Tentarei mostrar ao leitor mais atento As mil utilidades do maracujá

Tentarei mostrar ao leitor mais atento
As mil utilidades do maracujá
Nem Catulo ou Varela,doutos de talento,
Ousaram descrever tudo que nele há.
As folhas vistosas é o dileto alimento
Da sagaz lagarta ou mandarová
Para gente enferma é medicamento
Uma vez tomadas em um quente chá.
Transformação genética do
maracujazeiro para resistência a
doenças
F.M. Zerbini
A.V.S. Nascimento
P.F. Alfenas
L.B. Torres
A.S.K. Braz
E.N. Santana
W.C. Otoni
M.G. Carvalho
Introdução
O
maracujazeiro pertence ao gênero Passiflora, constituído por
mais de 580 espécies, sendo mais de 150, nativas do Brasil
(Bruckner et al., 2002). O endurecimento dos frutos, que pode
ser causado por duas espécies de vírus (Passionfruit woodiness virus, PWV e
Cowpea aphid-borne mosaic virus, CABMV), é a principal virose e uma das
principais doenças dessa cultura. O primeiro relato do endurecimento dos
frutos do maracujazeiro foi feito na Austrália, há mais de cem anos (Cobb,
1901). O agente causal da doença foi denominado Passionfruit woodiness virus
(PWV), até pouco tempo considerado o único vírus capaz de induzir esse tipo
de sintoma. Em 1993, Brand et al.(1993), clonaram e seqüenciaram o gene da
proteína capsidial de uma estirpe de PWV da África do Sul vírus e, ao compará-la
com a seqüência de estirpes de PWV da Austrália, concluíram que se tratava
de uma nova espécie viral, por eles denominada “South African Passiflora virus”
(SAPV). Essa denominação não foi aceita pelo Comitê Internacional de
Taxonomia de Vírus (ICTV), uma vez que o SAPV apresentava alta identidade na
seqüência de sua proteína capsidial com isolados de CABMV (Mckern et al.,
1994). Assim, o ICTV reclassificou-o como pertencente à espécie CABMV (Van
Regenmortel et al., 2000).
Plantas de maracujazeiro infectadas pelo PWV ou CABMV apresentam
mosaico e deformação foliar e produzem frutos pequenos, deformados e com
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Transformação genética do maracujazeiro para resistência a doenças
endurecimento do pericarpo. A produtividade e o ciclo da cultura são
reduzidos. Tanto o PWV quanto o CABMV são transmitidos de maneira nãocircultória por várias espécies de afídeos, além de serem facilmente
transmitidos via extrato foliar tamponado e por enxertia. Esses vírus infectam
naturalmente espécies de Passiflora e de leguminosas, além de infectarem
artificialmente alguns membros das famílias Amaranthaceae, Chenopodiaceae,
Solanaceae e Cucurbitaceae (Taylor;& Greber, 1973,; Mckern et al., 1994).
No Brasil, o endurecimento dos frutos já foi relatado nos principais
estados produtores de maracujá, incluindo Bahia, Ceará, Minas Gerais, Pará,
Rio de Janeiro e São Paulo (Chagas et al., 1981,; Lima et al., 1985,; Chagas et
al., 1992,; Bezerra et al., 1995). Em todos os casos, o PWV foi identificado
como agente etiológico da doença, com base em características biológicas e
sorológicas. Entretanto, a análise da seqüência de aminoácidos da proteína
capsidial de isolados procedentes de diversos estados brasileiros indicou que
todos eles pertencem à espécie CABMV (Santana et al., 1999,; Nascimento et
al., 2004). Até o presente, todos os isolados brasileiros seqüenciados
pertencem a essa espécie, e a detecção molecular do PWV no Brasil ainda
aguarda confirmação.
Uma vez que medidas tradicionais de controle de viroses não têm tido
sucesso no caso do endurecimento dos frutos do maracujazeiro, a alternativa
para o controle dessa virose é a obtenção de plantas de maracujazeiro
transgênicas expressando porções do genoma viral, a fim de obter resistência
pelo mecanismo de silenciamento gênico pós-transcricional (posttranscriptional gene silencing, PTGS).
Transformação
genética
A fim de obter plantas transgênicas de maracujá-amarelo (Passiflora
edulis f. flavicarpa) resistentes ao endurecimento dos frutos, um fragmento
não-traduzível do genoma do isolado CABMV-MG1, contendo dois terços da
região codificadora da polimerase viral (NIb) e um terço da região codificadora
da proteína capsidial (CP), foi inserido no sítio de BamH I do vetor binário
pBI121 (Figura 1). Plasmídeos recombinantes foram transformados em
590
Transformação genética do maracujazeiro para resistência a doenças
Agrobacterium tumefaciens LBA4404. A transformação genética de maracujáamarelo foi realizada por meio de co-cultivo de culturas de A. tumefaciens e
explantes (hipocótilos estiolados) de maracujá. Depois do co-cultivo, os
explantes foram transferidos para meio MS contendo 1,0 mg/L de
benzilaminopurina (BAP), 150 mg/L de canamicina e 250 mg/L de cefatoxima.
As plantas foram regeneradas, e os transformantes selecionados, levando-se
em conta sua capacidade de crescer em meio contendo canamicina.
Figura 1. Construção utilizada para a transformação genética de maracujá-amarelo.
BE, borda esquerda do T-DNA presente no vetor pBI121; BD: borda direita do T-DNA;
Nos pro: promotor do gene Nos que regula a expressão do gene npt II; Nos ter: sinal
de terminação da transcrição; 35S pro: promotor CaMV 35S que regula a expressão
do transgene. O fragmento viral inclui dois terços do gene NIb e um terço do gene cp.
do isolado CABMV-MG1.
Resistência das plantas F1
A presença do transgene foi confirmada via PCR em 15 das 16 plantas
regeneradas. As 15 plantas transformadas, contendo o transgene em
hemizigose, foram propagadas via estaquia, e as plantas resultantes foram
inoculadas com os isolados MG1 e PE1 do CABMV. Plantas provenientes do
transformante TE5-10 não apresentaram sintomas quando inoculadas com o
isolado MG1, mas os desenvolveram quando inoculadas com o isolado PE1. A
ausência de vírus nessas plantas foi confirmada por ELISA indireta. As plantas
provenientes dos demais transformantes foram suscetíveis a ambos os
isolados. Análise de Northern demonstrou que em plantas derivadas do
transformante TE5-10 não ocorre acúmulo de mRNA transgênico mesmo antes
da inoculação com o vírus. Depois da inoculação com ambos os isolados,
apenas em plantas inoculadas com o isolado PE1 foi detectado RNA viral
(Figura 2). Esses resultados comprovam que as plantas provenientes do
transformante TE5-10 são resistentes ao isolado CABMV-MG1, que o
591
Transformação genética do maracujazeiro para resistência a doenças
mecanismo de resistência envolvido é o silenciamento gênico póstranscricional e que esse mecanismo já está ativado nas plantas transgênicas
antes da inoculação com o vírus (Alfenas et al., 2005). Entretanto, a planta é
resistente apenas ao isolado utilizado para a transformação (MG1) e suscetível
ao outro isolado testado (PE1). A especificidade observada na resistência
pode ser explicada pelo modo de ação do mecanismo de PTGS que exige
identidade elevada entre a seqüência-alvo e a seqüência utilizada para a
transformação (Prins, 2003). A identidade das seqüências de nucleotídeos das
proteínas capsidiais dos isolados MG1 e PE1 é de 93% (Santana et al., 1999).
As plantas transgênicas analisadas encontravam-se em hemizigose, ou
seja, possuíam apenas uma cópia do transgene. Trabalhos realizados com
plantas transgênicas de mamoeiro, expressando uma construção não-traduzível
correspondente à proteína capsidial do Papaya ringspot virus (PRSV),
determinaram o mesmo tipo de especificidade da resistência nas plantas F1
(hemizigotas) (Tennant et al., 2001). Depois da autofecundação e da obtenção de
linhagens F2 em homozigose, a resistência foi efetiva contra várias estirpes do
vírus. Dessa forma, o estudo da herança da resistência das plantas transgênicas
de maracujá-amarelo e a avaliação de plantas F2 contendo o transgene em
homozigose podem revelar alterações no espectro da resistência.
Figura 2. Análise da expressão do
transgene em transformantes resistentes
ou suscetíveis ao endurecimento dos
frutos. RNA total foi extraído de plantas
inoculadas ou não-inoculadas derivadas
dos transformantes TE5-4 (suscetível) e
TE5-10 (resistente) e hibridizado com
uma sonda específica para os genes NIb
e cp. do CABMV. 1, TE5-4, não-inoculada.
2, TE5-10, não-inoculada. 3, Planta não-transformada, não-inoculada. 4, 5, Plantas
não-transformadas inoculadas com CABMV-MG1 e CABMV-PE1 respectivamente. 6, 7,
TE5-10 inoculado com CABMV-MG1 e CABMV-PE1 respectivamente. O gel de agarose
corado com brometo de etídeo, correspondendo ao rRNA 25S, é mostrado abaixo para
comparação das quantidades de RNA carregadas no gel.
592
Transformação genética do maracujazeiro para resistência a doenças
Resistência das plantas F2
A fim de determinar se a resistência é transmitida de forma estável e se a
presença do transgene em homozigose aumenta o espectro da resistência, foram
realizados cruzamentos entre o transformante resistente TE5-10, um transformante suscetível (T2-5), e uma planta não-transformada (Tabela 1). Para determinar se
a resistência se comporta da mesma forma em estado de homozigose foram
realizadas autofecundações do transformante TE5-10 (Tabela 1).
Tabela 1. Frutos obtidos dos cruzamentos realizados entre plantas transgênicas de
maracujá-amarelo resistentes e suscetíveis ao CABMV-MG1 e entre planta nãotransformada.
Progenitor materno
Progenitor
paterno
TE5-10 (resistente)
TE5-10
(autofecundação)
TE5-10
(autofecundação)
TE5-10
(autofecundação)
T2-5
T2-5
NT
Número do
fruto
Número de
sementes
obtidas
7
101
12
81
15
49
14
5
6
315
140
80
T2-5 (suscetível)
NT
TE5-10
TE5-10
8
13
16
90
140
95
NT (não-transformada)
TE5-10
TE5-10
TE5-10
T2-5
1
2
3
4
140
216
75
200
As plantas provenientes de cada cruzamento foram inoculadas com os
isolados CABMV-MG1, -PE1 e -SE1 e avaliadas por meio de observação visual de
sintomas e ELISA indireto (Tabela 2; Figura 3). Plantas F2 provenientes dos frutos
4 e 8 (NT x TE2-5 suscetível) e 5 e 13 (TE2-5 suscetível x TE5-10 resistente) foram
suscetíveis aos três isolados, conforme esperado. Plantas F2, provenientes dos
frutos 1 e 6 (NT vx. TE5-10 resistente), foram resistentes ao isolado MG1, todavia,
suscetíveis aos isolados PE1 e SE1, também, conforme esperado, pois o transge-
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Transformação genética do maracujazeiro para resistência a doenças
ne continua em hemizigose. Entre as 27 plantas F2, provenientes dos frutos 7, 12
e 15 (autofecundação do transformante TE5-10 resistente) testadas até o presente, uma (proveniente do fruto 15) mostrou-se resistente aos três isolados testados, não apresentando sintomas de infecção viral e com resultado negativo em
ELISA indireto (Tabela 2; Figura 3). Essa planta está sendo propagada vegetativamente a fim de se obter material suficiente para inoculação em todos os 16
isolados de CABMV disponíveis no Laboratório de Virologia Vegetal Molecular
da UFV e para análise genética a fim de comprovar que o transgene realmente se
encontra em homozigose. A análise das demais plantas provenientes dos frutos
7, 12 e 15 continua em andamento, bem como a análise molecular das plantas
F2, para verificar se o silenciamento gênico pós-transcricional continua ativo nas
plantas com o transgene em homozigose e se há correlação entre o número de
cópias do transgene, o nível de resistência e o silenciamento.
Tabela 2. Resultados de ELISA indireto (absorbância a 405 nm) para detecção de três
isolados de CABMV, quatro semanas depois da inoculação em plantas F2 provenientes
de diferentes cruzamentos entre plantas transgênicas de maracujá-amarelo e entre
planta não-transformada.
Cruzamento
Planta
MG1
PE1
SE1
TE2-5 × NT
(transgênica suscetível ×
não transformada)
8-1
8-3
8-4
8-5
0,89
0,87
0,85
0,88
0,97
0,99
0,95
0,90
0,88
0,85
0,87
0,86
TE5-10 × TE2-5
(transgênica resistente x
transgênica suscetível)
5-1
5-2
5-3
5-4
0,89
0,88
0,88
0,90
0,99
1,01
1,03
0,98
0,89
0,90
0,91
0,92
15-1
15-2
15-4
15-6
15-7
15-8
15-9
15-10
15-12
15-14
0,87
0,89
0,90
0,90
0,88
0,87
0,89
0,37
0,90
0,91
0,99
0,96
0,98
0,95
0,97
0,99
0,98
0,40
0,95
0,96
0,90
0,95
0,93
0,96
0,97
0,98
0,95
0,42
0,90
0,90
Não-transformada inoculada
1,30
1,03
1,21
Não-transformada sadia
0,25
0,24
0,21
TE5-10 × TE5-10
(autofecundação
transgênica resistente)
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Transformação genética do maracujazeiro para resistência a doenças
PE-1
SE-1
NT
8
5
15
Figura 3. Sintomas de infecção por três isolados de CABMV (MG-1, PE-1 e SE-1)
em plantas F2 provenientes de diferentes cruzamentos entre plantas transgênicas
de maracujá-amarelo e entre planta não-transformada. NT, planta nãotransformada; 8, planta F2 proveniente do cruzamento de planta transgênica
suscetível (TE2-5) e planta não-transformada; 5, planta F2 proveniente do
cruzamento de planta transgênica suscetível (TE2-5) e planta transgênica
resistente (TE5-10); 15, planta F2 proveniente de autofecundação de planta
transgênica resistente (TE5-10).
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Transformação genética do maracujazeiro para resistência a doenças
Conclusões
Plantas de maracujá-amarelo (Passiflora edulis f. flavicarpa) foram
transformadas geneticamente visando à obtenção de plantas resistentes ao
endurecimento dos frutos. As plantas transgênicas expressam um fragmento
não traduzível do genoma de um isolado do Cowpea aphid-borne mosaic virus
(CABMV) correspondente a dois terços da região codificadora da proteína NIb
e um terço da região codificadora da proteína capsidial. Uma das plantas
transgênicas obtidas foi resistente à infecção pelo mesmo isolado utilizado
para a transformação, porém, foi suscetível à infecção por outro isolado do
vírus. A análise molecular demonstrou que o mecanismo de resistência é o
silenciamento de RNA que já se encontra ativo na planta antes da infecção
viral. Após a autofecundação da planta resistente, uma planta F2 com o
transgene em homozigose foi analisada e mostrou-se resistente à infecção por
três isolados do vírus. Esse resultado indica que o espectro da resistência está
relacionado ao número de cópias do transgene. Essa planta está sendo
multiplicada vegetativamente para inoculação com demais isolados do vírus.
Caso a resistência de amplo espectro seja confirmada, a utilização desse
material pode constituir uma forma de controle eficiente para o endurecimento
dos frutos, uma virose endêmica no Brasil e para a qual não existem
atualmente medidas de controle satisfatórias.
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