marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo em

0
UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - PPGCS
LUCIANA ROSA
MARCADORES INFLAMATÓRIOS E DE ESTRESSE OXIDATIVO EM
PACIENTES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA E ANEMIA
CRICIUMA, JULHO DE 2011
1
LUCIANA ROSA
MARCADORES INFLAMATÓRIOS E DE ESTRESSE OXIDATIVO EM
PACIENTES COM DOENÇA RENAL CRÔNICA E ANEMIA
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde.
Orientadora: Profª. Drª. Cristiane Ritter
Coorientador: Prof. Dr. Felipe Dal-Pizzol
CRICIUMA, JULHO DE 2011
2
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
R788m
Rosa, Luciana.
Marcadores inflamatórios e de estresse oxidativo em
pacientes com doença renal crônica e anemia / Luciana
Rosa ; orientadora: Cristiane Ritter, co-orientador: Felipe
Dal-Pizzol. – Criciúma : Ed. do Autor, 2011.
61 f.; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) - Universidade do Extremo
Sul Catarinense, Programa de Pós-Graduação em Ciências
da Saúde, Criciúma (SC), 2011.
1. Insuficiência renal crônica. 2. Estresse oxidativo.
3. Inflamação. I. Título.
CDD. 21ª ed. 616.614
Bibliotecária: Rosângela Westrupp – CRB 364/14ª Biblioteca Central Prof. Eurico Back - UNESC
3
4
Dedico este trabalho aos meus pais Roberto
e Miguel, minha mãe Salete, Luiza e Lurdinha
e minha amada irmã Raquel por sempre
estarem ao meu lado de alguma forma
acreditando
potenciais.
em
meus
objetivos
e
5
AGRADECIMENTOS
Como é importante finalizar mais uma etapa em nossa vida com a sensação
de que algo ainda há por fazer, ou melhor para continuar, pois, nossos sonhos e
metas não param jamais de habitar nosso pensamento.
Mas com o findar desta etapa em minha vida gostaria de colocar aqui meus
agradecimentos a todos os colegas que contribuíram, de forma direta ou indireta,
para a concretização deste trabalho
A minha orientadora Cristiane Ritter pela oportunidade de aprendizado. Ao
meu co-orientador Felipe Dal-Pizzol, primeiramente pelo exemplo de simplicidade
frente a uma condição tão importante que conquistou através de sua luta, pela
produção do conhecimento, companheirismo, apoio e amizade sincera.
Aos membros da banca que prontamente se dispuseram a avaliar a presente
dissertação, compondo a banca examinadora.
Agradeço aos membros do Laboratório de Fisiopatologia Experimental da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, pelo importante apoio na realização deste
trabalho. Em especial a Larissa Constantino e Cristiane Damiani Tomasi pela
paciência e dedicação.
Meu muito obrigada aos meus colegas da clínica de nefrologia pelo grande
apoio dispensado durante a elaboração do trabalho em especial a Morgana e
Susana pela amizade e companheirismo.
6
CONFIA SEMPRE
Não percas a tua fé entre as sombras do mundo.
Ainda que os teus pés estejam sangrando, segue para frente, erguendo-a por
luz celeste, acima de ti mesmo.
Crê e trabalha.
Esforça-te no bem e espera com paciência.
Tudo passa e tudo se renova na Terra, mas o que vem do céu permanecerá.
De todos os infelizes, os mais desditosos são os que perderam a confiança em
Deus e em si mesmos, porque o maior infortúnio é sofrer a privação da fé e
prosseguir vivendo.
Eleva, pois, o teu olhar e caminha.
Luta e serve. Aprende e adianta-te. Brilha a alvorada além da noite.
Hoje, é possível que a tempestade te amarfanhe o coração e te atormente o
ideal, aguilhoando-te com a aflição ou ameaçando-te com a morte.
Não te esqueças, porém, de que amanhã será outro dia.
MEIMEI
Médium: Francisco Cândido Xavier do livro: CARTAS DO CORAÇÃO
7
RESUMO
Anemia e estresse oxidativo na doença renal crônica (DRC) são características
comuns e ambos estão envolvidos no aumento da morbidade e mortalidade. A
deficiência de ferro é muito comum na DRC sendo, ao lado da deficiência de
eritopoetina (EPO), as duas principais causas de anemia nesta população. O
objetivo do presente estudo foi determinar a relação entre marcadores inflamatórios
e de estresse oxidativo, e a terapia com agentes estimuladores da eritropoiese
(ESA) nos pacientes com DRC submetidos ao tratamento hemodialítico. Todos os
pacientes que frequentavam uma clínica de diálise com DRC e que necessitavam de
terapia de substituição renal foram incluídos e divididos em dois grupos de acordo
com o regime de tratamento ESA: Grupo 1 – Pacientes em tratamento com EPO e
Grupo 2 – pacientes em tratamento com ferro intravenoso, sendo coletado sangue
para determinação de marcadores de estresse oxidativo e inflamatórios na inclusão
do estudo, após interrupção do tratamento com ESA e após reintrodução dos
tratamentos. Nos resultados não foi encontrada diferença nos marcadores de
estresse oxidativo e inflamatórios entre pacientes com DRC e anemia que utilizavam
ou não EPO. Em contrapartida, os níveis de interleucina-6 (IL-6) mas não de
marcadores de estresse oxidativo, eram maiores nos pacientes em uso de ferro
quando comparado aos pacientes que não utilizavam ferro, valores que reduziam
com a suspensão da terapia. Conclusão, nós demonstramos que os pacientes com
DRC que fazem uso da terapia com ferro apresentam elevação dos níveis de IL-6
que decaem após a retirada da terapia. Não foi encontrada diferença na avaliação
nos marcadores de estresse oxidativo entre grupos, mas durante o
acompanhamento do curso da doença, os pacientes sofreram um incremento destes
marcadores em ambos os grupos, demonstrando que estes pacientes apresentam
dano oxidativo, que também pode ser causado por terapias adjuvantes durante o
tratamento da DRC.
Palavras-chave: Doença renal crônica, estresse oxidativo, inflamação
8
ABSTRACT
Anemia and oxidative stress are typical features in chronic kidney disease (CKD) and
are both involved in increased morbidity and mortality. Iron deficiency is also very
common in CKD and including next to the relative deficiency of erythropoietin (EPO),
these are the two main causes of anemia in CKD. The objective of this study was to
determine the relationship between the inflammatory markers, oxidative stress and its
therapy with erythropoiesis-stimulating agents (ESA) in CKD patients undergoing
hemodialysis. All patients who attended a dialysis clinic with CKD requiring renal
replacement therapy were enrolled and divided into two groups according to their
ESA treatment regimen: Group 1 - Patients treated with EPO and Group 2 - patients
treated with intravenous iron, being collected blood to the determination of oxidative
damage and inflammatory markers at study inclusion, after ESA interruption and after
ESA reintroduction. With reference to the markers of oxidative stress and
inflammation, there was no difference between patients with CKD and anemia and
the use or not of EPO in all collected samples. In contrast, iron therapy increased
interleukin-6 levels and iron interruption induces a decrease of this inflammatory
marker, but did not alter oxidative damage parameters. Conclusion, we demonstrated
that patients with CKD iron therapy have elevated levels of IL-6 which decay after the
withdrawal of therapy. There was no difference in the evaluation of oxidative stress
markers between the groups, but during the time-course that pathology was
established a increase of oxidative stress markers in the patients, although this
increase can be explained for the use of adjuvants therapy in the CKD.
Keywords. chronic kidney disease; inflammation; oxidative stress
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figure 1. Thiobarbituric acid reactive species in serum of patients with chronic
kidney disease...........................................................................................................40
Figure 2. Levels of protein carbonyls in the serum of patients with chronic kidney
disease. .....................................................................................................................40
Figure 3. Levels of Interleukin-6 (IL-6). The patients were divided in two groups,
one receiving iron therapy and the other not receiving iron therapy. .........................41
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estágios da doença renal crônica prosposta pelo grupo de trabalho do
K/DOQI......................................................................................................................15
Table 2. Characteristics of patients and the use or non use of iron therapy .............39
Table 3. Pearson Correlation ....................................................................................39
11
LISTA DE ABREVIATURAS
CAT – Catalase
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
DRC – Doença Renal Crônica
EPO – Eritropoetina
ESA – Agentes Estimuladores da Eritropoiese
FFR – Falência Funcional Renal
FG – Filtração Glomerular
GPx – Glutationa Peroxidase
GSH – Glutationa Reduzida
Hb – Hemoglobina
HD – Hemodiálise
IL-1 – Interleucina 1
IL-6 – Interleucina 6
i.v – Intra-Venoso
LOOH – Catalisador da Decomposição de Peróxidos Lipídicos
LPS – Lipopolissacarídeo
MDA – Malondialdeído
MDRD – Modification of Diet in Renal Disease
NF-kB – Fator de Transição Nuclear kappa B
NHANES – National Health e Nutrition Examination Survey
OMS – Organização Mundial de Saúde
PCR – Proteína C Reativa
RNA – Ácido Ribonucléico
ROS – Espécies Reativas de Oxigênio
SBN – Sociedade Brasileira de Nefrologia
SOD – Superóxido Dismutase
TBARS – Espécies Reativas ao ácido tiobarbitúrico
12
TNF-α – Fator de Necrose Tumoral α
TSAT – Saturação de Transferrina
13
SUMÁRIO
PARTE I – INTRODUÇÃO ........................................................................................14
1. Doença renal crônica ............................................................................................14
1.1. Definição e diagnóstico ......................................................................................14
1.2. Mecanismos da anemia na DRC........................................................................17
1.2.1. Estresse oxidativo na DRC..............................................................................20
1.2.2. Estresse oxidativo e anemia...........................................................................22
1.3. Marcadores de inflamação na DRC ...................................................................23
2. Objetivos ...............................................................................................................29
2.1. Objetivo geral .....................................................................................................29
2.2. Objetivos Específicos .........................................................................................29
PARTE II – RESULTADOS.......................................................................................30
Artigo 1 ......................................................................................................................30
PARTE III - DISCUSSÃO..........................................................................................42
REFERÊNCIAS.........................................................................................................51
Anexo 1 – Tabela para Coleta de Dados Clínicos e Laboratoriais do Paciente
Renal Crônico ..........................................................................................................60
14
PARTE I – INTRODUÇÃO
1. Doença renal crônica
1.1. Definição e diagnóstico
A doença renal crônica (DRC) atualmente é um problema de saúde
pública mundial. A National Kidney Foundation - K/DOQI (2002) define doença renal
crônica (DRC) como a presença de lesão renal ou diminuição do nível da função
renal por três meses ou mais, definida por anormalidades estruturais ou funcionais
do rim, com ou sem diminuições da filtração glomerular (FG) (< 60mL/min/1,73m2),
evidenciada por anormalidades histopatológicas ou de marcadores de lesão renal,
incluindo alterações sanguíneas ou urinárias, ou ainda de exames de imagem. A
DRC afeta aproximadamente 26 milhões de adultos nos Estados Unidos sendo esta
patologia associada com uma significativa morbidade e mortalidade por parte destes
pacientes que enfrentam muitos outros problemas médicos relacionados à DRC. Um
dos principais problemas médicos que enfrentam é a anemia, que muitas vezes se
desenvolve no início do curso da DRC e contribui para uma piora na qualidade de
vida (Lankhorst et al., 2010). Crescentes evidências acumuladas nas últimas
décadas indicam que os resultados adversos da DRC, tais como insuficiência renal,
doenças cardiovasculares, e morte prematura, podem ser prevenidos nos estágios
iniciais da DRC detectados pelos exames laboratoriais (Murphree, et al., 2010).
Um dos principais fatores é a falta de acordo sobre a definição e
classificação dos estágios da progressão da DRC. A classificação clinicamente
aplicável seria com base na avaliação laboratorial e a associação do nível de função
15
renal com complicações e estratificação de risco para a perda da função renal
(National Kidney Foundation – K/DOQI 2002).
A função renal é avaliada pela FG e a sua diminuição é observada na
DRC, associada a perda das funções regulatórias, excretórias e endócrinas do rim.
Quando a FG atinge valores muito baixos, inferiores a 15 mL/min/1,73 2, estabelecese o que denominamos falência funcional renal (FFR), ou seja, o estágio mais
avançado do continuum de perda funcional progressiva observado na DRC (Bastos
et al., 2010).
Tabela 1 - Estágios da doença renal crônica prosposta pelo grupo de trabalho do
K/DOQI (Bastos et. al., 2010).
No Brasil, de acordo com o último Relatório do Censo Brasileiro de
Diálise, a incidência e prevalência da DRC continuam aumentando o prognóstico
continua ruim e os custos gerados para o tratamento ainda são muito elevados
(Sesso et al., 2008). A taxa de mortalidade bruta foi de 15,2% em relação aos
pacientes em risco durante o ano (Sesso et al., 2008). E finalmente, uma proporção
expressiva de pacientes (41,7%) apresentam concentrações de hemoglobina (Hb)
16
inferior ao recomendado, ou seja, 11 mg/dL (K/DOQI, 2007; Sesso et al., 2008).
Alguns pacientes apresentam suscetibilidade aumentada para a DRC e
desta maneira são considerados grupo de risco: hipertensos, diabéticos, idosos,
pacientes com doença cardiovascular, familiares de pacientes portadores de DRC e
pacientes em uso de medicações nefrotóxicas (Bastos et al., 2010).
Estudos apontam também outros fatores relativos a suscetibilidade para a
DRC como: indivíduos acima de 60 anos, origem racial, nível de escolaridade,
doenças auto-imunes, infecções sistêmicas, infecções do trato urinário, nefrolitíase,
neoplasia, história familiar de doença renal e baixo peso ao nascimento (Murphree,
et al., 2010).
Atualmente a FG é considerada medida da função renal variando
conforme a idade, sexo e massa muscular. As diretrizes preconizam que a FG pode
ser medida a partir da dosagem sérica da creatinina juntamente com algumas
variáveis demográficas: idade, sexo, raça e tamanho corporal (K/DOQI, 2006). As
duas equações mais utilizadas são as equações de Cockcroft-Gaut: depuração de
creatinina (mL/min)=140 – idade (em anos) x peso (quilogramas) / 72 x creatinina (x
0,85 se mulher) (Cockcroft DW, 1976) e a equação abreviada do estudo Modification
of diet in Renal Disease (MDRD): filtração glomerular(mL/min/1,73m2)=186 x
creatinina-1,154 x (idade)-0,203 x (0,742 se mulher) x (1,210 se indivíduo afroamericano) (Levey , 1999; Murphree, et al., 2010).
A National Kidney Foundation - K/DOQI (2002) informa que a DRC pode
ser
diagnosticada
sem
o
conhecimento
da
sua
causa,
sendo
que
o
comprometimento renal pode ser confirmado por marcadores de lesão antes mesmo
da biópsia renal.
17
Conforme as diretrizes do K/DOQI (2006), SBN - Sociedade Brasileira de
Nefrologia (2004) e de Levin e colaboradores (2008) a proteinúria, em especial a
albuminúria persistente, é o principal marcador de lesão renal. A albumina é a mais
abundante proteína plasmática, representando aproximadamente 50% das proteínas
totais do soro humano. Comparada às outras proteínas, ela é uma molécula
relativamente pequena, formada por uma cadeia de 584 aminoácidos, constituindose em um polipeptídeo simples com um peso molecular em torno de 69000 Daltons,
arranjada predominantemente em α-hélices sustentadas e unidas por 17 pontes
dissulfeto. Suas concentrações séricas normais encontram-se entre 3,5 g/dL e 5,0
g/dL (Santos et al, 2004). O tratamento dos pacientes com DRC requer o
reconhecimento de aspectos distintos, porém, relacionados, que englobam a doença
de base, o estágio da doença renal, a velocidade da diminuição da FG, identificação
de complicações e comorbidades (Bastos et al., 2010).
1.2. Mecanismos da anemia na DRC
A anemia se desenvolve como uma complicação freqüente da DRC com
incidência e severidade que são proporcionais ao estágio da DRC. A correção da
anemia e a manutenção dos níveis de hemoglobina (Hb) utilizando agentes
estimuladores da eritropoiese (ESA) é um importante aspecto no manejo da DRC.
Estudos apontam que a manutenção nos níveis de Hb está associada a uma
melhora da anemia assim como melhora na qualidade de vida e diminuição no
número de transfusões sanguíneas (Kamyar et al., 2009).
A anemia é definida pela Organização Mundial de Saúde como uma
concentração de Hb inferior a 13,0 g/dL em homens adultos e mulheres com
18
amenorréia e Hb menor que 12,0 g/dL em mulheres que menstruam regularmente,
sendo um problema comum em pacientes com DRC e sua incidência aumenta na
medida em que diminui a taxa de filtração glomerular. Estudos populacionais, como
o National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES) sugerem que a
incidência de anemia é inferior a 10% na DRC no estágio 1 e 2, 20 a 40% na DRC
no estágio 3, 50 a 60% na DRC no estágio 4 e mais de 70% na DRC no estágio 5
(Lankhorst et al., 2010; Teehan et al., 2011).
A anemia tem um impacto profundo em pacientes com DRC. Os sintomas
mais comuns são: fadiga, perda da libido, tonturas, falta de ar e diminuição da
sensação de bem-estar. Geralmente estes sintomas aparecem quando a Hb fica
abaixo de 10 g/dL. Outros resultados mais perigosos e adversos incluem a doença
cardiovascular com hipertrofia ventricular esquerda e insuficiência cardíaca
congestiva (Lankhorst et al., 2010).
Embora a deficiência de eritropoetina seja comum entre pacientes com
anemia e DRC, outras causas potenciais podem contribuir para este tipo de
patologia e devem ser identificadas ou excluídas. A avaliação laboratorial
recomendada fornece informações sobre o grau e a causa da anemia, sobre a
atividade da medula e a avaliação das reservas de ferro e disponibilidade de ferro
para a eritropoiese. Em especial, os clínicos devem avaliar que as causas da anemia
não são em conseqüência da deficiência de eritropoetina (EPO) quando: (1) a
gravidade da anemia é desproporcional ao déficit da função renal, (2) há evidência
de deficiência de ferro, ou (3) há evidência de leucopenia ou trombocitopenia. Uma
avaliação da causa da anemia deve preceder o início da terapêutica com ESA. No
momento, não existem evidências da associação entre normalização da Hb e melhor
prognóstico
nos
pacientes
com
DRC.
Conforme
as
últimas
diretrizes
a
19
recomendação é manter os níveis de Hb entre 11,0 -12,0 g/dL para pacientes com
DRC e anemia (K/DOQI, 2007).
A EPO é uma glicoproteína que estimula na medula óssea, a divisão e a
diferenciação dos progenitores das células vermelhas do sangue. A EPO alfa,
produzida por tecnologia de ácido desoxirribonucléico (DNA) recombinante, é
idêntica e tem os mesmos efeitos biológicos da EPO endógena. Sua reposição
sistemática e a consequente correção da anemia levam à redução da necessidade
de transfusão sanguínea, da morbidade, da mortalidade e à melhora da qualidade
de vida em pacientes portadores de DRC (SBN, 2007).
A disponibilidade de ESA revolucionou o tratamento da anemia na DRC.
No entanto, a manutenção dos níveis de Hb fornece o máximo de benefício e se
tornou um desafio permanente neste campo (Angel et al., 2009). Antes da
disponibilidade de EPO recombinante, os pacientes que recebiam tratamento de
diálise, com freqüência necessitavam de transfusão de sangue, expondo-os a
sobrecarga de ferro, hepatites virais e HIV, e consequentemente aumento na
produção de anticorpos para antígenos humanos (Lankhorst et al., 2010).
Desde a introdução da EPO recombinante em 1989, a concentração
média de Hb em pacientes em diálise tem aumentado significativamente, tendo,
desta maneira, uma associação direta com a redução da mortalidade e internações
hospitalares, bem como melhoria na qualidade de vida dos pacientes (George et al.,
2006). Pacientes com DRC e o nível de Hb tem aumentado em paralelo com o uso
de ESA (Sevag et al., 2008).
20
1.2.1. Estresse oxidativo na DRC
O estresse oxidativo é definido como dano no tecido resultante de um
desequilíbrio entre uma geração excessiva de compostos oxidantes frente a
produção insuficiente de mecanismos antioxidantes de defesa (Kao et al., 2010).
Os antioxidantes podem ser classificados em enzimáticos e nãoenzimáticos. Os principais componentes do sistema antioxidante enzimático são as
enzimas superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase
(GPx), que agem no inicio da cadeia de formação das espécies reativas, evitando o
acúmulo dos radicais O2- e H2O2. Os antioxidantes não-enzimáticos incluem
compostos produzidos in vivo, tais como a glutationa reduzida (GSH), a ubiquinona,
o ácido úrico e as proteínas de transporte de metais de transição (transferrina e
ceruloplasmina), e compostos obtidos diretamente da dieta, tais como o
betacaroteno e as vitaminas C e E (Cavalcante et al., 2009).
Alguns autores também classificam os antioxidantes em intracelular e
antioxidantes extracelular. Enzimas como a SOD e CAT são exemplos de agentes
enzimáticos intracelulares, que convertem substratos (radicais ânion superóxido e
peróxido de hidrogênio) para formas menos reativas. Como antioxidantes
extracelulares temos a albumina, bilirrubina e urato (Mekki at al., 2010).
A maioria das células podem tolerar um grau leve de estresse oxidativo,
porque possuem capacidade de defesa antioxidante suficiente e sistemas de reparo
que reconhecem e removem moléculas danificadas por oxidação. Porém, o
desequilíbrio pode resultar de uma falta de antioxidantes causado por distúrbios na
produção e distribuição ou por excesso de espécies reativas de oxigênio (ROS) e
21
por outros fatores. O excesso de ROS pode danificar lipídios, proteínas, ou o DNA,
alterando a função normal. Desta maneira ROS causam diferentes alteracões nas
vias de sinalização, podendo modular a expressão de genes, adesão celular,
metabolismo celular, ciclo celular e morte celular, induzindo ao estresse oxidativo
(Hye-Lin Há et al., 2010; Gosmanova et al., 2011).
A DRC é acompanhada por um complexo de comorbidades. Algumas
manifestações como envelhecimento acelerado, catarata, aterosclerose, diminuição
das células vermelhas do sangue, aumento da hemólise e disfunção plaquetária,
estão presentes nestes indivíduos, e tais patologias podem estar associadas a
hiperprodução de radicais livres (Bianchi et al., 2009).
Vários estudos demonstram aumento de estresse oxidativo em pacientes
com DRC, incluindo o acumulo de compostos reativos carbonílicos como
marcadores elevados de peroxidação proteíca e aumento das concentrações de
ácido tiobarbitúrico no plasma, como marcadores de peroxidação lipídica elevada.
Níveis plasmáticos aumentados de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS), um marcador de peroxidação lipídica, estão
presentes em pacientes
renais crônicos que realizam tratamento dialítico. Outras complicações como
hemorragia e hipotensão durante o curso da doença e do tratamento hemodialítico
estão possivelmente associadas a um radical livre em especial, o óxido nítrico
(Bianchi et al., 2009; Emokpae et al., 2010; Gosmanova et al., 2011; Shimosawa,
2011)
Uma das razões para o estresse oxidativo na DRC é a própria doença
subjacente. A toxidade renal e distúrbios imunológicos do rim levam a formação
elevada de ROS ativas na patogênese da DRC. Porém, os procedimentos de terapia
22
renal substitutiva também induzem ao estresse oxidativo (Mekki at al., 2010;
Malyszko , 2010)
1.2.2. Estresse oxidativo e anemia
Anemia e estresse oxidativo na DRC são características comuns e ambos
estão envolvidos no aumento da morbidade e mortalidade. Duas das principais
abordagens terapêuticas da anemia na DRC são a terapia com EPO e ferro
endovenoso, embora sejam as causas mais relevantes do aumento do estresse
oxidativo em fase final de pacientes com DRC (Capusa et al., 2010).
O estresse oxidativo também pode contribuir para a hipoproliferação
normocítica normocrômica da anemia na DRC encurtando o tempo de vida das
células vermelhas do sangue e prejudicando a ação da EPO. Logo, a gestão atual
da anemia inclui os seguintes fatores relevantes: avaliação da Hb em todos os
pacientes com DRC, exclusão de outras possíveis causas, tais como inflamação,
deficiências nutricionais, hiperparatiroidismo grave, diálise insuficiente, doenças
hereditárias ou toxidades de drogas, avaliação do metabolismo do ferro, terapia do
ferro de acordo com a ferritina sérica e saturação de transferrina e administração de
EPO (Pawlak et al., 2007; Capusa et al., 2010; Gosmanova et al., 2011).
A diálise também pode estar relacionada com o aumento do estresse
oxidativo devido a bioincompatibilidade e perda de agentes antioxidantes. Porém,
fatores relacionados com a uremia parecem ser os mais importantes, aumentando a
produção de espécies reativas através da inflamação crônica e toxinas urêmicas
(Bianchi et al., 2009; Kim et al., 2010; Malyszko, 2010)
23
Neste contexto, a anemia na DRC pode reforçar a geração de ROS,
favorecendo o metabolismo anaeróbico induzindo a deficiência de agentes
antioxidantes. Desta maneira a peroxidação lipídica pode estar relacionada com a
gravidade da anemia (Gosmanova et al., 2011). Estudos recentes colocam que a
anemia atua como um fator contribuinte associado a DRC e estresse oxidativo,
enquanto terapias adjuvantes, principalmente de ferro intra-venoso (i.v), parecem
aumentar ainda mais este processo (Capusa et al., 2010).
1.3. Marcadores de inflamação na DRC
O ferro é um mineral vital para o a homeostase celular. É essencial para o
transporte de oxigênio, para a síntese de DNA e metabolismo energético. É um cofator importante para enzimas da cadeia respiratória mitocondrial e na fixação do
nitrogênio. Um indivíduo adulto tem no seu organismo de 4 a 5 g de ferro sendo que
sua deficiência acarretará conseqüências para todo o organismo, sendo a anemia a
manifestação mais relevante. Porém, o seu acúmulo também tem suas
consequências para os tecidos, uma vez que o ferro livre promove a síntese de ROS
que são tóxicas e lesam proteínas, lipídeos e DNA. O ferro utilizado pelo organismo
é obtido de duas fontes principais: da dieta e da reciclagem de hemácias
senescentes (Grotto, 2008). É necessário, portanto, que ocorra no organismo um
equilíbrio nos níveis de ferro.
A prevalência de deficiência de ferro é muito comum na DRC e é em torno
de 50%, portanto, ao lado da deficiência relativa de EPO, as duas principais causas
de anemia na DRC sendo esta um estado inflamatório onde os níveis de PCR
aumentam à medida que a função renal é perdida. Citocinas pró-inflamatórias, como
24
a IL-6 e o TNF- α, atuam nas células progenitoras eritropoéticas, de maneira oposta
à EPO, estimulando o apoptose. O estado inflamatório da DRC provoca uma
situação de resistência à ação medular da eritropoetina, tendo como as principais
conseqüências: anemia, desnutrição, agravamento da aterosclerose e aumento da
mortalidade. Existem diversos marcadores de inflamação, porém, a proteína C
reativa (PCR) é o marcador mais utilizado pelos nefrologistas. Ela é produzida no
fígado por estímulos de várias citocinas pró-inflamatórias, IL-6 e o TNF-α (Bruchfeld
et al., 2009; Abensur, 2010)
O processo inflamatório na insuficiência renal crônica parece também
estar associado à falência renal, bem como ao procedimento dialítico e às
intervenções médicas e complicações. Nestas situações as citocinas próinflamatórias são liberadas, e há evidências de que as membranas biocompatíveis
possam ser uma das causas da ativação dessas citocinas, sendo que as principais
envolvidas no processo de resposta inflamatória são a IL-1, TNF-α e a IL-6
(Adamson, 2008; Santos et al., 2004).
Tais citocinas podem causar quatro anormalidades hematológicas:
diminuição na produção de EPO pelo rim levando a níveis inapropriadamente baixos
no sangue e conseqüentemente piora da anemia, redução da resposta eritropoética
da medula óssea a ESA, falta de hepcidina induzida pela absorção de ferro a nível
de intestino e armadilhas de hepcidina induzidas pelos níveis de ferro em
macrófagos e hepatócitos (Silverberg et al., 2011).
A hepcidina é um peptídeo de fase aguda sintetizada pelo fígado com 25
aminoácidos, sendo considerada um regulador negativo do metabolismo do ferro.
Suas principais formas são: hepcidina-20, hepcidina-22 e hepcidina-25, sendo estas
25
moléculas clivadas do precursor (pró-hepcidina) que consiste de 84 aminoácidos
(Tsuchihashi et al., 2008).
A hepcidina quando liberada pelo fígado, inibe a proteína ferroportina que
é encontrada no trato gastrointestinal e também nos macrófagos e hepatócitos,
sendo responsável desta maneira pela liberação de ferro a partir destes três tipos de
células no sangue. Ocorrendo a inibição da ferroportina, a absorção de ferro em
nível gastrointestinal também é diminuída e sendo assim o ferro é liberado de seus
principais armazenadores, os macrófagos e hepatócitos. Isso gera como resultado,
um nível baixo de ferro sérico levando a diminuição da liberação de ferro para a
medula óssea e consequentemente favorecendo a anemia ferropriva, mesmo na
presença de reservas totais de ferro, ou seja, a chamada deficiência de ferro
funcional. É importante salientar que a ferroportina é o receptor da hepcidina e a
interação hepcidina-ferroportina controla os níveis de ferro nos enterócitos,
hepatócitos e macrófagos (Grotto, 2008; Jairam et al., 2010; Silverberg et al., 2011).
Se constatado a deficiência de ferro, a reposição deve ser feita
prontamente por via endovenosa nos pacientes em programa de hemodiálise, pois,
estes têm uma perda crônica de sangue e dificuldade de absorver ferro devido aos
níveis aumentados de hepcidina (Abensur, 2010), um regulador chave da
homeostase de ferro sendo que seus níveis são elevados em pacientes com DRC, o
que pode explicar o frequente desequilíbrio no metabolismo do ferro nestes
pacientes (Peters et al., 2010).
Os níveis de ferro e o estado inflamatório, onde a IL-6 tem um papel
fundamental, regulam a expressão da hepcidina sendo que a sobrecarga de ferro
aumenta seus níveis, enquanto a anemia reduz sua expressão, sendo que a IL-6
26
age diretamente nos hepatócitos estimulando sua expressão (Grotto, 2008; Wess et
al., 2009). A hepcidina reduz a transferência do ferro dos enterócitos para o plasma
através da inibição da absorção do ferro na dieta do intestino e inibe a mobilização
do ferro estocado nos macrófagos, sendo considerado um reagente de fase aguda
de proteínas produzidas no fígado e um regulador chave na homeostase do ferro
(Grotto, 2008; Zaritsky et al., 2009; Peters et al., 2010). Portanto, a hepcidina está
associada à fisiopatogenia da anemia na DRC, definida como uma anemia
hipoproliferativa, associada a condições infecciosas, inflamatórias ou neoplásicas
caracterizada laboratorialmente, por hipoferremia na presença de estoques
adequados de ferro (Grotto, 2008; Tsuchihashi et al., 2008). Sendo assim, a anemia
na DRC resulta da ativação dos sistemas imune e inflamatório, o que leva a uma
excessiva liberação de citocinas e proteínas de fase-aguda (Grotto, 2008; Santos et
al., 2004; Zaritsky et al., 2009).
A deficiência funcional de ferro é uma situação associada à inflamação
(aumento de hepcidina), em que o paciente apresenta estoque adequado de ferro no
organismo, caracterizado por níveis elevados de ferritina sérica, porém, não
consegue mobilizar o ferro dos estoques, e a saturação de transferrina fica abaixo
de 25%, sendo que o emprego do ferro endovenoso poderá contribuir para melhora
do quadro (Abensur, 2010). Assim, os objetivos da terapia com ferro são para evitar
o esgotamento do armazenamento de ferro, prevenir a eritropoiese deficiente e
alcançar e manter níveis alvo de Hb (K/DOQI, 2006).
De acordo com as últimas diretrizes que norteiam o tratamento da anemia
na DRC a dosagem dos níveis de ferro deve ser realizada mensalmente no início da
utilização de ESA e pelo menos a cada três meses durante o tratamento com ESA,
sendo que deverá ser mantida uma ferritina sérica > 200 ng / mL, saturação de
27
transferrina (TSAT) > 20%. A via de administração do ferro deve ser
preferencialmente a i.v sendo que quando o nível de ferritina for superior a 500 ng /
mL, as decisões relativas a administração de ferro i.v devem ser analisadas levandose em consideração a resposta aos ESA, bem como os níveis de Hb e TSAT e o
estado clínico do paciente (K/DOQI, 2006).
Estudos apontam que nenhum teste de parâmetros de ferro indica
fortemente a deficiência de ferro funcional em pacientes com DRC, pois, na maior
parte das vezes a coexistência de anemia crônica e inflamação acabam por
mascarar tais resultados, pois, os níveis de ferritina podem estar afetados devido ao
processo inflamatório. Logo, os pacientes com DRC em hemodiálise apresentam
níveis séricos de ferritina aumentados e estão mais propensos a apresentar anemia
grave (Cheng et al., 2006). Um estudo coloca que ferro e estado inflamatório devem
ser tomados em consideração para melhorar a eficácia do tratamento da anemia
com ESA (Kessler et al., 2009).
É importante ressaltar que se a dosagem do ferro e a administração de
ESA não estiverem devidamente equilibradas, o ferro pode não estar disponível em
quantidades suficientes para o efetivo processo da eritropoiese. Desta maneira nem
sempre é o caso de diminuir o teor de ferro total do corpo, em um paciente que a
perda de ferro seria por causa da perda de sangue, mas pode ser um problema de
fornecimento de ferro resultante da inflamação ou altas doses de ESA. Neste tipo de
situação a terapia com ferro deve ser cuidadosamente aplicada para a resolução do
déficit de ferro minimizando as doses de ESA e manter os níveis alvo de Hb
(Kapoian, 2008). Logo, os desafios da gestão da anemia em pacientes com DRC
dentro e fora da terapia de diálise são multifatoriais: manter níveis estáveis de Hb,
equilíbrio na terapia i.v de ferro e terapia de ESA, e melhorando a resposta enquanto
28
estiver usando doses menores e efetivas degentes (Kapoian, 2008; Weiss et al.,
2009).
Assim, a monitorização de rotina dos estoques de ferro é crucial para uma
gestão adequada da anemia nessa população, sendo a ferritina e a saturação de
transferrina atualmente os principais marcadores substitutos usados na prática
clínica diária para a avaliação do status do ferro (Rocha et al., 2009).
Estudos recentes apontam que existem outras causas da deficiência de
ferro que devem ser investigadas como: redução da ingestão de ferro devido a
dietas de baixa proteína e anorexia, perda de sangue a nível gastrointestinal devido
a uremia causando disfunção plaquetária bem como esofagite, gastrite, tumores,
antiagregantes plaquetários e anticoagulantes e aglutinantes de fosfato (Silverberg
et al., 2011). Torna-se necessária a realização de estudos que visem a conhecer de
forma mais efetiva a deficiência de ferro e sua reposição na DRC (Abensur, 2010),
pois o manejo isolado de eritropoetina não consegue funcionar de forma otimizada
na situação de deficiência de ferro.
29
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Determinar a relação entre marcadores inflamatórios e de estresse
oxidativo e a terapia com ESA nos pacientes com DRC submetidos ao tratamento
hemodialítico.
2.2. Objetivos Específicos
• Avaliar as características demográficas dos pacientes incluídos no
estudo.
• Determinar a relação entre tratamento com ESA e parâmetros
inflamatórios (IL-6), a cada coleta e durante o curso de tempo de
realização do estudo, a fim de avaliar se a implementação ou retirada
da terapia com ESA têm efeito nesses marcadores e se a mesma se
agrava durante o curso do tratamento hemodialítico.
• Determinar a relação entre tratamento com ESA e níveis plasmáticos
de marcadores de estresse oxidativo (TBARS e Carbonil), a cada
coleta e durante o curso de tempo de realização do estudo, a fim de
avaliar se a implementação ou retirada da terapia com ESA têm efeito
nesses marcadores e se a mesma se agrava durante o curso do
tratamento hemodialítico.
• Correlacionar parâmetros de estresse oxidativo e inflamatórios com
variáveis clínicas e demográficas.
30
PARTE II – RESULTADOS
Artigo 1
INFLAMMATORY MARKERS AND OXIDATIVE STRESS IN PATIENTS WITH
CHRONIC KIDNEY DISEASE AND ANEMIA.
Luciana Rosa1, Larissa de Souza Constantino1, Cristiane Damiani Tomasi1, Vinícius
René Giombelli1, Franciele Vuolo1, Andréia Batista Bialeski1, Karina Cardoso Gulbis
Zimmermann1, Celso Lufchitz1, Felipe Dal Pizzol1, Cristiane Ritter1
1
Laboratório de Fisiopatologia Experimental and Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia
Translacional em Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Unidade
Acadêmica de Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma,
SC, Brazil;
Correspondence and offprint requests to: Prof. Felipe Dal Pizzol, MD, PhD - Laboratório de
Fisiopatologia Experimental, PPGCS, UNASAU, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806000 Criciúma, SC, Brazil. Phone: #55 48 3431 2539. E-mail: [email protected]
Artigo submetido ao periódico: Nephrology Dialysis Transplantation
ABSTRACT
Background. Anemia and oxidative stress are typical features in chronic kidney disease and
both are involved in increased morbidity and mortality. The prevalence of iron deficiency is
also very common in CKD and next to the relative deficiency of erythropoietin, these are the
two main causes of anemia in CKD, which is an inflammatory state. The main objective of
this study was to determine the relationship between the inflammatory markers, oxidative
stress and its therapy with erythropoiesis-stimulating agents (ESA) in CKD patients
undergoing hemodialysis.
Methods. All patients who attended a dialysis clinic with chronic kidney disease requiring
renal replacement therapy were enrolled and divided into two groups according to their ESA
treatment regimen: Group 1 - Patients treated with EPO and Group 2 - patients treated with
intravenous iron, being collected blood to the determination of oxidative damage and
inflammatory markers at study includion, after ESA interruption and after ESA reintroduction.
Results. With reference to the markers of oxidative stress and inflammation, there was no
difference between patients with CKD and anemia and the use or not of EPO in all collected
samples. In contrast, iron therapy increased interleukin-6 levels and iron interruption induces
31
a decrease of this inflammatory marker, but did not alters oxidative damage parameters.
Conclusion. In conclusion, we demonstrated that patients with CKD who use iron therapy
have elevated levels of IL-6 which decay after the withdrawal of therapy. There was no
difference in the evaluation of oxidative stress markers between the groups, but during the
time-course that pathology was established a increase of oxidative stress markers in the
patients, although this increase can be explained for the use of adjuvants therapy in the
chronic kidney disease treatment.
Keywords. chronic kidney disease; inflammation; oxidative stress
32
INTRODUCTION
Chronic kidney disease is currently a public health problem worldwide. The National Kidney
Foundation [1] defines chronic kidney disease (CKD) as the presence of kidney damage or
decreased kidney function for three months or more, defined by structural or functional
abnormalities of the kidney, with or without decreases in glomerular filtration rate (FG)
(<60mL/min/1,73m2), evidenced by histopathological abnormalities or markers of kidney
damage, including changes in blood or urine or from imaging studies. CKD affects
approximately 26 million adults in the United States and millions more are at risk from a
condition associated with significant morbidity and mortality, with many of these patients
suffering with other medical problems and complications related to CKD. A major problem
facing doctors is anemia, which often develops early in the course of CKD and contributes to
a poorer quality of life [2].
Although erythropoietin deficiency is common among patients with anemia and CKD,
other potential causes can contribute to this type of pathology and should be identified or
excluded. Iron deficiencies are common in CKD, therefore, together with the relative
deficiency of erythropoietin they are the two main causes of anemia in CKD. At present,
there is no evidence of association between normalization of hemoglobin and a better
prognosis in patients with CKD [3]. According to the latest guidelines, the recommendation is
to maintain hemoglobin levels between 11.0 -12.0 g / dL for patients with CKD and anemia
[3].
Several studies have shown increased oxidative stress in patients with CKD,
including the accumulation of reactive carbonyl compounds as markers of protein
peroxidation and increased thiobarbituric acid concentrations in plasma as markers of lipid
peroxidation [4,5]. Increased plasma levels of thiobarbituric acid reactive substances
(TBARS), a marker of lipid peroxidation, has been reported in chronic renal patients who
perform dialysis [6]. One reason for oxidative stress in CKD is the underlying disease itself.
Renal toxicity and immune disorders of the kidney lead to the formation of highly active ROS
in the pathogenesis of CKD [7]. However, the procedures for renal replacement therapy also
induce oxidative stress [8]. Recent studies have placed the anemia itself acting as a
contributing factor associated with CKD and oxidative stress; while adjuvant therapies
especially iron IV, seem to make the situation worse [9].
In addition to this, CKD seems to be an inflammatory condition where levels of C
reactive protein increase as kidney function is lost. Pro-inflammatory cytokines such as IL-6
and tumor necrosis factor act on erythropoietic progenitor cells in a manner opposite to
erythropoietin, stimulating apoptosis. The inflammatory state of the DRC situation causes a
resistance to the action of erythropoietin, the main consequences of which are anemia,
malnutrition, worsening of atherosclerosis and increased mortality [10,11].
Inflammation regulates the expression of hepcidin since IL-6 acts directly by
stimulating its expression on hepatocytes[12,13]. The hepcidin reduces the transfer of iron
from enterocytes into the plasma by inhibiting the absorption of dietary iron in the intestine. It
also inhibits the mobilization of iron stored in macrophages, it is considered an acute phase
reactant protein produced in the liver and a key regulator in iron homeostasis [14,15,12]), this
being an important step in the pathophysiology of anemia in CKD [12,16].
Thus it is important to note that ROS and inflammation can lead to the progression of
chronic kidney disease, justifying the development of this work to determine whether a
relationship exists between the treatment of anemia in CKD and markers of oxidative stress
and inflammation.
33
MATERIALS AND METHODS
Study Design Setting and Patient Selection
This was a prospective cohort study performed between September 2010 and March of
2011. During the study all the 65 patients that were attended a dialysis clinic with chronic
kidney disease requiring renal replacement therapy were enrolled and divided into two
groups according to the ESA treatment regimen: Group 1 – Erythropoietin (EPO) treatment,
Group 2 - treatment with intravenous iron. Informed consent was obtained from all patients or
their legal representatives. The local institutional review board approved the present study.
Procedures used for data collection
Through the use of a standardized questionnaire, demographic information, clinical notes
and laboratory data of relevance were collected at the time of enrollment and after a
subsequent period of 6 months. After inclusion in the study, blood was collected during the
patient’s scheduled treatment for anemia which was used to obtain the individual's baseline.
As part of the routine care of these patients, ESA was stopped for at least 15 days prior to
the necessity for further medical treatment, then immediately before the start of a new cycle
of treatment, blood was collected to determine oxidative and inflammatory parameters
without ESA treatment. Patients returned to ESA treatment and blood was again collected
after 6 months to determin the oxidative and inflammatory parameters with the influence of
ESA. On all three occasions the blood was collected in the routine biochemistry laboratory
then placed immediately on ice and centrifuged to obtain serum that was stored at -80°C for
later analysis of inflammatory parameters and oxidative stress.
Inflammatory and oxidative stress markers
Thiobarbituric Acid Reactive Species. As an index of oxidative stress we used the formation
of TBARS during an acid-heating reaction as previously described by Draper HH et al. [17].
Briefly, the samples were mixed with 1 mL of trichloroacetic acid 10% and 1 mL of
thiobarbituric acid 0.67%, and then heated in a bath of boiling water for 15 min with the
addition of butylated hydroxytoluene. TBARS was determined by the absorbance at 535 nm
using 1,1,3,3-tetramethoxypropane as an external standard. Results are expressed as
malondialdehyde equivalents per milligram of protein.
Measurement of Protein Carbonyls
The oxidative damage to proteins was assessed by the determination of carbonyl groups
based on the reaction with dinitrophenylhidrazine as previously described by Levine RL et al.
[18]. Briefly, proteins were precipitated by the addition of 20% trichloroacetic acid and
redissolved in dinitrophenylhidrazine, and the absorbance was read at 370 nm.
Interleukin-6 measurements
The Interleukin-6 (IL-6) content, as a general marker of pro-inflammatory response, was
determined by capture enzyme-linked immunosorbent assay using ELISA kits (R&D
systems, Minneapolis, MN, USA) as indicated by the manufacturer. This assay yields an intra
assay reproducibility of 4.2%, an inter assay reproducibility of 6.4% and a minimum
detectable dose of less than 0.70 pg/mL.
34
Statistical analyses
The normal distribuition of data were tested using Student-t test have been used as
appropriate to compare groups at the same sample time. Paired-samples Student-t test was
used to compare patients at the same group on different sample times. Associations
between groups of categorical variables were assessed by chi-square analyses. Correlations
between continuous variables were performed using Pearson tests as appropriate.
Continuous variables with normal distribution were presented as mean ± standard deviation.
A two-tailed p-value < 0.05 was considered statistically significant. All the analyses were
performed with SPSS for Windows, version 17.0.
RESULTS
The study population has an average age of 56 years and is comprised mostly of
males (62%). At the end of the study, samples were collected from 65 patients in total. Based
on the records obtained, the common basic diseases included; hypertension (48%), diabetes
mellitus (40%) and glomerulonephritis (17%). Since EPO status did not interfere in the
measured parameters (see above) the demographic characteristics of the patients were
dichotomized by intravenous iron and presented in Table 1.
With regard to the markers of oxidative stress and in the levels of IL-6, there was no
difference between patients with CKD and anemia and the use of EPO, as the parameters of
lipid peroxidation in the three samples collected in this study compared to the group that
does not make use of EPO, respectively (data not show).
No significant difference was observed within the parameters of oxidative damage in
either markers of lipid peroxidation (Figure 1), or markers of protein damage (Figure 2) in
patients with chronic kidney disease with or without intravenous iron therapy. In contrast, the
inflammatory marker (IL-6) showed that therapy with intravenous iron increases levels of this
marker, indicating that the replacement of iron contributes to the exacerbation of the
inflammatory process in patients with CKD and anemia (Figure 3).
Following the patients for the duration of the research period (those receiving or not
receiving intravenous iron therapy), we observed a decrease in the levels of lipid
peroxidation in sample 2 compared to the baseline, indicating that the suspension of iron
minimizes damage to lipids (Figure 1). On the other hand, an increase of this marker in
sample 3 after the resumption of therapy with iron indicates oxidative damage (Figure 1).
Likewise, there is an increase of protein carbonylation in sample 3 compared to the baseline,
indicating that the resumption of treatment with iron in patients with CKD and anemia
contributes to the development of oxidative damage in these patients (Figure 2). Over the
course of this study, we did not observe any difference in the levels of IL-6 in any of the
interventions undertaken (Figure 3).
When was assessed the Pearson correlation, we analysed all possible correlation
between the variables collected. We just observed a significative correlation between
haemoglobin and the protein carbonyl levels in sample 3. Similarly, we found a strong
correlation between the levels of IL-6 sample 1 and the levels of IL-6 in samples 2 and 3,
these data was demonstred in the Table 2.
35
DISCUSSION
Iron deficiency is the most common cause of hyporesponsiveness to erythropoiesisstimulating agents in patients with CKD. The reasons for which this condition contributes to
functional iron deficiency include a low level of dietary iron, blood loss during extracorporeal
hemodialysis, gastrointestinal bleeding, diagnostic blood tests being undertaken too often,
poor intestinal absorption of iron and the inhibition of the macrophages to release iron, an
increased need for iron during the use of ESAs, low inventories and a decrease in body
levels of hemoglobin, the presence of pyrogen content in dialysis and the pro-oxidant effect
of metabolites such as uric acid [19].
Parenteral iron has emerged as an important tool in the management of anemia in
CKD, when used alone or combined with EPO. However, some findings suggest a
disadvantage for the indiscriminate administration of iron that can contribute to the
inflammatory state [20]. In patients with CKD on hemodialysis, the formation of reactive
oxygen species (ROS) is amplified, leading to oxidative stress by its participation as one of
the most important complications. This problem may not have immediate clinical effects,
although it may represent a secondary complication of the long-term interaction between
blood and dialysis membrane [21, 22,23].
Oxidative stress and inflammation are characteristic constants of advanced kidney
disease and play an important role in the progressive deterioration of kidney function and
structure. They are associated with some cardiovascular risk factors and numerous other
complications of CKD [24]. Our results showed no significant difference in the parameters of
lipid peroxidation and protein carbonylation when evaluating the patients that use or not
intravenous iron therapy. When we evaluated the time course of these oxidative stress
markers, we observed a decrease of lipid peroxidation within both groups with the
suspension of IV iron, but found that the resumption of therapy led to an increase of this
marker. As for protein carbonylation, we found increased levels of this marker in the sample
relative to the baseline in these patients. This suggests that iron may play an important role
in the pathophysiology of oxidative stress; however, its use is not the only factor triggering
this damage, as it also occurs in the group that does not make use of this therapy. Other
studies have shown that plasma levels of MDA (malondialdehyde) were significantly
increased in patients with CKD on hemodialysis compared with healthy subjects. MDA levels
are positively correlated with the activities of superoxide desmutase (SOD) and catalase
(CAT) [23,25]. With a decrease in antioxidant defenses, there is an accumulation of the
superoxide anion radical’s hydrogen peroxide and hydroxyl radical that may be responsible
for increased lipid peroxidation. Iron also plays an important role as a catalyst for the
decomposition of lipid peroxides (ROOH), turning them into alkoxyl and peroxyl radicals that
amplify the process of lipid peroxidation [7]. However, there is still no consensus regarding
the activity of enzymes belonging to radical scavengers such as SOD and CAT. There are
some studies that show a significant increase in enzyme activity in the blood. On the other
hand, other studies have shown a reduction of these enzymes in patients with CKD [23, 26,
27].
In some studies a single session of hemodialysis (HD) showed a potential deleterious
effect [28]. However, other studies denote that the acute administration of iron is not able to
modify the levels of systemic oxidative stress [29]. Nonetheless, several other factors can
alter this state in patients with CKD. Hemodialysis itself may also be a contributing factor to
the increase in the parameters of oxidative stress by increasing the levels of hydrogen
peroxide. There are data that confirms the role of hemodialysis being associated with
increased oxidative stress [30]. It is not yet possible to say with any clarity if therapy with
intravenous iron results in the increase of oxidative stress [19].
The imbalance between free radical formation and neutralization in dialysis patients
may be caused by activation of the inflammatory cascade by a variety of stimulators. The
common signaling occurs through the generation of reactive species oxygen, the activation
of the transcription factor nuclear factor kappa B (NF-kB) and the induction of adhesion
36
molecules, cytokines and chemokines [7]. When evaluating inflammatory parameters such
as IL-6, we found an elevation of their levels in patients receiving therapy with iron, both in
the sample 01, and sample 03, but found this did not occur in sample 02 when we conducted
the suspension of IV iron, demonstrating that iron plays a key role in the etiology of the
inflammatory process. Some studies show evidence of the activation of inflammatory factors
in patients with end-stage chronic renal failure, with a significant increase in the levels of creactive protein (CRP), IL-6 and TNF-α. It was also shown that there is a moderate
correlation between the levels of IL-6 and TNF-α. The proposed cause for this increase
includes the activation of inflammatory cells, a reduction of antioxidant activity, reduced
clearance and pre-existing subclinical infections by exposure to capillary unit or autoimmune
diseases [20]. By contrast, other studies show a decrease of inflammatory parameters such
as TNF-α [19, 31].
Other studies show that the increase in markers of inflammation is significantly
correlated with the severity of kidney disease and may increase mortality and morbidity
associated with sickle cell anemia [6]. This research is composed of a homogeneous
population with regard to hemodialysis. However our study has several limitations: the
sample size, the small number of patients without EPO, no standardization of diet that may
influence oxidative stress, little follow-up of patients and no association with clinically relevant
outcome markers of oxidative stress. Finally our study only showed an association of factors
involved in worsening the clinical picture in patients with CKD, but was unable to prove
causality.
In conclusion, we demonstrated that patients with CKD who use iron therapy have
elevated levels of IL-6 which decay after the withdrawal of therapy. There was no difference
in the evaluation of oxidative stress markers between the groups, but during the course of
monitoring the disease, patients suffered an increase of these markers in both groups,
demonstrating that these patients have oxidative damage, which can also be caused by
adjuvant therapies for the treatment of chronic kidney disease. However, during the timecourse that pathology was established a increase of oxidative stress markers in the patients,
although this increase can be explained for the use of adjuvants therapy in the chronic
kidney disease treatment.
Conflict of interest statement. None declared.
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39
Table 2. Characteristics of patients and the use or non use of iron therapy
Characteristics
With Iron
Without Iron
P value
Age, mean, SD
62.75 (12.35)
49.58 (15.66)
0.026*
Woman
46.2
43.7
0.883
Men
53.8
56.3
21.08 (19.83)
42.81 (23.53)
0.005*
70.26 (12.52)
62.75 (13.03)
0.077
Gender %
Time
of
treatment
in
months,
mean,
SD
Dry Body Mass
The values are expressed as mean ± Standard Deviation (SD).
*Significantly different from controls (P < 0.05).
Table 3. Pearson Correlation
Variables
Pearson Coeficients
P Value
0.765
<0.001
IL-6 Sample 1 X IL-6 Sample 2
0.887
<0.001
IL-6 Sample 1 X IL-6 Sample 3
0.848
<0.001
Hemoglobin
X
Carbonyl
Sample 3
#/##
40
#/##
#
#
Figure 1. Thiobarbituric acid reactive species in serum of patients with chronic kidney disease. The
patients were divided in two groups, one receiving iron therapy and the other not receiving iron
therapy. Three test samples were then taken over the duration of the research period. In the first test,
blood was collected to determine the values of MDA equivalents in the basal state. The second
sample was used to determine the same values after the administration of iron suspension, and the
third sample was used to determine the values after the return of iron therapy. Values are expressed
as mean ± S.D. *P < 0.05 compared to the without iron group (T-test independent). #p<0.05 compared
with the same group of sample 1; ##p<0.05 compared with the same group of sample 2 (paired-T
test);
Figure 2. Levels of protein carbonyls in the serum of patients with chronic kidney disease. The
patients were divided in two groups, one receiving iron therapy and the other not receiving iron
therapy. Three test samples were then taken over the duration of the research period. In the first test,
blood was collected to determine the values of MDA equivalents in the basal state. The second
sample was used to determine the same values after the administration of iron suspension, and the
third sample was used to determine the values after the return of iron therapy. Values are expressed
41
as mean ± S.D. *P < 0.05 compared to the without iron group (T-test independent). #p<0.05 compared
with the same group iof sample 1 (paired-T test);
Figure 3. Levels of Interleukin-6 (IL-6). The patients were divided in two groups, one receiving iron
therapy and the other not receiving iron therapy. Three test samples were then taken over the duration
of the research period. In the first test, blood was collected to determine the values of MDA
equivalents in the basal state. The second sample was used to determine the same values after the
administration of iron suspension, and the third sample was used to determine the values after the
return of iron therapy. Values are expressed as mean ± S.D. *P < 0.05 compared to the without iron
group (T-test independent).
42
PARTE III - DISCUSSÃO
Estudos prévios demonstram que os pacientes que correm maior risco de
desenvolver DRC são diabéticos de longa duração e/ou hipertensos. Segundo a
Fundação Nacional do Rim (K/DOQI, 2002) além da doença de base outros fatores
risco são contribuintes para desenvolvimento de DRC, entre estes destacam-se
idade superior a 60 anos, origem racial, exposição a nefrotoxinas conhecidas, baixa
renda e nível de escolaridade (Murphree et al., 2010).
Diabetes mellitus e hipertensão, que são comumente abordadas em
consultório, são os maiores contribuintes para a DRC e, portanto, esses fatores de
risco devem ser rigidamente controlados e estes doentes devem ser avaliados de
perto para sinais de dano renal (Murphree et al., 2010).
Define-se DRC como taxa de filtração glomerular <90mL/min_1/1,72m_2.
(Nakanisui et al., 2010). Segundo Organização Mundial da Saúde (OMS) a anemia é
definida como concentração de Hb < 12 g/ dL em mulheres e <13 g/dL em homens
(Izaks et. al., 1999; Jemtel e Arain, 2010). As características clínicas da anemia
incluem o aumento da idade, sexo feminino, DRC, o baixo índice de massa corporal,
acúmulo de líquido e hospitalização clínica (Jentel e Araim, 2010).
O valor ideal de Hb ainda é alvo de estudos controversos e ainda não há
definição dessas metas. Com a progressão da DRC há uma diminuição dos
estoques de Hb, provavelmente por diminuição nos níveis de EPO a ponto de
comprometer a produção das hemácias. Na prática clínica tem-se feito uso de EPO
exógena, no entanto, apesar do seu uso generalizado, em mais de 50% dos
pacientes com DRC, o quadro de anemia ainda é extremamente prevalente
43
(Lankhorst et al 2010).
A razão mais comum para a má resposta à EPO é a deficiência de ferro.
No entanto, estudos têm sugerido que a terapia parenteral de ferro pode contribuir
para a morbidade e mortalidade por induzir um estado pró-inflamatório, devido ao
aumento do estresse oxidativo (Jairam et al., 2010). Além disso, a avaliação do
status de ferro em si pode ser dificultada por conta da ativação inflamatória (Jairam
et al., 2010).
O ferro desempenha um papel crucial no transporte de oxigênio como
componente da Hb, no metabolismo como componente da mioglobina e de enzimas
oxidativas da cadeia respiratória. Também está envolvido na síntese e degradação
de lipídios, carboidratos, DNA, ácido ribonucléico (RNA) e no metabolismo de
colágeno, tirosina e catecolaminas (Silverberg et al., 2011)
Deficiência de ferro é a causa mais comum de hiporresponsividade de em
ESA pacientes com DRC.
As causas pelas quais essa patologia contribui para
deficiência de ferro funcional ou absoluta incluem: dieta pobre em ferro, perda
sanguínea durante o procedimento extracorpóreo na hemodiálise, sangramento do
trato gastrointestinal, testes sanguíneos diagnósticos realizados com muita
freqüência, baixa absorção de ferro intestinal e Inibição da liberação de ferro por
macrófagos,aumento da necessidade de ferro durante o uso de agentes
estimuladores da eritropoiese, baixa nos estoques corporais e diminuição nos níveis
de Hb, presença de conteúdo pirogênio no dialisador e o efeito pró-oxidante de
metabólitos, como o ácido úrico (Hörl et al., 2007).
Essa deficiência pode ser revertida pela suplementação de ferro
endovenoso que é mais efetiva que a administração oral até o momento. No entanto,
44
o uso dessa terapia não ocorre sem efeitos adversos agudos ou crônicos (Hörl et al.,
2007).
A terapia farmacológica de ferro oral não causa toxicidade, como
resultado da transferência de ferro a transferrina, o que permite uma distribuição
sistêmica segura, e podem ainda ser armazenadas nos tecidos sob forma de
apoferritina. Por causa da má absorção de ferro oral, atualmente a suplementação é
realizada na maioria das vezes por via endovenosa, sob a forma de carboidratos
(CHO) que devem funcionar como moléculas "escudos", permitindo a distribuição de
ferro de forma segura, impedindo reações com radicais livres (Zager, 2006).
O ferro parenteral tem emergido como uma importante ferramenta na
gestão de anemia na DRC, por si só ou quando combinado com EPO. No entanto,
algumas descobertas sugerem uma desvantagem para uma administração
indiscriminada de ferro que pode contribuir para o estado inflamatório (Jairam et al.,
2010).
Aproximadamente 150 mg de ferro são necessários para um aumento de
1g/dL nos níveis de Hb. Em pacientes em hemodiálise, ocorre uma perda anual de
4L de sangue, equivalente a 2g de ferro (Hörl et al., 2005; Hörl et al., 2007). Devese usar com cautela em pacientes inflamados, pois em sua maioria será
transportado dentro do sistema reticuloendotelial, o que não o disponibiliza para a
eritropoiese (Weiss et al., 2005).
O monitoramento de rotina das reservas de ferro corporal é um elemento
essencial na manutenção global dos pacientes em hemodiálise. A anemia na
DRC esta intimamente ligada a um suporte de ferro insuficiente para a eritropoiese,
esta muitas vezes associado com diminuição da função física e mental e uma baixa
45
qualidade
de
vida
(Coyne,
2006).
A
sobrecarga
de
ferro também
pode
estar associada com uma variedade de complicações, incluindo infecção e disfunção
endotelial (Weiss, 2009; Nakanishi et al., 2010)
Enquanto estudos realizados in vitro e em animais demonstram indução
da inflamação, estresse oxidativo e dano renal por administração de ferro parenteral,
muitos estudos clínicos recentes demonstram o efeito oposto com o uso prolongado
de dose adequada (Hörl et al., 2007).
Em
amplificada,
pacientes com DRC
tornando
o
em
estresse
hemodiálise, a
oxidativo
formação
uma
das
de
ROS é
complicações
mais relevantes. Este problema pode não ter efeitos clínicos imediatos, embora
possa representar uma complicação derivada da interação a longo prazo entre
sangue e membrana dialítica (Lowrie et al., 1990; Bloembergen et al., 1994; Roehrs
al., 2009).
Estresse oxidativo e inflamação são características constantes de doença
renal avançada e desempenham um papel importante na deterioração progressiva
da função e estrutura renal e estão associados a alguns fatores de risco
cardiovascular e inúmeras outras complicações da DRC (Kim et al.,2009).
Nossos resultados demonstraram que não houve diferença significativa
em parâmetros bioquímicos de peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas,
quando avaliamos os pacientes divididos em dois grupos, um que fazia uso da
terapia endovenosa de ferro e outro que não a utilizava.
Quando avaliamos o curso de tempo desses marcadores de estresse
oxidativo observamos que em ambos os grupos ocorreu uma diminuição da
46
peroxidação lipídica com a suspensão do ferro, porém com a retomada da terapia
levou ao aumento deste marcador. Quanto a carbonilação de proteínas encontramos
um aumento dos níveis deste marcador na amostra em relação ao estado basal
destes pacientes. Dessa forma o ferro pode desempenhar um papel importante na
fisiopatologia do estresse oxidativo, no entanto seu uso não é o único fator
desencadeante deste dano, visto que ocorre de forma similar no grupo que não faz
uso dessa terapia.
Outros estudos demonstram que níveis plasmáticos de malonildialdeído
(MDA) estão significativamente aumentados em pacientes com DRC em hemodiálise
em comparação a sujeitos saudáveis. Os níveis de MDA se correlacionam
positivamente de forma moderada com as atividades da SOD e CAT (Carbonneau et
al.,1994; Roehrs al., 2009;).
A partir de alguns resultados obtidos por estudos prévios, é possível
observar que o estresse oxidativo avaliado em pacientes renais crônicos que
realizam hemodiálise é significativamente maior que o observado em indivíduos
saudáveis. Estes dados são suportados pelo aumento significativo nos níveis de
lipoperoxidação e oxidação de proteínas, redução significativa da atividade das
enzimas antioxidantes SOD e CAT (Emokpae et al., 2010; Roehrs al., 2009; MimicOka et al., 1999; Lucchi et al., 1993) níveis aumentados de nitritos (Bianchi et al.,
2009) e aumento do dano oxidativo ao DNA, como demonstrado pelo aumento dos
níveis séricos de 8-hidroxi-20-desoxiguanosina (Maruyama et al., 2007).
Com uma diminuição das defesas antioxidantes, ocorre um acúmulo do
ânion radical superóxido, peróxido de hidrôgenio e radical hidroxil que podem ser
responsáveis pelo aumento da peroxidação lipídica. O ferro também desempenha
47
um papel importante como catalisador da decomposição de peróxidos lipídicos
(LOOH), transformando-os em radicais alcoxil e peroxil que amplificam o processo
de peroxidação lipídica (Mekki et al., 2010).
Ainda não há um concenso no que se refere a atividade das
enzimas scavengers de radicais, como a SOD e CAT. Há estudos que demonstram
um aumento significativo das suas atividades no sangue. No entanto, outros
trabalhos demonstram
uma
redução destas
enzimas
em pacientes
com
DRC (Zachara et al., 2001; Dursun et al., 2002; Roehrs et al., 2009).
Estudos denotam que a administração aguda de ferro não é capaz de
modificar os níveis de estresse oxidativo sistêmico (Bianchi et al., 2009). Em alguns
estudos uma única sessão de hemodiálise HD demonstrou um potencial efeito
deletério (Maruyama et al., 2007).
Existe uma infinidade de dados experimentais para indicar que o ferro no
parênquima renal é um forte participante em uma série de nefropatias experimentais
crônicas e agudas (Baliga, 1997; Nath et al., 2001). Primeiramente, o ferro poderia
causar estresse oxidativo diretamente, podendo ser especialmente relevante visto
que as defesas antioxidantes podem estar reduzidas em pacientes com doença
renal ou o ferro pode super expressar moléculas de estresse, que podem exercer
tanto efeitos de proteção, quanto lesões (Platt et al., 1998). Além disso, uma
sobrecarga
de
ferro
poderia
recrutar
moléculas
oxidantes
potencialmente
inflamatórias dentro do rim (Zager, 2006).
O agravamento do quadro causado pela hemodiálise pode ser devido
também a perdas hidrofílicas pela baixa ligação a substâncias de baixo peso
molecular como a vitamina C, oligoelementos e enzimas de regulamentação. Além
48
disso, o estado inflamatório desempenha um papel crítico na produção de oxidantes
contribuindo ainda mais para agravar o estado pró-oxidante de pacientes urêmicos
(Locatelli et al., 2003; Lucchi et al., 2005; Valko et al., 2006; Rahman et al., 2006;
Mekki et al., 2010).
O desequilíbrio entre a formação de radicais livres e neutralização em
pacientes em diálise pode ser causado pela ativação da cascata inflamatória por
uma variedade de estimuladores. A sinalização comum ocorre por meio de geração
de espécies reativas de oxigênio, ativação do fator de transcrição nuclear kappa B
(NF-kB) e indução de moléculas de adesão, citocinas e quimiocinas. O resultado
pode ser um aumento de IL-6 por PCR no fígado (Mekki et al., 2010).
Inflamação crônica, medida com biomarcadores como a IL-6, neutrófilos e
PCR, tem sido o foco de inúmeros estudos na DRC (Bruchfeld et al., 2009). A
produção de citocinas inflamatórias é um dos fatores que contribui para a elevação
da produção de hepcidina, um peptídeo recentemente descoberto gerado no fígado,
que interfere na produção de glóbulos vermelhos por diminuir a disponibilidade de
ferro e sua incorporação a eritroblastos (Lankhorst et al., 2010).
A interação de citocinas pró-inflamatórias com hepcidina na gênese da
deficiência de ferro funcional em pacientes com DRC é uma área de intensa
pesquisa. Vários estudos têm demonstrado níveis elevados de hepcidina na DRC,
sendo recentemente considerada como um elo crítico entre inflamação e anemia em
pacientes com DRC (Jairam et al., 2010).
Quando avaliamos parâmetros inflamatórios como a IL-6, nos deparamos
com uma elevação dos seus níveis em pacientes que fazem terapia com ferro, tanto
na amostra 01, quanto na amostra 03, o que não ocorreu na amostra 02, quando
49
realizamos a suspensão do ferro, demonstrando que o ferro tem um papel
fundamental na etiologia do processo inflamatório. Nenhuma diferença foi
encontrada quando avaliamos os níveis deste marcador inflamatório ao curso do
tempo.
A inflamação tem sido implicada em diversas complicações da DRC,
incluindo a má-nutrição e a aceleração do processo aterosclerótico, que tem efeito
no aumento de marcadores inflamatórios (Jairam et al., 2010). Alguns estudos
demonstram evidencias da ativação de fatores inflamatórios em pacientes renais
crônicos em estágio final, com aumento significativo nos níveis de PCR, IL-6 e TNFα. Também foi demonstrada uma correlação moderada entre níveis de IL-6 e TNFα. A causa proposta para esse aumento inclui a ativação de células inflamatórias,
redução da atividade antioxidante, redução do clearance, infecções subclínicas préexistentes por exposição ao capilar do aparelho ou doenças auto-imunes (Jairam et
al., 2010).
Em contra partida, estudos demonstram uma diminuição de parâmetros
inflamatórios como o TNF-α (Weiss et al., 2003; Hörl et al., 2007). Alguns autores
hipotetizam que a ativação de células inflamatórias pode levar a apoptose em
células progenitoras eritróides competindo com o efeito anti-apoptótico da EPO,
resultando em sua resistência (Jairam et al., 2010).
Outros estudos demonstram que a administração de ferro por si só
não altera os níveis de TNF-α no rim, coração, fígado, pulmão e baço. Mas a
administração
associada
lipopolissacarídeo
(LPS)
orgãos. Sugerindo
que
a
inflamação
provoca
o
ferro
seu
sistêmica
por
aumento em
parenteral
pode
administração
cada
um
de
destes
exercer efeitos sobre
o
50
estresse induzido pela produção citocinas, se estes achados podem ter um impacto
sobre a função do órgão ou sua integridade ainda permanece obscuro. (Zager,
2006)
Nós demonstramos que os pacientes com DRC que fazem uso da terapia
com ferro apresentam elevação dos níveis de IL-6 que decaem após a retirada da
terapia. Não foi encontrada diferença na avaliação nos marcadores de estresse
oxidativo entre grupos, mas durante o acompanhamento do curso da doença, os
pacientes sofreram um incremento destes marcadores em ambos os grupos,
demonstrando que estes pacientes apresentam dano oxidativo, que também pode
ser causado por terapias adjuvantes durante o tratamento da doença renal crônica.
Esta pesquisa é composta de uma população homogênea no que se
refere a hemodiálise. Contudo nosso estudo possui diversas limitações: tamanho da
amostra, pequeno número de pacientes sem EPO, não padronizacão da dieta que
pode influenciar no estresse oxidativo, seguimento pequeno dos pacientes, e não ter
desfecho clínico relevante associado aos marcadores de estresse oxidativo.
Finalmente nosso estudo somente demonstrou uma associação de fatores
envolvidos na piora do quadro clínico em pacientes com DRC, mas não foi capaz de
provar a causalidade.
51
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60
Anexo 1 – Tabela para Coleta de Dados Clínicos e Laboratoriais do Paciente
Renal Crônico
61
ANEXO 1
DADOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS DO PACIENTE RENAL CRÔNICO
1. IDENTIFICAÇÃO:
Nome:
Sexo:
Data:
Feminino
Masculino
(
(
)
)
Estado civil:
Religião:
2. CONDIÇÕES SÓCIO-ECONÔMICAS
Profissão:
Grau de Instrução:
Moradia
Própria
Alvenaria
(
(
)
)
Ocupção:
Renda
Familiar:
Alugada
Madeira
Água
Poço artesiano
(
(
)
)
Luz
Fossa
(
(
)
)
Outros
Mista
(
(
)
)
(
(
)
)
Esgoto
(
)
Saneamento:
Meio de Locomoção:
3. DADOS COMPLEMENTARES
Grupo
Altura:
Sanguíneo:
Número de transfusões sanguíneas
Peso Seco:
IMC:
Vacina para hepatite B:
4. HISTÓRIA ATUAL
Doença de Base:
(
)
Glomerulonefrites
(
)
Outras
Início do Tratamento dialítico:
Lista de Transplante:
HLA:
(
(
)
)
Pielonefrite
Hipertensão
(
)
Diabetes Melitus
(
(
)
)
Sim
Sim
(
(
)
)
Não
Não
5. TRATAMENTO DIALÍTICO ATUAL
Hemodiálise - HD
Data do Início:
Fístula Arterio Venosa
Catéter:
a) Duplo lúmem
b) Perm-Cath
Data do implante:
Número de sessões semanais
Horas semanais de
tratamento
Dialisador:
Solução esterelizante:
Fluxo sanguíneo:
(
(
(
(
(
(
(
)
)
)
)
)
)
)
Peso Seco:
MSE
MSD
Subclávia E
Subclávia D
Femural E
Femural D
Direito
(
(
(
(
)
)
)
)
MID
MIE
Jugular E
Jugular D
(
)
Esquerdo
Reposição de Ferro
Eritropoetina:
Sódio
Variável:
Fluxo
dialisato:
62
Heparina - número de unidades:
Intercorrências durante a diálise:
Outros
anticoagulantes:
6. PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
Hematócrito
(Hb)
Uréia pré
Uréia Pós
Cálcio
Saturação de transferrina
Ferro sérico
Proteínas Totais e frações
Colesterol total e frações
Alumínio Sérico
Marcadores virais
HBsAG
AntiHBS
AntiHCV
AntiHBC IGG
Resultados de exames complementares
Rx de Tórax PA e perfil - Laudo recente
TGP:
Glicemia
Creatinina
Potássio
Fósforo
Ferritina
Fosfatase
alcalina
PTH
Triglicérides
Medicações em uso:
Droga
Dose
Frequência