1 - Introdução

CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
ÁREA DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS
Programa de Pós-Graduação em Nanociências
Márcia Ebling de Souza
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME DE NANOPARTÍCULAS DE
ÓLEO DE Melaleuca alternifolia
Santa Maria, RS
2014
1
Márcia Ebling de Souza
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ANTIBIOFILME DE NANOPARTÍCULAS DE
ÓLEO DE Melaleuca alternifolia
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Nanociências do Centro
Universitário Franciscano de Santa MariaRS como requisito parcial para obtenção do
título de Mestre em Nanociências.
Orientador: Prof. Dr. Roberto Christ Vianna Santos
Co-orientador: Prof. Dr. Rodrigo de Almeida Vaucher
Santa Maria, RS
2014
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"Mesmo que o futuro lhe pareça distante ele está começando neste exato momento."
Mattie
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AGRADECIMENTOS
Inicialmente agradeço a Deus, já que ele colocou pessoas tão especiais a meu lado, sem as
quais certamente não teria dado conta!
A primeira, dessas pessoas, e alvo de meu primeiro, maior e mais sincero agradecimento, o
principal responsável pela execução deste trabalho, Professor Roberto, meu orientador desde a
graduação, época que me oportunizou descobrir o grande profissional e ser humano que é,
conquistando a minha admiração. Obrigada pela amizade, confiança e suporte em todas as
etapas envolvidas na conquista deste mestrado.
Ao meu co-orientador Professor Rodrigo, obrigada pelas valiosas contribuições ao trabalho.
Ao professor Diego Stéfani, o meu muito obrigada pelo aceite em compor esta banca de
Mestrado pois certamente seu conhecimento contribuirá muito. Agradeço também pela
parceria e hospitalidade no CNPEM e na UNICAMP.
A professora Virginia Rech, pela amizade e colaboração em muitos momentos ao longo deste
caminho. Obrigada por aceitar fazer parte desta banca.
A professora Michele Sagrillo e seu grupo de pesquisa, obrigada pelas contribuições.
Agradeço aos demais professores do Programa de Pós- Graduação em Nanociências pela
contribuição prestada não só durante as disciplinas, mas em vários momentos do curso. Um
agradecimento especial a Ivana Zanella, Luiz Bulhões e Renata Raffin que tiveram papel
importante para a finalização deste trabalho.
A todos os colegas do programa, pelo envolvimento, comentários, e os momentos de café, tão
importantes nessa jornada.
E, dentre os colegas, alguns se tornaram amigos. Obrigada, Nathana Mezzomo, Claudia Turra
pelos estudos, trabalhos e seminários, pelas conversas jogadas fora nas horas mais
necessárias...
Agradeço ao nosso Grupo de pesquisa, em especial ao Leonardo Lopes, pela amizade e
colaboração no meu trabalho.
Ao Programa de Pós Graduação em Nanociências e ao Centro Universitário Franciscano,
como instituição, que sempre me apoiou, tanto como aluno nesse e em outros cursos. Estendo
os agradecimentos às pessoas nos cargos de direção e coordenação, que, em algum momento,
prestaram algum tipo de apoio. Agradeço, também, à CAPES pelo apoio financeiro.
A todos os meus amigos e familiares pelo carinho, momentos de descontração e incentivo ao
longo da realização deste trabalho.
Aos meus irmãos, Marcos e Vinícius obrigada pela compreensão, apoio e por tornarem nossa
casa um ambiente tão alegre e divertido. Amo vocês!
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As minhas quase irmãs Luana e Sinara o meu muito obrigada, pelos momentos de riso, pelo
incentivo por sempre acreditarem em mim quando eu mesma não acredito! A minha querida
Vó Branca, pelas orações...
Por último um agradecimento especial a meus pais, por serem modelos de coragem, pelo seu
apoio incondicional, incentivo, amizade e paciência demonstrados e total ajuda na superação
dos obstáculos que ao longo desta caminhada foram surgindo. A eles dedico este trabalho!
Ninguém vence sozinho...
OBRIGADA A TODOS!
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RESUMO
As infecções causadas por espécies de Candida são importante causa de morbi-mortalidade em pacientes
imunodeprimidos. Esta tendência crescente tem sido associada a resistência a terapia antimicrobiana e a
capacidade do microrganismo em formar biofilmes. O óleo de Melaleuca alternifolia é um fitoterápico
tradicionalmente utilizado como antimicrobiano, que apresenta atividade em biofilmes formados por espécies de
Candida. O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade antimicrobiana e antibiofilme de
nanopartículas e do óleo essencial de M. alternifolia. Foi realizada a caracterização do óleo e das nanopartículas
de M. alternifólia A atividade antimicrobiana foi determinada através da técnica de microdiluição. Foi verificada
a capacidade de formação de biofilmes em diferentes concentrações de glicose e mensurados os níveis de
exopolissacarídeos e proteínas nos biofilmes formados. A análise qualitativa dos biofilmes foi realizada através
da coloração de Calcoflúor Branco. Foi avaliada a citotoxicidade do óleo e das nanopartículas. O perfil
cromatográfico demonstrou que óleo de M. alternifolia está de acordo com a ISO 4730 com os constituintes
majoritários, 41,9% de Terpinen-4-ol, 20,1% de γ-Terpineno, 9,8% de α-Terpineno e 6,0% de 1,8-Cineol. As
nanopartículas de óleo de M. alternifolia apresentaram pH de 6,3, diâmetro de partícula de 158,2 ± 2 nm, índice
de polidispersão de 0,213 ± 0,017 e potencial zeta de -8,69 ± 0,80 mV. O óleo e as nanopartículas de M.
alternifolia apresentaram atividade antimicrobiana frente a maioria dos microrganismos avalidados. Os
microrganismos que apresentaram uma maior capacidade na formação de biofilmes foram C. albicans, C.
tropicalis, C. membranafaciens, C. parapsilosis e C. glabrata na concentração de 1% de glicose. A
administração de óleo ou as nanopartículas de óleo de M. alternifolia representou uma redução significativa do
biofilme formado por todas as espécies de Candida utilizadas, bem como uma redução nos níveis de proteínas e
exopolissacarídeos dos biofilmes. Foi possível visualizar a redução do biofilme na presença das nanopartículas
de M. alternifolia com a coloração Calcofluor Branco. O óleo e as nanopartículas de M. alternifolia
apresentaram caráter citotóxicos em todas as concentrações avaliadas. Com o aumento na concentração de soro
fetal bovino do meio, ocorre uma inibição do efeito tóxico das nanopartículas. Provavelmente há o envolvimento
do efeito proteína-corona na citotoxicidade das nanopartículas.
Palavras- chave: Candida. Resistência. Alternativa terapêutica. Nanotecnologia. Árvore do Chá.
ABSTRACT
Infections caused by Candida species are an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised
patients. This growing trend has been linked to resistance to antimicrobial therapy and the ability of the organism
to form biofilms. Melaleuca alternifolia oil is traditionally used as an herbal antimicrobial that shows activity in
biofilms formed by Candida species. The present study aimed to evaluate the antimicrobial and antibiofilm
activity nanoparticles and the essential oil of M. alternifolia. Oil and characterization of nanoparticles M.
alternifolia. Antimicrobial activity was determined by the microdilution technique was performed. The ability to
form biofilms at different glucose concentrations and measured the levels of exopolysaccharides and proteins in
the biofilms was verified. The qualitative analysis of biofilms was performed by staining of Calcofluor White.
The cytotoxicity of nanoparticles and the oil was assessed. The chromatographic profile showed that M.
alternifolia oil conforms with ISO 4730 with the main constituents, 41.9% of Terpinen-4-ol, 20.1% of γterpinene, 9.8% of α-terpinene and 6.0% of 1.8-Cineol. Nanoparticles M. alternifolia oil had a pH of 6.3, particle
diameter of 158.2 ± 2 nm, polydispersity 0.213 ± 0.017 and zeta potential of -8.69 ± 0.80 mV. The oil and
nanoparticles M. alternifolia showed antimicrobial activity against most microorganisms evaluated.
Microorganisms that showed an increased capacity to form biofilms were C. albicans, C. tropicalis, C.
membranafaciens, C. parapsilosis and C. glabrata at a concentration of 1% glucose. Administration of oil or
nanoparticles of M. alternifolia oil represented a significant reduction of biofilm formed by all Candida species
used, as well as a reduction in protein levels and exopolysaccharide biofilms. Was possible to visualize the
reduction of biofilm in the presence of nanoparticles of M. alternifolia with Calcofluor White staining. The oil
and nanoparticles M. alternifolia showed cytotoxic character at all concentrations evaluated. With the increase in
the concentration of fetal calf serum medium, an inhibition of the toxic effect of the nanoparticles occurs. There
are probably involved in protein-corona effect on the cytotoxicity of nanoparticles.
Key word: Candida. Resistance. Alternative therapy. Nanotechnology. Tea Tree.
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Proporções relativas dos constituintes do óleo essencial de M. alternifolia foram
expressos em porcentagem. Tr - traços. IRE - índices de retenção experimental (com base na
série homóloga de n-alcanos C7-C30). IRL - índices de retenção da literatura (Adams, 1995).
ISO 4730 ................................................................................................................................... 37
Tabela 2- Valores de pH, tamanho de partícula, índice de polidispersão (IPD) e potencial zeta
das nanopartículas contendo óleo de M. alternifolia. ............................................................... 39
Tabela 3- Concentração inibitória mínima do óleo de M. alternifolia e das nanopartículas. .. 40
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Melaleuca alternifolia. Fonte: http://australianseed.com/shop/item/melaleucaalternifolia. ................................................................................................................................ 21
Figura 2- Processo de formação de biofilme. 1) Fixação à superfície da célula ou substrato. 2)
Fase de adesão e produção de Exopolissacarídeos (EPS). Em seguida, demonstrado nas
etapas: 3-4.) A arquitetura do biofilme se desenvolve. 5) Chega a uma massa crítica e ocorre
a liberação de células e/ou fragmentos do biofilme que podem colonizar/infectar outro local.
Fonte: http://prometheus.matse.illinois.edu/glossary/biofilms. ................................................ 27
Figura 3- Perfil cromatográfico do óleo essencial de M. alternifolia por Cromatografia
Gasosa (CG). Proporções relativas dos constituintes do óleo essencial foram expressos em
porcentagem. Os números 1-15 representam os compostos majoritários listados na Tabela 1.
.................................................................................................................................................. 38
Figura 4- Diâmetro de partícula a partir da Análise de rastreamento de nanopatículas. (A) Um
quadro de vídeo usada para determinar o tamanho da partícula medido. As posições das
partículas individuais são claramente identificados como ponto como objetos no quadro. (B)
Distribuição de tamanho determinado. ..................................................................................... 39
Figura 5- Determinação da influência de glicose na formação de biofilmes de 24 horas. D.O.
- Densidade óptica de 492nm. NP - Não produtor de Biofilme. FP – Fracamente Produtor. MP
– Moderadamente Produtor. FTP- Fortemente Produtor (KREPSKY et al, 2003). ................. 42
Figura 6- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia
(B) sobre a formação de biofilme de C. albicans. A formação de biofilme foi avaliada pela
técnica colorimétrica utilizando cristal violeta. Os resultados são expressos como absorbância
em 492nm. (Média ± Erro padrão da média). D.O. – Densidade ótica. CN- Controle Negativo.
C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b Diferença significativa com relação ao controle positivo. ....................................................... 43
Figura 7- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia
(B) sobre a formação de biofilme de C. tropicalis. A formação de biofilme foi avaliada pela
técnica colorimétrica utilizando cristal violeta. Os resultados são expressos como absorbância
em 492nm. (Média ± Erro padrão da média). D.O. – Densidade ótica. CN- Controle Negativo.
C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b Diferença significativa com relação ao controle positivo. ....................................................... 44
Figura 8- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia
(B) sobre a formação de biofilme de C. membranafaciens. A formação de biofilme foi
avaliada pela técnica colorimétrica utilizando cristal violeta. Os resultados são expressos
como absorbância em 492nm. (Média ± Erro padrão da média). D.O. – Densidade ótica. CNControle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle
negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo. .................................. 44
10
Figura 9- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia
(B) sobre a formação de biofilme de C. parapsilosis. A formação de biofilme foi avaliada pela
técnica colorimétrica utilizando cristal violeta. Os resultados são expressos como percentagem
de inibição do biofilme em relação ao controle não tratado. Os valores são expressos como
absorbância em 492nm. (Média ± Erro padrão da média). D.O. – Densidade ótica. CNControle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle
negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo. .................................. 45
Figura 10- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M.
alternifolia (B) sobre a formação de biofilme de C. glabrata. A formação de biofilme foi
avaliada pela técnica colorimétrica utilizando cristal violeta. Os resultados são expressos
como percentagem de inibição do biofilme em relação ao controle não tratado. Os valores são
expressos como absorbância em 492nm. (Média ± Erro padrão da média). D.O. – Densidade
ótica. CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação
ao controle negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo. ............... 46
Figura 11- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por
Bradford, (1976) em biofilmes formados de C. albicans. Os resultados são expressos em
µg/mL de proteínas (média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle
Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b - Diferença
significativa com relação ao controle positivo. ........................................................................ 47
Figura 12- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por
Bradford, (1976) em biofilmes formados de C. tropicalis. Os resultados são expressos em
µg/mL de proteínas (média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle
Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b - Diferença
significativa com relação ao controle positivo. ........................................................................ 48
Figura 13- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por
Bradford, (1976) em biofilmes formados de C. membranafaciens. Os resultados são expressos
em µg/mL de proteínas (média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b- Diferença
significativa com relação ao controle positivo. ........................................................................ 48
Figura 14- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por
Bradford, (1976) em biofilmes formados de C. parapsilosis. Os resultados são expressos em
µg/mL de proteínas (média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle
Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b - Diferença
significativa com relação ao controle positivo. ........................................................................ 49
Figura 15- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por
Bradford, (1976) em biofilmes formados de C. glabrata. Os resultados são expressos em
µg/mL de proteínas (média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo. Controle
Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b - Diferença
significativa com relação ao controle positivo. ........................................................................ 49
11
Figura 16- A Determinação de exopolissacarídeos (EPS) no biofilme formado por C.
albicans foi realizada através da técnica de Lawrence e Betty (1989). Os resultados são
expressos em absorbância a 500nm (média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo.
C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b Diferença significativa com relação ao controle positivo. ....................................................... 50
Figura 17- A Determinação de EPS no biofilme formado por C. tropicalis foi realizada
através da técnica de Lawrence e Betty (1989). Os resultados são expressos em absorbância a
500nm (média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a Diferença significativa com relação ao controle negativo. b - Diferença significativa com
relação ao controle positivo. ..................................................................................................... 51
Figura 18-A Determinação de EPS no biofilme formado por C. membranafaciens foi
realizada através da técnica de Lawrence e Betty (1989). Os resultados são expressos em
absorbância a 500nm (média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle
Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b - Diferença
significativa com relação ao controle positivo. ........................................................................ 51
Figura 19-A Determinação de EPS no biofilme formado por C. parapsilosis foi realizada
através da técnica de Lawrence e Betty (1989). Os resultados são expressos em absorbância a
500nm (média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a Diferença significativa com relação ao controle negativo. b - Diferença significativa com
relação ao controle positivo. ..................................................................................................... 52
Figura 20-A Determinação de EPS no biofilme formado por C. glabrata foi realizada através
da técnica de Lawrence e Betty (1989). Os resultados são expressos em absorbância a 500nm
(média ± erro padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a Diferença significativa com relação ao controle negativo. b - Diferença significativa com
relação ao controle positivo. ..................................................................................................... 52
Figura 21- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As
imagens foram obtidas através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle
negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle positivo: Meio de cultivo + C. albicans. C –
Meio de cultivo + C. albicans + 15,6% de nanopartículas de M. alternifolia. D - Meio de
cultivo + C. albicans + 31,2% de nanopartículas de M. alternifolia. ....................................... 53
Figura 22- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As
imagens foram obtidas através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle
negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle positivo: Meio de cultivo + C. tropicalis. C –
Meio de cultivo + C. tropicalis + 15,6% de nanopartículas de M. alternifolia. D - Meio de
cultivo + C. tropicalis + 31,2% de nanopartículas de M. alternifolia. ..................................... 54
Figura 23- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As
imagens foram obtidas através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle
negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle positivo: Meio de cultivo + C.
membranafaciens. C – Meio de cultivo + C. membranafaciens + 15,6% de nanopartículas de
12
M. alternifolia. D - Meio de cultivo + C membranafaciens + 31,2% de nanopartículas de M.
alternifolia. ............................................................................................................................... 54
Figura 24- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As
imagens foram obtidas através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle
negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle positivo: Meio de cultivo + C. parapsilosis.
C – Meio de cultivo + C. parapsilosis + 15,6% de nanopartículas de M. alternifolia. D Meio de cultivo + C. parapsilosis + 31,2% de nanopartículas de M. alternifolia................... 55
Figura 25- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As
imagens foram obtidas através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle
negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle positivo: Meio de cultivo + C. glabrata. C –
Meio de cultivo + C. glabrata + 15,6% de nanopartículas de M. alternifolia. D - Meio de
cultivo + C. glabrata + 31,2% de nanopartículas de M. alternifolia........................................ 55
Figura 26- Citotoxicidade do óleo de M. alternifolia (A) e das Nanopartículas de M.
alternifolia (B) após 72 horas, através da técnica de MTT. A análise estatística foi realizada
por ONE- way ANOVA seguido de teste de Dunnett.*Indica diferença significativa em
comparação com o controle (p <0,001). PHA- Fitohemaglutinina. Os valores são apresentados
como média ± erro padrão da média. ....................................................................................... 56
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 15
1.1 JUSTIFICATIVA ........................................................................................................... 16
2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 17
2.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................... 17
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 17
3 INTERDISCIPLINARIDADE ........................................................................................... 19
4 REFERENCIAL TEÓRICO .............................................................................................. 20
4.1 FITOTERÁPICOS .......................................................................................................... 20
4.2 M. alternifolia ................................................................................................................. 21
4.3 GÊNERO Candida ......................................................................................................... 22
4.4 GÊNERO Mycobacterium .............................................................................................. 24
4.5 OUTROS GÊNEROS ..................................................................................................... 24
4.6 BIOFILMES ................................................................................................................... 26
4.7 NANOTECNOLOGIA ................................................................................................... 27
5 METODOLOGIA................................................................................................................ 30
5.1 ÓLEO E SUSPENSÕES DE NANOPARTÍCULAS CONTENDO ÓLEO ESSENCIAL
DE M. alternifolia ................................................................................................................. 30
5.1.1 Caracterização Físico-Química das suspensões de nanopartículas de óleo de M.
alternifolia. ........................................................................................................................ 30
5.1.1.1 Determinação do diâmetro de partícula e índice de polidispersão. ....................... 30
5.1.1.2 Potencial zeta......................................................................................................... 31
5.1.1.3 Determinação do pH.............................................................................................. 31
5.1.1.4 Análise de rastreamento Nanopartículas ............................................................... 31
5.1.2 Caracterização do óleo de M. alternifolia ................................................................ 31
5.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA .............................................................................. 32
5.2.1 Teste de suscetibilidade frente ao gênero Candida .................................................. 32
5.2.2 Teste de suscetibilidade frente ao gênero Mycobacterium....................................... 32
5.2.3 Teste de suscetibilidade frente a outros gêneros ...................................................... 33
14
5.3 ENSAIO DE FORMAÇÃO DE BIOFILMES ............................................................... 33
5.4 ENSAIO DE QUANTIFICAÇÃO DE EXOPOLISSACARÍDEOS (EPS) ................... 34
5.5 ENSAIO DE DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA. .................... 35
5.6 ANÁLISE QUALITATIVA DO BIOFILME FORMADO - COLORAÇÃO DE
CALCOFLUOR BRANCO .................................................................................................. 35
5.6.1 Revelação do biofilme .............................................................................................. 35
5.7 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE ................................................................................ 36
5.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................................. 36
6.RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 37
6.1 CARACTERIZAÇÃO DO ÓLEO DE M. alternifolia ................................................... 37
6.2 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DO ÓLEO DE M. alternifolia. .... 38
6.2.1 Análise de rastreamento das nanopartículas de M. alternifolia ................................... 39
6.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA ............................................... 39
6.4 DETERMINAÇÃO DA INFLUÊNCIA DE CARBOIDRATOS NA FORMAÇÃO DO
BIOFILME DE Candida. ..................................................................................................... 41
6.5 QUANTIFICAÇÃO DO BIOFILME FORMADO ATRAVÉS DA TÉCNICA DO
CRISTAL VIOLETA ........................................................................................................... 42
6.6 ENSAIO DE DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA DO
BIOFILME. ........................................................................................................................... 47
6.7 ENSAIO DE DETERMINAÇÃO DE EPS NO BIOFILME FORMADO..................... 50
6.8 COLORAÇÃO DO BIOFILME ATRAVÉS DO CALCOFLUOR BRANCO. ............ 52
6.9.1 MTT ......................................................................................................................... 56
6.9.2 Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) .................................................. 57
6.9.3 Ensaio de viabilidade celular - MTT ........................................................................ 58
7 CONCLUSÃO...................................................................................................................... 59
8 ANEXOS .............................................................................................................................. 60
8.1 Publicações decorrentes da dissertação .......................................................................... 60
8.1.1 Aceite do manuscrito no Periódico Journal of Drug Delivery Science and
Technology. ....................................................................................................................... 60
8.1.2 Manuscrito aceito para publicação no periódico Fungal Genomics and Biology ... 61
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 63
15
1 INTRODUÇÃO
De acordo com o Ministério da Saúde mais de 70% dos microrganismos que causam
infecções hospitalares no Brasil, são resistentes a pelo menos um agente antimicrobiano e
cerca de 80% de todas as infecções microbianas em humanos estão relacionadas a biofilmes
(RICHARDS et al, 2008). Com o aumento da expectativa da população, há uma necessidade
de recorrer a dispositivos biomédicos como cateteres e próteses de válvulas cardíacas e
articulares, para proporcionar uma melhor qualidade de vida a muitos pacientes. No entanto, o
uso destes dispositivos aumentam a incidência das infecções bacterianas e fúngicas, diversas
espécies de Candida são encontradas com frequência aderidas à superfície destes materiais
(ALMIRANTE et al, 2006; LOCKHART et al, 2008).
A estrutura do biofilme, assim como certos mecanismos de comunicação entre
microrganismos e a sua alteração fenotípica, são fatores que inibem a penetração dos
antimicrobianos, tornando o tratamento ineficaz. Devido a esses fatos, algumas infecções
somente são tratadas de maneira eficiente após a retirada do implante, acarretando não só um
alto custo, como também em um trauma físico e emocional ao paciente (HOEFLER et al,
2006).
Ao longo do processo evolutivo, o homem aprendeu a selecionar plantas para a sua
alimentação, alívio dos seus males e doenças. Como resultado desse processo, muitos povos
começaram a dominar o conhecimento de ervas e plantas medicinais. Segundo a Organização
Mundial de Saúde (OMS), estima-se que 80% da população mundial, de algum modo, utiliza
plantas medicinais (GURIB-FAKIM, 2006; GURSOY et al, 2009). Neste contexto, o óleo de
Melaleuca alternifolia é um fitoterápico tradicionalmente utilizado como cicatrizante,
antimicrobiano e anti-inflamatório. Apresenta ação antisséptica, amplamente utilizado em
ferimentos, queimaduras e diversos processos infecciosos. Vários estudos in vitro indicam
que o óleo de M. alternifolia é um potente antimicrobiano frente a uma gama bastante grande
de microrganismos, incluindo bactérias, fungos, vírus e parasitas (CARSON et al, 1995;
HARKENTHAL et al, 1999).
O óleo de M. alternifolia apresenta alguns problemas relacionados as suas
propriedades físicas, como a miscibilidade em água e volatilização, resultando em baixa
estabilidade. Além disto o óleo é capaz de induzir reações alérgicas quando aplicados por via
tópica, devido à oxidação dos constituintes do óleo, de acordo com as condições de
16
armazenamento (CARSON et al, 1998; CARSON et al, 2006). Neste sentido, a
nanoestruturação de alguns produtos de origem natural resultam em uma maior eficácia
terapêutica, com liberação progressiva e controlada, diminuição significativa da toxicidade,
maior tempo de permanência na circulação, proteção contra mecanismos de instabilidade e
decomposição do fármaco (RUKHOLM et al, 2006; CHINOU et al, 2009; FLORES et al,
2011; HARPREET et al, 2011).
1.1 JUSTIFICATIVA
Os biofilmes são causas de altas taxas de mortalidade, aumentam o tempo de
internação, resultando em altos custos, esses chegando a 1 bilhão de dólares por ano nos EUA
(DAVEY e O’TOOLE, 2000). A nanotecnologia apresenta um grande número de vantagens,
especialmente no desenvolvimento de carreadores de fármacos, que a partir destas ocorre uma
liberação controlada. O fato da nanopartícula apresentar um tamanho bastante reduzido pode
facilitar a entrada do óleo na matriz polimérica do biofilme e também pode aumentar a
potência antimicrobiana do óleo de M. alternifolia. Considerando que existem vários relatos
na literatura do efeito antimicrobiano do óleo de M. alternifolia, no presente estudo se propôs
avaliar a atividade antimicrobiana e antibiofilme de nanopartículas deste óleo. Os modelos
experimentais utilizados para o estudo de biofilmes, contribuem para um melhor
entendimento da evolução processos infecciosos. Neste projeto, foi estabelecido um modelo
experimental de formação de biofilmes com diferentes espécies do gênero Candida onde
foram analisadas as etapas desta formação e o papel desempenhado pelo óleo e suas
nanopartículas, através da determinação do tamanho do biofilme, mensuração dos níveis de
exopolissacarídeo e proteínas, além da toxicidade em células mononucleares.
17
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a atividade antimicrobiana e antibiofilme in vitro de nanopartículas de óleo essencial
de M. alternifolia.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar a composição percentual do óleo essencial de M. alternifolia, através de
Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrofotometria de massas (CG-MS);
- Caracterizar as nanopartículas de óleo de M. alternifolia, através da determinação do
diâmetro de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta e determinação do pH;
- Avaliar a atividade antimicrobiana das nanopartículas de M. alternifolia em cepas de
Mycobacterium smegmatis, M. fortuitum, M. abscessus, M. massiliense, M. tuberculosis, M.
avium, M. bovis, Candida parapsilosis, C. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis, C.
glabrata, C. glabrata resistente ao fluconazol, Fusarium oxysporum, Alternaria alternata,
Trichophyton rubrum, e Fonsecaea pedrosoi através da técnica de microdiluição;
- Verificar a capacidade de formação de biofilmes de cepas padrão American Type Culture
Collection (ATCC) de C. albicans, C. geochares, C. glabrata, C. parapilosis, C. tropicalis, C.
membranaefaciens, C. kefyr, C. guilliermondii através da técnica de formação de biofilmes
em placas de poliestireno de 96 poços;
- Determinar a influência de carboidratos na formação do biofilme através da adição de
concentrações de 0 a 3% de glicose;
- Mensurar os níveis de proteínas no biofilme formado através do método de Bradford (1976);
- Mensurar os níveis de exopolissacarídeos (EPS) nos diferentes biofilmes formados através
do método espectrofotométrico proposto por Lawrence e Betty (1989);
- Analisar qualitativamente o biofilme formado através da coloração de Calcofluor Branco;
- Analisar a ação do óleo de M. alternifolia e das nanopartículas sobre os biofilmes formados
através da análise dos parâmetros supracitados;
18
- Determinar a citotoxicidade do óleo e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia em
cultura de células mononucleares de sangue periférico através da técnica de MTT;
- Comparar os resultados obtidos através de análise estatística adequada.
19
3 INTERDISCIPLINARIDADE
A essência da nanotecnologia consiste na produção, caracterização e aplicação de
novas estruturas, equipamentos e sistemas através do controle e da forma e do tamanho em
escala nanométrica. Ao contrário das demais tecnologias e ciências existentes, que utilizam
disciplinas específicas, a nanotecnologia é inter e multidisciplinar, devido a sua complexidade
e abrangência (BETTY et al, 2010). Para que ocorra o desenvolvimento de novas fórmulas,
avaliação de suas propriedades e para a análise dos resultados é necessário a união dos
diferentes domínios da ciência como a Biologia, Física, Matemática, Química e Sistemas de
computação. A nanotecnologia é considerada um importante recurso da indústria farmacêutica
no desenvolvimento de novas formulações com uma melhor capacidade de encapsulação,
onde os fármacos são entregues no local apropriado e permanecem por longos períodos no
organismo (PUTHETI et al, 2008). Deste modo, entende-se que este trabalho pôde ser
desenvolvido devido ao caráter interdisciplinar do Programa de Pós-Graduação em
Nanociências, pois abrange conhecimentos específicos de várias áreas.
20
4 REFERENCIAL TEÓRICO
4.1 FITOTERÁPICOS
As plantas medicinais vêm sendo utilizadas pelo homem ao longo de toda a história da
humanidade pela própria necessidade humana, uma vez que as plantas foram os primeiros
recursos terapêuticos utilizados no tratamento e cura de enfermidades. As antigas civilizações
utilizavam as plantas medicinais muito antes de aparecer qualquer forma de escrita, algumas
como alimentos e outras como medicamentos (DORTA, 1998). Nas antigas civilizações, os
primeiros registros datam de 1500 a.C. quando foi escrito o manuscrito egípcio “Papiro de
Ebers”, considerado um dos mais importantes livros da cultura médica. Neste livro foram
citados cerca de 700 tratamentos diferentes, incluindo extratos de plantas, metais (como cobre
e chumbo) e venenos de animais. A partir deste manuscrito o velho mundo tomou ciência de
uma Farmacopéia egípcia contendo diversas espécies vegetais, algumas delas utilizadas por
fitoterapeutas até hoje (ALMEIDA, 1993; ELDIN e DUNFORD, 2001).
Quando o Brasil foi descoberto, as plantas medicinais já eram utilizadas pelos índios
no tratamento de enfermidades. Nas tribos indígenas os Pajés passavam o conhecimento a
cada geração. Os escravos africanos também contribuíram, através de plantas utilizadas em
rituais religiosos, conhecidas por suas propriedades farmacológicas (TOMAZZONI et al,
2006). O termo Fitoterapia, tem origem grega fhtoi (plantas) e qerapa (tratamento), ou seja,
tratamento por meio de plantas (GUYOT, 1990). O conhecimento popular trouxe grande
contribuição para divulgação do uso de plantas no tratamento de doenças. A utilização desses
recursos terapêuticos pela medicina popular ocorre de forma contínua há décadas e tem
aumentado o interesse por fármacos alternativos, na maior parte deles proveniente de extratos
naturais, desencadeando busca pela validação do uso desses produtos, visto os efeitos
terapêuticos favoráveis in vitro e in vivo (CARSON et al, 2006b).
As plantas medicinais são utilizadas como principal opção terapêutica por grande parte
da população. Os fármacos desenvolvidos a partir de produtos naturais e seus derivados
representam mais de 50% dos medicamentos em uso clínico em todo o mundo. Atualmente o
homem ainda busca soluções para várias enfermidades humanas e possivelmente as plantas
poderão contribuir de maneira significativa para solucioná-las (PINTO, 2002; NEWMAN et
al, 2003).
21
4.2 M. alternifolia
A M. alternifolia (Figura 1) é nativa da Austrália e também é conhecida como árvoreTi, Tea Tree, ou Árvore-do-chá. Forma um arbusto que pode crescer até 5 metros de altura em
regiões pantanosas e próximas a rios. Suas folhas são afiladas de aproximadamente 2 cm de
comprimento (RIEDL, 1997). Devido as suas propriedades curativas a M. alternifolia é
utilizada há milhares de anos por aborígenes Australianos. Existem relatos de histórias sobre
uma “lagoa mágica” com poderes medicinais, onde os aborígenes se banhavam para curar
feridas e afecções. Contudo se tratava de uma lagoa onde caiam as folhas de M. alternifolia
(ALTMAN, 1988).
A partir das folhas de M. alternifolia é extraído o óleo essencial também chamado de
Tea tree oil. O óleo é extraído por hidrodestilação ou destilação por arraste de vapor. Este
óleo possui cerca de 100 compostos ativos diferentes. Os principais constituintes são:
terpinen-4-ol, 1,8-cineol, α-terpineno, γ-terpineno, α-pineno, β-pineno, α-terpineol, p-cimeno
e álcoois sesquiterpênicos. Tanto a farmacopéia, quanto a ISO4730 exigem que o óleo deva
ser obtido por destilação a vapor e apresente um teor mínimo de 30% de terpinen-4-ol e um
teor máximo de 15% de 1,8-cineol (COX, MANN e MARKHAM 2001;CARSON, 2006b ;
BAKKALI, et al, 2008).
Figura 1- Melaleuca alternifolia. Fonte: http://australianseed.com/shop/item/melaleuca-alternifolia.
Em 1920, Penfold e Grant relataram pela primeira vez as propriedades medicinais do
óleo e desde então ele passou a ser produzido em escala industrial e comercializado para
atender as demandas crescentes do mercado. Dentro de suas propriedades destacam-se as
22
atividades antissépticas, antibacteriana, antifúngica, antiviral e anti-inflamatória (CARSON e
RILEY, 1993). O terpinen-4-ol é o principal componente responsável por suas propriedades
medicinais, principalmente as antibacterianas. Sua ação antibacteriana abrange tanto as
espécies Gram positivas, quanto Gram negativas. Seu mecanismo de ação consiste no
comprometimento da integridade da membrana celular, ocorrendo assim uma perda de
material intracelular, incapacitando células microbianas de manter a homeostase. Ele também
atua na inibição da respiração celular. Apesar do óleo de M. alternifolia possuir vários
componentes ativos, diversos destes elementos ainda não foram avaliados quanto a sua
atividade antimicrobiana, sendo então possível de que muitos destes componentes contribuam
para a atividade antimicrobiana com um mecanismo de ação distinto dos descritos até o
momento (CARSON et al, 2006a; BAKKALI, 2008).
Alguns trabalhos relatam que o óleo essencial de M. alternifolia apresenta atividade
antimicrobiana contra vários patógenos como Staphylococcus aureus (incluindo S. aureus
resistente a meticilina - MRSA), C. albicans, Salmonella typhimurium e Trichophyton sp.
Uma pesquisa realizada por Mondello, em 2003, analisou a atividade in vitro do óleo de M.
alternifolia em diferentes isolados de C. albicans e outras espécies de Candida. Todos os
isolados testados foram sensíveis ao óleo, incluindo aqueles resistentes ao fluconazol e
itraconazol.
Há relatos ainda de que o óleo inibe a capacidade de formação de tubos
germinativos, o que é visto como um fator principal à sobrevivência e reprodução fúngica.
Há então uma dificuldade na interação do fungo com as células do hospedeiro, inibindo a
aderência e consequentemente a penetração nos tecidos (ROBERT, 2000; D'AURIA et al,
2001; MCMAHON et al, 2007; RIBEIRO et al, 2010).
4.3 GÊNERO Candida
A Candida pertence ao Reino Fungi, divisão Fungi Imperfecta, classe dos
Blastomicetos, família Cryptococcaceae. O gênero Candida foi descrito pela primeira vez em
1923 por Berkhout e alguns anos depois já foram relatadas espécies de importância clínica
tais como, C. albicans, C. krusei, C. tropicalis, C. kefyr e C. parapsilosis. As espécies do
gênero Candida podem ser consideradas comensais, pois fazem parte da microbiota normal de
indivíduos sadios. Normalmente são encontrados na cavidade bucal, trato digestivo e genitourinário. No entanto quando ocorrem alterações nos mecanismos de defesa do hospedeiro ou
nas barreiras anatômicas secundariamente a queimaduras ou procedimentos médicos
23
invasivos ocorre uma transição da fase comensal para a patogênica, provocando, na maioria
dos casos, um processo infeccioso (SAMARANAYAKE, 2001; BARNETT, 2008).
A C. albicans é considerada um fungo dimórfico que pode se apresentar como
leveduras esféricas ou na forma alongada denominadas hifas. Nos estágios iniciais da
infecção, a formação de hifas pode promover a aderência e a penetração do fungo nos tecidos
do hospedeiro. A capacidade de adesão é a primeira etapa que evidencia o desenvolvimento
do processo infeccioso provocado pelo fungo. Quando coloniza superfícies epiteliais, a C.
albicans encontra-se na forma leveduriforme (SWEET, 1997; JÄRVENSIVU et al, 2004).
As infecções causadas por leveduras do gênero Candida têm grande importância pela
alta frequência com que infectam e colonizam o hospedeiro, representando uma ameaça
crescente para a saúde humana. A incidência de infecções por estes microrganismos aumentou
significativamente durante os últimos 20 anos, especialmente após o advento da Síndrome da
Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Existem ainda outros fatores que pré-determinam a
infecção por Candida como uso de próteses, cateteres, tubos endotraqueais e marcapassos.
Possui a maior taxa bruta de mortalidade dentre as infecções relacionadas ao cateter vascular,
pois esses dispositivos facilitam a colonização desses microrganismos permitindo a formação
de biofilmes (BECK-SAGUE E JARVIS, 1993; WINGETER et al, 2007).
A C. albicans é a espécie de maior prevalência em infecções, representando mais de
80% dos isolados. A capacidade de C. albicans em causar infecções está correlacionada como
os níveis de imunossupressão do hospedeiro e devido a expressão de fatores de virulência
pelo fungo, como aderência as células do hospedeiro, hidrofobicidade celular, a formação de
tubos germinativos e hifas, secreção de proteinases e fosfolipases, além da capacidade de
formação de biofilmes. Esses aspectos em conjunto, têm como consequência um grande
impacto clínico e econômico (POMARICO et al, 2009; ELLEPOLA, SAMARANAYAKE,
2000; AKPAN e MORGAN, 2002;).
Atualmente outras espécies do gênero Candida também estão sendo relatadas
frequentemente tais como a C. guilliermondii, C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C.
glabrata, C. dubliniensis e C. kefyr. O aumento na prevalência de infecções causadas por
espécies de Candida não-albicans é preocupante, na medida em que essas espécies são mais
resistentes aos agentes antifúngicos comumente utilizados (MENEZES et al, 2004, LI et al,
2007).
24
4.4 GÊNERO Mycobacterium
As micobactérias podem ser parasitas obrigatórios, saprófitos ou oportunistas,
possuem vida livre no solo ou na água, mas para muitas espécies o habitat preferencial são os
tecidos de hospedeiros homeotérmicos. O gênero Mycobacterium é composto por mais de
uma centena de espécies e compreendem bacilos finos aeróbios, de crescimento lento e não
formadores de esporos (SHINNICK e GOOD, 1994; SOUSA et al, 2000).
As micobactérias apresentam diferenças de outras bactérias em um grande número de
propriedades, sendo a principal delas a composição e a estrutura do invólucro celular. A
composição química e estrutura complexa da parede celular é de extrema relevância, pois a
camada externa possui uma grande quantidade de lipídeos (tornando as taxas de crescimento
mais lentas) e confere uma barreira contra ação dos agentes físicos e químicos, dificultando a
entrada de nutrientes para a célula e também resultando em resistência a diversos compostos
antimicrobianos (FALKINHAM, 1996; TORTORA et al, 2000). O gênero Mycobacterium
compreende patógenos importantes como o M. tuberculosis, que é responsável por quase
totalidade dos casos de tuberculose em humanos. Entretanto dentro do grupo das
micobactérias ambientais raramente ou potencialmente patogênicas para os seres humanos,
destacam-se o M. avium, M. smegmatis, M. abscessus, M. massiliense e M. fortuitum
(TORTORA et al, 2000).
4.5 OUTROS GÊNEROS
As infecções fúngicas oportunistas estão cada vez mais frequentes, representando
alguns desafios terapêuticos significativos. A Alternaria alternata é um patógeno conhecido
por causar infeções sistêmicas e dermatológicas em pacientes transplantados, tornando
complicadas as questões de tratamento, como a escolha e tempo de uso do antifúngico. Nos
últimos anos estes fungos estão sendo cada vez mais descritos na literatura, como patógenos
que ocasionam significativas taxas de morbidade e mortalidade nos pacientes com a
imunidade comprometida (RINALDI, 1991; DIAZ et al, 2002; MIELE et al, 2002; KAZORY
et al, 2004).
O fungo Trichophyton rubrum, é o principal agente etiológico nos casos de
dermatofitoses humanas. Produz enzimas proteolíticas capazes de hidrolisar a queratina, a
principal proteína constituinte do cabelo, unhas e pele (SIMPANYA, 2000; VENA et al,
2012), facilitando sua invasão tecidual. Este patógeno vem atuando de modo invasivo,
25
principalmente em pacientes com o sistema imune comprometido, causando infecções
intensas, resultando em uma menor qualidade de vida aos pacientes infectados (ISA et al,
2010).
Um patógeno oportunista capaz de ocasionar doenças pulmonares em pacientes
imunodeprimidos é o Aspergillus fumigatus. Este é o fungo mais comum encontrado nas vias
aéreas e associado a Aspergilose (a principal causa de mortalidade por pneumonia em
receptores de transplante de medula óssea). Representa uma grave complicação de pacientes
transplantados e também aparece com frequência em pacientes com câncer (KANJ et al,
1996; KNUTSEN et al, 2012; BOUTATI e ANAISSIE, 2014).
As espécies de Fusarium causam um amplo espectro de infecções em seres humanos.
Dentre as espécies mais relatadas está o F. oxysporum, responsável por infecções graves em
pacientes imunocomprometidos (BOUTATI e ANAISSIE, 2014). Os principais sintomas são
lesões de pele, encontradas com maior frequência nas extremidades. São descritos nódulos
subcutâneos dolorosos podendo resultar em trombose e necrose dos tecidos. Essas lesões são
muitas vezes a única forma de diagnóstico, pois em muitos casos as culturas de sangue
permanecem negativas (FAN et al, 2010). As espécies de Fusarium estão entre os fungos
mais resistentes a terapia antifúngica e, portanto, associadas com altas taxas de morbidade e
mortalidade. Assim um rápido diagnóstico e uma terapia antifúngica eficaz, são essenciais
para a sobrevivência desses pacientes (WALSH et al, 1996; PAUW e MEUNIER, 1999;
SCHÄFER et al, 2014).
Outro fungo bastante comum, associado a pele e os tecidos subcutâneos é o Fonsecaea
pedrosoi. Este é o principal agente causador da Cromoblastomicose, uma infecção crônica de
pele que envolve principalmente as extremidades inferiores (SOUSA et al, 2011). Apesar de
algumas terapias existentes, nenhum tratamento apresenta resultados consistentes e
satisfatórios para ser considerado de escolha. Devido as condições sócio-econômicas baixas,
longo tempo de tratamento e o alto custo, a maioria dos pacientes não conseguem obter o
controle da doença (SHA et al, 2013). Assim, há uma necessidade clara no desenvolvimento
de novas estratégias terapêuticas, incluindo novos agentes antimicrobianos para combater
patógenos existentes e emergentes, principalmente patógenos que apresentam resistência as
terapias disponíveis no mercado atualmente (TALBOT et al, 2006; WEI e RUBIN, 2008).
26
4.6 BIOFILMES
Os biofilmes são comunidades microbianas complexas, onde os microrganismos estão
ligados em uma superfície natural ou artificial, envolvidos por uma matriz polimérica. Esta é
produzida por eles mesmos como uma forma de proteção às defesas do hospedeiro e aos
agentes terapêuticos (DUNNE, 2002). Os biofilmes constituem um modo de crescimento
protegido, que permitem a sua sobrevivência num ambiente hostil. A vida dos
microrganismos no interior do biofilme proporciona um grande número de benefícios quando
comparados com os que se encontram de modo livre. Essas vantagens ocorrem devido ao fato
dos agregados de microrganismos apresentarem maior disponibilidade de nutrientes,
interferindo nas taxas de crescimento, cooperatividade metabólica e proteção aos fatores
externos (BEHLAU e GILMORE, 2008). Os biofilmes podem ser compostos por
microrganismos de uma única espécie (biofilme monomicrobiano) ou por uma comunidade
derivada de múltiplas espécies (biofilme polimicrobiano). Quando ocorre o crescimento de
espécies diferentes uma espécie pode ser favorecida pela presença da outra em uma interação
chamada de comensalismo (NICOLAEV e PLACUNOV, 2007).
A formação do biofilme (Figura 2) envolve um processo coordenado de eventos
moleculares. Inicia-se com aderência microbiana a superfície e este processo é condicionado
à interferência de fatores biológicos e não biológicos. Entre os fatores não biológicos são
reconhecidas as interações químicas como as forças de Van der Walls, interações
hidrofóbicas, eletrostáticas e ligações de hidrogênio que ocorrem entre as macromoléculas.
Este estágio inicial de adesão em que há envolvimento de interações físico-químicas entre as
superfícies designa-se adesão primária. Após este estágio os microrganismos levemente
aderidos concretizam o processo de adesão, com a produção de exopolissacarídeos formando
complexos com os materiais da superfície onde aderem e/ou através de receptores específicos
localizados na superfície das paredes celulares caracterizando a adesão secundária. Em
seguida dá-se o início ao processo de maturação do biofilme, formado por leveduras que são
interceptadas por canais de água que permitem a entrada dos nutrientes. Ao final deste
processo, o biofilme atinge uma massa crítica, sendo estabelecido um equilíbrio dinâmico no
qual o crescimento de células é compensado pela liberação de células planctônicas
disponíveis para a colonização de outras superfícies formando novos biofilmes (DUNNE,
2003; COSTERTON et al, 2003; LA TOURETTE et al, 2003).
27
Figura 2- Processo de formação de biofilme. 1) Fixação à superfície da célula ou substrato. 2) Fase de adesão e
produção de Exopolissacarídeos (EPS). Em seguida, demonstrado nas etapas: 3-4.) A arquitetura do biofilme se
desenvolve. 5) Chega a uma massa crítica e ocorre a liberação de células e/ou fragmentos do biofilme que podem
colonizar/infectar outro local. Fonte: http://prometheus.matse.illinois.edu/glossary/biofilms.
A maioria das infecções causadas por biofilmes estão associadas à utilização de
implantes médicos invasivos (cateteres intravenosos e urinários, próteses ortopédicas, dentre
outros). O desenvolvimento do biofilme depende do tipo e do número de células que aderem
ao dispositivo, do tipo de superfície que constitui o dispositivo e do meio ou fluidos a que os
microrganismos estão expostos (DONLAN, 2001). Um grande número de cateteres é inserido
em pacientes todos os anos, e destes, mais de 60% acabam relacionados com a formação de
biofilmes. Nestes casos, o período de hospitalização pode aumentar de 2 a 3 dias onerando em
1 bilhão de dólares, todos os anos, os custos associados ao manejo do paciente (DAVEY e
O’TOOLE, 2000).
A problemática da formação do biofilme ocorre devido ao fato de que estas estruturas
podem ser 10 a 100 vezes mais resistentes aos agentes antimicrobianos do que as células
planctônicas (não fixas). Essa resistência pode estar relacionada à dificuldade de penetração
dos antimicrobianos na matriz composta por substâncias poliméricas extracelulares (como o
EPS), com as alterações fenotípicas dos microrganismos no biofilme, com o desenvolvimento
de mecanismos de resistência e ainda devido ao seu modo de crescimento estar associado a
natureza crônica das infecções posteriores. Ou seja, apresentam um papel significativo no
aparecimento de doenças infecciosas (TOMIHAMA et al, 2007).
4.7 NANOTECNOLOGIA
A nanotecnologia surgiu em 1959, no Instituto de Tecnologia da Califórnia quando o
pesquisador Richard Feynman realizou uma palestra intitulada “There’s Plenty of Room at
Botton” no encontro anual da American Physical Society.
Feynman vislumbrou uma
28
tecnologia capaz de construir nano-objetos átomo por átomo, molécula por molécula. O
prefixo “nano” está relacionado a uma escala de medida em que um nanômetro representa um
bilionésimo do metro ou um milionésimo do milímetro. O princípio dessa tecnologia é que os
componentes na escala nanométrica podem apresentar propriedades químicas, físico-químicas
diferenciadas daquelas conhecidas em escalas maiores e consequentemente maior capacidade
de atravessar as barreiras celulares, membranas e maior solubilidade (MANSOORI, 2002;
YANG et al, 2008).
A Nanotecnologia apresenta um campo inter e multidisciplinar, pois abrange áreas
como a Química, Física, Biologia, Computação, Engenharias e a Medicina. Esta tecnologia
também tem se destacado na área farmacêutica, especialmente no desenvolvimento de novos
produtos e formas farmacêuticas. Existem diversos materiais utilizados na produção de
nanoestruturas e estes determinam o tipo, as diferentes propriedades e as características de
liberação dos fármacos incorporados (VAUTHIER et al, 2003; PUTHETI et al, 2008). A
principal razão para as diferenças no comportamento entre os materiais compostos e os
nanocompósitos está relacionada com a grande área de superfície do material, resultando em
intensa interação entre a matriz e as nanopartículas. As nanopartículas possuem um futuro
promissor
na
indústria
farmacêutica,
especialmente
na
vetorização
de
fármacos
antimicrobianos. Podem ser sintetizadas para melhorar as propriedades farmacológicas e
terapêuticas dos fármacos, pois apresentam um controle de liberação sustentado, uma maior
seletividade (aumentando assim o índice terapêutico), uma diminuição dos efeitos colaterais e
uma proteção da degradação no trato gastro-intestinal, aumentando assim a biodisponibilidade
(MONALISA et al, 2013).
As
potencialidades
da
nanotecnologia
aplicada
no
desenvolvimento
de
antimicrobianos nanoestruturados é evidente. Rukholm e colaboradores, em 2005,
desenvolveram lipossomas de Gentamicina. Este fármaco (pertencente a classe dos
Aminoglicosídeos) representa importante opção terapêutica em pacientes alérgicos aos βlactâmicos, porém apresenta grande toxicicidade, especialmente nefro e ototoxicidade. Neste
trabalho os lipossomas de Gentamicina apresentaram maior potência frente a estirpes de
Pseudomonas sp. e menor toxicidade.
Em 2012, Sun e colaboradores sintetizaram nanopartículas lipídicas carregadas com o
principal ativo do óleo de M. alternifolia, o Terpinen-4-ol. O objetivo foi reduzir a
volatilização do composto majoritário, melhorando assim a estabilidade e a atividade em
29
biofilmes de C. albicans. Os resultados demonstraram que as nanopartículas lipídicas
apresentaram uma liberação controlada e sustentada, melhorando a estabilidade e
confirmando a atividade antibiofilme. As nanopartículas de Terpinen-4-ol possuíram a
capacidade de perturbar a estrutura da membrana celular bloqueando a cadeia respiratória,
inibindo a enzima succinato desidrogenase, que está ligada à membrana mitocondrial interna
de células fúngicas.
Flores e colaboradores (2013), avaliaram a atividade antifúngica de nanopartículas
poliméricas de M. alternifolia frente a um modelo de onicomicose, causadas pelo fungo T.
rubrum. Neste trabalho os autores verificaram a eficiência das nanocápsulas frente a redução
do crescimento do T. rubrum e sugeriram que as nanoestruturas podem ser utilizadas não
somente no tratamento, mas também na prevenção da infecção das unhas, evidenciando assim
o potencial na nanoencapsulação no tratamento de micoses superficiais.
Em uma pesquisa realizada por Low e colaboradores (2013), os autores produziram
dois diferentes tipos de lipossomas: um com óleo de M. alternifolia e outro com o mesmo
óleo associado a prata. Todos lipossomas demonstraram uma liberação controlada
melhorando a sua eficácia antimicrobiana, bem como reduziram a concentração eficaz
necessária. Os autores sugerem que estas descobertas podem reduzir os problemas de
toxicidade causados pelo óleo de M. alternifolia, devido ao uso de doses ativas elevadas.
Pérez-Limiñana e colaboradores (2013), desenvolveram materiais de calçados com
propriedades antimicrobianas usando o óleo de M. alternifolia microencapsulado como um
biocida
natural.
Essas
microcápsulas
foram
produzidas
à
base
de
gelatina
e
carboximetilcelulose e caracterizadas por diferentes técnicas experimentais, aplicadas a
materiais de calçados (couro e têxteis). A durabilidade das microcápsulas sob diferentes
condições, como esfregar e passar, foi analisada a fim de simular a fabricação de calçados e o
seu uso tendo como resultado um efeito notável sobre a eficiência da encapsulação do óleo
sob a ação antimicrobiana.
30
5 METODOLOGIA
Este estudo foi realizado nos Laboratórios de Nanotecnologia, de Microbiologia e de
Cultura Celular do Centro Universitário Franciscano, Santa Maria – RS, Departamento de
Química da Universidade Federal de Santa Maria- RS, Laboratório de Química do Estado
Sólido (LQES) Do Instituto de Química (IQ) na Universidade Estadual de Campinas,
Laboratório Nacional de Nanotecnologia, no Centro Nacional de Pesquisa em Energia e
Materiais (CNPEM) – Campinas- SP.
Para uma melhor organização dos dados, o trabalho foi dividido em três partes. Na
primeira, foi determinada a atividade antimicrobiana, já na segunda foi avaliada a atividade
antibiofilme e na terceira foi verificada a citotoxicidade. A primeira parte do trabalho foi
aceita para publicação no periódico Journal of Drug Delivery Science and Technology. Parte
do referencial teórico foi aceito para publicação como editorial no periódico Fungal
Genomics and Biology.
5.1 ÓLEO E SUSPENSÕES DE NANOPARTÍCULAS CONTENDO ÓLEO ESSENCIAL
DE M. alternifolia
O óleo de M. alternifolia foi obtido comercialmente da Importadora Química
Delaware Ltda, Brasil. As nanopartículas lipídicas sólidas contendo o óleo de M. alternifolia
foram gentilmente doadas pela Indústria INVENTIVA®. Resumidamente, as nanopartículas
lipídicas sólidas foram preparadas com 7,5% de óleo usando um método patenteado
(INVENTIVA®), com base na homogeneização de alta pressão. O Cetil palmitato foi usado
como lipídio sólido e Polissorbato 80 como surfactante. A concentração de sólidos totais foi
de 18,6%.
5.1.1 Caracterização Físico-Química das suspensões de nanopartículas de óleo de M.
alternifolia.
5.1.1.1 Determinação do diâmetro de partícula e índice de polidispersão.
As determinações do diâmetro e do índice de polidispersão das nanopartículas foram
realizadas através de espalhamento de luz dinâmico (Zetasizer® nano-ZS modelo ZEN 3600,
Malvern), após diluição das dispersões em água (500 vezes, v/v). Os resultados foram
expressos em nanometros (nm) a partir da leitura de três suspensões diferentes.
31
5.1.1.2 Potencial zeta
O potencial zeta foi obtido através de eletroforese (Zetasizer® nano-Zs modelo ZEN
3600, Malvern), após diluição das dispersões em solução de NaCl 10 mM (500 vezes,v/v)
previamente filtrada através de membrana 0,45 μm. Os resultados foram expressos em
milivolts (mV) a partir de uma média de três determinações de suspensões diferentes.
5.1.1.3 Determinação do pH
Os pHs das formulações foram determinados utilizando potenciômetro (Digimed®)
previamente calibrado (com soluções padrão de pH 4,0 e 7,0) diretamente nas dispersões
coloidais. Os resultados foram expressos a partir da leitura de três suspensões diferentes.
5.1.1.4 Análise de rastreamento Nanopartículas
A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), foram realizadas utilizando um
microscópio digital LM10 System (NanoSight, Salisbury, UK). Uma pequena quantidade da
amostra diluída foi introduzida na câmara com o auxílio de uma seringa. As partículas na
amostra foram observadas com um microscópio digital. As imagens de vídeo do movimento
de partículas em movimento browniano foram analisadas pelo NTA, software de análise de
imagem (B196) (NanoSight) versão 1.5. Cada clipe de vídeo foi capturado mais de 30 s. O
limite de detecção foi fixado em 100, enquanto que o salto máximo de partículas e o
comprimento mínimo de pista foram fixados em 10 no software NTA.
5.1.2 Caracterização do óleo de M. alternifolia
A composição de óleo foi analisada utilizando cromatografia gasosa (CG) utilizando o
sistema Agilent Technologies 6890N CG - FID, equipado com DB-5 de coluna capilar (30 m
x 0,25 mm x 2,5 mm espessura do filme) e ligado a uma ionização de chama (FID). As
temperaturas do injetor e do detector foram ajustados para 250 °C. O gás transportador foi o
Hélio, a uma taxa de fluxo de 1,3 mL/min. O programador térmico foi 100-280 °C a uma taxa
de 10 °C/min. Duas réplicas de amostras foram processadas da mesma maneira. As
concentrações relativas aos componentes foram calculadas com base nas áreas dos picos de
CG sem o uso de fatores de correção. O volume de injeção foi de 1 µL (Boligon et al, 2013).
A Espectrometria de Massa (CG-MS) foi realizada em um sistema de CG-MS da Agilent
Technologies Autosystem operando no modo El a 70 eV, equipado com um injetor de
separação/splitless (250 °C). A temperatura da linha de transferência foi de 280 °C. O Hélio
32
foi utilizado como gás portador (1,5 mL/min) e as colunas capilares utilizados foram um HP
5MS (30 m x 0,25 mm x 2,5 mm de espessura de filme e uma Innowax HP (D de 30 m x 0,32
milímetros, a espessura da película de 0,50 milímetros). A temperatura foi programada a
mesma que a utilizada para as análises de CG. O volume injetado foi de 1 µL do óleo de M.
alternifolia.
A identificação dos componentes do óleo de M. alternifolia foi realizada com base no
índice de retenção (IR), determinada com referência da série homóloga de n-alcanos, C7C30, sob condições experimentais idênticas, em comparação com a procura da biblioteca
espectros de massa (NIST e Wiley) e com a dados da literatura (espectros de massa de
Adams) (1995). As quantidades relativas dos componentes individuais foram calculadas com
base na área do pico da CG (resposta FID).
5.2 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
5.2.1 Teste de suscetibilidade frente ao gênero Candida
Os testes para avaliar a suscetibilidade dos microrganismos frente ao óleo de M.
alternifolia e as suas nanopartículas foram realizadas com base na M27-A3 (CLSI 2008) e
M38-A2 (CLSI 2008). A suscetibilidade foi expressa através da concentração inibitória
mínima (CIM) utilizando a técnica de microdiluição em caldo. Todas as soluções de
nanopartículas e as soluções de trabalho do óleo foram diluídas com meio Roswell Park
Memorial Institute (RPMI) 1640 contendo L - glutamina (Sigma Chemical Co., St. Louis,
Missouri, EUA), tamponado a pH 7,0 com 0,165 mol/L de tampão de MOPS (Sigma).
5.2.2 Teste de suscetibilidade frente ao gênero Mycobacterium
Foram utilizadas quatro Micobactérias de crescimento rápido: Mycobacterium
smegmatis mc2 155 (ATCC 700084), M. fortuitum ATCC 6841, M. abscessus ATCC 19977 e
M. massiliense ATCC 48898. Além disto, foram utilizadas três cepas de Micobactérias de
crescimento lento: M. tuberculosis H37Rv (ATCC 25618), M. avium LR541CDC e M. bovis
cepa (BCG Pasteur). Foi utilizada a técnica de microdiluição em caldo usando os protocolos
do CLSI M24-A. O ensaio foi realizado em microplacas de 96 poços com fundo em U em
triplicata. Foram realizadas diluições em série do óleo e da suspensão de nanopartículas. As
placas foram incubadas a 35°C por cinco (para Micobactérias de crescimento rápido) ou sete
33
dias (para Micobactérias de crescimento lento) em câmara úmida. Os resultados foram
observados a olho nu pela formação do pontilhado bacteriano no fundo dos poços.
5.2.3 Teste de suscetibilidade frente a outros gêneros
Para a determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi utilizada a técnica
de microdiluição em caldo, conforme preconizado pelo CLSI, 2010. Foi utilizado o caldo
Mueller Hinton para o crescimento das estirpes. Placas de 96 poços foram utilizadas para a
realização do teste. Os microrganismos foram inseridos em solução salina estéril, até atingir
0,5 na escala McFarland (equivalente a 1,5 x 108 UFC/mL) e então foram distribuídos nos
poços das placas. Em seguida, foram adicionadas diferentes concentrações do óleo ou
nanopartículas e as placas foram incubadas a 37°C/24 horas. Após 24 horas de incubação, o
resultado da CIM foi verificado. Para tal, utilizou-se o Cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio, que
indica crescimento bacteriano. O ensaio foi realizado em triplicata.
5.3 ENSAIO DE FORMAÇÃO DE BIOFILMES
Foram utilizadas cepas de C. albicans ATCC 14053, C. glabrata ATCC 66032, C.
parapilosis ATCC 220190, C. tropicalis ATCC 66029, C. membranaefaciens ATCC
2013770, C. kefyr ATCC 66028, C. guilliermondii ATCC 6260 e C. geochares ATCC
3685220 pertencentes à bacterioteca/micoteca do Laboratório de Microbiologia do Centro
Universitário Franciscano. As amostras foram inoculadas em ágar BHI (Brain Heart Infusion
Broth) sem glicose (0%) e BHI suplementado com 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5 e 3% de glicose,
incubadas a 37ºC por 24 horas e transferidas para caldo BHI. Em seguida, alíquotas das
culturas foram adicionadas ao caldo BHI com a mesma concentração de glicose até atingir a
escala 1 de MacFarland. Posteriormente, 200μL de cada suspensão bacteriana foram
inoculados, em triplicata, em poços de placas estéreis de microtitulação de poliestireno de 96
cavidades com fundo plano. Os controles negativos foram poços com caldos BHI com cada
concentração de glicose, em triplicata, não inoculados. As placas foram incubadas a 37°C por
24 horas. A suspensão bacteriana foi aspirada e cada poço foi lavado 3 vezes com 250μL de
solução fisiológica a 0,9% estéril. Após, foi realizada a fixação do biofilme em estufa a 60ºC
por 60 minutos. As placas foram coradas com 200μL de solução de cristal violeta de Hucker
1% durante 15 minutos, lavadas 5 vezes com agua deionizada após foi adicionado 200 μL de
Etanol 95% por 10 minutos. Após foi realizada a leitura da absorbância em leitor de
34
microplacas (Rosys Anthos 2010) em comprimento de onda de 492nm (RODRIGUES et al,
2009).
A determinação da concentração ótima de glicose (concentração que induz a formação
de maior quantidade de biofilme) foi determinada (Figura 5). Esta concentração foi a
concentração de glicose utilizada em todos os seguintes testes:
Foram divididos os grupos abaixo:
1) Controle positivo de crescimento – Cepas de Candida + BHI
2) Controle negativo de crescimento – BHI
3) Óleo de M. alternifolia – Cepas de Candida + BHI + óleo de M. alternifolia
4) Nanopartículas de M. alternifolia – Cepas de Candida + BHI + Nanopartículas de
M. alternifolia
Tanto o óleo quanto as nanopartículas de M. alternifolia, foram testados nas
concentrações de 31, 2 a 3,9 % (31,2; 15,6; 7,8; 3,9%)
Em todos os grupos experimentais foram realizados os seguintes ensaios:
5.4 ENSAIO DE QUANTIFICAÇÃO DE EXOPOLISSACARÍDEOS (EPS)
Para o ensaio, as cepas isoladas foram semeadas em placas de petri contendo BHI. A
partir destas placas, os microrganismos foram acondicionados em dois tubos de 3 mL
contendo soro de coelho e foram cultivadas a 37 °C durante 48 h. As amostras foram
colocadas em banho de água fervente por 5 minutos e sonicados a 60% de potência, durante
30 minutos. Os organismos foram centrifugados (950 x g, 15 min). Um mililitro do
sobrenadante (que contém o EPS) foi precipitado por adição em gotas a 10 mL de álcool
absoluto e após centrifugado (2400 xg, 15 min). O precipitado foi, dissolvido em 1 mL de
água destilada, e digerido em 7 mL de ácido sulfúrico a 77% e após foi adicionado durante 10
min em banho de gelo. Um mililitro de triptofano a 1% frio foi adicionado a cada tubo e
misturado. Depois de exposição a um banho de água fervente durante 20 minutos, os tubos
foram resfriados em gelo, e a absorbância (500nm) da amostra foi determinada contra um
branco de água destilada. O hidrato de carbono presente no glicocálice (EPS) desidrata na
35
presença de ácido concentrado para furfural. A cor violeta acastanhado que se desenvolveu é
o produto de condensação de furfural, com a amina aromática do triptofano (LAWRENCE e
BETTY, 1989).
5.5 ENSAIO DE DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA.
A concentração proteica das amostras foi determinada através do método descrito
inicialmente por Bradford (1976) com uma adaptação da técnica (ZOR e SELINGER, 1996).
Para este ensaio foi utilizado o reagente Bradford adquirido comercialmente e uma curva
padrão com albumina bovina (BSA) (Sigma) foi realizada nas concentrações de zero a 18
µg/mL. Foram transferidos 200 µL do reagente Bradford em cada poço de uma placa de 24
poços, em triplicata, e adicionados pontos da curva padrão ou das amostras a serem dosadas.
A reação foi agitada, colocada em estufa a 37ºC por 30 minutos e após submetida à leitura da
absorbância a 595 nm, em um leitor de microplacas. A concentração das amostras foi
determinada através da comparação com a curva padrão de BSA, plotada e analisada por
regressão linear em um programa de análise de curva GraphPad Prism Versão 6.0.
5.6 ANÁLISE QUALITATIVA DO BIOFILME FORMADO - COLORAÇÃO DE
CALCOFLUOR BRANCO
Foram utilizadas lâminas de vidro comuns (Lâminas para microscopia PERFECTA
com dimensões 26 x 76 mm e espessura 1,0 a 1,2 mm). Foram testadas estirpes de C.
albicans, C. membranafaciens, C. tropicalis, C. glabrata e C. parapsilosis.
Estes
microrganismos foram inoculados em caldo BHI e incubadas em estufa a 37ºC. A partir deste
crescimento foram realizadas suspensões correspondentes a 0,5 na escala de Mcfarland.
Foram adicionados 2 mL desta suspensão em placas de petri de 9 cm de diâmetro, contendo
20 ml de caldo Mueller Hinton e a lâmina de vidro nova. A placa foi incubada por 24h 37ºC
para a adesão dos microrganismos. Os testes foram realizados em duplicata. Após o período
de incubação foram adicionados 31,2 e 15,6% das nanopartículas e incubadas por mais 24
horas.
5.6.1 Revelação do biofilme
Após a formação do biofilme, a lâmina de vidro foi retirada da placa, fixada com
Cetona (P.A.). Após, foi corada com 10 ml de solução 25 mM de Calcofluor Branco (Sigma)
à temperatura ambiente durante 1 min conforme descrito por Gonçalves e colaboradores
(2006). Após a incubação, as lâminas foram lavadas com 100ml de água destilada estéril.
36
Após secagem, em temperatura ambiente as lâminas foram visualizadas sob microscopia de
fluorescência (luz U.V.).
Foram analisados 30 campos de visualização por lâmina em
objetivas de 10 e 40x.
5.7 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE
A citotoxicidade foi avaliada através do método baseado na medida da atividade da enzima
desidrogenase mitocondrial, a qual quando ativa, é capaz de metabolizar o reagente 3- (4,5Di-metil tiazol-2-il)-2,5-di fenil tetrazólio, um amarelo tetrazol (MTT) em um composto
colorido denominado formazan. Para isso, alíquotas de 0,1 mL de células primárias
(mononucleares humanos) a uma concentração de 2x10⁵ células/ml de Meio Essencial
Mínimo (MEM) acrescido de 10% de Soro Fetal Bovino (SFB) e antimicrobianos (penicilina
e estreptomicina), foram depositadas em microplacas de 96 poços. Após 24h de incubação, o
meio de cultivo foi removido e o meio fresco contendo diluições seriadas (0,04; 0,08; 0,4; 0,8;
2; 4; 6; 8%) de óleo de M. alternifolia ou nanopartículas de M. alternifolia foram adicionados.
Foram utilizados cinco poços da microplaca para cada diluição e 0,1 mL de inóculo por poço.
Ademais, um controle negativo (meio sem a adição de óleo/nanopartículas) foi realizado. As
microplacas foram incubadas em estufa a 37 ºC, com 5% de CO2 por 24 e 48hs. Após esse
período, o meio foi desprezado e foi adicionado 100 μL de MTT a uma concentração de
5mg/mL. As microplacas foram incubadas por 4h a 37 ºC para a incorporação do MTT e
formação dos cristais de formazan. Posteriormente, esses foram solubilizados pela adição de
100 μL de uma solução de 95% de isopropanol e 5% de ácido fórmico. A análise
espectrofotométrica foi realizada em um leitor de Microplacas a uma absorbância de 600 nm.
5.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os testes foram analisados utilizando o teste T de Student para os estudos de biofilme
e ONE-way ANOVA seguido de teste de Dunett para os ensaios de citotoxicidade. O nível de
significância será fixado em 5%. Os gráficos foram realizados no software Graphpad prism
6.01 (Graphpad Software, INC).
37
6.RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 CARACTERIZAÇÃO DO ÓLEO DE M. alternifolia
Os componentes majoritários do óleo podem ser visualizados na Tabela 1 e Figura 3.
Na análise do óleo foram identificados 15 componentes, representando 95,86% da
composição total do óleo utilizado no presente estudo. Os componentes majoritários são
Terpinen-4-ol (41,98%), seguido por γ-terpineno (20,15%), α-terpineno (9,85%), 1,8-cineol
(6,03%) e terpinoleno (4,15%). De acordo com os resultados obtidos e observando as Normas
da International Organization for Standardization (ISO 4730) (que normatiza o padrão de
qualidade internacional para o óleo de M. alternifolia), o óleo utilizado no presente estudo
atende plenamente os padrões de qualidade, pois todos os compostos identificados encontramse dentro das faixas de aceite (CARSON e RILEY, 1995; CARSON et al, 1998). O óleo de M.
alternifolia possui diversos hidrocarbonetos, monoterpenos, sesquiterpenos e seus álcoois,
podendo ser encontrados no óleo aproximadamente 100 terpenos, mais de 60 destas
substâncias já foram identificadas (SCIENTIFIC COMMITTEE ON CONSUMER
PRODUCTS, 2004).
Tabela 1- Proporções relativas dos constituintes do óleo essencial foram expressos em porcentagem. Tr - traços.
IRE - índices de retenção experimental (com base na série homóloga de n-alcanos C7-C30). IRL - índices de
retenção da literatura (Adams, 1995). ISO 4730
Pico
Compostos
IRE
IRL
Quantidade
(%)
ISO 4730
Faixa (%)
Fórmula Molecular
1
α-Pineno
937
939
3,51
1-6
C10H16
2
Sabineno
976
976
0,46
Tr-3,5
C10H16
3
α-Terpineno
1016
1018
9,85
5-13
C10H16
4
p-Cimeno
1025
1026
2,27
0,5-8,0
C10H14
5
Limoneno
1032
1031
C10H16
6
1.8-Cineol
1037
1038
1,39
6,03
0,5-1,5
Tr-15
C10H18O
7
γ-Terpineno
1062
1062
20,15
10-28
C10H16
8
Terpinen-4-ol
1178
1177
41,98
30-48
C10H18O
9
Terpinoleno
1089
1088
4,17
1,5-5
C10H16
10
α-Terpineol
1190
1189
2,43
1,5-8
C10H18O
11
Aromadendreno
1440
1439
1,04
Tr-3
C15H24
12
Ledene
1521
1525
0,80
Tr-3
C15H24
13
1538
C15H24
δ-Cadineno
1539
0,63
Tr-3
14
Globulol
1583
1583
0,97
Tr-1
C15H26O
15
Viridiflorol
1591
1590
0,18
Tr-1
C15H26O
Total identificado (%)
95,86
38
O Terpinen-4-ol é o principal composto ativo do óleo de M. alternifolia e quanto
maior a quantidade deste composto melhor a atividade antimicrobiana (CARSON e RILEY,
1995), anti-inflamatória (HART et al, 2000) e anestésico local (GHELARDINI, GALEOTTI
et al, 2001). Outros constituintes que contribuem para propriedades antimicrobianas são γterpineno,
α-terpineno
(BURT,
2004).
O
composto
1,8-cineol
apresenta
ação
broncodilatadora, expectorante, antisséptica dentre outras, no entanto deve estar em pequenas
concentrações, pois possui propriedades irritantes para a pele (WILLIANS et al, 1990;
ALBORNOZ, 1992). A Figura 3 apresenta o perfil cromatográfico do óleo de M. alternifolia
utilizado no presente estudo.
Figura 3- Perfil cromatográfico do óleo essencial de M. alternifolia por Cromatografia Gasosa (CG). Proporções
relativas dos constituintes do óleo essencial foram expressos em porcentagem. Os números 1-15 representam os
compostos majoritários listados na Tabela 1.
6.2 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS DO ÓLEO DE M. alternifolia.
A formulação preparada foi avaliada em relação às suas propriedades físico-químicas,
como pode ser visualizada na Tabela 2. Os resultados indicam uma homogeneidade adequada,
pois quando trabalha-se com partículas em tamanho nanométrico, indiferentemente do método
utilizado para obtenção, todas as formulações devem apresentar-se monodispersas (índice de
polidispersão < 0,25) e com diâmetros inferiores a 300 nm. Além disto, o resultado do
potencial zeta encontra-se satisfatório, pois, quando a nanoestrutura apresenta uma carga
negativa, a manutenção de estabilidade do sistema tende a ser superior, com uma menor
39
probabilidade de agregação das partículas e, consequentemente, precipitação das
nanoestruturas (SILVA et al, 2006; FRIEDRICH et al, 2008).
Tabela 2- Valores de pH, tamanho de partícula, índice de polidispersão (IPD) e potencial zeta
das nanopartículas contendo óleo de M. alternifolia.
pH
Tamanho da partícula (nm)
IPD
Potencial Zeta (mV)
158,2 ± 2 nm
0,213 ± 0,017
-8,69 ± 0,80
6,3 ± 0,3
6.2.1 Análise de rastreamento das nanopartículas de M. alternifolia
As nanopartículas de M. alternifolia apresentaram um tamanho médio de 166 nm ±
55nm (Figura 4). De acordo com os dados apresentados na Tabela 2.
Figura 4- Diâmetro de partícula a partir da Análise de rastreamento de nanopatículas. (A) Um quadro de vídeo
usada para determinar o tamanho da partícula medido. As posições das partículas individuais são claramente
identificados como ponto como objetos no quadro. (B) Distribuição de tamanho determinado.
Algumas vantagens do NTA sobre os outros métodos de caracterização é que ele não
fornece somente a informação quantitativa, mas também fornece informação visual. O
tamanho é calculado partícula por partícula, fornecendo uma medição de alta resolução da
distribuição, a medição direta, sem modelagem ou suposições (MALLOY, 2011).
6.3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA
A técnica de diluição para determinação da CIM é considerada o “padrão ouro” para
determinar a suscetibilidade de microrganismos. As CIMs são definidas como a concentração
mais baixa de um agente antimicrobiano que inibe o crescimento visível de um
microrganismo (DAVIDSON e PARISH, 1989; ANDREWS, 2001). Na determinação da
CIM (Tabela 3), o óleo essencial de M. alternifolia e as nanopartículas foram eficientes contra
a maioria dos microrganismos testados, em concentrações baixas, com exceção de algumas
espécies das Micobactérias.
40
Tabela 3- Concentração inibitória minima do óleo de M. alternifolia e das nanopartículas.
CIM (%)
Microrganismos
Óleo de M. alternifólia
Nanopartículas de M.
alternifolia
Isolados fúngicos
C. albicans
0,06
2,50
C. parapsilosis
0,06
2,50
C. glabrata
0,06
2,50
C. dubliniensis
0,06
2,50
C. krusei
0,06
1,25
C. tropicalis
0,15
2,50
T. rubrum
0,002
0,30
F. pedrosoi
0,03
0,60
A. fumigatus
0,15
1,25
A. alternata
0,15
0,30
F. oxysporum
0,15
2,5
Isolados de Mycobacterium
M. avium LR54
1,56
N. A.
M. smegmatis
0,39
0,22
M. abscessos
N. A.
N. A.
M. massiliense
N. A.
N. A.
M. fortuitum
N. A.
N. A.
M.tuberculosis
H37RV
N. A.
N. A.
M. bovis BCG
N. A.
N. A.
*N.A – Não apresenta atividade.
Foi possível observar que na concentração de 0,06 % o óleo é capaz de inibir o
crescimento da maioria das espécies de Candida analisadas, apresentando excelentes
resultados in vitro e confirmando a eficácia contra as espécies mais comuns deste gênero.
Uma grande variedade de leveduras, dermatófitos, e outros fungos filamentosos são
suscetíveis ao óleo de M. alternifolia e os resultados do presente estudo corroboram com os
41
dados da literatura (HAMMER et al, 2002; CARSON et al, 2006b). Um dos mecanismos de
ação relatados é que o óleo de M. alternifolia, estimula a perda de íons potássio e inibe a
respiração dos microrganismos sugerindo ação letal devido aos danos de membrana
citoplasmática (SOUTHWELL et al, 1998).
As nanopartículas também apresentaram ação antimicrobiana contra todas as espécies
de fungos avaliadas. Os resultados obtidos na CIM embora em concentrações mais elevadas
assemelham-se aos resultados do óleo, pois a suspensão das nanopartículas possui 7,5% de
óleo encapsulado. Existem vários relatos do aumento da atividade antimicrobiana após a
incorporação em nanopartículas (PAL et al, 2007; SANTOS et al, 2014). Alguns estudos
ainda sugerem através da técnica de microscopia de força atômica que as nanopartículas
danificam a parede celular do microrganismo, permitindo a entrada do ativo ocorrendo a
interação com macromoléculas, como proteínas e DNA, afetando assim os mecanismos de
replicação e processos celulares (REN et al, 2009).
6.4 DETERMINAÇÃO DA INFLUÊNCIA DE CARBOIDRATOS NA FORMAÇÃO DO
BIOFILME DE Candida.
A capacidade de várias espécies de Candida em formar biofilme em meios de cultivo
com diferentes concentrações de glicose foi avaliada. Os resultados mostraram (Figura 5) que
a maioria das estirpes foram capazes de formar biofilmes. No entanto pode-se observar que a
concentração ótima de glicose para esta formação em 24 horas foi de 1%, pois cinco das oito
cepas usadas formaram biofilme nesta concentração.
42
Figura 5- Determinação da influência de glicose na formação de biofilmes de 24 horas. D.O. - Densidade óptica
de 492nm. NP - Não produtor de Biofilme. FP – Fracamente Produtor. MP – Moderadamente Produtor. FTPFortemente Produtor (KREPSKY et al, 2003).
Os fungos dimórficos como as espécies de Candida crescem sob a forma de levedura ou de
hifas. No entanto quando expostos em meios com glicose mostram predominância na forma
leveduriforme, o que favorece a formação dos estágios iniciais para a formação do biofilme.
Nos estágios mais avançados, há uma mistura de populações: células em forma de leveduras,
pseudo-hifas e hifas, além de uma extensa matriz extracelular composta de proteínas e
polissacarídeos (MUKHERJEE et al, 2005). Como pode se observar, as espécies de Candida
que mais produziram biofilmes foram: C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C.
membranafaciens e C. tropicalis (Figura 5). Frente a esses resultados iniciais foi avaliada a
atividade antibiofilme do óleo e das nanopartículas de M. alternifolia nessas cinco espécies.
6.5 QUANTIFICAÇÃO DO BIOFILME FORMADO ATRAVÉS DA TÉCNICA DO
CRISTAL VIOLETA
A coloração de Cristal Violeta (CV) é um dos métodos mais utilizados para comparar
e quantificar o desenvolvimento de biofilmes de diferentes patógenos. O corante CV se liga
proporcionalmente à biomassa do biofilme e apresenta vantagens como baixo custo, sendo
uma técnica relativamente rápida e adaptável para uso, além de apresentar alto rendimento
com microplacas (O'TOOLE e KOLTER, 1998; LI et al, 2003; PITTS et al, 2003). A
influência do óleo de M. alternifolia e das nanopartículas foram avaliadas após 24 horas de
formação do biofilme. Os resultados estão apresentados nas Figuras 6, 7, 8, 9 e 10. As
concentrações que apresentaram redução no biofilme foram elavadas em comparação aos
43
resultados apresentados na CIM (Tabela 3) pois no interior do biofilme os microrganismos
são muito mais resistentes (TEITZEL e PARSEK, 2003).
Figura 6- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia (B) sobre a
formação de biofilme de C. albicans. A formação de biofilme foi avaliada pela técnica colorimétrica utilizando
cristal violeta. Os resultados são expressos como absorbância em 492nm. (Média ± Erro padrão da média). D.O.
– Densidade ótica. CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao
controle negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
As principais características que influenciam no desenvolvimento do biofilme incluem
a aderência e a proliferação (que inclui o desenvolvimento de hifas e formação de tubos
germinativos) a produção de matriz extracelular, maturação e a dispersão (RAMAGE et al,
2009). Estudos revelam que a ação do óleo essencial de M. alternifolia em biofilmes
formados por C. albicans possa estar associado a redução da hidrofobicidade das superfícies
celulares da Candida reduzindo assim a adesão (SUDJANA et al, 2012). Já HAMMER et al,
2000 demonstrou uma importante inibição da formação dos tubos germinativos.
O presente trabalho mostra pela primeira vez a ação das nanopartículas de M.
alternifolia em biofilmes formados por cinco espécies distintas de Candida. Este estudo
demonstrou que tanto o óleo quanto as nanopartículas levaram a uma redução significativa na
formação de biofilmes quando comparados ao controle positivo em todas as espécies
avaliadas. Quando analisado o biofilme de C. albicans, ocorreu a uma redução de 67%
quando comparadas com o controle positivo na maior concentração (31,2%), (Figura 6B)
enquanto que o óleo de M. alternifolia na forma livre manteve uma redução máxima de 58,6%
na concentração de 15,6%.
44
Figura 7- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia (B) sobre a
formação de biofilme de C. tropicalis. A formação de biofilme foi avaliada pela técnica colorimétrica utilizando
cristal violeta. Os resultados são expressos como absorbância em 492nm. (Média ± Erro padrão da média). D.O.
– Densidade ótica. CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao
controle negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
Para C. tropicalis o óleo de M. alternifolia reduziu 42,7% da biomassa do biofilme na
menor concentração (3,9%). Na avaliação da ação das nanopartículas, o biofilme que obteve o
menor crescimento foi na concentração de 15,6% onde foi observada uma redução de 58,5%
na figura 7B.
Figura 8- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia (B) sobre a
formação de biofilme de C. membranafaciens. A formação de biofilme foi avaliada pela técnica colorimétrica
utilizando cristal violeta. Os resultados são expressos como absorbância em 492nm. (Média ± Erro padrão da
45
média). D.O. – Densidade ótica. CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com
relação ao controle negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
A C. membranafaciens obteve uma diminuição na formação de biofilmes de 43% para
o óleo nas concentrações de 15,6 e 31,2%. Os resultados para as nanopartículas de M.
alternifolia mostram uma redução de 47 e 48% do biofilme nas concentrações de 3,9 e 7,8%
respectivamente.
Figura 9- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia (B) sobre a
formação de biofilme de C. parapsilosis. A formação de biofilme foi avaliada pela técnica colorimétrica
utilizando cristal violeta. Os resultados são expressos como percentagem de inibição do biofilme em relação ao
controle não tratado. Os valores são expressos como absorbância em 492nm. (Média ± Erro padrão da média).
D.O. – Densidade ótica. CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação
ao controle negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
As nanopartículas de óleo de M. alternifolia apresentaram um efeito superior ao óleo
na forma livre com uma inibição de 51% nos biofilmes formados por C. parapsilosis
enquanto que o óleo inibiu 38% ambos na concentração de 7,8% (Figura 9)
46
Figura 10- Efeito do óleo de M. alternifolia (A) e das nanopartículas de óleo de M. alternifolia (B) sobre a
formação de biofilme de C. glabrata. A formação de biofilme foi avaliada pela técnica colorimétrica utilizando
cristal violeta. Os resultados são expressos como percentagem de inibição do biofilme em relação ao controle
não tratado. Os valores são expressos como absorbância em 492nm. (Média ± Erro padrão da média). D.O. –
Densidade ótica. CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao
controle negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
Os melhores resultados (onde ocorreu a maior inibição) foram obtidos sobre a espécie
de C. glabrata. Os efeitos do óleo e das nanopartículas de M. alternifolia foram semelhantes:
o óleo reduziu a formação de biofilme em 72% na concentração de 15,6% e as nanopartículas
em 73% na mesma concentração. As nanopartículas potencializaram a atividade antibiofilme
in vitro do óleo de M. alternifolia (pois são produzidas com apenas 7,5% de óleo), frente a
todas as espécies de Candida analisadas.
O aumento da atividade antibiofilme das nanopartículas pode ser explicado por
algumas características: o diâmetro reduzido da partícula é crucial pois quanto menor o
diâmetro, maior o efeito antimicrobiano (a partícula parece ser mais capaz de penetrar na
célula bacteriana e biofilme, causando uma interferência na membrana causando a perda da
viabilidade celular) (SEIL e WEBSTER, 2012).
Os biofilmes apresentam ao seu redor uma molhabilidade (habilidade de um líquido
em manter contato com uma superfície sólida), resultante de um grande número de
interações intermoleculares. Este é um dos fatores que limita a penetração de fluidos,
representando um obstáculo para a passagem do agente antifúngico através das diferentes
camadas de células e da matriz polimérica do biofilme. Isto faz com que a concentração do
47
agente que atinge as células mais internas do biofilme seja muitas vezes inferior (MAH;
O'TOOLE, 2004). Estudos realizados em biofilmes de C. albicans, demonstraram que o
biofilme foi capaz de resistir a distintas concentrações de Terpinen-4-ol. No entanto quando
utilizados nanocarreadores lipídicos associados ao Terpinen-4ol, a atividade antimicrobiana
melhorou, sugerindo que nanocarreadores poderiam contornar este problema (SUN et al,
2012). Este mesmo fenômeno provavelmente ocorreu em nossos estudos, onde as
nanopartículas penetram através da matriz extracelular com maior facilidade e liberam o óleo
no interior do biofilme resultando em melhor atividade antimicrobiana.
6.6 ENSAIO DE DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTÉICA DO BIOFILME.
O presente estudo determinou a quantidade de proteínas presentes no biofilme após a
exposição a diferentes concentrações de óleo e nanopartículas de M. alternifolia. Como se
pode observar nas figuras 11, 12, 13, 14 e 15 a quantidade de proteínas foi reduzida na
presença do óleo e das nanopartículas nas concentrações testadas. Este foi um resultado
esperado, pois através da técnica de CV já foi possível visualizar uma diminuição da
amplitude do biofilme.
Figura 11- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por Bradford, (1976) em
biofilmes formados de C. albicans. Os resultados são expressos em µg/mL de proteínas (média ± erro padrão da
média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle
negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
Os biofilmes não são compostos somente por microrganismos. A matriz destas
comunidades microbianas é constituída por água, células, proteínas, produtos resultantes da
48
lise celular e EPS (BEHLAU e GILMORE, 2008). As proteínas são componentes de todas as
células vivas e com sucesso têm sido utilizadas como medida da biomassa celular em
biofilmes.
Figura 12- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por Bradford, (1976) em
biofilmes formados de C. tropicalis. Os resultados são expressos em µg/mL de proteínas (média ± erro padrão da
média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle
negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
Figura 13- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por Bradford, (1976) em
biofilmes formados de C. membranafaciens. Os resultados são expressos em µg/mL de proteínas (média ± erro
padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao
controle negativo. b- Diferença significativa com relação ao controle positivo.
49
O ensaio de Bradford é baseado na interação entre as moléculas de azul de Coomassie
G-250 e os grupos ácidos ou básicos das proteínas. Este reagente liga-se, preferencialmente,
aos resíduos de aminoácidos básicos e aromáticos, sendo amplamente utilizado para
quantificação de proteínas devido a sua sensibilidade, rapidez e fácil desempenho
(TSAFFRIR e SELINGER, 1996).
Figura 14- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por Bradford, (1976) em
biofilmes formados de C. parapsilosis. Os resultados são expressos em µg/mL de proteínas (média ± erro padrão
da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle
negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
Figura 15- A Quantificação de Proteínas foi determinada através da técnica proposta por Bradford, (1976) em
biofilmes formados de C. glabrata. Os resultados são expressos em µg/mL de proteínas (média ± erro padrão da
média). CN- Controle Negativo. Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo.
b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
50
6.7 ENSAIO DE DETERMINAÇÃO DE EPS NO BIOFILME FORMADO.
As figuras 16, 17, 18, 19 e 20 demonstram que há uma diminuição de
exopolissacarídeos na presença das concentrações analisadas de óleo e das nanopartículas de
M. alternifolia (15,6 e 31,2%) para todas as espécies analisadas. Estes resultados corroboram
com as técnicas anteriormente utilizadas, como CV e Proteínas.
Figura 16- A Determinação de exopolissacarídeos (EPS) no biofilme formado por C. albicans foi realizada
através da técnica de Lawrence e Betty (1989). Os resultados são expressos em absorbância a 500nm (média ±
erro padrão da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação
ao controle negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
Os microrganismos representam somente uma parte da massa de biofilme que,
frequentemente, é menor que 10%. As substâncias poliméricas extracelulares (Extracellular
Polymeric Substances - EPS), que formam um emaranhado polimérico que envolve todas as
células microbianas, representam cerca de 70 a 95% da matéria orgânica da massa seca do
biofilme (GEHRKE et al, 1998).
51
Figura 17- A Determinação de EPS no biofilme formado por C. tropicalis foi realizada através da técnica de
Lawrence e Betty (1989). Os resultados são expressos em absorbância a 500nm (média ± erro padrão da média).
CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b Diferença significativa com relação ao controle positivo.
Figura 18-A Determinação de EPS no biofilme formado por C. membranafaciens foi realizada através da
técnica de Lawrence e Betty (1989). Os resultados são expressos em absorbância a 500nm (média ± erro padrão
da média). CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle
negativo. b - Diferença significativa com relação ao controle positivo.
Segundo Kumar e Anand (1998), o aumento do EPS está intimamente associado ao
aumnto do tamnho do biofilme e sua capacidade de aderiancia a distintos substrates. A
produção de EPS aumenta com as adesões das bactérias às superfícies e se as células dos
biofilmes voltarem ao meio como células planctônicas, haverá uma redução na produção de
EPS.
52
Figura 19-A Determinação de EPS no biofilme formado por C. parapsilosis foi realizada através da técnica de
Lawrence e Betty (1989). Os resultados são expressos em absorbância a 500nm (média ± erro padrão da média).
CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b Diferença significativa com relação ao controle positivo.
Figura 20-A Determinação de EPS no biofilme formado por C. glabrata foi realizada através da técnica de
Lawrence e Betty (1989). Os resultados são expressos em absorbância a 500nm (média ± erro padrão da média).
CN- Controle Negativo. C+ - Controle Positivo. a - Diferença significativa com relação ao controle negativo. b Diferença significativa com relação ao controle positivo.
6.8 COLORAÇÃO DO BIOFILME ATRAVÉS DO CALCOFLUOR BRANCO.
O calcofluor é uma substância que torna a matriz extracelular com composição
polissacaridica fluorescente. Para a visualização das lâminas coradas com Calcofluor, foi
utilizado microscópio de fluorescência com uma câmera acoplada. Esta coloração serviu
53
como metodologia auxiliar para a coloração com Cristal violeta. A partir desta coloração,
foram geradas as figuras, 21, 22, 23, 24 e 25. As figuras corroboram com os resultados
obtidos na quantificação do biofilme formado através da técnica do Cristal Violeta onde há
demonstração clara da redução do biofilme formado na presença das nanopartículas de M.
alternifolia nas concentrações de 15,6 e 31,2%.
Figura 21- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As imagens foram obtidas
através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle
positivo: Meio de cultivo + C. albicans. C – Meio de cultivo + C. albicans + 15,6% de nanopartículas de M.
alternifolia. D - Meio de cultivo + C. albicans + 31,2% de nanopartículas de M. alternifolia.
54
Figura 22- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As imagens foram obtidas
através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle
positivo: Meio de cultivo + C. tropicalis. C – Meio de cultivo + C. tropicalis + 15,6% de nanopartículas de M.
alternifolia. D - Meio de cultivo + C. tropicalis + 31,2% de nanopartículas de M. alternifolia.
Figura 23- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As imagens foram obtidas
através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle
positivo: Meio de cultivo + C. membranafaciens. C – Meio de cultivo + C. membranafaciens + 15,6% de
nanopartículas de M. alternifolia. D - Meio de cultivo + C membranafaciens + 31,2% de nanopartículas de M.
alternifolia.
55
Figura 24- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As imagens foram obtidas
através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle
positivo: Meio de cultivo + C. parapsilosis. C – Meio de cultivo + C. parapsilosis + 15,6% de nanopartículas de
M. alternifolia. D - Meio de cultivo + C. parapsilosis + 31,2% de nanopartículas de M. alternifolia.
Figura 25- Análise do Biofilme formado através da técnica de Calcofluor Branco. As imagens foram obtidas
através de microscopia ótica em aumento de 10x. A - Controle negativo: Somente meio de cultivo. B - Controle
positivo: Meio de cultivo + C. glabrata. C – Meio de cultivo + C. glabrata + 15,6% de nanopartículas de M.
alternifolia. D - Meio de cultivo + C. glabrata + 31,2% de nanopartículas de M. alternifolia.
56
6.9 ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE
6.9.1 MTT
Os resultados obtidos para a citotoxicidade do óleo e das nanopartículas de de M.
alternifolia após 72 horas, são mostrados na Figura 26.
Figura 26- Citotoxicidade do óleo de M. alternifolia (A) e das Nanopartículas de M. alternifolia (B) após 72
horas, através da técnica de MTT. A análise estatística foi realizada por ONE- way ANOVA seguido de teste de
Dunnett.*Indica diferença significativa em comparação com o controle (p <0,001). PHA- Fitohemaglutinina. Os
valores são apresentados como média ± erro padrão da média.
O efeito dos tratamentos foi similar ao H2O2 (utilizado como controle de morte). Estes
resultados sugerem que todas as concentrações utilizadas neste estudo tanto do óleo livre
quanto à forma nanoestruturada apresentam uma atividade citotóxica. Para os ensaios de
citotoxicidade foram utilizadas as Células Mononucleadas de Sangue Periférico (CMSP).
Estas células têm sido aplicadas há muitos anos como biomarcadoras de efeitos cito e
genotóxicos, por serem abundantes na circulação sanguínea e quando são expostas a qualquer
agente mutagênico são capazes de refletir danos recentes. As CMSP semeadas em cultura
tornaram-se o modelo in vitro bastante promissor para diversos estudos, o que ressalta a
utilidade desta linhagem celular em estudos de cito-genotoxicidade (MALUF et al, 2011).
Os resultados do óleo livre corroboram com dois trabalhos previamente publicados
onde o óleo de M. alternifolia apresentou efeitos tóxicos contra monócitos humanos em
concentrações de 0,004% (HART et al, 2000) e contra neutrófilos humanos (em
concentrações superiores a 0,016%) (BRAND et al, 2001). A atividade citotóxica pode estar
relacionada a capacidade que os óleos essenciais têm de provocar uma despolarização das
membranas mitocondriais, afetando diversos canais iônicos, reduzindo o gradiente de pH,
57
além de alterar a fluidez das membranas, permitindo assim a entrada de radicais, citocromo C,
proteínas e íons, levando a morte da célula por apoptose e necrose (HAMMER et al, 2000;
BAKKALI et al, 2008).
Pouco se conhece sobre a citotoxicidade do óleo de M. alternifolia e diante desses
resultados é importante atentar que o óleo possui muitas propriedades medicinais, havendo
um grande número de relatos de suas atividades biológicas. Alguns autores descrevem o seu
potencial uso na medicina humana e veterinária e frente a isso se fazem necessários mais
estudos para que se possa estabelecer concentrações e modo de uso eficaz e seguro
(WESELER et al, 2002; OLIVA et al, 2003).
As nanopartículas de óleo de M. alternifolia se mostraram tão citotóxicas quanto o
óleo, um resultado surpreendente, pois é característica comum de sitemas nanoestruturados
uma liberação lenta, gradual do ativo e consequentemente uma menor toxicidade
(RUKHOLM et al, 2005). Um dos motivos especulados pode estar relacionado ao efeito
proteína-corona, que ocorre em algumas situações quando há aplicação de nanoestruturas em
sistemas biológicos. Neste fenômeno (associado à citotoxicidade das nanopartículas)
provavelmente há uma interação das nanopartículas de M. alternifolia com as proteínas
presentes no soro fetal bovino (presente no Meio de cultivo). Se não houver biomoléculas
suficientes no meio, as nanopartículas podem extrair componentes das próprias células. Isto
pode reduzir a disponibilidade proteica para a utilização por parte da célula, levando a morte
celular (LESNIAK et al, 2012).
Para analisar se o efeito Proteína-Corona está ocorrendo e interferindo na
citotoxicidade das nanopartículas foram realizado os seguintes testes:
6.9.2 Análise de rastreamento de nanopartículas (NTA)
As nanopartículas de óleo de M. alternifolia na presença de água deionizada
apresentaram um tamanho médio de 154,5 ± 1,5nm. Resultados que estão de acordo com os
dados obtidos com o espalhamento de luz dinâmico, como mostra a Tabela 2. Uma vez que
esta técnica permite a visualização e monitoramento de partículas individuais ou agregados,
parece ser ideal para obter uma melhor compreensão dos mecanismos que causam o aumento
do tamanho médio de partículas (LE et al, 2008). Quando estas mesmas nanopartículas foram
expostas na presença do meio de cultivo e a 10% de soro fetal bovino os tamanhos
apresentados foram de 276 ± 20nm (10 minutos de exposição). Demonstrando que as
58
nanopartículas aumentaram seu tamanho na presença do soro fetal bovino. Provavelmente há
a interação destas nanopartículas com as proteínas do meio de cultivo.
6.9.3 Ensaio de viabilidade celular - MTT
Foi utilizada a menor concentração de nanopartículas (0,04%) e foram adicionadas
concentrações crescentes de soro fetal bovino (Figura 28). A hipótese a ser testada é que um
aumento na concentração de soro fetal bovino induz um aumento na viabilidade celular. As
proteínas do soro fetal bovino adsorvem nas nanopartículas, reduzindo a disponibilidade de
proteínas para as células. A medida que há o aumento na concentração de soro fetal bovino
ocorre o aumento da disponibilidade de proteínas para as células e consequentemente
aumento da viabilidade celular.
Figura 27- Viabilidade celular na presença de 0,04% de nanopartículas de óleo de M. alternifolia em diferentes
concentrações de soro fetal bovino. a- Indica diferença significativa em comparação com o controle (p <0,05).
O mecanismo de morte, quando avaliada a toxicidade das nanopartículas
provavelmente está associado ao efeito proteína-corona. Há uma “reversão” da citotoxicidade,
já que na menor concentração (0,04%) as nanopartículas foram citotóxicas como mostra a
Figura 25. Utilizando as concentrações de 5 e 10% de soro fetal bovino as nanopartículas
apresentaram caráter citotóxico como mostra a Figura 27. Porém ao aumentar a concentração
de soro fetal bovino para 15 ou 20%, se observa um comportamento distinto, ou seja, as
nanopartículas não apresentam mais este caráter tóxico. Provavelmente este aumento na
concentração do soro fetal bovino adicionado ao meio “compense” a redução das proteínas
capturadas pelas nanopartículas.
59
7 CONCLUSÃO
Considerando os objetivos propostos neste trabalho e analisando-se os resultados
obtidos, é possível obter algumas conclusões em relação ao estudo realizado:
- O óleo de M. alternifolia utilizado apresentou 15 componentes majoritários e está de acordo
com as Normas da International Organization for Standardization (ISO 4730);
- As nanopartículas de óleo de M. altenifolia apresentaram diâmetro de partícula de 158 nm,
índice de polidispersão de 0,213 e o potencial zeta de -8,69 mV;
- O óleo e as nanopartículas de M. alternifolia apresentaram atividade antimicrobiana contra
os microrganismos: M. smegmatis, C. parapsilosis, C. albicans, C. tropicalis, C. dubliniensis,
C. glabrata sensível e resistente ao fluconazol, F. oxysporum, A. alternata, T. rubrum, e F.
pedrosoi. Para o Mycobacterium avium as nanopartículas não apresentaram atividade;
- Os microrganismos que apresentaram uma maior capacidade na formação de biofilmes
foram C. albicans, C. tropicalis, C. membranafaciens, C. parapsilosis e C. glabrata na
concentração de 1% de glicose;
- Houve uma redução nos níveis de proteínas nos biofilmes formados na presença do óleo e
das nanopartículas de M. alternifolia;
- O óleo e as nanopartículas de M. alternifolia demonstraram uma redução nos níveis de
exopolissacarídeos presentes no biofilme quando comparados com o controle positivo;
- Através da análise qualitativa do biofilme com a coloração Calcofluor branco foi possível
visualizar a redução do biofilme na presença das nanopartículas de M. alternifolia;
- A análise dos parâmetros citados acima demonstrou a atividade antibiofilme do óleo e das
nanopartículas de M. alternifolia frente as espécies de Candida estudadas;
- O óleo apresentou caráter citotóxico para todas as concentrações avaliadas. No entanto as
nanopartículas de M. alternifolia apresentaram uma menor citotoxicidade quando comparadas
com o óleo e provavelmente esta toxicidade está associada com o efeito proteína-corona.
60
8 ANEXOS
8.1 Publicações decorrentes da dissertação
8.1.1 Aceite do manuscrito no Periódico Journal of Drug Delivery Science and Technology.
61
8.1.2 Manuscrito aceito para publicação no periódico Fungal Genomics and Biology
62
63
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