caracterização molecular dos tipos de - pgbioexp
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA UNIR NUCLEO DE SAÚDE CENTRO INTERDEPARTAMENTAL DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL E BIOTECNOLOGIA CIBEBI PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTEL PGBIOEXP JÉFFERSON CASTRO DOS SANTOS CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS TIPOS DE PAPILOMAVÍRUS HUMANOS-HPV, NO MUNICÍPIO DE PORTO VELHO-RO NO PERÍODO DE 2008-2009 Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental/Doutorado-PGBIOEXP da Universidade Federal de Rondônia/ UNIR para obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Porto Velho-RO 2012 UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA UNIR NUCLEO DE SAÚDE CENTRO INTERDEPARTAMENTAL DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL E BIOTECNOLOGIA CIBEBI PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTEL PGBIOEXP JÉFFERSON CASTRO DOS SANTOS CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS TIPOS DE PAPILOMAVÍRUS HUMANOS-HPV, NO MUNICÍPIO DE PORTO VELHO-RO NO PERÍODO DE 2008-2009 Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental/Doutorado-PGBIOEXP da Universidade Federal de Rondônia/ UNIR para obtenção do título de Doutor em Biologia Experimental. Área do Conhecimento: Biologia Celular e Molecular. Orientadora: Drª. Maria Manuela da Fonseca Moura Porto Velho-RO 2012 UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA UNIR NUCLEO DE SAÚDE CENTRO INTERDEPARTAMENTAL DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL E BIOTECNOLOGIA CIBEBI PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTEL PGBIOEXP FICHA CATALOGRÁFICA BIBLIOTECA CENTRAL PROF. ROBERTO DUARTE PIRES Santos, Jéfferson Castro dos. S237c Caracterização molecular dos tipos de papiloma vírus humano-HPV, no município de Porto Velho-RO no período de 2008-2009. / Jéfferson Castro dos Santos. Porto Velho, Rondônia, 2012. 53 f.: il. Tese (Doutorado em Biologia Experimental) – Núcleo de Saúde (NUSAU), Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental, Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho, 2011. Orientadora: Profa. Dra. Maria Manuela da Fonseca Moura. 1. Genética Molecular. 2. Câncer Cervical. 3. Papiloma Vírus HumanoHPV. 4. Condilomas. 5. Doenças Sexualmente Transmissíveis DST/AIDS. 6. PCR/FRLP. I. Título. CDU: 616-006.5(811.1) Bibliotecária Responsável: Eliane Gemaque / CRB 11-549 UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA UNIR NUCLEO DE SAÚDE CENTRO INTERDEPARTAMENTAL DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL E BIOTECNOLOGIA CIBEBI PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTEL PGBIOEXP BANCA EXAMINADORA _______________________________________________ Dra. Maria Manuela da Fonseca Moura Geneticista / Orientadora __________________________ Dra. Francisca da Luz Dias Geneticista ________________________________ Dr. Eduardo Resende Honda Biotecnologista ___________________________________ Dra. Deusilene Souza Vieira Virologista Molecular __________________________________ ______________________________ Dra. Rubiani de Cássia Pagotto Geneticista Dr. Weber Cheli Batista Biotecnologista _____________________________________ Dra. Adriana Cristina da Silva Nunes Geneticista Tese de doutorado defendida e aprovada em 05 / 12 / 2012 Agradeço a Deus por permitir a Presença em minha vida Desde o ingresso nesta jornada (Graduação, Mestrado e Doutorado) Minha querida e estimada mãe Maria Íris Alves Nunes Castro dos Santos Pessoa essencial em que sempre tive O Total Apoio e incentivo para a realização de Todas as minhas conquistas, Para o meu crescimento intelectual... Aos meus verdadeiros Amigos, Pela amizade apoio e compreensão. UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA UNIR NUCLEO DE SAÚDE CENTRO INTERDEPARTAMENTAL DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL E BIOTECNOLOGIA CIBEBI PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EXPERIMENTEL PGBIOEXP À Drª. Maria Manuela da Fonseca Moura, que abriu as porta do seu laboratório, CIBEBI, onde realizei as atividades científicas com total liberdade aos atributos confiados a mim. Logo só tenho a agradecer a esta Professora e Pesquisadora que em todos os momentos sempre se posicionou de maneira científica as questões que remetem ao desenvolvimento biotecnológico que tanto nos fascina. À Drª. Vera Engracia Gama de Oliveira, sempre esteve à frente do PGBIOEXPE, pois com suas constantes lutas em prol ao desenvolvimento Acadêmico – Científico e Tecnológico de Rondônia tornou possível à realidade do curso de Mestrado e Doutorado, formando assim sementes que em um futuro desejoso possa tornar nosso estado um ponto referencial de descobertas cientificas em biotecnologia. À saudosa desbravadora secretária do Curso de Pós-Graduação em Biologia Experimental-PGBIOEXP: Professora Ednéia Muniz, por todo apoio, incentivo, total agilidade no atendimento competente e amizade dada. Aos amigos de Laboratório, mas em especial a Professora Mestre e Drª. Marlene Guimarães Santos que como todas as implacáveis mulheres das quais posso dizer que tive a honrosa oportunidade de telas como referencia, pois, contribuiu em minha formação de mundo. A senhora o meu muito OBRIGADO !!!. À Fundação Universidade Federal de Rondônia, por proporcionar a oportunidade de fazer este curso, e pelo desenvolvimento científico através do CIBEBI. À CAPES pelo apoio institucional. SUMÁRIO LISTA DE TABELAS................................................................................................................ i LISTA DE FIGURAS................................................................................................................ ii LISTA DE GRÁFICOS.............................................................................................................. iii LISTA DE ABREVEATURA E SIGLAS................................................................................. iv RESUMO.................................................................................................................................... v ABSTRACT............................................................................................................................... vi 1.0 INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 01 1.1 Breve Histórico..................................................................................................................... 01 1.2 Os Papilomavírus................................................................................................................. 02 1.2.1 Organização Genômica..................................................................................................... 03 1.2.2 Estrutura e Morfologia...................................................................................................... 04 1.2.3 Taxonomia e Nomenclatura............................................................................................... 04 1.2.4 Classificação dos Papilomavírus Humanos...................................................................... 06 1.2.5 Transmissão....................................................................................................................... 08 1.2.6 Manifestações Clínicas...................................................................................................... 09 1.2.7 Lesões Epiteliais do Colo Uterino...................................................................................... 10 1.2.7.1 Terminologia.................................................................................................................. 10 1.2.7.2 Classificação das Lesões Epiteliais da Cérvice Uterina............................................. 11 1.2.7.3 Atípicas Celulares........................................................................................................ 12 1.2.8 Evolução das Infecções..................................................................................................... 13 1.2.9 Exames Ginecológicos...................................................................................................... 15 1.2.9.1 Papanicolaou.................................................................................................................. 15 1.2.9.2 Colpocitologia................................................................................................................ 16 1.2.9.3 Colposcopia.................................................................................................................... 17 1.2.9.4 Citologia Esfoliativa....................................................................................................... 17 1.2.10 Técnicas Moleculares...................................................................................................... 17 1.2.10.1 Sensibilidade das Técnicas Moleculares no Diagnóstico do HPV............................... 18 1.2.11 Tratamento....................................................................................................................... 19 1.2.12 Situação Epidemiológica................................................................................................. 20 2. OBJETIVOS......................................................................................................................... 25 3. METODOLOGIA................................................................................................................ 26 3.1 Estratégias de Ação.............................................................................................................. 26 3.1.1 Registro de dados e Interação Médico / Paciente / Pesquisa Científica........................... 26 3.1.2 Local de Coleta.................................................................................................................. 26 3.1.3 Tamanho Amostral............................................................................................................ 26 3.1.4 Coleta e Acondicionamento das Amostras........................................................................ 26 3.2 Análises Laboratoriais......................................................................................................... 27 3.2.1 Método Citológico............................................................................................................. 27 3.2.2 Método Molecular............................................................................................................. 27 3.2.2.1 Extração do Material Genético gDNA........................................................................... 27 3.2.2.2 Verificação da Presença do DNA/HPV no gDNA.......................................................... 29 3.2.2.3 Caracterização do perfil eletroforético dos genótipos de HPVs por RFLP................... 29 3.3 Análises Estatísticas............................................................................................................. 30 3.4 Organograma Metodológico................................................................................................ 31 4. RESULTADOS.................................................................................................................... 32 4.1 Presença ou ausência do Material Genético Viral do Papilomavírus Humano (DNAHPV)....................................................................................................................................... 32 4.2 Perfil eletroforético de dois HPVs dos oitos tipos encontrados nas amostras confirmadas por PCR com o DNA/HPV.................................................................................... 4.3 Analises dos dados resultados obtidos................................................................................. 32 33 5. DISCUSSÃO......................................................................................................................... 37 7. CONCLUSÃO...................................................................................................................... 45 BIBLIOGRAFIA...................................................................................................................... 46 ANEXOS.................................................................................................................................... 54 I-Comitê de Ética........................................................................................................................ Anexo I II- Termo de Consentimento e Livre Esclarecimento (1ª e 2ª via).............................................. Anexo II III- Questionário de Dados Antropogenéticos............................................................................. Anexo III IV- Protocolo de Extração de DNA – Proteinase K.................................................................... Anexo IV V-Eletroforese em gel de Agarose.............................................................................................. Anexo V LISTA DE TABELAS Pg Tabela 01 Classificação de alguns tipos de papilomavírus divididos em grupos de alto e baixo risco oncogênico.......................................................................................... 7 Tabela 02 Sequência dos primers para amplificação dos fragmentos correspondentes ao gene G-6-PD.................................................................................................................. 28 Tabela 03 Seqüências dos oligonucleotideos correspondentes ao fragmento de 450pb da região L1............................................................................................................... 29 Tabela 04 Correlação dos resultados Citológicos quanto a alteração celular (+) ou sem alteração celular (-) e os resultados Moleculares (PCR) quanto à presença ou ausência do DNA-HPV (n= 334).......................................................................... 33 Tabela 05 Correlação dos resultados da Citologia com os tipos de HPVs analisados por RFLP e classificados conforme o grau oncogênico (n= 103/334).......................... 33 Tabela 06 Distribuição dos resultados da citologia de acordo com o Sistema Bethesda (2001) e os tipos de HPVs encontrados por RFLP, de acordo com a prevalência dos testes de rastreamento utilizados como preventivo do câncer cervical............................. 34 Tabela 07 Relação dos resultados de presença e ausência do DNA-HPV por PCR, tipagem dos HPVs por RFLP e alterações celulares por infecção dos HPVs verificados na citologia, nas 334 amostras analisadas................................................................... 36 i LISTA DE FIGURAS pg Figura 01 Organização do genoma dos HPVs. Fonte (adaptado) do endereço eletrônico: kesler.biology.rhodes.edu/scij/1999/lum.html...................................................... Figura 02 Figura 03 3 Representação da estrutura morfológica externo de forma geral dos Papilomavirus humanos. (fonte:http://www.corposaun.com/virus-hpv-cancerboca/8452/).......................................................................................................... 4 Árvore filogenética de 118 tipos de HPVs seqüenciados conforme a compatibilidade da região mais conservada L1 pertencente ao ORF (de Villiers e cols., 2004)........................................................................................................ 5 Figura 04 Gel de agarose 1,5%. Confirmação da extração do material biológico gDNA por PCR, com a amplificação de fragmentos com 320pb correspondente ao gene G6-PD. M: Ladder com 100pb; Linhas: 1, 2, 3 e 4 material biológico e neg.: controle negativo da reação................................................................................. 28 Figura 05 Gel de agarose 1,5%. Confirmação da amplificação por PCR do DNA-HPV correspondente ao fragmento de 450pb da região conservada do gene L1 do Papilomavírus Humanos (HPV). M: marcador de 100pb; B: controle negativo da reação................................................................................................................... 32 Figura 06 Gel de agarose a 2,5% com o perfil eletroforético do HPV-16 por RFLP. Linhas M: ladder de 100pb; neg: controle negativo de contaminação............... 32 Gel de agarose a 2,5% com o perfil eletroforético do HPV-33 por RFLP. Linhas M: ladder de 100pb; neg: controle negativo de contaminação............... 32 Figura 07 ii LISTA DE GRÁFICOS Pg Gráfico 01 Presença do DNA-HPV analisado por PCR nos raspados citológicos. Distribuição segundo a escolaridade....................................................................................................... Gráfico 02 Gráfico 03 Gráfico 04 34 Presença (+) e ausência (-) do DNA-HPV em amostras com alteração celular e sem alteração celular (normal) analisadas pela citologia.......................................................... 35 Relação dos 103/334 tipos de HPVs encontrados por RFLP e seu agrupamento em alto e baixo risco conforme seu potencial oncogênico em desencadear câncer cervical............ 35 Gráfico 04. Prevalência dos HPVs de acordo com o início da vida sexual...................... 36 iii LISTA DE ABREVIATURAS Siglas ou Abreviaturas Significado C l Asn Asp cM CONEP D DNA dNTP EDTA e cols FUNASA G-6-PD gDNA GSH GSSG H IBGE IPA Kb Km Km2 M/l mg min mM/l mmol NADP NADPH Nm OMS PAGE pb PCR Phe RFLP RO SEMUSA Ser TEMED Graus centígrados Microlitros Asparagina Ácido Aspártico Centi Morgan Comissão Nacional de Ética em Pesquisa Dalton Ácido Desoxirribonucléico Desoxinucleotídeo Ácido Ethilenodiamineteraacetico e colaboradores Fundação Nacional de Saúde Desidrogenase de glicose-6-fosfato Ácido Desoxirribonucléico genômico Glutation reduzido Glutation oxidado Hidrogênio Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística Índice Parasitário Anual Quilo bases Quilometro Quilometro quadrado Mol por litro Miligrama Minutos Mili mol por litro Mili molar Nicotinamida Adenina Difosfato Fosfato Reduzido de Nicotinamida Adenina Dinucleotideo Nano molar Organização Mundial de Saúde Eletroforese em gel de Poliacrilamida Pares de Base Reação da Polimerase em Cadeia, em português Fenilalanina Polimorfismos de Comprimento de Fragmento de Restrição Rondônia Secretaria Municipal de Saúde Serina N’, N’, N’, N’, -Tetramethylethylenediamina Teste do Qui-quadrado 2 iv RESUMO dos SANTOS, JS. Caracterização Molecular dos Tipos de Papilomavírus Humano (HPV), no Município de Porto Velho-RO, Período 2008-2009 / dos SANTOS, JS. Tese de Doutorado em Biologia Experimental / Fundação Universidade Federal de Rondônia UNIR. O Papilomavírus pertence à família Palillomaviridae, subfamília Papilomavirinae e ao gênero Papilomavirus. Existem mais de 100 tipos virais de HPVs descritos até o momento e, destes, aproximadamente 35 são encontrados na região anogenital. Os tipos (16 e 18) são os mais comuns encontrados em câncer cervical e precursor de lesões. O objetivo principal deste estudo foi caracterização dos tipos de Papilomavírus Humanos (HPV), no período de agosto de 2008 a agosto de 2009, em mulheres que realizam preventivo no Centro de Referência da Saúde da Mulher-CRSM, localizado nas dependências da Policlínica Rafael Vaz e Silva no Município de Porto Velho, Rondônia-RO. Foram coletados esfregaços de células cervicais de 334 mulheres. A presença do material genético viral do Papilomavírus humano (DNA/HPV) é confirmado por PCR com a utilização dos primers universais MY09/MY11 que amplifica um fragmento de 450pb correspondente a região conservada do gene L1. Os amplicons foram submetidos à (RFLP) com as endonucleases: Bam H I, Dde I, Hae III, Hinf I, Pst I, Rsa I e Sal 3AI e o perfil eletroforético dos tipos de HPVs foram visualizados em gel de agarose a 3,5%. O presente estudo confirmou o DNA/HPV em 31% (103/334) das amostras analisadas por PCR. Enquanto o método citológico revela alteração celular com indicativo para HPV em apenas 5% (16/334) dos esfregaços analisados. Em relação ao perfil eletroforético dos 103 DNA/HPV encontrados por PCR, foi possível verificar por RFLP a existência de oito (08) tipos distintos de Papilomavírus humano, classificados em HPVs pertencentes ao grupo de alto risco oncogênicos com 72% (74/103) correspondentes aos HPVs-16, 18, 33, 53 e 56; e ao grupo de baixo risco oncogênico com 28% (29/103) correspondente aos HPVs-11, 42 e 44. Com os achados se pode verificar a importância para a saúde na população a implantação de técnicas moleculares que possam captar a verdadeira situação epidemiológica dos HPVs circulantes na população de Porto VelhoRO. Tendo em vista os achados encontrados como mulheres assintomáticas e a presença do DNA/HPV de alto grau oncogênico. Com este conhecimento é possível auxiliar precocemente no tratamento da infecção por Papilomavírus humano no combate ao câncer do colo uterino. v ABSTRACT dos Santos, JS. Molecular Characterization of Types of Human Papillomavirus (HPV) in the city of Porto Velho-RO, Period 2008-2009 / dos Santos, JS. Doctoral tease in Experimental Biology / University of Rondônia UNIR. The Papillomavirus belongs to the Palillomaviridae family, Papilomavirinae subfamily and the genus Papillomavirus. There are more than 100 viral types of HPV described so far, of whom about 35 are found in the anogenital region. Types (16 end 18) are most commonly found in cervical cancer and precursor lesions. The objective of this study was characterization of the types of human papillomaviruses (HPV) in the period August 2008 to August 2009, in women undergoing in preventive Reference Center Women's HealthCRSM, located on the premises of the Polyclinic Rafael Vaz Silva and the city of Porto Velho, Rondônia, RO. We collected cervical cell smears of 334 women. The presence of viral genetic material of human papillomavirus (HPV DNA) was confirmed by PCR with the use of universal primers that amplify MY09/MY11 a fragment of 450bp corresponding to the conserved region of the L1 gene. The amplicons were subjected to (RFLP) with endonucleases: Bam HI, Dde I, Hae III, Hinf I, Pst I, Rsa I and Sal 3AI and electrophoretic profile of the types of HPV were visualized in agarose gel 3.5% . The present study confirmed the HPV DNA in 31% (103/334) of samples with PCR. While the cytologic method shows changes with cellular target for HPV infection in only 5% (16/334) of the smears examined. In relation to the electrophoretic profile of the 103 HPV DNA found by PCR, RFLP was verified by the existence of eight (08) distinct types of human papillomavirus, HPV classified as belonging to the oncogenic high-risk group with 72% (74/103) corresponding to HPV-16, 18, 33, 53 and 56, and the group of low risk HPV in 28% (29/103) corresponding to HPV-11, 42 and 44. With the findings can be seen the importance for population health in the deployment of molecular techniques that can capture the true epidemiological situation of the HPV circulating in the population of Porto Velho-RO. Given the findings as asymptomatic women and the presence of HPV DNA highly oncogenic. With this knowledge you can help in early treatment of human papillomavirus infection in the fight against cervical cancer. vi 1 INTRODUÇÃO Desde a antiguidade existem relatos de doenças que são provocadas por vírus. Mas é a partir do século XX, que os cientistas desenvolveram métodos e instrumentos que permitiram identificar e caracterizar esses patógenos, demonstrando, in vitro ou in vivo, sua capacidade de infecção, reprodução e transmissão de uma célula hospedeira a outra, por mecanismos bastante diversificados. A compreensão desses mecanismos é fundamental para o diagnóstico, tratamento, prevenção e controle das doenças virais (CAMARA e cols., 2003). 1.1-Breve Histórico: Os relatos históricos referentes aos Papilomavírus dizem respeito ao diagnóstico do câncer de colo uterino, sendo o primeiro tipo de câncer a ser associado a estes vírus (NEVES, 2005). É considerado agente causal do câncer cervical em mulheres, bem como de outros órgãos genitais, mucosas e pele. É uma das mais comuns infecções sexualmente transmitidas (MALUF, 2007). Na década de 70, o virologista alemão Harald Zur Hausen, pesquisador do Centro Alemão de Pesquisa do Câncer, investigava qual seria o agente causal do câncer de colo uterino, já que este tipo de câncer estava associado intimamente com o comportamento sexual das pacientes. Inicialmente acreditava-se que estaria vinculado à infecção pelo vírus do Herpes simplex e Chlamydia trachomatis, contrariando o dogma da época em que os vírus não tinham relação nenhuma com tumores (PEREZ e cols., 2008). Na década de 80, Zur Hausen, convencido por seus estudos com microscopia, mostrou ser o HPV o agente causal responsável pelo desenvolvimento do câncer de colo uterino por proporcionar alterações na estrutura genética das células, as quais levam ao desenvolvimento da doença. Seus estudos comprovaram que o DNA viral apresentava a capacidade de fundir-se às células cancerosas extraídas do colo do útero humano. A integração do material genético viral às células humanas é justamente o primeiro passo na cadeia de reações que levam à formação do tumor. Com estes dados procurou apoio de algumas companhias farmacêuticas para o desenvolvimento de uma vacina profilática. Entretanto, não obteve sucesso, pela falta de estudos de outros centros que confirmassem seus achados (MCINTYRE, 2005). Na década de 90, com a popularização das técnicas moleculares na detecção do HPV, inúmeros estudos epidemiológicos de outros autores comprovaram forte associação do HPV e o câncer de colo uterino (MALUF, 2007). Introdução 2 Em um estudo epidemiológico importante foi realizado com amostras de tumores e conseguiram provar que o material genético do Papilomavírus Humano (DNA-HPV) estava presente em 99,7% das amostras (WALBOOMERS e cols., 1999). Com estes achados, duas décadas após iniciados os estudos de Harald Zur Hausen, duas grandes companhias farmacêuticas iniciaram estudos clínicos sobre vacinas profiláticas para o HPV. Desde 2005, uma série de artigos científicos publicados em revistas de alto impacto comprovam a eficácia e a segurança destas vacinas, com excelentes resultados em termos de prevenção de lesões precursoras do câncer de colo uterino e também de verrugas genitais. Assim, rapidamente as vacinas foram aprovadas para uso comercial em diversas partes do mundo, inclusive no Brasil (RAMBOUT e cols., 2007). O pesquisador alemão, Harald Zur Hausen, foi responsável por identificar as variantes de HPV-16 e -18, que juntas, são responsáveis por 70% das formas de câncer do colo de útero no mundo (SANTOS, 2006). 1.2-Os Papilomavírus: Os papilomavírus (PVs) são grupos de vírus encontrados em mais de 20 espécies de mamíferos, bem como em aves e répteis. Entre os papilomas, devido à importância médica, os Papilomavírus humanos (HPVs) têm sido os mais estudados (NAIR E PILLAI, 2005). O papel do HPV do câncer bucal é controverso, porém uma vez que é considerado como o principal agente etiológico do câncer do colo uterino. Considerando-se que o revestimento das vias digestivas superiores é semelhante àquela da vagina e do ectocérvice, é perfeitamente explicável que se pode inferir uma associação entre o câncer cervical e o oral no que diz respeito à patogênese ligada ao HPV (MALUF, 2007). A fragilidade que ocorre nestas duas mucosas, seja causada por agressão do álcool ou tabaco, considerando-se a mucosa oral, ou por gestações repetidas ou transformações metaplásicas, como na mucosa vaginal e na junção escamo-colunar do colo uterino, facilita a penetração do vírus existente no estado latente, conseguindo atingir as células basais do revestimento e desencadear todo um mecanismo envolvido no processo de proliferação celular (FEHRMANN e cols., 2003; NAIR E PILLAI, 2005; CAVALCANTI E CARESTIATO, 2006). Introdução 3 1.2.1-Organização Genômica: O HPV apresenta seu material genético constituído por (DNA) em conformação circular de dupla hélice que compreende uma estrutura helicoidal (BURD, 2003). Apresenta 8000 pares de bases (pb), ligadas covalentemente e associados a histonas de origem celular, que formam um complexo compatível à estrutura molecular da cromatina (CAMARA e cols., 2003; CAVALCANTI E CARESTIATO, 2006; BAZAN, 2007). Seus genes, figura 01, encontram-se organizados em duas grandes regiões: a primeira é organizada por uma região reguladora, não codificadora, do inglês Long Control Region (LCR) ou Upper Regulatory Region (URR), situada entre o gene L1 e E6 (WYANT, 2007). É onde estão localizados os genes reguladores, iniciadores e sítios de ligação para fatores de transcrição parasita/hospedeiro (CAVALCANTI E CARESTIATO, 2006). A segunda região é organizada em oito sequências gênicas abertas de leitura, do inglês Open Reading Framer (ORFs), com os genes organizados em duas regiões distintas: I. Uma região precoce, do inglês Early (E), onde estão localizados os oncogêneses E1, E2, E4, E5, E6, E7 (Burd, 2003). As proteínas dos genes E1 e E2 modulam a replicação e transcrição, enquanto que os oncogenes E5, E6 e E7 modulam o processo de transformação (SOLIMAN e cols., 2004; ALMEIDA-NETO, 2007). II. Outra região denominada tardia, do inglês Late (L) que codifica duas proteínas estruturais L1 (proteína maior) que é gênero-específica e L2 (proteína menor) que é altamente tipoespecífica do capsídeo viral, as quais são altamente conservadas entre todos os papilomavírus e não possuem potencial de transformação celular (SOLIMAN e cols., 2004; ALMEIDA-NETO, 2007). Figura 01. Organização do genoma dos HPVs. Fonte (adaptado) do endereço eletrônico: kesler.biology.rhodes.edu/ scij/1999/lum.html. Introdução 4 1.2.2-Estrutura e Morfologia: Os Papilomavírus Humanos (HPVs), figura 02, consistem de uma capa protéica, o capsídeo, não envelopado de forma arredondada com aproximadamente 55 nanômetros de diâmetro e 2 nanômetros de espessura que envolve o genoma viral. Seu capsídeo contém 360 cópias da proteína L1 e 12 cópias da proteína L2 organizadas em 72 capsômeros, unidades morfológicas, dispostas segundo uma simetria icosaédrica (DE VILLIERS e cols., 2004; DOORBAR, 2005; SANTOS, 2006; CAVALCANTI E CARESTIATO, 2006). Os capsômeros, localizados em cada um dos 12 vértices, são pentavalentes, isto é, circundados por cinco capsômeros adjacentes, e os outros 60 capsômeros são hexavalentes (DE VILLIERS e cols., 2004). Os 72 capsômeros são pentâmeros da proteína estrutural principal, L1. Outra proteína estrutural menos representada, L2, também compõe mais internamente o capsídeo. Essas proteínas são responsáveis pela imunogenicidade do vírus e carregam determinantes antigênicos (DE VILLIERS e cols., 2004; DOORBAR, 2005). Figura 02. Representação da estrutura morfológica externo de forma geral dos Papilomavirus humanos. (fonte:http://www.corposaun.com/virus-hpv-cancerboca/8452/). 1.2.3-Taxonomia e Nomenclatura The International Comittee on Taxonomy of Viruses (ICTV) da Divisão de Virologia, da União Internacional de Associações de Microbiologia é responsável pela elaboração e nomenclatura de novos vírus. Até ao sexto relatório publicado, em 1995, os gêneros Papillomavirus e Polyomavirus constituíam a família Papovaviridae (CAMARA e cols., 2003). Introdução 5 A partir do sétimo relatório, foi criada a família Papillomaviridae assinalado com o número 00.009, subfamília Papilomavirinae, na qual passou a ser incluído o gênero Papillomavirus assinalado com o número 00.099.0.01. Nesse gênero são descritas oito espécies e entre elas está à espécie Human papillomavirus (HPV). Ainda segundo esse último relatório do ICTV, há 82 genótipos de HPV descritos na literatura. Entretanto, há outros tipos cuja identificação ainda é incerta (VAN REGENMORTEL e cols., 2000). Segundo DE VILLIERS e cols., (2004) em trabalho de revisão sobre a classificação dos papilomavírus, o gênero Papillomavirus subdivide-se em: Alpha-papillomavirus, HPVs que preferencialmente infectam a mucosa oral ou anogenital em humanos e primatas; Betapapillomavirus, Gamma-papillomavirus, Nu-papillomavirus, Mu-papillomavirus, HPVs que infectam preferencialmente a pele de humanos e os HPVs Delta-papillomavirus, Episilonpapillomavirus, Zeta-papillomavirus, Eta-papillomavirus, Theta-papillomavirus, Iota- papillomavirus, Kappa-papillomavirus, Lambda-papillomavirus, X-ipapillomavirus, Omikronpapillomavirus e Pi-papillomavirus ainda não definidos, figura 03. Alpa-papillomavirus Beta-papillomavirus Delta-papillomavirus Gamma-papillomavirus Epsilon-papillomavirus Zeta-papillomavirus Pi-papillomavirus Eta-papillomavirus Mu-papillomavirus Theta-papillomavirus Iota-papillomavirus Lambda-papillomavirus Kappa-papillomavirus Omikron-papillomavirus Xi-papillomavirus Nu-papillomavirus Figura 03. Árvore filogenética de 118 tipos de HPVs seqüenciados conforme a compatibilidade da região mais conservada L1 pertencente ao ORF (DE VILLIERS e cols., 2004). Introdução 6 O nome Papilomavírus foi composto do latim papila, diminutivo de papula, projeção ou saliência em forma de mamilo ou pústula; o sufixo ou desinência oma, usada pelos antigos médicos gregos para designar as tumorações (tumor) ou os entumescimentos; ou seja, tumor que forma mamilos ou papilas (DE VILLIERS e cols., 2004). O nome oficial da espécie é representado pelo nome do animal (hospedeiros) que eles infectam, em itálico, seguindo do nome do gênero, por exemplo, Bovine papillomavirus (BPV), Canine papillomavirus, Cottonnail rabbit papillomavirus, Deer papillomavirus, European elk papillomavirus, Ovine papillomavirus e Human papillomavirus (VAN REGENMORTEL e cols., 2000). 1.2.4-Classificação dos Papilomavírus Humanos A classificação dos HPVs baseia-se na divergência genômica da região L1 que corresponde ao gene mais conservado do genoma dos papilomavírus (PVs) e tem sido utilizada para identificação de novos tipos de papilomavírus nos últimos 15 anos (CAMARA e cols., 2003; DE VILLIERS e cols., 2004). Considera-se como um novo papilomavírus se o genoma completo tiver sido clonado e a seqüência de DNA da região (Open Reading Frame - ORF) diferir mais que 10% do papilomavírus de maior proximidade genética conhecido, exemplo, a família Papillomaviridae engloba 16 gêneros, que apresentam entre si uma diferença maior que 40% na sequencia nucleotídica do gene L1, enquanto as espécies apresentam diferença entre 30%, e 40% em L1(CAMARA e cols., 2003; DE VILLIERS e cols., 2004). Apesar da classificação em família, gênero e espécie os PVs são classificados em genótipos, subtipos e variantes, para isso tem-se como base na proximidade de sequencia dos nucleotídeos. É considerado genótipo quando o PV difere de outro em pelo menos 10% na sequencia de nucleotídeos do gene L1. Já o termo subtipo é empregado para identificar o PV com sequencia de nucleotídeos de L1 que diferem entre 2-10% daquela do genótipo mais próximo. E por último, são considerados variantes de genótipos de PV quando diferem em menos de 2% na sequência de nucleotídeos de L1, e em 5% na LCR (CAMARA e cols., 2003; WYANT, 2007). As nomenclaturas dos genótipos são datadas pela sigla (HPV) seguida de um número que é dado seqüencialmente, à medida que diferentes genótipos são descobertos, exemplo: HPV Introdução 7 51; HPV 52; HPV 53. (BERNARD e cols., 1994; CAMARA e cols., 2003). Esta definição está de acordo com o que foi estabelecido no International Papillomavirus Workshop realizado em Quebec no ano de 1995 (DE VILLIERS e cols., 2004). Os genótipos dos HPVs são classificados em cutâneos e mucosotrófico dependendo do tropismo pelo tecido, conhecidos como vírus epiteliotrópicos. Os vírus com tropismo cutâneo são aqueles que infectam a pele e os mucosotróficos são os que infectam as mucosas urogenitais, anais e oro-respiratórias (DOORBAR E STERLING, 2001). Os papilomavírus são freqüentemente designados como de alto risco (alto potencial oncogênico) e baixo risco (baixo potencial oncogênico) de acordo com o potencial de progressão para neoplasia. São apresentados alguns exemplos na tabela 01. Tabela 01. Classificação de alguns tipos de papilomavírus divididos em grupos de alto e baixo risco oncogênico. CLASSIFICAÇÃO HPV Baixo Risco HPV Alto Risco 6, 11, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 55, 62, 66, 70, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 72, 81... 52, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82... KANESHIMA e cols 2001. Os HPV de alto risco estão presentes em 97% dos carcinomas de células escamosas da cérvice uterina e incluem os inicialmente identificados em lesões pré-malignas e malignas, assim como os que apresentam seqüências de DNA filogeneticamente relacionados (CAMARA e cols., 2003). Os HPV de baixo risco são encontrados em tecido mucoso e cutâneo e podem causar lesões benignas, tais como: verrugas vulgaris, papilomas, hiperplasia epitelial focal (FEH) e condilomas (ZUR E DE VILLIERS, 1994). De acordo com revisão bibliográfica realizada por CAVALCANTI E CARESTIATO (2006), MCLACHLIN E CRUM, (2001), a afinidade de E6/p53 e E7/pRB variam de acordo com a menor ou maior oncogenicidade do vírus. Acredita-se que as oncoproteínas dos HPV-16 e HPV-18 formem complexos de alta afinidade com a p53 e pRB resultando numa maior agressividade viral. Assim, os mecanismos pelos quais se distingue HPV de alto e baixo risco são: diferentes expressões de genes transformantes, tais com as oncoproteínas E5, E6 e E7; o processo de integração do DNA viral ao DNA da célula hospedeira fica na região não codificante (non-coding region-NCR) é influenciada por fatores exógenos (SANTOS, 2006). Atualmente, dos mais de 100 genótipos diferentes de HPV, sendo que 35 infectam o trato genital feminino, 30 estão associados ao câncer de colo uterino e dezoito são de particular Introdução 8 interesse por estarem frequentemente associados ao desenvolvimento de câncer anogenital, portanto, classificados como HPVs de alto risco (BOSCH e cols., 2002). Esses genótipos de HPV pertencem ao gênero Alphapapillomavirus e às espécies Human Papillomavirus 16, Human Papillomavirus 18 e Human Papillomavirus 53, separadas em três ramos filogenéticos distintos (DE VILLIERS e cols., 2004). A infecção por HPV cervical é encontrada em 5 – 40% das mulheres, em que boa parte pode não apresentar alteração celular com indicativo a infecção por HPV (consideradas assintomáticas). O risco de contaminação aumenta dependendo do número de parceiros (as) sexuais e da precocidade do início da vida sexual (BOSCH e cols., 1995). No hospedeiro humano, os HPVs provocam diversas doenças, dependendo do tipo viral. Os HPV denominados de baixo risco (6, 11, e outros) estão associados a crescimentos epiteliais benignos na pele e mucosas, enquanto os HPV de alto risco (principalmente 16, 18, e 45) associam-se a lesões cancerosas, principalmente no colo uterino, onde DNA-HPV pode ser detectado em até 95% das lesões, por método molecular. Albring e cols (2006) observam variações geográficas quanto aos tipos de HPVs detectados nas amostras de tecidos de câncer cervical. O HPV dos tipos 16 e 18 são os mais comuns encontrados em câncer cervical e precursores de lesões. Muitos estudos têm sugerido que HPV dos tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59 também podem estar associados com câncer cervical e lesões pré-malignas (BOSCH e cols., 1995). Entretanto, o papel patológico de alguns desses e, outros tipos de HPV ainda permanecem sem ser bem estabelecidos (ALBRING e cols., 2006). 1.2.5-Transmissão: A transmissão ocorre geralmente através de contato interpessoal, por se tratar de uma doença sexualmente transmissível (DST), mesmo assim podemos verificar outras formas de transmissão que acarretam a infecção do HPV. A via de transmissão pode ser a sexual ou não sexual por fômites tais como: toalhas, roupas íntimas, além do instrumental ginecológico que prevalecem neste tipo de transmissão. Entretanto a via sexual representa a maioria dos casos (WRIGHT e cols., 2002). Pode haver a transmissão vertical de mães para filhos, via materno-fetal, que compreende o período (gestacional, periparto e intraparto) a placenta fica como principal veiculador do vírus, e durante o parto com a dequitação pode haver contaminação viral. Há Introdução 9 relatos de contaminação por partículas virais transportadas pelo ar, durante o procedimento de ablação de verrugas genitais com laser realizados nos tratamentos ginecológicos (CUTTS e cols., 2007). O HPV fora do organismo tem uma pequena resistência e por este motivo, a transmissão por fomites é viável por um curto período de tempo (BAUER E MANOS, 1998). 1.2.6-Manifestações Clínicas: As principais manifestações clínicas advindas da infecção por HPV apresentam verrugas que podem ser divididas em duas categorias: (A) verrugas cutâneas não-genitais e (B) verrugas mucosas (NEVES, 2005; VIANNA, 2008). A) Verrugas Cutâneas: São classificadas em verrugas (comuns, planares, profundas e planas). Todas apresentam características benignas e sofrem regressão em poucos meses ou anos. As verrugas comuns surgem na forma de pápulas bem demarcadas, ocorrem em grupos ou individuais. No corpo humano aparecem com mais freqüência, na parte dorsal dos dedos e das mãos. Estão associadas geralmente ao HPV do tipo 2 e 4. A verruga plana profunda se caracteriza por ser uma lesão endolítica bem demarcada. No corpo humano estão localizadas nas regiões plantares e palmares e está associado ao HPV tipo 1. As verrugas planas encontradas principalmente em crianças, na forma de múltiplas pápulas pequenas, lisas e ligeiramente elevadas, são encontradas principalmente nas mãos, face, pescoço e região anterior da perna, e são associadas ao HPV do tipo 3 e 10. B) Verrugas Mucosas: Podem ser anogenitais exofíticas, conhecida também como condiloma acuminado. São transitórias, podem sofrer regressão espontânea em meses ou anos, apresentam-se muitas vezes sendo multifocais e grandes. Estão relacionadas aos HPV do tipo 06 e 11. Introdução 10 As verrugas genitais nas mulheres são encontradas na parte posterior do intrório, pequenos e grandes lábios, períneo, ânus, vagina, uretra e colo uterino, e nos homens são encontradas no frênulo do prepúcio, sulco coronal, prepúcio, corpo do pênis, ânus e escroto. Depois de estabelecido as infecções elas podem se apresentar sob três formas distintas: I. Latente; II. Subclínica e III Clínica. I. Latente: Na ausência de evidência clínica, colposcópica, citológica e histológica de lesão, a infecção só poderá ser detectada através de estudos moleculares, com sequenciamento de HPV/DNA. São usadas técnicas de hibridização molecular in situ (HIS), imuno-histoquímica, captura híbrida e Reação em Cadeia de Polimerase (PCR), a mais usada na atualidade. II. Subclínica: É a forma mais freqüente de infecção pelo HPV no colo uterino, diagnosticado por colposcopia com o uso da solução iodo-iodetada de Schiller e o ácido acético 5%. III. Clínica: É a forma a olho nu, não apresentando dificuldade no diagnóstico. O condiloma acuminado (excrescência carnosa, tumor) dos órgãos genitais externos é bem conhecido desde a antiguidade, vulgarmente chamado de Crista de Galo. São lesões exofíticas, com pequenas neoformações sésseis, papilares, múltiplas e cobertas por epitélio queratótico. 1.2.7-Lesões Epiteliais do Colo Uterino: 1.2.7.1-Terminologia: A primeira tentativa de classificar os exames citológicos data de 1943, quando George Papanicolaou (1883-1962) diferenciou os esfregaços vaginais em cinco classes distintas: Classe I (ausência de células atípicas ou anormais); Classe II (presença de células atípicas sem evidencia de malignidade); Classe III (sugestivo de malignidade); Classe IV (muito suspeito de malignidade); Classe V (maligno). Introdução 11 Reagan em 1953 propôs os termos displasia e carcinoma in situ, para descrever as atipias celulares restritas ao epitélio malpighiano do colo uterino. As displasias foram distinguidas em três graus de intensidade (leve, moderada e severa) conforme acometessem os terços (inferior, médio e superior) do revestimento epitelial. O carcinoma in situ seria a lesão maligna que não ultrapassasse a membrana basal do revestimento epitelial (REAGAN e cols., 1953; VIANNA, 2008; SOLOMON e NAYAR, 2004). Em 1967, Richart questiona as classificações justificando que elas não permitem prever a evolução clínica e propõe a denominação de Neoplasia Intra-epitelial Cervical (NIC) de grau (I, II e III), conforme acometessem nos terços inferior, médio e superior do revestimento epitelial, respectivamente. Posteriormente a estes ajustes ocorreram algumas modificações na classificação proposta por Richart, um grupo de especialistas em 1988, reunidos na cidade de Bethesda, nos Estados Unidos, assumiu as críticas endereçadas às outras classificações e propuseram prioridades que refletem três princípios fundamentais nas terminologias anteriores em que se tornou conhecida como Sistema de Bethesda (2001): A terminologia deve comunicar informações clinicamente relevantes a partir do laboratório para o médico responsável pelo atendimento do paciente; A terminologia deve ser uniforme e razoavelmente reprodutível entre diferentes patologistas e laboratórios, devendo ser suficientemente flexível para se adaptar a uma grande variedade de situações laboratoriais e localizações geográficas; A terminologia deve refletir a compreensão mais atual das lesões. O objetivo desses princípios sempre foi promover uma correlação eficaz entre os achados relevantes da citologia, os achados clínicos e os laboratoriais, permitindo assim uma simplificação da análise tanto para o clínico como para o patologista. A última revisão do sistema de Bethesda data de 2001 e foi elaborada pelo Seminário de Trabalho do Sistema de Bethesda de 2001, no qual participaram quarenta e quatro organizações internacionais com interesse na citologia cervical (SOLOMON, DAVEY, KURMAN e cols., 2002; VIANNA, 2008). Introdução 12 1.2.7.2-Classificação das Lesões Epiteliais (Cérvice Uterina): As amostras sem alterações neoplásicas são consideradas, segundo os critérios de Bethesda (2001), como “Negativas para lesões epiteliais e malignidade (NIML)”. Para as lesões neoplásicas a designação usada pelo sistema Bethesda (2001), considera como lesão intraepitelial escamosa (SIL) são lesões não invasivas, ou seja, aquelas restritas ao epitélio de revestimento, que ainda não ultrapassaram a membrana basal epitelial e por último as lesões consideradas como carcinoma de célula escamosa que são lesões invasivas, ultrapassam a membrana basal do epitélio (SOLOMON, DAVEY, KURMAN e cols., 2002). As lesões intra-epiteliais escamosas encontram-se divididas em lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau (LSIL) e de alto grau (HSIL). As LSIL são alterações que histologicamente se restringem ao terço inferior do epitélio e abrangem o efeito citopático do HPV (coilocitose), correspondente as antigas denominações de displasia leve e neoplasia intraepitelial de baixo grau (NIC I). As HSIL são alterações que na histologia comprometem ao (terço médio e superior) do epitélio, correspondendo às displasias (moderada e avançada), as neoplasias intra-epiteliais de médio e alto grau (NIC II e III) e o carcinoma in situ (VIANNA, 2008). 1.2.7.3-Atipias Celulares: Segundo os critérios de Bethesda (2001), a designação de Células Escamosas Atípicas (ASC), é utilizada toda vez que são encontradas células escamosas com alterações da reação núcleo/citoplasma, sendo os núcleos hipercromáticos, irregulares, podendo apresentar multinucleação. Com essa designação subentende-se que o processo é indefinido, podendo estar incluídas alterações não somente relacionadas ao Papilomavírus humano (HPV), como também inflamações, dessecamento, degeneração ou outros problemas não relacionadas ao mesmo (BENNETT e GOLDMAN, 2001). As ASC podem ser subdivididas entre aquelas de significado indeterminado (ASC-US) e aquelas em que não é possível excluir uma lesão de alto grau (ASC-H). As células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US) são aquelas que apresentam aumento da relação núcleo/citoplasma, com um volume nuclear 2 a 3 vezes maior do que o núcleo de uma célula escamosa intermediária normal, núcleos discretamente hipercromáticos, com a cromatina distribuída de forma um pouco irregular e o citoplasma densamente orangeofílico (SOLOMON e Introdução 13 NAYAR, 2004). As células escamosas atípicas em que não é possível excluir lesão de alto grau (ASC-H) são alterações nas quais as células alteradas têm o tamanho das células metaplásicas, aparecendo de forma isolada ou em pequenos fragmentos com menos de dez células. Essas células apresentam núcleos hipercromáticos, irregulares, formas alteradas e com tamanho de (1 a 2) vezes maiores do que o núcleo de uma célula normal (SOLOMON e NAYAR, 2004; VIANNA, 2008). Os Carcinomas de Células Escamosas (CEC) são tumores malignos invasivos, mostrando diferenciação para células escamosas. Os critérios mínimos de celularidade escamosa definidos para que uma amostra de um esfregaço convencional seja considerada adequada é a presença de 8000 a 12000 células epiteliais escamosas bem preservadas e bem visualizadas. Entretanto, se o esfregaço estiver em meio líquido, ele deve conter no mínimo 5000 células escamosas bem individualizadas e bem preservadas (STUDEMAN, 2003; VIANNA, 2008). 1.2.8-Evolução das Infecções, NIC: Um possível papel do HPV na etiologia do câncer ano-genital tem sido sua capacidade de induzir lesões no trato genital feminino, que podem evoluir como Neoplasia Intra-epitelial Cervical (NIC) e posteriormente carcinoma invasivo. As neoplasias escamosas intra-epiteliais cervicais representam por ano quase 1 milhão de novos casos nos Estados Unidos (STUDEMAN, 2003). A NIC constitui um leque de lesões cervicais escamosas identificadas pela histologia, apesar de ser também utilizada na classificação citológica, e pode ser classificada em graus I, II e III. A graduação da NIC consiste na definição do aspecto morfológico de severidade da lesão precursora do câncer, e também tem sido utilizada no aspecto clínico-evolutivo citológico pelo Sistema de Bethesda. Esse sistema atual de classificação agrupa os aspectos sugestivos de NIC I e sinais de infecção pelo HPV nas chamadas lesões de baixo grau (LSIL), e os de NIC II e III em lesões de alto grau (HSIL) (SOLOMON e NAYAR, 2004). Nas evoluções das neoplasias intra-epiteliais, o arranjo das células escamosas da ectocérvice fica desorganizado, chamadas de células atípicas. Quando a desorganização ocorre apenas no terço profundo, temos a displasia leve, conhecida como NIC grau I ou (NIC I). Quando a desordem envolve os dois terços profundos da espessura do epitélio, preservando apenas as camadas mais superficiais, temos a displasia moderada que é conhecida como NIC II. Introdução 14 Se o desarranjo é observado em toda a espessura, envolvendo mais de dois terços do epitélio, temos a NIC grau III ou NIC III, conhecida também como carcinoma in situ. A lesão intraepitelial escamosa cervical de alto grau compreende as NIC graus II, III e carcinoma in situ (NEVES e cols., 2005). Nos dias atuais a NIC III é considerada a verdadeira lesão precursora do câncer cervical e existem dúvidas sobre o manejo das lesões de menor grau, principalmente a NIC I, cuja incidência é maior em jovens e cuja evolução ainda é pouco conhecida (SINGER, 2000). Buscam-se fatores de risco para adquirir a lesão assim como fatores preditivos de prognóstico, ou seja, marcadores que possam predizer qual será a evolução natural da NIC I (SOLOMON e NAYAR, 2004). A neoplasia intra-epitelial cervical pode permanecer em um estágio não invasivo por até vinte anos e desprender células anormais que podem ser detectadas pelo exame citológico, o que aumenta a eficácia da citologia na prevenção desse câncer. Também pode não evoluir necessariamente para um câncer, inclusive regredir espontaneamente. O risco de persistir ou evoluir para um câncer aumenta de acordo com a gravidade da displasia. Além disso, vários estudos indicam que a persistência da infecção pelo HPV, principalmente de alto risco, é necessária para o desenvolvimento e progressão da NIC para carcinoma invasivo (VIANNA, 2008). A infecção pelo HPV é o principal fator de risco para o desenvolvimento de NIC e do carcinoma invasivo. Clinicamente os vírus têm sido subdivididos entre grupos de baixo risco (HPV 6, 11, 42, 44) e de alto risco (HPV 16, 18, 31, 33). O grupo de baixo risco não tem sido associado ao carcinoma cervical e NIC de alto grau (SHEPHERD e cols., 1996; MERKELBACH-BRUSE e cols., 1999). O HPV 16 é detectado em 93% dos casos de câncer cervical e 65% dos casos de NIC III. Infecção por HPV de alto risco tem sido reconhecida como principal fator de risco para desenvolvimento de NIC e carcinoma invasivo (NIMAKO e cols., 1997). No trabalho realizado por (TER HARMSEL e cols., 1999), foi detectado o HPV em torno de 93% dos esfregaços cervicais de pacientes com NIC I, 95% com NIC II e 96% com NIC III; e nos carcinomas cervicais, o HPV foi detectado entre 84 e 100% dos casos. Apesar dos carcinomas in situ e invasivo serem sem sombra de dúvidas ligada à infecção pelo HPV 16 e outros HPV de alto risco, a atenção médica para o HPV não é muito realçada nesses casos avançados. A maior importância é dada às neoplasias intra-epiteliais cervicais. A tipagem do HPV tem um importante significado no prognóstico terapêutico das NIC pela distinção entre os tipos de HPV de alto e baixo risco oncogênico (MALUF, 2007). Introdução 15 A presença do HPV como infecção do colo uterino por si só não é suficiente para a oncogênese, sendo necessárias mudanças adicionais na célula hospedeira (MUÑOZ, 2000; MALUF, 2007). Processos genéticos múltiplos levam à transformação da célula e ao desenvolvimento de tumores malignos. No entanto, há necessidade de alguns eventos moleculares ocorrerem, para que se dê a progressão da doença (JOHNSON e cols., 1991). 1.2.9-Exames Ginecológicos: Os métodos de diagnóstico das lesões induzidas pelos HPV têm como base a identificação de alterações celulares características associadas à replicação viral e podem ser avaliados através dos exames clínicos laboratoriais que tem como base o exame Papanicolau que incluem a: citologia oncológica, colposcopia, histologia, histoquímica, imunohistoquímica, citometria e Colpocitologia. Outros métodos mais precisos são as técnicas de biologia molecular: Hibridização, Reação em Cadeia da Polimerase e análise do genoma com biochip ou microaray (DE VILLIERS e cols., 2004). 1.2.9.1-Papanicolaou: O teste de Papanicolau é um exame ginecológico de citologia cervical mais importante e realizado entre as mulheres na prevenção ao câncer do colo do útero. O nome vem de seu idealizador, o médico grego Georgios Nicholas Papanicolaou (1883-1962), considerado o pai da citopatologia. Por se ter tornado comum no Brasil escreve-se Papanicolau (MEISELS, 1992). O exame deve ser realizado por todas as mulheres com vida sexual ativa. Ele não detecta o vírus, mas sim as alteraçoes que o vírus pode causar nas células. Após três exames anuais consecutivos com resultados normais, o mesmo, pode ser realizado com menor frequencia (anual ou a cada seis meses), de acordo com indicação do médico (MURTA e cols., 1997). O sucesso do exame ginecológico deve-se ao seu caráter preventivo, podendo detectar a presença do HPV, devido às alterações celulares e outras doenças que ocorram no colo do útero, antes da instalação do quadro infeccioso. O exame ginecológico não é somente uma maneira de diagnóstico, mas principalmente para determinar o risco de uma mulher vir a desenvolver o câncer (KOUTSKY e cols., 1998). Introdução 16 O exame completo é constituído do exame das mamas e depois o exame ginecológico. Este é constituído pelo exame externo da vulva, visualização da vagina e o colo do útero. Também consiste no exame de toque vaginal, para examinar os órgãos internos da pélvis feminina. O exame ginecológico também é chamado de citologia oncótica, colpocitologia, Papanicolau, e fora do Brasil é conhecido como Pap Test ou Pap Smear. Este exame pode ser complementado com a Colposcopia (SCHNEIDER e cols., 1987). 1.2.9.2-Colpocitologia: O exame utilizado para a prevenção do câncer do trato genital feminino inferior (vulva, vagina, colo e corpo uterino) considerado confiável na detecção de lesões pré-malignas e malignas, quando a pesquisa é elaborada por meio da coleta tríplice (vagina, ectocérvice e endocérvice). A prevenção deve ser utilizada por pacientes sintomáticas ou assintomáticas, com ou sem vida sexual ativa, mesmo naquelas que tenham sido submetidas à histerectomia total. O exame avalia também a microflora vaginal, apesar de não ser específico para tal pesquisa (KOUTSKY e cols., 1988). É inquestionável a grande contribuição do exame colpocitológico (CO) como método de rastreamento primário das lesões cervicais precursoras e invasoras nos programas de prevenção do câncer de colo uterino, reduzindo em até 70% as taxas de mortalidade em países desenvolvidos. Porém são discutíveis sua viabilidade e eficácia em países em desenvolvimento, como o Brasil, e novas propostas para rastreamento têm surgido (KARLSSON e cols., 1995). O exame colposcópico e a avaliação histológica representam um trio comprovadamente eficaz. O objetivo dos programas de prevenção do câncer de colo uterino é o diagnóstico e tratamento da lesão precursora, a neoplasia intra-epitelial cervical (NIC) (KOUTSKY e cols., 1988). A colpocitologia vem sofrendo uma série de críticas nos últimos anos, principalmente devido às altas taxas de falso-negativos, que variam de 5% a 70% (FRANCO e cols., 2003). Existem várias limitações comprovadas do método, como a possibilidade de amostra celular insuficiente, a preparação inadequada dos esfregaços e leitura incorreta das lâminas (WRIGHT, 2003). Há ainda uma grande variabilidade de discordância nos resultados citológicos entre diferentes observadores (10% a 100%) e questiona-se muito a subjetividade dos resultados citológicos (KARLSSON e cols., 1995). Além disso, os números de falsos negativos e falso- Introdução 17 positivos aumentam em pacientes com mais de 40 anos de idade (WRIGHT, 2003; ACHA, 2005). As tentativas de minimizar as taxas de resultados falsos, positivos ou negativos, leva à emissão de laudo de citologia não conclusiva. Admite-se que até 80% das pacientes são submetidas à colposcopia desnecessária (FRANCO e cols., 2003). Nos países em desenvolvimento este problema ainda é maior devido à falta de padronização e controle de qualidade adequado dos laboratórios (PARASHARI e cols, 2000). 1.2.9.3-Colposcopia: Exame que permite visualizar a vagina e o colo do útero através de um aparelho chamado colposcópio. Este aparelho permite o aumento de 10 a 40 vezes do tamanho normal. Também é com o colposcópio que é examinada a vulva, e o nome deste exame é vulvoscopia (WRIGHT, 2003). Durante a colposcopia são usados produtos químicos e corantes para realçam as áreas a serem examinadas. Este exame é geralmente recomendado para mulheres que tem um resultado anormal do exame de Papanicolau ou para aquelas que durante o exame ginecológico foi notada alguma alteração. A colposcopia também é indicada quando é necessária uma biópsia do colo do útero ou quando há uma suspeita de HPV. Isso se faz necessário, pois pode detectar carcinoma do colo em fase precoce, podendo ser efetuado tratamento adequado (SANKARANARAYANAN e cols., 2003). 1.2.9.4-Citologia Esfoliativa: A citologia esfoliativa é realizada a partir de um simples esfregaço, de material colhido com uma escova ou com uma espátula de madeira ou metálica, que quando friccionados sobre a superfície da lesão, podem recolher células. O objetivo deste exame é detectar células alteradas, obtidas a partir de uma área lesada. Essas células podem fornecer informações importantes sobre a natureza da lesão, permitindo não só o diagnóstico, como também o acompanhamento de pacientes previamente tratados, no sentido de afastar possíveis recidivas (ACHA, 2005). Introdução 18 1.2.10-Técnicas Moleculares: A identificação do DNA-HPV bem como seu tipo e carga viral são realizados por métodos de biologia molecular. No momento, dois tipos de métodos de detecção de DNA-HPV têm sido descritos. Um está baseado na detecção direta e o outro na amplificação através de Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). As técnicas incluem hibridização Southern Blot, hibridização dot slot blot, hibridização in situ (WYANT, 2007). A hibridação molecular tem como princípio básico a utilização de uma sonda, a qual é constituída por uma sequência conhecida de DNA ou RNA, obtidos por clonagem ou síntese química e que contém uma marca que permite a visualização seletiva; a sonda liga-se à sequência de interesse (sequência alvo), sendo a visualização feita a partir da marca. Esta é uma técnica utilizada para detectar o genoma viral (BRASILEIRO, 2004). A técnica de microarrays ou biochip é o método que associa a técnica de análise do genoma com as de informática, as quais mostram as diferenças através da comparação qualitativa e quantitativa da expressão gênica dos tecidos baseada na intensidade da reação para cada fragmento examinado. Essa técnica utiliza uma sequência de DNA conhecida (oligonucleotídeos), denominada cDNA, um RNA isolado do tecido da amostra teste (tumor) e um RNA do tecido da amostra de referência (normal). Os RNA das amostras teste e referencia são transcritos separadamente para o cDNA, marcados respectivamente com fluorosceína de cores diferentes (uma cor para cada conjunto RNA/cDNA) e posteriormente hibridizados para que se ordenem. A fluorescência resultante revela respectivamente os níveis relativos de cada RNA transcrito, permitindo uma comparação qualitativa e quantitativa entre a amostra teste e a amostra referência. Desta forma ela permite determinar a instabilidade ou perda da heterozigose na sequencia genética da um cromossoma especifico (VIANNA, 2008). A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) baseia-se em uma reação de amplificação de sequencias especificas de DNA ou RNA, sendo este, conhecido como uma reação reversa, seguida de uma PCR (RT-PCR). Reações estas que ocorrem em um termociclador, com controle automático de variação de temperatura em função do tempo. Ao final da reação se obtém aproximadamente 10 bilhões de cópias da sequencia alvo, sendo possível sua visualização e manipulação. A técnica de PCR é utilizada para detectar o genoma de vírus, bactérias ou outros parasitas; também na determinação de alterações genéticas e doenças geneticamente transmissíveis através da presença do RNA mensageiro (BRASILEIRO, 2004; VIANNA, 2008). Introdução 19 1.2.10.1-Sensibilidade das Técnicas Moleculares no Diagnóstico do HPV: A hibridização in situ, a captura híbrida e a reação em cadeia da polimerase (PCR) são técnicas moleculares comumente usadas para detecção e tipagem do HPV. Atualmente, a PCR é considerada o método mais sensível para a detecção da infecção pelo HPV, uma vez que a hibridização in situ é limitada pelo número de cópias de HPV (MERKELBACH-BRUSE e cols., 1999). Outros estudos mostram que a técnica de captura híbrida é um método de fácil realização e com boa sensibilidade. Entretanto, uma das limitações para seu emprego rotineiro é o alto custo (JORDÃO e cols., 2003; MALUF, 2007). Com os avanços das técnicas moleculares pode-se verificar nas amostras com DNAHPV a presença de mais de um tipo de HPV em um mesmo epitélio, particularmente em lesões de baixo grau (RICHART e cols., 1967). MALUF (2007) em trabalhos com material de conização por NIC III detectou através da PCR DNA-HPV dos HPV-16 e HPV-18 na maioria dos casos positivos (87,9%) e, apenas em 9,1% dos casos havia HPV-6 e HPV-11 concomitantemente. CAMARA e cols (2003) observaram o HPV-16 em 43,8% dos casos de NIC de alto grau e neoplasias do colo uterino. O subtipo 58 foi encontrado em 12,5% dos casos, o HPV-31 em 10%, o HPV-53 em 6,3% e o HPV-18 e 33 em 3,8% dos casos. No Brasil, em estudo detectaram DNA-HPV através da PCR em casos de NIC III. O HPV 16 foi o subtipo mais freqüentemente encontrado, seguido dos subtipos 33, 18 e HPV-31. A prevalência de HPV com subtipo não classificado foi de 6% (RABELO-SANTOS e cols., 2003). ROBERTS e cols., (2006) usando a técnica da PCR, prevalência de 32,3% de HPV 16, e 6 % de HPV 18 em 1848 biópsias cervicais. O HPV 16 foi detectado em 47,5% e os HPV 18 e 26 em 5,9% dos casos de NIC II e NIC III. Cerca de 12% dos casos continham HPV de dois subtipos e 2,5% três subtipos. 1.2.11-Tratamento: Como não existe cura para o HPV, o primeiro objetivo de tratamento da infecção clínica é a remoção dos condilomas visíveis. Sabe-se que a regressão espontânea dos condilomas pode ocorrer em até 20% dos casos, porém o atraso no tratamento pode levar à disseminação local tornando as lesões mais extensas e potencialmente mais graves, além do potencial de Introdução 20 transmissão. Uma variedade de métodos citodestrutivos tem sido utilizada para remover as verrugas, incluindo excisão, vaporização a laser, eletrocauterização, crioterapia, podofilina, ácido tricloroacético, 5-FU e podofilotoxina (CAMARA e cols., 2003). Apesar de existirem várias opções terapêuticas para o tratamento das verrugas genitais, quase todos os tipos de tratamento possuem taxas de resposta em torno de 50 a 75%, sendo as taxas de recorrência em torno de 30%. Aproximadamente 80% das pacientes obtêm cura dentro do primeiro ano de tratamento, o restante (20%) necessitará de terapias múltiplas em longo prazo (FERENCZY A, 1999). 1.2.12-Situação Epidemiológica: O câncer de colo de útero por HPV é a doença de transmissão sexual mais comumente diagnosticada em populações jovens sexualmente ativas. Estima-se que 75% da população em idade reprodutiva estejam infectadas com HPV genital e que a maioria das mulheres sexualmente ativas irá adquirir infecção por HPV ao longo da vida. É o segundo tipo de câncer mais comum entre as mulheres no mundo, com cerca de 471.000 nos casos e 230.000 mortes por ano. 80% desses casos ocorrem em países em desenvolvimento (WYANT, 2007). Há 50 anos o carcinoma cervical era a principal causa de morte por câncer nos Estados Unidos. Entretanto, as taxas de incidência e de mortalidade declinaram significativamente desde 1960 (PEREIRA e cols., 2003). Acredita-se que a diminuição da incidência, bem como da morbidade e da mortalidade, decorrem em parte do rastreio através da citologia esfoliativa, que permitiu o diagnóstico de lesões precursoras tratáveis. A American Cancer Society (ACS) estima em 11.150 o número de novos casos de câncer cervical invasivo nos Estados Unidos para 2007, e em 3.670 o número de mortes (ACS, 2007). Nos casos de estadiamento inicial o prognóstico é bom, porém geralmente um terço das pacientes evolui para a morte (INCA, 2007). O Ministério da Saúde estimou 19.260 o número de novos casos de câncer de colo do útero no ano de 2006, no Brasil. Excluindo os tumores de pele não melanoma, o câncer de colo do útero foi o mais incidente na região Norte com 22 casos para cada 100.000 mulheres (22/100.000), o segundo mais incidente nas Regiões Sul (28/100.000), Centro-Oeste (21/100.000) e Nordeste (17/100.000), e o terceiro mais incidente com (20/100.000) na região Sudeste (Brasil, 2002). Na região Centro-Oeste, a estimativa foi de 1.430 novos casos para 2006, sendo 220 no Distrito Federal. Esses números podem estar subestimados, visto que, tanto o Introdução 21 câncer de colo do útero, quanto à infecção por HPV, não são doenças de notificação compulsória (BRASIL, 2002; WYANT, 2007). Os países integrantes do MERCOSUL, não apresentam dados estatísticos de prevalência de infecção pelo HPV na população sexualmente ativa de seus diversos Estados e Regiões. Os dados acerca da ocorrência do HPV, bem como de seus genótipos, terminam por serem obtidos na análise de pacientes portadoras de neoplasias intra-epiteliais cervicais e carcinoma invasivo do colo uterino (SOUZA e cols., 2004). O Instituto Nacional do Câncer (INCA) aponta o câncer de colo do útero como a terceira neoplasia maligna mais comum entre as mulheres brasileiras, sendo superado apenas pelo câncer de pele (não melanoma) e pelo câncer de mama, constituindo a quarta principal causa de morte por câncer em mulheres (INCA, 2007). No Brasil, entre 1979 e 2000 houve um aumento de 33.1% na mortalidade por câncer do colo uterino. Em 2003, 16.480 novos casos foram estimados, com 4.110 óbitos. As taxas de incidência e mortalidade para câncer do colo uterino na América Latina estão entre as mais altas do mundo. O câncer cérvico-uterino tem tido sua ocorrência associada ao nível de desenvolvimento dos países. Quanto menos desenvolvido um país maior o número de casos de câncer cérvico-uterino (BRASIL, 2002). O International Biological Study on Cervical Cancer demonstrou em 1995, uma análise estatística realizada em 22 países registraram que o HPV esteve associado com o câncer do colo uterino em 75 a 100% dos casos, com média de 92,9% (BOSCH e col., 1995). Variações na prevalência do DNA-HPV são, entretanto, altamente dependentes da técnica utilizada. A prevalência é maior quando se utiliza como técnica a PCR em relação às outras técnicas. O HPV está presente em 99,7% das pacientes com câncer invasivo quando a pesquisa foi feita pela técnica da PCR (WALBOOMERS e cols., 1999). Todavia, vale ressaltar que menos de 1% das mulheres com infecção por HPV de risco oncogênico irão desenvolver câncer do colo uterino (JOSEFSSON e cols., 2000). Estudos em mulheres brasileiras observaram que o DNA-HPV está presente em 55,2% das pacientes com câncer do colo uterino quando a pesquisa é feita pela captura híbrida, e 91% quando se utiliza a PCR (RABELO-SANTOS e cols., 2003). No Rio de Janeiro, estudos baseados na pesquisa do DNA-HPV em espécimes de 514 biópsias de pacientes com neoplasias intra-epiteliais cervicais, encontraram 73,9% de positividade para PCR (CAVALCANTI e cols., 2000). A prevalência do HPV associado ao câncer do colo uterino apresenta variações geográficas. De acordo com o International Biological Study on Cervical Câncer, o HPV 16 é o Introdução 22 mais prevalente em 21 países estudados, com exceção da Indonésia e Argélia, onde o tipo 18 foi o mais encontrado (YAMADA e cols., 1997). Na América Central e América do Sul, os cinco tipos de HPV mais prevalentes são os 16, 18, 45, 31 e 33. No Brasil, o HPV 16 é o mais prevalente em todas as regiões, todavia, há variações em relação aos outros tipos. O HPV 18 é o segundo mais prevalente nas regiões Norte, Sudeste e Sul, enquanto que o HPV-31 e HPV-33 são o segundo mais prevalente na região Nordeste e Central (BRASIL, 2002; RABELO-SANTOS e cols., 2003). O reconhecimento de um número limitado de tipos de HPV, como promotores do desenvolvimento do câncer do colo uterino abre novas perspectivas na prevenção desta neoplasia. Primeiro como prevenção primária, o uso efetivo e seguro das vacinas de HPV têm sido testados. Segundo, na prevenção secundária por introdução de testes de HPV aos programas de rastreamento. A Associação Médica Brasileira, e Conselho Federal de Medicina, recomendam o diagnóstico e tratamento das lesões precursoras do câncer do colo uterino como principal forma de prevenção (WYANT, 2007). O uso de preservativo é recomendado aos indivíduos que nunca tiveram contato com o HPV, bem como naqueles com infecção prévia, evitando as recorrências. Todavia, vale ressaltar que apesar de 10 a 20% das mulheres com HPV cervical detectado por PCR apresentarem alterações citológicas do exame de Papanicolaou, mulheres com Papanicolaou normal podem apresentar uma prevalência de HPV que varia de 3,7 a 47,9% (WIELAND e cols., 1997). Outro estudo realizado com base na análise colpocitológica de 3.715 pacientes submetidas a exame de rastreamento, o Papanicolaou registrou a ocorrência de 4,6% de Papilomavírus humano (MOTTA e cols., 1996). Segundo SOUZA (2004), nas duas últimas décadas os avanços nas técnicas de biologia molecular permitiram a realização de diversos estudos epidemiológicos que identificaram uma forte associação entre a infecção por HPV e o câncer de colo de útero. Essa hipótese foi analisada por diversos pesquisadores no mundo inteiro, de maneira que organizações acadêmicas internacionais concluíram que a infecção por HPV e o câncer de colo de útero se associam de forma causal, considerando que, a infecção por HPV é uma causa necessária, mas precisa de outros fatores para que ocasione o câncer de colo de útero (WALBOOMERS e cols., 1999; WYANT, 2007). Entre esses fatores, temos o tipo do vírus, e seu risco oncológico, a carga viral, persistência da infecção e sua integração com a célula hospedeira (SANTOS, 2004). Estudos referentes à etiologia viral do carcinoma de células escamosas (CCE) têm-se concentrado nos vírus do papiloma humano (HPV), comprovadamente associados aos cânceres de cérvice uterina e cânceres anogenitais de modo geral (MILLER e JOHNSTONE, 2001). Introdução 23 Como não existe cura para o HPV, o tratamento da infecção clínica é a remoção dos condilomas visíveis. Uma variedade de métodos citodestrutivos tem sido utilizada para remover as verrugas. Apesar de existirem várias opções terapêuticas para o tratamento das verrugas genitais, não se tem no estado de Rondônia um levantamento do tipo de HPV envolvidos nestes tratamentos. A detecção do DNA do HPV por técnica molecular (PCR-RFLP) em Porto Velho, Rondônia, é importante, mas se torna imprescindível discriminar o tipo de HPV presente em materiais clínicos provenientes das mucosas genitais, a fim de verificar se os perfis eletroforéticos identificados por RFLP pertencem ao grupo de alto ou baixo potencial oncogênico no desenvolvimento de neoplasias cervicais. Além disso, o entendimento com base nos conhecimentos da biologia molecular fornecerá informações que incidirão no esclarecimento nas relações de suscetibilidade e/ou resistência entre parasita/hospedeiro, para fins antropogenéticos ou médicos. Com isso, nós propomos um estudo para avaliar quais os tipos de HPV que se encontram circulantes no município de Porto Velho-RO e obter um levantamento epidemiológico (banco de dados) que nos forneça o conhecimento que possibilite contribuir com toda comunidade cientifica em uma melhor interpretação no diagnóstico precoce do câncer uterino e sua evolução. Objetivos 25 2. OBJETIVOS: Objetivo Geral: Realizar o levantamento genético dos tipos de HPVs (alto e baixo potencial oncogênico) em mulheres que realizam preventivo no Centro de Referencia de Saúde da Mulher (CRSM) em Porto Velho, Rondônia. Utilizando Técnicas Moleculares no período de 2008 – 2009. Objetivos Específicos: Rastrear por método da PCR a presença do DNA/HPV em células cervicais obtidas durante o exame do preventivo. Caracterizar por método de RFLP o perfil eletroforetico dos DNA/HPVs encontrados. Classificar o potencial oncogênico dos HPVs encontrados neste estudo, conforme literatura existente. Confrontar os dados moleculares (PCR) com os dados citológicos no diagnóstico do HPV, conforme a nomenclatura do Sistema de Bethesda (2001). Metodologia 26 3. METODOLOGIA: 3.1-Estratégias de Ação: 3.1.1-Registro de dados e Interação Médico / Paciente / Pesquisa Científica: Esta etapa do trabalho iniciou-se logo após a aprovação do comitê de ética em Pesquisa do Núcleo de Saúde – CEP/NUSAU (FR: 214785; Carta 018/CEP/NUSAU) da Universidade Federal de Rondônia – UNIR (anexo I). Posteriormente a isto, foi esclarecido em detalhes o conteúdo deste estudo para a paciente (voluntária) e a mesma não tendo duvida alguma autorizou e assinou Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, que segue em duas vias, sendo a primeira para o pesquisador e a segunda via fica com a voluntária que aceitou participar do estudo (Anexo II), também é realizado um Questionário Antropogenético para analise dos dados (Anexo III). 3.1.2-Local de Coleta: A coleta foi realizada no Centro de Referência da Saúde da Mulher, localizado nas dependências da Policlínica Rafael Vaz e Silva. Endereço: Rua Jaci Paraná, nº 1943, Bairro Nossa Senhora das Graças, Porto Velho-RO. 3.1.3-Tamanho Amostral: As coletas foram realizadas no período de um ano que compreendeu agosto de 2008 a agosto de 2009. Neste período foi possível obter 334 amostras de mulheres que procuraram o CRSM. O critério de inclusão utilizado foi de todas as mulheres que aceitaram participar do projeto. O critério de exclusão utilizado foi de todas as mulheres que não aceitaram participar do projeto. 3.1.4-Coleta e Acondicionamento das Amostras: A coleta foi obtida por curetagem endocervical com cotonete de cerdas e acondicionadas em tubos Vacuntainer de 5ml contendo 400µL de tampão TE I (Tris-HCl Metodologia 27 10mM; EDTA 1mM pH 8,0 e Tween 10%). Parte da amostra de células cervicais foi transportada ao laboratório do CRSM para análise citológica e outra parte (cotonete cervical) encaminhado ao CIBEBI-UNIR, onde foi mantido refrigerado até o processo de extração do DNA-HPV (KANESHIMA e cols., 2001). 3.2-Análises Laboratoriais: 3.2.1-Método Citológico: O material citopatológico foi obtido de duas formas, raspado ectocervical e escovado endocervical. A coloração das lâminas foi realizada pelo método convencional (coloração de Papanicolaou) avaliadas no próprio laboratório do CRSM. Os resultados foram classificados em: alterações inflamatórias, atipias de células escamosas de origem indeterminada (ASCUS), lesões de baixo grau (NIC I e HPV), lesões de alto grau (NIC II e NIC III), atipias glandulares de origem indeterminada (AGUS), adenocarcinoma in situ e carcinoma invasor escamoso ou glandular. As atualizações das nomenclaturas utilizadas nos resultados fornecidas pelo laboratório do CRSM foram realizadas no CIBEBI/UNIR, conforme a nomenclatura do Sistema de Bethesda (2001). 3.2.2-Método Molecular: 3.2.2.1-Extração do Material Genético gDNA: Os tubos com os fragmentos celulares (endocervical e ectocervical) acondicionados em 400μl de TE I, foram incubados em banho-maria por 2 horas a 65 °C. Após, decorrido esta etapa, foi resfriado a 37 °C, adicionado 5μl de tampão TPK (tampão proteolítico proteinase K 10mg/mL) e incubado por 3 horas. Após incubação são retirados a cerdas e acrescentado 500μl de clorofórmio e centrifugado por 3 minutos a 13000rpm em centrifuga refrigerada. O sobrenadante foi transferido para um microtubo de 1,5ml e adicionado 500μl de etanol e deixado agir por 5 minutos, após isso foi homogeneizado levemente e centrifugado por 5 minutos a 12000rpm. Descartou-se o sobrenadante e o precipitado foi ressuspenso em tampão TE II (Tris-HCl 10mM; EDTA 1mM; pH 8,0) e armazenado em freezer. Estes procedimentos encontram-se de acordo com o protocolo de extração segundo BAUER E MANOS (1998). Metodologia 28 A confirmação da extração do material biológico gDNA, utilizou-se o método de PCR com os iniciadores (primers) do segmento de DNA do lócus da G-6-PD Xq28, a partir do material genômico das amostras. Estes primers promovem a amplificação de um fragmento de 320 pares de base (tabela 02). Tabela 02. Seqüência dos primers para amplificação dos fragmentos correspondentes ao gene G-6-PD. Seqüências de Primers TM Bases 5’ AgggCAACggCAAgCCTTAC 3’ 3’ CTgCgTTTTCTCCgCCAATC 5’ 54.5 ºC 320pb Para o desempenho da PCR foi utilizado um mix com volume final de 25 l composto de: água Milli-Q autoclavada; 10pmol/ l de cada primer, 200 M de cada dNTPs; 200 mM de Tampão Buffer 10x (50mM KCl e 10 mM Tris-HCl (pH 8,5)); 1,5 mM de MgCl2 (50 mM); 1 U/ Taq polimerase e 3ul de DNA (BAUER E MANOS, 1998). O termociclador da marca, Eppendorf Mastercycler, foi utilizado para a realização da PCR com programa de 94°C por 3 minutos, seguido por 32 ciclos de 94°C por 1 minuto, 56°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto. Acrescentou-se 1 minuto a 72°C e manteve-se a temperatura a 4°C. Para a visualização utilizou-se gel de agarose a 1,5% corado com brometo de etídeo, figura 04. M 1 2 3 4 neg. 100pb Figura 04. Gel de agarose 1,5%. Confirmação da extração do material biológico gDNA por PCR, com a amplificação de fragmentos com 320pb correspondente ao gene G-6-PD. M: Ladder com 100pb; Linhas: 1, 2, 3 e 4 material biológico e neg.: controle negativo da reação. Metodologia 29 3.2.2.2-Verificação da Presença do DNA-HPV no gDNA: Para a detecção e amplificação do material genético viral do HPV (DNA-HPV), utilizaram-se os primers universais MY09 e MY11 (Tabela 03). Estes iniciadores possibilitam amplificar a região L1, porção altamente conservada nos diversos tipos de HPV. O fragmento correspondente a esta região apresenta uma sequencia de 450 pares de base (pb). Tabela 03. Seqüências dos oligonucleotideos correspondentes ao fragmento de 450pb da região L1. Primer Sequencias Referencia MY09/MY11 W= A+T; R= A+g; 5’CgTCCMAARggAWACTgATC 3’ 5’gCMCAgggWCATAAYAATgg 3’ M= A+C; K= g+T; (Bauer e Manos, 1998) Y= C+T Para a técnica de PCR é realizado um mix de solução composta pelos seguintes reagentes e concentrações, respectivamente: Água Milli-Q autoclavada; 5pmol de cada primers; Tampão Buffer 10x (50mM KCl e 10 mM Tris-HCl (pH 8,5)); 2,5 mM de dNTPs; 50 mM de MgCl2; 5 U de Taq DNA polimerase e 6μL de DNA, totalizando um volume final de 50μL. O termociclador da marca, Eppendorf Mastercycler, foi utilizado para a realização da PCR com programa de 94°C por 3 minutos, seguido por 32 ciclos de 94°C por 1 minuto, 56°C por 1 minuto e 72°C por 1 minuto. Com mais 72°C por 1 minuto e mantida a temperatura a 4°C. A confirmação de amplificação da região L1 do DNA/HPV por PCR foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 1,5% corado em solução com brometo de etídeo (1μg/ml) por 15 minutos e visualizado com luz ultravioleta e fotografado com sistema de fotodocumentação. 3.2.2.3-Caracterização do perfil eletroforético dos genótipos de HPVs por RFLP: Para a caracterização dos tipos de HPVs existentes foi utilizada a técnica da análise do Polimorfismo dos Fragmentos de Restrição RFLP, do inglês (Restriction Fragment Length Polymorphism). Esta técnica utilizou 7 enzimas de restrição para cada amostra analisada, Bam HI, DdeI, Hae III, Hinf I, Pst I, Rsa I, Sau 3AI, que reconhecem e clivam os sítios polimórficos existentes na região L1 amplificada na PCR, conforme trabalho realizado por Metodologia 30 BERNARD e cols., 1994. As condições para os procedimentos de RFLP seguem as condições estabelecidas pelo fabricante. A leitura dos padrões de bandas produzidos após clivagem nos sítios de restrição pelas endonucleases indica o perfil eletroforético do HPV que pode ser comparado ao mapa físico, já conhecido na literatura, anexo IV. A visualização do perfil eletroforetico é realizada submetendo o produto de digestão à técnica de eletroforese em gel de agarose a 2,5% e corado em solução com brometo de etídeo (1μg/ml) por 15 minutos. Após isso, é visualizado com luz ultravioleta e fotografado. 3.3-Análise Estatística: Os dados foram incorporados em um banco de dados de SPSS/Windows (versão 10) para execução das análises bivariada das diferenças entre as proporções (χ2) e os meios (ttestes). Metodologia 31 3.4-Organograma Metodológico Extração de DNA (Proteinase K) Confirmação da Extração do gDNA via PCR lócus da G-6-PD Xq28 Confirmação em Gel de agarose 1,5% (Negativa) Confirmação em Gel de agarose 1,5% (Positiva) Re-extração do gDNA Amplificação da região (L1) do DNA/HPV via PCR do gDNA Confirmação em Gel de agarose 1,5% da presença (+) do DNA/HPV Confirmação em Gel de agarose 1,5% da ausência (-) do DNA/HPV Restrição enzimática por RFLP de cada amostra com a presença (+) do DNA/HPV Bam HI Dde I Hae III Hinf I Pst I Rsa I Visualização em gel de agarose 2,5% do Perfil eletroforético após Restrição enzimática dos tipos de HPVs Análise Estatística Sau 3AI Resultados 32 4. RESULTADOS: 4.1-Presença ou ausência do Material Genético Viral do Papilomavírus Humano (DNA-HPV) M C+ 1 2 3 4 5 neg. 100 pb Figura 05. Gel de agarose 1,5%. Confirmação da amplificação por PCR do DNA-HPV correspondente ao fragmento de 450pb da região conservada do gene L1 do Papilomavírus Humanos (HPV). M: marcador de 100pb; C+: controle positivo; neg.: controle negativo da reação. Na figura 05 podemos verificar a amplificação dos 450pb correspondentes a região conservada do gene L1 do HPV. Os parâmetros da eletroforese seguem M: com o marcador de 100pb; o controle positivo da presença do DNA/HPV, padrão (C+); nas linhas 1 e 3 ausência do DNA/HPV e nas linhas 2, 4 e 5 presença dos DNA/HPV; Controle negativo (neg.). 4.2-Perfil eletroforético de dois HPVs dos oitos tipos encontrados nas amostras confirmadas por PCR com o DNA-HPV. M BamHI DdeI HaeIII Hinf I Pst I RsaI Sau3AI neg. 100pb Figura 06. Gel de agarose a 2,5% com o perfil eletroforético do HPV-16 por RFLP. Linhas M: ladder de 100pb; neg: controle negativo. Figura 07. Gel de agarose a 2,5% com o perfil eletroforético do HPV-33 por RFLP. Linhas M: ladder de 100pb; neg: controle negativo. Resultados 33 4.3-Analises dos dados obtidos Em nosso estudo observou-se a presença do material genético de Papilomavirus humano (DNA-HPV) em 103 (31%) das 334 amostras analisadas, enquanto que o método citológico revelou alteração celular com indicativo para HPV em apenas 16 (5%) das amostras analisadas. Com a utilização do método de RFLP, foi possível verificar a existência do perfil eletroforético de oito (08) fenótipos distintos de HPV nos 103 DNA-HPVs observados por PCR, tabela 04. Tabela 04. Correlação dos resultados Citológicos quanto a alteração celular (+) ou sem alteração celular (-) e os resultados Moleculares (PCR) quanto à presença ou ausência do DNA-HPV (n= 334). Métodos Molecular (PCR) Categorias Citologia (-) (+) Alterada (+) 16 - 16 (5%) Normal ( - ) 318 231 (69%) 87 (26%) Total 334 231 103 (31%) As 103 amostras confirmadas por PCR com a presença do DNA-HPV foram analisadas por RFLP e através do perfil eletroforético encontrado, se classificou os HPVs em grupo de alto risco oncogênico com 72% (74/103) correspondentes aos HPVs-16, 18, 33, 53 e 56; e grupo de baixo risco oncogênico com 28% (29/103) correspondente aos HPVs-11, 42 e 44 listados na tabela 05. Tabela 05. Correlação dos resultados da Citologia com os tipos de HPVs analisados por RFLP e classificados conforme o grau oncogênico (n= 103/334). Alto Risco Baixo Risco Alteração Celular HPV-16 HPV-18 HPV-33 HPV-53 HPV-56 HPV-11 HPV-42 HPV-44 (+) 03 05 - - - - 01 07 (-) 15 12 14 10 15 09 12 - % 17% 16% 14% 10% 14% 9% 13% 7% A correlação entre os resultados dos métodos citológicos e PCR, mostram uma prevalência do DNA-HPV de 30,83% (103/334), não apresentando variações em pacientes com resultado citopatológico com ASC-US, HPV de alto risco; LSIL, HPV de alto e baixo risco e paciente com HLSIL, HPV de alto risco, respectivamente, tabela 06. Resultados 34 Diferença estatisticamente significante foi observado nos resultados considerados normais pela citopatológia (NIML), em que revelam 26% (87) das mulheres não apresentam alterações celulares com indicativo para HPV de alto ou baixo grau oncogênico (tabela 01), com uma prevalência de 27,35% (87/318) da presença do DNA-HPV em amostras com diagnóstico NIML, tabela 06. Tabela 06. Distribuição dos resultados da citologia de acordo com o Sistema Bethesda (2001) e os tipos de HPVs encontrados por RFLP, de acordo com a prevalência dos testes de rastreamento utilizados como preventivo do câncer cervical. HPV Alto Risco HPV Baixo Risco Prevalência Citologia n 16 18 33 53 56 11 42 44 n % ASC-US 02 01 01 - - - - - - 02/02 100 LSIL 12 02 02 - - - - 01 07 12/12 100 - - - HLSIL 02 - 02 - - - 02/02 100 NIML 318 15 12 14 10 15 09 12 - 87/318 27,35 Total 334 18 17 14 10 15 09 13 07 103/334 30,83 O maior número de mulheres dentre as 334 estudadas tinham escolaridade até ao ensino médio. Destas, 102 (30%) estavam cursando ou concluído o ensino fundamental, 179 (54%) concluíram o ensino médio e 53 (16%) encontravam cursando nível superior, gráfico 01. % (53) DNA-HPV (+) DNA-HPV (-) Gráfico 01. Presença do DNA-HPV analisado por PCR nos raspados citológicos. Distribuição segundo a escolaridade. Os resultados citológicos com alteração celular correspondem a 16 (5%) das amostras e quando analisados por PCR confirmam a presença do DNA-HPV. Enquanto nas amostras sem alteração celular 318 (95%) foi confirmado à presença por PCR do DNA-HPV em 87 (26%) das amostras com diagnóstico normal pela citologia, gráfico 02. Resultados 35 % DNA-HPV ( +) DNA-HPV (-) DNA-HPV ( +) Gráfico 02. Presença (+) e ausência (-) do DNA-HPV em amostras com alteração celular e sem alteração celular (normal) analisadas pela citologia. Referente ao potencial oncogênico, gráfico 03, os 31% (103/334) DNA-HPV encontrado por PCR nas amostras analisadas podemos observar por método RFLP conforme comparação do perfil eletroforético, dos grupos de alto risco com 72% (74/103) e baixo risco 28% (29/103). % Gráfico 03. Relação dos 103/334 tipos de HPVs encontrados por RFLP e seu agrupamento em alto e baixo risco conforme seu potencial oncogênico em desencadear câncer cervical. Os resultados moleculares por PCR revelam que 31% (103/334) das amostras analisadas foram positivas para o DNA-HPV. Quanto à citologia apenas 5% (16/334) apresentaram alterações celulares com indicativo para infecção por HPV. A divergência encontrada corresponde a 26% (87/334) das amostras sem alterações celulares consideradas normais (NIML) para a citologia, mas confirmadas por PCR, em relação ao DNA-HPV, tabela 07. Resultados 36 Tabela 07. Relação dos resultados de presença e ausência do DNA-HPV por PCR, tipagem dos HPVs por RFLP e alterações celulares por infecção dos HPVs verificados na citologia, nas 334 amostras analisadas. PCR RFLP DNA-HPV Citopatologia N HPV 11 09 - - - 09 Prevalência (%) (3%) HPV 16 18 01 02 - 15 (4%) HPV 18 17 01 02 02 12 (4%) HPV 33 14 - - - 14 (4%) HPV 42 13 - 01 - 12 (4%) HPV 44 07 - 07 - - (2%) HPV 53 10 - - - 10 (3%) HPV 56 15 - - - 15 (5%) - 231 - - - 231 (71%) Tipos de HPVs (+) (-) ASC-US LSIL HLSIL NIML Total 334 02 12 02 318 * PCR / (+) / (-): presença ou ausência, respectivo, do material genético do Papilomavirus humano (DNA-HPV). * ASC-US / LSIL / HLSIL: alterações celulares por infecção do HPV. * NIML: sem alteração celular. Em nosso estudo a maioria da população estudada 66% (221/334) tiveram a primeira relação sexual entre o intervalo de 15-20 anos completos e destas 22% (74) apresentam DNAHPV (gráfico 04). % 10 15 15 20 20 25 25 30 Gráfico 04. Prevalência dos HPVs de acordo com o início da vida sexual. Discussão 37 5. DISCUSSÃO: Técnicas moleculares como a hibridização in situ, a captura híbrida e a reação em cadeia da polimerase (PCR), são comumente usadas para verificar a presença do material genético do Papilomavirus humano (DNA-HPV) em amostras de raspado cervical (NORONHA e cols., 1999; CAMARA e cols., 2003; ROBERTS e cols., 2006). Inúmeros trabalhos realizados na última década, conduzidos por diversos autores, analisaram amostras provenientes da cérvice uterina e com o auxilio de técnicas moleculares encontraram a prevalência do DNA-HPV situado na faixa de 90% a 100% (BOSCH e cols., 1995; CHEN e cols., 1999; MUNOZ e cols., 2003; CANG e cols., 2005). NORONHA e cols., (1999), encontraram a presença do DNA-HPV em 65,8% das biópsias analisadas. CAVALCANTI e cols., (2000) verificaram a presença de DNA-HPV em 73,9% das 514 de pacientes no Rio de Janeiro. Já na cidade de São Paulo, o Instituto Adolfo Lutz registrou taxa de 57,9% de DNA-HPV em amostras de esfregaço cervical (PEREIRA e cols, 2003). OLIVEIRA e cols., (2003) realizaram seus estudos em 43 mulheres e verificaram a presença de DNA-HPV em 95% (41/43) dos casos. CARVALHO (2004), em estudo com 1055 amostras de esfregaço cervical, observou a presença do DNA-HPV em 48,3% (510). MORAES, (2008) em seu trabalho com amostras cervicais de 106 mulheres confirmou a presença de DNA-HPV em 99% das amostras. CASTRO (2001), no estudo com 144 pacientes divididos em dois grupos de 83 e 61 pacientes encontrou a presença do DNA-HPV em 39,28% e 6,45%, respectivamente. Os achados do presente estudo revelam a presença do DNA-HPV em 31% (103/334) das amostras analisadas. O rastreamento do material genético viral do Papilomavírus humano (DNAHPV) por método molecular (PCR) em amostras provenientes de esfregaço cervical de 334 mulheres em Porto Velho-Rondônia. Deve-se destacar que as diferenças encontradas entre os achados da literatura com os do presente trabalho são devido à metodologia empregada no tipo de coleta. As amostras são provenientes de mulheres que já apresentavam algum tipo de alterações celulares utilizadas com o indicativo para a infecção por HPV. Já os achados do presente estudo são de amostras provenientes de mulheres que procuraram o Cento de Referencia de Saúde da Mulher (CRSM), quer por controle trimestral, semestral ou anual sem que tenha havido uma verificação prévia das condições sintomatológicas. Das pacientes com presença do DNA-HPV diagnosticado por PCR, apenas 16 apresentaram alterações celulares com indicativo para infecção por HPV dados estes que corroboram em 100% com os resultados da citologia. Discussão 38 De forma geral é possível encontrar na literatura especializada resultados significativos da eficiência dos métodos biotecnológicos referentes aos parâmetros estatísticos quanto à eficiência e sensibilidade de seus resultados. Na área da saúde, são utilizados para o diagnóstico de determinadas doenças como distúrbios, síndromes e deficiências, tornando-se uma referencia de ponta devido ao custo benefício e a sua evolução tecnológica em ganho de tempo no diagnóstico do resultado e a evolução para o tratamento. Em relação à caracterização do DNA-HPV em tipos e subtipos, há vários métodos moleculares disponíveis. A técnica do Polimorfismo dos Fragmentos de Restrição (RFLP) é um deles, em que se utilizam endonucleases que geram padrões de bandas revelando os diferentes perfis eletroforéticos de HPVs existentes (VILLA e cols., 2000; BROWN e cols., 2002; MUÑOZ e cols., 2003; DE VILLIERS e cols., 2004; FAUQUET e cols 2005; ROBERTS e cols., 2006). Após amplificação da região L1 do DNA-HPV encontrado por PCR, o presente trabalho utilizou a técnica de RFLP e observou o padrão de bandas produzidas de oito perfis eletroforéticos de diferentes tipos de HPV com 7,76% (8/103) do total de 334 amostras analisadas. Os oito perfis eletroforéticos são pertencentes aos HPV-16 (17%), HPV-18 (16%), HPV-56 (14%), HPV-33 (14%), HPV-53 (10%), HPV-11 (9%), HPV-44 (7%) e HPV-42 (13%). O perfil eletroforético dos HPVs encontrados nas amostras deste estudo está entre os mais de 120 genótipos já descritos na literatura e circulantes em todo o território brasileiro (VILLA e cols., 2000; MUÑOZ e cols., 2003; DE VILLIERS e cols., 2004; GABRIEL e cols., 2006). No Amazonas, CASTRO (2001) encontrou uma representatividade de 66,6% do HPV-16 em 19 amostras analisadas. ROBERTS e cols., (2006) em seu trabalho com 1.848 amostras observaram a presença do HPV-16 com 32,3% e o HPV-18 com 6 %. Estudo realizado por PFISTER (1997) revela que o HPV-18 predomina no sudeste da Ásia e o HPV-45 tem maior incidência na África Ocidental. O HPV-39 e o HPV-59 parecem estar restritos às Américas Central e do Sul, neste estudo não foram observados indivíduos com este perfil. CHANG e cols., (2001) em seu trabalho realizado em Taiwan com 25 amostras, através da PCR e Southern blot, observaram a prevalência em 100% do HPV-18 e sua associação com o HPV16 em 7 das 25 (28%) amostras. CORRÊA e cols., 2005 observaram a presença do HPV-16 e HPV18 em 75%, HPV-33 e HPV-2 em 8% e os HPV-31, -66 e -6 em uma amostra cada, com percentual inferior a 5%. Já nos trabalhos realizados por OLIVEIRA e cols., (2003) e MALUF, (2007) encontraram o genótipo do HPV-18 como o mais freqüente 78,79% dos casos estudados, porém associado ao HPV-16. Discussão 39 Vários estudos revelam que o HPV-16 e HPV-18 são os mais prevalentes e de forma geral podem ser encontrados associados ou não a outros tipos (CARVALHO 2004; ANDERSSON e cols., 2005; TROTTIER e cols., 2006; MORAES 2008). CARVALHO (2004), em 1055 amostras de esfregaço cervical, observou a presença de infecções múltiplas em 35,5% (181) das pacientes. Em recente estudo, realizado por ANDERSSON e cols., (2005), foram avaliadas 215 amostras, destas 45 casos eram de carcinoma escamoso invasor e os tipos detectados mais freqüentes foram dos HPV-16 e HPV-18 com 76% e os menos freqüentes os HPV-31, 33, 52, 67, 70 e 73 com 2 a 4%. ROSA e cols., (2009) em sua revisão bibliográfica utilizando a metodologia qualitativa que teve por esclarecer a associação entre HPV e o desenvolvimento do câncer do colo uterino, a autora observou os tipos de HPV prevalentes na etiopatologia em diversos países, sendo que no Brasil, o HPV-16 predomina nos cânceres cervicais em todas as regiões do Brasil com as seguintes freqüências: região Sul (52%), Centro oeste (57%), Nordeste (59%), Norte (43,5%) e Sudeste (52%). Já o HPV-18 aparece em segundo lugar, exceto na região Centro Oeste, e nordeste, quando prevalecem o HPV-33 e o HPV-31, respectivamente. Neste presente trabalho à semelhança dos anteriores as freqüências mais altas foram do HPV-16 e em segundo lugar o HPV-18 o HPV-33 foram observados em 14%. MORAES, (2008) com amostras de células cervicais de 106 mulheres observou que 68 (64,7%) destas amostras apresentavam infecções por múltiplos HPVs. Já TROTTIER e cols., (2006) quando avaliou a associação de infecção por múltiplos HPV em amostras de 2.462 mulheres brasileiras, verificou que apenas 3,2% das mulheres apresentavam infecção múltipla. Em relação às múltiplas infecções por HPVs só foi detectado um perfil eletroforético para cada uma das 103/334 amostras positivas para o DNA/HPV analisadas no presente trabalho o que geralmente não é observado na literatura. Vale ressaltar que o critério utilizado para a obtenção das amostras foi de todas as pacientes que estivessem aptas a realizar o preventivo e que aceitassem participar da pesquisa. Não foi realizado um levantamento prévio referente à citologia com indicativo para a presença do HPV, deste modo a nossa coleta é considerada aleatória, aliado ao fato das pacientes declararem no questionário realizado antes da coleta que não tiveram em toda sua vida sexual, relacionamento com mais de dois homens. Muitos estudos observaram a relação dos HPVs entre os grupos de alto e baixo potencial oncogênico com as alterações celulares diagnosticadas nos resultados citopatológicos (ZUR e DE VILLIERS, 1994; VAN REGENMORTEL e cols., 2000; ALBRING e cols., 2006). Estas alterações celulares acometidas por infecção do HPV estão associadas às evoluções das lesões precursoras de Discussão 40 diferentes graus oncongênicos que progridem para o desenvolvimento do câncer anogenital (DE VILLA e cols., 2000; BERNARD, 2002). CARVALHO (2004), observou a presença do DNA/HPV em 48,3% (510). Um total de 11,8% (60) dos DNA-HPV encontrados pertencia ao grupo de alto risco oncogênico, enquanto 52,7% (269) dos DNA-HPV eram pertencentes ao grupo de baixo potencial e 35,5% (181) correspondentes às infecções múltiplas. ROBERTS e cols., (2006) encontraram, através da PCR, prevalência de 32,3% de HPV-16, e 6 % de HPV-18 em 1848 biópsias cervicais. No diagnóstico de NIC II e NIC III o HPV-16 foi detectado em 47,5% e os HPV 18 e 26 em 5,9% dos casos. MORAES, (2008) em seu trabalho com amostras cervicais de 106 mulheres com neoplasia intra-epitelial cervical de alto grau (NIC II e NIC III) confirmou a presença de DNA-HPV em 99% das amostras e destas 68 (64,7%) apresentavam infecções por múltiplos HPVs. No presente trabalho 72% (74/103) dos tipos de HPVs observados são pertencentes ao grupo de alto risco oncogênico (HPVs-16, 18, 33, 53 e 56) e apenas 28% (29/103) pertencentes ao grupo de baixo risco oncogênico (HPVs-11, 42 e 44). Nas 16 amostras que apresentaram alterações citológicas com indicativo para infecção por HPV, os achados moleculares do presente estudo verificaram a presença do HPV-44 em 7%; o HPV-16 e HPV-18 em (2%) e o HPV-42 com 1% em amostras com lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau (LSIL). Já a presença do HPV-16 e HPV-18 foram observadas em 1% das células escamosas atípicas de significado indeterminado (ASC-US). Em nenhuma das amostras com alteração celular por infecção do HPV se observou mais de um tipo de HPV. Estudos realizados por CAMARA e cols., (2003) em amostras com lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau encontraram o HPV-16 em 43,8%. O subtipo 58 foi encontrado em 12,5% dos casos, HPV 31 em 10%, HPV 53 em 6,3% e o HPV-18, e 33 em 3,8% dos casos. Em seu trabalho ROSE e cols., (2009) afirmaram que a persistência da infecção pelo HPV é que leva ao aparecimento das neoplasias intra-epiteliais cervicais e que a presença dos tipos oncongênicos como o HPV-16 e HPV-18 contribuem para esta persistência, visto que 70% dos cânceres são causados por estes dois tipos. Ainda salientou que isoladamente o HPV não pode levar ao surgimento do câncer uterino e que a presença de alguns co-fatores também tem influência na oncogêneses cervical. Os HPV dos genótipos -53 e -56 pertencem à espécie Human Papillomavirus 53, gênero Alphapapillomavirus (FAUQUET e cols., 2005). Estudos realizados por GALLAHAN e cols (1993) isolaram pela primeira vez o DNA-HPV pertencente ao tipo -53 a partir de esfregaço cervical sem Discussão 41 anormalidade clínica ou citológica, subseqüentemente este genótipo tem sido detectado em vários outros trabalhos (GRAVITT e cols., 2000; CASTELLSAGUÉ e cols., 2004; CLIFFORD e cols., 2005; STEVENS e cols., 2007). Em nossos achados observamos a presença do HPV-56, HPV-53 em 8% e 2%, respectivamente. Em estudos epidemiológicos pelo mundo a prevalência do HPV-53 varia de 0,5% a 25% (BROWN e cols., 2002; CHAN e cols., 2005) em quanto à do HPV-56, fica entre 0,1% a 18% (GRAVITT e cols., 2000; LUQUE e cols., 2004; LEE e cols., 2005;). No Brasil a prevalência observada do HPV-53 varia entre 3,0% a 24,4% (GONÇALVES e cols 1999; LEVI e cols., 2002; CERQUEIRA e cols., 2007), e para o HPV-56 fica em torno de 1% a 11% (FRANCO e cols., 2003; LEVI e cols., 2002; CERQUEIRA e cols, 2007). Estudos realizados por CERQUEIRA e cols., (2007) no Distrito Federal verificaram a prevalência do HPV-53 de 6,2% em mulheres HIV-1 soropositivas e 6,0% em mulheres HIV-1 soronegativas (CAMARA e cols., 2003) e não há dados sobre a prevalência do HPV-56 em mulheres soronegativas. Em estudos nos Estados Unidos com mulheres HIV-1 soropositivas, o HPV-56 foi o mais prevalente entre os genótipos estudados tendo sido detectado em 18% das amostras (LUQUE e cols., 2004; WYANT, 2007). Das 334 mulheres que participaram de nosso estudo 10% correspondem ao grupo de soropositivas. Dentre estas 5% apresentam o HPV-56 e o HPV-53 em 3%. Até o momento em nosso levantamento bibliográfico não há na literatura trabalhos que relatam o DNA-HPV pertencente ao genótipo do HPV-56 em mulheres HIV-1 soronegativas, com isso podemos inferir que estes genótipos encontram-se circulantes em um grupo fechado. Vale ressaltar que das 33 (10%) mulheres soropositivas somente 2% foram diagnosticadas sem DNA/HPV. Muitos estudos têm relacionado à infecção por HPV com o nível de escolaridade por ser um fator de esclarecimento e informação. CORRÊA e cols (2005) que em 73,3% (31) das pacientes estavam cursando ou concluíram o ensino fundamental; 23,8% (10) estavam cursando ou concluíram o ensino médio e 2,4% (1) era analfabeta, não havendo registro de pacientes com nível superior. A maioria da população estudada neste trabalho, 54% (179/334), tinha o nível de ensino médio. O ensino fundamental foi observado em 30% (102/334) das pacientes e somente 16% (53/334) estavam cursando nível superior. A desinformação sobre programas de detecção do câncer cervical, a dificuldade de acesso aos serviços de atenção primária e a associação com fatores comportamentais sexuais em populações não esclarecidas quanto aos riscos de infecções sexualmente transmissíveis, podem contribuir para o aumento da incidência desta doença. Discussão 42 Diversos autores já demonstraram que as infecções genitais por HPV é uma doença de adultos jovens (WALBOOMERS e cols., 1999; FRANCO e cols., 2003). CARVALHO (2004) trabalhou com 1055 mulheres e também comprovou que 45,8% (235) das pacientes pertencentes ao intervalo de 20-30 anos são as que apresentam o maior índice de infecções pelo vírus, corroborando com os achados de MUÑOZ (2000) na população estudada na Costa Rica, em que faz a associação da infecção com o início da vida sexual. CORRÊA (2005) observou que a maioria da população estudada 76,2% teve a primeira relação sexual antes dos 16 anos e 50,0%, três ou mais parceiros sexuais. Em nosso estudo a maioria da população, 66% (221/334), tiveram a primeira relação sexual entre os 15 a 20 anos completos e destas 22% apresentam DNA/HPV. Diferentes autores chegaram à mesma constatação, caracterizando a associação do câncer do colo uterino com a atividade sexual. Estudos conduzidos durante os últimos 25 anos indicam que o risco de câncer cervical é fortemente influenciado por três medidas da atividade sexual: o número de parceiros sexuais, a idade do primeiro intercurso, e pelo comportamento sexual do marido ou dos parceiros masculinos da mulher (FRANCO, 2003). HARRIS e cols (1980) usando o instrumento estatístico da análise de risco relativo demonstraram risco aumentado para o aparecimento de neoplasia cervical em mulheres com múltiplos parceiros sexuais e pouca idade no início da atividade sexual. Inúmeros trabalhos que se utilizam de exames clínicos que tem como base o exame Papanicolaou que incluem a Citologia Oncótica, Colposcopia, Histologia, Histoquímica, Imunoistoquímica, Citometria e Colpocitologia para o diagnóstico através das alterações celulares acometidas por infecção do HPV vêm sofrendo uma série de críticas, principalmente devido às altas taxas de falsos-negativos, que variam de 5% a 70 % (NORONHA e cols., 1999; KOJIMA e cols., 2002; FRANCO e cols., 2003). Há ainda uma grande variabilidade de discordância nos resultados citológicos entre diferentes observadores (10% a 80%) e questiona-se muito a subjetividade dos resultados citológicos (KARLSSON e cols., 1995; ZEFERINO e cols., 2000; RABELO-SANTOS e cols., 2003). No presente estudo as amostras foram analisadas no intuito de se verificar a presença do DNA-HPV e a prevalência destes na população de Porto Velho, bem como verificar os tipos de genótipos dos HPV. Os achados do presente estudo revelam uma prevalência global do DNA-HPV em 30,83% entre as mulheres com ou sem alterações celulares com indicativo de infecção por HPV. Os resultados citológicos foram considerados normais em 95% (318/334) e 5% (16/334) apresentaram alterações celulares com indicativo para HPV. Os resultados da PCR confirmam em 100% a presença do HPV nas 16 amostras com alterações celulares em 103 com HPV, entretanto Discussão 43 87/103 amostras confirmadas com DNA-HPV por PCR não apresentaram alterações celulares com indicativo de infecção por HPV tendo 64% dos HPV-16; -18; -33; -53; -56 de alto potencial oncogênico e 20% dos HPV-11 e HPV-42 de baixo potencial oncogênico. Com este cenário observamos que os métodos realizados no presente estudo, a PCR mostrou ser eficiente com 27,35% em diagnosticar a presença do DNA-HPV antes de sua manifestação clinica (alteração celular que é utilizado como indicativo de infecção por HPV), realizando assim o papel de prevenção em relação ao método citológico que apresentou uma taxa de apenas 5% na identificação da presença do HPV tendo em vista que para isso já havia manifestação clínica de alterações celulares, não alcançando o objetivo de prevenir, mas sim, de controle e tratamento. Desta forma constatou-se que mesmo em mulheres com citologia positiva para quaisquer alterações celulares houve a presença do DNA-HPV pertencentes ao grupo de alto e baixo risco, confirmando a importância de se conhecer melhor os mecanismos envolvidos na oncogênese cervical, visando o diagnóstico precoce e a prevenção do câncer uterino tendo em vista à presença em ambas as situações de HPVs de alto potencial oncogênico. No Brasil há uma carência de dados referente à variabilidade genética dos HPVs de alto e baixo risco oncogênico. Estas diferenças encontradas entre os variantes de um mesmo genótipo relatados nos estudos filogenético do vírus HPV (SCHMIDT e cols., 2001; WYANT e cols., 2007) apontam um diferencial no potencial de infecção que é resultante na perda ou ganho da capacidade de ligação com um fator transcripicional na relação genética parasita/hospedeiro com a mudança do sítio específico de reconhecimento, para controle do complexo de proteínas regulatórias do gDNA humano. Trabalhos referentes à filogenia viral dos HPVs indicam que os diferentes genótipos de HPV têm potencial oncogênico distinto e que variantes do mesmo genótipo diferem biologicamente e etiologicamente dependendo da região geográfica, do mesmo modo, os variantes intragenótipos podem apresentar oncogenicidade diferenciada (VILLA e cols., 2000; BERUMEN e cols, 2001; WYANT e cols., 2007). Estudos posteriores com técnicas mais avançadas (real time, seqüenciador) serão necessários para verificar se os perfis eletroforéticos circulantes em Porto Velho são pertencentes a que genótipo, subtipo e a sua origem filogenética. Bem como sua verdadeira relação com os fatores transcricionais dos hospedeiros para que desta forma tenhamos um esclarecimento dos fatores endógenos favorecidos em desencadear o processo cancerígeno. Conclusão 45 7. CONCLUSÃO I. Foi possível realizar o levantamento por PCR da presença do material genético do Papilomavirus Humano (DNA-HPV) em 31% (103/334) das amostras provenientes de raspado da cérvice uterina. II. Foi caracterizado 8 dos tipos de HPV provenientes dos 103 DNA-HPVs encontrados por PCR em que se utilizaram os padrões de banda produzida por RFLP e através do perfil eletroforético pertencentes aos diferentes genótipos de HPV. III. Foi possível agrupar os HPV encontrados nas 103 amostras positiva para DNA-HPV em grupo de alto risco com 72% (74/103) correspondentes aos HPVs-16, 18, 33, 53 e 56 e baixo risco com 28% (29/103) correspondentes aos HPVs-11, 42 e 44 conforme literatura. IV. O método molecular PCR mostrou ser eficiente com 27,35% (87/318) em diagnosticar a presença do HPV antes de sua manifestação, realizando assim o papel de prevenção em relação ao método citológico na identificação da presença do HPV tendo em vista que os 5% das amostras com indicativo para o HPV já havia manifestação clínica. Bibliografias 46 BIBLIOGRAFIAS Albring L; Brentano JE; Vargas VRA. O câncer do colo do útero, o Papilomavírus Humano (HPV) e seus fatores de risco e as mulheres indígenas Guarani: estudo de revisão. RBAC, vol.38(2), p.87-90, 2006. Almeida-Neto, Adauto. Papilomavírus Humano e o Polimorfismo do Codon 72 (Alelo-G) do gene TP53 no carcinoma escamoso oral. 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