Aula 9 - Unesp

Introdução à Bioquímica
Nucleotídeos e Ácidos Nucléicos
Dra. Fernanda Canduri
Laboratório de Sistemas BioMoleculares.
Departamento de Física. UNESP
São José do Rio Preto - SP.
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Tópicos
!
Estrutura e função dos nucleotídeos
!
Estrutura dos ácidos nucléicos
!
Visão geral da função dos ácidos
nucléicos
!
Sequenciamento dos ácidos nucléicos
!
Tecnologia do DNA recombinante
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Métodos para sequenciar ácidos nucléicos
• Sequenciamento manual
: 2´,3´-dideoxinucleosídeo-trifosfato – ddNTP
• Sequenciamento automático
: Marcadores fluorescentes
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Sequenciamento pelo método de terminação
de cadeia – seq. manual
Uso de marcadores fluorescentes Sequenciamento automático
Tecnologia do DNA recombinante
!
Técnicas de clonagem
!
Bibliotecas genômicas
!
Amplificação de DNA por PCR
!
Aplicações da Tecnologia do DNA
recombinante
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Tecnologia do DNA recombinante
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Como genes são isolados da
fita de DNA ??
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As nucleases de restrição
A endonuclease cliva um ácido nucléico no interior
de uma fita polinucleotídica
A exonuclease cliva um ácido nucléico por meio da
remoção de um dos seus resíduos terminais
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Técnicas de clonagem
"
Amplificação de um segmento de DNA
1.
Um fragmento de DNA de tamanho apropriado é
produzido por meio de endonucleases de restrição,
e isolado
2.
O fragmento é incorporado em uma outra molécula
de DNA (vetor), que contém as seqüências
necessárias para dirigir a replicação do DNA
3.
O vetor recombinado é introduzido em células,
onde é replicado
4.
As células que contém o DNA desejado são
identificadas, ou selecionadas
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Clonagem
Produção de múltiplos organismos idênticos,
derivados de um ancestral comum
Em um organismo hospedeiro (como E. coli)
podem ser produzidas grandes quantidades do
DNA
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Uso da DNA-ligase na
clonagem
!
A DNA-ligase une fragmentos de DNA para
produzir uma molécula de DNA-recombinante
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Plasmídeos bacterianos podem
ser usados para clonar DNA
!
Plasmídeo: DNA circular
Genes humanos
são isolados pela
clonagem de DNA
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Vetor de
clonagem plasmídeo
+
fragmento
de DNA
(inserto)
Plasmídeo
recombinante
Os plasmídeos recombinantes são
geralmente clonados em células
bacterianas
Processo denominado transformação
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Bibliotecas genômicas
Bibliotecas de cDNA
representam o RNAm
produzido por determinado
tecido
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A hibridização permite que mesmo genes pouco
relacionados possam ser identificados – relação
com a função de proteínas conhecidas
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Amplificação de DNA por PCR
!
A reação em cadeia da polimerase amplifica
sequências selecionadas de DNA
↓
Iniciadores
!
Proteínas celulares raras podem ser
produzidas em grandes quantidades usando
DNA clonado
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PCR
Aplicações da Tecnologia do DNA
recombinante
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Estudo estrutural da CDK9
Objetivos
Expressar a proteína quinase (CDK9), purificá-la,
para então resolver sua estrutura cristalográfica a
alta resolução.
Usar as informações estruturais para desenhar
drogas específicas.
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Principal função das CDKs
O ciclo celular
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Ciclo de divisão celular: processo básico da gênese de novas células
Mitose
A regulação da divisão celular é crucial para o
desenvolvimento normal de organismos multicelulares
O sistema controle do ciclo celular está baseado em
duas famílias de proteínas que são chaves para o
seu funcionamento:
1) quinases dependentes de ciclinas (“cyclindependent kinase” – CDKs),
2) ciclinas, denominadas proteínas ativadoras.
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Cada subunidade catalítica da CDK pode associar-se
a diferentes ciclinas
Existem ao todo 13 CDKs (CDK1-CDK13).
CDKs1-8 estão envolvidas no controle do ciclo celular.
CDKs 9 e 10 são importantes reguladores transcricionais.
CDKs 11-13 – suas funções não estão bem claras
Existem 15 ciclinas:
Ciclinas A - T
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CDKs e ciclinas
A formação, ativação e a separação dos complexos
ciclinas-CDKs são os eventos fundamentais que
coordenam o ciclo celular
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Proteínas regulatórias – envolvidas em
neoplasias
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Quinase dependente de ciclina 9
(CDK9)
CDK9 é uma subunidade catalítica da P-TEFb, um
fator de transcrição que estimula a elongação da
RNA polimerase II
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Complexo de pré-iniciação para a transcrição da RNA
polimerase II do HIV (Fackler et al., 2001).
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Ex.: Replicação do vírus HIV
O estudo estrutural de proteínas envolvidas na
sua replicação são importantes para o
desenvolvimento de novos inibidores da sua
transcrição.
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Clonando o gene da CDK9
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cDNA total + iniciadores
PCR
Amplificação do fragmento de cDNA
Sequenciamento
Extração e purificação do gene da CDK9
plasmídeo
→
Reação com ligase
Inserção do gene da CDK9 no vetor pET23a
Transformação
Clonagem do vetor em Escherichia coli (DH10B)
Purificação do vetor
Clonagem e expressão em E. coli (BL21-DE3)
Solubilização!!
Purificação da CDK9
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3´
Mapa do
vetor
pET23a,
mostrando
os sítios de
restrição no
(MCS) sítio
múltiplo de
clonagem
(flecha em
preto).
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Desenho dos primers
Primer S: 5´ CGC GAA TTC ATG GCA AAG CAG TAC GAC 3´
Primer A: 5´ CCG GAA TTC TCA GAA GAC GCG CTC AAA C 3´
sítio da enzima de restrição Eco RI
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pET23a + fragmento da CDK9
Vetor pET23a linearizado com enzima de restrição,
mostrando a inserção do gene da CDK9 com T4 DNA ligase.
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Intervenção da atividade de CDKs
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Moduladores diretos de CDKs
Flavopiridol
UCN-01 (7-hidroxi-estaurosporina)
Olomoucina
Roscovitina
Purvanalol
Conseqüências da inibição de CDKs
Interrupção do ciclo celular
Apoptose
Diferenciação
Efeitos transcricionais
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Inibidores de CDKs
Ligam-se ao sítio de ligação do ATP, com o benzopirano
ocupando a mesma região do anel de purina do ATP
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Potenciais aplicações dos inibidores de CDKs
Por estar envolvida na proliferação celular, apoptose, funções
neuronais e transcrição, inibidores farmacológicos de CDKs são
usados em múltiplas áreas terapêuticas.
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Modelagem da CDK9 com flavopiridol
Elementos de
estrutura
secundária da
CDK9
complexada
com o inibidor
flavopiridol,
obtida por
modelagem
molecular por
homologia
(MODELLER).
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Situação atual do projeto
Purificar em grande quantidade e tentar
cristalizar a CDK9 para resolver sua
estrutura cristalográfica
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