Métodos usados em análise de alimentos Colorimetria Turbidimetria
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16/09/2015 1 Técnicas Analíticas Espectrometria Métodos usados em análise de alimentos Colorimetria Turbidimetria Absorção no Ultravioleta, Vísivel e Infravermelho Fluorimetria Absorção atómica e Emissão de Chama Ressonância Magnética Nuclear Espectroscopia de massa 2 Técnicas Analíticas Espectrometria Radiação electromagnética ondas electromagnéticas 2 campos oscilantes eléctrico magnético orientados em ângulo recto na direcção da propagação 1 16/09/2015 3 Técnicas Analíticas Espectrometria Radiação electromagnética propaga-se a velocidade constante depende do índice de refracção do meio que atravessa comprimento de onda (l) depende da frequência (n), da velocidade da luz (c) e do índice de refracção do meio (h) l c hn c – velocidade da luz 3x1010 cm/seg 4 Técnicas Analíticas Espectrometria Radiação electromagnética ondas electromagnéticas formadas por fotões energia de um fotão E hn E hc h – constante de Planck 6.624x10-27 erg.seg hl quanto menor o comprimento de onda, maior a quantidade de energia necessária para a absorção 2 16/09/2015 5 Técnicas Analíticas Espectrometria Radiação electromagnética requisitos para que uma molécula absorva radiação: radiação incidente deve ter a mesma frequência que a frequência rotacional, vibracional, electrónica ou nuclear da molécula molécula deve ter um dipolo permanente ou um dipolo induzido energia absorvida deve promover uma transição, rotação ou vibração 6 Técnicas Analíticas Espectrometria Radiação electromagnética estado fundamental átomo ou molécula no seu nível energético mais baixo (mais estável) estado excitado quando um átomo ou molécula possuem uma energia superior à mínima 3 16/09/2015 7 Técnicas Analíticas Espectrometria Radiação electromagnética espectro de absorção quando uma molécula absorve energia (radiação, colisão) e passa do estado fundamental ao excitado espectro de emissão quando a molécula cede o excesso de energia e volta ao estado fundamental 8 Técnicas Analíticas Espectrometria Radiação electromagnética técnicas de absorção de radiação UV e Vísivel baseiam-se na radiação de ressonância e- excitado pode passar de um nível de menor energia para outro de maior energia tendência para voltar ao normal, emitindo energia em excesso 4 16/09/2015 9 Técnicas Analíticas Espectrometria Radiação electromagnética radiação de raios X maior energia de excitação pode provocar a saída de um e- interno lugar será preenchido por outro e- de um nível superior radiação infravermelha e de microondas moléculas possuem energia interna associada a rotações das moléculas e vibrações entre os átomos que formam a molécula 10 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectro electromagnético 5 16/09/2015 11 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectro electromagnético raios cósmicos e raios g 0–1ː transições nucleares raios X 1 ː - 10 nm e- das camadas internas UV distante 100 – 200 nm ionização de átomos e moléculas e- da camada do meio UV 200 – 400 nm transições dos e- de valência Visível 400 – 700 nm transições dos e- de valência 12 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectro electromagnético IV próximo 700 – 2000 nm vibrações moleculares IV 2000 nm - 25000 nm vibrações moleculares IV afastado 25 – 500 mm rotações moleculares Microondas 500 mm – 3 cm rotações de grupos Ressonância electrónica de spin (ESR) 3 cm – 5 m orientação do spin Ressonância magnética nuclear (NMR) 5 – 30 m orientação do spin 6 16/09/2015 13 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectrometria de absorção electrónica transições dos e- da camada de valência amostra atravessada por radiação contínua de luz branca intensidade de radiação decresce, de modos diferentes, para diferentes comprimentos de onda radiação emergente pode ser colorida (Vísivel) ou incolor (UV) radiação absorvida é uma característica da amostra absorvente 14 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectrometria de absorção electrónica Colorimetria transformar uma substância incolor ou pouco colorida numa colorida, através de reacções químicas permite analisá-la absorção de radiação medida em espectrofotómetros ou colorímetros 7 16/09/2015 15 Técnicas Analíticas Espectrometria Turbidimetria também chamada nefelometria mede absorção da radiação incidente numa amostra devido à sua turvação intensidade da turvação proporcional à quantidade do componente que está a ser medido utiliza equipamento semelhante ao da colorimetria usada para estudar líquidos que tenham uma 2ª fase em suspensão fase suspensa dispersa a luz em geral, mede-se intensidade da luz dispersa 16 Técnicas Analíticas Espectrometria Turbidimetria sistemas estudados: concentrações de gás ou bolhas de ar em solução emulsões de óleo ou gordura partículas sólidas em suspensão permite determinar concentrações, mas também distribuição do tamanho das partículas 8 16/09/2015 17 Técnicas Analíticas Espectrometria Turbidimetria pode ser medida por 2 métodos: 1)mesma configuração que em colorimetria intensidade da luz emergente atenuada por um mecanismo de “bloqueio” 2)detector montado a 90º relativamente à luz incidente captura a radiação dispersa 1) Nefelometria; 2) Turbidimetria utilização indiferenciada 18 Técnicas Analíticas Espectrometria Turbidimetria soluções turvas têm tempo de vida limitado medidas e resultados dependem do tempo 9 16/09/2015 19 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectrometria de absorção electrónica radiação no UV e visível apenas afecta os e- que formam as ligações 3 tipos de e-: s – ligações simples p – ligações duplas n – e- não ligantes (elementos electronegativos – O, S) s* Antiligante n ↓ s* Energia p* Antiligante n↓ n p* Não ligante p ↓ p* p Ligante s ↓ s* s Ligante Técnicas Analíticas 20 Espectrometria Espectrometria de absorção electrónica ligações s muito fortes transição s ↓ s* dá-se no UV do vácuo compostos saturados – hidrocarbonetos transições n ↓ s* dão-se no UV do vácuo compostos com e- não ligantes – cloreto de metilo ligações p são mais fracas transição p ↓ p* dá-se no UV e Visível transições n ↓ p* dão-se no UV próximo e Visível compostos com ligações duplas conjugadas 10 16/09/2015 21 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectrometria de absorção electrónica ordem energética das transições electrónicas s ↓ s* >> n ↓ s* > p ↓ p* > n ↓ p* cromóforos compostos que absorvem radiação UV/Visível possuem ligações duplas (p) conjugadas transições electrónicas p ↓ p* transições n ↓ p* não seguem regras de selecção espectros com fraca intensidade 22 Técnicas Analíticas Espectrometria Lei de Beer-Lambert absorção de radiação por interacção com moléculas da matéria pode variar de intensidade absorção medida através da radiação transmitida 11 16/09/2015 23 Técnicas Analíticas Espectrometria Lei de Beer-Lambert quando encontra uma molécula, radiação pode ser: refractada reflectida difundida radiação totalmente reemitida em todas as direcções, de modo uniforme produzir fluorescência parte da energia absorvida é retida pela amostra radiação reemitida tem menor energia (> l) 24 Técnicas Analíticas Espectrometria Lei de Beer-Lambert desprezando fenómenos de reflexão, difusão e fluorescência: T I I0 T - transmitância I0 – radiação incidente I – radiação transmitida 12 16/09/2015 25 Técnicas Analíticas Espectrometria Lei de Beer-Lambert absorvância é o log do inverso da transmitância A log I 1 log 0 T I 26 Técnicas Analíticas Espectrometria Lei de Beer-Lambert passagem de um feixe de radiação monocromática num nº sucessivo de moléculas absorventes idênticas resulta na absorção de fracções iguais da energia radiante que as atravessa dI x dS Ix S fracção absorvente da radiação (I) é igual à secção S absorvida 13 16/09/2015 27 Técnicas Analíticas Espectrometria Lei de Beer-Lambert dS proporcional ao nº de moléculas absorventes na secção transversal dS k .dn I I0 se S dI x n k .dn Ix 0 S V b I n ln k S I0 I nb ln k V I0 V = volume do bloco 28 Técnicas Analíticas Espectrometria Lei de Beer-Lambert substituindo n e V por c (concentração) e –ln por log e incluindo a constante e (absortividade ou coeficiente de extinção molar) e é uma característica de cada composto I log e bc A I0 14 16/09/2015 29 Técnicas Analíticas Espectrometria Lei de Beer-Lambert A de uma solução directamente proporcional à concentração da espécie absorvente, para um comprimento de percurso fixo lei de Beer-Lambert válida se: radiação incidente é monocromática centros absorventes actuam independentemente uns dos outros no processo de absorção absorção ocorre numa secção transversal uniforme 30 Técnicas Analíticas Espectrometria Lei de Beer-Lambert desvios à lei de Beer-Lambert: químicos mudanças na concentração da solução por interacção das moléculas do soluto entre si e com o solvente associação ou dissociação trabalhar com soluções diluídas (<0.01 M) para evitar instrumentais radiação não monocromática sinal do detector não linear nem proporcional à concentração da solução 15 16/09/2015 31 Técnicas Analíticas Espectrometria Análise qualitativa identificação tentativa do composto através da comparação com padrões de: valor de lmax perfil do espectro total lmax afectado pela natureza do solvente solvente tem que ser transparente na região espectral necessária confirmação por métodos complementares compostos diferentes com lmax idênticos e perfis muito semelhantes 32 Técnicas Analíticas Espectrometria Análise quantitativa quantidade de composto medida pelo valor da absorvância máxima escolher l em que e seja máxima variação na absorvância para uma dada mudança de concentração será maior efeito relativo de outras substâncias e impurezas é minimizado mudança de absorvância com l é menor espectro de absorção médio não afectado por pequenos erros no ajuste de l 16 16/09/2015 33 Técnicas Analíticas Espectrometria Análise quantitativa exemplos cálculo da concentração numa amostra em que e é conhecido aplicação directa da lei de Beer-Lambert c A eb solução de Co(H2O)2+ tem uma absorvância de 0.20 a 530 nm numa célula de 1.00 cm. e = 10 L mol-1 cm-1 c 0.20 0.020 M 10 x1.00 34 Técnicas Analíticas Espectrometria Análise quantitativa cálculo da concentração numa amostra em que e é desconhecido fazer recta padrão constrói-se recta com pelo menos 4 concentrações diferentes coloca-se no gráfico o valor da absorvância máxima da amostra tira-se a concentração do composto analisado 17 16/09/2015 35 Técnicas Analíticas Espectrometria Análise quantitativa necessário verificar linearidade da resposta em relação à curva padrão acima de uma certa concentração a relação A vs. c deixa de ser linear 36 Técnicas Analíticas Espectrometria Análise quantitativa absorvância de uma solução de MnO4- é 0.500 a 525 nm. Em condições idênticas, uma solução de MnO4- com concentração 1.0x10-4 M tem uma absorvância de 0.200. cálculo da concentração desconhecida 0.500 e bcdesc. 0.200 e b104 cdesc. 2.5x104 M 18 16/09/2015 37 Técnicas Analíticas Espectrometria Análise quantitativa problemas de interferência na medida da absorvância 2 compostos com lmax igual ou próximo absorvância é aditiva interferência de um composto sobre o outro necessário separar os compostos cromatografia … 38 Técnicas Analíticas Espectrometria Análise quantitativa exemplo cálculo da concentração de um complexo metalreagente (MR) que absorve a 522 nm (e = 1.18x104) solução também contém R em excesso 1.00x10-4 M (e = 5.12x102 a 522 nm) absorvância total a 522 nm = 0.727 0.727 1.18x104.cMR 5.12x102.104 cRM 5.72x105 M 19 16/09/2015 39 Técnicas Analíticas Espectrometria Análise quantitativa exemplo 2 complexos metálicos (X e Y) Al1 = 0.533, Al2 = 0.590 em l1 0.533 3.55x103.cX 2.96x103.cY em l2 0.590 5.64x102.cX 1.45x104.cY 5.64x102. 0.533 2.96x103.cY 0.590 1.45x104.cY 3.55x103 cY 3.60x105 M cX 1.20x104 M 40 Técnicas Analíticas Espectrometria Equipamentos Colorímetros simples e fotoeléctricos aplicados apenas na região Visível Absorciómetros inclui a classe dos colorímetros, mas podem ser usados noutras regiões do espectro regiões selecionadas por filtros ópticos 20 16/09/2015 41 Técnicas Analíticas Espectrometria Equipamentos Espectrofotómetros usa uma banda mais estreita de comprimento de onda seleccionada por um monocromador feixe simples simples e barato apresenta erros devido a flutuações de voltagem e interferências do solvente não regista espectro 42 Técnicas Analíticas Espectrometria Equipamentos feixe duplo mais sofisticado e caro não apresenta os erros encontrados no de feixe simples regista espectro da amostra fonte de radiação dividida em 2 feixes um feixe passa na célula de referência onde fica o solvente puro outro feixe passa na célula da amostra efeitos da fonte ou do solvente registado por ambas as células detector mede a diferença entre ambos os sinais espectro apenas da amostra 21 16/09/2015 43 Técnicas Analíticas Espectrometria Equipamentos componentes básicos fonte lâmpada com descarga de hidrogénio utilizada na região UV (185 – 370 nm) lâmpada de tugsténio utilizada na região visível (350 - 2000 nm) atenuador ou fenda diminui largura do feixe da fonte, deixando passar apenas o comprimento de onda de interesse passa por uma fenda estreita fenda demasiado grande – passa radiação em excesso, provocando desvio à lei de Beer-Lambert (radiação não monocromática) fenda demasiado estreita – diminuição da intensidade da radiação e perca de sensibilidade 44 Técnicas Analíticas Espectrometria Equipamentos monocromador ou filtro selecciona uma banda ou comprimento de onda rede de difracção placa metálica polida (reflexão) ou de vidro (transmissão) com ranhuras muito próximas, paralelas e equidistantes separação do feixe de radiação em vários comprimentos de onda seleccionados em função do tipo de amostra prisma vidro (visível) ou quartzo (UV) dispersa o feixe de radiação 22 16/09/2015 45 Técnicas Analíticas Espectrometria Equipamentos célula para amostra amostras colocadas em células apoiadas em porta-células, colocados num compartimento vidro ou plástico região visível quartzo UV mais eficientes 2 janelas paralelas 2 lados bem polidos espessura mais comum – 1 cm 46 Técnicas Analíticas Espectrometria Equipamentos detector fotocélulas detectam a quantidade de radiação transmitida após passagem pela amostra radiação transmitida provoca emissão de e- a partir de uma superfície sólida com um cátodo e um ânodo produção de corrente eléctrica amplificador fotomultiplicador quando atravessado por um fotão, amplifica a resposta para maior nº de e- 23 16/09/2015 47 Técnicas Analíticas Espectrometria Equipamentos registador transforma sinal eléctrico que chega ao detector e amplificador em energia mecânica regista um sinal 48 Técnicas Analíticas Espectrometria Solventes Visível qualquer líquido incolor água destilada mais usada UV qualquer solvente que não absorva nesta região sem ligações duplas conjugadas água ou hidrocarbonetos saturados elevada pureza dissolver bem a amostra 24 16/09/2015 49 Técnicas Analíticas Espectrometria Aplicações na análise de alimentos absorção no Visível pigmentos naturais corantes artificiais absorção no UV conservantes antioxidantes caracterização de óleos e gorduras grau de oxidação de óleos e gorduras vitaminas A, B, C, E e K pesticidas micotoxinas pectina e polissacáridos 50 Técnicas Analíticas Espectrometria Aplicações na análise de alimentos colorimetria proteínas aminoácidos vitaminas A, B, C, D e E carboidratos metais pesticidas antioxidantes caracterização de óleos e gorduras grau de oxidação de óleos e gorduras 25 16/09/2015 51 Técnicas Analíticas Espectrometria Emissão de radiação electromagnética átomos, iões e moléculas podem ser excitados por diversos processos ao relaxar, libertam energia em excesso relaxação pode resultar em emissão de radiação electromagnética emissão é característica da substância 52 Técnicas Analíticas Espectrometria Emissão de radiação electromagnética tipos de espectro riscas espécies atómicas riscas estreitas diversas transições electrónicas e subníveis 26 16/09/2015 53 Técnicas Analíticas Espectrometria Emissão de radiação electromagnética bandas compostas por diversas riscas orbitais moleculares estados vibracionais e rotacionais 54 Técnicas Analíticas Espectrometria Emissão de radiação electromagnética contínuos produzidos por aquecimento intenso de sólidos luz emitida ao longo de um amplo intervalo de energia lmax é função da temperatura do material 27 16/09/2015 55 Técnicas Analíticas Espectrometria 56 Técnicas Analíticas Espectrometria Emissão de radiação electromagnética luz produzida é directamente proporcional à concentração das espécies a serem medidas c=kI c – concentração I – intensidade da luz k – constante de proporcionalidade 28 16/09/2015 57 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica absorção e emissão de radiação por átomos obtêm-se espectros de riscas utilização em análise elementar qualitativa e quantitativa 58 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica pode ocorrer alargamento das riscas por: efeito Doppler durante a atomização/ionização, a amostra pode aproximar-se ou afastar-se do detector desvio de Doppler na risca riscas espectrais que deveriam estar separadas de 1 – 5 nm, podem alargar até 100 vezes efeito de pressão colisão dos átomos da amostra com outras substâncias permuta de energia efeito aumenta com a temperatura 29 16/09/2015 59 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica Emissão atómica átomos promovidos a um nível energético elevado ao decair emitem luz, que é medida técnicas classificadas segundo fonte de excitação fotometria de chama fluorescência atómica excitação eléctrica emissão de plasma permitem análises qualitativas e quantitativas 60 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica análise qualitativa Emissão atómica baseada na presença de riscas de emissão específicas 30 16/09/2015 61 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica análise quantitativa Emissão atómica baseada na medição da intensidade das riscas de emissão intensidade proporcional à concentração grande erro relativo funciona melhor com metais 62 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica fontes de excitação Emissão atómica eléctrica eléctrodos de carbono de elevada pureza arco – excitação eléctrica contínua faísca – pequena rajada de excitação T = 4000 – 8000 ºC para uma faísca 15000 – 40000 V disposição dos eléctrodos depende do estado da amostra 31 16/09/2015 63 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica chama Emissão atómica funciona melhor com elementos dos grupos IA e IIA mais fáceis de ionizar amostras (líquidos ou gases) introduzidos na chama por aspiração utiliza temperaturas relativamente baixas (~2000 – 3000 ºC) < 1 % dos átomos são ionizados emissão de plasma permite temperaturas mais elevadas 64 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica plasma Emissão atómica semelhante à fotometria de chama gás inerte (geralmente Ar) excitado ioniza a amostra temperaturas mais elevadas (> 103 K) permitem maior sensibilidade 32 16/09/2015 65 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica plasma acoplado por indução (ICP) Emissão atómica 6000 – 8000 ºC funciona melhor para elementos com mais elevadas energias de excitação plasma acoplado directamente (DCP) plasma por microondas 66 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica monocromador Emissão atómica círculo de Rowland redes de elevada resolução devido a riscas muito estreitas 33 16/09/2015 67 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica detecção Emissão atómica olho, para sistemas mais simples análise qualitativa película qualitativa – posição das riscas quantitativa – grau de exposição tubo fotomultiplicador análise quantitativa 68 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica fotómetro de chama Emissão atómica sistema monocromador/detector mais simples menos espécies observáveis construção semelhante a espectrofotómetros de feixe único 34 16/09/2015 69 Técnicas Analíticas Espectrometria Emissão atómica 70 Técnicas Analíticas Espectrometria Emissão atómica 35 16/09/2015 71 Técnicas Analíticas Espectrometria Emissão atómica 72 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica Absorção atómica absorção de luz por átomos no estado atómico livre lei de Beer-Lambert maioria dos átomos não passa ao estado excitado com os processos de excitação atómica utilizados método de análise dos átomos livres é mais sensível 36 16/09/2015 73 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica vantagens relativamente à emissão atómica menos interferências Absorção atómica menor dependência da temperatura melhores sensibilidade e rigor para maioria dos elementos (gama de ppb) desvantagens relativamente à emissão só analisa metais apenas análise quantitativa 74 Técnicas Analíticas Espectrometria Absorção atómica 37 16/09/2015 75 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica 76 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento semelhante a espectrofotómetro de feixe simples Absorção atómica fontes lâmpada de cátodo oco fonte produz riscas de emissão específicas para o elemento usado na construção do cátodo lâmpada de descarga sem eléctrodo maior intensidade mas menor estabilidade 38 16/09/2015 77 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica lâmpada de cátodo oco lâmpada contém gás inerte (Ar, Ne) Absorção atómica aplicação de um potencial provoca excitação do gás, deslocando-o para o cátodo metal passa ao estado excitado devido ao contínuo bombardeamento pelo gás após relaxar, produz riscas de emissão atómica específicas 78 Técnicas Analíticas Espectrometria Absorção atómica 39 16/09/2015 79 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica lâmpada de descarga sem eléctrodo sal contendo o metal de interesse selado Absorção atómica num tubo de quartzo com um gás inerte campo de radiofrequência excita o gás gás excitado ioniza o metal 80 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica interruptor rotativo usado para dividir feixe de luz em 2 Absorção atómica reduz ruído da fonte 40 16/09/2015 81 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento métodos de atomização Absorção atómica exposição da amostra a temperaturas elevadas atomização separa partículas em moléculas individuais e estas em átomos átomos no estado estacionário em forma gasosa absorvem radiação produzem um sinal proporcional à sua concentração 82 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento métodos de atomização Absorção atómica chama líquidos e gases C2H2 usado como combustível e ar ou N2O como oxidantes N2O produz uma chama mais quente, mas mais ruidosa requer amostras grandes (> 1 mL) amostra continuamente consumida limites de detecção elevados pequena parte da amostra oxidada pela chama a cada momento 41 16/09/2015 83 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento métodos de atomização Absorção atómica sem chama (forno de grafite) líquidos e sólidos maior intensidade mas menor estabilidade amostra colocada num tubo de carbono aquecido por corrente eléctrica maior tempo de residência da amostra melhores sensibilidade e limite de detecção 84 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento métodos de atomização Absorção atómica sem chama (forno de grafite) usado um programa de temperatura para aquecer a amostra secagem 50 – 200 ºC para remover solvente carbonização 200 – 800 ºC para decompor a matriz atomização aumento rápido até 2000 – 3000 ºC em poucos segundos recolha dos dados 42 16/09/2015 85 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento métodos de atomização Absorção atómica sem chama (forno de grafite) Ar usado como gás de purga: remoção de material em excesso durante a secagem e carbonização e após a atomização redução da oxidação do tubo impede a reacção de C com N durante a atomização não se dá produção de cianogénio 86 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento monocromador e detector Absorção atómica rede holográfica para resolver as riscas detector habitual é um tubo fotomultiplicador habitual usar um método para correcção do “background” bandas largas devidas a absorção ou emissão molecular correcção com D2 ou efeito de Zeeman 43 16/09/2015 87 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento monocromador e detector Absorção atómica correcção com lâmpada de D2 luz da fonte e de uma lâmpada de D2 passam alternadamente pela amostra banda de luz da lâmpada de D2 que atravessa a amostra é mais larga diferença entre os 2 sinais dá a correcção 88 Técnicas Analíticas Espectrometria 44 16/09/2015 89 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento Absorção atómica limitações da correcção com lâmpada de D2: pode ocorrer sub- ou sobrecorrecção, dependendo da amostra requer bom alinhamento das lâmpadas D2 funciona mal a > 350 nm 90 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica equipamento monocromador e detector Absorção atómica correcção com efeito de Zeeman campo magnético forte aplicado à amostra separação dos níveis de energia electrónica dos átomos desloca-se o comprimento de onda de absorção da amostra, permitindo medir directamente o ruído de fundo 45 16/09/2015 91 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica interferências absorção de radiação da fonte Absorção atómica elementos diferentes do analisado podem absorver o comprimento de onda utilizado ionização formação de iões em vez de átomos causa menor absorção da radiação podem adicionar-se supressores de ionização auto-absorção átomos absorvem mais radiação no centro da risca do que nos lados provoca alteração na forma e intensidade da risca 92 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica interferências absorção de fundo da radiação da fonte Absorção atómica presença de partículas resultantes de uma atomização incompleta problema reduzido por aumento da temperatura da chama transporte velocidade de aspiração, nebulização ou transporte da amostra 46 16/09/2015 93 Técnicas Analíticas Espectrometria Absorção atómica 94 Técnicas Analíticas Espectrometria Absorção atómica 47 16/09/2015 95 Técnicas Analíticas Espectrometria Absorção atómica 96 Técnicas Analíticas Espectrometria Absorção atómica 48 16/09/2015 97 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica Absorção atómica vs. Emissão atómica Absorção Emissão Mede concentrações reduzidas de metal em matrizes complexas Mede concentrações reduzidas de metal em matrizes complexas Depende do nº de átomos no estado fundamental Depende do nº de átomos excitados Mede a radiação absorvida por átomos no estado fundamental Mede a radiação emitida por átomos excitados Presença de uma fonte luminosa (lâmpada de cátodo oco) Ausência de fonte luminosa Temperatura do atomizador ajustada de modo a apenas atomizar os átomos da amostra no estado fundamental Temperatura do atomizador suficientemente elevada, de modo a atomizar e excitar os átomos da amostra 98 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica Fluorescência atómica modificação no equipamento usado para absorção atómica lâmpada colocada em ângulo recto relativamente ao detector mede qualquer átomo que fluoresça 49 16/09/2015 99 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica Aplicações análise clínica análise de metais em fluidos biológicos sangue e urina análise ambiental avaliar o nível de diversos elementos em rios, água do mar, ar e combustíveis farmácia detecção de pequenas quantidades de catalisadores usados na produção de fármacos indústria verificar a presença dos principais elementos e garantir que impurezas tóxicas estão abaixo do nível permitido ex: teor de Pb no betão 100 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia atómica Aplicações minas detecção de ouro em rochas análise de alimentos determinação de elementos existentes em quantidades residuais cosmética análise de elementos existentes em quantidades residuais ex: no cabelo 50 16/09/2015 101 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X Absorção Difracção Emissão/fluorescência 102 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X se um e- de uma camada interna for ejectado de um átomo, o seu lugar será preenchido por outro proveniente da camada externa diferença de energia emitida como raios X função do nº atómico 51 16/09/2015 103 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X emissão de raios X é independente da forma química intensidade usada para identificar elementos com nº atómico ≥ 20 fonte de raios X tem que possuir um nº atómico superior ao da amostra absorção Z4 massa atómica 104 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X equipamento 52 16/09/2015 105 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X equipamento feixe de e- produz raios X a partir de um metal (Cu, W, Mo) colimador é constituído por uma série de placas metálicas perfuradas absorve todos os raios X não correctamente direccionados filtro constituído por um metal com nº atómico superior ao do elemento a analisar 106 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X monocromadores são raramente usados quando existem são de NaCl iões difractam raios X 53 16/09/2015 107 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X detectores por ionização em gases tubo cheio de Ar (≥ 1000 V) elevado nº de ionizações um único pulso de radiação com muitos iões não é discriminatório 108 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X detectores cintilação usados na detecção de raios X e g raios X interagem com cristais de NaI(Tl) e produzem luz 1 fotão por cada 200 eV nº de fotões proporcional à energia dos raios X luz dirigida para um tubo fotomultiplicador 54 16/09/2015 109 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X detectores estado sólido semicondutores de Si(Li) aplicando uma pequena diferença de potencial ao cristal obtêm-se 3 zonas positiva, negativa e vazia quando atravessado por uma radiação ionizante, esta deixa um rasto de cargas positivas e negativas na zona vazia detecção baseada na corrente necessária para reestabelecer a zona vazia 110 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X Difracção usada para medir dimensão e forma de cristais análise elementar estrutura de novos materiais identificação de substâncias 55 16/09/2015 111 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X Absorção usada para medir qualidade de metais e ligas medicina medicina dentária 112 Técnicas Analíticas Espectrometria Raios X Fluorescência quando uma amostra é exposta aos raios X, são produzidos raios X secundários para nos atómicos ≥ 11 obtém-se informação qualitativa e quantitativa técnica não destrutiva 56 16/09/2015 113 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular absorção e emissão de radiação por moléculas espectroscopias de UV/Vis, IV e Fluorescência 114 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular absorção molecular UV/Vis analisa transições electrónicas espectros aparecem como bandas grande nº de estados vibracionais e rotacionais 57 16/09/2015 Absorção molecular UV/Vis 115 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular para existir absorção no UV/Vis por compostos orgânicos energia absorvida pelo composto corresponda a uma transição de um orbital populado para um não populado s ↓ s* não observada habitualmente energia demasiado elevada n ↓ s* para compostos que contenham átomos com pares de e- não partilhados compostos com O, S, N e halogéneos 150 – 250 nm pouco intensas Absorção molecular UV/Vis 116 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular n ↓ p* e p ↓ p* necessária insaturação para ter orbitais p* ligações múltiplas e estruturas de ressonância aumento de insaturação provoca desvio para >l 200 – 700 nm intensas 58 16/09/2015 Absorção molecular UV/Vis 117 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular efeito do solvente na fase de vapor não existe solvente interacções mínimas entre moléculas solvente pode causar alargamento das bandas Absorção molecular UV/Vis 118 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular em compostos inorgânicos também se verifica absorção para espécies com orbitais d parcialmente ocupados mais intensas para complexos com metais de transição resultado da interacção do ligando com as orbitais d do metal num ião livre, as orbitais d têm energias iguais, mas não são idênticas interacção com um ligando afecta umas orbitais mais que outras desdobramento das orbitais d resulta numa transição d ↓ d (zona do UV/Vis) tipo e grau de desdobramento dependem do ligando e da geometria do complexo formado 59 16/09/2015 Absorção molecular UV/Vis 119 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular análise qualitativa pouco interessante bandas pouco estruturadas moléculas com grupos funcionais semelhantes apresentam espectros muito parecidos Absorção molecular UV/Vis 120 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular análise quantitativa diversas aplicações elevada sensibilidade limites de detecção entre 10-4 e 10-6 M razoável selectividade razoável simplicidade e baixo custo medida deve ser efectuada no lmax maior sensibilidade minimiza erros 60 16/09/2015 Absorção molecular UV/Vis 121 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular análise quantitativa condições de análise devem ser mantidas constantes: solvente temperatura pH preparação da amostra condições instrumentais iguais e constantes para amostra e padrões cuvettes fendas comprimento de onda Absorção molecular UV/Vis 122 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular análise quantitativa método apenas válido em condições de linearidade Abs vs. conc 61 16/09/2015 123 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular absorção molecular IV energia demasiado baixa para promover transições electrónicas limitada aos níveis vibracional e rotacional em líquidos e sólidos, rotação molecular é limitada principal interacção é vibracional depende de: nº de átomos tipo de átomos tipo de ligação entre átomos Absorção molecular IV 124 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular cada molécula pode apresentar diversos tipos de vibração 62 16/09/2015 Absorção molecular IV 125 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular principal vantagem: permite identificar grupos funcionais Absorção molecular IV 126 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular análise quantitativa bandas muito estreitas desvios à lei de Lambert-Beer pouco útil em análise quantitativa 63 16/09/2015 Absorção molecular IV 127 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular FTIR espectrofotómetros modernos usam sistema de transformada de Fourier operação matemática que traduz uma curva complexa nas suas componentes Absorção molecular IV/FTIR 128 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular num FTIR, a curva complexa é um interferograma soma das interferências construtivas e destrutivas geradas pelas ondas de luz curvas componentes são o espectro IV luz incidente é dividida 50:50 para um espelho fixo e outro móvel espelho móvel é o principal e mais caro componente 64 16/09/2015 Absorção molecular IV/FTIR Absorção molecular IV/FTIR 129 Técnicas Analíticas Espectrometria 130 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular exemplos de interferogramas 65 16/09/2015 131 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular absorção molecular Raman fotões absorvidos por moléculas sofrem espalhamento maioritariamente elástico (espalhamento de Rayleigh) fotão emitido tem mesmo l que o que absorve pequena parte (1:107) tem espalhamento inelástico (efeito de Raman) energias dos fotões incidentes e espalhados são diferentes Raman 132 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular linhas de Stokes são equidistantes da de Rayleigh 1 quantum vibracional de energia perdido ou ganho linha de Stokes mais intensa apenas as moléculas que sofrem excitação vibracional antes da irradiação podem originar linhas anti-Stokes em geral, apenas se medem as linhas de Stokes 66 16/09/2015 Raman 133 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular para que uma vibração seja activa em IV, tem que haver alteração no momento dipolar da molécula para que uma transição seja activa em Raman, tem que haver alteração na polarizabilidade da molécula polarizabilidade varia com movimento vibracional espalhamento de Raman pouco eficaz necessária forte fonte de excitação laser laser é monocromático permite avaliar diferença de energia entre as linhas de excitação e de Stokes Raman 134 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular espectrómetro de Raman fonte luminosa normalmente laser óptica recolhe luz espalhada pelo efeito de Raman sistema de detecção 67 16/09/2015 Raman 135 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular estudos biomédicos efectuados em microscópios de Raman ou sondas de fibra óptica acopladas a um sistema de Raman portátil permite trabalhar in vivo Raman 136 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular espectroscopias IV e Raman são complementares diferentes regras de selecção ex: moléculas diatómicas homonucleares não têm espectro IV não possuem momento dipolar têm espectro Raman ligação, ao contrair e esticar, altera interacções entre e- e núcleo, variando polarizabilidade ex: moléculas poliatómicas simétricas que possuem centro de inversão (benzeno) bandas activas no IV não são activas no Raman e vice-versa ex: moléculas com pouca ou nenhuma simetria activas tanto no IV como no Raman 68 16/09/2015 Raman 137 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular espectroscopia de Raman fornece detalhes sobre: composição química estrutura molecular interacções moleculares células e tecidos obtém-se informação sobre proteínas, lípidos, carboidratos e ácidos nucleicos Raman 138 Técnicas Analíticas Espectrometria 69 16/09/2015 139 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular fluorescência molecular moléculas absorvem energia e passam ao estado excitado quando relaxam de volta ao estado excitado podem emitir: calor luz fluorescência Conversão interna Co 140 Técnicas Analíticas Fluorescência Espectrometria Espectroscopia molecular conversão interna e fluorescência podem ocorrer simultaneamente percentagem de moléculas que fluorescem definida pelo rendimento quântico Q taxa de relaxação por fluorescência taxa de relaxação total 70 16/09/2015 Fluorescência 141 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular espectros de fluorescência tendem a apresentar-se como imagens reflectidas dos epectros de absorção energias menores parte da energia perdida de forma vibracional Fluorescência 142 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular excitação fluorescência produzida ao longo de uma gama de comprimentos de onda da luz incidente espectros de excitação corrigidos fluxo de fotões incidente mantido constante solução suficientemente diluída fracção da radiação absorvida é proporcional ao coeficiente de absorção do analito forma idêntica à do espectro de absorção 71 16/09/2015 Fluorescência Fluorescência 143 Técnicas Analíticas Espectrometria 144 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular técnica muito sensível e com baixos limites de detecção poucos compostos exibem fluorescência estruturas rígidas com modos de relaxação vibracional reduzidos compostos com anéis aromáticos fundidos são mais fluorescentes ligações duplas conjugadas também exibem fluorescência derivatização com grupos fluorescentes 72 16/09/2015 Fluorescência 145 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular fluorescência diminui com aumento da temperatura maior nº de colisões com o solvente resultam num aumento de relaxação vibracional aumento da viscosidade do solvente leva a um aumento da intensidade da fluorescência movimento mais lento das moléculas de solvente conduz a menores interacções entre elas Fluorescência 146 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular intensidade de fluorescência proporcional à concentração obtenção de curvas de calibração utilização dos valores mais convenientes de lmax de emissão e excitação 73 16/09/2015 Fluorescência 147 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia molecular auto-extinção a concentrações elevadas aumenta a probabilidade de que um fotão emitido venha a ser absorvido por outra molécula da amostra 148 Técnicas Analíticas Espectrometria Ressonância magnética nuclear (NMR) técnica que fornece informações sobre o ambiente de núcleos magneticamente activos núcleos absorvem radiação na zona das frequências de rádio medição das frequências às quais ocorre absorção e intensidade da mesma permite obtenção de dados sobre estrutura molecular frequência depende da ligação química, da conformação molecular e de processos dinâmicos núcleos mais estudados 1H e 13C 74 16/09/2015 149 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR todos os núcleos possuem um spin descreve a natureza do campo magnético do núcleo nº de spin (I) pode ser 0 ou qualquer múltiplo de ½ (½, 2/2, ×) núcleos com spin 0 não possuem campo magnético quanto mais alto I, mais complexo o campo magnético 12C e 16O têm I = 0 invisíveis em NMR usam-se aqueles que são “visíveis” I ʌ 0 1H, 13C (I = ½), 14N (I = 1), … I descreve forma do campo magnético, g descreve a sua intensidade g ≡ factor giromagnético 1H possui o campo magnético mais forte 150 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR spin do núcleo afectado por um campo magnético externo núcleo tenta alinhar-se segundo o campo aplicado alinhamentos são quantificados nº limitado de alinhamentos (depende de I) alinhamento (estados de spin ≡ Iz) varia de –I a +I em intervalos de 1 cada núcleo possui 2I+1 estados de spin 75 16/09/2015 151 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR estados de spin variam em energia consoante a sua orientação relativamente ao campo magnético externo mais paralelos têm menor energia mais opostos possuem maior energia 152 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR diferença de energia permite induzir transição entre diversos estados de spin irradiação de um dado núcleo induz um “salto” de um outro núcleo de menor energia para uma orientação de energia superior (absorção de energia) dão-se igualmente transições de mais alta para mais baixa energia (libertação de energia) se as populações em ambos níveis energéticos forem iguais, transições anulam-se e não há sinal observável sinal detectado pelo aparelho se populações diferentes 76 16/09/2015 153 Técnicas Analíticas Espectrometria 154 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR espectro de NMR alterando a frequência da radiação electromagnética aplicada obtém-se gráfico de absorção de energia vs. frequência 77 16/09/2015 155 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR espectro de NMR alternativamente pode variar-se a intensidade do campo magnético aplicado, mantendo a frequência constante obtém-se gráfico de absorção de energiavs. intensidade do campo magnético aplicado 156 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR espectro de NMR sistema homogéneo com um único tipo de núcleo um único pico no espectro compostos complexos núcleo influenciado pelo ambiente ambientes que aumentam separação energética entre estados de spin transições a frequências mais elevadas ambientes que provocam redução na separação transições a frequências mais baixas variações em frequência ≡ desvio químico 78 16/09/2015 157 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR blindagem e desblindagem e- possuem campo magnético (spin = ½) muito mais forte que o do núcleo polaridade oposta à do núcleo campo sentido pelo núcleo numa molécula é combinação do campo magnético externo aplicado e do gerado pela nuvem electrónica campo magnético externo oposto ao dos enúcleo “blindado” da força total do campo externo 158 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR blindagem e desblindagem blindagem afectada por factores que alteram a densidade electrónica à volta do núcleo diminuição da densidade - desblindagem aumento da densidade – maior blindagem blindagem provoca redução da intensidade do campo magnético separação de energia entre estados de spin diminui transição de spin pode ser induzida por menor frequência desblindagem produz o efeito inverso variação resulta em deslocamento químico (d) 79 16/09/2015 159 Técnicas Analíticas Espectrometria 160 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR deslocamento químico medido em relação a uma referência ex: TMS (0 ppm) 80 16/09/2015 161 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR blindagem e desblindagem e- mais próximos do núcleo são os que mais influenciam a blindagem e- que participam em ligações químicas electronegatividade afecta distribuição electrónica átomos electronegativos e grupos funcionais aceitadores de e- provocam desblindagem átomos electropositivos e grupos funcionais dadores de e- provocam blindagem 162 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR blindagem e desblindagem ex: C menos electronegativo que O em O-H, e- ligantes atraídos para O densidade electrónica à volta de H menor que em C-H menor blindagem 81 16/09/2015 163 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR blindagem e desblindagem corrente de anel em sistemas p uma carga em movimento (corrente) pode produzir um campo magnético átomos com hibridização sp2 possuem 1 orbital p disponível orbitais p em átomos adjacentes têm tendência para se alinhar produzindo um sistema p ex: benzeno (corrente de anel) corrente de anel oposta ao campo magnético externo 164 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR blindagem e desblindagem H do anel sofrem um reforço do campo magnético externo desblindados noutros sistemas p ocorre o mesmo orbitais p em átomos adjacentes têm tendência para se alinhar produzindo um sistema p 82 16/09/2015 165 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR blindagem e desblindagem em casos raros, H podem estar colocados acima ou abaixo do sistema p sofrem blindagem 166 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros intensidade do sinal depende do nº de núcleos envolvidos área de um pico é proporcional ao nº de núcleos que contribuem para o sinal ex: espectro de MeOH (CH3OH) 2 tipos de átomos de H 2 deslocamentos químicos (d) área 3:1 83 16/09/2015 167 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros relaxação de spin rápida áreas dos picos reflectem nº de núcleos relaxação lenta núcleos promovidos ao estado de spin de maior energia mais rapidamente do que podem sair deste excesso de população do nível de mais baixa energia será reduzido e as 2 populações tornam-se iguais saturação sinal de NMR diminui de intensidade sinal desaparece com saturação total 168 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar produzidos por campos magnéticos dos núcleos vizinhos campos fracos mas fazem-se sentir se o núcleo não estiver afastado mais de 3 ligações 84 16/09/2015 169 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar ex: moléculas com 2 H próximos (A e B) com desvios químicos diferentes HA tem estados de spin Iz = ½ e Iz = -½ na ausência de HB produz um único pico no NMR HB tem um pequeno campo magnético que pode estar alinhado ou oposto ao campo externo, com idêntica probabilidade se estiver alinhado HA fica desblindado se estiver em oposição HA fica blindado metade das moléculas possui ressonância a mais alta frequência metade a mais baixa 170 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar pico de HA desdobra-se em 2 (dobleto) por influência de HB e vice-versa* J (constante de acoplamento dipolar) frequência de separação ente os 2 picos varia entre 0 – 15 Hz *efeito usado para identificar que H estão acoplados um com outro 85 16/09/2015 171 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar valores de constantes de acoplamento Jtrans > Jcis 172 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar se o nº de H acoplados aumentar, desdobramento torna-se mais complexo ex: C2H6 para 3 H idênticos existem 8 combinações possíveis de spin blindagem ou desblindagem sentida por HA depende da soma dos campos magnéticos dos 3 HB maior blindagem ocorre quando 3 HB D – down estão opostos ao campo externo U - up (DDD) segue-se o caso em que 2 estão opostos intensidade destas duas 3 possíveis combinações (DDU, frequências é de 1:3 DUD, UDD) com a mesma probabilidade (1/18) 86 16/09/2015 173 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar no caso de apenas 1 HB estar em oposição (DUU, UUD, UDU) no caso de nenhum HB estar em oposição (UUU) intensidade dos 4 picos é de 1:3:3:1 174 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar se tivermos 3 H idênticos acoplados quarteto N núcleos idênticos acoplados originarão 2NI+1 picos intensidade das linhas prevista de acordo com o triângulo de Pascal 87 16/09/2015 175 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar no caso de acoplamento com um núcleo de spin mais elevado, situação é análoga ex: H acoplado com N (I = 1) tripleto de picos com igual intensidade representando as 3 possíveis orientações de spin do N (1, 0, -1) N acoplado a H (I = ½) dobleto 176 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar intensidades previstas com um método semelhante ao triângulo de Pascal para I = 1: 88 16/09/2015 177 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar acoplamento de 1ª ordem aplica-se quando desvios químicos dos núcleos acoplados estão suficientemente separados quando desvios se aproximam, interacções mais fracas começam a predominar efeitos de acoplamento de 2ª ordem: energias dos estados de spin sofrem desvios probabilidades das transições entre níveis variam posições e intensidades dos picos deixam de ser as previstas pela teoria de 1ª ordem 178 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar sistema com 2 núcleos acoplados de spin ½ pico de cada núcleo divide-se em 2 (dobleto) quando desvios químicos se tornam semelhantes, picos do dobleto mudam de intensidade pico de cada dobleto mais próximo dos picos do núcleo acoplado aumenta de intensidade (aumento da probabilidade da transição) o outro pico diminui de intensidade 89 16/09/2015 179 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros – acoplamento dipolar desdobramento não se verifica se protões estão separados por mais de 3 ligações s acoplamentos de longo alcance ocorrem quando protões estão separados por mais que 3 ligações s, mas com ligações duplas ou triplas 180 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR sinais de Hc, Hd e He sobrepostos sinais de Ha, Hb e Hc não se sobrepõem 90 16/09/2015 181 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR velocidade de relaxação processo exponencial descrito por T1 (tempo de relaxação) tempo necessário para que a energia em excesso desça para 1/e (0.36788) do seu valor original T1 para H em moléculas orgânicas ≤ 1 seg 182 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros exemplos de moléculas com protões quimicamente equivalentes 1 único sinal no espectro de 1H-NMR 91 16/09/2015 183 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros moléculas com protões não quimicamente equivalentes vários sinais no espectro de 1H-NMR 184 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros grupos aceitadores de e- provocam desvio de d para frequências mais altas ex: halogéneos 92 16/09/2015 185 Técnicas Analíticas Espectrometria 186 Técnicas Analíticas Espectrometria 93 16/09/2015 187 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros valores típicos de d 188 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros valores típicos de d 94 16/09/2015 189 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR interpretação de espectros variação com a temperatura ex: ciclohexano velocidade de conversão depende da temperatura 190 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR espectroscopia de 13C nº de sinais reflecte o nº de diferentes tipos de carbono intensidade do sinal muito menor que a de 1H (~ 6400 vezes) d acima de 220 ppm (com 1H até 10 ppm) 95 16/09/2015 191 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR espectroscopia de valores de d 13C 192 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR NMR a 2 dimensões espectro COSY 1H identifica acoplamentos picos cruzados indicam pares de H acoplados COrrelation SpectroscopY 96 16/09/2015 193 Técnicas Analíticas Espectrometria NMR NMR a 2 dimensões espectro HETCOR (HETeronuclear CORrelation spectroscopy) indica acoplamentos entre protões e carbonos, aos quais estão ligados 194 Técnicas Analíticas Espectrometria Ressonância paramagnética electrónica (EPR) técnica que detecta espécies com e- desemparelhados radicais livres, se forem moléculas orgânicas iões de metais de transição, no caso de complexos inorgânicos excitação dos spins electrónicos necessários campos magnéticos mais fracos e frequências mais altas que em NMR 97 16/09/2015 195 Técnicas Analíticas Espectrometria EPR e- possuem momento magnético colocados num campo magnético externo (B0) momento magnético alinha paralelo ou antiparalelo a B0 alinhamento paralelo define um estado de menor energia separação entre os 2 estados: ge – factor giromagnético do e- mB – magnetão Bohr (9.27x10-24 JT-1) ΔE=ge mBB0 para transitar entre os 2 níveis, um eabsorve radiação electromagnética ΔE=hn =ge mBB0 equação fundamental do EPR 196 Técnicas Analíticas Espectrometria EPR centro paramagnético colocado num campo magnético energia absorvida pelo e- detectada e convertida num espectro 98 16/09/2015 197 Técnicas Analíticas Espectrometria EPR e- livre tem um valor de g = 2.002319304386 (ge) radiação de 9.75 GHz (mais comum) provoca ressonância a 0.34 Tesla (T) sinais de EPR produzidos: medição de energia absorvida a diferentes frequências num campo magnético constante (como no NMR) variando o campo magnético externo a frequência constante (mais comum) 198 Técnicas Analíticas Espectrometria EPR na realidade, não existem centros paramagnéticos isolados, mas sim grandes grupos de centros população dos centros em equilíbrio termodinâmico distribuição estatística segue a distribuição de Boltzman nMJ+1 – nº de centros paramagnéticos a ocupar o nível MJ+1 k – constante de Boltzmann (1.38x10-23 JK-1) T – temperatura (K) nM J 1 nM e ( E ) kT J à frequência de 9.75 GHz (radiação da banda X) e à temperatura ambiente nM J 1 nM 0.998 J 99 16/09/2015 199 Técnicas Analíticas Espectrometria EPR g dá informação sobre a estrutura electrónica do centro paramagnético g ʌ ge razão do momento magnético do e- sobre o seu momento angular difere daquela de um e- livre como o momento magnético é constante (magnetão de Bohr), e- ganha ou perde momento angular resulta do acoplamento spin-órbita 200 Técnicas Analíticas Espectrometria EPR variação de g dá informação sobre a natureza do orbital atómico ou molecular que contém o ese o átomo ao qual o e- está associado tiver spin nuclear diferente de 0 o seu campo magnético vai também afectar o eacoplamento hiperfino, desdobrando o sinal em dobletos, tripletos, … 100 16/09/2015 201 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa produção de iões a partir de um composto e sua caracterização método qualitativo, podendo ser acoplado a outros 202 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa operação sob vácuo maior distância média percorrida pelos iões e moléculas antes de colidirem com outros iões ou moléculas fragmentação mais reprodutível maior sensibilidade maior rigor e fiabilidade na análise produzido por um sistema de 2 bombas uma rotativa (10-2 – 10-4 torr) bomba turbomolecular ou bomba de difusão (10-5 torr) 101 16/09/2015 203 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa existem diversos métodos de ionização: impacto de electrões (EI) ionização química (CI) fast atom bombardment (FAB) field ionization desorpção de plasma energia e fragmentação 204 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa impacto de electrões (EI) e- atinge uma molécula neutra liberta outro eforma ião molecular energia adicional causa fragmentação da molécula 102 16/09/2015 205 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa impacto de electrões (EI) e- com menos de 70 eV originam poucos iões e- com mais de 70 eV provocam fragmentação excessiva obtém-se pouca informação energia adicional causa fragmentação da molécula 206 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa impacto de electrões (EI) filamento e ânodo produzem erepelente “empurra” iões positivos produzidos para fora da fonte de ionização lentes aceleram iões até atingirem energia cinética constante 103 16/09/2015 207 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa analisadores de massa filtros que resolvem os fragmentos produzidos magnéticos electrostáticos time of flight (TOF) quadrupolo ion trap 208 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa analisadores de massa quadrupolos iões acelerados entram numa zona com 4 polos potencial dos polos varia iões com uma determinada massa alcançam o detector muito usados em GC/MS 104 16/09/2015 209 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa quadrupolos para um determinado conjunto de condições, apenas iões com uma massa (M/Z) específica são capazes de atravessar todo o filtro faz-se um varrimento numa gama de massas tipicamente 10 – 800 M/Z tempo de aquisição ≈ 1 seg 210 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa detecção habitualmente feita em multiplicadores de e material electroemissivo ao ser atingido por um ião, ejecta um ee- acelerados atingem parede do multiplicador, libertando mais esinal amplificado 105 16/09/2015 211 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa recolha e processamento de dados identificação do espectro de massa computadores com bibliotecas cada linha representa uma massa/carga específica habitualmente carga é 1 eixo dos x dá directamente a massa 212 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa espectros mostram: massa dos fragmentos padrão de fragmentação presença de isótopos isótopo mais abundante considerado ter um valor de 100 % restantes isótopos normalizados relativamente ao mais abundante intervalos entre as linhas intensidade proporcional à abundância 106 16/09/2015 213 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: analisar aspecto geral tentar encontrar o ião molecular determinar composição elementar identificar características estruturais analisar grau de fragmentação verificar a existência de aglomerados (clusters) presença de linhas com massas pares ou ímpares propor estruturas possíveis Ex: hidrocarbonetos saturados 214 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: espaçamento regular com 14 unidades de massa linha principal em cada cluster tem valor ímpar presença de ramificações linhas associadas a fragmentações de ambos os lados da ramificação aumento de ramificações aumento do nº de linhas 107 16/09/2015 Ex: hidrocarbonetos saturados 215 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: n-hexano ião molecular a 86 linha mais intensa a 57 típico dos hidrocarbonetos Ex: hidrocarbonetos insaturados 216 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: em alcenos fragmentos contendo ligação dupla são deslocados de -2 unidades num alcano os iões principais seriam 43, 57, 71, 85, … 108 16/09/2015 Ex: hidrocarbonetos insaturados 217 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: 1-hexeno ião molecular a 84 mais intenso que no n-hexano em cada cluster os iões CnH2n e CnH2n-1 têm maior intensidade Ex: hidrocarbonetos insaturados 218 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: 1-hexeno, 2-hexeno e 3-hexeno posição da ligação dupla não afecta fortemente o espectro 109 16/09/2015 Ex: compostos cíclicos 219 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: em cicloalcanos quebra de pelo menos 2 ligações para haver fragmentação aumento na intensidade do ião molecular Ex: compostos cíclicos 220 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: anéis insaturados aumento do grau de insaturação leva a um aumento de intensidade do ião molecular redução da fragmentação 110 16/09/2015 Ex: compostos aromáticos 221 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa interpretação de espectros de massa: ionização simples com formação de iões moleculares estáveis muito difícil determinar padrões de substituição nos anéis 222 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa “auxiliares” de interpretação dos espectros regra do e- ímpar usada para confirmar se uma linha pode ser devida a um ião molecular ionização provoca a perca de 1 e. espécie formada é um radical (M ↓ M+ ) se a espécie inicial tem um nº par de e-, o ião molecular terá um nº ímpar 111 16/09/2015 223 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa “auxiliares” de interpretação dos espectros regra do azoto no caso de existir um nº ímpar de N em compostos orgânicos existe uma relação entre a valência e a massa do isótopo mais comum da maioria dos elementos elementos pares têm valência par elementos ímpares têm valência ímpar regra assume que os elementos se limitam a C, H, halogénios, O e N composto contendo apenas C, H, O ou X tem peso molecular par composto com nº ímpar de N tem peso molecular ímpar e com nº par tem PM par 224 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa “auxiliares” de interpretação dos espectros percas lógicas as restantes linhas fazem sentido relativamente ao ião molecular? apenas um pequeno nº de fragmentos neutros de baixo PM é habitualmente perdido corte de uma única ligação simples percas de radicais 1 15 16 17 19 26 27 29 31 35 43 46 H CH3 NH2 OH F CN C2H3 C2H5 ou CHO OCH3 ou CH2OH Cl OC2H5 ou COOH NO2 quando pelo menos 2 ligações são quebradas percas neutras menos comum 2 17 18 20 27 28 30 34 36 44 74 80 H2 NH3 H2O HF HCN CO/C2H2 CH2O H2S HCl CO2 C3H6O2 HBr 112 16/09/2015 225 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa “auxiliares” de interpretação dos espectros percas lógicas (Exemplo) 86 parece ser o ião molecular 86 é nº par ou não há N ou nº par de N re-normaliza-se para calcular fórmula molecular m/z Abundância relativa 57 100.00 84 0.10 85 0.40 86 15.51 A+2 87 1.00 m/z Abundância relativa Abundância normalizada NF A 86 15.5 100 6.5 A+1 87 1.0 6.5 C5 C6 C7 72 6.6 86 – 72 = 14 ɸ C6H14 226 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa “auxiliares” de interpretação dos espectros percas lógicas (Exemplo) dados indicam ser o n-hexano 113 16/09/2015 227 Técnicas Analíticas Espectrometria Espectroscopia de massa “auxiliares” de interpretação dos espectros percas lógicas (2º exemplo) 84 indica presença de Cl2 49 indica Cl CH2Cl2 114
