Texto completo - Fiocruz Minas

Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte
Programa de Pós-graduação em Clínica Médica e Biomedicina
AVALIAÇÃO DO PAPEL DA APOPTOSE NAS
DIFERENTES FORMAS CLÍNICAS DA DOENÇA
DE CHAGAS
por
ANA THEREZA CHAVES
Belo Horizonte
Outubro/2009
TESE DIMUNO-SCMBH
A.T. CHAVES
2009
Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte
Programa de Pós-graduação em Clínica Médica e Biomedicina
AVALIAÇÃO DO PAPEL DA APOPTOSE NAS
DIFERENTES FORMAS CLÍNICAS DA DOENÇA
DE CHAGAS
por
ANA THEREZA CHAVES
Tese apresentada com vistas à obtenção do
Título de Doutor em Clínica Médica e
Biomedicina
na
área
de
concentração
Imunologia.
Orientação: Dr. Rodrigo Correa Oliveira
Co-orientações:
Dr. Giovanni Gazzinelli
Dra. Juliana de Assis Silva Gomes
Belo Horizonte
Outubro/2009
ii
Catalogação-na-fonte
Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ
Biblioteca do CPqRR
Segemar Oliveira Magalhães CRB/6 1975
Chaves, Ana Thereza.
A658
2009
Avaliação da apoptose nas diferentes formas
clínicas da doença de Chagas / Ana Thereza Chaves.
– Belo Horizonte, 2009.
xxiii, 151 f: il.; 210 x 297mm.
Bibliografia: f. 155 – 174
Tese (doutorado) – Tese para obtenção do
título de Doutor em Ciências pelo Programa de Pósgraduação em Clínica Médica e Biomedicina da
Santa Casa de Misericórdia – Belo Horizonte. Área
de concentração: Imunologia.
1. Doença de Chagas/imunologia 2. Doença
de Chagas/apoptose 3. Linfócitos/imunologia 4.
Trypanosoma cruzi/imunologia I. Título. II. CorreaOliveira, Rodrigo (Orientação). III. Gazzinelli,
Giovanni (Co-orientação) e Gomes, Juliana de Assis
Silva (Co-orientação).
CDD – 22. ed. – 616.936 3
iii
Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte
Programa de Pós-graduação em Clínica Médica e Biomedicina AVALIAÇÃO DO PAPEL DA APOPTOSE NAS
DIFERENTES FORMAS CLÍNICAS DA DOENÇA
DE CHAGAS
por
ANA THEREZA CHAVES
Foi avaliada pela banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Dr. Rodrigo Correa Oliveira (Presidente)
Prof.a Dr.a Ana Maria Caetano de Faria
Prof. Dr. André Talvani
Prof.a Dr.a Silvana Maria Eloi Santos
Prof.a Dr.a Walderez Ornelas Dutra
Suplente: Prof. Dr. José Augusto Nogueira Machado
Tese defendida e aprovada em 28/10/2009
iv
Este trabalho foi desenvolvido no Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ no
Laboratório de Imunologia Celular e Molecular.
COLABORADORES
Centro de Pesquisas René Rachou – Belo Horizonte
Dra. Andréa Teixeira Carvalho
Dra. Maria José Morato
Dra. Fernanda Fortes Araújo
Ms. Jacqueline Araújo Fiúza
Rafaelle Christine Gomes Fares
Karine Silvestre Ferreira
Universidade Federal de Minas Gerais
Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha
Dra. Elaine Maria de Souza Fagundes
Dra. Débora d’Avila Reis
Universidade Federal de Uberlândia
Dr. Alexandre Barcelos Morais da Silveira
SUPORTE FINANCEIRO
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – nº 474887/20049)
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG – nº CBB-1322/05)
Programa Estratégico de Apoio à Pesquisa em Saúde (PAPES IV– nº 400266/2006-7)
Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ
v
“São muitos os que se obstinam em seguir pelo caminho
escolhido; poucos os que perseguem um objetivo”.
(Friedrich Nietzsche)
“Vitórias fáceis são vitórias baratas. As únicas dignas de
se ganhar são as que vêm como resultado de uma grande
luta”.
(Henry Ward Beecher)
vi
Dedico este trabalho aos pacientes portadores da doença de Chagas, pois sem a participação
voluntária deles nada seria possível.
vii
AGRADECIMENTOS
“Agradecer é uma das coisas mais belas que o ser humano pode fazer. É admitir que houve
um momento em que se precisou de alguém”.
Considero que a elaboração de uma tese de doutorado é um produto coletivo embora
sua redação, responsabilidade e stress sejam predominantemente individuais. Várias pessoas
contribuíram para que este trabalho chegasse a bom termo. A todas elas registro minha
gratidão.
Ao meu orientador, Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira, agradeço eternamente por ter me
acolhido em seu laboratório e com isso ter aberto portas e possibilidades para a minha vida
profissional. Agradeço pelo incentivo, confiança e principalmente pela oportunidade de
realizar este trabalho. Obrigada por contribuir para o meu crescimento científico e pessoal.
Ao Dr. Giovanni Gazzinelli pela confiança, quando me apresentou a Pós-Graduação
da Santa Casa. Foi um enorme orgulho para mim, ter um pesquisador que sempre me inspirou
admiração, como co-orientador de doutorado. Muito obrigada pela oportunidade!
À Dra. Juliana de Assis Silva Gomes agradeço pela grande oportunidade de confiar a
mim a sua idéia de desenvolver este projeto, relacionando apoptose x doença de Chagas.
Sabemos que foi um tema novo onde todos os protocolos experimentais tiveram que ser
padronizados, já que a idéia e as técnicas inovadoras foram um árduo desafio. Apesar de todas
as dificuldades e da longevidade do projeto, por dificuldades inerentes ao espírito desbravador
de um tema novo, conseguimos enfim alcançar os nossos objetivos. Valeu por todas as horas
de concordâncias e discordâncias, pois somos pessoas diferentes em alguns pontos, mas em
relação à Ciência temos a mesma paixão! Muito obrigada pela co-orientação, por ter me
concedido o prazer de pertencer ao “Grupo Chagas”, pelas sugestões, críticas construtivas e
elucidações para a finalização desta etapa.
Às Instituições de Ensino e Pesquisa – Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ e
ao Núcleo de Pós-Graduação e Pesquisa da Santa Casa de Misericórdia de Belo Horizonte –
por proporcionarem meu aprendizado e minha formação acadêmica.
Aos órgãos financiadores – CPqRR/FIOCRUZ, CNPq, PAPES, FAPEMIG – que
proporcionaram a realização deste projeto. E também a CAPES por te me proporcionado os 4
anos de bolsa de doutorado, caso contrário, este trabalho não seria possível.
Ao Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha, pela disponibilidade, e acima de tudo pelo
exemplo profissional e humanitário. Obrigada pela generosidade de compartilhar comigo seu
enorme conhecimento que foi fundamental para a realização deste trabalho. Serei eternamente
viii
grata por sua confiança em mim, respeito e por sua amizade. “Ensinar é um exercício de
imortalidade. De alguma forma continuamos a viver naqueles cujos olhos aprenderam a ver
o mundo pela magia da nossa palavra. O professor, assim, não morre (...)”.
À Dra. Maria José Morato (Zezé) agradeço imensamente por compartilhar comigo seu
enorme conhecimento e verdadeiro amor à Ciência. Sempre disposta a oferecer estímulos e,
principalmente, a percorrer novos caminhos, ouvir com interesse e ânimo todas as questões,
dúvidas e problemas que surgiam durante o processo de reflexão. Por ser paciente e generosa
e pela coragem de ousar trabalhar com novas idéias e conceitos, correndo os riscos inerentes a
esta atitude. Por sua amizade, principalmente. Pela compreensão silenciosa dos momentos
difíceis pelos quais passei, permitindo que meu tempo interno fluísse, respeitosamente. Pela
alegria de trabalharmos juntas. Muito obrigada!
À Dra. Andréa Teixeira a sua disponibilidade incontestável, a sua forma criativa,
paciente, atenciosa que deram norte a este trabalho, facilitando o alcance de seus objetivos. À
Andréa meus irrestritos agradecimentos pela orientação, direcionamento e ensinamentos para
o desenvolvimento desta tese.
Aos colaboradores – Dra. Elaine Maria de Souza Fagundes, Dra. Débora d’Avila Reis
e Dr. Alexandre Barcelos – que confiaram e se propuseram a ajudar. Muito obrigada pelas
sugestões, apoio, incentivo e dedicação. Sem colaboradores não seria possível a realização e
finalização deste trabalho.
Às minhas amigas do “Grupo Chagas” Fê, Jacq, Rafa e Karine obrigada pelo carinho,
pela paciência, pela amizade, pelos dias e dias de ajuda (principalmente aos sábados e
domingos) na parte experimental desta tese, por tudo que vivemos juntas nestes últimos anos.
Valeu meninas!!!!!!! Tenho certeza que vocês adoraram! Ahhhh! Principalmente os meus
lanchinhos naturais, né Fê?! À Karine agradeço de forma especial pela colaboração nos
experimentos, pois você tinha acabado de chegar no LICM e realmente trabalhou hem?!
“Foguetinho na mão, Karineeeeee”!!!!!!! Sem vocês este trabalho seria mais árduo e difícil.
Muito obrigada pelo incentivo contínuo durante toda a minha trajetória.
Tive o grande privilégio de conhecer durante o meu doutorado, Jacqueline Fiúza que
esteve comigo em todos os momentos, principalmente nas horas que mais precisei de apoio,
incentivo e ajuda. Agradeço por sua amizade, por ter me emprestado os seus braços
(literalmente) quando eu não conseguia usar os meus. Pode ter certeza que essa foi a maior
prova de profissionalismo, lealdade, amizade, humanidade. Com certeza esta vitória é nossa
!!!!!! Sua presença foi a responsável pela minha saúde afetiva.
ix
Aos colegas, de hoje e de ontem, do Laboratório de Imunologia Celular e
Molecular/CPqRR pelo convívio, carinho e amizade: Ana Carolina Campi de Azevedo,
Andréia Rizia, Andréia Maria Molica, Alexandre Barbosa Reis, Daniela Carla Medeiros
Silva, Daniela de Melo Resende, Daniel Menezes Souza, Denise da Silveira Lemos
Giunchetti, Eduardo Augusto dos Santos Moreira Silva, Fernanda Fortes de Araújo, Flávio
Guimarães da Fonseca, Helton Santiago, Jacqueline Araújo Fiuza, Jaqueline Maria Siqueira
Ferreira, Karine Silvestre Ferreira, Luanda Guerra, Luciana Maria de Oliveira, Nilton Barnabé
Rodrigues, Marcos Paulo de Souza Damásio, Matheus Costa e Silva, Pedro Henrique
Gazzinelli, Pollyanna Castro e Silva, Rafaelle Christine Gomes, Paula França, Ricardo Toshio
Fujiwara, Rodolfo Cordeiro Giunchetti, Roberta Oliveira Prado, Sabrina Sidney Campolina,
Solange Cristina Busek, Stefan Michael Geiger, Vladimir Martins Pinheiro.
Agradeço a Luciana Lisboa Mota e Castro e a Lorena Júnia de Souza Santos também
pela disponibilidade, ajuda e presteza nos experimentos de apoptose. Obrigada pela IMENSA
ajuda no momento que mais precisei de “apoio técnico”! Foi muito agradável a convivência
com vocês!
À Ana Beatriz Ribeiro de Queiroz (Tiza) pela disponibilidade e presteza na leitura dos
experimentos em citometria de fluxo.
À Clari Lopes Gandra Martins agradeço, em primeiro lugar, pela alegria que você
proporciona ao nosso ambiente de trabalho! Muito obrigada pelo carinho, amizade,
disponibilidade em ajudar com grande competência nos momentos que mais precisei. Muito
obrigada Clari!!!!!!!
À Renata Gazzi Salum e ao Wallison Silva Gonçalves pela ajuda nos assuntos
burocráticos, nas compras dos materiais sempre com muita eficiência, paciência, presteza.
Obrigada por tudo!
Ao corpo técnico do Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Ana Pacheco,
Ricardo Ribeiro e Rita de Cássia da Cruz de Paula pelo importante trabalho de lavagem dos
materiais e limpeza do laboratório.
Às secretárias da Pós-Graduação da Santa Casa, Shirley e Zélia, por sempre atender
aos meus pedidos com muito profissionalismo, educação. Muito obrigada pela presteza as
minhas solicitações.
À Biblioteca do CPqRR em prover acesso gratuito local e remoto à informação
técnico-científica em saúde custeada com recursos públicos federais, integrante do rol de
referências desta tese, também pela catalogação e normalização da mesma.
x
A minha família agradeço pelo apoio incondicional para que este trabalho fosse
realizado e finalizado, mesmo sem terem a mínima idéia do que estava sempre fazendo.
Obrigada por compartilharem comigo tanto das minhas alegrias, vitórias como das minhas
tristezas, angústias. Muito obrigada por tudo! Ufa acabei a tese de doutorado!!!!!
A Deus por ter me dado forças, sabedoria, maturidade, humildade e evolução para eu
conseguir finalizar esta etapa.
Ao meu “anjo da guarda” agradeço, pois são os anjos que segundo as crenças cristãs,
Deus envia no nosso nascimento para nos proteger durante toda a nossa vida. Argumenta-se
que a Bíblia sustenta em algumas ocasiões a crença do anjo da guarda: "Vou enviar um anjo
adiante de ti para te proteger no caminho e para te conduzir ao lugar que te preparei".
(Êxodo 23, 20).
“Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo propósito debaixo do céu... Tempo
de chorar e tempo de rir, tempo de prantear e tempo de saltar de alegria”.
Eclesiastes 3,1-4
xi
Sumário
Lista de Figuras........................................................................................
xv
Lista de Tabelas........................................................................................
xix
Lista de Abreviaturas e Símbolos............................................................
xx
Resumo.......................................................................................................
xxii
Abstract......................................................................................................
xxiii
1 INTRODUÇÃO......................................................................................................... 24
2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 38
2.1 OBJETIVO GERAL...............................................................................................38
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................38
3 MATERIAS E MÉTODOS .......................................................................................39
3.1 Locais de realização................................................................................................ 39
3.2 Caracterização da população estudada ................................................................... 39
3.2.1 Critérios de inclusão ............................................................................................ 40
3.2.2 Critérios de exclusão............................................................................................ 40
3.2.3 Grupos de estudo ................................................................................................. 42
3.3 Coleta do sangue periférico .................................................................................... 43
3.4 Contagem de Leucócitos......................................................................................... 43
3.5 Obtenção do antígeno solúvel da forma epimastigota de T. cruzi (EPI) ................43
3.6 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos não infectados e
pacientes portadores da fase crônica da doença de Chagas por citometria de fluxo ................ 44
3.6.1 Detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V conjugada ao 7AAD
.................................................................................................................................................. 44
3.6.2 Detecção de apoptose através da marcação por Caspase-3 ativa ........................ 45
3.7 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) .....................47
3.8 Ensaio de proliferação celular ................................................................................ 47
3.9 Análise de marcadores de superfície e citocina intracitoplasmática (TNF-α) em
linfócitos totais ......................................................................................................................... 48
3.10 Detecção do nível de citocinas plasmáticas..........................................................50
xii
3.11 Obtenção e análise dos dados no citômetro de fluxo............................................53
3.12 Análise Estatística................................................................................................. 62
4 RESULTADOS .........................................................................................................64
4.1 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND e
CARD, por citometria de fluxo, através da utilização do Kit de marcação por Anexina-V
conjugada ao 7AAD ................................................................................................................. 66
4.1.1 Análise do percentual de linfócitos totais anexina+ ............................................. 66
4.1.2 Análise do percentual de linfócitos T CD4+anexina+ .......................................... 70
4.1.3 Análise do percentual de linfócitos T CD8+anexina+ .......................................... 71
4.2 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND e
CARD através da detecção de Caspase-3 ativa por citometria de fluxo .................................. 73
4.2.1 Análise do percentual de linfócitos totais caspase 3+ .......................................... 73
4.2.2 Análise do percentual de linfócitos T CD4+ caspase 3+ ....................................... 76
4.2.3 Análise do percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+ ....................................... 77
4.3 Análise do percentual de expressão da molécula CD25 em subpopulações de
linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD......................79
4.3.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD25- e
TCD4+CD25high ........................................................................................................................ 79
4.4 Análise do percentual de expressão da molécula CD25 na superfície dos linfócitos
+
T CD8 no sangue periférico dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD............................ 83
4.4.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD25+ ....................... 83
4.5 Análise do percentual de expressão da molécula CD28 em subpopulações de
linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD ...................... 85
4.5.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD28- ........................ 85
4.5.2 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD28- ........................ 87
4.6 Análise do percentual de expressão da molécula CD62L em subpopulações de
linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD......................89
4.6.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD62L- ...................... 89
4.6.2 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD62L- ...................... 91
4.7 Análise do percentual de expressão da molécula CD69 em subpopulações de
linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD......................93
4.7.1 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD69+ ....................... 93
4.7.2 Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD69+ ....................... 95
xiii
4.8 Análise de citocinas intracitoplasmática em linfócitos totais e nas subpopulações T
CD4+ e T CD8+ dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD ................................................. 97
4.9 Avaliação do padrão de citocinas plasmáticas em indivíduos dos grupos NI, IND e
CARD ..................................................................................................................................... 101
4.10 Ensaio de proliferação de PBMCs dos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD
................................................................................................................................................ 104
4.11 Resumo dos Resultados ...................................................................................... 105
5 DISCUSSÃO ........................................................................................................... 108
6 CONCLUSÃO......................................................................................................... 119
7 ANEXO I ................................................................................................................. 120
8 ANEXO II................................................................................................................ 135
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................155
xiv
Lista de Figuras １
Figura 1 - Análise quantitativa de citocinas no plasma utilizado pelo BD CBA Analyses
Software. Inicialmente, o programa promove a seleção automática da população de
esferas de captura em gráficos de tamanho versus granulosidade (Figura 1A). Em seguida,
separa as esferas e analisa da intensidade de fluorescência correspondente ao complexo
esfera-citocina-anticorpo PE (Figuras 1B e 1C). ............................................................... 52 Figura 2 - Análise de linfócitos totais anexina+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e
forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo............................................................ 55 Figura 3 - Análise de linfócitos T CD4+anexina+ e T CD8+anexina+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo. ..................... 56 Figura 4 - Análise de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e
forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo............................................................ 57 Figura 5 - Análise de linfócitos T CD4+ caspase 3+ e T CD8+ caspase 3+ do sangue
periférico de indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas –
forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo............ 58 Figura 6 - Análise de linfócitos T CD4+CD62L- e CD8+CD62L- do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo. ..................... 60 Figura 7- Análise de linfócitos T CD4+CD25high e T CD4+CD25- do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de fluxo. ..................... 61 Figura 8 – Desenho esquemático de um gráfico Box- plot utilizado para demonstração dos
dados com resumo da interpretação...................................................................................63 Figura 9 - Avaliação do percentual de linfócitos totais anexina+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 66 xv
Figura 10 - Avaliação do percentual de linfócitos totais anexina+, do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 69 Figura 11 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD4+anexina+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 70 Figura 12 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+anexina+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 72 Figura 13- Avaliação do percentual de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 73 Figura 14 - Avaliação do percentual de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 75 Figura 15 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+ do sangue periférico
de indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 76 Figura 16 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 78 Figura 17 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD25+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 80 Figura 18 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD25high do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes portadores com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 82 Figura 19 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD25+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 84 Figura 20 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD28- do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 86 xvi
Figura 21 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD28- do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 88 Figura 22 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD62L- do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 90 Figura 23 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD62L- do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 92 Figura 24 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD69+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 94 Figura 25 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD69+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 96 Figura 26 - Análise da expressão de linfócitos totais TNF-α+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 98 Figura 27 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+TNFα-+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). .............................................................. 99 Figura 28 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+TNFα-+ do sangue periférico de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). ............................................................ 100 Figura 29 – Dosagem de TNF-α (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). ............................................................ 102 Figura 30 – Dosagem de IFN- (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). ............................................................ 102 Figura 31 – Dosagem de IL-2 (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). ............................................................ 103 xvii
Figura 32 – Dosagem de IL-10 (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de
indivíduos não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma
indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD). ............................................................ 103 Figura 33 - Proliferação celular de PBMCs de indivíduos do grupo não infectados (NI) e de
pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca
(CARD). ........................................................................................................................... 104 xviii
Lista de Tabela
Tabela 1 – Caracterização da População Estudada.................................................................. 42
xix
Lista de Abreviaturas e Símbolos
APC – Aloficocianina
APCs – Células apresentadoras de antígenos
BSA – Albumina sérica bovina
CARD – Indivíduos portadores da forma clínica cardíaca
CBA - Cytometric Bead Array
CD – Grupos de diferenciação (Cluster of differentiation)
CD4 – Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T
CD8 – Marcador de superfície celular da subpopulação de linfócitos T
CD25 – Cadeia  do receptor para a citocina IL-2
CD28 – Marcador de superfície celular para molécula coestimulatória
CD62L – Molécula L-selectina considerada molécula de ativação e adesão de leucócitos
CD69 – Molécula de ativação de leucócitos
CDG – Indivíduos portadores da forma clínica cardiodigestiva
CMBLAST – Meio de Cultura
CPqRR – Centro de Pesquisas René Rachou
CTR-DIP – Centro de Treinamento e Referência em Doenças Infecciosas e Parasitárias
DIG – Indivíduos portadores da forma clínica digestiva
ECG – Eletrocardiograma
EDTA – Etilenodiaminotetracético
ELISA – Ensaio de Imunoabsorbância Ligado à Enzima
EPI – Formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi
FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz
FITC – Isotiocianato de fluoresceína
FL – Fluorescência
FSC – Tamanho celular
HAS – Hipertensão arterial sistêmica
IFN- – Interferon gamma
IL – Interleucina
IMF – Intensidade Média de Fluorescência
IND – Indivíduos portadores da forma clínica indeterminada
xx
LIT – Meio de cultivo para formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi (Liver Infusion
Tryptose)
LB – Linfócitos B
LT – Linfócitos T
LTCD4+ – Linfócitos T auxiliares
LTCD8+ – Linfócitos T citotóxicos
MEM – Meio de cultura (Minimal Essential Médium)
MFF – Solução Fixadora
MHC – Complexo Principal de Histocompatibilidade
mRNA – RNA mensageiro
n – número de indivíduos analisados
NI – Indivíduos não infectados
NK – Células natural killer
NO – Óxido Nítrico
PBMC – Células mononucleares do sangue periférico
PBS – Tampão Fosfato Salínico
PBS-P – PBS-W a 0,5% de saponina
PBS-W – PBS a 0,5% de albumina sérica bovina
PE – Ficoeritrina
PerCP – Proteína Clorofila Piridinina
RPMI – Meio de cultura (Rosweel Park Memorial Institute)
SSC – Granulosidade e complexidade interna de uma célula
STP – Estaurosporina
TCR – Receptor de linfócitos T
Th1 – Células TCD4+ secretoras do padrão 1 de citocinas
Th2 – Células TCD4+ secretoras do padrão 2 de citocinas
TNF- – Fator de Necrose Tumoral alfa
TNFR – Receptor do Fator de Necrose Tumoral
Treg – Células T reguladoras
TRIPO – formas tripomastigotas do Trypanosoma cruzi
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais
WHO – Organização Mundial de Saúde (World Health Organization)
xxi
Resumo
Vários mecanismos imunorreguladores têm sido propostos na infecção causada pelo
protozoário T. cruzi como imunossupressão, apoptose e citocinas reguladoras. Assim, o
objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da apoptose de linfócitos do sangue periférico de
pacientes com doença de Chagas, manifestando as formas indeterminada (IND) ou cardíaca
(CARD), com a finalidade de compreender o papel da morte programada das células no
controle e/ou desenvolvimento da miocardiopatia. Sangue de indivíduos não infectados (NI)
foi utilizado como controle. A apoptose dos linfócitos, estimulados ou não por antígeno
preparado com epimastigota do T. cruzi, foi avaliada pelos métodos da anexina e da caspase
3+. Paralelamente, avaliou-se, por citometria de fluxo, alguns marcadores de ativação na
superfície de linfócitos totais e das subpopulações TCD4+ e TCD8+, bem como a presença de
citocinas intracelulares e plasmáticas. Os resultados mostraram que a medida do percentual de
apoptose de linfócitos totais pela anexina, após o estímulo antigênico por EPI, evidenciou
aumento significativo no grupo CARD em relação aos grupos NI e IND. Já, avaliando a
apoptose pelo método da caspase 3+, foi possível verificar percentual de apoptose
significativamente maior nos linfócitos totais dos pacientes com doença de Chagas,
independente da forma clínica, do que no grupo NI. A avaliação da apoptose nas
subpopulações de linfócitos T CD4+ e CD8+ indicou maior suscetibilidade à apoptose de LT
CD4+ em pacientes com doença de Chagas: independente do estímulo específico pelo EPI,
verificou-se aumento no percentual de linfócitos TCD4+ anexina+ nos grupos IND e CARD,
enquanto que, a avaliação da apoptose pela caspase 3+, apresentou este aumento somente após
o estímulo específico. Os LT CD8+ anexina+ no grupo CARD mostraram-se mais suscetíveis à
apoptose, independente de estímulo específico in vitro. Além disso, através da avaliação por
caspase 3+, verificou-se também nos grupos IND e CARD, aumento de apoptose de LT CD8+,
após estímulo pelo EPI, em relação às culturas controle e ao grupo NI. Em relação às
citocinas intracitoplasmáticas, verificou-se aumento significativo de linfócitos totais, de
linfócitos TCD4+ TCD8+ TNF-α+ nas culturas estimuladas por EPI dos indivíduos dos grupos
IND e CARD. O TNF-α, IFN- e IL-2 foram significativamente maior no plasma circulante
de indivíduos do grupo CARD. Ao contrário, IL-10 foi significativamente maior no plasma do
grupo IND. Na avaliação de moléculas de superfície, os dados mostraram que pacientes com
doença de Chagas apresentaram maior ativação celular determinada pela expressão de
marcadores de ativação, após estímulo por EPI, em relação ao grupo NI. A resposta de
proliferação de PBMCs, induzida por EPI, de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD
mostrou menor resposta no grupo CARD em relação ao grupo IND. Finalmente, os dados
permitiram concluir que a apoptose observada nos pacientes com doença de Chagas pode
estar envolvida na eliminação de linfócitos ativados, induzidos pelo T. cruzi, sendo que a
associação com níveis elevados de citocinas inflamatórias no grupo CARD levaria à
exacerbação da patologia. Por outro lado, o controle do desenvolvimento da miocardiopatia
chagásica no grupo IND poderia ser decorrente da apoptose dos linfócitos ativados, mas sob o
controle de citocinas e de células reguladoras.
xxii
Abstract
Several mechanisms of immunoregulation have been suggested to play a role in the
infection with the protozoan T. cruzi. Among them are immunosupression, apoptosis and
regulatory cytokines. In this thesis the putative role of apoptosis of lymphocyte from the
peripheral blood of patients with Chagas disease, manifesting the indetermined (IND) or
cardiac (CARD) clinical forms of the disease where evaluated. The objective was to
determined whether programmed cell death (PCD) plays a role on the control and/or
development of chagasic myocardiopathy. Apoptosis of lymphocytes, under antigenic stimuli
(T. cruzi epimastigote extract) where compared to that of non-stimulated cells. Apoptosis was
evaluated using the expression of annexin and caspase 3+ by T cells and the percentage of
cells positive evaluated by flow cytometry. In addition activation and T cell markers were
used for the identification of TCD4+ and TCD8+ subpopulations. The presence of intracellular
and plasma cytokines were also evaluated. Analysis of the activation status of the peripheral
blood cells showed that patients with Chagas disease presented a higher levels of activation
determined by the expression of activation markers, after EPI stimulation. Our results show
that the percentage of total apoptic annexin+ lymphocytes after antigenic stimulation with EPI
was significantly increased in the CARD group when compared to the NI and IND groups.
Analysis of apoptosis using the expression of caspase 3 showed that the percentage of
apoptosis was significantly higher in total lymphocytes from patients with Chagas diseases,
regardless the clinical form. Evaluation of apoptosis in T CD4+ and CD8+ lymphocytes
subpopulations of showed that LT CD4+ cells had higher levels of apoptosis in patients with
Chagas disease and that it was independent of whether they were stimulated with EPI.
Analysis of the expression of annexin also showed an increase in TCD4+ lymphocytes
annexin+ in IND and CARD groups, while expression of caspase 3 was increase only after the
specific stimulation. LT CD8+ annexin+ in the CARD group have been shown to be more
susceptible to apoptosis, regardless of specific stimulation in vitro. Furthermore, evaluation of
caspase 3 expression showed that IND and CARD groups have an increased LT CD8+ caspase
3+ after stimulation with EPI. As for intracytoplasmic cytokine detection, a significant
increase was observed in TCD4+ TCD8+ TNF-α+ lymphocytes in EPI-stimulated cultures in
IND and CARD individuals. TNF-α, IFN- and IL-2 were significantly higher in the plasma
of individuals from the CARD group. In contrast, IL-10 was significantly higher in plasma of
IND individuals. The PBMCs proliferative response, induced by in vitro stimulation with EPI,
from showed the CARD group had the lowest response when compared to the IND group.
Finally, our data suggest that apoptosis seen in patients with Chagas disease may be involved
in the elimination of activated lymphocytes, induced by T. cruzi, with an association with a
high level of inflammatory cytokines in the CARD group. Together this process may lead to
the pathological exacerbation of the disease. On the other hand, the same process may be of
major important for the control of the development of chagasic myocardiopathy in the IND
group. However, apoptosis of activated lymphocytes in this group may be under the control of
cytokines and of regulatory cells.
xxiii
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
1 INTRODUÇÃO
A doença de Chagas é uma zoonose causada pelo protozoário, hemoflagelado,
Trypanosoma cruzi. Segundo a Organização Mundial de Saúde foram registradas na América
Latina vinte e uma mil mortes decorrentes da doença de Chagas no período de 2005/2006
(WHO, 2007). Estima-se que ainda existam 15 milhões de indivíduos infectados na América
Latina, com mais de 28 milhões de pessoas sob risco de transmissão, em cerca de 20 países
endêmicos, sendo aproximadamente 41.200 novos casos por ano e 12.500 mortes/ano (WHO,
2007, Dias, 2007).
A incidência da doença é maior em áreas rurais onde condições precárias de vida
facilitam o contato com os insetos triatomíneos (Bogitsh et al., 1999). Os insetos são
conhecidos como “barbeiros”, onde o T. cruzi, na forma epimastigota, vive no interior do
intestino, não invadindo outras partes do corpo, e multiplica-se por fissão binária. No intestino
posterior do barbeiro – reto e ampola retal – essa forma adere pelo flagelo às células da parede
do intestino e se diferencia para a forma tripomastigota metacíclica, altamente infectante para
vertebrados. Os “barbeiros” adquirem o T. cruzi ao ingerir sangue de animais infectados, ao
sugar o conteúdo intestinal de outro “barbeiro” infectado ou ao se alimentar de fezes
infectadas de outro “barbeiro”. O inseto vetor transmite as formas trimastigotas para o homem
e outros vertebrados pelas fezes e/ou urina, após o repasto sanguíneo. Incapazes de atravessar
a pele íntegra, essas formas morrem assim que os dejetos do inseto secam, mas, antes disso,
podem invadir o organismo e iniciar a infecção se entrarem em contato com mucosas ou com
alguma área lesada da pele do hospedeiro. As formas tripomastigotas metacíclicas não se
multiplicam no sangue do hospedeiro vertebrado, mas invadem seus tecidos. Após penetrarem
nas células, as formas tripomastigotas escapam do vacúolo fagocítico e se estabelecem no
citoplasma celular, onde se transformam nas formas amastigotas e passam a se dividir. Após
cinco dias, dezenas ou centenas de amastigotas sofrem um processo de alongamento e se
transformam em formas tripomastigotas, as quais, por sua grande motilidade, provoca o
rompimento da célula e os parasitos livres invadem outras células próximas ou alcançam a
corrente sangüínea, disseminando a infecção para diferentes órgãos e sistemas. Esse ciclo leva
a um crescimento exponencial das populações parasitárias intracelulares e, consequentemente,
ao aumento da parasitemia (Brener, Andrade & Barral-Neto; 2000).
24
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Outros mecanismos de transmissão já foram descritos, como a via transfusional
(Young et al., 2007), congênita (Gürtler, Segura & Cohen, 2003; Dorn et al., 2007), por
transplantes de órgãos (Centers for Disease Control and Prevention, 2006) e por meio de
acidentes laboratoriais (Herwaldt, 2001). A via transfusional é considerada a segunda mais
frequente de infecção, tendo especial importância epidemiológica, uma vez que pode levar a
doença para áreas sem transmissão natural (Wendel, 1998; Schofield & Dias 1999; Vinhaes &
Dias, 2000). Além disso, em regiões como na Amazônia, existem mecanismos excepcionais
de transmissão (vetorial extradomiciliar, vetorial domiciliar ou peridomiciliar sem
colonização do vetor) e a ocorrência de surtos episódicos de transmissão oral (Brasil, 2005;
Coura, 2006). Recentemente, ocorreram surtos de doença de Chagas com fase aguda e morte
por ingestão de formas tripomastigotas dissolvidas em bebidas, como suco de cana e açaí, em
que os insetos vetores silvestres, provavelmente, foram triturados durante o preparo ou suas
fezes contaminaram o alimento, conforme divulgado amplamente na mídia e no Guia de
Vigilância Epidemiológica do Ministério da Saúde (Brasil, 2005).
No Brasil, desde a década de 1970, diretrizes de combate à doença foram direcionadas
no sentido de interromper, com a maior agilidade possível, a transmissão vetorial. A
utilização de inseticidas eficientes, a melhoria das habitações rurais, com higiene e limpeza
adequadas, foram métodos utilizados na tentativa de se evitar a presença do vetor nas
residências. Concomitantemente foram adotadas medidas preventivas que permitiram
controlar, também, a transmissão por meio das transfusões de sangue e derivados nos grandes
centros urbanos. Assim sendo, foram estancados os dois mananciais mais importantes que,
anualmente, aumentavam em cerca de 100.000 novos casos da doença no Brasil (Consenso
Brasileiro em Doença de Chagas, 2005).
Com o êxito inicial, representado pela eliminação dos triatomíneos de hábitos
essencialmente domésticos, em especial o Triatoma infestans, os esforços se concentram
atualmente em se manterem os resultados obtidos, consolidar o controle de focos residuais e
impedir o estabelecimento de novos focos de transmissão vetorial (Consenso Brasileiro em
Doença de Chagas, 2005).
O T. cruzi pode induzir uma fase aguda de curta duração (4-12 semanas), caracterizada
por elevada parasitemia, facilmente detectada em exames de sangue a fresco. As principais
manifestações clínicas nessa fase são os sinais da porta de entrada do parasito, febre,
linfoadenopatia, esplenomegalia e miocardite. Essas manifestações são normalmente
25
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
detectadas em crianças, embora, no entanto, na maioria dos indivíduos infectados, a fase
aguda muitas vezes passe despercebida (Prata, 2001). A primeira reação ao T. cruzi durante a
fase aguda implica na migração de células mononucleares para o foco da lesão onde há
ruptura das células parasitadas (Andrade, 1991), liberando então citocinas que desencadeiam
o processo inflamatório. As lesões tendem a ser difusas e mais graves no coração. A
destruição de células parasitadas ou não, durante a fase aguda, parece ser importante na
patogenicidade da doença, especialmente para indução de disfunções cardíacas e digestivas
que podem ocorrer tardiamente (Andrade, 1983; Andrade et al., 1994). Na maioria dos casos
agudos, os sintomas clínicos são seguidos por uma aparente recuperação completa da
miocardite. A queda da parasitemia ocorre em decorrência da resposta imune efetora do
hospedeiro, dando início à fase crônica. Nessa fase, devido à parasitemia subpatente, os
métodos parasitológicos convencionais (xenodiagnóstico e hemocultura) são de baixa
sensibilidade, o que implica em pouco valor diagnóstico, tornando desnecessária a sua
realização para manejo clínico dos pacientes (Consenso Brasileiro em Doença de Chagas,
2005). Considera-se o indivíduo infectado na fase crônica aquele que apresenta anticorpos
anti-T. cruzi da classe IgG detectados por meio de dois testes sorológicos de princípios
distintos ou com diferentes preparações antigênicas. A PCR, nesta fase, tem indicação quando
os testes sorológicos resultam duvidosos, para o controle de cura após tratamento específico e
em áreas onde também exista infecção por T. rangeli (Consenso Brasileiro em Doença de
Chagas, 2005).
Do ponto de vista clínico, os indivíduos na fase crônica podem ser classificados como
pertencentes às formas clínicas: indeterminada (IND), cardíaca (CARD), digestiva (DIG) ou
cardiodigestiva (CD). Os pacientes portadores da forma clínica IND correspondem a cerca de
60-70% dos indivíduos infectados. São considerados portadores da forma clínica IND os
indivíduos que apresentam os exames parasitológicos e imunológicos positivos para o T.
cruzi, que não apresentam quadro sintomatológico próprio da doença, e com resultados de
eletrocardiograma de repouso (ECG), estudos radiológicos de tórax, esôfago e cólon normais
(Ribeiro & Rocha, 1998). No entanto, exames adicionais e mais sensíveis para demonstração
de acometimento cardíaco (ecocardiograma, teste ergométrico, Holter) podem evidenciar
nesses pacientes algumas alterações e anormalidades, geralmente discretas, que podem
significar tanto um processo evolutivo em marcha como apenas resquícios de processo agudo
ou crônico inicial já cicatrizado e sem progressão clínica ou anatômica (Rocha, Ribeiro &
26
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Teixeira, 2003). Acredita-se que cerca de 2 a 5% dos pacientes apresentando a forma clínica
IND irão desenvolver a forma clínica CARD a cada ano, enquanto um menor percentual irá
apresentar
a
forma
clínica
DIG
(megacólon
e/ou
megaesôfago)
(Dias,
1989).
Aproximadamente 20% - 30% dos pacientes podem apresentar a forma clínica CARD, que
inclui amplo espectro de manifestações, desde a presença de anormalidades subclínicas,
registradas apenas em exames complementares sofisticados, até formas graves, como a
insuficiência cardíaca refratária, tromboembolismo, arritmias complexas e morte súbita. O
fator prognóstico mais importante na cardiopatia chagásica crônica é a disfunção sistólica
global do ventrículo esquerdo. Uma nova classificação para insuficiência cardíaca,
considerando-se a função sistólica ventricular esquerda, obtida através da ecocardiograma, foi
adotada nos Consensos Brasileiro e Latinoamericano de Insuficiência Cardíaca. Essa
classificação mostrou-se de grande utilidade quando aplicada à cardiopatia chagásica crônica,
permitindo a identificação de subgrupos distintos do ponto de vista prognóstico e terapêuticos
(Consenso Brasileiro em Doença de Chagas, 2005). A classificação clínica publicada por
Rocha et al. (2005) está baseada na verificação do grau de acometimento cardíaco por
intermédio de técnicas padrão (ECG e radiografia do tórax) e técnicas mais sensíveis
(ecocardiográfica Doppler, Holter, teste ergométrico e cintilografia miocárdica). A infecção
chagásica pode, ainda, gerar em 5 a 10% dos pacientes, alterações anatômicas e funcionais do
trato gastrointestinal, como denervação da musculatura lisa da parede do tubo digestório,
dificuldades na deglutição e defecação, além de processos de dilatação de estruturas
esofagianas e intestinais (megas), caracterizando a forma clínica DIG (Koberle, 1968;
Macedo, 1982; Rezende, 1988). Finalmente, à forma clínica CD, associam-se alterações dos
sistemas digestório e cardiovascular (Macedo et al., 1982; Dias, 1989; Rassi et al., 1992).
A análise de particularidades na patogênese das diferentes formas clínicas sugere que
vários fatores possam estar nela envolvidos. Acredita-se que estas manifestações sejam
consequências de múltiplos fatores ligados ao T. cruzi (cepa, virulência, antigenicidade,
tropismo, tamanho do inóculo), ao homem (idade, sexo, raça, perfil da resposta imune) e ao
ambiente (Dias, 2000; Vago, 2000; Macedo, 2004).
A escassez de parasitos, contraposta à intensidade e extensão das lesões, assim como o
prolongado período de latência que precede essas lesões, tem levado diversos autores a
avaliarem o envolvimento de fatores autoimunes na patogênese da lesão cardíaca. Alguns
autores apontam para a existência de reação cruzada entre os componentes autólogos e
27
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
antígenos do T. cruzi (Cossio et al., 1974; Wood et al., 1982; Cunha-Neto et al.,1995, 1996;
2000; Al-Sabbagh et al., 1998; Leon & Engman, 2001). Estudos utilizando a amplificação de
DNA do T. cruzi presente em lesões inflamatórias do coração de pacientes chagásicos
demonstraram a presença do parasito ou fragmentos de seu genoma nas lesões (Jones et al.,
1993, Olivares & Vray, 1995; Palomino et al., 2000), sugerindo que a presença do parasito é
importante para a patogênese da doença.
Entretanto, outros fatores induzidos pela resposta aos parasitos têm importância na
patogênese da miocardite chagásica, como a resposta imune e alterações nos mecanismos de
regulação. A mobilização do sistema imune é importante na redução da carga parasitária, mas,
por outro lado, pode contribuir para o aparecimento das manifestações crônicas observadas
em alguns pacientes.
Sabe-se que a infecção do hospedeiro pelo T. cruzi mobiliza múltiplos mecanismos
humorais e celulares tanto da resposta imune inata quanto da resposta imune adquirida. A
resposta imune que se segue à infecção pelo T. cruzi é bastante complexa, envolvendo o
reconhecimento de antígenos do parasito por uma série de receptores de membrana e a
ativação de diferentes tipos celulares (Tarleton, 2007). Ao primeiro sinal de infecção,
moléculas derivadas do parasito, tais como GPI-mucinas, são capazes de estimular a síntese
de citocinas pró-inflamatórias, bem como de quimiocinas por macrófagos do hospedeiro
(Teixeira, Gazzinelli & Silva, 2002). Os eventos participantes tanto da resposta imune inata
quanto da adquirida tornam-se importantes delineadores do curso da infecção pelo T. cruzi.
A maior parte das informações relativas à resposta imune induzida pelo T. cruzi
derivou de estudos que utilizaram modelos experimentais e, em particular, o camundongo
(Dutra, Rocha & Teixeira, 2005). Várias conclusões surgiram a partir de estudos em
camundongos com respeito ao papel dos mediadores e células imunológicas envolvidas no
controle da infecção aguda. No geral, porém, os estudos experimentais não apresentaram uma
clara associação com o que é visto na forma crônica da doença humana. Durante os últimos
anos, vários estudos têm avaliado a resposta imune humoral e celular em pacientes com
doença de Chagas, na tentativa de encontrar marcadores imunológicos de prognóstico de
evolução da forma clínica cardíaca.
A resposta imune inata é considerada um fator primordial na resistência do hospedeiro
contra o T. cruzi na fase inicial da infecção. As células do sistema mononuclear fagocitário
são, por excelência, as primeiras células a entrarem em contato com o parasito e iniciam a
28
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
produção de citocinas que promovem uma autoativação nos fagócitos, induzindo-os a
produzir substâncias oxidantes, que levam à destruição do parasito (Silva, Machado &
Martins, 2003).
As citocinas desempenham papel importante na regulação da resposta imune, e,
seguramente, estão envolvidas tanto na resistência à infecção quanto nos mecanismos
relacionados com a evolução da doença. Experimentos in vivo e in vitro evidenciam que
macrófagos desempenham papel importante na resposta imune contra o T. cruzi. Demonstrouse que determinadas porções de glicoproteínas, do tipo mucinas, presentes na superfície de
formas tripomastigotas e amastigotas de T. cruzi, são capazes de induzir produção de IL-12 e
TNF-, além de outras citocinas pró-inflamatórias por macrófagos murinos normais
(Camargo et al., 1997). No entanto, o processo de fagocitose, mediado por macrófagos
infectados, também é capaz de ativar a produção IL-12 (Aliberti et al., 1996) e TNF- (Silva
et al., 1995), induzindo a produção de IFN- por células natural killer (NK) (Cardillo et al.,
1996) e linfócitos T (Rottenberg et al., 1995). Acredita-se que o IFN- atua nos macrófagos
induzindo a produção de óxido nítrico (NO) que, por sua vez, inibe a replicação intracelular
do parasito (Gazzinelli et al., 1992; Vespa et al., 1994). Além disso, a regulação da expressão
de quimiocinas e de IFN-, associada ao decréscimo do parasitismo nos tecidos pode ser
responsável pelo controle da inflamação e imunopatogenia observados no coração em
infecção experimentais pelo T. cruzi (Talvani et al., 2000). A resposta dos macrófagos a
glicoproteínas, via receptor TLR-2, com produção de citocinas como IL-12 e TNF-, foi
correlacionada à ativação de células T CD4+ e T CD8+ que, por sua vez, produzem IFN-
(Campos & Gazzinelli, 2004). Outro trabalho demonstrou a importância do receptor Toll-like
TLR-4 na resposta de macrófagos à presença de glicoinositolfosfolipídios (GIPL) derivados
do parasito, culminando na liberação de citocinas pró-inflamatórias. Nesse trabalho,
demonstrou-se a alta suscetibilidade de camundongos deficientes desse receptor, que exibiram
maior mortalidade do que os animais normais (Oliveira et al., 2004).
Por outro lado, a produção de IL-10 pelos macrófagos parece ser um mecanismo
associado à susceptibilidade dos animais à infecção pelo T. cruzi (Silva et al.,1992) devido,
provavelmente, ao seu papel regulador sobre a ativação de macrófagos induzida pelo IFN-,
inibindo tanto a liberação de metabólitos tóxicos quanto a diferenciação de células com perfil
de citocinas do tipo 1 (Reed, 1988; Cardillo et al., 1996; Silva et al., 1998). Desta forma, a
produção de citocinas como IL-4, IL-10 e TGF-β está relacionada como um importante
29
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
mecanismo de escape do parasito. É provável que essas citocinas sejam necessárias para
antagonizar os efeitos tóxicos, pró-inflamatórios e autoimunes potencialmente criados pela
alta produção de NO (DosReis & Lopes, 2000). Contudo, o NO associou-se também com a
inibição da resposta linfoproliferativa (Abrahamsohn & Coffman, 1995) e com a indução de
apoptose, observadas na fase aguda da infecção (Martins et al., 1998).
Além da participação de NO, a hiporresponsividade observada nos animais
agudamente infectados com T. cruzi pode estar associada a outros fatores tais como inibição
da produção de IL-2 (Harel-Bellan et al., 1983; Tarleton, 1988); deficiência na expressão do
receptor desta citocina (IL-2R) (Rottenberg et al., 1989; Beltz, Sztein & Kierszenbaum, 1988;
Kierszenbaum et al., 1991); presença de células supressoras (Tarleton, 1988); presença de
fatores imunossupressores produzidos pelo parasito (Kierszenbaum et al., 1990); o aumento
dos níveis séricos do receptor da IL-2 solúvel (Pakianathan & Kuhn, 1992); alterações das
funções de células acessórias (La Flamne et al., 1987); a atividade deficiente de células T
auxiliares (Ritter & Kuhn, 1990) e apoptose induzida por ativação (Lopes et al., 1995).
Enquanto a apoptose espontânea seria induzida pela presença de altas concentrações de NO
(Martins et al., 1998), a morte celular por ativação ocorreria por meio da interação Fas-FasL,
após ativação pela ligação ao TCR (Lopes et al., 1995; 1999).
A morte celular por apoptose tem importância crucial para o desenvolvimento e
homeostasia de vários tecidos, especialmente do sistema imune, no qual processos geradores
da resposta imune a patógenos e/ou antígenos precisam ser cuidadosamente controlados e
muitas vezes extinguidos, sob pena de danos irreparáveis ao hospedeiro.
Muitas evidências experimentais indicam que a indução de apoptose é um dos
mecanismos responsáveis pelo rápido declínio do número de linfócitos após a eliminação de
um antígeno. Existem pelo menos dois mecanismos de indução de apoptose implicados no
controle da resposta imune; um, denominado morte celular passiva (ou morte por negligência)
(Hildeman et al., 2002) e, o outro, de morte celular induzida por ativação (activation induced
cell death – AICD) (Krammer, 2000; Krammer, Arnold & Lavrik, 2007). Este último
mecanismo é dependente da estimulação dos linfócitos mediada por antígenos (Nagata &
Suda, 1995; Van Parjis, Ibraghimov & Abbas, 1996), enquanto que o primeiro ocorre no final
das respostas imunes (quando já não há grande disponibilidade de antígenos) e depende da
diminuição da concentração de citocinas necessárias para a manutenção dos linfócitos
30
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
ativados após o encontro com o antígeno (Collins et al., 1993; Van Parjis, Ibraghimov &
Abbas, 1996).
A ativação bioquímica da apoptose pode ocorrer por dois caminhos: o caminho
intrínseco envolve a liberação mitocondrial do citocromo c e fatores pró-apoptóticos tais
como Smac/DIABLO, Omi/HtrA2, EndoG dentre outros, associados à ativação da caspase 9;
o caminho extrínseco, originado a partir de ligações de fatores químicos nos receptores de
morte presentes na membrana plasmática, como o CD95 (Fas/Apo-1), resulta na ativação da
caspase-8 (revisto por Hengartner 2000; Salvesen, 2002). As caspases 3, 6 e 7 são as únicas
implicadas diretamente nos mecanismos denominados executores de apoptose. É importante
salientar que as vias de receptores de morte e a mitocondrial convergem para a ativação da
caspase 3, que é uma protease efetora dos processos apoptóticos (revisto por Hengartner
2000; Krammer, Arnold & Lavrik, 2007).
Na AICD, ocorre à dependência da ligação dos receptores de morte aos seus ligantes.
As moléculas Fas (CD95, APO-1, TNFR6) e FasL (CD95L, CD178) são as principais
moléculas implicadas na indução de AICD (Dhein et al., 1995; Krammer, 2000). A via de
morte celular por ativação é desencadeada pela ativação de outros receptores de superfície
celular tais como TNFR-1/TNF (Sytwu, Liblau & McDevitt, 1996), TRAILR/TRAIL
(Martinez-Lorenzo et al., 1998) e ainda por outros mecanismos independentes dos receptores
de morte celular (Devadas et al., 2006).
A molécula Fas é expressa na membrana da maioria das células. Em contraposição,
acredita-se que a expressão de FasL seja restrita a células do sistema imune, principalmente
linfócitos T, células NK e monócitos ativados (Takahashi et al., 1994; Brown et al., 1999). A
ligação entre Fas e FasL geralmente desencadeia o processo de apoptose na célula que
expressa a molécula de Fas (Su et al., 1998). A expressão dessas moléculas é induzida ou
aumentada nos linfócitos ativados, principalmente pelo reconhecimento antigênico, ou pela
ligação de anticorpos anti-CD3 (revisto por Lynch et al., 1995). A reestimulação do TCR de
células T já expandidas e ativadas na presença de coestimulação apropriada leva à indução
eficiente de AICD (Shi, Sahai & Green, 1989). Quanto à indução de apoptose como um dos
possíveis mecanismos envolvidos na supressão da resposta imune induzida pelo T. cruzi,
Lopes et al. (1995) demonstraram que a infecção leva à apoptose de células esplênicas, tanto
as de fenótipo CD4+ quanto CD8+ in vivo e à morte espontânea de células T CD8+ in vitro.
Neste estudo, a adição de IL-2 evitou a morte espontânea destas células, indicando que as
31
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
células T CD8+ do hospedeiro são propensas à morte celular passiva na infecção aguda pelo
T. cruzi. Por outro lado, células T CD4+ sofrem AICD após estimulação com anticorpos
monoclonais anti-TCR e anti-CD3 (Lopes et al., 1995).
Posteriormente, demonstrou-se que a indução de morte programada contribui
diretamente para a supressão das respostas proliferativas de células T CD4+ de animais
infectados (Lopes & DosReis, 1996), sugerindo que a apoptose de células T maduras após
ativação policlonal dos linfócitos poderia ser responsável pela imunossupressão observada
durante o curso da infecção. Esta idéia está de acordo com a observação que linfócitos T
maduros tornam-se suscetíveis à apoptose após sua ativação pelo TCR, na presença de IL-2
(Lenardo, 1991; Van Parijs et al., 1999; Schmitz et al., 2003). Várias evidências de que a
infecção pelo T. cruzi potencializa a via de morte por meio de Fas, levando à apoptose de
células T CD4+, foram descritas por Lopes et al. (1999). A expressão de Fas e FasL aumentou
nas células T CD4+ purificadas de camundongos infectados, e o tratamento com anti-FasL in
vitro diminuiu a apoptose e aumentou a resposta proliferativa das células T CD4+ (Lopes et
al., 1999). Dessa forma, foi sugerido que a morte por apoptose das células T CD4+ de animais
na fase aguda da infecção pelo T. cruzi pode desempenhar papel deletério para o hospedeiro,
resultando no escape do parasito à destruição pelos mecanismos efetores da resposta imune
celular (DosReis, Fonseca & Lopes, 1995).
Considerando que tanto os linfócitos T CD4+ como os T CD8+ são crucialmente
importantes para a resposta imune contra o T. cruzi, principalmente através da secreção de
citocinas tais como IL-2, IFN- e IL-10, entre outras (DosReis, 1997), a citocina IFN- tem
sido descrita como uma das principais ativadoras das funções efetoras dos macrófagos, mas
também, como promotora da diferenciação e ativação de linfócitos T CD8+. Por sua vez, os
linfócitos T CD8+ estariam também implicados no controle da replicação dos parasitos in vivo
(revisto por Brener & Gazzinelli 1997). Experimentos realizados in vitro indicam que a
atividade citotóxica de linfócitos T CD8+ de animais infectados com T. cruzi é dependente de
IFN- e da interação entre as moléculas Fas-FasL, e resulta na lise dos parasitos alojados no
interior das células-alvo (Nascimento, 1999). Por outro lado, a produção de IL-10 por células
T CD4+ do tipo Th2 e células B CD5+ (Minoprio, 1991) levaria à diminuição da resistência à
infecção (Minoprio, 1991).
Embora muitos trabalhos em modelos experimentais tenham definido a importância
das subpopulações de linfócitos T, bem como de células NK, macrófagos e células B na
32
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
infecção experimental pelo T. cruzi (Tarleton et al., 1992; Rottenberg et al., 1993; Brener &
Gazzinelli, 1997; Soares & Ribeiro dos Santos, 1999), estes parâmetros não se encontram
totalmente esclarecidos na infecção humana.
Os estudos da resposta imune celular na infecção chagásica têm sido desenvolvidos
por meio da análise da reatividade in vitro de células do sangue periférico de pacientes com
doença de Chagas, após estimulação antigênica específica, bem como por estudos da
composição celular de diferentes compartimentos (amostras de coração e/ou do tubo
digestivo). Análise ex vivo de linfócitos do sangue periférico de pacientes chagásicos
portadores de diferentes formas clínicas demonstrou a presença de grande número de células
T e B ativadas, embora não tenham sido detectadas diferenças entre pacientes portadores das
diferentes formas clínicas (Dutra et al., 1994). A progressão para a fase crônica é
acompanhada por aumento na resposta celular (Dutra et al., 1996). Os autores observaram que
na fase crônica houve aumento na frequência de células T CD4+ e CD8+ circulantes ativadas,
com elevada expressão da molécula HLA-DR e baixa expressão da molécula CD28. A
frequência elevada de células T ativadas CD4+CD28- no sangue periférico de pacientes
infectados pelo T. cruzi estava associada à produção de TNF-α e IL-10 em pacientes com as
formas cardíaca e indeterminada, respectivamente, sugerindo papéis funcionais distintos para
aquelas células (Menezes et al., 2004). Entretanto, no sangue periférico de pacientes
portadores da doença de Chagas, existe maior freqüência de linfócitos T CD4+CD28- e
CD8+CD28-, quando comparados com indivíduos não infectados (NI) pelo T. cruzi. Levandose em conta a importância da molécula CD28 na ativação de células T, essa observação pode
significar que diferentes estágios de ativação dos linfócitos ou eventos imunorreguladores
distintos estejam ocorrendo no curso da infecção chagásica (Caruso et al., 1994). As células
CD28- podem representar uma sub-população de células T especiais, com intensa capacidade
efetora associada à habilidade de regulação aos antígenos próprios (Menezes et al., 2004).
Alguns estudos têm sugerido que essas células são susceptíveis à apoptose, o que poderia
representar um mecanismo de controle de suas funções citotóxicas exacerbadas (Azuma,
Phillips & Lanier, 1993; Borthwich et al., 2000; Tsukishiro, Donnenberg & Whiteside, 2003).
Estudos demonstram que, no coração, as subpopulações de linfócitos T – CD4+ e
CD8+ – apresentam importância central na patologia da doença de Chagas, com uma
predominância de linfócitos T CD4+ em pacientes com a forma indeterminada e de células T
CD8+ ativadas em pacientes com a forma cardíaca, sugerindo a possível participação dessas
33
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
células em mecanismos imunopatológicos (Cuna & Cuna, 1995; Andrade, 1999). Esta
hipótese pode ser reforçada por estudos utilizando imunohistoquímica em corações de
pacientes com cardiopatia chagásica grave, onde observou-se que, nas lesões inflamatórias,
havia predomínio de linfócitos T CD8+, muitos dos quais expressando granzima A+,
indicando que a ativação celular poderia estar associada à destruição miocelular e fibrose,
sendo as células do miocárdio alvos de citotoxicidade mediada por estas células (Reis et al.,
1993; Higuchi et al., 1997; Santos et al., 2001). Contudo, na infecção experimental em
camundongos, as células T CD4+ seriam necessárias para a ação de células T CD8+, uma vez
que a depleção de células CD4+ diminui as respostas inflamatórias no coração durante a fase
crônica da doença (Tarleton, 1995). Sendo assim, as células CD4+ provavelmente são
necessárias para iniciar o processo inflamatório, enquanto as células T CD8+ seriam as células
efetoras causando a cardiopatia observada na doença de Chagas (Brener & Gazzinelli, 1997).
Corroborando essa hipótese, linhagens de células T CD4+ obtidas do coração tanto de
camundongos quanto de indivíduos apresentando miocardiopatia chagásica crônica mostram
perfil de citocinas do tipo 1 (Cunha et al., 1996; Ribeiro dos Santos et al., 2001; Abel et al.,
2001). Esse perfil é compatível com a doença de Chagas, uma vez que células do tipo 1 são
fortes indutoras de resposta de hipersensibilidade tardia. Neste contexto, Gomes et al. (2003)
estudando o papel da resposta imune no desenvolvimento da patologia na doença de Chagas
humana, observaram que pacientes com a forma cardíaca secretavam níveis elevados de IFN enquanto aqueles com a forma indeterminada secretavam baixos níveis desta citocina, mas
por outro lado, secretavam níveis significativamente mais elevados de IL-10. Nesse trabalho,
mostrou-se, ainda, que a maioria das células produtoras de IL-10 eram monócitos, enquanto a
principal fonte de IFN- eram linfócitos T CD3+CD4+, sugerindo uma relação entre a
produção de IL-10 por monócitos e mecanismos protetores, além de uma associação entre a
produção de IFN- por linfócitos TCD3+CD4+ e a morbidade da doença de Chagas. Essas
observações sugerem que a inflamação crônica do miocárdio mediada por IFN- pode
contribuir para a patogênese da forma clínica cardíaca (Abel et al., 2001; Gomes et al., 2003;
Bilate & Cunha-Neto, 2008).
Bahia-Oliveira et al. (1998) levantaram a possibilidade de um papel duplo para o IFN no desenvolvimento da doença de Chagas humana. Trabalhando com PBMCs obtidas de
grupos distintos de pacientes – tratados e não tratados durante a fase aguda – os autores
relataram níveis significativamente elevados desta citocina em pacientes considerados curados
34
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
quando comparados a pacientes tratados não curados. Paradoxalmente, no grupo não tratado,
composto por pacientes com formas crônicas da doença, o IFN- esteve mais elevado em
pacientes cardíacos do que em assintomáticos. Baseados nestes dados, os autores sugerem que
esta citocina poderia estar envolvida tanto na proteção quanto no desenvolvimento da
patogênese chagásica. Esses autores sugeriram, ainda, que o papel do IFN- na eliminação do
parasito, em conjunto com a quimioterapia específica, levaria à cura parasitológica dos
pacientes (Bahia-Oliveira et al., 2000) enquanto, nas formas mais graves, esta citocina estaria
envolvida na indução de resposta inflamatória (Gomes et al., 2003). Abel et al. (2001)
mostraram que pacientes cardíacos e assintomáticos secretam níveis diferentes de IFN- ao
estímulo induzido pelo T. cruzi. Estudos realizados em nosso laboratório demonstraram que
pacientes apresentando a forma cardíaca apresentam variações significativas nos níveis de
secreção de IFN- e IL-10 e que estes níveis estão diretamente correlacionados ao
desenvolvimento das formas mais graves da doença de Chagas. Mostrou-se ainda, que
pacientes CARD e IND secretam níveis distintos de IFN- ao estímulo induzido pelo T. cruzi,
sugerindo que um perfil do Tipo 1 possa ter papel no desenvolvimento da cardiopatia. A razão
entre as citocinas IFN-/IL-10 aumenta nos pacientes CARD quando comparados aos IND; no
entanto, a razão IFN-/IL-10 nos pacientes IND era maior que nos CARD (Gomes et al.,
2003). Interessantemente, quando se reavaliou a produção destas mesmas citocinas após dois
anos de estudo, verificou-se que os pacientes IND que evoluíram para a forma clínica CARD
apresentavam diminuição ou inversão significativa da razão IL-10/ IFN- (Gomes et al.,
2005). Em estudo recente, demonstrou-se que não houve diferença entre os níveis séricos de
IL-10 e IFN- entre pacientes IND e CARD, embora os pacientes IND mostrassem uma
correlação positiva na produção de citocinas inflamatórias e reguladoras, indicando controle
da resposta imune. No entanto, a análise dos resultados reforça a hipótese de que a falta de
uma regulação eficaz entre a produção de IL-10 e IFN- em pacientes com a forma cardíaca
pode levar ao estabelecimento da patologia (D’Ávila et al., 2009).
Esses achados enfatizam que o balanço na secreção de citocinas representa elemento
chave no estabelecimento/manutenção das diferentes formas clínicas na doença de Chagas.
Assim, avaliar a produção de diferentes citocinas com características inflamatórias e
reguladoras produzidas por subpopulações de leucócitos representa estratégia adequada para
caracterização do perfil de indivíduos portadores das diferentes formas clínicas dessa doença.
Dentro desse contexto, observou-se que indivíduos com a forma IND apresentam frequência
35
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
elevada de células com perfil imunorregulador como CD4+CD25high e NKT (CD3+CD16CD56+) quanta a presença de células efetoras, enquanto em indivíduos com a forma CARD
apresentaram diminuição de células reguladoras, o que poderia está associado com a
exacerbação das atividades citotóxicas, e, consequentemente com o desenvolvimento do dano
tecidual observado nesses pacientes (Vitelli-Avelar et al., 2005; Araújo et al., 2007).
Considerando que o balanço entre mecanismos imunorreguladores e efetores seja
importante na doença de Chagas, demonstrou-se recentemente que a apoptose, mediada pela
expressão de Fas/FasL e TNF-α poderia ser um mecanismo importante no controle da
resposta proliferativa durante a fase crônica da doença de Chagas.
Dentro desse contexto, observou-se que pacientes com insuficiência cardíaca
apresentaram resposta proliferativa significativamente menor, após estimulação in vitro por
antígenos T. cruzi, em comparação com pacientes assintomáticos. E essa baixa resposta
proliferativa associou-se com a apoptose induzida por ativação. Além disso, a presença de
apoptose nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), e a baixa resposta
proliferativa associaram-se com expressão Fas/Fas-L e de alta produção de TNF-α, uma
citocina conhecida por induzir a morte celular programada. Esses resultados sugerem que a
apoptose de PBMCs, provavelmente desencadeada pela expressão de Fas/Fas-L e produção de
TNF-α, está implicada como um mecanismo imunorregulador durante a fase crônica da
doença de Chagas (Rodrigues et al., 2008).
Bowen & Bowen (1990) demonstraram que a apoptose seria induzida por muitos
fatores que são liberados de células inflamatórias, incluindo aqueles pertencentes à
superfamília do TNF. Neste sentido, os membros da superfamília do TNF, como Fas/Apo-1
ligante, o TNF-α e Apo-2L, podem servir como sinais extracelulares de morte celular
programada, os quais agem em vários pontos na resposta imune, da inflamação à morte da
célula (Nagata & Golstein, 1995).
Em modelos experimentais, a ocorrência de apoptose em linfócitos T CD4+ tem sido
descrita in vivo, in vitro e associada ao crescimento e persistência do parasito (Lopes et al.,
1995; Nunes et al., 1998), além de acarretar a imunopatogênese da infecção (Freire-de-Lima
et al., 2000). Embora, na doença humana, esse fenômeno vem sendo demonstrado, mas os
mecanismos envolvidos na sua modulação ainda estão mal definidos (Centron et al., 1993).
Na doença de Chagas, a perda das células miocárdicas tem sido classicamente atribuída à
morte celular por necrose. Henriques-Pons et al. (2002), mostraram que a apoptose pode ser
36
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
detectada em coração de camundongos infectados pelo T. cruzi de maneira independente de
perforina. Em 2003, Souza et al. mostraram, em seus trabalhos, apoptose em células cardíacas
na infecção in vivo com T. cruzi. Tostes et al. (2005) investigaram o papel da perda de células
miocardiais e de células inflamatórias por apoptose em pacientes na fase crônica da doença de
Chagas. Demonstrou-se que, em pacientes com insuficiência cardíaca, a extensão da fibrose e
o número de células inflamatórias e células miocardiais apoptóticos eram significativamente
mais altos do que em espécimes de ventrículo esquerdo obtidos de pacientes sem insuficiência
cardíaca. Desses resultados, os autores sugerem que a perda de células miocárdicas por
apoptose e fibrose contribui para o desenvolvimento da insuficiência cardíaca na fase crônica
da doença de Chagas (Tostes et al., 2005). Provavelmente, a resposta imune foi causada pela
presença do parasita ou pela reação autoimune, induzindo apoptose de células do miocárdio.
A intensidade e a natureza de mediadores de reação inflamatória, observada na parede do
coração, podem contribuir para indução da morte programada de células miocárdicas.
Entretanto, a fagocitose de corpos apoptóticos pode induzir a secreção de TGF-,
possibilitando o escape do parasito (Savill & Fadok, 2000; Tostes et al., 2005).
Na possível explicação dos diversos aspectos intrigantes relacionados à doença de
Chagas, como, por exemplo, sua evolução clínica diferencial em indivíduos cronicamente
infectados, certamente assume um papel de grande destaque o perfil da resposta imune. Com
base no anteriormente exposto, os mecanismos imunorreguladores são importantes para
impedir uma estimulação excessiva do sistema imune. Por outro lado, esta regulação pode
permitir o escape do parasito, promovendo sua sobrevida no hospedeiro e o estabelecimento
da infecção crônica. A indução da apoptose é importante para a homeostasia do sistema
imune, mas em situações em que as vias moduladoras desse fenômeno estejam
descontroladas, pode favorecer o estabelecimento de condições patológicas.
A participação de componentes imunológicos na patogênese chagásica constitui,
ainda, ponto de grande importância a ser investigado. Nesse sentido, avaliamos o papel da
apoptose na fase crônica da doença de Chagas, buscando para melhor compreensão dos
mecanismos imunológicos envolvidos no desenvolvimento e/ou controle da miocardiopatia
através do fenótipo das células de sangue total de pacientes com diferentes formas clínicas da
doença de Chagas, antes e após estimulação antigênica, com antígenos epimastigotas (EPI) do
T. cruzi.
37
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
2 OBJETIVOS
2.1
OBJETIVO GERAL
Avaliar o papel da apoptose em linfócitos do sangue periférico de indivíduos não
infectados e de pacientes com as formas indeterminada e cardíaca da doença de Chagas.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Avaliar a ocorrência de apoptose em linfócitos do sangue periférico de indivíduos
não infectados e de pacientes portadores de diferentes formas clínicas da doença de Chagas;
2) Avaliar a expressão de moléculas de ativação celular (CD25, CD28, CD62L, CD69)
na superfície de linfócitos T de indivíduos não infectados e de pacientes portadores de
diferentes formas clínicas da doença de Chagas após estimulação in vitro por antígenos do T.
cruzi;
3) Avaliar a expressão intracelular de TNF-α em linfócitos de indivíduos não
infectados e de pacientes portadores de diferentes formas clínicas da doença de Chagas após
estimulação in vitro por antígenos do T. cruzi;
4) Avaliar a produção plasmática de TNF-α, IFN-, IL-2 e IL-10, de indivíduos não
infectados e de pacientes portadores de diferentes formas clínicas da doença de Chagas;
5) Avaliar a resposta de proliferação das células mononucleares do sangue periférico
(PBMCs) de indivíduos não infectados e de pacientes portadores de diferentes formas clínicas
da doença de Chagas após estimulação in vitro por antígenos do T. cruzi;
38
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
3 MATERIAS E MÉTODOS
3.1 Locais de realização
A avaliação clínica e coleta do sangue dos pacientes portadores da fase crônica da
doença de Chagas foram realizadas no Centro de Referências em Doenças Infecciosas e
Parasitárias (CTR-DIP) Orestes Diniz, unidade da Secretaria Municipal de Saúde de Belo
Horizonte conveniada com a Universidade Federal de Minas Gerais.
Os ensaios imunológicos foram realizados no Laboratório de Imunologia Celular e
Molecular do Centro de Pesquisas René Rachou (CPqRR) - FIOCRUZ.
3.2 Caracterização da população estudada
Neste estudo, foi avaliada a resposta imune de indivíduos não infectados pelo T. cruzi
e de pacientes com as manifestações crônicas da doença de Chagas, apresentando as formas
clínicas indeterminada e cardíaca grau V. Todos os pacientes foram examinados pelo Prof.
Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha.
No ambulatório Orestes Diniz, realizou-se exame clínico completo, conforme rotina,
em todos os pacientes deste trabalho. Posteriormente, foram solicitados exames
complementares, incluindo o raio-X de tórax, a eletrocardiografia convencional,
esofagograma ou enema opaco (em casos suspeitos de forma digestiva ou para definição da
forma indeterminada). Além disso, realizou-se avaliação complementar com emprego
ecodoplercardiografia, teste ergométrico, eletrocardiografia dinâmica (Holter) e testes de
função autonômica de acordo com os protocolos de investigação clínica padronizados no
Ambulatório. Tendo como base os critérios pré-estabelecidos pela New York Heart
Association (NYHA) e os resultados dos exames complementares, estabeleceu-se
classificação dos pacientes com relação ao grau de acometimento cardíaco (Rocha, Ribeiro &
Teixeira, 2003; Rocha, Teixeira & Ribeiro, 2007). Todas as avaliações complementares
cardiocirculatórias foram realizadas no Serviço de Cardiologia e Cirurgia Cardiovascular do
Hospital das Clínicas da UFMG, por profissionais qualificados, de acordo com o protocolo
estabelecido no projeto COEP/UFMG nº 001/79. Todos os sujeitos da pesquisa foram
39
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
voluntários e assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, aprovado pelo COEP
do CPqRR-14/2006 e CEP da Santa Casa de Misericórdia de BH/MG- 068/2007, de acordo
com as normas da Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Pesquisa do Brasil. O
esclarecimento foi dado, individualmente, antes da coleta de sangue, com o intuito de explicar
os objetivos e a metodologia aplicada. Todos os participantes tinham conhecimento que
poderiam se abster de participar do estudo ou a se retirar quando assim o desejassem, sem
prejuízo ou dano no atendimento clínico feito no Ambulatório.
3.2.1
Critérios de inclusão
Após avaliação laboratorial, clínica e eletrocardiográfica foram selecionados pacientes
de acordo com os seguintes critérios:

Diagnóstico sorológico de doença de Chagas caracterizado pela presença de pelo
menos duas reações sorológicas positivas dentre as três técnicas empregadas ELISA,
IFI e HAI;

Idade compreendida entre 25 e 70 anos;

Presença de alterações eletrocardiográficas compatíveis com associação do bloqueio
completo do ramo direito e hemibloqueio anterior esquerdo;

Níveis de tensão arterial dentro de faixa da normalidade (sistólica < 160 mmHg e
diastólica < 90 mmHg);

Ausência de evidências clínicas e complementares de acometimento cardíaco nãochagásico e ausência de condições clínicas que possam alterar a função
cardiocirculatória;

Conclusão dos exames propostos;

Assentimento voluntário de participação na pesquisa.
3.2.2
Critérios de exclusão
Foram excluídos deste estudo todos os pacientes que não preencheram os critérios de
inclusão definidos acima e os que apresentaram:

Impossibilidade ou ausência de disponibilidade para a realização dos exames
propostos;

Hipertensão arterial sistêmica (HAS), definida operacionalmente como:
40
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a) Pressão arterial medida durante o exame físico ≥ 160/95 mmHg, em mais de uma
oportunidade ou;
b) Pressão arterial medida durante o exame físico entre 140-159/90-94 mmHg, em
mais de uma oportunidade, associado a:
b.1) história de hipertensão arterial sistêmica, ou;
b.2) quarta bulha ao exame físico, ou;
b.3) provável sobrecarga ventricular esquerda ao ECG pelo critério de
Romhilt-Estes, ou;
b.4) evidências de dilatação aórtica à radiografia de tórax.;
 Evidências clínicas ou laboratoriais de hipo ou hipertireoidismo;
 Diabetes mellitus ou tolerância reduzida à glicose, conforme anamnese, dosagem de
glicemia em jejum e se necessário, prova de tolerância oral à glicose, (National
Diabetes Data Group Classification and diagnosis of diabetes mellitus and other
cathegories of glucose intolerance. Diabetes 1979; 28: 1039-1057);
 Episódio prévio sugestivo de doença reumática aguda;
 Doença pulmonar obstrutiva crônica, evidenciada pela história clínica, exame físico,
ECG e alterações radiológicas sugestivas;
 Alcoolismo, definido como consumo médio semanal acima de 420 g de etanol (média
diária acima de 60 g de etanol) (Skinner et al., 1984).
 Evidências clínicas, eletrocardiográficas e/ ou ergométricas de cardiopatia isquêmica;
 Outras cardiopatias não relacionadas à doença de Chagas;
 Gravidez, definida por critérios laboratoriais;
 Qualquer outra doença sistêmica significativa crônica ou aguda que pudesse interferir
nos resultados dos métodos propostos.
 Anemia significativa, definida arbitrariamente com hemoglobina menor que 10g/dL;
 Distúrbios hidroeletrolíticos, especificamente, níveis séricos anormais de potássio e
sódio;
 Insuficiência renal, definida pelo aumento dos níveis de creatinina e uréia plasmática,
associada ou não às manifestações clássicas de uremia.
41
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
3.2.3
Grupos de estudo
As formas clínicas foram classificadas segundo os critérios estabelecidos por Rocha,
Ribeiro & Teixeira (2003) a idade dos indivíduos não infectados e dos pacientes portadores da
doença de Chagas que participaram voluntariamente deste trabalho variou entre 31 a 70 anos
(Tabela 1). Os participantes da pesquisa foram então agrupados em:
Grupo de indivíduos Não-Infectados (NI): Constituído por indivíduos saudáveis,
não portadores da doença de Chagas que apresentavam testes sorológicos negativos
(imunofluorescência indireta, ELISA, hemaglutinação ou fixação do complemento), bem
como ausência de qualquer alteração cardíaca.
Grupo de pacientes com a forma Indeterminada (IND): Constituído por pacientes
com positividade sorológica e/ou parasitológica para doença de Chagas; ausência de sintomas
e/ou sinais da moléstia; eletrocardiograma convencional normal; estudos radiológicos do
coração, esôfago e cólon normais.
Grupo de pacientes com a forma Cardíaca (CARD V): Constituído por pacientes
com positividade sorológica e/ou parasitológica para doença de Chagas apresentando
cardiopatia
crônica
grau
V,
com
sinais
clínicos,
radiológicos
e
especialmente
ecocardiográficos de aumento do coração com ou sem manifestação de insuficiência cardíaca.
Estes pacientes apresentam aumento do diâmetro do ventrículo esquerdo em diástole (Ved 
55 mm) e uma silhueta cardíaca aumentada (índice cardiotorácico – ICT – acima de 0,5 mm).
Tabela 1 – Caracterização da População Estudada
FORMA
CLINICA
SIGLA
TOTAL DE
INDIVÍDUOS
SEXO M/F
VARIAÇÃO
DA IDADE
Indivíduos não
infectados
NI
12
6/6
31 – 60
Indeterminada
IND
15
4/11
34 – 70
Cardíaca
CARD V
15
9/6
31 – 70
42
19/23
42
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
3.3 Coleta do sangue periférico
Amostras de 5 mL de sangue periférico foram coletadas em tubos contendo
anticoagulante EDTA (Vacuum II EDTA K3 a 15%) para realização da contagem global e
diferencial de leucócitos em contador hematológico eletrônico de células. Para as demais
avaliações propostas para este estudo, foram coletados 30 mL de sangue periférico em tubos
Vacutainer® Sodium Heparin (heparina sódica) (Becton Dickinson – BD, E.U.A.). As coletas
foram realizadas no Ambulatório de Referência em Doença de Chagas do CTR-DIP,
coordenadas pelo Prof. Dr. Manoel Otávio da Costa Rocha.
3.4 Contagem de Leucócitos
O perfil hematológico da população avaliada foi feito utilizando-se sangue periférico,
coletado em tubos de 5 mL contendo anticoagulante EDTA (Vacuum II EDTA K3 a 15%), em
contador hematológico eletrônico de células Coulter MD18, E.U.A. Os parâmetros avaliados
foram global de leucócitos e diferencial de células com determinação do percentual e do
número absoluto de neutrófilos, eosinófilos, linfócitos e monócitos.
3.5 Obtenção do antígeno solúvel da forma epimastigota de T. cruzi (EPI)
As formas epimastigotas do parasito foram cultivadas e mantidas em meio LIT (Liver
Infusion Trytose). As formas epimastigotas da cepa CL foram lavadas três vezes em solução
salina (PBS 0,15 M pH 7,4) por centrifugação e a massa úmida congelada e degelada três
vezes. Completou-se a ruptura total dos parasitos por homogeneização em tubos (Potter
Elvejen) a 40.000g, por cinco vezes, por 60 segundos cada, com 30 segundos de intervalo em
banho de gelo. Subseqüentemente, as suspensões foram centrifugadas a 40.000g durante, 60
minutos, a 40°C contra PBS. O fluido sobrenadante límpido foi coletado, dialisado em PBS,
por 48 horas, a 40°C, esterilizado por filtração em filtro Millipore 0,22 µm. Após a dosagem
de proteínas utilizando o método de Lowry, o material foi mantido em pequenas alíquotas (1
mL) a -70 °C até o uso.
43
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
3.6 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos não
infectados e pacientes portadores da fase crônica da doença de Chagas
por citometria de fluxo
3.6.1
Detecção de apoptose através da marcação por Anexina-V conjugada ao 7AAD
Alíquotas de 1 mL (ajustado através da global de leucócitos/ indivíduo para 1 x 106
células/mL) das amostras de leucócitos do sangue periférico, coletados em heparina, foram
cultivadas na presença de meio de cultura - (RPMI 1640 suplementado com 1,6% Lglutamina, 3% antibiótico e antimicótico, 5% de AB Rh soro humano normal inativado pelo
calor), na presença de antígenos de EPI (25 g/mL concentração final) ou de estaurosporina
(4M) (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.). Depois desta etapa, as células foram incubadas por
aproximadamente 24 horas, em estufa de CO2 com 5% de umidade, a 37°C. Após este tempo,
foi adicionado 220 L de EDTA (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.) obtidos da solução estoque
20 mM, diluído 1/10 (concentração final – 2 mM) para cada tubo de cultura. Os tubos
contendo às amostras foram incubados por 15 minutos, em estufa de CO2 com 5% de
umidade, a 37°C (Forma Scientific E.U.A.). Esse procedimento bloqueia o processo de
ativação posterior das células e garante a obtenção de resultados padronizados e comparáveis.
Posteriormente, foram adicionados às amostras de sangue, 6 mL de PBS-W gelado (PBS pH
7,4, contendo 0,5% de albumina sérica bovina- BSA e 0,1% de azida sódica) e estas foram
centrifugadas (Centrífuga Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 1800 rpm, por 7 minutos, à
temperatura ambiente. O sobrenadante foi aspirado o máximo possível. O sangue foi
transferido para tubos de poliestireno de 5 mL (Falcon – BD, E.U.A.) com os anticorpos
monoclonais, anti-CD4 – Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) (RPA-T4), anti-CD8 (FITC)
(RPA-T8) – (BD Pharmingem), previamente adicionados. Após esta etapa, as culturas foram
incubadas por 30 minutos, à temperatura ambiente, no escuro. Posteriormente, as células
foram tratadas com 4 mL de solução de lise 1x (cloreto de amônio), para que os eritrócitos
fossem lisados. Em seguida, os tubos foram incubados por 10 minutos, à temperatura
ambiente, protegidos da luz. Após a incubação, as células foram lavadas duas vezes com 2
mL PBS-W gelado (PBS pH 7,4, contendo 0,5% de albumina sérica bovina- BSA e 0,1% de
azida sódica) e os tubos centrifugados (Centrífuga Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 1300
rpm, por 7 minutos, à temperatura ambiente. Após a centrifugação, o sobrenadante foi
44
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
removido, as células ressuspendidas em 200µL tampão de ligação para anexina V (0,1 M
Hepes/ NaOH (pH 7,4) 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2 - Biosciences, San Jose, CA), solução de
uso (1x). Adicionou-se a cada tubo de cultura 5 L anexina V-PE e 5 L 7AAD, e então,
procedeu-se à incubação por 15 minutos, à temperatura ambiente, protegidos da luz. Para
interromper a reação, 100 L de tampão de ligação (1X) foi adicionado a cada tubo. A leitura
foi realizada logo após o término do experimento, onde foram coletados 50.000 eventos para a
análise após estimulação in vitro.
A identificação de populações celulares de interesse, bem como a determinação do
valor percentual destas populações e sub-populações, foram feitas através de um sistema de
computador e o software, Cell Quest, acoplado ao citômetro (FACSCalibur – BD, E.U.A.). O
Cell Quest fornece um perfil de células de acordo com o tamanho e granulosidade.
A coloração pelo 7AAD baseia-se na diferença da permeabilidade da membrana de
células vivas, apoptóticas e mortas perante o corante marcador de DNA. Como o 7AAD é um
composto químico que apresenta fluorescência e que se intercala entre as bases de DNA de
dupla fita, ele serve como marcador de apoptose em análises por citometria de fluxo (Brons et
al., 1994). As células com membranas intactas excluem o 7AAD, enquanto as membranas de
células danificadas e mortas são permeáveis ao 7AAD. A anexina V é uma proteína ligadora
de fosfolipídeo dependente de Ca2+ que possui alta afinidade pelo fosfolipídeo fosfatidilserina
(PS), utilizada para identificar células apoptóticas com PS exposta. A associação dos
reagentes (anexina V + 7AAD) é capaz de identificar: células positivas à coloração pela
anexina V e negativas pelo 7AAD, células que sofrem apoptose, células positivas tanto para
anexina V quanto para 7AAD, quando estão no estágio final de apoptose, em necrose, ou já
mortas (Vermes et al., 2000).
3.6.2
Detecção de apoptose através da marcação por Caspase-3 ativa
Alíquotas de 1 mL (ajustado através da global de leucócitos/ indivíduo para 1 x 106
células/mL) das amostras de leucócitos do sangue periférico, coletados em heparina, foram
cultivadas somente na presença de meio de cultura - (RPMI 1640 suplementado com 1,6% Lglutamina, 3% antibiótico e antimicótico, 5% de AB Rh soro humano normal inativado pelo
calor), na presença de antígenos de EPI (25 g/mL concentração final) ou de estaurosporina
(4M) (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.). Depois desta etapa, as células foram incubadas por
aproximadamente 24 horas, em estufa de CO2 com 5% de umidade, a 37°C. Após a
45
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
incubação, foi adicionado 2 mL de PBS-W gelado (PBS contendo 0,5% de albumina sérica
bovina), e então, os tubos de cultura foram centrifugados (Centrífuga Beckman Modelo J-6B,
E.U.A.) a 1300 rpm, por 7 minutos, à temperatura ambiente. Em seguida, cuidadosamente, o
sobrenadante foi aspirado e descartado. Após esta etapa, foi adicionado a cada tubo anticorpos
monoclonais, anti-CD45 – Isotiocianato de Fluoresceína (FITC) (2D1), anti-CD14 – Cloreto
de Peridina Clorofila (PerCP) (M5E2), anti-CD4 (PerCP) (SK3) e anti-CD8 (FITC) (RPA-T8)
– (BD Pharmingem). Após a adição dos anticorpos, os tubos foram homogeneizados e
incubados, por 30 minutos, à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Após a incubação, as
células foram tratadas com 8 mL de solução de lise comercial (Facs Lysing Solution – FLS –
BD, E.U.A.) para que os eritrócitos fossem lisados. Em seguida, os tubos foram incubados por
10 minutos, à temperatura ambiente, protegidos da luz. Findo este tempo, as células foram
lavadas duas vezes com PBS-W gelado (PBS contendo 0,5% de albumina sérica bovina) e os
tubos centrifugados (Centrífuga Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 1300 rpm, por 7 minutos, à
temperatura ambiente. Após a centrifugação, as células foram permeabilizadas com tampão
contendo saponina PBS-P (PBS pH 7,4 contendo 0.5% de BSA, 0,1% de azida sódica e 0,5%
de saponina) por 15 minutos, à temperatura ambiente, protegidas da luz. Ao final desta etapa,
as células foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-caspase-3 PE (C92-605) (BD
Pharmingem) usando 20 L/1x106 células, por 60 minutos, à temperatura ambiente,
protegidas da luz. Após a incubação, as células foram lavadas em tampão Perm/Wash,
ressuspendidas em PBS-W, fixadas com 200 L de solução de fixação – MFF (10g/L
paraformaldeído, 1% cacodilato de sódio, 6,65g/L cloreto de sódio, 0,01% azida sódica).
A identificação de populações celulares de interesse, bem como a determinação do
valor percentual destas populações e sub-populações, foram feitas através de um sistema de
computador e o software, Cell Quest, acoplado ao citômetro (FACSCalibur – BD, E.U.A.).
O Cell Quest fornece um perfil de células de acordo com o tamanho e granulosidade. Foram
coletados 50.000 eventos dentro da população de linfócitos totais para a análise após
estimulação in vitro.
A apoptose é um processo ordenado de morte celular, disparado por enzimas
denominadas caspases que é iniciada em resposta a sinais pró-apoptóticos e que culmina na
clivagem de uma série de proteínas, promovendo ativação de algumas e desativação de outras.
A caspase 3, é uma das caspases, que está implicada diretamente nos mecanismos
denominados executores de apoptose (Krammer, Arnold & Lavrik, 2007).
46
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
3.7 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)
Amostras de sangue periférico foram coletadas em tubo Vacutainer estéril contendo
heparina. O sangue total heparinizado foi lentamente adicionado a uma mistura de FicollHypaque (LMS, Litton Biogenetics, Savannah, Georgia, E.U.A.), na proporção de 2:1 em
tubos de 50 mL e centrifugados a 400g durante 40 minutos a 20C em centrífuga refrigerada
Beckman, modelo J-6B (Beckman Instruments Icn., Irvine, E.U.A.). Ao final da centrifugação
obteve-se um anel de PBMCs entre a mistura de Ficoll-Hypaque e o plasma. O plasma foi
retirado, cuidadosamente, e posteriormente utilizado para os testes de sorologia convencional
para a doença de Chagas. As células foram coletadas e transferidas para tubos cônicos de 50
mL (Falcon – BD, E.U.A.) onde foram lavadas 3 vezes por centrifugação a 400g, por 10
minutos, a 4C, em meio de cultura MEM (Minimal Essential Medium). Finalmente, as
células foram ressuspendidas em RPMI, contadas em câmara de Neubauer, e ajustadas para a
concentração desejada de acordo com o ensaio a ser realizado. Toda a manipulação, com
exceção da contagem de células, foi realizada em condições estéreis em capela de fluxo
laminar (BBL-Biological Cabinet, model 60474, Cockeysville, MD ou Veco, modelo VLFS
12M, Campinas, São Paulo) com soluções e vidrarias também estéreis previamente
siliconizados para evitar aderência de células à parede dos vidros.
3.8 Ensaio de proliferação celular
O ensaio de proliferação celular (blastogênese) foi realizado segundo procedimento
descrito por Gazzinelli et al. (1983). Em resumo, as PBMCs foram mantidas em meio de
cultura CMBLAST. O cultivo foi feito em placas de fundo chato com 96 poços, onde se
acrescentava a cada poço 150 L de CMBLAST, 25 L de suspensão de células em RPMI, na
concentração de 107 células/mL, 25 L de preparação antigênica EPI na concentração de 200
g/mL.
As culturas foram mantidas em incubadora contendo 5% de CO2 em atmosfera úmida
(Forma Scientific, Marietta, OH, E.U.A.) a 37% durante 6 dias. No sexto dia de cultivo
adicionava-se a cada poço 25 L de solução de timidina tritiada (3[H]-timidina) contendo 0,2
Ci, com atividade de 20 Ci/mmol (ICN, Radiochemicals, Irvine, CA, E.U.A.), e as placas de
cultura foram, novamente, incubadas por mais 6 horas. Finalmente, as células foram coletadas
47
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
em papel de fibra de vidro (Whatman 934-AH, Whatman INC., Clifton, N.J., E.U.A.), com
auxílio de um coletor automático de células (Cell Harvester Brandel, M-24S, E.U.A.). O papel
de fibra de vidro contendo as células radioativas foi submetido à secagem em estufa e
colocado em frascos de cintilação líquida, aos quais se acrescentavam 3,5 mL de coquetel de
cintilação, contendo em cada litro de tolueno: -333 mL de Triton X 100 (Sigma), - 5g de PPO
(2,5-difeniloxazole / Fisher Scientific Company, N. J., E.U.A.) – 0,1g de POPOP (1,4-bis 2[5-feniloxazolil]-benzeno] / Fisher).
A radioatividade incorporada foi, inicialmente, determinada em cintilador Beckman
LS6000SC. Cada amostra era contada durante 2 minutos, com os canais de 3H e 14C abertos.
Cada experimento foi feito em triplicata, acompanhado da cultura controle, onde se
adicionava RPMI em substituição à preparação antigênica. Os resultados foram expressos em
contagens por minuto (cpm) e os dados analisados após a diminuição do cpm das células não
estimuladas (experimental – controle) E-C = Δ cpm.
3.9 Análise de marcadores de superfície e citocina intracitoplasmática
(TNF-α) em linfócitos totais
A metodologia utilizada neste estudo foi adaptada dos protocolos originais descritos
por Picker et al. (1995), Carrock-Sewell et al. (1997) e Suni, Picker & Maino (1998) onde
alíquotas de 1 mL de sangue periférico coletado a vácuo em tubos de 10 mL contendo
heparina sódica (Vacutainer – BD, E.U.A.), foram adicionadas em tubos de polipropileno de
12 mL (Falcon – BD, E.U.A.). É importante salientar que esse procedimento foi realizado em
duplicata. As células do sangue periférico foram incubadas na presença de meio de cultura
CMBlast
(RPMI-1640
suplementado
com
1,6%
de
L-glutamina,
3%
de
Antibiótico/Antimicótico e 5% de NHS – Gibco, E.U.A.) apenas recebendo a denominação de
cultura controle (C), ou na presença de antígenos solúveis da forma epimastigota (EPI) do T.
cruzi, apresentando concentração final de 25 µg/mL, recebendo a denominação de cultura
com estímulo específico (EPI). Os tubos foram previamente incubados durante 18 horas em
estufa com 5% CO2 a 37°C (Forma Scientific, E.U.A.). Em seguida, foram adicionados a
todos os tubos 20 µL de Brefeldina A (Sigma, St. Louis, MO, E.U.A.), na concentração
estoque de 1 mg/mL (concentração final de 10 µg/mL). As amostras foram incubadas por
mais quatro horas em estufa nas mesmas condições acima. A utilização da Brefeldina A
48
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
assegura a retenção das citocinas no interior das células, uma vez que essa substância mantém
a citocina no complexo de Golgi. Após a incubação, 220 µL de EDTA (Sigma, St. Louis, MO,
E.U.A.) a 20 mM, diluída 1/10 (concentração final de 2 mM) foram adicionados diretamente
às culturas. Os tubos contendo as amostras foram incubados por 15 minutos, em estufa com
5% CO2, a 37°C. Esse procedimento bloqueia o processo de ativação posterior das células e
garante a obtenção de resultados padronizados e comparáveis. Posteriormente, foram
adicionados as amostras de sangue 3 mL de PBS-W e estas foram centrifugadas (Centrífuga
Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 800g, por 10 minutos, a 18°C. O sobrenadante foi aspirado
deixando um volume final de 3 mL. Foram transferidos 200µL deste sangue para tubos de
poliestireno de 5 mL (Falcon, BD – E.U.A.), previamente identificados e contendo os
anticorpos anti-CD25 (PE) (M-A251), anti-CD28 (FITC) (CD28.2), anti-CD62L (PE-Cy5)
(Dreg 56), anti-CD69 (PerCP) (L78) – (BD Pharmingem). Após a adição do sangue, os tubos
foram incubados por 30 minutos, à temperatura ambiente. É importante mencionar que a
marcação com os anticorpos foi realizada anteriormente à etapa de lise das hemácias para
evitar que a ação do formol presente na solução de lise impedisse a detecção desses
marcadores celulares pelos anticorpos. Posteriormente, as amostras foram lisadas e fixadas em
2 mL de solução de lise comercial (Facs Lysing Solution – FLS – BD, E.U.A.) por 10 minutos
à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. As células foram lavadas com 1 mL de PBS-W e
centrifugadas (Centrífuga Beckman Modelo J-6B, E.U.A.) a 400g, por 10 minutos, a 18 °C. O
conteúdo foi vertido e 300 µL de solução fixadora – Macs Facs Fix (MFF) adicionados aos
tubos. Para a detecção da citocina intracitoplasmática, foram acrescentados aos tubos 2,5 mL
de PBS-P (PBS, pH 7,4, contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida sódica e 0,5% de saponina)
por 10 minutos à temperatura ambiente, seguidos da adição de 20 µL de anticorpos, anti-TNFα (PE) (L293) – (BD Pharmingem), diluídos 1:50 em PBS-P aos respectivos tubos, e
posteriormente incubados por 30 minutos à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Após a
incubação, as células foram primeiramente lavadas com 1 mL de PBS-P e em seguida, com 1
mL de PBS-W. No final, foram adicionado 300 µL de solução fixadora – Macs Facs Fix
(MFF) (10g/L de paraformaldeído, 1% de cacodilato de sódio, 6,67g/L de cloreto de sódio,
pH 7,2 - reagentes Sigma, E.U.A.). As amostras contendo a suspensão celular foram utilizadas
para aquisição de dados em citômetro de fluxo (FACSCalibur – BD, E.U.A.). Foram
analisados 100.000 eventos totais.
49
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
3.10 Detecção do nível de citocinas plasmáticas
Para determinação do nível de citocinas plasmáticas, amostras de sangue foram
coletadas à vácuo em tubos de 10 mL contendo heparina sódica (Vacutainer – BD, E.U.A.) e
centrifugados a 400g, por 40 minutos, a18°C. Após a centrifugação, o plasma foi aliquotado e
mantido a -70°C até a realização dos experimentos.
Os níveis plasmáticos de citocinas foram quantificados utilizando-se o sistema de
ensaio com microesferas fluorescentes (Cytometric Bead Array – CBA – BD, E.U.A.)
seguindo a metodologia sugerida pelo fabricante. Esta técnica emprega uma mistura de 6
esferas de poliestireno, de intensidades de fluorescência discretas e distintas, recobertas com
anticorpos específicos para as citocinas humanas detectadas no canal de fluorescência 3 (FL3) ou fluorescência 3 (FL-4). Essa metodologia permite a avaliação simultânea de diversas
citocinas de interesse no mesmo ensaio, empregando pequenos volumes de amostra. Desta
forma, alíquotas de 25 L de plasma diluído 1:5 com diluente G (reagente do kit CBA),
alíquotas de 25 L dos padrões de citocinas, foram submetidos à diluição seriada com
diluente G (Top Standard – 5000 pg/mL, 1:2 – 2500 pg/mL, 1:4 – 1250 pg/mL, 1:8 – 625
pg/mL, 1:16 – 312,5 pg/mL, 1:32 – 156 pg/mL, 1:64 – 80 pg/mL, 1:128 – 40 pg/mL e 1:256 –
20 pg/mL) e 25 L de diluente G apenas (Controle Negativo). Após esta etapa, as amostras
foram transferidas para tubos de poliestireno de 5 mL (Falcon – BD, E.U.A.). Posteriormente,
a cada tubo foram adicionados 15 L da mistura de esferas de captura, conjugadas a
anticorpos monoclonais anti-IFN-, TNF-, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, com subseqüente
incubação por 90 minutos, a temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Após a incubação, as
esferas de captura foram lavadas com 500 L da solução F (tampão de lavagem do kit CBA),
centrifugadas a 600g, por 10 minutos, a 18 ºC e o sobrenadante cuidadosamente aspirado e
descartado. As esferas foram então incubadas novamente na presença de 20 µL do reagente B,
que corresponde a um coquetel de anticorpos monoclonais anti-citocinas humanas,
conjugadas com PE (FL-2) por 90 minutos, temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Após a
incubação, as esferas de captura foram novamente lavadas com 500 L da solução F,
centrifugados a 600g, por 10 minutos a 18°C e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e
descartado. Após a centrifugação, as esferas foram ressuspendidas em 250 L de reagente F e
imediatamente analisados no citômetro de fluxo.
50
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Para aquisição dos dados obtidos, o aparelho foi ajustado utilizando o BD FACSComp
Software e o BD Calibrate Beads. O objetivo do ajuste do aparelho consiste em definir os
parâmetros de tamanho e granulosidade adequados para o posicionamento das esferas de
captura em gráficos de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC). Após a seleção das
esferas, procedeu-se o ajuste da intensidade da fluorescência detectada no canal de FL-3 para
permitir a segregação das esferas policromáticas, apresentando diferentes intensidades de
fluorescência, em histogramas unidimensionais. Para cada tubo processado foram adquiridos
1800 eventos dentro da região selecionada R1 (300 eventos por citocina testada). A análise do
perfil de citocinas do Tipo 1 (IL-2, IFN- ) e do Tipo 2 (IL-10 e IL-4) nos plasmas foi
realizada segundo protocolo proposto pelo fabricante através da utilização do BD CBA
Analyses Software, com auxílio do Microsoft Excel, modificado como descrito a seguir. O
programa BD CBA Analysis Software faz a seleção automática da região das esferas de
captura em gráficos de tamanho versus granulosidade (Figura 1A). Em seguida, o programa
separa as esferas em função da intensidade da fluorescência 3 (FL-3) e analisa o deslocamento
das esferas em função da intensidade da fluorescência 2 (FL-2) em gráficos bidimensionais de
FL-2 versus FL-3 (Figuras 1B e 1C). A ligação da citocina, presente na amostra de interesse à
esfera de captura e a revelação da ligação através do uso de um coquetel de anticorpos
monoclonais anti-citocinas humanas marcadas com o fluorocromo PE (FL-2), pode ser
evidenciada através do deslocamento do conjunto de esferas para a região de maior
intensidade de fluorescência em relação ao tubo controle negativo, sem amostra (Figuras 1B e
1C). Os valores correspondentes à intensidade média de fluorescência FL-2 na escala
logarítmica foram utilizados como a unidade de análise semi-quantitativa para cada citocina
analisada.
51
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
A
B
Amostra positiva
FL3
GRANULOSIDADE
C
IL‐
IL‐2
IL‐
IL‐4
IL‐
IL‐5
IL‐
IL‐10
TNF‐
TNF‐
IFN‐
IFN‐
R1
FL 2
Figura
Amostra negativa
FL 2
1 - Análise quantitativa de citocinas no plasma utilizado pelo BD CBA Analyses Software.
Inicialmente, o programa promove a seleção automática da população de esferas de captura em gráficos de
tamanho versus granulosidade (Figura 1A). Em seguida, separa as esferas e analisa da intensidade de
fluorescência correspondente ao complexo esfera-citocina-anticorpo PE (Figuras 1B e 1C).
52
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
3.11 Obtenção e análise dos dados no citômetro de fluxo
O citômetro de fluxo (FACSCalibur – BD, E.U.A.) utilizado neste trabalho é
equipado com laser de argônio e laser diodo, que permite a avaliação básica de 6 parâmetros:
dispersão frontal, referente ao tamanho celular (FSC) e dispersão lateral referente à
granulosidade celular (SSC), fluorescência do tipo 1 (FL-1), fluorescência do tipo 2 (FL-2),
fluorescência do tipo 3 (FL-3) e fluorescência do tipo 4 (FL-4). FL-1, FL-2, FL-3 e FL-4
correspondem respectivamente a sinais luminosos emitidos pela excitação de FITC, PE, PECy5 e APC. A identificação de populações celulares de interesse, bem como a determinação
do valor percentual destas populações e subpopulações, foram feitas através de um sistema de
computador e o software Cell Quest (BS, E.U.A.), acoplado ao citômetro. A análise das
células T foi feita obedecendo cada um dos objetivos específicos, da seguinte forma:
Detecção de apoptose pela coloração por Anexina PE: Primeiramente foi
selecionada a população de linfócitos totais, denominada R1, baseada em um gráfico de
distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 2A). Uma vez
selecionada a população de interesse foi construído um segundo gráfico de fluorescência 3
(FL-3) (7AAD) versus FSC. Esta estratégia foi utilizada para delimitar a população de
linfócitos totais 7AAD negativa (R2) (Figura 2B), ou seja, excluiu as membranas de células
danificadas e mortas que são permeáveis ao 7AAD. Em seguida, um terceiro gráfico de
fluorescência 2 (FL-2) (Anexina PE) versus FSC foi construído através da junção dos eventos
presentes simultaneamente em R1 e R2 (Figura 2C). Esta análise foi capaz de identificar
linfócitos totais positivos para anexina-V e negativos pelo 7AAD, isto é, linfócitos que
estavam sofrendo apoptose.
Para a análise de apoptose em subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CD8+)
primeiramente foram construídos gráficos de distribuição pontual de fluorescência 1 (FL-1)
versus granulosidade (SSC), onde as subpopulações CD4 ou CD8 foram selecionadas através
de regiões denominadas (R3, R4 respectivamente) (Figuras 3A e 3C). O próximo passo
constituiu na construção de gráficos de fluorescência 2 (FL-2) (Anexina PE) versus
fluorescência 3 (FL-3) (7AAD) dentro das regiões R3 ou R4 para a identificação de linfócitos
TCD4+ e TCD8+ positivos à coloração pela anexina V e negativos pelo 7AAD, isto é,
linfócitos que estavam sofrendo apoptose (Figuras 3B e 3D).
53
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Detecção de apoptose pela coloração por Caspase 3 ativa: Primeiramente foi
selecionada a população de linfócitos totais, denominada R5, baseada em gráficos de
distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 4A). O próximo
passo constituiu na construção de um segundo gráfico de fluorescência 1 (FL-1) (CD45 FITC)
versus fluorescência 3 (FL-3) (CD14 PerCP) para delimitar o leucogate onde as regiões (R1,
R2 e R3) correspondem respectivamente às populações de linfócitos, monócitos e
granulócitos (Figura 4B). Depois de selecionada a população de interesse foi construído um
terceiro gráfico de FSC versus fluorescência 2 (FL-2) (caspase 3- PE) para a identificação de
linfócitos totais positivos à coloração por caspase 3 ativa, isto é, linfócitos que estavam
sofrendo apoptose (Figura 4C).
Para a análise de subpopulações de linfócitos T (T CD4+ e T CD8+) primeiramente foi
selecionada a população de linfócitos totais, denominada R5, baseada em gráficos de
distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 5A). O próximo
passo constituiu na construção de um gráfico de fluorescência 3 (FL-3) (CD4 PerCP) versus
fluorescência 2 (FL-2) (caspase 3 PE), dentro de R5, para a identificação de linfócitos TCD4+
caspase 3+ (Figura 5B). Em seguida, um gráfico de fluorescência 1 (FL-1) (CD8 FITC) versus
fluorescência 2 (FL-2) (caspase 3 PE), dentro de R5, para a identificação de linfócitos TCD8+
caspase 3+, isto é células em apoptose (Figura 5C).
54
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Granulosidade
A
FL-3
R1
Tamanho
FL-2
Tamanho
Tamanho
Figura 2 - Análise de linfócitos totais anexina+ do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI) e de
pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de
fluxo.
A Figura 2A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC).
A Figura 2B representa o perfil celular obtido em gráficos de fluorescência 3 – FL-3 (7AAD) versus FSC dentro
da região R2. A Figura 2C representa o perfil obtido em gráficos de FSC versus fluorescência 2 – FL-2 (Anexina
PE) construído através da junção dos eventos presentes simultaneamente em R1 e R2. Esta abordagem é
utilizada identificar linfócitos totais (anexina+ 7AAD-).
55
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
A
Granulosidade
B
FL-3
R3
R13
FL-2
C
D
Granulosidade
FL-1
FL-3
R14
R4
FL-1
FL-2
Figura 3 - Análise de linfócitos T CD4+anexina+ e T CD8+anexina+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) –
por citometria de fluxo.
As Figuras 3A e 3C representam o perfil celular característico de gráficos de fluorescência 1 – FL-1
(CD4 e CD8 FITC) versus granulosidade (SSC), onde a subpopulações de linfócitos T CD4 e CD8 foram
selecionadas através de regiões denominadas (R3, R4 respectivamente). As figuras 3B e 3D representam o perfil
celular obtido em gráficos de fluorescência 2 – FL-2 (Anexina-PE) versus fluorescência 3 – FL-3 (7AAD) dentro
das regiões R3, R4. Esta abordagem é utilizada para delimitar a população celular de interesse CD4+ (anexina+
7AAD+), CD4+ (anexina+ 7AAD-) e CD8+ (anexina+ 7AAD+), CD8+ (anexina+ 7AAD-).
56
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
A
B
Granulosidade
R4
R3
FL-3
R2
R5
Tamanho
R1
FL-1
FL-2
C
Tamanho
Figura 4 - Análise de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não infectados (NI) e de
pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) – por citometria de
fluxo.
A Figura 4A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC)
versus granulosidade (SSC). A Figura 4B representa o perfil celular obtido em gráficos de
fluorescência 1 – FL-1 (CD45 FITC) versus fluorescência 3 – FL-3 (CD14 PerCP),
abordagem utilizada para delimitar as populações de linfócitos (R1), monócitos (R2) e
granulócitos (R3). A Figura 4C demonstra o perfil celular obtido em gráficos de tamanho
(FSC) versus fluorescência 2 – FL-2 (caspase 3 - PE). Esta abordagem é utilizada para
delimitar a população celular de interesse (linfócitos totais caspase 3+).
57
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
B
FL - 2
Granulosidade
A
R5
Tamanho
FL-3
FL - 2
C
FL-1
Figura 5 - Análise de linfócitos T CD4+ caspase 3+ e T CD8+ caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos
não infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca
(CARD) – por citometria de fluxo.
A Figura 5A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC) versus
granulosidade (SSC). A Figura 5B representa o perfil celular obtido de gráficos de fluorescência 3 – FL-3 (CD4
PerCP) versus fluorescência 2 – FL-2 (caspase 3 PE), dentro de R5. A Figura 5C representa o perfil celular
obtido de gráficos de fluorescência 1 – FL-1 (CD8 FITC) versus fluorescência 2 – FL-2 (caspase 3 PE), dentro
de R5. Esta abordagem é utilizada para delimitar a população celular de interesse CD4+ caspase 3+, e CD8+
caspase 3+.
58
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Marcação de moléculas de superfície celular:
*CD62L= Primeiramente foi selecionada a população de linfócitos totais, denominada
R1, baseada em gráficos de distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade
(SSC) (Figura 6A). Em seguida, gráficos de fluorescência 1 (FL-1) (CD4 ou CD8 FITC)
versus fluorescência 3
(FL-3) (CD62 PE-Cy5) foram construídos para identificar a
segregação das populações CD4 e CD8 em três subpopulações cada: CD4+C62Lhigh (R4),
CD4+CD62Llow (R3), CD4+CD62L- (R2) (Figura 6B) e CD8+C62Lhigh (R4), CD8+CD62Llow
(R3), CD8+CD62L- (R2) (Figura 6C). A combinação das regiões R1 e R2, R3, foi feita através
da fórmula G2=R1 and R2, G3=R1 and R3, onde and designa a interseção dos eventos
presentes simultaneamente em R1 e R2.
*CD25= Primeiramente foi selecionada a população de linfócitos totais, denominada
R1, baseada em gráficos de distribuição pontual de tamanho (FSC) versus granulosidade
(Figura 7A). Em seguida, gráficos de fluorescência 1 (FL-1) (CD4 FITC) versus fluorescência
2 (FL-2) (CD25 PE) foram construídos para identificar a segregação da população CD4+ em
três subpopulações: CD4+CD25high (R2), CD4+CD25low (R3), CD4+CD25- (R4) (Figura 7B).
O próximo passo consistiu na combinação das regiões R1 e R2, R3 através da fórmula G2=R1
and R2, G3=R1 and R3, onde and designa a interseção dos eventos presentes
simultaneamente em R1 e R2 (Figura 7).
59
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
A
FL - 3
Granulosidade
B
Tamanho
FL – 1
FL - 3
C
FL – 1
Figura 6 - Análise de linfócitos T CD4+CD62L- e CD8+CD62L- do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) –
por citometria de fluxo.
A Figura 6A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC)
versus granulosidade (SSC). As Figuras 6B e 6C representam o perfil celular obtido em
gráficos de fluorescência 1 – FL-1 (CD4 e CD8 – FITC) versus fluorescência 3 – FL-3
(CD62L – PE Cy5), abordagem utilizada para delimitar a população celular de interesse
CD4+C62Lhigh (R4), CD4+CD62Llow (R3), CD4+CD62L- (R2) (Figura 6B) e CD8+C62Lhigh
(R4), CD8+CD62Llow (R3), CD8+CD62L- (R2) (Figura 6C).
60
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
B
FCS- Height
Tamanho
FL - 2
CD25 PE
SSC- Height
Granulosidade
A
CD4 FITC
FL – 1
Figura 7- Análise de linfócitos T CD4+CD25high e T CD4+CD25- do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD) –
por citometria de fluxo.
A Figura 7A representa o perfil celular característico de gráficos de tamanho (FSC) versus
granulosidade (SSC). A Figura 7B representa um perfil celular obtido em um gráfico de fluorescência 1 – FL-1
(CD4 – FITC) versus fluorescência 2 – FL-2 (CD25 – PE), abordagem utilizada para delimitar a população
celular de interesse CD4+CD25high (R2), CD4+CD25low (R3) e CD4+CD25- (R4).
61
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
3.12 Análise Estatística
Para garantir a confiabilidade dos resultados apresentados neste estudo, realizou-se
uma análise estatística minuciosa na Assessoria em Estatística do CPqRR/FIOCRUZ. Todos
os dados foram trabalhados sob a coordenação das estaticistas Carolina Silva Pena e Graziele
Umbelina Alves Ferreira no período de 2008 a 2009.
Procedeu-se a realização dos testes estatísticos para comparação entre os grupos da
forma como apresentada no diagrama a seguir:
Teste de Normalidade
de Anderson-Darling
Dados normais
Teste de
Homogeneidade de
Variâncias de Bartlett
Dados não-normais
Teste de
Homogeneidade de
Variâncias de Levene
Variâncias
Homogêneas
Variâncias Nãohomogêneas
Variâncias
Homogêneas
Variâncias Nãohomogêneas
ANOVA
paramétrica
ANOVA
paramétrica com
correção de Welch
Kruskal-Wallis
Kruskal-Wallis
Mann-Whitney com
correção de
Bonferroni (quando
necessário)
Mann-Whitney com
correção de
Bonferroni (quando
necessário)
Tukey
Games-Howell
Na análise dos dados foram utilizados gráficos Box-plot, representações visuais
poderosas das coleções de dados a que se referem, por permitirem o rápido reconhecimento
dos quartis, mediana e outliers. O Box-plot, que será utilizado no decorrer do texto do item
Resultados, está ilustrado na Figura 8.
Este tipo de gráfico ajuda a observar a distribuição dos dados da seguinte maneira: o
local onde a linha vertical começa (de baixo para cima) indica o mínimo (excetuando algum
possível valor extremo), e onde a linha termina indica o máximo, também excetuando algum
possível outlier. O retângulo no meio dessa linha possui três linhas horizontais. A de baixo
(que é o próprio contorno externo inferior do retângulo) indica o primeiro quartil, a de cima
62
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
(que também é o próprio contorno externo superior do retângulo) indica o terceiro quartil e, a
do meio, indica a mediana. Para calcular o primeiro quartil, primeiramente ordenam-se os
dados do menor para o maior. O valor que é maior que os 25% menores e menor que os 75%
maiores é o primeiro quartil, pois deixa um quarto dos dados “abaixo” dele. Analogamente, o
terceiro quartil é o valor que é maior que os 75% menores e menor que os 25% maiores. A
mediana é o nome mais popular do segundo quartil, pois ela é o valor que é maior que os 50%
menores e menor que os 50% maiores, ou seja, ela está bem no meio dos dados ordenados.
Ela é a medida de tendência central mais indicada quando os dados possuem distribuição
assimétrica, mais indicada até do que a média aritmética, que nesse caso seria influenciada
pelos valores extremos.
a, b
*
Valor máximo observado na amostra.
3º Quartil – Valor o qual acima dele estão 25%
dos valores observados na amostra, e abaixo dele
75% dos valores observados na amostra.
Mediana – Valor o qual acima dele estão 50% dos
valores observados na amostra, e abaixo dele 50%
dos valores observados na amostra.
1º Quartil – Valor o qual acima dele estão 75%
dos valores observados na amostra, e abaixo dele
25% dos valores observados na amostra.
EPI
Valor mínimo observado na amostra.
CARD
Figura 8 – Desenho esquemático de um gráfico Box- plot utilizado para demonstração dos
dados com resumo da interpretação.
63
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4 RESULTADOS
Para avaliar o papel da apoptose nos linfócitos do sangue periférico de indivíduos não
infectados e de pacientes com as formas indeterminada e cardíaca da doença de Chagas e
relacionar com o controle/ e ou desenvolvimento da miocardiopatia os resultados serão
apresentadas em quatro partes.
A primeira parte constitui-se dos experimentos para detecção de apoptose em
populações e subpopulações celulares do sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND
e CARD. O primeiro experimento avaliou o percentual de células positivas à coloração pela
anexina-V, e negativas pelo corante 7AAD, isto é, células sofrendo apoptose na ausência de
estímulos ou após estímulos in vitro, recebendo as seguintes denominações: somente meio –
cultura controle (C); estímulo específico com antígenos solúveis de epimastigota – (EPI) ou
estímulo inespecífico com estaurosporina – controle positivo para apoptose (STP). O segundo
experimento realizado teve também como objetivo avaliar a apoptose, através do percentual
de células positivas à caspase 3 (caspase 3+), o que indica que estas células estavam sofrendo
apoptose na ausência e após estímulos.
Na segunda parte o trabalho teve como objetivo averiguar o panorama fenotípico dos
linfócitos T do sangue periférico de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD submetidos à
estimulação in vitro por EPI. Assim, o antígeno EPI foi responsável pelo estímulo das células
de memória de indivíduos dos grupos IND e CARD. As células estudadas através de análises
por citometria de fluxo foram as subpopulações de linfócitos T (CD4+ e CDC8+). Foram
realizados experimentos de dupla marcação para avaliar nestas subpopulações a expressão das
moléculas CD25, CD28, CD62L, CD69.
A terceira parte teve como objetivo analisar os níveis da citocina intracitoplasmática
TNF-α em linfócitos totais e nas subpopulações T CD4+ e T CD8+ nos indivíduos dos grupos
NI, IND e CARD após estimulação por EPI. Nesta parte também foi demonstrado os níveis
das citocinas plasmáticas (TNF-α, IFN-, IL-2, IL-10).
As citocinas são moléculas solúveis produzidas e secretadas pelas células do sistema
imune em resposta a patógenos e outros antígenos. Elas medeiam e regulam a resposta imune
por meio de ligações a receptores específicos. Sabe-se que o perfil de citocinas é fundamental
tanto para a definição dos mecanismos imunopatológicos envolvidos na miocardiopatia.
chagásica crônica, quanto para o controle da resposta imune durante a infecção pelo T. cruzi.
64
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Com intuito de avaliar se o perfil de citocinas poderia estar relacionado à indução de
apoptose em linfócitos totais e nas subpopulações T CD4+ e T CD8+, este estudo teve também
o objetivo de relacionar os percentuais apoptóticos com os níveis de citocinas, tanto no
interior das células como no plasma circulante de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD.
Dados da literatura demonstram que a baixa resposta proliferativa observada em
pacientes com insuficiência cardíaca pode ser devido a um menor número de linfócitos T
antígenos-específicos
ou
pode
estar
relacionada
a
mecanismos
envolvidos
no controle da resposta imune sugerindo o envolvimento do mecanismo de apoptose
(Rodrigues et al., 2008).
A quarta parte deste projeto teve então, como objetivo, avaliar a resposta de
proliferação das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos dos
grupos NI, IND e CARD, após estimulação in vitro por EPI.
65
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.1 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos
NI, IND e CARD, por citometria de fluxo, através da utilização do Kit
de marcação por Anexina-V conjugada ao 7AAD
Análise do percentual de linfócitos totais anexina+
4.1.1
Os resultados apresentados na Figura 9 mostram o percentual de linfócitos totais
anexina+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas nos tempos de 6 horas
(Figura 9A) e 24 horas (Figura 9B), na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após
estimulação in vitro com EPI e STP.
A
B
*
*
**
5
% de células Anexina +
6
a, b
*
4
*
*
a, b
3
2
1
4
*
**
3
a, b
*
a
*
*
2
a
1
0
a, b
*
*
5
% de células Anexina +
6
0
C
EPI
NI
STP
C
EPI
IND
STP
C
EPI
STP
C
CARD
EPI
STP
NI
C
EPI
IND
STP
C
EPI
STP
CARD
Figura 9 - Avaliação do percentual de linfócitos totais anexina+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com EPI e STP,
nos tempos de 6 horas (Figura 9A) e 24 horas (Figura 9B). Os asteriscos representam as diferenças
estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
(**) Quando existe diferença em relação às culturas estimuladas pelo EPI
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
66
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Na avaliação comparativa entre os estímulos dentro do mesmo grupo, observou-se
elevação significativa no percentual de linfócitos totais anexina+ nos indivíduos do grupo NI,
após estímulo inespecífico com STP, quando comparada às culturas controle (p=0,003) e
estimulada pelo EPI (p=0,024), após 6 horas de cultura (Figura 9A).
A análise das células de indivíduos dos grupos IND e CARD (Figura 9A) mostrou que
houve aumento significativo no percentual de linfócitos totais anexina+ nos grupos IND
(p=0,000) e CARD (p=0,001), após 6 horas de estimulação específica in vitro pelo EPI,
quando comparados às culturas controle dos respectivos grupos.
Na Figura 9B foi possível verificar, que o impacto do estímulo por EPI durante 24
horas na cultura de indivíduos do grupo NI permitiu elevação no percentual dos linfócitos
totais anexina+, da mesma forma que houve também um aumento destas células nos grupos,
IND e CARD, em relação às culturas controle no tempo de 24 horas (NI p=0,002; IND
p=0,003; CARD p=0,001).
Ainda nas culturas estimuladas durante 24 horas com STP, observou-se elevação
significativa no percentual de linfócitos totais anexina+ de indivíduos do grupo NI, quando
comparada à cultura controle (p=0,004), e mesmo à cultura estimulada por EPI (p=0,012) que
já se diferenciava estatisticamente da cultura controle (Figura 9B).
Comparando-se os resultados das células anexina+, cultivadas com EPI durante 6 horas
entre os indivíduos dos grupos NI, IND e CARD (Figura 9A), notou-se que no grupo CARD
houve aumento no percentual de linfócitos totais anexina+, em relação aos grupos NI
(p=0,000) e IND (p=0,000). Além disso, ao analisar os linfócitos totais anexina+ verificou-se
elevação significativa no percentual destas células no grupo CARD, em relação aos grupos NI
(p=0,032) e IND (p=0,006) (Figura 9A).
Através da análise entre os grupos observou-se aumento (p=0,024) no percentual de
linfócitos totais anexina+ na cultura controle do grupo CARD, em relação ao grupo NI, após
24 horas de cultura (Figura 9B).
Após estímulo específico pelo EPI observou-se aumento no percentual de linfócitos
totais anexina+ do grupo IND (p=0,003), quando comparado ao grupo NI (Figura 9B). Por
outro lado, foi interessante observar que houve elevação estatisticamente significativa no
percentual de linfócitos totais anexina+, estimulados pelo EPI no grupo CARD, em relação
aos grupos NI (p=0,000) e IND (p=0,002).
67
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Avaliando-se o estímulo inespecífico por STP, no tempo de 24 horas entre os grupos,
verificou-se aumento significativo de linfócitos totais anexina+ no grupo CARD, em relação
aos grupos NI (p=0,024) e IND (p=0,003) (Figura 9B).
É interessante verificar que no tempo de seis horas o percentual de apoptose das
células do grupo NI diferenciou-se entre os processos antígeno-específico (EPI) e antígenonão específico (STP); enquanto que, às 24 horas de cultura, foi possível também identificar
apoptose antígeno-específico. Considerando que a permanência entre células e antígenos
particulados e solúveis in vivo é onipresente optou-se neste trabalho pelos resultados obtidos
no tempo de 24 horas. Além disso, na avaliação comparativa entre os tempos de seis e 24
horas de cultura, da maioria dos resultados, não foi possível detectar diferenças estatísticas
entre os percentuais de linfócitos totais anexina+, para cada grupo estudado (Figura 10).
Através desta observação deve-se destacar que o tempo de 24 horas de cultura foi
escolhido para demais experimentos de apoptose que serão apresentados.
68
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
% de células Anexina +
6
5
4
3
2
#
1
0
6
24
C
6
24
EPI
6
24
STP
6
24
C
NI
6
24
EPI
IND
6
24
STP
6
24
C
6
24
EPI
6
24
STP
CARD
Figura 10 - Avaliação do percentual de linfócitos totais anexina+, do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com
EPI e STP, nos tempos de 6 horas (Figura 10A) e 24 horas (Figura 10B). A cerquilha (#) representa diferenças
estatisticamente significativas (p<0,05) entre os tempos.
69
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Análise do percentual de linfócitos T CD4+anexina+
4.1.2
Os resultados apresentados na Figura 11 mostram o percentual de linfócitos T
CD4+anexina+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas no tempo 24 horas,
na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI e STP.
35
a
% de LT CD4+Anexina +
30
a
25
a
20
a
a
15
a
10
5
0
C
EPI
NI
STP
C
EPI
STP
C
IND
EPI
STP
CARD
Figura 11 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD4+anexina+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com EPI e STP,
no tempo de 24 horas. Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de
um mesmo grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
(**) Quando existe diferença em relação às culturas estimuladas pelo EPI
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
70
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Na avaliação comparativa entre os estímulos dentro do mesmo grupo observou-se que
não houve diferenças significativas no percentual de linfócitos T CD4+anexina+, após
estimulação pelo EPI, quando se comparou às culturas controle dos grupos NI, IND e CARD
(Figura 11). Resultados semelhantes foram observados, após estimulação pela STP, não sendo
observadas diferenças significativas no percentual destas células nos grupos estudados, em
relação às suas culturas controle.
Através da avaliação comparativa entre os grupos já se pôde observar aumento
significativo no percentual destas células nas culturas controles dos grupos IND (p=0,016) e
CARD (p=0,000), em relação ao grupo NI (Figura 11). Após o estímulo específico pelo EPI
também se observou aumento significativo de linfócitos T CD4+anexina+ nos grupos IND
(p=0,039) e CARD (p=0,005), em relação ao grupo NI. Avaliando-se o estímulo pela STP
verificou-se elevação significativa destas células nos grupos IND (p=0,023) e CARD
(p=0,003), em relação ao grupo NI.
4.1.3
Análise do percentual de linfócitos T CD8+anexina+
Os resultados apresentados na Figura 12 mostram o percentual de linfócitos T
CD8+anexina+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas no tempo de 24
horas, na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI e
STP.
Na avaliação comparativa entre os estímulos dentro do mesmo grupo observou-se
aumento significativo desta população celular somente no grupo CARD, tanto nas culturas
celulares estimulas pelo EPI (p=0,001), como nas culturas estimuladas pela STP (p=0,000),
quando comparado à cultura sem estímulo (Figura 12).
Na avaliação comparativa entre os indivíduos dos grupos NI, IND e CARD notou-se
aumento significativo no percentual de linfócitos T CD8+anexina+ nos grupos IND e CARD,
tanto na ausência quando na presença de estímulos. Avaliando-se as culturas não estimuladas
já se observou aumento significativo no percentual destas células nos grupos IND (p=0,000) e
CARD (p=0,002) em relação ao grupo NI. No entanto, no grupo CARD, é interessante notar
que a elevação no percentual destas células foi significativa ao se comparar aos grupos NI
(p=0,000) e IND (p=0,000) (Figura 12).
Após estímulo específico pelo EPI observou-se aumento significativo no percentual de
linfócitos T CD8+anexina+ nos grupos IND (p=0,049) e CARD (p=0,000), em relação ao
71
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
grupo NI. No grupo CARD houve também elevação significativa no percentual destas células
ao se comparar aos grupos NI (p=0,000) e IND (p=0,014) (Figura 12).
Avaliando-se o estímulo inespecífico pela STP verificou-se elevação significativa no
percentual de linfócitos T CD8+anexina+ nos grupos IND (p=0,000) e CARD (0,000), em
relação ao grupo NI. Ainda na cultura estimulada pela STP foi observado no grupo CARD
elevação significativa no percentual destas células ao se comparar aos grupos NI (p=0,000) e
IND (p=0,002) (Figura 12).
60
% de LT CD8+Anexina +
a, b
*
a
50
a, b
*
40
a
30
a, b
a
20
10
0
C
EPI
NI
STP
C
EPI
STP
C
IND
EPI
STP
CARD
Figura 12 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+anexina+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com EPI e STP,
no tempo de 24 horas. Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de
um mesmo grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
(**) Quando existe diferença em relação às culturas estimuladas pelo EPI
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
72
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.2 Detecção de apoptose no sangue periférico de indivíduos dos grupos
NI, IND e CARD através da detecção de Caspase-3 ativa por
citometria de fluxo
Análise do percentual de linfócitos totais caspase 3+
4.2.1
Os resultados apresentados na Figura 13 mostram o percentual de linfócitos totais
caspase 3+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas nos tempos de 6 horas
(Figura 13A) e 24 horas (Figura 13B), na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após
estimulação in vitro com EPI e STP.
B
A
*
**
7
% de células Caspase 3+
6
6
*
*
**
*
5
4
*
*
3
2
5
% de células Caspase 3+
a
*
0
a
*
*
EPI
STP
*
**
4
3
*
2
a
1
1
*
**
a
0
C
EPI
NI
STP
C
EPI
IND
STP
C
EPI
STP
C
CARD
EPI
STP
NI
C
EPI
IND
STP
C
CARD
Figura 13- Avaliação do percentual de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com EPI e STP,
nos tempos de 6 horas (Figura 13A) e 24 horas (Figura 13B). Os asteriscos representam as diferenças
estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
(**) Quando existe diferença em relação às culturas estimuladas pelo EPI
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
73
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
A avaliação comparativa entre os estímulos dentro do mesmo grupo, após 6 horas de
estimulação pelo EPI (Figura 13A), mostrou um aumento significativo no percentual de
linfócitos totais caspase 3+ de indivíduos dos grupos NI (p=0,022), IND (p=0,000) e CARD
(p=0,000), quando comparado às suas culturas controle. Observou-se também uma elevação
significativa no percentual destas células de indivíduos dos grupos NI (p=0,003), IND
(p=0,000) e CARD (p=0,000), após estímulo pela STP, quando comparado às suas culturas
controle. Houve também um aumento significativo no percentual de linfócitos totais caspase
3+ nos grupos IND (p=0,021) e CARD (p=0,039) estimulados pela STP, quando comparado
às culturas estimuladas pelo EPI.
De forma semelhante, houve aumento significativo no percentual de linfócitos totais
caspase 3+ nos indivíduos dos grupos NI (p=0,004), IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), após
24 horas de estimulação pelo EPI, quando comparado às suas culturas controle (Figura 13B).
O efeito da estimulação antígeno-inespecífico pela STP também demonstrou elevação
significativa no percentual de linfócitos totais caspase 3+ nos grupos NI (p=0,001), IND
(p=0,000) e CARD (p=0,000), quando comparado às suas culturas controle (Figura 15B).
Ainda nas culturas estimuladas durante 24 horas com STP, observou-se aumento significativo
no percentual destas células nos grupos IND (p=0,001) e CARD (p=0,006), quando
comparado às suas culturas estimuladas pelo EPI (Figura 13B).
Com relação à avaliação comparativa do percentual de linfócitos totais caspase 3+
entre os indivíduos dos grupos NI, IND e CARD no tempo de 24 horas (Figura 13B), notou-se
elevação significativa nos grupos de indivíduos IND (p=0,022) e CARD (p=0,010), após a
estimulação pelo EPI, quando comparado às culturas não estimuladas.
Na avaliação comparativa entre os tempos de 6 e 24 horas de cultura não foi possível
detectar diferenças estatísticas significativas, na maioria dos resultados, entre os percentuais
de linfócitos totais caspase 3+, para cada grupo estudado (Figura 14).
Através desta observação deve-se destacar que o tempo de 24 horas de cultura foi
escolhido para os demais resultados que serão apresentados.
74
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
7
% de células Caspase 3+
6
#
5
#
4
3
2
1
0
6
24
C
6
24
EPI
6
24
STP
6
24
C
NI
6
24
EPI
IND
6
24
STP
6
24
C
6
24
EPI
6
24
STP
CARD
Figura 14 - Avaliação do percentual de linfócitos totais caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com EPI e STP,
nos tempos de 6 horas (Figura 14A) e 24 horas (Figura 14B). A cerquilha (#) representa diferenças
estatisticamente significativas (p<0,05) entre os tempos.
75
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.2.2
Análise do percentual de linfócitos T CD4+ caspase 3+
Os resultados apresentados na Figura 15 mostram o percentual de linfócitos T CD4+
caspase 3+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após cultura no tempo 24 horas, na
ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI e STP.
% de LT CD4+Caspase 3+
2,5
*
**
*
*
2,0
*
*
1,5
1,0
0,5
0,0
C
EPI
NI
STP
C
EPI
STP
IND
C
EPI
STP
CARD
Figura 15 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com EPI e STP,
no tempo de 24 horas. Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de
um mesmo grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
(**) Quando existe diferença em relação às culturas estimuladas pelo EPI
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
76
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo após
estimulação pela STP, a análise dos dados mostrou que houve aumento significativo no
percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+ quando se comparou, tanto às culturas controle
(p=0,000), quanto às culturas estimuladas pelo EPI (p=0,000) do grupo NI. Avaliando-se a
estimulação específica pelo EPI, houve aumento significativo no percentual de linfócitos T
CD4+caspase 3+ nos grupos IND e CARD, em relação às suas culturas não estimuladas
(p=0,021e p=0,034 respectivamente). Resultados semelhantes foram observados nos grupos
IND e CARD nas culturas estimuladas pela STP com aumento significativo (p=0,000 e
p=0,010 respectivamente) no percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+ (Figura 15).
Com relação à avaliação comparativa entre de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD
não foram observadas diferenças significativas no percentual de linfócitos T CD4+caspase 3+
(Figura 15).
4.2.3
Análise do percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+
Os resultados apresentados na Figura 16 mostram o percentual de linfócitos T
CD8+caspase 3+ de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, após culturas no tempo 24 horas,
na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI e STP.
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo após
estimulação pela STP, a análise dos dados mostrou que houve aumento significativo no
percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+, quando se comparou tanto às culturas controle
(p=0,000), quanto as estimuladas pelo EPI (p=0,000) do grupo NI.
É interessante notar que, após estimulação pelo EPI, houve também aumento
significativo no percentual de linfócitos T CD8+caspase+ nos grupos IND (p=0,000) e CARD
(p=0,000), em relação às suas culturas controle. Resultados semelhantes foram observados,
após estimulação pela STP, com aumento significativo no percentual destas células, nos
grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), em relação às suas culturas não estimuladas
(Figura 16).
Com relação à avaliação comparativa, entre os grupos NI, IND e CARD após a
estimulação pelo EPI, foi observado aumento significativo no percentual destas células nos
grupos IND (p=0,022) e CARD (p=0,010), em relação ao grupo NI (Figura 16).
77
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a
*
14
% de LT CD8+Caspase 3+
12
10
*
**
8
6
*
4
a
*
*
EPI
STP
2
0
C
EPI
NI
STP
C
EPI
STP
C
IND
CARD
Figura 16 - Avaliação do percentual de linfócitos T CD8+caspase 3+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro com EPI e STP,
no tempo de 24 horas. Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de
um mesmo grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
(**) Quando existe diferença em relação às culturas estimuladas pelo EPI
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
78
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.3 Análise do percentual de expressão da molécula CD25 em
subpopulações de linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos
grupos NI, IND e CARD
4.3.1
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD25+ e TCD4+CD25high
Os resultados apresentados nas Figuras (17 e 18 respectivamente) mostram o
percentual de linfócitos T CD4+CD25+ e T CD4+CD25high, nos indivíduos dos grupos NI, IND
e CARD, na ausência de estímulo – culturas controle (C) e após estimulação in vitro com EPI
por 24 horas de cultura.
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos
dados mostrou que aumento significativo no percentual de linfócitos T CD4+CD25+ no grupo
CARD (p=0,002), após estimulação por EPI em relação a sua cultura controle (Figura 17).
Com relação à avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD foi observado
uma queda significativa no percentual de linfócitos T CD4+CD25+ na cultura controle do
grupo CARD em relação aos grupos NI (p=0,047) e IND (p=0,001). Após estimulação por
EPI, houve diminuição significativa no percentual destas células em relação ao grupo IND
(Figura 17).
79
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
35
% de células CD4+CD25+
30
25
20
a, b
b
*
C
EPI
15
10
5
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
CARD
Figura 17 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD25+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
80
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos
dados mostrou que houve aumento estatisticamente significativo (p=0,000) no percentual de
linfócitos T CD4+CD25high, após estimulação por EPI somente no grupo IND em relação à sua
cultura controle (Figura 18). É interessante notar que através da avaliação comparativa dos
resultados entre os grupos NI, IND e CARD, após a estimulação pelo EPI, observou-se
elevação significativa no percentual de linfócitos T CD4+CD25high no grupo IND em relação
ao grupo NI (p=0,010) (Figura 18).
Na Figura 18 observa-se após a estimulação pelo EPI, diminuição significativa no
percentual de linfócitos T CD4+CD25high no grupo CARD quando comparado ao grupo IND
(p=0,007).
81
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a
*
% de células CD4+ CD25high
6
5
4
b
3
2
1
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 18 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD25high do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes portadores com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma
cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
82
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.4 Análise do percentual de expressão da molécula CD25 na superfície
dos linfócitos T CD8+ no sangue periférico dos indivíduos dos grupos
NI, IND e CARD
4.4.1
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD25+
Os resultados apresentados na Figura 19 mostram o percentual de linfócitos T
CD8+CD25+ nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas
controle (C) e após estimulação in vitro com EPI por 24 horas de cultura.
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos
dados mostrou que houve aumento significativo no percentual de linfócitos T CD8+CD25+,
após estimulação por EPI, tanto no grupo IND (p=0,000) quanto no grupo CARD (p=0,000)
em comparação às suas culturas controle.
Com relação à avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD, após a
estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de linfócitos T
CD8+CD25+ nos grupos IND (p=0,009) e CARD (p=0,000) em relação ao grupo NI (Figura
19). A análise dos resultados mostrou aumento significativo (p=0,000) no percentual destas
células, na cultura estimulada pelo EPI, no grupo CARD quando comparado ao grupo IND
(Figura 19).
83
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a, b
*
12
% de células CD8+CD25+
10
8
6
a
*
4
2
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 19 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD25+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
84
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.5 Análise do percentual de expressão da molécula CD28 em
subpopulações de linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos
grupos NI, IND e CARD
4.5.1
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD28Os resultados apresentados na Figura 20 mostram o percentual de linfócitos T
CD4+CD28- nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas
controle (C) e após estimulação in vitro com EPI por 24 horas de cultura.
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos
dados mostrou que houve aumento significativo no percentual de linfócitos T CD4+CD28após estimulação pelo EPI, tanto no grupo IND (p=0,000) quanto no grupo CARD (p=0,000)
em comparação às suas culturas controle.
Com relação à avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD, após a
estimulação pelo EPI (Figura 20), foi observada uma elevação significativa no percentual de
linfócitos T CD4+CD28- nos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000) em relação aos grupo
NI. A análise dos resultados demonstrou queda significativa (p=0,000) no percentual destas
células na cultura estimulada pelo EPI, nos grupos CARD quando comparado ao grupo IND.
85
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a *
35
% de células CD4+CD28‐
30
a
25
a, b *
20
a
15
10
5
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 20 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD28- do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
86
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.5.2
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD28Os resultados apresentados na Figura 21 mostram o percentual de linfócitos T
CD8+CD28- nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas
controle (C) e após estimulação in vitro com EPI por 24 horas de cultura.
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos
dados mostrou que não houve diferenças estatisticamente significativas no percentual de
linfócitos T CD8+CD28- em nenhum grupo estudado tanto nas culturas estimuladas pelo EPI
quanto nas culturas controles (Figura 21).
Com relação à avaliação comparativa entre os indivíduos dos grupos NI, IND e
CARD, após a estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de
linfócitos T CD8+CD28- nos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000) em relação ao grupo
NI (Figura 21). A análise dos resultados mostrou aumento significativo no percentual destas
células, também nas culturas controle, tanto grupos IND (p=0,000) quando comparado ao
grupo CARD (p=0,000) em relação às culturas do grupo NI (Figura 21).
87
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a
100
a
90
% de células CD8+CD28‐
a
a 80
70
60
50
40
30
20
10
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 21 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD28- do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença em relação ao grupo NI
88
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.6 Análise do percentual de expressão da molécula CD62L em
subpopulações de linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos
grupos NI, IND e CARD
4.6.1
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD62LOs resultados apresentados na Figura 22 mostram o percentual de linfócitos T
CD4+CD62L- nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas
controle (C) e após estimulação in vitro com EPI por 24 horas de cultura.
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos
dados mostrou que não houve diferenças significativas no percentual destas células em
nenhum grupo estudado tanto nas culturas controles quanto nas culturas estimuladas pelo EPI
(Figura 22).
Com relação à avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD, após a
estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de linfócitos T
CD4+CD62L- nos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000) em comparação ao grupo NI
(Figura 22). A análise dos resultados mostrou também aumento significativo no percentual
destas células nas culturas controle dos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000) em relação
às culturas controle do grupo NI (Figura 22).
89
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a
20
% de células CD4+CD62L‐
18
a
16
14
12
a
10
a
8
6
4
2
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 22 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD62L- do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença em relação ao grupo NI
90
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.6.2
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD62LOs resultados apresentados na Figura 23 mostram o percentual de linfócitos T
CD8+CD62L- nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas
controles (C) e após estimulação in vitro com EPI por 24 horas de cultura.
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos
dados mostrou que houve aumento estatisticamente significativo (p=0,002) no percentual de
linfócitos T CD8+CD62L- somente no grupo CARD em relação a sua cultura não estimulada
(Figura 23).
Com relação à avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD, após a
estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de linfócitos T
CD8+CD62L- no grupo CARD (p=0,000) em relação ao grupo IND (Figura 23).
91
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
30
b
*
% de células CD8+CD62L‐
25
20
15
10
5
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 23 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD62L- do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
92
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.7 Análise do percentual de expressão da molécula CD69 em
subpopulações de linfócitos T no sangue periférico dos indivíduos dos
grupos NI, IND e CARD
4.7.1
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD4+CD69+
Os resultados apresentados na Figura 24 mostram o percentual de linfócitos T
CD4+CD69+ nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas
controle (C) e após estimulação in vitro com EPI por de 24 horas de cultura.
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos
dados mostrou que houve aumento significativo no percentual destas células nos grupos IND
(p=0,007) e CARD (p=0,004) em relação às suas culturas não estimuladas (Figura 24).
Com relação à avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD, após a
estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de linfócitos T
CD4+CD69+ no grupo CARD, tanto em relação ao grupo NI (p=0,004), quanto ao grupo IND
(p=0,010) (Figura 24).
93
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a, b
*
12
% de células CD4+CD69+
10
8
*
6
a
4
2
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 24 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+CD69+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
94
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.7.2
Análise do percentual de expressão de linfócitos T CD8+CD69+
Os resultados apresentados na Figura 25 mostram o percentual de linfócitos T
CD8+CD69+ nos indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, na ausência de estímulo – culturas
controle (C) e após estimulação in vitro com EPI por 24 horas de cultura.
Na avaliação comparativa, entre os estímulos dentro do mesmo grupo, a análise dos
dados mostrou que houve aumento significativo no percentual destas células nos grupos IND
(p=0,007) e CARD (p=0,004) em relação às suas culturas não estimuladas (Figura 25).
Com relação à avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e CARD, após a
estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de linfócitos T
CD8+CD69+ no grupo CARD em relação aos grupos NI (p=0,004) e IND (p=0,010) (Figura
25).
95
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a, b
*
14
% de células CD8+CD69+
12
10
8
*
6
4
2
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 25 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+CD69+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
96
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.8 Análise de citocinas intracitoplasmática em linfócitos totais e nas
subpopulações T CD4+ e T CD8+ dos indivíduos dos grupos NI, IND e
CARD
A citocina TNF-α está envolvida na regulação de um amplo espectro de processos
biológicos, incluindo a proliferação celular, diferenciação e apoptose.
Os dados demonstram análise dos níveis da citocina intracitoplasmática TNF-α em
linfócitos totais e nas subpopulações T CD4+ e T CD8+ nos indivíduos dos grupos NI, IND e
CARD, após estimulação por EPI, como descrito no item Materiais e Métodos.
A análise dos dados mostrou que, tanto os indivíduos do grupo IND quanto os do
CARD, apresentaram percentual significativamente maior de linfócitos totais TNF-α+
(p=0,011, p=0,027 respectivamente) após a estimulação por EPI, quando comparado às suas
culturas controle (Figura 26).
É interessante observar que na avaliação comparativa entre os grupos NI, IND e
CARD, após a estimulação pelo EPI, foi observada elevação significativa no percentual de
linfócitos totais TNF-α+ nos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), em relação ao grupo
NI (Figura 26). Os dados também mostraram aumento significativo no percentual destas
células nas culturas não estimuladas dos grupos IND (p=0,000) e CARD (p=0,000), em
relação à cultura controle do grupo NI (Figura 26).
Em relação às subpopulações de células T a análise dos dados mostrou aumento no
percentual de linfócitos T CD4+ TNF-α+ tanto no grupo IND quanto no CARD (p=0,000,
p=0,000 respectivamente), após a estimulação por EPI quando comparado ao grupo NI
(Figura 27). Observou-se também elevação significativa no percentual destas células tanto
grupo IND (p=0,003) quanto no CARD (p=0,000), após estimulação pelo EPI em relação às
suas culturas controle (Figura 27). Observou-se aumento significativo no percentual de
linfócitos T CD4+ TNF-α+ na cultura controle do grupo CARD quando comparado às culturas
não estimuladas dos grupos NI (p=0,000) e IND (p=0,036) (Figura 27).
A análise dos dados mostrou elevação significa no percentual de linfócitos T
CD8+TNF-α+ tanto no grupo IND (p=0,001) quanto no CARD (p=0,006), após a estimulação
pelo EPI, quando comparado ao grupo NI. Observou-se também elevação significativa
(p=0,002) no percentual de linfócitos T CD8+ TNF-α+ no grupo IND após estimulação pelo
EPI quando comparado à cultura controle (Figura 28).
97
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a
*
10
% de Linfócitos Totais TNF‐α+
9
a
*
8
a
7
6
a
5
4
3
2
1
0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 26 - Análise da expressão de linfócitos totais TNF-α+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
98
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
a
*
3,0
% de LTCD4+TNF‐α+
2,5
a
*
2,0
1,5
1,0
a, b
0,5
0,0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 27 - Análise da expressão de linfócitos T CD4+TNFα-+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
99
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
3,5
% de LTCD8+TNF‐α+
3,0
a
2,5
a
*
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
C
EPI
NI
C
EPI
IND
C
EPI
CARD
Figura 28 - Análise da expressão de linfócitos T CD8+TNFα-+ do sangue periférico de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os linfócitos foram avaliados sem estímulo – culturas controle (C) e após a estimulação in vitro pelo EPI durante
24 horas de cultura.
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
Os asteriscos representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) dentro de um mesmo
grupo.
(*) Quando existe diferença em relação às culturas controle
100
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.9 Avaliação do padrão de citocinas plasmáticas em indivíduos dos
grupos NI, IND e CARD
A presença das citocinas TNF-α, IFN-, IL-2 e IL-10 foram avaliadas nos plasmas dos
indivíduos dos grupos NI, IND e CARD, como descrito no item Materiais e Métodos.
Verificou-se aumento significativo na produção de TNF-α no plasma de indivíduos do
grupo CARD, tanto em relação ao grupo NI (p=0,045), quanto ao grupo IND (p=0,015)
(Figura 29).
A Figura 30 mostra aumento significativo (p=0,046) da citocina IFN- no plasma do
grupo CARD em relação ao grupo IND.
Os dados da dosagem da citocina IL-2 mostraram aumento na produção desta citocina
no plasma do grupo CARD, tanto em relação ao grupo IND (p=0,000), quanto em relação aos
indivíduos NI (p=0,018) (Figura 31).
Os dados da dosagem da citocina IL-10 mostraram aumento na produção desta
citocina no plasma do grupo IND, tanto em relação ao grupo NI (p=0,000), quanto em relação
aos indivíduos CARD (p=0,010) (Figura 32).
101
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
TNF-α (IMF)
a, b
Figura 29 – Dosagem de TNF-α (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
IFN-(IMF)
b
Figura 30 – Dosagem de IFN- (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
102
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
IL-2 (IMF)
a, b
Figura 31 – Dosagem de IL-2 (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(b) Quando existe diferença com relação ao grupo IND
IL-10 (IMF)
a, c
Figura 32 – Dosagem de IL-10 (IMF – Intensidade Média de Fluorescência) no plasma de indivíduos não
infectados (NI) e de pacientes com doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
As letras representam as diferenças estatisticamente significativas (p<0,05) entre grupos NI x IND x
CARD
(a) Quando existe diferença com relação ao grupo NI
(c) Quando existe diferença com relação ao grupo CARD
103
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.10 Ensaio de proliferação de PBMCs dos indivíduos dos grupos NI, IND e
CARD
Para avaliar a proliferação de PBMCs de indivíduos dos grupos NI, IND e CARD,
procedeu-se então o ensaio de proliferação celular onde as células foram cultivadas in vitro na
ausência e na presença do homogenato antigênico de formas epimastigotas do T. cruzi (EPI),
como descrito no item Materiais e Métodos.
Através da análise dos dados é interessante observar que as PBMCs dos indivíduos do
grupo IND apresentaram resposta de proliferação celular, através da incorporação de 3[H]Timidina, significativamente maior (p=0,000) em comparação ao indivíduo do grupo NI
(Figura 33).
E – C ( cpm)
a
Figura 33 - Proliferação celular de PBMCs de indivíduos do grupo não infectados (NI) e de pacientes com
doença de Chagas – forma indeterminada (IND) e forma cardíaca (CARD).
Os resultados estão representados por Δ cpm - contagem de células por minuto (cpm) da cultura de células com
estímulo pelo EPI (E) menos cultura de células sem estímulo (C). A letra (a) representa as diferenças
estatisticamente significativas (p<0,05) relacionadas ao grupo de pacientes NI.
104
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
4.11 Resumo dos Resultados
 A estimulação in vitro por EPI foi capaz de aumentar significativamente o
percentual de apoptose, medida pela anexina, nos linfócitos totais no grupo
CARD em relação aos grupos NI e IND, nos tempos seis e 24 horas.
 Houve elevação no percentual de LT CD4+ anexina+ nos grupos IND e CARD
independente do estímulo específico pelo EPI, uma vez que já se observa
aumento no percentual de apoptose nessas células nas culturas não
estimuladas.
 Linfócitos T CD8+ anexina+ dos grupos IND e CARD apresentaram percentual
de apoptose significativamente maior do que o grupo NI, tanto nas culturas não
estimuladas como nas estimuladas.
 Linfócitos T CD8+ anexina+ do grupo CARD apresentaram alto percentual de
apoptose em relação ao grupo IND, independentemente de as células serem
estimuladas ou não por EPI.
 Dentro do grupo CARD, observou-se, ainda, um aumento no percentual de
apoptose LT CD8+ após estímulo pelo EPI, em relação à cultura controle.
 O percentual de apoptose induzida por EPI nos linfócitos totais caspase 3+ foi
significativamente maior do que as culturas controle em todos os grupos, NI,
IND e CARD, tanto no tempo de seis como no de 24 horas.
 No tempo de 24 horas, as culturas de linfócitos totais caspase 3+ de indivíduos
dos grupos IND e CARD, estimuladas por EPI, apresentaram percentual de
apoptose significativamente maior do que no grupo NI.
 Houve aumento no percentual de LT CD4+ caspase 3+ nos grupos IND e
CARD, após o estímulo por EPI, mostrando-se maior susceptibilidade a
apoptose.
 Linfócitos T CD8+ caspase 3+ dos grupos IND e CARD, estimulados por EPI,
apresentaram percentual de apoptose significativamente maior do que suas
células das culturas controle e às culturas do grupo NI.
 O percentual de células T CD4+CD25+ do grupo CARD, estimuladas in vitro
por EPI, foi menor do que o grupo IND, sendo que no grupo CARD observou105
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
se também diminuição no percentual destas células na cultura controle, em
relação aos grupos NI e IND.
 Houve aumento no percentual dos LT CD8+CD25+, após estímulo pelo EPI,
nos grupos IND e CARD em relação às culturas controle.
 Houve aumento no percentual dos LT CD8+CD25+ nos grupos IND e CARD,
após estímulo pelo EPI, em relação ao grupo NI.
 Observou-se também aumento no percentual dos LT CD8+CD25+ no grupo
CARD, após estímulo pelo EPI em relação ao grupo IND.
 O percentual de linfócitos T CD4+CD25high de indivíduos do grupo NI foi o
mesmo independente da estimulação antigênica.
 Houve aumento no percentual dos LT CD4+CD25high no grupo IND, após o
estímulo por EPI, em relação à sua cultura controle.
 Notou-se queda no percentual dos LT CD4+CD25high no grupo CARD, após o
estímulo pelo EPI, em relação ao grupo IND.
 Observou-se aumento no percentual dos LT CD4+CD28- nos grupos IND e
CARD, em relação ao grupo NI, tanto nas suas culturas controle quanto nas
suas culturas estimuladas por EPI.
 Observou-se aumento no percentual dos LT CD4+CD28- nos grupos IND e
CARD, após estímulo por EPI em relação às suas culturas controle.

No grupo CARD houve queda no percentual das células LT CD4+CD28-, após
estimulação in vitro por EPI, em relação ao grupo IND.
 Observou-se aumento no percentual dos LT CD8+CD28- nos grupos IND e
CARD, em relação ao grupo NI, tanto nas culturas controle quanto nas culturas
estimuladas pelo EPI.
 Observou-se aumento no percentual de LT CD4+CD62L- nos grupos IND e
CARD, em relação ao grupo NI, tanto nas culturas controle quanto nas culturas
estimuladas pelo EPI.
 Houve aumento no percentual dos LT CD8+CD62L-, após estímulo pelo EPI,
no grupo CARD em relação à cultura controle.
 No grupo CARD houve aumento no percentual destas células, após estímulo
pelo EPI, em relação ao grupo IND.
106
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
 Houve aumento no percentual dos LT CD4+CD69+, após estímulo por EPI, nos
grupos IND e CARD em relação às suas culturas controle.
 No grupo CARD houve aumento do percentual destas células após estímulo
pelo EPI, em relação aos grupos NI e IND.
 Houve aumento no percentual dos LT CD8+CD69+, após estímulo pelo EPI,
nos grupos IND e CARD em relação às culturas controle.
 No grupo CARD houve aumento no percentual destas células, após estímulo
pelo EPI, em relação aos grupos NI e IND.
 O percentual de linfócitos totais TNF-α+ das culturas não estimuladas dos
indivíduos dos grupos IND e CARD foi significativamente maior do que no
grupo NI.
 Houve aumento significativo destas células TNF-α+ em culturas estimuladas
por EPI dos indivíduos dos grupos IND e CARD.
 Culturas estimuladas por EPI induziram aumento no percentual de linfócitos
TCD4+, bem como de linfócitos T CD8+ positivos para TNF-α.
 O TNF-α plasmático foi significativamente maior na circulação sanguínea de
indivíduos do grupo CARD, bem como o IFN- e IL-2; ao contrário da IL-10
que foi significativamente maior no plasma do grupo IND.
 Os dados mostraram maior resposta proliferativa no grupo IND em relação ao
grupo NI.
107
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
5 DISCUSSÃO
O desenvolvimento de infecções por patógenos pode tornar-se crônico em
consequência de fatores do hospedeiro, bem como dos patógenos. No que diz respeito ao
hospedeiro, a resposta imune é desencadeada através de vários mecanismos, inclusive de
regulação, no sentido de manter a homeostasia, mesmo na presença de estímulos contínuos do
ambiente. Assim, tendo em vista que o sistema imune atua fisiologicamente, pode-se entender
que reações bioquímicas preservadas, ao longo da evolução das espécies, fazem parte deste
processo.
Neste contexto, a apoptose constitui um importante mecanismo necessário ao controle
de maturação de linfócitos no timo, frente a antígenos endógenos, embora, por outro lado
possa favorecer o estabelecimento de condições patológicas por estímulos exógenos.
A ocorrência de apoptose e os mecanismos que participam da modulação desse
fenômeno estão bem documentados na fase aguda da infecção experimental pelo T. cruzi
(Harel-Bellan et al., 1983; Lopes et al., 1995a; Lopes et al., 1995b; Lopes & DosReis 1996;
Martins et al., 1998; Lopes et al., 1999; Lopes, Guillermo & Silva 2007; Silva et al.; 2005,
Silva et al.; 2007; Guillermo et al., 2007; Guillermo et al., 2008; DosReis & Lopes, 2009),
embora não se saiba se os mecanismos apoptóticos podem estar presentes no estabelecimento,
no desenvolvimento, e/ou controle das formas graves da doença de Chagas. Nesse contexto,
investigou-se a apoptose, no presente estudo, como a ocorrência de um mecanismo regulador
após o primeiro contato in vitro de linfócitos com antígenos exógenos do T. cruzi, e após o
estabelecimento de resposta imune a estes mesmos antígenos exógenos – memória
imunológica – durante a fase crônica da doença de Chagas.
Para alcançar este objetivo, avaliou-se a ocorrência de apoptose em células do sangue
periférico de grupos de indivíduos NI e de pacientes na fase crônica da doença de Chagas,
apresentando a forma indeterminada (IND) ou cardiomiopatia dilatada (CARD grau V).
Vários questionamentos foram formulados: A apoptose é um mecanismo de
imunorregulação durante a doença de Chagas crônica? A persistência dos antígenos (próprios
e não próprios) na infecção crônica poderia ser a causa da apoptose dessas células ativadas? A
apoptose poderia estar envolvida na seleção do repertório molecular (TCR e moléculas
acessórias) de linfócitos ativados pelo T. cruzi nos pacientes com doença de Chagas?
108
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Para responder a tais questionamentos, foram traçados vários objetivos específicos:
avaliação do percentual de apoptose de linfócitos in vitro; detecção de TNF-α
intracitoplasmática e plasmática, como citocina envolvida em processos apoptóticos; estudo
do perfil fenotípico de linfócitos através da expressão de moléculas acessórias. Todos os
experimentos foram realizados em paralelo e concomitantemente.
Para a indução de apoptose, foram utilizados, neste estudo, dois indicadores de
ativação: a estaurosporina, que revela o máximo de apoptose inespecífica (independentemente
da estimulação específica por EPI) capaz de ocorrer na população celular em estudo, uma vez
que a STP é bloqueadora da ativação de enzimas quinases, impedindo, consequentemente, a
transdução de sinais e a transcrição gênica, levando a célula à morte programada. Em
contrapartida, o EPI estimula células de memória podendo levar à apoptose aquelas células
ativadas pelo antígeno em cultura, o que foi considerado dependente de antígeno.
A avaliação de apoptose de linfócitos totais, medida pela anexina, foi capaz de mostrar
diferença significativa entre células estimuladas (EPI e STP) e não estimuladas (C) nos três
grupos (NI, IND, CARD) (Figura 9B). Resultados semelhantes foram encontrados com a
avaliação de apoptose em linfócitos totais, pela detecção de caspase 3 ativa (Figura 13B).
Observou-se aumento no percentual de apoptose de linfócitos totais estimulados pelo EPI no
grupo NI. Uma vez que não há células de memória específicas para EPI nos indivíduos do
grupo NI (Figura 9B e 13B), sugere-se que a morte programada destas células tenha decorrido
da ação do estímulo antigênico do T. cruzi, possivelmente pelo fato de células do sistema
imune serem capazes de reconhecer semelhanças entre epitopos do T. cruzi e de moléculas
próprias (Gazzinelli et al., 1990; Reis et al., 1993a; Dutra et al., 2000; Gironès, Cuervo &
Fresno, 2005; Cunha-Neto et al., 2006). Se isto é verdade, tal apoptose pode representar uma
regulação imunológica no sentido de não permitir alteração da regulação fisiológica para
moléculas próprias.
Verificou-se, ainda, que a apoptose, medida pela anexina, decorrente de estímulo
específico, de linfócitos totais no grupo CARD, foi significativamente maior que no grupo NI
e IND (Figura 9B). Já, utilizando-se o método de detecção de caspase 3+, a apoptose foi
semelhante entre as formas clínicas (Figura 13B), não havendo diferenciação de maior índice
de apoptose no grupo CARD. De qualquer forma, os dois métodos foram indicativos de que
linfócitos totais de pacientes com doença de Chagas apresentam maior percentual de
apoptose, após estimulação in vitro pelo antígeno do parasito (Figura 9B e 13B).
109
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Considerando que a apoptose, avaliada pelo método da anexina V, investiga a
alteração estrutural da membrana plasmática em decorrência da inversão espacial da molécula
de fosfatidilserina (revisto por Schlegel & Williamson 2001), e o método da caspase 3 ativada
avalia a ativação em cascata de moléculas que levam à morte programada da célula (Patel,
Gores & Kaufmann 1996; Krammer, Arnold & Lavrik 2007), ou seja, os métodos medem
estágios diferentes do processo apoptótico. É, portanto, justificável haver discriminação entre
as formas clínicas, de acordo com o método, destacando-se que os dois métodos de avaliação
diferenciaram o percentual de apoptose do grupo NI em relação aos grupos de pacientes com
doença de Chagas, após estímulo antigênico. De fato, Rodrigues et al. (2008) também
mostraram maior percentual de apoptose em linfócitos de pacientes com cardiopatia grave, e
sugeriram que este evento poderia ser uma resposta à ativação de vias de morte programada,
através dos receptores Fas/Fas-L ou de TNF-α, levando ao escape do parasito, e
consequentemente, estimulação contínua do sistema imune.
Neste contexto, a apoptose de células T em modelo experimental mostrou exacerbar o
crescimento do parasito (Nunes et al., 1998). Experimentalmente, foi sugerido, ainda, que a
apoptose pode representar importante mecanismo de controle da resposta imune para limitar
os danos no coração (Henrique-Pons et al., 2002).
Com relação à cultura controle, houve também diferença nos linfócitos do grupo
CARD, mostrando maior suscetibilidade dos linfócitos totais para a morte programada
independente de estímulo antigênico (Figura 9B e 13B). Consequentemente, é provável que o
meio das células dos indivíduos do grupo CARD esteja exercendo alguma ação endógena,
favorecendo
tal
suscetibilidade.
Corroborando
essa
interpretação,
a
dosagem
intracitoplasmática de TNF-α (Figura 26) e de citocinas no plasma - TNF-α (Figura 29), IFN (Figura 30), e IL-2 (Figura 31) - mostrou elevação dos níveis no grupo CARD.
É importante ressaltar que apesar de não ter sido avaliada a expressão de Fas/Fas-L
neste estudo, Elzey et al. (2001) demonstraram que o TNF-α pode contribuir para a indução
da apoptose pela interação com seu receptor ou pela indução da expressão de Fas e Fas-L, ou
seja, morte celular induzida por ativação. Lula et al. (2009) demonstraram a existência de
forte correlação clínica entre os ligantes solúveis da superfamília do TNF (TNF-α, TRAIL e
FasL/CD95L) e os distúrbios funcionais do ventrículo esquerdo na cardiopatia chagásica
crônica. Esses resultados, por estarem associados a ligantes de receptores de morte celular
110
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
programada, reforçam a idéia de que mecanismos apoptóticos estejam envolvidos nos
distúrbios clínicopatológicos da doença de Chagas.
Nos últimos anos, número crescente de trabalhos tem focado na busca de marcadores
inflamatórios de prognóstico evolutivo na cardiopatia chagásica (Ribeiro et al., 2002; Talvani
et al., 2004; Marques et al., 2006; Melo, Parente & Victor, 2005; Arques et al., 2007). A
citocina TNF-α tem sido considerada um “biomarcador de apoptose”, pois a superfamília de
receptores de TNF-α inclui membros que se ligam não apenas à citocina TNF-α, como
também a outros ligantes clinicamente significativos (Lula et al., 2009). Nesse sentido, é
possível pensar que o nível elevado de TNF-α detectado no plasma de indivíduos do grupo
CARD (Figura 29), modifique o quadro fisiológico endógeno destes pacientes, alterando o
perfil fenotípico de linfócitos, e contribuindo, desta forma, para o desenvolvimento da
patologia cardíaca. A interpretação de que aumento de TNF-α leva ao aumento da apoptose
que, como consequência, à exacerbação da patologia no grupo CARD é pertinente, uma vez
que não é observada alta produção desta citocina no plasma dos indivíduos dos grupos NI e
IND (Figura 29). Esses dados estão de acordo com os de Ferreira et al. (2003), que
demonstraram correlação entre altos níveis de TNF-α no soro e a ocorrência de cardiopatia
chagásica grave. Esses dados foram complementados pela observação de correlação inversa
entre altos níveis de TNF-α à menor fração de ejeção ventricular esquerda observada em
pacientes com cardiopatia chagásica crônica (Talvani et al., 2004).
A elevação plasmática do IFN- nos pacientes do grupo CARD (Figura 30) está de
acordo com a literatura que vem mostrando, nos últimos vinte anos, que a resposta
inflamatória é dependente de IFN- e de outras citocinas pró-inflamatórias. Na doença de
Chagas, vários autores também mostraram a relação do IFN- com a cardiopatia, tanto em
modelos experimentais (Talvani et al., 2000), como em humanos (Ribeirão et al,. 2000; Abel
et al., 2001; Gomes et al., 2002; Ferreira et al., 2003; Talvani et al., 2004). A idéia que
sustentaria a participação da apoptose nos eventos, associados à cardiopatia chagásica, seria
exatamente o fato do IFN- potencializar a produção de alguns marcadores solúveis de
apoptose, como TNF-α e TRAIL (Miura et al., 2006).
Por outro lado, tem-se demonstrado que a IL-10 apresenta papel importante em
antagonizar a atividade de IFN- na infecção experimental pelo T. cruzi (Silva et al., 1992).
Sabe-se que a IL-10 tem atividade inibitória sobre a ativação de macrófagos, incluindo a
morte intracelular do T. cruzi in vivo mediada por IFN-. Essa atividade tem sido associada à
111
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
suscetibilidade à infecção pelo T. cruzi (Silva et al., 1992). Gomes et al., (2002) sugeriram
que a produção de IL-10 pode ter papel importante em regular a resposta excessiva do tipo 1.
Através dos resultados demonstrados na Figura 32 observou-se que pacientes do grupo IND
apresentaram níveis aumentados de IL-10 plasmático, corroborando os resultados encontrados
pelo nosso grupo (Gomes et al., 2003; Araújo et al., 2007) e por outros (Vitelli-Avelar et al.,
2005; da Costa et al., 2009).
Além disso, vale ressaltar o papel da IL-2 na indução da expressão de FasL quando as
células são repetidamente ativadas. FasL expresso na superfície celular se liga ao Fas de
superfície na mesma célula ou em células adjacentes, ativando a cascata de cisteína proteases
intracelular, as quais, em última análise, causam a AICD (Siegel et al., 2000). No presente
estudo, observou-se aumento significativo da citocina IL-2 plasmática em pacientes do grupo
CARD, em relação aos grupos NI e IND, sugerindo o papel desta citocina durante o
mecanismo de apoptose. Por outro lado, foi atribuída à IL-2 a ação de normalizar a apoptose
em pacientes com lupus eritematoso sistêmico (LES) (Lorenz et al., 1997). Os dados deste
trabalho mostraram também que as células T CD4+ expressando a cadeia α do receptor para
IL-2 (CD4+CD25+) (Figura 17), apresentam-se significativamente em menor percentual no
grupo CARD, indicando que a maior quantidade de IL-2 plasmática pode ser devido a não
internalização desta citocina por seu receptor nas células. Assim, a IL-2 detectada no grupo
CARD poderia estar relacionada à apoptose aumentada deste grupo (Figuras 9 e 12), uma vez
que é necessária a estimulação celular para que ocorra a expressão de FasL e, por conseguinte,
a AICD (Siegel et al., 2000).
Em conjunto, os dados mostram a importância das citocinas e seus receptores, quer
seja na indução quer seja na regulação do processo apoptótico, que por sua vez está envolvido
com o controle da homeostasia do organismo.
O estudo de apoptose nas subpopulações de LT, medida pela anexina, mostrou
elevação nos grupos IND e CARD, independentemente de as culturas serem estimuladas ou
não (Figuras 11 e 12).
De maneira semelhante, a apoptose de LT CD4+ nas culturas estimuladas dos grupos
IND e CARD não se diferenciou das culturas controle, embora tenha sido significativamente
maior do que no grupo NI (Figura 11). Mesmo no grupo NI, os níveis de apoptose nas
culturas controle e estimulada foram semelhantes, sugerindo a ocorrência de apoptose
espontânea.
112
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Seriam estas células T CD4+ mais suscetíveis à apoptose espontânea, de maneira
independente de estímulos específicos e induzida pela STP? Sendo pertinente tal
possibilidade, a apoptose espontânea torna-se mais acentuada nos pacientes com doença de
Chagas. Sabe-se, pela literatura, que linfócitos T sofrem dois tipos distintos de morte celular
por apoptose: morte celular espontânea ou passiva (PCD), e por AICD. A PCD é geralmente
induzida por diminuição de fatores de crescimento (Collins et al., 1993), e é efetuada pela via
mitocondrial de morte celular, na qual a caspase-9 é recrutada (revisto por Hengartner 2000;
revisto por Krammer, 2000; Krammer, Arnold & Lavrik, 2007). A AICD é induzida pela
ativação contínua das células T por antígenos, por meio do seu TCR, e é efetuada por
receptores de morte e pela ativação de caspase-8 (revisto por Krammer, 2000; Marsden &
Strasser, 2003; Krammer, Arnold & Lavrik, 2007). Entretanto, não é possível, por meio das
metodologias utilizadas neste trabalho, chegar à afirmação de qual tipo de morte programada
ocorreu na subpopulação LT CD4+, pois outras estratégias deverão ser empregadas. No
entanto, é interessante pontuar a escassez de relatos na literatura sobre estudos de apoptose em
subpopulações de linfócitos do sangue periférico de pacientes com doença de Chagas.
A metodologia utilizando caspase 3 ativa parece não ser possível identificar a PCD na
subpopulação LT CD4+, no entanto observou-se maior percentual de apoptose pela STP no
grupo NI, e ausência de apoptose induzida pelo antígeno (AICD).
Por outro lado, pacientes dos grupos IND e CARD apresentaram maior percentual de
apoptose estimulada por EPI e no mesmo nível daquela induzida pela STP, ao contrário do
grupo NI. Seria a apoptose antígeno-induzida na subpopulação LT CD4+ dependente de
memória imunológica nos pacientes? É possível que sim, uma vez que não foi observada
elevação no percentual de apoptose por EPI no grupo NI (Figura 15).
O percentual de apoptose da subpopulação de LT CD8+ em culturas não estimuladas
foi diferenciado para os grupos IND e CARD, em relação ao grupo NI. Esses resultados
sugerem que a apoptose seja do tipo PCD e que no grupo de pacientes CARD houve maior
percentual de morte do que no grupo IND. Além disso, observou-se, no grupo CARD,
aumento significativo da apoptose nas culturas estimuladas em relação à cultura controle
(Figura 12).
Assim, as células T CD8+ seriam mais suscetíveis à apoptose espontânea,
independentemente de estímulo específico e/ou induzida pela STP nos pacientes com doença
de Chagas? Os dados sugerem que há PCD nos grupos IND e CARD, uma vez que o
113
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
background de apoptose destas células em culturas não estimuladas de pacientes com doença
de Chagas é maior do que aquelas dos indivíduos do grupo NI. Um ponto importante a ser
destacado na população LT CD8+ do grupo CARD é que apesar de existir a morte espontânea
foi observado aumento significativo de apoptose, após a estimulação in vitro com o EPI
(Figura 12). A interpretação para tal fato é sugerir que no grupo CARD há os dois tipos de
morte programada PCD (cultura controle) e a AICD (na cultura estimulada por EPI).
Não há dados na literatura sobre o papel da apoptose de LT CD8+ em pacientes com
doença de Chagas. Na infecção experimental em camundongos, observa-se que linfócitos T
CD4+ e CD8+ expressam Fas e FasL, e que as células morrem após ativação com ligantes
agonistas do complexo TCR, como anti-CD3 e anti-TCR. Esta morte induzida por ativação
pode ser bloqueada com anticorpos antagonistas anti-FasL (Lopes et al., 1999; Guillermo et
al., 2007). Linfócitos T CD8+ de camundongos infectados também podem morrer por
diminuição de fatores de crescimento; entretanto, a adição das citocinas IL-2 e IL-4 protege os
linfócitos da apoptose. A ação de IL-2 em normalizar a apoptose em camundongos é
semelhante àquela citada anteriormente para células de pacientes com LES.
Ocorre, também, em cultura de células de camundongos, na fase aguda da infecção
experimental, a expressão de caspases ativas, em particular da caspase-8 na população de
linfócitos T, e da caspase-3 em linfócitos T CD4+ e CD8+. Foram utilizados peptídeos
inibidores de caspases, como zVAD (inibidor geral) e zIETD (inibidor da caspase-8), e
verificado o bloqueio da morte induzida por ativação de linfócitos T (Silva et al.; 2005; Silva
et al.; 2007).
Já, o método de caspase 3+ mostrou que o percentual de apoptose das subpopulações
LT CD8+ dos grupos IND e CARD se diferenciaram tanto em relação ao grupo NI, como
entre si. No grupo CARD, as células estimuladas especificamente (EPI) alcançaram
percentual semelhante de apoptose àquele das células do controle positivo (STP). Através
desta observação, pode-se sugerir que as células T CD8+ circulantes, mais susceptíveis à
apoptose (Figura 16), ao atingirem o coração contendo antígenos do parasito, se
desenvolveriam para a morte celular por estimulação antigênica local, aumentando ou
reforçando a inflamação cardíaca pertinente neste grupo de pacientes. É sabido que a resposta
imune adequada é uma consequência de mecanismos de ativação e de regulação (Mills, 2004).
Por exemplo, Araújo et al. (2007) vêm mostrando que, na circulação periférica de pacientes
do grupo CARD, há menor percentual de células reguladoras (T CD4+CD25high).
114
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Então, sugere-se que se há migração de células T CD8, susceptíveis à apoptose, do
sangue circulante para o tecido cardíaco, seria pertinente pensar que os corpos apoptóticos,
formados em ambiente inflamatório e deficiente em células reguladoras, poderiam ser
fagocitados por macrófagos in situ que, ao produzirem citocinas reguladoras (IL-10 e TGF-β),
favoreceriam a replicação dos parasitos; não contribuindo para a eliminação dos mesmos e
permitindo, desta forma, o desenvolvimento da patologia observada nos pacientes do grupo
CARD.
Dados na literatura em camundongos demonstraram que a remoção de células
apoptóticas por macrófagos previne a liberação de substâncias inflamatórias após a morte
celular programada (Freire-de-Lima et al.; 2000). Além disso, células apoptóticas induzem
resposta anti-inflamatória ativa devido à secreção de citocinas regulatórias como IL-10 e
TGF- (Voll et al., 1997; Fadok et al., 1998). Alguns estudos investigaram se as interações
entre células apoptóticas e macrófagos infectados com T. cruzi afetariam a replicação
intracelular do parasito (Nunes et al., 1998; Freire-de-Lima et al.; 2000). Macrófagos tratados
com células apoptóticas produziram prostaglandinas, TGF- e poliaminas, as quais
favoreceram a replicação intracelular do T. cruzi. Também ocorre inibição da produção de
óxido nítrico, diminuindo a atividade microbicida do macrófago. A injeção de células
apoptóticas aumenta a parasitemia em animais infectados e o tratamento com inibidores da
síntese de prostaglandinas diminui a parasitemia. Portanto, o aumento da apoptose de
linfócitos durante a infecção pode contribuir para a persistência do parasito (Freire-de-Lima et
al., 2000).
Em conjunto, os dados reforçam a interpretação de que o processo inflamatório no
coração esteja aumentado no grupo CARD pela diminuição de mecanismos reguladores,
incluindo as células T CD4+CD25high (Figura 18); também já mostrado por Araújo et al.
(2007). Por outro lado, há aumento no percentual destas células no grupo dos pacientes IND
(Figura 18). Estes dados sugerem que tais células podem estar envolvidas no controle da
morbidade da doença de Chagas, característica da forma clínica IND dos pacientes, bem como
do desenvolvimento do processo inflamatório da forma cardíaca. Baseado nesses dados, podese sugerir que a supressão da resposta imune protetora contra o patógeno, em pacientes com a
forma cardíaca da doença de Chagas estaria relacionada com a apoptose de células T
CD4+CD25high (Treg), explicando, assim, o menor percentual destas células neste grupo.
115
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
A presença de células T coexpressando o marcador CD4 e altos níveis de CD25
+
(CD4 CD25high) em humanos foi descrita como sendo responsável pela anergia em resposta a
estímulos policlonais, e elevada capacidade de suprimir a produção de citocinas e a
proliferação celular, por meio de um mecanismo de contato célula-célula (Baecher-Allan et
al., 2001). Em humanos, o papel destas células mostra sua importância crucial na contenção
de distúrbios autoimunes, uma vez que está associada com a manutenção da tolerância
periférica.
Araújo 2009, em sua tese de doutorado, demonstrou elevados percentuais de células T
CD4+CD25highCTLA-4+ nos pacientes com forma clínica CARD. A expressão da molécula de
superfície CTLA-4 é constitutiva nas células reguladoras, sugerindo que esta molécula pode
ser funcionalmente importante (Salomon et al.; 2000; Takahashi et al., 2000; Fontenot et al.,
2003). Entretanto, as células T CD4+CD25highCTLA-4+ dos pacientes do grupo CARD podem
não ser suficientes para controlar o desenvolvimento do processo inflamatório, ou podem,
ainda, estar suprimindo a resposta protetora contra o patógeno. Além disso, foi mostrado que
o percentual de LT CD4+CD25high contendo Granzima B intracitoplasmática foi
significativamente maior no grupo CARD, em relação ao grupo IND (Araújo, 2009). A
Granzima B é uma serina protease, cujos substratos apresentam especificidade similar à
família das caspases (Darmon et al., 1996). De fato, Granzima B pode diretamente ativar
caspase e consequentemente induzir apoptose (Barry et al., 2000). Baseado nestes dados,
Araújo (2009) sugere a hipótese de autocitotoxidade das células Treg para explicar sua
diminuição no grupo CARD.
Corroborando essa hipótese, é bem aceito que a baixa morbidade da infecção
chagásica em indivíduos associa-se com a capacidade de o paciente regular a resposta anti-T.
cruzi, responsável pelo controle da parasitemia persistente e do dano inflamatório tecidual
(Brener et al., 1997). Certamente, o dano tecidual frente à inflamação deve ser mais grave na
ausência de mecanismos reguladores que envolvem tanto a resposta imune inata quanto a
adaptativa. O mecanismo apoptótico é utilizado por células T para a eliminação de células
autoreativas e na redução de populações ativadas (O’Gorman et al., 2001). Para ilustrar, podese destacar o remodelamento cardíaco na doença de Chagas por ser um importante fator de
definição para o desenvolvimento e progressão da cardiopatia chagásica crônica. A simples
presença do T. cruzi ou de suas moléculas antigênicas na circulação e/ou nas células
miocárdicas é capaz de desencadear uma cascata de eventos inflamatórios coordenada,
116
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
principalmente, por mediadores inflamatórios (Machado et al., 2000; Bilate & Cunha-Neto
2008). Esses mediadores inflamatórios potencializam alterações moleculares nas células
miocárdicas conduzindo-as às alterações morfofuncionais como hipertrofia, necrose, fibrose
intersticial, proliferação de fibroblastos, degeneração de colágeno e, recentemente, eventos de
morte celular programada. Esses eventos, em conjunto, constituem fatores de remodelamento
cardíaco que, a médio ou longo prazo, contribuem para a perda da funcionalidade do
miocárdio (Cohn et al., 2000; Punukollu et al., 2007).
Em estudo recente, Rodrigues et al. (2008) também avaliaram a resposta imunológica
de pacientes na fase crônica da doença de Chagas. Observou-se que pacientes com
insuficiência cardíaca apresentaram resposta proliferativa de PBMCs significativamente
menor, quando estimuladas com antígenos T. cruzi, em comparação com pacientes
assintomáticos, sugerindo-se que esta baixa resposta proliferativa estaria associada à AICD.
Como já foi discutido neste trabalho, há aumento de IL-2 plasmática no grupo CARD,
concomitantemente a diminuição de células T CD4+CD25+, sugerindo que a menor
proliferação seja decorrente da ausência de estímulo pela IL-2.
Para confirmar o papel da apoptose em linfócitos, secções de miocárdio foram
avaliados (Rodrigues et al., 2008). Observou-se que o número de células inflamatórias não
diferiu entre os dois grupos de pacientes. No entanto, como observado in vitro, o percentual
de células apoptóticas na reação inflamatória foi significativamente maior em corações de
indivíduos com insuficiência cardíaca. Estes resultados mostram que a apoptose de linfócitos
pode ocorrer tanto in vitro como in vivo em pacientes com cardiopatia chagásica dilatada.
No presente estudo, avaliou-se a resposta de proliferação de PBMCs de indivíduos não
infectados e de pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas, após
estimulação in vitro por antígenos do T. cruzi (Figura 34). Os dados mostraram uma menor
resposta proliferativa de PBMC no grupo CARD em relação ao grupo IND. Os presentes
resultados estão de acordo com os dados observados por Rodrigues et al. (2008).
A ativação linfocitária é um evento fundamental para o desenvolvimento de vários
mecanismos da resposta imune, incluindo a ativação e a regulação. A análise percentual de
células T ativadas envolveu a identificação de marcadores de superfície celular tais como
CD25+, CD69+, CD62L-, CD28- (Figuras 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25). Resumidamente, em
pacientes com doença de Chagas, os marcadores de ativação em linfócitos, estimulados
antigenicamente por EPI, que se diferenciaram do grupo NI foram: CD4+CD28-, CD8+CD28-;
117
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
CD4+CD62L-; CD4+CD69+; CD8+CD25+, mostrando relação de 3 LTCD4: 2 LTCD8. Por
outro lado, os marcadores de ativação que se sobressaíram significativamente no grupo
CARD foram: CD4+CD69+, CD8+CD69+; CD8+CD25+; CD8+CD62L-, mostrando uma
relação 1 LTCD4: 3 LTCD8. O aumento da expressão dos marcadores no grupo CARD
sugere que a ativação por EPI da subpopulação LT CD8+ pode estar associada com a indução
de AICD, no sentido de favorecer o processo apoptótico. Neste caso, a apoptose estaria
associada mais com a morbidade da doença de Chagas do que a regulação da cardiopatia. No
sangue periférico de pacientes com doença de Chagas, existe maior frequência de linfócitos T
CD4+CD28- e CD8+CD28-, quando comparado com aos indivíduos NI pelo T. cruzi.
Levando-se em conta a importância da molécula CD28 na ativação de células T,
pode-se-ia interpretar que diferentes estágios de ativação dos linfócitos ou eventos
imunorreguladores distintos estejam ocorrendo no curso da infecção chagásica (Caruso et al.,
1994). As células CD28- podem representar uma subpopulação de células T especiais, com
intensa capacidade efetora, associada à habilidade de regulação aos antígenos próprios
(Menezes et al., 2004). A interpretação funcional para as células CD28- relaciona-se com a
sua eficiente habilidade efetora. Por outro lado, alguns estudos sugeriram que essas células
são suscetíveis à apoptose, o que poderia representar um mecanismo de controle de suas
funções citotóxicas exacerbadas (Azuma, Phillips & Lanier, 1993; Borthwich et al., 2000;
Tsukishiro, Donnenberg & Whiteside, 2003). A frequência elevada de células T ativadas
CD4+CD28- no sangue periférico de pacientes infectados pelo T. cruzi mostrou estar
associada à produção de IL-10 e TNF-α por pacientes IND e CARD, respectivamente,
sugerindo papéis funcionais distintos para aquelas células. (Menezes et al., 2004).
Em resumo, a apoptose observada nos pacientes com doença de Chagas estaria
envolvida na eliminação de linfócitos T ativados, induzidos pelo T. cruzi. Além disso, a
associação com níveis elevados de citocinas inflamatórias levaria à exacerbação da patologia
no grupo CARD. Por outro lado, a apoptose dos linfócitos T de indivíduos do grupo IND teria
a participação de células e citocinas reguladoras, controlando o desenvolvimento da
miocardiopatia chagásica.
118
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
6 CONCLUSÃO
A partir dos dados apresentados neste trabalho, conclui-se que, na doença de Chagas
crônica, são distintos os mecanismos imunológicos desenvolvidos pelos indivíduos
apresentando a forma indeterminada e aqueles apresentando cardiomiopatia dilatada.
Admitindo-se que a regulação imunológica, no grupo IND, possa controlar o desenvolvimento
da miocardiopatia chagásica, a ausência deste mecanismo, no grupo CARD, poderia ser um
dos fatores associados com a inflamação sustentada que, consequentemente, levaria à maior
morbidade neste último grupo. A associação da apoptose de linfócitos, induzida pela ativação
constante do sistema imune, com os níveis elevados de citocinas inflamatórias e eventos
patológicos associados (fibrose e apoptose) parece contribuir para o desenvolvimento e a
progressão das lesões cardíacas na fase crônica da doença de Chagas humana.
119
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
7 ANEXO I
Artigos publicados
1) da Silveira AB, Chaves AT, Araújo FF, Gomes JA, Correa-Oliveira R, Fujiwara
RT, Freitas MAR, Oliveira EC, Luquetti AO, Neto SG, D’Avila Reis D. Expression of
caspase-3 enteric cells is related to developement of chagasic megacolon. Human
Pathology. 2009; 40: 605-606.
2) da Silveira AB, Araújo FF, Freitas MAR, Gomes JA, Chaves AT, Oliveira EC,
Neto SG, Luquetti AO, Souza GC, Junior RB, Fujiwara RT, D’Avila Reis D, Correa-Oliveira
R. Characterization of the presence and distribuition of Foxp3+ cells in chagasic patient
with and without megacolon. Human Immunology. 2009; 70: 65-67.
3) Jacqueline Araújo Fiuza, Ricardo Toshio Fujiwara, Juliana Assis Silva Gomes,
Manoel Otávio das Costa Rocha, Ana Thereza Chaves, Fernanda Fortes de Araújo , Rafaelle
Christine Gomes Fares, Andrea Teixeira-Carvalho, Olindo de Assis Martins-Filho, Guilherme
Grossi Lopes Cançado and Rodrigo Correa-Oliveira. Profile of central and effector memory
T cells in the progression of chronic human Chagas disease. Plos Neglected Tropical
Disease. 2009; 3: 1-9.
120
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
121
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
122
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
123
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
124
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
125
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
126
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
127
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
128
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
129
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
130
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
131
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
132
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
133
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
134
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
8 ANEXO II
Artigos em preparação
1) Fernanda Fortes de Araujo, Rodrigo Correa Oliveira, Manoel Otávio Costa Rocha,
Ana Thereza Chaves, Jacqueline Araujo Fiuza, Rafaelle Christine Gomes Fares, Andrea
Teixeira Carvalho, Alexandre Barcelos Morais da Silveira, Ricardo Toshio Fujiwara and
Juliana de Assis Silva Gomes. Do regulatory T cells from patients with Chagas disease
express migratory profile that interferes in the inflammatory process in the heart tissue?
135
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Title: Do regulatory T cells from patients with Chagas disease express migratory profile that
interferes in the inflammatory process in the heart tissue?
FERNANDA FORTES DE ARAUJO1, RODRIGO CORREA OLIVEIRA1, MANOEL OTÁVIO COSTA
ROCHA2, ANA THEREZA CHAVES1,3, JACQUELINE ARAUJO FIUZA1,5, RAFAELLE CHRISTINE
GOMES FARES1, ANDREA TEIXEIRA CARVALHO1, ALEXANDRE BARCELOS MORAIS DA
SILVEIRA1,4, RICARDO TOSHIO FUJIWARA1,5 AND JULIANA DE ASSIS SILVA GOMES1,6
1. Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ, Belo Horizonte- Minas Gerais; Brazil, 2. Faculdade de
Medicina, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde: Infectologia e Medicina Tropical, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte- Minas Gerais; Brazil; 3. Santa Casa de Misericórdia de BH, Pósgraduação em Biomedicina e Clínica Médica, Belo Horizonte- Minas Gerais; Brazil; 4. Universidade Federal de
Uberlândia, Instituto de Ciências Biomédicas, Departamento de Morfologia, Uberlândia- Minas Gerais; Brazil;
5. Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte- Minas Gerais; Brazil; 6. Departamento de Morfologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade
Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte- Minas Gerais; Brazil
8.1.1
Corresponding author:
Dr. Juliana de Assis Silva Gomes
Laboratório de Imunologia Celular e Molecular – Centro de Pesquisas René Rachou/ FIOCRUZ
Av. Augusto de Lima 1715, 30190-002, Belo Horizonte, MG
FAX + 55 31 32953115
E-mail [email protected]
Abstract
Background: Chronic Chagas disease presents several different clinical manifestations ranging from
asymptomatic to severe cardiac and/or digestive clinical forms. The involvement of the host’s immune response
on the development of the severe clinical forms of Chagas disease and its mechanisms of action have been
widely studied. However, the causative mechanisms are not yet clearly understood. We postulate that
CD4+CD25high (Treg) cells play an important role on the maintenance of immunologic self-tolerance and
immunoregulation during this infection. Treg are highly specialized cell sub-population important on the control
of the immune response. Foxp3 expression by these cells has been described as an important factor for the
development and functional activity of Treg. Methodology/Principal Findings: In this study, we analyzed the
expression of Foxp3 on the heart tissue and CD4+CD25high T cells on peripheral blood of patients with the
136
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
indeterminate (IND) and cardiac (CARD) clinical forms of the disease. The results showed that IND patients
present the highest percentage of Foxp3 positive cells in the heart tissue when compared to non-infected (NI)
individuals and CARD patients. Analysis of the expression of adhesion molecules and chemokine receptor by
CD4+CD25high T cells from peripheral blood of chagasic patients showed a migratory profile. Conclusions: We
suggest that the balance between regulatory and effectors T cells may be important for the progression and
development of the disease. Furthermore, the presence of Foxp3+ cells in the heart tissue near blood vessels
suggest these regulatory cells may modulate the inflammatory response in the heart tissue during the chronic
phase of the disease and may also be involved on the control of cell migration to the inflammatory foci.
Introduction
Chagas disease is a parasitic infection caused by the protozoan Trypanosoma cruzi that affects
approximately 12 to 14 million people in Central and South America [1]. In human infection, the disease
presents an acute phase, characterized by circulating parasites, followed by a lifelong chronic phase, when
circulating parasites can hardly be detected by direct blood examination [2].
Most patients develop the chronic phase and remain asymptomatic throughout their life. Patients with
the chronic asymptomatic clinical form of Chagas disease are referred to as indeterminate (IND). In these
individuals the disease is diagnosed by specific serology using at least two different methods. Approximately
30% of the patients in the chronic phase of the disease develop the cardiac clinical form (CARD). This form has
a wide range of symptoms that range from mild alterations to severe heart damage [3]. The myocardium of
patients exhibiting chronic cardiomyopathy usually shows lymphocytic myocarditis with numerous degrees of
myocardial necrosis, reparative fibrosis, and myocardial hypertrophy. The pathogenesis of the chagasic
cardiomyopathy is still not fully understood and the data available is also controversial. Most investigators
believe that immunological reactions play a fundamental role in this pathological process [4-7]. Several studies
in Chagas disease demonstrate that immunoregulatory mechanisms come into play to control the intense immune
activity in the chronic phase. Immunoregulatory mechanisms have been shown to be of major role in preventing
a deleterious effect of the excessive immune stimulation that can in several instances lead to a fatal outcome
[8,9]. Although there are several hypothesis for the immune mechanism involved on the development of severe
cardiac disease due to T. cruzi infection, it is clear that the presence of the parasite is important for the
maintenance of the immune response in the tissues.
The identification of the CD4+CD25+ and of its role as regulatory T cells (Treg) has been the object of
intense studies due to the putative critical role of these cells in maintaining self tolerance, as well as in defense
against infections. CD4+CD25+ regulatory T cells were first identified in lymph nodes (LNs), as well as in
peripheral blood and constitute ~5-10% of total CD4+ T cells [10-12]. However, the expression of CD25 is not a
definitive marker, by itself, of natural regulatory T cells. CD25 is an activation marker for T cells and is
therefore also expressed by effectors Type 1 and Type 2 cells. The described markers that further characterize
CD4+CD25+ regulatory T cells are CD38, CD62L, CTLA-4 or the intracellular expression of the transcriptional
repressor Foxp3 (forkhead box P3) [13,14]. Recent studies have shown that Foxp3 is highly expressed in Tregs
and regulates their development and function [15].
137
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
The suppressive mechanisms of CD4+CD25+ T regulatory cells are not yet clear. There are increasing
evidences suggesting that cell-cell contact is required and the expression of CTLA-4 might be involved in this
process [16]. Furthermore, other studies have shown that IL-10 is an important cytokine involved on the
suppressive function of regulatory T cells [17]. Although there are no evidences for the effector function of this
cell population in Chagas disease, we have previously demonstrated that in the peripheral blood of IND patients
there is an increase on the frequency of CD4+CD25high cells expressing Foxp3 and IL-10, suggesting that these
cells could be involved in the control of Chagas disease morbidity [18]. Thus, it is plausible that in human
Chagas disease, CD4+CD25+ T cells may be an important population in the control of the inflammatory process.
Therefore, a comprehensive analysis on trafficking properties of Tregs is important for the understanding of the
putative mechanisms of these cells on the control of morbidity in Chagas disease.
Where Tregs act and how they migrate in vivo has not received significant attention in Chagas
disease. The expression of the L-selectin molecule (CD62L) has been shown to occur on the majority of CD25+
Tregs [10,19]. Others have reported the presence of receptors for inflamatory chemokines (CCR2, CCR4, CCR5
and CCR8) and increased levels of adhesion molecules (CD54 and LFA-1) on regulatory T cell subsets [10,2022], suggesting that these cells are able to enter inflamed tissues and might act directly on the sites of
inflammation [23]. To function effectively in vivo, Treg cells must migrate and operate in various lymphoid and
non-lymphoid tissues [24]. Indeed, an increasing body of data suggest that the migratory behaviour of Tregs
crucially influences their supressive activity in vivo. It is becoming clearer that not only the supressor potential
but the appropriate localization also determines the in vivo supressive capacity of Tregs [25]. Thus, it is possible
that in human Chagas disease CD4+CD25+ T cells may be an important population on the control of the
inflammatory response. Additionally, their effect may be dependent on their migratory profile, adhesion capacity
and their presence in the tissue. The analysis of this dynamic process may be fundamental for a better
understanding of the disease development and may contribute to the management of the disease.
Materials and Methods
Patients
Patients were identified and selected at the Referral Outpatient Center for Chagas disease of the Hospital
das Clínicas of the Federal University of Minas Gerais (UFMG), Brazil. Serology for Chagas disease was determined
by two or more tests (indirect immunofluorescence, ELISA, indirect haemagglutination) and patients are considered
infected when at least two tests were positive. Patients who consented to participate in this study were enrolled in a
prospective cohort study initiated 8 years ago and followed annually for clinical parameters specific for Chagas
disease patient management by Dr. Manoel Otávio Costa Rocha. This study was approved by the Ethics Committee
of the Centro de Pesquisas Rene Rachou- FIOCRUZ (27/2008 –CEP/CPqRR) and of the Human Ethics Committee
of the Universidade Federal de Minas Gerais (COEP- ETIC 372/04). Written informed consent was obtained from
all individuals prior to their inclusion in the study. Independent of their participation in this study, all individuals
enrolled were submitted to a standard screening protocol, follow up and treatment for Chagas’ symptoms according
to the standard of care of the Ministry of Health of Brazil. The exclusion criteria in this study included the presence
of systemic arterial hypertension, diabetes mellitus, thyroid dysfunction, renal insufficiency, chronic obstructive
138
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
pulmonary disease, hydroelectrolytic disorders, alcoholism, and previous clinical history suggesting coronary artery
obstruction and rheumatic disease, as well as the impossibility of undergoing the standard examinations.
For this study, we investigated the immune response of 27 patients in the chronic phase of the infection that
completed the screening protocol described above. The patients infected with T. cruzi were grouped as
indeterminate (IND) and cardiac (CARD) as previously reported [3]. The IND group (n=14) included individuals
ranging in age from 30 to 67 years, with no significant alterations in electrocardiography, chest x-ray,
echocardiogram, esophagogram and barium enema. All CARD patients (n=13), ranged in age from 25 to 70
years, presented echocardiographic signs of heart enlargement, with a final diastolic diameter of the left ventricle
of more than 55mm. The cardiac patients that participated in this study were classified as belonging to the group
CARD V, as previously reported [3]. Eleven normal healthy individuals, ranging in age from 29 to 55 years,
from a non-endemic area for Chagas disease and showing negative serological tests for the infection were
included as a control group (NI).
Samples of heart tissue were obtained from 7 chagasic patients with indeterminate (n=4) or cardiac
(n=3) clinical forms of the disease and 3 control individuals submitted to necropsy or surgical procedures at
Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro (Uberaba, Minas Gerais, Brazil). None of the patients received
parasite-specific treatment. Written informed consent was obtained from patient’s family and the collection and use
were approved by the Human Ethics Committee of the Universidade Federal de Minas Gerais (ETIC n° 127/03).
Results of serological tests indicative of Chagas disease (complement fixation, hemagglutination, and
immunofluorescence tests) were positive in all patients studied. Tissues from all patients were originated from
Uberaba, Minas Gerais, Brazil, where the natural transmission of Chagas disease was interrupted more than 20
years ago. The patients included in this study had never received blood transfusion. The mean ages were of 55 ±
14 years. The control group was composed of non-infected individuals, as indicated by negative serology
specific for Chagas disease. Non-infected individuals were also from the state of Minas Gerais and had a mean
age of 54 ± 20 years. The tissues samples were fixed in 4% neutral buffered formaldehyde solution and
embedded in paraffin for conventional histology and immunohistochemistry.
Antigens
Epimastigote (EPI) antigens were prepared by using the CL strain of T. cruzi. EPI were washed three
times in cold phosphate-buffered saline (PBS), disrupted by repeated freezing at -70°C and thawing, and
homogenized at 4 to 6°C in a Potter-Elvejem centrifuge(Vir Tis -Precise,Wisconsin, USA) at 20,000 rpm five
times for 60 s, with 30 s intervals at 4ºC. The suspension was subsequently centrifuged at 40,000 x g for 60 min
on ice. The clear supernatant was dialyzed for 24 h at 4°C against PBS, filter sterilized on 0.2-µm-pore-size
membranes, assayed for protein concentration, aliquoted, and stored at -20°C until use.
Flow cytometric analysis of peripheral blood
Whole blood was collected in Vacutainer tubes containing EDTA (Becton Dickinson) and 100µL
samples were mixed in tubes with 2µL of undiluted monoclonal antibodies (all from BD Pharmingen, USA)
conjugated either with fluorescein isothiocyanate (FITC), phycoerythrin (PE) or allophycocyanin (APC) for the
following cell surface markers: CD4 (SK3), CD25 (MA251), CD62L (DREG56), CD54 (HA58), CD11a
139
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
(G4325B) and CD18 (6.7). The tubes were incubated in the dark for 30 min at room temperature. Following
incubation, erythrocytes were lysed using 2mL of fluorescence-activated cell sorter (FACS) Lysing Solution
(BD Biosciences, USA). After incubation, the cells were washed twice with 2mL of phosphate-buffered saline
containing 0.01% sodium azide followed by fixation in 200µL of FACS fix solution (10g/L paraformaldehyde,
1% sodium-cacodylate, 6,65g/L sodium chloride, 0.01% sodium azide). Phenotypic analyses were performed by
flow cytometry with a Becton Dickinson FACScalibur flow cytometer. Data on 5 x 104 lymphocytes (gate by
forward and side scatter properties) were collected and the analysis performed using the CellQuest software (BD
Biosciences, USA).
Patterns of expression of cell surface markers on lymphocytes and their percentages were analyzed
using Cell Quest software according Araujo et al., 2007. The constitutive surface markers were analyzed by the
mean fluorescence intensity (MFI).
Statistical analysis
Analyses were performed using GraphPad Prism version 4.0 software. The following nonparametric
tests were performed: 1) Mann-Whitney test to compare two groups (NI x IND or NI x CARD or IND x CARD);
2) Kruskal-Wallis test to compare three groups (NI x IND x CARD) and 3) Wilcoxon test to compare stimulated
cultures and their controls. Differences were considered significant when the P value was less than 0.05.
Statistical analysis was performed using the median values of each group.
Histology and peroxidase immunohistochemistry
Sections of 7µm were deparaffinized using xylene, and rehydrated by sequential passage in graded
alcohols. Some sections were stained by standard histology, using haematoxylin and eosin (H&E) while others
were prepared for immunohistochemistry.
In immunohistochemistry analysis, endogenous peroxidase was
inhibited by incubation with 1% hydrogen peroxide and 30% absolute methanol for 30 min. The slides were then
incubated with 2% normal swine serum (NSS) (Sigma, USA) in phosphate buffered saline (PBS) for 15 min and
subsequently with the anti-Foxp3 monoclonal antibody (eBioscience, clone PCH101). Subsequently, the tissue
sections were incubated with peroxidase-conjugated rabbit anti-mouse antibodies (DAKO) for 45 min, and the
peroxidase activity detected by incubation with 3,3’-diaminobenzidine (Sigma) and hydrogen peroxide for 10
min. The slides were counterstained with Gill’s haematoxylin (Sigma), dehydrated in graded alcohols, and
mounted in synthetic mounting media. Negative control slides without primary antibody were done in each
individual experiment.
Foxp3 lymphocytes quantification and morphometric studies
Quantification of Foxp3+ cells in total lymphocytes was performed in the heart sections by counting 30
randomly-selected fields (total area of 1566µm2) on a single slide per patient. The percentage of Foxp3+ cells
was determined by the relation of total mononuclear cells (lymphocyte morphology) and total Foxp3+ cells. Both
total mononuclear cells and total Foxp3+ cells were counted in the same fields.
The inflammatory process was quantified by the number of total mononuclear cells (lymphocyte
morphology) to determine the intensity of inflammatory process. Morphometric studies of these cells were
140
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
performed by image analysis (Kontron KS300 v. 2.0). Statistical analysis among the different groups was
performed using one-way ANOVA. Differences were considered statistically significant at p<0.05.
141
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Results
Foxp3 positive cells are present in heart tissues close to blood vessels and are not associated with
the inflammatory foci
Previous studies on heart tissue sections obtained from patients with severe cardiomyopathy have
shown that significant cell infiltration is easily detectable. These infiltrates contain large number of lymphocytes,
mainly CD8+ cells that have been shown to be associated with the cytotoxic mechanisms that cause the
development of the severe cases of heart disease [26,27]. Although there is a predominance of CD8+ cells,
significant numbers of CD4+ cells, monocytes among others are also observed in these infiltrates [26]. However,
it is well known that in Chagas disease immunoregulatory mechanisms plays an important role on the control of
the severity of the heart pathology [8]. It has been demonstrated that in the peripheral blood regulatory cells are
present and that their number differ significantly in patients with the different clinical form of the disease.
Regulation of the partially protective immune response in naturally infected humans and in experimental T. cruzi
infection in mice is not understood precisely [28]. Partially protective immune responses associated with host
resistance to T. cruzi infection may be involved with severe inflammatory infiltrates and pathology in the heart
[29,30]. The degree of myocardial impairment in Chagas disease correlates with the severity of clinical heart
failure and shows a significant correlation with ventricular dysfunction [31]. However, the question that remains
is whether these regulatory cells are also present in the heart tissue and if their presence in the tissue correlates
with the control of pathology. In order to answer these questions, we performed a study on the heart tissue and
peripheral blood.
Using immunohistochemistry, we observed that while non infected individuals did not show
inflammatory processes (Figure 1A), IND patients presented with light inflammatory foci (Figure 1B) and
CARD patients intense inflammatory foci in several sites (Figure 1C). These results show that in tissues of
chagasic patients, the inflammatory foci are constituted mainly of mononuclear cells, with a significant presence
of lymphocytes (Figure 1A). As for the presence of Foxp3+ cells in cardiac tissue from chagasic patients we
observed that these cells are located mainly near blood vessels (Figure 1E), whereas these same cells were not
reported in inflammatory foci (Figure 1F). Based on these data we infer that Foxp3+ cells may express its
activity by controlling the migration of effector cells into the heart.
Comparative analysis of the expression of Foxp3 on the heart tissue and peripheral blood from IND and
CARD patients as well as of non-infected individuals (NI) was evaluated. We observed that IND had
significantly higher percentages of Foxp3 (p<0,05) when compared with non-infected individuals in the heart
tissue (Figure 2A). Non statistical differences was observed in the percentage of Foxp3+ cells in the ex vivo
context (Figure 2B) although a similar profile was noted, suggesting a possible association between the two
compartments, blood and heart tissue, in the Chagas disease.
CD4+CD25high T cells from chagasic patients show a migratory cell profile
CD4+CD25high T cells from chagasic patients were evaluated for expression of different cell surface
markers in order to characterize the migratory profile of this regulatory population in these patients.
142
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
CD62L is an adhesion molecule expressed on lymphocytes and their absence is associated with
activated cells [32]. Our results show that there was an increase on the percentage of CD4+CD25highCD62L- T
cells from chagasic patients when compared with the NI individuals, after in vitro stimulation with T. cruzi
antigens (Figure 3A). Our results also revealed an increase on the percentage of CD4+CD25highCD62L- T cells
from IND and CARD groups both ex vivo and after in vitro stimulation (Figure 3A). The activated effectors T
cells (CD4+CD25-CD62L-) were evaluated and the data demonstrated that CARD patients presented an increase
on the percentage of CD4+CD25-CD62L- T cells when compared with NI individuals (Figure 3B).
LFA-1 (CD11a/CD18) is the only 2 integrin family member expressed by CD4+CD25+ T cells and it
plays an important role in trafficking and cell activation besides adhesion properties [33-37]. Our results show
that the expression of the CD11a and CD54 on the surface of CD4+CD25high T cells from chagasic patients are
increased when compared with the NI individuals, after stimulation with T.cruzi antigens (Figure 4A,C). We also
observed that the expression of the CD18 by CD4+CD25high T cells from IND group was increased when
compared with the NI individuals, after stimulation with T.cruzi antigens (Figure 4B).
Discussion
It is becoming clearer that CD4+CD25high Foxp3+ cells are critical for suppressing/regulating the
immune responses to self antigens and consequently on the prevention autoimmune diseases. These cells are also
of major importance on the regulation of the immune responses against foreign antigens, especially in chronic
infections, such as leishmaniasis, hepatitis and HIV [38]. Chronic Chagas disease is characterized by the
development, by a significant number of infected individuals, of severe debilitating forms that have as their main
features damage of different tissues, mainly the heart. Several studies show that this damage correlates with
significant increase in the immune response against the parasites that migrate and remain in these tissues [27,3941]. This paper presents two novel findings related to the immune response of patients with chronic Chagas
disease. In this study, we demonstrate the presence of Foxp3+ cells in heart tissue of chagasic patients and also
show that in the peripheral blood these cells have a migratory profile as determined by the expression of
different cell surface markers such as an increase on the expression of cell surface adhesion molecules,
suggesting that regulatory cells may modulate the inflammatory response in heart tissue.
Infection with T. cruzi leads to an exacerbated type 1 specific response and apparently uncontrolled
inflammatory process in the heart of patients that develop the cardiac clinical form of the disease. Although the
patients with the indeterminate clinical form also develop a type 1 specific response against parasite, it is
regulated by a type 2 response, as previously reported by our group [30,42] and others [43-49]. More recently,
we showed that indeterminate patients have higher percentages of CD4+CD25high regulatory T cells in peripheral
blood [18] and we proposed that these regulatory T cells may be beneficial to these patients by maintaining the
balance between efficient effectors cells that kill the parasites without allowing for the development of a severe
inflammatory immune response against the heart tissue as observed in CARD patients. Therefore, these
differences in host-parasite interaction may be influenced by the ratio of regulatory to effector T cells. Based on
these data, we propose to investigate whether these cells are present in the heart tissue of chagasic patients with
the severe form of the disease and determine whether peripheral blood regulatory cells show a pattern of cell
surface expression that could explain their presence in the heart.
143
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
In the heart tissues, we observed a significant accumulation of Foxp3+ cells particularly near blood
vessels. It is interesting to note that contrasting with what we would expect, these cells were not associated with
the inflammatory foci (Figure 1). We also observed that both in the heart tissue and peripheral blood from IND
patients there is a higher percentage of these cells, suggesting that Foxp3+ regulatory cells may enter inflamed
tissues and act directly on the inflammation controlling the entry of effector cells. Several reports show that the
migratory behavior of Tregs crucially influences their suppressive activity in vivo [25] and not only the
suppressor potential. These studies also showed that the appropriate localization determines the in vivo
suppressive capacity of Tregs.
The control exerted by regulatory T cells at the inflammatory sites is a multi-step process that depends
on the nature and state of activation of these cells and is co-ordinated by chemoattractant receptors and adhesion
molecules. In fact, we observed that CD4+CD25high Foxp3+ T cells from chagasic patients express distinct profile
of adhesion molecules CD62L, CD54, CD11a, CD18 when evaluated after stimulation with T cruzi antigens
(Figures 3,4).
Several studies evaluating the expression of adhesion molecules and chemokine receptors showed that
Tregs are indeed able to both recirculate through lymphoid tissues and to enter inflamed sites [50-53]. Tregs
were identified in various peripheral sites and infectious sites particularly under pathological conditions [25],
such as the one described in this paper. Other reports have shown the expression of receptors for inflammatory
chemokines (CCR4, CCR5 and CCR8) and increased levels of adhesion molecules (CD54 and LFA-1) on
subsets of regulatory cells [25,51], suggesting that these cells present a migratory profile, which corroborates
with ours novel findings in human Chagas disease.
Thus, the balance between regulatory and effectors T cells may be important factor that determines the
progression of the cardiac disease, and it is possible that the presence of Foxp3+ cells in the heart tissue near
blood vessels play an important regulatory activity by blocking cells from entering the heart therefore controlling
the migration of effectors cells during the T cruzi infection. In fact, in chagasic patients the control of the
immune response is achieved at several levels and is comprised of effectors and regulatory T cells, however in
patients with the IND clinical form the inflammatory process is controlled by the secretion and the presence of
IL-10+ cells in the tissues and circulation. Our previous results indicated that IND patients present higher levels
CD4+CD25highIL-10+ [18], suggesting that these cells can also control the function of effectors T cells, that may
be mediated by IL-10.
Taken together our data suggest that regulatory cells may control the inflammatory response in heart
tissue of chagasic patients during the T cruzi infection. Therefore, it is possible that CD25high CD4+ Treg cells
from IND patients reduce the severity of type 1 response to T. cruzi infection and consequently control the
development of severe pathology. Thus, a unifying hypothesis might be that Treg cells through expression of IL10 are beneficial to patients in the indeterminate clinical form by maintaining a balance among anti-parasite
effectors cells that eliminate T. cruzi regulating the inflammatory process. On the other hand, based on our
observations in CARD patients, those cells are not sufficient and/or competent to control the inflammatory
process in these individuals. Furthermore, they present a different profile that is characterized by high levels of
activated CD8+ HLA-DR+ T cells as previously demonstrated in the peripheral blood [44], as well as in the
inflammatory infiltrate of cardiac lesions [26,27]. Thus, it is likely that CD25high CD4+ cells use several
144
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
mechanisms to regulate T cells responses in during Chagas disease and important differences on host-parasite
interactions may be significantly influenced by the ratio of regulatory to effectors T cells determining, therefore,
the outcome of disease development.
145
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
References
1-Dias JCP (2007) Globalização, iniqüidade e doença de Chagas. Cad. Saúde Pública 23:513-522.
2-Reis MM, Higuchi MDEL, Benvenuti LA, Aiello VD, Gutierrez PS, et al. (1997) An in situ
quantitative immunohistochemical study of cytokines and IL-2R+ in chronic human chagasic myocarditis:
correlation with the presence of myocardial Trypanosoma cruzi antigens. Clin Immunol Immunopathol 83:165172.
3-Rocha MO, Ribeiro AL, Teixeira MM (2003) Clinical management of chronic Chagas
cardiomyopathy. Front Biosci 1:44-54.
4-Harel-Bellan A., Joskowicz M, Fradelizi D, Eisen H (1985) T lymphocyte function during
experimental Chagas’ disease: Production of and response to interleukin 2. Eur. J. Immunol 15: 438–442.
5-Molina HA, Kierszenbaum F (1987) A study of human myocardial tissue in Chagas’ disease: A
distribution and frequency of inflammatory cell types. Int. J. Parasitol. 17:1297–1306.
6-Rossi MA. (1990) Myocardial damage in Trypanosoma cruzi. Can. J. Cardiol 6:293–298.
7-Cunha-Neto E, Duranti M, Gruber A, Zingales B, De Messias I, et al. (1995) Autoimmunity in
Chagas’ disease cardiopathy: Biological relevance of a cardiac myosin-specific epitope crossreactive to an
immunodominant Trypanosoma cruzi. Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:3541–3545.
8-Hunter CA, Ellis-Neyes LA, Slifer T, Kanaly S, Grunig G, et al. (1997) IL 10 is required to prevent
immune hyperactivity during infection with Trypanosoma cruzi. J. Immunol 158:3311-3316.
9-Golgher D, Gazzinelli RT (2004) Innate and acquired immunity in the pathogenesis of Chagas
disease. Autoimmunity 37:399-409.
10-Sakaguchi S, Sakaguchi N, Asano M, Itoh M, Toda M (1995) Immunologic self-tolerance
maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25).Breakdown of a single mechanism
of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J. Immunol 155:1151–1164.
11-Itoh M, Takahashi T, Sakaguchi N, Kuniyasu Y, Shimizu J, et al. (1999) Thymus and autoimmunity:
production of CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in
maintaining immunologic self-tolerance. J. Immunol 162:5317–5326.
12-Stephens LA, Mottet C, Mason D, Powrie F (2001) Human CD4+CD25+ thymocytes and peripheral
T cells have immune suppressive activity in vitro. Eur. J. Immunol 31:1247–1254.
13-Powrie F, Cartino J, Leach MW, Mauze S, Coffman RL (1996) A critical role for transforming
growth factor beta but not interleukin 4 in the suppression of T helper type 1 mediated colitis by
CD45RBlowCD4+ T cells. J. Exp. Med 183:2669-2674.
14-Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY (2003) Foxp3 programs the development and function of
CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunol 4:330-336.
15-Fontenot JD, Rudensky AY (2005) A well adapted regulatory contrivance: regulatory T cell
development and the forkhead family transcription factor Foxp3. Nat. Immunol 6:331–337.
16-Read S, Malmstrom V, Powrie F (2000) Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 plays an
essential role in the function of CD25+CD4+ regulatory cells that control intestinal inflammation. J. Exp. Med
192:295-302.
146
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
17-Hara M, Kingsley CI, Niimi M, Read S, Turvey SE, et al. (2001) IL-10 is required for regulatory T
cells to mediate tolerance to alloantigens in vivo. J. Immunol 166:3789-3796.
18-Araújo FF, Gomes JAS, Rocha MOC, Williams-Blangero S, Pinheiro VM, et al. (2007) Potential
role of CD4+CD25high regulatory T cells in morbidity in Chagas disease. Front Biosci 12:2797-2806.
19-Lepault F, Gagnerault MC (2000) Characterization of peripheral regulatory CD4+ T cells that
prevent diabetes onset in nonobese diabetic mice. J. Immunol 164:240–247.
20-Annunziato F, Cosmi L, Liotta F, Lazzeri E, Manetti R, et al. (2002) Phenotype, localization, and
mechanism of suppression of CD4+CD25+ human thymocytes. J. Exp. Med 196:379–387.
21-Bystry RS, Aluvihare V, Welch ka, Kallikourdis M, Betz AG (2001) B cells and professional APCs
recruit regulatory T cells via CCL4. Nat. Immunol 2:1126–1132.
22-Iellem A, Colantonio L, D’ambrosio D (2003) Skinversus gut-skewed homing receptor expression
and intrinsic CCR4 expression on human peripheral blood CD4+ CD25+ suppressor T cells. Eur. J. Immunol
33:1488–1496.
23-Belkaid Y, Piccirillo CA, Mendez S, Shevach EM, Sacks DL (2002) CD4+CD25+ regulatory T cells
control Leishmania major persistence and immunity. Nature 420:502–507.
24-Campbell DJ, Ziegler SF (2007) FOXP3 modifies the phenotypic and functional properties of
regulatory T cells. Nat Rev Immunol 7:305-310.
25-Huehn J, Hamann A. (2005) Homing to suppress: address codes for Treg migration. Trends in
Immunology 26: 632-636.
26. Reis DD, Jones EM, Tostes S, Lopes ER, Gazzinelli G, et al. (1993) Characterization of
inflammatory infiltrates in chronic chagasic myocardial lesions: presence of tumor necrosis factor- cells and
dominance of granzyme A+, CD8+ lymphocytes. Am. J. Trop. Med. Hyg 48 Suppl 5:637-644.
27-Higuchi ML, De Brito T, Reis MM, Barbosa A., Bellotti G, et al. (1993) Correlation between
Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis:
light microscopy and immunohistochemical findings. Cardiovasc. Pathol 2:101-106.
28. Marino AP, Da Silva A, Dos Santos P, Pinto LM, Gazzinelli RT, et al. (2004) Regulated on
activation, normal T cell expressed and secreted (RANTES) antagonist (Met-RANTES) controls the early phase
of Trypanosoma cruzi-elicited myocarditis. Circulation 110 Suppl 11:1443-1449.
29. Correa-Oliveira R, Gomes JAS, Lemos EM, et al. (1999) The role of the immune response on the
development of severe clinical forms of human Chagas disease. Mem Inst Oswaldo Cruz 94:253-255.
30-Gomes JA, Bahia-Oliveira LMG, Rocha MOC, Correa-Oliveira R (2003) Evidence that
development of severe cardiomyopathy in human Chagas disease is due to a non-balanced Th1 specific immune
response. Infect Immun 71:1185-1193.
31. Rocha MOC, Teixeira MM, Ribeiro AL (2007) An update on the management of Chagas
cardiomyopathy. Expert Rev. Anti Infect. Ther 5 Suppl 4: 1-17.
32-Dos santos PV, Roffê E, Santiago HC, Torres RA, Marino AP, et al. (2001) Prevalence of
CD8(+)alpha beta T cells in Trypanosoma cruzi- elicited myocarditis is associated with acquisition of
CD62L(Low)LFA-1(High)VLA-4(High) activation phenotype and expression of IFN-gamma-inducible adhesion
and chemoattractant molecules. Microbes Infect 3:971-984.
147
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
33. Lub M, Van K, Figdor CG (1995) Ins and outs of LFA-1. Immunol Today 16: 479-483.
34. Berlin-Rufenach, C, Otto F, Mathies M, Westermann J, Owen MJ, et al. (1999) Lymphocytes
migration in lymphocyte function-associated antigen (LFA)-1-deficient mice. J. Exp. Med 189:1467-1478.
35. Abraham C, Griffith J, Miller J (1999) The dependence for leukocyte function-associated antigen1/ICAM-1 interactions in T cell activation cannot be overcome by expression of high density TCR ligand. J.
Immunol 162: 4399-4405.
36. Abraham C, Miller J (2001) Molecular mechanisms of IL-2 gene regulation following costimulation
through LFA-1. J. Immunol 167:5193-5201.
37. Kandula S, Abraham C (2004) LFA-1 on CD4+ T cells is required for optimal antigen-dependent
activation in vivo. J. Immunol 173:4443-4444.
38. Flynn JL, Chan J. Immunology of tuberculosis (2001) Annu Rev Immunol.19:93-129.
39. Anez N, Carrasco H, Parada H, et al. (1999) Myocardial parasite persistence in chronic chagasic
patients. Am J Trop Med Hyg 60:726-735.
40. Vago AR, Macedo AM, Oliveira RP, et al. (1996) DNA signatures of Trypanosoma cruzi strains
obtained directly from infected tissues. Am J Pathol 149:2153-2159.
41. Tarleton RL (2001) Parasite persistence in the aetiology of Chagas disease. Int J Parasitol 31 Suppl
5-6: 550-554.
42. Gomes JA, Bahia-Oliveira LM, Rocha MO, Busek SC, Teixeira MM, et al. (2005) Type 1
chemokine receptor expression in Chagas' disease correlates with morbidity in cardiac patients. Infect Immun
73:7960-7966.
43. Vitelli-Avelar DM, Sathler-Avelar R, Dias JC, Pascoal VP, Teixeira-Carvalho A, et al. (2005)
Chagasic patients with indeterminate clinical form of the disease have high frequencies of circulating
CD3+CD16-CD56+ natural killer T cells and CD4+CD25High regulatory T lymphocytes. Scand J Immunol 62:297308.
44. Vitelli-Avelar DM, Sathler-Avelar R, Massara RL, Borges JD, Lage PS, et al. (2006) Are increased
frequency of macrophage-like and natural killer (NK) cells, together with high levels of NKT and CD4+CD25high
T cells balancing activated CD8+ T cells, the key to control Chagas' disease morbidity? Clin Exp Immunol
145:81-92.
45. Vitelli-Avelar DM, Sathler-Avelar R, Teixeira-Carvalho A, Dias JCP, Gontijo ED, et al. (2008)
Strategy to assess the overall cytokine profile of circulating leukocytes and its association with distinct clinical
forms of human Chagas disease. Scand J Immunol 68:516-525.
46. Dutra WO, Gollob KJ, Barcomb-Caddle L, Dias JCP, Gazzinelli G, et al. (1997) Cytokine mRNA
profile of peripheral blood mononuclear cells isolated from individuals with Trypanosoma cruzi chronic
infection. Scand. J. Immunol 45: 74-80.
47. Menezes CA, Rocha MO, Souza PE, Chaves AC, Gollob KJ, et al. (2004) Phenotypic and functional
characteristics of CD28+ and CD28- cells from chagasic patients: distinct repertoire and cytokine expression. Clin
Exp Immunol 137:129-38.
148
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
48. Souza PE, Rocha MO, Menezes CA, Coelho JS, Chaves AC, et al. (2007) Trypanosoma cruzi
infection induces differential modulation of costimulatory molecules and cytokines by monocytes and T cells
from patients with indeterminate and cardiac Chagas' disease. Infect Immun 75:1886-1894.
49. Soares MB, Gonçalves R, Pyrrho AS, Costa DA, Paiva CN, et al. (2003) Balanced cytokineproducing pattern in mice immunized with an avirulent Trypanosoma cruzi. An Acad Bras Cienc 75:167-172.
50. Lim HW, Hillsamer P, Kim CH (2004) Regulatory T cells can migrate to follicles upon T cell
activation and suppress GC-Th cells and GC-Th cell-driven B cell responses. J. Clin. Invest 114:1640–1649.
51. Iellem A, Mariani M, Lang R, Recalde H, Panina-Bordignon P, et al. (2001) Unique chemotactic
response profile and specific expression of chemokine receptors CCR4 and CCR8 by CD4+CD25+ regulatory T
cells. J.Exp.Med 194:847-853.
52. Colantonio L, Iellem A, Sinigaglia F, D'Ambrosio D (2002) Skin-homing CLA+ T cells and
regulatory CD25+ T cells represent major subsets of human peripheral blood memory T cells migrating in
response to CCL1/I-309. Eur. J. Immunol 32:3506–3514.
53. Szanya V, Ermann J, Taylor C, Holness C, Fathman CG (2002) The subpopulation of CD4+CD25+
splenocytes that delays adoptive transfer of diabetes expresses L-selectin and high levels of CCR7. J. Immunol
169:2461–2465.
149
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Legends
Figure 1. H&E coloration and immunohistochemistry of Foxp3+ cells in the heart tissue of
chagasic patients and noninfected individuals. H&E staining demonstrated the absence of inflammatory
processes in NI individuals (A) n=3, a mild inflammatory process in IND patients (B) n=4, and an intense
process in CARD patients (C) n=3. Foxp3 immunohistochemistry demonstrated that NI individuals and CARD
patients present with a low presence of Foxp3+ cells (D,F), whereas IND patients demonstrate a high
concentration of these cells near the blood vessels (E). Lymphocytes were were not found in the inflammatory
foci.
Figure 2. Analysis of Foxp3+ cells into heart tissue and identification of lymphocytes
CD4+CD25high Foxp3+ from peripheral blood. Percentage of Foxp3+ cells into heart tissue evaluated from NI
n=3, IND n=4 and CARD n=3 groups (A) and CD4+CD25high Foxp3+ T cells in peripheral blood evaluated from
NI n=5, IND n=5 and CARD n=5 groups (B) as described in Material and Methods. Foxp3 lymphocytes
quantification into heart tissue was performed by morphometric studies. The differences between the groups are
considered significant at p less than 0.05 and are represented by the lines.
Figure 3. Analysis of the surface marker expression CD62L by CD4+CD25 T cells in peripheral
blood. Percentage of CD4+CD25high CD62L- T cells (A) or CD4+CD25-CD62L- T cells (B) evaluated by flow
cytometry from NI n=11, IND n=14 and CARD n=13 groups before and after in vitro stimulation with T cruzi
antigens (Epi) as described in Material and Methods. Ex vivo = before stimulation and Epi = culture after
stimulation. The results are expressed as medium. The differences between the groups are considered significant
at p less than 0.05 and are represented by the lines.
Figure 4. Analysis of surface markers expression CD11a, CD18 and CD54 by CD4+CD25high T
cells in peripheral blood. Medium fluorescence intensity (MFI) of CD4+CD25highCD11a+ T cells (A),
CD4+CD25highCD18+ T cells (B) and CD4+CD25highCD54+ T cells (C) evaluated by flow cytometry from NI
n=11, IND n=14 and CARD n=13 groups before and after in vitro stimulation with T cruzi antigens (Epi) as
described in Material and Methods. Ex vivo = before stimulation and Epi = culture after stimulation. The
differences between the groups are considered significant at p less than 0.05 and are represented by the lines.
150
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Figure 1
A
D
B
E
C
F
151
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Figure 2
A
B
p <0.05
4
% of Foxp3+ cells
% of Foxp3+ cells
30
20
10
3
2
1
0
0
NI
IND
CARD
NI
IND
CARD
152
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Figure 3
B
% of CD4+CD25-CD62L- cells
% of CD4+CD25highCD62L- cells
A
60
50
p<0.01
p<0.001
40
30
p<0.0006
p<0.001
20
10
0
Ex vivo
NI
Epi
Ex vivo
IND
Epi
Ex vivo
CARD
Epi
60
50
p<0.05
40
p<0.05
p<0.04
30
20
10
0
Ex vivo
NI
Epi
Ex vivo
IND
Epi
Ex vivo
Epi
CARD
153
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Figure 4
A
B
MFI CD4+CD25highCD18+
600
500
400
300
200
100
0
350
p<0.05
300
250
200
150
100
50
0
Ex vivo Epi Ex vivo Epi Ex vivo Epi
NI
IND
Ex vivo Epi Ex vivo Epi Ex vivo Epi
CARD
NI
IND
CARD
C
p<0.05
MFI CD4+CD25highCD54+
MIF CD4+CD25highCD11a+
p<0.05
700
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Ex vivo Epi Ex vivo Epi Ex vivo Epi
NI
IND
CARD
154
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abel LC, Rizzo LV, Ianni B, Albuquerque F, Bacal F, Carrara D, Bocchi EA, Teixeira HC,
Mady C, Kalil J, Cunha-Neto E. Chronic Chagas' disease cardiomyopathy patients display an
increased IFN-gamma response to Trypanosoma cruzi infection. J. Autoimmun. 2001;
17(1):99-107.
Abrahamsohn IA & Coffman RL. Cytokine and nitric oxide regulation of the
immunossupression in Trypanosoma cruzi infection. J. Immunol. 1995; 155: 3955-3963.
Aliberti JC, Cardoso MA, Martins GA, Gazzinelli RT, Vieira LQ, Silva JS. Interleukin-12
mediates resistance to Trypanosoma cruzi in mice and is produced by murine macrophages in
response to live trypomastigotes. Infect. Immun. 1996; 64(6):1961-1967.
Al-Sabbagh A, Garcia CA, Diaz-Bardales BM, Zaccarias C, Sakurada JK & Santos LM
Evidence for cross-reactivity between antigen derived from Trypanosoma cruzi and myelin
basic protein in experimental Chagas disease. Exp. Parasitol. 1998; 89:304-311.
Andrade ZA, Andrade SG, Correa R, Sadigursky M, Ferrans VJ. Myocardial changes in acute
acute Trypanosoma cruzi infection. Ultrastructural evidence of immune damage and the role
of microangiopathy. Am. J. Pathol. 1994; 144:1403-1411.
Andrade ZA. Immunopathology of Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1999; 94
Suppl 1:71-80.
Andrade ZA. Mechanisms of myocardial damage in Trypanosoma cruzi infection. Ciba
Found. Symp. 1983; 99: 214-233.
Andrade ZA. Pathogenesis of Chagas' disease. Res. Immunol. 1991; 142(2):126-129.
Araujo FF, Gomes JA, Rocha MO, Williams-Blangero S, Pinheiro VM, Morato MJ, CorreaOliveira R. Potential role of CD4+CD25HIGH regulatory T cells in morbidity in Chagas
disease. Front Biosci. 2007; 12:2797-2806.
155
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Araujo FF. Avaliação do papel das células T reguladoras CD4+CD25+ nas diferentes formas
clínicas da doença de Chagas [Tese]. Belo Horizonte: Centro de Pesquisas René Rachou.
Curso de Pós-graduação em Biologia Celular e Molecular – Fundação Oswaldo Cruz, 2009.
Arques S, Roux E, Sbragia P, Pieri B, Gelisse R, Luccioni R, Ambrosi P. Usefulness of
bedside tissue doppler echocardiography and B-type natriuretic peptide (BNP) in
differentiating congestive heart failure from noncardiac cause of acute dyspnea in elderly
patients with a normal left ventricular ejection fraction and permanent, nonvalvular atrial
fibrillation: insights from a prospective, mono center study. Echocardiography: A J. of CV
ultrasound & Allied Tech. 2007; 24 (5): 499-507.
Azuma M, Phillips JH & Lanier LL. CD28- T lymphocytes. Antigenic and functional
properties. J. Immunol. 1993; 150(4):1147-1159.
Bahia-Oliveira LM, Gomes JA, Cançado JR, Ferrari TC, Lemos EM, Luz ZM, Moreira MC,
Gazzinelli G, Correa-Oliveira R. Immunological and clinical evaluation of chagasic patients
subjected to chemotherapy during the acute phase of Trypanosoma cruzi infection 14-30 years
ago. J. Infect. Dis. 2000; 182(2):634-638.
Barry M, Heibein JA, Pinkoski MJ, Lee SF, Moyer RW, Green DR, Bleackley RC.
Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic
T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid. Mol. Cell Biol. 2000; 20(11):3781-3794.
Beltz LA, Sztein MB & Kierszenbaum F. Novel mechanism for Trypanosoma cruzi-induced
suppression of human lymphocytes. Inhibition of IL-2 receptor expression. J. Immunol. 1988;
141(1):289-294.
Bilate AM & Cunha-Neto E. Chagas disease cardiomyopathy: current concepts of an old
disease. Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 2008; 50(2):67-74.
156
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Bogitsh BJ, Middleton OL, Ribeiro-Rodrigues R. Effects of the antitubuilin drug trifluralin on
the proliferation and metacyclogenesis of Trypanosoma cruzi epimastigotes. Parasitol. Res.
1999; Jun: 85(6):475-80.
Borthwick NJ, Lowdell M, Salmon M, Akbar AN. Loss of CD28 expression on CD8+ T cells
is induced by IL-2 receptor chain signaling cytokines and type I IFN, and increases
susceptibility to activationinduced apoptosis. Int. Immunol. 2000; 12(7):1005-1013.
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde: Guia de Vigilância
Epidemiológica. Brasília: Ministério da Saúde. 2005; p. 816.
Brener Z & Gazzinelli RT. Immunological control of Trypanosoma cruzi infection and
pathogenesis of Chagas’ disease. Int. Arch. Allergy. Immunol. 1997; 114:103-110.
Brown TL, Patil S, Cianci CD, Morrow JS, Howe PH. Transforming growth factor beta
induces caspase 3-independent cleavage of alphaII-spectrin (alpha-fodrin) coincident with
apoptosis. J Biol Chem. 1999; 274(33):23256-23262.
Camargo MM, Almeida IC, Pereira MES, Ferguson MAJ, Travassos LR, Gazzinelli RT.
Glycosylphosphatidylinositol-anchored mucin-like glycoproteins isolated from Trypanosoma
cruzi trypomastigotes initiate the synthesis of proinflammatory cytokines by macrophages. J.
Immunol. 1997; 158: 5890-5891.
Campos MA, Almeida IC, Takeuchi O, Akira S, Valente EP, Procópio DO, Travassos LR,
Smith JA, Golenbock DT, Gazzinelli RT. Activation of Toll-like receptor-2 by
glycosylphosphatidylinositol anchors from a protozoan parasite. J. Immunol. 2001;
167(1):416-423.
Campos MA, Gazzinelli RT. Trypanosoma cruzi and its components as exogenous mediators
of inflammation recognized through Toll-like receptors. Mediators Inflamm. 2004; 13(3):139143.
157
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Cardillo F, Voltarelli JC, Reed SG, Silva JS. Regulation of Trypanosoma cruzi infection in
mice by gamma interferon and interleukin 10: Role of NK cells. Infect. Immun. 1996;
64(1):128-134.
Caruso A, Cantalamessa A, Licenziati S, Peroni L, Prati E, Martinelli F, Canaris AD,
Folghera S, Gorla R, Balsari A, et al. Expression of CD28 on CD8+ and CD4+ lymphocytes
during HIV infection. Scand J Immunol. 1994; 40(5):485-490.
Collins MRL; Perkins GR, Rodrigues-Tarduchy G, Nieto MA, Lopez-Rivas A. Growth
factors as survival factors: Regulation of apoptosis. Bio Essays. 1993; 12:133-138.
Cossio PM, Laguens RP, Diez C, Szarfman A, Segal A, Arana RM. Chagasic cardiopathy.
Antibodies reacting with plasma membrane of striated muscle and endothelial cells.
Circulation 1974; 50(6):1252-1259.
Costa GC, da Costa Rocha MO, Moreira PR, Menezes CA, Silva MR, Gollob KJ, Dutra WO.
Functional IL-10 gene polymorphism is associated with Chagas disease cardiomyopathy. J.
Infect. Dis. 2009; 199(3):451-454.
Coura JR. [Transmission of chagasic infection by oral route in the natural history of Chagas
disease]. Rev.Soc. Bras. Med. Trop. 2006; 39(3):113-117.
Coura JR. Transmissão da infecção chagásica por via oral na história natural da doença de
Chagas. Rev Soc Bras Med Trop. 2006; 39 Suppl 3:113-7.
Cuna WR & Cuna CR. Characterization of T cell clones from chagasic patients:
predominance of CD8 surface phenotype in clones from patients with pathology. Mem. Inst.
Oswaldo Cruz. 1995; 90(4):503-506.
Cunha-Neto E, Bilate AM, Hyland KV, Fonseca SG, Kalil J, Engman DM. Induction of
cardiac autoimmunity in Chagas heart disease: a case for molecular mimicry. Autoimmunity.
2006; 39(1):41-54.
158
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Cunha-Neto E, Coelho V, Guilherme L, Fiorelli A, Stolf N, Kalil J. Autoimmunity in Chagas'
disease. Identification of cardiac myosin-B13 Trypanosoma cruzi protein crossreactive T cell
clones in heart lesions of a chronic Chagas' cardiomyopathy patient. J. Clin. Invest. 1996;
(8):1709-1712.
Cunha-Neto E, Duranti M, Gruber A, Zingales B, De Messias I, Stolf N, Bellotti G, Patarroyo
Me, Pilleggi F, Kalil J. Autoimmunity in Chagas disease cardiopathy: biological relevance of
cardiac myosin-specific epitope crossreactive to an immunodominant Trypanosoma cruzi
antigen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995; 92(8):3541-3545.
Darmon AJ, Ley TJ, Nicholson DW, Bleackley RC. Cleavage of CPP32 by granzyme B
represents a critical role for granzyme B in the induction of target cell DNA fragmentation. J.
Biol. Chem. 1996; 271(36):21709-21712.
D'Avila DA, Guedes PM, Castro AM, Gontijo ED, Chiari E, Galvão LM. Immunological
imbalance between IFN- and IL-10 levels in the sera of patients with the cardiac form of
Chagas disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2009; 104(1):100-105.
De Rezende JM & Moreira H. Chagasic megaesophagus and megacolon. Historical review
and present concepts. Arq Gastroenterol. 1988; 25:32-43.
Devadas S, Das J, Liu C, Zhang L, Roberts AI, Pan Z, Moore PA, Das G, Shi Y. Granzyme B
is critical for T cell receptor-induced cell death of type 2 helper T cells. Immunity. 2006;
25(2):237-47.
Dhein J, Walczak H, Bäumler C, Debatin KM, Krammer PH. Autocrine T-cell suicide
mediated by APO-1/(Fas/CD95). Nature. 1995; 373(6513):438-441.
Dias JC. [Epidemiological surveillance of Chagas disease]. Cad. Saude Publica. 2000; 16
Suppl 2:43-59.
159
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Dias JC. [Globalization, inequity and Chagas disease]. Cad. Saude Publica. 2007; 23 Suppl
1:S13-22.
Dias JC. The indeterminate form of human chronic Chagas' disease A clinical
epidemiological review. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 1989; 22(3):147-156.
Dorn PL, Perniciaro L, Yabsley MJ, Roellig DM, Balsamo G, Diaz J, Wesson D.
Autochthonous transmission of Trypanosoma cruzi, Louisiana. Emerg. Infect. Dis. 2007;
13(4):605-607.
Dos Santos PV, Roffê E, Santiago HC, Torres RA, Marino AP, Paiva CN, Silva AA,
Gazzinelli RT, Lannes-Vieira J. Prevalence of CD8(+) alpha beta T cells in Trypanosoma
cruzi-elicited myocarditis is associated with acquisition of CD62L(Low)LFA-1(High)VLA4(High) activation phenotype and expression of IFN-gamma-inducible adhesion and
chemoattractant molecules. Microbes Infect. 2001; 3(12):971-984.
DosReis GA & Lopes MF. A resposta imune à infecção pelo Trypanosoma cruzi em modelos
experimentais. In: Trypanosoma cruzi e Doença de Chagas. Brener Z, Andrade ZA, BarralNeto M. Rio de Janeiro, 2a Edição. Editora Guanabara Koogan, 2000, p. 153-166.
DosReis GA, Cell-mediated immunity in experimental Trypanosoma cruzi infection.
Parasitol. Today. 1997; 13(9):335-42.
DosReis GA, Fonseca ME & Lopes MF. Programmed T-cell death in experimental Chagas
disease. Parasitol. Today. 1995; 11(10):391-394.
DosReis GA, Lopes MF. The importance of apoptosis for immune regulation in Chagas
disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2009; 104(4):259-62.
Dutra WO, Colley DG, Pinto-Dias JC, Gazzinelli G, Brener Z, Pereira ME, Coffman RL,
Correa-Oliveira R, Carvalho-Parra JF. Self and nonself stimulatory molecules induce
preferential expansion of CD5+ B cells or activated T cells of chagasic patients, respectively.
Scand. J. Immunol. 2000; 51(1):91-97.
160
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Dutra WO, Martins-Filho AO, Cançado JR, Dias JCP, Brener Z. Freeman JR, Colley DC,
Gazzinelli G, Parra JC. Activated T and B lymphocytes in peripheral blood of patients with
Chagas disease. Int. Immunol. 1994; 6:499-506.
Dutra WO, Martins-Filho OA, Cançado JR, Pinto-Dias JC, Brener Z, Gazzinelli G, Carvalho
JF, Colley DG. Chagasic patients lack CD28 expression on many of their circulating T
lymphocytes. Scand. J. Immunol. 1996; 43(1):88-93.
Dutra WO, Rocha MO, Teixeira MM. The clinical immunology of human Chagas disease.
Trends Parasitol. 2005; 21(12):581-7.
Elzey BD, Griffith TS, Herndon JM, Barreiro R, Tschopp J, Ferguson TA. Regulation of Fas
ligand-induced apoptosis by TNF. J. Immunol. 2001; 167(6):3049-3056.
Fadok VA, Bratton DL, Konowal A, Freed PW, Westcott JY, Henson PM. Macrophages that
have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory cytokine production through
autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-β, PGE2 and PAF. J. Clin. Invest. 1998;
101(4):890-898.
Ferreira RC, Ianni BM, Abel LC, Buck P, Mady C, Kalil J, Cunha-Neto E. Increased plasma
levels of tumor necrosis factor-alpha in asymptomatic/"indeterminate" and Chagas disease
cardiomyopathy patients. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2003; 98(3):407-411.
Freire-de-Lima CG, Nascimento DO, Soares MBP, Bozza PT, Castro-Faria-Neto H, De Mello
FG, DosReis GA, Lopes MF. Uptake of apoptotic cells drives the growth of a pathogenic
trypanosome in macrophages. Nature. 2000; 403(6766):199-203.
Gazzinelli G, Katz N, Rocha RS, Colley DG. Immune responses during human
schistosomiasis mansoni. X. Production and standardization of an antigen-induced mitogenic
activity by peripheral blood mononuclear cells from treated, but not active cases of
schistosomiasis. J. Immunol. 1983; 130(6):2891-2895.
161
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Gazzinelli RT, Leme VM, Cancado JR, Gazzinelli G, Scharfstein J. Identification and partial
characterization of Trypanosoma cruzi antigens recognized by T cells and immune sera from
patients with Chagas' disease. Infect Immun. 1990; 58(5):1437-44.
Gazzinelli RT, Oswald P, Hienv S, James L, Sher A. The microbial activity of IFN- treated
macrophages against Trypanosoma cruzi envolves an L-arginine-dependent, nitrogen oxidemediated mechanism inhibitable by IL-10 and TGF-. Eur. J. Immunol. 1992; 22:2501-2506.
Gironès N, Cuervo H & Fresno M. Trypanosoma cruzi-induced molecular mimicry and
Chagas' disease. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2005; 296:89-123.
Gomes JA, Bahia-Oliveira LM, Rocha MO, Busek SC, Teixeira MM, Silva JS, CorreaOliveira R. Type 1 chemokine receptor expression in Chagas' disease correlates with
morbidity in cardiac patients. Infect. Immun. 2005; 73(12):7960-7966.
Gomes JA, Bahia-Oliveira LM, Rocha MO, Martins-Filho OA, Gazzinelli G, Correa-Oliveira
R. Evidence that development of severe cardiomyopathy in human Chagas’ disease is due to a
Th1-specific immune response. Infect. Immun. 2003; 71(3):1185-1193.
Green DR, Droin N & Pinkoski M. Activation-induced cell death in T cells. Immunol. Rev.
2003; 193:70-81.
Guillermo LV, Pereira WF, De Meis J, Ribeiro-Gomes FL, Silva EM, Kroll-Palhares K,
Takiya CM, Lopes MF. Targeting Caspases in Intracellular Protozoan Infections.
Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2008 Sep 10:1-30.
Guillermo LV, Silva EM, Ribeiro-Gomes FL, De Meis J, Pereira WF, Yagita H, DosReis GA,
Lopes MF. The Fas death pathway controls coordinated expansions of type 1 CD8 and type 2
CD4 T cells in Trypanosoma cruzi infection. J. Leukoc. Biol. 2007; 81(4):942-951.
162
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Gürtler RE, Segura EL, Cohen JE. Congenital transmission of Trypanosoma cruzi infection in
Argentina. Emerg. Infect. Dis. 2003; 9(1):29-32.
Harel-Bellan A, Joskowicz M, Fradelizi D, Eisen H. Modification of T-cell proliferation and
interleukin 2 production in mice infected with Trypanosoma cruzi. Proc Natl Acad Sci U S A.
1983; 80(11):3466-3469.
Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature. 2000; 407(6805):770-776.
Henriques-Pons A, Oliveira GM, Paiva MM, Correa AF, Batista MM, Bisaggio RC, Liu CC,
Cotta-De-Almeida V, Coutinho CM, Persechini PM, Araujo-Jorge TC. Evidence for a
perforin-mediated mechanism controlling cardiac inflammation in Trypanosoma cruzi
infection. Int. J. Exp. Pathol. 2002; 83(2):67-79.
Herwaldt BL. Laboratory-acquired parasitic infections from accidental exposures. Clin.
Microbiol. Rev. 2001; 14(4):659-688.
Higuchi MD, Reis MM, Aiello VD, Benvenuti LA, Gutierrez PS, Bellotti G, Pileggi F.
Association of an increase in CD8+ T cells with the presence of Trypanosoma cruzi antigens
in chronic, human, chagasic myocarditis. Am J. Trop. Med. Hyg. 1997; 56(5):485-489.
Hildeman DA, Zhu YN, Mitchell TC, Kappler J, Marrack P. Molecular mechanisms of
activated T cell death in vivo. Curr. Opin. Immunol. 2002; 14:354-359.
Jones EM, Colley DG, Tostes S, Lopes ER, Vnencak-Jones CL, McCurley TL. Amplification
of Trypanosoma cruzi DNA sequence from inflammatory lesions in human chagasic
cardiomyopathy. Am. J. Trop. Med Hyg. 1993; 48:348-357.
Ju ST, Panka DJ, Cui H, Ettinger R, el-Khatib M, Sherr DH, Stanger BZ, Marshak-Rothstein
A Fas(CD95)/FasL interactions required for programmed cell death after T-cell activation.
Nature. 1995; 373(6513):444-448.
163
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Kierszenbaum F, Cuna WR, Beltz LA, Sztein MB. Trypanosomal immunosuppressive factor:
a secretion product(s) of Trypanosoma cruzi that inhibits proliferation and IL-2 receptor
expression by activated human peripheral blood mononuclear cells. J. Immunol. 1990;
144(10):4000-4004.
Köberle F. Chagas' disease and Chagas' syndromes: the pathology of American
trypanosomiasis. Adv. Parasitol. 1968; 6:63-116.
Krammer PH, Arnold R & Lavrik IN. Life and death in peripheral T cells. Nature. 2007;
7(7):532-542.
Krammer PH. CD95's deadly mission in the immune system. Nature. 2000; 407(6805):789795.
Lenardo MJ. Interleukin-2 programs mouse alpha beta T lymphocytes for apoptosis. Nature.
1991; 353(6347):858-861.
Leon JS & Engman DM. Autoimmunity in Chagas heart disease. Int. J. Parasitol. 2001;
31:555-561.
Lopes MF, Cunha JM, Bezerra FL, Gonzalez MS, Gomes JE, Lapa e Silva JR, Garcia ES,
Dos Reis GA. Trypanosoma cruzi: both chemically induced and triatomine-derived
metacyclic trypomastigotes cause the same immunological disturbances in the infected
mammalian host. Exp Parasitol. 1995; 80(2):194-204.
Lopes MF, da Veiga VF, Santos AR, Fonseca ME, DosReis GA. Activation-induced CD4+ T
cell death by apoptosis in experimental Chagas' disease. J. Immunol. 1995; 154(2):744-752.
Lopes MF, DosReis GA. Trypanosoma cruzi-induced immunosuppression: selective
triggering of CD4+ T-cell death by the T-cell receptor-CD3 pathway and not by the CD69 or
Ly-6 activation pathway. Infect Immun. 1996; 64(5):1559-1564.
164
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Lopes MF, Guillermo LV & Silva EM. Decoding caspase signaling in host immunity to the
protozoan Trypanosoma cruzi. Trends Immunol. 2007; 28(8):366-372.
Lopes MF, Nunes MP, Henriques-Pons A, Giese N, Morse HC 3rd, Davidson WF, AraújoJorge TC, DosReis GA. Increased susceptibility of Fas ligand-deficient gld mice to
Trypanosoma cruzi infection due to a Th2-biased host immune response. Eur. J. Immunol.
1999; 29(1):81-89.
Lorenz HM, Grünke M, Hieronymus T, Herrmann M, Kühnel A, Manger B, Kalden JR. In
vitro apoptosis and expression of apoptosis-related molecules in lymphocytes from patients
with systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases. Arthritis Rheum. 1997;
40(2):306-317.
Lowry DM, Rosebrough NY, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951; 193:265-275.
Lula JF, Rocha MO, Nunes Mdo C, Ribeiro AL, Teixeira MM, Bahia MT, Talvani A. Plasma
concentrations of tumour necrosis factor-alpha, tumour necrosis factor-related apoptosisinducing ligand, and FasLigand/CD95L in patients with Chagas cardiomyopathy correlate
with left ventricular dysfunction. Eur. J. Heart. Fail. 2009; 11(9):825-831.
Macedo AM, Machado CR, Oliveira RP, Pena SD. Trypanosoma cruzi: genetic structure of
populations and resevance of genetic variability to the pathogenesis of Chagas disease. Mem.
Inst. Oswaldo Cruz. 2004; 99(1):1-12.
Macedo V, Prata A, da Silva GR, Castilho E. Prevalence of electrocardiographic changes in
Chagas' disease patients (preliminary information about the National Electrocardiographic
survey. Arq. Bras. Cardiol. 1982; 38:261-264.
Machado FS, Martins GA, Aliberti JC, Mestriner FL, Cunha FQ, Silva JS. Trypanosoma
cruzi-infected cardiomyocytes produce chemokines and cytokines that trigger potent nitric
oxide-dependent trypanocidal activity. Circulation. 2000; 102(24):3003-3008.
165
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Marques DSO, Canesin MF, Barutta F, Fuganti CJ, Barretto CP. Avaliação de pacientes
assintomáticos com forma crônica da doença de Chagas através da análise do
eletrocardiograma dinâmico, ecocardiograma e do peptídeo natriurético tipo B. Arquivos
Brasileiros de Cardiologia. 2006; 87 (3): 336-343.
Marsden VS & Strasser A. Control of apoptosis in the immune system: Bcl-2, BH3-only
proteins and more. Annu. Rev. Immunol. 2003; 21:71-105.
Martínez-Lorenzo MJ, Alava MA, Gamen S, Kim KJ, Chuntharapai A, Piñeiro A, Naval J,
Anel A. Involvement of APO2 ligand/TRAIL in activation-induced death of Jurkat and
human peripheral blood T cells. Eur J Immunol. 1998; 28(9):2714-2725.
Martins GA, Cardoso MGA, Aliberti JCS, Silva JS. Nitric oxide-induced apoptotic cell death
in the acute phase of Trypanosoma cruzi infection in mice. Immunol. Lett. 1998; 63:113-120.
Melo RB, Parente GB & Victor EG. [Measurement of human brain natriuretic peptide in
patients with Chagas' disease] Arq. Bras. Cardiol. 2005; 84(2):137-140.
Menezes CA, Rocha MO, Souza PE, Chaves AC, Gollob KJ, Dutra WO. Phenotypic and
functional characteristics of CD28+ and CD28- cells from chagasic patients: distinct repertoire
and cytokine expression. Clin. Exp. Immunol. 2004; 137(1): 129-138.
Mercep M, Weissmann A, Frank S, Klausner R, Ashwell J. Activation-driven programmed
cell death and T cell receptor zeta eta expression. Science. 1989; 246(4934):1162-1165.
Minoprio P, Coutinho A, Spinella S, Hontebeyrie-Joskowicz M. Xid immunodeficiency
imparts increased parasite clearance and resistance to pathology in experimental Chagas'
disease. Int Immunol. 1991; 3(5):427-433.
Minoprio P. Chagas' disease: CD5 B-cell-dependent Th2 pathology? Res. Immunol. 1991;
142(2):137-140.
166
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Miura Y, Tsujioka T, Nishimura Y, Sakaguchi H, Maeda M, Hayashi H, Dong M, Hyodoh F,
Yata K, Wada H, Sugihara T, Otsuki T. TRAIL expression up-regulated by interferon-gamma
via phosphorylation of STAT1 induces myeloma cell death. Anticancer Res. 2006;
26(6B):4115-4124.
Nagata S & Golstein P. The fas death factor. Science. 1995; 267:1449-1456.
Nunes MP, Andrade RM, Lopes MF, DosReis GA. Activation-induced T cell death
exacerbates Trypanosoma cruzi replication in macrophages cocultured with CD4+ T
lymphocytes from infected hosts. J. Immunol. 1998; 160(3):1313-1319.
O'Gorman DM, McKenna SL, McGahon AJ, Knox KA, Cotter TG. Sensitisation of HL60
human leukaemic cells to cytotoxic drug-induced apoptosis by inhibition of PI3-kinase
survival signals. Leukemia. 2000;14(4):602-611.
Olivares FE & Vray B. Relationship between granulocyte macrophage- colony stimulating
factor, tumor necrosis factor-alpha and Trypanosoma cruzi infection of murine macrophages.
Paras. Immunol. 1995; 17:135-141.
Oliveira AC, Peixoto JR, de Arruda LB, Campos MA, Gazzinelli RT, Golenbock DT, Akira
S, Previato JO, Mendonça-Previato L, Nobrega A, Bellio M. Expression of functional TLR4
confers proinflammatory responsiveness to Trypanosoma cruzi glycoinositolphospholipids
and higher resistance to infection with T. cruzi. J. Immunol. 2004; 173(9):5688-5696.
Pakianathan DR & Kuhn RE. Interleukin-2 receptors in experimental Chagas' disease. Infect
Immun. 1992; 60(9):3904-3908.
Palomino SA, Aiello VD & Higuchi ML. Systematic mapping of hearts from chronic chagasic
patients: the association between the occurrence of histopathological lesions and
Trypanosoma cruzi antigens. Ann. Trop. Med. Parasitol. 2000; 94:571-579.
167
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Patel T, Gores GJ & Kaufmann SH. The role of proteases during apoptosis. FASEB J. 1996;
10(5):587-597.
Picker LJ, Singh MK, Zdraveski Z, Treer JR, Waldrop SL, Bergstresser PR, Maino VC.
Direct Demonstration of Cytokine Synthesis Heterogeneity Among Human Memory/Effector
T Cells by Flow Cytometry. Blood. 1995; 86:1408-1419.
Prata A. Clinical and epidemiological aspects of Chagas disease. Lancet. Infect. Dis. 2001;
1(2):92-100.
Reed JC. Caspases and cytokines: roles in inflammation and autoimmunity. Adv. Immunol.
1999; 73:265-299.
Reis DD, Gazzinelli RT, Gazzinelli G, Colley DG. Antibodies to Trypanosoma cruzi express
idiotypic patterns that can differentiate between patients with asymptomatic or severe Chagas'
disease. J. Immunol. 1993 15; 150(4):1611-1618.
Reis DD, Jones EM, Tostes S, Lopes ER, Chapadeiro E, Gazzinelli G, Colley DG, McCurley
TL. Expression of major histocompatibility complex antigens and adhesion molecules in
hearts of patients with chronic Chagas' disease. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1993; 49(2):192-200.
Ribeirão M, Pereira-Chioccola VL, Rénia L, Augusto Fragata Filho A, Schenkman S,
Rodrigues MM. Chagasic patients develop a type 1 immune response to Trypanosoma cruzi
trans-sialidase. Parasite Immunol. 2000; 22(1):49-53.
Ribeiro AL & Rocha MO. [Indeterminate form of Chagas disease: considerations about
diagnosis and prognosis]. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. 1998; 31(3):301-314.
Ribeiro AL, dos Reis AM, Barros MV, de Sousa MR, Rocha AL, Perez AA, Pereira JB,
Machado FS, Rocha MO. Brain natriuretic peptide and left ventricular dysfunction in Chagas'
disease. Lancet. 2002; 360(9331):461-462.
168
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Ribeiro-Dos-Santos R, Mengel JO, Postol E, Soares RA, Ferreira-Fernandez E, Soares MB,
Pontes-De-Carvalho LC. A heart-specific CD4+ T-cell line obtained from a chronic chagasic
mouse induces carditis in heart-immunized mice and rejection of normal heart transplants in
the absence of Trypanosoma cruzi. Parasite Immunol. 2001;23(2):93-101.
Ritter DM & Kuhn RE. Antigen-specific T-helper cells abrogate suppression in Trypanosoma
cruzi-infected mice. Infect. Immun. 1990; 58(10):3248-3256.
Rocha MO, Ribeiro AL & Teixeira MM. Clinical management of chronic Chagas
cardiomyopathy. Front. Biosci. 2003; 8:44-54.
Rocha MO, Teixeira MM, Ribeiro AL. An update on the management of Chagas
cardiomyopathy. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2007; 5(4):727-43.
Rodrigues V Jr, Agrelli GS, Leon SC, Silva Teixeira DN, Tostes S Jr, Rocha-Rodrigues DB.
Fas/Fas-L expression, apoptosis and low proliferative response are associated with heart
failure in patients with chronic Chagas’ disease. Microbes Infect. 2008; 10(1):29-37.
Rottenberg M, Lindqvist C, Koman A, Segura EL, Orn A. Modulation of both interleukin-2
receptor expression and interleukin-2 production during experimental murine Trypanosoma
cruzi. Scan. J. Immunol. 1989; 30(1): 65-72.
Rottenberg ME, Bakhiet M, Olsson T, Kristensson K, Mak T, Wigzell H, Orn A. Differential
susceptibilities of mice genomically deleted of CD4 and CD8 to infections with Trypanosoma
cruzi or Trypanosoma brucei. Infect Immun. 1993; 61(12): 5129-5133.
Rottenberg ME, Sporrong L, Persson I, Wigzell H, Orn A. Cytokine gene expression during
infection of mice lacking CD4 and/or CD8 with Trypanosoma cruzi. Scand. J. Immunol.
1995; 41(2):164-170.
Salvesen GS. Caspases and apoptosis. Essays Biochem. 2002; 38:9-19.
169
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Savill J & Fadok V. Corpse clearance defines the meaning of cell death. Nature. 2000; 407:
784-788.
Schlegel RA & Williamson P. Phosphatidylserine, a death knell. Cell Death Differ. 2001;
8(6):551-563.
Schmitz I, Krueger A, Baumann S, Schulze-Bergkamen H, Krammer PH, Kirchhoff S. An IL2-dependent switch between CD95 signaling pathways sensitizes primary human T cells
toward CD95-mediated activation-induced cell death. J. Immunol. 2003; 171(6):2930-2936.
Schofield CJ & Dias JC. The Southern Cone Initiative against Chagas disease. Adv. Parasitol.
1999; 42:1-27.
Shi Y, Sahi BM & Green DR. Cyclosporin A inhibits activation-induced cell death in T-cell
hybridomas and thymocytes. Nature. 1989; 339(6226):625-626.
Siegel RM, Chan FK, Chun HJ, Lenardo MJ. The multifaceted role of Fas signaling in
immune cell homeostasis and autoimmunity. Nat. Immunol. 2000; 1(6):469-474.
Silva EM, Guillermo LV, Ribeiro-Gomes FL, De Meis J, Nunes MP, Senra JF, Soares MB,
DosReis GA, Lopes MF. Caspase inhibition reduces lymphocyte apoptosis and improves host
immune responses to Trypanosoma cruzi infection. Eur. J. Immunol. 2007; 37(3):738-746.
Silva EM, Guillermo LV, Ribeiro-Gomes FL, De Meis J, Pereira RM, Wu Z, Calegari-Silva
TC, Seabra SH, Lopes UG, Siegel RM, Dosreis GA, Lopes MF. Caspase-8 activity prevents
type 2 cytokine responses and is required for protective T cell-mediated immunity against
Trypanosoma cruzi infection. J. Immunol. 2005; 174(10):6314-6321.
Silva JS, Aliberti JC, Martins GA, Souza MA, Souto JT, Pádua MA. The role of IL-12 in
experimental Trypanosoma cruzi infection. Braz. J. Med. Biol. Res. 1998; 31(1):111-115.
170
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Silva JS, Machado FS & Martins GA. The role of nitric oxide in the pathogenesis of Chagas
disease. Front Biosci. 2003; 8:s 314-25.
Silva JS, Morrissey PJ, Grabstein KH, Mohler KM, Anderson D, Reed SG. Interleukin 10 and
interferon gamma regulation of experimental Trypanosoma cruzi infection. J. Exp. Med.
1992; 175(1):169-174.
Silva JS, Vespa GNR, Cardoso MAG, Aliberti JCS, Cunha FQ. Tumor necrosis factor alpha
mediates resistance to Trypanosoma cruzi infection in mice by inducing nitric oxide
production in infected gamma interferon-activated macrophages. Infect. Immun. 1995;
63(12):4862-4867.
Singer GG & Abbas AK. The fas antigen is involved in peripheral but not thymic delection of
T lymphocytes in T cell receptor transgenic mice. Immunity. 1994; 365-371.
Soares MB & Santos RR. Immunopathology of cardiomyopathy in experimental Chagas
disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1999; 94 Suppl 1:257-262.
Su X, Cheng J, Liu W, Liu C, Wang Z, Yang P, Zhou T, Mountz JD. Autocrine and paracrine
apoptosis are mediated by differential regulation of Fas ligand activity in two distinct Jurkat T
cell populations. J Immunol. 1998; 160(11):5288-5293.
Suni MA, Picker LJ & Maino VC. Detection of antigen-specific T cell cytokine expression in
whole blood by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 1998; 212:89-98.
Sytwu HK, Liblau RS & McDevitt HO. The roles of Fas/APO-1 (CD95) and TNF in antigeninduced programmed cell death in T cell receptor transgenic mice. Immunity. 1996; 5(1):1730.
Takahashi A, Iwabuchi K, Suzuki M, Ogasawara K, Nishihira J, Onoé K. Antisense
macrophage migration inhibitory factor (MIF) prevents anti-IgM mediated growth arrest and
171
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
apoptosis of a murine B cell line by regulating cell cycle progression. Microbiol. Immunol.
1999; 43(1):61-67.
Talvani A, Ribeiro CS, Aliberti JC, Michailowsky V, Santos PV, Murta SM, Romanha AJ,
Almeida IC, Farber J, Lannes-Vieira J, Silva JS, Gazzinelli RT. Kinetics of cytokine gene
expression in experimental chagasic cardiomyopathy: tissue parasitism and endogenous IFNgamma as important determinants of chemokine mRNA expression during infection with
Trypanosoma cruzi. Microbes Infect. 2000; 2(8):851-866.
Talvani A, Rocha MO, Barcelos LS, Gomes YM, Ribeiro AL, Teixeira MM. Elevated
concentration of CCL2 and tumor necrosis factor-alpha in chagasic cardiomyopathy. Clin.
Infect. Dis. 2004; 38:943-950.
Tarleton RL, Koller BH, Latour A, Postan M. Susceptibility of beta 2-microblobulin-deficient
mice to Trypanosoma cruzi infection. Nature. 1992; 356:338-340.
Tarleton RL. Immune system recognition of Trypanosoma cruzi. Curr. Opin. Immunol. 2007;
19(4):430-4.
Tarleton RL. Regulation of lymphokine production in experimental and human Chagas'
disease. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 1988; 83 Suppl 1:268-271.
Tarleton RL. The role of T cells in Trypanosoma cruzi infections. Parasitol. Today. 1995;
11(1):7-9.
Teixeira MM, Gazzinelli RT, Silva JS. Chemokines, inflammation and Trypanosoma cruzi
infection. Trends Parasitol. 2002;18(6):262-265.
Tostes S Jr, Bertulucci Rocha-Rodrigues D, de Araujo Pereira G, Rodrigues V Jr.
Myocardiocyte apoptosis in heart failure in chronic Chagas’ disease. Int. J. Cardiol. 2005;
99(2):233-237.
172
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Tsukishiro T, Donnenberg AD & Whiteside TL. Rapid turnover of the CD8(+)CD28(-) T-cell
subset of effector cells in the circulation of patients with head and neck cancer. Cancer
Immunol. Immunother. 2003; 52(10):599-607.
Vago AR, Andrade LO, Leite AA, d'Avila Reis D, Macedo AM, Adad SJ, Tostes S Jr,
Moreira MC, Filho GB, Pena SD. Genetic characterization of Trypanosoma cruzi directly
from tissues of patients with chronic Chagas disease: differential distribution of genetic types
into diverse organs. Am. J. Pathol. 2000; 156(5):1805-1809.
Van Parijs L, Ibraghimov A & Abbas AK. The roles of costimulation and Fas in T cells
apoptosis and peripheral tolerance. Immunity. 1996; 4:321-328.
Van Parijs L, Refaeli Y, Lord JD, Nelson BH, Abbas AK, Baltimore D Uncoupling IL-2
signals that regulate T cell proliferation, survival, and Fas mediated activation-induced cell
death. Immunity. 1999; 11(3):281-288.
Van Parijs L, Refaeli Y, Lord JD, Nelson BH, Abbas AK, Baltimore D. Retraction.
Uncoupling IL-2 signals that regulate T cell proliferation, survival, and Fas-mediated
activation-induced cell death. Immunity. 2009; 30(4):611.
Vespa GN, Cunha FQ & Silva JS. Nitric oxide is involved in control of Trypanosoma cruziinduced parasitemia and directly kills the parasite in vitro. Infect. Immun. 1994; 62(11):51775182.
Vinhaes MC & Dias JC. [Chagas disease in Brazil]. Cad. Saude Publica. 2000; 16 Suppl 2:712.
Vitelli-Avelar DM, Sathler-Avelar R, Massara RL, Borges JD, Lage PS, Lana M, TeixeiraCarvalho A, Dias JC, Elói-Santos SM, Martins-Filho OA. Are increased frequency of
macrophage-like and natural killer (NK) cells, together with high levels of NKT and
CD4+CD25high T cells balancing activated CD8+ T cells, the key to control Chagas' disease
morbidity? Clin. Exp. Immunol. 2006; 145(1):81-92.
173
Avaliação do papel da apoptose nas diferentes formas clínicas da doença de Chagas
________________________________________________________________________________________________
Voll RE, Herrmann M, Roth EA, Stach C, Kalden JR.
Immunosuppressive effects of
apoptotic cells. Nature. 1997; 390:350-351.
Wendel S. Transfusion-transmitted Chagas' disease. Curr. Opin. Hematol. 1998; 5(6):406411.
Wood JN, Hudson L, Jessel TM, & Yamamoto M. A monoclonal antibody defining antigenic
determinants on subpopulations of mammalian neurones and Trypanosoma cruzi parasites.
Nature. 1982; 296(5852):34-38.
World Heath Organization. Control of Chagas disease. World Heath Organ Tech Rep Ser.
2007; 905: 1-109.
Young C, Losikoff P, Chawla A, Glasser L, Forman E. Transfusion-acquired Trypanosoma
cruzi infection. Transfusion. 2007; 47(3):540-5444.
174