AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES MOLECULARES E

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE QUÍMICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM GEOCIÊNCIAS – GEOQUÍMICA AMBIENTAL
LEONARDO REVOREDO FRAZÃO
AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES MOLECULARES E
HISTOLÓGICOS EM ESPONJA Hymeniacidon heliophila
PARA APLICAÇÕES AMBIENTAIS
NITERÓI
2013
LEONARDO REVOREDO FRAZÃO
AVALIAÇÃO DE BIOMARCADORES MOLECULARES E
HISTOLÓGICOS EM ESPONJA Hymeniacidon heliophila PARA
APLICAÇÕES AMBIENTAIS
Dissertação apresentada ao Curso de PósGraduação
em
Geociências
da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para a obtenção do Grau
de Mestre. Área de concentração:
Geoquímica Ambiental.
Orientador: Prof. Dr. Wilson Thadeu Valle Machado
Co-orientadores: Prof. Dr. Cristiano Carvalho Coutinho
Prof. Dr. Ricardo Erthal Santelli
NITERÓI
2013
F848 Frazão, Leonardo Revoredo.
Avaliação de biomarcadores moleculares e histológicos em
esponja Hymeniacidon heliophila para aplicações ambientais /
Leonardo Revoredo Frazão. – Niterói : UFF. Programa de
Geoquímica, 2013.
84 f. : il. color. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado em Geociências - Geoquímica
Ambiental) - Universidade Federal Fluminense, 2013. Orientador: Prof.
Dr. Wilson Thadeu Valle Machado. Co-orientadores: Prof. Dr. Cristiano
Carvalho Coutinho, Prof. Dr. Ricardo Erthal Santelli.
1. Biomarcadores.
2. Biomonitoramento.
3. Proteína.
4. Esponja (Zoologia).
5. Cádmio.
6. Ecossistema marinho.
7. Produção intelectual. I. Título.
CDD 593.4
AGRADECIMENTOS
Gostaria de eternizar, por meio deste registro, meus agradecimentos às pessoas
que tornaram possível, ou pelo menos, menos penoso, a realização deste trabalho.
Agradecer à minha família que, além do suporte financeiro, me passaram questões
morais não possíveis de se aprender em escolas ou faculdades.
Ao Prof. Dr. Wilson Thadeu Valle Machado, que abraçou a ideia e me orientou de
forma singular na produção desta dissertação.
Ao Prof. Dr. Cristiano Carvalho Coutinho, que através de seus longos anos de
estudos e experiência, possibilitou o desenvolvimento das esponjas em aquário e,
ainda, no fornecimento dos estudos histológicos, uma proposta que enriqueceu
muito este trabalho.
Ao Prof. Dr. Ricardo Erthal Santelli, agradeço pela confiança e toda a logística e
material que deixou disponíveis a mim, pois sem estes, seria impossível realizar este
estudo.
Meu agradecimento ao Dr. Rodrigo Cunha Wanick pelos ensinamentos desde a
época da graduação e que se perduraram até o mestrado. Apesar das dificuldades
enfrentadas (trabalhar com biomarcadores às vezes é espinhoso), sem dúvida os
frutos começam a ser recolhidos.
Aos professores Dra Elisamara Sabadini Santos e Dr. Renato Campelo Cordeiro
pelas contribuições realizadas na pré banca.
Aos meus amigos de laboratório, Aline e Bernardo, um especial agradecimento, por
toda ajuda na determinação dos metais. Sem vocês, realmente, as coisas ficariam
complicadas.
Aos meus amigos da turma de mestrado, que juntos, compartilhamos aflições e
alegrias durante esta etapa em nossas vidas.
Por fim, agradeço à todos os membros do Programa de Pós-Graduação em
Geoquímica da UFF e à CAPES pela bolsa concedida.
RESUMO
O potencial de bioacumulação de metais; capacidade de expressar biomarcadores
moleculares (como a indução de proteínas semelhantes a metalotioneínas, MTLPs);
e
biomarcadores
histológicos
(quantidade
de
canais
aquíferos,
câmaras
coanocitárias e fibras de colágeno) foram estudados na esponja Hymeniacidon
heliophila.
Em aquário,
foi realizada
exposição
da
esponja
a
diferentes
concentrações de cádmio (controle; 0,05; 0,4 e 4 mg L -1 de Cd) ao longo de
determinados períodos de tempo (tempo zero, 24 horas, 7 dias e 14 dias). Também
foi avaliada a ocorrência de MTLPs e as concentrações de metais potencialmente
indutores da síntese dessas proteínas (Cd, Ni, Cu e Zn) em H. heliophila proveniente
diretamente da praia da Boa Viagem, situada na Baía de Guanabara (RJ). No
experimento em aquário, a esponja acumulou uma concentração máxima de 114 mg
Cd Kg-1, após 14 dias de exposição a 4 mg L-1 deste metal. Este valor corresponde a
14 vezes o encontrado em esponjas do aquário controle. Por meio da técnica de
eletroforese (SDS-Page) aliada a derivatização com monobromobimano, foi possível
observar forte indução de MTLPs apenas nas amostras expostas a 0,4 mg L-1 de Cd
nos períodos de 24 horas e 7 dias. As técnicas de histologia utilizadas para
evidenciar os efeitos morfológicos causados pela exposição ao Cd revelaram que
em 24 horas houve diminuição na quantidade das estruturas analisadas. A partir
desse período, nas esponjas submetidas a 4 mg L-1 de Cd, houve tendência de
diminuição (exceto para fibras colágenas) das estruturas, enquanto em 0,4 mg L-1 de
Cd houve tendência de estabilização e, em 0,05 mg L-1 de Cd, recuperação. No
estudo na praia da Boa Viagem, em nenhuma das cinco coletas realizadas, foi
constatada indução de MTLPs. As médias das concentrações de metais
encontradas no tecido das esponjas foram: 0,28 mg Cd kg-1, 46,3 mg Cu kg-1, 2 mg
Ni kg-1 e 965 mg Zn kg-1. Estes valores são elevados quando comparados às
concentrações reportadas para outros organismos da Baía de Guanabara. Assim, a
alta eficiência em acumular metais (observada na praia da Boa Viagem) e a
capacidade de induzir MTLPs e respostas histológicas (frente à exposição ao Cd),
indicam possibilidades para utilização de H. heliophila em futuros programas de
biomonitoramento.
Palavras-chave: Biomonitoramento. Biomarcadores. Metalotioneínas. Histologia.
Esponja. Hymeniacidon heliophila. Cádmio.
ABSTRACT
The metal bioaccumulation potential, the expression of molecular biomarkers
(induction of metallothionein-like proteins, MTLPs) and histological biomarkers
(number of channels, choanocyte chambers and collagen fibers) were studied in the
sponge Hymeniacidon heliophila. Exposure experiments to different concentrations
of cadmium (<0.01, 0,05, 0,4 and 4 mg L-1 Cd) along different time intervals (t = 24
hours, 7 days and 14 days) were performed under controlled (aquarium) conditions.
The occurrence of MTLPs and metal concentrations potentially involved in inducing
the synthesis of these proteins (Cd, Ni, Cu and Zn) were also investigated in H.
heliophila directly sampled from the Boa Viagem beach, located in Guanabara Bay
(RJ). In the aquarium experiment, the sponge accumulated a maximum
concentration of 114 mg Cd kg-1 after 14 days of exposure to 4 mg L-1 of this metal.
This corresponds to 14 times the concentration found in sponges found in a control
aquarium.
Electrophoresis
(SDS-PAGE)
combined
with
monobromobimano
derivatization indicated a strong induction MTLPs only in samples exposed to 0,4 mg
L-1 Cd in periods of 24 hours and 7 days. The histological techniques used to reveal
the morphological effects caused by exposure to Cd revealed that within 24 hours
there was a decrease in the quantity of the analyzed structures. In the study carried
out in Boa Viagem beach, there was absence of MTLPs induction along the five
sampling periods evaluated. The mean concentrations of metals found in the tissue
of the sampled sponges were: 0,28 mg kg-1 Cd, 46,3 mg kg-1 Cu, Ni 2 mg kg-1 and
965 mg kg-1 Zn. These values are higher than concentrations reported for other
organisms from Guanabara Bay. Thus, the high efficiency in accumulating metals
(found in the Boa Viagem beach) and the ability to induce MTLPs and histological
responses (under high Cd exposure) indicate possible uses of H. heliophila in future
biomonitoring programs.
Keywords:
Biomonitoring.
Biomarkers.
Hymeniacidon heliophila. Cadmium.
Metallothioneins.
Histology.
Sponge.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Representação esquemática dos diferentes níveis de organização
biológica frente à exposição a contaminantes. .......................................................... 19
Figura 2- Morfologia geral de uma esponja marinha. As setas representam o fluxo
de água através da esponja. ES= espícula; PI= pinacócito; CO= coanócito; CC=
câmara coanocitária; AR= arqueócito. ...................................................................... 24
Figura 3- Localização do ponto de coleta de água (ponto vermelho) para cultivo das
esponjas em laboratório, próxima a Ilha de Cataguases (23°1'32.71" Sul, 44°17'2.74"
Oeste), situada na região sul do estado do Rio de Janeiro. ...................................... 31
Figura 4- Detalhe das esponjas agregadas em placas de Petri em estrutura “varal”.32
Figura 5- Aquário com esponjas Hymeniacidon heliophila dispostas em “varal” para
aclimatização e cicatrização dos explantes ............................................................... 32
Figura 6- Representação esquemática do sistema vertical de eletroforese SDSPAGE. ....................................................................................................................... 40
Figura 7- Diagrama esquemático do protocolo de extração ..................................... 42
Figura 8- Localização da praia da Boa Viagem situada na Baía de Guanabara,
Niterói. ....................................................................................................................... 43
Figura 9- Localização dos pontos de coleta na praia da Boa Viagem. ..................... 44
Figura 10- Concentração de cádmio em Hymeniacidon heliophila nos tempos zero,
24 horas, 7 e 14 dias à exposição a 0,05, 0,4 e 4 mg L-1 de Cd e controle. .............. 46
Figura 11- Relação entre a concentração de Cd presente na água com o encontrado
no tecido de H. heliophila. Cada curva representa a tendência para cada tempo de
exposição com seus coeficientes. ............................................................................. 46
Figura 12- Fotografias de géis com proteínas extraídas de amostras de
Hymeniacidon heliophila expostas ao Cd por três períodos: 24 horas (gel 1), 7 dias
(gel 2) e 14 dias (gel 3). As raias que indicam 0,2, 0,6 e 1,0 µg correspondem aos
padrões de MT aplicados em cada gel. As raias indicam as amostras de esponjas
submetidas a controle (A), 0,05 (B), 0,4 (C) e 4 mg L -1 de Cd (D). Em destaque nos
géis, a faixa onde houve indução de proteínas que não no controle. No gel 2 e 3,
tempo zero indica amostras das esponjas provenientes do aquário de cultivo. ........ 49
Figura 13- Verificação da Intensidade da fluorescência das bandas na faixa de 28,5
a 37,6 kDa onde houve indução de proteínas que não na situação controle. Cada
ponto indica a média (n=4 e barra de erro é igual ao desvio padrão). ...................... 50
Figura 14- Fotografias de géis com proteínas de amostras de Hymeniacidon
heliophila nativas da praia da Boa Viagem. As raias que indicam 0,2; 0,6 e 1,0 µg
correspondem aos padrões de MT aplicados em cada gel. O gel 5B é o mesmo que
o gel 5, porém corado com comassie blue que apresenta os seguintes marcadores
de massa molecular: lisozima (14 kDa), mioglobina (18,4 kDa), anidrase carbônica
(28,5 kDa), álcool desidrogenase (37,6 kDa), albumina de soro bovino (66,2 kDa). As
chaves indicam a faixa de 28,5 a 37,6 kDa. .............................................................. 51
Figura 15- Imagem de corte histológico de Hymeniacidon heliophila proveniente do
aquário-mãe (tempo zero) corada por hematoxilina e eosina. CC= Câmara
coanocitária; CA= Canal aquífero. Aumento de 200x. ............................................... 55
Figura 16- Variação da quantidade de câmaras coanocitárias em Hymeniacidon
heliophila nos diferentes tempos de exposição e concentração de Cd. Cada ponto
indica a quantidade absoluta de câmaras coanocitárias em um corte histológico
inteiro pela área deste. .............................................................................................. 56
Figura 17- Variação da quantidade de canais aquíferos em Hymeniacidon heliophila
nos diferentes tempos de exposição e concentração de Cd. Cada ponto indica a
quantidade absoluta de canais aquíferos em um corte histológico inteiro dividido pela
área deste. ................................................................................................................ 57
Figura 18- Relação entre concentração de Cd no tecido com quantidade de câmaras
coanocitárias em H. heliophila em cada período de exposição. A curva e o
coeficiente representam função logarítmica de redução das câmaras coanocitárias
no período de 14 dias de exposição ao Cd, onde ocorreu maior tendência de
correlação.................................................................................................................. 57
Figura 19- Relação entre concentração de Cd no tecido com quantidade de canais
aquíferos em H. heliophila em cada período de exposição. A curva e o coeficiente
representam função logarítmica de redução das câmaras coanocitárias em 14 dias
de exposição ao Cd. .................................................................................................. 58
Figura 20- Relação entre Câmaras coanocitárias/pixel*10-3 e quantidade de canal
aquífero/pixel*10-3 em H. heliophila. .......................................................................... 58
Figura 21- Imagem de corte histológico de Hymeniacidon heliophila proveniente do
aquário de cultivo (A) e de 14 dias de exposição a 4 mg L -1 de Cd (B). As setas
indicam as fibras colágenas. Aumento de 400x. ....................................................... 60
Figura 22- Variação das fibras colágenas em Hymeniacidon heliophila medida em %
da área total dos corte histológicos em cada situação de tempo e exposição ao Cd.
Cada ponto indica a média (n=120 e barra de erro é igual ao desvio padrão) .......... 61
Figura 23- Relação entre concentração de Cd no tecido com quantidade de
colágeno em H. heliophila em cada período de exposição. As curvas e os
coeficientes representam função logarítmica de redução de colágeno no período de
14 dias. ...................................................................................................................... 61
Figura 24- Relação entre colágeno e quantidade de câmaras coanocitárias em H.
heliophila. A curva e o coeficiente representam a função logarítmica do período de
14 dias de exposição ao Cd, onde ocorreu a maior tendência de correlação. .......... 62
Figura 25- Relação entre colágeno (%) e quantidade de canal aquífero/pixel*10
-3
em H. heliophila. ........................................................................................................ 62
Figura 26- Médias das concentrações de Cd, Cu, Zn, Ni no tecido de H. heliophila
nas cinco coletas realizadas na praia da Boa Viagem, Niterói (n=6 em cada coleta e
barra de erros é igual ao desvio padrão). .................................................................. 64
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Média das concentrações de metais em mg kg -1 em outros estudos na
Baía de Guanabara. .................................................................................................. 66
LISTA DE ABREVIATURAS
HE - hematoxilina-eosina
HPS - heat shock protein
ICP MS - espectrometria de massa com fonte de plasma (do inglês: inductively
coupled plasma mass spectrometry)
ICP OES - inductively coupled plasma optical emission spectrometry
kDa - kiloDalton
mBBr- monobromobimano
PAGE – polyacrylamide gel electrophoresis
pH - potencial hidrogeniônico
PMSF – fluoreto de fenilmetanosulfonila
PSA – persulfato de amônio
MTLPs- proteínas semelhantes a metalotioneínas (do inglês: metallothionein-like
protein)
SDS – sodium dodecyl sulfate
SDS PAGE – sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis
-SH - grupamento sulfidrila
TEMED – N,N`,N,N`-tetrametilenodiamina
Tris - hydroxymethyl aminomethane hydrochloride
U.V.- ultravioleta
SUMÁRIO
RESUMO..................................................................................................................... 2
ABSTRACT ................................................................................................................. 4
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 5
LISTA DE TABELAS .................................................................................................. 8
LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................... 9
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16
1.1 BIOMONITORAMENTO E BIOINDICADORES ................................................... 16
1.2 BIOMARCADORES ............................................................................................. 19
1.2.1 Características das MTs e suas funções biológicas ................................... 20
1.3 UTILIZAÇÃO DE ESPONJAS COMO ORGANISMOS BIOINDICADORES E
SUA APLICAÇÃO EM ESTUDOS COM BIOMARCADORES ................................... 21
1.3.1 Esponjas marinhas como bioindicadores .................................................... 24
1.3.2 Aplicação das MTLPs em esponjas .............................................................. 26
1.3.3 Aplicação de biomarcadores histológicos em esponjas ............................ 27
1.4 Hymeniacidon heliophila (PARKER, 1910) .......................................................... 28
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 29
2.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 29
2.1.1 Objetivos específicos ..................................................................................... 29
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 30
3.1 PREPARO DO AQUÁRIO DE CULTIVO ............................................................. 30
3.1.1 Coleta e cultivo das esponjas........................................................................ 31
3.1.2 Preparo do aquário para o experimento de exposição ao cádmio ............. 33
3.2 DETERMINAÇÃO DE CÁDMIO........................................................................... 33
3.2.1 Preparo das amostras .................................................................................... 33
3.2.2 Determinação do cádmio e níquel pela técnica de espectrometria de
massa com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS) ......................... 34
3.2.3 Determinação do cobre e zinco pela técnica de espectrometria de
emissão óptica com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP OES) ........ 35
3.3 ANÁLISES HISTOLÓGICAS ............................................................................... 35
3.3.1 Coloração por hematoxilina e eosina (HE) ................................................... 36
3.3.2 Coloração por picro Sirius ............................................................................. 36
3.3.3 Análise de câmaras coanocitárias e canais aquíferos ................................ 37
3.3.4 Presença de matriz extracelular (colágeno) ................................................. 37
3.4 ANÁLISE PROTEICA .......................................................................................... 38
3.4.1 Extração de proteínas semelhantes a metalotioneínas .............................. 38
3.4.2 Preparo de amostras para a separação por eletroforese desnaturante em
gel de poliacrilamida ............................................................................................... 38
3.4.3 Dosagem de proteínas totais ......................................................................... 39
3.4.4 Separação de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDSPAGE)
............................................................................................................... 39
3.4.5 Digitalização das imagens dos géis e análise densitométrica das bandas
derivatizadas com monobromobimano ................................................................. 40
3.5 ESTUDO NA PRAIA DA BOA VIAGEM ............................................................... 43
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 45
4.1 EXPERIMENTO DE EXPOSIÇÃO AO CÁDMIO ................................................. 45
4.1.1 Bioacumulação de cádmio na esponja ......................................................... 45
4.1.2 Verificação da indução de MTLPs ................................................................. 48
4.1.3 Análise da quantidade de câmaras coanocitárias e canais aquíferos ....... 55
4.2 ANÁLISE DA MATRIZ EXTRACELULAR (COLÁGENO) .................................... 59
4.3 CONCENTRAÇÃO DE METAIS NAS ESPONJAS DA BOA VIAGEM ................ 63
5 CONCLUSÃO......................................................................................................... 68
6 REFERÊNCIAS ...................................................................................................... 70
16
1
INTRODUÇÃO
1.1
BIOMONITORAMENTO E BIOINDICADORES
A poluição por metais no ambiente marinho é uma questão que desperta
grande preocupação aos cientistas e governos há várias décadas (ZHANG et al.,
2012). Atividades de mineração, petrolífera, fabricação de produtos metálicos
comerciais, uso de pigmentos e lixiviação de resíduos sólidos, além de outras, têm
gerado o aumento de elementos como chumbo (Pb), cádmio (Cd) e mercúrio (Hg)
nos ambientes costeiros e estuarinos, principalmente através do aporte de rios
contaminados (FERREIRA-CRAVO et al., 2009).
Devido à toxicidade e comportamento acumulativo, estes metais podem
causar grandes prejuízos à diversidade de espécies e ecossistemas marinhos
(SIVAPERUMAL et al., 2007). O acúmulo destes elementos nos organismos
marinhos e a biomagnificação ao longo da cadeia trófica podem ainda gerar riscos à
saúde humana via alimentação de pescado (FIRAT et al., 2008).
Como exemplo, o histórico caso que ocorreu no ano de 1956, em Minamata,
Japão. Cerca de 1200 pessoas morreram e outras milhares desenvolveram
deficiências físicas e motoras ao se alimentarem de pescado contaminado com
metilmercúrio proveniente de despejos industriais (BASTOS, 1997).
A fim de garantir o levantamento do ambiente marinho submetidos à
contaminação antrópica, a análise química de matrizes do ambiente, tais como
águas e sedimentos, é a abordagem mais comumente utilizada, porém não
suficiente, pois a ocorrência de um produto químico em particular no meio ambiente
revelada por este tipo de análise não significa necessariamente que ele está
biodisponível, bem como não permite qualquer conclusão em relação aos efeitos
nocivos sobre a biota (CAJARAVILLE et al., 2000). Estas limitações levaram ao uso
de organismos bioindicadores para o monitoramento do ambiente marinho costeiro e
o estudo dos efeitos biológicos dos poluentes nesses organismos tornou-se
imprescindível para a avaliação da qualidade do meio ambiente (GRAY, 1992;
BARHOUMI et al., 2012).
17
Assim, para a melhor compreensão dos efeitos que elevadas quantidades de
metais tóxicos, como o cádmio, possam causar em organismos marinhos e o
aprimoramento de ferramentas que possam ser utilizadas em programas de
biomonitoramento é fundamental o estudo do efeito desses elementos nos
organismos. Para este fim, muitos estudos são realizados em laboratório, utilizando
organismos-alvo fáceis de manter em condições de laboratório (por exemplo,
BROWN; AHSNULLAH, 1971; RAINBOW et al., 1980; RAINBOW; WANG, 2001;
LOURENÇO et al., 2011; GENTA-JOUVE et al., 2012). Apesar dos experimentos
laboratoriais não levarem em conta uma série de complexas interações que ocorrem
no ambiente, condições controladas podem fornecer informações mais precisas e
confiáveis das mudanças que ocorrem no organismo, visto que o agente causador
dessas alterações são, em geral, de conhecimendo do observador. Assim, essas
pesquisas são a base para a aplicação em qualquer estudo que objetive o
monitoramento ambiental (CARMAN et al., 1995; CARBALLO; NARANJO, 2002;
CEBRIAN et al., 2003).
Em relação aos organismos utilizados como bioindicadores, de acordo com
Phillips e Rainbow (1993), é ideal ter as seguintes características:

ser séssil;

ter massa suficiente para fornecer tecido para análises;

ser de fácil identificação;

ser abundante;

ter longevidade;

ser cosmopolita ou apresentar ampla distribuição geográfica;

ser tolerante às variações físico-químicas do ambiente;

ser tolerante a elevados níveis de poluentes;

ser capaz de apresentar relação dose-efeito possível de ser obervada.
Dentre esses organismos, os bivalves têm sido historicamente os mais
utilizados como bioindicadores de contaminação de metais, principalmente devido
ao sucesso do programa de biomonitoramento US Mussel Watch Program
estabelecido pelos Estados Unidos nos anos 1970 (JERNELEV, 1996). Este
programa foi o precursor de um grande número de estudos usando uma seleção de
organismos bentônicos (moluscos bivalves predominantemente) para acompanhar a
18
contaminação de metais nos ambientes marinhos costeiros e estuarinos (COSSA,
1989; O’ CONNOR, 1992, 1998; ROBINSON et al., 2005; TAYLOR; MAHER, 2003,
2006; SEO et al., 2012).
Porém, segundo Phillips e Rainbow (1993), é importante a utilização de
diversos organismos e, se possível, de diferentes níveis tróficos para se estabelecer
um eficiente programa de monitoramento de contaminação por metais-traço. Assim,
além dos já conceituados moluscos bivalves, muitos outros organismos vêm sendo
propostos como bioindicadores, como anfípodas, macroalgas marinhas (RAINBOW,
1995), protozoários, gastrópodes, peixes, insetos, anfíbios (ZHOU et al., 2008) e
esponjas marinhas
(MESTRE et al., 2012). A análise com os organismos é
relativamente simples e, sobretudo, o resultado pode ser integrado através do tempo
e espaço.
Este tipo de análise consta entre os mais utilizados em programas de
biomonitoramento que, no caso, verifica-se por meio de organismos capazes de
acumular produtos químicos a fração biodisponível de contaminantes no ambiente
(ZHOU et al., 2008). Todavia, neste tipo de análise não é possível obter informação
sobre a toxicidade e seus efeitos no organismo (VAN DER OOST et al., 1996).
Desse modo, começou-se a observar o estresse que os contaminantes podem
causar aos organismos.
Por exemplo, a verificação do índice de diversidade de espécies, abundância
ou presença/ausência da espécie bioindicadora pode indicar em longo prazo os
efeitos do estresse causado pela contaminação sobre as populações e comunidades
(CARMAN et al., 1995). Entretanto, neste tipo de abordagem o ecossistema
geralmente está num avançado estado de degradação, podendo dificultar os
processos de remediação ambiental. Outro problema é que a detecção de
alterações
na
estrutura
de
comunidades
bentônicas
frequentemente
está
relacionada a concentrações aguda dos poluentes e, contudo, a maioria dos
contaminantes se apresenta em águas marinhas em graus crônicos de toxicidade
cujos efeitos nocivos nem sempre são possíveis de serem observados em maiores
níveis de organização biológica (YOUNG et al., 1979).
Por conseguinte, o levantamento de respostas biológicas em escala
individual, como biomarcadores de exposição e/ou biomarcadores de efeito, pode
19
gerar, em curto prazo, informações adicionais e biologicamente mais sensíveis e
relevantes do potencial efeito dos poluentes tóxicos sobre a saúde dos organismos
(LYONS et al., 2010).
1.2
BIOMARCADORES
Biomarcadores são os tecidos, fluídos corpóreos, as células ou compostos
químicos que indicam em termos bioquímicos ou celulares a presença de
contaminantes (BODIN et al., 2004). São incluídas ainda as respostas fisiológicas,
comportamentais ou energéticas dos organismos expostos (ROSS et al., 2002;
MAGNI et al., 2005). Existem assim biomarcadores moleculares, celulares ou
sistêmicos, sendo alguns deles específicos para determinados poluentes (LAM,
2009). Uma das vantagens de se utilizar biomarcadores é a possibilidade de
detectar efeitos deletérios de poluentes antes de serem evidenciadas alterações em
níveis superiores de organização biológica (LAM; GRAY, 2003; SARKAR et al.,
2006) (Figura 1).
Sinais de biomarcadores
“imediatos”
molecular
subcelular (organela)
celular
Exposição ao
tecido
Poluente
sistêmico (órgão)
organismo
população
efeitos “tardios”
comunidade
ecossistema
Figura 1- Representação esquemática dos diferentes níveis de organização biológica frente à
exposição a contaminantes.
Fonte: BAYNE et al., 1985.
Segundo a Who (1993), os biomarcadores podem ser classificados
basicamente em:

Biomarcadores de exposição: podem ser usados para confirmar e
avaliar a exposição para uma substância em particular.
20

Biomarcadores de efeito: podem ser usados para constatar os efeitos
adversos à saúde dos organismos decorrentes da exposição a um
xenobiótico.
Dentre os biomarcadores de exposição nas esponjas, diversas proteínas
induzidas sobre condições de estresse são relatadas, como a proteína heat shock
Hsp70 (MÜLLER et al., 1995), a proteína DnaJ (KOZIOL et al., 1997), a proteína
reguladora de glicose GRP78 (SCHRÖDER et al., 1999), ubiquitina (PFEIFER et al.,
1993), tiorredoxina (WIENS et al., 1999) e as metalotioneínas (MTs) e proteínas
semelhantes a metalotioneínas (MTLPS) (BERTHET et al., 2005). Estes últimos,
amplamente documentados como resposta ao estresse ocasionado por metais não
essenciais (AMIARD et al., 2006; PERCEVAL et al., 2006; MACHREKI-AJMI et al.,
2008; LADHAR - CHAABOUNI et al., 2012).
1.2.1 Características das MTs e suas funções biológicas
As metalotioneínas são uma classe de metaloproteínas descritas pela
primeira vez por Margoshes e Vallee (1957) em rim equino. Essas proteínas não
enzimáticas ricas em radicais sulfidrila (-SH) têm como algumas características
grande quantidade de cisteínas (cerca de 30% dos aminoácidos), estabilidade
térmica e forte afinidade para se ligar a cátions metálicos como Ag, Ni, Cd, Cu, Hg,
e Zn (AMIARD; COSSON, 1997; COSSON; AMIARD, 1998). As MTs são proteínas
ubíquas encontradas em animais, plantas superiores, organismos eucariotos e
alguns procariotos (PARK et al., 2007). Estas proteínas também exibem baixa
massa molecular, 14 kDa em mamíferos, porém com valores que variam entre os
organismos. Já as PSMTs são proteínas que apresentam características das
metalotioneínas, mas que não foram obtiveram uma confirmação por meio de
sequenciamento para serem classificadas como MTs.
A estrutura das metalotioneínas foi investigada em algumas classes de
mamíferos, utilizando ressonância nuclear magnética e técnicas de difração de
raios- X. De um modo geral, elas possuem dois domínios estruturais, alfa (α) e beta
(β). O domínio α é formado por 11 cisteínas organizadas de maneira cis-x-cis (x =
qualquer aminoácido) no qual se ligam a 4 átomos de metais bivalentes. O domínio
β possui apenas 9 cisteínas organizadas também de maneira cis-x-cis, onde se
21
ligam a 3 átomos de metais bivalentes (KÄGI; KOJIMA, 1987). Preferencialmente o
zinco se liga no domínio β e o cádmio no domínio α. Por conseguinte, o domínio β
tende a regular a homeostase de zinco e cobre, enquanto que o domínio α pode
desempenhar um papel central na detoxificação de metais tóxicos (ZHOU et al.,
2000).
Dessa forma, a homeostase de metais essenciais (Cu e Zn) (VIARENGO;
NOTT, 1993) e a proteção contra a toxicidade de metais não essenciais (como Cd)
são algumas das funções biológicas atribuídas às MTs, que atuam ainda como ação
antioxidante (VIARENGO et al., 2000) e na proteção contra radiação ionizante e UV
(CAI et al., 1999).
Apesar de outros fatores poderem contribuir para síntese de MTs, tais como
inanição, manuseamento, anoxia, congelamento e presença de antibióticos ou
herbicidas (MOSLEH et al., 2004), o nível de indução é geralmente menor que o
causado por metais (KÄGI, 1993). Decerto, a principal característica que capacita as
MTs como biomarcadores de exposição a metais é a elevada indução dessas
proteínas por esses elementos (AMIARD et al., 2006).
1.3
UTILIZAÇÃO DE ESPONJAS COMO ORGANISMOS BIOINDICADORES E
SUA APLICAÇÃO EM ESTUDOS COM BIOMARCADORES
Devido a características como grande abundância no ambiente marinho,
possuir hábito alimentar por filtração e por serem organismos sésseis, as esponjas
vêm sendo propostas como bioindicadores para a contaminação por metais em
ambientes marinhos costeiros.
Surgidas há 600 milhões de anos, as esponjas (Filo: Porífera) são
importantes membros da comunidade bentônica marinha (BELL, 2008). Estes
animais podem ocupar 80% das superfícies disponíveis das regiões polares
(DAYTON, 1989) e, não raramente, são dominantes da fauna de recifes tropicais e
temperados (BELL; SMITH, 2004; PAWLIK, 2011).
O Filo Porifera, totalmente dedicado às esponjas, encontra-se entre os mais
diversos e bem sucedidos filos de invertebrados marinhos. Existem mais de 7000
espécies descritas, com representantes em todos os tipos de habitats aquáticos –
22
desde locais de água doce até fossas abissais (HOOPER; SOEST, 2002) em várias
condições de temperatura, profundidade, salinidade e luminosidade (RÜTZLER,
2004). Este fato demonstra a elevada capacidade das esponjas sobreviverem e se
adaptarem a condições de vida extremas.
Dentro do seu filo, as esponjas subdividem-se em três classes: Demospongia,
Hexactinellida e Calcarea. Os critérios taxonômicos utilizados para a identificação
das esponjas em nível de espécie são vastos. Eles incluem: forma, tamanho, cor,
textura, produção de muco e cheiro, ornamentação superficial, presença, forma e
natureza química de espículas, etc. Atualmente, a resolução taxonômica dos filos
mais problemáticos está recebendo suporte de métodos moleculares, que se
baseiam nas diferenças das sequências de DNAs das espécies. O projeto
denominado “código de barras” encontra-se em (http://www.spongebarcoding.org)
(WÖRHEIDE; ERPENBECK, 2007).
A classe Calcarea compreende cerca de 5% das espécies vivas; é facilmente
identificável pela presença de espículas de carbonato de cálcio. A classe
Hexactinellida, ou esponjas de vidro, como são também conhecidas, possuem um
esqueleto inteiramente composto por espículas siliciosas, dispostas em arranjos
hexagonais, possuem sincícios em vez de células verdadeiras e são essencialmente
esponjas de altas profundidades. A classe Demospongia engloba esponjas com e
sem esqueleto mineral silicioso embebido numa matriz de fibras de espongina e
representa cerca de 85% das espécies de esponjas existentes atualmente
(HOOPER; SOEST, 2002; LEYS; ROHKSAR et al., 2005).
A não ser pelos epitélios formados pelos coanócitos e pinacócitos
(coanoderme e pinacoderme, respectivamente), as esponjas apresentam tecidos
anatomicamente discretos. As suas células apresentam grande mobilidade e
flexibilidade nas vias de diferenciação. Esta característica única do filo Porifera
ocorre através da capacidade de desdiferenciação das células, isto é, uma célula já
diferenciada retorna ao estágio de célula totipotente, podendo assim sofrer uma
nova diferenciação (MÜLLER; MÜLLER, 2003).
Como mostrado na figura 2, a superfície exterior da esponja (ectossoma) é
rodeada por uma camada unicelular (exopinacoderme) composta por células
epiteliais (pinacócitos). Algumas destas células epiteliais formam pequenos poros
23
externos (óstios ou poros inalantes) através dos quais a água é inalada; outras
formam aberturas na superfície externa, funcionando como chaminés (ósculos ou
poros exalantes) através dos quais a água é expelida.
O interior da esponja é denominado mesohilo e nele há o coanossoma, uma
região vasculada por canais de água limitadas por uma única camada de células
(endopinacócitos) formando a endopinacoderme. O bombeamento da água através
dos canais é executado pelos coanócitos das câmaras coanocitárias, células
flageladas existentes exclusivamente nas esponjas.
As fibras de espongina no mesohilo, compostas por colágeno, formam o
esqueleto orgânico e as espículas minerais formam o esqueleto inorgânico, que
podem ser de carbonato de cálcio ou sílica. Embebidas no meso-hilo encontram-se
células totipotentes, os arqueócitos, capazes de alterar a forma e a função de acordo
com as necessidades do animal. Os tipos celulares mais especializados do mesohilo
são os que produzem fibras (colêncito), secretam espículas (esclerócitos), executam
a contração em redor dos poros exalantes (miócitos), etc.
As esponjas alimentam-se por filtração, extraindo da água que entra e circula
nos seus canais, nutrientes e oxigênio. Partículas de até 10 micras são retidas na
bainha dos flagelos dos coanócitos e na parede dos canais. Após um primeiro
processamento do fagossoma, vesículas são exportadas no mesohilo e pinocitadas
por células fagocitárias circulantes (REISWIG, 1971).
O sistema aquífero é a principal autapormofia de Porífera, podendo ser
caracterizado como um intrincado sistema composto por poros, canais e câmaras
que, pelo movimento dos flagelos dos coanócitos, criam uma corrente unidirecional
através do corpo da esponja (CAVALCANTI; KLAUTAU, 2011).
As esponjas
apresentam diferentes tipos de sistema aquífero: leuconóide, asconóide, sileibide e
siconóide.
As esponjas que possuem sistema aquífero do tipo asconóide têm todas as
cavidades do corpo revestidas por coanócitos. Esponjas do tipo siconóide
apresentam câmaras coanocitárias alongadas distribuídas radialmente a um átrio
central (livre de coanócitos), onde esses canais deságuam. O sistema aquífero do
tipo sileibide é composto por câmaras coanocitárias alongadas distribuídas
24
radialmente em invaginações do átrio. Finalmente, as esponjas com o sistema
aquífero do tipo leuconóide (figura 2) atingem um elevado grau de ramificação, com
os coanócitos distribuídos em câmaras esféricas distintas dispersas pelo meso-hilo e
interligadas por canais que deságuam em um átrio (livre de coanócitos).
Figura 2- Morfologia geral de uma esponja marinha. As setas representam o fluxo de água através da
esponja. ES= espícula; PI= pinacócito; CO= coanócito; CC= câmara coanocitária; AR= arqueócito.
Outra importante característica das esponjas é a capacidade de abrigar em
seu tecido comunidades extremamente densas e diversificadas de bactérias,
archaeas e eucariotos unicelulares, que chegam a constituir 35% da biomassa total
da esponja (TAYLOR et al., 2007). Wanick et al. (2013), por exemplo, ao identificar
17 proteínas expressas na esponja Haliclona sp.verificou que 76% destas eram
relacionadas a microrganismos, sendo 47% referentes às bactérias e 29%, aos
fungos. No geral, estes microrganismos distribuem-se extracelularmente no mesohilo da esponja ou habitam intracelularmente os arqueócitos, em vacúolos ou até
mesmo no núcleo da célula (VACELET; DONADAY, 1977).
1.3.1 Esponjas marinhas como bioindicadores
Um dos primeiros trabalhos a citar as esponjas como possíveis bioindicadores
para contaminação por metais foi realizado por Bowen e Sutton (1951), que
analisaram 10 desses elementos em 5 espécies de esponjas pertencentes aos
25
gêneros Dysidea, Terpios e Chondrilla, e verificaram distribuição específica de
metais em relação a espécie, ou seja, conforme a espécie, determinado metal
acumula-se em menor ou maior concentração. Nos trabalhos de Patel et al. (1984)
em Spirastrella cuspidifera e Prostylyssa foetida; Cebrian et al. (2007) em Crambe
crambe, Reniformis chondrosia, Phorbas tenacior, e Dysidea avara, também foram
verificadas especificidade de metais quanto à espécie. No entanto, além de verificar
esta característica, outros trabalhos sugerem a utilização das esponjas para refletir,
por meio da concentração de metais acumuladas em seu tecido, um possível
gradiente de contaminação em áreas marinhas costeiras, como indicado a seguir.
Hansen et al. (1995), por exemplo, avaliaram a concentração de cobre, zinco,
cádmio e cromo na esponja marinha Halichondria panicea. Em ambiente controlado,
este estudo demonstrou correlação direta de cobre, cádmio e zinco acumulado pela
esponja com a concentração desses metais presentes no tanque do experimento.
Rao et al. (2006) também avaliaram a relação entre a concentração de metais na
água e o acúmulo destes elementos, utilizando a esponja Petrosia testudinaria no
Golfo de Mannar (Índia), e observaram diferenças significativas das concentrações
de metais acumulados nas esponjas coletadas mais próximas à área mais
contaminada da costa, chegando a uma diferença de até 64 vezes maior perto da
costa (0,5 a 1 km) do que às coletadas em áreas mais afastadas da costa (5 a 7 km
de distância).
Cebrian et al. (2003), ao transplantarem esponjas da espécie Crambe crambe
de uma área controle para uma área contaminada, observaram uma queda no
percentual de espécies com embriões e a diminuição da taxa de crescimento destes
organismos. Esses efeitos deletérios foram associados à presença de cobre e
chumbo significativamente maiores do que no local controle e acumulados pela
esponja.
Outros trabalhos como o de Perez et al. (2005) - em Spongia officinalis; Rao
et al. (2007 e 2009) - em Sigmadocia fibulata
e
em Haliclona tenuiramosa,
respectivamente; e Padovan et al. (2012) - em Spheciospongia vagabunda; também
encontraram paralelos entre a concentração de metais no tecido da esponja com a
proximidade do local contaminado.
26
1.3.2 Aplicação das MTLPs em esponjas
A aplicação das MTLPs em esponjas ainda é escassa na literatura. Philp
(1999); Schröder et al. (2000) e Berthet et al. (2005) são os poucos autores que
relacionam estas proteínas encontradas nesses organismos com uma possível
contaminação por metais.
Philp (1999), em estudo de campo, relacionou a indução de MTLPs em
Microciona prolifera com a presença de Cd nesta esponja. Schröder et al. (2000), ao
exporem a esponja Suberites domuncula a 0,1 mg L-1
de cádmio em aquário
encontraram paralelos com a concentração de MTLPs. Berthet et al. (2005)
utilizaram esponjas da espécie Spongia officinalis para verificar a relação entre
MTLPs e a concentração de metais, onde primeiramente foi constatado a existência
de um sistema de detoxificação de metais e a presença de MTLPs na esponja. Este
estudo também revelou a presença de características que exibem muito das
características das metalotioneínas: localização citosólica, termoestabilidade, baixa
massa molecular (4 a 15 kDa) e ligação (pelo menos) a Ag, Cu e Zn. Correlações
positivas de MTLPS para Cu (p <0.01), Zn (p <0.05) e Hg (p<0.01) foram
encontradas, entretanto, para Ag e Cd as correlações não foram significativas.
Determinar a indução de biomarcadores de exposição, como as MTLPs, é
importante para confirmar e avaliar a exposição a uma substância em particular,
fornecendo uma ligação entre exposição externa (concentração da substância no
meio) e a quantificação da exposição interna (concentração da substância no
organismo). No entanto, esta abordagem não informa os possíveis danos causados
ao organismo pela presença e bioacumulação destas substâncias. Desta forma, a
utilização de biomarcadores de efeito assoma como uma ferramenta para estimar os
efeitos deletérios causados pela exposição e acúmulo de contaminantes. Dentre
estes, a análise de biomarcadores histológicos podem sinalizar efeitos nocivos em
organismos, resultante da exposição anterior ou em curso a agentes tóxicos
(REDDY; RAO, 2008).
27
1.3.3 Aplicação de biomarcadores histológicos em esponjas
A
aplicação
de
biomarcadores
histológicos
determina
alterações
principalmente em tecidos que ficam expostos diretamente e/ou executam uma
função intimamente relacionada com o meio ambiente contaminado. Portanto, este
método é considerado uma ferramenta particularmente vantajosa devido à rapidez
da sua aplicação e da sua posição intermediária entre os níveis molecular e
individuais de organização (ADAMS et al., 1989; LAM; GRAY, 2003).
Nas esponjas algumas respostas em situação de estresse em nível
histológico são conhecidas, como: a diminuição de câmaras coanocitárias, perda de
células e contração de tecidos (KNIGHT; FELL, 1987; IMSIECKE et al., 1996; De
GOEIJ et al., 2009). Em relação ao estresse causado por metais, alguns trabalhos
utilizaram análises nos tecidos das esponjas como formas de avaliação dos efeitos
de metais (WAGNER et al., 1998; EFREMOVA et al., 2002).
Wagner et al. (1998) verificou a formação de gêmulas (uma forma de
adaptação das esponjas em condições de estresse) em esponjas previamente
tratadas com Cd (0,01-5 μg L-1) por um período máximo de 120 horas. A evidência
da formação das gêmulas pelos resultados histológicos auxiliou na verificação de
apoptose na esponja Suberites domuncula como consequência da exposição ao Cd.
Já o trabalho de Efremova et al. (2002) utilizou técnicas de histologia para tentar
avaliar os danos da exposição de B. intermedia a um efluente industrial contendo
metais por 16 horas a 8 ºC. Apesar de terem sido observadas a síntese de HSP 70 e
danos no DNA, os resultados histológicos não evidenciaram danos na morfologia
dos tecidos dos explantes expostos aos metais (ex.: alterações na superfície da
membrana dermal, desaparecimento de canais aquíferos e câmaras coanocitárias).
Os autores concluíram que o tempo de exposição (16 horas) não foi suficiente para
evidenciar efeitos deletérios na morfologia de B. intermedia, em que as
manifestações das respostas moleculares foram consideradas como sinais
antecipados da exposição das esponjas aos contaminantes presentes no efluente.
28
1.4
Hymeniacidon heliophila (PARKER, 1910)
A esponja Hymeniacidon heliophila está presente no oceano Atlântico tropical
ocidental. No Brasil, esta espécie encontra-se restrita nas regiões Sul e Sudeste,
onde distribuem-se em zonas entremarés, até 15 metros de profundidade, incluindo
áreas com poluição crônica, como a Baía de Guanabara (Rio de Janeiro) (BREVESRAMOS et al., 2005). Esta espécie possui coloração laranja, com tamanho variando
de 5 a 50 cm de comprimento por 1,5-3,0 cm de espessura, apresentando papilas
cônicas com um ósculo na extremidade, que variam de 1-5 cm de altura por 0,5-2,0
cm de largura ou podem ser ausentes.
Os ósculos em H. heliophila apresentam-se dispersos na superfície e na
extremidade das papilas, variando de 0,5-3,0 mm de diâmetro. Detritos, grãos de
areia e fragmentos de conchas são comumente encontrados aglomerados na sua
base. Possui consistência macia e compressível. O esqueleto coanossomal
apresenta uma arquitetura confusa no interior, tendendo a reticulado próximo à
superfície, composto de feixes ascendentes de espículas agrupados por espongina
e conectados por espículas dispersas em todas as direções. O ectossoma é formado
por
espículas
dispersas
aleatoriamente
e
às
vezes
também
por
feixes
multiespiculares (30-110 µm de espessura, entre 5-40 espículas) (MURICY; HAJDU,
2006).
Na literatura, em relação ao gênero Hymeniacidon, o estudo de Mahaut et al.
(2012) verificou alta capacidade de acumulação de cobre, zinco e hidrocarboneto
fluoranteno em H. perlevis presentes em áreas entremarés da costa da Normandia
(França). Ao compararem com mexilhões (Mytilus edulis) presentes nesta região, os
autores encontraram níveis cerca de 20, 44 e 16 vezes maiores de zinco, cobre e
fluoranteno,
encontram-se
respectivamente,
artigos
nas esponjas.
publicados
relacionados
Com
a
Hymeniacidon
produção
de
heliophila,
metabólitos
secundários produzidos (RIBEIRO et al., 2010) e associação com comunidade de
bactérias (TURQUE et al., 2008). Em relação à utilização desta espécie como
bioindicadora de metais, Batista (2010) observou concentração de Al, Cr, Cu, Fe,
Mn, Ni, Pb, Ti, V, Zn e Cd nesta esponja em regiões interna e externa da Baía de
Guanabara.
29
2
OBJETIVOS
2.1
OBJETIVO GERAL
Avaliar a indução de proteínas semelhantes a metalotioneínas (MTLPs) e
respostas histológicas em Hymeniacidon heliophila, em função da exposição ao
cádmio.
2.1.1 Objetivos específicos

Determinar a concentração de Cd no tecido de H. heliophila frente à
exposição a diferentes concentrações de Cd (0,05; 0,4 e 4 mg L-1) em
diferentes períodos de exposição (1, 7 e 14 dias);

Avaliar a indução de MTLPs em H. heliophila em diferentes períodos de
exposição e concentração de Cd;

Analisar as alterações morfológicas: quantidade de câmaras coanocitárias,
canais aquíferos e colágeno na matriz extracelular em H. heliophila em
diferentes períodos de exposição e concentração de Cd;

Avaliar a expressão de MTLPs relacionados à concentração de metais
potencialmente indutores (Cd, Cu, Zn e Ni) em H. heliophila na praia da Boa
Viagem, Niterói.
30
3
MATERIAIS E MÉTODOS
O cultivo das esponjas coletadas para o experimento de exposição ao cádmio
e todas as etapas das análises histológicas foram realizadas no Biotério
Experimental de Cultivo de Esponja (Porifera): Evolução e Desenvolvimento do
Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ, coordenado pelo professor Dr. Cristiano
Carvalho Coutinho. A análise proteica por eletroforese em gel de poliacrilamida
SDS-Page e a determinação de metais no tecido da esponja e água foram
realizadas no Departamento de Geoquímica da UFF.
3.1
PREPARO DO AQUÁRIO DE CULTIVO
Um aquário com capacidade de 170 litros foi previamente preparado e
equilibrado para que fosse possível a realização do cultivo das esponjas. Foi
adicionado substrato contendo 70% de aragonita e 30% de areia branca sobre um
sistema de placas de filtro anaeróbico. O aquário de cultivo foi equipado também
com um sistema de filtro, composto de cerâmica porosa, na presença de microorganismos
envolvidos
no
ciclo
do
nitrogênio
(Stresszyme,
Aquarium
Pharmaceuticals Inc, EUA) e um Skimmer (Morato, Brasil) e sistema automatizado
de controle da salinidade com boia de nível. A temperatura do biotério experimental
era mantida constante por meio de ar condicionado de 30.000 btus
O aquário foi devidamente submetido a um sistema de aeração por meio de
uma bomba submersa (400/1080 L h-1) para o fornecimento de fluxo contínuo e
ininterrupto de água. Além disso, o aquário contou com um sistema de iluminação
composto por uma lâmpada de halogênio 110W (Aquastar, Alemanha), duas
lâmpadas fluorescentes de 30 W para o favorecimento de comprimento de onda azul
(Marine Glo, Japão) e três lâmpadas fluorescentes de 15 W (Aquastar, Alemanha).
A água utilizada durante o preparo e durante todo período de cultivo foi
coletada próximo à Ilha de Cataguases (Figura 3), situada na Baía de Ilha Grande
(23° 1'32.71" Sul, 44°17'2.74" Oeste). Juntamente com a água, foram coletados
fragmentos de substrato rochoso contendo invertebrados, algas e microrganismos
31
associados. Durante o período de equilíbrio (dois meses), o aquário foi mantido com
fluxo contínuo e ininterrupto de água e iluminação constante.
Figura 3- Localização do ponto de coleta de água (ponto vermelho) para cultivo das esponjas em
laboratório, próxima a Ilha de Cataguases (23°1'32.71" Sul, 44°17'2.74" Oeste), situada na região sul
do estado do Rio de Janeiro.
3.1.1 Coleta e cultivo das esponjas
As esponjas Hymeniacidon heliophila utilizadas para cultivo em laboratório
foram coletadas na praia de Boa Viagem, Niterói. Em laboratório, permaneceu no
aquário de cultivo por 2 meses. Após o período de aclimatação o organismo foi
segmentado em explantes de aproximadamente 2 cm2 (cerca de 1 g de peso úmido)
e dispostos em placas de Petri (3,5 cm) para se obter um substrato para sustentação
dos explantes e para evitar o contato entre os mesmos (Figura 4). A estrutura "varal"
foi sustentada por fios de nylon para que os explantes tivessem a maior
uniformidade possível de contato com a água.
32
Figura 4- Detalhe das esponjas agregadas em placas de Petri em estrutura “varal”.
Após a montagem da estrutura "varal", os organismos foram mantidos por um
período de cinco dias no aquário de cultivo, para que os explantes recémsegmentados pudessem cicatrizar o corte e para que pudessem também ser
aclimatados nesta nova configuração (Figura 5).
Figura 5- Aquário com esponjas Hymeniacidon heliophila dispostas em “varal” para aclimatização e
cicatrização dos explantes.
33
3.1.2 Preparo do aquário para o experimento de exposição ao cádmio
Neste experimento foram utilizados quatro aquários com 74,5 litros de água
cada um e foram designados como "controle" e "expostos". Nos aquários expostos,
concentrações de cádmio de 0,05; 0,4 e 4 mg L-1, preparadas a partir de uma
solução padrão de 1000 mg L- (CertiPrep SPEX, Metuchen, USA) foram mantidas.
No aquário controle, a concentração de Cd foi <0,01 ppm. Estes valores foram
confirmados pela técnica de ICP OES.
Os tempos utilizados neste experimento foram: zero hora, 24 horas, 7 dias e
14 dias. Para cada tempo de exposição os explantes eram retirados até se obter
uma massa úmida de 0,5 gramas, onde imediatamente eram congelados (-80 °C)
para posterior liofilização.
3.2
DETERMINAÇÃO DE CÁDMIO
Para determinação do metal na esponja foi utilizada uma massa total de 150
mg de tecido liofilizado (75 mg de cada organismo) nos quais foram adicionados 5
mL de ácido nítrico concentrado. As amostras foram submetidas à digestão assistida
por meio de radiação de micro-ondas utilizando um forno. Após esta etapa e o
posterior resfriamento das amostras, o volume da solução foi completado com água
ultra pura para um volume final de 10 mL.
Para determinar a concentração de cádmio nos aquários foram coletados 50
mL de água nos aquários controle e expostos. Após a coleta, as amostras de água
foram transferidas para tubos de plástico (Falcon, Corning, EUA) no quais foram
adicionados 50 µl de ácido nítrico concentrado e as amostras foram mantidas a 4 ºC
até o momento da análise.
3.2.1 Preparo das amostras
Alíquotas de aproximadamente 0,5 g do material de referência certificado
SRM NIST 1566b (Oyster Tissue) e das amostras liofilizadas de esponjas foram
tratadas em forno de microondas pressurizado com 5,0 mL de HNO3 concentrado,
por 10 minutos, de acordo com o programa de temperatura pré-estabelecido pelo
34
método US EPA 3051A (5,5 min para a temperatura atingir 175 ºC seguido de mais
4,5 min em 175 ºC). Antes da realização do procedimento de digestão, as amostras
foram mantidas imersas no volume de HNO 3 "overnight", a fim de eliminar parte da
matéria orgânica e consequentemente minimizar os riscos de perdas e explosão.
Para a digestão das amostras empregou-se um forno de microondas marca
Provecto Analítica, modelo DGT 100 - Plus (Jundiaí, São Paulo, Brasil). Após
resfriamento, o volume da solução foi completado a 10 mL com água ultra pura
obtida de um sistema Elga modelo PURELAB Ultra Analytic (Elga, High Wycombe,
Bucks, UK) e a mistura resultante foi então centrifugada.
Os metais determinados foram Zn, Cu, Ni e Cd.
Zinco e cobre foram
determinados através da técnica de espectrometria de emissão óptica com fonte de
plasma indutivamente acoplado (ICP OES). Enquanto níquel e cádmio, como não
foram detectados pela técnica anterior, foram determinados pela técnica de
espectrometria de massa com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS),
cuja sensibilidade é maior. Em ambas as análises, foram utilizadas o material de
referência certificado SRM NIST 1566b (Oyster Tissue) para controle de qualidade.
3.2.2 Determinação do cádmio e níquel pela técnica de espectrometria de
massa com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP-MS)
Para a determinação das concentrações dos metais Cd e Ni nos extratos de
amostras liofilizadas de esponjas, utilizou-se um ICP-MS, marca Thermo Fischer
Scientific (Bremen, Alemanha), modelo X Series II, equipado com câmara de
nebulização ciclônica, nebulizador do tipo Meinhard, Peltier e software operacional
PlasmaLab. As condições de operação do equipamento foram: 1400 W de potência
incidente, 13 L min-1 de vazão de gás no plasma, 0,7 L min -1 de vazão de gás
auxiliar, 0,14 L min-1 de vazão de gás adicional, 0,90 L min -1 de vazão de
nebulização, dwell time de 10 ms e 1 canal por unidade de massa; vazão de
aquisição da amostra de 0,90 mL min-1. Os elementos foram determinados na forma
dos isótopos
60
Ni e
111
Cd. Para correção de interferências de transporte na
introdução da amostra e de ionização, foi realizada a padronização interna com a
adição e monitoramento dos isótopos
45
Sc,
72
Ge,
103
Rh e
205
Tl, todos na
concentração final de 50 μg L-1. Devido à acidez dos extratos, foi necessária a
35
diluição dos mesmos nas proporções de 1:5 v/v, realizada com água ultra pura
obtida de um sistema Elga modelo PURELAB Ultra Analytic (Elga, High Wycombe,
Bucks, UK).
3.2.3 Determinação do cobre e zinco pela técnica de espectrometria de
emissão óptica com fonte de plasma indutivamente acoplado (ICP OES)
Para a determinação de Cu e Zn nas amostras liofilizadas de esponjas,
utilizou-se um ICP OES, marca Perkin Elmer (EUA), modelo 7000 DV (Dual View)
equipado com câmara de nebulização ciclônica, nebulizador do tipo MiraMist
(Burgener Research Inc., Ontário, Canadá), amostrador automático, modelo AS 421,
e software operacional Analyst 5.4. As condições de operação do equipamento
foram: 1300 W de potência incidente, 15 L min -1 de vazão de gás no plasma, 0,2 L
min-1 de vazão de gás auxiliar, 0,80 L min-1 de vazão de nebulização.
3.3
ANÁLISES HISTOLÓGICAS
Para análise histológica, após cada tempo de exposição um fragmento do
explante foi imediatamente colocado em tubos de 50 mL (Falcon, Corning, EUA)
contendo 40 mL de solução fixadora de Bouin, que tem como função manter a
integridade do tecido, preservando suas estruturas celulares, o enrijecimento das
células e, ainda, pode aumentar a afinidade do material pelos corantes citológicos.
Após um período de fixação de 6 horas, o fragmento foi retirado da solução
fixadora e colocado em 40 mL de etanol 70%. A solução foi trocada a cada 30
minutos até não ser mais observada a presença de cor amarelada, indicativa da
presença da solução fixadora. Após essa lavagem, o fragmento foi colocado em um
cassete histológico no qual foi desidratado em uma série alcoólica de concentração
crescente (80%, 90%, 100%) em banhos de 30 minutos. Quando completamente
desidratado, o material foi submetido a dois banhos de 30 minutos em xilol e a dois
banhos de 30 minutos em parafina. Após o segundo banho em parafina o fragmento
foi emblocado.
36
Os blocos de parafina contendo o material foram cortados em micrótomo RM
21-55 (Leica, Alemanha) com uma espessura de 7 µm e colocados em lâminas
histológicas de vidro.
As lâminas, antes de serem coradas, foram colocadas em estufa a 60°C para
derretimento da parafina por, pelo menos, 30 minutos. As lâminas seguiram para
uma bateria que consistia em três banhos seguidos de 5 minutos em xilol e três
banhos de 5 minutos em uma série alcoólica decrescente (100%, 90%, 70%). Ao
final da bateria as lâminas foram imersas em água destilada e foram coradas pelas
técnicas de coloração por hematoxilina-eosina (HE) ou picro sirius.
3.3.1 Coloração por hematoxilina e eosina (HE)
As lâminas foram colocadas por 5 minutos na solução de hematoxilina de
Harris e lavadas por 5 minutos em água corrente. Após a lavagem, foram colocadas
por 1 minutos na solução de eosina e mais 3 segundos em água corrente. Em
seguida, foram submetidas a uma bateria de desidratação com banhos de 5 minutos
em concentração alcoólica crescente (95%, 100%) e em xilol por três vezes. As
lâminas eram então montadas em entellan (Merck, Alemanha) e guardadas para
posterior análise.
3.3.2 Coloração por picro Sirius
O protocolo utilizado para coloração de fibras de colágeno foi baseado na
modificação descrita por Dolber e Spach (1993). As lâminas foram colocadas por 2
minutos em uma solução de ácido fosfomolíbdico e em seguida na solução de picro
sirius por 90 minutos, abrigadas da luz. As lâminas foram então colocadas em ácido
clorídrico 0,01 mol L-1 por 1 minuto e em álcool 70% por 45 segundos. Foi realizada
uma bateria de desidratação com banhos de 5 minutos em concentração alcoólica
crescente (95%, 100%) por duas vezes e em xilol por três vezes. As lâminas foram
montadas em entellan (Merck, Alemanha) e guardadas para posterior análise.
37
3.3.3 Análise de câmaras coanocitárias e canais aquíferos
As lâminas coradas por HE foram usadas para quantificar o número de
câmaras coanocitárias e canais aquíferos por corte histológico registrado em
aumento de 200 vezes. As lâminas foram observadas em microscópio óptico de
campo claro (Eclipse E400, Nikon, Japão) equipado com sistema de captura digital
(Evolution VF, Media Cybernetics, EUA). De cada corte foram retiradas quantidades
de fotos suficientes para cobrir toda a área do corte histológico. Essas fotos foram
então unidas por meio da opção Photomerge do programa Photoshop versão CS5.
Obtida a imagem do corte inteiro, as câmaras coanocitárias e canais aquíferos em
cada corte histológico foram então individualmente contadas usando a ferramenta
cell counter do programa ImageJ. Os números obtidos foram corrigidos para
determinar a quantidade por pixels.
3.3.4 Presença de matriz extracelular (colágeno)
As lâminas coradas por picro sirius foram usadas para quantificar a
abundância de fibras colágenas por campo histológico registrado. As lâminas foram
observadas em microscópio de fluorescência (Axioplan, Zeiss, Alemanha) em
comprimento de onda correspondente a rodamina (cor vermelha, filtro Schott-Zeiss,
Alemanha) nas quais, nessas condições, as fibras colágenas marcadas apresentam
fluorescência vermelha.
Para cada situação experimental foram utilizados três cortes histológicos onde
foram capturadas 30 imagens digitalmente (Axiocam, Zeiss, Alemanha) por corte
com aumento de 400 vezes e processadas pelo programa ImageJ (RASBAND,
1997) utilizando-se a metodologia descrita por Rangan e Tesch (2007). Inicialmente,
as imagens foram convertidas para 8 bits e em seguida o threshold foi ajustado para
selecionar somente as fibras colágenas marcadas, na qual a área relativa das fibras
de colágeno era calculada pelo próprio programa.
38
3.4
ANÁLISE PROTEICA
3.4.1 Extração de proteínas semelhantes a metalotioneínas
Após a realização do experimento de exposição ao Cd, os pedaços
congelados (-80 °C) dos explantes foram liofilizados (Liotop, Brasil) por um período
de 12 horas a -57 ºC.
Para a extração das proteínas foram utilizados 50 mg de massa seca, onde
foram homogeneizados na proporção 1:3 (m/v) com tampão de extração (1500μl),
com auxílio de um micromisturador com ponta de aço inoxidável.
O tampão utilizado para a extração das proteínas foi composto por 10 mmol L1
Tris-HCl pH 9,0; 5 mM de β-mercaptoetanol; 0,5 mmol L-1
de fluoreto de
fenilmetanosulfonila (PMSF).
Depois de homogeneizado, o material foi centrifugado a 20.000 g por 30
minutos a 4 ºC, para a obtenção da fração citosólica. Em seguida, o sobrenadante
da amostra foi aquecido a 70 ºC por 15 minutos (ERK et al., 2002). Este
procedimento de desnaturação térmica consiste em eliminar proteínas termolábeis,
mantendo em solução as proteínas termoestáveis.
Após o aquecimento as amostras foram centrifugadas a 20.000 g por 20
minutos a 4ºC. Em seguida, o sobrenadante (fração de 550 µl) foi tratado com etanol
absoluto -20ºC na proporção 1:3 (v/v). No próximo passo, as amostras foram
deixadas por uma hora a -20ºC. Após este período foram centrifugadas pela última
vez a 20.000 g por 10 minutos, obtendo um pellet final.
3.4.2 Preparo de amostras para a separação por eletroforese desnaturante em
gel de poliacrilamida
Os pellets obtidos após a última centrifugação foram deixados por 5 minutos
em temperatura, para evaporação do etanol. Em seguida, foram ressuspensos em
150 µl de tampão Tris-HCl 10 mmol L-1 (pH= 9,0). Desse total, 100 µl foram
destinados a dosagem de proteínas totais e os 50 µL restantes foram destinados a
eletroforese. As alíquotas destinadas à eletroforese (50 µl) foram submetidas a
39
derivatização com a adição de 3 µL de monobromobimano (mBBr) 92 mmol L-1 e
mantidas a temperatura ambiente e protegidas da luz por 30 minutos. O mBBr é um
reagente fluorescente com alta afinidade pelos radicais tióis (abundante nas
cisteínas) e a derivatização foi seguida de acordo com o protocolo “MT PAGE
Tissue”
da
Ikzus
Environment
(http://www.ikzus.it),
seguido
de
algumas
modificações.
3.4.3 Dosagem de proteínas totais
A alíquota de 100 μl destinada para a dosagem de proteínas totais foi utilizado
o método de Bradford (1976), tendo como padrão a albumina de soro bovino (BSA)
0,1% (BioAgency). As absorbâncias dos padrões e das amostras foram medidas a
595 nm em um espectrofotômetro (Femto 700 plµs). Conhecida a quantidade de
proteínas totais nas alíquotas, os volumes eram padronizados para que se inserisse
em cada poço do gel de eletroforese, 5 μg de proteínas totais.
3.4.4 Separação de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDSPAGE)
As amostras derivatizadas com mBBr foram submetidas à eletroforese em gel
de poliacrilamida na presença de agentes desnaturantes (SDS) conforme descrito
por LaemmLi (1970). Esta técnica separa as proteínas com base na sua massa
molecular, migrando através do gel, sob a influência de um determinado campo
elétrico. A migração das proteínas se dá devido a presença de carga negativa que
as proteínas adiquirem após a adição de SDS.
A separação eletroforética foi realizada em um sistema vertical de eletroforese
BioRad- TetraCell (Figura 6). O gel separador foi preparado em concentração de
15% de acrilamida, utilizando tampão tris-HCl (1,5 mol L-1) em pH 8,8 na presença
de SDS. Os catalisadores de polimerização do gel: TEMED e PSA 10% foram
adicionados à solução depois desta ter sido desareada por 15 minutos a vácuo.
Após a polimerização do gel separador, foi adicionado o gel de empilhamento
preparado em concentração de 4% de acrilamida, utilizando tampão tris-HCl (0,5 mol
40
L-1) em pH 6,8, que também foi desareado por 15 minutos a vácuo antes da adição
dos catalisadores. A separação por eletroforese foi realizada em tampão tris (250
mmol L-1) - glicina (2,5 mol L-1) - SDS 1%.
Inicialmente, foi aplicada um potencial elétrico de 100V até as amostras
alcançarem o gel separador (aproximadamente 15 minutos), passando então a ser
exercido um potencial elétrico de 120V por um período de 70 minutos.
Figura 6- Representação esquemática do sistema vertical de eletroforese SDS-PAGE.
3.4.5 Digitalização das imagens dos géis e análise densitométrica das bandas
derivatizadas com monobromobimano
Após a separação eletroforética das proteínas derivatizadas com mBBr os
géis foram colocados em um Trasiluminador U.V acoplado a um sistema de
captação de imagem digital (BioAgency EasyDoc 100, Brasil). Feito o registro da
imagem, os géis foram fixados em uma solução contendo etanol absoluto, ácido
acético glacial e água ultra-pura (40:10:50) por 30 minutos. Após a fixação, os géis
foram corados com uma solução contendo Comassie Brilliant Blue R-250 (0,25%)
por 24 horas. O excesso do corante foi retirado com a mesma solução utilizada para
fixar os géis por aproximadamente 20 minutos. Os géis com as bandas protéicas
41
coradas foram fotografados no mesmo sistema de fotodocumentação em câmara
clara.
Para a determinação da intensidade das proteínas induzidas foi utilizado o
programa Imaje J (RASBAND, 1997) na qual foi realizada a análise densitométrica
das imagens obtidas.
42
50 mg de amostra de esponja
Homogeneização com 3V de tampão de amostra: 10 mmol L-1 Tris-HCl pH 9,0; 5
-1
mmol L de β-mercaptoetanol; 0,5 mmol L
-1
de PMSF
Centrifugação a 21000g por 30’ a 4°C
550 μl de sobrenadante aquecido a
70°C por 15’
Centrifugação a 16000g por 20’ a 4°C
Adição de 3V de etanol absoluto (20°C)
1 hora no freezer a
-20°C
Centrifugação a 16000g por 10’ a 4°C
Descarte do sobrenadante e ressuspensão do pellet com
150 μl de tampão de extração
100 μl da
3 μl de mBBr adicionados a 50 μl de amostra. Repouso
amostra
por 30’ no escuro a temperatura ambiente
destinados a
dosagem de
proteínas
Adição de 1V de tampão de amostra
totais
SDS-Page e análise em transiluminador U.V. para
identificação das MTLPs
Figura 7- Diagrama esquemático do protocolo de extração.
43
3.5
ESTUDO NA PRAIA DA BOA VIAGEM
As cinco coletas na praia da Boa Viagem (figura 7) foram realizadas
respectivamente
nas seguintes
datas: 03/08/2011,
31/08/2011,
19/10/2011,
30/01/2012 e 23/03/12. As coletas foram realizadas em três pontos distintos
indicados na figura 8. As esponjas eram retiradas manualmente e levadas ao
laboratório para limpeza e pesagem. Para verificação de MTLPs, foram utilizadas 0,5
g de massa úmida.
Para determinação de metais, foram utilizadas 0,5 g de massa seca. A
digestão das amostras seguiu o mesmo processo já descrito para esponjas
cultivadas em laboratório. Como já relatado, Zn e Cu foram determinados por ICP
OES e Cd e Ni, por ICP-MS.
Figura 8- Localização da praia da Boa Viagem situada na Baía de Guanabara, Niterói.
Fonte: Imagem Google Earth 6.0.
44
Figura 9- Localização dos pontos de coleta na praia da Boa Viagem.
Fonte: Imagem Google Earth 6.0.
45
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1
EXPERIMENTO DE EXPOSIÇÃO AO CÁDMIO
4.1.1 Bioacumulação de cádmio na esponja
A concentração de cádmio na esponja Hymeniacidon heliophila foi verificada
nos diferentes tempos de exposição e concentração deste elemento (Figura 9). Na
situação controle houve uma variação de 2,7 mg kg-1 no tempo zero a 11 mg kg-1 em
24 horas. Nos períodos seguintes, 7 e 14 dias, foram encontrados 6,6 e 8,0 mg kg-1,
respectivamente, de Cd no tecido da esponja. Este aumento da concentração de Cd
ao longo do experimento, em relação ao tempo zero, indica uma alta capacidade de
bioacmululação deste metal, mesmo havendo baixa concentração inicial na água do
aquário controle (<0,001 mg L-1).
Com 0,05 mg L-1
de Cd na água, em 24 horas de exposição foram
encontrados 6,9 mg kg-1 de Cd no tecido da esponja. Em 7 dias este valor se
manteve. Porém, em 14 dias houve um aumento de 48% na concentração de Cd no
tecido, chegando a 13 mg kg-1.
No aquário contendo 0,4 mg L-1 de Cd na água, nas esponjas expostas por
24 horas foram encontrados 6,9 mg kg-1 de Cd. Após 7 dias esta concentração
chegou a 24 mg kg-1, um aumento de 248%. Já em 14 dias, houve concentração de
48 mg kg-1 de Cd, 100% a mais que no período anterior.
No aquário com a maior quantidade de Cd (4 mg L-1) em 24 horas de
exposição foram encontrados 34 mg kg-1 de Cd no tecido de Hymeniacidon
heliophila. Em seguida, após o período de 7 dias, foram encontrados 78 mg kg-1,
representando um aumento de 129%. Aos 14 dias, houve um aumento de 46%,
chegando a 114 mg kg-1 de Cd no tecido da esponja. Na figura 10 estão presentes
as concentrações de Cd por tempo e concentração de Cd no tecido das esponjas e
a figura 11 indica as tendências de bioacumulação de Cd para os períodos de
exposição.
46
Cd (mg/kg) peso seco
120
100
80
controle
60
0,05 ppm
0,4 ppm
40
4,0 ppm
20
0
Tempo 0
24 horas
7 dias
14 dias
Figura 10- Concentração de cádmio em Hymeniacidon heliophila nos tempos zero, 24 horas, 7 e 14
dias à exposição a 0,05, 0,4 e 4 mg L-1 de Cd e controle.
Cd (mg/kg) peso seco
140
120
R² = 0,9867
100
7 dias
80
R² = 0,9406
14 dias
R² = 0,883
Exponencial (24
horas)
Potência (7 dias)
60
40
20
0
0,01
24 horas
0,1
1
10
Potência (14 dias)
Log concentração de Cd na água
Figura 11- Relação entre a concentração de Cd presente na água com o encontrado no tecido de H.
heliophila. Cada curva representa a tendência para cada tempo de exposição com seus coeficientes.
Como observado, a esponja Hymeniacidon heliophila apresentou uma
elevada capacidade em acumular cádmio em seu tecido durante o experimento em
laboratório. Outros autores também verificaram, em esponjas, a capacidade de
acumular cádmio em experimentos de exposição, como indicado a seguir.
Hansen et al. (1995) verificaram concentração de 985 mg kg-1 de cádmio após
expor a esponja Halichondria panicea a 1 mg L-1 deste metal por 14 dias,
aproximadamente 9 vezes a mais do que o encontrado em nosso trabalho, mesmo
com uma concentração 5 vezes menor de Cd na água.
47
Schröder et al. (1999), ao exporem a esponja Suberites domuncula a
concentração de 1 mg L-1 de Cd por 6 dias, verificaram concentração de 9 mg kg-1
deste elemento no tecido da esponja. No presente trabalho, no sétimo dia de
exposição, a concentração de Cd em H. heliophila foi de 24 e 78 mg kg-1 à exposição
a 0,4 e 4 mg L-1 de cádmio, respectivamente. Estes valores são aproximadamente 3
e 9 vezes maiores do que foi encontrado por Schöder et al. (1999). Já Wanick
(2012), em Haliclona sp, encontrou 9,13 mg kg-1 de Cd ao expô-la a 0,5 mg L-1
deste metal durante 14 dias. Neste mesmo período de tempo, a H. heliophila
exposta a 0,4 mg L-1 de Cd apresentou 48 mg kg-1 de Cd em seu tecido; cerca de 5
vezes o encontrado em Haliclona sp.
A diferença entre espécies de esponjas quanto à capacidade de acumular
cádmio e outros metais - como observado entre o presente trabalho e os citados
acima - é amplamente documentada na literatura (BOWEN; SUTTON, 1951; PATEL
et al., 1985; PÉREZ et al., 2004; CEBRIAN et al., 2007; RAO et al., 2009; PAN et al.,
2011).
Genta-Jouve et al. (2012) expuseram seis diferentes espécies de esponjas
(Agelas oroides, Chondrosia reniformis, Ircinia variabilis,
Acanthella acuta,
Cymbaxinella damicornis, Cymbaxinella verrucosa) a diferentes radioisótopos, entre
os quais o
109
Cd, e verificaram diferentes fatores de enriquecimento entre as
espécies. Segundo os autores, estes valores representam a eficiência do organismo
em acumular e concentrar um elemento presente na água depois de um
determinado tempo de exposição. Após 170 horas de exposição aos diferentes
radioisótopos, os fatores de enriquecimento variaram entre todas as espécies
conforme o elemento. Para o
109
Cd, houve uma variação de 12 a 276 entre os
fatores de enriquecimento nas seis espécies. Este resultado, como o de outros
trabalhos já citados, pode estar relacionado às distintas capacidades de
bombeamento e filtragem de água pelas esponjas (CEBRIAN et al., 2007).
Outro fator que pode influenciar nesta relação é a associação com os
microrganismos. Como bem documentado, as esponjas podem se associar a
diversos
organismos
simbiontes
sendo
em
alguns
casos
associações
interespecíficas (HENTSCHEL et al., 2012). Estes microrganismos podem
desempenhar um importante papel nos processos de bioacumulação, podendo
48
assim influenciar nas diferenças interespecíficas quanto à capacidade de acumular
metais (GADD, 1990; SELVIN et al., 2009; ERWIN et al., 2011).
4.1.2 Verificação da indução de MTLPs
A separação proteica, através da eletroforese em gel de poliacrilamida,
revelou a indução de proteínas termoestáveis e ricas em cisteínas na faixa de 28,5 a
37,6 kDa, após os períodos de exposição ao Cd (figura 12). Nas situações 24 horas
e 7 dias a 0,4 mg L-1
de Cd houve significativo aumento na intensidade de
fluorescência em uma banda não presente na situação controle (figura 12; gel 1C e
gel 2C, respectivamente). Esta fluorescência, embora menor, também é possível
observar na situação 24 horas à exposição a 4 mg L-1 de Cd (figura 12; gel 1D). Em
relação ao período de 14 dias de exposição, não houve indução de proteínas na
faixa encontrada nos períodos anteriores (figura 12; gel 3). Já nas esponjas
provenientes do aquário de cultivo, nenhuma banda apareceu na faixa de 28,5 a
37,6 kDa como encontrado nas condições controle e de exposição ao Cd (figura 12;
gel 2 e gel 3).
49
Figura 12- Fotografias de géis com proteínas extraídas de amostras de Hymeniacidon heliophila
expostas ao Cd por três períodos: 24 horas (gel 1), 7 dias (gel 2) e 14 dias (gel 3). As raias que
indicam 0,2, 0,6 e 1,0 µg correspondem aos padrões de MT aplicados em cada gel. As raias indicam
as amostras de esponjas submetidas a controle (A), 0,05 (B), 0,4 (C) e 4 mg L-1 de Cd (D). Em
destaque nos géis, a faixa onde houve indução de proteínas que não no controle. No gel 2 e 3, tempo
zero indica amostras das esponjas provenientes do aquário de cultivo.
A figura 13 apresenta uma estimativa da intensidade de fluorescência das
bandas onde houve indução de proteínas na faixa de 28,5 a 37,6 kDa,
principalmente nos tempos de 24 horas e 7 dias em exposição a 0,4 mg L-1 de Cd.
50
Densidade integrada (Pixels)
2500000
2000000
1500000
24 horas
1000000
7 dias
14 dias
500000
0
controle
0,05 ppm
0,4 ppm
4 ppm
Concentração de Cd
Figura 13- Verificação da Intensidade da fluorescência das bandas na faixa de 28,5 a 37,6 kDa onde
houve indução de proteínas que não na situação controle. Cada ponto indica a média (n=4 e barra de
erro é igual ao desvio padrão).
Em relação ao processo de extração de MTLPs seguido de separação
proteica por eletroforese em gel de poliacrilamida em Hymeniacidon heliophila
provenientes da praia da Boa Viagem, não houve indução de proteínas na faixa de
28,5 a 37,6 kDa, como ocorrera nas esponjas submetidas ao experimento de
incubação e exposição ao Cd, tendo apenas como exceção as esponjas do ponto 3
na coleta 1 (figura 14).
51
Figura 14- Fotografias de géis com proteínas de amostras de Hymeniacidon heliophila nativas da
praia da Boa Viagem. As raias que indicam 0,2; 0,6 e 1,0 µg correspondem aos padrões de MT
aplicados em cada gel. O gel 5B é o mesmo que o gel 5, porém corado com comassie blue que
apresenta os seguintes marcadores de massa molecular: lisozima (14 kDa), mioglobina (18,4 kDa),
anidrase carbônica (28,5 kDa), álcool desidrogenase (37,6 kDa), albumina de soro bovino (66,2 kDa).
As chaves indicam a faixa de 28,5 a 37,6 kDa.
Como observado na figura 12, a massa das MTLPs encontradas em H.
heliophila não corresponde com a verificada no padrão de matalotioneína utilizado
(14 kDa). Porém, diferenças entre massas moleculares de MTLPS induzidas pelo
cádmio já foram reportadas por diversos autores (VIARENGO et al., 1997;
SCHMITT-WREDE et al., 2004; DONDERO et al., 2004; ERK et al., 2005).
Viarengo et al. (1997), por exemplo, constataram MTLPs na faixa de 7 a 25
kDa no mexilhão Mytilus galloprovincialis. Já Schmitt-Wrede et al. (2004)
encontraram na oligoqueta Enchytraeus buchholzi proteínas induzidas por cádmio
com massa molecular de 25 kDa, diferente do seu padrão comercial utilizado cuja
massa molecular foi de aproximadamente 12,5 kDa. Dondero et al. (2004)
52
verificaram indução de MTLPs em duas faixas de massa moleculares, 15,6 e 23,6
kDa, após a exposição do protozoário Tetrahymena thermophila a períodos de 1, 6 e
24 horas a 20 µmol L-1 de Cd2+. Erk et al. (2005) encontraram em tecidos de três
invertebrados marinhos (mexilhão: Mytilus edulis , tunicato: Ciona intestinalis e
estrela do mar: Asterias rubens) MTs com massas moleculares correspondentes a 6
e 18 kDa.
Em esponjas, a indução de proteínas semelhantes a metalotioneínas com
diferentes massas também já foram documentadas na literatura. Berthet et al. (2005)
em um estudo de campo utilizando a esponja Spongia officinalis encontraram
MTLPs com massa molecular de 6 e 15 kDa, atribuídas pelos autores como
monômeros e dímeros da metalotioneína, respectivamente. Schröder et al. (2000)
verificaram MTLPs com massa molecular de 24 kDa ao expor a esponja Suberites
domuncula a cádmio por seis dias. Já Wanick (2012) ao expor a esponja Haliclona
sp. a 0,5 mg L-1 de cádmio por 326 horas observou indução de proteínas ricas em
cisteínas na faixa de 21-29 kDa.
Segundo Vergani et al. (2005), apesar das MTLPs ou MTs possuírem
características comuns, sua conformação espacial e propriedades funcionais podem
variar entre os organismos. Estes autores chegaram a esta conclusão após
compararem as MTs do peixe Oncorhyncus mykiss com as MTs do mexilhão Mytilus
galloprovincialis; e que cita algumas diferenças: tamanho, estabilidade térmica e
capacidade de sequestro de metais tóxicos, todas maiores nas MTs do mexilhão.
Estes autores sugerem que estas diferenças podem estar relacionadas com o modo
de vida de cada organismo: o mexilhão, por ser séssil e filtrador, está mais sujeito a
mudanças bruscas de variáveis ambientais (temperatura, anoxia, concentração de
poluentes na água), logo apresenta aumento do domínio α da MT, elevando a
capacidade no papel de desintoxicação / sequestro de metais tóxicos (por exemplo,
o cádmio), o que permitiria a sobrevivência destes organismos aquáticos em
condições adversas.
Também sendo sésseis e especializadas em alimentação por filtração, as
esponjas, assim como os mexilhões, poderiam ter desenvolvido metalotioneínas
mais especializadas na capacidade de sequestro e destoxificação de metais tóxicos.
De fato, as MTs conhecidas de metazoários são geralmente expressas
53
constitutivamente, especialmente em tecidos em crescimento e diferenciação
(BRADY et al., 1982), enquanto que as MTLPs das esponjas são expressas quando
induzidas. Schröder et al. (2000) observaram em experiências controladas em
aquários que não houve expressão do gene SDMTL (cDNA que codifica as
proteínas MTLPs na esponja Subentes domuncula) sem a presença de cádmio, no
entanto, depois de um período de incubação de um dia na presença de 200 mg L-1
de cádmio, ocorreu um grande aumento na expressão do gene SDMTL.
A exposição a 0,05 mg L-1 de cádmio parece não ter sido suficiente para
provocar indução de MTLPS durante os 14 dias de incubação. Em experimento de
exposição do bivalve Mizuhopecten yessoensis a 0,5 mg L-1 de Cd a indução de MT
foi observada apenas após 60 dias de incubação (EVTUSHENKO et al., 1986). Já
no molusco Ruditapes decussatus exposto a 0,4 mg L-1 de Cd por 30 dias, observouse aumento de duas vezes na concentração de MTs nas brânquias, porém na
glândula digestiva não foram identificadas aumentos significativos (BEBIANNO et al.,
1993). Entretanto, a indução de MTs na glândula digestiva nesta espécie de molusco
já foi demonstrada em trabalhos de transplante deste animal no mar Mediterrâneo
(HAMZA-CHAFFAI et al., 1999, 2000).
A dose de 4 mg L-1 de Cd utilizada neste trabalho corresponde a quase 740
vezes o máximo permitido pela resolução CONAMA 357 para águas salinas classe 1
(destinadas, por exemplo, à aquicultura e atividade de pesca). Em Hymeniacidon
heliophila, esta alta concentração de Cd provocou baixo aumento de MTLPs em 24
horas de exposição e, nos períodos de 7 e 14 dias, não foi observada indução de
MTLPs. De fato, em altas concentrações de Cd, pode haver danos no DNA e
redução concomitante na indução de RNAm das MTs, que é provavelmente causado
pela elevada citotoxicidade do Cd em alta disponibilidade (ROESIJADI et al., 1997).
As outras proteínas ricas em cisteínas que também surgiram na faixa mais
próxima a 37,6 kDa não indicaram indução devido à presença de cádmio, pois
aparecem também na situação controle. Entretanto, as amostras analisadas
diretamente do aquário de cultivo (denominado tempo zero) e as provenientes da
Boa Viagem não apresentaram estas proteínas. Elas poderiam ser indicadoras
(biomarcadores) de estresse, já que as esponjas foram retiradas de seus locais nos
54
quais já estavam adaptadas, mesmo sendo de um aquário para o outro. Isto será
investigado posteriormente.
Na faixa de 14 kDa também surgiram proteínas ricas em cisteínas e não
induzidas por metais e que foram observadas em todos os géis, tanto nas amostras
de aquário como nas coletadas na Boa Viagem. Proteínas com estas características
vêm sendo encontradas em organismos como vegetais, mamíferos e invertebrados.
Essas proteínas são atribuídas a diferentes funções como proteínas de defesa
contra fungos, transporte de zinco e proteínas de membrana (ZHANG et al., 1987;
HEMPE; COUSIN, 1991; TERRAS et al., 1995; TRAN et al., 2005).
Após 14 dias de exposição, não foi verificada indução de proteínas na faixa
de 28,5 a 37,6 kDa em nenhuma das concentrações de cádmio utilizadas.
Diferentemente do encontrado por Wanick (2012), que encontrou na esponja
Haliclona sp. a maior concentração de MTLPs após 14 dias de exposição a 0,5 mg
L-1 de Cd. Porém, como já observado, em H. heliophila, depois de 24 horas de
exposição a 0,4 mg L-1 de Cd, já foi possível observar indução de MTLPs, que se
manteve até os 7 dias de exposição nesta mesma concentração de Cd.
Também foi observado, após 14 dias de exposição, que proteínas da faixa
mais próxima a 37,6 kDa continuaram aparecendo nas condições controle e em 0,05
mg L-1 de Cd, mas ocorreu forte diminuição dessas nas condições de 0,4 e 4 mg L-1
de Cd. Esta situação pode estar refletindo a diminuição metabólica devido aos danos
causados pela alta concentração (0,4 e 4 mg L-1) de cádmio durante 14 dias. Apesar
disso, não foi constatada morte dos explantes como também observaram Olesen e
Weeks (1994) e Hansen et al. (1995) na esponja Halichondria panicea expostas a 1
mg L-1 de Cd por 14 dias. Importante ressaltar que a capacidade de suportar altas
concentrações de contaminantes, como o Cd, é um dos fatores que condicionam
potenciais bioindicadores, como relatado por Phillips e Rainbow (1993).
O processo de extração e identificação de MTLPs em Hymeniacidon
heliophila provenientes da praia da Boa Viagem não revelou indução de proteínas na
faixa de 28,5 a 37,6 kDa como encontrado no experimento de incubação em
aquário. Mesmos as bandas proteicas que ocorreram nas situações controle em
experimento nos aquários, não surgiram nas esponjas da Boa Viagem. Este
resultado, porém, foi semelhante às amostras provenientes do aquário de cultivo
55
(tempo zero), que também não apresentaram indução de proteínas nesta faixa.
Como já relatado, além das MTLPS, outras proteínas podem ser induzidas em
situações de estresse nas esponjas, assim, tanto as H. heliophila provenientes da
Boa Viagem como as do aquário de cultivo aparentemente não estavam em situação
que pudesse provocar a síntese dessas proteínas de estresse ricas em cisteínas
com massa molecular entre 28,5 a 37,6 kDa.
4.1.3 Análise da quantidade de câmaras coanocitárias e canais aquíferos
As imagens obtidas por meio de lâminas histológicas coradas com
hematoxilina e eosina evidenciaram alterações nas quantidades de câmaras
coanocitárias e canais aquíferos em Hymeniacidon heliophila conforme o tempo de
exposição e concentração de Cd presente nos aquários. A figura 15 mostra as
estruturas
que
foram
contadas
em
cada
corte
histológico
corado
com
hematoxilina/eosina.
Figura 15- Imagem de corte histológico de Hymeniacidon heliophila proveniente do aquário-mãe
(tempo zero) corada por hematoxilina e eosina. CC= Câmara coanocitária; CA= Canal aquífero.
Aumento de 200x.
Na figura 16, observa-se na situação controle, após 24 horas, um aumento na
quantidade de câmaras coanocitárias das esponjas controle. Passados 7 dias,
houve uma queda brusca (cerca de 40%), mas a quantidade de câmaras se
manteve, até 14 dias. Já nas situações de exposição ao Cd, houve quedas mais
acentuadas (cerca de 65%) na quantidade de câmaras, quando expostas a 0,4 e 4
56
mg L-1 de Cd na água e um pouco menor com 0,05 mg L-1 (55%). No período
seguinte, 7 dias, ocorreu aumento na quantidade das câmaras, que se manteve nas
esponjas expostas a 0,05 e 0,4 mg L-1 de Cd até o período de 14 dias, mas não na
situação de exposição a 4 mg L-1 de Cd, onde também houve uma nova redução de
Câmaras coanocitárias/pixels *
10 -3
55% de câmaras coanocitárias.
6,0
5,0
4,0
Controle
3,0
0,05 ppm
2,0
0,4 ppm
1,0
4 ppm
0,0
Tempo 0'
1 dia
7 dias
14 dias
Tempo
Figura 16- Variação da quantidade de câmaras coanocitárias em Hymeniacidon heliophila nos
diferentes tempos de exposição e concentração de Cd. Cada ponto indica a quantidade absoluta de
câmaras coanocitárias em um corte histológico inteiro pela área deste.
Na figura 17, observa-se uma tendência de queda na quantidade de canais
aquíferos até os 7 dias do experimento, tanto nas condições controle quanto nas de
exposição a Cd. Porém, até o período de 14 dias houve uma divergência. As
condições controle e exposição a 0,05 mg L-1 de Cd apresentaram aumento,
enquanto que em 0,4 e 4 mg L-1 de Cd, as quedas mantiveram-se.
57
Canais aquíferos/pixel 10-3
1,4
1,2
1,0
0,8
Controle
0,6
0,05 ppm
0,4
0,4 ppm
0,2
4 ppm
0,0
Tempo 0'
1 dia
7 dias
14 dias
Tempo
Figura 17- Variação da quantidade de canais aquíferos em Hymeniacidon heliophila nos diferentes
tempos de exposição e concentração de Cd. Cada ponto indica a quantidade absoluta de canais
aquíferos em um corte histológico inteiro dividido pela área deste.
A relação entre a concentração do Cd no tecido de H. heliophila e a
quantidade de câmaras coanocitárias/pixels*10-3 e canais aquíferos/pixel*10-3 nos
diferentes períodos de exposição estão apresentadas respectivamente na figura 18
e 19. Em ambas as relações, houve maior tendência de correlação nos períodos de
Câmaras coanocitárias/pixel
*10 -3
14 dias de exposição.
6
5
1 dia
4
7 dias
3
2
R² = 0,8181
14 dias
1
0
0
50
Cd (mg/kg)
100
150
Figura 18- Relação entre concentração de Cd no tecido com quantidade de câmaras coanocitárias
em H. heliophila em cada período de exposição. A curva e o coeficiente representam função
logarítmica de redução das câmaras coanocitárias no período de 14 dias de exposição ao Cd, onde
ocorreu maior tendência de correlação.
Canais aquíferos/pixel 10-3
58
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1 dia
7 dias
R² = 0,6883
0
50
Cd (mg/kg)
100
14 dias
150
Figura 19- Relação entre concentração de Cd no tecido com quantidade de canais aquíferos em H.
heliophila em cada período de exposição. A curva e o coeficiente representam função logarítmica de
redução das câmaras coanocitárias em 14 dias de exposição ao Cd.
A figura 20 apresenta relação entre a variação da quantidade de canais
aquíferos e câmaras coanocitárias ao longo do experimento, onde não houve
Canal aquífero/pixel *10-3
correlação entre as duas estruturas.
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1 dia
7 dias
14 dias
0
2
4
Câmaras coanocitárias/pixel *
6
10-3
Figura 20- Relação entre Câmaras coanocitárias/pixel*10-3 e quantidade de canal aquífero/pixel*10-3
em H. heliophila.
A capacidade de bombeamento e filtragem de água está diretamente ligada à
quantidade de câmaras coanocitárias e canais do sistema aquífero presentes na
esponja. Embora estes organismos não possuam sistema nervoso verdadeiro,
apresentam a capacidade de produzir comportamentos reflexos não neurais
(MEECH, 2008). É conhecido que em situações de estresse ocorre a contração de
seus tecidos e canais do sistema aquífero, o que reduz a área da esponja em
59
contato
com a
água
circundante
proporcionando
uma
defesa
contra os
contaminantes presentes na água (FRANCIS et al., 1990).
Mesmo na condição controle, foi observada diminuição das câmaras
coanocitárias e canais aquíferos. Esta situação foi observada por Luter et al. (2012)
em explantes de esponja Lanthella basta, que apresentou avançada condição de
estresse (perda do volume de tecido e câmaras coanocitárias) causado, segundo os
autores, pela exposição ao ar durante a coleta, manuseio, transporte ao laboratório e
mudança na qualidade da água (água do mar para água do aquário).
Na exposição à mais elevada concentração de Cd (4 mg L-1) a H. heliophila
apresentou sucessiva regressão de canais aquíferos até os 14 dias. Porém, no
controle e exposição a 0,05 mg L-1 de Cd a partir do sétimo dia de incubação,
ocorreu aumento da quantidade de canais, o que reflete uma possível recuperação
da esponja para as situações de menor estresse. Já para a quantidade câmaras
coanocitárias, houve uma tendência de estabilização, exceto na condição de
exposição a 4 mg L-1 de Cd, onde a tendência de redução foi até o fim do
experimento, demonstrando o forte estresse causado por esta alta concentração de
Cd.
Assim, a baixa correlação entre a variação das quantidades de câmaras
coanocitárias e canais aquíferos pode estar relacionado ao fato das esponjas
primeiramente apresentar regressão tecidual, logo a diminuição na quantidade de
canais aquíferos e, em seguida, devido a manutenção da condição de estresse, a
esponja começa a perder as câmaras coanocitárias, fator conhecido dos poríferos
(De GOEIJ et al., 2009). Analisando as figuras 16 e 17 este fato é corroborado, onde
observa-se que, nas esponjas controle, há primeiramente perda de canais aquíferos
e, posteriormente, de câmaras coanocitárias. Já nas esponjas expostas a Cd, a
perda de ambas as estruturas é simultânea, porém os canais aquíferos iniciam
recuperação mais rapidamente.
4.2
ANÁLISE DA MATRIZ EXTRACELULAR (COLÁGENO)
Imagens obtidas por meio de lâminas histológicas coradas com picro sirius
também evidenciaram alterações na estrutura multicelular de Hymeniacidon
60
heliophila, conforme o tempo e concentração de Cd na água. A figura 21 exemplifica
a diferença quanto a quantidade de fibras colágenas de esponja proveniente do
aquário de cultivo (figura 20A) e de exposta a 4 mg L-1 de Cd por 14 dias (figura
20B).
Figura 21- Imagem de corte histológico de Hymeniacidon heliophila proveniente do aquário de cultivo
(A) e de 14 dias de exposição a 4 mg L-1 de Cd (B). As setas indicam as fibras colágenas. Aumento
de 400x.
A quantificação das fibras de colágeno nas esponjas revelou uma diminuição
acentuada destas após 24 horas de incubação, principalmente na situação de 4 mg
L-1 de Cd na água. Em seguida, as esponjas expostas a 0,4 e 4 mg L-1 de Cd
mantiveram tendência de estabilização, por conseguinte, as esponjas controle e
expostas a 0,05 mg L-1 a partir do sétimo dia, apresentaram tendência de aumento,
principalmente o controle (figura 22). A diminuição de colágeno conforme a
concentração de cádmio no tecido da esponja apresentou tendência maior de
correlação no período de 14 dias de exposição (figura 23).
Colágeno (%)
61
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Controle
0,05
0,4
4
Tempo 0'
24h
7 dias
14 dias
Colágeno (%)
Figura 22- Variação das fibras colágenas em Hymeniacidon heliophila medida em % da área total
dos corte histológicos em cada situação de tempo e exposição ao Cd. Cada ponto indica a média
(n=120 e barra de erro é igual ao desvio padrão).
16
14
12
10
8
6
4
2
0
1 dia
7 dias
14 dias
R² = 0,7608
0
50
Cd (mg/kg)
100
150
Figura 23- Relação entre concentração de Cd no tecido com quantidade de colágeno em H.
heliophila em cada período de exposição. As curvas e os coeficientes representam função logarítmica
de redução de colágeno no período de 14 dias.
A relação entre a quantidade de colágeno e câmaras coanocitárias (figura 24)
e canal aquífero (figura 25) em H. heliophila apresentaram função logarítmica com
maior tendência de correlação após 14 dias de exposição ao Cd na primeira e fraca
correlação no segundo caso.
Câmaras coanocitárias/
*10-3
62
6
5
4
3
2
1
0
1 dia
7 dias
R² = 0,7685
0
5
10
14 dias
15
Colágeno (%)
Canal aquífero/pixel *10-3
Figura 24- Relação entre colágeno e quantidade de câmaras coanocitárias em H. heliophila. A curva
e o coeficiente representam a função logarítmica do período de 14 dias de exposição ao Cd, onde
ocorreu a maior tendência de correlação.
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1 dia
7 dias
14 dias
0
5
10
15
Colágeno (%)
Figura 25- Relação entre colágeno (%) e quantidade de canal aquífero/pixel*10 -3 em H. heliophila.
Segundo Cebrian et al. (2006), o aumento da presença de colágeno na matriz
extra celular é considerado como evidência de crescimento nas esponjas. Foi
observada em todas as condições forte diminuição das fibras de colágeno em todas
as condições após um dia de incubação. Entretanto, em todas as amostras houve
tendência de aumento a partir do sétimo dia até os 14 dias de experimento,
principalmente nas esponjas presentes no aquário controle. Pode-se observar ainda
que o aumento do colágeno apresentou maior tendência de correlação com o
aumento das câmaras coanocitárias, principalmente ao longo de 14 dias de
incubação, evidenciando a relação entre as duas estruturas para o crescimento da
esponja.
A tendência na recuperação de colágeno e câmaras coanocitárias pode ser
atribuída à alta capacidade de regeneração conhecida das esponjas, que podem se
63
recuperar rapidamente de situações causadas pela predação, distúrbios físicos e
estresse ambiental (AYLING, 1983; WULFF, 2010; LEAMON; FELL, 1990). De fato,
algumas esponjas podem iniciar a recuperação celular da pinacoderme dentro de 24
horas após a lesão, com recuperação completa ocorrendo em poucas semanas
(LOUDEN et al., 2007), destaca-se ainda a capacidade das células de esponja (por
exemplo, os arqueócitos) para migrarem e proliferarem (SIMPSON, 1984). Outro
aspecto é a elevada atividade enzimática da telomerase, possivelmente contribuindo
para a rápida proliferação celular e, consequentemente, na recuperação de lesões
(KOZIOL et al., 1998).
Em relação às estruturas morfológicas analisadas e as MTLPs foi possível
observar que na exposição a 0,4 mg L-1 de Cd, após queda na quantidade de
câmaras coanocitárias, canais aquíferos e fibras de colágeno nas primeiras 24 horas
de exposição, em seguida houve tendência na manutenção destas estruturas, onde
não ocorreu grande variação. Como foi analisado, nesta concentração de Cd
ocorreu indução de MTLPs pelo menos até o sétimo dia de exposição. Estas
proteínas, juntamente com outros processos de defesa das esponjas em situações
de estresse, podem estar atuando na destoxificação do Cd, diminuindo seus efeitos
danosos.
4.3
CONCENTRAÇÃO DE METAIS NAS ESPONJAS DA BOA VIAGEM
Nas esponjas provenientes da praia da Boa Viagem, foram analisados em
seus tecidos a concentração de Cd, Cu, Zn e Ni. A variação destes elementos ao
longo das coletas pode ser observada na figura 26.
64
Figura 26- Médias das concentrações de Cd, Cu, Zn, Ni no tecido de H. heliophila nas cinco coletas
realizadas na praia da Boa Viagem, Niterói (n=6 em cada coleta e barra de erros é igual ao desvio
padrão).
Como observado na verificação de MTLPs, as concentrações dos metais
analisados no tecido das esponjas Hymeniacidon heliophila durante as cinco coletas
não foram suficientes para provocar a síntese destes biomarcadores.
Perez et al. (2004), ao comparar a concentração de alguns metais (Fe, Cu,
Zn, Pb, Cd, As, Cr, V, Ti, Hg) no tecido de seis espécies de esponjas (Agelas
oroides, Cacospongia scalaris, Chondrosia reniformis, Cliona viridis, Spongia
officinalis e Spongia agaricina) e do mexilhão (Mytilus galloprovincialis) coletados em
uma região poluída na costa de Marseilles (mar Mediterrâneo, França), encontraram
concentrações médias de 6 a 145 vezes maiores nas esponjas que o encontrado no
mexilhão. A única exceção foi para o zinco, que foi em geral um pouco maior no
mexilhão que na maioria das esponjas testadas.
Em relação à Baía de Guanabara, segundo Carvalho et al. (1991), apesar de
ser um estuário que recebe grandes impactos na forma de esgoto doméstico e
efluente industriais não tratados provenientes de uma área densamente populosa
65
com aproximadamente 10 mil indústrias (FEEMA, 1990), não ocorre grande
contaminação de metais na biota local. Segundo os autores, a forte eutrofização
presente na baía, devido ao despejo de esgoto doméstico não tratado, interage com
os metais pesados provenientes de efluente industriais. De fato, estudos realizados
na Baía de Guanabara indicaram que os metais encontram-se especialmente
associados à matéria orgânica e aos sulfetos que, em condições redutoras,
geralmente encontradas na baía, são bastante estáveis, significando baixa
disponibilidade biológica desses elementos (REBELLO et al., 1986; SOUZA et al.,
1986; CARVALHO; LACERDA, 1992).
No estudo de Kehrig et al. (2007) com mexilhões Perna perna coletados em
diferentes locais da Baía de Guanabara (Marina da Glória, praia da Boa Viagem e
pilares do vão central da Ponte Rio Niterói), as concentrações médias encontradas
foram 1,4 (± 0,4) mg Cu kg-1, 28,0 (± 14,0) mg Zn kg-1, 1,8 (± 0,6) mg Ni kg-1 e 0,07
(± 0,03) mg Cd kg-1. Comparado ao presente trabalho, o mexilhão teve resultado
bem inferior à esponja Hymeniacidon heliophila, que apresentou médias de 46 (±
6,6) mg Cu kg-1, 965 (± 368) mg Zn kg-1, 2,0 (± 0,13) mg Ni kg-1 e 0,28 (± 0,07) mg
Cd kg-1. Portanto, mesmo com a baixa biodisponibilidade de metais encontrada na
Baía de Guanabara, como observado por Carvalho et al. (1991), a esponja
Hymeniacidon heliophila apresentou valores elevados de metais, principalmente
para Zn e Cu, evidenciando sua singular capacidade de acumular estes elementos.
Na tabela 1, pode-se observar concentrações médias de Cd, Cu, Ni e Zn em
outros estudos realizados na região interna da Baía de Guanabara. Os valores
médios de Cd, Cu e Zn encontrados em Hymeniacidon heliophila neste estudo foram
pouco menores que o encontrado por Batista (2010). Porém, as concentrações
foram superiores aos encontrados nos mexilhões Perna perna, com exceção para Ni
(REZENDE; LACERDA, 1986; CARVALHO et al., 1991; CARVALHO; LACERDA,
1992; KEHRIG et al., 2007; ANSARI, 2011), e na anêmona Bunodosoma caissarum
(ANSARI, 2011). Em Paraleucilla magna, outra espécie de esponja verificada por
Batista (2010) na Baía de Guanabara, os valores médios de Zn e Cu foram bem
abaixo do encontrado nos outros organismos.
66
Tabela 1- Média das concentrações de metais em mg kg-1 em outros estudos
na Baía de Guanabara.
Organismo
Cd
Cu
Ni
Zn
965
Hymeniacidon heliophila (este estudo)
0,28 46,3
2,0
Hymeniacidon heliophila (esponja) (a)
0,59
0,74 1160
Paraleucilla magna (esponja) (a)
0,13 2,39 1,41
25
Perna perna (mexilhão) (b)
0,26 9,52 8,55
213
50
Perna perna (mexilhão) (c)
-
9,1
8,2
127
Perna perna (mexilhão) (d)
0,1
12
4
150
Perna perna (mexilhão) (e)
0,1
10
6
150
Perna perna (mexilhão) (f)
0,07
1,4
1,8
28
Bunodosoma caissarum (anêmona) (b) 0,04 6,05 1,19
128
(a) Batista (2010); (b) Ansari (2011); (c) Rezende e Lacerda (1986); (d) Carvalho et al.
(1991); (e) Carvalho e Lacerda (1992); (f) Kehrig et al. (2007).
Em outros locais, estudos também encontraram altas concentrações de
metais em diferentes espécies de esponjas. Patel et al. (1985) reportaram
concentração média de 68 mg Cd kg-1, 270 mg Zn kg-1 e 1000 mg Ni.kg-1 na esponja
Spirastrella cuspidifera coletada na costa da Índia, próxima à Bombaim. Já Padovan
et al. (2012) encontraram concentração média de 111 mg Cd kg-1, 864 mg Zn kg-1,
1670 mg Ni kg-1 e 9,8 mg Cu kg-1 em Spheciospongia vagabunda coletadas próximo
a efluentes de esgoto. Cebrian et al. (2007) verificaram concentração de 280 mg Cu
kg-1 em Crambe crambe proveniente de região portuária.
Como observado, a Hymeniacidon heliophila, assim como muitas outras
espécies de esponjas relatadas, apresentou alta capacidade de acumular metais em
seu tecido. Esta capacidade chega a superar, em alguns casos, em muitas vezes o
encontrado em mexilhões, cujas espécies são as mais amplamente utilizadas em
programas de biomonitoramento. Tal fato pode ser explicado por algumas diferenças
entre estes organismos.
Primeiramente, apesar de ambos os organismos serem filtradores, a natureza
do material orgânico e o tamanho das partículas retidas diferem significativamente.
As esponjas possuem a capacidade de reter partículas do tamanho de bactérias e
estudos sugerem que podem suprir integralmente sua necessidade de carbono
alimentando-se de partículas menores que 1 μm (RIBES et al., 1999), além do mais,
67
esponjas ricas em bactérias associadas (“bacterioesponjas”), possuem a capacidade
de consumir até matéria orgânica dissolvida. Em contraste, bivalves retêm partículas
de até 4 μm, mas no geral, a maioria das partículas usadas para alimentação são
maiores que 100 μm (NEWELL et al., 1989; RIISGARD et al., 1996).
Outro aspecto importante é a longevidade das esponjas. Por exemplo,
mexilhões possuem vida curta, sendo então mais apropriados para monitoramentos
de fenômenos curtos e marcantes (AMIARD et al., 1986), enquanto que as esponjas
podem viver por décadas e acumular metal durante todo esse tempo. Perez et al
(2004) verificaram que do período de 1983 a 1998 em Marseilles (mar Mediterrâneo,
França) ocorreu uma diminuição significativa na concentração de metais em Spongia
officinalis coletadas no mesmo local, principalmente para Pb, Cr e Cd, que foram
respectivamente 9, 8 e 5 vezes menores em 1998. Segundo os autores, esta
diminuição foi devido à implantação de uma estação de tratamento de esgoto em
1987. Assim, como a Spongia officinalis relatada, Hymeniacidon heliophila poderia
ser utilizada para indicar a eficácia de projetos de despoluição em ambientes
costeiros como a Baía de Guanabara.
68
5
CONCLUSÃO
No experimento de exposição ao Cd, a esponja H. heliophila apresentou
máximo de 114 mg kg-1 de concentração deste elemento. Esta quantidade foi obtida
após 14 dias de exposição a 4 mg L-1 de Cd e corresponde a 14 vezes o encontrado
no controle. Apesar desta elevada quantidade de Cd no tecido da esponja, pelos
resultados obtidos pela separação eletroforética por SDS-PAGE com amostras
derivatizadas com monobromobimano não houve indução de MTLPs nesta
condição. As condições em que isto ocorreu foram, principalmente, nos períodos de
24 horas e 7 dias de exposição a 0,4 mg L-1 de Cd.
A não indução de MTLPs na exposição a 0,05 mg L-1 de Cd, indica que esta
concentração não foi suficiente para provocar a síntese dessas proteínas e/ou o
período de exposição, que pode não ter sido longo o suficiente para ocorrer a
indução, mesmo após 14 dias. A exposição a 4 mg L-1 de Cd apresentou pequena
indução após 24 horas de exposição, o que não voltou a ocorrer nos períodos
subsequentes, provavelmente causado pela alta disponibilidade e citotoxidade do
Cd. O mesmo pode ter ocorrido na condição de exposição a 0,4 mg L-1 de Cd após
14 dias de exposição, já que não houve MTLPs, em contraste com os períodos
anteriores.
Os resultados obtidos pelas imagens histológicas demonstraram ainda que as
esponjas submetidas a 4 mg L-1 de Cd tiveram redução concomitante de canais
aquíferos e câmaras coanocitárias e pequena tendência de recuperação das fibras
de colágeno, após forte queda em 24 horas. Já na exposição a 0,4 mg L-1 de Cd, a
tendência de queda destas estruturas cessaram a partir de 24 horas, configurando,
além de outras estratégias dos poríferos em situações de estresse, possível atuação
das MTLPs, pelo menos até o sétimo dia, na destoxificação do Cd.
As esponjas analisadas diretamente da praia da Boa Viagem não
apresentaram MTLPs em nenhumas das cinco coletas, provavelmente devido à
baixa disponibilidade de metais, onde a concentração média foi de: 0,28 mg Cd kg-1;
2 mg Ni kg-1; 46,3 mg Cu Kg-1; 965 mg Zn kg-1. Apesar da não indução de MTLPs,
há de se ressaltar que os níveis acumulados desses metais foram superiores ao
encontrado em outros organismos na Baía de Guanabara, como os mexilhões.
69
Desta forma, este trabalho apresenta uma contribuição para elucidar uma das
vastas possibilidades de aplicação da convergência da bioacumulação de metais e
biomarcadores em esponjas, organismos pouquíssimos estudados para este fim.
70
6
REFERÊNCIAS
ADAMS, S. M.; SHEPARD, K. L.; GREELEY, M. S.; JIMENEZ, B. D.; RYON, M. G.;
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