PATRIMÓNIO GENÉTICO_Planificação - Moodle @ FCT-UNL

PatrimónioGenéticoFenótipoGenótip
oHomozigóticosHeterózigóticoAlelor
ecessivoAlelodominanteAlelosmúltipl
osGenomaGeneCromossomaCromati
Património genético naAutossomaHeterossomaOperãoRe
Alteração do gulãoPromotorOperadorBiodiversida
material genético deVidaCruzamentoEspéciesPolinizaç
ãocruzadaMendelGenereguladorGene
estruturalÁrvoregenealógicaPoliniza
çãoReproduçãoMutaçõesgénicasMeio
seGâmetasFactoresNucleossomaHist
onaDNAPlasmídioNúcleoNucleossom
aCélulaHereditariedadeRNAPolimera
seEngenhariagenéticaPCRLeidasegre
gaçãofactorialGeraçãoProgenitoresCa
racteresherançagenéticaDarwinCiênc
iaHipótesesTeoriasPatrimóniogenétic
10‐12‐2008 Margarida Flores Martins Transmissão de características hereditárias Número de aulas previstas 22 Número de aulas leccionadas AULA 1 09.12.08 Sumário • Problematização da temática variabilidade genética/biodiversidade • Interpretação dos contributos de Gregor Mendel no estudo da transmissão de características hereditárias • Visionamento e discussão de um filme • Resolução de uma ficha formativa Referências relevantes http://pt.wikipedia.org/wiki/Biodiversidade http://www.ericdigests.org/2000‐2/biodiversity.htm http://www.iambiente.pt/rea99/docs/26biodiv.pdf http://www.simbiotica.org/genpop.htm http://genetics.nbii.gov/portal/server.pt http://www.colegiosaofrancisco.com.br/alfa/evolucao‐dos‐seres‐vivos/genetica‐das‐
populacoes.php http://www.universitario.com.br/celo/aulas/mendel/mono.ppt http://www.inedi.com.br/arquivos_baixar/20081003124450_Diibridismo.ppt http://biohelp.blogs.sapo.pt/3524.html http://www.institutovirtual.pt/edu‐agri‐
biotec/pdf/enunciados/ActividadesAprendizagem_1.pdf Palavras­chave Espécie Cruzamentos parentais População Cruzamentos recíprocos Biodiversidade Gâmetas Habitats Factores Ecossistemas Caracteres Variabilidade genética Pureza dos gâmetas Evolução Factor dominante Monibridismo Factor recessivo Linhas puras Meiose Problematizar O que há em comum entre as inúmeras espécies existentes em todo o mundo? De onde vêm as instruções para a vida? Como passam de geração em geração? Em que medida a reprodução sexuada contribui para o aumento da variabilidade genética? Em que medida a variabilidade genética das populações influência a biodiversidade? Enquadramento teórico O que há em comum entre as inúmeras espécies existentes em todo o mundo? De onde vêm as instruções para a vida? Como passam de geração em geração? Quando contemplamos um animal recém‐nascido de qualquer espécie, ou mesmo uma planta que desabrocha impetuosa do solo, sentimos que a continuidade da vida se faz mediante regras criteriosas, uma vez que apesar da grande variabilidade, os descendentes seguem, em regra, o padrão geral da forma e das funções dos seus progenitores. Nos seres vivos toda a complexidade das suas características anatómicas e funcionais está inscrita numa molécula simples designada DNA e esta é uma característica comum a todos eles. Todos os organismos, através a reprodução, passam aos seus descendentes, um conjunto de “instruções” que asseguram um determinado padrão e que pode eventualmente sofrer algumas modificações. Este processo, denominado hereditariedade, assegura a transmissão de caracteres (físicos ou psicológicos) aos descendentes. Assim, cada indivíduo recebe uma herança genética (ou património genético) que irá ser responsável pela expressão de determinadas características (fenótipo e genótipo). Esta é a base da Genética, compreender como se processa a transmissão de características hereditárias, como está organizado o Património genético e qual a implicação da genética na evolução da vida. A transmissão de características hereditárias está então na base da continuação da vida na Terra, uma vez que assegura a variedade e variabilidade entre espécies, isto é a biodiversidade. A biodiversidade ou diversidade biológica é a diversidade da natureza viva, que pode ser entendida como um conjunto de vários componentes hierárquicos: ecossistema, comunidade, espécies, populações e genes numa área definida. A Biodiversidade refere‐se tanto à variabilidade ao nível local (alfa diversidade), complementaridade biológica entre habitats (beta diversidade) e variabilidade entre paisagens (gama diversidade). Existem abordagens diferentes sobre a biodiversidade: •
Os biólogos geneticistas defendem que a Biodiversidade é a diversidade de genes e organismos. Eles estudam processos como mutação e troca de genes, que ocorrem ao nível do DNA e constituem, talvez a evolução. •
Os botânicos defendem que a Biodiversidade não é só apenas a diversidade de populações de organismos e espécies mas também a forma como se organizam e funcionam. •
Os ecólogos incluem na sua definição de Biodiversidade as interacções entre espécies (intra e inter específicas). A Biodiversidade não é um processo estático, pelo contrário, é um sistema em constante evolução. A diversidade aumenta dos pólos para os trópicos, quanto maior a latitude menor é o número de espécies. A riqueza de espécies tendem a variar de acordo com a disponibilidade energética, hídrica, clima e altitude. A Biodiversidade é assegurada pelos mecanismos de transmissão de características hereditárias através da informação contida nos genes que se manifestam segundo um determinado fenótipo. A manutenção da diversidade de espécies faz‐se segundo determinados mecanismos e acções, nomeadamente a selecção natural. O conceito de selecção natural foi originalmente desenvolvido na falta de uma válida teoria de hereditariedade; na época dos escritos de Darwin (A origem das espécies, em 1859), nada sobre genética moderna era conhecido. E embora Gregor Mendel, cujo trabalho é considerado como o pai da genética moderna, foi um contemporâneo de Darwin, o seu trabalho permaneceria desconhecido até o início do século XX. O conceito básico de selecção natural é que características favoráveis que são hereditárias tornam‐se mais comuns em gerações sucessivas de uma população de organismos que se reproduzem, e que características desfavoráveis que são hereditárias tornam‐se menos comuns. A selecção natural actua no fenótipo, ou nas características observáveis de um organismo, de tal forma que indivíduos com fenótipos favoráveis têm mais hipóteses de sobreviver e reproduzir‐se do que aqueles com fenótipos menos favoráveis. Com o passar do tempo, esse processo pode resultar na formação de nichos ecológicos particulares e pode eventualmente resultar no aparecimento de novas espécies. Contributo de Gregor Mendel no estudo da transmissão de características hereditárias Desde muito cedo que o Homem se interroga sobre a forma como as características hereditárias são transmitidas. Algumas explicações fantasiosas baseadas num conhecimento empírico eram avançadas. Contudo, só no século XIX, com os estudos de Gregor Johann Mendel foi formulada uma teoria credível e fundamentada que explicava o modo de transmissão das características hereditárias, que só foi aceite e reconhecida no início do século XX uma vez que até lá tinha sido totalmente ignorada pelos defensores da teoria de Darwin. (1859: Charles Darwin publishes On the Origin of Species; 1865: Gregor Mendel publishes Experiments on Plant Hybridization). Isso deveu‐se a dois factos importantes: 1. Darwin acreditava que as formas de vida poderiam variar de um modo quase infindável, desde que houvesse necessidade disso. 2. Mendel, com as suas experiências descobriu que, sim, há variações mas que essas variações ocorrem dentro de um campo genético limitado Dos trabalhos de Mendel ressaltam desempenhos metodológicos essenciais, concentrando neles, a sua análise, as chamadas características mendelianas, e por outro lado, delineou processos experimentais rigorosos e quantitativos. Os estudos de Mendel requeriam a utilização de um material biológico adequado às experiências que pretendia efectuar. ‐ Apresentam um conjunto de características discretas, isto é, bem diferenciadas e constantes ‐ Facilidade de cultivo, originando várias gerações com um elevado número de descendentes ‐ As flores das ervilheiras possuem estames (órgão reprodutor masculino) e carpelos (órgão reprodutor feminino) permitindo a autopolinização ‐ A fecundação das ervilheiras pode ser realizada de forma controlada, podendo efectuar‐se polinização cruzada. Para isso, removem‐se os estames numa fase em que ainda não são capazes de produzir grãos de pólen e, posteriormente fertiliza‐se essa planta com o pólen proveniente de uma planta escolhida. Em que medida a reprodução sexuada contribui para o aumento da variabilidade genética? NEODARWINISMO O Neodarwinismo é uma reinterpretação da teoria de evolução formulada por Charles Darwin através do contributo dos estudos de Gregor Mendel e da genética populacional. Esta corrente resulta da Teoria de Darwin, da teoria de Weissmann (as características adquiridas pelas células somáticas não podem ser transmitidas á descendência), das Mutações, da Teoria Cromossómica da Hereditariedade e dos dados fornecidos pela Paleontologia e pela Biologia em termos populacionais. A finalidade da meiose é formar esporos ou gâmetas necessários à reprodução sexuada. A meiose é muito importante para os seres vivos que se reproduzem de forma sexuada, na medida em que contribui para o aumento da variabilidade genética das espécies. A ocorrência dos crossing‐over, que conduz à recombinação genética, bem como a separação ao acaso dos cromossomas homólogos durante a Anafase I, resultante da orientação aleatória dos pares de cromossomas homólogos na placa equatorial formada na Metafase I, são fenómenos que contribuem para o aumento da variabilidade genética. Estes fenómenos, assim como a união ao acaso dos gâmetas na fecundação (a reunião ao acaso dos gâmetas feminino e masculino, com combinações genéticas diferentes, vai permitir novas e variadas associações de genes nos descendentes), permitem que a reprodução sexuada origine uma grande variedade de seres dentro da mesma espécie. Assim, a meiose e a fecundação, para além de assegurarem a estabilidade do número de cromossomas próprio de cada espécie, de geração em geração, permite a possibilidade de ocorrência de novas recombinações genéticas, contribuindo para uma acentuada variabilidade de características da descendência produzida por reprodução sexuada. AULA 2 11.12.08 Sumário •
•
•
•
Entrega da avaliação prática. Avaliação (análise) dos portfólios. Planificação da auto‐avaliação. Avaliação da saída à Tapada de Mafra Análise de dois excertos de artigos científicos publicados no Diário de Notícias e no Público sobre Esclerose múltipla e o efeito de um gene nos níveis de colesterol dos ratos. Referências relevantes www.cienciaviva.pt Palavras­chave Gene Amostra Genoma DNA Meio ambiente RNA Esclerose múltipla Colesterol População Comunidade Mutações Sequenciação do genoma Problematizar Qual a importância da descoberta da influência de 80 genes no desenvolvimento de uma doença crónica, como a esclerose múltipla? Quais as implicações destas investigações científicas no melhoramento da qualidade de vida da população mundial? AULA 3 15.12.08 Sumário • Análise dos resultados da pesquisa realizada na aula anterior, relativamente ao conhecimento da toda a sequência genómica da esclerose múltipla. • Breve referência à biografia de Mendel. • Análise e discussão dos trabalhos de Mendel: Cruzamentos de monibridismo. Conceito de linha pura e de híbrido. • Elaboração e discussão das actividades 1 e 2 do manual escolar Referências relevantes http://www.ccb.ufsc.br/~andre/aulas/BEG54020589.rtf http://www.ufv.br/dbg/gbolhtm/gbol0.htm http://www.todabiologia.com/genetica/ http://www.virtual.epm.br/cursos/genetica/genetica.htm http://learn.genetics.utah.edu/archive/bodypatterns/ http://www.mendel‐museum.com/eng/1online/experiment.htm http://nhscience.lonestar.edu/biol//bio1int.htm#gene http://www.genome.gov/25019887~ http://www.maxanim.com/genetics/Cloning%20Gene/Cloning.Gene.htm Gregor Mendel Património Genético Características descontínuas Linhas puras Cruzamentos parentais Monoibridismo Factor dominante Factor recessivo Autopolinização Polinização cruzada artificial Problematizar Quais eram os fenómenos científicos, relacionados com a reprodução, conhecidos na época de Mendel, que serviram de princípios orientadores no seu trabalho de pesquisa? Em que medida os conhecimentos de Gregor Mendel são relevantes para a evolução da Genética? Enquadramento teórico Gregor Mendel é considerado o Pai da Genética pelos resultados brilhantes obtidos nos seus trabalhos de pesquisa. Gregor Johan Mendel (20 de Julho de 1822 – 6 de Janeiro de 1884) foi um monge agostiniano que nasceu na região de Troppau então situada no território do Império Austro‐Húngaro, actualmente território da República Checa. Era o segundo de três filhos de um casal de camponeses. Foi um aluno brilhante, revelando capacidades promissoras, contudo as condicionantes económicas levá‐lo‐iam a ingressar numa ordem religiosa aos 21 anos. Entrou num mosteiro da Ordem de Santo Agostinho em 1843, situado em Brunn, onde tinha a seu cargo a supervsão dos jardins do mosteiro. Foi professor de ciências naturais, tendo dedicado grande parte do seu tempo ao cruzamento de inúmeras espécies, feijões, chicória, bocas‐de‐dragão e principalmente ervilhas cultivadas na horta do mosteiro. Mendel começou por estudar a existência de características, tais como a cor das flores e a sua transmissão às gerações seguintes. Nos seus estudos Mendel seleccionou características descontínuas (características constantes e discretas), contrariamente aos Naturalistas da época que privilegiavam pequenas variações nas características contínuas. Na época em que Mendel desenvolveu as suas pesquisas já era conhecido o facto de a união de um gâmeta masculino com um gâmeta feminino originar um novo ser. No entanto, a existência de cromossomas como suporte da informação genética, bem como os fenómenos mitose e meiose permaneciam ainda desconhecidos. Para tentar compreender os mecanismos de transmissão das características hereditárias, Mendel propôs a existência de “factores” hereditários, uma espécie de entidades abstractas que eram responsáveis pela manifestação de determinada característica. Nos seus trabalh
hos Mendel teve o cuid
dado de utilizar linhas puras, ou sseja, plantass que, quando são auto
opolinizadass, originam uma descen
ndência iguaal entre si e igual aoss seus progeenitores, relaativamente aa uma determ
minada característica. Destee modo, Greggor Mendel debruçou‐see, sobre o mo
odo de transsmissão de seete caracteríísticas de Pissum sativum
m: Órggão Caarácter FFormas antagónicas do carácter Sem
mente Cor da Forma da semente semen
nte A
Amarela V
Verde Lisa Rugosa Corr da corrola Púrpu
ura Flor Disposição daas flores Axiaal Vaagem Cor da Forma daa vagem vagem Verde Lisa Caule Tamanh
ho do caulle Alto Brancca Terminal Amarela Rugosa Baixo Após obter linhaas puras, Meendel efectu
uou cruzame
entos parentais, em que cada indivvíduo, envolvido no cruzzamento, apresentava um
ma forma an
ntagónica para a caracterrística em estudo. Um dos d aspecto
os importanttes no trabaalho de Mendel e a raazão pela qu
ual escolheu
u este mateerial biológicco é o facto
o de poder controlar a polinização. Por um laado, as flore
es das ervilh
heiras possueem estames e carpelos, permitindo aa autopolinizzação, fenóm
meno que é muito importante no co
ontrolo expeerimental um
ma vez que impede i
cruzzamentos com outras plaantas, mitindo ter ceerteza que os resultadoss obtidos são
o fiáveis. Por outro lado, a fecundaçãão das perm
ervilh
heiras pode sser realizadaa de forma co
ontrolada, attravés de polinização artificial. Cruzaamentos recíprocos Uma variedade era e usada algumas a
vezees como produtora de pólen e ou
utras vezes, como progeenitora feminina. AULA 4 17.12.08 Sumário • Monoibridismo: Determinação da Geração F1. • Exercícios de aplicação como forma de avaliação formativa. Problematizar Como se determina a Geração F1 num cruzamento de monibridismo? Quais os princípios subjacentes à Lei da segregação factorial formulada por Gregor Mendel? Enquadramento teórico MONIBRIDISMO A actividade realizada por Mendel refere‐se a uma situação em que se analisa a transmissão de uma característica. Assim, cruzou ervilheiras resultantes da germinação de sementes rugosas. Além disso, realizou cruzamentos recíprocos. Uma variedade era usada algumas vezes, como produtora de pólen e outras vezes, como progenitora feminina. As sementes colhidas nas plantas resultantes deste cruzamento eram todas lisas. Semeou então estas sementes lisas que deram origem a plantas adultas. Esta geração filial designa‐se por Geração F1. Simbologia F1 ou híbridos de primeira geração. Deixou então que os híbridos se autopolinizassem e recolheu as sementes, que eram lisas e outras rugosas. Estas sementes (7324) constituíam a 2ª geração ‐ Geração F2. Simbologia F2 5474 Sementes lisas 1850 Sementes rugosas Análise dos resultados: •
•
Existia uma uniformidade nos híbridos da primeira geração manifestando‐se apenas o carácter de um dos progenitores Na Geração F2, ambas as variantes surgiram na descendência, numa proporção de 3:1. Hipóteses formuladas por Mendel: •
•
•
•
Existem dois factores alternativos (ou variantes) que informam para cada carácter Para cada carácter, um organismo herda dois factores, um de cada progenitor Se os dois factores são antagónicos, um é dominante e é totalmente responsável pelo aspecto manifestado, enquanto o outro, chamado recessivo, não interfere com a aparência do indivíduo Durante a formação dos gâmetas, os factores separam‐se, de tal forma que cada gâmeta contém apenas um factor de cada par Lei da segregação factorial Interpretação dos resultados de Mendel à luz dos conhecimentos actuais •
Por convenção, representa‐se o factor que condiciona a forma dominante pela letra inicial maiúscula e o factor que condiciona a forma recessiva pela mesma inicial, mas minúscula. Por exemplo, para o cruzamento relativo à forma da semente lisa utiliza‐se L, para o factor que condiciona a semente lisa e l para o factor que condiciona a semente rugosa. •
•
•
Os factores considerados por Mendel responsáveis pela transmissão das características hereditárias correspondem aos genes, segmentos da molécula de DNA; O local do cromossoma ocupado por um gene, isto é, a localização física do gene é designado locus. Assim, por exemplo, o carácter “forma da semente” é determinado por dois alelos que se encontram num mesmo local correspondente (locus) em cromossomas homólogos; Cada organismo possui uma constituição genética própria, da qual dependem as suas características. O conjunto de todos os genes de um indivíduo constitui seu genoma. O genótipo é a porção da molécula de DNA que se expressa numa determinada característica. Os genótipos possíveis seriam: LL Ll ll •
A observação de um determinado genótipo é responsável pelo carácter observável ou fenótipo. Considera‐se fenótipo as características anatómicas, fisiológicas e bioquímicas que são observáveis no indivíduo. Os fenótipos possíveis seriam: Sementes lisas Sementes rugosas •
Quando, relativamente a um par de genes, estes são idênticos, diz‐se que o indivíduo é genotipicamente homogizótico em relação a esses grupos. Todos os seus gâmetas, relativamente aos genes considerados são idêticos sob o ponto de vista genético •
Se relativamente a um par de genes, estes forem diferentes, o indivíduo é heterozigótico e origina gâmetas portadores uns de uma forma alélica e outros de outra forma alélica. Recursos utilizados Ficha formativa Actividade Exercícios sobre monoibridismo Nos seus estudos experimentais com a ervilheira da espécie Pisum sativum, Mendel através da polinização cruzada artificial, cruzou duas linhas puras em que o carácter em estudo assumia para cada um dos progenitores aspectos antagónicos em relação à forma da semente. Um progenitor produzia sementes lisas e o outro produzia sementes rugosas. Com a informação anterior e o teu conhecimento adquirido sobre esta temática, utilize a tabela para efectuar o cruzamento pretendido, e responda às seguintes questões. Progenitores LL * ll Gâmetas L L l l Geração F1 Ll Ll Ll Ll F1× F1 Ll * Ll Gâmetas L l L l Geração F2 LL Ll Ll ll Tendo em conta o resultado do cruzamento, responde às seguintes questões: 1. Dos factores envolvidos na determinação da forma da semente, qual deles é recessivo? Justifica. O factor responsável pela forma rugosa. Porque nos individuo da geração F1 os dois factores se encontram na presença um do outro e só o liso se manifesta, sendo o factor dominante. O factor recessivo não se manifesta na presença do dominante correspondente. 2. Como explicas o aparecimento de sementes rugosas na geração F2? Na geração F1 quando se formam os gâmetas, os dois factores em causa separam‐se, levando cada um apenas um dos factores, dominante (L) e o recessivo (l). Na fecundação os dois gâmetas juntam‐se ao acaso, formando‐se zigotos com todos os tipos de combinações possíveis dos respectivos factores. Deste modo surgem sementes rugosas na geração F2 cuja composição factorial é ll. 3. As sementes lisas da geração F2 não têm todas a mesma constituição factorial. Como explicas tal facto? Devido ao princípio da segregação factorial, deste modo surgem sementes lisas que possuem dois factores que condicionam o carácter (LL) e sementes lisas que possuem o factor que condiciona a forma lisa (Ll), manifestando‐se o dominante. 4. Que procedimento permitiu que Mendel concluísse que o carácter herdado não dependia da planta que doava as células masculinas ou femininas? AULA 5 05.01.09 Sumário • Breve revisão de conceitos já abordados: monoibridismo e segregação factorial. • Correcção da ficha formativa realizada na última aula. • Cruzamento‐teste Referências relevantes http://www.slideshare.net/catir/transmisso‐de‐caractersticas‐hereditrias/ http://www.slideshare.net/isabelourenco/hereditariedade‐da‐cor‐dos‐
olhos?src=related_normal&rel=152090 Problematizar Em que medida os cruzamentos‐teste permitiram descobrir o genótipo de indivíduos que manifestam o fenótipo dominante para um dado carácter? Recursos utilizados Revisão (ficheiro *pp) Exercícios 1. Observe atentamente a árvore genealógica que representa o modo de transmissão da cor dos olhos em quatro gerações de uma mesma família. a.
b.
c.
Escreve o genótipo de cada indivíduo desta família, relativamente à cor dos olhos. Indique o nome dos indivíduos homozigóticos dominantes. Indique os nomes dos indivíduos homozigóticos recessivos. d. Indique os nomes dos indivíduos heterozigóticos. e. Comenta a seguinte afirmação: “A Inês herdou os olhos azuis dos avós”. f. Como é possível que pais de olhos castanhos possam ter filhos de olhos azuis? 2. Na urtiga‐branca (Lamium álbum) o carácter dentado das folhas é dominante sobre o carácter liso. Numa experiência com polinização cruzada, obtiveram‐se 117 plantas com folha dentada e 38 com folha lisa. O genótipo provável dos progenitores será (apresente os cálculos recorrendo a um xadrez mendeliano): a.
Dd x dd b.
Dd x Dd c.
DD x dd d.
DD x Dd e.
DD X DD 3. Um rato cinzento heterozigótico foi cruzado com uma fêmea do mesmo genótipo. Do cruzamento resultaram 25 descendentes. Se a pelagem branca dos ratos for recessiva é mais provável encontrar (apresente os cálculos recorrendo a um xadrez mendeliano): a. 13 ratos brancos b. 2 ratos brancos c. 9 ratos brancos d. 10 ratos brancos e. 6 ratos brancos 4. O caracol Cepaea memoralis possui uma concha lisa ou listada. Do cruzamento parental entre o caracol de concha lisa e um caracol de concha listada resultaram caracóis de concha lisa. Na geração F2 resultarão (apresente os cálculos recorrendo a um xadrez mendeliano): a. 50 % de caracóis de concha lisa e 50 % de caracóis de concha listada b. 75% de caracóis de concha listada e 25 % de caracóis de concha lisa c. 75 % de caracóis de concha lisa e 25 % de caracóis de concha listada d. 95% de caracóis de concha lisa e 5 % de caracóis de concha listada 5.
Nos coelhos, a cor preta dos pêlos é dominante em relação à cor branca. Do cruzamento entre coelhos pretos heterozigóticos resultou 360 crias. Nestes 360, o número de heterozigóticos será, aproximadamente, de (apresente os cálculos recorrendo a um xadrez mendeliano): a. 0 b. 90 c. 180 d. 270 e. 360 6.
Uma certa raça de carneiros, o alelo que determina “patas curtas” é dominante sobre o alelo que determina “patas longas”. Observe a figura, onde se evidencia os resultados obtidos em duas gerações (F1 e F2), após o primeiro cruzamento (P). A 2ª geração (F2) obteve‐se pelo cruzamento dos indivíduos “4” e “5”. Admita “C” para o alelo dominante e “c” para o alelo recessivo. Justifique as suas opções com o xadrez mendeliano. O genótipo do carneiro “1” é__CC__; do carneiro “3” é____CC___ e do carneiro “8” é__CC ou cc____.