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UNIVERSIDADE DO OESTE DE SANTA CATARINA
ÁREA DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
MESTRADO EM BIOCIÊNCIAS E SAÚDE
Marina Lopes Collet
FREQUÊNCIA DO POLIMORFISMO VAL1016ILE DO GENE Kdr
EM POPULAÇÕES DE Aedes aegypti e Aedes albopictus
(DIPTERA: CULICIDAE) NO OESTE DE SANTA CATARINA,
REGIÃO SUL DO BRASIL.
Dissertação de Mestrado
Joaçaba
2016
Marina Lopes Collet
FREQUÊNCIA DO POLIMORFISMO VAL1016ILE DO GENE Kdr
EM POPULAÇÕES DE Aedes aegypti e Aedes albopictus
(DIPTERA: CULICIDAE) NO OESTE DE SANTA CATARINA,
REGIÃO SUL DO BRASIL.
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-graduação Mestrado em Biociências
e Saúde, como requisito parcial para
obtenção do Grau de Mestre em
Biociências e Saúde, da Universidade do
Oeste de Santa Catarina, Joaçaba.
Orientador: Prof. Dr. Glauber Wagner
Co-orientador: Prof. Dr. Gerson Azulim
Muller
Joaçaba
2016
MARINA LOPES COLLET
FREQUÊNCIA DO POLIMORFISMO VAL1016ILE DO GENE Kdr
EM POPULAÇÕES DE Aedes aegypti e Aedes albopictus
(DIPTERA: CULICIDAE) NO OESTE DE SANTA CATARINA,
REGIÃO SUL DO BRASIL.
Esta dissertação foi julgada e aprovada como requisito parcial para a obtenção
do grau de Mestre em Biociências e Saúde no Programa de Mestrado em
Biociências e Saúde da Universidade do Oeste de Santa Catarina.
Joaçaba, 29 de abril de 2016.
__________________________
Prof. Dr. Jovani Antônio Steffani
Coordenador(a) do Programa
BANCA EXAMINADORA
_________________________
Prof. Dr. Glauber Wagner
Orientador
__________________________
___________________________
Prof. Dr. Diego de Carvalho
Prof. Dr. Gerson Azulim Muller
Universidade do Oeste de
Instituto Federal Farroupilha
Santa Catarina (Unoesc)
Campus Panambi
À minha família
Aos meus professores
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, que são meu norte, meu espelho e minha fortaleza. Por
todo o amor e carinho que sempre tiveram comigo. Pela educação e princípios
que aprendi a ter e transmitir. Por ter a oportunidade de escrever a história da
vida com vocês, por sempre estarem de braços abertos, prontos para me
apoiar, por terem me ensinado o verdadeiro sentido de responsabilidade,
persistência, determinação, e foco para alcançar o que se almeja. Agradeço
imensamente por tudo que fizeram para que esse trabalho acontecesse, vocês,
mais uma vez, foram peças chaves e fundamentais.
Ao meu companheiro Daniel, por todo seu carinho, dedicação,
compreensão, incentivo e força. Por estar sempre ao meu lado, por participar e
auxiliar em momentos importantes deste trabalho, por me fazer acreditar e por
permitir que essa jordana fosse cumprida de forma tranquila.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Glauber Wagner, por me acolher, pela
paciência, dedicação, empenho e profissionalismo. Por suas orientações e
direcionamentos. Pela confiança, pelos ensinamentos passados durante toda a
jornada, por me fazer acreditar que as coisas valem a pena, e principalmente
por não medir esforços na construção deste trabalho. Obrigada pelo apoio e
amizade.
Ao Prof. Dr. Gerson Azulim Muller, por abrir portar do conhecimento,
pela confiança, direcionamentos e orientações. Por sua acessibilidade e
disponibilidade de tempo durante este período. Agradeço por participar desta
caminhada e por compartilhar seus conhecimentos.
À Profa. Dr. Luisa Damazio Rona Pitaluga, por participar da construção
deste trabalho e por transmitir seus conhecimentos.
À minha colega Chaiane Frizzo, por me acolher, pela amizade, carinho,
compreensão e confiança, Por demonstrar o espírito de ajuda, por ser fonte de
inspiração e motivação. Agradeço por todo o apoio e disponibilidade. Você foi
fundamental,
A todos os excelentes professores com quem tive a oportunidade de
conviver, pelos conhecimentos, e por contribuírem na minha formação
acadêmica.
À Universidade do Oeste de Santa Catarina e seus dirigentes, que
incentivam a qualificação profissional.
RESUMO
Nos últimos anos foi observado um aumento no número de focos do Aedes
aegypti e de casos de Dengue na região Oeste de Santa Catarina, sul do
Brasil. Segundo a Diretoria de Vigilância Epidemiológica do Estado de Santa
Catarina o número de focos na região deu um salto de 125 focos em 2007,
para 2.083 focos em 2015, comprovando uma emergente preocupação com o
estabelecimento de epidemias de Dengue e outras doenças como, Zika e
Chikungunya, transmitidas por este mosquito na região. Dessa forma, o
monitoramento do surgimento de resistência das populações desses insetos
aos inseticidas sintéticos por meio do fenômeno de “Knockdown resistance”
(kdr) mostra-se muito relevante. O kdr ocorre por meio de mutações na
proteína dos canais de sódio dependentes de voltagem das células do
mosquito, e um dos polimorfismo descritos para este fenômeno é a substituição
da Valina (Val) pela Isoleucina (Ile) na posição 1016 dessa proteína. Assim,
quando o alelo Ile ocorrer em homozigose, o mosquito é considerado resistente
à ação inseticida. O presente trabalho avaliou a frequência destes alelos nas
populações de Ae. aegypti do Oeste de Santa Catarina. Foram obtidos DNA de
349 espécimes provenientes das microrregiões de Joaçaba (31), Concórdia
(35), Chapecó (154) e São Miguel do Oeste (129) por meio da extração de
DNA por Chelex e subsequente análise do polimorfismo através do AFLP-PCR.
Cento e nove espécimes (31%) mostraram-se homozigotos Val/Val (AA), 102
(29%) mostraram-se heterozigotos para os alelos Val/Ile (Aa) e 138 (40%)
homozigotos Ile/Ile (aa). As frequências genotípicas na população de estudo
foram de 0,33 (Val/Val), 0,32 (Val/Ile) e 0,35 (Ile/Ile). As frequências alélicas
foram similares para o alelo Val (0,455) e Ile (0,545). Porém, avaliando apenas
as frequências do alelo mutante, foi observado que as microrregiões de
Joaçaba e Concórdia apresentaram frequências mais elevadas, 0.825 e 0.685
respectivamente, em relação as demais microrregiões. Porém, apesar das
frequências elevadas as populações de Joaçaba e Concórdia ainda de
encontram em equilíbrio de Hardy-Weinberg, reforçando que nessas regiões
ainda não ocorreu uma pressão seletiva, mas destaca a necessidade de
monitoramento destas populações quanto ao aumento de mosquitos
resistentes à piretróides. Apesar de frequências alélicas serem similares na
população de mosquitos da região, a frequência observada de indivíduos
homozigotos Ile/Ile chama a atenção pois a implementação de controles com
os inseticidas sintéticos poderá aumentar a frequência deste alelo pela seleção
de populações resistentes, em especial nas populações que ainda não
sofreram pressão seletiva. Desta forma, enfatiza-se a necessidade do
monitoramento dessas populações quanto a resistência ao longo dos próximos
anos.
Palavras-chave: Enzimas de desintoxicação; mecanismos de resistência;
mosquito;Kdr.
ABSTRACT
In recent years there was an increase in the number of Aedes aegypti outbreak
and Dengue cases in the western region of Santa Catarina, southern Brazil.
According to the Department of Epidemiological Surveillance of the state of
Santa Catarina, the number of outbreaks in the region took a 125 outbreaks
jump in 2007 to 2,083 outbreaks in 2015, showing an emerging concern with
the establishment of Dengue epidemics and other diseases as Zika and
Chikungunya, transmitted by this mosquito in the region. Thus, monitoring the
emergence of resistance in populations of these insects to chemical insecticides
through the phenomenon of "Knockdown resistance" (kdr) proves to be very
relevant. KDR occur through mutations in the protein dependent sodium
channel voltage from mosquito cells, and one of the polymorphisms described
for this phenomenon is the replacement of valine (Val) for isoleucine (Ile) at
position 1016 of the protein. So when the allele Ile occur in homozygous, the
mosquito is considered resistant to the insecticide. This study evaluated the
frequency of alleles in populations of Ae. aegypti of the West of Santa Catarina.
DNA was obtained from 349 specimens from the microregions Joaçaba (31),
Concordia (35) Chapecó (154) and São Miguel do Oeste (129) through the DNA
extraction Chelex and subsequent analysis of polymorphism by AFLP-PCR .
One hundred and nine specimens (31%) showed homozygous Val / Val (AA),
102 (29%) were shown to be heterozygous for Val / Ile alleles (Aa) and 138
(40%) homozygous Ile / Ile (aa) . The genotypic frequencies in the study
population were 0.33 (Val / Val), 0.32 (Val / Ile) and 0.35 (Ile / Ile). Allele
frequencies were similar for the Val allele (0.455) and Ile (0.545). However, only
evaluating the frequency of the mutant allele it was observed that the micro
Joaçaba and Concordia had higher frequencies, 0825 and 0685 respectively,
compared with other micro-regions. However, seize the high frequencies
populations Joaçaba and Concordia still are in Hardy-Weinberg, stressing that
these regions have not yet occurred a selective pressure, but stresses the need
to monitor these populations on the increase of mosquitoes resistant to
pyrethroids. Although allele frequencies were similar in the mosquito population
in the region, the observed frequency of homozygous Ile / Ile draws attention for
the implementation of controls to synthetic insecticides may increase the
frequency of this allele by the selection of resistant populations, especially in
populations which they have not undergone selective pressure. Thus, it
emphasizes the need to monitor these populations for resistance over the next
few years.
Key-words: detoxification enzymes; mechanisms of resistance; mosquito; Kdr.
LISTA DE FIGURAS E GRÁFICOS
Figura 1 - Ciclo de vida do Aedes aegypti ....................................................... 9
Figura 2 – Diferenciação morfológica ente Aedes aegypti e Aedes albopictus. 10
Figura 3 – Esquema dos efeitos das mutações gene Nav que alteram a
estrutura do canal de membrana impedindo a entrada do piretróide nas células
do mosquito ...................................................................................................... 17
Figura 4 – Perfil representativo com três amplificações da região do sitio
1016 do gene kdr de larvas e pupas de Aedes aegypti da mesorregião do
Oeste de Santa Catarina, Brasil, de acordo com Saavedra-Rodriguez et al.
(2007). Val/Ile: Amostras heterozigotas (Aa) - 98 e 78 pb (pares de base);
Ile/Ile; homozigota recessiva resistente (aa) 78 pb; e Val/Val; homozigota
dominante selvagem (AA) 98 pb. Eletroforese em gel Poliacrilamida (PAGE)
12% e corado com brometo de Etídio ............................................................ 19
Figura 5 – Mapa com o número de larvas analisadas na mesorregião do
Oeste de Santa Catarina e em cada uma das quatro microrregiões ................ 22
Figura 6 – Frequências genotípicas do polimorfismo Val1016Ile do gene kdr
na mesorregião Oeste de Santa Catarina e de cada microrregião. As
diferenças observadas entre os genótipos em cada microrregião são
estatisticamente significativas (χ2= 29,4; d.f= 6; p<0,0001) ............................. 22
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Constituição Genotípica e estatística descritiva do gene Kdr de
várias amostras de Santa Catarina. N: total número de mosquitos por
amostra; He: heterozigosidade esperada; HO: heterozigosidade observadas;
Val: frequência do alelo Val; Ile: frequência do alelo Ile; * Χ2 Hardy-Weinberg
com valores de p < 0,0001. .............................................................................. 24
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO ......................................................................................... 4
2
OBJETIVOS ............................................................................................ 6
2.1 OBJETIVO GERAL ................................................................................. 6
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................... 6
3
REVISÃO DE LITERATURA ................................................................... 7
3.1 Aedes aegypti E Aedes albopictus........................................................... 7
3.2 DOENÇAS TRANSMITIDAS PELO VETOR ............................................ 10
3.3 CONTROLE DO VETOR ......................................................................... 13
3.4 RESISTÊNCIA AOS INSETICIDAS QUÍMICOS ...................................... 14
4
MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................... 18
4.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO ................................................ 18
4.2 GENOTIPAGEM DOS POLIMORFISMO Val1016Ile POR PCR-AFLP ... 19
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA, FREQUÊNCIA GENOTÍPICA E EQUILÍBRIO
DE WARDY-WEINBERG ................................................................................. 20
5
RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................ 21
6
CONCLUSÕES ........................................................................................ 27
7
CONSIDERAÇÕES A RESPEITO DA INTERDISCIPLINARIEDADE..... 29
REFERÊNCIAS ............................................................................................... 30
4
1 INTRODUÇÃO
O mosquito Aedes aegypti é um importante vetor de arboviroses como a
Dengue, o Chikungunya, a Encefalite equina venezuelana, o Mayaro, a Febre
amarela e o Zika, sendo abundante em áreas urbanas de pequeno a grande
porte1. Já o Aedes albopictus, é um segundo vetor em potencial, sendo uma
espécie que atua como vetor secundário da dengue em zonas rurais e
urbanas105 .
A proliferação desses insetos está frequentemente relacionada ao
processo de urbanização anômala, que proporciona o surgimento de zonas de
periferia com infraestrutura precária de saneamento básico ou ainda pelo
descarte inadequado de lixo por parte da população que, após uma chuva,
acaba funcionando como criadouro para as formas imaturas do mosquito 1.
No Brasil, as três principais arboviroses relacionadas ao Ae. aegypi, em
relação ao número de casos e/ou gravidade, são a Dengue, o Chikungunya, e
mais
recentemente,
o
Zika1.
No
ano
de
2015
foram
registrados
aproximadamente 20,5 mil casos suspeitos do Chikungunya e 1,6 milhões de
prováveis casos de dengue, o que representa um recorde para essa doença no
país2,3. Com relação ao Zika vírus, há falta de dados oficiais relacionados ao
número total de casos registrados em 2015, contudo sabe-se que transmissões
autóctones do vírus se iniciaram em abril daquele ano, sendo registradas em
19 Estados da federação ³.
Essas arboviroses causam um grande impacto negativo na saúde
pública do Brasil, uma vez que os índices de morbidade e mortalidade
associados a
elas,
dependendo
do
perfil
populacional
afetado,
são
considerados muito elevados4. Apesar do recente desenvolvimento de uma
vacina para os 4 subtipos do vírus da Dengue (DENV) 5,6,7, ainda não há
vacinas disponíveis para esta e para as outras arboviroses até início de 2016, e
sendo assim, elas não são utilizadas como mecanismo efetivo para o controle
destas doenças8, tornando o controle populacional vetorial o método mais
indicado para o controle destas doenças. Atualmente, este controle ainda é
5
realizado por meio da aplicação de inseticidas, principalmente, das classes dos
organofosforados e dos piretróides9,10.
Esses inseticidas empregados no controle do Ae. aegypti, no entanto, ao
longo do tempo, selecionaram populações de vetores resistentes, o que
dificulta o seu efetivo controle11. Segundo a Organização Mundial de Saúde12,
a capacidade de indivíduos de uma determinada espécie de inseto tolerarem
diferentes doses de inseticidas, que para a maioria dos indivíduos desta são
letais, determina o fenômeno fisiológico conhecido como resistência de uma
espécie. Geneticamente, este fenômeno é caracterizado pelo aumento na
frequência de alelos gênicos em uma determinada população como resultado
direto dos efeitos seletivos ocasionados por um inseticida 13.
Entre as alterações biológicas associadas à resistência aos inseticidas,
dois são os mais frequentes: o aumento na taxa de metabolismo do inseticida
pelo inseto e as alterações nos sítios-alvo de ação dos compostos químicos.
Esse último é conferido ao inseto por uma ou várias mutações, sendo que a
conhecida como “Knockdown resistance” (kdr) confere resistência aos
inseticidas piretróides. O kdr, no Ae. aegypti, ocorre a partir de mutações nos
códons do gene Canal Voltaico-Dependente de Sódio e impede que o
inseticida mantenha aberto os canais de Sódio dependente de voltagem (Nav)
das células nervosas do inseto, o que implicaria na incapacidade de
repolarização delas e, consequentemente, levaria a sua morte 14,15.
Dessas, a mutação do na primeira base do códon 1016 mostra-se
importante devido à sua elevada frequência de ocorrência, sendo responsável
pela alteração de uma Valina para uma Isoleucina (Val1016Ile) 16. No Brasil,
este fenótipo de resistência também já foi observado 17,16,18,19,20.
No estado de Santa Catarina, localizado na região sul do Brasil, na
ultima década, tem-se observado um aumento significativo no número de focos
do Ae. aegypti21 e, em contrapartida, os estudos relacionados a frequência de
ocorrência do kdr são inexistente.
6
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a presença e a frequência dos polimorfismos Valina (Val) e
Isoleucina (Ile) no códon 1016 do gene kdr nas populações de Aedes aegypti e
Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) da mesorregião oeste de Santa Catarina,
sul do Brasil.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Genotipar indivíduos de Aedes aegypti coletados nas micro regiões que
compõe a mesorregião do Oeste de Santa Catarina quando aos
polimorfismos Val1016Ile do gene kdr;

Genotipar estes polimorfimos para as populações de Aedes albopictus
desta mesma região;

Estabelecer as frequências de cada alelo observadas e esperadas nas
populações estudadas ;

Avaliar o equilíbrio das populações considerando o equilíbrio de HardyWeinberg e avaliar as hipóteses evolutivas para as frequências
genotípicas observadas.
7
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Aedes aegypti E Aedes albopictus
Aedes (Stegomyia) aegypti Linnaeus, 1762 e o Aedes albopictus Skuse,
1894, são importantes vetores em saúde pública devido ao seu papel como
transmissor de dengue, febre amarela febre Chikungunya e Zika22. Acredita-se
que o Ae. aegypti tem sua origem na África, e foi descrito pela primeira vez no
Egito. Este mosquito acompanhou o homem no processo de migração pelo
mundo, especialmente pela capacidade de se proliferar em locais com grandes
alterações antrópicas, tornando-se assim um vetor cosmopolita23.
Em função da sua disseminação ter sido principalmente de forma
passiva pelo homem, a distribuição geográfica da espécie é descontínua 24. No
Brasil, os primeiro registros datam de 1986, no município de Itaguaí, estado do
Rio de Janeiro23 e acredita-se, que o mosquito tenha sido introduzido no país
durante a ocorrência do tráfico de escravos, no período colonial 24.
Por ser um mosquito adaptado ao ambientes antropizados, em especial
em cidades, este vetor oviposita em recipientes encontrados em domicílios ou
peridomicílios como potes, reservatórios de água, pneus usados e latas, com
pouca matéria orgânica e preferencialmente em locais sombreados 23. Apesar
de conseguir manter uma população relevante durante as estações menos
chuvosas, em função dos criadouros semipermanentes, é na estação chuvosa
que a população alcança níveis elevados e constituindo esta estão como o
período de importância epidemiológica para fins de transmissão de doenças 24.
Um outro mosquito bastante similar e confundido pela população com o
Ae. aegypti é o Ae. albopictus Skuse, 1894. O Ae. albopictus é originário do
continente Asiático e teve sua provável introdução no Brasil por meio dos
portos no Espírito Santo e interiorizado através das estradas de ferro, como a
Vale do Rio Doce24. A sua distribuição está também bastante relacionada à
presença do homem em função de utilizar, assim como o Ae. aegypti,
8
criadouros artificiais resultantes da ação antrópica ao meio. Contudo, contrário
ao Ae. aegypti, é uma espécie de mosquito que possui facilidade em se
espalhar também em ambientes rurais e silvestres, além de ser mais tolerante
a baixas temperaturas25.
Apesar do Ae. albopictus não ter sido reportado como transmissor de
arboviroses como Dengue no Brasil26, sabe-se que este mosquito pode
transmitir o vírus Chikungunya no Brasil 27, bem como transmite todos estes
vírus em outras regiões do mundo, tendo assim um grande impacto na saúde
das populações daquelas regiões28.
Estima-se que em torno de 75% da população mundial residem em
áreas com infestação de vetores de dengue, como o Ae. aegypti. Esta espécie
está mundialmente distribuída, nos últimos anos, o alto fluxo de pessoas e
cargas entre diferentes regiões do mundo, bem como a ocupação desordenada
dos grandes centros urbanos, exerce uma influência direta na dispersão destes
mosquitos29,30. Estes fatores, combinado com as falha nos sistemas de
vigilância epidemiológica permitiram a rápida transmissão de vírus como a
Dengue e o Zika.
Estes dois mosquitos apresentam um ciclo de vida muito similar (Figura
1), porém com tempos de desenvolvimento diferentes de acordo com as
condições de temperatura, disponibilidade de alimento e umidade, mas
geralmente o ciclo leva em torno de 10 dias 31, passando pelos estágios de
ovos, larvas (de 1 a 4 instar), pupa e adulto 24. Os ovos, inicialmente de
coloração branca e menores do que 1 mm, tornam-se negros e rígidos após
duas horas da postura e não apresentam distinção na sua morfologia entre
estas duas espécies32. Já as larvas crescem de forma sequencial no seu
comprimento
passando
por
quatro
estádios,
e
este
desenvolvimento
dependente da disponibilidade de nutrientes, temperatura e densidade larvária,
variando entre cinco a sete dias24. A diferença morfológica básica entre estes
mosquitos é que o Ae. albopitcus apresenta um conjunto de espículas com
apenas um espinho no ultimo segmento larval, bem proeminente e de forma
acicular22. Em seguida transformam-se em pupas e seu período de
desenvolvimento dura de dois a três dias em condições adequadas de
temperatura, sendo este o estágio de transição entre o individuo de meio
aquático para o terrestre22.
9
Figura 1: Ciclo de vida do Ae. aegypti e Ae. albopictus.
Fonte: Adaptado de Bigents (2016).
O adulto representa a fase reprodutiva do inseto e os machos e fêmeas
se diferenciam essencialmente pelos machos apresentarem antenas mais
plumosas e palpos mais longos33. Os adultos destas espécies são facilmente
reconhecidos por apresentarem tegumentos escuros com escamas claras nas
pernas formando anéis, e no caso do Ae. aegypti apresentarem “lira”
desenhada no mesonoto enquanto o Ae. albopictus uma listra central 24. (Figura
2).
10
Figura 2: Diferenciação morfológica entre Ae. aegypti e Ae. albopictus.
Fonte: Adaptado Fiocruz, 2016 34.
Com relação aos hábitos alimentares, tanto machos quanto fêmeas
alimentam-se de néctar e fluídos açucarados, porém, apenas a fêmea
apresenta característica hemofágica em função da necessidade de proteínas
presentes no sangue de mamíferos como para a a maturação dos ovos,
influenciando assim a quantidade de oviposturas realizadas, que deve ocorrer a
cada repasto sanguíneo, com intervalos de três dias33.
Segundo Consoli24, seguinte a oviposição, os ovos ficam no ambiente
em um período de incubação para a ocorrência do processo de embriogenese
e formação das larvas, se houver condições favoráveis de temperatura e
umidade, caso contrário, ocorre a diapausa, onde os ovos ficam em suspensão
temporária de eclosão após o termino do desenvolvimento embrionário.
3.2 DOENÇAS TRANSMITIDAS PELO VETOR
As arboviroses são doenças virais (Arbovírus) são transmitidas ao
homem por meio de insetos e aracnídeos durante o repasto sanguíneo4. Dentre
os principais arbovírus podemos destacar os vírus da febre amarela, Dengue,
Chikungunya, da encefalite equina, Mayaro e o vírus da Zika1, que tem como
principal vetor o Ae. aegypti e para Dengue, febre amarela e Chikungunya
também se inclui o Ae. albopictus como vetor.
11
A dengue acomete aproximadamente 50 a 100 milhões de pessoas
anualmente em mais de 100 países de todos os continentes, com exceção da
Europa e Antártida. Apenas no Brasil aproximadamente 550 mil pessoas são
acometidas pela doença e em torno de 20 mil falecem em consequência da
dengue35. O agente causador da dengue é um vírus de RNA pertencente a
família Flaviviridae, do gênero Flavivirus, com quatro sorotipos virais
conhecidos (DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4). Esta infeção é acarreta em um
quadro
clínico
assintomático,
ou
ainda
provocar
a
dengue
clássica
(caracterizada por um estado febril agudo), ou ainda o quadro mais grave que é
a febre hemorrágica da dengue ou síndrome do choque da dengue 4 sendo
responsável por uma mortalidade causada superior a 20% se não tiver o
tratamento adequado36.
No Brasil, os primeiros relatos de epidemias de dengue foram no período
de 1846 a 1853, porém, a primeira evidência de ocorrências de epidemia foi em
1982, com o isolamento dos sorotipos DEN-1 e DEN-4 em Boa Vista, Roraima
Como Ae. aegypti não estava disperso pelo território brasileiro a capacidade de
disseminação do vírus não foi elevada, desta forma em poucos meses houve o
controle desta epidemia ainda na cidade de Boa vista37. Já em 1986, houve a
reintrodução do sorotipo DEN-1 no Rio de Janeiro, DEN-2 em 1990, DEN-3 em
200138 e em 1981 o DEN-439. Já em 2005 o nível endêmico de dengue em
nosso país havia alterado os indicadores de morbidade, superando a de todas
as outras doenças de notificação compulsória
40
. Deste então o vírus passou a
ser disseminado rapidamente em função das falhas no controle vetorial e a
rápida expansão urbana, chegando a mais de 1 milhão de casos em 2015 41.
Outra doença emergente é a febre Chikungunya, causada pelo vírus
CHIKV, que é um vírus da família Togaviridae composto de RNA pertencente.
Seu nome “chikungunya” é derivado da palavra em Makonde a qual traduz-se
em “aqueles que se dobram”, descrevendo os pacientes, que sofrem de
artalgia intensa, que apresentam uma aparência encurvada 42.
Desde o ano de 2004 o vírus CHIKV vem causando epidemias na Ásia e
África, com valores de morbidade relevantes43. De acordo com o Ministério da
Saúde42, a febre Chikungunya é caracterizada por febre alta, dores de cabeça,
mialgias e artralgias principalmente nas extremidades e articulações, com
12
período de incubação de aproximadamente de três a sete dias. Alguns desses
sintomas podem permanecer e a mesma converter-se na forma crônica.
No Brasil, já foram registrados mais de 3.748 casos, especialmente na
Bahia e em Pernambuco3, e
em função do conhecimento da capacidade
vetorial do Ae. albopictus para a transmissão deste vírus no Brasil 27, há uma
preocupação com o estabelecimento de uma epidemia no Brasil, pois este
mosquito está pela presente em mais de 59% das cidades brasileiras, incluindo
do Oeste Catarinense25.
Outro vírus transmitido pelo Ae. aegypti que merece destaque é o Zika
vírus (ZIKAV). Este vírus é também pertencente a família Flaviviridae, como o
vírus da dengue, e foi originalmente isolado em 1947 na floresta de Zika
(Uganda), a partir de sangue de Rhesus macaque1. Esta infeção pode ser
facilmente confundida com a dengue, apesar de haver sintomas característicos
como cefaleia, manchas avermelhadas na pele, febre baixa, dores articulares,
mal estar, coceira e vermelhidão ocular, contudo de maneira geral, a doença
evolui de forma benigna, onde os sintomas desaparecem após 3 a 7 dias
espontaneamente44,3.
Apesar do primeiro registro de ZIKAV em humanos datar de 1952 a
transmissão do vírus permaneceu restrita aquela região até no ano de 2007,
quando um grande surto, que afetou aproximadamente 70% dos residentes,
ocorreu na ilha de Yap e em outras ilhas nas proximidades dos Estados
Federados da Micronésia. Primeiramente, o surto foi relacionado ao vírus da
dengue, porém exames sorológicos e moleculares demonstraram a presença
do ZIKAV como sendo o agente etiológico responsável pelo surto45. No Brasil,
acredita-se que o ZIKAV foi introduzido no ano de 2015 primeiramente a região
Nordeste do país46.
A grande preocupação com o ZIKAV são os casos de microcefalia em
bebês reportados pelo Ministério da Saúde em associação com este vírus. Fato
comprovado nos meses seguintes pela identificação deste vírus através de
técnicas moleculares de RT-PCR e de microscopia em cérebro de uma criança,
cuja apresentava sintomas de Zika 47. Deste então, esta epidemia passou a ser
considerada vital para a saúde mundial segundo a Organização Mundial da
Saúde.
13
Apesar do recente desenvolvimento de uma vacina para os 4 subtipos
do vírus da Dengue (DENV)5,6,7, ainda não há vacinas disponíveis para esta e
para as outras arboviroses até início de 2016, e sendo assim, elas não são
utilizadas como mecanismos efetivos para o controle destas doenças 8,
tornando o controle populacional vetorial o método mais indicado para o
controle destas doenças.
3.3 CONTROLE DO VETOR
O controle da transmissão das arboviroses, tem como objetivo o
enfrentamento dos surtos, epidemias, o aumento da mortalidade e morbidade e
prevenção a reintrodução da doença e novas epidemias, indo muito além da
redução das populações dos vetores
48
. Contudo, de nada adianta remediar a
situação existente com o tratamento dos infectados e a eliminação temporária
de criadores destes mosquitos, se não focar na eliminação completa deste
mosquito nas áreas de foco.
No Brasil, os programas para controle ao vetor tem como base a
integração
de
ações
de
vigilância
epidemiológica,
manejo
ambiental
(eliminação dos criadouros do mosquito e armadilhas), controle biológico e
controle químico (uso de inseticidas e repelentes)49.
Os programas de vigilância epidemiológica ainda se constituem como
fundamentais estratégias para promover as ações no controle da população de
mosquitos50. Estes programas de vigilância do Ae. aegypti utilizam índices
como o Índice de Infestação Predial (IIP) e o Índice de Breteau (IB), que
baseiam-se na presença de larvas / pupas em recipientes na área amostrada
para determinar a taxa de infestação destes mosquitos. Para isto, a maioria dos
programas de vigilância visam o monitoramento e identificação das formas
aquáticas de Aedes spp.51 .
Então, com base neste programa, nas regiões onde for observada
formas aquáticas deste mosquito é necessário a intervenção do manejo
14
ambiental como medidas de caráter preventivo são direcionadas principalmente
aos criadouros52 e sua realização é feita pela combinação de vários métodos 53.
Essas medidas envolvem ações simples e eficazes, em especial aquelas que
envolvem cuidados a serem tomados pela própria população52.
Na última etapa deste programa está a utilização de agentes biológicos
ou químicos para o controle do Ae. aegypti em locais onde há infestação do
mesmo. Segundo Luna
54
, estas estratégias são baseadas na utilização de
produtos químicos, principalmente organofosforados e piretróides, que são
inseticidas químicos que necessitam de constante monitoramento. Este
acompanhamento deve ser realizado de forma continua e deve ser observada
a presença de mutações que conferem resistência às diferentes classes de
inseticidas químicos23,55. Com base neste acompanhamento é possível que os
agentes públicos adotem estratégias de controle do mosquito distintas, como
uso de diferentes inseticidas23, de inseticidas biológicos como o BTI56, de
mosquitos modificados geneticamente 57 ou o uso de mosquitos infectados com
o endosimbionte Wolbachia56.
Até o momento o monitoramento da resistência a inseticidas pelo
mosquito Ae. aegypti deve ser realizado baseado nos ensaios preconizados
pela Organização Mundial da Saúde12.
No Brasil, este monitoramento é
realizado especialmente pela Rede Nacional de Monitoramento da Resistência
de Aedes aegypti (MoReNa). Estes bioensaios são laboriosos e consomem
tempo até se chegar ao tipo de inseticida ou susceptibilidade que uma
determinada população de mosquito apresenta.
3.4 RESISTÊNCIA AOS INSETICIDAS QUÍMICOS
Os primeiros registros do uso de compostos com atividade inseticida
datam de mais de 2500 anos a.C, com os povos sumérios. Posteriormente,
com os Chineses, iniciou-se o desenvolvimento de inseticidas derivados de
plantas, mercúrio e arsênico. Sendo muitos destes compostos utilizados no
15
desenvolvimento da agricultura59. E o sucesso do uso destes compostos no
controle de pragas na agricultura, passou a despertar o interesse do seu uso
na saúde pública, tornando esses inseticidas químicos importantes nos
programas de controle de vetores de zoonoses60.
Desde então, o desenvolvimento científico e tecnológico para o
desenvolvimento de inseticidas mais potentes e com capacidade de uso em
diversas áreas foi alavancado. Dentre vários compostos, os inseticidas
organofosforados (OP) são os que apresentar o maior interesse comercial e
toxicológico61. Estes agem por contato e ingestão, ligando-se a enzima
acetilcolinesterase (AChE), incapacitando-a de hidrolisar acetilcolina (ACh) em
colina e ácido acético, promovendo a
paralisia e morte do inseto 23. O
organofosforado temephos, é o único larvicida pertencente a este grupo de
compostos que é aprovado pela Organização Mundial da Saúde para o
controle de larvas de mosquito em reservatórios de água para o consumo
humano, em função da baixa toxicidade e persistência no ambiente 62. No
Brasil, utiliza-se este desde 1967, tendo sua aplicação intensificada após a
epidemia de 1986
63
, estimando-se o seu emprego, na saúde publica, em 5 mil
toneladas por ano48.
Outra classe de inseticida muito utilizado no país são os piretróides, o
quais atuam no sistema nervoso do inseto, modificando a função normal do
canal de sódio, acarretando a morte do mosquito 64. Contudo, o uso
descontrolado e irrestrito destes compostos, possibilitou que populações de
mosquito apresentarem habilidades de resistência aos compostos 65.
Acredita-se que mais de 100 espécies de mosquitos apresentam
resistência a algum tipo de inseticida66. A resistência a um composto nada mais
é do que a capacidade desenvolvida por um organismo em tolerar variadas
concentrações de agentes tóxicos, as quais seriam letais para a maioria da
população da mesma espécie12. Mecanismos de resistência são gerados
através de modificações genéticas que acarretam em alterações morfológicas,
fisiológicas ou
comportamentais
que
são
selecionadas
pelo
próprios
compostos. Em função da resistência ser hereditária, é notado que em certos
locais ocorre um aumento na frequência destes alelos na população, formando
populações altamente resistentes aos compostos disponíveis 23.
16
Existem diferentes tipos de mecanismos de resistência conhecidos,
sendo eles: mudança na penetração do composto no inseto reduzida,
mudanças comportamentais, alteração do sítio-alvo e resistência metabólica67.
A redução na taxa de penetração do inseticida origina-se de mutações em
proteínas do tegumento que acarretam na diminuição da penetração do
inseticida no inseto23. Já as mudanças de comportamento dos insetos ocorrem
em função da presença do inseticida em certas áreas e os insetos tornam-se
capazes de reconhecer estas áreas e não aparecer em regiões sob tratamento,
alterando o seu biorritmo68.
Há resistência do tipo metabólica é determinada pelo aumento da
capacidade do inseto em detoxificar o inseticida 23, e fazem parte deste grupos
enzimas como as monooxigenases dependentes do citocromo P-450,
esterases e GSH-transferases69.
Já as alterações estruturais de proteínas em sítio-específico geram a
redução da afinidade do inseticida com a proteína alvo. Dentre estas proteínas,
destacam-se as enzimas acetilcolinesterase (AChE), receptores neuronais do
ácido gama-aminobutírico (GABA) e canais de sódio voltagem dependente
(Nav)70.
Dentre estes genes de resistência, as mutações do tipo kdr, do inglês
knockdown resistance, no gene Nav tem sido associada à resistência aos
piretroides. Os piretróideos agem na proteína canal e impedem a repolarização
da membrana plasmática das células nervosas destes insetos através da sua
interação com a proteína e manutenção deste constantemente aberto, levando
a morte do inseto15. Mutações nestes canais, levam a redução da afinidade do
piretróide com o canal, fazendo com que este permaneça ativo e fazendo com
que a transmissão de impulso nervoso permaneça ativa e o inseto vivo, mesmo
na presença do inseticida71,14 (Figura 3)
17
Figura 3: Esquema dos efeitos das mutações gene Nav que alteraram a estrutura do canal da
membrana impedindo a entrada do piretroide nas células do mosquito..
72
Fonte: Raven et al. (2011) .
Várias espécies de mosquitos de importância médica, incluindo
Anopheles gambiae, Culex pipiens, Culex quinquefasciatus e Ae. aegypti
apresentam fenótipos kdr55. Diversas mutações pontuais já foram associadas a
esse fenômeno, como por exemplo o polimorfismo L1014F em Anopheles
gambiae73, Culex pipiens74 e Culex quinquefasciatus75 e o L1014S também em
Culex pipiens74.
Diversas mutações já foram descritas relacionadas ao kdr em Ae.
aegypti: V1016I, I1011M20; G923V, V952I, H961K, L982W, I1011M, I1011V17;
V1011M, V1016I16; V1016G18; F1534C78; F1534C79; e D1794Y80.
Em especial, para o Ae. aegypti, Saavedra-Rodrigues16 descreveram a
transição A/G (adenina/guanina) na primeira base do códon 1011 que gera a
alteração de uma Isoleucina para uma Metionina (Ile1011Met) e uma transição
A/G na primeira base do códon 1016 modificando uma Valina por uma
Isoleucina (Val1016Ile), como mutações que levam ao fenótipo kdr.
Os genes associados a esse fenótipo kdr, se apresentam de forma
recessiva, ou seja, só é possível detectar a resistência quando exista
homozigose76. Desta forma, Martins77, perceberam, por estudos moleculares,
que a frequência do alelo 1016 mutante em homozigose (Ile/Ile), era maior em
indivíduos resistentes, contribuindo com a associação desta mutação com a
resistência a piretróides em populações de Ae. Aegypti.
18
4 MATERIAL E MÉTODOS
Esse estudo foi realizado a partir de imaturos de Ae. aegypti e Ae.
albopictus obtidos entre novembro de 2013 a abril de 2014 na mesorregião
Oeste do estado de Santa Catarina, que se divide em quatro microrregiões:
Chapecó (com 30 municípios), Concórdia (com 7 municípios), Joaçaba (com 12
municípios) e São Miguel do Oeste (com 16 municípios). Os espécimes
analisados foram obtidos a partir de ovitrampas mantidas e monitoradas pelas
Secretarias de Saúde dos Municípios, de acordo com o manual de normas
técnicas da Fundação Nacional da Saúde 48. Foram analisadas 349 espécimes
dos Ae. aegypti e 114 de Ae. albopictus identificados pela Diretoria de
Vigilância Epidemiológica (DIVE/SC) e as larvas ou pupas foram envidadas
para o Laboratório de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Unoesc
(Joaçaba), para a determinação do genótipo de resistência (kdr).
4.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO
O DNA dos espécimes foi obtido utilizando Chelex® (Chelating Ion
Exchange Resin), onde as amostras foram maceras em 100µL de água
ultrapura estéril e 100µL de PBS 1X, seguidas de centrifugação a 20.000 x g
por 2 minutos. Após descarte do sobrenadante o precipitado foi solubilizado
com 100µl de PBS 1X e submetido a nova centrifugação igual a anterior. Em
seguida o precipitado foi solubilizado em agitação por 5 segundos para liberar o
pellet e com 75µL de água ultrapura estéril e 25µL da solução de Chelex 20%.
Em seguida, foi feito um pequeno furo na superfície do tubo e as amostras
foram incubadas por 10 minutos à 90ºC. Após este período, as amostras foram
centrifugadas por 1 minuto a 20.000 x g e o sobrenadante (onde está o DNA)
foi transferido para um novo tubo.
19
4.2 GENOTIPAGEM DOS POMILMORFIMOS VAL1016ILE POR PCR-AFLP
A determinação dos genótipos Val1016Ile do gene kdr nos mosquitos foi
baseado no protocolo descrito por Saavedra-Rodriguez16 e Martins et al.
(2009b)77. Sumariamente, foram utilizados três iniciadores, um específico para
o alelo selvagem (Val) (5’-GCG GGC AGG GCG GCG GGG GCG GGG CCA
CAA ATT GTT TCC CAC CCG CAC CGG-3’), um específico para o alelo
mutante (Ile) (5’-GCG GGC ACA ATT GTT TCC CAC CCG CAC TGA-3’), e o
terceiro comum a ambos (Foward) (5’-GGA TGA ACC GAA ATT GGA CAA
AAG C-3’). As reações de PCR foram realizadas em volume final de 20µl,
1,5mM de MgCl2, 1,0 mM de dNTP, 2,5U de Taq DNA Polimerase (Ludwig
Biotecnologia), 1X tampão da Taq, 1,0 ρmol do iniciador Foward, 0,5 ρmol de
cada um dos iniciadores Val e Ile e ~50ng DNA. As condições de temperatura
foram desnaturação inicial a 95 °C por doze minutos, 39 ciclos de desnaturação
a 95 °C por 20 segundos, anelamento a 60 °C por um minuto e extensão a 72
°C por 30 segundos; seguidos de extensão final a 72° C por cinco minutos e
um incremento de 65° C para 95° C numa taxa de 0,3° C/s.
Para verificação dos alelos amplificados, foi preparado um gel de
poliacrilamida (PAGE) 12%, e Ladder de 25bp. A presença de banda única
98bp indica indivíduo homozigoto dominante susceptível (Val/Val); a presença
de banda única 78bp indica indivíduo homozigoto recessivo mutante (Ile/Ile); e
a presença de duas bandas indica indivíduo heterozigoto suscetível (Val/Ile)
(Figura 4).
Val/Ile
Ile/Ile
Val/Val
98 pb
78 pb
Figura 4: Perfil representativo com três amplificações da região do sítio 1016 do gene kdr de
larvas e pupas de Aedes aegypti da mesorregião do Oeste de Santa Catarina, Brasil, de acordo
com Saavedra-Rodriguez et al. (2007). Val/Ile: Amostras heterozigotas (Aa) - 98 e 78 pb (pares
de base); Ile/Ile; homozigota recessiva resistente (aa) 78 pb; e Val/Val; homozigota dominante
selvagem (AA) 98 pb. Eletroforese em gel Poliacrilamida (PAGE) 12% e corado com brometo
de Etídio.
20
4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA, FREQUÊNCIA GENOTÍPICA E EQUILÍBRIO DE
HARDY-WEINBERG
As frequências alélicas da mesorregião e das microrregiões foram
calculadas através da soma de 2 x número de indivíduos com genótipo
homozigoto + n° de indivíduos com genótipo heterozigoto dividido por 2n, onde
n é o número total de indivíduos analisados. Já as frequências genotípicas
foram determinadas com o número de indivíduos para cada genótipo dividido
pelo número total de indivíduos.
A comparação das frequências genotípicas e alélicas entre as
microrregiões foram realizadas utilizando o teste de Pearson 𝜒2, com nível de
significância p<0.005. Para calcular o esperado, a heterozigosidade observada,
bem como o equilíbrio de Hardy-Weinberg, foi utilizado o software Arlequin
3.181.
21
5 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Dos 349 espécimes de Ae. aegypti avaliados, 154 (44%) larvas
oriundas da microrregião de Chapecó, 129 (37%) de São Miguel do Oeste, 35
(10%) de Concórdia e 31 (9%) de Joaçaba (Figura 5). Também foram
avaliadas 114 espécimes de Ae. albopictus, sendo 32 (28%) larvas oriundas
da microrregião de Chapecó, 32 (28%) de São Miguel do Oeste, 25 (22%) de
Concórdia e 25 (22%) de Joaçaba. A variação na quantidade de espécimes
avaliados por microrregião pode ser explicada pela diferença no número de
espécimes coletados em cada uma destas regiões no período do estudo, pois
houve um número distinto de focos destes mosquitos observados entre as
microrregiões até o período de abril de 2014, onde as microrregião de
Chapecó e de São Miguel do Oeste apresentaram o maior número de focos
destes mosquitos 82.
Com relação as frequências genotípicas dos Ae. aegypti, dos 349
espécimes avaliados, 109 (31%) foram homozigotos para o alelo Val, 138
(40%) homozigotos para o alelo Ile e 102 (29%) heterozigotos Val/Ile (Figura
6). Ou seja, quase 40% dos indivíduos analisados apresentavam resistência a
inseticidas piretróides por meio do kdr.
Já com relação as frequências genotípicas dos Ae. albopictus, todos os
espécimes avaliados apresentaram genótipo homozigotos Val, ou seja, 100%
dos indivíduos apresentavam susceptibilidade a inseticidas do tipo piretróides,
com base nestes polimorfimos. Este fato já foi observado em outros estudos,
demonstrando que os mecanismos de resistência a estes inseticidas pode ser
associado a outro alelo ou mecanismo 16.
Como apenas os espécimes de Ae. aegypti apresentaram frequências
genotípicas variadas, a partir deste momento apenas serão apresentados e
discutidos os dados relativos aos polimorfismo do gene kdr desta espécie.
22
Figura 5: Mapa com o número de larvas analisadas na mesorregião do Oeste de Santa
Catarina e em cada uma das quatro microrregiões.
Considerando as microrregiões separadamente, observa-se uma
frequência maior de genótipos homozigotos Ile/Ile nas microrregiões de
Joaçaba e Concórdia (Figura 6).
Figura 6: Frequências genotípicas do polimorfismo Val1016Ile do gene kdr na mesorregião
Oeste de Santa Catarina e de cada microrregião. As diferenças observadas entre os
2
genótipos em cada microrregião são estatisticamente significativas (χ = 29,4; d.f= 6;
p<0,0001).
23
O fenótipo resistente aos inseticidas somente é manifestado em
homozigose recessiva (Ile/Ile) 16,76 e a manifestação e o aumento da frequência
da mutação 1016Ile do gene kdr já foi reportada nas Américas83,84,85 e no
Brasil77. Lima55 e Paiva86, observam a presença desta mutação (Ile) em
amostras do Nordeste brasileiro, porém apenas em indivíduos heterozigotos.
Contudo indivíduos homozigotos para o alelo mutante foram observados por
Alvarez
85
na Venezuela. Já Batista20 observou em algumas cidades de São
Paulo a frequência genotípica do homozigoto Ile de 78%. Considerando apenas
a região Sul do Brasil, Piccoli 19, também observou em municípios do oeste do
Paraná a presença de indivíduos homozigotos Ile/Ile. No Oeste de Santa
Catarina, as frequências de mosquitos com genótipo resistente (Ile/Ile), foram
similares aos resultados já encontrados em outras regiões do país.
As frequências observadas dos alelos selvagens (Val) e mutantes (Ile)
na mesorregião do Oeste de Santa Catarina foram de 0,455 e 0,545,
respectivamente (Tabela 1). Considerando apenas as frequências do alelo
mutante, foi observada que as microrregiões de Joaçaba e Concórdia
apresentaram frequências mais elevadas, 0.825 e 0.685 respectivamente,
quando comparadas com as demais microrregiões (p=0.0005). A frequência
maior deste alelo pode ser decorrente da baixa quantidade no número de focos
do mosquitos 18 e 20 nas microrregiões de Joaçaba e Concórdia,
respectivamente21, contra 432 e 1613 nas microrregiões de São Miguel do
Oeste e Chapecó, respectivamente, durante o período do estudo. Estudos
realizados em outras regiões do Brasil, observaram frequências do alelo Ile
variando entre 0,22 e 0,78 em populações naturais 87,19,55. Contudo, mesmo
ocorrendo a elevada frequência do alelo Ile, as populações de Joaçaba e
Concórdia ainda encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg (Tabela 1), o
que sugere que nestas regiões pressões seletivas não estejam ocorrendo, mas
reforça a necessidade de monitoramento destas populações quanto ao
aumento de mosquitos resistentes a piretróides no caso de introdução de
medidas de controle contra estes mosquitos.
Diferentes
amostras
das
populações
provenientes
de
Joaçaba,
Concórdia e São Miguel do Oeste e Chapecó não estão em Hardy-Weinberg
(X2> 27; d.f. = 1; P <0,0001) (Tabela 1).
24
Tabela 1. Constituição Genótipica e estatística descritiva do gene Kdr de várias amostras de Santa Catarina.
População
São Miguel do Oeste
Chapecó
Concórdia
Joaçaba
Total Oeste
N
Val/Val
Val/Ile
Ile/Ile
Val
129
154
35
31
349
45
60
03
01
109
33
44
16
09
102
51
50
16
21
138
0.475
0.535
0.315
0.175
0.455
Ile
(Kdr)
0.525
0.465
0.685
0.825
0.545
X2 HardyWeinberg
30.63*
27.97*
0.13
0.00
59.07*
HO
HE
0.256
0.286
0.457
0.290
0.292
0.500
0.499
0.437
0.297
0.497
N: total número de mosquitos por amostra; He: heterozigosidade esperada; HO: heterozigosidade observadas; Val: frequência do alelo Val; Ile: frequência do
2
alelo Ile; * Χ Hardy-Weinberg com valores de P < 0,0001
25
O desvio ao equilíbrio de Hardy-Weinberg observado nessas duas
populações pode ser explicado por um possível efeito fundador inicial, onde
pequenas populações de Aedes aegypti oriundas de outros locais passaram a
se estabelecer nessas regiões, trazendo o, alelo de resistência Ile. Esta
hipótese é plausível, pois a região Oeste do Estado de Santa Catarina
apresenta um alto fluxo de caminhões vindos das diferentes regiões do país,
especialmente de regiões onde há um elevado número de focos deste
mosquito como as regiões Sudeste e Centro-oeste, onde já foi comprovada a
presença da mutação Ile87,88,89. Além disso, as regiões Sudeste e Centro-oeste
do país tem influência direta na dispersão destes mosquitos entre diferentes
regiões29,30. Por isso, a região Oeste catarinense é considerada uma região
emergente para as arboviroses vinculadas pelo Aedes aegypti, sendo que nos
últimos anos ocorreu um aumento significativo no número de focos desse
vetor21. Este efeito fundador também foi observado para espécies como
Anopheles gambiae90 e Aedes albopictus91.
Mesmo com o custo evolutivo que a mutação Ile causa ao vetor 88, após
o efeito fundador a frequência deste alelo pode ter aumentado nessas duas
populações de tamanho muito reduzido i) primeiramente através dos efeitos da
deriva gênica92,93,94,95 e ii) posteriormente por uma possível pressão seletiva, já
que até meados de 2015 foram utilizados, em pontos estratégicos das cidades
de Chapecó e São Miguel do Oeste, o inseticida Alfacipermetrina que é um
composto do grupo dos piretróides (João Carlos Nascimento – Dive/SC,
Comunicação pessoal), além dos inseticidas domésticos utilizados pela própria
população, como os inseticidas de pastilhas e repelentes que utilizam
piretróides na sua composição89.
Ainda, nessas populações, os valores de HO (heterozigosidade
observada) foram inferiores aos valores de HE (heterozigosidade esperada), o
que indicam uma diminuição de heterozigotos e, consequentemente, alta
endogamia, a qual tem como efeito genético principal, o aumento no número de
homozigotos em detrimento à diminuição dos heterozigotos 96,97. Então, aliado a
um efeito fundador inicial e a uma posterior pressão seletiva nessas duas
populações, pode-se também relacionar o desvio ao HWE aos níveis
relativamente altos de endogamia detectada pelo excesso de homozigotos
nessas populações.
26
O fenômeno da resistência pode ser avaliado como um evento resultante
de um processo evolutivo acelerado onde uma população responde a uma
intensa pressão seletiva, com a consequente sobrevivência dos indivíduos que
possuem os alelos que lhe caracterizam como resistentes. Neste contexto, os
inseticidas químicos exercem pressões seletivas, e o seu uso continuado pode
selecionar os indivíduos resistentes23. Estudos que expõe larvas em contato
com inseticidas químicos, demostram que a pressão seletiva sob as larvas
promove a seleção de indivíduos resistentes, elevando a frequência dos
mosquitos resistentes após a exposição98,99,100. A identificação dessas
mutações no campo comprometem a indicação do uso de piretróides no
controle de mosquitos71,16. A frequência observada de indivíduos homozigotos
Ile/Ile na região do Oeste Catarinense acende um alerta, pois a implementação
de controles com os inseticidas sintéticos poderá aumentar a frequência deste
alelo pela seleção de populações resistentes 23,89. Porém sabe-se que este
genótipo Ile/Ile gera um custo no fitness destes indivíduos 89, e desta forma, na
ausência de inseticidas o alelo selvagem rapidamente aumentaria a sua
frequência101.
Desse modo, é recomendável que se faça o acompanhamento
continuado do fenômeno de resistência nessas populações 23,19,55,89 não só para
a mutação Val1016Ile, mas também, para outras mutações relacionadas com a
resistência às diferentes classes de inseticidas químicos. Com isto poderá ser
possível a utilização de diferentes estratégias de controle do mosquito como
uso de diferentes inseticidas23, uso de inseticidas biológicos como o BTI 56, uso
de mosquitos modificados geneticamente 57ou o uso de mosquitos infectados
com o endosimbionte Wolbachia102.
27
6 CONCLUSÕES

Foi evidenciada que 40% dos espécimes de Ae. aegypti avaliados na
mesorregião do oeste catarinense apresentam o genótipo homozigoto
Ile que confere que, sabidamente, determina um fenótipo de resistência
a inseticidas piretróides por meio do efeito kdr.

Em contrapartida, das 114 espécimes de Ae. albopictus analisadas,
todos apresentaram genótipo
homozigotos Val
evidenciando
a
susceptibilidade destes mosquitos para inseticidas do tipo piretróides,
considerando apenas estes polimorfimos avaliados.

As frequências observadas dos alelos selvagens (Val) e mutantes (Ile)
na mesorregião do Oeste de Santa Catarina foram de 0,455 e 0,545,
respectivamente, tendo nas microrregiões de Joaçaba e Concórdia as
frequências mais elevadas do alelo Ile, 0.825 e 0.685 respectivamente,
quando comparadas com as demais microrregiões. Contudo, mesmo
com esta elevada frequência, as populações de mosquitos destas
microrregiões encontram-se em equilíbrio de HW, diferentemente das
populações das outras microrregiões, onde a presença de pressões
seletivas podem ter contribuído para a perda do equilíbrio destas
populações.

Podemos observar então que fatos como efeito fundador, elevada
endogamia na população e o uso de Alfacipermetrina em alguns
municípios da região, podem ser os responsáveis pela perda do
equilíbrio de HW nesta população de mosquitos da mesorregião do
Oeste de Santa Catarina.

Já foi comprovado que a mutação Ile está relacionada à resistência a
inseticidas piretróides, e esta falta de equilíbrio genético populacional,
enfatiza-se
a
necessidade
do
monitoramento
contínuo
destas
populações quanto a resistência aos inseticidas utilizados no controle do
Aedes aegypti e de métodos alternativos de controle que não utilizem
inseticidas químicos para o controle deste vetor, desta forma,
28
minimizando a possiblidade de aumento na frequência e mosquitos
resistentes aos piretróides.
29
7
CONSIDERAÇÕES
A
RESPEITO
DA
INTERDISCIPLINARIEDADE
A interdisciplinaridade é caracterizada pela integração de diferentes
áreas do conhecimento em um mesmo contexto, em função das relações de
interdependência,
não
sendo
considerada
apenas
uma
troca
de
informações103,104. A interdisciplinaridade, não está relacionada com a simples
sobreposição de conhecimento e a anulação das especificidades, mas no
reconhecimento das limitações e potencialidades de cada uma, para que haja
uma disposição rumo a um objetivo coletivo 104.
Em biociências e saúde, pode ser entendida como uma abordagem de
diferentes situações, através da união de diferentes conhecimentos e práticas
gerando uma ação comum que valoriza o conhecimento e atribuições de cada
categoria de profissional
104
.
Sendo assim, avaliar um fenômeno com uma visão interdisciplinar,
permite que sejam desenvolvidas intervenções mais consististes, as quais
envolvam aspectos biológicos, econômicos, sociais e culturais.
Observa-se, nos últimos anos um aumento no número de focos do Ae.
aegypti e de casos de Dengue na região Oeste de Santa Catarina, sul do
Brasil, comprovando um interesse da área da saúde pública, em relação ao
estabelecimento de epidemias de Dengue e outras doenças como, Zika e
Chikungunya. Dessa forma, o monitoramento do surgimento de resistência das
populações desses insetos aos inseticidas sintéticos por meio do fenômeno de
“Knockdown resistance” (kdr) mostra-se muito relevante, pois a elevada
ocorrência de homozigotos Ile/Ile, mosquito com potencial resistente à ação
inseticida do tipo piretróide, leva aos agentes de saúde em pensar em
diferentes estratégias para o controle deste mosquito, que não o uso deste
composto. Neste sentido, o presente trabalho avaliou a frequência destes
alelos nas populações de Ae. aegypti do Oeste de Santa Catarina, abrangendo
dessa forma aspectos interdisciplinares, uma vez que abordou fatores
moleculares que podem nortear ações de controle do vetor e prevenção de
doenças que influenciam de forma direta a saúde pública.
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