DETERMINAÇÃO DA PATERNIDADE DE HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS E INTERGENÉRICOS DE CAFÉ POR MEIO DE MARCADORES MOLECULARES AFLP Natália Luiz de Souza, Bruna Delgado Góes, Claudete de Fátima Ruas (orientadora) email:[email protected] Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Biologia Geral/CCB. Área e subárea do conhecimento: Genética- Genética Vegetal Palavras-chave: Classificação fenotípica; Marcador dominante; Coffea arabica Resumo O cafeeiro pertence à família Rubiaceae e possui representantes nos gêneros Coffea e Psilanthus. As espécies Coffea arabica e Coffea canephora apresentam relevante importância econômica, no entanto espécies como C. dewevrei, C. stenophylla, C. eugenoides, C. kapakata, mesmo que não sendo cultivadas economicamente, possuem ampla variabilidade genética para resistência a doenças, nematoides e estresses abióticos como secas. Por esse motivo, muitos genes são transferidos para C. arabica por hibridização artificial, a fim de expandir o conjunto de genes dos cultivares. Com isso o objetivo desse estudo foi confirmar por meio de marcadores moleculares AFLP, a identidade de sete possíveis híbridos sendo que anteriormente estes haviam sido classificados de acordo com características fenotípicas e proximidade em campo. As quatro combinações de primers AFLP resultaram em um total de 984 marcadores com 99% de polimorfismo já que o estudo abrangeu espécies distintas, aumentando as diferenças entre os conjuntos de genes. A análise dos dados mostrou que a possível identidade de seis híbridos não estava correta, uma vez que estes se encontraram distante dos supostos parentais ressaltando a necessidade de estudos complementares que envolvam outras possíveis espécies parentais. O dendrograma mostra que o suposto híbrido de Psilanthus bengalensis X C. arabica agrupou-se com um de seus parentais, o que sugere hibridização, sendo necessárias análises completares para confirmar a paternidade e determinar a identidade do segundo parental. Introdução O cafeeiro pertence ao grupo das Fanerógamas, família Rubiaceae e gêneros Coffea e Psilanthus. Dentre os exemplares de café, C. arabica e C. canephora apresentam maior importância econômica, contudo, C. dewevrei, C. salvatrix, 1 C. stenophylla, C. eugenoides, C. liberica, C. congensis, C. kapakata, C. sessiflora, C. racemosa, entre outras que, apesar de não serem cultivadas comercialmente, possuem relevante variabilidade genética para a resistência a doenças, nematoides e secas, sendo por isso muito utilizada em cruzamentos interespecíficos nos programas de melhoramento vegetal (SAKIYAMA et al., 2005; CARVALHO, 2008). Híbridos interespecíficos e intergenéricos têm sido amplamente utilizados nos programas de melhoramento vegetal em diversas espécies, a fim de expandir o conjunto de genes dos cultivares. As espécies de café têm um genoma comum, tornando possível a hibridação interespecífica e produção de híbridos, seja dentro da espécie Coffea ou entre Coffea e Psilanthus, um gênero próximo a Coffea (ANTHONY et al., 2007; VAN LAERE et al., 2007; OCAMPO 2016). Na coleção que faz parte do banco ativo do germoplasma de Coffea, mantido no Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) surgiram híbridos interespecíficos de Coffea. Cogita-se que os possíveis pais desses híbridos sejam: C. arabica, C. canephora, C. dewevrei, C. eugenioides e C. racemosa. A determinação da paternidade destes híbridos é de extrema importância, tendo em vista que estes podem ser usados para transferir genes de importância agronômica, tanto para C. arabica como para C. canephora. Com isso, o objetivo desse trabalho foi determinar, por meio de AFLP, a paternidade de sete híbridos interespecíficos e intergenéricos. Procedimentos metodológicos Foram extraídos DNA de 22 espécies do gênero Coffea, sete possíveis híbridos e uma espécie do gênero Psilanthus no Instituto Agronômico do Paraná. A extração do DNA deu-se utilizando o protocolo proposto por Doyle e Doyle em 1987 com modificações como a substituição do CTAB por MATAB no tampão de extração. As reações de AFLP foram realizadas seguindo o protocolo de Vos et al. 1995. A restrição de 700ng/µL de DNA foi feita por duas enzimas de restrição EcoRI e MseI, seguida da ligação de adaptadores. Os fragmentos gerados foram pré-selecionados por primers baseados na sequência dos adaptadores EcoRI e MseI com a adição de um único nucleotídeo (EcoRI- C e MseI- A). E finalmente o uso de primers seletivos com dois nucleotídeos além da sequência complementar aos adaptadores, maximizou a seleção gerando uma quantidade menor de fragmentos. As combinações de primers usadas foram: EcoRI-AGG / MseI-CTT, EcoRI-AAC / MseI-CTAG e EcoRI-ACT / MseICTG e EcoRI-AGG / MseI-CTAG. Resultados e Discussão 2 As quatro combinações de primers AFLP aplicadas neste estudo resultaram em um total de 984 marcadores, sendo 99% destes polimórficos. O alto grau de polimorfismo encontrado para esses exemplares é explicado pelas diferentes espécies que fazem parte do estudo, aumentando o nível de informação genética. A possível identidade dos híbridos foi definida de acordo com a localização em campo associada a características fenotípicas. No entanto a árvore construída pelo método UPGMA conforme a distância genética de Nei (Fig. 1) apresentou agrupamentos diferentes do esperado, uma vez que, a maioria dos indivíduos considerados híbridos se associaram distante dos possíveis parentais. Constatou-se que o possível híbrido de Psilanthus bengalensis X C. arabica agrupou-se com um de seus parentais o que sugere a hibridização, sendo necessárias análises futuras para confirmar a paternidade e determinar a identidade do segundo parental. Ainda de acordo com o dendrograma, é possível verificar a existência de híbridos entre as espécies de café analisadas, porém, há necessidade de determinar os parentais já que estes híbridos não estão próximos aos indivíduos que se acreditava serem os pais. Figura 1. Dendrograma das espécies de café gerado pelo método UPGMA baseado na distância de Nei (1978). 3 A análise da distância genética de Nei (1978) mostrou variação de 0,0144 a 0,29683, sendo que a menor distância é observada entre C. arabica var. arabica (planta 1) e C. arabica var. arabica (planta 2), já que foram coletadas amostras de plantas diferentes, porém, da mesma espécie. A maior distância foi observada entre a Cultivar Nemaya 2 e o possível híbrido de Psilanthus bengalensis x C. arabica indicando que, dentre os 27 exemplares analisados, estes dois apresentam a maior divergência genética. Conclusões Os resultados apresentados nesse trabalho ressaltam a importância das ferramentas moleculares como os marcadores AFLP, para uso na determinação de paternidade de híbridos interespecíficos de café. Mesmo apresentando características fenotípicas dos possíveis parentais, possíveis híbridos podem ser produtos de hibridização entre outros indivíduos, igualmente resultantes de hibridação. Para que a real identidade dos híbridos interespecíficos seja confirmada, serão necessários estudos complementares envolvendo outros exemplares de possíveis parentais provenientes do banco de germoplasma do IAPAR Referências ANTHONY, F.; DUSSERT, S.; DULLOO, E. Coffea genetic resources. Complementary strategies for ex situ conservation of Coffee (Coffea arabica L.) genetic resources, p.11, 2007. CARVALHO, C. H. S. Cultivares de café: origem, características e recomendações. Brasília: Embrapa Café, 334p, 2008. DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. A rapid isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, v.19, p.11-15, 1987. NEI, M. Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press, New York, NY, USA. 1978. OCAMPO, J; ARIAS, J. C.; URREA, R. Interspecific hybridization between cultivated and wild species of genus Passiflora L. Euphytica, v. 209, n. 2, p.395408, 2016. SAKIYAMA, N. S; PEREIRA, A. A.; ZAMBOLIM, L. Melhoramento do café arábica. 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