O 2 - ICB-USP
Propaganda
LABORATÓRIO DE ANAERÓBIOS Bactérias Anaeróbias e diagnóstico microbiológico Prof. Dr. Mario Julio Avila-Campos http://www.icb.usp.br/bmm/mariojac ANAERÓBIOS - ORIGEM - Origem da Terra - ambiente atmosférico era totalmente livre de oxigênio. - Evidências filogenéticas sugerem que os organismos anaeróbios estritos seriam as primeiras formas de vida que emergiram em nosso planeta (Gest, 1980). Laboratório de Anaeróbios ANAERÓBIOS - ORIGEM - O sucessivo aumento da concentração de oxigênio na atmosfera terrestre causou a evolução dos sistemas biológicos no desenvolvimento transportadoras de de elétrons, cadeias e de complexos enzimáticos capazes de utilizar eficientemente o oxigênio como aceptor final dos elétrons. Laboratório de Anaeróbios HISTÓRICO Hipócrates (400 aC): Tétano Antony van Leewenhoek (1680): “Animálculos” Louis Pasteur (1861): Aeróbio e Anaeróbio Laboratório de Anaeróbios DEFINIÇÃO Bactéria anaeróbia “É todo microrganismo que cresce em ambiente isento de oxigênio e que realiza suas funções metabólicas vitais utilizando compostos diferentes do O2, tais como sulfatos, carbonatos, nitratos”. Laboratório de Anaeróbios SUSCEPTIBILIDADE AO OXIGÊNIO “ O OXIGÊNIO EXCESSIVO É TÃO PERIGOSO QUANTO A SUA DEFICIÊNCIA” (Lavoisier, 1785) [O2] Organismo MORTE * Por quê existem diferenças quanto à sensibilidade ao oxigênio entre os seres vivos? * A quê se deve a toxicidade desta substância? Laboratório de Anaeróbios RADICAIS LIVRES LETAIS Sub-produtos do metabolismo bacteriano que oxidam proteínas, lipídeos e DNA: - Anion superóxido: O2- Radical hidroxila: OH - Peróxido de hidrogênio: H2O2 - Óxido nítrico: NO Tóxicos para células eucarióticas e procarióticas Laboratório de Anaeróbios MECANISMOS DE DEFESA CONTRA O OXIGÊNIO H2 O + O2 O2 Catalase Fe2+ SOD O2- H2O2 NADH + H+ 2GSH Fe3+ * OH- H+ H2O ** O2- NAD+ GS-SH H2O *Reação de Fenton ** Reação de Haber-Weiss Glutationa peroxidase Laboratório de Anaeróbios TOXICIDADE DO OXIGÊNIO Oxigênio Altera membrana citoplasmática (lipídeos) Oxidação enzimática Oxidação lipídica Inibição enzimática Metabolismo inativo Lise Morte Laboratório de Anaeróbios CLASSIFICAÇÃO SEGUNDO A SENSIBILIDADE AO OXIGÊNIO - Anaeróbios estritos: não crescem O2 > 0,5% - Anaeróbios intermediários ou moderados: crescem de 2 a 8% O2 - Microaerófilos: baixa tensão de O2 - Capnofílicos: adição de 5 - 10% CO2 - Aerotolerantes: crescem em anaerobiose e viáveis por várias horas na presença de O2. Laboratório de Anaeróbios Metabolismo Bacteriano Anaeróbio Produção de Energia Anaeróbia: - Não existe participação do oxigênio - Realizado por três processos: » Respiração Anaeróbia » Fermentação » Fotossíntese Laboratório de Anaeróbios Respiração anaeróbia » Processo de liberação de energia, onde o aceptor final de elétrons não é o oxigênio, mas sim um substrato inorgânico: NO3, SO4, CO3. » Não se observa: Ciclo de Krebs, devido a que A-CoA em baixo Eh é inativo, nem a Cadeia Respiratória. » É um processo lento, havendo formação de somente 2 ATP. NO3 Nitrato redutase Desnitrificação NO2 Laboratório de Anaeróbios N2 Ciclo de Krebs em E. coli Crescida em Anaerobiose Glicose Fosfoenolpiruvato Etapa redutiva Etapa oxidativa Oxalacetato ACoA Malato Citrato Isocitrato Fumarato Cetoglutarato Succinato Hemina, etc. Piruvato Inexistente em anaeróbios Laboratório de Anaeróbios Glutamato, etc. Fermentação - Não há aceptor final de elétrons, Respiratória, e transporte de elétrons. Cadeia - Há pequena liberação de energia pelo processo denominado Fosforilação ao nível do substrato. - Compostos orgânicos funcionam como aceptores e doadores de eletrons. » Tipos de Fermentação: 1. Fermentação láctica: Acidifica produtos lácteos - Fermentação homoláctica: produz só ác. láctico - Fermentação heteroláctica: ác. láctico, acético, fórmico, etc. 2. Fermentação alcoólica: Produz álcool Laboratório de Anaeróbios Fotossíntese - Processo dependente da luz solar, utilizado por plantas e algumas bactérias. - A luz solar é transformada em Energia Química, utilizada para reduzir o CO2 para carboidrato. Plantas, algas, cianobactérias Luz solar Redução CO2 Carboidrato - Bacterioclorofila (Membrana plasmática) - Clorofila (Cloroplastos) 6 CO2 + 12 H2O + energia luminosa C6H12O + 6 O2 + 6 H2O Laboratório de Anaeróbios Anaeróbios como microbiota indígena, residente ou autóctone Laboratório de Anaeróbios Sabe-se pouco da associação hospedeiro-microbiota indígena Interação dinâmica Para a microbiota, a interação fornece: nutrientes, ambiente estável, temperatura constante, proteção e transporte. Para o homem, a interação traz: benefícios nutricionais, estimulação do sistema imune, e regulação da colonização endógena e exógena. Laboratório de Anaeróbios TIPOS DE MICROBIOTA 1. MICROBIOTA INDÍGENA, RESIDENTE OU AUTÓCTONE Bactérias indígenas: > 1% da microbiota total Bactérias suplementares: < 1% da microbiota total 2. MICROBIOTA EXÓGENA, ALÓCTONE OU TRANSITÓRIA Laboratório de Anaeróbios MICROBIOTA INDÍGENA: COLONIZAÇÃO NASCIMENTO: MICROBIOTA CERVICAL MATERNA MICROBIOTA INDÍGENA, AUTÓCTONE, RESIDENTE GRUPO MICROBIANO DE CADA SÍTIO CORPORAL COMUNIDADE CLIMAX Pele, C. bucal, T. gastrointestinal, T. respiratório Laboratório de Anaeróbios Brook (1979); Drasar et al. (1991) Adquisição da Microbiota Recém nascido Cesárea ? Parto normal Mamadeira ? Organismos do canal vaginal Predomínio de Anaeróbios Leite em pó ? Leite de cabra ? Início da colonização microbiana Laboratório de Anaeróbios ESTABELECIMENTO DA MICROBIOTA INDÍGENA Recém nascido Sucessão microbiana Cavidade bucal 24 h Aeróbios Trato intestinal 2 h Eh-positivo Bactérias maternas/ambiente E. coli/estreptococos Facultativos 6 meses Anaeróbios (108-1011 céls/g fezes) 24 h Aeróbios:difteróides - Estrógeno materno - Glicogênio 7-15 dias Eh-negativo Colonização-anaeróbios: Lactobacillus, pH 15-30 dias Bifidobacterium, Clostridium, Bacteroides Laboratório de Anaeróbios Trato vaginal Microbiota~adulto Funções da microbiota residente Protege e regula a microbiota residente Produção de substâncias antagonistas: bacteriocinas Auto-antagonismo Iso-antagonismo Laboratório de Anaeróbios Hetero-antagonismo Fatores que influenciam a colonização de bactérias anaeróbias ⇒ Presença de oxigênio ~ Eh ⇒ Falta de enzimas: superóxido dismutase, catalase, peroxidase ⇒ Excesso de radicais livres ⇒ Capacidade de sobreviver no interior do corpo humano ⇒ Esporos presentes em alimentos, meio-ambiente Laboratório de Anaeróbios Principais Bactérias Anaeróbias de Interesse Médico Medicina Veterinária Humana Clínica Clostridium Actinomyces Propionibacterium Fusobacterium Bacteroides Odontológica Porphyromonas Prevotella Treponema Peptostreptococcus Actinomyces Laboratório de Anaeróbios Diagnóstico Laboratorial de Bactérias Anaeróbias Laboratório de Anaeróbios Aparelho Respiratório: Infecções do aparelho respiratório superior, pneumonia necrotizante, abscesso pulmonar, pneumonia aguda. Abdômen: abscessos intraabdominais, abscesso hepático, peritonite. Pele e Tecidos Moles: feridas profundas infectadas, abscessos profundos, septicemia, gangrena, celulite. Laboratório de Anaeróbios Sistema Nervoso Central e Cabeça: Infecções periodontais, otite média crônica, abscesso cerebral, sinusite crônica. Tórax: endocardite, bacteremia, abscessos. Trato Genital Feminino: abscesso tubo-ovariano, abscesso pélvico, aborto séptico, endometrite Participação de anaeróbios em processos infecciosos Gengivite Veillonella spp. Periodontite Porphyromonas spp. e Treponema spp. Laboratório de Anaeróbios Prevotella spp. e Porphyromonas spp. Infecção endodôntica Laboratório de Anaeróbios Peptococcus spp. e Peptostreptococcus spp. Endocardite Laboratório de Anaeróbios Bacteroides fragilis Fascite necrosante Laboratório de Anaeróbios Celulite Indícios clínicos de infecção por anaeróbios Secreção de odor pútrido Tecidos: gás, necrose, crepitação, fluorescência, formação de pseudomembrana Endocardites com hemocultura negativo Infecções pelo uso de aminoglicosídeos Infecções após mordidas humanas ou animais; aborto séptico, infecção após cirurgia gastrintestinal, etc. Laboratório de Anaeróbios Indícios bacteriológicos de infecção por anaeróbios Morfologia única na coloração de Gram. Resistência a canamicina ou neomicina (100 µg/ml) ou vancomicina (7,5 µg/ml). Produção de gás, odor pútrido em culturas. Colônias produzem fluorescência sob luz UV. Laboratório de Anaeróbios Considerações para Isolamento de Anaeróbios 1. São infecções mistas e natureza endógena. 2. Espécimes a serem obrigatoriamente pesquisadas: - Lesões associadas com trato gastrintestinal ou trato genital feminino; - Septicemia; - Infecções crônicas do trato respiratório superior (sinusites, otite média); Laboratório de Anaeróbios - Lesão supurativa do trato respiratório inferior (pneumonia). - Meningites associadas com infecções crônicas do trato respiratório superior (fluido cérebro-espinal). - Abscessos superficiais e profundos (cerebral). - Infecções dentais. - Lesões por queimaduras e mordidas. Laboratório de Anaeróbios Esquema de Isolamento e Identificação Espécime Gram Meio seletivo Cultura pura Importantissimo!! Teste respiratório Identificação Susceptibilidade a antimicrobianos Laboratório de Anaeróbios Coleta e transporte de espécimes clínicos Soluções ou meios pré-reduzidos Hemocultura em meio PRAS Laboratório de Anaeróbios Coleta e transporte de espécimes em seringas Para líquidos corporais, pus, sangue, etc. Laboratório de Anaeróbios Procedimento de incubação em anaeróbiose Câmara de Anaerobiose Jarra de Anaerobiose ou GasPak Laboratório de Anaeróbios Identificação Presuntiva Laboratório de Anaeróbios Identificação definitiva Sistema Mini-API (bioMérieux) Laboratório de Anaeróbios Kit Rapid 32-A Genética e Biologia molecular √ Análise plasmídial √ Enzimas de restrição ou endonucleases: √ Sondas genéticas √ PCR Laboratório de Anaeróbios Considerações Finais A rotina laboratorial para anaeróbios é trabalhosa e de elevado custo; A maioria é exigente em termos atmosféricos e nutricionais; Fazem parte da microbiota residente humana e animal, e podem produzir infecções endógenas. http://www.icb.usp.br/bmm/mariojac Laboratório de Anaeróbios
