ESTUDO DA AÇÃO DO ÁCIDO KÓJICO (AK), UM METABÓLITO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
PAULA CRISTINA RODRIGUES FRADE
ESTUDO DA AÇÃO DO ÁCIDO KÓJICO (AK), UM METABÓLITO
OBTIDO DE FUNGOS DO GÊNERO Aspergillus, SOBRE NEUTRÓFILOS
HUMANOS in vitro
BELÉM
2012
PAULA CRISTINA RODRIGUES FRADE
ESTUDO DA AÇÃO DO ÁCIDO KÓJICO (AK), UM METABÓLITO
OBTIDO DE FUNGOS DO GÊNERO Aspergillus, SOBRE NEUTRÓFILOS
HUMANOS in vitro
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina.
Prof ª. Drª. Edilene Oliveira da Silva - Orientadora
BELÉM
2012
PAULA CRISTINA RODRIGUES FRADE
ESTUDO DA AÇÃO DO ÁCIDO KÓJICO (AK), UM METABÓLITO
OBTIDO DE FUNGOS DO GÊNERO Aspergillus, SOBRE NEUTRÓFILOS
HUMANOS in vitro
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina, aprovado com o conceito
____________________.
Belém (PA), 14 de dezembro de 2012.
Banca examinadora:
______________________________________________
Profª. Drª. Edilene Oliveira da Silva
ICB – UFPA
(Orientadora)
______________________________________________
Prof. Dr. Adriano Penha Furtado
(ICB – UFPA)
______________________________________________
Prof. Dr. Francisco Acácio Alves
(ICB – UFPA)
______________________________________________
Prof. Dr. José Luiz do Nascimento - Suplente
(ICB – UFPA)
i
“Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima.”
Louis Pasteur
ii
À Deus pelas inúmeras oportunidades de crescimento concedidas...
Aos meus pais por serem sempre o meu porto seguro...
Ao meu irmão pela cumplicidade e amizade.
iii
AGRADECIMENTOS
À Deus por sempre iluminar meu caminho... Pelo amparo, amor, auxílio ao longo
dessa trajetória de vida.
Aos meus pais, Paulo e Silvia, por serem a minha base de sustentação e os meus
exemplos de luta e de determinação. São vocês os responsáveis pelas minhas vitórias e
conquistas. Obrigada por fazerem dos meus sonhos, os seus, e por me ajudarem a construir
meu caminho com tanto afeto e dedicação.
Ao meu irmão Pedro pelo companheirismo, carinho e atenção, principalmente nos
momentos de desânimo. Obrigada por sempre conseguir me fazer rir e enxergar os pontos
positivos de tudo.
À minha orientadora Drª Edilene pela oportunidade de aprendizado e de trabalho.
Por ter acreditado em meu potencial e ter-me concedido à oportunidade de ingressar no
universo da pesquisa.
Ao HEMOPA por ter cedido às bolsas de sangue e possibilitado a realização deste
trabalho. Como também a todos os doadores de sangue que foram de fundamental
importância!
Ao Laboratório de Investigação Sistemática em Biotecnologia e Biodiversidade
Molecular da Universidade Federal do Pará por fornecer o metabólito utilizado neste estudo.
Ao Instituto Evandro Chagas e a Universidade Federal do Rio de Janeiro por ter
cedido os microscópios para a aquisição das imagens.
À Neide, minha mãe científica, companheira do “carma de trabalhar com células
humanas”. Não tenho palavras para descrever o imenso apoio que ela me concedeu ao longo
desses anos, principalmente nas inúmeras madrugadas na UFPA fazendo experimentos.
Guardo sua amizade com muito carinho!
À Ana Paula pela explicação de técnicas, pelas inúmeras sugestões, enfim por
toda a orientação que recebi ao longo desses anos. Obrigada principalmente pela paciência
para responder minhas intermináveis dúvidas e pelas longas horas de análises de microscopia.
Sempre disposta a me auxiliar, sou infinitamente grata por tudo!
Ao Luís pelas muitas vezes em que me ajudou, dentre elas na resolução de
cálculos, construção de gráficos e análises no citômetro. Além de sempre ter uma boa piada
para animar os meus dias.
iv
Ao Bruno, meu colega de curso e meu companheiro de insônia, obrigada por
tudo! Por tantas vezes teres a paciência de me aturar em desespero e por toda a ajuda que me
concedeste desde o momento em que nos conhecemos.
À Carol, minha parceira de desespero, sou grata pelo companheirismo e pela
amizade no decorrer de todo esse período tanto na graduação, quanto no laboratório.
À Raquel que me apresentou o laboratório, me ensinou os primeiros experimentos
e me fez amar esta área. Sou muito grata Raquelzinha pelos abraços, pelas palavras de
incentivo e pela amizade construída, a qual levarei por toda a minha vida.
À Amanda, a minha forte concorrente de mais azarada do laboratório e a minha
eterna amiga oculta, que por tantas noites ficou me fazendo companhia no laboratório.
Obrigada pelo carinho, pela ajuda, pelo incentivo e pela amizade.
À Lienne, uma das membras mais novas e que me encantou pela sua boa vontade
e alegria. Já tem um lugar guardado no meu coração e sou grata pelas ajudas, sugestões e
correções na construção deste trabalho.
Ao Rodrigo, o meu professor de português, obrigada pelos momentos de
descontração, pelas caronas, pelas conversas edificantes e pela atenção que deste na correção
deste trabalho.
Ao Jorge pela inesquecível aula de revelação de fotos, como também pelas risadas
na mesa do café.
Ao Davi e ao Aprígio pelos momentos de atenção e de descontração.
À Fernanda do Laboratório de Biologia Estrutural pelo auxílio no processamento
de amostras para microscopia eletrônica de transmissão.
À Neidiane do Laboratório de Neuroquímica pelas inúmeras ajudas. Sou grata por
nunca ter me negado auxílio.
Ao Heyder por toda ajuda que me prestou na utilização do microscópio eletrônico
de transmissão.
Aos meus amigos de graduação Adriano, Bruna e Fábio pela amizade e pelo
companheirismo. O auxílio de vocês foi fundamental para o meu crescimento profissional.
Aos meus queridos amigos Stéphanie, Vanessa, Andrei e André por tantas vezes
terem ouvido minhas ideias e desabafos com carinho e atenção. A nossa amizade levarei para
sempre!
v
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................... vii
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS .................................................................. viii
RESUMO ................................................................................................................................. x
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 1
1.1 MORFOLOGIA DE NEUTRÓFILOS ............................................................................... 2
1.2 PROCESSO DE MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS ......................................................... 4
1.3 RESPOSTA MICROBICIDA DE NEUTRÓFILOS .......................................................... 6
1.4 AGENTES ATIVADORES DA RESPOSTA MICROBICIDA DE NEUTRÓFILOS ...... 9
1.5 ÁCIDO KÓJICO ............................................................................................................... 10
2 OBJETIVOS .................................................................................................................... 13
2.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 13
2. 2 OBJETVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 13
3 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 14
3.1 OBTENÇÃO E CULTIVO DE NEUTRÓFILOS DO SANGUE PERIFÉRICO
HUMANO ............................................................................................................................... 14
3.2 OBTENÇÃO E DILUIÇÃO DO METABÓLITO AK ..................................................... 15
3.3 TRATAMENTO DAS CÉLULAS ................................................................................... 15
3.4 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DAS CÉLULAS TRATADAS COM AK .............. 15
3. 4. 1 Teste do Vermelho Neutro ........................................................................................... 15
3. 4. 2 Pelo Kit de Detecção de Potencial de Membrana Mitocondrial (JC-1) ....................... 16
3. 4. 3 Iodeto de Propídio ........................................................................................................ 17
3.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA DE NEUTRÓFILOS TRATADOS COM AK ................. 17
3.5.1 Microscopia Óptica ........................................................................................................ 17
3.5.2 Microscopia Eletrônica de Varredura ............................................................................ 18
3.5.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão ........................................................................ 18
3.5.4 Análise de área celular (Morfometria) ........................................................................... 19
3.5.5 Detecção dos filamentos de actina por Microscopia Óptica de Fluorescência .............. 19
3.6 RESPOSTA MICROBICIDA ........................................................................................... 19
3.6.1 Produção de Radicais Superóxidos em neutrófilos tratados com AK ........................... 19
3.6.2 Detecção da Produção de Óxido Nítrico ........................................................................ 20
3.7 INTERAÇÃO DE Leishmania (Leishmania) amazonensis COM NEUTRÓFILOS
TRATADOS COM AK........................................................................................................... 20
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................... 21
4 RESULTADOS ................................................................................................................... 22
4.1 ANÁLISE DA VIABILIDADE DAS CÉLULAS TRATADAS COM AK ..................... 22
4.1.1 Teste do Vermelho Neutro ............................................................................................. 22
4.1.2 Pelo Kit de Detecção de Potencial de Membrana Mitocondrial (JC-1) ......................... 23
4.1.3 Iodeto de Propídio .......................................................................................................... 24
4.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DE NEUTRÓFILOS TRATADOS COM AK ................. 25
4.2.1 Microscopia Óptica ........................................................................................................ 25
4.2.2 Microscopia Eletrônica de Varredura ............................................................................ 28
4.2.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão ........................................................................ 33
4.2.4 Análise de área celular (Morfometria) ........................................................................... 38
4.2.5 Detecção dos filamentos de actina por Microscopia Óptica de Fluorescência .............. 39
4.3 ANÁLISE DA RESPOSTA MICROBICIDA .................................................................. 44
4.3.1 Produção de Radicais Superóxidos em neutrófilos tratados com AK ........................... 44
4.3.2 Detecção da Produção de Óxido Nítrico ........................................................................ 48
4.4 ANÁLISE DA INTERAÇÃO DE Leishmania (Leishmania) amazonensis COM
NEUTRÓFILOS TRATADOS COM AK .............................................................................. 49
5 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 50
6 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 53
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 54
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Estágios de maturação de neutrófilos...................................................................... 1
Figura 2 – Morfologia de neutrófilos humanos ....................................................................... 2
Figura 3 – Recrutamento e fagocitose de neutrófilos .............................................................. 6
Figura 4 – Mecanismo oxidativo de neutrófilos ...................................................................... 7
Figura 5 – Estrutura química do ácido kójico ........................................................................ 10
Figura 6 – Viabilidade celular através do método VN de neutrófilos tratados com AK durante
1 hora........................................................................................................................................ 22
Figura 7 – Potencial de membrana mitocondrial avaliado por citometria de fluxo após
incubação com JC-1................................................................................................................. 23
Figura 8 – Ensaio de apoptose por citometria de fluxo utilizando Iodeto de Propídio como
marcador................................................................................................................................... 24
Figura 9 – Análise morfológica de neutrófilos tratados com AK por 1 hora e corados com
Giemsa .................................................................................................................................... 27
Figura 10 – Análise ultraestrutural em MEV de neutrófilos................................................... 30
Figura 11 – Análise ultraestrutural em MEV de neutrófilos tratados com 50 e 100 µg/mL de
AK ........................................................................................................................................... 32
Figura 12 – Análise ultraestrutural em MET de neutrófilos .................................................. 35
Figura 13 – Análise ultraestrutural em MET de neutrófilos tratados com 50 e 100 µg/mL de
AK ........................................................................................................................................... 37
Figura 14 – Medida da área citoplasmática de neutrófilos tratados com AK......................... 38
Figura 15 – Detecção dos filamentos de actina do citoesqueleto de neutrófilos.................... 41
Figura 16 – Detecção dos filamentos de actina do citoesqueleto de neutrófilos tratados com
50 e 100 µg/mL de AK ........................................................................................................... 43
Figura 17 – Detecção qualitativa da produção de radicais superóxidos em neutrófilos tratados
com 50 e 100 µg/mL de AK através da reação citoquímica com NBT................................... 46
Figura 18 – Detecção quantitativa da produção de radicais superóxidos em neutrófilos
tratados com 50 e 100 µg/mL de AK através da reação citoquímica com NBT..................... 47
Figura 19 – Detecção da produção de óxido nítrico em neutrófilos tratados com 50 e 100
µg/mL de AK .......................................................................................................................... 48
Figura 20 - Índice endocítico de neutrófilos tratados com 50 e 100 µg/mL de AK por 1 h,
seguido da interação por 3h com Leishmania (leishmania) amazonensis............................... 49
viii
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ºC – Graus Celsius
µg/mL – Microgramas por mililitros
µL – Microlitros
µm – Micrometros
AK – Ácido kójico
DAPI – Diamino fenilindole
DMEM – Duleccos’Modified Eagle’s Medium
DNA – Ácido desoxirribonucleico
EDTA – Sigla inglesa para ácido etilenodiamino tetra-acético
ERO – Espécie reativa de oxigênio
ERN – Espécie reativa de nitrogênio
ET – Sigla inglesa para redes extracelulares
fMLP – N-formil-metionil-leucifenilalanina
G-CSF – Fator estimulador de colônias de granulócitos
GM-CSF – Fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos
HMP – 5-hidroxi-2-hidroximetil-γ-pirona
H2O2 – Peróxido de hidrogênio
HOCl – Ácido hipocloroso
IL-1 – Interleucina 1
IL-8 – Interleucina 8
IP – Iodeto de Propídio
JC-1 – Potencial de Membrana Mitocondrial
LPS - Lipopolissacarídeo
M – Molar
M-CFS - Fator Estimulador de Colônia de Macrófago
MET – Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
mg/mL – Miligramas por mililitros
MPO – Mieloperoxidase
NAHCO3 – Bicarbonato de sódio
ix
NADPH – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfatase hidrogenase
NBT – Nitroblue tetrazolium
NET – Sigla inglesa para rede extracelular de neutrófilos
NH4Cl – Cloreto de amônio
nm – Nanômetros
NO – Óxido nítrico
O2 – Oxigênio molecular
O2- - Íon superóxido
1
O2 – Oxigênio Singlate
OH- – Radical hidroxila
ONOO- - Peroxinitrito
PBS – Sigla inglesa para tampão fosfato salino
PMA – 13-acetato de forbol éster 12-miristato
PMN - Polimorfonuclear
SBF – Soro bovino fetal
SOD – Superóxido dismutase
TNF – Sigla inglesa para fator de necrose tumoral
VN – Vermelho Neutro
x
RESUMO
Os neutrófilos são células que participam do sistema imune inato como fagócitos profissionais
para eliminação de patógenos. Os mecanismos que essas células usam são mediados
principalmente por espécies reativas de oxigênio e enzimas proteolíticas. A busca por
medicamentos em baixas doses, com baixa citotoxidade, que estimulem a resposta
microbicida de células fagocíticas e, que ainda seja capaz de destruir um microrganismo
intracelular é constante. O Ácido Kójico (AK) é um metabólito secundário sintetizado por
espécies dos gêneros Aspergillus, Penicillium e Acetobacter, que possui uma variedade de
aplicações biomédicas como antioxidante, agente antitumoral e ativador de macrófagos
peritoneais. Desta forma, este trabalho teve como objetivo analisar o efeito in vitro do AK,
isolado de fungos do gênero Aspergillus, sobre neutrófilos humanos. As células foram
tratadas nas concentrações de 50 e 100 µg/mL de AK por 1 hora. Os testes de viabilidade
(Vermelho Neutro, Potencial de Membrana Mitocondrial e marcação com Iodeto de Propídio)
mostraram que não houve redução da viabilidade dessas células após tratamento em diferentes
concentrações do AK. A morfologia das células foi avaliada através da microscopia óptica,
microscopia de fluorescência, microscopias eletrônicas de varredura e de transmissão. As
análises morfológicas dos neutrófilos tratados mostraram um aumento na quantidade de
vacúolos, do volume celular e formação de inúmeras projeções citoplasmáticas, características
de ativação celular. O aumento da área citoplasmática foi confirmado por análise
morfométrica. Em relação a atividade microbicida, o AK não induziu a produção de óxido
nítrico, mas foi possível observar aumento na produção de radicais superóxidos e da
capacidade fagocítica. A partir dos resultados obtidos, pode-se inferir que o AK não
apresentou efeito tóxico para os neutrófilos, e parece atuar na ativação celular devido as
alterações morfológicas, aumento da produção de radicais superóxidos e da capacidade
fagocítica.
Palavras chave: Ácido Kójico, Neutrófilos e Ativação Celular.
1
1 INTRODUÇÃO
Os leucócitos são um conjunto de células heterogêneas do sistema circulatório,
que atuam na imunidade do organismo. Em média, o número de leucócitos por microlitro de
sangue é de 7.400, com uma variação normal de 4.500 a 11.000 células (Abbas, 2012).
Em 1956, Paul Ehrlich descobriu os neutrófilos, também conhecidos como
leucócitos polimorfonucleares (PMNs), isso só foi possível devido ao desenvolvimento de
técnicas de fixação e coloração que permitiram a identificação de núcleos lobulados e os
grânulos característicos deste tipo celular. Assim, a utilização de uma mistura de corantes
ácidos e básicos, ou seja, neutros, para a granulação neutrofílica, originou o nome
“neutrófilos” (Borregaard & Cowland, 1997).
Essas células são produzidas na medula óssea e se originam de células-tronco
hematopoiéticas pluripotentes. A produção de neutrófilos é estimulada pelo fator estimulador
de colônias de granulócitos (G-CSF). Seus estágios morfológicos de maturação (Figura 1)
envolvem: mieloblasto, promielócito, mielócito, metamielócito, bastonetes e segmentados
(Mayer-Scholl et al., 2004; Abbas, 2012).
Figura 1. Estágios de maturação de neutrófilos.
É mostrado o fluxo celular e o tempo de maturação em cada compartimento. A área de cada secção indica
o número de células em cada compartimento. O aumento gradual durante os três primeiros
compartimentos representa divisões em série das células nestes compartimentos. Na fase promielócita, os
grânulos azurofílicos (pontos vermelhos) são formados, enquanto que os grânulos específicos (pontos
azuis) são formados na fase mielocítica. Fonte: Kuijpers (2001) com algumas modificações.
2
Os neutrófilos são os leucócitos mais numerosos na corrente sanguínea (50 a
70%) (Lorenzi, 2005), um adulto humano produz cerca de 100 bilhões deles por dia (Athens
et al., 1961) e apresentam vida média na circulação sanguínea de 6 a10 horas e nos tecidos
podem viver de 1 a 2 dias. No entanto, o tempo de vida dessas células pode ser prolongado ou
encurtado por sinais do micro-ambiente (Kobayashi et al., 2003; Maianski et al., 2004 a).
Os neutrófilos são considerados a primeira linha de defesa do organismo, pois são
as primeiras células a serem recrutadas da corrente sanguínea para os sítios de inflamação
(Luster et al., 2005; Nathan, 2006). A atividade desses fagócitos profissionais é importante
para atuação da resposta imune celular e apresentam como principais funções a fagocitose,
produção de citocinas e quimiocinas, liberação de grânulos sobre o patógeno e liberação de
redes extracelulares compostas por proteínas nucleares (Brinkman et al., 2004; Abbas, 2012).
1.1 MORFOLOGIA DE NEUTRÓFILOS
Os neutrófilos (Figura 2) presentes nos vasos sanguíneos possuem um aspecto
arredondado, com cerca de 10 a 15 µm de diâmetro e núcleo segmentado de três a cinco
lóbulos conectados, nucléolo ausente e grânulos citoplasmáticos (primário, secundário e
terciário) (Zychlinsky et al., 2003; Lorenzi, 2005; Abbas, 2012).
Neutrófilos
Eosinófilo
Figura 2. Morfologia de neutrófilos humanos. Fonte: Kennedy & DeLeo, 2009.
3
Os neutrófilos apresentam três tipos de grânulos em seu citoplasma compostos de
proteínas distintas. Os grânulos primários ou azurófilos possuem enzimas conversoras dos
reativos intermediários do oxigênio como a mieloperoxidase, α-defensinas, proteínas ligadas à
membrana e proteases; os grânulos secundários contêm enzimas proteolíticas antibacterianas
(lisozima e lactoferrina) e os grânulos terciários contêm catepsinas e gelatinases (Faurshou &
Borregaard 2003; Nathan, 2006; Borregaard et al., 1997).
Essas células permanecem em sua forma característica até serem ativadas por
algum sinal quimiotático, como citocinas, quimiocinas, produtos de microorganismos
invasores, dentre outros. Ao receber esse sinal, as células saem da circulação e migram para o
local da infecção ou injúria (Kobayashi et al., 2003).
Este mecanismo de ativação promove alterações morfológicas graduais na célula,
de forma que a maioria dos neutrófilos passam por uma fase de estimulação (fase
intermediária), antes de chegarem ao estágio de ativação. Assim, os neutrófilos possuem três
estágios distintos: repouso ou quiescente, estimulado e ativado (Botha et al., 1995; Swain,
2002; Sheppard et al., 2005).
Os neutrófilos quiescentes são aqueles que circulam livremente na corrente
sanguínea, não aderem ao endotélio e possuem morfologia arredondada (Botha et al., 1995;
Siddiqui et al., 1995; Vulcano et al., 1998; Swain, 2002; Sheppard et al., 2005).
Os neutrófilos, no estágio estimulado, são observados na primeira etapa do
processo inflamatório, onde realizam o rolamento sobre o endotélio, diapedese e migração.
Esse fenótipo é marcado pela mudança de morfologia relacionada à aderência, tornando-se
aderentes, além de produzir uma pequena quantidade de radicais superóxidos. Muitos agentes
estimulam os neutrófilos em baixas concentrações, tais como N-formil-metionilleucifenilalanina (fMLP), fator estimulador de colônias de granulócitos-monócitos (GMCSF) e lipopolissacarídeo (LPS) (Botha et al., 1995; Vulcano et al., 1998; Swain, 2002;
Sheppard et al., 2005).
O neutrófilo ativado encontra-se onde há maior concentração de ativadores e
patógenos. Nestas células ocorrem grandes alterações morfológicas como o aumento do
volume celular, emissão de pseudópodes e posteriormente a fagocitose. Ocorre também
grande produção de radicais superóxidos e degranulação no meio extracelular. Alguns
estimuladores também podem atuar como ativadores, quando usados em maior concentração,
como o fMLP e o LPS. O 13-acetato de forbol éster 12-miristato (PMA) é considerado o
ativador mais potente (Botha et al., 1995; Siddiqui et al., 1995; Vulcano et al., 1998; Swain,
2002; Faurschou & Borregaard, 2003; Sheppard et al., 2005).
4
1.2 PROCESSO DE MIGRAÇÃO DE NEUTRÓFILOS
Após receber um estímulo, o neutrófilo migra para o espaço extra vascular, em
direção ao gradiente quimiotático que é responsável pela atração, rolamento sobre o endotélio,
adesão, diapedese e movimentação da célula no tecido (Wagner & Roth, 2000; TheilgaardMonch, 2006).
A quantidade e a duração da reação inflamatória estão relacionadas ao tipo de
estímulo recebido pelas células. Essas diferenças são percebidas na adesão celular, nas
diferentes expressões de receptores, nos tipos de leucócitos envolvidos, na liberação dos
grânulos citoplasmáticos, na realização ou não de fagocitose e na regulação da apoptose
(Kuijpers, 2001).
Inicialmente, ocorrem alterações na membrana celular, com o aumento na
expressão de moléculas de adesão, sendo esta expressão a responsável por promover adesão
das células ao endotélio. As interações transitórias entre as glicoproteínas de transmembrana
de adesão chamadas selectinas, presentes no endotélio e no neutrófilo promovem o rolamento
dessas células pela parede do vaso sanguíneo adjacente ao sítio de inflamação (Kuijpers,
2001; Abbas, 2012).
As células endoteliais expressam a selectina P e a selectina E. A selectina P é
armazenada em grânulos do citoplasma e é rapidamente redistribuída à superfície em resposta
a produtos microbianos e citocinas. A selectina E, expressa na membrana celular, é sintetizada
em resposta a interleucina 1 (IL-1) e ao fator de necrose tumoral (TNF), que são citocinas
responsáveis pela ativação do endotélio, como também em resposta a produtos microbianos
(Abbas, 2012).
Os neutrófilos expressam a selectina L e os ligantes dos carboidratos para
selectinas P e E, facilitando as interações com as células endoteliais. Como essas interações
são transitórias, por serem de baixa afinidade, os neutrófilos podem se ligar e se destacar
repetidas vezes, permitindo a rolagem ao longo da superfície endotelial (Kennedy & DeLeo,
2009; Abbas, 2012).
Os neutrófilos também expressam uma família de moléculas de adesão, chamadas
integrinas. A ativação dessas moléculas permite a adesão das células ao endotélio, o qual
também aumenta a expressão dos ligantes das integrinas, propiciando a fixação dessas células
ao endotélio, através da reorganização do citoesqueleto e espalhamento sobre a superfície
endotelial (Abbas, 2012).
5
Em seguida ocorre a diapedese, que é a migração dos neutrófilos entre as células
endoteliais e a movimentação do neutrófilo no tecido. Esta migração é orientada pela
concentração de quimiocinas, as quais estimulam os neutrófilos aderentes a migrar através dos
espaços entre as células endoteliais para o local de infecção (Dallegri et al., 1997; Burg &
Pillinger, 2001; Theilgaard-Monch et al., 2006; Abbas, 2012).
No sítio inflamatório, os neutrófilos reconhecem e entram em contato com a
partícula ou microorganismo invasor, em seguida, os neutrófilos emitem pseudópodes que se
fundem em torno do patógeno, formando o fagossomo. Este mecanismo de fagocitose ocorre
através da interação entre receptores específicos na membrana dos neutrófilos com ligantes
presentes na superfície do agente invasor (Theilgaard-Monch et al., 2006; Abbas, 2012).
Subsequentemente à fagocitose, ocorre à fusão do fagossoma com grânulos
citoplasmáticos, seguida pela degranulação, formando o fagolisossoma. Dentro deste, o
microorganismo é degradado por peptídeos antimicrobianos e espécies reativas de oxigênio
(EROs) ou via espécies reativas de nitrogênio (ERNs) (Figura 3) (Mayer-Scholl et al., 2004;
Zychlinsky et al., 2003; Theilgaard-Moch, 2006).
6
Figura 3. Recrutamento e fagocitose de neutrófilos.
Ação do sistema imune inato mediado por neutrófilos em resposta à infecções ou injúrias. I. Saída do
neutrófilo do vaso sanguíneo: recebimento do estímulo, rolamento, adesão e diapedese; II. Chegada ao sítio
inflamatório com a ativação dessa célula; III. Reconhecimento do microrganismo invasor, fagocitose,
destruição, degradação e liberação de espécies reativas de oxigênio; IV. Liberação de citocinas para ativação
de outras células; V. Apoptose dos neutrófilos e fagocitose dos mesmos pelos macrófagos.
Abreviaturas: Az. Gr. – Grânulos Azurofílicos; Spec. Gr. – Grânulos Específicos; Gel. Gr. – Grânulos de
Gelatinase; ICAM – 1 – Antígeno associado a função dos linfócitos 1; LFA-1 – Antígeno associado a função
leucocitária; DC – Células Dendríticas e PMN – Neutrófilo Polimorfonuclear.
Fonte: Theilgaard-Monch et al., 2006 com algumas adaptações.
1.3 RESPOSTA MICROBICIDA DE NEUTRÓFILOS
Após fagocitose de microrganismos por neutrófilos, dois processos microbicidas
são ativados concomitantemente para criar um ambiente altamente tóxico dentro do
fagossomo: a degranulação, que corresponde à liberação do conteúdo dos grânulos dentro do
fagossomo, seguida pela secreção de enzimas presentes nesses grânulos para o meio
extracelular e a produção de O2- dependente do complexo enzimático NADPH-oxidase que é
um precursor de outras EROs (Nauseef, 2007; Abbas, 2012).
7
Além desses dois mecanismos microbicidas clássicos, um estudo realizado por
Brinkman e colaboradores (2004) descreveram um novo mecanismo microbicida associado à
morte de neutrófilos, inicialmente chamado de NETose. Neste mecanismo, a morte acontece
após ativação do neutrófilo levando a liberação de redes extracelulares (Neutrophil
Extracellular Traps - NETs) compostas por DNA, proteínas nucleares e dos grânulos. Como
foi descoberto que outras células como os eosinófilos também detinham a capacidade de
emitir essas redes, o nome foi alterado para ET (Extracellular Traps) (Guimarães-Costa et al.,
2011).
Essas ETs são capazes de prender bactérias, fungos e protozoários, além de
proporcionar uma alta concentração de moléculas antimicrobianas (Brinkmann et al., 2004;
Urban et al., 2009; Fuchs et al., 2007; Guimarães-Costa et al., 2009).
A degranulação é um mecanismo de defesa independente de oxigênio e baseia-se
na liberação do conteúdo dos grânulos (azurófilos, específicos e terciários). Os constituintes
dos diferentes tipos de grânulos dos neutrófilos são responsáveis pelos mecanismos de
destruição dos patógenos. A fusão dos grânulos nos fagossomas é seguida pela liberação de
substâncias microbicidas dentro dos mesmos, levando a morte do patógeno. Tais substâncias
microbicidas são, principalmente, proteínas antimicrobianas como a defensina e a lisozima
(que funcionam rompendo a superfície aniônica bacteriana) e as proteases (que degradam
proteínas bacterianas) (Mayer-Schol et al., 2004; Pham, 2006).
O mecanismo depende de oxigênio (Figura 4) baseia-se na conversão do oxigênio
molecular (O2) em espécies reativas de oxigênio (EROs) pelos neutrófilos ativados, sendo
denominado de “burst” oxidativo. As EROs são moléculas altamente reativas, por isso são
potentes agentes oxidantes, que atuam em conjunto com os constituintes dos grânulos e são
capazes de destruir os agentes fagocitados (Zychlinsky et al., 2003; Abbas, 2012).
Figura 4. Mecanismo oxidativo de neutrófilos.
Abreviaturas: O2 – Oxigênio molecular; O2- – Íon superóxido; H2O2 – Peróxido de hidrogênio; OH- – Radical
hidroxila; NO – Óxido nítrico; ONOO- - Peroxinitrito; MPO – Mieloperoxidase; HOCl – Ácido hipocloroso; 1O2
– Oxigênio singlete. Fonte: Cruz, 2010.
8
Sabe-se que o mecanismo microbicida oxidativo se inicia com a atuação do
complexo enzimático nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato oxidase (NADPH oxidase).
Esse complexo enzimático é responsável pela produção do radical ânion superóxido (O2-) a
partir da redução do oxigênio molecular. Esse radical superóxido é a principal espécie reativa
de oxigênio (Klebanoff, 2005; Abbas, 2012).
O aumento da atividade da NADPH oxidase deve ocorrer restritamente ao interior
do fagossomo e de forma rápida, pois a produção excessiva de EROs podem acarretar danos
aos tecidos. Um dos tipos de regulação da atividade desse complexo enzimático é a sua
separação em subunidades em diferentes compartimentos subcelulares (citosol e membrana
plasmática) durante o estado de repouso dessas células (Babior, 1999; Abbas, 2012). A
polimerização dos filamentos de actina também possui um papel importante na regulação da
montagem e estabilização dessa enzima (Bengtsson et al., 2006).
O O2- produzido pela NADPH oxidase ainda pode ser dismutado pela enzima
superóxido dismutase (SOD) produzindo peróxido de hidrogênio (H2O2), que pode ser
utilizado como substrato na produção de outras EROs e/ou outras ERNs tais como HOCL e
ONOO (Babior, 2000; Brigagão et al., 2000; Abbas, 2012).
Os radicais de nitrogênio também podem ser formados por sua reação com
radicais superóxidos. Como o peroxinitrito (ONOO-) que é um radical altamente reativo,
produzido a partir da reação do NO com o O2- (Abbas, 2012).
A reação do H2O2 com o íon Fe2+ forma outro composto reativo, o radical HO. E
também o H2O2 pode dar origem a outras moléculas altamente reativas. Um importante
composto é o ácido hipocloroso (HOCl) que é formado pela enzima mieloperoxidase (MPO)
na presença de íons Cl- (Clark, & Klebanoff, 1977; Klebanoff, 2005; Abbas, 2012).
Pode ocorrer ainda, a formação do oxigênio singlete (1O2) pela reação entre o
H2O2 e um halogênio oxidado, esta molécula é de grande importância para a morte de
microrganismos fagocitados (Kanovsky et al., 1984).
Segundo Nathan (2006), apenas os fagócitos possuem uma maquinaria complexa
para produzir ativamente e excretar grandes quantidades dessas espécies reativas. E apesar de
existirem outros mecanismos microbicidas, a geração das EROs e do ácido hipocloroso é
considerado o mecanismo mais crítico na destruição da maioria dos patógenos invasores
(Dale et al., 2008).
9
1.4 AGENTES ATIVADORES DA RESPOSTA MICROBICIDA DE NEUTRÓFILOS
Uma grande variedade de agentes é capaz de estimular o complexo enzimático da
NADPH oxidase em neutrófilos, tanto substâncias solúveis quanto as particuladas. Dentre as
substâncias solúveis encontram-se o fMLP e os ésteres de forbol, como o PMA. E dentre os
particulados encontram-se as bactérias, as leveduras e os complexos antígeno/anticorpo
opsonizados por componentes do sistema complemento (Andrews et al., 1984; Strnad et al.,
1986; Brigagão et al., 2000).
O PMA é um éster de forbol análogo do diacilglicerol, muito utilizado como
controle positivo de ativação in vitro. Os ésteres de forbol são produtos naturais isolados de
Crotontiglium e de outras plantas da família Euphorbiaceae (Botha, 1995).
O PMA é um agente estimulador solúvel que atravessa a membrana plasmática e é
capaz de disparar o “burst” oxidativo em neutrófilos (Edwards, 1996). Em neutrófilos do
sangue periférico humano estimulados com PMA, ocorre uma rápida fosforilação de
diferentes proteínas, tanto as presentes no citosol quanto as presentes no citosol e na
membrana plasmática, este evento está associado com a rápida produção de O2- por esses
fagócitos estimulados (Andrews et al., 1984). Entretanto o PMA só induz esse “burst”
oxidativo em altas concentrações (100 nM), promovendo a liberação ao máximo de EROs
(Botha, 1995).
Estudos in vitro também mostraram que o PMA pode atuar como um agente
quimiotático para neutrófilos humanos (Gabler et al., 1993). Além de promover alterações
morfológicas nessas células como a polimerização dos filamentos de actina (Downey et al.,
1992) e estímulo a vacuolização das mesmas (Karlsson et al., 2000).
O PMA, assim como outros estimuladores, mobiliza a formação de vesículas
secretórias, que são uma reserva de receptores associados à membrana, muito importantes na
resposta inflamatória (Senvelog et al., 1993 ).
Na literatura existem estudos demonstrando a atuação da atividade de drogas e
bioprodutos sobre células do sistema fagocítico, a fim de promover ativação celular para
atuação no combate aos patógenos (Lopes, et al., 2006; Maity, et al., 2009). Contudo, estudos
que visem à ação de metabólitos de fungos como agentes estimuladores de neutrófilos são
poucos, tornando-se assim, indispensável à realização de trabalhos nesta área.
10
1.5 ÁCIDO KÓJICO (AK)
O Ácido Kójico (AK), o 5-hidroxi-2-hidroximetil--pirona (HMP) (Figura 5) é um
metabólito secundário sintetizado por vários microorganismos, em especial fungos dos
gêneros Aspergillus, Acetobacter e Penicillium (Burdock et al., 2001; Nohynek, 2004; Parvez
et al., 2006; Rho et al., 2007; Rodrigues et al., 2011). É produzido a partir de um processo de
fermentação, envolvendo vários tipos de substratos que atuam como fonte de carbono (Rho et
al., 2007; Mohamad et al., 2010). Foi isolado pela primeira vez a partir de fungos do gênero
Aspergillus em 1907 e é uma substância cristalina altamente solúvel em água, etanol e acetona
(Gomes et al., 2001).
Figura 5: Estrutura química do ácido kójico.
Fonte: Rodrigues et al., 2011.
O AK possui uma ampla variedade de aplicações. Em relação à aplicabilidade
biológica, ele é comercializado no Japão há muitos anos como aditivo alimentar para vegetais
e frutos do mar (Burdock et al., 2001; Blumenthal, 2004; Nohynek, 2004; Bentley, 2006;
Chusiri et al., 2011). Também é encontrado em baixos níveis em comidas tradicionais
japonesas como molho de soja ou sakê (Nohynek, 2004).É utilizado nos alimentos como
antioxidante e intensificador de sabores (Burdock et al., 2001; Mohamad et al., 2010).
Burdock e cols (2001) mostraram que o AK é uma substância inofensiva para a saúde humana
na quantidade consumida como aditivo alimentar.
Em relação à aplicação terapêutica, o AK é amplamente utilizado em preparações
cosméticas como agente clareador (Lin & Huang, 2007), por possuir uma atividade inibitória
na formação da melanina e por sua ação protetora contra raios ultravioleta. Sendo bastante
11
utilizado também como componente fundamental em cremes para o tratamento de sardas e
manchas de idade e até mesmo produtos de clareamento dentário (Mohamad et al., 2010).
Além de prolongar a vida útil desses produtos, devido retardar sua degradação, tanto química
quanto microbiana (Uther et al., 1993).
O AK é um inibidor seletivo da tirosinase (Gupta et al., 2006; Sato et al., 2007;
Mohamad et al., 2010), que desempenha um papel chave na cascata melanogênica (Cabanes
et al., 1994; Virador et al., 1999). Por atuar como inibidor desta enzima, o AK auxilia no
tratamento de melasma, onde ocorre uma intensa produção da melanina (Lim, 1999; Parvez et
al., 2006; Mi Ha et al., 2007), devido à intensificação da ação da tirosinase (Gupta et al.,
2006; Smit et al., 2009).
Para avaliar a segurança (toxicidade e genotoxicidade) na utilização do AK,
Nohynek et al. (2004), realizaram uma revisão e concluíram que o seu uso pela via tópica não
oferece riscos ao consumidor. Possui, ainda, ação antioxidante contra espécies reativas de
oxigênio liberados no meio extracelular (Niwa & Akamatsu, 1991; Gomes et al., 2001).
Recentemente, um estudo realizado por Mohammadpour e colaboradores (2012),
demonstrou cicatrização de feridas em modelo animal, após o tratamento tópico com pomada
contendo diferentes concentrações de AK.
Além das funções já descritas, o AK possui outras aplicações, dentre elas:
industrial (Mohamad et al., 2010), antitumoral (Moto et al., 2006; Tamura et al., 2006; Higa
et al., 2007; Chusiri et al., 2011), agente radioprotetor (Emami et al., 2007), ação microbicida
em Candida albicans, Cryptococcus neoformans e Trichophyton rubrum, que são
considerados importantes patógenos humanos (Chee & Lee , 2003) e agente leishmanicida
(Rodrigues, 2010). Como também foi verificada a redução do número de ovos normais do
parasito Schistosoma mansoni, quando tratados com o metabólito (Fitzpatrick et al., 2007).
Em relação à ação do AK sobre neutrófilos humanos, há um único trabalho na
literatura em que foi observada a potencialização da produção intrínseca de radicais de
oxigênio, aumento da atividade fagocítica e da produção de Ca++ intracelular, um importante
íon relacionado com a ativação celular (Niwa & Akamatsu, 1991).
O nosso grupo mostrou recentemente que macrófagos peritoneais de murinos
tratados com 50µg/mL de AK apresentaram um aumento do espraiamento celular, formação
de filopódios, produção de radicais de oxigênio, alteração de componentes do citoesqueleto e
aumento do índice fagocítico, características de ativação celular (Rodrigues et al., 2011).
Os resultados obtidos em monócitos humanos, após tratamento nas concentrações
de 50 e 100 µg / mL de AK por 48 e 72 horas, mostraram que também ocorre ativação celular.
12
Além
disso,
análise
por
para
macrófago (F4/80)
imunofluorescência
demonstrou que
proteína
de
superfície específica
monócitos humanos tratados
com AK
mostraram um padrão de expressão dessas proteínas semelhante ao verificado em macrófagos
humanos originados de monócitos tratados com o Fator Estimulador de Colônia de Macrófago
(M-CFS). Estes
resultados
sugerem
que
o
AK pode
atuar
como um
agente imunomodulador, induzindo a diferenciação de monócitos em macrófagos (Costa,
2012).
Assim, estudos demonstraram que o AK é capaz de modular a resposta imune
mediada por macrófagos de murinos e monócitos humanos, atuando assim como ativador
dessas células. Contudo, até o presente momento existe apenas um único trabalho na literatura
relacionado à ação do metabólito em neutrófilos humanos.
13
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL:
Analisar o efeito do metabólito Ácido Kójico (AK) sobre neutrófilos humanos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
1. Analisar a viabilidade de neutrófilos humanos após o tratamento com AK;
2. Analisar alterações estruturais e ultraestruturais de neutrófilos humanos
tratados com AK;
3. Analisar o citoesqueleto (actina) de neutrófilos humanos seguido de tratamento
com AK;
4. Verificar a resposta microbicida de neutrófilos após tratamento com AK,
através da produção de Radicais Superóxidos e Óxido Nítrico;
5. Avaliar a capacidade fagocítica de neutrófilos tratados com AK.
14
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 OBTENÇÃO E CULTIVO DE NEUTRÓFILOS DO SANGUE PERIFÉRICO
HUMANO
Para obtenção dos neutrófilos foram obtidas bolsas com concentrado de leucócitos
provenientes da Fundação Centro de Hemoterapia e Hematologia do Pará (HEMOPA).
A purificação das células polimorfonucleares humanas foi realizada conforme
descrito anteriormente por Peres & Curi (2005) com algumas modificações. Este método
consiste na mistura do sangue com compostos que agregam as hemácias (polímeros de
polissacarídeos) e aumentam a taxa de sedimentação dos leucócitos.
As amostras contendo os leucócitos foram cuidadosamente adicionadas a tubos de
centrífuga de 15 ml contendo Histopaque®-1077 (Sigma Chem Co, St Louis, MO, U.S.A) na
proporção de 4,0 ml de Histopaque/8 ml de sangue. A separação das células ocorreu por
gradiente de densidade.
Posteriormente, essas amostras foram centrifugadas por 50 minutos a 1900 rpm
em temperatura de 23°C. Após isso, ocorreu à formação de um halo contendo células
polimorfonucleares, acima da camada de hemácias. As células foram aspiradas com auxílio de
uma pipeta Pasteur estéril. Em seguida, foram incubadas em uma solução de hemólise (150
Mm NH4Cl, 10 mM NaHCO3 , 0,1 mM EDTA, pH 7,4) em banho-maria a temperatura de 37º
C, por 10 minutos e depois foram centrifugadas a 1000 rpm por 10 minutos a temperatura de
4ºC.
O sobrenadante, contendo as hemácias hemolisadas, foi desprezado, e os neutrófilos
foram lavados com PBS e, posteriormente, ressuspendido em 1,0 ml de meio de cultura
DMEM sem soro.
A viabilidade celular foi avaliada pela técnica de exclusão com azul de Tripan,
sendo utilizadas apenas amostras com mais de 80% de viabilidade. Os polimorfonucleres
foram mantidos em suspensão de meio em tubo estéril contendo meio de cultivo DMEM. A
contagem das células foi feita em Câmara de Neubauer e a concentração ajustada de acordo
com o número de células utilizadas em cada experimento.
15
3.2 OBTENÇÃO E DILUIÇÃO DO METABÓLITO AK
O AK é um metabólito secundário obtido a partir de fungos do gênero Aspergillus
por um processo biotecnológico de acordo com Ferreira et al., 2010. Esta substância é
fornecida pelo grupo do Laboratório de Investigação Sistemática em Biotecnologia e
Biodiversidade Molecular da Universidade Federal do Pará.
A solução estoque foi preparada na concentração de 1mg/ml de AK diluída em
meio DMEM. A concentração final utilizada para cada experimento foi obtida a partir dessa
solução.
3.3 TRATAMENTO DAS CÉLULAS
Os neutrófilos foram tratados nas concentrações de 50 μg/mL e 100 μg/mL de AK
por 1 hora, e mantidos em estufa sob condições de 5% de CO2 a 37°C. Os procedimentos
foram realizados após o término desse tratamento. Neutrófilos não tratados foram utilizados
como controles.
3.4 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DAS CÉLULAS TRADADAS COM AK
Para análise do efeito do AK sobre a viabilidade de neutrófilos humanos, as
células foram tratadas com 50 e 100 µg/mL da droga por 1 hora. Foram utilizados três testes:
Vermelho Neutro (VN), detecção do Potencial da Membrana Mitocondrial- ΔΨM (JC1) e
Iodeto de Propídio (IP).
3.4.1 Teste do Vermelho Neutro (VN)
O Vermelho Neutro (VN) é um marcador catiônico, solúvel em água e possui a
capacidade de atravessar a membrana celular, concentrando-se nos lisossomos de células
viáveis. Esse marcador fixa-se por meio de ligações eletrostáticas em sítios aniônicos na
matriz lisossomal.
Assim, o teste baseia-se na capacidade de células viáveis incorporarem este
corante vital e acumularem em lisossomos. Alterações na membrana lisossomal resultam
numa redução da incorporação do VN, e desta forma é possível fazer a distinção entre células
16
viáveis e não viáveis (Babich et al.,1991; Rogero et al.,2003; Mamaca et al., 2005). O teste
foi realizado segundo o protocolo de Fotakis & Timbrell (2006) com adaptações.
Neutrófilos foram cultivados como descrito anteriormente, submetidos ao
tratamento com AK nas concentrações de 50 e 100 μg/mL. As células foram tratadas, depois
foram lavadas 2 vezes com PBS e incubadas com 1,7 μL/mL da solução VN (10 mM) diluído
em DMEM e, posteriormente, incubados à 37ºC em atmosfera contendo 5% de CO2 por 3
horas. Em seguida foi retirado o sobrenadante, lavado 1 vez com PBS e adicionado 200 μL da
solução de eluição contendo acetona:ácido acético (50:1) para solubilização dos cristais
seguido da incubação em agitação por 10 minutos. Após esses procedimentos, a solução
resultante foi transferida para placa de 96 poços e lida por espectrofotometria em leitor de
ELISA (BIO-RAD Model 450 Microplate Reader) em um comprimento de onda de 570 nm.
Como controle negativo, as células foram mortas com solução de 10% de formol em PBS.
3.4.2 Pelo Kit de Detecção de Potencial da Membrana Mitocondrial (JC-1)
O potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ) é um importante parâmetro da
função mitocondrial utilizado como indicador de viabilidade celular. O JC-1 é um marcador
fluorescente que mensura o potencial da membrana mitocondrial das células. A perda de
potencial de membrana mitocondrial é utilizada como indicador de apoptose.
O JC-1 possui formas conhecidas como “J-agregados” que coram células nãoapoptóticas com fluorescência vermelha intensa. Por outro lado, células apoptóticas com
baixo ΔΨ, permanecem na forma monomérica, apresentando apenas fluorescência verde
(Maianski et al., 2004 b).
Para realização do teste, neutrófilos foram cultivados em tubos de centrífugas e
submetidos ao tratamento por 1 hora com AK nas concentrações de 50 μg/mL e 100 μg/mL.
Após o tratamento, estas células foram centrifugadas a 1000 rpm por 10 minutos e
ressuspendidas em solução de PBS pH 7,4. Em seguida, as células foram novamente
centrifugadas a 1000 rpm por 10 minutos e incubados por 30 min com 10 mM de JC-1 a
37°C. Novamente foram centrifugadas, ressuspendidas em PBS e a fluorescência das células
foi imediatamente determinada por citometria de fluxo. As células foram analisadas utilizando
um citômetro de fluxo BD FACSCantoII TM em comprimento de onda de excitação de 488
nm, sendo que os monômeros de JC-1 emitem a 529 nm e os agregados a 590 nm. Os dados
foram obtidos utilizando o software BD FACSDiva. Um total de 10.000 eventos foram
17
coletados para cada amostra e analisados com auxílio do programa WinMDI 2.9. Foram
realizados três experimentos e os resultados foram expressos como porcentagens.
3.4.3 Iodeto de Propídio (IP)
A detecção da apoptose de neutrófilos foi realizada utilizando a marcação com
Iodeto de Propídio. O IP é impermeável à membrana plasmática íntegra, assim as células
negativas para a marcação com IP estão viáveis. Já nas células mortas o IP tem acesso ao
DNA celular devido à perda da integridade das membranas plasmática e nuclear destas células
(Rodrigues et al., 2011).
Para realização deste teste, neutrófilos foram cultivados em tubos de centrífuga e
submetidos ao tratamento por 1 hora com o AK nas concentrações de 50 e 100 μg/mL. Após o
tratamento, estes neutrófilos foram centrifugados, lavados com PBS e novamente
centrifugados. Em seguida, as células foram marcadas com 10 μL de IP por 30 minutos. Por
fim, as células foram novamente lavadas com PBS e a leitura feita imediatamente por
citometria de fluxo. Um total de 10.000 eventos foram coletados para cada amostra e
analisados conforme descrito no item 3.4.2. O experimento foi realizado três vezes e os
resultados foram expressos em porcentagens. Células marcadas pelo IP foram consideradas
mortas.
3.5 ANÁLISE MORFOLÓGICA DE NEUTRÓFILOS TRATADOS COM AK
3.5.1 Microscopia Óptica (MO)
Neutrófilos foram cultivados em lamínulas e, posteriormente tratados com HMP
nas concentrações de 50 μg/mL e 100 μg/mL, fixados com uma solução de tampão PHEM e
4% de paraformol durante 30 minutos e mantidos em tampão PHEM até ser realizada a
coloração. A coloração foi feita com o corante Giemsa, diluído a 10 % em água destilada,
durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após esse período, as células foram desidratadas
em acetona 100% e passadas em misturas crescentes de acetona–xilol, até duas passagens
finais em xilol puro. As lamínulas foram, então, montadas em lâminas de vidro, tendo
Entellan® como meio de montagem. As células foram analisadas em microscópio óptico
Axiophot. Como controles foram utilizados neutrófilos sem tratamento com HMP. E como
controle positivo, foram utilizadas células tratadas com 100 nM por 1 hora com PMA.
18
3.5.2Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Após tratamento com AK (item 3.3) as células foram processadas em lamínulas
de vidro. A desidratação foi feita em uma série de etanol em água a 30, 50, 70, 90% (10
minutos cada etapa) e 100% (3 vezes durante 10 minutos). As amostras foram secas pelo
método do ponto crítico (Modelo K 850 - Marca EMITECH) usando CO2. As lamínulas
foram fixadas em suporte apropriado e metalizadas com uma película de ouro, usando o
aparelho Emitech K550-England. As células foram analisadas nos microscópios eletrônicos
de varredura LEO 1450VP (Instituto Evandro Chagas) e Quanta 250, marca FEI Company
(Laboratório de Ultraestrutura Celular “Hertha Meyer” do Instituto de Biofísica Carlos
Chagas Filho – UFRJ). Como controles foram utilizados neutrófilos ativados com 100 nM de
PMA e células sem tratamento com AK.
3.5.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Neutrófilos foram cultivados e tratados como descrito nos itens 3.1 e 3.3
respectivamente. Posteriormente, foram fixados em uma solução contendo 2,5% de
glutaraldeido a 25%, 4% de paraformaldeído, 2,5% de sacarose, em tampão cacodilato de
sódio 0,1 M, pH 7.2. Após a fixação, as células foram lavadas 3 vezes em Tampão cacodilato
0,1 M e, posteriormente, incubadas em solução de pós-fixação contendo: 1% tetróxido de
ósmio e ferrocianeto de potássio 0,8% por 1 hora à temperatura ambiente. As células foram
lavadas três vezes em tampão cacodilato 0,1 M e então desidratadas em série crescente de
acetona durante 10 minutos à temperatura ambiente. Após desidratação as células foram
lentamente impregnadas com resina Epon nas seguintes concentrações: 2:1, 1:1 e 1:2 (acetona
100%: Epon - 12 horas em cada etapa). Em seguida o material foi colocado em Epon puro por
6 horas e depois no suporte para polimerização a 60o C por 48 horas. Os blocos polimerizados
foram cortados em ultramicrótomo (Leica EM UC6) e os cortes obtidos foram contrastados
com acetato de uralina 5% por 20 minutos, e posteriormente com citrato de chumbo por 5
minutos e observados em MET LEO 906 E. Como controles foram utilizados neutrófilos sem
tratamento com AK.
19
3.5.4 Análise de área celular (Morfometria)
A morfometria é um recurso utilizado para a medição de estruturas celulares. Foi
utilizada para medir a área total da célula, para avaliar se a utilização do AK em neutrófilos
estaria promovendo o aumento da área citoplasmática. Neutrófilos foram tratados como
descrito no item 3.3 e processados para a microscopia óptica e analisados conforme descrito
no item 3.5.1. Foram utilizadas três imagens de cada amostra para análise morfométrica
(células do grupo controle e tratadas) somando 50 células. Posteriormente a área total do
citoplasma das células foi medida através do programa ImageJ.
3.5.5 Detecção de filamentos de actina por Microscopia Óptica de Fluorescência
Neutrófilos foram cultivados e tratados como descrito no item 3.3. As células
foram fixadas em paraformaldeído 4% em tampão Phem 0,1 M por 1 hora. Posteriormente,
foram realizadas lavagens com PBS pH 8,0, seguido do processo de permeabilização com
Triton-X a 0,3%. Em seguida, as células foram novamente lavadas em PBS e os sítios de
ligação foram bloqueados com solução de NH4Cl 50mM.
Após o bloqueio, as células foram lavadas com PBS suplementado com 1 e 3% de
BSA. Para assim, serem incubadas com Faloidina (Molecular ProbesInvitrogen®), para
detecção de filamentos de actina, diluído 1:198 em PBS e DAPI, para marcação do núcleo,
diluído 1:10 por 40 minutos.
Por fim, as células foram lavadas em PBS e em água. Após isso, as lamínulas
foram montadas em lâmina contendo o Pro Long Gold antifade reagente (Molecular Probes
Invitrogen®). As células foram analisadas em Microscópio Confocal LSM5 ZEISS. As
células marcadas com Faloidina foram analisadas em filtro de 594 nm. A marcação com
DAPI foi analisada em filtro de 365 nm. Células ativadas como 100 nM de PMA foram
utilizadas como controle.
3. 6 RESPOSTA MICROBICIDA
3.6.1 Produção de Radicais Superóxidos em neutrófilos tratados com AK
Neutrófilos foram cultivados em placa de cultura de 24 poços como descrito no
item 3.3. As células foram lavadas com PBS e incubadas com meio contendo 1 mg/ml de
20
NitroblueTetrazolium (NBT) e 50 e/ou 100 μg/mL do AK. Como controle positivo foi
utilizado PMA. Após 1 h a 37 ºC e em atmosfera de 5% de CO, as células foram lavadas com
meio e fixadas em paraformaldeído 3% por 30 minutos, desidratadas e montadas em lâminas
de vidro, tendo Entellan® como meio de montagem. Após a montagem as células foram
analisadas em microscópio óptico Axiophot.
3.6.2 Detecção da produção de Óxido Nítrico (NO)
A determinação da concentração de nitrito no meio de cultura é uma forma
indireta de se determinar a concentração NO produzido. Pois, o óxido nítrico é rapidamente
convertido a nitrito em ambiente aquoso, e, assim, a concentração total de nitrito pode ser
utilizada como indicador da produção de óxido nítrico (Ding et al., 1988).
Portanto, para realização do teste, neutrófilos foram tratados por 1 hora com as
concentrações de 50 e 100 μg/mL de AK. Como controle negativo, foram utilizadas células
sem tratamento e como controle positivo, células incubadas com 15 μg/mL de LPS.
Este procedimento foi feito utilizando-se o método de Griess, que consiste em
adicionar 50μl do reagente de Griess (sulfanilamida a 1% em ácido fosfórico a 5% e
Naphtylenediamina a 0,1% em água destilada) a 50μl do sobrenadante dos neutrófilos tratados
ou não com HMP. A leitura foi realizada por espectrofotometria com um comprimento de
onda de 570 nm, e a concentração de nitrito expressa em μM de acordo com a curva padrão
estabelecida.
3.7 INTERAÇÃO DE Leishmania (leishmania) amazonensis COM NEUTRÓFILOS
TRATADOS COM AK
Os neutrófilos utilizados no ensaio foram obtidos como descrito no item 3.1. Para
observar o efeito do AK sobre a capacidade fagocítica dos neutrófilos, as células foram
tratadas por 1 hora. Em seguida, foi realizada a interação com Leishmania (leishmania)
amazonensis numa proporção de (1:10) durante 3 horas a 37 ºC em atmosfera de 5% de CO2.
Após esse período, o sobrenadante foi desprezado e os neutrófilos lavados com PBS, pH 7.2,
por três vezes, para retirar as leishmanias não internalizadas.
Em seguida, as células foram coradas com Giemsa e as lamínulas foram montadas
em lâminas de vidro, tendo Entellan como meio de montagem. Foram contados 200
neutrófilos por lamínula e o índice endocítico foi obtido calculando-se a porcentagem de
21
células que endocitaram e a média de parasitas por células. As células foram contadas em
microscópio óptico Olympus BX41.
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos foram analisados utilizando o GraphPedPrism Versão 5.0. Para
análise estatística foi utilizado análise de variância ANOVA seguido do Teste Tukey com
p<0,05.
22
4 RESULTADOS
4.1 AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DE NEUTRÓFILOS TRADADOS COM HMP
4.1.1 Teste do Vermelho Neutro (VN)
Este método fundamenta-se na captura do VN por lisossomos que possuam a
membrana celular íntegra, como observado em células viáveis. Não foi observada uma
diminuição de viabilidade das células tratadas com AK (Figura 6). Como controle negativo, as
células foram mortas com solução de 10% de formol em PBS.
AK
Figura 6. Viabilidade celular através do método VN de neutrófilos tratados com o AK durante 1 hora.
23
4.1.2 Pelo Kit de Detecção de Potencial da Membrana Mitocondrial (JC-1)
A viabilidade de neutrófilos tratados com AK foi avaliada pelo método JC-1. Este
método mostrou que neutrófilos tratados com 50 (Figura 7B) e 100 μg/mL (Figura 7C) de
HMP por 1 hora mantiveram-se viáveis. Isso indica que a droga utilizada não interfere na
viabilidade dos neutrófilos quando comparada as células sem tratamento (Figura 7A).
A
B
C
Figura 7. Potencial de membrana mitocondrial avaliado por citometria de fluxo após incubação com o JC1.
(A) Controle: neutrófilos sem tratamento. (B-C) Neutrófilos tratados com 50 e 100 μg/mL de AK,
respectivamente. JC-1 quando presente em mitocôndrias de células viáveis encontra-se em forma agregada e
fluoresce em 590 nm. Os números nos gráficos indicam as porcentagens da forma agregada.
24
4.1.3 Iodeto de Propídio (IP)
Para análise de morte celular foi utilizado o IP, onde apenas as células mortas são
capazes de reter o corante. Não foi observado aumento no número de células mortas tratadas
com o AK (Figura 8 B-C) quando comparadas com o controle sem tratamento (Figura 8A).
A
IP
B
IP
C
IP
Figura 8. Ensaio de apoptose por citometria de fluxo utilizando Iodeto de Propídio como marcador.
(A) Controle: neutrófilos sem tratamento. (B-C) Neutrófilos tratados com 50 e 100 μg/mL de AK,
respectivamente. Os números nos gráficos indicam as porcentagens de células marcadas com IP.
25
4.2 ANÁLISE MORFOLÓGICA DE NEUTRÓFILOS TRATADOS COM AK
4.2.1 Microscopia Óptica (MO)
A análise morfológica dos neutrófilos tratados por 1hora com 50 e 100µg/ml de
AK foi realizada por microscopia óptica. Foi observado um aumento na quantidade de
vacúolos, presença de projeções citoplasmáticas e aumento no volume de neutrófilos tratados
(Figura 9 E-F, G-H) em relação ao controle sem tratamento (Figura 9 A-B). E, para
comparação morfológica de neutrófilos ativados, as células foram tratadas com PMA (Figura
9 C-D).
26
Figura 9. Análise morfológica de neutrófilos tratados com AK e corados com Giemsa.
(A-B) Controle sem tratamento. Observar o tamanho da célula e a presença de pequenas projeções
citoplasmáticas. (C-D) Neutrófilos tratados por 1 hora com PMA. Observar a presença de projeções
citoplasmáticas e vacúolos. (E-F) Neutrófilos tratados com 50 µg/mL. (G-H) Neutrófilos tratados com 100
µg/mL. Observar nas células tratadas o aumento do tamanho celular, a presença de vacúolos e projeções
citoplasmáticas em comparação ao controle. Barra 10μm.
27
CTL
CTL
B
A
PMA
C
PMA
D
50 µg/mL
50 µg/mL
E
F
100 µg/mL
G
100 µg/mL
H
28
4.2.2Microscopia Eletrônica de Varredura
Para confirmação dos resultados observados em MO, foi realizada a MEV para
uma análise mais detalhada a respeito das alterações morfológicas. Neutrófilos tratados com
50 (Figura 11a-b) e 100 μg/mL (Figura 11 c-d) apresentaram aumento do volume celular e
projeções citoplasmáticas, semelhantes às alterações induzidas pelo PMA (Figura 10b). Já as
células sem tratamento (Figura 10a) permaneceram com a morfologia característica de
neutrófilos no estágio de repouso.
29
Figura 10. Análise ultraestrutural em MEV de neutrófilos
(A) Controle sem tratamento. Observar formato arredondado da célula e ausência de projeções
citoplasmáticas. (B) Neutrófilos tratados com PMA por 1 hora. Observar a presença de longas projeções
citoplasmáticas. Barra 15μm.
30
CTL
A
PMA
B
31
Figura 11. Análise ultraestrutural em MEV de neutrófilos tratados com 50 e 100 µg/mL de
AK.
(A-B) Neutrófilos tratados com 50 µg/mL. Barras: 5 e 15 μm respectivamente. (C-D) Neutrófilos
tratados com 100 µg/mL. Observar nas células tratadas a irregularidade na morfologia com o
surgimento de longas projeções citoplasmáticas e o aumento do volume celular. Barras: 4 e 15 μm
respectivamente.
32
50 µg/mL
50 µg/mL
A
B
100 µg/mL
100 µg/mL
C
D
33
4.2.3 Microscopia Eletrônica de Transmissão
Para obtenção de maiores detalhes acerca das alterações intracelulares induzidas
pelo AK nos neutrófilos foi realizada a MET. Foi observado a presença de muitas projeções
citoplasmáticas e vacúolos em células tratadas com 50 (Figura 13a) e 100 µg/mL (Figura 13b)
quando comparadas ao controle sem tratamento (Figura 12). Além disso, não houve alterações
nas organelas citoplasmáticas e no núcleo das células tratadas.
34
Figura 12. Análise ultraestrutural em MET de neutrófilos.
Controle sem tratamento. Observar formato arredondado da célula e ausência de projeções citoplasmáticas.
35
CTL
36
Figura 13. Análise ultraestrutural em MET de neutrófilos tratados com 50 e 100 µg/mL de AK.
(A) Neutrófilos tratados com 50 µg/mL.. (B) Neutrófilos tratados com 100 µg/mL. Observar nas células
tratadas a grande quantidade de vacúolos, longas projeções citoplasmáticas. N: Núcleo.
37
50 µg/mL
A
100 µg/mL
B
38
4.2.4 ANÁLISE DE ÁREA CELULAR (MORFOMETRIA)
Para analisar se houve aumento de área citoplasmática de neutrófilos tratados com
HMP, estas células foram analisadas por MO e posteriormente a área total do citoplasma foi
medida através do programa ImageJ. Assim, foi possível observar que neutrófilos tratados
com 50 e 100 μg/mL de AK sofreram aumento significativo da área citoplasmática em relação
ao grupo controle (Figura 14).
AK
Figura 14. Medida da área citoplasmática de neutrófilos tratados com AK.
Foi utilizado o teste estatístico Tukey (***) p < 0,001 representa a diferença entre células tratadas e o
controle sem tratamento.
39
4.2.5 Detecção de filamentos de actina por Microscopia Óptica de Fluorescência
Os filamentos de actina do citoesqueleto de neutrófilos tratados e não tratados
foram analisados utilizando a microscopia de fluorescência (Figuras 15 e 16) através da
marcação com Faloidina. O DAPI foi utilizado para a identificação e análise de alterações
nucleares. Células não tratadas demonstraram características semelhantes a neutrófilos
quiescentes (Figura 15 a, b, c). Células tratadas com PMA (Figura 15 d, e, f) apresentaram
características de células ativadas. Neutrófilos tratados com 50 μg/mL (Figura 16 a, b, c)
apresentaram dois tipos de alterações morfológicas. Demonstraram alterações no núcleo com
a liberação e o espalhamento do material genético e no citoesqueleto com a desorganização do
mesmo, essas alterações caracterizam a formação de ETs. No entanto, outras células
apresentaram somente o aumento do tamanho celular e formação de projeções
citoplasmáticas. E neutrófilos tratados com 100 μg/mL (Figura 16 d, e, f) apresentaram
aumento do tamanho celular e consequentemente polimerização dos filamentos de actina
favorecendo o espraiamento celular e formação de filopódios. As células foram analisadas em
Microscópio
Confocal
LSM5
ZEISS.
40
Figura 15. Detecção dos filamentos de actina do citoesqueleto de neutrófilos.
(A-C) Controle sem tratamento. Ausência de projeções citoplasmáticas. (D-F) Neutrófilos tratados com PMA.
Observar presença de projeções citoplasmáticas, aumento do tamanho celular e da intensidade da marcação.
Barra 10μm.
41
DAPI
Faloidina
Merge
42
Figura 16. Detecção dos filamentos de actina do citoesqueleto de neutrófilos tratados com 50 e 100 µg/mL
de AK.
(A-C) Neutrófilos tratados com 50 µg/mL de AK. Observar células com alterações morfológicas distintas:
aumento do tamanho celular em algumas células e formação de redes extracelulares em outras. (D-F) Neutrófilos
tratados com 100 µg/mL de AK. Observar presença de projeções citoplasmáticas e aumento do tamanho celular.
Barra 10μm.
43
44
4. 3 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA MICROBICIDA
4.3.1 Produção de Radicais Superóxidos em neutrófilos tratados com AK
A detecção da produção dos radicais superóxidos foi realizada através da reação
citoquímica utilizando a substância NBT. Foi detectada qualitativamente (Figura 17) e
quantitativamente (Figura 18) a produção dos radicais em neutrófilos tratados nas concentrações
de 50 e 100 μg/ml. Um controle negativo sem tratamento e um controle positivo com células
tratadas com PMA por 1 hora foram feitos para comprovar a especificidade do teste. Foi
observada uma maior produção de radicais superóxidos nas células tratadas quando comparadas
em relação ao controle.
45
Figura 17. Detecção da produção de superóxidos em neutrófilos tratados com 50 e 100 μg/mL de AK por
1 hora através da reação citoquímica com NBT.
(A) Controle negativo da reação, neutrófilos sem tratamento. Observar ausência da reação. (B) Controle positivo
da reação, neutrófilos estimulados com PMA. Observar forte reação. (C) Neutrófilos tratados com 50 μg/mL.
Observar reação por toda a célula. (D) Neutrófilos tratados com 100 μg/mL. Observar a presença de reação na
maioria das células. Barra: 10 μm.
46
CTL
A
PMA
B
100 µg/mL
50 µg/mL
C
D
47
Figura 18. Detecção da produção de superóxidos em neutrófilos tratados com 50 e 100 μg/mL de AK
por 1 hora através da reação citoquímica com NBT.
A produção de superóxidos foi avaliada a partir da contagem de 200 células. Os valores são expressos como
média de 3 experimentos.
48
4.3.2 Detecção da produção de Óxido Nítrico (NO)
Para detectar a produção de NO em culturas de neutrófilos tratadas com o extrato
aquoso foi realizado o método de Griess para análise de nitrito/nitrato. Foi possível observar
que não ocorreu a produção de NO em células tratadas por 1 hora com o AK nas
concentrações de 50 e 100 µg/ml, quando comparadas com o controle sem tratamento (Figura
19). Como controle positivo, as células foram estimuladas com 15 µg de LPS por 4 horas.
Figura 19. Detecção da produção de óxido nítrico em neutrófilos tratados com 50 e 100 μg/mL por 1
hora.
Foi utilizado ANOVA, t Student. (*) p < 0,05 representa a diferença entre células estimuladas com LPS e o
CTL sem tratamento e os neutrófilos tratados.
49
4. 4 AVALIAÇÃO DA INTERAÇÃO DE Leishmania (leishmania) amazonensis COM
NEUTRÓFILOS TRATADOS COM AK
A análise da atividade fagocítica foi realizada utilizando neutrófilos tratados com
50 e 100 µg/mL de AK por 1 h e submetidos à interação com Leishmania (leishmania)
amazonensis. Posteriormente, foi realizada a contagem do número de partículas fagocitadas
em microscópio óptico de campo claro. Foi observado aumento do índice fagocítico em
células tratadas com AK. No entanto, o aumento só foi significativo na concentração de 50
µg/mL (Figura 20).
Figura 20. Índice endocítico de neutrófilos tratados com 50 e 100 µg/mL de AK, seguido da interação
por 3h com Leishmania (leishmania) amazonensis.
50
5 DISCUSSÃO
Neutrófilos são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos e o primeiro
tipo celular a ser recrutado para locais de infecção. Os neutrófilos participam da defesa
primária contra infecções bacterianas e fúngicas, além de serem capazes de fagocitar
patógenos e destruí-los pela combinação de espécies reativas de oxigênio, nitrogênio e de
componentes citotóxicos (Faurschou & Borregaard, 2003; Klebanolff, 2005; Kobayashi et al.,
2005; Quinn et al., 2006; Nauseef, 2007).
O desenvolvimento de bioprodutos que atuem na ativação de células fagocíticas e
consequentemente no sistema imune inato é de suma importância na prevenção da invasão do
organismo por microrganismos. Muitas substâncias de origem vegetal vêm sendo estudadas
com a finalidade de buscar agentes ativadores dessas células (Lopes, et al., 2006; Maity, et
al., 2009; Fuzissaki, 2009). Contudo, existem poucos estudos relacionados à ação de
metabólitos sobre neutrófilos humanos, por isso a necessidade da realização de trabalhos nesta
área.
No presente estudo foram realizados inicialmente testes de viabilidade para
verificar se o AK apresentava algum efeito citotóxico em neutrófilos humanos. Em todos os
testes utilizados não houve redução significativa do número de células viáveis após
tratamento quando comparadas ao controle. Pelo contrário, as células tratadas demonstraram
ter uma taxa de viabilidade maior que o controle, sugerindo que o AK possa atuar na ativação
e, consequentemente, retardando a apoptose das mesmas. Como observado em estudos com o
fMLP e o GM-CSF, os quais são agentes ativadores capazes de retardar a apoptose de
neutrófilos (Akgul et al., 2001; Lotz et al., 2004).
Resultados semelhantes foram obtidos por Rodrigues e colaboradores (2011), em
que o AK não apresentou efeito citotóxico para macrófagos peritoneais provenientes de
camundongos após tratamento por 1 hora. Posteriormente, Costa (2012) observou que o AK
não é citotóxico para monócitos humanos, após tratamento por 24, 48, 72 e 96 horas.
Em seguida foram avaliadas as alterações morfológicas após tratamento com AK,
com o intuito de caracterizar o fenótipo que estas células apresentavam em decorrência dos
efeitos do metabólito. Foi possível observar que neutrófilos tratados apresentaram maior
número de projeções citoplasmáticas, aumento de volume e intensa vacuolização. A presença
de projeções citoplasmáticas e aumento do volume celular foram confirmados em análises por
microscopia eletrônica de varredura. As células apresentaram características morfológicas
semelhantes àquelas apresentadas por neutrófilos tratados com PMA. Além disso, análises por
51
microscopia eletrônica de transmissão mostraram que neutrófilos tratados apresentaram
considerável número de projeções citoplasmáticas, com número considerado de vacúolos e
sem alterações nos núcleos e organelas. Estes resultados são semelhantes aqueles obtidos por
Rodrigues e colaboradores (2011) e Costa (2012) em macrófagos peritoneais de camundongos
e monócitos humanos, respectivamente.
Para complementar os resultados obtidos por microscopia, foi realizada análise
morfométrica de neutrófilos tratados com o AK para confirmar o aparente aumento celular
visualizado nas análises morfológicas. Após a medição da área foi observado que as células
tratadas nas concentrações de 50 e 100 μg/mL sofreram aumento significativo quando
comparados ao controle sem tratamento. Resultados semelhantes foram mostrados por
Hoffstein e colaboradores (1982) em que observaram o aumento do volume celular que
facilitou a adesão em neutrófilos ativados com fMLP.
Como o AK promoveu alterações morfológicas semelhantes às promovidas pelo
PMA e todas essas alterações são características típicas de células ativadas, (Botha, 1995;
Kitchen, 1996; Vulcano, 1998; Swain, 2002; Sheppard, 2005), pode ser sugerido que o AK
esteja induzindo ativação celular.
A ativação de neutrófilos também é acompanhada pela reorganização do
citoesqueleto de actina a partir da interação de mediadores químicos com receptores
específicos da superfície celular (Rossi et al., 1983; Omann et al., 1987). Para avaliar se o AK
também á capaz de induzir alterações no citoesqueleto dessas células, foi realizada a
marcação com Faloidina. Foi observado que este metabólito promoveu a polimerização dos
filamentos de actina em células tratadas, semelhante à atuação de alguns ativadores já
conhecidos, como o PMA e o fMLP (Lepidi et al., 1995).
O processo de ativação em neutrófilos pode levar a liberação do material genético
associado a histonas e a proteínas para o meio extracelular e formar redes extracelulares, em
um processo conhecido como autruismo celular. Essas redes podem ser induzidas por
estruturas presentes na superfície de patógenos ou por substâncias ativadoras (GuimarãesCosta et al., 2011). Por exemplo, o tratamento de neutrófilos com PMA por 4 horas, com
interleucina 8 (IL-8) ou com LPS induzem a formação dessas redes (Brinkmann et al., 2004).
No presente trabalho foi observado que após tratamento na concentração de 50 μg/mL, uma
grande quantidade de neutrófilos apresentaram um citoesqueleto desorganizado e o material
genético liberado para o meio extracelular sugerindo que em algumas células, o AK pode
induzir um metabolismo microbicida mais eficaz, com liberação de redes extracelulares. Além
de células com características de ativação.
52
Outra característica de ativação dessas células foi observada com a produção
elevada de radicais superóxidos. O radical superóxido é a primeira espécie reativa de oxigênio
formada durante o “burst” oxidativo, através da redução do oxigênio molecular por meio da
ativação do complexo NADPH-oxidase. Estes radicais apresentam importante papel na
atividade microbicida dessas células, tornando-se um fator fundamental na defesa do
organismo (Siddiqui et al., 1995; Granfeldt, 2002).
A avaliação da produção de radicais superóxidos das células tratadas com o HMP
nas concentrações de 50 e 100 µg/ml demonstrou que o metabólito induziu um aumento na
produção desses radicais. Esses dados corroboram com o estudo de Niwa & Akamatsu
(1991), que observaram um aumento na produção desses radicais quando essas células foram
tratadas em diversas concentrações de AK.
Em contrapartida, neutrófilos tratados com AK não aumentaram a produção de
óxido nítrico, ocorrendo uma diminuição quando comparados ao controle. Resultado similar
foi encontrado por Rodrigues e cols (2011) em que os autores observaram que macrófagos
peritoneais de camundongos tratados com 50 e 100 µg/ml de AK não produziram óxido
nítrico. Estes resultados sugerem que o AK possa atuar na ativação dessas células através da
via de produção de espécies reativas de oxigênio e não de espécies reativas de nitrogênio.
O metabolismo oxidativo em célula fagocíticas é acompanhado da fagocitose
(Ertel et al., 1997; Van Eeden et al., 1999). Para confirmar o fenótipo de ativação de
neutrófilos tratados com o HMP foi avaliada a capacidade fagocítica dessas células durante a
interação com Leishmania (Leishmania) amazonensis. Os resultados obtidos mostraram que
ocorreu um aumento significativo da internalização deste patógeno, após o tratamento com
AK. Niwa & Akamatsu (1991) observaram que após tratamento de neutrófilos com AK nas
concentrações de 0.05, 0.5, 5 e 20 µg/mL ocorreu o aumento da fagocitose de leveduras. Estes
resultados mostram que AK pode induzir o processo fagocítico em neutrófilos.
Assim, pode-se inferir que o AK pode atuar como ativador dessas células devido
às alterações morfológicas observadas, pelo aumento da produção de radicais superóxidos e
pelo aumento da capacidade fagocítica, além de não possuir efeito citotóxico sobre as
mesmas.
53
6 CONCLUSÃO
Os resultados apresentados e discutidos permitem concluir que:
1. Não houve diminuição na viabilidade celular e nem aumento da indução de
morte celular em neutrófilos humanos tratados com o AK.
2. O metabólito AK foi capaz de promover alterações morfológicas em
neutrófilos humanos, uma vez que houve aumento do volume celular, aumento da
quantidade de vacúolos, projeções citoplasmáticas e alteração nos componentes
do citoesqueleto.
3. O metabólito AK induziu a formação de redes extracelulares na concentração
de 50 µg/mL.
4. O AK não promoveu um aumento na produção de óxido nítrico de neutrófilos
tratados.
5. O metabólito AK proporcionou a produção de radicais de oxigênio em
neutrófilos tratados.
6. O AK induziu ao aumento da capacidade fagocítica de neutrófilos humanos.
54
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