INSTITUTO OSWALDO CRUZ Mestrado em Biologia - Arca

INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Mestrado em Biologia Parasitária
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DO HIV-1 EM
INDIVÍDUOS SOROPOSITIVOS DO RIO DE JANEIRO COM
DIFERENTES PERFIS DE PROGRESSÃO PARA A AIDS
THAYSSE CRISTINA NEIVA FERREIRA LEITE
Rio de Janeiro
2012
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
Thaysse Cristina Neiva Ferreira Leite
Estudo da diversidade genética do HIV-1 em
indivíduos soropositivos do Rio de Janeiro com
diferentes perfis de progressão para a Aids
Dissertação apresentada ao Instituto
Oswaldo Cruz como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências
Orientador: Drª. Monick Lindenmeyer Guimarães
RIO DE JANEIRO
2012
ii
Ficha catalográfica elaborada pela
Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ- RJ
L533
Leite, Thaysse Cristina Neiva Ferreira
Estudo da diversidade genética do HIV-1 em indivíduos soropositivos do
Rio de Janeiro com diferentes perfis de progressão para a Aids / Thaysse
Cristina Neiva Ferreira Leite. – Rio de Janeiro, 2012.
xvi, 86 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz, Pós-Graduação em
Biologia Parasitária, 2012.
Bibliografia: f. 55-70
1. HIV-1. 2. Subtipos. 3. Progressão. 4. Correcepto res. I. Título.
CDD 616.9792
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
THAYSSE CRISTINA NEIVA FERREIRA LEITE
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DO HIV-1 EM INDIVÍDUOS
SOROPOSITIVOS DO RIO DE JANEIRO COM DIFERENTES PERFIS DE
PROGRESSÃO PARA A AIDS
ORIENTADOR: Drª. Monick Lindenmeyer Guimarães
Aprovada em: 28/09/2012
EXAMINADORES:
Drª. Ana Carolina Paulo Vicente – Presidente
Dr. Jorge Simão do Rosário Casseb
Drª. Esmeralda Augusta Jardim Machado Soares
Drª. Lívia Melo Villar
Drª. Flávia Barreto dos Santos
Rio de Janeiro, 28 de setembro de 2012
iii
Este
trabalho
foi
realizado
no
Laboratório de Aids e Imunologia Molecular
do Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, sob
orientação da Drª Monick Lindenmeyer
Guimarães.
iv
“Querem que vos ensine o modo de chegar à ciência verdadeira? Aquilo que
se sabe, saber que se sabe; aquilo que não se sabe, saber que não se sabe. Na
verdade é este o saber.”
Kung-Fu-Tzu
v
Agradecimentos
Aos meus pais e irmã, por todo amor, carinho, e dedicação ao longo da
minha vida. Obrigada por estarem sempre ao meu lado me incentivando na busca dos
meus objetivos. Ao Filipe, pelo amor, companheirismo, incentivo, carinho e torcida
pelo meu sucesso.
À Drª Monick Guimarães, minha orientadora querida, por todo ensinamento no
meu início de carreira científica, toda atenção a mim dedicada, pela amizade, paciência
e incentivo diário. Muito obrigada por sempre acreditar em mim e por me fazer crescer
muito da iniciação científica até hoje. Não canso de repetir: tenho sorte e orgulho em ser
sua aluna!
À Drª Mariza Morgado, por ter me recebido no Laboratório de Aids &
Imunologia Molecular depositando em mim sua confiança, além de ser colaboradora na
concepção e desenho do presente estudo.
À Drª Sylvia Teixeira, colaboradora do projeto, pelo carinho e prestatividade de
sempre, e por ter contribuído bastante com o meu desenvolvimento ao longo desses
quase quatro anos no laboratório, além, é claro, da excelente ajuda com as intermináveis
tabelas! Muito obrigada Sylvinha, você é 10!
À Dayse Campos e Alessandra Coelho, do setor de Estatística e Documentação
do IPEC/FIOCRUZ, pela preciosa ajuda com o banco de dados e análises estatísticas.
À Bianca, “minha irmã científica”, por ter estado sempre à disposição para me
ajudar em qualquer coisa que eu precisasse (qualquer mesmo!), e por me fazer enxergar
sempre o lado bom das coisas. Valeu, Bibi!
Aos amigos do LabAids, pela parceria, pelos momentos divertidos, pelas trocas
de informações e pelo apoio no desenvolvimento deste trabalho. Obrigada por tudo,
galera!
Às minhas companheiras do Mestrado que dividiram esta caminhada comigo,
muito obrigada pela amizade que formamos e pelos vários momentos divertidíssimos!
À todos os meus amigos, gostaria de agradecer pela presença na minha vida
nesses últimos anos e por compreenderem meus momentos de “sumiço”!
Aos membros da banca examinadora, por aceitarem o convite de avaliar este
trabalho e assim contribuir com o mesmo.
Aos órgãos que contribuíram com o financiamento deste estudo: CNPq e
FAPERJ.
vi
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DO HIV-1 EM INDIVÍDUOS SOROPOSITIVOS DO
RIO DE JANEIRO COM DIFERENTES PERFIS DE PROGRESSÃO PARA A AIDS
RESUMO
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Thaysse Cristina Neiva Ferreira Leite
A infecção pelo HIV-1 é caracterizada por um período assintomático extremamente variável entre os
indivíduos, o que permitiu a descrição de diferentes perfis de progressão para aids, os quais tem sido
associados a características específicas do hospedeiro e/ou do vírus, tal como o subtipo viral. Diante
do exposto, como o Rio de Janeiro apresenta uma cocirculação dos subtipos B, F1, recombinantes
BF1, além da variante B” do subtipo B, e há um suporte do governo quanto a realização dos exames
de rotina, o que permite o monitoramento dos pacientes HIV-1 positivos, foi possível a
caracterização desses quanto ao perfil de progressão para aids. Sendo assim, o presente estudo teve
como objetivo avaliar a associação dos subtipos de HIV-1 circulantes no Rio de Janeiro com os
distintos perfis de progressão e analisar em um subconjunto de pacientes a mudança do uso do
correceptor de entrada utilizado pelo vírus em dois momentos distintos da infecção, antes e após a
progressão. A casuística deste estudo foi composta por pacientes HIV-1 positivos que de acordo com
seu acompanhamento clínico foram classificados nos distintos perfis de progressão para aids:
Progressores Rápidos (PR – progressão em até 3 anos), Progressores Intermediários (PI - progridem
a partir de 4 anos de infecção) e Não progressores de longo termo (LTNP - mais de 10 anos de
infecção sem progressão). A subtipagem das amostras foi realizada a partir da região C2-V3 da
gp120 do envelope viral através da análise filogenética pelo método Neighbor-Joining com modelo
de substituição de Tamura-Nei, utilizando-se o programa Mega e análise de recombinação pelo
método de boostcan do programa Simplot. Das 486 amostras classificadas quanto ao seu perfil de
progressão, 285 eram PI, 179 PR e 22 LTNP. Destas, 238 foram caracterizadas quanto ao subtipo,
sendo 84,5% pertencentes ao subtipo B (destes 28,9% B”); 9,2% F1; 3,4% C; 1,3% D; 1,3% BF1 e
0,4% CRF01_AE, esta distribuição concorda com a descrita em estudos prévios com indivíduos do
Rio de Janeiro. Dos 92 PR, 54,3% foram caracterizados como B, 22,8% B”, 12% F1, 4,3% C,
3,3%D, 1,1% AE e 2,2% BF1. Dos 131 PI, 64,1% pertenciam ao subtipo B, 24,4% B”, 7,6% F1,
3,1% C e 0,8% BF1. Dos 15 LTNP, 60% foram B, 33,3% B” e 6,7% F1. Nossos achados apontam
para uma maior porcentagem do subtipo F1 em PR, porém sem significância estatística.
Contrapondo-se a outros estudos prévios, não foi verificada associação entre progressão mais lenta e
a variante B”. As análises de predição do uso do correceptor foram realizadas para 29 indivíduos. A
maior parte dos indivíduos caracterizados como subtipos B, B” e F1 apresentou a forma viral R5 em
ambos momentos estudados, no entanto uma alta proporção de vírus X4 (42,9%) foi detectada em
indivíduos classificados como B”, fato que corrobora a ausência de associação da variante B” com a
progressão mais lenta. No seu conjunto, os resultados deste trabalho reforçam a necessidade de
melhor se compreender características virais que possam apontar marcadores de prognóstico para a
aids.
Palavras-chave: HIV-1, subtipos, progressão, correceptores
vii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
GENETIC DIVERSITY OF HIV-1 SEROPOSITIVES INDIVIDUALS FROM RIO DE JANEIRO
WITH DIFFERENT AIDS PROGRESSION PROFILES
ABSTRACT
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Thaysse Cristina Neiva Ferreira Leite
The HIV-1 infection is characterized by an asymptomatic period highly variable among the
individuos leading to a description of different profiles to aids progression, which have been
associated with specific characteristics of the host and/or virus, such as viral subtype. Given the
above, as Rio de Janeiro city has a a co-circulation of subtypes B, F1, BF1 recombinants in addition
to B” variant of subtype B, and there is a government support for routine exames allowing a good
clinical follow up of the HIV-1 infected patients, it was possible to characterize them in the distinct
aids progression profiles. Therefore, this study aimed to evaluate the association between HIV-1
subtypes circulating in Rio de Janeiro with distinct progression profiles and analyse the shift of the
use of the correceptor used by virus in a subset of patients at two differents periods of infection,
before and after progression. The subjects of this study consisted of HIV-1 seropositives which were
classified according to their profile progression: rapid progressors (RP – less than to 3 years to aids
progression), intermediate progressors (IP – progression after 4 years of infection), and long-term
non-progressors (LTNP - more than 10 years of infection without progression). The samples
subtyping was performed based on the C2-V3 region of gp120 of the envelope viral by using
Neighbor-Joining phylogenetic inferences with Tamura-Nei substituition model, in Mega program
and recombination analysis by bootscan method in Simplot. From 486 classified samples, 285 were
as IP, 179 as RP and 22 as LTNP. From those, 238 were subtype characterized, being 84.5% B
(28.9% B"); 9.2% F1, 3.4 % C, 1.3% A, 1.3% and 0.4% CRF01_AE BF1, this distribution goes in
agreement with those reported in previous studies with individuals from Rio de Janeiro. From those
92 characterized as RP, 54.3% were classified as B, 22.8% B ", 12% F1, 4.3% C 3.3% D 1.1% and
2.2% AE BF1. From those 131 IP, 64.1% classified as B, 24.4% B”, 7.6% F1, 3.1% C and 0.8%
BF1. From those 15 LTNP, 60% were B, 33.3% B” and 6.7% F1. Our findings depicted a higher
percentage of sub-subtype F1 in RP, even thought no statistical significance was observed. Distinct
to the previous studies, no association between slower progression and variant B" was verified. The
coreceptor predition analisys were performed for 29 patients. Most individuals characterized as
subtypes B, B” and F1 presented R5 viral form in both periods, however, a high proportion (42,9%)
of X4 virus was detected in individuals classified as B”, fact consistent with no association among
variant B” and slower progression. Taken together, our results shows the necessity of better
understanding the viral characteristics that may reinforce prognostic markers for aids.
Key words: HIV-1, subtypes, progression, correceptors
viii
Lista de Figuras
Página
Figura 1: Estimativa do número de adultos e crianças infectados pelo HIV
no mundo, no período de 1990 a 2010.
2
Figura 2: Estimativa do número de novas infecções pelo HIV e óbitos
relacionados à aids no mundo, no período de 1990 a 2010.
2
Figura 3: Distribuição percentual dos casos de aids acumulados por região
do Brasil no período de 1980 a 2011. Fonte: MS/SVS/Departamento de
DST, Aids e Hepatites Virais, Boletim epidemiológico, 2011.
4
Figura 4: Representação esquemática da partícula madura do HIV-1.
5
Figura 5: Representação esquemática do genoma proviral do HIV-1.
6
Figura 6: Representação esquemática da gp120 do HIV-1, demonstrando
as cinco regiões conservadas (C1-C5) e as cinco regiões variáveis (V1-V5).
8
Figura 7: Representação esquemática do ciclo replicativo do HIV-1.
11
Figura 8: Distribuição global dos subtipos de HIV-1 e das formas
recombinantes circulantes de 2004 a 2007, com destaque para países da
África Central.
14
Figura 9: Distribuição dos subtipos e CRFs predominantes do HIV-1 por
região geográfica no Brasil.
16
Figura 10: Curso clínico, imunológico e virológico da infecção natural
pelo HIV-1.
19
Figura 11: Padrão natural da infecção pelo HIV-1 nos três perfis de
progressão para a aids: progressores rápidos, intermediários e não
progressores de longo termo. Apresentando os níveis de RNA e contagem
de células TCD4 em cada perfil ao longo da infecção.
21
Figura 12: Análise filogenética por “neighbor-joining”, modelo de
substituição de Tamura-Nei, do fragmento de 456pb correspondente à
região C2-V3 do envelope viral de 163 amostras de HIV-1.
34
Figura 13: Análise por bootscan das amostras PR21764, PI22953 e
PR23149 na região C2-V3 do envelope viral.
35
Figura 14: Distribuição dos subtipos encontrados na população estudada
(n=238).
36
ix
Figura 15: Análise filogenética por “neighbor-joining”, modelo de
substituição de Tamura-Nei, do fragmento de 456pb correspondente à
região C2-V3 do envelope viral das amostras de HIV-1 subtipadas como B.
38
Figura 16: Análise filogenética por “neigbor-joining”, modelo de
substituição de Tamura-Nei, do fragmento de 456pb correspondente à
região C2-V3 do envelope viral das amostras de HIV-1 subtipadas como B,
onde apenas amostras pertencentes à variante B” foram marcadas.
39
Figura 17: Análise filogenética por “neighbor-joining”, modelo de
substituição de Tamura-Nei, do fragmento de 456pb correspondente à
região C2-V3 do envelope viral das amostras de HIV-1subtipadas como
F1.
40
Figura 18: Análise filogenética por “neighbor-joining”, modelo de
substituição de Tamura-Nei, do fragmento correspondente à região C2-V3
do envelope viral das amostras dos indivíduos nos momentos antes (A) e
após (P) a progressão.
42
x
Lista de tabelas
Página
Tabela 1: Iniciadores utilizados para amplificação da região gp120 do
envelope viral.
27
Tabela 2: Iniciadores utilizados na reação de sequenciamento da região da
gp120 do envelope viral.
30
Tabela 3: Dados epidemiológicos dos pacientes classificados de acordo
com o seu respectivo perfil de progressão para a aids.
32
Tabela 4: Distribuição dos subtipos de HIV-1 de acordo com os diferentes
perfis de progressão para a aids.
37
Tabela 5: Análise estatística entre os principais subtipos e os três perfis de
progressão.
37
Tabela 6: Análise da predição do uso do correceptor de entrada com base
na região da alça V3 com a utilização dos programas Geno2pheno,
webPSSM e Regra das posições 11/25
44
xi
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos
A
Arginina
aids
Síndrome da Imunodeficiência Adquirida
ARV
Antirretroviral
CA
Capsídeo
CCR5
Receptor de alfa-quimiocinas 5
CD4
Grupamento de diferenciação 4
cDNA
Ácido desoxirribonucléico complementar
CRF
Forma Recombinante Circulante
CV
Carga Viral
CXCR4
Receptor de beta-quimiocinas 4
DNA
Ácido Desoxiribonucléico
dNTP
Deoxiribonucleotídeo trifostato
env
Gene que codifica as proteínas do envelope viral
FIOCRUZ
Fundação Oswaldo Cruz
G
Glutamina
gag
Gene do grupo antígeno do HIV
GALT
Tecido Linfóide Associado ao Intestino
gp120
Glicoproteína de 120 Kd
gp41
Glicoproteína de 41 Kd
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
HLA
Antígeno Leucocitário Humano
HSH
Homens que fazem sexo com homens
HXB2
Isolado Viral do HIV-1
IPEC
Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas
Kb
Kilobase
xii
LTNP
Não progressores de longo termo
LTR
Terminações Longas Repetidas
MA
Matriz
MgCl2
Cloreto de Magnésio
NC
Nucleocapsídeo
nm
Nanômetros
P
Prolina
pb
Pares de base
PBMC
Células Mononucleares do Sangue Periférico
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
PI
Progressores Intermediários
PM
Peso Molecular
pol
Gene da polimerase do HIV
PR
Progressores Rápidos
R5
Isolado de HIV-1 que utiliza o receptor CCR5
R5X4
Isolado de HIV-1 capaz de utilizar os receptores CCR5 e CXCR4
RNA
Ácido Ribonucléico
rpm
Rotações por minuto
RT-PCR
Transcrição Reversa seguida da Reação em Cadeia da Polimerase
SIV
Vírus da Imunodeficiência Símia
TBE
Tris-Ácido bórico- EDTA
TCD4
Linfócitos TCD4
TCD8
Linfócitos TCD8
TR
Transcriptase Reversa
UDI
Usuários de Drogas Injetáveis
UNAIDS
Programa das Nações Unidas no combate ao HIV/Aids
URF
Forma Recombinante Única
xiii
V3
Terceira região variável da gp120 do envelope do HIV-1
X4
Isolado de HIV-1 que utiliza o receptor CXCR4
xiv
Índice
Página
I. Introdução
1.1. Dados epidemiológicos
1.2. O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
1.2.1. O genoma do HIV
1.2.2. Ciclo de replicação do HIV
1.3. Origem e diversidade genética do HIV
1.3.1. Epidemiologia molecular do HIV-1 no mundo
1.3.2. Epidemiologia molecular do HIV-1 no Brasil
1.4. Caracterização biológica do HIV-1
1.5. Ainfecção pelo HIV-1 e a progressão para a aids
1
4
5
9
11
13
15
17
18
II. Justificativa
22
III. Objetivos
3.1. Objetivo geral
3.2. Objetivos específicos
24
24
IV. Material e Métodos
4.1. Casuística
4.2. Extração de DNA
4.3. Amplificação por “nested” PCR da região da gp120 do envelope
viral
4.4. Extração de RNA
4.5. Reação de retrotranscrição e amplificação por “nested” PCR da
região C2-V3 do envelope viral a partir do cDNA
4.6. Purificação e quantificação dos produtos de PCR para o
sequenciamento
4.7. Reação de sequenciamento
4.8. Análise e edição das sequências
4.9. Determinação dos subtipos virais
4.10. Predição dos correceptores CCR5 e/ou CXCR4
4.11. Análises estatísticas
V. Resultados
5.1. Identificação dos pacientes nos três perfis de progressão para aids e
análise dos seus dados clínicos e epidemiológicos
5.2. Caracterização dos subtipos virais
5.3. Análise da distribuição dos subtipos nos distintos perfis de
progressão
5.4. Análise temporal quanto ao uso do correceptor de entrada
VI. Discussão
6.1. Identificação dos perfis de progressão para a aids
6.2. Caracterização molecular e distribuição dos subtipos no Rio de
Janeiro
6.3. Análise da distribuição dos subtipos nos perfis de progressão
xv
25
26
27
28
28
29
29
30
30
31
31
32
33
36
41
47
48
50
6.4. Análise temporal do uso do correceptor de entrada utilizado pelo
vírus
51
VII. Conclusões
54
VIII. Referências Bibliográficas
55
xvi
I. Introdução
1.1.
Dados epidemiológicos
O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome
da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) (Coffin et al., 1986). A pandemia de aids é
considerada uma das mais importantes das últimas décadas, sendo caracterizada como
um grande problema de saúde mundial e socioeconômico, principalmente em países em
desenvolvimento, pois acomete majoritariamente a população economicamente ativa
(Aids Epidemic Update, UNAIDS, 2009).
Dados da UNAIDS revelam que no ano de 2010 cerca de 34 milhões de pessoas
estavam infectadas pelo HIV no mundo, sendo 17% mais do que em 2001 (Figura 1).
Deste total, 2,7 milhões de novos casos foram identificados em 2010. O número de
pessoas que foram a óbito por causas relacionadas à aids nesse mesmo ano foi de 1,8
milhões, o que demonstra um decréscimo em comparação aos dados de 2,2 milhões
registrados na metade da década de 2000. A prevalência dos casos de HIV̸AIDS no
mundo nos últimos anos tendeu a estabilização devido a significante expansão do
acesso à terapia antirretroviral pela população. Entretanto, o número de novas infecções
continua elevado, devido ao crescimento da população mundial e à redução da
mortalidade ao longo dos últimos anos (Figura 2) (World Aids Day Report, UNAIDS,
2011).
No início da epidemia, a maioria dos casos de aids estava relacionada a “grupos
de risco” tais como homossexuais/bissexuais e usuários de drogas injetáveis. Porém,
esse perfil de transmissão do HIV vem se modificando com expansão significativa entre
indivíduos heterossexuais, logo, houve um aumento do número de casos de transmissão
em mulheres e consequentemente, crianças.
A África Subsaariana continua sendo a região mais afetada pela epidemia, onde
concentra 2/3 dos casos de aids no mundo, cerca de 22,9 milhões de pessoas infectadas,
sendo 1,9 milhões de novos casos em 2010. Cerca de 1,5 milhões de pessoas infectadas
encontram-se na América Latina, dentre as quais, 100.000 foram infectadas em 2010.
Nesse mesmo ano, aproximadamente 67.000 pessoas morreram por causas relacionadas
à aids nessa região (World Aids Day Report, UNAIDS, 2011).
1
Figura 1: Estimativa do número de adultos e crianças infectados pelo HIV no mundo, no período de 1990
a 2010. Fonte: World Aids Day Report, 2011, UNAIDS
Figura 2: Estimativa do número de novas infecções pelo HIV e óbitos relacionados à aids no mundo, no
período de 1990 a 2010. Fonte: World Aids Day Report, 2011, UNAIDS
2
Dentre os países da América Latina, o Brasil concentra cerca de 1/3 dos
portadores de HIV. Entre os anos de 1980 a 2011, foram notificados 608.230 casos de
aids acumulados no país e cerca de 241.469 óbitos relacionados. Em 2010, 34.218
novos casos foram identificados, e observamos uma taxa de incidência nacional de 17,9
casos por 100.000 habitantes (Boletim Epidemiológico, 2011).
Dados do Ministério da Saúde de 2011 indicam uma tendência à estabilização da
taxa de incidência no Brasil ao longo dos últimos 12 anos. Porém, é importante frisar
que o número de casos notificados no país não se distribui de forma homogênea entre as
regiões. A região Sudeste é a mais acometida sendo responsável por mais da metade dos
casos de aids notificados acumulados (56,4%), seguida pela região Sul (20,2%),
Nordeste (12,9%), Centro-Oeste (5,8%), e por último a região Norte (4,7%) (Figura 3).
De acordo com o perfil de cada região, observa-se um processo lento de estabilização da
incidência nas regiões Sudeste e Sul, acompanhado mais recentemente pela região
Centro Oeste, já as regiões Norte e Nordeste mantém uma tendência de crescimento da
incidência de casos.
Assim como descrito para epidemia mundial, no Brasil verifica-se um aumento
na transmissão heterossexual; uma estabilização da transmissão homo/bissexual e uma
importante redução na transmissão por uso de drogas injetáveis. De acordo com o
boletim epidemiológico de 2011, a razão de sexo vem diminuindo ao longo dos anos,
iniciando com 40 homens para cada mulher com aids no ano de 1983, e chegando a 1,7
homens para cada mulher no ano de 2010 (Boletim Epidemiológico, 2001).
Vale ressaltar que o Brasil continua sendo uma referência entre países em
desenvolvimento por oferecer acesso gratuito aos medicamentos antirretrovirais para os
indivíduos infectados; e implementar um programa de redução de danos com medidas
preventivas como a distribuição de preservativos e seringas; e campanhas de
conscientização da população. Como resultado dessa política de prevenção da aids, as
taxas de transmissão reduziram, assim como a mortalidade, o que contribui no controle
da epidemia e em um aumento da expectativa de vida das pessoas com HIV/AIDS no
país.
3
Figura 3: Distribuição percentual dos casos de aids acumulados por região do Brasil no período de 1980
a 2011. Fonte: MS/SVS/Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais, Boletim epidemiológico, 2011.
1.2.
O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV)
O HIV é um retrovírus pertencente à família Retroviridae, a qual possui a
enzima transcriptase reversa capaz de retrotranscrever seu genoma de RNA em DNA; e
ao gênero Lentivirus (Coffin et al., 1986), que se caracteriza por produzir infecções
crônicas no hospedeiro, além de danos em seu sistema imune (revisto por Roquebert et
al., 2009).
A partícula viral (Figura 4) madura apresenta simetria icosaédrica, com
aproximadamente 110nm de diâmetro. O envelope corresponde à camada mais externa
do vírus e se origina da bicamada lipídica da célula hospedeira durante o brotamento
dos vírions e apresenta as glicoproteínas gp120 e gp41. Essas glicoproteínas codificadas
pelo gene do envelope (env) desempenham um importante papel nas etapas de adsorção,
fusão membranar e posterior entrada na célula hospedeira (Goto, Ashina, Nakai, 1994;
revisto por Goto, Nakai, Ikuta, 1998). Internamente ao envelope viral, encontramos a
matriz (MA) formada pela proteína p17 codificada pelo grupo antígeno específico, gene
gag. Essa proteína é essencial para a integridade do vírion e participa na maturação da
4
partícula viral pela incorporação das glicoproteínas do envelope no vírion maduro
(Rubbert et al., 2005). O capsídeo viral (CA) é constituído pela proteína p24 e apresenta
forma cônica (Marx, Munn, Joy, 1988). Envoltos pelo capsídeo encontram-se o
nucleocapsídeo (NC), as enzimas virais (protease, transcriptase reversa e integrase) e as
proteínas acessórias, as quais estão intimamente ligadas às duas fitas de RNA.
Capsídeo
Nucleocapsídeo
Matriz
gp41
Envelope
Integrase
Figura 4: Representação esquemática da partícula madura do HIV-1 destacando as camadas estruturais,
assim como as proteínas que as compõe e as enzimas (transcriptase reversa, protease e integrase). Fonte:
http://celulando.blogspot.com
1.2.1. O genoma do HIV
O HIV, como todo retrovírus, possui um genoma constituído de duas fitas de
RNA similares de polaridade positiva, cada uma com aproximadamente 9,7kb de
tamanho, contendo sequências de leitura abertas que codificam as diversas proteínas
virais (revisto por Goto et al., 1998).
O genoma do HIV apresenta nove genes: gag, env (codificam proteínas
estruturais) e pol (codifica as enzimas virais que são comuns a todos os retrovírus); tat e
rev (genes regulatórios) e vif, vpr, vpu e nef (genes acessórios, no caso do HIV-1)
5
(Figura 5).
Na extremidade 3’ e 5’ do genoma proviral do HIV são encontradas
repetições terminais longas denominadas de LTR (Long terminal repeats), onde estão
localizadas as principais sequências promotoras para a transcrição dos genes virais. As
regiões LTR não codificam proteína, mas exercem funções importantes como
participação na retrotranscrição, promovendo a interação do RNA molde com o cDNA e
participação na integração com o genoma hospedeiro (Cherrington, Ganem, 1992;
revisto por Freed et al., 2001).
Figura 5: Representação esquemática do genoma proviral do HIV-1. As proteínas codificadas pelos
genes gag, pol e env também encontram-se representadas. Fonte: http://www.liquidarea.com.
O gene gag (grupo antígeno específico) é o primeiro gene, localizado na
terminação 5’ do genoma do HIV. As proteínas codificadas a partir desse gene são
sintetizadas de uma poliproteína precursora de 55kD, denominada p55. Durante, ou
logo após a liberação de novas partículas virais, a protease cliva essa poliproteína em
quatro proteínas estruturais: p17 (matriz – MA), p24 (capsídeo – CA), p7
(nucleocapsídeo – NC) e p6 (revisto por Freed et al., 2001). As principais funções
dessas proteínas são: formar a estrutura funcional do vírus, proteger o material genético
viral e as enzimas necessárias à replicação, empacotamento do RNA viral, direcionar as
partículas nascentes para a superfície da célula hospedeira, estimular a liberação de
6
novas partículas virais, entre outras (Gottlinger et al., 1989; Yu et al., 1992; Huang et
al., 1995; revisto por Freed et al., 2001).
O gene pol (polimerase) codifica uma poliproteína precursora p160 gag/pol a
qual é clivada pela protease gerando as enzimas virais: protease (PR - p10),
transcriptase reversa (RT - p66/p51) e integrase (IN - p31), que estão envolvidas nos
processos de maturação, retrotranscrição e integração ao genoma viral, respectivamente.
A sequência do gene pol não possui um códon de iniciação, assim, não pode ser
traduzida independentemente. Ela é então traduzida fusionada a gag, formando um
precursor gag-pol. A protease, oriunda do gene pol, cliva o polipeptídeo pol, separandoo de gag, sendo então uma proteína indispensável na produção da partícula madura
(revisto por Freed, 2001).
O gene env (envelope) codifica uma poliproteína precursora, a gp160, que é
traduzida no retículo endoplasmático da célula hospedeira e é encaminhada para o
Complexo de Golgi, sendo glicosilada e clivada por proteases celulares em gp120
(superfície) e gp41 (transmembranar). Essas glicoproteínas desempenham um
importante papel nas etapas de adsorção e fusão do vírus à célula hospedeira (Goto,
Ashina, Nakai, 1994; revisto por Goto, Nakai e Ikuta, 1998). A gp120 contém
determinantes que interagem com o receptor CD4 e correceptores, enquanto a gp41
ancora o complexo gp120/gp41 na membrana, além de conter domínios importantes
para catalisar a reação de fusão entre a bicamada lipídica viral e do hospedeiro durante a
entrada do vírus (Caffrey et al., 1998; Chan et al., 1997). A glicoproteína gp120
reconhece e interage com o receptor CD4, promovendo a adsorção do vírus à superfície
da célula hospedeira. Além do CD4, essa glicoproteína reconhece e se associa a
receptores de quimiocinas CCR5 e/ou CXCR4. Essas interações promovem mudanças
conformacionais tanto na gp120 quanto na gp41, levando à exposição do peptídeo de
fusão da gp41 e consequente fusão do envelope viral à membrana da célula hospedeira
(Clapham, Weiss, 1997; Chan e Kim, 1998; revisto por Berger, Murphy e Farber, 1999;
revisto por Freed et al., 2001). A gp120 é o principal contato entre o vírus e a célula
hospedeira, sendo composta por cinco regiões constantes (C1 a C5), que geralmente são
semelhantes entre os diferentes subtipos virais, e cinco regiões variáveis (V1 a V5)
(Figura 6). Dentre as regiões variáveis, os domínios V1 e V2 são interligados através de
pontes dissulfeto, formando a alça V1/V2. As demais regiões variáveis, V3, V4 e V5,
formam alças independentes (Cicala, Arthos e Fauci, 2010). A região da terceira alça
7
hipervariável (V3) é constituída por 35 aminoácidos e é conhecida por codificar os
principais determinantes de especificidade do uso do correceptor (De Jong et al., 1992;
revisto por Chandramouli et al., 2012). Assim, variações genéticas nesta região podem
estar relacionadas com o uso diferencial de correceptores pelos vírus, tal como a
presença de aminoácidos básicos nas posições 11 e/ou 25 que tem sido associada com o
uso do correceptor CXCR4 (Fouchier et al., 1992; De Jong et al., 1992). Estudos
recentes têm mostrado que algumas características da região da gp120 do HIV-1 podem
estar correlacionadas com a velocidade de progressão para a aids, tais como: o
comprimento das regiões variáveis; diversidade total de aminoácidos e número de sítios
de glicosilação (PNGs) (Derdeyn et al., 2004; Rong et al., 2007; Archary et al., 2010).
Figura 6: Representação esquemática da gp120 do HIV-1, demonstrando as cinco regiões conservadas
(C1-C5) e as cinco regiões variáveis (V1-V5). Em destaque, o topo da alça V3 onde se encontra a
substituição da prolina pelo triptofano, que distingue a variante B” do subtipo B comum. Fonte:
Adaptado a partir de Leonard et al., 1990.
Os genes regulatórios e acessórios estão envolvidos em diversos fenômenos que
têm como objetivo aumentar a capacidade replicativa viral. Os genes regulatórios tat e
rev codificam proteínas reguladoras que se acumulam no núcleo e unem-se a regiões
8
específicas do RNA viral. A proteína Tat é um potente ativador da transcrição, pois tem
como principal função promover a fosforilação da RNApol II do hospedeiro,
aumentando os níveis de transcritos virais no interior da célula (revisto por Freed et al.,
2001). O gene acessório rev produz um fator de exportação nuclear que facilita a
exportação dos transcritos virais do núcleo para o citoplasma da célula, permitindo
assim a tradução e expressão das proteínas estruturais (revisto por Delgado, 2011). Os
genes acessórios codificam proteínas importantes para a replicação viral e infecção. A
proteína Vif é uma proteína citoplasmática que apesar de não ser necessária para
montagem e liberação dos vírions, parece ser importante para transmissão do vírus
célula-célula e na geração de vírus plenamente infecciosos (Strebel et al., 1987). Vif
interage com a proteína de defesa antiviral da célula humana, APOBEC3G, cancelando
seu efeito (revisto por Delgado, 2011). As principais funções da proteína Vpr incluem a
estimulação da expressão gênica (Cohen et al., 1990); e transporte do complexo viral
pré-integração ao núcleo imediatamente depois da entrada do vírus na célula, o que
diferencia o HIV-1 da maioria dos retrovírus (revisto por Delgado, 2011). Vpu é uma
proteína de membrana que tem como principal função promover a liberação dos novos
vírus (revisto por Strebel, 2003). Recentemente, foi descrita uma função de Vpu similar
a de Vif, inibir a ação de um fator de restrição novo chamado “Tetherin”, este tem a
função de impedir a liberação de partículas virais (revisto por Delgado, 2011). A
proteína Nef tem sido alvo de diversos estudos já que participa de funções diversas,
além de ser a maior proteína acessória. Nef induz a regulação negativa da expressão do
receptor CD4 e de moléculas de HLA classe I na superfície das células infectadas
(Collins et al., 1998), o que pode representar um mecanismo de escape importante ao
evadir um ataque mediado por células TCD8+; promove aumento da infectividade viral,
modulando vias intracelulares de ativação, e mantendo assim, altos níveis de replicação
viral no hospedeiro (revisto por Geyer, Fackler, Peterlin, 2001).
1.2.2. Ciclo de replicação do HIV
O ciclo de replicação do HIV é dividido em diversas etapas, e proteínas virais e
celulares estão envolvidas nesse processo. As principais etapas desse complexo ciclo
serão descritas a seguir.
9
A infecção pelo HIV-1 tem início com a entrada do vírus na célula hospedeira.
Esse processo se dá pela adsorção das partículas virais na superfície de células do
sistema imunológico que expressam o receptor CD4, através da interação da
glicoproteína do envelope viral gp120 com este receptor. A molécula CD4 é o principal
receptor para o HIV-1 e está presente em células como linfócitos T auxiliares,
monócitos/macrófagos, células dendríticas, células da micróglia do sistema nervoso
central (revisto por Gomez e Hope, 2005). Além do receptor CD4, a gp120 reconhece e
se associa a receptores de quimiocinas, CCR5 (expresso em macrófagos e células
dendríticas) e/ou CXCR4 (expresso em células T), que servem como correceptores para
a entrada do vírus na célula (Clapham, Weiss, 1997). Após essas ligações, ocorrem
mudanças conformacionais na gp120 e na gp41, levando a exposição dessa última,
ocorrendo então à fusão entre o envelope viral e a bicamada lipídica da célula
hospedeira. Como consequência, ocorre a entrada do vírus na célula (Sattentau et al.,
1993). O conteúdo do capsídeo é, então, liberado no citoplasma (Leavitt et al. 2004)
(Figura 7).
Uma vez no citoplasma, o capsídeo sofre um processo de dissociação estrutural e
o RNA genômico e as enzimas virais são liberadas na célula. Em seguida, a enzima
transcriptase reversa promove a síntese de uma molécula de DNA a partir do RNA viral.
Ao mesmo tempo, a enzima RNAseH é necessária para degradar o RNA do híbrido
DNA-RNA. A síntese da fita de DNA complementar é realizada pela atividade DNApolimerase RNA dependente da transcriptase reversa.
O DNA viral é transportado ao núcleo, e pela ação da enzima integrase ele é
integrado ao genoma do hospedeiro. Após essa integração, o genoma passa a ser
conhecido como provírus. Esse provírus tem uma tendência de manter-se no estado
latente na célula infectada sem produzir vírus até ser ativado por um determinado
evento mitogênico. Quando a célula é ativada, através do uso da maquinaria
biossintetizadora da célula (Frankel, Young, 1998), ocorre a transcrição do RNA viral, a
síntese de proteínas, a montagem e a liberação de novas partículas de HIV-1, que irão
sofrer maturação pela enzima protease (Freed, 2001).
10
Figura 7: Representação esquemática do ciclo replicativo do HIV-1. Fonte: Adaptado de Peterlin e
Trono, 2003.
1.3.
Origem e classificação genética do HIV
A hipótese mais aceita para a origem do HIV baseia-se na transmissão zoonótica
a partir de lentivírus de primatas, ou seja, o SIV (Vírus da Imunodeficiência Símia) teria
sido transmitido ao homem através do contato com fluidos de primatas não-humanos
infectados com esse vírus. Tanto o HIV-1 quanto o HIV-2 são oriundos de eventos
distintos de introdução na população humana. O HIV-1 apresenta relação filogenética
com o SIVcpz (infecta chinpanzés Pan troglodytes troglodytes) e HIV-2 com o SIVsm
(infecta macacos Sooty mangabey). Foi demonstrado que regiões africanas de ocupação
natural dos chipanzés Pan troglodytes troglodytes coincidem com áreas onde os grupos
de HIV-1 já foram encontrados; assim como regiões habitadas por macacos Sooty
mangabey coincidem com regiões endêmicas para o HIV-2, corroborando evidências de
transmissão zoonótica (Gao et al., 1999; revisto por Alaleus et al., 2000; revisto por
Hahn et al., 2000).
11
O HIV-1 é responsável pela pandemia de aids e o HIV-2 é endêmico em alguns
países da África e menos patogênico que o HIV-1 (Clavel et al., 1986; Alaeus et al.,
2000).
Uma das características mais marcantes do HIV é a alta variabilidade genética.
Essa diversidade está relacionada a diversos fatores como: os mecanismos de replicação
viral, a biologia do vírus e os mecanismos de defesa do hospedeiro (Wei et al., 1995adicionar).
O HIV apresenta uma alta taxa de produção viral, com cerca de 109 novos vírus
gerados por dia, o que potencializa os diversos mecanismos descritos a seguir. A prédisposição natural ao erro da enzima transcriptase reversa (TR) pela ausência de
mecanismos de correção no momento da transcrição do RNA viral em DNA, leva a
incorporação de substituições, deleções e inserções de nucleotídeos na ordem de 10-5
(Roberts et al., 1988; Zhang et al., 2010). A susceptibilidade aos eventos de
recombinação também é um importante mecanismo que contribui para o aumento da
variabilidade genética do HIV (Robertson et al., 1995). Este é um processo comum aos
retrovírus, devido a existência de duas fitas de RNA em um mesmo compartimento e
pela capacidade da TR em se transferir de uma fita de RNA para outra durante a
retrotranscrição. No HIV-1, ocorre uma média de três saltos da TR entre as fitas de
RNA durante esse processo (Yu et al., 1998). A recombinação pode ocorrer entre
genomas do mesmo subtipo, entre dois ou mais subtipos e até entre grupos diferentes de
HIV-1 (revisto por Steain et al., 2004).
O HIV-1 é classificado, com base no genoma completo, em quatro grupos
distintos geneticamente, com diferentes introduções de primatas não-humanos para
humanos: M (Major, majoritário), O (Outlier), N (Novo, não-M e não-O) e P (Simon et
al., 1998; Roques et al., 2004; Ayouba et al., 200; Plantier et al., 2009). O grupo M é o
mais prevalente no mundo, e devido a sua variabilidade genética, é
classificado
filogeneticamente em nove subtipos: A-D, F-H, J e K (Robertson et al., 2000). Os
subtipos A e F são ainda divididos em sub-subtipos: A1-A5 e F1-F2 (Gao et al., 2001;
Meloni et al., 2004; Triques et al., 1999; Vidal et al., 2006). A variabilidade genética
varia de acordo com a região genômica avaliada, podendo chegar a 35% entre os
distintos subtipos na região do envelope viral (revisto por Korber et al., 2001).
12
Além dos vários subtipos virais, os eventos de recombinação entre os diferentes
subtipos levam a geração de formas recombinantes circulantes (CRFs) e formas
recombinantes únicas (URFs). Tanto para a descrição de um CRF como para um grupo
ou subtipo, é necessário que sejam sequenciados pelo menos dois genomas completos e
um parcial de
vírus obtidos de
indivíduos distintos e não
relacionados
epidemiologicamente. No caso de um novo CRF, essas três sequências devem
apresentar o mesmo padrão de recombinação ao longo do genoma (Robertson et al.,
2000). Os URFs também são formas recombinantes entre subtipos, porém, são
encontrados em apenas um indivíduo infectado. Os genomas recombinantes são
atualmente responsáveis por pelo menos 20% das infecções por HIV-1 no mundo
(revisto por Hemelaar, 2011). Até o momento já foram descritas e depositadas no banco
de Los Alamos 51 CRFs (Hemelaar, 2011; HIV Sequence Database, 2012).
1.3.1. Epidemiologia molecular do HIV-1 no mundo
A distribuição global dos subtipos é altamente heterogênea (Figura 8). Um
estudo recente analisou a distribuição dos subtipos em diferentes países no período de
2004 a 2007 e comparou com os dados do período de 2000 a 2003 (Hemelaar et al.,
2006). Uma tendência à estabilização da distribuição dos subtipos foi observada, apesar
de um aumento no número de CRFs (Hemelaar et al., 2011).
O subtipo C é responsável por cerca de 50% das infecções pelo HIV-1 no
mundo. A África Subsaariana é a região mas acometida pela epidemia e contém cerca
de 65% dos casos, sendo o subtipo C responsável por mais da metade dessas infecções.
Esse subtipo é o mais prevalente em países com altas taxas de infecção, que inclui os
países da África Subsaariana, Índia e China (Sengupta et al., 2005; Hemelaar et al.,
2006; revisto por Hemelaar et al., 2011).
Os subtipos A, B, CRF02_AG, CRF01_AE, G e D são responsáveis por 12, 11,
8, 5, 5 e 2% das infecções, respectivamente. Já os subtipos F, H, J e K, representam uma
menor prevalência, juntos, causam menos de 1% das infecções no mundo (Hemelaar et
al., 2011). A África Central apresenta a maior diversidade de subtipos e recombinantes,
e é considerada o epicentro da epidemia global.
13
Figura 8: Distribuição global dos subtipos de HIV-1 e das formas recombinantes circulantes de 2004 a
2007, com destaque para países da África Central. Os gráficos em formato de pizza representam a
distribuição dos subtipos e formas recombinantes em cada região. A superfície relativa de cada gráfico
corresponde ao número relativo de indivíduos infectados pelo HIV-1 em cada região. Fonte: adaptado de
Hemelaar, 2012.
O subtipo B apresenta uma ampla distribuição, sendo prevalente na Europa, nas
Américas do Norte e Sul incluindo o Caribe, e na Austrália (Hemelaar et al., 2011).
Esse subtipo é o mais estudado por ser o mais difundido, e por predominar nas
epidemias de países desenvolvidos.
A América Latina abrange cerca de 5% das infecções mundiais e os países com
maiores prevalências são o Brasil e Argentina. Nessa região há uma intensa circulação
dos subtipos B (principal), C, F1 e recombinantes BF1 (Hemelaar et al., 2006; revisto
por Hemelaar et al., 2011). O sub-subtipo F1 está presente na maioria dos países da
América Latina: Argentina (Aulicino et al., 2007), Bolívia (Velarde-Dunois et al.,
2000), Uruguai (Hierholzer et al., 2002) e possui maior prevalência no Brasil (Morgado
et al., 1994; Morgado, 1998). É importante ressaltar que a maioria dos casos F1
encontram-se na sua forma recombinante BF1 (Barreto et al., 2006, Guimarães et al.,
2012; Delgado et al., 2010; Hierholzer at al., 2002; Aulicino et al., 2012), e destas,
destacamos os CRF_12BF e CRF17_BF encontrados da Argentina, Paraguai e Uruguai
14
(Carr et al., 2001; Aguayo et al., 2008; Bello et al., 2010; Aulicino et al., 2011) e mais
recentemente foi encontrado o CRF38_BF no Uruguai (Ruchansky et al., 2009).
A alta variabilidade genética do HIV-1 pode ter grande impacto na progressão
para a aids, transmissão, diagnóstico, resposta à terapia antirretroviral, resposta imune e
portanto, no desenvolvimento de vacinas (Hemelaar, 2011).
1.3.2. Epidemiologia molecular do HIV-1 no Brasil
A epidemia molecular de aids no Brasil é representada predominantemente pelo
subtipo B, seguido pelos subtipos F1 e C, além dos recombinantes BF1 e BC (Potts et
al., 1993; Morgado et al., 1994; Louwagie et al., 1994; Vicente et al., 2000; Guimarães
et al., 2002; Morgado et al., 2002; Brindeiro et al., 2003; Couto-Fernandez et al., 2005;
Brigido et al., 2011) (Figura 9). Também já foram descritos no país casos de infecções
pelos subtipos D, A e CRF02_AG (Morgado et al., 1998; Couto-Fernandez et al., 2006;
Caride et al., 2000; Pires et al. 2004, Machado et al., 2009; Cardoso et al., 2010).
A região Sul apresenta um perfil de distribuição de subtipos diferente do restante
do país, onde verifica-se uma alta proporção do subtipo C, principalmente nos estados
de Santa Catarina (50-80%) e do Rio Grande do Sul (30-45%) apresentando-se como
subtipo predominante (Brindeiro et al., 2003; Brigido et al., 2007; Locateli et al., 2007;
Simon et al., 2010; Rodrigues et al., 2010; revisto por Bello et al., 2012), seguido do
subtipo B e recombinantes BC (principalmente CRF31_BC) e baixa prevalência de F1
(Guimarães et al., 2002; Soares et al., 2005; Santos et al., 2006). O Paraná ainda
apresenta uma proporção maior do subtipo B (50-70%), seguido pelo subtipo C (2030%) e recombinantes BC (~15%) (Ferreira et al., 2008; Silva et al., 2010; Toledo et
al., 2010; Raboni et al., 2010).
A região Sudeste apresenta a maior prevalência de casos de aids do país e segue
o padrão molecular descrito para maior parte do território nacional, com subtipo B
predominante (75-80%), seguido do sub-subtipo F1 (10-15%), recombinantes BF1 (4 a
10%), e em menor proporção pelo subtipo C (2-5%) (Tanuri et al., 1999; Cabral et al.,
2006; Morgado et al. 1998, Pires et al., 2004; Sanabani et al., 2011; Sabino et al., 1994;
Brindeiro et al., 2003; Sá Ferreira et al., 2007; Barreto et al., 2006). Já foram descritas
no Brasil, cinco CRFs BF1, todos na região Sudeste: CRF28_BF, CRF29_BF,
15
CRF39_BF, CRF40_BF CRF46_BF (De Sa et al., 2006; Guimarães et al., 2008;
Sanabani et al., 2010). Casos isolados do subtipo D, bem como recombinantes BD,
CRF02_AG e A também já foram encontrados nessa região (Cabral et al., 2006; Caride
et al., 2000; Eyer-Silva e Morgado 2007; Morgado et al., 1998; Pires et al., 2004;
Tanuri et al., 1999; Varella et al., 2008; Delatorre et al., 2012).
Figura 9: Distribuição dos subtipos e CRFs predominantes do HIV-1 por região geográfica no Brasil.
Fonte: Atualizado a partir de Morgado et al., 2002
Através da caracterização do envelope viral de amostras do subtipo B no Brasil
foi possível descrever a existência de uma variante desse subtipo tipicamente brasileira,
denominada B”. Essa variante é caracterizada pela presença do aminoácido Triptofano
(W) na posição 16 do topo da alça V3 da gp120 do envelope (Potts et al, 1993;Morgado
et al., 1994; Covas et al., 1998), em substituiçãoao aminoácido Prolina (P) comum aos
isolados de subtipo B predominante nas Américas, inclusive Brasil, e na Europa. Essa
mudança de aminoácidos causa alterações na estrutura secundária da alça V3 nesses
isolados (Morgado et al., 1996). A variante B” do subtipo B representa cerca de 40 a
60% das sequências B e já foi encontrada em todas as regiões do Brasil (Machado et al.,
2009; Veras et al., 2007; Morgado et al., 1996); exceto o Sul, pois até o momento não
existem estudos de caracterização da região do envelope viral nesta região geográfica. A
16
figura 4, que representa a estrutura da gp120, destaca na alça V3 a posição da troca de
aminoácidos que caracteriza a variante B”.
1.4.
Caracterização biológica do HIV-1
Características relacionadas com o perfil biológico do HIV-1 permitem
classificar os isolados virais de acordo com o uso preferencial dos receptores de
quimiocinas e tropismo celular.
Os vírus com capacidade de utilização somente do correceptor CCR5 são
denominados R5; os que utilizam o correceptor CXCR4 são chamados X4; e aqueles
com capacidade de utilizar simultaneamente os correceptores CCR5 e CXCR4 são
denominados vírus R5X4 (Berger et al., 1999; revisto por Thielen et al., 2010). Os vírus
R5 são menos patogênicos e infectam predominantemente células TCD4+ ativadas e
macrófagos; já os vírus X4 têm como alvo células TCD4 em repouso e apresentam alto
poder replicativo e alta patogenicidade (Fouchier et al., 1992; Alkhatib et al., 1996;
revisto por Franca et al., 2011).
Estudos demonstram que, em geral, os vírus R5 predominam na infecção aguda,
enquanto que os vírus X4 emergem, em cerca de 40-50% dos infectados, somente no
estágio mais avançado da infecção, sendo correlacionados com a progressão acelerada
para a doença (Berger et al. 1999; Brumme et al., 2005; revisto por Thielen et al.,
2010). A dinâmica da transição que determina o surgimento dos vírus X4 a partir da
infecção primária por vírus X5 tem sido amplamente estudada. Mutações na alça V3 da
gp120 do envelope viral, tais como: a substituição de resíduos negativamente
carregados por outros de carga positiva ao longo da alça; e variações em aminoácidos
específicos das posições 11 e 25, parecem influenciar na mudança do uso do correceptor
CCR5 para CXCR4 pelos vírus durante a infecção (Revisto por Coetzer et al., 2006).
Além do V3, outras regiões como V1V2 e C4 também parecem ser importantes (Hartley
et al., 2005; Pastore et al., 2006).
A interação vírus-correceptor é atualmente um alvo importante de drogas
antirretrovirais. Desta forma, a determinação do tipo de correceptor utilizado pelo vírus
para penetrar na célula é de extrema importância para que a eficácia do tratamento seja
monitorada.
17
1.5.
A infecção pelo HIV-1 e a progressão para a aids
A infecção pelo HIV-1 ocorre através do contato de um indivíduo não-infectado
com o sangue, sêmen ou outros fluidos corporais de um indivíduo infectado.
Aproximadamente de duas a quatro semanas após essa exposição, inicia-se a fase de
infecção primária (fase aguda), que se caracteriza por altos índices de replicação viral
(> de 107 cópias de RNA/mL de plasma) e consequente disseminação do vírus para os
linfonodos e sangue periférico. Como consequência dessa alta replicação viral, ocorre
uma dramática depleção do número de linfócitos TCD4+ (Pantaleo e Fauci, 1996;
revisto por Moir, Chun e Fauci, 2011). Nos linfonodos, o vírus replica-se rapidamente e
atinge outros tecidos linfoides, particularmente o tecido linfoide associado ao intestino
(GALT), podendo atingir um pico de mais de 20 milhões de cópias por mililitro de
plasma por volta do 14º-21º dia de infecção (Piatak et al., 1993). Estima-se que durante
a fase primária, cerca de 50 a 90% dos indivíduos infectados apresentem sintomas que
geralmente incluem febre, fadiga, faringite, dor de cabeça entre outros que se
assemelham a uma gripe e tem duração de uma semana ou mais (Cohen, Kinter, Fauci,
1997; Walensky et al., 2001). Em resposta à infecção ocorre um aumento significativo
de células TCD8+ no sangue periférico, apontando assim para um papel importante
dessas células na tentativa de controle inicial da replicação viral (Barouch et al., 2000;
Borrow et al., 1994; Koup et al., 1994).
Após esta fase inicial, a viremia plasmática começa a declinar até atingir o
chamado “set point” viral, marcando o início da fase crônica (assintomática) da
infecção. Consequentemente, há a recuperação do número de linfócitos TCD4+ que se
mantém estável ou sofre um declínio gradual (Cohen et al., 1997). Nesta fase, a maioria
dos indivíduos se mantém assintomática (longo período de latência clínica), porém, os
níveis de viremia embora baixos, não são totalmente controlados (Pantaleo e Fauci,
1996) (Figura 10). Os mecanismos responsáveis pela habilidade do vírus em escapar da
resposta imune ainda não são bem entendidos. Um dos fatores que parecem contribuir
na elucidação dessa questão, é a propensão do HIV em gerar populações variantes virais
dentro de um mesmo indivíduo que podem não ser reconhecidas pelo sistema imune
(Brander, Frahm, Walker, 2006; Walker et al., 2008; revisto por Archary et al., 2010).
Após um período de geralmente três a dez anos, como consequência do efeito
citopático do vírus sobre as células infectadas e de mecanismos imunológicos que
18
causam a destruição destas células, como a apoptose e citotoxidade, ocorre uma perda
considerável de células TCD4+ (atingindo níveis inferiores a 200 células/mm³). A
resposta de linfócitos HIV-específicos é geralmente perdida e anticorpos neutralizantes
são raramente detectados. Concomitantemente, ocorre um novo aumento da replicação
viral culminando com os sintomas da chamada fase de aids. Portanto, esta síndrome se
caracteriza por uma imunossupressão acentuada, tornando o indivíduo infectado
susceptível às infecções oportunistas, neoplasias secundárias e manifestações
neurológicas (Cohen, Weissman, Fauci,1999; Kahn et al., 1998; revisto por Alcamí e
Coiras, 2011). Apesar de a terapia antirretroviral promover um aumento da sobrevida
dos portadores de HIV/Aids no mundo, é importante destacar que os indíviduos
infectados evoluem para o óbito.
Figura 10: Curso clínico, imunológico e virológico da infecção natural pelo HIV-1. Fonte: Adaptado de
Poignard, Klasse e Sattentau, 1996.
A duração do período de latência clínica, entre a fase aguda e a fase de aids, é
bastante variável e diferentes perfis de progressão para a doença foram descritos
(Pantaleo e Fauci, 1996; revisto por Casado et al., 2010). Esses perfis tem sido
associados a fatores relacionados ao perfil genético e imunológico do hospedeiro e à
características inerentes ao vírus.
A grande maioria dos indivíduos infectados (70-80%) apresenta um perfil típico
de progressão para a aids, levando de quatro a dez anos para atingí-la, sendo
19
denominados progressores intermediários (Pantaleo e Fauci, 1996; revisto por Langford
et al., 2007; Casado et al., 2010). Nesses indivíduos, após a infecção primária, ocorre
um longo período de latência clínica e, apesar da falta de sintomas, há uma replicação
persistente do vírus e uma perda progressiva de células TCD4+. Uma porcentagem
significativa dos indivíduos infectados (10-15%) evolui para a aids em até três anos
após a infecção aguda, sendo denominados progressores rápidos. Nesses indivíduos, o
período de latência clínica pode estar ausente ou ser muito breve. Mesmo após a queda
inicial, os níveis de viremia podem aumentar rapidamente, e isso se deve ao ineficiente
controle imune no início da infecção (Pantaleo e Fauci 1996; revisto por Langford et al.,
2007;Casado et al., 2010). Por outro lado, uma pequena fração dos indivíduos
infectados (até 5%), denominados não-progressores de longo termo (LTNP, “long term
non progressors”), permanece, mesmo na ausência de tratamento, clinicamente
assintomática e com altos valores de células TCD4+ (>500 células∕ mm³) por mais de
dez anos de infecção. A contagem de células TCD4+ nesses indivíduos permanece
estável por vários anos, apresentam baixos níveis virológicos, há também uma
preservação do tecido linfóide e da função imune (Easterbrook, 1994; Pantaleo e Fauci,
1996; revisto por Langford et al., 2007) (Figura 11). Existe também uma sub-população
de indivíduos pertencentes ao grupo dos LTNPs que são capazes de manter a carga viral
abaixo do limite de detecção (<50 cópias de RNA/mL no plasma). Esses indivíduos são
denominados controladores de elite (EC, “elite controllers”).
20
Figura 11: Padrão natural da infecção pelo HIV-1 nos três perfis de progressão para a aids: progressores
rápidos, intermediários e não progressores de longo termo. Apresentando os níveis de RNA e contagem
de células TCD4 em cada perfil ao longo da infecção. Fonte: Adaptado de Langford, 2007.
21
II. Justificativa
A infecção pelo HIV se caracteriza pela existência de um período de latência
clínica (período assintomático) entre a infecção aguda e a fase de aids, sendo este
altamente variável. Diversos estudos buscam uma possível influência de fatores virais,
genéticos e imunológicos do hospedeiro na taxa de progressão para a aids. A genética
do hospedeiro tem sido reconhecida como um determinante que afeta a susceptibilidade
à infecção pelo vírus e a progressão para a doença. Por exemplo, indivíduos que são
homozigotos para o alelo CCR5-Δ32 (gene com deleção de 32 pares de base) são
protegidos contra a infecção pelo HIV-1 (Liu et al., 1996), enquanto que indivíduos em
heterozigose apresentam uma progressão mais lenta para a doença (Michael et al., 1997;
Ioannidis et al., 2001; Pantaleo et al., 1997). Outro marcador importante são os alelos
HLA classe I, importantes na apresentação de antígenos. Os alelos HLA-B*27 e HLAB*57 são associados a uma progressão lenta para a aids (Kaslow et al., 1996; Hendel et
al., 1999; Altfeld et al., 2003). Uma progressão mais rápida é conferida pelo HLA-B*35
(Gao et al., 2001). Entretanto, a influência de características virais na progressão para a
aids ainda é controversa.
Alguns estudos conduzidos com indivíduos apresentando o mesmo background
genético já relataram possíveis diferenças de progressão entre indivíduos infectados por
diferentes subtipos de HIV-1. Estudos realizados em países da África demonstraram
uma possível relação entre o subtipo D e a progressão mais acelerada para a aids em
relação ao subtipo A (Kaleebu et al., 2001 e 2002; Baeten et al., 2007; Kiwanuka et al.,
2008; Easterbrook et al., 2010). Fato corroborado em um estudo realizado em 2007 em
Uganda, na África, onde foi observado uma maior número de aminoácidos carregados
positivamente na alça V3 da região env acarretando numa alta proporção de vírus X4
em indivíduos infectados pelo subtipo D em relação aos infectados pelo subtipo A
(Korber et al., 1994; Kaleebu et al., 2007). Essa emergência precoce de vírus que
utilizam o correceptor CXCR4 pode estar relacionada com o rápido declínio de células
TCD4+ e rápida evolução para a aids em infectados pelo subtipo D. Estudos
demonstraram que indivíduos infectados pelo subtipo C utilizam majoritamente o
correceptor CCR5 e que possuem uma menor eficiência de replicação em macrófagos e
linfócitos TCD4+ em relação aos outros subtipos, fatores estes que têm sido
relacionados a uma progressão mais lenta para a aids (Ping et al., 1999; Casper et al.,
2002; Cilliers et al., 2003). Coetzer e colaboradores sugeriram que para a troca do uso
22
do correceptor na infecção pelo subtipo C, mais mutações seriam necessárias na região
do envelope em comparação a outros subtipos (Coetzer et al., 2011). Em um estudo de
metanálise realizado em 2012, foi relatado que dentre os principais subtipos circulantes
no mundo, os subtipos B, D e C são mais patogênicos do que os subtipos G, AE e AG, e
o subtipo A foi considerado o menos agressivo de todos (Pant Pai et al., 2012). Estudos
conduzidos no Brasil demonstraram uma progressão mais lenta nos indivíduos
infectados pela variante B” em relação ao subtipo B (Santoro-Lopes et al., 2000;
Casseb et al., 2002; De Brito et al., 2006; Araujo et al., 2010) e ainda o uso exclusivo
do correceptor CCR5 por essa variante (Leal et al., 2008). Apesar destes estudos terem
nos fornecido conhecimento a respeito desta temática, alguns destes utilizaram ensaios
sorológicos com peptídeos sintéticos para subtipagem, que são menos sensíveis do que
os ensaios moleculares podendo resultar em falso-positivos. Estes ainda possuem tempo
de acompanhamento reduzido e ausência de dados importantes para categorização
quanto aos perfis de progressão. Além disso nenhum dos estudos realizados até o
momento incluíram amostras do sub-subtipo F1.
Diante deste panorama, é possível concluir que os subtipos de HIV-1 apresentam
características genéticas específicas que podem refletir na patogênese da infecção.
Como o Rio de Janeiro apresenta uma cocirculação dos subtipos B, F1, recombinantes
BF1, além da variante B” do subtipo B, e há um suporte do governo quanto a realização
dos exames de rotina, o que permite o monitoramento dos pacientes HIV-1 positivos,
nos possibilitou a caracterização desses quanto ao perfil de progressão para aids. Neste
sentido, o presente estudo pretende contribuir para a compreensão de características
virais que posam influenciar na progressão para a aids.
23
III. Objetivos
3.1.
Objetivo geral
Avaliar a associação entre os subtipos do HIV-1 circulantes no Rio de Janeiro
com os distintos perfis de progressão para a aids e com o uso do correceptor de entrada
na célula.
3.2.
Objetivos específicos
ü Classificar os indivíduos HIV-1 positivos nos distintos perfis de progressão para
a aids;
ü Subtipar as amostras dos indivíduos HIV-1 positivos pertencentes aos três
grupos estudados;
ü Correlacionar o subtipo viral com os diferentes perfis de progressão para a aids;
ü Analisar a mudança do uso do correceptor de entrada utilizado pelo subtipos
virais circulantes no Rio de Janeiro em dois momentos da infecção, antes e após
a progressão.
24
IV. Material e métodos
4.1.
Casuística
Este é um estudo retrospectivo onde os 3840 indivíduos HIV-1 positivos
acompanhados pelo Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas/IPEC-FIOCRUZ, no
período de 1988 a 2011, tiveram seus dados clínicos e epidemiológicos avaliados
visando a classificação dos mesmos nos distintos perfis de progressão para aids. Estes
dados foram disponibilizados em um banco de dados fornecido pelo Setor de Estatística
e Documentação do IPEC e analisados de forma conjunta com membros deste setor e do
Laboratório de AIDS Imunologia Molecular/IOC. A classificação dos pacientes nos
distintos perfis de progressão para a aids (Rápidos, Intermediários e Não progressores
de longo termo) foi baseada nos seguintes eventos definidores de aids: contagem de
linfócitos TCD4+ <350 células/mm³; presença de doença definidora de aids segundo o
ministério da saúde brasileiro; início ao tratamento antirretroviral (ARV) ou óbito
relacionado à aids. Também foi indispensável a data da primeira sorologia positiva para
todos os pacientes, e a data da sorologia negativa no caso do Progressores Rápidos. De
acordo com esses critérios, os pacientes foram classificados como:
Progressores Rápidos: indivíduos HIV-1 positivos que progrediram para a aids em até 3
anos após a infecção. Neste caso era indispensável que este possuísse a data da última
sorologia negativa e o intervalo entre a mesma e a sorologia positiva fosse de no
máximo três anos. O ponto médio entre essas datas foi adotado com a data da provável
infecção.
Progressores Intermediários: indivíduos HIV-1 positivos que progrediram para a aids a
partir de 4 anos de infecção. Para este caso não foi indispensável que o indivíduo
apresentasse data de sorologia negativa, quando tínhamos este dado, o mesmo critério
de ponto médio foi adotado para a provável data de infecção. Na ausência de sorologia
negativa, foi adotada a data de seis meses antes da sorologia positiva como data da
provável infecção.
Não progressores de longo termo (LTNPs): indivíduos HIV-1 positivos com todas as
contagens de linfócitos TCD4+ >500 células/ mm³, sem uso ARV e sem doença
definidora de aids por mais de 10 anos de infecção. Os critérios para a provável infecção
foram os mesmo adotados para os Progressores intermediários.
25
Dos 3840 pacientes, 3243 não puderam ser classificados, desses, 282
apresentavam menos de 10 anos de acompanhamento e sem evolução para a aids até
2010, data de corte de análise do banco. Os demais (2961) não foram classificados pelos
seguintes fatores:
- menos de dois ou nenhum exame de contagem de linfócitos TCD4+ antes do evento
definidor de aids;
- data da provável infecção até a data aids condizente com perfil de progressão rápida,
porém sem data da sorologia negativa;
- tempo entre a sorologia positiva e negativa maior que três anos;
- evento definidor de aids entre três e quatro anos – visto que foi aceita a inclusão de
pacientes que possuíssem até três anos entre a sorologia negativa e a positiva, e que a
data de provável infecção era o ponto médio entre estas datas. Achamos mais prudente
excluir estes indivíduos da classificação por estarem no tempo limite entre os perfis de
progressores rápidos e intermediários.
Esse projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de
Pesquisa Clínica Evandro Chagas/FIOCRUZ sob o parecer número 16/2008.
As amostras biológicas utilizadas neste estudo foram coletadas no âmbito da
rotina de contagem de células TCD4+ e Carga Viral do Laboratório de Aids e
Imunologia Molecular - IOC/FIOCRUZ, nos meses de outubro e novembro de 2008,
setembro de 2009 e março de 2011.
4.2.
Extração de DNA
O DNA proviral foi extraído a partir do sangue total, por método cromatográfico
(colunas de sílica), utilizando-se o kit de extração QIAamp DNA Blood Mini Kit
(Qiagen, Alemanha) conforme instruções do fabricante. O DNA extraído foi
identificado e estocado a -20ºC.
26
Amplificação por “nested” PCR da região da gp120 do envelope
4.3.
viral
Com a finalidade de caracterizar o subtipo viral dos indivíduos, o DNA extraído
foi submetido à técnica de “nested” PCR para a amplificação da região gênica C2-V3 da
gp120 do envelope viral. Essa técnica consiste na utilização de dois pares de iniciadores
utilizados em duas reações subsequentes. Para a amplificação da região escolhida foram
utilizados os iniciadores externos ED5/ED12 e os internos ED31/ED33 (Tabela 1).
Os reagentes utilizados na primeira reação de PCR para cada amostra foram:
10µl do Tampão 5X da Enzima; 5µl de MgCl2 25mM; 0,6µl de dNTP 25mM; 0,5µl de
cada iniciador na concentração de 25pmol/µl e 33,4µl de água DEPC. A essa solução
adicionamos 5µl de DNA de cada amostra e 0,25µl da enzima GoTaq DNA Polymerase
a 5U/µl (Promega, EUA). Para a segunda reação foram transferidos 5µl do produto da
primeira sob um volume de 50µl de reação. A concentração dos reagentes foi a mesma
da primeira reação.
As reações foram realizadas no termociclador Gene AMP PCR System 9700
(Applied Biosystems, EUA) com a seguinte ciclagem de PCR: 3 ciclos de 97°C por 1
min, 55°C por 1min, 72°C por 2 min seguindo-se de 32 ciclos de 95°C por 45 seg, 55°C
por 1 min, 72° por 2 min e uma extensão final de 72°C por 10 min.
Para verificar se ocorreu amplificação do fragmento alvo, foram aplicados 5µl
do produto da segunda reação de PCR com 1µl do corante Azul de Bromofenol em gel
de agarose a 1%, este foi corado com brometo de etídeo e foi submetido à eletroforese
por uma hora e meia a 80V, utilizando o TBE 1X como tampão de corrida. O fago
ΦX174 digerido com a enzima Hae III foi utilizado como padrão de peso molecular,
deste aplicamos1,5µl no gel.
Tabela 1: Iniciadores utilizados para amplificação da região da gp120 do envelope viral
primers
ED5 - ED12
ED31 - ED33
Sequência nucleotídica
ATGGGATCAAAGCCTAAARCCATGTG
AGTGCTTCCTGCTGCTCCCAAG
CCTCARYCATWACACARGCYTGTCCAAAG
TTRCARTAGAAAAATTCYCCTC
27
Tamanho
Posição genômica
do
relativa ao HXB2 fragmento
6557 - 7543
986pb
6817 - 7381
564pb
4.4.
Extração de RNA
Um subconjunto de amostras foram avaliadas quanto a predição do uso do
correceptor, para esta análise dois momentos, antes e após a progressão para aids foram
obtidos. As amostras de plasma do momento antes da progressão,foram submetidas à
centrifugação em microcentrífuga (Eppendorf) a 14000 rpm por 1 hora à temperatura de
4ºC para que houvesse concetração do RNA, aumentando a eficiência da
retrotranscrição subsequente. A extração do RNA plasmático foi realizada através do kit
QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Alemanha) conforme instruções do fabricante. O
material extraído foi identificado e estocado a -70ºC até sua utilização.
4.5.
Reação de retrotranscrição e amplificação por “nested” PCR da
região C2-V3 do envelope viral a partir do cDNA
A reação de retrotranscrição foi realizada utilizando-se o protocolo da enzima
M-MLV. Para esta reação utilizamos um iniciador específico (ENV04AS) para região
envelope viral ao invés de um random primer.
Para que houvesse a desnaturação do RNA, uma solução foi preparada contendo
1µl do iniciador ENV04AS a 4pmol/µl; 1μl de dNTPs 10mM e 10µl do RNA extraído a
partir do plasma, aquecida a 65ºC por 5 minutos e colocada imediatamente no gelo para
evitar formação de estruturas secundárias nesta molécula. Em sequência, foram
adicionados a essa solução 4µl do tampão da enzima M-MLV; 2μl de DTT 0,1M, 1μl
do inibidor de RNAase 40U/μl e 1µl da enzima M-MLV a 200U/μl. As reações de
retrotranscrição ocorreram em termociclador nas seguintes condições: 25ºC por 5
minutos, 37ºC por 90 minutos e 70ºC por 15 minutos para a reação de acorrer.
Após a retrotranscrição, 5 µl do cDNA foram submetidos ao mesmo protocolo
de “nested” PCR descrito anteriormente, onde um fragmento de 564pb foi amplificado
para a região C2-V3 do envelope viral.
28
4.6.
Purificação e quantificação dos produtos de PCR para o
sequenciamento
Os produtos de PCR amplificados foram purificados utilizando-se o kit
IllustraTM GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification com colunas de purificação
(GE Healthcare), seguindo as instruções do fabricante.
Para a quantificação do produto purificado, aplicamos no gel de agarose (2%,
corado com brometo de etídeo) 2µl do produto purificado juntamente com 1µl do
corante Azul de Bromofenol. Submetemos essas amostras à eletroforese a 80V por duas
horas utilizando o tampão de corrida TBE1X. Utilizamos 2µl do Low DNA Mass
Ladder como padrão de peso molecular (PM). Este padrão apresenta bandas de 100,
200, 400, 800, 1200 e 2000 pb que correspondem a 5, 10, 20, 40, 60 e 100 ng de DNA,
respectivamente. Após a corrida, a intensidade das bandas das amostras foram
comparadas com as bandas do padrão, assim, estimamos a concentração em
nanogramas/µl, do produto purificado para posterior utilização na reação de
sequenciamento.
4.7.
Reação de Sequenciamento
Após a purificação e quantificação, esses produtos foram submetidos à reação de
sequenciamento utilizando-se o kit BigDye Terminator v3.1. Utilizamos 1µl do BigDye,
1,5µl do tampão de diluição 5X, 1µl do iniciador a 5pmol/µl e a essa solução
adicionamos de 60 a 100ng da amostra purificada. Para completar a reação para um
volume final de 10µl, foi adicionada água Mili-Q.
Os iniciadores utilizados no sequenciamento da região env (gp120) foram:
ED31/ED33/ES7/ENV04AS (Tabela 2). A termociclagem consistiu em 25 ciclos de
96°C por 10 seg, 50°C por 5 seg e 60°C por 4 min. Os produtos sequenciados foram
precipitados com Isopropanol 75% (80µl por amostra). A placa foi incubada protegida
da luz por 15min e então centrifugada a 4000rpm por 45min. Após a centrifugação, a
placa foi vertida para que o Isopropanol fosse removido e o excesso retirado através da
centrifugação da placa invertida a 900rpm por 1 min. A placa então foi completamente
seca a 75°C por 5 min e mantida protegida daluz, até o dia em que foram submetidas ao
sequenciamento. Previamente a submissão ao sequenciador, as amostras foram
resssuspensas em 10µl de formamida Hi-Di (Applied Biosystems, EUA), aquecidas em
29
termociclador por 5 min a 95ºC, e então colocadas imediatamente no gelo. As amostras
foram sequenciadas no sequenciador automático ABI Prism 3100.
Tabela 2: Iniciadores utilizados na reação de sequenciamento da região da gp120 do envelope viral
primers
Sequência nucleotídica
Sentido
CCTCARYCATWACACARGCYTGTCCAAAG
ED31
SENSO
ES7
SENSO
CTGCTGTTAAATGGCAGTCTAG
ED33
ANTI-SENSO
TTRCARTAGAAAAATTCYCCTC
4.8.
Análise e edição das sequências
Após o sequenciamento automático de cada amostra, os cromatogramas gerados
foram visualizados e editados utilizando-se o pacote de programas DNASTAR 4.00
(DNASTAR Inc., EUA). Através do uso do software SeqMan 4.00, as sequências
geradas foram alinhadas e editadas manualmente gerando uma sequência consenso
correspondente à região amplificada.
O alinhamento das sequências de nucleotídeos foi realizado através do programa
ClustalX do programa MEGA 5.0 - Molecular Evolutionary Genetic Analysis (Kumar,
Tamura, Nei, 2011). As sequências editadas foram alinhadas juntamente com
sequências de referência correspondentes aos diferentes subtipos de HIV-1 obtidas do
banco de dados de Los Alamos (http://hiv-web.lanl.gov) para posterior análise
filogenética para a determinação do subtipo viral e análise de predição do uso dos
correceptores.
4.9.
Determinação dos subtipos virais
A análise filogenética para a determinação do subtipo de HIV-1 foi realizada
utilizando o programa MEGA 5.0 (Kumar, Tamura, Nei, 2011) utilizando os arquivos
correspondentes aos alinhamentos. O método de análise utilizado foi o método de
distância de agrupamento de vizinhos (Neighbor-Joining), com método de correção da
30
substituição de nucleotídeos foi Tamura Nei. Para a detecção de possíveis
recombinações, utilizamos o programa Simplot 3.5.1 (Lole et al., 1999).
4.10.
Predição dos correceptores CCR5 e/ou CXCR4
A análise temporal do uso do correceptor utilizado pelo vírus para entrada na
célula hospedeira foi realizada em dois momentos da infecção, sendo um antes e outro
após a progressão dos indivíduos para a aids. A predição do uso do correceptor foi
realizada com base na sequência de aminoácidos da região V3 da gp120 do envelope
viral para todas as amostras que possuíamos as duas visitas. Para tal, utilizamos os
programas webPSSM (http://indra.mullins.microbiol.washington.edu/webpssm/) para as
amostras de subtipos B, B” e C; Geno2pheno (http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de)
com três taxas conservativas de predição de CXCR4 ( 5%, 10% e 20%); além da regra
das posições 11 e 25 do topo da alça V3 para todos os subtipos, que baseia-se no
princípio da presença dos aminoácios K (Lisina) ou R (Arginina) nas posições 11 e/ou
25 predizerem o uso do correceptor CXCR4. O resultado final considerado foi o
detectado pela maioria das metodologias utilizadas.
4.11.
Análises Estatísticas
As análises estatísticas foram realizadas através do teste de Qui Quadrado e do
teste exato de Fisher utilizando-se o programa EpiInfo 3.5.4.
31
V. Resultados
5.1.
Classificação dos pacientes nos três perfis de progresssão para
aids e análise dos seus dados clínicos e epidemiológicos
A primeira etapa deste estudo consistiu na classificação dos pacientes de acordo
com o seu perfil de progressão para a aids.
De acordo com os critérios descritos na casuística, de 3840 pacientes inclusos no
banco, 486 indivíduos foram
intermediários (PI),
classificados, sendo 285 (58,6%) progressores
179 (36,8%) progressores rápidos (PR) e 22 (4,5%) não
progressores de longo termo (LTNP).
As informações epidemiológicas de todos os indivíduos classificados neste
estudo estão sumarizadas na tabela 3. Destes, 323 (65,5%) são homens e 163 (33,5%)
são mulheres (razão homem/mulher igual a 1,98:1). Com relação as diferentes
categorias de exposição ao risco, 204 (42%) informaram ser heterossexuais, 144
(29,6%) homens que fazem sexo com homens (HSH), 70 (14,4%) bissexuais, 68 (14%)
pertencem a outras categorias. Os valores correspondentes a cada perfil de progressão
estão indicados na tabela 1. Uma associação estatisticamente significativa entre homens
e progressores rápidos foi verificada (p=0,0051). Não houve significância estatística
para os outros parâmetros descritos na tabela (p>0,05).
Tabela 3: Dados epidemiológicos dos pacientes classificados de acordo com o seu respectivo perfil de
progressão para a aids.
Total
(n=486)
Sexo
Homens
Mulheres
Categoria de
exposição
Heterossexuais
HSH¹
Bissexuais
Outros²
Progressores Progressores Não progressores
Intermediários
Rápidos
de longo termo
(n=285)
(n=179)
(n=22)
323 (66,5%)
163 (33,5%)
179 (62,8%)
106 (37,2%)
133 (74,3%)
46 (25,7%)
11 (50,0%)
11 (50,0%)
204 (42,0%)
144 (29,6%)
70 (14,4%)
68 (14,0%)
128 (44,9%)
66 (23,2%)
38 (13,3%)
53 (18,6%)
64 (35,7%)
73 (40,8%)
30 (16,8%)
12 (6,7 %)
12 (54,4%)
5 (22,7%)
2 (9,1%)
3 (13,6%)
¹ Homens que fazem sexo com homens
² Usuários de drogas injetáveis, Transfusão, Transmissão vertical, Acidente de trabalho, Não-informado
32
5.2.
Caracterização dos subtipos virais
Com o intuito de identificar os subtipos de HIV-1 das amostras de DNA obtidas
dos indivíduos classificados nos diferentes perfis de progressão para a aids, foi utilizada
a região C2-V3 da gp120 do envelope viral.
De um total de 486 pacientes classificados quanto ao perfil de progressão e
selecionados para este estudo, foi possível obter amostra e caracterizar quanto ao
subtipo 238, destas, 92 eram PI; 131 PR e 15 LTNP. As amostras dos 248 pacientes
restantes não estavam estocadas e/ou viáveis em nosso laboratório (95,2%) ou não
amplificaram para a região alvo (4,8%). Esses pacientes foram excluídos dos próximos
passos do estudo. Dos 238 pacientes caracterizados quanto ao subtipo, 75 já
apresentavam amostras previamente subtipadas na região do envelope viral através da
técnica de HMA (“Heteroduplex mobility assay”) devido ao uso em projetos anteriores
em nosso laboratório.
Neste contexto, realizamos a análise filogenética da região C2-V3 da gp120 de
163 amostras (Figura 12). Pudemos observar que as amostras se agruparam de forma
consistente com as respectivas sequências de referência dos diferentes subtipos do
grupo M obtidas do Banco de Los Alamos. Algumas amostras agruparam-se entre si e
apresentaram agrupamento filogenético em ramo adjacente ao grupo B na análise,
sugerindo possíveis genomas recombinantes. As três referidas amostras foram então
submetidas à análise de recombinação através do método de bootscan presente no
programa Simplot (Figura 13). Com base nestas análises, foi possível caracterizar as
amostras
PR21764, PR23159 e PI22953 como recombinantes BF1. Assim, a
caracterização molecular obtida através da filogenia e bootscaan evidenciou 133 como
subtipo B (81,6%); 19 como sendo F1 (11,7%); 6 como C (3,7%); 1 como CRF01_AE
(0,6%); 1 como D (0,6%) e 3 caracterizadas como recombinantes BF1 (1,8%).
33
99
99
99
99
99
B.BR
B.FR
.83.H
XB
2 LA
I IIIB
BRU
.K03
7269
455
88
88
.02.
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RMS
.00.A
B.AR 05
3588
2.DQ
00
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70
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94
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99
90
K .C
M .9
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H.
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MP
99
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3.
53
AF
SE
J2
G .C
92
01
80
78
28
M
G
87
.A
.0
.B
F0
1 .0
E.
82
1C
96
39
.D
M
40
RC
4
49
BL
H
9
.B
93
.A
HA
F0
N .A
84
Y3
93
6
71
12
1
.V
I9
91
.A
F1
12
7
.06
9 23
.A O
J2 4
90
1.A
.A O
B1
F1
QT
86
06
5
3 .D
69
93
02
RE
90
2 .A
.FJ
R .0
25
.A
G1
006
F1
AN
771
.FJ
082
2BR
2.0
R.0
RE
E.
7Z
F1.B
7.9
23
D.9
49
K.C
5.A
19
Q1
89
08
8
0.02
Figura 12: Análise filogenética por “neighbor-joining”, modelo de substituição de Tamura-Nei, do fragmento de
456pb correspondente à região C2-V3 do envelope viral de 163 amostras de HIV-1. Os círculos em preto representam
as amostras obtidas neste estudo. Os ramos em azul são referentes as amostras do subtipo B, em vermelho amostras
referentes ao sub-subtipo F1 e em verde aos subtipo C, D e CRF01_AE. A seta indica as amostras recombinantes
BF1. As sequências foram alinhadas com sequências de refência dos diferentes subtipos obtidas do banco de Los
Alamos. Valores de bootstrap acima de 70 estão representados na figura. A barra de escala indica 2% de divergência
nas sequências de nucleotídeos.
34
Figura 13: Análise por bootscan das amostras PR21764 , PI22953 e PR23149 na região C2-V3 do envelope viral.
Os parâmetros utilizados foram janela de 200pb e passos de 20pb. As sequências de referência utlizadas encontram-se
representadas na legenda.
Assim, juntando-se as 163 amostras subtipadas no presente estudo com as 75
previamente caracterizadas tivemos,
201
(84,5%) foram classificados como
pertencentes ao subtipo B; 22 (9,2%) ao sub-subtipo F1; 8 (3,4%) pertencentes ao
subtipo C; 3 (1,3%) ao D, 3 (1,3%) caracterizadas como BF1 e 1 (0,4%) CRF01_AE.
Através da tradução das sequências de nucleotídeos, identificamos a presença do
Triptofano (W) no lugar da Prolina (P) na posição 16 do topo da alça V3 da gp120 em
58 (28,9%) sequências B, sendo essas então classificadas como variante B” do subtipo
B (Figura 14).
35
O gráfico abaixo representa a distribuição dos subtipos de HIV-1 na população
geral estudada (n=238):
28,9 % B”
Figura 14: Distribuição dos subtipos encontrados na população estudada (n=238).
5.3.
Análise da distribuição dos subtipos nos distintos perfis de
progressão
Uma vez subtipadas todas as amostras, partimos para avaliação da possível
correlação entre os subtipos detectados com os três perfis de progressão para a aids. A
tabela 4 sumariza a distribuição dos subtipos nos diferentes perfis (131PI; 92 PR e 15
LTNP), onde pudemos observar que os subtipos tiveram uma distribuição equivalente
entre os três perfis, dessa forma, nenhuma correlação estatisticamente significativa foi
observada (p>0,05) (tabela 5). Contudo, foi possível observar uma maior
representatividade do sub-subtipo F1 no grupo dos progressores rápidos. Destacamos
que os três indivíduos caracterizados como subtipo D apresentaram progressão rápida.
36
Tabela 4: Distribuição dos subtipos de HIV-1 de acordo com os diferentes perfis de progressão para a
aids.
B
B"
F1
Outros* Total (100%)
Progressores Rápidos
50 (54,3%) 21 (22,8%) 11 (12,0%) 10 (10,9%)
92
Progressores Intermediários
84 (64,1%) 32 (24,4%) 10 (7,6%) 5 (3,8%)
131
Não progressores de longo termo 9 (60,0%) 5 (33,3%) 1 (6,7%)
0
15
Total
143
58
22
15
238
* PR: 4C, 3D, 1CRF01_AE, 2BF1; PI: 4C, 1BF1
Tabela 5: Análise estatística entre os principais subtipos e os três perfis de progressão.
Subtipo
B
B"
F1
Valor de p*
Perfil de progressão
PR x PI
0,454
PR x LTNP
0,888
PI x LTNP
0,591
PR x PI
0,974
PR x LTNP
0,531
PI x LTNP
0,537
PR x PI
0,2
PR x LTNP
0,684
PI x LTNP
1
* valor de p não significativo no T este do Qui quadrado e T este exato de Fisher (p>0,05)
PR - Progressores rápidos; PI - Progressores intermediários; LT NP - Não progressores de
longo termo
A fim de avaliarmos se alguma linhagem de vírus subtipo-específica poderia
estar circulando em algum dos três perfis de progressão, destacamos nas figuras a seguir
a análise filogenética das amostras por subtipo de acordo com o perfil de progressão,
figura 15 (subtipo B), figura 16 (variante B”) e figura 17 (sub-subtipo F1). De acordo
com essas análises, nenhum agrupamento subtipo-específico pode ser detectado de
acordo com o perfil de progressão.
37
B
99
88
99
99
99
B.BR
.02.0
2BR
0
B .F
99
B.A
02.D
Q35
8805
R .0
0.A
RM
S0
08.A
R.
Y0
83
3 72
69
.H
XB
2L
I I IB
92
AI
BR
U.
K0
34
55
86
99
99
90
006
F1.BR.02.02BR082.FJ771
F1.AR.02.ARE933.DQ189088
F1.AO.06.AO 06 ANG125.FJ900269
C.BR.04.04BR013.AY727522
C.AR.0
1.A
RG
400
6.AY563170
C.BR.04.04
BR021.A
Y727523
A.CD.02
.02
CD
A.CD.9
KT
B035.AM
7.97C
A.CD.9
000055
D KCC
7.97CD
2.AM00
KTB13.
AM0000
0053
54
0.02
Figura 15: Análise filogenética por “neighbor-joining”, modelo de substituição de Tamura-Nei, do fragmento de
456pb correspondente à região C2-V3 do envelope viral das amostras de HIV-1subtipadas como B. Os círculos em
azul representam as amostras de Progressores intermediários; e os círculos em vermelho as amostras de Progressores
rápidos e em verde as amostras de Não progressores de longo termo. As sequências foram alinhadas com sequências
de refência dos diferentes subtipos obtidas do banco de Los Alamos. Valores de bootstrap acima de 70 estão
representados na figura. A barra de escala indica 2% de divergência nas sequências de nucleotídeos.
38
99
B”
99
99
99
B.BR
.02
008.A
RMS
.00.A
B.AR Q358805
02.D
0
R
.02B
Y 03
7269
84
99
95
.8 3
.H
XB
2L
AI
II IB
BR
U.
K0
34
55
97
93
FR
92
73
88
B.
85
99
99
99
91
3
2732
DK.M
.83.N
4
D.CD
.K0345
.83.ELI
D.CD
0054
.AM00
TB13
CD K
.97.97
A.CD
53
55
.AM0000
AM0000
KTB035
KCC2.
2.02CD
A.CD.0
NIH047
.95T
H.1995
01 AE.T
D
7.97C
082.FJ771006
F1.AR.02.ARE933.DQ189088
1
93.93JP NH
A.CD.9
01 AE.JP.19
249235
F1.AO.06.AO 06 ANG125.FJ900269
BR
F1.BR.02.02
K.CD.97.97ZR EQTB
11.AJ
K.CM.96.96CM MP535.AJ249239
G.CM.01.01CM
4049HAN.AY37112
1
G.BE.96.D
RCBL.AF084
J.SE.93.S
936
E9280 78
87.AF082
H.BE.9
394
3.VI997.
AF19
01
28
C.BR
C.BR.0
.04.0
4.04B
H.BE.9
4B R
R021.
013.A
3.VI991
AY72
C
75
.AF190
.A
23
R.01 Y727522
127
.AR
G40
06.A
Y 56
317
0
0.02
Figura 16: Análise filogenética por “neighbor-joining”, modelo de substituição de Tamura-Nei, do fragmento de
456pb correspondente à região C2-V3 do envelope viral das amostras de HIV-1subtipadas como B, onde apenas
amostras pertencentes à variante B” foram marcadas. Os círculos em azul representam as amostras de Progressores
intermediários; e os círculos em vermelho as amostras de Progressores rápidos e em verde as amostras de Não
progressores de longo termo. As sequências foram alinhadas com sequências de refência dos diferentes subtipos
obtidas do banco de Los Alamos. Valores de bootstrap acima de 70 estão representados na figura. A barra de escala
indica 2% de divergência nas sequências de nucleotídeos.
39
F1.BR.02.02BR082.FJ771006
F1
83
93
.A
02
R.
.A
88
F1
99
99
B
.0
2.
0
B .F
R
.B
R
.8 3
2B
R
.H
D
I II I
B
05
345
3
DK.M2732
5
D.CD.83.N
.K 0
D.CD.8
3.ELI.K
03454
BR
U
.00.A
R
M
S
008.A
Y037
269
LA
88
B.AR
2.
XB
2
00
Q3
5
0.02
23
75
72
AY
9
1.
26
02
00
J9
BR
.F
04
25
4.
.0
G1
BR
AN
522
C.
06
727
O
AY
.A
13.
06
R0
O.
4B
.A
4 .0
R. 0
F1
C .B
3170
06.AY56
.ARG40
C.AR.01
RE
93
3.
99
DQ
18
90
88
74
77
Figura 17: Análise filogenética por “neighbor-joining”, modelo de substituição de Tamura-Nei, do fragmento de
456pb correspondente à região C2-V3 do envelope viral das amostras de HIV-1subtipadas como F1. Os círculos em
azul representam as amostras de Progressores intermediários e os círculos em vermelho as amostras de Progressores
rápidos. As sequências foram alinhadas com sequências de refência dos diferentes subtipos obtidas do banco de Los
Alamos. Valores de bootstrap acima de 70 estão representados na figura. A barra de escala indica 2% de divergência
nas sequências de nucleotídeos.
5.4.
Análise temporal quanto ao uso do correceptor de entrada
Com a finalidade de analisar a troca do uso do correceptor de entrada utilizado
pelo vírus nos três principais subtipos/variantes (B, B” e F1) em dois momentos da
progressão (antes e após), foi necessário observar a data de progressão de cada
indivíduo analisado e verificar se o mesmo apresentava pelo menos uma amostra
biológica com carga viral maior que 1000 cópias/ml em um momento antes e outro após
40
a progressão para a aids. Do total de indivíduos subtipados, apenas 29 apresentaram
amostras estocadas em nosso laboratório nos dois períodos avaliados. Desses, 14
pertenciam ao subtipo B; 7 a variante B”; 6 F1 e 2 pertenciam ao subtipo C. Uma
análise filogenética das sequências obtidas antes e após a progressão dos indivíduos
avaliados foi realizada e encontra-se apresentada na figura 18. Conforme o esperado,
para cada indivíduo, as amostras pertencentes aos dois períodos se agruparam, além
disso, foi possível observar que para alguns indivíduos a distância entre suas duas
amostras foi curta, demonstrando que as mesmas quase não evoluíram ao longo do
tempo.
41
13229A
99
13229P
13707A
99
13707P
18947A
99
18947P
22091A
99
22091P
21125A
99
21125P
15963A
99
15963P
16290A
99
16290P
12857A
99
12857P
16712A
99
16712P
18653A
99
18653P
19534A
99
19534P
B
19054A
99
19054P
B.FR.83.HXB2 LAI IIIB BRU.K03455
20042A
99
20042P
B.BR.02.02BR002.DQ358805
17396A
99
17396P
20168A
99
20168P
19268A
99
19268P
B.AR.00.ARMS008.AY037269
13971A
99
83
13971P
24503A
99
24503P
21068A
99
21068P
18875A
99
18875P
20791A
99
20791P
A.CD.02.02CD KTB035.AM000055
91
A.CD.97.97CD KTB13.AM000054
A.CD.97.97CD KCC2.AM000053
19552A
96
19552P
86
20396A
98
78
C
20396P
C.BR.04.04BR021.AY727523
C.AR.01.ARG4006.AY563170
C.BR.04.04BR013.AY727522
H.BE.93.VI991.AF190127
86
H.BE.93.VI997.AF190128
K.CD.97.97ZR EQTB11.AJ249235
96
K.CM.96.96CM MP535.AJ249239
F1.AO.06.AO 06 ANG125.FJ900269
17862A
83
17862P
80
20393A
99
20393P
14811A
99
14811P
F1
F1.BR.02.02BR082.FJ771006
21555A
88
21555P
19378A
99
19378P
F1.AR.02.ARE933.DQ189088
13399A
99
13399P
0.02
0.02
Figura 18: Análise filogenética por “neighbor-joining”, modelo de substituição de Tamura-Nei, do fragmento
correspondente à região C2-V3 do envelope viral das amostras dos indivíduos nos momentos antes (A) e após (P) a
progressão. Os círculos em preto representam as amostras obtidas no presente estudo. Os ramos em azul, amostras
referentes ao subtipo B, em vermelho amostras referentes ao sub-subtipo F1 e em verde aos subtipo C, D e
CRF01_AE. As sequências foram alinhadas com sequências de refência dos diferentes subtipos obtidas do banco de
Los Alamos. Valores de bootstrap acima de 70 estão representados na figura. A barra de escala indica 2% de
divergência nas sequências de nucleotídeos.
42
As análises de predição do uso do correceptor realizadas para essas amostras,
nos dois momentos, estão sumarizadas na tabela 6. De maneira geral, das 29 sequências
de antes da progressão analisadas, 23 (79,3%) foram caracterizadas como vírus R5; 5
(17,2%) foram caracterizadas como vírus X4 e 1 (3,4%) não pode ser classificada
devido ao resultado discordante nos distintos métodos de análise. Já em relação às
sequências obtidas após a progressão, 20 (69%) foram caracterizadas como vírus R5; 8
(27,6%) como vírus X4 e 1 (3,4%) não classificada pelo mesmo motivo detectado
anteriormente. Da análise do uso do correceptor de acordo com o subtipo, dos 14
indivíduos classificados como subtipo B, 10 (71,4%) apresentaram a forma viral R5
antes e após a progressão; 2 (14,3%) apresentaram vírus R5 antes da progressão e X4
após; 1 (7,1%) apresentou perfil X4 antes e após a progressão e, curiosamente, 1 (7,1%)
indivíduo apresentou vírus X4 antes e R5 depois da progressão. Dentre os 7
caracterizados como B”, 4 (57,1%) apresentaram vírus R5 antes e após a progressão e 3
(42,9%) apresentaram vírus X4 nos dois momentos. Com relação ao sub-subtipo F1, em
3 (50%) indivíduos foram encontrados vírus R5 antes e após a progressão; 2 (33,3%)
apresentaram vírus R5 antes e X4 após a progressão e 1 (16,7%) não pode ser
classificado. Quanto aos dois indivíduos subtipados como C, ambos tiveram vírus R5
em nos momentos analisados.
43
Tabela 6: Análise da predição do uso do correceptor de entrada com base na região da alça V3 com a utilização dos programas Geno2pheno, webPSSM e Regra das
posições 11/25.
Amostra
Subtipo
Alça V3
(11)
P12857 A
P
P13971 A
P
P16712 A
P
P17396 A
P
P18653 A
P
P18875 A
P
P19054 A
P
PR19268 A
P
PR20042 A
P
P20168 A
P
PR20791 A
P
P21068 A
P
(25)
CTRPSNNTRKGIHFGPGRALYTT-KIIGDIREAHC
CTRPSNNTRKGIYFGPGRALYTT-KIIGDIREAHC
CTRPNNNTRRGIHIGPGSAFYTT-NIVGDIRKAYC
CTRPNNNTRRGIGIGPGRRAFVTTKIVGDIRKAYC
CTRPNNNTRKSISFGPGSAFYTTGDIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRKSISFGPGSAFYTTGDIIGDIRQAHC
CTRPGNNTRRSIHIGPGSAWYTTGDIIGDIRQAHC
CTRPGNNTRRSIHIGPGSAWYTTGDIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRKSITIGPGAAFF-TGEIIGNIRKAYC
CTRPNNNTRKSITIGPGAAFF-TGEIIGDIRRAYC
CTRPNNNTRKSIHMGPGRVFFAT-DIIGNIRRAHC
CIRPNNNTRKSIPMGPGKVFFAT-DIIGDIRRAHC
CTRPNNNTRKSIPIGPGRAFFTTGQIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRKRISIGPGRAFFTTGQIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRRSITIGPGRAFYAT-NIIGNIRDAHC
CTRPNNNTRRSITIGPGRAFYTT-NIIGNIRDAHC
CTRPNNNTRKGIHIGPGRAFYATGQIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRKGIHIGPGRAFYATGQIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRKSIHFAPGSALYTT-EIIGDIRQAHC
CARPNNNTRKSIHFAPGSAWYTT-EIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRKSIRIGPGSAFYATGDIIGDIRQAHC
CSRPNNNTRKSIRIGPGRAFYATGDIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRKSIHMGPGKAFFATGQIIGDIRKAYC
CTRPNNNTRKSIHMGPGRAFFATGDIIGDIREAHC
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
B
Geno2pheno
5% 10% 20%
R5 X4 X4
X4 X4 X4
R5 R5 X4
X4 X4 X4
R5 R5 R5
R5 R5 R5
R5 R5 R5
R5 R5 R5
R5 R5 R5
R5 R5 R5
R5 X4 X4
R5 R5 R5
R5 R5 R5
X4 X4 X4
R5 R5 R5
R5 R5 R5
R5 R5 R5
R5 R5 R5
R5 R5 R5
R5 R5 X4
R5 R5 X4
R5 R5 X4
R5 R5 R5
R5 R5 R5
44
Regra das posições
11/25 do V3
webPSSM
Classificação final
X4
X4
R5
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
R5
R5
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
X4
R5
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
X4
R5
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
R5
R5
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
P21125 A
P
P24503 A
P
P13229 A
P
P13707 A
P
P15963 A
P
P16290 A
P
P18947 A
P
P19534 A
P
P22091 A
P
PR13399 A
P
P14811 A
P
P17862 A
P
P19378 A
P
CTRPNNNTRKGIHTAFGRTLYATGAIIGDIRKAYC
CTRPNNNTRKGIHTAFGRTLYATGAIIGDIRKAYC
CTRPNNNTRRSIPMGPGKAFFATGDIIGDIRKAHC
CTRPNNNTRRSIPMGPGKAFFATGDIIGDIRKAHC
CTRPNNNTRKSIHIGWGRSLYTVGEIIGNIRQAHC
CTRPHNNTRKSIHIGWGRSLYTVGEIIGDIRQAHC
CTRPNNNTSKGIHLGWGRAFYATERITGDIRKAYC
CTRPNNNTSKGIHLGWRRSFFVTEKITGDTRKAFC
CTRPNNNTRKSIHMGWGRAFYATGEIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRKSIHMGWGRAFYATGEIIGDIRQAHC
CTRPNNNTRKSIHMGWGRAFYATGEIIGDIRKAYC
CTRPNNNTRKSIHMGWGRAFYATGEIIGDIRKAYC
CTRPNNNTAKSIHMGWGRVFHATGRIIGDIRQAHC
CTRPNNNTAKSIHMGWGRVFHATGRIIGDIRQAHC
CTRPGNYTRKSIYLGWGRALYATGDIIGDKRKAHC
CTRPGNYTRKSIYLGWGRAVYATGDIIGDKRKAHC
CTRPNNNTRKSIHIGWGRALFTTGEIIGEIRKAYC
CTRPNNNTRKSIHIGWGRALFTTGEIIGEIRKAHC
CTRPNNNTRKSIHIGPGQAFYATGDIIGDIRKAHC
CTRPNNNTRKSIHIGPGQAFYATGDIIGDIRKAHC
CTRPNNNTRKSIHLGPGQAFYATGDIIGDIRKAHC
CTRPNNNTRKSIHFGPGHAFHATGNIIGDIRKAHC
CTRPNNNTRKSIRIGPGSAFYATGEIIGDIRKAHC
CTRPNNNTRKSIRIGPGSAFYATGDIIGNIRKAHC
CTRPNNNTRKSIRIGPGQAFYTTGDIIGDIRKAHC
CTRPNNNIRKSIRIGPGQAFYTTGDIIGDIRKAHC
B
B
B"
B"
B"
B"
B"
B"
B"
F1
F1
F1
F1
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
X4
R5
R5
R5
R5
X4
X4
X4
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
45
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
X4
R5
R5
R5
R5
X4
R5
X4
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
X4
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X4
R5
R5
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R5
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R5
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R5
R5
R5
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R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
X4
R5
R5
R5
R5
X4
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R5
X4
R5
R5
Nr
Nr
Nr
Nr
Nr
Nr
Nr
Nr
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
X4
R5
R5
R5
R5
X4
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
X4
R5
R5
R5
R5
X4
X4
X4
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
NÃO CLASSIFICADO
NÃO CLASSIFICADO
R5
X4
P20393 A CTRPNNNTRKSIPIGPGRAFYATGDIIGDIRRAHC
F1
R5 R5 R5
P CTRPYKNTRKSIPIGPGRAFYTTGEIIGDIRKAHC
X4 X4 X4
P21555 A CTRPNNNTRKSIRIGPGQAFYATGGIIGDIRKAHC
F1
R5 R5 X4
P CTRPNNNTRKSIHIGPGQAFYATGDIIGDIRKAHC
R5 R5 R5
PR19552 A CTRPNNNTRKSMRIGPGQTFYATGDIIGDIRQAHC
C
R5 R5 R5
P CTRPNNNTRKSMRIGPGQTFYATGDIIGDIRQAHC
R5 R5 R5
PR20396 A CVRPNNNTRKSMRIGPGQTFYATGDIIGDIRQAHC
C
R5 R5 R5
P CIRPNNNTRKSLRIGPGQTFYATGDIIGDIRQAHC
R5 R5 X4
nr = não realizado
A = sequência antes da progressão; P = sequência após a progressão
As posições 11 e 25 estão destacadas em verde, assim como o topo da alça v3 está em amarelo.
46
Nr
Nr
Nr
Nr
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
R5
X4
R5
R5
R5
R5
R5
R5
VI. Discussão
6.1.
Identificação dos perfis de progressão para a aids
O presente estudo é parte de um projeto maior em desenvolvimento em nosso
laboratório, o qual tem como finalidade a avaliação da influência da diversidade viral e
dos marcadores genéticos do hospedeiro em indivíduos infectados pelo HIV-1 com
diferentes perfis de progressão para a aids. Diversos fatores relativos tanto ao perfil
genético quanto ao perfil imunológico do hospedeiro, bem como características
inerentes ao vírus têm sido associados à progressão, no entanto, a influência viral, ainda
é um assunto controverso e poucos estudos abordam essa temática apesar de sua
importância. Esse tipo de estudo é de difícil condução, pois em países onde se verifica
uma co-circulação bem representativa de subtipos de HIV, não se dispõem de um fluxo
regular de exames de contagem de células TCD4+ e carga viral para o acompanhamento
dos pacientes HIV positivos e de um banco de dados dos pacientes em
acompanhamento pelo longo período de infecção, e em países onde há uma boa
estrutura para acompanhamento de pacientes, geralmente é observada a prevalência de
um subtipo viral, geralmente o subtipo B. No Rio de Janeiro existe uma co-circulação
dos subtipos B, F1, recombinantes BF1, além da variante B” do subtipo B, e há um
suporte do governo quanto aos exames de rotina acima citados, os quais são em parte
realizados pelo Laboratório de AIDS e Imunologia Molecular/IOC. Além disso, temos
uma parceria de longa data com o Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC),
o que nos possibilitou a obtenção de dados clínicos e epidemiológicos para
classificação dos pacientes quanto aos distintos perfis de progressão. Neste sentido, o
presente estudo nos permite avaliar a associação entre características virais, como o
subtipo viral e o uso do correceptor de entrada na célula utilizado pelo vírus, com o
curso da infecção.
O primeiro objetivo deste trabalho foi classificar os pacientes HIV positivos em
acompanhamento no IPEC, de acordo com os dados clínicos, segundo os perfis de
progressão já descritos na literatura: progressores intermediários (PI), progressores
rápidos (PR) e não progressores de longo termo (LTNP). Do total de indivíduos
analisados, classificamos 486 pacientes. Desses, 58,6% foram classificados como PI;
36,8% como PR e 4,5% como LTNP. De fato, a literatura prevê cerca de 80% de PI,
15% de PR e 5% de LTNP (Pantaleo e Fauci, 1996; revisto por Langford et al., 2007;
47
Casado et al., 2010), ou seja, a nossa casuística ficou bastante acrescida de PR.
Entretanto, é importante destacar que este é um estudo retrospectivo, e que o banco de
dados contendo as informações clínicas e epidemiológicas dos pacientes não foi
desenhado exclusivamente para esse estudo, desta forma, muito pacientes tiveram seu
acompanhamento comprometido por não retornarem ao hospital para a realização dos
exames de rotina. Outros fatores que acarretaram a não classificação foram: ausência de
informações importantes para classificação em muitos dos casos, como datas de
sorologia negativa e positiva e exames de contagem de células TCD4+; o diagnóstico
tardio em muitos casos e uma porcentagem considerável de pacientes que ainda não
haviam evoluído para aids até a data de corte de análise do banco, dezembro de 2010.
Os estudos prévios que buscaram uma associação entre os subtipos virais e a
progressão para aids foram em grande parte baseados em coortes com pouco tempo de
acompanhamento (Amornkul et al., 1999; Kaleebu et al., 2002; Laurent et al., 2002;
Kaleebu et al., 2007; Easterbrook et al., 2010); alguns não apresentavam a data da
sorologia positiva dos pacientes (Kaleebu et al., 2002; Kaleebu et al., 2007; Vasan et
al., 2006); e ainda, alguns utilizaram a sorologia por peptídeos sintéticos como
metodologia para subtipagem (Santoro-Lopes et al., 2000; Casseb et al., 2002; De Brito
et al., 2006), sendo essa menos fidedigna que os métodos moleculares, com a
possibilidade de reatividade cruzada.
Diante deste panorama, esta etapa do presente trabalho foi realizada de forma
criteriosa tendo em vista a importância de uma classificação bem consistente dos
diferentes perfis de progressão para estudos da possível associação desses perfis com
características virais, tais como: subtipo e correceptor utilizado para entrada na célula
hospedeira.
6.2.
Caracterização molecular e distribuição dos subtipos no Rio de
Janeiro
Após a classificação dos indivíduos HIV-1 positivos nos diferentes perfis de
progressão para a aids, nosso próximo objetivo consistiu na caracterização molecular
das amostras classificadas. Para este fim, utilizamos a região C2-V3 da gp120 do
envelope viral, que é uma região bastante polimórfica e, rica em informações
48
filogenéticas. Além disso, esta é uma região determinante no tropismo de células T e
macrófagos (Shioda et al., 1991; Hwang et al., 1991), onde com base nas posições 11 e
25 da alça V3 da gp120 podemos predizer o correceptor utilizado pelo vírus para
entrada na célula (Fouchier et al., 1992; De Jong et al., 1992); contém o epítopo
reconhecido pelos anticorpos que neutralizam a infecção pelo HIV in vitro (Palker et
al., 1988; Larosa et al., 1990) e estimula uma potente resposta imunológica citotóxica e
auxiliar por linfócitos T (Takahashi et al., 1992; Palker et al., 1989). Logo, a região env
fornece subsídios importantes para o entendimento de forças seletivas que podem
influenciar na taxa de progressão da doença, além de ser importante nos estudos de
subtipagem do HIV-1.
De acordo com a caracterização molecular das amostras com relação ao subtipo
viral, constatamos uma alta prevalência do subtipo B (84,5%), seguido em menor
frequência do sub-subtipo F1 (9,2%); e pela detecção de alguns casos dos subtipos C;
D; e recombinantes BF1 e CRF01_AE. Estes achados concordam com os previamente
descritos em estudos iniciais no Rio de Janeiro com base na região do envelope, os
quais demonstram uma prevalência de 75-80% do subtipo B, enquanto que em torno de
10-15% são caracterizados como sub-subtipo F1 (Morgado et al., 1994; Morgado et al.,
1998; Tanuri et al., 1999; Guimarães et al., 2002). É importante ressaltar que
atualmente a maioria dos estudos baseia-se na região da polimerase viral e ainda sim um
alto percentual de B é descrito, porém, um acréscimo de recombinantes BF1 e
diminuição do sub-subtipo F1 é observado (Guimarães et al., 2010).
Casos isolados de subtipos C ,D (Morgado et al., 1998; Couto- Fernandez et al.,
2006) já haviam sido descritos no Rio de Janeiro, no entanto esta é a primeira descrição
do CRF01_AE. É importante ressaltar a recente disseminação do subtipo C para outras
regiões além do Sul (Cardoso et al., 2010; Ferreira et al., 2011; Brígido et al., 2011).
Destacamos ainda uma manutenção da frequência de amostras da variante B” dentro do
grupos de amostras caracterizadas como subtipo B, que foi de 28,9% neste estudo e 30 a
40% em estudos prévios (Potts et al., 1993; Morgado et al., 1994; Morgado et al.,
1998).
Alguns estudos realizados na região Sudeste demonstram correlação entre o subsubtipo F1 e a categoria dos usuários de drogas injetáveis (UDIs), apontando uma alta
proporção de F1 (19-23%) nesses indivíduos, o que indica que a frequência deste pode
49
diferir de acordo com a categoria de exposição (Rossini et al., 2001; Guimarães et al.,
2001; Teixeira et al., 2004; Maia Teixeira et al., 2006). Entretanto, essa associação não
foi observada no presente estudo.
Frente a essa cocirculação dos subtipos B e F1 do HIV-1 no Rio de Janeiro, os
eventos de recombinação se mostram frequentes, e bastante documentados em estudos
baseados na região da polimerase viral, ou envolvendo mais de uma região genômica.
Nesse estudo encontramos 1,3% de recombinantes BF1, uma taxa bem menor se
comparada a detectada (4 a 7,6%) em estudos realizados no Rio de Janeiro com base na
região polimerase (Ramos et al., 1999; Eyer-Silva e Morgado, 2007; Sa Ferreira et al.,
2007; Guimarães et al., 2010). Essa baixa representatividade de recombinantes já era
esperada, visto que a região do envelope viral possui um alto polimorfismo e
consequentemente uma baixa frequência de recombinações (Magiorkinis et al., 2003).
Através de uma análise preliminar de Neighbor-Joining não foi possível verificar
indícios de circulação de linhagens de vírus subtipo-específicas entre os diferentes
perfis de progressão, no entanto temos como perspectiva a realização de uma análise de
máxima verossimilhança ou bayesiana, as quais são mais robustas para esta análise.
Estudos prévios realizados com base na região do envelope descreveram um
agrupamento entre as amostras da variante B” demonstrando relação filogenética entre
essas, assim como foi verificado no presente estudo.
6.3.
Análise da distribuição dos subtipos nos perfis de progressão
Apesar de alguns estudos terem sugerido a associação da variante B” com um
perfil mais lento de progressão (Santoro-Lopes et al., 2000; Casseb et al., 2002; De
Brito et al., 2006; Araujo et al, 2010), no presente estudo não verificamos esta
associação. Nossos resultados estão de acordo com os achados de um estudo
recentemente publicado (Sucupira et al., 2012) que também não encontra associação
entre a variante B” e a progressão mais lenta. Vale ressaltar, que diferentemente do
nosso estudo, a maioria desses trabalhos utilizaram técnicas de subtipagem das amostras
baseadas em ensaios sorológicos com peptídeos sintéticos, que são técnicas menos
sensíveis podendo resultar em falso-positivos, o que não ocorre em ensaios moleculares.
No trabalho de Santoro-Lopes (2000), dos 331 indivíduos pertencentes ao subtipo B,
50
mais de 60% foram caracterizados como B”, porcentagem muito acima do esperado
para essa variante.
Uma frequência aumentada do sub-subtipo F1 nos grupos dos progressores
rápidos foi observada, porém, esta não reflete em significância estatística. Entretanto,
até o presente momento não temos relato de nenhum estudo sobre progressão e subtipo
F.
Observamos ainda, que as três amostras de subtipo D detectadas nesse estudo
apresentaram um perfil rápido de progressão, concordando com estudos que descrevem
uma progressão mais acelerada em infectados por esse subtipo (Kaleebu et al., 2001 e
2002; Baeten et al., 2007; Kiwanuka et al., 2008; Easterbrook et al., 2010).
6.4.
Análise temporal do uso do correceptor de entrada utilizado pelo
vírus
Diversos estudos tem sugerido que a troca do uso do correceptor CCR5 para
CXCR4 está relacionada com a progressão para aids (Berger et al., 1999; Brumme et
al., 2005; Kaleebu et al., 2007; Coetzer et al., 2006; Thielen et al., 2010 ), sendo assim,
com o objetivo de avaliar essa dinâmica, um subconjunto de amostras foi avaliado em
dois momentos da infecção.
Na análise temporal quanto ao uso do correceptor de entrada verificamos que a
maior parte dos indivíduos infectados pelo subtipo B manteve o perfil de vírus R5 ao
longo da infecção e que 14,3% fizeram a troca de R5 para X4. Este resultado difere do
observado em estudos prévios nos quais mais de 50% dos infectados pelo subtipo B
apresentam uma emergência de vírus X4 (Connor et al., 1997; Berger et al., 1999;
revisto por Araújo et al., 2010). Os demais 7,1% apresentaram vírus X4 em ambos os
momentos avaliados concordando com relatos de artigos que detectaram a presença
destes em 4 a 15,9% dos casos (De Mendonza et al., 2008; Huang et al., 2009; Frange
et al., 2009). Estes dados demonstram que a progressão para aids não está relacionada
somente ao perfil biológico do vírus. Com relação às amostras analisadas do subsubtipo F1, três (50%) apresentaram vírus R5 em ambos os momentos analisados e duas
(33,3%) fizeram a troca do correceptor de CCR5 para CXCR4. Dentre aqueles
infectados pela variante B”, uma porcentagem considerável (42,9%) apresentou vírus
51
X4 já no início da infecção. Essa porcentagem encontrada é superior ao esperado para o
início da infecção, e não concorda com os estudos que descreveram que vírus B”
utilizam exclusivamente o correceptor CCR5, apontando para uma progressão mais
lenta para a aids nesses indivíduos (Leal et al., 2008).
Ainda com relação a variante B”, em um trabalho recente, Sucupira e
colaboradores (2012)
sugeriram que o Triptofano pode ser substituído por outro
aminoácido ao longo do tempo, visto que este é codificado pelo códon TGG e o HIV-1
apresenta um processo de hipermutação do nucleotídeo G para A, comum aos
retrovírus. E atribuíram a este fato, a ausência de correlação entre a variante B” e a
progressão lenta para a aids em seu estudo. No entanto, na análise temporal das
amostras avaliadas de indivíduos infectados pela variante B”, não verificamos mudando
do Triptofano por outro aminoácido.
As duas amostras de subtipo C analisadas apresentaram vírus R5 tanto antes
quanto após a progressão, concordando com estudos prévios que relatam o uso
preferencial deste correceptor para este subtipo (Ping et al., 1999; Cecilia et al., 2000;
Coetzer et al., 2011). A reduzida incidência de vírus X4 nesses indivíduos pode ser
atribuída ao fato deste requerer mais mutações no V3 do que outros subtipos. Desta
forma, os subtipos podem desenvolver estratégias distintas para a mudança da utilização
do correceptor (Coetzer et al., 2011).
Com relação às análises de predição do uso dos correceptores, esperávamos ter
um número de amostras mais representativo de amostras por subtipo avaliado,
entretanto, encontramos alguns problemas na inclusão dessas amostras, tais como:
condições de armazenamento; carga viral abaixo de 1000 cópias/ml, não disponibilidade
de amostras para utilização. Tínhamos como objetivo inicial selecionar amostras com
tempo equivalente entre elas nos dois momentos estudados a fim de viabilizar uma
comparação mais acurada da troca do correceptor utilizado pelo vírus ao longo da
infecção. Diante do exposto, ficamos limitados a incluir todas as amostras que
apresentassem qualquer visita antes e após a progressão, sem nos preocuparmos que
todas tivessem o mesmo intervalo de tempo. Como perspectiva, pretendemos aumentar
o número de amostras analisadas através da inclusão de indivíduos não classificados por
ainda não terem evoluído para aids.
52
As análises a partir de assinaturas específicas do topo da alça V3 (posições 11 e
25) da gp120 são bastante comuns para inferir a predição do uso dos correceptores
utilizados pelo vírus para entrada na célula. Apesar da técnica padrão-ouro ser o ensaio
fenotípico, alguns programas facilitam a predição e são amplamente utilizados, como o
webPSSM e Geno2pheno. Entretanto, esses programas não discriminam os vírus R5X4.
Além da região V3, já foi descrito que outras regiões da gp120 também podem
influenciar nesse sentido. Vale ressaltar que estudos de predição dos correceptores
utilizados pelos vírus são de extrema importância para estudos terapêuticos.
O presente estudo nos permitiu melhor entendimento sobre a variante B” do
subtipo B tipicamente brasileira, onde observamos a manutenção desta na população de
indivíduos infectados no Rio de Janeiro e uma não-associação desta com a progressão
para aids. Enfatizamos ainda a importância de novos estudos com maior amostragem
para verificar a possível influência do sub-subtipo F1 com a progressão mais acelerada
para a aids. Além disso, reforçamos a possível associação entre o uso do correceptor de
entrada pelo vírus ao longo da infecção e o subtipo viral. No seu conjunto, os resultados
deste trabalho reforçam a necessidade de melhor se compreender características virais
que possa apontar marcadores de prognóstico para a aids.
53
VII.
Conclusões
ü A prevalência dos subtipos verificados nesse estudo concorda com os
previamente descritos no Rio de Janeiro;
ü Não foi verificada a circulação de linhagens de vírus subtipo-específicas nos
diferentes grupos de progressores;
ü Detectamos uma maior frequência do sub-subtipo F1 no grupos dos
progressores rápidos, embora sem significância estatística;
ü Não observamos associação da variante B” e a progressão mais lenta para a
aids;
ü Uma porcentagem considerável de vírus X4 no início da infecção em
indivíduos infectados pela variante B” foi observada. Fato que corrobora a
ausência de associação dessa variante com a progressão mais lenta para a
aids.
54
VIII.
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