DISSERTAÇÃO FINAL DE ACHICIANE FURNO PIRES

UVV - CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
RESPOSTA IMUNOLÓGICA EM CÃES ADULTOS
ALIMENTADOS COM DIETAS SUPLEMENTADAS COM LGLUTAMINA E L-ÁCIDO GLUTÂMICO
Achiciane Furno Pires
VILA VELHA – ESPÍRITO SANTO
Maio de 2011
UVV - CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
RESPOSTA IMUNOLÓGICA EM CÃES ADULTOS
ALIMENTADOS COM DIETAS SUPLEMENTADAS COM LGLUTAMINA E L-ÁCIDO GLUTÂMICO
Achiciane Furno Pires
Orientador: Prof. DSc. Douglas Haese
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Ciência Animal do Centro
Universitário Vila Velha, para a obtenção do
título de Mestre em Ciência Animal.
VILA VELHA – ESPÍRITO SANTO
Maio de 2011
Catalogação na publicação elaborada pela Biblioteca Central / UVV-ES
P667r
Pires, Achiciane Furno.
Resposta imunológica em cães adultos alimentados com
dietas suplementadas com L-Glutamina e L-Ácido Glutâmico /
Achiciane Furno Pires. – 2011.
41 f.: il.
Orientador: Prof. DSc. Douglas Haese
Dissertação (mestrado em Ciência Animal) – Centro
Universitário Vila Velha, 2011.
Inclui bibliografias.
1.
Cães. 2. Nutrição animal. 3. I. Haese, Douglas. II.
Centro Universitário Vila Velha. III. Título.
CDD 636.70852
UVV - CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA
PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
CERTIFICADO DE APROVAÇÃO
Resposta imunológica em cães adultos alimentados com dietas suplementadas com Lglutamina e L-ácido glutâmico
Autora: Achiciane Furno Pires
Orientador: Prof. DSc. Douglas Haese
APROVADO como parte das exigências do Programa de Mestrado em Ciência Animal para
obtenção do título de MESTRE em CIÊNCIA ANIMAL
Vila Velha, 30 de maio de 2011.
Banca Examinadora
Prof(a).Dr./Dra.______________________________________________________
(Douglas Haese)
Prof(a).Dr./Dra.______________________________________________________
(João Luís Kill)
Prof(a).Dr./Dra.______________________________________________________
(Geraldo Luiz Colnago)
Epígrafe
“A maioria dos aminoácidos tem múltiplas
funções, mas a glutamina parece ser o mais
versátil”
Hans Adolf Krebs, 1980
Dedicatória
Dedico a Deus, ao meu esposo e ao meu filho,
as três razões que eu tenho para lutar.
AGRADECIMENTOS
Agradecer é sempre necessário, agradecer a Deus por existir, Ele que nos deu tudo, o sopro da
vida, a força da existência, a fé de enfrentar os obstáculos da vida e da morte, sem nos exigir
absolutamente nada.
Ao meu esposo Bruno Zanet, meu filho Bruno, minha família, à minha família de escolha,
Jovana Zuccon Betini, Jeonildes Betini, Júlia e André Betini.
Aos meus amigos Lorena Goldner, Krishna Duro de Oliveira, Marcelo Monte Mor Rangel,
Georgia Galaes, Yuka Takasago, Isabella Rios, Rosa Maria dos Santos Brito, Silvia
Magalhães, Daniele Rankel Fernandes.
Meus queridos professores da graduação, que não citarei nomes, mas vale para todos, ao meu
orientador professor Dr. Douglas Haese, ao professor Dr. João Luís Kill, que me encorajou a
iniciar o mestrado, ao professor Dr. Geraldo Luiz Colnago que aceitou gentilmente participar
da minha banca e ao professor Dr. Ricardo Souza Vasconcellos, que muito colaborou neste
trabalho.
Ao Laboratório Marcos Daniel pela disponibilidade, em especial ao professor MSc. Marcelo
Renan de Deus Santos e ao tão prestativo amigo Rodney Cesana Lobo.
À Universidade Estadual de Londrina (UEL) que me recebeu tão gentilmente, principalmente
a equipe do Laboratório de Virologia, que teve participação primordial nos resultados do meu
trabalho, particulamente ao professor Dr. Amauri Alfiere, professora Dra. Alice Alfiere,
Juliana Torres Tomazi Fritzen, Rodrigo Otonel e Raquel de Arruda Leme.
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................................... 7
2. REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 9
2.1 História da imunologia............................................................................................................................... 9
2.2 Imunidade ................................................................................................................................................. 10
2.2.1 Imunidade inata .................................................................................................................................. 11
2.2.2 Imunidade adquirida .......................................................................................................................... 11
2.2.3 Imunoglobulinas ................................................................................................................................. 13
2.3 Utilização dos testes sorológicos .............................................................................................................. 13
2.4 Importância da nutrição no sistema imunológico.................................................................................. 14
2.4.1 A importância da Glutamina .............................................................................................................. 15
2.4.1.1 Fontes de Glutamina................................................................................................................... 16
2.4.2 Glutaminase........................................................................................................................................ 17
2.4.3 Metabolismo da glutamina no intestino.............................................................................................. 17
2.4.4 Importância da glutamina para os linfócitos...................................................................................... 18
2.5 Ácido Glutâmico ....................................................................................................................................... 18
2.6 Fitohemaglutinina .................................................................................................................................... 19
3. ARTIGO CIENTÍFICO..................................................................................... 21
3.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................................ 23
3.2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................................... 25
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................................................. 30
3.4 CONCLUSÃO .......................................................................................................................................... 36
3.5 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................................... 36
4. REFERÊNCIAS ................................................................................................. 38
7
1. INTRODUÇÃO GERAL
Para que o organismo consiga combater os causadores de enfermidades, são
necessários múltiplos sistemas de defesa que interagem para protegê-lo (Tizard, 2002). A
defesa do corpo provém de um sistema complexo de mecanismos sobrepostos e interligados,
denominado sistema imune (OMS 1993; Tizard, 2002).
Uma forma de verificar a imunidade de um animal é dosar imunoglobulinas (Ig), que
são glicoproteínas, compostas por cinco classes que se diferenciam quanto ao uso das cadeias
pesadas. A IgG é a classe encontrada no soro com maior concentração (OMS, 1993; Tizard,
2002).
Dentre os aminoácidos (AA) importantes para o restabelecimento do animal, está a
glutamina (Gln), sendo de suma importância para as células de alta replicação, tais como as
do trato gastrointestinal (TGI) e as do sistema imune, como linfócitos, macrófagos e timócitos
(Elliott & Biourge, 2006).
A Gln é considerada o AA mais abundante no plasma e no tecido muscular (Shabert &
Ehrlich, 1994), embora não seja considerada um AA essencial, pois pode ser sintetizada pelo
organismo (Curi, 2000). Porém a síntese de Gln pode não ser suficiente para corresponder ao
aumento da absorção e do metabolismo do TGI e da demanda do sistema imunológico de
pacientes enfermos, sendo assim classificada como aminoácido condicionalmente essencial
(Elliott & Biourge, 2006). Em condições estressantes, traumas, neoplasias, exercícios físicos
extremos, a quantidade de Gln pode diminiur até 50% (Curi, 2000). Segundo Wu et al.
(2010), a afirmação de que a Gln não é um AA essencial vem da dificuldade que existia em
dosá-la e da suposição infundada de que os animais podem sintetizar quantidades suficientes
para satisfazer às suas necessidades.
Na presença de uma doença, o aumento da necessidade e o consumo de fontes pobres
de Gln podem resultar em um comprometimento do sistema imunológico devido à redução da
produção de anticorpos, da barreira da mucosa do intestino, aumentando assim o risco de
infecções, que podem evoluir para um quadro de sepsemia (Elliott & Biourge, 2006).
Newsholme et al. (2003) propõem que, a Gln e o glutamato sejam considerados tão
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importantes quanto à glicose para o bom funcionamento das células, devido à importância que
esses AA desempenham em inúmeras funções do organismo.
A alta taxa de gliconeogênese acelera o catabolismo da Gln em um animal sob estresse
(Elliott, 2004), pois ela serve como substrato gliconeogênico para o fígado, e é altamente
consumida por células de divisão rápida, como células tumorais, enterócitos, fibroblastos e
tecidos como rins, fígado e cérebro (Curi, 2000). Sob alta demanda, a síntese muscular da Gln
é freqüentemente insuficiente e a concentração sérica decresce (Elliott, 2004).
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 História da imunologia
No século XII, os chineses, que também sofriam com surtos de doenças como varíola
ou a peste bubônica, observaram que pacientes recuperados da varíola tornavam-se resistentes
a ataques posteriores. Sendo assim, começaram a infectar crianças deliberadamente,
utilizando crostas das lesões da varíola extraídas de indivíduos infectados, em pequenos cortes
na pele das crianças. Os sobreviventes da doença resultante tornavam-se imunes à varíola pelo
resto da vida. Esta prática era aceita devido à alta taxa de mortalidade na época tendo como
resultado uma mortalidade oriunda da inoculação ou variolação reduzida para 1%, onde a
mortalidade de casos de varíola clínica era de 20% (Tizard, 2002). O médico inglês Edward
Jenner, em 1798, percebeu que poderia substituir as lesões de varíola bovina pela humana na
variolação. Desta forma, utilizou lesões de varíola bovina por ser mais amena no homem para
fazer o processo de variolação. Tendo resultado eficaz, denominou essa técnica de vacinação
(vacca do Latim vaca) que, por sua vez, foi utilizada na década de 1970 para erradicar a
varíola humana do mundo (Coico & Sunshine, 2009).
Em 1879, Louis Pasteur, na França, utilizando as descobertas de Jenner, investigou a
cólera aviária causada pela bactéria Pasteurella multocida. Inoculando uma cultura esquecida
por seu assistente no laboratório em galinhas, percebeu-se que as aves se mantiveram
saudáveis. Nessas mesmas aves, Pasteur inoculou uma cultura fresca e as aves permaneceram
sadias, reconhecendo assim este fenômeno como semelhante à vacinação de Jenner utilizada
na varíola bovina. Porém, Pasteur percebe que cepas avirulentas podiam provocar uma
resposta imune. Por conseguinte, ele criou uma vacina para ovinos contra bactérias virulentas
de antraz, a vacina contra raiva. O pesquisador Salmon, nos Estados Unidos, descobriu que as
vacinas podiam ser produzidas através de organismos mortos e mais tarde, Von Behring e
Kitasato, na Alemanha, utilizaram filtrado de cultura do bacilo do tétano (Clostridium tetani)
para proteger os animais contra a doença, mostrando que neste caso, não era necessário a
bactéria, e sim a toxina por ela produzida para a imunização dos animais (Tizard, 2002).
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Após a descoberta de Pasteur sobre a possibilidade de produzir imunidade pela vacina,
foi reconhecido que as substâncias que proporcionavam essa imunidade poderiam ser
encontradas no soro sanguíneo, através de um experimento onde foi utilizado soro de cavalos
vacinados contra tétano em cavalos não vacinados, que permaneceram resistentes ao tétano
por várias semanas, conhecida como imunidade passiva. Assim, descobriu-se que os fatores
protetores encontrados no soro dos animais imunizados são proteínas, que hoje são
conhecidas como anticorpos. Porém, no caso do tétano, este soro não é capaz de estimular a
produção de anticorpos, somente a toxina tetânica extraída da bactéria, considerada uma
substância estranha, seria capaz de estimular uma resposta imune. Essa substância passou a
ser conhecida como antígeno, formando assim uma imunidade ativa (Tizard, 2002). Os
antígenos são moléculas identificadas pelo sistema imunológico podendo ser uma substância
solúvel, como as toxinas, ou uma substância presente em uma bactéria, vírus, outra célula de
superfície ou parede celular (OMS, 1993). A desvantagem dessa imunização é que, ao
contrário da passiva que fornece anticorpos imediatos, ela não confere proteção imediata,
porém sua duração é longa uma vez que ela é estabelecida, e pode ocorrer uma reestimulação
caso o animal passe por uma reimunização ou infecção (Tizard, 2002).
2.2 Imunidade
Para que o organismo consiga expulsar invasores causadores de enfermidades, são
necessários múltiplos sistemas de defesa que possam interagir contra vários tipos de invasores
ou destruir organismos específicos. Alguns sistemas atuam somente na superfície do corpo,
outros agem internamente combatendo os patógenos que conseguiram vencer o mecanismo de
defesa externo (Tizard, 2002). A defesa do corpo provém de um sistema complexo de
mecanismos sobrepostos e interligados, denominado sistema imune (OMS 1993; Tizard,
2002). Uma falha deste mecanismo pode resultar em doenças ou até em morte (Tizard, 2002).
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2.2.1 Imunidade inata
O corpo possui muitas defesas e a primeira delas é a barreira física que é constituída
pela pele, que cicatriza assegurando uma reparação rápida, e nas outras superfícies corpóreas
o processo de limpeza se faz através de autolimpeza, tosse, muco do trato respiratório,
espirros, vômito e diarréia. A microbiota normal do trato gastrointestinal (TGI) também
elimina invasores em potencial, e existe ainda o fluxo urinário. Porém essas barreiras podem
falhar, então entra em ação o sistema imune inato, que é constituído por mecanismos
químicos e celulares de defesa que contam com o fato de que microorganismos invasores são
quimicamente diferentes dos componentes do organismo. Os animais possuem enzimas e
proteínas ligadoras de carboidrato que são capazes de destruir as bactérias, bem como células
que reconhecem estruturas moleculares associadas com invasão de microorganismos e
desencadear a sua destruição. A habilidade do corpo em focalizar a defesa nos sítios de
invasão bacteriana é chamada de inflamação (Tizard, 2002; Coico & Sunshine, 2009).
No processo inflamatório ocorrem trocas locais nos tecidos invadidos por bactérias,
bem como aumento de fluxo sanguíneo resultante do acúmulo de células, conhecidas como
neutrófilos e monócitos, que podem atacar e destruir invasores. Também são liberadas
enzimas produzidas pela presença de invasores, e estas constituem o sistema de complemento.
Existe ainda um mecanismo específico para responder à lipopolissacarídeos bacterianos, que
são as lisozimas, moléculas antimicrobianas naturais, presentes no organismo dos animais,
capazes de digerir carboidrato e proteínas ligadoras a carboidrato, acelerando assim a
destruição dos invasores, mecanismo este conhecido como via alternativa do complemento
(Tizard, 2002).
2.2.2 Imunidade adquirida
Apesar de a imunidade inata ser efetiva, ela não consegue promover uma defesa total
para o organismo, sendo necessária uma imunidade que possa destruir os invasores e aprender
a reconhecê-los quando encontrá-los novamente, esta imunidade é conhecida como adquirida.
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Este sistema é dividido em dois ramos, a reposta celular, constituída por células
citotóxicas especializadas, que destroem células anormais, responsáveis em combater
invasores que vivem ou têm sua origem dentro das células do corpo, como por exemplo,
vírus, bactérias ou protozoários intracelulares e células cancerosas (Tizard, 2002; Coico &
Sunshine, 2009).
O segundo ramo é a resposta humoral, que é conhecida por este nome quando
proteínas denominadas anticorpos são encontradas nos fluidos corpóreos (humor),
responsável por combater organismos originados fora do corpo, bactérias, muitos protozoários
e invasores. Esses anticorpos são produzidos por linfócitos denominados células B, que são
encontrados no córtex dos linfonodos, na zona marginal do baço, na medula óssea e nas
placas de Peyer do intestino, e somente um pequeno número circula na corrente sanguínea,
essa célula possui um grande número de receptores antigênicos idênticos podendo assim ligarse e responder somente a um antígeno simples, esses receptores são gerados aleatoriamente
durante o desenvolvimento da célula B, cada célula é coberta com cerca de 200 a 500 mil
receptores antigênicos idênticos, conhecidos como BCR (Tizard, 2002; Coico & Sunshine,
2009).
Com a erradicação da varíola no mundo, controle da febre aftosa e de várias outras
doenças, a vacinação é considerada hoje o método mais eficaz nos últimos 20 anos para o
controle de doenças (Tizard, 2002). A vacina é um processo artificial de imunização ativa,
que tem como objetivo proporcionar imunidade específica e duradoura de uma determinada
doença, mimetizando o processo natural que ocorre quando o animal é infectado e seu sistema
linfóide é ativado. Porém, com a vacina evita-se a ocorrência da doença infecciosa de causa
natural. As vacinas utilizadas são constituídas por toxóides ou anatoxinas, que são exotoxinas
modificadas por processos físicos ou químicos, extrato bacteriano, vírus inativados ou vivos
atenuados e bactérias mortas ou vivas modificadas (Baldy, 1981).
13
2.2.3 Imunoglobulinas
As imunoglobulinas são glicoproteínas, as quais são abreviadas por Ig. São compostas
por cinco classes diferentes que se diferem quanto ao uso das cadeias pesadas. A IgG é a
classe encontrada no soro com maior concentração (OMS, 1993; Tizard, 2002), seguida pela
IgM, IgA que está predominante nas secreções salivares, leite ou fluido intestinal, IgD,
raramente encontrada nos fluidos corpóreos e pode não estar presente em todos os mamíferos,
e IgE, que pode ser encontrada em concentrações muito baixas no soro e é mediadora das
reações alérgicas (Tizard, 2002).
A IgG tem sua produção e secreção efetuada pelos plasmócitos situados no baço,
linfonodos e medula óssea. Por ser a de maior concentração no sangue, exerce o papel
principal nos mecanismos de defesa mediados por anticorpos. Seu peso molecular é de 180
kDa, possui uma típica estrutura de BCR. É formada por duas cadeias pesadas γ, e duas
cadeias leves, que podem ser do tipo λ ou κ, sendo a menor das moléculas de Ig, podendo
assim escapar mais facilmente dos vasos sanguíneos, em relação às outras moléculas Ig. A
importância disto é que, em um processo inflamatório, o aumento da permeabilidade vascular
permite facilmente que a IgG participe do processo de defesa do fluido tecidual e das
superfícies corpóreas, ligando-se prontamente a antígenos estranhos. Sua presença em uma
superfície microbiana pode causar o seu agrupamento e induzir a uma opsinização (Tizard,
2002).
2.3 Utilização dos testes sorológicos
O exame sorológico, além de detectar a presença de agentes infecciosos, é a forma
mais comum de avaliar o status imunológico do organismo. Embora seja muito utilizado na
detecção de hormônio, drogas e proteínas, é provável que a sorologia, na medicina veterinária,
tenha como principal função o diagnóstico de doenças infecciosas. Basicamente, a
quantificação de antígeno e anticorpo pode ser efetuada de duas maneiras: detecção do
anticorpo específico em fluidos ou tecidos de um animal, que fornece evidência que esse
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animal tenha sido exposto a um determinado antígeno ou detectar o antígeno específico
através de reação com anticorpos específicos. Em relação aos resultados, os imunoensaios
sorológicos podem ser apresentados de duas formas: positivo ou negativo, enquanto os testes
submetidos à diluição de amostra, como por exemplo, fluorescência, mudança de cor e
aglutinação, prevê um título (Cohn, 2005).
2.4 Importância da nutrição no sistema imunológico
Segundo Elliott & Biourge (2006), estima-se que 50% dos cães de pequeno porte, que
são internados, estão desnutridos. Esse fato contribui para tornar o estado de saúde do animal
mais crítico pois, com a desnutrição ocorre um comprometimento na função imunológica,
aumento da susceptibilidade à infecção, da morbidade e mortalidade e retardo na cicatrização.
A resposta imune implica em síntese de compostos protéicos ativos e replicação
celular. Com isso, a desnutrição atrapalha uma resposta imunológica eficaz. As vitaminas A,
B6 (piridoxina), B9 (ácido fólico), B12 (cianocobalamina), D e E, os aminoácidos (AA) e os
minerais, ferro, zinco, cobre, magnésio e selênio, são nutrientes já estudados e comprovados
que atuam no funcionamento do sistema imune (Brunetto et al., 2007).
Dentre os aminoácidos importantes para o restabelecimento do animal, está a
glutamina, pois ela é de suma importância para as células de alta replicação tais como as do
TGI e as do sistema imune, como linfócitos, macrófagos e timócitos (Elliott & Biourge,
2006). Ela também é precursora dos nucleotídeos purinas e pirimidinas, participa do
equilíbrio ácido-base (Newsholme et al., 2003; Elliott & Biourge, 2006), faz parte da
desintoxicação, transportando nitrogênio entre os tecidos, regulador de síntese de proteínas
hepáticas e ainda mantém as células secretoras de IgA da mucosa do intestino (Elliott &
Biourge, 2006).
15
2.4.1 A importância da Glutamina
A Gln é considerada o AA mais abundante no plasma e no tecido muscular (Shabert &
Ehrlich, 1994), embora não seja considerada um AA essencial, pois pode ser sintetizada pelo
organismo, a partir de reações que envolvem enzimas, ácido glutâmico e amônia (Curi, 2000).
A síntese de Gln pode não ser suficiente para corresponder ao aumento da absorção e do
metabolismo do TGI e da demanda do sistema imunológico de pacientes enfermos, sendo
assim classificada como aminoácido condicionalmente essencial (Elliott & Biourge, 2006).
Em condições estressantes, traumas, neoplasias, exercícios físicos extremos, a quantidade de
Gln pode diminiur até 50% (Curi, 2000). Segundo Wu et al. (2010), a afirmação de que a Gln
não é um AA essencial vem da dificuldade que existia em dosá-la e da suposição infundada
de que os animais podem sintetizar quantidades suficientes para satisfazer as suas
necessidades.
Na presença de uma doença, o aumento do consumo metabólico de Gln e o
fornecimento de fontes pobres da mesma, podem resultar em um comprometimento do
sistema imunológico devido à redução da produção de anticorpos e da barreira da mucosa do
intestino, aumentando assim, o risco de infecções que podem evoluir para um quadro de
sepsemia (Elliott & Biourge, 2006). Newsholme et al. (2003) propõem que, a glutamina e o
glutamato sejam considerados tão importantes quanto a glicose para o bom funcionamento
das células, devido à importância que esses AA desempenham em inúmeras funções do
organismo.
Em 1955, Eagle mostrou pela primeira vez, através de seus trabalhos, que a Gln possui
propriedades metabólicas importantes, demonstrando através da cultura de células sua
importância para o crescimento e manutenção das mesmas. Posteriormente, resultados
similares foram encontrados demonstrando que a Gln é precursora de nucleotídeos e de outras
moléculas e serve também como substrato energético para proliferação celular. Nas décadas
de 1950 e 1960, descobriu-se que ela também é um importante intermediário para um grande
número de vias metabólicas, em diferentes tipos celulares. Este AA é doador de átomo de
nitrogênio durante a síntese de purinas, pirimidinas e aminoaçúcares em todas as células. Nos
rins, participa do equilíbrio ácido-base como substrato mais importante para amoniogênese.
Nos últimos 20 anos, observou-se que a Gln desempenha funções importantes em tecidos
16
específicos e na interação entre eles. Ela representa 60% do total de AA do músculo
esquelético, onde estão cerca da metade dos AA livres do organismo (Curi, 2000).
Alta taxa de gliconeogênese acelera o catabolismo da glutamina em um animal sob
estresse (Elliott, 2004), pois ela serve como substrato gliconeogênico para o fígado, além de
ser altamente consumida por células de divisão rápida, como as tumorais, os enterócitos, os
fibroblastos e tecidos como rins, fígado e cérebro (Curi, 2000). Sob alta demanda, a síntese
muscular da glutamina é freqüentemente insuficiente e a concentração sérica decresce (Elliott,
2004).
Klimberg et al. (1996), através de estudos, associaram a redução da atividade das
células natural killer (NK) em hospedeiros portadores de tumores, aos altos níveis de
prostaglandina E2 (PGE2), produzidas por monócitos in vitro. Sabia-se também que as
atividades das células NK possuíam uma dependência à Gln e que glutationa (Gsh) é
antagonista à síntese de PGE2, com isso, há a hipótese que a suplementação de Gln leva ao
aumento da Gsh, diminuindo assim a produção de PGE2, aumentando a regulação da
atividade citotóxica de NK. Para comprovar essa hipótese, Klimberg e colaboradores (1996)
utilizaram ratos, divididos em dois grupos, sendo um suplementado com Gln (1g/Kg/dia) e
outro com freamine isoprotéica, e implantado em ambos os grupos tumor de mama. Após sete
semanas, os animais foram eutanaziados e os tumores foram medidos, pesados e processados
para morfometria. Foram dosadas no sangue, a quantidade de Gln, Gsh e PGE2, tendo como
resultado, que o grupo suplementado com Gln teve o tumor reduzido em 40% comparado ao
grupo alimentado com FA.
2.4.1.1 Fontes de Glutamina
Fontes naturais e semi-sintéticas de Gln são encontradas em proteínas e peptídeos
oriundos das proteínas do leite, soja, carne e seus produtos hidrolisados. Foi desenvolvida
uma fração oligopeptídica rica em Gln a partir do glúten para ser comercializada.
Primeiramente, era produzida através da mucina, uma protease do tipo 13, e depois com
actinase, produzindo um hidrolisado purificado por cromatografia, obtendo-se uma fração de
17
oligopeptídeo com aproximadamente 50% de Gln. Recentemente, utilizam-se métodos
biotecnológicos nos quais a L-glutamina é obtida por fermentação e síntese de peptídeos,
catalisada por complexo enzimático de origem bacteriana ou fúngica. Através de protease de
plantas como, catalisadores biológicos, pode-se também preparar dipeptídeos que têm a
vantagem de ter a estéreo-seletividade da reação, baixo custo e a simplificação da purificação
(Garcia Júnior, 2000).
2.4.2 Glutaminase
O primeiro passo para utilização da Gln é a hidrólise, onde a partir da geração do
glutamato, por esta reação, outras reações podem acontecer permitindo que a Gln seja
consumida no ciclo do ácido tricarboxílico. A enzima responsável por esta hidrólise é
denominada glutaminase, onde a Gln é hidrolisada em glutamato e íon amônio. Essa reação
foi observada pela primeira vez por Krebs em 1935. Diversas enzimas fazem a hidrólise da
Gln, porém somente as que realizam esta atividade mais relevante e com geração
estequiométrica de amônio e glutamato, são considerados glutaminase. A glutaminase, nos
mamíferos, apresenta-se sob duas isoformas, uma localizada no fígado, denominada hepática,
e outra nos demais tecidos, principalmente cérebro, leucócitos, TGI e rins, sendo a última
isoforma denominada como glutaminase renal devido sua caracterização inicial ter sido feito
nos rins (Pompéia, 2000).
2.4.3 Metabolismo da glutamina no intestino
O órgão no qual a glutamina é mais utilizada é o TGI, onde sua captação ocorre
principalmente nas células epitelial dos vilos do intestino delgado. Estudos demonstraram
grandes quantidades de CO2, em porções intestinais, provenientes da Gln. Em 1970, pesquisas
demonstraram que o intestino delgado é o sitio de metabolização mais relevante da Gln, sendo
18
ela o substrato respiratório quantitativamente mais importante para os enterócitos que a
glicose, mesmo em recém nascidos, apesar da taxa de captação ser similar à da glicose. A Gln
é facilmente hidrolisável devido à presença de um grupo alfa-amino e um grupo amida
terminal, tornando-se um transportador de N e um carreador de amônia da periferia para os
órgãos viscerais. Sua metabolização pelos enterócitos torna-se uma etapa importante na
regulação intestinal do balanço nitrogenado, em estados normais ou patológicos, sendo que
em casos de estresse e doenças, a Gln pode ser um componente dietético (Palanch, 2000).
2.4.4 Importância da glutamina para os linfócitos
Quando os linfócitos são ativados pela administração de mitógenos ocorre um
aumento na utilização de Gln, isto sugere que este AA exerça um papel importante nestas
células. Os linfócitos T não conseguem proliferar-se na ausência de Gln, porém em meio de
cultura, quando a concentração deste AA é aumentada, a taxa de proliferação também se eleva
(Peres et al., 2000). A utilização de Gln em linfócitos estimulados in vitro, têm a sua
proliferação aumentada oito vezes quando comparada às células em repouso (Brand et al.,
1986).
2.5 Ácido Glutâmico
O ácido glutâmico, também conhecido como glutamato, é um importante
neurotransmissor excitatório (Forlenza, 2005).
Vários alimentos possuem na sua composição o L-ácido glutâmico, conhecido como
glutamato, que desempenha papel importante na palatabilidade e na aceitabilidade dos
alimentos. Em 1908, Kikunae Ikeda descobriu o sabor característico do glutamato, dando a
este sabor o termo “Umami”, sendo que este não possui tradução, por ter sido criado por um
japonês, onde o objetivo era descrever um sabor único relacionado à sensação de salgado,
19
carne e caldo, conhecido apenas pelos orientais. Com o tempo, muitos pesquisadores,
orientais e ocidentais, estudaram o umami e o definiram como o quinto sabor além do doce,
salgado, azedo e amargo. Estudar esse sabor contribui para melhorar nossos conhecimentos
em relação à importância da palatabilidade dos alimentos e sua contribuição na seleção dos
mesmos (Yamaguchi & Ninomiya, 2000).
2.6 Fitohemaglutinina
As lecitinas são amplamente distribuídas na natureza e representam uma classe de
glicoproteínas de origem não imune que se ligam especificamente e reversivelmente a
açúcares (Lis & Sharon, 1986; Mody et al., 1995; Sell & Costa, 2000). As lecitinas são de
grande interesse científico devido às diversas atividades biológicas a elas atribuídas, entre
elas, identificação de grupos sanguíneos, caracterização de microrganismos, processo de
reconhecimento e interações celulares e estimulação mitogênica de células imunes (Sell &
Costa, 2000; Peres et al., 2000). Exemplos de lecitinas incluem a fitohemaglutinina (PHA),
obtida a partir do feijão vermelho (Phaseolus vulgaris), a concanavalina A (Con A), obtida a
partir do feijão trepadeira (Canavalis ensiformes) e a erva-dos-cancros (Phytolacca
americana), que é um mitógeno (Tizard, 2002). Elas são classificadas como, mitogênicas ou
não mitogênicas, de acordo com a capacidade de aumentar a síntese de DNA e induzirem
transformação blástica de população específica de linfócitos (Wisler & Yates, 1980). Essa
transformação estimulada in vitro pela PHA tem sido foco de numerosos estudos nos últimos
anos, pois a taxa de células linfoblásticas produzidas nestas condições tem sido considerada
uma medida indireta da capacidade imunológica do organismo (Vozza et al., 1977)
A PHA é capaz de ativar uma série de vias metabólicas que capacitam as células a
proliferar e os mitógenos interagem com a membrana celular, causando mudança no fluxo
metabólico. Estudos realizados com linfócitos de humanos, cultivados por 24 horas e
estimulados por lipopolissacaríideos de parede de bactéria (LPS) e Con A, associados a
diferentes concentrações de Gln (0; 0,1; 0,4; 0,6 e 2 mM), a produção de IL-2, IL-10 e
interferon gama (IFN-gama) aumentou significativamente. A produção máxima dessas
20
citocinas ocorreu na presença de 0,1 mM de Gln, sendo que a partir desta concentração, não
houve aumento das citocinas (Peres et al., 2000).
Ao injetar a PHA intradermicamente no tecido, ocorre uma reação local similar a uma
resposta de hipersensibilidade tardia. Esta técnica é considerada um método conveniente e
rápido para avaliar a capacidade do animal em obter uma resposta imune mediada por células,
não sendo necessário sensibilizá-lo primeiramente a um antígeno, porém é uma resposta
inespecífica, o que pode dificultar a interpretação (Tizard, 1985).
21
3. Artigo Científico
RESPOSTA IMUNOLÓGICA EM CÃES ADULTOS ALIMENTADOS COM DIETAS
SUPLEMENTADAS COM L-GLUTAMINA E L-ÁCIDO GLUTÂMICO
Achiciane Furno Pires1, Douglas Haese1, João Luís Kill1, Geraldo Luiz Colnago2,
Marcelo Renan de Deus Santos1, Alice Fernandes Alfieri3, Ricardo Souza Vasconcellos1,
Danieli Rankel Fernandes1
RESUMO
Com o objetivo de avaliar o efeito dos aminoácidos L-glutamina e L-ácido glutâmico sobre o
sistema imunológico em cães adultos desafiados por vacina, foram formuladas quatro rações
com níveis crescentes de inclusão dos mesmos (0, 06, 1,2 e 1,8%). Os cães da raça Terrier
Brasileiro foram distribuídos em delineamento experimental de blocos ao acaso, com quatro
tratamentos e seis repetições. Para avaliar o efeito dos aminoácidos foram quantificadas:
imunoglobulina G total (IgG-T) e específica de parvovirose (IgG-P); e para a verificação da
imunidade celular, empregou-se o teste de hipersensibilidade cutânea tardia (HCT). Foi
observado um efeito quadrático sobre a produção de IgG-P, que aumentou até o nível 0,98%.
De forma semelhante, constatou-se efeito quadrático sobre o HCT. A utilização de Lglutamina e L-ácido glutâmico em alimentos extrusados apresentam benefícios sobre
parâmetros da resposta imunológica humoral e celular.
Palavras-chave:
aminoácido,
condicionalmente
essencial,
imunoglobulina, vacina
1
Centro Universitário Vila Velha - ES
Universidade Federal Fluminense – Faculdade de Medicina Veterinária - RJ
3
Universidade Estadual de Londrina – PR
E-mail para correspondência: [email protected]
2
fitohemaglutinina,
22
ABSTRACT
The aim of the present study was to evaluate the effect of L-glutamine and L-glutamic acid on
the immunologic system of adult dogs submitted to vaccine challenge. Four types of dog food
with increasing amounts of L-glutamine and L-glutamic acid (0, 0.6, 1.2 and 1.8%) were
formulated. Brazilian Terrier dogs were allocated in a randomized block experimental design,
with four treatments and six repetitions. To evaluate the effect of amino acids, total (IgG-T)
and specific (IgG-P) immunoglobulin G for parvovirus were quantified and to verify the
cellular immunity, the delayed hypersensitivity skin (DHS) test was used. It was shown a
quadratic effect on the IgG-P production that increased to a level of 0.98%. In a similar way, a
quadratic effect on the DHS was observed. The use of L-glutamine and L-glutamic acid in
extruded foods shows positive effects on the parameters of humoral and cellular
immunological response.
Keywords: amino acid, conditionally essential, phytohemagglutinin, immunoglobulin,
vaccine
23
3.1 INTRODUÇÃO
A Gln é considerada o aminoácido (AA) mais abundante no plasma e no tecido
muscular (Shabert & Ehrlich, 1994), embora não seja considerada um AA essencial, pois
pode ser sintetizado pelo organismo (Curi, 2000). Porem em determinadas condições do
organismo a síntese de Gln pode não ser suficiente para corresponder ao aumento da absorção
e do metabolismo do trato gastrintestinal e da demanda do sistema imunológico de pacientes
enfermos, sendo assim classificada como aminoácido condicionalmente essencial (Elliott &
Biourge, 2006).
Em condições estressantes, traumas, neoplasias e exercícios físicos extremos a
quantidade de Gln pode diminiur até 50% (Curi, 2000). Segundo Wu et al. (2010), a
afirmação que a Gln não é um AA essencial vem da dificuldade que existia em dosá-la e da
suposição de que os animais podem sintetizar quantidades suficientes para satisfazer as suas
necessidades.
A alta taxa de gliconeogênese aumenta o catabolismo de Gln (Elliott, 2004), pois ela
serve como substrato gliconeogênico para o fígado, sendo altamente consumida por células de
divisão rápida, como células tumorais, enterócitos, fibroblastos e tecidos como rins, fígado e
cérebro (Curi, 2000). Sob alta demanda, a síntese muscular da glutamina é freqüentemente
insuficiente e a concentração sérica decresce (Elliott, 2004). Fontes pobres de Gln, associada
a doenças que aumentam a necessidade da mesma, podem resultar em um comprometimento
do sistema imunológico devido à redução da produção de anticorpos e da barreira da mucosa
do intestino, aumentando assim o risco de infecções que podem evoluir para um quadro de
sepsemia (Elliott & Biourge, 2006).
O ácido glutâmico é um importante neurotransmissor excitatório (Forlenza, 2005).
Apesar dos papéis fisiológicos estimulantes da resposta imunológica e desenvolvimento da
mucosa intestinal ser atribuídos à glutamina, acredita-se que o ácido glutâmico, especialmente
o originado da dieta, possa substituir a Gln na produção de energia e biossíntese de
aminoácidos mediante situações não estressantes (Reeds & Burrin, 2001).
24
Newsholme et al. (2003) propõem que, a Gln e o ácido glutâmico sejam considerados
tão importantes quanto a glicose para o bom funcionamento das células, devido à importância
que esses AA desempenham em inúmeras funções do organismo. Além disso, os nucleotídeos
purina e pirimidina e a glutationa utilizam, preferencialmente, para sua síntese a glutamina e o
glutamato, respectivamente (Wu, 1998).
Objetivou-se com este estudo, avaliar a resposta imunológica em cães adultos
alimentados com dietas suplementadas com L-glutamina e L-ácido glutâmico.
25
3.2 MATERIAL E MÉTODOS
Todo procedimento experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética e Bem-estar
Animal do Centro Universitário Vila Velha (CEUA-UVV).
O experimento foi realizado no canil da Empresa Dumilho S/A, localizada no
município de Viana-ES. Foram utilizados 24 cães da raça Terrier Brasileiro, sendo 12 machos
e 12 fêmeas, com idade aproximada de quatro anos e peso de 7,65 Kg ± 1,59 Kg, no início do
experimento.
Os cães foram distribuídos em delineamento de blocos ao acaso, de acordo com o sexo
e o peso, com quatro tratamentos e seis repetições (n=6; três machos e três fêmeas), cada cão
foi considerado uma unidade experimental. Os animais foram alojados em baias individuais
com dimensões de 1,40m x 0,85m. Trinta dias antes de iniciar o experimento, foi feita a
avaliação clínica e hematológica e a vermifugação dos animais.
As rações experimentais foram constituídas de uma ração basal (Tabela 1) no qual
foram adicionados níveis crescentes de AminoGut®4 (0,6%; 1,2% e 1,8%), correspondendo à
suplementação de 0,06; 0,12 e 0,18 de L-glutamina e L-ácido glutâmico, sendo adicionados à
ração antes da extrusão.
As rações experimentais foram fornecidas aos animais durante 90 dias. A quantidade
diária administrada foi calculada de acordo com a estimativa da energia metabolizável do
alimento e necessidade energética do animal, levando-se em consideração o peso inicial dos
animais, foi utilizada a recomendação de 130 Kcal de energia metabolizável por Kg/dia
(NRC, 2006).
O alimento foi fornecido uma vez ao dia, pela manhã, e o consumo de cada animal foi
mensurado diariamente. O fornecimento de água foi à vontade durante todo o período
experimental.
4
10% de L-Glutamina e 10% de L-ácido glutâmico
26
Tabela 1. Composição centesimal e calculada da ração basal experimental
Ingrediente
%
Farinha de vísceras
29,22
Milho
23,35
Farelo de arroz
16,20
Quirera de arroz
10,00
Gordura de aves
7,00
Farelo de soja
5,00
Glúten de milho
5,00
Hidrolisado de frango
2,00
Linhaça Grão
1,00
Sal comum
Premix mineral e vitamínico
0,50
1
0,40
Açúcar
0,30
Extrato de Yucca
0,03
Nutrientes
Energia Metabolizada (Kcal/kg)
3400
Matéria Seca, %
90,11
Proteína Bruta, %
28,00
Extrato Etéreo, %
14,98
Material Mineral, %
5,75
Fibra Bruta, %
2,79
Arginina, %
1,79
Lisina, %
1,40
Cálcio, %
1,17
Fósforo, %
0,90
Metionina, %
0,53
Triptofano, %
0,26
1
Suplemento mineral e vitamínico: cobre – 1.850; ferro – 20.000; manganês – 1.250; cobalto
– 2.500; iodo – 375; zinco – 30.000; colina – 125.000; vitamina A – 2.500 UI; vitamina D3 –
250 UI; vitamina E – 15.000 mg; vitamina K3 – 250 mg; vitamina B1 – 500 mg; vitamina B2
– 1.000 mg; vitamina B6 – 1.000 mg; vitamina B12 – 8 mg; vitamina C – 6.250 mg; ác.
pantotênico – 3.750 mg; niacina – 6.250 mg; ác. fólico – 100 mg; biotina – 15 mg; selênio –
27 mg. L-lisina – 125.000 mg; BHT - 37.500 mg; bióxido Si – 20 g.
27
Os animais foram pesados no 1° dia do experimento, no 48° e 90° dia, com objetivo de
registrar variação de peso durante todo período experimental. Para o cálculo do consumo
médio diário de L-glutamina e L-ácido glutâmico/Kg/peso do animal, foram considerados os
consumos médios diários e o peso médio final de todos os animais no experimento.
Para ativar a resposta imunológica, os animais foram estimulados através da utilização
de vacina polivalente contra as seguintes doenças: cinomose canina, hepatite infecciosa,
coronavirose canina, parainfluenza, parvovirose – vírus modificado e vírus morto e
leptospirose, sendo este método considerando um estímulo fisiológico, sem promover
qualquer sofrimento aos animais. Desta forma, nos dias 48 e 69 após o início do experimento,
todos os animais receberam a primeira e segunda dose da vacina, respectivamente. Foram
realizadas coletas de sangue para avaliação do hemograma, quantificação de IgG-T e de IgGP. As coletas iniciaram no 48º dia antes da vacinação e repetidas com intervalo de sete dias
até o 90º dia de avaliação.
As alíquotas sanguíneas foram obtidas por venopunção jugular, após anti-sepsia local,
através do sistema a vácuo, com tubos de 7 mL, com e sem o anticoagulante ácido
etilenodiamino tetra-acético (EDTA). Da amostra total de sangue, foram separados 2 mL em
tubo de ensaio de vidro contendo o EDTA para a realização do hemograma, e 5 mL,
centrifugados e separados em três eppendorfs com partes iguais, para a realização do
bioquímico e os testes de IgG-T e IgG-P canina.
No hemograma, as contagens globais de hemácias, leucócitos, plaquetas, taxa de
hemoglobina, volume globular ou hematócrito, volume corpuscular médio (VCM) e
concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM), foram obtidos com auxílio de um
contador manual. A contagem diferencial dos leucócitos foi obtida utilizando-se de esfregaços
sanguíneos corados com uma mistura de Metanol – May Grunwald – Giemsa. A fórmula
leucocitária absoluta foi obtida a partir das contagens global e diferencial das células
leucocitárias.
Para a realização de IgG-P foi realizada a preparação das hemácias através da coleta
de sangue suíno com solução de Alsever em um volume de 1:1. Foi feita punção jugular
utilizando agulha 40/12 e coletado diretamente no recipiente e, posteriormente centrifugado
(Fanen, modelo Excelsa Baby II 206-R), em 2000 RPM por cinco minutos. O sobrenadante
28
foi retirado com o auxílio de uma pipeta Pasteur ficando somente as hemácias. As hemácias
foram lavadas com solução fisiológica a 0,9%, sendo homogeneizadas e centrifugadas por
mais cinco minutos por três vezes consecutivas. Após a lavagem, as hemácias foram
misturadas em solução tampão de 1:1 de VAD (Vírus Adjusting Diluent). As hemácias foram
diluídas para uma solução de 1% para uso.
A titulação da vacina foi feita pelo teste de hemaglutinação em placa de 96 poços com
fundo em U. Foram adicionados 25 µl das duas vacinas distintas nos poços das placas de
ELISA 1A, 2A, 1B e 2B, e 25 µl de solução BBS (Borate Buffered Saline) mais SAB a 0,2%
nos poços de 2 a 12 (A e B). Foi feita diluição seriada (fator 2) da vacina até 1:4096.
Foram adicionados 25 µl da solução de hemácias a 1% em cada poço que,
posteriormente, foi incubada por 4h a 4ºC em câmara úmida e logo foi realizada a leitura. Para
controle negativo foram adicionados solução de hemácia nos poços da terceira linha.
O teste de Inibição da Hemaglutinacao (IH) foi realizado de acordo com a
metodologia descrita por Carmichael et al. (1980) e Senda et al. (1986), com adaptações
padronizadas no Laboratório de Virologia Animal da UEL, tendo como base o clássico
trabalho de Clarke & Casals (1958).
Para a realização do teste IH, foi colocado 25 µl do soro diluído de cada amostra nos
poços da coluna 1. Nas demais colunas da placa de 96 poços com fundo em U, foram
adicionadas solução de BBS contendo 0,2% SAB. A diluição foi realizada da mesma forma
que a vacina no teste de hemaglutinação. Os soros foram inativados por 30 minutos a 56ºC
antes da análise.
Foram adicionados a todos os poços 25 µl
do antígeno (QUANTUM® - Dog
DA2PPvL + Cv) diluído, contendo 8 doses hemaglutinantes (DHA) determinado pela
hemaglutinação. As placas foram incubadas por 30 minutos à temperatura ambiente.
Posteriormente, foram adicionados 50 µl da solução de hemácias 1% em todos os poços da
placa. A placa foi incubada a 4ºC em câmara úmida e a leitura realizada após 4h. Para o
controle negativo, foi adicionado 25 µl da hemácia com e sem a adição BBS. Os valores
obtidos na leitura das amostras foram multiplicados por oito, pois foram utilizadas oito DHA
para determinação da titulação do soro dos animais testados.
29
O IgG-T foi dosado através de kit adquirido do laboratório Immunology Consultants
Laboratory, Inc., e a técnica foi seguida de acordo com as normas do laboratório. Se trata de
um imunoensaio ligado à enzima (ELISA), neste ensaio, a IgG presente na amostra reage com
os anticorpos anti-IgG que tenham sido adsorvidos à superfície de poços de microtitulação de
poliestireno. A máquina utilizada para lavagem foi a ELX-50 e a leitora ELX-800, ambas da
marca Bio-tek®. Os resultados obtidos têm como unidade de medida a Unidade Internacional
por mL (UI/mL).
Para a verificação da imunidade celular dos cães, empregou-se o teste de
hipersensibilidade cutânea tardia, realizado após a última coleta de sangue. O teste foi
realizado através da aplicação intradérmica de fitohemaglutinina na região do flanco. O local
da injeção foi limpo com álcool etílico 70% e, em cada animal, foi injetado 100 µL na
concentração de 200 µg/mL de fitohemaglutinina. A espessura de pele foi medida com o
auxílio de um cutímetro no tempo 0, 24, 48 e 72 horas após a injeção.
Os resultados foram submetidos à análise estatística utilizando o programa Sistema
para Análise Estática e Genética (SAEG), desenvolvido na Universidade Federal de ViçosaUFV (2007). Na análise de Variância (ANOVA) verificaram-se os efeitos de tratamento,
animal, período e a interação Período*Tratamento, considerando-se 5% de probabilidade.
Realizou-se análise de regressão utilizando efeitos lineares e quadráticos para determinação
do nível de L-glutamina e L-ácido glutâmico com base na avaliação imunológica.
30
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A quantidade de ração calculada com base nas recomendações do NRC (2006) foi
suficiente para manter o peso dos cães durante o período experimental, sendo o peso médio
inicial e final de 7,65 ±1,59 e 8,07 ±1,48 kg, respectivamente. Considerando um consumo
diário médio de 160 g de ração e a inclusão de L- glutamina e L-ácido glutâmico nas dietas
experimentais, a ingestão diária suplementar destes nutrientes nas rações com 0,6%, 1,2% e
1,8% foram, respectivamente, de 119, 238 e 357 mg/Kg.
Na avaliação dos resultados de IgG-T não houve (P>0,05) interação entre tratamento e
período (Tabela 2).
Tabela 2. Valores de probabilidade pela Análise de Variância, para tratamento, período e
interação tratamento/período e efeitos lineares e quadráticos pela análise de regressão aos
níveis de inclusão de L-glutamina e L-ácido glutâmico
Efeito
Parâmetro
IgG Total
1
IgG-Parvo2
Teste de HCT3
Análise Regressão
Período Tratamento Tratamento*Periodo
Linear
Quadrática
0,0002
Ns
Ns
0,391
0,142
Ns
0,001
Ns
Ns
0,012
0,0001
0,0003
Ns
Ns
0,0001
Imunoglubulina G Total (IgG Total)1; Imunoglobulina G anti-parvovirus (IgG-Parvo)2;
Hipersensibilidade cutânea tardia (HCT)3; Ns - não significativo.
A inclusão de L-glutamina e L-ácido glutâmico não promoveu diferença (P>0,05) nos
resultados de IgG-T dos animais (Tabela 3). Este resultado não corrobora o obtido por Bartell
& Batal (2007), que, obtiveram aumento significativo (P<0,05) nos níveis séricos desta
imunoglobulina em frangos de corte suplementados com dieta de 1% de glutamina, no
período de 0-21 dias.
31
Tabela 3. Concentrações séricas de Imunoglobulina G Total e anti-parvovírus canino em
resposta a vacinação (dias 48-90) dos cães que receberam as dietas Controle e contendo
diferentes níveis de L-glutamina/L-ácido glutâmico
L-glutamina/L-ácido Glutâmico
Período (dias)
Controle
0,6%
1,2%
1,8%
Média
CV1
Imunoglobulina G total (g/L)
48 (1a vacinação)
2184,8
2369,4
2255,2
2402,2
2295,4
9,19
55
2520,2
2460,8
2298,3
2245,4
2383,7
10,2
62
2385,5
1859,2
2199,5
1713,0
2062,3
24,4
69 (2a vacinação)
2200,8
2772,4
2085,0
2081,3
2301,9
33,7
76
2781,8
2792,6
2933,7
2843,2
2839,6
4,90
83
2488,8
2648,4
2464,3
2374,8
2492,5
13,0
90
2541,7
2119,4
2187,0
2267,6
2286,7
15,0
Média
2443,4
2431,7
2352,5
2287,1
2381,9
CV1
12,76
21,05
23,25
18,32
19,10
Imunoglobulina G anti-parvovirus
48 (1a vacinação)
5120,0
5017,6
7594,0
4300,8
5585,4
78,28
55
6144,0
6963,2
9898,3
5529,6
7214,5
75,92
6553,6
6963,2
9728,7
6348,8
7509,3
74,23
69 (2 vacinação)
5461,0
6348,8
10035,7
5734,4
6826,7
85,95
76
7168,3
4915,2
9728,3
5734,4
7028,4
71,98
83
6485,3
4915,2
10410,0
5734,4
7028,4
78,42
90
5802,7
4505,6
11093,7
5734.4
6935,3
80,47
6094,0
5661,3
9777,9
5588,1
6871,6
81,09
70,43
58,09
93,68
76,93
62
a
Média
1
CV
1
Coeficiente de variação.
Enquanto não foi possível detectar diferenças nas concentrações de IgG-T, entre os
tratamentos, constatou-se efeito quadrático (Tabela 2; P<0,05) dos níveis de inclusão de Lglutamina e L-ácido glutâmico sobre a produção de IgG-P (Tabela 3), que aumentou até o
nível estimado de 0,98% (Figura1).
32
IgG Anti-Parvovírus
12000
2
y = -2750.02x + 5383.19x + 5502 R² = 0.35
Concentração
10000
*
8000
6000
*
*
*
4000
2000
0
0.0
0.6
1.2
1.8
Nível de AminoGut (%)
Figura 1. Níveis de inclusão de L-glutamina e L-ácido glutâmico sobre a concentração de
IgG-P
Segundo Newsholme (2001) é possível que a concentração extracelular de Lglutamina regula a taxa de proliferação de linfócitos T e expressão de interleucina-2 (IL-2) de
superfície. Da mesma forma, a diferenciação de linfócitos B em células que sintetizam e
secretam anticorpos é dependente de glutamina e aumenta significativamente com a elevação
nas concentrações plasmáticas de glutamina. No presente estudo não foi quantificada a
concentração plasmática de glutamina, mas considerando a suplementação conjunta de Lglutamina/L-ácido glutâmico, a elevação na resposta imunológica humoral e celular
observadas atribui-se, provavelmente, à maior concentração sérica destes nutrientes.
A fonte de glutamina/glutamato dietético varia consideravelmente entre as dietas,
assim como as concentrações utilizadas. No entanto, tem sido demonstrado que concentrações
entre 0,8-2,0% de glutamina ou glutamato em dietas para suínos e aves tem se mostrado
eficiente em melhorar o desempenho e prevenir a atrofia de vilosidades intestinais nestas
espécies (Yi & Alee, 2011). Abreu et al. (2010) utilizando a mesma mistura comercial de Lglutamina/L-ácido glutâmico empregada neste estudo, demonstrou benefícios para suínos e
aves citadas acima.
33
Apesar
dos
papéis
fisiológicos
estimulantes
da
resposta
imunológica
e
desenvolvimento da mucosa intestinal serem atribuídos à glutamina, acredita-se que o
glutamato, especialmente o originado da dieta possa substituir a glutamina, incluindo a
geração de energia e biossíntese de aminoácidos mediante à situações não estressantes. Do
ponto de vista metabólico, o glutamato e a glutamina são facilmente intercambiáveis, pois
acredita-se que o glutamato e a glutamina tenham vias metabólicas intracelulares em comum
(Reeds & Burrin, 2001). Porém a alta taxa de gliconeogênese acelera o catabolismo da
glutamina em um animal sob estresse (Elliott, 2004), pois ela serve como substrato
gliconeogênico para o fígado e é altamente consumida por células de divisão rápida, como
células tumorais, enterócitos, fibroblastos e tecidos como rins, fígado e cérebro (Curi, 2000).
Sob alta demanda, a síntese muscular da glutamina é freqüentemente insuficiente e a
concentração sérica decresce (Elliott, 2004).
Soltan (2009) trabalhando com frangos de corte, verificou que a suplementação da
dieta com 1% de glutamina favoreceu a resposta humoral dos animais, vista pela maior
produção de anticorpos contra a Doença de Newcastle a partir do 14º até o 42º dia de
produção. Por outro lado, Peng et al. (2006) suplementaram 0,5g/kg de peso corporal em
pacientes humanos severamente queimados durante um período de 14 dias e não observaram
efeito da suplementação sobre a resposta imune humoral, vista pela quantificação de IgG, IgM
e componentes do complemento (C3 e C4). No entanto, estes autores verificaram melhora
significativa na resposta imunológica celular no grupo suplementado, especialmente na taxa
de diferenciação de linfócitos, relação linfócitos T CD4+/CD8+ e concentração de IL-2.
A inclusão de L- glutamina e L-ácido glutâmico influenciaram de forma quadrática
(Tabela 2; P<0,05) a resposta dos animais ao teste de hipersensibilidade cutânea tardia, DTH,
(Tabela 4), que aumentou até o nível estimado de 1,16% (Figura 2), sendo que a resposta
máxima foi obtida 24 horas (Figura 3) após a aplicação.
34
Tabela 4. Aumento de volume cutâneo ao teste de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH) em
resposta a aplicação de fitohemaglutinina, nos cães que receberam as dietas Controle e
contendo diferentes inclusões de L-glutamina/L-ácido glutâmico
Inclusão de
glutamina/ácido glutâmico
Período (horas)
Controle 0,6%
1,2%
1,8%
Média
CV2
Resposta cutânea ao DTH (mm)
1
2
0
2,32
2,48
2,20
2,34
2,34
16,41
24
2,87
3,66
3,42
3,54
3,36
15,04
48
2,77
3,30
3,20
3,00
3,07
13,56
72
2,43
3,22
2,88
3,16
2,91
18,82
AAC1(mm2)
192,4
235,4
219,8
223,0
217,6
21,14
Pico de volume (mm)
2,87
3,66
3,42
3,54
3,36
15,04
Média
2,59
3,16
2,92
3,01
2,92
CV2
19,69
18,67
19,17
19,60
19,13
Área abaixo da curva;
Coeficiente de variação
Teste de Hipersensibilidade Cutânea Tardia
4,00
Espessura da pele (mm)
2
y = -0.321907x + 0.746515x + 2.6473 R² = 0.81
3,50
*
3,00
*
*
*
2,50
2,00
0.0
0.6
1.2
1.8
Nível de AminoGut (%)
Figura 2. Espessamento cutâneo – Teste de Hipersensibilidade Cutânea Tardia
35
Figura 3. Aumento percentual em resposta a aplicação de Fitohemaglutinina, na espessura da
pele durante o teste de hipersensibilidade cutânea tardia (DTH), em relação ao momento
inicial nos grupos que receberam as dietas Controle e contendo diferentes inclusões de Lglutamina/L-ácido glutâmico (0,6%; 1,2% e 1,8%)
Estudos realizados com linfócitos de humanos cultivados por 24 horas e estimulados
por lipopolissacarídeos de parede de bactéria (LPS) e concavalina A, associados à diferentes
concentrações de Gln (0; 0,1; 0,4; 0,6 e 2 mM), aumentou significativamente a produção de
IL-2, interleucina-10 (IL-10) e interferon gama (IFN-gama). A produção máxima dessas
citocinas ocorreu na presença de 0,1 mM de Gln, sendo que, a partir desta concentração, não
houve aumento das citocinas (Peres et al., 2000).
A maior resposta cutânea verificada nos animais que receberam L- glutamina e Lácido glutâmico, pode estar relacionado à maior capacidade proliferativa e de diferenciação de
linfócitos T em resposta a um estímulo, mediadas principalmente pelas maiores concentrações
de glutamina no líquido extracelular e disponível para tais células. A proliferação de linfócitos
é altamente dependente de glutamina, de forma que na sua ausência, a proliferação celular in
vitro não ocorre e, por outro lado, esta proliferação é dose-dependente às concentrações de
glutamina no meio de cultura (Curi et al., 1999). O possível mecanismo ativador da
multiplicação linfocitária pela glutamina é a maior expressão de membrana, taxa de utilização
e produção de IL-2 por estas células frente à disponibilidade de glutamina para o metabolismo
celular (Yagoob & Calder, 1997).
36
3.4 CONCLUSÃO
A utilização de L- glutamina e L-ácido glutâmico em alimentos extrusados apresentam
benefícios sobre a resposta imunológica humoral (produção de imunoglobulina G específica)
e celular (resposta cutânea ao DTH) para cães sob estresse.
AGRADECIMENTOS
Às empresas Ajinomoto®, Dumilho S/A e Nutriave®, à Universidade Estadual de
Londrina e ao Laboratório Marcos Daniel.
3.5 REFERÊNCIAS
ABREU, M.L.T.; DONZELE, J.L.; SARAIVA, A. et al. Glutamina, nucleotídeos e plasma
suíno em rações para leitões desmamados. Revista Brasileira de Zootecnia, v. 39, n. 3, p.
520-525, 2010.
BARTELL, S.M.; BATAL, A.B. The effect of supplemental glutamine on growth
performance, development on the gastrointestinal tract, and humoral immune response
of broilers. Poultry Science, v. 86, p. 1940-1947, 2007.
CARMICHAEL, L.E.; JAUBERT, J.C.; POLLOCK, R.V.H. Hemagglutination by canine
parvovirus: Serologic studies an diagnostic applications. American Journal of Veterinary
Research, v.41, n.5, p. 784-91, 1980.
CURI, R. Considerações preliminares. In: Curi R. Glutamina: metabolismo e aplicações
clínicas e no esporte. 1ª edição. Rio de Janeiro: Sprint; 2000. p.15-16.
37
CURI, R.; NEWSHOLME, P.; PITHON-CURI, T.C. et al. Metabolic fate of glutamine in
lymphocytes, macrophages and neutrophils. Brazilian Journal of Medical and Biological
Research, v. 32, p. 15-21, 1999.
ELLIOTT, D. Parenteral nutrition. Scientific Proceedings of the WSAVA; 2004; HVMS
World Congress. Rhodes, Greece.
ELLIOTT, D.A.; BIOURGE, V. [2006]. Critical care nutrition. Waltham focus, v.16, n.3,
p.31-36, 2006. Disponível em: <http://www.ivis.org/journals/vetfocus/16_3/en/5.pdf> Acesso
em: 24/06/2010.
FORLENZA, O.V. Tratamento farmacológico da doença de Alzheimer. Revista de
Psiquiatria Clínica, v. 32, n. 3, p. 137-148, 2005.
NEWSHOLME, P. Why is L-glutamine metabolism important to cells of the immune
system in health, postinjury, surgery or infection? Journal of Nutrition, v. 131, p. 2515s2522s, 2001.
NEWSHOLME, P.; LIMA, M.M.R.; PROCOPIO, J. et al. Glutamine and glutamate as vital
metabolites. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 36, n. 2, p. 153-163,
2003.
NATIONAL RESEARCH COUNCIL (NRC). Nutrient requirements of dogs and cats.
Washington, D.C.: National Academy of Science, 2006. 424p.
PENG, X.; YAN, H.; YOU, Z.; WANG, P.; WANG, S. Glutamine granule-supplemented
enteral nutrition maintains immunological function in severely burned patients. Burns,
v. 32, p. 589-593, 2006.
PERES, C.M.; OTTON, R.; CURI, R. Glutamina e linfócitos. In: CURI, R. Glutamina:
metabolismo e aplicações clínicas e no esporte. 1ª edição. Rio de Janeiro: Sprint; 2000.
p.177-188.
38
REEDS, P.J.; BURRIN, D.G. Glutamine and the bowel. Journal of Nutrition, v. 131, p.
2505s-2508s, 2001.
SENDA, M.; HIRAYAMA, N.; YAMAMOTO, H.; KURATA, K. An improved
hemagglutination test for study of canine parvovirus. Veterinary Microbiology, v. 12, p. 16, 1986.
SHABERT, J.; EHRLICH, N. The Ultimate Nutrient Glutamine. New York: Paragon Press,
Honesdale; 1994
SOLTAN, M.A. Influence of Dietary Glutamine Supplementation on Growth
Performance, Small Intestinal Morphology, Immune Response and Some Blood
Parameters of Broiler Chickens. International Journal of Poultry Science, v. 8, n. 1, p. 6068, 2009.
WU, G. Intestinal mucosal amino acid catabolism. Journal of Nutrition, v. 128, p. 12491252, 1998.
WU, G.; BAZER, F.W.; JOHNSON, G.A. et al. Important roles for L-glutamine in swine
nutrition and production. Journal of Animal Science, 2010.
YAGOOB, P.; CALDER, P.C. Glutamine requirement of proliferating T lymphocytes.
Nutrition, v. 13, p. 646–651, 1997.
YI, G.F.; ALLEEG.L. Glutamina (Gln) e Glutamato (Glu): Revisão de Literatura.
Ajinomoto Animal Nutrition. 2011. Disponível em: <www.lisina.com.br> Acesso em:
25/06/2010.
4. REFERÊNCIAS
BALDY, J.L.S. Bases imunológicas para o uso de vacinas, soros e imunoglobulinas na
prevenção e no tratamento de doenças infecciosas. Semina ciências biológicas e da saúde.
v. 9, n. 3, p. 75-83, 1981.
39
BRAND, K.; LEIBOLD, W.; LUPPA, P. et al. Metabolic alterations associated with
proliferation of mitogen-activated lymphocytes and of lymphoblastoid cell lines:
evaluation of glucose and glutamine metabolism. Immunobiology, v. 173, n. 1, p. 23-34,
1986.
BRUNETTO, M.A.; GOMES, M.O.S.; JEREMIAS, J.T. et al. Imunonutrição: o papel da
dieta no restabelecimento das defesas naturais. Acta scientiae veterinariae. (Impr.). v. 35,
Suppl 2, p. 230-2, 2007
COHN, L.A. Immunologic methods of disease diagnosis. Proceeding of the NAVC North
American veterinary Conference; 2005 Jan 8-12; Orlando, Florida. Orlando: Ivis, 2005
COICO, R.; SUNSHINE, G. Immunology: a short course. 6ª edição. New Jersey: WileyBlackwell; 2009. falta paginacao
CURI, R. Considerações preliminares. In: Curi R. Glutamina: metabolismo e aplicações
clínicas e no esporte. 1ª edição. Rio de Janeiro: Sprint; 2000. p.15-16.
ELLIOTT, D. Parenteral nutrition. Scientific Proceedings of the WSAVA; 2004; HVMS
World Congress. Rhodes, Greece.
ELLIOTT, D.A.; BIOURGE, V. [2006]. Critical care nutrition. Waltham focus, v.16, n.3,
p.31-36, 2006. Disponível em: <http://www.ivis.org/journals/vetfocus/16_3/en/5.pdf> Acesso
em: 24/06/2010.
FORLENZA, O.V. Tratamento farmacológico da doença de Alzheimer. Revista de
Psiquiatria Clínica, v. 32, n. 3, p. 137-148, 2005.
GARCIA JÚNIOR, J.R. Glutamina e exercício. In: CURI, R. Glutamina: metabolismo e
aplicações clínicas e no esporte. 1ª edição. Rio de Janeiro: Sprint; 2000. 243-256.
KLIMBERG, V.S.; KORNBLUTH, J.; CAO, Y. et al. Glutamine suppresses PGE2
synthesis and breast cancer growth. Journal of Surgical Research, v. 63, n. 1, p. 293-7,
1996.
40
LIS, H.; SHARON, N. Lectin as molecules and tools. Annual Review of Biochemistry, v.
55, p. 35-67, 1986.
MODY, R.; JOSHI, S.; CHANEY, W. Use of lectins as diagnostic and therapeutic tools for
cancer. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, v. 33, n. 1, p. 1-10, 1995.
NEWSHOLME, P.; LIMA, M.M.R.; PROCOPIO, J. et al. Glutamine and glutamate as vital
metabolites. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v. 36, n. 2, p. 153-163,
2003.
ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DE SAÚDE (OMS). Série Imunologia Básica para
Imunizações. Imunologia Geral. Genebra (Suíça); 1993.
PALANCH, A.C. Metabolismo da glutamina no intestino. In: CURI, R. Glutamina:
metabolismo e aplicações clínicas e no esporte. 1ª edição. Rio de Janeiro: Sprint; 2000. p.
85-96.
PERES, C.M.; OTTON, R.; CURI, R. Glutamina e linfócitos. In: CURI, R. Glutamina:
metabolismo e aplicações clínicas e no esporte. 1ª edição. Rio de Janeiro: Sprint; 2000.
p.177-188.
POMPÉIA, C. Glutaminase (E.C.3.5.1.2) ou L-glutamina amido-hidrolase. In: CURI, R.
Glutamina: metabolismo e aplicações clínicas e no esporte. 1ª edição. Rio de Janeiro:
Sprint; 2000.17-64.
SELL, A.M.; COSTA, C.P. Atividades biológicas das lectinas PHA, WGA, jacalina e
artocarpina. Acta scientiarum, v. 22, n. 2, p. 297-303, 2000.
SHABERT, J.; EHRLICH, N. The Ultimate Nutrient Glutamine. New York: Paragon Press,
Honesdale; 1994
TIZARD, I.R. Introdução à imunologia veterinária. 2ª edição. São Paulo: Rocca; 1985.
TIZARD, I.R. Imunologia veterinária: Uma introdução. 6ª edição. São Paulo: Rocca; 2002.
41
VOZZA, J.A.; BEIGUELMAN, B.; PISANI, R.C.B. et al. Transformação dos linfócitos
induzida pela fitohemaglutinina e reação de Mitsuda. Hansenologia Internationalis, v. 2, n.
1, p. 53-9, 1977.
YAMAGUCHI, S.; NINOMIYA, K. Umami and food palatability. Journal of Nutrition, v.
130, p. 921S-926S, 2000.
WISLER, R.L.; YATES, A.J. Regulation of lymphocytes responses by human gangliosides
I-characteristics of inhibitory effects and the induction of impaired activation. Journal of
Immunology, v. 125, p. 2106-2111, 1980.
WU, G.; BAZER, F.W.; JOHNSON, G.A. et al. Important roles for L-glutamine in swine
nutrition and production. Journal of Animal Science, 2010.