Mário Cunha - IPO Lisboa

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Introdução as Técnicas de Biologia
Molecular em Virologia
Mário Cunha
Obj ti
Objectivos
Introdução ao PCR em Tempo Real
Colheita e manipulação de amostras
Diagnóstico Molecular em Microbiologia
Análise e Tratamento de Dados
`
`
`
`
2
1º Curso de Virologia Molecular em
Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012
I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
Biologia Molecular em Microbiologia:
`
`
`
Detecção Indirecta vs Detecção Directa do agente
M t i l Genético:
Material
G éti
`
`
`
Charles De Gaulle: 1958
`
`
3
DNA
RNA
Reune 12 cientistas
R
i i
d
de topo e concede
d a cada
d um 5 min
i para lhe
lh
explicar qual a area cientifica que teria um investimento reforçado
Em 1958,
1958 foi a Biologia Molecular a escolhida
1º Curso de Virologia Molecular em
Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012
Vírus
Ví
Dmitri Ivanovskyy ((1864-1920):
)
`
`
`
Um dos Fundadores da Virologia
1892: Descobriu que o agente responsável pela
doença de mosaico de tabaco passava através
dos filtros capazes de reter bactérias
Martinus Willem Beijerinck
j
((1851 – 1931):
)
`
`
`
Um dos Fundadores da Virologia
Em 1898, ele fez descobertas semelhantes mas
sugeriu que o patogeneo responsavel era
diferente
Principais
p Provas:
`
`
`
`
4
Agente de reduzido tamanho
Apenas replica no hospedeiro, não o faz no
meio
Passa nos filtros de 0,2 μm
1º Curso de Virologia Molecular em
Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012
Vírus
Ví
Quando lhe p
perguntaram
g
oq
que era um
Virus, ele respondeu com um Truismo:
“A virus is a virus”
André Lwoff: Prémio Nobel da Medicina em 1965.
5
1º Curso de Virologia Molecular em
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O que é um vírus?
“A virus is a piece of bad news wrapped up in protein”
Sir Peter Medawar –Nobel Prize 1960
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Vírus
Ví
1901
Yellow Fever Virus
(1st Human Virus)
1911
Rous Sarcoma Virus
7
1903
Rabies Virus
1915
Bacteriophages
1906
Variola
Virus
1908
Chicken
Leukemia Virus,
Virus
Poliovirus
1906
Influenza Virus
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O que é um vírus?
í
?
Historia da Virologia:
`
`
8
http://www.utmb.edu/virusimages/
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Vírus
Ví
Vírus
`
`
Toxina ou veneno liquido (Latim)
Apresentam as seguinte propriedades:
`
`
`
`
`
`
Um vírus é parasita intracelular obrigatório
O material genético pode ser DNA ou RNA
É este material genético que entra na célula hospedeira e é
responsável no direccionamento da maquinaria celular para a
produção de novas partículas virais – Viriões
E
Estes
viriões
i iõ são
ã produzidos
d id na célula
él l hospedeira
h
d i a partir
i da
d
“montagem” das diferentes unidades codificadas pelo material
genético
Os novos viriões produzidos na célula hospedeira transportam o
material genético para outra célula hospedeira ou organismo, de
modo a dando inicio a um novo ciclo infeccioso
Vírus: eles não crescem, eles não se dividem, apenas replicam
`
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Vírus
Ví
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1º Curso de Virologia Molecular em
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Vírus
Ví
•
Mimivirus:
• O maior vírus
conhecido!
• Tamanho: 750 nm
• Codifica 1018 genes
• Hosp:
p amiba
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Vírus
Ví
`
Classificação:
`
`
`
12
Em 1962, André Lwoff, Robert Horne e Paul Tournier foram os
primeiros a desenvolver a primeira metodologia para classificar
os vírus, baseada no sistema hierárquico de Lineu
Este sistema baseia a classificação em filo,
filo classe,
classe ordem,
ordem família,
família
género e espécie
Os vírus era agrupados de acordo com as propriedades
partilhadas (e não as dos seus hospedeiros) e o tipo de ácido
nucleico que constitui o seu genoma
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Vírus
Ví
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Vírus
Ví
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Vírus
Ví
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Vírus
Ví
`
Classificação dos Vírus:
`
`
`
Mais tarde, foi criado o Comité Internacional de
Taxonomia de Vírus ((International Committee on
Taxonomy of Viruses)
No entanto, os vírus não eram classificados com
base no filo
f ou classe, uma vez que o reduzido
tamanho do genoma dificulta e muito a
determinação do ancestral para alem da Ordem
As 4 principais características para classificar os
vírus são:
`
`
`
`
16
Natureza do ácido nucleico do virião: DNA e RNA
Simetria (cápside)
Presença/ Ausência de envelope (lípidos)
Dimensão do Virião e da Cápside
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Vírus
Ví
`
Naa cclassificação
ass cação actual
actua (2011),
( 0 ), o ICTV
C define
e e 6 ordens:
o e s:
`
`
`
`
`
`
`
`
`
Caudovirales
Herpesvirales
p
Mononegavirales,
Nidovirales,
Picornavirales
Tymovirales.
Foi proposta uma sétima
é
ordem: Ligamenvirales
O ICTV não distingue formalmente entre subespescies, tipos
e isolados
i l d
No total, temos 6 ordens, 87 famílias, 19 subfamílias, 349
géneros cerca de 2,284
géneros,
2 284 espécies e mais de 3000 tipos sem
classificação
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Vírus
Ví
`
Classificação de Vírus:
Classificação de Baltimore
`
`
Desenvolvida por David
Baltimore, Prémio Nobel
Medicina(1975)
Baseada no mRNA
http://www.virology.ws/2009/08/07/how-viruses-are-classified/
p
gy
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1º Curso de Virologia Molecular em
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Vírus
Ví
`
A Classificação de Baltimore implica que:
`
`
19
Todos os genomas vírus têm de produzir mRNA que possa ser
lido pelos ribossomas do hospedeiro
7 Tipos de Genomas:
A Classificação original não incluía um
tipo de genoma: dsDNA com RT da
família Hepadnaviridae
1º Curso de Virologia Molecular em
Oncologia - 26 e 27 Novembro 2012
Vírus
Ví
1º Cu
urso de Virrologia Mo
olecular em
m
Oncolo
ogia - 26 e 27 Nove
embro 2012
20
Vírus
Ví
`
DNA
`
dsDNA (I)
`
`
`
`
RNA
`
Adenovirus
Herpesvirus
Poxvirus
`
`
Parvovirus
`
`
`
Orthomyxovirus
Rhabdovirus
ss(+)RNA with DNA
intermediate (VI)
`
21
Picornavirus
Pic
rna ir s
Togavirus
ss( )RNA (V)
ss(-)RNA
`
He adna ir s
Hepadnavirus
Reovirus
ss(+)RNA (IV)
`
Gapped ds DNA (VII)
`
dsRNA (III)
`
ssDNA (II)
`
`
`
Retrovirus
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I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
`
Ácidos Nucleicos:
`
`
`
`
22
Friedrich Miescher (1860)
Ri h d Alt
Richard
Altmann (1889)
Albrecht Kossel, Prémio Nobel Medicina
1910 (descoberta
(d
b t d
das bases
b
e pentoses
t
dos ácidos nucleícos)
Ph bi Levine
Phoebis
L i e Walter
W lt JJacobs
b (1909)
(1909):
estrutura do nucleótido
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I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
`
James Watson e Francis Crick:
`
`
23
A estrutura final da molécula de DNA foi proposta por estes
dois cientistas em 1953
Ganharam o Prémio Nobel Medicina em 1962
1º Curso de Virologia Molecular em
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I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
`
Rosalind Franklin:
`
`
Difração do raio-X
raio X para
determinação da estrutura da
molécula do DNA
Dogma Central
D
C t l da
d Biologia
Bi l i
Molecular (Crick, 1957)
`
24
DNA -> mRNA -> Proteina
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E t t
Estrutura
C
Cadeia
d i dupla
d l DNA
Adenosina:
•Açucar (pentose):
•Base: Adenina
•Grupo Fosfato
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1º Curso de Virologia Molecular em
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Introdução Biologia Molecular
Á
Ácidos
Nucleícos: DNA vs RNA
26
Ligações
g ç
p
por p
pontes de Hidrogénio
g
entre cadeias complementares
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I t d ã Biologia
Introdução
Bi l i Molecular
M l
l
`
Replicação:
`
`
`
27
Ocorre na divisão celular
É realizada pelo enzima DNA Polimerase
E
Extensão:
ã 5’ – 3’
1º Curso de Virologia Molecular em
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D t Di
Det.
Directa
t vs Indirecta
I di t
`
Detecção Directa e
Indirecta agente:
`
`
28
Até a década de 1970, a
descoberta de vírus era
realizada com base na Cultura
Células e posterior
identificação por Microscopia
Eletrónica
Em 1971, foram desenvolvidos
os imunoensaios (EIA ou
ELISA), por Eva Engvall, Anton
Schuurs, Peter Perlmann e
Bauke van Weemen
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P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
`
`
Primeiro trabalho p
publicado em 1971,, ppor Kleppe
pp e
colaboradores
Só com a descoberta,
descoberta em 1976,
1976 da Taq Polimerase,
Polimerase uma
DNA Polimerase isolada de uma bacteria termofila,
Thermus aquaticus,
aquaticus capaz de aguentar as elevadas
temperaturas necessárias a desnaturação da dupla cadeia,
é que estavam criadas as condições para a invenção do
PCR
29
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P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
•
Invenção do PCR atribuida a Kary Mullis,
em 1983:
`
`
•
Trabalhava na Cetus Corp, equipa
multidisciplinar
"Beginning with a single molecule of the
genetic material DNA, the PCR can generate
100 billion
billi similar
i il molecules
l l in
i an afternoon.
ft
The reaction is easy to execute. It requires
no more than a test tube,, a few simple
p
reagents, and a source of heat.“
Kary Mullis:
`
Recebeu o Prémio Nobel Quimica em 1993
…
30
http://www.karymullis.com/
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P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
€
Diferentes passos do PCR:
y
y
y
Desnaturação da cadeia dupla (94-96ºC)
Ligação dos primers (Annealing,
(Annealing a 65
65ºC)
C)
Elongação (Taq Polimerase, 72ºC)
€
Necessário equipamento especifico (diferentes temperaturas)
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50º
A. Double
strand DNA
96º
B. Denature
50º
C. Anneal
primers
Taq
72º
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D. Polymerase
binds
1º Curso de Virologia Molecular em
Taq
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P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
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P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
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1º Curso de Virologia Molecular em
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P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
`
`
Detecção do produto amplificado é realizada por gel
Corantes:
`
`
`
`
`
Brometo EEtidio
B
d (20 ng DNA)
SYBR Green
Tampão de Carga (Loading Buffer)
Aplicação de corrente eléctrica
Marcador de peso molecular
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P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
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1º Curso de Virologia Molecular em
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R
Reverse
T
Transcription
i ti
PCR
`
Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction: RT-PCR
`
`
`
`
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Variante da Técnica de PCR
Aplicada quando se pretende determinar a presença de RNA
O RNA é convertido em DNA complementar ou cDNA,
através da acção de um enzima –Transcriptase Reversa
Uma vez obtido o cDNA, segue-se o PCR normal
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AAAAA
RT TTTTT
AAAAA
RT
TTTTT
AAAAA RT
TTTTT
Conversion of mRNA to cDNA by Reverse Transcription
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Oligo dT primer is
bound to mRNA
Reverse
transcriptase
(RT) copies first
cDNA strand
Reverse
transcriptase
g
and
digests
displaces mRNA
and copies
second strand of
cDNA
Double
D
bl
strand
cDNA
P li
Polimerase
Chain
Ch i Reaction
R
ti
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PCR Tempo
T
R
Reall
•
Limitações
Li
it õ da
d Detecção
D t ã d
de produtos
d t de
d PCR através
t é de
d
Gel de agarose (PCR Convencional):
•
•
•
•
•
•
•
•
40
Baixa
B
i P
Precisão
iã
Baixa sensibilidade
Gama mais curta < 2 logs
Baixa resolução
Sem automatização
Discriminação unicamente com base no tamanho fragmento
Resultados não são expressos numericamente
A coloração com Brometo Etidio não é muito precisa em
termos quantitativos
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PCR Tempo
T
R
Reall
`
História:
`
Primeiros artigos na década
d 1990:
de
1990
`
`
41
Higuchi et al, 1992
H id ett al,1996
Heid
l 1996
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PCR Tempo
T
R
Reall
€
Monitorização da fluorescência emitida durante a reacção
de PCR como consequência da formação de fragmentos
de DNA em cada ciclo de PCR, por oposição à detecção
na fase final do PCR:
y
y
y
43
Detecção em tempo real do aumento de fluorescência
Nã há necessidade
Não
id d d
de detectar
d
o produto
d
amplificado
lifi d atraves
de gel
T d a análise
Toda
áli é realizada
li d atraves de
d software
f
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PCR Tempo
T
R
Reall
€
Vantagens
a tage s PCR
C em
e Tempo
e po Real:
ea :
y
y
y
y
y
y
y
y
y
44
Não é influenciado por amplificação inespecifica
Amplificação
p
pode
p
ser monitorizada em Tempo
p Real
Não há necessidade de processamento pós PCR (dimimuição do
risco de contaminações)
R d (30 min. a 2 horas)
Rapidez
h
)
Maior Gama dinâmica (aumentos de 1010)
Re er menor
Requer
men r quantidade
antidade de DNA/RNA
Confirmação de amplificação específica através da Curva de
Dissociação
ssoc ação ((Melting
t g Curve)
Cu v )
Equipamento garante maior especificidade, sensibilidade e
reprodutibilidade
Não é mais caro que o PCR tradicional, excepto aquisição de
equipamento
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PCR Tempo
T
R
Reall
`
Desvantagens do PCR em Tempo Real:
`
`
45
Implementação requer capacidades técnicas especificas
Custo do equipamento
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`
`
`
`
`
`
LCR
TMA
NASBA
bDNA
Microarrays
Sequenciação
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