título do resumo

DETERMINAÇÃO DA PATERNIDADE DE HÍBRIDOS INTERESPECÍFICOS E
INTERGENÉRICOS DE CAFÉ POR MEIO DE MARCADORES
MOLECULARES AFLP
Natália Luiz de Souza, Bruna Delgado Góes, Claudete de Fátima Ruas
(orientadora) email:[email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Biologia Geral/CCB.
Área e subárea do conhecimento: Genética- Genética Vegetal
Palavras-chave: Classificação fenotípica; Marcador dominante; Coffea arabica
Resumo
O cafeeiro pertence à família Rubiaceae e possui representantes nos gêneros
Coffea e Psilanthus. As espécies Coffea arabica e Coffea canephora
apresentam relevante importância econômica, no entanto espécies como C.
dewevrei, C. stenophylla, C. eugenoides, C. kapakata, mesmo que não sendo
cultivadas economicamente, possuem ampla variabilidade genética para
resistência a doenças, nematoides e estresses abióticos como secas. Por esse
motivo, muitos genes são transferidos para C. arabica por hibridização artificial,
a fim de expandir o conjunto de genes dos cultivares. Com isso o objetivo
desse estudo foi confirmar por meio de marcadores moleculares AFLP, a
identidade de sete possíveis híbridos sendo que anteriormente estes haviam
sido classificados de acordo com características fenotípicas e proximidade em
campo. As quatro combinações de primers AFLP resultaram em um total de
984 marcadores com 99% de polimorfismo já que o estudo abrangeu espécies
distintas, aumentando as diferenças entre os conjuntos de genes. A análise dos
dados mostrou que a possível identidade de seis híbridos não estava correta,
uma vez que estes se encontraram distante dos supostos parentais ressaltando
a necessidade de estudos complementares que envolvam outras possíveis
espécies parentais. O dendrograma mostra que o suposto híbrido de Psilanthus
bengalensis X C. arabica agrupou-se com um de seus parentais, o que sugere
hibridização, sendo necessárias análises completares para confirmar a
paternidade e determinar a identidade do segundo parental.
Introdução
O cafeeiro pertence ao grupo das Fanerógamas, família Rubiaceae e gêneros
Coffea e Psilanthus. Dentre os exemplares de café, C. arabica e C. canephora
apresentam maior importância econômica, contudo, C. dewevrei, C. salvatrix,
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C. stenophylla, C. eugenoides, C. liberica, C. congensis, C. kapakata, C.
sessiflora, C. racemosa, entre outras que, apesar de não serem cultivadas
comercialmente, possuem relevante variabilidade genética para a resistência a
doenças, nematoides e secas, sendo por isso muito utilizada em cruzamentos
interespecíficos nos programas de melhoramento vegetal (SAKIYAMA et al.,
2005; CARVALHO, 2008).
Híbridos interespecíficos e intergenéricos têm sido amplamente
utilizados nos programas de melhoramento vegetal em diversas espécies, a fim
de expandir o conjunto de genes dos cultivares. As espécies de café têm um
genoma comum, tornando possível a hibridação interespecífica e produção de
híbridos, seja dentro da espécie Coffea ou entre Coffea e Psilanthus, um
gênero próximo a Coffea (ANTHONY et al., 2007; VAN LAERE et al., 2007;
OCAMPO 2016).
Na coleção que faz parte do banco ativo do germoplasma de Coffea,
mantido no Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) surgiram híbridos
interespecíficos de Coffea. Cogita-se que os possíveis pais desses híbridos
sejam: C. arabica, C. canephora, C. dewevrei, C. eugenioides e C. racemosa. A
determinação da paternidade destes híbridos é de extrema importância, tendo
em vista que estes podem ser usados para transferir genes de importância
agronômica, tanto para C. arabica como para C. canephora. Com isso, o
objetivo desse trabalho foi determinar, por meio de AFLP, a paternidade de
sete híbridos interespecíficos e intergenéricos.
Procedimentos metodológicos
Foram extraídos DNA de 22 espécies do gênero Coffea, sete possíveis híbridos
e uma espécie do gênero Psilanthus no Instituto Agronômico do Paraná. A
extração do DNA deu-se utilizando o protocolo proposto por Doyle e Doyle em
1987 com modificações como a substituição do CTAB por MATAB no tampão
de extração. As reações de AFLP foram realizadas seguindo o protocolo de
Vos et al. 1995. A restrição de 700ng/µL de DNA foi feita por duas enzimas de
restrição EcoRI e MseI, seguida da ligação de adaptadores. Os fragmentos
gerados foram pré-selecionados por primers baseados na sequência dos
adaptadores EcoRI e MseI com a adição de um único nucleotídeo (EcoRI- C e
MseI- A). E finalmente o uso de primers seletivos com dois nucleotídeos além
da sequência complementar aos adaptadores, maximizou a seleção gerando
uma quantidade menor de fragmentos. As combinações de primers usadas
foram: EcoRI-AGG / MseI-CTT, EcoRI-AAC / MseI-CTAG e EcoRI-ACT / MseICTG e EcoRI-AGG / MseI-CTAG.
Resultados e Discussão
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As quatro combinações de primers AFLP aplicadas neste estudo
resultaram em um total de 984 marcadores, sendo 99% destes polimórficos. O
alto grau de polimorfismo encontrado para esses exemplares é explicado pelas
diferentes espécies que fazem parte do estudo, aumentando o nível de
informação genética.
A possível identidade dos híbridos foi definida de acordo com a
localização em campo associada a características fenotípicas. No entanto a
árvore construída pelo método UPGMA conforme a distância genética de Nei
(Fig. 1) apresentou agrupamentos diferentes do esperado, uma vez que, a
maioria dos indivíduos considerados híbridos se associaram distante dos
possíveis parentais. Constatou-se que o possível híbrido de Psilanthus
bengalensis X C. arabica agrupou-se com um de seus parentais o que sugere a
hibridização, sendo necessárias análises futuras para confirmar a paternidade
e determinar a identidade do segundo parental. Ainda de acordo com o
dendrograma, é possível verificar a existência de híbridos entre as espécies de
café analisadas, porém, há necessidade de determinar os parentais já que
estes híbridos não estão próximos aos indivíduos que se acreditava serem os
pais.
Figura 1. Dendrograma das espécies de café gerado pelo método UPGMA
baseado na distância de Nei (1978).
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A análise da distância genética de Nei (1978) mostrou variação de
0,0144 a 0,29683, sendo que a menor distância é observada entre C. arabica
var. arabica (planta 1) e C. arabica var. arabica (planta 2), já que foram
coletadas amostras de plantas diferentes, porém, da mesma espécie. A maior
distância foi observada entre a Cultivar Nemaya 2 e o possível híbrido de
Psilanthus bengalensis x C. arabica indicando que, dentre os 27 exemplares
analisados, estes dois apresentam a maior divergência genética.
Conclusões
Os resultados apresentados nesse trabalho ressaltam a importância das
ferramentas moleculares como os marcadores AFLP, para uso na
determinação de paternidade de híbridos interespecíficos de café. Mesmo
apresentando características fenotípicas dos possíveis parentais, possíveis
híbridos podem ser produtos de hibridização entre outros indivíduos,
igualmente resultantes de hibridação. Para que a real identidade dos híbridos
interespecíficos seja confirmada, serão necessários estudos complementares
envolvendo outros exemplares de possíveis parentais provenientes do banco
de germoplasma do IAPAR
Referências
ANTHONY, F.; DUSSERT, S.; DULLOO, E. Coffea genetic resources.
Complementary strategies for ex situ conservation of Coffee (Coffea arabica L.)
genetic resources, p.11, 2007.
CARVALHO, C. H. S. Cultivares de café: origem, características e
recomendações. Brasília: Embrapa Café, 334p, 2008.
DOYLE, J.J.; DOYLE, J.L. A rapid isolation procedure for small quantities of fresh
leaf tissue. Phytochemical Bulletin, v.19, p.11-15, 1987.
NEI, M. Molecular evolutionary genetics. Columbia University Press, New York,
NY, USA. 1978.
OCAMPO, J; ARIAS, J. C.; URREA, R. Interspecific hybridization between
cultivated and wild species of genus Passiflora L. Euphytica, v. 209, n. 2, p.395408, 2016.
SAKIYAMA, N. S; PEREIRA, A. A.; ZAMBOLIM, L. Melhoramento do café arábica.
In: BORÉM, A (Ed.). Melhoramento de espécies cultivadas. Viçosa, MG:
Imprensa Universitária, p.189-204, 2005.
VAN LAERE, K; VAN HUYLENBROECK, J. M.; VAN BOCKSTAELE, E.
Interspecific hybridization between Hibiscus syriacus, Hibiscus sinosyriacus and
Hibiscus paramutabilis. Euphytica, v. 155, n. 1-2, p. 271-283, 2007.
VOS, P.; HOGERS, R.; BLEEKER, M.; REIJANS, M.; LEE, T.; HORNES, M.;
FRIJTERS, A.; POT, J.; PELEMAN, J.; KUIPER, M.; ZABEAU, M. AFLP: a new
technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, v.23, p.4407–4414,
1995.
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