagem dos marcadores foi feita por meio de PCR e subseqüente análise
no sequenciador automático ABI 3730 DNA Analyser (Applied Biosystems), sendo, mais tarde, analisadas com o uso
do programa GeneMapperâ Software Version 4.0. O SNP rs987525 foi discriminado utilizando o sistema TaqMan®
SNP Genotyping Assays (Applied Biosystems, EUA). Como método de análise dos resultados obtidos, utilizamos os
programas Structure 2.3.3, para identificar as proporções de ancestralidade de cada indivíduo, e Strat, para testar a
associação da FL/P NS com os marcadores e o SNP. Com a metodologia utilizada, foram identificadas as freqüências
alélicas do SNP e as contribuições ancestrais para cada indivíduo. Nos pacientes, a freqüência do alelo A é de 0,353,
enquanto que, nos controles, é de 0,327.A porcentagem das contribuições ancestrais média para os pacientes foi
de 12,29% indígena, 57,83% europeu e 29,88% africano e para os controles, 8,60% indígena, 67,01% europeu e 24,39%
africano. Considerando a amostra total dos pacientes, não foi detectada associação do SNP com FL/P NS. Quando
a análise foi separada para cada localidade, foi encontrada associação positiva em Barbalha e Santarém (P<0.01),
sugerindo que a contribuição deste alelo para a predisposição da FL/P NS varia de acordo com a origem geográfica
dos pacientes. Os resultados obtidos serão também analisados com o software Admixture Mapping, que busca fatores
genéticos relacionados à doença por meio da identificação de desvios de ancestralidade no genoma dos pacientes.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
179
Relação entre o Polimorfismo +61 G/A do gene EGF e o
Risco para Fissura de Lábio e/ou Palato
Lopes, TS1; Romanos, HF1; Kuchler, EC1; Amorim, LMF2; Granjeiro, JM1; Falagan-Lotsch, P1
Laboratório Biologia Celular e Molecular, Núcleo de Terapia Celular, Unidade de Pesquisa Clínica, Hospital Universitário Antonio Pedro,
Universidade Federal Fluminense.
2
Laboratório de Oncologia Molecular, Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense.
[email protected]
1
Palavras-chave: anomalias craniofaciais, fissura de lábio e/ou palato, polimorfismo, EGF, PCR-RFLP
As anomalias craniofaciais as são malformações congênitas mais comuns nos seres humanos. Dentre elas destacamse as fissuras de lábioe/ou palato (FL/P), cuja incidência pode variar de 1/500 a 1/2500 nascimentos. As FL/Ps
apresentam um caráter multifatorial, sendo seu aparecimento determinado por fatores genéticos e ambientais.
Vários estudos de associação foram realizados analisando alterações em genes candidatos e a susceptibilidade a
doença. O gene EGF exerce um papel fundamental na embriogênese e formação do palato, participando da vias
de transdução de sinal que culminam em crescimento e proliferação celular. Um polimorfismo na região +61 do
gene EGF foi descrito em 2002 e é caracterizado por uma troca de G (guanina) para A (adenina). Esta variação foi
correlacionada a uma alteração na produção da proteína EGF, sendo que células de indivíduos com genótipo AA
apresentavam menor produção da proteína in vitro. Assim, o presente trabalho objetiva, através de um estudo
caso-controle, verificar a associação entre o polimorfismo funcional na região +61 G/A e a susceptibilidade as FL/
Ps. O DNA genômico foi extraído de células bucais a partir de bochecho, utilizando Proteinase K, e quantificado
por espectrofotometria. A técnica de PCR foi utilizada para amplificar o fragmento especifico da região de
interesse do gene EGF. Os fragmentos obtidos foram submetidos a digestão com a enzima AluI e analisados
por eletroforese em gel de agarose 2,5% corado com brometo de etídeo. As análises estatísticas foram realizadas
pelo teste exato de Fisher. Até o momento foram analisados 312 indivíduos, sendo 150 pacientes com FL/P e 162
controles. As freqüências genotípicas em casos e controles foram: 26,0% AA, 53,3% AG, 20,7% GG e 24,0% AA,
52,0%AG, 24,0%GG, respectivamente. O alelo A apresentou uma freqüência maior no grupo de pacientes com FL/P
(0.53) do que no grupo controle (0,5). Não houve diferença significativa nas distribuições alélicas e genotípicas dos
grupos analisados. Para verificar o real papel do polimorfismo +61 G/A no gene EGF na susceptibilidade à FL/P
um número maior de indivíduos será analisado. Vale ressaltar que este é o primeiro estudo de associação entre este
polimorfismo do gene EGF e as FL/Ps.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
180
Identificação de vias de sinalização associadas
à predisposição às fissuras lábio-palatinas não
sindrômicas
Cruz, LA1; Sunaga, DY1; Bueno, DF1; Kobayashi, GS1; Aguena, M1; Ferreira, S1; Amaral, CER2; Brito, LA1;
Passos- Bueno, MR1.
Laboratório de Genética do Desenvolvimento Humano, Centro de Estudos do Genoma Humano, Departamento de Genética e Biologia
Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, Brasil.
2
Instituto de Cirurgia Plástica Craniofacial – SOBRAPAR, Campinas, Brasil.
1
Palavras-chave: expressão gênica, vias gênicas, fissuras lábio palatinas, células tronco, malformações craniofaciais
As fissuras lábio palatinas não sindrômicas (FL/P NS) são as malformações craniofaciais congênitas mais comuns,
com prevalência mundial de 1 afetado a cada 1000 nascimentos e possuem ampla variabilidade clínica, desde
cicatrizes labiais até o comprometimento da região dente-alveolar e palatal. As FL/P NS são decorrentes de erros
na migração e organização celular dos primórdios faciais, que resultam na junção incompleta das proeminências
fronto-nasais. Possuem herança multifatorial, ou seja, que envolve fatores ambientais e genéticos, com vários
loci já descritos como candidatos. Com o intuito de identificar e investigar genes e vias de suscetibilidade às
FL/P NS, neste trabalho analisamos o transcriptoma de células tronco mesenquimais de polpa de dente de 7
afetados em relação a 6 controles, através da técnica de microarray (Affymetrix). Para a identificação dos genes
diferencialmente expressos (DEGs), utilizamos 2 métodos distintos: o SAM (Significance Analysis of Microarray)
e o RankProd, ambos disponíveis no programa MeV (Multiexperiment Viewer) do pacote de ferramentas TM4.
Aplicamos um filtro de dados onde somente 30% dos genes de maior variância foram utilizados nas análises. O
SAM é um método mais conservador que o RankProd, por isso adotamos o p-valor corrigido por FDR ≤0,05 e ≤0,01,
respectivamente. Foram identificados 125 DEGs pelo SAM e 210 DEGs pelo RankProd, sendo 109 DEGs comuns
aos dois métodos. Utilizamos o total de 228 DEGs, sendo que 2 deles, PTCH2 e MTHFD2, já foram associados a esta
malformação em estudos anteriores. Em seguida fizemos uma análise de agrupamento com o método K-means
(k=10) para a identificação de grupos de genes com perfil de expressão similar. Um dos grupos foi formado por 46
DEGs (homogeneidade = 0,827). Quinze destes genes foram modelados numa única rede gênica com o programa
IPA (Ingenuity Pathways Analysis), corroborando a hipótese do agrupamento de que genes co-regulados podem
participar de um mesmo processo/rede biológico. Além disso, estes genes estão ligados na rede a outros genes
candidatos à FL/P NS, como o SHH, NOTCH1 e BMP1. A esta rede também foram associadas funções importantes
para a etiologia da doença: desenvolvimento (SHH, PTCH2), matriz extracelular (MMPs, ACAN, LAMA), proliferação
celular (AMIGO2, CDC, SMAD3) e metabolismo do folato (MTHFD2). Em seguida, associamos fatores de transcrição
ao resultado do agrupamento através da ferramenta PRIMA do programa Expander. Vinte e um DEGs do grupo
de 46 foram associados ao fator de transcrição ETF/TEAD2, 10 DEGs ao fator E2R e 7 DEGs ao fator ER. Estes
resultados indicam pela primeira vez a participação de redes gênicas associadas às fissuras lábio-palatinas, abrindo
novas perspectivas para a elucidação da etiologia desta malformação. Iniciaremos a validação destas redes por
PCR em tempo real.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
181
Associação tabagismo-dependente do polimorfismo
D9N do gene da Lipoproteína Lipase com a obesidade
em Afrodescendentes do estado da Bahia
Britto, FA¹; Maia, RR¹; Carneiro, CS¹; Chung-Filho, AA¹; Rosa, ASS¹; Matos, EJMO¹; Silva, KS2; Guimarães, LO2;
Korontai, LLS2; Magalhães-Oliveira, MCA3; Rios, LDS1,3
¹Laboratório de Genética Humana - Departamento de Ciências da Vida – Campus I. Universidade do Estado da Bahia.
2
Laboratório de Genética Humana – Departamento de Ciências Biológicas. Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia.
3
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. Universidade Estadual de Feira de Santana.
[email protected]
Palavras-chave: obesidade, tabagismo, Lipoproteína Lipase, Afrodescendentes, D9N, polimorfismos
A obesidade é um problema de saúde pública que alcança elevados níveis de morbimortalidade no Brasil e no
mundo. Epidemiologicamente, a doença atinge cerca de 50% da população brasileira e gera elevados gastos públicos
devido à grande mortalidade por suas complicações sistêmicas, prioritariamente as cardiovasculares. Sabe-se que
a obesidade é uma patologia multifatorial e que tanto os fatores genéticos, como os ambientais contribuem para
o seu desenvolvimento. Nos últimos anos, aumentaram-se as buscas pelos fatores genéticos que podem predispor
o indivíduo a obesidade e, portanto, as suas complicações. Um dos alvos desses estudos é a LPL (Lipoproteína
Lipase), enzima que regula o metabolismo lipídico, a partir da hidrólise de triglicerídeos em ácidos graxos livres,
necessários para absorção nos adipócitos. Estudos comprovam que, em indivíduos obesos, a produção de LPL,
pelo tecido adiposo, se encontra aumentada, favorecendo o acúmulo de gordura e impedindo a perda de peso.
Além disso, diversas variantes funcionais da LPL têm sido estudadas profundamente como possíveis preditores
genéticos da obesidade e hiperlipidemia. Dentre essas variantes funcionais, está o polimorfismo D9N. Indivíduos
com tal polimorfismo são portadores de uma mutação do gene da LPL, que altera aminoácido 9 de asparagina
para ácido aspártico. Alguns estudos têm demonstrado a sua associação com a obesidade, principalmente em
brancos. O presente trabalho tem como objetivo investigar o papel do polimorfismo D9N no gene da LPL em
Afrodescendentes tendo em vista que são raros os estudos realizados neste grupo étnico. Foram estudados 333
Afrodescendentes fumantes e 305 não fumantes provenientes do estado da Bahia com média de idade de 54,5 ±7,6
anos. O polimorfismo D9N no gene LPL foi estudado através da amplificação por PCR, usando primers, descritos
na literatura, seguido de digestão com a enzima de restrição TaqI e eletroforese em gel de poliacrilamida 8% para
visualização dos fragmentos e determinação do genótipo. A frequência dos portadores da mutação 9N foi maior entre
tabagistas com Índice de Massa Corpórea (IMC=peso/altura2) ³ 25 (36,4%) quando comparadas aos tabagistas com
IMC < 25 (22,4%; p=0,010). Nos não tabagistas com IMC ³ 25 a freqüência dos portadores 9N foi 27,9% enquanto que
a observada nos com IMC < 25 foi 32,4% (p=0,490). O presente estudo demonstrou uma associação da mutação D9N
do gene LPL com a obesidade/sobrepeso que foi dependente do tabagismo em Afrodescendentes do estado da Bahia.
Apoio Financeiro: FAPESB, CNPq e UNEB
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
182
O polimorfismo 45T>G no gene da adiponectina
aumenta o risco de doença cardiovascular em
pacientes com obesidade mórbida
Nascimento, GS1; Almeida, GE1; Rosseto, AS2; Silva, TL2; Carvalho, PS3; Pereira, LC1; Silva, PP1; Rabbi-Bortolini, E2; Bueno, MRP4; Errera, FIV1
Centro de Pesquisa EMESCAM;
FAESA;
3
HUCAM – UFES;
4
USP.
[email protected] e [email protected]
1
2
Palavras-chave: obesidade, doença cardiovascular, adiponectina-polimorfismo
A obesidade e as Doenças cardiovasculares (DC) são doenças complexas que dependem de fatores de risco
ambientais e genéticos para se manifestarem. A adiponectina, uma proteína secretada pelo tecido adiposo é
reduzida conforme aumenta a massa adiposa visceral, possui ações protetoras sobre as células endoteliais e parece
prevenir contra os efeitos deletérios da obesidade. Estudos associam polimorfismos no gene ADIPOQ, dentre eles
o SNP45T>G, e a presença de DC em pacientes obesos. Este trabalho teve como objetivos levantar as doenças
cardiovasculares existentes em pacientes com obesidade; analisar nesses pacientes a frequência da história familial
(HF) positiva de DC; calcular em uma amostra de 100 obesos as frequências gênicas e genotípicas para o SNP
45T>G em pacientes obesos em relação à presença de DC, classificando-os em casos (obesos com DC) e não-casos
(obesos sem DC). Métodos: O estudo foi aprovado pelo CEP-EMESCAM e foi realizado com um banco de dados
clínicos e de DNA de pacientes do ambulatório de obesidade do HUCAM-UFES. Os genótipos para o SNP 45T>G
foram obtidos por PCR/RFLP. Os pacientes que apresentaram o genótipo para o SNP45T>G disponível no banco de
dados foram separados como: casos (71,43%-85/119) e não casos (28,57%-34/119). A distribuição dos genótipos TT,
GG e TG foi verificada nos dois grupos em relação à hipertensão, infarto, angina e acidente vascular cerebral (AVC).
Resultados: A presença de DC em pai e mãe simultaneamente, não diferiu entre não casos e casos. Contudo, a HF
materna positiva estava significativamente mais presente em casos 62,3%(43/69) do que em não casos 48%(12/25)
(p=0,0350; OR=2,167). A amostra está em equilíbrio de Hardy-Weinberg. A distribuição dos genótipos TT, TG e GG
foi de 30,59% (26/85), 55,29% (47/85) e 14,12% (12/85) nos casos e 20,59% (7/34), 55,88% (19/34) e 23,53% (8/34)
nos não casos respectivamente. Dentre os casos, 10 pacientes apresentaram angina, sendo 5 deles homozigotos
TT (19,23%) e 5 heterozigotos TG (10,64%). O único paciente que sofreu infarto 1/26 (3,84%) apresenta o genótipo
TT. Os pacientes que tiveram AVC (2/85) apresentaram os genótipos TT 1/26 (3,84%) e de heterozigotos TG 1/47
(2,13%). O genótipo GG não foi observado em pacientes com infarto, angina ou AVC. A presença do alelo T foi
associada a presença de DC (p=0,0001; OR=2,132). Conclusões: Os dados demonstram a importância da HF materna
em obesos com DC e sugerem efeito protetor do genótipo da adiponectina contra as DC e que a presença do alelo
G teria efeito benéfico, o que neste estudo pode ser evidenciado pelo fato da ausência de homozigotos GG com DC.
Apoio financeiro: PIBIC-EMESCAM; FACITEC, PPSUS-FAPES e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
183
Associação dos Polimorfismos MAOAu-VNTR, MAOA
T941G e COMT Val158Met com Ingestão Alimentar
em Crianças
Almeida, S 1,2; Galvão, ACS1; Krüger, RC1; Campagnolo, PDB3; Mattevi, VS1,2; Vitolo, MR3; *.
¹Laboratório de Biologia Molecular, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Ciências da Saúde de
Porto Alegre;
2
Departamento de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre;
3
Departamento de Saúde Coletiva, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
[email protected]
Palavras-chave: COMT; MAOA; obesidade, ingestão alimentar; genética de doenças multifatoriais.
O aumento da prevalência de obesidade em todo o mundo é um dos mais importantes fenômenos da
atualidade. Evidências obtidas, a partir de estudos com humanos e modelos animais, indicam a importância
da função dopaminérgica no desenvolvimento da obesidade por seu papel na regulação do apetite. As enzimas
monoaminoxidase-A (MAOA) e catecol-O-metiltransferase (COMT) controlam a disponibilidade de dopamina
na fenda sináptica, os genes que codificam estas enzimas têm variantes funcionais bem caracterizadas. Desta
forma, polimorfismos nos genes destas enzimas podem estar relacionados diretamente com a disponibilidade de
dopamina e, consequentemente, com a ingestão alimentar. O objetivo deste estudo foi investigar a associação das
variantes MAOA-u VNTR, MAOA T941G e COMT Val158Met com aspectos relacionados à obesidade e a ingestão
alimentar. Participaram deste estudo transversal 354 crianças entre 3 e 4 anos de idade, das quais foram obtidos
dados alimentares e antropométricos. O DNA foi extraído, a partir de sangue periférico, os polimorfismos foram
analisados por métodos baseados na PCR, os genótipos foram visualizados posteriormente a eletroforese em gel de
agarose ou acrilamida. As comparações das médias foram realizadas por ANOVA, Kruskal Wallis ou Mann-Whitney
de acordo com a distribuição dos dados. Para analisar os polimorfismos no gene da MAOA a amostra foi dividida
em meninos e meninas, pois o gene MAOA está localizado no cromossomo X. Na amostra de meninos, o alelo longo
do polimorfismo MAOA-u VNTR foi associado com maior consumo de alimentos com alto teor de gordura (LDF)
(134.97 kcal [26.43–270.16]) e açúcar (SDF) (100.45 kcal [54.40–163.32]) quando comparado ao curto (LDF: 60.1
kcal [0.00–192.31]; p = 0.009; SDF: 80.01 kcal [37.45–127.11]; p = 0.034). Na amostra de meninas, o polimorfismo
MAOA-u VNTR não foi associado com a ingestão alimentar e dados antropométricos. No polimorfismo COMT
Val158Met os portadores do alelo Val tiveram um consumo maior de LDF em comparação aos homozigotos para
o alelo Met (p = 0.008), as medianas foram 133.79 kcal [44.23–265.80] e 83.37 kcal [0.00–252.95], respectivamente.
Estes achados indicam a associação dos alelos que codificam enzimas de maior atividade com a ingestão
de alimentos mais palatáveis, estando de acordo com o esperado pela hipótese da deficiência de recompensa.
Financiadores: FAPERGS, CNPq e CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
184
Associação do polimorfismo C161T no gene PPAR-gama
e obesidade em afro-descendentes do estado da Bahia
Magalhães-Oliveira, MCA3; Maia, RR¹; Britto, FA¹; Chung-Filho, AA¹; Rosa, ASS¹; Silva, KS2; Guimarães,
LO2; Korontai, LLS2; Rios, LDS1,3
¹Laboratório de Genética Humana - Departamento de Ciências da Vida – Campus I. Universidade do Estado da Bahia.
2
Laboratório de Genética Humana – Departamento de Ciências Biológicas. Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia.
3
Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. Universidade Estadual de Feira de Santana.
Palavras-chave: Polimorfismo, Obesidade, C161T, PPAR-gama, Afrodescendentes
O receptor ativado por proliferadores de peroxissoma tipo gama (PPAR-gama) é um fator de transcrição que
está envolvido no metabolismo e homeostase da glicose, lipídeos e inflamação, sendo relacionado à patogênese
da resistência à insulina, aterosclerose e obesidade. Observou-se que a substituição no exon 6 de “C” para “T”
(C161T) do gene PPAR-gama em mulheres coreanas conferiu proteção à dislipidemias, com níveis de HDLcolesterol maiores. Este polimorfismo isoladamente não foi relacionado com obesidade, alteração de níveis
lipídicos e níveis de leptina no plasma em um estudo com crianças obesas japonesas. Já em franceses obesos
observou-se maiores níveis de leptina no plasma quando na presença do alelo T. Em afro-descendentes, no
entanto, os estudos são escassos sendo necessárias mais pesquisas para compreender a associação deste
polimorfismo com a obesidade neste grupo etnico. Foram estudados 312 mulheres e 438 homens afrodescencentes
provenientes do estado da Bahia, com média de idade de 54,5 ±7,6 anos. O polimorfismo C161T foi estudado
através da amplificação por PCR, usando primers, descritos na literatura, seguido de digestão com a enzima de
restrição PmaC I e eletroforese em gel de poliacrilamida 8% para visualização dos fragmentos e determinação do
genótipo. A freqüência do alelo 161T não diferiu significantemente nas mulheres com Índice de Massa Corpórea
(IMC=peso/altura2) < 25 (11,4%) quando comparadas as mulheres com IMC ³ 25 (9,2%; p=0,487). Nos homens com
IMC < 25 a freqüência do alelo 161T foi 10,2% enquanto que a observada nos com IMC ³ 25 foi 13,8% (p=0,153).
Em afrodescedentes do estado da Bahia, o polimorfismo C161T não foi associado a obesidade/sobrepeso.
Apoio financeiro: CNPq/FAPESB e UNEB
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
185
Avaliação da influência dos polimorfismos 5-HTTLPR
e 5-HTTVNTR do gene do transportador de serotonina
(5-HTT) com ingestão alimentar e parâmetros de
adiposidade em crianças de 3 e 4 anos
Krüger, RC1; Galvão, ACS1,2; Mattevi, VS1,2; Campagnolo, PDB2; Vítolo, MR2; Almeida, S1,2
Laboratório de Biologia Molecular, Centro de Pesquisa e Pós-Graduação Heitor Cirne Lima, Universidade Federal de Ciências da Saúde
de Porto Alegre.
2
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
[email protected]
1
Palavras-chave: Ingestão alimentar, obesidade, 5-HTTLPR, 5-HTTVNTR, Sistema Serotoninérgico
Introdução: O sistema serotoninérgico exerce um papel crítico na regulação do apetite e alterações em sua
disponibilidade e/ou ação têm sido associadas com desordens alimentares. O transportador de serotonina (5-HTT)
regula a disponibilidade deste neurotransmissor. O gene do 5-HTT (SLC6A4) possui duas regiões polimórficas que
são amplamente investigadas: um polimorfismo funcional na região promotora (5-HTTLPR) que possui dois alelos alelo longo (L - inserção de 44pb) e alelo curto (C – deleção) – e o polimorfismo 5-HTTVNTR, que contém uma unidade
de repetição de 17pb, resultando em três variantes alélicas já descritas: 9, 10 e 12 repetições. Objetivos: Investigar
a associação dos polimorfismos 5-HTTLPR e 5-HTTVNTR com ingestão alimentar e parâmetros de adiposidade de
crianças entre 3 e 4 anos de idade. Métodos: O DNA foi extraído de amostras de sangue de 324 crianças utilizando o
método de precipitação com alta concentração de sal. Os polimorfismos foram analisados por reação em cadeia da
polimerase (PCR) com primers específicos, seguida de eletroforese em gel de agarose corado com brometo de etídio
e visualização sob luz ultravioleta. As frequências alélicas e genotípicas foram comparadas por qui-quadrado. As
médias de ingestão alimentar e dos dados antropométricos entre os genótipos foram comparadas por análise de
variância ou Kruskal-Wallis de acordo com a distribuição dos dados. Resultados: As distribuições das frequências
genotípicas encontradas estão de acordo com o esperado sob equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para o polimorfismo
5-HTTLPR, as frequências para o alelo L (longo) nos indivíduos brancos e não-brancos foram 0,580 e 0,503 (χ² com
correção de Yates = 0,9863; p=0,3206), respectivamente. As crianças da amostra de não-brancos com o genótipo
CC apresentaram maior ingestão energética total/dia (1665,3 ± 415,1 kcal/dia) do que as crianças com genótipos
LC e LL (1455,7± 358,5 e 1423,0 ± 374,4 kcal/dia, respectivamente; PostHoc Tukey HSD p=0,010). Elas também
apresentaram maior escore Z do IMC (PostHoc Tukey HSD p=0,042) e circunferência da cintura (PostHoc Tukey
HSD p=0,013) do que as portadoras do alelo L. As análises para o polimorfismo 5-HTTVNTR estão em andamento,
e até o momento foram genotipadas 158 amostras. As freqüências dos alelos 9, 10 e 12 foram, respectivamente,
0,04, 0,35 e 0,60 em indivíduos brancos e 0,01, 0,28 e 0,70 em indivíduos não-brancos. Conclusões: O genótipo CC
do polimorfismo 5-HTTLPR está associado com o aumento da ingestão alimentar, do IMC e circunferência da
cintura em crianças não-brancas. Este achado reforça o papel do transportador de serotonina na regulação da
ingestão alimentar e como fator de risco potencial para obesidade neste grupo, sugerindo possibilidades de novos
caminhos para seu tratamento farmacológico ou medidas ambientais preventivas. Contudo, ainda são necessários
mais estudos para elucidar a influência destes polimorfismos na ingestão alimentar e parâmetros de adiposidade.
Apoio financeiro: FAPERGS, CNPq e PIBIC-CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
186
A associação do polimorfismo HindIII da LPL com a
obesidade/ sobrepeso em população afrodescendente
do Estado da Bahia
Chung-Filho, AA¹; Rosa, ASS¹; Matos, EMO¹, Maia, RR¹; Britto, FA¹; Carneiro, CS1; Silva, KS2; Guimarães,
LO2; Korontai, LLS2; Magalhães-Oliveira, MCA3; Rios, LDS1,3
¹Laboratório de Genética Humana - Departamento de Ciências da Vida – Campus I. Universidade do Estado da Bahia.
2
Laboratório de Genética Humana – Departamento de Ciências Biológicas.
3
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia. Universidade Estadual de Feira de Santana.
[email protected]
Palavras-chave: Lipase lipoprotéica, polimorfismo, HindIII, obesidade, afrodescendente.
A lipase lipoprotéica (LPL) é a principal responsável pela hidrólise dos triglicerídeos presentes em quilomícrons
e lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL). Devido à importância desta enzima no metabolismo das
lipoproteínas, o gene da LPL, localizado no cromossomo 8p22.7, possivelmente está associado à patogênese da
obesidade central e de dislipidemias. Mais de 60 polimorfismos deste gene já foram descritos, entre eles, o HindIII,
uma mutação localizada no íntron 8 do gene. Muitos estudos têm encontrado associações entre a presença deste
polimorfismo e a frequência de dislipidemias, obesidade e problemas relacionados, como resistência à insulina e
aterosclerose, principalmente em populações de orígem européia e asiática. Em populações afrodescendentes,
porém, estes estudos são escassos. O estudo buscou analisar a relação entre a presença do polimorfismo HindIII
e a frequência de obesidade/sobrepeso em uma amostra de 259 mulheres e 350 homens afrodescendentes do
Estado da Bahia, com média de idade de 54,5 ± 7,6 anos. O polimorfismo foi analisado pela amplificação do
DNA de interesse por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR), seguida da técnica do polimorfismo de
tamanho de fragmento de restrição (RFLP), através de digestão com a enzima de restrição HindIII, como
descritos na literatura. Foi considerado com sobrepeso/obesidade, o indivíduo que possuísse índice de massa
corpórea (IMC) ³ 25 kg/m2, e eutrófico o indivíduo com IMC < 25 kg/m2. A freqüência do alelo HindIII + foi de
57,3% nas mulheres eutróficas e 60,2% (p=0,604) nas com obesidade/sobrepeso não sendo estatisticamente
significante esta diferença. Nos homens a freqüência do alelo HindIII foi de 61,8% nos eutróficos e 56,1%
(p=0,171) nos com obesidade/sobrepeso não sendo significante esta diferença. Portanto, não verificou-se relação
entre o polimorfismo hindIII do gene LPL e obesidade/sobrepeso em afrodescendentes do estado da Bahia.
Apoio financeiro: FAPESB/CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
187
Estudo da Influência de Polimorfismos dos Genes
APOC1, APOC2 e APOC4 no Perfil Lipídico de
Estudantes de Sapucaia do Sul/RS
Fontana, C1; Zandoná, M1; Vitolo, MR2; Rotta, LN3; Almeida, S1,4
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
Departamento de Nutrição, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
3
Departamento de Métodos Diagnósticos, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
4
Departamento de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Dislipidemia, APOC1, APOC2, APOC4, perfil lipídico.
Introdução: As doenças cardiovasculares (DCVs) exercem um papel preponderante na morbimortalidade mundial e
tem como fatores de risco a aterosclerose e a dislipidemia, que podem resultar de condições primárias ou secundárias.
A dislipidemia é uma condição caracterizada por concentrações anormais de lipídeos ou lipoproteínas no plasma.
As apolipoproteínas C (apoC) localizam-se na superfície das lipoproteínas e estão intimamente envolvidas no
metabolismo lipídico. A apoC-I está envolvida na inibição da ligação das lipoproteínas a seus receptores teciduais,
enquanto a apoC-II ativa a lipase lipoproteica nos capilares teciduais, causando a liberação de ácidos graxos. A função
da apoC-IV ainda não está clara. Objetivo: Investigar a associação dos polimorfismos 317insCGTT do gene APOC1,
C3548T do gene APOC2 e T3139C do gene APOC4 nas concentrações lipídicas em 615 estudantes de Sapucaia do
Sul/RS. Métodos: Os fragmentos gênicos contendo os polimorfismos de interesse foram amplificados pela reação
em cadeia da polimerase e submetidos à digestão por enzimas de restrição sítio específicas. Os genótipos foram
determinados após eletroforese em gel de agarose. As frequências genotípicas e alélicas foram obtidas por contagem
simples e testadas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg através do teste qui-quadrado de ajustamento. As médias das
concentrações de colesterol total, LDL, HDL e triglicerídeos foram comparadas entre os diferentes genótipos pela
análise de variância de uma via (ANOVA). A análise estatística foi realizada através do pacote estatístico Statistical
Package for Social Sciences versão 16.0 (SPSS®, Chicago, IL, USA), sendo considerado como significante um valor
p<0,05. Resultados: A frequência do alelo variante H2 do gene APOC1 foi de 0,2072, 0,6002 para o alelo variante
T2 do gene APOC2 e 0,5912 para o alelo variante C do gene APOC4. As frequências gênicas encontradas estão de
acordo com as esperadas pelo equilíbrio de Hardy-Weinberg. Na comparação entre as médias das concentrações
de colesterol total, LDL, HDL e triglicerídeos com os diferentes genótipos não foram observadas associações
estatisticamente significantes. Conclusões: As análises de associação para cada polimorfismo demonstraram que
isoladamente estes polimorfismos não estão associados com o perfil lipídico de crianças e adolescentes. Como a
concentração dos lipídios séricos é uma característica multifatorial, esta ausência de associação pode ser explicada
por um tempo curto de exposição a uma dieta rica em gorduras destas crianças. Para conclusões mais definitivas
serão realizadas análises dos três polimorfismos em conjunto, controlando com os dados de ingestão alimentar.
Apoio financeiro: FAPERGS, CNPq e PIC-UFCSPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
188
Oxidative stress in hypercholesterolemia and its
association with Ala16Val superoxide dismutase gene
polymorphism
Duarte, MMMF¹; Gollo, AL²; Moresco, RN²; Duarte, T²; Santi, A²; Bagatini, MD²; Schetinger, MRC²; Loro,
VL²; Manica-Cattani, MF²; Montagner, GFFS²; Cruz, IBM²
¹Universidade Luterana do Brasil.
²Laboratório de Biogenômica, Universidade Federal de Santa Maria.
[email protected]
Keywords: Hypercholesterolemia, Oxidative stress, MnSOD, Biomarkers, Polymorphism
Clinical studies have demonstrated that patients with hypercholesterolemia present antioxidant activity decreased
when compared with normal subjects. Therefore, the aim of this study was to investigate the lipid peroxidation,
protein oxidation and the antioxidant system in hypercholesterolemic patients and health subjects. We also
evaluated the influence of genotype manganese superoxide dismutase (Ala16Val) polymorphism on oxidative
stress biomarkers. To investigate the role of oxidative stress, the role of the antioxidant system, and the influence of
the manganese superoxide dismutase (Ala16Val) polymorphism in hypercholesterolemia. Levels of glucose, lipid,
high-sensitivity C reactive protein (hs-CRP), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), carbonyl protein,
thiols, reduced glutathione (GSH), catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), vitamin C, vitamin E, and the
presence of the manganese superoxide dismutase (Ala16Val) polymorphism were determined in 40 subjects with
hypercholesterolemia and 40 controls. Lipid profile, hs-CRP, glucose, TBARS, carbonyl protein, CAT, and vitamin
E were significantly higher in subjects with hypercholesterolemia. In contrast, GSH and SOD were lower. TBARS,
carbonyl protein, thiols, CAT, and vitamin E were significantly higher in hypercholesterolemic subjects with VV
genotype for MnSOD, while GSH, SOD, and vitamin C were lower in these subjects. Conclusions: We suggest
an association between the VV genotype of MnSOD, hypercholesterolemia, and oxidative stress biomarkers.
Financial Support: CNPq, CAPES e FAPERGS.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
189
Associação do polimorfismo -1131T>C no gene
da apolipoproteína A5 (APOA5) em indivíduos com
dislipidemia em Minas Gerais
Santos, IR1; Ferreira, CN1; Coelho, FF1; Cruz, NG1; Rodrigues, KF1; Pinheiro, PS1; Sóter, MO1; Fernandes, AP1;
Sousa, MO1; Gomes, KB1,2
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte,
Minas Gerais, Brasil.
2
Colégio Técnico, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: Apolipoproteína A5, polimorfismo -1131T>C, PCR, dislipidemia, DAC.
Introdução: As apolipoproteínas são proteínas que se associam aos lipídes permitindo seu transporte pelo plasma.
A apolipoproteína A5 (ApoA5) é detectada nas partículas de lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL), de
alta densidade (HDL) e quilomícrons, participando da modulação dos níveis plasmáticos de triglicérides por
propiciar sua chegada ao fígado, onde serão metabolizados. Polimorfismos no gene dessa apolipoproteína têm sido
associados ao aumento dos níveis de triglicérides plasmáticos. Estudos mostram que estas alterações metabólicas
são fatores de risco para a Doença Arterial Coronariana (DAC), uma das causas de morte mais comuns em nossa
população. Alguns trabalhos descreveram a relação entre o polimorfismo -1131T>C no gene da ApoA5 e variações
nos níveis de triglicérides. Objetivos: Comparar a frequência do polimorfismo -1131T>C no gene da ApoA5 entre
um grupo dislipidêmico e um grupo controle normolipêmico, a fim de avaliar a associação deste polimorfismo
com a dislipidemia. Metodologia: Participaram deste estudo 108 pacientes dislipidêmicos, com idade de 30 a
40 anos, e um grupo controle normolipêmico constituído por 107 indivíduos saudáveis na mesma faixa etária.
Após extração de DNA do sangue periférico, as amostras foram submetidas à técnica de PCR (Reação em Cadeia
da Polimerase) para a realização das análises moleculares, seguida por digestão com enzima de restrição MseI,
eletroforese em gel de poliacrilamida e revelação com solução de nitrato de prata. As dosagens bioquímicas foram
realizadas segundo métodos enzimáticos colorimétricos. Foram utilizadas como ferramentas estatísticas, o teste
de Qui-Quadrado ou Teste Exato de Fisher, quando apropriado, e a análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste
Student-Newman-Keuls (SNK). Resultados: Os dois grupos apresentaram-se sob o equilíbrio de Hardy-Weinberg.
A frequência encontrada para o alelo C no grupo de pacientes (0,278) foi maior do que aquela observada no grupo
normolipêmico (0,182, p=0,019). Quando comparada a freqüência do alelo C no grupo dislipidêmico em relação ao
grupo normolipêmico levando-se em consideração o gênero, foi observada significância apenas entre os homens
(p=0,037). A análise das freqüências genotípicas, entre os grupos estudados, revelou diferença unicamente para o
genótipo heterozigoto TC (p=0,009), sendo maior no grupo de dislipidêmicos. Foi observada ainda uma associação
dos parâmetros lipídicos com a presença do alelo C para o colesterol total (p=0,046), triglicérides (p=0,049),
VLDL-c (p=0,022) e fração não HDL-c (p=0,019). Conclusões: Os resultados obtidos até o momento sugerem que o
polimorfismo -1131T>C está associado aos aumentos de colesterol total, triglicérides, VLDL-c e fração não HDL-c. O
alelo C mostrou-se mais freqüente entre dislipidêmicos, sendo esta diferença destacada no grupo do sexo masculino.
Apoio financeiro: FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
190
Associação de marcadores moleculares com a
hipertensão arterial sistêmica e suas variáveis de risco
na região amazônica
Raiol-Moraes, M1; Freitas, NSC1; Marinho, A1; Santos, N1; Santos, S1; Callegari-Jacques, S2;
Ribeiro-Dos-Santos, A1
Laboratório de Genética Humana e Médica, Universidade Federal do Pará, Belém, Pará.
Departamento de Estatística, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hipertensão, PON1, ECA, NOS3, fatores ambientais.
A Hipertensão Arterial Sistêmica (HAS) é uma das áreas de investigação médica mais relevante em termos
mundiais, ocupando papel importante na saúde pública e na economia. É considerada uma doença crônicodegenerativa de caráter multigênico e multifatorial. Diferentes estudos sobre o controle da pressão arterial têm
evidenciado um complexo mecanismo de interação que envolve proteínas, moléculas, sistemas fisiológicos,
fatores ambientais e genéticos. Os polimorfismos genéticos constituem um destes elementos, principalmente
àqueles relacionados com a enzima óxido nítrico sintetase endotelial que produz o óxido nítrico, um importante
agente vasodilatador, cujo gene responsável é denominado NOS3. O gene ECA é outro polimorfismo do tipo
inserção/deleção responsável pela conversão de Angiotensina I e Angiotensina II, um potente vasoconstritor,
também está envolvido no aumento da pressão. A enzima paraoxonase 1 (PON1) adere a molécula de HDL,
na circulação sanguínea e impede que os lipídios sofram oxidação. Sua baixa atividade enzimática tem sido
correlacionada com diversas doenças, entre as quais a HAS. No presente trabalho, investigaram-se três genes
PON1, ECA e NOS3 e seus polimorfismos, em 400 indivíduos hipertensos e normotensos da população de Belém,
PA (Brasil). As amostras de DNA foram extraídas pela técnica fenol-clorofórmio, em seguida foram realizadas
técnicas básicas de biologia molecular e discriminação alélica por PCR em Tempo Real (Life Technologies, CA, US).
Como resultado observou-se que o risco de desenvolver HAS é 1,8 vezes maior em indivíduos que apresentaram
o genótipo ECA*DD em relação aos indivíduos que apresentaram outros genótipos deste marcador, ajustado
pelos fatores ambientais, laboratoriais e demais loci. Da mesma forma, diferentes fatores genéticos e ambientais
(idade, diabetes mellitus, índice de massa corpórea, concentrações de triglicerídeos e concentrações de uréia)
parecem favorecer o desenvolvimento de HAS. Apesar do pequeno número amostral, neste estudo, métodos de
diagnóstico e de prevenção como o utilizado poderiam indicar indivíduos com maior risco de desenvolvimento
de HAS, auxiliando na individualização e orientação destes indivíduos em relação à qualidade de vida.
Apoio financeiro: UFPA, FAPESPA e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
191
Variabilidade do gene NOS3 (endothelial nitric oxide
synthase) e haplótipos de suscetibilidade à hipertensão
Luizon, MR1; Sandrim, VC2; Izidoro-Toledo, TC1; Coelho, EB3; Tanus-Santos, JE1.
Departmento de Farmacologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, USP, Ribeirão Preto-SP.
Santa Casa de Belo Horizonte, Belo Horizonte-MG.
3
Departmento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, USP, Ribeirão Preto-SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hipertensão, óxido nítrico sintase endotelial, haplótipos, tagSNPs, caso-controle
A hipertensão afeta centenas de milhões de pessoas no mundo e é um dos principais fatores de risco para as doenças
cardiovasculares que, por sua vez, são a principal causa de mortalidade na sociedade Ocidental. O óxido nítrico
(NO) desempenha um papel essencial na regulação da homeostase vascular e é produzido nas células endoteliais
pela enzima óxido nítrico sintase endotelial, eNOS. Portanto, anormalidades na atividade da eNOS podem levar
a deficiência do NO e causar hipertensão. Haplótipos do gene da eNOS (NOS3) foram previamente associados
à hipertensão. Estes haplótipos foram formados por dois SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) funcionais
(T-786C na região promotora-rs2070744 e Glu298Asp no exon 7-rs1799983-G/T) e um VNTR (Variable Number of
Tandem Repeats) no intron 4 (b/a). Entretanto, polimorfismos no gene NOS3 não investigados previamente podem
contribuir para as associações relatadas. Portanto, nosso objetivo foi avaliar a eventual associação da hipertensão
com haplótipos extendidos do gene NOS3 formados por tagSNPs. Estes são SNPs que representam a informação
de outros SNPs adjacentes, em uma região do genoma com alto desequilíbrio de ligação, i.e., a associação não
aleatória de alelos em dois ou mais loci. Quatro tagSNPs (rs3918226-C/T, rs3918188-A/C, rs743506-A/G e rs7830A/C) com frequência do menor alelo >10% foram selecionados a partir do Banco de dados SeattleSNPs no intuito
de capturar >60% da variabilidade ao longo do gene NOS3, includindo as regiões promotora, codificadora e 5´ e
3´ não traduzidas. Hipertensos (81 brancos e 53 negros) e normotensos (83 brancos e 43 negros) foram avaliados.
Diferenças interétnicas significativas foram observadas na distribuição dos polimorfismos do gene NOS3. Portanto,
foram realizadas análises considerando a amostra total ou somente os indivíduos brancos (52-65%). A genotipagem
foi feita usando TaqMan® SNP Genotyping Assays e para o VNTR do intron 4 por PCR e PAGE 10%, e coloração por
nitrato de prata. As frequências alélicas e genotípicas foram comparadas pelo teste do qui-quadrado, mas não
foram observadas diferenças entre hipertensos e normotensos. As frequências dos haplótipos foram estimadas
pelo programa Haplo.stats, cuja função haplo.score gera testes de associação específicos para cada haplótipo,
considerando p<0,05. O haplótipo “CCbGCGA” foi mais comum em normotensos que em hipertensos, tanto quando
consideradas a amostra total (3% vs. zero, respectivamente; p=0,05) ou somente os indivíduos brancos (6% vs. zero,
respectivamente; p=0,007). Além disso, o haplótipo “TCbGAGC” foi mais comum na amostra total de hipertensos
do que em normotensos (8% vs. zero, respectivamente; p=0,02). O mesmo haplótipo também foi mais comum
em hipertensos brancos do que em normotensos brancos, embora esta diferença não tenha sido significativa
(p>0,05). Estes resultados sugerem um haplótipo do gene NOS3 que confere suscetibilidade à hipertensão e outro
haplótipo associado com um efeito protetor contra a hipertensão, a despeito da classificação em brancos e negros.
Agência de fomento: FAPESP (BP.PD 2007/55908-6)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
192
Associação do polimorfismo A1166C no gene AT1R com
a hipertensão arterial sistêmica em afro-descendentes
do estado da Bahia
Araujo, LJ1; Meira, DO2; Pereira, JF1; Oliveira, PB2; Barbosa, AAL2; Sousa, SMB3; Rios, DLS1,4.
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia (UEFS/FIOCRUZ-BA),
Departamento de Ciências Biológicas - UESB,
3
Departamento de Ciências Biológicas – UESC,
4
Departamento de Ciências da Vida – UNEB.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Receptor tipo 1 da angiotensina II (AT1R), Hipertensão, Polimorfismo, Sistema Renina-Angiotensina, Afro-descendente.
A hipertensão arterial sistêmica (HAS) é uma doença comum e multifatorial com forte impacto na saúde pública
devido ao seu papel no risco de outras doenças como acidente vascular cerebral (AVC) e infarto do miocárdio. O
sistema renina-angiotensina (RAS) possui papel importante na regulação da pressão sanguínea e a angiotensina
II é o agente fundamental na seqüência de reações que culminam no controle da pressão arterial, como este
agente tem como seu principal receptor o AT1R, seus genes tornam-se elementos importantes nos estudos que
avaliam o papel do sistema RAS e a hipertesão. O gene que codifica o receptor tipo I da Angiotensina II está
situado no cromossomo 3 e possui um polimorfismo na posição do nucleotídeo 1166 que corresponde a uma
transversão A®C. Este estudo teve como objetivo verificar a associação do polimorfismo A1166C no gene do
AT1R com a HAS em uma amostra composta por 458 indivíduos Afro-descendentes do estado da Bahia. Aqueles
que apresentaram níveis de Pressão Arterial Sistólica ³ 140mmHg e/ou Diastólica ³ 90 mmHg e/ou que faziam
uso de medicações anti-hipertensivas foram considerados como casos e aqueles cujos níveis tensionais foram
normais (>140X90 mmHg) e que não faziam tratamento com medicações anti-hipertensivas foram incluídos
na amostra controle. O DNA genômico foi extraído segundo protocolo de LAHIRI & NURNBERGER (1991). O
estudo do polimorfismo do gene AT1R foi realizado pela técnica da PCR/RFLP utilizando a enzima de restrição
DdeI. O produto de restrição foi analisado em gel de poliacrilamida 8% seguido de coloração com brometo de
etídio; as bandas foram visualizadas com luz ultravioleta. As análises estatísticas foram feitas utilizando-se o
programa SPSS ver. 10 e as freqüências gênicas e genotípicas foram comparadas entre os grupos utilizando o teste
do c2. Foi utilizada a análise de regressão logística multivariada para estimativas dos odds ratio associados aos
genótipos. As freqüências genotípicas observadas do polimorfismo AT1R estavam de acordo com as esperadas
para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Não houve diferenças significantes nas freqüências do polimorfismo 1166
A®C no gene AT1R entre casos e controles para a HAS. As freqüências do alelo 1166C no gene AT1R foram de
26% nos casos e de 27% nos controles, não sendo significantes esta diferença (P= 0,616). Mesmo após correção
para o efeito de outras co-variáveis em regressão logística multivariada, o polimorfismo 1166A>C não foi
associado com a hipertensão entre os Afro-descendentes. Este resultado confirma estudos anteriores que não
mostraram associação do mesmo polimorfismo com a hipertensão na população brasileira (Freitas et al., 2007), na
Malásia (Rehman et al., 2007) e em estudo de Cohort com mulheres caucasianas (Conen et al., 2008). Entretanto,
mais estudos em Afro-descendentes são necessários para confirmar estes resultados neste grupo étnico.
Apoio financeiro: CAPES e FAPESB.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
193
Associação entre polimorfismos nos genes AGT e
SCNN1B com hipertensão arterial em afrodescendentes
no estado do Pará
Matos, BS; Carvalho TAC; Guerreiro, JF.
Laboratório de Epidemiologia Molecular - Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal do Pará.
[email protected]
Palavras-chave: Hipertensão, Afrodescendentes, Polimorfismos, AGT,SCNN1B.
A hipertensão é uma doença crônica de elevado custo sócio-econômico por suas complicações, sendo uma
das causas mais freqüentes de óbito relacionadas ao sistema cardiovascular. Segundo a Sociedade Brasileira de
Hipertensão, a pressão arterial é considerada alta quando igual ou superior a 140 mmHg durante a sístole e/ou
superior a 90 mmHg durante a diástole. Registros na literatura demonstram que indivíduos afrodescendentes
apresentaram maior risco para desenvolvimento da hipertensão em comparação aos de descendência européia.
Fatores ambientais e genéticos contribuem em conjunto para a elevação da pressão arterial. O gene AGT está
localizado no cromossomo 1 (posição 1q42-q43) e é responsável pela síntese de angiotensinogênio. Essa proteína
é um componente essencial do sistema renina-angiotensina, que atua na queda da pressão arterial e tem como
principal agente a angiotensina II, promovendo a liberação de aldosterona e retenção de sódio nos rins. Os canais
epiteliais de sódio são proteínas compostas por subunidades homólogas (a, b e l) e são reguladores do balanço
da ingestão e eliminação de sódio. O gene da subunidade b dos canais epiteliais de sódio (SCNN1B) está localizado
no cromossomo 16 (posição 16p12.1-p12.2). Mutações no gene SCNN1B foram associadas com elevação da
reabsorção de sódio no néfron distal e desenvolvimento de hipertensão. Existe uma lacuna acerca de informações
referentes às causas genéticas da hipertensão essencial em populações região Norte, onde a obtenção desses dados
poderá facilitar o desenvolvimento de estratégias para um melhor diagnóstico genético para a doença. Dessa
forma, foi investigada a relação de polimorfismos presentes no gene AGT (-6AG e M235T) e no gene SCNN1B
(T594M) em indivíduos provenientes de comunidades remanescentes de quilombos nos municípios de Oriximiná
e Inhangapi, no estado do Pará. Foram analisados 399 indivíduos, dentre os quais 199 indivíduos classificados
como hipertensos e 200 como controles (pressão sanguínea normal), pareados por faixa etária e sexo. Coletouse uma alíquota de sangue para posterior extração de DNA. Os polimorfismos selecionados foram pesquisados
por PCR, seguida de sequenciamento de DNA. As mutações no gene AGT (- 6ag e M235T) e no gene SCNN1B
(T594M) apresentaram, isoladamente, correlação positiva com a patologia da hipertensão arterial (p=0,004;
p=0,034; p=0,019 respectivamente). A análise por regressão logística revelou associação entre a hipertensão o
polimorfismo no AGT-6a, IMC (↑ 25), circunferência da cintura (↑ 0,77m ♀ e ↑ 0,8m ♂) e índice de gordura (↑
26,2% ♀ e ↑ 23,2% ♂) com p=0,0177. Os dados apresentados sugerem uma correlação positiva entre valores de
pressão arterial elevados em indivíduos afrodescendentres com os polimorfismos nos genes AGT e SCNN1B, com
um fator de risco aproximado de 1,9 para o AGT-6a, 5,3 para o 594M e 1,5 para 235M. Estudos mais aprofundados
acerca da contribuição destes e outros polimorfismos nos genes investigados e a patologia da hipertensão poderão
aumentar o conhecimento dos fatores genéticos relacionados a essa patologia em afrodescendentes no Brasil.
Apoio financeiro: CNPq, FADESP, FAPESPA e UFPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
194
Análise de haplótipos dos polimorfismos T-786C, VNTR
4a/b e GLU298ASP do gene da óxido nítrico sintase
endotelial (ENOS) em pacientes com insuficiência
cardíaca e indivíduos saudáveis
Martinelli, NC1; Santos, KG1,2; Silvello, D1; Cohen, CR1; Porta VL1; Biolo, A3; Clausell, N3; Rohde, LE3
Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
Centro de Pesquisas em Ciências Médicas, Universidade Luterana do Brasil (ULBRA).
3
Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Insuficiência cardíaca, óxido nítrico sintase endotelial (eNOS), polimorfismos, haplótipos, suscetibilidade.
A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome multifatorial caracterizada por disfunção miocárdica. O óxido nítrico
desempenha importante papel cardioprotetor na IC e é produzido pela óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Os
polimorfismos mais estudados no gene da eNOS são uma substituição de base na região promotora (T-786C), uma
repetição de 27pb no intron 4 (VNTR 4a/b) e uma troca de aminoácido no éxon 7 (Glu298Asp). O haplótipo -786C/4b/
Glu298 foi associado a menores concentrações plasmáticas de nitritos em indivíduos saudáveis. O objetivo deste
estudo foi avaliar a associação dos haplótipos do gene da eNOS com a IC. Para isso, foram analisados 310 pacientes com
IC por disfunção sistólica (220 caucasianos e 90 afro-descendentes), acompanhados no Ambulatório de Insuficiência
Cardíaca e Transplante do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). O grupo controle era composto por 361
indivíduos doadores de sangue (280 caucasianos e 81 afro-descendentes) atendidos no Serviço de Hemoterapia do
HCPA. A análise dos polimorfismos foi realizada pela técnica de PCR (intron 4) ou PCR-RFLP (promotor e éxon 7). As
freqüências alélicas e genotípicas observadas para o polimorfismo T-786C não diferiram entre pacientes e controles
caucasianos. Entre os afro-descendentes, embora o alelo C tenha sido mais freqüente nos controles do que nos
pacientes (31% contra 21%, respectivamente; p=0,048), o mesmo não ocorreu entre os genótipos (p>0,05). Quanto à
variante 4a/b (intron 4), as freqüências alélicas e genotípicas foram semelhantes entre os diferentes grupos (p>0,05).
Da mesma maneira, as freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo Glu298Asp foram similares entre os
pacientes e controles de ambas etnias (p>0,05). Os haplótipos mais freqüentes em controles e pacientes caucasianos
foram: -786T/4b/Glu298 (47% e 43%, respectivamente) e -786T/4b/Asp298 (21% e 22%, respectivamente). De forma
similar, entre os controles e pacientes afro-descendentes, as combinações mais freqüentes foram: -786T/4b/Glu298
(61% e 54%, respectivamente) e -786T/4b/Asp298 (12% e 20%, respectivamente). Para ambas etnias, não se verificou
diferença estatisticamente significativa nas freqüências haplotípicas entre pacientes e controles (p>0,05). Entre os
pacientes caucasianos não houve qualquer associação dos haplótipos com a mortalidade total ou por IC. Entretanto,
na análise de sobrevida dos pacientes afro-descendentes, a presença de um dos haplótipos -786C/4b/Asp298 ou
-786C/4a/Asp298 estava associada com uma menor mortalidade total quando comparada com os outros haplótipos
(6% contra 38%, respectivamente; log rank=0,032). Ajustando para idade, sexo, infarto agudo do miocárdio prévio, sódio
sérico, duração do complexo QRS, fração de ejeção do ventrículo esquerdo e diâmetro diástolico final do ventrículo
esquerdo, o haplótipo acima citado se manteve como fator de proteção associado a uma menor mortalidade por
todas as causas neste grupo de pacientes (HR=0,11, IC 95% 0,01-0,85; p=0,03). Com isso, sugere-se uma associação
dos haplótipos -786C/4b/Asp298 e -786C/4a/Asp298 com a mortalidade por todas as causas nos afro-descendentes.
Apoio: CNPq, FIPE-HCPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
195
Evaluation of interleukin-6 promoter polymorphism
-174G>C and development of angina pectoris
Amorim, FG1; Campagnaro, BP1; Tonini, CL1; Norbim, APOC2; Arruda, JA2; Louro, ID3; Vasquez, EC1,4;
Meyrelles, SS1
Lab. Transgenes & Cardiovascular Control (Federal University of Espírito Santo - UFES)
Intercath-Meridional
3
Human Molecular Genetics Core (Federal University of Espírito Santo - UFES)
4
EMESCAM, Health College of Sciences
[email protected]
1
2
Keywords: -174G>C, IL6, polymorphism, angina pectoris, cardiovascular disease
The polymorphism in the promoter region -174 of interleukin-6 (IL6) gene involves a change of a single base, from G
to C. IL6 is a pro-inflammatory cytokine that participates in the worsening of cardiovascular diseases (CVD). To date
the involvement of this polymorphism between patients (stable or unstable angina) compared to subjects without
angina pectoris has not been evaluated. Therefore, this study aimed to evaluate the correlation between -174G>C
polymorphism of IL6 gene and angina pectoris in individuals in the region of Grande Vitória-ES (Brazil). Methods:
This study was previously approved by Institutional Human Research Ethics Committee (CEP-UFES). A total of
143 patients were recruited, submitted to evaluation of cardiovascular parameters and separated into two groups:
without angina (n=71) and angina (n=72) and genotyped for the region -174G> C through PCR-RFLP with the
enzyme NlaIII. The genotypes (GG, GC and CC) were observed in 10% polyacrylamide stained with silver. Statistical
analysis was performed through Student t test, chi-square, multiple logistic regression and odds ratios (OR), as
appropriated. Results: Genotype distribution was consistent with that predicted by Hardy-Weinberg equilibrium
in both groups. There were no differences between groups when risk factors for CVD were compared. On the other
hand, the genomic study showed that GG genotype was higher in group without angina (58%) when compared
with angina group (40%), while the IL6 polymorphism (GC + CC) was observed in greater number in the group with
angina (60%) when compared to the group without angina (42%). In the group with angina, the OR of 2.02 for GC+CC
genotype (95% CI: 1.041 - 3.945; p= 0.036) compared with GG genotype was achieved. According the OR results, the
presence of C allele increases 2 fold the risk of angina onset in these patients. Conclusion: Our results suggest that in
our patients population the polymorphism -174G>C of IL6 gene seems to be involved in the appearance of angina.
Financial Support: CAPES, CNPq, FACITEC, FAPES-PPSUS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
196
Relação dos polimorfismos funcionais do gene do
receptor dos produtos finais de glicação avançada
(RAGE) com a patogênese da insuficiência cardíaca
Cohen, CR1; La Porta, VL1; Diel, VBN2; Martinelli, NC1; Biolo, A3; Clausell, N3; Rohde, LE3; Santos, KG1,2
Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
Centro de Pesquisas em Ciências Médicas, Universidade Luterana do Brasil (ULBRA)
3
Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Insuficiência cardíaca, Receptor dos produtos finais de glicação avançada (RAGE), Doença arterial coronariana (DAC),
Polimorfismos genéticos, Susceptibilidade.
A insuficiência cardíaca (IC) é uma síndrome clínica multifatorial, decorrente de várias doenças que comprometem
o desempenho cardíaco. O receptor dos produtos finais de glicação avançada (RAGE) é um membro da superfamília
das imunoglobulinas e o aumento na sua expressão está relacionado ao desenvolvimento e progressão de várias
doenças, como o diabetes mellitus, a doença arterial coronariana (DAC) e a IC. Os polimorfismos -429T>C,
-374T>A e uma inserção/deleção de 63pb (I/D), localizados na região promotora do gene do RAGE, parecem afetar
a expressão desse gene. Sugere-se que os alelos -429C e -374A estão associados com a redução de risco para a
DAC. Assim, o objetivo do presente estudo é avaliar o papel desses polimorfismos genéticos na susceptibilidade
e progressão da IC em pacientes ambulatoriais do Estado do Rio Grande do Sul. Para isso, foram estudados 307
pacientes consecutivos com IC (casos) do Ambulatório de Insuficiência Cardíaca e Transplante do Hospital de
Clínicas de Porto Alegre (HCPA), com IC por disfunção sistólica e fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE)
≤45%. Destes pacientes, 215 eram caucasianos e 92 afro-descendentes. Também foram analisados 286 indivíduos
caucasianos e 83 afro-descendentes, provenientes do Centro de Hemoterapia do HCPA (controles), sem história
pessoal ou familiar de doença cardíaca ou morte súbita. A genotipagem foi realizada utilizando a técnica de PCRRFLP. As freqüências genotípicas dos polimorfismos -429T>C e -374T>A foram semelhantes entre casos e controles
em ambos os grupos étnicos (p>0,05 para todas as comparações). Porém, a freqüência do genótipo I/I (63pb I/D)
foi diferente entre casos e controles afro-descendentes (97% e 87%, respectivamente; p=0,02) e semelhante nos
indivíduos caucasianos (p>0,05). As freqüências dos alelos -374A, -429C e 63bp D foram similares entre casos
(caucasianos 0,35, 0,13 e 0,02; afro-descendentes 0,25, 0,11 e 0,03, respectivamente) e controles (caucasianos 0,33, 0,15
e 0,01; afro-descendentes 0,28, 0,11 e 0,07, respectivamente) (p>0,05). No entanto, entre os pacientes caucasianos,
observou-se que a FEVE foi menor nos portadores do alelo D (63bp I/D) do que nos homozigotos II (24±7% contra
32±8%, p=0,016). Do mesmo modo, os pacientes caucasianos portadores do alelo -374T apresentaram maiores
diâmetros ventriculares sistólico e diastólico quando comparados aos AA (5,6±1,0mm contra 5,0±1,0mm, p=0,026;
6,7±1,0mm contra 6,1±1,0mm, p=0,018, respectivamente). A análise da sobrevida dos pacientes não demonstrou
associação entre a mortalidade total e os polimorfismos estudados. Em suma, os polimorfismos -429T>C e -374T>A
do gene do RAGE não parecem estar associados com a susceptibilidade à IC. Contudo, nossos dados apontam uma
maior freqüência do genótipo I/I 63bp nos pacientes afro-descendentes. Além disso, os polimorfismos 63bp I/D
e -374T>A contribuem para a variabilidade da manifestação clínica dos pacientes com IC. Outras análises com
um tamanho amostral maior são necessárias para elucidar o papel desses polimorfismos na patofisiologia da IC.
Apoio financeiro: CNPq e FIPE-HCPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
197
Análise da frequência alélica de 30 polimorfismos
de inserção Alu em amostras de coronariopatas do
estado da Bahia
Pereira, JF1; Araújo, LJ1; Meira, DO3; Souza, JS3; Souza, Carvalho, KN3 Barbosa, AAL3; Sousa, SMB4; Rios, DLS1, 2
Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia – UEFS/ FIOCRUZ,
Departamento de Ciências da Vida – Universidade do Estado da Bahia - UNEB,
3
Departamento de Ciências Biológicas - UESB,
4
Departamento de Ciências Biológicas – UESC.
[email protected].
1
2
Palavras-chave: Polimorfismos, Inserção Alu, Ancestralidade, Afro-brasileiros e PCR-multiplex.
Marcadores Informativos de Ancestralidade (AIMs - do inglês Ancestry Informative Markers) são aqueles que
apresentam uma diferença nas freqüências alélicas entre duas populações com valor superior a 0,45. Os polimorfismos
de inserção Alu escolhidos para este trabalho são altamente informativos e podem ser utilizados para caracterizar a
composição genética de diferentes povos, uma vez que possui freqüências diferenciadas para cada etnia. A análise
das inserções Alu foi realizada com intuito de verificar as freqüências alélicas dos 30 polimorfismos estudados e
quantificar a diversidade genética intrapopulacional em amostras casos-controle de coronariopatas do estado da
Bahia. Foram analisados 30 marcadores em 539 pacientes coronariopatas (364 euro-brasileiros e 175 afro-brasileiros)
e em 302 controles (164 euro-brasileiros e 138 afro-brasileiros). O DNA genômico foi amplificado utilizando o método
de PCR-multiplex e os produtos amplificados foram corados com nitrato de prata. Estes dados foram utilizados
para cálculos de freqüências alélicas, Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), diferenciações gênica e genotípica e
diversidade intrapopulacional. As análises estatísticas foram realizadas com o uso dos programas GENEPOP e FSTAT.
Os loci Ya5AC1982, Ya5ACA1400, Ya5ACA1441, Ya5ACA1555, Ya5ACA1184, Ya5_541F e Ya5NBC354 foram os que
apresentaram maior freqüência alélica para ausência da inserção Alu em todas as amostras analisadas. Dos 30 loci
analisados, apenas sete (Ya5ACA733, Yb8NBC157, Ya5NBC150, Ya5ACA1242, Yb8NBC67, Ya5ACA862 e Ya5NBC354)
apresentam uma frequência maior que 50% para o componente afro-americano. Porém, do total de loci analisados,
16 diferenciam exclusivamente os afro-americanos dos europeus e asiáticos. Os 30 polimorfismos de seqüência Alu
foram escolhidos por apresentarem altos diferenciais de freqüências entre as populações asiáticas, afro-americanas
e européias. Seria esperada uma maior distribuição de alelos freqüentes em africanos, considerando-se a história
de formação de populações da Bahia. Talvez estes resultados estejam relacionados com os marcadores utilizados,
uma vez que a maior parte deles (24) é indicativa de ancestralidade européia e asiática. Foram observados desvios
significativos para o equilíbrio de Hardy-Weinberg em todas as amostras analisadas sendo que a maioria pode ser
explicada por déficit de heterozigotos. Efeitos de amostragem, mistura étnica recente, amplificação preferencial
dos alelos menores por conta da quantidade de DNA utilizado na PCR poderiam também explicar os desvios
observados nestas amostras. A diferenciação gênica e genotípica não apresentou valores significativos. A diversidade
gênica esperada (HS) variou de 0,415 nos casos afro-brasileiros no locus Ya5_541F a 0,503 em casos afro-brasileiros
no locus Ya5ACA866. Uma maior diversidade genética seria esperada entre os afro-brasileiros, pois populações
africanas apresentam altos valores de diversidade. Os afro-americanos apresentam altos valores de heterozigose,
provavelmente resultante do processo de miscigenação envolvendo estas populações. As inserções Alu analisadas
apresentaram um grande diferencial de freqüência entre os grupos étnicos formadores da população brasileira.
Apoio Financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
198
Avaliação dos níveis plasmáticos e do polimorfismo
4G5G na região promotora do gene do PAI-1 e níveis
de proteina C reativa (PCR) em pacientes com Acidente
Vascular Cerebral Isquêmico
Sabino, AP1,2; Ribeiro, DD3; Gadelha, T4; Carvalho, MG2; Fernandes, AP2
Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de São João Del Rei.
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Mina Gerais.
3
Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Mina Gerais.
4
Departamento de Medicina Interna, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: PAI-1, Polimorfismo, PCR, Doença arterial, AVC
A inserção/deleção 5G4G localizado a 675 pb antes do sítio de inicio da transcrição, na região promotora do gene
do inibidor do ativador de plasminogênio tipo 1 (PAI-1), tem sido associado à doença arterial, no entanto há
controvérsias em relação à ocorrência de acidente vascular cerebral. Neste estudo foi investigado a freqüência deste
polimorfismo e sua associação com os níveis plasmáticos de PAI-1, bem como os níveis de proteina C reativa (PCR),
como marcador de processo inflamatório, em pacientes jovens que tiveram acidente vascular cerebral isquêmico
(AVCisq). Os níveis plasmáticos de PAI-1 e PCR e a frequência do polimorfismo 4G5G foram analizados em um grupo
de 127 pacientes com AVCisq e em 201 indivíduos sem história de trombose venosa ou arterial que constituiram o
grupo controle. Níveis plasmáticos significativamente elevados foram observados para PCR(p<0.001) e PAI-1 (p<
0.001) entre os pacientes, quando comparados com o grupo controle. Entretanto, após ajustes para as variáveis
sexo, idade, tabagismo e hipertensão, em um modelo de regressão logística múltipla, somente os níveis plasmáticos
de PAI-1 foram independemente associados ao risco de ACVisq (OR 3.40; 95% CI 1.49 – 7.74; p = 0.001). A frequência
do genótipo 4G4G foi maior entre os indivíduos do grupo controle, quando comparado aos pacientes (OR 0.41; 95%
CI 0.24 – 0.68; p < 0.001), no entanto nenhuma correlação foi observada entre a presença do polimorfismo e os níveis
plasmáticos de PAI-1. Os dados obtidos neste estudo sugerem que, embora os níveis plasmáticos de PAI-1 estejam
associados ao desenvolvimento de AVCisq em pacientes jovens, eles não são influenciados pelo polimorfismo 4G5G.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
199
Haplótipos do Gene VKORC1 como Fatores de Risco
para o Desenvolvimento de Trombose Venosa
Gorziza, RP¹; Botton, MR¹; Bandinelli, E¹
¹Laboratório de Hemostasia, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
Palavras-chave: VKORC1, Trombose, 1173C>T, -1639G>A, haplótipo
A trombose venosa (TV) é uma patologia multifatorial, decorrente de fatores genéticos e adquiridos. Alterações da
hemostasia, que provocam hipercoagulação, são fatores de risco para TV. A subunidade 1 do complexo da vitamina
K epóxido redutase (VKORC1) tem um importante papel na regulação da hemostasia. O VKORC1 é responsável pela
conversão da vitamina K epóxido à vitamina K reduzida, sua forma ativa. A vitamina K reduzida atua como cofator
para a gama-glutamil-carboxilase, enzima que realiza a carboxilação de fatores de coagulação ( fatores II, VII, IX e
X) e dos inibidores fisiológicos da coagulação (proteínas C e S). O polimorfismo -1639G>A, localizado no promotor
do gene VKORC1, diminui a transcrição do gene, reduzindo a produção de vitamina K ativa e, conseqüentemente,
a carboxilação das proteínas da coagulação. O polimorfismo 1173C>T localiza-se no íntron 1 do gene VKORC1 e
encontra-se em desequilíbrio de ligação com o polimorfismo -1639G>A. Alguns estudos têm relatado que essas
variantes podem estar relacionadas ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares, como a TV, a doença arterial
coronariana e o acidente vascular cerebral. O objetivo deste trabalho é verificar se os polimorfismos -1639G>A e
1173C>T estão associados à TV. Foram estudados 213 pacientes eurodescendentes com TV, pareados por sexo
e idade com um grupo controle. Os polimorfismos foram identificados pela técnica de PCR/RFLP, utilizando-se
as enzimas de restrição MspI ou StyI. Para verificar a associação entre casos e controles foi feito o teste de c2. O
software MLocus foi utilizado para estimar os haplótipos. A distribuição genotípica está em equilíbrio de HardyWeinberg, em ambos grupos, para os dois polimorfismos. As freqüências do alelo -1639A em pacientes e controles
foram 39,4% e 40,1%, respectivamente (p= 0.91). Para o alelo 1173T, as freqüências encontradas foram 40,4% e 41,1%,
para pacientes e controles, respectivamente (p= 0.91). Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa
entre essas freqüências, para ambos polimorfismos. O valor de D’ encontrado foi de 0.889 (p< 0.001), indicando
que os polimorfismos -1639A>G e 1173C>T estão em forte desequilíbrio de ligação. Foram encontrados quatro
haplótipos, sendo que dois deles (GC e AT) corresponderam a 96% dos cromossomos nos pacientes e a 94% nos
controles. Quanto aos diplótipos, as combinações mais freqüentes encontradas foram os conjuntos GC/GC, GC/
AT e AT/AT. Não foi encontrada diferença estatisticamente significativa entre casos e controles, tanto para os
haplótipos (p= 0.75) quanto para os diplótipos (p= 0.37). Assim, esses dados indicam que não há associação entre os
polimorfismos -1639A>G e 1173C>T e a TV na nossa população. Os resultados discordam de um estudo previamente
publicado, o qual encontrou associação entre o polimorfismo 1173C>T e a TV. Entretanto, nossos resultados
corroboram com outros trabalhos, os quais relatam a ausência de associação destes polimorfismos com a doença.
Apoio Financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
200
Pesquisa de variantes do gene CDKN1C em pacientes
portadoras de síndromes hipertensivas gestacionais
Soares, MR1; Araujo, FM1; Kaneto, CM2; Galerani, MAV2; Ferreira, CA3; Marques, AA3; Quiapim, AC4; Goldman, MH4; Duarte, G1; da Silva Junior, WA2; Ramos, ES1,2
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
3
Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
4
Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: síndromes hipertensivas gestacionais, gene CDKN1C, polimorfismo, epigenética, seqüenciamento automático
As síndromes hipertensivas gestacionais (SHG) [hipertensão arterial crônica (HAC), hipertensão arterial gestacional
(HAG), pré-eclâmpsia/eclâmpsia (PE/E) e PE/E sobreposta à HAC] estão entre as maiores causas mundiais de
morte materna e fetal. A etiologia das SHG permanece desconhecida, mas há crescentes evidências da influência
da predisposição genética e epigenética no desenvolvimento dessas síndromes. Vários estudos que dizem respeito
a genes candidatos têm sido realizados; todos na tentativa de associar dados epidemiológicos ao modelo de
transmissão. O gene CDKN1C (cyclin-dependent kinase inhibitor 1C), também denominado P57Kip2, sofre marcação
(imprinting) genômica e está mapeado no cromossomo 11p15.5 em humanos. Nesta região encontram-se também os
genes IGF2 (insulin-like growth factor-2), H19, KvLQT1 e LIT1. O CDKN1C possui um importante papel na inibição da
proliferação do trofoblasto. Estudos em camundongos mostraram que alterações da PE talvez sejam induzidas por
proliferação do trofoblasto resultante da perda de expressão deste gene. O presente trabalho verificou a associação de
SHG com variantes do gene CDKN1C. Foram selecionadas 357 mulheres grávidas, sendo 168 pertencentes ao grupo
controle, 66 portadoras de HAG, 43 portadoras de HAC, 75 com PE e 4 com eclâmpsia. Também foram analisados
302 indivíduos (204 do sexo feminino e 98 do sexo masculino) saudáveis com idades entre 18 e 35 anos da população
geral como um segundo grupo controle. Após extração do DNA de sangue periférico, foram utilizadas técnicas de
Biologia Molecular [Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), Polimorfismo Conformacional de Fita Simples (SSCP)
e seqüenciamento automático] para o estudo do genótipo das pacientes e controles. Foram encontradas quatro
novas variantes no exon 2 do gene CDKN1C humano (uma no grupo controle de mulheres grávidas, uma em uma
mulher do grupo controle da população geral e duas em portadoras de HAC), e todas as mutações causaram
mudanças na seqüência de aminoácidos. Embora o presente estudo não tenha envidenciado associação de variantes
do gene CDKN1C diretamente com as SHG, mostra que esse gene pode estar envolvido no desenvolvimento de HAC
(4,65% dos casos) e, portanto, deveria ser avaliado em casos de hipertensão arterial não relacionada à gravidez.
Apoio financeiro: FAPESP (2007/01911-6), CNPq, CAPES e FAEPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
201
O polimorfismo Fok1 do gene vdr como fator de risco
para endometriose
Lerner, TG; Mafra, FA; Brandes, A; Christofolini, DM; Bianco, B; Barbosa, CP
Disciplina de Ginecologia Patológica e Reprodução Humana – Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – Faculdade de Medicina do
ABC, Santo André/SP
[email protected]
Palavras-chave: Endometriose, Vitamina D, gene VDR, polimorfismo.
Introdução: Estudos recentes têm relacionado a vitamina D com a regulação do sistema imunológico.
Polimorfismos no gene VDR, do receptor de vitamina D, corroboram com as teorias imunológicas que explicam
o desenvolvimento da endometriose, uma vez que alterações no sistema imune poderiam alterar a capacidade
de eliminar o endométrio da cavidade pélvica. Poucos estudos foram realizados associando a endometriose e o
sistema da vitamina D e, até o momento, não há estudos na literatura relacionando os polimorfismos do gene
VDR com a doença. Objetivo: Avaliar a freqüência do polimorfismo Fok1 (T2C) do gene VDR em mulheres inférteis
com endometriose, mulheres inférteis sem endometriose e no grupo controle. Métodos: Foram estudadas 220
mulheres inférteis com endometriose, 63 mulheres com infertilidade idiopática e um grupo controle composto
por 147 mulheres férteis. O polimorfismo Fok1 do gene VDR foi identificado por reação em cadeia de polimerase
(PCR) seguida de digestão com endonuclease de restrição, eletroforese em gel de agarose e visualização em luz
UV. O teste qui-quadrado foi utilizado para comparar as freqüências alélicas e genotípicas entre os grupos e
para calcular o equilíbrio de Hardy-Weinberg. O nível de significância considerado foi 0,05 (p>0,05). Resultados:
Os genótipos TT, TC e CC do polimorfismo FokI apresentaram, respectivamente, freqüência de 42,2%, 46,4% e
11,4% nas mulheres inférteis com endometriose (p=0,142), 39,7%, 55,5% e 4,8% (p=0,574) nas mulheres com
infertilidade idiopática, enquanto que no grupo controle, 46,9% apresentaram genótipo normal (TT), 47,6%
heterozigoto (TC) e 5,5% mutado (CC). Em relação aos alelos, o alelo T estava presente em 65,5% das mulheres
inférteis com endometriose, 67,5% das mulheres com infertilidade idiopática e em 70,7% das mulheres do grupo
controle, enquanto que o alelo 5G estava presente em 34,5% das mulheres inférteis com endometriose (p= 0,155,
OR=1,28, 95% IC=0,93-1,76), 32,5% das mulheres com infertilidade idiopática (p=0,578, OR=1,17, 95% IC=0,74-1,83)
e 29,3% do grupo controle. Tanto o grupo de endometriose, como o grupo de infertilidade idiopática e o grupo
controle estavam equilíbrio de Hardy-Weinberg. Conclusão: Os resultados sugerem que o polimorfismo Fok1 do
gene VDR não está relacionado com predisposição à endometriose ou a infertilidade na população estudada.
Apoio: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP No. 2010/00459-5 e No. 2010/01104-6)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
202
Análise do polimorfismo MspI do gene CYP1A1m1
(citocromo P450) e sua possível associação com a
infertilidade em portadoras de endometriose
Souza, SR1,2; Silva RCPC1,2,3; Costa, IR1,2; Barbosa, AM1,2; Frare, AB1,2 ; Bordin, BM1,5; Júnior, CLR1; Moura,
KKVO1,4,5
Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Núcleo de Pesquisas Replicon
Mestrado em Genética - UCG
3
Laboratório de Reprodução Humana – Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Goiás
4
Departamento de Biomedicina – UCG
5
Profª. Dra.-UCG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: endometriose, citocromo P450 (CYP450), polimorfismo MspI e infertilidade.
A endometriose é uma enfermidade que afeta a população feminina na idade reprodutiva. Esta patologia
é caracterizada pela presença de tecidos de estruturas semelhante a do endométrio fora do útero e á ação de
hormônios. Presume-se que no genoma humano tenham em torno de 60 a 100 genes codificadores de enzimas
P450, e em grande número deles estejam envolvidos na codificação de enzimas que metabolizam compostos
exógenos. Sucessivamente tem sido associada de alguma forma a infertilidade com a endometriose, tornando-se
comum em mulheres com esta doença. Objetivo: Analisar a freqüência alélica o polimorfismo do gene CYP1A1m1
e relacionar com endometriose e suas manifestações clínicas. Métodos: Foram analisadas 52 amostras de
portadoras de endometriose com idade entre 25 e 35 anos, e 30 amostras sem endometriose com idade entre 25
e 57 anos, utilizando a análise molecular através da técnica da PCR (polymerase chain reaction). Resultados: As
freqüências genotípicas do gene CYP1A1m1 nas pacientes com endometriose (n = 52) para o genótipo homozigoto
selvagem W1/W1 foi de 67,30% (35/52), 28,85 % (15/52) do genótipo W1/m1 e 3,85% (2/52) do genótipo m1/m1. As
freqüências genotípicas do gene CYP1A1m1 nas pacientes do grupo controle para o genótipo W1/W1 foi de 100%
(30/30), para o grupo controle com genótipo heterozigoto W1/m1 e para o genótipo com homozigoto m1/m1 foi de
0,0% (0/30).67,30% (35/52). Conclusão: Parece haver uma relação entre o polimorfismo estudado e a endometriose.
Apoio Financeiro: FAPEGO E PUC-GOIÁS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
203
Caldesmon aumentado em lesões endometrióticas
Meola, J1; Hidalgo, GS1; Rosa e Silva, JC1; Paz, CCP2; Ferriani, RA1
Laboratório de Biologia da Reprodução - Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: CALD1, endometriose, expressão gênica, PCR em tempo real, tecido ectópico.
Background: A endometriose é uma doença ginecológica benigna, estrógeno dependente, caracterizada pela
presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina (ectópico). Acomete 10% da população feminina e sua
sintomatologia é variada. Possui etiologia complexa e multifatorial. Estudo da expressão de genes envolvidos em
vias que possam levar ao desenvolvimento e manutenção do tecido ectópico pode esclarecer eventos envolvidos
com a doença. Várias funções, direta ou indiretamente, vêem sendo associadas ao gene CALD1 (caldesmon), como:
inibição da contratilidade celular e adesão dependente de sinalização; estabilização das fibras de stress afetando a
morfologia, crescimento e motilidade celular; há controvérsias quanto sua regulação na formação de podossomos,
estruturas altamente dinâmicas que são encontradas em células móveis e invasivas, e na invasão celular; e regulação
da migração celular. Objetivo: Avaliar a expressão do gene CALD1 indicado como desregulado previamente por
nosso grupo em lesões endometrióticas (Meola et al., 2010). Casuística: As pacientes foram divididas em dois grupos.
Grupo I: composto por 40 pacientes com endometriose, das quais foram feitas 40 biopsias pareadas de endométrio
eutópico (20 fase proliferativa e 20 fase secretora) e 40 de tecido ectópico (20 lesões peritoneais e 20 endometriomas
ovariano). Grupo II: composto por 15 mulheres saudáveis, das quais se coletou duas biopsias de endométrio pareadas
de acordo com a fase do ciclo menstrual, sendo 15 biópsias na fase proliferativa e 15 na fase secretora do ciclo
menstrual. Métodos: A expressão foi analisada por PCR em tempo real. O nível de expressão do gene foi calculado para
cada amostra de acordo com o método de 2-ΔΔCT. Análise Estatística: A variável expressão gênica foi transformada
pelo log10. Utilizamos o teste de t pareado e t não pareado para comparar a expressão do CALD1 entre os tecidos.
Foram feitas análises de t não pareado para comparar os níveis de expressão gênica obtidos nos tecidos ectópicos
com o estadiamento das lesões, estadios iniciais (I + II) e avançados (III + IV). Foi feita correlação de coeficiente
de Pearson para comparar as expressões entre os genes. Foram considerados significantes P < 0,05. Resultados:
Diferenças significativas de expressão para o gene foi encontrada quando comparamos: 1) o grupo controle com o
endométrio eutópico de pacientes com endometriose na fase secretora do ciclo menstrual (P=0.0232); 2) endométrio
eutópico com o ectópico peritoneal de mulheres com endometriose nas fases proliferativa (P=0.0109) e secretora
do ciclo (P=0.0034); 3) as lesões ovarianas com o tecido eutópico nas fases proliferativa (P=0.0046) e secretora
(P=0.0024). Conclusão: a desregulação do CALD1 nas lesões endometrióticas pode ser responsável pela perda da
homeostase celular nas células ectópicas, contribuindo para seu desenvolvimento, estabelecimento e manutenção.
Apoio: FAPESP e FAEPA.
Referência
Meola J et al. (2010) Differentially expressed genes in eutopic and ectopic endometrium of women with
endometriosis. Fertil Steril, 93: 1750-73.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
204
Estudo da via de sinalização de p53 em mulheres com
infertilidade e endometriose: papel dos polimorfismos
nos genes TP53, MDM2 e LIF
Paskulin, DD1,2; Koehler-Santos, P1,3; Cunha-Filho, JS4; Achatz, MI5; Hainaut, P6; Ashton-Prolla, P1,2,3,7
Laboratório de Medicina Genômica, Centro de Pesquisa Experimental, Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Programa de Pós Graduação em Ciências Médicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
4
Serviço de Ginecologia e Obstetrícia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre
5
Departamento de Oncogenética do Hospital AC Camargo
6
Molecular Carcinogenesis Group, International Agency for Research on Cancer; 7Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de
Porto Alegre
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Infertilidade, Endometriose, TP53, MDM2, LIF
Conhecido como “o guardião do genoma”, o gene supressor tumoral TP53 atua regulando genes que controlam
a progressão do ciclo celular, angiogênese e apoptose. TP53 codifica uma proteína nuclear fosforilada de 53kD,
com propriedades de ligação ao DNA, que responde a uma grande variedade de estresses como danos ao DNA
por radiação ionizante e luz UV, situações de hipóxia, privação nutricional e perda telomérica, e pela ativação de
oncogenes como Ras e Fas. Estudos demonstraram que alelos dos genes TP53 e de seu regulador negativo MDM2
estão sofrendo processo de seleção positiva, sugerindo que a atuação de gene supressor tumoral não seja a função
original do gene TP53. Uma ação anteriormente desconhecida de p53 foi recentemente descoberta: a proteína
possui importante papel no processo gestacional através da regulação do fator inibidor de leucemia (LIF). LIF é
a citocina mais importante no processo de implantação e o aumento de sua expressão coincide com o momento
da implantação do blastocisto. Sendo a falha da implantação a causa mais frequente de perda gestacional após
transferência embrionária e fertilização in vitro (FIV), nossa hipótese é que mulheres inférteis, com ou sem
endometriose, apresentem frequências alélicas e genotípicas de polimorfismos nos genes TP53, MDM2 e LIF
distintas de mulheres férteis. Nosso objetivo é verificar a frequência de polimorfismos nos genes TP53 (rs1642785,
rs17878362 e rs1042522), MDM2 (rs2279744) e LIF (rs929271) em diferentes grupos de mulheres com e sem
infertilidade (Grupo 1- mulheres normais férteis; Grupo 2 - mulheres inférteis submetidas à FIV; e Grupo 3: mulheres
inférteis com endometriose). Para determinação dos genótipos e dos haplótipos definidos pelos 3 polimorfismos do
gene TP53, será utilizada a técnica de Amplification Refractory Mutation Syste e a técnica TaqMan SNP Genotyping
Assay será utilizada para identificação dos SNPs rs2279744 e rs929271. Os resultados preliminares da análise dos
polimorfismos do gene TP53 demonstram que a frequência dos alelos PIN3-A1 e PEX4-72Pro é significativamente
maior nas mulheres inférteis com endometriose (n=81) em comparação com mulheres normais férteis (n=79)
(χ2=33.809; P<0.001 e χ2=7.206; P<0.027, respectivamente), o que explicaria a recorrente falha da implantação
devido a menor atividade da citocina LIF. O tamanho amostral será incrementado até n=130 em cada grupo e as
análises serão complementadas com genotipagem de MDM2 e LIF. A caracterização de polimorfismos da via de
sinalização de TP53, que tem um importante papel no processo de implantação do embrião, poderá ser de grande
auxílio no entendimento da etiopatogenia da endometriose e da infertilidade associada a anormalidades neste
período gestacional, com consequente impacto na decisão sobre estratégias de tratamento para estas condições.
Fomento: CNPq, FIPE-HCPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
205
O polimorfismo 4G/5G do gene PAI-1 em mulheres
com endometriose
Brandes, A; Teles, JS; Lerner, TG; Christofolini, DM; Bianco, B; Barbosa, CP
Disciplina de Ginecologia Patológica e Reprodução Humana – Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – Faculdade de Medicina do ABC
[email protected]
Palavras-chave: Endometriose, infertilidade, gene PAI-1, polimorfismo.
Introdução: Há evidências de que a alteração da atividade fibrinolítica no endométrio eutópico das mulheres
com endometriose resultaria em fragmentos do endométrio com um elevado potencial de adesão ao peritônio,
degradação dos componentes da matriz extracelular e migração celular do tecido circundante. Assim, o objetivo
deste estudo foi avaliar a freqüência do polimorfismo 4G/5G do gene PAI-1 em um grupo de mulheres com ou
sem endometriose e controles. Pacientes e Métodos: Foram triadas 219 mulheres inférteis com endometriose,
63 mulheres com infertilidade idiopática e 148 mulheres férteis sem história de endometriose que compuseram
o grupo controle. O polimorfismo 4G/5G do gene PA-1 foi estudado por PCR-RFLP (Restriction fragment lengh
polymorphism). O teste qui-quadrado foi utilizado para comparar as freqüências alélicas e genotípicas entre os
grupos. O nível de significância considerado foi 0,05 (p>0,05). Resultados: Os genótipos 4G/4G, 4G/5G e 5G/5G
do polimorfismo 4G/5G do gene PAI-1 apresentaram freqüência de 42,5%, 36,1% e 21,4% nas mulheres inférteis
com endometriose (p=0,001), 79,4%, 12,7% e 7,9% nas mulheres com infertilidade idiopática (p=0,029) e 60,8%,
20,3% e 18,9% no grupo controle. Em relação aos alelos, o alelo 4G estava presente em 60,5% das portadoras de
endometriose, 85,7% das mulheres com infertilidade idiopática e em 70,9% das mulheres do grupo controle,
enquanto que o alelo 5G estava presente em 39,5% das portadoras de endometriose (p= 0,004, OR=1,59, 95%
IC=1,16–2,19), 14,3% das mulheres com infertilidade idiopática (p=0,002, OR=0,41, 95% IC=0,23–0,71) e 29,1% do
grupo controle. Conclusão: Os dados mostraram que o polimorfismo 4G/5G na região promotora do gene PAI-1 está
associado com um risco aumentado de desenvolvimento de endometriose e infertilidade em mulheres Brasileiras.
Agradecimentos: CNPq/PIBIC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
206
Análise do polimorfismo PROGINS em mulheres com
endometriose
Barbosa, AM1; Costa IR1; Frare, AB1; Souza, SR1; Bordin, BM1; Silva, CTX1; Silva, RCPC1; Júnior, CLR1;
Moura, KKVO2
Núcleo de Pesquisas Replicon – PUC Goiás – Goiânia – Go – Brasil
Professora Doutora da PUC Goiás – Goiânia – Go – Brasil
[email protected], [email protected]
1
2
Palavras-chave: endometriose, receptor de progesterona, polimorfismo, PROGINS, PCR.
A endometriose é definida como aparecimento de focos de tecido endometrial com características glandulares e/ou
estromais idênticos aos da cavidade uterina em outras localizações, que não o endométrio, apresentando um forte
componente genético. Incide principalmente em mulheres em idade reprodutiva, podendo estar relacionada com
infertilidade em 30% a 40% dos casos. É uma patologia de diagnóstico histológico, devendo o mesmo, confirmar as
suspeitas clínicas e os achados macroscópicos encontrados em cirurgias. Pode afetar vários órgãos, sendo por isso
mesmo denominada atualmente de multi-sistêmica. A expressão exagerada de receptores de estrogênio e defeitos
no receptor de progesterona são consequências da anormalidade do efeito progestacional sobre o endométrio
tópico e ectópico. Alterações da sua função podem, portanto, facilitar o aparecimento da moléstia porque, no
sentido amplo, deixa de antagonizar os efeitos proliferativos dos estrogênios. Recentemente, vários polimorfismos
do receptor de progesterona têm sido descritos. Dentre eles destaca-se o polimorfismo PROGINS que consiste
em uma inserção Alu de 306 pb no íntron G entre o exon 7 e 8 do gene do receptor de progesterona humano.
Este estudo tem como objetivo verificar a possível correlação entre a endometriose e o Polimorfismo do Gene
do Receptor de Progesterona (PROGINS). O grupo endometriose foi composto por 54 pacientes de um centro de
referência em videolaparoscopia e infertilidade de Goiânia (FÉRTILE). O grupo controle incluiu 45 mulheres sem
diagnóstico de endometriose por anamnese. Os genótipos para o polimorfismo PROGINS (A1/A1, A1/A2 e A2/
A2) foram determinados por PCR. A frequência dos genótipos polimórficos (A1/A2 e A2/A2) é duas vezes maior
nas pacientes com endometriose (33,3%) do que no grupo controle (15,5%). Houve significância estatística que
indicasse a associação entre o polimorfismo PROGINS e a patologia endometriose (P = 0,0351).
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
207
Estudo dos polimorfismos TaqI E ApaI do gene
VDR como fatores de risco para a endometriose e
infertilidade
Mafra, FA; Teles, JS; Christofolini, DM; Bianco, B; Barbosa, CP
Disciplina de Ginecologia Patológica e Reprodução Humana – Departamento de Ginecologia e Obstetrícia – Faculdade de Medicina do
ABC (FMABC)
[email protected]
Palavras-chave: Endometriose, Auto-imunidade, Vitamina D, polimorfismos, infertilidade feminina.
INTRODUÇÃO: A endometriose tem sido considerada por alguns autores como uma doença auto-imune devido
a freqüente associação com a presença de auto-anticorpos e doenças auto-imunes associadas. Polimorfismos no
gene do receptor da vitamina D (VDR) têm sido associados com a susceptibilidade a diferentes doenças autoimunes e infecções. OBJETIVOS: Avaliar a freqüência dos polimorfismos TaqI e ApaI do gene VDR em mulheres
inférteis com endometriose, mulheres inférteis sem endometriose e no grupo controle. MÉTODOS: Foram
estudadas 257 pacientes inférteis com endometriose, 49 pacientes com infertilidade idiopática e 176 pacientes
férteis sem endometriose e/ou doença auto-imune provenientes como controles. Os polimorfismos TaqI (T1056C)
e ApaI (G1025-49T ) do gene VDR foram identificados por análise de polimorfismos de fragmentos de restrição.
O teste qui-quadrado foi utilizado para comparar as freqüências alélicas e genotípicas entre os grupos. O nível de
significância considerado foi p>0,05. RESULTADOS: Os genótipos TT, TC e CC do polimorfismo TaqI apresentaram,
respectivamente, freqüência de 40,1%, 49,0% e 10,9% nas mulheres inférteis com endometriose (p=0,691), 40,8%,
46,9% e 12,2% (p=0,698) nas mulheres com infertilidade idiopática, enquanto que no grupo controle, 38,1%
apresentaram genótipo normal (TT), 52,8% heterozigoto (TC) e 9,1% mutado (CC). Os alelos T e C estavam presentes
em 64,6% e 35,4% das mulheres inférteis com endometriose (p=1,0, OR=1,0, 95% IC=0,75-1,32), 64,3% e 35,7% das
mulheres com infertilidade idiopática (p= 0,920, OR=1,01, 95% IC=0,63-1,61) e em 64,5% e 35,5% das mulheres do
grupo controle. Considerando o polimorfismo ApaI, os genótipos GG, GT e TT apresentaram, respectivamente,
freqüência de 37,0%, 52,9% e 10,1% nas mulheres inférteis com endometriose (p=0,729), 28,6%, 52,3% e 12,5%
(p=0,680) nas mulheres com infertilidade idiopática, enquanto que no grupo controle, 35,2% apresentaram genótipo
normal (GG), 52,3% heterozigoto (GT) e 12,5% mutado (TT). Os alelos G e T estavam presentes em 63,4% e 36,6%
das mulheres inférteis com endometriose (p=0,584, OR=0,92, 95% IC=0,69-1,21), 57,1% e 42,9% das mulheres com
infertilidade idiopática (p= 0,522, OR=1,19, 95% IC=0,76-1,88) e em 61,4% e 38,6% das mulheres do grupo controle.
CONCLUSÃO: Esse é o primeiro estudo que faz associação entre os polimorfismos do gene VDR e a endometriose.
Os resultados não mostraram associação entre os polimorfismos do gene VDR com a endometriose e a infertilidade.
Apoio Financeiro: FAPESP (2010/00459-5)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
208
Estudo dos polimorfismos C677T e A1298C do
gene MTHFR e A66G do gene MTRR relacionados
ao metabolismo do folato na infertilidade masculina
idiopática
Teles, JS1; de Paiva, CP1; Gava, MM1,2; Christofolini, DM1; Bianco, B1; Barbosa, CP1
Disciplina de Ginecologia Patológica e Reprodução Humana – Departamento de Ginecologia
Disciplina de Urologia – Departamento de Cirurgia Faculdade de Medicina do ABC – FMABC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: infertilidade masculina, polimorfismo, MTHFR, MTRR.
INTRODUÇÃO: Aproximadamente 30% das causas de infertilidade estão relacionadas a fatores masculinos e
dessas, cerca de 15% são genéticas e incluem aberrações cromossômicas e mutações gênicas. O metabolismo
do folato é crucial para a reprodução humana e alterações do seu status podem afetar a espermatogênese.
As vias desse metabolismo podem ser modificadas por polimorfismos em genes relevantes como: MTHFR
(metilenotratraidrofolato redutase) e MTRR (metionina sintetase redutase). Dessa forma, o objetivo do presente
estudo foi analisar a freqüência dos polimorfismos dos genes MTHFR (C677T e A1298C) e MTRR (A66G) em homens
com infertilidade idiopática e controles. MÉTODOS: Foram estudados 83 homens com infertilidade idiopática
sendo 54 com oligozoospermia grave e 29 com azoospermia não-obstrutiva (NOA) provenientes do Ambulatório
de Andrologia do Serviço de Reprodução Humana da FMABC e um grupo controle composto por 208 homens
férteis do Ambulatório de Planejamento Familiar da FMABC. Os polimorfismos A1298C e C677T do gene MTHFR
e A66G do gene MTRR foram identificados por qPCR. Os resultados foram analisados estatisticamente através do
teste qui-quadrado e o nível de significância considerado foi 0,05. Os homens com anormalidades cromossômicas e
microdeleções do cromossomo Y foram excluídos do estudo. RESULTADOS: As freqüências dos genótipos MTHFR
677CC, 677CT e 677TT no grupo NOA foram 55.2%, 37.9% e 6,9% (p=0.0007); 40,7%, 44,4% e 14,8% (p=<0,0001) em
relação aos oligozoospérmicos graves e 83,2%, 11,5% e 5,3% no grupo controle. Os alelos C e T estavam presentes
em 74,1% e 25,9% dos homens com NOA (p=0,0032, OR=2,81, 95% IC=1,45-5,44), em 63,0% e 37,0% dos homens com
oligozoospermia grave (p=<0,0001, OR=4,73, 95% IC=2,88-7,77) e em 88,9% e 11,1% do grupo controle. Quanto ao
polimorfismo A1298C, as freqüências dos genótipos 1298AA, 1298AC e 1298CC no grupo NOA foram de 24,1%, 58,6%
e 17,2% (p=o,0026); 14,8%, 46,3% e 38,9% (p=<0,0001) entre os grupo oligozoospérmicos graves e 5,8%, 77,4% e 16,8%
no grupo controle. Os alelos A e C estavam presentes em 53,5% e 46,5% dos homens com NOA (p=0,2524, OR=0,70,
95% IC=0,40-1,21), em 38,0% e 62,0% dos homens com oligozoospermia grave (p=0.2674, OR=1,31, 95% IC=0,852,02) e em 44,5% e 55,5% do grupo controle. Já os genótipos MTRR 66AA, 66AG e 66GG apresentaram freqüências
de 17,2%, 48,3% e 34,5% (p=0,5827) no grupo NOA; 11,1%, 53,7% e 35,2% (p=0,0593) entre os oligozoospérmicos
graves e 25,0%, 39,9% e 35,1% no grupo controle. Os alelos A e G estavam presente em 41,4% e 58,6% do grupo NOA
(p=0,6101, OR=1,16, 95% IC=0,66-2,02), 38,0% e 62,0% dos homens com oligozoospermia grave (p=0,1923, OR=1,33,
95% IC=0,86-2,06) e 44,9% e 55,1% do grupo controle. CONCLUSÂO: Os resultados sugerem que os polimorfismos
C677T e A1298C do gene MTHFR são importantes fatores genéticos envolvidos na predisposição à infertilidade
masculina idiopática.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
209
Análise do polimorfismo de presença/ausência dos
genes GSTM1 e GSTT1 na patologia endometriose
Frare, AB1; Souza, SR1; Barbosa, AM1, Silva, CTX1; Costa, IR1; Silva, RCPC1; Bordin, BM1, Júnior, CLR1;
Moura, KKVO1,2
Núcleo de Pesquisas Replicon – PUC Goiás – Goiânia – Go – Brasil
Professora Doutora da PUC Goiás – Goiânia – Go – Brasil
[email protected], [email protected]
1
2
Palavras-chave: endométrio, infertilidade, glutationa S-transferase, GSTM1 e GSTT1
Endometriose é a presença funcional das glândulas estromais do endométrio em locais fora da cavidade
uterina. Sua etiologia é desconhecida, embora uma origem multifatorial, resultante da contribuição de fatores
imunológicos, genéticos e ambientais, é considerada a mais plausível. A teoria mais aceita para a patogênese da
endometriose é a de Sampson (1927), conhecida como mestruação retrógrada. Como os mecanismos celulares
e moleculares envolvidos na endometriose ainda estão sendo descobertas, a classificação desta patologia
evoluiu de transtorno local para complexo, doença crônica sistêmica. A prevalência da endometriose em
mulheres assintomáticas é de 2-50% dependendo do critério de diagnóstico utilizado e da população estudada,
já nas mulheres com dismenorréia é de 40-60%. Em mulheres com subfertilidade a prevalência é de 20-30%. A
endometriose é a causa mais comum de dor pélvica e ocorre em 13-33% das mulheres com infertilidade e sua
prevalência e gravidade são relatadas a aumentar nos países em desenvolvimento. Encontrar variantes genéticas
que contribuem para doenças complexas, como a endometriose, diabetes ou doenças cardíacas é muito mais
difícil porque a contribuição de genes individuais é pequeno, muitos genes contribuem para o risco de um
indivíduo de desenvolver a doença e o risco da doença é muitas vezes modificado pelo ambiente. Nos últimos
anos, tem sido procurado exaustivamente o papel dos polimorfismos da glutationa S- transferase (GST) como
fator de risco para a endometriose. GST são enzimas chave da fase II, que catalisam a conjugação de glutationa a
inúmeros compostos potencialmente genotóxicos. Apesar de não ser totalmente coerente, vários estudos sugerem
que há uma correlação entre a endometriose e o genótipo GSTM1 ou GSTT1. O objetivo deste estudo é analisar
o polimorfismo de presença/ausência dos genes GSTM1 e GSTT1 em um grupo de mulheres com endometriose e
outro sem apresentar a patologia. Através de amplificação por PCR, foram analisados os genes GSTM1 e GSTT1,
em amostras de DNA de 50 pacientes, com idade entre 27 e 37 anos, todas portadoras de endometriose, e 47
amostras de DNA de pacientes em que não foi diagnosticado endometriose. As amostras foram submetidas a
extração de DNA utilizando Wizard® Genomic DNA Purification Kit. O produto da amplificação foi visualizado
após eletroforese em gel de agarose 2% e corado com brometo de etídio. Para a análise estatística foi utilizado
o teste do x2. Das pacientes portadoras de endometriose, 16% apresentaram ausência para os genes GSTM1 e
GSTT1, nas pacientes não portadoras 49% apresentaram ausência dos dois genes. O resultado do teste do x2, foi
significativo (p=0,0049), indicando a influência do polimorfismo dos genes GSTM1 e GSTT1 na endometriose.
Apoio Financeiro: FAPEGO E PUC-GOIÁS.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
210
Relação entre o polimorfismo -402G/A no gene do
Fator VII e a ocorrência de pré-eclâmpsia
Coelho, FF1; Godoi, LC1; Alpoim, PN1; Carvalho, MG1; Fernandes, ASM1; Dusse, LMS1; Gomes, KB1,2
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia - Universidade Federal de Minas Gerais
Colégio Técnico - Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pré-eclâmpsia, fator VII, -402 G/A, PEc, FVII.
Introdução: A pré-eclâmpsia (PEc) é uma doença caracterizada pelo aparecimento em grávida normotensa, após a
vigésima semana de gestação, da tríade sintomática: hipertensão, proteinúria e edema. A PEc constitui a principal
causa de morte materna em diversos países do mundo e contribui significativamente para a prematuridade e
aumento da mortalidade neonatal. O estado de hipercoagulabilidade fisiológico na gravidez normal torna-se ainda
mais exacerbado na PEc. O fator VII da coagulação (FVII) constitui o principal iniciador do processo de coagulação,
sendo ativado quando ocorre lesão tecidual e liberação de fator tissular (FT). Estudos sugerem que o polimorfismo
-402G/A, presente na região promotora do gene do FVII, esteja relacionado ao aumento plasmático desse fator
favorecendo, dessa forma, a hipercoagulabilidade. Objetivos: Elucidar a relação entre a presença do polimorfismo
-402G/A no gene do FVII e a ocorrência de PEc em gestantes. Métodos: Foram avaliados 3 grupos de mulheres da
Maternidade Odete Valadares, Belo Horizonte-MG; Grupo I: gestantes com PEc grave (n=79); Grupo II: gestantes
normotensas (n=56); Grupo 3: mulheres não gestantes (n=61). A pesquisa do polimorfismo -402G/A foi feita através
da técnica de PCR-RFLP. Resultados: No grupo I foram encontradas 16 gestantes com o polimorfismo em heterozigose
e uma em homozigose. A frequência genotípica foi 0,784 G/G, 0,203 G/A e 0,013 A/A. A frequência gênica foi 0,114
para o alelo A e 0,886 para o alelo G. No grupo II foram observadas 17 mulheres com o polimorfismo em heterozigose
e 4 em homozigose. A frequência genotípica foi 0,625 G/G, 0,304 G/A e 0,071 A/A. A frequência gênica foi 0,223 para
o alelo A e 0,777 para o alelo G. Já no grupo III, 17 gestantes apresentavam o polimorfismo em heterozigose e uma em
homozigose. A frequência genotípica foi 0,705 G/G, 0,279 G/A e 0,016 A/A. A frequência gênica foi 0,156 para o alelo
A e 0,844 para o alelo G. Na análise estatística, realizada pelo teste de qui-quadrado considerando a presença ou
ausência da mutação entre os grupos I e II, obteve-se p=0,042, OR=0,457 e IC=0,215-0,972. Realizando-se a mesma
análise entre os grupos I e III, obteve-se p=0,327; OR=0,655 e IC=0,306-1,401. Conclusão: Constatou-se uma relação
inversa entre a presença do polimorfismo -402 G/A no gene do FVII e a pré-eclâmpsia. Isto sugere que a presença
do polimorfismo diminui a chance de ocorrência da pré-eclâmpsia por desfavorecer o processo de coagulação.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
211
Avaliação da influência dos polimorfismos H19/RsaI
e IGF2/ApaI no peso da placenta de pacientes com
Síndromes Hipertensivas Gestacionais
Leite, SBP1; Araujo, FM2, Soares, MR2; Duarte, G2; Galerani, MAV1; Ramos, ES1,2
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: síndromes hipertensivas gestacionais, gene H19, gene IGF2, peso, placenta
Em humanos, a região cromossômica 11p15.5 apresenta domínios com genes controlados por um processo
epigenético conhecido como imprinting genômico. Dentre esses genes, o H19 e o IGF2 são importantes no
desenvolvimento embrionário e fetal assim como na formação placentária. Alguns distúrbios durante a gravidez,
como as Síndromes Hipertensivas Gestacionais (SHG), que incluem hipertensão arterial gestacional (HAG),
hipertensão arterial crônica (HAC) e pré-eclâmpsia/eclâmpsia (PE/E), estão entre as principais causas de morte
materna e fetal em todo o mundo. A PE, em especial, ainda tem etiologia desconhecida, porém, alguns estudos
relatam um forte componente genético ao mesmo tempo em que outros apontam para a influência de fatores
epigenéticos. O objetivo deste trabalho foi avaliar se há influência dos polimorfismos H19/RsaI e IGF2/ApaI sobre
o peso das placentas assim como seu possível impacto no desenvolvimento das SHG. Para tanto, foram coletadas
amostras de sangue e pesadas as placentas de 167 pacientes (70 do grupo controle, 32 com PE/E, 23 com HAC
e 32 com HAG) atendidas no HCFMRP-USP. O DNA extraído foi submetido à reação em cadeia da polimerase
(PCR) e às enzimas de restrição RsaI para a seqüência do gene H19 (diferenciando em alelos A e G) e ApaI para
o IGF2 (também alelos A e G), seguidos por eletroforese para visualização dos resultados. A classificação do
percentil para o peso das placentas foi feita de acordo com valores internacionais. Os resultados foram avaliados
pelos testes estatísticos do Qui-quadrado e exato de Fisher e pela análise de haplótipos. Observou-se uma
maior freqüência do alelo G, assim como uma baixa freqüência genotípica de AA, para ambos os polimorfismos.
Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas (p>0,05) para a associação entre o peso das
placentas e os diferentes genótipos, assim como não se observaram diferenças dos genótipos em relação às SHG.
Apesar da influência dos genes IGF2 e H19 no desenvolvimento placentário, nosso estudo não mostrou diferenças
estatisticamente significativas dos genótipos em relação aos pesos das placentas e no desenvolvimento das SHG.
Apoio financeiro: FAEPA, FAPESP, CNPq, CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
212
Índice de positividade no diagnóstico molecular de
contatos domiciliares de pacientes com hanseníse no
município de São Luis - Maranhão
Rivas, PMS1; Pinho, JD1; Rodrigues, TMS1; Soares, RP1; Almeida, LP1; Lima, MIS1; Aquino, SMC2; Figueredo, IA2; Paiva, MFL2; Nunes, SPH1; Goulart, IMB3; Pereira, SRF1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular (LabGeM), Universidade Federal do Maranhão
Ambulatório de Dermatologia
3
Centro de Referência em Dermatologia Sanitária e Hanseniase
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hanseníase, Mycobacterium leprae, diagnóstico molecular, contatos domiciliares, monitoramento epidemiológico.
Introdução: A hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, constitui um problema de saúde pública em diversos
países. O Brasil ocupa o segundo lugar do mundo em número absoluto de casos de hanseníase, sendo o primeiro das
Américas. O Estado do Maranhão é classificado como região hiperendêmica pelo Ministério da Saúde. Segundo
a Secretária de Saúde do Maranhão, o Estado registrou 6,26 milhões, no ano de 2007 e apresentou um índice médio
de detecção de 6,7 casos por 10.000 habitantes. Dos 4.175 casos registrados, 384 estavam abaixo de 15 anos de
idade (1,6 casos/10.000). Objetivo: Detectar o DNA do M. leprae em amostras de swab bucal e nasal de contatos
domiciliares de pacientes com hanseníase da cidade de São Luís-MA, utilizando o método de PCR (Reação em
Cadeia da Polimerase), para gerar fragmentos de 130pb da região RLEP3 (X17153) e utilizar os dados obtidos para
monitoramento da epidemia no município de São Luis - MA. Métodos: Foram coletadas 50 amostras das mucosas
bucal e 50 amostras da mucosa nasal de contatos de pacientes com hanseníase no Ambulatorio de Dermatolgia do
HU-UFMA e processadas no LabGeM da UFMA. O DNA total das amostras foi extraído, quantificado e os fragmentos
de 130pb do DNA de M. leprae foram separados por eletroforese em gel de agarose 2%, corados com brometo de etídio
e fotodocumentados. Resultados: 8,0% das amostras de swab bucal foram positivas para M. leprae, onde 50% dos
contatos conviviam com pacientes de forma clínica multibacilar e 50% paucibacilar. Por outro lado, nenhuma das
50 amostras de swab nasal foi positiva para M. leprae. Conclusões: Os resultados indicam que a forma predominante
de transmissão na cidade de São Luis pode ser por via oral. Estes dados remetem à importância da aplicação
de tecnologias moleculares para o entendimento dos mecanismos de transmissão e epidemiologia da doença no
estado do Maranhão para o tratamento precoce, contribuindo para a diminuição dos casos de hanseníase no estado.
Apoio financeiro: CNPQ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
213
Estudo dos polimorfismos de deleção/inserção de 14
pb del/ins e +3142C/+3142G na molécula HLA-G em
pacientes infectados com os vírus das hepatites B e C
Toledo, SS1; Soares, CP2; Donadi, EA3; Souto, FJD4; Bassi, CL5
Instituto de Biociências de Mato Grosso (IB-UFMT)
Depto. Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Estado de São Paulo (UNESP-Araraquara)
3
Depto. Clínica Médica da FMRP-USP
4
Depto. de Clínica Médica da FCM-UFMT
5
Depto. de Ciências Básicas em Saúde da FCM-UFMT
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hepatite B e C, HLA-G, polimorfismo, 14pb, +3142
As hepatites B e C são importantes problemas de saúde mundial. A molécula HLA-G tem sido descrita como
um mecanismo utilizado pelas células virais para escapar do sistema imune do hospedeiro, mas o papel desta
molécula nas hepatites virais ainda não foi investigado. O objetivo deste trabalho foi determinar a freqüência do
polimorfismo 14pb del/ins e do polimorfismo +3142C/+3142G em indivíduos portadores dos vírus HBV e HCV,
comparando com indivíduos não infectados. O polimorfismo de 14pb del/ins foi avaliado em amostras de DNA de
100 pacientes com HBV e 90 com HCV, além de 115 controles, enquanto que o polimorfismo +3142C/+3142G foi
avaliado em 50 pacientes com HBV, 30 com HCV e 50 controles. Os polimorfismos foram determinados utilizando-se
as técnicas de PCR (14pb) e PCR-RFLP (+3142), sendo o resultado das amplificações/digestões visualizadas em gel
de poliacrilamida a 10% corado com nitrato de prata. Não houve diferença estatisticamente significativa quando os
grupos de pacientes foram comparados com os controles para os dois polimorfismos analisados (p>0,05). Embora
existam evidências que os polimorfismos 14pb ins e +3142G estejam relacionados com diminuição na expressão da
molécula HLA-G, o que poderia facilitar a eliminação do vírus, os dados obtidos até o momento neste estudo não
sugerem que possam conferir maior proteção para a infecção crônica pelos vírus da hepatite B ou C. No entanto,
a análise num número maior de amostras, bem como a verificação da associação desses polimorfismos com
manifestações clínicas da doença, são imprescindíveis para elucidar o papel destes polimorfismos nas hepatites virais.
Apoio: FAPEMAT, CNPq e CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
214
Associação entre o Loco TNFα com Dengue
Neurológica em Rondônia, Amazônia Ocidental
Brasileira
Delani, D1; Krauze, A4; Guimarães, MS1; Andrade-Casseb, A1,3; Engracia, V1,2
Laboratório de Genética Humana – Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais, IPEPATRO
Universidade Federal de Rondônia/ Departamento de Medicina – UNIR
3
Universidade Federal de Rondônia/ Departamento de História e Arqueologia – UNIR
4
Centro de Pesquisa em Medicina – CEPEM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: TNFα, Dengue Neurológica, Suscetibilidade Genética.
O gene TNFα, localizado do cromossomo 6p21.3, mostrou uma associação significante com as formas graves de
infecção pelo vírus causador de Dengue (Sierra, e colb. 2010). Por apresentar extensa variabilidade de SNPs, tornou-se
ferramenta genética essencial para estudos de ligação e/ou associação em composição e frequência dentro e entre
diferentes grupos étnicos (Vejbaesya, e cols. 2009). Visando a genotipar os SNPs -238 e -308 localizados na região
promotora deste gene e observar a associação genética entre indivíduos infectados por Dengue, foram coletadas
108 amostras sanguíneas de indivíduos residentes nos municípios de Cacoal e Jaru, ambos do estado de Rondônia,
cujo projeto foi aprovado sob o número CONEP 13.356. A extração do DNA foi realizada através do protocolo
descrito por Higuchi e a análise das amostras ocorreu pelas técnicas de PCR (reação em cadeia da polimerase),
RFLP (análise do polimorfismo do fragmento de restrição), seguidos de eletroforese em PAGE a 6% corados com
AgNO. Os dados estatísticos foram obtidos utilizando-se o programa Genepop (Version 4,0). A frequência alélica
observada foi de 0.936 para -238G, e 0.0640 para -238A, correspondendo à observada em populações européias
(0.068 e 0.932 respectivamente; NCBI, 2010). Em pacientes com dengue a presença deste alelo mutante -238A
está relacionada à proteção (Oliveira 2004). Neste estudo não foi detectada associação significante (p>0,05). O
alelo -308G apresentou uma frequência de 0.878 e o alelo -308A de 0.122, similar à descrita para afro-americanos
(0.123 e 0.877 respectivamente; NCBI, 2010), confirmando a heterogeneidade étnica da população em estudo.
Não foi possível estabelecermos uma base biológica de suscetibilidade/resistência em relação ao TNFα, mesmo
havendo dados na literatura (Fernández, 2004). Novas abordagens moleculares e estatísticas serão realizadas
para que a associação dengue/ TNFα possa ser analisada, de maneira a confirmar, ou não, dados da literatura.
Apoio: CNPq; IPEPATRO, UNIR.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
215
Polimorfismos do gene da ß-defesina 1 na
susceptibilidade à infecção pelo HTLV-1
Kamada, AJ1; Campos, AV1; Brandão, LAC1; Guimarães, RL1; Loureiro, P2; Arraes, LC3; Crovella, S4,5
Setor de Virologia - Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) – UFPE, Recife
Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco – HEMOPE, Recife
3
Instituto Materno Infantil de Pernambuco - IMIP, Recife
4
Medical Genetic Service, Institute for Maternal and Child Health - IRCCS Burlo Garofolo (Trieste, Italy)
5
Departamento de Genética, UFPE, Recife
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DEFB1, ß-defesina 1, HTLV-1, SNP.
O sistema imune inato humano atua como a primeira linha de defesa durante a infecção por microorganismos,
sendo capaz de promover a detecção e a resposta aos patógenos de forma direta e inespecífica. No sítio inicial
de uma infecção viral, esta função pode ser exercida por certos tipos de peptídeos antimicrobianos catiônicos
conhecidos como defensinas, que atuam tanto na ruptura de membranas e de envelopes virais, como pode
desempenhar um eficiente papel quimiotático, promovendo a modulação da resposta imunológica. Respostas
diferenciais às infecções virais têm sido atribuídos às variações do gene codificante da ß-defesina 1 (DEFB1),
expresso constitutivamente em diversos epitélios e mucosas. Com o intuito de caracterizar um dos fatores
genéticos envolvidos na susceptibilidade à infecção pelo HTLV-1 (vírus T-linfotrópico humano tipo I), foram
investigados polimorfismos genéticos funcionais do gene DEFB1 na população da Região Metropolitana do Recife.
O grupo de estudo foi composto por 107 pacientes portadores do HTLV-1 e 98 indivíduos saudáveis provenientes
do HEMOPE, com a devida caracterização clínica e da carga proviral dos pacientes. Os polimorfismos de base
única (SNPs) do gene DEFB1 (-52G/A, -44C/G e -20G/A), foram determinados através do seqüenciamento
direto pelo MegaBACE™ 750 (Amershan Bioscience). As freqüências dos SNPs no grupo de estudo foram
analisadas estatisticamente pelos testes do X2 e de Fisher para a avaliação do equilíbrio de Hardy-Weinberg e da
susceptibilidade, respectivamente; e a análise dos haplótipos formados pelos três SNP’s da DEFB1 foi realizada
através do software Arlequin (versão 3.5). Diferenças significativas das freqüências do SNP -44C/G entre os
grupos sugerem um papel protetor tanto do alelo G (p=0.046, O.R.=1.802), quanto do haplótipo GGG (p=0.010)
à infecção pelo HTLV-1. A ausência de associação entre as freqüências genotípicas e haplotípicas com relação à
carga proviral dos pacientes, foi avaliada através do teste de Kruskall-Wallis. Embora a identificação de fatores
genéticos na resposta às doenças infecciosas apresente inúmeros desafios, foi possível ratificar a importância da
ß-defesina 1 como um dos componentes importantes da imunidade inata na proteção à infecção pelo HTLV-1.
Apoio financeiro: FACEPE, CNPq, UFPE-LIKA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
216
Estudo de mutações no gene da CCR5 e sua
associação com a infecção pelo HIV-1
Costa, GCS1,2; Jesus, JG2; Santos, ES2; Castro-Filho, BG1,2; Alcantara, LCJ1,2
Laboratório Avançado de Saúde Pública, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, Bahia
Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública, Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências, Salvador, Bahia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: HIV-1, CCR5, mutações
Introdução: Vários fatores relacionados ao hospedeiro e/ou ao vírus podem contribuir para a susceptibilidade
à infecção pelo HIV-1 e para a evolução para a AIDS em indivíduos infectados. Modificações pós-traducionais,
como sulfatação de tirosinas e O-glicosilação, no domínio N-Terminal da proteína CCR5 (co-receptor do HIV-1)
são cruciais para mediação das interações com a proteína do envelope do HIV-1. Além disso, algumas mutações
na região gênica que codifica para o domínio C-Terminal da CCR5 podem resultar na produção de uma proteína
truncada que pode não ancorar na membrana celular. Objetivos: Analisar variações nos domínios N e C-Terminal da
proteína CCR5 e associá-las à infecção pelo HIV-1. Métodos: Os domínios N e C-Terminal da CCR5 foram analisados,
até o momento, em 119 e 124 indivíduos infectados pelo HIV-1 provenientes de Feira de Santana, Bahia, Brasil
e em 24 e 25 indivíduos não-infectados de Salvador, Bahia, Brasil, respectivamente, através de sequenciamento.
Sítios de sulfatação e O-glicosilação e outros sítios de modificações pós-traducionais foram analisados utilizando
a ferramenta Prosite implementada no software GeneDoc. Resultados: Os estudos do domínio N-Terminal da
proteína CCR5 revelaram a existência de uma mutação sem sentido, ainda não descrita na literatura, na posição
246 do gene que altera o aminoácido 82 da proteína em duas amostras de indivíduos não-infectados ( freqüência
alélica de 4,0%). Esta mutação caracteriza-se pela substituição pontual de uma Timina por uma Adenina o que gera
uma troca de uma Lisina (L) para uma Glutamina (Q) na posição 82 da proteína, não resultando em modificação
pós-traducional. Quando os grupos de indivíduos infectados e não-infectados pelo HIV-1 foram comparados, a
freqüência do alelo mutante (A) foi maior nos indivíduos não-infectados do que nos infectados, apresentando uma
diferença estatisticamente significante (p=0,031). Três novas mutações silenciosas foram observadas na região
C-Terminal da CCR5 nos indivíduos infectados pelo HIV-1: C3765T, A3777T e A3831G. As freqüências alélicas
das três mutações não apresentaram uma diferença estatisticamente significante entre controles e indivíduos
infectados pelo HIV-1. Conclusão: Estes resultados sugerem que a nova mutação L82Q no domínio N-Terminal da
CCR5 pode ter um importante papel na infecção pelo HIV-1 não relacionado com modificações pós-traducionais.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
217
Mutações no promotor do gene da Langerina afetam a
infecção pelo HIV-1?
Jesus, JG2; Costa, GCS1,2; Santos, ES2; Castro-Filho, BG1,2; Alcantara, LCJ1,2
Laboratório Avançado de Saúde Pública, Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, Fundação Oswaldo Cruz, Salvador, Bahia
Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública, Fundação Bahiana para o Desenvolvimento das Ciências, Salvador, Bahia
[email protected]
1
2
Palavras-chave: HIV-1, langerina, mutações.
Introdução: A entrada do HIV-1 na célula hospedeira depende da interação de suas glicoproteínas do envelope
com moléculas receptoras e co-receptoras da célula. A langerina, uma lecitina do tipo C, presente nas células de
Langerhans (LCs), as quais são abundantes em mucosas e no canal vaginal, constitui uma das vias de entrada
do HIV-1 nestas células. Estudos evidenciam que a langerina impede a infecção pelo HIV-1, uma vez que atua
na remoção deste vírus dos tecidos, destruindo-o no interior das LCs através da formação dos grânulos de
Birbeck. Vários fatores relacionados ao hospedeiro e/ou ao vírus podem contribuir para a susceptibilidade à
infecção pelo HIV-1 e para a evolução para a AIDS em indivíduos infectados. As alterações na região promotora
do gene da Langerina podem influenciar a infecção pelo HIV-1 e modificar o curso da progressão para AIDS por
comprometerem a regulação gênica, afetando a ligação de fatores de transcrição e/ou a expressão da proteína
na superfície celular. Objetivos: Analisar variações na região promotora do gene da Langerina e associá-las à
infecção pelo HIV-1. Métodos: A região promotora do gene da Langerina foi analisada, até o momento, em 55
amostras de indivíduos infectados pelo HIV-1 provenientes de Feira de Santana, Bahia, Brasil e em 44 indivíduos
não-infectados de Salvador, Bahia, Brasil através de sequenciamento. Sítios de ligação de fatores de transcrição
foram analisados utilizando a ferramenta MatInspector implementada no software Genomatix. Resultados: Os
estudos na região promotora do gene da Langerina revelaram a existência da mutação -223T>C, localizada no sítio
de ligação do fator de transcrição da família V$FKHD, que apresentou a uma freqüência de 2,7% do alelo C nos
indivíduos infectados pelo HIV-1, e da mutação -297T>C, localizada no sítio de ligação do fator de transcrição da
família V$AIRE, a qual apresentou freqüências do alelo C de 7,2% e 25% em indivíduos infectados e não infectados
pelo HIV-1, respectivamente. As freqüências alélicas das duas mutações observadas apresentaram uma diferença
estatisticamente significante quando os grupos de indivíduos infectados e não-infectados foram comparados
(p<0,05). Conclusão: Estes dados sugerem que as mutações -223T<C, observada apenas nos indivíduos infectados
pelo HIV-1, e -297T<C, encontrada em uma freqüência muito maior nos indivíduos não-infectados pelo HIV1, pode apresentar um papel importante no mecanismo de infecção pelo vírus por, possivelmente, alterar
a ligação de fatores de transcrição na região promotora do gene da Langerina, afetando a regulação gênica.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde, FAPESB
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
218
Polimorfismos associados com a resposta inflamatória
e susceptibilidade a meningite bacteriana
Araújo, LF1; Fontes, FL1; Silva, TA1; Souza, FRS1; Coutinho, LG1; Agnez-Lima, LF1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Rio Grande do Norte, Laboratório de Biologia Molecular e
Genômica
[email protected]
1
Palavras-chave: Polimorfismos, Susceptibilidade, Meningite Bacteriana, Resposta Inflamatória, Enzimas de Reparo.
As meningites são doenças infecto-contagiosas com alta prevalência na faixa etária pediátrica. A susceptibilidade
e sequelas da meningite podem estar associadas a características genéticas individuais como polimorfismos.
Foram analisados 8 polimorfismos em genes que refletem eventos patofisiológicos durante a meningite, podendo
estar determinando a ocorrência da doença. São eles: TNFα -308G/A, TNFα -857C/T, CXCL8/IL-8 -251A/T,
KATII +401C/T e MMP9 -1562C/T, consistindo em citocinas e proteínas da resposta inflamatória, e APE1/Ref1+148T/G, OGG1+326C/G e PARP1+762T/C, enzimas de reparo do DNA. Estudos relacionaram enzimas de reparo
com alterações nos níveis de citocinas e mudança de classe de imunoglobulinas. Amostras sanguíneas coletadas
no Hospital Giselda Trigueiro (Natal-RN) e de indivíduos saudáveis, utilizados para controle, foram processadas
para extração de DNA genômico. Foram efetuadas PCR ou PIRA-PCR, seguido por RFLP. Associou-se freqüências
alélicas e genotípicas com níveis de citocinas, mensurados por xMAP (Bio-Plex 200), e imunoglobulinas. Análises
individuais de cada polimorfismo mostraram maior incidência dos alelos polimórficos dos genes da APE1/Ref1+148T/G, OGG1+326C/G e PARP1+762T/C, KATII +401C/T e MMP9 -1562C/T nos pacientes com meningite. Para
polimorfismos no TNFα observou-se maior frequência dos alelos polimorficos no grupo controle. Níveis de IgG e IgA
foram alterados na presença do polimorfismo em APE1/Ref-1+148T/G e OGG1+326C/G, e houve diminuição dos
níveis de CCL2/MCP-1 e CXCL8/IL-8 nos paciente com polimorfismo para a APE1/Ref-1+148T/G. Nos pacientes
homozigotos polimórficos para KATII+401C/T houve diminuição nos níveis de TNF-α e IL-6. Análises para CXCL8/
IL-8 -251A/T demonstraram o alelo polimórfico T diminuindo os níveis de algumas quimiocinas (CXCL8/IL-8, CCL3
e CCL4) e celularidade total no liquor dos pacientes. Nos pacientes portadores do polimorfismo TNFα-308G/A e
TNFα -857C/T encontrou-se correlação de níveis mais altos de cito/quimiocinas estatisticamente significativa
quando comparado com os pacientes portadores apenas do alelo selvagem. Nas combinações dos genótipos foram
observadas as seguintes correlações: TNFα -308GG/ APE1/Ref-1 TG/GG p= < 0,0001, TNFα -308GG/ APE1/Ref1 +148TG/GG/ OGG1+326CGGG p= 0,0004, APE1/Ref-1+148TGGG/ OGG1+326CGGG/ PARP1+762TCCC p=
0,0112, TNFα -308GG/KATII +401CTTT p= 0,0001 e TNFα -308GAAA/ TNFα -857CTCC p= 0,0002, CXCL8/IL-8
-251ATTT/ APE1/Ref-1 +148TGGG p= 0,0046. Nossos dados indicam que a avaliação extensiva das variabilidades
desses genes podem contribuir para aumentar a compreensão da susceptibilidade à meningite bacteriana.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
219
Tuberculose óssea torácica: Relato de caso
diagnosticado através de STNPCR
Santos, FCF1; Lima, JFC1; Nascimento, ALA1; Lima, AS1; Montenegro, RA1; Lira, LAS1; Guarines, KM1; Vasconcelos, RHT1; Montenegro, LML1; Schindler, HC1
Departamento de Imunologia, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz
[email protected]
1
Palavras-chave: Tuberculose, Diagnóstico, STNPCR
A tuberculose é uma enfermidade infecciosa que pode acometer seres humanos, causada pelo bacilo Mycobacterium
tuberculosis, e que permanece como umas das maiores causas de mortalidade entre as doenças infecciosas e
parasitárias no Brasil e no mundo. A tuberculose comumente se localiza nos pulmões, embora possa acometer
qualquer órgão, sendo então denominada tuberculose extrapulmonar. A tuberculose óssea é uma forma de
tuberculose extrapulmonar que pode ocorrer através de disseminação hematogênica ou erosão de linfonodos
caseosos adjacentes após uma infecção primária pulmonar. No esqueleto, a coluna vertebral é a sede mais comum
de acometimento, seguida pelo quadril. O diagnóstico desta forma de tuberculose é freqüentemente complicado
pelas dificuldades associadas à cultura do patógeno causador da doença através de material obtido da punção com
agulha do sítio da lesão. A confirmação diagnóstica através do uso da Reação de Cadeia da Polimerase (PCR) tem
permitido o diagnóstico mais rápido e seguro nos casos de suspeita de tuberculose óssea. O objetivo deste trabalho
foi relatar um caso de tuberculose na coluna vertebral em uma criança, com diagnóstico confirmado através de
Nested-PCR em único tubo (STNPCR). Paciente do sexo feminino, de 12 anos de idade, foi admitida no ambulatório
do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco com suspeita de tuberculose óssea torácica.
Amostras de aspirado de T9 e T10, sangue periférico e urina foram encaminhadas ao Departamento de Imunologia
do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz para realização de testes moleculares. O DNA alvo foi extraído de
todas as amostras através do QIAamp DNA Minikit® (Qiagen), segundo as instruções do fabricante. O DNA extraído
foi submetido a protocolo de STNPCR tendo como alvo o elemento de inserção IS6110, segundo Figueirêdo et al. 2009.
As amostras de aspirado de T9 e T10 e urina foram positivas para o complexo M. tuberculosis. Com os resultados do
exame molecular, a equipe médica do ambulatório decidiu iniciar o esquema terapêutico para tuberculose óssea. A
paciente apresentou melhora clínica evidente e está sendo acompanhada mensalmente até conclusão do tratamento.
Apoio Financeiro: Fiocruz, Facepe
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
220
Polimorfismos do gene L-SIGN (exon 4) associados
com a susceptibilidade e proteção a tuberculose
Silva, RC1,2; Cruz, HLA3; Crovella, S1,2
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA) – Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, Pernambuco, Brasil.
Departamento de Genética – Centro de Ciências Biológicas (CCB) – Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Recife, Pernambuco, Brasil
3
Laboratório de Imunoepidemiologia - Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães (CpqAM – Fiocruz), Recife, Pernambuco, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Polimorfismos, L-SIGN, Tuberculose, PCR, Associação.
A tuberculose é uma doença multifatorial e infecto-contagiosa, causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis,
o qual burla os mecanismos de defesa da árvore respiratória, alcançando os alvéolos pulmonares, onde se
instala e dar início a patologia. Apesar da existência profilaxia específica, a tuberculose é responsável por
aproximadamente 3 milhões de mortes anuais em todo o planeta, sendo uma das mais importantes causas globais
de morbidade e mortalidade. A identificação de genes, relacionados com infecções, é de extrema importância
para o entendimento dos mecanismos genéticos envolvidos na resposta do hospedeiro frente ao patógeno, bem
como, no desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. O gene codificador do receptor L-SIGN, pertence
à família gênica CD209, localizada no cromossomo 19 e é formado por 8 éxons. Funcionalmente, promove o
reconhecimento de inúmeros patógenos pelo sistema imune inato, incluindo M. tuberculosis. O éxon 4 do L-SIGN
é caracterizado por apresentar um número variável de repetições em tandem. Variações no comprimento dessa
região, podem influenciar a afinidade de ligação do patógeno ao receptor. Visando associar os polimorfismos
genéticos presentes éxon 4 do gene L-SIGN com a susceptibilidade e/ou proteção a tuberculose, conduziu-se um
estudo com 121 pacientes diagnosticados com tuberculose e 151 controles saudáveis, oriundos de Pernambuco.
Os polimorfismos foram identificados por PCR e genotipados por eletroforese em gel de agarose, sendo,
posteriormente, analisados através do teste do X2 e o Exato de Fisher, utilizando o programa R. A população
apresentou 7 alelos distintos, variando de 5 a 10 repetições, sendo que os mais freqüentes, entre os pacientes,
foram: 7, 8 e 9 (33,1%; 20,7% e 17,4%), destes, apenas o alelo 9 diferiu significativamente do controle (17,4% vs 5,3%,
p=0,01). Foram identificados também, um provável alelo de risco, o alelo 9 (p=9.26e-06, odds=3.745, IC95%=1.9967.345), e um provável alelo de proteção a doença, o alelo 4 (p=0.048, odds=0.153, IC95%=0.003-1.154). Quanto aos
genótipos, encontrou-se 22 tipos, sendo que os mais frequentes, entre os pacientes, foram: 7/7, 7/6 e 9/8 (17,36%,
10,74% e 10,74%, respectivamente), os quais, não diferiram significativamente do controle (10,6%, 10,6%, 4,64%).
Os demais genótipos, também não apresentaram diferenças significativas do controle, exceto o genótipo 9/9
(p=0.04). Pacientes com genótipos contendo de 10 a 13 repetições (p=0,004; odds=0.478; IC95%=0.279-0.808) e 17 a
19 repetições (p=0.01; odds=2.708; IC95%=1.23-6.28) apresentaram diferenças significativas em relação ao controle,
podendo ser considerados, respectivamente, como fatores de proteção e de risco. Quanto à homozigosidade e
heterozigosidade, não foram evidenciadas diferenças significativas entre os grupos estudados. Os resultados
sugerem que polimorfismos presentes no éxon 4 do L-SIGN, em pacientes pernambucanos, podem estar associados
à tuberculose, conduzindo o indivíduo portador a uma maior susceptibilidade ou/e a uma maior resistência à
doença. Entretanto, faz-se necessária ampliação do número de pacientes e replicação em outras populações.
Apoio financeiro: CNPq, LIKA-UFPE, CpqAM.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
221
Co-Infecção pelo HTLV-1 diminui a expressão de IL-17
na Tuberculose
Lima, R¹; Ramasawmy, R¹ ²; Souza, A¹; Bastos, Mª L¹; Santos, S¹ ³; Cardoso, T¹; Carvalho, EM¹
Serviço de Imunologia, Hospital Universitário Professor Edgar Santos, Universidade Federal da Bahia, Salvador, Brasil
Divisão de Imunologia Clínica e Alergia, Departamento de Medicina, Universidade de São Paulo Escola de Medicina
3
Universidade Estadual de Feira de Santana
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tuberculose, HTLV-1, IL-17, Co-infecção, RNAm
Tuberculose (TB) é um grande problema de saúde publica no Brasil e no mundo. M. tuberculosis é um patógeno
intracelular obrigatório de macrófagos que induz uma forte resposta Th1 com elevada produção de citocinas
proinflamatorias e complementarmente IL-17 (Sutherland 2009). O vírus linfotrópico de células T humanas tipo
1 (HTLV-1) infecta preferencialmente células T CD4 e está etiologicamente relacionado ao linfoma de células T
do adulto (ATL) e a mielopatia associada ao HTLV. Existem evidências que a infecção pelo HTLV-1 conduz a uma
imunossupressão e a uma maior susceptibilidade às doenças infecciosas. Indivíduos co-infectados por TB/HTLV1 podem apresentar menor resposta Th1 e Th17, com maior progressão da infecção por TB. Visto que a IL-17
tem efeito protetor na infecção pelo M. tuberculosis (Khader 2007/Scriba 2008), o objetivo deste estudo é avaliar o
papel da co-infecção pelo HTLV-1 na expressão de IL-17 de indivíduos com TB. Células mononucleares de sangue
periférico de indivíduos infectados com TB (n=2) e pacientes co-infectados TB/HTLV-1(n=3) foram separados e
mantidos em cultura com e sem estimulo com PPD (0,5µg/ml). Após 72 horas as células foram colhidas com trizol
para posterior extração de RNA. Após conversão do RNAm em cDNA, realizou-se a determinação da expressão
de IL-17 por PCR em tempo real. A análise dos dados foi realizada através do software Graph-Pad. Embora não
tenha sido observada diferença estatística significante, células de pacientes com TB infectados pelo HTLV-1 após
estimulo com PPD, apresentaram uma menor expressão de Rnam para IL-17 do que em indivíduos infectados
somente com TB. Indivíduos infectados pelo HTLV-1 cursam com imunossupressão e desenvolvem infecção mais
grave pelo M. tuberculosis. Pacientes com TB co-infectados pelo HTLV-1 apresentam uma menor expressão de
RNAm para IL-17 do que pacientes infectados somente com TB. É possível que a co-infecção HTLV-1/TB diminua
o efeito protetor de IL-17 e que a diminuição da proteção conferida pela IL-17 conduza a um pior prognóstico da
infecção pelo TB. Faz-se necessário um maior recrutamento de pacientes para confirmação dos dados apresentados.
Apoio financeiro: CNPQ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
222
Associação da Alfa-1-antitripsina com tuberculose
pulmonar
Silva, TC1; Assunção-Silva, AC1; Garate, JP2; Santos, DP2; Oliveira, JCC2; Pagotto, RC1,3
Laboratório de Genética do Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnologia da Universidade Federal de Rondônia
Departamento de Medicina da Universidade Federal de Rondônia
3
Departamento de Biologia da Universidade Federal de Rondônia
1
2
Palavras-chave: Tuberculose; Rondônia; polimorfismo; inibidor de protease
A deficiência da Alfa-1-Antitripsina (DAAT, DA1AT) é uma doença de origem genética que tem diversas implicações
quanto ao aumento do risco de desenvolvimento de uma variedade de patologias, afetando especialmente
pulmões e fígado. Em relação à tuberculose poucos trabalhos relacionam esta doença a proteínas reativas de
fase aguda como A1AT, proteína cujo aumento significativo dos níveis séricos foi identificado em pacientes com
TB, porém sem nenhuma referência ao polimorfismo da mesma. No presente trabalho, foi investigado, a partir
de uma verificação de prontuários de pacientes com TB positivos atendidos nas Unidades Básicas de Saúde de
Porto Velho (RO) nos anos de 2007 a 2008, o perfil epidemiológico da doença no referido município e a ocorrência
dos principais alelos determinantes da DAAT em uma amostra de pacientes. Foram analisados inicialmente 227
prontuários, cuja idade média dos pacientes foi de 35,4 anos (dp= 16,35), sendo 37,4% dos pacientes atendidos nos
períodos de avaliação, do sexo feminino. Foram identificadas falhas nos registros desta doença, sendo observados
prontuários incompletos com ausência de informações pessoais, resultados de exames básicos de TB, teste de
HIV, bem como as informações clínicas do quadro atual do paciente. A genotipagem molecular para os alelos PI*S
e PI*Z da A1AT (n=66), realizada pela técnica de PCR-RFLP, possibilitou a estimativa das freqüências de PI*S e
PI*Z, respectivamente, de 0, 0379 e 0,0227. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as freqüências
observadas e as esperadas segundo a Lei de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (p= 0,2072; dp= 0,0059). O calculo do risco
relativo de desenvolver TB entre os pacientes e indivíduos da população de Porto Velho não foi estatisticamente
significante (p=0,448), indicando a necessidade de maiores estudos para que se possa concluir com segurança em
relação à associação dos alelos PI e a suscetibilidade a TB.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
223
Avaliação dos polimorfismos 14pb deleção/inserção e
+3142 C/G da molécula de imunohistocompatibilidade
G (HLA-G) em pacientes com hanseníase
Leotti, NF1; Ramos, JMH1; Donadi, EA2; Souto, FJD3; Soares, CP4; Toledo, SS5; Dadalto, JD5; Bassi, CL6
Pósgradução em Ciências Médicas, FCM-UFMT
Depto. Clínica Médica, FMRP-USP
3
Depto. de Clínica Médica, FCM-UFMT
4
Depto. Análises Clínicas, FF-UNESP
5
IB-UFMT
6
Depto. de Ciências Básicas e da Saúde, FCM-UFMT
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hanseníase, HLA-G, Polimorfismo 14pb del/ins, Polimorfismo +3142 C/G, miRNA. Por apresentar uma multiplicidade de formas clínicas, a hanseníase leva o organismo do indivíduo infectado a
desenvolver padrões imunológicos distintos. A predominância de uma defesa mais ou menos eficiente, vai
depender do tipo de subpopulação de células T em atividade no momento do processo infeccioso, em resposta
à progressão da doença; no entanto, pouco se sabe sobre a base genética dessas respostas. Vários estudos nos
últimos anos sugerem que a molécula de imunohistocompatibilidade G (HLA-G) pode ser um modulador da
resposta imune. O objetivo deste estudo foi avaliar a frequência dos polimorfismos 14pb deleção/inserção e +3142
C/G na molécula HLA-G em pacientes com hanseníase, bem como, nas manifestações clínicas da doença. Para
tanto, 162 pacientes com hanseníase foram avaliados para o polimorfismo de 14pb deleção/inserção por PCR
e 161 para o polimorfismo +3142 C/G PCR-RFLP, além dos 185 controles saudáveis. Não houve associação do
polimorfismo 14pb deleção/inserção com a doença ou suas manifestações clínicas. No entanto, foi observada
uma maior frequência do polimorfismo +3142C em pacientes em relação aos controles, sugerindo que esse alelo
confere suscetibilidade à doença (p=0,03). Existem evidências que o polimorfismo +3142G favorece a ligação
de microRNAs que agem reduzindo a expressão de HLA-G. Portanto, indivíduos com o polimorfismo +3142C
possivelmente apresentam maior expressão de HLA-G em comparação com aqueles apresentando o polimorfismo
+3142G, e, consequentemente, uma resposta Th1 menos eficiente, dificultando a eliminação do parasito.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMAT.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
224
Hanseníase e Interleucina 17A
Garcia, PA1; Alencar, DO1; Hamoy, IG1; Santos, NPC1; Ribeiro-dos-Santos, AKC1; Santos, S1
Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: Hanseníase, IL17A, Th17, Paucibacilar, Multibacilar.
Introdução: Hanseníase é uma doença infectocontagiosa, de evolução lenta, que se manifesta principalmente
através de sintomas dermatoneurológicos. O comprometimento dos nervos periféricos é a característica
diferencial da doença, conferindo assim, potencial para provocar incapacidades físicas irreversíveis. Seu agente
etiológico, o Mycobacterium leprae, é uma bactéria intracelular obrigatória com tropismo por macrófagos e células
de Schwann. Em 2008, WHO registrou 249.007 novos casos de hanseníase no mundo. No Brasil, em 2007, a taxa de
incidência chegou a 21,08/100.000 habitantes, apresentando o Pará o 5º maior coeficiente, quando comparado aos
demais estados brasileiros. A imunobiologia da hanseníase sempre esteve associada com as subpopulações Th1
(próinflamatória) e Th2 (anti-inflamatória) de linfócitos TCD4+ e com suas respectivas citocinas. Recentemente,
uma nova subpopulação TCD4+ foi reconhecida (Th17), mas ainda não há dados sobre a relação deste novo perfil
imune com as manifestações clínicas de hanseníase. A subpopulação Th17 é altamente próinflamatória, o que a
aproxima da subpopulação Th1. Três citocinas participam diretamente da formação e manutenção do perfil Th17:
IL1β, IL23 e IL17. A produção da IL17A já foi confirmada em infecções humanas causadas pelo Mycobacterium
tuberculosis. Objetivos: Investigar a associação do polimorfismo da IL17A (A-197G; rs 2275913) com a progressão
da hanseníase, tendo por base a classificação operacional do Ministério da Saúde (Paucibacilar - PB e Multibacilar MB). Métodos: Amostras de DNA foram extraídas de 139 pacientes hansênicos (PB, N=30; MB N=109) do Estado do
Pará, através da técnica de fenol-clorofórmio. A quantificação do DNA ocorreu com auxílio do Espectrophotometer
NanoDrop™ 1000 (Thermo Scientific). A genotipagem foi realizada pela técnica de PCR em tempo real com sistema
de sonda TaqMan® (Applied Biosystems). As análises estatísticas foram executadas empregando o programa
Arlequin 3.1. e SPSS versão 8.0. Resultados: No grupo PB, as frequências alélicas para A e G foram 0.17 e 0.83,
respectivamente. As frequências genotípicas observadas foram 33.33% para AG e 66.67% para GG. A distribuição
genotípica no referido grupo encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p=0.56). No grupo MB, as frequências
alélicas para A e G foram 0.22 e 0.78, respectivamente. As frequências genotípicas foram 5.52% para AA, 33.03%
para AG e 61.45% para GG. A distribuição genotípica neste grupo também está em equilíbrio de Hardy-Weinberg
(p=0.79). O teste x2 (p=0,42) mostrou que não há diferença significativa nas frequências dos genótipos do referido
polimorfismo entre os grupos PB e MB. Conclusão: Apenas com os dados desta pesquisa não é possível associar o
polimorfismo da IL17A A-197G (rs 2275913) a nenhum dos grupos representativos da progressão da hanseníase.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
225
PCR multiplex sequência-específica revela associação
entre haplótipos de MASP2 e a susceptibilidade à
Doença de Chagas crônica
Boldt, ABW¹; Luz, PR¹; Grisbach, C¹; de Messias-Reason, IJT¹
¹Laboratório de Imunopatologia Molecular, Hospital de Clínicas, Universidade Federal do Paraná - R. General Carneiro, 181, CEP 80060900, Curitiba, PR
[email protected]
Palavras-chave: PCR multiplex, PCR-SSP, doença de Chagas, MASP2, polimorfismo.
A doença de Chagas (DC) é causada pela infecção intracelular do Trypanosoma cruzi. Há 109 milhões de pessoas em
situação de risco na América Latina, principalmente nas classes sociais menos favorecidas. 60-74% dos infectados
permanecem indefinidamente na fase ‘indeterminada’ (DCI), 20-30% progridem para a forma cardíaca, 10-15%
desenvolvem danos digestivos, e uma pequena percentagem apresenta a forma associada. Em estudos prévios
do nosso grupo, encontrou-se associação entre altos níveis de lectina ligande de manose (MBL) e a gravidade da
cardiomiopatia chagásica. MBL inicia a via das lectinas do sistema complemento através do reconhecimento dos
padrões moleculares associados aos patógenos e da ativação da serina protease 2 associada a MBL (MASP-2). Sabese que o polimorfismo p.D120G de MASP2 codifica uma molécula não funcional associada com susceptibilidade
a doenças infecciosas. Para a avaliação do efeito dos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) de MASP2,
investigou-se 169 pacientes chagásicos (87,6% euro-brasileiros, 10,6% afro-brasileiros e 1,8% ameríndios, com
idade média de 56,4 anos [34-90]), sendo 92 pacientes crônicos sintomáticos (DCCDA) e 77 DCI. O grupo controle
constituiu-se de 169 indivíduos saudáveis (87,6% euro-brasileiros e 12,4% afro-brasileiros, com idade média de
40,6 anos [26-69]). Os SNPs rs7548659 do promotor; p.R99Q e p.P126L do exon 3; rs17409276 do intron 8; p.D371Y
e p.V377A do exon 9; p.R439H e rs1782455 no exon 11 foram genotipados, simultaneamente, através de duas
reações de PCR multiplex com iniciadores sequencia-específicos (SSPs), além da amplificação por PCR-SSP de
p.D120G. A dosagem sérica de MASP-2 e MBL funcional foi obtida através de kits de ensaio de imunoadsorbância
enzimática (ELISA). A distribuição dos genótipos apresentou-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para os
pacientes chagásicos, os genótipos sem o haplótipo ARDPCYVRT, mas com CRDPCDVRC e/ou CRDPCDART, foram
associados com DCCDA (0,01% para DCI e 0,12% para DCCDA; P=0,006, OR=10,91 [IC95%=1,41-81,9]). O diplótipo
CD (intron 8 - exon 9), associado com níveis séricos mais baixos de MASP-2, também foi observado com maior
frequência em pacientes DCCDA (5,6% vs. 13,9%; P=0,007; OR=2,71 [IC95%=1,24-5,95]). Para o grupo controle,
os genótipos CRDPCYVRT ou CRDPTDVRC sem CRDPCDVRC e ARDPCYVRT, associados com as concentrações
séricas mais elevadas de MASP-2, apresentaram-se associados com a susceptibilidade à doença de Chagas per
se (4,32%; P=0,0073, OR= 1,41, [IC95%=1,28-7,56]) e à proteção ao desenvolvimento das formas crônicas (22,22%
para DCI; 6,98% para DCCAD; P=0,02; OR = 0,162 [IC95%=0,114-0,862]). Houve uma correlação altamente
significativa entre os níveis séricos de MBL (previamente determinados pelo nosso grupo) e a capacidade de
ativação do complemento. Isto leva-nos a sugerir que MASP-2 possui um papel importante no desenvolvimento
crônico da DC, sendo este o primeiro estudo de associação com outros polimorfismos de MASP2, além de p.D120G.
Apoio Financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
226
Investigação de polimorfismos das interleucinas 1α e
1β e fatores de susceptibilidade à periodontite crônica
nas aldeias Xingu e Apterewa – Pa
Queiroz, MG1; Rodrigues, TMS1; Carvalho, TAA1; Guerreiro, JF1
Laboratório de Epidemiologia Molecular - Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: Interleucina 1α, Interleucina 1β, Periodontite crônica, Xingu, Apterewa.
A periodontite crônica é uma doença multifatorial, cuja caracterização clínica é resultado da ação de citocinas,
principalmente as pro-inflamatórias, liberadas em resposta à infecção bacteriana localizada no biofilme dental
subgengival. Determinados alelos de citocinas pro-inflamatórias são responsáveis por uma maior produção das
mesmas durante o processo inflamatório, tais como a mutação C->T na posição -889 no gene da interleucina 1a
(IL1A), e a substituição de C->T na posição 3954 do gene da interleucina 1β (IL1B). As IL-1a e IL-1β são duas formas
estruturalmente distintas da interleucina 1, codificadas por genes localizados no braço longo do cromossomo 2. A
população estudada foi constituída por 90 indivíduos das aldeias Xingu e Apyterewa, da etnia Parakanã, na bacia
do Xingu, nos municípios de Altamira e São Félix do Xingu, Estado do Para, nos quais foram encontrados casos
de periodontite crônica, porém com baixo grau de severidade, apesar de frequentes hábitos culturais que levam
ao aumento da gravidade da doença como o tabagismo. O objetivo deste trabalho foi investigar a associação dos
polimorfismos IL1A (-889) e IL1B (+3954) e de alguns outros fatores considerados de risco, tais como o hábito de
fumar, gênero e idade, com a susceptibilidade à periodontite crônica nesta população. As amostras de DNA foram
extraídas a partir de sangue periférico pela técnica fenol-clorofórmio, e os polimorfismos foram investigados por
meio de amplificação por PCR seguido de digestão enzimática e visualização em gel de poliacrilamida. Foi realizada
a análise de regressão logística com as informações sobre hábito de fumar, gênero, idade e o genótipo, utilizando o
software SPSS. O alelo 3954 T (IL1B) não foi identificado, enquanto que o alelo -889 T (IL1A) apresentou frequência
de 0,08%. Das variáveis analisadas, apenas a idade mostrou associação significativa com periodontite crônica
(OR=0,3387, p=0,0002), sendo 96% do grupo de doentes composto por indivíduos com mais de 35 anos, enquanto
que o grupo saudável apresentou 31,25% de indivíduos nessa faixa etária. Tal associação pode ser justificada pelo
fato de que a periodontite começa sem sintomas muito aparentes, passando a ter sintomatologia evidente em
estágios mais tardios. As variáveis sexo, tabagismo e a presença do alelo -889 T (IL1A) apresentaram os seguintes
valores de p: 0,0872; 0,2887 e 0,90773, respectivamente. Esses resultados contradizem as estatísticas mundiais
que apontam uma maior frequência de casos de periodontite em homens. O tabagismo é considerado fator de
risco, contudo dados da literatura não têm encontrado associação com a periodontite crônica, como no presente
estudo. Os polimorfismos estudados também são descritos em trabalhos recentes como associados à doença,
porém, tais resultados são contraditórios em diferentes grupos étnicos. Conclui-se que não é possível generalizar
fatores intrínsecos de predisposição à periodontite crônica, mas sugere-se que estes possam estar ligados à etnia.
Apoio Financeiro: CNPq / UFPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
227
Polimorfismo da Alfa-1-antitripsina (Alelos PI*S e PI*Z)
em pacientes com doença pulmonar obstrutiva crônica
e em uma amostra populacional de Porto VelhoRondônia
Assunção-Silva, AC1 ; Costa-da-Silva, T1; Souza, RCP 1; Moura, MMF1,2; Pagotto, RC1,2
Laboratório de Genética do Centro Interdepartamental de Biologia Experimental e Biotecnologia da Universidade Federal de Rondônia
(CIBEBI-UNIR)
2
Departamento de Biologia-Núcleo de Ciência e Tecnologia da Universidade Federal de Rondônia
[email protected]
1
Palavras-chave: Sistema inibidor de protease / DPOC / freqüência alélica/ A1AT /Amazônia
As doenças respiratórias são as principais causas de internação no SUS do Brasil. Doença Pulmonar Obstrutiva
Crônica (DPOC), asma e pneumonia juntas são responsáveis por cerca de 12% de todas as Autorizações de
Internamento Hospitalar no SUS. A DPCO é considerada uma doença relacionada ao tabagismo, contudo somente
cerca de 10 a 20% dos fumantes é que desenvolvem a DPOC sintomática, outros fatores, como predisposição
genética, também podem estar relacionados ao desenvolvimento desta. A deficiência da Alfa-1-antitripsina
(A1AT), determinada pela homozigose do alelo PI*Z, é considerada a principal causa genética para a DPOC. Não há
estudos na região a respeito da freqüência dos alelos PI*S e PI*Z na população normal ou em pacientes com DPOC.
Este trabalho visa descrever a distribuição das freqüências alélicas do polimorfismo da A1AT em uma amostra da
população de Porto Velho. A realização da coleta de amostras foi previamente aprovada pelo CEP-NUSAU-UNIR.
Pacientes com diagnóstico de DPOC foram identificados a partir da análise dos prontuários de pacientes agendados
para consultas nos ambulatórios de clínica geral do hospital Marcelo Cândia e ambulatório de pneumologia da
Policlínica Oswaldo Cruz (POC), município de Porto Velho/RO. Foram encontrados 76 pacientes com DPOC com
agendamento no ano de 2007, dos quais 12 foram contatados a partir das informações dispostas nos prontuários e
genotipados para a presença dos alelos PI*S ou PI*Z, bem como outras 46 amostras, provenientes de supostos pais
e mães, previamente utilizadas em trabalho de teste de paternidade realizado no CIBEBI em anos anteriores. Para
extração e purificação do DNA utilizou-se o método de precipitação de proteínas. A detecção dos alelos PI*S e PI*Z
foi realizada pela técnica de PCR/RFLP (Lucotte & Sesboüe, 1999). Das 46 amostras de indivíduos da população
geral, encontramos 6 heterozigotos PI*MS e 1 heterozigoto PI*MZ, o que equivale a uma freqüência gênica,
respectivamente, 0,065 e 0,011 para os alelos PI*S e PI*Z. A amostra estudada apresenta aderência ao modelo de
equilíbrio de Hardy-Weimberg (p~10). Não foi detectada a presença dos alelos PI*S ou PI*Z no grupo de pacientes.
Devido ao pequeno número de amostras analisadas não é possível afirmar ou descartar a possibilidade da ocorrência,
em Porto Velho, de pacientes com DPOC em que esta esteja associada ou agravada pela deficiência de A1AT.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
228
Distribuição do polimorfismo da IL-17A em pacientes
com doença periodontal em uma amostra da
população de Belém
Barros-Lopes, C1; Barroso, RF12; Ribeiro-dos-Santos, A1
Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
Instituto de Ciências da Saúde, Faculdade de Odontologia, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
2
Palavras-chave: IL17A, TH17, doença periodontal, resposta imune, população Amazônica
A doença periodontal (DP) é a doença inflamatória de maior prevalência na cavidade oral, de progressão lenta e
destrutiva. Acomete os tecidos de proteção, a gengiva e de suporte dos dentes (ligamento periodontal, cemento
e osso alveolar). Clinicamente apresenta sangramento gengival, presença ou não do biofilme dentário e presença
de bolsa periodontal, formada em conseqüência da perda óssea e migração do epitélio juncional. De acordo com
Ministério da Saúde (2003), a periodontite está presente em 15 a 20% da população com mais de 35 anos de idade.
E acomete principalmente a população adulta, representando a maior causa de perda de dentes nessa faixa etária.
O fator etiológico da doença se inicia pela ação de bactérias, o que desencadeará diferentes respostas imunes.
Estas podem estar associadas com a resposta imune do tipo TH1 e TH2. Recentemente, uma nova subpopulação
TCD4+ foi descrita, a TH17, entre as quais encontram-se as citocinas da família IL-17 (relacionada com doenças
autoimunes). Polimorfismos genéticos presentes nessas citocinas, podem estar associados ou podem ser
funcionalmente responsáveis pela diferença na resposta imune, frente as infecções. Desta forma, as variações
nas citocinas tanto quantitativa como qualitativa também podem estar associadas com a susceptibilidade
do hospedeiro à doença periodontal. No presente trabalho, investigou-se por meio da PCR em Tempo Real, os
polimorfismos presentes no gene da IL17A (-197 A-G) na doença periodontal, assim como em uma amostra
saudável da população em geral. A presente amostra foi composta por 90 pacientes da população de Belém (PA):
52 com doença periodontal (DP); e ii) 38 controles saudáveis (CS). A extração do DNA foi realizada pelo método
orgânico fenol-clorofórmio, o DNA foi quantificado com auxílio do Espectrophotometer NanoDrop™ 1000 (Thermo
Scientific, CA, US), seguida da análise por PCR em Tempo Real. Esta amplificação foi realizado pela metodologia
de discriminação alélica com sistema de sondas TaqMan® (Life Technologies, CA, US). Todos os dados clínicopatológicos e genéticos foram analisados estatisticamente pelos programas Arlequin 3.1 e SPSS. Como resultado,
observou-se uma freqüência alélica para o alelo de risco (G) de 0,16 e 0,24 nos grupos DP e CS, respectivamente.
Em relação as frequências genotípicas observou-se 27,5% para a combinação AG e 2% para GG, no grupo da DP. No
grupo CS, as frenquências observadas foram 38,5% para a combinação genotípica AG e 5,1% para GG. A distribuição
genotípica em ambos os grupos encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg. O fator de risco do alelo IL17A*197
G na DP não apresentou valores significativos (X2=1.939; p=0.121). Entretanto, a análise de regressão logística
mostrou valores significativos em relação a presença do biofilme dentário (p=0.000). Estes dados confirmam os
observados na literatura em relação a presença do biofilme dentário no desenvolvimento da DP. Adicionalmente,
estes foram os primeiros resultados de análise genética para o polimorfismo IL17A(-197 A-G) na Doença Periodontal.
Apoio Financeiro: CNPq, UFPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
229
Associação de polimorfismos nos genes MSX1 e PAX9
com agenesia dentária
Boeira Júnior, BR; Rohr, R; Echeverrigaray, S
Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul, RS
Palavras-chave: agenesia dentária, gene msx1, gene pax9, mutação, polimorfismo
Agenesia dentária, a falha do desenvolvimento do germe dentário causando ausência definitiva do elemento
dentário, é a anomalia craniofacial humana mais comum, podendo afetar até um quarto da população em geral.
Entre os sinais clínicos e sintomas envolvidos observam–se injúrias à oclusão dentária, sintomatologia dolorosa
orofacial e na articulação temporomandibular (ATM), ineficiência mastigatória determinando disfunção no
aparelho digestivo e baixa autoestima devido à estética facial não agradável. Os indivíduos afetados com mais
de 6 ausências dentárias – oligodontia – normalmente apresentam esses sinais e sintomas de forma acentuada.
Na maioria dos casos, é segregada de maneira autossômica dominante; entretanto, a herança autossômica
recessiva e a ligada ao X também podem estar envolvidas. O aspecto etiológico principal parece estar relacionado
à função anormal de genes específicos que desempenham atividades fundamentais durante a odontogênese,
particularmente os genes MSX1 e PAX9. Apesar da alta prevalência da agenesia dentária, até o momento, somente
um número restrito de mutações nestes genes tem sido associadas à hipodontia e/ou oligodontia. O objetivo deste
estudo foi analisar, por meio de sequenciamento, as regiões codificantes dos genes MSX1 e PAX9 em busca de
mutações ou polimorfismos relacionados à agenesia dentária. Para tanto, foi avaliada uma amostra composta por
seis indivíduos, os quais apresentavam oligodontia ou hipodontia – ausência de até seis elementos dentários –
não sindrômica. Todos os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido e a pesquisa foi
aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa. O DNA foi obtido a partir de células do epitélio bucal provenientes
de raspagens com swab na mucosa jugal. Após o isolamento do DNA, procedeu–se a amplificação dos fragmentos
alvos (regiões exônicas dos genes avaliados) por meio de PCR. Em seguida, foi realizado o sequenciamento em
Sequenciador ABI Prism®, e os resultados foram analisados com auxílio do software BioEdit®. Os resultados das
sequências do exon 2 do gene MSX1 permitiram evidenciar a presença de um polimorfismo no indivíduo 3,
previamente descrito na literatura, e de uma mutação no indivíduo 6. Já os resultados das sequências do gene
PAX9 permitiram evidenciar três polimorfismos e três mutações. Os mesmos polimorfismos foram observados
em todos os indivíduos da amostra. Contudo, as três mutações foram encontradas em somente quatro dos seis
participantes. Estas mutações levam a alterações de aminoácidos – mutações missense que podem influenciar a
atividade da proteína PAX9. Devido à natureza e recorrência das mutações encontradas, sugere–se que as mesmas
apresentam associação com o fenótipo identificado nos indivíduos estudados.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
230
Variantes genéticas da calpaína-10 relacionadas ao
DM2 em uma tribo indígena da Amazônia brasileira
Oliveira, TF1; Diniz, IG1; Silva, ANLM1; Almeida, NCA1; Guerreiro, JF1
Laboratório de Epidemiologia Molecular - Laboratório de Genética Humana e Médica, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: Calpaína10, Diabetes Mellitus tipo 2, Asuriní.
O Diabetes Mellitus Tipo 2 (DM2) é uma doença multifatorial influenciada por fatores genéticos e ambientais.
A hiperglicemia é secundária à disfunção progressiva das células β pancreáticas e à capacidade reduzida das
células do organismo de utilizarem a insulina. Vários genes estão envolvidos na patogênese dessa doença e tornase crescente o número de genes identificados em diferentes estudos associados ao DM2. Cada conjunto de genes
apresenta um pequeno papel no desencadeamento do DM2. O gene da calpaína 10 tem sido associado a DM2 e
algumas síndromes metabólicas em diferentes populações. Este gene é sintetizado em vários tecidos do corpo
(incluindo coração, fígado, músculo esquelético e pâncreas), está situado no cromossomo 2q 37.3 e codifica
uma protease neutra cálcio-ativada que coordena a ativação ou inibição de inúmeras proteínas implicadas na
sinalização intracelular, proliferação, diferenciação (incluindo adipocítica) e nos mecanismos de secreção de
insulina. A combinação de haplótipos 112/121, definidos pela presença (1) e ausência (2) dos polimorfismos
nucleotídicos simples (UCSNP-43[G/A], UCSNP-19[del/ins] e UCSNP-63[C/T]) no gene CAPN10 foi descrito
como associado a DM2 em indivíduos Mexicano-Americanos, mas esse efeito não foi observado em amostras da
Corea, Japão, Reino Unido, Polônia, México e Samoa. Por outro lado, dois novos diplótipos, incluindo 111/121 e
121/121, demonstraram estar associados a diabetes tipo 2 em coreanos e europeus. O objetivo deste trabalho foi
investigar a frequência dos polimorfismos do gene CAPN10 (UCSNP-43, UCSNP-19, UCSNP-63) em 28 indivíduos
(5 com DM2) pertencentes a tribo indígena Asuriní, município de Altamira, PA. O DNA foi obtido de leucócitos por
método de extração com o kit comercial NeoIsoColumn (Neoscience®) e a genotipagem foi realizada por PCR-RFLP
utilizando enzimas de restrição HhaI (UCSNP-63) e NsiI (UCSNP-43) e posterior visualização em gel de agarose.
O polimorfismo CAPN19 (inserção de 32 pb) foi analisado por PCR seguida de visualização em gel de agarose. As
frequências haplotípicas foram calculadas pelo programa Mlocus. Apenas o diplótipo de risco 112/121(0,086) foi
identificado, no grupo controle. Nesse grupo os diplótipos mais comuns foram 221/122 (0,170) e 221/211 (0,210).
Entre os pacientes foram encontrados os diplótipos 211/111 (20%), 221/112 (20%), 221/121 (40%) e 221/122 (20%).
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e UFPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
231
Variante -116A DO GENE DA BUTIRILCOLINESTERASE
(BCHE) e atividade da butirilcolinesterase (BChE)
em amostras de pacientes com Diabetes Mellitus
gestacional (DMG) e de grávidas não diabéticas
Guimarães, LO1; Brandão, MB1; Bono, GF1; Setoguchi, TE1; Santoos, ICR2; Picheth, G2; Souza, RLR1;
Furtado-Alle, L1
Departamento de Genética, Setor de Ciências Biológicos – UFPR
Departamento de Patologia Médica, Setor de Ciências da Saúde – UFPR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: butirilcolinesterase, diabetes gestacional, gene BCHE, variante -116A, atividade enzimática.
A butirilcolinesterase (BChE) é uma esterase sérica, codificada pelo gene BCHE (3q26.1-q26.2) que possui quatro
exons formados por 2.445 pares de bases. Sua função no organismo e o seu substrato natural permanecem
desconhecidos, mas já foi associada ao metabolismo de lípides, à proteção da acetilcolinesterase e a patologias
como obesidade, diabetes, doença coronariana, câncer e Hanseníase. O exon 1 do gene BCHE contém um sítio
polimórfico no nucleotídeo -116 (TGC/TAC), conhecido como variante -116A, associado com a redução da
atividade da enzima. O Diabetes Mellitus Gestacional (DMG) é caracterizado por intolerância à glicose com início ou
primeiro diagnóstico durante o segundo ou terceiro trimestres da gestação e sua incidência é estimada em 3% a 8%
das gestantes. O presente estudo analisou a atividade da BChE e a freqüência da variante -116A do gene BCHE em
amostra de pacientes com DMG (N=116) e em grávidas não-diabéticas (N=293), ambas provenientes da cidade de
Curitiba – PR. A atividade enzimática foi quantificada em espectrofotômetro e a pesquisa da variante no sítio -116
foi realizada por PCR em tempo real. As freqüências alélicas e genotípicas foram obtidas por contagem direta e as
análises estatísticas foram feitas no programa Statistica para Windows. As freqüências genotípicas para a variante
-116A estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg e não diferem entre pacientes com DMG e controles (χ2= 0,976, p>0,25;
χ2= 0,0001, p>0,99, respectivamente). A frequência do alelo -116A não diferiu entre pacientes e controles (8,2% ±
2% e 5,8% ± 1%, respectivamente, χ2= 2,4, p>0,50). A média de atividade enzimática é significativamente mais
alta no grupo controle (2,83 KU/L ± 0,05) que no grupo de gestantes com DMG (2,24 KU/L ± 0,05; t= 8,21, p= 3,17
x10-15), mas nos dois grupos é significativamente menor que a média da atividade na população de Curitiba (4,76
KU/L ± 1,63; t=13,69 e p<0,0001 para grávidas não diabéticas; t=17,96 e p<0,00001 para pacientes com DMG). Nos
dois grupos avaliados, a média da atividade da BChE foi significativamente mais alta nos indivíduos homozigotos
para o alelo usual do que nos indivíduos heterozigotos com o alelo -116A (2,30 KU/L ± 0,60 e 1,93 KU/L ± 0,39;
t=2,33, p=0,02, para gestantes com DMG; e 2,87 KU/L ± 0,88 e 2,40 KU/L ± 0,81; t=2,9, p=0,004, para grávidas nãodiabéticas, respectivamente). Estudos anteriores sugerem que a atividade da BChE é aumentada em pacientes com
o Diabetes Mellitus, entretanto essa relação com o DMG não está tão bem definida, pois existem poucos estudos
de associação entre a BChE e esta patologia. A gravidez sabidamente leva a uma diminuição da atividade desta
enzima e a mutação -116A, quando somada a esse estado continua associada à redução da atividade da BChE.
Apoio financeiro: Capes/REUNI
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
232
Estudo de associação do polimorfismo 869T>C
(Leu10Pro) no gene do TGFB1 com a retinopatia e
nefropatia diabéticas em pacientes com diabetes
mellitus tipo 2
Giordani, CH1; Manica, MB1; Carvalho, PS1; Gonçalves, MH1; Crispim, D2; Canani, LH2; Santos, KG1,3
Centro de Pesquisas em Ciências Médicas, Universidade Luterana do Brasil (ULBRA)
Serviço de Endocrinologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
3
Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: diabetes mellitus tipo 2, retinopatia diabética, nefropatia diabética, polimorfismo, TGFB1.
O fator de crescimento transformante b1 (TGFB1) é uma citocina multifuncional que regula a proliferação, a
diferenciação, a formação da matriz extracelular e outras funções em vários tipos celulares. Como o polimorfismo
869T>C (Leu10Pro) localiza-se no peptídeo sinal, uma região que sinaliza a exportação do TGFβ1 recémsintetizado através da membrana do retículo endoplasmático, acredita-se que modificações na seqüência de
aminoácidos podem afetar a sua polaridade, levando a diferentes taxas de exportação desta proteína. Entretanto,
os poucos estudos que investigaram a relação deste polimorfismo com as complicações crônicas do diabetes
mellitus tipo 2 (DM2) obtiveram resultados contraditórios. Assim, o objetivo deste estudo de caso-controle é
analisar a associação do polimorfismo 869T>C no gene do TGFB1 com a presença e a gravidade da retinopatia
(RD) e nefropatia (ND) diabéticas, em pacientes ambulatoriais com DM2. Para isso, 371 caucasianos com DM2
provenientes de três centros médicos gaúchos (209 com e 133 sem RD; 182 com e 155 sem ND) foram genotipados
para o polimorfismo 869T>C por meio de PCR em tempo real, utilizando “primers” e sondas contidas em ensaio
comercial de discriminação alélica específico para a genotipagem desta variante (TaqManÒ, Applied Biosystems,
EUA). As análises estatísticas foram realizadas por meio do teste de qui-quadrado nos programas estatísticos
PEPI e SPSS. As freqüências alélicas e genotípicas obtidas para o polimorfismo 869T>C nos pacientes com RD
não diferiram significativamente daquelas observadas nos pacientes sem RD, mesmo quando a análise levou em
consideração a gravidade desta complicação (p>0,05 para todas as comparações). Da mesma forma, os pacientes
com e sem ND também não apresentaram diferenças estatisticamente significativas nas freqüências alélicas
e genotípicas. No entanto, quando a gravidade da ND foi analisada, observou-se que o alelo C foi bem menos
freqüente entre os 15 pacientes com insuficiência renal crônica (23,3%) do que entre os 155 normoalbuminúricos
(41,6%), 86 microalbuminúricos (50,6%), 35 macroalbuminúricos (42,9%) e entre os 46 pacientes em diálise (50,0%)
(p=0,036). Além disso, nenhum homozigoto para o alelo C foi observado entre os pacientes com insuficiência
renal crônica quando comparados aos demais grupos de pacientes. Esse resultado deve-se, provavelmente, a
um viés de mortalidade, pois os portadores do alelo C que progrediram para a insuficiência renal crônica podem
ter sobrevivido menos, e isso se refletiu na menor prevalência deste alelo entre os pacientes com doença renal
avançada. Como o tamanho amostral analisado até o momento é pequeno, novas análises são necessárias para
avaliar o papel do polimorfismo 869T>C no gene do TGFB1 na patogênese das complicações crônicas do DM2.
Apoio financeiro: CNPq e ULBRA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
233
Associação do polimorfismo SW19 do gene da
apolipoproteína A5 e o diabetes mellitus tipo 2
Pinheiro, PS1; Sóter, MO1; Fernandes, AP1; Carvalho, MG1; Sousa, MO1; Gomes, KB1,2
Departamento de Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Minas
Gerais, Brasil
2
Colégio Técnico, Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: gene APOA5, polimorfismo SW19, apolipoproteína A5, diabetes mellitus tipo 2, dislipidemia.
O diabetes mellitus tipo 2 (DM2) é caracterizado como uma síndrome de etiologia múltipla, devido a produção
deficiente de insulina e/ou redução da sensibilidade dos tecidos alvo ao efeito bioquímico da insulina, descrito
como resistência insulínica. Portadores de DM2 apresentam mortalidade três vezes maior do que a população em
geral e a dislipidemia é um dos principais fatores de risco para doença cardiovascular em pacientes diabéticos.
As alterações lipídicas mais frequentes na população diabética são aumento de triglicérides (TG), diminuição
de colesterol da lipoproteína de alta densidade (HDLc) e alterações qualitativas nas lipoproteínas, tais como a
formação de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDLc) pequenas e densas. O gene da apolipoproteína
A5 (APOA5) é um membro recentemente descoberto no grupo ApoA1/C3/A4/A5, e o seu produto, a apoA5, parece
ativar a hidrólise intravascular dos TG pela lipoproteína lipase e inibir a produção hepática de lipoproteína de
muito baixa densidade (VLDLc). Polimorfismos do gene APOA5, como o SW19, têm sido associados com variações
nos níveis plasmáticos de TG em diferentes populações. Dessa forma, como a principal alteração no perfil lipídico
de diabéticos é o aumento de TG, justifica-se a investigação do polimorfismo SW19, bem como a avaliação da
correlação destes polimorfismos com perfil lipídico de pacientes portadores de DM2. O estudo objetivou a análise da
frequência do polimorfismo SW19 do gene APOA5 em 156 indivíduos portadores de DM2, selecionados no Hospital
de Especialidades Médicas do Instituto de Previdência Social de Minas Gerais (IPSEMG) e 163 indivíduos hígidos
(controles), confirmados por exames laboratoriais, selecionados no Banco de Dados e Amostras Biológicas da
Faculdade de Farmácia-UFMG. O estudo foi aprovado no Comitê de Ética da UFMG. Após extração de DNA do sangue
periférico, as amostras foram submetidas à PCR-RFLP. A análise genética mostrou que 14,1% e 16,0% dos indivíduos
diabéticos e controles, respectivamente, eram heterozigotos para o polimorfismo SW19. Indivíduos homozigotos não
foram detectados em nenhum dos grupos. As freqüências do alelo S foram de 0,93 e 0,92 e a do alelo W de 0,07 e 0,08
nos grupos diabéticos e controle, respectivamente. Não foram observadas diferenças significativas nas frequências
do polimorfismo entre os dois grupos estudados (p=0,644; OR=0,865; IC=0,470-1,592; teste Qui-quadrado). Esses
dados indicam que o polimorfismo SW19 do gene APOA5 parece não ser associado ao desenvolvimento de DM2.
Patrocínio: FAPEMIG
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
234
Associação de polimorfismos na região promotora do
gene da interleucina 18 com a Diabetes Mellitus do
tipo 1, em pacientes do Estado de Pernambuco – Brasil
Tavares, NAC1; Serafim-Silva, SP1, Brandão, LAC1; Guimarães, RL1; Crovella, S1, 2
Laboratório de Variabilidade Genética - Laboratório de Imunopatologia Keiso Asami, Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Genética, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Diabetes melittus tipo 1, auto – imune, IL – 18, SNPs, mecanismos patogenéticos.
O Diabetes Mellitus Tipo 1 (DM1) é uma doença auto-imune, caracterizada pela destruição seletiva de células Beta
pancreáticas, produtoras de insulina. Atualmente, a DM1 é classificada como uma doença crônica multifatorial
dependente da complexa interação entre a resposta imunológica, fatores genéticos e a influência do meio-ambiente
que estão associados para a produção do fenótipo final. Um dos componentes de fundamental importância na
imunomodulação e polarização da resposta imune de linfócitos T são a Interleucina (IL) -18. A IL-18 é uma potente
citocina pró-inflamatória. Polimorfismos no gene para a IL-18 têm sido associados com susceptibilidade a DM1.
As variações genéticas estudadas são encontradas na posição -607 (A / C) (rs1946518) e -137 (C / G) (rs187238) da
região promotora da IL-18. O presente estudo tem como principal objetivo, avaliar a associação de polimorfismos
funcionais na região promotora do gene IL18 com a susceptibilidade ao desenvolvimento da DM1 em crianças e
adolescentes do Estado de Pernambuco e esclarecer os mecanismos patogenéticos envolvidos com a promoção do
seu quadro auto-imune. As amostras foram processadas e tiveram o seu DNA genômico humano extraído de acordo
com as instruções do fabricante do Kit comercial. Em seguida, foi realizada uma reação em cadeia da polimerase
(PCR) utilizando primers específicos para a região promotora do gene IL18. Os produtos obtidos foram seqüenciados
em analisador genético Mega BACE (TM) 750. As freqüências alélicas do SNP G-137C (n=96) do grupo controle
foram: C=27% (53/192) e G=72% (139/192), com as freqüências genotípicas sendo: C/C=10% (10/96), C/G=33%
(33/96) e G/G=55% (53/96). As freqüências alélicas do SNP C-607A (n=96) foram: C=57% (110/192) e A=42% (82/192);
enquanto as freqüências genotípicas foram C/C=33% (32/96), C/A=48% (46/96) e A/A=19% (18/96). As freqüências
observadas no grupo controle para ambos os polimorfismos estudados estão em conformidade com o Princípio de
Hardy-Weinberg. Foram construídos os haplótipos possíveis para os SNPs, observando-se as seguintes freqüências:
AC = 27%, CG = 57% e AG = 15%. Comparando-se nossos resultados às freqüências dos haplótipos possíveis para os
SNPs -607/-137 com os de Segat et al. (2009), que utilizaram um grupo controle composto por brasileiros diferente do
nosso, observamos grande semelhança na distribuição dos haplótipos. O seqüenciamento das amostras do grupo de
pacientes DM1 pertencente ao grupo de estudo já foi realizada. A genotipagem está sendo realizada para permitir a
comparação estatística com o grupo controle, dessa forma, será possível traçarmos um perfil genético dos grupos e
compreender a função do gene IL18 como marcador no desenvolvimento da DM1. A genotipagem do grupo controle
será ainda aumentada para ampliar nosso número amostral. Conclusões: O entendimento progressivamente
mais detalhado da patogenia dessa doença culminará com estratégias terapêuticas cada vez mais efetivas.
Apoio financeiro: Facepe
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
235
Associação entre o gene da butirilcolinesterase e
diabete melito tipo 1
Fernandes, AB1; Almeida, ACR2, Réa, RR2; Furtado-Alle, L1; Souza, RLR1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná
Hospital de Clínicas, Universidade Federal do Paraná
[email protected]
1
2
Palavras-chave: butirilcolinesterase, diabete melito tipo 1.
A butirilcolinesterase (BChE) é codificada pelo gene BCHE que apresenta dezenas de alelos, sendo alguns
polimórficos. O diabete melito (DM) é uma síndrome de etiologia múltipla, decorrente da falta de insulina e/ou
da incapacidade desta exercer adequadamente seus efeitos levando a vários distúrbios metabólicos. O objetivo
deste estudo foi buscar informações que levem à indicação mais precisa do possível envolvimento do gene BCHE
na susceptibilidade ao diabete melito ou se existe outro gene de susceptibilidade na região proximal ao gene
BCHE. Foram utilizadas duas amostras de pacientes com DM1, uma já coletada em estudo anterior (N=71) e outra
coletada para o presente estudo (N=103), com suas respectivas amostras controle. Ambas as amostras de DM1
foram coletadas no Hospital de Clínicas, Curitiba, PR. As amostras controle são de doadores de sangue de Curitiba,
coletadas no HEMEPAR. A nova amostra de pacientes com DM1 foi genotipada para as mutações K (rs1803274),
-116 (rs1126680), já genotipadas para a amostra antiga e controles, e os 4 SNPs (para as duas amostras e respectivos
controles) em torno do gene BCHE (rs2863381 e rs4440084 a montante do gene e rs7624915 e rs4387996 a jusante do
gene) utilizando a técnica de genotipagem por PCR em tempo real. Fazendo a análise conjunta das duas amostras,
foram encontradas diferenças significativas, entre DM1 e seus controles, na freqüência genotípica (rs1803274 e
rs7624915) e na freqüência alélica (rs7624915 e rs4387996). Em estudo anterior de nosso laboratório, com a amostra
antiga, foi encontrada diferença na freqüência da mutação K e -116 quando a amostra de DM1 foi separada pela
mediana da idade de aparecimento de DM1. Com as amostras agrupadas, esse resultado não se repetiu, no entanto,
foi encontrada diferença para o SNP rs7624915. Esse SNP é o mesmo que apresentou diferenças alélica e genotípicas
entre DM1 e seus controles. Como esse SNP, assim como o outro que apresentou diferença na freqüência alélica
ficam a jusante do gene BCHE, pode ser que a associação encontrada seja com outro gene próximo ao gene.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
236
Associação de polimorfismos na região codificadora do
gene FYB (Fyn Binding Protein) com a susceptibilidade
ao lupus eritematoso sistêmico
Addobbati, CJC¹; Brandão, LAC¹;Guimarães, RL¹; Pancotto, JAT2; Donadi, EA2; Crovella, S1,3, Sandrin-Garcia, P¹
Laboratório de Imunologia Keizo Asami LIKA/Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Depto de Clínica Médica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/Universidade de São Paulo (USP)
3
Depto de Genética/ Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
[email protected]
1
2
Palavras-chaves: FYB, Lupus Eritematoso Sistêmico, SNP, auto-imunidade e PCR em tempo real
Introdução: O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença auto-imune que afeta diversos órgãos e sistemas.
Embora os fatores que contribuem para a patogenia da doença não estejam esclarecidos, sabe-se que o LES é
um distúrbio multifatorial que envolve a ativação de células B e T auto-reativas contra uma variedade de
componentes intracelulares. Desse modo, o gene FYB pode estar envolvido no desencadeamento da doença, uma
vez que codifica uma proteína sinalizadora da cascata de células T e participa da modulação da expressão de
interleucina-2A. O presente estudo investigou a associação de 13 SNPs localizados em diferentes exons do gene
FYB com a susceptibilidade ao LES. Métodos: As genotipagens foram realizadas através da PCR em tempo real,
utilizando a tecnologia de sondas TaqMan e o Rotor Gene 3000 como plataforma (Uniscience, Corbett Research).
O grupo de estudo foi composto por 143 pacientes com LES e 185 indivíduos saudáveis como grupo controle. As
frequências obtidas foram analisadas pelo genotype transposer e teste exato de Fisher para avaliar o Equilíbrio
de Hardy-Weinberg (HW) e a associação ao LES, respectivamente. Resultados: Todos os grupos analisados
estavam em equilíbrio de HW. Foram observadas diferenças significativas entre as frequências alélicas do grupo
controle e dos pacientes para o SNP [C/T] encontrado no exon 1 (rs6863066) e para os SNPs [A/G] e [C/T]
localizados no exon 19 (rs2161612 e rs358501, respectivamente). As freqüências alélicas observadas para o SNP
no exon 1 foram C=62,94% e T=37,06% nos pacientes e C=25,5% e T=74,5% nos controles (p<2.2e-16, OR=4.95).
Para o SNP [A/G] no exon 19 foram obtidas as freqüências A=26,92% e G=73,08% nos pacientes e A=69,8% e
G=30,2% nos controles (p<2.2e-16, OR=6.26). Para o SNP [C/T] no exon 19, observamos as freqüências C=24,8%
e T=75,2% nos pacientes e C=16,3% e T=83,7% nos controles (p= 0, 007, OR=1.69). Não foi observada associação
entre os outros SNPs estudados e a susceptibilidade ao LES. Conclusão: Existe associação entre SNPs na região
codificadora do gene FYB e o aumento do risco de desenvolvimento de LES. Entretanto, futuros estudos para
investigar uma possível função da proteína codificada pelo gene ainda são necessários para a compreensão da
fisiopatologia da doença, aperfeiçoamento de métodos diagnósticos e tratamentos terapêuticos para a doença.
Apoio Financeiro: FACEPE (Bolsa BIC-0760-2.01/09)/CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
237
Análise de polimorfismos no gene MBL2 (MannoseBinding Lectin) em pacientes com lúpus eritematoso
sistêmico e artrite reumatóide
Fernandes, KM1; Fragoso, TS2; Dantas, AT2; Duarte, ALBP2; Crovella, S1,3; Sandrin-Garcia, P1
Laboratório de Imunologia Keizo Asami LIKA/Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
Serviço de Reumatologia, Hospital das Clínicas/Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
3
Depto de Genética/ Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)
[email protected]
1
2
Palavras-chaves: MBL2, LES, AR, polimorfismo e PCR em tempo real
Introdução: Doenças autoimunes acometem cerca de 3 a 5% da população em geral. O Lúpus Eritematoso Sistêmico
(LES) e Artrite Reumatóide (AR) são duas importantes doenças autoimunes responsáveis por uma considerável
parcela de morbilidade e mortalidade em todo mundo. Tanto LES quanto AR são doenças sistêmicas, inflamatórias
e progressivas, com manifestações clínicas múltiplas. A herança é multifatorial, sendo que vários fatores estão
implicados no desencadeamento dessas doenças como genéticos, ambientais, hormonais e imunológicos. O gene
MBL2 tem papel fundamental no sistema imune inato humano, em processos inflamatórios, e já foi relatada a
associação entre a freqüência aumentada de alelos mutantes neste gene em pacientes com doenças auto-imunes,
como LES e AR. Desta forma, devido à associação do gene MBL2 com doenças auto-imunes, e uma vez que a patogenia
de LES e AR não é completamente conhecida, o gene MBL2 é considerado um forte candidato a estar envolvido na
susceptibilidade, atividade de doença e prognóstico do LES e AR. Objetivos: Genotipagem dos polimorfismos do
exon 1 (A/O) (codons 52, 54 e 57) do gene da MBL2 em pacientes brasileiros com LES e AR utilizando a técnica de
PCR em tempo real. Métodos: As genotipagens foram realizadas através da PCR em tempo real, pela metodologia
da curva de quantificação e de melting, respectivamente, usando o Rotor Gene 3000 como plataforma (Uniscience,
Corbett Research). O grupo de estudo foi composto por 38 pacientes com LES e 23 pacientes com AR e grupos
controles com 38 e 23 indivíduos saudáveis para cada grupo de pacientes. As frequências obtidas foram analisadas
pelo genotype transposer e teste exato de Fisher para avaliar o Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HW) e a associação ao
LES e AR, respectivamente. Resultados: Tanto o grupo analisado para LES quanto para AR estavam em Equilíbrio
de Hardy-Weinberg. As freqüências alélicas observadas para LES foram A=63,2% e O=36,8% nos pacientes e
A=68,4% e O=31,6% nos controles (p=0,60). As freqüências alélicas observadas para AR foram A=63% e O=34%
nos pacientes e A=71,7% e O=28,3% nos controles (p=0.50). Os resultados obtidos não mostraram associação
entre os polimorfismos analisados e a susceptibilidade ao LES e AR. Conclusão: Não foram observadas diferenças
significativas entre as frequências alélicas e genotípicas dos grupos controles e dos pacientes com LES e AR.
Apoio Financeiro: FACEPE(APQ-0087-2.02/08)/CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
238
Influência do polimorfismo BAT1 -22 no
desenvolvimento da Doença de alzheimer na
população de Vitória–ES
Almeida, LD1; Camporez, D1; Belcavello, L1; Almada, BVP1; Morelato, RL2,3; Paula, F1
1 Núcleo de Genética Humana e Molecular (NGHM), Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Humanas e Naturais
(CCHN), Universidade Federal do Espírito Santo (UFES)
2 Escola de Medicina da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM)
3 Hospital da Santa Casa de Misericórdia (HSCM)
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: Doença de Alzheimer; Estudo de associação; BAT 1; Doenças multifatoriais; Vitória-ES
A Doença de Alzheimer (DA) é a doença mais comum do envelhecimento. O aumento da longevidade assegura
que sua prevalência crescerá ainda mais. A DA é uma desordem neurodegenerativa progressiva caracterizada
por declínio cognitivo global, incluindo a perda progressiva da memória, raciocínio e linguagem. É uma doença
multifatorial resultante da combinação de envelhecimento, predisposição genética, exposição a um ou mais
agentes ambientais como traumatismo craniano, vírus e/ou toxinas, fatores sociodemográficos como nível de
educação/estudo, inteligência, estilo de vida, aspectos de nutrição, condicionamento aeróbico e exercício mental.
Estudos com gêmeos sugerem que cerca de 74% de risco para DA de início tardio (início após os 65 anos) é genético.
Estudos têm sido realizados com o objetivo de identificar as variáveis genéticas associadas à DA e como elas atuam
no seu desenvolvimento. O presente trabalho é um estudo de associação, em pacientes e controles de Vitória-ES,
que analisou o polimorfismo na posição -22 da região promotora do gene BAT1, substituição de uma Guanina
(G) por uma Citosina (C), apontado em estudos anteriores como fator de proteção para a DA. O gene BAT1 é um
membro da família DEAD-box de RNA helicases, localizado no Complexo Principal de Histocompatibilidade no
cromossomo 6, numa região que afeta várias desordens imunopatológicas e é considerado um regulador negativo
de inflamação. Esse gene parece regular a produção de citocinas inflamatórias associadas com a DA. A amostra
conta com 264 indivíduos não consangüíneos dentre eles 82 são pacientes com diagnóstico de DA de acordo
com os critérios NINCDS-ADRDA e 182 são controles pareados em relação à idade e sexo. A proporção sexual
entre pacientes foi 54 mulheres e 28 homens com idade média de 80.28 ± 7.44 e entre controles 132 mulheres e
50 homens com média de idade de 78.18±8.29. Até o momento foi analisada 87% da amostra, sendo que a mesma
foi submetida ao método PCR-RFLP com a enzima de restrição Alw44I, analisada em gel de poliacrilamida a 7% e
coradas com nitrato de prata. A frequência dos alelos G e C foi de 65% e 35%, respectivamente, na amostra total
estudada. Os resultados estatísticos dos genótipos GG, CG e CC, foram, respectivamente: OR= 1.537, 95% IC.: 0.83352.823, p= 0.2016; OR=0.6902, 95% IC.: 0.3758-1.267, p= 0.2677 e OR= 0.5328, 95% IC.: 0.02521-11.262, p= 1.0000. Esses
resultados sugerem que o polimorfismo estudado é, estatisticamente, não significativo. Polimorfismos associados
à doenças multifatoriais podem se comportar de diferentes formas (risco, proteção neutro), dependendo do grupo
populacional estudado, em função do perfil genético de cada grupo étnico. Assim, estudos de diferentes populações
são importantes para identificar fatores relacionados a doenças específicas. Nesse estudo os resultados sugerem
que o polimorfismo BAT1 -22 não apresenta associação com DA em pacientes de Vitória-ES.
Agência financiadora: FACITEC, Arcelor Mital Brasil, FAHUCAM.
Apoio: UFES, EMESCAM e HSCM.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
239
Investigação da mutação c.1448T>C (p.L444P) no
gene GBA como fator de risco para a Doença de
Parkinson
Pereira, ACV1; Santos, AV1; Santos, FL1; Rodrigues, FC1; Guimarães, BC1; Campos Jr. , M1; Santos, JM1;
Pereira, JS3; Nicaretta, DH3,4; Rosso, ALZ2; Santos-Rebouça, CB1; Pimentel, MMG1
Departamento de Genética, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
3
Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do Rio de Janeiro
4
Santa Casa de Misericórdia do Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Doença de Parkinson, GBA, L444P, Glicocerebrosidase.
A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais frequente depois da Doença de
Alzheimer e afeta aproximadamente 1% da população com idade superior a 65 anos. Caracteriza-se pela
presença de tremor de repouso, bradicinesia, rigidez muscular, instabilidade postural, decorrente da perda
seletiva de neurônios dopaminérgicos e da formação de agregados de alfa-sinucleína (corpúsculos de Lewi). A
DP é uma desordem complexa, resultante da interação de fatores ambientais e genéticos. Entre estes, podemos
destacar mutações no gene GBA, localizado em 1q21, codificador da enzima glicocerebrosidase. Temos como
objetivo determinar a freqüência da mutação p.L444P em pacientes com DP, em comparação com uma amostra
controle, visando analisar se esta mutação constitui um fator de risco para a doença na população brasileira.
Foram analisados 206 pacientes com DP, de ambos os sexos e uma amostra controle de 155 indivíduos. A
extração de DNA foi realizada a partir de amostras de sangue periférico ou de saliva. A triagem molecular
da referida mutação foi realizada através da técnica de PCR-RFLP, seguida por digestão enzimática com a
enzima NciI e análise em gel de agarose 2%. Identificamos 7 pacientes DP com a mutação L444P (3,39%), não
sendo esta encontrada em nenhum individuo da amostra controle. Até o momento, nossos resultados, apóiam
a hipótese de que esta mutação pode constituir um fator de risco para a doença na população brasileira.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde, CNPq, FAPERJ, CEPUERJ.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
240
Estudo de associação entre o polimorfismo genético da
interleucina 1β e a osteoporose em idosos
Poli-Frederico, RC1; Carvalho, LCL1; Ruzzon, E1, Valério, ACB1; Araújo, ACG1; Souza,RDN1; Marquez, AS1;
Maciel, SM1
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade Norte do Paraná
[email protected]
1
Palavras-chave: Polimorfismo genético, Interleucina 1β, Osteoporose, Idosos.
O processo de envelhecimento é um fenômeno complexo resultando em inúmeras alterações fisiológicas, afetando
a integridade do organismo e permitindo o surgimento das doenças crônicas, com impacto sobre a saúde e a
qualidade de vida do idoso. Polimorfismos em genes que codificam mediadores da resposta imunológica têm
sido associados a parâmetros de densidade mineral óssea e à incidência de desordens comuns ao metabolismo
ósseo, em particular, a osteoporose. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar a associação entre as
frequências alélicas e genotípicas do gene da interleucina 1b e a osteoporose em idosos atendidos em unidades
básicas de saúde de Londrina/PR. Foram extraídos DNAs a partir de leucócitos do sangue periférico de 41 idosos
de ambos os gêneros. O polimorfismo no gene da IL-1β foi avaliado por meio da reação em cadeia da polimerase
seguida por digestão com a enzima de restrição TaqI. Foi utilizado o teste do c2. e a correlação de Spearman para
a análise das freqüências alélicas e genotípicas da IL-1b e a osteoporose. Maior parcela dos idosos pertencia ao
gênero feminino (54%) e à etnia branca (68%), possuindo entre 60 e 75 anos de idade (76%). 58% reportaram fazer
uma baixa ingestão de cálcio e 56% não tinham o hábito de fumar. Dos 41 idosos, 9,8% eram portadores da doença
osteoporose. Em relação ao genótipo, a maioria (75%) era representada por heterozigotos para o gene da IL1-B.
Foram encontradas uma associação estatisticamente significante (p = 0,007) e uma moderada correlação (r =
0,34) entre a osteoporose e o genótipo somente para o gênero feminino. Pode ser verificado que 67% das idosas
com osteoporose eram homozigotas para o alelo 1, em contra partida, as que eram heterozigotas ou homozigotas
para o alelo 2 não apresentaram esta comorbidade. Futuros estudos deverão ser conduzidos em um número maior
de indivíduos, assim como, avaliar outros polimorfismos genéticos envolvidos na predisposição à osteoporose.
Apoio Financeiro: Funadesp e UNOPAR
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
241
Estudo de associação do polimorfismo TNFA -850T na
Doença de Alzheimer na população de Vitória-ES
Camporez, D1; Almeida, LD1; Belcavello, L1; Almada, BVP1; Morelato, RL2,3; Paula, F1
1 Núcleo de Genética Humana e Molecular (NGHM), Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES)
2 Escola de Medicina da Santa Casa de Misericórdia de Vitória (EMESCAM)
3 Hospital da Santa Casa de Misericórdia (HSCM)
Palavras-chave: Doença de Alzheimer; TNFA; Vitória-ES
A Doença de Alzheimer (DA) é uma doença degenerativa, progressiva que compromete o cérebro causando
alterações comportamentais profundas, com efeitos devastadores sobre o doente e sobre a família. A Doença
de Alzheimer esporádica (DAE) é causada por fatores genéticos e ambientais, juntamente com fatores de
predisposição de cada indivíduo. Estudos estão sendo desenvolvidos sobre o mal de Alzheimer para identificar as
causas de predisposição genéticas da doença, dentre os genes estudados pode-se citar o polimorfismo -850T do
gene TNFA (Fator de Necrose Tumoral alfa), que substitui uma Citosina (C) na posição -850 da região promotora
do gene TNFA por uma Timina (T) localizado no cromossomo 6p21.3. A proteína TNFA age nos mecanismos
imunológicos e inflamatórios, desempenhando um papel importante na causa da DA. Tendo isso em vista
esse projeto de pesquisa tem como objetivo à análise do polimorfismo -850T no gene TNFA em portadores de
Alzheimer na população da grande Vitória-ES, por meio de métodos de associação (caso: controle). A amostra
é composta por 264 indivíduos não consangüíneos dentre esses 82 são pacientes com diagnostico de DAE de
acordo com os critérios NINCDS-ADRDA e 182 são controles pareados em relação á idade e sexo. A proporção
sexual entre pacientes foi de 54 mulheres e 28 homens com idade média de 80.28 ± 7.44 e entre controles 132
mulheres e 50 homens com média de idade de 78.18±8.29. As amostras foram submetidas ao método PCR-RFLP,
analisados em gel de poliacrilamida 7% com a enzima de restrição HincII e coradas com nitrato de prata. Foi
analisada, até o momento, 70% da amostra. As freqüências dos alelos C e T foram de 85% e 15%, respectivamente,
na amostra total estudada. Os resultados estatísticos dos genótipos CC, CT e TT foram, respectivamente: OR=
1.605, 95% IC.: 0.8358-3.080, p= 0.1743; OR=0.6570, 95%IC.:0.3298-1.309, p=0.2775 e OR=0.6667, 95% IC.:0.18102.456, p= 0.5067. Esses resultados sugerem que o polimorfismo estudado é, estatisticamente, não significativo.
O gene TNFA, uma citocina pró-inflamatória, é um importante regulador da resposta imune na inflamação
de múltiplos tecidos do organismo, incluindo o cérebro. Na população da Austrália o polimorfismo TNFA
-850T se comporta como um fator de risco para a doença de Alzheimer (Anastazita et al., 2008). Polimorfismos
de risco para doenças multifatoriais podem se comportar como um polimorfismo neutro dependendo do
grupo populacional estudado em função do perfil genético de cada grupo étnico. Assim, estudos de diferentes
populações são importantes para identificar os alelos de risco para doenças específicas. Nesse estudo os resultados
sugerem que o polimorfismo TNFA -850T não apresenta associação com DAE em pacientes de Vitória-ES.
Agência financiadora: FACITEC, Arcelor Mital Brasil, FAHUCAM.
Apoio: UFES, EMESCAM e HSCM.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
242
Influência dos genes APOE e HTR2A sobre escores de
memória no envelhecimento
Schuch, JB1; da Silva, VK2; Constantin, PC2; Orlandini, D3; DallaCosta, F3; Tisser, L3; de Andrade, FM2
Doutoranda em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Curso de Biomedicina, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Feevale
3
Curso de Psicologia, Instituto de Ciências Humanas, Letras e Arte, Universidade Feevale
[email protected]
1
2
Palavras-chave: memória, capacidade de aprendizado, APOE, HTR2A.
Alterações da memória são uma das queixas mais freqüentes durante o processo de envelhecimento, têm etiologia
multifatorial e envolvem fatores endógenos e exógenos. A etiologia desta característica ainda não está esclarecida,
mas sabe-se que fatores genéticos estão envolvidos nos processos metabólicos que a influenciam, e dentre estes estão
os genes relacionados aos neurotransmissores. O gene do receptor 2A do neurotransmissor serotonina (HTR2A)
tem sido relacionado com alterações da memória. O bloqueio deste receptor parece estar associado a um singelo
benefício à memória imediata e tardia. Outro gene candidato é o gene da APOE, que codifica a apolipoproteína E,
sendo produzida em abundância no cérebro pelos astrócitos. O objetivo do presente trabalho é analisar se algum
destes polimorfismos possui influência sobre os escores de memória em indivíduos com idade superior a 50 anos.
A amostra conta com 112 indivíduos da região metropolitana do Rio Grande do Sul. Foi coletado sangue venoso
para as análises genéticas. Para a avaliação da memória foram realizados os testes de Weschler de memória verbal
e visual imediata e tardia, e o teste de aprendizado de Rey, sendo que valores inferiores a -1 foram considerados
como déficit de memória. A genotipagem foi realizada através da técnica de PCR-RFLP na Universidade Feevale.
Os escores de memória foram ajustados para idade, sexo e nível educacional através de regressão linear múltipla.
Escores ajustados de memória foram comparados entre genótipos através de ANOVA e teste t. Freqüências alélicas
e genotípicas foram comparadas entre grupos com e sem déficit de memória através do teste de qui-quadrado.
As análises estatísticas foram realizadas através do programa SPSS versão 15.0. A freqüência do alelo 102C do
polimorfismo T102C do gene HTR2A foi de 58,2%. Não foi possível observar a influência deste gene sobre os escores
de memória e sobre a capacidade de aprendizado. Em relação ao gene APOE, a freqüência do alelo E*2 foi de 10,7%
e do alelo E*4 de 8,2%. Indivíduos E*2E*3 apresentaram piores escores para a memória visual imediata e tardia em
relação a homozigotos E*3E*3 (respectivamente, p=0,01; p=0,02). Portadores do alelo E*2 foram mais freqüentes
nas amostras com déficit de memória visual imediata (p=0,037). Não foi observada nenhuma influência do alelo E*4
neste estudo. O trabalho continua em andamento, e o aumento da amostra poderá determinar novas associações.
Apoio financeiro: CNPq, Feevale, CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
243
Estudo 80+: identificação de genes associados
à dominância motora em idosos cognitivamente
saudáveis
Naslavsky, MS1; Schlesinger, D1,2; Mendes, TAB2,3; Forbes, JF4; Amaro Jr, E2; Zatz, M1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo (USP)
Instituto do Cérebro, Instituto Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein
3
Departamento de Medicina Preventiva, Faculdade de Medicina da USP
4
Instituto de Psicanálise Lacaniana
[email protected]
1
2
Palavras-chave: envelhecimento saudável, genômica populacional, dominância motora, fMRI, estudo de associação
No Brasil a população idosa em 2050 representará 30% da população total. Os componentes genéticos que participam
do desenvolvimento da assimetria funcional do cérebro e contribuem para a manutenção da função cognitiva
em idosos não são completamente conhecidos. Sabe-se que a dominância motora e a lateralidade cerebral estão
intimamente relacionadas com características fenotípicas da cognição e com predisposição a doenças diversas.
A proposta do Estudo 80+ é analisar dados fenotípicos de mil voluntários com mais de 80 anos, cognitivamente
saudáveis (MMSE ≥ 26), contemplando dados sobre dominância motora e cognição. Será realizada a genotipagem
de polimorfismos no genoma inteiro com o objetivo de identificar as variantes associadas às características
fenotípicas testadas. Os voluntários serão estudados em ressonância magnética de 3 Tesla, com aquisições
volumétricas, tratográficas e funcionais ( fMRI), o que deverá enriquecer os dados fenotípicos quantitativamente e
qualitativamente. Os dados de dominância motora serão complementados com dominância de áreas de linguagem
conforme resultado da fMRI. Os resultados parciais obtidos a partir de levantamento bibliográfico sugerem a
genotipagem de 150 SNPs localizados em 77 genes ao longo do genoma. Adicionalmente, foram selecionados para a
análise dois genes assimetricamente expressos entre os hemisférios cerebrais (HEY1 e LMO4), em busca de variantes
associadas a lateralidade, e em paralelo a genotipagem do gene ApoE, importante marcador do declínio da função
cognitiva. A média de idade dos voluntários entrevistados até o momento é de 85,4 anos, indivíduos os quais, após
levantamento do histórico familiar, declararam ter parentes próximos (pais, tios e irmãos) com grande longevidade,
mantendo-se ativos e sem evidências de declínio cognitivo. Os voluntários também se auto-avaliam como otimistas,
condição associada previamente com o variante 5-HTTLPR, polimorfismo localizado em um transportador de
serotonina. Estes indícios apontam para a herdabilidade de variantes associadas ao envelhecimento saudável.
Desta maneira, a medida que o número de voluntários recrutados pelo estudo atinja um patamar de significância
estatística, o cruzamento dos dados de genótipos e fenótipos, questionários e neuroimagens, permitirá a conclusão
do estudo de associação. A análise de componentes genéticos associados à assimetria cerebral poderá contribuir
para complementar o conhecimento sobre o envelhecimento e a manutenção da capacidade cognitiva em idosos.
Apoio financeiro: FAPESP/CEPID, INCT e CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
244
Polimorfismos 5-HTTVNTR e 5-HTTLPR no gene do
transportador de serotonina: depressão pós-parto e
avaliação das concentrações salivares de cortisol
Zimmermann-Peruzatto, JM1; Pinheiro, RT2; Silva, RA2; Oses, JP2; Giovenardi, M3; Almeida, S3
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Universidade Católica de Pelotas
3
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre
1
2
Palavras-chave: depressão pós-parto, transportador de serotonina, polimorfismo 5-httlpr, polimorfismo 5-httvntr, cortisol
Introdução: A depressão pós-parto (DPP) é um importante problema de saúde pública que pode provocar
a ruptura do vínculo entre a mãe e o bebê. A DPP é multifatorial e o seu surgimento pode ser favorecido por
componentes hormonais, genéticos e ambientais. O ciclo gravídico-puerperal é considerado um período de risco.
O risco de DPP é aumentado em mulheres que possuem histórico de depressão na família, logo, um componente
genético determina maior suscetibilidade. Segundo o DMS-IV, existe uma relação entre a sintomatologia
depressiva e as alterações na concentração cerebral de neurotransmissores, com destaque para serotonina (5HT). O transportador de serotonina (SERT) controla a intensidade e duração da re-captação da 5-HT nas sinapses
serotonérgicas e, diversos trabalhos associam os polimorfismos do gene do SERT (SLC6A4) com transtornos
mentais, como unipolar, bipolar, depressão e esquizofrenia. Objetivo: Investigar a associação dos polimorfismos
5-HTTVNTR e 5-HTTLPR no gene SLC6A4 com as concentrações salivares de cortisol (cort) e DPP. Material e
Métodos: A amostra foi constituída por 128 mulheres brancas da cidade de Pelotas/RS, triadas em ambulatórios
do SUS. O diagnóstico foi feita através de entrevista psiquiátrica usando-se o Inventário de Depressão de Beck
(BDI). A região promotora do gene contendo o polimorfismo 5-HTTLPR e a região do segundo intron contendo
o polimorfismo 5-HTTVNTR foram amplificadas através da reação em cadeia da polimerase. A dosagem do cort
foi realizada a partir da saliva por técnica de ELISA utilizando kit específico. A mediana e o intervalo interquartil
das concentrações salivares do cort entre os portadores dos diferentes genótipos foram comparados entre os
grupos estudados usando o teste de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. A comparação das freqüências alélicas e
genotípicas dos polimorfismos estudados entre as mulheres que apresentarem ou não DPP foi feita pelo teste do
Qui-quadrado, com correção de Yates quando necessário. Resultados e Conclusões: Nossos resultados apontam
para a não existência de associação entre o polimorfismo 5-HTTLPR do gene SLC6A4 e o diagnóstico de DPP em
mulheres brancas nos modelos co-dominante (p=0,48), dominante (p=0,48) e recessivo (p=1,00) do alelo curto (S).
Além disso, não verificamos associação entre o polimorfismo 5-HTTVNTR utilizando-se o modelo co-dominante
(p=0,77) e o diagnóstico de DPP. Em relação às concentrações salivares de cort não observamos diferença
significativa na associação destas e os modelos co-dominante (p=0,41), dominante (p=0,25) e recessivo (p=0,32) do
alelo (S) do polimorfismo 5-HTTLPR. Por outro lado, houve diferença significativa entre as concentrações salivares
de cort e o modelo co-dominante (p=0,03) do polimorfismo 5-HTTVNTR do gene SLC6A4. Ao melhor de nosso
conhecimento, este é o primeiro estudo investigando a associação destes polimorfismos com DPP e concentrações
de cortisol em mulheres no período pós-parto, mais estudos devem ser realizados para que conclusões definitivas.
Agências Financiadoras: CNPq, PROAP/UFCSPA,
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
245
Polimorfismo no gene do receptor nicotínico
subunidade α5 (CHRNA5) na suscetibilidade a
dependência de substâncias
Polina, ER; Contini, V; Bau, CHD
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UFRGS, Porto Alegre, RS, Brasil
Palavras-chave: alcoolismo, tabagismo, D398N, nicotina, acetilcolina
O uso de álcool e tabaco está amplamente correlacionado em humanos, estima-se que 80-90% dos dependentes
de álcool sejam tabagistas. A prevalência de fumantes em pacientes dependentes de álcool é maior que
na população em geral. Além disso, é observada uma maior gravidade na dependência de álcool entre os
fumantes, como uma maior frequência e quantidade de álcool consumida. As dependências de álcool e nicotina
possuem envolvimento de componentes genéticos e ambientais, podendo haver uma suscetibilidade genética
compartilhada. Os receptores nicotínicos neuronais de acetilcolina (nAChRs) são expressos no sistema nervoso
central e periférico e são os principais alvos da nicotina. Estudos farmacológicos e neuroquímicos sugerem que
o etanol também pode interagir com os nAChRs. Os receptores nicotínicos são componentes importantes do
sistema de recompensa dopaminérgico, o qual pode ser um elemento comum de muitos tipos diferentes de
dependência. Uma alta concentração desses receptores está presente nos neurônios dopaminérgicos, sendo que
o subtipo α4α5β2 é o mais expresso. A subunidade α5 forma somente receptores funcionais quando presente
com outras subunidades α e β, e a presença dessa subunidade parece alterar as propriedades funcionais dos
nAChRs através de mudanças conformacionais. O gene CHRNA5 codifica a subunidade α5 de receptor nicotínico
e está localizado na região cromossômica 15q25. O polimorfismo D398N (rs16969968) é uma substituição não
sinônima (G>A) que resulta na troca de aminoácido no códon 398 (Asp398Asn). Foi observado que as formas
variantes da subunidade α5 alteram a função do receptor sem afetar a expressão do receptor. Este trabalho tem
por objetivo verificar uma possível associação entre o polimorfismo D398N e a dependência de substâncias. A
amostra (ainda em obtenção) consiste de 104 dependentes de álcool tabagistas, 118 tabagistas e 107 controles,
sendo todos do sexo masculino e eurodescendentes. A genotipagem do polimorfismo foi realizada através
do sistema de discriminação alélica TaqMan. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa
estatístico SPSS. Não foi observada diferença estatisticamente significante nas frequências genotípicas entre os
dependentes de substâncias e o grupo controle (alcoolistas tabagistas x controle: x2= 5,256 p= 0,072; alcoolistas
tabagistas x tabagistas x controle: x2= 6,774 p= 0,148; tabagistas x controle: x2= 2,048 p= 0,359). Nossos resultados
preliminares não evidenciam associação do polimorfismo com a dependência de álcool e o tabagismo.
Apoio financeiro: CNPq, PRONEX, FAPERGS, CAPES, HCPA, DECIT/SCTIE/MS/PPSUS.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
246
Análise da Transferência gênica da esquizofrenia em
pacientes psiquiátricos na cidade de Manaus
Britto-Jr, A¹; Vieira, DM¹; Oliveira, ACL de ¹; Moraes, LC de ¹; Ribeiro, HCT²; Fajardo, LB³; Souza, AQL de¹
¹Laboratório de Genética Humana da Escola Superior de Ciências da Saúde da Universidade do Estado do Amazonas (ESA/UEA)
²Laboratório de Genômica e Proteômica do Mestrado em Biotecnologia da Universidade do Estado do Amazonas (MBT/UEA)
³Centro Psiquiátrico Eduardo Ribeiro (CPER)
[email protected]
Palavras-chave: Psiquiatria, Esquizofrenia, Transferência Gênica, Heredograma, Manaus.
A esquizofrenia (ESQ) é uma das mais intrigantes doenças psiquiátricas e tem prevalência de cerca de 1% nas
diversas populações e geralmente acomete indivíduos durante o ápice dos seus processos produtivos. A idade
na primeira admissão hospitalar é mais precoce para os homens (média de 25 anos) do que para as mulheres
(média de 30 anos). A ESQ, assim como outras doenças complexas, é causada por uma série de fatores,
incluindo o ambiente e a herança gênica. De acordo com o modelo multifatorial, há vários genes envolvidos no
desenvolvimento do transtorno que podem agir de forma aditiva e sofrer influências ambientais, aumentando a
susceptibilidade à doença e/ou agravando o quadro do paciente. Este modelo requer também a existência de um
limiar de suscetibilidade, a partir do qual a doença passa a ocorrer. Estudar os padrões genéticos de pacientes
esquizofrênicos através da produção de heredogramas e analisar, para cada família, o risco de transferência gênica
dos padrões da esquizofrenia para os descendentes, foram os objetivos desta pesquisa na cidade de Manaus.
Foram investigações de casos de esquizofrenia na família de oito pacientes do Centro Psiquiátrico Eduardo
Ribeiro através de entrevistas com estes, parentes e responsáveis no Ambulatório Psiquiátrico Dra. Rosa Blaya,
as quais serviram de informação para a construção de heredograma das famílias de cada um dos pacientes
que participaram do estudo. A partir da análise dos dados foi possível a construção dos heredogramas com 3-5
gerações, cada família contendo de 15-52 indivíduos num universo total de 245 pessoas, destas 21 com diagnóstico
de esquizofrenia. Estudos mostram claramente que o risco de desenvolver esquizofrenia está aumentado nos
familiares dos probandos esquizofrênicos, sendo o risco mais marcado para os familiares de 1º grau e menor
nos de 2º grau, o mesmo foi visto em todas as famílias, tendo o predomínio de afetados entre parentes de 1º
grau, afetando irmãos, primos e tios principalmente. Foi observado que não há alternância de geração, marca
freqüente encontrada em heranças de cunho dominante exceto para a família 8. A ESQ atinge tanto homens
quanto mulheres (9 homens e 12 mulheres) avaliados nas 8 famílias, característica de herança autossômica e a
depressão aparece como uma das características fenotípicas mais freqüente nos afetados e em seus familiares.
Esta pesquisa destaca-se por ser a primeira que estuda as relações genéticas de pacientes esquizofrênicos na
cidade de Manaus e terá continuidade em 2010-11 ampliando a amostragem para 30 famílias. Espera-se poder
contribuir para a compreensão do padrão de caracteres fenotípicos ligados a esquizofrenia na cidade de Manaus.
Apoio: Fapeam, Susam, UEA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
247
Determinação da frequência alélica e genotípica do
polimorfismo G20210A do gene protrombina em
indivíduos com epilepsia provenientes do Estado de
Alagoas
Born, JPL1; Almeida, DH1; De Mendonça, LR1; Gitaí, LLG3; Machado, LCH4; Gameleira, FT3; Andrade, TG2;
Gitaí, DLG1
Setor de Genética e Biologia Molecular, ICBS, UFAL, Maceió
Laboratório de Biologia Molecular e Expressão Gênica, UFAL, Arapiraca
3
Setor de Neurologia, HUPAA, UFAL, Maceió
4
Setor de Histologia e Embriologia, ICBS, UFAL, Maceió
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Epilepsia Mioclônica Juvenil, polimorfismos genéticos, RFLP, SNP e Protrombina.
Epilepsia é uma desordem neurológica caracterizada pela presença de crises espontâneas e recorrentes, que
afeta 2 a 3% da população mundial. As crises epilépticas refletem atividade elétrica anormal e paroxística, que
podem ser causadas por inúmeras patologias estruturais ou neuroquímicas. Por ser de natureza complexa e
multifatorial, a epilepsia apresenta diferentes etiologias, sejam associadas a lesões cerebrais específicas, como no
caso das epilepsias sintomáticas; ou a alterações genéticas, como no caso das epilepsias idiopáticas. No entanto,
postula-se que, em ambas as situações, um limiar genético de susceptibilidade é essencial para o estabelecimento
das crises epilépticas. Assim, a identificação de variantes alélicos associados a este limiar é fundamental para o
entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na predisposição ou proteção às crises. Uma abordagem
para identificação desses alelos baseia-se na análise direta do material genético, através de estudos de associação.
Neste contexto, exploramos o Banco de DNA de indivíduos epilépticos e não-epilépticos da UFAL para investigar
se o polimorfismo G20210A do gene da protrombina está associado à Epilepsia Mioclonica Juvenil. Este variante
provoca uma hipertrombinemia que tem sido caracterizada como um fator de risco a trombofilias. Além do
mais, a trombina, uma serina-protease envolvida no processo de coagulação, está associada à indução de crises
epilépticas. A genotipagem está sendo realizada por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) que
possibilita a detecção dos variantes G ou A. Até o presente momento, 53 amostras de DNA de indivíduos com
Epilepsia Mioclônica Juvenil foram analisadas. O variante G apresentou uma freqüência de 99,06 % (105 alelos) e
o variante A de 0,94 % (1 alelo). As freqüências genotípicas dos homozigotos GG e AA e do heterozigoto GA foram
as seguintes: 98.11%, 0 % e 1,89 %, respectivamente. Embora estes dados ainda não tenham sido confrontados
com os dos indivíduos não-epilépticos da população alagoana, a freqüência do variante A na população estudada
é comparável às obtidas em estudos com outras populações. A comparação das freqüências alélicas e genotípicas
entre as populações epiléptica e não-epiléptica do Estado de Alagoas permitirá avaliarmos se o variante
polimórfico G20210A do gene protrombina está associado ao limiar genético de susceptibilidade ou proteção à
Epilepsia Mioclônica Juvenil, uma das síndromes epilépticas idiopáticas mais freqüentes no Estado de Alagoas.
Apoio financeiro: FAPEAL e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
248
Participação do gene PRODH na patogênese da
esquizofrenia
Bellucco, FTS1; Belangero, SIN1,2; Gadelha, A2,3; Ota, VK1; Christofolini, DM1; Santoro, ML1; Rocha, DMFL2,3;
Mari, JJ3; Smith, MAC1; Bressan, RA2,3; Melaragno, MI1
Disciplina de Genética, Departamento de Morfologia e Genética, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brasil
Laboratório Interdisciplinar de Neurociências Clínicas (LiNC), Departamento de Psiquiatria, Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP), São Paulo, Brasil
3
Departamento de Psiquiatria, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brasil
1
2
Palavras-chave: Esquizofrenia, PRODH, polimorfismos, prolina
A esquizofrenia é um transtorno mental grave e incapacitante, sendo uma das principais causas de anos perdidos
de vida saudável e que acomete 0,3 a 1,6% da população. Existem evidências de associação entre a esquizofrenia e
polimorfismos do gene PRODH, embora a sua ação na patogênese não esteja muito clara. Esse gene, localizado em
22q11.2, codifica a enzima POX (prolina oxidase) envolvida na degradação da prolina, catalisando sua conversão
em Δ1-pirolina-5-carboxilato (P5C). Essa enzima da membrana mitocondrial se expressa nos rins, no fígado
e no cérebro. Este estudo teve como objetivo investigar a relação entre polimorfismos do gene PRODH com a
esquizofrenia. Nós estudamos 188 portadores de esquizofrenia, acompanhados no Programa de Esquizofrenia
(PROESQ) da UNIFESP e 155 indivíduos saudáveis, selecionados pelo Laboratório Interdisciplinar de Neurociências
Clínicas (LiNC), utilizados como controles. A extração de DNA do sangue periférico foi realizada utilizando o kit
Gentra da Qiagen®. Foram estudados 16 polimorfismos do gene PRODH: rs4819756 no éxon 5, L289M no éxon 8,
rs2870987, rs2870986, rs2870985, rs34603845, rs16983466, rs2238731, rs2904552, rs2904551, rs3970559, rs1807467,
rs2870984 e rs2870983 no éxon 12, rs450046 no éxon 14 e rs372055 no éxon 15 por meio de PCR em Tempo Real
com sistema de detecção Taqman®, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) e seqüenciamento gênico.
Para verificar se os polimorfismos se encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg e para o estudo de associação
dos polimorfismos com a doença, utilizamos o teste Qui-Quadrado com índice de significância p<0,05. Nos
polimorfismos rs2870987, rs2870986, rs2870985 os alelos polimórficos não foram encontrados em nenhum dos
grupos e no rs34603845 o alelo polimórfico não foi encontrado no grupo de controles. Todos os polimorfismos
se encontraram em equilíbrio de Hardy-Weinberg com exceção do rs4819756. Foi observada uma associação
entre portadores do alelo G do polimorfismo rs2904552 (p=0,004) e do alelo A do rs2870983 (p=0,0188) com a
esquizofrenia, mas nenhuma associação entre os outros polimorfismos e a doença. Esses dados mostraram que o
gene PRODH parece participar na patogênese da esquizofrenia, sendo que polimorfismos funcionais nesse gene
podem levar à alteração na estrutura proteica e também à predisposição à doença.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
249
Polimorfismos funcionais do gene DGCR2 e sua
possível relação com reduções no córtex insular e
temporal em pacientes com esquizofrenia
Belangero, SIN1,2; Gadelha, A2,3; Ota, VK1; Christofolini, DM1; Bellucco, FTS1; Santoro, ML1; Mazzotti, DR1;
de Assunção, IB2,3; Rocha, DMLV2,3; Bressan, RA2,3; Melaragno, MI1; Smith, MAC1; Jackowski, AP2,3; Mari, JJ3
Disciplina de Genética, Departamento de Morfologia e Genética, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brasil
Laboratório Interdisciplinar de Neurociências Clínicas (LiNC), Departamento de Psiquiatria, Universidade Federal de São Paulo
(UNIFESP), São Paulo, Brasil
3
Departamento de Psiquiatria, Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brasil
1
2
Palavras-chave: Esquizofrenia, DGCR2, Ressonância Magnética Estrutural, Ínsula, Córtex Temporal.
A esquizofrenia é um transtorno mental grave e incapacitante e acomete 0,3 a 1,6% da população. Existem
evidências de associação entre a esquizofrenia e o gene DGCR2, embora sua ação na patogênese não esteja muito
clara. Esse gene, localizado em 22q11.2, codifica uma proteína transmembrânica com função ligante e parece
participar na migração das células da crista neural. Nosso objetivo foi investigar a relação entre polimorfismos do
gene DGCR2, tanto com a esquizofrenia quanto com a estrutura cerebral de pacientes. Estudamos 193 portadores
de esquizofrenia, acompanhados no Programa de Esquizofrenia da UNIFESP e 156 indivíduos saudáveis, utilizados
como controles. A extração de DNA do sangue periférico foi realizada utilizando o kit Gentra da Qiagen®. A
genotipagem de três polimorfismos (rs2073776, rs807759 e rs2072123) desse gene foi realizada por PCR em Tempo
Real com sistema de detecção Taqman®. Para verificar se os polimorfismos encontravam-se em equilíbrio de HardyWeinberg e para o estudo de associação dos polimorfismos com a doença, utilizamos o teste Qui-Quadrado com
índice de significância p<0,05. Dos 193 pacientes, 139 foram submetidos ao exame de ressonância magnética
(RM) estrutural em um aparelho de 1.5T. As imagens de RM foram analisadas através de morfometria baseada
em voxel utilizando SPM5, normalizadas ao template T1 e suavizadas utilizando um filtro Gaussiano isotrópico
de 10 mm. Os mapas probabilísticos da substância cinzenta foram comparados voxel-a-voxel usando uma análise
de covariância, na qual o volume encefálico foi utilizado como covariável. Para análise exploratória de imagens
cerebrais, os indivíduos foram separados de acordo com seus genótipos de cada polimorfismo genético estudado.
O valor de significância utilizado foi p<0.05 corrigido para múltiplas comparações, utilizando correções para
pequenos volumes. Todos os polimorfismos se encontraram em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Observamos uma
associação entre portadores do alelo T do polimorfismo rs2073776 e a esquizofrenia, mas nenhuma associação
entre os outros dois polimorfismos (rs2072123 e rs807759) e a doença. As análises dos mapas de substância
cinzenta revelaram uma redução significativa da ínsula direita (Z=3.33, pFDR<0.01) e dos giros temporais bilaterais
(Z=4.05, pFDR<0.01) nos sujeitos com genótipo GG, quando comparado com AG e AA para o rs2072123. O mesmo
padrão de achados foi encontrado nos sujeitos com o genótipo TT em comparação com CT e CC para o rs2073776.
Portadores do alelo T do polimorfismo rs2073776 apresentam risco para a esquizofrenia e quando em homozigose,
este alelo pode promover também uma redução do volume cerebral nas regiões da ínsula e dos giros temporais.
Portadores do alelo G em homozigose do polimorfismo rs2072123 também apresentaram redução do volume das
mesmas regiões cerebrais. Esses achados, tomados em conjunto, reforçam a idéia de que o gene DGCR2 pode, não
só estar relacionado à patogênese da doença, como também atuar no neurodesenvolvimento normal.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
250
Estudo de associação entre polimorfismo do gene
GABRG2 e Epilepsia Mioclônica Juvenil (EMJ) em
população do Estado de Alagoas
Almeida, DH1; Born, JPL1; Silva, LRP1; Marques, TEBS3; Gitaí, LLG2; Gameleira, FT2; Andrade, TG3; Machado, LCH4; Gitaí, DLG1
Setor de Genética e Biologia Molecular, ICBS, UFAL, Maceió
Setor de Neurologia, HUPAA, UFAL, Maceió
3
Setor de Genética e Biologia Molecular, UFAL, Arapiraca
4
Setor de Histologia e Embriologia, ICBS, UFAL, Maceió
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Epilepsia Mioclônica Juvenil, polimorfismos genéticos, PCR-RFLP, estudo de associação e GABRG2.
Epilepsia é uma desordem neurológica caracterizada pela presença de crises espontâneas e recorrentes, que
afeta 2 a 3% da população mundial. Por ser de natureza complexa e multifatorial, a epilepsia apresenta diferentes
etiologias, sejam associadas a lesões cerebrais específicas, como no caso das epilepsias sintomáticas; ou a alterações
genéticas, como no caso das epilepsias idiopáticas. No entanto, postula-se que, em ambas as situações, um limiar
genético de susceptibilidade é essencial para o estabelecimento das crises epilépticas. Assim, a identificação de
variantes alélicos associados a este limiar é fundamental para o entendimento dos mecanismos moleculares
envolvidos na predisposição ou proteção às crises. Uma abordagem para identificação desses alelos baseia-se na
análise direta do material genético, através de estudos de associação. Neste contexto, exploramos o Banco de DNA
de indivíduos epilépticos e não-epilépticos da UFAL para investigar se o polimorfismo SNP211037 (Asn196Asn)
do gene que codifica a subunidade γ2 do receptor do ácido γ-aminobutírico (GABRG2) está associado à Epilepsia
Mioclonica Juvenil. Objetivo: avaliar as freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo SNP211037 do gene
GABRG2 na população de indivíduos com Epilepsia Mioclônica Juvenil e indivíduos controle. Metodologia: até
o momento, 40 amostras de DNA de indivíduos com epilepsia e 36 amostras de DNA de indivíduos controle
foram genotipados quanto ao polimorfismo de interesse através de PCR-RFLP. As freqüências alélicas,
genotípicas e análises estatísticas foram determinadas através da plataforma SnpSTAT. Resultados e discussão:
Para a população de indivíduos com EMJ estudada, o variante (SNP211037)-C do gene GABRG2 apresentou
uma freqüência de 71% (57 alelos) e o variante (SNP211037)-T de 29 % (23 alelos). As freqüências genotípicas
dos homozigotos CC e TT e do heterozigoto CT foram, respectivamente: 50%, 7,5% e 42.5%. Para a população
de indivíduos controle o variante (SNP211037)-C do gene GABRG2 apresentou uma freqüência de 71% (51
alelos) e o variante (SNP211037)-T de 29 % (21 alelos). As freqüências genotípicas dos homozigotos CC e TT e
do heterozigoto CT foram, respectivamente: 50% (18 alelos), 8.3% (3 alelos) e 41.7% (15 alelos). As diferenças das
freqüências alélicas e genotípicas - entre os grupos epiléptico e controle - não foram estatisticamente significantes.
Desde que, em estudo independente, foi descrito a associação do polimorfismo SNP211037 do gene GABRG2 à
Epilepsia Idiopática Generalizada numa população Taiwanesa; a não associação deste polimorfismo à EMJ na
população Alagoana pode ser explicada por diferenças entre o background genético das populações. Conclusão:
o estudo em desenvolvimento, portanto, sugere fortemente que o polimorfismo SNP11037 (Asn196Asn) do
gene GABRG2 não está associado à Epilepsia Mioclônica Juvenil na população Alagoana. Entretanto, para
melhor avaliar esse dado, expandiremos as análises para um total de 70 amostras de cada grupo experimental.
Apoio financeiro: FAPEAL e CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
251
Estudo da variabilidade do gene DRD4 em alcoolistas e
em indivíduos com Transtorno de Déficit de Atenção e
Hiperatividade (TDAH)
Tovo-Rodrigues, L1; Roman, T1; Bau, CHD1; Callegari-Jacques, SM1,2; Hutz, MH1
Departamento de Genética; Instituto de Biociências; Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Departamento de Estatística; Instituto de Matemática; Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DRD4, VNTR, heterogeneidade alélica, alcoolismo, TDAH
O consumo de álcool é reconhecido como um importante problema de saúde pública. A Organização Mundial da
Saúde (OMS) estima que haja cerca de 2 bilhões de pessoas em todo o mundo que consumam bebidas alcoólicas
e 76,3 milhões de indivíduos com enfermidades relacionadas ao uso do álcool. Entre elas, o TDAH representa um
fator de risco para problemas com uso de bebidas alcoólicas, principalmente durante a adolescência. O gene DRD4,
que codifica o Receptor de Dopamina D4, tem sido amplamente estudado na susceptibilidade genética de ambas
as patologias. Seu terceiro éxon contém um polimorfismo do tipo VNTR de 48 pb cujas variantes apresentam uma
grande diversidade em populações humanas. O alelo de 7 repetições (7R) apresenta menor resposta à dopamina e é
considerado uma variante de risco, apesar de haver resultados conflitantes. Além disso, internos ao VNTR, muitos
polimorfismos do tipo SNPs são observados, totalizando 74 diferentes haplótipos descritos em humanos até o
momento. Um excesso de haplótipos raros no alelo 7R foi descrito para indivíduos com TDAH, mas o mesmo não foi
observado para autistas, sugerindo que variantes raras possam ser específicas de TDAH. O objetivo deste estudo é
comparar a variabilidade da região do VNTR do alelo 7R entre indivíduos com TDAH, alcoolistas e controles. De uma
amostra composta por 125 alcoolistas, 650 indivíduos com TDAH e 330 controles, tiveram seu DNA sequenciado
os indivíduos homozigotos para o alelo 7R, totalizando 7 alcoolistas, 31 indivíduos com TDAH e 15 controles. A
amplificação do alelo 7R foi realizada pela técnica de PCR e o sequenciamento através da empresa Macrogen Inc.
Os haplótipos foram derivados pelo método Bayesiano implementado no programa Phase 2.1. A comparação da
distribuição dos alelos entre casos e controles foi feita por Teste G. Dois diferentes haplótipos foram observados
em controles (6 sítios variáveis), três em alcoolistas (6 sítios variáveis) e 10 em indivíduos com TDAH (33 sítios
variáveis). As análises revelaram diferenças envolvendo a distribuição de haplótipos envolvendo o alelo 7R entre os
três grupos (P = 0,042). Entretanto, quando os grupos foram comparados entre si, a diferença se mostrou significante
entre controles e TDAH (P = 0,028), mas não entre alcoolistas e controles (P = 0,123). Os resultados sugerem que
variantes raras possam ser TDAH-específicas e que elas possam apresentar uma maior contribuição para a etiologia
do TDAH do que para o alcoolismo. Dessa maneira, heterogeneidade alélica pode estar atuando na região do VNTR
do gene DRD4 e as variantes raras possam ter um efeito confundidor nos estudos de associação com o TDAH.
Apoio financeiro: CNPq, Institutos do Milênio, PRONEX e FAPERGS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
252
Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade e
estudo de associação com os polimorfismos -141C
ins/del e TaqIA da região DRD2/ANKK1
Nuss, A1; Akutagava-Martins, GC1; Genro, JP1; Salatino-Oliveira, A1; Polanczyk, G2; Zeni, C2; Rohde, LAP2;
Hutz, MH1; Roman, T1
1
2
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Departamento de Psiquiatria e Medicina Legal, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Palavras-chave: TDAH, DRD2, ANKK1, sistema dopaminérgico, suscetibilidade
O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é um dos transtornos mais comuns da infância
e adolescência, com prevalência mundial estimada em 5% das crianças em idade escolar. Esse transtorno
apresenta três subtipos clínicos: predominantemente desatento, predominantemente hiperativo/impulsivo
e combinado, onde sintomas das duas outras áreas estão presentes. Etiologicamente, o TDAH é considerado
uma doença complexa, pois tanto fatores genéticos como ambientais são necessários para a manifestação dos
sintomas. Estima-se que sua herdabilidade seja de aproximadamente 76%. Evidências neurobiológicas sugerem
que genes codificadores de componentes do sistema dopaminérgico sejam os principais candidatos para estudos
moleculares com o TDAH, dentre eles o gene que codifica o receptor D2 de dopamina (DRD2). O estudo teve
enfoque em dois polimorfismos: TaqIA (rs1800497), SNP originalmente descrito na região flanqueadora 3’ do
DRD2 mas localizado no gene ANKK1 (ankyrin repeat and kinase domain containing 1) e -141C ins/del (rs1799732),
inserção/deleção localizada na região promotora do gene DRD2. O presente estudo buscou verificar a possibilidade
de associação destes polimorfismos com o TDAH numa amostra composta por 478 crianças e/ou adolescentes
diagnosticados pelo Programa de Déficit de Atenção e Hiperatividade do Hospital de Clínicas de Porto Alegre
(ProDAH-HCPA) de acordo com o DSM-IV e seus pais biológicos. Os polimorfismos foram genotipados por PCR
seguido de clivagem com as endonucleases de restrição TaqI e MvaI, respectivamente. A hipótese de associação foi
verificada por método baseado em famílias, através do programa FBAT. As frequências gênicas do polimorfismo
-141C ins/Del foi de 0,11 para o alelo 1 e de 0,89 para o alelo 2. As freqüências gênicas obtidas para o polimorfismo
TaqIA foi de 0,21 para o alelo 1 e 0,79 para o alelo 2. As freqüências genotípicas de ambos os polimorfismos se
encontraram em Equilíbrio de Hardy-Weinberg e de acordo com o descrito na literatura. Os resultados não
indicaram associação de nenhum dos polimorfismos com o TDAH. Apesar do resultado de associação ter
sido negativo na amostra estudada, não podemos afirmar que o gene DRD2 não contribui para a patofisiologia
do TDAH, uma vez que dados da literatura sugerem que seja um gene relacionado com comportamentos
caracterizados por impulsividade. É necessário um maior estudo de toda a região genômica DRD2/ANKK1 para
definir se a mesma influencia ou não no TDAH, através do estudo de outros polimorfismos e estudo de haplótipos.
Apoio financeiro: PROPESQ, FAPERGS, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
253
Estudo de associação entre o gene ADRA2A e o
Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade
Baumont, AC1; Ferraz, G1; Akutagava-Martins, GC1; Genro, JP1; Guimarães, APM1; Salatino-Oliveira, A1;
Polanczyk, G2; Zeni, C2; Schmitz, M2; Chazan, R2; Rohde, LA2; Hutz, MH1; Roman, T1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Departamento de Psiquiatria e Medicina Legal, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: TDAH, ADRA2A, associação, polimorfismos, doença complexa
O Transtorno de Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é uma das condições psiquiátricas mais comuns da
infância e adolescência, afetando cerca de 5% das crianças em idade escolar e sendo caracterizado por sintomas
de desatenção, hiperatividade e impulsividade. É considerado um fenótipo complexo e de herança multifatorial,
no qual a presença tanto de genes como de fatores ambientais é necessária para a manifestação dos sintomas.
A herdabilidade está entre as mais altas observadas em transtornos psiquiátricos, sendo estimada em 76%.
Estudos neurobiológicos indicam que pacientes com TDAH apresentam volume e atividade diminuídos no lobo
frontal, estriado e cerebelo, regiões nas quais as catecolaminas são os principais neurotransmissores atuantes.
Com base nessas evidências, acredita-se que mecanismos noradrenérgicos contribuam para a fisiopatologia do
TDAH, influenciando principalmente em aspectos cognitivos e de atenção. Projeções noradrenérgicas do locus
coeruleus para o córtex pré-frontal parecem modular diferentes funções nesta região. Ademais, níveis ótimos de
noradrenalina atuando especificamente através de receptores adrenérgicos do tipo α2A, parecem ser essenciais
para o funcionamento adequado do córtex pré-frontal, o que torna o gene que codifica o receptor adrenérgico α2A
(ADRA2A) um bom candidato para estudos moleculares. Este gene, particularmente o SNP MspI (rs1800544), já
foi investigado na nossa população, tendo sido obtidos resultados positivos em diferentes amostras e através de
diferentes abordagens. O objetivo do presente estudo foi aprofundar o estudo do gene ADRA2A na nossa população,
aumentando a amostra de TDAH genotipada para o MspI (rs1800544) e verificando a possibilidade de associação
com dois outros SNPs, HhaI (rs1800545) e DraI (rs553668). Para tanto, foi investigada uma amostra composta por
478 crianças e/ou adolescentes, diagnosticadas como casos de TDAH de acordo com os critérios do DSM-IV e
provenientes do Programa de Déficit de Atenção e Hiperatividade do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, assim como
seus pais biológicos. Os polimorfismos foram genotipados por PCR-RFLP. A hipótese de associação foi verificada
por método baseado em famílias, através do programa FBAT, para o grupo total de pacientes, pacientes apenas
do subtipo combinado, pacientes apenas do subtipo desatento e pacientes que apresentavam comorbidade com
transtorno de oposição desafio e/ou conduta. Não houve nenhuma evidência de associação entre os polimorfismos
estudados e o TDAH, seja como um todo ou subtipos (valores de P entre 0.066 e 0.898). Entretanto, os resultados
aqui apresentados são preliminares, havendo a necessidade de outras análises, tais como estudo dessas variantes
em haplótipos e análises de dimensões de sintomas entre pacientes de diferentes genótipos, principal abordagem
utilizada em nossos estudos anteriores. Assim, apesar dos resultados negativos, a continuidade das análises será
fundamental para compreender melhor o envolvimento do gene ADRA2A na etiologia do TDAH em nossa população.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPERGS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
254
Variantes em genes da rota do metabolismo do folato e
a suscetibilidade para os Transtornos do Espectro Autista
Godoy, BA1; Longo, D1; dos Santos, PAC1; Brandalize, APC1; Lima, ZSF1; Schuler-Faccini, L1
1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
Palavras-chave: autismo, transtornos do espectro autista, folato, gene mtrr, suscetibilidade
Introdução: Os Transtornos do Espectro Autista (TEA) formam um grupo heterogêneo de transtornos do
desenvolvimento caracterizado pelo prejuízo na interação social e comunicação, e por padrões restritos de
comportamentos e interesses. A prevalência na população é de ~1/300–1/500 e sua etiologia permanece
desconhecida, sendo apontados como possíveis fatores de risco genes envolvidos no desenvolvimento fetal, bem
como fatores ambientais presentes no período do desenvolvimento neurológico de indivíduos geneticamente
suscetíveis. Entre os fatores genéticos apontados, estão os genes polimórficos que codificam enzimas envolvidas
no metabolismo do ácido fólico. O folato é uma vitamina do complexo B que desempenha um papel importante no
desenvolvimento neurológico, agindo como co-fator na manutenção e reparo do genoma, regulação da expressão
gênica, metabolismo de aminoácidos, formação da mielina e síntese de neurotransmissores. O objetivo deste
estudo é investigar os polimorfismos MTR A2756G, MTRR A66G, CBS 844ins68 e RFC-1 A80G, envolvidos no
metabolismo do folato, e a suscetibilidade para os TEA em uma amostra do sul do Brasil. Material e métodos: A
análise caso-controle envolveu 152 pacientes com diagnóstico prévio de TEA idiopático, avaliadas clinicamente
e diagnosticadas de acordo com os critérios do DSM-IV-TR (American Psychiatric Association, 2000) e/ou do
questionário ASQ (Autism Screening Questionnaire), e 197 controles sem diagnóstico de TEA. O DNA genômico
foi obtido de amostras de sangue periférico e a genotipagem foi realizada através de PCR, seguida de clivagem
com enzima de restrição específica e posterior visualização dos fragmentos em gel de poliacrilamida ou agarose.
Freqüências alélicas foram estimadas por contagem direta e as freqüências genotípicas, com exceção daquelas
estimadas para o sistema MTRR, estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Resultados e discussão: A freqüência do
alelo 66G do MTRR (53,3% em casos e 36,5% em controles), bem como o genótipo homozigoto GG (20,3% em casos
e 6,0% em controles), foram significativamente maiores nos indivíduos com TEA (P=0,0003; P=0,00007). Quando
comparados os genótipos GG vs. AA+AG, observa-se um risco quatro vezes maior para os indivíduos com genótipo
homozigoto GG (OR:4,01; CI:1,52-11,21; P=0,0015). Para os demais polimorfismos, não foram observadas diferenças
significativas entre caso e controle. Nosso estudo é o primeiro a encontrar uma evidência de que o polimorfismo
MTRR A66G representa um fator de risco para desenvolvimento de TEA. Esse resultado está de acordo com dados
da literatura que sugerem alterações no metabolismo do folato como mecanismo envolvido na etiologia do autismo.
Apoio financeiro: FIPE-HCPA, CNPq, CAPES, FAPERGS e CNPq-Institutos do Milênio.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
255
As bases genéticas da dificuldade do aprendizado da
matemática
Miranda, M; Costa, LL; Couy, MF; Bretas, RV; Ferreira, FO; Locke, JFA; Micheli, LR; Júlio, A; Viana, VN;
Costa, DS; Pinheiro-Chagas, P; Moura, RJ; Oliveira, LFS; Haase, VG; Carvalho, MRS
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Departamento de Psicologia, Faculdade de Filosofia e Ciências Humanas, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: dificuldade de aprendizagem da matemática, Discalculia, déficit na memória de trabalho, déficit no processamento
quantitativo, déficit viso-espacial
Introdução: A dificuldade de aprendizagem da matemática (DAM) é um transtorno cognitivo, que afeta a população
infanto-juvenil em idade escolar, sendo responsável pelo elevado índice de repetência e abandono do processo de
escolarização, além de contribuir para a baixa auto-estima e salários inferiores à média. As principais características
da DAM são: déficits de processamento quantitativo numérico, memória de trabalho, função executiva, orientação
viso-espacial e habilidades verbais (estas associadas à dislexia). A freqüência populacional da DAM é de 3,5 a 6%.
Objetivos: Investigar as bases genéticas e os mecanismos de transmissão hereditária da DAM. Materiais e Métodos:
A amostra é aleatória e representativa da população em idade escolar de Belo Horizonte. A testagem inicial é
feita com o TDE (teste de desempenho escolar) e teste de transcodificação, aplicado em toda a turma. Uma vez
estabelecido a média e desvio-padrão para cada turma de cada escola, os alunos com resultados abaixo do percentil
25 (P25) são submetidos a uma bateria de avaliação, que inclui testes de inteligência, estado mental, função
executiva, memória, memória de trabalho, percepção viso-espacial, coordenação motora fina, orientação e função
somato-sensorial e linguagem. A avaliação da cognição matemática é feita através de tarefas computadorizadas
e de lápis e papel, que incluem estimação de magnitudes, comparações simbólicas e não-simbólicas, leitura de
números arábicos, ditado de numerais verbais, cálculos aritméticos simples e resolução de problemas formulados
verbalmente; além da coleta da história familiar. Até o presente momento 1.433 indivíduos foram triados, pelo TDE
e transcodificação. Dos indivíduos abaixo do P25, 111 já foram submetidos a testagem completa. Destes, 19 (1,3%)
apresentam retardo mental, 74 (5,2%) apresentaram dificuldade de matemática, leitura e escrita (DAMEL), e 37 (2,6%)
apresentaram DAM isolada. Das 23 famílias de indivíduos com DAM ou DAMEL, 7 famílias eram de casos isolados
e em 16 houve recorrência familiar. Quanto ao mecanismo de herança das 16 famílias com recorrência familiar:
02 famílias haviam apenas irmãos afetados, dois em cada. Nas demais houve múltiplos afetados. Em duas houve
transmissão homem a homem, caracterizando herança autossômica dominante (AD). As demais são sugestivas
de herança autossômica dominante com penetrância incompleta. Estes resultados sugerem heterogeneidade
etiológica, com parte dos casos devidos a herança monogênica e parte devida a herança multifatorial e/ou
agentes ambientais. Perspectivas: A coleta de famílias prossegue com vistas à análise de segregação complexa.
Apoio: FAPEMIG, CNPq, CAPES, CAPES-DAAD (PROBRAL)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
256
Influência do polimorfismo Ala16Val do gene da enzima
superóxido dismutase dependente de manganês na
taxa de hemólise produzida pela exposição in vitro ao
nitroprussiato sódico
Montagner, GFFS¹; Silva, AMB¹; Mostardeiro, CP¹; Krewer, CC¹; Rocha, MIUM¹; Vencato, MS¹; ManicaCattani, MF¹; Algarve, TD¹; Duarte, MMMF²; Cruz, IBM¹
¹Laboratório de Biogenômica, Universidade Federal de Santa Maria
²Universidade Luterana do Brasil
Palavras-chave: Hemólise, Nitrupussiato, Polimorfismo, SOD2, Estresse Oxidativo
A enzima superóxido dismutase dependente de manganês (SOD2) é uma molécula antioxidante que protege as
células da ação do radical superóxido. Investigações observaram que células-tronco do sistema hematopoiético que
não são capazes de produzir SOD2 dão origem a animais com uma anemia hemolítica persistente caracterizada por
aumento no dano oxidativo nas hemáceas. Estudos prévios in vitro sugerem que o genótipo VV do polimorfismo
Ala16Val-SOD2 em humanos está associado à maior nível de peroxidação lipídica in vitro em linfócitos expostos
a radiação UV. O quanto este polimorfismo poderia afetar a fisiologia e a resposta ao estresse oxidativo das
hemáceas ainda não foi descrito. Avaliar in vitro a taxa de hemólise de hemáceas oriundas de indivíduos com
diferentes genótipos Ala16Val-SOD2 submetidas a tratamento com nitroprussiato sódico (NS). Após genotipagem
de 50 indivíduos saudáveis e com perfil de estilo de vida similar, foram selecionados 12 indivíduos (04 de cada
genótipo) do qual foram feitas as coletas de sangue. Ainda que não ocorra proliferação celular o sangue obtido foi
colocado em condições de cultura por 72h, em estufa CO2 a fim de estabilizar as condições oxidativas ambientais
das hemáceas. Após este período a amostra foi incubada com NS (2, 5 a 10mM) por um período de 2h e a taxa de
hemólise foi determinada pela concentração de hemoglobina em espectrofotometria (590nm). A taxa de hemólise
foi significativamente maior nas VV (0,431±0,006) do que nas hemáceas AA (0,256±0,0105) e AV(0,384±0,005)
(p=0,0001). Entretanto, os tratamentos com 5mM e 10mM de NS só aumentaram a taxa de hemólise do grupo AA
(p=0.004) sem ocorrência de efeito nos demais genótipos. Conclusões: parece que o polimorfismo Ala16Val-SOD2
afeta a qualidade da hemacea produzida bem como a resposta toxicológica a agentes oxidativos geradores de
superóxido como o NS.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
257
Caracterização do gene NAT2 em uma população
exposta ao Urânio, município de Prainha, Estado do Pará
Amador, MAT1; Alencar, DO1; Santos, NPC1; Burbano, RMR2; Aguiar, JC1; Ribeiro-dos-Santos, AKC1
Laboratório de Genética Humana e Médica/Laboratório de Antropologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
do Pará
2
Laboratório de Citogenética Humana, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
Palavras-chave: NAT2, radiações ionizantes, urânio, câncer, susceptibilidade
As enzimas N-acetiltransferases 2 (NAT2) são responsáveis pela metabolização de substâncias endógenas e
xenobióticos, como drogas, carcinógenos ambientais e substâncias químicas. Polimorfismos nos genes responsáveis
pela codificação dessas enzimas estão relacionados à presença de diferenças individuais na metabolização de drogas,
eventos de toxicidade e susceptibilidade a diversos tipos de câncer. O sinergismo entre os polimorfismos do gene
NAT2 e outros genes do biometabolismo também é referido como fator de susceptibilidade ao desenvolvimento do
câncer. O município de Prainha localiza-se em uma região que contém reservas naturais de urânio, e seus moradores
estão expostos às radiações ionizantes emitidas por este elemento. Essas radiações podem causar danos ao material
genético, conferindo maior risco para o desenvolvimento de processos carcinogênicos. O objetivo do presente
trabalho é investigar mutações no gene NAT2 que caracterizem os fenótipos de acetilação rápida, intermediária e
lenta, assim como inferir seus efeitos de riscos, em uma amostra populacional exposta ao urânio (Prainha, PA). O
gene NAT2 foi seqüenciado ( forward e reverse) em 32 indivíduos não relacionados, por meio do sequenciamento
direto do produto da PCR. Os resultados revelaram sete mutações (G590A, A803G, G857A, G191A, C282T, T341C
e C481T). As mutações que apresentaram as maiores freqüências foram NAT2*803G e NAT2*341C, com 21,05% cada.
A mutação NAT2*191A foi a que apresentou a menor freqüência, 1,75%. Os resultados mostraram ainda, que os
haplótipos/alelos mais frequentes foram NAT2*5C e NAT2*4, ambos com frequência de 15,62%. Em relação ao
fenótipo, os acetiladores lentos representam 34,37% da amostra, os acetiladores intermediários 31,25%, enquanto
os acetiladores rápidos 6,25%. E em seis haplótipos novos (28,12% dos genótipos obtidos) não foi possível identificar
o perfil de acetilação. O predomínio de acetiladores lentos nesta população pode representar um risco aumentado
ao desenvolvimento de câncer. Desta forma, faz-se necessário investimentos preventivos na área de saúde, nas
populações cronicamente expostas às radiações ionizantes do urânio, para que ocorra uma melhor caracterização
molecular dos principais genes de biometabolismo presente na região, assim como das doenças e terapias utilizadas.
Fonte de apoio: CNPq, PIBIC/CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
258
Histórico familiar como fator de risco para o
desenvolvimento de asma entre crianças de 9 a 11 anos
Pereira, RD1; Albuquerque, LARS2; Ferriani, VPL3; Giuliatti, S4
Laboratório de Bioinformática, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
Departamento de Puericultura e Pediatria Serviço de Imunologia, Alergia e Reumatologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
[email protected]
1, 4
2,3
Palavras-chave: Asma, reações alérgicas, fatores genéticos, banco de dados, diagnóstico clínico e funcional
A asma é uma doença heterogênea e sabe-se que diferentes fatores e estímulos são capazes de induzir reações
alérgicas e não alérgicas no trato respiratório. Estudos recentes sugerem que fatores genéticos, fumo durante
a gestação, prematuridade, fumo no período pós-natal, assim como as infecções virais, poluentes ambientais e
exposição a alérgenos intradomiciliares estão envolvidos na fisiopatologia da asma. Associação de estudos em
indivíduos não aparentados também identificaram mais de 100 genes associados com a alergia e asma. Dados
recentes dos Estados Unidos sugerem que o prolongado aumento da prevalência, hospitalizações e mortalidade
por asma entre crianças de 0 a 17 anos têm apresentado um incremento importante nos últimos anos. Entretanto,
para alguns grupos, particularmente crianças de 0 a 4 anos e crianças negras, há um aumento desproporcional
na prevalência. Além disso, os índices de morbidade e mortalidade por asma não têm mostrado tendência à
estabilização em determinadas regiões. O objetivo deste trabalho foi criar um banco de dados e um sistema de
apoio à analise, afim de estabelecer relações entre o histórico familiar de 80 indivíduos que apresentaram episódios
de sibilância entre 0 e 2 anos e o desenvolvimento de asma entre os 9 e 11 anos. Durante a pesquisa outros fatores
de risco (associados a fatores genéticos e ambientais) envolvidos na fisiopatologia da asma foram avaliados. Para
criação do banco de dados e do sistema foram utilizados o Sistema Gerenciador de Banco de Dados (SGBD)
MySQL, e as linguagens de programação PHP e JavaScript. Os resultados obtidos através do sistema mostram
que trinta e oito por cento dos pacientes que apresentaram episódio agudo de chiado nos dois primeiros anos de
vida tornaram-se asmáticos seguindo parâmetros clínicos e funcionais de diagnóstico de asma, sendo possível,
portanto, corelacionar as variáveis envolvidas afim de auxiliar o diagnóstico e tratamento da doença.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
259
Polimorfismos no gene IL10 e o risco de
desenvolvimento de inibidores do Fator VIII em
hemofílicos A graves do Rio Grande do Sul
Agostini, D1; Bandinelli, E2; Rosset, C2; Botton, MR1; Salzano, FM1, 2
1
2
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Palavras-chave: Hemofilia, IL10, -1082G>A, -819C>T, -592C>A
A hemofilia A é uma doença hemorrágica hereditária causada pela redução da atividade do fator VIII da coagulação
(FVIII). Uma das principais complicações no tratamento de hemofílicos é o desenvolvimento de anticorpos
(inibidores) contra o FVIII administrado, o que leva à diminuição da qualidade e expectativa de vida dos pacientes.
O desenvolvimento de inibidores contra o fator VIII é uma resposta imune multifatorial complexa, envolvendo
tanto fatores de risco genéticos quanto não-genéticos. Genes que influenciam no funcionamento do sistema
imune podem ser importantes na formação desses inibidores. A interleucina 10 (IL10) é uma importante citocina
antiinflamatória que exerce um amplo espectro de atividades. Ela aumenta a produção in vitro de todos os tipos
de imunoglobulinas pelas células mononucleares do sangue periférico em pacientes com determinadas doenças
autoimunes, e sua concentração sérica está correlacionada com a atividade da doença nesses pacientes. O gene da
IL10 está localizado no cromossomo 1, e apresenta três principais SNPs na região promotora: -1082G>A, -819C>T,
e -592C>A. O objetivo do nosso trabalho foi estudar a associação entre estes polimorfismos e o desenvolvimento
de inibidores em pacientes com hemofilia A grave. Foram investigados 161 pacientes, dentre os quais 50
apresentavam inibidores. Os polimorfismos foram identificados por PCR em tempo real. As frequências foram
comparadas pelo teste χ2. O software MLocus foi utilizado para estimar os haplótipos. A distribuição genotípica
está em equilíbrio de Hardy-Weinberg para os três polimorfismos, tanto no grupo de pacientes com inibidores
quanto no sem inibidores. No grupo de pacientes com inibidores e no grupo sem inibidores, as frequências do
alelo -1082G foram, respectivamente, 41,0% e 65,9% (p=0,28). Para o alelo -819T, essas freqüências foram 30,0% e
28,3% (p=0,86), e para o alelo -592A, foram 29,0% e 28,7% (p=0,09). Não foi encontrada diferença estatisticamente
significativa entre essas frequências em nenhum dos polimorfismos. Todos os pares de polimorfismos comparados
estão em forte desequilíbrio de ligação (D´= 1,0; p<0,001). Foram encontrados três haplótipos (GCC, ACC e ATA)
tanto no grupo de pacientes com inibidores quanto no sem inibidores. Não foi encontrada associação entre
esses haplótipos e o desenvolvimento de inibidores (p=0,35). Quanto aos diplótipos, foram encontradas seis
combinações. Também não houve associação entre nenhum diplótipo e o desenvolvimento de inibidores (p=0,51).
Nossos resultados discordam do trabalho realizado por Chaves et. al. (International Journal of Immunogenetics,
37: 79-82, 2009), no qual foi encontrada associação entre o diplótipo GCC/ACC e a ocorrência de inibidores em
hemofílicos A, e o diplótipo GCC/ATA foi relacionado com o grupo de pacientes sem inibidores. Logo, mais
estudos são necessários para que o papel desses polimorfismos na etiologia dessa complicação seja esclarecido.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
260
Metilação e resistência a drogas em pacientes com
leucemia mieloide aguda
Mac-Cormick, TM1,2; Bagni, C1; Maia RC1; Moreira, MAM1
Divisão de Genética – Instituto Nacional do Câncer
Departamento de Genética – Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: MDR1, Metilação, Leucemia, CpG
O fenômeno conhecido como Resistência a Múltiplas Drogas (MDR) é um dos principais obstáculos ao uso
intensivo de quimioterápicos em pacientes com câncer. Um dos responsáveis por esse fenótipo é o gene MDR1, o
qual codifica uma proteína (Pgp 1) envolvida no desenvolvimento de resistência ao tratamento quimioterápico de
diferentes tipos de tumores. Sabe-se que um fator que influencia na expressão do gene MDR1 é o padrão de metilação
na região promotora proximal, situada a 3’ do exon 1a, já que a metilação das citosinas em sequências 5`-CpG-3`
está relacionada à compactação da cromatina nestas regiões, inviabilizando o acesso de fatores de transcrição, e
que o aumento da expressão de MDR1 está relacionado à hipometilação desta região em pacientes com Leucemia
Mielóide Aguda (LMA). Neste trabalho, verificamos o padrão de metilação em um segmento da região promotora do
gene MDR1 em pacientes com LMA. Para isso, foram utilizadas amostras de DNA provenientes do sangue periférico
de pacientes com LMA do Serviço de Hematologia do INCA., às quais foram aplicadas a técnica de tratamento do
DNA genômico com Bissulfito de Sódio, utilizando o Kit “CpGenome Fast DNA Modification Kit” (Chemicon), onde
somente as citosinas não metiladas são convertidas em uracila. Posteriormente, o DNA tratado foi amplificado
através da técnica de PCR-em-ninho, utilizando iniciadores específicos para a região promotora de MDR1. Os
fragmentos gerados foram clonados em plasmídeos pMOS-Blue, e os clones, submetidos a Mini-Prep e PCR-colony.
Posteriormente, os produtos foram sequenciados e os eletroferogramas gerados foram analisados. Até o presente
momento, 3 pacientes foram sequenciados: 2 apresentaram um padrão de demetilação clara de seus sítios CpG
compreendidos na região de análise; no terceiro, o sequenciamento mostra uma aparente demetilação destes sítios,
porém o resultado ainda é inconclusivo devendo repetir a técnica para confirmação. Devemos ressaltar ainda que
um dos sítios CpG analisados se mostrou metilado em 1 clone de um paciente; e que o sequenciamento das amostras
submetidas a PCR-colony se apresentou melhor que o das amostras submetidas a Mini-Prep. O próximo passo de
nosso trabalho é continuar a investigação acerca dos sítios CpG da região promotora proximal do gene MDR1 dos
demais pacientes através do sequenciamento e correlacioná-los com os dados de expressão e atividade da Pgp 1.
Apoio financeiro: CNPq, Ministério da Saúde, Convênio INCA-FIOCRUZ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
261
Efeito de polimorfismos do gene DAT1 sobre dose
equivalente e complicações do uso crônico de
levodopa em pacientes com doença de Parkinson
Altmann, V1; Schuh, AS2; Rieck, M1; Francisconi, CLM2; Monte, TL2; Rosso, ALZ3; Nicaretta, DH4; Pereira,
JS5; Bastos, IC6; Pimentel, M5; Rebouças, CBS5; Rieder, CRM2; Hutz, MH1
Laboratório de Genética Humana, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Serviço de Neurologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
3
Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Universidade Federal do Rio de Janeiro
4
Santa Casa de Misericórdia
5
Laboratório de Genética, Universidade do Estado do Rio de Janeiro. 6Instituto de Neurologia Deolindo Couto, Universidade Federal do
Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DAT1, Parkinson, VNTR, SNP, levodopa
A doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais frequente e é a única que possui tratamento
sintomático eficaz. A levodopa é a principal medicação para o controle dos sintomas motores. Entretanto, seu
uso continuado pode provocar o surgimento de fenômenos indesejados, como a flutuação motora, a discinesia e
a alucinação, que dificultam o manejo e prejudicam a qualidade de vida dos pacientes. Além disso, a dose ótima
para o controle adequado dos sintomas apresenta grande variação individual. O transportador de dopamina
tem importante papel na ação deste neurotransmissor por ser responsável pela sua recaptação pré-sináptica.
Acredita-se que polimorfismos no gene deste receptor possam influenciar a variabilidade na resposta ao uso
de levodopa. O objetivo deste estudo é avaliar a influencia de um VNTR de 40bp mapeado na região 3’-UTR
do gene e um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) na região promotora (-839 C>T) do gene DAT1. Foram
incluídos 165 pacientes em atendimento em clínicas de Distúrbios do Movimento de hospitais universitários de
Porto Alegre e do Rio de Janeiro, com diagnóstico de doença de Parkinson idiopática, com idade de início dos
sintomas acima de 45 anos e uso mínimo de 200mg de dose equivalente de levodopa por dia. As amostras de DNA
foram extraídas pelo método de salting out, a partir de sangue periférico. Os polimorfismos foram amplificados
pela técnica de PCR. Para identificar os genótipos do VNTR, os produtos de amplificação foram submetidos
diretamente a eletroforese em gel de agarose a 2,5% contendo brometo de etídio. Os produtos de amplificação
do SNP da região promotora foram clivados com MspI. Os fragmentos foram separados por eletroforese em
gel de agarose a 3% corado com brometo de etídio. A frequencia do alelo de 9 repetições do VNTR na região
3’ UTR foi de 32,4% para a amostra do RS e de 40,6% para a amostra do RJ. A dose equivalente de levodopa,
controlando para tempo de doença, foi menor nos pacientes portadores do alelo de 9 repetições (665,80mg+370 vs 763,31mg+-441,3; p=0,042). Essa diferença não foi observada quando as amostras de Porto Alegre e do Rio
de Janeiro foram analisadas independentemente, possivelmente devido ao pequeno tamanho amostral de cada
uma. Em 155 pacientes, a frequencia do alelo T da região promotora foi de 37,5% para a amostra do RS e de 36,2%
para a amostra do RJ. Verificou-se que em homozigotos para o alelo C a frequencia de alucinações era maior em
comparação com os portadores do alelo T(OR 5,17 CI 95% 1,45-18,41 p=0,01). Os resultados obtidos até o momento
sugerem que o gene DAT1 apresenta importante papel na farmacogenética da doença de Parkinson idiopática.
Apoio financeiro: CNPq, FINEP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
262
Polimorfismos no gene do receptor de dopamina D2 na
doença de Parkinson
Rieck, M1; Schuh, AF2; Altmann, V1; Francisconi, C2; Monte, TL2; Rieder, CRM2; Hutz, MH1
Laboratório de Genética Humana, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Serviço de Neurologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Parkinson, DRD2, Taq1A, -141C Ins/Del, Levodopa, Farmacogenética
A doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais freqüente e é caracterizada por tremor de
repouso, bradicinesia e rigidez muscular. Esse é o único distúrbio neurodegenerativo que possui tratamentos
sintomáticos eficazes. A levodopa é o principal e o melhor medicamento para o controle dos sintomas motores.
Entretanto, seu uso continuado pode provocar o surgimento de fenômenos indesejados, como as flutuações
motoras e alucinações, que dificultam o manejo e prejudicam a qualidade de vida dos pacientes. A levodopa é um
precursor da dopamina, substância que está diminuída no circuito nigroestriatal pela degeneração das células
produtoras da substantia nigra em pacientes com Parkinson. O receptor de dopamina D2 (DRD2) é reconhecido
como um dos maiores sítios de ação da dopamina no sistema nigroestriatal, controlando funções relacionadas ao
movimento. Os polimorfismos – 141C Ins/Del na região promotora e o Taq1A a 3’ do gene são os mais estudados.
O objetivo do presente trabalho é investigar a relação dos polimorfismos -141C Ins/Del e Taq1A do gene DRD2
com a resposta a levodopa em 131 pacientes portadores de Parkinson idiopático, do Hospital de Clínicas de Porto
Alegre (RS). Foram selecionados e avaliados pacientes do ambulatório de Distúrbios do Movimento do Hospital
de Clínicas de Porto Alegre, com diagnóstico de doença de Parkinson idiopática. Foram incluídos nesse estudo
apenas pacientes que possuíam 45 anos ou mais no momento do diagnóstico da doença e que tomam mais de
200mg de dose equivalente de levodopa por dia. As amostras de DNA foram extraídas pelo método de salting out,
a partir de sangue periférico. Os polimorfismos foram amplificados pela técnica de PCR e os produtos clivados por
endonucleases de restrição. Os fragmentos foram separados por eletroforese em gel de agarose a 2% corado com
brometo de etídio. A freqüência do alelo -141C Ins foi de 86,26%. Utilizando um modelo dominante, portadores do
alelo Del, quando controlados por tempo de doença e dose equivalente do medicamento, estão influenciando na
ocorrência de discinesia, uma complicação do uso crônico de levodopa (P=0,007). A freqüência do alelo Taq1 A2
foi de 73,7%. Utilizando um modelo dominante, portadores do alelo A1 necessitam doses maiores de levodopa,
quando essa variável é controlada por tempo de doença e sexo, (P=0,039). Os resultados obtidos até o momento
sugerem que o gene DRD2 apresenta importante papel na farmacogenética da doença de Parkinson idiopática.
Apoio financeiro: CNPq, FINEP.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
263
Influência de fatores genéticos e não-genéticos
na variação da dose de varfarina: proposta de um
algoritmo para a predição da dose na população do sul
do Brasil
Botton, MR1; Bandinelli, E1; Rohde, LE2; Amon, LC3; Hutz, MH1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil.
Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS, Brasil, 3Serviço de Medicina Interna, Hospital de Clínicas de Porto
Alegre, RS, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: CYP2C9, VKORC1, CYP4F2, F2, varfarina, farmacogenética
Introdução: A varfarina é um anticoagulante oral muito utilizada na profilaxia de doenças tromboembólicas. Existe
uma grande variação interindividual na resposta à varfarina, uma vez que sua farmacocinética e farmacodinâmica
variam de acordo com fatores ambientais e genéticos. As enzimas CYP2C9 (metabolização do fármaco) e VKORC1
(alvo da varfarina) estão diretamente envolvidas na farmacocinética e farmacodinâmica do medicamento,
respectivamente. A enzima CYP4F2, envolvida na metabolização de vitamina K, atua de forma indireta na
farmacodinâmica do medicamento. O fator II é um fator de coagulação dependente de carboxilação, sendo sua
funcionalidade dependente da atuação da varfarina. Polimorfismos nestes genes estão relacionados com variação
na resposta ao medicamento. Objetivos: Investigar a influência dos polimorfismos CYP2C9*2 e CYP2C9*3 no gene
CYP2C9, -1639G>A, 1173C>T e 3730G>A no gene VKRC1, 1347C>T no gene CYP4F2 e 494C>T no gene F2 na dose/
resposta de varfarina de forma independente assim como elaborar um modelo incluindo fatores genéticos e nãogenéticos capazes de predizer a dose de varfarina necessária a cada paciente. Métodos: Foram estudados 279
pacientes anticoagulados provenientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre com descendência européia. Todos
os SNPs foram identificados pelo sistema TaqMan de discriminação alélica através de PCR em tempo real. Resultados
e Conclusões: Em análises univariadas e multivariadas observou-se que os polimorfismos CYP2C9*2 (P<0,001) e
CYP2C9*3 (P<0,001) no gene CYP2C9, -1639G>A (P<0,001) e 1173C>T (P<0,001) no gene VKORC1 e 494C>T (P<0,001)
no gene F2 são responsáveis pela necessidade de uma dose menor do anticoagulante. Em contrapartida, os SNPs
1347C>T (P<0,001) no gene CYP4F2 e 3730G>A (P<0,001) no gene VKORC1 são responsáveis pela necessidade de
uma dose maior de varfarina. Já os resultados referentes aos polimorfismos nos genes CYP4F2 e F2 foram observados
apenas na análise multivariada, após controlar por confundidores, pois na análise univariada estes polimorfismos
não apresentaram associação com a dose de varfarina. A partir destes polimorfismos e de algumas variáveis clínicas
foi elaborado um algoritmo que explica 63,3% da variação de dose de varfarina. Este algoritmo incluiu os fatores:
peso, idade, uso de anlodipino, amiodarona, carbamazepina, β-bloqueadores, diuréticos de alça e polimorfismos
nos genes CYP2C9, VKORC1, CYP4F2 e F2. A média da diferença absoluta entre a dose predita e a dose observada
foi de 6,9 mg/semana e a correlação entre as doses predita e observada foi rs=0,77. O modelo sugerido é um dos
que apresenta maior coeficiente de determinação entre os descritos na literatura, porém, para que seja possível
um futuro uso clínico é necessário que seja validado em uma amostra independente. Mais estudos são necessários
para determinar quais são os outros fatores genéticos/ambientais que explicam os demais 40% da variação de dose.
Apoio financeiro: CNPq, PRONEX, FAPERGS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
264
Análise populacional de polimorfismos
farmacogenéticos relacionados a drogas utilizadas no
tratamento da leucemia linfoide aguda
Chiabai, MA1; Lins, TC2; Pereira, RW1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília
Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, Universidade de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: SNP, população brasileira, polimorfismos farmacogenéticos, HapMap, leucemia linfoide aguda
A variabilidade de resposta aos medicamentos ocorre tanto dentro de populações como entre populações. A
análise de polimorfismos genéticos que possam explicar tal variação é estudada no contexto da farmacogenética.
Neste trabalho, a proposição foi investigar em uma amostra da população brasileira a frequência de polimorfismos
farmacogenéticos envolvidos na resposta a drogas utilizadas no tratamento da leucemia linfoide aguda (LLA). A
LLA é o tipo de câncer infantil mais comum, correspondendo a 25% dos casos de câncer infantil, com taxa atual
de sobrevida em torno de 80%. A amostra utilizada neste estudo foi composta por 200 indivíduos representando as
cinco regiões geopolíticas do Brasil. Para esta amostra conhecia-se a ancestralidade biogeográfica estimada com
28 SNPs informativos de ancestralidade. Desta forma foi possível buscar por correlações entre os polimorfismos
genéticos estudados e a ancestralidade biogeográfica. Foram genotipados 20 SNPs relacionados a drogas utilizadas
no tratamento da LLA, principalmente o metotrexato. Não foi encontrado nenhum loco em desequilíbrio de
Hardy-Weinberg na população brasileira. As amostras foram divididas em cinco grupos de acordo com as regiões
geopolíticas brasileiras, e não foi encontrado valor de Fst significativo entre elas, indicando que do ponto de vista
dos locos farmacogenéticos estudados nossa amostra representa uma população homogênea. Considerando as
amostras das cinco regiões geopolíticas como uma única amostra foi realizada a comparação com populações
obtidas em banco de dados do projeto HapMap. A comparação entre a população brasileira e as populações do
HapMap apontou que do ponto de vista dos locos farmacogenéticos estudados nossa população está mais próxima
da população europeia. A análise molecular de variância loco a loco mostrou locos com Fst significativo até
mesmo entre populações pertencentes a uma mesma região geográfica, indicando que apesar de mais próximas
elas se diferenciam em alguns locos e não podem ser agrupadas como uma só nem os dados sobre os locos
extrapolados de uma para a outra. Não foi encontrada correlação alta entre os polimorfismos e a ancestralidade
nas amostras da população brasileira, sendo encontrada correlação baixa em poucos locos e a ancestralidade.
Os resultados de estrutura populacional e de correlação com ancestralidade encontrados neste trabalho
apontam para a necessidade de genotipar SNPs farmacogenéticos e não basear-se em atalhos para diferenças na
resposta a drogas. Atalhos como cor de pele, ancestralidade auto-referida e mesmo a ancestralidade genômica
são preditores pobres do genótipo que um indivíduo apresenta para os locos farmacogenéticos de interesse.
Apoio financeiro: FAP/DF, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
265
Influência de polimorfismos nos genes PPARA,
RXRA, NR1I2 e NR1I3 sobre o perfil lipídico e a
farmacogenética de estatinas
Lima, LO1,2; Bruxel, EM1,3; Hutz, MH1; Van der Sand, CR4; Van der Sand, LC4; Ferreira, MEW4; Pires, RC4;
Almeida, S2,5; Fiegenbaum, M2, 3,5
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Laboratório de Biologia Molecular, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal de Ciências da Saúde de
Porto Alegre
3
Laboratório de Biologia Molecular, Centro Universitário Metodista do IPA
4
Centro de Diagnóstico Cardiológico - CDC, Porto Alegre
5
Departamento de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre
[email protected]
1
2
Palavras-chave: receptores nucleares, níveis lipídicos, farmacogenética de estatinas
Introdução: Os receptores nucleares são fatores de transcrição ligante-ativados capazes de participar da regulação
da expressão de múltiplos genes. Dessa forma, podem estar envolvidos em uma vasta gama de vias metabólicas,
incluindo as vias relacionadas à metabolização e homeostase de lipídios, e as vias de metabolização de xenobióticos.
Objetivos: Investigar a associação de variantes genéticas nos genes codificadores dos receptores nucleares PPARα
(PPARA rs1800206; L162V), RXRα (RXRA rs11381416), PXR (NR1I2 rs1523130 e rs2472677) e CAR (NR1I3 rs2307424
e rs2501873) com níveis lipídicos basais, e com resposta hipolipemiante e segurança de inibidores da HMG-CoA
redutase (estatinas). Métodos: A amostra foi composta por 286 pacientes dislipidêmicos, descendentes de europeus
da região metropolitana de Porto Alegre, submetidos ao tratamento com sinvastatina ou atorvastatina. Destes,
240 fizeram uso de estatinas por aproximadamente 6 meses, permitindo a avaliação da resposta hipolipemiante;
98 mantiveram-se sob tratamento por mais de um ano e não desenvolveram efeitos adversos, sendo considerados
controles para o desenvolvimento de tais eventos; e 30 desenvolveram mialgia, elevação dos níveis séricos de creatina
fosfoquinase e/ou alteração da função hepática. O DNA foi extraído a partir de amostras de sangue total por método
de precipitação com alta concentração de sal. Os pacientes foram genotipados para os polimorfismos de interesse
através das técnicas de PCR-RFLP ou PCR em Tempo Real (sistema TaqMan). A associação dos genótipos com o nível
lipídico basal e com a modificação percentual de cada variável após o tratamento foi testada pelo método General
Linear Model utilizando o tipo III de soma dos quadrados (ajustando para covariáveis). A distribuição dos genótipos
entre pacientes controles e que desenvolveram efeito adverso foi avaliada por teste do qui-quadrado. Resultados:
Heterozigotos para o polimorfismo NR1I2 rs1523130 apresentaram níveis basais de colesterol total (261,81 ±
39,92mg/dL versus 241,52 ± 41,39mg/dL; P=0,001) e LDL-colesterol (179,46 ± 36,01mg/dL versus 160,12 ± 35,10mg/
dL; P=0,001) mais elevados que homozigotos CC. Homozigotos AA para o polimorfismo NR1I3 rs2501873 tiveram
uma menor redução nos níveis de LDL-colesterol após o tratamento com estatina do que portadores do alelo G
(-37,63 ± 16,79% versus -29,82 ± 21,66%; P=0,026). O genótipo heterozigoto do polimorfismo NR1I3 rs2307424 foi o
mais frequente entre os pacientes que apresentaram efeito adverso, e não foram observados homozigotos T nesse
grupo, sendo encontrada uma diferença significativa da distribuição genotípica entre os pacientes que desenvolveram
efeitos adversos e o grupo controle (P=0,007). Conclusões: Em suma, nossos resultados sugerem a influência de uma
variante genética no NR1I2 sobre o perfil lipídico basal, e de variantes genéticas no NR1I3 sobre a farmacogenética
de estatinas; porém, estudos posteriores devem ser realizados para confirmar as associações encontradas.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERGS, PROAP-CAPES, Programa de Bolsas REUNI/UFCSPA
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
266
Associação entre polimorfismo no gene SREBP-1c e
a ocorrência de lipohipertrofia em euro-descendentes
portadores do HIV sob terapia antirretroviral
Trinca, JR1; Sprinz, E2; Lazzaretti, RK2; Hutz, MH3; Kuhmmer, R2; Almeida, S1; Mattevi, VS1
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, RS
Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS
3
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: lipodistrofia, TARV, farmacogenômica, HIV, PPARG, SREBP
Introdução: Os avanços terapêuticos no tratamento da AIDS (síndrome da imunodeficiência adquirida) estão
modificando a percepção desta patologia, de uma doença fatal para uma condição crônica. A síndrome da
lipodistrofia (LD) associada à terapia antirretroviral (TARV) é caracterizada por alterações parciais ou generalizadas
no desenvolvimento e/ou distribuição do tecido adiposo, normalmente acompanhadas por disfunções
metabólicas (dislipidemia e resistência à insulina). Estas alterações podem levar a um aumento no risco de doenças
cardiovasculares, além de modificações estéticas, responsáveis por uma fração considerável da não-adesão à TARV.
Objetivos: Este trabalho teve como objetivo investigar associação entre polimorfismos em dois genes que codificam
fatores de transcrição envolvidos na diferenciação dos adipócitos, PPARG (peroxissome proliferator-actived receptor
gamma) e SREBP-1c (sterol regulatory element binding protein-1c) e a ocorrência de LD e dislipidemia em pacientes
infectados com HIV sob TARV. Métodos: Genótipos de 410 indivíduos portadores do HIV, sob TARV há pelo menos
um ano, provenientes do Ambulatório HIV/AIDS do Hospital de Clínicas de Porto Alegre foram analisados. Os
pacientes foram classificados em relação a ocorrência de LD e seus subtipos (lipoatrofia, lipohipertrofia ou ambos)
através de avaliação clínica e de parâmetros bioquímicos (perfil lipídico e glicose plasmáticos) e antropométricos
(peso, altura, circunferência da cintura e soma de pregas subcutâneas). Modelos de regressão de Poisson foram
utilizados para estimar a contribuição dos polimorfismos PPARG Pro12Ala (rs1801282) e SREBP-1c 3322C>G
(rs2297508) para a ocorrência de lipoatrofia e lipohipertrofia separadamente. Resultados: A prevalência de LD
foi superior em descendentes de europeus (61,1%) quando comparada com a prevalência em afro-descendentes
(42,7%; P<0,001). As frequências genotípicas do polimorfismo SREBP-1c 3322C>G foram diferentes entre euro e
afro-descendentes (P=0,024). A presença do alelo G do polimorfismo SREBP-1c 3322C>G foi associada com maior
risco de desenvolvimento de lipohipertrofia em euro-descendentes (razão de prevalências=1,41; P=0,039), não
contribuindo para este fenótipo em afro-descendentes. Os polimorfismos PPARG Pro12Ala e SREBP-1c 3322C>G não
contribuíram significativamente para a ocorrência de lipoatrofia em ambas as etnias. Conclusões: Este é o primeiro
trabalho demonstrando associação entre o polimorfismo SREBP-1c 3322C>G e lipohipertrofia relacionada à TARV
em pacientes infectados pelo HIV. Nenhuma evidência de associação entre o polimorfismo PPARG Pro12Ala e o
desenvolvimento de LD foi encontrada. Os resultados aqui obtidos sugerem que o gene SREBP-1c é um candidato
promissor na etiologia da LD associada à TARV e justificam estudos mais aprofundados envolvendo o mesmo.
Apoio financeiro: Programa Nacional DST/AIDS, CNPq e CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
267
Influência do polimorfismo C3435T do gene MDR1
sobre as doses terapêuticas do anticoagulante
varfarina
Oliveira, VC1,2; Borges, KBG3; Ferreira, ACS2; Ribeiro, DD4; Caxito, FA2; Godard, ALB1
Laboratório de Genética Humana e Animal. Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Minas Gerais; Minas Gerais, Brasil
2
Departamento de Genética Humana, Hermes Pardini, Minas Gerais, Brasil;
3
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, Brasil
4
Ambulatório de Hematologia, Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Minas Gerais, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Farmacogenética, Varfarina, Gene MDR1, Polimorfismo C3435T, Terapia anticoagulante
O gene MDR1 codifica o transportador de efluxo unidirecional MDR1, que exporta seus substratos do interior
para o exterior das células, protegendo-as de inúmeras substâncias e metabólitos tóxicos. O polimorfismo
C3435T de MDR1 reduz ligeiramente a expressão e função de transporte de MDR1, afetando a farmacocinética e a
efetividade terapêutica das inúmeras drogas que são substratos deste transportador, entre elas, o anticoagulante
varfarina. A influência de inúmeros fatores genéticos e ambientais sobre a ação da varfarina resulta em uma ampla
variabilidade de resposta à mesma. Por este motivo, a terapia anticoagulante requer monitorização laboratorial
e ajuste de dose periódicos e individualizados, a fim de minimizar o risco de hemorragia e/ou de recorrência de
eventos tromboembólicos. Portanto, conhecer as fontes de variação individual da resposta à varfarina é essencial
para a segurança e efetividade do tratamento anticoagulante. O objetivo deste trabalho foi investigar a associação
entre o polimorfismo C3435T e a dose de varfarina requerida semanalmente por 110 pacientes trombofílicos e
anticoagulados. As amostras de DNA foram extraídas por precipitação alcoólica e, em seguida, submetidas à
reação em cadeia da polimerase, restrição enzimática com Bsp143I (Unisciense®) e eletroforese em acrilamida. As
frequências alélica e genotípica da variante C3435T dos pacientes com doses de varfarina < 70 e ≥ 70 mg/semana
foram comparadas utilizando o Teste Exato de Fisher. Foi observado que o genótipo T3435T é 3,82 vezes mais
frequente nos pacientes com dose ≥ 70 mg/varfarina/semana, quando comparado aos pacientes com dose < 70
mg/varfarina/semana (p = 0,009, OR = 3,82). Também foi observado que a variante alélica 3435T é 3,13 vezes mais
frequente nos pacientes com dose ≥ 70 mg/varfarina/semana do que nos pacientes com dose inferior a 70 mg/
varfarina/semana (p = 0,007, OR = 3,134). As doses de varfarina mostraram correlação crescente com a presença
da variante 3435T, segundo as análises de Correlação de Spearman. Neste sentido, estes resultados inéditos na
literatura permitem concluir que o polimorfismo C3435T apresenta ser um importante fator de influência sobre a
terapia anticoagulante, principalmente, nos casos de requerimentos de varfarina maiores que 70mg por semana e
que deve ser considerado nos próximos estudos farmacogenéticos de estimativa de dose personalizada de varfarina.
Apoio financeiro: Instituto Hermes Pardini
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
268
O gene COMT e o TDAH: Estudo de suscetibilidade e
farmacogenética
Salatino-Oliveira, A1; Genro, JP1; Guimarães, AP1; Zeni, C2; Polanczyk, G2; Roman, T1; Callegari-Jacques, SM3;
Rohde, LA2; Hutz, MH1
Departamento de Genética
Departamento de Psiquiatria e Medicina Legal, Hospital de Clinicas de Porto Alegre
3
Departamento de Estatística, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: COMT, TDAH, Farmacogenética, Metilfenidato, Catecolaminas
O transtorno de déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) é uma doença psiquiátrica comum na infância e
adolescência, caracterizada por sintomas de desatenção, hiperatividade e impulsividade. Vários estudos sugerem
que a prevalência de comorbidade entre o TDAH e transtornos disruptivos do comportamento (TDC), situa-se em
torno de 50%. O TDAH envolve o efeito de muitos genes, além de contribuição ambiental. A hipótese mais provável
é que crianças com TDAH apresentem desequilíbrio nos níveis de catecolaminas do córtex pré-frontal (CPF). O
fármaco mais utilizado no tratamento dessa patologia é o metilfenidato (MPH), que age no aumento dos níveis
de catecolaminas na fenda sináptica. O gene catecol-O-metiltransferase (COMT) codifica uma enzima que atua na
degradação das catecolaminas, sendo responsável por aproximadamente 60% do catabolismo de dopamina do
CPF. O polimorfismo Val158Met causa uma substituição de aminoácido afetando a atividade enzimática da COMT.
O alelo Valina codifica uma enzima que possui quatro vezes mais atividade do que a isoforma codificada pelo
alelo Metionina. O objetivo do trabalho foi analisar se o polimorfismo Val158Met está associado com a presença
de TDC como comorbidade em crianças com TDAH e se pode influenciar na melhora clínica dos sintomas de
oposição em meninos com TDAH tratados com MPH. A amostra consiste de 473 pacientes que passaram por
avaliação clínica pelo Serviço de Psiquiatria da Infância e Adolescência do Hospital de Clínicas de Porto Alegre.
Destes, 112 meninos com dados de melhora clínica dos sintomas de oposição no tratamento com MPH foram
analisados no estudo farmacogenético. A genotipagem foi realizada por discriminação alélica por PCR em tempo
real. O genótipo Val/Val foi 16% mais freqüente nas crianças com TDAH e TDC do que em crianças com TDAH
sem essa comorbidade (p=0.017). Utilizando o modelo de equações de estimação generalizadas verificou-se que
existe um efeito significativo do gene COMT (p = 0.027) e da interação entre o genótipo e o tempo de tratamento
(p = 0.01) na melhora clínica observada nos sintomas de oposição em meninos com TDAH após três meses de
tratamento. Crianças com TDAH e genótipo Val/Val parecem ser mais suscetíveis a desenvolver TDCs do que
crianças portadoras do alelo Met. Além disso, meninos portadores do alelo Met, quando comparados aos
homozigotos para o alelo Val, obtiveram uma melhora significativamente maior dos sintomas de oposição após
três meses de tratamento com MPH. Este estudo enfatiza a presença de heterogeneidade genética no TDAH e o
papel do gene COMT na melhora clínica dos sintomas de oposição em meninos com TDAH tratados com MPH.
Auxílio financeiro: CNPq, Institutos do Milênio, FAPERGS
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
269
Ancestralidade genética e polimorfismos
farmacogenéticos em pacientes com leucemia linfoide
aguda
Filiatre, JM1; Marques, TM1; Leite, TM1; Chiabai, MA1; Magalhães, IMQS2; Sakamoto, LHT2; Cordoba, JCM2;
Pereira, RW1
Programa de Pós Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília – UCB
Núcleo de Oncologia Pediátrica, Hospital de Apoio de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: LLA, polimorfismos farmacogenéticos, AIM, ancestralidade, SNaPshot
A leucemia linfóide aguda (LLA) é o tipo de câncer infantil mais comum, correspondendo a 25% dos casos de câncer
infantil e com taxa de sobrevida de 80%. No intuito de melhorar o tratamento da LLA, estudos farmacogenéticos têm
sido realizados através da análise de polimorfismos genéticos em genes envolvidos na resposta a medicamentos.
Essa diversidade de resposta a drogas pode acontecer tanto em indivíduos de uma mesma população como entre
populações diferentes. Dados encontrados em uma população não podem necessariamente ser extrapolados para
outras, principalmente quando estas forem miscigenadas, como a brasileira, para evitarem-se resultados espúrios.
Neste estudo, foram genotipados 21 polimorfismos de base única (SNPs) informativos de ancestralidade (AIMs)
em 95 crianças com LLA para ser estimada a ancestralidade dos pacientes. Nestas mesmas amostras também
foram genotipados, nove SNPs relacionados à resposta a drogas utilizadas no tratamento da LLA, com enfoque
no metotrexato. Ambas as genotipagens utilizaram o sistema SNaPshot. Locos em desequilíbrio de HardyWeinberg foram encontrados nos AIMs, sendo este um indício de miscigenação recente. Em contrapartida, não
foi encontrado nenhum loco farmacogenético em desequilíbrio de Hardy-Weinberg nas crianças de LLA. Através
do cálculo de diferenciação genética (Fst), valores significativos foram encontrados para os AIMs e os pacientes
de LLA e as cinco regiões do país com maior enfoque no Sul e no Sudeste. Quanto ao cálculo da ancestralidade,
a européia se mostrou ser a de maior influência representando 51,7% e a africana com 32 % apresentou valores
superiores em relação às diversas regiões do Brasil. Ao compararmos os locos farmacogenéticos com os AIMs
nos pacientes de LLA, uma baixa correlação foi encontrada em três dos nove locos estudados, reafirmando a
importância da genotipagem do SNPs farmacogenéticos em relação a outros critérios, tais como a ancestralidade.
Por outro lado, a genotipagem dos AIMs é necessária para determinar a ancestralidade dos pacientes estudados,
no intuito de evitar falsos resultados, principalmente em estudos de caso-controle, onde as populações
estudadas devem ser homogêneas, o que pode não ocorrer em populações miscigenadas como a brasileira.
Apoio financeiro: Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
270
Influência de polimorfismos nos genes PROC e F7 na
dose terapêutica da varfarina
Borsatto, T1; Botton, MR1; Hutz, MH1; Rohde2, LE; Amon, LC3; Bandinelli, E1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Serviço de Cardiologia, Hospital de Clínicas de Porto Alegre
3
Serviço de Medicina Interna, Hospital de Clínicas de Porto Alegre
[email protected]
1
2
Palavras-chave: varfarina, farmacogenética, polimorfismos, PROC, F7
Introdução: A varfarina é o anticoagulante oral mais utilizado para prevenção e tratamento de pacientes com
desordens tromboembólicas arteriais ou venosas. Ela bloqueia a regeneração da vitamina K oxidada à forma
reduzida, e assim impede a carboxilação de fatores de coagulação dependentes de vitamina K ( fatores II, VII, IX e
X) e de inibidores fisiológicos da coagulação (proteína C e proteína S). Sem a carboxilação, essas proteínas não são
funcionais. A dose de varfarina é ajustada por tentativa e erro até que o paciente atinja o seu INR alvo, uma vez que
há uma grande variação interindividual na resposta ao anticoagulante. Sua farmacocinética e farmacodinâmica
são influenciadas por fatores ambientais e genéticos, entre os quais peso, idade, uso de outros medicamentos,
polimorfismos nos genes CYP2C9 (metabolizador da varfarina) e VKORC1 (alvo da varfarina). Tais fatores
explicam parte da variação da dose terapêutica. Polimorfismos em outros genes envolvidos na farmacodinâmica
da varfarina, como o da proteína C (PROC) e do fator VII (F7), também já foram relacionados com a dose. Os
objetivos desse estudo foram investigar a influência dos polimorfismos PROC -1654C>T e F7 1238G>A na dose de
varfarina em pacientes do sul do Brasil e, verificar a interação entre eles e outros fatores genéticos e não-genéticos
previamente estudados na mesma amostra. Materiais e métodos: Foram analisados 279 pacientes descendentes
de europeus do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, todos usuários de varfarina com INR dentro do alvo. As
genotipagens foram feitas por PCR/RFLP. O teste qui-quadrado foi realizado para verificar o Equilíbrio de HardyWeinberg, ANOVA para analisar a influência dos genótipos na dose terapêutica da varfarina, e regressão linear
múltipla para verificar a interação dos polimorfismos PROC -1654C>T e F7 1238G>A com outras variáveis.
Resultados: A dose semanal média de varfarina foi 33,5mg (amplitude 7,5mg-85mg). A distribuição genotípica
dos polimorfismos estudados está em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Para o polimorfismo PROC -1654C>T, a dose
semanal média de varfarina por genótipo foi: 32,9mg para CC, 34,5mg para CT e 31mg para TT; essas diferenças
não foram significativas (p=0,47). Quanto ao polimorfismo F7 1238G>A, a dose semanal média de varfarina por
genótipo foi: 33,7mg para GG, 32,5mg para GA, e 35,8mg para AA; essas diferenças também não foram significativas
(p=0,74). Na regressão linear múltipla foram incluídos, além dos genótipos de PROC e F7, dados clínicos (idade,
peso, uso de amiodarona, carbamazipina, β-bloqueador, anlodipino, diuréticos) e genéticos (genótipos do CYP2C9,
VKORC1, CYP4F2 e F2). Nesta análise, os polimorfismos PROC -1654C>T e F7 1238G>A em interação com outros
fatores continuaram sem influência sobre a dose do fármaco. Conclusão: Os resultados desse estudo indicam que os
polimorfismos investigados não estão associados com a dose terapêutica de varfarina na população do Sul do Brasil.
Apoio financeiro: BIC-UFRGS, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
271
Investigação farmacogenômica dos principais efeitos
adversos da terapia antirretroviral combinada em
pacientes infectados pelo HIV
Mattevi, VS1; Gasparotto, AS¹; Kayser, M¹; Turatti, L¹; Lazzaretti, RK2; Kuhmmer, R2; Almeida, S1;
Giovenardi, M1; Agnes, G¹; Silveira, JM³; Basso, RP³; Pinheiro, CAT4; Silveira, MF4; Sprinz, E2
Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, RS
Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Porto Alegre, RS
3
Hospital Universitário Dr. Miguel Riet Correa Jr., Universidade Federal do Rio Grande, Rio Grande, RS
4
Serviço de Assistência Especializada em HIV/AIDS, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: farmacogenômica, HIV, terapia antirretroviral, efeitos adversos, tecido adiposo
Introdução: A terapia antirretroviral combinada (TARV) protagonizou uma revolução no tratamento da infecção
pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), que passou do status de infecção fatal para o de doença crônica.
No entanto, a utilização prolongada da TARV tem sido acompanhada de efeitos adversos graves, os quais podem
comprometer a adesão dos pacientes e a eficácia da terapia. Dentre estes incluem-se a lipodistrofia, caracterizada
por alterações na distribuição do tecido adiposo corporal, acompanhada por distúrbios metabólicos (dislipidemia
e resistência à insulina), a toxicidade mitocondrial, que pode se manifestar com o desenvolvimento de lipoatrofia,
anemia, neuropatia periférica, acidose láctica e esteatose hepática, e a hiperbilirrubinemia. Objetivos: Investigar
a associação entre os principais efeitos adversos da TARV e a presença de polimorfismos em genes candidatos
envolvidos no metabolismo mitocondrial e do tecido adiposo e na regulação dos níveis de ferro e de bilirrubinas
no organismo. Métodos: A população-alvo consistiu em pacientes infectados pelo HIV sob TARV em Serviços de
referência localizados no estado do Rio Grande do Sul, nos municípios de Porto Alegre, Rio Grande e Pelotas. Os
critérios de inclusão foram: idade igual ou superior a 18 anos, utilização regular da TARV há pelo menos um ano e
carga viral abaixo do limite de detecção do teste. A amostra foi constituída de 614 indivíduos. Os pacientes foram
submetidos a avaliação clínica, de parâmetros bioquímicos, hematológicos, imunológicos e antropométricos. Para
a realização das análises genéticas, as regiões de interesse de cada gene candidato foram amplificadas pela reação
em cadeia da polimerase (PCR). Os polimorfismos foram detectados por clivagem com endonucleases de restrição,
eletroforese capilar em sequenciador ou PCR em tempo real, de acordo com a necessidade. As variáveis bioquímicas
e antropométricas foram comparadas entre os genótipos através de análises de covariância. Modelos de regressão
de Poisson foram utilizados para estimar a contribuição dos polimorfismos para a ocorrência de cada um dos
efeitos adversos avaliados. Resultados: Os efeitos adversos mais prevalentes investigados foram lipodistrofia,
síndrome metabólica, anemia e hiperbilirrubinemia. Foram analisados treze polimorfismos localizados em sete
diferentes genes: receptores de estrógeno alfa (ESR1) e beta (ESR2), gene da hemocromatose (HFE), uridina difosfato
glicuronosil-transferase 1A1 (UGT1A1) e proteínas desacopladoras 1 (UCP1), 2 (UCP2) e 3 (UCP3). A variante UGT1A1
(TA)n apresentou uma associação significativa com a hiperbilirrubinemia severa. Observou-se uma associação
significativa entre a presença do genótipo heterozigoto de um polimorfismo do gene ESR1 (rs2813544) e a ocorrência
de síndrome metabólica. Conclusões: Dos sete genes investigados, foram encontradas associações com efeitos
adversos da TARV para dois. Em relação aos demais, a sua contribuição para os efeitos adversos deve ser esclarecida
com a investigação de outras variantes nos mesmos e de polimorfismos localizados em outros genes candidatos.
Apoio financeiro: Programa Nacional DST/AIDS, CNPq e CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
272
Suscetibilidade e farmacogenética da hanseniase em
pacientes no Estado do Pará
Pinto, PD1; Ferreira, AM1; Alencar, DO1; Salgado, CG2; Santos, S1; Hutz, MH3; Ribeiro-dos-Santos, A1
Laboratório de Genética Humana e Médica/Laboratório de Antropologia Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
do Pará
2
Laboratório de DermatoImunologia, UEPA/UFPA/MC
3
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[email protected]
1
Palavras-chave: Hanseniase, Poliquimioterapia, Suscetibilidade, Farmacogenética, GSTM1, CYP2E1, SLC11A1
O Brasil é o segundo país do mundo em número de casos registrados e em prevalência de hanseníase, particularmente
o estado do Pará atinge níveis elevados. O tratamento indicado ao paciente com hanseníase é a poliquimioterapia
(PQT - rifampicina, dapsona, clofazimina). Entretanto, é comum a observação de efeitos adversos em resposta a
utilização desses medicamentos que podem ocorrer em função da presença de polimorfismos genéticos. Os genes
GSTM1 e CYP2E1 que traduzem enzimas de metabolização de Fase I e II desempenham um papel fundamental no
metabolismo celular, bem como na modificação e eliminação de compostos eletrofílicos reativos, como fármacos
e xenobióticos. O SLC11A1 (N-RAMP1) constitue um gene da família SLC (Solute Carrier Family) que codifica
uma proteína transmembranar, que funciona como transportador de metal de transição divalente (Fe+2 e Mg+2,
entre outros). Está envolvido no mecanismo de resistência de algumas bactérias como o Micobacterium leprae.
Polimorfismos em genes que participam de mecanismos de detoxificação celular, ou como proteínas carreadoras
de soluto na membrana podem influenciar o mecanismo de resposta ao tratamento da hanseníase, assim como a
suscetibilidade as suas formas clinicas. No presente trabalho, investigou-se os possíveis efeitos dos polimorfismos
nos genes GSTM1, CYP2E1 e SLC11A1 em 140 pacientes com Hanseníase, selecionados de acordo índice bacilar (IB)
do hospital Marcelo Cândia e do município de Dom Eliseu (PA). As amostras de DNA foram extraídas pela técnica
fenol-clorofórmio e posteriormente quantificadas, em seguida foram analisadas utilizando-se de técnicas básicas
de biologia molecular, como reação em cadeia da polimerase, e também análise em gel de poliacrilamida e agarose.
As análises estatísticas foram feitas com o programa SPSS 8.0. O resultado da comparação entre os alelos GSTM1*1
(presença) e GSTM1*0 (ausência) demonstraram significância (p=0,0276) em relação ao índice bacilar elevado (IB),
assim como o alelo GSTM1*0 demonstrou ser um fator de proteção (OR<1). Em relação aos genes CYP2E1 (INSERÇÃO)
e SLC11A1 (TGTG-3’UTR) não se observou significância para a suscetibilidade da hanseníase. Os polimorfismos
presentes em genes de reação de Fase II, dificultam a eliminação dos fármacos utilizados na PQT, deixando-os mais
tempo na circulação sanguínea e em contato com os patógenos dessa doença. Isto pode levar ao desenvolvimento de
resistência a tais fármacos, ocasionando uma elevação do índice bacilar para níveis críticos, principalmente naqueles
pacientes multibacilares. Genes de reação Fase I, tornam as moléculas mais eletrofílicas, deixando-as mais reativas
e passiveis de conjugação com moléculas orgânicas ( facilita a eliminação). Desta forma, os resultados encontrados
em relação ao gene GSTM1 podem sugerir sua importância pré-clínica (avaliação farmacogenética), na formulação
de tratamentos individualizados, a fim de ser obter uma farmacoterapêutica eficaz e com menos reações adversas.
Fonte financiadora: CNPq, PIBIC/CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
273
Transleitura do códon de parada prematura do alelo
CYP2C19*3: um modelo farmacogenético
Fuchshuber-Moraes, M1; Carvalho, MA1,2; Carvalho, RS1,2 3; Rimmbach, C4; Rosskopf, D4 Suarez-Kurtz, G1
Laboratório de Farmacologia - Instituto Nacional de Câncer
Coordenação de Biotecnologia - Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de Janeiro
3
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – Universidade Federal do Rio de Janeiro
4
Institut für Pharmakologie – Universität Greifswald
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mutação nonsense, transleitura, aminoglicosídeos, parada prematura, farmacogenética
Introdução: Mutações nonsense são responsáveis por diversos casos de doenças genéticas, tais como a fibrose
cística e a distrofia muscular de Duchenne. Estudos demonstram que os aminoglicosídeos são capazes de induzir
os ribossomos a transleitura de códons de parada prematura (transleitura), permitindo assim a elongação da
cadeia completa da proteína e parcial recuperação da atividade biológica da proteína. O alelo farmacogenético
CYP2C19*3 é caracterizado por um códon de parada prematura, originado a partir do polimorfismo G6363A, que
dá origem a uma proteína inativa. Objetivo: Investigar o efeito de aminoglicosídeos como indutores de transleitura
do códon de parada prematura do alelo farmacogenético CYP2C19*3. Metodologia: O alelo CYP2C19*3 foi gerado
por mutagênese sítio-dirigida a partir do alelo selvagem. Estes foram clonados no vetor de expressão pQCXIH
fusionados a egfp na porção C-terminal e as construções transfectadas em linhagem celular HeLa. Os clones
celulares de expressão estável foram obtidos por pressão seletiva. A expressão gênica foi medida por Real Time RTPCR e Western blotting. A indução de transleitura foi realizada por tratamento das células com G418 e gentamicina
em concentrações variadas por 48 horas e as análises realizadas por técnicas de citometria de fluxo, imunoblotting e
microscopia de epifluorescencia. Resultados: As análises de expressão gênica mostram que as células transfectadas
com as construções CYP2C19/egfp apresentam expressão dos alelos investigados quanto ao mRNA. Em relação
à expressão de proteínas, células transfectadas com a construção pQCXIH-CYP2C19*WT/egfp apresentaram
expressão detectável, o que não ocorreu com o alelo variante, uma vez que a mutação introduz um códon de parada
prematura, produzindo uma proteína truncada. Os ensaios de transleitura demonstram que após os tratamentos, as
células portadoras do alelo variante apresentaram expressão detectável da proteína de cadeia completa por todas
as técnicas aplicadas, sendo este efeito de dose-resposta. Conclusões: O modelo gerado para o estudo é aplicável
aos ensaios de transleitura e, de acordo com os resultados obtidos, os aminoglicosídeos são agentes indutores de
transleitura do códon de parada prematura do alelo CYP2C19*3. A próxima etapa será a validação do modelo para
estudos de farmacologia clínica, avaliando a atividade enzimática da proteína obtida após o processo de transleitura.
Apoio financeiro: INCA/FAF/CNPq/CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
274
Associação do polimorfismo PlA1/A2 da integrina
plaquetária GP IIb/IIIa e a resistência ao ácido
acetilsalicílico em pacientes diabéticos
Alves, MT1; Gonçalves, LH1; Freitas, FRD1; Fernandes, AP1; Carvalho, MDG1; Gomes, KB1,2
Laboratório de Biologia Molecular, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Minas Gerais
Colégio Técnico, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: AAS, eventos trombóticos, Diabetes Mellitus tipo 2, GP IIb/IIIa, PIA1/A2
O ácido acetilsalicílico (AAS) é um dos principais agentes antiplaquetários utilizados para a prevenção de eventos
tromboembólicos. Pacientes com diabetes Mellitus tipo 2 apresentam maior predisposição à ocorrência desses
eventos, sendo preconizado o uso do AAS em baixas doses. Apesar de o AAS ser capaz de reduzir o risco de
eventos trombóticos, sua atividade como antiagregante plaquetário apresenta variação interindividual, sendo que,
em alguns casos, o paciente apresenta resistência ao medicamento. A resposta insatisfatória ao AAS, avaliada
através da medida do metabólito 11-dihidro-tromboxano urinário, pode estar relacionada a uma ativação
plaquetária independente da formação de tromboxano A2, possivelmente ligada aos polimorfismos de receptores
plaquetários ou de moléculas pró-agregantes. A integrina da membrana plaquetária GP IIb/IIIa é essencial para
a interação das plaquetas às proteínas do plasma e à matriz extracelular durante o processo de coagulação, cujo
gene apresenta o polimorfismo plaqueta-específico PlA1/A2. O objetivo do presente estudo foi avaliar a associação
entre o polimorfismo PlA1/A2 e os níveis de 11-dihidro-tromboxano em pacientes diabéticos sob terapia com o AAS.
Participaram deste estudo 69 pacientes com Diabetes Mellitus tipo 2 em tratamento preventivo com o AAS. As
análises moleculares foram realizadas por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), seguida por digestão
com enzima de restrição HspI e visualização dos fragmentos através de gel de poliacrilamida e coloração com
nitrato de prata. O 11-dihidro-tromboxano urinário foi medido utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA).
A resistência ao AAS foi considerada quando a redução de 11-dihidro-tromboxano foi inferior a 90%. A análise
mostrou que 18 pacientes eram heterozigotos e 2 eram homozigotos para o polimorfismo PlA1/A2. Foi observado
que 15 pacientes com o polimorfismo mostraram redução do 11-dihidro-tromboxano inferior a 90%, enquanto
que apenas 5 pacientes com o polimorfismo tiveram redução de 11-dihidro-tromboxano superior a 90%. Não foi
encontrada diferença significativa na freqüência do polimorfismo quando comparados os pacientes com redução
de 11-dihidro-tromboxano maior ou menor que 90% (p = 0,57, OR = 0,16, IC = 0,51-4,93), no entanto, um número
maior de pacientes com o polimorfismo apresentou resistência ao AAS. Os dados obtidos não confirmaram a
associação significativa entre o polimorfismo PlA1/A2 no gene GP IIb/IIIa e a resposta ao AAS em pacientes
diabéticos. No entanto, a análise em um grupo amostral maior deve ser realizada a fim de confirmar a tendência
observada.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
275
Estudo da relação do polimorfismo C50T no gene
da ciclooxigenase 1 (COX-1) e a resistência ao ácido
acetilsalicílico em pacientes diabéticos
Rodrigues, KF1; Gonçalves, LH1; Fernandes, AP1; Carvalho, MG1; Gomes, KB1,2
Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte
– MG, Brasil
2
Colégio Técnico da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte – MG, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Ciclooxigenase 1, Ácido acetilsalicílico, Diabetes mellitus tipo 2, Tromboxano A2, Nested-PCR
Introdução: A enzima ciclooxigenase 1 (COX-1) é uma prostaglandina sintase que catalisa a conversão do ácido
aracdônico num intermediário instável, a prostaglandina H2, precursor de prostanóides como tromboxano
A2 (TXA2). O TXA2 é um potente vasoconstritor e indutor da agregação plaquetária. O AAS reduz a ativação
das plaquetas pela acetilação irreversível da COX-1, em nível pré-sistêmico, reduzindo a produção de TXA2
plaquetário. A prevenção de eventos trombóticos pode ser feita a partir da administração diária de pequenas
doses de ácido acetilsalicílico (AAS). Estudos mostram que um haplótipo da enzima COX-1 (-A842G/C50T, em
desequilíbrio de ligação) está significativamente associado com a diminuição da resposta de pacientes ao uso
diário de AAS. A resistência ao ASS pode ser determinada pela redução da produção dos metabólitos de TXA2,
através das dosagens de 11-dihidro TXB2 urinário. Objetivos: Determinar a frequência gênica e genotípica
do polimorfismo C50T da COX-1 em pacientes de Minas Gerais com diabetes mellitus tipo 2, em uso recente
de AAS; e relacionar a presença do polimorfismo com a redução da produção de TXA2, através da dosagem de
11-dihidro TXB2 urinário. Métodos: Participaram desse estudo 58 pacientes, de ambos os sexos, idade média
de 57,3 ± 4,9 anos, com diagnóstico recente de diabetes mellitus tipo 2. O DNA genômico foi extraído a partir
de amostras de sangue total colhidas com EDTA e submetidas à técnica de Nested PCR associada à RFLP,
com enzima de restrição AciI, eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e revelação com solução de nitrato de
prata. A dosagem de 11-dihidro TBX2 foi realizada em amostras de urina utilizando o kit diagnóstico 11-dehydro
Thromboxane B2 EIA Kit (Cayman Chemical®). Cada paciente coletou amostra de urina, primeira da manhã, antes
de iniciar o uso de AAS e após 15 dias do início da terapia, a fim de verificar a redução da produção de 11-dihidro
TBX2. Resultados: A análise revelou que 55 pacientes (0,948) não apresentavam o polimorfismo C50T, 2 (0,035)
apresentavam o polimorfismo em homozigose e 1 (0,017) em heterozigose. A frequência gênica encontrada para
o alelo selvagem foi 0,96 e para o alelo polimórfico 0,04. A presença do polimorfismo C50T, tanto em homozigose
quanto em heterozigose, não mostrou associação com a redução na produção de 11-dihidro TBX2. Conclusões:
O trabalho permitiu a padronização da técnica de Nested PCR–RFLP para o estudo do polimorfismo C50T. No
entanto, não foi observada associação entre a presença do polimorfismo e a resistência ao AAS no grupo estudado.
Apoio financeiro: Fapemig
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
276
Células tronco mesenquimais como modelo para
screening de drogas para o tratamento da síndrome
de Apert
Atique, RFT; Yeh, E; Fanganiello, R; Passos-Bueno MR
Centro de Estudos do Genoma Humano, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Apert, Células-tronco, Osteogênese, Craniossinostose, Proliferação
Introdução: A síndrome de Apert é uma doença genética autossômica dominante, causada em geral por 2
mutações de troca de aminoácido no gene FGFR2, as quais diminuem a especificidade de ligação do receptor,
aumentando sua afinidade tanto por seus ligantes quanto por outros FGFs que normalmente não se ligariam. Um
dos principais sinais da síndrome é a fusão das suturas coronais ao nascimento, responsável pelas deformações
craniofaciais desses pacientes. Atualmente o único tratamento para a síndrome de Apert são as intervenções
cirúrgicas, nas quais as suturas fusionadas são reabertas. No entanto as suturas voltam a se fechar, fazendo
necessárias várias cirurgias durante a vida do paciente. Acredita-se que o fechamento das suturas coronais
na síndrome de Apert ocorre pelo aumento da proliferação e diferenciação osteogênica das células tronco
mesenquimais causadas pela mutação. Sendo assim, drogas capazes de reverter esse fenótipo têm grande
potencial para auxiliar no tratamento pós-cirúrgico de portadores da síndrome. Metodologia: Duas drogas foram
testadas, 5-Hidroxitriptamina (Serotonina) e PD173074, um inibidor do domínio Tirosina-quinase dos FGFRs.
Foram verificados os efeitos das drogas sobre a proliferação celular com a contagem total de células durante 4
dias. Foram utilizadas 3 culturas de pacientes com Apert e 3 controles. A diferenciação osteogênica foi verificada
indiretamente pela deposição de cálcio na matriz extracelular por coloração com Vermelho de Alizarina.
Resultados: A Serotonina não foi capaz de causar diferenças significativas na proliferação celular ou na deposição
de cálcio na matriz. O PD173074 foi capaz de diminuir significativamente a proliferação celular tanto em células
de pacientes quanto nas controles. Conclusões: As células tronco mesenquimais se mostraram sensíveis a pelo
menos uma das drogas, o que demonstra que são capazes de evidenciar diferenças no fenótipo celular que leva
à síndrome, no entanto estudos in vivo ainda são necessários para corroborar os resultados encontrados in vitro.
Apoio financeiro : FAPESP, FINEP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
277
Uso de células-tronco mesenquimais no estudo da
ação de antipsicóticos associados ao ganho de peso
Suzuki, AM; Passos-Bueno, MR; Gattaz, WF; Sertié, AL
Laboratório de Genética do Desenvolvimento, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
Palavras-chave: antipsicóticos, ganho de peso, células-tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano, adipogênese
Introdução: Os antipsicóticos têm sido fundamentais no tratamento e prognóstico de distúrbios mentais como
esquizofrenia e transtorno bipolar. De maior uso na atualidade, os antipsicóticos de segunda geração (ASG)
apresentam amplo perfil de ação e maior eficácia no tratamento dos sintomas neurológicos quando comparados
aos antipsicóticos convencionais. Contudo, efeitos colaterais importantes associados ao uso dos ASG constituem
o ganho significativo de peso e o desenvolvimento de distúrbios metabólicos, fatores que levam ao abandono do
tratamento. A magnitude do ganho de peso varia conforme o medicamento e a dosagem, mas fatores como genética
e ambiente também contribuem para essa variabilidade. Estudos recentes sugerem que além da ação central
sobre sistemas de neurotransmissores, os ASG apresentam ação direta sobre o tecido adiposo, promovendo maior
diferenciação de pré-adipócitos e acúmulo de lipídios em adipócitos maduros. Contudo, modelos experimentais
para estudo dos efeitos de diferentes antipsicóticos sobre a biologia do tecido adiposo humano são escassos, e
os mecanismos moleculares associados são pouco conhecidos. Objetivos: Comparar alterações no potencial
adipogênico de células-tronco mesenquimais humanas tratadas com os ASG clozapina e olanzapina (associados com
os mais altos riscos de ganho de peso), e com o antipsicótico convencional haloperidol (não associado com ganho de
peso significativo). Métodos: Células-tronco mesenquimais de tecido adiposo subcutâneo (n=5 mulheres controles)
foram isoladas e cultivadas em meio DMEM-LG/10% SFB. Quando confluentes na quarta passagem em cultura, as
células foram cultivadas em meio adipogênico acrescido ou não de clozapina, olanzapina, e haloperidol (20μM a
100μM) e mantidas em cultura durante: a) 3 dias; b) 7 dias, e mais 7 dias adicionais somente com meio adipogênico,
totalizando 14 dias de diferenciação. O RNA foi extraído (kit NuCleoSpin RNA II), o cDNA sintetizado (Super Script
II), e genes específicos de adipócitos (PPARγ2, LPL e CEBP/β) quantificados (PCR em Tempo Real). Resultados| O
tratamento das células-tronco humanas com meio adipogênico suplementado com os três antipsicóticos resultou
em aumentos da expressão dos genes analisados de forma similar e dosagem-dependente. Assim, concentrações
maiores de olanzapina, clozapina e haloperidol induziram respectivamente: a) no dia 3 do processo de diferenciação,
aumentos médios de expressão de PPARγ2 de 2.7, 2.3 e 2.5 vezes; e de CEBP/β de 2.0, 1.8 e 2.3 vezes; b) no dia 14,
aumentos médios de expressão de PPARγ2 de 1.8, 2.2 e 1.8 vezes; e de LPL de 3.1, 2.6 e 1.9 vezes. Conclusões: Alteração
no controle transcricional da adipogênese parece não ser um mecanismo pelo qual antipsicóticos associados ao
ganho de peso atuam, já que haloperidol (antipsicótico não relacionado a esse efeito) também estimula similarmente
a expressão de genes relacionados à adipogênese. Estamos no momento medindo a quantidade de lipídios
armazenados nas células e averiguando a ação desses antipsicóticos no metabolismo de adipócitos maduros.
Apoio financeiro: Fapesp, Capes, USP/IB
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
278
Análise da atividade de fármacos anti-estrogênicos no
nível de metilação global em linhagens celulares de
carcinomas mamários
Aguiar, G1; Ierardi, DF1; Jasiulionis, MG1
Laboratório de Ontogenia e Epigenética, Departamento de Farmacologia, Universidade Federal de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Câncer de mama, epigenética, metilação de DNA, drogas anti-estrogênicas
Introdução: O desenvolvimento e aperfeiçoamento de técnicas que ajudem no diagnóstico precoce do câncer,
em geral, são de suma importância. Os tumores de mama ainda hoje apresentam índices elevados de incidência,
sendo que, no Brasil, é o tipo de câncer mais incidente entre as mulheres. Apesar de ser uma doença extremamente
heterogênea, atualmente já é possível a utilização de biomarcadores na avaliação do prognóstico e na escolha
terapêutica. Um biomarcador extensamente usado nos tumores de mama é o receptor de estrógeno e entre os
biomarcadores em fase de estudo estão as modificações epigenéticas. Epigenética é definida como mudanças
na estrutura da cromatina que não envolvem alterações na sequência de nucleotídeos e são reversíveis e
herdáveis. A metilação do DNA é um dos mecanismos epigenéticos mais estudados e está relacionada com a
interferência na expressão gênica quando concentrada em regiões críticas para a transcrição. Os tumores em
geral apresentam hipometilação global do DNA, o que está relacionado com instabilidade cromossômica e
desmetilação de genes que deveriam estar silenciados, como oncogenes. Objetivo: Analisar a variação no nível
global de metilação do DNA na linhagem de carcinoma mamário SKBr-3 antes e após o tratamento com as
drogas Fulvestranto, Anastrozol, 17-β-estradiol, Tamoxifeno, 5-aza-2´-deoxicitidina e Tricostatina A. Métodos:
O teste de viabilidade celular utilizando MTT foi utilizado para padronizar a concentração das drogas usadas
nos diferentes tratamentos. Foi realizada a extração do DNA através a técnica de fenol-clorofórmio e a análise
do nível global de metilação do DNA foi realizada pela técnica methylation-specific restriction enzyme (MSRE),
baseada na digestão do DNA com as enzimas MspI (não sensível à metilação)e HpaII (sensível à metilação).
Resultados: O ensaio demonstrou diminuição no nível global de metilação do DNA na linhagem SKBr3 após os
tratamentos com 5-aza-2´-deoxicitidina, Tamoxifeno e Fulvestranto. Após os tratamentos com 17-β-estradiol
e Anastrozol, a metilação global parece não sofrer alteração. Conclusões: Análises mais detalhadas estão em
andamento em nosso laboratório com o objetivo de validar e compreender o efeito de drogas como o tamoxifeno
e o fulvestranto na metilação do DNA e seu impacto no tratamento de pacientes com carcinoma de mama.
Apoio financeiro: Fapesp, CAPES, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
279
TNF induz a expressão de HEY1, HES1 e GATA3 em
células-tronco hematopoéticas durante a linfopoiese T
de forma dependente da via Notch
Schiavinato, JLS1,2,3; Oliveira, LHB1,3; Araujo, AG¹; Orellana, MD³; Palma, PVB³; Covas, DT³; Zago, MA1,3;
Panepucci, RA1,3
Laboratório de Hematologia e Biologia Molecular, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
3
Hemocentro de Ribeirão Preto, Centro de Terapia Celular – CTC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Células-tronco hematopoéticas, CD34+, cocultivo, OP9-DL1, HEY1, HES1, GATA3, Notch
Previamente mostramos que células-tronco hematopoéticas (CTH) do sangue de cordão umbilical (SCU), quando
comparadas as de medula óssea, expressam elevados níveis dos componentes e dos alvos transcricionais das vias
Notch e NF-kB. Essas diferenças se relacionam com o maior potencial das CTH do SCU de gerar linfócitos T. O
tratamento das CTH com TNF-a (agonista de NF-kB) aumenta a geração de células T. Entretanto, os mecanismos
moleculares pelos quais o TNF-a promove linfopoiese T são desconhecidos. Avaliamos a influência do TNF-a na
sinalização de Notch. Assim, CTH CD34+ foram isoladas imunomagneticamente do SCU e cocultivadas (12h)
com células expressando o ligante de Notch, Delta like 1 (OP9-DL1), ou não (OP9), em presença ou ausência de
TNF-a (0,25ng/ml) e do inibidor de Notch, DAPT (10nM). As mesmas condições de cultura foram empregadas
com CTH pré-tratadas com inibidor de síntese protéica, cicloheximidina (CHX). A quantificação dos alvos
transcricionais de Notch (HEY1, HES1 e GATA3) foi realizada por PCR em tempo real. O nível de GAPDH foi
utilizado para a normalização, e a expressão relativa foi obtida em relação às CTH cocultivadas com OP9. O nível
transcricional de HEY1 e HES1 foi induzido pelo cocultivo com OP9-DL1. Interessantemente, esses níveis foram
ainda maiores na presença de TNF-a, mas apenas na ausência de DAPT, indicando efeito positivo da dependência
de Notch. Como esperado para alvos diretos de Notch, a indução pelas OP9-DL1 ocorreu mesmo com o prétratamento das CTH com CHX, entretanto, esse tratamento aumenta a expressão de HES1 enquanto, reduz HEY1.
Esses resultados indicam que proteínas sintetizadas durante o período de cocultivo atuam negativamente na
transcrição de HES1 e positivamente sobre HEY1. Além disso, o efeito de TNF-a na expressão de HES1 quando
CTH recebem pré-tratamento com CHX foi maior do que quando as células não foram pré-tratadas enquanto
que, sobre a expressão de HEY1 foi menor nas pré-tratadas. Apesar dessas mudanças, o efeito positivo de
TNF-a foi presente mesmo nas células pré-tratadas com CHX, o que indica a existência de um mecanismo de
sinalização molecular independente da síntese de novo proteína. Para GATA3, a indução não foi evidente em
CTH cocultivadas apenas com OP9-DL1, entretanto, CHX e TNF-a induziram a expressão de GATA3. Finalmente,
em presença de ambos, CHX e TNF-a, DAPT reduz a expressão de GATA3, indicando sinalização dependente de
Notch. Nossos resultados indicam que: o efeito positivo de TNF-a na linfopoiese T pode derivar parcialmente de
um mecanismo de sinalização molecular dependente de Notch (independente da síntese de novo de proteínas)
que contribui para a indução transcricional de alvos de Notch; a expressão de HEY1 e HES1 é controlada por
mecanismos de feedback positivo e negativo, respectivamente, dependentes da síntese de novo de proteínas.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e FINEP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
280
Análise da Expressão Gênica durante a diferenciação
osteogênica de células mesenquimais estromais
da medula óssea de pacientes portadores de
Osteogênese Imperfeita
Kaneto, CM1; Lima, PSP2; Prata, KL1; Lorenzi, JCC1; Silva, VAO1; Paula, FJA3; Silva-Jr, WA1
Departamento de Genética – FMRP
Departamento de Genética – FMRP
3
Departamento de Genética - FMRP
1
2
A osteogênese imperfeita (OI) é caracterizada como uma desordem genética das células mesenquimais na qual
uma osteopenia generalizada leva a deformidades ósseas, fragilidade óssea excessiva e baixa estatura. As células
mesenquimais estromais multipotentes (CTMs) são precursores presentes na medula óssea adulta capazes de se
diferenciar em osteoblastos, adipócitos e mioblastos que passaram a ter grande importância como fonte terapia
celular. O projeto tem como objetivos: 1) analisar o perfil de expressão gênica de células CTMs isoladas de medula
óssea de pacientes com Osteogênese Imperfeita, durante a diferenciação em osteoblastos, e 2) realizar análises
funcionais em um grupo de genes associado com a osteogênese anormal. Foram coletadas amostras de três
indivíduos normais e quatro amostras de pacientes portadores de Osteogênese Imperfeita. As células mononucleares
(CMN) foram isoladas para a obtenção de células mesenquimais que foram expandidas em 8 garrafas na terceira
passagem e então iniciou-se o estímulo para diferenciação osteogênica. Também foram realizadas análises para
contagem de CFU-F e para três das quatro amostras de pacientes portadores de OI, o número de CFU-F observado
foi inferior ao geralmente encontrado para amostras de doadores normais. Foram coletadas células de uma
garrafa para análises de imunofenotipagem celular por citometria de fluxo e o RNA foi extraído de outra garrafa
originando a amostra denominada D0. As garrafas restantes tiveram suas células estimuladas para diferenciação
osteogênica. Após um dia em cultura com estímulo, mais uma garrafa teve o RNA de suas células extraído (D+1), e
o mesmo procedimento foi realizado nos dias 2 (D+2), 7 (D+7), 12 (D+12), 17 (D+17) e 21 (D+21). Todas as amostras
demonstraram possuir potencial de diferenciação in vitro em osteoblastos e adipócitos. A imunofenotipagem de
células mesenquimais foi realizada pela montagem de um painel contendo os seguintes marcadores: CD45 FITC,
CD14 PE, CD29 PE, CD105 PE, CD90 PE, CD34 PE, CD31 FITC e CD73 PE. As amostras de todos os pacientes
apresentaram perfil imunofenotípico compatível com trabalhos anteriores. Para avaliar a diferenciação das células
mesenquimais em osteoblastos foram realizadas reações de PCR em Tempo Real para os genes ALPL ( fosfatase
alcalina), VDR (receptor de vitamina D) e MSX2. Utilizando-se deste tipo de técnica, alguns estudos têm sido
conduzidos com o objetivo de se identificar genes com expressão exclusiva ou diferenciada durante o processo
de diferenciação osteogênica, a fim de se estabelecer padrões de expressão potencialmente alterados nos diversos
tipos de displasias ósseas existentes.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
281
Estudo dos níveis de expressão de microRNAs preditos
para DNMT3B/Dnmt3b e MECP2/Mecp2 durante a
diferenciação de células-tronco embrionárias humanas
e murinas
Schoof, CRG1,2; Vergani, N2; Oliveira, MT1; Fraga, AM2; Pereira, LV2; Vasques, LR1
1
2
Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP
Universidade de São Paulo, USP
Palavras-chave: epigenética, metilação do DNA, DNMT3B, MECP2, microRNAs
Durante o início do desenvolvimento embrionário, há uma reprogramação epigenética e, salvo regiões parentais
específicas, ocorre uma onda de desmetilação global do DNA. Após a implantação, concomitante com o início
da diferenciação, um novo padrão de metilação passa a ser estabelecido. Uma importante metiltransferase
envolvida neste processo é a DNMT3B. O DNA metilado é reconhecido por proteínas como a MECP2, que então
recrutam as desacetilases de histonas (HDACs) que, por sua vez, levam à compactação da cromatina e à repressão
transcricional.De acordo com o descrito na literatura, tanto a Dnmt3b, como Mecp2 têm padrão de expressão
modulado neste início do desenvolvimento, porém sua regulação ainda não foi elucidada. Com a descoberta de
uma nova classe de moduladores transcricionais, os microRNAs (miRNAs), foi objetivo deste trabalho: comparar a
expressão de Dnmt3b e Mecp2 e de miRNAs preditos para alvejarem seus RNAs, em células tronco-embrionárias
humanas (hESC) e murinas (mESC) antes e depois da diferenciação.A expressão dos genes foi realizada por PCR
em tempo real. Além disso, foi analisada a expressão de Oct4 nas diferentes linhagens para confirmação de seu
estado de diferenciação. A expressão do RNAm do gene DNMT3B/Dnmt3b apresentou-se diminuída em células
humanas e murinas submetidas à diferenciação em cerca de 97% e 70%, respectivamente, quando comparada às
células indiferenciadas, o que está de acordo com a literatura. No caso de MECP2/Mecp2, os níveis de seu RNA
encontraram-se diminuídos em cerca de 50% após a diferenciação em humanos , tendo ocorrido o inverso em
células murinas, nas quais ocorreu um aumento de cerca de 5 vezes. Dos miRNAs preditos para alvejarem, tanto os
RNAm de MECP2/Mecp2 quanto DNMT3B/Dnmt3b, foram escolhidos alguns fortes candidatos por programas de
predição: miR-26a, miR-26b, miR-29a, miR-29b, miR-29c e miR-203.Em hESC, foi observada uma forte expressão
inversa dos microRNAs miR-26a, miR-26b e miR-203 em relação aos de seus potenciais genes-alvo, tendo os
outros microRNAs apresentado um aumento discreto ou manutenção da expressão em células diferenciadas
em comparação às indiferenciadas. No caso de células-tronco murinas, foi observada expressão inversa entre o
microRNAs miR-26a e , em menor proporção, dos microRNAs miR-26b, miR-29c e miR-203 em relação aos níveis
de RNAm de Dnmt3b, indicando um possível alvejamento destes RNAs pelos microRNAs estudados. A expressão
inversa entre um miRNA e seus possíveis alvos parte da premissa de que um miRNA regula negativamente seus
RNAm alvos, sendo um indício de alvejamento que deve ser validado com novos experimentos. Assim, o presente
trabalho indica possíveis microRNAs inversamente expressos em relação ao RNAm de genes da maquinaria
epigenética, abrindo caminho para novos estudos ligando estes dois mecanismos regulatórios, tão importantes
no início do desenvolvimento embrionário, bem como no desenvolvimento de diversas doenças, como o câncer.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
282
Perfil de Expressão de microRNAs em Linfócitos T
CD4+ Infectados pelo Vírus Linfotrópico de Células T
Humanas Tipo 1 (HTLV-1)
Otaguiri, KK1; Zanette, D1; Azevedo, R1; Pinto, MT1,3; Takayanagui, OS2; Silva Jr, WA1,2; Covas, DT1,2,3;
Kashima, S1,2.
Centro de Hemoterapia de Ribeirão Preto
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo (USP)
3
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil
1
2
Palavras-chave: miRNA, HTLV-1, regulação gênica, linfócito T CD4+, HAM/TSP
Introdução: O vírus linfotrópico da célula T humana tipo-1 (HTLV-1) está etiologicamente associado a uma doença
neurológica crônica progressiva denominada mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical
(HAM/TSP). Atualmente, uma abordagem promissora tem sido a avaliação da função de microRNAs (miRNAs)
no entendimento da fisiopatogênese das infecções virais. A literatura relata a importância dos linfócitos T CD4+
na infecção pelo HTLV e no desenvolvimento da HAM/TSP, no entanto, poucos dados relacionam a função dos
miRNAs nesta infecção. Objetivos: Este trabalho propõe identificar e avaliar o perfil de expressão de hsa-miRNAs
em células T CD4+ provenientes de indivíduos infectados pelo HTLV-1, e associar os miRNAs diferencialmente
expressos com mecanismos de desencadeamento da doença. Métodos: A partir das células mononucleares de
sangue periférico (PBMC) foram isolados os linfócitos T CD4+ por meio de colunas imunomagnéticas. O RNA
total foi extraído e a expressão dos hsa-miRNAs foi determinada por PCR em tempo real. Em seguida, foram
eleitos 56 hsa-miRNAs diferencialmente expressos nos grupos estudados: controles, assintomáticos e HAM/
TSP para validação da expressão. Resultados: Foram analisados os padrões de expressão de 196 miRNAs em três
pools de amostras: assintomáticos (HAC), pacientes HAM/TSP e grupo controle (indivíduos não-infectados).
Foram identificados um total de 56 miRNAs diferencialmente expressos, destes 20 apresentaram expressão
≥ 1,5X no grupo HAM/TSP quando comparados ao grupo HAC, e 36 com expressão ≤1,5X. Esta diferença de
expressão foi confirmada para sete miRNAs. Conclusão: Estes resultados demonstram que há uma desregulação
de miRNAs em linfócitos T CD4+ entre os diferentes grupos avaliados. Estes dados sugerem que miRNAs
participem nos processos de infecção e desenvolvimento de HAM/TSP. Assim, esta abordagem pode fornecer
informações acerca dos mecanismos moleculares utilizados pelos vírus/hospedeiro durante a infecção/doença.
Suporte financeiro: FUNDHERP, CNPq, CTC/FAPESP, INCTC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
283
Superexpressão do LOXL1 em lesões endometrióticas
Hidalgo, GS1; Meola, J1; Rosa e Silva, JC1; Ferriani, RA1
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto- FMRP-USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Endometriose, LOXL1, expressão gênica, PCR em tempo real
INTRODUÇÃO: A endometriose é uma doença ginecológica benigna de etiologia complexa e multifatorial, que
acomete de 10 a 15% da população feminina. A LOX (lysyl oxidase) é uma cobre-amino oxidase que catalisa
a formação de aldeído, a partir de resíduos de lisina, de precursores de elastina e colágeno. Efeitos celulares e
extracelulares desta família de enzimas vêm sendo sugeridos como: adesão celular, migração, proliferação e
malignidade. O gene LOXL1 é membro desta família. O RNAm do LOXL1 é particularmente superexpresso no
coração, placenta, pâncreas, músculo esquelético, próstata, ovário, osso e colo do útero. Trabalhos prévios vêm
associando a participação deste gene com a fisiopatologia da endometriose. Objetivo: Avaliar a expressão do gene
LOXL1 em lesões endometrióticas. Material e métodos: As pacientes foram divididas em dois grupos. Grupo I:
composto por 40 pacientes com endometriose, das quais foram feitas 40 biopsias pareadas de endométrio eutópico
(20 fase proliferativa e 20 fase secretora) e 40 de tecido ectópico (20 lesões peritoneais e 20 endometriomas ovariano).
Grupo II: composto por 15 mulheres saudáveis, das quais se coletou duas biopsias de endométrio pareadas
de acordo com a fase do ciclo menstrual, sendo 15 biópsias na fase proliferativa e 15 na fase secretora do ciclo
menstrual. As expressões do gene foi medida por PCR em tempo real. O nível de expressão para o gene analisado foi
calculado para cada amostra de acordo com o método de 2-ΔΔCT. Resultados: No presente trabalho, a maior expressão
significativa do gene foi detectada em lesão endometriótica quando comparada com o tecido autólogo na fase
secretora (P=0.0329 para lesões peritoneais e P=0.01 para lesão ovariana). Além disso, o gene é significativamente
menos expresso no endométrio controle que no eutópico tanto na fase proliferativa (P=0.046) quanto na secretora
(P=0.0325). Ainda, uma regulação positiva significativa do gene foi encontrada na fase proliferativa em relação à
fase secretora do ciclo menstrual quando se comparou os endométrios controles (P<0.0001). Devido às funções
do LOXL1 de renovação e estabilização da matriz extracelular era esperada esta maior expressão no endométrio
proliferativo. Conclusões: O endométrio sofre regenerações cíclicas envolvendo constantes alterações da matriz
extracelular. O gene LOXL1 pode estar envolvido indiretamente neste processo, assim é possível que o desbalanço
na expressão deste gene em lesões endometrióticas permita o estabelecimento e a manutenção do tecido ectópico.
Suporte financeiro: FAPESP, FAEPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
284
Diferenciação neuronal de células-tronco derivadas
de dentes deciduos de pacientes com a síndrome de
Angelman
Cruvinel, EM1; Secco, M1; Almeida, CAN1; Zatz, M1; Cassola, AC2; Koiffmann, CP1
Departmento de Genética e Biologia Evolutiva, Centro de Estudos do Genoma Humano, Instituto de Biociências, Universidade de São
Paulo, São Paulo, Brasil
2
Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Células-tronco, Síndrome de angelman, Diferenciação neuronal, Polpa de dente, UBE3A
A síndrome de Angelman (AS) é uma doença neurocomportamental caracterizada por atraso do desenvolvimento
neuropsicomotor, retardamento mental grave, deficiência na fala, epilepsia, ataxia, aspecto feliz com crises de riso
facilmente motivadas, microcefalia, braquicefalia, macrostomia e prognatismo. A AS é causada pela perda de função
do gene UBE3A localizado no cromossomo 15 materno. UBE3A codifica uma ubiquitina ligase (E6-AP) e apresenta
imprinting tecido-específico: transcrito predominantemente materno é encontrado em regiões do cérebro, mas
nos demais tecidos a expressão é bialélica. Um RNA antisenso paterno que é expresso no cérebro é considerado o
responsável pelo imprinting. Quatro mecanismos diferentes podem resultar na AS: aproximadamente 70-75% dos
pacientes apresentam deleção materna do segmento 15q11-q13, 2-3% UPD(15) paterna, cerca de 5% têm defeito
no (centro de imprinting (IC) do cromossomo 15 materno e, finalmente, 8% apresentam mutação no gene UBE3A.
Recentemente, células-tronco de pacientes com diferentes doenças genéticas têm sido investigadas visando a
compreensão dos mecanismos que levam às patologias e ao desenvolvimento de terapias. O objetivo deste trabalho
é analisar e comparar neurônios derivados de células-tronco de dente decíduos (SHEDs) de pacientes com AS e
controles normais. Foram estabelecidas 3 linhagens de SHEDs de pacientes AS com deleção. Todas as linhagens
foram caracterizadas como células-tronco: mostram capacidade de se auto-renovar, expressam proteínas de
membrana de células mesenquimais e se diferenciam em adipócitos, condrócitos e osteoblastos. As SHEDs já
expressam nestina, que é um marcador neuronal imaturo, e algumas linhagens expressam MAP2, que é uma proteína
de neurônio maduro. As SHEDS foram submetidas a um protocolo já descrito de diferenciação neuronal. As células
diferenciadas continuaram expressando nestina e algumas linhagens tiveram aumento da expressão de MAP2. A
imunocitoquímica mostrou que SHEDs diferenciadas de controles normais apresentaram aumento da expressão
de MAP2 e TUJ1, enquanto que linhagens de pacientes não apresentaram aumento da expressão protéica de MAP2
e em 2 linhagens não houve aumento da expressão de TUJ1. Resultados de medidas eletrofisiológicas (técnica
de “patch-clamp”. configuração “whole-cell” voltage clamp) mostraram que SHEDs diferenciadas em neurônios
apresentam correntes de sódio e potássio passando por canais dependentes de voltagem, característicos de células
excitáveis. Mesmo, células não diferenciadas também apresentavam tais correntes. O fato das SHEDs expressarem
constitutivamente algumas proteínas neuronais, incluídas as dos canais pelos quais passam estas correntes,
sugerem que são células que já possuem alguma característica de diferenciação neuronal. Além disso, nossos
resultados indicam que as células dos pacientes respondem diferentemente ao protocolo de diferenciação neuronal.
Apoio financeiro: CEPID-FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
285
Estudo comparativo de linhagens celulares do aparelho
reprodutor feminino como Feeder-layers de células
tronco embrionárias humanas
Pelatti, M; Secco, M; Zatz, M; Jazedje, T
Laboratório de Células Tronco, Centro de Estudos do Genoma Humano, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo.
[email protected]
Palavras-chave: Feeder-layers, MEF, Células tronco embrionárias
Células Tronco Embrionárias Humanas (CTEH) apresentam um grande potencial de auto-renovação e
diferenciação, podendo originar qualquer um dos 216 tecidos do corpo humano. O cultivo das CTEH necessita
de uma camada de células que auxiliam no seu desenvolvimento, as chamadas feeder-layers. Dentre as várias
possibilidades de feeder-layers disponíveis, o fibroblasto de embrião de camundongo (MEF – murine embryonic
fibroblast) é o mais utilizado. Visando mimetizar ao máximo o ambiente de desenvolvimento do embrião humano,
o objetivo do nosso trabalho é testar três diferentes linhagens de células do aparelho reprodutor feminino humano
como feeder-layers de CTEH: células tronco de trompa, de sangue menstrual e de endométrio. Fazendo uma análise
comparativa entre estas três linhagens celulares e as linhagens controle (MEF e fibroblasto de pele humana)
estamos avaliando quais destas células conferem um melhor suporte para o crescimento das CTEH, qualitativa
(através da morfologia, diâmetro e quantidade colônias) e quantitativamente (dosando os fatores liberados pelas
feeder-layers). A capacidade tumorigênica de todas as linhagens celulares utilizadas neste estudo foram avaliadas
in vivo, no modelo de camundongo imunossuprimido (nude). Neste momento, verificamos que: (1) nenhuma
das feeder-layers propostas causou tumores nos animais nude; (2) as células tronco de trompa apresentaram
melhores resultados, sendo inclusive melhores do que a MEF em relação ao número de colônias e número total
de células, e melhores do que o fibroblasto de pele humana, em relação ao diâmetro e morfologia das colônias.
Avaliaremos, ainda, a expressão dos fatores: bFGF (basic Fibroblast Growth Factor), LIF (Leukemia Inhibitor
Factor), TGF-β (Transforming Growth Factor), WINTs 2, 4 e 8b, através de Elisa e Western Blot, e os marcadores
específicos: Oct-4, Nanog, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 e SOX2, através de RT-PCR e Realtime. Com estes
resultados, esperamos contribuir para o melhoramento não apenas do cultivo de CTEH em ambiente livre de
contaminantes de origem animal, como também propor uma nova alternativa para o cultivo de embriões humanos.
Apoio financeiro: FAPESP/CEPID, INCT, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
286
Identificação de possíveis pontos de transcrição
intergênica através da análise em bancos de dados de
ESTs humanas
Amendro, MF1; Rios, AFL1
Laboratório de Biotecnologia (LBT), Centro de Biociências e Biotecnologia (CBB), Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro (UENF), Avenida Alberto Lamêgo, 2000, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: Epigenética, ncRNA, miRNA, Ilhas CpGs, Transcrição Intergênica
A análise dos dados gerados pelo seqüenciamento do genoma humano revelou que o mesmo é constituído por
aproximadamente 98% de seqüências não codificadoras de proteína. Diversos estudos têm demonstrado que
aproximadamente 60% do genoma humano são constituídos por seqüências transcritas, no entanto, apenas 1.2%
correspondem a seqüências codificadoras de proteínas. Esses dados apontam para a presença de um número
inesperado de RNAs não codificadores de proteína (ncRNAs). Os ncRNAs têm emergido como importantes
moléculas no controle da expressão gênica desde o bloqueio da tradução, na degradação de RNA mensageiro
ou mesmo estabelecendo padrões epigenéticos específicos na cromatina. O presente estudo teve por objetivo
identificar pontos de transcrição intergênica (PTIs) através de análise in silico em regiões regulatórias de genes
codificadores de fatores de transcrição (TF) associados à diferenciação celular embrionária. Para identificação de
possíveis PTIs, foram realizadas análise das seqüências candidatas através do programa Megablast contra o banco
de dados de ESTs (Expressed Sequence Tags) humanas depositadas no GenBank. Foram realizadas análises através
de programas de bioinformática para a identificação de: a) possíveis seqüências precursoras de miRNAs (MFold
e CIDmiRNA); b) identificação de seqüências relacionadas a elementos genômicos repetitivos (Repeatmasker); c)
presença de ilhas CpGs (MethPrimer). Foram identificados hits de ESTs em 50 dos 55 genes (~90%) analisados
totalizando 121 hits. A média do comprimento dos hits foi de 420 pb, com o comprimento máximo encontrado
de 1002 pb e o mínimo de 43 pb. A estrutura secundária de várias das seqüências identificadas demonstra que as
mesmas poderiam constituir novos miRNAs ainda não identificados. Os resultados da análise com Repeatmasker
indicam que em 56.5% (26/46) dos genes, onde supostos pontos de transcrição foram encontrados, continham
segmentos de elementos genômicos repetitivos. Outro dado encontrado é a associação em 63% dos genes
estudados das seqüências supostamente transcritas com ilhas CpGs. Os dados do presente estudo apontam para
a possibilidade da presença de novos transcritos intergênicos associados a regiões regulatórias de diversos genes
codificadores de TFs envolvidos na diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário. Os dados aqui
apresentados poderão corroborar em futuros estudos in vitro com a hipótese da existência de um forte componente
de RNA no estabelecimento de programas de expressão gênica e memória celular em mamíferos.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
287
Células-tronco embrionárias humanas reduzem
marcadores de pluripotência em sistema de co-cultivo
com OP9
Costa, EBO1,2; Orellana, MD1; Magalhães, DAR1; Picanço-Castro, V1,2; Covas, DT1
Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Células-tronco, INCTC, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Células-tronco Embrionárias, Células progenitoras hematopoéticas, Diferenciação celular, Células-tronco pluripotentes,
Células estromais OP9
Introdução: As células-tronco embrionárias humanas (hCTEs) são caracterizadas por sua ilimitada capacidade de
auto-renovação e diferenciação em todas as células especializadas do indivíduo adulto. A alta potencialidade de
diferenciação dessas células em linhagens celulares específicas por métodos de indução in vitro, faz delas grandes
promessas para o desenvolvimento de novas tecnologias aplicáveis à medicina regenerativa e terapia celular.
Imunofenotipicamente, as hCTEs são caracterizadas pela elevada expressão dos marcadores de pluripotência SSEA3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81 e do fator de transcrição Oct-4. Quando co-cultivadas com células OP9 de estroma
de camundongo, as hCTEs são capazes de se diferenciarem em células precursoras hematopoéticas. Objetivo: este
trabalho procurou caracterizar imunofenotipicamente as células diferenciadas obtidas a partir do co-cultivo de
hCTEs com células OP9. Material e Métodos: hCTEs mantidas em cultura em estado indiferenciado foram cocultivadas com células OP9 de estroma de camundongo em meio α-MEM 10% SFB + 100µM Monoatilglicerol
durante 4 dias. Após esse período, as colônias diferenciadas foram desagregadas manualmente e submetidas à
digestão enzimática com tripsina-EDTA (0,05%). As células foram analisadas quanto ao seu perfil imunofenotípico
por citometria de fluxo e quanto ao potencial de formação de CFUs em metilcelulose suplementada com G-CSF,
SCF, BMP-4, FLt3lig, IL-6, IL-3 e EPO. Resultados e Discussão: Colônias de hCTEs foram mantidas em cultivo
durante 40 passagens e apresentaram morfologia de células indiferenciadas. Quando analisadas por citometria de
fluxo, as células apresentaram elevados níveis dos marcadores de pluripotência: TRA-1-60 (26,7%), TRA-1-81 (29%),
Oct-4 (7,2%), e foram negativas para o marcador KDR, um receptor de VEGF que têm sua expressão aumentada
durante os estágios iniciais de diferenciação das hCTEs em células progenitoras hematopoéticas durante o cocultivo com OP9. Após o co-cultivo com células OP9 por 4 dias, as colônias de hCTEs passaram a apresentar
morfologia de células mais diferenciadas e mostraram uma redução evidente nos marcadores de pluripotência,
TRA-1-60 (14,2%), TRA-1-81 (15,1%), Oct-4 (0,2%), e um leve aumento na expressão de KDR (0,52%). No entanto
não foi observada a formação de CFUs na metilcelulose, possivelmente pela quantidade mínima de células
diferenciadas obtidas. Conclusões: hCTEs passam a adquirir morfologia de células mais diferenciadas e têm seus
marcadores de pluripotência diminuídos quando co-cultivadas com células estromais OP9, indicando que estas
células estromais podem dar suporte à diferenciação hematopoética in vitro. O sutil aumento na expressão do
marcador KDR, pode ser um indício de que essas células estejam se diferenciando na linhagem hematopoética/
endotelial, visto que o método de cultivo é indutor desse processo. Ainda é necessária uma adequação do método
para a obtenção de um número maior de células diferenciadas e análises de expressão gênica por PCR em Tempo
Real estão sendo realizadas para verificar com maior precisão em qual tipo celular as hCTEs estão se diferenciando.
Apoio financeiro: FAPESP, FINEP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
288
A Imunomodulação dos linfócitos T pelas Células
Tronco Mesenquimais: o papel do marcador CD69 e da
adenosina
Araujo, FS1; Panepucci, RA1; Haddad, R1; Ferreira, FIS2; Araujo, AG1; Palma, PV1; Queiroz, RHC2; Covas,
DT1; Zago, MA1
INCTC-FUNDHERP, FMRP-USP, Brasil
FCFRP-USP, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Células tronco mesenquimais, microarray, linfócitos, adenosina, CD69
As células tronco mesenquimais (CTMs) exercem um efeito imunoregulatório e suprimem a proliferação dos
linfócitos T. Um dos mecanismos pelo qual esse efeito ocorre é a pela indução de linfócitos regulatórios (Tregs).
O CD69 é um marcador de ativação linfocitária controlado pela via canônica de NK-KB. Entretanto a expressão
estável desse receptor esta relacionada à imununoregulação. Nosso objetivo foi investigar novos mecanismos de
imunoregulação promovidos pela CTMs sobre os linfócitos T. Para isso, linfócitos T foram isolados e ativados com
uso de beads anti-CD3/CD28 e cultivados ou não com CTMs. Após cinco dias de cultivo, isolamos os linfócitos
TCD4 e realizamos uma análise transcricional em larga escala, por microarray (triplicata biológica). Entre os genes
diferencialmente expressos, encontramos componentes da adenosina (potente imunosupressor); como o receptor
de adenosina (ADORA2A) e a enzima adenosina deaminase (ADA) e o marcador CD69. Para investigação do papel
da adenosina nesse contexto, utilizamos a técnica de RT-PCR para validar os achados do microarray, citometria de
fluxo para analisar a expressão das ecto-enzimas CD39/CD73 (produtoras de adenosina) e cromatografia liquida
de alta pressão para quantificar a adenosina nos meios de cultura dos linfócitos co-cultivados ou não com CTMs.
A investigação da geração de linfócitos CD69+ foi feita por uso de citometria de fluxo e relacionamos essa expressão
a participação da via não-canônica de NF-KB, usando como ferramentas RT-PCR, inibidor químico (BAY11-7082)
e siRNA contra componentes da via canônica de NF-KB. Os linfócitos co-cultivados com CTMs expressam maiores
níveis de ADORA2A e menor de ADA do que os linfócitos cultivados isoladamente. Em linha, os Tregs gerados
pelas CTMs possuem elevada expressão de CD39/CD73, assim como há maior concentração de adenosina na
condição de co-cultivo, comparada a cultura isolada de linfócitos. Demonstramos ainda que CTMs cultivadas em
meio de cultura obtido de linfócitos ativados (ambiente inflamatório) produzem elevados níveis de adenosina. A
investigação da indução de linfócitos CD69+ pelas CTMs, revelou que esses linfócitos estão expressos entre vários
subtipos de Tregs (CD4+CD25hi, CD8+CD25hi e Cd8CD28-) e que diferentemente do papel de ativação, essas células
CD69+ são controladas pela via não-canônica de NF-KB. Conclusão: demonstramos claramente, que em situações
inflamatórias, as CTMs podem promover uma passagem da via canônica para não-canônica de NF-KB e induzir a
expressão do CD69 nos linfócitos e esse mecanismo pode estar envolvido com a geração de Tregs periféricas. Por fim,
a porcentagem de linfócitos expressando CD39 e CD73 e de CTMs expressando CD39, aumentou significantemente
após co-cultivo, indicando produção de adenosina. Em suma, a regulação de CD39/CD73 e de ADORA2A nos
linfócitos e de CD39 nas CTMs apontam para um novo mecanismo imunoregulatório promovido pelas CTMs.
Apoio financeiro: CNPq & FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
289
Enriquecimento de queratinócitos secretores de
mGH em células-tronco mediante adesão rápida ao
colágeno
Oliveira, NAJ; Cecchi, CR.; Higuti, E; Bartolini, P; Peroni, CN
Departamento de Biotecnologia, IPEN-CNEN, São Paulo, SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: colágeno IV, hormônio de crescimento de camundongo, queratinócitos, terapia gênica, camundongos lit/scid
Introdução: A obtenção de níveis persistentes de secreção de hormônio de crescimento (GH) in vivo é um dos
principais desafios para que a terapia gênica baseada em queratinócitos modificados geneticamente possa ser
empregada em seres humanos. A rápida queda dos níveis circulatórios de GH produzido por queratinócitos
humanos primários transduzidos pode ser atribuída ao: baixo número de células-tronco transduzidas,
inativação de componentes do vetor utilizado ou transporte ineficiente da proteína produzida para a circulação.
Objetivos: Investigar se o enriquecimento da população de queratinócitos em células-tronco é um pré-requisito
importante para a manutenção da expressão da proteína transgênica in vivo. Métodos: Uma das metodologias
utilizadas para enriquecer uma determinada população de queratinócitos em células menos diferenciadas é a
rápida adesão destas células progenitoras a substratos derivados de diferentes tipos de colágeno, utilizando-se a
técnica da rápida adesão destas células a substratos derivados de colágeno IV. Os queratinócitos humanos foram
cultivados e transduzidos com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH), seguindo protocolo
padrão estabelecido em nosso laboratório. As células transduzidas foram semeadas em placas de cultura celular,
previamente recobertas com colágeno humano tipo IV, e aquelas que não se aderiram em 5 e 15 minutos foram
removidas e contadas, sendo assim determinada a porcentagem de células aderidas. Posteriormente foi avaliada
a viabilidade celular e a produção de mGH in vitro e in vivo, mediante a construção de culturas organotípicas
e implante desses enxertos em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Resultados: As células tratadas
com o colágeno por 5 min. apresentaram uma produtividade média de 3,1± 0,8 µg mGH/106 cél./dia, enquanto
as não tratadas de 3,2 ± 1,2 µgmGH/106 cél./dia. Em termos de aumento da produção de mGH não foi portanto
obtida uma diferença significativa entre as células tratadas e as não tratadas, resultado similar foi obtido com o
tratamento por 15 min. Quanto à viabilidade celular, foi verificado que as células tratadas puderam ser cultivadas
por um número maior de passagens do que as não tratadas: as células não tratadas entraram em senescência
na 12ª passagem, enquanto as células tratadas por 5 min com colágeno estão atualmente na 18ª passagem. As
culturas organotípicas derivadas dos queratinócitos transduzidos e enriquecidos pelo método de aderência
ao colágeno apresentaram um valor médio de produção de mGH, após 1 hora do implante, de 14,0 ng/ml ±
6,8(n=3); enquanto os não enriquecidos apresentaram um valor médio de 13,0 ng/ml ± 2,0(n=3). Conclusões:
Os queratinócitos enriquecidos pelo método de aderência ao colágeno mostraram maior viabilidade celular in
vitro do que os não enriquecidos. Mais estudos são necessários para determinar se o aumento de viabilidade
que ocorre in vitro também ocorre in vivo, e se este fato implica numa maior durabilidade da secreção do mGH.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
290
Construção de ferramentas de interferência de RNA
para investigar o papel dos marcadores endocíticos
Appl1 e Ocrl1 em células-tronco embrionárias e na
diferenciação neural
Da-Fonseca, HLS1; Do-Amaral, MJ1; Reis, SA1; Bonamino, MH3; Rehen, SK4; Lopes, UG2; De-Melo, LDB1,2
Instituto Federal do Rio de Janeiro, Campus Maracanã, Rio de Janeiro, RJ
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, CCS, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ
3
Instituto Nacional do Câncer, CPQ, Rio de Janeiro, RJ
4
Instituto de Ciênicas Biomédicas, CCS, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: células-tronco; lentivírus; APPL1; OCRL1, diferenciação neural
Introdução: A utilização eficiente de células-tronco embrionárias humanas (hESC) como alternativa terapêutica
em doenças neurodegenerativas como o mal de Parkinson, depende da compreensão das vias de sinalização
que definem o estabelecimento de interações neuronais, e o controle do potencial proliferativo das célulastronco. A diferenciação e migração neuronal são controladas pela transdução de sinal mediada por receptores
de membrana. Neste trabalho será analisada a participação das proteínas endocíticas APPL1 e OCRL1 na
internalização e reciclagem de receptores neuronais para TrkA e Netrin-1.Objetivo: Construir as ferramentes
moleculares necessárias para realizar interferência de RNA em hESC e analisar a conseqüência da depleção das
proteínas APPL1 e OCRL1 ao longo da diferenciação neural clássica. Metodologia: Clonagem de shRNA contendo
sequência alvo para APPL1 e OCRL1 no vetor constitutívo pLVTHM, e subclonagem no vetor indutível pLVETtTR-KRAB. De posse das construções, obtenção de partículas virais por co-transfecção de células HEK-293T
com pMDL g/p RRE, pRSV-Rev e VSV por precipitação com cloreto de cálcio. Validação do RNAi constitutivo
em HEK-293T com os vírus VSV-shRNAAppl1-1574, VSV-shRNAAppl1-1441, VSV-shRNAOcrl1-2820, VSVshRNAOcrl1-2382. Verificação da eficiência dos shRNA por western blotting. Posterior transdução de células-tronco
embrionária humana H9 com os vírus para expressão induzível: VSV-shRNAAppl1-1441, VSV-shRNAOcrl-2382,
VSVshRNAOcrl-2820. Conclusão: Comprovamos a eficiência do shRNAAppl1-1441 na redução da expressão de
APPL1, enquanto o shRNAAppl1-1574 não demonstrou a mesma capacidade. Por outro lado, a expressão de
shRNAOcrl-2382 e shRNAOcrl-2820 mostraram-se letais para as células HEK293T. No momento, está em curso
a seleção das linhagens hESC H9 transduzidas com os vírus VSV-shRNAAppl1-1441, VSV-shRNAOcrl-2382,
VSVshRNAOcrl-2820. Esperamos observar alterações na capacidade endocítica das células-tronco transduzidas,
assim como, alterações na expressão de receptores de membrana e em marcadores da diferenciação neuronal.
Financiamento: CNPq, IFRJ e FAPERJ
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
291
LM-Database: uma base de conhecimento sobre
lamininas e seus receptores
Golbert, DCF 1,2,3; Linhares-Lacerda, L2; Almeida, LGP3; Mundstein, AS3; Savino, W2; Vasconcelos, ATR1,3
Departamento de genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro
Laboratório de pesquisa sobre o timo, Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Oswaldo Crus, Rio de Janeiro
3
Laboratório Nacional de Computação Científica
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Banco de dados, Lamininas, Bioinformática, Receptores de laminina e Sistema linfo-hematopoiético
Laminina (LM) é uma família de proteínas da matriz extracelular, constituindo o principal componente não
colágeno da membrana basal. Atuam em diversos processos biológicos, incluindo adesão, diferenciação, migração
e proliferação celular, e metástase. Esses efeitos são, em grande parte, mediados pela ligação a diferentes receptores
presentes na superfície celular. No sistema linfo-homatopoiético, exercem importante papel nas interações que
medeiam a migração celular. As lamininas são um heterotrímero composto por três cadeias, alfa (α), beta (β), e
gama (γ), que se associam fornecendo diferentes isoformas de lamininas. As isoformas são designadas por numerais
arábicos seguindo a ordem de descoberta da proteína, como a laminina 111 (α1B1γ1). Atualmente, existe uma
enorme quantidade de informações sobre essas proteínas dispersas na literatura e em diversos bancos de dados.
A criação do “LM-Database” tem como objetivo unificar todos esses conhecimentos num único local, facilitando
a busca de informações, além de fornecer uma ótima fonte de referências que ajuda e estimula estudos com essas
proteínas, com particular ênfase para o sistema linfo-hematopoiético. O LM-Database é mais do que uma fonte
de dados, uma vez que todas as informações serão cuidadosamente curadas e anotadas, com muitos dos dados
sendo especialmente processados e estocados localmente. O LM-Database fornecerá informações básicas sobre
cada proteína e seu respectivo gene (lamininas, receptores, ligantes extracelulares e outras proteínas relacionadas).
As informações sobre proteína compreendem os nomes, RefSeq, número de acesso no PubMed, dados sobre gel
2D, modificações de aminoácidos, estrutura, função e interações com outras proteínas e domínios funcionais. A
seção de genes foi dividida em estrutura e expressão gênica. Na parte de estrutura estão dados como o RefSeq do
nucleotídeo, anotação sobre a identificação do gene, estrutura e localização cromossomal, variantes de splicing,
SNPs, conservação, além de serem disponibilizados acessos a browsers de visualização no genoma. Em expressão
gênica serão disponibilizados diferentes dados experimentas, além de sequencias de primers. Outra seção é sobre
distribuição nos tecidos e terapêutica, com informações sobre imunoistoquímica, anotação sobre uso terapêutico
da proteína, os anticorpos disponíveis e inibidores da síntese ou da ligação proteína-receptor. Além disso, o LMDatabase proverá informações sobre as relações moleculares das proteínas em diferentes vias metabólicas, e
os mais recentes conhecimentos sobre microRNAs que estão regulando a expressão do gene em questão. Serão
recuperados da literatura todos os links de artigos sobre cada proteína do banco, e disponibilizados na seção
PubMed. Além disso, o banco também abrange novos conhecimentos sobre a laminina no que diz respeito a
sua atuação no sistema linfo-hematopoiéico, com dados gerados pelo projeto/PRONEX intitulado “Laminina
e migração celular no sistema linfo-hematopoiético: papel funcional e potencial terapêutico”. Atualizações
regulares serão realizadas. A perspectiva é disponibilizar a versão on line do LM-Database no ano de 2010.
Apoio financeiro: CNPq, Fiocruz, FAPERJ, LNCC
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
292
Novo RNA antissenso intrônico candidato a regulador
da expressão do gene RASSF1
Crocci-Souza, R1; Beckeddorff, FC1; Oliveira, ACA1; Verjovski-Almeida, S1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, 05508-900 São Paulo, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: RNA não-codificador, regulação gênica, RASSF1, super-expressão, caracterização funcional
Trabalhos recentes têm revelado que uma porção significativa das mensagens transcritas dos organismos superiores
é composta por RNAs não-codificadores (ncRNA), que, possivelmente, desempenham papéis definidos, mas até
agora pouco elucidados. Nosso grupo tem empregado abordagens in silico baseadas em mapeamento genômico e
clustering de ESTs, juntamente com experimentos de microarray utilizando oligoarrays intron/exon, para catalogar
cerca de 78000 ncRNAs longos intrônicos; expressos em orientação antisenso em relação ao mRNA codificador para
proteína. Neste trabalho, nós estudamos um desses novos ncRNA que é transcrito na fita oposta do gene supressor
tumoral RASSF1. Confirmamos a expressão desse ncRNA antisenso por experimentos de RT-PCR fita-específica em
duas linhagens de células humanas, HeLa e HEK293; o ncRNA é mapeado no genoma em um intron do gene RASSF1A
upstream do sítio de iniciação da transcrição da isoforma RASSF1C. Este novo ncRNA foi chamado de RASSF1-AS
RNA. Caracterizamos que ele é transcrito pela RNA polimerase II, uma vez que a sua transcrição foi inibida quando
as células HeLa foram tratados com α-amanitin; mostramos que ele não apresenta CAP na sua extremidade 5’, com
experimentos quantitativos usando tobacco acid pyrophosphatase e terminator 5´-phosphate-dependent exonuclease.
Os níveis de expressão dos genes RASSF1A e RASSF1-AS RNA foram determinados por experimentos de PCR em
tempo real nas duas linhagens de células. Curiosamente, uma correlação negativa entre os níveis de expressão
desses transcritos foi encontrada, sugerindo que o ncRNA poderia regular a expressão de RASSF1A. Para responder
esta questão, super-expressamos RASSF1-AS RNA em células HeLa. Dois ensaios independentes de transfecção
foram realizados e, em ambos os casos, a super-expressão de RASSF1-AS RNA promoveu uma diminuição nos
níveis de RASSF1A. A fim de descobrir se a regulação do gene RASSF1A promoveu um efeito fenotípico nas
células, foram realizados ensaios de proliferação em células HeLa, com e sem super-expressão de RASSF1-AS RNA.
Detectamos que as células super-expressando o ncRNA proliferaram mais rapidamente, com um aumento da taxa
de proliferação de, em média, 1,17 vezes. Identificamos ainda uma provável sequência promotora para RASSF1-AS
RNA através de análise in silico e clonagem desta região upstream ao gene da luciferase em um vetor repórter de
promotor. A atividade do promotor do RNA intrônico antisenso foi confirmada em células HeLa. Este estudo auxilia
na elucidação de novos mecanismos que envolvem ncRNAs como importantes peças na regulação da transcrição.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
293
Estudo da biogênese e distribuição sub-celular de
RNAs não-codificadores intrônicos em células HeLa e
MCF-10A
Oliveira, ACA; Verjovski-Almeida, S; Reis, EM
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: ncRNAs, intrônicos, núcleo, expressão gênica, cap 5’
Estudos recentes têm demonstrado que uma fração significante do transcriptoma de mamíferos é composta por
RNAs longos (>200 nt) que tem pouco ou nenhum potencial codificador (ncRNAs), sendo muitos deles originados
de regiões intrônicas e intergênicas do genoma. Pouco ainda é sabido sobre a biogênese e função dos ncRNAs
intrônicos. Portanto, o estudo de sua localização sub-celular e a avaliação da existência de modificações póstranscricionais nas extremidades 5’ e 3´ características de mRNAs nesses transcritos podem contribuir com novas
pistas sobre sua possível função biológica.Neste trabalho nós investigamos a distribuição de ncRNAs intrônicos
nos compartimentos nuclear e citoplasmático de células HeLa e MCF-10A, combinando fracionamento celular
seguido da análise do RNA presente nas frações sub-celulares através da hibridização com oligoarrays intronexon customizados. Foram identificados 7.100 e 5.820 transcritos diferencialmente distribuídos (FDR ≤ 1%)
entre as frações nucleares e citoplasmáticas de células HeLa e MCF-10A, respectivamente. Destes, 1.604 (19,4%)
e 1.869 (20,1%) são ncRNAs que mapeiam em regiões intrônicas e 5.496 (50,9%) e 3.951 (37,3%) mapeiam em
regiões exônicas, em células HeLa e MCF-10A, respectivamente. A maior parte dos transcritos intrônicos (78%
em HeLa e 86,8% em MCF-10A) e exônicos (83,8% em HeLa e 79,3% em MCF-10A) representados no oligoarray
e diferencialmente distribuídas entre as frações nuclear e citoplasmática nas duas linhagens celulares mostrouse enriquecida no núcleo. Experimentos utilizando as enzimas tobacco acid pyrophosphatase (TAP) e terminator
5´-phosphate-dependent exonuclease têm revelado que alguns desses ncRNAs intrônicos são dotados da estrutura
cap em sua extremidade 5’, indicando um processamento pós-transcricional semelhante ao encontrado em mRNAs
transcritos pela RNA Polimerase II. A análise de enriquecimento de categorias funcionais entre os loci gênicos que
possuem ncRNAs intrônicos predominantemente localizados no núcleo indicou a super-representação (p < 0,05)
de genes relacionados ao metabolismo de RNA, regulação da expressão da gênica, genes que codificam proteínas
localizadas no compartimento nuclear, incluindo speckles nucleares que estão envolvidas com splicing de RNA.
Não foi observado o enriquecimento significativo de categorias funcionais quando analisados os transcritos
enriquecidos na fração citoplasmática de células HeLa e MCF-10A. Potencialmente, os ncRNAs intrônicos
enriquecidos no núcleo das células HeLa e MCF-10A podem afetar a regulação da expressão gênica através de
remodelamento da cromatina, edição do mRNA e/ou splicing alternativo do pre-mRNA. Os ncRNAs intrônicos
nucleares identificados neste trabalho constituem-se em interessantes candidatos para testar estas hipóteses.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
294
Expressão Alterada dos Genes NUMB, TXNIP, SGPL1,
MSH2, FOXO3, RHOG e MIF em Células da Medula
Óssea de Pacientes com Anemia Refratária com
Excesso de Blastos
Freitas, PC1; Mendiburu, CF1; Silva Jr, WA2; Ricci Jr, O3; Fett-Conte, AC4
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
3
Departamento de Medicina, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto. 4Departamento de Biologia Molecular, Faculdade de
Medicina de São José do Rio Preto
[email protected]
1
2
Palavras-chave: SMD, AREB, expressão gênica, SAGE, PCR em tempo real
Introdução: Anemia Refratária com Excesso de Blastos (AREB) é um estágio avançado de Síndrome Mielodisplásica
(SMD). Esta última compreende um conjunto heterogêneo de desordens clonais, que têm origem em células
multipotentes e resultam em doenças hematopoéticas que podem evoluir para leucemia mielóide aguda. A
incidência anual é estimada entre dois e 12 casos por 100.000 pessoas da população em geral, com até 50 casos por
100.000 em indivíduos com idades superiores a 70 anos, o que evidencia um aumento proporcional à idade. Contudo,
a etiologia, especialmente a base molecular, permanece desconhecida. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil
de expressão gênica de AREB e identificar os genes com expressão alterada. Método: Foi construída uma biblioteca
SAGE AREB, que foi comparada com a biblioteca SAGE de células da medula óssea normal. Os genes candidatos
foram selecionados e a expressão foi validada por PCR em tempo real. Resultado: Um total de 59.459 tags foram
seqüenciadas na biblioteca SAGE AREB. Vários genes apresentaram expressão alterada e sete foram selecionados por
estarem relacionados com carcinogênese. Os genes FOXO3, NUMB, MSH2, TXNIP e SGPL1 estavam hipoexpressos,
enquanto os genes MIF e RHOG estavam hiperexpresso. Os resultados foram validados por PCR em tempo real.
Discussão: Estes genes são importantes na regulação do ciclo celular, manutenção da homeostase e supressão
tumoral. Alteração na sua expressão sugere que podem desempenhar um papel na patogênese e/ou evolução de AREB.
Apoio financeiro: CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
295
Defining mRNA targets of microRNAs during osteoblastic
differentiation of human mesenchymal stem cells by
microarray transcriptional interaction networks
Octacílio-Silva, S1,2; Marques, MM1; Evangelista, AF1; Magalhaes, DA1; Dernowsek, JA1; Bombonato-Prado, KF3;
Passos, GAS1,3
Molecular Immunogenetics Group, Department of Genetics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, USP.
Laboratory of Morphophysiological and Molecular Investigation, Department of Morphology, Biological and Health Sciences Center, UFS,
São Cristóvão, SE, Brazil
3
Dept. Morphology, School of Dentistry of Ribeirão Preto, USP
[email protected], [email protected]
1
2
Keywords: microRNA, miRNA-mRNA interaction, gene network, microarrays, stem cells, differentiation
Studies on transcriptional profiling during differentiation have successfully elucidated the role of key genes and their
signaling pathways. The fine control of this process is mainly exerted by microRNAs (miRNAs) at post-transcriptional
level, which interact with target mRNAs inhibiting protein translation. In mammalian cells, imprecise base-pairing
between miRNAs and 3’-UTR region of mRNAs allow the possibility of different mRNA targets. Accordingly, specific
miRNA-mRNA interactions need be experimentally determined depending on the model-system focused. To access
this hypothesis, we employed the microarray method to study the differential expression of 640 miRNAs and 4500
mRNAs of human umbilical cord mesenchymal stem cells (ucMSC) during the in vitro osteoblastic differentiation at
different times (0 to 48 hours and to 7 days in culture). The expression profiling data were analyzed by bioinformatic
programs as SAM and Cluster-TreeView allowing determining the differentially expressed miRNAs and mRNAs
during the differentiation process. In order to determine specific mRNA targets, the data were re-analyzed using
GenMir algorithm allowing reconstruction miRNA-mRNA interaction networks along osteoblastic differentiation.
At early differentiation (24 h), the DTX1 mRNA, which is involved in negative regulation of differentiation, was a
target of a group of miRNAs (miR135a, miR520h, miR24, miR7g, miR527, miR152 and miR515_5p). Subsequently
(48h), SQSTM1 mRNA involved in NF-kB regulation, interacts with miR191*, miR449a, miR491, miR365, miR95 and
miR425*. Late cultures (7d) featured large density of differentiated osteoblasts and showed that the up-regulated
BGLAP mRNA, which is involved in bone differentiation and metabolism, is regulated by miR135a, miR-let7a,
miR363* and miR95. These results indicate that reconstruction of networks based on actual microarray data is
adequate to determine miRNA-mRNA interactions defining specific mRNA targets. We demonstrated that fine
molecular regulation of osteoblastic differentiation is an on-off-like process in which key mRNAs can play a role
as negative (e.g. DTX1, SQSTM1) or positive (BGLAP) controllers and that these can be targets of several miRNAs.
Financial support: CNPq, MCT, MS, FAPESP and CAPES.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
296
Caracterização da interação entre RNAs não
codificadores (ncRNAs) intrônicos e complexos
protéicos modificadores da cromatina
Amaral, MS1; Verjovski-Almeida, S1
Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: regulação da expressão gênica, RNAs não-codificadores de proteína, transcritos intrônicos, complexos modificadores
da cromatina, tumorigênese
Trabalhos recentes têm revelado que uma fração significativa do transcriptoma dos organismos superiores é
composta por RNAs não codificadores de proteínas (ncRNAs), que possuem função regulatória na expressão gênica
em situações normais e patológicas. Uma das classes destes RNAs é composta por transcritos longos, expressos
em trechos intrônicos em orientação antisenso em relação ao RNA mensageiro codificador de proteína transcrito
no mesmo locus genômico. Entre as funções já descritas desempenhadas por estes ncRNAs estão a regulação do
splicing alternativo, a estabilização de RNAs codificadores de proteína e a geração de microRNAs. No entanto, um
possível mecanismo de ação pouco estudado é a interação destes ncRNAs com proteínas. Neste trabalho temos
como objetivo estudar a possível interação destes ncRNAs com complexos protéicos, selecionados com base nos
seguintes critérios: presença na proteína de domínios de ligação a RNA, envolvimento em processos relacionados
à regulação da expressão gênica por meio de modificação da cromatina e à tumorigênese e disponibilidade de
anticorpos comerciais. Os complexos protéicos PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) e Ash1-like (absent,
small or homeotic-like) foram selecionados e, inicialmente, estabelecemos a linhagem celular a ser utilizada nos
experimentos. Para tanto, quantificamos os níveis dos transcritos codificadores para estes complexos, além de
transcritos não codificadores sabidamente ligados a eles (HOTAIR e TRE para PRC2 e Ash1-like, respectivamente)
em diferentes linhagens celulares. PCR quantitativo em tempo real (qPCR) indicou que a linhagem celular HEK-293
apresenta os níveis mais altos dos transcritos analisados. Em seguida, realizamos imunoprecipitações dos complexos
ribonucleoprotéicos com anticorpos dirigidos a componentes dos dois complexos selecionados, além de anticorpos
não relacionados (controle) em paralelo. Por meio de qPCR, observamos um enriquecimento de aproximadamente
170 vezes do transcrito HOTAIR entre os RNAs co-imunoprecipitados com anticorpo dirigido a um dos componentes
do complexo PRC2, quando comparado à fração imunoprecipitada com anticorpo não relacionado. Além disso, o
transcrito TRE foi identificado por meio de RT-PCR na fração imunoprecipitada com anticorpo anti-Ash1, mas não
na fração imunoprecipitada com anticorpo não relacionado. Em paralelo, realizamos western blot e confirmamos a
imunoprecipitação dos componentes dos complexos. Para identificarmos os RNAs co-imunoprecipitados com cada
um destes complexos, utilizaremos lâminas Agilent de microarranjo contendo sondas de oligonucleotídeos 60-mer,
desenhada em nosso grupo, com 244 mil elementos representando regiões intrônicas, intergênicas e exônicas do
genoma humano. Concluímos que a imunoprecipitação dos complexos ribonucleoprotéicos é eficiente, e a marcação
e hibridização nos microarranjos dos RNAs co-imunoprecipitados é o próximo passo a ser realizado neste estudo.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
297
Terapia Celular do Enfisema Pulmonar induzido
experimentalmente
Longhini dos Santos, N1; Faria, CA2; Alves-de-Moraes, LBC2; Frei, F1; Nogueira, MFG1; Stessuk, T1;
Marcelino, MY2; Oliveira, ALD 3; Barbosa de Oliveira, VA1; Ribeiro-Paes, JT1
Departamento de Ciências Biológicas, Unesp - Campus de Assis
Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia, USP – IPT – Butantan –SP
3
Universidade Paulista, Campus de Assis
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Enfisema Pulmonar, DPOC, Células-tronco, Terapia Celular
No espectro da Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC), o enfisema é caracterizado pela destruição das paredes
alveolares, com diminuição da superfície de troca gasosa e dispnéia progressiva. Os aspectos epidemiológicos (como
alta prevalência) e o impacto econômico-social vinculados a essa condição patológica têm motivado uma série de
estudos visando novas alternativas terapêuticas clínicas e cirúrgicas. Não se logrou, no entanto, até o presente, um
tratamento clínico efetivo. Neste trabalho, objetivou-se avaliar a eficiência da terapia celular com pool de células
mononucleares da medula óssea (BMMC) em modelo animal de enfisema pulmonar. O enfisema foi induzido em
camundongos fêmeas da linhagem C57Bl/6 por instilação intranasal de elastase. Após 21 dias, os camundongos
receberam BMMC de camundongos machos transgênicos EGFP+, com background genético da linhagem C57Bl/6.
Os animais receptores de BMMC foram sacrificados aos 7, 14 e 21 dias posteriores à infusão das células. Os grupos
controle e experimental foram avaliados comparativamente, considerando-se a medida do intercepto linear médio
dos alvéolos pulmonares (Lm). Os valores obtidos de Lm foram submetidos à análise de variância (Kruskal-Wallis),
sendo observadas diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre os grupos tratados com BMMC e
avaliados após 7, 14 e 21 dias. Por meio da análise das medianas dos diferentes grupos, o resultado mais expressivo,
caracterizado por uma melhor recuperação histológica do tecido pulmonar, foi diretamente proporcional ao
tempo, ou seja, obtido no grupo tratado com BMMC e avaliado após 21 dias. Entre os grupos controle, tratados
apenas com elastase e/ou uma dose de meio DMEM, não foi observada diferença estatisticamente significativa.
A análise dos cortes histológicos por fluorescência demonstrou presença expressiva das células infundidas (GFP
+) no pulmão dos animais receptores. Nos testes de imunohistoquímica, houve marcação de metaloproteinase 9
(MMP9) somente nos cortes dos grupos controle, indicando uma possível diminuição do processo inflamatório
nos animais tratados. Os resultados obtidos mostram a recuperação morfológica do parênquima pulmonar após
infusão de BMMC em animais com enfisema pulmonar induzido experimentalmente.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
298
GAS1 como novo gene candidato para Holoprosencefalia
Ribeiro-Bicudo, LA1,2,3; Quiezi RG1,2; Nascimento A1; Bertolacini CDP1,2; Richieri-Costa A1
Laboratório de Genética Molecular – Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais, Universidade de São Paulo, Bauru –SP
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Área de Concentração em Genética, Universidade Estadual Paulista, Botucatu-SP
3
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação – Área de Concentração em Fissuras Orofaciais e Anomalias Relacionadas,
Universidade de São Paulo, Bauru-SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: HPE, HPE-Like, SHH, GAS1, variantes
O termo Holoprosencefalia foi proposto por DeMeyer et al. (1963) para definir o envolvimento dos componentes do
prosencéfalo - telencéfalo e o diencéfalo e caracteriza-se por um defeito da linha média do prosencéfalo embrionário
devido à falha do crescimento ou segmentação do final do tubo neural anterior. De acordo com a gravidade das
malformações cerebrais são definidos quatro tipos: 1) HPE alobar, 2) HPE semilobar, 3) HPE lobar e 4) fusão interhemisférica média. Um fenótipo diverso e mais leve espectro holoprosencefálico, foi descrito recentemente, e foi
denominado de HPE-“like”. As faces desses portadores apresentam características da HPE (hipotelorismo, incisivo
central superior único, fissura labiopalatina, hipoplasia da face média, microcefalia) acompanhada de sistema
nervoso central íntegro ou com pequenos desvios da normalidade. O fenótipo da holoprosencefalia é bastante
variável abrangendo um espectro contínuo desde manifestações severas envolvendo graves anomalias do cérebro e
face até indivíduos clinicamente normais. O modelo principal relacionado com as HPE refere-se à rede sinalizadora
do gene Sonic Hedgehog (SHH), o qual controla decisões celulares críticas em relação ao destino de múltiplos
sistemas, particularmente nas células tronco e a partir delas, funcionando como um “interruptor” – inibidor ou
facilitador – ditando o destino celular desde etapas iniciais do embrião até a vida adulta. Os genes mais conhecidos
relacionados à rede sinalizadora do SHH compreendem o ZIC2, TGIF, PTCH, GLI2, FAST1, TDGF, SUFU e o DHCRT,
entretanto diversos outros genes tem sido indicados como genes candidatos. O gene GAS1 codifica uma glicoproteína,
a glicosil-fosfatidil-inositol, a qual é reprimida em resposta ao Shh e tem sido demonstrado que, in vitro, tem um
efeito antagonista na sinalização do Shh nos somitos. O gene GAS1 humano está mapeado na região 9q21.3-q22,
um lócus associado a diversas desordens humanas envolvendo defeitos dentro da região craniofacial. O gene GAS1
tem sido indicado como um modificador do Sonic Hedgehog. O objetivo desse trabalho foi analisar o gene GAS1 em
60 casos de holoprosencefalia. O gene GAS1 possui apenas 1 éxon, e foi dividido em 3 fragmentos. Para amplificação
dos fragmentos de interesse utilizou-se a técnica do PCR (Polymerase Chain Reaction), sendo seguida da purificação
e sequenciamento direto dos mesmos utilizando-se o analisador genético ABI 3130 (Applied Biosystems- CA,
USA). Identificamos 5 variantes não sinônimas as quais foram consideradas como possivelmente patogênicas pela
análise do programa PolyPhen. Dois desses pacientes também apresentaram mutação no gene SHH, previamente
analisado. Esse é o primeiro relato de variações no DNA no gene GAS1 em pacientes com HPE. As manifestações
clínicas apresentadas por estes pacientes estabelecem o gene GAS1 como um dos candidatos para a HPE humana.
Apoio financeiro: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
299
Sistema de auxilio a análise de dados de doenças
reumáticas pediátricas
Souza, IGS1; Ferriani, VPL2; Melo, JML2; Giuliatti, S1
Laboratório de Bioinformática, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
Departamento de Puericultura e Pediatria, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Doenças Reumáticas, Análise de Dados, Base de dados, Banco de Dados Inteligência Artificial
Introdução: A grande quantidade de dados obtidos através de pesquisas utilizando um grupo de oito doenças
reumáticas pediátricas como Artrite, Esclerodermia e Dermatomiosite Juvenil, fazem parte do grupo de doenças
pesquisadas em estudos com pacientes do Departamento de Pediatria e Puericultura da Universidade de São
Paulo, do Hospital das Clínicas de Ribeirão Preto. A Dermatomiosite Juvenil não possuem causa conhecida, mas
o seu desenvolvimento está relacionado a um distúrbio imunológico e associado a uma predisposição genética.
Tais doenças estão incluídas entre as doenças raras e com grande repercussão funcional e na qualidade de vida,
causando ônus econômico e social. A elevada quantidade de informações coletadas e geradas por meio desses
dados é utilizada para estudos em pacientes do hospital e para as pesquisas e estudos de alunos, mestrandos e
doutorandos do departamento. No intuito de facilitar o registro epidemiológico destas doenças raras, é de grande
importância o desenvolvimento de uma base de dados. Faz-se necessário também um sistema que auxilie na
classificação do perfil dos pacientes. Para isso a Inteligência Artificial tem como objetivo desenvolver métodos
que simulem a capacidade humana de resolver problemas, buscando implementar algumas características
humanas nos sistemas de computação. Objetivo: O presente projeto tem como objetivo a análise e criação de
um sistema voltado para o auxílio na padronização de medidas clínicas propiciando a base logística para
delineamento provendo ao grupo maiores oportunidades de financiamento e de cooperação científicotecnológica na formação acadêmica de novos especialistas. O sistema para o auxílio, análise e transferência de
dados inicialmente coletados localizados e armazenados em planilhas eletrônicas é utilizada no intuito de auxiliar
os envolvidos do grupo de pesquisa agindo como um serviço na investigação de patologias em um conjunto de
informações que crescem exponencialmente e que tendem a variar de acordo com a quantidade de pacientes
envolvidos. Para isso, fez-se necessário a utilização de recursos indispensáveis na criação do sistema. Metodologia:
Para a transcrição e armazenamento de dados de planilhas para o sistema gerenciados de banco de dados, será
utilizado o MySQL 5.0, o Preprocessor Hypertext Protocol (PHP) para processamento de grandes quantidades de
texto e Asynchronous Javascript and Xml (AJAX) para criação de scripts do sistema e o servidor APACHE para
armazenar o sistema. Conclusões: O sistema trabalha atualmente com inserção, deleção e atualização automática
de pacientes, operação facilmente concedida através da iteração com o banco de dados. No momento a fase
de seleção de atributos e classificação está em andamento. Estudos, incluindo informações genéticas poderão
ser incluídos para pesquisas mais abrangentes e avaliações na influência da interação entre esses dados.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
300
Genética e genômica na atenção básica à saúde:
necessidade de saúde atual
Lopes-Junior, LC1; Carvalho-Júnior, P1; Alvarenga, LM; 2Nascimento, LC2; Ferraz, VE3; Flória-Santos, M2
FAMEMA - Faculdade de Medicina de Marília, Marília, SP
Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP
3
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Genética, Genômica, Defeitos congênitos, Aconselhamento Genético, Saúde Pública
Introdução: Os defeitos congênitos apresentam relevância crescente para a saúde pública brasileira. As causas
infecciosas como responsáveis pela taxa total de óbitos na infância vêm decaindo, resultando no aumento da
proporção de mortes atribuíveis a esses defeitos, que se configuram como a segunda causa de mortalidade
infantil no país. Com o intuito de organizar uma rede de atenção aos mesmos, o Ministério da Saúde propôs a
implantação da Portaria GM/MS nº 81/20 jan/2009, instituindo, no âmbito do Sistema Único de Saúde, a Política
Nacional de Atenção Integral em Genética Clínica (PNAIGC), que se constituí em dois níveis de atenção: básica
e especializada. Ressalta-se a importância da atenção básica no processo de estruturação desta rede, que por
ser a porta de entrada do sistema, pode incorporar estratégias cruciais para a prevenção das doenças genéticas
na Estratégia Saúde da Família (ESF). Objetivo: conhecer a formação em genética e levantar o conhecimento de
profissionais, médicos e enfermeiros, que atuam na ESF, em relação às propostas da PNAIGC. Método: pesquisa
de campo, descritiva-exploratória, com abordagem quantitativa. Após aprovação do CEP, no período de dezembro
de 2009, foi aplicado um questionário estruturado, com dados sociodemográficos e questões de conhecimento a
30 médicos e 30 enfermeiros de 30 unidades da ESF, em uma cidade do interior paulista. Resultados: a maioria dos
respondentes era do sexo feminino (78,4%), 56,9% enfermeiros, 43,1% médicos; 86,3% tiveram conteúdos de genética
na graduação, que ocorreu entre 2000 e 2009 para 60,7% dos sujeitos. Muitos (71,5%) reconheceram a importância
da realização de aconselhamento genético (AG) e 46% já haviam desenhado heredograma. Grande parte dos
profissionais (81,6%) não apresentava experiência em genética clínica, 70% nunca ouviram falar da PNAIGC e 78%
não se sentem preparados para prestar cuidado e/ou avaliar um caso de anomalia congênita ou de deficiência
mental. Ressalta-se que 92% gostariam de participar de um curso de capacitação sobre doenças genéticas e AG.
Conclusões: a regulamentação da Portaria possibilitará a implantação de um novo modelo de atenção à população,
com perspectivas inovadoras e implicações na organização da atenção em genética no SUS e na capacitação da
força de trabalho para a escuta das necessidades de saúde dos usuários. Torna-se urgente o oferecimento de
oportunidades de educação, com base em competências essenciais em genética/genômica, para os profissionais
de saúde, independentemente do seu nível de formação, especialidade e cenário de atuação. Espera-se que esses
conhecimentos e habilidades sejam incorporados na prática profissional, favorecendo o planejamento e as ações
programáticas nessa área ainda desassistida, possibilitando avanços frente aos desafios dessa problemática no Brasil.
Apoio financeiro: FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
301
Análise retrospectiva de pacientes com Síndrome de
Down e avaliação da idade das avós maternas como
fator de risco
Pereira, CS1; Pola, L1; Santos, SA1; Laureano, LAF2; Paz, CCP1,3; Martelli, L1
1: Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP
2: Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP
3: Instituto de Zootecnia – Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios
[email protected]
Palavras-chave: Síndrome de Down, fator de risco, aneuploidia, idade materna, cromossomo 21.
A trissomia do cromossomo 21, responsável pela síndrome de Down (SD), é a aneuploidia mais frequente em
nascidos vivos, com incidência entre 1/500 a 1/1000 nascimentos. A trissomia livre do cromossomo 21 é
responsável por cerca de 95% dos pacientes com SD, sendo 5% originados por translocações robertsonianas e
mosaicismo. Desde a sua descrição, em 1959, esta cromossomopatia tem sido alvo de diversos estudos. A idade
materna ainda permanece como um dos poucos fatores de risco bem estabelecidos para o desenvolvimento de
gestações aneuplóides. A geração de um maior número de oócitos aneussômicos conforme o aumento da idade
é atribuída à deterioração de fatores celulares e moleculares associados ao controle meiótico. Contudo, estudos
recentes evidenciaram um baixo nível de mosaicismo gonadal na população feminina em geral, demonstrando que
o erro mitótico (pré-meiótico) pode contribuir consideravelmente para a formação de aneuploidias. Paralelamente
aos estudos de famílias com mosaicismo gonadal, foi verificada uma possível influência da idade das avós de
pacientes com Síndrome de Down, sugerindo que as filhas dessas mulheres apresentariam mosaicismo em alguns
tecidos, sem expressão fenotípica, porém com maiores chances de ter um filho com alterações cromossômicas.
No presente estudo, realizamos um levantamento de 10.454 pacientes atendidos no ambulatório de Genética do
Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP no período de 1976 a 2005, encaminhados
para estudo citogenético com suspeita de cromossomopatia. Dentre eles, 8.131 (77%) apresentaram cariótipo
informativo, sendo que 983 tiveram confirmação do diagnóstico de SD, constituindo 13,16% do total analisado
e 72,12% das aneuploidias. Não houve prevalência maior de um dos sexos, sendo 54% do sexo masculino e 46%
feminino. Adicionalmente realizamos um estudo da idade das avós maternas dos pacientes com SD em 65 famílias
e comparamos a idade das avós no momento da gestação das mães que tiveram filhos com SD com idade <35
anos (grupo I) e >35 anos (grupo II). Apesar da média da idade das avós maternas do grupo I ser maior (29,3
anos), o aumento não foi significativo em relação à idade das avós do grupo II (25,3 anos). Nossos resultados não
corroboram estudos anteriores que demonstraram correlação entre idade avançada das avós maternas e a maior
incidência de SD. Meio século após sua caracterização cromossômica, a Síndrome de Down ainda apresenta diversos
questionamentos e os mecanismos responsáveis pelas aneuploidias cromossômicas permanecem não identificados.
Auxílio financeiro: CNPq, FAEPA HCFMRP-USP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
302
Distribuição geográfica e tendências temporais na
gemelaridade de Cândido Godói- RS e sua possível
relação com o médico nazista Joseph Mengele
Oliveira, M1,2; Tagliani-Ribeiro, A1,3; Fagundes, NJR1,3;Matte, U1,4; Koslovski-Sassi, A1,2; Schüler-Faccini, L1,3
Instituto Nacional de Genética Médica Populacional (INAGEMP)
Universidade Federal do Pampa (UNIPAMPA)
3
Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS)
4
Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: gemelaridade, Cândido Godói, distribuição geográfica, tendência temporal, Joseph Mengele.
Apesar de terem sido objeto de diversas investigações, a etiologia de nascimentos gemelares em seres humanos
ainda é desconhecida. O município de Cândido Godói (CG), situado no nordeste do Rio Grande do Sul, possui
uma alta taxa de gemelaridade, cerca de 2%, em comparação com a média de 1% em todo país, tal fato a faz ser
conhecida como a “Cidade dos Gêmeos”. Além disso, uma das localidades do município (Linha São Pedro - LSP)
parece concentrar o nascimento de gêmeos. Algumas hipóteses já foram levantadas a respeito desta frequência
elevada, e a mais controversa liga o fenômeno da gemelaridade a supostos experimentos do médico nazista Joseph
Mengele, que teria atuado como médico no município durante a década de 1960. Esse trabalho teve como objetivo
analisar epidemiologicamente nascimentos gemelares em CG, testando padrões temporais e geográficos que
permitam verificar se esses dados poderiam fornecer algum subsídio aos rumores que ligam Mengele ao município.
Os registros de nascidos vivos foram obtidos a partir dos livros de batismo de igrejas católicas do município no
período entre 1927-2008. A proporção relativa de gêmeos dizigóticos e monozigóticos foi estimada de acordo com a
fórmula de Weinberg. A heterogeneidade no número de nascimentos de gêmeos entre as localidades do município
foi testada com um teste qui-quadrado utilizando apenas os nascimentos ocorridos após 1959, por serem dados
confiáveis. As variações temporais nas freqüências de nascimentos duplos foram analisadas com um teste G
seguido de um teste de tendência, agrupando-se os nascimentos em períodos de 5 anos e considerando apenas os
nascimentos pós-1959. De fato, LSP é a localidade que concentra o nascimento de gêmeos (7,5% em comparação
com 1,5% em todo município de CG) (P<10-4). Além disso, a proporção de gêmeos DZ é significativamente maior
em LSP (P=0,0004). A análise dos registros de batismo mostra que nascimentos gemelares já eram bastante
freqüentes muito antes da década de 60. A taxa de nascimentos duplos em CG não mostra uma heterogeneidade
temporal significativa (P=0,65). Para LSP, a heterogeneidade temporal é significativa (P=0,003), com tendência
de aumento (P=0,001). Em conjunto, esses resultados claramente refutam qualquer possibilidade de que uma
possível experiência realizada na década de 60 tenha produzido um efeito agudo no nascimento de gêmeos em
CG. Uma hipótese alternativa para a alta taxa de nascimentos gemelares em CG está relacionada a um efeito
fundador decorrente da colonização de CG por poucas famílias de imigrantes alemães no início do século XX.
Apoio financeiro: INAGEMP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
303
Análise de polimorfismos possivelmente associados à
gemelaridade na cidade de Cândido Godói-RS, a “Terra
dos Gêmeos”
Tagliani-Ribeiro, A1,2; Fagundes, NJR1,2; Matte, U2,3; Schüler-Faccini, L1,2
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto Nacional de Genética Médica Populacional (INAGEMP)
3
Centro de Terapia Gênica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre
[email protected]
1
2
Palavras-chave: gemelaridade, genes candidatos, Cândido Godói
A cidade de Cândido Godói está localizada no Noroeste do Rio Grande do Sul e é conhecida como a “Terra do
Gêmeos” devido às altas taxas de nascimentos duplos. Até agora, não há explicações científicas para a ocorrência
aumentada de nascimentos gemelares nesse município, porém o alto grau de parentesco entre os moradores e
a existência de uma grande recorrência familiar de nascimentos gemelares sugerem o envolvimento de fatores
genéticos. Sabe-se que o município de Cândido Godói foi fundado por poucas famílias de imigrantes de origem
alemã. Existem na literatura variantes genéticas que poderiam explicar as causas da gemelaridade, tanto aquelas
envolvidas na poli-ovulação quanto relacionadas ao sucesso da implantação do (s) óvulo(s) fecundado no útero.
O objetivo desse trabalho é realizar um estudo de associação através da análise de polimorfismos em três genes
candidatos comparando se há diferença nas frequências alélicas ou genotípicas entre mulheres com e sem
gestações gemelares. Para o gene FSHr, possivelmente associado à poli-ovulação, será estudado o polimorfismo
na posição 680 do éxon 10. Para os genes MTHFR e TP53, possivelmente associados ao sucesso de implantação
do(s) blastocisto(s) no útero, estão sendo estudados, respectivamente, os polimorfismos C677T e P72R. A amostra
consiste em 42 mulheres com histórico de gestação dupla e 101 mulheres que só tiveram gestações simples,
todas residentes de Cândido Godói. As genotipagens estão sendo feitas por PCR em tempo real e as freqüências
alélicas e genotípicas comparadas entre os grupos pelo teste do qui-quadrado. A análise do gene MTHFR já foi
concluída em 39 mães de gêmeos e 97 controles. O grupo de mães de gêmeos apresentou a freqüência do alelo T
de 0,29 e o grupo controle de 0,34, valores muito próximos àqueles encontrados em outras populações brasileiras
de origem européia, não havendo diferença estatisticamente significativa nas freqüências alélicas (P=0,52) nem
genotípicas (P=0,77) entre os dois grupos em estudo. Assim, este resultado não aponta o polimorfismo C677T
do gene MTHFR como um fator de suscetibilidade na gemelaridade em Cândido Godói. A conclusão das
genotipagens dos outros dois polimorfismos propiciará uma análise mais abrangente. Da mesma forma, serão
realizadas novas análises levando em conta o histórico familiar para gemelaridade dentro do grupo controle.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
304
Análise dos dados do “Campo 34” da Declaração de
Nascidos Vivos
Oliveira, CIF1; Fett-Conte, AC2
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
Laboratório de Genética, Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto
[email protected]
1
2
Palavras-chave: “Campo 34”, Recém-nascido, Anomalia Congênita, Anomalia Cromossômica, Defeito Congênito.
Introdução: Os defeitos congênitos afetam cerca de 3 a 5% dos recém-nascidos e são considerados como uma
das causas principais de morbidade e mortalidade no primeiro ano de vida, além de serem responsáveis por uma
frequência elevada de perdas embrionárias e fetais. Dados brasileiros sobre a prevalência de defeitos congênitos
são escassos e incompletos. O “campo 34” da Declaração de Nascidos Vivos é uma estratégia para detecção de
defeitos de nascimento, pois questiona ao profissional de saúde se alguma anomalia congênita e/ou anomalia
cromossômica foi observada no recém-nascido. Objetivos: Investigar se o “campo 34” foi preenchido corretamente
nos casos de recém-nascidos com defeitos congênitos no Hospital de Base de São José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.
Métodos: Foram analisados os prontuários de todos recém-nascidos com defeitos congênitos em um período de
um ano. Resultados: O preenchimento do “campo 34” foi realizado em 97% dos casos de recém-nascidos com
defeitos congênitos. No entanto, o preenchimento deste campo estava incorreto em 28%, pois a criança possuía
um ou mais defeitos visíveis ao nascimento que não foram registrados. A opção “desconhecida” não foi assinalada
para nenhum dos pacientes com defeitos congênitos, e em apenas dois casos, o campo foi deixado em branco.
Conclusões: O Sistema de Informação (SINASC) é uma fonte de dados para estudos sobre a prevalência de defeitos
de nascimento e o problema envolvendo dados incorretos no “campo 34” observado em um hospital escola da
região mais desenvolvida do Brasil, provavelmente também ocorre em outros hospitais do país, subestimando os
dados oficiais. Assim, há necessidade de desenvolver estratégias de sensibilização para o preenchimento correto
do “campo 34”, cujos dados podem ser úteis para o desenvolvimento de políticas públicas de saúde, de estratégias
de prevenção de defeitos de nascimento no Brasil e encaminhamento de casos para o Aconselhamento Genético.
Apoio financeiro: CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
305
Defeitos congênitos em Cachoeira do Sul, Rio Grande
do Sul, Brasil
Menezes, CD1; Brites, PC1; Machado, DTM1; Bordignon, S1; Holthausen, R1; Skolaude, AR1
Curso de Biologia da Universidade Luterana do Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: defeitos congênitos, anomalias isoladas, síndrômico, síndrome de Down, síndrome de Edwards.
São conhecidos aproximadamente 4.000 defeitos congênitos, sendo que essas anomalias constituem uma das
causas de morte no primeiro ano de vida. As anomalias congênitas de seres humanos atingem cerca de 3%
de todos os nascidos vivos. Do ponto de vista biológico, representam um grupo heterogêneo de distúrbios do
desenvolvimento embrio-fetal, no qual cerca de 60% dos casos são de causa desconhecida. As de etiologia genética
são as mais conhecidas e abrangem as cromossômicas (6%) e as com herança mendeliana (20%). O objetivo desta
pesquisa foi determinar a frequência dos defeitos congênitos em todos os nascimentos ocorridos no município
de Cachoeira do Sul – RS. Este foi um estudo descritivo de base populacional realizado no Centro Obstétrico
da Maternidade do Hospital do município de Cachoeira do Sul. Foram considerados como investigados todos os
recém-nascidos (RN), vivos ou mortos, de 500g ou mais de peso, durante 5 anos. Foi considerado defeito congênito
toda alteração morfológica, interna ou externa, clinicamente diagnosticáveis, com um aceitável grau de certeza
antes da alta hospitalar. Nesse período ocorreram 5027 nascimentos e ocorreram 42 casos de RN com defeitos
congênitos, com uma incidência de 0,84%. Peso médio dos RN foi de 2.828g, 12 RN com peso menor que 2.500g.
A estatura média foi de 46,5 cm. Quanto ao sexo: 64,3% eram do sexo masculino e 35,7% do sexo feminino, sendo
1,8:1 homens:mulheres. Quanto à sazonalidade: 78% dos portadores de defeitos congênitos nasceram no período
de outono/inverno. A idade média das mães foi de 29,6 anos, sendo 19% entre 10-19 anos, 54,8% entre 20-35 anos
e 26,2% Idade materna maior do que 35 anos. Os RN com defeitos congênitos foram descritos como sindrômicos
e em RN com anomalia única. Dos RN sindrômicos verificou-se 20 casos, sendo 14 casos com síndrome de Down,
01 para cada 359 nascimentos, as mães dos portadores de síndrome de Down, sendo que 57% tinham com idade
superior a 35 anos; 02 casos com síndrome de Edwards, 01 para cada 2513 nascimentos; e 03 casos de RN com
anomalias múltiplas. Foram observados 23 casos de anomalias únicas, sendo divididos em 04 casos com anomalias
maiores, e 07 casos possuindo anomalias menores. Foi verificado que em 05 anos de monitoramento não houve
um alarme quanto à ocorrência de defeitos congênitos. Mas quanto à ocorrência de síndrome de Down essa é
considerada alarmante, pois está acima do esperado. Esse tipo de estudo serve como referência para estudos
comparativos e para programas de vigilância epidemiológica, que constituem o eixo norteador na pesquisa da
etiologia dos defeitos congênitos.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
306
Prospecção de doenças genéticas na Paraíba
(Nordeste - Brasil)
Pereira, JC; Franca, LN; Almeida, ES; Alves, AMM; Brasileiro, RA; Soares, MTO; Melo, US; Weller, M;
Santos, S
Universidade Estadual da Paraíba (UEPB), Departamento da Biologia, Campus Universitário do Bodocongô, 58429600 Campina Grande,
Paraíba, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Prospecção, doenças genéticas, Paraíba, epidemiologia genética, SIAB.
No sertão do Rio Grande do Norte, foram descritas duas doenças genéticas novas, a Sindrome Spoan (OMIM
609541) e Sindrome Santos (OMIM 613005). A primeira afeta 70 pessoas de uma mesma família. A pesquisa dessas
doenças envolveu abordagem prospectiva que difere do atendimento ambulatorial. Os estudos prospectivos são
realizados em regiões de difícil acesso e nas quais não são oferecidos serviços de diagnóstico e aconselhamento
genético. Neste trabalho, descrevemos os procedimentos e resultados da prospecção de doenças genéticas
realizada em dez municípios da Paraíba. De agosto de 2009 a maio de 2010, foram visitadas famílias com repetições
de casos de deficiências físicas em um núcleo familiar, indicadas pelos agentes de saúde de dez municípios com
menos de 10.000 habitantes na macrorregião de Campina Grande (PB). Para prospecção, foram selecionados os
municípios com menor número de habitantes e maior frequências de indiviudos com deficiência segundo o banco
de dados do SIAB/DATASUS. Após seminário com profissinais do PSF das secretarias de saúde, os agentes de
saúde indicavam famílias para entrevista com pesquisadores. Algumas delas participaram posteriromente de
uma ação de avaliação clínica, sendo ou não escolhidas para continuidade de estudos clínico-genéticos. Durante
a prospecção, foram preenchidas 80 fichas e registrado 129 indivíduos com alguma deficiência. Desse total, foram
selecionados para avaliação clínico-genética 22 indivíudos afetados por doenças neuromusculares pertencentes a
cinco famílias de quatro municípios diferentes; 30 pessoas com deficiencia auditiva, sendo 16 delas pertencentes
a uma mesma família; 20 indivíduos com retardo mental, sendo 80% deles concentrados em dois municípios
do Cariri paraibano e 19 casos de deficiências múltiplas. Os estudos prospectivos se mostraram efetivos para
localização de famílias nas quais há repetição de indivíduos acometidos por uma mesma doença genética. O
relativo isolamento geográfico, pouca mobilidade populacional e baixa densidade populacional contribuem para
manutenção de endocruzamentos nas famílias e isto eleva os riscos de nascimento de indivíduos acometidos por
diferentes doenças genéticas. A maior parte desses indivíduos não possuem acesso aos centros de referência em
genética humana e não possuem diagnóstico e aconselhamento genético sobre as doenças que os acometem.
Apoio financeiro: FAPESQ/PRPGP-UEPB
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
307
Análise de recém-nascidos portadores de
dismorfologia congênita na cidade de Manaus
Moraes, LC de1; Cavalcanti, SS1; Britto-Jr, A1; Ribeiro, HCT2; Souza, AQL de1
¹Laboratório de Genética Humana da Escola Superior de Ciências da Saúde da Universidade do Estado do Amazonas (ESA/UEA)
²Laboratório de Genômica e Proteômica do Mestrado em Biotecnologia da Universidade do Estado do Amazonas (MBT/UEA)
³Serviço de Arquivo Médico e Estatístico da Maternidade Ana Braga (SAME)
[email protected]
Palavras-chave: Malformações, congênito, recém-nascidos, maternidades,síndrome.
O conhecimento da genética do embrião, incluindo os mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento humano
normal tem sido o alvo de pesquisa de pesquisadores interessados em elaborar avaliações diagnósticas e
prognósticas mais eficazes no tratamento de pacientes portadores de defeitos congênitos. A dismorfologia é o
estudo dos defeitos congênitos que alteram a formação ou a forma de uma ou mais partes do corpo de uma criança
recém-nascida. As dismorfologias são classificadas em três categorias: malformações; deformações e disrupções. A
presente pesquisa é a primeira realizada com recém-nascidos portadores de malformações congênitas na cidade de
Manaus/AM, onde se procurou conhecer os tipos e a freqüência de malformações em recém-nascidos, contribuir
com a orientação da equipe médica, sobre a solicitação de exames genéticos e o enquadramento do diagnóstico
preciso. Os levantamentos foram realizados através dos dados do livro de entrada na maternidade e do centro
cirúrgico. Foram observados 58 casos anotados, no período de 12 meses (maio/2009 – abril/2010) na maternidade
Ana Braga da Zona Leste da cidade, com 23 diferentes dismorfologias, sendo que as maiores prevalências são de
casos não identificados (14) alguns apenas com a descrição de faces sindrômicas, seguido de sete casos de pé torto
congênito (sendo um bilateral), sete casos de gastroquise, cinco de hidrocefalias e cinco de lábios leporinos. Há uma
prevalência em recém-nascidos do sexo masculino (69%). Esta pesquisa é a primeira realizada na cidade de Manaus
sobre mal formação congênitas e será ampliada para mais duas maternidades estaduais. Tendo sido solicitada a sua
inclusão numa maternidade municipal, onde podemos contribuir com o diagnóstico de um recém-nascido com
síndrome de Apert e outro com síndrome de Patau, além do período da amostragem ser ampliado para dois anos.
Suporte Financeiro: FAPEAM.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
308
Levantamento das síndromes genéticas presentes nas
APAEs da região do Alto Tietê
Gouveia, MC1,2; Silva, JH1,2; Bracarense, CF1,2; Monteiro, MS1,2; Nascimento, T1,2; Abondanza,TS3
Graduanda do curso de Biomedicina da Universidade de Mogi das Cruzes
Membro da Liga de Genética Médica da Faculdade de Medicina da Universidade de Mogi das Cruzes.
3
Professora Coordenadora da Liga de Genética Médica da Faculdade de Medicina da Universidade de Mogi das Cruzes
Professor orientador: [email protected]
1
2
Palavras-chave: Síndromes Genéticas, APAEs, Alto Tiête, Síndrome de Down, pré-natal, diagnóstico.
Introdução: O censo do IBGE (2000) aponta que 24,6 milhões de pessoas apresentam alguma deficiência,
demonstrando que 14,5 % da população brasileira têm algum tipo de deficiência física, mental, sensorial, surdocegueira, ou múltipla. Dentre as causas dessas condições, muitas são geneticamente determinadas, algumas mais
freqüentes na população e outras raras. Em uma rápida pesquisa na base de dados DataSUS, sobre as cidades do Alto
Tietê, percebeu-se que não há informações específicas desta região; os indivíduos Diagnosticados com Síndromes
Genéticas (DSG) integram os números de malformação congênita; os que apresentam alterações cromossômicas
numéricas ou estruturais não aparecem descritos; erros de alteração gênica, como de metabolismo, nem sequer são
descriminados. Observou-se ainda que a região é considerada integrnate da grande São Paulo, o que contribui para
a dificuldade em obter dados desta área. Objetivos: Coletar dados sobre a população com síndromes genéticas na
região do Alto Tietê atendidos pelas APAEs, no perído de 2005 a 2008. Metodologia: O estudo consistiu em visitar
as instituições de amparo a população objeto da região e coletar dados sobre as síndromes genéticas da população
alvo. Na sequencia, realizou-se uma entrevista com os responsáveis pelos indivíduos. Resultados: De acordo com
o DataSUS, no periodo de 2005 a 2008, houve um total de 93.582 nascidos vivos e 444 indivíduos com anomalias
congênitas. Desse total 9,6% apresentam síndromes genéticas, sendo que a de maior frequencia é a Síndrome de
Down, seguida do X–Frágil. Conclusão: As anomalias congênitas da população alvo em comparação com o total
de nascidos vivos, no período analisado, são representativas. Dos dez municípios pesquisados, oito apresentaram
um serviço direcionado para a população objeto. Observou-se que há dificuldade em obter o diagnóstico genético
na maior parte dos casos. Identificou-se que a limitada capacidade de atendimento deste provoca uma espera na
admissão. Constatou-se que a criação dos serviços, deu-se por iniciativa dos responsáveis pelos indivíduos com
síndromes genéticas. Verificou-se que as instituições não dispõem de geneticista para atendimeto à população.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
309
The prevalence of endogamy and physical disability
in populations of Paraíba, North-Eastern Brazil, is
associated with geographic isolation
Tanieri, M; Melo, US; Martins, A; Almeida, ES; Franca, LN; Pereira, JC; Azevedo RB; Santos, S; Weller M
Universidade Estadual da Paraíba (UEPB), Departamento da Biologia, Campus Universitário do Bodocongô, 58429-500 Campina Grande,
Paraíba, Brasil
[email protected]
Keywords: endogamy, consanguinity, physical disability, geographic isolation, human populations
Consanguineous unions cause in general an increase of recessive genetic disorders and are associated with the
occurrence of rare genetic syndromes. The marriage between close relatives is still practiced in many communities
of North-Eastern Brazil and recent studies revealed communities with up to 32% of consanguineous unions
(Santos et al., 2010). This high frequency may be influenced by cultural, economic and demographic factors.
Previous studies postulated that the affected populations are characterized by reduced gene flow due to their
geographic isolation. Furthermore, it was postulated that geographic regions with low population densities are
characterized by elevated physical disability (PD). The present study aimed to analyse the influence of geographic
isolation on communities and regions (r1, r2, r3 and r4), defined by the public health system in the state of
Paraíba. We addressed the question of geographic isolation affecting both the degree of endogamy and the total
PD. Questionnaires were elaborated, in cooperation with local public health agencies, to estimate the degree of
endogamy in communities of Paraíba. The data to calculate PD and population density were obtained by the
Information System of Basic Attention (SIAB) and the Brazilian Institute of Geography and Statistics (IGBE),
respectively. Analysis of data was performed applying PASW STATISTICS, version 18, (SPSS Inc., IBM company).
The division of all 223 communities in two groups, below and above 50 habitants/km2, revealed significant more
disabilities in the communities with lower population densities (p50 < 0.037). Regression analysis indicated that
smaller communities with lower population densities have a higher PD (p < 0.021). The mean PD varied between
1.32% (r1), 1.36% (r2), 1.46% (r3) and 1.71% (r4) in the different regions. Regression analysis revealed a significant
increase of PD in the communities localized more distantly to the coast and generally characterized by lower
population densities (p < 0.013). The difference of mean endogamy values (F) varied considerably from 0.004826
to 0.01206, between communities with low and high population densities, respectively (not significant). Analysis
revealed a correlation between PD and the degree of endogamy (p < 0.007). We postulate that low population
densities affect the degree of endogamy in the same way as they do it in the case of PD. More data are elaborated
actually to test this hypothesis. Population density could serve as a demographic parameter to foresee increased
frequencies of genetic disorders in Brazilian communities. The interpretation of correlation between PD and
endogamy has to be taken with care, as both factors could be influenced independently by socio economical
factors and not being related directly to each other. Future studies will reveal if endogamy and PD are really
correlated by direct estimations of the contribution of consanguineous unions to the total number of deficiencies.
This work was supported by the Paraíba State University (UEPB)
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
310
Análise do impacto da endogamia na freqüência alélica
da fenilcetonúria em Minas Gerais
Santos, LL1,4; Lopes DO4; Castro-Magalhães, M1; Fonseca, CG1; Vaintraub, MT2; Vaintraub, P2;
Januário, JN3; Aguiar, MJB3; Carvalho, MRS1
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
GENETICENTER - Centro de Genética e Reprodução
3
NUPAD - Núcleo de Ações e Pesquisa em Apoio Diagnóstico, Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais
4
Laboratório de Biologia Molecular, Campus centro-oeste Dona Lindu, Universidade Federal de São João Del-Rei
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Endogamia, freqüência alélica, PKU, Minas Gerais
Introdução: A Fenilcetonúria (PKU) é um erro inato do metabolismo que tem sido incluída na maioria dos
programas de triagem neonatal pois leva ao retardo mental, se não tratada. Em MG, o programa de triagem
neonatal tem sido realizado desde 1993 e é considerado o mais eficiente do Brasil, com uma cobertura média de
aproximadamente 98% dos nascimentos no Estado. Devido a alta cobertura do programa uma boa estimativa
da freqüência da PKU é possível, sendo esta de 1:20.000. Geralmente, as estimativas das freqüências alélicas para
doenças recessivas são baseadas na freqüência de indivíduos afetados, entretanto, podem ser fortemente desviadas
dependendo da endogamia presente na população. Objetivo: O objetivo deste estudo foi analisar o impacto da
endogamia sobre a freqüência do alelo PKU em Minas Gerais. Métodos: Foram estudadas duas amostras da
população de Minas Gerais. A primeira é composta por 76 pacientes com PKU seqüencialmente triados de 19932004. A segunda amostra é composta de 104 indivíduos não aparentados que realizaram teste de paternidade
na Geneticenter, MG. O coeficiente de endogamia das amostras controle e PKU foram estimados através de
microssatélites. Foram testados 11 loci microssatelites (CSF1PO, TPOX, TH01, vWA, D16S539, D7S820, D13S317,
D3S1358, D14S1434, D22S1045 e D10S1248). As análises estatísticas foram realizadas pelos softwares GenePop e
FSTAT. A diferenciação das populações foi estimada pelos índices de fixação de Wright Fit, FST e Fis. A freqüência
do alelo q para PKU foi estimada com a fórmula i = qF + q2 (1- F). Resultados: A heterozigosidade observada
variou de 0,49 (CSF1PO) a 0,64 (vWA) na amostra PKU e 0,62 (D22S1045) a 0,85 (D13S317) na amostra controle. Os
valores de Fis para cada locus na amostra PKU variaram de -0,035 para o locus TH01 até +0,18 para D13S317. Na
amostra controle, Fis variou de -0,050 para D13S317 até +0,063 para D16S539. O valor global Fis para os pacientes
com fenilcetonúria e a amostra controle foram de 0,042 e 0,003, respectivamente, apesar da baixa diferenciação
genética total entre as amostras (Fst 0,0018). A estimativa Fit para ambas as amostras em conjunto foi de 0,02.
Nenhuma diferenciação genética foi observada entre as amostras. No entanto, o valor de Fis encontrado para a
amostra de pacientes com fenilcetonúria (0,042) foi quase 15 vezes maior que a encontrada entre os controles
(0,003). Com a incidência da PKU estimada pelo programa de triagem neonatal do Estado, a freqüência do alelo
q seria 0.0071 e 2pq seria 0.0141. Quando a freqüência do alelo PKU é corrigida pelo coeficiente de endogamia
encontrado entre os controles, esta diminuiu de 0,0071 para 0,0057. Conclusões: Os resultados nos permite inferir
que pelo menos 35% dos pacientes com PKU de Minas Gerais podem ser devido a casamentos consangüíneos.
Apoio financeiro: FAPEMIG, GENETICENTER, NUPAD
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
311
Consanguineous unions in communities of Paraíba,
North-Eastern Brazil, indicate preferential kinship
marriage systems
Tanieri, M; Melo, US; Martins, A; Almeida, ES; Franca, LN; Pereira, JC; Azevedo, RB; Santos, S; Weller M
Universidade Estadual da Paraíba (UEPB), Departamento da Biologia, Campus
Universitário do Bodocongô, 58429-500 Campina Grande, Paraíba, Brazil
Keywords: human populations, endogamy, consanguineous unions, kinship systems, first-cousin unions.
Consanguinity is a widespread phenomenon even in modern human societies. There exist two main reasons
for the prevalence of consanguineous unions: First, many societies maintain the tradition of consanguineous
marriage for cultural reasons (Bittles and Black, 2010). Second, geographic isolation, accompanied by high rates of
emigration and the absence of immigration, may play a crucial role in maintaining high levels of endogamy within
human populations. The latter aspect may lose its importance due to the high mobility of modern societies, but
still might be important to explain different patterns of consanguinity. Previous studies of communities in NorthEastern Brazil with elevated frequencies of endogamy indicated that both, geographic and cultural aspects might
be important for consanguineous unions (Santos et al., 2010). Previous studies of Brazilian populations indicated
that first-cousin unions (F= 0.0625) are preferentially practised between the son and daughter of brothers (FreireMaia, 1953 e 1961). The present study aimed to test the hypothesis of these preferential kinship systems among
first-cousin couples in Paraíba, North-Eastern Brazil. Questionnaires were elaborated and applied in cooperation
with local public health agencies of 19 communities. In these questionnaires first-cousin couples were asked about
the kinship of their parents. It was discriminated between the four possible kinship systems: 1. Both fathers of the
first-cousin couple were brothers (FF). 2. The father of the husband and the wife’s mother were sisters (FFMM).
3. The mother of the husband and the wife’s father were sisters (MFFM). 4. The mothers of the first-cousin couple
were sisters (MM). The analysis of data was performed applying PASW STATISTICS, version 18, (SPSS Inc., IBM
company). Altogether, within the 4368 couples interviewed, 489 had a first-cousin kinship. The mean values of
the different first-cousin kinship systems were 4.74 in FF, 3.47 in FFMM, 5.58 in MFFM and 5.63 in MM. The data
revealed significant differences between the both pairs FFMM/MFFM and FFMM/MM, respectively (p< 0.010 and
p< 0.029). All the other differences between single data sets, including FF/MM and also the grouping of data, did
not indicate significant differences. The analysis of data did not support the idea that consanguineous kinship
relations are mainly maintained in maternal or paternal lineages (MM/FF). Instead the data showed that husbands
of consanguineous couples preferentially have a mother (MFFM and MM) instead of a father (FFMM and FF) with
a kinship relation to the wife’s mother or father.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
312
HIpotireoidismo congênito: perfil epidemiológico e
análise da consanguinidade no estado da Paraíba
Araujo, DC1; Souza, RS1; Araujo, RMS1; Medeiros, GM2; Andrade, R2; Porto, MLS2; Rocha, AM2; Pontes,
AAN2; Santos-Lopes, SS1
Departamento de Biologia - Universidade Estadual da Paraíba – UEPB
Hospital Universitário Alcides Carneiro – HUAC- UFCG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: c, Índice de consangüinidade, perfil epidemiológico.
O hipotireoidismo congênito (HC) é um distúrbio causado pela produção deficiente de hormônios da tireóide, devido
a um defeito na formação da glândula, ou a um déficit da síntese dos hormônios tireoidianos (disormonogênese). O
padrão de transmissão das mutações para HC é bastante heterogêneo com mutações ligadas ao X, autossômicas
recessivas e dominantes. O HC é uma das causas mais freqüentes de retardo mental em crianças, com sério
detrimento do desenvolvimento cognitivo e motor, que pode ser evitado com o início precoce do tratamento. A
incidência do HC é 1:3000 a 1:4000,com maior frequência em mulheres (2:1a 4:1). A incidência encontrada na Paraíba
foi de 1:2300 nascidos vivos em 2005. No intuito de verificar o perfil epidemiológico e o índice de consanguinidade
de pacientes com hipotireoidismo congênito no estado da Paraíba analisamos 20 pacientes (casos esporádicos
e familiares) tratados no Hospital Universitário Alcides Carneiro - HUAC/UFCG. Na análise das genealogias dos
pacientes encontramos um índice de consanguinidade de 33%, considerado elevado em comparação aos demais
estados brasileiros cujo índice é de apenas 1 a 2%, demonstrando a tradição ainda presente de casamentos entre
aparentados no Nordeste. Cerca de 30% dos pacientes têm pais consanguíneos, sendo 25% de primos em 1º grau. A
média de idade dos pacientes foi 22,8 anos (DP 14.61711, p<0,05). Entre os 20 pacientes pesquisados não observamos
prevalência do sexo feminino (50% mulheres). Destes 75% não haviam sido submetidos ao teste do pezinho,
implantado em 1998 no estado, o que pode ser justificado pela média elevada de idade da nossa amostra e a baixa
cobertura do Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN) na Paraíba, com apenas 32,2% de cobertura no
município de Campina Grande-PB em 2001. A idade de diagnóstico variou entre 22 dias a 33 anos e 35% dos pacientes
tiveram o desenvolvimento psicomotor alterado, com a idade de diagnóstico tardio acima de 180 dias; apenas 20%
deram início ao tratamento antes do 3º mês de vida. No presente trabalho podemos verificar que o diagnóstico
precoce e o tratamento iniciado nas primeiras semanas de vida são fundamentais para o desenvolvimento
psicomotor normal das crianças com HC. O rastreamento do HC na Paraíba através do teste do pezinho
identificou 37 casos tratados e 9 novos no ano 2007. Podemos concluir que o elevado índice de consanguinidade e
o diagnóstico tardio são os fatores que corroboram para o aumento da incidência de HC e do numero de crianças
com retardo no desenvolvimento psicomotor na Paraíba. Esse trabalho serve de alerta para a necessidade da
antecipação do tratamento e uso do aconselhamento genético para prevenir danos irreversíveis aos pacientes.
Apoio financeiro: PROPESQ/UEPB e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
313
Avaliação da ação da Ciclosporina A modificada (CsAm)
no tecido muscular estriado esquelético de cães GRMD
Freitas, CL1; Caetano, HVA1; Bonaldo, GL1; Landini e Silva, VP1; Andrade, T1; Zatz, M1
Laboratório de Doenças Neuromusculares, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do Instituto de Biociências da Universidade
de São Paulo
1
Centro de Estudos do Genoma Humano, Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (CEGH/IBUSP)
[email protected]
1
Palavras-chave: Distrofia Muscular, Duchenne, fármaco, CsAm, cães GRMD
A distrofia muscular de Duchenne (DMD) é uma doença letal ligada ao cromossomo X, caracterizada pela
ausência de distrofina nas fibras musculares que causa degeneração progressiva na musculatura esquelética.
Cães Golden Retriever possuem a mutação genética (GRMD) que gera um quadro homólogo à distrofia muscular
de Duchenne (DMD) em humanos. Os GRMD são considerados modelos experimentais para estudo desta
doença humana. Até agora não foi desenvolvido tratamento eficiente para a DMD e novos fármacos têm sido
testados em modelos animais visando a terapia da doença. Recentemente surgiu um novo fármaco, derivado da
ciclosporina A (CsAm), que regula o mecanismo celular de degeneração das fibras musculares mas, sem atividade
imunossupressora. O objetivo desse trabalho foi avaliar a ação do fármaco CsAm no tecido muscular estriado
esquelético em cães GRMD. Para isso, cães GRMD, portadoras, afetados e normais, receberam diariamente
o fármaco CsAm (10mg/kg) em um período de tratamento de oito meses. Amostras de músculo esquelético
foram obtidas através de biópsias do bíceps femoral, processadas e coradas com hematoxilina e eosina (H.E)
como de rotina para a obtenção de cortes histológicos. Esses cortes foram avaliados quanto à organização e
morfologia das fibras musculares (desordem das fibras, taxas de nucleação central e tamanho e variabilidade
das fibras) comparando o animal tratado do animal não tratado. Até o presente momento, analisando-se os
parâmetros acima entre o grupos tratado e controle, não foi possível observar melhora clínica no grupo tratado.
Apoio financeiro: FAPESP/CEPID, INCT, ABDIM, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
314
Dupla mutação no DNA mitocondrial de paciente com
miopatia
Gamba, J1; Kiyomoto BH1; Tengan, CH1
Departamento de Neurologia e Neurocirurgia, Laboratório de Neurobiologia Molecular, Universidade Federal de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: doença mitocondrial, DNAmt, mutação de ponto, tRNA, dupla mutação.
Introdução: As doenças mitocondriais formam um grupo altamente heterogêneo de doenças humanas causadas
por um ou múltiplos defeitos no sistema de fosforilação oxidativa levando a danos no metabolismo energético.
São caracterizadas por um amplo espectro clínico e promovem comprometimento multissistêmico, mas
principalmente muscular, como no caso das miopatias, causadas principalmente por rearranjos e mutações
de ponto no DNA mitocondrial (DNAmt). Apesar de inúmeras mutações de ponto já terem sido descritas em
vários genes do DNAmt, como as mutações A3243G, A8344G e T8993G, os genes mitocondriais que codificam
RNAs transportadores (tRNAs) são considerados preferenciais quanto à ocorrência de mutações patogênicas.
A presença de dupla mutação pode ocorrer em alguns casos, como na neuropatia óptica hereditária de Leber,
mas é extremamente rara em outros genes, especialmente em genes codificadores de tRNA. Objetivo: Relatar
a ocorrência de dupla mutação rara em genes codificadores de tRNA em paciente com doença mitocondrial.
Materiais e Métodos: Um screening de mutações em toda a sequência codificante do DNAmt foi realizado em
um grupo de 24 pacientes. DNA genômico foi extraído de biópsias musculares e utilizado para Southern blotting,
PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction – Restriction Fragment Length Polymorphism) e seqüenciamento. As
sequências obtidas foram comparadas com a sequência do genoma mitocondrial normal utilizando dois bancos
de dados (www.MITOMAP.org e mamit-trna.u-strasbg.fr). Análise de atividades específicas mitocondriais e
expressão de proteínas mitocondriais foram realizadas por estudos de histoquímica e imunohistoquímica de
biópsia de músculo. Resultados: A dupla mutação foi identificada em somente um paciente dentre o total de
24. As mutações encontradas foram T5628C (tRNAAla) e A8348G (tRNALis), e também não foram encontradas de
forma única nos outros pacientes. A análise específica do paciente com a dupla mutação mostrou que se tratava
de uma mulher, com manifestação de oftalmoplegia externa crônica progressiva de início aos 35 anos de idade,
sem história familiar. A biópsia muscular mostrava a presença de proliferação mitocondrial com RRF (ragged
red fibers) (13%), com 10% de fibras citocromo-c-oxidase (COX) negativas (deficiência do complexo IV da cadeia
respiratória), e o estudo de imunohistoquímica demonstrou que as fibras COX negativas tinham uma expressão
reduzida da COX-II (subunidade codificada pelo DNAmt) e normal de COX-IV (subunidade codificada pelo DNA
nuclear). Os pacientes estudados não apresentavam rearranjos do DNAmt por Southern blotting. Conclusão: Este
estudo relata a ocorrência rara de uma dupla mutação em genes codificadores de tRNA. Não há estudos anteriores
que descrevam estas duas mutações em um mesmo paciente. A patogenicidade de cada mutação deverá ser
estudada futuramente através da análise da proporção de DNAmt mutado em fibras musculares isoladas.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
315
Identificação de alelos expandidos longos no gene
DMPK
Gheno, TC1,2; Furtado, GV1,2; Jardim, LB1,2,3,4; Saraiva-Pereira, ML1,2,4,5
Laboratório de Identificação Genética – Centro de Pesquisa Experimental – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Departamento de Genética – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Departamento de Medicina Interna – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
4
Serviço de Genética Médica – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
5
Departamento de Bioquímica – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DM1, alelos expandidos longos, TP-PCR
Introdução: A distrofia miotônica tipo 1 (DM1) é uma doença multissistêmica, de herança autossômica dominante,
caracterizada por fraqueza muscular mas que afeta também a visão, o coração, o sistema endócrino e o sistema
nervoso central. O gene associado à DM1 é denominado DMPK (dystrophia myotonica protein kinase) e se
caracteriza por apresentar repetições trinucleotídicas CTG na porção 3’ terminal. O número dessas repetições
é polimórfico e, quando acima da faixa de normalidade, é a causa primária de casos de DM1, cujo mecanismo
patológico é de ganho de função. As CTG repetições variam de 5 a 38 em indivíduos normais e de 50 a mais de 2500
em indivíduos afetados. Regiões com repetições trinucleotídicas podem ser identificadas pela reação em cadeia da
polimerase (PCR) quando o comprimento da região repetitiva não é muito longo. Porém, em indivíduos com um
grande número de repetições, a PCR pode não ser eficiente na amplificação do alelo longo. Mais recentemente,
uma variação da técnica de PCR, denominada triplet repeat primed PCR (TP-PCR), foi desenvolvida para aplicação
em casos em que a expansão nucleotídica pode produzir alelos muito longos. Objetivos: Identificar alelos mutantes
longos através de TP-PCR em amostras de pacientes com suspeita clínica de DM1. Métodos: Amostras de DNA
foram obtidas de 18 indivíduos não relacionados. Os critérios de inclusão foram: (1) suspeita clínica de DM1 e
(2) identificação de apenas um alelo normal após a análise de PCR. As amostras de DNA foram submetidas à
técnica de TP-PCR, que se caracteriza por utilizar 3 primers, sendo que um deles é marcado com um composto
fluorescente. Após a amplificação, as amostras foram submetidas à eletroforese capilar no analisador genético
ABI 3130xl (Applied Biosystems) e analisadas pelo programa GeneMapper v4.0 (Applied Biosystems) tendo como
padrão o GeneScan-500-Liz. Resultados: Quinze (83,3%) dos 18 indivíduos foram identificados como portadores
de um perfil compatível com a presença de um alelo expandido. Os outros 3 indivíduos apresentaram perfil de
alelos normais. Não foi possível determinar o número exato do número de repetições nucleotídicas pelo fato
que o TP-PCR é uma técnica que avalia o perfil da amostra e não permite uma análise quantitativa. Porém, uma
amostra padrão com 78 repetições CTG foi identificada pela PCR, o que indica que o número de repetições das
nossas amostras deve ser maior do que o encontrado nessa amostra. Conclusões: A metodologia empregada foi
adequada para identificar alelos expandidos longos, sendo aplicada com sucesso no diagnóstico de DM1. Portanto,
amostras com suspeita clínica de DM1 devem ser analisadas por uma combinação das duas metodologias (PCR
e TP-PCR) para permitir a identificação de alelos longos, frequentemente encontrados em pacientes com DM1.
Apoio Financeiro: FAPERGS, CNPq e FIPE-HCPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
316
Utilização de microssatélites intragênicos inéditos para
análise indireta de portadores de mutações causadoras
de Distrofia Muscular de Duchenne
Sarlo, LG1; Machado, FB2; Cerqueira, A3; Passos-Bueno, MR3; Zatz, M3; Medina-Acosta, E1
Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular. Universidade Estadual do Norte Fluminense. Avenida Alberto Lamego 2000, Parque
Califórnia, Campos dos Goytacazes, RJ, CEP 28013-602, Brasil
2
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Avenida Bandeirantes 3900, Monte
Alegre, Ribeirão Preto, SP, CEP 14049-900, Brasil
3
Centro de Estudos do Genoma Humano, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, Butantan, Rua do Matão 277, Cidade
Universitária, São Paulo, SP, CEP 05508-090, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Análise de ligação, Distrofia Muscular de Duchenne, microssatélites, X-STRs, análise indireta.
A Distrofia Muscular Duchenne (OMIM #310200) é a doença monogênica recessiva ligada ao sexo mais frequente
em humanos. Ela é causada por mutações no gene DMD (GeneID: 1756), localizado na região Xp21.2-Xp21.1, que
codifica a distrofina. O diagnóstico indireto de portadores de mutação é feito pela análise de segregação de até
15 microssatélites dinucleotídeos. A designação alélica de locos de microssatélites dinucleotídeos é dificultada
pela ocorrência de produtos que diferem em tamanho por múltiplos da unidade de repetição do alelo verdadeiro.
Os microssatélites dinucleotídeos geralmente exibem maiores taxas de mutação do que locos tetranucleotídeos
e pentanucleotídeos. O presente trabalho visou à identificação e utilização de microssatélites intragênicos
para análise indireta de portadores de mutações causadoras de Distrofia Muscular de Duchenne. Foi realizada
mineração in silico para microssatélites intragênicos tri-, tetra-, penta- e hexanucleotídeos, aplicando critérios
de predição de polimorfismo. Foram identificados 13 locos intrônicos inéditos, compreendidos em uma região
de 1,95 Mb (intervalo genético de 8,8 cM). Os locos foram polimórficos e informativos pela análise de ligação
em cinco núcleos familiares com pelo menos um acometido utilizando um novo ensaio multiplex da Reação
Quantitativa Fluorescente em Cadeia da Polimerase (QF-PCR). As taxas de heterozigose foram determinadas. A
taxa combinada de heterozigose permitiu diferenciar todos os cromossomos X tipados. Uma mutação de uma
repetição foi detectada em dois locos microssatélites em um único núcleo familiar. O ensaio multiplex desenvolvido
permite a designação alélica acurada, com maior precisão do que a tipagem com os microssatélites disponíveis.
Apoio financeiro: Universidade Estadual do Norte Fluminense, Núcleo de Diagnóstico e Investigação Molecular,
Hospital Escola Álvaro Alvim, FAPERJ, FAPESP.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
317
Recorrência de fissura labiopalatina não sindrômica:
estudo genético-clínico de 307 famílias brasileiras
Santos, DVC1; Lauris, JRP2; Kokitsu-Nakata, NM1
Seção de Genética Clínica, Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais - Universidade de São Paulo
Departamento de Saúde Coletiva, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: fissura labiopalatina não sindrômica, recorrência familial, recorrência de fissura labiopalatina não sindrômica,
recorrência de fissura palatina, fissuras orais
As fissuras labiopalatinas constituem uma das anomalias congênitas mais frequentes, envolvendo o complexo
craniofacial e podendo se manifestar isoladamente ou fazer parte do espectro fenotípico de várias síndromes. Cerca
de 30% a 40% das fissuras labiopalatinas apresenta-se na forma não sindrômica. Estudos têm mostrado diferentes
riscos de recorrência familial de fissura labiopalatina, dificultando o aconselhamento genético. Diante do vasto
universo de pacientes cadastrados no Hospital de Reabilitação de Anomalias Craniofaciais da Universidade de
São Paulo, o objetivo deste estudo foi investigar, sob o ponto de vista genético-clínico, 307 famílias brasileiras com
fissura labiopalatina não sindrômica (FLPNS), com o intuito principal de se estabelecer a frequência de recorrência
familial dessa anomalia. Os critérios mínimos para a inclusão neste estudo retrospectivo foram: presença de
FLPNS (associada, no máximo, a duas anomalias menores) e existência de filhos biológicos dos propósitos. A
amostra foi dividida em dois grupos: Grupo I ( fissura de lábio com ou sem fissura de palato – FL+/-FP) e Grupo
II ( fissura de palato – FP). No Grupo I, observou-se 234 indivíduos com FL+/-FP (116M e 118F) e, no Grupo II,
73 indivíduos com FP (19M e 54F). Analisando o total de 234 indivíduos, do Grupo I, 28 (17M/9F) apresentaram
recorrência familial (propósito/filhos). Esses 28 própositos com recorrência tiveram um total de 74 filhos, dos
quais 28 (37.84%) nasceram com FL+/-FP. Já, em relação ao Grupo II, o total de 15 filhos dos 4 propósitos com
recorrência, 4 crianças (26.67%) nasceram com fissura, sendo 3 com fissura de palato e 1 com fissura de lábio.
Consanguinidade entre o propósito e seu cônjuge foi observada, apenas no Grupo I, em 5 indivíduos, os quais
tiveram filhos sem fissura labiopalatina. Este estudo mostrou que a frequência de recorrência de FLPNS foi maior
no Grupo I (11.96%) do que no Grupo II (5.48%); que a consanguinidade parental não foi significativa como fator de
risco e, aparente hipertelorismo ocular e discreta micrognatia foram as anomalias menores mais frequentemente
associadas à fissura labiopalatina no Grupo I e II, respectivamente. Expansão da casuística para posterior cálculo
dos riscos de recorrência de fissura labiopalatina será de grande relevância, principalmente no tocante ao adequado
aconselhamento genético às famílias envolvidas.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
318
Estudo do gene SOD1 em formas esporádicas de
esclerose lateral amiotrófica
Andrade, HSP1; Lazar, M1; Mitne-Neto, M1; Machado, M2; Oliveira, ASB2; Silva, HCA2; Callegaro, D3; Zatz, M1
Centro de Estudos do Genoma Humano, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
Setor de Investigação de Doenças Neuromusculares, Universidade Federal de São Paulo
3
Divisão de Neurologia, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: esclerose lateral amiotrófica, forma esporádica, SOD1, doença do neurônio motor, análise de mutações.
A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é a doença do neurônio motor mais comum, com início tardio, acometendo
1:100.000 nascidos vivos. É caracterizada pela esclerose da região lateral da medula espinhal decorrente da morte
dos neurônios motores superiores e fraqueza dos músculos, que se tornam atróficos devido à morte dos neurônios
motores inferiores. Com causas ainda pouco conhecidas, a ELA hoje é uma doença incurável que leva os pacientes
a óbito, aproximadamente, cinco anos após início dos sintomas. A forma esporádica da doença representa 90%
dos casos mundiais e, deste percentual, 7,0% apresentam alterações no gene SOD1. Esse gene codifica a CuZn
superóxido dismutase, enzima antioxidante que atua na conversão de íons superóxido em peróxido de hidrogênio.
Mais de 140 mutações foram descritas no SOD1, sendo que elas alteram a estrutura da proteína, que passa a ter
função tóxica no neurônio. Objetivos: Avaliar a frequência de mutações no gene SOD1 na forma esporádica de ELA,
a fim de traçar o perfil genético dos pacientes brasileiros, e comparar com a frequência de outros países. Pacientes
e Métodos: Os pacientes foram avaliados por neurologistas da Unifesp e Hospital das Clínicas (SP); 85 pacientes
preencheram os critérios estabelecidos, entre eles ausência de histórico familiar e diagnóstico de ELA definida,
provável ou possível. Amostras de sangue foram coletadas e o DNA foi extraído pela técnica de Miller. Em seguida,
foram executados os seguintes procedimentos: amplificação das regiões codificantes do gene SOD1 por PCR,
reação de sequenciamento e sequenciamento dos amplicons no sequenciador automático ABI 3730. As sequências
foram analisadas com a ajuda do programa Sequencher. Para os 100 indivíduos controles, realizou-se a triagem de
mutações no amplicon 5 utilizando a técnica de SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism). Resultados: Dos
85 pacientes testados, 1 paciente (1,2%) apresentou uma alteração no exon 5 (358C>T). Esta alteração leva à troca
de uma valina por uma leucina na posição 119 da proteína (V119L), até então não descrita nos bancos de dados
mundiais. Esta mesma alteração não foi encontrada em nenhum dos 100 controles testados. Outros 6 pacientes
(7,0%) apresentaram o polimorfismo de base única intrônico rs2234694. Conclusão: A frequência de mutações no
gene SOD1 observada nos pacientes brasileiros com ELA esporádica é menor que aquela encontrada no restante
dos países (7,0%). A alteração V119L não foi encontrada nos indivíduos controle, sugerindo a patogenicidade da
alteração. Além disso, estudos mostram que alterações próximas, nos resíduos 118 e 124, conduzem à alteração
na conformação da proteína, levando a casos de ELA. A frequência do polimorfismo rs2234694 é maior que
aquela encontrada na população caucasóide (3,5%), e será investigada. A amostra está sendo ampliada e mais
genes serão testados para traçarmos o perfil genético dos pacientes brasileiros da forma esporádica de ELA.
Apoio financeiro: CEPID/FAPESP e CNPq.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
319
DNA damage and polymorphic sites of genes
responsible for DNA repair (XRCC1 and XRCC4) in
patients with systemic sclerosis
Martelli Palomino, G1; Bassi, CL2; Wastowski, IJ1,6; Xavier, DJ3; Lucisano-Valim, YM1;4; Crispim, JCO1; Rassi,
DM1; Marques-Neto JF5; Sampaio- Barros, PD5; Saddi. VA6; Donadi, EA1
Program of Basic and Applied Immunology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo (FMRP-USP), Brazil
Department of Basic Sciences in Health, Faculty of Medical Sciences, Federal University of Mato Grosso (UFMT), Brazil
3
Department of Genetics, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of São Paulo (FMRP-USP), Brazil
4
Department of Physical and Chemical, Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeirão Preto (FCFRP-USP), Brazil
5
Unit of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas, (UNICAMP), Brazil
6
Master’s Program in Genetics. Pontifical Catholic University of Goiás (PUC-GO), Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: Systemic sclerosis, Autoimmunity, DNA damage, XRCC1 and XRCC4
Patients presenting with systemic sclerosis (SSc) exhibit increased toxicity when exposed to genotoxic agents
and present genomic instability even before disease onset. Considering that no previous study has reported DNA
damage in SSc patients, this study analyzed DNA damage (comet assay) and polymorphic sites of the DNA repair
genes XRCC1 (Arg/Gln) and XRCC4 (Ile/Thr). Allele and genotype frequencies of XRCC1 and XRCC4 genes were
studied in 177 patients and 191 controls; 56 patients and 36 controls were also used to evaluate DNA damage
(tail moment-TM). Statistical analyses were performed using the GraphPad Instat and SigmaStat softwares.
Compared to controls (TM = 3.50), SSc patients exhibited increased DNA damage (TM= 28.30; p<0.001). After
stratifying patients according to clinical variants (limited or diffuse), clinical manifestations (organ or tissue
involvement) and laboratory findings (autoantibodies), no significant differences were observed. Compared
to controls, the frequency of the mutant XRCC1 Gln allele was increased in limited SSc patients as well as in
those presenting modified Rodnan skin score higher than 12 or cutaneous manifestations (p<0.001 for each
comparison). In addition, the XRCC1 Gln/Gln genotype frequency was also increased in limited SSc patients
(p=0.0147). XRCC4 allele and genotype frequencies observed in SSc patients were not significantly different from
those observed in controls. DNA damage was not influenced by the XRCC1 genotypes among patients; however,
XRCC4 Ile/Thr heterozygotes exhibited increased DNA damage (TM= 80.04) when compared to the wild or
mutant Ile/Ile and Thr/Thr homozygous (p<0.001 for each comparison). Among controls, the XRCC1 Arg/Gln
and XRCC4 (Ile/Thr) genotypes exhibited increased DNA damage (TM= 11 and 15. 52, respectively) in relation
to individuals presenting other genotypes (p<0.001). The present results clearly show the presence of genomic
instability in SSc lymphocytes, being the XRCC1 Gln and XRCC4 Thr alleles associated with DNA repair inefficiency.
Financial support: CNPq and CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
320
Panorama de gravidade pulmonar na fibrose cística (FC)
mediado por genes modificadores de gravidade clínica
distribuídos por agrupamento genotípico do gene CFTR
Marson, FAL¹; Ribeiro, JD¹; Bertuzzo, CS²; Ribeiro, AF¹
¹Departamento de Pediatria - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
²Departamento de Genética Médica - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
[email protected]
Palavras-chave: ACE, GCLC, GST (M1, T1, P1), NOS-1, ADRB2R
Introdução: O genoma humano apresenta milhões de polimorfismos, sendo que, virtualmente todo gene apresenta
alguma variação. Enquanto a maior parte da variação não apresenta consequência funcional, em muitos
genes, formas variantes, garantem resposta diferenciada a agentes diversos, podendo levar a variabilidade na
apresentação clínica de algumas doenças como a FC. Nesse estudo, foram selecionados os genes ACE(atividade
pró-inflamatória), GCLC(polimorfismos-129C/T e -350A/G) e GST(M1,T1,P1)(atuantes no ciclo da glutationa-GSH),
NOS-1(resposta antimicrobiana decorrente do óxido nítrico- polimorfismos de repetição em tandem AAT,TG1 e
TG2) e ADRB2R(resposta a broncodilatação, polimorfismos-46A/G e -79C/G) como possíveis modificadores da
FC. Objetivo: Associar os polimorfismos com a gravidade pulmonar da FC em grupos de pacientes distribuídos
de acordo com a mutação do gene CFTR. Método: 184fibrocísticos, idade média17,5anos, sexo masculino50,3%.
Técnicas: PCR para análise dos polimorfismos de deleção, juntamente ao NESTED de PCR e PCR multiplex. Para
os polimorfismos do tipo SNPs utilizou-se a digestão por endonucleases. O gene ADRB2R foi analisado pela PCR
ARMS e o NOS-1 pela genotipagem(sequenciador MegaBace1000®). Parâmetros clínicos:Escores de Kanga(EK),
Shwachman-Kulczycki(ES) e Bhalla, IMC(para idade), diagnóstico, inicio dos sintomas(pulmonar/digestivo),
microrganismos isolados, espirometria(CVF, VEF1, CVF/VEF1 e FEF25-75%) e saturação de oxigênio(SaO2).
Análise estatística:teste de regressão multivariada logística e linear, 5% de significância. Resultados:Pacientes
foram agrupados de acordo com o genótipo CFTR em 3 grupos(portadores de duas, uma ou nenhuma
mutação grave)para minimizar a influência desta variável na análises. Genes GSTM1, GCLC(polimorfismo129C/T) e GSTP1 não apresentaram correlação significativa. Genes GSTT1*M1:portadores do alelo codificante
apresentaram menor IMC(OR:3,08; IC=1,35-7,09) e com ambos alelos nulos menor SaO2(OR:4,27;IC=1,2-20,09) e
ES(OR:9,0;IC=1,47-5,07). O alelo nulo para T1 foi associado à infecção pela Pseudomonas aeruginosa não mucóide e
mucóide(OR:3,1,IC=1,28-7,56; OR:4,8;IC=1,69-13,74; respectivamente). GCLC350(A/G):o genótipo A/A foi associado
com pior classificação na SaO2(OR:5,8; IC=2,31-14,54), EK(p=0,02) e espirometria[FEF25-75%(p=0,01), VEF1/
CVF(p=0,02) e VEF1(OR:4,6;IC=1,3-5,2)]. ACE:portadores do alelo D tiveram o diagnóstico e o inicio do quadro
digestivo precoces(OR:3,07;IC=1,1-2,61; OR:8,2;IC=1,4-1,46, respectivamente). O genótipo DD foi associado com pior
ES(OR:6,8;IC=1,19-34,21) e infecção pulmonar pelo Achromobacter xylosoxidans(OR:4,5;IC=1,20-17,05). ADRB2R:
polimorfismo +79C/G teve o genótipo C/C(Gln/Gln) associado ao inicio do quadro pulmonar, digestivo e diagnóstico
precoce(p=0,04) e o genótipo G/G(Glu/Glu) a pior classificação para o EK(p=0,04) e ES(p=0,04). O genótipo A/A(Arg/
Arg) do polimorfismo +46A/G foi associado com a redução do FEV1/CVF(%) após o uso do broncodilator(p=0,02),
diagnóstico(p=0,02), idade da primeira manifestação(p=0,04) e inicio do quadro pulmonar(p=0,02) precoces.
NOS-1: mais que 12 repetições no polimorfismos AAT associou-se com o inicio das manifestações(p=0,03) e da
doença pulmonar(p=0,01) precocemente, menor valor do FEV1(p=0,04) e SaO2(p=0,03) e infecção pela Bulkoderia
cepacia(OR=2,6;IC:1,23-2,40). Polimorfismo TG1:pacientes com mais que 16 repetições tiveram valores elevados
para o FVC(p=0,03) e FEV1(p=0,04), porém isolou-se a B. cepacia precocemente (p=0,03). Já pacientes com
mais que 25 repetições no TG-2 tiveram o A. xylosoxidans isolado precocemente (p=0,03) e presença crônica do
Staplylococcus aureus (OR=2.15). Conclusão:Polimorfismos em diferentes genes podem modular a gravidade da FC.
Apoio financeiro: FAPESP, FUNCAMP e CAPES
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
321
Frequência do polimorfismo (TG)m-Tn em pacientes com
Fibrose Cística clássica e atípica
Simon, L1; Kiehl, MF 1,2; Bock, H1; Dalcin, P3; Abreu e Silva, F3; Sanseverino, MT4; Saraiva-Pereira, ML1,3
Laboratório de Identificação Genética – Centro de Pesquisa Experimental – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
Departamento de Genética – Universidade Federal do Rio Grande do Sul
3
Serviço de Pneumologia – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
4
Serviço de Genética Médica – Hospital de Clínicas de Porto Alegre. 5Departamento de Bioquímica - Universidade Federal do Rio Grande
do Sul
[email protected]
1
2
Palavras chaves: Fibrose Cística, CFTR, (TG)m-Tn
Introdução: A Fibrose Cística (FC) é a doença autossômica recessiva mais comuns em euro-descendentes, sendo
causada por mutações no gene regulador da condutância transmembrânica da fibrose cística (CFTR), o qual
funciona como um canal de cloreto regulado por cAMP na superfície apical da célula. A FC clássica se caracteriza
pela presença de pelo menos uma mutação grave em cada cópia do gene CFTR, enquanto uma mutação branda
em combinação com uma mutação grave ou outra mutação branda estão associadas à FC atípica. Além das
mutações responsáveis pela FC, genes modificadores e polimorfismos podem atuar parcialmente na penetrância
fenotípica da doença. O polimorfismo (TG)m-Tn localizado no íntron 8, próximo ao sítio aceptor de splicing do éxon
9, pode determinar a perda deste éxon durante a transcrição, resultando em uma proteína anormal. Três alelos
comuns são conhecidos na região de politiminas (T5, T7 e T9), associados a repetições de 10 a 13 (TG)m localizadas
imediatamente ajusante do lócus Tn. Um número menor de timinas associado com longas repetições (TG)m aumenta
a proporção de perda do éxon 9 e pode determinar fenótipos atípicos de FC. Objetivos: Avaliar o polimorfismo
(TG)m-Tn em 89 pacientes com diagnóstico clínico de FC clássica e 25 pacientes com diagnóstico clínico de FC
atípica, provenientes do Serviço de Pneumologia do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Métodos: O DNA
genômico dos pacientes foi extraído pela técnica de salting-out e quantificado pelo método fluorimétrico QuantiT (Invitrogen). A região polimórfica foi amplificada por PCR e submetida ao sequenciamento direto seguida por
eletroforese capilar no analisador genético ABIPrism 3130xl (Applied Biosystems). Resultados: O alelo T5 apresentou
frequência de 0,011 entre os pacientes com diagnóstico clínico de FC clássica, enquanto nenhum dos pacientes
com fenótipo atípico da doença apresentou a variante. As variantes T7 e T9 foram encontradas com frequências
de 0,840 e 0,160 nos pacientes com FC atípica e com frequências de 0,489 e 0,500 nos pacientes com FC clássica.
Nos grupos analisados, 10, 11 e 12 repetições TG foram observadas. Os alelos T5 encontrados nessa estavam
associados com 11 repetições TG. Conclusões: Através desse trabalho, 2 pacientes com FC foram identificados
como portadores do alelo T5. Os aspectos clínicos e genotípicos desses pacientes estão sendo analisados para
permitir a comparação dos dados encontrados. O presente trabalho avaliou o polimorfismo (TG)m-Tn no gene
CFTR, o qual está associado com modificações na manifestação fenotípica da doença em pacientes com FC.
Apoio financeiro: CNPq, FIPE-HCPA.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
322
Variante da Síndrome Ullrich-Turner e
Neurofibromatose Tipo I
Huber, J1,3; Ramos, ES1,2; Laureano, LAF1; Machado, ML2; Martelli, LR1,2
Setor de Genética Médica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo – USP
3
Disciplina de Genética Médica do Curso de Medicina do Centro Universitário Barão de Mauá
1
2
Keywords: Neurofibromatose, Noonan, Ullrich-Turner, Síndrome, Cariótipo.
A Neurofibromatose tipo I (NF1) é uma doença monogênica caracterizada pela presença de múltiplas manchas
café-com-leite, efélides (sardas) axilares e/ou inguinais, neurofibromas e nódulos de Lisch em íris. Alguns
pacientes portadores de NF1 tem sobreposto um fenótipo da síndrome de Noonan (baixa estatura, hipertelorismo
ocular, fendas palpebrais obliquas para baixo, orelhas baixo implantadas, pescoço alado e estenose pulmonar)
que possui um conjunto de alterações físicas muito semelhantes às da Síndrome de Ullrich-Turner (SUT). Alguns
autores consideram esta associação de fenótipos como uma entidade nosológica distinta denominada síndrome
Neurofibromatose-Noonan. O objetivo desse trabalho é relatar o caso de um paciente de 16 anos de idade com
diagnóstico clínico de NF1 apresentando manchas café-com-leite em tronco e membros, nódulos de Lisch em iris e,
ainda, baixa estatura, pescoço curto, nevi melanocíticos em tronco e valgismo cubital. Não há história familiar de NF1.
O estudo citogenético com bandeamento GTG em linfócitos obtidos em sangue periférico foi 45,X[28]/46,XY[72].
O US de bolsa escrotal revelou testículos de dimensões reduzidas. Há raros casos descritos na literatura médica de
pacientes portadoras de SUT e NF1 e sugerindo o cariótipo das meninas com a associação dos dois fenótipos (Noonan
e NF1). Neste trabalho os autores concluem que o estudo citogenético deve ser realizado não só em pacientes do sexo
feminino com a associação de fenótipo NF1 e estigmas de Noonan, mas também em pacientes do sexo masculino.
Apoio: FAEPA, Centro Universitário Barão de Mauá.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resum