instituto oswaldo cruz letícia de paula scalioni avaliação de testes

INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Medicina Tropical
LETÍCIA DE PAULA SCALIONI
AVALIAÇÃO DE TESTES RÁPIDOS PARA O DIAGNÓSTICO DA
INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C
Dissertação apresentada ao Instituto
Oswaldo Cruz como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ciências em
Medicina Tropical.
Orientadora: Dra. Livia Melo Villar
RIO DE JANEIRO
2013
i
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo cruz
Curso de Pós-Graduação em Medicina Tropical
Esta dissertação intitulada:
AVALIAÇÃO DE TESTES RÁPIDOS PARA O DIAGNÓSTICO DA
INFECÇÃO PELO VÍRUS DA HEPATITE C
por
Letícia de Paula Scalioni
Banca examinadora composta pelos seguintes membros:
Titulares
Dra. Flávia Barreto dos Santos
Dra. Vanessa Salete de Paula
Dra. Cristiane Alves Villela Nogueira
Suplentes:
Dr. Thiago Moreno Lopes e Souza
Dra. Alexsandra Rodrigues de Mendonça Favacho
ii
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Hepatites Virais
do Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ,
Rio de Janeiro,RJ.
iii
AGRADECIMENTO
Agradeço primeiramente a Deus por ser minha fonte de inspiração e determinação
na busca constante da sabedoria, por sempre nos momentos difíceis torna-me forte
para transpor as barreiras impostas.
À minha mãe e irmã por todo o amor incondicional e apoio prestado em tudo o que
faço, por acreditarem em mim muito mais que eu mesma e fazerem seus, os meus
sonhos.
Às amigas Natasha Rocha e Moyra Portilho, por me ouvirem incansáveis vezes, pelo
apoio, amizade e cumplicidade.
À minha orientadora Dra Livia Melo Villar agradeço por compartilhar seu
conhecimento comigo, por me ensinar não apenas valores científicos, mas também
pessoais. Tenho imenso orgulho em ser sua aluna. Do fundo do meu coração o meu
muito obrigado. Você é uma referência para mim!
À Vanessa Marques, Livia Villar e Márcia Paschoal agradeço a amizade dedicada
durante esses anos, à paciência infinita e todo carinho que me deram.
Aos amigos que conquistei e que me conquistaram Nathália Motta, Helena Medina,
Maristella Costa, Allan Peres, Adilson José de Almeida, Lucy Dalva, agradeço pelo
companheirismo, momentos de descontração e auxílio nos momentos difíceis.
Agradeço a todos do Laboratório de Hepatites Virais em especial a Dra Elisabeth
Lampe pelo apoio e acolhimento em seu laboratório.
À Dra Vanessa Salete de Paula por seus conselhos, carinho e amizade.
iv
A toda equipe do Programa de Diagnóstico Sorológico do LHV, em especial a
Juliana Miguel, Elisângela Ferreira e Helena Medina. A ajuda de vocês foi
fundamental para que este projeto fosse finalizado.
Aos médicos do Grupo de atendimento às Hepatites Virais (IOC/Fiocruz) e do
Hospital Clementino Fraga Filho em especial a Dra. Lia Lewis e Dra. Cristiane Alves
Villela-Nogueira, ao Dr Flávio Flores, a Secretaria Municipal de Saúde de
Tocantinópolis, a Fundação de Medicina Tropical/TO, a Universidade Federal de
Tocantins, a Secretaria de Estado e Saúde de Tocantins e aos integrantes da Base
de Estudo da UFMS no Pantanal, agradeço o auxílio para obtenção do material de
estudo.
À Fiocruz, a Pós-Graduação em Medicina Tropical e a CAPES por financiarem
nossos trabalhos e a minha bolsa de estudo.
Agradeço a todos os voluntários que cederam seu material biológico sem o qual
este trabalho não seria realizado.
Por fim agradeço aos membros da banca Dra. Flávia Barreto dos Santos, Dra.
Vanessa Salete de Paula, Dra. Cristiane Alves Villela Nogueira, Dr. Thiago Moreno
Lopes e Souza e Dra. Alexsandra Rodrigues de Mendonça Favacho que gentilmente
aceitaram nosso convite.
v
RESUMO
Os testes rápidos de detecção de anticorpos anti-HCV podem facilitar o acesso ao
diagnóstico em cenários de recursos limitados, logo, o objetivo deste estudo foi
avaliar o desempenho de testes rápidos para o diagnóstico de anti-HCV em
amostras de soro, sangue total e fluido oral em populações com diferentes perfis de
endemicidade e comportamento de risco para o HCV. Foram obtidas amostras
biológicas de 3 grupos entre fevereiro de 2010 a setembro de 2011: (I) 194
indivíduos atendidos em centros de referência para o diagnóstico das hepatites virais
no Rio de Janeiro (IOC/Fiocruz e UFRJ) que forneceram amostras pareadas de soro,
sangue total e fluido oral avaliadas pelos testes rápidos WAMA Imuno-Rápido HCV
(WAMA Diagnóstica) e Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) e, 174
amostras de fluido oral avaliadas pelo teste rápido Oraquick HCV (Orasure); (II)
indivíduos residentes em áreas remotas (Tocantinópolis, Tocantis e Pantanal do
Moto Grosso do Sul), onde 430 amostras pareadas de soro, sangue total e fluido
oral foram avaliadas pelos testes Wama e Bioeasy e 459 amostras foram avaliadas
pelo teste rápido Orasure; (III) indivíduos usuários de crack residentes em duas
regiões geográficas do Brasil (Sudeste e Nordeste) e profissionais de beleza
residentes na cidade do Rio de Janeiro que forneceram 200 amostras pareadas de
soro, sangue total e fluido oral para avaliação nos testes Wama e Bioeasy e 43
amostras de fluido oral para uso no teste rápido Orasure. O anti-HCV foi avaliado em
amostras de soro por dois testes imunoenzimáticos (ELISA) (Radim e Diasorin) e
aquelas amostras reagentes foram submetidas ao PCR para detecção do HCV RNA.
A reprodutibilidade, repetitividade e reação cruzada para outras infecções (dengue,
HIV, malária e sífilis) também foram avaliadas. A sensibilidade e especificidade dos
testes rápidos variaram respectivamente de 76,03% a 93,84% e 93,75% a 100%
quando todos os indivíduos anti-HCV reagentes pelo ELISA foram incluidos. Ao
incluirmos somente as amostras anti-HCV/HCV RNA detectado, a sensibilidade e
especificidade dos testes avaliados no grupo I foram respectivamente: 99,09% e
100% no teste Bioeasy utilizando soro ou sangue total; 98,18% e 93,75% no teste
Wama em soro; 95,35% e 100% no teste Orasure em fluido oral; 90,91% e 93,75%
no teste Wama em fluido oral; e 86,36% e 100% no teste Bioeasy em fluido oral. No
grupo II, o teste rápido Orasure em fluido oral apresentou o melhor desempenho
com somente 4 resultados anti-HCV falso negativos em relação ao ELISA, porém
todas estas amostras não tinham HCV RNA no soro. No grupo III, o teste rápido
Bioeasy em sangue total e no soro apresentou o melhor desempenho sem nenhum
resultado falso positivo ou negativo. Os ensaios de reprodutibilidade e repetitividade
apresentaram concordância de 100%. Na avaliação da reação cruzada, foram
encontrados 5 resultados falso negativo, sendo no teste Wama: 1 amostra reagente
para Dengue e outra reagente para HIV, e no teste Bioeasy: 1 amostra reagente
para Dengue, 1 reagente para HIV e 1 reagente para Plasmodium vivax. Também
observamos 3 resultados falso positivo no teste Wama entre aquelas amostras
reagentes para P.vivax. Concluímos que os testes rápidos para detecção de antiHCV possuem sensibilidade apropriada para detecção de infecção ativa em
populações com diferentes perfis de endemicidade, porém o desempenho dos
mesmos varia de acordo com o fabricante do teste e a amostra biológica
empregada.
Palavras chave: teste rápido, anti-HCV, diagnóstico, soro, sangue total, fluido oral.
vi
ABSTRACT
Rapid tests for detection of anti-HCV antibodies can facilitate the access of diagnosis
in limited resource scenarios, thus, the objective of this study is to evaluate the
performance of rapid tests for the diagnosis of anti-HCV in sera, whole blood and oral
fluid samples from populations with different endemicity profiles and risk behavior for
HCV. Biological samples were obtained from 3 groups from February 2010 to
September 2011: (I) 194 individuals referred to Reference Centers for Viral Hepatitis
Diagnosis at Rio de Janeiro (IOC/Fiocruz e UFRJ) who donate paired sera, whole
blood and oral fluid samples evaluated by rapid tests WAMA Imuno-Rápido HCV
(WAMA Diagnóstica) and Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) and,
174 oral fluid samples evaluated by rapid test Oraquick HCV (Orasure); (II)
individuals residing in remote areas (Tocantinópolis, Tocantis and Pantanal of Mato
Grosso do Sul), where 430 paired sera, whole blood and oral fluid samples were
evaluated by Wama and Bioeasy and 459 samples evaluated by Orasure rapid test;
(III) crack users residing in two geographical areas of Brazil (Southeast and
Northeast) and beauty professionals residing at Rio de Janeiro city who donated 200
paired sera, whole blood and oral fluid samples for evaluation at Wama and Bioeasy
tests and 43 oral fluid samples to use in Orasure rapid test. Anti-HCV was evaluated
in sera samples by two enzyme immunoassays (ELISA) (Radim and Diasorin) and
those reactive samples were submitted to PCR for HCV RNA detection. The
reprodutibility, repetitivity and cross reactivity for other infections (dengue, HIV,
malaria and siphilis) were also evaluated. Sensitivity and specificity of rapid tests
varied respectively from 76.03% to 93.84% and 93.75% to 100% when all anti-HCV
reactive individuals by ELISA were included. When only anti-HCV/HCV RNA
detected were included, the sensitivity and specificity of evaluated tests in group I
were respectively: 99.09% and 100% at Bioeasy test using será or whole blood;
98.18% and 93.75% at Wama test in sera; 95.35% and 100% in Orasure test in oral
fluid; 90.91% and 93.75% at Wama test in oral fluid and 86.36% and 100% at
Bioeasy test in oral fluid. At group II, Orasure rapid test in oral fluid presented the
best performance with only 4 anti-HCV false negative results compared to ELISA,
however all of these samples did not have HCV RNA at serum. At group III, Bioeasy
rapid test in whole blood and sera presented the Best performance without no false
positive and negative results. Reprodutibility and repetitivity assays presented 100%
of concordance. At cross reactivity evaluation, 5 false negative results were found,
being at Wama assay: 1 reactive sample for dengue and another reactive sample for
HIV, and at Bioeasy assay: 1 reactive samples to dengue, 1 reactive for HIV and 1
reactive for Plasmodium vivax. We also observed 3 false positive results at Wama
assay among reactive samples for P.vivax. We concluded that rapid tests for antiHCV detection present appropriate sensitivity for detection of active infection in
populations with different profiles of endemicity, however the performance of those
tests vary according the manufacturer of the assay and the type of biological samples
employed.
Keywords: rapid test, anti-HCV, diagnosis, serum, whole blood, oral fluid.
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1. Morfologia do Vírus da Hepatite C....................................................................... 3
Figura 1.2. Estrutura do genoma viral .................................................................................. 4
Figura 1.3. Genótipos do HCV ............................................................................................. 8
Figura 1.4. Ciclo de replicação do HCV .............................................................................. 10
Figura 1.5. Prevalência global da infecção pelo vírus da Hepatite C .................................. 12
Figura 1.6. Distribuição geográfica da prevalência de anti-HCV segundo os Estados
brasileiros ............................................................................................................................ 14
Figura 1.7. Representação esquemática da infecção pelo HCV.......................................... 16
Figura 4.1. Fluxograma do estudo realizado com as amostras presentes no painel de
referência e estudo de campo.............................................................................................. 25
Figura 4.2. Localização geográfica do Rio de Janeiro. ........................................................ 29
Figura 4.3. Localização da cidade de Tocantinópolis no estado do Tocantins, Brasil .......... 30
Figura 4.4. Cidade de Tocantinópolis .................................................................................. 31
Figura 4.5. Localização geográfica das comunidades pantaneiras, Mato Grosso do Sul, MS,
Brasil ................................................................................................................................... 32
Figura 4.6. Comunidade Serra do Amolar/São Lourenço, Pantanal, MS, Brasil. ........................... 33
Figura 4.7. Instruções para coleta de fluido oral com Salivette. ........................................... 35
Figura 4.8. Extremidade coletora do teste rápido Oraquick. ................................................ 36
Figura 4.9. Representação esquemática do princípio do teste imunoenzimático para
detecção de anti-HCV. ......................................................................................................... 37
Figura 4.10. Disposição dos controles e amostras na microplaca do teste ETI-AB-HCVK-4
de acordo com o protocolo do fabricante ............................................................................. 38
Figura 4.11. Representação esquemática da disposição dos controles e amostras na
microplaca do teste HCV Ab, Radim de acordo com o protocolo do fabricante. ................... 39
Figura 4.12. Representação esquemática dos testes rápidos para detecção de anticorpos
anti-HCV .............................................................................................................................. 41
Figura 4.13. Representação esquemática da estrutura de um dispositivo de teste rápido. . 41
Figura 4.14. Representação das etapas para realização dos testes rápidos WAMA ImunoRápido HCV (WAMA Diagnóstica) e Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda). 43
Figura 4.15. Etapas de coleta e realização do teste do teste rápido Oraquick..................... 44
viii
Figura 4.16. Modelo de quadro utilizado para a avaliação do desempenho dos testes
rápidos em relação a um ensaio de referência (ELISA). ...................................................... 47
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.1. Relação do n de amostras, testes rápidos e espécime biológico coletado ........ 26
Tabela 4.2. Grau de concordância, segundo o valor do índice Kappa (κ) para avaliação dos
testes rápidos para detecção dos anticorpos anti-HCV ........................................................ 46
Tabela 4.3. Parâmetros utilizados para a avaliação do desempenho dos testes rápidos..... 46
Tabela 5.1. Desempenho dos testes rápidos Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica
Ltda) e WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) para detecção de anti-HCV em
amostras de soro avaliadas por dois ensaios imunoenzimáticos comerciais (ETI-AB-HCVK4, Diasorin e HCV Ab, Radim). ............................................................................................ 50
Tabela 5.2. Valores de DO e DO/CO das amostras falso negativas no teste rápido Bioeasy
HCV Rapid Test avaliadas quanto à detecção do HCV RNA. .............................................. 51
Tabela 5.3. Valores de DO e DO/CO das amostras falso negativas no teste rápido WAMA
Imuno-Rápido HCV avaliadas quanto à detecção do HCV RNA .......................................... 52
Tabela 5.4. Desempenho dos testes rápidos em população de alta prevalência de antiHCV.. ................................................................................................................................... 55
Tabela 5.5. Desempenho dos testes rápidos em população com comportamento de risco de
de baixa prevalência para anti-HCV..................................................................................... 56
Tabela 5.6. Desempenho do teste rápido Oraquick HCV Rapid Antibody Test (Orasure)
em amostras de soro, sangue total e fluido oral. (n=120)..................................................... 57
Tabela 5.7. Avaliação da resposta cruzada em amostras reagentes para Dengue, HIV,
P.vivax, T.pallidum testadas nos testes rápidos WAMA Imuno-Rápido HCV e Bioeasy HCV
Rapid Test. .......................................................................................................................... 58
ix
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
HAV
Vírus da Hepatite A
HBV
Vírus da Hepatite B
HCV
Vírus da Hepatite C
CMV
Citomegalovírus
EBV
Epstein-Barr Vírus
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
HBsAg
Antígeno de Superfície do HBV
Anti-HCV
Anticorpo anti-HCV
HPT
Hepatite pós-transfusional
HNANB
Hepatite Não-A Não-B
ORF
do inglês Open Reading Frame – fase de leitura aberta
3’NC
Região 3’ Não Codificante
5’NC
Região 5’ Não Codificante
UTR
Untranslated region
RNA
Ácido ribonucleico
DNA
Ácido desoxirribonucleico
UDIs
Usuários de drogas intravenosa
CG
Complexo de Golgi
RE
Retículo Endoplasmático
RNAm
RNA mensageiro
PCR
Reação em cadeia da polimerase
DIV
Droga Intravenosa
UFRJ
Universidade Federal do Rio de Janeiro
DO/CO
Densidade óptica dividido pelo cut off
TO
Tocantins
MS
Mato Grosso do Sul
IOC
Instituto Oswaldo Cruz
x
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
LRNHV
Laboratório de Referência Nacional para Hepatites Virais
EUA
Estados Unidos da América
SINAN
Sistema de Informação de Agravos de Notificação
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
UFMS
Universidade Federal de Mato Gross do Sul
DO
Densidade óptica
VPP
Valor Preditivo Positivo
VPN
Valor Preditivo Negativo
FP
Falso Positivo
FN
Falso Negativo
HCC
Hepatocarcinoma
RSV
Resposta Viral Sustentada
IRES
Do inglês internal ribosome entry site
aa
Aminoácido
RIBA
Do inglês recombinant immunoblot assay
ELISA
Do inglês enzyme linked immunosorbent assay
LDL
Lipoproteína de baixa densidade
LDL-R
Receptor para LDL
NC
Não codificante
RER
Retículo endoplasmático rugoso
Linha T
Linha Teste
Linha C
Linha Controle
xi
LISTA DE SINAIS, SÍMBOLOS E UNIDADES DE MEDIDA
%
Percentual
I
Um (algarismo romano)
II
Dois (algarismo romano)
III
Três (algarismo romano)
KDa
Kilo Dáltons
ºC
Graus Celcius
no
Número
=
Igual
>
Maior
<
Menor
X
Multiplicação
UI/mL
Unidades Internacionais por mililitro
nm
Nanômetro
ng
Nanograma
µm
Micrômetro
µL
Microlitro
xii
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 1
1.1.Histórico .......................................................................................................................... 1
1.2.Estrutura e Organização Genômica do HCV .................................................................... 2
1.2.1.Proteínas estruturais ..................................................................................................... 4
1.2.2.Proteínas não estruturais .............................................................................................. 6
1.4.Genótipos ........................................................................................................................ 7
1.5.Replicação do HCV ......................................................................................................... 9
1.6.Epidemiologia ................................................................................................................ 10
1.7.Aspectos Clínicos .......................................................................................................... 14
1.8.Transmissão e Prevenção ............................................................................................. 16
1.9.Diagnóstico ................................................................................................................... 18
1.9.1.Diagnóstico Sorológico ............................................................................................... 18
1.9.2.Diagnóstico Molecular ................................................................................................. 19
1.10.Tratamento .................................................................................................................. 20
2.RACIONAL E JUSTIFICATIVA ........................................................................................ 22
3.OBJETIVO GERAL. ......................................................................................................... 24
3.1.Objetivos Específicos ..................................................................................................... 24
4.MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 25
4.1.Aspectos Éticos ............................................................................................................. 25
4.2.População de Estudo ..................................................................................................... 27
4.2.1.Painel de Referência .................................................................................................. 27
4.2.2.Estudo de Campo ....................................................................................................... 27
4.2.2.1.População de alta prevalência para anti-HCV .......................................................... 28
4.2.2.2.População de baixa prevalência para anti-HCV ....................................................... 29
4.2.2.3.População com comportamento de risco ................................................................. 34
4.3. Coleta das amostras biológicas de sangue e fluido ....................................................... 34
4.4.Testes de diagnóstico do HCV ....................................................................................... 36
4.4.1.Ensaio Imunoenzimático ............................................................................................ 36
4.4.1.1.Princípio dos Testes................................................................................................. 36
xiii
4.4.1.2.Procedimento do Teste ETI-AB-HCVK-4 (Diasorin) ................................................. 38
4.4.1.3.Procedimento do Teste HCV Ab (Radim) ................................................................. 39
4.5.Testes Rápidos para detecção de anticorpos anti-HCV ................................................ 40
4.5.1.Testes Rápidos utilizados no estudo ........................................................................... 42
4.5.1.1.Wama Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) ..................................................... 42
4.5.1.2.Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) .............................................. 42
4.5.1.3.Oraquick HCV Antibody Rapid Test (OraSure Technologies, Inc. Bethlehem
Pensilvânia) ......................................................................................................................... 43
4.6.Detecção do RNA do HCV ............................................................................................. 44
4.7.Genotipagem ................................................................................................................. 45
4.8. Avaliação do desempenho dos testes rápidos para detecção dos anticorpos anti-HCV 45
4.8.1.Testes de Concordância ............................................................................................. 45
4.8.2.Sensibilidade, especificidade e valores preditivos ....................................................... 46
4.9.Avaliação da reprodutibilidade e repetitividade dos testes rápidos para diagnóstico da
hepatite C ............................................................................................................................ 47
4.10.Avaliação do desempenho do teste rápido Oraquick em amostras de soro, sangue total
e fluido oral ......................................................................................................................... 47
4.11.Avaliação da reação cruzada em testes rápidos para diagnóstico de anticorpos antiHCV ..................................................................................................................................... 48
4.12.Análise Estatística........................................................................................................ 48
5.RESULTADOS ................................................................................................................. 49
5.1.População de Estudo ..................................................................................................... 49
5.1.1.Painel de Referência .................................................................................................. 49
5.1.2.Avaliação de testes rápidos para detecção de anticorpos anti-HCV em estudo de
campo .................................................................................................................................. 52
5.1.2.1.Avaliação do teste rápido Oraquick HCV (Orasure) em amostras de soro, sangue
total e fluido oral ................................................................................................................. 56
5.2.Avaliação da reprodutibilidade e repetitividade dos testes para detecção do anti-HCV .. 57
5.3.Avaliação da reação cruzada dos testes rápidos para detecção de anti-HCV ................ 57
6.DISCUSSÃO ................................................................................................................... 59
7.CONCLUSÕES ................................................................................................................ 65
8.PERSPECTIVAS .............................................................................................................. 67
9.REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 68
xiv
ANEXO I .............................................................................................................................. 86
ANEXO II ............................................................................................................................. 87
xv
1. INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
Até o final da Segunda Guerra Mundial apenas dois tipos de hepatites virais,
com diferentes meios de transmissão (parenteral e entérico), haviam sido
descobertos. Os agentes etiológicos das hepatites A e B foram identificados no início
da década de 70 e com o desenvolvimento de testes sorológicos sensíveis a esses
agentes, foi possível observar que muitos casos de hepatite pós-transfusional não
eram atribuíveis à infecção pelo vírus da hepatite A (HAV) ou pelo vírus da hepatite
B (HBV). Dessa forma, foi descrito pela primeira vez uma nova hepatite póstransfusional (HPT), chamada de hepatite “não-A não-B”(HNANB) (Feinstone et al.
1975).
Após a implementação de medidas preventivas, na década de 70, como a
exclusão de doação de sangue remunerada e/ou de portadores de HBsAg
reagentes, foi possível observar uma redução de aproximadamente 85% do número
de casos de hepatite pós-transfusional (HPT) (Alter et al. 1972). Mesmo com a
adoção destes critérios, o número de casos de HPT continuou a ser notificado e
sabidamente não estavam relacionados ao vírus HAV e HBV, bem como a outros
agentes hepatotrópicos como o Citomegalovírus (CMV) e vírus Epstein-Barr (EBV)
(Alter et al. 1975).
A ausência de marcador sorológico associado à infecção pelo(s) agente(s) da
HNANB dificultou a investigação etiológica da HNANB. No final dos anos 70,
diferentes grupos de pesquisadores demonstraram ser possível a transmissão
experimental dos agentes da HNANB aos chimpanzés através da administração
parenteral de material infeccioso humano (soro, plasma, hemoconcentrado)
(Hollinger et al. 1978; Alter et al. 1978; Tabor et al. 1978; Bradley et al. 1979; Bradley
et al. 1981; Hollinger et al. 1984; Bradley et al, 1985).
Em estudo realizado por Alter et al. (1978) onde amostras de plasma ou soro
de pacientes com infecção aguda ou crônica NANB foram inoculadas em 5
chimpanzés, foi possível observar evidências bioquímicas e histológicas de hepatite,
porém não houve evidência sorológica de hepatite tipo A ou tipo B. A hepatite havia
sido transmitida pelo soro derivado de pacientes com hepatite crônica, bem como
aguda, sugerindo fortemente um estado de portador crônico para o agente
responsável pela hepatite “não-A não-B”. Portanto, era sabido que o agente
transmissível poderia persistir e permanecer infeccioso por longos períodos.
1
Estudos posteriores tornaram evidente a natureza viral do agente etiológico
da HNANB (Bradley et al. 1979; Bradley et al. 1980; Bradley et al. 1981; Feinstone et
al. 1983; Hollinger et al. 1984; Bradley et al. 1985).
Em 1989, o vírus da hepatite C (HCV) foi descrito por Choo et al. (1989) como
o principal agente etiológico das hepatites conhecidas como NANB utilizando
estudos de clonagem e sequenciamento genético de uma cepa isolada do plasma
de um chimpanzé cronicamente infectado com o vírus da HPT “não-A não B”(Choo
et al. 1989). A partir da identificação do agente etiológico da hepatite NANB e
utilização de testes de detecção de anticorpos anti-HCV (utilizando peptídeos
recombinantes) (Kuo et al. 1989), foi possível esclarecer que os casos clínicos de
hepatite pós-transfusional NANB (Alter et al. 1989) tinham como responsável o HCV.
1.2 Estrutura e organização genômica do HCV
O HCV é um vírus envelopado que possui estrutura genômica composta por
uma fita simples de RNA de polaridade positiva e com aproximadamente 9.400
nucleotídeos (Figura 1.1) (Choo et al. 1991; Li et al. 1995; Hoffmann et al. 2012).
Através de comparações filogenéticas das seqüências virais, o HCV foi classificado
como pertencente ao gênero Hepacivirus, na família Flaviviridae (Choo et al. 1991;
Simmonds 2004).
2
E2
E1
RNA Fita Simples
Glicoproteínas do
Envelope
Nucleocapsídeo
Envelope
Figura 1.1. Morfologia do Vírus da Hepatite C. As particulas de virus da hepatite C
tem diâmentro estimado de 70 nm. Estruturalmente, apresentam moléculas de
proteína C formando o nucleocapsídeo. Cobrindo o nucleocapsídeo, encontra-se o
envelope de composição lipoglicoprotéica, contendo dois tipos de glicoproteínas
denominadas E1 e E2. Disponível em: www.hopkins-gi.org [Acesso em: 28 mar. 2012].
A partícula do HCV tem 70nm de diâmetro aproximadamente (He et al.1987;
Simmonds 2004), estrutura tridimensional análoga à dos Flavivírus e simetria
icosaédrica, com espículas de 6-8 nm em sua superfície (Prince et al. 1996) (Figura
1.1). As partículas virais apresentam elevada heterogeneidade bioquímica pela sua
associação com anticorpos ou lipoproteínas (Roingeard et al. 2004). Os vírions
podem circular na corrente sanguínea complexados às lipoproteínas de baixa
densidade ou às imunoglobulinas, ou como partículas livres. O HCV possui uma
relação restrita de hospedeiros, sendo apenas o homem e o chimpanzé susceptíveis
à infecção natural (Brass et al. 2007).
O HCV possui duas regiões não codificantes nas extremidades 5’ e 3’(5’NC e
3’NC) e uma única região aberta de leitura (ORF) ao longo de seu genoma, que
codifica uma poliproteína de cerca de 3000 aminoácidos (3010 – 3033 aa) que
durante e após a tradução, sofre uma série de clivagens por proteases virais e do
hospedeiro que geram proteínas estruturais e não estruturais (Choo et al.1991;
3
Valoup-Fellous et al. 2006) (Figura 1.2). Dessa forma, tem-se uma divisão funcional
em três regiões: região amino terminal que compreende as proteínas estruturais
[core (C), glicoproteínas do envelope 1 (E1) e envelope 2 (E2)]; uma região central
que inclui duas proteínas (p7 e NS2) que podem ter papel essencial na morfogênese
viral visto que a expressão excessiva de proteínas p7 induz a apoptose em culturas
de célula Huh 7 (Aweya et al. 2012); e região carboxi terminal que compreende as
proteínas não estruturais necessárias para a replicação do RNA (NS3, NS4A, NS4B,
NS5A e NS5B) (Figura 2.1) (Tellinghusein et al. 2007).
Figura 1.2. Estrutura do genoma viral. Representação da fase de leitura aberta
(ORF – open reading frame) codificando genes estruturais e não-estruturais com as
regiões 5’ e 3’ NC. O círculo claro refere-se ao sítio de atuação da peptidase celular;
círculos escuros são sítios de atuação das peptidases virais; seta clara indica atuação
da autoprotease NS2-NS3; setas escuras são referentes aos locais de atuação da
protease NS3-NS4A (Adaptado de Lindenbach & Rice, 2005).
1.2.1 Proteínas Estruturais
O segmento amino terminal da poliproteína é processado pela peptidase sinal
do hospedeiro para então produzir a proteína do nucleocapsídeo (core), duas
glicoproteínas do envelope (E1 e E2) e a proteína p7 que é uma pequena proteína
transmembrana composta por 63 aa pertencente à família das viroporinas, que são
famílias de proteínas virais capazes de formar poros nas membranas das células
infectadas (Reed et al. 2000).
As proteínas do core (C) são compostas por 191 aa constituintes do capsídeo
viral e associam-se, provavelmente, pela porção N-terminal, ao RNA genômico para
formar
o
nucleocapsídeo
(Drazan
2000).
Apresenta
peso
molecular
de
aproximadamente 21 kDa e é a proteína mais conservada do HCV. Acredita-se que
a proteína do core madura é capaz de se agrupar espontaneamente para formar o
capsídeo viral e interagir com as glicoproteínas do envelope E1 e E2 (Forns et al.
4
1999). Em sua região carboxi terminal há uma sequencia de 20 aa com função de
sinalização que direciona a glicoproteína E1 ao retículo endoplasmático granular
(Forns et al. 1999).
As glicoproteínas do envelope viral E1 (35 kDa) e E2 (70 kDa) são produzidas
a partir de clivagem enzimática e estão envolvidas nos processos de interação com
o receptor e fusão celular (Grakoui et al. 1993; Takikawa et al. 2000). A proteína E1
é utilizada para propósitos clínicos de diagnóstico em testes de genotipagem
enquanto a proteína E2 apresenta uma região hipervariável (HVR1) que pode induzir
a produção de anticorpos neutralizantes, funcionando como um mecanismo de
escape, evadindo desta forma da resposta imune do hospedeiro (Bukh et al. 1995;
Penin et al. 2004; Lyra et al. 2004). A HVR1 desempenha papel importante na
evolução da infecção pelo HCV. Os casos de resolução na fase aguda apresentam
menor variabilidade (nas sequências de E2) dentro de um mesmo paciente em
relação àqueles casos que evoluem para hepatite crônica (Chen & Wang 2007).
Quanto a proteína E2, esta apresenta um sítio de ligação para CD81, que é
uma proteína de membrana (26 kDa), encontrada em diversas células, incluindo
hepatócitos, células do sistema imune, fibroblastos e células endoteliais e, além
disso, podem participar do processo de penetração do HCV nessas células. Além da
interação das proteínas E2 com CD81 para penetração nos hepatócitos, o HCV
ainda utiliza o receptor de lipoproteína de baixa densidade (LDL-R) (Chen & Wang,
2007). A ligação com LDL-R e SR-B1 leva a mudanças conformacionais na partícula
viral permitindo o envolvimento de outros co-receptores de membrana do hepatócito
(CD 81, claudina-1 e ocludina) (Jahan et al. 2011). As proteínas E1 e E2 ainda são
os principais alvos para produção de vacinas e têm sido bastante estudadas quanto
à sua variabilidade (Chen & Wang 2007).
A proteína p7 é um polipeptídeo de 63 aa que é parcialmente clivado a partir
de E2. É composto por um pequeno fragmento hidrofóbico (hexâmeros) que tem
atividade de canal iônico e pode ter um importante papel na maturação e liberação
da partícula viral e, sua necessidade para a replicação do HCV em chimpanzés,
confirma a proteína como possível alvo para a quimioterapia antiviral, já que está
relacionado a apoptose celular, maturação e liberação da partícula viral (Sakai et al.
2003; Roingeard et al. 2004; Aweya et al. 2012).
5
1.2.2 Proteínas não estruturais
A proteína NS2 é uma proteína não-estrutural de 23 kDa e, é a primeira
protease viral ativada pelo polipeptídeo. É responsável pela clivagem da junção
NS2/NS3 (NS2/NS3 protease) e pela maturação das proteínas NS restantes
(Dumoulin et al. 2003). Até hoje, poucas propriedades foram atribuídas a NS2
clivada madura, visto que ela parece agir inibindo a apoptose, modulando a
expressão gênica e também, na fosforilação de NS5A (Franck et al. 2005). Sabe-se
também, que a atividade de protease da NS2 é fundamental para que ocorra a
replicação completa do HCV in vivo, entretanto a mesma é dispensável para
replicação do vírus in vitro (Roingeard et al. 2004).
A proteína NS3 (serina protease específica) é uma proteína não-estrutural
hidrofílica de aproximadamente 70 kDa. É uma proteína multifuncional e contém um
domínio serino-protease na porção amino terminal e um domínio RNAhelicase/NTPase na porção carboxi terminal (Lindenbach & Rice 2005). O papel da
helicase do HCV ainda não foi bem descrito, mas acredita-se que esteja envolvida
na iniciação da síntese de RNA, sendo responsável pela dissociação das fitas de
RNA de seus moldes (Pang et al. 2002). Além disso, estudos mostraram que a NS3
pode interferir nas funções da célula hospedeira, influenciando desta forma a
resposta imune inata e celular (Gale et al.1998; Borowski et al.1999; Gale & Foy
2005; Meylan et al. 2005). Atualmente o alvo mais utilizado para o estudo de novas
drogas antivirais para o HCV tem sido a serina protease NS3/4A (Vermehren &
Sarrazin et al. 2011).
A região genômica de NS4 codifica duas proteínas: NS4A (8 kDa) e NS4B (23
kDa). A proteína NS4A é composta por aproximadamente 54 aa e funciona como
cofator para serina protease NS3 e é também incorporada como componente
integral do core (Roingeard et al. 2004; Dubuisson et al. 2002). A proteína NS4B
(p27), por sua vez, é a proteína viral do HCV menos caracterizada, porém, alguns
estudos sugeriram que ela seja responsável por induzir a alterações nas membranas
celulares denominada “teia membranosa” (Roingeard et al. 2004; Dubuisson et al.
2002; Moradpour & Blum 2004).
Duas proteínas diferentes são codificadas pela região genômica NS5: NS5A
ou p56 na forma hiperfosforilada (58 kDa) e NS5B ou p65 (68 kDa). Ambas
proteínas são liberadas pela ação conjunta de NS3/NS4A.
Embora já tenha sido demonstrado que as proteínas NS4B e NS5A são
6
proteínas associadas à membrana e a outras proteínas não estruturais do HCV,
suas funções bioquímicas ainda são pouco conhecidas (Lin et al. 1997; Hugle et al.
2001). Alguns estudos mostram que proteína NS5A apresenta um domínio de zinco
o qual é essencial para a replicação do HCV, além disso, funciona como co-receptor
para outras proteínas (Verdegem et al. 2011; Yamasaki et al. 2012). Alguns estudos
sugerem que a proteína NS5A esteja relacionada a resposta ao interferon,
especulando que seja responsável pela manutenção da replicação viral mesmo na
presença da droga (Gale et al. 1998; Tan & Katze 2001).
A proteína NS5B é uma RNA-polimerase dependente do RNA viral,
responsável por toda a replicação do material genético viral, sendo este empacotado
para dar origem a novos vírions.
1.4 Genótipos
A replicação do HCV é muito propensa a erros e gera mutações em uma taxa
de aproximadamente 10-5 por nucleotídeo por replicação, gerando uma elevada
diversidade viral (Stumpf & Pybus 2002). Desta forma, foi proposta uma classificação
do HCV em genótipos (homologia de 65,7% a 68,9%) e subtipos (homologia de
76,9% a 80,1%) baseados em análises filogenéticas e sequenciamento. Os
genótipos propostos são seis (1, 2, 3, 4, 5 e 6), sendo cada um subdividido em
subtipos nomeados alfabeticamente, de acordo com a sua ordem de descoberta
(Stumpf & Pybus 2002; Simmonds et al. 1993). O estabelecimento de um genótipo 7
está sendo proposto pela análise de um novo isolado (Murphy et al. 2007).
A heterogeneidade genética do HCV faz com que este apresente
quasispécies, que são vírus com genomas muito semelhantes, porém com
homologia entre 90,8% a 99% nas sequências de nucleotídeos (Ueda et al. 2004).
Quanto às regiões utilizadas para genotipagem, as mais utilizadas são: região 5´ NC
(RFLP e Lipa) e NS5B (sequenciamento).
Algumas regiões são potencialmente endêmicas para determinados genótipos
tais como (Figura 1.3): Costa da Guiné na África Ocidental para o genótipo 1, a
África Central para o genótipo 2, o Norte do subcontinente indiano para o genótipo 3,
a África Central para o genótipo 4 e o Sudeste Asiático para o genótipo 6 (Smith et al
1997). Esses genótipos disseminaram-se por todo o mundo principalmente no
século XX como resultado da introdução de determinados fatores de risco, como as
transfusões sanguíneas e a partilha de agulhas entre UDIs (Pybus et al. 2001;
7
Simmonds 2004). Dessa forma, os principais subtipos encontrados nos países
industrializados incluem: o subtipo 1a distribuído globalmente no Norte da Europa e
EUA e fortemente associado a UDIs; o subtipo 1b associado a indivíduos de idade
mais avançada e a transfusões sanguíneas no passado; o subtipo 3a distribuído
amplamente nos UDIs, particularmente da Europa. Os subtipos 2a, 2b e 2c, são
encontrados nos países mediterrânicos e Extremo Oriente; o subtipo 4a, altamente
distribuído na África e no Oriente Médio, onde no Egito é associado ao tratamento
massivo da Esquistossomose; o subtipo 5a prevalente na África do Sul; e o genótipo
6 encontrado nos UDIs de Hong Kong, Vietnam e também na Austrália (Simmonds
2004). No entanto, tem sido verificada uma crescente disseminação do genótipo 4
(subtipos 4a e 4d) em alguns países do Sul da Europa, associado a infecção entre
UDIs, co-infecção HCV-HIV e imigração proveniente do Norte de África (Franco et al.
2007; Sereno et al. 2009).
Figura 1.3. Genótipos do HCV. Árvore filogenética dos genótipos do HCV e suas
principais associações epidemiológicas com grupos de risco. (Adaptado de Simmonds,
2004)
1.5 Replicação do HCV
8
1.5 Replicação do HCV
A replicação do HCV, mesmo com os avanços no desenvolvimento de cultivos
celulares, ainda está pouco esclarecida e o modelo aceito mais utilizado para estudo
é aquele baseado na similaridade do ciclo dos vírus pertencentes à família
Flaviviridae.
O início da replicação ocorre na membrana do hepatócito com a adsorção da
partícula viral. Após adsorção o vírus se internaliza a célula por fusão de membrana
ou endocitose mediada por receptor (Cabot et al. 2000; Szabó et al. 2003; Pawlotsky
2004; Penin et al. 2004). Algumas moléculas de superfície celular foram identificadas
como possíveis receptores para o HCV nos processos de adsorção e internalização
do HCV na célula hospedeira. Dentre os candidatos a receptores do HCV,
receberam maior destaque as moléculas CD81 (forte interação com E2),
encontradas na superfície de muitos tipos celulares, incluindo hepatócitos (Pileri et
al. 1998), receptores LDL (LDLR) (Agnello et al. 1999) e SR-BI (scavenger receptor
class B type I) (Scarselli et al. 2002). A claudina-1 foi descrita como molécula coreceptora necessária à internalização do HCV na célula (Evans et al. 2007).
Após internalização, o vírus sofre desnudamento, expondo o genoma viral,
para assim iniciar a replicação. A atividade de RNA-polimerase RNA - dependente
(transcriptase) gera uma fita de RNA, de polaridade negativa, complementar ao RNA
viral, que serve também de molde para que haja a síntese de novas fitas de RNA de
polaridade positiva que servirão para a formação de novos vírus (Figura 1.4)
(Pawlotsky 2004; Penin et al. 2004).
O RNA de polaridade positiva, sintetizado a partir das fitas RNA negativas
interage com inúmeras proteínas do capsídeo para formar o nucleocapsídeo viral, o
qual adquire o envelope no RE (retículo endoplasmático). A partícula viral montada é
transportada, via complexo de golgi (CG), para ser exocitada da célula hospedeira
(Pawlotsky 2004). O RNA viral serve como RNA mensageiro (RNAm) e depois da
tradução, uma poliproteína é produzida e clivada em proteínas estruturais e nãoestruturais (Santos et al. 2002; Szabó et al. 2003).
As regiões terminais não codificantes (NC) são essenciais no processo de
replicação viral. A região 5’ NC, (sequência mais conservada do genoma do HCV),
contém um sítio interno de entrada de ribossomo (IRES) essencial para a tradução
independente do RNA viral (Honda et al. 1996; Hellen et al. 1999). A região 3’ NC
por sua vez, é constituída de uma estrutura em forma de trevo, consistindo de uma
9
região variável pequena de aproximadamente 40 nucleotídeos, uma cauda poli-U e
uma região altamente conservada de 98 nucleotídeos (Tanaka et al. 1995;
Kolykhalov et al. 1996).
Figura 1.4. Ciclo de replicação do HCV. Partículas de HCV se ligam à célula
hospedeira via interação específica entre as glicoproteínas do envelope e receptores
celulares. As partículas ligadas são então internalizadas, provavelmente por meio de
endocitose mediada por receptor. Após a liberação do genoma viral no citoplasma
(desnudamento) ocorre a tradução, no retículo endoplasmático rugoso (RER) em uma
poliproteína que é clivada nas proteínas estruturais e não-estruturais. As proteínas nãoestruturais participam da replicação viral e as estruturais fazem parte da estrutura do
capsídeo e glicoproteínas do envelope. O local de montagem das partículas virais ainda
não foi identificado, mas acredita-se que seja em membranas intracelulares derivadas
do retículo endoplasmático ou do compartimento de Golgi. Os vírions recém montados
são então liberados da célula hospedeira, possivelmente por meio da via secretória.
Adaptado
de:
http://www.tibotec.com/content/backgrounders/www.tibotec.com/hcv_lifecycle.html
[Acesso em 5 mai 2012)].
1.6 Epidemiologia
A ferramenta mais utilizada para estimar a prevalência da hepatite C são
estudos de soroprevalência realizados em doadores de sangue (Gonçales et al.
1993; Parolin et al. 1999), usuários de drogas (Oliveira et al. 1999) e pacientes
submetidos à hemodiálise (Yoshida et al. 1992). No entanto, por se tratar de
populações com características específicas (grupos de risco para hepatite C), estes
10
estudos podem não representar a prevalência real da infecção pelo HCV (Martins et
al. 2010). Em estudos realizados na população norte-americana que apresentava na
década de 1990 prevalência estimada de infecção pelo HCV de 0,6% em estudos
com doadores de sangue e de 1,8% na população geral, demonstram a falha neste
mecanismo de avaliação (Alter et al.1999).
Apesar de estudos populacionais com amostras representativas de múltiplas
comunidades serem mais adequados, esse tipo de estudo possui maior
complexidade, custo elevado e não pode ser executado na maior parte das regiões
do mundo (Martins et al. 2010). Mesmo com essas ponderações, as estimativas da
OMS apontam para valores absolutos de indivíduos infectados variando de 130 a
170 milhões o que significa uma prevalência de 2,2 a 3% sobre a população mundial
(Wasley & Alter 2000; Armstrong et al. 2002; Shepard et al. 2005; Alter 2007;
Lavanchy et al. 2009).
Além disso, todos os anos, 3-4 milhões de pessoas são infectadas com o
HCV e aproximadamente 150 milhões de pessoas estão cronicamente infectados e
em risco de desenvolver cirrose hepática e/ou câncer de fígado. A cada ano, mais
de 350000 pessoas morrem de doenças no fígado relacionadas com a hepatite C
(WHO, 2012).
Embora o HCV tenha distribuição mundial, existe um elevado grau de
variação geográfica em sua prevalência (Figura 1.5)(Wasley & Alter 2000; Shepard
et al. 2005; Alter 2007).
11
Figura 1.5. Prevalência global da infecção pelo vírus da Hepatite C. Em muitos
países não existem dados sobre a infecção e as estimativas são baseadas em
médias ponderadas para as regiões. Adaptado de Perz et al. 2004.
A prevalência da hepatite C é baixa no Reino Unido, Escandinávia (0,01% a
0,1%), Américas, Europa Ocidental, Austrália e África do Sul (0,2% a 0,5%).
Prevalências intermediárias são encontradas no Leste Europeu, Mediterrâneo,
Oriente Médio e Índia. Outros países com prevalência intermediária incluem Brasil,
Europa Oriental, partes da África e Ásia (Perz et al. 2004). Os países com as taxas
mais altas de infecção crônica são: Egito (22%), Paquistão (4,8%) e China (3,2%)
sendo o principal modo de transmissão nesses países atribuído às injeções usando
seringas contaminadas (Wasley & Alter 2000; Yen et al. 2003; WHO 2012).
Em alguns estudos isolados na população em geral foi possível observar uma
prevalência de anti-HCV de 24,6% na Itália (Castellana), 10,4% no Camboja e
0,87% na Índia (Osella et al. 1999; Chowdhury et al. 2003). Outros trabalhos
realizados com população em risco de infecção por HCV como doadores de sangue
e hemodialisados foi encontrada uma prevalência de 16% na Mongólia (Takahashi et
al. 2004) principalmente em indivíduos da faixa etária de 50 a 86 anos e em
pacientes de diálise na Grécia (22,5%), sendo este valor muito maior do que a
relatada na população em geral, sugerindo que a transmissão de um paciente para o
outro pode ser uma importante via de transmissão (Katsoulidou et al. 1999).
12
No Brasil, aproximadamente 70 mil casos de hepatite C crônica foram
confirmados de 1999-2010 (MS, 2010). Em 2010 a taxa média de número de casos
foi de 4,5 casos por 100 mil habitantes. As maiores taxas foram identificadas nas
regiões Sul (7,2 casos/100 mil hab) e Sudeste (6,8 casos/100 mil hab) onde as
maiorias dos casos ocorreram em indivíduos com idade superior a 35 anos (80,7%).
A prevalência de anti-HCV na população brasileira entre 10 e 69 anos foi de 2,10%
na região Norte, 1,32% na região Centro-Oeste, 1,27% na região sudeste, 1,19% na
região sul e 0,68% na região Nordeste. Neste levantamento soroepidemiológico
realizado em indivíduos saudáveis também foi possível observar uma prevalência de
0,75% em indivíduos com idade entre 10 a 19 anos e 1,56% em indivíduos com 20 a
69 anos (MS, 2010). A mortalidade encontra-se decrescente desde 2000,
alcançando um óbito a cada 100 mil habitantes em 2007 e assim permanecendo até
2010 (MS, 2010).
Por ser um país de dimensões continentais e com grandes variações
demográficas, sociais e culturais entre as diferentes regiões, os estudos de
prevalência no Brasil são poucos e imprecisos, englobando no geral populações
específicas (Ferreira & Silveira 2004).
De acordo com o inquérito realizado pela Sociedade Brasileira de Hepatologia
(SBH, 1999), dos 1.173.406 doadores de sangue avaliados, 14.527 (1,23%) foram
reativos para o anti-HCV.
A Figura 1.6 mostra a distribuição da prevalência de anti-HCV no Brasil em
estudo realizado em doadores de sangue onde é possível observar que nas mesmas
regiões podem ser encontradas prevalências altas e baixas (SBH, 1999).
13
Figura 1.6. Distribuição geográfica da prevalência de anti-HCV
segundo os Estados brasileiros (SBH, 1999).
Os valores mais elevados de prevalência foram observados nos Estados da
região Norte (2,12%). A região Sul, por sua vez, mostrou baixa prevalência de antiHCV (0,65%) enquanto as regiões Centro-Oeste, Nordeste e Sudeste apresentaram
taxas intermediárias (1,04%, 1,19% e 1,43%, respectivamente) (SBH, 1999).
Em estudo de base populacional realizado em 1049 indivíduos moradores de
São Paulo, a prevalência de anti-HCV foi de 1,42%. Os maiores valores de
prevalência foram observados nos indivíduos acima de 30 anos, com pico de 3,8%
observado na faixa etária entre 50 e 59 anos (Focaccia et al.1998).
1.7 Aspectos Clínicos
Apesar de o HCV possuir baixa infectividade e lenta taxa de replicação, 80 a
85% dos pacientes irão desenvolver uma persistente infecção assintomática, que
pode progredir para cirrose em aproximadamente 20% dos pacientes e em
carcinoma hepatocelular em parte desses casos (Seef et al. 1992; Takahashi et al.
1992). Dessa forma, a hepatite C pode ser classificada clinicamente como forma
aguda ou crônica. É estabelecido que a forma aguda equivale à presença de sinais
clínicos, alterações enzimáticas ou sintomas da hepatite C até um período de 6
14
meses após o a exposição ao HCV (Blackard et al. 2008). Entretanto, a forma aguda
é observada em apenas 20-30% dos indivíduos infectados (Augusto & Lobato 2003).
Apenas 5% dos indivíduos portadores da hepatite C apresentam doença
sintomática (Multimer et al.1995). Nos demais indivíduos infectados a infecção é
subclínica ou assintomática sendo este um dos maiores problemas de saúde pública
pois, podem transmitir o vírus sem conhecimento (Ferreira & Gameiro 2002;
Blackard et al. 2008). Em somente 20% dos casos ocorrem resolução espontânea
da viremia, sendo a maioria ocorre em indivíduos jovens, do gênero feminino,
caucasianos e com baixa viremia (Thomas et al. 2000; Lauer & Walker 2001; Chen
& Morgan 2006; Blackard et al. 2008). Clinicamente, os sintomas da hepatite C são
semelhantes aqueles observados nos outros casos de hepatites virais, onde o
paciente pode apresentar icterícia, fadiga, anorexia, náusea e outros sintomas
inespecíficos (Kohara 2000).
É possível detectar o HCV pela reação em cadeia da polimerase (PCR) nos
primeiros estágios da hepatite aguda (a região utilizada para a PCR é a região 5´ NC
do vírus), surgindo, concomitantemente, os níveis anormais de transaminases.
Diferente destes, a soroconversão para anti-HCV pode demorar meses ou semanas
para ocorrer (Pawlotsky et al. 1999)(Figura 1.7).
Nos indivíduos com infecção aguda não resolvida, 70-80%, evoluem para a
forma crônica, onde o vírus replica-se persistentemente e é possível detectar o RNA
viral no soro ou tecido hepático, na presença de resposta imune (Figura 1.7)
(Blackard et al. 2008). Com o estabelecimento da infecção crônica, não ocorrerá
resolução espontânea da viremia (Lemon et al. 2007).
Dos indivíduos cronicamente infectados, aproximadamente 15 a 20%
desenvolvem cirrose num período de 10 a 30 anos e, por ano, 1-5% destes doentes
desenvolve hepatocarcinoma (HCC) (Bruijne et al. 2009).
15
Figura 1.7. Representação esquemática da infecção pelo HCV. Níveis de RNA
do HCV (linha preta) e início da produção de anticorpos anti-HCV (seta azul) ao
longo da infecção. No eixo dos X encontram-se representados o tempo (meses)
após a infecção por HCV e no eixo Y a carga viral (log10 cópias/ml). PJ – Período
Janela (Adaptada de Blackard et al. 2008).
1.8 Transmissão e Prevenção
Até o momento não existe uma vacina disponível contra a hepatite C. Desta
forma, a eliminação dos comportamentos de risco é fundamental para que as taxas
de incidência da infecção sejam reduzidas e, consequentemente, diminuição dos
casos de doença hepática.
A grande maioria das infecções por HCV está associada à utilização de
drogas injetáveis e, por isso, a prevenção deste comportamento de risco irá eliminar
grande parte das infecções. O uso de drogas intravenosas (DIV) é uma das
principais formas de transmissão do HCV nos últimos 40 anos em países como os
Estados Unidos e a Austrália, e atualmente este é o principal fator de risco em
países desenvolvidos (Alter 2002; Dore et al. 2003). Nesses países, o uso de DIV
responde por cerca de 70% a 80% das contaminações pelo HCV ocorridas nos
últimos 30 anos (Alter 2002; Dore et al. 2003).
Outras formas de infecção pelo HCV incluem os procedimentos médicos e
exposição nosocomial, transplante de órgãos, exposição ocupacional, transmissão
vertical e sexual.
Procedimentos com equipamentos ou seringas contaminadas se apresentam
como uma forma possível de transmissão. Estima-se que aproximadamente 2
16
milhões de indivíduos se infectem por esta via. Em países subdesenvolvidos, muitas
vezes ocorre reutilização de material ou falta de cuidado com a esterilização. Além
disso, muitas terapias são realizadas em ambiente doméstico por indivíduos não
habilitados o que aumenta significativamente o risco de infecção pelo HCV (Hauri et
al. 2004).
Acredita-se que entre os anos de 1960 e 1991, antes da introdução dos testes
sorológicos nos bancos de sangue, 5% a 15% dos receptores de hemoderivados
infectaram-se com HCV e, atualmente, após a adoção dos testes de rastreamento, o
risco de infecção por transfusão sanguínea está em torno de 0,001% por unidade de
sangue transfundida. A prevalência do anti-HCV em doadores de órgãos, varia de
4,2% a 5,1% dependendo do teste realizado. Receptores de órgãos sólidos de
doadores anti-HCV positivos apresentam elevadas taxas de soroconversão. Em
estudo realizado com transplantados renais, 35% dos receptores de doadores com
anti-HCV reagente desenvolveram doença hepática no pós-transplante, e 74%
apresentaram evidências de viremia. Apesar desses dados, as evidências ainda são
limitadas e são necessários novos estudos para avaliar o impacto do transplante de
órgãos na prevalência do HCV (Martins et al. 2011).
Quanto aos acidentes ocupacionais, os acidentes perfurocortantes são uma
forma
bem
documentada
de
transmissão
do
HCV,
apresenta
taxas
de
soroconversão após uma única exposição percutânea com objeto sabidamente
contaminado variando entre 3% e 10% (Mitsui et al. 1992; Lahphear et al. 1994,
Martins et al. 2011)
A transmissão vertical apresenta taxas variando entre 0% a 20%, com média
em torno de 5% na maioria dos estudos (Taler et al,1991, Martins et al. 2011).
Por fim, o papel da transmissão sexual ainda não foi bem estabelecido (Sy &
Jamal 2006), constituindo este um fato controverso na epidemiologia da hepatite C
devido à divergência entre resultados (Alter et al.1982; Alter et al.1989). A maioria
dos trabalhos afirma que as chances de transmissão são baixas ou quase nulas e as
porcentagens oscilam entre 0% e 3% (Cavalheiro 2007).
17
1.9 Diagnóstico
1.9.1 Diagnóstico Sorológico
O diagnóstico da infecção pelo HCV é realizado através de testes de
detecção de anticorpos, antígenos e do genoma viral em amostras de soro ou
plasma. Para a detecção de anticorpos anti-HCV no plasma ou soro são utilizados
ensaios imunoenzimáticos de terceira geração que detectam anticorpos contra
vários epítopos do HCV e apresentam especificidade maior que 99% (Uyttendaele et
al. 1994; Barrera et al. 1995). Um dos problemas desta técnica é a possibilidade de
resultados falsos negativos devido ao período de janela imunológica necessária para
o surgimento de anticorpos. Além disso, indivíduos imunocomprometidos têm uma
maior possibilidade de obterem resultados falsos negativos (Pawlotsky 1999). Um
novo ensaio imunoenzimático foi desenvolvido para diagnóstico de infecção pelo
HCV, baseado na detecção de antígeno e anticorpo. Este teste detecta o antígeno
do HCV antes que uma resposta com anticorpos tenha sido gerada e dessa forma
diminui o período de janela para diagnóstico e são denominados ensaios de quarta
geração (Nick & Scheiblauer 2007).
Os testes sorológicos se baseiam na detecção de anticorpos anti-HCV no
soro de pacientes infectados, através de técnica imunoenzimática (Enzyme linked
immunosorbent assay ou ELISA) (Pawlotsky 2002). O antígeno de captura dos
testes imunoenzimáticos de primeira geração era a proteína NS4 do HCV, enquanto
que o nos testes de segunda geração eram compostos pela proteína core, NS3 e
NS4 do vírus. Já os testes de terceira geração utilizam uma mistura de antígenos
virais (três ou quatro) de regiões estruturais e não-estruturais do HCV (core, NS3,
NS4 e/ou NS5) (Cossart 1999). Atualmente já estão disponíveis os testes de quarta
geração para detecção simultânea de antígenos do HCV e anticorpos anti-HCV em
amostras de soro ou plasma (Lambert 2007). O teste apresenta eficiência
comparada à detecção qualitativa do vírus e tem sido muito utilizado para
acompanhamento de pacientes, onde permite correlacionar os níveis de antígeno
core com a carga viral no soro dos pacientes infectados podendo ser utilizado com
marcadores de replicação do HCV (Buti et al. 2004).
Além dos ensaios imunoenzimáticos convencionais, o ensaio imunoblot
recombinante (RIBA) é um teste suplementar empregado naquelas amostras com
resultados positivos no ELISA e pode ser útil na diferenciação de indivíduos com
18
testes imunoenzimáticos falso-positivos daqueles que necessitarão de investigação
clínica. O RIBA utiliza antígenos recombinantes do HCV que são imobilizados como
bandas individuais na tira de reação. O mais utilizado é o imunoblot (RIBA) de 2ª ou
3ª geração, que detecta reação do soro do indivíduo contra proteínas de até 4
regiões diferentes do genoma do HCV. Quando não há reação a qualquer desses
antígenos o teste é considerado negativo. Quando há reação a apenas uma
proteína, indeterminado. No caso de reação a duas bandas do RIBA ou mais, a
positividade do ELISA anti-VHC é confirmada. (Munoz Espinosa 2002; Souto et al.
2002).
Além do diagnóstico sorológico convencional, atualmente os testes rápidos
para detecção de anticorpos anti-HCV vem sendo introduzidos como uma
ferramenta alternativa e prática para o diagnóstico da hepatite C. O teste baseia-se
no princípio da reação antígeno-anticorpo onde o antígeno encontra-se fixado na
linha T do teste e os anticorpos anti-HCV na amostra do paciente (em casos de
infecção por HCV). A linha T dos testes apresenta uma combinação de antígenos
(core, NS3, NS4 e NS5) que pode variar de acordo com o fabricante (Shivkumar et
al. 2012). Após a adição da amostra do paciente, na presença de anticorpos antiHCV, este reage com o conjugado (proteína A) e migra até a linha T do teste onde
se liga aos antígenos lá fixados produzindo cor rosa. Alguns estudos realizados até
o momento encontraram resultados de sensibilidade e especificidade superiores a
95% (Lee et al. 2010, 2011; Smith et al. 2011, Drobnik et al. 2011). Além da
praticidade do teste rápido, alguns ainda podem ser utilizados em amostras de fluido
oral apresentando sensibilidade e especificidade, em ambientes de campo e
laboratorial, superior a 90% (Lee et al. 2010,2011; Smith et al. 2011, Drobnik et al.
2011).
1.9.2 Diagnóstico Molecular
Para a detecção do HCV-RNA, testes qualitativos e quantitativos podem ser
empregados. Estes testes são baseados na amplificação, através de métodos de
biologia molecular, de regiões específicas do genoma do vírus. A detecção do RNA
viral pode ser qualitativa ou quantitativa e, geralmente, a detecção é feita em
amostras de soro ou plasma.
19
Os testes qualitativos permitem determinar a presença do HCV na fase inicial
da infecção (1-2 semanas após exposição), antes mesmo da produção de anticorpos
(Ozaras & Tahan 2009). São exemplos de testes qualitativos a reação em cadeia de
polimerase (PCR) ou testes de amplificação mediada pela transcrição (TMA). Ambos
ensaios utilizam o produto da transcrição reversa (RT) (Chevaliez & Pawlotsky 2006)
Os testes quantitativos incluem a RT-PCR competitiva, PCR-ELISA
quantitativa, PCR em tempo real e amplificação de sinal [ensaio por DNA ramificado
(bDNA)]. Estes testes devem apresentar elevada sensibilidade para determinação
da carga viral antes e durante o tratamento antiviral, uma vez que são utilizados
tanto no diagnóstico quanto no monitoramento da eficácia terapêutica (Strauss 2001;
Portaria n˚ 221, de 13 de julho de 2011, Brasil).
Os testes de detecção de anticorpos são utilizados para triagem sorológica,
sendo apropriados para rastreamento em populações de risco e recomendado como
teste inicial para pacientes com hepatopatia (Seeff & Hoofnagle 2002). Já os testes
moleculares são importantes para determinação da carga viral presente no soro de
pacientes infectados (carga viral), o que é utilizado para avaliação do prognóstico e
monitoramento da terapia antiviral (Ballardini et al.1997; Strauss 2001; Seeff &
Hoofnagle 2002).
1.10 Tratamento
O tratamento padrão da infecção crônica pelo HCV, atualmente, consiste na
administração da combinação de interferon peguilado alfa-2a ou alfa-2b (IFN) e
ribavirina (Fried et al. 2002). O interferon peguilado e a ribavirina são utilizados para
o tratamento em pacientes monoinfectados com HCV e em pacientes co-infectados
HCV/HIV. A resposta virológica sustentada é determinada pela ausência de RNA
viral no período de seis meses após o tratamento (Pawlotsky 2009). A duração do
tratamento para indivíduos monoinfectados HCV é baseado no genótipo infectante
onde, é recomendado 24 a 48 semanas de tratamento para os genótipos 2 ou 3 e 48
a 72 semanas para os genótipos 1 e 4. A taxa de resposta depende do genótipo
infectante, o que sugere que as diferenças de seqüência entre genótipos influenciam
a susceptibilidade a esses medicamentos (Van den Eynde et al. 2009; Portaria n˚
221, de 13 de julho de 2011, Brasil). O tratamento é eficaz em aproximadamente
80% dos doentes infectados com o genótipo 2 ou 3 e menos de 50% dos doentes
com o genótipo 1 (Pawlotsky 2009). Assim, doentes com o genótipo 1 necessitam de
20
uma maior dose de RBV e tratamento mais prolongado (1,0-1,2 g/dia, 48 a 72
semanas) do que doentes infectados com o genótipo 2 ou 3 (0,8 g/dia, 24 a 48
semanas). Para os genótipos 4, 5 e 6 existem ainda poucos ensaios clínicos,
aplicando-se o protocolo terapêutico utilizado para o genótipo 1 (Pawlotsky 2009;
Portaria n˚ 221, de 13 de julho de 2011, Brasil). Atualmente, terapias utilizando
antivirais de ação direta contra o HCV (inibidores de protease) podem ser uma
estratégia eficaz para o tratamento do genótipo 1. As drogas Boceprevir e Telaprevir
foram os primeiros inibidores de protease para o tratamento da hepatite C e
recentemente obtiveram registro na Anvisa, entrando dessa forma no esquema
terapêutico nacional (MS, 2012). As novas drogas serão utilizadas em terapia tripla
com interferon-α e ribavirina. Estas drogas demonstraram taxas de RVS de 67%75% em estudos de fase III com pacientes infectados pelo HCV genótipo 1 (Poordad
et al. 2011; Jacobson et al. 2011). Em relação aos efeitos adversos, foram
observados para Boceprevir, anemia, pele seca e disgeusia e para o Telaprevir,
anemia, náuseas, rash, diarreia, prurido e sintomas anorretais (MS, 2012).
Quanto os efeitos adversos do tratamento convencional para hepatite C, os
principais
eventos
associados
aos
fármacos
são:
interferon
(alterações
hematológicas, sintomas semelhantes a gripe, dor de cabeça, fadiga, febre e
mialgia) e ribavirina (anemia hemolítica, tosse, dispinéia, gota, náuseas, erupções
cutâneas e teratogenicidade) (MS, 2011).
21
2. RACIONAL E JUSTIFICATIVA
O Brasil é um país composto por uma população heterogênea principalmente
quanto ao nível cultural e socioeconômico. Sua geografia variada e grande área
territorial tornam o país ainda mais complexo do ponto de vista epidemiológico. Esta
grande diversidade dificulta e até mesmo impossibilita uma estratégia única de
atuação frente aos problemas de saúde da população. Dessa forma, novas
metodologias de detecção de marcadores sorológicos para hepatite C têm sido
estudadas para permitir o acesso ao diagnóstico em populações situadas em áreas
remotas, longe dos centros urbanos.
Uma metodologia que pode ser bastante útil em áreas remotas são os testes
rápidos que superam a limitação comum da realização dos testes sorológicos que
em média duram 4 horas, além de diminuírem os custos de realização dos testes.
Os testes rápidos de diagnóstico já são utilizados para o diagnóstico da infecção
pelo HIV de acordo com a Portaria 151 do Ministério da Saúde.
Os testes rápidos constituem testes de triagem que produzem resultados em
um curto intervalo de tempo, em geral de 10 minutos a 2 horas, sem necessidade de
grandes equipamentos. No mercado, existem testes rápidos para a detecção de
diferentes patógenos [HCV (Lee et al. 2010; Drobnik et al. 2011; Smith et al. 2011;
Lee et al. 2011), dengue (Lima et al. 2010; Lima et al.2011; Tontulawat et al. 2011),
rotavirus (Park et al. 2012; Bruggink et al. 2011), HIV (Stevinsona et al. 2011;
Delaneya et al. 2011), HBV (Soeung et al. 2009; Lin et al. 2008), sífilis (Lien et al.
2000), HEV (Chen et al. 2005), HAV (Lee et al. 2010)] os quais se baseiam em
diferentes princípios: aglutinação de partículas, imunocromatografia e immunodot.
Em sua maioria, os testes podem ser estocados à temperatura ambiente e são
embalados em embalagens individuais. Estes testes constituem uma ferramenta de
grande utilidade em situações como os estudos de campo, laboratórios que
processam um pequeno número de amostras – dispensando o investimento e
subutilização de equipamentos, casos de exposição ocupacional, situações de
emergência e diagnóstico de infecções em populações de risco, onde nem sempre
ocorre o retorno pós-teste dos indivíduos para a decisão terapêutica.
Além da utilização de testes rápidos, o estudo de fluidos alternativos ao soro
tal como o fluido oral, faz-se necessário para reduzir o custo e o processo invasivo
tradicionalmente utilizado para obtenção do espécime biológico para o diagnóstico
da infecção pelo HCV (coleta de sangue). O uso da saliva também aumenta a
22
segurança do profissional de saúde, pois diminui o risco de acidentes com perfuro
cortantes e podem garantir acesso às populações distantes do laboratório e com
acesso venoso dificultado (ex. usuários de drogas endovenosas, hemodialisados,
idosos e obesos). Dessa forma, a avaliação de testes rápidos associados à
utilização de fluido oral como amostra biológica é necessária para determinar
métodos mais eficientes para o diagnóstico da hepatite C. Logo, neste estudo
esperamos contribuir para o desenvolvimento de estratégias efetivas voltadas ao
diagnóstico da infecção pelo HCV.
23
3. Objetivo Geral
Avaliar a utilização de testes rápidos para detecção de anticorpos anti-HCV para fins
de diagnóstico e estudos epidemiológicos.
3.1 Objetivos Específicos
▪ Estabelecer os padrões necessários para a avaliação do desempenho dos testes
rápidos, mediante a confecção de painéis de referência composta por amostras
positivas e negativas para o HCV, caracterizadas frente a testes de diagnóstico
disponíveis comercialmente;
▪ Avaliar parâmetros relacionados com a acurácia do teste como a sensibilidade,
especificidade, bem como os valores preditivos positivo e negativo de testes rápidos
de diferentes fabricantes;
▪ Avaliar o desempenho dos testes rápidos para detecção do anti-HCV em
populações com diferentes perfis de endemicidade para a infecção pelo HCV;
▪ Avaliar o uso de fluido oral em testes rápidos de diagnóstico para hepatite C;
▪ Avaliar os parâmetros relacionados com a precisão intra e interensaio dos testes;
▪ Avaliar a reação cruzada dos testes rápidos para hepatite C em amostras de soro
com outras infecções presentes (sífilis, malária, dengue, HIV).
24
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Aspectos éticos
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
FIOCRUZ (Parecer 063/09) (ANEXO 1). Todos os pacientes que aceitaram participar
do presente estudo foram informados sobre o mesmo e assinaram o termo de
consentimento pós-informação, conforme resolução nº 01, de 13 de junho de 1988
do Conselho Nacional de Saúde – Ministério da Saúde.
Neste estudo o fluxo de trabalho pode ser observado na Figura 4.1. O estudo
foi composto por amostras de soro avaliadas em um painel de referência que foram
testadas nos testes rápidos Wama Imuno Rápido HCV e Bioeasy HCV Rapid Test.
Além disso, todas as amostras foram testadas em dois ELISAs de fabricantes
distintos: HCV Ab (Radim, Itália) e ETI-AB-HCVK4 (Diasorin, Itália). As amostras
reagentes no Elisa foram retestadas em duplicata e submetidas à detecção de HCV
RNA e genotipagem quando o volume de amostra foi suficiente.
Figura 4.1. Fluxograma do estudo realizado com as amostras presentes no painel de
referência e estudo de campo.
25
Além de um painel de referência, este trabalho realizou coletas de campo a
fim de avaliar o desempenho dos testes rápidos em diferentes populações. Dessa
forma foram estudas populações com baixa e alta prevalência para anti-HCV, além
de populações com comportamento de risco para infecção por HCV. Neste estudo
amostras pareadas de soro e fluido oral foram testadas no teste rápido Wama Imuno
Rápido HCV, bem como amostras pareadas de soro, sangue total e fluido oral foram
testadas no teste rápido Bioeasy HCV Rapid Test. Em adicional, amostras de fluido
oral destas diferentes populações foram testadas no teste rápido Oraquick HCV
Rapid Test. As amostras de soro coletadas nestas diferentes populações foram
submetidas à detecção de anti-HCV no Elisa HCV Ab (Radim, Itália). As amostras
regentes no Elisa foram retestadas em duplicata e submetidas à detecção do HCV
RNA e genotipagem. O número de amostras realizadas em cada teste e população
está descrito na Tabela 4.1.
Tabela 4.1. Relação do número de amostras, testes rápidos e espécime biológico coletado.
Número de
Amostras
Teste Rápido
Espécime
Biológico
575
575
Wama Imuno Rápido HCV
Bioeasy HCV Rapid Test
SO
SO
194
194
174
Wama Imuno Rápido HCV
SO e FO
Bioeasy HCV Rapid Test SO, ST e FO
Oraquick HCV Rapid Test
FO
336
336
459
Wama Imuno Rápido HCV
SO e FO
Bioeasy HCV Rapid Test SO, ST e FO
Oraquick HCV Rapid Test
FO
94
94
Wama Imuno Rápido HCV
SO e FO
Bioeasy HCV Rapid Test SO, ST e FO
Usuários de crack
114
114
43
Wama Imuno Rápido HCV
SO e FO
Bioeasy HCV Rapid Test SO, ST e FO
Oraquick HCV Rapid Test
FO
Profissionais de beleza
86
86
Wama Imuno Rápido HCV
SO e FO
Bioeasy HCV Rapid Test SO, ST e FO
População
Painel de Referência
População de alta prevalência
População de baixa prevalência
Tocantinópolis/TO
Pantanal de Mato Grosso do
Sul/MS
População com comportamento de risco
26
4.2. População de estudo
4.2.1. Painel de Referência
Inicialmente foi confeccionado um painel contendo 575 amostras de soro de
indivíduos encaminhados ao Grupo de Atendimento do Laboratório de Referencia
Nacional para Hepatites Virais (LRNHV), do Instituto Oswaldo Cruz (IOC)/Fundação
Oswaldo Cruz(FIOCRUZ) e do Hospital Clementino Fraga Filho (UFRJ, RJ).
As amostras biológicas foram submetidas à detecção de anti-HCV utilizando
testes imunoenzimáticos (ELISA) de dois fabricantes distintos (ETI-AB-HCVK-4,
Diasorin, Itália e HCV Ab, Radim, Itália) e dois testes imunocromatográficos WAMA
Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica, Brasil) e Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy
Diagnóstica Ltda, Brasil). As amostras inicialmente reativas pelo ELISA foram
retestadas em duplicata (FDA, 1987) e, posteriormente, foram testadas para
detecção do genoma viral e genotipagem. Para detecção do HCV RNA foi utilizado o
teste comercial COBAS AMPLICOR HCV Test 2.0 (Roche Diagnostics, Pleasanton,
EUA) e para genotipagem do HCV foi utilizado Versant HCV Genotype Assay 2.0
(Siemens, Nova Iorque, EUA).
4.2.2. Estudos de campo
Para avaliação do desempenho dos testes rápidos em estudos de campo,
foram recrutados voluntários no período de fevereiro de 2010 a setembro de 2011.
Estes indivíduos foram divididos em três grupos distintos: grupo I - população de
elevada prevalência para anti-HCV (prevalência maior ou igual a 10%), grupo II população com baixa prevalência para anti-HCV (prevalência menor que 1%),
provenientes dos estados de Tocantins (0,5 casos/100.000 habitantes) e Mato
Grosso do Sul (3,2 casos/100.000 habitantes) (MS, 2012) e grupo III- população com
algum comportamento de risco para aquisição da infecção pelo HCV (uso de drogas
injetáveis ou não injetáveis, tal como usuários de crack e realização de algum
procedimento estético ou médico invasivo, tal como profissionais de beleza).
Estes indivíduos forneceram amostras de sangue e fluido oral, onde as
amostras de soro obtidas foram testadas para a presença de anti-HCV utilizando um
ELISA comercial disponível no laboratório (HCV Ab, Radim, Pomezzia, Itália). As
amostras pareadas de soro e fluido oral foram submetidas à detecção do anti-HCV
utilizando os testes rápidos WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) e
27
Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) enquanto as amostras de
sangue total foram testadas apenas no teste rápido Bioeasy HCV Rapid Test
(Bioeasy Diagnóstica Ltda). Adicionalmente, as amostras de fluidos oral também
foram submetidas à detecção do anti-HCV utilizando o teste rápido Oraquick HCV
Rapid test (OraSure Technologies, Inc. Bethlehem, Pensilvânia, EUA).
4.2.2.1. População de alta prevalência para anti-HCV
O grupo I foi composto por indivíduos com idade ≥ 18 anos, de qualquer
idade, sexo ou etnia que concordaram em participar do estudo após leitura e
assinatura do termo de consentimento (anexo 2) recrutados no Grupo de
atendimento do Laboratório de Referencia Nacional para Hepatites Virais (LRNHV),
do Instituto Oswaldo Cruz (IOC)/Fundação Oswaldo Cruz e no Hospital Clementino
Fraga Filho, UFRJ, RJ (Figura 4.2). Os critérios de exclusão do estudo foram ter
menos de 18 anos de idade e não concordar em participar do estudo. Os pacientes
recebidos nestes centros são oriundos de Postos de Saúde e Hospitais
credenciados do Rio de Janeiro. Os dois centros realizam o atendimento e
acompanhamento de casos de hepatites virais e realizam o esclarecimento
diagnóstico de indivíduos com resultados reagentes para hepatite oriundos de
bancos de sangue. A prevalência estimada de anti-HCV neste grupo deveria ser
maior ou igual a 10%.
Para o cálculo do tamanho da amostra, tomamos como base o número de
indivíduos anti-HCV reagentes notificados ao SINAN no período de 1999 a 2011 no
Estado do Rio de Janeiro (n= 4472) (Ministério da Saúde, 2012), e uma estimativa
de alta prevalência de anti-HCV de 10% nesta população. Para o cálculo amostral,
foi utilizada a calculadora on line [http://www.calculoamostral.vai.la/ (Santos, 2012)],
com erro amostral de ±5% e nível de confiança de 95%, fornecendo uma amostra
mínima de 135 indivíduos. Logo, neste grupo foram incluídos 194 indivíduos que
forneceram amostras pareadas de soro, sangue total e fluido oral que foram
submetidos ao teste rápido do fabricante Bioeasy [Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy
Diagnóstica Ltda, Brasil)]. O soro e fluido oral obtido destes 194 indivíduos também
foram submetidos ao teste rápido do fabricante Wama [WAMA Imuno-Rápido HCV
(WAMA Diagnóstica)]. Adicionalmente, 174 amostras de fluido oral foram submetidas
ao teste rápido Oraquick [Oraquick HCV Rapid test (OraSure Technologies)].
28
Figura 4.2. Localização geográfica do Rio de Janeiro.
4.2.2.2. População de baixa prevalência para anti-HCV
O grupo II foi composto por indivíduos residentes em áreas remotas
localizadas na região norte do Brasil (Tocantins, TO) e na região do Pantanal de
Mato Grosso do Sul.
As populações de difícil acesso foram escolhidas neste estudo para avaliar a
aplicabilidade dos testes rápidos em campo e demonstrar na prática sua utilidade
em regiões remotas onde nem sempre ocorre o retorno pós-teste dos indivíduos
para a decisão terapêutica.
Os voluntários deste estudo provenientes do estado de Tocantins foram
convidados a participar do estudo na cidade de Tocantinópolis (Figura 4.3). Esta
cidade está localizada no Norte do Estado as margens do Rio Tocantins, a 523 km
da capital Palmas e a 715 km de São Luiz do Maranhão.
29
Figura 4.3. Localização da cidade de Tocantinópolis no estado do Tocantins, Brasil.
De acordo com dados do IBGE 2010, a população de Tocantinópolis é
estimada em 22.608 habitantes. Sua economia compõe-se basicamente dos
seguintes setores: funcionários públicos, comércio varejista, prestadores de
serviços, atividades agropecuárias, pequenas indústrias e também mercado
informal. Na pecuária destaca-se a predominância de criação de bovinos e suínos,
para produção de leite e carne e apenas para o consumo da população local. A
agricultura é voltada para a produção de arroz, milho, feijão e mandioca. Este estudo
foi desenvolvido durante o projeto de “Ações integradas de vigilância de doença de
chagas, hepatites, leishmaniose, malária, saúde do trabalhador e tracoma”
organizado pela Secretaria Estadual de Saúde do Estado de Tocantins. Os
voluntários deste estudo residiam em povoados rurais (Mumbuco, Folha Grossa,
Cacau e Fazenda Bela Vista) e na área urbana, e foram selecionadas de acordo
com a presença de casos confirmados de doença de chagas nos últimos anos
(Figura 4.4).
30
A
B
Figura 4.4.Cidade de Tocantinópolis. (A) Travessia de balsa pelo Rio Tocantins
entre Porto Franco (MA) e Tocantinópolis (TO). (B) Subúrbio da cidade de
Tocantinópolis.
Os voluntários residentes no Pantanal do Mato Grosso do Sul foram
selecionados de 3 comunidades: Serra do Amolar/São Lourenço localizada a 217
Km de Corumbá (via fluvial) em uma planície inundável onde a maioria das casas é
construída sobre palafitas, Porto do Manga localizada na estrada Parque pantanal
sul-mato-grossense a 385Km de Campo Grande que possui suas casas construídas
sobre toras de madeira como medida de proteção às cheias, e comunidade Passo
do Lontra localizada na estrada do Parque do Pantanal, a 300 Km da capital Campo
Grande, constituída por pescadores, piloteiros de barco e serviços gerais turísticos
(Figura 4.4). Nesta região, está localizada a Base de Estudos do Pantanal da
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS) a qual oferece atendimento
médico e odontológico periódico e, foi fundamental para a elaboração deste estudo
com a população ribeirinha do Pantanal de Mato Grosso do Sul.
31
Figura 4.5. Localização geográfica das comunidades pantaneiras, Mato Grosso do
Sul, MS, Brasil.
A população ribeirinha possui um modo de vida bastante simples que
apresentam como principal atividade ocupacional a pesca artesanal e a coleta e
venda de iscas vivas. As casas são modestas e rústicas, sendo muitas ainda
construídas de pau-a-pique. Próximo as suas residências mantêm atividades
agrícolas de subsistência além da criação de animais domésticos. O rio é utilizado
além da pesca, como auxiliar na higiene pessoal (banhos) e doméstica (louças e
roupas). Não possuem saneamento básico ou sequer pronto atendimento. Sua
população é predominantemente infantil devido à alta taxa de natalidade, as escolas
oferecem Ensino Fundamental e Médio e o principal meio de transporte são os
barcos e canoas (Figura 4.6).
32
Figura 4.6. Comunidade Serra do Amolar/São Lourenço, Pantanal, MS, Brasil.
Fonte: BIGATON, 2009.
A prevalência estimada de anti-HCV neste grupo é menor que 1%. Foram
incluídos no estudo indivíduos de qualquer idade, sexo ou raça/etnia que
concordaram em participar do estudo após leitura e assinatura do termo de
consentimento (Anexo 2). Foram excluídos do estudo aqueles indivíduos que após
leitura do termo de consentimento, não concordaram em participar do estudo.
Para o cálculo do tamanho da amostra, considerou-se o número de indivíduos
residentes no município de Tocantinópolis (n=22608), visto que não foi possível
estabelecer uma estimativa precisa do número de indivíduos residentes nas
comunidades do Pantanal do Mato do Grosso do Sul. Para analise, foi considerada
uma prevalência de anti-HCV de 1% nesta população. Foi utilizada a calculadora on
line [http://www.calculoamostral.vai.la/ (Santos, 2012)], com erro amostral de ±1% e
nível de confiança de 95%, o que nos deu uma amostra mínima de 375 indivíduos.
Neste grupo, foram incluídos 430 indivíduos que forneceram amostras
pareadas de soro, sangue total e fluido oral para realização do teste rápido do
fabricante Bioeasy [Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda, Brasil)].
Estes mesmos indivíduos também forneceram soro e fluido oral para realização do
teste rápido do fabricante WAMA [WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica)].
Adicionalmente, 459 indivíduos forneceram amostras de fluido oral para realização
do teste rápido Oraquick [Oraquick HCV Rapid test (OraSure Technologies)].
33
4.2.2.3. População com comportamento de risco
O grupo III foi composto por voluntários usuários de crack localizados em
duas regiões geográficas do Brasil (região Sudeste e Nordeste) e profissionais de
beleza moradores da cidade do Rio de Janeiro.
Neste grupo não foi possível realizar o cálculo do tamanho da amostra devido
à ausência de estudos de prevalência de usuários de crack e profissionais de beleza
no Rio de Janeiro. Desta forma, foram admitidos neste estudo 200 indivíduos que
concordaram em fornecer amostras pareadas de soro, sangue total e fluido oral para
realização do teste rápido Bioeasy [Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica
Ltda, Brasil)] e Wama [WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica)]. Neste
grupo, 43 indivíduos também concordaram em fornecer amostras de fluido oral para
realização do teste rápido Oraquick [Oraquick HCV Rapid test (OraSure
Technologies)].
Foram incluídos no estudo indivíduos de qualquer idade, sexo ou raça/etnia
que concordaram em participar do estudo após leitura e assinatura do termo de
consentimento (Anexo 2). Em relação aos profissionais de beleza, os mesmos
deviam relatar que exerciam alguma atividade ligada ao setor de estética, tal como,
manicure, cabelereiro, depilador, esteticista, entre outros. Os usuários de crack
deviam reportar o uso da droga nos últimos 12 meses. Foram excluídos do estudo
aqueles indivíduos que após leitura do termo de consentimento, não concordaram
em participar do estudo e aqueles que não se enquadraram nos critérios de
inclusão.
4.3. Coleta das amostras biológicas de sangue e fluido oral
As amostras de sangue total foram coletadas por punção venosa (8 ml) em
tubo com gel (SST II Advance, BD Vacutainer, Nova Jersey, EUA) e tubo com
anticoagulante (K2 EDTA 7.2mg, BD Vacutainer, Nova Jersey, EUA). As amostras
coletadas em tubo gel SST II Advance foram centrifugadas a 1972 x g na centrífuga
Centurion Vector Inverter System (Laborline, São Paulo, Brasil) à temperatura de
25ºC durante 5 minutos. O soro obtido foi acondicionado em um microtubo
previamente identificado com o número de registro e armazenado à temperatura de
-20 ºC até a realização das análises.
34
As amostras coletadas em estudos de campo foram processadas no mesmo
dia, congeladas e encaminhadas via aérea para o laboratório de Hepatites Virais –
Instituto Oswaldo Cruz – RJ. As amostras de sangue total foram testadas no teste
rápido Bioeasy HCV Rapid Test no mesmo dia da coleta, assim como as amostras
de fluido oral avaliadas no teste rápido Oraquick HCV Rapid Test.
As amostras de saliva foram coletadas utilizando o coletor comercial Salivette
(Sarstedt, Alemanha) (Figura 4.7) e a extremidade coletora de fluido oral do teste
rápido Oraquick [Oraquick HCV Rapid test (OraSure Technologies)] (Figura 4.8). O
coletor Salivette (Sarstedt, Alemanha) consiste em uma esponja cilíndrica de
algodão que deve ser introduzida entre a bochecha e a gengiva e permanecer nesta
região por aproximadamente dois minutos. Em seguida, a esponja foi recolocada na
parte superior do coletor comercial onde foi adicionado 1mL de tampão PBS/BSA
0,5% que serve para eluição da amostra conforme estabelecido previamente (Cruz
et al. 2011) (Figura 4.7). Em seguida, a amostra foi centrifugada à velocidade de
1440g por dez minutos a 25 °C em centrífuga RDE i (RDE Equipamentos Científicos
Ltda). Logo após, o conteúdo resgatado foi transferido para microtubos previamente
identificados com o número de registro até o momento da análise.
Figura 4.7. Instruções para coleta de fluido oral com Salivette. 1,2 e 3) o algodão é
retirado do frasco e colocado entre a bochecha e a gengiva e deixado por aproximadamente
2 minutos. 4) após a coleta, o algodão e depositado no frasco do coletor onde foi adicionado
1 mL de tampão. 5 e 6) o frasco foi fechado e centrifugado. 7 e 8) o sobrenadante obtidofoi
aliquotado Fonte: Salivette® Hygienic saliva collection for diagnostics and monitoring
< http://obchod.sarstedt.cz/www/prilohy/156%20-%20Salivette%C2%AE.pdf>
35
Figura 4.8. Extremidade coletora do teste
rápido Oraquick. Seta vermelha indicando a
região coletora de fluido oral do teste rápido
Oraquick. Fonte: http://www.orasure.com/productsinfectious/products-infectious-oraquick-hcv.asp)
4.4. Testes de diagnóstico do HCV
4.4.1. Ensaio Imunoenzimático
As amostras de soro incluídas no painel de referência foram submetidas a
dois ensaios imunoenzimáticos comerciais para detecção de anticorpos anti-HCV:
ETI-AB-HCVK-4, DiaSorin (Itália) e HCV Ab, Radim (Itália). As demais amostras de
soro empregadas no estudo de campo e nas outras avaliações do desempenho dos
testes rápidos foram submetidas apenas ao ELISA HCV Ab, Radim (Itália) .
4.4.1.1. Princípio dos Testes
O teste de detecção de anticorpos anti-HCV do fabricante Radim baseia-se na
ligação de anticorpos anti-HCV da amostra de soro aos antígenos específicos
derivado das regiões core e peptídeos recombinantes NS3, NS4 e NS5, que
compreendem a fase sólida da placa. Os anticorpos anti-HCV presente nas
amostras se ligam aos anticorpos humanos policlonais produzidos em cabra,
imunoglobulinas G e M (IgG e IgM), conjugados com a enzima peroxidase de rábano
36
(HRP). A peroxidase reage com o cromógeno (tetrametilbenzidina) / substrato
(peróxido de hidrogênio), gerando um sinal óptico (coloração) que é proporcional à
quantidade de anticorpos anti-HCV presentes na amostra de soro. O resultado final
das amostras é dado em densidade ótica (D.O.) obtida pela leitura em
espectrofotômetro a 450-620nm (Figura 4.9).
No teste de detecção de anticorpos anti-HCV do fabricante DiaSorin, as
microplacas apresentam como fase sólida polipeptídios recombinantes das regiões
estrutural e não estrutural do HCV (não especificados pelo fabricante) que se ligam
aos anticorpos presentes na amostra. O conjugado enzimático composto de
anticorpos IgG monoclonal murinos anti-IgG humana conjugados com HRP se liga
ao anti-HCV presente no soro humano quando este estiver presente (amostra
reagente). Com a adição da solução cromógeno/substrato, a enzima (peroxidase)
reduz
quimicamente
seu
substrato
(H2O2)
o
qual
oxida
o
cromógeno
tetrametilbenzidina (TMB) gerando coloração amarelada. A coloração é proporcional
à quantidade de anticorpos anti-HCV presentes na amostra de soro. O resultado
final das amostras é dado em DO obtida pela leitura em espectrofotômetro a 450620nm (Figura 4.9).
Figura 4.9. Representação esquemática do princípio do teste imunoenzimático para
detecção de anti-HCV. Etapa 1) representação da fase sólida dos testes contendo
antígenos do HCV. Etapa 2) adição de amostra contendo anticorpos anti-HCV. Etapa 3)
conjugado se liga ao complexo antígeno anticorpo formado previamente com a fase sólida e
o anticorpo anti-HCV do paciente. Etapa 4 e 5: adição do cromógeno e substrato. O
substrato
reage
com
a
enzima
produzindo
cor.
(Fonte:
http://www.liaccentralsorologica.com.br/) colocar o titulo da fonte e citar a referencia na parte
da mesma
37
4.4.1.2. Procedimento do Teste ETI-AB-HCVK-4 (Diasorin)
Para a realização do teste ETI-AB-HCVK-4 (Diasorin) de acordo com
instruções do fabricante, primeiramente 200 µL de diluente da amostra foram
adicionados em todas as cavidades exceto na microcavidade correspondente ao
branco. Em seguida foram adicionados 20 µL de cada controle negativo e positivo e
de cada amostra em teste em cada cavidade correspondente. A representação da
placa teste com os seus respectivos controles e amostras está apresentada na
Figura 4.10.
Figura 4.10. Disposição dos controles e amostras na microplaca do teste ETI-ABHCVK-4 de acordo com o protocolo do fabricante.
Após adição das amostras, a reação foi incubada por 60 minutos a 37ºC. Em
seguida, cada microcavidade da placa foi lavada com 350 µL de solução de
lavagem, fornecido pelo teste, por 5 vezes . Logo após, foi adicionado 100 µL de
conjugado enzimático em cada microcavidades (exceto no controle negativo
“branco”), e a reação foi incubada por 60 minutos a 37ºC. Após a incubação, a placa
foi novamente lavada como previamente descrito.
38
Após a lavagem, foi adicionado 100 µL do cromógeno/substrato em cada
microcavidade, incluindo o controle negativo (branco). A reação foi novamente
incubada por 30 minutos a temperatura ambiente, protegida da luz. A reação foi
interrompida com adição de 100 µL de ácido sulfúrico e a leitura foi realizada em um
espectrofotômetro com um filtro de 450nm com referencia de 620-630nm (ELx800,
DiaSorin, Itália).
O valor do ponto de corte foi calculado de acordo com a fórmula: CNX +
0,500, onde CNX é a média das D.O.s dos controles negativos. As amostras foram
consideradas positivas quando sua absorbância foi maior do que o valor do ponto de
corte; e negativa quando a absorbância da amostra foi menor que este ponto
(DiaSorin, Itália)
4.4.1.3. Procedimento do Teste HCV Ab (Radim)
De acordo com as instruções do fabricante, inicialmente foram adicionados
200 µL de diluente de amostra em cada microcavidade da microplaca. Em seguida
adicionou-se 200 µL de cada controles positivo e negativo e calibrador, assim como
10 µL de amostra de soro em cada microcavidade da microplaca. A representação
da microplaca contendo seus controles, calibradores e amostras está apresentada
na Figura 4.11.
Figura 4.11. Representação esquemática da disposição dos controles e amostras na
microplaca do teste HCV Ab, Radim de acordo com o protocolo do fabricante.
39
Em seguida, adicionou-se 50 µL do diluente de ensaio em cada
microcavidade da placa e a reação foi incubada por 45 minutos a 37ºC. Após a
incubação, cada cavidade da microplaca foi lavada com 350 µl de solução de
lavagem fornecida pelo teste por 5 vezes. Logo após, foram adicionados 100 µL de
conjugado enzimático em cada microcavidade da microplaca, exceto no branco e
mais uma vez a reação foi incubada por 45 minutos a 37ºC. Após a incubação,
repetiu-se o procedimento de lavagem como descrito previamente e foram
adicionados 100 µL do cromógeno/substrato em cada microcavidade. A reação foi
incubada por 15 minutos a temperatura ambiente (20-25˚C), protegido da luz. A
reação foi interrompida com 100 µL de ácido sulfúrico e a leitura foi realizada em um
espectrofotômetro com um filtro de 450nm com filtro de referência de 620-630 nm
(ELx800, Diasorin Itália).
O valor do ponto de corte foi calculado usando a seguinte fórmula: CNX +
0,350, onde CNX é a média das D.O.s dos controles negativos. As amostras foram
consideradas positivas se a absorbância da amostra foi maior do que o valor do
ponto de corte; e negativa se a absorbância da amostra foi menor que este (Radim
Itália).
4.5. Testes Rápidos para detecção de anticorpos anti-HCV
Os testes rápidos para diagnóstico da hepatite C apresentam uma membrana
pré-coberta com antígenos recombinantes do HCV que podem ser: core, NS3,NS4 e
NS5 e estão capturados na Linha Teste “T”. Após adição da amostra, esta se une a
proteína A (conjugado coloidal de ouro) e migram através da membrana
imunocromatográfica até passarem pela região da Linha T, formando uma linha
visível (complexo antígeno-anticorpo-proteínas A de partículas de ouro com alto grau
de sensibilidade e especificidade) (Figura 4.12).
40
Figura 4.12. Representação esquemática dos testes rápidos para detecção de
anticorpos anti-HCV. Adaptado do Manual de Teste Rápido, Millipore.
Nos dispositivos de teste é possível observar gravado em sua superfície as
letras T e C, indicando respectivamente a Linha Teste “T” e a Linha Controle “C”. As
linhas T e C não são visíveis na janela de resultados antes da aplicação da amostra.
A linha C é usada como controle do experimento e deve sempre ser visualizada
após adição da amostra para validação do teste (Figura 4.13).
Figura 4.13. Representação esquemática da estrutura de um dispositivo de teste
rápido. Adaptado do Manual de Teste Rápido, Millipore.
41
4.5.1.Testes rápidos utilizados no estudo
Neste estudo, as amostras de soro, sangue total e fluido oral foram
submetidas a três testes rápidos disponíveis comercialmente: WAMA Imuno-Rápido
HCV (WAMA Diagnóstica), Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) e
Oraquick HCV Rapid test (OraSure Technologies, Inc).
4.5.1.1. WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica)
O teste WAMA Imuno-Rápido HCV é um teste qualitativo que utiliza na fita de
reação, uma mistura de proteínas sintética e recombinantes do HCV não descrito no
protocolo. O teste permite a utilização de amostras de soro, plasma e sangue total,
porém este último deve ser obtido sem anticoagulante. Neste estudo, apenas as
amostras de soro e fluido oral foram utilizadas neste teste rápido
.
Para procedimento do teste, inicialmente os dispositivos foram identificados
com o número da amostra. Em seguida, foram adicionados 10µL da amostra e 3
gotas do tampão diluente fornecido pelo fabricante na área destinada a amostra no
dispositivo do teste. Por apresentarem menores concentrações de anticorpos antiHCV que o soro e o sangue total, as amostras de fluido oral tiveram seu volume
aumentado para 20µL (dobro do volume recomendado pelo fabricante para amostras
de soro) com objetivo de obter resultados mais sensíveis nos testes. Os resultados
foram interpretados entre 15 – 20 minutos de acordo com o fabricante (Figura 4.14).
4.5.1.2. Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda)
O teste rápido HCV Rapid Test (Bioeasy) é um imunoensaio qualitativo para a
detecção de anticorpos específicos anti-HCV que utiliza proteínas recombinantes do
Core, NS3, NS4 e NS5 do HCV como agentes detectores e de captura. O teste
permite a utilização de amostras de soro, plasma e sangue total com ou sem
anticoagulante. Neste teste, amostras de soro, sangue total e fluido oral foram
analisadas.
Para procedimento do teste, inicialmente os dispositivos foram inicialmente
identificados com o numero da amostra. Em seguida, 10µL da amostra e 4 gotas do
tampão diluente fornecido pelo fabricante foram adicionados na área destinada a
amostra no dispositivo do teste. Por apresentarem menores concentrações de
anticorpos anti-HCV que o soro e o sangue total, as amostras de fluido oral tiveram
42
seu volume aumentado para 20µL (dobro do volume recomendado pelo fabricante
para amostras de soro) com objetivo de obter resultados mais sensíveis nos testes.
Os resultados foram interpretados entre 5– 20 minutos de acordo com o fabricante
(Figura 4.14).
Figura 4.14. Representação das etapas para realização dos testes rápidos
WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) e Bioeasy HCV Rapid Test
(Bioeasy Diagnóstica Ltda). A) Para realização dos testes rápidos Wama e
Bioeasy, 10 microlitros de amostra foi depositado na região S do dispositivo de teste
e em seguida foram adicionadas 3 e 4 gotas de diluente para os testes Wama e
Bioeasy respectivamente. B) Em um teste com resultado positivo, tanto a banda
controle (C) quanto a banda teste (T) reagem. Em um teste negativo apenas a
banda (C) é reagente. O teste Wama pode ser lido entre 10 e 15 minutos enquanto
Bioeasy entre 5 e 20 minutos. Após 20 minutos os resultados devem ser
desconsiderados.
4.5.1.3. Oraquick HCV Antibody Rapid Test (OraSure Technologies, Inc.
Bethlehem, Pensilvânia)
O teste rápido Oraquick HCV Rapid test é um imunoensaio qualitativo para a
detecção de anticorpos anti-HCV que utiliza proteínas recombinantes do Core, NS3,
NS4 do HCV como agentes detectores e de captura. O teste permite a utilização de
amostras de soro, plasma, sangue total e fluido oral e neste estudo foram
empregadas amostras de soro, sangue total e fluido oral.
Para procedimento do teste, inicialmente os dispositivos foram inicialmente
identificados com o número da amostra. Em seguida, foi adicionado ao dispositivo
do teste aproximadamente 5µL de amostra de soro ou sangue total com auxílio de
uma alça coletora fornecida pelo próprio teste. Em seguida, a alça foi depositada no
frasco contendo tampão e agitada para que todo o material entrasse em contato com
o tampão. Quando a amostra de fluido oral foi utilizada, esta foi coletada pela
extremidade coletora do teste inserida na cavidade oral do paciente e passada
levemente entre os dentes, a gengiva e lábios superior e inferior. Em seguida esta
extremidade foi inserida no frasco com tampão conforme descrito para as amostras
de soro e sangue total.
43
Os resultados foram interpretados entre 20 – 40 minutos (Figura 4.15). Todos
os procedimentos para a realização do teste seguiram as recomendações do
fabricante.
Figura 4.15. Etapas de coleta e realização do teste do teste rápido Oraquick. A)
Haste coletora para obtenção sangue total coletado por punção digital ou soro; B)
Após a coleta de sangue total ou soro, a haste é depositada no frasco que contém o
tampão teste e é então agitada de forma que a amostra entre totalmente em contato
com o tampão. C) Após agitação da haste no interior do frasco com tampão, o
dispositivo de teste é colocado no interior do frasco contendo tampão. D) A coleta de
fluido oral é realizada com a extremidade coletora do próprio dispositivo de teste.
Após a coleta o procedimento descrito em C é realizado. (E) Leitura do teste
indicando amostra reagente com bandas nas linhas: C (controle) e T (teste). (F)
Leitura do teste indicando amostra não reagente com banda somente na linha C
(controle).
4.6. Detecção do RNA do HCV
Todas as amostras anti-HCV reagentes nos testes imunoenzimáticos e
aquelas que apresentaram resultados discordantes entre teste imunoenzimático e
teste rápido com volume suficiente foram submetidas a detecção do RNA do HCV
através do ensaio COBAS Amplicor HCV version 2.0 (Roche Diagnostics, França)
de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante.
O ensaio COBAS® AMPLICOR HCV Test v2.0 (Roche Diagnostics, França)
permite, de forma simultânea, a transcrição reversa e amplificação do HCV-RNA
alvo e do RNA de um Controle Interno do HCV, disponível no ensaio. O reagente da
mistura principal contém um par de iniciadores específicos para o HCV-RNA e outro
para o RNA do Controle Interno do HCV. A detecção de DNA amplificado é efetuada
44
através de sondas oligonucleotidicas específicas que permitem a identificação
independente do produto amplificado do HCV e do Controle Interno do HCV.
4.7. Genotipagem
Todas as amostras que tiveram RNA do HCV detectado e que apresentaram
volume suficiente foram genotipadas utilizando o ensaio Versant HCV Genotype 2.0
(Innogenetics, Ghent, Bélgica) de acordo com o protocolo do fabricante.
O ensaio é um teste de hibridização de produtos de PCR com sondas de
oligonucleotídeos genótipo-específico desenvolvido para identificar os genótipos 1 a
6 do vírus da hepatite C (HCV).
O DNA biotinilado gerado pela amplificação por RT-PCR da região não
traduzida 5’ (5’ NC) é hibridizado por sondas de oligonucleotídeos imobilizadas. As
sondas, que são ligadas a uma fita de nitrocelulose por uma cauda poli(T) e são
específicas para a 5’NC dos diferentes genótipos do HCV.
4.8. Avaliação do desempenho dos testes rápidos para detecção dos
anticorpos anti-HCV
Apenas as amostras com perfil sorológico definido (anti-HCV reagente ou não
reagente) foram incluídas na avaliação do desempenho dos testes. As amostras
com sorologia indeterminada foram excluídas da presente análise.
4.8.1. Testes de Concordância
Para avaliar a concordância entre o perfil sorológico das amostras dos painéis
e os resultados apresentados pelos testes rápidos, procedemos à análise de tabelas
de contingência e cálculo do índice Kappa (Tabela 4.1). Os resultados foram
considerados significativos quando p<0.05 (teste exato de Fisher).
45
Tabela 4.2. Grau de concordância, segundo o valor do índice Kappa (κ) para avaliação dos
testes rápidos para detecção dos anticorpos anti-HCV.
Concordância
Kappa (k)
Deficiente
<0,20
Regular
0,21 – 0,40
Moderada
0,41 - 0,60
Boa
0,61 – 0,80
Muito Boa
0,81 – 1,00
4.8.2. Sensibilidade, especificidade e valores preditivos
O desempenho dos testes rápidos foi avaliado com base na sensibilidade
clínica (Sc), especificidade (E), valores preditivos positivo (VPP) e negativo (VPN).A
sensibilidade e especificidade foram calculadas comparando os resultados de cada
teste rápido com os resultados de testes de referência (ELISA e/ou PCR). A
sensibilidade foi definida como o número de resultados reagentes nos testes rápidos
e no teste de referência, dividido pelo total de resultados reagentes no ensaio de
referência. A especificidade foi definida como o número de resultados não reagentes
nos testes rápidos e no ensaio de referência, dividido pelo total de resultados não
reagentes no ensaio de referência (Tabela 4.2). Intervalos de Confiança para a
sensibilidade, especificidade e valores preditivos foram calculados de forma bicaudal
(95%).
Tabela 4.3. Parâmetros utilizados para a avaliação do desempenho dos testes rápidos.
Nesta análise, o “padrão de referência” foi definido pelo status sorológico das
amostras (verdadeiro-positivos e verdadeiro-negativos), definido ao longo do
46
processo de caracterização sorológica do painel, conforme anteriormente descrito
(Figura 4.16).
Figura 4.16. Modelo de quadro utilizado para a avaliação do desempenho dos testes
rápidos em relação a um ensaio de referência (ELISA).
4.9. Avaliação da reprodutibilidade e repetitividade dos testes rápidos para
diagnóstico da hepatite C.
Para avaliação da reprodutibilidade e repetitividade dos testes rápidos para
detecção de anti-HCV dos fabricantes WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA
Diagnóstica) e Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda), quatro amostras
foram testadas (duas de soro e duas de saliva), sendo que duas eram anti-HCV
reagente e as outras duas eram anti-HCV não-reagente. Estas amostras foram
testadas por dois observadores distintos por 2 dias consecutivos.
4.10. Avaliação do desempenho do teste rápido Oraquick em amostras de soro,
sangue total e fluido oral.
Para a avaliação do desempenho do teste rápido (Oraquick HCV Rapid
Antibody Test, Orasure) para detecção de anticorpos anti-HCV em amostras de
sangue total, soro humano e fluido oral foram selecionados 81 indivíduos reagentes
para anti-HCV por ELISA e HCV RNA por PCR, e 39 indivíduos ELISA HBsAg/antiHCV não reagentes.
47
4.11. Avaliação da reação cruzada em testes rápidos para diagnóstico de
anticorpos anti-HCV.
Para a avaliação da reação cruzada, amostras reativas para anticorpos contra
o vírus dengue (n=35), vírus da imunodeficiência humana (HIV) (n=30), Plasmodium
vivax (n=17) e Treponema pallidum (n=20) foram obtidas de Centros de Referências
localizados na cidade do Rio de Janeiro, RJ. Todas as amostras foram submetidas
ao diagnóstico sorológico de anti-HCV utilizando o ensaio HCV Ab (Radim, Italia).
Após o teste sorológico,o anti-HCV foi avaliado nestas amostras utilizando os
testes rápidos dos fabricantes WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) e
Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda).
4.12. Análise Estatística
As informações clínicas e epidemiológicas, os resultados dos testes
sorológicos (caracterização do painel) e os resultados obtidos com os testes rápidos
foram inseridos em um banco de dados (Excel 2011, Microsoft Inc., EUA). Para as
análises estatísticas, utilizamos o Programa SPSS para Windows, versão 20.0 (IBM,
Inc., EUA). Para a avaliação de parâmetros relacionados ao desempenho do teste
(sensibilidade, especificidade, valores preditivos, e concordância) foi utilizado o
programa GraphPad (GraphPad Software, Inc, San Diego, EUA).
48
5. RESULTADOS
5.1. População de Estudo
5.1.1. Painel de Referência
A caracterização do painel de soros para avaliação dos testes rápidos para
detecção do anti-HCV foi realizada em amostras de soro de 575 indivíduos com
idade média de 44,73 anos (±15,53) e predomínio do sexo feminino (313/575).
Dos 575 voluntários, 324 apresentaram resultados não reagentes para antiHCV e 251 foram reagentes para anti-HCV pelos testes imunoenzimáticos de dois
fabricantes distintos (HCV Ab, Radim e ETI-AB-HCVK-4, Diasorin). Dos 251
indivíduos anti-HCV reagentes, 202 também tiveram o RNA do HCV detectado. Das
amostras HCV RNA detectadas, 122 foram genotipadas e destas 108 foram
caracterizadas como genótipo 1, 1 amostra como genótipo 2, 12 amostras como
pertencentes ao genótipo 3 e 1 amostra com o genótipo 5.
A sensibilidade dos testes rápidos WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA
Diagnóstica) e Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) em amostras
anti-HCV reagentes foi de 95,62% (240/251) e 93,23% (234/251), respectivamente.
Nestes casos a especificidade do teste rápido Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy
Diagnóstica Ltda) foi de 100% e do teste WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA
Diagnóstica) 99,07%, com três casos falsos positivos (Tabela 5.1 a).
Em casos positivos para a detecção de anticorpos anti-HCV e RNA do HCV
(n=202), as sensibilidades dos testes rápidos Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy
Diagnóstica Ltda) e WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) foram 98,51%
(199/202) e 97,03% (196/202), respectivamente. As especificidades estudadas
foram às mesmas observadas quando todos os casos anti-HCV reagentes fora
estudados (Tabela 5.1 b).
49
Tabela 5.1. Desempenho dos testes rápidos Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) e WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA
Diagnóstica) para detecção de anti-HCV em amostras de soro avaliadas por dois ensaios imunoenzimáticos comerciais (ETI-AB-HCVK-4,
Diasorin e HCV Ab, Radim).
Testes Rápidos
a – anti-HCV detectado
b-anti-HCV e HCV RNA detectado
Bioeasy HCV Rapid Test
WAMA Imuno-Rápido HCV
Bioeasy HCV Rapid Test
WAMA Imuno-Rápido HCV
n Total
575
575
526
526
Verdadeiro Positivo
240
234
199
196
Verdadeiro Negativo
324
321
324
321
Falso Positivo
0
3
0
3
Falso Negativo
11
17
3
6
95,62
93,23
98,51
97,03
(92,29%–97,79%)*
(89,38%–96,01%)*
(95,72%–99,69%)*
(93,65%–98,90%)*
Sensibilidade %
Especificidade %
Valor Preditivo Positivo %
Valor Preditivo Negativo %
Kappa %
100
99,07
100
99,07
(98,87%–100%)*
(97,32%–99,81%)*
(98,87%–100%)*
(97,32%–99,81%)*
100
98,73
100
98,49
(98,47%–100%)*
(96,35%–99,74%)*
(98,16%–100%)*
(95,66%–99,69%)*
96,73
94,97
99,09
98.17
(94,22%–98,35%)*
(92,07%–97,04%)*
(97,35%–99,81%)*
(96,05%–99,32%)*
96,09
92,88
98,79
96,37
(93,8%–98,3%)*
(89,82%–95,94%)*
(97,43%–100%)*
(94,02%–98,72%)*
P<0,0001 (Intervalo de Confiança 95%)* a) todas as amostras anti-HCV detectadas b) apenas amostras anti-HCV e HCV RNA
detectados.
50
As amostras de soro com resultado anti-HCV falso-negativo pelo teste
Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) apresentaram valores médios
de DO/CO (densidade óptica dividida pelo ponto de corte – “cut off”) pelo ELISA
inferiores àqueles observados nas amostras com resultados verdadeiros positivos
pelo mesmo teste rápido. As amostras falso-negativas apresentaram valores médios
de DO/CO igual a 2,36±1,43 pelo kit ETI-AB-HCVK-4 (Diasorin) e 5,13±2,59 pelo kit
HCV Ab (Radim). As amostras verdadeiro positivas apresentaram valores de DO/CO
igual a 3,98±0,77 pelo kit ETI-AB-HCVK-4 (Diasorin) e 8,46±0,61 pelo kit HCV Ab
(Radim). Pelo teste WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica), também
observamos menores valores de DO/CO nas amostras falso negativas e maiores
valores de DO/CO nas amostras verdadeiro-positivas. As amostras falso-negativas
apresentaram valores médios de DO/CO igual a 2,53±1,18 pelo kit ETI-AB-HCVK-4
(Diasorin) e 5,94±2,47 pelo kit HCV Ab (Radim). As amostras verdadeiro positivas
apresentaram valores de DO/CO igual a 4,01±0,75 pelo kit ETI-AB-HCVK-4
(Diasorin) e 8,49±0,56 pelo kit HCV Ab (Radim).
Nas Tabelas 5.2 e 5.3 é possível observar os valores de DO e DO/CO das
amostras reagentes nos testes Elisa e não reagentes nos testes rápidos e também,
os resultados da detecção molecular do HCV RNA.
Tabela 5.2. Valores de DO e DO/CO das amostras falso negativas no teste rápido Bioeasy
HCV Rapid Test avaliadas quanto à detecção do HCV RNA.
DO
Diasorin
DO/CO
Diasorin
DO
Radim
DO/CO
Radim
ELISA
Teste Rápido
Bioeasy
HCV RNA
1705/07
0,707
1,368
1,249
3,558
Reagente
Não reagente
Detectado
4027/07
0,657
1,271
0,864
2,462
Reagente
Não reagente
Detectado
TSO162
1,958
3,599
2,555
7,340
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO203
2,678
4,923
>3,000
8,618
Reagente
Não reagente
Detectado
TSO220
0,657
1,208
1,880
5,388
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO224
>3,000
4,910
0,672
1,942
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1264
0,662
1,303
0,803
2,334
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1289
0,828
1,630
3,000
8,571
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1467
0,848
1,669
1,072
3,089
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1532
0,973
1,878
1,951
5,558
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1542
1,179
2,276
2,680
7,635
Reagente
Não reagente
Não detectado
Média
1,115
2,367
1,673
5,136
Amostras
Resultados de DO/CO superiores a 1,1 são considerados positivos, resultados entre 1,1 e 0,9
indeterminados e menor que 0,9 negativos.
51
Tabela 5.3. Valores de DO e DO/CO das amostras falso negativas no teste rápido WAMA
Imuno-Rápido HCV avaliadas quanto à detecção do HCV RNA.
DO
Diasorin
DO/CO
Diasorin
DO
Radim
DO/CO
Radim
ELISA
Teste Rápido
Wama
HCV RNA
419
1,317
2,490
2,708
7,782
Reagente
Não reagente
Não detectado
443
1,906
3,603
>3,000
8,621
Reagente
Não reagente
Detectado
674
1,422
2,688
>3,000
8,621
Reagente
Não reagente
Não detectado
SPI053
1,755
3,318
>3,000
8,621
Reagente
Não reagente
Não detectado
1293/07
1,221
2,380
2,336
6,599
Reagente
Não reagente
Detectado
1705/07
0,707
1,368
1,249
3,558
Reagente
Não reagente
Detectado
4027/07
0,657
1,271
0,864
2,462
Reagente
Não reagente
Detectado
TSO162
1,958
3,599
2,555
7,340
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO220
0,657
1,208
1,880
5,388
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO222
>3,000
4,910
1,701
4,916
Reagente
Não reagente
Detectado
TSO224
>3,000
4,910
0,672
1,942
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1238
1,29
2,539
2,765
8,038
Reagente
Não reagente
Detectado
TSO1264
0,662
1,303
0,803
2,334
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1289
0,828
1,630
3,000
8,571
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1467
0,848
1,669
1,072
3,089
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1532
0,973
1,878
1,951
5,558
Reagente
Não reagente
Não detectado
TSO1542
1,179
2,276
2,680
7,635
Reagente
Não reagente
Não detectado
Média
1,159
2,532
1,874
5,946
Amostras
Resultados de DO/CO superiores a 1,1 são considerados positivos, resultados entre 1,1 e 0,9
indeterminados e menor que 0,9 negativos.
5.1.2. Avaliação de testes rápidos para detecção de anticorpos anti-HCV em
estudo de campo.
Para o estudo de campo, foram obtidas amostras biológicas de 824
voluntários com média de idade (± desvio padrão) igual a 34,89 anos (±17,80), 391
eram do sexo feminino, 366 do sexo masculino e 77 não possuíam informação. Dos
824 indivíduos, 430 estavam localizados em áreas de difícil acesso e baixa
prevalência para a infecção por HCV (Tocantinópolis, TO e Pantanal de Mato
Grosso do Sul, MS), 200 indivíduos apresentavam algum comportamento de risco
para aquisição da infecção pelo HCV (profissionais de beleza e usuários de crack) e
194 indivíduos provenientes de áreas de alta prevalência para a infecção pelo HCV
(casos suspeitos de hepatite C atendidos em Centros de Referência para Hepatites
Virais).
Para avaliação do teste rápido Oraquick HCV Rapid Test em amostra de
fluido oral (OraSure, EUA), foram incluídos 674 indivíduos com média de idade de
33,08 anos (±18,13) e predomínio do sexo feminino (347/674), provenientes dos
52
seguintes locais: Tocantins (n=459), Centros de Referência para Hepatites Virais
(n=172) e usuários de crack (n=43).
Em uma população com alta prevalência de anti-HCV, as sensibilidades dos
testes rápidos para o diagnóstico da hepatite C variaram entre os diferentes fluidos
biológicos de 76,03 a 93,84%, onde o teste Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy
Diagnóstica Ltda) foi o mais sensível quando o sangue total e o soro foram testados,
93,84% e 93,15% respectivamente. Em amostras de fluido oral, a sensibilidade do
teste foi de 76,03%, contudo, maiores sensibilidades em fluido foram obtidas pela
utilização dos testes WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) (81,51%) e
Oraquick HCV Rapid Antibody Test (Orasure) (Tabela 5.4 a).
Neste mesmo grupo, a especificidade dos testes rápidos variou de 93,75% a
100% entre os diferentes fluidos biológicos, onde as amostras de soro, sangue total
e fluido oral empregadas no teste rápido Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy
Diagnóstica Ltda), bem como as amostras de fluido oral avaliadas no teste rápido
Oraquick
HCV
Rapid
Antibody
Test
(Orasure)
apresentaram
100%
de
especificidade. As amostras de soro e fluido oral avaliadas no teste rápido WAMA
Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) apresentaram 93,75% de especificidade.
Os testes rápidos Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) e WAMA
Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica) apresentaram concordância acima de 80%
exceto quando testados com amostras de fluido oral, enquanto o teste rápido do
fabricante Oraquick HCV Rapid Antibody Test (Orasure) realizado em amostras de
fluido oral apresentou concordância acima de 80%.
Quando avaliamos os parâmetros de desempenho do teste na população com
alta prevalência de anti-HCV incluindo somente amostras anti-HCV/HCV RNA
reagentes, a sensibilidade dos testes rápidos variou de 86,36% a 99,09%, onde o
maior valor obtido foi aquele com amostras de sangue total e soro testadas no teste
Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) (99,09%), seguido por
amostras de soro testadas no teste do fabricante WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA
Diagnóstica) (98,18%), fluido oral testado no teste do fabricante Oraquick HCV
Rapid Antibody Test (Orasure) (95,35%), fluido oral avaliado no teste WAMA ImunoRápido HCV (WAMA Diagnóstica) (90,91%) e fluido oral avaliado no teste Bioeasy
HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) (86,36%) (Tabela 5.4 b). Neste grupo, a
especificidade dos testes foi a mesma àquela observada quando todas as amostras
anti-HCV reagentes foram incluídas. Em relação à concordância, observamos
valores acima de 90% quando o teste rápido Oraquick HCV Rapid Antibody Test
53
(Orasure) foi empregado em amostras de fluido oral, e quando os testes rápidos
Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) e WAMA Imuno-Rápido HCV
(WAMA Diagnóstica) foram empregados, exceto quando avaliados em amostras de
fluido oral (Tabela 5.4).
Em população com baixa prevalência para anticorpos anti-HCV (Tabela 5.5)
foi possível observar que a maioria dos testes foram verdadeiros negativos. Porém,
na população de baixa prevalência foram encontrados 7 resultados anti-HCV falso
negativo, onde 4 destes apresentaram HCV RNA não detectado e 3 não foram
submetidos a investigação de HCV RNA devido ao volume insuficiente de amostra.
Também foram encontrados 4 anti-HCV falso negativos nas amostras testadas com
o teste rápido do fabricante Orasure e todas as 4 amostras foram HCV RNA não
detectado.
A população em risco de infecção por HCV também apresentou maioria de
seus resultados verdadeiros negativos, porém, foram encontrados 5 resultados
discordantes (anti-HCV falso positivo). Estes resultados não foram confirmados
quanto à presença de HCV RNA devido ao volume insuficiente de amostra (Tabela
5.5).
54
Tabela 5.4. Desempenho dos testes rápidos em população de alta prevalência de anti-HCV.
VN FP FN
n
Sensibilidade %
Especificidade %
VPP %
VPN%
(IC 95%)
(IC 95%)
(IC 95%)
(IC 95%)
Teste Rápido / Amostra
VP
Kappa %
93,15
100
100
82,76
87,06
Bioeasy HCV Rapid Test / Amostras de soro
136 48
0
10 194
(87,76%–96,67%)
(92,60%–100%)
(97,32%–100%)
(70,57%–91,41%)
(79,25%–94,87%)
91,78
93,75
97,81
78,95
80,47
WAMA Imuno-Rápido HCV / Amostras de soro
134 45
3
12 194
(86,08%–95,68%)
(82,80%–98,69%)
(93,73%–99,55%)
(66,11%–88,62%)
(70,98%–89,96%)
93,84
100
100
84,21
88,28
(88,62%–97,14%)
(92,60%–100%)
(97,34%–100%)
(72,13%–92,52%)
(80,8%–95,76%)
76,03
100
100
57,83
61,08
(68,27%–82,70%)
(92,60%–100%)
(96,73%–100%)
(46,49%–68,60%)
(49,41%–72,75%)
81,51
93,75
97,54
62,5
64,44
(74,25%–87,44%)
(82,80%–98,69%)
(92,98%–99,49%)
(50,30%–73,64%)
(52,74%–76,14%)
88,52
100
100
78,13
81,77
(81,50%–93,58%)
(92,89%–100%)
(96,64%–100%)
(66,03%–87,49%)
(72,62%–90,92%)
99,09
100
100
97,96
98,51
(95,04%–99,98%)
(92,60%–100%)
(96,67%–100%)
(89,15%–99,95%)
(95,6%–100%)
98,18
93,75
97,30
95,74
92,47
(93,59%–99,78%)
(82,80%–98,69%)
(92,30%–99,44%)
(85,46%–99,48%)
(85,98%–98,96%)
99,09
100
100
97,96
98,51
(92,60%–100%)
(96,67%–100%)
(89,15%–99,95%)
(95,6%–100%)
a)
Bioeasy HCV Rapid Test / Amostras de sangue total 137 48
Bioeasy HCV Rapid Test / Amostras de fluido oral
111 48
WAMA Imuno-Rápido HCV / Amostras de fluido oral 119 45
Oraquick HCV Rapid Test / Amostras de fluido oral
108 50
0
0
3
0
9
194
35 194
45 194
14 172
b)
Bioeasy HCV Rapid Test / Amostras de soro
WAMA Imuno-Rápido HCV / Amostras de soro
109 48
108 45
0
3
1
2
158
158
Bioeasy HCV Rapid Test / Amostras de sangue total 109 48
0
1
158
(95,04%–99,98%)
86,36
100
100
76,19
79,37
Bioeasy HCV Rapid Test / Amostras de fluido oral
48
0
15 158
(78,51%–92,16%)
(92,60%–100%)
(96,19%–100%)
(63,79%–86,02%)
(69,44%–89,3%)
90,91
93,75
97,09
81,82
81,32
WAMA Imuno-Rápido HCV / Amostras de fluido oral 100 45
3
10 158
(83,92%–95,55%)
(82,80%–98,69%)
(91,72%–99,40%)
(69,09%–90,92%)
(71,59%–91,05%)
95,35
100
100
92,59
93,78
Oraquick HCV Rapid Test / Amostras de fluido oral
0
4
(88,52%–98,72%)
(92,89%–100%)
(95,60%–100%)
(82,11%–97,94%)
(87,77%–99,79%)
95
82
50
136
P<0,0001. a) todas as amostras anti-HCV detectadas b) apenas amostras anti-HCV e HCV RNA detectados. VP-verdadeiro positivo, VN-verdadeiro negativo, FP-falso
positivo, FN-falso negativo, IC-intervalo de confiança, VPP-valor preditivo positivo, VPN-valor preditivo negativo
55
Tabela 5.5. Desempenho dos testes rápidos em população com comportamento de risco de
de baixa prevalência para anti-HCV
Teste Rápido / Amostra
População com comportamento de risco
População de baixa prevalência para anti-HCV
VP
VN
FP
FN
VP
VN
FP
FN
Bioeasy HCV Rapid Test / Soro
0
199
1
0
0
421
2
7
WAMA Imuno-Rápido HCV / Soro
0
198
2
0
0
423
0
7
Bioeasy HCV Rapid Test / Sangue Total
0
200
0
0
0
423
0
7
Bioeasy HCV Rapid Test / Fluido Oral
0
200
0
0
0
422
1
7
WAMA Imuno-Rápido HCV / Fluido Oral
0
198
2
0
0
423
0
7
Oraquick HCV Rapid Test / Fluido Oral
0
43
0
0
0
455
0
4
VP-verdadeiro positivo, VN-verdadeiro negativo, FP-falso positivo, FN-falso negativo
5.1.2.1. Avaliação do teste rápido Oraquick HCV Rapid Antibody Test (Orasure)
em amostras de soro, sangue total e fluido oral
Para avaliar o desempenho do teste Oraquick HCV em diferentes espécimes
biológicos, 120 amostras pareadas de soro, sangue total e fluido oral foram testadas,
onde 81 amostras eram anti-HCV reagente e HCV RNA detectado e 39 eram antiHCV e HCV RNA não detectados. Esses voluntários apresentaram idade média de
50,52 (±13,40) e predomínio do sexo feminino (65/120). Dos 81 indivíduos anti-HCV
reagentes, 9 já haviam sido tratados, 6 estavam em tratamento, 37 ainda não
haviam sido tratados e 29/81 não sabiam.
Na Tabela 5.6 podemos observar 100% de especificidade entre os resultados
do teste rápido Oraquick HCV em todos os tipos de fluidos biológicos avaliados em
comparação com os testes de referencia (ELISA e PCR). Em relação à
sensibilidade, os maiores valores foram observados em amostras de soro (100%).
56
Tabela 5.6. Desempenho do teste rápido Oraquick HCV Rapid Antibody Test
(Orasure) em amostras de soro, sangue total e fluido oral. (n=120).
Sensibilidade %
Especificidade %
VPP %
VPN %
Espécime
VP
VN
FP
FN
(IC 95%)
(IC 95%)
(IC 95%)
(IC 95%)
100
100
100
100
Soro
81
39
0
0
(95,55%–100%)
(90,97%–100%)
(95,55%–100%)
(90,97%–100%)
98,77
100
100
97,5
(93,31%–99,97%)
(90,97%–100%)
(95,49%–100%)
(86,84%–99,94%)
97,53
100
100
95,12
(91,36%–99,70%)
(90,97%–100%)
(95,44%–100%)
(83,47%–99,40%)
Sangue
Total
80
39
0
1
Fluido
Oral
79
39
0
2
Kappa %
100
98,11
96,25
VP - Verdadeiro Positivo, FP- Falso Positivo, VN - Verdadeiro Negativo, FN - Falso Negativo –
FN, VPP - Valor Preditivo Positivo e VPN - Valor Preditivo Pegativo. Todos os resultados dos
testes rápidos foram comparados aos resultados dos testes imunoenzimáticos realizados em
amostras de soro conforme protocolo do teste. IC – Intervalo de Confiança,. P<0,0001.
5.2. Avaliação da reprodutibilidade e repetitividade dos testes para detecção
do anti-HCV.
Para avaliar a reprodutibilidade e repetitividade foram realizados 176 testes
rápidos para cada fabricante avaliado [Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy
Diagnóstica Ltda) e WAMA Imuno-Rápido HCV (WAMA Diagnóstica)], sendo que 88
testes foram realizados em amostras de saliva e 88 testes foram empregados em
amostras de soro. Somente três testes rápidos do fabricante Bioeasy foram inválidos
em amostras de fluido oral. Os resultados obtidos nesta avaliação foram de 100% de
concordância entre os resultados de cada teste rápido em relação ao EIA tanto em
amostras de soro quanto em amostras de fluido oral.
5.3. Avaliação da reação cruzada dos testes rápidos para detecção de antiHCV.
A fim de avaliar possível reação cruzada dos testes rápidos com outras
infecções, amostras reagentes para o vírus dengue, HIV, Plasmodium vivax e
Treponema pallidum foram avaliadas. A concordância entre os resultados obtidos no
ELISA e testes rápidos variou de 82,35% a 100% quando o teste WAMA ImunoRápido HCV (WAMA Diagnóstica) foi empregado e 94,11% a 100% quando o teste
Bioeasy HCV Rapid Test (Bioeasy Diagnóstica Ltda) foi utilizado (Tabela 5.7).
Resultados anti-HCV falso negativo foram obtidos em 5 amostras, onde 3 amostras
foram avaliadas pelo teste rápido HCV Rapid Test (Bioeasy) sendo 1 reagente para
57
dengue, 1 reagente para HIV e 1 reagente para P. vivax e 2 amostras haviam sido
avaliadas no teste Imuno-Rápido HCV (Wama) onde 1 foi reagente para dengue e 1
reagente para HIV. Além disso, 3 amostras anti-HCV falso positivo foram obtidas em
amostras de P. vivax testadas no teste Imuno-Rápido HCV (Wama).
Tabela 5.7. Avaliação da resposta cruzada em amostras reagentes para Dengue, HIV,
P.vivax, T.pallidum testadas nos testes rápidos WAMA Imuno-Rápido HCV e Bioeasy HCV
Rapid Test.
Wama Imuno Rápido HCV
Reagente
Não Reagente
Reagente
HIV
Não Reagente
Reagente
P. vivax
Não Reagente
Reagente
T. pallidum
Não Reagente
Dengue
Bioeasy HCV Rapid Test
Reagente
Não Reagente
Reagente
HIV
Não Reagente
Reagente
P. vivax
Não Reagente
Reagente
T. pallidum
Não Reagente
Dengue
58
Soro Radim HCV
Reagente Não-reagente
0
0
1
34
0
0
1
29
1
3
0
13
8
0
0
12
Soro Radim HCV
Reagente Não-reagente
0
0
1
34
0
0
1
29
0
0
1
16
8
0
0
12
6. DISCUSSÃO
A hepatite C é uma doença infecciosa, onde muitos indivíduos infectados
ainda não foram identificados, pois em geral a fase aguda com apresentação de
sintomas não é muito comum (WHO, 1999). Além disto, o diagnóstico convencional
é bastante difícil em áreas situadas longe dos grandes centros urbanos ou em
determinadas populações, tais como, usuários de drogas. Deste modo, os testes
rápidos para detecção do anti-HCV podem ser uma ferramenta útil para identificar os
indivíduos
infectados,
especialmente
nas
regiões
remotas
de
países
em
desenvolvimento, tal como o Brasil.
Os testes rápidos têm apresentado bom desempenho em estudos sobre HIV,
aumentando desta forma a identificação de indivíduos infectados pelo vírus (Zelin et
al. 2008). Entretanto, um dos problemas da utilização dos testes rápidos para o
diagnóstico de doenças infecciosas está relacionado à qualidade e desempenho do
teste (Gray et al. 2004). Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar
três testes rápidos de diferentes fabricantes [(WAMA Imuno-Rápido HCV, Brasil),
(Bioeasy HCV Rapid-Test, Brasil) e (Oraquick HCV Rapid Test, EUA)] em
populações com diferentes prevalências para anti-HCV e também diferentes
espécimes biológicos.
O desempenho dos testes rápidos avaliados no presente estudo variou de
acordo com a população estudada e o fluido biológico avaliado, onde as
sensibilidades e especificidades variaram respectivamente no teste rápido Bioeasy
HCV Rapid-Test para amostras de soro (93,15 - 99,09% e 100%), sangue total
(93,84 – 99,09% e 100%) e fluido oral (76,03-83,36% e 100%), no teste rápido
WAMA Imuno-Rápido HCV para amostras de soro (91,78 – 98,18% e 93,75%) e
fluido oral (81,51 – 90,91% e 93,75%), por fim no teste rápido Oraquick HCV Rapid
Test a variação foi de (88,52 – 95,35% e 100%).
Ao comparamos os resultados dos testes rápidos com o ELISA na população
de alta prevalência para anti-HCV, o teste rápido Bioeasy HCV Rapid-Test realizado
em amostras de sangue total foi o que apresentou maior sensibilidade e
especificidade (93,84% e 100%). Uma possível explicação para o melhor
desempenho deste teste em comparação aos demais avaliados neste trabalho
poderia ser o fato do teste apresentar quatro diferentes antígenos do HCV na linha
teste (core, NS3, NS4 e NS5). Smith e colaboradores (2011b) também observaram
uma maior sensibilidade de teste rápido para detecção de anti-HCV em amostras de
59
sangue total utilizando os testes rápidos Chembio DDP HCV test (Chembio
Diagnostic Systems, Inc, EUA) (96,2%), Multiplo Rapid HIV/HCV Antibody Test
(MedMira Laboratories, Canadá) (78,9%) e OraQuick Rapid HCV Antibody Test
(OraSure, EUA)(95,9%).
Ao considerarmos, em todos os espécimes biológicos, somente amostras
anti-HCV/HCV RNA reagentes para determinação da sensibilidade dos testes
rápidos avaliados neste estudo, foi demonstrado um aumento destes valores com
variação geral de 86,36% a 99,09%. Este resultado mostra que os testes rápidos
são bastante eficientes para detectar aqueles indivíduos que estão com infecção
ativa e deste modo poderiam ser beneficiados com o encaminhamento para o
tratamento e acompanhamento diagnóstico. Em geral amostras anti-HCV reagentes
pelo ELISA e não reagentes pelo teste rápido não apresentam HCV RNA detectado
no soro, tal como foi observado na avaliação do teste rápido Oraquick HCV
(OraSure) em fluido oral e sangue total (Drobnik et al. 2011; Lee et al. 2011).
Ao avaliarmos o desempenho dos testes rápidos em amostras de fluido oral,
verificamos melhor desempenho do teste rápido OraQuick Rapid HCV Antibody Test
quando todas as amostras anti-HCV reagentes foram analisadas (88,52% e 100%)
ou quando somente amostras anti-HCV/HCV RNA reagentes foram consideradas
(95,35% e 100%). Como os testes WAMA Imuno-Rápido HCV e Bioeasy HCV Rapid
Test não foram desenvolvidos para amostras de fluido oral, este fato poderia explicar
os baixos valores de sensibilidade e especificidade encontrados no presente estudo.
Estudos prévios também demonstraram alta sensibilidade e especificidade do teste
rápido Oraquick em amostras de fluido oral (Lee et al. 2010) (99,2% e 100%) e Lee
et al. 2011) (98,1% e 99,6%). Nestes estudos, indivíduos em risco de contrair HCV,
população de baixo risco e pacientes com sintomas da infecção pelo HCV foram
incluídos, porém somente indivíduos com resultado no soro reagente para anti-HCV
por ELISA e RIBA e com HCV RNA detectado foram incluídos para avaliação da
sensibilidade. O teste rápido OraQuick Rapid HCV Antibody Test também foi
avaliado em amostras de soro, fluido oral e sangue total em usuários de droga
injetável e populações com risco para infecção por HIV, onde a sensibilidade e
especificidade variaram respectivamente entre 94,7% e 99,3% e 92,1% e 98,6%
(Smith et al. 2011a,b) demonstrando a aplicabilidade deste teste para diferentes
fluidos biológicos.
Estudos epidemiológicos utilizando testes rápidos vêm sendo documentados
principalmente em regiões de difícil acesso ou em países subdesenvolvidos
60
(Laperche et al. 2009, 2012). Trabalhos de prevalência para co-infecção HIV e HCV
utilizando testes rápidos já foram realizados com mulheres grávidas na Nigéria (Duru
et al. 2009) bem como no diagnóstico de anti-HCV em hospitais do Uganda onde o
teste
RSA,
RAPIDTEST
(Cortez
Diagnostics,
Calabasas,
CA)
apresentou
sensibilidade de 73,07% (Seremba et al. 2010), ou seja, inferior ao observado no
presente trabalho.
É muito importante a realização do aconselhamento pré e pós teste rápido em
qualquer situação onde o mesmo seja realizado. No aconselhamento pré-teste o
profissional de saúde deve apresentar ao paciente os objetivos da realização dos
testes, expondo sobre as diversas formas de se infectar bem como identificar o nível
de exposição a um ou vários riscos em que o paciente se encontra. Além disso, o
agente de saúde deve verificar o conhecimento da pessoa sobre os modos de
transmissão e de prevenção da doença, assim como sobre a importância da
realização do teste. Por fim, o profissional de saúde deve antecipar as emoções
relacionadas ao resultado. Quanto ao aconselhamento pós-teste, o resultado deve
ser mencionado em particular, livre de qualquer interferência. Além disso, cabe ao
agente informar imediatamente sobre as estratégias às quais o paciente deve ser
encaminhado. Por fim, colocar a disposição da pessoa os recursos da rede de saúde
existente como assistentes sociais, médicos, hospitais e grupos de discussão.
Os testes rápidos também foram avaliados em estudos de campo em
populações com baixa prevalência para anti-HCV e em populações com algum
comportamento de risco de infecção pelo HCV.
Na população de baixa prevalência para anti-HCV, o teste rápido OraQuick
Rapid HCV Antibody Test apresentou o melhor desempenho em amostras de fluido
oral entres os demais testes rápidos avaliados (Bioeasy HCV Rapid Test e WAMA
Imuno-Rápido HCV não utilizam em seu protocolo de execução amostras de fluido
oral) com somente 4 resultados discordantes (anti-HCV falso negativo) que não
tiveram o HCV RNA detectado (Kondili et al. 2002; Lee et al. 2011; Drobnik et al.
2011). Este resultado demonstra que o teste pode ser bastante útil para identificação
de indivíduos com infecção ativa pelo HCV em áreas de difícil acesso. Nesta mesma
população, o teste rápido Bioeasy HCV Rapid Test em amostras de soro, sangue
total e fluido oral e o teste rápido WAMA Imuno-Rápido HCV em amostras de soro e
fluido oral obtiveram os mesmos 7 resultados anti-HCV falso negativos dos quais 4
amostras foram HCV RNA não detectado e 3 amostras HCV RNA detectado. Além
disso, no teste rápido Bioeasy HCV Rapid Test também foram detectados 3
61
resultados anti-HCV falso positivos, 2 em amostras de soro e 1 em amostras de
fluido oral. Entretanto, estes resultados discordantes encontrados no teste rápido
Bioeasy HCV Rapid Test em amostras de soro e fluido oral não puderam ter seu
HCV RNA estudado devido volume insuficientes de amostra.
Estudos realizados por Smith e colaboradores (2011a, 2011b), para a
avaliação dos testes rápidos Chembio, MedMira e OraSure realizados pelo CDC em
população usuária de droga intravenosa também encontraram resultados falso
negativos. É possível que fatores pré-analíticos, como conservação da amostra,
transporte e reações inespecíficas possam estar relacionadas a estes resultados.
Além disso, foi observado que os resultados falsos negativos apresentaram média
de DO/CO inferior aos resultados verdadeiros positivos e, de acordo com o Manual
de Gestão da Fase Analítica do Laboratório (ControLab, 2010), quanto menor as
concentrações de analito de interesse em uma amostra, maior serão as variações.
Na população com algum comportamento de risco para infecção com o HCV
observou-se resultados anti-HCV falsos positivos nos testes Bioeasy HCV Rapid
Test e WAMA Imuno-Rápido HCV. Entretanto, não foi possível avaliar a presença do
HCV RNA nestas amostras devido ao volume insuficiente das mesmas. Estes
resultados discordantes podem ter ocorrido devido a diferentes sensibilidades entre
os dois testes, visto que o teste WAMA Imuno-Rápido HCV não informa quais
antígenos do HCV são utilizados na linha teste. Além disto, amostras de fluido oral
podem apresentar componentes não específicos que podem interferir no
desempenho do teste visto que o teste utilizado (WAMA Imuno-Rápido HCV) não foi
desenvolvido para este fluido. No estudo de campo, somente as amostras de fluido
oral avaliadas no teste OraQuick Rapid HCV Antibody Test e sangue total foram
testadas imediatamente após a coleta, logo o transporte e congelamento e
descongelamento da amostra também podem ter interferido no desempenho dos
testes rápidos na amostra de soro ou fluido oral obtido com o coletor comercial.
No presente estudo não foi observada diminuição dos valores de
sensibilidade e especificidade ao compararmos os resultados obtidos no painel de
referência aos resultados dos testes (Bioeasy HCV Rapid Test e WAMA ImunoRápido HCV) realizados durante trabalho de campo. Porém, os resultados obtidos
com a utilização do teste rápido OraQuick Rapid HCV Antibody Test em campo com
fluido oral diferiu dos testes realizados no laboratório com amostras de fluido oral,
sangue total e soro onde os resultados obtidos em laboratório foram superiores aos
encontrados em campo.
62
Como descrito acima, além da avaliação em trabalho de campo amostras
pareadas de soro, sangue total e fluido oral foram testadas em laboratório no teste
rápido OraQuick Rapid HCV Antibody Test. Apesar do bom desempenho do teste
em amostras de fluido oral, os valores de sensibilidade foram inferiores aqueles
observados em soro e sangue total. Isto provavelmente se deve a menor
concentração de anticorpos anti-HCV presentes neste fluido em comparação com o
soro ou sangue, fato que foi observado em estudos de avaliação de testes rápidos
para detecção de anti-HCV (Lee et al. 2010; Smith et al. 2011). Outros estudos que
avaliaram a detecção de anti-HCV por ELISA em fluido oral também observaram
resultados de sensibilidade mais baixos quando comparados a amostras de soro
(Van Doornum et al. 2001; Amado et al. 2006; Cruz et al. 2012).
Dessa forma, independentemente do fluido biológico avaliado, o teste rápido
OraQuick Rapid HCV Antibody Test apresentou valores de sensibilidade e
especificidade acima de 95%, corroborando estudos prévios (O’Connel et al. 2008;
Lee et al. 2010). Uma maior sensibilidade foi obtida em amostras de soro, seguido
pelo sangue total e fluido oral. O mesmo foi observado por Lee e colaboradores,
(2011) em estudo realizado em população de risco ou sintomática para o HCV. A
alta sensibilidade obtida pode ser devido à utilização de amostras anti-HCV/HCV
RNA reagentes como foi realizado em outros estudos (Kondili et al. 2002; Lee et al.
2011; Drobnik et al. 2011).
Os testes rápidos também foram avaliados quanto à reprodutibilidade e
repetitividade, onde 100% de concordância foram obtidas para os dois fabricantes
avaliados (WAMA Imuno-Rápido HCV e Bioeasy HCV Rapid Test) em soro e fluido
oral.
Este resultado demonstra que os testes apresentam fácil leitura além de
fornecerem o mesmo resultado repetidamente. Resultados concordantes também
foram obtidos por Smith e colaboradores (2011) na análise de 3 diferentes testes de
detecção para anti-HCV em amostras de sangue e fluido oral testado por 3
operadores.
Este estudo também avaliou um fator de interferência importante no controle
laboratorial de resultados verdadeiros positivos e negativos para anti-HCV que é a
reação cruzada com outros agentes infecciosos. Ao avaliarmos as amostras
positivas para anticorpos anti - Treponema pallidum, nenhum resultado discordante
foi observado. No entanto resultados anti-HCV falso negativos foram observados
nos testes rápidos de amostras reagentes para anti-HIV (co-infectados) do mesmo
modo que observado por Smith e colaboradores (2011), o que pode ser devido à
63
baixa produção de anticorpos anti-HCV durante a infecção por HIV. No caso das
amostras reativas para dengue, foram observados resultados anti-HCV reagentes
pelo EIA e não reagentes pelo teste rápido, o que pode ter ocorrido devido a alguma
interferência da infecção pelo vírus dengue no sistema imune do individuo levando a
uma baixa produção de anticorpos anti-HCV (Smith et a.l 2011) ou reação cruzada
no teste imunoenzimático. No caso da reação com P. vivax, relatos de casos de antiHCV falsos positivos em testes ELISA e RIBA de amostras reagentes para P.
falciparum também foram encontrados no Camarão (Aceti et al.1990).
O presente estudo apresenta algumas limitações: i) a não realização de testes
de detecção do HCV RNA em amostras de soro com resultados duvidosos, devido
ao volume insuficiente de amostras ii) o reduzido número de amostras avaliadas
quanto à reação cruzada e não realização de um teste confirmatório para anticorpos
como RIBA iii) ausência de análise de alguns fatores de interferência nos resultados
obtidos tal como: fatores de risco, condições de higiene bucal e saúde oral nos
casos das amostras de fluido oral.
Apesar dos testes rápidos apresentarem resultados comparáveis aos ensaios
imunoenzimáticos convencionais utilizados para a detecção do anti-HCV, foram
observadas variações na sensibilidade, especificidade e valores preditivos destes
testes. A sensibilidade dos testes rápidos foi adequada para o estudo em
populações com elevada prevalência para anti-HCV, estudos epidemiológicos em
áreas remotas ou urbanas. Além disso, a utilização do fluido oral demonstrou
resultados aceitáveis de sensibilidade e especificidade podendo ser empregados
principalmente em indivíduos com difícil acesso venoso ou na ausência de equipe
altamente especializada.
64
7. CONCLUSÕES
•
A sensibilidade e especificidade dos testes rápidos avaliados neste estudo
(Bioeasy HCV Rapid Test em amostras de soro e sangue total e WAMA
Imuno-Rápido HCV em amostra de soro) foram superiores a 98% quando
amostras anti-HCV/HCV RNA detectados foram inclusas. Isto demonstra que
estes testes podem ser utilizados com boa eficiência para diagnóstico da
infecção pelo HCV em indivíduos com infecção ativa (HCV RNA);
•
O teste rápido do fabricante Bioeasy HCV Rapid Test apresentou os maiores
valores de sensibilidade e especificidade para detecção do anti-HCV em
amostras de sangue total na população de alta prevalência para anti-HCV,
sugerindo que este teste seria a melhor escolha para identificação de casos de
infecção ativa pelo HCV.
•
Na população com baixa prevalência para anti-HCV, o teste rápido Oraquick
HCV Rapid Antibody Test apresentou o melhor desempenho entres os demais
testes rápidos avaliados, com somente 4 resultados discordantes (anti-HCV
falso negativo) que não tiveram o HCV RNA detectado; indicando que este
teste pode ser utilizado com boa eficiência neste grupo
•
Na população com algum comportamento de risco para hepatite C, o teste
rápido Bioeasy HCV Rapid Test em amostras de sangue total e fluido oral, e o
teste rápido Oraquick em amostras de fluido oral, não apresentaram
resultados discordantes sugerindo que os mesmos são os mais eficientes para
uso neste grupo.
•
O teste rápido Oraquick HCV Rapid Antibody Test apresentou excelente
desempenho em diferentes tipos de amostras biológicas (soro, sangue total e
fluido oral) indicando seu uso em diferentes fluidos, o que pode facilitar o
acesso ao diagnóstico, especialmente em situações de emergência, em áreas
remotas e estudos epidemiológicos.
•
Os testes rápidos WAMA Imuno-Rápido HCV e Bioeasy HCV Rapid Test em
amostras de soro e fluido oral apresentaram boa reprodutibilidade e
repetitividade indicando que os testes são de fácil execução e leitura dos
resultados;.
65
•
Observamos alguns resultados discordantes entre amostras reagentes para
HIV, Plasmodium vivax e Dengue com os testes rápidos para detecção de
anti-HCV, porém devido ao reduzido número de amostras avaliado não é
possível afirmar que ocorra de fato reação cruzada entre estes patógenos e o
HCV.
66
8. PERSPECTIVAS
O presente estudo tem como perspectivas:
-Avaliar o custo benefício da utilização de testes rápidos no diagnóstico da hepatite
C em populações com diferentes perfis da infecção;
-Elaborar um algoritmo para o diagnóstico de anti-HCV utilizando testes rápidos aifm
de facilitar o acesso ao diagnóstico em áreas remotas e situações de emergência;
-Avaliar o desempenho dos testes rápidos em outros grupos, tais como indivíduos
que usam droga intravenosa, hemodialisados, pacientes renais crônicos, pacientes
com doenças hematológicas, profissionais de saúde, a fim de confirmar o emprego
dos testes em diferentes populações;
-Avaliar um número maior de amostras reagentes para HIV, Plasmodium vivax,
dengue e outros possíveis agentes infecciosos frente aos testes rápidos para
diagnóstico do anti-HCV a fim de confirmar ou descartar a reação cruzada com estes
patógenos.
67
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85
ANEXO I – PARECER DO PROJETO
86
ANEXO II – TERMO DE CONSENTIMENTO
Ministério da Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Instituto Oswaldo Cruz
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Instituição: Laboratório de Hepatites Virais do Instituto Oswaldo Cruz - Fiocruz
Projeto de Pesquisa: AVALIAÇAO DA PERFORMANCE DE TESTES RAPIDOS PARA O
DIAGNÓSTICO DE MARCADORES DAS INFECÇÕES PELOS VÍRUS DAS HEPATITES B
EC
Pesquisador: Dra. Lívia Melo Villar
Como voluntário, o (a) Sr. (a) está sendo convidado a participar de uma pesquisa realizada
pelo Laboratório de Hepatites Virais do Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz sob a coordenação
da Dra. Lívia Melo Villar. O objetivo da pesquisa é avaliar a performance de testes rápidos
para o diagnóstico de marcadores das infecções pelos vírus das hepatites B e C em
diferentes fluidos biológicos.
Este documento pretende fornecer a (o) Sr. (a) informações sobre o problema de
saúde em estudo, detalhando os procedimentos, exames, benefícios, inconvenientes e
riscos potenciais. O (a) Sr.(a) possui a liberdade de recusar a participar da pesquisa ou
retirar seu consentimento, em qualquer fase da pesquisa, sem penalização e sem prejuízo
ao seu cuidado.
Os investigadores se obrigam a não revelar sua identidade em qualquer publicação
resultante de informações obtidas durante o estudo. Os exames e procedimentos aplicados
são gratuitos. O (a) Sr. (a) receberá todos os cuidados médicos adequados para o controle
dos efeitos colaterais que possam ocorrer em conseqüência de sua participação na
pesquisa.
Antes de assinar este termo, o Sr.(a) será informado plenamente sobre a pesquisa,
não hesitando em formular perguntas sobre qualquer aspecto que julgar conveniente
esclarecer. É importante estar ciente das seguintes condições:
1. Exames e procedimentos que serão realizados: o voluntário será submetido à
coleta de sangue venoso e saliva. Os técnicos especializados dos Laboratórios de
Hepatites Virais e Desenvolvimento Tecnológico em Virologia (IOC/FIOCRUZ)
coletarão 2 tubos de sangue por punção venosa periférica (volume final de 4 ml de
soro) e aproximadamente 1 ml de saliva utilizando três coletores comerciais
(Chembio, Orasure e Salivette) e por salivação espontanea.
2. Benefícios: Obter resultado de exames laboratoriais para as Hepatites A, B e C que
serão entregues acompanhados de esclarecimentos sobre o significado dos
87
resultados de maneira confidencial. O (a) Sr. (a) também será encaminhado para
unidades de saúde do Estado do Rio de Janeiro, nos casos em que o tratamento da
hepatite se fizer necessário.
3. Inconvenientes: Caso seja necessário, o (a) Sr. (a) será contatado por um dos
membros da pesquisa que irá perguntar se o (a) Sr. (a) está disposto a doar nova
amostra de sangue. O (a) Sr. (a) estará livre para recusar esta solicitação.
4. Riscos potenciais conhecidos até o dia de hoje: Os possíveis riscos e
desconfortos são aqueles relacionados com a retirada rotineira de sangue, dor ou
rouxidão no local que serão controladas por uma coleta de sangue realizada dentro
das normas de biossegurança.
5. Garantia de esclarecimentos: Todos os esclarecimentos sobre a metodologia da
pesquisa antes e durante o desenvolvimento da mesma serão realizados pela equipe
da Pesquisa.
Eu,_________________________________________________________________
____ (nome do(a) paciente), abaixo identificado(a) e firmado(a), declaro ter sido
informado(a) claramente sobre todas as indicações e riscos relacionados à coleta de sangue
e saliva.
Os termos médicos foram explicados e todas as minhas dúvidas foram esclarecidas
pelo pesquisador ___________________ ________________________________(nome do
pesquisador).
Expresso também minha concordância e espontânea vontade em submeter-me ao
referido procedimento (coleta de sangue e saliva).
Entendi que minhas informações pessoais poderão ser revistas por pessoas
devidamente autorizadas para conduzir a pesquisa, porém serão estritamente
CONFIDENCIAIS e, de forma alguma, poderão tornar-se públicas.
Assim, declaro que:
- Fui claramente informado a respeito dos benefícios que a pesquisa pode trazer na
avaliação dos resultados dos exames usados no diagnóstico das hepatites virais.
- Fui também claramente informado a respeito dos potenciais riscos relacionados a
coleta de sangue para a realização desses exames.
Paciente: _______________________________________________RG do paciente:
___________
Sexo do
paciente:
Telefone: (
( ) Masculino Idade: ______
( ) Feminino _______________________
)
Endereço: ______________________________________________ Cidade:
__________________ CEP: _______-____
Responsável legal (quando for o caso): _______________________________________
RG do responsável legal: __________________________________________________
88
Assinatura do paciente ou do responsável legal: ________________________________
Pesquisador Responsável: Livia Melo Villar
RG:11403613-0/IFP
Caso tenha alguma dúvida ou necessite de qualquer esclarecimento sobre o estudo você
pode entrar em contato com o pesquisador relacionados acima:
Dra. Livia Melo Villar, Laboratório de Hepatites Virais, fone 2562-1918.
____________________________________
(local e data)
Testemunha:_________________________________________ (nome completo)
____________________________________(assinatura)
___________________________________________
Assinatura do pesquisador responsável.
89