UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC CURSO DE FARMÁCIA THALITA DA ROSA AVALIAÇÃO DO EFEITO GASTROPROTETOR DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Zollernia ilicifolia (FABACEAE) EM RATOS CRICIÚMA, 16 DE NOVEMBRO DE 2009. 1 UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC CURSO DE FARMÁCIA THALITA DA ROSA AVALIAÇÃO DO EFEITO GASTROPROTETOR DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Zollernia ilicifolia (FABACEAE) EM RATOS Projeto de trabalho de conclusão de curso, apresentado para o curso de Farmácia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC. Orientador: Prof. Dr. Emilio Luiz Streck CRICIÚMA, 16 DE NOVEMBRO DE 2009. 2 1 INTRODUÇÃO O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos (Maciel et al., 2002). O uso de plantas e extratos vegetais no tratamento de algumas doenças é um hábito bastante difundido no Brasil, devido a uma importante fonte de produtos naturais biologicamente ativos e, devido a sua grande diversidade em termos de estrutura, propriedades físico-químicas e biológicas, podendo assim ser modelo para a síntese de inúmeros fármacos (Jorge et al., 2004; Simões, 2003, p.14-15). Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram que cerca de 80% da população mundial fazem uso de algum tipo de erva, buscando alívio para sintomas dolorosos ou desagradáveis (Franco, 1998). Segundo Corrêa et al. (2002, p.12), a OMS tem encorajado o estudo de plantas tradicionais, com a esperança de obter os benefícios que elas poderiam possivelmente fornecer, enquanto ao mesmo tempo poderia evitar os efeitos irracionais ou prejudiciais que esse tipo de medicina pode ter. Sendo assim, existe um grande interesse científico pelo desenvolvimento da pesquisa de plantas utilizadas na medicina popular, envolvendo áreas multidisciplinares, como, por exemplo, botânica, farmacologia e fitoquímica. O conhecimento existente nas comunidades tradicionais sobre as propriedades terapêuticas das plantas encontradas em seu ambiente natural pode ser uma ferramenta poderosa na descoberta de novos medicamentos (Corrêa et al., 2002, p.18; Almeida, 2004; Maciel et al., 2002). Os marcadores morfológicos são utilizados para discriminar espécies. Contudo, quando a morfologia é altamente semelhante, corre-se o risco de equívocos na classificação. Assim, a identificação da espinheira-santa (Maytenus ilicifolia, Celestraceae) via marcadores morfológicos não é tão simples, uma vez que existem várias espécies do mesmo gênero com 3 morfologia semelhante, sendo uma destas espécies a Zollernia ilicifolia, que é também conhecida popularmente como falsa espinheira-santa, mocitaíba, laranjeira-do-mato, moçataíba, orelha-de-onça e/ou carapicica-de-folha-lisa. Além disso, a discriminação entre a espinheira-santa e as espécies conhecidas como mata-olho (Sorocea bonplandii) e falsaespinheira-santa (Zollernia ilicifolia) praticamente só pode ser feita in vivo desde que se tenham conhecimentos botânicos (Coelho et al., 2003; Di Stasi & Hiruma-Lima, 2002, p.312; Simões, 2003, p.35). A Zollernia ilicifolia (Fabaceae) é uma planta nativa da Floresta Tropical Atlântica (Mata Atlântica, Brasil). É utilizada tradicionalmente suas folhas na forma de decocto como analgésico e antiulcerosa, com as mesmas utilizações tradicionais da verdadeira "espinheirasanta" (Maytenus ilicifolia, Celastraceae) (Gonzalez et al., 2001; Di Stasi et al., 2002). A Planta é uma árvore de porte médio (aproximadamente 15m); folhas simples coriáceas com cerca de 15cm de comprimento e 5cm de largura, oblongas, com margens onduladas e providas de espinhos; estípulas espesas (característica marcante na diferenciação da Espinheira-santa verdadeira, Maytenus ilicifolia); flores rosadas (Di Stasi & Hiruma-Lima, 2002, p.312-313). Em um recente estudo comparativo, Gonzalez et al. (2001) investigou a atividade analgésica e antiulcerosa do extrato metanólico 70%, de folhas de Zollernia ilicifolia, Sorocea bomplandii e Maytenus aquifolium. O extrato metanólico da Zollernia ilicifolia mostrou efeitos analgésico e antiulceroso sobre lesões gástricas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Os testes mostraram também que os animais tratados com o extrato de Zollernia ilicifolia apresentaram aumento de irritabilidade e freqüência respiratória, perda de reflexos da córnea e diminuição da atividade motora. Em outro estudo, Coelho et al. (2003) observou que a atividade antiulcerosa do extrato metanólico 70% de Zollernia ilicifolia poderia estar relacionada à presença do 4 flavonóide tetraglicosídeo, uma vez que as estruturas são semelhantes as encontradas em espécies de Maytenus, plantas com efeitos analgésico e antiulcerosa. A gastrite é uma lesão gástrica, patologicamente caracterizada pela inflamação inespecífica da mucosa gástrica (Wang et al., 2009). Apesar da definição ser histológica, o diagnóstico geralmente é feito pelo clínico e/ou endoscopista, prescindindo da microscopia (Prado, 2007, p.382). A gastrite ocorre em qualquer região do globo, a prevalência é alta e aumenta com a idade. Algumas destas lesões são de natureza microbiana (Helicobacter pylori), mas também pode ser decorrente de agentes químicos, biológicos ou físicos (álcool, AINES, intoxicações, infecções). Sua maior prevalência é pela Helicobacter pylori, mas também ocorre frequentemente pela ingestão de álcool ou de anti-inflamatórios não-esteróides (AINES) e intoxicações ou infecções (Calabuig et al., 2009; Prado, 2007, p.382). A expansão mundial do consumo de álcool e AINES têm contribuído para o crescimento de úlcera gástrica. Os AINES estão entre os medicamentos mais utilizados/prescritos e que mais desencadeiam efeitos indesejáveis. A maioria desses efeitos relaciona-se ao sistema digestório, destacando-se a capacidade de causar principalmente gastrite aguda, dispepsia e úlcera péptica (Prado, 2007, p.382-383; Moraes et al, 2009). O efeito ulcerogênico dos AINES tem sido relacionado com o potencial deste medicamento para inibir a síntese de prostaglandina E2. A secreção ácida aumentada também contribui para este processo prejudicial, tal como o fato de provocar distúrbios na microcirculação gástrica, aumento da infiltração de neutrófilo, induz a expressão de TNF- , e perturba o equilíbrio entre óxido nítrico e apoptose. A introdução de antagonistas dos receptores histamínicos e inibidores de bomba de prótons têm sido associados com um aumento na taxa de cura da úlcera (Moraes et al, 2009). Os AINES, tais como a indometacina, tem a capacidade de induzir danos 5 gástricos, especialmente devido à inibição da biossíntese de prostagladinas por inibição da ciclooxigenase via metabolismo do ácido araquidônico (Rainsford, 1987; Wallace, 2001). O sucesso dos tratamentos farmacológicos para prevenir ou curar lesões ulcerativas depende não só do bloqueio da secreção ácida, mas também em aumentar fatores protetores da mucosa incluindo prostaglândinas, fatores de crescimento, somatostatina, o óxido nítrico e compostos sulfidrílicos (Moraes et al, 2009). Devido a Zollernia ilicifolia ser uma planta bastante utilizada para gastrite, mas com poucos estudos comprovando a sua ação farmacológica, torna-se muito importante verificar se a mesma realmente apresenta efeito gastroprotetor. 6 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL: - Avaliar o efeito gastroprotetor do extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia em ratos. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: - Verificar o efeito do tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia sobre os seguintes parâmetros, em mucosa gástrica de ratos submetidos a gastrite experimental induzida por indometacina: 1) a medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), um marcador de lipoperoxidação; 2) a oxidação de proteínas (carbonilação de proteínas e grupos sulfidrila); 3) a atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (I, II, III e IV); 4) análise histológica. 7 3 METOLOGIA 3.1 Tipo de pesquisa Pesquisa básica, quantitativa, experimental. 3.2 Animais Para realização dos experimentos serão utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300 g, provenientes do Biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). Os animais serão mantidos em ambiente climatizado (22oC) com ciclos claroescuro de 12 horas, com água e alimentação ad libitum. O projeto será enviado ao Comitê de Ética de Uso de Animais da UNESC. 3.3 Preparação do extrato As folhas secas e maceradas serão colocadas em um recipiente contendo o líquido extrator (álcool 70%) deixando-se em repouso durante um período de 21 dias. Os extratos sólidos serão obtidos para obtenção da concentração da planta a ser utilizada. 3.4 Preparação do tecido Os animais serão mortos por decapitação e posteriormente exerese do estômago para observação das lesões gástricas. 8 3.5 Indução do modelo de gastrite e tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia Os animais serão divididos em quatro grupos: controle, indometacina, extrato, indometacina+extrato. Os ratos serão tratados por sete dias, sendo que dois grupos serão tratados com extrato hidroalcoólico da Zollernia ilicifolia (168mg/rato) e dois grupos com água destilada, por meio de gavagem (Carrier et al., 2002; Ritter et al., 2004; Dal-Pizzol et al., 2006; Tadros et al., 2005). Do 7° para o 8° dia ficarão em jejum por 24 horas; após esse período, por meio de gavagem, a indometacina (2,5 mg/rato) será administrada em dois grupos, e também por meio de gavagem será administrado água destilada nos dois grupos controle. Após administração da indometacina, os animais ficarão em jejum por 6 horas e serão mortos por decapitação para exerese do estômago e observação das lesões gástricas. Depois da avaliação macroscópica, o tecido será armazenado a -70oC para posterior análise dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial. 3.6 Avaliação Macroscópica A avaliação será realizada por dois observadores (cegos ao estudo) e o índice de lesões ulcerativas (ILU), determinado após aplicação dos protocolos referentes aos modelos de indução, irá ser calculado por meio de somatória dos parâmetros abaixo, de acordo com a metodologia descrita por Gamberini. A escala é a seguinte: até 10 petéquias: 2 pontos; acima de 10 petéquias: 3 pontos; úlceras de até 1mm: *n x 2 (*n=número de lesões encontradas); úlceras maiores que 1mm: *n x 3 (*n=número de lesões encontradas); úlceras perfuradas: *n x 4 (*n=número de lesões encontradas); hemorragia: 1 ponto; edema: 1 ponto; perda de pregas: 1 ponto; perda da coloração: 1 ponto. 9 3.7 Medida de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) Como indício de peroxidação lipídica será medida a concentração de TBARS durante uma reação ácida aquecida como previamente descrito (Dal-Pizzol et al., 2000). Brevemente, as amostras obtidas serão misturadas com 1ml de ácido tricloroacético 10% e 1ml de ácido tiobarbitúrico, fervidas por 15 minutos e a quantidade de TBARS será determinada por absorbância em 535 nm. 3.8 Medida do dano oxidativo em proteínas O dano oxidativo em proteínas será determinado pela medida de grupos carbonil conforme previamente descrito (Klamt et al., 2001). Brevemente, as amostras obtidas serão precipitadas e as proteínas dissolvidas com dinitrofenilidrazina. Os grupamentos carbonil serão medidos pela absorbância em 370 nm. 3.9 Medida de grupos sulfidrila O ensaio será baseado na redução de 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) pelos tióis, que se tornam por sua vez oxidados, gerando um derivado amarelo cuja absorção será medida por espectrofotômetro em 412 mm (Aksenov e Markersbery, 2001). 3.10 Atividades dos complexos enzimáticos da cadeia respiratória mitocondrial A atividade do complexo I será determinada de acordo com Birch-Machin e colaboradores (1994) e será baseada na redução da absorbância devido à oxidação do 10 NADH em 340 nm. A atividade do complexo I será medida antes da adição de rotenona (20g/mL) e a absorbância será acompanhada durante outros 3 minutos. A atividade do complexo será determinada como atividade sensível à rotenona. A atividade do complexo II + succinato desidrogenase será medida pelo método descrito por Fischer e colaboradores (1985), onde a diminuição da absorbância do 2,6-DCIP em 600 nm será usada para o cálculo da atividade do complexo II. Para o cálculo da SDH será utilizado o mesmo sistema na presença de metassulfato de fenazina. A atividade do complexo III será determinada de acordo com Birch-Machin e colaboradores (1994) e será baseada na redução do citocromo c acompanhada a 550 nm a 37ºC. A reação será iniciada com a adição de decilubiquinol e será acompanhado o aumento na absorbância a 550 nm durante 3 minutos a 37ºC devido à redução do citocromo c. Após 3 minutos será acrescentada antimicina A (3µg/mL) e a absorbância será acompanhada durante outros 3 minutos. A atividade do complexo III será determinada como atividade sensível à antimicina. A atividade do complexo IV será determinada de acordo com Rustin e colaboradores (1994), e será calculada pela diminuição da absorbância causada pela oxidação do citocromo c reduzido, medido em 550 nm. 3.11 Avaliação da toxicidade Serão realizados os testes bioquímicos TGO (transaminase glutâmico oxalacética) e uréia com os kits comerciais. 3.12 Análise estatística A diferença entre os grupos será avaliada pela análise de variância de uma via (ANOVA). Quando o valor de F for significativo comparações post hoc serão feitas pelo teste 11 de Duncan. Diferença entre grupos individuais será avaliada com teste t de Student. A análise de dados não-paramétricos também será realizada para os dados da avaliação macroscópica de lesão. 12 4 CRONOGRAMA DAS ATIVIDADES DE PESQUISA Tabela 1: Atividades realizadas no ano 2009. Atividade Revisão bibliográfica Preparação extratos mai jun jul ago set out nov X X X X X X X Indução da gastrite e tratamento com o extrato X Avaliação macroscópica X Testes bioquímicos X Análise estatística X Término da elaboração do TCC e defesa X X X 13 5 ORÇAMENTO Tabela 2: Orçamento dos gastos com a pesquisa. Material de consumo Valores Animais R$ 240,00 Indometacina R$ 100,00 Reagentes para dosagem dos parâmetros de R$ 2.000,00 estresse oxidativo Reagentes para dosagem dos complexos da R$ 2.000,00 cadeia respiratória Sub-total: R$ 4.340,00 Este projeto esta sendo financiado pelas seguintes agências financiadoras UNESC, CNPq e FAPESC. 14 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALMEIDA, C.F. Etnobotânica nordestina: estratégia de vida e composição química como preditores do uso de plantas medicinais por comunidades locais na Caatinga. Dissertação (Mestrado – área de concentração em etnobotânica) – Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, 66p, 2004. 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Computers in Biology and Medicine 39:425432, 2009. 18 NORMAS DA REVISTA Latin America Journal of Pharmacy Os manuscritos enviados ao Latin American Journal of Pharmacy serão aceitos com o conhecimento de que serão submetidos a uma revisão editorial e de que não devem ter sido, nem serão futuramente publicados, em todo ou em parte, em nenhuma outra revista. Serão aceitos trabalhos escritos em inglês, português ou espanhol. Quando os manuscritos estiverem escritos em português ou espanhol, deverá ser incluído um resumo em inglês. Envio de Trabalhos Os Trabalhos Originais deverão conter informações não publicadas previamente, exceto em formato preliminar, e não deverão exceder 5000 palavras. As Comunicações Breves são trabalhos de investigação que compreendem uma descrição concisa, mas completa, de uma investigação limitada, que não será incluída em um próximo trabalho; deverão ser completamente documentadas, tal como um Trabalho Original, e não deverão conter mais de 2500 palavras. As Revisões e Mini-revisões serão aceitas nas áreas de interesse da revista e deverão dar ênfase às publicações dos últimos cinco anos. As Cartas ao Editor serão publicadas ocasionalmente em determinados temas de interesse. Preparação do Manuscrito Os manuscritos deverão ser apresentados em página tamanho A4, com espaçamento duplo, inclusive nas tabelas, com margens de 2 cm em todos os lados (os autores são convidados para usar o padrão incluído). Recomenda-se aos autores consultar um trabalho recente na revista para adequação do estilo. O editor se reserva o direito de ajustar o estilo a certos 19 padrões de uniformidade. As páginas do manuscrito devem ser numeradas na extremidade superior direita, precedidas do nome do autor a quem será remetida as correspondências. Sublinhar apenas as palavras que devem aparecer em itálico, mas não sublinhar outras palavras. O uso de itálico está reservado para nomes científicos de organismos. Não é necessário enviar uma carta ao editor, porém si se deseja fazer deverá incluir no início do manuscrito. Em geral, os manuscritos deverão ser organizados na seguinte ordem: Título: deve ser claro, conciso e refletir sem ambigüidades o conteúdo do trabalho. Caso o trabalho esteja escrito em espanhol ou português, o título deve incluir também uma tradução para o inglês. Nome(s) do(s) autor(es): primeiro nome, inicial do(s) nome(s) seguinte(s) e sobrenome de cada autor. O autor a quem devem ser dirigidas as correspondências deve ser identificado com um asterisco (*). • Endereço postal completo do lugar de trabalho de cada autor. • Endereço de e-mail do autor correspondente, já que todos os contatos, inclusive a respeito das provas de imprensa, serão mantidos apenas com ele. Resumo: não deverá exceder 150 palavras e deverá informar concisamente os principais resultados do trabalho. Deve-se levar em conta que muitos serviços bibliográficos utilizam o resumo tal como está escrito, por isso essa seção deve ser totalmente compreensível por si mesma. Quando os manuscritos estiverem escritos em português ou espanhol deverão possuir um resumo ("summary") em inglês. 20 Palavras-chave: deverão ser listadas pelo menos três, em ordem alfabética. Se o manuscrito estiver escrito em português ou espanhol, deverão ser incluídas também as palavras-chave em inglês ("key words"). Introdução: deve considerar, de forma sucinta, as publicações prévias mais importantes sobre o tema e explicitar claramente as razões pelas quais o estudo foi realizado. Materiais e métodos: descrição dos métodos, equipamentos e técnicas (incluindo tratamentos estatísticos utilizados no estudo). Resultados. Discussão (pode ser combinada com a seção anterior). Conclusões: não devem repetir aspectos mencionados na discussão ou nos comentários introdutórios, devem ser conclusões genuínas derivadas dos resultados do estudo. • Agradecimentos e todas as informações adicionais referentes a subsídios, etc. Referências: serão numeradas seqüencialmente, na ordem em que são citadas, no texto e listadas separadamente (solicita-se o uso de recuo a partir da segunda linha). O estilo usado para citar trabalhos de revistas (1), monografias (2) e capítulos de livros (3) deverá ser estritamente observado, como segue nos seguintes exemplos: (4) Souza, H.M., G.R. Borba-Murad, R. Curi, R. Galleto & R.B. Bazotte (2001) Res. Commun. Molec. Pathol. Pharmacol. 110: 264-72. Os nomes das revistas deverão ser abreviados de acordo com o critério utilizado pelo ISI (pode ser consultado para isso o site http://library.caltech.edu/reference/abbreviations/) 21 (5) Minoia, C. & L. Perbellini (2000) Monitoraggio ambientale e biologico dell'esposizione professionale a xenobiotici: chemoterapici antiblastici. Morgan, Milan, Vol. 3. (6) Pathak, M.A. (1997) "Photoprotection against harmful effects of solar UVB and UVA radiation: an update", in "Sunscreens: development, evaluation and regulatory aspects", (N.J. Lowe, N.A. Shaath, M.A. Pathak, eds.) Marcel Dekker, New York, pp. 59-79. Tabelas e Figuras: deverão ser numeradas utilizando números arábicos na ordem em que aparecem no texto. As letras e os símbolos incluídos nas figuras deverão ter tamanho adequado, tendo em conta que as figuras usualmente são reduzidas ao tamanho de uma coluna (7,5 cm). Tanto fotografias como gráficos e diagramas devem ser considerados como "Figuras". Deverão acompanhar o manuscrito, mas não devem ser incluídas dentro do texto e sim separadamente. Todas as ilustrações devem ser claramente identificadas com seu número e deverão ter uma legenda auto-explicativa. As legendas de tabelas e figuras deverão ser fornecidas em folha aparte. Na provas de impressão, os autores poderão corrigir apenas erros tipográficos. As provas deverão retornar ao editor no prazo máximo de 72 horas. Não serão enviadas separatas aos autores, pois elas podem ser obtidas sem custo no síto da web http://www.latamjpharm.org em formato PDF. 22 UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC CURSO DE FARMÁCIA THALITA DA ROSA AVALIAÇÃO DO EFEITO GASTROPROTETOR DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Zollernia ilicifolia (FABACEAE) EM RATOS Trabalho de conclusão de curso, apresentado para obtenção do grau de Farmacêutico no curso de Farmácia da Universidade do Extremo Sul Catarinense, UNESC. Orientador: Prof. Dr. Emilio Luiz Streck CRICIÚMA, 16 DE NOVEMBRO DE 2009. 23 AVALIAÇÃO DO EFEITO GASTROPROTETOR DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Zollernia ilicifolia (FABACEAE) EM RATOS EVALUATION OF THE GASTROPROTECTIVE EFFECT OF Zollernia ilicifolia (FABACEAE) EXTRACT IN RATS Thalita da Rosa1, Giselli Scaini1, Débora D. Maggi1, Daiana P. Pezente1, Wanice L. Valerio1 Angela E. Rossato2, Patrícia A. Amaral2, Vanilde Citadini-Zanette3, Emilio L. Streck1* 1 Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brasil; 2 G-FITO, Unidade Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brasil; 3 Herbário Pe. Raulino Reitz, Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais, Unidade Acadêmica de Humanidades, Ciências e Educação, Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brasil. Autor correspondente: Prof. Dr. Emilio L. Streck, Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, Avenida Universitária, 1105, Bloco S, CEP 88806-000, Criciúma/SC, Brasil. Fax: +55 48 3341 2644. E-mail: [email protected] 24 RESUMO A Zollernia ilicifolia (Fabaceae) é uma planta nativa da Floresta Tropical Atlântica, é utilizada principalmente contra úlceras e problemas estomacais. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito gastroprotetor do extrato hidroalcoólico de Z. ilicifolia em ratos, através dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e da análise histológica do estômago dos ratos submetidos a um modelo animal de gastrite induzido por indometacina. Ratos Wistar adultos foram tratados com extrato e água destilada (controle), por meio de gavagem. Os animais foram submetidos a jejum por 24h; após esse período foi administrado indometacina em dois grupos e água destilada nos outros dois grupos. Os animais foram mortos após 6 horas por decapitação para exerese do estômago e observação das lesões gástricas e posteriormente para avaliação da cadeia respiratória mitocondrial. Os resultados mostraram que o extrato não foi capaz de prevenir o aumento da lesão induzida pela indometacina e também pode ser observado que o extrato não pode reverter à inibição da atividade da cadeia respiratória mitocondrial. Palavras-chave: Zollernia ilicifolia, gastrite, cadeia respiratória, planta medicinal. 25 ABSTRACT Zollernia ilicifolia (Fabaceae) is a native plant from Brazil’s Tropical Forest, and is mainly used for the treatment of gastric ulcers and other stomacal diseases. The aim of the present study was to evaluate the gastroprotective effect of Z. ilicifolia extract in rats, by measuring the activities of mitochondrial respiratiry chain and hystological analysis of the stomach in rats submitted to an animal model of gastritis induced by indomethacin. Wistar adult rats were treated with extract of distilled water (control group), by gavage. The animals were submitted to fasting for 24 h; after that they received indomethacin or water. After 6 h, the animals were killed by decapitation, and the stomach was removed for analysis of gastric lesions and evaluation of mitochondrial respiratory chain complexes. The results demonstrated that the extract was not able to prevent the appearance of gastric lesions induced by indomethacin. Moreover, the extract did not prevent the inhibition in the activity of complexes I and III caused by indomethacin. Key words: Zollernia ilicifolia, gastritis, respiratory chain, medicinal plant. 26 INTRODUÇÃO O conhecimento sobre plantas medicinais simboliza muitas vezes o único recurso terapêutico de muitas comunidades e grupos étnicos 1. O uso de plantas e extratos vegetais no tratamento de algumas doenças é um hábito bastante difundido no Brasil, devido a uma importante fonte de produtos naturais biologicamente ativos e devido a sua grande diversidade em termos de estrutura, propriedades físico-químicas e biológicas, podendo assim ser modelo para a síntese de inúmeros fármacos 2, 3. O Brasil é um país que apresenta bastante biodiversidade, possuindo em seu território 20% do total de espécies vegetais conhecidas no mundo. Apesar disso, apenas 8 % das espécies vegetais da flora brasileira foi estudada em busca de compostos bioativos, sendo que boa parte delas possui patente estrangeira, sendo exploradas por multinacionais, e 1.100 espécies foram avaliadas em suas propriedades medicinais. Destas, 590 foram registradas no Ministério da Saúde para comercialização 3. Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) mostram que cerca de 80% da população mundial faz uso de algum tipo de erva, buscando alívio para sintomas dolorosos ou desagradáveis 4. Segundo Corrêa et al. 5, a OMS tem encorajado o estudo de plantas tradicionais, com a esperança de obter os benefícios que elas poderiam possivelmente fornecer, enquanto ao mesmo tempo poderia evitar os efeitos irracionais ou prejudiciais que esse tipo de medicina pode ter. Sendo assim, existe um grande interesse científico pelo desenvolvimento da pesquisa de plantas utilizadas na medicina popular, envolvendo áreas multidisciplinares, como, por exemplo, botânica, farmacologia e fitoquímica. O conhecimento existente nas comunidades tradicionais sobre as propriedades terapêuticas das plantas encontradas em seu ambiente natural pode ser uma ferramenta poderosa na descoberta de novos medicamentos 1,5, 6. 27 A Zollernia ilicifolia (Fabaceae) é uma planta nativa da Floresta Tropical Atlântica (Brasil), sendo encontrada principalmente nos estados da Bahia, Espírito Santo, São Paulo e Santa Catarina. É conhecida popularmente como falsa espinheira-santa, mocitaíba, laranjeira-do-mato, moçataíba, orelha-de-onça e/ou carapicica-de-folha-lisa. Tradicionalmente, suas folhas são utilizadas internamente na forma de decocto contra úlceras e problemas estomacais, inclusive dor 3, 7, 8. A Zollernia ilicifolia é uma árvore de porte médio (aproximadamente 15 m); folhas simples coriáceas com cerca de 15 cm de comprimento e 5 cm de largura, oblongas, com margens onduladas e providas de espinhos; apresentam estípulas espessas (característica marcante na diferenciação da espinheirasanta verdadeira, Maytenus ilicifolia); e flores rosadas 9. Poucos estudos foram realizados com essa planta. Gonzalez et al. 7 investigaram a atividade analgésica e antiulcerosa do extrato metanólico 70% de folhas de Zollernia ilicifolia, Sorocea bomplandii e Maytenus aquifolium. O extrato metanólico da Zollernia ilicifolia mostrou efeito analgésico e antiulceroso sobre lesões gástricas induzidas por indometacina/betanecol em camundongos. Em outro estudo, Coelho et al. 10 observaram que a atividade antiulcerosa do extrato metanólico 70% de Zollernia ilicifolia poderia estar relacionada à presença do flavonóide tetraglicosídeo, uma vez que as estruturas são semelhantes às encontradas em espécies de Maytenus, plantas com efeito analgésico e antiulceroso. Considerando que a Zollernia ilicifolia é uma planta popularmente utilizada para gastrite, mas com poucos estudos comprovando a sua ação farmacológica, o presente estudo teve como objetivo avaliar o efeito gastroprotetor do extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia em um modelo animal de gastrite induzido por indometacina, através da avaliação da atividade dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial. 28 MATERIAIS E MÉTODOS Animais: Para realização dos experimentos foram utilizados ratos Wistar machos pesando entre 250 e 300 g, provenientes do Biotério da Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC). Os animais foram mantidos em ambiente climatizado (22oC) com ciclos claroescuro de 12 horas, com água e alimentação ad libitum. Preparação do extrato: As folhas secas e maceradas foram colocadas em um recipiente contendo o líquido extrator (álcool 70%) deixando-se em repouso durante um período de 21 dias. Após este período, com auxílio de funil e gaze, o extrato é filtrado e concentrado em estufa numa temperatura de 45ºC. A determinação dos sólidos totais foram obtida através do peso da cápsula de porcelana previamente submetida à estufa a 120ºC por 3 horas e depois em 24 horas em dessecador vazia (pC1), subtraída pelo peso da cápsula adicionada 10 mL do extrato com total evaporação do solvente em estufa a 120ºC (pC2), realizada através do cálculo pC2 – pC1 x 100/10. O extrativo sólido foi obtido pela concentração/evaporação do solvente, para posterior obtenção da concentração da planta a ser utilizada. Indução do modelo de gastrite e tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia: Os animais foram divididos em quatro grupos: controle, indometacina, extrato, indometacina+extrato. Os ratos foram tratados por sete dias, sendo que dois grupos foram tratados com extrato hidroalcoólico da Zollernia ilicifolia (168 mg/rato) e dois grupos com água destilada, por meio de gavagem 11,12,13,14 . Do 7° para o 8° dia ficaram em jejum por 24 horas; após esse período, por meio de gavagem, a indometacina (2,5 mg/rato) foi administrada em dois grupos, e também por meio de gavagem foi administrada água 29 destilada nos dois grupos controle. Após a administração da indometacina, os animais permaneceram em jejum por seis horas e foram mortos por decapitação para exerese do estômago e observação das lesões gástricas. Depois da avaliação macroscópica, o tecido foi armazenado a -70oC para posterior análise dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial. Avaliação Macroscópica: A avaliação foi realizada por dois observadores (cegos ao estudo) e o índice de lesões ulcerativas (ILU), determinado após aplicação dos protocolos referentes aos modelos de indução, foi calculado por meio de somatória dos parâmetros abaixo, de acordo com a metodologia descrita por Gamberini et al.15. A escala foi a seguinte: até 10 petéquias: 2 pontos; acima de 10 petéquias: 3 pontos; úlceras de até 1mm: *n x 2 (*n=número de lesões encontradas); úlceras maiores que 1mm: *n x 3 (*n=número de lesões encontradas); úlceras perfuradas: *n x 4 (*n=número de lesões encontradas); hemorragia: 1 ponto; edema: 1 ponto; perda de pregas: 1 ponto; perda da coloração: 1 ponto. Atividades dos complexos enzimáticos da cadeia respiratória mitocondrial: A atividade 16 do complexo I foi avaliada pelo método descrito por Cassina & Radi pela taxa de NADH- dependente da redução do ferricianeto a 420 nm. As atividades enzimáticas do complexo II foram medidas pelo método descrito por Fischer e colaboradores 17 , onde a diminuição da absorbância do 2,6-DCIP em 600 nm é usada para o cálculo da atividade do complexo II. A atividade enzimática do complexo II-III foram medidas pelo método descrito por Fischer e colaboradores 17 , onde a redução do citocromo c oxidado na presença de azida e rotenona acompanhada em 550 nm é avaliado. A atividade do complexo IV foi determinada de acordo com Rustin e colaboradores 18 , e é calculada pela diminuição da absorbância causada pela oxidação do citocromo c reduzido, medido em 550 nm. 30 Análise estatística: A diferença entre os grupos foi avaliada pela análise de variância de uma via (ANOVA). Quando o valor de F for significativo, comparações post hoc foram feitas pelo teste de Duncan. RESULTADOS O objetivo deste trabalho foi avaliar um possível efeito gastroprotetor em um modelo animal de gastrite induzido por indometacina. Foi demonstrado que a administração do extrato de Zollernia ilicifolia não alterou o escore de lesão gástrica, sugerindo que o mesmo não é tóxico para o estômago. Além disso, como já demonstrado em outros estudos, a indometacina aumentou o escore de lesão; o tratamento com o extrato não foi capaz de prevenir esse aumento (Figura 1). Em relação aos complexos da cadeia respiratória mitocondrial, foi demonstrado que a atividade dos complexos I e III foi inibida pela indometacina e que o tratamento com o extrato não foi capaz de prevenir essa inibição (Figuras 2 e 4, respectivamente). O complexos II e IV não foram alterados pela indometacina ou pelo extrato de Zollernia ilicifolia (Figuras 3 e 5, respectivamente). DISCUSSÃO A gastrite é uma lesão gástrica, patologicamente caracterizada pela inflamação inespecífica da mucosa do estômago 19 . Apesar de a definição ser histológica, o diagnóstico geralmente é feito pelo clínico e/ou endoscopista, prescindindo da microscopia 20 . A gastrite afeta milhões de pessoas em todo o mundo e traz inúmeros custos à sociedade, torna a vida 31 das pessoas difíceis, além de levar muitas vezes à morte. Vários fatores estão associados ao desenvolvimento das úlceras e gastrites, como o hábito de fumar, utilizar bebidas alcoólicas, a alimentação, o estresse diário, a presença da bactéria Helicobacter pylori na mucosa do trato intestinal e a utilização de fármacos anti-inflamatórios utilizados em excesso como é o caso da indometacina. Sua maior prevalência é pela Helicobacter pylori, mas também ocorre frequentemente pela ingestão de álcool ou de anti-inflamatórios não-esteróides (AINES) e intoxicações ou infecções 20,21,22. A expansão mundial do consumo de álcool e AINES têm contribuído para o crescimento de úlcera gástrica. Os AINES estão entre os fármacos mais utilizados/prescritos e que mais desencadeiam efeitos indesejáveis. A maioria desses efeitos relaciona-se ao sistema digestório, destacando-se a capacidade de causar principalmente gastrite aguda, dispepsia e úlcera péptica 20, 23 . Os AINES, tais como a indometacina, tem a capacidade de causar lesões hemorrágicas na mucosa gástrica decorrentes da inibição da síntese de prostanglandinas, inibição da ciclooxigenase via metabolismo do ácido araquidônico e assim reduzindo o efeito protetor da superfície da mucosa causando as gastrites e as úlceras 22, 24, 25 . A secreção ácida aumentada também contribui para este processo prejudicial, tal como o fato de provocar distúrbios na microcirculação gástrica, aumento da infiltração de neutrófilos , induz a expressão de TNF- , e perturba o equilíbrio entre óxido nítrico e apoptose. A introdução de antagonistas dos receptores histamínicos e inibidores de bomba de prótons têm sido associados com um aumento na taxa de cura da úlcera 23. O sucesso dos tratamentos farmacológicos para prevenir ou curar lesões ulcerativas depende não só do bloqueio da secreção ácida, mas também em aumentar fatores protetores da mucosa incluindo prostaglândinas, fatores de crescimento, somatostatina, o óxido nítrico e compostos sulfidrílicos 23. Os compostos ativos da Zollernia ilicifolia ainda não são conhecidos, mas a presença 32 de flavonóides, triterpenos e taninos identificados nesta planta podem ser considerados como possíveis compostos ativos contra lesões gástricas por aumento dos fatores de proteção. Estes dados justificam a utilização popular desta planta como analgésica e antiulcerosa. Além disso, os dados fitoquímicos obtidos são importantes para o controle da qualidade deste produto 7. Vários estudos demonstram que defeitos da cadeia respiratória podem levar a estresse oxidativo, que pode, por sua vez, danificar os complexos da cadeia respiratória, gerando um ciclo vicioso que pode resultar na morte da célula. Por exemplo, a rotenona, inibidor do complexo I, a azida, inibidor do complexo IV e o malonato, inibidor da sucinato desidrogenase, aumentam a produção de radicais livres in vivo e in vitro. Por outro lado, o grupamento Fe-S, presentes no complexo I da cadeia respiratória e na sucinato desidrogenase, é sensível ao ataque de radicais superóxido, que são produzidos pela própria cadeia respiratória. Além disso, substratos energéticos apresentam efeitos neuroprotetores que podem ser aumentados por antioxidantes. O complexo III também é especialmente sensível ao estresse oxidativo 25. Sendo assim, os resultados apresentados neste estudo indicaram que a Zollernia ilicifolia não obteve efeito gastroprotetor no modelo animal utilizado, isto pode estar relacionado com o solvente utilizado para obtenção do extrato da planta, pois o solvente utilizado foi o álcool 70%, sendo que Gonzalez e colaboradores 7, utilizaram em seu estudo o metanol para obtenção do extrato, podendo este ter uma eficácia melhor em relação aos compostos extraídos desta planta. Além disso, a indometacina inibiu a atividades dos complexos I e III, os mais sensíveis ao estresse oxidativo. Mais estudos são necessários para verificar se outros parâmetros de metabolismo energético, inflamação e estresse oxidativo estão alterados no estômago dos animais submetidos a esse modelo animal de gastrite. 33 CONCLUSÃO Com base em nossos dados, é possível afirmar que o extrato hidroalcoólico da Zollernia ilicifolia não possui efeito gastroprotetor neste modelo animal de gastrite, como demonstrado pelo fato de não prevenir o dano causado pela indometacina na mucosa gástrica. Esses resultados foram contraditórios a resultados obtidos em outro estudo com a mesma planta, considerando assim que devido a poucos estudos realizados sobre a ação farmacológica da Zollernia ilicifolia, serão necessários outros estudos para a confirmação do efeito gastroprotetor da planta. 34 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Maciel, M.A.M., A.C. Pinto, V.F. Veiga Jr, N.F. Grynberg & A. Echevarria (2002) Quim. Nova. 25: 429-438, 2002. 2. Jorge, R.M., J.P.V. Leite, A.B. Oliveira & C.A. Tagliati (2004) J. 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Avaliação macroscópica da mucosa gástrica após a indução do modelo animal de gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. *Diferente do grupo controle, p<0,05 (n=6). 37 Figura 2. Atividade do complexo I na mucosa gástrica após a indução do modelo animal de gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. *Diferente do grupo controle, p<0,05 (n=6). 38 Figura 3. Atividade do complexo II na mucosa gástrica após a indução do modelo animal de gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. Não houve diferença significativa entre os grupo (n=6). 39 Figura 4. Atividade do complexo III na mucosa gástrica após a indução do modelo animal de gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. *Diferente do grupo controle, p<0,05 (n=6). 40 Figura 5. Atividade do complexo IV na mucosa gástrica após a indução do modelo animal de gastrite e o tratamento com extrato hidroalcoólico de Zollernia ilicifolia. Não houve diferença significativa entre os grupo (n=6).