INSTITUTO AGRONÔMICO DE PERNAMBUCO

INSTITUTO AGRONÔMICO DE PERNAMBUCO
SECRETARIA DE AGRICULTURA E REFORMA AGRÁRIA
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE CULTIVARES TRADICIONAIS DE
FEIJOEIRO COMUM PARA SUSTENTABILIDADE DO CULTIVO EM
PERNAMBUCO
Orientador: Dr. Sc. Antonio Félix da Costa
Bolsista: Nathália Gabrielle de Araújo Leite
Recife
Janeiro de 2012
Resumo
Devido à sua grande importância na alimentação da população, o feijão comum
(Phaseolus vulgaris L.) tem grande destaque no mercado nacional, sendo comumente
cultivado, principalmente, nas regiões Sul, Sudeste e Nordeste do Brasil. Apesar do
cultivo dessa espécie já ser feito em larga escala, o percentual de uso de sementes
melhoradas tem sido consideravelmente menor em comparação com sementes
tradicionais. Dessa forma, o presente estudo tem como objetivo caracterizar a nível
molecular 50 cultivares tradicionais de feijão, coletadas em diferentes municípios do
Estado de Pernambuco, para associação do perfil genético a características fenotípicas
marcantes. Nesse sentido, amostras de sementes crioulas obtidas em diferentes regiões
do estado, devidamente identificadas e conservadas em câmara fria, serão plantadas em
casa de vegetação para posterior extração de DNA. Após limpeza e quantificação do
DNA extraído, as amostras provenientes de cada cultivar serão amplificadas por meio
de primers ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) e DAF (DNA Amplification
Fingerprinting) e, em seguida, submetidas à eletroforese em gel de agarose para
posterior visualização dos fragmentos amplificados. A partir dos produtos de
amplificação, uma matriz será construída com base na presença e ausência de bandas,
para geração de um dendrograma pelo método de agrupamento UPGMA, por meio do
qual será possível analisar a variabilidade genética entre os genótipos estudados.
Espera-se que os resultados obtidos possibilitem a identificação de materiais
tradicionais divergentes, tanto fenotipicamente quanto geneticamente, os quais possam
se adaptar a diferentes regiões, bem como serem inseridos em programas de
melhoramento, favorecendo com isso o comércio e cultivo da cultura, o que beneficiará
grandemente os agricultores, em especial os praticantes da agricultura de subsistência,
principais responsáveis pela conservação e manejo de materiais tradicionais.
Palavras chave:
Phaseolus vulgaris, marcador molecular, diversidade genética, caracterização
morfológica.
2
Introdução
Devido à sua grande importância na alimentação da população brasileira, o feijão
comum (Phaseolus vulgaris L.) tem grande destaque no mercado nacional, sendo seu
plantio comumente feito em diversas épocas do ano, sob diferentes sistemas de
produção, como o que ocorre durante a entressafra em sistemas irrigados,
principalmente nas regiões Central e Sudeste do Brasil (BARBOSA FILHO et al.,
2001). É interessante ressaltar que mesmo após a intensificação do melhoramento
genético no País, o percentual de uso de sementes melhoradas de feijão não tem
conseguido ultrapassar os 20%, ao passo que os demais 80% são representados por
sementes oriundas de cultivares locais, selecionadas por agricultores, de acordo com as
condições socioeconômicas e ambientais de cada microrregião. Esse fato leva a refletir
que apesar da ocorrência de uma grande pressão para seleção de cultivares mais
uniformes e produtivas, o processo de melhoramento pode conduzir a perda de alguns
caracteres importantes, como estabilidade de produção, resistência a doenças, qualidade
tecnológica e nutricional dos grãos, além de outros. Nesse sentido, ao contrário das
cultivares melhoradas, tais caracteres estão mais presentes em materiais tradicionais,
devido à grande diversidade genética encontrada em tais genótipos (COELHO et al.,
2007).
Ao longo dos anos, diversos estudos têm procurado analisar a variabilidade genética
entre acessos tradicionais de feijão comum, a exemplo de Bonett et al. (2006), que
avaliaram a divergência genética entre 63 cultivares crioulas de feijão comum, tendo
obtido resultados capazes de evidenciar a existência de variabilidade genética
considerável entre as cultivares de feijão utilizadas pelos agricultores. Resultados como
esses justificam a utilização e conservação de materiais tradicionais, especialmente por
agricultores familiares, visto que análises realizadas em genótipos tradicionais,
geneticamente divergentes, verificaram que tais acessos apresentaram adaptação
específica (SOBRAL, 2006).
Dessa forma, pode-se afirmar que é imprescindível que os recursos genéticos,
incluindo cultivares tradicionais (locais), sejam devidamente caracterizadas para
permitir ganhos genéticos mais promissores, tanto para o melhoramento como para
potencializar o uso desses recursos pelo próprio agricultor (COELHO et al., 2007).
Nesse sentido, o presente estudo tem como objetivo caracterizar a nível molecular
3
cultivares tradicionais de feijão, coletadas em diferentes municípios do Estado de
Pernambuco, para associação do perfil genético a características fenotípicas marcantes,
possibilitando assim a identificação de cultivares adaptáveis às diferentes regiões de
cultivo, as quais, além de serem fenotipicamente distintas sejam também geneticamente
divergentes para que possam ser inseridas em programas de melhoramento, bem como
empregadas pelos próprios agricultores.
Objetivos específicos
- Selecionar 50 acessos tradicionais de feijão comum a partir da coleção de trabalho do
IPA (Instituto Agronômico de Pernambuco), comumente cultivados e conservados por
agricultores familiares do Estado de Pernambuco;
- Analisar geneticamente os acessos, por meio de marcadores moleculares ISSR (Inter
Simple Sequence Repeat) e DAF (DNA Amplification Fingerprinting), para geração de
um dendrograma UPGMA;
- Caracterizar fenotipicamente os acessos escolhidos, levando em consideração
principalmente os caracteres de impacto no cultivo do genótipo;
- Associar o perfil genético das cultivares às características fenotípicas das mesmas,
selecionando assim os melhores acessos para ingresso em programas de melhoramento
genético vegetal, visando também à conseqüente melhoria na viabilidade de cultivo
dessa espécie no Estado de Pernambuco.
Justificativa
Apesar das técnicas modernas de melhoramento genético terem possibilitado o
desenvolvimento de variedades de feijão com características desejadas pelos grandes
produtores, o emprego comercial dessas cultivares não tem superado as expectativas,
visto que a utilização de materiais locais tem sido consideravelmente maior em relação
ao uso de sementes melhoradas. Isso tem ocorrido, provavelmente, porque o constante
cruzamento entre cultivares em processo de melhoramento acaba por aproximá-las
geneticamente, o que culmina com a perda de características importantes para a
produção. Tais características são encontradas em cultivares crioulas, que, por não
terem ingressado em programas de melhoramento, são conservadas geneticamente,
apresentando considerável variabilidade genética.
4
Como em cada região cultivares tradicionais assumem dimensões distintas, tanto no
aspecto genético como no fenotípico, um estudo que associe características fenotípicas
com o perfil genético dessas cultivares será de extrema importância, pois auxiliará no
reconhecimento de cultivares adaptadas para cada região, bem como incentivará o
comércio desse tipo de material e o ingresso em programas de melhoramento, o que
beneficiará também os agricultores familiares, principais responsáveis pela conservação
desses genótipos.
Metodologia proposta
Todo o trabalho será realizado na sede do Instituto Agronômico de Pernambuco
(IPA), localizado na Avenida General San Martin, 1371, bairro do Bongi, Recife,
Pernambuco. Entretanto, eventualmente, a avaliação fenotípica poderá ser feita na
Estação Experimental José Nilson de Melo, localizada no município de Caruaru.
Seleção de cultivares tradicionais
A seleção dos 50 acessos para o estudo será feita dentre os materiais pertencentes ao
Banco de Germoplasma dos Feijões Caupi e Comum do IPA. Os acessos pertencentes a
este banco permanecem armazenados em câmara fria, em amostras de sementes,
catalogados e com a devida identificação. Dentre os materiais, serão selecionados
aqueles coletados no Estado de Pernambuco e considerados como de cultivo tradicional.
Plantio do material
O plantio das sementes será feito em casa de vegetação, para a extração do DNA, e
em campo, para caracterização fenotípica, na sede do IPA, entretanto, havendo
necessidade, esta poderá ser feita na Estação Experimental José Nilson de Melo,
localizada no município de Caruaru. Para a extração de DNA, três sementes serão
plantadas por cultivar, contudo, após a germinação, apenas uma plântula será mantida e
cultivada. Para a caracterização fenotípica, serão plantadas quatro sementes por cova,
efetuando-se o desbaste para duas plantas.
Caracterização morfofenológica
Na sede do IPA / ou na Estação Experimental José Nilson de Melo (Caruaru), serão
plantadas as sementes de cada amostra em fileiras simples de cinco metros lineares, em
espaçamento adequado para a cultivar / espécie, a partir da qual serão estudados e
5
registrados os caracteres morfológicos e fenológicos de cada material, como cor,
tamanho, forma, presença ou ausência de antocianina no hipocótilo, datas de floração,
de maturação fisiológica e de colheita, segundo metodologia descrita por Silva (2005),
com modificações.
Extração, limpeza e quantificação do DNA
O isolamento do DNA nuclear dos genótipos cultivados será realizado utilizando-se
folhas frescas ou congeladas em freezer a -80oC, segundo a metodologia descrita em
Ferreira & Grattapaglia (1998), enquanto que a limpeza do DNA obtido será feita de
acordo com o protocolo para precipitação de polissacarídeos descrito em Michaels et al.
(1994). A quantificação do DNA será efetuada pelo método comparativo em gel de
agarose a 1,2%, utilizando-se diferentes concentrações de DNA de Fago-λ como
referencial. Após a quantificação, parte do DNA será diluído para 5 ng/µL para uso nas
reações de PCR (Polymerase Chain Reaction).
Amplificação do DNA
As reações de ISSR ocorrerão conforme o protocolo descrito por Bornet &
Branchard (2001) enquanto que as reações de DAF seguirão a metodologia proposta por
Benko-Iseppon et al. (2003). Os produtos das amplificações serão submetidos à
eletroforese em gel de agarose, por 4 h a 70 V, numa proporção de 5,4 g de agarose e 20
µL de Brometo de Etídio (corante), ou de SyBr (corante), para um gel de 300 mL. Após
a eletroforese, os fragmentos amplificados serão visualizados com auxilio de um
aparelho transiluminador de luz ultravioleta e fotografados para posterior análise.
Análise dos produtos da amplificação (ISSR e DAF)
O tamanho dos fragmentos amplificados será estimado pela comparação com o
marcador Ladder 100 pb (Fermentas). A partir dos resultados, serão realizadas
comparações entre as amostras, com base na ausência ou presença de bandas de DNA
no gel de agarose, o que vai gerar uma matriz de dados. A partir da matriz obtida, um
dendrograma será construído, utilizando-se o método UPGMA (Unweighted Pair
Group Method with Arithmetic Mean). Vale salientar que todas as análises serão
realizadas com o auxílio do programa estatístico MEGA, versão 5.0.
6
Resultados esperados
A partir do presente estudo espera-se ser possível a identificação de cultivares
tradicionais de feijão comum que apresentem características fenotípicas marcantes,
adaptáveis a diferentes regiões e benéficas para o cultivo pelos agricultores familiares,
além disso, espera-se que essas cultivares apresentem variabilidade genética
considerável para que possam ser inseridas em programas de melhoramento,
favorecendo com isso o comércio da cultura, o que beneficiará grandemente os
agricultores, em especial aqueles que praticam a agricultura de subsistência, sendo os
principais responsáveis pela conservação e manejo de materiais locais.
Cronograma de trabalho
Atividade x Mês
Seleção dos acessos
Plantio
Caracterização morfofenológica
Extração de DNA
Limpeza e quantificação do DNA
Amplificação do DNA e análise dos
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
x
x x
x x x x
x x x
x x
x x x
produtos de amplificação
Elaboração de relatório e de artigo
Apresentação do trabalho em congressos
Publicação em periódico
Entrega do relatório final
x x
x
x
x
x
x
x
7
Referências Bibliográficas
ARAÚJO, M. R. A; VASCONCELOS, H. E. M.; SOUSA, F. B. Resgatando e
preservando a base genética da Bacia do rio Curu, Ceará: alguns resultados
e considerações preliminares.
In: CONGRESSO DA SOCIEDADE DE
ECONOMIA RURAL,
44., Questões agrárias, educação no campo e
desenvolvimento. Fortaleza, CE, Brasil, 2006. Disponível em:
<http://www.sober.org.br/palestra/5/ 886.pdf. >. Acesso em: 2 dez. 2011.
BARBOSA FILHO, M.P.; FAGERIA, N.K.; SILVA, O.F. da. Aplicação de nitrogênio
em cobertura no feijoeiro irrigado. Santo Antônio de Goiás: EmbrapaCNPAF, 2001. 8p. (Embrapa-CNPAF. Circular Técnica, 49).
BENKO-ISEPPON, A. M.; WINTER, P.; HUETTEL B.; STAGINNUS, C.;
MUEHLBAUER, F. J.; KAHL, G. Molecular markers closely linked to fusarium
resistance genes in chickpea show significant alignments to pathogenesis-related
genes located on Arabidopsis chromosomes 1 and 5. Theoretical and Applied
Genetics, v.107, p.379-386, 2003.
BERTINI, C. H. C. M.; TEÓFILO, E. M.; DIAS, F. T. C. Divergência genética entre
acessos de feijão caupi do banco de germoplasma da UFC. Revista
CiênciaAgronômica, v. 40, n. 1, p.99-105, 2009.
BONETT, L.P.; GONÇALVES-VIDIGAL, M.C.; SCHUELTER, A.R.; VIDIGAL
FILHO, P.S.; GONELA, A.; LACANALLO, G.F. Divergência genética em
germoplasma de feijoeiro comum coletado no Estado do Paraná, Brasil. Semina:
Ciências Agrárias, v.27, p.547-560, 2006.
BORNET, B.; BRANCHARD, M. Nonanchored inter simple sequence repeat (ISSR)
markers: reproducible and specific tools for genome fingerprinting. Plant
Molecular Biology Reporter, v.19, p.209-215, 2001.
COELHO, C. M. M.; COIMBRA, J. L. M.; SOUZA, C. A.; BOGO, A. GUIDOLIN, A.
F. Diversidade genética em acessos de feijão (Phaseolus vulgaris L.). Ciência
Rural, v.37, p.1241–1247, 2007.
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores
moleculares em análise genética. 3.ed. Brasília: EMBRAPA-CENARGEN,
1998. 220p.
MICHAELS, S. D.; JOHN, M. C.; AMASINO, R. M. Removal of polysaccharides from
plant DNA by ethanol precipitation. Biotechniques, v.17, p.274-276, 1994.
SILVA, H. T. da. Descritores mínimos indicados para caracterizar
cultivares/variedades de feijão comum (Phaseolus vulgaris L.). Santo
Antonio de Goiás: Embrapa Arroz e Feijão, 2005. 32p. (Embrapa Arroz e Feijão.
Documentos, 184).
8