Artigo científico original formatado para publicação (exemplo)

Título:
Prevalência de Parvovírus Humano B19 em Dadores de Sangue
Autores:
A. Ferreira (1, 2); A. Pina (1, 2); P. Palminha (3);C. Sargento (1,2)
1- Laboratório de Virologia do Serviço de Imuno-hemoterapia dos Hospitais da
Universidade de Coimbra
2- Escola Superior de Tecnologia da Saúde de Coimbra
3- Laboratório de Virologia do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge
Endereço para contacto:
Ana Ferreira
Laboratório de Virologia, Serviço de Imuno-hemoterapia
Hospitais da Universidade de Coimbra
Praceta Professor Mota Pinto
3049 - 075 Coimbra
Telefone: 239 400 546 / 239 400 400 – Extensão 12524
Resumo:
O Parvovírus B19 foi inicialmente identificado em dadores de sangue assintomáticos
por Cossart e colaboradores em 1975, na Inglaterra. O vírus está distribuído por todo o
mundo, com 20 a 80% dos adultos da Europa e Estados Unidos da América a mostrar
evidência de infecção antiga. Sabe-se que é transmitido por sangue e secreções
respiratórias dos doentes virémicos. Os métodos de inactivação viral no plasma não são
completamente eficazes na destruição do vírus. Os indivíduos adultos, mesmo na fase
aguda de virémia, são geralmente assintomáticos. Os métodos directos de pesquisa são
muito importantes na fase aguda, pois os anticorpos específicos ainda não são
detectados.
Tendo por objectivo determinar a prevalência do Parvovírus B19 em dadores de sangue
da região Centro de Portugal, estudaram-se 3000 amostras, obtidas por selecção
aleatória, nos meses de Maio a Julho de 2001. Na pesquisa do antigénio Parvovírus B19
foi utilizada uma técnica de aglutinação em coluna, baseada no princípio de
hemaglutinação mediada por receptor. As reacções positivas por esta técnica foram
confirmadas por PCR e feita a determinação de anticorpos específicos da classe IgM e
IgG. Observou-se uma frequência de 0,3% pela técnica de aglutinação em coluna e
0,1% após confirmação por PCR, o que corrobora outros estudos.
Palavras chave: Parvovírus B19, dador de sangue, infecção pós transfusão, segurança
transfusional
2
Introdução:
O Parvovírus B19 foi descoberto ocasionalmente em 1975, por Cossart e colaboradores,
enquanto estudavam a serologia da Hepatite B em dadores de sangue saudáveis 1.
Pertence à família Parvoviridae, e devido ao seu alto tropismo para as células
eritropoiéticas foi incluído no género Erythrovirus. É o único desta família conhecido
como agente patogénico para o homem2,3.
O Parvovírus B19 é um vírus pequeno, com cerca de 20 a 25 nm de diâmetro, de
simetria icosaédrica e sem invólucro lipídico o que lhe confere grande resistência.
Possuí um genoma ADN de cadeia simples, com aproximadamente 5 Kb, que codifica
uma proteína não estrutural (NS1), duas proteínas estruturais (VP1 e VP2) e diversos
peptídeos com função desconhecida2,3,4,5. A afinidade do vírus pelas células
progenitoras eritróides, deve-se à presença de um antigénio do grupo sanguíneo do
sistema P, conhecido como antigénio P ou globosídeo6. O antigénio P está presente não
só nos eritrócitos como também nos megacariócitos, células endoteliais e células da
placenta, fígado e coração fetal. As raras pessoas de fenótipo p (1/200.000),não
possuem o antigénio P, sendo naturalmente imunes á infecção pelo Parvovírus B193,4.
A população apresenta quatro grandes grupos de pessoas com riscos diferentes à
infecção: 1) indivíduos saudáveis por norma sofrem aplasia eritroíde devido a uma
paragem na eritropoise medular durante 5 a 7 dias acompanhada de rash e artropatia; 2)
grávidas, nas quais pode provocar abortamento e hidropsis fetalis ; 3) doentes com
patologia hematológica, podendo originar anemias agudas; 4)doentes imunodeprimidos,
nos quais pode induzir anemias crónicas2,3,4,5,7,8,9,10,11.
A infecção por Parvovírus B19 ocorre em todo o mundo, durante todo o ano e em todas
as idades, aquando dos surtos de eritema infeccioso ou em casos esporádicos3,4. Este
3
vírus possuí alta infecciosidade, estando descritos episódios com características
epidémicas em muitas comunidades. Os vírus estão presentes no sangue e secreções
respiratórias dos doentes virémicos, sendo o contacto directo o modo preferencial de
transmissão2,3,4,12. A virémia é curta e ocorre na fase precoce da infecção3,4.
Cerca de 30 a 60% dos dadores de sangue possuem anticorpos (anti-B19-IgG) que
indicam imunidade12,13,14. A incidência de virémia nos dadores de sangue é considerada
baixa, sendo estimada entre 1/3.300 a 1/50.0003,8,10,12.Os dadores virémicos são
normalmente assintomáticos, pelo que, nem os sintomas clínicos, nem a pesquisa de
anticorpos se revelam eficazes no momento da dádiva. Os métodos directos são muito
importantes na fase aguda, enquanto os anticorpos específicos não são detectados. Estes
métodos baseiam-se na pesquisa de partículas antigénicas, dos ácidos nucleícos ou na
cultura celular3,8. Sato e colaboradores consideram a hemaglutinação mediada por
receptor (RHA), usando a técnica de aglutinação em coluna (TAC), um teste funcional
na detecção de vírus intactos que se ligam específicamente ao receptor P 15,16.
Comparativamente, a PCR detecta os vírus intactos mas também partículas virusais
desnaturadas e inactivadas, sem carácter infeccioso. A positividade na PCR pode indicar
contaminação com Parvovírus B19, mas não necessariamente infectante3,12,15(Figura 1).
O risco estimado de desenvolver infecção em indivíduos não imunes, após contacto
com o Parvovírus B19 , é elevado e pode ter consequências nefastas3,5,8,9. Em Portugal
ainda não estão descritos estudos de prevalência deste vírus. Os objectivos deste estudo
são: determinar a prevalência do Parvovírus B19 nos dadores de sangue da região
Centro de Portugal e tentar demonstrar a necessidade de pesquisa deste vírus sobretudo
nas dádivas dirigidas para os receptores de alto risco a esta infecção.
4
Material e métodos
População:
Realizou-se um estudo numa população de 3000 dadores de sangue seleccionados
aleatóriamente na região centro de Portugal e distribuídos maioritariamente pela Beira
Litoral e parte da Beira Interior, nos meses de Maio a Julho de 2001. Esta população é
constituída por 68,2 % de homens e 31,8 % de mulheres, com idades compreendidas
entre os 18 e os 65 anos.
Todas as amostras de sangue foram colhidas sem anticoagulante para a obtenção de soro
e rotuladas com código de barras identificativo do número de colheita.
Pesquisa do antigénio Parvovírus B19:
A pesquisa do antigénio Parvovírus B19 foi efectuada por uma técnica de aglutinação
em coluna, usando o sistema “ID- Parvovirus B19” (DiaMed AG, Cressier, Suiça),
baseado na aglutinação de eritrócitos por ligação do Parvovírus B19 ao antigénio P ou
globosídeo17. De acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante, as células foram
preparadas com tampão ID-PV pH 5.8, de modo a optimizar a ligação, e misturadas ao
soro do dador na câmara de incubação do “card” que contendo partículas Parvovírus
B19 causam aglutinação
16
. Para separar as células aglutinadas das não aglutinadas a
mistura foi centrifugada ao longo da matriz de filtração do gel.
A leitura baseou-se na observação visual da ocorrência ou não de aglutinação no “card”.
Todos os resultados positivos foram repetidos.
5
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Extracção de DNA:
Incubaram-se 10 l de soro a 60 ºC durante 3 horas em 500 g/ml de proteinase K
(Boehringer Mannheim, Alemanha), 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 10 mM
de EDTA, 2% SDS. Procedeu-se à extracção com volume igual de fenol saturado com
TE (pH 8.0), fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e clorofórmio/álcool
isoamílico (24:1), respectivamente. Após precipitação com etanol, isolou-se o ADN do
parvovírus B19 por centrifugação. O centrifugado foi seco ao ar e dissolvido em 10 l
de água destilada. Utilizou-se uma alíquota de 2.5 l desta solução na amplificação
subsequente por PCR.
Amplificação por PCR:
A amplificação foi efectuada num volume de reacção de 25 l com 10 mM de Tris-HCl
(pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 0.001% de gelatina, 200 M de dNTPs, 100nM
de cada primer, 0.625 U de Taq ADN polimerase (Perkin Elmer, Foster City, EUA) e
ADN alvo. A reacção realizou-se num termociclador GeneAmp 9600 (Perkin Elmer,
Foster City, EUA). As temperaturas e tempos foram as seguintes: 1 ciclo de 5 minutos a
95 ºC, 1 minuto a 37 ºC, 1 minuto a 72 ºC; 38 ciclos de 1 minuto a 37 ºC, 1 minuto a 72
ºC, e 1 ciclo de 1 minuto a 95 ºC, 1 minuto a 37 ºC e 5 minutos a 72 ºC. As sequências
dos primers foram as seguintes: 5’-GGA ACA GAC TTA GAG CTT ATT C-3’ (nt
2537-2558) e 5’-GCT TGT GTA AGT CTT CAC TAG-3’ (nt 2795-2774). Os produtos
da reacção PCR foram submetidos a uma electroforese em gel de acrilamida a 7% em
tampão Tris-borato-EDTA. O gel foi corado com brometo de etídeo.
6
Determinação de anticorpos Parvovírus B19, da classe IgM e IgG:
A pesquisa de anticorpos específicos para o Parvovírus B19 foi executada por técnicas
ELISA - Parvovirus B19 IgM e Parvovírus B19 IgG (Biotrin International, Dublin,
Irlanda), de acordo com os protocolos fornecidos pelo fabricante. Estas técnicas
detectam anticorpos contra a proteína estrutural VP2, que constitui cerca de 95% da
cápsula do Parvovírus B19.
7
Resultados e discussão:
No rastreio a 3000 dadores de sangue para a pesquisa do antigénio Parvovírus B19,
usando uma técnica de aglutinação em coluna, obtivemos 10 amostras repetidamente
positivas (0.3%) e nas quais a confirmação por PCR mostrou reacção positiva em
apenas 3 amostras (0,1%). Das amostras positivas por PCR, duas não apresentaram
anticorpos nem da classe IgM nem IgG, indicando fase de virémia. Nesta fase, os
anticorpos específicos ainda não foram produzidos, sendo o dador potencialmente
infeccioso. A outra amostra PCR positiva apresentou apenas anticorpos da classe IgG, o
que se explica pela grande sensibilidade da PCR que detecta ADN Parvovírus B19 por
um longo período após a infecção, mesmo depois de os anticorpos IgM já terem
desaparecido. Em seis amostras positivas pelo método de aglutinação em coluna e
negativas por PCR apenas se detectaram anticorpos da classe IgG, indicando já
imunização nesses dadores. Uma outra amostra, fracamente positiva pela técnica de
aglutinação, foi considerada falsa positiva uma vez que tanto a PCR como a pesquisa de
anticorpos por ELISA se revelaram negativos. A existência de resultados falsos
positivos por TAC pode ser explicada pela menor especificidade do teste relativamente
à PCR e provavelmente por reacções inespecíficas devido a infecção anterior já
resolvida (Tabela 1).
A prevalência encontrada após confirmação por PCR foi de 0,1%. Comparando estes
resultados com a bibliografia referente ao uso de PCR verificamos que esta prevalência
é significativamente superior á descrita por Mc Osmish e colaboradores19 no estudo de
20.000 dadores na área de Edimburgo (0,03%) e inferior á descrita por Yoto e
colaboradores20 (0,6%) relativo a um período endémico de eritema infeccioso no Japão.
8
No entanto, esta prevalência foi a encontrada num estudo realizado em 10.200 dadores
voluntários em Pittsburgh, nos EUA, por Jordan e colaboradores13,14.
Analisando, nas dez amostras positivas por aglutinação, os outros parâmetros
obrigatórios a todas as dádivas: HBsAg, HBcAc, AcHCV, Ac HIV 1+2 e HTLV 1+2,
Treponema pallidum (VDRL), hemograma e doseamento da alanina aminotransferase
(ALT) verificamos que duas amostras apresentaram valores de ALT superiores ao valor
estipulado como normal no Serviço, e outra amostra foi positiva para o HBcAc e
posteriormente para o HBsAc com um título de 49UI/L (Tabela 2). Desta forma, apenas
dois componentes (concentrado eritrócitário e concentrado plaquetar ) das três dádivas,
cuja PCR foi positiva, foram administrados.
Sabe-se que o Parvovírus B19 é transmitido por transfusões e pode ter consequências
nefastas, nomeadamente em imunodeprimidos e grávidas. Cohen e colaboradores11
descrevem um caso de anemia aplástica crónica devido a infecção pelo Parvovírus B19,
após transfusão de um concentrado plaquetar num doente transplantado de medula
óssea. Jordan e colaboradores14 relatam o caso de um índividuo transplantado hepático
que desenvolveu anemia crónica depois de ter recebido, dois dias após o transplate, um
concentrado eritrócitário com ADN Parvovírus B19 e sem imunoglobulinas específicas.
No nosso estudo, tentámos fazer uma avaliação clínica do receptor do concentrado
plaquetar da dádiva cuja PCR foi positiva e sem alterações nos outros parâmetros
analisados. O receptor foi um indivíduo de 24 anos, doente de Hematologia e com
diagnóstico de leucemia mielóide aguda M3v.Os hemogramas na data da transfusão e
dias seguintes revelaram um quadro de infecção que foi acompanhada de febre. No
entanto, foi-lhe diagnosticada uma apendicite que após a cirurgia, sete dias depois da
transfusão, se manifestou em valores de hemogramas normalizados (Tabela 3).
9
De referir, que a presença de anticorpos aumenta com a idade, sendo que 40-60% dos
adultos são anti-IgG positivos, indicando por norma imunidade duradoura, embora haja
casos descritos de reinfecção
3,4,14
. A ausência
de doença nalguns receptores de
unidades ADN positivas pode ser explicada em parte pelo efeito protector dos
anticorpos específicos dos componentes recebidos, assim como, pela probabilidade de a
maioria dos adultos já possuírem anticorpos Parvovírus B19 IgG3,13,14.
A sensibilidade do método de hemaglutinação usando a técnica de aglutinação em
coluna(TAC) é de 108-1010partículas /ml comparativamente à PCR cuja sensibilidade se
situa entre 100-102equivalentes genoma /ml
8,16,18
. Sabendo que, na fase de virémia o
título de Parvovírus B19 é aproximadamente 1012partículas/ml e a “clearance” viral
ocorre entre 3 a 6 meses, sugere-nos que o nível de sensibilidade da técnica de
aglutinação em coluna é apropriado para a detecção na fase aguda da infecção por
Parvovírus B19. Deste modo, a pesquisa do antigénio pela técnica de aglutinação em
coluna não excluí completamente a transmissão do Parvovírus B19 nas transfusões, mas
o risco está seguramente reduzido. Outros factores como o custo, a simplicidade de
execução, o espaço necessário, o tempo para obter o resultado e a versatilidade do teste,
contribuem para a fácil adaptação aos bancos de sangue no rastreio individual de
dadores em larga escala. Este método surge como boa alternativa à pesquisa de ADN,
sem alterar significativamente a rotina laboratorial e contribuindo para que o risco de
infecção Parvovírus B19 pós transfusão seja menor.
10
Conclusão:
A prevalência encontrada em dadores de sangue da região centro de Portugal, após
confirmação por PCR, foi de 0.1% (1/1000).Esta prevalência mostra que o rastreio
nestes dadores pode ser importante e poderá contribuir para um aumento na segurança
transfusional. O uso de testes simples e rápidos como a hemaglutinação por TAC
permitem detectar a fase de virémia, reduzindo substancialmente o risco de infecção
nos receptores. No entanto, permanecem dúvidas sobre o título de Parvovírus B19
suficiente para provocar a infecção. Serão necessários mais estudos para avaliar as
consequências nos receptores, caracterizando melhor os efeitos clínicos e infeciosidade,
e clarificar a importância da infecção na Saúde Pública.
Uma amostragem de dadores de sangue mais significativa permitirá esclarecer e
determinar a prevalência real do Parvovírus B19 em Portugal.
11
Referências:
1 Cossart YE, Field AM, Cant B, Widdows D. Parvovirus-like particles in human
sera. Lancet 1975; 11: 72.
2 Azzi A, Morfini M, Mannucci M. The transfusion-associated transmission of
parvovirus B19. Transfusion Med Rev 1999; 13: 194.
3 Araújo F, Koch MC, Monteiro F, Araújo AR. A infecção pelo parvovirus B19. Acta
Med Port 1999; 12: 195.
4 Godinho C, Costa M, Alegria A, Coimbra E. Infecção por parvovirus B19-revisão
bibliográfica. Rev Port Doenc Infec 1994; 4: 215.
5 Wakamatsu C, Takakura F, Kojima E, Kiriyama Y, Goto N, Matsumoto, Oyama M,
Sato H, Okochi K, Maeda Y. Screening of blood donors for human parvovirus B19
and characterization of the results. Vox Sang 1999; 76: 14.
6 Brown KE, Anderson SM, Young NS. Erythrocyte P antigen: cellular receptor for
B19
Parvovirus. Science 1993; 262: 114-117.
7 Santagostino E, Mannucci PM, Gringeri A, Azzi A, Morfini M. Eliminating
Parvovirus B19 from blood products. Lancet 1994; 343: 798.
8 Siegi G, Cassinotti P. Presence and significance of parvovirus B19 in blood and
blood products. Biologicals 1998; 26: 89.
9 Prowse C, Ludlam CA, Yap PL. Human parvovirus B19 and blood products. Vox
Sang 1997; 72: 1.
12
10 Aubin JT, Defer C, Vidaud M, Maniez Montreuil M, Flan B. Large-scale screening
for human parvovirus B19 DNA by PCR : application to the quality control of
plasma for fractionation. Vox Sang 2000; 78:7.
11 Cohen BJ, Beard S, Knowles WA, Ellis JS, Joske D, Goldman JM, Hewitt P, Ward
KN. Chronic anemia due to parvovirus B19 infection in a bone marrow transplant
patient after platelet transfusion. Transfusion 1997; 37: 947.
12 Tsujimura M, Matsushita K, Shiraki H, Sato H, Okochi K, Maeda Y. Human
parvovirus B19 infection in blood donors. Vox Sang 1995; 69: 206.
13 Tankersley DL. Safety of multiple-unit transfusions. Vox Sang 2000; 78: 132.
14 Jordan J, Tiangco B, Kiss J, Koch W. Human parvovirus B19: prevalence of viral
DNA in volunteer blood donors and clinical outcomes of transfusion recipients. Vox
Sang 1998; 75: 97.
15 Sato H, Takakura F, Kojima E, Fukada K, Okochi K, Maeda Y. Screening of blood
donors for human parvovirus B19. Lancet 1995; 346: 1237.
16 Cohen B, Millar A, Schwind P. Screening blood donations for parvovirus B19.
Lancet 1995; 346: 1631.
17 Brown KE, Cohen BJ. Haemagglutination by parvovirus B19. J Gen virol 1992; 73:
2147-2149.
18 Sekiguchi S, Sato S, Kato T. Human parvovirus B19 DNA detected by receptormediated hemagglutination assay of pooled plasma for fractionation. Transfusion
1998; 38: 108.
13
19 Mc Omish F, Yap PL, Jordan A, Hart H, Cohen BJ, Simmonds P. Detection of
parvovirus B19 in donated blood: a model system for screening by polymerase chain
reaction. J Clin Microbiol 1993; 31: 323-328.
20 Yoto Y, Kudoh T, Haseyama K, Suzuki N, Oda T, Katoh
T, Takahashi T,
Sekiguchi S, Chiba S. Incidence of human parvovirus B19 DNA detection in blood
donors. Br J Haematol 1995; 91: 1017.
14
Agradecimentos :
Os autores agradecem à Drª Ana Esesumaga e à Drª Maria De La Lastra a colaboração
prestada na consulta de processos de doentes.
15
PCR
ID-B19
IgM B19
IgG B19
Virémia
0
2
4
6 8 10 12 14
Dias
Meses
Figura 1
16
Tabela 1: Comparação de diferentes técnicas de análise laboratorial para o estudo da
infecção pelo Parvovírus B19 (TAC, PCR, Anti-B19 IgM e Anti-B19 IgG), em
amostras TAC positivas.
Hemaglutinação
PCR
Anti- B19
Anti- B19
(TAC)
B19 DNA
IgM
IgG
1
++++
+
-
-
2
+++
+
-
-
3
+++
+
-
+
4
+++
-
-
+
5
++
-
-
+
6
++
-
-
+
7
++
-
-
+
8
+
-
-
+
9
+
-
-
+
10
+
-
-
-
17
Tabela 2: Parâmetros analíticos obrigatórios efectuados aos dadores de sangue,
referentes ás dádivas positivas por TAC.
Amostra Sexo HBsAg HBcAc HBsAc AcHIV AcHTLV AcHCV
1+2
1+2
VDRL ALT
Hb
1
M
-
-
ND
-
-
-
-
126
>13.5
2
M
-
-
ND
-
-
-
-
<68
>13.5
3
F
-
-
ND
-
-
-
-
39
>12.5
4
M
-
-
ND
-
-
-
-
<68
>13.5
5
M
-
+
+
-
-
-
-
<68
>13.5
6
F
-
-
ND
-
-
-
-
<38
>12.5
7
M
-
-
ND
-
-
-
-
<68
>13.5
8
F
-
-
ND
-
-
-
-
<38
>12.5
9
M
-
-
ND
-
-
-
-
<68
>13.5
10
F
-
-
ND
-
-
-
-
<38
>12.5
ND= não determinado
18
Tabela 3: Valores dos hemogramas e temperaturas do receptor do concentrado
plaquetar com PCR positiva e sem imunoglobulinas específicas para o Parvovírus B19.
Dia após Hemoglobina
Eritrócitos
Leucócitos
Plaquetas
Temperatura
transfusão (g/dl)
(T/l)
(G/l)
((G/l)
(ºC)
D0
9,2
3,05
1,33
19
38,0
D2
7,6
2,53
1,02
29
38,5
D5
9,1
3,02
1,58
14
38,5
D7
8,3
2,57
2,49
17
41,0
D19
11,0
3,65
5,20
408
37,5
19
Figura 1: Evolução serológica da infecção pelo Parvovírus B19. A fase de virémia
ou fase aguda é curta, de aproximadamente 10 dias após a exposição ao vírus. Esta fase
pode ser inicialmente detectada por PCR, seguindo-se com poucos dias pelo teste “IDB19” na pesquisa do antigénio, enquanto os anticorpos específicos ainda não são
detectados. A “clearance” viral ocorre entre 3 a 6 meses, mantendo-se apenas anticorpos
específicos IgG, indicando imunização.
20