sergio silva alves junior¹, rodrigo vasconcelos salla¹

AGENTES CRIPROTETORES E CRIOPRESERVAÇÃO SEMINAL
SERGIO SILVA ALVES JUNIOR¹, RODRIGO VASCONCELOS SALLA¹, RÔMULO DA SILVA JORGE¹,
JOÃO FLAVIO PANATTONI MARTINS²
¹ Graduandos do Curso de Medicina Veterinária - UNIFEOB, São João da Boa Vista/SP.
² Professor e Coordenador do Curso de Medicina Veterinária - UNIFEOB, São João da Boa Vista/SP.
RESUMO: Esta revisão de literatura tem como finalidade apresentar os principais agentes
crioprotetores, utilizados na criopreservação seminal, com o intuito de comparar os resultados
obtidos através de novos protocolos de congelação e descongelação, visando os melhores
índices de vigor, motilidade e outros parâmetros seminais pós descongelação.
PALAVRAS-CHAVE: Crioprotetores, congelação, descongelação, sêmen
INTRODUÇÃO
Com o avanço da biotecnologia da reprodução animal, a utilização de sêmen
criopreservado aliado às técnicas de inseminação artificial se destacam como importantes
ferramentas para o melhoramento genético de várias espécies animais, principalmente
aquelas, envolvidas com a produção de alimentos de origem animal (MARTINS, 1997).
A tecnologia de criopreservação de sêmen foi revolucionada com a descoberta do
glicerol como crioprotetor, o que permitiu que o espermatozóide fosse congelado e armazenado
por longos períodos. Entretanto, é fato que a viabilidade e a fertilidade do espermatozóide após
o descongelamento, são prejudicadas em conseqüência das injúrias impostas durante a
criopreservação.
A redução da taxa de fertilidade verificada após o processo de congelação e
descongelação está relacionada principalmente, aos danos causados às estruturas e
propriedades bioquímicas da membrana dos espermatozóides, que podem comprometer os
processos de capacitação espermática e a reação acrossomal.
Neste processo, constata-se uma relação direta entre o grau de lesões celulares e a
curva de resfriamento. O efeito lesivo na membrana espermática, causado pelo choque
térmico, é mais pronunciado quando o resfriamento ocorre rapidamente na faixa de
temperatura entre 20 e 0ºC, constatando-se que o resfriamento mais lento do sêmen até 0ºC
induz níveis menores de lesão espermática. Sendo assim, a velocidade de redução da
temperatura durante o processo de congelação, consiste um fator de extrema importância no
processo de criopreservação do sêmen (FURST et al., 2005).
A velocidade ótima de congelação deveria, supostamente, ser ao mesmo tempo lenta
para prevenir os efeitos do choque osmótico e cristalização e, rápida o suficiente, para
minimizar os efeitos prejudiciais da exposição prolongada a altas concentrações de sais.
Além da taxa de resfriamento, os meios diluentes, concentração espermática, tempo e
método de adição dos crioprotetores, métodos de envase e as condições de congelação,
também são fatores que exercem influência sobre a qualidade do sêmen criopreservado.
Por este motivo, testes laboratoriais para avaliação seminal são importantes não só
para avaliação da fertilidade, mas também para o desenvolvimento de meios de preservação
mais eficientes (LUZ et al., 2000). Atualmente a avaliação da motilidade, do vigor e os testes de
termorresistência preconizados para bovinos e ovinos são os mais utilizados.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O processo de congelação associado às substâncias osmoticamente ativas resulta na
expulsão de água intracelular associada ao influxo de íons e conseqüente perda de
turgescência da célula (CASTELLINI et al., 1996). A descongelação envolve o reverso deste
processo com o influxo de água para as células, podendo provocar ruptura da membrana
plasmática e/ou dos compartimentos membranosos intracelulares e alterações nas
biomembranas, que acarretam mudanças das propriedades cinéticas de enzimas presentes na
bicamada lipídica (DROBNIS et al., 1993; HOLT e NORTH, 1984, 1986)
Durante o processo de criopreservação, o sêmen deve ser resfriado da temperatura
corpórea à temperatura ambiente (37º à 20ºC), o que parece não ocasionar danos aos
espermatozóides quando estes se encontram diluídos em meio adequado. O estresse inicial
ocorre quando o espermatozóide passa da temperatura ambiente para 5ºC (MELO, 2003).
Para minimizar este efeito é necessário controlar a taxa de resfriamento entre as temperaturas
de 19º a 8ºC para o sêmen bovino (MELO, 2003) e de 19º a 5ºC para o sêmen eqüino, antes
do congelamento (FURST et al., 2005).
Se o resfriamento for feito de maneira inadequada, o espermatozóide sofre um
fenômeno conhecido como choque térmico, a qual induz a danos irreversíveis, que se
caracterizam por alterações nos padrões normais de motilidade (movimento circular ou
retrógrado), perda rápida de motilidade, danos na membrana plasmática e no acrossoma,
ocasionando comprometedoras alterações metabólicas às células espermáticas (MELO, 2003;
ALBERTI, 2004; FURST et al., 2005; FERRARRI et al., 1999).
Segundo ALBERTI, 2004, o meio diluente e o crioprotetor são utilizados com o intuito
de proteger os espermatozóides dos choques térmicos e osmóticos que ocorrem durante o
processo de congelação/descongelação.
Para um meio diluente ser completo e eficiente, algumas substâncias são necessárias
na sua composição:
- substâncias iônicas e não iônicas que mantém a osmolaridade;
- lipoproteínas ou material de alto peso molecular que previnem o choque térmico,
como a gema de ovo ou leite;
- glicerol, propanediol, ou dimetilsulfoxide (DMSO) como agentes crioprotetores
intracelulares;
- glicose ou frutose como fonte de energia;
- outros aditivos como enzimas e antibióticos.
As substâncias crioprotetoras são divididas em permeáveis ou intracelulares e
impermeáveis ou extracelulares de acordo com o peso molecular e a conseqüente propriedade
de atravessar ou não a membrana celular (RODRIGUES, 1992; SEIDEL, 1984).
Os crioprotetores permeáveis mais utilizados são o glicerol, etilenoglicol e
dimetilsulfóxido (DMSO), essenciais para minimizar ou prevenir a formação de cristais de gelo
intracelular. Os crioprotetores impermeáveis, como a sacarose lipoproteínas da gema do ovo e
proteínas do leite, por outro lado, auxiliam na estabilização da membrana plasmática durante o
processo de congelação/descongelação (RODRIGUES, 1992).
CRIOPROTETORES NÃO PENETRANTES
Os dois principais protetores de membrana comumente utilizados em meios diluentes
para congelação de sêmen bovino têm sido gema de ovo e glicerol. Entretanto nos últimos
anos aumentou-se o argumento contra a presença de gema de ovo na composição desses
meios, em função do risco de contaminação por bactérias ou micoplasma, propondo-se meios
diluentes livres de proteína de origem animal para o sêmen bovino como alternativa viável
(ALBERTI, 2004).
Frank (1978) testou a conservação do sêmen bovino por inoculação no saco da gema
de ovos inférteis. A conservação à temperatura ambiente foi pequena, mas em condições de
refrigeração atingiu a 12 dias com 70% de motilidade.
Entretanto, a gema de ovo ainda é rotineiramente utilizada nos diluentes para
criopreservação de sêmen de mamíferos. Atribui-se sua ação crioprotetora à presença de
lipoproteínas de baixa densidade (LDL), as quais aderem à membrana celular durante o
processo de criopreservação, preservando-a através da atuação na superfície da membrana
plasmática do espermatozóide restaurando a perda de fosfolipídeos e aparentemente
induzindo a uma alteração transitória de sua composição, prevenindo sua ruptura (MELO,
2003). Relatos recentes confirmam a melhoria da motilidade espermática com o meio Triladyl,
contendo LDL quando comparado com o meio Triladyl original, concluindo que o LDL pode ser
uma ótima alternativa para composição de meios quimicamente definidos (ALBERTI, 2004).
Diluentes a base de leite também constituem uma boa alternativa de crioproteção. Um
meio com 10% de leite ou leite desnatado em combinação com 7% de glicerol e antibiótico tem
sido utilizado com sucesso para congelação do sêmen bovino (ALBERTI, 2004).
A combinação de gema de ovo e leite desnatado tratado pelo calor, foi relatada como
alternativa promissora, apresentando duas vantagens definidas: protegem os espermatozóides
tornando-os mais resistentes ao choque de temperatura devido às lipoproteínas da gema e à
caseína do leite desnatado e contém fatores de conservação, como proteínas, sais minerais e
açúcares (FERRARI et al., 1999).
O diluente Tris-gema-Citrato é um diluente a base de leite, que tem sido rotineiramente
utilizado em alguns centros de inseminação artificial para congelação de sêmen. Contudo, o
seu uso é mais freqüente na espécie eqüina (ALBERTI, 2004; HAFEZ, 1988).
A viabilidade dos espermatozóides da espécie caprina, conservados em diluidor à base
de leite desnatado e congelados com ou sem o plasma seminal, também foi testada. Após 48
horas de permanência em nitrogênio líquido, as palhetas foram descongeladas e incubadas
durante 120 minutos a 37° C. Após este período de teste de termorresistência, a porcentagem
de espermatozóides móveis das amostras de sêmen sem o plasma seminal foi
significativamente superior à porcentagem daquelas contendo o plasma seminal (FERRARRI et
al., 1999).
O efeito nocivo do plasma seminal do caprino é atribuído a uma enzima tipo fosfolipase
secretada pela glândula bulbouretral, que interage com os fosfolipídeos da gema de ovo
constituinte do diluidor, resultando em lisolecitinas e ácidos graxos que são tóxicos ao
espermatozóide. Para a criopreservação do sêmen de caprinos sem a remoção do plasma
seminal, preconiza-se a concentração de 1,5% de gema de ovo no diluidor à base de TRIS.
Com a finalidade de eliminar a lavagem do sêmen foi desenvolvido o diluente TRIS modificado.
A motilidade retilínea e progressiva e a porcentagem de acrossomos normais dos
espermatozóides de caprinos após a congelação utilizando-se este diluidor, foram de 63,6 e
57,5 respectivamente (FERRARI et al., 1999).
Também os açúcares demonstram capacidade de estabilizar a bicamada lipídica, a
rafinose tem sido o açúcar mais utilizado na criopreservação de sêmen de ratos com o intuito
de promover a hipertonicidade necessária para desidratar a célula antes da congelação. Seu
uso na criopreservação de sêmen eqüino demonstrou melhores resultados quando comparado
à sacarose e sugeriu o uso de uma associação glicose-lactose-rafinose (MELO, 2003).
CRIOPROTETORES PENETRANTES
A descoberta da ação do glicerol foi de grande importância para o avanço da tecnologia
de criopreservação de sêmen e atualmente é o agente crioprotetor mais utilizado para a
redução dos danos impostos aos espermatozóides durante o processo de congelação (MELO,
2003; ALBERTI, 2004).
Usualmente o glicerol é adicionado ao sêmen depois do resfriamento a 5°C, no
entanto, ele proporciona maior proteção quando adicionado logo antes do congelamento. A
quantidade final varia de menos de 5% em alguns meios de gema-açucar a 10% em leite.
Alguns adicionam o glicerol lentamente por gotejamento ou pela adição de pequenas
quantidades por um período de uma hora (HAFES, 1995).
Entretanto o efeito tóxico do glicerol tem sido relatado por muitos autores, para o
sêmen eqüino, bovino e ovino, conforme a concentração (ALVARENGA et al., 2000).
O sêmen bovino é rotineiramente congelado utilizando-se entre 4% a 8% de glicerol,
porém, relatos da utilização de concentrações a 0,25M (2,25%) determinam uma menor
toxicidade (ALBERTI, 2004)
A utilização de DMSO na tentativa de substituir o glicerol na criopreservação de sêmen
vem demonstrando bons resultados. Relatos de aumento da motilidade pós-descongelação do
sêmen bovino utilizando-se o DMSO em relação ao glicerol podem ser comprovados, assim
como, a melhor eficiência entre a combinação de glicerol e DMSO em relação ao congelamento
realizado somente com o glicerol (ALBERTI, 2004). MELO em 2003 observou que o DMSO
pode ser utilizado não só para a espécie bovina como para outras espécies apresentando
resultados satisfatórios com relação a motilidade pós-descongelação associado ou não ao
glicerol.
Outras alternativas de crioproteção também são propostas na congelação do sêmen
eqüino, a Dimetil formamida e metil formamida são crioprotetores que vem sendo utilizados
com grande sucesso na congelação de sêmen nesta espécie. Seu uso para congelação de
sêmen de garanhões com boa congelabilidade proporcionou melhores resultados quando
comparados ao glicerol. Assim sendo, a associação da dimetil formamida e do glicerol,
conforme a composição do meio diluidor, proporcionou uma melhor proteção da célula
espermática durante a congelação, pois além da obtenção de excelentes resultados
laboratoriais pós-descongelação, manifestaram índices de fertilidade superiores aos descritos
na literatura. O uso do etilenoglicol associado a um diluente contendo lactose e gema de ovo,
também pode se empregado na criopreservação do espermatozóide eqüino sem interferir na
fertilidade do sêmen. Éguas inseminadas com sêmen congelado obtiveram 80 % prenhez
utilizando-se tanto o glicerol como o etilenoglicol como crioprotetores (MELO, 2003).
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Apesar de existir uma grande variedade de diluidores para congelação de sêmen
bovino, proposto por diversos autores, persiste a necessidade de aperfeiçoamento dos
protocolos de criopreservação seminal, principalmente em pequenos ruminantes.
Através dos dados apresentados na presente revisão, percebe-se que apesar de ter
sido utilizado por um longo período, o glicerol começa a dar lugar a crioprotetores alternativos
por apresentar altos níveis de toxicidade e influenciar negativamente a fertilidade do sêmen
congelado.
Com a utilização de novos crioprotetores de menor toxicidade abre-se perspectivas
para a melhoria das técnicas de congelação de sêmen nas diferentes espécies animais,
favorecendo a difusão desta biotécnica e a otimização dos índices de fertilidade, principalmente
nas espécies onde os índices de prenhez estão aquém do necessário quando o sêmen
criopreservado é utilizado.
REFRÊNCIAS
ALBERTI, K. Congelação de sêmen Bovino: Novos enfoques em meios diluentes.
(Monografia de Pós-Graduação): Botucatu, 2004.
ALVARENGA, M.A.; LANDIM-ALVARENGA, F.C.; MOREIRA, R.M.; CESARINO, M.M.
Acrossomal ultrastructure of stallion spermatozoa cryopreserved with ethylene glycol using
two packaging systems, Jornal Equino Veterinário v. 32, n°6, p.541-545, 2000.
CASTELLINI, C.; BIZZARRI, A. R.; CANNISTRARO, S. Water volume of rabbit spermatozoa
measured by electron paramagnetic resonance at different temperatures. In: WORLD
RABBIT CONGRESS, 6., 1996, Toulouse. Proceedings… [S.l. : s.n.],.p. 55-58, 1996.
DROBNIS, E. Z.; CROWE, L. M.; BERGER, T.; ANCHORDOGUY, T. J.; OVERSTREET, J. W.;
CROWE, J. H. Cold chock damage is due to lipid phase-transitions in cell-membranes – a
demonstration using sperm as a model. The Journal of Experimental Zoology, v. 265, p.
432-437, 1993.
FILHO, A. M.; Tecnologia do sêmen. In FILHO, A. M. Reprodução dos animais e
inseminação artificial, Porto Alegre: Sulina, cap.ll, pp,517-581, 1987.
FURST, R.; CARVALHO, G.R.; FURST, M.C.O; RUAS, J.R.M; BORGES, A.M.; MAFILLI, V.,
Efeito do resfriamento do sêmen eqüino sobre sua congelabilidade, Arquivo Brasileiro
de Medicina Vetetrinária e Zootecnia Vol. 57 no.5 Outubro, 2005.
HAFES, E.S.E. Técnicas para melhorar a eficiência reprodutiva. In HAFES, E.S.E.
Reprodução Animal, São Paulo: Manole, cap.V, pp.601-659, 1988.
HAFES, E.S.E. Preservação e criopreservação de gametas e embriões. In HAFES, E.S.E.
Reprodução Animal, São Paulo: Manole, cap.V, pp.513-535, 1995.
HOLT, W. V.; NORTH, R. D. Thermotropic phase transitions in the plasma membrane of ram
spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, v. 78, p. 445-457, 1986.
LUZ, S.L.N; NEVES; J.P.; GONSALVES, P. B. D., Parâmetros utilizados na avaliação do
sêmen congelados ovino para inseminação laparoscópica, Brasil Jornal Veterinário
Resumo Animal Scielo V. 37 n. 2, 2000.
MARTINS, J.F.P. Comportamento do DNA-Proteína, do vigor da motilidade de
espermatozóide de touros submetidos a diferentes tempos de congelação. (Tese de
Mestrado): Campinas, 1997.
MELO, C.M. Ação dos crioprotetores na biotecnologia de sêmen congelado. (Seminário de
Mestrado): Botucatu, 2003.
RODRIGUES, J. L. Aspectos da congelação de embriões bovinos. In: REUNIÃO ANUAL DA
SOCIEDADE BRASILEIRA DE TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES, Jaboticabal.
Anais…[S.l.: s.n.], p. 55-79, 1992.
SEIDEL, G. E. Principles of cryopreservation of mammalian embryos. In: TECHNIQUES FOR
FREEZING MAMMALIAN EMBRYOS, Colorado State University. Proceedings… [S.l.:
s.n.], 1984, p. 7-14, 1984.