Diego Ramos Azevedo

Pró-Reitoria de Graduação
Curso de Biomedicina
Trabalho de Conclusão de Curso
Importância da introdução do NAT (Nucleic Acid Test)
HIV/HCV nos serviços de hemoterapia do Brasil
Autor: Diego Ramos Azevedo
Orientadora: Profa. Esp. Simone Cruz Longatti
Co-orientador: Prof. Msc. Fernando Vianna Cabral Pucci
DIEGO RAMOS AZEVEDO
Brasília – DF
2014
DIEGO RAMOS AZEVEDO
IMPORTÂNCIA DA INTRODUÇÃO DO NAT HIV/HCV NOS SERVIÇOS DE
HEMOTERAPIA DO BRASIL
Artigo apresentado ao curso de graduação em
Biomedicina da Universidade Católica de Brasília
como requisito parcial para obtenção do título de
Bacharel em Biomedicina.
Orientadora: Profa. Esp. Simone Cruz Longatti
Co-orientador: Prof. Msc. Fernando Vianna
CabralPucci
Brasília
2014
Artigo de TCC II, de autoria de Diego Ramos Azevedo, intitulado “Importância da
introdução do NAT HIV/HCV nos serviços de hemoterapia do Brasil”, apresentado como
requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade
Católica de Brasília, em 20/05/2014, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo
assinada:
____________________________________________________
Profa. Esp. Simone Cruz Longatti
Orientadora
Curso de Biomedicina – UCB
_____________________________________________________
Prof. Msc. Fernando Vianna Cabral Pucci
Co-orientador
Curso de Biomedicina – UCB
_____________________________________________________
Profa. Dra. Cintia do Couto Mascarenhas
Curso de Biomedicina – UCB
____________________________________________________
Dra. Liz Maria Teles
Fundação Hemocentro de Brasília – FHB
Brasília
2014
Dedico esse trabalho a todos os amigos e
familiares que caminharam comigo nessa
longa,
cansativa
e
prazerosa
jornada
universitária. E também aos professores,
mestres e doutores que dispuseram seu tempo
e conhecimento.
AGRADECIMENTO
Primeiramente agradeço a Deus por me proporcionar entrar e viver uma universidade,
pela saúde e pela minha vida, e também por colocar ao meu redor pessoas especiais e
imprescindíveis para o meu crescimento pessoal e profissional.
Agradeço aos meus pais Washington Silva Azevedo e Rosane Rosas Ramos Azevedo
por me apoiarem incondicionalmente e pela invalorável importância que têm em minha vida.
Aos meus irmãos, amigos e namorada que souberam me aturar nos momentos difíceis,
dizendo frases de apoio ou de conforto ou pela simples companhia que foi o mais importante.
Aos colegas de universidade por compartilharem ideias, expectativas, conhecimentos e
erros, ou seja, tudo aquilo que provoca crescimento pleno.
Aos professores da Universidade Católica de Brasília que nunca hesitaram em me
ajudar quando era necessária minha ausência devido a competições esportivas, e em especial
aos professores Simone Cruz Longatti e Fernando Vianna Cabral Pucci, que não mediram
esforços para que minha formação fosse completada com êxito, por isso serei eternamente
grato pelos conselhos e confiança depositada em mim.
Por fim, agradeço também as pessoas que apareceram ao longo desse último semestre
e ajudaram de alguma forma, como a doutora Liz Maria Teles e o mestre Agenor de Castro da
Fundação Hemocentro de Brasília (FHB) e também a todos os funcionários do banco de
sangue do Hospital de Base do Distrito Federal (HBDF) que com todo carinho e paciência
permitiram que meu conhecimento fosse abrangido através do deles, me fornecendo materiais
e experiências chaves para a conclusão deste trabalho.
“(...) Biomédicos,
Sem palco
Sem luzes ofuscantes
Sem cenários deslumbrantes
Às vezes sem nenhum aplauso
Heróis anônimos
Que brilham nos bastidores
Criando scripts e roteiros de amor a vida.”
Fábio de França Martins
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IMPORTÂNCIA DA INTRODUÇÃO DO NAT HIV/HCV NOS SERVIÇOS DE
HEMOTERAPIA DO BRASIL
DIEGO RAMOS AZEVEDO
Resumo: Diante dos grandes avanços na hemoterapia, o suporte transfusional, com uso
racional do sangue, tem se tornado cada vez mais importante na medicina, sendo ainda um
grande desafio. Nesse contexto o período em que os anticorpos são indetectáveis, chamado de
janela imunológica, é um dos grandes problemas enfrentados na triagem laboratorial do
sangue doado. Entretanto, as técnicas moleculares têm contribuindo de maneira eficaz na
diminuição desse problema. O Nucleic Acid Test (NAT) se baseia na amplificação de regiõesalvo do RNA viral e na detecção do número de cópias a partir da PCR em tempo real,
reduzindo a janela de detecção do HIV de 22 para 11 dias, e do Vírus da Hepatite C (HCV) de
70 para 10-12 dias. O desenvolvimento e implantação desse método para triagem de outros
patógenos, como o vírus da Dengue e o da hepatite B, vêm sendo discutido no Brasil. Apesar
do uso dessa tecnologia acarretar em um aumento de custo, em médio e longo prazo traz
importantes benefícios para o receptor devido a qualidade dos hemocomponentes produzidos.
Palavras-chave: NAT HIV. NAT HCV. Soroconversão. Segurança do Sangue. Medicina
transfusional.
1. INTRODUÇÃO
Por definição todo processo transfusional sempre traz riscos, como reações imediatas
ou tardias(1). A transfusão se caracteriza como uma potencial via de contágio, e dentre os vírus
de importância na transmissão por transfusão destacam-se o vírus da imunodeficiência
humana adquirida (HIV) e o vírus da hepatite C (HCV) devido às complicações como a
severa imunossupressão e infecções oportunistas, além do surgimento de cirrose hepática e
carcinoma hepatocelular, respectivamente (1,2).
O vírus da hepatite C (HCV) pertence à família Flaviviridae, e tem tropismo por
células hepáticas, mas também podem infectar células mononucleadas do sangue, o que
ocasiona distúrbios imunológicos. Já o HIV pertence à família Retroviridae, possui em seu
maquinário a transcriptase reversa (capaz de transformar o RNA em fita de DNA para
posterior incorporação ao material genético do hospedeiro) e apresenta tropismo por células T
CD4+ causando, após a evolução da doença, a síndrome da imunodeficiência humana
adquirida (AIDS ou SIDA) quando a contagem de T CD4+ caem em um nível inferior a
200/µl. O HIV se divide em 3 subtipos: HIV-1, HIV-2 e HIV-O, eles se diferem entre si por
mutações genéticas que levam a proteínas estruturais diferentes (6). O HIV-1 tem uma
evolução mais rápida e com a carga viral maior do que quando comparados aos outros dois
tipos anteriormente citados, além de ser mais prevalente no Brasil (4,7).
A SIDA tornou-se rapidamente uma doença de grande impacto no cenário mundial e
no Brasil, sendo notificada na década de 80 e alcançando cerca de 630.000 pessoas em 2009
(8)
. Em um dos maiores e mais antigos centros de hemoterapia do Brasil, o Hemocentro de
São Paulo, foi verificada uma prevalência de HIV-1 de 0,17% no período de 1995 a 2001 e
7
uma incidência de soroconversão em doadores de repetição de 25,9 a cada 100.000
pessoas/ano, e de 26,9 a cada 100.000 pessoas/ano em primeira doação. Já para o HCV
verificou-se uma incidência de 51 a cada 100.000 pessoas/ano no hemocentro de Santa
Catarina (8). Em um estudo realizado no banco de sangue do Pará (HEMOPA) foi verificado
que no período de 2008 a 2010, entre 157.432 doações de sangue, foram constatados 42 casos
de HIV. Essas taxas são consideradas altas quando comparadas ás encontradas nos Estados
Unidos: de 2,92/100.000 pessoas; Canadá 1/100.000; Austrália 1,1/100.000; e outras regiões
da Europa ocidental, 1,8/100.000 (9,10).
A Agency for Helthcare Research and Quality (AHRQ), responsável por investigar a
qualidade dos procedimentos médicos americanos, mostrou que procedimentos de transfusão
de sangue foram realizados em 10% dos pacientes internados em 2007, demonstrando um
aumento de 140% desde 1995 (3,4). Devido isso a preocupação e discussão acerca da segurança
transfusional vêm ganhando força tanto no uso racional de hemocomponentes quanto na
evolução de técnicas de triagem cada vez mais sensíveis e específicas, como é o caso do
Nucleic Acid Test (NAT) (4,5).
Visando melhorar a segurança transfusional no Brasil, a Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA) publicou o regulamento sanitário para serviços que
desenvolvem atividades relacionadas ao ciclo produtivo do sangue humano, seus
componentes e procedimentos transfusionais por meio da RDC nº 57 de 16 de Dezembro de
2010. Assim como a portaria nº 2.717 de 12 de Novembro de 2013 do Ministério da Saúde,
que define o regulamento técnico de procedimentos hemoterápicos e atinge todos os
estabelecimentos públicos e privados do Sistema Nacional do Sangue (SINASAN). Segundo a
legislação vigente, há obrigatoriedade da triagem clínica e da triagem laboratorial do doador
(11,12)
.
Entretanto, algumas evidências mostram que nesse processo existem lacunas
decorrentes da omissão de informações em relação a comportamentos de risco, como o
comportamento sexual questionável e uso de drogas injetáveis (3), ou doadores que buscam
diagnóstico rápido, gratuito e confiável, desconhecendo os riscos que podem levar aos
receptores dos produtos oriundos do sangue (13). Um estudo mostra que em São Paulo cerca de
1 em cada 11 doadores procuram os serviços hemoterápicos com tal finalidade (14).
Na tentativa de minimizar os riscos aos receptores, a triagem laboratorial visa detectar
bolsas contaminadas que são incapazes de serem descobertas na triagem clínica. Atualmente
são utilizados: ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) de 4ª geração e
quimioluminescência (15) capazes de detectar anticorpos IgG e IgM anti-HCV após cerca de
70 dias de contato com o agente infeccioso, assim como para anticorpo anti-HIV que
começam a aparecer a partir do 22º dia de exposição ao vírus, juntamente com a detecção do
antígeno nuclear p24 que diminui a detecção para cerca de 15-16 dias (detecção combinada)
(16, 17)
.
Para os serviços de hemoterapia a desvantagem da utilização de testes sorológicos
convencionais, como o ELISA e em especial para o rastreamento de HIV e HCV, é a chamada
janela imunológica. Este é o período em que há presença do vírus, mas a quantidade de
anticorpos produzidos até então é indetectável por esse método, tornando impossível a
identificação da presença viral nesse período(15, 16, 17). Aí reside a importância da introdução
do NAT nos serviços de hemoterapia por ser uma técnica de triagem capaz de reduzir esse
período de janela, diminuindo assim o risco de transmissão por transfusão desses agentes (18).
2. DESENVOLVIMENTO
2.1. BENEFICIOS DA INTRODUÇÃO DO NAT HIV/HCV
8
Com o advento de métodos de biologia molecular como o NAT, o risco estimado da
transmissão de HIV por transfusão nos serviços de hemoterapia americanos, que era de 1 para
1.468.000 pessoas, caiu de 1 para 2.135.000 pessoas, sendo a janela imunológica de apenas 10
a 12 dias. Na transmissão do HCV por transfusão o risco residual também foi diminuído,
tendo uma queda de 1 em 276.000 para 1 em 1.935.000 pessoas, com uma janela de 10 a 12
dias, como mostrado na figura 1 (19, 20).
Figura 1: Período de detecção viral, em dias, quando em métodos sorológicos e pelo NAT.
Estudos sobre a efetividade, que representa o número de pacientes detectados com a
presença do RNA viral através do NAT e com sorologia negativa, ainda não foram realizados
no Brasil em grande escala, mas podem ser observados em outros países (21), como mostrado
na tabela 1.
Tabela 1: Efetividade a cada 1 milhão de doações.
País
Itália
Espanha
França
Canadá
Efetividade/milhão
HIV
HCV
1,8
2,37
2,37
0,33
0,65
0,31
0,45
Na Alemanha, no período de 1999 a 2007, foram identificados para HCV 92 casos de
efetividade em 40,8 milhões de doações (1/444.000 pessoas), e 11 de HIV em 17,1 milhões de
doações (1/1.556.000 pessoas), mas foi identificado também dois casos de transmissão por
transfusão: 1 para HIV e 1 para HCV, devido ao período mesmo que reduzido (10 a 12 dias),
da janela de detecção do método (baixa viremia) (22).
Um estudo sueco mostra que, se amostras do ano de 2008 fossem testadas apenas por
métodos sorológicos, o país teria um custo de cerca de 6,25 milhões de dólares, porém se
9
introduzido o NAT (individual) esse custo aumentaria para 8,5 milhões. Mesmo com o custo
aumentado, o risco de doença infecciosa viral por ano, apenas com as dosagens sorológicas, é
de 83%, enquanto que, com o NAT, o risco diminuiria para a cada quatro ou cinco anos (23).
Esses dados mostram como a introdução da tecnologia em todo o mundo, mesmo
demandando reorganizações laboratoriais e treinamento técnico altamente avançado, se
tornou de alta relevância para a segurança transfusional dos receptores e reitera cada vez mais
a importância dos estudos de efetividade e de rendimento dessa técnica no Brasil (20, 21, 22, 23).
2.2. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A técnica do NAT para vírus de RNA baseia-se na detecção do material genético do
vírus após transcrição reversa e amplificação por PCR em tempo real, ou qPCR. A reação da
polimerase em cadeia (PCR) consiste basicamente em amplificar uma sequência alvo, sendo a
primeira fase a transcrição reversa do RNA para o DNA, por meio da atividade da
transcriptase reversa (Figura 2). Posteriormente ocorre à elevação da temperatura fazendo
com que as fitas se desnaturem do mesmo modo que os fragmentos iniciadores de ligação
específica (primers), e então a temperatura é reduzida novamente para que os primers anelem
em regiões de homologia no fragmento alvo, e possibilitando assimque a enzima polimerase
estenda a fita complementar de DNA (cDNA) a partir da extremidade 3’ livre dos primers,
usando os nucleotídeos livres (dNTP’s) que estão presentes na reação. Esse ciclo se repete por
várias vezes fazendo com que a sequência de interesse seja duplicada a cada ciclo (24).
Figura 2: Esquema de ciclagem na real time PCR após transcição reversa.
A PCR em tempo real utiliza o princípio da PCR convencional, porém a detecção e
quantificação do material genético amplificado são realizadas ao final de cada ciclo
basicamente por duas maneiras: moléculas intercalantes ou sondas específicas (24).
As moléculas intercalantes possuem a característica de ligação à dupla fita de DNA
gerada fazendo com que sua propriedade fluorescente aumente concomitantemente com o
aumento do numero de cópias da sequencia alvo, onde a cada ciclo a florescência detectada
aumenta. Contudo, os primers definirão a especificidade da reação. Basicamente existem três
moléculas intercalantes fluorescentes: a SybrGreen®, LCGreen® e EvaGreen®. Como essas
moléculas são capazes de se ligar a qualquer molécula fita dupla, possuem característica de
alta sensibilidade e de baixa especificidade, podendo se intercalar aos dímeros de primers ou a
10
outras moléculas de DNA presentes, sem ser a de interesse. O uso delas exige uma otimização
extensa da análise que se quer estudar a fim de se validar os resultados (24).
As sondas específicas, por sua vez, se baseiam na ideia de emissão de fluorescência
após a ligação de uma sonda homóloga na etapa de anelamento dos primers. Basicamente as
sondas possuem duas moléculas, uma doadora (repórter) e uma que absorve esse sinal
fluorescente (Quencher) devido a sobreposição de comprimentos de onda e pela distância
física entre ambas, chamado de FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). As sondas
TaqMan® então são quebradas na etapa de extensão do fragmento devido a atividade de
exonuclease da TaqPolimerase, e isso faz com que as moléculas repórter e quencher se
separem ocorrendo emissão de fluorescência, que é quantificada (24).
Essa detecção então deve ultrapassar um limiar mínimo designado pelo aparelho,
tendo a finalidade de excluir os “ruídos”, ou seja, a pequena fluorescência que ocorre sem a
positividade da amostra. Esse limite é chamado de threshold (24). A quantificação então se
torna possível na avaliação do ciclo em que a curva de amplificação exponencial ultrapassa o
limiar, o thresholdcycle (CT) (25,26).
2.3. O MÉTODO NACIONAL
O primeiro teste de NAT aceito pelo órgão regulamentador e fiscalizador dos Estados
Unidos o FDA (Food and Drugs Administration) para a triagem em serviços de hemoterapia
no mundo foi o Procleix da Novartis Diagnostics, que tem como princípio a separação do
material genético por campo magnético e detecção dos amplicons ao final da reação através
da hibridização de sondas homólogas fluorescentes (3,27,28,29). A partir de então, houve o
desenvolvimento de um novo método para o NAT baseado em TaqMan®, o cobas multiplex s
201 system da Roche, que permitia análise de amostras em pool de 6, porém sem a
identificação de qual vírus positivava o grupo de amostras, sendo necessária nova análise
individual para HIV e HCV de cada amostra presente no grupo reagente (30).
Avaliando a importância da introdução do NAT nos serviços de hemoterapia, o
Ministério da Saúde publicou a portaria nº 112, de 29 de Janeiro de 2004, que trata sobre a
implantação obrigatória da tecnologia do NAT nos centros hemoterápicos brasileiros, visando
aumentar a segurança transfusional. Porém, a falta de metodologias nacionais atrasou de certa
forma a implementação da metodologia no Brasil devido ao alto custo até então dos kits
importados, cerca de US$ 30,00 por bolsa de sangue (8,31). Em estudo de custo-benefício em
2007 foi avaliado o custo anual, desse método importado, de cerca de R$ 172 milhões/ano
(3.035.748 doações), se utilizada taxa de câmbio de 1,89/dólar (21).
Esse elevado custo mobilizou o desenvolvimento de um kit nacional, viável para a
realidade brasileira, através de um consórcio entre a Bio-Manguinhos/FIOCRUZ e o
Ministério da Saúde. A metodologia foi aprovada e incorporada à triagem de bolsas de sangue
para HIV e HCV no SINASAN e no Sistema Único de Saúde (SUS) através da portaria nº 25
de 12 de Junho de 2013 (32). O kit com tecnologia brasileira tem a capacidade de 96 reações,
sendo 4 controles (2 negativos e 2 positivos para HIV e HCV), possuindo assim 92 reações
para as amostras em teste. Cada “poço” de reação é composto por um minipool de 6 amostras
caracterizando então dosagem de, no máximo, 552 amostras por placa. Em casos de
positividade de um poço, deve-se realizar novos testes, individualizando as 6 amostras
inicialmente contidas no pool, a fim de detectar quais amostras estão positivando o teste. O
desenvolvimento desse tipo de tecnologia favorece a sua introdução no mercado brasileiro
devido ao custo muito reduzido quando comparado a tecnologias importadas, tendo um custo
médio de triagem inicial de US$ 4,30 por bolsa quando negativa, pois se positivo é necessária
nova pesquisa individual, aumentando consequentemente o custo (8).
11
A plataforma NAT multiplex para HIV/HCV nacional se utiliza do princípio de PCR
em tempo real multiplex (amplificação de mais de uma sequência de interesse), no qual
permite uma avaliação qualitativa do material genético viral (8). Basicamente o processo de
identificação é baseada na detecção de fluorescência emitida pela amplificação de regiões
altamente conservadas (região C-terminal do gene da integrase para o HIV e região 5’ não
traduzida para o HCV – 5’UTR) através da metodologia de TaqMan. Utilizam-se três sondas
TaqMan com fluoróforos que emitem fluorescência de comprimentos de ondas diferentes, o
VIC para o HIV, o FAM para o HCV, e o DYE para a partícula calibradora, tornando possível
a detecção de qual agente positiva o minipool (33,34).
A detecção consiste em 4 momentos, como ilustrado na figura 3: o primeiro ocorre no
equipamento Janus da PerkinElmer (preparo do pool, confecção da mistura de PCR e
pipetagem no poço da reação). O preparo do pool com 6 amostras utiliza-se de 100µl de cada,
incluindo 10 µL partícula calibradora (IPC) que serve para validação da amplificação em
cada poço, sua amplificação deve ocorrer entre os valores de Ct de 30,53 a 35,47. O IPC é um
vírus HIV/HCV mimético biosseguro capaz de identificar se a reação é verdadeiramente
negativa ou se trata de um falso-negativo devido a algum inibidor (uréia, detergentes, acetato
de sódio, heparina, fenol e outros componentes orgânicos). Quando isso acontece as amostras
devem ser identificadas e posteriormente analisadas separadamente (single) (33,34).
A segunda etapa ocorre no BioRobotMDx, da Qiagen, que é responsável pela extração
do material genético do pool anteriormente preparado, através da lise do capsídio viral,
utilizando-se o tampão de lise e poteases a 56ºC, então a adição do etanol aumenta a afinidade
do RNA à membrana de sílica, esse é adsorvido por vácuo, passando então por três etapas de
lavagem sob vácuo se utilizando dos tampões de lavagem 1 e 2. Ao final o material genético
da coluna é eluido com o tampão de eluição, tornando o produto de extração livre de albumina
sérica, nucleases, sais e possíveis interferentes(33, 34).
Na terceira etapa, o material extraído volta ao equipamento Janus para pipetagem da
mistura de PCR, também chamada de PCR setup. E, por fim, a quarta etapa consiste na
amplificação e detecção do sinal em si através do termociclador ABI 7500 da Applied
Biosystems (8) que faz a variação de temperatura anteriormente citada e também a leitura de
fluorescência emitida, em que a emissão de luz é diretamente proporcional a quantidade de
amplicons a cada ciclo, permitindo a detecção em tempo real (8,30). Este teste nacional é capaz
de detectar em 95% das vezes 600 UI/ml para HCV e 600 cópias/mL para HIV na amostra
individual do doador (33,34).
Figura 3: Esquema do teste NAT da Bio-Manguinhos /Fiocruz.
2.4. NAT NA IDENTIFICAÇÃO DE NOVOS PATÓGENOS VIRAIS
12
A ampliação do teste NAT para o vírus da hepatite B (HBV) em escala mundial
ressalta a importância de que novos microrganismos sejam aderidos a essa nova técnica,
agregando mais qualidade à segurança transfusional. Alguns estudos internacionais mostram
que a introdução do NAT HBV poderia prevenir até 117 hemocomponentes potencialmente
infectados e de 10-19 infecções clinicamente graves por HBV (36). Entretanto, a sua
introdução, mesmo diminuindo o período de janela imunológica em cerca de 25 a 36 dias
(NAT single) e de 9 a 11 dias (NAT multiplex) (35), não excluirá as dosagens sorológicas de
anti-HBc e HBsAg devido às características virais, em que, no período de cronicidade, os
níveis de DNA viral no soro podem estar indetectáveis (36, 37).
Fica ainda mais evidente a importância da incorporação desse vírus a pesquisa do
NAT no Brasil devido à notificação de um aumento de casos confirmados de hepatite B, de
473 pessoas em 1999 para 14.601 em 2009, juntamente com o fato que cerca de 77,2% dessas
pessoas possuem a doença de forma crônica ou ignorada e que a transfusão representa uma
porcentagem considerável de transmissão (38).
De acordo com isso, atualmente, os debates para a implementação desse teste,
concomitantemente com o do vírus da dengue na metodologia nacional, vêm ganhando força
(39)
. Baseia-se no método NAT multiplex, reduzindo a janela do HBV de 50 para 41-39 dias
(35, 36, 37)
.
2.5. NAT POR SYBRGREEN/MELTING CURVE
Alternativamente ao método TaqMan utilizado no kit do NAT nacional (BioManguinhos) para a triagem laboratorial, a utilização de moléculas intercalantes (SybrGreen)
com posterior análise da curva de derretimento (melting curve) vêm mostrando certa
eficiência, além de possuir baixo custo e maior sensibilidade (cerca de 50 UI/ml para HCV) e
também diminui os erros devido a mutações em regiões de anelamento das sondas (25, 40, 41).
Porém devido a inespecificidade de ligação das moléculas intercalantes (ligação em
todo tipo de DNA dupla fita, mesmo não sendo o cDNA de análise), algumas otimizações
devem ser realizadas, como a concentração do co-fator MgCl2 para que a enzima polimerase
atue da sua melhor forma, e a quantidade de primers para garantir que menor número de
dímeros ocorram (25). A especificidade da reação para todos os vírus é relacionada ao tamanho
do amplicon como também a homogeneidade da sua sequencia de bases nitrogenadas (25).
Após a amplificação, ocorre a etapa de detecção por melting curve que determinará o vírus
que positiva a reação (40, 41).
A curva de derretimento, ou melting curve, pode ser traduzida em uma etapa de
aumento gradual da temperatura para que as fitas se dissociem e assim a emissão de
fluorescência diminua (Pico do gráfico mostra a temperatura em que estão separadas metade
das fitas, consequentemente metade da fluorescência inicial também). Uma relação de
densidade de Citosina (C) e Guanina (G) é observada, ou seja, quanto maior a densidade de
(CG) maior também a temperatura necessária para dissociação da fita (Tm). Então, se
comparada a amostra a um controle, cada fragmento específico de detecção terá uma
temperatura de melting específica, o que possibilita a detecção de qual vírus amplificou na
etapa anterior (25, 40, 41).
3. CONCLUSÃO
A evolução mundial dos procedimentos de triagem, através de técnicas ainda mais
sensíveis, tem despertado a responsabilidade política diante de questões que visam garantir
maior qualidade e segurança das transfusões ao receptor. Devido às características virais do
13
HIV e do HCV é importante salientar sobre o período de janela sorológica em que os níveis
de anticorpos são indetectáveis mesmo com a presença do vírus no organismo.
Desse modo,o desenvolvimento e a introdução da tecnologia nacional são de extrema
importância, uma vez que possibilitam uma triagem laboratorial mais confiável, e
consequentemente bolsas mais seguras para transfusões, com custo cerca de 3 a 4 vezes
menor quando comparado às tecnologias importadas, além da possibilidade da diferenciação
do tipo viral já na primeira análise.
A extensão do método nacional, com a introdução da triagem de outros vírus, como o
da hepatite B e o da dengue, assim como a melhoria da tecnologia, têm sido abordados
recentemente e reitera a importância da exploração cada vez maior dessa tecnologia para os
serviços hemoterápicos.
Importance of introduction of NAT HIV/HCV on the services of hemotherapy in Brazil
Abstract: The process of transfusion has become increasingly important in therapeutic
medicine and the safe use of blood components is a big challenge. The window period, period
of time during which the antibodies are undetectable, is one of the biggest problems in
laboratory screening. Therefore, the molecular techniques have, as objective, to reduce this
problematic situation. Nucleic Acid Test (NAT) is based on the amplification of target regions
of viral RNA and its real-time detection, reducing the detection window of the human
immunodeficiency virus (HIV), from 22 to 10-12 days and the Hepatitis C virus (HCV), from
70 to 10-12 days. The development of this method for screening other pathogens, such as
dengue and hepatitis B viruses, are currently on ruling in Brazil. In overview, the
implementation of this technology, even resulting on a cost increase, brings, to medium and
long term, benefits to the receiver due to better quality of blood products produced.
Keywords: NAT HIV. NAT HCV. Seroconversion. Blood Safety.Transfusion Medicine.
14
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32. Brasil. Ministério da Saúde. Portaria nº 25, de 12 de Junho de 2013. Decisão de
incorporar o procedimento para possibilitar a testagem de amostra de sangue de
doadores pelo teste de amplificação de ácidos nucleicos (NAT) para detecção dos
vírus da imunodeficiência humana (HIV) e da hepatite C (HCV) no âmbito do
Sistema Nacional de Sangue, Componentes e Hemoderivados no Sistema Único de
Saúde - SUS. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 13 de Junho de 2013, seção 1,
pg. 69;
33. Fiocruz. Bio-Manguinhos. Bula kit NAT HIV/HCV. Rio de Janeiro 2012.
34. Fiocruz. Bio-Manguinhos. Fundação Oswaldo Cruz. Guia de treinamento para kit
Nat HIV/HCV. Divisão de atendimento ao cliente e pós-marketing. Rio de Janeiro
2012.
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blood donors? Transfusion Clinique etBiologique. 2004; 11(1):26-32.
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donations at Qingdao central blood bank, China, for hepatitis B virus (HBV) DNA
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immunodeficiency virus Types 1 and 2. Transfusion. 2013; 53(10):2538-2544.
37. Kuhns MC, Busch MP. New strategies for blood donor screening for hepatitis B
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diagnosisandtherapy. 2006; 10(2):77-91.
38. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Hepatites virais.
Boletim epidemiológico nº 1. Brasília, 2010.
39. Ferreira AGP. Bio-Manguinhos. Fundação Oswaldo Cruz. Ensaio real triplex para
HBV e Dengue, visando ampliação de alvos do kit NAT HIV/HCV BioManguinhos. [Internet] 2013 [Citado em 26 de mar 2014]. Disponível em:
<http://sact.bio.fiocruz.br/trabalhos/13-antonio-pinto.pdf>.
40. Cousins MM, Swan D, Magaret CA, Hoover DR, Eshleman SH. Analysis of HIV
using a high resolution melting (HRM) diversity assay: automation of HRM data
analysis enhances the utility of the assay for analysis of HIV incidence. PLoS One.
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screening of hepatitis B virus genotypes A, D and F in patients from a general
hospital in southern Brazil. Arquivos de Gastroenterologia. 2013; 50(3):219-225.
17
- ANEXO I Information for Authors
The Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, ISSN 1516
8484, theofficialscientificpublicationofthe Associação Brasileira de
Hematologia, Hemoterapia e Terapia Celular, Sociedade Brasileira de
Transplante de Medula Óssea, AssociazioneItalo-Brasiliana
diEmatologiaand Sociedade Brasileira de Oncologia Pediátrica
aimstopromotescientificdevelopment in Hematology, Transfusion
Medicine andrelatedareas. All manuscripts, after initial acceptance by the
editors, will be sent for analysis by two peer reviewers. Anonymity is
guaranteed throughout the evaluation process. When considered
necessary, a list of modifications will be sent to authors to correct their
work or justify their decision not to do so. The responsibility for opinions
expressed in articles is solely of the authors.
Manuscripts should not be submitted simultaneously to more than one
journal. This is an Open Access article distributed under the terms of the
Creative Commons Attribution Non-Commercial License
(http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/) which permits
unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any
medium, provided the original work is properly cited. Reproduction, in
full or partial, translated into other languages requires prior permission
of the editors.
The journal publishes the following sessions: Original Article, Special
Article, Review Article, Updates in the Specialty, Case report, Letter to
the Editor, Images in Clinical Hematology, Editorial, Scientific Comment
and What is the Evidence. Other types of publications of interest in the
area will be published at the discretion of the editors. All articles will be
published in English however at the start of the review process
manuscripts can be submitted in Portuguese or English.
Preparation of the manuscript
General information
For any manuscript to be evaluated, it must be accompanied by the
following documentation:



Conflict of interest: Situations that may improperly influence the
development or the conclusions of the work such as participation
in drug- or equipment-producing companies cited or used in the
work, as well as competitors of these companies should be
mentioned. Financial assistance, payments received for
consultancies, relationships related to employment, etc. are also
considered sources of conflict.
Approval of the study by a Research Ethics Committee recognized
by the National Research Ethics Committee (CONEP);
Articles that deal with clinical research involving human beings
must include a statement in the Methods Section that all study
participants signed an informed consent form. Authors should also
confirm that the study was conducted in accordance with the
Helsinki Declaration as revised in 2008;
18

For works involving animal experimentation, the authors should
confirm in the Methods Section that the study followed the rules
contained in the Ethical Code for Animal Experimentation of the
Council for International Organizations of Medical Sciences
(CIOMS) [WHO Chronicle 1985; 39 (2): 51-6] and the principles
of the Brazilian College of Animal experimentation - COBEA
(www.cobea.org.br). Authors must complete the Declaration Statement of Human and Animal Rights.
All randomized controlled trials and clinical trials submitted for
publication must be registered in a clinical trials database. This is a
guideline of the International Clinical Trial Registry Platform (ICTPR) of
the World Health Organization (WHO) and the International Committee of
Medical Journal Editors (ICMJE). The instructions for the registry are
available at http: www.icmje.orgclintrialup.htm and registration can be
attained in the Clinical Trials Database of the National Library of Medicine
available at http://clinicaltrials.gov/ct/gui.
Technical requirements
1. Article identification: a) A concise however informative title; b)
Complete names of authors without abbreviations and their
institutions; c) Department and official name of the institution(s)
to which the work should be attributed; d) Name, full address
including telephone and e-mail of corresponding author; e)
financial support (if any).
2. Abstract and keywords: Abstract in English of not more than
250 words. For Original Articles this should be structured with
background, method, main results and conclusion. For the other
article types, the abstract need not be structured but should
contain information illustrating the importance of the work.
Specify up to five keywords, which define the theme of the paper.
The keywords should be based on MeSH (Medical Subject
Headings) from the National Library of Medicine available
at:http://www.sgponline.com.br/rbhh/sgp/naveg/mesh.asp. For
clinical trials, indicate the International Clinical Trials Registry
Number below the summary.
3.Manuscript content: a) Original Article: Used to publish the
results of scientific research, it must be original and should
comprise the following: Introduction, Objective, Method, Results,
Discussion, Conclusion and References. The work should not
exceed 4000 words (including references), up to 6 authors, up to
7 tables, illustrations and photos and up to 30 references; b)
Special Article: With the same structure as original articles,
Original Articles are reclassified by the Editor depending on their
importance: C) Review Articles: narrative reviews addressing an
important issue in the specialty. These articles should not exceed
5000 words (including references), a maximum of 7 tables,
Figures and Photos and up to 60 references; d) Update in the
Specialty: on a theme, method, treatment, etc. It must contain a
brief history of the topic, its current state of knowledge and the
reasons for the work; study methods (data sources, selection
criteria), hypotheses, study lines, etc., criteria similar to review
articles: e) Case Report: should have an introduction with a brief
19
literature review, a description of the case showing significant
results for the diagnosis and differential diagnoses (if any),
discussion or comments and references. It should not exceed
1800 words, two tables, illustrations and photographs, up to four
authors and ten references: f) Letters to the Editor: a
maximum of 1000 words (including references), three authors,
and two illustrations: g) Images in Clinical
Hematology: Maximum 100 words, two images, three authors
and three references: h) Scientific comments: will only be
accepted by invitation of the editors.
4 Acknowledgements: Should be addressed to collaborators who
deserve recognition, but whose participation does not justify their
inclusion as an author such as technical assistants, as well as
financial support received.
5. References: References should always be numbered in the
order they appear in the text. The format must be based on the
"Uniform Requirements for Manuscripts Submitted to Biomedical
Journals" guidelines proposed by the International Committee of
Medical Journal Editors and updated in 2009, as follows: the titles
of journals should be abbreviated following the List of Journals
Indexed in Index Medicus of the National Library of Medicine
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez). Cite the first six
authors after which add the words et al.
Examples of references:
Printed documents
Journals: Padley DJ, Dietz AB, Gastineau DA. Sterility testing of
hematopoietic progenitor cell products: a single-institution series of
culture-positive rates and successful infusion of culture-positive products.
Transfusion. 2007;47(4):636-43.
Books: Chalmers J. Clinician’s manual on blood pressure and stroke
prevention. 3rd ed. London: Science Press; 2002. 70 p.
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Management. 2nd ed. Oxford: Blackwell Science Ltd Editorial Offices;
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eritrocitária, granulocítica e megacariótica em pacientes com síndromes
mielodisplásicas [thesis]. São Paulo: Universidade Federal de São Paulo;
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Electronicdocuments
Articles in Periodicals: Almeida ID, Coitinho AS, Juckowsky CA,
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Boston: Butterworths; 1990. [cited 2010 Jun 10]. Available
from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=cm
Illustrations and photos: Must have a resolution of at least 1000 dpi.
Color figures should be in CMYK and will be published in color only if
essential and must be in TIFF, JPEG or CDR format. Do not send the
figures within the text.
Tables: should be numbered consecutively using Arabic numerals and
cited in the text in numerical order. If the table requires special symbols,
it should be sent as a high resolution image (1000 dpi) in TIFF or JPG
format.
Submission
The submission of the manuscript must be via the website of the
RevistaBrasileira de Hematologia e Hemoterapia, (Journal of Hematology
and Hemoterapy) www.rbhh.org. A copyright transfer form (available on
the website) must be completed and signed by all authors and sent to
the editorial office e-mail [email protected].
When a manuscript is accepted for publication, the author(s) will be
requested to complete a conflict of interest form which must be sent to
the editorial office.
It is the responsibility of authors to obtain written permission to
reproduce any previously published data included in the manuscript.
The editors can publish papers that do not exactly follow the instructions
after careful evaluation always taking into account the interests of the
readership.
Correspondenceaddress:
Milton Artur Ruiz
Editor in Chief
Rua Catarina NucciParise, 760 - Jardim Vivendas
15090-470 São Jose do Rio Preto, SP, Brazil