Características biogenéticas e de resistência ao mercúrio

“Características biogenéticas e de resistência ao mercúrio em amostras
de Escherichia coli isoladas de sistemas aquáticos no Rio de Janeiro”
por
Raquel Costa de Luca Rebello
Dissertação apresentada com vistas à obtenção do título de Mestre em
Ciências na área de Saúde Pública.
Orientadora principal: Prof.ª Dr.ª Adriana Hamond Regua Mangia
Segundo orientador: Prof. Dr. Paulo Rubens Guimarães Barrocas
Rio de Janeiro, fevereiro de 2012.
Esta dissertação, intitulada
“Características biogenéticas e de resistência ao mercúrio em amostras
de Escherichia coli isoladas de sistemas aquáticos no Rio de Janeiro”
apresentada por
Raquel Costa de Luca Rebello
foi avaliada pela Banca Examinadora composta pelos seguintes membros:
Prof. Dr. Dennys Monteiro Girao
Prof.ª Dr.ª Joseli Maria da Rocha Nogueira
Prof.ª Dr.ª Adriana Hamond Regua Mangia – Orientadora principal
Dissertação defendida e aprovada em 28 de fevereiro de 2012.
Catalogação na fonte
Instituto de Comunicação e Informação Científica e Tecnológica
Biblioteca de Saúde Pública
R291
Rebello, Raquel Costa de Luca
Características biogenéticas e de resistência ao mercúrio em
amostras de Escherichia coli isoladas de sistemas aquáticos no
Rio de Janeiro. / Raquel Costa de Luca Rebello. -- 2012.
xxii,121 f. : il. ; tab. ; graf.
Orientador: Mangia, Adriana Hamond Regua
Barrocas, Paulo Rubens Guimarães
Dissertação (Mestrado) – Escola Nacional de Saúde Pública
Sergio Arouca, Rio de Janeiro, 2012
1. Escherichia coli. 2. Mercúrio-análise. 3. Variação Genética.
4. Ambiente Aquático. 5. Virulência. I. Título.
CDD - 22.ed. – 363.73098153
Este trabalho foi realizado no Departamento de Ciências Biológicas (DCB) e no
Departamento de Saneamento e Saúde Ambiental (DSSA) da Escola Nacional de Saúde
Pública Sergio Arouca/Fundação Oswaldo Cruz, com auxílio financeiro da Fundação
Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) e da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
iii
Ao meu pai Aluizio de Luca Rebello,
minha mãe Sonia Bretz Costa, e aos
meus avôs maternos Edilberto
Bacellar Costa e Wilma Bretz Costa
in memoriam todo o meu amor e
imensa saudade.
iv
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora da Dissertação de Mestrado Prof. Drª. Adriana Hamond Regua
Mangia, da Escola Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca (ENSP/Fiocruz), por todos
os ensinamentos durante os quatro anos de trabalho em seu laboratório, por sua
confiança, incentivo, dedicação e paciência.
Ao meu Segundo orientador Prof. Dr. Paulo Rubens Guimarães Barrocas, da Escola
Nacional de Saúde Pública Sérgio Arouca (ENSP/Fiocruz), também por todos os seus
muitos ensinamentos durante meu percurso pelo Mestrado.
Aos professores do Programa de Saúde Pública Adriana Hamond Regua Mangia, André
Reynaldo Santos Périssé, Antonio Nascimento Duarte, Elvira Maria Godinho de Seixas
Maciel, Joseli Maria da Rocha Nogueira, Rosemere Duarte, Sonia Duarte de Azevedo
Bittencourt e Valmir Laurentino Silva pelas disciplinas ministradas e pela dedicação ao
compartilhar seus conhecimentos com os alunos.
A todos os componentes do Departamento de Ciências Biológicas (DCB) agradeço de
coração pelo acolhimento e colaboração durante esses anos. Agradeço especialmente a
técnica Rose Mary Pimentel Bezerra pelos auxílios prestados durante o desenrolar da
Dissertação.
Ao Prof. Dr. Alexandre Soares Rosado do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes –
Universidade Federal do Rio de Janeiro (IMPPG/UFRJ) por ter permitido o
desenvolvimento de uma parte de minha Dissertação em seu laboratório.
Ao Prof. Dr. Rafael Duarte do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes – Universidade
Federal do Rio de Janeiro (IMPPG/UFRJ) por ter cedido gentilmente a sua aluna de
doutorado Karen Gomes para me auxiliar na realização da técnica de DGGE.
A doutoranda Karen Gomes do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes –
Universidade Federal do Rio de Janeiro (IMPPG/UFRJ) por auxiliar na realização da
técnica de DGGE. Agradeço enormemente a sua paciência e dedicação.
v
As alunas do Dr. Paulo Rubens Guimarães Barrocas, Adriana Bezerra de Lima
(Mestranda), Ana Claudia Vasconcellos (Doutoranda) e Sheila Duque (Doutoranda)
pelos ensinamentos, conversas, amizade e auxílio indispensável no desenvolvimento da
minha pesquisa de Mestrado.
A Marcelo Sampaio dos Santos Sampaio, técnico do Departamento de Saneamento e
Saúde Ambiental (DSSA/ENSP) e a Thiago Souza Figueiredo, aluno de Iniciação
Científica do Prof. Dr. Paulo Rubens Guimarães Barrocas pelo auxílio prestado durante
parte das coletas de campo realizadas neste trabalho.
A Prof. Drª. Joseli Maria da Rocha Nogueira, Prof. Dr. Dennys Monteiro Girão, Prof.
Dr. Antonio Nascimento Duarte e a Prof. Drª. Flavia Coelho Ribeiro por participarem
como componentes da banca de defesa da minha dissertação.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo
auxílio financeiro concedido durante o mestrado.
A minha companheira de subárea que se tornou uma grande amiga Thays Araujo
Gonçalves, que por muitas vezes me deu apoio nos momentos mais difíceis enfrentados
para concluir a Dissertação.
A minhas colegas de laboratório Fernanda Santos e Andréia Santos Silva pelos
conselhos e amizade.
Aos meus familiares, principalmente ao meu pai Aluizio de Luca Rebello e Sonia Bretz
Costa pelo auxílio material, amoroso e de conhecimentos. A minha avó Wilma Bretz
Costa in memoriam por todo seu amor por mim e pela vida, por toda a inspiração que
por sua causa sempre estará presente em minha vida. Ao meu avô Edilberto Bacellar
Costa in memoriam cujas memórias apesar de serem principalmente de minha infância
ainda estão muito claras e vivas.
As amigas Caroline Brandão, Polliana Lacerda, Isabelle Souza e Julia Rego pelos
muitos momentos de descontração.
Ao meu namorado Rômulo Pompeu Ferreira pela cumplicidade, companheirismo e
amor dedicados a mim.
vi
“A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original”
(Albert Einstein)
vii
RESUMO
Escherichia coli é uma bactéria com potencialidades de virulência para seres
humanos tendo impacto significativo na Saúde Pública, principalmente, de países em
desenvolvimento. Em alguns casos, esta bactéria pode carrear determinantes genéticos
de resistência ao mercúrio, o que a torna uma alternativa promissora para processos de
biorremediação. O objetivo desse estudo foi isolar amostras de E. coli a partir de
ambientes aquáticos no Estado do Rio de Janeiro e investigar características
biogenéticas e de resistência ao mercúrio. Para atingir a presente proposta foram
realizados testes bacteriológicos para o isolamento, a análise do padrão de
susceptibilidade ao mercúrio e a antimicrobianos e, ensaios moleculares de
amplificação visando a investigação do potencial de enteropatogenicidade, da
diversidade genética e da presença do gene merA. Foram incluídas no estudo 178
amostras de Escherichia coli isoladas de sistemas aquáticos no estado do Rio de
Janeiro. Os resultados obtidos revelaram a presença do gene merA em 14 amostras, cuja
diversidade foi revelada por eletroforese em gel desnaturante. A filogrupagem revelou
uma população bacteriana distribuída nos grupos A (91,6%), B2 (3,4%) e D (5%) e os
genes de enterovirulência foram detectados em 11,2% das amostras permitindo a
classificação nos patotipos ETEC, ATEC e STEC. A análise do genoma total por
ensaios de amplificação randômica do DNA polimórfico revelou uma elevada
diversidade genética entre as amostras de E. coli carreadoras do marcador de resistência
ao mercúrio. A resistência aos antimicrobianos foi detectada em 37% das amostras e
definiu 23 perfis de resistência distintos (I-XXIII) e o fenótipo de multirresistência foi
observado para até 07 dos antimicrobianos testados. Concluimos que amostras de
Escherichia coli com propriedades e potencialidades de virulência circulam amplamente
em diferentes sistemas aquáticos no Estado do Rio de Janeiro, alertando para ações
específicas na área de vigilância epidemiológica. Em função das potencialidades
patogênicas nas amostras bacterianas resistentes ao Hg, análises mais precisas são
requeridas visando aplicações em processos de biorremediação.
Palavras-chave: Escherichia coli, mercúrio, merA, diversidade genética, ecossistemas
aquáticos, virulência
viii
ABSTRACT
Escherichia coli is a bacterial specie with virulence potential for humans
impacting significantly on public health, especially in developing countries. In some
cases, this bacteria carry mercury resistance genetic markers, which makes it a
promising alternative for bioremediation processes. The objective of this study was to
isolate Escherichia coli from aquatic environments in the state of Rio de Janeiro and to
investigate biogenetic characteristics and resistance to mercury. To achieve this
proposal bacteriological tests were carried out in order to isolate, to determine
antimicrobial and mercury susceptibility, and to investigate the potential of
enteropathogenicity, diversity and the presence of the merA gene by molecular
approaches. The study included 178 strains of Escherichia coli isolated from different
aquatic systems in the state of Rio de Janeiro. The results detected the presence of the
merA gene in 14 samples, which diversity was analysed by denaturing gel
electrophoresis methodology. Phylogenetic analysis revealed a bacterial population
distributed in groups A (91.6%), B2 (3.4%) and D (5%) and enterovirulence genes were
detected in 11.2% of the samples allowing classification in ETEC, ATEC, and STEC
pathotypes. Random amplification of polymorphic DNA typing revealed a high genetic
diversity among mercury resistant bacterial population. Antimicrobial resistance was
detected in 37% of the samples and defined 23 distinct profiles (I-XXIII) and multidrug
resistance phenotype was observed for up to 07 antimicrobials. The study revealed
Escherichia coli strains with virulence properties and potential are circulating widely in
different aquatic systems in the state of Rio de Janeiro, alerting to specific actions in the
area of surveillance. Due to enteropathogenic potential of E. coli samples resistant to
Hg, more accurate analysis is required aiming applications in bioremediation processes.
Key-words: Escherichia coli, mercury, merA, genetic diversity, aquatic ecosystems,
virulence
ix
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
01
1.1) Contaminação microbiológica dos sistemas aquáticos
01
1.2) Escherichia coli
02
1.3) Patotipos intestinais de Escherichia coli
03
1.3.1) E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli enteropatogênica atípica
(ATEC)
04
1.3.2) E. coli enterotoxigênica (ETEC)
06
1.3.3) E. coli enteroinvasora (EIEC)
07
1.3.4) E. coli produtora de toxina de Shiga (STEC) e E. coli enterohemorrágica
(EHEC)
09
1.3.5) E. coli enteroagregativa (EAEC)
10
1.4) Agrupamento filogenético de Escherichia coli
13
1.5) Resistência a antimicrobianos em Escherichia coli
14
1.6) Diversidade genética de populações bacterianas
15
1.7) Escherichia coli ambiental
16
1.8) Contaminação química dos sistemas aquáticos
17
1.9) Mercúrio
17
1.9.1) Toxicologia do mercúrio
18
1.10) Mecanismos de resistência bacteriana ao mercúrio
20
1.11) Co-seleção da resistência a antimicrobianos e a metais
20
1.12) Operon-mer
21
2. OBJETIVOS
24
2.1) Objetivo geral
24
2.2) Objetivos específicos
24
3. ÁREA DE ESTUDO
25
3.1) Águas de regiões de aglomerados residenciais
25
3.2) Águas de regiões industriais
25
3.3) Águas de regiões de agropecuária
25
3.4) Águas próximas a hospitais
26
3.5) Águas recreacionais
26
x
4. METODOLOGIA
28
4.1) Coleta de água
28
4.2) Isolamento e identificação de Escherichia coli
28
4.3) Estocagem das cepas de Escherichia coli
30
4.4) Avaliação da susceptibilidade ao mercúrio
30
4.4.1) Determinação do fenótipo de resistência ao mercúrio
30
4.4.2) Determinação da concentração mínima inibitória (CMI)
30
4.5) Avaliação da susceptibilidade aos antimicrobianos
31
4.6) Extração do DNA bacteriano
32
4.7) PCR para amplificação do gene merA
32
4.7.1) Reação de PCR
32
4.7.2) Condições de eletroforese
32
4.8) PCR-Triplex para agrupamento filogenético de Escherichia coli
33
4.8.1) Reação de PCR
33
4.8.2) Condições de eletroforese
34
4.8.3) Agrupamento filogenético
35
4.9) PCR-Multiplex para enterovirulência de Escherichia coli (PCR-DEC)
35
4.9.1) Reação de PCR
35
4.9.2) Condições de eletroforese
36
4.10) Amplificação randômica do DNA polimórfico (RAPD-PCR)
38
4.10.1) Extração do DNA e reação de PCR
38
4.10.2) Condições de eletroforese
39
4.11) Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE)
40
4.11.1) Extração do DNA em gel
40
4.11.2) Reação de PCR
40
4.11.3) Condições de eletroforese
41
5. RESULTADOS
43
5.1) Coleta de água, isolamento e identificação de Escherichia coli
44
5.2) Fenótipo de susceptibilidade ao mercúrio
45
5.2.1) Determinação do fenótipo de resistência ao mercúrio e determinação da
concentração mínima inibitória (CMI)
5.3) Fenótipo da susceptibilidade aos antimicrobianos
5.3.1) Fenótipo da susceptibilidade a antimicrobianos por área de coleta
5.4) PCR para amplificação do gene merA
45
46
48
50
xi
5.4.1) PCR-merA por área de coleta
52
5.4.2) PCR-merA e fenótipo de resistência aos antimicrobianos
52
5.5) PCR-Triplex para agrupamento filogenético de Escherichia coli
54
5.5.1) Filogrupagem por área de coleta
55
5.5.2) Filotipagem em amostras merA+
56
5.6) PCR-Multiplex para enterovirulência de Escherichia coli (PCR-DEC)
56
5.6.1) Perfil de enterovirulência por área de coleta
58
5.6.2) Perfil de enterovirulência em amostras merA+
62
5.6.3) Perfil de enterovirulência, fenótipo de resistência aos antimicrobianos e
grupo filogenético
62
5.7) Amplificação randômica do DNA polimórfico (RAPD-PCR)
63
5.8) Eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE)
70
6. DISCUSSÃO
79
6.1) Coleta de água, isolamento e identificação de Escherichia coli
80
6.2) Fenótipo da susceptibilidade ao mercúrio
81
6.2.1) Determinação do fenótipo de resistência ao mercúrio e determinação da
concentração mínima inibitória (CMI)
81
6.3) Fenótipo da susceptibilidade aos antimicrobianos
83
6.4) PCR para amplificação do gene merA
87
6.5) PCR-Triplex para agrupamento filogenético de Escherichia coli
89
6.6) PCR-Multiplex para enterovirulência de Escherichia coli (PCR-DEC)
90
6.7) Amplificação randômica do DNA polimórfico (RAPD-PCR)
93
6.8) Eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE)
93
6.9) Biorremediação
94
7. CONCLUSÕES
96
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
98
ANEXO – Soluções utilizadas para PCR
118
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Iniciadores de PCR para a amplificação do gene merA
33
Tabela 2. Iniciadores de PCR-triplex para agrupamento filogenético de E. coli
34
Tabela 3. Iniciadores utilizados para o PCR-multiplex para enterovirulência de
E. coli
37
Tabela 4. Iniciadores para amplificação randômica do DNA polimórfico de E. coli
39
Tabela 5. Iniciadores de PCR para a amplificação do gene merA usados para o ensaio
de DGGE
41
Tabela 6. Número de amostras de E. coli por área e ponto de coleta
44
Tabela 7. Número e porcentagem de amostras de E. coli HgR por área de coleta
45
Tabela 8. Número e porcentagem de amostras de E. coli HgR isoladas de águas de
regiões de aglomerados residenciais
45
Tabela 9. Perfis de resistência a antimicrobianos encontrados nas amostras de E. coli
por área de coleta
46
Tabela 10. Número de amostras de E. coli resistentes aos antimicrobianos separados
por classe e grupo de antimicrobianos
47
Tabela 11. Perfis de amplificação resultantes dos produtos de PCR-merA
51
Tabela 12. Amostras de E. coli merA+ por área e ponto de coleta
52
Tabela 13. Resistência aos antimicrobianos nas amostras de E. coli merA+
53
Tabela 14. Grupo e perfil filogenético das amostras de E. coli incluídas no estudo
55
Tabela 15. Grupo filogenético das amostras de E. coli por área de coleta
55
xiii
Tabela 16. Perfis de enterovirulência e grupo filogenético das amostras de E. coli
57
Tabela 17. Distribuição dos marcadores genéticos de enterovirulência investigados nas
amostras de E. coli por área de coleta
60
Tabela 18. Distribuição dos perfis de enterovirulência nas amostras de E. coli conforme
áreas e pontos de coleta
61
Tabela 19. Características gerais de enterovirulência e resistência a antimicrobianos nas
amostras de E. coli carreadoras de marcadores de enteropatogenicidade
63
Tabela 20. Representação numérica dos perfis de RAPD-PCR das amostras de E. coli
merA+ a partir dos iniciadores utilizados
64
Tabela 21. Características biogenéticas das amostras de E. coli que apresentaram perfis
eletroforéticos de RAPD-PCR idênticos entre si com os iniciadores 1247, 1290 e
1254
65
Tabela 22. Características fenotípicas e genotípicas investigadas nas amostras de E.
coli incluídas no estudo
70
xiv
LISTA DE QUADROS, GRÁFICOS E FIGURAS
Quadros
Quadro 1. Principais características de E. coli enteropatogênica típica e atípica
05
Quadro 2. Genes e fatores de virulência descritos para EAEC
12
Quadro 3. Classificação dos patotipos intestinais de E. coli com base nos marcadores
genéticos investigados
38
Gráficos
Gráfico 1. Porcentagem total de amostras de E. coli resistentes por antimicrobiano
testado
47
Gráfico 2. Porcentagem total de amostras resistentes a antimicrobianos de acordo com
a área de coleta
50
Gráfico 3. Porcentagem de amostras de E. coli merA+ por antimicrobiano testado
53
Gráfico 4. Proporção dos genes de enterovirulência nas amostras de E. coli
58
Gráfico 5. Proporção dos marcadores de enterovirulência em amostras de E. coli por
área de coleta
59
Figuras
Figura 1. A diversidade patogênica de E. coli
03
Figura 2. Microscopia eletrônica mostrando a lesão A/E induzida por EPEC típica
05
Figura 3. Microscopia eletrônica mostrando a expressão do BFP em EPEC típica
06
Figura 4. Padrão de aderência localizada manifestado por EPEC típica em células
HEp-2
06
xv
Figura 5. Padrão de aderência expresso por EAEC em células HEp-2
12
Figura 6. Esquema geral de patogenicidade descritos para os patotipos diarreiogênicos
de E. coli
13
Figura 7. Diagrama esquemático do ciclo de vida de E. coli
17
Figura 8. Estrutura genética do operon mer em bactérias Gram-negativas
22
Figura 9. Mecanismo proposto de resistência bacteriana ao mercúrio de “amplo
espectro” e de “espectro restrito”
22
Figura 10. Rio Faria (Esquerda) e Rio Jacaré (Direita)
27
Figura 11. Canal do Cunha (Esquerda) e Rio Iguaçú (Direita)
27
Figura 12. Canal do Mangue (Esquerda) e Lagoa Rodrigo de Freitas (Direita)
27
Figura 13. Procedimento de coleta e filtração da água coletada
28
Figura 14. Fotografia do aspecto colonial característico de E.coli em Teague
29
Figura 15. Fotografias do procedimento de isolamento e provas bioquímicas para
confirmação de espécie
30
Figura 16. Teste de sensibilidade a antimicrobianos: halos de inibição exibidos pela
amostra RM 95
31
Figura 17. Árvore de classificação filogenética de amostras de E. coli
35
Figura 18. Ensaio DGGE
41
Figura 19. Esquema geral de caracterização realizada para as amostras de E. coli
incluídas neste estudo
42
Figura 20. Eletroforese em gel de agarose do produto de amplificação para detecção do
gene merA
51
xvi
Figura 21. Eletroforese em gel de agarose do produto de amplificação para detecção do
gene merA
51
Figura 22. Perfis eletroforéticos dos agrupamentos filogenéticos de E. coli encontrados
neste estudo
54
Figura 23. Perfis eletroforéticos obtidos a partir da amplificação simultânea dos genes
de enterovirulência
57
Figura 24. Eletroforese dos produtos de PCR-DEC nas amostras de E. coli
merA+
62
Figura 25. Perfis eletroforéticos das amostras de E. coli merA+ obtidos a partir da
amplificação randômica do DNA polimórfico a partir dos iniciadores A04, 1247, 1290 e
1254
65
Figura 26. Dendrograma gerado a partir da técnica de RAPD-PCR utilizando o
iniciador 1290
66
Figura 27. Dendrograma gerado a partir da técnica de RAPD-PCR utilizando o
iniciador 1254
67
Figura 28. Dendrograma gerado a partir da técnica de RAPD-PCR utilizando o
iniciador 1247
68
Figura 29. Dendrograma gerado a partir da técnica de RAPD-PCR utilizando o
iniciador A04
69
Figura 30. Perfis eletroforéticos das amostras de E. coli merA+ gerados por
DGGE
70
xvii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA: Aggregative adherence (aderência agregativa)
AAF: Aggregative adherence fimbriae (fimbria de aderência agregativa)
A/E: Attaching and effacing (aderência e achatamento)
aggR: Agreggative regulator (regulador agregativo)
AIEC: adherent invasive Escherichia coli
AL: Aderência localizada
AN: Agar nutriente
ATEC: Escherichia coli enteropatogênica atípica
BFP: Bundle-forming pilus (pilus formador de feixe)
CDEC: cell detaching Escherichia coli
CFs: Colonization factors (fatores de colonização)
CH: Colite hemorrágica
CMI: Concentração mínima inibitória
CT: Cholera toxin (toxina do Cólera)
DAEC: Escherichia coli que adere difusamente
DEC: Diarrhoeagenic Escherichia coli (Escherichia coli diarreiogênica)
DGGE: Denaturing gradient gel electrophoresis (eletroforese em gel com gradiente
desnaturante)
DNA: Deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucléico)
dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphates (nucleotídeos trifosfatados)
eae: EPEC attaching and effacing (EPEC aderência e achatamento)
EAEC: Escherichia coli enteroagregativa
xviii
EAF: EPEC adherence factor (fator de aderência de EPEC)
EAST1: Heat-stable enterotoxin (enterotoxina termoestável)
EHEC: Escherichia coli enterohemorrágica
EIEC: Escherichia coli enteroinvasora
EMB: Eosin methylene blue agar (agar eosina azul de metileno)
EPEC: Escherichia coli enteropatogênica
Esp: EPEC secreted proteins
EspFu: Escherichia coli secreted protein F-like from prophage U
ETEC: Escherichia coli enterotoxigênica
HeLa: Células de linhagem de carcinoma cervical (Henrietta Lacks)
HEp-2: Células de linhagem de carcinoma epidermóide de laringe humana
Hg: Mercúrio
Hg0: Mercúrio metálico
Hg2+: Íon mercúrico
Hg22+: Íon mercuroso
HIV: Human immunodeficiency virus (vírus da imunodeficiência humana)
IL-1β: Interleucina 1 beta
irp2: Iron-repressible high-molecular-weight protein 2
LEE: Locus of enterocyte effacement
LT: Enterotoxina termolábil
MgCl2: Cloreto de magnésio
MILi: Motilidade, Indol e lisina descarboxilase
xix
MLEE: Multilocus enzyme electrophoresis
NTEC: necrotoxigenic Escherichia coli
OMPs: Outer membrane proteins (proteínas de membrana externa)
pAA: Plasmid-aggregative adherence (plasmídeo de aderência agregativa)
PAI: Pathogenicity islands (ilhas de patogenicidade)
Pb: Pares de base
PCR: Polymerase chain reaction (reação da polimerase em cadeia)
pet: Plasmid-encoded toxin (toxina codificada por plasmídeo)
pic: protein involved in intestinal colonization (proteína envolvida na colonização
intestinal)
pInv: Plasmídeo de invasão
PTT: Púrpura trombocitopênica trombótica
RAPD: Random amplification of polymorphic DNA (amplificação randômica do DNA
polimórfico)
REDUC: Refinaria de Duque de Caxias
RFLP: Restriction fragment lenght polymorphism (polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrição
rpm: rotações por minuto
ShET1: Shigella enterotoxin 1 (enterotoxina de Shigella flexneri)
SHU: Síndrome hemolítica urêmica
SSTT: Sistema de secreção do tipo III
ST: Enterotoxina termoestável
STEC: Escherichia coli produtora de toxina Shiga
xx
stx: Shiga toxin (toxina Shiga)
TccP: Tir cytoskeleton coupling protein
Tir: Translocated intimin receptor (receptor de intimina translocado)
TNF-α: Tumor necrosis factor-alpha (fator de necrose tumoral alfa)
TSA: Tryptic soy agar (agar de tripticaseína de soja)
TSB: Tryptic soy broth (caldo de tripticaseína de soja)
UNEP: United Nations Environmental Programme
UV: Ultravioleta
VT: Verotoxina
WHO: World Health Organization (Organização Mundial da Saúde)
µL: Microlitro
xxi
1. INTRODUÇÃO
A poluição dos sistemas aquáticos tem grande relevância no âmbito da Saúde
Pública devido ao papel fundamental que estes ecossistemas têm para o homem, sendo
fornecedores de serviços essenciais como: fonte de água potável, produção de
alimentos, necessidades sanitárias, recreação entre outros. A água que foi submetida a
algum tipo de contaminação, microbiana ou química, tem potencial de afetar um grande
número de pessoas podendo causar doenças infecciosas e também ser fonte de
intoxicações resultantes da exposição a compostos químicos. Por isso, a água livre de
poluentes de qualquer espécie é indispensável para a manutenção da Saúde Pública e,
sendo assim, torna-se imprescindível o desenvolvimento de estudos que permitam
avaliar e monitorar a qualidade da água utilizada para o consumo e atividades afins1.
1.1) Contaminação microbiológica dos sistemas aquáticos
A contaminação microbiológica dos sistemas aquáticos é decorrente
principalmente do despejo de material fecal humano e animal sem tratamento
adequado2. O consumo desta água coloca as pessoas em grande risco de contaminação
por
microrganismos
potencialmente
patogênicos3.
Em
muitos
países
em
desenvolvimento uma grande parte da população faz uso de água de rios, lagos, poços
ou outras fontes não tratadas para consumo, recreação ou outros propósitos
domésticos4,5. Assim, a contaminação microbiana de sistemas aquáticos tem grande
relevância para a Saúde Pública, por veicular microrganismos patogênicos capazes de
causar doenças das mais diversas naturezas e complexidades. Dentre as doenças
veiculadas pela água, as diarréicas são reconhecidas pelo impacto negativo que exercem
na saúde dos seres humanos, sendo responsáveis por altas taxas de morbimortalidade,
especialmente, em crianças menores de cinco anos5,6,7. De acordo com a WHO a
mortalidade associada a doenças transmitidas pela água ultrapassa os cinco milhões de
pessoas por ano, sendo 50% destas mortes causadas por infecções microbianas
intestinais3. Portanto, a vigilância epidemiológica realizada através de estudos que
visam identificar as características fenotípicas e genotípicas dos microrganismos
circulantes em ambientes aquáticos é de extrema importância para a Saúde Pública,
principalmente no Brasil, onde parte considerável da população vive em condições
higiênico-sanitárias insatisfatórias.
1
1.2) Escherichia coli
Um grande número de microrganismos tem sido descrito como agentes das
doenças diarréicas, entretanto, o papel de destaque na etiologia destas infecções é
atribuído a espécie bacteriana Escherichia coli. No Brasil e em outros países em
desenvolvimento infecções causadas pela E. coli são a principal causa de diarréia aguda
em crianças menores de 5 anos de idade, com significantes taxas de morbidade e
mortalidade8,9,10. E. coli foi primeiramente descrita pelo pediatra Theodor Escherich no
século XIX após a observação do microrganismo em indivíduos saudáveis ao qual deu o
nome de Bacterium coli, posteriormente renomeada em sua homenagem11. E. coli
pertence à família Enterobacteriaceae, são bacilos anaeróbicos facultativos, Gramnegativos, reduzem nitrato a nitrito, fermentam a glicose (geralmente com formação de
gás), são catalase positivas e oxidase negativas12.
Escherichia coli coloniza o trato gastrointestinal humano dentro de poucas horas
após o nascimento e coexiste em seu hospedeiro humano por décadas, geralmente em
benefício mútuo13. Entretanto, existem várias cepas de E. coli que adquiriram fatores de
virulência específicos que conferem maior habilidade de adaptação a novos nichos,
permitindo assim, o desenvolvimento de um amplo espectro de doenças intestinais e
extraintestinais como infecções do trato urinário, da corrente sanguínea e do sistema
nervoso central14,15.
Por ser uma espécie bacteriana encontrada no trato intestinal do homem e de
outros animais homeotérmicos, a contaminação aquática normalmente é ocasionada
pelo lançamento de esgoto doméstico não tratado nestes ambientes16,17. Essa espécie é
versátil e diversa, exibindo uma enorme plasticidade genética18. E. coli pode ser
subdividida em: (1) comensais ou não patogênicas, (2) patógenos intestinais e (3)
patógenos extraintestinais. Essa classificação é baseada principalmente na presença ou
ausência de fatores de virulência, codificados por determinantes genéticos, que definem
patotipos particulares. Essa informação genética pode ser horizontalmente adquirida
por meio de elementos genéticos móveis como plasmídeos, bacteriófagos e ilhas de
patogenicidade, o que contribui para a rápida evolução de E. coli e para a criação de
novas variantes patogênicas, já que esta espécie bacteriana é freqüentemente submetida
a rearranjos, excisões, transferências e aquisições de DNA (Figura 1)19.
2
E. coli comensal
LEE PAI
CFAs PAI
Enterotoxinas LT/ST
pAA
pINV
Enterotoxinas
Fimbrias
Afa/Dr
Genes stx
Plasmídeo EAF
(bfp)
ATEC
EIEC
ETEC
EPEC
EHEC
STEC
EAEC
DAEC
Figura 1. A diversidade patogênica de E. coli. A diversidade patogênica de E. coli resulta da deleção e
aquisição de genes que conferem características de virulência específicas para cada patotipo. Somente as
combinações de fatores de virulência que resultarem em maior sucesso na sobrevivência e persistência da
espécie definem novos patotipos (Adaptado de Williams e colaboradores20).
Legenda. ATEC - Escherichia coli enteropatogênica atípica; EPEC - Escherichia coli enteropatogênica
(típica); EHEC - Escherichia coli enterohemorrágica; STEC - Escherichia coli produtora de toxina Shiga;
ETEC - Escherichia coli enterotoxigênica; EAEC - Escherichia coli enteroagregativa; EIEC Escherichia coli enteroinvasora e DAEC - Escherichia coli que adere difusamente.
1.3) Patotipos intestinais de Escherichia coli
Os patotipos de E. coli associados a infecções intestinais, também chamados de
diarreiogênicos (DEC), são diferenciados entre si de acordo com seus mecanismos
específicos de virulência8. Essa especificidade determina perfis clínicos, patológicos e
epidemiológicos característicos de cada um dos diferentes patotipos intestinais. Sendo
assim, a detecção e caracterização de E. coli diarreiogênica tem sido realizada,
principalmente, através da detecção de características associadas com a virulência deste
microrganismo20. Atualmente são reconhecidas, pelo menos, seis categorias de E. coli
agentes de infecção intestinal: E. coli enteropatogênica (EPEC), E. coli enterotoxigênica
(ETEC), E. coli enteroinvasora (EIEC), E. coli produtora de toxina Shiga (STEC), E.
coli enteroagregativa (EAEC) e a E. coli que adere difusamente (DAEC)15. Além destes
patotipos já classicamente reconhecidos ainda existem variações que definem novos
patotipos, como as E. coli enterohemorrágicas (EHEC), variantes das STEC e as E. coli
enteropatogênicas atípicas (ATEC), variantes das EPEC21. Além disso, existem novos
grupos sendo descritos como, por exemplo, cell detaching E. coli (CDEC),
necrotoxigenic E. coli (NTEC) e adherent invasive E. coli (AIEC) que requerem estudos
mais detalhados14,22,23.
3
1.3.1) E. coli enteropatogênica (EPEC) e E. coli enteropatogênica atípica (ATEC)
EPEC foi o primeiro patotipo de E. coli descrito. Os primeiros estudos
epidemiológicos relacionando a E. coli com a diarréia humana foram publicados na
Alemanha, nas décadas de 1920 e 1930, porém, sua patogenicidade só foi comprovada
cientificamente na Inglaterra em 1945. Neste ano o pediatra John Bray observou que um
grupo de cepas de E. coli estavam relacionadas a uma doença em particular, a diarréia
infantil. Apesar de ter sido a primeira categoria de E. coli identificada, seu potencial
patogênico só foi amplamente aceito em 1978 através de estudos realizados por Myron
Levine e colaboradores utilizando voluntários em protocolos experimentais11,15,18,24.
As EPEC foram primeiramente classificadas com base nos sorotipos O e H.
Atualmente esta definição se dá com base nas características patogênicas deste grupo25.
Este patotipo inclui um grupo de microrganismos que aderem intimamente às células
epiteliais intestinais induzindo a formação da lesão attaching/effacing (A/E) (Figura
2)14. Essa lesão é mediada pela intimina, uma adesina codificada pelo gene eae (E. coli
attaching effacing), que está presente na membrana externa desta bactéria e é capaz de
promover uma ligação íntima e irreversível entre a bactéria e a membrana do
enterócito26. A bactéria intimamente aderida ao enterócito elimina as microvilosidades
da célula intestinal exatamente no ponto de contato bactéria-enterócito e causa
modificações notáveis no citoesqueleto da célula hospedeira. O acúmulo de actina
polimerizada diretamente abaixo da bactéria promove a formação de estruturas em
forma de pedestal ao redor do ponto de adesão. Este fenótipo é codificado por genes
localizados em uma ilha de patogenicidade (PAI) conhecida como LEE (Locus of
enterocyte effacement). LEE codifica um sistema de secreção tipo III (SSTT) que
transloca proteínas efetoras bacterianas para dentro do citoplasma da célula
hospedeira14,15. Uma destas proteínas efetoras, conhecida como Tir (Translocated
intimin receptor) é inserida na membrana da célula hospedeira e funciona como um
receptor para a intimina15. Além de Tir, também são secretadas por EPEC através SSTT
as proteínas conhecidas pela sigla Esp (EPEC secreted proteins)24.
Atualmente EPEC é subdividida nos subgrupos típica e atípica. EPEC típica é a
classificação dada para as EPECs que carreiam o plasmídeo do fator de aderência (EAF)
onde está localizado o operon que codifica uma fímbria do tipo IV, o BFP (Bundle
forming pilus) (Figura 3), responsável por mediar a aderência entre a bactéria e a célula
epitelial. Já as EPECs atípicas são destituídas do plasmídeo EAF e, portanto, não
4
expressam BFP funcional. A EPEC típica expressa o padrão de adesão localizada (AL)
caracterizado pela formação de microcolônias compactas aderidas em regiões da
superfície celular (Figura 4). Em contraste, as EPEC atípicas expressam um padrão
similar ao AL, o padrão de adesão localizada-like (AL-like) com microcolônias mais
frouxamente aderidas em relação às EPEC típicas, ou ainda apresentam os padrões de
aderência agregativa ou difusa (Quadro 1)24,26.
Em países desenvolvidos a E. coli enteropatogênica atípica é mais
freqüentemente isolada de casos de diarréia do que as E. coli enteropatogênicas típicas.
Em países em desenvolvimento a E. coli enteropatogênica atípica vem cada vez mais
assumindo um papel de importância como agente etiológico das doenças diarréicas10,15.
A infecção por EPEC ocorre com frequência em lactentes e é caracterizada por febre
baixa, mal-estar, vômitos, diarréia aquosa e presença de muco nas fezes27.
Quadro 1. Principais características de E. coli enteropatogênica típica e atípica (Adaptado de Gomes
& Trabulsi24).
Característica
EPEC típica
EPEC atípica (APEC)
Padrão de adesão
AL
AL-like, AA, AD, NA
Plasmídeo EAF (expressão do BFP)
presente
ausente
Lesão A/E
sim
sim
Região LEE
presente
presente
Marcas genéticas de identificação
eae, EAF, bfpA
eae
Reservatório
ser humano
ser humano, animais
Legenda. AL – Aderência localizada; AA – Aderência agregativa; AD – Aderência difusa e NA – Não aderente
Figura 2. Microscopia eletrônica mostrando a lesão A/E induzida por EPEC típica (Foto de Nataro
& Kaper25)
5
Figura 3. Microscopia eletrônica mostrando a expressão do BFP em EPEC típica (Foto de Nataro &
Kaper25).
Figura 4. Padrão de aderência localizada manifestado por EPEC típica em células HEp-2 (Foto de
Nataro & Kaper25).
1.3.2) E. coli enterotoxigênica (ETEC)
A descoberta das ETEC teve início em Calcutá no ano de 1956. Neste ano De e
colaboradores inocularam amostras de E. coli isoladas de crianças e adultos com
sintomas similares aos do Cólera nas alças intestinais de coelhos e observaram uma
grande quantidade de fluidos acumulados nas alças, resultado semelhante ao observado
após infecção por Vibrio cholerae. Em 1968, Sack reportou o isolamento de E. coli a
partir de amostras de fezes e do intestino de adultos e crianças com sintomas muito
similares ao do Cólera. Esses resultados foram observados e confirmados por trabalhos
posteriores utilizando voluntários humanos28.
As ETEC são definidas como cepas de E. coli que produzem ao menos uma das
enterotoxinas: ST (enterotoxina termoestável) e LT (enterotoxina termolábil)
codificadas pelos genes ST1 e LT1 respectivamente7,29. A termolabilidade está
relacionada à perda de atividade tóxica da enterotoxina após aquecimento a 100ºC
durante um período de 30 minutos, enquanto que a termoestabilidade representa a
manutenção da sua atividade tóxica nestas condições30. O mecanismo de patogenicidade
das ETEC é caracterizado, resumidamente, pela colonização da mucosa intestinal e
6
produção de enterotoxinas, que dão início a secreção intestinal15,30. A colonização é
mediada por adesinas como os fatores de colonização (CFs) que podem ser nãofimbriais, fimbriais, fibrilares ou helicoidais14. Quanto às enterotoxinas as ETEC podem
expressar somente a LT, somente ST ou tanto ST quanto LT. As LT são uma classe de
enterotoxinas intimamente relacionadas em termos de estrutura e função com a
enterotoxina do cólera (CT)15. Essas enterotoxinas provocam alterações nas
concentrações intracelulares de nucleotídeos levando à alteração do equilíbrio
hidrossalino que resulta na secreção de eletrólitos e na redução de absorção de água no
intestino. A presença de água nas fezes, sintoma característico da ação deste patotipo, é
resultante da ação destas enterotoxinas30.
A infecção por ETEC é causada pelo consumo ou uso de água ou alimentos
contaminados e tem curto período de incubação (14-50h) desencadeando um processo
diarréico aquoso agudo (semelhante ao causado por Vibrio cholerae), sem sangue, muco
ou pus. Normalmente este processo infeccioso é autolimitante podendo levar, em alguns
casos, ao quadro de desidratação devido à perda excessiva de fluidos e eletrólitos.
Podem ocorrer, em algumas situações, vômitos e cólicas abdominais27,31. ETEC é
reconhecida como enteropatógeno de humanos em todo o mundo, afetando
principalmente crianças, viajantes e militares que visitam países onde infecções por
ETEC são endêmicas31. ETEC é normalmente associada a duas síndromes: “a diarréia
da criança desmamada” entre crianças nos países em desenvolvimento e a “diarréia do
viajante”27. Nos países em desenvolvimento é estimado que ocorram 650 milhões de
casos de infecção por ETEC resultando em aproximadamente 800 mil mortes,
principalmente de crianças32.
1.3.3) E. coli enteroinvasora (EIEC)
E. coli enteroinvasora foi primeiramente observada através do trabalho com
voluntários conduzido por DuPont e colaboradores na década de 70. Esse patotipo é
intimamente relacionado bioquimicamente, geneticamente e patogenicamente com a
espécie bacteriana Shigella spp. Os dois patotipos compartilham fatores de virulência e
testes bioquímicos similares, geralmente tendo resultado negativo para lisina
descarboxilase, motilidade e lactose. Somente alguns poucos testes bioquímicos são
capazes de diferenciá-los. Muitos pesquisadores, inclusive, afirmam que ambas são
indistinguíveis taxonomicamente, mas devido à grande importância clínica de Shigella
esta nomenclatura ainda é mantida15,25,33.
7
EIEC difere dos outros patotipos de E coli por ser uma bactéria intracelular e por
não possuir flagelos14. O modelo patogênico de ação de EIEC ainda está por ser
elucidado, entretanto estudos sugerem que a dinâmica de atuação deste microrganismo
inclui: penetração da célula epitelial, lise do vacúolo endocítico, multiplicação
intracelular, movimentação através do citoplasma, morte das células hospedeiras e, por
conseguinte, disseminação extracelular15,25,34.
Os genes necessários para o processo de invasão das EIEC são codificados em
um plasmídeo de 140-MDa denominado pInv. Destacam-se entre esses genes o mxi e o
spa que codificam um aparato de secreção tipo III responsável pela secreção das
proteínas Ipa (IpaA-IpaD), IcsA e IpgD, indispensáveis para o desenvolvimento do
papel enteropatogênico deste microrganismo. As proteínas IpaB, IpaC e IpaD são
responsáveis pelo fenótipo de invasão, no qual IpaC promove a entrada de EIEC na
célula eucariótica, enquanto que IpaB acredita-se que seja responsável pela lise do
vacúolo endocítico e pela indução da apoptose em macrófagos. IpgD ajuda a
reorganizar a morfologia célula-hospedeiro, processo que resulta num fenômeno
conhecido como blebbing de membrana. IcsA é uma proteína de superfície essencial
para nucleação de filamentos de actina que formam uma espécie de “cauda” que se
estende a partir do pólo da bactéria e possibilita a movimentação de EIEC através do
citoplasma e para as células adjacentes. Além disso, outro fator de virulência descrito
para este patotipo é a enterotoxina termolábil denominada ShET2, codificada por genes
cromossomais15,25,33. A capacidade de invasão e sobrevivência deste patotipo depende
dos genes contidos no plasmídeo pInv, que contém todos os genes relacionados a
invasão, consequentemente a perda deste plasmídeo torna as cepas de EIEC avirulentas.
As infecções intestinais causadas por EIEC são mais freqüentes em crianças
maiores de dois anos e em adultos. A transmissão deste enteropatógeno ocorre através
da ingestão de água e alimentos contaminados33. A infecção por EIEC pode se
manifestar sob a forma de diarréia aquosa, indistinguível da causada por ETEC. Em
algumas pessoas é observada a evolução para o quadro de desinteria, caracterizada por
febre e colite. Os sintomas da infecção por este patotipo são urgência e tenesmo e as
fezes contêm sangue, muco e leucócitos27.
8
1.3.4) E. coli produtora de Toxina Shiga (STEC) e E. coli enterohemorrágica (EHEC)
Konowalchuk e colaboradores no ano de 1977 reportaram após a observação de
amostras bacterianas provenientes de crianças em processo diarréico uma característica
que distinguia a STEC de outras categorias patogênicas de E. coli: a produção de uma
toxina com efeito citotóxico irreversível em células Vero (células do rim do macaco
verde africano), sendo esta posteriormente chamada de verotoxina (VT). Em 1982
pesquisadores purificaram e caracterizaram a citotoxina produzida por um dos isolados
de Konowalchuk e descobriram uma similaridade estrutural e de atividade biológica
com as toxinas Shiga (Stx) produzidas por Shigella dysenteriae. Sendo assim, estas
amostras podem ser chamadas de E. coli produtoras de Stx e também de E. coli
produtoras de VT. Apesar da associação entre E. coli produtoras de citotoxinas e a
doença diarréica já ser conhecida desde 1977, a importância de STEC como patógeno
humano só foi reconhecida nos anos 1980, quando foi associada a surtos epidêmicos de
colite hemorrágica (CH) e de síndrome hemolítica urêmica (SHU). Surgiu então o
termo E. coli enterohemorrágica (EHEC), atualmente considerado um subgrupo das
STEC, e que foi utilizado inicialmente para nomear as amostras O157:H7 responsáveis
pelos surtos de CH e SHU. O reconhecimento inicial das EHEC como uma classe
distinta resultou de observações epidemiológicas conduzidas na década de 8035,36.
Assim, atualmente o termo STEC refere-se a cepas de E. coli produtoras da
toxina Shiga enquanto que o termo EHEC corresponde aos sorotipos de STEC que
produzem a toxina Shiga e também causam a lesão A/E23. O modelo de patogênese que
ocasiona a formação da lesão A/E proposto para EHEC é muito semelhante ao proposto
para EPEC, entretanto existem algumas diferenças. Nas EHEC Tir não é fosforilado e o
processo de formação do pedestal é Nck-independente, neste caso é a proteína efetora
TccP (Tir-cytoskeleton coupling protein) também conhecida como EspFu (Escherichia
coli secreted protein F-like from prophage U) que se liga a N-WASP estimulando a
polimerização de actina e a formação do pedestal14,35.
A toxina Shiga é o principal fator de virulência das STEC caracterizando,
portanto, o patotipo. Esta citotoxina constitui uma família de citotoxinas estruturalmente
relacionadas e com atividades biológicas muito semelhantes35. Existem dois subgrupos
da toxina Shiga, Stx1 que representa um grupo mais homogêneo de toxinas
praticamente idênticas à toxina Stx de S. dysenteriae e Stx2 que apresenta diversas
variantes e tem menos de 60% de homologia com a toxina Stx de S. dysenteriae14,35. Os
9
determinantes genéticos para a elaboração da toxina Shiga está albergada no genoma de
um
bacteriófago
lisogênico
integrado
ao
cromossoma
de
STEC.
Estudos
epidemiológicos têm associado a toxina Stx2 a quadros mais graves destas infecções em
humanos37. Os receptores para a toxina Stx são os Gb3s que são expressos,
principalmente, em células do rim, intestino e cérebro. A subunidade B desta toxina
interage com o Gb3 induzindo a invaginação da membrana para facilitar a
internalização da toxina. A Stx depois de internalizada é transportada por endossomos
até o Complexo de Golgi, onde a subunidade A é ativada. A subunidade A da toxina Stx
possui uma N-glicosidase responsável por remover um resíduo de adenina da molécula
de RNA ribossômico 28S e, consequentemente, impedindo a síntese protéica, causando
necrose e levando a morte celular. Embora as células endoteliais pareçam ser o principal
alvo para Stx, outras células como monócitos e plaquetas também são afetados. Após
serem estimulados pela ação da Stx os monócitos produzem citocinas pró-inflamatórias,
como o fator de necrose tumoral α (TNF-α) e a interleucina-1β (IL-1β) que
potencializam a ação da toxina por induzir a expressão de mais G3bs14,23,35.
As EHEC são altamente infecciosas para seres humanos, estima-se que nos
surtos causados pelo patotipo O157:H7, menos de 100 células bacterianas já sejam
suficientes para causar doença35,37. A infecção por este patotipo é adquirida pelo
consumo de alimentos ou água contaminados ou em alguns casos, no contato próximo
pessoa-a-pessoa37. As manifestações clínicas da doença incluem um amplo espectro
clínico podendo compreender desde quadros assintomáticos, sintomáticos com diarréia
branda, até casos mais graves evoluindo para a colite hemorrágica (CH), síndrome
hemolítica urêmica (SHU), púrpura trombocitopênica trombótica (PTT), apendicite,
cistite hemorrágica e anormalidades neurológicas35.
1.3.5) E. coli enteroagregativa (EAEC)
Dois grupos de pesquisadores examinaram na década de 80 coleções de E. coli
provenientes de estudos realizados em países em desenvolvimento e observaram,
através de testes de aderência, que algumas cepas não pertencentes ao grupo das EPEC,
também eram capazes de aderir as células HEp-2 exibindo, porém, um padrão de
aderência distinto do apresentado pelas EPEC. Este novo padrão de aderência
encontrado foi mais profundamente estudado e caracterizado por Nataro e colaboradores
em 1987 em um estudo sobre a etiologia da diarréia infantil no Chile. A partir deste
10
estudo os pesquisadores foram capazes de subdividir este padrão de aderência em duas
categorias: agregativa e difusa. O padrão de aderência agregativa (AA) é caracterizado
pela aderência das bactérias umas as outras e à superfície das células numa configuração
que lembra tijolos empilhados, formando agregados heterogêneos ou também em forma
de cordões (Figura 5)25,38.
EAEC é considerada um patógeno intestinal emergente responsável por causar
diarréia persistente e desnutrição em crianças e em pessoas infectadas pelo HIV em
países em desenvolvimento. É também reconhecida como a segunda maior causa da
“diarréia
dos
viajantes”
tanto
em
países
desenvolvidos
quanto
nos
em
desenvolvimento14,39. A patogênese de EAEC é complexa e as cepas componentes deste
grupo são extremamente heterogêneas. Apesar disso, foi proposto um modelo de três
estágios de sua patogênese. No primeiro estágio da infecção as bactérias aderem à
mucosa intestinal e à camada de muco através da fimbria de aderência agregativa (AAF)
e fatores de aderência, no segundo estágio as bactérias continuam se multiplicando na
camada de muco e estimulam a sua hipersecreção formando um biofilme bacteriano.
Por fim, o terceiro estágio é caracterizado pela produção de toxinas e pelo
desenvolvimento de processo inflamatório resultando em lesões da mucosa intestinal.
Os danos causados nas microvilosidades e a presença do biofilme bacteriano geram a
má absorção de fluidos e solutos desencadeando a diarréia38,39. A diarréia causada por
EAEC é normalmente aquosa, mas pode ser em alguns casos conter também sangue ou
muco14.
Muitos fatores de virulência em potencial vêm sendo identificados para EAEC
(Quadro 2), porém seu mecanismo exato de patogênese ainda não é totalmente
compreendido. Sabe-se que algumas cepas de EAEC são carreadoras do plasmídeo pAA
de 60-65 MDa que alberga genes necessários ao fenótipo de aderência agregativa. Neste
plasmídeo estão localizados genes codificadores das toxinas EAST-1 e Pet, da
dispersina, genes codificadores das subunidades estruturais da fimbria de aderência
agregativa aggA (AAF/I), aafA (AAF/II) e agg-3 (AAF/III), shf, além do gene regulador
de genes de virulência aggR. Os genes que codificam a proteína Pic, ShET1
(enterotoxina de Shigella flexneri) e Irp2 são de localização cromossômica. A existência
de fatores de virulência de EAEC em ilhas de patogenicidade vem sendo estudada,
tendo sido identificadas três ilhas até o momento14,38,40.
11
Figura 5. Padrão de aderência expresso por EAEC em células HEp-2 (Foto de Nataro & Kaper25).
Quadro 2. Genes e fatores de virulência descritos para EAEC (Adaptado de Huang e
colaboradores39).
Fator
Gene
Descrição
Regulador global
aggR
Codifica a proteína reguladora dos genes de virulência
Fimbrias
aggA
aafA
agg3
Codifica AAF/I e a hemaglutinação de eritrócitos
Codifica AAF/II responsável pela mediação da aderência a mucosa
Codifica AAF/III
astA
Enterotoxinas
pet
Codifica a toxina agregativa termoestável EAST1 (similar a ST de
ETEC)
Codifica proteína que funciona como enterotoxina termolábil e
citotoxina
OMPs
OMP
Permite a aderência de EAEC e a hemaglutinação de eritrócitos
Transportador de dispersina
aatA
Codifica uma proteína responsável pelo transporte da dispersina para
fora da membrana externa de EAEC
aap
Proteínas de secreção
pic
Yersiniabactina
irp2
Codifica uma dispersina responsável pela dispersão da EAEC através
da mucosa intestinal
Codifica uma serina protease com atividade de mucinase, resistência
ao soro e de hemaglutinação de eritrócitos
Codifica um sistema de captura de ferro por sideróforo
12
Resumidamente, o modelo patogênico dos diferentes patotipos diarreiogênicos
de E. coli seguem os principais eventos demonstrados a seguir (Figura 6).
Aderência
agregativa
Formação de
biofilme
Aderência
íntima da
bactéria
LT e ST
Citotoxinas
Enterotoxinas
Condensação de
actina e apagamento
das microvilosidades
Stx
Alongamento de
microvilosidades
Aderência inicial
via BFP
Aderência
íntima da
bactéria
Condensação de
actina e apagamento
das microvilosidades
Invasão
Lise da
vesícula
Movimentação
citoplasmática
Disseminação
para células
adjacentes
Figura 6. Esquema geral de patogenicidade descrito para os patotipos diarreiogênicos de E. coli
(Adaptado de Nataro & Kaper25).
1.4) Agrupamento filogenético de Escherichia coli
Os estudos filogenéticos têm contribuído com o estudo da diversidade e da
virulência de cepas de E. coli isoladas de uma grande variedade de hospedeiros,
ambientes e origens geográficas evidenciando que, tanto populações comensais quanto
patogênicas de E. coli são divididas em quatro filogrupos designados A, B1, B2 e D41,42.
Amostras de E. coli pertencentes a cada um destes quatro grupos filogenéticos diferem
em importantes características relacionadas à biologia de suas populações como
habilidade para explorar diferentes açúcares, perfis de resistência a antimicrobianos e
taxas de crescimento de acordo com variações de temperatura41,42. Isolados clínicos
agentes de doenças extra-intestinais pertencem, em sua maioria, ao grupo B2 e em
menor escala ao grupo D. Amostras de E. coli comensais pertencem em sua maioria ao
grupo A e em menor proporção ao grupo B1 e as agentes de doença diarréica são
normalmente encontradas como membros dos grupos A, B1 e D41,42. Os grupos A e B1
são considerados grupos mais estreitamente relacionados e o grupo B2 é considerado
por alguns pesquisadores como representante de uma linhagem ancestral de E. coli43.
13
Estudos filogenéticos realizados com populações de E. coli isoladas de ambientes
aquáticos, apesar de ainda muito escassos, tem permitido observar que patotipos
diarreiogênicos e extra-intestinais de E. coli estão distribuídos nos mais variados
ecossistemas aquáticos, salientando a importância de tais estudos para a Saúde
Pública44.
Métodos de agrupamento filogenético podem ser realizados através de MLEE ou
ribotipagem, porém ambas as técnicas são complexas, consomem muito tempo para sua
conclusão e requerem uma coleção de cepas já tipadas45. Observando este fato,
Clermont e colaboradores45 desenvolveram um método simples e rápido de PCR
multiplex que permite que cepas de E. coli sejam classificadas em filogrupos usando
uma chave dicotômica baseada na presença ou ausência de dois genes (chuA e yjaA) e
de um fragmento anônimo de DNA (TSPE4.C2)41. O gene chuA é responsável pelo
transporte de ferro na E. coli O157:H7 e o gene yjaA foi identificado no genoma da E.
coli K-12 porém ainda não sabe-se a sua função45.
1.5) Resistência a antimicrobianos em Escherichia coli
Para populações de E. coli diarreiogênicas a detecção da resistência e da
multirresistência a múltiplos agentes antimicrobianos vem sendo observada em
amostras clínicas provenientes de diferentes origens46,47,48,49. A co-localização de
marcadores genéticos de enteropatogenicidade e de genes de resistência aos
antimicrobianos sugere que a resistência desempenha um papel adicional na virulência
destes microrganismos, quando associada a marcadores de enteropatogenicidade42.
Considerando a elevada plasticidade genética e a ampla circulação destes
microrganismos em ambientes diversos deve ser salientado o seu papel fundamental na
disseminação de mecanismos genéticos de resistência entre microrganismos presentes
em diferentes ambientes e hospedeiros.
Grande parte dos antibióticos é lançada em ambientes aquáticos a partir de
diferentes fontes, tais como efluentes domésticos, hospitalares e águas residuais de
regiões de agropecuária. Quando presentes nestes ambientes os resíduos destas
substâncias antimicrobianas impõem pressão seletiva em populações bacterianas
circulantes nos sistemas aquáticos, resultando na prevalência de bactérias resistentes. O
ambiente aquático favorece a disseminação de genes de resistência, que na maioria das
vezes estão albergados em elementos genéticos móveis, entre as populações bacterianas
14
locais. Sendo assim, os ambientes aquáticos são ideais para o surgimento de novas
cepas patogênicas e, também, carreadoras de mecanismos genéticos de resistência aos
antimicrobianos. Portanto, o estudo das características biogenéticas de cepas
bacterianas presentes nos sistemas aquáticos é indispensável para prever o risco a que a
população que vive no entorno deste ambiente está submetida50,51.
1.6) Diversidade genética de populações bacterianas
A E. coli apresenta um genoma bastante diversificado e uma elevada
plasticidade genética. A grande diversidade do genoma de E. coli é resultado de eventos
genéticos tais como deleções, substituições e adições de genes ao cromossoma
bacteriano ou também da aquisição ou perda de elementos genéticos móveis através
fenômenos como a transferência horizontal de genes52. Somente as combinações
genéticas que obtiverem sucesso persistem e se tornam parte de patotipos específicos de
E. coli20. A aquisição de plasmídeos, bacteriófagos, transposons e ilhas de
patogenicidade tem importância crucial na emergência de novas espécies, subespécies e
patotipos. Dentre outras espécies bacterianas, a E. coli é um ótimo modelo para o estudo
da evolução do genoma bacteriano53.
Nos últimos anos, o uso de técnicas moleculares de tipagem, também conhecidas
como técnicas de fingerprinting, tem possibilitado analisar a diversidade e a estrutura
genética de populações e sub-populações bacterianas de diversas espécies, assim como
estabelecer relações de clonalidade entre elas54. Dentre os sistemas de tipagem
utilizados atualmente, destaca-se a amplificação randômica do DNA polimórfico,
conhecida pela sigla RAPD-PCR (Random Amplification of Polymorphic DNAPolymerase Chain Reaction). Esta metodologia é rápida, de simples execução, com
reduzido custo, grande flexibilidade e sensibilidade e, por isso, tem sido amplamente
utilizada para esclarecer a diversidade, as relações entre isolados e possibilitar a
identificação de marcadores epidemiológicos. O potencial discriminatório desta técnica
tem sido reconhecido por diversos estudos científicos conferindo ao método
reconhecida contribuição em sobre a diversidade, evolução e circulação de diferentes
linhagens patogênicas55,56,57,58. A técnica de RAPD emprega geralmente um único
iniciador que amplifica regiões não específicas do DNA bacteriano. Em condições de
baixa estringência o iniciador hibridiza, ao acaso, em múltiplas localizações do DNA
iniciando a sua amplificação. O número e localização das regiões do DNA amplificadas
15
variam entre diferentes cepas e estas variações são detectadas por eletroforese em gel
através da visualização de fragmentos de tamanho e em números diferentes59,60.
Outra técnica molecular de fingerprinting que vem sendo muito utilizada em
estudos de ecologia molecular de microrganismos é a eletroforese em gel com gradiente
desnaturante (DGGE)61,62. O DGGE é utilizado para estudar variações genéticas em
populações bacterianas e baseia-se na separação da fita dupla de DNA em uma matriz
com gradiente de temperatura e/ou de agente desnaturante (uréia ou formamida)63. A
diferença de migração no gel de poliacrilamida entre fragmentos de DNA de mesmo
tamanho molecular, porém com diferentes sequências internas de ácidos nucléicos
geram diferentes perfis de amplificação que refletem a diversidade das amostras ou dos
genes analisados62.
1.7) Escherichia coli ambiental
Por ser uma espécie bacteriana encontrada no trato intestinal do homem e de
outros animais homeotérmicos, a contaminação de ambientes aquáticos por E. coli é
ocasionada pelo lançamento de esgotos domésticos, de efluentes de origem
agropecuária, hospitalar entre outros, e por isso, a E. coli tem sido utilizada como um
indicador de contaminação fecal de ambientes aquáticos. Porém, a classificação de
microrganismo como um indicador de contaminação fecal depende, dentre outras
características, da incapacidade do microrganismo de se multiplicar fora do hospedeiro
primário64.
Pesquisas recentes indicam que a E. coli sobrevive durante longos períodos após
sua deposição no ambiente e também se multiplica na água, em algas e no solo em
ambientes tropicais, subtropicais e temperados64,65,66,67,68,69,70,71,72. As altas temperaturas
e a grande disponibilidade de nutrientes nestes ambientes parecem permitir a
sobrevivência e persistência da E. coli fora do hospedeiro (Figura 7). Além disso, a
habilidade desta bactéria de se aclimatar a novos nichos em razão, por exemplo, de sua
grande versatilidade para a aquisição de energia, parece permitir que estes
microrganismos se tornem membros de comunidades microbianas em uma grande
variedade de ambientes, mesmo em condições muito diferentes do seu habitat primário
(hospedeiro)20,70,73,74,75.
16
Habitat primário - aves e mamíferos
Reinoculação
Despejo de
material
fecal
Habitat secundário – solo, água etc
Baixas temperaturas
Altas temperaturas
Escassez de nutrientes
Disponibilidade de
Radiação solar
nutrientes etc
Predação etc.
Populações autosustentáveis
“naturalizadas”
Morte
Figura 7. Diagrama esquemático do ciclo de vida de E. coli. Após ser eliminada pelo seu hospedeiro a
maioria das bactérias morre devido a fatores ambientais desfavoráveis. Algumas bactérias, porém, se
aderem a partículas do solo, sedimento, areia ou algas e sobrevivem durante maior tempo. Nestas
condições, estas cepas de E. coli podem se multiplicar e manter suas populações por tempo suficiente
para se tornarem adaptadas ou “naturalizadas” ao ambiente. Esta E. coli naturalizada sobrevive e se
multiplica no ambiente secundário podendo ser reintroduzida em hospedeiros que entrem em contato com
a água contaminada (Adaptado de Ishii & Sadowsky70).
1.8) Contaminação química dos sistemas aquáticos
Além da contaminação microbiológica, outra relevante forma de poluição de
sistemas aquáticos com impactos drásticos na saúde de seres humanos, animais e do
ecossistema é a causada pelo lançamento de substâncias químicas nesses ambientes.
Essa contaminação tem origem a partir do lançamento de efluentes industriais ou
domésticos não tratados ou tratados de forma inadequada, que podem conter substâncias
químicas tóxicas, tais como os metais76,77.
1.9) Mercúrio
Dentre os metais, o mercúrio destaca-se pela sua capacidade de bioacumulação e,
no caso do metilmercúrio, pela capacidade de biomagnificação ao longo de cadeias
tróficas. Mesmo não alcançando concentrações de mercúrio acima dos naturais em
ambientes aquáticos, por exemplo, este metal pode ser bioacumulado pelos organismos
circulantes nestes ambientes, atingindo concentrações não permitidas para o consumo
humano. Além disso, o mercúrio não é degradado, podendo permanecer por muito
tempo nestes ambientes sem perder suas características de toxicidade. A apreensão
17
acerca da contaminação ambiental por este metal se deve a sua elevada toxicidade, a
amplitude global da sua contaminação, podendo ter efeitos mesmo em ambientes muito
distantes das fontes de contaminação e pela magnitude dos danos, em alguns casos
irreversíveis, causados à saúde de populações humanas e de ambientes expostos. Assim
torna-se fundamental o desenvolvimento de estudos que visam reduzir a exposição
humana e ambiental ao mercúrio78,79,80,81.
O mercúrio está presente no ambiente em um grande número de formas
químicas: no estado elementar, o mercúrio metálico (Hg0) ou nas formas oxidadas, o íon
mercuroso (Hg22+) e o íon mercúrico (Hg2+). As espécies do mercúrio as quais se atribui
maior relevância são: o mercúrio elementar, as espécies de mercúrio inorgânico e as
espécies de mercúrio orgânico. As formas do mercúrio mais comumente encontradas no
ambiente são o mercúrio metálico, o sulfeto de mercúrio, cloreto de mercúrio e o
metilmercúrio82,83.
De acordo com UNEP83 os lançamentos de mercúrio no ambiente podem ser
agrupados nas seguintes categorias:
(1) provenientes de fontes naturais – lançamento decorrente da mobilização
natural do mercúrio presente na crosta terrestre através de erupções vulcânicas e
intemperismo das rochas;
(2) provenientes de ação antropogênica atual – lançamentos decorrentes da
mobilização do mercúrio presente em combustíveis e em outros minerais extraídos,
tratados e reciclados pelo homem;
(3) Provenientes do uso atual do mercúrio em produtos e processos – lançamento
do mercúrio decorrente de processos industriais, da incineração de produtos, do uso de
pesticidas e fertilizantes, da mineração e de refinarias, do vazamento de produtos
químicos, de ambientes hospitalares e do uso de medicamentos entre outros;
(4) Remobilização de lançamentos antropogênicos antigos depositados no solo,
sedimentos, ambientes aquáticos e aterros sanitários.
1.9.1) Toxicologia do mercúrio
A toxicidade do mercúrio está relacionada à forma química a qual o organismo
foi exposto e também, ao tempo de exposição. Os sintomas e as fontes de contaminação
18
são diferentes na exposição pelo mercúrio elementar, compostos inorgânicos ou
orgânicos do mercúrio81,83. Maiores estudos são necessários para esclarecer o
mecanismo de ação exato de cada uma das formas do mercúrio nos organismos, porém,
tem-se descrito que os íons de mercúrio ao se ligarem aos grupos sulfidril de proteínas e
enzimas alteram a estrutura e a função de ambas, resultando na sua inativação. É
possível que o mercúrio também tenha efeitos no metabolismo celular através de
ligações bioquímicas a grupos amina e fosforila81,84,85. A exposição ao mercúrio
desencadeia uma série de efeitos no organismo exposto, dentre eles estão os
neurológicos, genéticos, cardiovasculares, imunológicos, teratogênicos e em casos de
exposição ocupacional ou de contato com altas doses de mercúrio tem sido descritos até
efeitos genéticos, como aberrações cromossomiais81.
Toxicologicamente a mais devastadora exposição a compostos mercuriais é a
causada pelo metilmercúrio, responsável por causar danos irreversíveis à saúde humana,
do ambiente e de outros animais. A contaminação por este composto se dá através da
ingestão de alimentos ou de água que foram, em algum momento, expostos a este metal,
da inalação de vapores e do contato cutâneo. Em adultos os primeiros sintomas a serem
observados após a exposição ao metilmercúrio são parestesia, indisposição e visão
embaçada, com o aumento da exposição passam a ser observados restrição do campo
visual, surdez, disatria, ataxia, inibição motora, tremores e diminuição da sensibilidade
em algumas partes do corpo. Em situações extremas, a exposição a altas doses de
metilmercúrio pode levar ao coma e posteriormente à morte em cerca de 2-4 semanas
após o aparecimento dos primeiros sintomas. Uma grande preocupação acerca do
contato humano com este metal se deve também ao fato de que mesmo após cessar a
exposição, os sintomas geralmente não desaparecem em populações expostas
cronicamente ao metilmercúrio. Devido a sua grande solubilidade em lipídeos o
metilmercúrio ainda é capaz de atravessar a barreira placentária causando danos severos
no desenvolvimento das crianças expostas, como microencefalia, retardo mental,
incoordenação, ataxia, movimentos involuntários, paresia ou paralisia muscular, perda
da audição, cegueira, distúrbios na deglutição, além de outros sintomas observados
também em adultos expostos81,82,83,85,86.
19
1.10) Mecanismos de resistência bacteriana ao mercúrio
A resistência ao mercúrio é um dos mecanismos de resistência a metais tóxicos
mais estudados80,87,88,89,90,91,92,93,94. Tem-se descrito que algumas espécies de fungos e
bactérias isoladas de diferentes fontes desenvolveram mecanismos de resistência que as
permitem viver em ambientes mesmo altamente contaminados pelo mercúrio95.
Dentre os mecanismos bacterianos que conferem proteção a concentrações
nocivas do mercúrio são descritos: (1) bombas de efluxo que removem o íon da célula
bacteriana; (2) redução enzimática do metal para uma forma elementar menos tóxica;
(3) quelação através da ação de polímeros enzimáticos; (4) adsorção do mercúrio às
superfícies celulares; (5) precipitação de complexos inorgânicos insolúveis na superfície
da célula e (6) biometilação seguida de transporte por difusão através da membrana
celular. Este último mecanismo transforma o mercúrio elementar em metilmercúrio,
forma mais tóxica para outros organismos96.
A detoxificação enzimática do mercúrio é um dos mecanismos de resistência a
metais mais estudados. Este mecanismo consiste na redução da forma iônica reativa do
mercúrio (Hg2+) para uma forma elementar (Hg0), volátil e menos reativa87,92. A
presença desta característica já foi observado tanto em bactérias Gram-positivas (S.
aureus, Bacillus sp.) quanto Gram-negativas (E. coli, P. aeruginosa, Serratia
marcescens e Thiobacillus ferrooxidans)89.
Existem evidências que indicam que a resistência ao mercúrio é codificada por
uma região conservada do operon mer e que este pode ser detectado em bactérias
isoladas de ambientes geograficamente muito distantes. Isto porque, a localização mais
frequente deste mecanismo genético está em elementos genéticos móveis, como
plasmídeos (pKLH2, pDU1358, pMERPH e pPB) e transposons (Tn501, Tn5041,
Tn5056 e Tn21), o que o torna mais facilmente transferível horizontalmente entre
diferentes bactérias contribuindo para a sua ampla ocorrência em diferentes grupos
bacterianos e ambientes92.
1.11) Co-seleção da resistência a antimicrobianos e a metais
A co-ocorrência da resistência a agentes antimicrobianos e a metais em
populações bacterianas ambientais e clínicas vem sendo amplamente reportada nas
últimas décadas97,98,99,100. Estes mecanismos de co-seleção incluem a co-resistência, co-
20
regulação e a resistência cruzada. A primeira ocorre quando diferentes genes
responsáveis pelo fenótipo de resistência estão albergados no mesmo elemento genético
como plasmídeo, integron e/ou transposon. Esta mesma localização dos genes de
resistência a antimicrobianos e aos metais resulta na co-seleção de ambos os genes no
caso de trocas genéticas. A resposta regulatória indireta, porém compartilhada,
resultante da exposição a metais ou antimicrobianos é chamada de co-regulação. A
resistência cruzada é definida pela presença de um único determinante genético
responsável tanto pela resistência aos metais quanto aos antimicrobianos101.
Apesar de ainda existirem dúvidas sobre o assunto, alguns estudos sugerem que
a exposição de populações bacterianas a metais, tais como o mercúrio, resulta na
seleção de bactérias resistentes aos antimicrobianos em muitos ambientes aquáticos100.
É unanimidade entre os autores a afirmação da necessidade de pesquisas ecoepidemiológicas para avaliar as implicações para a Saúde Pública da seleção indireta de
bactérias resistentes aos antimicrobianos realizada pela exposição a metais.
1.12) Operon-mer
Em bactérias a resistência ao mercúrio conferida pelo operon mer é bem
conhecida tanto em bactérias Gram negativas quanto em Gram positivas. Este operon
inclui genes essenciais e genes acessórios para a realização deste processo (Figura 8).
Os genes essenciais codificam as proteínas: MerR (responsáveis pela regulação do
operon), MerT/MerP (transporte do mercúrio para dentro da célula bacteriana) e MerA
(redução do mercúrio iônico). Os genes acessórios – merB, merC, merD, merE, merF e
merG – codificam proteínas que adicionam habilidades aos microrganismos102,103. Na
maioria das vezes o operon mer se inicia com um gene regulatório, o merR cujo produto
é a proteína MerR que pode atuar tanto como repressor como um ativador de trancrição.
Na ausência de Hg2+, MerR atua como repressor se ligando à região operadora do
operon mer e impedindo a transcrição de merTPCAD. Na presença de Hg2+, ele se liga
em um dos dois sítios de ligação de MerR formando um complexo, que atua como um
ativador da transcrição do operon mer1.
Nos sistemas mer de bactérias Gram negativas, merR é transcrita separadamente
e de forma divergente dos outros genes do operon mer permitindo um controle maior do
operon em relação as bactérias Gram positivas104. A proteína periplasmática MerP se
liga a Hg2+ transferindo-o para uma proteína de membrana, a MerT responsável por
21
transportar o Hg2+ para o interior da célula bacteriana. Através da ação da enzima
mercúrio redutase (MerA) o Hg2+ é reduzido a Hg0 e liberado para o meio extracelular
em uma forma volátil e menos tóxica (Figura 9)1. O operon-mer pode codificar ainda
um gene adicional, o merB, que confere além da resistência ao mercúrio inorgânico
também a resistência ao metilmercúrio, forma orgânica do mercúrio. Neste caso, a
bactéria é capaz de clivar a ligação C-Hg de compostos organomercuriais através da
ação da enzima organomercurial liase (MerB)95. A presença do gene acessório merB
tem sido usada na classificação do operon-mer. A resistência somente a compostos de
mercúrio inorgânicos é chamada de resistência de “espectro restrito” enquanto que a
resistência tanto a compostos inorgânicos quanto orgânicos é chamada de resistência de
“amplo estrectro”103.
*
*
*
*
*genes essenciais
Figura 8. Estrutura genética do operon mer em bactérias Gram-negativas (Adaptado de Lal &Lal105).
Periplasma
Membrana
interna
Citoplasma
Difusão
passiva
Resistência de
“amplo espectro”
Resistência de
“espectro restrito”
Figura 9. Mecanismo proposto de resistência bacteriana ao mercúrio de “amplo espectro” e de
“espectro restrito” (Adaptado de Osborn e colaboradores92).
22
Em bactérias Gram-negativas, inclusive as pertencentes à espécie Escherichia
coli, o operon mer tem sido descrito, porém, estudos sobre os aspectos genéticos deste
gene assim como características das populações microbianas carreadoras destes
determinantes são escassos107,108. Na maioria dos trabalhos realizados o gene merA tem
sido empregado como alvo de análise para estudos sobre a resistência ao mercúrio em
populações bacterianas. A investigação dos mecanismos bacterianos envolvidos na
resistência ao mercúrio tem sido de fundamental importância para subsidiar processos
de biorremediação de ambientes contaminados ou a mitigação dos efeitos da poluição
do mercúrio, os quais visam minimizar a exposição humana ao mercúrio e os
conseqüentes efeitos danosos à saúde109,110.
23
2. OBJETIVOS
2.1) Objetivo geral
Isolar amostras de E. coli a partir de ambientes aquáticos no Estado do Rio de
Janeiro e investigar características biogenéticas e de resistência ao mercúrio.
2.2) Objetivos específicos
 Coletar amostras de água de sistemas aquáticos fluminenses com histórico de
contaminação por resíduos químicos e/ou efluentes domésticos visando o isolamento de
E. coli;
 Determinar o fenótipo de resistência e da concentração mínima inibitória (CMI)
ao mercúrio, assim como o fenótipo de resistência a antimicrobianos nas amostras de E.
coli isoladas;
 Detectar o genótipo de resistência ao mercúrio, o grupo filogenético e o
potencial de enterovirulência de todas as amostras de E. coli isoladas empregando
ensaios de amplificação;
 Avaliar a diversidade e as relações entre subpopulações bacterianas carreadoras
do gene de resistência ao mercúrio assim como investigar a ocorrência de padrões
eletroforéticos e/ou variantes grupo-específicos pela técnica de RAPD-PCR;
 Detectar a diversidade do gene merA (285pb) pela técnica da eletroforese em gel
de gradiente desnaturante (DGGE) em amostras de E. coli carreadoras do gene de
resistência ao mercúrio;
 Analisar comparativamente as características investigadas e sua distribuição
entre as diferentes subpopulações bacterianas;
24
3. ÁREA DE ESTUDO
As áreas de coleta foram agrupadas de acordo com a proximidade de possíveis
fontes de contaminação do sistema aquático:
3.1) ÁGUAS DE REGIÕES DE AGLOMERADOS RESIDENCIAIS
Os locais de coleta classificados como pertencentes a regiões de aglomerados
residenciais foram escolhidos pela proximidade com aglomerados residenciais
localizado em regiões com precárias condições higiênico-sanitárias. O esgoto doméstico
pode conter compostos químicos potencialmente nocivos à saúde humana, assim como
microrganismos patogênicos. Para esta categoria foram selecionados os pontos de
coleta: Canal do Mangue, Rio Jacaré, Canal do Cunha, Rio Faria, Rio Irajá, Canal do
Meriti, Rio Sarapuí, Lagoa Rodrigo de Freitas, Lagoa da Tijuca, Lagoa de Marapendi e
Rio São João.
3.2) ÁGUAS DE REGIÕES INDUSTRIAIS
Esses locais de coleta foram escolhidos pela proximidade com a Refinaria de
Duque de Caxias (REDUC) que está localizada no município de Duque de Caxias (RJ).
A REDUC é a segunda maior refinaria do país podendo ser responsável pelo despejo de
óleos, graxas e metais nos sistemas aquáticos111. Nesta categoria foram incluídos o Rio
Iguaçú, Rio Saracuruna e Rio Imbariê, todos localizados no município de Duque de
Caxias nas proximidades da Refinaria de Duque de Caxias (REDUC).
3.3) ÁGUAS DE REGIÕES DE AGROPECUÁRIA
Áreas próximas a regiões de agropecuária têm grande importância pelo
conhecido uso de antimicrobianos como promotor de crescimento animal, com a
utilização na medicina veterinária e na agricultura na prevenção de pragas112,113. Além
disso, estes ambientes contribuem na contaminação dos sistemas aquáticos com fezes
principalmente
de
origem
animal,
podendo
disseminar
diferentes
tipos
de
microrganismos potencialmente patogênicos no ambiente aquático. Nesta categoria
foram incluídos o Rio Vargem Grande e o Córrego das Pedras localizados na região
serrana do Estado do Rio de Janeiro.
25
3.4) ÁGUAS PRÓXIMAS A HOSPITAIS
Efluentes de origem hospitalar representam um grande problema de Saúde
Pública pela possibilidade de conter substâncias radioativas, químicas e farmacêuticas
além de microrganismos patogênicos114. Apesar de microrganismos multirresistentes a
agentes antimicrobianos serem encontrados em diferentes sistemas aquáticos, estudos
têm demonstrado que águas contaminadas por efluentes hospitalares se tornam
ambientes altamente seletivos e contribuem com o lançamento de microrganismos que
exibem altos índices de resistência a antimicrobianos nos sistemas aquáticos114,115. O
ponto de coleta selecionado neste grupo foi selecionado pela proximidade visual a um
hospital localizado na zona oeste do Estado do Rio de Janeiro.
3.5) ÁGUAS RECREACIONAIS
Podem ser classificadas como águas recreacionais regiões de água doce como
lagoas, riachos e lagos, salobras como lagunas ou piscinas públicas utilizadas para fim
de recreação. Estes ambientes podem ser fonte de diversas doenças veiculadas pela água
podendo resultar em surtos comparáveis aos causados pelo consumo de água potável
contaminada1. O local de coleta escolhido para análise nesta categoria foi o Parque
Ambiental da Praia de Ramos, conhecido popularmente como “Piscinão de Ramos”,
pela grande quantidade de freqüentadores. O Parque Ambiental da Praia de Ramos é
uma praia artificial pública de água salgada, situada na zona norte do Estado do Rio de
Janeiro, no bairro de Ramos.
26
Abaixo encontram-se fotos de alguns dos pontos de coleta amostrados no
presente estudo:
Figura 10. Rio Faria (Esquerda) e Rio Jacaré (Direita) (Fonte: Google Earth).
Figura 11. Canal do Cunha (Esquerda) e Rio Iguaçú (Direita) (Fonte: Google Earth).
Figura 12. Canal do Mangue (Esquerda) e Lagoa Rodrigo de Freitas (Direita) (Fonte: Google Earth).
27
4. METODOLOGIA
4.1) COLETA DE ÁGUA
O procedimento de coleta seguiu a metodologia de filtração por membrana
(Figura 13) com algumas modificações16. Resumidamente, uma alíquota de 60 mL foi
aspirada da camada superior da coluna d´água a uma profundidade de aproximadamente
30 centímetros com auxílio de uma seringa estéril adaptada ao suporte de filtração. O
material aspirado foi filtrado em membrana de acetato celulose (Milllipore®), com
porosidade de 0,22 µm e transportado em ambiente devidamente refrigerado para
imediato processamento em laboratório.
Figura 13. Procedimento de coleta e filtração da água coletada. Após a coleta da água com a seringa,
o procedimento de filtração das células bacterianas contou com o auxílio do suporte de filtração com a
membrana de acetato celulose estéril (Fotografia de: Adriana Bezerra).
4.2) ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE Escherichia coli
A membrana contendo as células bacterianas retidas foi incubada em 20 mL de
caldo de tripticaseína de soja (TSB - Difco®) por 18-24 horas a 37ºC. Após o período de
crescimento bacteriano, o caldo foi diluído em salina 0,9% (p/v) nas proporções de
1:10, 1:50 e 1:100 e, em sequência, uma alíquota de 50µL de cada uma das diluições foi
utilizada para semear em agar eosina azul de metileno (EMB - Difco®), visando o
isolamento de E. coli. O EMB é um meio de cultura diferencial e seletivo utilizado para
o isolamento, cultivo e diferenciação de bastonetes Gram-negativos entéricos tanto de
origem clínica quanto não-clínica. Este meio contém eosina amarela e corante azul de
metileno que inibem, até certo ponto, o crescimento de bactérias Gram-positivas e
também são indicadores diferenciais para a fermentação de lactose e/ou sacarose. O
28
aspecto morfológico característico de E. coli neste meio é de colônias grandes, negroazuladas com brilho verde metálico, podendo algumas vezes apresentar colônias com o
centro púrpura e sem a produção de brilho verde metálico ou mesmo colônias rosadas
lactose negativas (Manual BBL® EMB Agar, Modified, Holt-Harris and Teague,
disponível em: http://www.bd.com/ds/productCenter/221354.asp). Após 18-24 horas a
37oC 10 a 15 colônias bacterianas, lactose positivas e lactose negativas, foram
selecionadas com base nas características morfofisiológicas sugestivas da espécie
(Figura 14).
Figura 14. Fotografia do aspecto colonial característico de E.coli em Teague (Fotografia de: Raquel
Rebello).
Para a confirmação do gênero e da espécie, as colônias foram submetidas a
provas bioquímicas utilizando-se os meios EPM, MILi e Citrato de Simmons (Probac
do Brasil®) (Figura 15). O padrão bioquímico esperado para a espécie bacteriana E. coli
no meio EPM é produção de gás em glicose (+), utilização da glicose (+), produção de
sulfeto de hidrogênio (-), hidrólise da uréia (-) e desaminação do triptofano (-). No meio
MILi os resultados esperados são motilidade (variável), produção de indol (+) e
descarboxilação de lisina (variável). E. coli apresenta resultado negativo para utilização
de citrato no meio Citrato de Simmons em 99% dos casos27.
29
1
2
3
Figura 15. Fotografias do procedimento de isolamento e provas bioquímicas para confirmação de
espécie. Sendo: (A) Crescimento bacteriano em caldo de tripticaseína de soja com a membrana pós-coleta
após incubação de 18-24hs a 37ºC; (B) Crescimento de colônias bacterianas em ágar eosina azul de
metileno a partir da suspensão bacteriana em caldo de tripticaseína de soja e (C) Padrão bioquímico da
espécie nos meios EPM (1), MILi (2) e Citrato de Simmons (3) (Fotografias de: Raquel Rebello)
4.3) ESTOCAGEM DAS CEPAS DE Escherichia coli
As amostras bacterianas identificadas bioquimicamente como E. coli foram
estocadas e congeladas à -20ºC em caldo tripticaseína de soja (TSB - Difco®) contendo
glicerol a 15% (v/v) até serem utilizadas para as análises propostas. A cada teste foram
avaliados o grau de pureza e a viabilidade das células bacterianas.
4.4) AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE AO MERCÚRIO
4.4.1) Determinação do fenótipo de resistência ao mercúrio
Para classificar a amostra bateriana como resistente ou sensível ao Hg, as
mesmas foram semeadas em meio agar nutriente (AN – Difco®) contendo 5 M de
solução padrão de mercúrio (Hg2+)116. A observação do crescimento bacteriano após o
período de 24-48 horas a 37°C permitiu classificar a amostra como resistente ao Hg.
Foram utilizadas as amostras de E. coli ATCC 35218 e ATCC 23724 como controles de
resistência e sensibilidade ao Hg, respectivamente.
4.4.2) Determinação da concentração mínima inibitória (CMI)
A determinação do CMI foi feita seguindo a metodologia apresentada por
Andrews117 com algumas modificações. A suspensão-inóculo de cada amostra a ser
testada foi preparada em solução salina 0,9% (p/v), a partir de culturas de 18-24 horas
30
em agar nutriente devendo a solução final conter 1,5 x 109 células bacterianas (escala de
McFarland 0,5). Uma alíquota de 2µL desta suspensão bacteriana foi semeada na forma
de spots e em duplicata em placas de agar nutriente contendo concentrações crescentes
de mercúrio (10 a 40 M). Após o período de 24-48 horas a 37°C, o valor de CMI foi
determinado observando-se a inibição do crescimento bacteriano em placa. Os testes
foram realizados apenas com as amostras de E. coli que expressaram o fenótipo de
resistência ao mercúrio na concentração de 5 M. Como controle foram utilizadas placas
com o mesmo meio de cultura sem a adição do mercúrio.
As etapas subseqüentes foram realizadas com todas as amostras de Escherichia coli do
estudo, incluindo dessa forma, tanto as sensíveis quanto as resistentes ao mercúrio.
4.5) AVALIAÇÃO DA SUSCEPTIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS
A susceptibilidade a agentes antimicrobianos foi avaliada empregando o
método de difusão em agar seguindo recomendações prévias (CLSI118) utilizando os
discos impregnados com os seguintes antimicrobianos: amicacina - AMI (CECON® 30µg), ampicilina - AMP (CECON® - 10µg), cefalotina - CFL (CECON® - 30µg),
cefepima - CPM (CECON® - 30µg), cefoxitina - CFO (CECON® - 30µg),
ciprofloxacino - CIP (CECON® - 5µg), gentamicina - GEN (CECON® - 10µg),
nitrofurantoína - NIT (CECON® - 300 µg), norfloxacino - NOR (CECON® - 10µg),
sulfazotrim - SUT (CECON® - 25µg), trimetoprim - TRI (CECON® - 5µg) (Figura 16).
Para os controles de qualidade dos testes de susceptibilidade foram incluídos os
seguintes padrões: E. coli ATCC 23724 e E. coli ATCC 35218.
Figura 16. Teste de sensibilidade a antimicrobianos: halos de inibição exibidos pela amostra RM 95
(Fotografias de: Raquel Rebello).
31
4.6) EXTRAÇÃO DE DNA BACTERIANO
Para a extração do DNA as amostras foram semeadas em agar de tripticaseína
de soja (TSA - Difco®) a 37oC por 18-24 horas. Após o período de crescimento, as
células bacterianas foram ressuspensas em 60µL de tampão Tris-EDTA (Anexo, item
1.1), submetido a fervura por 5 minutos e centrifugado a 14.000 rpm por cerca de 1
minuto. O sobrenadante, cerca de 40µL, foi aspirado, transferido para outro tubo estéril
e conservado a 4ºC, por até uma semana, até o momento da reação. Os produtos da
extração de DNA bacteriano foram usados como fonte de DNA para as PCRs de
amplificação do gene merA e de agrupamento filogenético.
4.7) PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE merA
A reação de amplificação do gene merA seguiu recomendações prévias de
Chadhain e colaboradores119 com algumas modificações.
4.7.1) Reação de PCR
Para a reação de PCR foi utilizado um volume final de 25 L nas reações de
amplificação contendo um volume de 3 l do lisado bacteriano, 2,5 L de tampão 10X
(Invitrogen®), 2mM de MgCl2 (Invitrogen®), 0,2mM de dNTPs (Invitrogen®),
30pmol/µL de cada iniciador (Tabela 1) e 1U/µL de Platinum Taq DNA polimerase
(Invitrogen®). A reação foi realizada em termociclador Mastercycler Personal
(Eppendorf®) e programada para uma desnaturação inicial de 94oC por 5 minutos
seguida de 45 ciclos de 94oC por 10 segundos, 68oC por 40 segundos e 72oC por 1
minuto e extensão final de 72oC por 7 minutos.
4.7.2) Condições de eletroforese
Aproximadamente 10µL dos produtos de amplificação foram adicionados a
2µL de tampão de corrida (gel loading buffer - Invitrogen®) e submetidos à eletroforese
em gel de agarose na concentração de 1,3% (p/v) (Anexo, item 1.2) preparado em TrisBorato-EDTA 0,5X (Anexo, item 1.3) com voltagem constante de 70V por 3 horas e 30
minutos. Após a eletroforese o gel foi corado com solução de brometo de etídeo
(Invitrogen®) a 0,5µg/mL (Anexo, item 1.4) durante um período de 15 minutos e
submetido à lavagem em água destilada durante cerca de 30 minutos. O gel foi
32
inspecionado visualmente em transiluminador de luz ultravioleta (UVITec®,
Cambridge, Reino Unido) e fotografados em sistema de captura de imagem digital
(UVIPro silver®, Cambridge, Reino Unido). Para estimar o tamanho dos fragmentos
obtidos foi utilizado o padrão de 100pb DNA ladder (Invitrogen®). Como controles de
reação foram incluídas cepas bacterianas resistentes e sensíveis ao mercúrio (E. coli ATCC 35218; E. coli - ATCC 23724).
Tabela 1. Iniciadores de PCR para a amplificação do gene merA (Chadhain e colaboradores119).
Iniciador
Sequência (5´-3´)
A1s-n.F
A5-n.R
TCCGCAAGTNGCVACBGTNGG
ACCATCGTCAGRTARGGRAAVA
Gene ou
fragmento
alvo
Tamanho do
amplicon
(pb)
Concentração
do primer
(pmol/µL)
merA
285
30
4.8) PCR-TRIPLEX PARA AGRUPAMENTO FILOGENÉTICO DE Escherichia
coli
A detecção dos genes chuA, yjaA e do fragmento TSPE4.C2 foi realizada
através de ensaios de amplificação seguindo metodologia já descrita45.
4.8.1) Reação de PCR
Para a reação de PCR foi utilizado um volume final de 20 L contendo 3 L do
DNA bacteriano, 2 L de tampão 10X (Invitrogen®), 20pmol/µL de cada iniciador
(Tabela 2), 0,16mM de dNTP (Invitrogen®), 3mM de MgCl2 (Invitrogen®) e 2,5U/µL de
Taq DNA polimerase (Invitrogen®). A reação foi realizada em termociclador
Mastercycler Personal (Eppendorf®) e programada para desnaturação inicial de 94oC
por 4 minutos seguida de 30 ciclos de 94oC por 5 segundos e 59oC por 10 segundos
seguida de uma extensão final de 72oC por 5 minutos.
33
Tabela 2. Iniciadores de PCR-triplex para agrupamento filogenético de E. coli (Clermont e
colaboradores45).
Gene ou
fragmento alvo
Tamanho do
amplicon (pb)
Concentração do
primer (pmol/µL)
GACGAACCAACGGTCAGGAT
TGCCGCCAGTACCAAAGACA
chuA
279
20
yjaA.1
yjaA.2
TGAAGTGTCAGGAGACGCTG
ATGGAGAATGCGTTCCTCAAC
yjaA
211
20
tspE4C2.1
tspE4C2.2
GAGTAATGTCGGGGCATTCA
CGCGCCAACAAAGTATTACG
TSPE4.C2
152
20
Iniciador
Sequência (5´-3´)
chuA.1
chuA.2
4.8.2) Condições de eletroforese
Aproximadamente 10µL dos produtos resultantes de amplificação foram
adicionados a 2µL de tampão de corrida (gel loading buffer - Invitrogen®) e submetidos
à eletroforese em gel de agarose na concentração 1,2% (p/v) (Anexo, item 1.5)
preparado em tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X com voltagem constante de 100V por 3
horas e 30 minutos. Após a eletroforese o gel foi corado com solução de brometo de
etídeo (Invitrogen®) a 0,5µg/mL durante um período de 15 minutos e submetido à
lavagem em água destilada durante cerca de 30 minutos. O gel foi inspecionado
visualmente em transiluminador de luz ultravioleta (UVITec®, Cambridge, Reino
Unido) e fotografados em sistema de captura de imagem digital (UVIPro silver ®,
Cambridge, Reino Unido). Para estimar o tamanho dos fragmentos obtidos foi utilizado
o padrão de 100pb DNA ladder (Invitrogen®).
A reprodutibilidade foi avaliada
observando-se a repetição do padrão eletroforético com base em diferentes reações de
amplificação e de culturas do mesmo isolado. Como controle de reação foi utilizada a
amostra selvagem L75A (UPEC: chuA +, yjaA+ e TSPE4.C2+).
34
4.8.3) Agrupamento filogenético
A tipagem filogenética seguiu a observação da presença ou ausência dos alvos
genéticos de acordo com a árvore dicotômica proposta por Clermont e colaboradores45 e
demonstrada no esquema a seguir:
chuA
+
B2 ou D
B1 ou A
yjaA
TSPE4.C2
+
B2
D
+
B1
A
Figura 17. Árvore de classificação filogenética de amostras de E. coli. Classificação proposta por
Clermont e colaboradores45 a partir da amplificação dos genes chuA, yjaA e do fragmento TSPE4.C2
(Adaptado Clermont e colaboradores45).
4.9) PCR-MULTIPLEX PARA ENTEROVIRULÊNCIA DE Escherichia coli
(PCR-DEC)
A reação de PCR-DEC seguiu a metodologia utilizada por Müller e
colaboradores120 para a detecção e diferenciação simultânea das sete categorias de
E.coli diarreiogênicas descritas no artigo (EPEC, ATEC, ETEC, EIEC, EAEC, STEC e
EHEC) (Quadro 3).
4.9.1) Reação de PCR
Para a reação de PCR foi utilizado um volume final de 25 L contendo 2,5 L
de tampão 10X (Invitrogen®), 0,3mM de cada dNTP (Invitrogen®), 2,1mM de MgCl2
(Invitrogen®) e 2U/µL de Taq DNA polimerase (Invitrogen®), 14mM 2-mercaptoetanol
(Sigma®), 0,14% Triton X-10 (Sigma®) e as concentrações dos iniciadores listadas na
tabela 3. Como fonte de DNA foi selecionada uma colônia de cada amostra proveniente
35
de crescimento recente em agar de tripticaseína de soja (TSA-Difco®). A colônia foi
ressuspensa no mix de reação e a solução foi acondicionada em gelo durante 1 minuto.
A reação foi realizada em termociclador Mastercycler Personal (Eppendorf®) e
programada para desnaturação inicial de 94oC por 5 minutos seguida de 30 ciclos de
94oC por 30 segundos, 63oC por 30 segundos e 72ºC por 1,5 minuto seguida de uma
extensão final de 72oC por 5 minutos.
4.9.2) Condições de Eletroforese
Aproximadamente 10µL dos produtos de amplificação foram adicionados a
2µL de tampão de corrida (gel loading buffer - Invitrogen®) e submetidos à eletroforese
em gel de agarose na concentração de 1,5% (p/v) (Anexo, item 1.6) preparado em
tampão Tris-Borato-EDTA 0,5X com voltagem constante de 80V por 4 horas e 30
minutos. Após a eletroforese o gel foi corado com solução de brometo de etídeo
(Invitrogen®) a 0,5µg/mL durante um período de 15 minutos e submetido à lavagem em
água destilada durante cerca de 30 minutos. O gel foi inspecionado visualmente em
transiluminador de luz ultravioleta (UVITec®, Cambridge, Reino Unido) e fotografados
em sistema de captura de imagem digital (UVIPro silver®, Cambridge, Reino Unido).
Para estimar o tamanho dos fragmentos obtidos foi utilizado o padrão de 100pb DNA
ladder (Invitrogen®). Como controles de reação foram utilizadas as amostras clínicas
243IV (EPEC típica - escV, bfpB), 36IV (ETEC - lt), 245I (ETEC - st), E30138 (STEC
- stx2), E40705 (STEC - stx1), 103V (EAEC - aggR) e 129III (EIEC - inv)48,58.
36
Tabela 3. Iniciadores utilizados para o PCR-multiplex para enterovirulência de E. coli (Müller e
colaboradores120).
Iniciador
Sequência (5´-3´)
Gene ou
fragmento
alvo
Tamanho
do amplicon
(pb)
Concentração
do primer
(µM)
MP3-escV-F
MP3-escV-R
ATTCTGGCTCTCTTCTTCTTTATGGCTG
CGTCCCCTTTTACAAACTTCATCGC
escV
544
0.4
0.4
MP3-bfpB-F
MP3-bfpB-R
GACACCTCATTGCTGAAGTCG
CCAGAACACCTCCGTTATGC
bfpB
910
0.1
0.1
MP4-stx1A-F
MP4-stx1A-R
CGATGTTACGGTTTGTTACTGTGACAGC
AATGCCACGCTTCCCAGAATTG
stx1
244
0.2
0.2
MP3-stx2A-F
MP3-stx2A-R
GTTTTGACCATCTTCGTCTGATTATTGAG
AGCGTAAGGCTTCTGCTGTGAC
stx2
324
0.4
0.4
MP2-LT-F
MP2-LT-R
GAACAGGAGGTTTCTGCGTTAGGTG
CTTTCAATGGCTTTTTTTTGGGAGTC
elt
655
0.1
0.1
MP4-STIa-F
MP4-STIa-R
CCTCTTTTAGYCAGACARCTGAATCASTTG
CAGGCAGGATTACAACAAAGTTCACAG
estIa
157
0.4
0.4
MP2-STI-F
MP2-STI-R
TGTCTTTTTCACCTTTCGCTC
CGGTACAAGCAGGATTACAACAC
estIb
171
0.2
0.2
MP2-invE-F
MP2-invE-R
CGATAGATGGCGAGAAATTATATCCCG
CGATCAAGAATCCCTAACAGAAGAATCAC
invE
766
0.2
0.2
MP2-astA-F
MP2-astA-R
TGCCATCAACACAGTATATCCG
ACGGCTTTGTAGTCCTTCCAT
astA
102
0.4
0.4
MP2-aggr-F
Mp2-aggr-R
ACGCAGAGTTGCCTGATAAAG
AATACAGAATCGTCAGCATCAGC
aggR
400
0.2
0.2
MP2-pic-F
MP2-pic-R
AGCCGTTTCCGCAGAAGCC
AAATGTCAGTGAACCGACGATTGG
pic
1,111
0.2
0.2
MP2-uidA-F
MP2-uidA-R
ATGCCAGTCCAGCGTTTTTGC
AAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTG
uidA
1,487
0.2
0.2
37
Quadro 3. Classificação dos patotipos intestinais de E. coli com base nos marcadores genéticos
investigados, segundo critério definido por Müller e colaboradores120.
Patotipo
Genes de enterovirulência
Função dos genes
EPEC
escV
bfpB
SSTT
Fímbria do tipo IV
ATEC
escV
SSTT
ETEC
elt
estIa
estIb
Toxina termolábil
Toxina termoestável I
Toxina termoestável II
STEC
stx1
stx2
Toxina citotóxica de Shiga (família 1)
Toxina citotóxica de Shiga (família 2)
EHEC
escV
stx1
stx2
Toxina citotóxica de Shiga (família 1)
Toxina citotóxica de Shiga (família 2)
EIEC
invE
Regulon
EAEC
astA
aggR
pic
Enterotoxina termoestável 1 (EAST1)
Regulon
Proteína extracelular
Marcador de espécie
uidA
A investigação da diversidade do genoma total e da diversidade do gene merA foram
realizadas apenas com as amostras de Escherichia coli merA+.
4.10) AMPLIFICAÇÃO RANDÔMICA DO DNA POLIMÓRFICO (RAPD-PCR)
A reação de RAPD-PCR foi realizada seguindo a metodologia proposta por
Pacheco e colaboradores57.
4.10.1) Extração do DNA e reação de PCR
O DNA bacteriano foi obtido por meio de extração térmica a partir de uma
suspensão bacteriana de concentração definida conforme previamente descrito57. Para a
reação de PCR foi utilizado um volume final de 30 L contendo 2 L do DNA
bacteriano, 3 L de tampão 10X (Invitrogen®), 30pmol/µL de cada iniciador (Tabela 4),
250µM de cada dNTP (Invitrogen®), 3mM de MgCl2 (Invitrogen®) e 1U/µL de Taq
DNA polimerase (Invitrogen®). A reação foi realizada em termociclador Mastercycler
Personal (Eppendorf®) e programada uma etapa de desnaturação inicial de 94oC por 1
38
minuto seguida de 4 ciclos de 94oC por 4 minutos, 37oC por 4 minutos e 72oC por 4
minutos, 30 ciclos de 94oC por 1 minuto, 37oC por 1 minuto e 72oC por 2 minutos e
extensão final de 72oC por 10 minutos.
Tabela 4. Iniciadores para amplificação randômica do DNA polimórfico de E. coli.
Iniciador
Sequência (5´-3´)
Concentração do
primer
(pmol/µL)
Referência
1247
AAGAGCCCGT
30
Johnson e colaboradores121
1254
CCGCAGCCAA
30
Regua-Mangia e colaboradores48
1290
GTGGATGCGA
30
Regua-Mangia e colaboradores48
A04
AATCGGGCTG
30
Silva122
4.10.2) Condições de eletroforese
Aproximadamente 10µL dos produtos de amplificação foram adicionados a
2µL de tampão de corrida (gel loading buffer - Invitrogen®) e submetidos à eletroforese
em gel de agarose na concentração de 1,5% (p/v) preparado em tampão Tris-BoratoEDTA 0,5X com voltagem constante de 60V por 4 horas e 30 minutos. Para estimar o
tamanho dos fragmentos obtidos foi utilizado o padrão de 1Kb DNA ladder
(Invitrogen®). Após a eletroforese o gel foi corado com solução de brometo de etídeo
(Invitrogen®) a 0,5µg/mL durante um período de 15 minutos e submetido à lavagem em
água destilada durante cerca de 30 minutos. Os perfis de amplificação foram submetidos
à análise visual e automatizada, com auxílio do UVI Soft Image Acquisition and
Analysis Software, empregando-se o programa UVIPro bandmap versão 11.9 (UVItec®,
Cambridge, Reino Unido). O critério para a definição dos perfis eletroforéticos
consideram a intensidade, presença e ausência de bandas. Para estimar o tamanho dos
fragmentos obtidos foi utilizado o padrão de 1Kb DNA ladder (Invitrogen®).
39
O potencial discriminatório dos iniciadores utilizados neste trabalho foi
calculado através da equação da diversidade122,123.
Onde N é o número total de amostras, S é o número total de perfis gerados e nj
é o número de amostras pertencentes a um perfil.
4.11) ELETROFORESE EM GEL COM GRADIENTE DESNATURANTE
(DGGE)
O procedimento realizado no presente estudo incluiu: 1) extração do DNA das
amostras de E. coli carreadoras do gene merA; 2) nova reação PCR e corrida de
eletroforese para a detecção do gene merA; 3) purificação do fragmento esperado
através de Kit de extração de DNA em gel e 4) Separação dos produtos de PCR pelo
DGGE.
4.11.1) Extração do DNA em gel
A extração do DNA em gel realizada empregando o kit AxyPrepTM DNA Gel
Extraction Kit (Axygen Biosciences®) foi utilizada para possibilitar a purificação do
fragmento de DNA alvo da reação de PCR-merA (285pb) (item 4.7). O produto
purificado foi utilizado como fonte de DNA.
4.11.2) Reação de PCR
Para a reação de DGGE-PCR foi utilizado um volume final de 25 L nas
reações de amplificação contendo um volume de 3 l do DNA purificado, 2,5 L de
tampão 10X (Invitrogen®), 2mM de MgCl2 (Invitrogen®), 0,2mM de dNTPs
(Invitrogen®), 30pmol/µL de cada iniciador (Tabela 5), formamida 1% (Anexo, item
1.7) e 1U/µL de Platinum Taq DNA polimerase (Invitrogen®). A reação foi realizada
em termociclador Mastercycler Personal (Eppendorf®) e programada para uma
desnaturação inicial de 94oC por 5 minutos seguida de 45 ciclos de 94oC por 10
segundos, 68oC por 40 segundos e 72oC por 1 minuto e extensão final de 72oC por 7
minutos.
40
Tabela 5. Iniciadores de PCR para a amplificação do gene merA usados para o ensaio de DGGE.
Iniciador
Sequência (5´-3´)
A1s-n.F*
TCCGCAAGTNGCVACBGTNGG
CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCAC
GGGGGG
A5-n.R
Gene ou
fragmento
alvo
Tamanho
do amplicon
(pb)
Concentração
do primer
(pmol/µL)
merA
285
30
ACCATCGTCAGRTARGGRAAVA
*Iniciador adicionado do grampo CG, referência Muyzer e colaboradores124
4.11.3) Condições de eletroforese
Aproximadamente 25µL do produto de amplificação foram adicionados a
15µL de corante para eletroforese de DNA (Anexo, item 1.8) e aplicados em gel de
poliacrilamida com gradiente linear de desnaturantes de 55%-80% (Anexo, itens 1.91.12), formados a partir de soluções estoque de poliacrilamida (8%), uma com 0% e
outra contendo 100% dos agentes desnaturantes (Anexo, itens 1.13-1.15). A eletroforese
foi realizada no equipamento DcodeTM Universal Mutation System (BIO-Rad®) (Figura
18) e conduzida na voltagem constante de 100V a 60°C por 6 horas em Tris-acetato
0,5X (Anexo, item 1.16). Após a corrida o gel foi corado em Sybr Green (Molecular
Probes®, Oregon, EUA) (Anexo, item 1.17) por 30 minutos e visualizados em
transiluminador UV.
Figura 18. Ensaio DGGE. Sendo: (A) Formação do gradiente desnaturante e (B) Sistema de eletroforese
DcodeTM (Fotografias de: Raquel Rebello).
41
O esquema geral da caracterização realizada para as amostras do estudo estão
resumidas na figura abaixo (Figura 19):
Membrana de acetato celulose-Millipore
pós-coleta
Caldo de Tripticaseína
de soja
Diluição seriada em ágar
eosina azul de metileno
(Teague)
IDENTIFICAÇÃO BIOQUÍMICA
EPM, MILi e citrato de simmons
ESTOQUE
TSB glicerol
MÉTODOS
GENOTÍPICOS
MÉTODOS
FENOTÍPICOS
Determinação da
resistência ao Hg*
Avaliação da
susceptibilidade aos
antimicrobianos**
PCR merA*
Gene merA+
HgR
PCR-Triplex
Filogenia**
PCR-Multiplex
Enterovirulência**
*Método relacionado
resistência ao Hg
à
** Método relacionado à
virulência em E. coli
Determinação da
CMI ao Hg*
PCR-RAPD*
DGGE do gene merA*
Figura 19. Esquema geral de caracterização realizada para as amostras de E. coli incluídas neste
estudo.
42
5. RESULTADOS
Os resultados obtidos no presente estudo foram parcialmente apresentados nos
seguintes eventos científicos:
 XLVII Congresso da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. RN, 2011.
“Potencial de uropatogenicidade e enteropatogenicidade em amostras de Escherichia
coli isoladas de diferentes sistemas aquáticos”.
 26º Congresso Brasileiro de Microbiologia. PR, 2011. “Caracterização
fenotípica da resistência a antimicrobianos e ao mercúrio em amostras de Escherichia
coli isoladas de sistemas aquáticos fluminenses”.
43
5.1) COLETA DE ÁGUA, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE Escherichia
coli
Foram obtidas amostras de E. coli em todos os 18 diferentes pontos de coleta
situados no Estado do Rio de Janeiro. As amostras foram agrupadas em áreas de coleta
de acordo com a proximidade de possíveis fontes de contaminação do sistema aquático
(Tabela 6; Tabela 22).
Tabela 6. Número de amostras de E. coli isoladas por área e ponto de coleta.
Área de coleta
Ponto de coleta
Número de
amostras
Total de
amostras (%*)
Águas de regiões de aglomerados
residenciais
Canal do Mangue
Rio Jacaré
Canal do Cunha
Rio Faria
Rio Irajá
Canal do Meriti
Rio Sarapuí
Lagoa Rodrigo de Freitas
Lagoa da Tijuca
Lagoa de Marapendi
Rio São João
05
01
03
03
13
04
01
18
08
07
12
75 (42,1%)
Águas de regiões industriais
Rio Saracuruna
Rio Imbariê
Rio Iguaçú
04
02
03
09 (5%)
Águas de regiões de agropecuária
Rio Vargem Grande
Córrego das Pedras
06
20
26 (14,6%)
Águas próximas a hospitais
Canal Cândido Portinari
29
29 (16,3%)
Águas recreacionais
Parque Nacional da Praia de Ramos
39
39 (22%)
Total
18
178
178
* O valor da porcentagem foi calculado de acordo com a população total (n=178)
44
MÉTODOS FENOTÍPICOS
5.2) FENÓTIPO DE SUSCEPTIBILIDADE AO MERCÚRIO
5.2.1) Determinação do fenótipo de resistência ao mercúrio e determinação da
concentração mínima inibitória (CMI)
Do total de 178 amostras de E. coli isoladas neste estudo, 164 (92,1%) foram
classificadas como resistentes ao Hg (HgR) pois cresceram em placas de agar nutriente
contendo 5 M de mercúrio (Tabela 7). Todas essas 164 amostras que exibiram
resistência a 5 M de Hg apresentaram o valor de CMI igual a 10µM de Hg (Tabela 22).
Tabela 7. Número e porcentagem de amostras de E. coli HgR por área de coleta.
Área de coleta
Isolados de E. coli (nº)
Resistência a 5µM de Hg (%)
Águas de regiões de aglomerados residenciais
Águas de regiões industriais
Águas de regiões de agropecuária
Águas recreacionais
Águas próximas a hospitais
Total
75
9
26
39
29
178 (100%)
60 (80%)
9 (100%)
26 (100%)
39 (100%)
29 (100%)
164 (92,1%)
Tabela 8. Número e porcentagem de amostras de E. coli HgR isoladas de ÁGUAS DE REGIÕES DE
AGLOMERADOS RESIDENCIAIS.
Ponto de Coleta
Amostras de E. coli (nº)
Resistência a 5µM de Hg (%)
Canal do Mangue
Rio Jacaré
Canal do Cunha
Rio Faria
Rio Irajá
Canal do Meriti
Rio Sarapuí
Lagoa Rodrigo de Freitas
Lagoa da Tijuca
Lagoa de Marapendi
Rio São João
Total
05
01
03
03
13
04
01
18
08
07
12
75 (100%)
04 (80%)
01 (100%)
03 (100%)
01 (33,3%)
10 (76,9%)
02 (50%)
01 (100%)
11 (61,1%)
08 (100%)
07 (100%)
12 (100%)
60 (80%)
45
5.3) FENÓTIPO DA SUSCEPTIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS
Os testes de difusão em agar revelaram que 18,5%
(n=33) da população
bacteriana foi sensível a todos os antimicrobianos testados. O fenótipo de resistência foi
detectado em 37% (n=66) dos isolados definindo 23 perfis de resistência distintos (IXXIII) (Tabela 9). Desses perfis, quatro corresponderam a padrões de resistência
isolada para amicacina, cefalotina, gentamicina e nitrofurantoína e 19 a padrões de
multirresistência, ou seja, resistência a mais de um agente antimicrobiano (V-XXIII). A
resistência aos antimicrobianos testados na população total (n=178) foi de: 24,7% CFL
(n=44), 12,4% AMI (n=22), 9% AMP (n=16), 5,6% GEN (n=10), 3,4% CIP (n=06),
3,4% NOR (n=06), 3,4% TRI (n=06), 2,8% CFO (n=05), 2,8% NIT (n=05) e 0,6%
CPM (n=01) (Gráfico 1). A multirresistência para até 07 antimicrobianos foi detectada
em 16,8% (n=30) das amostras e a resistência intermediária em 62,3% (n=118).
Tabela 9. Perfis de resistência a antimicrobianos encontrados nas amostras de E. coli por área de
coleta.
Perfil de
resistência
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
XX
XXI
XXII
XXIII
Total
Nº de amostras por área de coleta
Antimicrobiano
AMI
CFL
GEN
NIT
AMP, CFL
AMI, GEN
AMI, CFL
CFO, CPM
CFL, TRI
CIP, NOR
TRI, SUT
AMP, TRI, SUT
AMI, GEN, CFO
AMI, GEN, CFL
CFL, NOR, NIT
AMP, AMI, GEN, CFO
AMP, AMI, GEN, CFL
AMP, CFO, CFL, NIT
AMP, CFL, CIP, NOR
CIP, TRI, SUT, NOR
AMP, AMI, GEN, CFL, NIT
AMP, AMI, CFL, TRI, SUT
AMP, AMI, GEN, CFO, CFL, CIP, NIT
A
B
C
D
E
3
2
1
0
1
1
1
1
1
0
0
1
1
1
0
0
0
0
3
0
0
0
0
17
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
02
3
6
0
0
1
0
1
0
0
0
2
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
0
0
15
1
16
0
0
2
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
1
0
0
0
0
0
1
22
3
0
0
1
2
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
0
10
Total de
amostras
10
24
1
1
6
2
2
1
1
1
2
1
1
2
1
1
1
1
3
1
1
1
1
66
Legenda. A - Águas de regiões de aglomerados residenciais; B - Águas de regiões industriais; C - Águas
de regiões de agropecuária; D - Águas recreacionais e E - Águas próximas a hospitais.
46
24,7
12,4
9
2,8
5,6
3,4
0,6
2,8
3,4
3,4
Gráfico 1. Porcentagem total de amostras de E. coli resistentes por antimicrobiano testado (n=178).
Códigos referentes aos antimicrobianos: AMI (amicacina), AMP (ampicilina), CFL (cefalotina), CFO
(cefoxitina), CIP (ciprofloxacino), CPM (cefepima), GEN (gentamicina), NIT (nitrofurantoína), NOR
(norfloxacino), SUT (sulfazotrim) e TRI (trimetoprim).
Tabela 10. Número de amostras de E. coli resistentes aos antimicrobianos separados por classe e
grupo de antimicrobianos.
Classe
Grupo
Antimicrobiano
Nº de amostras
Aminopenicilinas
Ampicilina
16
Cefamicinas
Cefalotina (1ª geração)
Cefepima (4ª geração)
Cefoxitina
44
05
01
Aminoglicosídeos
-
Amicacina
Gentamicina
22
10
Quinolonas
Fluoroquinolonas
Ciprofloxacino
Norfloxacino
06
06
Inibidores da via
folato
-
Sulfonamidas
Trimetoprim
05
06
Nitrofuranos
-
Nitrofurantoína
05
Β-lactâmicos
cefalosporinas
47
5.3.1) Fenótipo da susceptibilidade a antimicrobianos por área de coleta
No grupo das amostras isoladas de águas de regiões de aglomerados residenciais
a resistência foi detectada em 22,7% (n=17) das amostras representando índices de 12%
CFL (n=09), 9,3% AMI (n=07), 6,7% AMP (n=05), 5,3% GEN (n=04), 4% NOR
(n=03), 4% CIP (n=03), 2,7% CFO (n=02), 2,7% TRI (n=02), 1,3% SUT (n=01) e 1,3%
CPM (n=01). Nenhuma amostra apresentou resistência à nitrofurantoína. O fenótipo de
resistência nesta área de coleta definiu 12 perfis de resistência distintos sendo 03
correspondentes a padrões de resistência isolada para amicacina, cefalotina e
gentamicina e 09 a padrões de multirresistência. A resistência intermediária foi
detectada
para
ampicilina,
amicacina,
gentamicina,
cefoxitina,
cefalotina,
ciprofloxacino, trimetoprim, sulfazotrim e nitrofurantoína. A multirresistência foi
observada para até 04 antimicrobianos e detectada em 14,6% (n=11) das amostras.
No grupo das amostras isoladas de águas de regiões industriais a resistência foi
detectada em 22,2% (n=02) das amostras representando índice de 11,1% (n=01) para os
antimicrobianos AMP, AMI, CFL, CIP, TRI, SUT e NOR. Nenhuma amostra
apresentou resistência à gentamicina, cefoxitina, cefepima e nitrofurantoína. O fenótipo
de resistência nesta área de coleta definiu 02 perfis de resistência sendo um
correspondente a um padrão de multirresistência para ciprofloxacino e norfloxacino e o
outro correspondende a um padrão de multiresistência para ampicilina, amicacina,
cefalotina, trimetoprim e sulfazotrim. A resistência intermediária foi detectada para
amicacina, gentamicina e cefalotina. A multirresistência foi observada para até 05
antimicrobianos e detectada em 22,2% (n=02) das amostras.
No grupo das amostras isoladas de águas de regiões de agropecuária a
resistência foi detectada em 57,7% (n=15) das amostras representando índices de 34,6%
CFL (n=09), 15,4% AMI (n=04), 11,5% TRI (n=03), 11,5% SUT (n=03), 7,7% NOR
(n=02), 3,8% AMP (n=01), 3,8% CIP (n=01), e 3,8% NIT (n=01). Nenhuma amostra
apresentou resistência à gentamicina, cefoxitina e cefepima. O fenótipo de resistência
nesta área de coleta definiu 07 perfis de resistência distintos sendo 02 correspondentes a
padrões de resistência isolada para amicacina e cefalotina e 05 a padrões de
multirresistência. A resistência intermediária foi detectada para amicacina, gentamicina,
cefoxitina, cefalotina, ciprofloxacino e norfloxacino. A multirresistência foi observada
para até 04 antimicrobianos e detectada em 23% (n=06) das amostras.
48
No grupo das amostras isoladas de águas recreacionais a resistência foi detectada
em 56,4% (n=22) das amostras representando índices de 53,9% CFL (n=21), 10,2%
AMP (n=04), 10,2% AMI (n=04), 7,7% GEN (n=03), 2,6% CFO (n=01), 2,6% CIP
(n=01) e 2,6% NIT (n=01). Nenhuma amostra apresentou resistência à cefepima,
trimetoprim, sulfazotrim e norfloxacino. O fenótipo de resistência nesta área de coleta
definiu 06 perfis de resistência distintos sendo 02 correspondentes a padrões de
resistência isolada para amicacina e cefalotina e 04 a padrões de multirresistência. A
resistência intermediária foi detectada para ampicilina, amicacina, gentamicina,
cefalotina, ciprofloxacino e norfloxacino. A multirresistência foi observada para até 07
antimicrobianos e detectada em 12,8% (n=05) das amostras.
No grupo das amostras isoladas de águas próximas a hospitais a resistência foi
detectada em 34,5% (n=10) das amostras representando índices de 20,7% AMI (n=06),
17,2% AMP (n=05), 13,8% CFL (n=04), 10,3% NIT (n=03), 10,3% GEN (n=03) e
6,9% CFO (n=02). Nenhuma amostra apresentou resistência à cefepima, ciprofloxacino,
trimetoprim, sulfazotrim e norfloxacino. O fenótipo de resistência nesta área de coleta
definiu 07 perfis de resistência distintos sendo 02 correspondentes a padrões de
resistência isolada para amicacina e nitrofurantoína e 05 a padrões de multirresistência.
A resistência intermediária foi detectada para ampicilina, amicacina, gentamicina,
cefoxitina, cefepima, cefalotina, ciprofloxacino, trimetoprim e norfloxacino. A
multirresistência foi observada para até cinco antimicrobianos e detectada em 20,7%
(n=06) das amostras.
49
57,7
56,4
34,5
22,7
22,2
Gráfico 2. Porcentagem total de amostras resistentes a antimicrobianos de acordo com a área de
coleta (n=178). Códigos referentes às áreas de coleta: (A) Águas de regiões de aglomerados residenciais,
(B) Águas de regiões industriais, (C) Águas recreacionais, (D) Águas próximas a hospitais e (E) Águas de
regiões de agropecuária.
MÉTODOS GENOTÍPICOS
5.4) PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DO GENE merA
Do total de amostras de E. coli analisadas neste estudo foram detectados
produtos de amplificação estáveis e reprodutíveis dentro das condições experimentais
empregadas em 46% (n=82) das amostras. Com base na presença ou ausência dos
fragmentos de 285pb e 720pb foram definindos três perfis eletroforéticos (Tabela 11;
Tabela 22). O fragmento de 285pb foi detectado em 14 amostras sendo que 12 destas
também apresentaram amplificação do fragmento de aproximadamente 720pb (Figura
20). Definindo o terceiro perfil eletroforético 68 amostras amplificaram somente o
fragmento de 720pb (Figura 21).
Foram consideradas amostras merA+ aquelas
pertencentes aos perfis I e II (n=14), que apresentaram amplificação do gene alvo
específico da resistência ao mercúrio (merA – 285pb) descrito por Chadhain e
colaboradores119.
50
2072pb
1500pb
600pb
285pb
100pb
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12
Figura 20. Eletroforese em gel de agarose do produto de amplificação para detecção do gene merA.
Colunas: (1) padrão de peso molecular 100pb; (2) RM 1; (3) RM 7; (4) RM 8; (5) RM 9; (6) RM 17; (7)
RM 20; (8) RM 31; (9) RM 37; (10) RM 44; (11) RM 45 e (12) RM 46. Nota: A seta indica a
amplificação do fragmento esperado.
2072pb
1500pb
≈ 720pb
600pb
285pb
100pb
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Figura 21. Eletroforese em gel de agarose do produto de amplificação para detecção do gene merA.
Colunas: (1) padrão de peso molecular 100pb; (2) RM 57; (3) RM 61; (4) RM 71; (5) RM 72; (6) RM
103; (7) RM 118; (8) RM 150; (9) RM 165; (10) padrão de peso molecular 100pb. Nota: A seta indica a
amplificação do fragmento esperado (285pb) e o fragmento detectado em grande parte das amostras
(aproximadamente 720pb).
Tabela 11. Perfis de amplificação resultantes dos produtos de PCR-merA.
Perfil do genótipo de R ao Hg
Marcador genético
Número de
amostras*
I
285pb
2
II
III
Total
285pb e 720pb
720pb
12
68
82
*Foram excluídas desta tabela 96 amostras que não tiveram nenhum produto de amplificação estável e
reprodutível.
51
5.4.1) PCR-merA por área de coleta
Foram detectadas amostras de E. coli merA+ nas águas de regiões de
aglomerados residenciais, de regiões industriais e próximas a hospitais (Tabela 12). As
amostras merA+ corresponderam a 13,3% (n=10) do total de amostras isolados de áreas
de aglomerados residenciais (n=75), 11,1% (n=1) do total de amostras isolados de águas
de regiões industriais (n=09) e 6,9% (n=2) do total de amostras isolados de águas
próximas a hospitais (n=29).
Tabela 12. Amostras de E. coli merA+ por área e ponto de coleta.
Amostras
Área de coleta
Ponto de coleta
RM 1
Canal do Mangue
RM 7
RM 8
RM 9
Canal do Cunha
RM 17
RM 20
Águas de regiões de
aglomerados residenciais
Rio Irajá
RM 37
RM 44
RM 45
RM 46
Lagoa Rodrigo de Freitas
RM 61
Lagoa de Marapendi
RM 31
Águas de regiões industriais
Rio Iguaçú
RM 150
RM 165
Águas próximas a hospitais
Canal Cândido Portinari
5.4.2) PCR-merA e fenótipo de resistência aos antimicrobianos
Dentre as amostras de E. coli merA+ (n=14) incluídas neste estudo, 42,9%
(n=06) apresentaram perfil de multirresistência aos agentes antimicrobianos testados
(Tabela 13). Os maiores índices de resistência foram observados para os
antimicrobianos cefalotina 42,9% (n=06), ampicilina 35,7% (n=05), ciprofloxacino e
norfloxacino 21,4% (n=03) e trimetoprim 14,3% (n=02) (Gráfico 3).
52
Tabela 13. Resistência aos antimicrobianos nas amostras de E. coli merA+.
Antimicrobianos
Amostras
AMP
AMI
GEN
CFO
CPM
CFL
CIP
TRI
SUT
NOR
NIT
RM 1
I
S
S
S
S
R
S
R
S
S
S
RM 7
RM 8
RM 9
RM 17
RM 20
RM 31
RM 37
RM 44
RM 45
RM 46
RM 61
RM 150
RM 165
S
S
S
S
S
R
R
R
S
R
S
S
R
I
S
I
S
S
R
S
S
I
S
S
I
S
S
S
S
S
S
I
S
I
I
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
I
S
S
S
I
S
R
R
R
S
R
S
S
R
S
S
S
S
S
S
R
R
I
R
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
R
S
R
S
S
I
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
Legenda. AMI (amicacina), AMP (ampicilina), CFL (cefalotina), CFO (cefoxitina), CIP (ciprofloxacino), CPM
(cefepima), GEN (gentamicina), NIT (nitrofurantoína), NOR (norfloxacino), SUT (sulfazotrim) e TRI (trimetoprim).
R (resistente), I (resistência intermediária) e S (sensível).
42,9
35,7
21,4
21,4
14,3
7,1
7,1
7,1
7,1
Gráfico 3. Porcentagem de amostras de E. coli merA+ por antimicrobiano testado (n=14). Códigos
referentes aos antimicrobianos: AMI (amicacina), AMP (ampicilina), CFL (cefalotina), CFO (cefoxitina),
CIP (ciprofloxacino), CPM (cefepima), GEN (gentamicina), NIT (nitrofurantoína), NOR (norfloxacino),
SUT (sulfazotrim) e TRI (trimetoprim).
53
5.5) PCR-TRIPLEX PARA AGRUPAMENTO FILOGENÉTICO DE Escherichia
coli
Os resultados da filogrupagem revelaram que as amostras de E. coli analisadas
neste estudo se encontram distribuídas em três dos quatro grupos filogenéticos descritos
por Clermont e colaboradores45 (Tabela 14; Tabela 22). Os isolados de E. coli foram
encontrados principalmente no grupo A (91,6%) seguindo-se os grupos B2 (5%) e D
(3,4%). Nenhuma amostra foi classificada como pertencente ao grupo filogenético B1
(Figura 22).
1500pb
600pb
A
D
B2
D
A0
3
4
5
6
7
chuA
yjaA
TSPE4.C2
100pb
1
2
8
Figura 22. Perfis eletroforéticos dos agrupamentos filogenéticos de E. coli encontrados neste estudo.
Colunas: (1) padrão de peso molecular 100pb; (2) L75A (chuA, yjaA e TSPE4.C2); (3) RM 14 (yjaA); (4)
RM 5 (chuA); (5) RM 151(chuA, yjaA e TSPE4.C2); (6) RM 22 (chuA e TSPE4.C2); (7) RM 88 e (8)
padrão de peso molecular 100pb.
De acordo com as análises de filotipagem detectamos a presença de cinco
diferentes perfis filogenéticos com base nas diferentes combinações das sequências
genéticas chuA, yjaA e do fragmento de DNA TSPE4.C2. Para o filogrupo A foram
detectados os genótipos -,-,- e -,+,- representado 70,2% (n=125) e 20,7% (n=37) do total
de amostras respectivamente. O filogrupo D teve como representantes os genótipos +,,+ e +,-,- correspondendo a 2,8% (n=5) e 2,2% (n=4) do total de amostras
respectivamente. Já o grupo filogenético B2 apresentou somente um genótipo, +,+,+
representando 3,4% (n=6) do total de amostras (Tabela 14).
54
Tabela 14. Grupo e perfil filogenético das amostras de E. coli incluídas no estudo.
Grupo
filogenético
Perfil filogenético
Nº de amostras (%)
chuA
yjaA
TSPE4.C2
A0*
A
-
+
-
125
37
163 (91,6%)
B2
+
+
+
+
+
0
6
6 (3,4%)
+
-
+
5
+
-
-
4
D
9 (5%)
Total
178 (100%)
*Foram chamadas de A0 as amostras que não apresentaram amplificação de nenhum gene ou fragmento
alvo
5.5.1) Filogrupagem por área de coleta
O grupo filogenético A foi representado por 100% das amostras de E. coli
isoladas de águas de regiões industriais. Este filogrupo também representou a maioria
das amostras obtidas de águas de regiões de aglomerados residenciais (89,3%), águas de
regiões de agropecuária (92,3%), em águas próximas a hospitais (89,7%) e em águas
recreacionais (94,9%). O grupo filogenético B2 só foi encontrado em amostras obtidas
de águas de regiões de aglomerados residenciais e em águas próximas a hospitais,
representado 4% e 10,3% das amostras respectivamente. Já o filogrupo D foi
representado por amostras pertencentes a águas de regiões de aglomerados residenciais
(6,7%), águas de regiões de agropecuária (7,7%) e de águas recreacionais (5,1%)
(Tabela 15).
Tabela 15. Grupo filogenético das amostras de E. coli por área de coleta.
Grupo filogenético (%)
Área de coleta
Águas de regiões de aglomerados residenciais
Águas de regiões industriais
Águas de regiões de agropecuária
Águas próximas a hospitais
Águas recreacionais
Total
A
B2
D
67 (89,3%)
9 (100%)
24 (92,3%)
37 (94,9%)
26 (89,7%)
163
3 (4%)
3 (10,3%)
6
5 (6,7%)
2 (7,7%)
2 (5,1%)
9
Total de
amostras
75
9
26
39
29
178
55
5.5.2) Filotipagem em amostras merA+
Todas as amostras de E. coli merA+ foram incluídas no grupo filogenético A.
Dentre estas amostras foram detectados os genótipos -,-,- e -,+,- representando 57,1%
(n=08) e 42,9% (n=6) do total de amostras merA+ respectivamente.
5.6) PCR-MULTIPLEX PARA ENTEROVIRULÊNCIA DE Escherichia coli
(PCR-DEC)
Foram detectados genes de enterovirulência em 20 amostras de E. coli incluídas
neste estudo, correspondendo portanto, a 11,2% do total (n=178) e definindo cinco
perfis de enterovirulência (Tabela 16). As análises revelaram que dessas 20 amostras,
apenas sete apresentaram características de patotipos já bem definidos sendo, quatro
pertencentes ao patotipo ATEC (escV) e 3 ao patotipo STEC (stx1). As amostras RM 11
(estIa e astA), RM 71 (stx1 e astA) e RM 73 (stx1 e astA) foram consideradas como
pertencentes aos patotipos ETEC, STEC e STEC respectivamente por possuírem
determinantes genéticos particulares destes grupos patogênicos apesar de também
possuírem o gene astA, um marcador não específico de grupo patogênico. Por fim, as 10
amostras restantes não puderam ser classificadas em nenhum patotipo. Isto porque, estas
amostras foram consideradas positivas apenas para o gene específico de espécie (uidA) e
para astA. Para serem consideradas como pertencentes ao patotipo das EAEC, de acordo
com a metodologia empregada neste estudo, estas amostras deveriam ser positivas para
o gene aggR ou para uma combinação de pelo menos dois dos três marcadores deste
patotipo (aggR, astA e pic).
Dentre os genes de enterovirulência pesquisados neste estudo o mais encontrado
foi o astA presente em 7,3% (n=13) das amostras incluídas no estudo (n=178).
Seguiram-se então os genes stx1 presente em 2,8% (n=5), escV presente em 2,2% (n=4)
e estIa presente em 0,6% (n=1) do total de amostras (n=178). Considerando as amostras
que apresentaram amplificação de, pelo menos, um gene de enterovirulência (n=20) o
percentual de ocorrência desses genes seria de 65% para astA, 25% para stx1, 20% para
escV e 5% para estIa (Gráfico 4). O marcador genético de espécie uidA esteve presente
em 100% das amostras incluídas neste estudo (n=178) (Figura 23).
56
2072pb
1500pb
uidA
600pb
escV
100pb
stx1
estIa
astA
1
2
3
4
5
6
7
Figura 23. Perfis eletroforéticos obtidos a partir da amplificação simultânea dos genes de
enterovirulência. Colunas: (1) padrão de peso molecular 100pb; (2) RM 2 (uidA e astA); (3) RM 11
(uidA, estIa e astA); (4) RM 25 (uidA e escV); (5) RM 73 (uidA, stx1 e astA); (6) RM 74 (uidA e stx1) e
(7) padrão de peso molecular 100pb.
Tabela 16. Perfis de enterovirulência e grupo filogenético das amostras de E. coli.
Perfil de virulência
Marcadores genéticos
de enterovirulência
Grupo filogenético (n)
Número de
amostras
I
astA
A0 (1), A (7) e D (2)
10
II
III
IV
V
Total
escV
stx1
stx1, astA
estIa, astA
A0 (2) e B2 (2)
A0 (3)
A0 (2)
D (1)
4
3
2
1
20
57
65%
25%
20%
7,3%
2,2%
5%
0,6%
2,8%
Gráfico 4. Proporção dos genes de enterovirulência nas amostras de E. coli. Legenda. 1- percentual
de amostras carreadoras de, pelo menos, um gene de enterovirulência (n=20) e 2. Percentual do gene em
questão considerando a população bacteriana total do estudo (n=178). Observação: Foram excluídas deste
gráfico as amostras que não tiveram amplificação de nenhum dos genes de enterovirulência estudados.
5.6.1) Perfil de enterovirulência por área de coleta
No grupo das amostras isoladas de águas de regiões de aglomerados residenciais
foram detectados genes de enterovirulência em 22,7% (n=17) do total de amostras
isoladas desta área de estudo (n=75) (Tabela 17; Gráfico 5). Dentre as amostras que
apresentaram amplificação de, pelo menos, um gene de enterovirulência (n=20) as
isoladas desta área coleta corresponderam a 85% do total. Esta área teve representação
de todos os perfis de enterovirulência encontrados: I (n=8), II (n=4), III (n=3), IV (n=2)
e V (n=1). As análises revelaram que dessas 17 amostras, 06 representaran
características de patotipos intestinais sendo, 03 pertencentes ao patotipo ATEC (uidA e
escV) e 03 ao patotipo STEC (uidA e stx1) (Tabela 17; Tabela 18). Nesta área de coleta
foram isoladas as amostras RM 11 (uidA, estIa e astA), RM 71 (uidA, stx1 e astA) e RM
73 (uidA, stx1 e astA) consideradas como pertencentes aos patotipos ETEC, STEC e
STEC respectivamente. Além desses marcadores, essas amostras foram também
carreadoras do gene astA. As 08 amostras restantes não puderam ser classificadas em
nenhum patotipo, por possuírem apenas o gene astA além do marcador de espécie uidA.
No grupo das amostras isoladas de águas de regiões industriais foram detectados
genes de enterovirulência em 11,1% (n=1) do total de amostras isoladas desta área de
estudo (n=9). Dentre as amostras que apresentaram amplificação de, pelo menos, um
58
gene de enterovirulência (n=20) as isoladas desta área de coleta corresponderam a 5%
do total. Esta área teve representação somente do perfil de enterovirulência II (n=1). As
análises revelaram que esta única amostra carreadora de genes de enterovirulência foi
considerada como pertencente ao patotipo ATEC.
No grupo das amostras isoladas de águas recreacionais foram detectados genes
de enterovirulência em 5,1% (n=2) do total de amostras isoladas desta área de estudo
(n=39). Dentre as amostras que apresentaram amplificação de, pelo menos, um gene de
enterovirulência (n=20) as isoladas desta área de coleta corresponderam a 10% do total.
Esta área teve representação somente do perfil de enterovirulência I (n=2). Ambas as
amostras não puderam ser classificadas em nenhum patotipo, por possuírem apenas o
gene astA além do marcador de espécie uidA.
Tanto no grupo dos isolados de água próximas a regiões de agropecuária quanto
das isoladas próximas a hospitais não foram encontradas amostras carreadoras de
marcadores genéticos de enteropatogenicidade.
85%
22,7%
11,1%
5%
10%
5,1%
Gráfico 5. Proporção dos marcadores de enterovirulência em amostras de E. coli por área de coleta.
Códigos referentes as áreas de coleta: (A) Águas de regiões de aglomerados residenciais, (B) Águas de
regiões industriais, (C) Águas de regiões de agropecuária, (D) Águas recreacionais e (E) Águas próximas
a hospitais. Legenda. 1- proporção dos genes de virulência na população que teve amplificação de pelo
menos um gene de virulência (n=20) e 2. Proporção de genes de virulência na população total isolada da
referente área de coleta: A (n=75), B (n=9), C (n=26), D (n=39) e E (n=29).
59
Tabela 17. Distribuição de marcadores genéticos de enterovirulência investigados nas amostras de
E. coli por área de coleta.
Marcadores genéticos de enterovirulência
Amostra
Área de coleta
Patotipo
uidA
escV
bfpB
stx1
stx2
elt
RM 2
+
-
-
-
-
RM 11
RM 12
RM 24
RM 25
RM 39
RM 43
RM 48
RM 69
RM 70
RM 71
RM 72
RM 73
RM 74
RM 75
RM 76
RM 77
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
+
+
-
-
Águas de regiões
de aglomerados
residenciais
estIa
estIb
invE
astA
aggR
pic
-
-
-
-
+
-
-
ND*
-
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
ETEC
ATEC
ATEC
ATEC
ND*
ND*
ND*
ND*
ND*
STEC
STEC
STEC
STEC
STEC
ND*
ND*
RM 31
Águas de regiões
industriais
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
ATEC
RM 118
RM 119
Águas
recreacionais
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
ND*
ND*
20
4
-
5
-
-
1
-
-
13
-
-
Total
Legenda. ATEC (Escherichia coli enteropatogênica atípica), ETEC (Escherichia coli enterotoxigênica) e STEC
(Escherichia coli produtora de Shiga).
ND* - patotipo não determinado pelos marcadores investigados.
60
Tabela 18. Distribuição dos perfis de enterovirulência nas amostras de E. coli conforme áreas e
pontos de coleta.
Ponto de coleta
Patotipo
Perfil de
enterovirulência
RM 2
Canal do Mangue
ND*
I
RM 11
RM 12
RM 24
RM 25
RM 39
RM 43
RM 48
RM 69
RM 70
RM 71
RM 72
RM 73
RM 74
RM 75
RM 76
RM 77
Rio Faria
Rio Faria
Rio Irajá
Rio Irajá
Lagoa Rodrigo de Freitas
Lagoa Rodrigo de Freitas
Lagoa Rodrigo de Freitas
Rio São João
Rio São João
Rio São João
Rio São João
Rio São João
Rio São João
Rio São João
Rio São João
Rio São João
ETEC
ATEC
ATEC
ATEC
ND*
ND*
ND*
ND*
ND*
STEC
STEC
STEC
STEC
STEC
ND*
ND*
V
II
II
II
I
I
I
I
I
IV
III
IV
III
III
I
I
Amotra
Área de coleta
Águas de regiões de
aglomerados
residenciais
RM 31
Águas de regiões
industriais
Rio Iguaçú
ATEC
II
RM 118
RM 119
Águas recreacionais
Parque Nacional da Praia de Ramos
Parque Nacional da Praia de Ramos
ND*
ND*
I
I
Legenda. ATEC (Escherichia coli enteropatogênica atípica), ETEC (Escherichia coli enterotoxigênica) e STEC
(Escherichia coli produtora de Shiga).
ND* - patotipo não determinado pelos marcadores investigados.
61
5.6.2) Perfil de enterovirulência em amostras merA+
Todas as amostras de E. coli merA+ apresentaram amplificação do gene
específico de espécie (uidA). Apenas a amostra RM 31 apresentou amplificação de um
gene de enterovirulência característico de um patotipo intestinal, sendo positiva para
escV e, portanto, classificada como pertencente ao patotipo ATEC (Figura 24).
2072pb
1500pb
uidA
600pb
escV
100pb
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Figura 24. Eletroforese dos produtos de PCR-DEC nas amostras de E. coli merA+. Colunas: (1)
padrão de peso molecular 1Kb; (2) RM 1; (3) RM 7; (4) RM 8; (5) RM 9; (6) RM 17; (7) RM 20; (8) RM
31; (9) RM 37; (10) RM 44; (11) RM 45; (12) RM 46; (13) RM61; (14) RM150; (15) RM165 e (16)
padrão de peso molecular 1Kb.
5.6.3) Perfil de enterovirulência, fenótipo de resistência aos antimicrobianos e grupo
filogenético
Amostras carreadoras de marcadores genéticos de enterovirulência foram
identificadas como pertencentes aos grupos filogenéticos A, B2 e D e associados com
padrões diversos de resistência a antimicrobianos (Tabela 19). Apesar do grupo B2 ser
tradicionalmente mais associado com microrganismos agentes de doenças extraintestinais, neste estudo foram carreadoras do gene escV da variante de patotipo
intestinal, ATEC.
62
Tabela 19. Características gerais de enterovirulência e resistência a antimicrobianos nas amostras
de E. coli carreadoras de marcadores de enteropatogenicidade.
Amostra
Patotipo
Perfil de
enterovirulência
Antimicrobianos
R
RI
Grupo
filogenético
RM 2
ND*
I
-
CFL, SUT
A0
RM 39
RM 43
RM 48
RM 69
RM 70
RM 76
RM 77
RM 118
RM 119
ND*
ND*
ND*
ND*
ND*
ND*
ND*
ND*
ND*
I
I
I
I
I
I
I
I
I
AMI
CFL
CFL
GEN
GEN, CFL
AMI
AMI
A
A
A
A
A
A
A
D
D
RM 12
RM 24
RM 25
ATEC
ATEC
ATEC
II
II
II
CFL
AMI, GEN, CFL
-
A0
B2
B2
RM 31
ATEC
II
AMP, AMI, CFL,
TRI e SUT
GEN
A0
RM 72
RM 74
RM 75
STEC
STEC
STEC
III
III
III
-
CFL
CFL
CFL
A0
A0
A0
RM 71
RM 73
STEC
STEC
IV
IV
-
AMI, GEN, CFL
A0
A0
RM 11
ETEC
V
AMI
CFL
D
Legenda. AMI (amicacina), AMP (ampicilina), CFL (cefalotina), CFO (cefoxitina), CIP (ciprofloxacino), CPM
(cefepima), GEN (gentamicina), NIT (nitrofurantoína), NOR (norfloxacino), SUT (sulfazotrim), TRI
(trimetoprim), ATEC (Escherichia coli enteropatogênica atípica), ETEC (Escherichia coli
enterotoxigênica), STEC (Escherichia coli produtora de Toxina Shiga), R (resistência) e RI (resistência
intermediária)
ND* - patotipo não determinado.
5.7) AMPLIFICAÇÃO RANDÔMICA DO DNA POLIMÓRFICO (RAPD-PCR)
A diversidade nas amostras de E. coli merA+ foi investigada pelo RAPD-PCR.
Os perfis de RAPD-PCR foram determinados empregando os iniciadores A04, 1247,
1290 e 1254 (Figura 25). As reações de amplificação geraram perfis polimórficos
compostos por 5 a 9 bandas (A04), 4 a 11 bandas (1247), 5 a 10 bandas (1290) e 8 a 12
bandas (1254) variando entre 600-4.100 pb, 200-5.600 pb, 450-8.000 pb e 250-9.000
pb, respectivamente. Reações que empregaram os iniciadores 1247, 1290 e 1254
resultaram em 10 diferentes perfis eletroforéticos reprodutíveis, enquanto o iniciador
A04, 11 perfis eletroforéticos (Tabela 20). O poder discriminatório dos iniciadores foi
63
calculado através da equação de diversidade, sendo encontrados os seguintes índices:
88% para o iniciador A04 e 80% para os iniciadores 1247, 1290 e 1254.
Os resultados obtidos revelaram uma população geneticamente diversa. Perfis
idênticos foram observados entre amostras de mesma origem de isolamento e exibindo
as mesmas características biogenéticas (Tabela 21). Todas as amostras que
apresentaram perfis RAPD idênticos entre si foram isoladas de águas de regiões de
aglomerados residenciais, sendo as amostras RM 7, RM 8 e RM 9 provenientes do
Canal do Cunha e as amostras RM 37, RM 44 e RM 46 da Lagoa Rodrigo de Freitas.
A análise dos dendrogramas derivados dos perfis eletroforéticos gerados por
RAPD-PCR revelou uma população bacteriana geneticamente diversa formada por
pequenos grupos clonais, com índices de similaridade variando de 6-65%, 18-69%, 650% e 6-65% para os iniciadores 1290, 1254, 1247 e A04 respectivamente (Figuras 26,
27, 28 e 29). De um modo geral, a relação de identidade genética observada a partir dos
diferentes iniciadores foi concordante para todas as amostras incluídas nesta análise.
Tabela 20. Representação numérica dos perfis de RAPD-PCR das amostras de E. coli merA+ a
partir dos iniciadores utilizados.
Perfil RAPD
Amostras
A04
1247
1290
1254
RM 1
1
1
1
1
RM 7
RM 8
RM 9
RM 17
RM 20
RM 31
RM 37
RM 44
RM 45
RM 46
RM 61
RM 150
RM 165
2
2
2
3
4
5
6
6
7
8
9
10
11
2
2
2
3
4
5
6
6
7
6
8
9
10
2
2
2
3
4
5
6
6
7
6
8
9
10
2
2
2
3
4
5
6
6
7
6
8
9
10
64
Tabela 21. Características biogenéticas das amostras de E. coli que apresentaram perfis
eletroforéticos de RAPD-PCR idênticos entre si com os iniciadores 1247, 1290 e 1254.
Amostras
Ponto de coleta
R/S
Hg
MIC
Hg
Perfil de R a
antimicrobianos
Perfil
merA
Grupo
filogenético
Patotipo
Perfil
RAPD
RM 7
RM 8
RM 9
Canal do Cunha
R
10µM
-
II
A
-
2
RM 37
RM 44
RM 46
Lagoa Rodrigo de Freitas
R
10µM
XIX
III
A0
-
6
A04
1247
PM
(pb)
3054
1636
1018
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1290
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1254
PM
(pb)
3054
1636
1018
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Figura 25. Perfis eletroforéticos das amostras de E. coli merA+ obtidos a partir da amplificação
randômica do DNA polimórfico a partir dos iniciadores A04, 1247, 1290 e 1254. Colunas: (1) padrão
de peso molecular 1Kb; (2) RM 1; (3) RM 7; (4) RM 8; (5) RM 9; (6) RM 17; (7) RM 20; (8) RM 31; (9)
RM 37; (10) RM 44; (11) RM 45; (12) RM 46; (13) RM61; (14) RM150; (15) RM165 e (16) padrão de
peso molecular 1Kb.
65
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
Amostra
Perfil RAPD
GF
PV
RM 20
RM 165
RM 150
RM 61
RM 46
RM 44
RM 37
RM 31
RM 45
RM 17
RM 9
RM 8
RM 7
RM 1
4
10
9
8
6
6
6
5
7
3
2
2
2
1
A
A0
A0
A
A0
A0
A0
A0
A
A0
A
A
A
A0
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
100%
Coeficiente Dice de similaridade
Figura 26. Dendrograma gerado a partir da técnica de RAPD-PCR utilizando o iniciador 1290.
Legenda. GF (grupo filogenético) e PV (perfil de virulência).
66
66
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
Amostra
Perfil RAPD
GF
PV
RM 46
RM 44
RM 37
RM 45
RM 31
RM 150
RM 165
RM 61
RM 17
RM 20
RM 9
RM 8
RM 7
RM 1
6
6
6
7
5
9
10
8
3
4
2
2
2
1
A0
A0
A0
A
A0
A0
A0
A
A0
A
A
A
A
A0
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
100%
Coeficiente Dice de similaridade
Figura 27. Dendrograma gerado a partir da técnica de RAPD-PCR utilizando o iniciador 1254.
Legenda. GF (grupo filogenético) e PV (perfil de virulência).
67
67
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
Amostra
Perfil RAPD
GF
PV
RM 165
RM 150
RM 61
RM 45
RM 46
RM 44
RM 37
RM 31
RM 20
RM 17
RM 9
RM 8
RM 7
RM 1
10
9
8
7
6
6
6
5
4
3
2
2
2
1
A0
A0
A
A
A0
A0
A0
A0
A
A0
A
A
A
A0
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
100%
Coeficiente Dice de similaridade
Figura 28. Dendrograma gerado a partir da técnica de RAPD-PCR utilizando o iniciador 1247.
Legenda. GF (grupo filogenético) e PV (perfil de virulência).
68
68
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
Amostra
Perfil RAPD
GF
PV
RM 165
RM 150
RM 61
RM 45
RM 46
RM 44
RM 37
RM 31
RM 20
RM 17
RM 9
RM 8
RM 7
RM 1
11
10
9
7
8
6
6
5
4
3
2
2
2
1
A0
A0
A
A
A0
A0
A0
A0
A
A0
A
A
A
A0
1
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
1
1
1
100%
Coeficiente Dice de similaridade
Figura 29. Dendrograma gerado a partir da técnica de RAPD-PCR utilizando o iniciador A04.
Legenda. GF (grupo filogenético) e PV (perfil de virulência).
69
69
5.8) ELETROFORESE EM GEL DE GRADIENTE DESNATURANTE (DGGE)
No presente estudo, a resolução dos produtos de amplificação de tamanhos
similares foi possível sem haver a necessidade da utilização do CG clump no iniciador
A1s-n.F. A técnica de eletroforese em gel com gradiente desnaturante permitiu detectar
uma diversidade genética no fragmento de 285pb associado com a resistência ao
mercúrio (merA). Em concordância com os resultados obtidos a partir do RAPD-PCR as
amostras RM 7, RM 8 e RM 9 também apresentaram padrão DGGE idêntico entre si
(Figura 30).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12 13 14
Figura 30. Perfis eletroforéticos das amostras de E. coli merA+ gerados por DGGE. Colunas: (1) RM
1; (2) RM 7; (3) RM 8; (4) RM 9; (5) RM 17; (6) RM 20; (7) RM 31; (8) RM 37; (9) RM 44; (10) RM
45; (11) RM 46; (12) RM 61; (13) RM 150 e (14) RM 165.
70
Tabela 22. Características fenotípicas e genotípicas investigadas nas amostras de E. coli incluídas no estudo.
70
Amostra
Classificação do sistema aquático
R/S
a 5µM Hg
CMI
Hg
Perfil de resistência a
antimicrobianos
Gene
merA
Grupo
filogenético
Patotipo
RM 1
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
IX
I
A0
-
RM 2
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
III
A0
I
RM 3
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 4
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 5
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
D
-
RM 6
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 7
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
II
A
-
RM 8
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
II
A
-
RM 9
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
II
A
-
RM 10
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
III
A0
-
RM 11
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
I
III
D
V
RM 12
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
II
RM 13
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
D
-
RM 14
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A
-
RM 15
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 16
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
III
A
-
RM 17
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
II
A0
-
RM 18
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A
-
RM 19
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A
-
RM 20
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
II
A
-
71
RM 21
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 22
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
II
III
D
-
RM 23
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
III
B2
-
RM 24
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
B2
II
RM 25
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
III
B2
II
RM 26
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A
-
RM 27
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A
-
RM 28
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
III
A0
-
RM 29
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
VII
III
A0
-
RM 30
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
V
III
A0
-
RM 31
Águas de regiões industriais
R
10µM
XXII
II
A0
II
RM 32
Águas de regiões industriais
R
10µM
-
III
A
-
RM 33
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 34
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
II
III
A
-
RM 35
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 36
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
I
III
A
-
RM 37
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
XIX
III
A0
-
RM 38
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A
-
RM 39
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
-
A
I
RM 40
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 41
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A
-
RM 42
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
III
A
-
RM 43
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
III
A
I
RM 44
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
XIX
II
A0
-
RM 45
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
II
A
-
71
72
RM 46
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
XIX
II
A0
-
RM 47
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
III
III
A
-
RM 48
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
I
III
A
I
RM 49
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
-
III
A
-
RM 50
Águas de regiões de aglomerados residenciais
S
≤5 M
XII
III
A0
-
RM 51
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 52
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 53
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
XIV
III
A0
-
RM 54
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 55
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
VI
III
A0
-
RM 56
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 57
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
XIII
III
A0
-
RM 58
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 59
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A
-
RM 60
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
D
-
RM 61
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
I
A
-
RM 62
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 63
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
VIII
-
A
-
RM 64
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A
-
RM 65
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 66
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 67
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 68
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 69
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A
I
RM 70
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A
I
RM 71
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
IV
72
73
73
RM 72
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
III
RM 73
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
IV
RM 74
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
III
RM 75
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A0
III
RM 76
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A
I
RM 77
Águas de regiões de aglomerados residenciais
R
10µM
-
-
A
I
RM 78
Águas de regiões industriais
R
10µM
X
-
A0
-
RM 79
Águas de regiões industriais
R
10µM
-
-
A
-
RM 80
Águas de regiões industriais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 81
Águas de regiões industriais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 82
Águas de regiões industriais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 83
Águas de regiões industriais
R
10µM
-
-
A
-
RM 84
Águas de regiões industriais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 85
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
XI
-
A
-
RM 86
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
XI
-
A
-
RM 87
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
XX
-
A
-
RM 88
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
V
-
A0
-
RM 89
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 90
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
XV
-
A0
-
RM 91
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 92
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 93
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 94
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 95
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
II
-
A0
-
RM 96
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
II
-
A0
-
RM 97
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
74
74
RM 98
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
II
-
A0
-
RM 99
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
I
-
A0
-
RM 100
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
I
-
A0
-
RM 101
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 102
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
I
-
A0
-
RM 103
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 104
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 105
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
VII
III
D
-
RM 106
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
II
-
A0
-
RM 107
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 108
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
II
-
A0
-
RM 109
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
II
-
D
-
RM 110
Águas de regiões de agropecuária
R
10µM
-
-
A0
-
RM 111
Águas recreacionais
R
10µM
II
III
A0
-
RM 112
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
-
RM 113
Águas recreacionais
R
10µM
II
III
A0
-
RM 114
Águas recreacionais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 115
Águas recreacionais
R
10µM
II
III
A0
-
RM 116
Águas recreacionais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 117
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
-
RM 118
Águas recreacionais
R
10µM
II
III
D
I
RM 119
Águas recreacionais
R
10µM
II
III
D
I
RM 120
Águas recreacionais
R
10µM
XIV
III
A0
-
RM 121
Águas recreacionais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 122
Águas recreacionais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 123
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
75
75
RM 124
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
-
RM 125
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
-
RM 126
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 127
Águas recreacionais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 128
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 129
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
-
RM 130
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 131
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 132
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
-
RM 133
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 134
Águas recreacionais
R
10µM
XXIII
-
A0
-
RM 135
Águas recreacionais
R
10µM
XVII
-
A0
-
RM 136
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 137
Águas recreacionais
R
10µM
II
III
A0
-
RM 138
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 139
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 140
Águas recreacionais
R
10µM
I
-
A0
-
RM 141
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
-
RM 142
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 143
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
-
RM 144
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 145
Águas recreacionais
R
10µM
V
III
A0
-
RM 146
Águas recreacionais
R
10µM
V
-
A0
-
RM 147
Águas recreacionais
R
10µM
II
-
A0
-
RM 148
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 149
Águas recreacionais
R
10µM
-
-
A0
76
76
RM 150
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 151
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
B2
-
RM 152
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 153
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
B2
-
RM 154
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 156
Águas próximas a hospitais
R
10µM
V
-
A
-
RM 157
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 158
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
B2
-
RM 159
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A
-
RM 160
Águas próximas a hospitais
R
10µM
I
-
A0
-
RM 161
Águas próximas a hospitais
R
10µM
XVI
-
A0
-
RM 162
Águas próximas a hospitais
R
10µM
IV
-
A0
-
RM 163
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 164
Águas próximas a hospitais
R
10µM
V
-
A0
-
RM 165
Águas próximas a hospitais
R
10µM
XVIII
II
A0
-
RM 166
Águas próximas a hospitais
R
10µM
I
III
A0
-
RM 167
Águas próximas a hospitais
R
10µM
XXI
III
A0
-
RM 168
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 169
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 170
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 171
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 172
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 173
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 174
Águas próximas a hospitais
R
10µM
I
III
A0
-
RM 175
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 176
Águas próximas a hospitais
R
10µM
VI
-
A0
77
RM 177
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
RM 178
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
III
A0
-
RM 179
Águas próximas a hospitais
R
10µM
-
-
A0
-
77
78
6. DISCUSSÃO
A água é essencial para todas as formas de vida, sendo necessária para
hidratação, produção de alimentos, necessidades sanitárias, recreação, utilização como
solvente, nos diversos segmentos da indústria dentre outros. O tratamento inadequado
ou o não tratamento da água utilizada para consumo tem impacto significativo sobre a
Saúde Pública resultando todos os anos na morte de cerca de cinco milhões de pessoas,
principalmente em países em desenvolvimento. Metade destas mortes, segundo a WHO,
é causada por infecções microbianas intestinais veiculadas pela água3,125.
A contaminação microbiológica dos sistemas aquáticos pode veicular
microrganismos patogênicos responsáveis por causar doenças de diferentes naturezas e
complexidades. Dentre as doenças veiculadas pela água, as diarréicas são reconhecidas
pelo impacto negativo que exercem sobre a saúde dos seres humanos, sendo
responsáveis por altas taxas de morbimortalidade5,6,7. Um grande número de
microrganismos tem sido descrito como agentes das doenças diarréicas, entretanto, o
papel de destaque na etiologia destas infecções é atribuído a espécie bacteriana
Escherichia coli, principalmente, em países em desenvolvimento8,9,10. Por ser encontrada no trato intestinal do homem e de outros animais homeotérmicos, a contaminação de
ambientes aquáticos por este microrganismo é ocasionada, principalmente, pelo
lançamento de esgoto doméstico sem tratamento adequado, sobretudo em localidades
com condições higiênico-sanitárias insatisfatórias16,17.
Além da contaminação microbiológica, outra importante forma de poluição de
sistemas aquáticos, com impactos drásticos na saúde de seres humanos e do ecossistema
é a causada pelo lançamento de substâncias químicas de diversas naturezas nesses
ambientes. Essa contaminação tem origem a partir do lançamento de efluentes
industriais ou domésticos não tratados ou tratados de forma inadequada, que podem
conter substâncias químicas tóxicas, tais como os metais76,77. Dentre os metais, o
mercúrio destaca-se pela sua capacidade de bioacumulação e, no caso do metilmercúrio
pela capacidade de biomagnificação ao longo das cadeias tróficas, pela sua elevada
toxicidade, pela amplitude global da sua contaminação, podendo ter efeitos mesmo em
ambientes muito distantes das fontes de contaminação e pela magnitude dos danos, em
alguns casos irreversíveis, causados à saúde de populações humanas e de ambientes
expostos81.
79
A sobrevivência microbiana em ambientes contaminados pelo mercúrio depende
de propriedades bioquímicas e estruturais intrínsecas, adaptações fisiológicas e/ou
genéticas77. Microrganismos desenvolveram vários tipos de mecanismos de resistência
em resposta aos metais tóxicos125. Esses mecanismos podem ser codificados por genes
cromossomais, porém é mais frequente que estejam localizados em elementos genéticos
móveis como plasmídeos e transposons77,127. A resistência bacteriana ao mercúrio é um
dos mecanismos de resistência a metais tóxicos mais estudados. Em bactérias Gramnegativas, inclusive as pertencentes à espécie Escherichia coli, a presença de
determinantes genéticos de resistência ao mercúrio vem sendo descritos, o que a torna
uma alternativa promissora para processos de biorremediação. Em E. coli esta
abordagem ainda é muito recente e o estudo com populações bacterianas é restrito e de
um modo geral, limitado a regiões com características geoeconômicas e culturais
distintas da nossa107,108.
A partir destas observações o presente estudo visou isolar amostras de E. coli a
partir de ambientes aquáticos no Estado do Rio de Janeiro e investigar características
biogenéticas e de resistência ao mercúrio. Para tal foram realizados ensaios de
amplificação para caracterização quanto à presença e a diversidade do gene merA, para
a avaliação da diversidade genética das amostras carreadoras do gene de resistência ao
mercúrio e a detecção de genes específicos do agrupamento filogenético e de
enteropatogenicidade, assim como testes bacteriológicos visando a análise do padrão de
susceptibilidade ao mercúrio e aos antimicrobianos.
6.1) COLETA DE ÁGUA, ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE Escherichia
coli
Foram obtidas 178 amostras de E. coli a partir de 18 diferentes pontos de coleta
situados em sistemas aquáticos localizados no Estado do Rio de Janeiro. As amostras
foram agrupadas em 5 principais áreas de coleta de acordo com a proximidade de
possíveis fontes de contaminação do sistema aquático: águas de regiões de aglomerados
residenciais, águas de regiões industriais, águas de regiões de agropecuária, águas
recreacionais e águas próximas a hospitais.
O isolamento de E. coli nos diferentes pontos de coleta escolhidos para este
estudo já era esperado dado as possíveis fontes de contaminação e a capacidade de
80
persistência e multiplicação deste microrganismo em ambientes aquáticos aliados à
precariedade do saneamento básico em algumas regiões do Estado do Rio de Janeiro.
Apesar da contagem de E. coli em sistemas aquáticos ser normalmente associada a
qualidade da água é válido lembrar que este estudo utilizou técnicas seletivas de
isolamento de E. coli, e portanto, os microrganismos isolados por ponto de coleta não
refletem a qualidade da água no ponto de coleta analisado podendo subestimar a
contaminação microbiológica real.
A grande quantidade de amostras isoladas do Parque Ambiental da Praia de
Ramos (n=39) e a facilidade de isolamento podem ser justificadas considerando o alto
grau de contaminação microbiana deste ambiente durante o período da coleta. A
Secretaria de Meio Ambiente do Estado do Rio de Janeiro (SMAC) através do
monitoramento da qualidade das areias das praias classificou a areia da praia do Parque
Ambiental da Praia de Ramos durante o período em que foi realizada a coleta como
“não recomendada” apresentando índices acima de 30.000 coliformes fecais
(NMP/100g) e contagem de E. coli superior a 3.800 (NMP/100g) na areia.
6.2) FENÓTIPO DE SUSCEPTIBILIDADE AO MERCÚRIO
6.2.1) Determinação do fenótipo de resistência ao mercúrio e determinação da
concentração mínima inibitória (CMI)
Muitos estudos têm sido realizados com o objetivo de determinar a resistência ao
mercúrio em bactérias ambientais através da realização do teste de concentração
inibitória mínima (CMI)99,128,129,130,131,132,133,134. Entretanto, não existe um protocolo
padrão para ser utilizado na determinação da CMI dos metais pesados, ao contrário do
que é observado, por exemplo, nos testes de antibiograma. São utilizados meios de
cultura líquidos a sólidos, com diferentes composições químicas, diferentes
concentrações dos metais em diferentes composições químicas. A própria metodologia
pode oferecer alguns obstáculos que se não minimizados antes sua aplicação podem
influenciar no resultado obtido como, por exemplo, a adsorção do metal utilizado às
paredes dos frascos utilizados, precipitação e volatilização da solução, formação de
complexos do metal com os componentes do meio de cultura entre outros116,129.
Portanto, é muito difícil comparar resultados obtidos neste estudo com trabalhos prévios
81
devido à grande diversidade entre os valores de CMI encontrados especialmente se
considerarmos a espécie bacteriana e as diferentes regiões geográficas envolvidas.
Além dos possíveis problemas metodológicos existem controvérsias sobre a
definição do significado do termo “resistência” aos metais. Vasconcellos135 empregou o
termo “tolerância” para cepas bacterianas capazes de crescer em meios seletivos
contendo mercúrio em qualquer concentração e o termo “resistência” apenas para cepas
em que se confirmou a presença de componentes genéticos relacionados à resistência ao
mercúrio, neste caso o gene merA. Entretanto, no atual estudo preferimos utilizar apenas
o termo geral resistência e sensibilidade, conforme reconhecido para os testes de
susceptibilidade aos antimicrobianos. O termo “tolerância” é utilizado na Microbiologia
para caracterizar cepas bacterianas incapazes de se multiplicar em determinada
concentração inibitória mínima (CMI) do agente antimicrobiano, porém capazes de
permanecerem viáveis na presença da droga, não sofrendo ação da concentração
bactericida mínima (CBM) habitual136. Assume-se que a propriedade de “resistência”
pode ser tanto de origem genética quanto não-genética como a proporcionada por
biofilmes. No atual estudo adotamos como referência para a classificação de bactérias
resistentes e sensíveis ao mercúrio o valor de CMI de 5µM de Hg baseado em estudos
prévios que utilizaram cepas padrão E. coli ATCC 23724 (sensível ao Hg) e E. coli
ATCC 35218 (resistente ao Hg)116.
Apesar de bactérias HgR já terem sido isoladas de ambientes considerados “não
contaminados” pelo mercúrio, a presença desses microrganismos é relacionada ao nível
de contaminação no ambiente pelo metal. A resistência bacteriana ao mercúrio presente
no meio ambiente é considerada um dos muitos exemplos de adaptação genética e
fisiológica de comunidades microbianas expostas a contaminantes. A seleção de
comunidades microbianas expostas a níveis tóxicos deste metal reflete no aumento da
circulação dessas bactérias resistentes137,138. Apesar de não ter sido realizada nenhuma
medição da contaminação por mercúrio nos pontos de coleta do estudo, é possível que
as amostras analisadas tenham tido, em algum momento, contato prévio com
concentrações do metal ou com microrganismos carreadores de genes de resistência aos
antimicrobianos que podem estar co-localizados com marcadores de resistência ao Hg
em elementos genéticos móveis. Isto porque, o fenótipo da resistência ao Hg foi
amplamente detectado, sendo observado em 92,1% das amostras. Este resultado
82
corrobora estudos que apontam a ubiqüidade da resistência bacteriana ao mercúrio
mesmo em ambientes não contaminados por este metal92.
Todas as 164 amostras que apresentaram o fenótipo HgR exibiram o mesmo
valor de CMI de 10µM de Hg. Hassen e colaboradores129 apontaram o mercúrio
(HgSO4) como o metal mais tóxico dentre os testados, uma das cepas bacterianas
utilizadas neste trabalho foi a Escherichia coli K12 que teve valor de CMI em meio
líquido igual a 0,05mM. O valor de CMI encontrado foi superior ao observado mesmo
nas cepas mais resistentes ao mercúrio no atual estudo, entretanto, as condições
envolvidas no protocolo experimental foram distintas das do presente estudo. Narita e
colaboradores131 analisaram 30 amostras de Bacillus isoladas de sedimentos da baía de
Minamata localizada no Japão, região onde ocorreu um grande desastre ambiental
decorrente do lançamento de metilmercúrio nesta baía. Os valores de CMI para HgCl2
encontrados pelos autores variaram de 40 até 320µM. Neste caso, além da espécie
bacteriana estudada ser outra, o meio utilizado para a realização do CMI foi o caldo LB.
Segundo Chang e colaboradores139 o mercúrio forma complexos com a triptona e o
extrato de levedura presentes no meio LB diminuindo a disponibilidade de mercúrio no
meio. Outra dificuldade encontrada para a comparação com outros resultados consiste
da falta de informações sobre como foi o procedimento metodológico ou mesmo
lacunas de informação na apresentação dos resultados.
6.3) FENÓTIPO DA SUSCEPTIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS
Durante os últimos anos a utilização de antimicrobianos tem aumentado de
forma exponencial na medicina humana para tratar e prevenir doenças, na medicina
veterinária, como promotores de crescimento na criação de animais, na aqüicultura, na
agricultura entre outros140. Em conseqüência da utilização excessiva e não controlada
dos antimicrobianos, principalmente nos países em desenvolvimento, observa-se o
surgimento de novos mecanismos de resistência e a rápida disseminação dos
mecanismos já existentes. A disseminação destes mecanismos de resistência bacteriana
a múltiplos agentes antimicrobianos é responsável pelas altas taxas de falha nos
tratamentos de infecções em todo o mundo e é considerado um dos maiores desafios em
Saúde Pública do mundo moderno112,141,142,143,144. Por este motivo, a resistência a
antimicrobianos detectada em diferentes espécies bacterianas embora não esteja
diretamente associada à virulência, tem sido descrita como um fenômeno de grande
83
importância, cuja evolução vem sendo observada e acredita-se contribuir com as altas
taxas de morbimortalidade associadas a este tipo de infecção em humanos42.
Nas últimas décadas passou a haver uma maior preocupação acerca dos efeitos
adversos para a saúde do homem e do ambiente resultante da utilização não controlada
de antimicrobianos nos diversos setores da saúde e da economia. Muitos estudos têm
sido realizados visando à pesquisa de características de resistência em microrganismos
no ambiente hospitalar. Entretanto, pesquisas sobre a estrutura de comunidades
bacterianas e sobre as características de resistência aos antimicrobianos em
microrganismos circulantes nos sistemas aquáticos ainda são escassas. Muito pouco se
sabe sobre o destino de antimicrobianos nos sistemas aquáticos e os efeitos causados em
microrganismos presentes neste ambiente140,141,144.
A presença de bactérias patogênicas em ambientes aquáticos pode ser fonte de
doenças quando a água é usada para consumo, recreação ou irrigação. Este risco é
potencializado se as bactérias presentes nos ambientes aquáticos além de causarem
doença também são carreadoras de características de resistência a antimicrobianos
diversos dificultando então o tratamento de doenças infecciosas. Além disso, estas
bactérias podem ser capazes de transmitir, através da transferência lateral de genes, os
determinantes de resistência aos antimicrobianos que estão albergados em elementos
genéticos móveis para outras bactérias autóctones, resultando na disseminação da
resistência bacteriana140. O fenômeno da resistência aos antimicrobianos na espécie
bacteriana E. coli isolada de sistemas aquáticos tem sido observado em diversas partes
do mundo, sendo objeto de diversos trabalhos científicos51,140,144,145,146,147.
No presente estudo a resistência a, no mínimo, um dos antimicrobianos testados
foi detectada em 37% das amostras de E. coli, sendo 16,8% destas multirresistentes. O
grande percentual de amostras resistentes e multirresistentes aos antimicrobianos
detectado neste estudo é motivo de preocupação. Isto porque, as conseqüências para a
saúde associadas com infecções causadas por E. coli diarreiogênica são agravadas pela
emergência de cepas de E. coli multirresistentes a diferentes agentes antimicrobianos. O
fenômeno crescente de detecção de cepas bacterianas de diferentes espécies carreadoras
de características de resistência e multirresistência a um amplo espectro de
antimicrobianos tem sido considerado um dos grandes desafios do século XXI para a
ciência e para a medicina. Além disso, a resistência intermediária foi detectada em
84
62,3% do total de amostras isoladas neste estudo. A existência de cepas de E. coli
isoladas de sistemas aquáticos que exibem características de resistência intermediária
aos antimicrobianos tem sido crescentemente detectada por outros autores em diferentes
partes do mundo5. Esta emergência e disseminação de cepas que apresentam resistência
intermediária a um amplo espectro de agentes antimicrobianos é motivo de preocupação
por indicar que caminhamos para a diminuição na disponibilidade de alternativas
terapêuticas efetivas para o tratamento de um grande número de doenças causadas por
microrganismos de importância médica5.
A ocorrência de E. coli no ambiente aquático e os seus perfis de susceptibilidade
aos antimicrobianos mostram variações geográficas significantes assim como entre
populações e ambientes113. Portanto, há uma grande variação de percentuais de
resistência e de multirresistência detectados por diferentes autores. Servais & Passerat140
isolaram suas amostras de ambientes classificados em áreas similares as áreas de coleta
incluídas em nosso estudo e detectaram a resistência a antimicrobianos em 42% de suas
amostras isoladas de rios, entrada e saída de estações de tratamento de esgoto
doméstico, efluentes hospitalares, áreas de agricultura e regiões de floresta na França.
Não foram encontrados estudos realizados no Brasil sobre resistência aos
antimicrobianos em E. coli isolados de áreas similares as incluídas no atual estudo,
geralmente os estudos encontrados incluíam áreas de coleta com características muito
particulares.
No presente estudo, o fenótipo de resistência foi detectado para a cefalotina em
24,7% do total de amostras, seguido por amicacina com 12,4%, ampicilina com 9%,
gentamicina com 5,6%, ciprofloxacino, norfloxacino e trimetoprim com 3,4%,
cefoxitina e nitrofurantoína com 2,8% e cefepima com 0,6%. Amostras de E. coli que
apresentaram resistência a ciprofloxacina foram resistentes a múltiplos agentes
antimicrobianos, fato já observado em diversos estudos5. Em E. coli normalmente os
índices de resistência são altos para as penicilinas de amplo espectro e para o
trimetoprim e baixas para cefalosporinas de terceira geração e nitrofurantoína113. O
percentual encontrado de amostras resistentes a cefalotina (cefalosporina de 1ª geração)
e ampicilina (aminopenicilina) já era esperado dado que as penicilinas e cefalosporinas
de 1ª geração são utilizadas há décadas na clínica. Enquanto que as quinolonas e em
especial as fluoroquinolonas e os aminoglicosídeos passaram a ser usados
recentemente125,140. Apesar disso, na Europa central vem sendo observado desde 1998
85
um crescente aumento em isolados resistentes fluoroquinolonas. O surgimento da
resistência a fluoroquinolonas e a produção de β-lactamases de amplo espectro (ESBL)
por cepas de E. coli multirresistentes tem causado apreensão pelo efeito que possuem na
limitação de alternativas terapêuticas em infecções causadas por estas cepas113.
Houve uma variação considerável nas freqüências de amostras de E. coli que
exibiram padrões de resistência e multirresistência entre as diferentes áreas de coleta
incluídas neste estudo. O percentual de amostras de E. coli resistentes a antimicrobianos
isoladas de águas recreacionais detectado neste estudo, representando a área de coleta
com segundo maior percentual de resistência, é bem maior do que o relatado por outros
autores. Segundo o trabalho realizado por Hamelin e colaboradores146 em lagos
recreacionais no Canadá, apenas 14% das amostras de E. coli incluídas no estudo
apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano. O grande percentual de
bactérias resistentes em águas recreacionais no Rio de Janeiro se deve possivelmente ao
uso indiscriminado de antimicrobianos pela população. A presença destas cepas de E.
coli que exibem padrões de resistência e multirresistência a antimicrobianos em águas
recreacionais é motivo de preocupação pelo alto risco de contaminação a que as pessoas
que entram em contato com este ambiente estão submetidas.
O isolamento de bactérias resistentes a antimicrobianos em amostras
provenientes águas de regiões de agropecuária pode estar relacionada ao uso de
antimicrobianos em concentrações subterapêuticas como promotor de crescimento
animal, com a utilização na medicina veterinária e na agricultura na prevenção de
pragas112,113. Esta hipóstese é apoiada por alguns autores que afirmam que a utilização
sem restrições de antimicrobianos na agropecuária tem influência na prevalência de
genes de resistência em cepas bacterianas encontradas em sistemas aquáticos148. O atual
estudo demonstra a importância desta área de coleta na qual foi encontrado o maior
percentual de resistência bacteriana aos antimicrobianos. A elevada prevalência de
bactérias resistentes isoladas de águas próximas a hospitais tem sido observado em
diversos outros trabalhos114,149 e, portanto, já era esperado no presente estudo.
Ambientes aquáticos que sofrem este tipo de contaminação são altamente seletivos e
contribuem com altos índices de bactérias resistentes e multirresistentes lançadas no
ambiente114. Estudos mostram que apesar de altas doses de antimicrobianos serem
consumidos em hospitais a maioria dos antibióticos consumidos na medicina humana,
entretanto, é consumida fora do ambiente hospitalar113. A automedicação e o uso
86
indiscriminado de antimicrobianos pela população humana, contribuindo para a
presença de bactérias resistentes encontradas em águas de regiões de aglomerados
residenciais.
6.4) PCR PARA A AMPLIFICAÇÃO DO GENE merA
A resistência ao mercúrio é um dos mecanismos de resistência a metais tóxicos
mais estudados. Pesquisas que visam a detecção dos elementos genéticos que conferem
resistência a este metal, dentre eles o gene merA, têm sido amplamente
desenvolvidos103,119. A diversidade destes determinantes genéticos de resistência ao
mercúrio, principalmente em bactérias Gram-negativas, tem sido constatada por
diversos trabalhos científicos92,103,131,137,150,151,152,153. Observando este fato Chadhain e
colaboradores119 desenvolveram iniciadores degenerados para mostrar a grande
diversidade das sequências do gene merA nas bactérias Gram-negativas. Com esta
modificação os autores permitiram a detecção de 37 variantes genéticas adicionais se
comparadas com as encontradas por outras metodologias descritas por Liebert e
colaboradores103 e Felske e colaboradores154,119.
A
partir
destes
iniciadores
degenerados
descritos
por
Chadhain
e
colaboradores119 fomos capazes de detectar produtos de amplificação estáveis e
reprodutíveis em 46% das amostras, definindo três perfis eletroforéticos. Os autores do
artigo utilizado como referência para esta metodologia atribuem a presença de produtos
de amplificação diferentes do fragmento esperado (285pb) como resultado da menor
especificidade da reação de PCR em determinados grupos bacterianos. Porém no atual
estudo preferimos também incluir nos resultados o produto de amplificação de 720pb
que se manteve estável e reprodutível. Supomos que a ocorrência de modificações
internas na sequência do gene merA nas amostras analisadas como conseqüência de
eventos genéticos tais como adições ou deleções podem ter contribuído para a
diversidade do gene resultando em amplificações de fragmentos não esperados. Porém,
como o fragmento alvo esperado pelos autores era o de 285pb e como não foi realizado
nenhum estudo acerca da estrutura genética do outro fragmento amplificado, os ensaios
de RAPD-PCR e DGGE foram realizados somente com as 14 amostras pertencentes aos
perfis I e II, que apresentaram amplificação do fragmento esperado.
87
A detecção do gene de resistência ao mercúrio em amostras isoladas de
diferentes pontos de coleta distantes entre si corrobora a afirmação de que tais
mecanismos genéticos estão amplamente distribuídos em populações microbianas
circulantes em ambientes extremamente diversos incluindo desde solos e sedimentos
119,131,137,138,155,156,157
, águas95,157, animais103 e isolados clínicos129. Tal fato se deve a
localização mais frequente deste mecanismo genético em elementos extracromossomicos que podem ser facilmente transferidos horizontalmente inclusive entre
bactérias pertencentes a espécies distintas, o que justificaria a sua distribuição e
ambientes geograficamente distantes.
A co-ocorrência da resistência a agentes antimicrobianos e a metais em
populações bacterianas ambientais e clínicas vem sendo reportada nas últimas
décadas97,98,99. Esta co-ocorrência se dá porque genes que codificam a resistência a
metais estão normalmente associados a genes que conferem resistência a
antimicrobianos em um mesmo plasmídeo e/ou transposon87. Os resultados obtidos nos
nossos estudos estão em concordância com estas afirmações mostrando elevados
percentuais de resistência, particularmente para cefalotina e ampicilina entre as cepas
carreadoras do gene merA. Em adição, uma fração significante das cepas carreadoras do
gene de resistência ao mercúrio, cerca de 40%, foi considerada multirresistente aos
agentes antimicrobianos testados.
A resistência a ampicilina tem sido muito correlacionada com a resistência ao
mercúrio em diversos trabalhos científicos95,116,134. Algumas das associações específicas
de resistência aos antimicrobianos e a metais já foram descritas como, por exemplo, a
que concerne à resistência ao mercúrio e a ampicilina. Gosh e colaboradores 158 ao
retirarem um plasmídeo específico de cepas bacterianas do gênero Salmonella
perceberam que estas perderam suas características pré-detectadas de resistência a
ampicilina e a metais, incluindo o mercúrio. Uma explicação para essa associação seria
a utilização do mercúrio como desinfetante e antimicrobiano em ambientes hospitalares
no passado, fato que possivelmente exerceu uma pressão seletiva nas bactérias
semelhante a causada pela utilização dos antibióticos150.
88
6.5) PCR-TRIPLEX PARA AGRUPAMENTO FILOGENÉTICO DE Escherichia
coli
De acordo com a literatura, linhagens patogênicas de E. coli agentes de doenças
extra-intestinais têm sido classificadas como pertencentes, em sua maioria ao grupo B2
e em menor escala ao grupo D, as comensais pertencem em sua maioria ao grupo A e
em menor proporção ao grupo B1 e as agentes de doença diarréica são encontradas
como membros dos grupos A, B1 e D42. Nossos resultados permitiram classificar as
amostras de E. coli incluídas no estudo em três dos quatro filogrupos genéticos descritos
por Clermont e colaboradores45. As amostras foram classificadas principalmente no
grupo A (91,6%) seguindo-se os grupos B2 (5%) e D (3,4%). Nenhuma amostra foi
classificada como pertencente ao grupo filogenético B1.
A presença majoritária do filogrupo A corrobora resultados encontrados em
diversos estudos realizados com amostras isoladas de sistemas aquáticos17,71,147,159,160 e
indica a presença de cepas comensais ou agentes de doença diarréica. Tal distribuição
possivelmente se deve ao fato de que as amostras de água tenham sido coletadas de
regiões com histórico prévio de contaminação fecal147. É importante salientar a
importância de medidas de vigilância após terem sido encontradas neste estudo
amostras pertencentes aos filogrupos B2 e D possíveis agentes de doenças extraintestinais e, no caso do filogrupo D também agente de doenças diarréicas17,161. É
unanimidade entre os autores o reconhecimento da importância que o estudo e
identificação dos grupos filogenéticos possuem para o aumento do conhecimento e
entendimento da diversidade e virulência bacteriana em diferentes sistemas ambientais.
Estudos filogenéticos realizados com populações de E. coli isoladas destes ambientes,
apesar de ainda muito limitados, tem permitido identificar que patotipos diarreiogênicos
e extra-intestinais de E. coli estão amplamente distribuídos nos mais variados
ecossistemas aquáticos, salientando a importância de tais estudos no âmbito da Saúde
Pública e alertando para a elaboração de estratégias de prevenção de doenças
infecciosas44.
Os estudos realizados com amostras ambientais ainda são escassos,
principalmente no Brasil, dificultando a comparação com outros estudos. Apesar disso,
alguns estudos foram realizados no estado de São Paulo por Orsi e colaboradores17,160
em Guarapiranga e no reservatório Billings no primeiro estudo e no Rio Jaguari e no
89
Rio Sorocaba no segundo estudo. A distribuição dos filogrupos em ambos os trabalhos
foi muito similar apresentando a distribuição dos filogrupos em ordem decrescente de
ocorrência dos filogrupos A, B1, D e B2. O filogrupo A é apontado como mais
prevalente nos dois estudos.
6.6) PCR-MULTIPLEX PARA ENTEROVIRULÊNCIA DE Escherichia coli
(PCR-DEC)
Muitas revisões foram publicadas sobre a patogenia, o diagnóstico e a origem de
E. coli enteropatogênica, principalmente utilizando como exemplos amostras
clínicas14,15,18,25,28,34,36,37,39,40,162,163,164,165,166,167,168. Entretanto, estudos realizados para
esclarecer características de distribuição, patogênese e persistência de E. coli ambientais
são menos numerosos. Em alguns trabalhos têm sido relatada, em geral, uma alta
freqüência de cepas carreadoras de genes de enterovirulência as pertencentes aos
patogrupos EAEC, ETEC, STEC, EIEC e ATEC5,7,146,160,169.
Recentemente tem sido reportado que o gene astA está presente não só em
amostras de EAEC, mas também em outros patotipos de E. coli diarreiogênica incluindo
ETEC, EPEC e EHEC120,170. Os resultados do nosso estudo corroboram esta observação
visto que o gene astA esteve presente em grande parte das amostras que exibiram
marcadores de patogenicidade, cerca de 65%. Por exemplo, as amostras isoladas RM 11
(uidA, estIa e astA), RM 71 (uidA, stx1 e astA) e RM 73 (uidA, stx1 e astA) foram
classificadas nos grupos patogênicos ETEC (estIa), STEC (stx1) e STEC (stx1)
respectivamente, apesar de também carrearem o gene astA.
A co-ocorrência de genes de enterovirulência pertencentes a diferentes patotipos
em uma mesma cepa bacteriana pode ser motivo de confusão. Como exemplo, após a
eletroforese do produto de PCR-DEC descobriu-se que a amostra RM 11 (uidA, estIa e
astA) apresentou os mesmos marcadores genéticos de enterovirulência da amostra 037355 (uidA, estIa e astA) do artigo utilizado como base para a realização desta
metodologia. No presente estudo a amostra RM 11 foi categorizada como pertencente
ao grupo patogênico ETEC e no artigo base a amostra 03-7355, após ter seu padrão de
aderência agregativa constatado, foi categorizada no grupo das EAEC, porém com a
adição de um fator de virulência da toxina ST (característica de ETEC). Este é um ponto
bastante controverso e torna-se evidente a necessidade de mais estudos para descobrir a
90
propriedade patogênica destas cepas para que se possa definir exatamente a qual grupo
estão inseridas ou se há a possibilidade da criação de novos patotipos para a sua
classificação dado que estas já são circulantes em sistemas aquáticos. Deve se
considerar também que a plena expressão do potencial de virulência pode, em certos
casos, requerer a atuação de características genéticas de regulação localizadas em outros
elementos genéticos.
Este resultado evidencia o fato de que os perfis de virulência em E. coli não são
estáticos e estas variações podem ser explicadas pela grande plasticidade genômica
característica desta espécie bacteriana. Esta plasticidade existe como resultado de
adição, rearranjos, excisões e transferência horizontal de genes de virulência que, na
maioria das vezes estão albergados em elementos genéticos móveis tais como
plasmídeos, bacteriófagos e ilhas de patogenicidade. A situação é amplificada pelo fato
de que ilhas de patogenicidade são instáveis a temperaturas mais baixas que 21ºC e,
sendo assim, podem ser deletadas do genoma bacteriano quando submetidas a esta
condição ambiental. A recombinação destes fatores genéticos contribui para a rápida
evolução de cepas de E. coli e para a formação de novas combinações genéticas de
fatores de virulência que podem conduzir ao surgimento de novos patotipos. Estas
modificações
genéticas
complementam o perfil de virulência destas cepas
provavelmente aumentando a sua capacidade de adaptação aos mais diferentes
ambientes44,120,146,171.
Metade das amostras que tiveram amplificação de algum gene de virulência
carreavam somente o gene astA. Müller e colaboradores120 realizaram testes de padrão
de aderência com células em cultura, “padrão-ouro” na classificação de EAEC, nas
cepas que foram positivas para determinantes deste patotipo com o objetivo de
confirmar se estas seriam mesmo pertencentes ao grupo. Como resultado ele observou
que os 15% falso-positivos obtidos pelo PCR carreavam somente o marcador astA ou
pic. Portanto no atual estudo, no qual não foi realizado o teste de padrão de aderência,
classificamos as 10 amostras positivas apenas para o gene astA como pertencentes a um
grupo de patotipo ainda não determinado. Existe um consenso entre diversos estudos de
que bactérias comensais podem em algum momento carrear genes de virulência para
auxiliar na sua sobrevivência e ampliar o sucesso na colonização de seu hospedeiro146.
91
As amostras isoladas de águas de regiões de aglomerados residenciais foram as
que exibiram maior quantidade de genes de virulência pesquisados, correspondendo a
85% das amostras que apresentaram amplificação dos genes de enterovirulência
investigados. Cerca de 20% das amostras isoladas desta área de coleta foram
carreadoras de genes de enterovirulência, o que indica o grande potencial destes
microrganismos como fonte de contaminação desses sistemas aquáticos. A presença de
cepas bacterianas carreadoras de marcadores de virulência indica o grande o risco de
contaminação para a população que vive ao redor destes locais. As amostras isoladas
desta área de estudo e pertencentes à patotipos definidos estavam incluídas no grupo das
ETEC, STEC e ATEC e foram isoladas de pontos de coleta como o Rio Faria, Rio Irajá
e Rio São João que são rodeados por residências de baixa renda que vivem em
condições de saneamento e hábitos de higiene precários, muitas vezes utilizando a água
destes rios como fonte de consumo e recreação. Especialmente para as STEC era
esperado o isolamento em regiões agropastoris, onde são encontrados bovinos,
reservatórios tradicionais deste microrganismo, resultado que não foi observado no
presente estudo172.
A pesquisa de genes de virulência em E. coli isoladas de sistemas aquáticos que
podem em algum momento ser utilizados como fonte de água ou de recreação é uma
importante ferramenta diagnóstica com potencial de subsidiar estratégias de proteção a
saúde da população. Em termos de Saúde Pública, a presença de patotipos intestinais
responsáveis por diferentes quadros da doença diarréica, podendo levar, em alguns
casos, até a morte é motivo de alerta e demonstra a necessidade de um melhor
monitoramento da qualidade da água.
Dentre as amostras merA+, apenas uma apresentou amplificação de genes de
enterovirulência. O gene detectado foi o escV, classificando esta amostra como
pertencente ao grupo das ATEC. Apesar da baixa prevalência de amostras com
potencial de enteropatogenicidade entre os isolados de E. coli merA+, deve ser
considerado a elevada plasticidade e intercâmbio genético da espécie, possibilitando a
emergência de cepas altamente patogênicas. Assim sendo, a utilização de amostras
bacterianas pertencentes a esta espécie em processos de biorremediação, requer prévia e
cautelosa análise genética.
92
6.7) AMPLIFICAÇÃO RANDÔMICA DO DNA POLIMÓRFICO (RAPD-PCR)
O ensaio de amplificação randômica do DNA polimórfico (RAPD) tem sido
amplamente utilizado como método de tipagem molecular devido a sua simplicidade,
sensibilidade, flexibilidade e relativo baixo custo. Esta técnica foi utilizada com êxito
por Pacheco e colaboradores57 e Regua-Mangia e colaboradores48 para o estudo da
diversidade entre amostras de E.coli provenientes de diferentes origens.
No presente estudo, a análise do agrupamento obtido a partir do RAPD-PCR
permitiu detectar que a população de E. coli carreadora do gene de resistência ao
mercúrio é geneticamente diversa, porém, uma relação mais estreita foi observada entre
os isolados que compartilham origem de isolamento e as demais características
biogenéticas investigadas, possivelmente pertencendo também ao mesmo sorotipo.
Perfis eletroforéticos idênticos de RAPD-PCR foram observados entre amostras do
Canal do Cunha e entre amostras da Lagoa Rodrigo de Freitas, ambos localizados em
águas de regiões de aglomerados residenciais. Além de estas amostras terem sido
isoladas de um mesmo ponto de coleta também apresentaram o mesmo genótipo que
codifica a resistência ao mercúrio, o mesmo perfil de resistência a antimicrobianos,
mesmo CMI para o mercúrio, mesmo grupo filogenético e patotipo.
6.8) ELETROFORESE EM GEL DE GRADIENTE DESNATURANTE (DGGE)
O DGGE é uma técnica de fingerprinting genético muito utilizada em estudos de
ecologia molecular de microrganismos. Desde o seu primeiro uso em trabalhos
científicos sobre a complexidade de comunidades bacterianas em 1993 esta metodologia
tem sido empregada no estudo da diversidade de genes e de comunidades bacterianas
presentes em diferentes ambientes62. Esta técnica é utilizada no estudo da diversidade de
genes para detectar mutações pontuais nas sequências de mesmo tamanho, porém com
diferentes sequências de ácidos nucléicos173.
A diversidade do gene merA já descrita por outros trabalhos tanto em bactérias
Gram-negativas quanto Gram-positivas tem sido detectada utilizando principalmente a
técnica de RFLP (restriction fragment lenght polymorphism) que emprega enzimas de
restrição131,137,151,152. Entretanto para ensaios de RFLP é necessário que os sítios de
variabilidade correspondam aos sítios de reconhecimento da enzima para que sejam
detectados. No atual estudo utilizando a técnica de DGGE também observamos
93
variações genéticas entre as amostras de E. coli carreadoras do gene merA. A técnica de
DGGE não requer conhecimento de suas sequências para que seja possível detectar a
variabilidade, o que confere grande vantagem e sensibilidade ao método. Amostras que
apresentaram o mesmo padrão de amplificação na técnica de RAPD-PCR também
apresentaram o mesmo padrão de amplificação na técnica de DGGE. Este resultado
indica que as amostras são pertencentes a um mesmo grupo clonal circulante no
ambiente aquático de onde foram isoladas.
6.9) BIORREMEDIAÇÃO
A descontaminação de ambientes poluídos é um dos principais desafios para o
desenvolvimento sustentável132. Dentre os contaminantes ambientais o mercúrio
destaca-se entre os de maior relevância devido aos danos irreversíveis que pode causar
ao ambiente, aos animais e aos seres humanos. Normalmente áreas contaminadas por
metais são tratadas com métodos químicos, físicos e térmicos tradicionais que tem alto
custo e causam perturbações ambientais174. Em contraste, processos de biorremediação
são muito mais atrativos para a remoção de metais por terem custo mais baixo e maior
eficiência a baixas concentrações175.
Wagner-Dobler e colaboradores176 demonstraram com sucesso a eficiência e
aplicabilidade da técnica de biorremediação através do uso de uma população de
bactérias do gênero Pseudomonas capazes de reduzir o Hg+2 em Hg0 com o objetivo de
remover o mercúrio inorgânico dos efluentes de uma indústria de cloro-soda. Este
processo resultou na remoção de até 99 % do Hg+2 presentes nos efluentes desta
indústria em um período de 56 horas. Esta técnica é considerada uma aliada ambiental,
pois, além de remover o mercúrio de efluentes, requer pouca energia, trabalha em
temperatura ambiente, tem baixo custo e não utiliza substâncias químicas extras176. O
uso do operon mer para remoção do Hg+2 é uma promissora tecnologia de
biorremediação que está sendo desenvolvida durante os últimos anos e que tem grande
potencial para diminuir a exposição ambiental e humana a este metal tóxico.
Com relação ao potencial de utilização da espécie bacteriana Escherichia coli em
processos de biorremediação de águas contaminadas pelo mercúrio poucos estudos
foram realizados. Devido à grande importância do mercúrio como poluente global e o
sucesso de empreitadas anteriores para a biorremediação de áreas impactadas, estudos
94
que visam esclarecer os mecanismos bacterianos envolvidos na resistência ao mercúrio
têm fundamental importância para minimizar a exposição humana e ambiental ao
mercúrio.
95
7. CONCLUSÕES
 Amostras bacterianas pertencentes a espécie Escherichia coli com propriedades
e potencialidades de virulência circulam amplamente em diferentes sistemas
aquáticos no Estado do Rio de Janeiro;
 A identificação da prevalência do grupo filogenético A e a detecção de
marcadores genéticos de enteropatogenicidade, característicos de patotipos
intestinais associados com quadros clínicos severos em humanos indica a
circulação, nesses ambientes, de microrganismos de grande relevância para a
Saúde Pública e alerta para ações específicas na área de vigilância
epidemiológica;
 O perfil de susceptibilidade a antimicrobianos detectada nas amostras do estudo
corrobora padrões observados em amostras bacterianas isoladas de comunidade.
Entretanto, o fenótipo de resistência e multirresistência assim como os padrões
de resistência intermediária, possivelmente refletem as peculiaridades das
regiões geográficas envolvidas e o uso indiscriminado de antimicrobianos;
 A ampla circulação de amostras bacterianas resistentes ao mercúrio é um
processo decorrente da seleção de populações microbianas e reforça estudos
prévios que demonstram a ocorrência natural do metal nos mais diversos
ambientes, em um grande número de formas químicas;
 A diversidade detectada no gene merA possivelmente é decorrente de eventos
simples de mobilidade genética como mutações, deleções, inserções e
substituições. A co-ocorrência de determinantes de resistência ao Hg com
propriedades de resistência a antimicrobianos vem reforçar a observação sobre a
co-localização genética destas características;
 A análise do genoma total revelou uma elevada diversidade genética nas
amostras carreadoras dos marcadores de resistência ao mercúrio. Entretanto, foi
observada a ocorrência de genótipos merA-específicos em microrganismos
geneticamente mais relacionados, sugerindo uma circulação clonal-específica;
96
 Em função das potencialidades patogênicas nas amostras bacterianas resistentes
ao Hg, análises mais precisas são requeridas visando aplicações em processos de
biorremediação.
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scale.
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117
ANEXO – SSoolluuççõõeess uuttiilliizzaaddaass ppaarraa PPC
CR
R
1) Reagentes e soluções utilizadas nos ensaios de PCR
1.1) Solução tampão Tris-EDTA (TE), pH 7.5
Tris-HCl (LGC Biotecnologia®)
10Mm
EDTA (LGC Biotecnologia®)
0,1mM
1.2) Gel de agarose 1,3% (p/v)
UltraPure Agarose (Invitrogen®)
1,3%
TBE 0,5X q.s.p.
100mL
1.3) Solução tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 5X, pH 8.4
Tris-HCl (LGC Biotecnologia®)
0,89M
Ácido bórico (Merck®)
0,89M
EDTA (LGC Biotecnologia®)
0,024M
1.4) Solução de brometo de etídeo (0,5µg/mL)
Brometo de etídio (10mg/mL) (Invitrogen®)
10µL
Água destilada
200mL
1.5) Gel de agarose 1,2% (p/v)
UltraPure Agarose (Invitrogen®)
1,2%
TBE 0,5X q.s.p.
100mL
1.6) Gel de agarose 1,5% (p/v)
UltraPure Agarose (Invitrogen®)
1,5%
TBE 0,5X q.s.p.
100mL
118
1.7) Formamida deionizada 100%
Formamida P.A.
100mL
Resina deionizante
5g
1.8) Corante para eletroforese de DNA
Azul de bromofenol
0,005g
Xilenocianol
0,005g
Glicerol P.A.
7mL
Água deionizada
3mL
1.9) Solução de Persulfato de Amônio 10% (APS)
Persulfato de amônio
0,1g
Água deionizada
1mL
1.10) Solução 80% desnaturante (Solução High)
Solução 0% desnaturante
1,4mL
Solução 100% desnaturante
12,6mL
APS 10%
60µL
TEMED
30µL
Dcode Dye Solution
30µL
1.11) Solução 55% desnaturante (Solução Low)
Solução 0% desnaturante
4,9mL
Solução 100% desnaturante
9,1mL
APS 10%
60µL
TEMED
30µL
119
1.12) Solução para vedar as placas (Solução Stak)
Solução 0% desnaturante
4mL
APS 10%
30µL
TEMED
15µL
1.13) Solução de acrilamida 40%
Acrilamida
38,93g
Bis-acrilamida
1,07g
Água deionizada q.s.p.
100mL
1.14) Solução 0% desnaturante (gel a 8% de acrilamida)
Solução de acrilamida 40%
20mL
Solução tampão TAE 50X
2mL
Água Mili-Q q.s.p.
100mL
1.15) Solução 100% desnaturante (gel 8% de acrilamida)
Solução de acrilamida 40%
20mL
Solução tampão TAE 50X
2mL
Formamida deionizada
40mL
Uréia
42g
Água Mili-Q q.s.p.
100mL
1.16) Tris-acetato 1X (TAE 1X)
Tris-acetato, pH 7.4
20mM
Acetato de sódio
10mM
EDTA
0,5mM
Água Milli-Q q.s.p.
250mL
120
1.17) Solução de Sybr Green®
Diluir o Sybr Green® em água deionizada na proporção de 1:10.000. Esta
solução deve ser preparada somente no dia do uso, na ausência de luz ou em frasco
âmbar.
121