Pró-Reitoria de Graduação Curso de Farmácia Trabalho de Conclusão de Curso AVALIAÇÃO FÚNGICA DE PLANTAS MEDICINAIS COMERCIALIZADAS EM LUZIÂNIA - GO Autora: Fernanda Araújo Medeiros Orientadora: Laís Flávia Nunes Lemes Brasília - DF 2014 FERNANDA ARAÚJO MEDEIROS AVALIAÇÃO FÚNGICA DE PLANTAS MEDICINAIS COMERCIALIZADAS EM LUZIÂNIA - GO Trabalho apresentado ao curso de graduação em Farmácia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do título de Farmacêutico. Orientador: MSc. Laís Flávia Nunes Lemes Brasília 2014 CURSO DE FARMÁCIA COORDENAÇÃO DE TCC Ciência do Orientador Eu, Laís Flávia Nunes Lemes, professora do curso de Farmácia, orientadora da estudante Fernanda Araújo Medeiros, autora do trabalho intitulado “Avaliação fúngica de plantas medicinais comercializadas em Luziânia – GO”, estou ciente da versão final entregue à banca avaliadora quanto ao conteúdo e à forma. Taguatinga: ____/_____/______ Laís Flávia Nunes Lemes Monografia de autoria de Fernanda Araújo Medeiros, intitulada “AVALIAÇÃO FÚNGICA DE PLANTAS MEDICINAIS COMERCIALIZADAS EM LUZIÂNIA – GO”, apresentada como requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Farmácia da Universidade Católica de Brasília, em ____/____/______, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada: Laís Flávia Nunes Lemes Orientador Farmácia - UCB Brasília 2014 Aos meus pais, que são as pessoas mais importantes da minha vida e que sempre me apoiaram. AGRADECIMENTO Quero agradecer a todos que de uma forma ou de outra colaboraram para essa conquista, pessoas que me apoiaram e que sempre estarão em meu coração. Palavras não seriam suficientes para expressar o meu muito obrigado! Agradeço primeiramente a Deus que foi quem tudo me concedeu nessa vida. Sempre esteve comigo, guiando-me e iluminando todos os meus caminhos. Aos meus pais pelas oportunidades que me propuseram e por todo o esforço que fizeram para que eu pudesse estudar, sempre acreditando que eu era capaz de vencer na vida. Ao meu irmão, Artur, que é meu grande companheiro de todos os dias e que sempre me animou para que conseguisse atingir a vitória. Ao meu namorado, Pedro, que sempre esteve ao meu lado, me motivando e me compreendendo. A todos os meus familiares, em especial meus avós e minha prima Alinda, e aos meus amigos, em especial a Sophia, que de uma forma ou outra me apoiaram, deramme palavras de força e motivação para continuar em frente e não desistir. Aos meus colegas, em especial aos componentes do quinteto fantástico (Wolmer, Mariane, Laís e Cinthia) que lutamos, estudamos muito, passamos por dificuldades, conversamos, rimos e vencemos juntos. A amizade e a companhia ajudaram a descontrair até mesmo nos momentos mais tensos que passamos. A todos os meus professores que transmitiram seus conhecimentos com tanta dedicação, e contribuíram com grande peso para a minha formação acadêmica. À minha orientadora Laís Flávia que com grande disposição me auxiliou na construção do Projeto de Conclusão de Curso. Ao técnico Elias e ao professor Marcos que me apoiaram e me auxiliaram durante a parte experimental do trabalho. Enfim a todos que contribuíram para a elaboração do trabalho e para a minha formação acadêmica. “4 O Senhor fez a terra produzir os medicamentos: o homem sensato não os despreza. 7 E dela se serve para acalmar as dores e curá-las; o farmacêutico faz misturas agradáveis, compõe unguentos úteis à saúde, e seu trabalho não terminará.” (Eclesiástico 38, 4.7) SUMÁRIO RESUMO......................................................................................................................... 1 ABSTRACT .................................................................................................................... 2 INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 6 RESULTADOS ............................................................................................................... 7 DISCUSSÃO ................................................................................................................... 9 CONCLUSÃO............................................................................................................... 11 AGRADECIMENTOS ................................................................................................. 12 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 12 TABELAS ..................................................................................................................... 18 ANEXO .......................................................................................................................... 20 Avaliação fúngica de plantas medicinais comercializadas em Luziânia-GO MEDEIROS, Fernanda Araújo1; LEMES, Laís Flávia Nunes2 1- Acadêmica da Universidade Católica de Brasília, 72803-050, Luziânia, Goiás, Brasil. [email protected] 2- Orientadora. Professora mestre do curso de Farmácia da Universidade Católica de Brasília. RESUMO Plantas medicinais são frequentemente contaminadas por microrganismos, pois estão em contato direto com o solo e devido às precárias condições de colheita, processamento, armazenamento, transporte, manipulação e embalagem. O presente trabalho teve como objetivo avaliar plantas medicinais, Rosmarinus officinalis e Matricaria chamomilla, provenientes de feira livre, ervanaria e farmácias de Luziânia – GO quanto à contaminação fúngica. A contagem fúngica foi realizada através do semeio das diluições 10-1 a 10-4 em ágar Sabourand Dextrose e após isso a identificação dos fungos presentes foi realizada através de isolamento em macrocultura e microcultivo. Fungos e/ou leveduras estavam presentes em 87,5% das amostras com variação de 4,2 x 101 a 9,0 x 103 UFC/g. Todas as amostras encontraram-se aprovadas se realizados o processo extrativo a quente, porém duas amostras de Rosmarinus officinalis e um de Matricaria chamomilla foram reprovadas se forem utilizadas a extração à frio, pois possuem contagem superior a 103, limite especificado pela ANVISA. Verificou-se a presença de diversos fungos, como Aspergillus, Penicillium e Fusarium, potenciais produtores de micotoxinas, e Exophiala e Microsporum que podem ocasionar danos à 1 saúde daqueles que entram em contato ou consumem tais plantas medicinais. A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que algumas plantas medicinais analisadas não estão aptas para o consumo se extraídas pelo processo a frio, sendo assim a população necessita de informação quanto ao modo correto de preparo. Palavras-chave: Plantas medicinais. Controle de qualidade. Fungos. ABSTRACT Medicinal plants are often contaminated by microorganisms as they are in direct contact with the soil and due to the poor conditions of harvesting, processing, storage, transportation, handling and packaging. This study aimed to evaluate medicinal plants, Rosmarinus officinalis and Matricaria chamomilla, from open markets, herbal stores and pharmacies in Luziânia – GO regarding fungal contamination. Fungi and/or yeasts were present in 87,5% of the samples ranging from 4,2 x 101 a 9,0 x 103 CFU/g. All samples were approved if it was performed the extraction process at high temperature (below the limit established by ANVISA 104), but two samples of Rosmarinus officinalis and one of Matricaria chamomilla were disapproved if it was performed the cold extraction (maceration) , because they have a counting higher than 103 , limit specified by ANVISA . It was verified the presence of many fungi as Aspergillus, Penicillium and Fusarium, potential mycotoxin producers, and Exophiala and Microsporum that cause harm to the health of those who come into contact or consume medicinal plants. From the results, it can be concluded that analyzed medicinal plants are unfit for consumption if performed the cold extraction, thus people need to be informed about the correct method of preparation. 2 Keywords: medicinal plants, quality control , fungi. INTRODUÇÃO Plantas medicinais são muito utilizadas no cuidado com a saúde (Santos et al., 2011), segundo Carvalho, Costa e Carnelossi (2010) 75% da população mundial as utilizam para tal finalidade. O elevado consumo destas é devido às grandes influências culturais, ao crescente interesse por consumir algo que seja natural e devido à facilidade de acesso (menor preço quando comparado aos demais medicamentos) (Azevedo e Kruel, 2007; Santos et al., 2011). Segundo a Lei no 5.991 de 17 de dezembro de 1973 “a dispensação de plantas medicinais é privativa das farmácias e ervanarias, observados o acondicionamento adequado e a classificação botânica”, porém, na realidade, podem-se encontrar tais plantas sendo comercializadas em demais estabelecimentos como feiras livres e mercados populares devido à falta de fiscalização (Santos et al., 2011). Microrganismos são frequentemente encontrados em plantas medicinais pelo fato destas entrarem em contato direto com o solo durante o cultivo ficando expostas a diversos microrganismos e quando as condições de colheita, processamento, armazenamento, transporte, manipulação, embalagem, entre outros são precárias, afetando assim a qualidade (Adeleye, 2005; Okogi e Ojo, 2005; Marcondes e Esmerino, 2010; Rocha, Medeiros e Silva, 2010; Rocha et al., 2012). Plantas medicinais regulamentadas (comercializadas em farmácias e ervanarias) devem passam por testes de controle microbiológico, entre eles a quantificação de fungos o que garante maior qualidade e segurança ao consumidor (Andrade et al., 2005). 3 A contaminação de plantas medicinais por microrganismos pode ocasionar sérios problemas à saúde, pois bactérias ou fungos podem utilizar as plantas como veículos para atingir o organismo humano e assim proliferarem podendo acarretar doenças, ou podem ainda produzir substâncias tóxicas, ocasionando intoxicação aguda ou crônica, mesmo quando consumidas na forma de chá, pois muitos são termoestáveis. Várias são as patologias ocasionadas devido à utilização de plantas medicinais contaminadas, devendo-se atentar para pessoas que possuem maior susceptibilidade a adquirir doenças infecciosas, tais como crianças, idosos e imunodeprimidos. Microrganismos também podem destruir ou alterar a ação farmacológica das plantas, e assim os tratamentos com elas serem ineficazes (Marcondes e Esmerino, 2010). Entre os microrganismos que contaminam as plantas medicinais tem-se os fungos que são organismos eucarióticos e desenvolvem-se em condições de temperatura e umidade bastantes variáveis. Várias espécies são patogênicas, como Aspergillus, Microsporum (Santos et al, 2013) e Fusarium spp (Martins et al, 2001), podem causar manifestações clínicas, invasão de tecidos, alergias e toxicoses (Russomanno e Kruppa, 2009). O gênero Aspergillus ssp é o principal produtor de aflotoxina. As plantas medicinais que geralmente estão contaminados com a aflatoxina são aquelas que não foram secas de modo adequado ou quando a preparação e o armazenamento foram realizados incorretamente (Ali et al, 2005). Já o fungo do gênero Fusarium ssp produz a micotoxina fusariotoxina, que está relacionada com o desenvolvimento de câncer de esôfago em humanos (Santos et al, 2013). Tendo-se em vista o risco à saúde relacionado ao uso de plantas medicinais contaminadas com microrganismos (Gomes, Negrelle e Elpo, 2008), uma das 4 exigências das Boas Práticas de Fabricação é garantir o cumprimento dos testes de controle de qualidade, para assim comprovar que o produto está dentro dos limites aceitáveis de microrganismos (especificação) (Brasil, 2010). A RDC nº 10 de 2010 que dispõe sobre a notificação de drogas vegetais junto à Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) classifica as plantas medicinais de acordo como é realizado o processo extrativo, a quente (infusão e decocção) ou a frio (maceração) e especifica limites de contaminantes microbiológicos para cada caso. Essa classificação é realizada devido o aquecimento durante o processo reduzir o crescimento microbiano (Bauer e Franz, 2004). Os limites fúngicos para plantas medicinais que passam por processo extrativo a quente é de no máximo 104 UFC/g e para aquelas que passam por processo extrativo a frio é de no máximo 103 UFC/g (Brasil, 2010) Vários são os fatores que podem influenciar a qualidade da matéria prima vegetal. Para obter plantas medicinais de boa qualidade deve-se realizar estudo prévio sobre as individualidades das espécies, identificando-as corretamente e providenciando condições adequadas de plantio com a faixa de temperatura ideal, iluminação, umidade (quantidade de água), altitude e latitude, melhor época para o plantio (Marchese e Figueira, 2005; Azevedo e Moura, 2010). Outro fator importante é o solo que deve ser analisado previamente quanto aos componentes químicos, drenagem, pH, inclinação, além de que o local não deve ser próximo de fontes de poluição (lavouras que utilizem agrotóxicos, estradas) (Marchese e Figueira, 2005). A secagem, realizada após a colheita, é uma etapa fundamental para a manutenção da qualidade da matéria prima vegetal, interrompe o metabolismo de degradação e impede a contaminação por microrganismos. O tipo de secagem a ser realizado depende 5 da espécie vegetal e dos seus componentes. Outras atividades como processamento, transporte e armazenamento, se realizados de maneira correta contribuem para a conservação da qualidade da planta. (Marchese e Figueira, 2005; Aquino, 2007). Levando-se em consideração o risco da contaminação microbiana de plantas, o presente trabalho teve por objetivo avaliar as plantas medicinais Rosmarinus officinalis e Matricaria chamomilla, popularmente conhecidas como alecrim e camomila respectivamente, comercializadas em feira livre, ervanaria e farmácia na cidade de Luziânia (Goiás) quanto à presença de fungos. MATERIAL E MÉTODOS Foram coletadas amostras de aproximadamente 20g cada, de Rosmarinus officinalis (alecrim) e Matricaria chamomilla (camomila) comercializadas em feira livre (amostras 1 e 2), ervanaria (amostras 3) e farmácias (amostras 4) de Luziânia – GO. As amostras foram encaminhadas ao laboratório de Microbiologia e Controle de Tecnologia de Alimentos da Universidade Católica de Brasília, em suas embalagens originais, onde foram submetidas à análise fúngica. Pesou-se 10g da amostra e transferiu-se para frasco de vidro juntamente com 90mL de solução tampão cloreto de sódio peptona pH 7,0. Após agitação manual e filtragem do concentrado transferiu-se 1mL deste para tubo de ensaio contendo 9mL da mesma solução (diluição 10-1) . Diluições seriadas 10-2, 10-3 e 10-4 foram realizadas em tubos de ensaios transferindo 1 mL da diluição anterior junto com 9 mL da solução tampão. Realizou-se o semeio transferindo 0,1mL de cada diluição para placas de Petri contendo ágar Sabouraud Dextrose e incubou-se a temperatura de 20-25ºC durante 7 6 dias. Os testes foram realizados em duplicata para cada diluição. Foram consideradas apenas as placas com número de colônias inferior a 50 (fungos filamentosos e levedura). A partir da média aritmética do número de colônias por placa calculou-se o número de UFC por grama da planta medicinal. Para identificação dos fungos filamentosos presentes realizou-se isolamento, macrocultura, transferindo parte de cada fungo presente para uma placas de Petri com ágar Sabouraud Dextrose. Para confirmar a identificação realizou-se o microcultivo em lâmina com ágar Sabouraud Dextrose em placa umedecida e incubou-se de 7 a 14 dias em temperatura ambiente. Visualizou-se ao microscópio as lâminas após coloração com azul de algodão e analisou-se a micromorfologia. RESULTADOS Dentre as plantas analisadas constatou-se a presença de fungos e/ou leveduras em 87,5% das amostras conforme as tabelas 1 e 2. Encontraram-se contaminadas com fungos todas as amostras de Matricaria chamomilla e 75% das amostras de Rosmarinus officinalis. As contagens de bolores e leveduras foram menores que 104, limite de UFC/g especificado pela ANVISA para plantas medicinais que passarão por processo extrativo a quente, estando assim todas as amostras aprovadas se utilizadas na forma de infusão ou decocção. Porém se o processo extrativo utilizado for a frio, as amostras 1 e 3 de Rosmarinus officinalis e a amostra 1 de Matricaria chamomilla estão reprovadas pois possuem contagem superior a 103 UFC/g, limite especificado pela ANVISA para plantas medicinais utilizadas na forma de maceração. 7 Pode-se observar que as amostras de Rosmarinus officinalis comercializadas em feiras livres (amostras 1 e 2) e em ervanaria (amostra 3) apresentaram contagem fúngica maior que a da planta medicinal comercializada em farmácia (amostra 4) que não apresentou contaminação fúngica nas diluições avaliadas. Das amostras de Matricaria chamomilla observa-se que a comercializada em feira livre (amostra 1) foi a que apresentou maior número de UFC/g e que a de menor contagem fúngica foi a comercializada em ervanaria (amostra 3). Já a amostra 2 de Matricaria chamomilla (proveniente de feira livre) apresentou igual contaminação fúngica que a amostra 4 (proveniente de farmácia). Realizou-se a identificação apenas dos fungos filamentosos, pois estes possuem a capacidade de crescerem na presença de baixas umidades (Pandey et al., 2000). As tabelas 3 e 4 apresentam os diversos gêneros presentes nas amostras avaliadas. As amostras de Rosmarinus officinalis não apresentaram grande variedade fúngica. Os fungos Aspergillus sp. e Exophiala sp. foram os únicos que estavam presente em duas amostras diferentes. As amostras 1 e 3 foram as que mais apresentaram variedade fúngica, porém nenhum dos gêneros estavam presentes em todas as amostras. Dentre as amostras de Matricaria chamomilla, a amostra 1 foi a que apresentou maior variedade fúngica, constando a presença de 4 gêneros diferentes. O Aspergillus sp., o Microsporum sp., o Exophila sp. e o Fusarium sp. encontraram-se presentes em mais de uma amostra. 8 DISCUSSÃO Sete das oito amostras avaliadas apresentaram contaminação, ou seja, 87,5% constaram a presença de fungos e/ou leveduras com variação de 4,2 x 101 a 9,0 x 103 UFC/g. Resultados superiores foram encontrados por Zaroni et al. (2004) que verificaram a qualidade microbiológica de 72 amostras de plantas medicinais comercializadas no estado do Paraná e constataram contaminação fúngica em 100% das amostras com contagem variando de 1,0x102 a 8,4x106UFC/g, estando 79% das amostras fora dos limites estabelecidos pela OMS (5,0x104 UFC/g). Borges et al. (2002) avaliaram cinco amostras de Ilex paraguariensis St. Hil, mais conhecida como erva-mate, e identificaram a presença em maior percentual dos fungos dos gêneros Aspergillus sp. (62,13%) e Penicillium sp. (32,35%), sendo estes potencialmente micotoxicogênicos. Tais fungos também foram encontrados nas amostras do presente estudo, sendo que o gênero Aspergillus estava presente em 50% das amostras e o Penicillium em 25% destas. Algumas espécies do Aspergillus como Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, são produtoras de aflatoxinas (Santos, 2005), que são metabolitos secundários altamente tóxicos e carcinogênicos para o ser humano (Einloft, Hoeltz e Noll, 2009). A RDC 10 de 9 de março de 2010 estabelece que plantas medicinais que possuem especificado em monografia na Farmacopéia a necessidade de passar por teste quanto a presença de aflatoxinas, devem possuir ausência destas. As plantas medicinais analisadas neste estudo não exigiram a necessidade da realização de tal teste. Espécies do Aspergillus e do Penicillium produzem ocratoxinas que tem ação teratogênica e mutagênica, possivelmente ocasiona nefropatia, redução da função renal, 9 e câncer do trato urinário (Santos, 2005; Duarte, 2010) devendo-se dar maior atenção ao risco de contaminação por esses fungos. O presente estudo verificou que o Fusarium sp. estava presente em 25% das amostras, já Martins et al. (2001) observaram que 93.5% das amostras de plantas medicinais utilizadas na forma de infusões em Lisboa (Portugal) estavam contaminadas com fungos, sendo que 82,4% com Fusarium spp. Várias espécies do Fusarium produzem fusariotoxinas (zearalenona, tricotecenos e fumonisinas). Zearalenona possui efeitos estrogênicos e afeta principalmente suínos, tricotecenos provocam irritação e inflamação da pele podendo ocasionar destruição das células. Ainda não há muitos estudos sobre a ação das fumonisinas em humanos, mas evidências sugerem que ela pode estar relacionada a ocorrência de câncer de esôfago (Santin et al., 2001; Maziero & Bersot, 2010). Das amostras de Matricaria chamomilla 25% continha o fungo Syncephalastrum sp. e 50% o Exophiala sp . Santos et al. (2013) avaliaram plantas medicinais utilizadas em chás em Campinas Grande (Paraíba) e encontrou Syncephalastrum sp. presente em 33,3% e o Exophila sp. em 44,4% das amostras de Matricaria chamomilla, já nas amostras de Peumus boldus Molina (boldo) Syncephalastrum sp. estava presente em 22,2%, Curvularia em 11,1% e Microsporum em 100%. O Exophiala sp. tem importância clínica pois causa dermatoses de caráter crônico. Geralmente é inoculado através de ferimentos ou em imunodeprimidos, podendo contaminar os manipuladores de plantas medicinais (Hoffmann et al., 2011). O Microsporum sp. também está presente no solo e pode através de plantas contaminarem pelo contato direto com a pele causando dermatofitoses com diversos sintomas clínicos como eritema, descamação e prurido (CFSPH, 2005). 10 Para obter-se plantas medicinais de boa qualidade deve-se adquiri-las apenas em locais onde a dispensação é permitida, ou seja, farmácias ou ervanarias (Brasil, 1973). O tempo de armazenamento da planta medicinal em casa favorece o crescimento fúngico e consequentemente a produção de micotoxinas, por isso apesar de muitas amostras estarem dentro dos valores aceitáveis elas podem acarretar danos futuros. O armazenamento inadequado favorece a contaminação fúngica, devendo ser então em local limpo e seco para preservar a qualidade destas (Gomes, Elpo & Negrelle, 2007; Brasil, 2013). De acordo com os resultados encontrados a extração a quente é a mais aconselhável uma vez que pode reduzir a carga microbiana, porém não é eficaz contra micotoxinas (Araujo e Bauab, 2012). CONCLUSÃO A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que algumas plantas medicinais analisadas comercializadas em Luziânia – GO, principalmente em feira livre, não estão aptas para consumo se extraídas pelo processo a frio, sendo importante a orientação farmacêutica à população quanto à melhor forma de preparo e ao local correto para adquiri-las. Verificou-se a presença de diversos fungos nas plantas medicinais analisadas comercializadas em Luziânia, alguns potenciais produtores de micotoxinas e outros que podem ocasionar danos à saúde naqueles que entram em contato ou consomem tais plantas medicinais. 11 AGRADECIMENTOS A autora agradece aos técnicos e professores do laboratório de Microbiologia e Controle de Tecnologia de Alimentos da Universidade Católica de Brasília pelo apoio e disposição. 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TABELAS TABELA 1 – Resultado da contagem de fungos e/ou leveduras presentes nas amostras de Rosmarinus officinalis comercializadas em Luziânia-GO AMOSTRAS Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Bolores e/ou Leveduras (UFC/g) 1,7 x 103 4,2 x 101 1,7 x 103 0 18 TABELA 2 - Resultado da contagem de fungos e/ou leveduras presentes nas amostras de Matricaria chamomilla comercializadas em Luziânia-GO AMOSTRAS Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3 Amostra 4 Bolores e/ou Leveduras (UFC/g) 9,0 x 103 3,1 x 102 2,0 x 102 3,1 x 102 TABELA 3 – Fungos presentes em amostras de Rosmarinus officinalis comercializadas em Luziânia – GO. FUNGOS AMOSTRA 1 Aspergillus sp. + Penicillium sp. + Microsporum sp. Syncephalastrum sp. Exophiala sp. + Curvularia sp. + : presença do fungo na amostra - : ausência do fungo na amostra AMOSTRA 2 + + - AMOSTRA 3 + + + AMOSTRA 4 - TABELA 4 – Fungos presentes em amostras de Matricaria chamomilla comercializadas em Luziânia – GO. FUNGOS Aspergillus sp. Penicillium sp. Microsporum sp. Syncephalastrum sp. Exophiala sp. Fusarium sp. AMOSTRA 1 + + + + - AMOSTRA 2 + + + AMOSTRA 3 + - AMOSTRA 4 + + + : presença do fungo na amostra - : ausência do fungo na amostra 19 ANEXO 20