Animal

56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
Casa Grande Hotel Resort • Guarujá • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
1
Origem e diversificação de Delphinoidea (Mammalia –
Cetacea)
Costa Moraes, L; Cunha, HA; Medeiros, BV; Schrago, CEG.
Departamento de Genética – Universidade Federal do Rio de Janeiro.
[email protected]
Palavras-chave: Evolução Molecular, Filogenia Molecular, Cetacea, Tempos de divergência, Genética animal
O notável registro fóssil de baleias e golfinhos fez dos cetáceos um grupo exemplar para estudos de macroevolução
e alvo de intensos estudos filogenéticos usando tanto caracteres morfológicos como moleculares. Embora a transição desses animais de terrestres para totalmente aquáticos seja bem documentada, as relações filogenéticas e a
diversificação do grupo ainda não são compreendidas. Este estudo visa compreender melhor as relações evolutivas entre os membros da superfamília Delphinoidea (Delphinidae + Monodontidae + Phocoena). Para isso foram
feitas análises filogenéticas e de evolução molecular usando sequências de três genes mitocondriais completos
(citocromo b, Citocromo oxidase I e ND2) de 81 espécies do clado Cetartiodactyla (Cetacea + Artiodactyla) que
apresentavam sequências disponíveis de publicações anteriores. Adicionalmente, foram produzidas sequências para as espécies Sotalia fluviatilis, Sotalia guianensis e Steno bredanensis. Uma pequena amostra de pele de
cada um dos animais foi utilizada para realizar a extração de DNA. O material foi então amplificado por PCR.
Os produtos de PCR foram purificados, sequenciados e as sequências posteriormente editadas. Foram realizados
alinhamentos das sequências dos três genes entre todas as espécies (N=84). Em seguida, foi realizado um levantamento bibliográfico visando coletar todos os dados possíveis sobre o registro fóssil dos membros da ordem Cetacea, os quais são essenciais para estabelecer parâmetros de calibração do relógio molecular para a estimativa
de tempos de divergência. Após esse processo, uma análise foi rodada utilizando os softwares Beast1.5.4 e BEAUti,
a fim de se obter uma árvore filogenética com os dados envolvidos no estudo. Conclusão: Com os dados obtidos
foi possível realizar uma análise filogenética entre os membros do clado Cetartiodactyla bem como estimar os
tempos de divergência entre todos os membros da superfamília Delphinoidea, que foi estabelecida como ocorrendo por volta de 16 milhões de anos atrás, no mioceno médio. Dados geológicos foram considerados para relacionar os tempos de divergência obtidos com eventos geológicos que possam ter ocorrido concomitantemente.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERJ.
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Diversidade genética de golfinhos-rotadores (Stenella
longirostris) baseada em análises de DNA mitocondrial
Faria, DM1; Costa, LP2; Silva Jr., JM3; Farro, APC1
Departamento de Ciências Agrárias e Biológicas, Centro Universitário Norte do Espírito Santo, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES).
Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Humanas e Naturais, UFES.
3
Centro de Mamíferos Aquáticos, Instituto Chico Mendes de Biodiversidade (ICMBio).
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cetáceos; D-loop; Fernando de Noronha; marcadores moleculares; variabilidade genética
A espécie Stenella longiostris (golfinhos-rotadores) apresenta ampla distribuição geográfica, no entanto, pouco
se sabe sobre a variabilidade genética e estruturação de suas populações, principalmente no Oceano Atlântico.
O objetivo do presente estudo foi avaliar a diversidade genética de golfinhos-rotadores do Arquipélago de Fernando de Noronha a partir da região controle do DNA mitocondrial (mtDNA). Nas análises foram utilizadas
amostras de pele de 108 golfinhos-rotadores de Fernando de Noronha, coletadas pelo método de raspagem. As
amostras tiveram seu DNA extraído por protocolos que utilizavam solução salina ou resina Chelex, quantificado
e submetido à PCR (Polymerase Chain Reaction) utilizando-se primers D-loop. Os fragmentos foram purificados
utilizando-se ExoSap-IT, e, posteriormente, sequenciados. Fragmentos de 414bp foram alinhados e analisados.
Um total de 13 haplótipos foi identificado, sendo que dois haplótipos tiveram maior frequência, um presente em
80% da população, e outro em 14%. As diversidades nucleotídicas (π) e haplotípicas (h) foram 0.00656 e 0.4346,
respectivamente. 29 sítios polimórficos foram detectados com 23 transições e seis transversões. Com relação a
outros trabalhos populacionais de cetáceos estes índices de diversidade genética não são considerados altos. As
diversidades nucleotídicas e haplotípicas encontradas em Fernando de Noronha são próximas as encontradas por
Andrews e colaboradores (2010) para as ilhas Ni’ihau e Kaua’i do Arquipélago do Havaí. Estudos como este visam
ampliar o conhecimento básico da espécie, o que pode auxiliar na formulação de futuras estratégias para sua conservação, principalmente em Fernando de Noronha, área considerada no Brasil como refúgio natural da espécie.
Apoio Financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Espírito Santo (FAPES)
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Estrutura genética dos ovinos naturalizados do Pantanal
Silva, DBS1; Seno, LO1; Grisolia, AB1; Vargas JR, FM1; Oliveira, CAL2; Oliveira, DP2; Martins, CF3; Pinto, GS4.
Universidade Federal da Grande Dourados, UFGD/Dourados-MS
Universidade Estadual de Maringá, UEM/Maringá-PR
3
Universidade Federal de Pelotas, UFPel/Pelotas-RS
4
Universidade Anhanguera-Uniderp, Campo Grande-MS.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: recurso genético, conservação, endogamia, características adaptativas, características reprodutivas
Introdução: As raças ovinas naturalizadas ou locais se destacam pela rusticidade e a capacidade adaptativa adquiridas nas regiões de clima tropical e subtropical. Tais características possibilitaram a sobrevivência dos animais
nesses locais, justificando assim, a conservação para a sua utilização futura. Alguns desses recursos, como no
caso dos ovinos naturalizados do Pantanal, foram descobertos recentemente e para que esses sejam conservados
seria necessário avaliar a estrutura populacional e estimar parâmetros que permitam definir planos de gestão,
a fim de evitar a consanguinidade. Objetivos: Quantificar os parâmetros populacionais da população de ovinos
naturalizados do Pantanal. Métodos: Foram utilizadas nas análises, as informações do arquivo de pedigree (identificação do animal, pai, mãe, sexo e data de nascimento) do rebanho de ovinos pertencente ao Centro Tecnológico
de Ovinocultura (CTO – UNIDERP). Dos 355 animais analisados, 144 foram considerados fundadores (geração
zero e aqueles de genealogia desconhecida) e o restante (211) constituíram a população referência, que nasceram entre os anos de 2006 e 2009. Os parâmetros populacionais foram obtidos através do software ENDOG: a)
coeficiente de endogamia (F); b) intervalo médio de gerações das quatro passagens gaméticas: pai-filho, pai-filha,
mãe-filho, mãe-filha; e c) a diversidade gênica esperada, demonstrada como um menos o parentesco médio entre
os indivíduos da população. Resultados: O F médio observado foi igual a 0 (zero). Esse resultado era esperado,
pois, após a formação do rebanho base passaram-se apenas duas gerações, e as estimativas de F obtidas pelo
método tabular, podem ser observadas a partir da terceira geração. Além disso, as pressuposições desses cálculos
assumem que os animais fundadores são não endogâmicos e não aparentados. Contudo, se os fundadores têm
origem em pequenas populações, eles podem ser consanguíneos. Neste sentido, técnicas moleculares podem ser
utilizadas para determinar o grau de parentesco entre os fundadores e melhorar as informações no pedigree. O
parentesco médio entre os animais foi de 1,37%, ou seja, que se os machos fossem acasalados ao acaso resultaria
em um F de 1,37%. Este resultado indica a importância de um programa de acasalamento, que evite o acasalamento entre indivíduos mais aparentados que a média da população. A estimativa do intervalo médio de geração foi de 3,85±0,75 anos. Ao considerar as passagens gaméticas (pai-filho, pai-filha, mãe-filho, mãe-filha) foram
observados intervalos de 3,91±0,70; 3,84±0,75; 3,84±0,77 e 3,82±0,77 anos, respectivamente. Se tratando de um
recurso genético, seria interessante que os intervalos de geração fossem maiores, para que não houvesse seleção
e, consequentemente, alterações nas freqüências gênicas e genotípicas da população. Conclusões: Apesar do coeficiente de endogamia observado no rebanho ter sido igual a zero, o parentesco médio encontrado indica que
seria necessário o planejamento dos acasalamentos dos indivíduos para a conservação genética desses animais.
Apoio financeiro: CNPq, FUNDECT e UFGD.
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Diversidade genética dos ovinos naturalizados do Pantanal
Seno, LO1; Silva, DBS1; Grisolia, AB1; Vargas JR, FM1; Oliveira, CAL2; Oliveira, DP2; Martins, CF3; Pinto, GS4.
Universidade Federal da Grande Dourados, UFGD/Dourados-MS
Universidade Estadual de Maringá, UEM/Maringá-PR
3
Universidade Federal de Pelotas, UFPel/Pelotas-RS
4
Universidade Anhanguera-Uniderp, Campo Grande-MS.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ovinos, conservação genética, variabilidade genética, censo efetivo, contribuição de fundadores
Introdução: A maioria das medidas de diversidade genética é baseada em índices de heterozigosidade, que pode ser
definida como a probabilidade que dois genes em um dado locus, selecionados aleatoriamente em uma população
relevante, serem diferentes. A redução no número e na frequência de alguns alelos reduziria a heterozigosidade e,
consequentemente, a variabilidade genética. A redução na heterozigosidade poderia refletir no desvio da condição
ideal devido aos efeitos de tamanho reduzido da amostra e do acasalamento não aleatório. O tamanho reduzido
das populações poderia diminuir o nível de diversidade genética através da perda de alelos e de heterozigosidade
devido à amostragem aleatória dos gametas, o que pode afetar as frequências subsequentes dos genes na população. Objetivos: Estudar a variabilidade genética de uma população de ovinos naturalizados do Pantanal. Métodos:
Foram utilizadas nas análises, as informações do arquivo de pedigree (identificação do animal, pai, mãe, sexo e data
de nascimento) do rebanho de ovinos pertencente ao Centro Tecnológico de Ovinocultura (CTO – UNIDERP). Dos
355 animais analisados, 144 foram considerados fundadores (geração zero e aqueles de genealogia desconhecida)
e o restante (211) constituíram a população referência, que nasceram entre os anos de 2006 e 2009. Os parâmetros
populacionais estudados foram: a) o tamanho efetivo da população (Ne), que foi obtido pelo coeficiente de regressão
(b) do coeficiente de endogamia do indivíduo sobre o número de gerações completas equivalentes (limite real do
Ne); b) a contribuição de fundadores; e c) a diversidade gênica esperada, que foi obtida como um menos o parentesco
médio entre os indivíduos da população. Resultados: O estudo indicou que o Ne da população foi de 196 e que apenas
42 animais dos 144 considerados como fundadores da população base contribuíram efetivamente para a formação
das gerações sucessivas. É importante ressaltar que quanto mais balanceadas as contribuições esperadas dos fundadores, maior o tamanho efetivo da população e menor a perda em diversidade genética. A diversidade gênica esperada foi de 0,98; revelando apenas uma pequena perda de variabilidade (0,02). Contudo, essa perda corresponde
ao aumento da homozigose e, consequentemente, redução da heterozigosidade de alelos na população. Estudos
semelhantes, indicam que o declínio na porcentagem de heterozigotos (onde se encontra a diversidade gênica)
ocorre sobre o tempo em função da redução do Ne. Conclusões: Os resultados demonstraram que a variabilidade
genética na população reduziu pouco, mas tende a reduzir no decorrer das gerações, se não forem tomadas as devidas precauções no intuito de aumentar o censo populacional e evitar o acasalamento entre indivíduos aparentados.
Apoio financeiro: CNPq, FUNDECT e UFGD.
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Variação no padrão de expressão de citocinas em
ovinos da raça Somalis naturalmente infectados por
Haemonchus contortus
Zaros, LG1; Coutinho, RMA1; Coutinho, LL2; Navarro, AMC3; Neves, MRM3; Benvenuti, CL3; Sider, LH4; Vieira, LS4
Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN – Natal/RN
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – ESALQ/USP - Piracicaba/SP
3
Universidade Estadual Vale do Acaraú – UVA – Sobral/CE
4
Embrapa Caprinos e Ovinos, Sobral, CE.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Citocinas, ovinos, PCR em tempo real, resistência, susceptibilidade
Indivíduos pertencentes a uma mesma raça tais como ovinos da raça Somalis, podem exibir diferentes padrões de
expressão de citocinas quando infectados por nematódeos gastrintestinais. Por esse motivo, o presente trabalho
teve como objetivo quantificar a expressão de citocinas (IL-4, IL-13, TNF-α e IFN-γ) em dois grupos de ovinos da
raça Somalis: um resistente e outro susceptível às infecções por Haemonchus contortus. Um rebanho de 75 ovinos
jovens, com idade entre 4 e 5 meses foram mantidos durante 4 meses em caatinga nativa naturalmente infectada
por nematódeos gastrintestinais, sem receber tratamento anti-helmíntico. Semanalmente, estes animais foram
monitorados pela contagem de OPG e no final do período experimental, os oito animais que apresentaram as
menores médias de OPG, foram classificados como resistentes e os oito que apresentaram as maiores médias de
OPG, foram classificados como susceptíveis. Estes foram selecionados e abatidos para a coleta de amostras dos
nódulos linfáticos abomasais e recuperação dos nematódeos do abomaso para posterior contagem e identificação.
A metodologia de PCR em tempo real foi realizada em equipamento LightCycler utilizando o corante SYBR Green
I. RPL-0 (proteína ribossomal L-0) foi utilizada para a normalização e a quantificação relativa dos genes foi calculada pelo software REST. Os animais resistentes apresentaram menor contagem média de OPG do que os animais
susceptíveis (1312,5 e 5081,6, respectivamente; P<0.001) e 9 vezes menos exemplares de
(P<0.05). Das quatro citocinas analisadas, IL-13 foi mais expressa no grupo resistente (3,6 vezes; P<0,05) e IFN-γ
foi mais expressa no grupo susceptível (2,7 vezes; P<0,01). Os outros dois genes analisados apresentaram o mesmo
padrão de expressão entre os grupos resistente e susceptível (P<0,05). IL-13 é uma citocina que estimula a resposta
TH2, levando o hospedeiro a responder eficientemente à infecção e a expulsar rapidamente os parasitas. Esta citocina atua juntamente com IL-4 na resposta à infecção parasitária, mas sem depender desta para a eliminação do
parasita. Já a maior expressão de IFN-γ observada nos animais susceptíveis indica uma resposta TH1, caracterizada
pelo ineficiente combate à infecção, que contribui para o efeito crônico da doença. Animais com um perfil de expressão de citocinas TH1, tais como o IFN-γ, além de levarem um maior tempo para expulsar os parasitas, também
apresentam um maior número de ovos nas fezes, e conseqüentemente um maior número de parasitas. Pode-se
inferir que ovinos Somalis classificados como resistentes apresentaram uma resposta caracterizada por citocinas
TH2 e que os ovinos classificados como susceptíveis apresentaram uma resposta caracterizada por citocinas TH1.
Apoio financeiro: CNPq, Embrapa Caprinos e Ovinos e FUNCAP.
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Conservação de Recursos Genéticos Animais:
Superioridade Genética da Ovelha Crioula Lanada em
Condições Naturais de Produção no Brasil
Rebelato, AB1; Mendonça, FC1; Ferreira, GC1; Vaz, CMSL2; Mariante, AS2; Lopes, DO1
Universidade Federal de São João del Rei
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária.
[email protected]
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Palavras-chave: Conservação Genética, Resistência a Endoparasita, Raça Naturalizada, Seleção Natural, Adaptação
A Ovelha Crioula Lanada é uma raça naturalizada que descende das raças europeias Churra ou Churra Bordaleira.
Trazidos pelos Jesuítas na colonização do Brasil, estes animais foram soltos, indiscriminadamente, e, por seleção
natural, desenvolveram uma nova raça caracterizada pela sua rusticidade. O patrimônio genético destes animais
conferem a eles um pacote de características que permite sua criação de uma maneira mais natural, diminuindo a
necessidade de utilização de procedimentos físicos e químicos de manejo, típicos de raças importadas. Com uma
lã naturalmente colorida, variando do branco ao preto, passando por tons de bege, marrom e cinza, esta ovelha
produz, de maneira satisfatória, uma lã naturalmente colorida que dispensa a utilização de pigmentos industriais,
o que constitui matéria prima interessante para artesanato rústico e grande importância na geração de renda
para agricultura familiar. Outra característica relevante deste ovino é a sua resistência natural a endoparasitas.
Quando criados em condições de pastagens naturais e sem a utilização de anti-helminticos, seja com o objetivo
de produzir carne ou produzir lã, os ovinos crioulos apresentam melhores resultados do que ovinos de raças especializadas, como a Corriedale por exemplo. Tal resistência se torna evidente quando esses ovinos são contaminados intencionalmente com parasitos de relevância na ovinocultura, a ovelha crioula lanada apresenta contagem
muito baixa de ovos nas fezes, sugerindo assim uma resistência natural a estes parasitos. Mesmo com essas vantagens este animal quase foi levado à extinção na década de 80 por causa da introdução de raças especializadas
e importadas. Através do Programa Brasileiro de Conservação de Recursos Genéticos Animais, desenvolvido pela
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Recursos Genéticos e Biotecnologia, tal material genético, após
mais de 20 anos de trabalho, encontra-se fora de risco de extinção, dessa forma os genes responsáveis por essas
vantagens, uma vez identificados, podem ser utilizados como material para melhoramento genético. Conclusões:
Com o avanço e popularização das biotécnicas na agropecuária, com a crescente demanda da população por
produtos “orgânicos” e com a necessidade de produção de alimentos adequada à agricultura familiar, os genes que,
comprovadamente, conferem resistência a endoparasitas, e que foram conservados naturalmente na ovelha crioula lanada, podem ser alvos de estudos para uma produção de ovinos com responsabilidade ambiental e social.
Apoio Financeiro: Fapemig, UFSJ.
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Análise da expressão gênica da hepcidina na medula
óssea de ovinos saudáveis
Badial, PR1; Oliveira Filho, JP1; Cunha, PHJ2; Silva, JR3; Cagnini, DQ1; Araujo Jr, JP4; AS. Borges1
Departamento de Clínica Veterinária, Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, SP
Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Goiás - Escola de Veterinária, Goiânia, GO
3
Departamento de Genética, Universidade Estadual Paulista - Instituto de Biociências, Botucatu, SP
4
Departamento de Microbiologia e Imunologia, Universidade Estadual Paulista - Instituto de Biociências, Botucatu, SP.
Autor para correspondência: [email protected]
1
2
Palavras-chave: Hepcidina, Ovinos, Medula Óssea, Expressão Gênica, qPCR
Introdução: A hepcidina é um peptídeo que participa na regulação do metabolismo do ferro, na defesa do hospedeiro e na inflamação. O fígado é o principal local de expressão do RNAm e síntese de hepcidina, todavia sua síntese também ocorre, em menor grau, em diversos outros tecidos. Objetivo: Realizar a análise da expressão gênica
da hepcidina na medula óssea de ovinos saudáveis. Métodos: Foram utilizados 20 ovinos, sendo quatro da raça
Suffolk e 16 da raça Santa Inês, com seis meses de idade, clinicamente sadios e não portadores de processo inflamatório sistêmico. As amostras de medula óssea foram colhidas do esterno, através de biópsia aspirativa, utilizando agulha Komiyashiki. O RNA foi extraído, imediatamente após a colheita, utilizando o QIAamp RNA Blood
Mini Kit (Qiagen®) e foi tratado com a enzima DNAse I AMP Grade (Invitrogen®), visando eliminar DNA genômico
residual. O cDNA foi obtido utilizando “random primers” e a enzima Improm-IITM RT (Promega). As reações de
qPCR foram realizadas em triplicata utilizando e o kit Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems),
o termociclador 7300 Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems) e como controle endógeno a βactina ovina.
Os oligonucleotídeos iniciadores, desenhados com o programa PrimerQuest®, amplificaram produtos contendo
108 e 82 pares de base para os genes da hepcidina ovina (GQ901053) e βactina ovina (NM_001009784), respectivamente. A quantificação relativa foi realizada utilizando o método baseado na curva padrão para o processamento relativo dos dados. A expressão basal média da hepcidina do fígado recebeu o valor relativo de 1,0 e
a concentração da medula óssea foi calculada proporcionalmente. A análise estatística foi realizada pela comparação entre as médias pelo teste de Tukey com o SAS software e significância estatística de 5% (p<0,05). Todos os procedimentos foram previamente aprovados pela Câmara de Ética e Experimentação Animal (177/2007).
Resultados: A concentração relativa do RNA mensageiro da medula óssea, quando comparada com o fígado foi
de 6,18 x 10-5. Este valor foi significativamente menor (p<0,0001) do que o valor observado no fígado. Portanto,
a medula óssea expressou 16.183 vezes menos hepcidina que o fígado. Conclusões: Os resultados do presente
estudo permitem concluir que ovinos saudáveis apresentam expressão de transcritos da hepcidina na medula
óssea, contudo em baixos níveis quando comparados com o fígado. Este resultado amplia o conhecimento deste
peptídeo e será útil para estudos futuros sobre o metabolismo de ferro e do processo inflamatório nos ovinos.
Apoio Financeiro: CNPq (478621/2007-8)
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Mapeamento fino de QTL associado à resistência ao
carrapato bovino no cromossomo 2
Gasparini, K1; Bernardo, KB1; Azevedo, ALS1; Verneque, RS1;Peixoto, MGCD1; Silva, MVGB.1; Machado, MA1.
Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG.
[email protected]
1
Palavras-chave: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, marcadores moleculares, BTA2, Gir, Holandês
Nas regiões tropicais, a alta incidência do carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus causa grande impacto, reduzindo a produção, afetando características reprodutivas e deixando os animais mais susceptíveis a
outras infecções. A identificação de regiões genômicas e de marcadores de DNA ligados a resistência ao carrapato poderá ser uma excelente estratégia para selecionar os animais mais resistentes. Com o mapeamento de
QTL e a identificação de genes que afetam a resistência ao carrapato, a seleção assistida por marcadores (MAS)
poderá ser usada em programas de melhoramento. Estudos anteriores realizados pelo nosso grupo detectaram
a presença de QTL para resistência ao carrapato em uma população F2 Gir x Holandês. Contudo esse QTL foi
detectado com uma resolução moderada, pois a distância entre os marcadores era relativamente grande. O
intervalo de confiança para a maioria dos QTL detectados é de 20 a 30 cM, contudo a identificação de genes
candidatos requer que o QTL seja mapeado em um intervalo menor, sendo necessário refinar a região onde o
mesmo foi detectado. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi saturar a região onde foi identificado um QTL associado à resistência ao carrapato bovino no cromossomo dois. Quatro novos marcadores microssatélites foram
adicionados ao BTA 2. Amostras de sangue foram coletadas de 480 animais experimentais, incluindo parentais,
F1 e F2 e submetidas à extração de DNA. Os produtos de PCR foram detectados utilizando o seqüenciador automático de DNA MegaBACE 1000 e as análises estatísticas foram feitas utilizando do software GridQTL. Novas análises de associação foram realizadas após a adição dos novos marcadores confirmando a presença de um
QTL na estação seca. O intervalo de confiança no BTA 2 sofreu redução de 22 para 13 cM. A variação fenotípica
explicada por esse QTL é de 4.17% e o efeito aditivo encontrado não foi significativo, indicando que esse QTL
tem efeito dominante. A adição de marcadores e a diminuição do intervalo de confiança é um importante passo
para identificação de genes candidatos que futuramente poderão ser utilizados em programas de melhoramento.
Apoio financeiro: Fapemig, CNPq, Embrapa
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Hibridação Genômica Comparativa em Bos taurus
taurus LINNAEUS, 1758 (Artiodactyla – Bovidae)
Silva, DC1; da Cruz, AS1; Ribeiro, CL1; Minasi, LB1; Silva, GP2; da Silva, CC1, 2; da Cruz, AD1, 2
Núcleo de Pesquisas Replicon, Depto. de Biologia, Pontifícia Universidade Católica de Goiás.
LaGene – Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular , Lacen – Laboratório de Saúde Pública Dr. Geovanni Cysneiros,
SES – Secretaria da Saúde do Estado de Goiás.
[email protected]
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Palavras-chave: Produção animal, bovinos, gado holandês, citogenética molecular, Cot-1 DNA
A seleção animal por fenótipo observado sempre teve um papel muito importante ao longo da história da formação de subespécies e raças bovinas, moldando assim as características de grupos desses animais conforme as
necessidades populacionais localizadas. Contudo, características mais complexas só começaram a ter seus mecanismos de determinação aplicados na seleção a partir de técnicas de melhoramento genético animal. O objetivo
do presente estudo foi avaliar estrategicamente o uso da técnica de Hibridação Genômica Comparativa (CGH) em
Bos taurus taurus, promovendo assim uma nova ferramenta de detecção de regiões potencialmente relacionadas
a características produtivas em bovinos. Foram utilizadas duas vacas da raça Holandesa em mesmas condições
ambientais e nutricionais, sendo, uma apresentando alta produção leiteira diária, e outra com produção de leite
considerada baixa em condições normais para a raça. Os DNAs foram extraídos e marcados diferencialmente
com fluorocromos, sendo posteriormente hibridados em metáfases da mesma espécie por reação de CGH. Após
medição quantitativa dos sinais de fluorescência resultantes, notou-se hibridação de sondas nas regiões centroméricas dos cromossomos autossomos, e não hibridação nos centrômeros dos cromossomos X. Concluiu-se então
que a enzima Cot-1 DNA humana não é capaz de se ligar a regiões autossômicas de DNA repetitivo, ao passo
que esta mesma enzima exerce sua função de maneira correta mediante o cromossomo X de B. taurus taurus.
Portanto, notamos que o cromossomo X mostrou maior grau de conservação em relação aos cromossomos autossomos durante os processos biológicos evolutivos envolvidos entre bovinos e humanos. Como a enzima Cot-1
DNA humana não funcionou como esperado, a análise de regiões genômicas potencialmente relacionadas com
a produção de leite foi impossibilitada, havendo assim a necessidade de futuros estudos de CGH em bovinos.
Apoio financeiro: FP/PROPE/PUC-GO.
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Diferenciação genética na metapopulação da raça
Guzerá criada no estado de Minas Gerais
Silva, LA1; Cestaro, LS1; Gasparini, K1; Bernardo, KB1; Caldi, JFB1; Azevedo, ALS1; Carvalho, MRS2;
Egito, AA3; Machado, MA1; Verneque, RS1; Peixoto, MGCD1
Embrapa Gado de Leite – Juiz de Fora, MG
Laboratório de Genética Médica e Humana, Instituto de Ciências Biológicas, UFMG – Belo Horizonte, MG
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Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia – Brasília, DF.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Variabilidade genética, Marcador microssatélite, Bos indicus, Estatística F
Na índia, na região conhecida como Kankrej, de terras baixas e secas, solo arenoso e sem arvores, desenvolveu-se
a raça Guzerá (Bos indicus). A introdução da raça Guzerá no Brasil se deu ao final do século 19, onde se adaptou
de forma satisfatória às condições ambientais, relevando alta capacidade para produção de carne e leite. O Guzerá
predominou no país até 1930 e após este período foi muito utilizado em cruzamentos, o que levou à redução no
tamanho efetivo da população. Em 1994, iniciou-se o Programa Nacional de Melhoramento de Gado Guzerá para
Leite com o objetivo de melhorar a produtividade deste importante recurso genético tropical. A preocupação é
crescente com respeito ao impacto do programa sobre a variabilidade genética da população, em função da utilização intensa de reprodutores provados e superiores. O objetivo desse trabalho, portanto, foi avaliar a diversidade
genética dentro e entre populações da raça Guzerá em Minas Gerais. Para tanto, foram colhidas aleatoriamente
amostras de sangue de cerca de 10% dos animais em 15 rebanhos disseminadores de genética para corte ou duplo
propósito, totalizando 744 animais. As amostras de sangue foram submetidas à extração de DNA pelo método do
fenol-clorofórmio. O produto da extração foi quantificado e qualificado por nanoespectofotometria. Foram utilizados 11 marcadores microssatélites, previamente testados ( polimorfismo e heterozigosidade), para genotipagem
dos animais. As amostras de DNA foram amplificadas por PCR e os produtos das amplificações submetidos à
eletroforese capilar no equipamento MegaBACE 1000 (GE Healthcare). Os genótipos observados foram analisados por meio do programa GENEPOP versão 4.0 (Rousset, 2008). A diferenciação populacional foi analisada pela
estatística Fis para a diversidade dentro e entre indivíduos em cada rebanho, pelos cálculos do pairwise Fst para
comparação dos pares de rebanhos e do Fst para toda a população, todas baseadas na identidade alélica (Weir
e Cockerham, 1984). A estatística Fis encontrou valores de -0,0534 a 0,1106, evidenciando baixos níveis de variabilidade genética nos rebanhos estudados. Por meio do pairwise Fst’s, foi mostrada a baixa diferenciação (0,0269)
entre as populações. Os rebanhos de duplo propósito (corte e leite) diferenciaram-se mais dos rebanhos de corte
( = 0,0410) e assemelharam-se mais ( = 0,0146). Os rebanhos de corte, por sua vez, diferenciaram-se mais entre si ( = 0,0370). Nos rebanhos de duplo propósito, o aspecto geográfico interferiu pouco no fluxo gênico e os
rebanhos de formação mais recente são os que mais se assemelharam aos demais rebanhos. Provavelmente, a
ampla utilização de inseminação artificial contribuiu para este resultado. Nos rebanhos de corte, pode-se observar
que nem sempre a proximidade geográfica favoreceu o fluxo gênico entre as populações. Conclui-se que há certo
grau de diferenciação genética entre as linhagens de corte e de duplo propósito na população Guzerá estudada.
Apoio financeiro: Fapemig e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Avaliação do polimorfismo do gene da BetaLactoglobulina na raça Girolando
Meira, LHR1, Paiva, DS2, Pinto. ISB3, Alvino, RM1, Caetano, AR4, Paiva, SR4, Arbex, W5, Guimarães, MFM5,
Silva, MVGB5
GG
Universidade Presidente Antônio Carlos/ Juiz de Fora2Universidade Federal de Juiz de Fora
3
Bolsista de Apoio Técnico à Pesquisa - BAT II – FAPEMIG
4
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
5
Embrapa Gado de Leite.
[email protected]
1
Palavras-chave: beta-lactoglobulina, equilíbrio de Hardy-Weinberg, Girolando, PCR-RFLP, polimorfismo
Introdução: A beta-lactoglobulina (LGB) representa cerca de 50 a 55% das proteínas do soro de leite de ruminantes
e de alguns outros mamíferos, mas não está presente em humanos. Consiste de uma sequência de 162 resíduos
de aminoácidos com peso molecular de 18,4 kDa e está localizado no cromossomo 11 de bovinos (BTA11). Doze
variantes (A a J, W e Dr) já foram identificadas em bovinos, sendo as variantes A e B as mais caracterizadas e frequentes nas populações. Elas diferem entre si nos aminoácidos de posição 64 e 118. Na posição 64, Asp (GAT) é
substituída por Gly (GGT) e, na posição 118, Val (GTC) é substituída por Ala (GCC), para A e B respectivamente. A
mudança na posição 118 dá origem a um sítio de restrição para a enzima Hae III para a variante B, o qual não está
presente na variante A. Pesquisadores observaram que a variante A estava associada à maior produção de leite,
enquanto a B estava relacionada ao maior rendimento de gordura e de proteína. Objetivos: Estimar as frequências
alélicas e as genotípicas do gene LGB, na raça Girolando, e verificar se a população se encontra em equilíbrio de
Hardy-Weinberg. Métodos: O DNA foi extraído de amostras de sangue utilizando DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha), quantificado e avaliado por espectrofotometria (Nanodrop®, Wilmington, DE, EUA). Os
genótipos foram estabelecidos pela técnica de PCR-RFLP, utilizando primers já descritos e as condições da PCR
foram otimizadas quanto à concentração dos reagentes e da temperatura de anelamento, sendo conduzidas no
termociclador modelo 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). A digestão foi realizada com a enzima de
restrição Hae III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e o padrão de bandas observado em gel de agarose 2,5% corado
com Brometo de Etídeo para o estabelecimento dos genótipos. As frequências alélicas e genotípicas, bem como
o teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg, foram calculados por meio do programa GENEPOP web version 1.2. Resultados: A frequência da variante A foi de 0,4952 e da variante B foi de 0,5048. As frequências genotípicas foram
de 0,2289; 0,5325; 0,2385 para os genótipos AA, AB e BB, respectivamente, estando a população em equilíbrio de
Hardy-Weinberg (p<0,01) para os alelos A e B. Conclusão: Aparentemente, na população estudada, não há seleção
para as variantes A e B do gene da LGB. Caso os produtores queiram simplesmente aumentar a produção de
leite, devem ser selecionados os animais com genótipo AA. Todavia, caso haja melhor remuneração por maiores
teores de gordura e de proteína por parte dos laticínios, recomenda-se a seleção de animais com genótipo BB.
Apoio financeiro: FAPEMIG e EMBRAPA.
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O Padrão de bandamento DAPI é uma abordagem útil
para o pareamento cromossômico de Bovinos
(Bos taurus taurus Linnaeus, 1758)
Cruz, ASP¹; Da Cruz, AS1; Silva, DC1; Silva, GP2; da Silva, CC1, 2; da Cruz, AD1, 2
Laboratório Replicon¹ – Departamento de Biologia – Pontifícia Universidade Católica de Goiás.
LaGene² - Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular - Vinculado ao Lacen – Laboratório de Saúde Pública Dr. Giovanni
Cysneiros - Secretaria da Saúde do Estado de Goiás
[email protected]
Palavras-chave: Cariótipo bovino; cromossomo; DAPI; Bos taurus; Melhoramento genético
As estratégias de melhoramento genético (MG) animal visam a aumentar e a aperfeiçoar a produção das raças
de interesse socioeconômico para o homem. É amplamente aceito que o fenótipo observado é o resultado da
interação do genótipo individual com meio ambiente. Os protocolos de MG atualmente usados são baseados na
seleção de características econômicas das raças puras e de suas derivadas por cruzamento. O principal efeito
esperado do MG seria o aumento da herança do traço desejado na população de descendentes, fixando assim a
característica de interesse. Para a espécie bovina, a análise citogenética dos animais pode ser usada como uma
ferramenta importante para se compreender os eventos biológicos subjacentes ao complexo processo biológico da
lactação. Consequentemente, uma melhor adequação da resposta dos animais à sua interação genótipo-ambiente.
O objetivo deste estudo foi aplicar a coloração fluorescente com DAPI em metáfases de bovinos para pareamento
correto e a ordenação por tamanho dos cromossomos no cariótipo. Foi coletada uma amostra de cerca de 2 ml de
sangue periférico de um espécime bovino (Bos taurus taurus Linnaeus, 1758) em seringa heparinizada. A amostra
foi mantida a 4°C em câmara fria para se preservar a variabilidade das células. Os cromossomos metafásicos foram
obtidos segundo o protocolo adaptado de Verna e Barbosa (1995), que consistiu basicamente na inoculação da
amostra em dois frascos de cultura celular, contendo 4 ml do meio de cultura celular RPMI-1640® (GIBCO), 1 ml de
Soro Fetal Bovino, 100 µl de Fitohemaglutinina e 100 µl de L-glutamina em ambiente estéril em câmara de fluxo
laminar. A cultura das células foi colocada em estufa a 37°C com 5% de CO2 por 48 horas. Ápos o tempo de incubação, foi adicionado 100 µl de colchicina na concentração final de 6µg/ml. Lâminas de vidro com extremidade fosca
foram previamente limpas com álcool etílico a 70% e, no mínimo cinco lâminas foram preparadas com a suspensão
celular armazenada. As lâminas foram envelhecidas à temperatura ambiente por um período de 7 dias e depois
contracoradas com DAPI, que emite uma fluorescência azul. Os sinais de fluorescência foram capturados pelos
sistemas de microscopia de fluorescência Axioplan-Imaging® utilizando o software metasystems Isis®. O padrão
de bandamento DAPI permitiu o pareamento e a ordenação correta dos cromossomos bovinos, para compor o
cariótipo da espécie.
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SSCP versus PCR-RFLP: detecção de mutação no
exon14 do gene calpaína em populações bovinas
Lara, MAC1; Pivetta, AJ1; Faria, MH2; Pinatti, E1; Gutmanis, G1; Cavalcante Neto, A3.
Centro de P&D Genética Reprodução Animal – Instituto de Zootecnia, APTA, Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de
São Paulo
2
Pólo Regional de Tecnologia dos Agronegócios da Alta Mogiana, APTA. 3UA/CESAM/Portugal
[email protected]
1
Palavras-chave: maciez de carne, calpaína, SNP530, PCR-RFLP, SSCP
Introdução: Diversos marcadores genéticos associados à maciez da carne bovina têm sido investigados visando
o emprego de técnicas moleculares na identificação e seleção precoce de animais superiores. A calpaína apresenta um papel importante durante o processo enzimático de amaciamento da carne, uma vez que promove a
degradação de proteínas miofibrilares, sendo inibida pela calpastatina. O SNP530 do gene calpaína, caracterizado
pela substituição de G por A no exon 14, que resulta na substituição de valina por isoleucina na posição 530, tem
sido relacionado à diminuição da maciez da carne, avaliada pelo aumento da força de cisalhamento de Warner
Bratzler no músculo contra-filé (Longissimus dorsi). Objetivo: Investigar o SNP530 em 145 bovinos das raças Simental, Nelore e Caracu pelas técnicas PCR-RFLP e SSCP, com intuito de verificar a eficiência das mesmas. Métodos: Os primers foram desenhados, baseando-se nas sequências do gene CAPN1 no GenBank (AF248054). Para
as análises PCR-RFLP, fragmentos com 787 pb foram hidrolisados com a enzima de restrição AvaII e analisados
em gel de poliacrliamida 10%. Para as análises de SSCP, foram amplificados fragmentos de 318 pb, contendo a
referida mutação. O produto amplificado foi diluído 1:5 em tampão (10mM NaOH, 0,25% azul de bromofenol,
0,25% xileno cianol, 95% formamida), desnaturado a 95oC por 5 min e mantido em gelo até ser aplicado em gel
de poliacrilamida 12% (49:1). As análises de eletroforese para SSCP foram realizadas em tampão TBE 0,5X, empregando-se 400V e 25 mA, durante 20 horas a 120C. Resultados: As análises de RFLP revelaram três genótipos
(AA, AG, GG). O alelo A foi caracterizado pela presença de dois sítios de restrição, enquanto o G, por apenas um
sítio de restrição para AvaII. As freqüências do alelo G foram 0,625, 0,074 e 0,210 no Simental, Nelore e Caracu
respectivamente. As condições empregadas nas análises de SSCP permitiram não só a identificação dos alelos
A e G, descritos anteriormente para a mutação V530I, como também a caracterização de um novo alelo, que foi
denominado por A1. Esse alelo não foi detectado na população Simental, ocorrendo apenas nas Nelore e Caracu
em frequências de 0,04 e 0,111 respectivamnte. Conclusão: Os resultados obtidos revelaram que a técnica PCRRFLP foi sensível para detectar o SNP530, embora a técnica de SSCP tenha sido mais eficiente e com custo inferior,
permitindo relacionar as alterações de conformação de cadeia simples de DNA (SSCP) com a referida mutação.
Auxílio financeiro: FAPESP e IZ
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Efeito do touro na sobrevivência in vitro de embriões
bovinos após a retirada de uma única célula na fase de
8 a 16 células
Elias, FP1; Vila, RA1; Renzi, A1; Lemes, RC1; Galerani, MAV1; Lôbo, RB1
Departamento de Genética – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: blastômero, embrião, touro, blastocisto
Introdução: As biotecnologias reprodutivas têm despontado atualmente no cenário mundial como ferramentas
importantes para o desenvolvimento da pecuária já que permitem diminuir o intervalo de gerações, aumentar a
eficiência reprodutiva da fêmea, causando aceleração do processo de melhoramento genético dos rebanhos. Dentre as várias técnicas existentes, a biópsia embrionária vem sendo cada vez mais utilizada no mercado da produção
in vitro de embriões bovinos desde que foi mostrada a possibilidade de sexagem e de seleção de embriões por
marcadores moleculares. Objetivos: Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito do touro no desenvolvimento in
vitro de embriões no estágio de blastocisto após a retirada de 1 único blastômero na fase de 8 – 16 células durante
o período de pré-implantação. Métodos: Os oócitos grau I foram coletados de ovários provenientes de matadouro
e maturados em meio TCM199 com sais Earles, glutamina, NaHCO3, 22µg piruvato/ml, 83µg sulfato de amicacina/
ml, 10% SFB, 0,5µg FSH/ml, 50µg LH/ml e 1,0µg estradiol/ml, por 24 horas a 38,5 oC, 5% CO2 em atmosfera, sendo
que 172 oócitos formaram o grupo controle (intactos) e 180 oócitos formaram o grupo teste (biopsiados). Sêmen de
18 touros foi utilizado para a fertilização in vitro (FIV). Os espermatozóides viáveis foram obtidos por centrifugação
em gradiente de Percoll (45 e 90%) e utilizados para a fecundação in vitro com concentração de 2 milhões de sptz/ml
em meio TALP suplementado com 10µl heparina/ml, 22µl piruvato/ml, 83µl sulfato de amicacina/ml, 6µg BSA sem
ácidos graxos/ml e solução PHE. Após 12 horas, os supostos embriões foram transferidos para meio CR2 acrescido
de 10% SFB e 83µl sulfato de amicacina/ml. No terceiro dia de cultivo, embriões do grupo teste que se encontravam
com 8-16 células sofreram retirada de uma única célula com auxílio de micropipetas de um micromanipulador acoplado a microscópio invertido. Após 168h da FIV foi feita a classificação dos embriões viáveis em Be (blastocisto
eclodido), Bx (blastocisto expandido), Bl (blastocisto), Bi (blastocisto inicial) e Mórula. Para cada grupo foram coletados dados de três repetições. Resultados: O teste de Skapiro-Wilk mostrou que os dados transformados apresentam distribuição normal. A análise de variância (ANOVA) mostrou que houve diferença entre touros (F = 3.17; P <
0,01) quanto à fertilidade e no desenvolvimento de embriões no estágio de Bi (F = 1,86; P = 0,05) nos dois tratamentos,
não havendo variação entre as repetições. Conclusões: Assim, verificamos que os touros diferem entre si no desenvolvimento de embriões no estágio de blastocisto inicial e na sobrevivência de embriões biopsiados e isto pode ser
utilizado como um critério de seleção para a utilização desses animais na produção in vitro de embriões, de modo
que, esta característica pode ser um critério quando se deseja utilizar a prática da biópsia para seleção de embriões.
Agradecimentos: FAPESP, CNPq, PROEX
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Associação de polimorfismos nos genes da kappacaseína e beta-lactoglubulina com produção e
composição do leite na raça Guzerá
Fonseca, PAS¹; Steinberg, RS¹; Peixoto, MGCD²; Verneque, RS²; Machado, MA2; Fonseca, CG¹; Carvalho, MRS1
¹Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Brasil
²Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: melhoramento genético, kappa-caseína, beta-lactoglubulina, leite, bovino, Guzerá
Estudos de associação permitem a identificação de polimorfismos que podem ser usados como marcadores moleculares na seleção assistida por marcadores. Em bovinos, a maioria dos estudos de associação são feitos em
Bos taurus, porém no Brasil, a maior parte dos rebanhos são de origem zebuína. Como entre as subespécies podem existir diferenças na variabilidade e no efeito de diferentes genótipos sobre características de produção, são
necessários estudos em animais Bos indicus. O gene da kappa-caseína (CNS3) atua na estabilização das micelas de caseína no leite. Tem sido descrita associação entre o alelo B deste locus ao aumento do rendimento na
produção de queijo. Para o locus da Beta-lactoglobulina (LGB), os estudos de associação são conflitantes, porém
o genótipo BB é correlacionado ao aumento na produção de queijo e o genótipo AA com aumento na produção
de leite. Uma amostra de 260 animais foi genotipada, usando-se PCR-RFLP, para os polimorfismos nos genes da
CNS3 e da LGB para avaliação da variabilidade destes loci na raça Guzerá. A freqüência do alelo B encontrada em
CSN3 foi de 0.1692 e em LGB, de 0.8154. Foram encontras as seguintes freqüências alélicas e genotípicas: Para o
gene CSN3 os alelo A e B apresentaram uma freqüência, 0.8308 e 0.1692, e os genótipos AA, AB e BB, 0,7; 0, 2615 e
0,0385, respectivamente. O gene LGB teve uma freqüência alélica de 0.1846 e 0.8154 para os alelos A e B, os genótipos AA, AB e BB foram observados em uma freqüência de 0,0192; 0,3308 e 0,65, respectivamente. As freqüências
alélicas e genotípicas estão em Equilíbrio de Hardy Weinberg (p>0.05). Para a análise de associação foi usado o
modelo de substituição gênica com base nos valores genéticos para lactação em 305 dias (VGL), quantidade de
gordura (VGG) e proteína (VGP) no leite de 139 progênies de 27 touros pertences ao núcleo MOET de seleção
para leite na raça Guzerá. Foi encontrada associação significativa (p <0,05) entre o efeito de substituição gênica
e variação em VGL, VGG e VGP, apenas para o lócus da LGB. Este dado está de acordo com a literatura, uma
vez que a CSN3 não tem sido associada ao volume de leite produzido nem a concentração de gorduras ou proteinas, apenas à velocidade de retração do coalho. Com base nesses resultados, estudos em amostras maiores
e usando outras raças devem ser realizados para validar a associação aqui detectada em animais Bos indicus.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPEMIG, PRONEX, EMBRAPA.
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Parâmetros genéticos para altura do posterior e área
de olho de lombo em bovinos da raça Canchim
Meirelles, SL; 2Alencar, MM; 2Tullio, RR; 3Barbosa, PF; 2Regitano, LCA
1
Pós doutoranda do programa de pós-graduação em Genética e Evolução – UFSCAR, bolsista do PNPD – CAPES
Embrapa Pecuária Sudeste - São Carlos/SP
3
Ex-pesquisador da Embrapa Pecuária Sudeste – São Carlos/SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: altura, área de olho de lombo, Canchim, correlação genética, critério de seleção
Um dos aspectos mais importantes a ser melhorado na pecuária de corte brasileira diz respeito às características
determinantes da qualidade das carcaças produzidas. A área de olho de lombo (AOL) é uma das características
indicadoras da composição da carcaça, medida relacionada à musculosidade e usada como indicador de rendimentos dos cortes de alto valor comercial. No Brasil, vários produtores consideram apenas características de
crescimento (peso) e reprodutivas, como critérios de seleção, o que pode acarretar em animais cada vez maiores. A
altura do posterior (ALT) pode ser uma boa alternativa para controlar o tamanho dos animais, por ser de fácil mensuração e refletir melhor o tamanho corporal quando comparada à medida de peso vivo do animal. Diante disso, o
objetivo neste trabalho foi estimar a herdabilidade e a correlação genética da AOL aos 19 meses de idade, medida
por ultrassom e da ALT ao desmame em bovinos da raça Canchim (5/8 Charolês + 3/8 zebu) e MA ( filhos de touros
Charoleses e vacas 1/2 Canchim + 1/2 zebu), criados a pasto. Dados de 900 animais, machos e fêmeas, nascidos
entre 2003 e 2008 na Embrapa Pecuária Sudeste, foram analisados por meio de análise bicaracterística. Utilizou-se
um modelo animal com os efeitos fixos de grupo de contemporâneos (ano de nascimento, sexo, grupo genético e
mês de nascimento) e da covariável idade do animal na data da medida (efeito linear), além dos efeitos aleatórios
genético aditivo direto e residual. As estimativas de herdabilidade de AOL (0,39 ± 0,10) e ALT (0,66 ± 0,10) indicam que essas características devem responder à seleção. A estimativa de correlação genética (0,25 ± 0,16) entre
AOL e ALT sugere que a seleção para animais mais altos não deve resultar em mudanças significativas na AOL.
Concluímos que, para a raça Canchim, estas duas características podem ser incluídas como critério de seleção.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, Embrapa
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Correlação de polimorfismo do gene B4Galt1 com a
precocidade sexual em touros da raça Nelore
Cipriano, VTF; Mioranza, A; Vila, RA; Miranda – Furtado, CL; Ramos, ES; Lôbo, RB
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: polimorfismo, B4galt1, marcador molecular, melhoramento genético, precocidade sexual
Introdução: A produtividade de um rebanho depende entre outros fatores da reprodução. Por isso, a seleção de animais com maior precocidade sexual e fertilidade é de grande interesse para os programas de melhoramento genético. Atualmente, a medida do perímetro escrotal tem sido utilizada para selecionar animais com maior fertilidade,
de forma que animais com maior perímetro escrotal são escolhidos para serem utilizados como reprodutores. Para
que melhores animais sejam selecionados, inúmeras técnicas vêm sendo aplicadas. Dentre elas, os marcadores
moleculares tem se destacado, pois podem detectar características de interesse precocemente. Em bovinos, o gene
codificador da proteína beta 1,4- galactosyltransferase (B4galt1), localizado no cromossomo 8, está envolvido com
o crescimento escrotal, podendo ter um envolvimento na precocidade sexual. Foi visto que este gene apresenta
uma alteração no nucleotídeo 174, que resulta na substituição do aminoácido arginina (AGG) por lisina (AAG).
Objetivo: O objetivo deste estudo foi verificar a correlação deste polimorfismo com a precocidade sexual em touros jovens, pertencentes a um programa de melhoramento genético da raça Nelore. Métodos: Para isso, 54 touros
foram separados em dois grupos com relação à Diferença Esperada na Progênie (DEP) para perímetro escrotal: 20
destes animais possuem uma DEP maior do que 1 cm, sendo considerados de alta fertilidade e outros 34 animais
com uma DEP inferior a 1cm foram considerados de baixa fertilidade. A partir do DNA genômico destes touros,
um fragmento de 524 pb foi amplificado por PCR, utilizando iniciadores específicos para a região de interesse do
gene B4galt1. Posteriormente, foram realizadas análises de Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) com
a enzima de restrição NcoI, para identificar o polimorfismo neste gene. Resultados: Em todos os touros analisados
foi identificada somente a presença do aminoácido lisina, que é codificado pela presença do alelo A. A ausência do
outro alelo pode ser explicada pelo baixo número de animais avaliados até agora. Deste modo, um número maior
de animais é necessário para identificar a existência do outro alelo e inferir a sua freqüência na população de gado
Nelore. Com estes dados, será possível correlacionar a presença do polimorfismo com os dados de perímetro escrotal e definir se este polimorfismo pode ser aplicado como um marcador molecular para seleção genética em
bovinos.
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Análise de expressão gênica da Calpastatina em
bovinos da raça Nelore mediante suplementação de
vitamina D3
Rezende, LR1; Jorge, EC1, Delgado, EF1; Coutinho, LL1
Departamento de Zootecnia - ESALQ/USP, Piracicaba, SP - Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: Cálcio, maciez da carne, proteólise post-mortem, suplementação, vitamina D3
A maciez da carne bovina é o resultado do processo de proteólise miofibrilar influenciado pelas calpaínas (CAPN),
enzimas ativadas pelo cálcio. A calpastatina (CAST) constitui um regulador das calpaínas, atuando como substrato
e degradando-se pela ação da própria calpaína. No postmortem, o nível inicial de calpastatina pode causar uma
menor taxa e extensão de amaciamento. A suplementação com vitamina D3 na dieta dos animais tem alterado positivamente a maciez da carne, por obter maior absorção e deposição de cálcio nos músculos. Porém, a eficiência desta suplementação pode ser influenciada pela exposição dos animais aos raios ultravioletas (UV) solares. Tendo em
vista a importância desse gene para a maciez da carne em bovinos, o objetivo deste estudo foi testar a hipótese que
preconiza a regulação gênica da calpastatina (CAST), quando os animais são expostos a níveis diferenciados de UV,
como forma suficiente para ditar resposta do organismo à suplementação suprafisiológica com vitamina D3. Foram
utilizados 42 machos castrados da raça Nelore que foram divididos em 6 tratamentos (7 animais por tratamento).
Os animais foram alojados em baias individuais e os tratamentos foram: T1) sem suplementação de Vitamina D3 +
sem sombrite; T2) sem suplementação de Vitamina D3 + com sombrite – filtração de 50% de UV; T3) com 2x106UI
de vitamina D3 por dois dias consecutivos pré-abate + sem sombrite; T4) com 2x106UI de vitamina D3 por dois dias
consecutivos pré-abate + com sombrite – filtração de 50% de UV; T5) com 2x106UI de vitamina D3 por oito dias
consecutivos pré-abate + sem sombrite; 6) com 2x106UI de vitamina D3 por oito dias consecutivos pré-abate + com
sombrite – filtração de 50% de UV. A expressão gênica foi analisada por PCR quantitativa em tempo real. Para a
análise de expressão gênica foi utilizado o método comparativo descrito por Pfaffl (2001), empregando-se o GAPDH
como gene referência. O nível de significância obtido entre os tratamentos foi avaliado por análises não-paramétricas usando o software REST© (Relative Expression Software Tool) (2009). Para todas as análises estatísticas, o nível
de significância atribuído foi de P<0,05. A comparação entre os tratamentos foi realizada através do teste de casualização por realocação fixa aos pares, onde não foi verificado efeito significativo (P>0,05) em nenhuma das comparações realizadas. A suplementação de vitamina D3 e a influência da exposição dos animais aos raios ultravioletas
não casou alterações na expressão do gene da calpastina em músculo bovino. No entanto, mais pesquisas são
necessárias para identificar um ótimo regime de suplementação de vitamina D3 para bovinos Bos taurus indicus
visando maximizar a carga de cálcio em fibras musculares de modo a modificar o sistema proteolítico citossólico.
Apoio financeiro: FAPESP
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Identificação de polimorfismo no gene PPARGC1A em
bovinos da raça Nelore
Fonseca, PDS1; Gil, FMM¹; Chiquitelli, MG1; Souza, FRP1; Albuquerque, LG2; Mercadante, MEZ3;
Camargo, GMF1; Tonhati, H2
¹Laboratório de Genética Molecular – Departamento de Zootecnia – FCAV – UNESP - Jaboticabal.
2
Departamento de Zootecnia - FCAV - UNESP – Jaboticabal.
3
Centro de Pesquisa em Pecuária de Corte / Instituto de Zootecnia. Sertãozinho/SP.
[email protected]
Palavras-chave: PCR-SSCP, PPARGC1A, bovinos, nelore, deposição de gordura
Introdução: O gene Coativador1-Alfa de Ativação da Proliferação Peroxissomal Gama (PPARGC1A) conhecido também como PGC-1α, é regulador no processo de transcrição do PPAR y, que é um fator que promove
a regulação de genes ligados a adipogênese. A ausência de PPAR γ resulta na perda da capacidade adipogênica das células. Assim, a caracterização do gene PGC-1 torna-se imprescindível, pois o gene proposto demonstra estar ligado diretamente à deposição de gordura em bovinos. Objetivos: O objetivo do presente estudo foi
de identificar polimorfismos no gene PGC-1 em animais da raça Nelore (Bos indicus). Materiais e Métodos: Para
isso utilizou a técnica de PCR-SSCP em amostras de DNA de 112 bovinos da raça Nelore pertencentes ao rebanho da Estação Experimental de Zootecnia de Sertãozinho. Os fragmentos apresentaram aproximadamente
350 pb, e foram submetidos à técnica de SSCP. Resultados: Foi possível visualizar 2 tipos de migrações diferentes, os quais foram denominados de padrão 1 e 2. As freqüências desses padrões foram 0,018 e 0,982 para
padrão 1 e 2, respectivamente. Conclusão: Com a identificação deste polimorfismo por seqüenciamento novos testes de genotípagem podem ser elaborados pela técnica de PCR-RFLP visando a caracterização do polimorfismo e futuras análises de associação com características econômicas em bovinos de origem indiana.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP.
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Padronização da técnica de PCR-RFLP para
genotipagem de búfalos da raça murrah (Bubalus
bubalis) para o íntron 1 do gene GHRL
Gil, FMM¹; Souza, FRP1; Camargo, GMF1; Fonseca, PDS1; Stefani, G1; Garbuio, DH1; Chiquitelli, MG1;
Albuquerque, LG2; Tonhati, H2
¹Laboratório de Genética Molecular – Departamento de Zootecnia – FCAV – UNESP – Jaboticabal
2
Departamento de Zootecnia - FCAV - UNESP – Jaboticabal.
[email protected].
Palavras-chave: enzima restrição, grelina, PCR-RFLP, búfalo, produção de leite
A grelina é um hormônio gastrintestinal e, dentre suas várias funções, age como um potente estimulador da
liberação do hormônio de crescimento (GH) e estimulador da secreção lactotrófica e corticotrófica. Estudos
em vacas Holstein-Friesian confirmam que as concentrações plasmáticas de grelina e GH são mais elevadas
em animais com maior mérito genético. Assim, a caracterização do gene da grelina em búfalos torna-se essencial, sendo este gene proposto como gene candidato para identificação de marcadores genéticos relacionados
a características de crescimento, carcaça e produção de leite. Nesse contexto, objetivou-se investigar polimorfismos no íntron 1 do gene da grelina em búfalos (Bubalus bubalis). As amostras de DNA de búfalas da raça
Murrah pertenciam a três fazendas localizadas no estado de São Paulo. Essas amostras foram analisadas por
PCR-SSCP (Polimerase Chain Restriction - Single-Strand Conformation Polymorphism) e através desta técnica, pôde-se visualizar três padrões de migração diferentes. Amostras de DNA destes padrões foram seqüenciadas e confirmou-se a existência do polimorfismo na forma de SNP na substituição de uma guanina por uma
adenina (G/A). Então, foi utilizada a enzima de restrição BsTUI para aplicação da técnica de PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) para caracterização do polimorfismo G/A por um método mais
objetivo. Foram obtidos três padrões de migração, GG, AG e AA, representando as três classes genotípicas.
A utilização desta endonuclease de restrição demonstrou-se eficiente e mais precisa que a técnica de SSCP na genotipagem dos animais, podendo desta maneira, prosseguir para realização de estudos de associação com características de interesse econômico em búfalas leiteiras da raça Murrah.
Apoio Financeiro: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
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Incidência da doença CVM em bovinos da raça
Girolando
Paiva, DS1; Meira, LHR2; Silvestre, IR3; Alvino, RM2; Fonseca, I3; Arbex, W4; Silva, MVGB4; Guimarães, MFM4
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal de Juiz de Fora
Universidade Presidente Antônio Carlos, Juiz de Fora, MG
3
Bolsistas de Apoio Técnico à Pesquisa II – FAPEMIG
4
Embrapa Gado de Leite.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Teste de Progênie, doenças hereditárias, Equilíbrio de Hardy-Weinberg, gene SLC35A3
Introdução: A doença do Complexo de Má Formação Vertebral, conhecida como CVM é uma doença hereditária
recessiva que ocorre durante o desenvolvimento fetal, levando a frequentes abortos, além de anormalidades vertebrais. Foi determinado que CVM é causado por uma mutação pontual (G/T) no nucleotídeo 559 do gene SLC35A3
em bovinos. Esse gene codifica uma proteína transportadora de UDP-N-acetilglicosamina, que desempenha um
papel essencial nos mecanismos que controlam a formação das vértebras. CVM é uma síndrome letal, caracterizada por retardamento do crescimento congênito, má-formação vertebral e deformações no septo ventricular. Essa
foi, provavelmente, a desordem hereditária mais frequente em animais da raça Holandesa já registrada, chegando
a uma frequência de 30% em alguns países. No Brasil ainda não há estudos que demonstrem a frequência dessa
doença em bovinos. Objetivo: Estimar as frequências alélicas e genotípicas do gene SLC35A3 em animais da raça
Girolando e verificar se os mesmos estão em Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW). Métodos: Foram genotipados
todos os touros Girolando (93) pertencentes ao Teste de Progênie (TP) da raça coordenado pela Embrapa Gado de
Leite e a GIROLANDO. A extração do DNA do sêmen foi feita utilizando um kit comercial seguindo as recomendações do fabricante. A quantificação e avaliação da qualidade foram feitas por espectrofotometria (Nanodrop®). Para
determinação do genótipo, foi utilizada a técnica AS-PCR (Allele Specific-Polymerase Chain Reaction), onde foram
empregados dois forward primers: um para o alelo normal (G) e outro para o alelo CVM (T); e um reverse primer comum para os dois alelos (Ghanem et al., 2008). Em animais portadores, pode-se visualizar em géis de agarose, a amplificação de um fragmento de 395 pb para os dois alelos; e em animais normais, essa banda é visualizada somente
para o alelo G. As análises de frequências gênicas e genotípicas e o teste de probabilidade de EHW foram estimados
pelo programa GENEPOP web version 3.4. A probabilidade de EHW associado às frequências genotípicas observadas foi testada pelo teste χ2 (p< 0,05). Resultados: Não foram encontrados animais portadores da mutação no
gene SLC35A3 nos touros pertencentes ao TP da raça. Uma das possíveis causas da ausência de touros Girolando
portadores pode ter ocorrido devido a um crescente uso da genotipagem em touros de alto mérito genético, principalmente na raça Holandesa. De acordo com a análise estatística, as frequências encontradas estão próximas
às esperadas e, portanto, a amostra está em EHW. Conclusões: Estatisticamente a população de touros Girolando
pertencente ao TP da raça encontra-se em EHW, entretanto está havendo seleção contra o alelo T e fixação do
alelo normal. As centrais de Inseminação Artificial têm implementado a genotipagem dos touros e para os animais
portadores, mesmo com alto mérito genético para produção leiteira, têm sido desestimulada a venda de sêmen.
Apoio financeiro: EMBRAPA e FAPEMIG.
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Associação de um SNP no gene DDEF1 com área de
olho de lombo em bovinos da raça Canchim
Souza, MM1; Veneroni, GB1; Meirelles, SL1, Alencar, MM2; Regitano, LCA2
Programa de pós graduação em Genética e Evolução – UFSCAR
Embrapa Pecuária Sudeste - São Carlos/SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: área de olho de lombo, Canchim, gene DDEF1
O Canchim é uma raça de bovinos de corte composta, desenvolvida no Brasil para intensificar a produção. A recente anotação do genoma bovino tem propiciado o estudo de novos genes candidatos que possam estar associados a
características economicamente importantes. No cromossomo 14 de bovinos está o gene de um fator de aumento
de desenvolvimento e de diferenciação celular 1 (DDEF1). O produto desse gene interage com proteínas de transdução de sinais envolvidas no crescimento e diferenciação celular, sendo assim um bom candidato a influenciar a
variação da área de olho de lombo (AOL) em bovinos. O objetivo neste trabalho foi testar a associação de um SNP
presente no gene DDEF1 com a variação da área de olho de lombo em bovinos da raça Canchim. Foram genotipados para um SNP presente no intron 13 do gene DDEF1, por PCR-ARMS, 869 animais da raça Canchim, criados em
pastagens de sete fazendas, machos e fêmeas e, nascidos entre os anos de 2003 e 2005. Uma associação significativa
(P = 0,08), entre os genótipos do SNP em DDEF1 e AOL, foi detectada pela análise de Máxima Verossimilhança
Restrita. No entanto, a análise de substituição alélica não apresentou efeito significativo. Pode-se concluir que há
um pequeno efeito desse gene ou de outro gene em desequilíbrio de ligação sobre a variação total da característica.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, Embrapa, FAPESP
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Efeito da qualidade morfológica do oócito bovino na
cinética de desenvolvimento embrionário in vitro
Lemes, RC1,2; Elias, FP1; Renzi, A1; Vila, RA1; Lôbo, RB1
Laboratório de Micromanipulação de Embriões, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo.
2
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
[email protected]
1
Palavras-chave: qualidade oocitária, complexo cumulus-oócito, blastocisto, bovino, fertilização in vitro
Introdução: Durante o processo de oogênese, células germinativas se transformam em oogônias e posteriormente
em oócitos, os quais são envoltos por células somáticas, (entre elas as células do cumullus oophorus) e juntos formam o folículo, uma unidade fisiológica equilibrada cujas estruturas e funções dependem de interações intrafoliculares e de fatores extracelulares. Ao longo de toda a foliculogênese, a comunicação existente entre o oócito e as
células do cumulus se intensifica, evidenciando a importância dessas células para o completo desenvolvimento do
oócito e vice-versa. Através das junções do tipo gap ocorre a transferência de moléculas de pequeno peso molecular,
necessárias para o crescimento oocitário, tais como, metabólitos, íons, aminoácidos e nucleotídeos, assim como
pequenas moléculas reguladoras. Objetivos: Com base na importância da troca bidirecional entre o oócito e as células do cumulus, esse trabalho visa analisar qual a dimensão dessa interação para o desenvolvimento embrionário
in vitro, por meio da análise de embriões, em estádio de blastocisto, frutos de fertilizações in vitro de complexos
cumulus-oócito de diferentes qualidades morfológicas com sêmen de um único touro. Métodos: Oócitos de grau
I, II e III foram extraídos de ovários de vacas abatidas em matadouro, sendo coletados 206, 275 e 302, respectivamente, em três repetições. Estes foram maturados, separadamente, em meio TCM199 com sais Earles, glutamina,
NaHCO3, 22µg piruvato/ml, 83µg sulfato de amicacina/ml, 10% SFB, 0,5µg FSH/ml, 50µg LH/ml e 1,0µg estradiol/
ml, por 24 horas a 38,5 oC, 5% CO2 em atmosfera. Em seguida, foram fecundados com sêmen de um único touro com
concentração de 2 milhões de sptz/ml, em meio TALP suplementado com 10µl heparina/ml, 22µl piruvato/ml, 83µl
sulfato de amicacina/ml, 6µg BSA sem ácidos graxos/ml e solução PHE. Após 12 horas, os supostos embriões foram
transferidos para meio CR2 acrescido de 10% SFB e 83µl sulfato de amicacina/ml. Após 168 horas da fertilização, foi
feita uma contagem do número de embriões viáveis. Resultados: A análise estatística por meio de ANOVA (α=0,05)
mostrou que a taxa de fertilidade (número de embriões viáveis/número de oócitos) é significativamente diferente
entre os três graus (p<0,0002). Conclusões: A qualidade morfológica do oócito influencia na quantidade de embriões
viáveis, portanto, é possível afirmar que as células do cumulus interagem ativamente com o oócito, possuindo uma
importante função durante a foliculogênese, a fertilização e o desenvolvimento embrionário pré-implantacional.
Apoio Financeiro: FAPESP, PROEX, PAEX.
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Descrição de novos polimorfismos do tipo SNP no gene
da calpastatina em bovinos
Mello, SS1; Rocha, MIP2; Gromboni, JGG1; Veneroni, GB3; Méo, SC2
Centro Universitário Central Paulista, UNICEP-São Carlos
Embrapa Pecuária Sudeste
3
Departamento de Genética e Evolução - Universidade Federal de São Carlos.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: maciez da carne, marcadores moleculares, qualidade de carne
A maciez é um dos atributos da carne mais apreciado pelo consumidor. A obtenção de carcaças com maciez
desejável pode contribuir para a agregação de valor comercial à carne bovina brasileira no mercado, principalmente, internacional. A maciez é influenciada por inúmeros fatores, tais como ambientais, fisiológicos e genéticos, o que se torna um obstáculo para a seleção animal e para o melhoramento genético da característica.
Entretanto, alguns trabalhos demonstram que a calpaína (CAPN1) e a calpastatina (CAST) são genes de efeitos
maior no processo de amaciamento da carne no período post mortem. Assim, o objetivo do presente trabalho
foi identificar novos SNPs nos genes CAPN1 e CAST, nas regiões do éxon 14 e da 3’UTR, respectivamente. Para
tanto, DNA extraído com fenol: clorofórmio a partir de pele de fetos bovinos obtidos em abatedouro foi destinado à amplificação e ao sequenciamento. A partir do resultado da genotipagem por TaqMan para outros SNPs
nos genes CAPN1 (V530I) e CAST (2.870UTR) (dados não apresentados), foram selecionados 3 fetos (um de cada
genótipo) para o sequenciamento. Após amplificação por PCR com os primers CAPN1F: 5’-TGACTTTGTGCTGCGTTTCT-3’ e CAPN1R: 5’-AGGGATGTGTATGGCTCCTG-3’; e CASTF: 5’-TTGCCTTCAGTTGGGAGAGA-3’ e
CASTR: 5’-ACAAGGTGCGGAAGTCCTAA-3’, as amostras foram purificadas com a enzima ExoSAP e submetidas
a duas reações de sequenciamento, uma com cada um dos primers forward e reverse para cada gene, com o kit
Big Dye (Applied Biosystems). A seguir, as amostras foram analisadas em sequenciador automático ABI Prism
3100 Avant (Applied Biosystems), e os eletroferogramas gerados foram avaliados nos programas Phred/Phrap/
Consed para identificação de SNPs. Para o gene CAPN1 (NM_174259), só foram observados os SNPs D528D
(C/T na posição 1.661) e V530I (G/A na posição 1.665), já descritos no banco de dados do NCBI. Entretanto,
para o gene CAST (NM_174003), além do SNP 2.870UTR (A/G na posição 2.870), foram identificados os SNPs
3.016UTR (A/T na posição 3.016) e 3.114UTR (T/C na posição 3.114). Dessa maneira, descreve-se pela primeira vez os polimorfismos do tipo SNP 3.016 (A/T) e 3.114 (T/C) na 3’UTR do gene da calpastatina, em bovinos.
Apoio financeiro: FAPESP.
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25
Análise do polimorfismo CAPN530/Psyl em bovinos de
diferentes grupos genéticos
Machado, COF1; Flores, RS2; Siqueira, F3; Torres Junior, RAA3; Medeiros, SR3; Feijó, GLD3
Ciências Biológicas, UFMS, Campo Grande/MS
Bolsista de Desenvolvimento Técnico Industrial/CNPq, Campo Grande/MS
3
Pesquisadores da Embrapa Gado de Corte, Campo Grande/MS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Calpaína, cruzamento, maciez de carne, marcador molecular e melhoramento animal
Para os consumidores uma carne palatável deve apresentar suculência, sabor e maciez. O complexo enzimático calpaína-calpastatina tem despertado grande interesse em estudos com marcadores moleculares para melhoramento genético animal, devido à ação da calpaína na ativação de proteases que levam ao amaciamento da
carne no processo post mortem. Marcadores para o gene CAPN foram analisados e associados favoravelmente
com a maciez da carne bovina, possibilitando o seu uso para a escolha precoce de reprodutores em programas
de melhoramento genético. Dentro das raças, a variabilidade genética provoca diferenças no grau de maciez da
carne, com isso programas de melhoramento utilizam cruzamentos entre as subespécies Bos taurus taurus e Bos
taurus indicus, resultando em animais com melhor qualidade da carne e adaptação ao clima, como consequência da heterose e do efeito aditivo. Neste trabalho, foram analisadas as frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo CAPN530/PsyI em 63 animais de sete grupos genéticos criados em confinamento, a fim de verificar
se o efeito deste polimorfismo, que já foi identificado em rebanhos de outros países, mantém-se nos diferentes
grupos genéticos e em condições brasileiras. Os grupos genéticos estudados foram: Nelore; Caracu; cruzamentos de touros Caracu e Canchim com vacas Angus x Nelore; touros Angus com vacas Caracu x Nelore; touros
Canchim e Caracu com vacas Simental x Nelore. Os animais foram abatidos com idade entre 16 e 20 meses e
foram avaliados quanto à maciez de carne, deposição de gordura intramuscular e de cobertura e área de olho
de lombo. Os mesmos foram genotipados por meio da técnica de PCR-RFLP (Polymorphism Chain Reaction –
Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e as frequências alélicas e genotípicas foram comparadas utilizando
o teste de Qui-quadrado. O alelo favorável para maciez de carne designado G foi identificado pela presença de
dois fragmentos de 146pb e 195pb e o alelo designado A pela presença de um fragmento de 341pb. Não houve
diferença significativa entre os grupos genéticos para as frequências gênicas, ao nível de significância de 5%,
entretanto em relação às frequências alélicas houve diferença significativa, com p<0,05. Posteriormente, será
genotipado um número maior de animais e realizados estudos de associação entre os genótipos e fenótipos utilizando o procedimento GML do programa estatístico SAS. Esses resultados mostram que, se confirmada a associação desse polimorfismo com maciez de carne, este marcador poderá ser viável para a seleção de animais
com potencial para a produção de carne de melhor qualidade, por apresentar uma frequência alta na população.
Apoio financeiro: EMBRAPA, FUNDECT e CNPq
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Caracterização de polimorfismos no gene FASN em
novilhas Nelore (Bos taurus indicus)
Chiquitelli, MG¹; Souza, FRP1; Gil, FMM1; Fonseca, PDS1; Mercadante, MEZ3; Albuquerque, LG2
¹Laboratório de Genética Molecular – Departamento de Zootecnia – FCAV – UNESP - Jaboticabal.
2
Departamento de Zootecnia - FCAV - UNESP – Jaboticabal.
3
Centro de Pesquisa em Pecuária de Corte / Instituto de Zootecnia. Sertãozinho/SP.
[email protected]
Palavras-chave: Gado de corte, carcaça, marcador molecular, polimorfismo, RFLP
O gene FASN é responsável pela codificação de uma enzima multifuncional com papel central na formação de ácidos graxos de cadeia longa, a Enzima Ácido Graxo Sintase (Fatty Acid Synthase - FAS). Neste contexto, objetivouse verificar e caracterizar a existência de polimorfismos no gene FASN em novilhas Bos taurus indicus. Para isso
foi analisado por PCR-RFLP um polimorfismo descrito em Bos taurus taurus. Foram utilizadas amostras de DNA
provenientes de 190 bovinos da raça Nelore pertencentes à três linhas de seleção para crescimento do Programa
de Melhoramento Genético do Instituto de Zootecnia de Sertãozinho. Adicionalmente, foi realizada a técnica de
SSCP para identificação de polimorfismos específicos da raça Nelore. Os fragmentos amplificados pela técnica de
PCR apresentaram 382 pb e, através da técnica de RFLP, utilizando-se a Enzima de Restrição Msc I, visualizou-se
um único padrão de migração. O SSCP, por outro lado, identificou dois padrões de migração diferentes. Estes resultados sugerem que o polimorfismo encontrado em Bos taurus taurus está fixado na raça Nelore. Entretanto o SSCP
sugere a existência de um polimorfismo específico de Bos taurus indicus. Foram identificados 2 padrões (1 e 2) nas
freqüências de 0.95 e 0.05, respectivamente. Futuros estudos visam a identificação do polimorfismo descoberto
pela técnica de SSCP, sua caracterização e associação com características de interesse econômico na raça Nelore.
Apoio Financeiro: PIBIC CNPq/ FAPESP.
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Análise Multivariada da Diversidade Genética entre
Touros da Raça Tabapuã
Souza, AC¹; Ferraz-Filho, PB¹
¹Laboratório de Genética – Departamento de Ciências Naturais – Universidade Federal de Mato Grosso do Sul – Campus de Três Lagoas, MS.
[email protected]
Palavras-chave: Bovinos; Componentes principais; Distância Genética
A avaliação de reprodutores representa uma etapa importante do programa de melhoramento de bovinos
de corte, visando à identificação e recomendação de genótipos superiores, em busca de um maior efeito heterótico e ainda planejar os acasalamentos com base no parentesco dos indivíduos de grupo similares, objetivando manter reduzidas as taxas de endogamia. Estudou-se a divergência genética entre 59 reprodutores
da raça Tabapuã, por meio de medidas de dissimilaridade, métodos de agrupamento e análises gráficas por
componentes principais, com base nas diferenças esperadas em suas progênies relativos a caracteres ponderais e reprodutivos. As distâncias Euclidianas médias padronizadas obtidas foram 4,3743 entre os mais dissimilares e 0,1135 para os mais similares. Doze grupos de reprodutores com a mesma similaridade foram obtidos por métodos de agrupamento por otimização. Os três primeiros componentes principais explicaram
82,66% da variância total, o primeiro explicou 50,76%, o segundo respondeu por 21,03% e o terceiro por 10,87%
da variância. Os escores dos componentes principais possibilitaram a avaliação visual da divergência genética,
por meio de gráficos de dispersão. Os resultados encontrados permitiram identificar entre os animais avaliados, os mais divergentes, recomendando que suas progênies possam ser utilizadas como genitores de acasalamentos em programas de melhoramento que visem obter bezerros com melhor desempenho que os pais.
Apoio financeiro: Cnpq.
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Estimativas de parâmetros genéticos e fenotípicos para
peso ao nascer e período de gestação em bovinos da
raça Nelore
Chud, TCS1,7; Caetano, SL2,7; Buzanskas, ME3,7; Lôbo, RB4; Bezerra, LAF5; Munari, DP6,7
1. Graduação em Zootecnia – FCAV/UNESP, Jaboticabal, SP. Bolsista de iniciação científica FAPESP.
2. Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, FCAV/UNESP, Jaboticabal, SP. Bolsista CAPES
3. Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, FCAV/UNESP, Jaboticabal,SP. Bolsista CNPQ.
4. ANCP – Ribeirão Preto, SP.
5. USP – Ribeirão Preto, SP
6. Professor Assistente Doutor, FCAV/UNESP, Jaboticabal,SP. Bolsista, PQ Unesp; e-mail:
7. Departamento de Ciências Exatas, FCAV/UNESP, Jaboticabal,SP.
[email protected];
Palavras-chave: bovinocultura de corte, características reprodutivas, crescimento, herdabilidade, seleção
Introdução: A mudança na constituição genética da população brasileira de bovinos de corte, necessária para
melhorar a produtividade dos rebanhos, depende dos programas de melhoramento genético. O período de gestação (PG) é uma característica que tem reflexos econômicos na pecuária zebuína, pois está relacionado ao peso ao
nascer (PN) e a partos distócicos. Bezerros provenientes de gestações mais curtas nascem mais leves e tendem a
produzir mais kg de carne/hectare/ano. Assim, o conhecimento das herdabilidades para PG e PN permitirá verificar se estas respondem adequadamente à seleção. Objetivos: Estimar parâmetros genéticos e fenotípicos para
período de gestação e peso ao nascer em bovinos da raça Nelore. Material e Métodos: Os dados analisados são de
animais da raça Nelore, provenientes de rebanhos participantes do Programa de Melhoramento Genético da Raça
Nelore (Nelore Brasil), mantido pela Associação Nacional de Criadores e Pesquisadores. Os arquivos para análise
continham 71373 dados de PN e 43563 de PG, sendo ambas consideradas como características do bezerro. Os
parâmetros foram estimados pelo método da máxima verossimilhança restrita em análise uni-característica. No
modelo animal, foram incluídos os efeitos fixos de grupo de contemporâneos (GC) e os efeitos aleatórios aditivos
genéticos diretos e maternos, de ambiente permanente (somente para PG) e residuais. Os GC foram constituídos
por animais do mesmo sexo, fazenda e nascidos no mesmo ano e época. A idade da vaca ao parto foi considerada
como covariável com efeito linear e quadrático. Resultados: As médias encontradas foram 32,15 ± 3,83 kg para PN
e 296,44 ± 6,10 dias para PG. As estimativas de herdabilidade para efeito genético direto foram 0,33 ± 0,02 e 0,34 ±
0,02, respectivamente para PN e PG. Para o efeito genético materno, as herdabilidades encontradas foram de 0,09
± 0,01 para PN e 0,12 ± 0,01 para PG. A fração da variância fenotípica devido ao efeito de ambiente permanente
da vaca para PG foi de 0,08 ± 0,01. Conclusão: As herdabilidades estimadas para efeito genético aditivo direto para
PG e PN, como características do bezerro foram de média magnitude, indicando que estas características devem
ser utilizadas como critérios de seleção em programas de melhoramento genético. Para preservar a facilidade de
parto da vaca Nelore deve-se manter o peso médio da característica PN.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Análises de diversidade genética em dois grupos de
quatis Nasua nasua do sudeste e nordeste do Brasil:
implicações para identificação da espécie e manejo
em cativeiro
Barbosa, CM1,3; Oliveira, FC1; Assis, FG2; Alves-Costa, FA1; Mota, LSLS1; Wasko, AP1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista – UNESP
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista – UNESP
3
Colégio La Salle de Botucatu, Ensino Médio.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Nasua nasua, quati, diversidade genética, RAPD
Introdução: A espécie de quati Nasua nasua encontra-se amplamente distribuída por todo o continente americano.
Apesar de sua extensa distribuição geográfica, algumas populações já são consideradas ameaçadas devido à ação
antrópica, especialmente relacionada à destruição de seus habitats. Apesar do declínio de algumas populações, os
estudos genéticos em N. nasua ainda são escassos. Objetivos: Determinar os níveis de diversidade genética de um
grupo de quatis mantido no Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros (Sorocaba, SP) e de um grupo de animais mantido no Parque Zoobotânico de Carajás (Paraubebas, PA). Métodos: Amostras de sangue de animais das
duas localidades foram coletadas para isolamento de DNA através da utilização de fenol-clorofórmio. Posteriormente, as amostras de DNA foram amplificadas via PCR (“Polymerase Chain Reaction”) utilizando diferentes oligonucleotídeos decâmeros através da técnica de RAPD (“Random Amplified Polymorphic DNA”). Resultados: Utilizando vinte primers, foi possível obter um total de 137 bandas polimórficas. Análises estatísticas através do programa
PopGene (“Population Genetic Analysis”) indicaram que o grupo de animais da região nordeste apresentou maior
porcentagem de locos variáveis (70,8%) quando comparado com os animais da região sudeste (35,04%). Comparações entre os indivíduos de cada região demonstraram um índice de similaridade genética de 85% e de 74% entre os
animais do Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros e entre os animais do Parque Zoobotânico de Carajás,
respectivamente. Análises UPGMA geraram um dendograma em que foi possível identificar uma distinção entre
os dois grupos de quatis analisados, porém, um dos animais da região nordeste apresentou uma relação genética
distante com os demais indivíduos deste grupo, característica que pode estar relacionada à presença de animais de
diferentes subespécies de Nasua nasua. Conclusões: Os resultados provavelmente refletem as peculiaridades de formação dos dois grupos analisados - o maior índice de similaridade genética evidenciado no Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros refere-se ao grupo ter sido formado a partir de um pequeno número de animais, enquanto que a maior diversidade genética evidenciada no Parque Zoobotânico de Carajás relaciona-se ao grupo ter sido
formado por animais de distintas regiões e, provavelmente, incluir exemplares de distintas subespécies de N. nasua.
Apoio Financeiro: FAPESP, CAPES/FINEP e PROEX/UNESP.
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Método alternativo de genotipagem do polimorfismo
CAST/DdeI localizado no gene bovino da calpastatina
Blecha, IMZ1; Siqueira, F2; Feijó, GLD2; Torres Junior, RAA2; Flores, RS3; Regitano, LCA4.
Ciências Biológicas, Universidade Anhanguera Uniderp, Campo Grande/MS
Pesquisadores da Embrapa Gado de Corte, Campo Grande/MS
3
Bolsista de Desenvolvimento Técnico Industrial/CNPq, Campo Grande/MS
4
Pesquisadora da Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos/SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Maciez de carne, marcador molecular, melhoramento genético, PCR-RFLP, seleção assistida por marcadores
O complexo enzimático calpaína/calpastatina tem despertado grande interesse em estudos com marcadores
moleculares para melhoramento genético animal, devido à ação da calpaína na ativação de proteases que levam ao amaciamento da carne no processo post-mortem e a ação da calpastatina como inibidora da calpaína.
Neste contexto, os objetivos deste trabalho foram analisar o polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) A2959G
(AF159246) do gene bovino da calpastatina (CAST/DdeI) pela técnica de PCR-RFLP (Polymorphism Chain Reaction – Restriction Fragment Lenght Polymorphism), utilizando primers diferentes daqueles que foram previamente
descritos na literatura e reportar a utilização destes primers pela primeira vez. Para tanto, foram genotipados
126 touros das raças Bonsmara, Caracu e Senepol (taurinas adaptadas), Nelore (zebuína) e Angus (taurina nãoadaptada), escolhidos de acordo com o menor grau de parentesco possível. A acurácia do método foi confirmada por meio de sequenciamento direto de produtos de PCR de três indivíduos, sendo um de cada genótipo
(AA, GG e AG). O alelo A caracteriza-se por fragmentos de 32, 68, 191 e 195 pares de bases (pb). O alelo G produz fragmentos de aproximadamente 32, 68 e 386 pb. Sendo que o fragmento de 68 pb, que aparece em todos
os genótipos devido ao alongamento dos primers, é considerado o fragmento controle, ou seja, a presença desse
fragmento garante que o fragmento de PCR tenha sido cortado pela enzima de restrição. As frequências alélicas e genotípicas foram comparadas utilizando o teste de Qui-quadrado e observou-se diferença significativa
(p<0,01) entre as raças para as frequências alélicas e genotípicas, onde a raça Bonsmara apresentou frequência
de 100% para o alelo A (alelo favorável para maciez de carne), seguida pela raça Angus (94%) e Senepol (76%). A
raça Nelore apresentou maior frequência para o alelo G (40%), seguida da raça Caracu (32%). A menor frequência do alelo A observada nos animais Bos indicus já era esperada e bem documentada na literatura. Portanto,
o uso destes primers se mostrou eficiente para a genotipagem do SNP A2959G, pois com a amplificação de um
fragmento mais longo pode-se inserir um novo ponto de corte para a enzima de restrição DdeI, garantindo, dessa forma, que o fragmento de PCR realmente tenha sido cortado pela enzima, eliminando artifícios da técnica.
Apoio Financeiro: EMBRAPA, FUNDECT e CNPq
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Análises cariotípicas em Holochilus da região da
baixada maranhense
Santos, LL1; Paz, FS¹; Fonseca, LCA1; Silva-Souza, N2; Freitas, TRO3; Tchaicka, L1
¹Laboratório de Genética e Biologia Molecular/LabWick - Universidade Estadual do Maranhão
²Dept. de Química e Biologia - Universidade Estadual do Maranhão
³Programa de Pós- Graduação em Genética e Biologia Molecular – Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[email protected]
Palavras-chave: Roedores, Citogenética, Holochilus, Cricetidae, Metáfase
Os roedores constituem a ordem mais diversificada da fauna atual de mamíferos e a mais abundante na
Região Neotropical, onde as famílias mais representativas são Echimiydae e Cricetidae. A organização taxonômica vigente para os roedores é baseada, em maior parte, em características morfológicas. Porém, neste grupo,
o uso dessas características é muitas vezes dificultada por variações discretas na morfologia externa e craniana dos
indivíduos. Devido a essas dificuldades, as características citogenéticas e moleculares têm sido cada vez mais empregadas como ferramentas para elucidar problemas taxonômicos, através do estabelecimento de cariótipos espécie-específicos e de filogenias baseadas em seqüências de nucleotídeos. A família Cricetidae, na qual se enquadra
o gênero Holochilus, compreende seis subfamílias, 130 gêneros e mais de 600 espécies, sendo uma das maiores
famílias de mamíferos. O aprofundamento no estudo das populações de Holochilus da região da Baixada Ocidental Maranhense poderá contribuir com o entendimento dos limites de distribuição das espécies do gênero, assim
como na compreensão da dinâmica das populações de roedores. Este trabalho tem com objetivo a descrição do
cariótipo de animais do gênero Holochilus (Cricetidae) da Baixada Maranhense, município de São Bento – MA. Para
obtenção das células metafásicas, utilizou-se medula óssea do fêmur dos animais com pré administração de colchicina. As lâminas foram coradas com Giemsa e analisadas em microscópio ótico. Utilizou-se 2 animais machos,
tendo sido análisadas pelo menos trinta metáfases de cada espécime. O número modal encontrado foi de 2N=50.
Estudos realizados com Holochilus mostram que há uma extensa variação no número diplóide desses indivíduos,
sendo esses números diferentes dos encontrados no nosso trabalho. Mais dados serão adicionados a este estudo.
Apoio: UEMA, UFRGS
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Estrutura populacional, filogenia e filogeografia de
roedores do gênero Scapteromys (Sigmodontinae)
Ferreira, LB1; Bobadilla, UL1; Rosa, RM1; Siqueira, N1; Freygang, CC1; Andrades-Miranda, J1; Oliveira, LFB2;
Sbalqueiro, IJ3; Mattevi, MS1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada, Universidade Luterana do Brasil, Campus Canoas
Museu Nacional, Universidade Federal do Rio de Janeiro
3
Depto. de Genética, Universidade Federal do Paraná.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Scapteromys, Sigmodontinae, Filogeografia, Citocromo B, RAG
Introdução: O gênero Scapteromys Waterhouse, 1837 distribuí-se no Uruguai, leste da Argentina e sul do Brasil. O gênero é considerado monotípico, apenas com a espécie Scapteromys tumidus, embora a subespécie S.
tumidus aquaticus também tenha sido admitida. Seus membros apresentam hábito semi-aquático, sendo encontrados em lugares úmidos ou alagados. O fato de mostrar grandes diferenças nos cariótipos (2n = 24, 32, 34,
36, todos com NF = 40, resultantes de sucessivas fusões cêntricas) nas diversas localidades em que foi estudado sugere, fortemente, que S. tumidus possa constituir um táxon complexo. Objetivos: Este projeto visa verificar se os diferentes citotipos observados correspondem a clados moleculares bem como testar a hipótese de
Scapteromys constituir um táxon complexo. Métodos: Foram analisadas as seqüências dos genes mitocondrial citocromo b e nucleares RAG2 e GHR de 38 espécimes com 2n = 24 (8), 2n = 32 (14), 2n = 34 (12) e 2n = 36
(4) provenientes de 8 localidades do Brasil, 7 do Uruguai, 6 da Argentina,e 1 do Paraguai. Os produtos de PCR
foram seqüenciados no Laboratório de Seqüenciamento da ULBRA e as seqüências foram alinhadas no programa ClustalX e analisadas nos programas MEGA 4 (NJ), PAUP versão 4.0b10 (MP, ML) e MrBayes versão 3.0b4
(IB). A análise filogeográfica foi efetuada usando AMOVA, teste de Mantel, distribuição mismatch, network e o
programa DIVA (Dispersal Vicariance). Resultados: as análises efetuadas mostraram a presença de diversos
clados, com forte estruturação das populações e dos citótipos. Conclusões: Scapteromys parece ser um taxon
complexo, englobando pelo menos quatro espécies plenas as quais mostram relações claras com seus padrões
cromossômicos, sugerindo que este tenha sido um mecanismo fortemente associado com sua cladogênese.
Apoio financeiro: ULBRA, CNPq, FAPERGS e OEA
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Efeito do transplante de células mononucleares da
medula óssea em camundongos submetidos à lesão
eletrolítica do hipocampo dorsal
Ribeiro-Paes, JT1; Alves-de-Moraes, LBC2; Andrade, TGCS1; Longo, BM3; Oliveira, ALD4, Faria, CA2;
Ferrazoli, EG3; Marcelino, MY2; Longhini dos Santos, N1; Stessuk, T1; Barbosa de Oliveira, VA1
Departamento de Ciências Biológicas, UNESP - Campus de Assis.
Programa de Pós-Graduação Interunidades em Biotecnologia, USP– I.Butantan - IPT – SP.
3
Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP - SP.
4
Universidade Paulista – UNIP –Assis
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hipocampo, lesão eletrolítica, terapia celular, células-tronco, ansiedade
As células-tronco (CT) da medula óssea têm sido amplamente empregadas em protocolos de terapia celular. Há
na literatura um grande número de trabalhos dedicados ao emprego das células-tronco adultas (CTA) em modelos
experimentais e testes clínicos em lesões e doenças neurodegenerativas. Este trabalho teve como objetivo avaliar
o potencial de CTA como uma alternativa terapêutica em camundongos da linhagem C57BL/6 que sofreram lesão
eletrolítica na região do hipocampo dorsal. Para tanto, investigou-se a capacidade da terapia celular em modificar
os efeitos comportamentais decorrentes da lesão. Os camundongos receberam, sete dias após a indução de lesão
eletrolítica bilateral no hipocampo dorsal, meio de cultura (controle) ou células mononucleares da medula óssea
(BMMC) marcadas com a proteína fluorescente verde (EGFP, enhanced green fluorescent protein). Uma semana
após o transplante, os animais foram submetidos à avaliação comportamental no labirinto em cruz elevado (LCE),
um modelo de estudo amplamente utilizado em pesquisas sobre a ansiedade animal. Ao todo, foram conduzidas três sessões de avaliação no LCE, com intervalo de sete dias entre cada avaliação. Trinta e cinco dias após a
indução da lesão hipocampal, os camundongos foram sacrificados e os encéfalos retirados para análise imunohistoquímica do tecido cerebral. Os resultados da avaliação comportamental mostraram que a lesão hipocampal
produziu um efeito desinibitório, quadro que se mostrou atenuado, a partir do segundo período de observação,
nos animais transplantados com BMMC. Essa análise indicou também que as exposições repetidas ao LCE provocaram efeito ansiogênico nos animais testados, fenômeno que se mostrou menos intenso naqueles que sofreram a
lesão no hipocampo e que, aparentemente, não recebeu influência do tratamento com as CTA. Pela análise imunohistoquímica, foi observada presença reduzida de células EGFP+ no cérebro dos animais lesionados. Quando presentes, essas células encontravam-se predominantemente associadas a vasos sanguíneos, e sem sinais evidentes
de diferenciação. Diante da não recuperação da citoarquitetura tissular nos animais lesionados que receberam o
transplante, pode-se aventar a possibilidade que as respostas comportamentais observadas sejam resultantes de
efeitos parácrinos mediados pelas BMMC, como a liberação de fatores modulatórios ou ativadores endógenos para
restituição parcial das funções do hipocampo. Em conclusão, os resultados deste estudo mostram que o transplante de células da medula óssea tem potencial para reduzir prejuízos funcionais decorrentes de lesões cerebrais.
Novas investigações necessitam, no entanto, ser conduzidas a fim de que se possa avançar no conhecimento e
formular proposições mais acuradas sobre os mecanismos de ação da CT no tecido cerebral lesionado.
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Desenvolvimento de marcadores microssatélites
tetranucleotídicos para uma espécie brasileira de tucotuco (Ctenomys torquatus, Rodentia)
Roratto, PA1; Bartholomei-Santos, ML2; Freitas, TRO1.
Laboratório de Citogenética e Evolução, Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul
2
Laboratório de Diversidade Genética, Programa de Pós Graduação em BiodiversidadeAnimal, Universidade Federal de Santa Maria.
[email protected]
1
Palavras-chave: marcadores moleculares, roedores subterrâneos, hibridização seletiva, deriva genética, amplificação cruzada
O gênero Ctenomys compreende roedores com hábito de vida subterrâneo, popularmente conhecidos como tucotucos, amplamente distribuído em toda a região sul da América do Sul. O hábito de vida subterrâneo e a organização das populações de tuco-tucos em pequenos demes, associados ao curto tempo de geração e baixa vagilidade
desses roedores, propiciam a ação da deriva genética. Esse tipo de estruturação populacional parece favorecer a
fixação de diferentes rearranjos cromossômicos em populações e/ou espécies distintas, com efeito marcante também em nível molecular. Estudos que utilizaram microssatélites dinucleotídicos Hai e Soc previamente descritos
para espécies argentinas de tuco-tucos têm demonstrado baixa diversidade intrapopulacional e alta diferenciação
entre populações. O objetivo deste trabalho é isolar marcadores microssatélites tetranucleotídicos para Ctenomys
torquatus, espécie sul brasileira, e comparar com os índices de diversidade obtidos com os locos dinucleotídicos.
Uma biblioteca genômica enriquecida com microssatélites (GATA)n foi construída utilizando o protocolo de hibridização seletiva. Os clones foram sequenciados e os pares de primers desenvolvidos com o programa Primer3.
Produtos de PCR marcados com fluorescência HEX foram genotipados em sequenciador automático ABI3730 para
duas populações de C. torquatus, Cachoeira do Sul (NCAC=20) e Butiá (NBUT=17). Os índices de diversidade foram
calculados com o programa Arlequin. Entre as 76 sequências não redundantes, 85,5% foram descartadas por não
apresentar motivo repetitivo, repetição curta ou não possuir região flanqueadora. Dos 11 pares de primers designados, apenas um não amplificou com sucesso para todos os indivíduos. O número de alelos total variou de 1 a 8
(CAC: 1-4; BUT: 1-6), sendo que apenas o loco Tor10 foi monomórfico no geral. Entretanto, CAC apresentou outros
três locos monomórficos (Tor1, Tor3 e Tor7). Para os 14 locos heterólogos Hai e Soc essas populações apresentaram
resultado semelhante (CAC: 1-4; BUT: 1-7). Os valores de heterozigosidade observada variaram de 0,15 a 0,55 para
CAC (média 0,35) e 0,12 a 0,82 para BUT (média 0,63). Na comparação com os locos Hai e Soc, não houve diferença
significativa para CAC (Hobs=0,25; P=0,215), mas para BUT houve um aumento significativo (Hobs=0,41; P=0,03). Nenhum loco apresentou desequilíbrio de Hardy-Weinberg ou de ligação. O Fst entre CAC e BUT foi alto e significativo
(Tor=0,47; Hai e Soc=0,64) e os resultados de AMOVA demonstraram que a maior parte de variação é encontrada
entre populações (Tor: 47,7%; Hai e Soc: 64,4%). Embora diferentes, as comparações entre populações (Fst e AMOVA) foram extremamente altas, como é esperado para tuco-tucos. Análises dos dados em conjunto (Tor, Hai e Soc)
fornecem índices intermediários (Fst=0,57; AMOVA=57,1%). Dado o sucesso de amplificação cruzada de microssatélites em Ctenomys, os locos apresentados neste estudo são promissores em análises não só com C. torquatus.
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Análises citogenéticas em uma zona híbrida
interespecífica entre Ctenomys minutus e Ctenomys
lami (Rodentia:Ctenomyidae) na planície costeira do
Sul do Brasil
Ximenes, SSF1; Lopes, CM1,2; Freitas, TRO1,2
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
email: [email protected]
1
2
Palavras-chave: ctenomys, zona hibrida, cromossomos, planicie costeira, ctenomyidae
Ctenomys lami (Freitas, 2001) e Ctenomys minutus (Nehring, 1887) são espécies de roedores subterrâneos próximos filogeneticamente que ocorrem na planície costeira do Sul do Brasil. As duas espécies são caracterizadas
por possuírem uma notável variabilidade cariotípica, C. lami apresenta 26 cariótipos distintos e C. minutus possui 45 cariótipos. No passado essas duas espécies eram isoladas geograficamente pela presença de um banhado
entre suas distribuições, porém, a partir de 1950, com o desenvolvimento da cultura de arroz na região, esta área
úmida foi completamente drenada expondo uma área arenosa que possibilitou o contato secundário entre as
populações de C. lami com 2n = 56b e C. minutus com 2n = 48a. O objetivo deste trabalho é confirmar e caracterizar citogeneticamente o evento de hibridação na região de contato entre estas duas espécies. Neste trabalho foram realizadas coletas em três localidades, distantes entre si em 3 km, na margem sudoeste da Lagoa dos
Barros. No primeiro ponto de coleta, localizado próximo às populações de C. lami, foram coletados 8 espécimes
com cinco diferentes cariótipos: 2n = 53, NA = 74 (1 indivíduo); 2n = 54, NA = 78 (1 indivíduo); 2n = 55, NA = 76
(2 indivíduos); 2n = 56, NA = 78 (2 indivíduos) e NA = 80 (2 indivíduos). No segundo ponto, localizado entre as
populações das duas espécies, foram coletados 7 espécimes com seis diferentes cariótipos: 2n = 50, NA = 74 (1
indivíduo) e NA = 76 (1 indivíduo); 2n = 53, NA = 74 (1 indivíduo) e NA = 80 (2 indivíduos); 2n = 54, NA = 78 (1
indivíduo) e NA = 80 (1 indivíduo). No terceiro ponto, com maior proximidade com as populações de C. minutus, foram coletados 5 espécimes com quatro cariótipos distintos: 2n = 48, NA = 76 (2 indivíduos); 2n = 49, NA =
74 (1 indivíduo); 2n = 49, NA = 76 (1 indivíduo); 2n = 50, NA = 76 (1 indivíduo). Os dados de meiose dos machos
híbridos demonstraram que a segregação dos cromossomos é regular, evidenciando a viabilidade reprodutiva
dos heterozigotos. A descoberta de diferentes combinações cariotípicas intermediárias aos parentais envolvidos sugere a existência de cruzamentos além da F1, cruzamentos entre híbridos e retrocruzamentos, demonstrando a formação de uma zona híbrida bem estabelecida nessa região. O modelo de superioridade dos híbridos
é o que melhor se aplica para essa zona híbrida, pois o número de espécimes com citótipos híbridos alternativos foi maior do que espécimes com citótipos parentais ou híbridos resultantes da F1. Nossos dados sugerem
que as diferenças cariotípicas não agem como barreiras efetivas para a reprodução entre C. lami e C. minutus.
Apoio financeiro: Capes, CNPQ, Fapergs, Departamento de Genética/UFRGS
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Análises filogenéticas de roedores do gênero
Euryoryzomys (Rodentia: Cricetidae) baseadas em
sequências do gene mitocondrial citocromo-b
Almeida, KA1; Patané, JSL1; Silva, MJJ1
¹Laboratório de Ecologia e Evolução - Instituto Butantan
[email protected]
Palavras-chave: filogenia molecular, roedores, Euryoryzomys, sequências gênicas, citocromo-b
Euryoryzomys corresponde a um dos dez novos gêneros de roedores da tribo Oryzomyini (Subfamília Sigmodondinae) reconhecidos após recente revisão do então gênero Oryzomys. São reconhecidas seis espécies, E. emmonsae, E. lamia, E. macconelli, E. nitidus E. russatus e E.legatus. As cinco primeiras espécies são encontradas
em território brasileiro e somente E. legatus possui distribuição exclusivamente andina. Embora as espécies sejam bem caracterizadas, suas relações intragenéricas não estão totalmente esclarecidas. Sequências gênicas de
DNA mitocondrial e nuclear têm sido amplamente empregadas em reconstruções filogenéticas para um melhor
entendimento da história evolutiva de diversos grupos. Neste estudo foram utilizadas sequências de 50 exemplares de 31 localidades pertencentes a 11 estados brasileiros. O DNA foi extraído de tecidos de fígado ou músculo com Chelex 100 (Bio Rad - código 143-2832) e a reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada com
os primers MVZ 05 e MVZ 16 para amplificação de 1143 pb do gene mitocondrial citocromo-b. A filogenia foi
reconstruída utilizando-se os métodos de máxima parcimônia e máxima verossimilhança. Foram empregadas
1.000 psedo- réplicas de bootstrap para estimativa de suporte dos ramos. Como grupos externos foram utilizados indivíduos representantes de outros gêneros da tribo Oryzomyini e representantes das tribos Abrothrichini,
Akodontini, Phyllotini, Thomasomyini e Wiedomyini, provenientes do Genbank. As topologias obtidas recuperaram o monofiletismo do grupo nitidus em relação aos grupos externos, incluindo um clado de Euryoryzomys sp.,
espécie que apresenta 2n=76, proveniente de Pacotí (CE), mostrando-se proximamente relacionada a E. lamia.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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37
Caracterização cromossômica de Proechimys cf.
longicaudatus (Rodentia, Echimyidae) do Norte do Mato
Grosso-MT, com sistema sexual múltiplo
Amaral, PJS1,3; Nagamachi, CY1,2; Costa, MJR1,7; Pereira, AL1,4; Noronha, RCR 1; Rossi, RV5; Oliveira, ACM6;
Pieczarka, JC1,2
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista FAPESPA de doutorado em Genética e Biologia Molecular
4
Programa de Institucional de Bolsas de Iniciação Científica-PIBIC
5
Departamento de Biologia e Zoologia, IB-UFMT
6
Lab. Zoologia de Vertebrados, ICB, UFPA
7
Bolsista PIBIC-UFPA.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Roedor; Proechimys; Citogenética, FISH, Biodiversidade
O gênero Proechimys é o mais diverso da família Echimyidae, com 25 a 32 espécies reconhecidas dependendo
do autor, distribuídas em nove grupos. Algumas destas espécies estão entre as mais abundantes em comunidades de pequenos roedores na Amazônia. Apesar de sua riqueza de espécies, a similaridade fenotípica dentro
do gênero origina grandes problemas taxonômicos. Entretanto, esta similaridade contrasta com a sua grande
variação cariotípica, com complemento diplóide variando de 14 a 62 cromossomos ocorrendo heteromorfismos em alguns casos, com aproximadamente 57 formas cariotípicas já descritas. No presente trabalho caracterizamos um novo citótipo para Proechimys cf. longicaudatus capturado na Região Norte do Mato Grosso-MT,
Fazenda Tanguro, município de Querência (coordenadas 12º 54”S e 52º 22”W). Os resultados demonstram que
os exemplares machos e fêmeas apresentam número diplóide composto por 17 e 16 cromossomos respectivamente, formado em sua totalidade por cromossomos acrocêntricos, com exceção do cromossomo X que é de
dois braços. O sistema sexual encontrado nos machos é do tipo XY1Y2 e nas fêmeas a constituição é XX. Nos machos observamos, por bandeamento G e meiose, que a origem do sistema sexual múltiplo foi devido a um rearranjo Robertsoniano, envolvendo um autossomo acrocêntrico grande e o X, resultando na formação de XY1Y2,
enquanto que nas fêmeas ocorrem dois Neo-X. As marcações Ag-NOR estão localizadas na região intersticial de
um único par cromossômico. Também observamos incorporação de prata em todas as regiões centroméricas
dos outros pares cromossômicos. A FISH com sonda telomérica apresentou marcações distais em todos os pares
cromossômicos. Sistema sexual múltiplo do tipo XX/XY1Y2 é semelhante ao observado anteriormente por nós
para a espécie Proechimys cf. goeldii (2n=25 nos machos e 2n=24 nas fêmeas). Entretanto, as duas espécies diferem quanto ao autossomo envolvido na translocação com o X, que em Proechimys cf. goeldii é um acrocêntrico
pequeno e, no presente trabalho, um acrocêntrico grande. Isso demonstra origem independente das duas espécies.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESPA, CAPES, UFPA.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Caracterização cariotípica de três espécies do gênero
Akodon (Rodentia, Akodontini) do Parque Municipal de
Sertão/RS, com descrição do padrão heterocromático
Ferreira, JR; Luza, AL; Severo, MS; Souza, VT; Grando, JV; Porto, SM; Zanella, N; Busin, CS;
Curso de Ciências Biológicas/Bel - Instituto de Ciências Biológicas – Universidade de Passo Fundo – UPF – Passo Fundo/RS.
[email protected]
Palavras-chave: cariótipo, roedores, NOR, heterocromatina
O gênero Akodon é o mais numeroso entre os roedores. Atualmente é formado por 41 espécies que tem ampla distribuição na América do Sul, principalmente no Brasil. São animais caracterizados pelo porte pequeno,
orelhas grandes e cauda igual ou pouco menor que o comprimento do corpo; a pelagem pode variar do verdeolivácio até o cinza. O gênero caracteriza-se por apresentar grande similaridade fenotípica entre as espécies o
que acarreta problemas taxonômicos contrastando com sua ampla multiformidade cariotípica, pois apresenta
grande variação tanto no número diplóide de cromossomos quanto no número de braços que estes apresentam (2n=10 a 2n=46; NA=14 – 16 a 46). O Parque Municipal de Sertão/RS é um dos maiores fragmentos de floresta ombrófila mista do bioma Mata Atlântica na região norte do Rio Grande do Sul. Pela dificuldade em estudar os roedores, em função da sua grande riqueza de espécies, formas e adaptações, pouco se sabe sobre a
composição taxonômica, distribuição e caracterização genética deste grupo nesta região. Este trabalho teve o
objetivo de caracterizar citogeneticamente cinco espécimes de roedores do gênero Akodon, coletados no Parque
Municipal de Sertão/RS e auxiliar na correta identificação das espécies deste gênero no parque. As coletas ocorreram com autorização expedida pelo SISBIO/ICMBio, sob número 20110-1. As preparações cromossômicas
foram obtidas por meio de suspensão de células de medula óssea dos fêmures dos espécimes submetidos à colchicina e posteriormente a eutanásia por inalação de halotano. As metáfases foram analisadas através da coloração convencional dos cromossomos, para montagem dos cariótipos e do bandamento C, para a determinação
do padrão heterocromático. Foram analisadas 50 metáfases por espécime e as cinco melhores foram digitalizadas e os cariótipos montados. Entre os cinco espécimes analisados foram econtradas três fêmeas de Akodon sp,
apresentando 2n=40 cromossomos todos telocêntricos, uma fêmea de A. paranaensis com 2n=44 cromossomos
telocêntricos e um macho de A. montensis, com 2n=24 cromossomos, meta, submeta e telocêntricos. Em A. montensis os cromossomos sexuais são telocêntricos porém o X é maior que o Y. Nas três espécies identificadas, o bandamento C revelou padrão de heterocromatina essencialmente centromérica. Portanto entre os cinco espécimes
analisados foram identificadas as espécies Akodon sp (2n=40), A. paranaensis (2n=44) e A. montensis (2n=24).
Apoio Financeiro: UPF
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Arquitetura Genética do Comportamento Materno de
Ansiedade em Camundongos
Sauce, B1,2; Monte, BGO1,2; Góes, CP1,2; Sucomine, VM1,2; Watanabe, IM1,2; Cunha, JP1,2; Peripato, AC1,2
Laboratório de Genética de Populações e Evolução
Departamento de Genética e Evolução (DGE) - UFSCar campus São Carlos
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Ansiedade, Comportamento Materno, Camundongos, QTL, Arquitetura Genética
O cuidado materno em mamíferos é um comportamento complexo e flexível que gera variação na progênie de
fenótipos vitais como crescimento e sobrevivência. Nosso grupo trabalha com camundongos do intercruzamento de duas linhagens endogâmicas SM/J e LG/J; em que as fêmeas apresentam variações associadas ao cuidado
materno. A capacidade de uma mãe em manter seus filhotes vivos pode estar relacionada a mecanismos gerais
como depressão, medo e ansiedade. A ansiedade destaca-se por diversos efeitos em outros comportamentos
específicos do cuidado materno. Investigamos se a ansiedade em nossos animais é influenciada pela fase materna e examinamos a arquitetura genética (genes e seus efeitos individuais) da ansiedade pós-parto. Avaliamos a ansiedade em 182 fêmeas F2 no quarto dia pós-parto e 103 fêmeas F2 fora da fase materna com o teste
do Labirinto em Cruz Elevado. Usamos os fenótipos de frequência e tempo relativos nos braços abertos para
compararmos essas fêmeas e testamos, com a análise de QTL, a associação desses fenótipos com regiões (101
marcadores microssatélites) por todo o genoma das fêmeas F2 em fase materna. Encontramos maior frequência
nos braços abertos em fêmeas na fase materna (F=15,56; p<0,05), sugerindo efeitos hormonais da gravidez e do
parto influenciando a ansiedade em nossas linhagens. Obtivemos 4 QTLs de efeito individual (D8Mit58+16cM;
D13Mit115+36cM; D8Mit58+22cM; DXMit55+6cM) relacionados com a ansiedade explicando de 4,7 a 6,1% da
variação nesses fenótipos. Encontramos QTLs no cromossomo 8 para frequência e tempo no mesmo intervalo
de confiança – refletindo a semelhança entre esses dois fenótipos. Porém, o QTL para frequência no cromossomo 13 e o QTL para tempo no cromossomo X mostram que talvez esses fenótipos no teste de Labirinto em
Cruz Elevado tenham alguns componentes bioquímicos e fisiológicos distintos – possivelmente explicando
porque não encontramos diferenças no tempo de braços abertos entre as fêmeas dentro e fora da fase materna.
Em nossos QTLs, encontramos genes descritos por outros estudos associados à fenótipos de estresse, ansiedade
e depressão. Desses, o gene Htr1A (serotonin receptor 1A) tem associação em camundongos com a ansiedade no
período materno; e codifica uma proteína receptora da serotonina – hormônio associado em camundongos com
a sobrevivência dos filhotes. Por fim, a identificação em camundongos de genes relacionados ao cuidado materno, como a ansiedade, poderão contribuir na identificação de genes para esses fenótipos em outros mamíferos.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Caracterização do microambiente tímico de
camundongos através de microarranjos de DNA
Linhares-Lacerda, L1, Ramos-Pedrosa, KM12, Ribeiro-Alves,2M3; Passos,3GA4; Savino, W1.
Laboratório de Pesquisas sobre o Timo, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ2
Universidade Estadual de Ciências da Saúde de Alagoas, Maceió, AL;
3
Centro Tecnológico de Desenvolvimento em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ;
4
Laboratório de Imunogenética Molecular, Departamento de Genética, Faculdade de Medicina, Ribeirão Preto, SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microambiente tímico, célula epiteliais tímicas corticais, células epiteliais tímicas medulares, células endoteliais tímicas,
microarranjo de DNA
O timo é um órgão linfóide onde os precursores das células T derivados da medula óssea passam por um complexo
processo de diferenciação, que envolve a expressão seqüencial de várias proteínas de membrana e o rearranjo dos
genes que codificam o receptor de célula T (TCR), cujo produto final interage com proteínas do complexo principal
de histocompatibilidade (MHC), expressas pelas células do microambiente tímico. Este microambiente é uma rede
celular tridimensional (composta de tipos celulares distintos como: células epiteliais, macrófagos, células dendríticas e fibroblastos), que modula a diferenciação intratímica de linfócitos T, determinando a geração de um repertório
de células T diverso e funcional, o qual é restrito ao MHC e tolerante às proteínas próprias do organismo. As células
epiteliais tímicas (TEC) representam o maior componente do microambiente tímico e sub-populações de TEC podem ser identificadas pela expressão diferencial de citoqueratina, sendo divididas em células epiteliais tímicas corticais (cTECs) e células epiteliais tímicas medulares (mTECs). Cada sub-população de TEC desempenha papéis distintos na diferenciação dos timócitos, por exemplo, as TECs corticais são responsáveis pelo comprometimento dos
precursores hematopoiéticos com a linhagem T, e as TECs medulares são responsáveis pela seleção dos timócitos
auto-reativos. Com o objetivo de caracterizar e comparar a expressão gênica de linhagens representativas do microambiente tímico, nós utilizamos a técnica de microarranjo de cDNA. Inicialmente, utilizamos anticorpos monoclonais para fenotipar essas linhagens e separá-las em TEC cortical e medular. Utilizando TECs corticais, medulares,
células endoteliais tímicas e uma linhagem representativa de linfócitos T nós realizamos os ensaios de microarranjos de cDNA em lâminas que continham 4500 genes, dos quais 17 genes apresentaram diferença de expressão. O
agrupamento Bayesiano hierárquico construído a partir dos perfis de expressão dos genes diferencialmente expressos segmentou as amostras celulares em três grupos, onde o maior deles reuniu as duas sub-populações de TECs.
Além disso, este mesmo grupo se mostrou mais próximo àquele formado exclusivamente por amostras de células
endoteliais tímicas, quando comparado ao grupo formado exclusivamente por células representativas do linfócito
T. Dentre os genes diferencialmente expressos podemos destacar o gene da caspase 8 e da anexina A1. Este foi o
primeiro trabalho comparando a expressão gênica de linhagens representativas do microambiente tímico. Nosso
próximo passo será definir a expressão dos microRNAs nessas linhagens e comparar a expressão dos microRNAs
com os dados descritos nesse trabalho, relacionando os microRNA com seus possíveis RNA mensageiros alvos.
Apoio financeiro: Fiocruz, UNCISAL, FMRP-USP, CNPq, FAPERJ
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Descrição cariotípica e do padrão heterocromático de
duas espécies de roedores do gênero Oligoryzomys
(Rodentia, Cricetidae) do Parque Municipal de Sertão/RS
Basso, M; Necker, M; Ferreira, JR; Luza, AL; Souza, VT; Grando, JV; Porto, SM; Busin, CS;
Laboratório de Citogénica Animal - Instituto de Ciências Biológicas – Universidade de Passo Fundo – UPF – Passo Fundo/RS
[email protected]
Palavras-chave: cariótipo, padrão heterocromático, roedores, banda C
O Parque Municipal de Sertão constitui-se num dos maiores fragmentos de Floresta Ombrófila Mista da região
norte do Rio Grande do Sul, porém nada se sabe sobre a diversidade e a estrutura da comunidade de roedores nessa
unidade de conservação. Os roedores são de fundamental importância no estabelecimento do equilíbrio ecológico de diversas cadeias alimentares e apresentam maior número de espécies do que qualquer outra ordem dos
mamíferos. O gênero Oligoryzomys é representado por indivíduos de pequeno porte e com coloração de pelagem
que, muitas vezes, pode dificultar a identificação taxonômica. A citogenética, somada aos dados morfológicos, é
uma ferramenta importante para auxiliar na correta identificação taxonômica do grupo. Esse trabalho teve como
objetivo caracterizar citogeneticamente doze espécimes de roedores do gênero Oligoryzomys coletados no Parque
Municipal de Sertão/RS, auxiliando assim a correta identificação das espécies do gênero que ocorrem no parque.
As coletas ocorreram com autorização do SISBIO/ICMBio, número 20110-1. Preparações cromossômicas foram
obtidas por meio de suspensão de células da medula óssea dos fêmures de espécimes submetidos à colchicina
e posteriormente à eutanásia por inalação de halotano. Foram analisadas metáfases por meio da coloração convencional dos cromossomos para montagem dos cariótipos e, do bandamento C para a determinação do padrão
heterocromático. Cinquenta metáfases por espécime foram analisadas e as cinco melhores foram digitalizadas e
os cariótipos montados. Dos doze espécimes, nove (oito e um) apresentaram 2n=62, com cromossomos metacêntricos, submetacêntricos, subtelocêntricos e telocêntricos, característicos de O. nigripes. O cromossomo X é submetacêntrico grande e o Y é um pequeno cromossomo submetacêntrico. Esses exemplares apresetaram diferentes
morfologias nos cromossomos dos pares 3 (M/M ou M/SM) e 4 (M/M, M/T ou T/T). Os outros três espécimes (dois
e uma) apresentaram número cromossômico variando de 2n=64 a 66 cromossomos, com três pares de cromossomos metacêntricos e/ou submetacêntricos e os demais todos telocêntricos, característicos de O. flavescens. O
cromossomo X é submetacêntrico de tamanho grande e o Y é telocêntrico de tamanho médio. O padrão heterocromático das duas espécies mostrou bandas centroméricas em todos os cromossomos. Bandas heterocromáticas
adicionais foram detectadas telocêntricamente em ambos braços de um par cromossômico submetacêntrico e
em um telocêntrico, além de uma banda intersticial num par telocêntrico em O. nigripes. Nesta espécie o cromossomo X apresentou uma evidente banda heterocromática que ocupa grande parte do braço curto e, o cromossomo Y apresentou-se totalmente heterocromático. Já O. flavescens apresentou dois pares de cromossomos
telocêntricos com bandas pericentroméricas e o cromossomo Y também é totalmente heterocromático. Portanto
entre os doze espécimes do gênero Oligoryzomys coletados no Parque Municipal de Sertão/RS foram identificados oito fêmeas e um macho de O. nigripes (2n=62) e, dois machos e uma fêmea de O. flavescens (2n=64 a 66).
Apoio Financeiro: UPF
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Variações no gene HTR1B e seu significado evolutivo
Vieira, E¹; Paixão-Côrtes, VR¹; Salzano, FM¹; Bau, CHD¹; Bortolini, MC¹.
1 - PPGBM, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[email protected]
Palavras-chave: serotonina, HTR1B, 5HT1B, evolução molecular, mamíferos
Os receptores de serotonina (5HT) são produtos de genes amplamente distribuídos em vertebrados. São receptores de membrana pós-sináptica, e em humanos são produzidos a partir de 20 loci diferentes. Estudos recentes
com camundongos indicam especialização funcional dos diferentes receptores, particularmente HTR1A e HTR1B,
que parecem ter um papel na regulação de regiões cerebrais correlacionadas à emoção. Em humanos, HTR1B
tem sido associado a condições psiquiátricas tais como o transtorno de déficit de atenção e o comportamento
depressivo/suicida. O gene HTR1B é constituído de um único éxon de 1260pb e localiza-se na posição 6q14.1.
No presente estudo foram analisadas sequências de ortólogos que cobrem até 1170pb da região codificadora do
gene HTR1B, em vinte e cinco espécies de mamíferos, retiradas dos bancos de dados Ensembl (www.ensembl.
org) e NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) e alinhadas através do algoritmo ClustalW. Utilizando-se o programa PAML_4,
estimaram-se as taxas de substituições sinônimas e não-sinônimas (dN/dS ou ω). Valores das taxas de substituição
ω < 1 e ω > 1 indicam respectivamente seleção purificadora (ou negativa), ou positiva (Darwiniana). Já valores de
ω = 1 indicariam que a hipótese de neutralidade não poderia ser descartada. A taxa de substituições sinônimas e
não-sinônimas (dN/dS = ω = 0,007) é significativamente menor que um, sinalizando que a principal força agindo
neste caso é a seleção purificadora. Porém, quando os modelos de substituição são comparados, tanto o modelo
que assume variação nos valores ω (p < 0,001) quanto aquele que assume variação nos valores ω, bem como possível seleção positiva (p = 0,002) mostraram-se significativamente melhores que os modelos neutros. Ou seja,
pelo menos 2% dos sítios estariam sob ação de seleção positiva (ω = 1,09). Estes sítios foram então analisados
pela ferramenta PolyPhen (= Polymorphism Phenotyping - http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/ ) e a maioria
das substituições não-sinônimas promovem alterações que, em princípio, não provocariam dano à proteína. Já
no sítio de um conhecido polimorfismo não sinônimo humano no gene HTR1B (rs130060; Phe124Cys, que tem
sido investigado em estudos de associação com transtornos psiquiátricos) foi encontrado um novo alelo 124Leu
fixado em algumas espécies de mamíferos (cachorro, raposa, vaca e coelho), enquanto que em todas as demais 20
espécies estudadas o alelo fixado é Phe124. Curiosamente, três das quatro espécies com a variante são de animais
que passaram por eventos de domesticação, enquanto que das outras vinte, somente duas (cavalo e porco) são domesticadas (p = 0,018). Análises posteriores poderão esclarecer se há ou não relevância funcional nesses achados.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPERGS.
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QTL para variação de ejeção de leite em camundongos
SM/J x LG/J
Goes, CP1,2; Sauce, B1,2; Peripato, AC1,2.
Laboratório de Genética de Populações e Evolução
Departamento de Genética e Evolução (DGE) – UFSCar campus São Carlos
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Camundongo, Comportamento Materno, Leite, Egf, QTL
Em mamíferos, após o parto, as fêmeas necessitam alimentar sua prole para garantir a sobrevivência da mesma.
A amamentação faz parte de um processo fundamental para o sucesso da progênie chamado cuidado materno. A
não ejeção de leite logo após o parto, então, torna-se um problema, visto que os filhotes não possuem suprimento
suficiente para manter-se viável até essa provisão e somente através da mãe podem alimentar-se. Vários fatores
podem interferir na ejeção do leite, podendo ser tanto hormonais como psicológicos, associados ao ambiente ou
do simples mau desenvolvimento da fêmea. Recentemente foi verificado o envolvimento do gene Egf (epidermal
growth factor) no crescimento da glândula mamária durante a gravidez, tornando, na ausência deste, as fêmeas
incapazes de alimentar seus filhotes e levando à morte da ninhada. No presente estudo investigamos QTLs (Quantitative Trait Loci) associados a variação de ejeção de leite no primeiro dia pós parto. Para tanto foram utilizadas
234 fêmeas da geração F2 proveniente do intercruzamento das linhagens endogâmicas SM/J e LG/J de camundongos. Realizamos a análise de QTL utilizando 101 marcadores distribuídos por todo o genoma (19 cromossomos
autossômicos e 1 sexual) e o fenótipo de presença ou ausência de leite no primeiro dia pós-parto. A presença de
leite é realizada através da visualização de leite no estômago dos filhotes. Nossos resultados revelam um QTL individual no cromossomo 3 (D3Mit14+14cM), acima do nível de significância do genoma (LOD = 3,66), aditivo e que
responde por cerca de 8% da variação de ejeção de leite em nossa população. No intervalo de confiança deste QTL
encontramos o gene Egf como o potencial gene candidato. Este gene é expresso através do estímulo de hormônios
como a insulina, prolactina, estrógeno e progesterona, os quais promovem uma maior produção da proteína Egf,
afetando o desenvolvimento da glândula mamária e modulando a produção de leite em quantidade e qualidade.
Nossa próxima etapa envolve a procura par-a-par pelo genoma por interações epistáticas respondendo pela variação de ejeção de leite em nosso intercruzamento e a ratificação do papel do gene candidato Egf nesta característica.
Apoio financeiro: FAPESP
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Evolução em tempo real: o exemplo dos Ctenomídeos
na planície costeira do Sul do Brasil
Lopes, CM1,2; Ximenes, SSF1; Freitas, TRO1,2
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: roedores subterrâneos, polimorfismo cariotípico, barreiras geográficas, zona híbrida, filogeografia, especiação
Ctenomys minutus e Ctenomys lami são espécies de roedores subterrâneos filogeneticamente irmãs, com morfologia externa muito semelhante, e alto polimorfismo cariotípico. São consideradas espécies distintas por diferenças em seus cariótipos (C. minutus de 2n=42 até 2n=50, e C. lami com 2n=54 até 2n=58), distinção nas áreas
de ocorrência (C. minutus linearmente distribuído entre primeira e segunda linha de dunas da planície costeira
do Rio Grande do Sul e sul de Santa Catarina, e C. lami restrito à região da Coxilha das Lombas no Rio Grande do
Sul), e diferenças na morfometria craniana. No passado, uma extensa área úmida isolava geograficamente as duas
espécies, porém em meados de 1950 a introdução de culturas de arroz na região secou o antigo banhado o que
possibilitou o contato secundário e conseqüentemente a formação de uma zona de hibridação interespecífica.
Os objetivos deste estudo são: acessar os padrões filogeográficos de C. minutus e C. lami; analisar o papel dos diferentes cariótipos e barreiras geográficas na estruturação da variabilidade genética destas espécies; e propor um
panorama sobre o estabelecimento e diferenciação das duas espécies na planície costeira do Sul do Brasil. Para tal,
foram analisados, além dos cariótipos, 398pb da região controladora e 620pb do citocromo c oxidase subunidade I
em 276 espécimes de C. minutus, 166 espécimes de C. lami, e 19 indivíduos híbridos. Os resultados demonstraram
que as diferentes populações das duas espécies se diferenciam de acordo com o modelo de isolamento pela distância. Características geomorfológicas da região que habitam e descontinuidades no ambiente representam fatores
importantes na estruturação da variabilidade genética destes Ctenomídeos, sendo que os diferentes cariótipos
parecem não agir como barreiras reprodutivas, desempenhando um papel secundário na estruturação das populações. Entre os 19 espécimes coletados na zona de hibridação foram encontradas 15 combinações cariotípicas
intermediárias aos parentais envolvidos (de 2n=48 a 2n=56), todos eles compartilhando haplótipos apenas com
C. minutus, o que sugere cruzamento preferencial entre fêmeas de C. minutus com machos de C. lami. Apesar dos
resultados demonstrarem o compartilhamento de haplótipos entre as duas espécies, e a formação de uma zona
de hibridação interespecífica bem estabelecida, o cruzamento entre machos de C. minutus com fêmeas de C. lami
não foi registrado, sugerindo um isolamento reprodutivo parcial entre as duas espécies. Nossos dados demonstram que a partir de um ancestral comum estas duas espécies começaram a se diferenciar em alopatria, porém
alterações no habitat possibilitaram a formação de uma zona de hibridação, evidenciando que o período de isolamento geográfico não foi suficiente para permitir o completo isolamento reprodutivo. Os efeitos que esta zona de
hibridação pode acarretar na manutenção destas duas espécies como unidades taxonômicas distintas é incerto.
Apoio financeiro: Capes, CNPQ, Fapergs, Departamento de Genética e UFRGS.
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Análises cariotípicas em populações de roedores
do gênero Thrichomys (Echimyidae) no cerrado do
Maranhão
Abreu, CP1; Santos, LL1; Amorim, APS1; Oliveira, TG1; Freitas, TRO2; TchaickA, L1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular , Curso de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Maranhão – Campus São Luís.
. Curso de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Roedores, Thrichomys, citogenética
A família Echimyidae é composta pelos animais conhecidos popularmente como ratos espinhosos. Neste grupo,
assim como para os demais roedores, a classificação taxonômica geralmente é feita com base em estudos morfológicos, o que dificulta a diferenciação de espécies devido às semelhanças apresentadas. Para o Estado do Maranhão, recentemente foi registrado a ocorrência de Thrichomys apereoides nas áreas de cerrado próximas ao
município de Balsas. A uma distância de apenas 200Km, na região das cidades de Carolina e Estreito, no entanto,
foram capturados indivíduos de morfologia diferenciada, sugerindo a ocorrência de uma espécie ainda não descrita. Este trabalho tem como objetivo realizar análises citogenéticas em populações de roedores do gênero Thrichomys (Echimyidae) da região do Estado do Maranhão, a fim de investigar a distribuição das espécies já conhecidas
e a possível ocorrência de um nova espécie. Para tal, cinco roedores foram capturados com o auxílio de armadilhas
tipo Tomahawk, na região de Tasso Fragoso (MA). Estes foram submetidos à injeção de 0,01% de colchicina na
proporção 1ml para 10gr de peso do animal. Com auxilio de uma seringa e de solução hipotônica de KCL 0,75M, foi
coletada a medula óssea do fêmur dos animais. A partir do material obtido, foram preparadas lâminas coradas com
Giemsa para análise das metáfases em microscópio óptico comum com objetiva de imersão. As análises foram
concluídas para dois espécimes, que tiveram número cromossômico modal igual a 30. Esse resultado aproxima
esses roedores de Thrichomys sp. (2n = 30 e NF = 56) registrado para o estado de Tocantins em regiões de fronteira
com o Maranhão, e os diferencia de T. apereoides (2N = 28 NF = 50). Maior número de animais e análises moleculares serão adicionados a este estudo a fim de elucidar os padrões de distribuição de Thrichomys no Maranhão. .
Apoio financeiro: UEMA, UFRGS
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Microssatélite no DNA mitocondrial de Tamanduábandeira (Myrmecophaga tridactyla)
Santos, LLL¹; Nascimento, DC¹; Fraga, E¹; Sampaio, I²; Schneider, H²; Barros, MC¹
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança PA
[email protected]/[email protected]
1
2
Palavras-chave: RNAr 16S, Microssatélite, Pilosa, Tamanduá; Xenarthra
Os tamanduás e as preguiças pertencem à ordem Pilosa e estão incluídos na superordem Xenarthra, à qual pertencem
também os tatus. Os integrantes desta superordem são restritos à região Neotropical e ocorrem predominantemente
na América do Sul. Os tamanduás taxonomicamente são considerados como uma única família, embora recentemente dados moleculares tenham sugerido duas, Cyclopidae e Myrmecophagidae, com a família Myrmecophagidae compreendendo dois gêneros e três espécies (Tamandua tetradactyla, tamandua mexicana e Myrmecophaga
tridactyla) e Cyclopidae com um gênero e uma única espécie (Cyclopes didactylus). A resolução taxonômica para os
tamanduás ainda apresenta problemas ao nível de família. Neste sentido objetivou-se caracterizar as espécies do
grupo, por meio de análises moleculares, a fim de inferir quanto aos seus status. Foram seqüenciados 503pb do gene
rRNA 16S do genoma mitocondrial para 17 espécimes coletados em diversos pontos do Brasil (nos estados de São
Paulo, Piauí e Pará). Foram incorporadas nosso banco de dados cinco seqüências do Genbank (AJ297939, AJ421450,
NC004032, Z48946 e AY057981). Para as análises foram utilizados os programas BioEdit, DAMBE e MEGA. Para as
22 seqüências analisadas foi observado que M. tridactyla apresenta uma região de microssatélites (AT) que varia em
tamanho de 7 a 11 AT repetidos. Este microssatélite está ausente em T. tetradactyla e C. didactylus. Foi observado
que esta região de repetição apresentou-se polimórfica, isto é, para cada estado coletado o número de repetições foi
diferente, onde os espécimes do Piauí apresentaram sete repetições AT, São Paulo oito repetições e Pará 11 AT. As
espécies T. tetradactyla e C. didactylus apresentam 15 deleções nos sítios correspondentes às repetições. Em função
do observado na presente análise, pelo menos duas indagações podem ser levantadas: (i) considerando-se C. didactylus como a linhagem mais basal dos tamanduás vivos e T. tetradactyla e M. tridactyla como as mais derivadas (as
filogenias são bem conclusivas quanto a isso), como explicar o surgimento deste microssatélite apenas em uma
das duas linhagens derivadas? (ii) as diferenças no número de repetições AT por área geográfica indica isolamento
de populações ou é fruto do acaso devido o pequeno N amostral estudado? Para o primeiro questionamento é
possível postular que este microssatélite é uma aquisição evolutivamente recente e exclusiva de M. tridactyla, e
portanto, filogeneticamente não informativo para o grupo como um todo por se tratar de uma autopomorfia. Para
responder à segunda questão serão necessárias análises adicionais com amostras representativas de outras regiões
do Brasil, pois, considerando-se que o Tamanduá-bandeira é uma espécie seriamente ameaçada de extinção,
uma análise de genética populacional poderá ser muito útil para a definição de áreas de proteção desta espécie.
Apoio financeiro: UFPA e UEMA
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Microssatélites disponíveis para estudos populacionais
da anta centro-americana (Tapirus bairdii): o estudo
de caso da população do Parque Nacional Corcovado,
Costa Rica
Carvalho, CS1; Garcia, PC1; Sanches, A1; Gamboa, JO2; Espeleta, GG2; Galetti, M1
Laboratório de Biologia da Conservação, Departamento de Ecologia, UNESP, CP199, CEP 13506-900, Rio Claro, SP, Brasil
Escuela de Biología, Universidad de Costa Rica, San Jose, Costa Rica
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tapirus bairdii, Tapirus terrestris, endogamia, genética de populações, microssatélites
Introdução: A anta centro-americana (Tapirus bairdii) já foi encontrada desde o noroeste do Equador até centro
sul de Vera Cruz no México. Por apresentar comportamento solitário e baixa taxa reprodutiva que combinados
com a pressão da caça e com a destruição de seus habitats, é considerada ameaçada de extinção. Atualmente
as populações de T. bairdii se encontram confinadas a parques e reservas nacionais, impedindo a migração dos
animais e o fluxo gênico. Uma população do Parque Nacional Corcovado (Costa Rica) vem sendo monitorada por
rádio-colar há mais de dez anos, onde foi estimada uma população de 155 a 249 antas, que por meio de uma investigação genética com a utilização de seis marcadores microssatélites, foi detectada um baixo nível de diversidade
genética. Entretanto, os autores ressaltaram a necessidade de aumentar o número de marcadores microssatélites
disponíveis para estudos populacionais desta espécie. Objetivos: No sentido de dar continuidade ao monitoramento da diversidade genética dessa população, novos marcadores microssatélites prospectados para T. terrestris
foram aplicados na análise genética de indivíduos de T. bairdii. Metodologia: Foram utilizadas 14 amostras de
sangue de indivíduos de T. bairdii da população natural do Parque Nacional Corcovado – Costa Rica. As extrações
de DNA foram efetuadas mediante um protocolo baseado na utilização de fenol-clorofórmio e precipitação com
etanol. Para a análise da variabilidade genética foram utilizados 10 locos de microssatélites heterólogos isolados
para T. terrestris, além de dois novos marcadores que não incluídos na publicação Tter6/(CA)11 e Tter10/(AC)9. As
PCRs foram efetuadas seguindo-se o método que utiliza um primer adicional para incorporar a fluorescência. Resultados: Todos os 12 locos heterólogos testados amplificaram fragmentos de tamanho esperado. Destes, somente
sete foram polimórficos para a população analisada. Conclusão: sete novos locos estão disponíveis para estudos
populacionais da anta centro-americana. Aqueles locos que não se apresentaram polimórficos para a anta centroamericana não devem ser desconsiderados já que esse monomorfismo pode não ser característica do marcador,
mas sim dessa população endocruzada por várias gerações e do pequeno número de amostras utilizadas. Portanto, neste trabalho os marcadores microssatélites heterólogos se mostraram úteis para aplicações em T. bairdii.
Apoio financeiro: Fapesp, Ministerio de Ciéncia e Tecnología de Costa Rica.
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Detecção in silico de polimorfismos de 16S (mtDNA)
com potencial para identificação molecular do muriqui
(Brachyteles arachnoides)
Cardoso, MLV1; Ferreira, PB1; Torres, RA2; Talebi, MG3; Teixeira, RHF4; Duarte, JMB5; Garcia, JE1
1. Núcleo de Biologia, Centro Acadêmico de Vitória – UFPE, Vitória de Santo Antão
2. Laboratório de Genômica Evolutiva e Ambiental – Depto de Zoologia, Centro de Ciências Biológicas – UFPE, Recife
3. Departamento de Ciências Biológicas – UNIFESP/Diadema
4. Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros – Sorocaba/SP
5. Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP – Jaboticabal
Palavras-chave: In Silico, 16S MTDNA, Muriqui, Brachyteles arachnoides, Caça predatoria
Considerado o maior primata neotropical endêmico na mata atlântica o muriqui (Brachyteles arachnoides) está
listado como uma das espécies mais ameaçadas de extinção do mundo devido a perda de habitat e a forte pressão
da caça. Apesar da caça ser proibida no Brasil conforme a Lei de Proteção a Fauna (Lei n° 5.197/1967) e a Lei de
Crimes Ambiental (9.605/ 1998), essa atividade ainda continua sendo amplamente praticada no País como prática
desportiva e com finalidades comerciais. Uma das principais dificuldades para redução desta prática é a inexistência de instrumentos cientificamente comprovados capazes de comprovar o ato ilegal. A caça ao muriqui tem um
caráter cultural muito forte uma vez que um prato típico da culinária regional do Vale do rio Ribeira de Iguape
(Sudeste do Brasil) é a “rabada de mono”. O objetivo desse trabalho foi identificar mutações de ponto em seqüências de DNA mitocondrial de muriqui capazes de diferenciar molecularmente amostras desta espécie daquelas dos
animais domésticos mais consumidos no Brasil e de outras espécies congêneres. Para tanto, foram recuperadas no
GenBank seqüências parciais da região mitocondrial 16S do muriqui e de espécies filogeneticamente relacionadas
da subfamília Atelinae (Ateles belzebuth, Ateles geoffroyi e Lagothrix lagotricha). Foram também obtidas as seqüências completas dos animais domésticos mais consumidos no Brasil (bovino, suíno, caprino e ovino). Tais seqüências foram analisadas pelos pacotes computacionais Sequencher 4.9 (Gene Codes) e BioEdit 6.0.7 para que fossem
eliminadas as seqüências redundantes e detectados os polimorfismos. Sítios de restrição discriminantes foram
identificados pelo programa CLEAVER. Foram então selecionadas as enzimas capazes de clivar no mesmo ponto
apenas as seqüências dos primatas aqui estudados, quando da comparação com as seqüências dos domésticos.
Após a eliminação das seqüências redundantes, o banco de dados foi reduzido a quatorze seqüências cujo tamanho médio foi de 523pb. Para a discriminação entre a espécie alvo (muriqui) e os animais domésticos foram
identificadas quatro enzimas de restrição: Asp718I, CjeI, EciI e TspGWI+), capazes de gerar fragmentos de restrição
de tamanho de 468+55pb, 349+174pb, 328+195pb e 355+168pb respectivamente, apenas nos membros da subfamília Atelinae. Assim, os SNPs identificados podem ser utilizados para o diagnóstico rápido baseado na digestão
de produtos de PCR (PCR/RFLP). Espera-se, a partir desses resultados a possibilidade de prover às autoridades
brasileiras um conjunto de marcadores moleculares diagnósticos úteis no combate à caça predatória do muriqui.
Apoio Financeiro: FACEPE (APQ-1059-2.01/08, IBPG - 1483 - 2.01/08) e CNPq
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Variabilidade Genética de Cerdocyon thous ao Norte de
Sua Distribuição no Território Brasileiro
Paz, FS1; Alves, JJ1; Sousa, HL1; Rego, PS1; Araripe, JG2; Tchaicka, L1
1 - Laboratório de Genética e Biologia Molecular – Labwik, Universidade Estadual do Maranhão, Departamento de Química e Biologia.
2 - Laboratório de Genética e Biologia Molecular – Campus de Bragança UFPA
[email protected]
Palavras-chave: Variabilidade genética, Cerdocyon thous, DNA mitocondrial, Populações, Distribuição
Cerdocyon thous é popularmente conhecido como cachorro do mato, raposa, lobinho, lobete ou graxaim-domato. É encontrado na Venezuela, Colômbia, Guianas, Uruguai, Paraguai, Argentina e em uma grande parte do
território brasileiro com exceção da planície Amazônica. Estudos realizados utilizando um fragmento da região
controladora do DNA mitocondrial de C. thous revelaram elevados índices de diversidade genética e uma forte
estruturação entre as regiões norte (estados do nordeste e norte) x sul de sua distribuição no território brasileiro.
Este trabalho teve por objetivo ampliar as análises de diversidade genética de Cerdocyon thous ao longo da distribuição norte da espécie no Brasil, a fim de obter dados a respeito da história evolutiva das populações nesta região. Para tal, foram analisadas 52 seqüências de um fragmento de 456pb da região controladora do DNA
mitocondrial, provenientes de: i) amostras de animais encontrados mortos por atropelamento em rodovias dos
estados do Maranhão e Pará, as quais foram submetidas a extração de DNA (precipitação de sal ou fenol/clorofórmio), amplificação por PCR e sequenciamento (Seqüenciador Automático ABI 377); ii) sequências obtidas do Genbank (números de acesso: EF106991, 93, 98- 01, 03-04, 11-15, 17, 25-26, 28, 68-72, 74- 94), iii) dados
de Tchaicka et al, 2007. A análise revelou 66 sítios variáveis, definindo 39 diferentes haplótipos. Altos níveis de
diversidade haplotípica (HD = 0,98) e diversidade nucleotídica (π = 0,030) foram observados para a amostragem
total de indivíduos. Apesar da significante diferenciação haplotípica observada, indicando uma longa história evolutiva, não foi encontrado nenhum indício de estruturação populacional dentro da região geográfica estudada.
Apoio financeiro: FAPEMA e UEMA
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A identificação sexual da anta (Tapirus terrestris)
por meio de marcadores heterólogos do gene da
Amelogenina
Garcia, CP1; Carvalho, CS1; Sanches, A1; Galetti, M1
Laboratório de Biologia da Conservação, Departamento de Ecologia, UNESP, CP199, CEP 13506-900, Rio Claro, SP, Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: Tapirus terrestris, marcadores sexuais, amelogenina, KY1/KY2, identificação sexual
Introdução: Tapirus terrestris é um dos maiores membros sobreviventes da megafauna Neotropical. Apresentam
baixa taxa reprodutiva, resultante de um longo período de gestação (13 meses) e do nascimento de apenas um
indivíduo, que quando somado com a perda de habitat e pressões da caça são consideradas espécies ameaçadas
de extinção. A utilização de marcadores para identificação sexual tem sua importância em estudos de análises de populações viáveis (PVA) que por sua vez podem ser utilizados em estudos de demografia que analisem
dispersão diferencial entre machos e fêmeas, marcação de territórios por latrina, planos de manejo, entre outros. Além disso, esses marcadores poderão colaborar em estudos que utilizem análises genéticas não-invasivas.
Objetivo: Este trabalho tem por objetivo testar e padronizar marcadores moleculares para a identificação sexual
das antas através de marcadores já descritos. Metodologia: Foram utilizados dois pares de primers prospectados para uma espécie de cervídeo da Ásia e uma espécie de bovino. Estes marcadores amplificam porções do
gene da amelogenina que estão presentes nos cromossomos X e Y com diferentes tamanhos, dada uma deleção
no cromossomo Y, sendo possível a identificação do sexo em gel de agarose. Para a padronização da reação
foram utilizadas amostras de sangue de indivíduos de T. terrestris de sexo previamente conhecidos. Resultados
e discussão: Um dos pares de primers testados (KY1 e KY2) já tiveram suas reações otimizadas. No entanto, o
sucesso da utilização desse marcador foi maior na fêmea. Sendo assim, o fragmento amplificado foi purificado
e será seqüenciado no sentido de desenhar primers específicos para a identificação sexual da anta. Esses marcadores já estão sendo desenvolvidos pelo Laboratório de Ecologia Microbiana e Molecular (UNESP Rio ClaroSP). Conclusão: Um dos marcadores testados para a identificação sexual da anta foi padronizado, mas o sucesso
foi maior na identificação de fêmeas. Portanto, a construção de primers específicos para a espécie foi iniciada.
Apoio financeiro: FAPESP.
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51
Análise molecular da filogeografia do cateto
(Pecari tajacu, Tayassuidae)
Rosa, RM1; Figueiredo, FZM1; Siqueira, N1; Oliveira, LF2; Barquero, G3; Freygang, CC1; Mattevi, MS1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Toxicologia Aplicada, Universidade Luterana do Brasil, Campus Canoas
Museu Nacional, Universidade Federal do Rio de Janeiro. 3Tropical Sustainability Institute, São Paulo.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cateto, Pecari Tajacu, Tayassuidae, Filogeografia, Citocromo B
Introdução: Os suínos pertencem à ordem Artiodactyla e à subordem Suiformes e estão reunidos em apenas duas
famílias, a Suidae e a Tayassuidae Os taiassuídeos ou pecaris são mamíferos onívoros e de hábitos gregários que
estão restritos às Américas. A família Tayassuidae inclui quatro espécies: Pecari tajacu (“Cateto”), Tayassu pecari
(“Queixada”), Catagonus wagneri (“Taguá”) e Pecari maximus (“Caititu-mundé), recentemente descrito. Esta última
espécie ainda é considerada de validade incerta. O cateto é a espécie de menor tamanho, ocorreu em grupos, em
geral constituídos de poucos membros. Distribui-se em uma ampla e contígua faixa geográfica nos três continentes
americanos, desde o sul dos Estados Unidos até o centro-norte da Argentina. A Colômbia, por apresentar a porção
norte da Cordilheira do Andes, é considerada como uma área na qual ocorre fluxo gênico entre populações das
Américas do Norte e Central e América do Sul. Objetivos: O objetivo deste trabalho é analisar a estrutura genética
e a biogeografia das populações de Pecari tajacu, através do marcador mitocondrial, cyt b, e dos marcadores
nucleares, PRE-1P27 e PRE-1P642 (um SINEs). Métodos: A amostra consiste de 51 indivíduos de diversas regiões
do Brasil e de seqüências obtidas no GenBank de espécimes dos EUA, México, Colômbia, Bolívia e Argentina. A
amplificação e o seqüenciamento (Lab. de Seqüenciamento da ULBRA) foram efetuados com os primers MVZ5
e MVZ16 no caso do cyt b e no gene PRE-1 com os primers 27F,27R,642F e 642R. As analises filogenéticas e
demográficas foram feitas usando os programas MEGA 4 (NJ), PAUP versão 4.0b10 (MP, ML) e MrBayes versão 3.0b4
(IB), AMOVA, teste de Mantel, distribuição mismatch, e network. Resultados: as análises efetuadas mostraram que
as populações de catetos organizam-se em dois clados: Clado América do Sul, que, por sua vez, subdividiu-se e
em dois ramos, um deles reunindo parte dos exemplares da Colômbia (Clado A) mais as populações da Bolívia
e, o outro, agrupando os espécimes da Argentina e os de Guarapuava, PR. O outro ramo do Clado América do
Sul reuniu todos os exemplares das demais localidades do Brasil amostradas. O outro clado, denominado de
Clado América do Norte, apresentou, na base, outro grupo de animais da Colômbia (Clado B) seguido de um
agrupamento com espécimes do México e USA. Conclusões: o arranjo dos catetos da Colômbia em dois ramos
distintos, um associado às populações da América do Sul e o outro na base do Clado América do Norte, apóia
fortemente a hipótese de ser esta região uma zona de contato e o centro de dispersão desta espécie no continente.
Apoio financeiro: ULBRA, CNPq, FAPERGS e OEA
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Identificação baseada em PCR-RFLP do gene
Citocromo b: desenvolvimento de uma ferramenta
molecular para a conservação da paca (Agouti paca)
Silva-Neto, AA1; Ferreira, PB1; Cardoso, MLV1; Lima, ILMNF1; Teixeira, RHF2; Duarte, JMB3; Barbosa, AC4;
Vargas, RC4; Torres, RA5; Garcia, JE1
Núcleo de Biologia, Centro Acadêmico de Vitória – UFPE, Vitória de Santo Antão
Parque Zoológico Municipal Quinzinho de Barros – Sorocaba / SP
3
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP – Jaboticabal
4
Instituto Federal Minas Gerais – Bambui / MG
5
Laboratório de Genômica Evolutiva e Ambiental – Depto de Zoologia, Centro de Ciências Biológicas – UFPE, Recife.
1
2
Palavras-chave: PCR/RFLP, Agouti paca, Identificação molecular, citocromo B, forense
Pertencente à família Agoutidae, a paca é o segundo maior roedor da fauna brasileira. A qualidade da carne e
a forte tradição de caça são fatores que vêm contribuindo para o declínio de suas populações ao longo da sua
distribuição. Apesar da caça ser proibida no Brasil (Lei n° 5.197/1967), a mesma tem conotação desportiva, e até
mesmo com finalidades comerciais ainda continua sendo amplamente praticada em diversas regiões do país.
Um dos principais fatores para a manutenção da impunidade dos caçadores é a ausência de recursos eficientes
e cientificamente comprovados que possam ser utilizados como instrumentos forenses visando o melhor
cumprimento da legislação. O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método simples, rápido e eficiente
para identificar material biológico de paca, diferenciando-o de material de espécies domésticas utilizadas para o
consumo humano no Brasil. Para tanto, a primeira etapa do trabalho consistiu no reconhecimento de polimorfismos
no gene mitocondrial citocromo b através de sequências recuperadas do banco público de sequências GenBank.
Foram analisadas 8 sequências parciais de Paca (Agouti paca) e 5 sequências completas do gene citocromo b dos
animais domésticos mais consumidos no Brasil (bovino, suíno, caprino e ovino). As sequências foram alinhadas
e analisadas pelos pacotes computacionais Sequencher 4.9 (Gene Codes) e BioEdit 6.0.7, tanto para a eliminação
das sequências redundantes, como para a detecção dos polimorfismos úteis para a identificação da espécie. Sítios
de restrição discriminantes foram identificados pelo programa CLEAVER, pelo qual foi selecionada a enzima
de restrição BsiEI/CGRYCG capaz de definir padrões de restrição diferentes nas diferentes espécies analisadas.
Foram desenhados primers para a reação de PCR com auxílio do programa Gene Runner 3.0.5 (Hastings Software
Inc.), capazes de amplificar um fragmento do gene citocromo b em todas as espécies analisadas. O DNA de
22 amostras de paca (Agouti paca) e 10 amostras dos animais domésticos foram isolados com auxílio do kit
de extração de DNA QIampTissue Kit (Qiagem Inc.), quantificados em gel de agarose, corados com GelRed™ e
visualizados sob luz ultravioleta. A reação de PCR gerou fragmentos de aproximadamente 395pb para todas as
espécies, que foram submetidos à digestão com a enzima BsiEI. O resultado da reação de restrição foi analisado
sob eletroforese em gel de agarose 2% e confirmou a presença do sítio de restrição apenas nas amostras de
paca, gerando fragmentos de 297 + 98pb. A identificação das amostras de paca foi possível em 100% do material
analisado demonstrando que a metodologia aqui proposta é confiável, rápida, de fácil execução, podendo ser
utilizada não somente em análises forenses, mas também em estudos eco-sistemáticos dessa espécie na natureza.
Apoio Financeiro: FACEPE (APQ-1059-2.01/08, IBPG - 1483 - 2.01/08 e BIC-0254-2.01/09) e CNPq
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Adaptação e aprimoramento de painel de
microssatélites (STR) de identificação genética de cães
Malta, FSV; Nascimento, AFMM; Maia, AM; Fóscolo, CB e Caxito, FA
Hermes Pardini
[email protected]
Palavras-chave: str canino, paternidade, identificação, multiplex, isag
Introdução: A identificação genética de cães pode ser feita para a confirmação de um pedigree, identificar machos
diferentes em uma mesma gestação e até em suspeita de roubo de cães ou confirmação do animal em casos de
suspeita de cão agressor. A sociedade internacional de genética animal (ISAG), é uma sociedade aberta, voltada
para pesquisadores e interessados, que disponibiliza um painel contendo 22 marcadores de microssatélites (STR)
canino, dividido em quatro reções de PCR multiplex, desenvolvida para uma plataforma de leitura capaz de
interpretar 5 canais diferentes de fluorescência. No entanto, algumas plataformas disponíveis no mercado são
capazes de interpretar apenas quatro canais de fluorescência, inviabilizando a utilização deste painel ou tornando
sua utilização ainda mais trabalhosa. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi adaptar o painel da ISAG para uma
plataforma de leitura de quatro canais de fluorescência de forma a estender sua utilização entre os diferentes perfis
de usuários. Material e métodos: Foi elaborado duas reações multiplexes compostas de conjuntos de iniciadores
marcados com três fluorescências ( a última fluorescência é destinada para o normalizador de corrida). As reações
foram amplificadas por PCR, separadas por eletroforese de capilar e interpretadas pelo software “Fragment Profiler™”
do sequenciador automático MegaBACE® (quatro canais de fluorescência). Resultados: Foram padronizadas duas
reações de PCR multiplex contendo 21 dos 22 microssatélites recomendados pela ISAG, além disso foi colocado um
marcador redundante em uma das reações para servir de contra-prova. Todas as duas reações multiplex contém
iniciadores marcados apenas com três fluorescências, 6-Carboxyfluorescein (FAM), 5’-Hexachloro-Fluorescein
(HEX) e Tetramethylrhodamine (TAMRA) e não houve sobreposição dos marcadores em nenhum canal. Conclusão:
Concluímos que foi possível realizar com êxito a adaptação do painel para uma plataforma capaz de interpretar
apenas quatro canais de fluorescência, além disso tivemos uma redução no número de reações de PCR necessárias
para realizar o painel contendo os 22 marcadores STR.
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A procura pela família PAX em genomas de vertebrados
Paixão-Côrtes, VR1; Salzano, FM1; Bortolini, MC1
.PPGBM, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
[email protected]
1
Palavras-chave: PAX, domínio paired, genoma, vertebrados.
Os genes PAX constituem uma família de genes que provavelmente originaram-se antes da radiação Cambriana há
542 milhões de anos atrás. Todos os PAX possuem o chamado domínio paired que confere à proteína codificada,
um fator de transcrição, ou seja, uma capacidade de se ligar ao DNA. Desse modo estes genes têm importância
fundamental no desenvolvimento de órgãos e tecidos. Em mamíferos foram encontrados nove genes PAX (PAX
1... 9), com ortólogos já identificados em peixes, anfíbios, repteis e aves. Com o advento dos projetos de genoma
completo de diversos animais, surge a possibilidade de confirmar a presença desta família nas diferentes ordens
dos vertebrados. Nessa investigação uma análise foi feita através de busca por seqüências contendo o domínio
paired no banco de genoma do Ensembl (http://www.ensembl.org) utilizando o sistema de gerenciamento de
dados BIOMART, e as ferramentas de busca textual e de seqüências (BLAT - http://www.ensembl.org/ Multi/
blastview). Foi possível localizar nos genomas de cinco peixes (Danio rerio, Gasterosteus aculeatus, Oryzias latipes,
Takifugu rubripes, Tetraodon nigroviridis) todos os noves genes. Já o único anfíbio com genoma completo conhecido
(Xenopus tropicalis) somente oito membros da família foram identificados ( falta o gene - PAX4). No lagarto (Anolis
carolinensis –e no genoma das três aves disponíveis (Gallus gallus- e Meleagris gallopavo (Pre!Esemble) - Taeniopygia
guttata -) seis membros da família PAX foram localizados, estando faltantes, respectivamente PAX4/7/8; PAX1/4/8;
PAX4/5/8; PAX4/7/8. Salienta-se que os genes PAX4 é o que mais freqüentemente está ausente. A ausência de alguns
genes da família em alguns ramos filogenéticos pode ser explicada por várias razões, entre estas pela sobreposição
da expressão e redundância funcional de genes parálogos dentro família PAX, no embrião, que parece ser um
mecanismo geral que atua de maneira compensatória. Desta forma, a presença de um gene contrabalançaria
a ausência de outro. Análises posteriores poderão esclarecer a intricada relação evolutiva desta família gênica.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPERGS.
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Análise da influência do parentesco no padrão de
fissão-fusão de um bando de queixadas (Tayassu
pecari) do Pantanal matogrossense (MS)
Rufo, DA1; Biondo, C2; Keuroghlian, A3; Miyaki, CY1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Departamento de Ecologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Rio Claro, SP, Brasil
3
Wildlife Conservation Society - Brazil, Rio de Janeiro, RJ, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mamíferos, Estrutura social, Fissão-fusão, Parentesco, Tayassu pecari.
Introdução: Queixadas (Tayassu pecari) são ungulados sociais que vivem em bandos que facilmente ultrapassam
100 indivíduos e que apresentam fissão-fusão periódica, ou seja, o grupo se divide periodicamente em grupos
menores, que depois se fundem novamente. Porém, pouco se sabe sobre os fatores que influenciam a formação
dos subgrupos em queixadas. Objetivo: Avaliar se há correlação entre o parentesco de indivíduos e a estrutura
social de um bando de queixadas (Tayassu pecari). Mais especificamente, testar a hipótese de que os subgrupos
gerados após uma fissão são compostos de indivíduos mais proximamente aparentados do que o esperado ao
acaso. Métodos: As amostras de DNA foram extraídas de sangue de 45 indivíduos pertencentes a 13 subgrupos
de um bando de queixadas da região da Fazenda Rio Negro, Pantanal, MS. Foram utilizados 11 locos polimórficos
de microssatélites, sendo quatro desenvolvidos especificamente para queixadas, seis descritos para porco
doméstico (Sus scrofa) e um descrito para cateto (Pecari tajacu). Todos os 11 locos foram amplificados por PCR
e genotipados no sequenciador automático ABI 3730 (Applied Biosystems). A partir dos genótipos obtidos,
calculou-se o coeficiente de parentesco para cada par de indivíduos. As medianas do coeficiente entre pares de
indivíduos pertencentes ao mesmo subgrupo e entre pares de indivíduos pertencentes a subgrupos diferentes
foram comparadas usando o teste estatístico de Mann-Whitney. Resultados: Nenhum erro de genotipagem
foi evidenciado. O número de alelos encontrado variou de 2 a 10 com média de 4,27 alelos por loco. As
heterozigosidades médias observada e esperada foram iguais a 0,508 e 0,531, respectivamente. Os locos estão
em equilíbrio de ligação e de Hardy-Weinberg. A mediana dos coeficientes de parentesco entre indivíduos do
mesmo subgrupo (0,20) foi significativamente maior do que entre indivíduos de subgrupos diferentes (0,00;
Z = -7,045; P <0,05). Conclusão: Os resultados obtidos sugerem que o parentesco influenciou na formação dos
subgrupos do bando de queixadas analisado. Entretanto, outros bandos, com maior número de indivíduos,
precisam ser estudados para que o papel do parentesco na estrutura social dessa espécie seja melhor avaliado.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP e CNPq.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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56
Gene da lipoproteína lipase (LPL) e ausência da mutação
Gly412Arg em duas espécies de felinos neotropicais
Moreno-Cotulio, VR1; Garcia, JE2; Souza, EB3
Instituto de Ciências da Natureza, Universidade Federal de Alfenas – UNIFAL-MG
Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco/UFPE
3
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Assis/SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Leopardus tigrinus, Herpailurus yagouaroundi, lipoproteína lipase (LPL), mutação, genética molecular
A lipoproteína lipase LPL é uma das enzimas cruciais na regulação do metabolismo de lipídios e lipoproteínas.
Está presente principalmente nos tecidos adiposo e muscular, mas também pode ser encontrada, por exemplo,
nos pulmões e glândulas mamárias. O gene da LPL foi descrito em várias espécies incluindo os seres humanos
e os gatos. Entre essas duas espécies, há uma grande similaridade na seqüência de nucleotídeos desse gene.
Além disso, tanto numa espécie quanto na outra, há mutações importantes envolvendo o gene LPL. Em gatos,
a mutação Gly412Arg é uma das mais importantes, podendo desencadear uma deficiência da atividade da LPL
nos indivíduos homozigotos, com conseqüências diversas para os animais. O objetivo desse trabalho foi verificar
a ocorrência dessa mutação em duas espécies de felinos neotropicais mantidos em cativeiro: Leopardus tigrinus
e Herpailurus yagouaroundi. A região de interesse foi amplificada via PCR e os produtos submetidos à digestão
com enzima de restrição BstNI e visualizados em gel de agarose. Para todos os indivíduos os produtos de PCR
foram do mesmo tamanho, em torno de 150pb. A digestão aconteceu em todos os fragmentos, identificando,
assim, todos os indivíduos analisados como homozigotos normais para a mutação Gly412Arg. Dessa forma,
o presente trabalho contribuiu na identificação do gene LPL nessas duas espécies de felinos silvestres
estudados e na determinação de um método simples que poderá ser utilizado em planos de manejo desses
animais em cativeiro, no sentido de determinar a presença ou ausência da mutação estudada nos animais.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CAPES
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Caracterização cariotípica do quati Nasua nasua Linnaeus,
1766 (Procyonidae, Carnivora) de Minas Gerais
Godinho, RM1; Hemetrio, NS2; Rodrigues, FHG2; Svartman, M1
Laboratório de Citogenética Evolutiva
Laboratório de Ecologia de Mamíferos, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais.
rodrigomezencio@ hotmail.com, [email protected]
1
2
Palavras-chave: citogenética, padrões de bandeamento, quatis, carnívoros, Procyonidae
O quati, um carnívoro da família Procyonidae, possui anéis na longa cauda não preênsil, que é geralmente
mantida verticalmente ereta, tem o rostro alongado, focinho flexível, garras longas e patas plantígradas com
solas de pele glabra. É silvícola, de hábitos diurnos e onívoro, alimentando-se de frutas, raízes, invertebrados e
pequenos vertebrados. O gênero Nasua possui duas espécies: Nasua narica, que tem pelagem branca no focinho,
e N. nasua, no qual a mesma pelagem é cinza ou marrom. Nasua narica é encontrado no sul dos EUA, no México
e América Central, enquanto Nasua nasua habita da Colômbia e Venezuela até o Uruguai e norte da Argentina. A
taxonomia do gênero Nasua é complicada, principalmente devido a classificações baseadas na cor da pelagem e
em características cranianas variáveis, o que acaba gerando uma multiplicação equivocada do número de táxons
reconhecidos. Neste trabalho, estudamos os cariótipos de dezenove indivíduos: dois machos e uma fêmea de Nasua
nasua provenientes do município de Betim-MG e dezesseis exemplares (quatro machos e doze fêmeas) coletados
no Parque das Mangabeiras, na cidade de Belo Horizonte-MG. As preparações cromossômicas foram obtidas a
partir de culturas de linfócitos e analisadas após coloração convencional, marcação das regiões organizadoras
de nucléolos e bandeamentos G e C. Todos os animais apresentaram um cariótipo com 38 cromossomos e 66
braços autossômicos (2n=38, NF=66). Ambos os cromossomos sexuais eram submetacêntricos, sendo o X
médio e o pequeno Y, o menor cromossomo do complemento. O único par de Ag-RONs estava localizado numa
constrição secundária do par 15, que apresentou variações de tamanho. Após o bandeamento C, observamos,
além de marcações nas regiões pericentroméricas, blocos intersticiais de heterocromatina constitutiva em vários
autossomos, que apresentaram polimorfismos em tamanho. Comparações do cariótipo dos quatis com os de
outros membros da família Procyonidae após coloração convencional, marcação das regiões organizadoras de
nucléolo (Ag-RONs) e padrões de bandeamento G e C mostraram um alto grau de semelhança, que se estende
ao suposto cariótipo ancestral da ordem Carnivora, que tem o mesmo número diplóide de 38 cromossomos.
Apoio Financeiro: FAPEMIG
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58
Caracterização Citogenética de pequenos mamíferos do
núcleo Santa Virgínia, Parque Estadual da Serra do Mar,
São Paulo – Brasil
Di Nizo, CB1; Neves, CL2; Santiago, AC1; Silva, MJJ1
Laboratório de Ecologia e Evolução – Instituto Butantan
Laboratório de Biologia da Conservação, Departamento de Ecologia – UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Citogenética, Bandamento cromossômico, Pequenos mamíferos, Parque Estadual da Serra do Mar, Espécies crípticas
A Floresta Atlântica abriga cerca de 260 espécies de mamíferos, dentre as quais, espécies endêmicas e ameaçadas,
em decorrência principalmente da ação antrópica. Como consequência, restam atualmente aproximadamente
11% da vegetação original e somente 1,6% legalmente protegidos. A maior região contínua de Mata Atlântica está
localizada na Serra do Mar, na qual está inserido o Parque Estadual da Serra do Mar (PESM). O núcleo Santa
Virgínia (23°17’a 23°24’S e 45°03’ a 40°11’W) ocupa a parte norte do Estado de São Paulo, abrangendo os municípios
de Cunha, Natividade da Serra, São Luis do Paraitinga e Ubatuba, área com alta diversidade de espécies endêmicas
e, portanto, demanda urgentemente a catalogação da fauna local. Para caracterização da mastofauna, informações
citogenéticas são importantes, especialmente para roedores, que apresentam vários casos de espécies crípticas.
Análises citogenéticas em marsupiais e roedores coletados no núcleo Santa Virgínia foram realizadas com o
objetivo de auxiliar na identificação dos táxons e conhecer a diversidade cariotípica da fauna local. As coletas
foram realizadas entre setembro de 2008 e setembro de 2009, com armadilhas de queda ou captura-viva (Sherman e
Tomahawk). Os estudos citogenéticos foram desenvolvidos a partir de células da medula óssea e baço, por meio de
coloração convencional, bandamento C e G e montagem de cariótipos. Foram registradas 21 espécies de pequenos
mamíferos, pertencentes às ordens Didelphimorphia e Rodentia. Dentre os marsupiais, os cariótipos obtidos foram
relacionados às espécies Marmosops incanus (2n=14), Micoureus paraguayanus (2n=14), Monodelphis scalops (2n=18)
e Philander frenata (2n=22). Entre os roedores, os cariótipos obtidos foram correlacionados às espécies Akodon
montensis (2n=24-25), Blarinomys breviceps (2n=31), Brucepattersonius soricinus (2n=52), Thaptomys nigrita (2n=52),
Euryoryzomys russatus (2n=80), Oecomys catherinae (2n=62), Oligoryzomys nigripes (2n=62), Nectomys squamipes
(2n=58), Sooretamys angouya (2n=58), Calomys tener (2n=66), Rhipidomys sp. (2n=44), Juliomys pictipes (2n=36) da
Família Cricetidae, e Trinomys iheringi (2n=61-64) da Família Echimyidae. A. montensis, T. nigrita, O. nigripes, N.
squamipes, S. angouya, C. tener, J. pictipes e Trinomys iheringi são portadores de cariótipos espécie-específicos. Foram
detectados rearranjos Robertsonianos, inversões pericêntricas, adição/deleção de heterocromatina constitutiva e
presença de supernumerários. Os estudos citogenéticos aqui obtidos reiteram sua importância na caracterização de
alguns táxons. O número de espécies coletados durante o período de um ano para o núcleo Santa Virgínia do PESM
pode ser considerado de grande representatividade, atingindo 87,5% das espécies estimadas registradas. Além
disso, Akodon montensis e Brucepattersonius soricinus representam novos registros para a área. Dada a expressiva
riqueza de táxons, é evidente a significância do núcleo na manutenção das espécies de pequenos mamíferos.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
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Efeito do gene halotano sobre a deposição de gordura
intramuscular em suínos
Alves, LR1; Andrade, RB2; Antunes, RC1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Uberlândia, UFU
Graduação em Medicina Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Uberlândia, UFU.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: HAL, Heterozigose, GIM, Qualidade de Carne, Suínos.
Introdução: O teor de gordura intramuscular (GIM) tem sido identificado como um importante fator na
determinação da qualidade da carne suína. Há constatações de que a deposição de GIM pode estar relacionada
com a presença do gene halotano (HAL). Objetivos: Avaliar o efeito do gene HAL sobre a deposição de GIM em
suínos híbridos de duas linhagens comerciais, abatidos em matadouro-frigorífico sob inspeção oficial. Métodos:
O genótipo do gene halotano foi caracterizado por meio de PCR-RFLP utilizando os seguintes primers específicos:
F-5’- GTGCTGGATGTCCTGTGTTCCCT-3’ e R-5’-CTGGTGACATAGTTGATGA GGTTTG-3’. O procedimento foi
realizado em um volume final de 30 µL com tampão enzima 10X (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl), contendo
aproximadamente 100 ng de DNA genômico da amostra, 1,0 mM de MgCl2, 6,0 pMol de cada primer, 50 µM de cada
DNTP, 1,25 UI de enzima Taq DNA Polimerase (Fermentas®). A reação ocorreu no termociclador sob as seguintes
condições: 94ºC de temperatura de desnaturação por 30 segundos, 58ºC por 30 segundos para anelamento dos
primers e 72ºC por 45 segundos para a extensão do DNA, sendo realizada em 35 ciclos. O produto de PCR foi
digerido com a enzima Hha I e posteriormente submetido à eletroforese (90 V) em gel de agarose à 2,8% contendo
brometo de etídio. As bandas foram visualizadas sob luz ultravioleta. A digestão dos produtos de amplificação
com a enzima HhaI permitiu observar dois fragmentos (de 48 e 85 pares de bases) para animais homozigotos
normais e três fragmentos (de 48, 85 e 133 pares de bases) para heterozigotos. A análise da gordura intramuscular
foi mensurada a partir de amostras coletadas do músculo longissimus dorsi utilizado como base o Manual de
Procedimentos Analíticos do Compêndio Brasileiro de Alimentação Animal. Resultados: Dos animais analisados,
42,36% foram caracterizados como HalNN e 57,64% como HalNn. A média geral encontrada para GIM foi de 2,14%.
Para os animais homozigotos dominantes para o genótipo halotano, a média encontrada foi de 2,09%, enquanto
que para os animais heterozigotos foi de 2,17%. A variação da GIM entre os genótipos foi avaliada por análise de
variância, usando o software SISVAR. Não houve diferença significativa (P<0,05) para a característica GIM entre a
carne de suínos HalNN e a dos HalNn. Conclusões: A carne dos suínos estudados apresentou baixo conteúdo de
gordura intramuscular e a deposição desta não foi influenciada pela presença do alelo n do gene halotano, quando
em heterozigose. Resultados estes que podem ser importantes num programa de melhoramento genético suíno.
Apoio financeiro: FAPEMIG/CNPq
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60
Análise de alterações no gene p53 em tumores caninos
Thomazi, G; Delamare, APL; Echeverrigaray, S
Instituto de Biotecnologia, Universidade de Caxias do Sul, RS
Palavras-chave: Tumor, P53, Canis, Oncogenes, Dog
O câncer é uma das principais doenças em cachorros, sendo responsável por aproximadamente 50% das mortes
em animais com mais de 10 anos. Os principais tumores em cachorros são linfosarcomas e mastocitomas.
Predisposição racial e outros dados indicam importante contribuição genética na ocorrência destas doenças. Um
dos oncogenes mais relevantes em distintas espécies animais, inclusive o homem, é o p53, gene responsável pela
produção de proteína chave no processo apoptótico e ciclo celular. No presente trabalho foram analisadas 50
amostras de tecidos normais e tumorais de cachorros de distintas raças e sexos. Estes foram avaliados por análise
histopatológica quanto ao tipo e grau de malignidade. Um fragmento de aproximadamente 890pb correspondente
aos exons 5, 6 e 7 e os introns 5 e 6 foi amplificado utilizando um par de primers específicos. Os amplificados
foram seqüenciados em seqüenciador ABIPrism 3130XL. As sequências obtidas foram comparadas com aquelas
disponíveis no GenBank após alinhamento pelo programa ClustalW. Os resultados das análise histopatológicas
mostraram uma prevalência de carcinomas túbulo-papilares complexos de grau II nos tumores de mama, seguido
por carcinomas de células escamosas de grau II em tumores de pele. Todas as amostras (tecidos tumorais e normais)
exibiram amplificados com peso molecular de aproximadamente 890pb, indicando a ausência de deleções ou
inserções importantes no gene p53. O seqüenciamento do gene p53 das amostras de tecido tumoral mostrou:
49 amostras sem alterações e apenas uma amostra com mutação. A única alteração ocorreu num osteosarcoma,
sendo a mesma uma transição GàA no códon 270 (exon 7) que leva a uma troca ArgàHis. Alterações neste
códon tem sido relatadas em humanos, e provavelmente altera a capacidade de ligação P53/DNA. A prevalência
de alterações no gene p53 observada é menor do que a relatada na literatura.
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Efeitos da fragmentação florestal sobre a genética
da paisagem de um pequeno mamífero, Hylaeamys
megacephalus (Fischer, 1814), 20 anos após a
construção da Usina Hidrelétrica de Balbina
Nunes, MS1,2; Borges, MLO3; da Silva MNF3; Farias, IP2
Programa de Pós-Graduação em Diversidade Biológica Genética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas,
Manaus/Brasil
2
Laboratório de Evolução e Genética Animal, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas, Manaus/Brasil
3
Programa de Coleções e Acervos Científicos, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus/Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Hylaeamys megacephalus, Usina Hidrelétrica de Balbina, Citocromo b, Fragmentação ambiental, Genética de paisagem
Introdução: A Reserva Biológica do Uatumã abrange uma área de aproximadamente 940.000 ha e está localizada na
margem esquerda do reservatório da Usina Hidrelétrica de Balbina. Vinte anos após a construção do reservatório,
grande parte da biota que sobreviveu ao alagamento ficou confinada em ilhas de diversos tamanhos e graus de
isolamento. Com o aumento progressivo das taxas de desmatamento sobre as florestas tropicais nas últimas
décadas, faz-se necessário entender como as comunidades biológicas têm suas características genéticas e ecológicas
afetadas pelas novas configurações espaciais de uma paisagem causadas pela fragmentação florestal. Objetivo:
Sendo assim, a proposta deste trabalho foi avaliar como Hylaeamys megacephalus (Fischer, 1814) foi afetada pelas
mudanças abruptas na paisagem oriundas do alagamento do reservatório, através das análises genéticas de suas
populações correlacionadas com o tamanho e grau de isolamento dos fragmentos florestais (ilhas remanescentes).
Métodos: Os espécimes foram amostrados entre julho e dezembro de 2006, em 12 sítios de coleta (8 em ilhas e 4
em terra firme), com um esforço total de 9600 armadilhas-noite. O DNA foi extraído através do protocolo de CTAB
2%; e fragmentos parciais do gene mitocondrial do citocromo b foram obtidos utilizando-se primers específicos. A
edição e alinhamento das seqüências foi realizado no programa BioEdit v.7.0.5.3. As análises de distância genética
foram realizadas no programa MEGA 4.1. Resultados: Considerando-se as seqüências parciais do fragmento de
500 pares de bases do gene mitocondrial citocromo b, 12 sítios foram variáveis e 11 informativos para parcimônia.
Aplicando-se o modelo de evolução Kimura-2-parâmetros as distâncias genéticas observadas nos grupos de
indivíduos entre os fragmentos florestais variaram de 0,0 a 1,7%. Altos valores de distância genética foram obtidos
nos pares de fragmentos mais distantes geograficamente, e valores mais baixos foram observados entre pares
de fragmentos florestais geograficamente mais próximos. O coeficiente de correlação entre os fragmentos e as
localidades da terra firme ficou em torno de 0,3, mais devido ao tamanho amostral não foi possível confirmar
se existem diferenças significativas nas correlações. Conclusão: Existe uma correlação entre distância genética
e distância geográfica, entre as ilhas/fragmentos, da mesma maneira que entre as localidades da terra firme.
Entretanto, ainda não está claro se existem diferenças significativas nas correlações observadas para os fragmentos
e localidades da terra firme. Diferenças significativas indicariam efeitos sob a genética de H. megacephalus como
um resultado da fragmentação ocorrida nos últimos 20 anos.
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Relação de parentesco e filopatria em bandos de
Alouatta caraya (Primates: Atelidae) na bacia do alto
Tocantins
Souza-Neto, AC1; Ribeiro, RS2; Silva-Jr, NJ2; Collevatti, RG1; Telles, MPC1
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, CP 131, Goiânia, GO. Brasil.
74001-970. [email protected]
2
Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda. Goiânia, GO.
1
Palavras-chave: Autocorrelação espacial, cerrado, estrutura intrapopulacional, filopatria, microsatélites.
O gênero Alouatta (Primates, Atelidae) é considerado o mais basal de sua família, tendo divergido dos demais
membros a cerca de 15 milhões de anos. A espécie Alouatta caraya é encontrada no Brasil, Paraguai, Bolívia e
Argentina e possui hábito florestal. No Brasil, ocorre principalmente no Cerrado e no Pantanal. A espécie forma grupos
sociais com grande variação de tamanho, podendo ser composto por 2 a 23 indivíduos. Os grupos são formados
geralmente por um macho adulto dominante, fêmeas adultas e jovens. Machos adultos não-dominantes podem ser
tolerados, porém apresentam pouca ou nenhuma participação reprodutiva. O objetivo deste trabalho foi estudar
a diversidade genética e estrutura de parentesco em bando de A. caraya da região da bacia do alto Tocantins. Para
tanto, foram coletados, no município de São Salvador (TO), 47 indivíduos de A. Caraya distribuídos em oito bandos,
compostos por três a oito indivíduos. Todos os indivíduos foram sexados em campo e foram coletadas amostras de
sangue para obtenção dos genótipos em nove locos microssatélites. A bateria de locos apresentou alta probabilidade
de exclusão de paternidade (QC = 0,9901) e baixa probabilidade de identidade (IC = 0,0000155) sendo, portanto,
apropriada para estudos de parentesco e paternidade. O número de alelos por loco variou de dois a oito (média de
4,6 alelos por loco) e a heterozigozidade média esperada e observada foram iguais a 0,647 e 0,598, respectivamente.
Todos os locos estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg (p > 0,0038) e os pares de locos estão em equilíbrio de ligação
(p > 0,00064). O parentesco apresentou-se alto dentro dos bandos (r > 0,25) e baixo entre bandos (r < 0,05). Além
disso, não foi verificado autocorrelação significativa entre parentesco e distância espacial entre bandos (SPAGEDI),
sugerindo que a dispersão é aleatória. Os resultados da análise de filopatria indicaram que a dispersão não é
enviesada pelo sexo, assim, machos e fêmeas dispersam com igual probabilidade (Assigment test, FSTAT). De fato,
alguns machos e fêmeas de bandos diferentes apresentaram parentesco equivalente ao esperado para a relação entre
pais e filhos ou irmãos completos, sugerindo que ocorrem eventos de migração para formação de novos bandos.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda.
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Análises filogenéticas de cinco espécies de macacosprego (Gênero Cebus) a partir de sequências do gene
mitocondrial citocromo b
Martins-Junior, AMG1; Fernandes, FMC1
2
Laboratório de Biologia Molecular “Carmen Lemos” – Instituto de Biologia – UFBA
Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública.
[email protected] ; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Análises filogenéticas, Cebus, Citocromo b, Máxima verossimilhança, Macaco-prego.
Espécies do gênero Cebus (Primates:Cebidae), conhecidas como macacos-prego, são primatas do Novo Mundo
generalistas, apresentando alta capacidade de manipulação de ferramentas bem como grande capacidade de
adaptação e flexibilidade comportamental, o que as ajudaram a ter sucesso reprodutivo em diversos ecossistemas
(cerrado, caatinga, florestas neotropicais) como, também, em áreas antropodizadas. Estudos taxonômicos são de
suma importância para compreensão da evolução e ações de manejo e conservação do grupo. Com o presente
estudo, pretendemos contribuir para o esclarecimento das relações filogenéticas entre cinco espécies do gênero
Cebus, C. albifrons, C. apella, C. capucinus, C. cay e C. olivaceus a partir da análise de seqüências do gene mitocondrial
citocromo b. As seqüências de DNA foram coletadas no GenBank e foram, ainda, incluídas nas análises sequências
do gênero Saimiri, grupo-irmão de Cebus, para o enraizamento da árvore. As sequências foram alinhadas e
editadas no software BioEdit. Constatamos, a partir dos resultados obtidos com o auxílio do programa Paup*, que
as freqüências das bases foram: A= 0,29, C= 0,31, G= 0,12 e T= 0,28. Para reconstruir a árvore filogenética com base
no critério de máxima verossimilhança no software Paup*, verificamos qual o modelo evolutivo de substituição de
nucleotídeos que melhor explicou os dados através do teste de razão de verossimilhança (LRT-Likelihood Ratio
Test) realizado com o programa ModelTest. O modelo HKY85 associado à distribuição gama foi o melhor para
explicar os dados. O valor do parâmetro α da distribuição gama foi de 0,1796, indicando que as sequências são
heterogêneas em relação às taxas de mutações. Posteriormente, a árvore filogenética foi produzida utilizando-se
o modelo escolhido, incluindo o algoritmo de branch-swapping (TBR) e foi feito o teste de bootstrap com 1000
pseudo-réplicas para observar a sustentação dos ramos internos. O valor de verossimilhança foi -ln L=2167,3848.
A topologia da árvore filogenética apresentou dois grandes clados: um composto de C. apella e C. cay como grupos
irmãos e no outro clado, C. albifrons como grupo irmão de C. capuchinus que, juntos, compõem o grupo irmão de
C. olivaceus. O esclarecimento das relações filogenéticas é importante para o estabelecimento de ações de manejo
e conservação do gênero. Dessa forma, considerando que as relações filogenéticas dentro deste gênero ainda estão
controversas, pretendemos inserir novas sequências ainda não publicadas do mesmo gene obtidas das outras
espécies de Cebus.
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Hibridismo entre Alouatta caraya e Alouatta clamitans:
uma estratégia reprodutiva para sobrevivência ou um
caminho para a extinção?
Souza, VT1; Codenotti, TL2; Oliveira, M3; Müller4, J; Busin, CS1
Laboratório de Citogénica Animal - Instituto de Ciências Biológicas – Universidade de Passo Fundo- UPF – Passo Fundo/RS
Criadouro Conservacionista do Cetro de Acolhimento de Primatas e Aves – Passo Fundo/RS
3
Criadouro Arca de Noé, Morro Reuter/RS
4
Universidade do Vale dos Sinos – Unisinos – São Leopoldo/RS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cariótipo, híbridismo, simpatria, bugios
Na natureza ou em cativeiro, muitas espécies de primatas estão obtendo sucesso reprodutivo cruzando-se com
outras espécies, como ocorre com os sagüis da família Callithrichidae e com os macacos prego da família Cebidae
(com gêneros iguais ou diferentes). Esse fato tem causado problemas sistemáticos de difícil solução. Em muitos
casos, os híbridos são viáveis e podem reproduzir-se normalmente. Em ambiente selvagem foram descritos casos
de simpatria entre espécies do gênero Alouatta: A. caraya e A. clamitans; A. palliata e A. pigra onde foi levantada
hipótese de hibridismo baseada nas características morfológicas que alguns descendentes apresentavam.
O objetivo do presente estudo foi confirmar, por meio da comparação entre os cariótipos, o hibridismo de um
espécime resultante do cruzamento entre um macho A. caraya e uma fêmea A. clamitans do Criadouro “Arca
de Noé”, Morro Reuter, Rio Grande do Sul. Foi coletado um mL de sangue periférico de cada um dos espécimes:
A. caraya (macho), A. clamitans ( fêmea) e do filhote do casal. As preparações cromossômicas foram obtidas
por meio de cultura de longa duração de linfócitos, onde 20 gotas do sangue total de cada um dos espécimes
foram lançadas em meio de cultura RPMI 1640, suplementado com soro fetal bovino (SFB) e Fitohemaglutinina
(PHA). As culturas foram incubadas a 37ºC e colchicinizadas. Ao final de 72 horas foram interrompidas e
processadas. A coloração dos cromossomos foi realizada com solução de Giemsa 10%. As metáfases foram
analisadas e digitalizadas e os cariótipos montados. O número diplóide de cromossomos encontrado no
macho A. caraya foi 52, com sete pares de cromossomos metacêntricos, cinco pares submetacêntricos, 13
pares subtelocêntricos e dois cromossomos Y morfológicamente distintos, ambos subtelocêntricos (Y1; Y2).
No espécime fêmea A. clamitans foi encontrado 2n=46 cromossomos, sendo seis pares metacêntricos, oito
submetacêntricos e nove pares subtelocêntricos. No cariótipo do híbrido foi encontrado 2n=49, apresentando
cromossomos metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos, com impossibilidade de emparelhamento dos
pares homólogos. Não foi possível, por meio da coloração com Giemsa, reconhecer quais cromossomos foram
herdados do genoma paterno ou materno. Portanto o número cromossômico (2n=49), intermediário entre
o conjunto cromossômico de A. caraya (2n=52) e de A. clamitans (2n=46) confirmam o hibridismo do filhote.
Apoio financeiro: UPF
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Filogenia molecular dos gêneros Saguinus, Mico e
Callithrix (Platirrinos, Primatas) através de sequências
de inserções ALU
Cunha, DB1; Monteiro, EMG1; Vallinoto, M1; Sampaio, I1; Schneider, H1
Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança, Instituto de Estudos Costeiros (IECOS).
[email protected]
1
Palavras-chave: Platirrinos, Callitrichineos, Callithrix, genética, sequências de inserções Alu.
Introdução: A subfamília Callitrichinae compreende os pequenos primatas dos gêneros Callithrix, Mico, Cebuella,
Saguinus, Leontopithecus e Callimico, popularmente conhecidos como sagüis, marmosets ou tamarins. Nas últimas
décadas a filogenia desses primatas tem sofrido fortes alterações, devido as primeiras terem sido baseadas
somente em caracteres morfológicos, além da descrição de novas espécies. Contudo, o considerável volume de
trabalhos são focados nas relações entre os gêneros, sendo negligenciados os posicionamentos intra-genéricos.
Dentre os primatas do Novo Mundo, a diversidade de táxons, especialmente da subfamília Callitrichinae, é
exuberante e ainda necessita de estudos taxonômicos adicionais. Objetivo: Desta forma o objetivo do presente
estudo foi esclarecer as relações dentro de três gêneros dessa subfamília: Callithrix, Mico e Saguinus. Métodos:
Através da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase), foram obtidas seqüências de cinco lócus nucleares, utilizando
os iniciadores ALU_F3, SAG_132A, SF7, SAG_29 e SAG_39 no seqüenciador automático ABI 377. As análises
filogenéticas foram realizadas nos programas PAUP4.b10, MrBayes3.1.2, BEASTv1.4.8 e Bestv2.0. Os dados
concatenados (Teste de Homogeneidade partição: p > 0,05) somaram um total de 2530 pares de bases (pb).
Nas análises filogenéticas foram geradas árvores de Máxima Verossimilhança (MV), Máxima Parcimônia (MP),
Inferência Baesyana (IC) e uma árvore de espécie. Resultados: Os dados concatenados apresentaram algumas
incongruências e os melhores resultados obtidos foram com base em coalescência. As árvores de MP, MV e
IC apresentaram a formação de três grandes clados: o clado agrupando Callithrix como grupo irmão de Mico
fortemente apoiado (MP: 95%, MV: 100% bootstrap e MB: 1.0 IC), suportando a proposição de dois grupos, um
grupo distribuído na Amazônia (Mico), com um tempo de diferenciação mais antigo, e o outro na mata Atlântica
(Callithrix). Além disso, foi observado o agrupamento de Cebuella como grupo irmão de Callibela/M. argentata/M.
emiliae com valores moderados (MP: 89%, ML: 81% e MB: 0.95 IC). Outro fato interessante dentro deste mesmo
clado é o posicionamento de Callibela como grupo irmão de Mico (MP: 96%, ML: 98% e MB: 1.0 IC). Dentro do
gênero Saguinus a espécie mais basal foi S. fuscicollis (MP: 99%, ML: 100% e MB: 1.0 IC). O clado dos bigodudos
é monofilético e é grupo irmão de S. bicolor e S. midas/S. niger (MP: 98%, ML: 95% e MB: 1.0 IC). Conclusões: No
grupo dos Callithrix a árvore de espécie resolveu a politomia e posicionou C. geoffroyi como o mais basal do grupo,
suportado por altos valores de credibilidade, assim como, todos os agrupamentos mencionados anteriormente.
Apoio financeiro: CNPq; IECOS e UFPA.
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Descrição cariotípica da espécie Lophostoma
silvicolum (Phyllostomidae, Chiroptera – Mammalia)
ocorrente no Cerrado de Nova Xavantina – MT
Sousa, RF1, Resende, TRPS2, Faria, KC2; Venere, PC3
Programa de Pós Graduação em Ecologia e Conservação, UNEMAT- Campus de Nova Xavantina
Departamento de Ciências Biológicas, UNEMAT– Campus de Nova Xavantina
3
Departamento de Ciências Biológicas e da Saúde, UFMT – Campus Universitário do Araguaia.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bandamento C, Coloração convencional, Cromomicina A3, Distribuição geográfica, Morcegos.
A espécie Lophostoma silvicolum (Chiroptera, Phyllostomidae) pode ser diferenciada dentro do gênero por
apresentar o maior porte, sendo os machos maiores que as fêmeas. A cor da pelagem pode variar do cinza ao marrom
avermelhado com pelagem mais clara no ventre e as orelhas são grandes e arredondadas ligando-se no topo da
cabeça. Esta espécie apresenta ampla distribuição geográfica, já tendo sido registrada em alguns países da America
Latina e em doze estados brasileiros; no entanto, não há registro para o estado de Mato Grosso. Em nível citogenético
poucos foram os estudos realizados com L. silvicolum, sendo este o primeiro estudo com espécimes brasileiros. O
objetivo do presente trabalho foi caracterizar cariotipicamente a espécie L. silvicolum através das técnicas de colação
convencional, bandamento C e cromomicina A3. O estudo foi realizado em uma área de cerradão associado à mata
ciliar do Córrego Estilac, 14º38’13’’S e 52º21’36’’W, no município de Nova Xavantina situado no vale do Araguaia,
região leste do Estado de Mato Grosso. A técnica para obtenção do material citogenético seguiu o procedimento
de preparação direta de medula óssea. Por meio da coloração usual com Giemsa foi possível verificar que a espécie
L. silvicolum apresenta 2n=34 cromossomos e número de braços autossômicos de 62. O conjunto diplóide desta
espécie é composto por 15 pares de cromossomos meta-submetacêntricos variando o tamanho de grandes a
pequenos e um par de cromossomos acrocêntricos pequeno e o par de cromossomos sexuais (X e Y). O cromossomo
X é um submetacêntrico médio e o cromossomo Y é um acrocêntrico pequeno. A análise da heterocromatina
constitutiva, após tratamento com BaOH revelou um padrão de bandas C na região pericentromérica de todos
os cromossomos, exceto no Y. Com o fluorocromo cromomicina A3 foi possível observar bandas transversais
múltiplas nos cromossomos que permitiram uma boa identificação dos diferentes pares cromossômicos. Os dados
obtidos revelam-se particulares para Lophostoma silvicolum, contribuindo assim com novas informações sobre
a distribuição geográfica para a espécie além de ser esse o primeiro estudo citogenético para o grupo no Brasil.
Apoio Financeiro: CAPES e FAPEMAT.
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Levantamento de regiões microssatélites no genoma
de Glossophaga soricina (Chiroptera, Phyllostomidae)
Oprea, M1; Peixoto, FP1; Silva, JB1; Resende, LV1; Collevatti1, RG; Walter, MEMT2, Telles, MPC1.
Laboratório de Genética & Biodiversidade, DBG/ICB/Universidade Federal de Goiás
Departamento de Ciência da Computação, Universidade de Brasília.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Biblioteca shotgun, clonagem, morcego, motivos de repetição, STR.
Microssatélites são definidos como sendo as menores sequências de DNA repetitivo (entre 1 a 6pb de comprimento)
presentes nos genomas. Essas regiões possuem características evolutivas que possibilitam o desenvolvimento de
iniciadores nas regiões que as flanqueiam e são, portanto, amplamente utilizados como marcadores genéticos em
diversas áreas da biologia. Suas possibilidades de aplicação vão desde estudos sobre a evolução dos genomas até
estudos de ecologia molecular, genética de populações e questões forenses. São comuns e amplamente distribuídos
no genoma nuclear dos eucariontes, ocorrendo também, em menor frequência, nos genomas de mitocôndrias
e cloroplastos. Apesar do extenso uso de marcadores microssatélites em diferentes estudos genéticos, ainda é
necessário conhecer sua distribuição no genoma de muitas espécies eucariotas, especialmente dos quirópteros.
Neste trabalho apresentamos os resultados do levantamento de regiões microssatélites presentes no genoma de
uma espécie de morcego nectarívoro, Glossophaga soricina. O DNA foi extraído a partir de 1ml de sangue de dois
indivíduos, utilizando o protocolo de fenol-clorofórmio. Após a quantificação, o DNA foi clivado por sonicação para
obtenção de fragmentos entre 500pb e 1Kb, e depois inseridos no vetor pMOSBlue para a clonagem das bibliotecas
shotgun. Em seguida, o DNA dos clones foram extraídos (miniprep) e seqüenciados (ABI3100). As sequências
geradas foram preparadas no site “http://citosina.biomol.unb.br/papirus” para que as buscas das regiões repetitivas
fossem realizadas no software WebSat. Estas buscas foram realizadas para um mínimo de 6 repetições nos
mononucleotídeos e quatro para os di-, tri-, tetra-, penta- e hexanucleotídeos. Foram sequenciados 2.112 clones que
resultaram em 218.951 bases nos produtos sequenciados, sendo encontradas 474 regiões microssatélites contendo
diferentes motivos de repetição. Destas, 404 eram mononucleotídeos (85,23%), 48 dinucleotídeos (10,13%), 9
trinucleotídeos (1,9%), 9 tetranucleotídeos (1,9%), 2 pentanucleotídeos (0,42%) e 2 hexanucleotídeos (0,42%).
Dentre os mononucleotídeos, o mais abundante foi A(n), seguido de T(n), C(n) e G(n), representando 78%, 10%, 8% e 4%,
respectivamente. Estavam presentes os dinucleotídeos AT(n), AG(n), AC(n),TC(n), TG(n), TA(n), GT(n), GA(n), CA(n), sendo que
os cinco primeiros representam cerca de 15% cada e o último somente 0,5%. Como o esperado, os motivos de repetição
maiores apresentaram uma freqüência bem mais baixa de ocorrência. A partir dos dinucleotídeos, foi possível
desenhar quatro sequências iniciadoras. Apesar da presença de regiões repetitivas não garantir a possibilidade
de desenhos de iniciadores nas regiões flanqueadoras, foram detectadas sequências viáveis em quatro destas
regiões contendo dinucleotídoes (TC(6), AG(8), TG(20), TG(7), TC(24)). Este tipo de estudo é necessário para entender a
abundância diferencial das repetições sob o cenário evolutivo e possibilitar futuros estudos genético-populacionais.
Apoio financeiro: PRONEX/CNPq/FAPEG e Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda.
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Pintura cromossômica utilizando seis sondas
cromossômicas totais de Carollia brevicauda no
cariótipo de Micronycteris minuta (ChiropteraPhyllostomidae) da amazônia brasileira
Benathar, TCM1,3; Gomes, AJB1,4; Rodrigues, LRR5; Nagamachi, CY1,2; Pieczarka, JC1,2.
Laboratório de Citogenética, ICB, UFPA
Pesquisador do CNPq
3
Bolsista IC-CNPq;
4
Bolsista Doutorado CAPES em Genética e Biologia Molecular
5
Laboratório de Genética & Biodiversidade, UFOPA-Santarém.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ZOO-FISH; Chiroptera; Micronycteris minuta.
O gênero Micronycteris (Chiroptera - Phyllostomidae) atualmente inclui dez espécies divididas tradicionalmente
em dois grupos: os de ventre escuro (M. hirsuta, M. matse, M. microtis, M. megalotis e atualmente M. giovanniae)
e os de ventre claro (M. homezi, M. minuta, M. sanbornii, M. schmidtorum e M. brosseti). O gênero Micronycteris
constitui um dos grupos mais complexos dentro da Família Phyllostomidae, revelando uma extensa variação
cariotípica tanto no número diplóide (2n) quanto no número fundamental (NF). Com o desenvolvimento
das técnicas de Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) a identificação de segmentos homeólogos entre
cariótipos diferenciados se tornou possível, utilizando sondas que detectam grandes regiões de homologia,
demonstrando as seqüências conservadas entre as espécies. No presente trabalho foram hibridizadas seis sondas
de cromossomos totais de Carollia brevicauda (CBR 4, 5, 6, 7, 8 e 9) no cariótipo de Micronycteris minuta (2n=28
e NF=52) para identificação de blocos sintênicos entre as duas espécies. Os resultados da análise por ZOOFISH dos seis cromossomos de CBR revelaram 10 sinais no cariótipo da espécie Micronycteris minuta (MMI). Os
cromossomos CBR 5, 8 e 9 apresentaram uma única marcação (sintenia conservada) no cariótipo de M. minuta
sendo que o CBR 9 marca um cromossomo inteiro, correspondendo ao MMI 12; os cromossomos CBR 5 e 8
marcam parte dos cromossomos MMI 2 e MMI 7, respectivamente. Os CBR 4 e 7 mostram dois sinais e o CBR
6 mostra 3 sinais. Hibridizações com as demais sondas de CBR estão sendo realizadas visando o mapeamento
completo no cariótipo de M. minuta. Esses resultados permitirão uma análise comparativa mais precisa e
melhor compreensão dos mecanismos de evolução cromossômica que atuaram na diversificação desta espécie.
Apoio: CNPq, CAPES, UFPA
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Pintura cromossômica utilizando quatro sondas de
cromossomos totais de Carollia brevicauda no genoma
de Micronycteris hirsuta (Chiroptera-Phyllostomidae)
Ribas, TFA1; Benathar, TCM2; Gomes, AJB2; Nagamachi, CY2; Pieczarka, JC2; Rodrigues, LRR1
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Instituto de Biodiversidade e Florestas, Universidade Federal do Oeste do Pará, Campus de
Santarém-Pa
2
Laboratório de Citogenética, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Campus do Guamá, Belém-Pa
[email protected]
1
Palavras-chave: citogenética, FISH, morcegos, Phyllostomidae, Micronycteris
O gênero Micronycteris (Chiroptera-Phyllostomidae) é constituído por 10 espécies: M. brosseti, M. hirsuta, M.
giovannie, M. homezi, M. matses, M. megalotis, M. microtis, M. minuta, M. sanborni e M. schmidtorum. Análises
citogenéticas realizadas em morcegos deste gênero revelam extensa variabilidade cariotípica em relação a
morfologia cromossômica, número diplóide e número fundamental, dificultando o entendimento de suas relações
evolutivas apenas por métodos de bandeamentos clássico. Com o surgimento da técnica de Hibridização in situ
Fluorescente (FISH) tornou-se possível a identificação de regiões homeólogas entre cariótipos diferenciados.
Uma variante dessa técnica, a pintura cromossômica, utiliza cromossomos inteiros como sonda, permitindo
a comparação de genomas em nível citológico, e a detecção de regiões de sintenia conservada entre espécies
que possuem cariótipos altamente rearranjados. Objetivou-se caracterizar a espécie M. hirsuta por meio da
citogenética clássica e mapeamento genômico comparativo cross species. Foram analisados os cariótipos de
dois espécimes fêmeas (LR-275 e LR-1342) de M. hirsuta (MHI), através de técnicas de coloração convencional,
bandeamento G e Hibridização in situ Fluorescente (FISH) utilizando quatro sondas de cromossomos totais
da espécie Carollia brevicauda (CBR). Os espécimes possuem número diplóide de 2N=25/26 cromossomos e
número fundamental NF=32. Para LR-275 o complemento autossômico foi constituído por nove cromossomos
de dois braços e 14 acrocêntricos, enquanto que LR-1342 apresentou oito cromossomos de dois braços e oito
acrocêntricos. O cromossomo X é acrocêntrico. O padrão de bandeamento G possibilitou o correto pareamento
dos homólogos e evidenciou um polimorfismo cromossômico intraespecífico. Os resultados da análise por
pintura cromossômica utilizando sondas de cromossomos totais de C. brevicauda (CBR), correspondendo aos
cromossomos CBR-4, CBR-5, CBR-8 e CBR-9 evidenciaram seis sinais de hibridização no genoma de M. hirsuta
(MHI). Duas sondas cromossomo específicas de Carollia (CBR-5 e 9) hibridizaram em um único segmento
cromossômico de Micronycteris: região intersticial de MHI-1 e porção distal em MHI-4, respectivamente. As
duas sondas restantes detectaram sinais de hibridização em mais de um segmento cromossômico: CBR-4
evidenciou dois sinais, ambos na porção distal de MHI-4 e 5; CBR-8 mostrou dois pontos de hibridização, um
na porção intersticial de MHI-1 e outro evidenciado na região centromérica de MHI-8. Essa distribuição de
sinais pode ser explicada pela ocorrência de rearranjos Robertsonianos e/ou translocações que ocorreram
ao longo da história evolutiva desta espécie. Os resultados obtidos revelam que M. hirsuta apresenta variação
cariotípica intraespecífica e possui um cariótipo altamente rearranjado em relação ao suposto ancestral da família.
Apoio Financeiro: Aotus-Consultoria, Biodinâmica-RIO, CNPQ, FINEP, CAPES, UFOPA, UFPA
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Determinação da expressão do RNAm da hepcidina
na medula óssea em relação ao fígado de equinos
normais por RT-PCR (RT-qPCR)
Oliveira Filho, JP¹; Badial, PR¹; Cunha, PHJ²; Cagnini, DQ¹; Delfiol, DJZ¹; Araujo Jr., JP³; Borges AS¹.
¹ Departamento de Clínica Veterinária, Universidade Estadual Paulista - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, SP
² Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal de Goiás - Escola de Veterinária, Goiânia, GO
³ Departamento de Imunologia e Microbiologia, Instituto de Biociências, Botucatu, SP.
[email protected]
Palavras-chave: Equinos, Expressão Gênica, Hepcidina, Medula Óssea, RT-qPCR.
Introdução: A hepcidina foi inicialmente descrita como um peptídeo rico em cisteínas com atividade
antimicrobiana. Contudo, nos últimos anos confirmou-se que a função principal da hepcidina é a regulação do
metabolismo do ferro, através da internalização e degradação da Ferroportina, único canal exportador de ferro
da célula, impedindo que o ferro seja liberado do ferro dos macrófagos e absorvido pelos enterócitos. Cerca de
80% do ferro plasmático é utilizado nos eritrócitos circulantes e nos precursores eritróides na medula óssea.
Portanto, a hepcidina regula indiretamente a eritropoiese. A hepcidina foi recentemente sequenciada em equinos,
sendo predominantemente expressa no fígado e em menores níveis em outros tecidos, contudo, a expressão
na medula óssea ainda não foi descrita. Objetivo: Determinar a expressão relativa do RNAm da hepcidina na
medula óssea em relação ao fígado de equinos saudáveis por RT-qPCR. Métodos: Foram coletadas, através de
biópsias, amostras de fígado e de medula óssea de 10 equinos clinicamente saudáveis. Cada animal foi submetido
à biópsia hepática e de medula do esterno no mesmo momento. RNA total foi extraído das amostras de fígado
e de medula óssea com RNeasy® Mini Kit (Qiagen®) e QIAamp® RNA Blood Mini Kit (Qiagen®), respectivamente, e
tratado com RQ1 RNase-Free DNase (Promega), “random primers” e a enzima Improm-IITM RT (Promega). O cDNA
foi confeccionado utilizando “random primers” e a enzima Improm-IITM RT (Promega), segundo recomendações
do fabricante. As reações de qPCR foram realizadas em triplicata com o kit Power SYBR® Green PCR Master Mix
(Applied Biosystems) e “primers” previamente descritos para as sequências do RNAm da hepcidina e do RNAm
do gene endógeno da β-actina equina. A expressão relativa da hepcidina na medula óssea em relação ao fígado foi
calculada usando o método do 2-ΔΔCT e o programa 7300 Systems SDS (Applied Biosystems). A análise estatística
foi realizada com o teste t de Student, com significância estatística de 5%. Todos os procedimentos foram
aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais da FMVZ/UNESP. Resultados: As reações de qPCR para os
genes da hepcidina e da β-actina obtiveram eficiências semelhantes e próximas a 100% e apresentou coeficiente
de correlação entre o Ct (ciclo “threshold”) e a concentração de 0,99. A expressão do RNAm da hepcidina na
medula óssea foi 381 (±119) vezes menor que a do fígado (p<0,0001). Conclusões: O RNAm da hepcidina foi
expresso em baixos níveis na medula óssea de equinos hígidos, e foi significantemente menor que a expressão
hepática. Estes dados poderão ser utilizados em estudos futuros relacionados à expressão deste peptídeo no
fígado e em outros tecidos, além daqueles que envolvam o metabolismo do ferro durante a inflamação em equinos.
Apoio Financeiro: FAPESP (2007/07344-6; 2007/05008-9)
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Padrão de metilação da região diferencialmente
metilada do éxon 10 do gene IGF2 em células do
cumulus de vacas da raça Nelore
Rodrigues, FC1; Michalczechen-Lacerda,VA2; Fagundes, NS3; Machado, GM1; Caixeta, ES1; Dode, MAN4;
Franco, MM4
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária - Universidade de Brasília
Departamento de Biologia Celular - Universidade de Brasília
3
Faculdade de Medicina Vetrinária - Universidade Federal de Uberlândia
4
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia/Laboratório de Reprodução Animal.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bovino, Epigenética, Metilação, IGF2, Células do cumulus.
Uma extensa reprogramação epigenética acontece nos ovócitos até que esses estejam aptos a serem fecundados.
Entretanto, quando se utiliza técnicas de reprodução assistida, tais como a produção in vitro de embriões (PIVE),
a maturação do ovócito é realizada artificialmente in vitro, sendo esse processo um dos passos chave para a
obtenção de um gameta de qualidade. Existe uma intensa comunicação bioquímica entre o ovócito e as células do
cumulus (CC) que os circundam e esse contato funcional durante a maturação é essencial para expressão da total
competência ovocitária. Portanto, se o sistema in vitro pode afetar os padrões de metilação do DNA, esse efeito pode
ser tanto nos ovócitos quanto nas CC. Este trabalho teve como objetivo avaliar o padrão de metilação de uma DMR
localizada no éxon 10 do gene IGF2 em CC isoladas de complexos cumulus ovócitos (COC) imaturos e maturados
in vitro, obtidos de folículos de 1–3 mm e ≥ 8,0mm de diâmetro, de ovários de vacas Nelore. Os ovários foram
obtidos de abatedouros e os folículos dissecados e mensurados utilizando-se um estereomicroscópio. Somente
COC classificados como Grau 1 e Grau 2 foram utilizados. As CC foram removidas por sucessivas pipetagens e
posteriormente congeladas a -80˚C. Para a extração do DNA foi utilizado um protocolo baseado em “salting out”.
Posteriormente o DNA foi tratado com bissulfito de sódio para que apenas as citosinas não metiladas fossem
convertidas em uracilas. Na etapa seguinte, foi feita reação de PCR “nested” e os produtos foram recortados do gel
e purificados. Em seguida foram utilizados para ligação e transformação em células XL-1 Blue. Os clones foram
seqüenciados e analisados utilizando uma sequência controle do “GenBank”, com o programa Biq Analyzer. Os
resultados mostraram um nível de metilação de 78,17± 14,11% para CC oriundas de folículos de 1-3 mm imaturos,
82,93 ± 5,86% para CC oriundas de folículos de 1-3 mm maturados, 81,81±10,41% para CC oriundas de folículos
≥ 8 mm imaturos e 79,64±13,0% para CC oriundas de folículos ≥ 8 mm maturados. Não houve diferença entre
os tratamentos (P>0,05). O nível de metilação apresentado pelas CC de todos os tratamentos foi maior que o
esperado pois, considerando que seja uma DMR de um gene imprinted em uma célula somática, espera-se um
padrão próximo de 50%. Como as CC de folículos imaturos não passaram por nenhum processo de manipulação
in vitro, especula-se que este deve ser o padrão normal para esse tipo celular. Além disso, com relação ao efeito
da maturação in vitro, os resultados estão dentro do esperado, considerando que estas células não devem sofrer
nenhum processo de reprogramação, alterando seu padrão de metilação, diferentemente das células germinativas.
Apoio financeiro: EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia e CNPq.
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Ocorrência de SNPs nos genes IGF2 e CYP21 em
bovinos da raça Nelore e relações com características
de interesse zootécnico
Martins da Silva, A; Rios, AFL; Ramos, ES; Lôbo, RB; de Freitas, MAR
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
[email protected]
Palavras-chave: IGF2 (Insulin-like growth factor 2), CYP21 (Steroid 21-hidroxilase), SNPs, raça Nelore.
Os polimorfismos de única base (SNPs) são extremamente abundantes e geram variabilidade na representação
alélica do genoma dos eucariotos. Foram considerados dois polimorfismos: um no exon 6 do gene IGF2 (Insulin-like
growth factor 2) e outro na região promotora do gene CYP21 (Steroid 21-hidroxilase). O gene IGF2 está localizado
no cromossomo 29 e desempenha papel importante na fisiologia do desenvolvimento dos mamíferos enquanto
que o gene CYP21 está envolvido na síntese de hormônios esteróides, localizado no cromossomo 23 bovino. O
principal objetivo deste estudo foi verificar a existência de alguma relação dos genótipos ­apresentados pelos SNPs
com características produtivas e reprodutivas em bovinos da raça Nelore. A população analisada (N=112 animais)
encontrou-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os resultados evidenciaram predominância do genótipo TT
(polimorfismo CYP21-RFLP/HpaII), que foi relacionado a valores desejáveis para Diferenças Esperadas na Progênie
para Idade ao Primeiro Parto (IPP) e Perímetro Escrotal (PE365), com referência aos animais que apresentaram os
genótipos TT, TC e CC (polimorfismo IGF2 RFLP/MboII) não foi observada uma tendência definida com relação a
todas as características analisadas (P120, P210, P365, PE365, IPP, 3P e AOL). Este é o primeiro estudo da associação
do genótipo desses dois polimorfismos com características de interesse zootécnico em animais zebuínos.
Apoio financeiro: PRONEX, FAPESP, CNPq, ANCP e CAPES.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Uso de haplótipos de mtDNA para o manejo e
conservação de um Núcleo de Conservação da raça
Somalis Brasileira (Ovis aires)
Lacerda, T1; Faria, DA1; Facó, O2; Barreto, G3; Carneiro, PLS4; Lobo, RNB2; McManus, C5; Paiva, SR1
Laboratório de Genética Animal - Prédio Conservação de Germoplasma - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Embrapa Caprinos e Ovinos
3
UPIS Faculdades Integradas
4
Universidade Estadual Sudoeste da Bahia
5
Universidade de Brasília.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ovinos, marcadores moleculares, Recursos Genéticos Animais, Conservação, haplótipos.
Ovinos Somalis são originados da região Oeste da África, provavelmente da Somália e países vizinhos e, foram
introduzidos no Brasil inicialmente por criadores do Rio de Janeiro. Atualmente, os rebanhos da raça Somalis
Brasileira é uma das principais raças de ovinos localmente adaptados localizados na região Nordeste do Brasil.
Esta raça de ovinos deslanados é caracterizada por ter reservas de gorduras perto da cauda, sendo assim,
adaptados a serem criados em regiões com condições de alimentação menos favoráveis. O objetivo deste trabalho
foi estudar a variabilidade genética por meio de haplótipos do DNA mitocondrial (mtDNA) em um núcleo de
conservação da raça Somalis localizado no Estado do Ceará. A região analisada incluiu uma seqüência de 404
pares de bases da segunda metade da região controle do mtDNA de ovinos. Foram seqüenciados 34 indivíduos
do Núcleo de Conservação da raça Somalis brasileira coletados na Embrapa Caprinos, localizada em Sobral- CE.
Foram identificados 16 haplótipos dentro desta raça e 17 sítios polimórficos com valor de diversidade nucleotídica
(Pi) de 0,0177 e diversidade haplotípica (Hd) 0,8913. O haplótipo H3 foi o mais freqüente na raça em 10 animais. Dez
dos 17 haplótipos foram observados apenas uma vez na amostra estudada. Os resultados mostraram um elevado
número de haplótipos existente dentro desta raça, padrão esperado de raças naturalizadas e que podem contribuir
significativamente para a conservação da diversidade genética e para desenvolvimento de estratégias de manejo.
|Conclusões: Tais resultados, adicionados de marcadores nucleares codominantes (microssatélites), serão usados
para delineamento de famílias de manejo dentro do Núcleo de conservação de forma a otimizar a variabilidade
genética e aumentar o tamanho efetivo do rebanho. Adicionalmente estas análises irão subsidiar animais a terem
seu germoplasma coletado para inclusão no Banco Nacional de Germoplasma da Embrapa.
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Genes e vias metabólicas envolvidos nos mecanismos
de resistência e susceptibilidade de bovinos infestados
com carrapato Rhipicephalus microplus
Ibelli, AMG1; Higa, RH2; Giachetto, PF2; Yamagishi, MEB2; Oliveira, MCS3; Cardoso, FF4†; Alencar, MM3†;
Regitano, LCA3†
Programa de Pós Graduação em Genética e Evolução, Universidade Federal de São São Carlos, São Carlos – SP. Bolsista CAPES
Embrapa Informática Agropecuária, Laboratório de Bioinformática Aplicada, Campinas-SP
3
Embrapa Pecuária Sudeste, Laboratório de Biotecnologia Animal, São Carlos – SP. † Bolsista CNPq
4
Embrapa Pecuária Sul, Bagé – RS.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microarranjos, análise discriminante, Rhipicephalus microplus, bovinos, expressão gênica
Entre os principais problemas da pecuária brasileira está o parasitismo pelo carrapato bovino, Rhipicephalus
microplus, acarretando prejuízos de mais de dois bilhões de dólares por ano. A compreensão dos mecanismos
envolvidos na resistência genética aos carrapatos é importante porque pode auxiliar a identificação de genes ou
marcadores para essa característica. O objetivo deste trabalho foi identificar genes e vias regulatórias envolvidos
na discriminação de grupos de bovinos resistentes e sensíveis submetidos à infestação artificial com o carrapato
Rhipicephalus microplus. Após o nono dia da infestação artificial com larva de carrapato, 40 amostras de pele
(PE) e linfonodo (LN) foram coletadas de bovinos, Nelore, Angus x Nelore, Simental x Nelore e Canchim x Nelore,
previamente classificados como resistentes (PER e LNR) e sensíveis (PES e LNS). O RNA total foi isolado e purificado
em coluna de sílica e as amostras foram submetidas à análise de expressão gênica em larga escala utilizando
a plataforma de microarranjos GeneChip® Bovine Genome Array (Affymetrix). O controle de qualidade e préprocessamento (transformações, correção de background, sumarização) foram realizadas utilizando os pacotes
Affy, AffyQCReport e RMA/EXPRESS, do R/Bioconductor. Posteriormente, foi utilizado o pacote R/VarSelRF para
selecionar um conjunto de genes que melhor discriminasse as categorias de resistência em cada tecido. R/VarSelRF
utiliza uma estratégia para seleção de genes do tipo SBS (sequencial backward selection) e realiza a classificação dos
tecidos utilizado o algoritmo Random Forest. Os genes selecionados corresponderam ao maior conjunto de genes
que, utilizados para discriminar as amostras PER x PES e LNR x LNS resultaram no menor erro de classificação.
Para linfonodo, foram encontrados 242 genes em 59 vias metabólicas, e para pele, 25 genes e 22 vias com maior
capacidade de discriminar o grupo resistente do grupo sensível. Em pele, as principais vias de diferenciação foram
as de cascata de complemento e de sinalização de quimiocinas, destacando-se os genes fator I do complemento
(CFI) e receptor 1 de quimiocinas (CCR1). Em linfonodo, as principais vias que podem ser destacadas foram as
de biossíntese de glicanas, exportação de proteínas e metabolismo de nucleotídeos, compostas exclusivamente
por genes induzidos no grupo resistente, entre os quais genes de proteínas de choque térmico (HSPA5), GDPmanose (GMDS) e riboforinas (RPN1). Em contrapartida, as vias de cardiopatia miopática dilatada e de orientação
de axônios, continham genes induzidos no grupo sensível, como por exemplo, fosfolambam (PLN) e fator de
crescimento transformante beta 1 (TGFB1). Esses genes apresentam funções relacionadas à regulação de canais de
cálcio e interações com receptores de citocinas, que já são conhecidas por serem moduladas pelo ectoparasita. Dessa
maneira, pode-se concluir que além do sistema imune já amplamente estudado, outros genes e vias metabólicas
são importantes na categorização de bovinos resistentes e sensíveis ao carrapato Rhipicephalus microplus.
Apoio Financeiro: Embrapa, CNPq, CAPES
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Variabilidade genética de pesos corporais a diferentes
idades em avestruzes (Struthio camelus)
Ramos, SB¹; Ramos, AA²; Caetano, SL¹, Bainy, AM¹; Nunes, BN¹, Munari, DP¹
¹Departamento de Ciências Exatas, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
²Departamento de Produção e Exploração Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista Júlio
de Mesquita Filho.
[email protected]
Palavras-chave: herdabilidade, ratitas, parâmetros genéticos, estrutiocultura.
O conhecimento de parâmetros genéticos para características de importância econômica é um pré-requisito
para a formação de programas de melhoramento genético eficientes. Mas a escassez de trabalhos e o contínuo
e intenso crescimento do rebanho de avestruzes existente no país justificam a necessidade do estudo da
variabilidade genética e fenotípica destas características para esta espécie. Neste trabalho, estimativas de
herdabilidade para pesos ao nascer, aos 90 e 180 dias foram obtidas utilizando dados de desempenho e de
pedigree cedidos pelo Programa de Melhoramento Genético do Avestruz (PROGESTRUZ). Ao todo, 9330 animais
foram cadastrados com a identificação do pai e da mãe, sexo, piquete, data de nascimento e características de
desempenho. As estimativas de herdabilidade das características estudadas foram obtidas pelo método da
Máxima Verossimilhança Restrita, em modelo animal. O método dos quadrados mínimos foi utilizado por meio
do programa computacional SAS para a definição dos possíveis efeitos fixos a serem considerados no modelo
de análise. Assim, mês de nascimento foi considerado como efeito fixo para todas as características estudadas
e para pesos aos 90 e 180 dias, a idade de mensuração dos animais foi utilizada como covariável. As estimativas
obtidas para herdabilidade foram 0,45±0,05, 0,56±0,07 e 0,25±0,09 para peso ao nascer, aos 90 e aos 180 dias,
respectivamente. As moderadas estimativas de herdabilidade mostram que níveis significantes de variação
genética aditiva estiveram presentes para as características estudadas e que estas responderão à seleção.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Estimativas de herdabilidade para peso de gordura
abdominal e características de qualidade da carne em
aves oriundas de cruzamento recíproco
Bainy, AM1,4; Ramos, SB1,5; Savegnago, RP1,5; Ledur, MC2; Nones, K3; Munari, DP1,6
Departamento de Ciências Exatas, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
²Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC
³The New Zealand Institute for Plant and Food Research Limited, New Zealand
4
Bolsista CNPq
5
Bolsista Fapesp
6
Bolsista, PQ Unesp
e-mail: [email protected];
1
Palavras-chave: aves, qualidade da carne, herdabilidade, gordura abdominal, PSE.
A intensa seleção para maiores taxas de crescimento levou a conseqüências indesejáveis relacionadas à qualidade
da carne de aves, como a ocorrência da carne pálida, mole e exsudativa (PSE) e ao aumento da deposição de gordura
nos frangos. É possível determinar a ocorrência de carne PSE por meio da combinação dos resultados obtidos para
as propriedades funcionais desta carne (cor e pH). As estimativas de herdabilidade para peso de gordura abdominal
e de características de qualidade da carne podem auxiliar nos programas de seleção e favorecer a obtenção de
produtos de melhor qualidade sensorial e de maior rentabilidade. Neste trabalho, os objetivos foram estimar a
herdabilidade para a característica de peso de gordura abdominal, de pH aferido em 15 minutos post mortem (pH15),
de pH aferido 24 horas post mortem (pH24), da medida da luminosidade da amostra (L*), da medida da intensidade
da cor vermelha (a*) e da cor amarela da carne (b*). Foram utilizadas 1494 aves pertencentes à terceira geração do
cruzamento recíproco de animais das linhagens de corte e de postura desenvolvidas na Embrapa Suínos e Aves, em
Concórdia, SC. As aves foram abatidas entre 41 e 44 dias. Aferiu-se o pH15 e o pH24 com o potenciômetro Sentron
1001. Para a análise de cor e obtenção dos valores de L*, a* e b* utilizou-se o colorímetro Minolta em amostras de
peito desossadas. Neste experimento foi estabelecido a existência de 2 grupos distintos: controle e submetido
a estresse térmico pré-abate. As análises para obtenção da estimativa das herdabilidades foram efetuadas pelo
método de máxima verossimilhança restrita, considerando os efeitos aleatórios, genético aditivo, residual e os
efeitos fixos (sexo, incubação e estresse) em modelo animal uni-característica. O pH15 e pH24 possuíram baixas
estimativas de herdabilidade de 0,11±0,04 e 0,08±0,03, respectivamente. Em relação aos parâmetros de cor da
carne de aves, estimativas de herdabilidade foram de 0,20±0,05 para L*, de 0,18±0,05 para a* e de 0,13±0,04, para b*.
A herdabilidade para o peso de gordura abdominal foi alta com valor de 0,77±0,08. Conclusões: O peso da gordura
abdominal pode ser um bom critério para a seleção contra a deposição de gordura nas aves. Parte da variação
fenotípica das medidas de cor e de pH nos tempos estudados poderia ser atribuída aos efeitos aditivos dos genes.
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77
Amplificação cruzada de loci microssatélites em
Dixiphia pipra (Aves: Pipridae)
Fortuna, JR1,3; Anciães, M1,2; Farias, IP1,3
Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus/Brasil
Coordenação de Pesquisas em Ecologia e Programa de Coleções e Acervos Científicos, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia,
Manaus/Brasil
3
Laboratório de Evolução e Genética Animal, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Amazonas, Manaus/Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microssatélites, amplificação cruzada, tranferibilidade, Pipridae, Dixiphia pipra
Introdução: Os microssatélites são marcadores moleculares amplamente usados em estudos populacionais
devido a características como neutralidade, co-dominância e alta taxa de mutação. Além do mais, é possível
a amplificação cruzada de microssatélites entre espécies filogeneticamente próximas, como uma alternativa
menos custosa do que o desenvolvimento de microssatélites para a espécie de interesse. Os Pipridae são
pequenos pássaros dançarinos com plumagens exuberantes, distribuídos na região Neotropical. Existem
aproximadamente 45 espécies, mas microssatélites espécie-específicos foram desenvolvidos para apenas cinco
espécies: Chiroxiphia caudata, C. lanceolata, C. linearis, Corapipo altera e Manacus manacus. Objetivo: O objetivo
do presente estudo foi testar 21 pares de primers para loci de microssatélites de Chiroxiphia caudata (n=9), C.
lanceolata (n=4) e Manacus manacus (n=8) em amplificação cruzada para testar a utilidade dos mesmos como
marcadores informativos para estudos populacionais com Dixiphia pipra. Métodos: Foram utilizadas 30 amostras
de sangue de indivíduos da espécie capturados em redes de neblina em três fragmentos florestais próximos
(150 a 1000m), localizadas a cerca de 70Km ao Norte de Manaus/AM. O DNA foi extraído pelo método de CTAB
com modificações. Para todos os loci foram feitos testes de gradiente de temperaturas por PCR e cinco não
amplificaram (Chir1_6, Chir3_27, Lan20, Man1, Man4). Para os loci que amplificaram com sucesso foram feitas
genotipagens no seqüenciador ABI 3130 xl. Resultados: Dentre os locos amplificados dois não apresentaram
padrões definidos dos alelos (Chir1_18 e Lan21), e 14 locos apresentaram alelos bem definidos na genotipagem,
sendo que quatro foram pouco polimórficos (Chir3_15: 3 alelos, Chir4_34: 1 alelo, Lan10: 2 alelos, Man14: 2 alelos).
Os dez locos restantes (Chir1_16, Chir2_9, Chir3_22, Chir4_33, Lan22, Man3, Man6, Man7, Man8 e Man13)
foram polimórficos e informativos (4-14 alelos) para serem usados em estudos de genética de populações de
D. pipra. Conclusão: Com este trabalho foi possível padronizarmos 10 marcadores microssatélites que podem
ser usados para trabalhos de genética de populações e de ecologia comportamental para a espécie D. pipra.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEAM
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78
Isolamento de marcadores microssatélites em
populações brasileiras de Bubulcus ibis (Ciconiiformes:
Ardeidae)
Campanini, EB1; Moralez-Silva, E1; Sanches, A2; Hatanaka, T3; Del Lama, SN1
Laboratório de Genética de Aves, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
Laboratório de Biologia da Conservação, Departamento de Ecologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista – campus
Rio Claro
3
Laboratório de Imunogenética, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: garça-vaqueira, espécie exótica invasora, efeito fundador, genotipagem, estrutura genética.
Introdução: A garça-vaqueira (Bubulcus ibis, L., 1758) (Ciconiiformes: Ardeidae), é uma ave migratória, de médio
porte, oriunda do continente africano. Supõe-se que a espécie atravessou o Oceano Atlântico há pelo menos
100 anos, sendo considerada uma espécie exótica invasora no continente americano. A colonização do Brasil
parece ter ocorrido no sentido norte-sul, tendo iniciado na fronteira com as Guianas e irradiado, tanto para o
nordeste quanto para o sul do país. A população brasileira cresceu rapidamente e pode representar uma ameaça
às espécies nativas, principalmente as que nidificam apenas em ilhas. Analisar a estrutura genética dessas
populações é essencial para esclarecer questões relacionadas ao histórico da invasão, auxiliar na compreensão
do evento fundador no país e auxiliar no manejo da espécie. Objetivos: o isolamento e a caracterização de
pelo menos oito locos de microssatélites espécie-específicos para B. ibis, visando uma posterior análise da
estrutura genética de populações brasileiras. Métodos: O DNA foi extraído de uma amostra de sangue de um
indivíduo oriundo de uma população reprodutiva localizada em Barra do Ribeira (RS), pelo método de fenolclorofórmio. A partir do DNA desse indivíduo, foram construídas bibliotecas genômicas parciais enriquecidas,
cujos fragmentos gerados foram posteriormente sequenciados e analisados quanto à presença de sequências de
microssatélites. Foram encontradas 11 sequências de microssatélites mononucleotídicas, 21 dinucleotídicas, duas
trinucleotídicas, quatro tetranucleotídicas e uma hexanucleotídica, totalizando 39 sequências. Oligonucleotídeos
iniciadores foram desenhados para 15 locos, tendo sido 10 deles já analisados. Para a caracterização dos locos
encontrados, foram utilizadas 35 amostras de sangue de ninhegos pertencentes a uma população reprodutiva
localizada em Rio Claro (SP). Resultados: Seguiu-se a amplificação e a genotipagem de 16 indivíduos para cada
loco de microssatélite prospectado e, do total de dez locos analisados, seis se mostraram monomórficos e quatro
polimórficos. O loco Bi01 apresentou quatro alelos: 263, 265, 267 e 269, com as freqüências alélicas de 0,030, 0,439,
0,515 e 0,015 respectivamente; Bi05 com 2 alelos: 288 e 292, com frequências de 0,114 e 0,886; Bi13 com 2 alelos:
191 e 193, com frequências de 0,094 e 0,906; e Bi15 com 2 alelos: 199 e 201, com frequências de 0,300 e 0,700.
Conclusões: O número relativamente baixo de locos microssatélites encontrados já era esperado, assim como a
porcentagem de locos polimórficos encontrada até o momento (40%) e o número de alelos por loco (2 a 4). A baixa
freqüência de locos polimórficos de microssatélites no genoma das aves é fato bem estabelecido na literatura.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP (2010/15205-8).
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Análise de componentes principais dos valores
genéticos de características de produção de ovos de
aves White Leghorn
Savegnago, RP1; Ramos, SB2; Nascimento, GB3; Ledur, MC4; Schmidt, GS4; Munari, DP5
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Doutorado, FCAV/UNESP, Bolsista FAPESP
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Mestrado, FCAV/UNESP, Bolsista FAPESP
3
Graduando em Ciências Biológicas, FCAV/UNESP
4
Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC, Brasil
5
Departamento de Ciências Exatas, FCAV/UNESP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Peso do ovo, Peso Corporal, Idade à Maturidade Sexual, Períodos Parciais
No presente trabalho, o objetivo foi verificar a associação genética de características relacionadas à postura de
ovos por meio da análise de componentes principais e identificar qual(is) característica(s) poderiam auxiliar o
processo de seleção para melhorar a postura das aves. As características avaliadas foram medidas na linhagem
CC de aves de postura da raça White Leghorn, desenvolvida e mantida sob seleção pela Embrapa Suínos e Aves,
em Concórdia, SC. Foram utilizados os valores genéticos da taxa de postura total (VGPtotal) da 17ª a 70ª semana
de idade (totalizando 54 semanas de produção), da taxa de postura inicial da 17ª a 30ª semana (VGP1730) e da
17ª a 40ª semana (VGP1740), da taxa de postura residual da 30ª a 70ª (VGP3070) e da 40ª a 70ª semana de idade
(VGP4070), da idade a maturidade sexual (VGIMS), dos pesos corporais às 54ª e 62ª semana de idade (VGPC54 e
VGPC62), dos pesos dos ovos às 32ª, 37ª e 40ª semana de idade (VGPO32, VGPO37, VGPO40) e da relação alturalargura dos ovos medidos nas mesmas semanas (VGREL32, VGREL37 e VGREL40). Para a análise de componentes
principais, os valores genéticos (VG) das características foram padronizados por z = (x - x ) / s, em que z é o
valor padronizado dos valores de x, x a média da característica e s o respectivo desvio-padrão. A escolha dos
componentes principais que explicaram a maior parte da variação do conjunto de dados foi determinada por
aqueles com autovalores superiores à 1, segundo o critério de Kaiser. Observou-se que, das 14 dimensões originais,
67,57% da variação total das características foi mantida em três variáveis latentes ortogonais, denominadas
componentes principais. Os componentes principais 1 (CP1), 2 (CP2) e 3 (CP3) explicaram, respectivamente,
32,30%, 18,71% e 16,56% da variação total das características. A ortogonalidade entre as variáveis do eixo CP1
(VGPO32, VGPO37, VGPO40, VGREL32, VGREL37, VGREL40, VGPC54 e VGPC62) com as do eixo CP2 (VGP1730,
VGP1740, VGP3070, VGP4070 e VGPtotal) indicou baixa associação genética entre as variáveis do CP1 com as do
CP2. Logo, podem-se selecionar características relacionadas à produção de ovo sem muitas consequências para
o peso corporal e peso de ovos. Observou-se que no eixo CP3 existiu tendência dos indivíduos que possuíram
maiores valores genéticos para VGIMS (postura tardia do primeiro ovo) terem maiores VGP3070 e VGP4070 e
baixos valores genéticos para VGP1730 e VGP1740, quando VGPtotal tendeu a ser alto. Isso indicou que a
produção de ovos dessas aves poderia ser maior se fosse melhorada a postura nos períodos iniciais (até 40 semanas
de idade) e pela redução da idade à maturidade sexual e uniformização da produção de ovos neste período.
Apoio financeiro: FAPESP, Embrapa Suínos e Aves
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80
Identificação de polimorfismos nos genes MC4R,
FGFBP1 e FGFBP2 em galinhas
Felício, AM1; Boschiero, C1; Silva, NA1; Ledur, MC2; Jorge, EC1; Coutinho, LL1
Laboratório de Biotecnologia Animal - ESALQ/USP, Piracicaba – Brasil
Embrapa Suínos e Aves, Concórdia - Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: crescimento, genes candidatos, genômica, melhoramento genético, polimorfismos de base única
Polimorfismos de base única (SNPs) podem ser utilizados como alternativa aos marcadores microssatélites para
o mapeamento de QTLs (loci que controlam características quantitativas), por meio de análise de associação
com características de interesse econômico. O estudo de polimorfismos em genes candidatos tem contribuído
para a descoberta de informações genéticas que poderão ser incorporadas aos programas de melhoramento
genético avícola. Os genes candidatos receptor da melacortina 4 (MC4R), proteína de ligação do fator de crescimento
do fibroblasto 1 (FGFBP1) e proteína de ligação do fator de crescimento do fibroblasto 2 foram selecionados por
posição e função. O gene MC4R está localizado em uma região do cromossomo 2 da galinha (GGA2), onde foi
mapeado um QTL para peso vivo aos 42 dias na população F2 da Embrapa obtida pelo cruzamento de machos
de corte com fêmeas de postura. Este gene está associado com peso vivo, obesidade, regulação do consumo
alimentar e do balanço energético, crescimento e carcaça. Os genes FGFBP1 e FGFBP2 apresentam um papel
importante na regulação negativa da proliferação celular e crescimento. Estes genes estão localizados em uma
região do GGA4, onde foi mapeado um QTL para peso vivo aos 41 dias na mesma população experimental. O
objetivo deste trabalho foi identificar polimorfismos nos genes MC4R, FGFBP1 e FGFBP2 na geração F1 desta
população. Foram desenhados três pares de primers, um em cada gene selecionado para amplificar fragmentos
de 700 a 800 pb em regiões de exons e introns. A amplificação das regiões por PCR foi seguida de purificação
com isopropanol 65% e etanol 70%, e sequenciamento no sequenciador automático ABI PRISM 3100 Genetic
Analyzer (Applied Biosystems). Para a detecção dos polimorfismos, as sequências de nucleotídeos obtidas foram
analisadas e alinhadas com o auxílio dos programas Phred, Phrap e Consed. Foram detectados sete SNPs nos três
genes estudados: dois no gene MC4R (região de exon), três no FGFBP1 (exon) e dois no FGFBP2 (exon e intron).
Os polimorfismos encontrados nas regiões de exons dos três genes não acarretaram alterações nos aminoácidos
e consequentemente na proteína. Os SNPs detectados nestes genes deverão ser investigados nos animais da
geração F2 para testar se estão associados com características de interesse econômico para a indústria avícola,
visando o desenvolvimento de marcadores genéticos que possam ser utilizados em programas de seleção.
Apoio Financeiro: CNPq
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
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Acréscimo na natureza de araras-canindés (Ara
ararauna, Psittaciformes:Aves) provenientes do tráfico
ilegal com auxílio de análise de seqüências de DNA
Fernandes, GA1; Barros, ER2; Caparroz, R1
Laboratório de Genética e Biodiversidade - Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Goiás, Campus II – Samambaia, Goiânia, GO
2
Consultório veterinário especializado no atendimento de aves. Rua Senador Milton Campos, 58, Brooklin, São Paulo, SP
[email protected], [email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: Psittacidae, região controladora, neighbor-joining, DNA mitocondrial
O tráfico de fauna representa uma das principais ameaças à biodiversidade brasileira. Cerca de 80% dos animais
apreendidos são aves, sendo que dessas 15% são psitacídeos. Apesar de um grande número de indivíduos não
sobreviver, dos que sobrevivem, muitos são recuperados e estão, em teoria, aptos para voltarem à natureza.
Contudo, a realização de acréscimo de indivíduos na natureza deve ser conduzida com cautela, já que efeitos
negativos podem ser causados para as populações locais se inseridos nelas indivíduos de grupos genéticos
diferentes (p. ex. depressão exogâmica). O presente trabalho teve por objetivo identificar a relação genética de oito
araras-canidés apreendidas e selecionadas para acréscimo no nordeste de Goiás com a população local, visando
com isso minimizar eventuais problemas genéticos para a população receptora. A relação genética entre as aves foi
avaliada por comparação de um fragmento de 403pb da região controladora do DNA mitocondrial com seqüências
homólogas de araras-canindés de diferentes regiões do Brasil disponíveis no genbank (inclusive do nordeste de
Goiás) por meio da análise das distâncias genéticas entre as seqüências pelo método de neighbor-joining, aplicando
o modelo de substituição Tamura-Nei, com 1.000 réplicas de bootstrap, com auxílio do programa Mega 4.1. Estudo
recente baseado no DNA mitocondrial mostrou que existem três grupos geográficos de arara-canindé no Brasil:
(I) grupo do oeste, compreendendo o noroeste de Minas Gerais, sul de Tocantins e o nordeste de Goiás, (II) grupo
do leste, compreendendo o sudoeste de Goiás e a região central de Mato Grosso do sul, e (III) grupo do Pará,
compreendendo o estado do Pará. Das oito araras analisadas, cinco apresentaram proximidade genética com as
araras do grupo do oeste, duas com as do grupo do leste, e uma com as do grupo do Pará. Os resultados obtidos
sugerem que as cinco araras com proximidade genética com o grupo do oeste, seriam as mais indicadas para
acréscimo na região do noroeste de Goiás. Contudo, o acréscimo dessas aves deverá seguir todas as recomendações
técnicas exigidas pelos órgãos ambientais competentes, principalmente de monitoramento pós-soltura.
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Filogeografia de Polystictus superciliaris
Costa, LC¹; Nascimento, ACA¹; Chaves, AV¹; Vasconcelos, MF²; Santos, FR¹
¹Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular- Universidade Federal de Minas Gerais
²Pontifícia Universidade Católica de Minas Gerais
[email protected]
Palavras-chave: filogeografia, Polystictus superciliaris, Tyrannidae, DNA mitocondrial, COI
O papa-moscas-de-costas-cinzentas, Polystictus superciliaris, pertence à família Tyrannidae, uma linhagem
Suboscines da ordem Passeriformes, e é considerado quase ameaçado pela IUCN. A espécie é endêmica
dos campos cerrados e campos rupestres dos topos de morro do sudeste brasileiro, sendo encontrada nos
estados de São Paulo, Minas Gerais e Bahia entre 1000 e 1600m de atitude. O objetivo do estudo é caracterizar
a distribuição da variabilidade genética da espécie no espaço e no tempo. Foram analisados 29 indivíduos
provenientes de 10 localidades geográficas a partir do seqüenciamento de 1266 pb do DNA mitocondrial (586pb
do gene COI e 682pb do gene ND2). Para a análise dos dados foram usados os softwares Phred-Phrap-Consed,
MEGA 4, DnaSP, NETWORK e GENELAND. Foram encontrados 13 haplótipos, sendo a diversidade nucleotídica
estimada em 0,002 e a diversidade haplotípica em 0,796. A alta diversidade haplotípica se deve à grande presença
de caracteres exclusivos de alguns indivíduos. A construção de uma rede de haplótipos usando o método
median-joining revelou uma estrutura em forma de estrela, o que sugere expansão populacional e diversificação
recente. Este dado é suportado pelo valor negativo (-1,85) obtido no teste D de Tajima. A árvore construída
com os haplótipos, usando-se o método Neighbor Joining e o modelo evolutivo K2p, mostra os haplótipos da
região mais ao sul na distribuição da espécie como basais, sugerindo colonização no sentido de sul para norte.
A análise dos dados no software GENELAND revelou a presença de duas populações: Quadrilátero Ferrífero e
Cipó-Serras do Norte. O AMOVA utilizando essa divisão obteve resultados significativos com estruturação
média( fST = 0.13, p = 0,002). Os resultados mostram o cenário de uma expansão populacional recente e uma
diversidade haplotípica significativa, apesar do pequeno tamanho amostral. É observada ainda uma divisão
entre populações norte-sul de acordo com diferentes fitofisionomias de afloramentos ferruginosos e calcários.
Apoio financeiro: FAPEMIG
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Sexagem e sequenciamento parcial do gene CHD-1/Z
de Mimus saturninus taxidermizado
Matsui, QYP1; Mota, AJ4; Back-Brito, GN2; Pereira, DB1; da Silveira, NJF3; Mittmann, J1
Laboratório de Parasitologia e Biotecnologia, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba
Departamento de Biociência e Diagnostico Bucal,Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho
3
Departamento de Ciências Exatas,Universidade Federal de Alfenas
4
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociência, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mimus saturninus, CHD1 –Z, Seqüenciamento.
Os cromossomos sexuais na maioria dos pássaros são heteromórficos, caracterizados por um grande cromossomo
Z e um cromossomo W menor heterocromático. Estudos recentes indicam que o cromossomo W o mais polimórfico
entre eles. O cromossomo Z é fortemente conservado em todas as aves entretanto, em estudo anterior observamos
um polimorfismo de tamanho justamente entre os amplicons de um intron do gene CHD1-Z de Mimus saturninus
(Mimidae) e Ara ararauna (Psitacídae). O presente estudo teve por objetivos contribuir para o conhecimento do
gene CHD, amplamente utilizado em sexagem molecular e adequar a metodologia da sexagem para estudo de
aves taxidermizadas. Bulbos de 0,5 cm de seis penas da cauda de M. saturninus taxidermizado foram lavados em
álcool 70% e em água destilada. Procedeu-se lise alcalina com 20µL de 0,2 M NaOH (20 min à 75ºC), em seguida
foi adicionado 180 µL de Tris-HCl 0,04M, pH 7,5. A PCR foi realizada utilizando 8 µL do produto de extração, 20
mM Tris - HCl, pH 8,4, 500 mM KCl; 3 mM de MgCl2, 2 mM de dNTP’s; 50 pmol de cada oligonucleotídio (P2/
P8), 1U Taq DNA polimerase (LGC) e água ultrapura para um volume final de 50 µL nas seguintes condições de
termociclagem: 5 min a 95°C, 36 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 51° e 72°C por 1 min e etapa final a 51°C por 2
min e 72°C por 5 min. Os amplicons foram clonados no vetor PCR 2.1-TOPO (Kit TOPO TA cloning - Invitrogen).
Dos 11 clones obtidos 4 foram selecionados para sequenciamento automático (ABI 3100 da Applied Biosystems)
utilizando o Kit DYEnamic Et Terminator Cycle Sequencingo (Amersham®). Os eletroferogamos foram analisados
segundo o pipeline PHRED, PHD2FASTA e CROSS MATCH. Com esse processamento obteve-se arquivos
“Singlets” (seqüências fasta) que foram comparados com o banco de seqüências nucléicas não redundantes
(nr), obtido do site <ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db> utilizando o programa “Basic Local Alignment Search Tool”
(BLAST), configurado na opção “blastn”. Um dos clones sequênciados apresentou o inserto do intron do gene
CHD-Z de M. Saturninus. Após análise da sequência de 349 pb obtida com demais sequências depositadas para
o mesmo gene, as maiores identidades encontradas foram entre o intron do gene CHD-Z de Passer montanus
(GU370351.1) com 94% de identidade (e-value 5e-147) e o de Turdus merula (DQ517891.1) com 93% de identidade
(e-value 6e-143). Após as análises computacionais a sequência foi incluída no NCBI número de acesso GQ472931.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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Expressão gênica de Paired box 7 (Pax7) durante o
desenvolvimento muscular de Gallus gallus
Ninov, K1; Mourão, GB1, Alves, HJ1; Jorge, EC1; Ledur, MC2; Coutinho, LL1
Departamento de Zootecnia - ESALQ/USP, Piracicaba, SP – Brasil
Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC - Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Miogênese, mioblastos, células satélites, aves, proliferação celular
Diversos estudos relatam o envolvimento da família de genes Pax (Pax3 e Pax7) na miogênese e no crescimento
muscular pós-natal. Pax7 é expresso nas células satélites musculares, que são as células que mantém a capacidade
proliferativa do músculo em resposta a regeneração e crescimento (hipertrofia). Este gene é expresso nas células
satélites em estado quiescente e também quando ativadas para produzir novas fibras, mas tem expressão reduzida
durante a diferenciação desses novos mioblastos. Neste estudo, a expressão do gene Pax7 foi acompanhada na
musculatura peitoral de duas linhagens de galinhas de composições genéticas distintas: uma de corte, selecionada
para maior deposição de massa muscular, e uma de postura, caracterizada pela baixa taxa de crescimento e pouca
massa muscular, na tentativa de associar este gene como marcador para deposição de massa muscular. Foram
utilizados 90 animais distribuídos nas duas linhagens e cinco estádios de desenvolvimento: 9 e 17 dias da fase
embrionária e 1, 21 e 42 dias da fase pós-eclosão. A expressão gênica foi analisada por PCR quantitativa em tempo
real. Os dados foram normalizados utilizando-se um fator de correção dos genes βactina, EEF1, GAPDH, MRPS27
e RPL5 e submetidos à análise de variância, seguido pelo teste Tukey para comparação de médias. Na ontogenia de
Pax7, as duas linhagens apresentaram maior nível de expressão de RNAm nas idades embrionárias, diminuindo (P
<0.05) o nível gradativamente nos dias pós-eclosão. O RNAm do gene Pax7 foi mais expresso na linhagem de corte
em relação a de postura no dia 1 (P <0.05), e mais expresso na linhagem de postura em relação a de corte aos 42
(P <0.05) dias pós-eclosão. Estes resultados indicam que já se observa uma diferença significativa na proporção de
células satélites entre as linhagens estudadas, sugerindo que a musculatura da linhagem de corte apresenta um
potencial maior de crescimento pós-natal em relação à linhagem de postura. A proporção dessas células na linhagem
de postura só é maior em relação à linhagem de corte aos 42 dias pós-natal, quando a linhagem de corte apresenta
marcante hipertrofia das fibras musculares. No futuro, estudos de genes marcadores de diferenciação celular
deverão ser realizados, no intuito de auxiliar o entendimento do processo de desenvolvimento muscular in vivo.
Apoio financeiro: CNPq
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Estudo citogenético de populações amazônicas
de Phyllomedusa hypochondrialis (Anura, Hylidae,
Phyllomedusinae) sugere a existência de um complexo de
espécies
¹Bruschi, DP; ²Busin, CS; ³Toledo, LF;4 Lima, AP; 5Lima, JRF; ¹ Recco-Pimentel, SM
¹ Departamento de Anatomia, Biologia Celular, Fisiologia e Biofísica, Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP
² Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Passo Fundo (UPF), Passo Fundo, RS
³ Museu de Zoologia “Prof. Adão Cardoso” (ZUEC), Instituto de Biologia Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP.
4
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, AM.
5
Instituto de Pesquisas Científicas e Tecnológicas do Estado do Amapá, Macapá, AP.
E-mail: [email protected]
Palavras-chave: Phyllomedusa, Cariótipo, Heterocromatina, NOR, taxonomia
A espécie Phyllomedusa hypochondrialis tem distribuição essencialmente amazônica ou associada a esta região.
Populações dessa espécie, no entanto, apresentam variações de morfologia externa, especialmente em caracteres de
diagnose e separação de outras duas espécies morfologicamente muito semelhantes, como P. azurea, o que dificulta
sua identificação taxonômica. Neste trabalho, analisamos citogeneticamente populações de P. hypochondrialis
de Belterra (PA), Laranjal do Jari (AP), e Prainha (PA), além de um espécime de Phyllomedusa cf. hypochondrialis
proveniente de Alta Floresta/MT. Os dados foram comparados com de outras populações previamente
analisadas. As preparações cromossômicas foram submetidas à coloração com Giemsa 10%, ao bandamento C e
à impregnação pela prata (Ag-NOR). Os cariótipos de todas as populações apresentaram fórmula cromossômica
2n= 12M+12SM+2ST. Foram detectados blocos de heterocromatina centromérica e pericentromérica no par 7p
em todos os cariótipos. Heterocromatina telomérica foi detectada em 9p de Belterra e Laranjal do Jari, além de
blocos intersticiais em 8q em todos os cariótipos e em 8p de Belterra e Alta Floresta. A NOR foi detectada apenas
no par 8, pericentromericamente em 8q nas populações de Laranjal do Jari/AP e Prainha/PA e intersticial em
8p na população de Belterra. No espécime de Alta Floresta/MT foi detectado um heteromorfismo na posição da
NOR entre os homólogos do par 8, sendo pericentromérica (morfo 8a) e intersticial (morfo 8b). Adjacente à NOR
foi detectado um bloco heterocromático, telomérico no morfo 8a e pericentromérico no morfo 8b, o que sugere a
ocorrência de uma inversão paracêntrica neste cariótipo. A morfo 8b parece ter homologia com o cromossomo 8
da população de Belterra, também portador da NOR na mesma região. Populações previamente analisadas de P. cf.
hypochondrialis da Chapada dos Guimarães e Santa Teresinha (MT) apresentam NOR em 8q, enquanto populações
de Phyllomedusa sp. (aff. hypochondrialis) de Bacabeira, Alumar e Urbano Santos (MA) e de Porto Nacional (TO)
apresentaram NOR em 7p. Phyllomedusa azurea apresenta NOR pericentromérica em 4p separando esta espécie das
populações de P. hypochondrilais analisadas. A variação de NOR sugere a existência de mais de um táxon sob o nome
P. hypochondrialis e, possivelmente, este táxon comporte um complexo de espécies morfologicamente relacionadas.
A separação e descrição de espécies crípticas pode ter implicações para a conservação de anfíbios na Amazônia.
Apoio financeiro: CNPq; FAPESP e CAPES/PROEX
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Cariótipos de cinco espécies de Leptodactylus
(Amphibia, Anura, Leptodactylidae) analisados com
técnicas de citogenética clássica e molecular
Gazoni, T; 2Araújo, OGS; 3Narimatsu, H; 2Haddad, CFB; 1Kasahara, S
1
Departamento de Biologia
Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro, SP
3
Universidade Braz Cubas, Mogi das Cruzes, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Ag-RON, bandas C, FISH, sondas de DNAr, sondas teloméricas
O gênero Leptodactylus compreende 88 espécies que mostram ampla distribuição no continente americano,
com predominância na região Neotropical. Até o presente, menos de 40 espécies foram cariotipadas, a maioria
apresentando 2n=22 e NF=44. Números diplóides discrepantes iguais a 18, 23, 24 e 26 foram também relatados,
principalmente nas espécies de Adenomera e Lithodytes que passaram a integrar o gênero Leptodactylus a partir
de 2006. São apresentados dados citogenéticos adicionais de L. chaquensis, L. labyrinthicus, L. marmoratus, L. cf.
petersii e, pela primeira vez, de L. rhodomystax. As espécies foram coletadas, respectivamente, em Três Lagoas, MS,
Rio Claro, SP, Biritiba Mirim, SP e Paranaíta, MT, caso das duas últimas. Cromossomos metafásicos foram obtidos
a partir de preparações diretas ou de cultura de linfócitos e analisados com coloração convencional, Ag-RON,
bandamento C, bem como pela técnica de FISH com sondas de DNAr e telomérica, essa última sonda somente em
duas das espécies. Com exceção de L. marmoratus que apresentou 2n=24 e NF=34, com sete pares de cromossomos
telocêntricos, as demais possuem 2n=22 e NF=44, e cariótipos similares com coloração convencional. L. chaquensis
e L. labyrinthicus têm o organizador nucleolar no par 8, o que é frequente no gênero, sendo que em ambas a AgRON marca na região terminal dos braços curtos. Em L. petersii, as Ag-RONs estão na região proximal dos braços
longos dos cromossomos 4, enquanto em L. rhodomystax, na região terminal dos braços longos dos cromossomos
3. L. marmoratus apresentou Ag-RONs múltiplas, com marcação em quatro telocêntricos dos pares 6 e 8. O padrão
de banda C é predominantemente centromérico em todas as espécies, porém, L. chaquensis, L. cf. petersii e L.
rhodomystax mostraram marcações adicionais em alguns cromossomos, nas regiões terminais, intersticiais ou
mesmo coincidentes com os sítios das Ag-RONs. É importante ressaltar que em L. rhodomystax os cromossomos 2
mostram bandas C intersticiais heteromórficas nos braços curtos. Os procedimentos de FISH com sondas de DNAr
confirmaram as Ag-RONs como sítios contendo sequências ribossômicas para todas as espécies, inclusive no caso
de L. marmoratus com Ag-RONs múltiplas. As sondas teloméricas empregadas somente nos cromossomos de L.
labyrinthicus e L. marmoratus hibridaram nas regiões dos telômeros, porém, nessa última foi detectado sinal adicional
na região centromérica dos metacêntricos 1. Os dados obtidos reforçam a necessidade de se aplicar outras técnicas,
como a de coloração com fluorocromos base-específicos e de replicação após incorporação de BrdU, nas espécies de
Leptodactylus do presente trabalho, assim como estender as análises para um número maior de representantes, com
o objetivo de se buscar marcadores citológicos que sejam úteis para o entendimento dos mecanismos de evolução
cromossômica e dos processos de diferenciação cariotípica interespecífica e mesmo em nível de populações.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
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Análise citogenética de Proceratophrys bigibbosa
(Cycloramphidae) e Physalaemus gracilis (Leiupridae)
do Parque Municipal de Sertão/RS
Sielski, MS; Souza, VT; Liné, MA; Oliveira, FB; Zanella, N; Busin, CS.
Laboratório de Citogénica Animal - Instituto de Ciências Biológicas – Universidade de Passo Fundo/UPF/RS
[email protected]
Palavras-chave: cariótipo, anura, heterocromatina, NOR
O Parque Municipal de Sertão é uma área de aproximadamente 500 hectares de mata, localizado ao norte do
Estado do Rio Grande do Sul e faz parte do bioma Mata Atlântica. Para esta região não há informações sobre
a citogenética dos anfíbios Proceratophrys bigibbosa (Cycloramphidae) e Physalaemus gracilis (Leiuperidae).
Com distribuição na região central e norte do Rio Grande do Sul, nordeste da Argentina e, provavelmente, no
Paraguai a espécie P. bigibbosa, caracteriza-se por apresentar corpo robusto, focinho curto e, arredondado em
vista dorsal, duas protuberâncias ósseas na cabeça, dorso castanho-escuro a castanho-claro e o ventre vermelho
e manchado com preto. Já P. gracilis distribui-se pelo sul do Brasil, no Uruguai, na Argentina e provavelmente
no Paraguai. Apresenta tegumento dorsal geralmente cinzento-castanho claro, faixa lateral castanho escuro
com bordas brancas dorsais e ventrais desde o rosto até o olho e deste até a região inguinal. Com o objetivo de
caracterizar citogeneticamente P. bigibbosa e P. gracilis provenientes do Parque Municipal de Sertão/RS, foram
analisados dois machos e três fêmeas de P. bigibbosa e três fêmeas de P. gracilis. As preparações cromossômicas,
obtidas por suspensão de células do epitélio intestinal e dos testículos, foram analisadas por meio da coloração
convencional dos cromossomos, do bandamento C e da impregnação pela prata (Ag-NOR). Nos exemplares de P.
bigibbosa o número cromossômico é 2n=22, metacêntricos (pares 1, 6, 8 e 11), submetacêntricos (2, 4, 5, 7, 9 e 10)
e subtelocêntrico (3). O padrão heterocromático é essencialmente centromérico. A NOR foi detectada na região
pericentromérica dos braços curtos dos cromossomos do par 3 com duplicação em um dos homólogos, em 100%
dos espécimes analisados. O cariótipo de P. gracilis é formado por 2n=22 cromossomos, sendo os pares 1, 4, 6, 9 e 11
metacêntricos e os pares 2, 3, 5, 7, 8 e 10 submetacêntricos. O padrão heterocromático é também é exclusivamente
centromérico. A NOR foi detectada em 8p localizando-se pericentromericamente em um dos homólogos
(morfo a) e subtelomérica no outro (morfo b). Todos os indivíduos analisados apresentaram heteromorfismo no
tamanho das NORs entre os homólogos. Portanto, P. bigibbosa apresenta cariótipo 2n=22 cromossomos meta,
submeta e subtelocêntricos, heterocromatina centromérica em todos os cromossomos e NOR localizada em 3q
e P. gracilis, apresenta 2n=22 cromossomos meta e submetacêntricos, heterocromatina centromérica também
em todos os cromossomos e NOR em 8p na região pericentromérica em um dos homólogos (morfo a) e na
região subtelomérica (morfo b) no outro, evidenciando um processo de inversão no braço p desse cromossomo.
Apoio financeiro: UPF
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Caracterização citogenética de Melanophryniscus
devincenzii (Anura, Bufonidae) do Parque Municipal de
Sertão/RS
Gatto, KP¹; Ferreira, JR¹; Sielski, MS¹; Zanella, N²; Busin, CS¹
¹Laboratório de Citogenética Animal, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Passo Fundo
²Laboratório de Zoologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Passo Fundo, Passo Fundo/RS
[email protected]
Palavras-chave: cariótipo, heterocromatina, NOR, heteromorfismo cromossômico
A família Bufonidae apresenta 550 espécies com ampla distribuição em todo o planeta, exceto nas áreas polares e
algumas ilhas oceânicas. O gênero Melanophryniscus, considerado monofilético e basal entre a família Bufonidae,
é composto por 25 espécies. A espécie Melanophryniscus devincenzii, pertencente ao grupo Melanophryniscus
tumifrons, era conhecida somente para o nordeste do Uruguai e norte da Argentina e, recentemente, foi descrita
também para o Brasil no norte do Rio Grande do Sul. Com o objetivo de caracterizar citogeneticamente uma
população de M. devincenzii, coletados em solo brasileiro e contribuir para o conhecimento da herpetofauna
brasileira e especificamente do parque Municipal de Sertão/RS, foram analisadas quatro fêmeas de
Melanophryniscus devincenzii, coletados no Município de Sertão/RS (28o02’19’’ S; 52o12’32’’ W). As metáfases,
obtidas por suspensão de células de epitélio intestinal, foram submetidas à coloração convencional com Giemsa
para montagem do cariótipo, ao bandamento C para a determinação do padrão heterocromático do genoma e
a impregnação por prata (Ag-NOR) para a localização das regiões organizadoras de nucléolo (NOR). Todos os
espécimes apresentaram 2n=22, com cromossomos metacêntricos (1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 e 11) e submetacêntricos (4
e 5). Em dois espécimes os cromossomos do par 1 apresentaram evidente heteromorfismo de tamanho. O padrão
de bandamento C revelou a existência de heterocromatina nas regiões centroméricas de todos os cromossomos.
Nos dois cariótipos que apresentaram heteromorfismo no tamanho dos cromossomos do par 1 foi evidenciado
também, heteromorfismo no tamanho da banda centromérica que, no cromossomo maior, se estende pela região
pericentromérica de ambos os braços cromossômicos. A NOR foi detectada na região telomérica dos braços longos
dos homólogos 5. A espécie M. devincenzii apresenta 2n=22 cromossomos meta e submetacêntricos, o padrão
heterocromático é essencialmente centromérico e a NOR está localizada na região telomérica dos braços longos
dos homólogos do par 5. Estes resultados corroboram os já descritos para a espécie para localidades não brasileiras.
Apoio financeiro: Universidade de Passo Fundo - UPF
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Microdissecção e Pintura Cromossômica de
cromossomo B de Hypsiboas albopunctatus
(Anura, Hylidae)
Gruber, SL1; Diniz, D3; Sobrinho-Scudeler, PE2; Foresti, F2; Kasahara,S1.
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro, SP
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista, UNESP - Botucatu-SP
3
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, UESB- Jequié – BA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: anfíbios, cromossomo B, DOP-PCR, microdissecção, FISH
Cromossomos B têm sido descritos em muitos grupos de plantas e animais. Compartilham algumas características
que os diferenciam dos cromossomos do complemento A, isto é, são dispensáveis, apresentam variação em
frequência intra e inter-individualmente, têm natureza predominantemente heterocromática e comportamento
instável durante a divisão celular, não seguindo padrão mendeliano de herança. Apesar de terem sido analisados,
em alguns casos, com o uso de técnicas de biologia molecular, a origem, estrutura e evolução dos Bs permanecem,
ainda, não completamente esclarecidas. Em anfíbios, cromossomos B são raros, tendo sido descritos em cerca
de 2% do número total de espécies cariotipadas. No hilídeo Hypsiboas albopunctatus, o número diploide é de
2n=22, mas alguns exemplares mostram cariótipo com 2n=22 +1B, sendo o supernumerário um metacêntrico de
tamanho médio, semelhante aos cromossomos 8 que são os portadores de Ag-RON. O bandamento C revelou
que o B é quase todo heterocromático, mostrando padrão tardio de replicação pela incorporação de BrdU. A
dupla coloração com os fluorocromos DAPI/CMA3 revelou apenas uma pequena banda DAPI brilhante na
região intersticial dos braços curtos. Na meiose, o B permanece sempre como univalente nas fases de diplóteno
e metáfase I. No presente trabalho, o cromossomo B de H. albopunctatus foi analisado através de técnicas de
citogenética molecular. Inicialmente, uma amostra de quatro cromossomos B foi isolada a partir de células
em metáfase I com o uso de micromanipulador com agulha de vidro, instalado em microscópio invertido. O
material assim obtido foi amplificado duas vezes pela técnica de DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide Primer
- Polymerase chain reaction) em rampa para garantir o anelamento dos primers degenerados com o DNA
molde do cromossomo B. O produto da PCR foi marcado com digoxigenina e utilizado como sonda na técnica
de FISH (Fluorescent in situ hibridization). O experimento de pintura cromossômica foi realizado em células do
próprio animal de cujas metáfases foram realizadas as microdissecções. Foi observada forte hibridação em toda
extensão do cromossomo B de células mitóticas e meióticas sem qualquer sinal em nenhum cromossomo do
complemento A, sugestivo de que os cromossomos A e B não compartilham sequências de DNA. No entanto,
novos experimentos são ainda necessários para obtenção de informações mais detalhadas que permitam
avançar no conhecimento acerca da origem e composição molecular do cromossomo B de H. albopunctatus.
Apoio: FAPESP e CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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90
Redução do número cromossômico em espécies do
gênero Engystomops e caracterização do cariótipo de
Engystomops coloradorum (Anura, Leiuperidae)
Targueta, CP1; Rivera, M2; Lourenço, LB1
Departamento de Anatomia, Biologia Celular, Fisiologia e Biofísica – Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), Campinas – SP
2
Citogenética de Anfíbios, Pontifícia Universidad Católica Del Ecuador, Ecuador..
[email protected]
1
Palavras-chave: Engystomops, cromossomos, Anura, Leiuperidae, cariótipo
As relações filogenéticas e a genética populacional de várias espécies do gênero Engystomops têm sido bastante
estudadas, especialmente com base em dados moleculares. No entanto, esse gênero ainda é pouco estudado
citogeneticamente. Suas espécies estão distribuídas por várias regiões do Equador, na América Central, no norte
da América do Sul e na região Amazônica de diversos países. O gênero é composto atualmente por 8 espécies
descritas e em alguns casos parece haver um complexo de espécies sendo erroneamente identificadas como uma
só, principalmente no que diz respeito às espécies amazônicas. Estudos filogenéticos anteriores mostraram que as
espécies E. petersi, E. freibergi e E. pustulosus estão agrupadas em um pequeno clado, Edentulus, enquanto o cladoirmão, Duovox, é composto pelas outras espécies: E. coloradorum, E. guayaco, E. randi, E. montubio e E. pustulatus.
Análises cariotípicas de diferentes populações das espécies amazônicas E. petersi e E. freibergi mostraram importantes
variações. Pouco se conhece, no entanto, sobre o cariótipo das outras espécies de Engystomops. Sabe-se apenas que
E. pustulosus apresenta cariótipo com 2n=22 e uma outra espécie ainda não descrita, Engystomops sp. D, apresenta
2n=20, com a região organizadora do nucléolo localizada no par 9. O objetivo do presente trabalho foi descrever
o número cromossômico das outras espécies do gênero e caracterizar o cariótipo de E. coloradorum quanto à
localização da NOR e de bandas heterocromáticas. Para isso, espécimes de E. coloradorum, E. guayaco, E. randi, E.
montubio foram coletados de diferentes localidades do Equador. Os animais foram colchicinizados e preparações
cromossômicas foram obtidas de células do intestino. As preparações foram submetidas à coloração por Giemsa
e, no caso daquelas referentes a E. coloradorum, também ao bandamento C e à impregnação pela prata. Todas as
espécies apresentaram 2n=20, ao contrário do que foi encontrado anteriormente para as espécies amazônicas e
para E. pustulosus (2n=22). O cariótipo de E. coloradorum apresentou a NOR localizada na região telomérica do
braço longo dos cromossomos do par 9. Regiões heterocromáticas foram localizadas em todos os centrômeros,
pericentromericamente no braço curto dos cromossomos do par 3, na região telomérica do braço longo dos
cromossomos do par 8, adjacente à NOR nos cromossomos 9 e intersticialmente no braço longo dos cromossomos
do par 10. Considerando que o grupo-irmão de Engystomops é Physalaemus, composto por espécies que apresentam
2n=22, é possível supor que houve uma redução do número diplóide no gênero Engystomops. No entanto, os
dados disponíveis ainda não permitem inferir os possíveis rearranjos cromossômicos envolvidos nesse processo.
Apoio: FAPESP, CAPES/PROEX
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Localização cromossômica diferencial de sequências
de DNAr 5S do tipo I e do tipo II em cariótipos de
anuros do gênero Engystomops
Rodrigues, DS1; Rivera, M2; Lourenço, LB1
Departamento de Anatomia, Biologia Celular, Fisiologia e Biofísica – Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP), Campinas – SP
2
Citogenética de Anfíbios, Pontifícia Universidad Católica Del Ecuador, Ecuador.
[email protected]
1
Palavras-chave: Anuros, FISH, marcador, gene ribossomal 5S, NTS.
O DNA ribossomal (DNAr) 5S é constituído por cópias conservadas de uma sequência de 120 pb organizadas in
tandem, intercaladas por espaçadores não-transcritos (NTS), os quais podem diferir em tamanho e composição
nucleotídica. O DNAr 5S tem servido como marcador genético e citogenético em estudos evolutivos e tem
auxiliado, inclusive, na identificação de espécies e híbridos. Em estudos anteriores, notamos que em anuros do
gênero Engystomops dois tipos de DNAr 5S, facilmente diferenciados pelo tamanho de suas unidades de repetição,
estão presentes. No entanto, naqueles estudos a localização cromossômica de cada um desses DNAr 5S não ficou
clara. As análises citogenéticas de diferentes populações das espécies amazônicas E. freibergi e E. petersi mostraram
interessantes divergências inter e intra-específicas, e um possível envolvimento de variações citogenéticas na
especiação incipiente foi sugerido. Ainda assim, os marcadores citogenéticos disponíveis não possibilitam uma
identificação apropriada de homeologias cromossômicas e, consequentemente, possíveis rearranjos responsáveis
por divergências cariotípicas permanecem desconhecidos. No presente estudo mapeamos as sequências de DNAr
5S do tipo I e do tipo II no cariótipo de E. freibergi e de espécimes de E. petersi, a fim de obter caracteres cromossômicos
adicionais para o estudo dessas espécies. Para tanto, unidades repetitivas inteiras correspondentes a cada tipo de
sequência e regiões que correspondiam especificamente a espaçadores não-transcritos foram isoladas por PCR a
partir de amostras do DNA genômico de indivíduos de E. freibergi provenientes da Boca do Tejo, Acre, Brasil, e de
E. petersi provenientes de Yasuní, Equador. Os fragmentos obtidos foram clonados, sequenciados, marcados com
digoxigenina e usados como sondas em experimentos de FISH. No cariótipo de E. freibergi, sondas referentes às
unidades repetitivas de DNAr 5S do tipo I e do tipo II hibridaram tanto na região pericentromérica do braço curto
do cromossomo 3 quanto na região distal do braço longo do cromossomo 6, embora as sondas do tipo II tenham
detectado preferencialmente essa segunda região. Já a sonda composta exclusivamente pelo NTS do DNAr 5S tipo
II detectou especificamente essa região distal de 6q. No cariótipo referente a E. petersi também foi possível notar a
presença de dois sítios de DNAr 5S, uma na região pericentromérica do braço curto do cromossomo 5 e outra na
região distal do braço longo do cromossomo 6. O FISH com o NTS do tipo II detectou especificamente a região distal
do cromossomo 6 nesse cariótipo. Esses dados sugerem a localização cromossômica diferencial das sequências de
DNAr 5S do tipo I e do tipo II. Tais sítios de DNAr 5S constituem novos marcadores cromossômicos, que permitiram
detectar uma grande semelhança dos cromossomos 3 e 6 do cariótipo de E. freibergi com os cromossomos 5 e 6,
respectivamente, do cariótipo de espécimes de E. petersi de Yasuní, sugerindo uma possível homeologia entre eles.
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Primeiro relato da presença do retrotransposon Rex1
em anuros
Nascimento, J1; Baldo, D2; Lourenço, LB1
Departamento de Anatomia, Biologia Celular, Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP
Faculdade de Ciências Exatas, Química e Natural, Universidade Nacional de Misiones, Argentina
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: sequências repetitivas, hibridação in situ, cromossomos, retrotransposon, Physalaemus ephippifer
Embora alguns elementos transponíveis tenham sido encontrados em genomas de espécies de anuros, estudos
acerca desses elementos têm sido muito escassos nesse grupo. A identificação desse tipo de sequência repetitiva
pode, entretanto, representar uma valiosa ferramenta para estudos de evolução cromossômica. O gênero
Physalaemus conta atualmente com 20 espécies já estudadas citogeneticamente das 43 já descritas e representa,
portanto, um interessante grupo para a investigação da presença de elementos transponíveis. No presente trabalho,
foi investigada a presença do retrotransposon Rex1 no genoma de cinco espécies de Physalaemus, pertencentes
a 4 dos 7 grupos reconhecidos nesse gênero. As sequências pertencentes a esses elementos foram isoladas
por PCR com o auxílio dos primers RTX1-F1 (TTCTCCAGTGCCTTCAACACC) e RTX1-R3 (TCCCTCAGCAG
AAAGAGTCTGCTC) a partir de amostras do genoma de espécimes de P. ephippifer provenientes de Belém-PA, de P.
albifrons de Vassouras-MA, P. spiniger de Guaraqueçaba-PR, P. albonotatus de Corrientes,-Argentina e P. henselii de
Uruguay. Os fragmentos amplificados foram clonados, sequenciados e, no caso de P. ephippifer, foram mapeados por
FISH. Fragmentos de 550 pb foram obtidos de P. albifrons, P. ephippifer, P. henselii e P. spiniger e a análise comparativa
com sequências depositadas no GenBank teve similaridade desses com parte da sequência codificadora da
enzima transcriptase reversa do elemento Rex1. A tradução em sequências de aminoácidos dos fragmentos de
Rex1 permitiu localizar claramente as regiões correspondentes aos domínios 3 a 7 da transcriptase reversa. A
sequência isolada de P. albonotatus apresentou uma deleção interna de cerca de 220 pb quando comparada com as
demais sequências correspondentes, aqui descritas ou disponíveis no GenBank, Isso permite sugerir que, embora
derivado de um elemento Rex1, esse segmento provavelmente deixou de ser um elemento de transposição ativo. O
fragmento Rex1 isolado de P. ephippifer foi mapeado na região heterocromática pericentromérica do braço curto
do cromossomo 3 no cariótipo dessa espécie. A região evidenciada permite clara distinção entre os cromossomos
3 e 4 de P. ephippifer, frequentemente confundidos se analisados apenas em relação à seu tamanho e morfologia.
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DNA satélite derivado do DNA ribossomal 5S em
Physalaemus cuvieri (Anura Leiuperidae)
Vittorazzi, SE¹; Lourenço, LB¹; Del-Grande, ML²; Recco-Pimentel, SM¹
¹Departamento de Anatomia, Biologia Celular e Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (Unicamp),
SP, Brasil
²Departamento de Ciências Naturais, Universidade do Sudoeste da Bahia (UESB), Vitória da Conquista, BA, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: DNA satélite, DNA ribossomal 5S, Citogenética, Anura, Physalaemus cuvieri.
A origem das sequências de DNA repetitivos no genoma dos eucariotos é muito discutida. No presente trabalho,
descrevemos o primeiro caso em anfíbios anuros de uma família de DNA satélite relacionada ao DNAr 5S,
cujas unidades de repetição são constituídas de 190 pb e podem ser isoladas a partir da digestão enzimática de
amostras de DNA genômico de Physalaemus cuvieri com EcoRI. Foram também detectadas duas formas de DNAr
5S, a sequência do tipo I com 201 pb e a do tipo II com cerca de 690 pb. As sequências foram obtidas de uma
população de P. cuvieri proveniente do município de Palmeiras, estado da Bahia, Brasil. A análise da sequência
de bases mostrou que o DNA satélite, denominado PcP190EcoRI, apresenta 70% de similaridade com a região
codificadora do DNAr 5S tipo I e 66% com a região codificadora do DNAr 5S tipo II. A hibridação em membrana
e a amplificação por PCR de unidades adjacentes a partir de DNA genômico mostraram que o PcP190EcoRI
é repetido in tandem. As sequências de DNA satélite e dos DNAr 5S foram localizadas nos cromossomos de P.
cuvieri por hibridação in situ fluorescente (FISH). A sequência PcP190EcoRI foi localizada nos centrômeros dos
cromossomos 1 a 5 e na região pericentromérica dos cromossomos do par 3. O tipo I de DNAr 5S foi detectado
no cromossomo 3, coincidente ao sítio do PcP190EcoRI, e o tipo II de DNAr 5S foi localizado na região intersticial
do braço longo do cromossomo 5. Nenhuma dessas sequências colocalizou em sítios dos genes ribossomais
de regiões organizadoras de nucléolo (NOR). A grande semelhança entre as sequências nucleotídicas do DNAr
5S e o PcP190EcoRI, e a co-localização dessas sequências na região pericentromérica do par 3 no cariótipo
de P. cuvieri sugerem que o PcP190EcoRI pode ter originado por um evento de duplicação do DNAr 5S tipo I.
Similarmente, a presença de dois tipos de DNAr 5S em cromossomos distintos pode ser resultado de eventos de
recombinação entre cromossomos não homólogos que levou à variação no tamanho e composição nucleotídica.
Apoio: FAPESP; CAPES/PROEX.
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Análise citogenética de Siphonops annulatus
(Amphibia, Gymnophiona), e presença de sistema
sexual XX, XY
Silva, SP; Santos, RA; Siqueira, S
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos (LAGOA), Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste
da Bahia (UESB), Jequié, Bahia, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, Ag-NOR, bandamento-C, Giemsa, Cromossomo Sexual
A Ordem Gymnophiona compreende 183 espécies, dentro desta, a família Caeciliidae possui o maior número, com
123 espécies distribuídas em 21 gêneros. São encontrados em quase toda a América do Sul. O gênero Siphonops
possui cinco espécies, S. annulatus, S. hardyi, S. insulanus, S. leucoderus e S. paulensis. Neste trabalho analisou-se
citogeneticamente espécimes de Siphonops Annulatus que foram coletados em um fragmento de mata de cipó no
municipio de Jequié-Ba. Os espécimes foram depositados na coleção do «Laboratório de Genética de Organismos
Aquáticos» (LAGOA), em Jequié, Bahia. Foram analisadas metáfases obtidas a partir de suspensão celular do
epitélio intestinal e as metáfases foram analisadas através de técnicas de coloração convencional com Giemsa,
bandamento-C e Ag-NOR. O número cromossômico encontrado foi 2n=24, sendo os pares autossômicos (1 a 11)
e o par sexual (12). O pares 1, 7, 8 são metacêntricos, os pares 2, 3, 4, 5, 6, 9 e 11 submetacêntricos e o par 10
subtelocêntrico. O par sexual apresentou sistema XX, XY, sendo o cromossomo X um cromossomo telocêntrico e
o Y um cromossomo metacêntrico. O padrão de bandamento-C revelou pouca heterocromatina centromérica e a
técnica de Ag-NOR evidenciou cístrons ribossomais ativos na região adjacente aos centrômeros do cromossomo
X e do braço maior do cromossomo Y. Até o momento apenas cerca de 15 espécies de cecílias foram analisadas
citogeneticamente, apresentando números diplóides 2n=20 a 42. Apenas uma espécie do gênero Siphonops foi
analisada citogeneticamente S. paulensis, com 2n=24 cromossomos. O sistema sexual XX, XY foi descrito para
pelo menos sete espécies. Os dados de morfologia cromossômica destes trabalhos pode-se evidenciar que o
cariótipo destas espécies e do presente trabalho são muito semelhantes, com exceção de pares telocêntricos
nas espécies com maior número cromossômico. Estes dados evidenciam alta conservação cromossômica
em Gymnophiona e futuros estudos poderão auxiliar nos estudos de evolução cromossômica deste grupo.
Apoio: CNPq, UESB
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Análise citogenética de duas espécies de Microhylidae
Stereocyclops incrassatus e Dermatonotus muelleri
(Amphibia, Anura) do sudeste da bahia
Santos, RA¹; Lantyer-Silva, ASF¹; Zanoni, JB¹; Solé, M²; Siqueira, S¹
¹Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos (LAGOA), Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste
da Bahia (UESB), Jequié, Bahia, Brasil
2
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: Heterocromatina, Poliploidia, Cariótipo, Bandamento C, Ag-NOR.
A família Microhylidae compreende um grupo de anfíbios anuros que possuem hábito de vida fossorial.
Atualmente possui 466 espécies distribuídas em 55 gêneros e 11 subfamílias. Encontrados nas Américas, África
Subsariana, Índia, Coréia do Sul e norte da Austrália. Neste trabalho foram estudados citogeneticamente dois
gêneros, Stereocyclops e Dermatonotus. Stereocyclops possui duas espécies S. incrassatus e S. parkeri e é endêmico da
Mata Atlântica, desde o leste do estado de São Paulo (Ilha-bela) até a porção sul do estado da Bahia. Dermatonotus é
monoespecífico e encontrado na Argentina, leste da Bolívia, Paraguai e Brasil onde se distribui pelo Maranhão,
Goiás e São Paulo. Quatro espécimes de S. incrassatus foram coletados na UESC em uma floresta de Cabruca,
três espécimes de D. muelleri foram coletados em um fragmento de mata de cipó no município de Jequié – Bahia;
sendo depositados na coleção do “Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos” (LAGOA), em Jequié,
Bahia. Foram analisadas metáfases obtidas a partir de suspensão celular do epitélio intestinal, através de técnicas
de coloração convencional com Giemsa, Ag-NOR e bandamento-C. O número cromossômico encontrado para os
gêneros foi 2n = 22, tendo NF = 44. Em S. incrassatus os pares 1, 6 e 9 são metacêntricos, enquanto os pares 2 a 5,
7, 8, 10 e 11 submetacêntricos. Uma constrição secundária foi encontrada adjacente a região telomérica do par
11. O padrão de bandamento-C revelou a presença de heterocromatina na região centromérica de todos os pares
cromossômicos, além disso, apresentou uma marcação intersticial no braço maior do par 1 e uma telomérica no
braço maior do par 6. Impregnações por nitrato de prata revelaram sítios ativos de NOR na região intersticial do
braço menor do par 11. Em D. muelleri a análise microscópica revelou os pares 1, 7 e 8 sendo metacêntricos e os
demais, 2 a 6 e 9 a 11, submetacêntricos. O padrão de bandamento-C evidenciou heterocromatina centromérica
em todos os cromossomos, além de marcações teloméricas no braço maior dos pares 1, 4, 5 e 9, adjacente ao
centrômero no braço menor do par 5, telomérica no braço menor do par 4 e intersticial no par 6. A técnica de AgNOR evidenciou marcação telomérica no braço maior do par 9, coincidente com a região de heterocromatina. No
momento cerca de trinta espécies de Microhylidae tiveram seus cariótipos analisados apresentando 2n=22, 24, 26
e 28, sendo 2n=22 comum para os Microhylidae das Américas, tendo também relatos de poliploidia. Os dados de
marcadores cromossômicos ainda são escassos para este grupo. Entretanto nos poucos trabalhos em que estes
são utilizados, sugerem que sejam potencialmente úteis para definir rearranjos e evolução cromossômica nos
Microhylidae. O grande número de regiões heterocromáticas em D. mulleri demonstram grande valia nestes estudos.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq, FAPESB e UESB
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Desenvolvimento de marcadores microssatélites a
partir de bibliotecas genômicas enriquecidas para
Tartaruga de Couro, Dermochelys coriacea
(reptilia: dermochelyideae)
Molfetti, E; Vilaça, ST; Chaves, BRN; Clozato, CL; Santos, FR
Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular, ICB, UFMG, Belo Horizonte, MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: microssatélites, biblioteca genômica, Dermochelys coriacea, genética de populações, conservação
Microssatélites, STRs ou SSRs são loci com repetições em tandem de 1 a 6 nucleotídeos que possuem grande
número de alelos e padrão codominante, podendo assim ser utilizados para a caracterização de populações.
São marcadores de uso relativamente fácil quando se tem os iniciadores específicos para a espécie de interesse.
O objetivo deste trabalho foi desenvolver um maior número de marcadores microssatélites para a espécie de
tartaruga marinha Dermochelys coriacea. A análise de novos marcadores altamente polimórficos, como os
microssatélites, é muito informativa para o diagnóstico do status de conservação de populações remanescentes
de espécies ameaçadas, como é o caso de Dermochelys coriacea. Esta é a espécie de tartaruga marinha mais
ameaçada de extinção no Brasil e no mundo, considerada “criticamente em perigo” pela IUCN e pelo IBAMA. A
população de desova no Brasil é bastante restrita, ocorrendo apenas na costa do Espírito Santo. Foram construídas
duas bibliotecas enriquecidas seguindo o protocolo de Ostrander et al (1992) utilizando aproximadamente 5 µg
de DNA genômico de um único indivíduo, extraído conforme protocolo de Sambrook e Russell (2001). Uma das
bibliotecas foi enriquecida com as sondas biotiniladas (CT)8 e (GT)8 e a outra com as sondas (GATA)4 e (GACA)4.
Foram amplificados os insertos de 20 clones diretamente do meio sólido e construída uma biblioteca de 480
clones, que foram submetidos ao seqüenciamento e à análise para busca de microssatélites. As sequências foram
analisadas com o auxílio da ferramenta SSRTool que revelou a existência de microssatélites com pelo menos
15 nucleotídeos no bloco repetitivo em 19 amostras, sendo 15 destes perfeitos (dez dinucleotídeos e cinco
tetranucleotídeos), dois compostos, um interrompido, além de dois microssatélites ligados (um dinucleotídeo
e um trinucleotídeo). O motivo mais freqüente nos dinucleotídeos foi GT/CA e encontramos motivos de
tetranucleotídeos dos tipos GACA, ATCT, GATT e AAAC. Foi possível desenhar iniciadores baseados nas regiões
flanqueadoras para 14 sequências microssatélites, utilizando o programa Primer3Plus. Esta metodologia se
mostrou eficiente no isolamento de novos marcadores em espécies ameaçadas e raras como a tartaruga de couro.
Apoio financeiro: CNPq e FAPEMIG
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High-resolution melting na identificação de espécies
de Crocodilianos Brasileiros
Villela, PMS; Ninov, K; Gasparin, G; Verdade, LM ; Coutinho,LL
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Departamento de Zootecnia, Universidade de São Paulo.
[email protected]
Palavras-chave: Melting de alta resolução, temperatura de dissociação, crocodilianos brasileiros, diferenciação de espécies, PCR em
tempo real.
No Brasil encontram-se seis espécies de jacarés: Paleosuchus palpebrosus (jacaré-paguá), Paleosuchus trigonatus
(jacaré-coroa), Melanosuchus niger (jacaré-açu), Caiman crocodilus (jacaré-tinga), Caiman yacare (jacaré-dopantanal) e o Caiman latirostris (jacaré-de-papo-amarelo). Apesar de se assemelharem, elas produzem pele e carne
com valores econômicos distintos. Em adição, elas apresentam também diferentes níveis de riscos de extinção.
Por isso, a identificação correta dessas espécies e seus produtos é essencial ao sucesso de seus planos de manejo.
Atualmente, comercializam-se cerca de um milhão de peles de jacarés por ano a partir de criatórios e programas
de caça controlada. Suspeita-se, no entanto, que apenas metade disso seja legal. A identificação das peles pode
ser feita a partir do tamanho e forma de suas escamas e da presença/ausência de osteodermos. No entanto, em
produtos finais como sapatos, cintos e bolsas, nem sempre essa identificação é simples. Tampouco é simples a
identificação da carne de diferentes espécies. Nesses casos, marcadores moleculares podem ser de extrema valia,
pois permitem a identificação não ambígua mesmo de produtos industrializados. A análise de High Resolution
Melting (HRM) é uma técnica recente que consiste na caracterização de amostras de DNA de acordo com seus
comportamentos de dissociação durante sua transição de DNA dupla fita para DNA fita simples com o aumento
da temperatura, utiliza corantes fluorescentes que se ligam ao DNA dupla fita e são monitorados através da PCR
em tempo real. Durante a PCR, quando ocorre a desnaturação do DNA a fluorescência desaparece, gerando a
curva de melting. As diferenças da composição de bases do DNA podem ser detectadas e comparadas através
da curva e temperatura de melting (Tm). Há um padrão da curva e temperatura de melting para cada seqüência
já que existem mutações características de cada espécie, podendo assim diferenciá-las. HRM é uma técnica
simples e muito mais rápida quando comparada com outras técnicas utilizadas para diferenciação de espécies,
como sequenciamento e RFLP-PCR. O objetivo deste trabalho foi identificar as seis espécies de crocodilianos
brasileiros por meio da diferença de temperatura de melting (Tm) estimada pelo software HRM do equipamento
de PCR em tempo real LightCycler 480 (Roche). Um fragmento conhecido do citocromo b foi amplificado a
partir de amostras de três indivíduos de cada espécie. A Tm padronizada foi de 83,01ºC para M.niger, 83,74 ºC
para C. yacare, 84,09 ºC para C. latirostris, 85,30 ºC para C. crocodilus, 85,40 ºC para P. trigonatus e 85,48 ºC para
P. palpebrosus. Foi possível estabelecer um padrão de curva e temperatura de melting para cada espécie e esta
técnica poderá ser utilizada para diferenciação das seis espécies de crocodilianos, podendo ser utilizada pelo
ICMBio/IBAMA como metodologia oficial de controle da comercialização de carne e couro de jacarés brasileiros.
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Método simples para cultura de linfócitos em Phrynops
Geoffroanus (Testudines, Pleurodira, Chelidae)
Azeredo-Oliveira, MTV; Lucena-Silva,T; Silva, MIA; Venancio, LPR; Moschetta, VAG; Ribeiro, IC; Zago, CES;
Santos, JR; Oliveira, C; Bonini-Domingos, CR
Centro de Estudos de Quelônios - Departamento de Biologia - UNESP/IBILCE São José do Rio Preto, SP - Universidade Estadual
Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
[email protected]
Palavras-chave: Cultura de linfócitos; Phrynops geoffroanus; cariótipo; Região Organizadora Nucleolar (RON); Bandamento C e Bandamento G.
A caracterização citogenética é um importante parâmetro para a conservação dos organismos no seu habitat
natural. A otimização de técnicas de cultura de linfócitos é essencial para investigações citogenéticas, mas poucos estudos
tratam deste assunto em quelônios brasileiros. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver métodos de cultura
de linfócitos em machos e fêmeas de Phrynops geoffroanus (Testudines, Pleurodira, Chelidae). Foram utilizados três
casais e o sangue foi coletado por punção cardíaca, seguindo-se os parâmetros para cultura de linfócitos: quantidade
de agentes mitogênicos; separação dos linfócitos; volume de cultura; tempo para o crescimento de linfócitos; adequação dos
diferentes meios de cultura e as concentrações de soro fetal bovino. As melhores condições foram: meio de cultura RPMI
(7,5mL/amostra), combinada com fitohemaglutina (0,375uL/amostra); soro fetal bovino (1,5mL/amostra) e 2mL da camada
de linfócitos. O procedimento foi realizado em câmara de fluxo laminar. Após 70 horas em estufa de cultura à 37oC, foi aplicado
0,1 mL de colchicina em cada amostra, mantidas em estufa por 2 horas. Após este período, foi adicionada solução de cloreto
de potássio (0,075M), e a cultura foi mantida em repouso por 2 horas. A solução fixadora foi metanol - ácido acético (3:1). As
técnicas foram: Giemsa (Coloração convencional); Bandamento G e C; impregnação com íons prata (AG-NOR) e
hibridização fluorescente in situ (FISH), com sondas para região ribossomal 28S de Xenopus laevis, marcadas com
FITC (Fluoresceína Isotilcianato) e contracoloração com DAPI. A coloração convencional indicou um número
diplóide de cromossomos em fêmeas de 2N = 58, dispostos em pares, distribuídos em três grupos: A - 1 metacêntrico,
2 submetacêntricos e 7 acrocêntricos; B - 16 acrocêntricos e C - 6 microcromossomos. Os machos apresentaram 2N
= 57: A - 1 cromossomo metacêntrico, 2 submetacêntricos e 4 acrocêntricos; B - 13 acrocêntricos e C - 8 pares de
microcromossomos e um microcromossomo ímpar. O padrão de bandamento G foi constante nos cromossomos
em todas as metáfases analisadas. A técnica de bandamento C revelou, nos machos, a presença de heterocromatina
constitutiva em dois microcromossomos e na região centromérica de dois macrocromossomos e, nas fêmeas,
em dois microcromossomos. A técnica de impregnação por íons prata (Ag-NOR) marcou nos machos os dois
microcromossomos do par 10, e nas fêmeas apenas um microcromossomo desse par apresentou marcação. A técnica
de hibridização in situ identificou os dois microcromossomos do par 10 em ambos os sexos, indicando serem esses
os cromossomos portadores das Regiões Organizadoras Nucleolares (RONs). As condições otimizadas neste estudo
produziram resultados consistentes com índice mitótico de 10-15 metáfases por lâmina. A metodologia desenvolvida forneceu
uma orientação para a determinação de condições adequadas de cultura de linfócitos de tartarugas brasileiras de água doce.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq , FAPESP e FUNDUNESP.
98
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Estudo Citogenético Comparativo em Podocnemis
expansa e Podocnemis unifilis (Testudines, Podocnemidae)
do rio Uatumã-Am
Nakayama, CM¹; Sales, MEP²; Oliveira, PHG³; Feldberg, E¹
¹Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA
²Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Amazonas – IFAM
³Centro de Preservação de Pesquisa de Quelônios Aquáticos – CPPQA - Amazônia Energia – Balbina.
[email protected]
Palavras-chave: Quelônios, Cariótipo, RONs, Banda C.
O gênero Podocnemis possui seis espécies descritas para a América do Sul: Podocnemis expansa, P. erytrocephala,
P. vogli, P. lewyana, P. sextuberculata e P. unifilis. Quatro das seis espécies ocorrem na Amazônia que são P.
expansa, P. erytrocephala, P. sextuberculata e P. unifilis. Os quelônios têm como característica marcante um casco
ósseo formado pela carapaça e plastrão. Essas estruturas são caracteres importantes na sistemática do grupo.
Esses animais são encontrados nos mais variados locais e considerados os mais antigos répteis existentes. São
importantes na economia das populações tradicionais da região amazônica. Esse trabalho teve como objetivo
comparar citogeneticamente P. unifilis e P. expansa do rio Uatumã, AM. Foram analisados nove exemplares de
P. expansa e seis de P. unifilis. Os cromossomos metafásicos foram obtidos pela técnica de cultura de linfócitos
a partir de sangue periférico. A detecção das regiões organizadoras do nucléolo (RONs) foi feita com Nitrato de
Prata e para detecção da heterocromatina constitutiva os cromossomos foram tratados com hidróxido de bário
e corados com Giemsa. O número diplóide encontrado para as duas espécies foi 28 cromossomos. A fórmula
cariotípica de P. expansa é constituída de 12m + 6sm + 2st + 8a com NF=48 e de P. unifilis 10m + 2st + 16a com
NF=40. Ambas as espécies apresentaram um sistema de região organizadora de nucléolo (RON) simples, ou seja,
apenas um par de cromossomos portador de RONs. Estas se localizaram na região intersticial, proximal dos braços
curtos de um par de cromossomos submetacêntricos grandes em P. expansa, enquanto que em P. unifilis, estas
foram em um par de cromossomos metacêntricos grandes. Quanto ao padrão da heterocromatina constitutiva,
P. expansa apresentou marcações na região pericentromérica de alguns cromossomos, e um par submetacêntrico
pequeno com os braços todo heterocromático. Em P. unifilis foi detectado marcações em posição pericentromérica
em quase todos os cromossomos, marcações bem conspícuas no braço longo próximo ao centrômero de um par
de subtelocênticos e marcações intersticiais nos braços longos de dois pares de acrocêntricos, o qual parece ser
um marcador para a espécie. Assim verifica-se que, embora o número diplóide seja o mesmo para as duas espécies,
os marcadores cromossômicos como as RONs e o padrão de banda C são caracteres que identificam as espécies.
Apoio Financeiro: MCT/ INPA – PRJ- 012
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Diversidade genética de Podocnemis expansa e
Podocnemis unifilis na Bacia Araguaia - Tocantins
Agostini, MAP¹; Teles, NMM¹; Malvasio, A²; Farias, IP³; Dias-Oliveira, JD¹; Oliveira-Junior, WP¹
¹Laboratório de Biotecnologia – LABIOTEC, Fundação Universidade Federal do Tocantins
²Laboratório de Ecologia e Zoologia - LABECZ, Fundação Universidade Federal do Tocantins
³Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia.
[email protected]
Palavras-chave: Biodiversidade, Quelônios, DNA animal, Tracajá, Tartaruga da Amazônia.
A ordem CHELONIA, que engloba os quelônios terrestres, marinhos e de água doce, é tida como a mais antiga de
todas entre os vertebrados atuais. O Brasil possui 36 espécies, sendo 16 podendo ser encontradas na Amazônia
como Podocnemis expansa e Podocnemis unifilis. Sobre os indicadores genéticos de P. expansa pouco é conhecido,
podendo ser um sério problema nos esforços de conservação ou mitigação das mudanças após distúrbios. Mediante
o exposto, esta pesquisa propôs-se aumentar os conhecimentos sobre as populações de P. expansa e P. unifilis, no
rio Araguaia, nas regiões dos municípios de Xambioá e Antonina - TO e no Rio Tocantins, na região do município
de Tucuruí - PA, contribuindo para a conservação e uso sustentado das espécies. Desta maneira, amostram-se 110
indivíduos, sendo 75 da espécie P. unifilis, coletados nas regiões de Xambioá (N=35), Antonina (N=30) e Tucuruí
(N=10) e 35 da espécie P. expansa, das localidades de Xambioá (N=17) e Antonina (N=18). Foi coletado sangue da veia
femural, armazado em 1:1 com etanol absoluto e encaminhado ao laboratório para o processamento. A extração e
o isolamento do DNA foram realizados utilizando o DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen). A região controle do DNA
mitocondrial foi amplificada via PCR utilizando-se um par de primers externos e seus produtos foram purificados
utilizando polietilenoglicol (PEG) e precipitados. Em seguida, as placas com os DNAs foram submetidas a eletroinjeção e as seqüências nucleotídicas determinadas pelo seqüenciador ABI PRISM®. As medidas de variabilidade
genética foram estimadas nos programas ARLEQUIN versão 3.1 e DNASP versão 4.0. Os níveis de diferenciação
entre as populações foram calculados usando a análise de variância molecular (AMOVA). As diversidades gênica
(Ĥ) e nucleotídica (Π) dos tracajás variaram respectivamente de 0,40 e 0.001543 em Xambioá, 0,72 e 0.004506
em Antonina, a 0,78 e 0.007053 em Tucuruí, quanto aos níveis de estruturação genética a AMOVA revelou fraca
subdivisão populacional na análise global (ФST = 0.04707, P = 0.03519), mostrando que 5% da variância total ocorrem
entre as populações e 95% dentro das amostras populacionais. As análises das comparações par a par dos valores de
estruturação entre as localidades mostraram ausência de estrutura genética após a correção de Bonferroni (P<0.016).
Quando a amostragem do rio Araguaia foi combinada ao banco de dados de outros locais da bacia Amazônica
esses indivíduos apresentaram-se geneticamente diferenciados (ФST = 0.46623, P = 0.03535). Os resultados obtidos
sobre as populações de P. expansa em conjunto com os de outro autor evidenciaram nenhuma variação genética
entre todas as localidades deste trabalho. Com isso concluímos que as populações desta espécie dentro da bacia do
rio Araguaia são panmíticas, entretanto, são diferenciadas com relação a outras localidades da bacia Amazônica.
Apoio financeiro: Consórcio Geração Santa Isabel (Gesai).
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Estudo citogenético preliminar em Astyanax lineatus
(Characiformes) do Pantanal Matogrossense, Brasil
Souza, RM; Araújo, JKM; Centofante, L.
Laboratório de Citogenética Animal, Instituto de Biociências, Universidade Federal de Mato Grosso
[email protected]
Palavras-chave: Astyanax, Citogenética, Pantanal, Peixe, Riacho Aricá, Rio Cuiabá
O gênero Astyanax está representado no Pantanal Matogrossense por cinco espécies: A. lineatus, A. pellegrini, A.
marionae, A. bicanulatus, A. abramis. No presente estudo foram realizadas análises citogenéticas em Astyanax lineatus
coletadas no riacho Aricá que é afluente da margem esquerda do rio Cuiabá que por sua vez é um dos formadores
do Pantanal Matogrossense. Para obtenção dos cromossomos mitóticos foi utilizada a técnica de preparação
direta, em 24 indivíduos (10 machos e 14 fêmeas). Para cada indivíduo foram contadas 30 células metafásicas
para a determinação do número modal. A montagem do cariótipo seguiu a organização dos tipos cromossômicos:
metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntrico ( st) e acrocêntrico (a). Astyanax lineatus apresentou
um número diplóide de 2n= 50 cromossomos, sendo a fórmula cariotípica constituída por: 3m+11sm+1st+10a. Não
foram observados através da coloração Giemsa heteromorfismo cromossômico sexual. Análises citogenéticas nas
outras espécies do gênero Astyanax e também utilizando-se de outras técnicas para a identificação de marcadores
cromossômicos estão sendo realizadas no intuito de entender a organização cromossômica dentro do grupo.
Apoio financeiro: UFMT; FAPEMAT e CNPq
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Estudo citogenético preliminar em Pimelodella
taenioptera (Siluriformes) do Pantanal Matogrossense,
Brasil
Araújo, JKM; Souza, RM; Centofante, L
Laboratório de Citogenética Animal, Instituto de Biociências, Universidade Federal de Mato Grosso
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, Pantanal, Peixe, Pimelodella, Riacho Aricá, Rio Cuiabá
O gênero Pimelodella está representado no Pantanal Matogrossense por cinco espécies: P. taenioptera, P. gracilis, P.
megalura, P. mucosa, P. notomelas. No presente estudo foram realizadas análises citogenéticas em Pimelodella taenioptera
coletadas no riacho Aricá que é afluente da margem esquerda do rio Cuiabá que por sua vez é um dos formadores
do Pantanal Matogrossense. Para obtenção dos cromossomos mitóticos foi utilizada a técnica de preparação
direta, em 12 indivíduos (quatro machos e oito fêmeas). Para cada indivíduo foram contadas 30 células metafásicas
para a determinação do número modal. A montagem do cariótipo seguiu a organização dos tipos cromossômicos:
metacêntricos (m), submetacêntricos (sm), subtelocêntrico ( st) e acrocêntrico (a). Pimelodella taenioptera apresentou
um número diplóide de 2n= 52 cromossomos, sendo a fórmula cariotípica constituída por: 7m+10sm+4st+5a. Não
foram observados através da coloração Giemsa heteromorfismo cromossômico sexual. Análises citogenéticas nas
outras espécies do gênero Pimelodella e também utilizando-se de outras técnicas para a identificação de marcadores
cromossômicos estão sendo realizadas no intuito de entender a organização cromossômica dentro do grupo.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMAT e UFMT
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103
Caracterização molecular de regiões codificantes e
não-codificantes do locus de LDH-A e filogenia em
espécies de peixes amazônicos
Castro, NS1; Ghelfi, A2; Matoso, D1; Almeida-Val, VMF1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA /Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular.
Instituto de Saúde e Biotecnologia – Universidade Federal do Amazonas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: LDH, Peixes, Amazônia, Evolução Molecular, Filogenia
Introdução: A enzima Lactato Desidrogenase (LDH, EC: 1.1.1.27) é responsável pelo metabolismo glicolítico
anaeróbico e pelo equilíbrio redox em vertebrados. O estudo sobre a evolução desta enzima em peixes tem sido
considerado importante para explicar a grande radiação adaptativa apresentada pelo grupo (a maior dentre os
vertebrados). São três isoformas distintas, codificadas por seus respectivos genes: LDH-A, LDH-B e LDH-C. O gene
LDH-A foi considerado ancestral desta família de genes até que análises da sequência destes apontaram o gene LDH-C
como ancestral. Objetivos: Caracterização molecular e relação filogenética do gene LDH-A em peixes amazônicos
da ordem perciformes a partir de suas sequências parciais. Métodos: Amostras de DNA foram extraídas do músculo
branco de 23 espécies de peixes por meio do kit “Wizard Genomic DNA Purificationt”, quantificadas e avaliadas por
eletroforese em gel de agarose. Posteriormente, tais amostras foram amplificadas por PCR, purificadas e clonadas
no vetor pGEM-T easy. Os sequenciamentos foram realizados em Sequenciador ABI 3130 (Applied Biosystems). As
sequências obtidas foram comparadas àquelas do banco de dados NCBI, alinhadas no ClustalW e suas inferências
filogenéticas feitas com auxílio do programa Paup v.4.010. Resultados: Foram amplificados e sequenciados
fragmentos de aproximadamente 550 nucleotídeos que codificam a proteína LDH-A em 23 espécies de peixes
pertencentes a 16 famílias. Comparando-se as sequências de todas as espécies de perciformes, excluindo-se os
íntrons, detectou-se uma região conservada com 33 nucleotídeos. As espécies Cichla monoculus e Pachypops trifilis
compartilham 32 aminoácidos idênticos e suas sequências revelam duas regiões intrônicas de alta similaridade,
ambas com três éxons. Plagioscion squamosissimus possui dois íntrons (223 nucleotídeos). Astronotus ocelattus não
apresenta íntrons, diferentemente de sua espécie congênere Astronotus crassipinnis para a qual 42 nucleotídeos
podem ser identificados como uma região intronica. Comparando-se as espécies de Cichidae (Tucunaré e Acarás),
foram detectadas oito regiões conservadas. Em P. trifilis. e P. squamosissimus análises sem íntrons revelam 6 regiões
conservadas. P. squamosissimus e Astronotus ocelattus, apesar de pertencerem a famílias diferentes, apresentam 3
regiões conservadas do gene. As sequências de C. monoculus, P. trifilis e A. ocelattus, revelam a presença marcante
de 15 aminoácidos iniciais, ausentes em todas as demais espécies estudadas. P. squamosissimus apresenta
um aminoácido não-polar (Leucina) em uma região única entre as espécies. Na região codificadora, foram
identificados 17 aminoácidos altamente conservados em todas as espécies em estudo. Conclusões: Sequências
obtidas a partir de fragmentos de amplificação do gene LDH-A apresentam regiões muito conservadas e regiões
intrônicas distintas entre as espécies, o que pode contribuir para estabelecer parte da evolução molecular da LDH.
Apoio: INPA, PIATAM, FINEP, CNPq, FAPEAM, INCT-ADAPTA
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Sistemática molecular e biogeografia histórica do
bagre de água doce Pseudoplatystoma Bleeker, 1862
(Pimelodidae) na América do Sul
Carvalho-Costa, LF1; Piorski, NM2; Willis, S3; Ortí, G3; Galetti Jr, PM4
Centro de Ciências Agrárias e Ambientais, Universidade Federal do Maranhão
Departamento de Oceanografia e Limnologia, Universidade Federal do Maranhão
3
Department of Biological Sciences, The George Washington University
4
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Neotropical, Filogenia, bagres, mtDNA, introns, biogeografia, sistemática molecular.
Pseudoplatystoma engloba bagres migradores de grande importância pesqueira na América do Sul. Apenas
três espécies eram reconhecidas para o gênero (P. corruscans, P. fasciatum e P. tigrinum), mas uma nova revisão
elevou para oito o número de espécies (P. fasciatum, P. punctifer, P. orinocoense, P. magdaleniatum, P. reticulatum, P.
tigrinum, P. metaense e P. corruscans). Entretanto, nem todas essas espécies formam agrupamentos monofiléticos,
segundo um estudo recente de filogenia molecular baseado em DNA mitocondrial. Dessa forma, o presente
estudo objetivou uma análise filogenética molecular mais ampla em Pseudoplatystoma para abordar a realidade
biológica da sistemática e taxonomia vigente do grupo, bem como propor um cenário biogeográfico para a sua
diversificação. Para isso, foram empregados o gene mitocondrial do Citocromo b (245 indivíduos sequenciados)
e íntrons dos genes nucleares Rag1 (228 indivíduos) e S7 (122 peixes), cujas filogenias foram estimadas por
Máxima Verossimilhança no programa TreeFinder. Posteriormente, os nós dessas filogenias foram datados no
programa Beast. Os resultados mostraram que algumas das espécies não correspondem a grupos monofiléticos
ou não tiveram clados significativamente sustentados em todas as árvores. As únicas espécies monofiléticas em
todos os marcadores foram P. magdaleniatum e P. corruscans. Pseudoplatystoma orinocoense só foi uma linhagem
monofilética no Citocromo b. À luz desses resultados, sugere-se que a antiga terminologia P. fasciatum (sensu
Burgess, 1989) seja revalidada para os seguintes táxons: P. punctifer (Amazonas, Maranhão, Tocantins-Araguaia),
P. reticulatum (Paraná-Paraguai) e P. fasciatum (sensu Buitrago-Suárez & Burr, 2007) (Guianas). Da mesma forma,
P. tigrinum (sensu Burgess, 1989) deveria ser revalidado para o Orinoco, dado o parafiletismo de P. metaense. A
diversificação de Pseudoplatystoma foi, provavelmente, influenciada por eventos orogenéticos do Mioceno e
Plioceno (25-1,8 ma, milhões de anos) e eventos climáticos do Plio-Pleistoceno (5-0,1 ma). A primeira cladogênese
do grupo ocorreu há 11,9 milhões de anos com a divisão que originou P. magdaleniatum e o ancestral dos outros
táxons, provavelmente, associada ao isolamento da drenagem do Magdalena datado desta mesma época. O
segundo evento teria ocorrido há 9 ma e teria sido influenciado pela vicariância entre o Amazonas e Orinoco
que determinou a quebra entre o clado P. tigrinum e o grupo formado por P. corruscans+ clado P. fasciatum + P.
orinocoense. Os dados mostram ainda que o ancestral de P. corruscans pode ter migrado da bacia Amazônica para
o sistema Paraná-Paraguai e a partir deste para o São Francisco. Esta também é a explicação para P. reticulatum,
que, no entanto, dispersou para o Paraná-Paraguai mais recentemente. No clado P. fasciatum, eventos de
dispersão mediados pelas oscilações Plio-pleistocênicas no nível do mar ajudam a explicar a distribuição de P.
punctifer nas bacias do Maranhão e de P. fasciatum (sensu Buitrago-Suárez & Burr 2007) nas bacias das Guianas.
Apoio financeiro: Banco da Amazônia, CNPq, CAPES, FAPESP, National Science Foundation (NSF).
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Identificação molecular de peixes sciaenídeos do
litoral de São Paulo utilizando sequências do gene
mitocondrial citocromo oxidase I
Ribeiro, AO; Pereira, LHG; Foresti,F; Oliveira, C
Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia, UNESP-Botucatu
[email protected]
Palavras-chave: DNA barcode, Sciaenidae, peixes, COI, biodiversidade.
Introdução: Os peixes da família Sciaenidae são carnívoros que habitam tanto ambientes marinhos como de água
doce, sendo mais comumente encontrados em águas rasas da plataforma continental sobre fundos de areia ou
lama. Constituindo um importante recurso pesqueiro com alto valor comercial, os sciaenídeos abrangem mais
de 280 espécies em cerca de 70 gêneros que ocorrem nos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico; aproximadamente
20 destes gêneros e mais de 50 destas espécies são encontrados no Brasil. Estudos recentes propõem o uso do
gene mitocondrial “citocromo oxidase subunidade I” (COI) como um código de barras (DNA barcode) para a
identificação molecular de animais, delimitando as espécies por uma sequência particular ou por um conjunto
de sequências muito similares. Objetivos: Considerando-se o potencial das sequências de DNA barcode para a
identificação de espécies, a importância da informação genética para a conservação e a eficácia do DNA barcode
em identificar complexos de espécies em diversos grupos de animais, o presente trabalho teve por objetivos
obter sequências parciais do gene COI para espécies de peixes da família Sciaenidae e avaliar o potencial
dessas sequências na discriminação e na identificação de espécies desta família. Métodos: Foram analisados
56 espécimes pertencentes a dez espécies da família Sciaenidae, os quais foram previamente identificados em
nível de espécies a partir de caracteres morfológicos. O DNA total, obtido a partir de amostras de tecido dos
animais preservados em etanol 95% depositados na coleção do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes
da UNESP, Botucatu-SP, foi submetido a PCR para amplificação do gene COI, posteriormente sequenciado
por um sequenciador automático. As sequências obtidas foram editadas, analisadas e depositadas no banco
de dados do Barcode of Life Data Systems (BOLD). Resultados: As distâncias Kimura-2-Parâmetros médias
encontradas foram de 0,26±0,02% dentro das espécies, 14,83±0,12% dentro dos gêneros e 19,49±0,07% dentro da
família, fornecendo um barcode gap de cerca de 57 vezes. A divergência média entre os grupos interespecíficos
vizinhos (Nearest Neighbor Analysis) foi de 15,56±0,19%. Os valores de divergência genética entre indivíduos coespecíficos obtidos são em média semelhantes aos encontrados em outros trabalhos abrangendo diversos grupos.
Conclusões: A partir da análise molecular, foram formados dez grupos que corresponderam às dez espécies
identificadas pela análise morfológica, evidenciando que o DNA barcode foi um método eficiente na identificação
das espécies analisadas e promissor em aplicações subsequentes, como sistemática e conservação do grupo.
Apoio: FAPESP.
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Filogeografia das espécies de tainha Mugil liza e Mugil
platanus (Teleostei: Mugiliformes)
Ramirez, ZRS1; Menezes, NA2; Foresti, F1; Oliveira, C1
¹ Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP
² Universidade de São Paulo, Museu de Zoologia, São Paulo, SP
[email protected]
Palavras-chave: filogeografia, genética de população, peixe
A família Mugilidae inclui dezessete gêneros e mais de 60 espécies. O status taxonômico de algumas espécies
e gêneros dentro desta família ainda é confuso. Sua filogenia tem sido estudada em vários níveis taxonômicos
mas os resultados sempre causam conflito devido à sua alta homogeneidade morfológica. Os mugilídeos
apresentam distribuição mundial exceto nas regiões polares. Sete espécies são encontradas no Brasil, sendo M.
liza e M. platanus encontradas em maior abundancia e conhecidas popularmente como “tainhas” ou “paratis”.
M. liza encontra-se distribuída desde a Florida ate o Rio de Janeiro e M. platanus desde o Rio de Janeiro até a
Argentina. Procurando esclarecer o status taxonômico destas duas espécies e testar a hipótese de que M.
liza, M platanus e M. cephalus constituem uma única espécie no Brasil, empregamos as seqüências de quatro
genes mitocondriais: Citocromo Oxidase subunidade I (COI) de 650 pb, 16S rRNA de 600pb e ATP sintetase
subunidade 6 e 8 (ATPase 6-8) de 750pb. Estes genes foram escolhidos por apresentarem diferentes taxas de
evolução, que poderiam representar importantes caracteres filogenéticos para resolver essa questão. Foram
analisados um total de 69 indivíduos de M. liza, M. platanus, M. curema, M. cephalus, M. trichodon, M. incilis e
M. rubrioculus procedentes do Brasil, da Argentina, do Uruguai, da Venezuela e a da Grécia (M. cephalus). Os
programas ATCG, Bioedit, Dambe e Mega 4.0 foram utilizados para a edição, alinhamento, análises e obtenção
da arvore das seqüências obtidas. Os resultados mostraram a existência de seis clados fortemente suportados
por um alto índice de bootstrap correspondentes às espécies analisadas, com exceção de M. liza e M. platanus
que formam um só clado, com uma divergência genética de 0.9%, sugerindo que este clado constitui uma única
espécie. Apesar de que os genes ATPase 6 e 8 apresentam maior taxa de evolução, em relação aos outros genes
analisados, não foi possível separar populações dentro do clado formado por M. liza e M. platanus, porém outros
genes com taxas de evolução mais rápida estão sendo seqüenciados para identificar possíveis populações.
Financiamento: CNPq, FAPESP
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Desenvolvimento de marcadores microssatélites para
estudos de conservação de Raia-viola Rhinobatos
percellens (Chondrichthyes, Rhinobatidae)
Ferreira, DC1; Ferrette, BLS2; Mendonça, FF2; Mariguela, TC2; Hashimoto, DT1; Porto-Foresti, F1;
Oliveira, C2; Foresti F2
Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, UNESP/Bauru
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, IB/UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Raia-viola, microssatélites, conservação, polimorfismos, Rhinotabos
A exploração pesqueira, tanto artesanal quanto industrial, se constitui na maior ameaça à biodiversidade dos
elasmobrânquios. Em escala mundial, o manejo adequado destes recursos é dificultado pela escassez de
informações básicas sobre a dinâmica populacional destes organismos. A captura comercial de elasmobrânquios
tem alcançado números alarmantes, com a inclusão de diversas espécies nas listas de risco de extinção
nacional e também internacional. A identificação e a conservação de estoques geneticamente diferenciados e
adaptados ao seu habitat, representam um ponto fundamental para o setor pesqueiro, pela sua relação direta
com a produtividade total e o uso sustentável dos recursos. Entre as raias marinhas, a família Rhinobatidae é
representada pelos gêneros Rhinobatos, Zapteryx, Trygonorhina e Aptychotrema, sendo registrada a ocorrência da
espécie Rhinobatos percellens no Oceano Atlântico desde as Antilhas e Panamá, Venezuela, Jamaica, Brasil, Uruguai,
até a Argentina. No presente trabalho, foram desenvolvidos através de bibliotecas enriquecidas marcadores
moleculares do tipo microssatélites para a espécie Rhinobatos percellens, provenientes do pontal do Paraná.
Foram sequenciados 48 clones, dos quais 13 apresentaram regiões de microssatélites e, a partir destas, 10 primers
foram desenhados para serem testados nas populações de Rhinobatos. Além dos primers isolados no presente
trabalho, foram testados três primers adicionais isolados para a espécie de tubarão azul (Prionance glauca). Dos
10 primers isolados em Rhinobatos percellens, cinco são polimórficos, dois monomórficos e três apresentaram
bandas muito fracas, enquanto os primers testados de tubarão azul mostraram-se monomórficos. Todos os loci
polimórficos estão em equilíbrio de Wardy-Weinberg, exceto o RVA9 (de R. percellens) e apresentam de três a
seis alelos por locus e heterozigosidade média esperada de 0.62. Considera-se que os marcadores moleculares
do tipo microssatélites desenvolvidos no presente trabalho poderão ser utilizados em análises populacionais
para a espécie Rhinobatos percellens, a fim de se conhecer sua estruturação genética e se constituir numa
importante ferramenta para o estabelecimento de programas de conservação e manejo biológico desta espécie.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES e FAPESP
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DNA barcoding de raias Neotropicais (Chondrichthyes,
Myliobatiformes). Confirmação de duas novas espécies
e de um novo gênero na bacia Amazônica
Pansonato-Alves, JC1; Ferreira, DC3; Charvet-Almeida, P2; Porto-Foresti, F3; Oliveira, C1; Foresti, F1.
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes – IBB – UNESP – Botucatu, SP
SENAI - Departamento Regional do Paraná – Curitiba, PR
3
Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências – UNESP – Bauru, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Potamotrygonidae, DNA mitocondrial, COI
As raias da família Potamotrygonidae são os únicos elasmobrânquios que vivem exclusivamente em água
doce. Esta família é formada pelos gêneros Plesiotrygon, Paratrygon e Potamotrygon, sendo os dois primeiros
monotípicos e Potamotrygon constituído por 16 a 18 espécies. O presente estudo teve por objetivo identificar
as espécies da família Potamotrygonidae com o auxílio de ferramentas moleculares, através da amplificação
do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I (COI). As análises foram realizadas em oito espécies, envolvendo
representantes dos gêneros Potamotrygon, Paratrygon e Plesiotrygon, além de amostras de duas espécies em
fase de descrição e de um possível novo gênero ainda não descrito. O DNA total das amostras foi extraído
e purificado, sendo os fragmentos do gene mitocondrial amplificados e sequenciados. As sequências foram
alinhadas com o uso do programa Muscle e uma árvore de distância foi construída com a aplicação do método
Neighbor-Joining. A árvore gerada por esta análise permitiu separar os quatro gêneros, indicando que Plesiotrygon
é grupo irmão de Paratrygon, do possível novo gênero e de Potamotrygon. Dentro do gênero Potamotrygon, as
espécies P. leopoldi, P. motoro e P. orbignyi do Rio Xingu e as duas espécies ainda não descritas formaram clados
monofiléticos com alto suporte estatístico. Porém, as espécies P. scobina e P. orbignyi coletadas em Colares, no
Pará, não formaram um clado monofilético. A variação identificada entre as amostras das espécies de Colares
precisa ser mais bem analisada, para verificação da possibilidade da ocorrência de híbridos entre essas espécies
na natureza. O uso do gene COI se mostrou interessante para separar os gêneros de Potamotrygonidae,
mas marcadores adicionais serão necessários para uma completa separação das espécies da família.
Apoio financeiro: Capes, CNPq e Fapesp
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Análise cromossômica em quatro espécies de peixes
do gênero Characidium (Characiformes, Crenuchidae)
por microdissecção e pintura cromossômica
Pazian, MF; Alves, JCP; Oliveira, C; Foresti, F
IBB-Unesp, Botucatu
Palavras-chave: Characidium, cromossomos sexuais, Crenuchidae, pintura cromossômica, ZZ/ZW
Entre os peixes da ordem Characiformes, a família Crenuchidae é bastante diversificada e atualmente está
representada por 12 gêneros (Ammocryptocharax, Characidium, Crenuchus, Elachocharax, Geryichthys, Klausewitzia,
Leptocharacidium, Melanocharacidium, Microcharacidium, Odontocharacidium, Poecilocharax e Skiotocharax),
com 71 espécies descritas. O gênero Characidium, o mais especioso da subfamília Characidiinae, é formado por 43
espécies reconhecidas como válidas e apresenta ampla distribuição na região Neotropical, ocorrendo do Panamá
até a Argentina. Os estudos cromossômicos no gênero Characidium têm evidenciado características particulares
para cada espécie e/ou população analisada. Apesar dos dados citogenéticos disponíveis indicarem conservação
no número diplóide (2n=50 cromossomos), observa-se extensa variação estrutural no cariótipo das espécies,
notadamente em relação a eventos cromossômicos envolvendo as regiões de heterocromatina constitutiva. Em
algumas espécies, é característica a ocorrência de cromossomos sexuais heteromórficos do tipo ZZ/ZW, sendo
o W totalmente heterocromatinizado. Atualmente, com a aplicação de técnicas de pintura cromossômica e de
microFISH tem sido possível a localização cromossômica de seqüências específicas, a detecção de rearranjos
cromossômicos e a marcação de cromossomos inteiros, tornando-se ferramentas importantes para estudos
citogenético-evolutivos nos peixes neotropicais. Considerando a existência de cromossomos sexuais Z com
heterocromatina apenas na região pericentromérica e W totalmente heterocromático em Characidium cf.
fasciatum da população do Rio das Velhas, bacia do rio São Francisco, foi confeccionada uma sonda a partir dos
cromossomos W utilizando-se a metodologia de microdissecção cromossômica e amplificação por DOP-PCR. A
técnica FISH, aplicada com a sonda produzida sobre os cromossomos de exemplares desta população evidenciou
marcação na região pericentromérica do cromossomo Z e pintou totalmente o cromossomo W. Quando a
mesma sonda foi utilizada nos cromossomos de C. cf. gomesi, foi observado um padrão muito similar ao de C. cf.
fasciatum, enquanto em C. cf. zebra e em C. cf. lagosantense, não revelou sinais de hibridação. Como mecanismo
causador da diversificação pode ser considerada a ocorrência de modificações estruturais nos cromossomos do
sistema sexual na forma ancestral do grupo ao qual pertencem às espécies C. cf. gomesi e C. cf. fasciatum durante
o estabelecimento da especiação. O processo de heterocromatinização desses cromossomos possivelmente
iniciou-se nos cromossomos homólogos e homomórficos na forma ancestral do grupo das espécies que possuem
sexual nos dias atuais. Este processo deve ter ocorrido depois da separação dos ancestrais dos grupos C. zebra e C.
gomesi, fato este explicado pela sonda não hibridar nos cromossomos das espécies C. cf. zebra e C. cf. lagosantense.
Apoio financeiro: Fapesp, Capes, CNPq.
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Sistemática molecular de peixes da família
Pimelodidae (Pisces Siluriformes) de ocorrência no rio
Itapecuru/MA
Reis, LL1; Sampaio I2; Fraga, EC1; Barros, MC1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança PA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pimelodidae, Rio Itapecuru, Haplotipo, Filogenia, rRNA 16S.
Os peixes da família Pimelodidae ocorrem nas principais bacias hidrográficas sul-americanas, incluindo os maiores
rios, como: Paraná, Amazonas, Orinoco e São Francisco. Estes são conhecidos vulgarmente como bagres e mandis
e tem grande importância econômica, sendo considerados os peixes de água doce de maior valor comercial,
assim ressalta-se a importância de conhecer geneticamente as espécies a fim de contribuir com informações que
permitam nortear quanto ao uso sustentável destes recursos e conseqüentemente a conservação de seus estoques,
bem como, na resolução das incertezas taxonômicas da família. Cinco espécies de Pimelodidae (Sorubim lima,
Pseudoplatystoma fasciatum, Pimelodus blochii, Pimelodus ornatus e Hemisorubim platyrhynchos) foram coletadas
ao longo da bacia do rio Itapecuru/MA. Após a obtenção estas foram levadas ao Laboratório de Genética e Biologia
Molecular do CESC/UEMA (GENBIMOL) e identificadas utilizando-se chaves especificas. Em seguida realizou-se a
extração de DNA a partir do tecido muscular, utilizando o protocolo de fenol-clorofórmio e ampliação do gene rRNA
16S por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando iniciadores universais. O produto da PCR foi seqüenciado
usando-se o método didesoxiterminal. As seqüências foram editadas e alinhadas no programa BIOEDIT e as
análises filogenéticas geradas no programa MEGA e DnaSP. Foram obtidas 66 sequencias com 458 pares de bases do
gene rRNA 16S, estas apresentaram 392 sítios conservados, 66 variáveis e 65 informativos para a parcimônia, nove
haplótipos, diversidade haplotípica de 0, 854 e nucleotídica 0, 04815. O haplótipo H2 e H8 mostraram-se como os
mais freqüentes. A composição nucleotídica encontrada foi 21, 5% de timina, 24, 4% de citosina, 32, 5% de adenina
e 21, 6 % de guanina. A reconstrução filogenética utilizando os diferentes métodos, Agrupamento de vizinhos,
Evolução Mínima e Máxima Parcimônia, gerou árvores com topologias similares e concordantes quanto a monofilia
do grupo. A matriz de divergência gerada no MEGA utilizando o modelo Kimura 2 parâmetros, mostrou valores que
variam entre 0% a 15,7 % entre as espécies analisadas. A magnitude da divergência e a reconstrução filogenética
para as espécies da família Pimelodidae de ocorrência no rio Itapecuru/MA confirmam a sua caracterização
quanto ao status de espécies, sendo assim, pode-se pensar em estratégias de manejo e conservação para este grupo.
Apoio financeiro: CNPq,UFPA,UEMA.
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Diferenciação genética em populações de Pygocentrus
nattereri (Characidae) com base em sequências da
região controle
da Luz, LA¹; Fraga, E¹; Barros, MC¹
¹Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
Email: [email protected] e [email protected]
Palavras-chave: Piranha, DNA mitocondrial, D-loop, Variabilidade, Itapecuru
A Família Characidae, ordem Characiformes, compreende cerca de 30 subfamílias e 250 gêneros amplamente
distribuídos na América do Sul. As espécies desta família são de alto valor econômico e constituem importantes
recursos pesqueiros, como é o caso de Pygocentrus nattereri. O presente trabalho teve como objetivo determinar o
nível de diferenciação genética dos estoques de Pygocentrus nattereri em bacias hidrográficas do Norte (Amazonas/
AM, Madeira/AM, Solimões/AM e Ucayali/AM), Sul (Paraná/PR) e Nordeste (Itapecuru/MA e São Francisco/BA),
por meio de seqüências da região controle D-loop do mtDNA, gerando informações que possam contribuir para
futuros programas de manejo e conservação destes recursos pesqueiros. As amostras foram oriundas do alto, médio
e baixo curso da bacia do rio Itapecuru/MA. O DNA foi isolado utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio
e a amplificação da região controle D-loop, foi realizada via PCR. Os produtos das PCRs foram seqüenciados
utilizando-se o método didesoxiterminal. As seqüências foram editadas e alinhadas no programa BIOEDIT
e as análises filogenéticas geradas no programa MEGA4, DnaSP 4.0 e Arlequin 3.0. Vinte e duas seqüências de
Pygocentrus nattereri retiradas do Genbank referentes às bacias hidrográficas do Norte e Sul, constituíram-se como
parte da amostragem. Um fragmento de 480 pares de bases da região controle (D-loop) foram obtidos de trinta e
dois espécimes de Pygocentrus nattereri. Dentre as seqüências analisadas foram encontrados 29 sítios polimórficos,
21 haplótipos, diversidade haplotípica de 0,964 e nucleotídica de 0,01400, no qual o haplótipo 11 (H11) mostrou-se
como o mais freqüente ocorrendo na população do rio Madeira. Analisando-se todas as populações, os maiores
valores de diversidade haplotípica foram encontrados nas populações do Rio Itapecuru (h = 0,978), Paraná (h = 0,900)
e São Francisco (h = 1,000). Os testes de neutralidade de D e Fs, não foram significativos para maioria das análises
(populações isoladas e todas as populações) com P > 0,05, indicando que o polimorfismo está de acordo com o
modelo neutro de mutações, exceto para população do rio Itapecuru (Fs= -4,485 e p=0,005). Quando as populações
foram consideradas como um único grupo, o resultado da AMOVA mostrou valor de FST = 0,668 e p altamente
significativo, com maior índice de variação (66,87%) entre as populações. Os índices de diversidade genética
encontrados neste estudo para a bacia do rio Itapecuru, foram relativamente altos (h = 0,978 e π = 0,00810) quando
comparados com os espécimes das demais bacias hidrográficas. Verifica-se, portanto, que as populações analisadas
estão em processo de diferenciação genética e reforça o indício de estruturação populacional para em P. nattereri.
Apoio financeiro: BNB/UEMA/FAPEMA e UFPA.
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Sistemática molecular do gênero Cichla com base em
gene nuclear
Passos, JFA1; Nascimento, DC1; Fraga, E1; Sampaio, I2; Barros, MC1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança/PA
[email protected]/ [email protected]
1
2
Palavras-chave: Peixes, Cichlidae, Cichla, Filogenia, TMO M27
Os tucunarés são peixes pertencentes à ordem Perciformes, família Cichlidae e gênero Cichla, são endêmicos
da Amazônia e incluem espécies de alta importância pesqueira. A filogenia das principais linhagens de peixes
ciclídeos são baseadas na informação de seqüências de DNA de regiões flanqueadoras de locus de microssatélites,
Tmo M27. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi obter filogenias moleculares do gênero Cichla através de
seqüências do gene nuclear Tmo M27 a fim de contribuir com o entendimento da sistemática do gênero. As análises
foram baseadas em amostras de ambientes onde os tucunarés foram introduzidos, compreendendo os Rios São
Francisco/PE, Parnaíba/PI, Paraná/PR e açudes do Piauí. Após as identificações dos espécimes o DNA total foi
isolado a partir de tecido muscular, utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio. O isolamento e amplificação da
região genômica, a partir de DNA total foi realizado através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
usando-se combinações de primers específicos. Os produtos das PCRs purificados foram seqüenciados utilizandose o método didesoxiterminal. As seqüências foram editadas e alinhadas no programa BIOEDIT. O número de
haplótipos, sua freqüência e sítios variáveis foram obtidos pelo programa DnaSP. A composição nucleotídica e
as árvores filogenéticas, pelo programa MEGA com significância dos agrupamentos estimada pela análise de
bootstrap. Seqüências do GenBank foram incorporadas na análise (DQ779583/Cichla sp DQ779584/Cichla sp;
DQ779585/Cichla sp; AF112601 DQ779586/Cichla sp; U63666/Cichla ocellaris; AF112602/Cichla orinocensis). A
espécie Geophagus brasiliensis foi utilizada como grupo externo (AF112626). Foi obtido um fragmento de 249 pb
do gene nuclear Tmo M27 a composição nucleotídica foi de: 25% de Timina, 20% de Citosina, 29,7% de Adenina,
25,3% de Guanina. As análises filogenéticas produziram árvores com topologia similar nos diferentes métodos
utilizados parcimônia e agrupamentos de vizinhos. Foi observado para os espécimes analisados 233 sítios
conservados, 16 sítios variáveis, três sítios informativos para parcimônia, sete haplótipos, diversidade haplotípica
de 0,673 e nucleotídica 0,00991. A topologia apresentou três clados distintos para as espécies do gênero Cichla nos
diferentes ambientes analisados. A divergência genética para as diferentes espécies do gênero Cichla variou de
0% a 2,4% corroborando com o status taxonômico de espécies estabelecido por suas características morfológicas.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMA, UFPA e UEMA
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Análise temporal da estrutura populacional do jaraquiescama-grossa (Semaprochilodus insignis) da bacia
Amazônica
Passos, KB1; Farias, IP1; Hrbek, T1,2
Departamento de Biologia, Laboratório de Evolução e Genética Animal, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM, Brasil
Biology Department, University of Puerto Rico, San Juan, PR, Porto Rico
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Jaraqui de escama grossa, explotados, panmítica
Introdução: O jaraqui é um dos peixes migradores mais apreciados e explotados na Amazônia, formando mais
de 90% da pesca comercial em algumas regiões. Por ser um peixe comparativamente mais barato faz parte da
dieta da população urbana de baixa renda, cabendo ao jaraqui a importância de principal fonte protéica para esta
população. A intensa explotação de seus estoques já é sentida pelos pescadores e pelos ribeirinhos que vivem
da pesca de subsistência. Sendo assim, este trabalho representa um passo para o conhecimento da biologia da
espécie visando a sua conservação e manejo. Segundo alguns trabalhos realizados em outras espécies de peixes
migradores do Brasil, mesmo espécies que realizam grandes migrações podem apresentar estruturação genética
populacional dentro de um sistema hidrográfico contínuo e sem barreiras geográficas aparentes, formando
populações geneticamente estruturadas de peixes que co-existem e co-migram ao longo do rio. Objetivos:
Caracterizar geneticamente as populações de jaraqui da bacia Amazônica com o objetivo de testar a ocorrência de
populações diferenciadas geneticamente provenientes de diferentes locais e diferentes anos de coleta. Métodos:
Para responder a estas questões, foram coletadas amostras de nadadeiras de Semaprochilodus insignis (jaraqui de
escama grossa) em 10 localidades da bacia Amazônica de Santarém ate Tabatinga (leste – oeste), e Novo Airao
ate Eurunepe (norte – sul). Os DNAs foram extraídos por método padrão. Amplificações da região controle do
DNA mitocondrial foram seqüenciadas para um total de 218 indivíduos, com uma média de 22 indivíduos por
localidade. Resultados: As análises de variância molecular (AMOVA) indicaram não haver diferenças genéticas (FST
= -0.00184; P = 0.51020) entre as localidades amostradas. Considerando a ausência de estrutura populacional testouse a possibilidade de estrutura genética temporal. Foram analisados indivíduos coletados em quatro localidades:
Tabatinga e RDS - Purus coletados nos anos de 2007 e 2008, e Santarém e Tapajós nos anos de 2006 e 2008. Os
resultados também evidenciaram valores de FST não significativos nos pares de populações analisadas. Conclusões:
A partir de nossos resultados, as localidades amostradas de jaraqui não indicaram diferenças significativas no
espaço nem no tempo, sugerindo que os indivíduos de jaraqui de escama grossa da bacia amazônica compõem
uma única população panmítica. Os resultados que obtivemos no presente trabalho corroboram com a hipótese
levantada nos estudos já realizados em peixes da região amazônica, de que o sistema de sazonalidade da várzea
na bacia amazônica bem como as migrações para alimentação e reprodução favorece o padrão encontrado.
Financiamento: CNPq/CT-Amazônia
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A análise de códigos de barra do DNA em espécies do
gênero Pimelodella (Siluriformes, Heptapteridae)
Peixoto, MS1; Trajano, E2; Bockmann, FA3; Toledo, LF1; Calcagnotto, D1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
3
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: códigos de barra, Pimelodella, mtDNA, COI, Siluriformes.
A família Heptapteridae, endêmica da região Neotropical, é uma das maiores entre os Siluriformes. O gênero
Pimelodella, cuja última revisão taxonômica completa foi feita por Eigenmann em 1917, é um dos mais especiosos
da família Heptapteridae com cerca de 70 espécies consideradas válidas. Destas, 14 são descritas para as bacias
do Alto Paraná, do Paraíba do Sul e dos rios costeiros do sudeste brasileiro. Recentemente, vários estudos tem
demonstrado que a divergência de seqüência na porção 5’ do gene que codifica para a Citocromo Oxidase C
(Cox1 ou COI) pode ser empregada com sucesso na identificação de espécies de diferentes grupos de organismos
como insetos, aves, peixes e mamíferos. O objetivo deste estudo foi testar a utilidade do código de barras de
DNA empregando sequências do gene Cox1 para a identificação de espécies do gênero Pimelodella. Foram
utilizados, para tanto, os métodos mais tradicionais de análise de distância e também a abordagem baseada em
caracteres utilizando o algoritmo CAOS inserido no aplicativo P-Gnome. Um total de 135 exemplares previamente
identificados como pertencentes a nove espécies de Pimelodella, provenientes de diferentes bacias hidrográficas
e 613 caracteres do gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I foram utilizados para este trabalho. Os
resultados mostram que as espécies P. kronei e P. transitoria provenientes do município de Iporanga-SP, PETAR,
foram recuperadas no mesmo clado, não podendo ser distinguidas através do código de barras utilizando
tanto medidas de distâncias genéticas como a análise de caracteres. Contudo, outras espécies do gênero
puderam ser positivamente discriminadas, corroborando a identificação com base em caracteres morfológicos.
Os gêneros Ancestronychthys, Imparfinis, Microglanis e Rhamdia foram utilizados como grupos externos.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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Estudos citogenéticos em duas populações de
Astyanax aff. paranae (Characidae, Incertae Sedis)
pertencentes à bacia do rio Ivaí, região de Maringá/PR
Nishiyama, PB1; Porto, FE1; Borin, LA3; Zawadzki, CH2; Portela-Castro, ALB1; Santos, ICM1
Departamento de Biologia Celular e Genética- Universidade Estadual de Maringá
Departamento de Biologia – Universidade Estadual de Maringá
3
Departamento de Biologia – FAFIMAN
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Astyanax, citogenética, cromossomos B, NOR, Banda C
O grupo Incertae Sedis dentro da família Characidae compreende uma assembléia de peixes de pequeno porte
com grande heterogeneidade. Neste grupo destaca-se o gênero Astyanax, com ampla distribuição na região
Neotropical, representado por 86 espécies que apresentam morfologia muito similar. Considerando que ainda
se conhece pouco sobre as características biológicas, ecológicas e genéticas deste gênero, o presente estudo
procurou realizar a caracterização citogenética da espécie Astyanax aff paranae coletadas no Ribeirão Andirá
e no Córrego Itiz (bacia do Rio Ivaí), na região de Maringá, Pr. As preparações cromossômicas dos indivíduos
foram submetidas à análise convencional com Giemsa, impregnação com nitrato de prata e bandeamento C. As
análises citogenéticas realizadas nos indivíduos coletados no Córrego Itiz evidenciaram um número diplóide
igual a 51 cromossomos com a presença de um macro cromossomo B metacêntrico, com cariótipo contendo
12 metacêntricos, 16 submetacêntricos, 6 subtelocêntricos e 16 acrocêntricos. Foi observado um sistema de
NOR-simples, com marcação no braço curto de um par de cromossomos submetacêntricos. O bandeamento C
destacou blocos heterocromáticos próximas aos centrômeros da maioria dos cromossomos e nos telômeros de
alguns deles. Além disso, a região da NOR foi banda C positiva e o cromossomo B totalmente heterocromático.
Já as análises cromossômicas realizadas na população do Ribeirão Andirá evidenciaram a presença de dois
citótipos, com 2n=50 (citótipo 1) e 2n=48 (citótipo 2), simpátricos e sintópicos, ambos sem a presença de
cromossomos supranumerários. O citótipo 1 apresenta 6 metacêntricos, 24 submetacêntricos, 12 subtelocêntricos
e 8 acrocêntricos. Através da análise do bandeamento C foi verificado marcações na região pericentromérica
e teloméricas em alguns cromossomos. O citótipo 2 apresenta 14 metacêntricos, 18 submetacêntricos,
6 subtelocêntricos e 10 acrocêntricos . O bandeamento C evidenciou blocos heterocromáticos na região
pericentromérica de alguns cromossomos e blocos bem destacados na região telomérica de alguns cromossomos,
especialmente acrocêntricos. Nos dois citótipos o sistema de NOR foi semelhante ao observado para a população
do Córrego Itiz. As diferenças cariotípicas entre as populações corroboram a complexidade taxonômica em
Incertae Sedis e parecem indicar que variações cromossômicas estejam relacionadas a rearranjos estruturais,
os quais, provavelmente, estariam envolvidos na evolução cariotípica deste grupo de peixes de pequeno porte.
Apoio: CNPq, UEM
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Diversidade Haplotípica de Hoplias malabaricus
(Erythrinidae) da Bacia do Rio Itapecuru/MA
Pinto-Junior, JS1; Barros, MC1; Sampaio, I2; Fraga, E1
Centro de Estudos Superiores de Caxias/UEMA. Caxias, MA.
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança PA.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNA mitocondrial, 16S, Hoplias, Traíra, Rio Itapecuru
O gênero Hoplias se distingue dos outros dois gêneros da família Erythrinidae por apresentar dentes caninos no
maxilar e na porção anterior do dentário; possuem a nadadeira ventral com oito raios e a dorsal com 10 a 12 raios.
Embora a espécie Hopilas malabaricus seja considerada uma única espécie nominal, padrões cariotípicos (citótipos)
diversificados tem sido encontado entre populações isoladas ou até mesmo entre populações simpátricas. Este
cenário revela uma problemática na taxonomia deste grupo com reconhecimento de um “complexo de espécies”
que apresenta uma conspícua diversidade cariotípica, variando o número de cromossomos de 2n=39 a 2n=42.
Neste contexto, temos como objetivo a caracterização genética das populações de H. malabaricus da bacia do
rio Itapecuru (MA) a partir de sequências do gene rRNA 16S. A amostragem foi constituída de 17 espécimes
obtidos no rio Itapecuru. O DNA total foi extraído a partir do tecido muscular utilizando o protocolo de fenolcloroformio. O isolamento e ampliação do gene rRNA 16S foi realizada através da técnica de Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR). O produto da PCR foi seqüenciado utilizando o método Didesoxiterminal com Kit Big
Dye e as sequências obtidas foram editadas e alinhadas no programa Bioedit. Os cladogramas filogenéticos e
composição nucleotídica, foram obtidas através do programa MEGA4. O polimorfismo de DNA foi estimado no
programa DnaSP. Duas sequências de outras famílias da ordem Characiforme foram incorporadas às análises,
uma de Anostomidae e outra de Prochilodontidae, ambas usadas como grupo externo. Um fragmento de 518
pares de bases do gene 16S foi obtido de dezessete espécimes analisadas, com composição nucleotídica de 22,9%
de timina, 23,9% de citosina, 30,6% de adenina e 22,6% de guanina. A análise do polimorfismo do fragmento
obtido revelou 23 sítios variáveis e a ocorrência de nove haplótipos com uma elevada diversidade haplotípica
de 0,8897. A análise filogenética gerou árvores com topologia similar mostrando um forte agrupamento entre
os haplótipos (100% de bootstrap). Observou-se ainda, que a maioria dos haplótipos formaram um clado
fortemente suportado com 95% de bootstrap, diferenciando-se do haplótipo cinco. A diferenciação haplotípica
de H. malabaricus da bacia do rio Itapecuru gerada na analise de um fragmento do gene rRNA 16S confirmam
a diversidade deste gênero corroborando com os dados cromossômicos e fornece informações preliminares
importantes para resolução de problemas na taxonomia do grupo esclarecendo o status taxonômico desta espécie.
Apoio financeiro: FAPEMA, UEMA e UFPA.
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Identificação e caracterização de locos de
microssatélites para Potamotrygon falkneri
(Elasmobranchii: myliobatiformes)
Soares, AA1; Cruz, VP1; Diniz, D2; Mori, GM3; Vigna, B3; Oliveira, C1; Foresti, F1
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista
Laboratório de Citogenética, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
3
Laboratório de Análise Genética e Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
1
2
Palavras-chave: raias, marcador molecular, microssatélites, biblioteca genômica, conservação
As raias da família Potamotrygonidae representam uma importante parte da ictiofauna neotropical, sendo o
único grupo de elasmobrânquios totalmente restrito ao ambiente de água doce. A família Potamotrygonidae
compreende de 16 a 20 espécies, as quais se distribuem nos gêneros Plesiotrygon, Paratrygon e Potamotrygon,
sendo encontradas nos principais sistemas fluviais da América do Sul. Antes da submersão das Cachoeiras de Sete
Quedas pelo reservatório da Usina Hidrelétrica de Itaipu, formado nos anos 80, não existiam informações sobre a
presença de raias à montante dessa barreira natural. Hoje, duas espécies de raias, Potamotrygon falkneri e P. motoro,
são coletadas nos baixos cursos dos rios Paranapanema e Tietê, a mais de 300 km ao norte do seu ponto inicial
de dispersão. Nesses novos locais de ocorrência, as raias têm aproveitado as áreas represadas e eclusas existentes
para dispersão e reprodução, passando a fazer parte da fauna destes ambientes, porém ainda permanecem entre os
peixes cartilaginosos menos estudados. Os marcadores microssatélites (SSR) constituem a classe de marcadores
moleculares mais polimórficos conhecidas atualmente. As diversas aplicações, tais como análise populacional,
biologia da conservação, mapeamento genético, diagnóstico de doenças, investigação forense, estudos ecológicos e
de paternidade dependem, do desenvolvimento de primers espécie-específicos para estas regiões genômicas serem
amplificadas através da PCR. No presente estudo foi construída uma biblioteca enriquecida de SSR para P. falkneri.
Para a construção da biblioteca enriquecida foi utilizado o DNA de um único exemplar, sendo realizadas as seguintes
etapas: digestão do DNA genômico; ligação dos adaptadores, amplificação, purificação e seleção dos fragmentos
contendo SSR; amplificação dos fragmentos selecionados; ligação dos adaptadores, amplificação, purificação e
seleção dos fragmentos contendo SSR; amplificação dos fragmentos selecionados; ligação dos fragmentos a um
vetor de clonagem; amplificação dos insertos clonados; inoculação e extração plasmidial e, isolamento do fragmento
para posterior sequenciamento. Foram sequenciados 34 clones utilizando os primers SP6 e T7 promoter, visando a
identificação e caracterização de locos de microssatélites. As sequências obtidas foram analisadas e manipuladas
utilizando-se os programas DNASTAR e Microsat. Posteriormente foram desenhados 10 pares de primers que estão
sendo testados em representantes capturados a jusante e montante da Usina Hidrelétrica de Itaipu. Conforme dados
apresentados, a técnica de construção de bibliotecas enriquecidas para microssatélites mostrou-se adequada para
detecção de primers específicos para P. falkneri. Espera-se com a continuação do estudo, obter um número satisfatório
de primers para locos polimórficos que fornecerão informações que poderão ser utilizadas na identificação dos
mecanismos determinantes do processo de colonização, caracterizando a variabilidade genética basal das espécies
e os genótipos representativos no estabelecimento das formas colonizadoras em ambientes recém-colonizados.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Pintura dos cromossomos de Leporinus elongatus
utilizando sondas provenientes de citometria de fluxo
e microdissecção cromossômica (Characiformes:
Anostomidae)
Parise-Maltempi, PP1; Lowell, FL2; Rens, W2; O´Brien, PCM2; Ferguson-Smith, M2
UNESP - Rio Claro, Departamento de Biologia
University of Cambridge, Department of Veterinary Medicine
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Peixes, FISH, microdissecção, Flow-sorting
A hibridação in situ fluorescente (FISH), a citometria de fluxo e a microdissecção cromossômica, em conjunto com o
desenvolvimento do DOP-PCR abriram o caminho para que a pintura cromossômica entre espécies fosse realizada
em escala genômica, especialmente entre os mamíferos que possuem conteúdo de DNA total praticamente
constante. Existem muito poucos trabalhos envolvendo pintura cromossômica em peixes, especialmente com
sondas obtidas através da citometria de fluxo e considerando-se a grandeza em número de grupos de espécies,
diferenças de morfologias cromossômicas e sistemas de determinação de sexo, este tipo de estudo pode ser
considerado imprescindível dentro da citogenética molecular de peixes. O presente estudo foi realizado no
laboratório de Citogenética Molecular da Universidade de Cambridge, Reino Unido, onde foram analisados
cromossomos de Leporinus elongatus tendo como principal objetivo a obtenção de material total dos cromossomos
sexuais para estudos envolvendo a evolução de cromossomos sexuais e mapeamento gênico. O cromossomo W foi
microdissectado e totalmente amplificado, incluindo as regiões eucromáticas, com o Kit WGA4 (Sigma). Devido a
semelhança nos tamanhos, alto número de cromossomos e baixo conteúdo de DNA na espécie L. elongatus, apenas
alguns grupos de cromossomos foram isolados através da citometria de fluxo, dentre eles o cromossomo da NOR
que parece estar envolvido com o sistema de cromossomos sexuais. O material obtido foi marcado com Biotina
utilizando-se a marcação direta e/ou Nick translation e a hibridação in situ seguiu a metodologia utilizada naquele
laboratório. Como resultado da microdissecção obteve-se o cromossomo W inteiro marcado que demonstrou
possuir uma heterocromatina altamente específica, não possuindo homologia com partes dos autossomos e nem
mesmo com qualquer região do cromossomo Z. Como resultado da citometria de fluxo, foram obtidas sondas de
cromossomos inteiros que serão utilizados em experimentos de “Cross-FISH” com outras espécies de Leporinus a
fim de se tentar entender a evolução cariotípica do grupo com ênfase principalmente nos cromossomos sexuais.
Apoio Financeiro: CAPES, Wellcome trust
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Caracterização de locos microssatélites no genoma de
Salminus franciscanus (Characiformes: Characidae)
Freitas, PD; Rossini, BC; Nunes, AG; Galetti Jr, PM
Laboratório de Biodiversidade Molecular e Citogenética, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de São Carlos.
[email protected]
Palavras-chave: Dourado, rio São Francisco, genética da conservação, microssatélites, polimorfismo
A espécie Salminus franciscanus é considerada um peixe de médio a grande porte e apresenta grande importância
econômica, sendo muito apreciada na gastronomia e na pesca esportiva. Ela apresenta hábito predatório na
idade adulta e migratório durante o período reprodutivo. Enquanto o gênero Salminus ocorre em várias bacias
da América do Sul, desde o Uruguai até a Colômbia, S. franciscanus está restrita à bacia do São Francisco (Brasil),
tendo sido descrita recentemente como uma espécie válida. A despeito da importância deste grupo de peixes,
no geral, a ictiofauna de muitas regiões vem sofrendo ameaça devido à interferência antrópica e destruição de
seus habitats. No caso de espécies migradoras, a construção de barragens hidrelétricas, impede a passagem de
cardumes no período reprodutivo podendo interferir diretamente na viabilidade de suas populações. Apesar
de existirem muitos estudos abordando aspectos biológicos deste animal, pouco se conhece sobre a estrutura
genética dessas populações. É sabido, no entanto, que conhecer a diversidade genética intra- e inter- populacional
pode contribuir para o melhor entendimento do comportamento de populações naturais e para o delineamento
de programas que minimizem o impacto de atividades antrópicas sobre a ictiofauna local. Dentro deste
contexto, este trabalho se propôs a isolar marcadores do tipo microssatélites, com o intuito de disponibilizar
locos potencialmente úteis para serem utilizados em estudos genéticos deste importante peixe migrador.
A extração de DNA se deu utilizando fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (Sambrook et al., 1989) e o método
utilizado para isolamento das seqüências microssatélites se deu a partir da construção de bibliotecas genômicas
parcialmente enriquecidas, seguindo Hamilton et al. (1999). Após o seqüenciamento de 96 clones positivos, as
seqüências obtidas foram submetidas à análise no software CID para caracterização dos locos microssatélites
e seus respectivos pares de primers flanqueadores. Dezoito locos foram selecionados e testados em PCR, sendo
que nove demonstraram padrão polimórfico de amplificação. Após genotipagem em seqüenciador MegaBace
(GE Healthcare Life Sciences), os genótipos foram estabelecidos usando o software Fragment Profiler 1.2 e as
análises estatísticas foram realizadas no Genepop 4.0 e Micro-Checker 2.2.3. O número de alelos variou de cinco
a 21 e a heterozigosidade observada de 0,28 a 1,00. Três locos apresentaram desvio do Equilíbrio de HardyWeinberg e presença de alelos nulos. Os testes de cross-species amplification demonstraram grande potencial
para uso destes locos nas espécies S. brasiliensis e S hilarii. Desta forma, esperamos viabilizar um conjunto
eficiente de marcadores microssatélites para os estudos genéticos deste importante grupo de peixe migrador.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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Estudo Citogenético Comparativo em três espécies do
gênero Ageneiosus (Siluriformes: Auchenipteridae) do
lago Catalão
Silva, JCO¹; Sales, MEP¹; Feldberg, E²; Nakayama, CM²
¹Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Amazonas – IFAM
²Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA
[email protected]
Palavras-chave: Cariótipo, RON, Banda C, Bacia amazônica, Mandubé
Ageneiosus pertence à família Auchenipteridae, é composto por 11 espécies válidas conhecidas popularmente
como Mandubés, sendo preferencialmente noturnas e amplamente distribuídas na América do Sul. Este trabalho
teve como objetivo comparar citogeneticamente três espécies de Ageneiosus. Foram analisadas 14 fêmeas de A.
brevis, quatro machos de A. inermes e seis machos de A. ucayalensis. Os cromossomos mitóticos foram obtidos
pela técnica “air drying”. Para detecção das regiões organizadoras do nucléolo (RONs), os cromossomos foram
corados com Nitrato de Prata e para a determinação do padrão heterocromático os cromossomos foram
tratados com hidróxido de bário e corados com Giemsa. O Número diplóide modal encontrado para A. brevis e
A. ucayalensis foi igual a 56 cromossomos e para A. inermis foi igual a 54, sendo a fórmula cariotípica de A. brevis
34m+14sm+8a, perfazendo um NF=104 e para A. ucayalensis 28m+20sm+8a, NF=104. A fórmula cariotípica de A.
inermis consistiu de 28m+18sm+8a, NF=100, sendo que o primeiro par do complemento foi cerca de três vezes
maior que o segundo, o que evidencia a presença de uma fusão, quando comparado com as outras duas espécies.
Com relação ao padrão das RONs, as três espécies apresentaram apenas um par marcado pelo Nitrato de Prata.
Nas duas espécies com 2n=56, esta se localizou em posição terminal nos braços curtos de um par metacêntrico,
enquanto que em A. inermis esta se localizou também em posição terminal dos braços curtos, porém de um
par acrocêntrico, sugerindo a presença de outros rearranjos, envolvendo os cromossomos nucleolares. Quanto
ao padrão de banda C as três espécies apresentaram blocos heterocromáticos principalmente nas regiões
teloméricas em ambos os braços, sendo que poucos tiveram marcações centroméricas. A. inermis apresentou
marcações biteloméricas, em especial o primeiro par cromossômico. Este padrão é o mesmo já encontrado
para a maioria dos Siluriformes. Assim, os dados citogenéticos aqui obtidos sugerem que tanto Rearranjos
Robertsonianos como não Robertsonianos estão presentes na evolução cromossômica da família Auchenipteridae.
Apoio Financeiro: MCT/ INPA – PRJ- 012
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Estudo citogenético em Hemiloricaria parva
(Siluriformes, Loricariidae) coletada em um afluente do
rio Taquari, município de Coxim, MS
Porto, FE1; Nishiyama, PB1; Vieira, MMR2; Ferreira, GE1; Zawadzki, CH1; Portela-Castro, ALB1;
Martins-Santos, IC1
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul- UEMS/UCX
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Banda-C, Citogenética, Hemiloricaria, NOR, Loricariinae
A família Loricariidae é uma das maiores famílias de peixes de água doce da região Neotropical, contudo, apenas
algumas espécies foram estudadas citogeneticamente, apresentando uma grande variabilidade cariotípica, tanto
do ponto de vista numérico, quanto em relação à estrutura cariotípica, além de apresentarem um alto número
de cromossomos acrocêntricos. Os gêneros Rineloricaria e Hemiloricaria tem sido objeto de discussão entre os
taxonomistas devido à grande similaridade morfológica entre eles. Apenas recentemente este último tem sido
aceito como válido, tendo sido alocadas 25 espécies no gênero, com distribuição que abrange desde as drenagens
do Panamá até o rio Paraná na Argentina (exceto o alto Paraná). Apesar disso, estudos citogenéticos não foram
conduzidos no gênero, até o presente momento. Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo analisar
citogeneticamente uma população de Hemiloricaria parva do córrego da Onça (bacia do rio Taquari, CoximMS), pelas técnicas: convencional com Giemsa, impregnação por nitrato de prata (Ag-NOR) e bandamento C.
A análise cariotípica mostrou número diplóide de 2n=48 cromossomos, distribuídos em 6m + 10sm + 14st +
18a e NF=78. Através da técnica Ag-NOR foi identificado um sistema de NOR múltipla, sendo observada uma
marcação abrangendo todo o braço curto do primeiro par de submetacêntrico e outras marcações terminais
menores nos braços curtos de pelo menos dezesseis cromossomos acrocêntricos. Estas regiões são também
coincidentes com a heterocromatina constitutiva evidenciada pela banda-C, sendo que 6 destes acrocêntricos
apresentaram também banda C teloméricas, incluindo cromossomo com marcações biteloméricas. Hemiloricaria
e Rineloricaria são gêneros próximos do ponto de vista taxonômico. A posição da NOR no primeiro par de
submetacêntrico presente em Hemiloricaria tem sido frequentemente observada em espécies de Rineloricaria,
sugerindo ser este um cromossomo homeomólogo; contudo, a presença de NOR múltipla na espécie estudada
indica uma condição derivada dentro do grupo Loricariinae. Além disso, a presença de 32 cromossomos subteloacrocêntricos indica também uma maior proximidade deste gênero com grupo Rineloricaria em relação aos
demais da tribo Loricariinae. Assim, estudos citogenéticos em espécies do gênero Hemiloricaria, podem fornecer
subsídios aos estudos taxonômicos e sistemáticos do gênero e futuras análises comparativas na subfamília.
Apoio financeiro: CAPES, UEM-PBC.
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Estudos citogenéticos em três populações de Ancistrus
aff. cirrhosus (Siluriformes, Loricariidae) da bacia do
Alto Paraná, PR
Borin, LA1,2; Prizon, AC1; Nishiyama, PB1; Porto, FE1; Zawadzki, CH3; Santos, ICM1; Portela-Castro, ALB1
Fundação Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Jandaia do Sul.
Departamento de Biologia Celular e Genética- Universidade Estadual de Maringá
3
Departamento de Biologia – Universidade Estadual de Maringá
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Siluriformes, Pimelodidae, Ancistrus, citogenética de peixes, citogenética de peixes, cromossomos.
A subfamília Hypostominae, pertencente à família Loricariidae, compreende a maior porcentagem de espécies
dentro da família, sendo as tribos Hypostomini e Ancistrini as maiores em número de espécies. O gênero mais
especioso dentre Ancistrini com 59 espécies nominais, Ancistrus Kner, 1854, está amplamente distribuído pela
região neotropical, desde o Panamá até a porção média da Argentina. A alta similaridade morfológica entre as
espécies e o grande número de formas não descritas fazem a taxonomia deste grupo bastante complexa. Em
coletas realizadas pelo Nupélia (Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura) foram capturados
na bacia do alto rio Paraná, representantes do gênero Ancistrus com indícios de serem espécies desconhecidas
pela ciência. Estudos citogenéticos podem ser utilizados como ferramenta importante para distinguir espécies
crípticas, bem como auxiliar na resolução de problemas taxonômicos. No presente trabalho comparamos as
características cariotípicas de três populações de Ancistrus aff. cirrhosus coletados nos rios Mourão, Cambira e
Ocoí (tributários do rio Ivaí – PR) a partir de análises de metáfases mitóticas. Os espécimes das três populações
mostraram um número diplóide de 2n=50 cromossomos com a fórmula cariotípica de 16M+14SM+10ST+10A.
A coloração por nitrato de prata indicou a presença de um sistema de NOR simples em posição terminal sobre
o braço curto de um par de subtelocêntricos para as três populações analisadas. A técnica de bandeamento C
revelou consideráveis porções de heterocromatina distribuída em regiões terminais e pericentroméricas sobre
o complemento cromossômico. Entretanto, estudos prévios na população do rio Mourão caracterizaram
a presença de um polimorfismo de heterocromatina constitutiva em um par de cromossomos homólogos
resultante de um processo de inversão. Adicionalmente, cromossomos B foram descritos para esta população
com variação de 0-1. Nossas análises atuais para a população do rio Ocoí, demonstram a ocorrência de um
par heteromórfico cuja origem parece associada a existência de um sistema de cromossomos sexuais do tipo
ZZ-ZW. Embora similaridades quanto ao número e fórmula cariotípica tenha sido observada nas populações
analisadas, a presença de polimorfismos cromossômicos e mecanismo de determinação sexual constituem
em evidências do processo de transformação evolutiva, que podem subsidiar o diagnóstico de novas espécies.
Apoio financeiro: UEM, FAFIJAN
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Triploidia natural no gênero Rineloricaria (Loricariidae,
Loricariinae)
Rodrigues, RM; Almeida-Toledo, LFA
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: choque térmico, corpúsculo polar, Ribeira do Iguape, vantagem evolutiva, triploidia natural
Variações no número cromossômico e no material genético têm representado papel determinante na evolução
dos eucariontes. As variações mais dramáticas ocorrem por meio da poliploidia, processo caracterizado pela
multiplicação do genoma inteiro. Entre os vertebrados, relatos de poliplóides viáveis estão restritos aos peixes,
anfíbios anuros e alguns répteis. Muitos peixes economicamente importantes, tais como a carpa, salmões
e esturjão, evoluíram de antepassados poliplóides. Entre os peixes neotropicais, o gênero Corydoras apresenta
em sua história evolutiva uma possível ocorrência de poliploidia. O gênero Rineloricaria é composto por 64
espécies distribuídas da Costa Rica até o Norte da Argentina. Este gênero apresenta uma variação cariotípica de
2n=36 a 2n=70, indicando um aumento no número de cromossomos com dois braços à medida que se reduz o
número diplóide, o que demonstra uma marcante participação de rearranjos Robertsonianos em sua evolução.
Jamais foram relatados casos de poliploidia em populações de Rineloricaria, apesar de eventos de poliploidia
na evolução do gênero não estarem descartados. No presente trabalho é apresentado o cariótipo de uma fêmea
triplóide originada a partir do número diplóide 2n=70 cromossomos da espécie Rineloricaria sp. n., proveniente
da bacia do Ribeira do Iguape (Cajati/SP). A fêmea triplóide apresentou 2n=3x=105 cromossomos, com uma
fórmula cariotípica de 3M+3SM+99ST/A e uma heterocromatina distribuída nas regiões pericentroméricas dos
cromossomos. A triploidia foi identificada por três fatores: 1) número de cromossomos elevado, 2) marcações
de Ag-RONs em três cromossomos do complemento e 3) sondas do gene ribossomal DNAr 18S hibridadas, por
meio da hibridação in situ fluorescente, em três cromossomos do complemento. A triploidia foi confirmada com a
montagem do cariótipo, indicando que cada cromossomo apresentou três cópias nesse complemento. A triploidia
aqui registrada pode ser o resultado de uma retenção do segundo corpúsculo polar na meiose dessa fêmea,
originando um núcleo com três conjuntos haplóides. Em psicultura, a ploidia pode ser manipulada por meio de
choque térmico ou exposição das células a irradiações. Como a Bacia do Ribeira do Iguape está localizada numa
região fria do Estado de São Paulo e outros casos de triploidia já foram registrados nessa bacia, as oscilações bruscas
na temperatura da água podem ter sido a fonte de choque térmico que provocou a retenção do corpúsculo polar.
Não são totalmente claras as vantagens evolutivas que peixes poliplóides apresentam sobre peixes diplóides, uma
vez que ambos são fenotipicamente similares. Talvez uma vantagem exista no fato de peixes diplóides possuírem
somente duas cópias de cada alelo do genoma, e, portanto, se uma mutação ao acaso ocorrer em um alelo com
uma função vital para o organismo, esta mutação poderá ocasionar efeitos deletérios no indivíduo, mas cópias
adicionais deste alelo em peixes poliplóides reduziriam a probabilidade de esses efeitos negativos ocorrerem.
Apoio Financeiro: FAPESP; CNPq
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Análise de PCR-RFLP nas espécies do grupo
Characidium lauroi (characiformes, crenuchidae)
Oliveira-Bressane, KC1; Garcia, C1,2; Buckup, PA3; Almeida-Toledo, LF1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo.
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, campus Jequié.
3
Museu Nacional, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Characidium lauroi, PCR-RFLP, ATPase 6 e 8, enzima de restrição, DNAmt
Para o gênero Characidium, pertencente à família Crenuchidae, existem relatos sobre a formação de um grupo de
espécies relacionadas à espécie C. lauroi, sendo que as relações entre as espécies que compõem esse grupo não
foram ainda totalmente resolvidas. Esse grupo é formado por C. lauroi, C. japuhybense, C. schubarti, C. oiticicai, C.
sp “Piabanha”, C. sp “Iguaçu”, e as características morfológicas que agrupam essas espécies estão relacionadas ao
padrão característico de pigmentação e ao fato de que se encontram restritas aos pequenos riachos montanhosos
de primeira e segunda ordem da região de Mata Atlântica da região Sul e Sudeste, caracterizados pela presença de
corredeiras e cachoeiras de água cristalina e temperatura freqüentemente baixa. A aplicação da técnica de PCRRFLP pode ser resolutiva nessa problemática, pois é capaz de identificar haplótipos espécie-específicos, por meio da
qual uma reconstrução filogenética pode ser obtida. O objetivo do presente trabalho é analisar molecularmente as
espécies pertencentes ao grupo C. lauroi, provenientes de suas localidades-tipo, a fim de tentar elucidar as relações
filogenéticas entre as espécies do grupo em questão. O uso do marcador PCR-RFLP demonstrou a separação clara das
espécies estudadas, uma vez que o padrão de digestão observado para as 7 enzimas de restrição aplicadas permitiu
identificar padrões de mtDNA espécie-específicos. Uma exceção a isso são as espécies C. lauroi (pop 2) e C. sp
“Piabanha”, que compartilharam o mesmo haplótipo conjugado. Com base nesses haplótipos, foi possível construir
uma matriz de ausência/presença de cortes, que foi utilizada para reconstruir uma árvore filogenética bastante
resolutiva para o grupo C. lauroi. A árvore obtida nos mostra que dentro do grupo C. lauroi, a espécie C. schubarti é a
espécie mais basal, seguida de dois clados, um formado pelas espécies C. lauroi pop 2, C. sp “Piabanha”, C. oiticicai,
grupo-irmão do clado composto por C. japuhybense e C. sp “Iguaçu”. Já C. lauroi (pop 1) agrupou com C. cf zebra. Com
base nesses resultados, podemos dizer que, provavelmente, C. lauroi (pop 2) e C. sp “Piabanha” representam uma
única espécie, assim como que C. lauroi (pop 1) não pertence ao grupo Characidium lauroi, uma vez que agrupou com
C. cf zebra, considerada a espécies basal dentro do gênero. Logo, conclui-se que a utilização desse tipo de marcador
molecular fornece informações resolutivas para as análises das espécies pertencentes ao grupo Characidium lauroi.
Auxílio financeiro: Capes, FAPESP e CNPq.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Isolamento e Caracterização parcial de marcadores
Moleculares Microssatélites para a piraíba –
Brachyplatystoma filamentosum – (PIMELODIDAESILURIFORMES): Um grande bagre migrador em
sobrepesca na Amazônia
Batista-Silva, L1,2,3; Menezes-Araújo, L2; Formiga, KM2,3 ; Alves-Gomes, JA2,3; Batista, JS2,3
Bolsista DTI/CNPQ
Laboratório Temático de Biologia Molecular – LTBM/COPE/INPA
3
Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática – CPBA/INPA, Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução - LFCE
[email protected]
1
2
Palavras-chave: piraiba, microssatelites, bagres migradores, conservação, sobrepesca
Introdução: A Amazônia é considerada um dos ecossistemas mais íntegros e produtivos por ser o responsável pelo
maior volume de captura de peixes de água doce. Um dos aspectos mais marcantes da bacia amazônica é a elevada
riqueza da ictiofauna composta de um elevado nível de diversificação e com alta variabilidade genética. Os grandes
bagres migradores são um dos grupos de peixes capturados pela pesca comercial na Amazônia, destacado por seu
grande valor comercial, sendo a piraiba (B. filamentosum) a espécie de maior porte desse grupo e que atualmente está
em sobrepesca. Objetivos: Isolar e parcialmente caracterizar marcadores moleculares microssatélites para piraíba
(Brachyplatystoma filamentosum). Métodos: Uma biblioteca genômica enriquecida foi construída seguindo-se as
etapas: digestão do DNA genômico com a enzima SAU3AI; ligação dos adaptadores Er1Bh1Blunt e Er1Bh1GATCSticky;
pré-amplificação; seleção de fragmentos contendo microssatélites, por hibridização de sondas biotiniladas e
magnetização; amplificação dos fragmentos selecionados, clonagem e transformação em bactéria da linhagem TOPO
TA (Invitrogen); amplificação dos insertos clonados, seleção e sequenciamento nucleotídico dos clones positivos.
Resultados: Foi obtida uma biblioteca genômica com 672 clones recombinantes e destes 237 com seqüência de boa
qualidade. Com o auxílio do programa STADEN e WEBSAT foram observados 178 Microssatélites em 216 contigs não
redundantes, sendo 129 SSRs classificados como dinucleotídeo (72%), 11 trinucleotídeos (6%), 11 tetranucleotídeos
(6%), 5 pentanucleotídeos (3%) e 1 hexanucleotídeo (1%). Quanto a natureza de origem , 82% foram classificados
como simples perfeitos, 11% simples imperfeitos e 12% compostos. O motivo de repetição mais freqüente (AG/
TC) variou entre 6 a 21repetições e o microssatélite com maior número de repetições encontrado foi do tipo AG
com 34repetições. Com o auxílio dos programas WEBSAT e PRIMER3, foram desenhados primers flanqueadores
para 32 marcadores SSR com tamanho variando entre 111 a 340 pb. Até o momento, 27 locos amplificaram com
temperatura de anelamento variando entre 56 a 65 ºC. Destes, 12 mostram-se polimórficos. Conclusão: O sucesso da
conservação dos sistemas aquáticos e do manejo dos recursos pesqueiros depende do conhecimento integrado em
diferentes aspectos da biologia das espécies explotadas e das características do ambiente onde vivem. Neste contexto,
os Microssatelites (SSR) são marcadores potenciais a serem utilizados como ferramenta não só na identificação
genética de estoques pesqueiros mais também na estimativa da variabilidade genética de populações naturais
dessa espécie. Essas informações irão contribuir significativamente para a obtenção deste sucesso e subsidiando
políticas de manejo uma vez que a elaboração das estratégias será baseada no conhecimento científico da espécie.
Apoio: CNPq, FAPEAM, PROCAD/CAPES E INPA
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Rápida evolução independente de cromossomos
sexuais: implicações para especiação em espécies
crípticas de Eigenmannia (Teleostei: Gymnotiformes)
Henning, F1,2; Moysés, CB1; Calcagnotto, D1; Meyer, A2; de Almeida-Toledo, LF1
1 Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil
2. Lehrstuhl für Zoologie und Evolutionsbiologie, Fachbereich Biologie, Universität Konstanz, Konstanz, Germany
Palavras-chave: microdissecção, especiação, pintura cromossômica, máxima parcimônia, métodos Bayesianos de reconstrução filogenética, tempo para o ancestral em commum mais recente (TACMR).
A teoria da evolução de cromossomos sexuais (CS) tem seu início nas idéias de S. Ohno e é baseada principalmente
no trabalho de B. Charlesworth, podendo ser resumida da seguinte forma: CS diferenciados morfologicamente
se originaram repetidamente a partir de pares homólogos de autossomos. Após a evolução de um novo gene de
determinação (de novo ou por transposição) tem início o processo de diferenciação morfológica, que é explicada
pelos efeitos da falta de recombinação e conflitos inter-sexuais. CS se originaram repetidas vezes em vertebrados.
Particularmente em peixes, são encontrados sistemas cromossômicos de determinação de sexo, diversos em
espécies próximas. Exemplos de CS recentes foram descritos nos teleósteos-modelos Gasterosteus e Oryzias, onde
os CS se originaram há não mais do que 10 m.a e 6 m.a., respectivamente. Estes exemplos permitem testar a
teoria do processo inicial de diferenciação. Isto é de grande interesse, uma vez que a teoria foi formulada baseada
primariamente na análise de cromossomos altamente diferenciados. Interesse adicional para o estudo da
evolução de CS vem do fato de que estes parecem ter um efeito desproporcional no estabelecimento de barreiras
pos-zigóticas, sendo, portanto de grande importância no processo de especiação. Neste trabalho, confirmamos
sugestões anteriores de origens repetidas de CS no gênero Eigenmannia através de reconstrução filogenética
usando metodos de máxima parcimônia e Bayesianos em seqüências mitocondriais. Os dados sugerem ainda uma
terceira origem independente de um sistema ZW. Tempos de divergência foram estimados e sugerem que dois
sistemas de CS se originaram há 6 m.a. e 0,6 m.a e são, portanto, os CS mais recentes descritos até hoje. Através
de pintura cromossômica, mostramos que um néo-cromossomo Y evoluiu por fusão, e que um dos cromossomos
ancestrais fundiu-se independentemente, a um outro cromossomo na espécie irmã. Possiveis efeitos na meiose de
híbridos são discutidos e sugere-se que esses rearranjos podem ter implicações nos processos de especiação neste
gênero.
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Analise morfológica em cromossomos de Apareiodon
affinis (Characiformes,Parodontidae), Rio Coxipó, Bacia
do Alto Paraguai, Mato Grosso, Brasil
Montezol, M1; Centofante, L2
Ciências Biológicas - IB - UFMT
Departamento de Zoologia e Biologia; Instituto de Biociências/Faculdade de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Apareiodon affinis; citogenética
A diversidade das espécies descritas da ictiofauna na Bacia do Pantanal Matogrossense consiste em 269 espécies,
em que 110 dessas espécies pertencem a ordem Characiformes. No Pantanal, a família Parodontidae, pertencente
a ordem Characiformes, é composta por dois gêneros (Parodon, Apareiodon), sendo o gênero Apareiodon
representado por uma única espécie, A. affinis. Parodontidae são peixes pequenos sem valor econômico, no entanto,
apresentam grande importância biológica. As informações a respeito de análises citogenéticas dessa família
ainda são relativamente escassas, por isso esta pesquisa teve como objetivo colaborar no estudo da sistemática e
análises das relações evolutivas desse grupo através da caracterização citogenética da espécie Apareiodon affinis.
Os indivíduos foram coletados (22 fêmeas e 17 machos) no período de Outubro/2008 e Maio/2009, no Rio Cuiabá,
na região do São Gonçalo. Utilizou-se a rede de arrasto como técnica de coleta. Os indivíduos foram levados para o
laboratório de citogenetica animal da Universidade Federal de Mato Grosso, seguindo a técnica de preparação de
cromossomos mitoticos direta. Para marcação das Regiões Organizadoras de Nucléolo (RON) foi utilizado o Nitrato
de Prata (AgNO3), que é uma importante ferramenta citotaxonômica para identificação e estudos evolutivos em
peixes. Os dados citogenéticos para esta espécie ainda são preliminares. Observou-se na população analisada um
valor diplóide de 2n=54, apresentando a seguinte fórmula cariotípica: 19 pares de cromossomos metacêntricos/
submetacêntricos, 8 pares de subtelocêntricos/acrocêntricos, mostrando o número fundamental igual a 100. As
regiões heterocromáticas, como evidenciadas neste trabalho, revelaram pequenos blocos de heterocromatina
constitutiva na região centromérica de alguns cromossomos de dois braços, e alguns blocos conspícuos intersticiais
em poucos pares de acrocêntricos. Em outros Parodontidae, o acúmulo de heterocromatina constitutiva parece
ter sido um evento importante na evolução cariotípica e origem de cromossomos sexuais. A impregnação de
Nitrato de Prata (AgNO3), para Apareiodon affinis, mostrou regiões organizadoras de nucléolos (RON’s) simples. A
ampliação de trabalhos citogenéticos neste grupo é importante para auxiliar na compreensão da linha evolutiva
e no conhecimento da biodiversidade, podendo inferir na definição de áreas estratégicas à conservação da
biodiversidade, além de demonstrar a ocorrência de populações com diferenças a nível cromossômico e/ou a
existência de espécies crípticas.
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Análise morfométrica e da expressão de elementos
retrotransponíveis (Rex 1, 3 e 6) na musculatura
estriada do tambaqui (Colossoma macropomum)
Alves-Costa, FA1; Diniz, TH1; Barbosa, CM1; Wasko, AP2; Martins, C3; Silva, MDP1
UNESP - Instituto de Biociências de Botucatu, Departamento de Morfologia, Laboratório de Biologia do Músculo Estriado
UNESP - Instituto de Biociências de Botucatu, Departamento de Genética, Laboratório de Biologia Molecular Animal
3
UNESP - Instituto de Biociências de Botucatu, Departamento de Morfologia, Laboratório de Genômica Integrativa
[email protected]
1
2
Palavras-chave: tambaqui, Colossoma macropomum, elementos retrotransponíveis, Rex, análise morfométrica
Das 3000 espécies de peixes descritas na Amazônia, estima-se que somente 100 são exploradas comercialmente. Entre
as espécies de interesse econômico, destaca-se o tambaqui (Colossoma macropomum), peixe de hábito migratório
que adapta-se facilmente à criação em cativeiro e apresenta crescimento rápido, atingindo grande tamanho
corpóreo. Estas características impulsionam as atividades comerciais e, conseqüentemente, diversos estudos
relacionados a esta espécie. Porém tais estudos estão relacionados, em sua maioria, com trabalhos citogenéticos e
ecológicos, sendo escassas as pesquisas sobre a expressão de genes associados com o desenvolvimento do tecido
muscular, bem como, a expressão gênica e função de elementos transponíveis neste tecido. O músculo esquelético
é um tecido versátil, constituído por células multinucleadas especializadas, as fibras musculares, que exibem alta
plasticidade. Esta particularidade habilita este tecido a alterar suas características morfológicas e funcionais, em
resposta a estímulos ambientais específicos. De uma maneira geral, alguns fatores como doenças, poluição, alteração
de temperatura e outros desafios ambientais que expõem um organismo a situações de estresse, podem levar à
expressão de elementos de transposição. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo avaliar a morfologia
e a presença de transcritos dos elementos retrotransponíveis, Rex 1, 3 e 6, no músculo estriado esquelético de
tambaqui. A amostragem apresentou espécimes oriundos do Lago Catalão, região de Manaus (AM) e com peso
médio de 176,01 ± 55,14 gramas,. Para realização das análises morfológicas foram coletadas amostras de músculo
branco na região dorsal, as quais foram fixadas em formalina tamponada e incluídas em Historesina. Os cortes
histológicos foram submetidos à coloração HE para a realização do cálculo do menor diâmetro das fibras musculares,
visando avaliar o grau de crescimento muscular. Para realização das análises da expressão de transcritos de Rex 1,
3 e 6 foram extraídos os RNAs de amostras da musculatura branca do tambaqui. Essas amostras foram tratadas
com DNAse e foram transcritas reversamente. Foram realizadas reações de PCR utilizando vários conjuntos de
primers previamente desenhados para Rex 1, 3 e 6. Os produtos de PCR foram analisados em eletroforese em
gel de agarose 1,5%, a qual permitiu a identificação de bandas de tamanhos correspondentes aos elementos de
retrotransposição Rex 3 e 6 previamente descritos para outras espécies de peixes. Nenhum produto específico
pôde ser observado para amplificação de Rex 1 com o conjunto de primers utilizado. Também, foram calculados
os diâmetros das fibras musculares e 68,13% das fibras apresentaram diâmetro maior que 50µm, mostrando que
o crescimento muscular por hipertrofia foi o mecanismo predominante na espécie analisada. Além de ampliar os
conhecimentos genéticos acerca desta espécie de peixe amazônico e sobre os elementos transponíveis, os dados
obtidos podem contribuir para futuros estudos que visam a melhor compreensão dos mecanismos de interferência
ambiental sobre a regulação da expressão desses elementos no tecido muscular esquelético desta espécie.
Apoio Financeiro: CNPq FAPESP, PROC. no 2009/52007-3) e INCT–ADAPTA/FAPEAM/CNPq, Processo no.
573976/2008-2.
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O monofiletismo do clado Otothyris, Pseudotothyris
e Schizolecis (Siluriformes: Loricariidae: Otothyrinae)
testado por dados moleculares
Chiachio, MC1; Oliveira, C2; Langeani, F1
Laboratório de Ictiologia, Departamento de Zoologia e Botânica, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – IBILCE / UNESP,
São José do Rio Preto, SP
2
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências de Botucatu – IB / UNESP, Botucatu, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Sistemática Molecular, Filogenia, Siluriformes, Hypoptopomatinae
A família Loricariidae, com aproximadamente 720 espécies descritas, é a maior em número de espécies entre
os Siluriformes e também uma das maiores famílias da ictiofauna mundial. Apresenta vários problemas de
classificação, principalmente quando se trata das subfamílias. A subfamília Hypoptopomatinae foi considerada
monofilética desde a sua descrição incluíndo aproximadamente 90 espécies distribuídas em 17 gêneros e duas
tribos, Hypoptopomatini e Otothyrini. A relação direta entre os membros dessa subfamília e de outras dentro de
Loricariidae foi evidenciada em diversos trabalhos baseados em dados morfológicos, indicando a necessidade
de novas reconstruções filogenéticas para seus representantes, baseadas em dados independentes. Atualmente
diversos grupos de pesquisa têm estudado a subfamília Hypoptopomatinae do ponto de vista molecular. As relações
filogenéticas de Hypoptopomatinae sensu lato são ainda controversas, sendo modificadas constantemente em
consequência do tipo de marcadores ou conjunto de terminais utilizados. O clado “Schizolecis + (Pseudotothyris
+ Otothyris)”, com sete espécies nominais (uma em Schizolecis, duas em Pseudotothyris e quatro em Otothyris),
é aceito como monofilético em hipóteses com base em caracteres morfológicos, porém análises baseadas
exclusivamente em caracteres oriundos de sequências de DNA não recuperam o grupo como monofilético. Baseado
nesses questionamentos, o presente trabalho testou o monofiletismo do clado, utilizando sequências dos genes
mitocondriais 12S e 16S rRNA e Citocromoxidase I, e do gene nuclear F-Reticulon 4. A reconstrução filogenética foi
realizada para 5 das 7 espécies pertencentes ao clado alvo de nosso estudo. Paralelamente, também foram utilizados
outros representantes da subfamília Hypoptopomatinae para as mesmas análises a fim de se comparar as relações
dos gêneros em questão com os outros da mesma subfamília. Em nossos resultados o gênero Otothyris não aparece
irmão de Pseudotothyris, como originalmente proposto, e sim de Otothyropsis. Já Pseudotothyris mostra-se irmão
dos representantes de Schizolecis. Hisonotus francirochai, que pertence a um gênero polifilético, agrupa-se com
os dois representantes de Corumbataia e, esse agrupamento, com os representantes de Schizolecis guntheri para
o qual nós temos indivíduos que representam toda sua área de distribuição. Pseudotothyris obtusa vem próximo
ao gênero Schizolecis, claramente separado do gênero Otothyris, como definido anteriormente, que tem uma
posição mais derivada em nossa árvore, não corroborando as propostas filogenéticas já divulgadas anteriormente.
Uma combinação de dados morfológicos e moleculares em uma análise filogenética de evidência total, visando
especialmente testar o monofiletismo do clado formado por Otothyris, Pseudotothyris e Schizolecis seria necessária,
procurando detectar a presença de sinapomorfias que possam diagnosticar o grupo como monofilético.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Caracterização preliminar do gene Sox9a no peixe
ciclídeo Cichla monoculus
Valente, GT1; Martins, C1
Laboratório Genômica Integrativa, Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
[email protected]
1
Palavras-chave: Determinação sexual, Substituição não sinônima, Domínio, Aminoácidos, Vertebrados
Sox9 é um gene codificante de um fator de transcrição membro de uma família multigênica envolvida na
regulação do desenvolvimento. Este gene é um dos primeiros a ser expresso durante o desenvolvimento das
gônadas masculinas e também é conhecido como um gene ancestral de determinação sexual para vertebrados.
De fato, em mamíferos, sabe-se que o gene Sry evoluiu a partir de uma duplicação do gene Sox3. Os ciclídeos
representam uma família de peixes muito utilizada em estudos evolutivos e incluem espécies como Oreochromis
niloticus (Tilápia do Nilo) e espécies do gênero Cichla (Tucunarés), muito importantes economicamente. O
objetivo do presente trabalho foi analisar a estrutura de um fragmento do gene Sox9a utilizando Cichla monoculus
como modelo experimental. A sequencia de aminoácidos (aa) do gene Sox9a de O. niloticus foi recuperada do
banco de dados ExPASy Proteomics Server e as sequencias obtidas após um BLASTp (49 sequencias, incluindo
teleósteis e todos os maiores grupos de tetrapodas) foram alinhadas (ClustalW) e os primers Sox9aF e Sox9aR
foram desenhados na região mais conservada do gene. Amostras de DNA de C. monoculus foram extraídas pela
técnica de fenol-clorofórmio e os fragmentos de PCR foram sequenciados no aparelho ABI 3730 DNA Analyser.
Os fragmentos obtidos possuem 195 pb e representam parte do éxon 1 do gene Sox9a de O. niloticus. A sequencia
consenso foi submetida a um MegaBLAST e o alinhamento das sequencias (15 sequencias, incluindo teleósteis e
o mamífero Sus scrofa) (ClustalW) demonstram uma relativa conservação entre esse fragmento de C. monoculus
e outras espécies de vertebrados. A conservação foi também observada nos aminoácidos (aa) revelando que as
substituições observadas são em geral mutações sinônimas. Nota-se que a substituição da segunda base dos 21º.
e 23º. códons levam à substituição dos aa Treonina e Asparagina, respectivamente, de O. niloticus, para Serina
em C. monoculus. O aa Treonina na referida posição é comum aos vertebrados pois é notado em 38 sequencias
(incluindo teleósteis e tetrapodas) e o aa Asparagina é observado em apenas 5 espécies de teleósteis e em Xenopus
tropicalis. As análises de instabilidade da cadeia de aa das espécies C. monoculus e O. niloticus pelo programa
Protparam sugere que esses fragmentos podem ser estáveis. Uma análise no software ScanProsite revela que
os aa 27-39 participam do domínio HMG_BOX_2 (PDOC00305) da família multigênica Sox. Outros softwares
InterProScan e MotifScan e a análise no Pfam, demonstraram os mesmo motifs para esses segmentos. Porém,
o MotifScan revelou também que os aa 18-21 e 19-24 exibem um domínio de glicosilação e de miristoilação,
respectivamente, em ambas as espécies. Sendo assim, as análises em relação as referida substituição dos
aa sugere que as diferenças nas cadeias não produzem mudanças na função da região protéica em questão.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq.
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Identificação de um possível marcador sexo-específico
em Arapaima gigas (Schinz, 1822), por meio da técnica
de AFLP
Moraes, LN; Venere, PC; Souza, IL
Laboratório Biologia Molecular do GEPEMA e DiMol, Instituto de Ciências Biológicas e da Saúde, Campus Universitário do Araguaia – UFMT
Palavras-chave: AFLP, Seqüências sexo-específicas, pirarucu, Araguaia, Bulked Segregant
Arapaima gigas (Schinz, 1822), popularmente conhecido como pirarucu no Brasil ou paiche no Perú, é um dos
maiores peixes de água doce do mundo. É caracterizado pela presença de um sistema complexo de respiração
acessória e branquial, necessitando continuamente emergir para capturar ar. Pode atingir cerca de dois a três
metros de comprimento e pesar mais de 200 kg, apresentando uma taxa de crescimento invejável e atingindo,
em um ano, até 10 kg, além de apresentar 57% de rendimento em carne. Algumas estimativas indicam que
numa área de um hectare de água se pode produzir, cerca de 8.000 kg de carne de pirarucu/ano. Apesar desse
potencial, um grande empecilho para seu cultivo em grande escala é a impossibilidade de identificar seu sexo
enquanto juvenis, uma vez que não há dimorfismo sexual externo antes do período fértil, que ocorre a partir
do 4º ano de idade. Diante do exposto, o presente estudo objetiva procurar no genoma da espécie, por meio
da técnica de AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), seqüência(s) de DNA sexo-específica(s) e,
a partir dessa(s), confeccionar primers que possibilitem identificar o sexo de espécimes em qualquer fase do
desenvolvimento. No total, foram analisados materiais de 16 indivíduos, 8 machos e 8 fêmeas, todos procedentes
de lagoas marginais do médio rio Araguaia e da fazenda Guarany (Várzea Grande-MT). A metodologia seguiu
os protocolos rotineiros para as técnicas de AFLP que consiste basicamente da análise de misturas segregantes
(Bulked Segregant Analisys Technique). Os produtos de AFLP são analisados em gel de poliacrilamida 10% e,
sempre que se observa(m) banda(s) diferencial(is) em um dos sexos, novas reações são preparadas utilizandose o DNA de cada indivíduo, separadamente, a fim de verificar se o(s) amplificado(s) representa(m), ou não,
seqüência(s) sexo-específica(s). Até o momento 16 combinações de diferentes de primers foram utilizadas nas
reações de AFLP. Dentre essas, uma combinação revelou uma banda de aproximadamente 710bp no bulk de
machos (ausente no bulk de fêmeas). A banda amplificada é candidata a ser marcador molecular sexo-específico
que necessita de confirmação. Diante disso estão sendo realizadas novas reações empregando o DNA de cada
indivíduo separadamente a fim de se verificar sua presença (ou não) em todos os machos e sua ausência (ou não)
nas fêmeas, uma vez que o simples fato de ter sido encontrada uma banda apenas em machos ainda não nos
garante que a mesma representa um bom marcador molecular sexo-específico. Por outro lado, confirmando-se
sua eficiência como marcador nesses indivíduos, novas estratégias serão adotadas para sua validação, como por
exemplo, clonagem, seqüenciamento, confecção de primers e testes em outras populações de Arapaima gigas.
Apoio financeiro: FAPEMAT, CNPq.
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132
Estudos citogenéticos em duas espécies de Astyanax e
a presença de cromossomos supranumerários
Santos, LP¹; Martins, RR¹ ; Morelli, S¹
¹Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
Palavras-chave: Characidae, cariótipo, bandamento, cromomicina.
A família Characidae é a maior e mais complexa dentre os Characiformes, compreendendo a maioria dos peixes
de água doce do Brasil, com espécies variando consideravelmente em tamanho, peso, forma, alimentação e
comportamento. Recentemente, várias espécies deste grupo foram listadas como Incertae Sedis devido a falta
de evidências consistentes de monofiletismo. Atualmente essa família é composta por 12 subfamílias, além
daqueles grupos citados acima. Com o objetivo de levantar informações que possam ser úteis para auxiliar na
compreensão dessa complexa ictiofauna, foram realizadas análises citogenéticas em espécies de Astyanax
sp e Astyanax aff. bimaculatus da região de Monte do Carmo-TO. Astyanax sp e Astyanax aff. bimaculatus
apresentaram 50 cromossomos, sendo que no primeiro se verificou a presença de 0 a 6 cromossomos B e um
sistema de Ag-RONs simples. Estes sítios se mostraram também heterocromáticos. Além disso, conspícuas
marcações heterocromáticas centroméricas e pericentroméricas também foram observadas, Astyanax
aff. bimaculatus apresentou sistema de Ag-RONs múltiplas com até três pares marcados, alguns dos quais
também CMA3+. O bandamento C revelou marcas pericentroméricas em quase todos os cromossomos.
Esses resultados vão de encontro à idéia de que o grupo anteriormente tratado como Tetragonopterinae
engloba uma diversidade de grupos bastante acentuada o que é um reflexo de sua natureza polifilética.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CAPES, CNPq, UFU
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133
Análise das relações filogenéticas dos gêneros
Odontostilbe e Serrapinnus com outros Cheirodontinae
(Characidae) baseada em sequências de DNA
mitocondrial e nuclear
Mariguela, TC1; Abe, KT1; Santos, GAS 1; Castro, RMC 2; Oliveira, C1
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista (UNESP), Botucatu, São Paulo, Brazil
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, Brazil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Sistemática molecular, 16S rRNA, Citocromo b, RAG1, RAG2, Myh6
Os Characiformes são peixes exclusivamente de água doce e encontram-se distribuídos nas Américas e na África,
atingindo maior diversidade nas principais drenagens neotropicais. A família Characidae é o grupo mais especioso
entre os Characiformes, porém a relação dessa família com outras famílias é ainda incerta. São conhecidas cerca de
1000 espécies de Characidae das quais cerca de um terço está distribuída em 14 subfamílias, e as demais não tem
uma posição filogenética clara, sendo incluídas em um grande grupo considerado incertae sedis em Characidae. A
subfamília Cheirodontinae compreende cerca de 55 espécies válidas, sendo um grupo de characídeos amplamente
distribuídos nas bacias hidrográficas da América do Sul e Central, incluindo espécies trans-Andinas. Os 16
genêros de Cheirodontinae reconhecidos atualmente estão divididos em duas tribos: Cheirodontini (Cheirodon,
Nanocheirodon, Heterocheirodon, Spintherobolus, Amazonspinther e Serrapinnus), Compsurini (Saccoderma,
Compsura, Acinocheirodon, Kolpotocheirodon, e Macropsobrycon ) e alguns genêros sem posição filogenética
conhecida (Odontostilbe com Holoshesthes como sinônimo, Aphyocheirodon, Cheirodontops, Pseudocheirodon e
Prodontocharax). No presente estudo, foram investigadas as relações entre os gêneros e o maior número possível
de espécies de Cheirodontinae, com ênfase nos gêneros Odontostilbe e Serrapinnus, que compreendem a maioria
das espécies da subfamília. Foram utilizadas no estudo, sequências de DNA mitocondrial (16S rRNA e Citocromo
b) e nuclear (RAG1, RAG2 e Myh6) que foram analisadas por análise bayesiana. As análises de consenso por
maioria resultaram em uma nova proposta de relacionamento entre gêneros de Cheirodontinae, uma vez que
as tribos reconhecidas não se mostraram monofiléticas. Os gêneros Odontostilbe e Serrapinnus apresentaram-se
polifiléticos, e O. fugitiva e S. piaba, que são os gêneros tipos dos gêneros, mostraram-se agrupados e formando um
grupo monofilético contendo também muitas outras espécies de Serrapinnus e Odontostilbe. Conclui-se que os dois
gêneros analisados no presente trabalho pertencem à um mesmo grupo, com uma proposta de unificação desses
gêneros em um só, o gênero Odontostilbe, que apresenta-se como o mais antigo reconhecido para o grupo encontrado.
Apoio financeiro: FAPESP e CNPq
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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134
Relações filogenéticas entre espécies do gênero
Brycon (Characiformes: Characidae) baseadas em
sequências do gene mitocondrial 16s
Panarari-Antunes, RS1; Gomes, VN2; Galdino, AS3; Prioli, AJ 2,4; Prioli, SMAP2,4; Agostinho, CS5
Departamento de Ciências, Universidade Estadual de Maringá
Núcleo de Pesquisas em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura (Nupelia), Universidade Estadual de Maringá
3
Núcleo de Bioquímica, Universidade Federal de São João Del-Rei, Campus Centro-Oeste Dona Lindu
4
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá
5
Núcleo de Estudos Ambientais, Universidade Federal de Tocantins
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Brycon, relações filogenéticas, gene mitocondrial 16S
O gênero Brycon pertence à subfamília Bryconinae e no Brasil espécies deste gênero podem ser encontradas
na maior parte das bacias hidrográficas, tais como a bacia Amazônica, do Paraná, do Paraguai e do AraguaiaTocantins. O presente trabalho teve como objetivo estudar as relações filogenéticas entre as espécies Brycon cf.
pesu, Brycon cephalus, Brycon falcatus, Brycon gouldingi, e outras treze espécies do gênero Brycon baseado em
seqüências parciais do gene mitocondrial 16S, que transcreve o rRNA 16S. O DNA de espécimes de B. cf. pesu, B.
cephalus, B. falcatus e B. gouldingi foi extraído com metodologia baseada em fenol/clorofórmio. Para as demais
espécies foram utilizadas seqüências já editadas e presentes no genbank. A região 16S do genoma mitocondrial
foi parcialmente amplificada por PCR. Foi analisado um fragmento de aproximadamente 433 pb do gene 16S
mitocondrial. As árvores filogenéticas de máxima verossimilhança, bayesiana e de máxima parcimônia foram
obtidas com os programas PHYML, MrBAYES 3.0 e MEGA 4.0, respectivamente. As árvores geradas pelos
algoritmos Bayesiano e de máxima parcimônia mostraram alguma similaridade com análises filogenéticas préexistentes. Mas pela inclusão de novas espécies, B. falcatus, B. cephalus, B. gouldingi, houve diferenciação em
alguns clados. Com as espécies Chalceus macrolepidotus e C. erythrurus como grupo externo, houve a formação
de dois clados considerando o gênero Brycon. O clado basal foi composto pelas espécies trans-andinas, B. henni,
B. petrosus e B. chagrensis. O segundo clado é constituído por duas grandes bifurcações. A primeira é composta
apenas por B. aff. atrocaudatus. A segunda bifurcação é dividida em três ramos. O primeiro é composto por cinco
espécies pertencentes às bacias do sudeste do Brasil e uma à bacia do Araguaia-Tocantins, no norte do Brasil. O
segundo ramo é subdividido em dois grupos. No primeiro, apesar de B. moorei ser uma espécie trans-andina, ela
foi estabelecida como grupo irmão para as espécies B. orbignyanus, B. orthotaenia e B. gouldingi distribuídas nas
bacias do rio Paraná, São Francisco e Araguaia-Tocantins, respectivamente. Já no segundo grupo, B. cephalus, B.
amazonicus e B. hilarii foram considerados grupos irmãos sendo os dois primeiros pertencentes à bacia Amazônica
e o último presente na bacia do rio Paraguai. O terceiro ramo da segunda bifurcação é composto apenas por B.
pesu, a espécie mais basal do segundo clado. Pelos resultados obtidos, pode-se inferir que geralmente espécies
morfologicamente semelhantes e presentes nas mesmas bacias ou bacias próximas, tais como B. cephalus e B.
amazonicus apresentam maior grau de parentesco. As três espécies pertencentes à bacia Araguaia-Tocantins,
B. pesu, B. falcatus e B. goulding apresentaram grau de parentesco maior com outras espécies do que entre si,
demonstrando que tais espécies podem ter se originado a partir de outras bacias e se separado posteriormente.
Apoio finaceiro: Nupélia, CAPES e Furnas Centrais Elétricas.
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Construção e caracterização de uma biblioteca
genômica enriquecida em microssatélites de Matrinxã
(Brycon amazonicus), uma espécie de importância
comercial e ambiental para a Amazônia
Lima, MP1; Climaco, GT1; Fagundes, DB1; Sousa, CFS1; Santos, CHA1; Almeida-Val, VMF1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular, Av. André Araujo, 2936, Bairro Aleixo,
CEP: 69.060-001, Manaus-AM.
[email protected]
1
Palavras-chave: microssatélites, variabilidade genética, conservação, piscicultura, matrinxã
O matrinxã (Brycon amazonicus) é a segunda espécie mais utilizada na aquicultura amazônica, principalmente
por apresentar rápido crescimento em cativeiro, alta densidade de estocagem e alcançar bons preços no mercado
consumidor. Brycon amazonicus é um caracídeo onívoro que realiza migrações reprodutivas no início da enchente,
quando desce os afluentes para desovar nos rios de água branca; realiza também migração trófica, quando sobe
os rios na cheia para se alimentar na floresta alagada. Microssatélites são marcadores moleculares muito úteis
em estudos populacionais devido ao seu alto grau de polimorfismo, co-dominância e multialelismo. A etapa
limitante no uso desses marcadores é o desenvolvimento dos iniciadores utilizados para amplificar regiões
flanqueadoras dos microssatélites. Com o objetivo de estudar os níveis de variabilidade genética de populações
naturais e de cativeiro de B. amazonicus, foram desenvolvidos marcadores moleculares microssatélites utilizando
a metodologia de construção de bibliotecas genômicas enriquecidas em microssatélites com sequências CT e
GT. O DNA total foi extraído a partir do tecido muscular e os fragmentos de interesse foram selecionados,
inseridos em bactérias competentes e depois sequenciados em sequenciador ABI 3130. As sequências foram
editadas e clusterizadas utilizando os programas EditSeq e SeqMan do pacote Laser Gene vs.5.03 (DNASTAR
Inc). Para encontrar as regiões com microssatélites, foi utilizado o programa SSRIT-Gramene, em seguida os
iniciadores foram desenhados com o programa Primer Select (DNASTAR Inc.). A partir do sequenciamento de
96 clones, foi possível desenhar 34 pares de iniciadores flanqueando regiões com microssatélites. Desse total, a
grande maioria foi constituída de dinucleotídeos com 97% e apenas 3% de trinucleotídeos, sendo 59% perfeitos e
41% imperfeitos. De todos os primers desenhados, 82% eram simples e 18 % compostos. A partir dos resultados
obtidos, conclui-se que a construção de bibliotecas genômicas enriquecidas é uma metodologia muito eficiente
para a obtenção de marcadores moleculares microssatélites. Depois de sintetizados, os primers serão validados
em populações naturais e utilizados para estudar a variabilidade genética de populações naturais e de cativeiro,
servindo de subsídio para programas de manejo e conservação dessa importante espécie de peixe da Amazônia.
Apoio Financeiro: PIATAM, CAPES (PROCAD), FAPEAM, CNPq, INCT-ADAPTA.
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Análise citogenética de Tetragonopterus chalceus
(characiformes, characidae) usando fluorocromo baseespecíficos
Almeida, LAH¹; Bitencourt, JA²; Migues, VH¹; Almeida, JA; Carneiro, PLS¹; Affonso, PRAM¹
¹Departamento de Ciências Biológicas-DCB, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia.
²Departamento de Biologia Geral-CCB, Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
Palavras-chave: Tetragonopterinae, cariótipo, RON, heterocromatina, fluorocromos
A subfamília Tetragonopterinae é composta por um único gênero e duas espécies amplamente distribuídas na
América do Sul. Porém, as relações filogenéticas dessa subfamília com os outros caracídeos são pouco conhecidas.
Adicionalmente, dados citogenéticos sobre a ictiofauna neotropical brasileira são considerados escassos nos
sistemas hídricos da região Nordeste e a biodiversidade regional ainda é pouco estudada. Sob essa perspectiva,
o presente trabalho teve por objetivo analisar a estrutura cromossômica de Tetragonopterus chalceus. Foram
coletados nove exemplares de T. chalceus (5♂ e 4♀) no rio Itapicuru Mirim (Bacia do Rio Itapicuru), município
de Caldas do Jorro (BA). A obtenção de cromossomos mitóticos foi feita a partir das células do rim anterior, a
morfologia cromossômica foi identificada de acordo com a razão de braços após coloração convencional com
Giemsa, e as regiões organizadoras de nucléolo (RONs) foram identificadas pela impregnação por nitrato de
prata. A heterocromatina foi localizada por bandamento C e a coloração com os fluorocromos cromomicina A3
(CMA3) e DAPI foi realizada para detectar as regiões ricas em GC e AT, respectivamente. Os espécimes analisados
apresentaram número modal de 2n=52, com fórmula cariotípica de 12m+12sm+28st/a (NF=78). Contudo, o
primeiro par não apresentou diferenças significativas de tamanho em relação aos demais cromossomos do
complemento, diferentemente da maioria das espécies de Characidae de pequeno porte, como os do gênero
Astyanax. A impregnação por nitrato de prata revelou RONs simples na região intersticial do braço curto do
segundo par de cromossomos submetacêntricos (par 8), apresentando-se heteromórfica entre os homólogos.
De acordo com a literatura, a presença de RONs simples não constitui uma característica comum na subfamília.
O bandamento C revelou marcações discretas nos centrômeros e ausência de heterocromatina associada às
RONs, divergindo do padrão descrito para outros pequenos caracídeos. Com relação aos fluorocromos baseespecíficos observou-se um par de cromossomos submetacêntrico CMA3 positivo e DAPI negativo marcado
na região subterminal do braço curto, coincidente com o par da NOR. Assim como na coloração com nitrato
de prata, o par portador de RONs apresentou heteromorfismo entre homólogos, caracterizando uma variação
estrutural dessa região. Adicionalmente, visualizou-se marcações CMA3 positiva e DAPI negativa na região
centromérica de seis a dez cromossomos m/sm. Os dados citogenéticos aqui apresentados representam, a
primeira descrição da espécie na região e os primeiros resultados de bandamento C e fluorocromos na espécie,
podendo contribuir para o conhecimento da biologia, taxonomia e relações evolutivas dentro da subfamilia.
Apoio financeiro: UESB, CNPq e FAPESB.
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Unusually high levels of phylogenetic diversity in
rheophilic fishes of rio Araguaia
Hrbek, T1,4; Zuanon, JA2; Batista, JS2,3; Formiga, KM2,3; Farias, IP4
Biology Department, University of Puerto Rico - Rio Piedras/UPR-RP, San Juan, Puerto Rico
Coordenação de Pesquisas Em Biologia Aquática/CPBA, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA, Manaus, Amazonas, Brazil
3
Laboratório Temático da Biologia Molecular/LTBM, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA, Manaus, Amazonas, Brazil
4
Laboratório de Evolução e Genética Animal/LEGAL, Universidade Federal do Amazonas/UFAM, Manaus, Amazonas, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: distinct lineages, micro-endemism, rheophilic habitat, ichthyofauna, rio Araguaia
Introduction: Rheophilic species as well as rheophilic habitats are increasingly threatened by construction of
dams and water-highway. Rheophilic habitats are patchily distributed in rivers descending the Brazilian and
Guyana shields, and contain a large number of endemic species; however, the rheophilic ichthyofauna is poorly
known, and it is unclear how species are shared among different rheophilic habitats within and among river
systems. Objectives. To address the degree of genetic divergence of individuals of selected rheophilic fishes
sampled from distinct regions of rapids within the same river. Methods: We analyzed 739 individuals representing
12 morphospecies from three families sampled from six rheophilic habitats of the lower Araguaia River (linear
distance of approximately 250 km between the most distant habitats), and collected approximately 660 pb each of
COI and Control Region mitochondrial DNA for each individual. Results: In the 12 morphospecies we observed
31 distinct clades (lineages), with morphospecies having from one to six distinct clades based on the criterion
of at least 5% sequence divergence between clades. Nine of the 12 morphospecies had at least two distinct
lineages, and in eight out of the nine morphospecies, the lineages were non-randomly distributed between the
sampling localities. In at least three of the morphospecies the clades showed no geographic overlap. For those
clades that were found in multiple rheophilic habitats, the alleles comprising these clades were non-randomly
distributed in two of the three Loricariidae species (a strictly sedentary, rheophilic Ancistrini taxa), in three
of the four Cichlidae species (a family of territorial and sedentary fishes), and in one out of five Anostomidae
species (Leporinus pachycheilus – a specialist of extremely high energy currents). Conclusion: Our study indicates
that ichthyofaunal biodiversity of rheophilic habitats is grossly underestimated, and that even geographically
proximate habitats have distinct and unique evolutionary lineages and fish community assemblages.
Funding. Consorcio Gesai
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Identificação de sequências parciais de cDNA dos
genes de resposta à hipóxia Epo, LDH e VEGF do
ciclídeo amazônico Astronotus ocellatus
Baptista, RB¹; Castro, NS¹; Almeida-Val, VMF¹
¹Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular (LEEM), Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA)
[email protected]
Palavras-chave: Bacia Amazônica, hipoxia, cDNA, Astronotus ocellatus e expressão gênica
As baixas concentrações de oxigênio dissolvido (hipoxia) são uma característica comum aos ecossistemas
aquáticos da Bacia Amazônica, se tornando um fator crítico, principalmente nas regiões recém alagadas de várzea
e igapó, durante os períodos de inundação. Os inúmeros ambientes hipóxicos e suas diferenças limnológicas
favoreceram o desenvolvimento de uma série de mecanismos adaptativos pelos peixes, de modo que as diferenças
marcantes nestas adaptações e na tolerância apresentadas pelas inúmeras espécies revelam as oscilações de
oxigênio como um importante agente seletivo na história evolutiva dos peixes amazônicos. A espécie Astronotus
ocellatus (Cichlidae) é nativa da Bacia Amazônica e normalmente encontrada em condições hipóxicas em seu
ambiente natural, águas lênticas de lagos e áreas alagadas da várzea, onde adentram para fins reprodutivos e
alimentares. Nos últimos anos esta espécie vem ganhando notoriedade na comunidade científica por sua extrema
tolerância à hipoxia, de modo que, além de seus aspectos comportamentais, fisiológicos e bioquímicos mais bem
caracterizados, aspectos sobre a regulação da transcrição gênica em condições hipóxicas vêm sendo enfatizados.
Por isso, considerando que a maior parte do conhecimento do papel do oxigênio sobre os mecanismos de
expressão de genes é baseada em mamíferos e um grupo seleto de organismos modelo, é indispensável focar-se
em organismos aquáticos que vivenciaram naturalmente oscilações de oxigênio ao longo de sua evolução, como
os peixes amazônicos. O objetivo deste trabalho foi identificar sequências de cDNA dos genes Eritropoietina
(Epo), Lactato desidrogenase (LDH) e Fator de Crescimento do Endotélio Vascular (VEGF) da espécie A. ocellatus.
Para tal, amostras de RNA total foram extraídas do músculo branco e, após a síntese de cDNA através do Reverse
Transcription & cDNA Synthesis Kit (Invitrogen), a amplificação dos fragmentos de interesse via PCR foi realizada
utilizando-se primers forward e reverse desenhados a partir de sequências de perciformes depositadas no banco
de dados do NCBI (http://www.ncbi.nml.nih.gov), por meio do software Oligo Explorer versão 1.2. Os produtos
amplificados foram seqüenciados num aparelho ABI 3130 (Applied Biosystems) e os eletroferogramas obtidos foram
submetidos a um Pipeline com os programas Phred (análises da qualidade das seqüências), CAP3 ( formação de
consensos) e, finalmente, o programa BLASTn do NCBI para comparar as sequências obtidas do A. ocellatus com os
bancos de dados disponíveis on line. Foram obtidas sequências de 411bp para VEGF, 436bp para LDH e 481pb para
Epo. Todas as sequências apresentaram valores adequados de e-value, com similaridade maior que 90% com outras
espécies de perciformes, cypriniformes e salmoniformes. Estes resultados serão muito úteis em ações futuras
que objetivem identificar e mapear genes de interesse para a espécie A.ocellatus, bem como a obtenção de suas
sequências completas e, principalmente, avaliação dos padrões de expressão dos mesmos em condições hipóxicas.
Apoio Financeiro: Capes e INCT ADAPTA.
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Heterogeneidade da heterocromatina em Hypostomus
aff. unae (siluriformes, loricariidae)
Affonso, PRAM1; Bitencourt, JA1; Giuliano-Caetano, L2; Dias, AL2
Departamento de Ciências Biológicas-DCB, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia
Departamento de Biologia Geral-CCB, Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hypostomus, enzimas de restrição, polimorfismo, bandamento C, ictiofauna.
As endonucleases de restrição (ER) são uma ferramenta poderosa no estudo da organização do DNA. Essas enzimas
bacterianas reconhecem e clivam seqüências alvo na dupla fita, gerando um padrão de bandas cromossômicas
altamente específico para cada uma delas. Devido a essa característica, o bandamento obtido com as ER
representam um método sensível de análise da heterocromatina, podendo revelar maior grau de heterogeneidade
e melhores análises comparativas do que o tradicional bandamento C. Dados na literatura demonstram que as
espécies do gênero Hypostomus apresentam variabilidade na natureza e distribuição de heterocromatina, mas a
utilização da digestão enzimática é ainda inexistente no gênero e mesmo na família Loricariidae. Sendo assim, o
presente trabalho teve por objetivo analisar comparativamente cromossomos metafásicos de Hypostomus aff. unae
pelo bandamento C e enzimas de restrição (Alu I, Bam HI, Hae III e Dde I), caracterizando a heterocromatina entre
as distintas populações. Foram coletados 10 espécimes no canal principal da bacia do rio de Contas (população A),
10 no rio Preto do Costa (B), 15 no rio Oricó (C) e 11 no rio Preto do Criciúma (D). Todas as populações apresentam
2n=76 e RONs simples no segundo par de cromossomos metacêntricos, porém, fórmulas cariotípicas exclusivas
para cada uma delas. As populações A e B apresentaram blocos heterocromáticos terminais e intersticiais
conspícuos na maioria dos cromossomos acrocêntricos, e equivalente às RONs, com diferenças referentes à
posição e ao par envolvido. Já a população D apresentou marcações mais evidentes nas regiões intersticiais e
também intercaladas às RONs. Blocos heterocromáticos intersticiais e terminais, não coincidentes com as
RONs, foram observados na população C. Os dados obtidos a partir da digestão com as ER revelaram grande
heterogeneidade nas frações de heterocromatina, permitindo a identificação de diferentes famílias de DNA
repetitivo nas populações e a classificação destas em grupos, sendo 5 para a população A, 6 para a B, 4 para C e D.
A região organizadora de nucléolo (par 2) apresentou-se digerida por todas as enzimas em todas as populações,
mesmo na população C onde os blocos heterocromáticos não são evidentes pelo bandamento C. A análise com
ER mostrou ser altamente informativa, revelando diferenças populacionais e particularidades na composição
do genoma em H. aff. unae, reforçando o grau de divergência evolutiva e a diversidade já fixada entre elas.
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Variabilidade genética e estrutura populacional da
pescada goete Cynoscion jamaicensis do Norte e
Sudeste do Brasil
Alencar, SSC1; Carneiro, MA1; Silva, JGR1; Santos, S1; Sampaio, I1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança
[email protected]
1
Palavras-chave: Cynoscion jamaicensis, Estrutura Populacional, Região controle mitocondrial, Costa Brasileira, Sciaenidae.
A pescada goete, Cynoscion jamaicensis, é abundante nas costas Norte e Sudeste-Sul do Brasil onde é capturada como
fauna acompanhante da frota camaroeira e na pesca direcionada, respectivamente. O presente estudo objetivou
avaliar a variabilidade e a estrutura genética populacional de C. jamaicensis das costas Norte (Pará e Amapá) e
Sudeste (Espírito Santo e São Paulo) do Brasil. Foram obtidos 557 pb da região controle de 95 indivíduos resultando
em 63 haplótipos sendo 78% únicos. As populações apresentaram altos valores de diversidade haplotípica (h = 0,90
– 0,98), porém a diversidade nucleotídica foi alta para populações do Sudeste (π = 1,2 - 1,4%) e baixa para o Norte
(π = 0,5 - 0,6%), indicando que a taxa de exploração ainda não comprometeu os índices de diversidade genética
uma vez que no Sudeste o estoque está em estado de sobrepesca. Análises de variância molecular e FST mostraram
elevada subestruturação genética entre os grupos do Norte e Sudeste (FCT = 0,23, P < 0,05; FST= 0,24 – 0,26, P < 0,05),
e baixa, mas significante diferenciação, no Sudeste (FST= 0,05, P < 0,05). Os haplótipos dos dois grupos não foram
reciprocamente monofiléticos, sugerindo fluxo gênico atual e/ou retenção de polimorfismo ancestral. O teste de
Mantel apresentou correlação positiva, porém não significativa, indicando que esse teste mostra que não é possível
explicar a diferença observada entre populações de C. jamaicensis avaliadas pela distância geográfica. Portanto
fatores históricos e/ou características ambientais distintas que dominam as áreas de ocorrência destes grupos tais
como padrões de temperatura e correntes, podem ter proporcionado a subestruturação detectada. O teste Fs de Fu
foi negativo e significativo para todas as populações, enquanto o D de Tajima foi negativo e significativo apenas para
a Costa Norte. Associados aos testes de neutralidade, os diferentes valores de θ, resultados de Raggedness (0,02 a
0,04) e SSD (P > 0,05) não rejeitam expansão para as populações do Norte e Sudeste do Brasil. No entanto, outros
processos evolutivos como efeito carona ou seleção não podem ser descartados uma vez que as distribuições das
diferenças par a par mostraram curva multimodal para todas as populações. Apesar de poucas populações avaliadas,
a evidência de dois grupos de C. jamaicensis deve ser considerada para manejar a espécie na área amostrada.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESPA, UFPA.
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Identificação molecular de tucunarés, Cichla
(Perciformes: Cichlidae) da bacia Amazônica utilizando
sequências do gene mitocondrial rRNA 16S
Silva, APL¹; Watanabe, LA¹; Schneider, H¹; Sampaio, I¹
¹Laboratório de Genética e Biologia Molecular – Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança
[email protected]
Palavras-chave: Cichla, tucunaré, 16S, mtDNA, identificação.
Os tucunarés, peixes originários da bacia amazônica, pertencem ao gênero Cichla, família Cichlidae e ordem
Perciformes. São carnívoros de água doce, adaptados a ambientes lênticos, podendo atingir cerca de 60 cm de
comprimento e peso acima de 7 kg. O grupo possui ampla distribuição nas bacias Amazônica e do Orinoco, além de
ser encontrado em muitos locais fora de sua distribuição natural. Em virtude dessa ampla distribuição geográfica
e alta diversidade morfológica encontrada no grupo, a taxonomia de Cichla foi revista recentemente, sendo
postuladas 15 espécies válidas para o gênero. Porém, análises baseada apenas em caracteres morfológicos (cor
padrão, dados morfométricos e merísticos) não são suficientes para distinguir algumas espécies do gênero Cichla,
que quando juvenis e semi-adultos apresentam os mesmos padrões de cores, as quais se modificam apenas quando
adultos. Em vista disso, o presente estudo tem como objetivo a identificação molecular das populações naturais de
tucunarés da bacia Amazônica, utilizando seqüências do gene mitocondrial rRNA 16S. As análises foram baseadas
em seqüências de 55 indivíduos de Cichla provenientes dos seguintes rios da bacia Amazônica: Tocantins, Xingu,
Trombetas, Amazonas, Solimões e Uatumã, juntamente com cinco sequências do Genbank (AF049017, AF049018,
AF049019, AF112640 e AY263831) que foram incorporadas ao banco de dados para identificação das espécies. A
matriz de divergência nucleotídica e um cladograma de agrupamento de vizinhos foram obtidos pelo programa
MEGA 4.0 e PAUP* versão 4.0b10, com significância dos agrupamentos estimada pela análise de bootstrap. Entre
as 55 seqüências de DNA obtidas, apenas nove haplótipos diferentes foram observados, sendo que os haplótipos
distintos de 16S de Cichla diferem em 23 dos 408 sítios analisados. Para os haplótipos diferentes, a menor
divergência foi de 0,3%, enquanto a mais elevada foi de 3,6%. Com base nesses valores de divergências nucleotídicas,
na distribuição geográfica, e na descrição morfológica das espécies, foi possível identificar pelo menos oito das
15 espécies atualmente propostas para o gênero: Cichla thyrorus, C. melaniae, C. temensis, C. piquiti, C. kelberi, C.
monoculus, C. orinocensis e C. ocellaris. Contudo, os resultados sugerem que este fragmento de 16S pode ser usado
para discriminar espécies de Cichla, embora não resolva satisfatoriamente as relações filogenéticas entre as espécies.
Apoio financeiro: CNPq e Capes.
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Ocorrência de citótipos e variação de NORs em
Bryconamericus aff. iheringii do ribeirão Três Bocas/PR
Silva, LLL; Giuliano-Caetano, L; Dias, AL
Laboratório de Citogenética de Peixes, Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina.
[email protected]
Palavras-chave: Bryconamericus, citótipos, heterocromatina, NOR, variabilidade
Introdução: A família Characidae contém a maior diversidade da ordem Characiformes, com 952 espécies válidas
e 400 ainda não descritas, distribuídas amplamente pela região Neotropical. O gênero Bryconamericus inclui
56 espécies descritas que habitam uma variedade de ecossistemas de água doce em toda América Central e do
Sul e pertence ao grupo Incertae Sedis, proposto para incluir os gêneros antigamente pertencentes à subfamília
Tetragonopterinae que não apresentavam evidências de monofiletismo. O gênero Bryconamericus é um dos menos
diversificados da família Characidae e seus representantes são muito semelhantes entre si, diferindo apenas em
pequenos detalhes. Objetivo: O presente trabalho teve como objetivo contribuir com dados citogenéticos de
Bryconamericus aff iheringii. Métodos: Foram coletados 5 exemplares do Ribeirão Três Bocas, afluente do rio Tibagi/
PR. Foram empregadas técnicas para obtenção de cromossomos mitóticos, impregnação por nitrato de prata
para evidenciar as NORs, banda C para observar a distribuição da heterocromatina, fluorocromos cromomicina
A3 e DAPI para localizar, respectivamente, regiões ricas em G-C e A-T. Resultados: Todos os exemplares de
Bryconamericus aff iheringii apresentaram 2n=52 com diferentes citótipos ( formas cariotípicas): citótipo I com
18m+14sm+12st+8a (NF=96) e citótipo II com 12m+10sm+16st+14a (NF=90). Todos os exemplares apresentaram
NORs simples, mas com variação na localização cromossômica entre os citótipos: no citótipo I a NOR se encontra
no braço curto de um par metacêntrico e no citótipo II em um par subtelocêntrico, sendo observadas tanto NORs
homomórficas como heteromórficas quanto ao tamanho, entre os cromossomos homólogos. No indivíduo do
citótipo I foi observada NOR dupla em apenas um dos cromossomos marcados pela prata. A coloração com o
fluorocromo CMA3 nas preparações cromossômicas de Bryconamericus aff iheringii, evidenciou marcação positiva
no par cromossômico da NOR, e o DAPI mostrou-se negativo nesta região, caracterizando-a como rica em bases
GC e pobre em AT. A heterocromatina, através da técnica de banda C, mostrou-se distribuída principalmente
em regiões terminais e pericentroméricas na maioria dos cromossomos, não sendo evidenciada nenhuma
diferença entre os citótipos. Um par de cromossomos banda C positiva apresentou bandas coincidentes com a
NOR, significando que regiões heterocromáticas encontram-se intercaladas aos genes ribossômicos. Conclusões:
Os dados obtidos comparados aos da literatura sugerem que espécies distintas de Bryconamericus estejam
em simpatria no Ribeirão Três Bocas, pois diferenças significativas foram observadas para essa população.
Apoio: Fundação Araucária
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Desenvolvimento de iniciadores para amplificação
da região D-Loop mitocondrial da espécie Trichiurus
lepturus para estudos genéticos populacionais
Resende, PCB1; Hilsdorf, AWS2
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura, Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes.
[email protected]
Palavras-chave: espada, região controle, DNA mitocondrial, iniciadores, D-loop.
Introdução: Trichiurus lepturus é uma espécie cosmopolita de extrema importância comercial, sendo a nona espécie
mais capturada no mundo com um volume de captura de 1.326.975 t. No Brasil, a pesca do espada vêm se tornando
cada vez mais expressiva na região sudeste-sul, a última estimativa em 2005 foi de uma captura de 1.976,50 t. Para que
os impactos causados com a pesca sejam reduzidos e esta atividade se torne sustentável, estratégias de manejo das
populações sob explotação devem ser adotadas, levando em consideração variáveis ecológicas, comportamentais
e fisiológicas, bem como a estrutura genética das populações da espécie em questão, logo que a conservação
da variabilidade genética das populações de peixes ou outros organismos aquáticos é uma etapa fundamental
para manutenção da viabilidade destas populações a médio e longo prazo. Estudos populacionais utilizando
DNA mitocondrial são amplamente difundidos por conta de suas características permitirem o gerenciamento
e a identificação de populações. Parte dessa molécula corresponde a região controladora ou D-loop, que é uma
região não codificante de aproximadamente 1.200 nucleotídeos, esta região é muito mais sensível a mutação que
o DNA nuclear, assim, vem sendo amplamente utilizado em pesquisas, fornecendo novas informações sobre a
variabilidade genética de várias espécies de peixes e permitindo a delimitação de unidades de gestão e a avaliação
de propriedades de conservação. Objetivos: Desenvolver iniciadores específicos da região controle do DNA
mitocondrial (D-Loop) de Trichiurus lepturus para serem usados em avalições genéticas populacionais da espécie
na costa brasileira. Métodos: Sequências registradas no GenBank dos genes de CitB e 12s de Trichiurus lepturus
foram utilizadas para o desenvolvimento dos iniciadores foward e reverse, utilizando os programas Primer3
Input (version 0.4.0) para a obtenção dos primers e IDT Scitools OligoAnalyzer 3.1 para verificação da qualidade
desses iniciadores. Resultados: Na região do gene CitB foi desenhado o iniciador 5’- GCA GCC TGA ATC GAA AAC
-3’ cuja TM foi de 51,9°C e na região do gene ribossomal 12s foi desenhado o iniciador 5’- CTA GAG GGA TCT
GAT GAA CC -3’ cuja TM foi de 51,5°C, ambos contém 50% de citosinas e guaninas. Conclusões: Os iniciadores
revelaram um amplicon de aproximadamente 1600 pares de base que serão utilizados em avaliação populacional.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Marcadores de DNA microssatélites para a dourada
- Brachyplatystoma rousseauxii- (Siluriformes:
Pimelodidae), o bagre de maior importância para a
pesca na Amazônia: Isolamento e caracterização de 30
locos polimórficos
Batista, JS1,2; Farias, IP3; Formiga, KM1,2; Sousa, ACB4, Alves-Gomes, JA1,2
Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução (LFCE), Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática (CPBA), Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA)
2
Laboratório Temático de Biologia Molecular (LTBM/COPE), Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA)
3
Laboratório de Evolução e Genética Animal (LEGAL), Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas (UFAM)
4
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG), Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
[email protected]
1
Palavras-chave: bagre migrador, marcadores microssatélites, Amazônia, dourada, conservação.
Introdução: a dourada (B. rousseauxii) é provavelmente a espécie do gênero Brachyplatystoma mais importante para
a pesca na Amazônia, sendo capturada há décadas ao longo da bacia Amazônica no território de pelo menos cinco
países amazônicos. Essa espécie se encontra em sobrepesca de crescimento e possui um ciclo de vida complexo e pouco
compreendido que inclui a maior migração reprodutiva conhecida para peixes de água doce, compreendendo áreas
de criação, alimentação e reprodução geograficamente diferenciadas, distantes cerca de 4500 km. Objetivos: Isolar e
caracterizar marcadores moleculares microssatélites (SSR) para B. rousseauxii. Métodos: uma biblioteca genômica
enriquecida em SSR foi construída utilizando o DNA genômico extraído a partir de um pool de 10 indivíduos amostrados
no município de Iranduba-AM, Brasil. Após digerido com a enzima RSAI, os Fragmentos de DNA contendo SSR foram
selecionados por hibridização com sondas (CT)8 e (GT)8. Após ligação, clonagem e transformação, os clones recombinantes
foram seqüenciados e eletroinjetados em ABI 3130. As sequências de DNA foram editadas e compiladas com os
programas CHROMAS v2.33 e BIOEDIT v7.0.9, os contigs gerados com o programa STADEN e os primers desenhados com
os programas WEBSAT e PRIMER3. Cada loco SSR foi marcado com uma fluorescência (FAM ou HEX) e os produtos de
PCR, gerados com o DNA de 35 indivíduos de dourada coletados no Pará (AM), foram eletroinjetados em MegaBACE
1000. O tamanho dos alelos foi estimado com o programa FRAGMENT PROFILER v1.2, usando o padrão de genotipagem
ET400 ROX. A estatística descritiva, o teste de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) e de Desequilíbrio de Ligação (LD)
foram inferidos com o programa ARLEQUIN v3.11 e alelos nulos checados usando o programa MICRO-CHECKER v2.2.3.
Resultados: Foram seqüenciados 133 clones recombinantes, e destes 120 (85%) geraram 87 contigs não redundantes com
o total de 140 (81,37%) SSR. A partir de 51 contigs (61,45%) foram desenhados 40 pares de primers. Destes, 35 locos (87,5%)
amplificaram entre 58 a 65°C de temperatura de anelamento. Nos 30 locos polimórficos (77,5%) o número de alelos variou
entre 2 a 22 por loco, com uma média de 9,87. A heterozigosidade observada variou entre 0,143 a 0,914 com uma média de
0,636, enquanto que a heterozigosidade esperada variou entre 0,215 a 0,929, média de 0,706. Cinco locos não apresentaram
HWE após correção de Bonferroni. LD foi verificado entre três pares de locos e a presença de alelos nulos em cinco locos. O
conteúdo de polimorfismo informativo variou entre 0,207 a 0,910, média de 0,668 e o poder discriminante variando entre
0,403 a 0,995, com média de 0,848. Conclusão: os 30 locos microssatélites podem ser usados em estudos de genética de
populações e identificação de estoques pesqueiros, subsidiando assim, políticas de conservação e manejo para essa espécie.
Apoio Financeiro: SECT-FAPEAM, CNPq, PROCAD/CAPES, GCBEv, INPA.
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Divergência Genética em Leporinus piau Fowler, 1941
(Characiformes, Anostomidae) a partir de sequências
do gene rRNA 16S
Fraga, E1; Silva, LMM1; Gualter, PKC1; Sucupira, IG1; Barros, MC1; Sampaio, I2
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA, Caxias-MA
Laboratório de Genética e Biologia Molecular/IECOS – Campus de Bragança/UFPA, Bragança-PA.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Piaus, DNA mitocondrial, Rio Parnaíba, Rio Poti, Rio Itapecuru
Leporinus piau Fowler, 1941 tem como localidade-tipo o rio Salgado (Icó) no estado do Ceará, sendo também
encontrada com frequência em diferentes bacias do Nordeste brasileiro, como São Francisco, Parnaíba e Itapecuru.
Em virtude de sua abundância ao longo de sua distribuição esta espécie tem sido explorada nas pescas artesanal
e esportiva e também como peixe forrageiro. Em cativeiro, apresenta condições favoráveis para ser utilizada
na piscicultura por aceitar bem ração peletizada e extrusada. No gênero Leporinus a morfologia é bastante
similar diferindo apenas em alguns caracteres morfométricos e no padrão de coloração. No entanto os taxons
morfologicamente similares exibem diferenciação genética que sugerem evidências de isolamento. Na tentativa de
conhecer os índices de divergência genética de L. piau, sequências do gene rRNA 16S foram obtidas de espécimes
oriundos da bacia do rio Itapecuru, Parnaíba e Poti. O DNA foi isolado utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio
e a amplificação da região de interesse, foi realizada via PCR. Os produtos das PCRs foram seqüenciados utilizandose o método didesoxiterminal. As seqüências foram editadas e alinhadas no programa BIOEDIT e as análises
filogenéticas geradas no programa MEGA4. Foram adicionadas seqüências do Genbank de L. piau oriundas da
bacia do São Francisco (EU181563/voucher LBP260 4161, EU181564/voucher LBP260 4162 e HM015214/voucher
LBP260 4309) e de Prochilodus nigricans (AY788075) usada como grupo externo. Os resultados da análise de um
fragmento de 433 pb revelaram uma elevada divergência genética (7 a 8%) entre os haplótipos de L. piaui (voucher
MZUSP 104576) da bacia do rio Itapecuru e os haplótipos dos rios Poti e Parnaíba. A divergência genética entre
os haplótipos da bacia do rio Itapecuru e do rio São Francisco variou de 3 a 7%. A reconstrução filogenética gerou
árvores com topologia similar mostrando três clados distintos, o clado I que agrupou os haplótipos de L. piau
do rio Itapecuru (100% bootstrap), o clado II os haplótipos de L. piau do São Francisco, sequências do GenBank
(100% bootstrap) e o clado III os haplótipos do rio Poti e Parnaíba fortemente agrupados com 99% de bootstrap
com outra sequência do GenBank HM015214/voucher LBP260 4309. Embora as variações do gene rRNA 16S não
possibilitem uma quantificação de variabilidade genética na maioria dos organismos, foi possível detectar níveis
elevados de divergência genética em L. piau o que sugere um padrão de diferenciação para esta espécie nas diferente
bacias em estudo e consequentemente contribui na resolução de questões taxonômicas que comprometem o
sucesso de programas de manejo e conservação desta espécie que apresenta grande potencial na piscicultura.
Apoio financeiro: FAPEMA/UNIVERSAL Nº. 10/2009, BNB, UFPA e UEMA.
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Relações filogenéticas em Heptapteridae (siluriformes)
com base em genes mitocondriais
Garcia, C1; Oliveira, C2; Almeida-Toledo, LF3
Laboratório de Genética – Depto de Ciências Biológicas – Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – UESB Jequié
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu
3
Laboratório de Ictiogenética – Instituto de Biociências – Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Análise filogenética, Heptapteridae, Heptapteriinae, mtDNA, Phreatobiini
A família Heptapteridae, endêmica da região Neotropical, é uma das famílias mais representativas dentro da ordem
Siluriformes, sendo que seus representantes podem ser encontrados em pequenos corpos de água desde o México até
o Sul da Argentina. A última filogenia proposta com base em dados morfológicos recuperou a família Heptapteridae
como um grupo monofilético e propôs sua subdivisão em duas tribos também monofiléticas: Phreatobiini
e Heptapteriinae. Tendo em vista o escasso conhecimento sobre a família Heptapteridae e sua importância
ecológica e evolutiva, o presente trabalho buscou testar as hipóteses de monofilia da família Heptapteridae e de seu
relacionamento inter-genérico, para tal foi utilizado o seqüenciamento de genes mitocondriais (ATPase 6 e 8, Cit b
e 16S). Até o momento foram incluídos nas análises 26 dos 31 gêneros descritos de heptapterídeos e representantes
das famílias Pimelodidade e Pseudopimelodidae e exemplares de Conorhynchus conirostris como grupos externos.
Foram realizadas análises de Neigbor-Joining e Máxima Parcimônia utilizando 1000 réplicas de bootstrap, sendo que
para as análises de Máxima Parcimônia foi também calculado o índice de decaimento de Bremer. Nos dendogramas
obtidos a família Heptapteridae foi recuperada como monofilética, e a divisão de seus representantes em duas
tribos foi fortemente suportada. Alguns gêneros como Rhamdia não foram recuperados como monofiléticos, sendo
que algumas espécies, até então atribuídas a este gênero, possivelmente correspondem a novos gêneros ainda
não descritos para a família. O gênero Pimelodella, embora tenha sido recuperado como monofilético, apresenta
uma clara divisão em dois grupos a qual também é corroborada por dados citogenéticos. Este estudo ainda está
em andamento e pretende-se ainda adicionar outros dados moleculares e bem como representantes dos demais
gêneros de modo a melhor definir as relações evolutivas dentro desta importante família de bagres neotropicais.
Apoio Financeiro: FAPESP, CAPES e CNPq.
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Locos microssatélites heterólogos em seis espécies
de bagres migradores (Siluriformes: Pimelodidae) da
Amazônia
Formiga, KM1,2; Farias, IP3; Sousa, ACB4; Alves-Gomes, JA1,2 Batista, JS1,2
Laboratório Temático de Biologia Molecular-LTBM, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA
²Bolsista PIBIC/CNPq/INPA. 2Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução – LFCE, Coordenação de Pesquisas em Biologia
Aquática – CPBA/INPA
3
Universidade Federal do Amazonas- UFAM, Laboratório de Evolução e Genética Animal – LEGAL. 4Universidade Estadual de Campinas UNICAMP, Departamento de Genética e Evolução, Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – CBMEG
[email protected]
1
Palavras-chave: Bagres migradores, Amazônia, Brachyplatystoma, Microssatélites, Amplificação heteróloga.
Introdução: Os peixes lisos (Siluriformes: Pimelodidae) perfazem cerca de 55% da pescaria existente na região
sendo feita em cima de cinco espécies da Familia Pimelodidae, e cerca de 95% deste percentual é obtido
somente pela captura de cinco espécies do gênero Brachyplatystoma. O melhor aproveitamento dos recursos
pesqueiros amazônicos, a sustentabilidade da pesca, e conseqüentemente a melhoria das condições de vida
de milhares de famílias que dependem destes recursos, a médio e longo prazo dependem de um plano de
manejo e de políticas publicas fundamentadas em conhecimento científico. Hoje, com o uso dos marcadores
genéticos, é possível melhor obter informações fundamentais sobre a estrutura genética e populacional das
espécies de interesse. Isto tem permitido que se possa isubsidiar, com muito mais propriedade, políticas de
sustentabilidade da explotação pesqueira. Trinta e seis locos microssatelites polimórficos foram desenvolvidos
e caracterizados para a dourada (Brachyplatystoma rousseauxii), a partir de 35 indivíduos da espécie, amostrados
em 10 cidades do Pará, Brasil. Objetivos: verificar o alcance da amplificação interespecífica e do polimorfismo
dos 36 locos microssatélites, desenvolvidos para a dourada (B. rousseauxii), nas demais seis espécies do gênero
Brachyplatystoma (B. vaillantii, B. filamentosum, B. capapretum, B. tigrinum, B. platynemum, B. juruense). Métodos:
Foi extraído o DNA total de 4 espécimes de cada uma das seis espécies, seguindo o protocolo com fenolclorofórmio. A reação de amplificação dos locos de SSR seguiu as mesmas condições de temperatura utilizadas
com as amostras de B. rousseauxii incluindo um primer M13 universal, marcado com fluorescência (FAM ou HEX)
e genotipada em Analisador Automático de DNA megaBACE 1000, usando como marcador padrão o ET 400R.
A análise dos genótipos foi realizada com o auxílio do programa FRAGMENT PROFILER 1.2 (GE HeathCare) e
os parâmetros genéticos, foram obtidos com o auxílio do programa ARLEQUIN 3.0. Resultados: Trinta e cinco
locos amplificaram em pelo menos uma espécie e 17 locos amplificaram em todas as seis espécies. O número de
locos amplificados variou entre 22 (B. tigrinum) e 35 (B. capapretum), o número de locos polimórficos variou entre
15 (B. tigrinum) e 27 (B. filamentosum) e o número de alelos variou entre um a sete alelos por loco. Conclusão:
os locos microssatélites polimórficos desenvolvidos podem ser usados como marcadores moleculares nas
demais seis espécies do gênero Brachyplatystoma. Considerando que esse gênero engloba a maioria das espécies
de bagres comercialmente mais importantes na Amazônia, a aplicação desses marcadores pode contribuir
significativamente no subsídio de políticas de conservação e manejo dessas espécies na região Amazônica.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES/PROCAD Amazônia, MCT/INPA.
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Estudos citogenéticos preliminares em
Neoplecostomus yapo e Pareiorhaphis hypselurus
(Loricariidae, Neoplecostominae)
Rubert, M1; Rosa, R2; Giuliano-Caetano, L2; Moreira Filho, O1
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Neoplecostominae, Neoplecostomus, Pareiorhaphis, citogenética, peixes neotropicais.
A subfamília Neoplecostominae pertence à família Loricariidae e é composta por sete gêneros e 33 espécies. São
peixes de pequeno a médio porte, e geralmente são caracterizadas por apresentarem na maioria das espécies
placas ósseas na região do abdômen. Apresentam uma ampla distribuição, podendo ser encontrados na maioria
dos rios brasileiros. Considerando o elevado número de loricarídeos, o número de espécies cariotipadas ainda
é muito escasso e muitas vezes se restringem a poucas espécies de um único gênero, além disso, a taxonomia
do grupo ainda é muito confusa e vem sendo constantemente revisada, para isso, os estudos citogenéticos
podem ser utilizados como uma ferramenta adicional nos estudos sistemáticos do grupo. Foram analisadas duas
espécies pertencentes à subfamília Neoplecostominae: Neoplecostomus yapo, coletada no ribeirão dos Apertados
(Mata dos Godoy), município de Londrina-PR e rio Água do Oito, município de Califórnia-PR, e Pareiorhaphis
hypselurus, coletada no rio Maquiné- RS, ambas foram analisadas através da coloração por Giemsa, impregnação
por nitrato de prata e bandamento-C. Na análise por Giemsa ambas as espécies apresentaram 2n = 54, porém,
com 20m+20sm+14st-a para P. hypselurus, com presença de constrição secundária na região intersticial do braço
longo do 11º par; e 22m+20sm+12st-a para N. yapo, com a presença de constrição secundária na região intersticial
do braço longo do 12º par. A impregnação por nitrato de prata detectou RONs simples para as duas espécies,
porém localizadas em pares cromossômicos diferentes, provavelmente correspondentes aos pares portadores das
contrições secundárias, 11º e 12º, respectivamente. Quanto à distribuição da heterocromatina, em P. hypselurus
está presente na região pericentromérica de um par submetacêntrico e associada às RONs e para N. yapo as bandas
positivas estão localizadas na região pericentromérica de um par st-a e no par 12, provavelmente associada às
RONs. Com os dados obtidos até o presente momento, podemos corroborar a literatura que considera a subfamília
Neoplecostominae como um grupo conservado dentro da família Loricariidae, no que diz respeito ao número
diplóide, RONs e padrão de bandamento-C, sendo observada apenas variação na fórmula cariotípica entre as
espécies, sugerindo que a evolução cariotípica deve-se principalmente a rearranjos cromossômicos do tipo
inversão pericêntrica ou translocação.
Apoio Financeiro: CAPES, UFSCar e UEL.
IBAMA: 1947869
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Diferenciação genética em Plagioscion
squamosissimus (Sciaenidae, Perciformes) utilizando
sequências da região controle (D-loop)
Santos, SM¹; Sampaio, I²; Barros, MC¹; Fraga, E¹
¹Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA, Caxias-MA
²Instituto e Estudos Costeiros/UFPA, Bragança-PA
[email protected] e [email protected]
Palavras-chave: Populações, diversidade genética, corvina, haplótipos e D-loop.
O gênero Plagioscion concentra espécies de grande interesse econômico, sendo a espécie Plagioscion
squamosissimus a mais comum e de grande importância na pesca artesanal e comercial. Esta espécie é
conhecida popularmente como corvina e originária das bacias dos rios Amazonas, Orenoco e rios das Guianas,
sendo introduzida nas bacias dos rios Paraná, Paraguai e São Francisco, como também, em reservatórios da
região Nordeste na década de 40. O presente estudo teve como objetivo determinar os níveis de variabilidade
genética utilizando seqüências da região controle (D-loop). A amostragem constituiu-se de espécimes oriundos
do reservatório da usina hidrelétrica de Boa Esperança/PI e do açude de Paulistana/PI. Sequências retirados
do GenBank de espécimes provenientes do rio Parnaíba, município de Miguel Alves/PI, lagoa de Nazaré/PI, rio
Piauí e do rio Poti, reservatório Mesa de Pedra/PI foram incorporadas na análise (DQ328960 - DQ328979). O DNA
total foi isolado a partir de tecido muscular, utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio. Um fragmento do
gene mitocondrial, região controle (D-loop) foi amplificado através da PCR, utilizando-se primers específicos e
seqüenciado através do método didesoxi terminal com Kit Big Dye. As seqüências foram editadas e alinhadas no
programa BIOEDIT e as análises filogenéticas geradas no programa MEGA4, DnaSP 4.0 e Arlequin 3.0. A análise
do polimorfismo do fragmento de 323 pb da região controle, revelou a presença de três sítios variáveis indicando
a ocorrência de quatro haplótipos. O Haplótipo I foi o mais frequente e compartilhado pelas populações de Boa
Esperança, Paulistana e do rio Parnaíba. Observou-se ainda, que o haplótipo II é exclusivo para reservatório de
Boa Esperança, o III para a lagoa Nazaré e o IV para o rio Poti. A diversidade haplotípica e nucleotídica quando
todas as seqüências foram consideradas como um único grupo foi de 0,5978 e 0,00211, respectivamente. No
entanto, na análise das populações separadas verificou-se valores de diversidade haplotipica e nucleotídica igual
a zero para as populações do rio Poti, Lagoa Nazaré e Paulistana. A partir dos resultados da análise molecular
de variância (AMOVA), verifica-se que a maior parte da variação encontra-se entre as populações (84,54%)
com valor de FST igual a 0,84542 e P < 0,0001, altamente significativo. Nesta análise observou-se que, apesar dos
baixos valores de diversidade haplotípica e nucleotídica estes resultados indicaram uma diferenciação genética
entre os grupos analisados. Portanto, a presente análise gerou informações que confirmam a diferenciação de P.
squamosissimus e contribui para o delineamento de ações voltadas para a conservação deste recurso pesqueiro.
Apoio Financeiro: UEMA, UFPA.
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Sistemática molecular de Mugil (mugilidae) da Costa
Maranhense
Silva, MML; da Luz, LA; Barros, MC; Fraga, E
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA, Caxias-MA
[email protected]
Palavras-chave: Mugil, DNA mitocondrial, Curimã, Cytocromo b, Tainha
A família Mugilidae agrupa 14 gêneros e 64 espécies válidas, sendo a maioria delas encontrada nos gêneros Liza
(23) e Mugil (12). O gênero Mugil agrupa 12 espécies e o único que ocorre na Costa Norte da América do Sul. No
Brasil, as espécies desta família são conhecidas como tainhas e paratis na região Sudeste e Sul, e como tainhas
e curimãs no Norte e Nordeste. A família Mugilidae tem sofrido várias revisões taxonômicas, pois apresenta
morfologia externa conservada dificultando a identificação dos taxons que agrupa exibindo uma taxonomia
confusa baseada em caracteres morfológicos. A realização deste estudo permitiu a caracterização molecular e a
estimativa dos níveis de divergência genética de mugilidios da costa maranhense com base no gene Cytocromo b.
A amostragem foi constituída de espécimes obtidos no baixo curso da bacia do rio Itapecuru/MA, em São Luis/
MA e em Rosário/MA. Para a identificação dos exemplares, utilizou-se chaves específicas, seguindo com a extração
de DNA a partir do tecido muscular, utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio. O isolamento e amplificação
da região genômica, a partir de DNA total foi realizada através da técnica de PCR usando-se primers específicos
e seqüenciado através do método didesoxi terminal com Kit Big Dye. Seqüências de Mugil retiradas do Genbank
(M. hospes MA94; M. curema MA40 TipoI; M. curema TipoII CE; M. incilis AP127; M. liza PA25) foram incorporadas
na análise para verificar a similaridade genética com as sequências geradas de mugilidios. Uma sequência de
Macrodon ancylodon do Genbank (AY526306) foi usada como grupo externo. As sequências obtidas foram editadas
e alinhadas no programa Bioedit e os cladogramas filogenéticos e a matriz de distância genética gerados através
do programa MEGA4. Um fragmento de 425 pb do gene da cytocromo b foi obtido em 12 espécimes de Mugil
revelando uma elevada distância genética entre os taxons (7 a 20%). A análise filogenética gerou árvores com
topologia similar mostrando três clados fortemente suportados (95 a 100% de bootstrap), o primeiro agrupou M.
incilis e M. Curema, o segundo M. hospes e M. curema Tipo I, classificada anteriormente como M. gaimardianus e o
terceiro agrupando os haplótipos de M. liza. Nesta análise foi possível detectar a elevada distância genética entre
taxons morfologicamente similar com taxonomia problemática como é o caso do gênero Mugil e identificar a
eficiência do gene mitocondrial da citocromo b na discriminação das espécies deste gênero. Portanto, para a costa
maranhense confirmou-se a ocorrência de mais duas (M. incilis e M. liza) das sete espécies citadas para a área.
Apoio Financeiro: UEMA, UFPA, BNB, CNPq.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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151
Caracterização molecular de duas espécies da família
Pimelodidae de ocorrência no Rio Pindaré/MA
Aragão, CKC¹; Fraga, EC¹; Sampaio, I²; Barros, MC¹
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança PA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pimelodidae, Pimelodus ornatus, Sorubim lima, rio Pindaré, caracterização molecular.
A família Pimelodidae pertencente a ordem siluriformes, agrupa atualmente 29 gêneros e 93 espécies, entre estas,
Pimelodus ornatus (Kner, 1857) popularmente conhecido como mandi-sacaca e Sorubim lima (Bloch & Schneider,
1801) como bico de pato, ambas são amplamente distribuídas por toda América do Sul e vive em diferentes habitat:
lagos, rios e bocas de igarapés. e são muito explorados na pesca comercial e de subsistência. Devido a sua ampla
distribuição e sua importância comercial objetivou-se caracterizar molecularmente e estimar a variabilidade
genética das espécies P. ornatus e S. lima de ocorrência na bacia do rio Pindaré/MA através do gene mitocondrial
utilizando rRNA 16S a fim de gerar informações que possam subsidiar o manejo e a conservação deste importante
recurso pesqueiro. A amostragem foi constituída de 18 espécimes oriundos do rio Pindaré, sendo sete exemplares
da espécie S. lima e 11 da espécie P. ornatus. Para a coleta utilizou-se redes de malhadeiras de vários milímetros,
tarrafas e espinhéis. O DNA total foi obtido a partir de tecido muscular, utilizando-se o protocolo de fenolclorofórmio. A amplificação da região genômica foi realizada através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), as
seqüências obtidas foram editadas e alinhadas no programa BIOEDIT. As análises filogenéticas foram realizadas
usando-se o programa MEGA e a obtenção dos haplótipos pelo DNAsp. Um fragmento de 500 pares de bases foi
obtido, onde observou-se 54 sítios polimóficos, três haplótipos, diversidades haplotípica de 0,660 e nucleotídica de
0,05399. Ocorreram três haplótipos, sendo o haplótipo dois o mais frequentes, seguido pelo haplótipo 1. A espécie
P. ornatus apresentou 2 haplótipos o H2 com freqüência de oito vezes e o H3 com freqüência três. A divergência foi
de 0% entre os S. lima e variou de 0% a 0,4% entre os P. ornatus. No entanto entre S. lima e P. ornatus a divergência
foi de 10,5%. Árvores filogenéticas foram obtidas através dos métodos de Agrupamento de Vizinhos (NJ), modelo
Jukes-Cantor, e Máxima Parcimônia estas mostraram-se com topologias similares, onde obsevou-se dois clados
fortemente agrupados. Os índices de diversidade haplotípica e nucleotídica, tão quanto, da divergência genética e
a reconstrução filogenética para as espécies P. ornatus e S. lima do rio Pindaré/MA confirmam a sua caracterização
quanto ao status de gênero, sendo assim, pode-se pensar em estratégias de manejo e conservação para este grupo.
Apoio financeiro: UFPA,UEMA.
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Mapeamento físico cromossômico comparativo entre
espécies de peixes ciclídeos utilizando marcadores de
DNA ligados a sexo
Mazzuchelli, J1; Martins, C1
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, UNESP-Universidade Estadual Paulista, Botucatu/SP
[email protected]
Palavras-chave: determinação sexual, cromossomos, ciclídeos, evolução
Os ciclídeos compreendem um grupo de peixes de grande importância na economia mundial devido ao seu
potencial na aqüariofilia, pesca esportiva e consumo alimentar. A espécie africana Oreochromis niloticus
(Tilápia do Nilo), devido ao seu valor econômico e sua facilidade adaptativa, tornou-se um excelente modelo
experimental na área de genética. Avanços significativos foram obtidos para esta espécie como a construção
de bibliotecas genômicas construídas em BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) e a identificação de quatro
grupos de ligação (LG) (1, 3, 5 e 7) relacionados aos mecanismos genéticos de determinação sexual. A fim de
obter melhores esclarecimentos sobre os mecanismos genéticos e moleculares envolvidos na determinação
sexual e sobre a evolução cromossômica desta família, o objetivo do nosso trabalho foi realizar o mapeamento
físico cromossômico comparativo entre espécies de ciclídeos através da hibridação in situ, utilizando como
sondas BACs do genoma de O. niloticus que contenham marcadores de DNA/genes presentes nos grupos de
ligação relacionados com a determinação sexual. Foram mapeados 14 sondas/BACs em 9 espécies da subfamília
Pseudocrenilabrinae (tilapiíneos, haplocromíneos e hemichromíneos) e os resultados obtidos indicaram uma
conservação do número e localização dos sinais de hibridação entre as espécies. Os marcadores do LG3 mapeiam
no maior par cromossômico dos ciclídeos analisados, sendo que diversos estudos citológicos sugerem que este par
representa os cromossomos sexuais da espécie O. niloticus. Na espécie Metriaclima lombardoi (haplochromíneos) foi
observado um indício de duplicação de uma região do LG3 (marcador UNH115) em relação ao padrão encontrado
nas demais espécies. Estudos recentes indicam que o LG1 está fortemente associado com determinação de
sexo em O. niloticus, porém se encontra em um cromossomo pequeno subtelo/acrocêntrico (st/a) nas espécies
estudadas e não no maior par como anteriormente observado. O LG5 também se localiza em um cromossomo
st/a, porém distinto do que contêm o LG1. Os ciclídeos africanos em geral descendem de um ancestral comum e
divergiram a cerca de 15 milhões de anos, partilham genes relacionados com a determinação sexual e apresentam
uma estrutura cariotípica conservada com a presença deste grande par cromossômico que possue os locos do
LG3. Este cromossomo se destaca dos demais tornando-se um excelente marcador para este grupo, e reflete
uma história evolutiva inicial de diferenciação de cromossomos sexuais. A utilização de BACs contendo genes/
marcadores representa uma promissora e alternativa fonte ao mapeamento físico dos cromossomos dos peixes,
que tem sido amplamente explorada sob o foco do mapeamento de sequências repetitivas de DNA. O avanço
em metodologias que integrem dados genômicos e citológicos das espécies mostra-se muito significativo para a
compreensão de diversas questões, como a determinação sexual, que norteiam a história evolutiva dos vertebrados.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP, CAPES
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Estudo dos padrões demográficos de Gymnotus
pantherinus (Gymnotiformes, Gymnotidae): um modelo
de diversificação da ictiofauna em drenagens costeiras
do sudeste/sul brasileiro
Baroni, S1; Almeida-Toledo, LF1
Laboratório de Ictiogenética, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Gymnotus pantherinus, filogeografia, drenagens costeiras, demografia.
As drenagens costeiras do leste e sudeste do Brasil apresentam um alto grau de endemismo em sua composição
faunística. Características topográficas e ecológicas dessa região fazem dela uma área de grande significado
biogeográfico, entretanto, pouco se sabe a respeito dos eventos cladogenéticos que promoveram tamanha
diversificação. No presente trabalho, foram estudadas populações de Gymnotus pantherinus endêmicas dos riachos
costeiros do litoral brasileiro, com o objetivo de se avaliar a diversidade genética do grupo e investigar possíveis
rotas de colonização e diversificação. As análises foram feitas com base em marcadores moleculares mitocondriais
(Citocromo b e Atpase 6/8), em 25 populações amostradas desde o Rio de Janeiro até Santa Catarina. Nossos resultados
mostram populações altamente estruturadas, apresentando um alto índice de fixação e baixo compartilhamento
de haplótipos. Três linhagens principais foram identificadas por meio da construção de uma rede de haplótipos,
a saber: (1) Rio de Janeiro; (2) Norte de São Paulo; e, (3) Centro-Sul de São Paulo, Paraná e Santa Catarina. A
maior diversidade genética foi encontrada no Vale do Ribeira, a qual pode ser decorrente da maior mobilidade dos
riachos nessa porção onde a planície costeira é mais extensa. Por meio do Teste de Mantel, verificou-se não haver
correlação positiva entre as distâncias genéticas e as distâncias geográficas, de modo que o padrão filogeográfico
apresentado pela espécie parece estar relacionado a eventos paleogeográficos. O clado SP/Sul é o que apresenta a
divergência mais recente, a qual pode ter ocorrido após o Último Máximo Glacial (UMG), influenciada pelas drásticas
alterações climáticas ocorridas no período. As populações localizadas a oeste da Serra do Mar (Paraíba do Sul, Alto
Tietê e Alto Iguaçu) demostram maior similaridade com drenagens adjacentes à leste, o que reforça a hipótese de
captura de cabeceiras entre drenagens previamente noticiada a partir do compartilhamento de fauna. No caso do
Alto Tietê, Paranapiacaba parece ser a localidade responsável pelo evento de conexão/dispersão das linhagens,
por compartilhar haplótipos com populações de ambos os lados da Serra do Mar. Sendo assim, nossos resultados
sugerem que o principal componente associado à dispersão e diversificação da ictiofauna costeira seja decorrente
da remodelagem das drenagens resultante de processos tectônicos e que, as alterações do nível do mar e mudanças
climáticas ocorridas durante o UMG possam ter influenciado a expansão demográfica das linhagens mais recentes.
Apoio Financeiro: Fapesp, CNPq
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Influência dos estuários na estruturação genética
de um peixe estuarino residente: O caso do tralhoto,
Anableps anableps Linnaeus, 1758 e suas linhagens
mitocondriais
Watanabe, LA1; Vallinoto, M1; Rêgo, PS2; Silva, APL1; Souza, L2; Schneider, H1; Sampaio, I1
Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança, Instituto de Estudos Costeiros (IECOS)
Universidade Estadual do Maranhão
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tralhoto, Anableps, Alça-D, Haplótipos mtDNA, Estuário.
Os estuários são ecossistemas costeiros de alta produtividade, que abrigam uma grande diversidade de organismos,
e por isso são considerados importantes berçários para muitas espécies. Estudos recentes mostram claramente
que esses ambientes podem servir como barreiras e consequentemente promover a estruturação de populações,
como por exemplo, da espécie Anableps anableps, conhecida como tralhoto, que é um peixe estuarino residente,
vivíparo e que não migra grandes distâncias, características essas que o torna um excelente objeto de estudo para
entender processos evolutivos que envolvem a diferenciação genética de espécies e populações em estuários. Para
o presente estudo foram analisadas seqüências da alça-D do DNA mitocondrial de 383 indivíduos pertencentes
a três estuários do estado do Amapá (Calçoene, Amapá e Macapá), sete do Pará (Soure, Curuçá, Salinopólis,
Maracanã, Japerica, Quatipuru, Bragança e Viseu), um do Maranhão (São Luís) e um do Piauí (Parnaíba). As
análises foram realizadas nos programas MEGA 4.1, DnaSP 4.0, ARLEQUIN 3.11 e NETWORK 4.5. Os resultados
mostraram a existência de 83 haplótipos reunidos em três linhagens mitocondriais, com até 4% de divergência
nucleotídica e diferentes centros de origem. As análises de variabilidade, os testes de neutralidade e os de expansão
revelaram que as linhagens possuem diferentes características, as quais podem ser conseqüências de processos
evolutivos diferentes pelos quais estas populações passaram. A Linhagem I apresenta sinais de que está em
expansão e está presente em Japerica, Quatipuru, Bragança, Viseu, São Luís, Parnaíba e Salinopólis, podendo ter
como centro de origem o estuário de Viseu (Rio Gurupi) devido à alta variabilidade encontrada nesta população.
Já a origem da linhagem II, que é compartilhada por indivíduos de Calçoene, Amapá e Bragança é incerta, pois
apesar dessas populações estarem em uma mesma linhagem elas não compartilham haplótipos e estão isoladas
geograficamente, além de ter a menor variabilidade dentre as três linhagens. A Linhagem III, que é encontrada
em Macapá, Soure, Curuçá, Maracanã, Salinopólis e Amapá, parece ter seu centro de origem em Salinopólis. As
análises de AMOVA mostraram que a maior porção da variância observada é em decorrência de divergência
entre as linhagens. A principal hipótese para explicar esse padrão filogeográfico é o isolamento por alopatria
em decorrência de alterações no nível do mar e posterior surgimento dos estuários atuais. Algumas populações
apresentam fluxo gênico recente, que pode ser visualizado pelo compartilhamento de haplótipos divergentes,
como por exemplo, Salinopólis que apresenta haplótipos das linhagens I e III. Os resultados do presente estudo
podem ser muitos úteis para a compreensão da história evolutiva dos estuários da Costa Norte Brasileira.
Apoio Financeiro: CNPq, FINEP.
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Desenvolvimento e seleção de marcadores
moleculares microssatélites para Phractocephalus
hemeliopterus, Pirarara (Siluriformes, Pimelodidae)
Souza, CA1; Hashimoto, DT1; Mendonça, FF2; Oliveira, C2; Foresti, F2; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microssatélites, Pimelodidae, pirarara, conservação, marcador molecular.
A pirarara (Phractocephalus hemeliopterus) é um bagre nativo da bacia amazônica e pode atingir na sua fase adulta
cerca de 80 kg. A espécie pertence à família Pimelodidae e tem sido ameaçada em seu habitat devido à crescente
interferência antrópica nas últimas décadas. A poluição, a construção de barragens, a pesca excessiva e a introdução
de espécies exóticas figuram entre as principais causas de alterações nos modos de vida dos peixes desta família.
Aliado a estes fatores, o conhecimento sobre a estrutura genética das populações de peixes neotropicais ainda é
escasso, e o acesso aos dados sobre a situação destas populações constitui um importante meio para o delineamento
de projetos de manejo e conservação. Atualmente, diversos marcadores moleculares estão disponíveis na literatura
para este fim, dentre os quais se destacam os microssatélites. Esses marcadores são interessantes para estudos
genéticos devido a sua natureza codominante e multialélica, características ideais para serem utilizados em
estudos de mapeamento genético, identificação e discriminação de genótipos, além da elucidação de questões
sobre a genética de populações de diferentes organismos. Neste contexto, o presente projeto tem por objetivo
principal a identificação e seleção de marcadores moleculares tipo microssatélites para indivíduos da espécie
Phractocephalus hemeliopterus, coletados na bacia Araguaia-Tocantins. Inicialmente, foi construída uma biblioteca
genômica enriquecida em microssatélites [(AC)n e (AG)n] que resultou em 67 colônias recombinantes que foram
seqüenciadas. A seguir, identificou-se 32 clones que continham seqüências repetitivas do tipo microssatélite, sendo
a maioria de repetições dinucleotídeos (62,5%), e o restante composto por trinucleotídeos e tetranucleotídeos
repetidos de forma imperfeita. Deste total, foi possível desenhar primers para 20 destes loci. Após a amplificação
por PCR, 10 loci se mostraram polimórficos. Os resultados obtidos são de grande relevância e disponibilizam
marcadores suficientes para futuras análises populacionais. Assim, torna-se possível uma inferência segura dos
níveis de polimorfismos em diferentes populações, que possibilitem identificar e delimitar bancos genéticos desta
espécie ainda pouco estudada e de grande valor econômico nas áreas onde ocorre. Por fim, os dados obtidos
podem fornecer ferramentas que auxiliem na gestão e na estruturação de programas de conservação para a espécie.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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A eficácia do DNA Barcode para identificação
molecular de raias de água doce do gênero
Potamotrygon
Cruz, VP¹; Henriques, JM¹; Soares, AA¹; Oliveira, C¹; Foresti, F¹
¹Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista - UNESP – Distrito de Rubião Jr. s/n, Instituto de Biociências, Cep 18600000, Botucatu - SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: DNA mitocondrial, COI, Potamotrygon motoro, Potamotrygon falkneri, sequenciamento
Estudos recentes propõem o uso de um segmento do gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (Cox I)
como um sistema global de identificação de plantas e animais. Sequências desse gene são interpretadas como um
código de barras (barcode), com as espécies sendo delimitadas por uma sequência particular ou por um conjunto
de sequências muito similares. Em vista do potencial uso das sequências de DNA barcode para a identificação de
espécies, o presente trabalho teve por objetivos: obter sequências parciais do gene Cox I para as raias do gênero
potamotrygon, de ocorrência recente na bacia do Prata, avaliando o potencial dessas sequências para discriminação
e identificação dessas espécies. Os exemplares coletados tiveram um fragmento de tecido retirado e posteriormente
foram fixados em formol e depositados na coleção de peixes do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes (LBP)
de Botucatu. O fragmento de tecido retirado foi utilizado para extração de DNA total, o qual foi submetido a PCR
para amplificação do gene Cox I e posteriormente sequenciado por um sequenciador automático. Os programas
ATGC, Bioedit, Dambe e Mega 4.0 foram utilizados para edição e análise das sequências obtidas. Nesse trabalho
foram analisados 16 espécimes de raias, sendo 4 exemplares de P. falkineri, 9 exemplares de P. motoro e 4 exemplares
que possuem coloração diferenciada das espécies que ocorrem no local do estudo. Após análises moleculares das
sequencias obtidas, verificou-se que entre os exemplares de P. motoro e a raia de coloração diferenciada a divergência
genética encontrada foi de 0,2%, já a espécie P. falkneri quando comparada com a raia de coloração diferenciada,
estas apresentaram divergência genética de 2,0%. Quando comparado esses valores de divergência obtidos com
outros trabalhos para os mais variados grupos, pode-se concluir que os indivíduos encontrados que possuíam
uma coloração diferenciada são na realidade, indivíduos pertencentes a P. motoro. Concluindo através deste
estudo, que a espécie P. motoro apresenta uma ampla variação no padrão de coloração. A correta identificação das
espécies analisadas indica a eficácia do sistema de identificação por DNA barcode. Assim acreditamos que nosso
trabalho possa contribuir para uma melhor identificação das espécies de raias de água doce da bacia do Prata.
Apoio Financeiro: FAPESP, CAPES e CNPq.
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Polimorfismos das regiões organizadoras de nucléolo e
mapeamento físico do DNAr 5S em peixes Neotropicais
da família Loricariidae (Teleostei, Siluriformes)
Serrano, EA; Pansonato-Alves, JC; Oliveira, C; Foresti, F
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP
[email protected]
Palavras Chave: Hypostomus, evolução cromossômica, Ag-RONs
A ordem Siluriformes caracteriza-se como um grupo de peixes extremamente diverso e amplamente distribuído pela
região Neotropical. Pertencente a ordem Siluriformes, a família Loricariidae é uma das maiores famílias de peixes
do mundo, compreendendo cerca de 700 espécies e dividida em oito subfamílias, sendo Hypostominae a mais bem
estudada citogeneticamente e a mais complexa. O gênero Hypostomus é o mais numeroso dentre os Hipostominae,
composto por 121 espécies descritas e com ampla distribuição, desde a América Central até ao sul da América do
Sul. Estudos citogenéticos evidenciaram uma extensa diversidade cariotípica nesse grupo, variando desde 2=54
cromossomos em H. plecostomus até 2=84 cromossomos em Hypostomus sp. O presente trabalho teve por objetivo
analisar citogeneticamente nove exemplares de Hypostomus ancistroides provenientes do rio Roseira, bacia do
Rio Tietê, município de Bofete-SP, utilizando técnicas citogenéticas convencionais e moleculares, como coloração
convencional por Giemsa, identificação de regiões heterocromáticas por bandamento C, localização das regiões
organizadoras de nucléolos (RONs) através da impregnação por nitrato de Prata e localização do DNAr 5S através de
hibridação fluorescente in situ. As análises citogenéticas revelaram um número diplóide de 2n= 68 cromossomos em
todos os exemplares de ambos os sexos. O bandamento C evidenciou blocos heterocromáticos preferencialmente
localizados em posição centromérica e em posição terminal em alguns pares cromossômicos. As RONs foram
localizadas em posição terminal nos braços curtos de dois pares submetacêntricos, sendo também constatado um
polimorfismo dessas regiões de DNAr, caracterizado pela presença de um grande bloco marcado no braço curto
de apenas um dos homólogos de um par submetacêntrico. O DNAr 5S foi localizado em posição intersticial em
apenas um par submetacêntrico. Considerando que o gênero Hypostomus apresenta espécies com grande variação
em seus números diplóides, pode-se sugerir que a ocorrência de rearranjos cromossômicos do tipo fissão cêntrica e
inversão pericêntrica no decorrer do processo evolutivo, tenham contribuído para a grande diversidade de fórmulas
cariotípicas existentes atualmente. Já a variação observada junto aos cromossomos portadores de RONs pode ser
explicada pela atividade diferencial dessas regiões na intérfase precedente à divisão celular. Ainda, os resultados
revelados no presente trabalho fornecem informações que podem ser úteis para uma melhor compreensão da
estrutura cariotípica apresentada pelos representantes da família Loricariidae, além de reforçar a importância
de estudos citogenéticos como importante contribuinte para o entendimento das relações evolutivas em peixes.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP.
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Análise filogenética de Characiformes (Ostariophysi)
com base nos genes mitocondriais ATPase 6 e 8
Avelino, GS1; Foresti, F1; Castro, RMC2; Oliveira, C1
Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia, UNESP – Botucatu – SP
Departamento de Biologia, FFCLRP - Universidade de São Paulo – Ribeirão Preto – SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Filogenia, Sistemática molecular, DNA mitocondrial, peixes, sequenciamento
Entre os Ostariophysi, os Characiformes compreendem cerca de 1.500 espécies divididas em 14 famílias, sendo
quatro africanas e as demais neotropicais. Os Characiformes apresentam uma grande variação na forma corporal,
estrutura da mandíbula, dentição e anatomia interna. Este trabalho faz parte de um projeto cujo objetivo é
estudar as relações entre os Characiformes. Neste trabalho foram estudados representantes de todas as famílias de
Characiformes, todas as subfamílias reconhecidas em Characidae e 60% dos gêneros incertae sedis em Characidae.
Foram amplificados e seqüenciados parte dos genes mitocondriais ATPase 6 e 8. As seqüências foram alinhadas
usando o programa Muscle e analisadas pelos métodos de Máxima Parcimônia e Neighbour-Joining, realizadas
com o programa MEGA 4.1. A confiabilidade dos nós internos foi testada pelo método de bootstrap utilizando 1000
réplicas. O alinhamento final resultou em uma matriz de 786 caracteres dos quais 202 foram conservados, 583 foram
variáveis e 519 foram filogeneticamente informativos para as análises de parcimônia. Os resultados das análises
pelos métodos de Neighbour-Joining e Parcimônia mostraram que várias famílias de Characiformes formaram
grupos esperados, como Acestrorhynchidae, Chilodontidae, Cynodontidae, Gasteropelecidae, Hemiodontidae e
Parodontidae, ainda que em algumas dessas famílias alguns indivíduos não ficaram agrupados com a maioria, como
em Anostomidae, Curimatidae, Erythrinidae e Lebiasinidae. Algumas subfamílias de Characidae também formaram
grupos esperados como, Bryconinae, Cheirodontinae, Serrasalminae, Stethaprioninae, Stevardiinae e Triportheinae
e, também nesse caso, alguns indivíduos não ficaram agrupados com a maioria dos membros dessas subfamílias. O
alto suporte estatístico encontrado para os grupos mais internos da árvore e o baixo suporte verificado para os nós
mais internos confirmam as proposições iniciais de que os genes ATPase 6 e 8 são bons marcadores em nível de
espécie e gênero, mas não são bons marcadores em nível de família e ordens. Para resolução das relações dos grupos
que não apareceram monofiléticos a adição de novos dados de outras espécies e de outros genes está em andamento.
Apoio financeiro: FAPESP
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Paternidade múltipla no Tubarão-Crocodilo
(Pseudocarcharias kamoharai) no Atlântico Equatorial
identificada por marcadores moleculares
Ferrette, BLS1; Mendonça, FF1; Oliveira, C1; Ussami, LHS1; Gadig, OBF2; Santos, MN4; Coelho, R3; Foresti, F1
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita
Filho
2
Laboratório de Pesquisa em Elasmobrânquios, Campus Experimental do Litoral Paulista, Universidade Estadual Julio de Mesquita Filho
3
Centro de Ciências do Mar, Universidade do Algarve
4
Instituto Nacional de Recursos Biológicos, I.P. / IPIMAR
Email: [email protected]
1
Palavras-chave: paternidade múltipla, microssatélite, conservação, variabilidade genética, tubarão-crocodilo, Pseudocarcharias
kamoharai.
Os estudos relacionados à estruturação genética populacional de peixes têm contribuído substancialmente para
a elucidação de questões como a variabilidade genética, distribuição geográfica, padrões de migração, estoques
reprodutivos, taxonomia e sistemática, eventos históricos e conservação. Associado a estas informações,
o entendimento dos mecanismos relacionados às estratégias de reprodução de uma espécie constitui um
dos requisitos fundamentais para a proposição de planos efetivos de conservação e manejo. Neste contexto,
os elasmobrânquios ocupam lugar de destaque como um dos grupos de vertebrados mais negligenciados,
contrastando com a atual exploração pesqueira que vem dizimando populações de diversas espécies e colocando
várias delas nas listas de risco iminente de extinção. A espécie Pseudocarcharias kamoharai, popularmente
denominada de tubarão-crocodilo ou tubarão-cachorro, ocorre em todos os oceanos, principalmente nas regiões
tropicais. Espécie oceânica epipelágica e mesopelágica, ocupa o ambiente desde as camadas superficiais até
cerca de 350m de profundidade. A cada gestação nascem normalmente quatro filhotes com cerca de 40 cm
de comprimento total, atingindo a espécies cerca de 120 cm de tamanho máximo. O presente trabalho visa
avaliar a ocorrência de paternidade múltipla desta espécie com o uso de marcadores genéticos moleculares codominantes do tipo microssatélites. Até o momento foram analisadas 4 fêmeas prenhes com 4 embriões cada,
coletadas em regiões do Atlântico Equatorial, entre Brasil e África. As amostras foram analisadas utilizando
4 primers polimórficos e a aplicação dos dados no programa GERUD 2.0 revelou a ocorrência de paternidade
múltipla, constatando-se a presença de 2 a 4 genomas diferentes em cada ninhada examinada e identificando,
portanto, a participação de diferentes componentes da linhagem paterna nestas ninhadas. Além de identificar e
comprovar o uso de uma estratégia reprodutiva própria da espécie considera-se que as informações obtidas serão
de importância para o conhecimento biológico e evolutivo em elasmobrânquios, podendo fornecer subsídios para o
desenvolvimento de estratégias de manejo e conservação do tubarão-crocodilo P. kamoharai no Oceano Atlântico.
Apoio financeiro: CNPq
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Ausência de divergência genética entre espécies de
bagres marinhos bem definidas através de dados
morfológicos (Siluriformes; Ariidae; Genidens)
Silva, CCF; Marceniuk, AP; Hilsdorf, AWS
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura (LAGOAA), Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi
das Cruzes.
[email protected]
Palavras-chave: Genidens, D-loop, COI, ariidae, siluriformes.
O gênero Genidens é um grupo monofilético bem definido em estudos morfológico e molecular recentes. O gênero
inclui 4 espécies bem caracterizadas morfologicamente, Genidens genidens espécie com hábitos costeiros e
estuarinos, encontrada do Espírito Santo ao Uruguai, G. planifrons é restrita a lagoa dos Patos no Rio Grande do Sul,
G. barbus ocorre em estuários e na plataforma continental até 40 metros de profundidade do sul da Bahia ao norte
da Argentina e G. machadoi ocorre em regiões costeiras até profundidade 80 metros na plataforma continental,
do norte do Rio de Janeiro ao estreito de Magalhães no Chile. Embora apresentem diferentes hábitos de vida e
sejam bem caracterizadas morfologicamente, G. barbus, G. planifrons e G. machadoi não foram diferenciadas
pelos diferentes marcadores moleculares utilizados na literatura. A fim de diferenciar molecularmente as espécies
Genidens foram realizadas amplificações por PCR de dois genes, um conservado e outro considerado altamente
variável, Citocromo c Oxidase subunidade I (COI) e região controle (D-loop) do DNA mitocondrial. As sequências
foram analisadas através dos programas BioEdit e MEGA4.1. Obteve-se a sequência de 624 pb do gene COI de 7
indivíduos, que apresentaram 620 sítios conservados, 4 variáveis, 4 parsimoniosamente informativos e nenhum
sítio único. A divergência encontrada no gene COI foi de 0,6 a 0% entre as espécies do gênero, com 0% de divergência
entre G. barbus e G. machadoi, 0,2% entre G.barbus e G.planifrons e 0,6% entre G.barbus e G.genidens. Do D-loop
obteve-se 717 pb de 20 indíviduos, 10 G. barbus e 10 G. machadoi provenientes de duas populações do sul e sudeste do
Brasil, que exibem 702 sítios conservados, 15 sítios variáveis, 10 parsimoniosamente informativos e 5 sítios únicos,
com divergência nucleotídica de 1,7 a 0% entre os indivíduos analisados, não diferenciando as duas espécies. A
definição dos limites das espécies de Genidens é fundamental para o entendimento de sua biologia e conservação,
tendo em vista que as espécies do grupo apresentam importância econômica para pesca, além de desempenharem
importante papel ecológico em regiões estuarinas e costeiras. Embora novas evidências tenham sido encontradas
distinguindo G. genidens e G. planifrons, diferenças moleculares entre Genidens barbus e G. machadoi não foram
encontradas. Face aos achados, outros estudos são necessários em busca de marcadores nucleares que sustentem o
estabelecimento de hipóteses que justifiquem a ausência de divergência molecular entre espécies bem caracterizadas
morfologicamente, como por exemplo, plasticidade fenotípica, variação populacional ou especiação recente.
Apoio: CNPq, PIBIC/UMC e FAEP
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Citogenética estrutural de duas espécies do gênero
Copionodon (Siluriformes: Trichomycteridae)
endêmicas da Chapada Diamantina, Bahia
Aguilar-Aleixo, L1,2; Diniz, D1,3; Oliveira, C1; Foresti, F1
¹Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP
2
Laboratório de Citogenética de Peixes e Anfíbios – Departamento de Ciências Naturais – UESB
3
Laboratório de Citogenética – Departamento de Ciências Biológicas – UESB
[email protected]
Palavras-chave: cariótipo, bandamento C, RON, Copionodon, Trichomycteridae
A família Trichomycteridae é a segunda em número de espécies dentre os Loricarioidea, com cerca de 200 espécies
descritas, distribuídas em oito subfamílias. Os peixes reunidos nesta família formam um grupo monofilético bem
corroborado e possuem peculiar resistência e capacidade de ascensão em corredeiras, o que explica sua presença
em muitos cursos d’água em montanhas na América do Sul. Os membros da subfamília Copionodontinae, descrita
na década de 1990, possuem como características peculiares a presença de uma nadadeira adiposa conspícua e
nadadeira dorsal anterior à região mediana do corpo. É endêmica do alto curso da bacia do rio Paraguaçu, na Chapada
Diamantina, Bahia e compreende os gêneros Copionodon, com três espécies descritas e Glaphyropoma, com duas.
O objetivo deste trabalho foi comparar citogeneticamente as espécies Copionodon orthiocarinatus e C. pecten com
a aplicação de técnicas de citogenética clássica. Ambas as espécies possuem 2n=54 cromossomos nos indivíduos
de ambos os sexos e número fundamental NF=108. Tanto C. orthiocarinatus quanto C. pecten apresentaram 24
cromossomos metacêntricos, 22 submetacêntricos e 8 subtelocêntricos. Uma constrição intersticial conspícua
foi identificada no 1º par cromossômico das duas espécies, coincidente com a localização das RONs revelada
por impregnação com AgNO3. Baixa quantidade de heterocromatina constitutiva foi revelada nestas espécies pela
técnica de bandamento C, em consonância com o observado em outras espécies da família Trichomycteridae já
analisadas. Preparações cromossômicas de C. pecten foram submetidas à técnica de hibridação fluorescente in situ
com sondas para rDNAs 18S e 5S, verificando-se que a sonda para rDNA 5S marcou pontos fluorescentes no braço
curto de um par de cromossomos submetacêntricos pequenos. Enquanto o rDNA 18S foi revelado com marcação
simples e tamanho heteromórfico, localizada em posição coincidente com a constrição secundária do primeiro
par de cromossomos e RONs. Os resultados obtidos indicam que o cariótipo destas espécies possui características
plesiomórficas para a família Trichomycteridae, sustentando a hipótese de que a subfamília Copionodontinae
seja um grupo basal dentre os tricomicterídeos. A análise citogenética clássica e molecular de todas as espécies
desta subfamília bem como estudos moleculares são fundamentais para a elucidação das relações entre elas
e dos componentes da subfamília Copionodontinae com os das demais subfamílias de Trichomycteridae.
Apoio Financeiro: FAPESB, UESB, FAPESP e CNPq
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Análise da variabilidade genética do tubarão azul,
Prionace glauca (Chondrichthyes, Carcharhinidae)
ao longo da costa brasileira, com o uso de marcador
molecular
Teixeira, AF1; Ussami, LH1; Mendonça, FF1; Gadig, OBF2; Oliveira, C1; Foresti, F1
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual
Paulista (UNESP)
2
Campus Experimental do Litoral Paulista, Universidade Estadual Paulista (UNESP)
[email protected]
1
Palavras-chave: Elasmobranchii, genética de populações, DNAm, Prionace glauca, conservação
O tubarão azul (Prionace glauca) pertence à Classe Chondrichthyes, subclasse Elasmobranchii, família
Carcharhinidae. Apresenta ampla distribuição, com migrações transoceânicas e a captura pesqueira anual está
estimada entre 10 a 20 milhões de indivíduos, fazendo dessa espécie a mais pescada dentre os tubarões. A falta
de dados precisos de captura das diferentes espécies e a constatação de crescente atividade de pesca extensiva
e predatória podem levar a distorções irreversíveis a médio e longo prazos na grande malha da fauna marinha.
Assim, no caso das populações de tubarão azul na costa brasileira, torna-se premente e necessário o estudo das
características das populações, com base na avaliação da variabilidade genética existente, com o uso de marcadores
moleculares. Visando caracterizar a estrutura populacional da espécie P. glauca na costa brasileira, foram
analisadas sequências nucleotídicas de parte da região controle do DNA mitocondrial de exemplares capturados
no Rio Grande do Sul (n=38) e no Rio Grande do Norte (n=26). O alinhamento foi conduzido pelo programa BioEdit
Sequence Alignement Editor e a diversidade haplotípica e nucleotídica, o número de sítios polimórficos e o número
de haplótipos foram calculados usando o programa DnaSP 5.10. Análise de AMOVA foi conduzida pelo programa
ARLEQUIN 3.01 para determinação da estrutura populacional. O seqüenciamento de 580 nucleotídeos revelou 23
sítios polimórficos e 25 haplótipos. Os resultados indicam altas diversidades haplotípica (h= 0,9320) e nucleotídica
(π= 0,00738), sendo semelhantes aos resultados observados para as espécies Rhincodon typus, Carcharhinus limbatus
e Sphyrna lewini. A análise AMOVA detectou uma moderada estruturação populacional entre as regiões amostradas
(Fst= 0,056, P<0,02), o que pode ser justificado, apesar da relativa distância geográfica, pelo comportamento de
migrações transoceânicas da espécie P. glauca. Esses resultados são similares aos encontrados para as populações
de Carcharhinus limbatus (Fst= 0,612) e de Sphyrna lewini (Fst= 0,519), sendo estas espécies também de ampla
distribuição geográfica e comportamento altamente migratório. Tal padrão de estruturação populacional
presente em espécies altamente móveis e explotadas denotam a necessidade de um consenso no manejo dos
estoques entre as jurisdições políticas envolvidas, visando a manutenção e conservação dos estoques pesqueiros.
Apoio financeiro: CNPq
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163
Marcação diferencial por sonda DNAr 5S e análise
citogenética em duas espécies do gênero Eigenmannia
(Teleostei, Gymnotiformes)
Sene, VF1; Pansonato-Alves, JC1; Almeida-Toledo, LF2; Oliveira, C1; Foresti, F1
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP
Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Eigenmannia, DNAr, cromossomos sexuais, Bandamento C, Ag-RONs
O gênero Eigenmannia compreende um agrupamento monofilético de espécies de peixes com distribuição
endêmica na região Neotropical, englobando uma série de espécies crípticas que apresentam ampla gama de
fórmulas cariotípicas e cromossomos sexuais morfologicamente diferenciados. O objetivo do presente trabalho foi
comparar as formulações cromossômicas de duas espécies do gênero Eigenmannia, sendo uma oriunda da bacia
do rio Tietê (Eigenmannia sp2) e outra da bacia do rio Grande (Eigenmannia virescens). Foram realizadas análises
cromossômicas envolvendo coloração convencional por Giemsa, identificação das regiões heterocromáticas por
bandamento C, localização das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) por nitrato de prata e hibridização
fluorescente in situ (FISH) com sonda para o DNAr 5S. Eigenmannia sp2 apresentou 2n=31 cromossomos (9m +
6sm + 16a) nos exemplares machos e 2n=32 cromossomos (8m + 8sm + 16a) nos exemplares fêmeas, identificado
um sistema múltiplo de cromossomos sexuais do tipo X1X1X2X2-X1X2Y. E. virescens apresentou número diplóide
igual a 2n=38 cromossomos (6m + 14sm + 18a) para ambos os sexos e cromossomos sexuais homomórficos,
identificadores de um sistema simples do tipo XX-XY. A heterocromatina constitutiva identificada através
do bandamento C foi localizada em posição centromérica e em posição terminal em 10 pares cromossômicos
em Eigenmannia sp2. Já em E. virescens blocos heterocromáticos foram evidenciados em posição centromérica
e em posição terminal em apenas um par cromossômico para ambos os sexos. As RONs foram observadas
em posição intersticial em um par cromossômico acrocêntrico tanto em E. virescens como em Eigenmannia
sp2. Os sítios de DNAr 5S foram localizados no par número 12 em E. sp2 e em 4 pares cromossômicos em E.
virescens. A ocorrência de sítios de DNAr 5S dispersos tem sido detectada em diversas espécies de peixes e a
não conservação do padrão de distribuição desses sítios ribossômicos poderia estar associada à perda ou ganho
desses genes durante o processo de diferenciação. Considera-se, pois, que o mapeamento deste marcador
citológico em outros representantes desse grupo poderá resultar em informações que permitam estabelecer a
trajetória evolutiva desses genes no gênero Eigenmannia,bem como desvendar o processo de especiação ocorrido.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP, CAPES
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Caracterização citogenética de Synbranchus
madeirae Rosen & Rumney, 1972 e Synbranchus
lampreia Favorito, Zanata & Assumpção, 2005
(Synbranchiformes) do lago Catalão, Amazonas
Carvalho, NDM1; Gross, MC 2; Feldberg, E 3
PPG-GCBEv/ Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA)
Universidade Federal do Amazonas, ICB, Depto de Biologia
3
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mussum, Variabilidade cromossômica, Heterocromatina constitutiva, Região organizadora de nucléolo, Amazônia
Introdução: Synbranchidae é composta por quatro gêneros: Macrotrema, Ophisternon, Monopterus e Synbranchus.
Synbranchus é amplamente distribuído na América do Sul e atualmente compreende três espécies válidas: S.
marmoratus Bloch, 1795, S. madeirae Rosen & Rumney, 1972 e S. lampreia Favorito, Zanata & Assumpção, 2005.
Estudos citogenéticos têm evidenciado uma variação no número diploide: 42, 44 e 46 cromossomos para “S.
marmoratus” das regiões sul, sudeste e centro-oeste do Brasil e diversas fórmulas cariotípicas foram descritas.
Objetivos: Caracterizar, citogeneticamente, Synbranchus madeirae e Synbranchus lampreia. Métodos: Para
isto foram analisados 11 indivíduos de S. madeirae e oito de S. lampreia, coletados no lago Catalão, situado na
confluência dos rios Negro e Solimões. As preparações cromossômicas foram obtidas a partir de células renais
conforme a técnica “air drying”. Para detecção da heterocromatina constitutiva foi utilizada a técnica de
bandeamento C e para localizar as regiões organizadoras de nucléolo (RON) utilizou-se a impregnação por nitrato
de prata. A morfologia cromossômica foi determinada com base na razão entre os braços. Resultados: Para S.
madeirae foi encontrado 2n=46 cromossomos, sendo 6m+40a, NF=52 e para S. lampreia 2n=44, sendo 6m+2st+36a,
NF=52. Ambas as espécies apresentaram RON múltipla com até seis marcações, entretanto nem sempre todas
estiveram ativas. Deste modo, em S. madeirae foram observados quatro padrões de RON e para S. lampreia três
padrões. A heterocromatina foi observada na maioria dos cromossomos nas regiões centromérica e terminal,
para as duas espécies, porém, as marcações foram sempre tênues. Entretanto, em S. lampreia foram observados
também blocos distais em cerca de cinco pares, intersticial em um par e proximal em um par, diferenciando
totalmente as duas espécies quanto à banda C. Conclusões: Synbranchus marmoratus foi considerada por alguns
autores como sendo um complexo de espécies. Entretanto, já é conhecido que esta espécie só ocorre no Suriname
o que nos leva a sugerir que os vários cariótipos observados para diferentes populações desta espécie tratamse, realmente de diferentes espécies, o que torna claro a necessidade de uma revisão sistemática deste gênero.
Apoio financeiro: MCT/INPA, PPG-GCBEv e FAPEAM
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Identificação genética de tambaqui (Colossoma
macropomum) e dos híbridos tambatinga e tambacu
através de marcadores moleculares nucleares e
mitocondriais
Cunha, MFG;¹ Hashimoto,DT²;Watanabe, LA¹; Porto-Foresti,F²; Sampaio,I¹; Schneider, H¹
¹Instituto de Estudos Costeiros, Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Universidade Federal do Pará (Campus de Bragança)
²Laboratório de Genética de Peixes, Campus de Bauru, Universidade Estadual de São Paulo (UNESP)
[email protected]
Palavras-chave: Aquicultura, Tambaqui, Híbrido, Região Controle, PCR multiplex.
O tambaqui (Colossoma macropomum), nativo das bacias do Solimões/Amazonas e Orinoco, é a espécie nativa
mais cultivada no país, estando presente, atualmente, em quase todos os estados brasileiros. Essa espécie se
destaca pela boa adaptação ao cativeiro, inclusive em policultivo, apresenta crescimento rápido e é muito
fecunda. Tem sido normalmente induzida a cruzamento artificial com outras espécies da linhagem dos pacus
(Piaractus mesopotamicus e Piaractus brachypomus) em várias pisciculturas do Brasil, com o objetivo de produzir
organismos com vigor híbrido; os híbridos comumente produzidos são o tambacu e a tambatinga. Identificar um
híbrido pelas características morfológicas é uma tarefa difícil, pois esses indivíduos assemelham-se muito entre
si e aos parentais. O objetivo do presente estudo foi diferenciar organismos híbridos de suas respectivas espécies
parentais utilizando técnicas moleculares de sequenciamento de DNA e de PCR multiplex. Foram analisados 93
espécimes de pisciculturas dos estados do Pará, Amapá, Piauí e Rondônia, além de 34 indivíduos nativos da espécie
C. macropomum, provenientes do Lago Grande/PA. As análises foram feitas com seqüências de DNA da região
controle (DNA mitocondrial) e também pelo método de PCR multiplex do gene nuclear α- tropomiosina. Foram
sequenciados 505 pares de bases (pb) da região controle para todos os espécimes analisados (nativos e de cultivo).
A comparação das seqüências deste estudo com sequências retiradas do GenBank, mostrou similaridade genética
de aproximadamente 100% com a espécie C. macropomum, confirmando a linhagem materna desses indivíduos
como sendo oriunda de tambaqui. As sequências dos indivíduos de cativeiro revelaram baixa diversidade
haplotípica comparadas com as seqüências dos espécimes nativos, tendo sido obtido apenas dois haplótipos para
todos os 93 organismos provenientes de piscicultura, enquanto que para indivíduos selvagens foram observados
28 haplótipos. Isso se deve ao fato de que na maioria das vezes, os cultivos são formados a partir de um pequeno
número de reprodutores (endogamia), e como conseqüência desse método se tem a drástica diminuição da
variabilidade da população cultivada. Por meio da PCR multiplex foi possível identificar todos os indivíduos
analisados e, consequentemente, diferenciar se os organismos eram puros ou híbridos (tambatinga ou tambacu).
Esta ferramenta pioneira é de grande importância para a aqüicultura brasileira, pois permite determinar a pureza
(ou não) das matrizes produtoras de alevinos, a identificação de alevinos e juvenis adquiridas por piscicultores,
além de produtos ( filés) comercializados em supermercados. O resultado obtido nesse trabalho mostra que o
uso em conjunto de marcadores nucleares e mitocondriais é uma ferramenta robusta e viável para a aqüicultura.
Apoio: CNPq, CAPES, UFPA, IECOS.
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Variabilidade e estruturação genética de populações
do Tubarão-Azul (Prionace glauca) na Costa Brasileira
utilizando marcadores microssatélites
Ussami, LHF1; Mendonça, FF1; Pereira, LHG1; Teixeira, AF1; Oliveira, C1; Gadig, OBF2; Foresti, F1
Laboratorio de Biologia e Genética de peixes, Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista (UNESP Botucatu-SP)
Laboratório de Pesquisa em Elasmobrânquios, Campus Experimental do Litoral Paulista (UNESP São Vicente SP)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Conservação, elasmobrânquios, microssatelite, estruturação genética, Prionace glauca.
A identificação e manejo de estoques diferenciados é de fundamental importância para o setor pesqueiro, pela
sua relação direta com a produtividade total e uso sustentável dos recursos. Do mesmo modo, o conhecimento
acerca da variabilidade e estrutura genética das espécies é essencial para o estabelecimento de programas de
preservação. Com distribuição global, o tubarão-azul, Prionace glauca (Carcharhinidae) ocorre na área oceânicoepipelágica de toda a costa brasileira, sendo um importante recurso econômico pesqueiro, já que representa cerca
de 60% dos tubarões capturados pelas frotas pesqueiras industriais que operam com espinhéis neste sistema.
Os marcadores genéticos moleculares do tipo microssatélite têm sido amplamente empregados no estudo
de populações de peixes, com inferências sobre conservação e manejo de espécies, estudos sobre padrões de
migração, diferenciação de estoques cultivados, evidencias de introgressão genética, sistemas reprodutivos e
efeitos de fragmentação de ambientes entre taxa relacionados, gerando informações fundamentais para o manejo
adequado e conservação das espécies. Assim, o presente trabalho teve por objetivo analisar a estruturação gênica
das populações de tubarão azul encontradas no litoral brasileiro. Foram testados 22 primer de microssatelites,
dos quais 8 mostraram-se polimórficos, sendo estes aplicados na análise de amostras de indivíduos de populações
naturais capturados na região próxima ao Rio Grande do Sul (n=35) e na região próxima ao Rio Grande do
Norte (n=30). Os testes foram conduzidos via PCR e resolvidos em gel de poliacrilamida 6%, a genotipagem foi
realizada através do programa Kodak Digital Science 1D e o número de alelos/lócus, heterozigosidade esperada
e observada, equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) e o coeficiente de endocruzamento (Fis) foram obtidos com o
programa Popgene v.1.32. Para a análise da estruturação gênica foi o programa Arlequin3.11. A heterozigosidade
observada apresentou uma média de 0,5775 e a heterozigosidade esperada de 0,9209, sendo o número médio
de alelos observado de 24,375 e os alelos efetivos de 13,229. O coeficiente de endocruzamento (Fis) apresentou
uma variação de 0,1546 á 0,6386, sendo que nenhum locos apresentou-se em HWE, o qual pode ser devido ao
elevado número de homozigotos observados. O índice FST encontrado foi de 0,0667 (P< 0,00001), denotando
uma estrutura populacional moderada entre as regiões analisadas. O baixo índice de estruturação genética
encontrado nas amostras estudadas nestas duas regiões, mesmo considerando a relativa distância geográfica,
pode ser justificado pelo comportamento altamente migratório da espécie. Análises abrangendo uma maior
área de distribuição ainda devem ser realizadas para a delimitação de estoques reprodutores desta espécie.
Apoio: FAPESP; CNPq e CAPES
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Citogenética de Geophagus brasiliensis (Cichlidae;
Perciformes) do Rio das Pedras, Bacia do Rio das
Contas-BA
Oliveira, IA¹; Migues, VH¹; Diniz, D¹; Affonso, PRAM¹
¹Laboratório de Citogenética, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié – BA
[email protected]
Palavras-chave: Geophagus brasiliensis, citogenética, RONs, heterocromatina, FISH, bacia do Rio de Contas.
A Bacia hidrográfica do Rio das Contas é a maior bacia inteiramente situada no estado da Bahia. Apesar da
rica ictiofauna descrita ao longo dessa bacia análises citogenéticas para as espécies nativas são escassas.
Geophagus brasiliensis, é um ciclídeo encontrado em seus rios e diferenças morfológicas entre populações dessa
espécie são tão marcantes que chegam a sugerir a existência de um complexo de espécies. Além disso, alguns
estudos vêm revelando grandes variações no número fundamental de braços cromossômicos entre populações.
Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar citogeneticamente espécimes de Geophagus
brasiliensis da Bacia do Rio de Contas, inferindo sobre tendências evolutivas do gênero e da família Cichlidae.
Os espécimes foram coletados no Rio das Pedras, afluente do Rio de Contas no município de Jequié, distrito
de florestal, BA. A obtenção dos cromossomos mitóticos foi realizada a partir de células do rim cefálico. A
técnica de coloração convencional (Giemsa) revelou 2n = 48, com fórmula cariotípica de 2m+46st/a (NF=50).
A presença de grande número de cromossomos acrocêntricos constitui uma característica conservada nos
ciclídeos neotropicais. As técnicas de impregnação pelo nitrato de prata e bandamento C evidenciaram RONs
múltiplas, com até 3 cromossomos subtelocêntricos marcados na região telomérica no braço curto e blocos
heterocromáticos na região pericentromérica e associados às RONs, respectivamente. Através da técnica de
double-FISH usando sonda de DNAr 18S marcada com FITC e de DNAr 5S marcada com digoxigenina foi possível
mapear os genes ribossomais maiores e menores nessa população. Dois pares de cromossomos st/a foram
hibridados com o DNAr 18S marcado nos braços curtos, sendo mais evidente no par usualmente corado pelo
nitrato de prata. O DNAr 5S foi localizado na região intersticial de um grande par acrocêntrico, não sintênico
ao par portador de RONs. Os dados obtidos demonstram o caráter conservativo da estrutura macrocariotípica
da espécie. Entretanto, particularidades microestruturais são encontradas para as populações estudadas,
incluindo a detecção de sítios múltiplos de DNAr e presença de um único par portador de genes RNAr 5S.
Apoio financeiro: FAPESB
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Varredura do genoma de Pirarucu (Arapaima gigas)
para prospecção de marcadores moleculares sexoespecíficos
Almeida, IG1,3; Ianella, P2,3; Paiva, SR3; Faria, MT4; Caetano, AR3
Bolsista CNPq – CAPES - Pós Graduação em Ciências Animais, Universidade de Brasília
Bolsista PNPD-CAPES
3
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília/DF
4
Embrapa Amazônia Oriental.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pirarucu, marcador sexo-específico, RAPD-PCR.
O Pirarucu (Arapaima gigas), é um dos maiores peixes da Bacia Amazônica (atingindo até três metros de comprimento
e 200Kg) e apresenta características muito interessantes para o desenvolvimento da piscicultura da espécie: grande
rusticidade, elevada taxa de crescimento, elevado rendimento da carcaça, carne desprovida de espinhos e com
ótimas qualidades organolépticas, entre outras. A espécie apresenta um comportamento reprodutivo natural em que
macho e fêmea formam casais e portanto para se obter um bom manejo nos tanques de acasalamento, é necessário
adicionar uma quantidade equivalente de machos e fêmeas, reduzindo o estresse entre os animais. A espécie não
apresenta dimorfismo sexual ou cromossômico que permitam a distinção visual ou por cariotipagem de machos e
fêmeas. Atualmente, a sexagem de animais vivos só é possível na fase reprodutiva com o uso da ultrassonografia. A
impossibilidade de se determinar visualmente o sexo dos animais pré-puberes é um dos grandes obstáculos para
o desenvolvimento da piscicultura do pirarucu, pois não permite o manejo adequado de animais destinados a
reprodução. Com base na hipótese de que esta espécie possui um sistema de determinação sexual cromossômico,
o objetivo desse trabalho foi realizar uma varredura do genoma desta espécie utilizando a metodologia BSA (Bulk
Segregant Analysis) com marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). A identificação de sequências
sexo-específicas que permitam o desenvolvimento de um ensaio molecular para sexagem de peixes pré-púberes
permitirá o desenvolvimento de métodos inovadores de manejo de reprodutores. Amostras de sangue coletadas de
peixes pescados e sexados no município de Santarém-PA foram processadas e tiveram DNA extraído utilizandose protocolo adaptado do kit de extração de DNA - RBC Bioamérica. A quantificação e avaliação da qualidade do
DNA foram realizadas em espectrofotômetro tipo Nanodrop. Quantidades idênticas de DNA de indivíduos machos
e fêmeas foram misturadas para se constituir dois pools de DNA de ambos os sexos. Um total de 600 primers
RAPD (Operon®) foram testados em duplicata nos pools de macho e fêmea por meio da reação de RAPD-PCR. O
resultado das amplificações foi observado em eletroforese em gel de agarose a 1,5%. Dos 600 primers testados,
apenas três apresentaram banda específica em um dos pools, entretanto após repetir-se a RAPD-PCR com o
mesmo primer e com DNA de cada indivíduo componente do pool, foi possível confirmar que tratava-se de uma
seqüência indivíduo-específica, não se mantendo o padrão sexo-específico. Com base nos dados obtidos não foi
possível encontrar, até o momento, uma seqüência sexo-específica para a espécie. Um conjunto adicional de 400
primers RAPD ainda será testado para finalização do experimento e outras metodologias alternativas estão sendo
avaliadas para prospectar seqüências sexo-específicas no genoma desta espécie de alto potencial para piscicultura.
Apoio Financeiro: Embrapa e CNPq
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Identificação molecular de espécies do gênero
Eigenmannia utilizando-se o gene mitocondrial
citocromo oxidase I (COI) e o gene ribossômico 5S
Claro, FL1; Oliveira, C2; Almeida-Toledo, LF1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo
Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia, UNESP-Botucatu
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Barcoding, Eigenmannia, COI, rDNA, 5S
O gênero Eigenmannia (Gymnotiformes, Sternopygidae) compreende espécies com ampla distribuição na região
neotropical, que exibem variação no número cromossômico e apresentam padrões morfológicos complexos.
Em decorrência dessa problemática, o gênero apresenta inúmeros problemas taxonômicos e acredita-se que no
grupo haja complexos de espécies de difícil identificação apenas com caracteres morfológicos. A identificação
molecular (DNA barcode) corresponde a uma ferramenta molecular recente, cujo intuito é discriminar e identificar
espécies através da análise de seqüências de DNA. Em vista do potencial uso das seqüências de DNA barcode
para a identificação de espécies, o presente trabalho tem por objetivo avaliar esse potencial de discriminação e
identificação de espécies do gênero Eigenmannia utilizando o gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I
e o gene ribossômico 5S juntamente com seu espaçador não transcrito. O gene COI foi amplificado e seqüenciado
apresentando seqüências com o total de 671pb. A análise dessas seqüências permitiu identificar a ocorrência
abundante de transições entre as espécies, com total aproximado de 72,5% para os sítios informativos em
comparação aos 27,5% de transversões encontradas. Utilizando-se o programa MEGA foi possível esboçar a relação
entre as espécies através da construção de uma árvore de Neighbour Joining (NJ) corroborando dados prévios já
obtidos para espécies do gênero. Foram claramente identificados cinco grupos monofiléticos correspondentes
aos citótipos 2n=28, 2n=31/32, 2n=36, 2n=38 e 2n=38XY com distância genética entre 0,004 e 0,124, nos quais
espécies com menor número cromossômico (2n=31/32 e 2n=28) estão filogeneticamente mais próximas, tal qual
espécies com maior número cromossômico (2n=36, 2n=38 e 2n=38XY). O gene COI foi, portanto, suficientemente
informativo para delimitar as espécies em estudo, demonstrando ser eficaz em estudos de barcoding. De modo
complementar o gene ribossômico 5S foi também amplificado com tamanho aproximado de 300pb e a análise de
sua seqüência evidenciou uma grande conservação da região do gene em si, apresentando variação significativa
apenas em seu espaçador. Dentre as variações encontradas, a taxa de transversão, de aproximadamente 55,25%
é ligeiramente maior do que a de transição, aproximadamente 44,25%, diferindo do gene mitocondrial COI,
onde a taxa de transição é sensivelmente maior. Outra diferença importante encontrada consiste na presença
de uma inserção/deleção de 6 bases, fato esse que discrimina as espécies em dois grandes grupos, as de maior
e menor número cromossômico, tal qual visto para o gene mitocondrial COI. O esboço das relações através do
programa MEGA recuperou a mesma topologia obtida para o gene COI e distâncias genéticas similares, variando
entre 0,0035 e 0,1345, evidenciando também a eficácia desse gene, mais especificamente de seu espaçador para
estudos de barcoding. Sendo assim, a delimitação das espécies para ambos os genes indica a eficácia do sistema de
identificação por DNA barcode, fornecendo assim dados que auxiliarão na identificação taxonômica das espécies.
Apoio: FAPESP, CAPES, CNPq
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Análise de cromossomos supernumerários em
Haplochromis obliquidens (Perciformes, Cichlidae)
Fantinatti, BEA1; Valente, GT1; Mazzuchelli, J1; Martins, C1
Laboratório Genômica Integrativa, Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” –
UNESP
[email protected]
1
Palavras-chave: Cromossomos B, citogenética, DNA repetitivo, evolução, genoma
Os peixes da família Cichlidae têm recebido grande interesse científico nas últimas décadas, uma vez que muitas
das suas espécies apresentam grande importância para a aqüicultura mundial e alguns grupos particulares terem
sofrido um rápido e extenso processo de radiação adaptativa. A distribuição natural dos ciclídeos concentra-se
principalmente na África, América Latina e Madagascar. O ciclídeo africano Haplochromis obliquidens, natural do
lago Vitória na África, apresenta um ou dois grandes cromossomos supernumerários. Este trabalho teve por objetivo
a análise da composição genômica dos cromossomos B de H. obliquidens por meio de isolamento e hibridização
dos elementos transponíveis (TEs) Rex1, Rex3 e Rex6 e hibridizações de BACs enriquecidos com sequências
repetitivas provenientes de uma biblioteca do genoma de Oreochromis niloticus. As hibridizações do elemento
Rex1 apresentaram sinais em toda a extensão do cromossomo B, um padrão bastante disperso ao longo do braço
q do primeiro par (1q) e com sinais nas regiões pericentroméricas da maioria dos cromossomos. As hibridizações
da sonda Rex3 apresentaram os mesmos padrões de hibridização de Rex1, adicionado de uma marcação na região
mediana do braço q do segundo maior par do complemento A. Rex6 não apresentou marcações nos cromossomos
B, porém apresentou o mesmo padrão disperso em 1q. Em geral, os BACs hibridizados apresentaram marcações
dispersas ao longo de 1q, sendo que os BACs O04 e P02 apresentaram marcações também em 1p. Todos os BACs
apresentaram marcações levemente dispersas pela maioria dos cromossomos, com maior intensidade nas regiões
pericentroméricas da maioria dos cromossomos. Somente o BAC P02 apresentou marcações nos cromossomos
B. Tem sido frequentemente observado que TEs, assim como outras sequências repetitivas, tendem a se fixar em
regiões heterocromáticas, reduzindo assim os efeitos deletérios no genoma hospedeiro. Em H. obliquidens essas
regiões concentram-se em 1p e nas regiões pericentroméricas da maioria dos cromossomos do complemento A.
Entretanto 1q, apesar de eucromático, apresenta sítios para todos os TEs e BACs hibridizados e dessa forma,
supõe-se que essas sequências aparentemente não são prejudiciais ao genoma. Apesar do cromossomo B em
questão ser rico em heterocromatina e da dinâmica diferencial dos TEs, o compartilhamento dos elementos Rex1,
Rex3 e do BAC P02 entre 1q e os cromossomos B leva à formulacão da hipótese de que a região 1q provavelmente
contenha segmentos genômicos que deram origem à formação dos cromossomos B na espécie H. obliquidens.
Apoio financeiro: FAPESP,CNPq e CAPES.
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Isolamento e caracterização de locos de
microssatélites para Astronotus crassipinis (Heckel,
1840)
Santos, CHA1; Sousa, CFS1; Paula-Silva, MN1; Ferreira-Nozawa, MS3; Almeida-Val, VMF1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular, Aleixo, CEP: 69.060-001, Manaus,
Amazonas, Brasil
2
Universidade Federal do Amazonas, Laboratório de evolução e Genética Animal, Coroado, CEP: 69077-000, Manaus, Amazonas, Brasil
3
Centro Universitário Nilton Lins, Laboratório de Expressão Gênica, Parque das Laranjeiras, CEP: 69058-030, Manaus, Amazonas, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Marcadores molecular, Diversidade genética, Astronotus crassipinis.
Astronotus crassipinis é um importante peixe de água doce na bacia Amazônica. Pouco se sabe sobre sua
estrutura populacional e diversidade genética. Eles vivem em lagos de várzea da Amazônia e são peixes de
hábitos territoriais. Os estudos que envolvem as populações de A. crassipinis são de grande importância
para a conservação e manejo desta espécie. Assim, o objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar locos de
microssatélites para A. crassipinis, a partir de biblioteca genômica enriquecida. A construção do banco enriquecido
de microssatélites foi desenvolvido a partir do protocolo descrito por Billotte et al. (1999). A extração do DNA
genômico total foi realizada utilizando o protocolo descrito por Sambrook et al. (1989). Na caracterização dos
13 primers de microssatélites foram utilizados 30 indivíduos de A. crassipinis, e para a transferibilidade dos locos
utilizamos 10 exemplares da espécie congênere A. ocellatus. Para a amplificação do produto de PCR foi utilizada
a técnica de PCR-Touchdown (Don et al. 1991) e o produto final da PCR foi visualizado em gel desnaturante
de acrilamida 6% corado em prata (Creste et al. 2001). Na análise dos dados utilizou-se o programa Tool For
Population Genetics Analysis – TFPGA (Miller, 1997). Os resultados obtidos mostraram que a heterozigosidade
observada e esperada variaram de 0,00 a 0,72 e 0,25 a 0,58, respectivamente. Os alelos por loco variaram de dois
a seis, com uma média de três. Três locos afastaram-se significativamente do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (P
< 0,05) após a correção de Bonferroni. O valor do Fis ( f) variou de -0,666 a 0,909 (média de -0,133). Este novo
conjunto de microssatélites irá contribuir para estudos de diversidade genética e conservação de A. crassipinis.
Apoio financeiro: FAPEAM, CNPq, CAPES, PROCAD/CAPES, INCT/ADPTA.
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Marcadores citogenéticos na diferenciação de três
espécies do gênero Prochilodus (Characiformes,
Prochilodontidae)
Mendonça, BB¹; Voltolin, TA¹; Senhorini, JA2; Bortolozzi, J1; Foresti, F3; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, CEPTA, MMA
3
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Marcadores citogenéticos, Prochilodus.
A família Prochilodontidae é amplamente distribuída pela América do Sul e em muitas regiões servem como fonte
para comércio e pesca de subsistência. É constituída de três gêneros, Prochilodus, Semaprochilodus e Icthyoelephas
onde estão inclusas atualmente 21 espécies. Dentre estes gêneros, Prochilodus é considerado mais abundante
e disperso entre os peixes neotropicais, nas bacias hidrográficas sul americanas. Estudos abordando análises
citogenéticas mostram que este gênero apresenta características cariotípicas conservadas, apresentando número
diploide constante de 2n = 54 cromossomos, dos tipos metacêntricos e submetacêntricos com número fundamental
de 108, além da presença de cromossomos supranumerários que variam de zero a sete em alguns exemplares das
espécies Prochilodus lineatus, Prochilodus nigricans, Prochilodus mariae e Prochilodus brevis. Diante disto, o objetivo
deste trabalho foi realizar a caracterização citogenética de exemplares de diferentes espécies do gênero Prochilodus
através da utilização de marcadores citogenéticos como Giemsa, coloração por impregnação de nitrato de Prata
(NOR) e detecção dos padrões de heterocromatina constitutiva (banda C), buscando dados detalhados a respeito da
constituição cariotípica das espécies deste gênero. Para a realização das análises citogenéticas foram coletados 15
exemplares de P. lineatus no rio Mogi-Guaçu, 15 exemplares Prochilodus costatus na piscicultura RT-alevinos (Sergipe,
SE) e 15 exemplares da espécie P. nigricans no rio Tocantins-Araguaia (TO). Os resultados mostraram que em todos
exemplares analisados, o número diploide é de 2n=54 cromossomos do tipo metacêntrico e submetacêntrico, além
da presença de cromossomos supranumerários em alguns exemplares de P. lineatus e P. nigricans. Nas amostras
de P. costatus da piscicultura RT-alevinos (Sergipe, SE) não foi observado nenhum cromossomo supranumerário.
Utilizando a técnica de impregnação por nitrato de Prata (NOR), foi observado a presença de marcações na
posição pericentromérica do braço longo em um par cromossômico submetacêntico nas três espécies analisadas.
Padrões da distribuição de heterocromatina constitutiva (banda C) permitiu observar, em P. nigricans um par de
cromossomos submetacêntricos do conjunto A, um grande bloco heterocromático no braço longo, além das
marcações heterocromáticas presentes em todos os centrômeros. Para a espécie P. costatus a heterocromatina
constitutiva apresentou marcações em um par de cromossomos submetacêntricos do conjunto A, além de marcações
heterocromáticas em todos os centrômeros, igualmente observado em P. nigricans. Porém, padrões da distribuição de
heterocromatina constitutiva permitiram diferenciar a espécie P. lineatus das demais espécies neste trabalho, onde
se detectou marcações fortes somente na região centromérica de todos os cromossomos do conjunto A, no entanto,
os cromossomos B apresentaram-se inteiramente heterocromáticos. Considerando os resultados obtidos, pode-se
concluir que os exemplares do gênero Prochilodus estudados apresentaram constituição cariotípica conservada,
no entanto, com a técnica de bandamento C foi possível notar diferenças na constituição heterocromática de
duas espécies analisadas, o que pode inferir uma suposta relação filogenética entre P. nigricans e P. costatus.
Apoio financeiro: CEPTA/ICMBio, CNPq.
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Padrão heterocromático de quatro citótipos de
Bryconamericus ecai do Rio Forquetinha/RS
Santos, AR; Giuliano-Caetano, L; Dias, AL
Laboratório de Citogenética Animal, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
Palavras-chave: Bandamento C, Characidae, cromossomos, fluorocromos e variabilidade cariotípica
Introdução: o gênero Bryconamericus é um dos menos diversificados da família Characidae, sendo pouco conhecido
taxonomicamente e constituído por aproximadamente 56 espécies, com distribuição por toda região Neotropical.
São muito semelhantes entre si, diferindo apenas em pequenos detalhes, sendo que os padrões de coloração são
invariáveis. Neste grupo de peixes existem poucos dados citogenéticos, entretanto, o número diplóide de 52 parece
ser característico neste gênero, sendo significativas as variações na macro e microestrutura cariotípicas. Objetivos:
analisar o padrão de distribuição e a composição da heterocromatina em quatro citótipos de Bryconamericus ecai
do rio Forquetinha/RS. Métodos: os cromossomos mitóticos foram obtidos por meio de preparação direta com
retirada do rim anterior e para o bandamento C foram utilizadas soluções de ácido clorídrico 0.2N, formamida 50%
e 2XSSC, corado com Giemsa e fluorocromos base-específicos Cromomicina A3 e DAPI, para evidenciar regiões
ricas em pares CG e AT, respectivamente. Resultados: foram analisados 13 indivíduos (5 machos, 6 fêmeas e 2 de
sexo indefinido) de Bryconamericus ecai coletados no rio Forquetinha/RS. Todos indivíduos apresentaram 2n=52
porém, foram observadas variações na estrutura cariotípica entre eles, caracterizando 4 citótipos (ou formas
cariotípicas): citótipo I com 10m+10sm+8st+24a e NF=80, observado em 3 exemplares (23%), citótipo II com
10m+14sm+12st+16a e NF=88 observado em 4 exemplares (31%), citótipo III com 14m+12sm+12st+14a e NF=90
em 4 exemplares (31%) e citótipo IV com 10m+26sm+12st+4a e NF=100 com 2 exemplares (15%). Mudanças no
número fundamental (NF) podem sugerir que rearranjos cromossômicos, tais como inversões pericêntricas, estejam
ocorrendo entre os indivíduos de B. ecai. No citótipo III também foi observada a presença de um cromossomo
supranumerário do tipo submetacêntrico de tamanho grande em um indivíduo, sendo o primeiro relato da
ocorrência deste tipo de cromossomo no gênero Bryconamericus. A heterocromatina apresentou-se distribuída
na região pericentromérica da maioria dos cromossomos nos citótipos I, II e III. Nos citótipos I e II também foi
observada marcação na região terminal do braço curto do primeiro par de cromossomos submetacêntricos. No
citótipo IV foram evidenciadas poucas regiões heterocromáticas pericentroméricas e terminais. Na coloração com
fluorocromos os citótipos I e II apresentaram regiões heterocromáticas DAPI+, o citótipo III apresentou algumas
regiões CMA3+ e a maioria DAPI+; e no citótipo IV foram evidenciadas regiões heterocromáticas CMA3+ e poucas
DAPI+. Conclusões: os dados apresentados confirmam a variabilidade cariotípica evidenciada anteriormente em
diferentes populações de Bryconamericus, e o padrão de distribuição e composição da heterocromatina em B. ecai foi
característico para cada citótipo ou grupos de citótipos, sendo, portanto, um importante marcador cromossômico.
Apoio Financeiro: CAPES e Fundação Araucária.
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Caracterização de locos microssatélites para o
filhote capapreta - Brachyplatystoma capapretum
(Siluriformes: Pimelodidae).
Lira-Cordeiro, A¹; Batista JS12; Alves-Gomes, JA12; Formiga-Aquino, K12;
¹ Laboratório de Biologia Molecular/INPA ² Laboratório de Biologia Molecular /Coordenação de Pesquisa em Biologia Aquática/INPA
2
Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática – CPBA, Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução – LFCE
[email protected]
Palavras-Chave: Siluriformes, filhote capapreta, Marcadores microssatélites, bagres migradores, Bacia Amazônica
Introdução: A bacia amazônica é composta por 85% de peixes da super-ordem Ostariophysi, sendo os Siluriformes
representantes de 39% desta. A ordem dos Siluriformes é caracterizada por agregar diversos grupos de bagres (peixes
lisos e com placas ósseas), sendo alguns de elevada importância comercial e intensamente pescados em águas
doces e estuarinas. Dentre estes, destaca-se o filhote capapreta ou piraíba negra (Brachyplatystoma capapretum),
um bagre amazônico de grande porte cujo ciclo de vida não é bem conhecido. Dados da literatura indicam que esse
espécie possa realizar migrações para completar seu ciclo de vida, podendo abranger desde o estuário amazônico
até as cabeceiras dos rios amazônicos. Objetivos: O presente trabalho teve como objetivo caracterizar locos
microssatélites (SSRs) desenvolvidos para B.capapretum. Métodos: Foram utilizados 40 exemplares amostrados
em sete localidades da Amazônia Brasileira (Belém N= 3, Manaus N=9, Porto Velho N=8, Purus N=3, Santarém
N= 8 , Tefé N= 5 e Tabatinga N= 7 ) na caracterização dos locos. Os primers flanqueadores, desenhados para os 35
marcadores microssatélites foram amplificados inicialmente utilizando quatro amostras de B. capapretum a 60ºC
de temperatura de anelamento, com o intuito de verificar a amplificação e o padrão dos alelos para cara loco. As
amplificações foram realizadas de forma que cada loco estivesse marcado com uma fluorescência (FAM ou HEX).
Para os locos não amplificados ou que não tiveram amplificação satisfatória, foram submetidos a gradientes de
temperatura com amplitude de 50º à 66ºC e/ou PCR touch down (em que a temperatura de anelamento diminuía
1ºC por ciclo). O produto de amplificação foi vizualizado em gel de agarose 1,5% e comparado com marcador
Ladder 1kb Plus (Invitrogen) de tamanho de bandas conhecido. Em seguida foi submetido à eletroforese capilar em
Analisador de DNA MegaBace 1000 (GE healthcare) e detectado os alelos com auxílio de marcador padrão ET400R
. Os genótipos foram analisados com o auxílio do programa Fragment Profile 2.1 (GE Healthcare). Resultados: Dos
35 locos microssatélites desenvolvidos, 30 locos amplificaram satisfatoriamente para pelo menos quatro amostras
de B.capapretum, sendo 16 locos amplificados a 60ºC e 14 com temperatura de anelamento variando entre 55° a
66º C. Foram genotipados 20 locos microssatélites utilizando entre 4 a 40 indivíduos por loco. Até o momento foram
observados 14 locos polimórficos contendo entre 2 a 13 alelos por loco. Conclusão: Os locos microssatélites isolados
e em caracterização são marcadores em potencial para estudos populacionais e de conservação de B.capapretum.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEAM, PROCAD/CAPES e INPA
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Variabilidade de sítios Ag-RONs e CMA3/DAPI em
Astyanax fasciatus (Pisces: Characidae) em bacias
hidrográficas do atlântico-leste no estado da Bahia
Medrado, AS1; Ribeiro, MS2; Affonso, PRAM2; Carneiro, PLS2; Costa, MA1
Departamento de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa
Cruz, Ilhéus-BA
2
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié-BA
[email protected]
1
Palavras-chave: Ictiofauna, Characidae, Polimorfismo, Fluorocromos, Ag-NORs.
Os peixes do gênero Astyanax ocorrem em pequenos riachos, lagos e os grandes rios formadores das bacias
hidrográficas de todo o ambiente tropical. Mesmo tendo sido alvo de estudos cromossômicos durante anos, esses
peixes são caracterizados como um grupo com grande diversidade cariotípica. Objetivando contribuir com novos
dados citogenéticos para este gênero, foram analisadas cinco populações de Astyanax fasciatus provenientes das
bacias do rio das Contas (calha principal e afluentes) e do Recôncavo Sul (Ribeirão Mineiro). Após obtenção de
cromossomos mitóticos, foram realizadas técnicas de impregnação por nitrato de prata (Ag-RON) e coloração
com fluorocromos base-específicos CMA3 e DAPI. A impregnação por nitrato de prata revelou uma variação
interpopulacional com múltiplos pares cromossômicos portadores de regiões organizadoras de nucléolos. Os
espécimes do Rio das Contas (calha principal Frisuba - FR) mostraram marcações Ag-RON terminais no braço curto
de um par cromossômico submetacêntrico, de um grande par subtelocêntrico no braço longo e esporadicamente
em um dos braços de um cromossomo metacêntrico. Na população do rio Preto do Costa (PC), sítios ativos de
RONs foram detectados na região terminal do braço curto de um grande par de cromossomos ST. Nos espécimes
do rio Crisciúma (CR) observou-se um par de cromossomos submetacêntricos portadores de um sítio Ag-RON
na região subterminal do braço curto, um cromossomo subtelocêntrico e um cromossomo acrocêntrico com
marcações teloméricas. Nos espécimes do rio Mutum (MU), marcações teloméricas foram observadas em um
cromossomo subtelocêntrico grande e em um cromossomo submetacêntrico de tamanho médio. Nos espécimes
do rio ribeirão Mineiro (MN), as marcações Ag-RON se mostraram presentes em regiões teloméricas de um par
de cromossomos subtelocêntricos no braço longo e em um cromossomo submetacêntrico no braço curto. Todas
as RONs revelaram-se também CMA3 positivas e DAPI negativas evidenciando que estas regiões são ricas em
pares de bases GC. No entanto, sítios adicionais CMA3+ foram observados em três populações: PC (2 cromossomos
metacêntricos não homólogos, um deles com marcação telomérica nos dois braços e um par de cromossomos
submetacêntricos no braço longo), CR (1 cromossomo metacêntrico grande) e MN (1 cromossomo subtelocêntrico
com marcações teloméricas nos dois braços). Estes resultados reforçam a diversidade cariotípica do gênero,
causada por variações microestruturais. É possível que essa plasticidade cariotípica encontrada ao longo da bacia
do rio das Contas e em outras bacias representem formas evolutivas distintas ainda não devidamente identificadas.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESB, UESB, UESC.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Caracterização de marcadores microssatélites tri
e tetranucleotídeos para o Tambaqui (Colossoma
macropomum)
Hamoy, IG1; Cidade, FW2; Barbosa, MS3; Schneider, MPC3; Santos, S1
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Genética Humana e Médica, Belém, Pará, Brasil.
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas
3
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Polimorfismo de DNA, Belém, Pará, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Colossoma macropomum, Tambaqui, microssatélites, trinucleotídeos, tetranucleotídeos.
O Tambaqui (Colossoma macropomum), segundo maior peixe de escamas da ictiofauna amazônica, é de grande
importância econômica para pesca comercial e para a criação em cativeiro. Sua captura vem se intensificando ao
longo dos anos, fato que vem ameaçando os estoques naturais dessa espécie. Estimar a diversidade genética em
populações naturais e cultivadas é a principal forma de avaliar a viabilidade de uma espécie. Para um grande número
de espécies de peixes essas investigações estão centradas na análise da variabilidade de marcadores microssatélites.
Foram publicados marcadores microssatélites para o Tambaqui, todos eles constituídos por motif de dois pares de
bases (dinucleotídeos). A análise laboratorial de dinucleotídeos é complexa e freqüentemente apresenta artefatos
de PCR (sttuters) que induzem a erros de genotipagem que podem comprometer os resultados do trabalho. De forma
diferente, marcadores microssatélites com motif de três (trinucleotídeos), quatro (tetranucleotídeos) nucleotídeos
ou mais, são mais estáveis e apresentam menos artefatos de PCR. O objetivo do presente trabalho foi Isolar e
caracterizar marcadores tri e tetranucleotídeos para a espécie Colossoma macropomum. Isolamos 21 marcadores
microssatélites tri e tetranucleotídeos, averiguamos seus polimorfimos em géis de poliacrilamida a 7% corados
com nitrato de prata, encontramos 13 loci polimórficos, os quais tiveram seus primers forward marcados com os
fluorocromos 6-FAM, HEX, NED e PET. Esse painel de 13 marcadores microssatélites foi utilizado na genotipagem
de 20 indivíduos coletados nos lagos do município de Óbidos, na Amazônia brasileira. O número de alelos por locus
variou de quatro a dez. A heterozigosidade observada variou entre 0.31 e 0.95. Em nenhum dos loci investigados foi
observado desvio significativo do esperado na premissa de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Na amostra investigada
não foi possível identificar desequilíbrio de ligação significativo entre todos os 78 possíveis pares de loci. Nas
análises realizadas não encontramos indicação de erros de genotipagem atribuídos a stutters. Esse conjunto de
marcadores microssatélites pode ser empregado para obter-se estimativas confiáveis de variabilidade genética
que poderão ser utilizadas em programas de manejo e conservação para a espécie Colossoma macropomum.
Apoio financeiro: CNPq, UFPA e FINEP.
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Eficiente identificação genética de tubarões por
PCR multiplex para monitoramento e fiscalização do
comércio e da pesca
Nachtigall, PG¹; Shivji, M²; Martins, C³; Pinhal, D³
¹Departamento de Biologia e Tecnologia, UENP – Universidade Estadual do Norte do Paraná
²Guy Harvey Research Institute, Oceanographic Center, Nova Southeastern University
³Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP – Universidade Estadual Paulista
[email protected]
Palavras-chave: Conservação, Rhizoprionodon, Identificação genética, ITS2, Chondricthyes
Os tubarões têm sofrido um acentuado declínio populacional nas últimas décadas devido à excessiva exploração
pela pesca e principalmente ao alto valor comercial adquirido pelas barbatanas, utilizadas para fins gastronômicos,
indústria farmacêutica e medicinal. Dentre os mais explorados estão os tubarões do gênero Rhizoprionodon, grupo
composto por sete espécies de pequeno porte, com ampla distribuição nos mares tropicais e subtropicais do
Pacífico, Índico e Atlântico. Por apresentarem hábitos associados à região litorânea, desempenham papel central
como predadores do sistema trófico costeiro e são alvo de pescarias realizadas em várias partes do mundo. Assim
como outros tubarões da família Carcharhinidae, os Rhizoprionodon apresentam alta similaridade morfológica,
o que dificulta a identificação em nível espécie-específico. Tal problema é exacerbado pela retirada da cabeça
e nadadeiras pelos pescadores, principais caracteres utilizados para diagnóstico das espécies. As carcaças
desembarcadas acabam registradas nas estatísticas pesqueiras apenas com o nome genérico de “tubarão”. O
objetivo deste trabalho foi desenvolver uma metodologia rápida, de baixo custo, reprodutível e de fácil aplicação
para identificação das sete espécies de tubarões Rhizoprionodon em toda sua distribuição global. Para isso
utilizamos uma metodologia baseada na reação em cadeia da polimerase da região ribossomal ITS2 do DNA
nuclear, utilizando 7 primers espécie-específicos e 2 primers universais como controle (PCR nonaplex). Toda
a região ITS2 do genoma nuclear foi seqüenciada nas sete espécies de tubarões Rhizoprionodon, as sequências
obtidas alinhadas no software Geneious e primers espécie-específicos desenhados em posições polimórficas
únicas em cada espécie. Todas as reações de PCR multiplex foram realizadas com sucesso a partir dos 9 primers
utilizados. Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1% (120V, 100mA
por 1 hora), corados e as imagens captadas em transluminador. Pela PCR multiplex foi gerado para cada espécie
de Rhizoprionodon um padrão único, formado por duas bandas nos géis: a maior presente em todas as espécies
e uma banda espécie-específica de peso molecular variável. A banda controle foi de 1650 pb enquanto a banda
espécie-específica foi de 100 pb em R. acutus, 390 pb em R. porosus, 480 pb em R. longurio, 650 pb em R. terranovae,
870 pb em R. oligolinx, 1150 pb em R. taylori e 1300 pb em R. lalandii. Estes resultados mostram-se extremamente
promissores para o monitoramento global do comércio de produtos e subprodutos dos tubarões Rhizoprionodon,
ao possibilitar a inequívoca identificação em nível espécie-específico através de uma metodologia rápida e de baixo
custo. Os dados gerados podem também subsidiar programas de conservação e manejo dos estoques pesqueiros.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e Guy Harvey Ocean Foundation
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Mapeamento citogenético comparativo do DNA
ribossomal 5S em peixes ciclídeos
Nakajima, RT; Cabral-de-Mello, DC; Mazzuchelli, J; Martins, C
UNESP – Univ Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia, Botucatu, São Paulo, Brazil
Palavras-chave: Cichlidae, DNA repetitivo, evolução, cromossomo, FISH
Devido a sua rápida radiação adaptativa e grande importância de algumas espécies na aqüicultura mundial os
peixes ciclídeos têm sido atualmente modelos para diversos estudos. Em relação ao mapeamento cromossômico
de seqüências de DNA, os estudos neste grupo estão concentrados em Oreochromis niloticus e envolvem
principalmente o mapeamento de seqüências repetitivas de DNA, principalmente o DNAr 18S, elementos
transponíveis, DNAs satélites e da fração C0t-1 DNA. No presente trabalho foi realizado o mapeamento físico
cromossômico do gene de RNAr 5S em 17 espécies representativas da família Cichlidae, incluindo 1 asiática
e 16 pertencentes a linhagem africana. A sequência de DNAr 5S foi obtida através da reação em cadeia da
polimerase (PCR) utilizando o DNA genômico de O. niloticus e os primers, A 5’TACGCCCGATCTCGTCCGATC3’ e
B 5’CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC3’ e para hibridização in situ fluorescente os produtos de PCR foram marcados
com biotina. Para as 17 espécies estudadas, basicamente dois padrões de localização do gene de RNAr 5S foram
observados: (1) presença desta seqüência em apenas um par subtelocêntrico/acrocêntrico (st/a), que ocorre em
cinco espécies e (2) localização na região pericentromérica de apenas um par meta/submetacêntrico (m/sm),
par 1, observado em dez das espécies estudadas. Por outro lado variações em relação a estes padrões foram
observadas em O. niloticus (dois pares st/a com marcas pericentroméricas e um par st/a com marca terminal) e
em Gephyrochromis moorii (dois pares portadores do gene de RNAr 5S, um st/a e outro m/sm). Além disso, para as
espécies com marcação em um par st/a, foi observado variação em relação a posição exata desta sequência, podendo
a mesma ser intersticial, como em Etroplus maculatus, Oreochromis mossambicus e Tilapia mariae, ou terminal, como
em Hemichromis bimaculatus e Oreochromis aureus. A presença do gene de RNAr 5S localizado na região centromérica
do par 1 dos haplocromíneos e em um par st/a nos tilapiíneos e em hemichromíneos pode representar um padrão
ancestral para a subfamília Pseudodrenilabrina (ciclídeos Africanos). Por outro lado a ocorrência desta sequência no
par 1 pode ser decorrente de uma fusão cêntrica entre um cromossomo st/a pequeno portador do DNAr 5S (ocorrente
em diversas espécies) e um par st/a grande. Levando-se em consideração esta segunda hipótese o processo de redução
do número diplóide nos ciclídeos africanos aparentemente envolveu distintos eventos de fusões de cromossomos.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES e CNPq
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Estudo cromossômico em populações de
Isbrueckerichthys sp. (Siluriformes, Loricariidae) da
bacia do rio Ribeira
Barros, AV1; Vicari, MR1; Rosa, KO1; Ziemniczak, K2; Almeida, MC1; Artoni, RF1
Universidade Estadual de Ponta Grossa/SEBISA/DEBIOGEM - Ponta Grossa – PR
Universidade Federal do Paraná - Curitiba - PR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: FISH, Polimorfismo, Isbrueckerichthys, Ribeira, rDNA
A família Loricariidae está agrupada em 96 gêneros e 716 espécies, distribuídos em seis subfamílias e estendendose por toda a região Neotropical. A bacia do rio Ribeira de Iguape é rica em espécies da família Loricariidae, sendo
observado o endemismo de várias delas, como espécies do gênero Isbrueckerichthys. Logo, um estudo cromossômico
detalhado de tais espécies é indispensável no entedimento da evolução, organização taxonômica e conservação do
grupo. Foram coletados exemplares de Isbrueckerichthys sp. no riacho da Areia Ponta Grossa (PR), e no rio Açungui,
Campo Largo (PR), ambos cabeceiras do rio Ribeira. A obtenção de cromossomos mitóticos foi realizada segundo
o procedimento de ressuspensão de células do rim anterior. A localização das Regiões Organizadoras de Nucléolo
(RONs) foi realizada pela coloração com nitrato de prata coloidal, a heterocromatina foi analisada pelo procedimento
de bandamento C e para a localização cromossômica dos sítios dos rDNAs 18S e 5S foi realizada a Hibridação in
situ Fluorescente (FISH). O número diplóide observado em ambas populações foi de 54 cromossomos, com fórmula
cariotípica constituída por 20m+20sm+14st e NF = 108. O número 2n=54 representa um estado plesiomórfico
da família Loricariidae. A RON foi localizada na região subterminal do braço longo do par 11 pelos métodos de
nitratro de prata e FISH com sondas de rDNA 18S. O bandamento C evidenciou pequenos sítios heterocromáticos
proximais na maioria dos cromossomos e alguns blocos distais em poucos cromossomos. O par 11 apresentou um
heteromorfismo de tamanho em um grande bloco de heterocromatina. Esse par demonstra-se polimórfico em ambas
populações analisadas, onde são verificadas situações homozigotas para blocos de tamanho reduzido, homozigotas
para os blocos maiores e a situação heterozigota. A localização in situ com sonda de rDNA 5S localizou estes sítios
em posição sintênica ao rDNA maior e evidenciou que o acúmulo in cis destas sequências 5S têm proporcionado o
heteromorfismo observado para o par cromossômico 11. Cariótipos com as características de 2n=54 e um único par
de RON em posição intersticial são encontrados na maioria das espécies de Hypoptopomatinae, e entre algumas
espécies de Hypostominae e Neoplecostominae. No entanto, a maioria das outras subfamílias de Loricariidae,
com 2n = 54, têm RONs terminais. Acredita-se que a localização tanto da RON quanto dos sítios de rDNA 5S nesta
população possa representar um polimorfismo estrutural, que poderia ser explicado por duas hipóteses: Crossingovers desiguais (Permuta entre cromátides irmãs envolvendo sequências repetidas e loci adjacentes) ou alterações
cromossômicas estruturais, assim como repetidas quebras e deleções cromossômicas. Os resultados encontrados
demonstram-se plesiomórficos na família Loricariidae, no entanto, algumas divergências cariotípicas foram
observadas entre a população de Isbrueckerichthys sp. aqui analisada em comparação àquelas descritas na literatura.
Apoio: UEPG, CNPq, CAPES e Fundação Araucária.
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Estrutura genética de população de Gymnotus (Pisces:
Gymnotiformes) na região de Poconé/MT e sua relação
com o impacto da pesca
Andrade, AC¹; Fernandes, FMC¹ ²
¹ Escola Bahiana de Medicina e Saúde Pública
² Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Federal da Bahia
[email protected]
Palavras-chave: Gymnotus, SPAR, Pantanal, marcador molecular, genética de populações
Introdução: Gymnotus (Pisces: Gymnotiformes) conhecido popularmente na região pantaneira como tuvira,
caracteriza-se por ser um gênero fracamente elétrico, de água doce neotropical e notoriamente utilizado como
isca para pesca esportiva na localidade em estudo. Atualmente existem cerca de 34 espécies e ainda outras a
serem descritas, sendo o gênero Gymnotus o grupo mais diverso entre os Gymnotiformes. Freqüentemente, as
técnicas da biologia molecular podem ser empregadas como ferramentas para obtenção de informações no
campo da ecologia. De modo geral, são utilizados marcadores moleculares para acessar o genoma de uma ou
mais espécies e quantificar a variabilidade e determinar a estrutura genética das populações. O objetivo do
presente trabalho foi analisar a estrutura genética das populações naturais e cultivadas deste gênero no intuito
de avaliar o impacto da pesca nessas populações. Métodos: 19 exemplares de uma população selvagem de
Cuiabá, MT e 32 exemplares de uma população de criadouro de Poconé, MT, foram analisados empregando-se
a técnica molecular SPAR (Single Primer Amplification Reaction), a qual se baseia na amplificação de fragmentos
de DNA flanqueados por microssatélites palidrômicos. Para tal, após a extração do DNA total, foi levada a efeito
a amplificação empregando-se primers micro11 (GGAC)4. Resultados: Os dados até agora obtidos, em ambas as
amostras, apresentaram haplótipos similares com os Gymnotus pantanal. Com relação à população de Cuiabá,
também foram verificados espécimes com padrões polimórficos, diferentemente dos indivíduos analisados
do criadouro, que se apresentou monomórfica. Conclusão: Os resultados preliminares permitem sugerir que
provavelmente esta última população esteja sob forte pressão endogâmica. Novos marcadores RAPD (Random
Amplification of Polymorphic DNA) serão empregados no intuito de testar a hipótese de pressão endogâmica.
Apoio Financeiro: Fapesb
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Isolamento e caracterização de locos microssatélites
para Pseudoplatystoma punctifer (Castelnau,1855)
Saulo, ACM1,2,3; Formiga, KM1,3; Ortiz, MF4; Sousa, ACB5; Alves-Gomes, JA1,3; Batista, JB1,3
Laboratório Temático de Biologia Molecular-LTBM, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA
²Bolsista PIBIC/CNPq/INPA
³ Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução – LFCE, Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática – CPBA/INPA
4
Universidade Federal do Amazonas- UFAM, Laboratório de Evolução e Genética Animal – LEGAL
5
Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP, Departamento de Genética e Evolução, Centro de Biologia Molecular e Engenharia
Genética – CBMEG
[email protected]
1
Palavras-chave: Microssatélites, conservação, Amazônia, Pseudoplatystoma punctifer.
Introdução: Pseudoplatystoma punctifer, popularmente conhecido como surubim, é uma espécie de bagre de alto
valor comercial na Amazônia incluindo a Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador, Peru e Venezuela por apresentar
excelente qualidade de carne com poucos ossos intramusculares e uma alta taxa de crescimento com o potencial
de alcançar 50 kg. Para o manejo e conservação das populações de P. punctifer é importante seu conhecimento
genético e biogeográfico. O conhecimento genético advindo dos marcadores moleculares microssatélites permitirá
a estimativa da variabilidade genética de populações naturais e a identificação de estoques sob o ponto de vista
genético, no intuito de subsidiar políticas de conservação e manejo dessa espécie. Métodos: A construção e o
sequenciamento da biblioteca genômica enriquecida com microssatélites de P. punctifer foi realizada a partir
de um pool de amostras de DNA genômico de 10 indivíduos amostrados no rio Madeira. O DNA foi digerido
com a enzima Rsa I, gerando fragmentos de 300 pb a 1000 pb que foram selecionados e ligados a adaptadores e
hibridizados com sondas CT(8) e GT(8) ligadas a biotina e esferas magnéticas envolvidas com estrepitavidina.
As seqüências de DNA dos clones recombinates foram analisadas em busca de microssatélites e de regiões
franqueadoras de boa qualidade para o desenho de primers utilizando os programas CHROMAS, STADEN,
BIOEDIT e WEBSAT. Resultados: Dos 96 clones da biblioteca, foram sequenciados 79 clones. Em 56 destes clones
foram encontrados 100microssatélites, sendo 95 do tipo dinucleotídeos e 5 tetranucleotídeos com uma média de
1,7 microssatélites por clone e 3,44% de redundância. O microssatélite de maior extensão encontrado foi (TG)32.
As seqüências de 45 contigs foram utilizadas para o desenho e a obtenção de primers, e a presença de. Dos 45
locos, até o momento 32 amplificaram entre 58°C a 65°C de temperatura de anelamento, e destes 21 locos foram
genotipados utilizando entre 4 a 18 indivíduos por loco e observados 13 locos polimórficos. Conclusão: Os locos
microssatélites em desenvolvimento são marcadores potenciais não somente para serem utilizados em estudos de
genética e conservação de populações naturais mais também auxiliar na identificação de estoque pesqueiro para
essa espécie. Esses dados são úteis para auxiliar no subsídio de políticas de manejo e conservação para o Surubim.
Apoio financeiro: CNPq, PROCAD/CAPES e INPA
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Monitoramento da estrutura populacional de Astyanax
altiparanae (Pisces, Characidae) da represa da UHE
Escola Mackenzie, rio Paranapanema
Banin-Hirata, BK¹; Gomes, CP¹; Suzuki, KM; Sodré, LMK¹; Orsi, ML; Almeida, FS¹
Laboratório de Genética e Ecologia Animal (LAGEA) – Departamento de Biologia Geral
Departamento de Biologia Animal e Vegetal – CCB, Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Astyanax altiparanae, monitoramento genético, RAPD, estrutura genética, variabilidade genética.
O presente estudo visa monitorar a variabilidade genética e estrutura populacional da espécie Astyanax altiparanae,
a qual foi anteriormente estudada em um projeto realizado entre os anos de 2000 e 2003, intitulado “Caracterização
Genética da Ictiofauna do Reservatório de Capivara (UHE Escola Mackenzie), que de forma geral tinha o propósito
de caracterizar geneticamente algumas espécies de peixe desse ecossistema. O presente estudo visa monitorar a
manutenção da variabilidade genética em dois trechos situados no reservatório Capivara, denominados Cinzas e
Porecatu, utilizando-se de marcadores RAPD, tal como foi padronizado no projeto anterior. Os dados obtidos serão
comparados com os resultados do projeto anterior, com o intuito de fornecer informações importantes visando a
conservação da espécie. Foram coletados 30 indivíduos de cada um dos trechos. O DNA genômico foi extraído e
quantificado por fluorímetro e amplificado com seis primers de RAPD, sendo eles OPC02, OPC04, OPC08, OPC11,
OPC13 e OPC15. A análise dos perfis eletroforéticos permitiu a identificação de 140 locos, os quais foram utilizados
para as análises genéticas. Foram estimados, através de programas computacionais, os seguintes parâmetros
genéticos: variabilidade, distância genética e theta (TFPGA 1.3); análise da variância molecular (AMOVA); estimativa
de FST (ARLEQUIN 3.0) e construção do dendrograma de similaridade genética (NTSYS-PC). O valor de variabilidade
genética obtido pela proporção de locos polimórficos (P) para Cinzas e Porecatu foi de 90% e 92,86%, respectivamente.
No estudo anterior os valores para as mesmas localidades foram de 73,38% e 69,78%. O dendrograma de similaridade
genética revelou uma tendência à formação de dois agrupamentos separando os indivíduos de cada uma das
localidades. A AMOVA indicou uma alta variação entre os indivíduos dentro do mesmo grupo (92,52%) e um FST de
0,074 indicando uma diferenciação genética de moderada à baixa entre os grupos. O valor de theta foi de 0,0804, e
se mostrou um pouco inferior ao do projeto anterior (0,1390). O aumento da variabilidade genética e a diminuição
da diferenciação genética observadas no presente monitoramento pode ser justificado pelo cumprimento de uma
das ações de manejo propostas no projeto anterior que foi o do fechamento do sistema de transposição de peixes
(escadas) localizado na área compreendida imediatamente à montante da UHE Escola Mackenzie (reservatório de
Capivara). Esta ação pode evitar o declínio populacional das espécies de peixes no reservatório de Capivara, visto
que as populações podem utilizar dos afluentes presentes na represa (rios Tibagi, Cinzas e Vermelho) para concluir
seu ciclo reprodutivo, o qual podia estar sendo prejudicado pelo funcionamento das escadas de transposição.
Órgão financiador: Duke Energy International
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Monitoramento da pesca e comercialização da carne
de tubarões capturados em Macaé, RJ utilizando PCRMultiplex
Cheida, IM¹; Ferreira, DC¹; Mendonça, FF²; Oliveira, C²; Foresti, F²; Porto-Foresti, F¹
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pesca de Tubarões, PCR-multiplex, COI.
Peixes cartilaginosos são comumente capturados nos arrastos de fundo, nos espinhéis e nas redes de emalhe,
intencionalmente ou como fauna acompanhante. Dados estatísticos do IBAMA/MMA sobre a exploração
pesqueira de elasmobrânquios no Brasil registraram que nos últimos anos a captura de tubarões representa cerca
de 70% do total capturado, tendo um aumento registrado de 10% por ano. Contudo, as dificuldades na identificação
morfológica de muitas espécies de tubarões exploradas pela pesca, associada à prática bastante usual de remoção
da cabeça e das nadadeiras dos animais, na maioria das vezes antes mesmo do desembarque, tem resultado em
uma escassez global de informações sobre captura e comercialização, tornando quase impossível a avaliação
de seus efeitos. De acordo com os relatórios a respeito da produção pesqueira, nos últimos anos apenas 22% de
todos os tubarões capturados no Brasil recebem algum tipo de classificação, ainda assim, relacionando apenas um
nome popular que em muitos casos refere-se a mais de uma espécie. Um fato agravante é que no Brasil, quinze
espécies de tubarões e raias estão ameaçadas de extinção, enquanto seis espécies de estão sobreexplotadas ou
ameaçadas de sobreexplotação. Nesse sentido, técnicas moleculares com maior rapidez e baixo custo, como a
PCR-Multiplex, foram desenvolvidas podendo servir como importante ajuda no monitoramento da pesca e na
conservação das espécies ameaçadas de extinção. O objetivo deste trabalho foi identificar, através de marcadores
moleculares, amostras de espécies pescadas no litoral de Macaé-RJ. Para isso, foram extraídas 50 amostras de DNA
de exemplares coletados em desembarques na região em estudo. Após a extração, foram realizados PCR-multiplex
com primers já isolados para nove espécies de tubarões, desenhados com base no gene Citocromo Oxidase I.
Posteriormente, as amostras foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 2%. Das 65 amostras analisadas,
55 correspondiam a espécie Rhizoprionodon porosus (84,6%), três amostras eram da espécie Alopias vulpinus (4,6%),
três amostras foram identificadas como pertencentes à espécie Carcharhinus falciformes (4,6%), duas amostras
pertenciam a espécie Isurus oxyrinchus (3%) e para duas amostras não foram visualizados fragmentos nas
amplificações de identificação simultânea (3%). De acordo com os dados encontrados até o momento, a espécie
mais capturada no litoral de Macaé foi Rhizoprionodon porosus. Podemos relacionar tal resultado com o método
de pesca utilizado, pesca costeiro, muito praticado por pescadores autônomos que visam a captura de tubarões
na região. A utilização da técnica de PCR-multiplex se revelou importante como ferramenta para a identificação
das espécies de tubarões, que com certeza poderão enriquecer os dados estatísticos de exploração pesqueiras,
servindo como ferramenta na formulação de programas adequados de manejo e conservação dessas espécies.
Apoio Financeiro: FAPESP, Capes e CNPq
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Inventário da ictiofauna do alto rio Paraíba do Sul e
caracterização molecular das espécies encontradas
Maia, GMG1 ; Pereira, LHG1 ; Foresti, F1 ; Oliveira, C1
Laboratório de Genética de Peixes - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências - Campus de Botucatu, Departamento de
Morfologia
[email protected]
1
Palavras-chave: Rio Paraíba do Sul, ictiofauna, Cox 1, barcode
O Estado de São Paulo apresenta quatro drenagens: Rio Paraná, Rio Paraíba do Sul, Rio Ribeira de Iguape e rios
litorâneos. O rio Paraíba do Sul nasce em São Paulo e drena uma importante faixa de terras da região leste do Estado.
Sua ictiofauna tem algumas semelhanças e muitas diferenças em relação às drenagens continentais e costeiras o
que realça a importância do presente estudo. Estimativas sugerem que existam entre 40 e 80 espécies na bacia do
rio Paraíba do Sul,no Estado de São Paulo mas os levantamentos ictiofaunísticos realizados nessa bacia são ainda
incompletos. Estudos recentes têm proposto o uso de parte do gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I
(Cox 1) como um sistema global de identificação de espécies. Considerando a ampla diversidade de peixes da bacia
do Rio Paraíba do Sul, os dados promissores obtidos com o uso do sequenciamento do gene Cox 1 e o impacto
ambiental que esses cursos de água vêm enfrentando ao longo de sua história, o projeto tem por meta realizar
um inventário da ictiofauna da porção paulista do rio Paraíba do Sul e realizar o seqüenciamento de segmentos
parciais do gene mitocondrial Cox 1 para todas as espécies de peixes encontradas nessa bacia, com o objetivo de
gerar um banco de dados das espécies presentes na bacia e sua respectiva identidade molecular (-DNA barcode).
Um total de 295 espécimes, representando 58 espécies, 40 gêneros, 17 famílias e cinco ordens foram amostrados
e sequenciados. A análise das sequências permitiu a discriminação de todas as espécies analisadas com um alto
grau de segurança. Os resultados mostraram uma grande diferença nas comparações entre espécies e gêneros
demonstrando a existência de um ‘barcode gap’ para as espécies analisadas. Somente três pares de comparações
mostraram valores de distância genética (K2P) menores que 2%. Entretanto os valores observados foram suficientes
para discriminar essas espécies, revelando a acurácia do DNA barcode nesses casos de baixa divergência genética.
Duas espécies mostram altos valores de divergência genética (K2P) dentro das mesmas. Para um caso, Geophagus
proximus, o DNA barcode permite sugerir a existência de uma nova espécie não identificada previamente para a
bacia. Para outro caso, gênero Astyanax, o uso do DNA barcode na comparação entre espécies compartilhadas entre
bacias mostrou que um grupo identificado como A. bimaculatus representava na verdade exemplares da espécie A.
altiparanae, espécie ainda não assinalada para essa bacia. O presente estudo é o primeiro a testar a eficácia da técnica
de DNA barcode na identificação da mega-fauna brasileira de peixes de água doce e os resultados obtidos provam
que o método é muito útil para uma melhor compreensão, identificação e caracterização dessa biodiversidade.
Apoio financeiro: FAPESP
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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185
Evidências moleculares dos padrões evolutivos e
filogeográficos de populações de Astyanax bockmanni
(teleostei: characidae) na bacia do alto rio Paraná
Cholak, LR1; Marreta, ME1; Oliveira, C2; Parise-Maltempi, PP1; Alves, AL1
Laboratório de Genética de Peixes, Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Julio de
Mesquita Filho”, Rio Claro, SP, Brasil
2
Departamento de Morfologia, UNESP, Botucatu, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Astyanax bockmanni, Filogeografia, Haplótipo, ATPase 8/6.
O gênero Astyanax pertence à família Characidae e distribuí-se dos EUA a Argentina, tendo grande variação de habitats.
É um gênero composto por espécies de pequeno porte, com cerca de 100 espécies válidas e de grande complexidade
morfológica, sendo reconhecido ao menos três complexos de espécies no gênero. Novas espécies de Astyanax são
freqüentemente descritas ou renomeadas, como Astyanax bockmanni que está distribuída por toda a bacia do Alto
rio Paraná e era considerada sinônima de Astyanax eigmmaniorum. Poucos relatos usando marcadores moleculares
estão disponíveis para o gênero apesar de toda complexidade, nesse sentido a identificação de processos históricos
de origem e diversificação de espécies do gênero são necessários. O presente trabalho teve como objetivo realizar
uma análise filogeográfica em 06 populações de Astyanax bockmanni da bacia do Alto rio Paraná, incluindo as subbacias do rios Tietê (4) e Paranapanema (2), num total de 24 indivíduos, verificando assim a variabilidade genética
nestas sub-bacias e identificando processos históricos de colonização destas áreas. Foram realizadas as extrações
de DNA e a amplificação total do gene mitocondrial ATPase 8/6 (840pb). Após seqüenciamento as sequências
obtidas foram alinhadas com o programa Bioedit, e as análises filogenéticas foram realizadas no programa MEGA
5.0 através dos métodos de Neighbor-Joining, Minimum Evolution, Máxima Parcimônia e Máxima Verosimilhança,
com 1000 réplicas de boostrap. Para as análises filogeográficas as sequências foram analisadas no programa TCS.
As análises filogenéticas mostram que A. bockmanni forma uma unidade monofilética para os quatro métodos,
tendo A. paranae como grupo irmão. A análise filogeográfica mostrou a presença de nove haplótipos (A-I) entre
as populações de Astyanax bockmanni estudadas, sendo o haplótipo H o mais freqüente (29%) e os haplótipos
únicos C, D, G e I. O haplótipo A considerado ancestral para as populações analisadas foi observado apenas na
população de Paranapiacaba, cabeceira do rio Tietê, nesta sub-bacia ainda são encontrados os haplótipos B, C, D,
F, G e H, enquanto na bacia do rio Paranapanema foram encontrados os haplótipos E, H e I, mostrando que na subbacia do rio Tietê ocorre maior variabilidade genética. O haplótipo H é o único compartilhado entre as duas subbacias (T: r. Campo Novo, Bauru e PP: r. Hortelã, Botucatu) sugerindo que a colonização de Astyanax bockmanni
na sub-bacia do rio Paranapanema é recente em relação ao rio Tietê e pode ter ocorrido a partir desta região.
Apoio Financeiro: FAPESP (proc. n. 2007/58641-0)
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Padrão de transmissão dos diferentes tipos de
cromossomos supranumerários em Prochilodus
lineatus (Characiformes, Prochilodontidae)
Penitente, M1; Voltolin, TA1; Senhorini, JA2; Bortolozzi, J1; Foresti, F3; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, CEPTA, MMA
3
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Curimbatá, citogenética, herança mendeliana, neutralização, extinção.
Prochilodus lineatus, popularmente conhecido como curimbatá, é uma espécie de grande frequência na bacia
superior do rio Paraná, envolvendo, sobretudo, os rios Grande, Pardo e Mogi-Guaçu. Citogeneticamente, P. lineatus
apresenta número diplóide de 2n=54 cromossomos dos tipos meta/submetacêntricos com número fundamental
igual a 108, além da presença de zero a sete cromossomos supranumerários. Estes são uma modalidade de
cromossomos adicionais encontrados em espécies vegetais e animais os quais, provavelmente, surgiram de
cromossomos do complemento normal (A), mas seguiram seu próprio caminho evolutivo. São frequentemente
heterocromáticos e geralmente não apresentam homologia com nenhum cromossomo A, podendo variar
tanto no número quanto na morfologia. Na população do rio Mogi-Guaçu encontrou-se polimorfismo quanto
à presença dos cromossomos B em P. lineatus, onde se pode constatar três tipos de microcromossomos B:
acrocêntrico (pequeno), metacêntrico (médio) e submetacêntrico (grande). Atualmente existem somente
especulações a respeito de sua função, origem, estrutura e herança, o que torna a análise da estrutura do DNA
destes cromossomos B assim como o estudo do seu padrão de herança extremamente importante. Diante disso,
este trabalho objetivou o estudo da herança dos cromossomos B quanto à frequência e morfologia, resultantes de
cruzamentos dirigidos na espécie P. lineatus. Os cruzamentos foram realizados no CEPTA/ICMBio, Pirassununga,
SP com reprodutores capturados da população natural do rio Mogi-Guaçu, mantidos na piscicultura do CEPTA/
ICMBio e descendentes produzidos através de técnicas de reprodução induzida. Realizaram-se análises
citogenéticas por meio de preparações cromossômicas utilizando a técnica de estimulação de divisão celular,
para a obtenção de maior número de mitoses e preparações diretas de células renais in vivo e in vitro. O padrão
de transmissão destes elementos supranumerários foi obtido utilizando o teste de distribuição “T” de Student.
A taxa de transmissão de cromossomos B (kB) foi calculada a partir da média do número de cromossomos B da
progênie, dividido pelo número total de B dos parentais. O levantamento de cromossomos B nesta população,
a partir da análise de 50 exemplares, apresentou a incidência de 6,34% cromossomos acrocêntricos, 53,18%
metacêntricos e 40,48% submetacêntricos. Os dados sobre a taxa de transmissão destes microcromossomos foram
kB=0,388, kB=0,533 e kB=0,536, respectivamente. O resultados obtidos indicam que os cromossomos B acrocêntricos
estão em fase de extinção nesta população (kB=0,388), enquanto que os supranumerários do tipo meta e
submetacêntrico estão em fase de neutralização, seguindo um modelo de transmissão mendeliano (kB=0,500).
Apoio financeiro: CEPTA/ICMBio, PROEX e FAPESP
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Conservação cariotípica em Brachychalcinus
copei (Teleostei, Characiformes, Stethaprioninae) e
mapeamento físico dos genes ribossomais 18S e 5S
Oliveira, MLM1; Carvalho, ML2; Pansonato-Alves, JC1; Oliveira, C1; Foresti, F1
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP
Universidade Federal do Acre – UFAC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cromossomos, Brachichalcinus, DNAr, heterocromatina
A família Characidae, uma das maiores e mais complexas famílias de peixes dentro da ordem Characiformes,
está amplamente distribuída na região Neotropical e compreende cerca de 170 gêneros e 885 espécies. Um
grupo interessante de peixes Characiformes é formado pelos membros da subfamília Stethaprioninae, que
podem ser facilmente distinguidos de outros caracídeos pela forma do corpo característica e por estarem
distribuídos em todas as grandes bacias hidrográficas da América do Sul. Os representantes deste grupo são
muito homogêneos em termos de tamanho e forma corporal, sendo que o comprimento máximo padrão varia
de 65mm em Brachichalcinus retrospina a 90mm em B. orbicularis. O presente trabalho teve por objetivo analisar
citogeneticamente doze exemplares de Brachychalcinus copei provenientes do rio Branco, bacia Amazônica, no
Estado do Acre, utilizando técnicas citogenéticas convencionais e moleculares, como coloração por Giemsa,
identificação de regiões heterocromáticas por bandamento C, localização das regiões organizadoras de nucléolos
(RONs) pela da impregnação por nitrato de Prata e localização dos genes de DNAr 5S e 18S pela técnica de
hibridação fluorescente in situ. As análises citogenéticas revelaram número diplóide de 2n=50 cromossomos em
todos os exemplares de ambos os sexos. Blocos de heterocromatina constitutiva foram observados nas regiões
centroméricas de todos os cromossomos, além de blocos heterocromáticos intersticiais nos braços longos dos
cromossomos do par três. Polimorfismos relacionados ao sexo não foram observados. As regiões organizadoras
de nucléolo (RONs), evidenciadas pela reação com nitrato de Prata e pela sonda de DNAr 18S, foram localizadas
em posição terminal do braço longo nos cromossomos do par nove, enquanto a hibridação com a sonda de DNAr
5S evidenciou ampla variação de localização deste gene nos indivíduos analisados, sendo observadas marcações
em até cinco cromossomos. Os dados obtidos para esta população de Brachychalcinus copei são similares aos
resultados já descritos na literatura para outros membros da ordem Characiformes, como em espécies de
Steindachnerina e Charax, que possuem o mesmo número diplóide, RONs em apenas um par cromossômico e
ausência de sistema cromossômico de diferenciação sexual. No entanto, a presença de múltiplos sítios de DNAr
5S em porção intersticial de vários cromossomos do complemento, situação provavelmente derivada em relação
a condição plesiomórfica de marcação apenas em um par cromossômico, pode acontecer devido à ocorrência
de arranjos estruturais nestes cromossomos. Está hipótese é contrária a proposição de que a presença de sítios
5S em posição intersticial seria uma forma de proteção para estes genes, visto que os domínios cromossômicos
e a presença de heterocromatina podem ter desempenhado papel fundamental na dispersão destes genes.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP
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Padrão de bandamento C em diferentes espécies da
família Curimatidae (Characiformes): comportamento
do cromossomo supranumerário
Sampaio, TR; Giuliano-Caetano, L; Dias, AL
Laboratório de Citogenética de Peixes - Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brasil.
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: peixes, Curimatidae, banda C, CMA3, cromossomos supranumerários.
Introdução: A família Curimatidae é composta por 8 gêneros e aproximadamente 97 espécies distribuídas na
América do Sul e América Central, onde são comumente conhecidos como “birú”, “voga” ou “saguirus”, e representa
um grupo de peixes encontrados em diversos ecossistemas aquáticos, como rios, córregos e lagos. Somente 36
espécies foram estudadas citogeneticamente, sendo que 30 apresentam número diplóide (2n) de 54 cromossomos
e número fundamental (NF) igual a 108. Das 30 espécies, 26 possuem cromossomos meta-submetacêntricos
(m-sm). Objetivos: Analisar o padrão de distribuição da heterocromatina, por meio de coloração convencional
e sua composição de pares de base por meio de fluorocromos; e observar o comportamento do cromossomo
supranumerário ou B. Materiais: No presente trabalho foram analisadas 6 espécies de curimatídeos: Cyphocharax
modestus, C. voga, C. spilotus, C. saladensis, Steindachnerina insculpta e S. biornata coletadas em diferentes pontos da
bacia do rio Tibagi/PR, do Sistema Hidrográfico da Laguna dos Patos/RS e da bacia do rio Tramandaí/RS. Métodos:
Os cromossomos mitóticos foram obtidos através da preparação direta com retirada do rim anterior, as regiões
heterocromáticas foram visualizadas a partir da técnica de banda C, com utilização de ácido clorídrico, formamida
50% e solução salina 2XSSC e posteriormente coradas com Giemsa e fluorocromos cromomicina A3 (CMA3) e DAPI.
Resultados: O número diplóide encontrado foi de 54 cromossomos do tipo m-sm e NF igual a 108. Foi observada
a presença de um cromossomo supranumerário nas células somáticas das seis espécies estudadas. A banda C
corada com Giemsa evidenciou a heterocromatina em regiões pericentroméricas e terminais em Cyphocharax
modestus, C. voga, C. spilotus e Steindachnerina inculpta, em regiões pericentroméricas em C. saladensis e regiões
terminais em S. biornata. O cromossomo B apresentou-se heterocromático em C. saladensis e S. insculpta. Nas
demais espécies não foi possível sua visualização com banda C. Quando a banda C foi corada com os fluorocromos,
as regiões heterocromáticas, inclusive do cromossomo B, mostraram-se positivas para CMA3 e negativas para
o DAPI, sendo, portanto regiões ricas em pares de base GC. Conclusões: Os dados apresentados mostram a
distribuição e a composição em pares de base da heterocromatina de algumas espécies de curimatídeos, mostrando
algumas diferenças entre elas, sendo um importante marcador para caracterizar espécies e/ou populações. Novas
ocorrências de cromossomo B em Cyphocharax voga, C. saladensis e Steindachnerina biornata foram observadas,
confirmando que a presença deste tipo de cromossomo é uma característica marcante deste grupo de peixes.
Apoio: Fundação Araucária, PIBIC-CNPq
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Diversificação cromossômica em populações de
Synbranchus marmoratus (Teleostei, Synbranchiformes).
Aspectos evolutivos da diferenciação alopátrica
Utsunomia, R; Pansonato-Alves, JC; Oliveira, C; Foresti, F
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP
[email protected]
Palavras chave: Synbranchus, Evolução cariotípica, DNAr, FISH e citogenética
O gênero Synbranchus está inserido na família Synbranchidae e compreende um grupo de peixes de corpo alongado
e sem nadadeiras pares conhecidos como muçum ou cobra d’água, que se apresenta amplamente distribuído na
América do Sul. Estudos citogenéticos evidenciaram a existência de interessante organização cariotípica na espécie
Synbranchus marmoratus, com a ocorrência de diferentes citótipos e com o número diplóide variando de 2n=42
a 2n=46 cromossomos. No presente trabalho, foram analisadas seis populações de S. marmoratus provenientes
de diferentes bacias hidrográficas brasileiras (rios Tietê, Paranapanema, Paraguai, Mogi-Guaçu e Grande) com
a aplicação de técnicas citogenéticas clássicas (Giemsa, RONs e bandamento-C) e moleculares (localização
do DNAr 5S). As populações provenientes dos rios Tietê, Paranapanema, Mogi-Guaçu (Jaboticabal) e Paraguai
apresentaram cariótipo com 2n=42 cromossomos (4m+6sm+8st+24a); a população proveniente do rio Grande
apresentou variação quanto ao número e morfologia cariotípica, sendo que um indivíduo apresentou 2n=42
cromossomos (6m+4sm+6st+26a) e cinco indivíduos apresentaram 2n=46 cromossomos (6m+2sm+6st+32a).
Os exemplares provenientes do rio Mogi-Guaçu (Pirassununga) também apresentaram 2n=46 cromossomos
(6m+2sm+6st+32a); contudo, apesar do número diplóide e fórmula cariotípica idêntica à da população do Rio
Grande, esta amostra apresentou cariótipo com um segundo par cromossômico metacêntrico com tamanho
maior àquele observado na amostra do Rio Grande, além da presença de uma constrição secundária no braço
curto desse par. O bandamento-C restringiu-se às regiões centroméricas de todos os cromossomos de todos os
indivíduos analisados, sendo ainda observados blocos heterocromáticos intersticiais e terminais em alguns pares.
As RONs foram identificadas em apenas um par cromossômico em todas as populações, localizadas em posição
terminal no quarto par de cromossomos nos exemplares do Rio Paranapanema; em posição terminal no oitavo
par cromossômico nos indivíduos dos Rio Tietê, Paraguai, Mogi Guaçu (Jaboticabal) e do Rio Grande (exemplar
com 2n=42); em posição terminal no segundo par cromossômico dos exemplares com 2n=46 cromossomos
(Rio Grande) e em posição intersticial no segundo par cromossômico nos exemplares do Rio Mogi Guaçu
(Pirassununga). A aplicação da técnica de FISH utilizando sonda de DNAr 5S revelou marcações simples apenas
no braço longo dos cromossomos do par 11 nos quatro citótipos analisados. A ocorrência de distintos citótipos
em Synbranchus marmoratus reforça a ideia da existência de um complexo de espécies para esse grupo, sendo que
os resultados apontam para o citótipo com 2n=46 cromossomos (Rio Grande) como o possível cariótipo ancestral
e que, possivelmente, deu origem ao citótipo com 2n=46 cromossomos (Rio Mogi Guaçu - Pirassununga). E, com
a ocorrência de eventos de fusão cromossômica, ao citótipo de 2n=42 cromossomos (Rio Grande). A ocorrência
de inversões pericêntricas nos indivíduos com 2n=42 cromossomos (6m+4sm+6st+26a) poderia explicar a origem
do citótipo que apresenta o mesmo número diplóide, porém, com fórmula cariotípica distinta (4m+6sm+8st+24a).
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP
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190
Estudo comparativo dos cromossomos B em
quatro espécies do gênero Astyanax (Teleostei,
Characiformes)
Daniel, SN; Hashimoto, DT; Bortolozzi, J; Porto-Foresti, F
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: cromossomo supranumerário, diferenciação cromossômica, polimorfismo, origem interespecífica
Cromossomos supranumerários têm sido descritos em mais de 1300 espécies de plantas e quase 500 espécies
de animais. A ocorrência desses cromossomos em peixes parece ser um evento comum em espécies de regiões
Neotropicais, relatada em cerca de 40 espécies pertencentes a diferentes táxons. A ocorrência de cromossomos
supranumerários em espécies do gênero Astyanax, descrita ao longo dos últimos anos, mostra a diversidade em
tamanho, forma e freqüência da ocorrência destes. O principal tipo encontrado nestas espécies é representado por
um cromossomo metacêntrico grande (BM), similar ao primeiro par do cariótipo, o que sugere uma origem comum
por derivar de um mesmo cromossomo em uma espécie ancestral. Dado o exposto, este trabalho teve como objetivo
descrever novos polimorfismos de cromossomos B em quatro espécies do gênero Astyanax (A. bockmanni, A.
paranae, A. fasciatus e A. altiparanae), acrescentando dados para uma melhor elucidação dos processos de origem
e função destes cromossomos nesse grupo. Para as análises citogenéticas foram utilizadas as colorações utilizando
Giemsa e bandamento C. Com exceção à A. fasciatus, que apresentou 2n=46, todas as outras espécies apresentaram
número diplóide cromossômico de 2n=50. Em relação aos cromossomos B, em A. bockmanni foram registrados
indivíduos com um ou dois cromossomos extras. Em sua estrutura cariotípica, estes foram caracterizados como
sendo dos tipos acrocêntrico (Ba) e metacêntrico (Bm), de tamanhos inferiores ao restante dos cromossomos do
complemento padrão. A população analisada de A. paranae apresentou indivíduos portando apenas um cromossomo
B, com tamanho e morfologia similar ao primeiro par do cariótipo (BM). A população de A. altiparanae apresentou
alguns indivíduos com um cromossomo extra do tipo acrocêntrico (Ba), similar ao encontrado em indivíduos de A.
bockmanni. Por fim, na população de A. fasciatus foi observado um cromossomo supranumerário do tipo acrocêntrico
(BA), similar ao primeiro par de cromossomos acrocêntricos do cariótipo padrão. Por Bandamento C, constatouse que todos os cromossomos B eram totalmente heterocromáticos, exceto o cromossomo BA de A. fasciatus, que
revelou padrões de heterocromatina apenas na região terminal do braço longo. Além disso, foram observados
diferentes padrões de intensidade heterocromáticas dos cromossomos B, quando comparados aos cromossomos
padrão, sugerindo distinta organização da composição de DNA repetitivo nesses cromossomos. Nossos dados
evidenciam que os cromossomos B encontrados nas espécies de Astyanax analisadas, corroboram com os dados
descritos na literatura, e ainda reforçam a hipótese que provavelmente tiveram sua origem de forma interespecífica.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP e PROEX.
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191
Contaminação genética de estoques de Pseudoplatystoma
corruscans (pintado) (Teleostei, Siluriformes) por híbridos
em rios da bacia do Alto Paraná
Prado, FD1; Hashimoto, DT1; Senhorini, JA2; Bortolozzi, J1; Foresti, F3; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, CEPTA, MMA
3
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pseudoplatystoma, híbridos interespecíficos, introdução de espécies, marcador molecular, conservação genética.
Pseudoplatystoma corruscans (pintado) é um bagre de grande porte encontrado em importantes bacias
hidrográficas brasileiras. Contudo, seus estoques selvagens tem sofrido impactos ocasionados por ações
humanas como a pesca excessiva e a construção de barragens que impedem sua migração e reprodução. Além
disto, tem se tornado comum a prática da hibridação artificial utilizando como espécies parentais P. corruscans
e outra espécie do mesmo gênero (P. reticulatum, ou cachara). A contaminação de estoques naturais por estes
híbridos representa um risco adicional para a integridade genética de P. corruscans, tendo em vista que esta
espécie é atualmente considerada criticamente em perigo no Estado de São Paulo. Diante disso, este trabalho
teve como objetivos utilizar marcadores moleculares com base em polimorfismos de regiões do DNA nuclear
(genes RAG2 e 18S) e mitocondrial (gene 16S) como ferramentas para realizar um monitoramento genético de
populações naturais de P. corruscans, a fim de verificar se os exemplares capturados na natureza são pertencentes
à linhagens puras desta espécie ou se está ocorrendo a contaminação por híbridos. Foram analisadas amostras
de indivíduos provenientes dos rios Mogi-Guaçu (n=21), Verde (n=14), e Paraná (n=51) (Bacia do Alto Paraná).
Os resultados revelaram que, no rio Mogi-Guaçu, 17 exemplares foram identificados como P. corruscans e quatro
como híbridos interespecíficos de P. corruscans e P. reticulatum. No rio Paraná foram identificados dois híbridos e
49 exemplares de pintado enquanto no rio Verde todos os 14 exemplares foram pertencentes à linhagem pura P.
corruscans. De uma maneira geral, foi verificada uma baixa contaminação no rio Paraná (4% de híbridos), contudo,
no rio Mogi-Guaçu os híbridos corresponderam a aproximadamente 20% das amostras analisadas, indicando
um maior grau de contaminação e que possivelmente estes animais estão se adaptando e permanecendo nesta
região. Já no rio Verde a introdução de híbridos aparentemente não está ocorrendo, e esta região ainda pode ser
considerada uma importante área a ser preservada. Possivelmente a ocorrência destes híbrídos nos rios Paraná
e Mogi-Guaçu é resultante de introduções e escapes de pisciculturas ou “pesque-pagues”, uma vez que não há
registro de P. reticulatum nas localidades estudadas, o que dificultaria a ocorrência de hibridação natural. Os
resultados da introdução de híbridos no ambiente selvagem podem levar a impactos irreversíveis, pois estes
animais são férteis e podem ocasionar “mistura”, introgressão genética e até a extinção genética da espécie P.
corruscans, principalmente em localidades com maiores níveis de contaminação, como é o caso do rio Mogi-Guaçu.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e ICMBio
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192
Diversidade genética e estruturação populacional do
tubarão-martelo Sphyrna lewini na costa do Brasil
Pinhal, D1; Shivji, MS2; Testerman, CB2; Gadig, OBF3; Martins, C1
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP – Universidade Estadual Paulista
Campus Experimental do Litoral Paulista, UNESP – Universidade Estadual Paulista
3
Guy Harvey Research Institute, Oceanographic Center, Nova Southeastern University
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNA mitocondrial, filopatria, conectividade, conservação, pesca
O tubarão-martelo Sphyrna lewini, conhecido no Brasil como Panan ou Cambeva, é uma espécie cosmopolita
atualmente em risco de extinção. Tal condição decorre da excessiva exploração pesqueira, principalmente para
a retirada de suas nadadeiras, as quais estão dentre as mais valorizadas no comercio internacional de nadadeiras
e mercados asiáticos. Pouco é conhecido sobre o nível de diversidade genética e estrutura populacional presente
em populações selvagens do Brasil, onde a exploração ocorre ao longo de toda a costa e com maior intensidade
em áreas de berçário costeiras. O objetivo do presente trabalho é avaliar o nível da diversidade genética e a
diferenciação populacional em fina escala da espécie ao longo da costa brasileira. Para isso foi analisada toda a
região controle do DNA mitocondrial (1092bp) e a diferenciação genética entre as populações estimada com o
Fst. Todas as análises foram realizadas com o programa Arlequin versão 3.01. Até o momento foram coletados
125 indivíduos, sendo 46 de SP, 9 do RN, 9 do RJ, 20 de SC e 41 do RS. A partir desses dados preliminares, foram
detectados 19 haplótipos (Hd: 0,4674) e diversidade haplotípica superior nas localidades de SP, RN e SC. Forte
estruturação populacional (Fst=0551; p<0,0001) foi detectada entre todas as populações, inclusive entre pares de
populações geograficamente próximas, onde o Fst variou de 0,277 a 0,628. Houve correlação positiva entre distância
genética e distância geográfica, sugerindo algum tipo de isolamento por distância. Contudo, a inexistência de
haplótipos totalmente exclusivos e o grande número de indivíduos compartilhando um mesmo haplótipo
sugerem a existência de conectividade, possivelmente mediada pela migração dos machos adultos entre as áreas
amostradas. Pelo Fst significante encontrado na análise em fina escala do DNA mitocondrial, pode-se supor que
as áreas de berçário, em detrimento de barreiras geográficas, exerçam maior influência na diferenciação genética
existente entre as populações, uma vez que as fêmeas desta espécie apresentam comportamento filopátrico. Os
altos valores de Fst entre localidades contíguas sugerem ainda que haja maior grau de fidelidade das fêmeas às áreas
de berçário do que o previamente reportado na literatura, o que ajudaria a explicar o aparecimento de populações
geneticamente diferenciadas ao longo da costa brasileira. Análises de marcadores microssatélites e extensivo
incremento no número amostral estão em desenvolvimento e permitirão melhor compreensão da dinâmica
populacional de S. lewini, contribuindo para o correto manejo integrado da pesca e conservação da espécie.
Apoio financeiro: Fapesp, CNPq e Guy Harvey Ocean Institute
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Identificação de grupos naturais em Rineloricaria
(Actinopterygii, Siluriformes; Loricariidae) com base em
caracteres moleculares
Costa-Silva, GJ1; Rodriguez, MS2; Oliveira, C1; Foresti F1
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, instituto de Biociências, UNESP - Campus de Botucatu
Laboratório de Ictiologia de Ribeirão Preto, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras, USP - Campus de Ribeirão Preto
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Rineloricaria, Filogenia-molecular, Mitocondrial, COI, Cit B.
O gênero Rineloricaria é um dos gêneros mais especiosos da família Loricariidae, com distribuição desde a Costa
Rica até a Argentina. Estes peixes habitam desde ambientes lênticos até lóticos com os mais distintos substratos,
o que requer do gênero uma grande variedade de formas. Algumas espécies possuem distribuição restrita,
apresentando certo grau de endemismo, porém, outras espécies possuem ampla distribuição. Até o momento foram
descritas cerca de 66 espécies para o gênero Rineloricaria, porém muitas outras são conhecidas e não descritas. A
grande quantidade de espécies conhecidas e não descritas deve-se em parte ao fato de ser escasso o conhecimento
sistemático entre as espécies de Rineloricaria, dificultando na logística taxonômica, por necessitar de um extenso
material comparativo e, em alguns casos, exigindo a análise comparativa em grupos por proximidade geografia,
o que, muitas vezes, tratam-se de agrupamentos artificiais. O objetivo do presente trabalho foi identificar grupos
naturais de espécies a partir de uma análise filogenética molecular. Para isso, foram sequenciados os genes
mitocondriais Citocromo Oxidase 1 e Citocromo B de 41 espécies de Rineloricaria, sendo 17 delas ainda não descritas
taxonomicamente. Também foram sequenciadas amostras de outros 6 gêneros de Loricariinae que foram tratados
como grupos externos. A partir de nossas análises pudemos identificar 5 grupos com mais de uma espécie: grupo
R. formosa, grupo R. lanceolada, grupo R. heteroptera, grupo R. cadeae e um grupo do litoral sul-sudeste. Alguns
desses grupos, além de apresentarem uma correspondência geográfica, possuem caracteres morfológicos que
possibilitam a sua identificação. Também é possível observar vários grupos compostos por apenas uma espécie.
Os nós internos a esses grupos (mais recentes) apresentaram um bom suporte estatístico, apontando uma escolha
adequada dos caracteres para esclarecimento das relações a esse nível. Apesar da identificação e a relação interna
desses grupos terem sido bem definida, a relação entre os mesmos não foi totalmente esclarecida. Para isso a adesão
de novos caracteres de diferentes fontes e com um menor grau de saturação, tal como a incorporação de mais
táxons, deve ser decisivo para o esclarecimento dos arranjos filogenéticos existentes dentro do gênero Rineloricaria.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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Caracterização citogenética de três espécies da
família Loricariidae (Pisces, Siluriformes) da região de
Rondonópolis, Mato Grosso
Becker, QMC¹; Silva, AM¹; Oliveira, ML1; Balcaçar, PA1; Castro, RJ¹; Vizzotto, PC¹
Departamento de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Naturais, Campus Universitário de Rondonópolis, Universidade
Federal do Mato Grosso
[email protected]
1
Palavras-chave: Peixes Neotropicais, Citogenética, Evolução, Loricariidae, Hypostomus, Ancistrus
O cerrado do Brasil central é atualmente um dos ecossistemas mais ameaçados do mundo. Os ambientes
aquáticos desse bioma abrigam uma ictiofauna extremamente diversificada. Contudo, é nítida a escassez de
dados citogenéticos referentes à ictiofauna desta região. Loricariidae é uma das mais numerosas e diversificadas
famílias de peixes da região Neotropical, sendo ampla a variação na morfologia e padrão de cores de seus
representantes, o que dificulta sua identificação taxonômica. É crescente o número de registros de novas espécies
deste grupo. Seus representantes são conhecidos popularmente como cascudos, geralmente apresentam hábito
bentônico, tendo como característica básica o corpo coberto por placas ósseas dispostas em várias séries, as quais
formam uma armadura que protege seu corpo. O presente trabalho visa caracterizar citogeneticamente duas
espécies do gênero Hypostomus e uma espécie do gênero Ancistrus, ambos pertencentes à família Loricariidae,
através do emprego da técnica convencional de coloração dos cromossomos mitóticos com Giemsa. Foram
analisados 5 exemplares de Hypostomus cochliodon coletados no Córrego do Esparramo, localizado na reserva
do 18º Grupo de Artilharia e Campanha, bem como, 7 exemplares de Hypostomus sp e 3 exemplares de Ancistrus
sp coletados no Córrego Pitaluga. Os dois córregos estão localizados no município de Rondonópolis, região
sul do estado de Mato Grosso, pertencendo, portanto, à Bacia do Alto Rio Paraguai. Hypostomus cochliodon
apresentou 2n=64 cromossomos (12M+20SM+32ST/A) e NF=96, Hypostomus sp apresentou 2n=60 cromossomos
(14M+18SM+28ST/A) e NF=92, e Ancistrus sp apresentou 2n=42 cromossomos (24M+12SM+6ST/A) e NF=78.
Apesar de Hypostomus cochliodon e Hypostomus sp apresentarem números e fórmulas cariotípicas distintas, o
que é natural por serem espécies diferentes, os dados obtidos se enquadram na variação descrita na literatura
para o gênero Hypostomus, que é de 2n=52 a 2n=80 cromossomos, com elevada quantidade de cromossomos do
tipo subtelocêntricos e acrocêntricos. O número diplóide observado em Ancistrus sp também vem corroborar
os dados descritos para o gênero, ou seja, se encontra entre 2n=38 a 2n=54 cromossomos. Os resultados
obtidos contribuem para o entendimento da evolução cariotípica deste grupo tão complexo, que participa
ativamente da manutenção do equilíbrio ambiental e reforça a importância de estudos citogenéticos básicos
em áreas ainda pouco exploradas do ponto de vista científico, que podem estar prestes a serem degradadas.
Apoio financeiro: FINEP
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A genética no controle de híbridos em pisciculturas:
comércio ilegal de peixes e ameaça para espécies
nativas
Hashimoto, DT1,3; Senhorini, JA2; Bortolozzi, J1; Foresti, F3; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, CEPTA, MMA
3
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Conservação genética, genética forense, híbridos interespecíficos
Identificação molecular é um das principais áreas de aplicação na conservação genética de espécies. Através do
perfil de DNA é possível fiscalizar a venda fraudulenta de produtos oriundos de espécies em extinção bem como
monitorar o comércio de espécimes que representam ameaças às espécies nativas. Nestes casos, identificações
morfológicas são de difícil acesso e duvidosas com relação à origem e identidade das espécies analisadas. Híbridos de
peixes produzidos artificialmente em pisciculturas são considerados eminentes ameaças biológicas às populações
naturais. Podem apresentar fertilidade e “contaminar geneticamente” os estoques através de introgressão, com
vários casos em que há extinção dos estoques nativos. Neste trabalho, estabelecemos e utilizamos marcadores
de PCR-Multiplex e PCR-RFLP com genes nucleares (α-tropomiosina e RAG – recombination activating gene) e
mitocondriais (ribossômico 16S e citocromo oxidase) para a identificação de híbridos entre espécies Neotropicais
atualmente produzidos nas grandes pisciculturas brasileiras. Entre estes, estão cruzamentos envolvendo espécies
de Anostomidae (Leporinus macrocephalus e Leporinus elongatus), Pimelodidae (Pseudoplatystoma reticulatum,
P. corruscans, Phractocephalus hemioliopterus e Leiarius marmoratus) e Serrasalminae (Colossoma macropomum,
Piaractus mesopotamicus e P. brachypomus). A identificação molecular foi realizada em 13 lotes de juvenis de peixes
(cerca de 700 amostras), comprados vivos (de 5 a 15 cm) em quatro diferentes pisciculturas. Foram adquiridos
tanto espécies parentais quanto produtos híbridos. Os resultados indicaram que dez lotes apresentaram-se
irregulares e foram vendidos de forma fraudulenta, pois não correspondiam ao que foi comercializado pelos
piscicultores. Nestes lotes, amostras de diferentes híbridos e espécies estavam misturadas, com casos de até
cinco diferentes produtos no mesmo lote. A situação é preocupante em relação aos híbridos de peixes redondos
(Serrasalminae) e de pintados (Pimelodidae), pois foram comercializados erroneamente em alta proporção.
Além do mais, estes animais apresentam fertilidade e já são encontrados em ambientes naturais, provavelmente
oriundos de escapes e solturas de sistemas de cultivo. Os dados mostram que a produção, manejo e comércio
de peixes, em especial de híbridos, são realizados de forma descontrolada nas pisciculturas brasileiras. Uma vez
que híbridos apresentam características morfológicas intermediárias às dos parentais, o principal obstáculo
para tornar estas práticas monitoradas é a dificuldade de identificação destes animais pela análise morfológica,
especialmente de juvenis. Nesse sentido, a aplicação de métodos moleculares PCR-Multiplex e PCR-RFLP tornase imprescindível, principalmente por serem técnicas rápidas e de baixo custo. Nossos resultados permitirão a
proteção ao consumidor contra práticas fraudulentas de comércio de peixes e auxiliarão na elaboração de leis
nacionais visando conservação genética e análise forense na indústria da aquicultura. Por fim, junto aos órgãos
competentes será possível delinear planos de conservação biológica para um manejo adequado destes animais, de
forma a minimizar os impactos negativos aludidos com a implantação de projetos de hibridação em pisciculturas.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP e ICMBio.
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Monitoramento da estrutura genética de Pimelodus
maculatus (Pisces, Pimelodidae) da represa da UHE
Escola Mackenzie, rio Paranapanema
Gomes, CP1; Banin-Hirata, BK1; Penha, RES1; Sodré, LMK1; Orsi, ML2; Almeida, FS1
Departamento de Biologia Geral
Departamento de Biologia Animal e vegetal, Universidade Estadual de Londrina – Rodovia Celso Garcia Cid PR 445 Km 380 Campus
Universitário, Caixa Postal 6001, Cep 86051-990, Londrina – PR, Brasil;
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pimelodus maculatus, monitoramento genético, RAPD, estrutura genética, variabilidade genética.
Durante os anos de 2000 a 2003 foi desenvolvido o estudo intitulado como “Caracterização Genética da Ictiofauna
do Reservatório de Capivara (UHE Escola Mackenzie)” que tinha como objetivo central caracterizar geneticamente
dez espécies de peixes deste ecossistema, dentre elas Pimelodus maculatus. O presente estudo tem como propósito
monitorar a estrutura e variabilidade genética desta espécie em dois trechos localizados neste reservatório fazendose uso de marcadores RAPD tal como foi padronizado no projeto anterior. Os dados obtidos serão comparando com
os do referido projeto, com o intuito de obter informações relevantes visando a conservação da espécie. Os locais
de coleta foram Cinzas e Sertanópolis, tendo sido capturados 30 espécimes em cada. O DNA genômico foi extraído
e quantificado por fluorímetro e amplificado com seis primers de RAPD (OPA1, OPA10 OPA12, OPA13, OPA18 e
OPX1). Foi obtido um total de 86 locos, os quais foram utilizados para as análises genéticas. Foram estimados,
através de programas computacionais, os seguintes parâmetros genéticos: variabilidade, distância genética e
theta (TFPGA 1.3); análise da variância molecular (AMOVA), estimativa de FST (ARLEQUIN 3.0) e construção do
dendrograma de similaridade genética (NTSYS-PC). Os valores de variabilidade genética obtidos pela proporção
de locos polimórficos (P) foram 67,44% para a população de Cinzas e 65,11% para a população de Sertanópolis, no
estudo anterior os valores encontrados para estas mesmas localidades foram de 60,36% e 56,11%. A construção do
dendrograma de similaridade genética mostrou a formação de um grande agrupamento contendo os indivíduos
das duas localidades, com uma amplitude de variação de 0,70 a 0,86. O valor de theta observado foi de 0,0890,
sendo que no projeto anterior havia sido de 0,1299. Os resultados obtidos com a AMOVA indicaram que a maior
fonte de variação está dentro dos grupos amostrados (95,58%) e não entre eles (4,42%), sendo o valor de FST de
0,044. Acreditamos que o aumento dos valores de variabilidade genética e a diminuição da diferenciação genética
em relação ao estudo precedente seja resultado da ação de manejo adotada entre ambos os projetos, dada pelo
fechamento da escada de transposição de peixes do complexo Canoas, localizado a montante da Represa Capivara,
já que há indícios de que os peixes realizavam a transposição, mas não conseguiam completar seu ciclo reprodutivo
a montante por ausência de locais propícios e de retorno à represa a jusante. É possível que os indivíduos de P.
maculatus com as escadas para transposição de peixes fechadas, tenham se mantido na represa Capivara fazendo
uso dos grandes tributários presentes (Rios Tibagi e Rio Cinzas) para consolidação do seu ciclo reprodutivo.
Órgão financiador: Duke Energy international
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Isolamento e caracterização de marcadores
microssatélites em Astyanax altiparanae (Teleostei,
Characiformes)
Zaganini, RL1; Hashimoto, DT1; Mendonça, FF2; Pereira, LHG1; Oliveira, C2; Foresti, F2; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Microssatélites; Astyanax; Estrutura Populacional
Astyanax altiparanae, o lambari do rabo amarelo, é uma espécie amplamente distribuída em diferentes
ambientes da bacia do rio Paraná e apresenta um grande interesse econômico. É utilizado principalmente
para consumo alimentar ou como isca viva na pesca esportiva e com papel relevante na piscicultura brasileira.
Consequentemente, estudos genéticos enfocando um maior conhecimento das populações naturais e estoques
cultivados são considerados essenciais, principalmente no sentido de fornecer estratégias para programas de
manejo, aquicultura e conservação biológica deste grupo de peixes. Desta maneira, o presente trabalho teve como
objetivo isolar e caracterizar marcadores do tipo microssatélites para análise populacional de A. altiparanae. Uma
biblioteca genômica enriquecida em microssatélites [(AC)n e (AG)n] foi construída possibilitando a aquisição de
noventa e seis clones positivos, das quais quarenta e oito foram sequenciados. Os resultados do sequenciamento
possibilitaram identificar 37 clones (77,08%) que continham sequências repetitivas do tipo microssatélites. No
entanto, em apenas 25 loci foram possíveis desenhar primers para isolamento e amplificação destas regiões.
Até o momento, em análise de uma população de A. altiparanae foram encontrados seis loci microssatélites
polimórficos, tendo o número de alelos variando de 6 a 17 por locus. O valor de heterozigosidade esperada
variou de 0,65 a 0,92. Cinco loci apresentaram desvio do equilíbrio Hardy-Weinbeirg com índice de significância
de p<0,001. E o índice de endogamia (FIS) apresentou valores negativos apenas para um dos locus. Atualmente,
tendo em vista a pouca disponibilidade de marcadores microssatélites para a ictiofauna Neotropical, os dados
obtidos até o presente se mostram de extrema significância, pois são potencialmente úteis para um manejo
adequado dos estoques e na orientação de programas de conservação biológica em Astyanax altiparanae.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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Identificação molecular de Carcharhinus falciformis
e Carcharhinus signatus (ChondrichthyesCarcharhiniformes) capturados pela pesca atuneira na
costa sudeste e sul do Brasil
Domingues, RR1,2; Rezende, PC2; Amorim, AF1; Hilsdorf, AWS2
Instituto de Pesca – APTA –SAA-SP
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura (LAGOAA), Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi
das Cruzes
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Identificação, tubarões, mtDNA, pesca , conservação
A pesca atuneira que atua no sudeste e sul do Brasil captura grande quantidade de tubarões que nas estatísticas
de desembarque estão divididos em cinco grupos: azul (Prionace glauca), martelo (Sphyrna lewini e S. zygaena);
raposa (Alopias superciliosus e A. vulpinus); anequim (Isurus oxyrhincus) e os “outros tubarões” representados
principalmente pelo gênero Carcharhinus. Dentre os tubarões do gênero Carcharhinus existe uma natural
similaridade morfológica que dificulta a identificação precisa da espécie, associado à prática usual da retirada
da cabeça, vísceras e nadadeiras ainda no mar, caracteres chave para a identificação morfológica. Em 2009, as
espécies Carcharhinus falciformis e Carcharhinus signatus representaram 98% do desembarque desse gênero
pela pesca atuneira que desembarcou em São Paulo. O presente estudo objetivou o desenvolvimento de um
método prático, rápido e de baixo custo para a identificação molecular das espécies C. falciformis e C. signatus
capturadas pela pesca atuneira na citada área, através do método PCR-RFLP. Foram recebidas cabeças das duas
espécies, identificadas através da contagem e forma dos dentes e posteriormente coletado tecido muscular da
região dorsal próxima à cabeça. Para a extração do DNA, utilizou-se o kit GE Healthcare Life Sciences ®, sendo o
DNA amplificado por reação de PCR do gene 16s ribossomal do DNA mitocondrial, purificado e sequenciado.
Após o seqüenciamento as amostras foram tratadas e alinhadas in silico pelo pacote MEGA 4.1. Para localizar as
enzimas de restrição utilizou-se o programa Neb Cutter V.2.0. Um total de 663 pares de bases do mtDNA 16s foram
analisados para ambas as espécies e 43 enzimas de restrição testadas quanto a eficiência de produzir fragmentos
diagnósticos para determinação de cada espécie. As enzimas DraI (TTTAAA) e PasI (CCCWGGG) foram bastante
eficientes para a identificação das espécies fornecendo fragmentos chaves que permitiram diferenciar as espécies.
A identificação da espécie torna-se imperativa, uma vez que cada espécie responde de maneira diferente à pressão
pesqueira. O emprego desta metodologia pode auxiliar nas estatísticas de desembarque, que comumente agrupam
mais de uma espécie com um mesmo nome comum, bem como futuros planos de manejo dessas espécies que se
encontram na lista vermelha de espécies ameaçadas de extinção da IUCN como quase ameaçada e vulnerável.
Apoio: FAPESP; Project Aware Foundation
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DNA Barcode como ferramenta de identificação
da biodiversidade de peixes pertencentes aos rios
litorâneos do Estado de São Paulo
Henriques, JM¹; Foresti, F¹; Oyakawa, OT2; Oliveira, C¹
¹Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista - UNESP – Distrito de Rubião Jr. s/n, Instituto de Biociências, Cep 18600000, Botucatu - SP, Brasil
2
Seção de Peixes, Museu de Zoologia, Universidade de São Paulo - USP, São Paulo – SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: DNA Barcode, COI, peixes, biodiversidade, rios costeiros
O conjunto de drenagens atlânticas, denominado rios litorâneos, corresponde a diversos cursos d’água que nascem
na Serra do Mar e desembocam no mar. Com exceção dos riachos contidos no complexo do Parque Estadual da
Serra do Mar, os rios da região sofrem há algum tempo um intenso impacto resultante do desmatamento e produção
de lixo e esgotos domésticos não tratados, associados à ocupação imobiliária intensa e desordenada, com fins
turísticos e de lazer. Embora em termos numéricos seja taxonomicamente menos diversa que outras bacias, é a
mais rica em formas endêmicas, já que a longa história evolutiva independente de suas bacias componentes gerou
um bom número de formas endêmicas conhecidas, número este que deverá aumentar significativamente quando
a região for melhor explorada ictiofaunisticamente. Estudos recentes propõem o uso de um segmento do gene
mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (Cox I) como um sistema global de identificação de plantas e animais.
Sequências desse gene são interpretadas como um código de barras (barcode), com as espécies sendo delimitadas
por uma sequência particular ou por um conjunto de sequências muito similares. Os exemplares coletados tiveram
um fragmento de tecido retirado e posteriormente foram fixados em formol e depositados na coleção de peixes do
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes (LBP) de Botucatu. O fragmento de tecido retirado foi utilizado para
extração de DNA total, o qual foi submetido a PCR para amplificação do gene Cox I e posteriormente sequenciado
por um seqüenciador automático. Os programas ATGC, Bioedit, Dambe e Mega 4.0 foram utilizados para edição e
análise das sequências obtidas. No presente trabalho foram analisadas 308 sequencias pertencentes a 49 espécies
de peixes. Todas as espécies analisadas foram discriminadas corretamente. As divergências genéticas médias (K2P)
encontradas foram de 0,77% dentro das espécies, 6,16% dentro dos gêneros, 23,98% dentro das ordens. Os valores de
divergência obtidos são similares aos encontrados em outros trabalhos para os mais variados grupos. A separação de
todas as espécies analisadas indica a eficácia do sistema de identificação por DNA barcode. Assim acreditamos que
nosso trabalho possa contribuir para uma melhor identificação da ictiofauna dos rios costeiros do estado de São Paulo.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Citogenética comparativa de Astyanax bockmanni
(Pisces, Characidae)
Silva, DMZA¹; Neto, MF¹; Oliveira, C¹; Foresti, F¹
¹Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, Astyanax bockmanni, peixes.
Introdução: Os membros do gênero Astyanax são semelhantes na morfologia, no entanto apresentam amplas
variações cariotípicas, podendo variar de 2n=36 a 2n=50, sendo que para A. bockmanni o número diplóide basal
é de 2n=50. Esta espécie foi recentemente descrita e há poucos dados citogenéticos disponíveis na literatura, o
que demonstra uma grande necessidade de estudos citogenéticos para melhor entender a origem e evolução da
espécie. Métodos: O presente trabalho analisou indivíduos do ribeirão Água da Madalena, bacia do Rio Pardo e do
rio Canta Galo, bacia do rio Corumbataí, por meio de técnicas de citogenética básica, com estimulação mitótica,
coloração convencional com Giemsa, identificação dos padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva
(Bandamento C), detecção das regiões organizadoras de nucléolos através da impregnação com nitrato de Prata
(Ag-RONs), coloração com o fluorocromo GC específico cromomicina A3 (CMA3) e hibridação in situ fluorescente
(FISH) com sonda de rDNA 5S. Resultados: O cariótipo dos exemplares analisados foi organizado em 2n=50
cromossomos, diferenciados em 10M+12SM+12ST+16A em ambas as localidades. Nos indivíduos da bacia do
Pardo a heterocromatina está localizada terminalmente nos pares 18 e 19 de cromossomos A, apresentando um
heteromorfismo em um dos homólogos do par 19, além de marcações centroméricas em todos os pares do cariótipo,
resultado semelhante ao encontrado no rio Corumbataí. As RONs, múltiplas, mostraram analogia com a CMA3 em
quase todos os indivíduos, sendo que não ocorreram marcações em um ou dois cromossomos positivos para CMA3,
para indivíduos da bacia do Pardo. Já para os indivíduos da bacia do Corumbataí, as RONs se apresentaram no braço
curto de um par e longo de outro de cromossomos ST. A análise com CMA3 revelou marcações conspíscuas nos
quatro cromossomos portadores das Ag-RONs, e além das marcas concordantes com as Ag-RONs, este fluorocromo
marcou mais seis cromossomos em posições terminais. Os sítios contendo rDNA 5S foram localizados nos pares
3 (M) e 18 (A) nas duas populações. Discussão: Os dados deste trabalho mostram que a evolução cariotípica em A.
bockmanni até o presente momento não conduziu a grandes divergências. O sítio de rDNA 5S mostra-se conservado
no gênero Astyanax, corroborando os resutados do presente trabalho. As diferenças encontradas podem ser
decorrentes de um isolamento geográfico entre as populações, que em diferentes ambientes seguem cada uma seu
próprio curso evolutivo, porém devido ao pouco tempo de surgimento da espécie, que foi descrita recentemente, as
diferenças cariotípicas ainda são pouco expressivas. Estudos empregando FISH com sonda de rDNA 18S, além de
outras análises moleculares estão sendo realizados para melhor compreensão da evolução do cariótipo da espécie.
Apoio Financeiro: Capes, CNPq, Fapesp.
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Diversidade genética em populações de Salminus
brasiliensis do rio Mogi-Guaçu (Pirassununga, SP)
utilizando locos microssatélites heterólogos de
espécies relacionadas
Rossini, BC; Galetti Jr, PM; Freitas, PD
Laboratório de Biodiversidade Molecular e Citogenética, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Dourado, microssatélites, genética da conservação, estruturação de populações, locos heterólogos.
O dourado (Salminus brasiliensis Cuvier, 1816) é um excelente peixe migrador, possuindo grande porte e larga
distribuição na América do Sul, com presença nas bacias dos rios Paraná, Uruguai, Prata e Paraguai (Brasil,
Argentina, Uruguai e Paraguai), na drenagem da Laguna dos Patos (RS, Brasil) e na porção superior do sistema
do alto Rio Madeira (Bolívia e Peru). Este peixe é muito apreciado na pesca esportiva e gastronomia. Porém,
com a crescente degradação dos habitats, a sobrepesca e o represamento de rios para fins de geração de energia
elétrica, a fauna aquícola dessas áreas vem sofrendo grandes impactos, sendo necessários estudos que visem sua
conservação. Dentro desta abordagem, marcadores moleculares microssatélites vêm sendo utilizados para avaliar
a estrutura genética de populações naturais com o objetivo de subsidiar programas de manejo e conservação.
Apesar dos microssatélites serem marcadores extremamente úteis, para muitos organismos incluindo o dourado,
não há locos espécie-específicos descritos. Desta forma, no presente trabalho, foram utilizados locos heterólogos,
descritos para três espécies relacionadas à S. brasiliensis, em oito populações deste peixe (sendo três residentes e
cinco migradoras). Amostras de 201 animais foram coletadas no rio Mogi-Guaçú (região da Cachoeira de Emas,
município de Pirassununga, SP) durante os anos de 2007 a 2009, incluindo os períodos reprodutivos (Novembro
a Fevereiro) e não reprodutivo (Março a Outubro). O DNA foi extraído segundo protocolo de Sambrook et
al. (1989), utilizando fenol:clorofórmio:álcool isoamílico. Foram testados 31 locos microssatélites, sendo 18
descritos para Salminus franciscanus (dados não publicados), seis para Brycon hilarii (Sanches & Galetti, 2006)
e sete para Brycon opalinus (Barroso et al. 2003). Deste total, apenas dez locos (nove de S. franciscanus e um de
B. opalinus) demonstraram excelente padrão de amplificação e alto polimorfismo, sendo utilizados nas análises
populacionais de S. brasiliensis. As análises estatísticas foram feitas nos softwares Genepop 4.0.10 (EHW, níveis
de heterozigosidade, desequilíbrio de ligação) e GenAlEx 6 (distância e identidade genética, alelos privados, Fst).
O número de alelos variou de oito (SFRA18) a 48 (SFRA02), considerando as oito populações conjuntamente.
Os níveis heterozigosidade média observada variaram de 0,66 (População Julho 2008) a 0,77 (População Janeiro
2009), sendo que sete populações apresentaram-se fora do EHW para pelos um loco. Os valores de distância
e identidade genética de Nei variaram, respectivamente, de 0,08 a 0,29 e 0,75 a 0,92. Os dados obtidos até o
momento demonstram que estas populações apresentam alta variabilidade genética intra-populacional e baixa
diversidade gênica entre as populações aqui analisadas. Estes resultados podem auxiliar a entender melhor
o comportamento migratório e reprodutivo destes animais na região de Cachoeira de Emas, contribuindo
para proposições de ações de manejo relacionadas à pesca e conservação desta importante espécie de peixe.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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202
DNA Barcode: uma nova ferramenta para o estudo da
biodiversidade de peixes
Pereira, LHG1; Maia, GMG1; Foresti, F1; Oliveira, C1
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes – Departamento de Morfologia - Instituto de Biociências – UNESP – Botucatu
[email protected]
1
Palavras-chave: DNA Barcode, COI, Biodiversidade, Alto Rio Paraná, Paraíba do Sul.
A biodiversidade global é estimada em aproximadamente 10 milhões de espécies, das quais apenas 1,8 milhão são
oficialmente reconhecidas. O conhecimento dessa diversidade, bem como a capacidade de nomear as espécies
é o ponto de partida para todos os estudos básicos ou aplicados relacionados às ciências da vida. Diante desse
desafio foi proposta, em 2003, a técnica de DNA Barcode cujo objetivo principal é a criação de um sistema rápido,
eficaz e padronizado de identificação de espécies. Esta técnica baseia-se no seqüenciamento de um fragmento
de aproximadamente 650 pb do gene mitocondrial Citocromo Oxidase I (COI) que funciona como um código
de barras genético na identificação das espécies. Muitas vantagens são apontadas no uso do DNA Barcode: uso
de fragmentos dos espécimes; identificação a partir de qualquer estágio de vida do organismo; identificação de
espécies similares; identificação rápida e sem ambigüidades. A obtenção dessas sequências abre perspectivas
para outros estudos como a identificação de possíveis novas espécies, estudos de teias alimentares, estudos
comparativos, biologia forense, dentre outros. Diante deste cenário o presente trabalho teve como objetivos
analisar o uso do DNA Barcode na identificação das espécies de peixes das bacias hidrográficas do Alto Rio
Paraná e Paraíba do Sul e verificar a eficácia do método na identificação de possíveis novas espécies e no estudo
comparativo entre as duas bacias hidrográficas. Foram obtidas as sequências Barcode de 978 espécimes (200
espécies) da bacia do Alto Rio Paraná e de 295 espécimes (58 espécies) da bacia do Rio Paraíba do Sul, as quais
discriminaram corretamente 90% e 100% das espécies analisadas, respectivamente (divergências médias intraespecíficas de 1,9% e 0,1% e interespecíficas de 6,5% e 10,4%, respectivamente). Considerando-se as duas bacias,
23 espécies apresentaram divergência genética pronunciada entre indivíduos assinalados como de mesma espécie
(>4%), sinalizando a existência de diversas possíveis novas espécies. 17 espécies foram comuns às duas bacias
hidrográficas. Nos estudos comparativos, oito dessas espécies apresentaram profunda divergência genética
entre as áreas estudadas, indicando se tratar de espécies diferentes (possivelmente novas). As outras nove
espécies não apresentaram divergências genéticas significativas entre as duas bacias confirmando pertencerem
à mesma espécie. Este fato pode evidenciar uma possível ligação pretérita entre as duas bacias analisadas ou
ainda pode sinalizar uma possível introdução de espécies. Os resultados obtidos mostraram a eficácia do método
de DNA Barcode nas diferentes abordagens realizadas. Desta forma esta ferramenta mostra-se de altamente
importante para o estudo da biodiversidade, contribuindo para seu conhecimento, proteção e manutenção.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq
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203
Filogeografia do gênero Fluviphylaxs (Cyprinodontiformes),
os menores peixes da Amazônia: Influência de áreas
alagáveis na distribuição das espécies
Souza, ER1; Farias, IP1; Hrbek, T1,2
Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia, Universidade Federal do Amazonas
Departamento de Biologia, Universidade de Puerto Rico, Río Piedras, San Juan, Puerto Rico
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fluviphylax, Filogeografia, bacia Amazônica.
A dinâmica de formação de rios é um dos fatores determinantes da distribuição e da evolução de organismos
aquáticos, e está intimamente relacionada à grande diversidade da iciofauna da região Neotropical. Nesse
contexto, análises filogeográficas dos organismos aquáticos da bacia Amazônica refletem os processos biológicos e
geológicos dessa região. Dentre as espécies amazônicas encontram-se os peixes do gênero Fluviphylax, os menores
vertebrados da América do Sul e endêmicos das bacias do Amazonas e do Orinoco e drenagens do Atlântico,
distribuídos desde o oeste da bacia amazônica até sua foz a leste. Esse gênero inclui peixes de hábito pelágico,
não migradores, e que habitam ambientes lênticos de áreas abertas de rios, igarapés ou lagos, afastados dos
canais principais. Com base em análises morfológicas são reconhecidas cinco espécies de Fluviphylax: F. simplex,
F. zonatus, F. obscurum, F. palikur e F. pygmaeus. O fato dessas espécies apresentarem uma ampla distribuição
na bacia amazônica associada ao comportamento não migrador, e não serem alvo de exploração antropogênica,
fazem delas um bom modelo para estudos de processos biológicos e geológicos. Assim sendo, esse trabalho teve
como objetivo avaliar as hipóteses filogenéticas e a filogeografia do gênero Fluviphylax para entender os processos
que influenciaram os padrões de distribuição e diferenciação de suas espécies. A amostragem abrangeu alto e
médio rio Negro, Purus, Solimões, Amazonas, Trombetas, Madeira, Ilha de Marajó e ao longo dos riachos e rios do
estado do Amapá. Para análise filogenética foram seqüenciados fragmentos de 521 pb do gene citocromo oxidase I
de 146 indivíduos e 379 pb da região controle de 154 indivíduos, ambos para as cinco espécies. Após alinhamento e
edição foi reconstruída a filogenia baseada no método de Máxima Verossimilhança para ambas as regiões gênicas
de interesse, gerados os clados hierarquizados (NCA -Nested Clade Analysis) e parâmetros populacionais (Arlequin
3.1). Os resultados evidenciaram a existência de seis linhagens monofiléticas distribuídas em distintas regiões
geográficas. F. obscurum sensu lato foi separada em dois grupos monofiléticos distintos com forte estruturação
populacional (ΦST = 0,9154). AMOVA e distância par-a-par evidenciaram alto fluxo gênico entre as populações de F.
simplex, devido à influência de áreas inundáveis como a várzea. Espécimes da Venezuela e alto rio Negro, separadas
pelo canal do Casiquiare, representam indivíduos da mesma linhagem (Fluviphylax sp.), que ainda não sofrerem
especiação. Os resultados sugerem que o Cassiquiara, recente corredor geológico, funcione como fluxo de captação
entre o Orinoco e o rio Negro,e que o sistema de inundação, disponível de forma permanente ou sazonal na região
amazônica pelos ecossistemas de várzea e igapó, permite a interconexão biológica das espécies de Fluviphylax.
Apoio financeiro: CNPq, IEB/BECA, American killifish Association
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Mapeamento dos genes ribossomais 18s e 5s por
hibridação in situ em duas espécies de peixes da
subfamília Callichthyinae (Callichthyidae) da Bacia do
rio de Contas, Bahia
Almeida, JS1; Diniz, D1; Affonso, PRAM2; Carneiro, PLS2; Dias, AL1
¹Laboratório de Citogenética de Peixes, Universidade Estadual de Londrina. Londrina-PR
2
Laboratório de Citogenética, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia. Jequié- Bahia
[email protected]
Palavras-chave: Callichthys callichthys, Siluriformes, Ag-RON, Hibridação in situ, rDNA.
A família Callichthyidae pertence à ordem Siluriformes e é composta por 194 espécies e oito gêneros distribuídos
em duas subfamílias: Corydoradinae e Callichthyinae. Esse grupo de peixes apresenta ampla distribuição,
ocorrendo nos rios das principais bacias hidrográficas da América do Sul. A localização cromossômica de genes
ou sequências de DNA específicos constitui uma importante ferramenta para o esclarecimento de questões
relacionadas à diversificação cariotípica nos organismos. Em peixes Neotropicais, trabalhos com a análise e
localização dos genes de DNAr 18S e 5S e o conhecimento sobre a distribuição cromossômica desses genes ainda
é restrito. O presente trabalho objetivou evidenciar a localização física das regiões organizadoras de nucléolos
(Ag-RONs) e dos genes ribossomais 18S e 5S, por meio de hibridação in situ em cromossomos de duas espécies
da subfamília Callichthyinae da bacia do Rio de Contas. Foram coletados 17 exemplares de Callichthys callichthys
e 8 de Hoplosternum littorale numa lagoa temporária na fazenda Santo Antônio, próxima à cidade de Jitaúna/BA,
próxima ao rio de Contas. Após obtenção de cromossomos mitóticos, realizou-se técnicas de impregnação por
nitrato de prata (Ag-RON) e Double-FISH usando sonas de DNAr 18S e 5S marcadas com FITC e digoxigenina,
respectivamente. Em C. callichthys, as RONs, apresentaram-se múltiplas e polimórficas onde foram observados
de 1 a 2 cromossomos impregnados por prata em cada indivíduo, com freqüência considerável de marcações
nos acrocêntricos, totalizando 6 diferentes fenótipos de NOR. Em H. littorale, as RONs são simples, localizadas
no braço curto de um par de acrocêntricos de tamanho médio. A utilização de sondas de detecção ribossômica
dos sítios de DNAr 18S em C. callichthys mostrou grande variação, revelando de marcações na região terminal
dos braços curtos de 5 a 7 cromossomos, enquanto H. littoralle evidenciou constantemente, 2 cromossomos
acrocêntricos marcados na posição terminal do braço curto. Já o DNAr 5S foi observado em diferentes
cromossomos em C. callichthys, variando em número (8 a 12 marcações) e com sinais na posição intersticial e/ou
terminal do braço curto. Em H. littorale, observou-se 4 acrocêntricos com sítios de DNA ribossômico 5S na posição
terminal do braço curto. Os dados aqui apresentados fornecem informações essenciais para a compreensão
da estrutura e organização de genes ou seqüências específicas no genoma das duas espécies estudadas.
Apoio: FAPESB, UESB, CNPq, CAPES
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205
Adaptação de protocolo para extração, amplificação
e uso da técnica de RAPD e ISSR para estudos
comparativos em peixes do gênero Astyanax
(Characidae) do estado da Bahia
Ribeiro, MS¹; Brandão, JHSG¹; Affonso, PRAM¹; Waldschmidt, AM¹
Laboratório de Genética Molecular - Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié – BA
[email protected]
1
Palavras-chave: Astyanax, Protocolos, Extração de DNA, RAPD, ISSR
Considerado um gênero Incertae sedis devido às incertezas sistemáticas e filogenéticas, Astyanax se caracteriza
por espécies com definições taxonômicas pouco detalhadas e pela formação de vários complexos de espécies.
Análises citogenéticas e moleculares constituem ferramentas importantes para a elucidação da estrutura genética
de populações e identificação de espécies crípticas. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo testar
e padronizar protocolos para extração de DNA, amplificação e utilização da técnica RAPD e ISSR em estudos
comparativos no gênero Astyanax coletados no estado da Bahia, nas quais informações moleculares são incipientes.
As amostras de DNA de Astyanax sp., A. aff, fasciatus e A. aff. bimaculatus coletadas na bacia do Rio de Contas foram
obtidas pelo aproveitamento do tecido muscular e hepático fixados em etanol absoluto. O método de extração de
DNA foi padronizado a partir de dois protocolos voltados para insetos e peixes com algumas modificações. As
diferenças entre os dois protocolos envolvem a composição do o tampão de extração (CTAB e SDS, respectivamente)
e a temperatura e tempo de digestão (65°C por 30 minutos e 50°C por três horas, respectivamente). Pode-se observar
que houve diferenças na qualidade do DNA para os dois protocolos utilizados. No protocolo descrito para insetos,
a extração foi mais eficiente com amostras de fígado, enquanto que o DNA de músculo foi degradado. No segundo
protocolo, o músculo apresentou um DNA de melhor qualidade que o fígado. A partir da extração, foram testados
quatro primers para RAPD e ISSR, respectivamente, onde pode-se notar que não houve amplificação para os primers
RAPD testados, enquanto que bandas polimórficas foram observadas no teste de primers ISSR, demonstrando a
eficácia desses marcadores. No caso da técnica de ISSR, os primers testados serão utilizados para avaliar a extensão
do polimorfismo, bem como a inclusão de mais primers para analisar a composição genética das espécies estudadas.
Apoio financeiro: FAPESB, UESB
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Incongruência entre marcações de Ag-NORs e FISH
(rDNA 18S) e variação inter-sexual na frequência de
cromossomos Bs EM Corydoras aeneus (Teleostei:
Callichthyidae)
Pacheco, ACS1; Silva, EL1; Parise-Maltempi, PP1; Alves, AL1
Laboratório de Genética de Peixes, Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Julio de
Mesquita Filho”, Rio Claro, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Corydoras aeneus, Cromossomo B, Citogenética, Freqüência e FISH.
O gênero Corydoras, o maior entre os Siluriformes, é pertencente a família Callichthyidae, constituído de 177
espécies validas e amplamente distribuído na porção cis-andina da América do Sul. Como característica marcante
possui duas séries longitudinais de placas dérmicas revestindo quase todo o corpo. Estudos citogenéticos em
Callichthyidae mostram muitos rearranjos cromossômicos, incluindo eventos de poliploidia na sua história
evolutiva, particularmente no gênero Corydoras, no qual a variação do número diplóide é de 2n=40 a 2n=134
cromossomos. A ausência de informação sobre a freqüência de cromossomos Bs no grupo motivou o presente
trabalho com a espécie Corydoras aeneus. Uma população proveniente da bacia do rio Tietê no Ribeirão Claro
(sub-bacia do rio Corumbataí - Rio Claro, SP) foi amostrada totalizando 20 indivíduos (12 Machos e 8 Fêmeas)
e 30 metáfases por indivíduo foram analisadas citogeneticamente. Foram realizadas as técnicas de impregnação
pela prata (Ag-NOR)(Ag NOR não é considerada bandamento), bandamento C e hibridação in situ cromossômica
(FISH) com sondas de genes ribossomais de rDNA 18S. O número diplóide modal observado foi de 2n=60
(26m+26sm+8st), com a ocorrência variável de 1 ou 2 cromossomos Bs em machos e 1 cromossomo B nas fêmeas,
ambos acrocêntricos. Em machos a freqüência de cromossomos Bs foi de aproximadamente 2n=60 20%, 2n=61
32% e 2n=62 48%, já em fêmeas aproximadamente 2n=60 92% e 2n=61 8%. O bandamento C mostrou que os
cromossomos Bs são totalmente heterocromáticos. As Ag-NORs foram localizadas em 4 pares de cromossomos,
no entanto o FISH rDNA 18S marcou somente dois cromossomos subtelocêntricos. Este resultado confirma
a idéia de que a técnica de impregnação pela prata (Ag-NOR) nem sempre é confiável para se determinar o
número de cromossomos envolvidos com a organização nucleolar. Em relação a variação na freqüência de
cromossomos Bs, a ocorrência de 2 cromossomos B está diretamente ligada ao sexo masculino, pois não foi
encontrada nenhuma fêmea amostrada com a ocorrência de 2 cromossomos Bs. A baixa freqüência de Bs em
fêmeas sugere que este evento possa ser esporádico neste sexo, diferente dos machos no quais este cromossomo
supranumerário parece estar fixado mostrando uma freqüência maior de 2 Bs do que o próprio número modal
de 2n=60. Novos estudos serão realizados para compreender a dinâmica do cromossomo B na população.
Apoio financeiro: FAPESP (proc. n. 07/58641-0)
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Filogeografia de Hypostomus strigaticeps (Siluriformes:
Loricariidae) revela novos padrões de distribuição da
espécie na bacia do Alto Rio Paraná
Borba, RS1; Marreta, ME1; Zawadzki, CH2; Oliveira, C3; Parise-Maltempi, PP1; Alves, AL1
¹Departamento de Biologia, Laboratório de Genética de Peixes, UNESP, Rio Claro, SP
2
Departamento de Biologia, NUPELIA, UEM, Maringá, PR
3
Departamento de Morfologia, UNESP, Botucatu, SP
[email protected]
Palavras-chave: Filogeografia, Filogenia, DNA mitocondrial, Alto Paraná e Hypostomus
O gênero Hypostomus está entre os mais complexos da ictiofuana Neotropical do ponto de vista taxonômico,
devido às dificuldades na identificação de caracteres diagnósticos para muitas de suas 122 espécies. Entre estas,
H. strigaticeps está amplamente distribuída na bacia do Alto rio Paraná, embora seja descrita originalmente como
restrita à bacia do rio Tietê. Buscando identificar marcadores populacionais que indiquem supostos mecanismos
de isolamento entre as populações e mesmo evidências de um possível complexo de espécies “H. strigaticeps”, o
presente trabalho teve como objetivo a realização de análises filogenéticas e filogeográficas em populações de
H. strigaticeps, com base em sequências de DNA mitocondrial do gene ATPase 8/6. No total de 18 exemplares
provenientes de seis populações de três sub-bacias: rio Mogi-Guaçu (1), rio Paranapanema (3) e rio Tietê (2), tiveram
DNA extraído e o gene ATPase 8/6 completamente amplificado (840 pares de base) e sequenciado. As sequências
obtidas foram alinhadas com o programa Bioedit, as análises filogenéticas foram realizadas no programa MEGA
5.0 através do método de Neighbor-Joining e Máxima Parcimônia, com 1000 réplicas de boostrap. Para as análises
filogeográficas as sequências foram analisadas no programa TCS. As análises filogenéticas mostraram que a espécie
forma uma unidade monofilética composta por duas linhagens: “TG” com representantes das populações dos rios
Tietê e Mogi-Guaçu, e “PC” com representantes dos rios Paranapanema e reservatório de Chavantes. A divergência
genética da linhagem “TG” é de 0,1% e da linhagem “PC” é de 0,2%, enquanto a divergência genética entre as duas
linhagens é de cerca de 1%, com esta divergência não é possível separar os indivíduos em nível de espécie. Na análise
filogeográfica observou-se a existência de seis haplótipos (A-F), sendo o haplótipo A considerado ancestral para as
populações analisadas. Apenas os representantes do reservatório de Chavantes (rio Paranapanema) possuem este
haplótipo ancestral, enquanto o haplótipo B possui a maior freqüência (27,77%). Dos seis haplótipos encontrados 4
(A, B, C e D) estão na bacia do rio Paranapanema, 2 (E e F) estão na bacia do rio Tietê e 1 (F) na bacia do rio MogiGuaçu e sendo este haplótipo F o mais distribuído, encontrado nas bacias dos rios Tietê e Mogi-Guaçu. Estes dados,
embora preliminares, sugeriram que a origem de H. strigaticeps tenha ocorrido na bacia do rio Paranapanema, com
posterior expansão para a bacia do rio Tietê, e a partir desta bacia ocorreu, recentemente, a colonização da bacia do
rio Mogi-Guaçu. Os resultados não corroboram a hipótese de existência de um complexo de espécies “H. strigaticeps”,
mas são conclusivos para determinar que a distribuição da espécie não está restrita apenas à bacia do rio Tietê.
Apoio financeiro: FAPESP (proc. n. 2007/58641-0)
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Estudo citogenético comparativo de NORs de duas
populações de peixe da espécie Astyanax altiparanae, do
Córrego dos Caetano e do Rio Araguari (Uberlândia-MG)
Oliveira, DM1; Oliveira-Júnior, RJ2; Morelli, S3; Alcalá, AS4
Instituto de Genética e Bioquímica; Universidade Federal de Uberlândia; Av. Amazonas, Bloco 4C, sala 26, Uberlândia CEP 38400-902;
Acadêmica do Curso de Ciências Biológicas e bolsista CNPq. [email protected]
2
Instituto de Genética e Bioquímica; Universidade Federal de Uberlândia; Doutorando em Genética e Bioquímica. robson_junr@yahoo.
com.br
3
Instituto de Genética e Bioquímica; Universidade Federal de Uberlândia; Orientadora. [email protected].
4
Graduação em Ciências Biológicas; Universidade Federal de Uberlândia; aline.alcala.s@hotmail
1
Palavras-chave: Characidae; Citogenética; NORs; Astyanax; Cromossomos.
Os peixes formam um grupo cariotipicamente diversificado, no qual o número diplóide pode variar de 12 a 250
cromossomos. A família Characidae é o grupo mais complexo dos Characiformes, integrante desta família, o gênero
Astyanax tem sido objeto de vários estudos citogenéticos, os quais mostraram uma grande variabilidade cariotípica
dentro do grupo, com um número diplóide variando de 2n=36 a 2n=50. Estudos citogenéticos nestas espécies
possibilitaram uma grande evolução no conhecimento taxonômico e das particularidades e semelhanças entre as várias
espécies. Com o objetivo de caracterizar citogeneticamente as NORs das duas populações de Astyanax altiparanae,
do Córrego dos Caetano e do Rio Araguari, foram realizadas técnicas de detecção das NORs pela impregnação com
nitrato de Prata-(Ag-NORs). Ambas as populações apresentaram um número diplóide de 50 cromossomos, porém
ocorreram variações quanto à fórmula cariotípica das mesmas. Quando submetida à coloração com nitrato de prata
a população do Córrego dos Caetano apresentou um padrão de NOR múltipla, sendo a marcação observada, mais
freqüentemente, na região terminal de três cromossomos submetacêntricos. A população do rio Araguari apresentou
um padrão de NOR simples, sendo a marcação observada em dois cromossomos submetacêntricos do mesmo par.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPEMIG e UFU
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Caracterização citogenética dos Gobiidae
Coryphopterus glaucofraenum e Gobioides
broussonnetii (Percifromes)
Lima Filho, PA¹; Molina, WF¹
¹Laboratório de Genética de Recursos Marinhos, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte
[email protected]
Palavras-chave: Gobiidae, Caracterização Citogenética, Diversificação Cariotípica.
A família Gobiidae é particularmente bem especiosa, composta por indivíduos pequenos, especialmente
marinhos e encontra-se presente em todos mares tropicais e subtropicais. É um dos táxons mais diversificados
da ordem Perciformes, sendo constituída por mais de 1.800 espécies. São bem representados nos ambientes
estuarinos e dulcícolas e constituem um elemento dominante na fauna de pequenos peixes de habitats
bentônicos. As espécies Coryphopterus glaucofraenum e Gobioides broussonnetii, habitam respectivamente
áreas recifais e estuarinas, ambos distribuem-se do sudeste dos EUA ao sul do Brasil e apresentam uma biologia
pouco conhecida. A caracterização citogenética de C. glaucofraenum e G. broussonnetii, provenientes do litoral
do estado do Rio Grande do Norte, NE-Brasil, foi realizada por meio de coloração convencional com Giemsa,
bandamento C e identificação dos cístrons ribossomais pela técnica de Ag-RONs. O Cariótipo da espécie C.
glaucofraenum apresentou 2n=40, cromossomos consistindo de 2st+38a (NF=42). Os sítios Ag-RONs estão
localizados em posição telomérica no braço curto do primeiro par cromossômico submetacêntrico. Alguns
pares cromossômicos apresentaram segmentos heterocromáticos localizados em regiões centroméricas e
teloméricas. A espécie G. broussonnetii apresentou cariótipo 2n=46, com todos pares cromossômicos acrocêntricos
(NF=46). Os sítios Ag-RONs estão localizados em posição telomérica no primeiro par cromossômico. Segmentos
heterocromáticos estão presentes na maioria dos pares cromossômicos, localizados em regiões centroméricas
e teloméricas. A família Gobiidae é um dos táxons mais diversificados e pouco estudados citogeneticamente,
dentre os Perciformes, uma vez que especiação é freqüentemente promovida por rearranjos cromossômicos,
à análise da organização da cromatina nos cromossomos de Gobídeos torna-se extremante importante para
melhor compreensão dos processos carioevolutivos envolvidos na diversificação cariotípica deste táxon.
Apoio financeiro: CAPES
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Análise citogenética de três espécies simpátricas
do gênero Astyanax (Characiformes, Characidae) da
região de Rondonópolis, Mato Grosso
Oliveira, ML1; Balcaçar, PA1; Becker, QMC1; Silva, AM1; Castro, RJ1; Vizzotto, PC1
Departamento de Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Naturais, Campus Universitário de Rondonópolis, Universidade
Federal do Mato Grosso
[email protected]
1
Palavras-chave: Peixes Neotropicais, Citogenética, Evolução, Characiformes, Astyanax
O estado de Mato Grosso atrai a atenção devido à riqueza de sua ictiofauna e dinâmica de seus ecossistemas.
No entanto, as informações disponíveis sobre a citogenética básica de peixes de pequeno porte deste estado são
escassas se comparadas às dos estados de São Paulo, Paraná e Minas Gerais. O presente estudo destaca o gênero
Astyanax, que abrange cerca de 100 espécies nominais e se distribui amplamente em toda região Neotropical, em
seus diversos ambientes. Inclui peixes de até 200 mm, popularmente conhecidos como lambaris, sendo que, o
atual entendimento evolutivo deste gênero permanece pouco satisfatório. O objetivo deste trabalho é caracterizar
citogenéticamente três espécies simpátricas do gênero Astyanax da região de Rondonópolis, Mato Grosso, através
do emprego da técnica convencional de coloração dos cromossomos mitóticos com Giemsa. Foram analisados
citogeneticamente 03 exemplares de Astyanax abramis, 7 exemplares de Astyanax lineatus e 15 exemplares de
Astyanax sp, todos coletados no Córrego do Esparramo (Bacia do Alto Rio Paraguai), localizado na reserva do
18º Grupo de Artilharia e Campanha, no município de Rondonópolis, região sul de Mato Grosso. As três espécies
analisadas apresentaram o mesmo número cromossômico, 2n=50 cromossomos, no entanto, as fórmulas
cariotípicas se mostraram diversificadas. Astyanax abramis apresentou 24M+20SM+6ST/A e NF=94, Astyanax
lineatus apresentou 12M+18SM+20ST/A e NF=80, e Astyanax sp apresentou 24M+26SM e NF=100. Os resultados
observados quanto ao número de cromossomos são similares àqueles descritos na literatura, para espécies coletadas
em outros rios da Bacia do Alto Rio Paraguai. A marcante variação da fórmula cromossômica e número fundamental
com conservação do número diplóide, entre as espécies analisadas, indicam que rearranjos cromossômicos foram
importantes na história evolutiva do grupo. Tais dados, aliados a caracterização citogenética de uma espécie que
até o momento não apresenta descrição taxonômica, reforçam a importância da realização de pesquisas básicas
nesta região e abrem perspectivas para estudos mais aprofundados, inclusive em outras áreas de conhecimento.
Apoio financeiro: FINEP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Estudo citogenético em Loricaria cataphracta
(Loricariidae, Loricariinae) do Córrego do Onça,
afluente do Rio Taquari, município de Coxim, MS
Gonzalez, MI1; Errero-Porto, F2; Vieira, MMR1; Martins-Santos, IC2
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, UEMS - Unidade Universitária de Coxim, MS
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá - UEM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Loricaria cataphracta, Loricariinae, Banda C, NOR, Citogenética.
A família Loricariidae compõe uma das maiores famílias de peixes do mundo, com aproximadamente 690 espécies
distribuídas em cerca de 70 gêneros na região Neotropical. Embora componham uma das maiores famílias de
peixes do mundo, os estudos citogenéticos ainda são escassos, sendo que para subfamília Loricariinae, apenas
exemplares dos gêneros Harttia, Loricaria, Loricariichthys e Rineloricaria foram analisados. Estes estudos
revelaram ampla variabilidade cariotípica com número cromossômico variando de 2n=36 em Rineloricaria
latirostris a 2n=74 para Sturisoma cf. nigrirostrum. Dentro da subfamília Loricariinae, o gênero Loricaria apresenta
grande complexidade taxonômica e apenas cinco espécies do gênero foram estudadas citogenéticamente,
observando-se também grande variabilidade cariotípica entre as espécies estudadas (2n = 48 em Loricaria
parva a 2n= 66 cromossomos para Loricaria sp). Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo caracterizar
citogeneticamente exemplares de Loricaria cataphracta através da coloração usual por Giemsa e de técnicas
de Ag-NOR e bandamento C. Os espécimes foram coletados no Córrego do Onça, afluente do Rio Taquari,
município de Coxim, MS. Todos os exemplares analisados apresentaram 2n=64 cromossomos, fórmula cariotípica
10m+10sm+8st+36a e NF=92. A técnica de Ag-NOR para detecção das Regiões Organizadora de Nucléolo
evidenciou sistema de NOR simples, com marcação intersticial na região terminal do braço longo do primeiro par
de acrocêntricos. O padrão de heterocromatina constitutiva revelado pela técnica de bandamento C, evidenciou
marcações principalmente nas regiões pericentroméricas da maioria dos pares cromossômicos e a região da
NOR mostrou-se banda C positiva. O presente trabalho vem colaborar com a ampliação de estudos dentro da
subfamília Loricariinae, especificamente no gênero Loricaria, para o qual estudos citogenéticos são escassos, bem
como auxiliar na identificação de espécies e ampliar as informações ainda escassas sobre a ictiologia pantaneira.
Agência financiadora: CAPES
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Estudos citogenéticos em duas populações de
Hypostomus ancistroides (Siluriformes, Loricariidae,
Hypostominae) da bacia do rio Iguatemi, MS, Brasil
Damasio, JF1; Fernandes, CA1
Laboratório de Citogenética e Mutagênese da Universidade Estadual do Mato Grosso do Sul, Unidade Universitária de Mundo Novo
[email protected]
1
Palavras-chave: Cromossomos, Heterocromatina constitutiva, Região organizadora do nucléolo, Evolução cariotípica, Peixes.
O gênero Hypostomus é um dos mais especiosos e largamente distribuídos gêneros de peixes na América do Sul,
compreendendo cerca de mais de cem espécies. Este gênero tem apresentado uma ampla variação cariotípica,
com diferentes números diplóides variando entre 2n=52 cromossomos (Hypostomus emarginatus) à 2n=80
cromossomos (Hypostomus sp. 2). Diante disso, o presente estudo teve como objetivo avaliar citogeneticamente
duas populações de Hypostomus ancistroides pertencentes à bacia do rio Iguatemi, Mato Grosso do Sul, de modo
a contribuir com dados que permitam um melhor entendimento das relações evolutivas do gênero dentro da
família Loricariidae. Foram analisados quatro espécimes do córrego Dourado e um espécime do córrego Água
Boa. Os cromossomos foram obtidos através da preparação de células renais após tratamento de colchicina e
corados pela coloração convencional de Giemsa. O cariótipo foi organizado em um numero diplóide de 2n=68
cromossomos para as duas populações, distribuídos em 10m+22sm+16st+20a para a população do córrego
Dourado e 14m+24sm+10st+20a para a população do córrego Água Boa e o número fundamental de braços foi de
116 para as duas populações. O nitrato de prata foi utilizado para detectar as regiões organizadoras de nucléolos,
sendo detectada no braço curto de quatro cromossomos subtelocêntricos para a população do córrego Água Boa e
detectada nos braços curtos de dois cromossomos submetacêntricos e de três cromossomos subtelocêntricos para
a população do córrego Dourado, revelando NORs múltiplas para ambas as populações. A técnica de banda C foi
utilizada para detectar as regiões de heterocromatina constitutiva, sendo evidenciados blocos heterocromáticos
em regiões centroméricas e teloméricas em poucos cromossomos nas duas populações. Além disso, a população
do córrego Água Boa apresentou um grande bloco heterocromático no braço longo de um par de cromossomos
acrocêntricos, com heteromorfismo de tamanho, o que pode ter surgido a partir de um crossing-over desigual
entre os homólogos. Portanto, apesar das duas populações de Hypostomus ancistroides apresentarem o mesmo
número diplóide de 2n=68 cromossomos, elas defeririam na fórmula cariotípica, indicando que rearranjos
cromossômicos, como inversões pericêntricas, possam ter ocorrido durante a diversificação destas populações.
Apoio financeiro: FUNDECT
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Análise de fluorocromos base- específicos (CMA3 e
DAPI-) em Cichlasoma sanctifranciscensis (Perciformes,
Cichlidae) em Bacias hidrográficas da Bahia
Ferreira-Santos, M1; Sampaio-Santos, C1; Migues, VH1; Almeida, JS2; Medrado, AS3; Affonso, PRAM¹;
Carneiro, PLS¹
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia. Jequié - BA
Departamento de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de
Londrina, Londrina - PR
3
Departamento de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa
Cruz, Ilhéus - BA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Flurocromo, Cichlasoma, Ciclídeos, heterocromatina, heteromorfismo.
O gênero Cichlasoma é considerado um dos táxons mais amplos entre os peixes da família Cichlidae. Isso
se deve principalmente por não haver um consenso entre taxonomistas a respeito dos gêneros que devem ser
reconhecidos nessa família e pela inexistência de um sistema global de atribuição das espécies com gêneros
monofiléticos. O presente estudo foi realizado com exemplares coletados nos Rios Itapicuru (Bacia do Rio
Itapicuru, Caldas do Jorro-BA) e Criciúma (Bacia do Rio de Contas, Jequié-BA). O objetivo é incrementar os
dados citogenéticos da espécie Cichlasoma sanctifrasciscencis (Perciformes, Cichlidae) a partir da coloração com
fluorocromos base- específicos (CMA3 e DAPI-) e técnicas convencionais com Giemsa, impregnação por nitrato
de prata (Ag-RON) e bandamento C. Os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir de células renais. Todos
os indivíduos apresentaram número diplóide 2n=48 e fórmulas cariotípicas idênticas, independentemente do
sexo e localidade. O maior par cromossômico é do tipo subtelocêntrico, como tipicamente descrito para espécies
dessa subfamília. A impregnação por nitrato de prata (Ag-RON) demonstrou um único par de homólogos
portadores de RONs com marcações nos braços curtos de um dos maiores pares st. O bandeamento C revelou a
heterocromatina distribuída nas regiões centroméricas de todos os cromossomos. A aplicação de fluorocromos
base- específicos (CMA3+ e DAPI-) revelou marcações CMA3+ e DAP – nas regiões teloméricas em dois pares de
cromossomos subtelocêntricos, incluindo o par portador de RONs. As marcações com CMA3 equivalente às
RONs revelaram heteromorfismo de tamanho entre os homólogos caracterizando polimorfismo estrutural.
Os estudos citogenéticos com técnicas mais refinadas mostram que a espécie estudada apresenta um padrão
divergente de composição da heterocromatina em relação ao padrão comumente descrito para ciclídeos.
Apoio: FAPESB, CAPES e UESB
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Estudo citogenético de Hoplias malabaricus Bloch,
1794 (Characiformes - Erythrinidae) proveniente da
região do Baixo Amazonas, Óbidos-PA
Oliveira, JA; Marques, DF; Rodrigues, LRR
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Federal do Oeste do Pará
[email protected]
Palavras-chave: Hoplias malabaricus, Óbidos, citótipo, diversidade cromossômica, cariotipo
Os peixes representam o grupo mais diversificado entre os vertebrados. Tal diversidade também se reflete na
variação cariotípica do grupo. A família Erythrinidae compreende três gêneros incluindo Hoplias que apresenta
grande diversidade cariotípica. A espécie Hoplias malabaricus (traíra) caracteriza-se por apresentar sete citótipos
distintos (A-G) que sugerem a ocorrência de espécies crípticas neste táxon. Objetivo: Caracterizar os citótipos
presentes em igarapés da região do Baixo Amazonas. Métodos: No município de Óbidos, região oeste do Pará,
foram capturados 14 espécimes, sendo que 7 foram coletados no igarapé Pororoca, 2 no igarapé Curuçambá e 5
no igarapé Mamauru. Após a obtenção dos cromossomos mitóticos, os espécimes foram submetidos às técnicas:
coloração convencional, bandeamento C, coloração com AgNO3, marcação com FISH rDNA 18S e coloração
com Cromomicina A3. Resultados: Os espécimes provenientes dos igarapés Pororoca e Mamauru apresentaram
2n=40 (10M+10SM) e 2n=42 (11M+10SM) no igarapé Curuçambá. O padrão de distribuição da heterocromatina
foi evidente na região centromérica de todos os cromossomos e teloméricas de alguns pares. As marcações com
Ag-NOR e FISH, evidenciaram dois pares de cromossomos submetacêntricos marcados, sendo que em espécimes
com 2n=40 um terceiro par apresentou sinal de hibridização com a sonda rDNA 18S. Este sítio foi sempre
positivo para a cromomicina A3 , porém este resultado não se repetiu com os sítios Ag-NOR ativos. Conclusão: O
cariótipo 2n=42 foi classificado como citótipo A, enquanto que o cariótipo com 2n=40 assemelha-se tanto com o
citótipo C, pelo padrão de heterocromatina constitutiva, quanto com o citotipo F pelo padrão de Ag-NOR e FISH.
Apoio: FINEP, INPA, UFPA, UFOPA, CNPq-INCT-Adapta
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215
Dados moleculares contradizem a taxonomia de
duas espécies do complexo gênero Astyanax (Pisces:
Characidae)
Corrêa, JW¹; Oliveira, C²; Parise-Maltempi, PP¹; Alves, AL¹
¹Departamento de Biologia, UNESP, Rio Claro, SP
²Departamento de Morfologia, UNESP, Botucatu, SP
[email protected]
Palavras-chave: Astyanax, Astyanax paranae, Astyanax bockmanni, filogeografia, citocromo B.
O gênero Astyanax é um dos maiores em quantidade de espécies de peixes de água doce da Região Neotropical.
Com cerca de 100 espécies válidas descritas sua ocupação vai desde o sul dos Estados Unidos até a região central
da Argentina. Essa ampla distribuição faz com que sua taxonomia seja uma das mais complicadas entre os peixes
de água doce da Região Neotropical. A sistemática do gênero é complicada e ainda não está resolvida devido
à falta de evidências para corroborar seu status monofilético. Desta forma estudos taxonômicos e sistemáticos
são necessários para se entender as relações filogenéticas entre as espécies. Nesse sentido análises moleculares
são fundamentais para estabelecer estas relações. O gene mitocondrial Citocromo B (1140pb) foi utilizado para
a análise de 56 indivíduos de quatro espécies de Astyanax que ocorrem na Bacia do Rio Tietê. Trinta e cinco (35)
classificados - através de caracteres morfológicos - como sendo Astyanax paranae; 10 como Astyanax bockmanni;
5 como Astyanax fasciatus e 5 como Astyanax altiparanae. Como grupo externo foram utilizadas sequências de
Serrapinus notonelas. As populações de A. parane pertencem às seguintes regiões: Rio Claro, Botucatu e Santo
André. As de A. bockmanni são de Bauru e de Rio Claro. As análises filogenéticas foram conduzidas pelos métodos
de distância genética: Neighbor Joining (NJ), Minimum Evolution (ME) e Máxima Parcimônia (MP) através do
programa MEGA versão “4.0.2”. A confiabilidade das árvores foi testada fazendo-se 1000 reamostragens pelo
método de Bootstrap. As análises filogeográficas foram realizadas pelo programa TCS versão “v1.21”. As análises
filogenéticas demonstraram que A. altiparanae é o grupo mais derivado entre as espécies analisadas do gênero
e que A. fasciatus é grupo irmão de A. paranae juntamente com A. bockmanni. Estes dois últimos formam um
clado parafilético dividido em duas linhagens com 2,3% de divergência entre elas. Uma das linhagens, com
maior preponderância de A. bockmanni (Clado bockmanni) possui 0,5% de divergência entre seus indivíduos, e
é constituída por amostras de Botucatu, Rio Claro, Santo André e Bauru. No outro clado (paranae) a distância
entre as amostras é de 0,3%, e contém indivíduos de Rio Claro e Bauru. As análises filogeográficas mostraram a
ocorrência no Clado bockmanni de 9 haplótipos, sendo o de Botucatu (BTU) o mais primitivo. No Clado paranae
o haplótipo RC, de Rio Claro, é o mais primitivo dentre os 14 existentes. A existência de duas linhagens que
contenham indivíduos classificados morfologicamente como espécies distintas, afirmada por este trabalho, reforça
a complexidade da taxonomia entre as espécies de Astyanax e a necessidade de estudos moleculares no auxílio
da compreensão das relações filogenéticas do grupo, principalmente entre A. bockamanni e A. paranae, onde uma
revisão taxonômica deve ser realizada buscando identificar novos caracteres que distinguam as duas espécies.
Apoio: FAPESP (proc. N. 2007/58641-0)
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Dispersão diferencial de sítios do gene para RNAr
5S em espécies simpátricas do gênero Gymnotus
(Gymnotiformes, Gymnotidae)
Scacchetti, PC1; Pansonato-Alves, JC1; Utsunomia, R1; Almeida-Toledo, LF2; Oliveira, C1; Foresti, F1
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP
Laboratório de Genética de Peixes - Instituto de Biociências – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Gymnotus, espécies simpátricas, heterocromatina, rearranjos cromossômicos, DNAr
Os estudos citogenéticos têm contribuindo para o esclarecimento de questões taxonômicas, caracterização e
distinção de espécies, na identificação dos mecanismos de diferenciação cariotípica, assim como no estabelecimento
das relações evolutivas entre os diferentes grupos de organismos. A partir da aplicação da técnica de hibridação
fluorescente in situ (FISH) utilizando sondas de DNA repetitivo, foi possível aumentar o conhecimento acerca
da distribuição, dinâmica e características de diferentes famílias gênicas pelo genoma nas células dos animais e
plantas. Este tipo de abordagem tem sido utilizado em estudos em diversos grupos de peixes, revelando uma alta
variabilidade na distribuição cromossômica de sequências de DNA ribossomal, entre outras, em distintas espécies
ou até mesmo em populações de uma mesma espécie. Na família Gymnotidae, o gênero Gymnotus se destaca por
apresentar uma alta variabilidade cariotípica, com números diplóides variando desde 2n=40 cromossomos em
G. sylvius até 2n=54 cromossomos em G. inaequilabiatus. No presente trabalho, preparações cromossômicas de
exemplares de duas espécies simpátricas do gênero Gymnotus, G. sylvius e G. inaequilabiatus, foram analisadas
citogeneticamente por coloração convencional com Giemsa, localização da heterocromatina constitutiva por
bandamento-C e hibridação fluorescente in situ com o uso de sonda de DNAr 5S. Foram analisados exemplares de
ambos os sexos de G. sylvius (42 exemplares), que apresentaram cariótipo com 2n=40 cromossomos (22m + 12sm
+ 6st) e de G. inaequilabiatus (8 exemplares), que apresentaram cariótipo com 2n=54 cromossomos (42m + 10sm +
2a). A heterocromatina constitutiva foi detectada somente nas regiões centroméricas em G. sylvius, enquanto em
G. inaequilabiatus, além das marcações centroméricas, também foi possível observar vários pares de cromossomos
com blocos conspícuos de heterocromatina. A hibridação fluorescente in situ com a sonda de DNAr 5S, revelou
marcações em 15 pares de cromossomos em G. inaequilabiatus, sendo que a maioria das regiões marcadas coincide
com porções heterocromáticas. Já em G. sylvius, apenas o par número cinco apresentou marcações com a sonda
para esse DNA ribossômico. A localização das regiões heterocromáticas e as variações no padrão de distribuição
dos sítios do DNAr 5S em G. inaequilabiatus podem ter favorecido a ocorrência de rearranjos estruturais no
cariótipo desta espécie, facilitando a dispersão dessa sequência gênica em uma ou mais classes diferentes de DNA.
Entretanto, a existência de pseudogenes não pode ser descartada na constatação da dispersão das marcações, uma
vez que a heterocromatina poderia apresentar sequências semelhantes às do DNAr 5S. A partir desses resultados,
foi possível observar grandes diferenças na macroestrutura cariotípica entre estas duas espécies do gênero
Gymnotus, dando indícios sobre possíveis caminhos evolutivos percorridos nos seus processos de diferenciação.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP
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Transferência de locos de microssatélites de Salminus
franciscanus para a espécie Salminus hilarii
Nunes, AG; Galetti Jr, PM
Laboratório de Biodiversidade Molecular e Citogenética, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São
Carlos, SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: peixe de água doce, tabarana, variação genética, conservação
Salminus hilarii, também conhecido como tabarana, são peixes reofílicos que apresentam hábitos migratórios
relacionados a atividades de reprodução e alimentação. Pertencente à família Characidae, é uma espécie de
grande importância ecológica e apreciada na pesca esportiva. Dentro do gênero Salminus, S. hilarii é a espécie com
distribuição mais ampla, ocorrendo desde o Rio Orinoco na Venezuela até a bacia do Rio Paraguai, sendo encontrado
na bacia do Amazonas, São Francisco, Rio Doce e Paraná. Nas últimas décadas, as análises por microssatélites
emergiram devido a sua grande sensibilidade em detectar variações genéticas intra e inter-populacionais. O
relativo conservadorismo de suas sequências flanqueadoras permite a utilização de primers heterólogos entre
espécies filogeneticamente próximas. Este trabalho teve como objetivo testar a eficiência de transferência de
locos de microssatélites de Salminus franciscanus para a espécie S. hilarii, bem como avaliar a variação genética
de uma população de tabarana da bacia do Alto São Francisco. Amostras de DNA de 44 indivíduos de S. hilarri
foram extraídas, seguindo protocolo de Sambrook (1989), quantificadas em gel de agarose e, em seguida, utilizadas
em PCR (reações em cadeia da polimerase) com 11 pares de primers de microssatélites previamente isolados em
S. franciscanus. Um seqüenciador automático MegaBace foi usado para a genotipagem das amostras. Todos os
locos de microssatélites testados amplificaram em S. hilarii, sendo nove polimórficos e dois monomórficos. Os
valores de riqueza alélica variaram de 4,583 a 19,348, a diversidade gênica de 0,567 a 0,917 e a média de alelos
foi de 11 alelos por loco. A heterozigosidade esperada encontrada variou de 0,5663 a 0,9151 a heterozigosidade
observada de 0,25 a 1,00. Os locos Sfra02, Sfra04, Sfra05, Sfra10 e Sfra13 encontraram-se em desequilíbrio de HardyWeinberg na população estudada e a utilização do programa MicroChecker sugeriu a ocorrência de alelos nulos. Os
resultados obtidos mostraram, assim, sucesso na transferência dos locos isolados de S. franciscanus para a espécie
relacionada S. hilarii, contribuindo para o conhecimento genético desses peixes e possibilitando seu uso em estudos
que visem conservação e o manejo adequado da pesca, para a manutenção da diversidade genética da espécie.
Apoio financeiro: Capes, CNPq
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Avaliaçao da diversidade genética de populações de
dourado Salminus brasiliensis (Teleostei: Characidae)
introduzida na Bacia do Rio Paraíba do Sul a partir do
Rio Mogi-Guaçu
Ponzetto, JM1; Polaz, CNM2; Rocha, RCGA2; Souza, G3; Senhorini, JA2; Parise-Maltempi, PP1; Alves, AL1
Laboratório de Genética de Peixes – LGP - Depto. de Biologia – UNESP Rio Claro
Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais – CEPTA/ICMBio, Pirassununga, SP
3
Projeto Piabanha, Itaocara – RJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Gene Mitocondrial, Atpase 8/6, Filogenia, Filogeografia, Haplótipo
Os peixes têm acentuada importância como fonte de alimento e geração de riquezas, analises envolvendo
conservação e manejo da biodiversidade, incluindo a variabilidade genética, devem ser priorizados. Por este
motivo, tem ocorrido um aumento expressivo de interesse por estudos voltados a esse grupo de animais,
e principalmente para espécies como o dourado Salminus brasiliensis, uma das mais importantes espécies
comercializadas no Centro-Oeste, Sudeste e Sul do Brasil. A distribuição da espécie S. brasiliesis estende-se
por toda a bacia do Prata, que envolve rios do Brasil, Argentina e Uruguai. A ausência desta espécie em bacias
costeiras, como do rio Paraíba do Sul, motivou a cerca de 30 anos a introdução de alevinos de S. brasiliensis
nesta bacia a partir de matrizes do rio Mogi-Guaçu da região de Cachoeira de Emas. Estudos envolvendo esta
espécie têm crescido não somente devido a sua importância econômica, mas também pelo declínio acentuado
que ela vem sofrendo nos rios onde anteriormente habitavam abundantemente. No entanto, há raros relatos de
dados moleculares populacionais e ausência de análise filogeográfica consistente para populações de Salminus.
Nesse sentido, o presente trabalho teve por objetivo identificar a variabilidade genética entre duas populações
de S. Brasiliensis, sendo uma introduzida (20 indiv. Rio Paraíba do Sul, Itaocara, RJ) e uma da região matriz (20
indiv. Rio Mogi-Guaçu, Cachoeira de Emas, SP). O gene mitocondrial ATPase 8/6 foi completamente sequenciado
(840pb), as análises filogenéticas foram conduzidas pelos métodos “Neighbor Joining (NJ)”, “Minimum Evolution
(ME)” e “Máxima Parcimônia (MP)”, com 1000 réplicas de boostrap no programa MEGA 5.0. Analisando-se as
três árvores (NJ, ME, MP), constatou-se que as populações agrupavam-se em apenas um clado monofilético. A
divergência genética encontrada entre as duas populações foi de 0,3%. Para análises filogeográficas as sequências
foram analisadas no programa TCS, e os resultados obtidos indicam a ocorrência de seis haplótipos (A, B, C, D,
E, F), sendo o haplótipo A, que em sua maioria é encontrado no rio Mogi-Guaçu (apenas 1 indiv. Paraíba do Sul),
considerado ancestral para as duas populações analisadas. O haplótipo B possui maior freqüência (28%), sendo
encontrado em sua maioria na população do rio Mogi-Guaçu (apenas 1 indiv. Paraíba do Sul), o haplótipo E só
ocorre na população do rio Mogi, o haplótipo C ocorre tanto na população do rio Paraíba do Sul quanto na do
rio Mogi-Guaçú, enquanto os haplótipos D e F ocorrem somente na população do rio Paraíba do Sul, sendo a
freqüência do haplótipo D a maior da bacia (55%). Estes resultados mostram que a maior diversidade genética
está presente na população matriz (Mogi-Guaçu), e embora a introdução seja recente na bacia do rio Paraíba
do Sul o isolamento geográfico destas duas populações já foi suficiente para diferenciá-las a nível populacional.
Apoio financeiro: FAPESP (proc. n: 07/58641-0)
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Evidência de hibridização introgressiva entre duas
espécies de acará-disco (Symphysodon discus e S.
aequifasciatus)
Amado, MV1,2; Hrbek, T1,3; Farias, IP1
Departamento de Biologia, Laboratório de Evolução e Genética Animal, Universidade Federal do Amazonas
Coordenadoria de Química e Biologia, Instituto Federal do Estado do Espírito Santo, Campus Vitória
3
Biology Department, University of Puerto Rico
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hibridização, Introgressão, Microssatélites, Symphysodon discus, Symphysodon aequifasciatus.
Introdução: O Acará Disco é um dos ciclídeos mais conhecido e admirado pelos aquarista. Peixes híbridos são
facilmente obtidos por aquaristas mais experientes e novas formas de coloração estão sempre surgindo no
mercado internacional. Híbridos naturais também são comuns e já foram reportados muitas vezes na literatura.
Possivelmente a ocorrência de hibridização observada dentro do gênero Symphysodon seja a principal responsável
pelos resultados conflitantes obtidos em estudos genéticos com DNA mitocondrial, onde não são encontrados
correspondência entre as genealogias e os fenótipos das espécies de acará-disco. Biólogos evolutivos têm considerado
as zonas de hibridização natural como laboratórios ou janelas no qual é possível observar a evolução de forma
privilegiada. A utilização de marcadores moleculares, como os microssatélites, revelou-se extraordinariamente útil
para a resolução de velhos problemas, bem como para melhorar a qualidade e a quantidade de dados empíricos
disponível sobre as zonas híbridas. Objetivo: utilizar marcadores microssatélites para verificar a ocorrência de
eventos de hibridização entre as espécies de acará-disco (Symphysodon spp.) e caracterizar geneticamente as
zonas híbridas. Métodos: Amostras de 336 indivíduos foram coletadas em 24 localidades ao longo de toda área de
distribuição do gênero Symphysodon. O DNA total foi extraído das amostras coletadas de músculo ou nadadeira,
através do protocolo padrão de extração com fenol-cloroformio, as genotipagens foram realizadas para 11 pares de
primers e a eletroforese em seqüenciador automático MegaBace. Resultados: Os resultados estatísticos confirmam
as observações de campo, que apontam as populações de Nhamundá e Madeira como áreas onde as espécies
S. discus e S. aequifasciatus ocorrem em simpatria e onde são vistos indivíduos híbridos, com características
intermediárias entre essas espécies. Portanto, essas duas populações foram caracterizadas como zonas de
hibridização. A população de Nhamundá apresentou maior número de indivíduos híbridos (76%, n=18) que
o Madeira (19%, n=4). Em Nhamundá não houve correspondência entre as classes fenotípicas e genotípicas
encontradas. As porcentagens das classes genotípicas dos híbridos de Nhamundá foi semelhante a do Madeira,
apresentando efetivamente indivíduos da segunda geração e uma pequena probabilidade de retrocruzantes.
Resultados qualitativos mostram um maior nível de introgressão na região de Nhamundá. Conclusões: A
hibridização encontrada foi simétrica e a introgressão observada dentro das zonas híbridas ocorreu de forma
bidirecional entre as duas espécies de acará-disco, S. discus e S. aequifasciatus. Apesar das provas que sustentam
substancial fluxo genético entre essas espécies, a ocorrência restrita de hibridização em ambiente intermediário,
as significantes diferenças genéticas e morfológicas entre os exemplares puros e a preferências por distintivos
habitats, sugerem que S. discus e S. aequifasciatus possuem independentes trajetórias evolutivas.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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220
Filogenia molecular de Illex argentinus (Castellanos,
1960) baseada no gene mitocondrial Citocromo
Oxidase Subunidade I (COI) sugere a presença de
espécies crípticas em águas brasileiras
Sales, JBL1; Haimovici, M2; Sampaio, I1; Schneider, H1
Universidade Federal do Pará, Instituto de Estudos Costeiros, Campus de Bragança, PA
Departamento de Oceanografia, Fundação Universidade de Rio Grande, Cx Postal 474, Rio Grande, RS
[email protected]
1
2
Palavras-chave: COI, Lulas, Illex argentinus, Filogenia molecular, DNA mitocondrial.
Illex argentinus é uma espécie nerítico-oceânica, distribuída ao longo da plataforma continental, do Rio de Janeiro
(22°S) até o extremo sul da América do Sul (54°S). Esta espécie é a principal representante da pesca industrial de
cefalópodes em águas Argentinas e Uruguaias, tendo sua captura aumentada anualmente. Entretanto, assim como
outras espécies de cefalópodes, sua identificação morfológica e bastante difícil, sendo geralmente confundida com
outras espécies como Loligo plei. O presente trabalho avaliou geneticamente Illex argentinus do sul do Brasil, bem como
a posição filogenética da espécie em relação a outros representantes do gênero. Amostras de Illex argetinus foram
coletadas junto às frotas pesqueiras dos estados de Santa Catarina e Rio Grande de do Sul, e o DNA foi extraído com
o método do fenol clorofórmio. Um fragmento parcial de aproximadamente 480 pares de base do gene mitocondrial
COI foi amplificado e seqüenciado. Para complementar a análise, seqüências adicionais de COI foram obtidas junto
ao GenBank para quatro espécies do gênero Illex e de outros representantes da família Ommastrephidae. As análises
filogenéticas foram realizadas no PAUP 4.0b. Os resultados demonstram que Illex argentinus e Illex Illecebrosus
são mais proximamente relacionadas, assim como Illex coidentii e Illex oxygonus. Fato interessante foi constatar
que as seqüências depositadas no GenBank como sendo de Illex argentinus na verdade são de outra espécie do
gênero Todarodes. Com relação à Illex argentinus coletados no sul do Brasil, a divergência genética da maioria foi de
aproximadamente 0.3%. Porém, três amostras, sendo uma de SC e duas do RS, apresentaram divergência genética
de 4.5% a 5.7% em relação às outras amostras de I. argentinus. Para as outras três espécies do gênero Illex, a distância
genética foi de 5.7% (I. argentinus x I. illecebrosus), 6.2% (I. argentinus x I. coindetti) e 8% (I. argentinus x I. oxygonus).
Os resultados da presente análise sugerem a ocorrência em águas brasileiras de outra espécie ainda não descrita
do gênero Illex, sendo desta forma mais um caso de espécies crípticas de cefalópodes no Atlântico ocidental.
Apoio financeiro: Projeto Casadinho (CT-Hidro n. 552126/2005-5/CNPq)
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Análises genéticas confirmam a ocorrência de uma
espécie exótica de camarão na Ilha do Marajó
Santos, P; Iketani, G; De Paula, NF; Sampaio, IM
Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança, Instituto de Estudos Costeiros (IECOS), Bragança, Pará
[email protected]
Palavras-chave: Gigante-da-Malásia, Macrobrachium dacqueti, Espécie exótica, mtDNA, Ilha do Marajó.
A carcinicultura de água doce foi desenvolvida no Brasil com a introdução da espécie exótica Macrobrachium
rosenbergii (Gigante-da-Malásia), endêmica do sul e sudeste asiático. No Pará, pós-larvas deste camarão
foram distribuídas pela Secretaria de Agricultura (SAGRI) entre 1995 e 1998. Nos anos seguintes a espécie foi
acidentalmente liberada na natureza e atualmente encontra-se amplamente distribuída, e bem adaptada, por toda
a região costeira paraense. Sua ocorrência tem sido documentada em todos os estuários paraenses a leste de Belém,
desde Mosqueiro até Vizeu. Para a extensa região do Marajó a presença do Gigante-da-Malásia já foi registrada em
Soure, mas não se sabe ainda a abrangência desta invasão para outros pontos do arquipélago. Análises genéticas
nas populações de várias localidades brasileiras (São Paulo, Bahia e Pará) evidenciaram que o estoque de póslarvas importado pelo Brasil e introduzido no Pará é representativo da subsespécie Macrobrachium rosenbergii
dacqueti, que alguns autores atualmente consideram como espécie válida, M. dacqueti. Para o presente estudo
foram analisados exemplares de Gigante-da-Malásia coletados no município de Soure no ano de 2009. DNA total
foi extraído de tecido muscular por meio de protocolo padrão de fenol-clorofórmio, e um fragmento de 500 pares de
bases da alça-D mitocondrial foi isolado via PCR e seqüenciado no ABI 3130xl. Após edição das seqüências de DNA,
estas foram comparadas com uma base de dados previamente gerada para os exemplares de outras localidades
do Pará e identificadas como sendo da espécie M. dacqueti. Na amostra de 18 exemplares de Soure analisados no
presente estudo foram observados dois haplótipos com freqüências de 78% e 22%, respectivamente. Este estudo
foi importante para validar a abordagem genética de identificação deste camarão em ambientes naturais do Brasil,
e servirá particularmente para o monitoramento da colonização desta espécie exótica no enorme “santuário
ecológico” que é o Arquipélago do Marajó.
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Anotação genômica de marcas expressas e validação
populacional de locos SSR-ESTS do genoma do
camarão Litopenaeus vannamei
Santos, CA2; Galetti Junior, PM2; Freitas, PD1
Instituto de Biologia, Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP
e-mail: [email protected]
1
2
Palavras-chave: microssatélites, QTL, polimorfismo, vias metabólicas, cross-amplification
A carcinicultura tem se destacado nos últimos anos através do cultivo do camarão branco, também conhecido
como Litopenaeus vannamei. Esta espécie, exótica à Costa do Brasil, vem sendo manejada em cativeiro,
principalmente, através da prática do endocruzamento, o qual promove conseqüente perda de variabilidade
genética e diminuição do fitness desses plantéis. Para monitorar isso, a utilização de marcadores moleculares,
incluindo locos microssatélites presentes em regiões expressas do genoma, ou SSR-EST (Simple Sequence
Repeats - Expressed Sequence Tags), tem se mostrado eficiente. No presente trabalho, realizou-se a validação de
17 locos SSR-EST de L. vannamei através de reações de PCR contendo o primer universal M13 com fluorescência
e posterior genotipagem. Além disso, a anotação genômica de 400 seqüências expressas, depositadas no banco
de dados do Projeto Genoma EST de L. vannamei (ShEST), foi realizada com o intuito de identificar genes de
interesse que possam servir para estudos de QTLs (Quantitative Trait Loci) e desenvolvimento de programas
de Seleção Assistida por Marcadores (MAS). Na etapa de validação, obteve-se nove locos polimórficos após a
genotipagem. Os valores de PIC (Polymorphism Information Content) variaram de 0,34 a 0,92 e a heterozigozidade
de 0,35 a 0,86. Houve déficit de heterozigotos em quatro do total de locos polimórficos. Foi testada também a
amplificação heteróloga em cinco espécies nativas de peneídeos: Farfantepenaeus paulensis, Farfantepenaeus
brasiliensis, Rimapenaeus constrictus, Xiphopenaeus kroyeri e Litopenaeus schmitti, com o objetivo de fornecer
subsídios para os estudos nesses camarões. Todos os locos polimórficos validados para L. vannamei mostraram
amplificação satisfatória também para estas espécies. Dentre as 400 ESTs anotadas, o produto gênico pôde ser
elucidado para 397 delas, sendo que 115 EC numbers (Enzyme Commission) puderam ser estabelecidos. Estes
serão utilizados posteriormente para o estabelecimento de possíveis vias metabólicas no grupo dos camarões.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, ABCC
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Cracterização do padrão de esterases no
hepatopâncreas de camarões palemonídeos do gênero
Macrobrachium
Lima, AVB1,2, Guerra, AL1,2; Oliveira, SA2; Taddei, FG3; Castiglioni-Ruiz, L1,2
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), Depto. de Biologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
UNESP, São José do Rio Preto/SP
2
Laboratório de Biologia Molecular - Hospital Veterinário “Dr. Halim Atique”. Campus II/ UNIRP (Centro Universitário de Rio Preto)
3
Laboratório de Zoologia - Depto. de Biologia. Campus I - UNIRP (Centro Universitário de Rio Preto)
[email protected]
1
Palavras-chave: Macrobrachium; palaemonídeos; polimorfismo genético; variabilidade genética; marcadores moleculares; esterases.
Introdução: Os camarões dulcícolas, pertencentes ao gênero Macrobrachium apresentam particularidades
adaptativas quanto aos seus aspectos morfológicos, fisiológicos que podem torná-los objetos de muitos estudos.
Entretanto, pouco se sabe a respeito da biologia dos mesmos, uma vez que os trabalhos encontrados na literatura
abordam, principalmente, aspectos ecológicos. As esterases são enzimas que hidrolisam ésteres de ácidos
carboxílicos, conservadas evolutivamente, apresentam importantes funções fisiológicas. No presente estudo, foi
analisado o padrão eletroforético da atividade esterásica no hepatopâncreas de três espécies de camarões do
gênero Macrobrachium: M. amazonicum, M.jelskii e M. brasiliense, a fim de se obter o perfil isoenzimático neste
órgão, ainda desconhecido nestas espécies. Nos camarões, o hepatopâncreas é um órgão muito importante, pois
possui diversas funções fisiológicas importantes. Métodos: machos e fêmeas das três espécies em questão foram
coletados em Mendonça (SP) e Talhados (SP). Após a dissecação, o hepatopâncreas foi homogeneizado em tampão
de amostra e o extrato obtido foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%, por aproximadamente
cinco horas, com voltagem constante (200V). Após a eletroforese, os géis foram corados a partir da coloração usual
para esterases, a qual utiliza os corantes alfa e beta naftil acetatos. Também foram realizados testes com diferentes
inibidores, visando à classificação das enzimas esterásicas obtidas neste órgão. Resultados: No hepatopâncreas
foram observadas doze bandas esterásicas, denominadas de EST 1 a EST 12, a partir da extremidade mais anódica
do gel. Não foram observadas diferenças qualitativas de bandas interespecíficas e nem entre os sexos. As diferenças
existem apenas nas freqüências das mesmas. Conclusão: Os dados relacionados ao uso de inibidores mostraram
que as bandas EST1, EST2, EST4 a EST6, EST8 e EST10 foram classificadas como acetilesterases, provavelmente
associadas à degradação de feromônios, desintoxicação do organismo, em processos digestivos e, ainda, à produção
e armazenamento de energia para a utilização em processos reprodutivos, uma vez que são funções importantes
deste órgão. A banda EST9, presente em alta freqüência em ambos os sexos, levemente inibida pelo pOHMB, indicou
tratar-se de uma arilesterase, provavelmente associada à degradação de hormônios e substâncias tóxicas (entre
elas agrotóxicos oriundos do ambiente), e proteção contra estresse oxidativo causado por vários fatores. As bandas
EST3 e EST7, presentes em altas freqüências em ambos os sexos, foram moderadamente inibidas pelo malathion,
sendo classificadas como carboxilesterases, enzimas envolvidas com a desintoxicação do organismo e, em várias
espécies, estão relacionadas com a degradação do hormônio juvenil, o qual controla a metamorfose, a oogênese,
a vitelogênese e a produção de feromônios. A banda EST12 foi inibida levemente pelo malathion e pelo sulfato
de eserina, sendo classificada como colinesterase. A alta freqüência desta banda indicou um papel fisiológico
importante, provavelmente associado à atividade de condução neural e degradação de neurotransmissores.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES
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Caracterização da amplitude geográfica das espécies
crípticas brasileiras de Xiphopenaeus (Crustacea:
Penaeidae) usando PCR / RFLP do gene mitocondrial COI
Piergiorge, RM1; Morelli, KA1,2; Gusmão, J1
Laboratório de Genética Pesqueira e da Conservação, Depto° de Genética, Instituto de Biologia Roberto Alcântara Gomes, Universidade
do Estado do Rio de Janeiro
2
Laboratório de Doenças Parasitárias, Departamento de Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz
[email protected]
1
Palavras-chave: camarão sete-barbas, identificação molecular, espécies crípticas, conservação, genética animal.
A pesca camaroneira representa um importante recurso econômico em diversos países, e o camarão sete-barbas,
Xiphopenaeus kroyeri, é uma das espécies brasileiras de maior importância. Dados de produção anual de “X. kroyeri”
entre 1964 e 1994 mostram uma redução significativa na abundância relativa entre 1990 e 1991, com preocupantes
indicativos de super-explotação nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. Um estudo recente realizado por pesquisadores
do nosso grupo demonstrou a existência de duas espécies crípticas de Xiphopenaeus no oceano Atlântico e uma
terceira no Pacífico. Estudos de identificação molecular e caracterização morfológica estão sendo conduzidos em
nosso laboratório a fim de elucidar a distribuição geográfica das espécies brasileiras de sete-barbas e dessa maneira
contribuir para elaboração de estratégias eficazes de conservação dos estoques de Xiphopenaeus. Até o momento
seis localidades foram amostradas: Atafona/RJ, Nova Almeida/ES, Santos, Ilhéus, Caravelas/BA, Barra Velha/SC e
Ubatuba/SP (duas coletas sazonais). Uma porção do gene mitocondrial COI foi amplificada e os produtos de PCR
foram digeridos com as endonuleases Hinf I e/ou Hinc II usando um sistema de identificação molecular descrito
previamente; o padrão de corte foi visualizado em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio. Ao todo 260
espécimes foram analisados para as seis localidades. Em todos os pontos amostrados os haplótipos encontrados
corresponderam à espécie I, exceto em Ubatuba/SP, onde os haplótipos correspondentes à espécie II foram encontrados
em dois indivíduos da primeira coleta (agosto/2009), e em dezoito indivíduos da segunda coleta (dezembro/2009).
O sequenciamento de dois indivíduos de cada espécie de cada localidade confirmou a identificação por PCR/RFLP.
Os resultados obtidos sugerem uma distribuição geográfica contínua para a espécie I e disjunta para espécie II,
corroborando os estudos anteriores nos quais a espécie dos foi apenas observada em Natal, Ubatuba e Cananéia.
A observação de maior ocorrência de indivíduos da espécie II em Ubatuba durante o verão (dez/2009) sugere
modificação sazonal na abundância da espécie, o que poderia interferir nos resultados obtidos sobre o padrão de
distribuição geográfica, porém mais coletas sazonais e a ampliação dos pontos de amostragem ao longo da costa são
necessárias para a elucidação de tal padrão, bem como para a determinação da amplitude de ocorrência das espécies.
Apoio financeiro: CNPq / PIBIC-UERJ
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225
Ocorrência de uma espécie exótica de ostra do gênero
Crassostrea (Bivalvia: Ostreidae) no estuário de
Cananéia, SP, Brasil (25°S; 48°W)
Galvão, MSN2; Pereira, OMP2; Hilsdorf, AWS1
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura – Núcleo Integrado de Biotecnologia – Universidade de Mogi das
Cruzes
2
Núcleo de Pesquisa e Desenvolvimento – Centro de Pesquisa do Pescado Marinho – Instituto de Pesca – APTA/SAA
[email protected]
1
Palavras-chave: espécie exótica, Crassostrea, 16S ribossomal, coletores artificiais, manejo sustentável.
O complexo estuarino-lagunar de Iguape/Cananéia/Paranaguá possui o maior banco natural de ostras das regiões
sudeste e sul do Brasil. Nele, co-habitam duas espécies de ostras nativas Crassostrea brasiliana e C. rhizophorae. O
objetivo deste trabalho foi identificar a espécie predominante em coletores artificiais de captação de sementes
de ostras para fins de cultivo. Os coletores foram lançados em duas épocas distintas, abril de 2009 e fevereiro
de 2010, defronte ao píer do Núcleo de Pesquisas do Litoral Sul do Instituto de Pesca, em Cananéia. Após três
meses da captação, os juvenis foram retirados da água e o conteúdo interno fixado em etanol 95%. As análises
moleculares foram conduzidas no Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura (Lagoaa)
(NIB/UMC). O DNA de 200 exemplares (100 para cada período de captação) foi extraído com kit de extração
genômico. As amostras foram submetidas à análise de polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição
(RFLP) de um fragmento da subunidade ribossomal (16S) do DNA mitocondrial, amplificado por meio da reação
em cadeia da polimerase (PCR). Os produtos de PCR foram digeridos com a enzima de restrição HaeIII e os
fragmentos gerados foram visualizados em gel de agarose 2,5%. Verificou-se que 100% das amostras fixadas em
coletores comerciais mostraram um padrão de bandas diferente de C. brasiliana e C. rhizophorae. Exemplares
de cada espécie foram sequenciados em sequenciador ABI 3730. As sequências foram alinhadas usando o
programa MEGA 4.1. As análises fenéticas foram realizadas pelo método de neighbour-joining. A divergência
genética foi calculada usando as distâncias do parâmetro-2 de Kimura. As ostras obtidas da captação em
coletores artificiais apresentaram uma distância de 19,8% em relação a C. brasiliana, de 19,6% para C. rhizophorae
e de 11,0% para C. gigas (cultivada no sul do país), demonstrando elevada divergência genética para com essas
espécies. Os resultados indicam que as ostras oriundas da captação em ambiente natural pertencem a uma
espécie exótica mais relacionada às espécies do Índico e do Pacífico. O registro da ocorrência de uma espécie
exótica na região estuarina de Cananéia pode ter fortes implicações ecológicas e econômicas. A adoção de
novas condutas para o cultivo, o manejo sustentável e a conservação das espécies nativas deve ser considerada.
Apoio financeiro: FAPESP e FAEP
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Estudo populacional de Mytella guyanensis de
ocorrência em Barreiras, no Maranhão, através do
sequenciamento do gene mitocondrial COI
Gomes, LA; Barros, NGV; Marques-Silva, NS; Tagliaro, CH
Laboratório de Conservação e Biologia Evolutiva, Universidade Federal do Pará, Instituto de Estudos Costeiros, Campus Bragança
[email protected]
Palavras-chave: sururu, COI, genética populacional, Mytella, Mytillidae
A Mytella guyanensis é um bivalve comercialmente explorado conhecido como sururu. O presente estudo
tem como objetivo a caracterização genética de uma população de Mytella guyanensis de ocorrência em
Barreiras, no Maranhão, e comparação com dados outras populações da costa brasileira. Foram sequenciados
e alinhados 472 pb do gene COI (parcial) de 23 espécimens. Essas sequências foram adicionadas a um banco
de dados das populações do Pará, Paraíba, Sergipe e Espírito Santo, somando um total de 143 indivíduos. No
total, foram encontrados 67 haplótipos e destes, 12 estavam presentes na população de Barreiras. O haplótipo
H1 foi verificado em todas as cinco populações. Além de H1, o único haplótipo de Barreiras compartithado
foi o H8, encontrado também na população do Pará. Os testes de neutralidade seletiva de Fu e de Tajima
foram negativos e significativos. A diversidade haplotípica foi alta (0,7787) e a nucleotídica foi baixa (0,003249)
sugerindo que esta população sofreu gargalo de garrafa ou efeito fundador seguido de crescimento populacional.
As curvas de distribuição para diferenças par-a-par observadas e esperadas para crescimento populacional
(unimodal) não apresentaram diferenças significativas (SSD=0,00023515, P= 0,99). Os valores de Fst e a AMOVA
indicaram que a população de Barreiras é homogênea em relação à do Pará e heterogênea em relação às demais.
Apoio: CNPq (Universal)
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227
Estudos moleculares em duas populações de Mytella
guyanensis (Lamarck, 1819) da Bahia
Souza, TO; Marques- Silva, NS; Tagliaro, CH
Laboratório de Evolução e Biologia Evolutiva, Campus de Bragança, Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: sururu, COI, genética populacional, Mytella, populations
A Mytella guyanensis, conhecida como sururu, é um bivalve com valor comercial encontrado com frequência
no litoral do Brasil. O presente estudo tem como objetivo a caracterização genética de duas populações de
Mytella guyanensis de ocorrência nos estuários de Caravelas e Pirajuía, ambas na Bahia, e comparação com
dados de outras populações da costa brasileira. Foram amplificados, sequenciados e alinhados 343 pb do gene
citocromo oxidase I, subunidade c (COI) de 27 espécimes de Caravelas e 24 de Pirajuía. Essas amostras foram
adicionadas a um banco de dados das populações do Pará, Paraíba, Sergipe e Espírito Santo, somando um total
de 171 indivíduos. Foram encontrados 48 haplótipos para todas as populações, sendo que o haplótipo H1 foi
verificado nas seis populações. A diversidade haplotípica e nucleotídicas para as amostras de Caravelas foram: H=
0,5613 e pi = 0,002279, e para as de Pirajuía foram H= 0,5652 e pi= 0,001944. As duas populações da Bahia foram
homogêneas entre si (AMOVA: p= 0,1890). A população de Caravelas (BA) mostrou-se heterogênea em relação a
população de Aracaju (SE) e a de Camurupim (PB) foi heterogênea em relação a todas as populações comparadas.
Apoio: PIBIC/UFPA; CNPq (Universal)
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Comparação entre duas populações de Mytella
guyanensis de Sergipe a partir de sequências de COI
Oliveira, MJS1; Nascimento, LSO1; Marques-Silva, NS1; Tagliaro, CH1
Laboratório de Evolução e Biologia Evolutiva, Campus de Bragança, Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: mexilhão, COI, população, Mytella guyanensis, Mytilidae
O presente estudo tem objetivo comparar geneticamente e verificar se há heterogeneidade entre duas populações
proximamente localizadas da espécie de Mytella guyanensis: Lagoa Redonda (LR) e Brejo Grande (BG). Para este
fim, foram obtidas sequências parciais do gene citocromo oxidase c subunidade I (COI). No total foram gerados
e sequenciados amplicons com 492 pb de um grupo de dez indivíduos de BG e quatorze indivíduos de LR. As
frequências nucleotídicas foram similares. As distâncias (Tamura-Nei) verificadas entre as amostras das duas
populações variaram de 0 a 0,10 e as intrapopulacionais variaram de 0 a 0,006 (BG) e de 0 a 0,008 (LR). Árvore de
agrupamento de vizinhos não mostrou valores de significativos de bootstrap. As populações apresentaram 10
haplótipos, sendo o H1 o mais freqüente, presente em 6 indivíduos de BG e em 9 de LR. Os valores das diversidades
haplotípicas foram altos e os das nucleotídicas baixos para as duas populações (H=0,6667 e π=0,002710 para BG;
H=0,6044 e π=0,002278 para LR). Os testes de Fu (Fs), Tajima (D) e Onzins-Rozas (R2) mostraram que BG está
em neutralidade seletiva. Entretanto, a população de LR não se encontra em neutralidade e a causa provável é
expansão populacional SSD (SSD=0,02683; p=0,42720). Os teste de Fst (Fst= 0,10883; p= 0,01109) indicaram
a presença de estruturação entre BG e LR e esta heterogeneidade foi confirmada pela AMOVA (p= 0,00723).
Apoio: CNPq (Universal, PIBIC)
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Diversidade genética do domínio hipervariável da
região controle do mtDNA encontrada em populações
de Lagosta Espinhosa, Panulirus echinatus, de Ponta
Grossa - CE
Soares, AG1; Britto, FB2; Diniz, FM3
Aluna de Mestrado do Programa de Genética e Biologia Molecular da UFPA
Universidade Federal do Piauí - UFPI
3
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA MEIO-NORTE
[email protected]
1
2
Palavras-chave: genética populacional, região controle, diversidade genética, lagosta, DNA mitocondrial.
O conhecimento da diversidade genética entre populações de lagosta espinhosa, Panulirus echinatus, sob intensa
exploração pesqueira, é de fundamental importância à conservação da espécie e manutenção da pesca como
atividade de valor econômico. A diversidade genética do domínio hipervariável da região controle (HV-CRd1)
do DNA mitocondrial do estoque de Ponta Grossa - CE (PG), comunidade cuja economia se baseia na pesca de
lagosta, foi investigada e comparada a diversidade apresentada pelo estoque de Penedos de São Paulo e São Pedro
(PSP). Essa região, por não ser uma região codificante, é mais sensível como marcador populacional apresentando
uma alta taxa de evolução. Dentro dessa região, os domínios periféricos, possuem uma alta taxa de substituição
de bases comparada ao domínio central. Amostras de DNA de 16 indivíduos foram obtidas de tecido muscular,
digeridos com Proteinase K e 20% dodecil sulfato de sódio, seguindo o método PCI (Phenol - Chloroform - Isoamyl
Alcohol) (25:24:1, v/v/v). Fragmentos de 521 bp foram obtidos por PCR, seguida de eletroforese em gel de agarose,
utilizando os primers CRL-F e CRL-R. Os produtos da PCR foram purificados com Qiagen Qiaquick PCR Purification
columns e sequenciados em ambas as direções (Forward e Reverse), utilizando-se ABI Prism Big Dye Ready Mix
(Applied Biosystems) e os primers CRPa-F e CRPa-R.. Seguiu-se a analise em sequenciador ABI Prism Model 310
Automated DNA Sequencer (Applied Biosystems). As sequências foram inspecionadas com CHROMAS v.2.23,
alinhadas com CLUSTAL W, implementado no BIOEDIT, e analisadas com MEGA4 e DNAsp. Para as análises,
utilizou-se o modelo de substituição Kimura-2-parameter. A composição nucleotídica do domínio hipervariável
foi AT-rich, apresentando 62,6% de bases A+T e 37,4% de bases C+G. A composição nucleotídica é similar em
outros invertebrados e concordante com a relação: A (35,1%) > T(27,5%) > C(23,5%) > G(13,9%). As sequências
apresentaram 478 sítios conservados, 43 variáveis, sendo 15 destes “singletons” e nenhum indel. A estimativa da
diversidade (d) dentro das populações foi menor na população de Ponta Grossa (0.008) que na população Penedos
(0.033). Isso pode ser reflexo da perda de estoques causada pela pesca predatória. A diversidade genética entre os
grupos foi de 0.023. A região apresentou 14 haplótipos distintos. A diversidade haplotípica (Hd) entre as populações
foi de 0,975 e a diversidade nucleotídica (p) foi de 0.018. O nível de divergência baseado na região controle observado
dentro das populações de Panulirus echinatus foi de pequena magnitude comparada aos níveis encontrados para
P. argus.
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230
Caracterização molecular (RAPD-PCR), em espécies do
Gênero Macrobrachium
Castiglioni-Ruiz, L1,2; Guerra, AL1,2; Lima, AVB1,2; Oliveira, SA2; Taddei, FG3
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), Depto. de Biologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
UNESP, São José do Rio Preto/SP
2
Laboratório de Biologia Molecular - Hospital Veterinário “Dr. Halim Atique”. Campus II/ UNIRP (Centro Universitário de Rio Preto)
3
Laboratório de Zoologia - Depto. de Biologia. Campus I - UNIRP (Centro Universitário de Rio Preto)
[email protected]
1
Palavras-chave: Macrobrachium; palaemonídeos; polimorfismo genético; variabilidade genética; marcadores moleculares; RAPD-PCR.
Introdução: Os camarões palemonídeos apresentam particularidades adaptativas quanto aos seus aspectos
morfológicos, fisiológicos e de padrões comportamentais que podem torná-los objetos de muitos estudos.
Entretanto, pouco se sabe a respeito da biologia dos mesmos, uma vez que os trabalhos encontrados na literatura
abordam, principalmente, aspectos ecológicos. Um fato importante é a dificuldade taxonômica na classificação de
algumas espécies de Macrobrachium, com base apenas em características morfológicas. As espécies M. amazonicum
e M. jelskii apresentam muitas semelhanças morfológicas dificultando a identificação dos mesmos, este fato pode
ser agravado por tratarem-se de espécies sintópicas, ou seja, são coletadas juntas. Com base nesses aspectos e
na ausência de trabalhos esclarecedores que abordem a biologia das mesmas, o objetivo do presente estudo foi
detectar marcadores moleculares capazes de identificar três espécies pertencentes a este gênero (M. amazonicum,
M. jelskii e M. brasiliense), e obter dados a cerca da filogenia das mesmas. Métodos: As amostras analisadas
foram coletadas em Mendonça (SP). O DNA genômico foi extraído de fragmentos de músculos abdominais e
amplificados a partir da utilização de dez oligonucleotídeos iniciadores decaméricos e aleatórios. Resultados: Dos
182 fragmentos polimórficos obtidos no presente estudo, três podem ser utilizados como marcadores específicos
para M. amazonicum e M. jelskii: o fragmento de 0,60kb gerado pelo primer 08, exclusivo de M. amazonicum, o
fragmento de 1,50kb, gerado pelo primer 10, também exclusivo desta espécie e o fragmento de 0,60kb, o produto
de amplificação do primer 11, exclusivo de M. jelskii. Para a análise filogenética foi utilizado o método bootstrap
com busca neighbor-joining (programa PAUP 4.0), utilizando-se os 182 fragmentos obtidos pela técnica RAPDPCR. A árvore produzida mostrou que M. brasiliense constitui um ramo mais periférico sendo, portanto, a mais
diferenciada das três espécies em estudo. M. amazonicum e M. jelskii encontram-se filogeneticamente mais
próximas, constituindo ramos irmãos, com posição de dicotomia altamente significante (84%). Conclusão:
Os resultados obtidos ampliaram os conhecimentos sobre a evolução desses camarões dulcícolas, atestaram
a alta semelhança existente entre as espécies estudadas e demonstraram a eficiência da técnica de RAPDPCR para a obtenção de marcadores moleculares seguros, capazes de diagnosticar espécies muito próximas.
Apoio Financeiro: Fapesp
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Caracterização preliminar da Região Intergênica
Transcrita, ITS-1, do DNA ribossomal em espécies do
Gênero Macrobrachium.
Guerra, AL1,2; Lima, AVB1,2; Oliveira, SA2; Martins, LN; Taddei, FG3; Castiglioni-Ruiz, L1,2
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), Depto. de Biologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
UNESP, São José do Rio Preto/SP
2
Laboratório de Biologia Molecular - Hospital Veterinário “Dr. Halim Atique”. Campus II/ UNIRP (Centro Universitário de Rio Preto)
3
Laboratório de Zoologia - Depto. de Biologia. Campus I - UNIRP (Centro Universitário de Rio Preto)
[email protected]
1
Palavras-chave: Macrobrachium; palaemonídeos; polimorfismo genético; variabilidade genética; marcadores moleculares; ITS-1.
Introdução: Os camarões de água doce do gênero Macrobrachium possuem um importante valor econômico.
Esses camarões apresentam particularidades adaptativas quanto aos seus aspectos morfológicos, fisiológicos e de
padrões comportamentais que podem torná-los objetos de muitos estudos. Entretanto, pouco se sabe a respeito da
biologia desses organismos, uma vez que os trabalhos encontrados na literatura abordam, principalmente, aspectos
ecológicos. Um fato importante é a dificuldade taxonômica na classificação de algumas espécies de Macrobrachium,
com base apenas em características morfológicas. As espécies M. amazonicum e M. jelskii apresentam muitas
semelhanças morfológicas dificultando a identificação dos mesmos, este fato pode ser agravado por tratarem-se de
espécies sintópicas, ou seja, são coletadas juntas. Uma das formas de se compreender a evolução entre espécies é
a partir da análise de sequências do DNA ribossômico (rDNA). O rDNA possui seqüências intercalares, que variam
intra e interpopulacionalmente, e seqüências codificadoras altamente conservadas que servem como marcadores
para comparação entre táxons divergentes e até mesmo entre diferentes reinos. Com base na importância econômica
e ecológica das espécies analisadas, na ausência de trabalhos esclarecedores que abordem a biologia das mesmas,
o objetivo do presente estudo foi utilizar a região intergênica presente no rDNA, ITS-1, como ferramenta molecular
para ampliar o conhecimento biológico, genético e evolutivo dos camarões dulcícolas M. amazonicum e M. jelski.
Métodos: As amostras de M. amazonicum e M. jelskii, foram coletadas em diversas localidades pertencentes à
hidrografia do Rio Tietê. O DNA genômico foi extraído de fragmentos de músculos abdominais. Para a obtenção do
marcador molecular ITS-1 foram construídos oligonucleotídeos iniciadores, com base nas seqüências codificadoras
dos genes para o rDNA 18S e 5,8S de M. rosenbergii, depositadas no banco de dados público GenBank. Resultados:
As análises foram realizadas inicialmente por meio da comparação do polimorfismo dos tamanhos dos fragmentos
amplificados. Após o sequênciamento e o alinhamento dos fragmentos, a análise da variabilidade do ITS-1 nessas
duas espécies foram realizadas. Os oligonucleotídeos iniciadores foram sintetizados a partir do alinhamento e
comparação de regiões codificantes com o auxílio do programa BioEdit Sequence Alignment Editor Bioedit V. 4.0.
Para síntese do iniciador ITS-1 foram analisadas o final da sequência 18S e início da sequência 5,8S do rDNA que
originaram as sequências dos primer foward e reverse, respectivamente. Conclusão: Os resultados obtidos até o
momento corroboraram e ampliaram os conhecimentos sobre a evolução desses camarões dúlciculas. As técnicas
moleculares indicaram as semelhanças existentes entre as duas espécies estudadas, o que pode ser comprovado por
meio do sequênciamento da região ITS-1 do rDNA evidenciando o elevado grau de proximidade entre as mesmas.
Apoio financeiro: Fapesp e Capes
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Padrão de enzimas esterásicas em diferentes órgãos
de três espécies de camarões dulcícola
Oliveira, SA2; Lima, AVB1,2; Guerra, AL1,2; Martins, LN2; Taddei, FG3; Castiglioni-Ruiz, L1,2
Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), Depto. de Biologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
UNESP, São José do Rio Preto/SP
2
Laboratório de Biologia Molecular - Hospital Veterinário “Dr. Halim Atique”. Campus II/ UNIRP (Centro Universitário de Rio Preto)
3
Laboratório de Zoologia - Depto. de Biologia. Campus I - UNIRP (Centro Universitário de Rio Preto)
[email protected]
1
Palavras-chave: Macrobrachium; palaemonídeos; polimorfismo genético; variabilidade genética; marcadores moleculares; esterases.
Introdução: As esterases pertencem a um grupo de enzimas que hidrolisam, preferencialmente, os ésteres de
ácidos carboxílicos. Pertencentes a uma grande família multigênica, conservada evolutivamente, diferentes tipos
de esterases têm sido caracterizadas em inúmeros organismos. Os camarões dulcícolas, pertencentes ao gênero
Macrobrachium apresentam particularidades adaptativas quanto aos seus aspectos morfológicos e fisiológicos
que podem torná-los objetos de muitos estudos. Entretanto, pouco se sabe a respeito da biologia dos mesmos, uma
vez que os trabalhos encontrados na literatura abordam, principalmente, aspectos ecológicos. No presente estudo,
foi analisado o padrão eletroforético da atividade esterásica em fragmentos do músculo abdominal e na estrutura
ocular e de três espécies de camarões do gênero Macrobrachium: M. amazonicum, M.jelskii e M. brasiliense, a fim de
se obter o perfil isoenzimático nestes órgãos, ainda desconhecido nestas espécies. Métodos: machos e fêmeas das
três espécies em questão foram coletados em Mendonça (SP). Após a dissecação, os órgãos foram homogeneizados,
separadamente, em tampão de amostra e o extrato obtido foi submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida
a 10%, por aproximadamente cinco horas, com voltagem constante (200V). Após a eletroforese, os géis foram
corados a partir da coloração usual para esterases, a qual utiliza os corantes alfa e beta naftil acetatos. Também
foram realizados testes com diferentes inibidores, visando à classificação das enzimas esterásicas obtidas nestes
órgãos. Resultados: Com relação aos fragmentos de músculos abdominais analisados no presente estudo, foram
observadas sete bandas esterásicas, denominadas EST 1 a EST 7, a partir da extremidade mais anódica do gel. Os
dados relacionados ao uso de inibidores mostraram que todas as bandas analisadas, com exceção da EST 1, devem
ser classificadas como colinesterases. Na estrutura ocular foram identificadas onze bandas esterásicas (EST 1 a
EST 11), com variações interespecíficas, mas encontradas igualmente em ambos os sexos. O padrão de inibição
permitiu a classificação de todas as bandas como sendo colinesterases. Conclusão: O polimorfismo das enzimas
esterásicas observado nos fragmentos de músculos abdominais, juntamente com o padrão de inibição das mesmas,
indicaram provável envolvimento com a atividade de condução neural e degradação de neurotransmissores,
muito importantes na atividade de contração muscular. Com relação à estrutura ocular, a mesma é considerada
um órgão sensorial importante para os crustáceos. Assim, o alto polimorfismo visualizado neste órgão deve
corresponder à alta atividade de condução neural das fibras sensoriais que fazem parte desta estrutura.
Apoio financeiro: Fapesp
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Sistemática molecular da família Palaemonidae
(Decapoda, Caridea), inferida a partir de um marcador
do genoma mitocondrial
Souza, GO; Kersanach, R; D’Incao, F
Laboratório de Crustáceos Decápodes, Instituto de Oceanografia, Universidade Federal do Rio Grande – FURG
[email protected]
Palavras-chave: Palaemonidae, filogenia molecular, Citocromo Oxidase I, Palaemonetes argentinus.
A família Palaemonidae compreende um grupo de decápodes de bastante sucesso, que habitam ambientes
marinhos, estuarinos e dulcícolas em todo o mundo. É considerado um grupo natural mas as relações de
indivíduos desta família não são claras. Análises cladisticas baseadas na morfologia mostram claramente o
problema filogenético da família. Estes problemas são tanto ao nível específico quanto genérico. Como exemplo
tem-se a polifilia dos gêneros Macrobrachium e Palaemonetes. O uso de métodos moleculares para compreender
filogenia de grupos com dados morfológicos limitantes é cada vez mais comum. Estudos recentes baseados
em marcadores moleculares confirmam a situação polifilética em Macrobrachium, no entanto pouco se sabe a
respeito dos demais gêneros e suas relações. O objetivo deste trabalho é acrescentar a sequência de mais uma
espécie, Palaemonetes argentinus, nas análises para possibilitar uma melhor avaliação da filogenia da Família. O
DNA de P. argentinus foi extraído pelo método “Salt-in”, amplificado utilizando primers universais (Coi-A e Coi-F)
e sequenciado. Sequências da região COI foram obtidas no Genbank para Creaseria morleyi, Kakaducaris glabra,
Leptopalaemon sp., L. gagadjui Exopalaemon carinicauda, E. orientis, E. modestus, P. varians, Macrobrachium
inflatum, M. nipponense, M. edentatum, M. pinguis, M.asperulum e M. Pinguis. Como grupos externos foram utilizadas
sequencias das espécies Jonga serrei, Parisia unguis, Alpheus aequus e Synalpheus fritzmuelleri. As sequências foram
alinhadas utilizando o módulo ClustalW do programa Bioedit (versão 7.0.5.2). Análises filogenéticas foram feitas
utilizando o programa Tree-Puzzle (versão 5.2) com modelo de substituição HKY, 100000 passos de “Puzzle” e
a construção da árvore foi realizada pelo parâmetro de quartetos. Os dados obtidos se apresentaram bastante
consistentes, com alto poder de informação filogenética (93,6% de quartetos resolvidos). A árvore gerada mostrou
a polifilia do gênero Macrobrachium, o que está de acordo com outros estudos moleculares e morfológicos sobre
a gênero. P. argentinus não se agrupou com P. varians, levando a crer que o gênero Palaemonetes também não
seja monofilético. Pelo presente trabalho, percebe-se que Macrobrachium realmente seja um gênero polifilético
e há indícios de que Palaemonetes se comporte da mesma forma, suportando os dados morfológicos descritos.
Apoio financeiro: CAPES
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Comportamento meiótico de Edessa collaris
(Heteroptera, Pentatomidae, Edessinae)
Almeida, EC; Souza, HV; Itoyama, MM
UNESP - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, Laboratório de
Citogenética e Molecular de Insetos, São José do Rio Preto, SP
[email protected]
Palavras-chave: Lobo harlequin, espermatogênese, espermiogênese, meiose, cariótipo
Os Heteroptera possuem testículos subdivididos em compartimentos ou lobos. O número mais comum é de sete,
embora haja variações entre tribos e espécies. Possuem, ainda, cromossomos holocêntricos (sem centrômero
organizado), nenhuma estrutura cinetocórica está presente nas células meióticas, atividade cinética é restrita
aos finais dos cromossomos, ou seja, nas regiões teloméricas (cromossomos são denominados telocinéticos),
terminalização dos quiasmas é presumido ocorrer e a primeira divisão meiótica é reducional para os autossomos
e equacional para os sexuais. O gênero Edessa é o maior de família Pentatomidae, com cerca de 260 espécies
descritas até o momento. Relatos citogenéticos de espécies de Pentatomidae mostram número diplóide de
cromossomos, em machos, de 6 a 27, sendo o mais frequente o de 14 cromossomos (85%). Com o objetivo de
ampliarmos as informações referentes à família Pentatomidae analisamos a espermatogênese de Edessa collaris,
após coloração com orceína lacto-acética. Após dissecação dos machos adultos verificamos que os testículos de
E. collaris são alongados e recobertos por membrana amarelada e constituídos de 4 lobos de mesmo tamanho.
Para verificarmos a presença ou não de lobo harlequin, os testículos tiveram os lobos individualizados e
analisados separadamente, chegando-se à conclusão de que esta espécie não o possui, por este motivo os dados
de todos os lobos foram agrupados. Nos testículos tivemos a oportunidade de visualizar metáfases mitóticas
constituídas de 12 cromossomos e núcleos poliploides. Além destas células visualizamos: a) prófases I com um
corpúsculo heteropicnótico arredondado e intensamente corado, b) cromossomos com associações teloméricas,
c) metáfase I com os autossomos em anel e no seu centro os cromossomos sexuais, podendo-se verificar que o
complemento cromossômico é de 2n= 10A + XY, d) anáfase e telófase com distribuição regular dos cromossomos,
e) metáfase II com os autossomos em anel e os sexuais, XY, no centro formando uma estrutura semelhante a
um pára-quedas, f) espermátides arredondadas recém-formadas com material heteropicnótico distribuído
irregularmente pela célula, g) espermátides iniciais com uma vesícula grande ao lado do núcleo, h) espermátides
elípticas com material heteropicnótico em apenas um dos lados da célula, i) espermátides em fase final do
desenvolvimento sem material heteropicnótico. De maneira geral as características descritas anteriormente
para E. collaris foram semelhantes às descritas na literatura para outras espécies da família Pentatomidae.
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Análise de marcadores do genoma mitocondrial
de espécies de moscas de importância forense
(Diptera: Sarcophagidae) no contexto da identificação
taxonômica molecular
Rodrigues, EL1; Mello-Patiu, CA2; Lessinger, AC1
Laboratório de Genética Molecular, Universidade Federal de São Carlos campus Sorocaba
Setor de Diptera – Departamento de Entomologia, Museu Nacional do Rio de Janeiro/ Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNA barcoding, Sarcophagidae, DNAmt, biodiversidade.
A família Sarcophagidae possui aproximadamente 2.600 espécies, das quais 622 estão distribuídas na região
Neotropical. Nesta família, a identificação das espécies é uma questão complexa que requer amplo conhecimento
taxonômico. A avaliação de metodologias de identificação com base em sequências DNA é uma nova abordagem
que pode contribuir no esforço de caracterização destas espécies. Um trecho de 658pb do gene COI (sub-unidade
I do complexo Citocromo Oxidase) têm sido empregado no contexto da análise de “DNA barcodes”, assim como
outras regiões do DNAmt. O objetivo deste trabalho é avaliar o potencial informativo do gene COI para promover
a identificação de espécies da família Sarcophagidae em um contexto integrado às análises morfológicas. Os
espécimes foram coletados usando iscas em decomposição em Cerrado e Mata Atlântica, sendo identificados
pela análise de imagens digitalizadas das genitálias masculinas. O tórax dos indivíduos coletados foi removido
e armazenado em etanol absoluto a -200C ou via seca a -700C visando posterior análise. Os aedeagos foram
preservados como material testemunho (voucher). A extração de DNA foi realizada utilizando-se o tórax seguindo
as instruções do sistema Invisorb Spin Tissue Mini (Invitek). Sequências do gene COI foram amplificadas via
PCR utilizando-se os “primers” L2-N-3014 e C1-J-2195. Além disso, dois novos “primers” foram identificados pela
análise de alinhamentos dos genes COI e COII de dípteros caliptrados e estão sendo testados para amplificar
uma região gênica mais ampla. Visando análises mais abrangentes do genoma mitocondrial foram testadas
combinações de “primers” de PCR de longa-extensão (H16SB/HCOII e H16SA/HCOIII). Até o momento foram
coletados 165 espécimes, abrangendo 16 espécies de sarcofagídeos, onde Oxysarcodexia thornax foi a espécie
mais abundante (64%). Uma região de aproximadamente 850 pb foi satisfatoriamente amplificada para nove
espécies: Oxysarcodexia thornax, O. admixta , O. culmiforceps, O. parva, Peckia (Peckia) pexata, P. (Euboettcheria)
australis, P. (Euboettcheria) anguilla, Sarcodexia lambens e Ravinia advena. Reações de amplificação referentes a P.
(Squamatodes) ingens, P. (Euboettcheria) collusor e P. (Pattonella) intermutans estão sendo conduzidas utilizando-se
novos “primers” elaborados a partir de reformulações em “primers universais” (região COI/COII - 2300pb). Com
relação aos resultados de PCR de longa-extensão, uma região de 9.6 Kb foi amplificada nas espécies O. thornax e
R. advena, a partir da combinação de “primers” H16SB/HCOII, e está sendo testada para as demais espécies. Neste
trabalho apresentamos a padronização da reação de amplificação de um trecho do gene COI para 9 espécies de
Sarcophagidae, a elaboração de novos “primers” táxon-específicos para promover a caracterização de sequências
do DNAmt nestas espécies e o potencial de estratégias de PCR de longa-extensão para estudos do genoma
mitocondrial neste grupo.
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Presença de AT/GC na cromatina de células de
Triatoma infestans e Panstrongylus megistus
(Hemiptera, Reduviidae): estudo com microscopia de
fluorescência
Alvarenga, EM1; Mondin, M2; Rodrigues, VLCC3; Mello, MLS1
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo (USP), Piracicaba, SP, Brasil
(3)
Superintendência de Controle de Endemias (SUCEN), Mogi Guaçu, SP, Brasil
[email protected]
(1)
(2)
Palavras-chave: Heterocromatina, Triatoma infestans, Panstrongylus megistus, DAPI, Cromomicina A3, Microscopia de fluorescência.
Introdução: Em hemípteros reduviídeos o DNA é especialmente rico em bases AT. Em núcleos de T. infestans e P.
megistus essa riqueza, demonstrável por ensaios citoquímicos clássicos, ocorre nos seus corpos heterocromáticos
(cromocentros). Nas áreas heterocromáticas de núcleos de T. infestans não foi constatada, por ensaios com
enzimas de restrição, presença significativa de citosinas metiladas ou não-metiladas, porém suspeita-se que estas
possam ocorrer em algumas áreas eucromáticas. A presença de AT e GC poderia ser determinada pela utilização
de corantes fluorescentes, como o 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), com afinidade por AT, e a cromomicina A3
(CMA), com afinidade por GC. Objetivos: Esclarecer a presença e a localização de bases AT/GC no DNA de áreas
heterocromáticas e eucromáticas de núcleos de T. infestans e P. megistus com fluoróforos que possam discriminálas ao nível microscópico. Métodos: Túbulos de Malpighi de T. infestans e P. megistus foram fixados em etanol–ácido
acético (3:1, v/v), levemente esmagados e corados com CMA (0,5 mg/mL), DAPI (2 µg/mL) e associações destes a
bloqueadores de ligações inespecíficas, como os antibióticos distamicina e actinomicina D, respectivamente. Os
preparados foram analisados em microscópio de fluorescência com sistema de captura de imagens Zeiss Kontron
KS400-3. Resultados: A análise de imagens permitiu-nos inferir que em T. infestans a afinidade por DAPI, salientando
presença de AT, mostrou-se distribuída uniformemente na eucromatina, mas com concentração elevada nos
cromocentros. A CMA apresentou afinidade fraca e uniforme na eucromatina, concentrando-se geralmente como
um anel na periferia dos corpos heterocromáticos. Quanto a P. megistus, seu cromocentro mostrou-se intensamente
corado pelo DAPI, denotando riqueza em AT; quanto à resposta ao tratamento com CMA, foi possível perceber apenas
uma distribuição homogênea na eucromatina, ocorrendo imagem negativa no corpo heterocromático. A afinidade
por DAPI foi, pois, maior do que aquela por CMA, sendo muito intensa nos cromocentros de ambas as espécies. A
associação de DAPI com actinomicina D favoreceu um aumento do contraste entre eucromatina e heterocromatina
e a associação de CMA à distamicina diminuiu o contraste em fluorescência. Conclusões: O padrão reverso de
coloração observado entre CMA e DAPI, em especial após avaliação da contribuição de fluorescência inespecífica,
garante maior exatidão nas análises, comprovando o alto teor de bases AT na heterocromatina de T. infestans e de
P. megistus. Essa elevada resposta positiva ao DAPI nos corpos heterocromáticos de ambas as espécies também
está em concordância com uma suposta baixa densidade e atividade gênicas aí observadas. A presença de uma
afinidade mais forte à CMA na periferia dos corpos heterocromáticos de T. infestans pode estar associada à presença
na mesma das NORs, identificadas especificamente por este corante em núcleos de outras espécies de insetos.
A grande atividade de transcrição observada nessas NORs poderia, portanto, refletir riqueza em conteúdo GC.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP e Faepex
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Aspectos ecológicos e sanitários da Doença de Chagas
com participação da comunidade do Bairro BNH na
Cidade de Barra do Garças, Mato Grosso
Arrais-Silva, WW1; Ivairton, RRL1; Souto, PCS1; Andrade Neto, OA2; Arruda, MCC2
Universidade Federal de Mato Grosso, Campus de Pontal do Araguaia, Rodovia MT 100, Km 3,5, Instituto Universitário do Araguaia,
Setor Universitário, CEP 78698-000 - Pontal do Araguaia, MT – Brasil
2
Universidade do Estado de Mato Grosso, Mestrado em Ecologia e Conservação, Campus de Nova Xavantina, Rod BR 158 KM148, Cx.P.
08, Nova Xavantina, MT, CEP 78690-000, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Doença de Chagas, Intradomicílio, Peridomicílio, Recrudescência, Sinantropia, Tripanossomíase, Vetores
Introdução: A existência da doença de Chagas atingiu a extensão geopolítica do município de Barra do Garças,
situado ao pé da Serra Azul, uma continuidade da Serra do Roncador, registrando presença do vetor Triatoma
williami, inclusive em unidades domiciliares. Com o aparecimento de triatomíneos no bairro BNH é necessário a
realização de uma pesquisa exploratória, entre os moradores, que permita identificar o conhecimento básico sobre
tripanossomíase e seus vetores, no âmbito ecológico, devido à localização do bairro ficar na encosta da serra do
Parque Serra Azul. Objetivo: Avaliar alguns aspectos da doença de Chagas na população urbana do bairro BNH,
visando abordar o nível de conhecimento de seus residentes em relação à tripanossomíase e a caracterização de
seus vetores, no município de Barra do Garças-MT, abordando aspectos ecológicos e sanitários da doença de Chagas
local. Métodos: A estratégia de coleta dos dados nos 376 domicílios georeferenciados foi por meio da aplicação de um
questionário estruturado composto de oito questões categorizadas, de modo a obter do respondente sua percepção
sobre as variáveis escolhidas para avaliar a qualidade das informações e do ambiente analítico. Todas as entrevistas
foram realizadas após aceite do termo de consentimento livre. Para a análise dos dados, contidos no questionário,
foi utilizado o programa ArcView GIS versão 3.2, enquanto os dados de posicionamento global foram aferidos com
GPS Garmin 60 CSx. Resultado: As análises obtidas mostram um possível potencial de recrudescência da doença
de Chagas, mesmo com o certificado de interrupção de transmissão vetorial e, também um potencial sinantropico
do vetor T. williami. Conclusão: Frente à atual condição sanitária do Brasil, a comunidade científica deve propor
aos órgãos públicos de controle epidemiológico/sanitário uma maior atenção ao combate e controle da doença
de Chagas. O processo de ocupação desordenado e o desmatamento do hábitat natural veem contribuindo para
drásticas mudanças ambientais, aumentando a invasão de espécies selvagens, além da existência de diversidade
de espécies de triatomíneos com potencial de transmissão. Há um enorme desafio para evitar a recrudescência
da transmissão de doença de Chagas, uma vez que um dos vetores tem apresentado alto grau de sinantropia.
Apoio financeiro: CAPES
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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238
Isolamento e caracterização de locos microssatélites
em Anopheles nuneztovari sensu lato (Diptera:
Culicidae) da Amazônia, Brasil
Cardoza, TB1; Sousa, ACB2; Cidade, FW2; Campos, T2; Lima, MP3; Souza, AP2; Scarpassa, VM4
Mestrandra do Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva do INPA (Manaus, AM)
CBMEG-UNICAMP (Campinas, SP)
3
Bolsista de DTI do INPA (Manaus, AM)
4
Pesquisadora do INPA (Manaus, AM)
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Microssatélites, Anopheles nuneztovari, Malária, Complexo de espécies.
Introdução: Anopheles nuneztovari é considerada um importante vetor da malária humana no norte e oeste da
Colômbia e oeste da Venezuela. Na Amazônia brasileira, embora esta espécie tenha sido encontrada infectada
com o parasito da malária, o seu envolvimento na transmissão é bastante controverso. Estudos genéticos
recentes indicam a existência de cinco “linhagens” dentro do táxon A. nuneztovari, que podem diferir quanto à
capacidade de transmitir o agente etiológico que causa a malária. Neste sentido, estudos genéticos adicionais
com marcadores microssatélites podem auxiliar a esclarecer as relações genéticas entre estas linhagens e
proporcionar uma melhor compreensão da dinâmica de transmissão da malária envolvendo esta espécie
na Amazônia brasileira. Objetivos: Com o objetivo de caracterizar a estrutura genética de populações de A.
nuneztovari foram desenvolvidos marcadores microssatélites a partir de uma biblioteca genômica enriquecida
com seqüências de CT8 e GT8. Material e Métodos: No desenvolvimento das bibliotecas, os mosquitos procederam
das periferias das cidades de Manaus (Amazonas) e de Macapá (Amapá). O DNA genômico foi extraído com
fenol e clorofórmio e os fragmentos de interesse foram selecionados, inseridos em bactérias competentes e,
em seguida, os 192 clones positivos foram sequenciados no Analisador de DNA, ABI 3130. As sequências foram
editadas e clusterizadas nos Programas EditSeq e SeqMan do pacote LASER GENE, versão 5.03 (DNAStar Inc.,
Madison, WI, E.U.A.). As regiões contendo os microssatélites foram localizadas com o auxílio do Programa SSRITGramene e os pares de primers foram desenhados com o Programa PrimerSelect (DNAStar Inc.). Resultados: A
partir do sequenciamento dos 192 clones foi possível desenhar 58 pares de primers flanqueadores das regiões
de microssatélites. Observou-se microssatélites com diferentes motivos de repetições. Dentre eles, 70,69%
foram dinucleotídeos, 15,52% trinucleotídeos, 8,62% tetranucleotídeos e 5,17% pentanucleotídeos, sendo 79,31%
microssatélites simples perfeitos, 8,62% simples imperfeitos e 12,07% compostos perfeitos e imperfeitos. Dos
12 locos microssatélites dinucleotídeos, validados até o momento, oito mostraram-se polimórficos e quatro
monomórficos. Conclusão: Esses resultados comprovam a eficiência dos marcadores microssatélites para
determinar o polimorfismo e futuramente caracterizar, no nível molecular, as linhagens de A. nuneztovari.
Apoio financeiro: CNPq/CT-Amazônia, FAPEAM e PROCAD-CAPES
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239
Variação isoenzimática em populações da espécie
Drosophila antonietae (Diptera; Drosophilidae) da
região média da bacia dos rios Paraná-Uruguai
Lorenci, M; Mateus, RP; Machado, LPB
Laboratório de Genética e Evolução, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Centro-Oeste
[email protected]
Palavras-chave: Isoenzimas, Variabilidade genética, Drosophila antonietae, Heterozigosidade, Rio Iguaçu, Drosophila cactofílica.
As populações naturais de Drosophila antonietae estão associadas à presença do cacto Cereus hildmaniannus e,
portanto, podem ter seguido as suas expansões e retrações paleoclimáticas dos períodos terciário e quaternário.
Seria esperado um certo grau de diferenciação entre as suas populações, porém estudos com marcadores
independentes evidenciaram homogeneidade genética e sugeriram a existência de fluxo gênico entre elas. Em
vista disso, o objetivo deste trabalho foi analisar o padrão isoenzimático de duas populações naturais de Drosophila
antonietae de ocorrência na bacia do rio Iguaçu, região intermediária às áreas previamente estudadas, a fim de
obter um levantamento da variabilidade genética para este marcador nesta região. Coletas com armadilhas
abertas (latas), contendo iscas compostas de banana, laranja e fermento biológico fresco, foram realizadas no
Rio do Poço (25o28’67”S; 51o87’62W) e em Cantagalo-PR (25o28’67”S; 51o87’62”W), na bacia do rio Cavernoso,
pertencente à bacia do rio Iguaçu. Os machos da espécie D. antonietae foram identificados através do edeago e
as fêmeas foram colocadas para a formação de isolinhagens e posterior identificação. A cabeça dos indivíduos
de D. antonietae coletados foi armazenada em álcool 70% à -20º C para utilização em posteriores experimentos
moleculares. O restante do corpo foi congelado individualmente a seco em tubos a -20º C e foram utilizados
nas análises isoenzimáticas. Foram avaliados oito sistemas isoenzimáticos, ADH, EST, GPDH, HK, IDH, ME,
MDH e PGM, em géis de amido (Penetrose 30™) a 14%. A análise dos dados foi realizada através do programa
TFPGA. Dez locos isoenzimáticos foram evidenciados, apresentando no máximo 5 alelos. Apenas 70% dos
locos foram polimórficos. Os locos Adh-2, Hk-1 e Mdh foram monomórficos. As heterozigosidades médias
observadas variaram entre 0,1429 (Me) e 0,8 (Hk-3). As esperadas variaram entre 0,398 (Idh) e 0,7502 (Est-1). As
heterozigosidades médias observadas no total (0,3508), para a população do Rio do Poço (0,3561) e para Cantagalo
(0,2362) foram maiores do que as obtidas previamente para espécies de Drosophila cactofílicas (0,087) e não
cactófilas (0,160). Estas populações da região intermediária de ocorrência da espécie apresentaram juntas maior
variabilidade genética isoenzimática do que a maioria das populações anteriormente analisadas, o que evidencia
a importância da amostragem desta região para estudos de diferenciação e da história evolutiva desta espécie.
Apoio financeiro: Fundação Araucária, CNPq, CAPES e UNICENTRO
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240
Estrutura genética em populações de Aedes
(Stegomyia) aegypti (Diptera: Culicidae) da Amazônia
brasileira por marcadores microssatélites
Lima, SFA1; Batista, JS2; Formiga, KM2; Tadei, WP 3; Santos, JMM 3
¹ Universidade Estadual do Maranhão, UEMA/CESC, Caxias, MA
² Laboratório Temático de Biologia Molecular, Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução - Coordenação de Pesquisas em
Biologia Aquática - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Manaus, AM
3
Laboratório de Malária e Dengue - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/ Escola Superior de Saúde – Universidade do Estado
do Amazonas, Manaus, AM
[email protected]
Palavras-chave: Aedes aegypti, microssatélites, vetor da dengue, bacia amazônica, genética de populações
Introdução: O Aedes aegypti é originário do continente africano e considerado de grande importância epidemiológica,
por ser o principal vetor dos quatro sorotipos do vírus da dengue e da febre amarela. A presença desse vetor nas
áreas urbanas tem se tornado um grande problema de saúde pública em regiões tropicais, provocando anualmente
milhares de casos de dengue e de febre hemorrágica. Objetivos: Considerando a importância epidemiológica desse
vetor e a eficiência dos marcadores microssatélites em estudos de genética de populações, foram analisados oito
locos microssatélites para estimar a variabilidade genética em quatro populações da Amazônia brasileira e obter
dados sobre a estrutura genética de suas populações, que possam subsidiar em programas de controle desse vetor.
Métodos: As amostras de DNA obtidas de Porto Velho (RO), Boa Vista (RR), Santarém (PA) e São Luis (MA) foram
extraídas pela técnica de acetato de potássio e posteriormente quantificadas. As amplificações de genotipagem
foram realizadas, de forma que cada loco foi marcado com as fluorescências, FAM ou HEX. A genotipagem de 129
indivíduos foi realizada em sequenciador de DNA Megabace 1000, em sistema multiplex, e tamanho dos alelos obtidos
utilizando o programa Genetic Profiler 2.2. Nas análises estatísticas foram utilizados os programas ARLEQUIN 3.1,
TFPGA 1.3, POPGENE e STRUCTURE 2.3.2. Resultados: O número total de alelos detectados por loco nas quatro
populações variou de 3 a 21, enquanto que o número médio de alelos por loco/população variou 5,12 a 7,12. A
heterozigosidade média observada variou de 0,42 a 0,61 e a esperada foi de 0,50 a 0,66. Entre as quatro populações,
Boa Vista mostrou apenas um loco em desequilíbrio genético, enquanto que, para as populações de Porto Velho,
Santarém e São Luís, dois a três locos estavam em desequilíbrio gamético. Os resultados da AMOVA mostraram
que 68,03% da variação foram verificadas dentro das populações, 23,67% entre grupos dentro das populações,
e apenas 8,29% entre elas. O valor de FST foi significativo (FST= 0.083; P= 0,0083 < 0,05), indicando diferenciação
genética entre as populações. O Teste de Mantel não mostrou nenhuma correlação entre as distâncias geográfica
e genética. A análise Bayesiana implementada no programa STRUCTURE 2.3.2, evidenciou a existência de dois
clusters distribuídos em três grupos, confirmando uma moderada estruturação populacional. Com base na distância
genética foi possível construir um dendrograma, que separou também as quatro populações em dois clusters: 1Santarém/São Luís; 2- Porto Velho/Boa Vista. Conclusões: Desta forma, os resultados desse trabalho mostram
estas populações de A. aegypti num processo inicial de estruturação genética, decorrente principalmente, da ação
antrópica, que favorece uma forte pressão de seleção, pelo uso constante de inseticidas no controle desse vetor.
Apoio financeiro: PROCAD/CAPES, CTPETRO, FAPEAM e INPA
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241
Atividade alozimática em amostras preparadas para
análises morfométricas e moleculares em duas
espécies de Drosophila do grupo guarani (Diptera:
Drosophilidae)
Silva, DC; Mateus, RP; Machado, LPB; Santos, K; Trava, BM
Laboratório de Genética e Evolução, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Centro-Oeste
[email protected]
Palavras-chave: Alozimas, Expressão corporal, Marcadores genéticos, Drosophila, Atividade enzimática, grupo guarani.
O nível de variação genética dentro das populações tem recebido considerável atenção, pois pode ser um indício da
vitalidade total de espécies e do seu potencial para responder evolutivamente às mudanças ambientais. Tal variação
tem sido verificada através de diversos marcadores morfológicos e moleculares, que combinados produzem
melhores resultados sobre a história evolutiva e estrutura genética de populações. A eletroforese de isoenzimas
tem sido utilizada em pesquisas populacionais e evolutivas de diversos organismos, incluindo Drosophila, pelo
fato de fornecer uma forma direta de avaliar a variabilidade genética de populações através do produto direto do
gene. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade alozimática em indivíduos de duas espécies de Drosophila
do grupo guarani, D. ornatifrons e D. maculifrons, após a separação de amostras para trabalhos com marcadores
morfológicos e moleculares. Para tanto, foram comparados os padrões de sete sistemas alozimáticos (GPDH,
EST, IDH, LAP, MDH, ME e PGM) de amostras de indivíduos inteiros e de partes separadas do corpo, tais como,
cabeça, tórax (com e sem asas), e abdômen (com e sem edeago). Para GPDH foi detectado apenas um loco nas
duas espécies, que apresentou a maior parte da sua expressão no tórax. Para as esterases, foi observado um loco
para D. ornatifrons e dois para D. maculifrons, sendo o primeiro loco com maior expressão no tórax e o segundo
mais fracamente detectável no corpo todo. Um loco específico do abdômen foi detectado esporadicamente em
D. ornatifrons. Para IDH, LAP e PGM foi observado apenas um loco em cada. Para MDH, foi detectado um loco
catódico, que teve maior expressão no tórax e abdômen, e outro anódico, com maior expressão no abdômen.
E para ME, apenas um loco foi evidenciado, o qual apresentou maior expressão no abdômen. Os resultados
encontrados demonstram que não há diferença no padrão de expressão corporal das alozimas analisadas, o que
indica que a cabeça pode ser separada para futuras análises de marcadores de DNA, e que a remoção de das
asas e do edeago para análises morfométricas também não afetou os resultados obtidos. A atividade alozimática
parece ser muito mais afetada pela qualidade das amostras (se foram descongeladas várias vezes, e o tempo
para estocagem durante a identificação e/ou manipulação, etc.) do que pela separação de partes do corpo.
Apoio financeiro: Fundação Araucária, CNPq, CAPES, FINEP e UNICENTRO
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242
Fotomapa dos cromossomos politênicos de Anopheles
darlingi, principal vetor da malária neotropical
Rafael, MS1; Rohde, C2; Bridi, LC3; Valente, VLS4; Tadei, WP1
Laboratório de Vetores da Malária e Dengue - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
Centro Acadêmico de Vitória – Universidade Federal de Pernambuco
3
Bolsista CNPq
4
Departamento de Genética –Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Anopheles darlingi, inversões, fotomapa, malária, Amazônia brasileira.
Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi Root, 1926 é o vetor primário da malária e o anofelino mais antropofílico e
endofágico das Américas. Na bacia amazônica brasileira, esse mosquito é o mais importante vetor da malária
humana. A relevância do A. darlingi como transmissor da malária está na existência de diversos estudos sobre
isoenzimas, comportamento, estrutura genética, biologia, cariótipo metafásico, mapeamento e polimorfismo
cromossômico. A presente descrição do Fotomapa para a espécie favorecerá estudos sobre aspectos evolutivos
e de sintenia. As fêmeas de A. darlingi foram coletadas na localidade de Guajará-Mirim, Estado de Rondônia.
As amostras de adultos fêmeas foram transportadas ao insetário do Laboratório de Vetores de Malária e
Dengue - INPA, para identificação taxonômica e oviposição em copos plásticos individuais. Após a eclosão dos
ovos, as larvas foram alimentadas com farinha de peixe e atingiram o 4o estádio, quando foram utilizadas nas
preparações cromossômicas. O fotomapa do A. darlingi foi construído, a partir de microfotografias de diversos
núcleos politênicos considerando a representatividade do padrão de bandeamento. As microfotografias foram
capturadas em microscópio de luz e processadas com auxilio de scanner, utilizando os programas Adobe
Photoshop (Adobe, 2002 7.0, v 701, San Jose, California, Adobe Sytems Inc) e Corel Draw (Corel-DRAW´10 2000,
10.410, Corel Corporation). Todos os cromossomos foram divididos em seções representadas por números e, as
subseções por letras maiúsculas, começando com a letra A na região distal. Os cromossomos foram divididos em
45 seções, mas a denominação de cada inversão paracêntrica anterior foi mudada. Então, os diversos rearranjos
de inversões heterozigotas no cromossomo X e nos autossomos 2 (braços cromossômicos 2R e 2L) e 3 (braços
cromossômicos 3R e 3L) foram identificados por letras maiúsculas, em ordem alfabética de acordo com a
descrição anterior. O número de seções no mapa de referência de A. darlingi anterior foi mantido e as subseções
novas foram adicionadas aos cinco braços cromossômicos como, por exemplo, nas seções 2 e 4 do cromossomo
X, subdividido dentro de três subseções. Pontos de quebra das inversões paracêntricas foram incorporados no
fotomapa da espécie. A maior inversão já descrita para A. darlingi foi registrada, denominada 3Lc, totalizando
14 inversões nos braços dos cromossomos politênicos de A. darlingi. O resultado foi um fotomapa com seções e
subseções bem distribuídas. O fotomapa proposto é potencialmente útil para mapeamentos in silico e in situ de
sequências do transcriptoma e genoma completo de A. darlingi em seus núcleos politênicos, para elucidar questões
evolutivas. Além disso, em nossa tentativa de comparar as seções do braço do cromossomo 2R de A. darlingi
com Anopheles funestus, Anopheles stephensi e Anophele gambiae, encontramos grandes diferenças no arranjo
das bandas dos cromossomos politênicos, que são consistentes com a divergência filogenética dessas espécies.
Apoio financeiro: FAPEAM (PIPT/2008), CAPES/PROCAD Amazônia (Processo nº 023/2006), MCT/INPA (Processo
nº 014/2008), PIATAM/Petrobrás, FACEPE (Processo nº APQ-0757-2.02/06) e CNPq
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243
Study of hybrid zones in the Trigona carbonaria
complex (Hymenoptera, Apidae, Meliponini) through
molecular tools
Brito, RM1; Oldroyd, BP3
1
2
INGEB/UFU
University of Sydney (School of Biological Sciences)
Keywords: Meliponini; hybridization; microsatellites; mitochondrial DNA; population genetics
In Australia, the endemic Trigona carbonaria group of stingless bees comprises at least 4 similar species (T.
carbonaria, T. hockingsi, T. davenporti and T. mellipes) whose identification is difficult due to morphological
variations along latitudinal clines and the occurrence of sympatric species. Nest architecture is the primary means
used for distinguishing the species. The present work aimed to genetically analyse populations of T. carbonaria and
T. hockingsi populations along Queensland state in order to understand the genetic structure of the contact zone
between the two species. A total of 282 samples have been collected within the region of the two putative contact
zones in South and North Queensland. Sequencing of two mitochondrial genes (16S and COI) resulted in highly well
assigned molecular species identifications. Based on this marker, Trigona carbonaria has shown to be monophyletic
while T. hockingsi is paraphyletic. Interestingly, Trigona hockingsi from North Queensland presented different
haplotypes from bees from Southern region. Also, it was possible to distinguish other species using the molecular
data such as Trigona sapiens, Trigona clypearis and Austroplebeia, later confirmed by morphological traits. We also
genotyped nine polymorphic microsatellite loci for all samples using primers designed from T. carbonaria genome.
Genetic distance of Nei and Fst values were low between geographic sub-groups of each species. However, Fisher’s
exact test results pointed genotypic differentiation for most pairs of sub-groups, as would be expected between
groups from different species. We could not point out introgressions of species specific mitochondrial haplotypes
into specific genotypes, discriminated by exclusive alleles from most loci. In spite of morphological traits not being
sufficiently clear for species discrimination, no evidence of hybridization has been found in the present work.
Financial support: CNPq; Endeavour Awards; FAPEMIG
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Atividade esterásica em populações de Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) do agreste paraibano
Silva, DBS1; Filho, MLL1; Martins, WFS1; Beserra, EB1
Laboratório de Controle Biológico, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual da Paraíba
[email protected]
1
Palavras-chave: dengue, insetos vetores, isoenzimas, esterase.
Aedes (Stegomyia) aegypti (L.) é uma das principais pragas urbanas por ser o vetor da febre amarela e da dengue. As
estratégias de controle desse vetor estão baseadas na utilização de produtos químicos e biológicos, integrados com
programas de manejo ambiental. No Brasil, os programas que visam o controle do A. aegypti utilizam principalmente
inseticidas químicos, onde se destacam os organofosforados e piretróides. No entanto, seu uso continuado tem
provocado o aparecimento de populações resistentes a estes compostos, especialmente devido a mecanismos
de resistência metabólica que aumentam a atividade de enzimas detoxicantes como S-transferases, Esterases e
Oxidases de Função Mista, que contribuem para a inativação dos inseticidas no organismo dos insetos. Desta forma,
este trabalho teve como objetivo verificar o padrão esterásico em populações de A. aegypti do Agreste paraibano. As
coletas foram realizadas nos municípios de Esperança e Serra Redonda utilizando armadilhas do tipo ovitrampas.
Posteriormente, em laboratório foram obtidas cinqüenta larvas L4 de cada município. O homogenato protéico de
cada larva foi submetido à eletroforese em géis de poliacrilamida 7,5%. A identificação da atividade esterásica nos
géis foi realizada utilizando á- e â- naftil acetato como substrato. Os resultados preliminares revelaram a presença
de sete regiões com atividade esterásica denominadas de EST-1 a EST-7, sendo a região EST-7 exclusiva para a
população de Serra Redonda. A maioria dos locos detectados foram monomórficos, com exceção de Est-3, o qual
apresentou dois alelos nas duas populações, e Est-1 e Est-2, polimórficos apenas na população de Serra redonda.
A análise de freqüência dos dez alelos detectados nas populações revelou que a proporção de locos polimórficos
da população de Serra Redonda (42,85%), e quase três vezes maior que a visualizada na população de Esperança
(16,6%). A variação genética observada nas populações estudadas sugere que a ampliação das análises poderá
auxiliar na identificação de padrões de atividade esterásica que diferenciem populações resistentes e suscetíveis.
Apoio financeiro: PROPESQ/UEPB
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Genetic diversity and interpopulation relationships in
Triatoma maculata: a comparison of three molecular
markers
Santos, WS1; Pavan, MG2; Barrett, TV3; Monteiro, FA2; Abad-Franch, F1
Instituto Leônidas e Maria Deane – Fiocruz Amazônia, Rua Teresina 476, 69057-070 Manaus, Amazonas, Brazil
Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ, Departamento de Medicina Tropical, Rio de Janeiro, Brazil
3
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia – INPA, Departamento de Pesquisas em Entomologia, Av. André Araújo, 2936, Aleixo,
69060-001, Manaus, Amazonas, Brazil
Corresponding author: [email protected]
1
2
Keywords: Triatoma maculata, cytb, COI, ITS-2, Roraima
Gene sequencing can help ascertain interpopulation relationships and the levels of genetic diversity within a
vector species, thus assisting in the design of rational control strategies. However, because sequencing methods are
costly and labor-intensive, multilocus analyses are still infrequent in triatomines. Determining which molecular
marker is best suited for tackling species- or population-level questions is particularly relevant under such
practical constraints. We compared the performance of three DNA-markers in recovering the patterns of genetic
diversity and relationships in three geographic populations of Triatoma maculata from Roraima. We sequenced
two mitochondrial genes (cytb, N=79, and COI, N=41) and one ribosomal spacer (ITS-2, N=42); the alignments
were surveyed for genetic diversity (in Mega 5.0) and used to construct median-joining networks (Network 4.5.1.6).
The number migrants exchanged between populations was evaluated based on the sequence data for both
mitochondrial gene fragments using the software Migrate-n 3.1.6. The nuclear ITS-2 data was not subjected to this
analysis as the multicopy nature and “concerted” mode of evolution render it unsuitable for population genetics
inferences. Seventeen out of 682 cytb nucleotides were variable (2.5%), yielding 19 haplotypes with 13 parsimonyinformative and four autapomorphic transitions; five positions were variable in the deduced amino acid sequence.
Eleven haplotypes were identified in the 632-bp COI alignment; variable sites (20 silent transitions, 3%) included
two singletons. All the differences identified in the ITS-2 alignment involved microsatellite repeat number variation,
which resulted in 11 unique sequences. Although COI is somewhat more variable than cytb, both gene fragments
recover congruent patterns of interpopulation relationships. Network analyses consistently suggest, for all three
markers, that T. maculata populations are tightly interconnected within a metapopulation at the spatial scale we
studied. Gene flow inferences showing unidirectional migration of specimens from a single population to the other
two populations (3-16 individuals per generation), further support the results above. Focal household spraying
may thus be ineffective, and wide coverage will probably be key to the control of this vector species in Roraima.
Financial support: PAPES-FIOCRUZ; PPI-INPA 1-0705; CAPES; FIOCRUZ-FAPEAM
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O DNA satélite 1.688 de D. melanogaster: organização,
associação com genes e padrões de homogeneização
intra e inter-cadeias de cópias dos cromossomos 2 e 3
Kuhn, GCS
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: DNA satélite, DNA repetitivo, Drosophila, Recombinação, Heterocromatina
Introdução: Uma fração importante do genoma de muitos organismos (10-50%) é composta por DNAs satélites
(DNAsat) que se concentram nas regiões heterocromáticas dos cromossomos e não codificam proteínas. Até o
presente, 16 DNAs satélites foram descritos no genoma de D. melanogaster. Entre eles, está o DNAsat 1.688 com
unidades de repetição de aproximadamente 360 pb que representam 5% do genoma. A grande maioria de suas
cópias reside no cromossomo X, enquanto uma fração menor, e pouco estudada, ocupa regiões discretas da
heterocromatina dos cromossomos 2 e 3. O genoma seqüenciado e a vasta quantidade atualmente disponível
de BACs seqüenciados e mapeados de D. melanogaster fornecem uma oportunidade valiosa para o estudo da
organização e evolução de DNAs satélites em uma escala nunca possível anteriormente. Objetivo: Investigar a
distribuição e padrões de variação intra e inter-cadeias do DNAsat 1.688 nos cromossomos 2 e 3 de D. melanogaster.
Métodos: Seqüências consenso do DNAsat 1.688 foram utilizadas para a prospecção de seqüências homólogas em
BACs de D. melanogaster depositados no GenBank. Apenas seqüências com localização cromossômica determinada
e e-values <10-5 foram selecionadas. Resultados e Discussão: Foi encontrado um total de 15 BACs do cromossomo
2 e 4 BACs do cromossomo 3 com cópias 1.688 provenientes de regiões genômicas distintas. Estes BACs possuem
um número variado de repetições 1.688 em tandem, de 3 a 80, (média de ~9 cópias por BAC). No total, foram
obtidas 128 cópias completas do cromossomo 2 e 15 do cromossomo 3. Surpreendentemente, elas localizam-se
em 13 regiões genômicas não descritas anteriormente (incluindo eucromáticas), possivelmente não detectadas
experimentalmente devido à divergência nucleotídica maior que 35% em relação às seqüências pericentroméricas
homólogas. O tamanho das unidades de repetição varia de 249 a 361 bp, mas é pouco variável entre cópias de um
mesmo BAC. Em média, a variabilidade entre cópias é de 27%, comparável a variação normalmente encontrada
entre espécies. Dendrogramas mostraram um forte agrupamento (boostratps > 95%) de cópias BAC-especificas.
Este resultado fornece uma das evidências mais contundentes já observadas sobre a eficiência da homogeneização
local em cópias de uma mesma cadeia. Agrupamentos contendo cópias 1.688 de BACs de ambos os cromossomos
ainda indicam possíveis rotas de transferência de um cromossomo a outro. A associação destas cópias com outros
elementos foi analisada usando dados genômicos completos de D. melanogaster, em uma janela de 10 kb. A maioria
das cópias localiza-se em regiões “desertas”, mas outras estão próximas ou fazem parte de genes. Conclusão: Os
dados apresentados fornecem uma nova visão e derrubam paradigmas sobre os DNAs satélites, mostrando um
componente com papel dinâmico na heterocromatina e na eucromatina. Além disso, constituem um material
valioso para o teste de modelos de homogenização e transferências inter-cromossômicas de cópias satélites.
Financiado pela FAPESP
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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247
Structural diversity of degenerated transposable
elements belonging to different classes in the genome
of Anopheles gambiae
Medina, RDF1; Ribeiro, JM2; Struchiner, CJ1,3
Depto de Endemias-Escola Nacional de Saúde Pública-FIOCRUZ-RJ-BRASIL
Laboratory of Malaria and Vector Research-National Institute of Health-Maryland-USA
3
Instituto de Medicina Social-UERJ-RJ-BRASIL.
[email protected]
1
2
Keywords: Transposable elements, Anopheles gambiae
Introduction: Transposable elements (TEs) are ubiquitous in eukaryotic genomes representing a high percentage of
the total DNA content in certain species. In A. gambiae, the transmitting vector of the malaria parasite, TEs constitute
16% of the euchromatic and up to 60% of the heterochromatic regions of the genome. TEs are classified in two
classes (I and II) according to differences in genetic structure and replication mechanisms. On the other hand, TEs
are classified according to the presence or absence of functional genes for their own transposition, as autonomous
or non-autonomous, respectively. The last constitute degenerated copies of the original active elements. Sequence
degeneration is part of the so called life cycle of TEs, however certain degenerated copies continues to amplify within
the genome by means of the autonomous elements, constituting families of non-autonomous elements. Examples
of these are TRIMs and SINEs (among class I –order LTR and NLTR respectively) and MITEs and SNACs (among
class II elements). We compared the presence and the genetic structure of degenerated copies of transposable
elements belonging to different families of LTR, NLTR and Class II elements in the genome of A. gambiae. Methods:
We used an in silico algorithm for the identification and characterization of families of repetitive elements in the
mosquito genome. Our approach permitted the retrieval of degenerated elements and full-length copies belonging
to the same families permitting further studies on these families. We choose representative families for both classes
of TEs and compared the proportion of defective and full length elements in each category as well as the structural
deterioration of the sequences in each class. Results: The proportion of defective and full-length sequences is
different for the three types of analyzed elements. Overall, the LTRs contain mainly full-length copies (presenting
characteristics of recent activity in certain cases), many Solo-LTRs and few fragmented sequences. The NLTRs
present both full-length and fragmented copies containing deletions in the 5’-end constituting dead-on-arrival
copies. NLTRs are mostly represented by deleted sequences. The Class II is mainly represented by degenerated, nonautonomous elements, most of which are MITEs or MITE-like elements. On the other hand, the degenerated copies
belonging to the different classes present different deletion patterns along their lengths. Conclusions: These results
show that there is an unequal proportion of degenerated and full-length copies of TEs belonging to different classes
in the A. gambiae genome, and indicate that different TEs suffered different degeneration processes and DNA loss.
Apoio financeiro: CNPq, FAPERJ
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248
Filogenia de Aeshnidae (Odonata) baseada no gene
mitocondrial 12S e no gene nuclear 28S
Dias, CAR1; Santos Jr, JE1
Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
Palavras-chave: Evolução, Taxonomia, Epiprocta, Inferência Bayesiana, Parcimônia
A ordem Odonata inclui aproximadamente 5600 espécies divididas em duas subordens (Zygoptera e Epiprocta). As
libélululas, nome pelo qual são popularmente conhecidas, são predadores generalistas tanto na fase larval (aquática)
como na fase adulta (terrestre). A estrita relação entre esses organismos e as características dos ambientes
onde são encontrados permite seu uso no monitoramento de mudanças em uma grande variedade de parâmetros
ambientais; desde condições físico-químicas dos corpos d’água até mudanças da cobertura vegetal. Aeshnidae é
a família de libélulas cosmopolitas onde são encontradas algumas das maiores e mais rápidas espécies. Seu status
taxonômico foi revisto recentemente em diferentes estudos filogenéticos, entretanto resultados incongruentes
levaram alguns pesquisadores a sugerirem a necessidade de mais estudos. A fim de contribuir com a resolução
de tal problema, foram construídas hipóteses filogenéticas para a família baseadas em genes disponíveis em
bancos de dados públicos. Foram obtidas sequências nucleotídicas no GenBank, sendo elas: 12S rDNA (marcador
mitocondrial) e 28s rDNA (marcador nuclear). Elas foram alinhadas com auxílio do programa Clustal W e corrigidas
manualmente. Em seguida foram realizadas análises filogenéticas pelo método de parcimônia e pela análise
bayesiana, que foram conduzidas em programas apropriados para cada método. As árvores construídas baseadas
em ambos os genes recuperaram Aeshnidae como grupos monofilético, com alto suporte estatístico (valores de
bootstrap e probabilidade posterior superiores a 90%).
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249
Estudo comparativo das características citogenéticas
em espécies do gênero Rhodnius (Triatominae,
Heteroptera)
Tridico, LM1; Mendonça, PP1; Scagion, GP1; Succi, M1; Pereira, NP1; Azeredo-Oliveira, MTV1
Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita” (UNESP), Instituto de Biociências, Letras e Ciências
Exatas (IBILCE), São José do Rio Preto, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Triatomíneos, Citogenética, Cromossomos holocêntricos, Regiões Organizadoras Nucleolares, Heterocromatina.
A doença de Chagas atinge aproximadamente 15 milhões de indivíduos, dos quais, 1,6 milhões se referem a
casos brasileiros que se encontram na fase crônica da doença. Essa enfermidade tem como agente etiológico
o protozoário Trypanosoma cruzi, cujos vetores pertencem à subfamília Triatominae. Todas as espécies de
triatomíneos são suscetíveis à infecção pelo T. cruzi, e consequentemente, potenciais vetores do protozoário.
Além da importância médico-sanitária, esses insetos destacam-se por constituírem um modelo para o estudo
da citogenética, por apresentarem características peculiares como cromossomos holocêntricos, que possuem
cinetócoros difusos ao longo do comprimento da cromátide, e uma meiose incomum, na qual os autossomos
segregam-se de maneira regular, enquanto que os cromossomos sexuais apresentam a primeira divisão
equacional e a segunda reducional. Dentro desta subfamília, o gênero Rhodnius é considerado o mais homogêneo,
pois todas as espécies descritas até agora possuem o mesmo número cromossômico (2n = 22 A + XX / XY) e
um comportamento meiótico semelhante. Além dessa característica, esse gênero apresenta espécies muito
semelhantes morfologicamente, e, por esse motivo sua identificação é dificultada. Deste modo, inúmeras técnicas
de citogenética vêm sendo empregadas para auxiliar a identificação e a sistemática dos Triatominae. O presente
trabalho teve como objetivo comparar citogeneticamente três espécies do gênero Rhodnius, por meio do padrão
de bandamento-C e do comportamento nucleolar. Foram analisadas as células meióticas dos túbulos seminíferos
das espécies R. neglectus, R. prolixus e R. robustus. Após o esmagamento celular, foram realizadas as técnicas de
citogenética convencional de impregnação por íons prata e bandamento-C. A técnica de bandamento-C permitiu a
identificação das regiões de heterocromatina nas células meióticas dos túbulos seminíferos de machos adultos das
três espécies analisadas. Uma análise detalhada das células em prófase I (estágio difuso) possibilitou a diferenciação
das espécies de acordo com o tamanho e número dos blocos heterocromáticos. O estudo comparativo entre as
características nucleolares observadas nas espécies analisadas propiciaram um melhor entendimento do ciclo
nucleolar meiótico. Conclusões: No presente estudo foi possível acompanhar o ciclo nucleolar e localizar as regiões
heterocromáticas nos cromossomos meióticos das espécies pertencentes ao gênero Rhodnius, ampliando, dessa
forma, os conhecimentos a respeito da citogenética da subfamília Triatominae, vetores da doença de Chagas.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
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250
Análise mitogenômica Bayesiana de lepidópteros
utilizando modelos mistos e de mistura
Zenker, MM; Portella, TP; Pie, MR
Laboratório de Dinâmica Evolutiva e Sistemas Complexos, Universidade Federal do Paraná
[email protected]
Palavras-chave: filogenia molecular, análise particionada, evolução molecular, Borboleta, Mariposa.
Apesar de Lepidoptera ser um dos clados mais diversificados dentre os insetos, somente recentemente foram
realizados estudos sobre suas relações filogenéticas utilizando dados moleculares. A disponibilidade de
informações moleculares em bancos de dados públicos trouxe consideráveis desafios sobre a melhor forma
de modelar o processo de evolução molecular ao longo de filogenias. Duas principais abordagens tem sido
implementadas na análise filogenética Bayesiana: modelos mistos, onde diferentes regiões de um alinhamento
são divididas a priori e ajustadas com modelos qualitativamente diferentes, e modelos de mistura, onde o número
de modelos e o seu respectivo ajuste a diferentes posições em um alinhamento é definida durante a própria
inferência filogenética. No presente estudo exploramos estas abordagens utilizando dados mitogenômicos de
20 espécies de lepidópteros, totalizando seis superfamílias. Quatro níveis de particionamento foram utilizados
em modelos mistos: (1) cada gene possuía seu modelo de evolução; (2) idem ao anterior, mas todos os tRNAs
obedeciam a um mesmo modelo; (3) cada família gênica era representada por um modelo distinto; e (4) todo
o alinhamento obedecia a um único modelo. Cada partição obedeceu a um modelo GTR+G. As análises de
modelos mistos foram realizadas utilizando o software MrBayes 3.1.2, com 4 ou 1 cadeias de Markov em cada
replicata durando 10 milhões de gerações, com os primeiros 10% de cada cadeia sendo descartada como burnin. Análises de modelos de mistura foram implementadas no software BayesPhylogenies V.1.0, utilizando um
algoritmo de rjMCMC. Um resultado surpreendente da comparação de modelos mistos foi uma considerável
discrepância entre os resultados por diferentes níveis de particionamento, onde não somente os valores de BPP
diferiram, mas as próprias relações entre as linhagens. Por exemplo, os valores de BPP foram maiores no modelo
(2) do que nos outros modelos e Noctuoidea formou um clado monofilético apenas no modelo (3). Os valores
mais altos de BPP encontrados no modelo (2) sugerem uma possível influência de sobreparametrização. Valores
de fatores de Bayes indicaram que o modelo misto menos parametrizado (2) apresentaria o melhor respectivo
ajuste. A análise de modelos de mistura rapidamente convergiu à somente cinco padrões de evolução molecular,
corroborando a hipótese de sobreparametrização nos modelos mistos mais complexos. Algumas relações entre
as diferentes linhagens de lepidópteros foram particularmente influenciadas pelo esquema de particionamento. É
notável, nas árvores geradas tanto pelo modelo de mistura quanto pelos modelos mistos, a falta de agrupamento
das superfamílias em Apoditrysia, Obtectomera e Macrolepidoptera, diferindo profundamente do atual
posicionamento filogenético de Lepidoptera. Em conjunto, os resultados do presente estudo enfatizam que,
mesmo sendo um aspecto negligenciado na literatura, o esquema de particionamento pode influir profundamente
nos resultados de análises filogenéticas, principalmente em conjuntos de dados incluindo diferentes tipos de genes.
Apoio: CNPq (proc. N. 2007/58641-0)
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251
Análise genética e caracterização funcional das
esterases em Tribolium castaneum (Coleoptera:
Tenebrionidae) e a relação com os mecanismos de
resistência ao Malathion
Moreira, JP2; Gigliolli, AAS1; Lapenta, AS1; Sousa, G2
Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá
Curso de Ciências Biológicas, Faculdade Integrado de Campo Mourão
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tribolium castaneum, organofosforados, esterases, resistência inseticidas.
Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) é uma praga secundária que infesta grãos e sementes
(amendoim, café, cacau, soja, algodão, nozes, feijão, ervilha), cereais moídos ( farelos, rações, farinhas, fubá) e
outros subprodutos armazenados, gerando perdas qualitativas e quantitativas na produção. O uso intensivo
de inseticidas no controle de pragas de produtos armazenados tem contribuído para o desenvolvimento de
resistência, por meio de mecanismos fisiológicos, comportamentais e bioquímicos. O mecanismo bioquímico, um
dos mais importantes, é realizado por enzimas, tais como as esterases. Duas classes de esterases estão envolvidas
na resistência aos inseticidas, as carboxilesterases e as colinesterases. Sendo assim, este trabalho teve como
objetivos identificar e caracterizar genética e bioquimicamente as esterases nos estágios do desenvolvimento de
T. castaneum e avaliar o envolvimento destas isoenzimas nos mecanismos que tornam os insetos desta espécie
resistentes ao organofosforado malathion. Para tanto, os insetos foram expostos diretamente aos inseticidas e a
mortalidade verificada após 24 horas. Várias concentrações foram testadas e a CL50 estimada para quatro linhagens
denominadas LA, LB, LC e LD. Os indivíduos sobreviventes a cada tratamento foram congelados e submetidos à
eletroforese em gel vertical de poliacrilamida (PAGE), para a análise das esterases. O sistema PAGE permitiu a
identificação de 19 bandas esterásicas, atribuídas a 11 locos gênicos, com expressão diferencial tanto ao longo do
desenvolvimento quanto entre as linhagens analisadas. Foram identificadas cinco esterases em insetos adultos, das
quais, as EST-1, 2, 3 e 9 foram classificadas como colinesterases e a EST-5 como carboxilesterase. Houve diferenças
nos índices de resistência ao malathion entre as linhagens, com CL50 variando de 8,81 (LD) a 49,93 µg/cm2 (LA).
Foi verificado que a EST-5, por estar presente nas linhagens resistentes (LA, LB e LC) e ser ausente na linhagem
mais sensível ao malathion (LD), parece atuar na pronta resposta dos insetos resistentes ao malathion. Insetos
da linhagem mais sensível, em que a EST-5 está ausente, passaram a apresentar esta enzima após a exposição
ao inseticida. Já a EST-3, apresentou sensibilidade diferencial entre as linhagens analisadas, o que pode refletir
diferenças na capacidade de detoxificação enzimática. De maneira especial este trabalho mostra a existência de
grande variação no grau de resistência ao inseticida malathion e sugere a participação da carboxilesterase EST-5
nestes mecanismos. Maiores investigações envolvendo análises moleculares devem ser realizadas para um melhor
entendimento de aspectos regulatórios do gene Est-5 envolvido com o mecanismo de resistência aos inseticidas.
Apoio Financeiro: CNPq
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252
Análise da influência do gene period nos padrões de
emissões acústicas de acasalamento em moscas-dasfrutas (Diptera: Tephritidae) por inferência filogenética
Tanaka, R1; Selivon, D1
1
Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo
Palavras-chave: bioacústica, period, moscas-da-frutas, isolamento reprodutivo, especiação.
Os tefritídeos são moscas fitófagas, constituindo-se diversas espécies em importantes pragas agrícolas pelos danos
aos frutos causados pela oviposição e pela ação das larvas que se desenvolvem alimentando-se de tecidos vegetais.
Constituem-se também em modelos bastante estudados do processo de especiação. Muitas espécies ocorrem em
simpatria e, em laboratório, é possível realizar cruzamentos interespecíficos, no entanto, híbridos raramente são
encontrados na natureza. Padrões de emissão acústica por vibração das asas podem ser importantes sinais de
reconhecimento interespecífico, tendo um potencial papel no isolamento pré-zigótico. O gene nuclear period tem
uma função conhecida em insetos no controle pleiotrópico de diversos ritmos biológicos ultra, circa e infradianos.
Em moscas-das-frutas tem sido usado na reconstituição de relações evolutivas e foi relacionado ao isolamento
alocrônico em Bactrocera cucurbita com alteração nos períodos de acasalmento, bem como a alterações no parâmetro
acústico de intervalo entre trens de pulso. Neste trabalho, hipotetiza-se que o gene period possa influir também nos
padrões de emissão acústica: frequência fundamental (FF), duração de trem de pulso (PD) e intervalo entre trens
pulsos (IPI). Dados iniciais indicam que os padrões não estão correlacionados filogeneticamente entre si de modo
significativo. Porém, a filogenia de genes individuais pode diferir da filogenia de populações e espécies, de modo
que, em princípio, possa haver correlação entre diferenças dos padrões e no gene per. Para se testar a hipótese de
trabalho, foi realizada uma análise de inferência filogenética dos parâmetros acústicos baseada na filogenia do gene
period de espécies de moscas-das-frutas: Ceratitis capitata, B. cucurbita, B. tryoni, Rhagoletis juglandis, Toxotrypana
curvicauda, Anastrepha grandis, A. suspensa, A. ludens, A. obliqua, A. sororcula e a espécie nominal A. fraterculus.
Apoio financeiro: Capes/IBUSP
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253
Mapeamento cromossômico dos genes DNAr 18S
e histona H3 em Xyleus discoideus angulatus
(Romaleidae)
Machado, CB; Silva-Neto, LC; Loreto, V; Souza, MJ
Laboratório de Citogenética e Genética Animal – Departamento de Genética, Centro de Ciência Biológicas, Universidade Federal de
Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: FISH, gafanhoto, citogenética, cromossomo, meiose.
A hibridização in situ fluorescente (FISH) é um método que permite, a partir do uso de sondas marcadas por
fluorocromos, localizar sequências de ácidos nucléicos em citoplasma, organelas, cromossomos ou núcleos de
organismos eucariotas. Na citogenética de insetos, a FISH tem sido principalmente utilizada para melhorar a
caracterização do cariótipo, com detecção de marcadores citológicos através da localização cromossômica de
sequências de DNA de uma grande variedade de espécies. O gafanhoto Xyleus discoideus angulatus é uma espécie
endêmica do nordeste brasileiro cujo cariótipo é 2n♂=23,X0/2n♀=24,XX. Técnicas de bandeamento C, impregnação
com nitrato de prata, fluorocromos base específico (CMA3/DA/DAPI) e até mesmo a FISH (DNAr 45S) já foram
empregadas no estudo cromossômico da espécie. O objetivo deste trabalho é identificar e localizar, através da
FISH, os sítios de DNAr 18S e de histona H3 em X. d. angulatus. As preparações citológicas foram obtidas a partir da
técnica de esmagamento de folículos testiculares e submetidas ao procedimento de hibridização in situ com sonda
de DNAr 18S e H3 obtidas por PCR a partir do DNA genômico da espécie usando primers universais. As sondas
foram marcadas via PCR com biotina (bio 11-dUTP) com posterior detecção com mouse anti-biotin/ rabbit antimouse. A técnica permitiu revelar variação intra e inter-individual no número de sítios de DNAr (18S). A condição
mais comum foi células meióticas com dois sítios localizados nas regiões pericentroméricas dos cromossomos
X e G3. A outra condição foi células com três sítios de DNAr 18S nos bivalente G3 e M4 e no cromossomo X. Os
resultados utilizando sonda para histona H3 mostraram em todos os indivíduos analisados a presença de 3 sítios,
sendo estes localizados em regiões pericentroméricas dos cromossomos G3, M4 e X. Os dados obtidos pela FISH
permitiram determinar que em X. d. angulatus ocorre co-localização dos sítios de DNAr 18S e histona H3 no
cromossomo X. Estudos de mapeamento cromossômico de sítios de histona H3 são escassos em gafanhotos.
Nenhuma espécie até o momento apresentou padrão semelhante ao observado na espécie analisada. Por outro lado,
a variação inter-individual no número de sítios de DNAr observada em X. d. angulatus foi também descrita para
outras espécies, porém variação intra-individual é incomum no genoma de animais, sendo inédita em gafanhotos.
Apoio financeiro: FACEPE e CNPq
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254
Análise do perfil esterásico de populações resistentes
e suscetíveis de Aedes aegypti (Díptera, Culicidae)
Guirado, MM1 ; Bicudo, H.E.M.C.2
Programa de Pós Graduação em Genética
Departamento de Biologia, UNESP, São José do Rio Preto, SP
[email protected], [email protected]
1
2
Palavras-chave: Aedes aegypti, polimorfismo, esterases, resistência a inseticidas, mecanismo de resistência.
Hoje, sabe-se que as enzimas esterásicas estão relacionadas com o desenvolvimento de resistência a inseticidas,
em muitos organismos. Em Aedes aegypti a dedução desse envolvimento tem resultado mais em testes que
permitem a avaliação da atividade das esterases no extrato total dos mosquitos (mostrando valores maiores nas
populações resistentes) do que em estudos mais profundos de padrões e bandas individualizadas e sua relação
com a resistência. Com o objetivo básico de contribuir para o conhecimento desse aspecto, no presente trabalho
11 populações geográficas daquele vetor, sendo 6 classificadas como resistentes, 3 como suscetíveis e 2 como
tendo suscetibilidade diminuída, foram analisadas quanto ao polimorfismo de esterases, por eletroforese em
géis de poliacrilamida. O resultado do estudo – cerca de 30 amostras de larvas e adultos de cada população –
mostrou 24 bandas que foram tentativamente associadas com oito loci genéticos. Considerando também os
dados de LIMA-CATELANI et al. (2004) e de SOUSA-POLEZZI & BICUDO (2005), temos o total de 25 bandas
esterásicas, incluídas em 12 supostos loci, em 15 populações daquele vetor, até a presente data. A população de
São José do Rio Preto (SP), analisada em intervalos de cinco anos entre aqueles dois estudos e sete anos entre
SOUSA-POLEZZI & BICUDO (2005) e o presente trabalho, mostrou modificações no padrão de esterases, que
ocorreram ao longo do tempo, paralelamente ao surgimento e aumento da resistência aos inseticidas utilizados
no controle, nessa população. Essas modificações abrangeram, basicamente, aumento ou diminuição da
frequência de algumas bandas e ausência de bandas previamente detectadas. De modo geral, a busca por padrões
esterásicos específicos relacionados ao desenvolvimento da resistência indicou algumas bandas ou combinações
de bandas para um estudo mais aprofundado. Essas bandas são: EST-1, sozinha, devido à sua alta frequência
em 5 das 6 populações classificadas como resistentes; a combinação de EST-1 com EST-4, ambas ocorrendo
simultaneamente, de forma predominante nas populações resistentes; e as colinesterases αβ, detectadas nas 11
populações, mas apresentando frequências mais altas em 4 das 6 populações consideradas resistentes. Diante
do conhecimento atual sobre as esterases e sua relação com a resistência a inseticidas em A. aegypti, no presente
trabalho é discutida a possibilidade de que a quantidade total de esterases, principalmente das carboxilesterases,
produzidas por um grupo de genes possa ser mais importante em gerar resistência do que o grau de expressão
de genes individuais que codificam para bandas específicas. Contudo, entendemos que as bandas destacadas
neste trabalho devem ser alvo de um estudo mais detalhado, antes que esta hipótese ganhe maior força.
Apoio Financeiro: FAPESP
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255
Positive selection on the gene fruitless in the
Anastrepha group.
Sobrinho Jr, IS1; De Brito, RA1
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Dep. de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos (UFSCar)
[email protected]
1
Palavras-chave: fruitless, Anastrepha, fruit fly, sexual selection, positive selection.
Several genes related to reproduction have shown higher rates of divergence than other genes in the genome. Although
fruitless gene (fru) is one of the most important genes responsible for the development of male sexual behavior, general
studies on its evolution had explained its high rates of evolution in insects by relaxed selective constraint. However,
such explanation was based in general phylogenetic comparisons and tests of rescue of fru function via ectopic
expression, and no formal study of the role of selection in its evolution were performed. Here we study the most
divergent region of fru, the connecting region, to test whether fru had evolved neutrally or under positive selection
in species of Anastrepha (A. fraterculus, A. sororcula and A. obliqua) using two different approaches, a long-term
evolutionary analysis and a populational data analysis. The first analysis was performed by contrasting sequences
of three species of Anastrepha to sequences from several species of Drosophila using the ratio of nonsynonymous to
synonymous rates (dN/dS) by the branch-site test implemented in PAML, which revealed that the region evolved by
positive selection. Using Bayes Empirical Bayes analysis we estimated that 16 sites located in the connecting region
of fru were evolving under positive selection. We also investigated the evolution of this region using populational
data from 50 specimens from the three species of Anastrepha from different localities in Brazil. The use of standard
tests of selection, such as Tajima’s D, Fu and Li’s D and F and Fay and Wu’s H, and a new test that compares patterns
of differential survival between synonymous and nonsynonymous in evolutionary time also provides evidence
of positive selection and of a selective sweep for A. obliqua. Our data indicates that the high diversification of fru
connecting region in Anastrepha flies is due at least in part to positive selection, not merely as a consequence of
relaxed selective constraint. These conclusions are based not only on the comparison of distantly related taxa,
that show long-term divergence time, but also on recently diverged lineages. The evidence of selective sweep and
the almost total isolation of A.obliqua in an haplotype network suggests an episode of adaptive evolution responsible
for the isolation of this species from the others. These results suggest that such episodes of adaptive evolution
in fru may be related to sexual selection and/or conflict related to its involvement in male courtship behavior.
Acknowledgements: FAPESP, CAPES.
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256
Rearranjo da região telomérica do III cromossomo
de Drosophila willistoni (Diptera, Drosophilidae) nas
populações da Caatinga de Pernambuco, Brasil
Silva, THS1; Montes, MA2; Garcia, ACL1; Valente, VLS3; Rohde, C1
Laboratório de Genética, Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco
Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco. 3 Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Inversão, cromossomo politênico, Caatinga, Drosophila willistoni, Citogenética.
As inversões cromossômicas se originam a partir de duas quebras no mesmo cromossomo, seguida de uma
rotação de 180 graus da porção intermediária, e ligação das extremidades em orientação invertida. A análise do
polimorfismo cromossômico baseado em inversões se constitui em excelente método de pesquisa em genética de
Drosophila, capaz de avaliar variabilidade genética diferencial entre populações naturais, em resposta adaptativa
a biomas, a condições climáticas ou a perturbações ambientais (como poluição, urbanização e agentes químicos).
A Drosophila willistoni pertence ao grupo willistoni e é considerada a espécie mais polimórfica (ou variável) para a
presença de rearranjos cromossômicos do tipo inversões paracêntricas (que não envolvem a região do centrômero)
entre as mais de mil espécies que compõem o gênero Drosophila. Desde 2008 a espécie D. willistoni tem sido coletada
em diversos locais do Estado de Pernambuco, incluindo-se aí os biomas de Floresta Atlântica, de Manguezal e de
Caatinga. Apresentamos aqui um novo arranjo cromossômico, ou inversão, encontrado em alta frequência entre
os indivíduos de certas populações que ocupam a Caatinga, nos municípios de Serra Talhada/PE e Buíque/PE.
Entre as mais de 50 inversões já descritas para a espécie na literatura, este novo arranjo é o único que envolve
completamente a região do telômero, reestruturando a ponta do III cromossomo e deslocando sua porção terminal
para uma porção intermediária, na eucromatina. Além disso, esta inversão segrega entre os indivíduos analisados,
que foram classificados em três categorias genéticas: indivíduos sem a inversão (homozigotos), indivíduos com
uma inversão (heterozigotos) e indivíduos com a inversão em dose dupla (homozigotos invertidos). Com os novos
estudos será possível definir se este arranjo pode ser considerado um arranjo endêmico da Caatinga, o que poderia
ajudar no entendimento da colonização deste bioma pela D. willistoni.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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Participação das esterases nos mecanismos de
resistência A Cipermetrina em Tribolium castaneum
(Coleoptera: Tenebrionidae)
Gigliolli, AAS1; Lapenta, AS1; Sousa, G2; Moreira, JP2.
Departamento de Biologia Celular e Genética da Universidade Estadual de Maringá
Departamento de Ciências Biológicas da Faculdade Integrado de Campo Mourão
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Tribolium castaneum, esterases, piretróides, resistência a inseticidas, cipermetrina.
Como conseqüência do uso intensivo do malathion no controle de pragas de grãos armazenados, várias espécies
de insetos tais como o coleóptero Tribolium castaneum, têm se tornado resistentes a esse composto. Assim, os
inseticidas piretróides começaram a ser utilizados para complementar e possivelmente substituir os inseticidas
organofosforados a fim de minimizar as perdas físicas e a qualidade final dos produtos. Desta forma, esse trabalho
teve como objetivos investigar a participação da carboxilesterase EST-5, presente em insetos adultos de Tribolium
castaneum, nos mecanismos de resistência a cipermetrina e verificar a efetividade deste piretróide no controle
desta praga. Para tanto, quatro linhagens foram utilizadas a LG, LU, LGC (mantida sob pressão de seleção com
cipermetrina) e LUM. Os insetos foram expostos diretamente aos inseticidas e a mortalidade verificada após 24
horas. Várias concentrações foram testadas e os índices de resistência destas linhagens para a cipermetrina foram
determinados a partir da estimativa da CL50. Os indivíduos sobreviventes a cada tratamento foram congelados e
submetidos à eletroforese em gel vertical de poliacrilamida (PAGE), para a análise das esterases. Os valores da CL50
estimados para as linhagens LG e LGC foram de 0,60 e 1,60 µg/cm2, respectivamente. E para as linhagens LU e LUM
os valores da CL50 para a cipermetrina foram de 0,15 e 0,16 µg/cm2, respectivamente. Por meio do sistema PAGE,
após a exposição dos insetos a cipermetrina, podemos observar a expressão de esterases ausentes anteriormente,
as quais foram denominadas EST-C. Além disso, a EST-5 foi inibida em todas as linhagens analisadas, o que pode
ser indicativo da participação desta esterase na detoxificação metabólica deste composto. As maiores alterações
na expressão dessas esterases foram visualizadas na linhagem LGC, a qual foi mantida sob pressão de seleção
com cipermetrina. Provavelmente, o inseticida deve ter selecionado enzimas qualitativamente diferentes, mais
eficientes na detoxificação, por meio da hidrólise e/ou seqüestro das moléculas de cipermetrina, fazendo com que
uma menor quantidade de inseticida atinja os seus principais alvos, os canais de sódio voltagem-dependentes,
contribuindo para que esta linhagem tenha se tornado mais resistente a ação deste piretróide. Os nossos
resultados indicam que a cipermetrina pode ser efetiva no controle deste inseto-praga. Além da alta toxicidade o
que requer aplicações a doses mínimas, apresentam custos inferiores e menor toxicidade para os mamíferos em
relação aos outros inseticidas convencionais, como os organofosforados. No entanto, se faz necesssário monitorar
o desenvolvimento de mecanismos de resistência a essa classe de inseticidas, para garantir o sucesso no controle
deste inseto praga, bem como, minimizar os impactos desses contaminantes ao meio ambiente e a saúde humana.
Apoio financeiro: CNPq
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Marcadores de DNA microssatélites para Anopheles
albitarsis: Construção e caracterização de uma biblioteca
genômica enriquecida e isolamento de locos SSR
Guimarães, HM1,2; Guimarães-Marques, GM1,2; Naice, MV1; Lima, MP4; Formiga, KM2,3; Santos, JMM1,2;
Batista, JS2,3; Rafael, MS1,2
Laboratório de Vetores da Malária/Dengue – CPCS/INPA
Laboratório Temático de Biologia Molecular – COPE/INPA
3
Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução, Coordenação de Pesquisas em Biologia Aquática – CPBA/INPA
4
Laboratório de Evolução e Ecofisiologia Molecular – LEEM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Anopheles albitarsis, microssatélites, genética de populações, malária, biologia molecular.
Introdução: O mosquito Anopheles albitarsis é vetor secundário da malária, podendo passar a vetor primário
mediante mudanças ambientais, especialmente por ações antrópicas. O complexo Anopheles (Nyssorhynchus)
albitarsis inclui seis espécies: Anopheles albitarsis s.s, A. oryzalimnetes, A. marajoara, A. janconnae, A. albitarsis F e
A. deaneorum. Os agentes etiológicos são espécies do gênero Plasmodium: P. vivax, P. malarie e P. falciparum, sendo
este último considerado o mais grave por causar o maior número de óbitos. Considerando os estudos da literatura
em A. albitarsis e sua importância como vetor da malária na Amazônia, há poucos estudos sobre DNA e ausência
de trabalhos envolvendo DNA microssatélites para A. albitarsis. Objetivo: Construir, sequenciar e caracterizar
uma biblioteca genômica enriquecida em DNA microssatélites bem como e isolar locos SSR (Sequências Simples
Repetidas) para Anopheles albitarsis. Métodos: As amostras do DNA genômico foram coletadas em Coari (AM)
e extraídas a partir de um pool de 10 indivíduos adultos. O protocolo de construção da biblioteca constituiu-se
nas seguintes etapas: digestão do DNA genômico com a enzima RsaI; ligação dos adaptadores Rsa21 e Rsa25; préamplificação com o primer Rsa21; seleção de fragmentos contendo microssatélites por hibridização de sondas
biotiniladas e magnetização; amplificação dos fragmentos selecionados, clonagem e transformação; amplificação
dos insertos clonados, seleção e sequenciamento dos clones recombinantes. Resultado: foram obtidas e
sequenciadas 88 colônias, apresentando um índice de enriquecimento de DNA microssatélites de 95,8%, com 62%
de redundância. Foram identificados 53 clones contendo sequencias SSR com a seguinte classificação: 47 perfeitos,
1 perfeito composto, 4 imperfeitos e 2 imperfeito composto. A maioria foi classificada como dinucleotídeo (79,2%),
sendo AC/GT (32,5%) o mais encontrado. Com o auxílio dos programas WEBSAT, PRIMER3, OLIGO CALCULATOR
e CHROMAS PRO foram desenhados e sintetizados primers flanqueadores para 34 microssatélites, Os primers
apresentaram porcentagem média de GC igual a 52%, amplificando produtos com tamanho médio de 201 pb
(pares de bases), desenhados a partir de seqüências de DNA com tamanho médio de 506 pb. Foram amplificados
31 locos com temperatura de anelamento variando entre 56 a 65ºC. Conclusão: Estes marcadores são potenciais
não somente para serem utilizados em estudos de estrutura populacional, mas também para elucidar problemas
taxonômicos de A. albitarsis por se tratar de um complexo de espécie e devido a sua importância epidemiológica.
Apoio Financeiro: CAPES/PROCAD Amazônia, PIPT/FAPEAM, MCT/INPA.
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Taxonomia molecular de Rhodnius nasutus (Hemiptera:
Reduviidae) do Nordeste do Brasil
Antônio, JC1; Ferro, JLS1; Morelli, KA; Pavan, MG; 2Lima, MM; 3Gurgel-Gonçalves, R; Monteiro, FA
Laboratório de doenças Parasitárias, Depto de Medicina Tropical, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro/RJ
Laboratório de Eco-Epidemiologia da Doença de Chagas, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro/RJ
3
Laboratório de Parasitologia Médica e Biologia de Vetores, Área de Patologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Brasília, Brasília/DF
[email protected]
1
2
Palavras-chave: taxonomia molecular, Rhodnius nasutus, Rhodnius neglectus, citocromo B, doença de Chagas.
O gênero Rhodnius (Hemiptera: Reduviidae) é composto por 14 espécies descritas e diversos estudos apontam
a existência de espécies crípticas no grupo. Algumas espécies como R. nasutus e R. neglectus são praticamente
indistinguíveis morfológicamente. No Brasil, insetos desse gênero são considerados de importância epidemiológica
secundária pois esporadicamente infectam seres humanos. O conhecimento acerca da estrutura genéticopopulacional e a delimitação dos limites de áreas de co-ocorrência de triatomíneos são informações cruciais
para o desenvolvimento de medidas eficazes no controle da doença de Chagas, uma vez que as espécies podem
apresentar papel epidemiológico distintos. Visando a obtenção de tais informações, nosso grupo tem realizado
estudos de genética de populações e identificação molecular de várias espécies de triatomíneos. O presente
trabalho investiga as questões mencionadas acima, para R. nasutus, espécie que ocorre no bioma da caatinga.
Insetos dessa espécie podem apresentar morfótipos distintos, dependendo da espécie de palmeiras em que
se encontrem. Além disso, R. nasutus pode ocorrer em simpatria com R. neglectus em algumas regiões. Serão
estudadas populações oriundas de todos os estados da região Nordeste. As análises moleculares estão sendo
realizadas utilizando o marcador mitocondrial citocromo b (cytb) e microssatélites. Até o presente momento
analisamos duas populações de R. nasutus: Jaguaruama/CE (40 indivíduos) e Curaça/BA (8 indivíduos). Uma
análise filogenética preliminar realizada com as populações em estudo e indivíduos de R. neglectus e R. nasutus
previamente identificados molecularmente, mostrou que os espécimes de Jaguaruama apresentam haplótipos
da espécie R. nasutus e os de Curaçá de R. neglectus. A divergência entre as seqüências destas populações é
alta (11,4%) em relação ao esperado para esse grupo de insetos. Ao todo foram determinados sete haplótipos
para Jaguaruama, com cinco sítios polimórficos e três haplótipos para Curaçá, que apresentaram apenas dois
sítios polimórficos. Nossos dados também ilustram a dificuldade de se identificar morfologicamente espécies
deste gênero, revelando a necessidade de utilizar marcadores moleculares como cytb para essa finalidade.
Apoio financeiro: CNPq, Fiocruz
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Estudo citogenético da espermatogênese em
Zaprionus indianus e Zaprionus sepsoides (Diptera,
Drosophilidae)
Rego, LNAA; Landim, MCS; Azeredo-Oliveira, MTV; Madi-Ravazzi, L
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), Universidade Estadual Paulista (UNESP)
[email protected]
1
Palavras-chave: espermatogênese, Zaprionus, meiose, espermatócitos, prófase I.
Zaprionus indianus é um drosofilídeo nativo da região Afrotropical que, recentemente, colonizou o continente Sul
Americano, espalhando-se rapidamente por várias regiões. Vários estudos têm sido realizados com o objetivo de
entender a dinâmica dessa espécie invasora e o sucesso de sua colonização. Entretanto, há poucos estudos sobre a
biologia reprodutiva desse gênero na literatura. A espécie Z. indianus apresenta uma ampla distribuição geográfica
enquanto a outra é restrita a algumas regiões africanas. O objetivo desse trabalho foi analisar a espermatogênese
de duas espécies do gênero Zaprionus: Z. indianus e Z. sepsoides. Para as análises citogenéticas foram utilizados
10 machos de cada espécie, com diferentes idades (de um a 8 dias). Os testículos foram dissecados em solução
fisiológica, corados com orceína lacto-acética 2%, recobertos com lamínula e esmagados. As lâminas foram
observadas no sistema de analisador de imagem Image Pró-Plus Media Cybernetics, Versão 4.5 para Windows.
A análise morfológica dos testículos das duas espécies, realizada em contraste de fase, demonstrou que esses
apresentam estrutura em espiral e diferem quanto ao tamanho e à espessura dos túbulos seminíferos: testículos de
tamanho médio e com espessura mediana (Z. indianus) e testículos pequenos com maior diâmetro (Z. sepsoides). A
análise dos espermatócitos (prófase I) mostrou que essas células possuem um tamanho bem maior que as células
que não estão em divisão, além de um grande núcleo com um corpúsculo heteropicnótico evidente. A distribuição
do material cromatínico nesse estágio pode estar associada com a organização dos cromossomos bivalentes ao
longo da prófase I, especialmente nas fases tardias (paquíteno até a diacinese). Estas fases foram observadas nas
duas espécies entre 5 e 7 dias de vida, pela presença de células com 5 corpúsculos maiores e 1 menor, provavelmente
sendo os pares bivalentes (5 bivalentes maiores e 1 bivalente menor formado por um par de cromossomos menores),
confirmando o número de 12 cromossomos para o gênero (10 macrocromossomos e 2 microcromossomos).
Todavia, com 6 dias, Z. indianus apresentou muitos espermatozóides, enquanto em Z. sepsoides muitas células
em divisão foram detectadas. Observou-se também a presença de espermatozóides dispostos em feixes finos
e alongados em Z. indianus, enquanto em Z. sepsoides os feixes apresentaram-se grossos e curtos. As análises
citogenéticas das duas espécies de Zaprionus indicam que todos os estágios da espermatogênese estão presentes
e organizados de forma regular e progressiva ao longo do comprimento do testículo, semelhantemente ao que
ocorre em Drosophila. As diferenças morfológicas e citogenéticas das duas espécies refletem uma diferenciação
genética nesse grupo, que poderão auxiliar no entendimento da biologia reprodutiva do gênero Zaprionus,
além de contribuir com o entendimento do sucesso da colonização de Z. indianus em outros continentes.
Apoio Financeiro: CAPES
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Variação genética temporal do vetor da dengue (Aedes
aegypti, Diptera: Culicidae), estimada a partir de
marcadores microssatélites em Manaus-AM, Brasil
Mendonça, BAA1; Sousa, ACB2; Pereira, JMA1; Ferreira, SB1; Souza, AP2; Scarpassa, VM1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), Manaus, AM, Brasil
Universidade Estadual de Campinas(UNICAMP), Campinas, SP, Brasil
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Mosquito da dengue, Estrutura microgeográfica, Sazonalidade, Genética de populações.
Introdução: A dengue é atualmente a mais importante arbovirose a acometer as populações humanas em áreas
tropicais e subtropicais, com elevadas taxas de morbi-mortalidade. Apesar disso, nenhuma vacina está até o
momento disponível, assim como não há tratamento específico aos pacientes que contraem esta doença. Portanto,
a ferramenta profilática mais eficaz para a redução dos índices de transmissão é a utilização de medidas de controle
integradas do mosquito vetor, Aedes aegypti. Objetivos: Com o intuito de conhecer melhor a dinâmica populacional
deste vetor cuja distribuição está sob influência de fatores ambientais (precipitação e temperatura), analisou-se a
variação genética temporal de mosquitos Ae. aegypti procedentes de quatro bairros (Jorge Teixeira, Coroado, Praça
14 de Janeiro e Cidade Nova) da cidade de Manaus, Amazonas, através de marcadores microssatélites. Material e
Métodos: As amostras foram obtidas nas estações chuvosa (165 indivíduos) e seca (156 indivíduos), sendo analisados,
em média, 40 indivíduos por localidade. Após as coletas, criação e identificação dos espécimes foram realizadas
as extrações e as amplificações de seus DNAs, utilizando-se nove locos de microssatélites de dinucleotídeos. Esses
locos foram genotipados em géis de poliacrilamida 6% corados com nitrato de prata e os dados obtidos analisados
em programas estatísticos específicos. Resultados: Os nove locos foram polimórficos nas duas estações para as 4
localidades. O número de alelo por loco variou de 3 a 7 na estação chuvosa e de 2 a 7 na estação seca. Na estação
chuvosa, a heterozigosidade esperada (HE) média variou de 0.55 a 0.61, sendo o maior valor obtido para a localidade
do Coroado. Na estação seca, a HE média foi de 0.53 a 0.59, sendo o maior valor para a localidade do Jorge Teixeira. Os
valores de FST e a análise de variância molecular (AMOVA) evidenciaram muito baixa a estrutura genética entre as
amostras da estação chuvosa. Contudo, houve maior estrutura genética, com valores significantes, entre as amostras
coletadas na estação seca. Esta análise foi suportada pelos índices do tamanho efetivo de população (Ne), que
foram muito menores na estação seca. Conclusões: Estes resultados são provavelmente decorrentes da redução dos
criadouros disponíveis na estação seca para o desenvolvimento das formas imaturas, com subsequentes reduções
na densidade populacional do Ae. aegypti e, consequentemente, no tamanho efetivo das populações, acarretando
perdas de variabilidade genética e a formação da estrutura genética mais evidente. Os dados deste estudo sugerem
que as implementações das medidas de controle deste vetor devem ser diferenciadas no transcorrer das estações.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPEAM-PIPT e MCT/INPA.
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Variação morfométrica de asa em espécies de
Drosophila em uma zona de contato secundário
Bizzo, L¹; Manfrin, MH²; Sene, FM³
¹ Programa de Pós-Graduação em Entomologia, FFCLRP-USP
2
Departamento de Biologia, FFCLRP-USP
³ Departamento de Genética, FMRP-USP
[email protected]
Palavras-chave: Drosophila, zona de contato, morfometria geométrica, cluster buzzatii, morfometria de asa
No litoral do estado de Santa Catarina existe uma zona de contato secundário entre as duas espécies cactófilas
Drosophila serido e D. antonietae, pertencentes ao cluster Drosophila buzzatii. Para estudar esta zona de contato,
foram realizadas seis coletas quadrimestrais (maio 2008/2009, setembro 2008/2009 e fevereiro 2009/2010) nos
municípios de Penha, Florianópolis e Laguna, distantes aproximadamente 100 km um do outro no sentido
norte-sul. Em Florianópolis (ilha de Santa Catarina), foram escolhidos quatro locais de coleta de acordo com a
distribuição dos dois cactos hospedeiros destas moscas: 1-Praia da Joaquina e 2-Costa da Lagoa, onde ocorre Cereus
hildmaniannus, na 3-Praia da Armação, onde ocorre exclusivamente Opuntia monacantha, e 4-Barra da Lagoa, com
ambos cactos. Os indivíduos machos coletados tiveram suas asas direitas analisadas por morfometria geométrica,
utilizando dez marcos anatômicos. Isto gerou um componente de tamanho (centróide) e 16 componentes de
forma, que foram comparados entre populações e coletas por meio de análises de variância uni e multivariada.
De maneira geral, o tamanho das asas das duas espécies variou de modo similar entre as coletas, porém de modo
mais intenso entre os indivíduos de D. serido. Os indivíduos coletados em fevereiro (verão) foram menores que os
demais. Os espécimes de D. antonietae de Laguna e D. serido de Penha, também foram, respectivamente, maiores
e menores que indivíduos de sua espécie provenientes da ilha. Entre os indivíduos da ilha, não houve diferença de
tamanho entre as populações das duas espécies. Algumas populações apresentaram forma diferenciada, porém
com grande sobreposição em relação às outras. Drosophila serido de Praia da Armação apresentou forma diferente
dos de Barra da Lagoa (Wilk´s lambda=0,72; p<0,001; teste de Tukey, p<0,01), e D. antonietae de Costa da Lagoa
apresentou forma diferente de Praia da Armação e Barra da Lagoa (Wilk´s lambda=0,41; p<0,05; teste de Tukey,
p<0,05). As diferenças na forma da asa encontradas são discutidos considerando os cactos hospedeiros disponíveis
nas populações. A variação temporal similar no tamanho das duas espécies sugere que as condições ambientais são
importantes na determinação do tamanho e forma das asas. A análise de indivíduos que emergiram dos diferentes
cactos poderá trazer informações sobre a relação da morfologia da asa com o cacto em que a mosca se desenvolve.
Apoio Financeiro: CNPq e Fapesp
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Análise do comportamento meiótico e nucleolar de
Piezodorus guildinii (Heteroptera: Pentatomidae)
Moura, J; Souza, HV; Itoyama, MM
UNESP – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, Laboratório de
Citogenética e Molecular de Insetos, São José do Rio Preto, SP
[email protected]
Palavras-chave: espermatogênese; pragas; espermiogênese; holocêntrico; testículo; citogenética.
Heteroptera da família Pentatomidae são fitófagos, causadores de grandes prejuízos a agricultura, podendo afetar
diretamente os humanos. Além dessa característica, o estudo citogenético, desta família, é extremamente escasso.
Eles possuem, na sua maioria, 2n= 14 cromossomos (2n= 12A + XY), além de apresentarem os testículos formados
de lobos, sendo um deles às vezes denominado harlequin por produzirem diferentes tipos de espermatozóides.
As amostras de Piezodorus guildinii coletadas na cidade de São José do Rio Preto, SP, foram transportadas para o
Laboratório de Citogenética e Molecular de Insetos, com os objetivos de: verificar a presença do lobo harlequin e
de analisar o comportamento meiótico e espermiogênese após coloração com orceína lacto-acética e impregnação
por íons prata. Após incisão observou-se que os testículos são alongados e cobertos com membrana avermelhada
e constituídos de seis lobos alongados, de mesmo tamanho, e dispostos lado a lado. Para a análise citogenética os
lobos foram individualizados e analisados separadamente, chegando-se à conclusão de que P. guildinii não possui
lobo harlequin. Portanto, os resultados dos lobos serão apresentados em conjunto. A análise citogenética permitiu
visualizar que: a) os núcleos poliplóides possuem vários corpúsculos heteropicnóticos pequenos e distribuídos
homogeneamente pelo núcleo, b) as células em prófase I apresentam um corpúsculo heteropicnótico evidente,
arredondado, deslocado para periferia do núcleo e fortemente corado, c) no final da profase I verifica-se a presença
de pontes cromatínicas unindo os cromossomos pelas regiões teloméricas, d) na metáfase I, podemos, verificar que
o complemento cromossômico é de 14 cromossomos (2n= 12A + XY), e) as anáfases possuem migração regular dos
cromossomos, f) as espermátides iniciais possuem material heteropicnótico distribuído irregularmente pela célula,
g) as espermátides em alongamento possui material heteropicnótico no centro e na periferia da célula. As células
impregnadas pelos íons prata apresentaram as seguintes características: a) os núcleos poliplóides apresentaram
marcações prata positivas de tamanhos e formas variadas, b) durante o início da prófase I observou-se, em todas
as células, um corpúsculo nucleolar arredondado maior e outros menores, em número variável, b) nas metáfases I e
anáfases há regiões cromossômicas marcadas, c) na telófase observa-se material nucleolar em uma única célula em
formação, d) os espermatócitos apresentam uma única marcação arredondada e intensamente corada deslocada
para periferia da célula e várias menores, arredondadas e menos coradas, e) as espermátides elipsóides possuem
marcação prata mais arredondada e fortemente corada na região posterior da cabeça e marcação tênue ao redor do
envoltório nuclear, f) a espermátide no final do desenvolvimento apresenta marcação ao longo de seu comprimento,
sendo mais impregnada em um dos lados. De maneira geral, o comportamento das células de Piezodorus guildinii
durante a espermatogênese é semelhante aos dos outros Heteroptera, porém com ausência do lobo harlequin.
Apoio Financeiro: FAPESP, FUNDUNESP
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Comportamento meiótico das células testiculares
do Heteroptera aquático Martarega brasiliensis
(Heteroptera, Notonectidae)
Pereira, LLV; Castanhole, MMU; Itoyama, MM
UNESP-Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, Laboratório de
Citogenética e Molecular de Insetos, São José do Rio Preto, SP
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, espermátide, espermatogênese, espermiogênese.
O gênero Martarega é um dos oito gêneros pertencente à família Notonectidae, composto por formas
verdadeiramente aquáticas, caracterizados por nadarem de costas. Além disso, eles possuem pernas posteriores
adaptadas para a natação. Vivem submersos em lagoas e córregos lentos, e possuem distribuição limitada que se
restringem à América Central, América do Sul e México. Citogenéticamente eles foram, ainda, pouco explorados.
Com o objetivo de ampliarmos as informações relativas às espécies da família Notonectidae, exemplares de M.
brasiliensis foram coletados na Represa de São José do Rio Preto, SP, transportados para o Laboratório e fixados
em metanol:ácido acético (3:1). Para a análise citogenética os testículos dos machos adultos foram retirados e
corados com orceína lacto-acética. Após a incisão da região abdominal verificou-se que os testículos são em forma
de espiral, de cor branca e localizados lateralmente à região abdominal. As análises citogenéticas permitiramnos verificar que os testículos possuem: a) prófases I com um único corpúsculo heteropicnótico sem morfologia
definida e intensamente corado que persiste até o final do paquíteno, que geralmente, é o cromossomo sexual;
b) células em diplóteno/diacinese com cromossomos com morfologia bem definida, onde se pode, também,
observar que os cromossomos homólogos associam-se telomericamente; c) quiasmas terminais ou intersticiais
(com morfologia em forma de cruz) únicos ou duplos. Quando há quiasmas duplos terminais a morfologia dos
cromossomos é em anel; d) células metafásicas I com os autossomos dispondo-se em anel e os m-cromossomos
e o sexual no seu centro; e) complemento cromossômico de 2n= 24A+2m+X0; f) primeira divisão meiótica
equacional e a segunda reducional para os cromossomos sexuais característica que pode ser confirmada
nas células em anáfases; g) células em anáfase II com migração tardia de apenas um cromossomo sexual; h)
células telofásicas II na qual apenas uma das células em formação possui cromossomo sexual; i) espermátides
arredondadas com coloração uniforme; j) espermátides em alongamento com a região da cromatina em forma
de bastão localizada na região anterior da cabeça. Na posterior verifica-se a presença de uma vesícula grande
alongada, que vai reduzindo de tamanho conforme o desenvolvimento da espermátide; k) espermátides em fase
final de alongamento com cabeça bastante alongada e cromatina homogeneamente distribuída e cauda muito
longa. A avaliação da espermatogênese, desta espécie, permitiu-nos concluir que as características descritas
anteriormente são, de maneira geral, semelhantes a das outras espécies de Heteroptera, descritas na literatura,
diferindo apenas com relação: ao tamanho celular, pois estas são maiores que as dos indivíduos terrestres;
número de cromossomos, pois esta característica está relacionada à família e sistema cromossômico do sexo.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP e FUNDUNESP.
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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265
Descrição da espermatogênese de Dictyla
monotropidia (Heteroptera, Tingidae)
Souza-Firmino, TS; Almeida, EC; Souza, HV; Castanhole, MMU; Pereira, LLV; Itoyama, MM
UNESP - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, Laboratório de
Citogenética e Molecular de Insetos, São José do Rio Preto, SP
[email protected]
Palavras-chave: meiose, lobos, espermiogênese, espermátides, citogenética
Tingidae é uma da 79 famílias de Heteroptera constituídos de insetos muito pequenos (10-20 mm) denominados
popularmente de percevejos-de-renda, devido ao aspecto reticulado da superfície de suas asas. Esses insetos
localizam-se na face abaxial das folhas onde suga a seiva e provoca o amarelecimento e senescência precoce
das mesmas, produzindo grande prejuízo às plantações. Cada indivíduo completa o ciclo de vida na mesma
planta, às vezes na mesma região. A maioria das espécies tem uma ou duas gerações por ano, mas algumas
espécies apresentam várias gerações. A maioria hiberna como adultos, mas algumas espécies hibernam como
ovos ou ninfas. Os Heteroptera possuem testículos subdivididos em compartimento ou lobos. O número mais
comum é de sete, embora haja variações entre tribos e espécies. Possuem, ainda, cromossomos holocêntricos,
atividade cinética restrita aos finais dos cromossomos e primeira divisão meiótica reducional para os autossomos
e equacional para os sexuais. Poucas espécies foram analisadas citogeneticamente e a maioria apresentou
complemento cromossômico de 2n= 12A + XY. Para ampliarmos as informações referentes à família Tingidae,
espécimes de Dictyla monotropidia foram coletados em pés de Frei Jorge na cidade de São José do Rio Preto, SP e
armazenados em metanol:ácido acético (3:1) para confecção de lâminas coradas com orceína lacto-acética. Após
dissecarmos verificamos que D. monotropidia possui testículos alongados, recobertos por membrana transparente
e muito tecido adiposo associado a esta membrana o qual dificultava a confecção das lâminas. Ao analisarmos
a espermatogênese observamos: a) prófases I iniciais com dois corpúsculos heteropicnóticos intimamente
associados, b) prófases finais com associações, em anel, dos cromossomos, pelas regiões teloméricas, c) no início
da metáfase I, os cromossomo ainda estão associados telomericamente; d) metáfases I com dissociação dos
cromossomos, e) cromossomos autossomos se dispondo em anel com os cromossomos sexuais no centro, f) que
o complemento cromossômico de D. monotropidia é de 2n= 12A + XY, g) cromossomos em final de metáfase I
migrando para a placa equatorial da célula, h) telófase com migração regular dos cromossomos, i) espermatócito
com material heteropicnótico deslocado para a periferia da célula, j) espermátides arredondadas com material
heteropicnótico ao redor do envoltório nuclear, k) espermátide elíptica com material heteropicnótico nas
regiões anterior e posterior, l) espermátide em alongamento com cabeça com material heteripicnótico e cauda
muito longa. De maneira geral as características apresentadas por D. monotropidia são semelhantes aos demais
Heteroptera terrestres, exceto a cabeça das espermátides no final de seu desenvolvimento que são alongadas e
os testículos que não possuem lobos propriamente ditos, mas sim uma associação de filamentos justapostos.
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266
Descrição da espermatogênese da espécie
Rheumatobates crassifemur crassifemur
(Heteroptera, Gerridae)
Castanhole, MMU; Pereira, LLV; Itoyama, MM
Laboratório de Citogenética e Molecular de Insetos - LACIMI, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual
Paulista, Departamento de Biologia, São José do Rio Preto, SP
[email protected]
Palavras-chave: Rhagadotarsinae, testículo, citogenética, meiose, cromossomo holocêntrico.
A família Gerridae tem distribuição mundial, exceto na Antártida. Ocupa a película superficial da água, tanto
em habitats lóticos quanto lênticos, principalmente em água doce, mas com algumas espécies de ambientes
marinhos. Eles são uma família rica em espécies, mas em relação à família Veliidae (espécies aquáticas) é um grupo
estruturalmente mais homogêneo. Rheumatobates Bergroth é um gênero de insetos aquáticos pequenos do Novo
Mundo pertencentes a subfamília Rhagadotarsinae. Com o objetivo de ampliarmos as informações citogenéticas dos
Heteroptera, coletamos a espécie Rheumatobates crassifemur crassifemur na cidade de Guaraci, SP (20°30’S 48°56’O
altitude 481) e fixamos em metanol: ácido acético (3:1) para posterior esmagamento e coloração com orceína lactoacética. Após as incisões abdominais verificamos que os testículos são arredondados e envoltos por membrana
transparente. Após coloração, observamos que as células espermatogoniais, desta espécie, são em torno de seis
vezes maiores que as das espécies terrestres. As células em prófases I possuem dois corpúsculos heteropicnóticos
alongados e intensamente corados, sendo possivelmente os cromossomos sexuais (X e Y). Observamos, também,
a presença de uma região menos corada, que indica ser a região do nucléolo. Na metáfase I, visualizamos que o
complemento cromossômico é de 2n= 22 (20A + XY). Anáfases e telófases apresentaram-se com segregação regular
dos cromossomos formando duas células grandes. As espermátides, inicialmente, encontram-se arredondadas
com uma marcação heteropicnótica localizada na periferia do envoltório. Com o alongamento essa marcação vai se
concentrando na região posterior da cabeça. Na espermátide em alongamento, o material heteropicnótico concentrase na região posterior, sendo, posteriormente, alongada em forma de bastão. As espermátides, em forma de bastão,
apresentam uma grande região heteropicnótica na parte posterior da cabeça, onde ocorre o início da formação da
cauda. Na região anterior, destas espermátides, ocorre a formação de uma expansão, sem indicação de material
cromatínico. Com o desenvolvimento, a região da cabeça torna-se mais alongada, sendo a cauda muitas vezes maior
que a cabeça. Podemos concluir que as características descritas anteriormente são semelhantes aos dos outros
Heteroptera aquáticos descritos na literatura, em que as células também são grandes e as espermátides apresentamse em forma de bastão. Porém, com relação ao complemento cromossômico e a morfologia dos testículos, notamos
que a maioria das espécies descritas na literatura é X0 e os outros Heteroptera da família Gerridae apresentaram
testículos morfologicamente alongados. Portanto, esta é uma das espécies que não possui o sistema cromossômico
do sexo padrão descrito para a família, necessitando, assim, de análises de um número maior de espécies.
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Análise citogenética e molecular de espécies do
complexo Maculata
Mendonça, PP1; Guerra, AL1; Tridico, LM1; Pereira, NP1; Bardella, VB; Castiglioni, L1; Azeredo-Oliveira, MTV1
Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita” (UNESP), Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE), São José do Rio Preto, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Triatomíneos, Citogenética, Cromossomos holocêntricos, Heterocromatina, RAPD-PCR
Os triatomíneos são insetos hematófagos de grande importância para a parasitologia humana, pois são transmissores
do Trypanosoma cruzi, protozoário causador da doença de Chagas. Atualmente são admitidas 142 espécies da
subfamília Triatominae que são agrupadas em 18 gêneros. O gênero Triatoma é o mais numeroso e está subdividido
em complexos específicos de acordo com semelhanças morfológicas e distribuição geográfica de suas espécies. A
identificação e a sistemática desses insetos baseiam-se nos caracteres morfológicos, entretanto, algumas espécies
são muito semelhantes, o que dificulta a classificação. Dessa forma, a caracterização citogenética e a obtenção de
marcadores moleculares possuem um importante papel no processo de identificação dos Triatominae. As espécies
Triatoma maculata e T. pseudomaculata compartilham várias semelhanças externas e, por este motivo, foram
agrupadas no complexo Maculata. Contudo, alguns autores não aceitam o atual agrupamento destas espécies.
Assim, a citogenética e as inúmeras técnicas de biologia molecular são consideradas importantes ferramentas na
identificação dessa subfamília. No presente trabalho, compararam-se as espécies do complexo Maculata, com dados
baseados em citogenética, na tentativa de observar variações na estrutura cromossômica com ênfase ao padrão e à
caracterização das regiões heterocromáticas e, também, utilizando-se marcadores moleculares RAPD-PCR. Foram
analisados os túbulos seminíferos das espécies T. maculata e T. pseudomaculata submetidos ao esmagamento
celular e, posteriormente, foram realizadas às técnicas citogenéticas de bandamento-C e bandamento-C
fluorescente CMA3/DAPI. Para a obtenção dos marcadores RAPD-PCR foram analisados 10 indivíduos de T.
maculata e T. pseududomaculata. O DNA genômico foi extraído da musculatura da perna e amplificado pela
PCR, utilizando-se 10 primers aleatórios (Operon-RAPD® 10mer). As análises citogenéticas destacaram várias
semelhanças nas estruturas nuclear e cromossômica de ambas as espécies: mesmo número cromossômico (2n
= 22); cromossomo Y heterocromático, rico em bases AT e cromossomos autossomos com a mesma composição
de bases. As análises moleculares (RAPD-PCR) mostraram um padrão de bandas polimórficas, sendo possível
obter marcadores moleculares capazes de diferenciar as espécies analisadas. Conclusões: As diversas semelhanças
encontradas no presente estudo, verificadas pelas técnicas citogenéticas e pelos marcadores moleculares
obtidos a partir da técnica de RAPD-PCR, suportam a hipótese que essas duas espécies devem ser agrupadas
no complexo Maculata. Estes dados auxiliam na compreensão da história evolutiva dessas espécies, fornecendo
subsídios que minimizam a problemática taxonômica existente entre T. maculata e T. pseudomacula, contribuindo,
para o conhecimento da biologia dessas espécies, que, atualmente, são consideradas importantes vetores na
região Nordeste do Brasil, fornecendo, dessa forma, novas ferramentas para a profilaxia da doença de Chagas.
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268
Análise da expressão gênica diferencial de machos de
Melipona quadrifasciata indica ausência de transcritos
relacionados a espermatogênese em machos diplóides
Borges, AA1; Humann, FC2; Hartfelder, K2; Campos, LAO1; Tavares, MG1
Departamento de Biologia Geral da Universidade Federal de Viçosa – UFV/MG
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP/SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Melipona quadrifasciata, abalhas, expressão gênica, RDA, machos diplóides.
Em Melipona quadrifasciata, e nos Hymenoptera em geral, os machos originam-se de ovos não fertilizados e as
fêmeas de ovos fertilizados. No entanto, ovos fertilizados que apresentam homozigose no loco da determinação
sexual se desenvolvem em machos diplóides. A produção destes machos é desvantajosa porque aumenta a carga
genética da colônia, além de impor um custo significativo no sucesso reprodutivo de seus progenitores e no próprio
desenvolvimento da colônia. A fim de compreender os mecanismos moleculares envolvidos nos processos de
diferenciação dos machos foi empregada a técnica de Representational Difference Analysis (RDA), para identificar
genes diferencialmente expressos. Cruzamentos endogâmicos foram realizados para a obtenção dos machos
diplóides. Amostras de indivíduos recém-emergidos destes machos foram utilizadas para a construção das
bibliotecas subtrativas. As etiquetas de sequências expressas (ESTs) dos machos haplóides e diplóides apresentaram
alta qualidade (83,3% e 86,7%, respectivamente) após passarem por um pipeline construído sobre a plataforma Egene.
Posteriormente, as ESTs foram submetidas a análises CAP3 gerando 30 contigs e 88 singlets. Análises BLAST revelaram
similaridades, principalmente, com genes de Apis melifera, de outros meliponíneos e de Drosophila melanogaster.
Adicionalmente, algumas ESTs não apresentaram similaridade com sequências depositadas nos bancos de dados.
Informações funcionais relativas aos genes ortólogos de Drosophila e com similaridades a sequências de abelhas
foram atribuídas por meio do Gene Ontology, mostrando diferenças significativas para genes agrupados nos níveis
5, 6 e 7 de componentes celulares (p < 0,05). A análise comparativa da expressão gênica destes machos revelou que
os machos haplóides expressam genes envolvidos nos processos reprodutivos, de espermatogênese e de resposta a
estímulos químicos, enquanto que a maioria dos genes expressos nos machos diplóides está envolvida com transporte
intracelular de íons, localização celular, desenvolvimento tecidual e atividade hidrolítica. A ausência de transcritos
relacionados com processos reprodutivos nos machos diplóides pode explicar a sua esterilidade e menor fitness.
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269
Filogenia molecular de espécies de besouros
bioluminescentes (Coleoptera: Elateroidea)
Neotropicais
Amaral, DT1; Arnoldi, FGC2; Viviani, VR1
Lab. De Bioquímica e Biotecnologia de Sistemas Bioluminescentes, Universidade Federal de São Carlos (UFSCar), Campus Sorocaba
Departamento de Bioquímica e Imunologia, Universidade de São Paulo (USP), Campus Ribeirão Preto
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bioluminescência, Luciferase, Elateroidea, Genoma Mitocondrial, Filogenia
A bioluminescência, emissão de luz fria visível por organismos vivos, é um interessante objeto de estudo devido
a suas origens bioquímicas independentes e sua diversidade filogenética entre os organismos terrestres. A
bioluminescência, ainda incerta, pode ter se originado de 30 a 40 vezes independentemente durante a evolução dos
organismos. Em besouros, a bioluminescência ocorre dentro da superfamília Elateroidea (Coleoptera), que inclui
as principais famílias de vaga-lumes: Elateridae (pirilampos ou vaga-lumes tec-tec), Phengodidae (trenzinhos)
e Lampyridae (Vaga-lumes tradicionais). Dentro dessa superfamília a bioluminescência pode ter se originado 3
vezes independentemente ou apenas uma vez, derivando-se de um ancestral protobioluminescente. O sistema
bioluminescente dos besouros elateróides já é bem conhecido e sabe-se que a grande diversidade de cores, que varia
do verde ao vermelho, deve-se a diferenças estruturais de luciferases homólogas, já que o substrato e a reação são os
mesmos. A região Neotropical abriga à maior biodiverisidade de besouros bioluminescentes do planeta. Apesar disto,
existem poucos estudos abordando a filogenia destas espécies a nível molecular. Nosso grupo clonou anteriormente
várias luciferases de espécies brasileiras das 3 famílias e sequenciou o genoma mitocondrial do elaterídeo Pyrophorus
divergens. A partir deste genoma e de outros de espécies relacionadas depositadas no GeneBank, desenhou-se
primers e sequenciou-se regiões dos genes NADH2 e COI/COII de espécies representantes da região Neotropical
destas famílias para análises filogenéticas. Resultados iniciais indicam a proximidade de relação entre Pyrophorus
divergens, Pyrearinus termitilluminans, Hapsodrilus ignifer e Fulgeoshlizus brcuchii todos pertencentes a famílias
Elateridae, o que confirma a monofilia da família. Surpreendentemente, os dados moleculares para as regiões gênicas
NADH2 e COI/COII também indicaram uma relação mais estreita entre as famílias Elateridae e Phengodidae que
entre as famílias Lampyridae e Phengodidae, em contraste com a filogenia tradicional deste grupo taxonômico.
Financiamento: FAPESP, CNPq
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270
Ocorrência de fragmentos do transposon DNAREP1
contendo sítios de ligação de fatores de transcrição
nos genes Cyp6w1 e Cyp12d1 de Drosophila
melanogaster e D. simulans
Rauber, ALN1; Ricci, J1; Lopes, FR1; Carareto, CMA1
Laboratório de Evolução Molecular de Insetos - Departamento de Biologia - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”
[email protected]
1
Palavras-chave: Transposon DNAREP1, Cyp6w1, Cyp12d1, sítios de ligação de fatores de transcrição, Drosophila.
Recentemente tem sido demonstrado que os elementos de transposição são fontes de novas sequências
reguladoras tendo, portanto, um papel relevante na evolução genômica. Fragmentos desses elementos se inserem
geralmente em regiões regulatórias 5` de genes podendo levar à modificação da expressão gênica, como é o caso
da família gênica Cyp, relacionada à resistência a inseticidas em Drosophila. Neste trabalho, foi analisada a região
flanqueadora 5` dos genes Cyp6w1 e Cyp12d1 em linhagens geográficas de D. melanogaster, todas coletadas
no Brasil (Itaúnas, Tavares, Bento Gonçalves e Lençóis) e de D. simulans do Brasil (Itaúnas, Lençóis, Paulo de
Faria), da África (Makindu) e de Nova Caledônia (Amieu). As sequências foram amplificadas com iniciadores
sense, que se anelava na região upstream ao início do gene (distante em até 1kb), e antisense, que se anelava na
extremidade 5´ do gene. Os elementos de transposição existentes nessas sequências foram identificados por meio
do RepeatMasker e, com elas, foram realizadas análises evolutivas (DNAsp) e da ocorrência de sítios de ligação
de fatores de transcrição (Alibaba2). DNAREP1, um transposon da família dos Helitrons, foi o único elemento
identificado nos dois genes, ocorrendo em 100 % das linhagens no gene Cyp6w1. Por outro lado, no gene Cyp12d1,
esteve presente na única linhagem de D. simulans analisada e ausente em todas as de D. melanogaster. Essas cópias
apresentavam um tamanho médio de 312 pb e 396 pb e divergência média em relação ao DNAREP1 consenso de
14,8 % e 15,6%, respectivamente em D. melanogaster e D. simulans. As inserções relacionadas ao gene Cyp6w1,
que são compartilhadas entre linhagens, e entre as duas espécies, correspondem à sequência da extremidade
3´ do elemento e, suas orientações, sense (54%) ou antisense (46%), não diferiram significantemente (p>0,05). A
diversidade nucleotídica dessas inserções foi de 0,0129 e 0,0183, respectivamente para D. melanogaster e D. simulans.
O teste de Tajima (D) aplicado para avaliar a dinâmica evolutiva indica que essas sequências evoluem de forma
neutra (D. melanogaster: -0,80861, p>0,05 e D. simulans: -0,2309, p>0,05). Foram identificados três sítios de ligação
de fatores de transcrição característicos de Drosophila, C/EBPALP, Oct1 e Antp, sendo o último mais freqüente
em D. simulans. Tem sido demonstrado em várias espécies que elementos de transposição foram incorporados ao
aparato regulatório de genes adjacentes. A presença dos sítios de ligação em fragmentos do elemento DNAREP1,
que correspondem a inserções compartilhadas pelas duas espécies, sugere que estas sequências possam estar
sendo conservadas por desempenharem função regulatória na expressão dos genes Cyp. Análises de expressão
desses genes estão em andamento e poderão confirmar a efetiva influência desses fragmentos na expressão gênica.
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271
Análise do marcador COI revela a ocorrência de duas
introduções de Z. indianus no Brasil e que a invasão na
Flórida se deu a partir de população brasileira
Commar, LS1; Ceron, CR1; Carareto, CMA2
Laboratório de Genética-Bioquímica - UNESP, São José do Rio Preto, SP
Laboratório de Evolução Molecular de Insetos – UNESP, São José do Rio Preto, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: invasão biológica, Zaprionus indianus, COI, marcador mitocondrial, continente americano.
Zaprionus indianus é uma espécie de origem africana que se dispersou pelas regiões tropicais da Ásia e das Américas
do Sul e do Norte. Grande interesse tem sido despertado sobre essa espécie, principalmente pela recente expansão
da sua área de distribuição com a invasão do continente americano, possivelmente em 1998. Hoje, indivíduos
dessa espécie são encontrados em uma larga amplitude latitudinal (68°), do Uruguai a Belém (Brasil) e, em 2005,
na Flórida (Estados Unidos). Tem sido proposta que a introdução da espécie no Brasil se deu a partir do Estado
de São Paulo, no entanto, há dúvidas se a população da Flórida é originária da América do Sul, África ou Ásia.
Na tentativa de esclarecer essa questão, avaliamos a variabilidade genética de um fragmento do marcador COI
(citocromo oxidase I), de 612 pb, de vinte populações de Z. indianus, de diversas regiões geográficas, como África,
Ásia e Américas. O marcador utilizado, de origem mitocondrial, é especialmente favorável a estudos evolutivos
de populações ou espécies recentemente diferenciadas por apresentar altas taxas evolutivas, transmissão
exclusivamente materna e ausência de recombinação. Para tal análise, foi construída uma rede de haplótipos
por meio do método “median-joning network”. Os resultados obtidos demonstram o agrupamento das espécies
africanas, compartilhando sequências ancestrais ou não amostradas, como também apresentando o maior número
de mutações (todas elas sinônimas), indicando serem essas populações as mais divergentes e portanto ancestrais.
A rede mostra dois haplótipos ancestrais distintos relacionados diretamente aos haplótipos amostrados nas
populações brasileiras e a ocorrência de não apenas uma, mas de duas invasões no Brasil a partir da África. De uma
das invasões derivaram os haplótipos amostrados em populações localizadas preferencialmente ao sul da América
do Sul (sul do Brasil e Uruguai). A outra é proveniente da mesma população ancestral africana que colonizou
anteriormente a Ásia (1970) e, a esse haplótipo, associam-se diretamente os aqueles amostrados em populações
do norte, sudeste e sul do Brasil e o haplótipo amostrado na população da Flórida. Nossos resultados são inéditos,
pois indicam não apenas a ocorrência de duas invasões no Brasil, ao contrário de uma, previamente sugerida,
como também que a invasão da América do Norte se deu a partir de migrantes de populações brasileiras, e não
africanas ou asiáticas. Essa origem pode estar diretamente relacionada ao fato de o Brasil ser hoje o terceiro maior
produtor mundial de frutas e exportar 14 culturas para os Estados Unidos, dentre elas uva, banana, manga e melão.
Interessantemente, a Flórida é centro das atividades comerciais e financeiras na América do Norte, o que explicaria
a introdução de Zaprionus indianus partir de populações brasileiras, primeiramente neste estado norte-americano.
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Análises de Cromossomos de Três Espécies do Grupo
tripunctata de Drosophila
Brianti, MT1; Ananina, G1; Klaczko, LB1
1
Instituto de Biologia, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Estadual de Campinas
[email protected]
Palavras-chave: Drosophila, Cromossomos, elementos de Muller
Arquitetura genômica, voltou a ser tema importante no cenário da genética evolutiva. Neste contexto, estudos
com Drosophila podem proporcionar resultados interessantes pela possibilidade de conciliar investigações
cromossômicas com a grande quantidade de informações genômica disponíveis para este gênero. Além disso, as
investigações cromossômicas podem ser abordadas em diferentes níveis de organização, uma vez que estas espécies
possuem cromossomos politênicos. Estes cromossomos têm sido amplamente utilizados em análises genéticas de
Drosophila e outros dípteros. Os mapas de cromossomos politênicos tornaram-se ferramentas importantes para
localização de genes, detecção de diversidade genética entre populações, inferência filogenéticas, e de um modo mais
amplo, estudos de arquitetura genômica. Sendo assim, neste trabalho, apresentamos análise dos cromossomos de
três espécies proximamente relacionadas do grupo tripunctata (subgênero Drosophila): Drosophila mediopunctata,
D. roehrae e D. unipunctata; com a pretensão de subsidiar novos estudos abordando arquitetura genômica e outros
possíveis enfoques. Mais especificamente analisamos as configurações dos cariótipos metafásicos das três espécies
e produzimos fotomapa dos cromossomos politênicos. Também identificarmos os elementos de Muller utilizando
sondas de genes de Drosophila melanogaster em hibridação in situ por fluorescência (FISH). Bem como, fizemos a
comparação dos dois elementos cromossômicos mais conservados entre as espécies, através da análise do padrão
de bandas. Caracterizamos, também, os polimorfismos de inversões encontrados nas linhagens estudadas de D.
roehrae e D. unipunctata. Ao realizar estas análises, podemos notar que D. unipunctata apresenta uma conformação
cariotípica singular, o que sugere uma rápida evolução cromossômica ou, então, uma incongruência com a filogenia
molecular. Uma vez que, estudos anteriores que compararam sequências gênicas, apontam ao fato das espécies
D. mediopunctata e D. unipunctata serem filogeneticamente mais próximas entre si que D. roehrae. Também
foi possível notar, que os dois elementos comparados apresentaram grande similaridade, indicando a estreita
relação entre as três espécies. Além da existência de um padrão de distribuição do polimorfismo de inversões
cromossômicas entre elementos de Muller, nestas espécies. O elemento E é o mais polimórfico, com muitas
inversões em cada espécie, e o elemento C é o segundo mais polimórfico; enquanto B e D são os menos polimórficos.
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Molecular differences between queens and workers
after vitellogenin gene knockdown
Nunes, FMF1*; Bomtorin, AD2; Freitas, FCP2; Cristino, AS3; Barchuk, AR5; Simões, ZLP1
Departamento de Biologia - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP, Brazil
Departamento de Genética – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, Brazil
3
The Queensland Brain Institute, Australia
4
Instituto de Ciências Biomédicas – UNIFAL, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: Apis mellifera, vitellogenin, RNAi, microarrays, caste differentiation.
The genetic components relating to evolutionary and developmental questions of phenotypic plasticity in social
Hymenoptera are not completely understood. In honeybees (Apis mellifera), workers are short-lived, functionally
sterile, and perform all the non-reproductive tasks in the colony. Queens, on the other hand, engage in laying eggs
and are long-lived. Vitellogenin (Vg), an egg yolk precursor protein, serves essential reproductive functions, but is
also involved with lifespan and behavior, which makes it an eminent target for the study of caste differences. In an
effort to find genes that respond to Vg disruption, we used RNAi and microarrays approaches. We manipulated
the diet of 2nd instar larvae using either Vg-derived double-stranded RNA (dsRNA-Vg) or a green fluorescent
protein-derived double-stranded RNA (dsRNA-GFP, as exogenous control). Larvae were allowed to develop in
a natural setting inside the colony until the moment of sampling, which took place either upon emergence for
queens (QNE) or at 7 days for workers (W7d). Total RNA from the fat body was used to synthesize probes to
perform dye-swap microarrays. In terms of up-regulation, 39 genes in QNE and 38 in W7d were altered in Vgknockdown samples. As for down-regulation, we observed changes in 37 QNE- and 19 W7d-genes. From these
lists of genes, only a sensory perception gene, named odorant binding protein (Obp16), was equally inhibited
in both castes. Ten other genes were found to be antagonistically regulated by Vg between castes. In particular,
genes that are important to communication, defense, nutrition and body development were identified: melittin
(venom component), headcase (related to morphogenesis), carboxypeptidase A (degradation of proteins in
the digestive tract), ecdysteroid regulated protein (cholesterol/lipid binding), serine protease (melanization
and immune defense). These data indicate that Vg disruption can differentially affect gene expression in
castes, by disturbing similar biological processes involved in the complex formation of social life traits.
Financial support: FAPESP 2005/03926-5 (ZLPS, MMGB) and 2007/07594-2 (FMFN); CNPq 481000/2009-7 (FMFN)
and 473748/2008-8 (ARB); Unifal-MG (ARB).
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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274
Descrição do cariótipo de Triatoma vandae
(Triatominae, Heteroptera)
Pereira, NP1; Mendonça, PP1; Tridico, LM1; Azeredo-Oliveira, MTV1
Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita” (UNESP), Instituto de Biociências, Letras e Ciências
Exatas (IBILCE), São José do Rio Preto, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Triatomíneos, Citogenética, Cromossomos holocêntricos, Espermatogênese, Cariótipo.
Os insetos da subfamília Triatominae, também conhecidos como barbeiros, possuem uma grande importância
na parasitologia humana, pois são vetores do Trypanosoma cruzi, protozoário causador da doença de Chagas.
Esses insetos são hematófagos e pertencem à ordem Heteroptera e à família Reduviidae e transmitem a doença
por seu hábito de defecar, após a hematofagia. Além da importância médico-sanitária, esses insetos destacam-se
por constituírem um modelo para o estudo da citogenética, por apresentarem características peculiares como
cromossomos holocêntricos, que possuem cinetócoros difusos ao longo do comprimento da cromátide, e uma
meiose incomum, na qual os autossomos segregam-se de maneira regular, enquanto que os cromossomos sexuais
apresentam a primeira divisão equacional e a segunda reducional. O número básico de cromossomos para os
triatomíneos é de 22, sendo 10 pares de cromossomos autossomos e 1 par de heterocromossomos sexuais. Porém,
existem espécies com múltiplos cromossomos sexuais (XY, X1X2Y, X1X2X3Y), provenientes da fragmentação do X
original, e, também, aquelas que apresentam 9 ou 11 pares de autossomos. Atualmente são admitidas 143 espécies
da subfamília Triatominae que são agrupadas em 18 gêneros, sendo o Triatoma o gênero mais numeroso. A espécie
T. vandae foi recentemente descrita a partir de insetos silvestres procedentes do Estado de Mato Grosso. Esta
nova espécie está incluída no complexo Oliveirai que, atualmente, é composto por nove espécies. Apesar de ter
sido encontrada infectada pelo T. cruzi, pouco se sabe sobre sua biologia e seus aspectos citogenéticos. Dessa
forma, tornam-se imprescindíveis estudos nesta espécie, com ênfase às suas características citogenéticas, para
melhor entender a distribuição e expansão desse inseto e, consequentemente, contribuir com a profilaxia da
Doença de Chagas. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar citogeneticamente a espécie T. vandae, por
meio da análise dos túbulos seminíferos de machos adultos, com ênfase, principalmente, à análise do cariótipo
e da meiose desta espécie. Foram analisados os túbulos seminíferos de machos adultos de T. vandae, submetidos
ao esmagamento celular. Posteriormente, foi realizada a técnica citogenética convencional de orceína lactoacética, para análise geral da espermatogênese, com ênfase às células em divisão e às regiões heteropicnóticas.
O cariótipo dessa espécie, montado com base nas metáfases mitóticas e meióticas, apresentou 22 cromossomos
(10 pares de autossomos e um par de cromossomos sexuais) coincidentes, portanto, com o número modal do
grupo. Conclusões: O presente trabalho possibilitou descrever, pela primeira vez, o cariótipo da espécie T.
vandae e destacar os padrões de heteropicnose nas células interfásicas e nos cromossomos holocêntricos,
ampliando, dessa forma, o conhecimento sobre o conjunto cromossômico diplóide da subfamília Triatominae.
Apoio Financeiro: FAPESP e PIBIC/CNPq.
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275
Identificação molecular de abelhas sem ferrão da Amazônia
Souza, MT1; Brasil, AMB2; Vilas Boas, HC3; Carvalho-Zilse, GA4
Mestranda do Programa de Pós-Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva. Grupo de Pesquisas em Abelhas do Instituo
Nacional de Pesquisas da Amazônia (GPA/INPA). Av. André Araújo, 2936, Aleixo, Manaus. 69.060001
2
Bolsista PCI GPA/INPA
3
Técnico GPA/INPA
4
Orientadora/Coordenadora do Projeto e do GPA/INPA
[email protected]
1
Palavras-chave: 16S, COI, SSCP, Meliponini
No Brasil ocorrem 192 espécies de abelhas sem ferrão ou indígenas dentre as quase 400 que pertencem a Tribo
Meliponini. Estas abelhas além de produzirem mel, são importantes polinizadoras da flora nativa e dispersoras de
sementes. Apesar disto, estão em acelerado processo de desaparecimento, principalmente por causa da destruição
dos seus habitats naturais. Ainda é necessário muito trabalho para conhecer a real diversidade dessas abelhas
na região amazônica. Atualmente, com o advento de estudos moleculares, a caracterização de espécies vem
avançando, pois tais técnicas permitem a comparação de seqüências de DNA. Especialmente, o DNA mitocondrial
vem sendo utilizado em estudos intra e inter-específicos por ser pequeno, transmitido maternalmente e altamente
conservado. Tal sensibilidade culminou na proposição de uma tecnologia nova e rápida para identificação das
espécies com base na região COI (Citocromo oxidase I), denominada DNA Barcode. Diante disto, este estudo teve
por objetivo comparar a eficiência das regiões 16S rRNA e COI do DNA mitocondrial para diferenciar nove espécies
de abelhas sem ferrão da Amazônia (Melipona interrupta, M. seminigra, M. rufiventris, M. dubia, M. nebulosa, M.
eburnea, Scaptotrigona sp., S. polystica, Trigona williana) com base em polimorfismo de DNA de fita simples pela
técnica SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism). Foram coletados cinco indivíduos adultos de 10 colméias
de cada espécie para extração individual de DNA pelo protocolo de Paxton et al. (1996). As seqüências alvo foram
amplificadas pela técnica PCR (Polimerase Chain Reaction), desnaturadas em tampão SSCP e submetidas a
eletroforese em gel de poliacrilamida 12% corado com nitrato de prata. Observou-se 23 haplótipos (16SH1-16SH23)
para a região 16S, sendo dois compartilhados (16SH1 entre M. interrupta e M. seminigra, 16SH5 entre S. polysticta,
M. interrupta e M. eburnea). O número de haplótipos exclusivos por espécie variou de um (M. dubia) a cinco (M.
seminigra e M. eburnea). Para COI foram encontrados 23 haplótipos (COIH1-COIH23), sendo três compartilhados
(COIH10 e COIH11 entre M. eburnea e M. rufiventris e COIH16 entre Scaptotrigona sp e S. polysticta). O número
de haplótipos exclusivos variou de um (M. dubia e Trigona williana) a seis (M. interrupta). A distância genética de
Nei, tanto para 16S quanto para COI, foi de 100% para as espécies que não compartilharam haplótipos. Para 16S
as distâncias entre M. interrupta e M. seminigra foi de 80%, entre M. interrupta e M. eburnea e entre S. polysticta
e M. eburnea de 70%, e entre S. polysticta e M. interrupta de 58%. Para COI as distâncias encontradas foram de
1,4% entre M. eburnea e M. rufiventris e 58% entre Scaptotrigona sp. e S. polysticta. Com bases nestes resultados,
pode-se inferir que tanto a região 16S quanto a COI diferenciam as espécies de abelhas sem ferrão estudadas.
Apoio financeiro: CNPq (CT-Amazônia), FAPEAM, FINEP (Fronteira).
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276
Correlação entre os componentes do valor adaptativo e a
resistência ao DDT em linhagens de laboratório e recémcoletadas de Drosophila melanogaster e D. simulans
Gomes, MO1; Madi-Ravazzi, L1
Laboratório de Genética, Ecologia e Evolução de Drosophila, Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências
Exatas - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”- Campus de São José do Rio Preto
[email protected]
1
Palavras-chave: grupo melanogaster, resistência a inseticidas, valor adaptativo.
Introdução: Linhagens resistentes de D. melanogaster são notavelmente ajustadas a seus ambientes e o lócus
da resistência DDT-R parece estar se aproximando de uma fixação global, mesmo após o uso do DDT ter sido
abolido em atividades agrícolas, embora ainda utilizado no controle de insetos vetores. Trabalhos na literatura
indicam que este lócus pode não apresentar custo adaptativo para esta espécie. Objetivo: O presente trabalho
avaliou cinco componentes do valor adaptativo ( fertilidade, fecundidade, viabilidade ovo-pupa, viabilidade pupaimago e viabilidade ovo-imago) em linhagens de laboratório e recém-coletadas de D. melanogaster e D. simulans e
correlacionou com a resistência ao DDT. Métodos: Para essa análise, casais de quatro dias de idade, permaneceram
em tubos de excursão contendo meio de cultura padrão (banana-ágar) para oviposição. Os componentes do valor
adaptativo foram analisados nesta descendência. Após quatro ou cinco dias de oviposição, os casais parentais
foram submetidos ao bioensaio com DDT em concentrações previamente estabelecidas (CL50) para a classificação
dos fenótipos resistentes ou suscetíveis. Os casais que sobreviveram ao teste foram considerados resistentes e
os que não sobreviveram foram considerados suscetíveis. Resultados: As linhagens de laboratório resistentes
de D. melanogaster mostraram valores maiores nos parâmetros avaliados do que as suscetíveis, isto também foi
verdadeiro para as linhagens de D. simulans. Estes resultados corroboram a idéia difundida na literatura que, em D.
melanogaster, o lócus DDT-R parece não apresentar custo, no presente trabalho os dados obtidos para D. simulans
também sugerem ausência de custo dos fenótipos resistentes. Nas linhagens recém-coletadas de ambas as espécies
foram obtidos somente fenótipos resistentes, os quais mostraram valores significantemente superiores aos das
linhagens resistentes de laboratório tanto para D. melanogaster quanto para D. simulans, indicando que na natureza
estas populações estão sofrendo a ação de outros inseticidas que favorecem o fenótipo da resistência. Destaca-se
que os valores dos parâmetros avaliados das linhagens D. melanogaster foram significantemente superiores aos de
D. simulans em todos os casos, refletindo um valor adaptativo maior para as populações de D. melanogaster em
relação à D. simulans. A diferença na fertilidade entre os fenótipos resistentes e suscetíveis, já foi evidenciada em
outros trabalhos apenas para linhagens de D. melanogaster e foi atribuída a uma vantagem do fenótipo resistente
das fêmeas e no presente trabalho isso também foi verificado para a espécie irmã, D. simulans. Conclusões: A não
observação de custo para o fenótipo resistente pode ser causada pela perda dos efeitos pleiotrópicos negativos
associados com o alelo resistente. Entretanto, a redução do valor adaptativo nestes traços pode não estar
associada somente com os genes responsáveis pela resistência e novos estudos devem ser realizados com intuito
de esclarecer e compreender melhor os mecanismos dos custos fisiológicos associados à resistência a inseticidas.
Apoio Financeiro: CNPq, Capes e Fundunesp.
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277
Variação fenotípica na asa da espécie Drosophila
serido associada ao cacto hospedeiro
Nuayed, ABC¹; Bizzo, L¹,²; Manfrin, MH¹
¹Laboratório de Genética Evolutiva – Departamento de Biologia – FFCLRP – USP
²Programa de Pós-Graduação em Entomologia - FFCLRP - USP
[email protected]
Palavras-chave: cluster Drosophila buzzatii, morfometria geométrica, asa, Cereus hildmaniannus, Opuntia monacantha.
Drosophila serido (“cluster” Drosophila buzzatii, grupo repleta) é uma espécie cactofílica, utilizando tecidos de cactos
em decomposição como fonte de alimentação exclusiva para suas larvas. Está distribuída no nordeste do Brasil e,
ao longo da costa atlântica, até o estado de Santa Catarina. Ao longo de sua distribuição utiliza diferentes espécies
de cactos como hospedeiro e em localidades do município de Florianópolis, mais especificamente na Ilha de Santa
Catarina, está associada aos cactos Cereus hildmaniannus e Opuntia monacantha. O objetivo deste estudo foi verificar
se diferentes cactos hospedeiros influenciam forma e tamanho das asas de indivíduos de D. serido provenientes da
localidade da Ilha de Santa Catarina. Os indivíduos analisados foram obtidos a partir da coletas de cladódios de
O. monacantha e C.hildmaniannus da Barra da Lagoa. Os cladódios foram trazidos para o laboratório e colocados
individualmente em terrários. A partir destes cladódios, indivíduos machos que emergiram do cluster D. buzzatii
foram aspirados e identificas por meio de eletroforese usando o sistema enzimático isocitrato desidrogenase (IDH),
que apresenta alelos diagnósticos para estas espécies cactofílicas. Os machos de D.serido tiveram suas asas direitas
analisadas por morfometria geométrica, utilizando dez marcos anatômicos. Estes geraram um componente de
tamanho (centróide) e 16 componentes de forma, que foram comparados por análises de variância uni e multivariada.
A análise de alometria foi feita por análise multivariada de covariância sobre a regressão múltipla de cada variável
de forma em relação ao tamanho. Os indivíduos que emergiram de O. monacantha possuem a asa maior (F=5,69, p<
0,001) e forma diferente (Wilk´s=0,90; p<0,001) daqueles que emergiram de C. hildmaniannus. Entre os indivíduos de
O. monacantha (R²=0,08; p<0,001) a forma está menos relacionada à variação de tamanho que em C. hildmaniannus
(R²=0,19; p<0,001). A análise dos marcos anatômicos mostrou variação similar de tamanho entre os indivíduos, mas
com variação de forma. Os de O. monacantha, com as células discal-medial e anal mais alongadas, gerando asas
mais circulares, e os indivíduos de C. hildmaniannus, com a porção distal mais alongada, gerando asas mais elípticas.
Os dados obtidos são discutidos considerando diferenças entre os cactos hospedeiros, como ambientes mais ou
menos estressantes para as larvas, e expressão diferencial de genes associados aos diferentes substratos de cria.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP, CAPES, FINEP e USP.
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Análise da diversidade genética em Drosophila antonietae
(Diptera; Drosophilidae) através de DNA microssatélite
Tractz, CC; Simão, DP; Machado, LPB; Mateus, RP
Laboratório de Genética e Evolução, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Centro Oeste do Paraná
[email protected]
Palavras-chave: Microssatélite, Bacia dos rios Paraná-Uruguai, Drosophila antonietae, Variabilidade genética, Evolução.
Drosophila antonietae é uma espécie cactofílica, pertencente ao cluster buzzatii, e pode ser encontrada ao longo da
bacia dos rios Paraná-Uruguai. O estudo de populações localizadas em áreas dentro da porção média da bacia dos
rios Paraná-Uruguai (Análise Regional), até o presente trabalho não amostradas, através de um marcador molecular
seletivamente neutro, o DNA microssatélite, possibilitou a análise comparativa da variabilidade genética destas
populações recém descobertas de Drosophila antonietae com outras da porção alta e baixa da bacia. Uma baixa
diferenciação genética entre as populações foi observada na Análise Regional, e não houve correlação significativa
entre as distâncias genéticas e físicas (em linha reta e ao longo dos rios) na porção média da bacia. Estes resultados
não corroboraram a proposição de similaridade gradual ao longo de toda a distribuição geográfica da espécie.
Além disso, a detecção de um possível alelo nulo para um loco de microssatélite indica um estado incipiente
de diferenciação populacional na espécie D. antonietae. Na Análise Macrogeográfica, foi encontrada, entre as 14
populações analisadas, uma diferenciação genética moderada, e os índices de distâncias genéticas ficaram de
acordo com esta diferenciação moderada. Novamente, os resultados não corroboraram que esta similaridade
seja contínua ao longo da bacia dos rios Paraná-Uruguai, pois a porção média apresentou maior distância das
demais, assim como maior variabilidade genética. Não houve correlação significativa entre as distâncias físicas e
genéticas nas porções alta, média e baixa das bacias, indicando que não há correlação entre as mesmas. Assim,
pode ser levantada a hipótese de que a homogeneidade e alto índice de polimorfismo nas populações naturais
de D. antonietae sejam decorrentes de uma manutenção histórica de polimorfismos compartilhados. Por outro
lado, os nossos dados parecem indicar diversificação incipiente para as populações da porção média da bacia dos
rios Parana-Uruguai, a qual pode ser em resposta adaptativa regional, ou simplesmente por eventos estocásticos.
Apoio financeiro: Fundação Araucária, CAPES, CNPq, FINEP e UNICENTRO.
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279
Análise Filogenética do Grupo saltans de Drosophila
baseada em Características da Terminália Masculina
Souza1, TAJ; Ravazzi-Madi, L1
Laboratório de Genética, Ecologia e Evolução de Drosophila, Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências
Exatas/UNESP
1
Palavras chave: Drosophila, grupo saltans, terminália, edeago, filogenia
Estudos evolutivos ou da diferenciação genética do grupo saltans do gênero Drosophila têm sido baseados em
análises cromossômicas, bioquímicas, do isolamento reprodutivo e moleculares baseadas na comparação de
seqüências de genes estruturais, em polimorfismos de DNA ou de elementos transponíveis. O objetivo principal
da maioria destes estudos é detectar as relações filogenéticas entre as espécies e entre os subgrupos. Embora
todos os genes estudados confirmaram a monofilia do grupo e dos subgrupos, diferentes genes forneceram
diferentes topologias de relação entre os subgrupos, e mesmo dentro do subgrupo mais amostrado, que é o
subgrupo saltans. Nesta situação as análises morfológicas surgem como uma alternativa para solucionar os
conflitos filogenéticos do grupo saltans. A morfologia do terminália masculina evolui de forma rápida, por
isso tem sido amplamente utilizada em análises morfológicas visando estudos filogenéticos. No presente
trabalho foram analisadas 15 características da terminália e edeago das espécies D. prosaltans, D. saltans e
D. lusaltans do subgrupo saltans; D.sturtevanti e D. dacunhai do subgrupo sturtevanti, D. parasaltans do grupo
parasaltans; D. neocordata do subgrupo cordata e D. emarginata do subgrupo elliptica. As características
diagnósticas das terminálias e edeagos das diferentes espécies analisadas foram identificadas através de análises
de eletromicrografias e posteriormente descritas com auxílio de esquemas de câmara clara de Magalhães (1957,
1962) e Mourão e Bicudo (1957). A espécie D. willistoni foi utilizada como grupo externo e a filogenia foi gerada
pelo programa PAUP (Phylogenetic Analysis Using Parsimony) v. 4.0b10. Uma análise filogenética preliminar foi
gerada baseada em 17 características da terminália masculina e nesta filogenia o grupo saltans não foi considerado
monofilético, possuindo 3 ramos independentes. O primeiro ramo é formado pelo grupo externo (D. willistoni), o
segundo se ramifica em um grupo monofilético formado pelas espécies D. prosaltans, D. lusaltans, D. saltans, D.
parasaltans, D. neocordata e D. emarginata. O terceiro ramo é formado pelas espécies D. sturtevanti e D. dacunhai.
Esta filogenia é em parte concordante com outra filogenia gerada por análises morfológicas descrita recentemente.
Entretanto, esta análise ainda não está finalizada o que pode acarretar algumas mudanças na filogenia aqui proposta.
Apoio Financeiro: FAPESP
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280
Análise comparativa dos sítios de DNAr 18S e Histona
H3 em Brasilacris gigas e Chromacris speciosa
(Orthoptera, Romaleidae)
Regueira Neto, MS1; Souza, MJ1; Loreto, V1
Laboratório de Genética e Citogenética Animal – Departamento de Genética – Centro de Ciências Biológicas – UFPE
[email protected]
1
Palavras-chave: Cromossomo, DNAr, FISH, Gafanhoto, Histona H3
A Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) é, atualmente, a técnica citogenética mais usada na investigação da
história da evolução cromossômica em diversos grupos de organismos. O mapeamento gênico e a análise de
rearranjos cromossômicos diminutos podem ser realizados com precisão devido a uma grande especificidade e
resolução desta técnica. Os genes ribossomais 45S, que são formados pelas subunidades 28S, 18S e 5,8S, juntamente
com os genes da Histona H3, uma classe de proteínas básicas que formam o nucleossomo com ajuda de outras
três (H2A, H2B e H4), tem sido usados como marcadores cromossômicos em comparações interespecíficas. Genes
ribossomais e de histonas são melhores empregados devido as suas organizações repetidas em clusters e por
serem conservados evolutivamente. Em B. gigas e C. speciosa foi realizado um mapeamento cromossômico dos
genes de DNAr 18S e Histona H3 buscando identificar o número e a localização dessas sequências nas espécies.
Foram utilizadas células meióticas de folículos testiculares de dois indivíduos de B. gigas (coletados em Belo
Jardim - PE) e de quatro indivíduos de C. speciosa (coletados em Camocim de São Félix - PE). O mapeamento
cromossômico foi realizado através de FISH a partir de sondas específicas obtidas por PCR. A FISH com
DNAr 18S revelou que ambas as espécies apresentam apenas um sítio contendo a sequência situado na região
proximal de um par médio. Contudo, para B. gigas este foi o megamérico M9 e para C. speciosa o M6. O gene
para Histona H3 também está presente em apenas um sítio em cada uma das espécies, localizando-se na região
proximal do par M9 em B. gigas e na região proximal do par G2 em C. speciosa. Quando cromossomos de B. gigas
foram submetidos a um duplo FISH, para os genes DNAr 18S e Histona H3, os resultados mostraram que os dois
sítios se apresentavam adjacentes no par M9. O fato do DNAr 18S está presente em apenas um cromossomo de
tamanho médio em ambas as espécies estudadas, condição também observada em três outros Romaleideos,
pode indicar que este seria o par ancestral portador do sítio. Adicionalmente, não foi observada amplificação
e dispersão da sequência ribossomal (atribuídos a ação de elementos de transposição) como já relatados em
gafanhotos Acridídeos. Os dados obtidos a respeito do número e localização de sítios H3 são inéditos para a
família Romaleidae e indicam que esta sequência estava presente em apenas um cromossomo originalmente.
A análise comparada entre as espécie mostraram que ambas tem apenas um sítio de DNAr 18S e um de H3,
contudo para C. speciosa eles estão em cromossomos distintos e em B. gigas num arranjo contíguo no mesmo
cromossomo. Rearranjos como translocações ou transposições podem ser responsáveis por estas diferenças.
Apoio financeiro: FACEPE e CNPq (PIBIC – UFPE)
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281
Estruturação genética na broca-da-cana, Diatraea
saccharalis (Lepidoptera, Crambidae) inferida por
diferentes marcadores mitocondriais
Santos, TV1; Silva-Brandão, KL2; Cônsoli, FL3, Omoto, C4
Programa de Pós-Graduação em Entomologia, ESALQ-Universidade de São Paulo. Piracicaba, SP, Brasil
Prof. Dr. do Departamento de Entomologia e Acarologia, ESALQ-USP, Piracicaba, SP, Brasil
4
Prof. Dr. Associado ao Departamento de Entomologia e Acarologia, ESALQ-USP, Piracicaba, SP, Brasil
[email protected]
2
3
Palavras-chave: cox1, cox2, DNAmit, haplótipos, nad6.
Diatraea saccharalis F. é um inseto-praga de grande importância agrícola. Suas larvas trazem perdas significativas
a culturas de milho, sorgo e arroz, além de serem consideradas a principal praga da cana-de-açúcar, afetando
profundamente o estado de São Paulo, responsável por 51% da produção nacional de cana. É uma espécie
facilmente amostrada e de grande distribuição espacial. Recentemente, vários genomas mitocondriais completos
foram sequenciados para Lepidoptera, incluindo várias espécies de interesse agrícola. Assim, o presente trabalho
teve como objetivo comparar alguns desses marcadores mitocondriais em D. saccharalis para inferir qual a
região de maior variabilidade e qual delas pode fornecer uma maior quantidade de informações para análises de
estruturação genética e estimativas de fluxo gênico. Foram sequenciados três genes mitocondriais: as subunidades
I e II da citocromo oxidase (cox1 e cox2, 1466 e 682 pb, respectivamente) e a subunidade 6 do gene que codifica
a desidrogenase dinucleotídica da adenina nicotinamida (nad6, 504 pb) de 37 indivíduos, correspondentes a
cinco populações produtoras de milho no Brasil (GO, MG, MT, RS e SP). Foram calculadas as distâncias genéticas
entre essas sequências através do modelo de distância-p e geradas árvores de distância por Neighbor-Joining (NJ)
(Bootstrap = 1000), usando o programa Mega 4.0. Além disso, foi feita uma rede de haplótipos das sequências
analisadas usando o programa TCS 1.21. De acordo com os resultados, a região do cox1 apresenta o maior número
de bases nitrogenadas diferentes (11 sítios variáveis em 1466), uma vez que essa foi a maior região sequenciada.
Essa informação possibilitou a definição de 8 haplótipos distintos. Os genes cox2 e nad6 mostraram 4 e 2 haplótipos,
respectivamente. A análise conjunta das três regiões resultou em 12 haplótipos distintos. Independente do
marcador utilizado na análise, indivíduos do RS sempre formam um clado separado, e essa relação foi ressaltada
quando os marcadores foram analisados em conjunto, sugerindo estruturação genética nas populações de D.
saccharalis estudadas. Apesar de alguns marcadores não mostrarem resultados satisfatórios quando analisados
separadamente, a análise em conjunto dessas regiões mostraram estruturação genética da população do RS, embora
as outras populações não possam ser diferenciadas. Além disso, os valores de Bootstrap nos ramos recuperados
por NJ foram mais altos, o que nos fornece uma maior confiabilidade nos resultados obtidos. Assim, embora
separadamente cada um dos genes mitocondriais analisados aqui sejam apenas moderadamente informativos, a
sua análise conjunta fornece informações mais precisas e detalhadas sobre a variabilidade genética de D. saccharalis.
Apoio financeiro: Projeto Universal MCT/CNPq 14/2008 (Processo 480619/2008-5); Edital CNPq/MAPA 064/2008
(Processo 578509/2008-3)
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Análise filogeográfica de populações brasileiras de
Zygothrica vittimaculosa
Fonseca, P1; Robe, LJ2; Loreto, ELS2
Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Maria
Programa de Pós-Graduação em Biodiversidade Animal, Universidade Federal de Santa Maria
xxxxxxxxxxxx
1
2
Palavras-chave: Drosophilidae, filogeografia, genes mitocondriais, região neotropical, Zygothrica vittimaculosa.
O gênero Zygothrica abrange atualmente um total de 124 espécies descritas, a maior parte das quais essencialmente
micófagas e/ou antófilas. No Brasil foram identificadas, até o momento, 54 espécies pertencentes a este gênero.
Entretanto, a despeito de toda esta diversidade, vários aspectos ecológicos e evolutivos acerca destas espécies ainda
são desconhecidos. Zygothrica vittimaculosa, por exemplo, apresenta registros de ocorrência para o Rio Grande do
Sul, Santa Catarina e São Paulo, apresentando um gap considerável em sua distribuição. Esta espécie pode ser
considerada um organismo-modelo ideal para a investigação dos fatores ecológicos e evolutivos que oportunizaram
a diversificação de drosofilídeos em associação a fungos e flores, já que apresenta adaptações úteis à exploração de
ambos os nichos. Neste sentido, o presente trabalho visa auxiliar na compreensão da estruturação de populações de
Z. vittimaculosa ao longo da região sul do Brasil, buscando avaliar os padrões evolutivos associados à radiação desta
espécie junto à região Neotropical. Para tanto, indivíduos desta espécie vem sendo coletados em inflorescências
de Cestrum parquii e C. calycinum ( família Solanaceae) encontrados em diferentes pontos do estado do Rio Grande
do Sul. Cada indivíduo tem, então, seu haplótipo avaliado com base nas sequências de dois genes mitocondriais,
codificadores das subunidades I e II da citocromo oxidase (COI e COII, respectivamente). Até o momento, foram
analisadas as sequências de aproximadamente 14 indivíduos coletados nos Municípios de Santa Maria, Porto
Alegre, Horizontina e Santo Cristo. Neste caso, foi possível evidenciar a existência de baixos níveis de estruturação
entre populações, que apresentam amplos níveis de compartilhamento de um haplótipo principal. Entretanto, na
população de Porto Alegre dois haplótipos bastante diferenciados foram encontrados em espécimes obtidos a partir
de inflorescências de um único indivíduo de C. parquii, o que levanta a hipótese de que duas espécies simpátricas
possam estar sendo amostradas. A continuidade do trabalho, associada à realização de uma análise morfológica
dos espécimes coletados deverá auxiliar no esclarecimento desta e de outras questões relacionadas à evolução
de Z. vittimaculosa). Novos indivíduos serão coletados em corpos de frutificação de fungos e serão amostrados.
Apoio: CAPES e CNPq
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Caracterização molecular de populações de Planococcus
minor (Hemiptera: Pseudococcidae) em algodoeiro
Noia, NP1; Leite, IP1,2; Martins, WFS1; Arriel, NHC2; Martins, PGS3
Laboratório de Controle Biológico, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual da Paraíba
Laboratório de Entomologia, Embrapa Algodão
3
Programa de Pós-Graduação em Melhoramento Genético de Plantas, Universidade Federal Rural de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cochonilha, insetos praga, RAPD-PCR, variabilidade genética.
As cochonilhas do gênero Planococcus (Hemiptera: Pseudococcidae) são consideradas pragas severas de uma
grande variedade de plantas de importância econômica, pois estes insetos sugam a seiva das plantas e em grandes
infestações, podem causar seu definhamento, levando-as à morte. A identificação rápida e acurada de uma espécie
constitui-se em passo fundamental na geração de medidas de convívio, uma vez que espécies distintas podem se
comportar de maneira adversa requerendo medidas de manejo específicas para a espécie em questão. No entanto,
a espécie Planococcus minor é facilmente confundida com Planococcus citri em identificações morfológicas, devido
ao fato de que alguns caracteres morfológicos que permitem a distinção entre as espécies do gênero Planococcus
podem ser alterados dependendo das condições ambientais tais como temperatura. Neste contexto, a utilização
de técnicas moleculares permitirá a rápida caracterização de diferentes populações sem a mesma restrição.
Desta forma, este trabalho objetivou a caracterização inicial de populações de P. minor do estado do Ceará e
Paraíba através de RAPD-PCR. Os insetos foram coletados em campos de produção de algodão localizados na
região Nordeste nas cidades de Patos e Campina Grande, estado da Paraíba e Barbalha no estado do Ceará. A
caracterização molecular das populações foi realizada pela técnica RAPD-PCR, onde inicialmente foram testados
vinte primers da séria E. Dos quais, foram selecionados os primers OPE-7, OPE-12 e OPE-15 por apresentarem
melhor eficiência de amplificação e reprodutibilidade. Os amplicons forma analisados em géis de agarose 1,2%
visualizado com Syber Green. Os referidos primers geraram 13, 10 e 11 fragmentos respectivamente, totalizando
34 bandas analisadas, possibilitando a identificação de fragmentos variando entre 300 e 4.300pb. A análise das
freqüências alélicas revelou uma proporção de locos polimórficos de 66,67% e heterozigosidade observada de
0,253. Os índices de variabilidade genética mostraram maior diversidade na população de Patos (P = 79,41; He
=0,317) e menor variação na população de Barbalha (P = 55.88; He = 0,037). A diferenciação genética entre as
populações foi estimada através da distância genética de Nei (1978), sendo observado maior diferenciação entre as
populações de Patos e Barbalha (0,868) e menor diferenciação entre Patos e Campina Grande (0,924). Os resultados
parcialmente obtidos possibilitaram inferir que as populações de P. minor estudadas apresentam padrões similares
de genotipagem, podendo ser utilizado como perfil para caracterização molecular interespecífica. Entretanto,
resultados mais conclusivos serão possíveis a partir da caracterização molecular de outras espécies do gênero
Planococcus.
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Frequência de Zaprionus indianus (Gupta, 1970) no
Parque Ecológico Jatobá Centenário do Estado de
Goiás, Brasil
Pereira, EA¹,5; Pereira, AV²,5; Souza, MC²,5; Ferreira, AKS²,5; Junqueira, EWL4,5; Pires, DJ ³,5
¹ Bolsista do Programa de Bolsa de Iniciação Científica (PBIC – UEG) do Curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas
² Acadêmicos do Curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas
³ Profª. Drª. Orientadora
4
Bolsista do Programa de Bolsa de Iniciação Científica (PIBIC – CNPq) do Curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas
5
Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Morrinhos
[email protected]
Palavras-chave: Drosophilidae, conservação, impacto ambiental, Zaprionus indianus e fatores abióticos.
As unidades de conservação representam uma das melhores estratégias de proteção aos atributos e patrimônio
naturais. Nestas áreas, tanto a fauna quanto flora estão protegidas, assim como os processos ecológicos que regem
os ecossistemas, garantindo a manutenção do estoque da biodiversidade. As espécies da família Drosophilidae
apresentam-se como modelos adequados, dada sua megadiversidade taxonômica de hábitos e habitat ocupados.
Considerados um dos grupos de insetos mais interessantes para estudos de Diversidade e de Conservação.
Zaprionus indianus é uma espécie de drosofilídeo introduzida que vem colonizando com sucesso diversos
habitats no Brasil e mostra características ecológicas generalistas e capaz de adaptar-se a diferentes condições
ambientais, tal versatilidade ecológica pode ter sido a razão do sucesso da dispersão da espécie. O objetivo
desta pesquisa foi analisar a ocorrência de Z. indianus no Parque Ecológico Jatobá Centenário no município de
Morrinhos, Goiás. Foram realizadas duas coletas por mês durante três meses no período de novembro/2009 a
janeiro/2010. Armadilhas fechadas com iscas de banana fermentada foram distribuídas em pontos estabelecidos
na trilha localizada no interior e na borda do Parque ficando nestes locais por um período de 24 horas. Durante
as coletas foram anotados dados meteorológicos como temperatura e umidade relativa do ar. Os resultados
obtidos mostraram um total de 877 indivíduos de Zaprionus indianus. Destes, 87,57% foram coletados na borda
e 12,43% na trilha do Parque. A frequência nos dois locais foi maior para fêmeas, sendo na trilha 66,05% e na
borda 62,64%, e menor para machos, 33,95% na trilha e 37,36% na borda. Correlacionado o sexo de Z. indianus
nos dois locais, observamos que teve maior ocorrência de machos na borda, onde as temperaturas foram
maiores, variando de 30,2°C e 25,8°C e os valores de umidade relativa foram menores, entre 75% e 60%. Já a
ocorrência de fêmeas foi maior na trilha, com temperaturas menores, entre 26,4°C e 19,6°C e umidade relativa
do ar maiores, entre 88% e 72%. Estes resultados preliminares mostram que as diferenças dos fatores abióticos
encontradas no interior e na borda do Parque podem afetar as atividades da espécie Zaprionus indianus.
Apoio financeiro: PBIC-UEG e PIBIC-CNPq.
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Caracterização da enzima Fosfatase Ácida-1 (Acph-1)
em populações naturais de Drosophila nebulosa de
Pernambuco, Brasil
Silva, RDC; Cabral, WBM; Nascimento, GAF; Garcia, ACL; Rohde, C
Laboratório de Genética, Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
Palavras-chave: Enzima Acph-1, Drosophila nebulosa, populações naturais, biomas, Pernambuco.
Drosophila nebulosa (Diptera, Insecta) é uma espécie Neotropical com ampla distribuição no Brasil e no Estado de
Pernambuco. Ela pertence ao grupo willistoni e ao subgênero Sophophora da família Drosophilidae. Em trabalho
prévio do nosso grupo de pesquisa foi apresentada a metodologia de eletroforese em gel de poliacrilamida para a
enzima Fosfatase Ácida-1 (Acph-1), capaz de discriminar as espécies crípticas do sub-grupo willistoni, entre elas a
D. willistoni, D. paulistorum, D. equinoxialis, D. tropicalis e D. insularis. Para estas espécies o padrão eletroforético
obtido da enzima Acph-1 foi espécie-específico, com a presença de apenas uma banda, exceto D. equinoxialis,
que apresentou dois alelos segregantes para esta enzima dimérica. Na continuidade dos estudos com as demais
espécies do grupo willistoni, apresentamos os resultados da caracterização do padrão da Acph-1 na espécie D.
nebulosa. Foram investigadas cinco populações e três diferentes ambientes do Estado de Pernambuco: Caatinga,
Floresta Atlântica e Manguezal. A metodologia seguiu a descrição da literatura (eletroforese horizontal em gel de
poliacrilamida) e incluiu a caracterização da enzima tanto entre populações quanto entre isolinhagens da mesma
população. Os resultados contrastam com aqueles observados para as espécies crípticas do subgrupo willistoni,
indicando a existência de variabilidade no padrão da enzima, com diferentes formas alélicas segregando nas
populações e nas isolinhagens analisadas. Os resultados obtidos com esta enzima serão utilizados para estudos sobre
a variabilidade genética das populações e seu relacionamento com a colonização diferencial dos diferentes biomas.
Apoio financeiro: FACEPE, CNPq, PROPESQ-UFPE.
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Resultados preliminares sobre a diversidade de
Drosofilídeos em duas fitofisionomias do Parque
Estadual da Serra de Caldas Novas, Goiás, Brasil
Souza, MC1,5; Pereira, EA3,4; Pereira, AV1,5; Ferreira, AKS1,5; Junqueira, EWL2,5; Pires, DJ4,5
¹ Acadêmica do Curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas
² Bolsista do Programa de Bolsa de Iniciação Científica (PIBIC – CNPq) do Curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas
³ Bolsista do Programa de Bolsa de Iniciação Científica (PBIC – UEG) do Curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas
4
Profª. Drª. Orientadora
5
Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Morrinhos
[email protected]
Palavras-chave: Unidades de Conservação, Zaprionus indianus, fatores abióticos, temperatura, umidade relativa do ar.
O Parque Estadual da Serra de Caldas está localizado no município de Caldas Novas – Rio Quente e encontram-se
no bioma Cerrado. O Cerrado é um domínio bastante antigo e já no Cretáceo havia uma formação de pré-cerrado.
Logo, após esse período, ocorreu o surgimento do Planalto Central, e uma alteração gradativa de clima, que
anteriormente era mais seco, para um período mais úmido favorecendo a diversificação da flora e fauna. Estudos
sobre a diversidade de espécies de insetos, principalmente de drosofilídeos são importante por serem indicadores de
impacto ambiental em unidades de conservação. A pesquisa visou identificar as espécies de drosofilídeos coletados
em duas fitofisionomias do Parque Estadual da Serra de Caldas Novas. Seis coletas foram realizadas no Cerrado sensu
stricto e Mata de galeria e as armadilhas fechadas com iscas de banana fermentada com Saccharomyces cerevisiae
foram utilizadas no período de novembro/2009 a janeiro/2010. Em dez pontos foram colocadas as armadilhas,
sendo uma por ponto e retiradas no dia seguinte, portanto permanecendo 24horas no local. Foram capturadas 1.972
moscas, sendo 12 espécies no Cerrado sensu stricto e 14 espécies na Mata de galeria. Dentre elas, estão algumas;
Drosophila immigrans, D. polymorpha, D. simulans, D. nebulosa, Zaprionus indianus e seis espécies não identificadas.
Espécies introduzidas, como por exemplo, Zaprionus indianus foi mais abundante no Cerrado sensu stricto (1.409) e
D. simulans na Mata de galeria (70). As fêmeas em ambas fitofisionomias tiveram uma maior porcentagem (56,13%)
de indivíduos capturados, em relação aos machos (43,87%) durante o período experimental. A umidade relativa do
ar teve valores maiores na Mata de galeria e, ao contrário, as temperaturas foram maiores no Cerrado sensu stricto.
De uma maneira geral, estes resultados preliminares mostram que os fatores ambientais podem estar interferindo
na diversidade, assim como, características de vegetação das duas fitofisionomias e os efeitos da sazonalidade.
Apoio financeiro: PIBIC – CNPq e PBIC – UEG.
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Variação da atividade do elemento transponível
mariner em diferentes estágios do desenvolvimento de
Drosophila simulans
Santos, MD ¹; Wallau, GL²; Loreto, ELS³
¹ Curso de Ciências Biológicas, Laboratório de Biologia Molecular - Universidade Federal de Santa Maria
² Programa de Pós Graduação em Biodiversidade Animal - UFSM
³ Departamento de Biologia - UFSM
[email protected]
Palavras-chave: mariner, Drosophila simulans, transposon, estágio de desenvolvimento, temperatura.
Introdução: O elemento transponível mariner foi descoberto no genoma de Drosophila mauritiana em uma
mutação no gene white, a qual produz uma alteração fenotípica na coloração selvagem do olho. Esta alteração
ocorre devido a inserção do elemento mariner no gene white, inativando-o, gerando assim, indivíduos com olhos
cor de pêssego (linhagem white-peach). Por cruzamentos interespecíficos entre D. mauritiana e D. simulans foi
produzida uma linhagem white-peach da espécie D. simulans. O elemento mariner é instável tanto em células
somáticas quanto em células germinativas, sendo que sua mobilização pode ser observada fenotipicamente com
a reversão da mutação. A mobilização gera indivíduos com manchas de coloração selvagem em um contexto
peach nos olhos. Contudo, o mariner é incapaz de realizar sua própria mobilização, necessitando de uma fonte
extrínseca de tranposase. O cruzamento das linhagems white-peach com populações selvagens fornece a fonte de
transposase para a mobilização, o que permite utilizar este sistema para análises do nível de atividade de mariner
em diferentes populações naturais de D. simulans. Objetivos: Este trabalho tem por objetivo principal detectar
qual estágio do desenvolvimento de D. simulans que é mais susceptível a atividade do elemento mariner. Métodos:
Foram realizados cruzamentos-teste entre 10 machos de D. simulans da população Campeche – Santa Catarina e
10 fêmeas de D. simulans da linhagem white-peach. Estes são condicionados a mudanças de temperatura, onde os
cruzamentos-controle são mantidos sempre a 20°C, enquanto que nos experimentos de elevação de temperatura,
os indivíduos são expostos à elevação da temperatura a 28°C durante o estágio de desenvolvimento desejado.
Os estágios considerados são: embrião, 1º instar larval, 3º instar e pupa. Resultados: Nos cruzamentos realizados
até o momento foram obtidos os seguintes resultados: porcentagem de machos-mosaico (%PPM): Controle
18,18, Embrião 58,82, 1º instar 45,45; média do número de manchas por indivíduo: Controle 2,82, Embrião 9,70, 1º
instar 2,00; média da área total de manchas por indivíduo (µm²): Controle 1.680,81, Embrião 10.360,01, 1º instar
1.761,62; média dos maiores manchas por indivíduos (µm²): Controle 1.688,89, Embrião 4.711,12, 1º instar 2.204,45.
Conclusões: Nossos resultados, apesar de parciais, sugerem um aumento da atividade do elemento mariner
durante o estágio de embrião, sendo que nele encontramos o maior número e as maiores áreas de manchas.
Esses resultados indicam que quanto mais cedo no desenvolvimento ocorrer a mobilização do elemento, maior
será a mancha resultante no olho do adulto. Além disso, a atividade de mariner pode ocorrer preferencialmente
antes da formação do grupo de células disco imaginal que dão origem ao olho composto de Drosophila.
Apoio financeiro: SESu/MEC, Fapergs e CNPq
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Preferências ecológicas da espécie invasora Zaprionus
indianus nos ambientes naturais da Caatinga, Floresta
Atlântica e Manguezal do Estado de Pernambuco, Brasil
Melo, KPS; Oliveira, GF; Garcia, ACL; Rohde, C
Laboratório de Genética, Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco
Palavras-chave: Drosophilidae, Caatinga, Zaprionus indianus, Ecologia, Citogenética.
A espécie Zaprionus indianus (Diptera, Drosophilidae) é, reconhecidamente, uma espécie exótica e invasora,
não só no Brasil como nos demais países da América. Diversos estudos se iniciaram em 1999, quando ela foi
descrita pela primeira vez em São Paulo, Brasil. Zaprionus indianus foi encontrada na cidade do Recife em abril
de 2000, conforme descrição de Santos e colaboradores. Desde 2007 nosso grupo vem estudando a ocorrência
desta espécie em diversos ambientes do Estado, incluindo os biomas da Floresta Atlântica, Manguezal e Caatinga,
além da Ilha de Fernando de Noronha. A partir da análise de 33 coletas realizadas nestes ambientes, foi possível
reconhecer que a espécie é encontrada, preferencialmente, nas áreas abertas da Caatinga, preferindo bem menos
as proximidades das áreas de Floresta Atlântica. Além disso, a espécie também pode ser encontrada nas áreas
de Manguezais do Litoral. Suas maiores frequências foram obtidas na Trilha das Conchas (58%) do Parque
Nacional do Catimbau (Caatinga), em uma coleta feita na estação chuvosa (junho/2008); e no ambiente urbano
da Vila dos Remédios (55%), Ilha de Fernando de Noronha, em coletada realizada na estação seca (março/2010).
Quando são comparadas as preferências da espécie entre períodos secos e chuvosos entre todas as coletas
feitas, é possível verificar que as frequências aumentam na estação seca. Em média, variaram de 7,6% na estação
chuvosa para 11,8% na estação seca. Os resultados permitem traçar uma linha com sentido leste-oeste em
Pernambuco, que reflete o aumento das frequências de Z. indianus em direção ao interior do Estado. Embora
a Caatinga seja um ambiente bastante diverso em termos de espécies, com registro de pelo menos 28 delas,
em relação às 30 espécies já encontradas na Floresta Atlântica, não podemos esquecer que Zaprionus compete
fortemente com as espécies nativas no uso dos recursos tróficos, como frutos fermentados. Sua presença,
portanto, pode ser um risco às espécies adaptadas às condições adversas da Caatinga. Uma vez conhecida suas
preferências ecológicas, será feito um amplo estudo da variabilidade genética das populações, principalmente
através da presença e frequência de rearranjos cromossômicos. A primeira análise indica que as populações são
polimórficas, embora em menor proporção que em outros locais já estudados como São Paulo e Rio Grande do Sul.
Apoio financeiro: FACEPE, CNPq, PROPESQ-UFPE.
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Flutuação populacional das espécies de Drosophilidae
na Ilha de Fernando de Noronha, Pernambuco/ Brasil
Oliveira, GF; Garcia, ACL; Rohde, C.
Laboratório de Genética, Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco
Palavras-chave: Drosophilidae, Fernando de Noronha
Este estudo inclui a análise da composição de espécies da família Drosophilidae em cinco diferentes locais da
Ilha de Fernando de Noronha, amostradas em duas épocas distintas: uma estação chuvosa e uma estação seca.
Dois dos locais estão inseridos na área do Parque Nacional Marinho de Fernando de Noronha, e os demais na
Área de Proteção Ambiental, que pertence ao Estado de Pernambuco. Na primeira coleta, realizada no período
chuvoso, em setembro de 2009 foram coletados 20.486 indivíduos pertencentes a sete espécies com as seguintes
frequências médias: Drosophila simulans (93,32%), D. ananassae (1,24%), D. malerkotliana (3,71%), Scaptodrosophila
latisfasciaeformis (0,13%), Zaprionus indianus (1,52%), D. melanogaster (0,09%), e D. zotti (0,02%). Com exceção da
D. zotti que é nativa, todas as demais são espécies exóticas cosmopolitas, sendo D. simulans a espécie dominante
em todos os locais amostrados. Nas coletas realizadas no período seco, em março de 2010, foram coletados
5.417 indivíduos, e houve grande variação nas frequências entre as espécies, em relação ao período chuvoso. Em
média, as frequências entre as espécies foram as seguintes: Drosophila simulans (44,55%), D. ananassae (2,78%), D.
malerkotliana (24,77%), Scaptodrosophila latisfasciaeformis (0,44%), Zaprionus indianus (18,92%), D. melanogaster
(8,47%), e D. zotti (0%). Os resultados indicam que D. simulans teve uma queda bastante pronunciada em três dos
locais da Área de Proteção Ambiental, mantendo-se dominante, nas duas épocas, apenas nas áreas de manguezal e
mata adjacente, nos domínios do Parque Nacional. Assim, nos locais denominados Pousada, Estrada do Porto e Mata
do Pico, a frequência da espécie foi substituída pela Z. indianuos e D. malerkotliana. Estas duas espécies apresentam
frequências inversamente proporcionais, prevalecendo Z. indianus na Pousada e D. malerkotliana na Mata do Pico.
Os resultados apontam uma constância na frequência entre as espécies no Manguezal do Sueste e Mata adjacente, o
que nos permite sugerir que nestes locais, provavelmente, não há variação na umidade. Por outro lado, a diminuição
da umidade na época de seca nos outros locais amostrados pode ser responsável pelo aumento expressivo das
frequências das demais espécies, principalmente Z. indianus e D. malerkotliana, em detrimento da D. simulans. Os
resultados indicam, ainda, que ambientes oceânicos são locais muito interessantes para estudo e podem refletir
melhor o papel de aspectos abióticos (temperatura, umidade, etc.) para o sucesso da colonização pelas espécies.
Apoio financeiro: FACEPE, CNPq, PROPESQ-UFPE
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Expressão diferencial in silico de Seqüências Curtas
Expressas (Expressed Sequence Tags =ESTs) de larvas
e adultos de Anopheles darlingi
Azevedo, GMA1; Vicentini, R2; Nunes-Silva, CG3; Guimarães, GM1; Bridi, LC4; Tadei, WP5; Rafael, MS5
Bolsistas da CAPES e FAPEAM, Programa de Pós-graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva/INPA
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética-Universidade estadual de Campinas (Unicamp)
3
Centro Universitário Nilton Lins, Pesquisa e Pós-Graduação
4
Bolsista CNPq
5
Laboratório de Vetores de Malária e Dengue, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA)
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Anopheles darlingi, malária, cDNA, IDEG6, expressão gênica diferencial.
Introdução: O mosquito Anopheles darlingi é o principal vetor da malária na Amazônia. Há poucos estudos de
DNA/RNA sobre esse mosquito quando comparado a outros anofelinos como Anopheles gambiae, vetor da malária
na África. A análise de sequências de bibliotecas do genoma funcional de larvas e adultos de A. darlingi possibilita
uma melhor compreensão da atividade de genes expressos dessa espécie. É possível, a partir de sequências de
cDNA medir-se o nível de expressão gênica diferencial “in silico” entre as diferentes etapas do desenvolvimento
de um organismo. Métodos: Utilizaram-se sequências de bibliotecas da fita complementar (cDNA) do RNA
mensageiro de larvas e adultos de A. darlingi. As sequências geradas de cDNAs ou reads foram organizadas em
contigs, agrupamento de reads, feita pelo programa CAP3, e analisadas pelo teste estatístico Audic & Claverie,
contido no pacote do software Identification Differentially Expressed Genes (IDEG6). Resultados: Foram confirmados
pelo teste estatístico de Audic & Claverie que 20 contigs são mais expressos em adultos e 71 contigs são mais
expressos em larvas, segundo a relação dos números de reads com o número total de reads em cada biblioteca
de cDNA, gerando um valor estatístico que confirma a expressão gênica nas fases de desenvolvimento de larva e
adulto desse mosquito. A hipótese do gene expresso em uma determinada fase de desenvolvimento do organismo
é aceita quando o valor fica entre “zero” e “cinco” por cento. Conclusão: O teste estatístico de Audic & Claverie
corroborou dados genéticos de que mais sequências únicas ou contigs das bibliotecas de cDNA de A. darlingi
foram expressas na fase juvenil do mosquito, quando a maioria dos genes encontram-se ativos, contrastando com
alguns genes desativados na fase adulta. Este estudo foi útil para identificação de contigs expressos associandoos com as fases larval e adulta do A. darlingi. Em larvas encontram-se mais genes ativos, o que é interessante
para estudos posteriores com genes relacionados às diferentes fases do desenvolvimento desse mosquito.
Apoio financeiro: Bolsa CAPES, PROCAD Amazônia (Processo nº 023/2006)/CAPES, MCT/INPA (Processo nº
014/2008), FAPEAM (PIPT/2008), Rede Malária CNPq, PIATAM/ Petrobrás.
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Ensaio de excisão do elemento de transposição relic hobo
ten-Caten, F; Kaminski, VL; Loreto, ELS
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Santa Maria
[email protected]
Palavras-chave: transposon, hobo, excisão, embriões, microinjeção
Introdução: Há alguns anos, nosso grupo de pesquisa caracterizou molecularmente uma mutação que causava a
ausência de pigmentação nos omatídeos, isolada a partir de uma linhagem hipermutável de Drosophila simulans.
Naquele trabalho, descobriu-se que o gene white, responsável pela produção da pigmentação, estava inativado
em virtude da inserção de um elemento de transposição. Análises mais detalhadas mostraram que esse elemento
relacionava-se ao transposon hobo, no entanto, possui grandes deleções internas, as quais o impossibilitam de
produzir a enzima responsável pela sua mobilização, a transposase. Esse elemento foi denominado hobova. Assim,
surge o questionamento: de que forma esse elemento não autônomo, relic, foi transposto ocasionando a mutação?
A hipótese levantada para explicar o fenômeno é a mobilização cruzada via elementos hobo canônicos, os quais
são capazes de produzir uma transposase ativa e estão presentes no genoma de D. simulans. Para testar essa
hipótese, realizamos um ensaio de excisão em embriões de D. simulans no qual utilizamos a técnica de microinjeção
para inserir, nos embriões, dois plasmídeos. O primeiro, pHVAW, contendo o elemento hobova flanqueado por
pequenas porções do gene white e o segundo, pHFL1, contendo um gene codificante de transposase sob efeito de
um promotor de choque térmico – HSP70. Após a microinjeção, os embriões foram colocados em estufa a 28º C
para promover a expressão do gene da transposase e depois mantidos a 22º C por 24h para o desenvolvimento.
Após essa etapa, realizamos extração de DNA dos embriões e utilizamos o produto da extração para PCR, a qual
evidencia, pelo tamanho do fragmento amplificado, o acontecimento ou não da mobilização. A amplificação do
plasmídeo pHVAW é feita utilizando uma combinação de primers que evita a amplificação do plasmídeo auxiliar,
pHFL1, e do gene white dos embriões. Resultados: Foram realizadas sete repetições do ensaio e todas apresentaram
resultados negativos para mobilização do elemento em D. simulans. Conclusões: A não mobilização do elemento
deve-se, possivelmente, a algum mecanismo de regulação nessa espécie, a qual apresenta um grande número de
cópias do elemento e possui características de repressão da mobilização do elemento, como já demonstrado em
outros trabalhos. Dessa forma, são necessários mais ensaios em linhagens de outras espécies de Drosophila, que não
apresentam o elemento, como a linhagem Zola de D. melanogaster. Além disso, uma outra possibilidade é o ensaio
de transformação, onde um plasmídeo, contendo o gene EGFP sob controle de um promotor do gene PAX6 clonado
entre hovova, é microinjetado com o plasmídeo pFHL1. Se a mobilização e a inserção do elemento no genoma
ocorrerem, poderemos detectá-las através da fluorescência de GFP nos omatídeos dos indivíduos transformados.
Orgão financiador: CNPq
56º Congresso Brasileiro de Genética
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Dinâmica evolutiva intragenômica do transposon Bari3
em Drosophila mojavensis
Proença, MA1; Dias, ES1; Carareto, CMA1
Laboratório de Evolução Molecular de Insetos - Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – IBILCE - Campus de São José do
Rio Preto - Departamento de Biologia
[email protected]
1
Palavras-chave: transposon Bari, evolução intragenômica, repetições terminais invertidas, Drosophila mojavensis.
O elemento Bari, membro da superfamília Tc1-mariner de transposons de DNA, foi recentemente identificado no
genoma de D. mojavensis e denominado como Bari3. Apresenta 1.717 pb, repetições terminais invertidas (TIRs)
longas (~256 pb) e diversas cópias completas, ao contrário dos Bari de outras espécies com TIRs longas, em
que as cópias são quase sempre degradadas (ex. Bari2 de D. erecta), ou em que as cópias são preferencialmente
completas, mas as TIRs são curtas (ex. Bari1, de D. melanogaster). TIRs longas têm sido associadas à instabilidade
do elemento. Desse modo, Bari1 representaria um elemento “velho”, em que a fonte de instabilidade teria sido
perdida, e Bari3 estaria em sua infância evolutiva, onde o processo de instabilidade ainda não teria se manifestado.
Essa particularidade torna este estudo muito apropriado. Nosso objetivo foi ampliar o conhecimento do elemento
Bari3 e das relações evolutivas entre suas cópias no genoma de D. mojavensis. Cópias homólogas ao Bari1 foram
identificadas no genoma de D. mojavensis por meio do RepeatMasker (cobertura ≥70%). Essas foram extraídas,
comparadas e, as sequências com identidade ≥80% ao elemento consenso Bari3 foram alinhadas. Foram
realizadas análises evolutivas e filogenéticas (Network Median Joining), bem como estimativas de distância,
testes de seleção e estimativas de tempo de divergência (r:k/2T). Para reconstrução das relações evolutivas
entre as sequências completas foram utilizadas tanto as sequências da transposase quanto da TIR 5’. Foram
encontradas 33 cópias, sendo 12 completas (quatro portadoras de stop codons) e 21 com apenas a TIR 3’. Cinco
sequências apresentaram-se 100% idênticas e com todas as estruturas completas. O tempo de divergência das
sequências completas foi muito similar (8,58 ± 0,01 milhões de anos) e relativamente alto para o elevado grau
de conservação (≥ 94%) e baixa diversidade nucleotídica (0,01065). Análises de Network realizadas com as TIRs
3’ de todas as cópias possibilitaram identificar três grupos de sequências, derivadas, aparentemente, de uma
sequência ancestral comum: sequências com distâncias médias iguais a zero (grupo 1), 0,049 (grupo 2) e 0,017
(grupo 3). Propõe-se, então, que o grupo 1 (contém as TIRs das cópias completas) seja possivelmente o mais
recente e constituído por sequências transposicionalmente ativas. Essa conclusão é suportada pelo baixo número
de mutações e alta similaridade entre suas TIRs e as estimativas de forte seleção purificadora atuando nessas
sequências. O grupo 2 pode ter sido o primeiro a surgir (maior divergência entre as sequências) e o grupo 3 estaria
em um estado evolutivo intermediário. A análise das sequências deletadas indica que processo de degradação do
Bari3 de D. mojavensis ocorre na extremidade 5’ do elemento, sugerindo que a proposta instabilidade relacionase especificamente a essa extremidade do elemento, e não às duas TIRs longas, como proposto na literatura.
Apoio financeiro: Bolsista CNPq/PIBIC.
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Diferenciação Genética de Aedes aegypti (Diptera,
Culicidae) nos Estados do Maranhão e Piauí
Barros, MC1; Sousa, AA1; Almeida, SB1; Lima, MMO1; Silva, NB1; Sampaio I2; Fraga, E1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança PA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Aedes aegypti, Maranhão, Piauí, ND4, Polimorfismo
O Aedes aegypti é um vetor de ampla distribuição e de grande importância epidemiológica por ser responsável
pela transmissão da febre amarela e dos quatro sorotipos de dengue (DENV1, DENV2, DENV3, DENV4). Este
vem causando impactos em termos de morbidez o que exige esforços e investimentos cada vez mais intensos
no sentido de compreender a dinâmica populacional deste vetor e com isso contribuir com os serviços de
saúde pública. Apesar dos muitos estudos realizados sobre o Ae. aegypti inferência genética quanto a estrutura
populacional deste nos Estados do Maranhão e Piauí ainda são bastante incipientes. Visando preencher esta
lacuna, a presente análise molecular envolveu representantes de Ae aegypti coletados em uma ampla área
geográfica compreendendo os dois estados nordestinos acima citados. As amostras foram obtidas através de
armadilhas para ovos (APO) e transportadas para o Laboratório de Genética e Biologia Molecular do CESC/
UEMA (GENBIMOL) onde foram aplicados os procedimentos laboratoriais: Larvas foram alimentadas, quando
adultos transportados para gaiolas entomológicas onde foram proporcionadas as condições de cruzamentos e
obtenção da F1. A partir da F1 foram aplicados os procedimentos moleculares: extração de DNA, amplificação
do gene ND4 por PCR e reação de sequenciamento. As seqüências geradas foram editadas e alinhadas através
do programa BIOEDIT. O número de sítios polimórficos, as diversidades haplotípica (h) e nucleotídica (π) para
cada uma das populações e a análise de variância molecular (AMOVA) foram realizadas nos programas DNASP
e ARLEQUIN. Um fragmento de 336 pares de bases para o gene ND4 foi obtido em 188 espécimes de Ae. aegypti
onde observou-se 18 sítios polimórficos, 20 haplótipos, sendo o haplótipo 3 o mais freqüente, seguido pelo
haplótipo 1 ambos compartilhados pelas populações de Teresina; Floriano; Balsas; Caxias; Imperatriz; Mirador;
Pedreiras; São Bernardo; São Mateus e Timon. A diversidade haplotípica encontrada foi de 0,717 e nucleotídica de
0,01674. Os resultados da AMOVA mostraram que a maior parte da variação encontra-se dentro das populações
(69,39%). O índice de diferenciação genética entre as populações (FST) apresentou um valor de 0,30605 com P
altamente significativo evidenciando diferenças entre as populações analisadas. A magnitude das diversidades
haplotípica e nucleotídica das populações nos estados do Maranhão e Piauí indicam diferenças significativas entre
as populações analisadas e os resultados da AMOVA apontam para uma estruturação populacional. Uma hipótese
é que esta diferenciação genética nas populações pode ser reflexo das campanhas sistemáticas de controle
com aplicação de inseticidas pelo qual o vetor vem sendo submetido o que leva a diminuição no tamanho da
população, repetidos gargalos, e uma rápida expansão de poucos haplótipos conduzindo à diferenciação genética.
Apoio Financeiro: UFPA e UEMA
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Diversidade Genética em Populações de Aedes aegypti
(Diptera: Culicidae) da Amazônia Brasileira
Santos, JMM1; Menezes, AFM2; Maia, JF2; Tadei, WP1
Laboratório de Malária e Dengue - Coordenação de Pesquisas em Ciências da Saúde, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/
Escola Superior de Saúde, Universidade do Estado do Amazonas
2
Laboratório de Malária e Dengue - Coordenação de Pesquisas em Ciências da Saúde, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]
1
Palavras-chave: Aedes aegypti, RAPD-PCR, Vetor da dengue, Amazônia
Introdução: Aedes (Stegomyia) aegypti apresenta ampla distribuição geográfica e é o principal vetor do vírus da
febre amarela e dos quatro sorotipos do dengue, nas áreas tropicais e subtropicais. No Brasil, esta espécie tem
provocado grandes epidemias com a transmissão da dengue, causando um sério problema de Saúde Pública.
Objetivos: Estimar a variabilidade e divergência genética intra e interpopulacional em quatro populações de
Aedes aegypti utilizando RAPD-PCR. Métodos: As larvas de mosquito obtidas em Manacapuru (AM), Manaus
(AM), Bragança (PA) e Porto Velho (RO) foram identificadas e mantidas em laboratório até o estágio adulto.
As amostras de DNA foram extraídas pela técnica de acetato de potássio e posteriormente quantificadas, em
seguida foram realizadas as técnicas básicas de biologia molecular para RAPD-PCR. Foram utilizados dez
“primers”: OPA03 (5’-AGTCAGCCAC-3’), OPA04 (5’-AATCGGGCTG-3’), OPA07 (5’–GAAACGGGTG-3’), OPA08
(5’–GTGACGTAGG–3’), OPA09 (5’-GGGTAACGCC-3’), OPA11 (5’-CATGCCCGT-3’), OPA14 (5’-TCTGTGCTGG-3’),
OPA16 (5’-AGCCAGCGAA-3’), OPA18 (5’-AGGTGACCGT–3’) e OPA20 (5’-GTTGCGATCC–3’). Os produtos
amplificados foram corados com brometo de etídio (5ng/ml), em gel de agarose a 1,5%, e fotodocumentados. As
análises estatísticas foram obtidas no Programa Tools for Population Genetics Analyses - TFPGA. Resultados:
As análises dos perfis de RAPD revelaram 108 bandas nas quatro populações, variando entre 300 e 2200 pb. A
variabilidade genética observada nas quatro populações foi bastante elevada, com a percentagem de locos
polimórficos variando de 97,22 a 98,14 e a heterozigosidade média observada de 0,4199 a 0,4420. Das populações
analisadas, a de Porto Velho mostrou maior variabilidade (P= 98,14; Ho= 0,4420), enquanto a de Bragança revelou
menor heterozigosidade, tanto observada quanto esperada (Ho= 0,4199; He= 0,4282). O valor de Fst foi de 0,0357
± 0,0054, indicando baixa estruturação microgeográfica, com o índice de “bootstrapping” de 95%, para 1000
replicações. Os valores de distância genética foram muito baixos (D= 0,0173 – 0,0407), revelando homogeneidade
entre as populações. Mesmo assim, foi possível separar as populações em três grupos: 1-Manaus e Porto Velho (D=
0,0173); 2- Bragança (D= 0,0328) e 3- Manacapuru (D= 0,0407). Conclusões: Os dados mostram baixa estruturação
genética nessas populações da Amazônia, e apesar de estarem separadas com grandes distâncias geográficas,
elas são muito semelhantes geneticamente, não havendo correlação entre a distância geográfica e a distância
genética. O alto polimorfismo encontrado em Porto Velho pode estar associado, às chances de maior fluxo
gênico, diante da facilidade de dispersão desse mosquito e do maior tempo de introdução do vetor nesta região.
Apoio financeiro: FAPEAM, PPI/INPA
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Vicariance and dispersal in the evolution of Amazonian
triatomines: do the Rhodnius pictipes and R. robustus
species groups tell congruent stories?
Pavan, MG1; Abad-Franch, F2; Azanar, C3; Obara, MT­4; Jaramillo, NO5; Llewellyn, MS6; Monteiro, FA1
Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz/RJ, Brazil
Instituto Leônidas e Maria Deane – Fiocruz Amazônia, Brazil
3
UFR de Médecine Antilles-Guyane, French Guiana
4
Secretaria de Vigilância em Saúde – Ministério da Saúde, Brazil
5
Instituto de Biología – Universidad de Antioquia, Colombia
6
London School of Hygiene and Tropical Medicine, UK
1
2
Keywords: Vicariance Biogeography, Phylogeography, Rhodnius pictipes, R. robustus, cytochrome b
Rhodnius pictipes, vector of Chagas disease, is the sylvatic Rhodnius species with the widest distribution in the
Amazon region. Its area of occurrence largely overlaps that of the four cryptic species that comprise the R. robustus
complex. Moreover, R. pictipes and R. robustus s.l. are congeneric and occupy the same sylvatic ecotopes. This
peculiar setting contains all elements required for testing a basic principle of Vicariance Biogeography: that
important vicariant events will affect equally all organisms with comparable dispersal capabilities that occur in
a particular area. Thus, vicariant events that isolated populations of the ancestral R. robustus stock and led to the
formation of the species complex should have had the same effect on R. pictipes. The interpretation of phylogenetic
results followed a recent calibration of the mitochondrial cytochrome b (cytb) molecular clock for triatomines, as
well as population genetics estimates, allowed for inferences to be made regarding the evolutionary history of the
‘pictipes lineage’ in Amazonia. Phylogeographic analyses included 115 cytb (682bp) and 50 D2 28S RNA variable
region sequences (632pb) from ten R. pictipes subpopulations (Brazil, Colombia, Bolivia, and French Guiana)
and the comparison with sequence data from R. robustus s.l. We also analyzed cytb and D2 fragments from R.
stali, R. brethesi, R. amazonicus, R. pallescens, R. ecuadoriensis, and R. colombiensis to investigate the origin and
dispersal of the ‘pictipes group’ in South America. As for R. robustus s.l., R. pictipes is a paraphyletic assemblage of
four sibling or near-sibling species, three of which are new to science. However, markedly different levels of withincomplex inter-specific divergence suggest that the phylogeographic patterns of these two groups were not shaped
by the same vicariant events. The cytb molecular clock calibration (1.1-1.8% sequence divergence per million
years) suggests that the ancestral ‘pictipes group’ stock went through at least eleven speciation events during the
Miocene, Pliocene, and Pleistocene. The three cryptic species discovered in this study diverged from R. pictipes s.s.
during the Mid/Late Miocene (12.6-6.8 Mya), possibly as a consequence of the Amazon-Orinoco Miocene marine
transgressions. The wide geographic distribution and shallow phylogeographic structuring of R. pictipes s.s. suggest
a sudden post-speciation, Mid-Pleistocene range expansion during an interglacial about 0.295-0.180 Mya, probably
starting in the eastern Amazon and extending throughout the basin. Our results show how contemporary patterns
of biogeography (including co-distribution) and species diversity may emerge from markedly different evolutionary
histories within a single genus.
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Análise da expressão de genes relacionados ao
comportamento alimentar na família Calliphoridae
Antoniazzi, G; Matiolli, CC; Azeredo-Espin, AML; Torres, TT
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG),UNICAMP
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: PCR em tempo real, parasitismo, hábito alimentar, expressão gênica diferencial, foraging, malvolio
O parasitismo é o comportamento mais bem sucedido entre as espécies. Quase todas as espécies conhecidas
são parasitadas pelo menos em uma fase de seu desenvolvimento. Dentro da diversa ordem Diptera, a família
Calliphoridae, em particular, é ideal para o estudo da evolução do comportamento de parasitismo. Moscas desta
família se alimentam de diferentes substratos como tecido vivo de hospedeiros vertebrados (biontófagas) e matéria
orgânica em decomposição (necrófagas). Além disso, os gêneros Cochliomyia e Chrysomya contêm tanto espécies
biontófagas como necrófagas, permitindo a comparação dos diferentes comportamentos alimentares entre espécies
próximas. A análise comparativa da expressão de genes entre espécies próximas com diferentes hábitos alimentares
proporciona uma excelente oportunidade para estudar a evolução do parasitismo. O comportamento alimentar
está ligado ao modo como cada organismo percebe o ambiente e responde a ele. Genes relacionados aos hábitos
alimentares envolvidos em vias de transdução de sinal podem ser os responsáveis pela percepção do ambiente e
plasticidade das diversas repostas às variações desse ambiente. Assim, foram selecionados dois genes associados
com o comportamento alimentar em outros dípteros, os genes foraging (For) e malvolio (Mvl). Estes genes foram
amplificados com sucesso em seis e quatro espécies diferentes de califorídeos, respectivamente. Quantificamos,
via PCR em tempo real, a expressão destes dois genes em larvas e fêmeas adultas de Co. hominivorax (biontófaga),
Co. macellaria e C. albiceps (ambas necrófagas). As larvas destas três espécies apresentam os dois comportamentos
alimentares, necrófago e biontófago, enquanto que as fêmeas adultas são responsáveis por procurar sítios de
oviposição onde as larvas serão capazes de continuar o seu ciclo de vida. As diferenças observadas nos níveis de
expressão dos genes For e Mvl em larvas está possivelmente relacionada à divergência entre as três espécies; as
larvas de Co. macellaria e Co. hominivorax não apresentaram diferenças significativas no nível de expressão desses
dois genes. Por outro lado, em fêmeas adultas, ambos os genes foram significativamente mais expressos nas espécies
necrófagas e a maior diferença entre elas foi observada na expressão do gene Mvl. Com base nestes resultados,
é possível que as fêmeas adultas tenham um papel importante na evolução dos diferentes comportamentos
alimentares através de uma preferência pelo substrato para oviposição. Este é o primeiro estudo funcional
realizado na família Calliphoridae e, embora ainda não esteja claro como os genes For e Mvl estão relacionados
com o comportamento alimentar das três espécies, nossos resultados abriram o caminho para uma investigação
mais detalhada da base molecular do comportamento alimentar em califorídeos e do hábito de parasitismo. Estas
investigações são o primeiro passo para compreendermos a evolução do parasitismo na família Calliphoridae.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP
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Análises de contorno e marco anatômico do edeago na
interação Drosophila/Cacto
Santos, CG1; Mateus, RP2,3; Sene, FM2; Manfrin, MH1,2
Programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada
Depto. de Biologia, FFCLRP/USP
3
Laboratório de Genética e Evolução, Depto. de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Centro-Oeste, Guarapuava-PR
[email protected]
1
2
Palavras-chave: edeago, Drosophila cactofílica, planta hospedeira, método de contorno, marco anatômico.
O edeago dos insetos apresenta evolução rápida e divergente em relação aos outros caracteres morfológicos,
sendo por isso um órgão muito utilizado em estudos taxonômicos e de evolução morfológica. No grupo repleta
(gênero Drosophila) a radiação do cluster Drosophila buzzatii é composta por sete espécies crípticas e cactofílicas
e a morfologia do edeago é um caráter diagnóstico para suas identificações. Nesse estudo nós analisamos
a plasticidade fenotípica e a variação genética associadas ao tamanho e forma do edeago entre as espécies
crípticas D. serido e D. antonietae (cluster D. buzzatii) de populações simpátricas, sem formação de híbridos, e
de alopátricas, para compreender os fatores envolvidos na evolução dessa estrutura. A variação fenotípica da
morfologia do edeago foi estimada pelo método de morfometria geométrica baseado nos descritores elípticos
de Fourier (contorno) e nos marcos anatômicos. Foram avaliadas as respostas nas interações espécie/cacto/
linhagens quando as moscas foram criadas em meio de cultura preparado com os seus cactos hospedeiros naturais:
Cereus hildmaniannus e Opuntia monacantha. Para a forma do edeago, no método de contorno, as variações de
forma observadas sugerem um componente genético (espécie e linhagem significativas) e também apresentam
plasticidade fenotípica (interação espécie/cacto significativa). Esses resultados também foram observados quando
a forma foi analisada pelo método dos marcos anatômicos, porém nessa análise a interação linhagem/cacto foi
significativa sugerindo interação genótipo/ambiente. Nos dois métodos, as regiões que mais variaram foram a
margem dorsal e a ponta do órgão. A variação de tamanho, tanto no método do contorno como no de marcos
anatômicos, em espécie e linhagem foi independente do cacto de criação, sendo o edeago de D. serido maior que o
de D. antonietae. Embora a variação tenha sido independente do cacto, no geral o tamanho da genitália foi maior
no cacto C. hildmaniannus que em O. monacantha, sendo que a variação no primeiro cacto foi maior. Em relação
às linhagens das duas espécies, os resultados mostraram que as diferenças de tamanho são independentes do
cacto de criação e as variações, no tamanho e na forma do edeago, ocorrem nas linhagens de populações da área
de simpatria e na de alopatria. Nossos resultados sugerem que a planta hospedeira exerce um importante efeito
na morfologia da forma do edeago nas duas espécies analisadas, embora as diferenças interespecíficas tenham
sido mantidas. Além disso, indicam um papel potencial da heterogeneidade ambiental, representada pelos cactos
hospedeiros, na manutenção da variação interespecífica e intra-específica na morfologia da genitália masculina.
Apoio Financeiro: FAPESP, Programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada, CNPq, Capes, USP
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Prevalência e efeito androcida da bactéria Spiroplasma
poulsonii em espécies de Drosophila
Ventura, IM; Martins, AB; Klaczko, LB
Laboratório de Biodiversidade Genética e Evolução de Drosophila
Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, UNICAMP
Palavras-chave: Drosophila, Endossimbiontes, elementos egoístas, agentes androcidas, proporção sexual.
Elementos citoplasmáticos egoístas disseminam-se nas populações através da manipulação da reprodução de
seus hospedeiros. Em espécies de Drosophila, a bactéria Spiroplasma poulsonii é transmitida das fêmeas para sua
prole, na qual tem efeito androcida, isto é, causa mortalidade precoce dos machos, gerando desvios na proporção
sexual. Neste trabalho, testamos a presença da bactéria egoísta nas espécies D. melanogaster (n = 24 em 2009; n = 80
em 2010), D. anassae (n = 46), D. malerkotliana (n = 45) e Zaprionus indianus (n = 18) coletadas em Recife e Salvador
em 2009 e 2010, através da contagem das proles das fêmeas e PCR com primers específicos. Apenas fêmeas da
espécie D. melanogaster mostraram-se infectadas por Spiroplasma associado a desvios na proporção sexual (12,5%
em 2009 e 9% em 2010), além de duas fêmeas que se mostraram infectadas por uma linhagem não androcida da
bactéria. Estes resultados sugerem que a frequência do agente androcida é temporalmente estável na população
amostrada. A seguir, investigamos se a ausência da bactéria nas outras três espécies é devida à resistência ao efeito
androcida. Para tanto, a hemolinfa de uma estirpe de D. melanogaster infectada foi transferida para fêmeas das três
espécies receptoras e os efeitos na proporção sexual foram avaliados. A contagem da prole das fêmeas injetadas
demonstrou que as espécies D. ananassae, D. malerkotliana e Z. indianus exibiram o fenótipo androcida com altas
taxas de transmissão da bactéria. Estes resultados descartam a resistência a Spiroplasma como explicação para
sua ausência nestas espécies. Portanto, outros fatores devem estar envolvidos, como efeitos indiretos no valor
adaptativo das moscas infectadas ou baixa ocorrência de transferência horizontal nas populações naturais.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPESP, Faepex-Unicamp.
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Mapeamento citogenético de DNAs repetitivos em
Coprophanaeus cyanescens (Coleoptera, Scarabaeidae)
Oliveira, SG1; Moura, RC2; Martins, C1
Laboratório Genômica Integrativa, Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP
Laboratório de Biodiversidade e Genética de Insetos, Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, UPE
[email protected]
1
2
Palavras-chave: C0t-1 DNA, Coleoptera, elementos transponíveis, evolução, restrição enzimática.
As seqüências repetitivas de DNA estão envolvidas na organização estrutural e funcional dos genomas, atuando em
rearranjos cromossômicos e sendo responsáveis por variações cariotípicas observadas em muitos grupos. Embora
elementos transponíveis tenham sido descritos em muitos insetos, o uso destas seqüências como marcadores
citogenéticos são escassos em insetos e ausentes em Coleoptera. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo
analisar a distribuição cromossômica de DNAs repetitivos em diferentes populações do coleóptero Coprophanaeus
cyanescens (Scarabaeidae, Scarabaeinae), visando a compreensão dos mecanismos evolutivos que estiveram
envolvidos na sua diversificação genômica e cariotípica. Células meióticas foram analisadas através da localização
da heterocromatina constitutiva (HC) por bandeamento C e de hibridização in situ fluorescente (FISH) utilizando
diversas seqüências de DNAs repetitivos como sondas: (i) C0t-1 DNA ( fração do genoma rica em DNAs repetitivos);
(ii) DNA satélite CoKpnI, isolado através de digestão enzimática com a enzima KpnI; (iii) elementos transponíveis
Mariner e R2 (tipo 1 e tipo 2), isolados por PCR. O bandeamento C revelou cromossomos autossômicos difásicos
com o braço longo heterocromático, o X quase completamente heterocromático e o Y com HC pericentromérica.
O uso de C0t-1 DNA revelou regiões ricas em DNAs repetitivos coincidindo com regiões heterocromáticas, exceto
para o Y, que não apresentou marcação. A hibridação do DNA satélite (DNAsat) CoKpnI revelou blocos intersticiais
grandes nos braços longos de todos os autossomos e do cromossomo X, similar ao padrão de distribuição da HC.
O transposon Mariner mostrou-se presente em oito autossomos com marcações pericentroméricas grandes e seis
autossomos com marcações pericentroméricas que se estendem pelo braço longo. Hibridizações com sondas de
R2-tipo 1 mostraram 10 autossomos com marcações pericentroméricas e seis autossomos e o cromossomo X com
marcação telomérica, enquanto a hibridização com sondas de R2-tipo 2 evidenciou marcações teloméricas em
14 autossomos, discordando dos dados descritos na literatura. A presença de cromossomos difásicos contrasta
com o padrão pericentromérico de HC observado em outros Scarabaeinae, indicando uma diferenciação de
compartimentalização da heterocromatina nesta espécie. Os resultados obtidos evidenciam um acúmulo de
diferentes DNAs repetidos nas regiões de heterocromatinas dos cromossomos, provavelmente como conseqüência
da baixa taxa de recombinação característica destas regiões. Possivelmente a ocorrência e conservação destas
seqüências em posições cromossômicas similares entre cromossomos não homólogos são favorecidas pelo
comportamento cromossômico na configuração Rabl, que também propiciaria um ambiente favorável à
amplificação destes DNAs repetitivos. Coprophanaeus cyanescens apresenta número e morfologia cromossômica
padrão para Scarabaeidae, indicando que a presença de grandes blocos de DNAs repetitivos, como aqui observado,
não estão relacionados a mecanismos evolutivos geradores de alterações cromossômicas. Por outro lado, estas
sequências repetitivas podem estar sendo mantidas no genoma de C. cyanescens devido a algum papel funcional que
desempenham na manutenção de regiões genômicas específicas, como por exemplo, as regiões pericentroméricas.
Apoio financeiro: FAPESP,CNPq e CAPES.
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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300
As rotas de dispersão da Drosophila buzzatii na
América do Sul
Santos, MH1,2; Manfrin, MH1,3
Laboratório de Biologia Evolutiva – Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
Programa de Pós-Graduação em Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
3
Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Riberião Preto – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Drosophila buzzatii, Repleta, Filogeografia, Genética de populações, Evolução.
Drosophila buzzatii é uma espécie cactófila associada a diferentes espécies de cactus distribuída nos Domínios
fitogeográficos da Caatinga, Cerrado, Mata Atlântica, Campos e Chaco. Baseado na diversidade de inversões
cromossômicas, o Chaco foi considerado por alguns autores como o “centro de origem” da espécie. Entretanto,
trabalhos recentes, utilizando aloenzimas e DNA mitocondrial, apontaram para uma possível origem na Caatinga.
Os objetivos foram avaliar a hipótese da possível origem na Caatinga e rotas históricas de dispersão da espécie.
Foram obtidas seqüências de 714 pb da COI do mtDNA de 124 indivíduos em 40 localidades ao longo da distribuição
natural da espécie, gerando 34 haplótipos. Foram calculados os índices de diversidade nucleotídica, o teste AMOVA
(as populações foram subdivididas segundo seus biomas), testes de neutralidade, a Mismatch Distribution, Baesyan
Skiline Analysis, Nested Clade Phylogeographical Analysis e o sentido dos movimentos migratórios (Migrate) a fim
de determinar parte da história evolutiva da espécie. As diversidades nucleotídicas encontradas por bioma foram
de 0,00278 - Caatinga, 0,00269 - Mata Atlântica, 0,00198 - Cerrado, 0,00133 - Campos e 0,00125 - Chaco. A AMOVA
agrupando as amostras em 5 regiões demonstrou que 33,62% da variação é intra-populacional e que uma porção
significativa da variação é devido a diferenças inter-regionais (Fct = 0,0629, p = 0,0196). Os testes de Neutralidade
(D de Tajima = -1,7776, p = 0,0317 e Fs de Fu = -5,9931, p = 0,00001), a forma em estrela da rede e haplótipos,
e a Mismatch Distribution confirmam um evento de expansão populacional há aproximadamente 195795 anos,
segundo modelo de Rogers e Harpending (1992). Entretanto, a Baesyan Skiline Analysis mostrou apenas um
crescimento discreto das populações. A NCPA demonstrou que há fluxo gênico restrito com isolamento por
distância e alguma dispersão a longa distância em alguns dos clados analisados. O resultado do programa Migrate
indicou que os indivíduos do Chaco não fornecem migrantes para outras regiões, apenas recebem. A estruturação
genética pode ser explicada devido à grande área de distribuição da espécie, gerando isolamento por distância e
pela presença de barreiras geográficas como a Serra do Cipó (entre o Cerrado e a Caatinga) e no estado do Rio de
Janeiro (ao longo da Mata Atlântica) onde há pouco ou nenhum indivíduo da espécie. Os eventos de expansão
ocorreram no Quaternário durante o período glacial conhecido como Iliniolian que com a diminuição da umidade
pode ter gerado condições favoráveis à expansão da vegetação de climas secos e espécies associadas. A menor
diversidade nucleotídica do Chaco e o resultado do programa Migrate reforçam a hipótese que o “centro de origem”
da espécie não é esta região, entretanto dados deste trabalho apontam para a caatinga ou alguma região próxima
como provável “centro de expansão” da espécie.
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301
Repeated DNAs profile in six Dichotomius (Coleoptera,
Scarabaeidae) species: heterochromatin and multigene
family organization
Cabral-de-Mello, DC1; Melo, AS2; Moura, RC2; Martins, C1
UNESP – Univ Estadual Paulista, Departamento de Morfologia, Botucatu, São Paulo, Brazil
UPE – Univ de Pernambuco, Departamento de Biologia, ICB, Recife, Pernambuco, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: beetles, C0t-1 DNA, chromosome evolution, histone, rDNA
Here we performed a comparative analysis of repeated DNAs in six Dichotomius species (Coleoptera, Scarabaeidae) trough chromosomal banding and fluorescence in situ hybridization with probes for the 18S and 5S rRNAs,
and H3 histone genes, and for highly repeated sequences (C0t-1 DNA fraction). The heterochromatin was mostly
located in the pericentromeric regions of autosomes and also in the X chromosome. The y chromosome was euor heterochromatic. The CMA3/DA/DAPI staining revealed AT neutral blocks and distinct patterns of CMA3+ regions. The H3 histone and 5S rRNA genes were collocated in the pair 2 in all species, while the 18S rDNA was
variable, presenting 1-2 sites with different localization in the chromosomes. The C0t-1 DNA fraction (isolated
using distinct times of reanealing: 0,5 to 5 min) obtained for each species hybridized mostly in the heterochromatin and in some terminal regions. Only in D. bos the heterochromatin of pairs 1-3 did not reveals hybridization
signals. The use of C0t-1 DNA from D. geminatus against the chromosomes of the other five species revealed positive hybridization only with terminal regions of all autosomes, and with distinct degree with sex chromosomes.
A highly conserved organization of heterochromatin was indicated by C-banding in all species with pericentromeric blocks, being this pattern common in Coleoptera. On the other hand the fluorochrome staining revealed
some level of compartmentalization of the heterochromatin. The use of C0t-1 DNA fractions as probes in the six
species confirmed the heterochromatin pattern in five species, indicating the presence of highly/moderate repetitive sequences in the heterochromatic areas. The absence of C0t-1 DNA hybridization in the chromosomes 1-3 of
D. bos suggests the presence of heterochromatin composed of low repeated sequences or with a high diversity
of repetitive sequences represented by few copies. An intense variation in the kinetics of renaturation to obtain
C0t-1 DNA fraction was observed, which can be attributed to differences in amount of repeated DNAs between
the genomes of the six species. The location of 5S rRNA and histone multigene families is highly conserved in
the genus Dichotomius, whereas the major rDNA clusters were highly variable. Moreover the 5SrDNA/H3 signals
are overlapped, indicating interspersed arrangement for these genes. The results presented here reinforce previous findings concerning the association/interspersion of the 5S rRNA and H3 histone genes. Additionally, we
show the application of C0t-1 DNA fraction as an useful tool for studies of repeated DNAs in insects, bringing
contributions in understanding heterochromatin differentiation. Although this methodology does not permit the
generation of precise information about specific chromosomes or DNA sequences it allows a wide comparison
of the whole repetitive portion of the genomes, without expensive application of DNA cloning and sequencing.
Financial support: FAPESP, CNPq and CAPES
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302
Componentes da variação fenotípica ao longo de
um gradiente altitudinal numa população natural de
Drosphila mediopunctata
Rocha, FB1; Klaczko, LB1
Laboratório de Biodiversidade Genética e Evolução de Drosophila, Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia, Unicamp
[email protected]
1
Palavras-chave: adaptação térmica, herdabilidade, comprimento do tórax, pigmentação.
Em populações naturais, indivíduos de todas as espécies precisam lidar com o desafio evolutivo imposto pela
heterogeneidade ambiental, podendo apresentar como resposta padrões de variação fenotípica causados por diferentes fatores. Para compreender as estratégias evolutivas que podem surgir diante desse desafio, é necessário
investigar o papel dos componentes ambiental e genético na determinação dos padrões de variação fenotípica de
populações naturais. Neste trabalho, descrevemos a variação fenotípica e genética ao longo de um gradiente altitudinal numa população natural de Drosophila mediopunctata, uma espécie do grupo tripunctata exclusiva de áreas
florestais. Foram analisados machos e fêmeas do campo coletados em sete altitudes diferentes (de 593 a 1128 m), e
a F1 (criada a 18 °C no laboratório) de 10 fêmeas por altitude de coleta. Da F1 de cada fêmea, foram analisados três
casais, sendo cada um de um tubo diferente, eliminando o efeito de ambiente comum. Cada indivíduo foi analisado
para: comprimento do tórax; número de pintas abdominais; número de cerdas esternopleurais (lado esquerdo). A
influência da altitude, do sexo e a interação entre essas variáveis foram testadas por uma ANCOVA para cada um
dos caracteres analisados nos animais do campo, revelando um padrão geral de variação fenotípica, independente
do sexo: o valor médio de cada caráter aumentou como uma função do aumento da altitude (P<0,005 em todos os
casos). Na análise da F1, porém, tal padrão não se repetiu (não houve efeito da altitude nos três caracteres). A variação fenotípica observada nos animais do campo remete às normas de reação que os três caracteres apresentam: a
diminuição da temperatura (até ~17 °C) leva ao aumento do valor médio. Assim, os padrões observados são consistentes com o efeito esperado pela variação de temperatura que acompanha o aumento de altitude. Foram feitas
estimativas de herdabilidade no campo (pela regressão das médias da F1 pelas mães do campo) e no laboratório
(pelo coeficiente de correlação intraclasse das irmandades), que revelaram que a variação genética tem um papel
variável na determinação da variação fenotípica (independente da altitude). As estimativas mais altas e significativas nos dois conjuntos foram aquelas referentes ao número de pintas abdominais (h²campo- fêmeas– 39,3%; machos–
35,4%; h²lab.: fêmeas– 64,8%; machos– 74,1%), em concordância com resultados anteriores. Para o comprimento do
tórax, as estimativas do campo para machos e fêmeas foram significativas e negativas, indicando que fêmeas do
campo que eram maiores produziram indivíduos menores no laboratório. Já as estimativas do laboratório foram
positivas (h²lab.: fêmeas – 34,2%; machos – 25,9%), sendo que apenas nas fêmeas ela foi significativa. Para o número
de cerdas esternopleurais, as quatro estimativas foram menores que 25% e não significativas, indicando que tanto
no laboratório como no campo a variação fenotípica desse caráter é quase totalmente determinada pelo ambiente.
Apoio financeiro: FAPESP; CNPq, CAPES, FAEPEX-UNICAMP
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303
Estudo do comportamento meiótico e nucleolar de
Galgupha sidae (Heteroptera: Thyreocoridae)
Souza, HV1; Itoyama, MM1
Laboratório de Citogenética e Molecular de Insetos, Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, Departamento de Biologia, Universidade Estadual Paulista
[email protected]
1
Palavras-chave: Espermatogênese, espermiogênese, meiose, nucléolo, Corimelaenidae
A família Thyreocoridae (=Corimelaenidae) é tratada por alguns autores como uma subfamília de Cydnidae ou
percevejos-negros. Reúnem cerca de 200 espécies, distribuídas em nove gêneros, no hemisfério ocidental. Pouco se
sabe sobre a espermatogênese do grupo. Por isso, 15 machos da espécie Galgupha sidae, coletados em São José do
Rio Preto-SP, tiveram seus lobos testiculares utilizados para avaliação da espermatogênese e do comportamento
nucleolar. As células coradas orceína lacto-acética evidenciaram: núcleo poliploide com inúmeras marcações heteropicnóticas; prófase inicial com cromatina muito dispersa e com alguns corpúsculos heteropicnóticos, os quais
se observam, dentro deles, vesículas; diplóteno inicial apresentando pontes cromatínicas ligando alguns cromossomos, sendo possível notar a presença de quiasmas; metáfase I mostrando 2n= 10A + XY; anáfase I/telófase I inicial
com segregação pós-reducional dos cromossomos sexuais; telófase II com segregação regular dos cromossomos;
espermatócito com cromatina heteropicnótica no centro e na periferia do núcleo formando “grumos” heteropicnóticos e uma formação vesicular ao lado do núcleo; espermátide arredondada com cromatina heteropicnótica na
periferia do núcleo; na espermátide em alongamento a cromatina encontra-se na periferia do núcleo, sendo mais
evidente em um dos lados; espermátide no final do desenvolvimento com material cromatínico heteropicnótico
por todo núcleo. Ao analisar o comportamento dos corpúsculos prata-positivo, verifica-se: núcleo poliplóide com
várias marcações irregulares espalhadas pelo núcleo; prófase I inicial com grande marcação arredondada que, nos
estágios subsequentes, observa-se uma marcação menor e outra maior e evidente que se desorganiza; no diplóteno/
diacinese não é possível a verificação de corpúsculos prata-positivos; metáfases I com algumas impregnações nos
cromossomos; telófase I/metáfase II com impregnações apenas nos cromossomos; no espermatócito ocorreu a reorganização nucleolar, com várias e pequenas marcações prata-positivas; espermatócito com marcações maiores
e mais evidentes; espermátides arredondadas com intensa marcação pelo núcleo e uma maior e mais clara deslocada para a periferia; espermátide em alongamento evidenciando uma marcação escura e arredondada na porção
mediana do núcleo e outra mais clara em forma de bastão localizada na região posterior do núcleo; espermátide
média com três marcações escuras e arredondadas, na região anterior, mediana e posterior da cabeça; espermátide
no final do desenvolvimento com marcação clara em forma de bastão na região posterior do núcleo. O comportamento da espermatogênese e da impregnação pelos íons prata assemelham-se aos demais heterópteros, contudo
se faz necessária o destaque de algumas características peculiares desta espécie tais como: cromatina muito dispersa, baixo número de complemento cromossômico, pontes cromatínicas evidentes, alta taxa de síntese proteica.
Apoio financeiro: CNPq, Fapesp e Fundunesp
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304
Desenvolvimento ontogenético na borboleta Heliconius
erato phyllis em função do canibalismo/nãocanibalismo de lagartas de primeiro estádio
De Nardin, J1; Araújo, AM1
Laboratório de Genética Ecológica, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
[email protected]
1
Palavras-chave: canibalismo lagarta-ovo, desenvolvimento ovo-pupa, taxa de crescimento, mortalidade imaturos, reconhecimento de parentesco.
As lagartas recém eclodidas da borboleta Heliconius erato phyllis são canibais, devorando ovos co-específicos nas
proximidades. Um estudo anterior realizado por nosso grupo mostrou que as lagartas de 1º estádio conseguem reconhecer ovos que são seus parentes biológicos (irmãos) de ovos não aparentados, canibalizando preferencialmente
ovos de não-parentes. Assim, uma vez evidenciado o reconhecimento de parentesco, o objetivo deste trabalho foi
avaliar as diferenças no desenvolvimento ontogenético de lagartas canibais e não canibais de H. erato phyllis, como
uma forma de estimar os custos/benefícios do comportamento canibal/não canibal. Primeiramente, ovos foram
pesados e o volume de cada um, estimado. Após, realizou-se uma série de testes onde, sobre um triângulo equilátero
de papel cartolina verde, com 0,5 cm de lado, colocou-se um ovo em cada vértice. Para cada teste utilizaram-se apenas ovos irmãos. Após a emergência da lagarta, verificou-se a ocorrência do canibalismo desta em relação aos ovos
restantes. A partir de então, as lagartas foram identificadas como canibal (Can, n = 15 até o momento), ou nãocanibal (NCan, n = 15). Os ovos que não foram canibalizados foram utilizados como controle (Ctr, n = 21). O desenvolvimento de cada indivíduo foi acompanhado, sendo anotadas as datas de cada muda até a fase adulta. As pupas
foram pesadas 24h após a sua formação. Dessa forma, foi possível a comparação do peso do ovo, volume do ovo, duração de cada estádio larval e peso da pupa entre os indivíduos canibais, não canibais e controles. Também foi feita
a comparação da mortalidade de lagartas e pupas e da taxa de crescimento larval de cada indivíduo (R), através de
fórmula obtida da literatura. Para a comparação entre os comportamentos (Can, NCan, Ctr), foi feita uma análise
da variância (ANOVA) com dois critérios (comportamento e sexo). Para todas as variáveis analisadas (peso do ovo,
volume do ovo, número total de dias a partir da eclosão da lagarta até o 5º estádio, peso da pupa, R), não foram encontradas diferenças significativas. A distribuição de frequência do número de dias de desenvolvimento por intervalo de idade das lagartas também foi comparada entre os grupos (teste de Kolmogorov-Smirnov), não mostrando
diferenças significativas. Para o cálculo da mortalidade após a eclosão, utilizou-se o teste-G de independência, que
também não revelou diferenças significativas entre os três grupos. Com base nesses resultados, os indivíduos canibais não parecem ter vantagens com relação aos não canibais quando toda a ontogênese é considerada. Entretanto,
os resultados apresentados são parciais, prevendo-se o aumento do número amostral e outros tipos de testes, a fim
de verificar, por exemplo, se as lagartas canibais teriam maior sobrevivência em situação de estresse nutricional.
Apoio Financeiro: CNPq
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305
A inibição da atividade dos genes amplificados BhC52, BhC4-1 e BhB10-1 pela 5-bromo-2’-desoxiuridina
(BrdUrd)
Viana, JC1; Almeida, JC1
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: Diferenciação Celular, Genes Amplificados, 5-bromo-2’-desoxiuridina, Expressão Gênica, Pufes de DNA, Bradysia hygida.
Durante as últimas décadas, uma grande quantidade de trabalhos foi publicada, tratando dos diferentes papéis
exercidos pelo análogo da timidina (dThd), a 5-bromo-2’-desoxiuridina (BrdUrd), em muitos modelos biológicos.
Dentre eles, nos interessam seus efeitos sobre a diferenciação celular. É interessante notar que a BrdUrd, pode
tanto inibir como induzir a diferenciação celular, inibindo ou ativando a expressão de genes específicos. Nos sciaridae, a diferenciação celular na glândula salivar, envolve um processo de amplificação gênica, que ocorre em sítios
específicos dos cromossomos politênicos, ao final do quarto e último, estádio larval, levando à formação dos pufes
de DNA. A injeção de BrdUrd em larvas de Bradysia hygida, durante o período de amplificação gênica, leva a um
efeito morfológico notável – os pufes de DNA não se expandem, a cromatina, nesses sítios cromossômicos, permanece muito compactada durante o resto do quarto estádio e o processo de transcrição parece ser severamente
prejudicado nestes pufes (Almeida, 1978). O objetivo do presente trabalho é demonstrar, morfológica e molecularmente, como ocorre o efeito da BrdUrd sobre a diferenciação celular, estudando seu papel no controle da atividade
de genes específicos. Foram feitas injeções de solução de dThd (controle) ou de BrdUrd em larvas durante o início
do período de amplificação gênica, com as glândulas salivares, foram preparados “Northern blots” ou “Western
blots”, contendo, respectivamente, RNA total ou amostras de polipeptídios. Os “Northern blots” foram hibridados com sondas específicas para os genes amplificados: BhC5-2, BhC4-1 e BhB10-1, localizados em três pufes de
DNA diferentes, marcadas não radioativamente. Os “Westerns blots”, foram tratados com anticorpos policlonais
específicaos, para a detecção das proteínas BhC4-1 e BhB10-1 (produzidos pelo grupo da Dra. Maria Luísa PaçóLarson). Estes experimentos demonstraram, que o tratamento com BrdUrd, resultou em um forte prejuízo na
transcrição dos três genes amplificados e, praticamente, na ausência das proteínas BhC4-1 e BhB10-1. Supomos
que o efeito inibidor da BrdUrd sobre o processo de diferenciação celular, aqui descrito, ocorre devido à incorporação preferencial do análogo, pelos genes amplificados. Estão em curso, experimentos in situ, que visam mostrar o
que acontece, sob mesmo tratamento, com diferentes componentes das maquinarias de replicação e transcrição.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP e FAEPA
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306
DNA mitocondrial e morfologia clássica aplicados
na caracterização do complexo de espécies
Hermeuptychia hermes (Lepidoptera: Nymphalidae:
Satyrinae)
Seraphim, N1; Freitas, AVL2; Silva-Brandão, KL3
Programa de Pós-graduação em Ecologia – IB/Unicamp
Departamento de Biologia Animal – IB/Unicamp
3
Departamento de Entomologia e Acarologia – ESALQ/USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Lepidoptera, Satyrinae, complexo de espécies, DNAmit, morfologia de genitália
O gênero Hermeuptychia está amplamente distribuído no continente Americano, desde a Argentina até o sul dos
Estados Unidos. Existem cerca de oito espécies reconhecidas até o momento para esse gênero, e sua posição dentro dos Satyrinae permanece incerta. Todas as espécies possuem um padrão alar muito parecido, o que dificulta a sua identificação. Para o presente estudo foram obtidos espécimens de cinco países, com maior ênfase em
uma amostragem nacional. Duas regiões do DNAmit foram utilizadas para se obter uma hipótese filogenética
baseada em Inferência Bayesiana (IB): a porção anterior do gene da citocromo oxidase subunidade I (COXI) e
a subunidade 6 do gene da NADH, recentemente sugerida para a análise de espécies próximas de Lepidoptera.
A região da COXI também foi utilizada para estimar o tempo de divergência dos clados observados, usando um
modelo Bayesiano de relógio molecular relaxado de lognormal não-correlacionado. Caracteres da genitália masculina também foram analisados, uma vez que são muito utilizados no diagnóstico de espécies de lepidópteros
quando a morfologia alar é muito similar. A IB de ambas as regiões sequenciadas, analisadas separadamente,
recuperam sete clados bem definidos, com alto valor de Probabilidade Posterior. Um desses clados (DE) inclui
espécimens identificados morfologicamente como três espécies diferentes, presentes quase exclusivamente na
região Andina: H. calixta, H. harmonia e H. pimpla. A espécie norte americana H. sosybius aparece em um grupo separado (G). Os indivíduos comumente identificados como H. hermes no Brasil se dividem em cinco grupos
diferentes (A, B, C, F, e alguns espécimens em H). O grupo B ocorre apenas no Brasil, com maior frequência no
litoral do estado de São Paulo, onde é o grupo mais comum. O tempo de divergência estimado para o gênero
é de 10,6 mya (com intervalo de 95% de confiança 14,457 - 6,591). Os nós mais antigos são os dos grupos C e F
(10,3 mya), seguidos pelo grupo DE (9,6 mya), A (9,4 mya), H (7,4 mya) e G (6,4 mya); o nó mais recente é o do
grupo B (4,5 mya). Através da análise da genitália podemos separar claramente os grupos A, B, C, DE e H, sendo
que o grupo com maior divergência no padrão morfológico é o grupo B, onde a valva é reta, não possui lobo na
região sacular e estão presentes os apêndices angulares, ausentes em todos os outros representantes do gênero. Os grupos G e F ainda não dispõem do número de machos necessários para essa análise. Ambas as análises,
morfológica e genética, sugerem que os grupos observados dentro do complexo H. hermes senso latu representam espécies diferentes que estão se diferenciando no continente americano nos últimos 10 milhões de anos.
Apoio financeiro: CNPq, FAEPEX/Unicamp e FAPESP
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307
Macroestrutura da heterocromatina terminal de
espécies da família Sciaridae revelada com sondas
obtidas por microdissecção cromossômica
Fernandes, T; Madalena, CRG; Gorab, E
Laboratório de Biologia Celular de Dípteros – Instituto de Biociências – USP
[email protected]
Palavras-chave: heterocromatina, DNA terminal, centrômero, microdissecção cromossômica, Sciaridae.
Centrômeros e telômeros são usualmente definidos como regiões heterocromáticas e geralmente compostos por
diferentes DNAs repetitivos (satélites e/ou elementos móveis). Visando elucidar aspectos estruturais de conservação e/ou divergência da heterocromatina terminal, quatro espécies da família Sciaridae foram avaliadas por
hibridação in situ em cromossomos politênicos: Rhynchosciara americana, Rhynchosciara hollaenderi, Rhynchosciara milleri e Trichosia pubescens. O DNA utilizado como sonda foi obtido por microdissecção de extremidades
cromossômicas não-centroméricas dessas espécies, exceto R. milleri, seguido de amplificação e marcação por
DOP-PCR. Quando cada sonda foi hibridada nos cromossomos que lhe deram origem, alguns padrões foram
observados: i) hibridação em todas as extremidades não-centroméricas (R. americana), ii) hibridação em apenas algumas extremidades cromossômicas (R. hollaenderi) e, o mais surpreendente, iii) apenas na extremidade
que deu origem ao produto de microdissecção (T. pubescens). Sondas obtidas de R. americana e R. hollaenderi
não produziram sinais de hibridação em cromossomos de T. pubescens e R. milleri. A sonda de R. hollaenderi,
por sua vez, hibridou nas cinco extremidades não coincidentes com o centrômero de R. americana. Por outro
lado, a sonda obtida de R. americana hibridou em três extremidades não centroméricas de R. hollaenderi e também na sua heterocromatina associada ao centrômero. Resultados inesperados foram observados quando a sonda obtida de T. pubescens foi hibridada nas espécies R. americana e R. milleri. Surpreendentemente, essa sonda
que marcou apenas uma extremidade no seu próprio complemento cromossômico, gerou sinais de hibridação
em todas as extremidades cromossômicas não-centroméricas de R. americana e também na heterocromatina
centromérica-pericentromérica desta espécie. Em R. milleri, a sonda de T. pubescens hibridou claramente com a
heterocromatina associada ao centrômero do seu cromossomo C. A análise em conjunto dos resultados sugere
que a ausência de sinais de hibridação em certas regiões heterocromáticas não se deva a ausência de sequências
complementares à sonda, mas sim à diminuição significativa destas sequências na composição de cada região
heterocromática. Evidências de sequências comuns entre a heterocromatina terminal de T. pubescens e R. americana foi obtida após exploração, por sequenciamento, de uma microbiblioteca da extremidade cromossômica X1
de T. pubescens. O inserto de um subclone desta microbiblioteca mostrou alta similaridade com uma sequência
de R. americana previamente caracterizada e proveniente de microdissecção cromossômica, reforçando uma possível amplificação diferencial de sequências repetitivas na heterocromatina terminal das espécies estudadas. No
caso mais extremo, sequências associadas à uma extremidade não-centromérica de T. pubescens parecem estar
significativamente representadas na heterocromatina associada ao centrômero do cromossomo C de R. milleri,
embora pareça não estar representada nas extremidades não-centroméricas desta espécie. Em resumo, os dados
obtidos até aqui apóiam que o processo de divergência cromossômica entre as quatro espécies aqui estudadas
ocorreu, dentre outros processos, pela amplificação diferencial de sequências componentes da heterocromatina.
Apoio Financeiro: Fapesp
56º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
308
Genômica mitocondrial em Calliphoridae (Brachycera:
Oestroidea) e as perspectivas filogenéticas em Diptera
Junqueira, ACM1; Azeredo-Espin, AML1
Laboratório de Genética e Evolução Animal. Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética (CBMEG). Departamento de Genética,
Evolução e Bioagentes. Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
[email protected]
1
Palavras-chave: mtDNA, Calliphoridae, Diptera, filogenia, mitogenômica.
O DNA mitocondrial (mtDNA) de três espécies da família Calliphoridae foi completamente sequenciado, apresentando 16147 pb em Chloroprocta idioidea, 16143 pb em Calliphora vomitoria e 16635 pb em Phormia regina.
Os três genomas mitocondriais apresentaram a ordem gênica ancestral de Pancrustacea, contendo 13 genes
codificadores de proteínas (GCPs), duas subunidades de RNA ribossomal e vinte e dois RNAs transportadores
(tRNAs). No entanto, P. regina apresentou uma duplicação envolvendo a sequência completa dos genes de tRNAIle
e tRNAGln, além da sequência parcial do tRNAMet. Uma duplicação similar foi previamente descrita para espécies
do gênero Chrysomya na mesma localização, inserida no domínio hipervariável da região controle do mtDNA. A
composição de nucleotídeos dos mtDNAs sequenciados mostrou um alto viés de bases A e T (71.7% em C. idioidea, 72.9% em C. vomitoria e 75.6% em P.regina), principalmente nas terceiras posições do códon e regiões nãocodificadoras, onde o conteúdo A+T é >90%. As reconstruções filogenéticas foram conduzidas com todas as espécies de dípteros com mtDNAs completos, cosistindo no estudo mais amplo com sequências de mtDNA da ordem
Diptera. O emprego de genes individuais para a reconstrução de filogenias resultou em topologias variadas com
baixo suporte, enquanto o uso de sequências concatenadas de nucleotídeos e aminoácidos dos GCPs mostrou
resolução para as relações internas de Diptera. A monofilia de Muscomorpha não obteve suporte nas análises
apresentadas neste trabalho, assim como a de Acalyptratae. A família Calliphoridae foi recuperada como monofilética, mas as relações internas de Oestroidea recuperaram espécies de Muscoidea como um grupo irmão de Calliphoridae. As relações entre as subfamílias de Calliphoridae indicaram que Luciliinae e Calliphorinae são grupos
irmãos, relacionados a Chrysomyinae. Devido à importância médica, veterinária, sanitária, econômica e forense
da família Calliphoridae, o esclarecimento das relações evolutivas desta família é interessante para guiar futuros
estudos acerca da evolução do parasitismo e do hábito de causar miíases, além de contribuir para o diagnóstico
espécie-específico. Além disso, a caracterização de genomas mitocondriais completos também pode contribuir
na resolução de filogenias da ordem Diptera e estudos em evolução molecular e divergências antigas de insetos.
Apoio financeiro: Fapesp, CNPq.
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Dinâmica evolutiva do elemento de transposição
Helena: identificação e atividade in vitro do promotor
de Drosophila simulans e Drosophila mojavensis
Granzotto, A1; Fablet, M 2; Vieira, C 2; Carareto, CMA 1
Laboratório de Evolução Molecular de Insetos, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, UNESP, São José do Rio Preto, SP,
Brasil
2
Laboratoire de Biométrie e Biologie Evolutive, Université Lyon 1, Lyon, França
[email protected]
1
Palavras-chave: Elementos de transposição; Helena; promotor; Drosophila simulans; Drosophila mojavensis.
Os elementos de transposição (TEs) contribuem com a evolução dos genomas hospedeiros e desempenham papel
chave como mediadores da evolução molecular. TEs estão submetidos a processos evolutivos, como rearranjos,
mutações pontuais, deleções e inserções. Análises de bioinformática de 12 espécies de Drosophila mostraram que
o retrotransposon sem LTRs Helena apresenta-se em diferentes estágios do seu ciclo evolutivo e apenas uma cópia
completa foi identificada em D. simulans e D. mojavensis. Enquanto Helena é altamente expresso em D. mojavensis, em D. simulans apenas expressão residual foi observada. Em eucariotos, a expressão gênica durante o desenvolvimento necessita de três diferentes regiões: promotor core, promotores proximais e acentuadores, sendo que
a primeira região é a porção mínima do promotor necessária para o correto início da transcrição e, a segunda,
contém os sítios de ligação dos fatores de transcrição (FTs), os quais exercem um importante papel na regulação
da transcrição gênica. Neste trabalho, foram analisadas as espécies D. simulans e D. mojavensis com o objetivo de
identificar in vitro o promotor mínimo de Helena. A análise funcional de regiões localizadas upstream a ORF1 da
cópia completa de Helena foi realizada usando o kit Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega). Foram
transfectadas duas regiões upstream início da ORF1 de D. simulans (P3 sim (478pb), P4 sim (320pb)) e quatro de
D. mojavensis (P2 moj (876pb), P3moj (454pb), P4 moj (359pb) e P5 moj (251pb)). Para D. mojavensis foi testada
ainda uma seqüência interna da gag (Gag moj), visto que em alguns TEs o promotor pode ser encontrado dentro
da ORF1. Os dados da média da razão da atividade luciferase/Renilla mostram que apenas os valores de P3 sim
e P3 moj são maiores e significantemente diferentes da média do controle negativo (teste t de Student: P=0 para
ambas as construções), o que permite sugerir que o promotor mínimo de Helena esteja localizado a 478 pb e 454 pb
5’ upstream da ORF1 da cópia completa, respectivamente em D. simulans e D. mojavensis. Para uma análise mais
detalhada do promotor de Helena, utilizando a ferramenta Alibaba2, foi realizada uma busca por possíveis sítios de
ligação de FTs nessas duas regiões. A análise da região promotora de D. mojavensis revela a presença de dois sítios
para Sp1, o qual tem sido demonstrado contribuir para a atividade do promotor de elementos LINE, como por exemplo, do elemento L1 em humanos, que apresenta dois sítios de ligação para esse FT na região promotora UTR 5’.
Desde que a ligação de FTs ao DNA tem um importante papel na regulação da transcrição gênica, a presença desses sítios FT na região promotora de Helena reforça nossa proposição de P3 ser a região promotora em D. mojavensis.
Apoio Financeiro: Fapesp e Capes-PDEE
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Análise dos pontos de inserções do elemento
transponível Galileo e sua correspondência com pontos
de quebras de inversões em Drosophila willistoni
Garcia, CF1; Gonçalves, JW1; Panadero, AR2; Valente, VLS1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Departamento de Genética y Microbiología, Universidad Autónoma de Barcelona, Espanha
[email protected]
1
2
Palavras-chave: elemento transponível Galileo, polimorfismo cromossômico, pontos de quebra de inversões, hibridização in situ, Drosophila willistoni.
Elementos transponíveis atuam na evolução genômica, sendo importante fonte de diversidade. Galileo é o único
elemento transponível conhecido que é responsável pela geração de inversões cromossômicas naturais em Drosophila. Este transposon foi identificado em Drosophila buzzatti onde é responsável pela formação de três inversões cromossômicas (2j, 2q7 e 2z3) através de recombinação ectópica. Análises in silico dos 12 Genomas sequenciados (Drosophila 12 Genomes Consortium, 2007) encontraram este elemento em outras seis espécies (D.
ananassae, D. willistoni, D. pseudoobscura, D.persimilis, D. virilis, and D.mojavensis), todas cromossomicamente
polimórficas. Em D. willistoni foram encontradas 495 cópias de Galileo, sendo esta espécie reconhecidamente
a mais polimórfica do grupo willistoni, este achado abre um campo sem precedentes, para estudos sobre o envolvimento entre o elemento transponível Galileo e a geração destes polimorfismos. O presente estudo apresenta
os resultados iniciais sobre a presença e localização cromossômica de cópias completas e incompletas de Galileo, nos núcleos politênicos da linhagem wip-4 de D. willistoni. Para a análise citogenética é empregada a técnica de hibridização in situ, utilizando como sonda um fragmento de 2441 pb obtido da linhagem de D. willistoni
GdH4, utilizada no sequenciamento. Através de nossas análises, encontramos 14 pontos de inserção de Galileo
nos cromossomos autossômicos, das quais 8 encontram-se em regiões de pontos de quebra (ou na seção exata do ponto de quebra ou próximo dela) de inversões. Análises posteriores serão feitas para o cromossomo X.
Apoio Financeiro: CNPq
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311
Variação geográfica e evolução da genitália masculina
em Drosophila cactófilas
Kokudai, CBS1; Santos, CG1; Sene, FM1, 2; Manfrin, MH1
Programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada, Depto. de Biologia, FFCLRP, USP
Depto. de Genética, FMRP, USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Análise elíptica de Fourier; variabilidade interpopulacional; edeago; grupo repleta; populações naturais.
A evolução rápida e divergente da genitália masculina é um dos padrões mais gerais de diversificação morfológica
em animais com fertilização interna. Todavia, as causas desta diversificação são pouco conhecidas. Considerando as três hipóteses centrais de evolução da genitália, a da chave-e-fechadura prediz padrões de divergência da
variação geográfica relacionados à seleção favorecendo o reconhecimento espécie-específico, portanto, seria esperado que não houvesse variabilidade intraespecífica entre populações alopátricas. As hipóteses de pleiotropia e
de seleção sexual, contudo, predizem algum nível de variação geográfica, refletindo diferentes pressões de seleção
sexual ou deriva genética. Para testar essas predições, nós investigamos a variação geográfica na morfologia de 122
edeagos provenientes de seis populações naturais com distribuição alopátrica de Drosophila serido e D. antonietae
(grupo repleta) e uma localidade de simpatria entre as duas espécies, por meio de análise elíptica de Fourier. A
análise de variância multivariada (MANOVA), considerando 10 variáveis de forma e uma variável de tamanho,
identificou diferentes níveis de variação geográfica, independentemente da condição de alopatria ou simpatria
(Wilks lambda=0,00967, F(77, 630.65)=9.5726, p=0,00001). As populações de D. antonietae analisadas, mesmo em simpatria, não apresentaram variação interpopulacional significativa, possivelmente devido ao fluxo gênico interpopulacional ao longo de sua distribuição geográfica, como sugerido por análises moleculares prévias. Já as populações de D. serido, conhecidamente politípicas para vários marcadores, apresentaram diferentes graus de variação
interpopulacional, sendo que a população encontrada em simpatria com D. antonietae não diferiu significativamente das outras populações alopátricas analisadas. Esses resultados rejeitam a hipótese de chave e fechadura, e
podem sugerir tanto a seleção sexual quanto a pleiotropia como hipóteses para explicar os padrões de evolução
da genitália nestas espécies. A variabilidade interpopulacional observada pode, também, ser determinada por fatores históricos, por se tratarem de duas linhagens evolutivas independentes e, pelo menos na diversificação da
morfologia do edeago, a condição de simpatria não parece desempenhar um papel determinante nestas espécies.
Apoio financeiro: Programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada, Fapesp, Capes, CNPq, Finep, USP.
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Aspectos ecológicos e genéticos da abelha
Tetragonisca angustula analisados pelo DNA
mitocondrial
Francisco, FO1,2; Oldroyd, BP2; Arias, MC1
Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
School of Biological Sciences, University of Sydney
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNAmt, jataí, evolução, ecologia, Mata Atlântica.
Introdução: A caracterização da variabilidade genética de populações é essencial para o conhecimento da biodiversidade de um determinado ecossistema. Entretanto, a devastação da vegetação nativa nos diversos ecossistemas
brasileiros vem ameaçando de extinção as espécies de abelhas, dentre outras, que dependem de substratos como
ocos de árvores para a nidificação, e afetando negativamente a polinização da flora local. Através da análise do DNA
mitocondrial (DNAmt) nós investigamos a estrutura genética de subpopulações da abelha Tetragonisca angustula
da Ilha Grande (RJ) e de seis fragmentos florestais nas regiões Sul e Sudeste do Brasil. Métodos: Oitenta e três abelhas de sete subpopulações tiveram 3 genes parcialmente sequenciados: ND2 (565 pb), COI (441 pb) e cytB (294 pb).
Resultados: Foram encontrados 10, 7 e 16 haplótipos para esses genes, respectivamente. A concatenação dessas sequências (1300 pb) gerou 24 haplótipos distintos no total. Contudo, o número de haplótipos por subpopulação variou de 2 a 6, enquanto que a diveridade haplotípica por subpopulação variou de 0.57 a 1.00. Testes de diferenciação
genética entre subpopulações baseados nos valores de Fst indicaram um alto grau de estruturação entre as subpopulações (0,22 < Fst < 0,91). Conclusões: Nossos resultados mostraram que as rainhas não atravessam os 2 km de
mar entre a Ilha Grande e o continente (Angra dos Reis). Contudo, esse isolamento da população insular ainda não
acarretou na perda de sua variabilidade genética, visto que a diversidade haplotípica encontrada foi de 0.84. Além
disso, subpopulações conectadas por uma grande área de Mata Atlântica e distantes 100 km mostraram-se isoladas,
o que não evidencia ainda nenhum grande efeito da fragmentação na estrutura das populações. Esses resultados indicam que o comportamento filopátrico das rainhas pode ser o principal responsável pelos resultados observados.
Apoio financeiro: Fapesp.
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Filogenia molecular de vespas da família Bethylidae
usando DNA mitocondrial (Hymenoptera, Bethylidae).
Nunes, RRA1; Azevedo, CO2; Fagundes, V1
1
2
Laboratório de Genética Animal, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
Instituto Bethylidae de Sistemática, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
Palavras-chave: Hymenoptera, Bethylidae, filogenia, evolução, DNA
A família Bethylidae é representada por 101 gêneros e 2349 espécies, e de extrema importância devido ao seu
papel ecológico atuando como parasitóides que controlam populações de coleópteros e lepidópteros que atacam
culturas agrícolas. A filogenia interna de Bethylidae ainda é incipiente e em sua maioria baseada em caracteres
morfológicos. O presente estudo visou apresentar uma hipótese filogenética de sete gêneros de três subfamílias
de Bethylidae utilizando dados de seqüência de DNA mitocondrial e comparar essa proposta com a atual organização baseada em dados morfológicos. Foram selecionadas duas regiões do genoma mitocondrial: 450 pb do
gene citocromo oxidase I (COI) e 560 pb do gene ribossomal 16S (rDNA_16S). Foram utilizados 14 espécimes dos
sete gêneros de Bethylidae; seqüência do gene rDNA 16S de um exemplar de Rhabdepyris retirado do Genbank
(numero acesso AJ514326); e como grupo externo, a espécie Disclusa disclusa, Superfamília Chrysidea (Número
acesso Genbank AJ514381.1) para COI e o gênero Formica (Hymenoptera, Formicidae) para rDNA_16s. As seqüências foram obtidas através de seqüenciamento direto de produtos de PCR. As análises de filogenéticas foram
realizadas pelos métodos de máxima parcimônia (MP) e máxima verossimilhança (MV) com o programa PAUP.
A matriz de alinhamento do gene COI apresentou 371 caracteres constantes dos quais 124 foram informativos,
enquanto que rDNA_16S apresentou 185 caracteres constantes e 151 informativos. As relações entre e dentro de
alguns gêneros obtidas pelas seqüências de DNA mostraram-se incongruentes com a atual classificação baseada
em dados morfológicos, revelando uma origem parafilética das subfamílias Epyrinae e Pristocerinae. Os dados de
rDNA_16S mostraram que representantes de Chrysidoidea, Pristocerinae e Epyrinae (gêneros Goniozus, Pseudisobrachium e Rhabdepyris, respectivamente) agruparam-se em um clado monofilético com alto suporte de bootstrap
(100%), porém esse Rhabdepyris da Flórida (EUA) não agrupou com outro Rhabdepyris da Mongólia, revelando
uma origem parafilética desse gênero. Da mesma forma Calopnesia (Pristocerinae) e Aspidepyris (Epyrinae) não
agruparam com representantes de suas subfamílias. A análise do gene COI, na qual analisamos somente gêneros
de Epyrinae e Pristocerinae, Rhabdepyris (Epyrinae) é grupo irmão de representantes de Pristocerinae, porém Holepyris e Anysepyris (Epyrinae) mostraram-se como clados irmãos de Rhabdepyris e Pristocerinae. O gênero Acrepys
(Pristocerinae) também mostrou uma origem parafilética. Nossos dados são inéditos na literatura e mostram uma
primeira tentativa de organização genérica na família Bethylidae. Apesar de preliminares, os dados moleculares
mostraram que podem contribuir com informações importantes para a organização e classificação de Bethylidae.
Apoio Financeiro: Facitec, Fapes, CNPq, Capes.
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314
Construção de mapa genético para Drosophila
mediopunctata
Laborda, PR1; Souza, AP1
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, UNICAMP
[email protected]
1
Palavras-chave: Drosophila, mapeamento genético, microssatélites, marcador molecular, mapa de ligação.
Identificar a posição cromossômica dos genes sempre foi uma questão central na Genética. Para genomas pouco
conhecidos, uma maneira interessante de iniciar a exploração molecular é obter um mapa de ligação com base em
regiões genômicas que possam atuar como marcadores de localização. Marcadores microssatélites desempenham
com excelência essa função, dados o perfil codominante de herança e a facilidade com que podem ser desenvolvidos e genotipados. A espécie Drosophila mediopunctata vem sendo estudada sob diferentes ângulos e a literatura
mostra evidências da existência de regiões possivelmente sob ação da Seleção Natural. Neste âmbito, a obtenção de
um mapa genético poderia auxiliar a localização mais fina de regiões de interesse e assim proporcionar um estudo
mais detalhado de locos que possam estar influenciando a evolução da espécie. Portanto, o objetivo de nosso trabalho é construir um mapa para D. mediopunctata usando marcadores microssatélites recentemente desenvolvidos
para a espécie. Para maximizarmos o desequilíbrio de ligação, optamos por uma população segregante do tipo F2, a
qual foi obtida a partir do cruzamento recíproco de duas estirpes de laboratório com mesmo padrão de inversões
cromossômicas. Entre os marcadores desenvolvidos, foram selecionados apenas aqueles que apresentam perfil homozigótico nos genótipos fundadores da população, além, é claro, de polimorfismo entre eles. Aproximadamente,
3000 indivíduos F2 foram obtidos, dos quais 800 (400 machos e 400 fêmeas) estão sendo usados no mapeamento.
Dado o delineamento da população, esperam-se marcadores segregrando na proporção 1:2:1. A genotipagem está
sendo feita em géis de agarose/brometo de etídeo ou poliacrilamida/nitrato de prata. Até o momento, foram genotipados 35 locos, do conjunto de 50 que pretendemos usar para estimar as frações de recombinação e, conseqüentemente, as distâncias genéticas nos grupos de ligação. A construção de uma mapa genético para D. mediopunctata
possibilitará a investigação do genoma da espécie sob uma nova perspectiva uma vez que disponibilizará a localização de marcadores moleculares que podem ser usados como sinalizadores de diversos processos genéticos.
Apoio financeiro: Fapesp
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315
Polimorfismo genético e morfológico em Aedes
scapularis (Diptera; Culicidae)
Devicari, M1, 2; Sallum, MAM 3; Suesdek, L1,2
Laboratório de Parasitologia e Malacologia, Instituto Butantan
Pós –Graduação Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
3
Departamento de Epidemiologia, Faculdade de Saúde Pública, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Aedes, Culicidae, morfometria geométrica, citocromo oxidase subunidade i, microevolução.
Aedes scapularis é uma espécie de mosquito de distribuição aproximadamente Neotropical. É um vetor competente para diversos arbovírus e provavelmente estava envolvida na transmissão do vírus Rocio no Estado de São
Paulo na década de 1970. Estudos anteriores demonstraram a presença de variabilidade em caracteres morfológicos, porém ainda não está claro se tais polimorfismos são correlatos a populações geográficas ou se indicam estruturação populacional. Existe hipótese sobre Aedes scapularis representar complexo de espécies crípticas, porém
as investigações nesse contexto ainda são incipientes. Para testar a hipótese de haver polimorfismos geográficos
em Ae. scapularis, avaliamos a variabilidade de caracteres genéticos e morfológicos em três populações. Foram coletados indivíduos adultos de Ae. scapularis nas localidades: a) Parque ecológico do Tietê, município de São Paulo
(PET); b) Campus do Instituto Butantan, município de São Paulo (BUT); c) Município de Pariquera-Açu (PAR).
Para análise genética, um fragmento de ≅ 600 pb do gene mitocondrial COI flanqueada pelos primers LCO1490
e HCO2198 foi seqüenciada para16 indivíduos de cada amostra populacional. No estudo morfológico, o formato
das asas de 30 indivíduos de cada localidade foi comparado sob perspectiva multivariada utilizando-se morfometria geométrica. A porção seqüenciada do COI apresentou 21 haplótipos, evidenciados por 23 sítios polimórficos. As diversidades haplotípicas e nucleotídicas globais foram respectivamente de h= 0,867 e dπ = 0,006. As
amostras PET, BUT e PAR apresentaram respectivamente 12, 5 e 8 haplótipos. Os haplótipos H16 e H14, os mais
freqüentes, foram os únicos presentes nas três populações. Os demais haplótipos, no entanto, foram exclusivos
de cada população. A análise morfométrica revelou que as amostras populacionais diferem entre si quanto ao
formato das asas. De acordo com as distâncias fenéticas de Mahalanobis, PET e BUT são as amostras mais aparentadas entre si. Considerando-se isoladamente ou conjuntamente os resultados dos marcadores morfológicos
e genéticos, concluímos que existe polimorfismo indicativo de estruturação populacional em Ae. scapularis. A interpretação desses padrões como indicadores de espécies crípticas depende ainda do conhecimento da amplitude
desses padrões morfo-genéticos, o que requisitará possivelmente a extensão desse estudo a outras localidades.
Apoio Financeiro: CNPq 136597/2009-2 e Fapesp 05/53973-0 e 06/02622-5
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316
Filogenia molecular de liturgusidae e mantidae
(Mantodea) baseada em sequencias do gene
mitocondrial rDNA 16S
Lima, KM1,2; Costa, MA2; Terra, PS3; Silva, JG2
Laboratório de Marcadores Moleculares - UESC
Laboratório de Citogenética - UESC
3
Departamento de Ciências Biológicas – UESC
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Mantodea, Liturgusidae, Mantidae, sequenciamento, filogenia
Os insetos da ordem Mantodea, conhecidos como louva-deus, são predadores encontrados em todo o mundo, mas
a maior parte de suas 2.452 espécies distribuídas em 446 gêneros ocorre nas regiões tropicais. Na região Neotropical há 474 espécies descritas distribuídas em 91 gêneros e seis famílias. Destas, 259 espécies ocorrem no Brasil. Esses insetos apresentam uma grande diversidade quanto à morfologia, estratégias de caça e especialização de hábitat. Entretanto, estudos a respeito da sua evolução e filogenia são escassos. O objetivo deste estudo foi reconstruir
a filogenia de alguns mantódeos das famílias Liturgusidae e Mantidae que ocorrem na região Neotropical. Para
esta análise, utilizou-se sequencias do rDNA 16S (~ 440pb). As amostras foram sequenciadas em um seqüenciador
automático DNA MegaBACE™. As seqüências geradas foram analisadas juntamente com sequencias selecionadas
do GenBank, compondo uma matriz com 14 táxons e 434 caracteres. Destes, quatro pertencem à subfamília Liturgusinae, representada por dois gêneros e oito à subfamília Photininae, representada por sete gêneros. Foi utilizado
como grupo externo espécies do gênero Chaeteessa. Para o alinhamento das sequencias foi utilizado o programa
Clustal W implementado no programa BioEdit e para a análise filogenética pelo método de máxima parcimônia
o programa MEGA 4.1 e “bootstrap” com 1000 replicações. A matriz gerada apresentou 177 sítios variáveis, o que
corresponde a 40,8% da sequencia, sendo 127 destes informativos para a análise de máxima parcimônia. O nível
máximo de divergência encontrado foi de 21,4% entre Cardioptera brachyptera e Hangiomantis superba. O conjunto de sequencias apresentou um desvio composicional de A+T = 74,1%. A análise resultou em 13 árvores mais
parcimoniosas com 109 passos, índice de consistência de 0,61 e índice de retenção de 0,59. A árvore de consenso
estrito apresenta-se altamente politômica, entretanto, alguns agrupamentos intergenéricos e intragenéricos foram
confirmados apresentando alto suporte estatístico. As espécies C. brachyptera e Cardioptera squalodon aparecem
agrupadas com elevado suporte de bootstrap, confirmando as classificações baseadas em dados morfológicos.
Uma das árvores mais parcimoniosas confirma a monofilia da família Mantidae, que em análises anteriores aparecia dividida pelo clado contendo as espécies da família Liturgusidae, mostrando que a região mitocondrial rDNA
16S foi informativa. Entretanto, não foi possível a confirmação da monofilia dos táxons neotropicais da família
Liturgusidae.
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Expressão da proteína fibrilarina em corpos
cromatóides de células espermatogênicas de
triatomíneos
Silistino-Souza, R1; Peruquetti, RL1; Taboga, SR1; Rosa, JA2; Azeredo-Oliveira, MTV1
Departamento de Biologia – Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, IBILCE/UNESP.
Departamento de Ciências Biológicas – Faculdade de Ciências Farmacêuticas, FCF/UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Fibrilarina, Corpo Cromatóide, Espermatogênese, Triatomíneos, Doença de Chagas.
O Corpo Cromatóide, organela específica de células reprodutoras, foi descoberto há 130 anos e pode ter sua origem no núcleo ou nucléolo. Apesar das pesquisas realizadas, atualmente, a função precisa do corpo cromatóide
ainda é desconhecida. O objetivo deste estudo é analisar a expressão da proteína nucleolar fibrilarina no corpo cromatóide de células espermatogênicas dos folículos testiculares de triatomíneos, por meio das técnicas de
impregnação com íons prata, análise ultraestrutural e reação de imunohistoquímica e imunofluorescência. Os
resultados demonstraram a presença de corpos cromatóides nas células espermatogênicas e espermátides em
estágio de elongação, com a marcação citoplasmática, para fibrilarina. Conclusões: Esses dados sugerem que
a fibrilarina seja constituinte do corpo cromatóide e derivada de provável fragmentação nucleolar, além de ter
participação na formação do acrossomo. Os constituintes do corpo cromatóide podem auxiliar na compreensão
do papel fisiológico desta organela em células espermatogênicas de triatomíneos, vetores da doença de Chagas.
Apoio Financeiro: CNPq, Capes e Fapesp
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Resumos do 56º Congresso Brasileiro de Genética • 14 a 17 de setembro de 2010
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318
Culex quinquefasciatus (Diptera; Culicidae) infectados
por Wolbachia sp. (Alphaproteobacteria; Rickettsiales):
influência da infecção sobre fenótipo reprodutivo e
morfológico do mosquito
Almeida, F1,2; Suesdek, L1,2
1
2
Laboratório de Parasitologia e Malacologia, Instituto Butantan
Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo
Palavras-chave: Culex quinquefasciatus, Wolbachia SP, Morfometria Geometrica alar, Fitness Reprodutivo, Infecção.
Introdução: Wolbachia é uma alfa-proteobactéria endosimbionte intracelular capaz de infectar diversos artrópodes e nematóides, são transmitidas maternalmente através do citoplasma do ovo. Pode alterar reprodução de
seus hospedeiros, induzindo feminização dos machos, partenogênese, morte dos machos, incompatibilidade citoplasmática e alterações no fitness reprodutivo. Os efeitos da infecção podem ser vantajosos ou desvantajosos,
dependendo do hospedeiro e da cepa da bactéria. Um de seus hospedeiros é Culex quinquefasciatus, um mosquito de hábitos noturnos, cosmopolita, urbano, muito comum na cidade de São Paulo e que tem competência
vetora para filarias e arbovírus. A despeito da importância médica desse mosquito e da relevância biológica de
Wolbachia, pouco é conhecido sobre a associação desses dois táxons. Neste trabalho buscamos avaliar se a bactéria endossimbionte influencia o fitness reprodutivo e o formato alar do mosquito. Métodos: A colônia de Culex
quinquefasciatus naturalmente infectada por Wolbachia foi iniciada com mosquitos coletados às margens do Rio
Pinheiros na cidade de São Paulo. Um lote de mosquitos foi tratado com antibiótico, cloridrato de tetraciclina,
em duas gerações consecutivas para a eliminação da bactéria. Após a obtenção de uma colônia de mosquitos
não-infectados, foram realizadas comparações de fitness reprodutivo entre mosquitos infectados e não-infectados.
Esses dois grupos de mosquitos foram também comparados quanto à geometria alar, para avaliar se o fenótipo da forma alar sofreria alterações após eliminação da bactéria. Resultados: Observamos que os mosquitos infectados depositaram menor quantidade de ovos e que o percentual de viabilidade de seus ovos foi menor que o
dos mosquitos desinfectados. Por outro lado, os dados de morfometria alar mostraram que a presença da bactéria não altera o formato das asas. Conclusão: A presença da bactéria não interfere na determinação do formato alar de Culex quinquefasciatus, embora pareça influenciar o fitness reprodutivo dos mosquitos. O modo
pelo qual a bactéria endossimbionte causa tal distúrbio nessa espécie de mosquito ainda está sendo investigado.
Auxílio financeiro: CNPq
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Modelo de dispersão intragenômico “transposon” não
caracteriza o elemento Bari em populações naturais de
Drosophila simulans
Dias, ES1; Carareto, CMA1
Laboratório de Evolução Molecular, Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – IBILCE, Universidade
Estadual Paulista – UNESP, Campus de São José do Rio Preto
[email protected]
1
Palavras-chave: dispersão intragenômica; transposon Bari; família Tc1-mariner; Drosophila; grupo melanogaster.
O modelo transposon de dispersão intragenômico é esperado para os elementos transponíveis da classe II, visto que
todas as cópias que apresentam suas sequências de reconhecimento íntegras podem sofrer mobilização. Testamos
essa hipótese utilizando o transposon Bari, em linhagens oriundas de populações de Drosophila simulans com
tempos origem diferentes: ancestrais (da África, onde a espécie se originou – Zimbábue e Madagascar), invasoras
antigas - anciãs - (da Europa - França e Escócia) e invasoras mais recentes (do Brasil - Pernambuco e Florianópolis).
A partir de um pool populacional, uma região da transposase do elemento Bari foi amplificada e os fragmentos clonados e sequenciados (18 a 23 clones de cada linhagem). O modelo de dispersão foi gerado utilizando o programa
Network algoritmo Median Joining. Uma sequência, compartilhada por todas as populações, se caracteriza como
“master copy”. Essa, tanto na análise geral, quanto em cada população, posiciona-se centralmente na rede e dela
parte a maioria das diferentes cópias (50%). Infere-se, portanto, que ela é a cópia ancestral e que se mantém ativa
em todas as populações. Modelos distintos de dispersão se ajustam às cópias do Bari nas populações africanas. Em
Zimbábue, além da ancestral, outras cinco sequências originam, secundariamente, 60% (10) das diferentes cópias,
ajustando-se ao modelo “transposon”. Por outro lado, em Madagascar, apenas 20% (2) são originadas secundariamente por duas sequências distintas, ajustando-se ao modelo “master copy”. Sequências que constituem fontes
secundárias de novas cópias (“submasters”) também foram encontradas em ambas as populações anciãs, três delas
originando 50% (4) e 63% (7) das diferentes cópias, ajustando-se ao modelo “intermediário” de dispersão. Nas populações invasoras, 70% (9) e 65% (11) das cópias originam-se da “master copy” e apenas 15% (3), na de Florianópolis,
se originam de três “submasters”, dados que também se ajustam ao modelo “master copy”. Nestas populações, a
semelhança, tanto do modelo de dispersão quanto do número de cópias diferentes encontrados em ambas, sugere
a ausência de influência de fatores ambientais na origem e na dispersão de novas cópias do transposon Bari, ao
contrário do reportado para o retrotransposon 412, cujo número de cópias varia com a temperatura. As relações
evolutivas entre todas as cópias do elemento Bari permitem, ainda, sugerir que a origem das populações brasileiras
remete às européias e não às africanas, visto o compartilhamento de sequências entre elas. Em síntese, a aleatoriedade esperada na dispersão intragenômica do transposon Bari não foi corroborada e os modelos sugeridos variam
tanto entre populações com diferentes tempos de origem, como anciãs e invasoras, bem como entre populações
distintas, mas com provável tempo de origem similar, como as de Zimbábue e Madagascar. Na última, a característica insular pode ter influenciado na dispersão, aproximando-a dos modelos observados nas anciãs e nas invasoras.
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Bombus morio e Bombus pauloensis (Hymenoptera:
Apidae): espécies válidas ou complexo de espécies?
Françoso, E1; Arias, MC1
Laboratório de Genética e Evolução de Abelhas, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade
de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: DNA mitocondrial, complexo de espécies, variação genética, Bombus morio, Bombus pauloensis.
Introdução: Bombus é um gênero de abelhas conhecido popularmente por mamangavas. Em habitats temperados, constituem os principais polinizadores. Dentre essas abelhas se destacam B. morio e B. pauloensis, espécies
que possuem ampla e bem documentada distribuição, o que permite estudar efeitos de fenômenos que possam
ter influenciado sua estrutura genética populacional; possuem associações com as florestas tropicais e subtropicais; são espécies abundantes na natureza e em coleções de museus e são fáceis de serem coletadas. B. morio é
completamente preta e pilosa, com hábito preferencialmente florestal, sendo mais comum em matas ao longo de
rios, apesar de ocorrer em uma região ampla no sul e sudeste do Brasil (do Rio Grande do Sul até Minas Gerais e
Espírito Santo). B. pauloensis é a espécie mais politípica do Brasil, com uma alta variação de cores e de habitats.
Ocupa praticamente a mesma área de B. morio, apesar do hábito mais generalista. Uma característica interessante é a variação da flavinização (padrão de cor) ao longo da distribuição, sendo que no sul os indivíduos são
mais amarelos e ao norte, mais escuros. Objetivos: a partir de marcadores de DNA mitocondrial, verificar se B.
morio e B. pauloensis realmente constituem espécies únicas ou se constituem complexos de espécies, em especial pelo fato de suas grandes áreas de ocorrência e pela grande diversidade morfológica encontrada em B. pauloensis. As distância genéticas intra e inter-específicas foram calculadas para verificar se realmente constituem
espécies únicas e se essas regiões do mtDNA podem ser utilizados como marcadores para a identificação dessas
abelhas. Métodos: os exemplares foram coletados em toda a distribuição geográfica e em coleções para a extração de DNA. Os genes mitocondriais seqüenciados foram: citocromo c oxidase I (COI), subunidade maior do
RNA ribosômico (16S) e cluster IV de tRNA (que abrange dois transportadores e uma região do COII e ATPase
8). Resultados: B. morio e B. pauloensis apresentaram clados bem definidos, com variações inter-específicas de
4,82%, 7,02% e 7,2% para as regiões COI, cluster IV e 16S, respectivamente. As variações intra-específicas foram:
COI 0,328% e 2,074%, cluster IV 0,412% e 2,075%, 16S 0,06% e 1,286% para B. morio e B.pauloensis, respectivamente. Conclusões: B. morio e B. pauloensis constituem espécies monofiléticas. B. pauloensis apresenta uma
variação intra-específica maior do que B. morio para as três regiões analisadas. Apesar de B. morio e B. pauloensis apresentarem praticamente a mesma distribuição geográfica e hábito florestal, as duas espécies têm características bem diferentes. B. morio é mais homogênea morfologicamente, enquanto B. pauloensis apresenta alta
variação de cores e de habitats. A alta diversidade genética, aliada à alta variação morfológica e de habitats em
B. pauloensis, sugere a presença de espécies crípticas caracterizando o táxon como um complexo de espécies.
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Relações entre sequências do ITS1 de espécies do
complexo Anastrepha fraterculus (Diptera, Tephritidae)
de diferentes áreas geográficas da Região Neotropical
Prezotto, LF; Perondini, ALP; Selivon, D
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: moscas-das-frutas, DNA ribossômico, espécies crípticas.
As espécies de moscas-das-frutas da família Tephritidae são consideradas importantes pragas da fruticultura
mundial. O gênero Anastrepha, endêmico do Continente Americano, compreende 212 espécies descritas, das quais
101 ocorrem no Brasil. Dentre essas espécies, destaca-se a Anastrepha fraterculus (sensu lato), que compreende um
complexo de espécies crípticas. Até o momento, foram reconhecidas a Anastrepha sp.1 aff. fraterculus, A. sp.2 aff.
fraterculus, A. sp.3 aff. fraterculus, que ocorrem no Brasil, a A. sp.4 aff. fraterculus encontrada no Equador. O presente
trabalho buscou a caracterização da variabilidade da região espaçadora ITS1 do DNA ribossômico de A. sp.1, A. sp.2
e A. sp.3 em amostras populacionais de diversas localidades do Brasil e de A. fraterculus (s.l.) em diferentes amostras
da Região Neotropical (Argentina, Peru, Equador, Colombia, Guatemala e México). Os fragmentos amplificados,
com cerca de 900 pb para todas as amostras, continham uma seqüência parcial do gene 18S, o ITS1 completo e o
início do gene 5.8S. O ITS1 variou de 539 a 584 bases. Todos os exemplares apresentaram um teor de bases AT entre
77,6 a 88,6%. O índice de distância entre as amostras variou de 0,001 a 0,130. Não foram observadas diferenças significativas intra-específicas entre as seqüências de amostras populacionais das diferentes entidades do complexo.
A análise filogenética agrupou as amostras em clados distintos de acordo com as regiões geográficas (Colombia
(México/Guatemala)((Peru/Equador)(Brasil/Argentina))). No clado de Brasil/Argentina, as amostras das três entidades que ocorrem no Brasil estão separadas em subgrupos distintos. Estes agrupamentos estão coerentes com as
divisões de províncias biogeográficas da entomofauna da Região Neotropical. Desta forma, a análise do ITS1 corrobora a hipótese de existência de diferentes entidades biológicas no complexo fraterculus na Região Neotropical.
Apoio: Fapesp, Capes
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Novos marcadores de DNA microssatélites em
Anopheles (N.) darlingi (Diptera: Culicidae), principal
vetor da malária no Brasil: desenvolvimento,
caracterização e amplificação interespecífica
Lima, GN¹; Batista, JS2; Formiga, KM2; Cidade, FW3; Rafael, MS4; Tadei, WP1; Santos, JMM1
¹ Laboratório de Malária e Dengue - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/ Escola Superior de Saúde – Universidade do Estado
do Amazonas
² Laboratório Temático de Biologia Molecular - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
3
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Departamento de Genética e Evolução - Universidade Estadual de Campinas
4
Laboratório de Malária e Dengue - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]
Palavras-chave: Anopheles darlingi, microssatélites, vetor da malária, bacia amazônica, genética molecular.
Introdução: Anopheles (Nyssorhynchus) darlingi é o principal e o mais antropofílico e endofágico vetor da malária
no Brasil, principalmente na bacia amazônica. É também um dos principais vetores em outros países distribuídos
pela América do Sul como o Peru, Colômbia e Suriname. Objetivos: Considerando a importância epidemiológica
desse vetor e a eficiência dos marcadores microssatélites para estudos de genética de populações, foram isolados e
caracterizados 24 marcadores microssatélites para A. (N.) darlingi e posterior amplificação heteróloga em três espécies do mesmo subgênero: Anopheles (N.) rangeli, Anopheles (N.) benarrochi e Anopheles (N.) triannulatus. Métodos:
A biblioteca genômica enriquecida com regiões microssatélites de A. (N.) darlingi foi construída a partir do DNA
genômico extraído de um pool de 10 espécimes adultos recém eclodidos não alimentados e coletados em Coari-AM,
Brasil, utilizando o método acetato de potássio 3M. Os 96 clones gerados por essa biblioteca foram seqüenciados em
ABI 3130. Foram utilizados os programas CHROMAS 2.23, BIOEDIT 7.0.0.9, WEBSAT e PRIMER3 para caracterização da biblioteca e desenho dos primers. Os produtos da PCR de genotipagem foram eletroinjetados no analisador
de DNA MegaBACE 1000 (GE Healthcare). O tamanho dos alelos foi estimado usando o padrão de genotipagem ET550 ROX e os dados analisados no programa FRAGMENT PROFILER v1.2 (GE Healthcare). Resultados: A biblioteca
genômica apresentou 77 clones (80,2%) com sequências nucleotídicas de boa qualidade e 1,3% de redundância.
Destes, 73 clones (94,8%) apresentaram sequências com SSRs, gerando um total de 124 SSRs na biblioteca, sendo
1,7 a média por clone. A partir de 63 clones (81,8%) foram desenhados 69 pares de primers, sendo 66 sintetizados.
Foram obtidos 36 locos microssatélites polimórficos, dos quais, 24 já foram caracterizados. O número de alelos por
locos variou de 4 a 11, com a média de 7,667. A heterozigosidade observada (HO) variou entre 0,037 e 0,833, com média de 0,500 e a esperada (HE) entre 0,177 e 0,871, com média de 0,723. O PIC variou entre 0,168 e 0,840, com a média
de 0,679. Treze locos mostraram desvio significativo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW), depois da correção
de Bonferroni (P: (5%) ≤ 0,002). Os 24 locos foram testados para amplificação heteróloga em três espécies de Anopheles: A. rangeli, A. benarrochi e A. triannulatus. O numero de marcadores amplificados variou entre 10 (A. rangeli) e
15 (A. benarrochi). Oito locos foram amplificados em todas as três espécies e 17 locos amplificaram em pelo menos
uma espécie. Quatorze locos foram polimórficos em pelo menos uma espécie e variou entre oito (A. rangeli) e 13 locos (A. triannulatus). Conclusão: Os 24 microssatélites polimórficos desenvolvidos podem ser usados como eficientes marcadores para genética de populações e mapeamento genético de A. darlingi e outras espécies de Anopheles.
Apoio Financeiro: PROCAD/CAPES, FAPEAM, CTPETRO, CNPq/FAPEAM – Rede Malária
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Construção e caracterização de uma biblioteca
genômica enriquecida com regiões de microssatélites
para Anopheles triannulatus (Diptera: Culicidae)
Cruz, PF1,3,4; Batista, JS 2,3; Formiga, KM 2,3; Tadei, WP 1,3,4; Santos, JMM 1,3,4
Universidade do Estado do Amazonas, MBT, Manaus, AM
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Fisiologia Comportamental e Evolução – LFCE, CPBA, Manaus, AM
3
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, LTBM/COPE, Manaus, AM
4
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Laboratório de Vetores da Malária e Dengue, CPCS, Manaus, AM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Anopheles triannulatus, microssatélites, biblioteca genômica, genética de populações, malária.
Introdução: Anopheles triannulatus é um complexo de espécies crípticas constituindo-se de pelo menos três espécies: Anopheles triannulatus s.s., Anopheles halophylus, e outra ainda não identificada, denominada A. triannulatus C. É uma espécie zoofílica, crepuscular e exofílica. No entanto, tem a capacidade endofágica e antropofílica.
Sua importância como transmissora da malária humana ainda é controvertida. A. triannulatus já foi encontrada
contaminada por Plasmodium e considerada uma possível vetora da malária na Venezuela. Considerando a importância dos microssatélites (SSR), que têm sido muito eficientes em estudos populacionais de diversos organismos e por apresentar um elevado índice de polimorfismo, estes foram escolhidos para serem utilizados em uma
futura análise populacional dessa espécie. Objetivos: Isolar e caracterizar uma biblioteca genômica enriquecida
de microssatélites para A. triannulatus. Métodos: Uma biblioteca genômica enriquecida com microssatélites foi
construída a partir do DNA obtido de um pool de 15 mosquitos adultos não alimentados procedentes de Manaus,
AM. O DNA foi digerido com enzima de restrição RsaI e ligado a adaptadores com T4 DNA ligase. A seleção dos
fragmentos foi feita por hibridização utilizando sondas (CT)8 e (GT)8 marcadas com biotina e esferas magnéticas
recobertas por estreptavidina. Os fragmentos selecionados foram ligados no vetor pGEM-T (Promega) e a trasformação bacteriana foi realizada por eletroporação, seguida da inoculação em meio contendo IPTG e X-GAL. Foi
extraído o DNA plasmidial e o sequenciamento foi realizado com o kit Big Bye Terminator V3.1 em sequenciador
automático ABI 3130. As seqüências foram analisadas com os programas CHROMAS 2.23 e BIOEDIT 7.0.0.9 e os
contigs gerados com o programa STADEN. A caracterização da biblioteca foi realizada com o auxilio do programa
WEBSAT. Resultados: A biblioteca genômica de A. triannulatus resultou em 96 clones com insertos e desses 84 com
seqüências nucleotídicas de boa qualidade. Foram gerados 72 contigs não redundantes a partir da Sequência de
DNA de 76 clones e 85 microssatelites foram encontrados em 60 contigs na biblioteca, com a média de 1,42 SSRs/
contig. A redundância encontrada na biblioteca foi estimada em 5,26 %. Quanto ao motivo de repetição, foram
encontrados os seguintes microssatélites: 70 dinucleotídeos (82,5%), 7 trinucleotídeos (8,2%), 6 tetranucleotídeos
(7%) e 2 pentanucleotídeos (2,3%). De acordo com a natureza de repetições, os microssatélites foram classificados
em: 73 simples perfeitos (86%), 3 simples imperfeitos (3,5%), 2 simples interrompidos (2,3%), 4 compostos imperfeitos (4,7%) e 3 compostos interrompidos (3,5%). Conclusão: A bilbioteca genômica gerou uma alta eficiência (66,7%)
de microssatélites. Essas regiões microssatélites isoladas serão utilizadas para desenho de primers flanqueadores
para A. triannulatus que serão posteriormente validados a fim de obter locos polimórficos e utilizá-los não somente
em estudos de genética populacional, mas também, no entendimento do complexo de espécies de A. triannulatus.
Apoio financeiro: Fapeam, CNPq/Fapeam – Rede Malária
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324
Identificação de genes expressos em moscas-dasfrutas do gênero Anastrepha
Nakamura, AM; Gonçalves, VR; de Brito, RA
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Departamento de Genética de Populações e Evolução, Universidade Federal de São
Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Anastrepha, SNPs, genética de populações.
O gênero Anastrepha de moscas-das-frutas é praticamente endêmico da América do Sul apresentando mais de
200 espécies até o momento identificadas. Além da grande diversificação na América do Sul, diversas espécies do
gênero Anastrepha são importantes economicamente por causar grandes prejuízos às culturas de frutos, particularmente no grupo fraterculus. Apesar desta importância, poucos estudos têm identificado marcadores genéticos
relevantes ao estudo destas moscas e sua diferenciação. Por não serem animais-modelo, a melhor estratégia para
a identificação de novos genes nestas espécies é através da construção de bibliotecas de cDNA. Neste estudo buscamos identificar, a partir de um conjunto de ESTs isolados de uma biblioteca de cDNAs de A. obliqua produzida
em nosso laboratório, genes com baixas taxas de identidade buscando a identificação de regiões ricas em polimorfismos intra e interespecíficos, que possam ter se diversificado por seleção positiva. A partir da identificação de
tais genes, buscamos a elaboração de primers que amplificassem tais genes para diversas espécies de moscas-dasfrutas, particularmente no grupo fraterculus. Em uma primeira etapa, selecionamos, baseado em taxas de dN/dS,
regiões relevantes para a identificação de genes com alta taxa evolutiva em Anastrepha. Alinhamos as seqüências
desses genes com espécies próximas, tais como as do gênero Drosophila, com a finalidade de encontrarmos regiões
conservadas para a construção de primers. Caso o gene já houvesse sido completamente seqüenciado em nossa
biblioteca, criamos primers forward e reverse, outrossim criamos primers forward construídos juntamente com o
M13 reverse para a amplificação do clone possuindo tal EST. Após a purificação, seqüenciamos as amostras amplificadas para conseguirmos visualizar o gene completo. Numa segunda etapa, com essas seqüências foi possível
a construção de primers reverse de forma a obter a seqüência completa do gene de interesse em amplificações
para as outras espécies do gênero (A. fr