Mário Cunha - IPO Lisboa
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Introdução as Técnicas de Biologia Molecular em Virologia Mário Cunha Obj ti Objectivos Introdução ao PCR em Tempo Real Colheita e manipulação de amostras Diagnóstico Molecular em Microbiologia Análise e Tratamento de Dados ` ` ` ` 2 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 I t d ã Biologia Introdução Bi l i Molecular M l l Biologia Molecular em Microbiologia: ` ` ` Detecção Indirecta vs Detecção Directa do agente M t i l Genético: Material G éti ` ` ` Charles De Gaulle: 1958 ` ` 3 DNA RNA Reune 12 cientistas R i i d de topo e concede d a cada d um 5 min i para lhe lh explicar qual a area cientifica que teria um investimento reforçado Em 1958, 1958 foi a Biologia Molecular a escolhida 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví Dmitri Ivanovskyy ((1864-1920): ) ` ` ` Um dos Fundadores da Virologia 1892: Descobriu que o agente responsável pela doença de mosaico de tabaco passava através dos filtros capazes de reter bactérias Martinus Willem Beijerinck j ((1851 – 1931): ) ` ` ` Um dos Fundadores da Virologia Em 1898, ele fez descobertas semelhantes mas sugeriu que o patogeneo responsavel era diferente Principais p Provas: ` ` ` ` 4 Agente de reduzido tamanho Apenas replica no hospedeiro, não o faz no meio Passa nos filtros de 0,2 μm 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví Quando lhe p perguntaram g oq que era um Virus, ele respondeu com um Truismo: “A virus is a virus” André Lwoff: Prémio Nobel da Medicina em 1965. 5 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 O que é um vírus? “A virus is a piece of bad news wrapped up in protein” Sir Peter Medawar –Nobel Prize 1960 6 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví 1901 Yellow Fever Virus (1st Human Virus) 1911 Rous Sarcoma Virus 7 1903 Rabies Virus 1915 Bacteriophages 1906 Variola Virus 1908 Chicken Leukemia Virus, Virus Poliovirus 1906 Influenza Virus 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 O que é um vírus? í ? Historia da Virologia: ` ` 8 http://www.utmb.edu/virusimages/ 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví Vírus ` ` Toxina ou veneno liquido (Latim) Apresentam as seguinte propriedades: ` ` ` ` ` ` Um vírus é parasita intracelular obrigatório O material genético pode ser DNA ou RNA É este material genético que entra na célula hospedeira e é responsável no direccionamento da maquinaria celular para a produção de novas partículas virais – Viriões E Estes viriões i iõ são ã produzidos d id na célula él l hospedeira h d i a partir i da d “montagem” das diferentes unidades codificadas pelo material genético Os novos viriões produzidos na célula hospedeira transportam o material genético para outra célula hospedeira ou organismo, de modo a dando inicio a um novo ciclo infeccioso Vírus: eles não crescem, eles não se dividem, apenas replicam ` 9 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví 10 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví • Mimivirus: • O maior vírus conhecido! • Tamanho: 750 nm • Codifica 1018 genes • Hosp: p amiba 11 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví ` Classificação: ` ` ` 12 Em 1962, André Lwoff, Robert Horne e Paul Tournier foram os primeiros a desenvolver a primeira metodologia para classificar os vírus, baseada no sistema hierárquico de Lineu Este sistema baseia a classificação em filo, filo classe, classe ordem, ordem família, família género e espécie Os vírus era agrupados de acordo com as propriedades partilhadas (e não as dos seus hospedeiros) e o tipo de ácido nucleico que constitui o seu genoma 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví 13 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví 14 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví 15 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví ` Classificação dos Vírus: ` ` ` Mais tarde, foi criado o Comité Internacional de Taxonomia de Vírus ((International Committee on Taxonomy of Viruses) No entanto, os vírus não eram classificados com base no filo f ou classe, uma vez que o reduzido tamanho do genoma dificulta e muito a determinação do ancestral para alem da Ordem As 4 principais características para classificar os vírus são: ` ` ` ` 16 Natureza do ácido nucleico do virião: DNA e RNA Simetria (cápside) Presença/ Ausência de envelope (lípidos) Dimensão do Virião e da Cápside 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví ` Naa cclassificação ass cação actual actua (2011), ( 0 ), o ICTV C define e e 6 ordens: o e s: ` ` ` ` ` ` ` ` ` Caudovirales Herpesvirales p Mononegavirales, Nidovirales, Picornavirales Tymovirales. Foi proposta uma sétima é ordem: Ligamenvirales O ICTV não distingue formalmente entre subespescies, tipos e isolados i l d No total, temos 6 ordens, 87 famílias, 19 subfamílias, 349 géneros cerca de 2,284 géneros, 2 284 espécies e mais de 3000 tipos sem classificação 17 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví ` Classificação de Vírus: Classificação de Baltimore ` ` Desenvolvida por David Baltimore, Prémio Nobel Medicina(1975) Baseada no mRNA http://www.virology.ws/2009/08/07/how-viruses-are-classified/ p gy 18 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví ` A Classificação de Baltimore implica que: ` ` 19 Todos os genomas vírus têm de produzir mRNA que possa ser lido pelos ribossomas do hospedeiro 7 Tipos de Genomas: A Classificação original não incluía um tipo de genoma: dsDNA com RT da família Hepadnaviridae 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Vírus Ví 1º Cu urso de Virrologia Mo olecular em m Oncolo ogia - 26 e 27 Nove embro 2012 20 Vírus Ví ` DNA ` dsDNA (I) ` ` ` ` RNA ` Adenovirus Herpesvirus Poxvirus ` ` Parvovirus ` ` ` Orthomyxovirus Rhabdovirus ss(+)RNA with DNA intermediate (VI) ` 21 Picornavirus Pic rna ir s Togavirus ss( )RNA (V) ss(-)RNA ` He adna ir s Hepadnavirus Reovirus ss(+)RNA (IV) ` Gapped ds DNA (VII) ` dsRNA (III) ` ssDNA (II) ` ` ` Retrovirus 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 I t d ã Biologia Introdução Bi l i Molecular M l l ` Ácidos Nucleicos: ` ` ` ` 22 Friedrich Miescher (1860) Ri h d Alt Richard Altmann (1889) Albrecht Kossel, Prémio Nobel Medicina 1910 (descoberta (d b t d das bases b e pentoses t dos ácidos nucleícos) Ph bi Levine Phoebis L i e Walter W lt JJacobs b (1909) (1909): estrutura do nucleótido 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 I t d ã Biologia Introdução Bi l i Molecular M l l ` James Watson e Francis Crick: ` ` 23 A estrutura final da molécula de DNA foi proposta por estes dois cientistas em 1953 Ganharam o Prémio Nobel Medicina em 1962 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 I t d ã Biologia Introdução Bi l i Molecular M l l ` Rosalind Franklin: ` ` Difração do raio-X raio X para determinação da estrutura da molécula do DNA Dogma Central D C t l da d Biologia Bi l i Molecular (Crick, 1957) ` 24 DNA -> mRNA -> Proteina 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 E t t Estrutura C Cadeia d i dupla d l DNA Adenosina: •Açucar (pentose): •Base: Adenina •Grupo Fosfato 25 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Introdução Biologia Molecular Á Ácidos Nucleícos: DNA vs RNA 26 Ligações g ç p por p pontes de Hidrogénio g entre cadeias complementares 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 I t d ã Biologia Introdução Bi l i Molecular M l l ` Replicação: ` ` ` 27 Ocorre na divisão celular É realizada pelo enzima DNA Polimerase E Extensão: ã 5’ – 3’ 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 D t Di Det. Directa t vs Indirecta I di t ` Detecção Directa e Indirecta agente: ` ` 28 Até a década de 1970, a descoberta de vírus era realizada com base na Cultura Células e posterior identificação por Microscopia Eletrónica Em 1971, foram desenvolvidos os imunoensaios (EIA ou ELISA), por Eva Engvall, Anton Schuurs, Peter Perlmann e Bauke van Weemen 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 P li Polimerase Chain Ch i Reaction R ti ` ` Primeiro trabalho p publicado em 1971,, ppor Kleppe pp e colaboradores Só com a descoberta, descoberta em 1976, 1976 da Taq Polimerase, Polimerase uma DNA Polimerase isolada de uma bacteria termofila, Thermus aquaticus, aquaticus capaz de aguentar as elevadas temperaturas necessárias a desnaturação da dupla cadeia, é que estavam criadas as condições para a invenção do PCR 29 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 P li Polimerase Chain Ch i Reaction R ti • Invenção do PCR atribuida a Kary Mullis, em 1983: ` ` • Trabalhava na Cetus Corp, equipa multidisciplinar "Beginning with a single molecule of the genetic material DNA, the PCR can generate 100 billion billi similar i il molecules l l in i an afternoon. ft The reaction is easy to execute. It requires no more than a test tube,, a few simple p reagents, and a source of heat.“ Kary Mullis: ` Recebeu o Prémio Nobel Quimica em 1993 30 http://www.karymullis.com/ 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 P li Polimerase Chain Ch i Reaction R ti Diferentes passos do PCR: y y y Desnaturação da cadeia dupla (94-96ºC) Ligação dos primers (Annealing, (Annealing a 65 65ºC) C) Elongação (Taq Polimerase, 72ºC) Necessário equipamento especifico (diferentes temperaturas) 31 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 50º A. Double strand DNA 96º B. Denature 50º C. Anneal primers Taq 72º 32 D. Polymerase binds 1º Curso de Virologia Molecular em Taq Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 P li Polimerase Chain Ch i Reaction R ti 33 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 P li Polimerase Chain Ch i Reaction R ti 34 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 P li Polimerase Chain Ch i Reaction R ti ` ` Detecção do produto amplificado é realizada por gel Corantes: ` ` ` ` ` Brometo EEtidio B d (20 ng DNA) SYBR Green Tampão de Carga (Loading Buffer) Aplicação de corrente eléctrica Marcador de peso molecular 35 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 P li Polimerase Chain Ch i Reaction R ti 36 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 R Reverse T Transcription i ti PCR ` Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction: RT-PCR ` ` ` ` 37 Variante da Técnica de PCR Aplicada quando se pretende determinar a presença de RNA O RNA é convertido em DNA complementar ou cDNA, através da acção de um enzima –Transcriptase Reversa Uma vez obtido o cDNA, segue-se o PCR normal 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 AAAAA RT TTTTT AAAAA RT TTTTT AAAAA RT TTTTT Conversion of mRNA to cDNA by Reverse Transcription 38 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 Oligo dT primer is bound to mRNA Reverse transcriptase (RT) copies first cDNA strand Reverse transcriptase g and digests displaces mRNA and copies second strand of cDNA Double D bl strand cDNA P li Polimerase Chain Ch i Reaction R ti 39 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 PCR Tempo T R Reall • Limitações Li it õ da d Detecção D t ã d de produtos d t de d PCR através t é de d Gel de agarose (PCR Convencional): • • • • • • • • 40 Baixa B i P Precisão iã Baixa sensibilidade Gama mais curta < 2 logs Baixa resolução Sem automatização Discriminação unicamente com base no tamanho fragmento Resultados não são expressos numericamente A coloração com Brometo Etidio não é muito precisa em termos quantitativos 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 PCR Tempo T R Reall ` História: ` Primeiros artigos na década d 1990: de 1990 ` ` 41 Higuchi et al, 1992 H id ett al,1996 Heid l 1996 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 42 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 PCR Tempo T R Reall Monitorização da fluorescência emitida durante a reacção de PCR como consequência da formação de fragmentos de DNA em cada ciclo de PCR, por oposição à detecção na fase final do PCR: y y y 43 Detecção em tempo real do aumento de fluorescência Nã há necessidade Não id d d de detectar d o produto d amplificado lifi d atraves de gel T d a análise Toda áli é realizada li d atraves de d software f 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 PCR Tempo T R Reall Vantagens a tage s PCR C em e Tempo e po Real: ea : y y y y y y y y y 44 Não é influenciado por amplificação inespecifica Amplificação p pode p ser monitorizada em Tempo p Real Não há necessidade de processamento pós PCR (dimimuição do risco de contaminações) R d (30 min. a 2 horas) Rapidez h ) Maior Gama dinâmica (aumentos de 1010) Re er menor Requer men r quantidade antidade de DNA/RNA Confirmação de amplificação específica através da Curva de Dissociação ssoc ação ((Melting t g Curve) Cu v ) Equipamento garante maior especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade Não é mais caro que o PCR tradicional, excepto aquisição de equipamento 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 PCR Tempo T R Reall ` Desvantagens do PCR em Tempo Real: ` ` 45 Implementação requer capacidades técnicas especificas Custo do equipamento 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012 ` ` ` ` ` ` LCR TMA NASBA bDNA Microarrays Sequenciação 46 1º Curso de Virologia Molecular em Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012
