tese final!!!!!!!

FABIANA DO AMARAL SERRANO
NOVOS COMPOSTOS DERIVADOS DE PALÁDIO E RUTÊNIO COM
ATIVIDADE ANTITUMORAL
Tese apresentada à Universidade Federal
de
São
Paulo
–
Escola
Paulista
de
Medicina, para obtenção do título de Doutor
em Ciências.
São Paulo
2010
FABIANA DO AMARAL SERRANO
NOVOS COMPOSTOS DERIVADOS DE PALÁDIO E RUTÊNIO COM
ATIVIDADE ANTITUMORAL
Orientadora: Profª. Dra. Elaine Guadelupe Rodrigues
Tese apresentada à Universidade Federal
de
São
Paulo
–
Escola
Paulista
de
Medicina, para obtenção do título de Doutor
em Ciências.
São Paulo
2010
Serrano, Fabiana do Amaral
Novos compostos de Paládio e Rutênio com atividade antitumoral/
Fabiana do Amaral Serrano – São Paulo, 2010.
165 folhas.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pósgraduação em Microbiologia, Imunologia e Parasitologia
Título em inglês:
compounds
Novel
1. Compostos de Paladio
palladium
and
ruthenium
antitumoral
2. Compostos de Rutênio
3. melanoma murino B16F10-Nex2
4. apoptose
5. metástase
MY WAY - Frank Sinatra
And now the end is near
And so I face the final curtain
My friend, I'll say it clear
I'll state my case of which I'm certain
I've lived a life that's full
I traveled each and every highway
And more, much more than this
I did it my way
Regrets, I've had a few
But then again, too few to mention
I did what I had to do
And saw it through without exemption
I've planned each charted course
Each careful step along the byway
And more, much more than this
I did it my way
Yes there were times, I'm sure you knew
When I bit off more than I could chew
But through it all when there was doubt
I ate it up and spit it out
I faced it all and I stood tall
And did it my way
I've loved, I've laughed and cried
I've had my fill, my share of losing
And now as tears subside
I find it all so amusing
To think I did all that
And may I say, not in a shy way
Oh no, oh no, not me
I did it my way
For what is a man, what has he got?
If not himself, than he has naugth
To say the things he truly feels
And not the words of one who kneels
The record shows, I took the blows
And did it my way
Aos meus pais Antonio e Lídia;
Ao meu marido André Luiz.
AGRADECIMENTOS
Agradeço minha orientadora, Dra. Elaine Guadelupe Rodrigues, por me
aceitar como aluna e pela oportunidade de desenvolver um trabalho
maravilhoso. Sou grata por todos os ensinamentos ao longo desta trajetória,
pela confiança depositada em mim, pela paciência, pelas conversas, pelos
chás, e pelas broncas merecidas.
Agradeço ao Profº Dr Luiz Rodolpho Travassos pela grande contribuição
durante o desenvolvimento deste trabalho. Pelas dicas, pelas conversas, por
ser o grande cientista que é.
Aos Professores e colaboradores que participaram deste trabalho:
- Profº Dr. Antonio Carlos Caíres, pela síntese do composto Ciclopaladado 7A;
- Profº Dr. Douglas Wagner Franco e a sua aluna, Renata Osti, pela síntese
dos compostos de Rutênio;
- Profª Dra. Soraya Smaili e sua aluna, Priscila Monteforte, pela colaboração
estabelecida para identificar o mecanismo de ação do ciclopaladado 7A;
agradeço pelas reuniões esclarecedoras e por tudo que foi aprendido através
desta parceria;
- Profª Dra. Leny Toma e sua aluna, Vivien Coulson-thomas, por auxiliar nos
experimentos (ainda que em andamento) com os compostos de rutênio
sulfatados;
- Aos meus amigos doutores da Unidade de Oncologia Experimental
(UNONEX) Dr. Alisson Matsuo, pelo auxílio nos experimentos finais com o
ciclopaladado 7A; Dra. Thaysa Paschoalin, pelos ensaios de angiogênese; Dra.
Denise Arruda, por ajudar a determinar o mecanismo de ação dos compostos
sulfatados.
Agradeço aos professores e alunos da Disciplina de Biologia Celular, por
disponibilizarem seus laboratórios e reagentes para a conclusão desta tese.
Agradeço aos profissionais técnicos da Discilpina de Biologia Celular:
Antonio Furlaneti (Tutis) e Luizão, pela disposição e ajuda durante os
experimentos.
Agradeço aos funcionários da sala de lavagem Maria e Américo. Sem
eles nada disso (de verdade!) seria possível!
Agradeço ao pessoal da Secretaria, que está sempre “quebrando nossos
galhos”, Marcelo e Márcia. Márcia, pelas risadas, pela amizade, por me ouvir,
obrigada!
Agradeço meus pais Lidia e Antonio, por todo amor, pela confiança e por
estarem sempre ao meu lado em todos os momentos da minha vida. Obrigada
por serem meus pais....tenho muito orgulho de vocês. Tenho certeza de que
vocês também estão orgulhosos de mim. Sem vocês, nada disso seria
verdade...obrigada! Amo vocês!
Ao meu marido André Luiz (conhecido popularmente como mor querido
e/ou morzão) por ter me ajudado com problemas tecnológicos durante o
desenvolvimento deste trabalho. Agradeço todos os dias pela sua carreira de
analista de sistemas, que possibilita eu queimar o notebook, sumir com os
dados do pen-drive, e mesmo assim você consegue recuperar todas as
informações! Obrigada por todo o apoio durante esta fase da minha vida, por
acreditar em mim, por achar que as coisas que eu faço são sempre “as mais
bonitas”, “as melhores”, por ter certeza de que tudo o que eu faço vai dar
certo........por ser meu amor!
Aos meus queridos amigos que pertencem, ou algum dia fizeram parte
da Unidade de Oncologia Experimental: Ana Beatriz, Andrey, Alisson, Bianca,
Carla, Cíntia, Denise, Ellen, Eliana, Flávia, Filipe, Felipe, Jorge, Juliana, Karina
Luana,
Luis,
Manoela,
Mariana,
Natasha,
Rafael
(Toddy),
Tiemi,
Thaysa.......espero não ter esquecido de ninguém. Gostaria de deixar explícito
que todos vocês contribuíram, de alguma forma, para meu crescimento
profissional e pessoal. Obrigada por me ouvirem, por estarem sempre
querendo o meu melhor. Foram muitas risadas e tensões, mas todos os
momentos passados juntos foram igualmente inesquecíveis. Pelos grandes
amigos que eu fiz, este trabalho valeu muito à pena.
Enfim.....a todas as pessoas que, de alguma forma, meu auxiliaram para
a realização deste trabalho maravilhoso. Aos amigos, professores e
colaboradores, muito obrigada!
ÍNDICE
RESUMO.........................................................................................................i
ABSTRACT...................................................................................................iii
1.0 INTRODUÇÃO...............................................................................................1
1.1 Origem do Melanoma..........................................................................1
1.2 O Melanoma........................................................................................2
1.3 Dados Epidemiológicos.......................................................................3
1.4 Quimioterapia Antitumoral...................................................................4
1.5 Compostos de Coordenação..............................................................8
1.5.1 Compostos de Platina......................................................................9
1.6 Exemplos de Compostos metálicos em Ensaios Pré-clínicos..........11
1.6.1 Complexos de Ferro.......................................................................11
1.6.2 Compostos de Ouro.......................................................................12
1.6.3 Compostos de Paládio...................................................................13
1.7 Exemplos de Compostos Metálicos em Ensaios Clínicos................16
1.7.1 Compostos de Gálio.......................................................................16
1.7.2 Compostos de Rutênio...................................................................17
1.8 Apoptose...........................................................................................23
1.8.1 Apoptose mediada pela Via Extrínseca.........................................25
1.8.2 Apoptose mediada pela Via Intrínseca..........................................26
1.8.3 Alterações celulares ausadas pelo estímulo apoptótico................28
2.0 OBJETIVOS.................................................................................................33
3.0 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................34
3.1 Quimioterápicos.................................................................................34
3.2 Linhagens de células tumorais e condições de cultivo......................36
3.3 Animais..............................................................................................37
3.4 Obtenção de macrófagos derivados de medula óssea.....................38
3.5 Dosagem protéica.............................................................................38
3.6 Ensaio de citotoxicidade celular in vitro.............................................39
3.7 Ensaio de inibição da citotoxicidade do complexo 7A in vitro com
DTT....................................................................................................39
3.8 Ensaio de citotoxicidade
in vitro em presença de inibidores de
proteases: Ca074-Me (catepsina B) ou E-64 (cisteíno-proteases)...40
3.9 Quantificação da acidificação extracelular........................................40
3.10 Microscopia ótica..........................................................................41
3.11 Microscopia de Transmissão Eletrônica.......................................41
3.12 Alterações no Potencial de membrana mitocondrial....................42
3.13 Translocação da Proteína Bax-GFP em células transfectadas....43
3.14 Determinação da concentração intracelular de cálcio..................43
3.15 Ativação de caspases...................................................................44
3.16 Avaliação
de
condensação
nuclear
por
microscopia
de
fluorescência.....................................................................................45
3.17 Ensaio de degradação de DNA....................................................46
3.18 Ensaio de TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick End
Labeling)............................................................................................47
3.19 Detecção da translocação da fostatidilserina (PS) para a
superfície celular...............................................................................48
3.20 Ensaio de Angiogênese................................................................49
3.21 Ensaio de hemólise......................................................................49
3.22 Ensaio
de
colonização
pulmonar
e
tratamento
com
os
quimioterápicos.................................................................................50
3.23 Desenvolvimento tumoral subcutâneo in vivo..............................50
3.24 Análise estatística.........................................................................51
4.0 RESULTADOS: CICLOPALADADO...........................................................52
4.1 Efeitos sobre células tumorais humanas in vitro...............................52
4.2 Efeito antimetastático do Ciclopaladado 7A......................................60
4.3 Alterações morfológicas provocadas pelo Composto 7A..................62
4.4 Interação do Ciclopaladado 7A com mitocôndrias............................64
4.5 Alterações mitocondriais observadas por microscopia de transmissão
eletrônica em células de melanoma murino tratadas com C7A........72
4.6 Participação do cálcio no processo de morte induzido pelo
Ciclopaladado 7A..............................................................................74
4.7 Ativação de caspases........................................................................76
4.8 Alterações nucleares e degradação de DNA induzidas pelo
Cciclopaladado 7A.............................................................................78
4.9 A morte celular causada pelo Ciclopaladado 7A em células tumorais
não é dependente de catepsinas......................................................81
4.10 Efeito do Ciclopaladado 7A no processo angiogênico.................84
5.0 RESULTADOS: COMPOSTOS DE RUTÊNIO............................................86
5.1 Compostos de Rutênio apresentam ação citotóxica in vitro..............86
5.2 Alterações morfológicas causadas por Compostos de Rutênio nas
células tumorais in vitro.....................................................................91
5.3 Degradação de DNA provocada por Compostos de Rutênio............93
5.4 Efeito do RuImNO na angiogênese...................................................95
5.5 Estabelecimento de protocolo terapêutico in vivo para avaliação do
efeito antitumoral dos Compostos de Rutênio...................................98
5.6 Determinação do mecanismo de ação do Composto RuImSO4.....108
6.0 DISCUSSÃO..............................................................................................118
6.1 Composto Ciclopaladado C7A: mecanismo de ação......................118
6.2 Compostos de Rutênio....................................................................130
7.0 CONCLUSÕES..........................................................................................138
8.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................141
9.0 ANEXOS....................................................................................................164
9.1 Comitê de Ética...............................................................................164
RESUMO
O melanoma é a forma mais agressiva de câncer de pele em virtude do
elevado grau de proliferação, invasão e metástase das células tumorais. Menos
de 10% dos pacientes com melanoma metastático sobrevivem por 5 anos.
Quimioterapias com um único composto são bem toleradas, mas associadas a
baixas taxas de resposta terapêutica. Associações de quimioterápicos já
aprovados para uso humano também foram relacionadas a baixas taxas de
resposta, sem redução da toxicidade. Logo, a identificação de novos agentes
antitumorais é crítica para o tratamento do melanoma, e este trabalho buscou
avaliar a atividade antitumoral de novos quimioterápicos derivados de paládio e
rutênio no modelo pré-clínico de melanoma murino B16F10-Nex2.
Um
composto
ciclopaladado,
[Pd2(S(-)C2,
N-dmpa)2
(µ-dppe)Cl2],
denominado C7A, avaliado anteriormente pelo nosso grupo, demonstrou
elevada atividade antitumoral e baixa toxicidade in vivo, porém, seu mecanismo
de ação ainda não estava determinado. Neste trabalho demonstramos que este
composto interage com grupos tiol presentes em proteínas da membrana
mitocondrial, induzindo uma abrupta redução na acidificação extracelular,
colapso do potencial de membrana mitocondrial e translocação da proteína Bax
para o interior dessa organela. Evidenciamos também um aumento nas
concentrações intracelulares de cálcio, proveniente de organelas celulares e do
meio extracelular. Estes efeitos iniciais causaram ativação de caspases
efetoras, condensação nuclear, degradação do DNA e dramáticas alterações
morfológicas nessas células. Esses dados sugerem que C7A provoca uma
morte celular por apoptose induzindo a via intrínseca em células de melanoma
i
murino B16F10-Nex2. Observou-se que células tumorais humanas são
sensíveis ao C7A, e o mecanismo de ação do composto nessas células parece
ser idêntico ao observado em células murinas. O ciclopaladado 7A reduziu
significativamente o número de nódulos pulmonares sem toxicidade aparente,
indicando sua eficiência também contra tumores metastáticos.
A atividade antitumoral de diversos compostos nitrosil-tetraamina-rutênio
(trans-[RuII(NH3)4(L)NO+], onde L corresponde a diferentes ligantes de
estabilização, e que são doadores de óxido nítrico (NO) em meios biológicos foi
avaliada. Todos os compostos testados foram citotóxicos in vitro para células
tumorais murinas e humanas. Alguns compostos foram selecionados e
avaliados in vivo, mostrando uma elevada toxicidade em paralelo a uma
atividade antitumoral. No entanto, observou-se que os compostos onde o NO
havia sido substituído por um radical sulfato, utilizados como controles dos
compostos doadores de NO, apresentaram elevada atividade antitumoral e
baixa toxicidade in vivo, retardando o desenvolvimento do tumor subcutâneo e
prolongando a sobrevida dos animais tratados. Os compostos sulfatados
também apresentaram baixa toxicidade ao reduzir o número de nódulos
metastáticos dos animais tratados. Esses compostos também foram citotóxicos
in vitro para células tumorais humanas, e as alterações morfológicas,
externalização de fosfatidilserina, condensação nuclear e degradação de DNA
observados sugerem que os compostos tetraamina rutênio sulfatados levam a
célula tumoral à morte por apoptose.
Ambos os quimioterápicos testados abrem novas possibilidades para o
tratamento do melanoma maligno.
ii
ABSTRACT
Melanoma is the most aggressive form of skin cancer mainly because of
the high degree of tumor cell proliferation, invasion and metastasis. Less than
10% of metastatic melanoma patients show 5 years survival. Single drug
chemotherapy is well tolerated but associated with low response rates.
Associations of chemotherapeutic agents approved for human use are related
to low response rates, without improvement on side effects. Therefore, the
identification of new antitumor agents is critical to melanoma treatment, and this
study aimed to evaluate the antitumor effect of novel palladium and rutheniun
derived chemotherapeutic drugs in the preclinical model of murine melanoma
B16F10-Nex2.
A cyclopalladated compound, [Pd2(S(-)C2, N-dmpa)2 (µ-dppe)Cl2], named
C7A was previously evaluated by our group. The complex showed high
antitumor and low toxicity in vivo, however, the targets for this compound in
tumor cells were not determined yet. In this work we demonstrated that C7A
interacts with thiol proteins present in the mitochondrial membrane, leading to
an abrupt reduction of extracellular acidification, collapse of mitochondrial
membrane potential and Bax translocation to the interior of this organelle. It was
also observed an increase in intracellular calcium concentrations, originated
from cellular organelles as well as from extracellular medium. These initial
effects caused activation of effector caspases, nuclear condensation, DNA
degradation and dramatic morphological changes in these cells. All these data
suggests that the cyclopalladated 7A induces the intrinsic pathway apoptotic
cell death on B16F10-Nex2 murine melanoma cells. Human tumor cells are
sensitive to this compound and mitochondria also seem to be the target for C7A
iii
on these cells. Cyclopalladated 7A significantly reduced the number of
pulmonary nodules with no apparent toxicity, indicating that this compound is
also active against metastatic melanoma lesions.
Antitumor activity of several nitrosyl tetraammine ruthenium compounds
with general formula (trans-[RuII(NH3)4(L)NO+], where L corresponds to different
stabilization ligands, were evaluated. These compounds are nitric oxide (NO)
donors in biological media. All tested compounds were cytotoxic in vitro to
human and murine tumor cells. Some compounds were selected and evaluated
in vivo, showing numerous side effects in association with the antitumor effect.
However, it was found that the compounds where the NO was replaced by a
sulfate group, used regularly as a negative control for NO-donor ruthenium
complexes, showed a pronounced antitumor activity and low toxicity in vivo,
delaying subcutaneous tumor development and extending survival of treated
animals. Sulfate compounds also reduced the number of metastatic lung
nodules with no apparent toxicity. These compounds were also cytotoxic for
human
tumor
cells
in
vitro,
and
the
morphological
alterations,
phosphatidylserine externalization, nuclear condensation and DNA degradation
observed after cell treatment suggested that sulfate tetraamine compounds
induced an apoptotic cell death.
Both evaluated chemotherapeutic drugs open new possibilities for
malignant
melanoma
iv
treatment.
1.0 INTRODUÇÃO
O presente trabalho concentra-se na avaliação de novos quimioterápicos
com atividade antitumoral no modelo de melanoma murino B16F10-Nex2 in
vivo e in vitro. Foi também analisado o modo de ação destes compostos que
futuramente poderão ser empregados como agentes antitumorais na clínica
médica.
1.1 Origem do Melanoma
O melanoma desenvolve-se a partir da transformação maligna dos
melanócitos. Os melanócitos são células produtoras de melanina, que residem
na camada basal da epiderme na pele humana. Os melanócitos cutâneos
originam-se da alta mobilidade dos progenitores presentes na crista neural, que
migram para a pele durante o desenvolvimento embrionário (Chudnovsky et al,
2005). É possível que a habilidade de rápida metastatização das células de
melanoma seja uma característica semelhante à propriedade de migração dos
melanócitos precursores, antes de alcançar os tecidos epiteliais (Balch et al,
1993).
A homeostase dos melanócitos é regulada por queratinócitos presentes
na epiderme. Em resposta à luz ultravioleta, estes queratinócitos secretam
fatores que regulam a sobrevivência, diferenciação, proliferação e motilidade
desses melanócitos, estimulando estas células a produzir melanina. Portanto
os melanócitos têm a função de proteger a pele contra os danos causados pela
luz ultravioleta (Gray-Schopfer et al, 2007). Existe uma série de fatores de
1
riscos para o desenvolvimento do melanoma. De acordo com a Organização
Mundial da Saúde, sensibilidade ao sol, pele clara e exposição excessiva são
fatores que predispõem ao desenvolvimento do melanoma. Dessa forma,
medidas preventivas para se evitar a doença devem ser tomadas, tais como,
evitar a exposição prolongada ao sol, principalmente em horários onde a
incidência de radiação ultravioleta (UVB) dos raios solares é maior, além do
uso de equipamentos de proteção, como óculos escuros, chapéu e filtro solar.
1.2 O Melanoma
O melanoma cutâneo pode ser subdividido em vários subtipos,
dependendo de sua localização anatômica e do seu padrão de crescimento.
Clark et al (1978) propuseram um modelo classicamente aceito para a
progressão de melanomas. Os melanócitos de lesões névicas, originados
direta ou indiretamente de melanócitos imaturos, poderiam se converter
progressivamente em melanócitos de nevos displásicos, melanomas de
crescimento radial (invasivo in situ), melanomas de crescimento vertical e
finalmente melanomas metastáticos. Alternativamente, como em todos os
modelos de progressão, melanócitos imaturos poderiam originar ab initio
qualquer uma das formas tumorais propriamente ditas. As lesões névicas são
caracterizadas por serem lesões proliferativas benignas com potencial de
malignidade. Uma vez estabelecido o melanoma primário profundo (fase de
crescimento vertical), subpopulações dessas células têm a capacidade para
causar metástases. Nos indivíduos, estas transformações celulares se
convertem em alguns sintomas característicos. A manifestação da doença na
2
pele normal se dá a partir do aparecimento de uma pinta escura com bordas
irregulares, acompanhada de coceira e descamação. Em casos de uma lesão
pigmentada pré-existente, ocorre um aumento no tamanho e alteração na
coloração e na forma da lesão que passa a ser assimétrica com bordas
irregulares (Instituto Nacional do Câncer - http://www.inca.gov.br).
1.3 Dados epidemiológicos
A incidência do melanoma está aumentando drasticamente na população
ocidental. Estima-se que 2 a 3 milhões de casos de câncer de pele sejam
diagnosticados no mundo a cada ano, e apesar do melanoma representar
aproximadamente 132.000 destes casos (cerca de 7%), esta é a forma mais
agressiva de câncer de pele, e pode levar o indivíduo à morte (Gray-Schopfer
et al, 2007). De acordo com o Instituto Nacional do Cancer (INCA), foram
relatados no Brasil cerca de 470.000 novos casos de neoplasias em 2008.
Destes, 6.000 eram casos de câncer do tipo melanoma, com taxas de
equivalência entre homens e mulheres (Instituto Nacional do Câncer http://www.inca.gov.br).
O prognóstico deste tipo de câncer pode ser considerado bom, se
detectado nos estágios iniciais da doença. Neste caso há a possibilidade de
cura através da intervenção cirúrgica. Cerca de 80% dos casos são tratados
dessa maneira. Nos últimos anos houve uma grande melhora na sobrevida dos
pacientes com melanoma, principalmente devido à detecção precoce do
mesmo. Nos países desenvolvidos a sobrevida média dos pacientes com
detecção precoce da lesão é de 73%, enquanto que em países em
3
desenvolvimento, a sobrevida média desses pacientes é de 56%. Entretanto,
se detectado apenas nos estágios avançados da doença, o melanoma maligno
metastático é altamente resistente às terapias disponíveis atualmente e possui
um prognóstico ruim, com uma média de sobrevida de apenas 6 meses, e de 5
anos para menos de 5% dos pacientes. Dessa forma, novas estratégias de
tratamento precisam ser urgentemente desenvolvidas (Gray-Schopfer et al,
2007).
1.4 Quimioterapia antitumoral
Atualmente, os maiores problemas associados ao tratamento do
melanoma, bem como da maioria dos cânceres, estão relacionados ao rápido
crescimento tumoral e ao desenvolvimento de metástases. Portanto, a
utilização de drogas que interfiram nestes dois processos é de fundamental
importância clínica (Dua et al, 2007). Diferentes abordagens vêm sendo
desenvolvidas para o tratamento do melanoma, incluindo quimioterapia e
bioquimioterapia, como terapia simples ou ainda em combinação.
A quimioterapia é considerada o tratamento padrão para o melanoma em
estágios mais avançados. Entretanto, o melanoma é considerado um tumor
resistente às quimioterapias. Os quimioterápicos poderiam teoricamente atingir
as células metastáticas, porém os tratamentos atuais não promovem benefício
terapêutico significativo (Soengas & Lowe, 2003). Vários quimioterápicos
podem ser utilizados no tratamento do melanoma (Tabela 1), e o único
quimioterápico aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration, USA) é a
Dacarbazina (DTIC). Este quimioterápico, utilizado como terapia simples
4
permite remissão completa em apenas 5 a 10% dos pacientes tratados
(Serrone et al, 2000). Termozolomide, um derivado da dacarbazina mostrou-se
um agente eficaz contra metástases cerebrais, mas não demonstrou aumento
significativo nos índices de sobrevida (Atkins, 2000). Ambos os agentes
promovem alquilação e metilação dos ácidos nucléicos, levando à inibição da
síntese de proteínas e de ácidos nucléicos (Soengas & Lowe, 2003). Outros
compostos que não foram eficazes em estudos randomizados incluem as
nitrosuréias (carmustina, lomunstina) que provocam quebra do DNA da célula
tumoral; taxanos (taxol, docetaxol) e alcalóides da vinca (vincristina,
vimblastina), que agem alterando a divisão celular, motilidade e transporte
intracelular por impedir os mecanismos de despolimerização das proteínas do
microtúbulo no citoesqueleto; e derivados de platina (cisplatina, carboplatina).
Além disso, o melanoma é notavelmente resistente ao tratamento com outros
quimioterápicos considerados padrão, como, por exemplo, doxorubicina (que
age provocando quebra e inibição de síntese do DNA e ainda impede
replicação do DNA) e etoposide (que atua inibindo a enzima topoisomerase II).
Como existem quimioterápicos que, quando usados como terapia
simples, possuem alguma atividade contra o melanoma, existe a possibilidade
de se combinar dois ou mais quimioterápicos para se alcançar uma resposta
antitumoral mais expressiva. No entanto, mesmo a combinação de dois ou
mais quimioterápicos não promoveu um aumento significativo da sobrevida.
Estudos recentes sugerem que a associação de sorafenib (um inibidor de
tirosina quinase com atividade no receptor de VEGF e BRAF) e dacarbazina,
droga padrão utilizada no tratamento do melanoma, pode dobrar as taxas de
resposta, no entanto não aumenta a sobrevida dos pacientes. Tem sido
5
sugerido que essas duas drogas possam ainda ser combinadas com novas e
efetivas drogas quimioterápicas, desenvolvendo um protocolo terapêutico que
leve a um aumento real na sobrevida total dos pacientes tratados.
Combinações de quimioterápicos têm sido utilizadas com sucesso no aumento
da sobrevida de outros tumores sólidos como, por exemplo, no carcinoma de
cólon, que atualmente utiliza a associação de fluorouracil (5FU) e leucovorin
(Yang & Chapman, 2009).
As
células
tumorais
podem
responder
aos
tratamentos
com
quimioterápicos de diversas formas. Kerr et al (1972) foram os primeiros a
descrever alterações morfológicas, como formações de blebbing na membrana,
condensação de cromatina e fragmentação nuclear, após tratamento com
compostos que levam as células tumorais à morte. Estas características foram
posteriormente descritas como indicativas de uma morte celular por apoptose.
Atualmente, está bastante claro que apoptose é um, e não o único, dos eventos
que contribuem para o efeito dos quimioterápicos convencionais (Johnstone et
al, 2002). Proteínas que controlam o processo apoptótico mostram-se alvos
promissores para diversos tipos de tumores, incluindo o melanoma (Reed,
2001a).
Sabe-se que o melanoma é extremamente resistente a agentes
quimioterápicos, e os mecanismos de resistência variam de acordo com o
quimioterápico avaliado (Zigler et al, 2008). Os mecanismos de escape e
resistência à quimioterápicos podem ser devidos à desregulação na via de
apoptose das células tumorais, dano nas proteínas que controlam o ciclo
celular e no reparo do DNA (La Porta, 2007). Soengas e Lowe (2003) postulam
que uma explicação simples para as células de melanoma serem tão eficientes
6
no controle das vias de apoptose e sobrevivência celular não se dá apenas
pela ação da própria célula tumoral, mas também por mecanismos oriundos
das células vizinhas presentes no estroma e no microambiente tumoral. A
produção de produtos inesperados e eventos autócrinos e/ou parácrinos
contribuem bastante para os eventos de resistência aos quimioterápicos.
Tabela 1: Quimioterápicos utilizados no tratamento do melanoma. (Yang &
Chapman, 2009; Soengas & Lowe, 2003)
Nitrosuréias
Carmustina
Lomustina
Semustina
Alquilação de ácidos nucléicos e proteínas
Quebra do DNA
Triazenos
Dacarbazina
Temozolomida
Alquilação e metilação de ácido nucléicos
Inibição da síntese de ácidos nucléicos e
proteínas
Antibi óticos
Doxorubicina
Quebra do DNA
Inibição da replicação do DNA e RNA
Alcalóides da Vinca
Alterações na divisão celular e motilidade
Alterações no transporte intracelular
Vincristina
Vimblastina
Taxanos
Taxol
Paclitaxel
Docetaxol
Alterações na divisão celular e motilidade
Alterações no transporte intracelular
Drogas de Platina
Mudanças na estrutura do DNA
Inibição na síntese de DNA e RNA
Cisplatina
Carboplatina
7
1.5 Compostos de coordenação
Para um futuro imediato, a combinação de modalidades terapêuticas,
como cirurgia, radioterapia e quimioterapia é a melhor escolha para o
tratamento das neoplasias. Entretanto, para que avanços terapêuticos sejam
alcançados é necessária a descoberta de quimioterápicos mais efetivos. A
maioria dos novos compostos estudados é de origem inorgânica ou produtos
naturais, incluindo antibióticos, agentes alquilantes, alcalóides, enzimas e
hormônios. A alta reatividade dos compostos metálicos é a razão pela qual
estes compostos tem sido frequentemente usados como agentes diagnósticos
ou terapêuticos (Bonati et al, 2006; Clarke, 2003, Galanski et al, 2003). O
sucesso limitado da pesquisa com agentes antitumorais derivados de metais
pode ter sido causado pela falta de diversidade estrutural dos compostos
avaliados em ensaios clínicos, que na sua maioria são derivados do
quimioterápico Cisplatina, o primeiro agente quimioterápico a ser descrito
(Matesanz & Souza, 2007).
A aplicação de quimioterápicos contendo átomos de metais no
tratamento do câncer teve seu início em 1969, quando Rosenberg,
acidentalmente, descobriu que a eletrólise de um eletrodo de platina gerou
vários compostos que inibiram a fissão binária da bactéria Escherichia coli, que
cresceu cerca de 300 vezes seu tamanho normal sem divisões celulares. Ao
testar esses compostos em um modelo de sarcoma inoculado em ratos,
observou que o composto mais ativo foi a cis-platina (cis-Pt(NH3)2Cl2)
(Rosenberg et al, 1969). Esta descoberta abriu perspectivas para uma nova
classe de agentes antitumorais denominados de complexos inorgânicos de
coordenação.
8
1.5.1 Compostos de Platina
A Cisplatina [Pt(NH3)2Cl2] é um dos agentes antitumorais mais utilizados
no mundo. É um agente efetivo no tratamento de vários tipos de câncer,
especialmente no tratamento de tumores testiculares, como uma taxa de cura
de 90% (Zhang & Lippard, 2003). No tratamento do melanoma, a Cisplatina
como agente único tem atividade que varia de 10 a 20% (Chapman & Yang,
2009). A Cisplatina entra na célula por difusão passiva (Ziegler et al, 1999) e
também através de transporte ativo mediado por receptor (Ishida et al, 2002). A
citotoxicidade da Cisplatina inicia-se pela ligação da droga ao DNA e formação
de adutos de platina. A interação da Cisplatina com o DNA causa uma
distorção significativa da sua estrutura helicoidal, resultando em inibição da
replicação, transcrição e reparo desse DNA (Ziegler et al, 1999). A Cisplatina
induz a apoptose por aumentar a atividade da caspase-8, aumentar a
expressão de p53, quebra de Bid para sua forma truncada, ativação e
translocação mitocondrial de Bax, indução de permeabilidade da mitocôndria,
liberação de citocromo C no citosol, ativação da caspase-9 e consequente
entrada na fase de execução da apoptose. Está também envolvida na
degradação proteolítica da procaspase-3 e ativação da caspase-3, redução de
Bcl-2 e aumento de Bcl-xL, todos esses fatores levando a célula a um processo
de morte por apoptose (Henkels et al, 1999). Curiosamente, a ativação das
duas vias de apoptose, extrínseca e intrínseca, são também responsáveis
pelos efeitos tóxicos do quimioterápico (Florea et al, 2009). Há evidências que
a ligação da cisplatina com alvos diferentes do DNA pode contribuir com o
mecanismo de ação do composto (Fuertesa et al, 2003; Cepeda et al, 2007).
9
O sucesso clínico da Cisplatina é limitado pela grande quantidade de
efeitos colaterais e pela rápida indução de células tumorais resistentes ao
quimioterápico. Para contornar esses problemas, novos compostos derivados
de platina foram desenvolvidos para que apresentassem uma melhora no
desempenho farmacológico e um grande espectro de atividade antitumoral.
Vários compostos de platina foram aprovados para uso na terapêutica
antitumoral, como por exemplo, carboplatina, oxaliplatina, nedaplatina e
lobaplatina, todavia, estes novos complexos não demonstraram vantagens com
relação à Cisplatina, principalmente com relação aos efeitos de toxicidade
gastrointestinal e hematológicos induzidos (Zhang & Lippard, 2003).
A
resistência das células à Cisplatina e seus análogos está associada a um
aumento na atividade do sistema de reparo do DNA e também com a captura e
inativação do composto por componentes macromoleculares do sangue e/ou
tiol-proteínas que atuam como redutoras, podendo modular a sensibilidade das
células ao quimioterápico (Timerbaev et al, 2006). Mais importante, somente
um número limitado de tumores podem ser tratados com quimioterápicos
contendo platina (Galanski et al, 2005).
Estas desvantagens, sem soluções aparentes, com relação aos
complexos de platina estimulam a pesquisa de novos compostos coordenados
com outros íons metálicos, diferentes da platina. Embora poucos compostos
com metais diferentes da platina tenham sido aprovados para uso como
agentes quimioterápicos antitumorais, existe um considerável progresso no
desenvolvimento destes agentes (Ott & Gust, 2007). Até o momento, apenas o
composto trióxido de arsênico (ATO) foi aprovado para o uso na clínica. Este
composto,
relativamente antigo proveniente da medicina chinesa, foi
10
redescoberto e demonstra uma completa remissão em pacientes com leucemia
promielocítica aguda (Soignet et al, 1998). O uso deste composto foi aprovado
pelo FDA (Food and Drug Administratrion, USA) em 2000, para o tratamento da
leucemia, mieloma e para pacientes com alto risco de desenvolver
neuroblastoma (Bahlis et al, 2002; Munshi et al, 2001). Este composto, em
baixas concentrações, causa inativação da proteína de fusão oncogênica PMLRARα, enquanto que em altas concentrações induz as células ao processo
apoptótico, causando quebra no DNA e estresse oxidativo (Dilda & Hogg,
2007).
Complexos de titânio, gálio e rutênio estão sendo preparados e testados,
sendo que alguns deles já estão em ensaios clínicos de fase II e III (Alama et
al, 2009). Em fase pré-clínica estão complexos de ferro, cobalto, ouro e
paládio, que demonstram uma promissora atividade antitumoral, mas também
complexos de outros metais estão em avaliação, como bismuto, antimônio,
estanho, vanádio, rádio e cério (Ott & Gust, 2007).
1.6 Exemplos de compostos metálicos em ensaios pré-clínicos:
1.6.1 Complexos de Ferro
Os primeiros complexos de ferro que mostraram alguma atividade
antitumoral foram os sais de ferroceno, picrato e tricloroacetato, com o íon ferro
em estado de oxidação +III (Köpf-Maier et al, 1984). Estes compostos
apresentaram atividade antiproliferativa in vitro, e in vivo no modelo utilizando
animais desenvolvendo tumor de Ehrlich, observando-se uma redução de 48%
no tamanho dos tumores subcutâneos dos animais tratados com o composto
11
(Köpf-Maier, 1985) A atividade citotóxica destes compostos não é baseada na
ligação direta com o DNA, e sim à capacidade de formar espécies reativas de
oxigênio, que acarreta em dano ao DNA (Ott & Gust, 2007).
Mais recentemente, outros compostos contendo ferro foram sintetizados
e testados, mostrando efeito apoptótico ou antiproliferativo in vitro, como por
exemplo, um derivado ferroceno do tamoxifeno (Ott & Gust, 2007).
1.6.2 Compostos de Ouro
Compostos contendo átomos de ouro são bastante conhecidos devido a
sua aplicação clínica no tratamento da artrite reumatóide, sendo também
agentes antitumorais. Complexos de ouro mostram um enorme espectro de
atividade antitumoral in vitro, especialmente em linhagens tumorais resistentes
à cisplatina. Estudos demonstram que, ao contrário da cisplatina, o DNA não é
o primeiro alvo destes compostos. A sua citotoxicidade é mediada pela
capacidade de alterar as funções mitocondriais e inibir a síntese de proteínas
(McKeage, 2002). Pillarsetty e colaboradores (2003) relataram a atividade de
um complexo de ouro (I), sobre células de carcinoma de cólon humano. Neste
caso houve um prolongamento na fase G1 do ciclo celular. Complexos de ouro
(III) são candidatos promissores como agentes antitumorais. Ensaios de
citotoxicidade in vitro demonstram intensa atividade antiproliferativa em
linhagens celulares humanas de gliobastoma (Ott & Gust, 2007).
12
1.6.3 Compostos de Paládio
Antes dos estudos desenvolvidos por Khan et al (1991), os compostos
de paládio possuíam pouca ou nenhuma aplicação como agentes antitumorais,
devido a sua extrema instabilidade em fluidos biológicos. Entretanto,
complexos ciclopaladados são mais estáveis, além de menos tóxicos,
sugerindo que podem ter uma atividade antitumoral mais específica in vivo
(Navarro-Ranninger et al, 1993). A atividade citotóxica de diversos compostos
ciclopaladados foi testada in vitro contra várias linhagens tumorais humanas, e
os resultados mostraram que a maioria desses complexos são mais eficientes
que a cisplatina, carboplatina e oxaliplatina, levando as células a um processo
de morte por apoptose (Caires, 2007)
Em colaboração com o Prof. Antonio Carlos Favero Caires, da
Universidade de Mogi das Cruzes, foram sintetizados diversos compostos
ciclopaladados. Esses complexos ciclopaladados foram obtidos a partir dos
agentes de ciclometalação N, N-dimethyl-1-phenethylamine (dmpa), phenyl-2pyridinyl-acetylene
e
1-phenyl-3-N,N-dimethylamine-propine,
que
foram
complexados ao ligante bifosfínico dppe [1, 2 ethanebis (diphenylphosphine)]
(Rodrigues et al, 2003).
Os compostos foram testados in vitro e in vivo no modelo de melanoma
murino B16F10-Nex2, com o objetivo de avaliar uma possível atividade
antitumoral. A sublinhagem de melanoma murino B16F10-Nex2 é pouco
imunogênica e possui a capacidade de desenvolver-se in vivo tanto como um
tumor subcutâneo ou ainda como nódulos metastáticos pulmonares, quando
administrado intravenosamente.
13
De acordo com o esperado, os compostos ciclopaladados sintetizados
foram mais estáveis em ambientes biológicos, permitindo a utilização de doses
baixas, reduzindo a toxicidade. Três dos compostos sintetizados apresentaram
atividade citotóxica in vitro com baixas doses, menores que 1,25 µM.
Entretanto, uma resposta efetiva contra o tumor in vivo depende de
vários parâmetros, incluindo metabolismo e clearance da droga, concentração
plasmática e acesso às células tumorais. Características estruturais dos
compostos podem afetar drasticamente as suas propriedades antitumorais.
Quando testados in vivo, apenas o complexo [Pd2(C2,N-S(-)(dmpa)2(µ-dppe)Cl2]
(Figura
1),
denominado
7A,
(mas
não
o
seu
estereoisômero
[Pd2(C2,N-R(-)(dmpa)2(µ-dppe)Cl2]), provocou um retardo no desenvolvimento
do tumor, aumentando significativamente a sobrevida dos animais tratados
(Rodrigues et al, 2003).
O complexo 7A causou degradação de DNA, mas não aumentou os
níveis das caspases 1 e 3, sugerindo a indução de um processo apoptótico
caspase-independente in vitro. Principalmente, o complexo demonstrou efeito
no metabolismo respiratório da célula, causando um colapso no gradiente de
prótons mitocondrial, como demonstrado por uma abrupta e total redução na
acidificação extracelular em tempo curto de incubação, cerca de 100 minutos
(Rodrigues et al, 2003). Mais importante, não foi observada toxicidade em
camundongos inoculados com doses crescentes do complexo, chegando a
240ng/kg, dose 6 vezes maior que a dose terapêutica utilizada (40ng/kg).
Esses resultados introduziram os complexos ciclopaladados-dppe como
promissores
quimioterápicos
antitumorais,
estrutural para sua ação in vivo.
14
com
elevada
especificidade
Outro
complexo
ciclopaladado,
derivado
do
N,N-dimethyl-1-
phenethylamine e o ligante de coordenação 1,1’-bis(diphenylphosphine)
ferrocene, apresentou atividade antitumoral in vitro contra células leucêmicas
humanas. O complexo [Pd2(C2,N-S(-)(dmpa)(dppf)Cl2] mostrou-se um potente
inibidor reversível da atividade da Catepsina B (Bincoletto et al, 2005), (Figura
1). Ratos inoculados subcutaneamente com tumor de Walker e tratados com
uma dose do composto tiveram 90% do crescimento tumoral inibido. Por outro
lado, esse complexo ciclopaladado não protegeu ratos desenvolvendo ascites
após inoculação do tumor de Erlich, embora tenha apresentado baixa
toxicidade (Bincoletto et al, 2005). O complexo ciclopaladado-dppf induziu
apoptose em linhagem celular de leucemia humana (HL60) por uma via nãoclássica (Bincoletto et al 2005), e quando foi testado em células de leucemia
K562, foi sugerido uma via de apoptose dependente da permeabilização da
membrana de lisossomos, sendo essa organela o alvo inicial da droga e a
catepsina B liberada no citoplasma atuaria como mediador do processo de
morte celular (Barbosa et al, 2006). Esses resultados introduziram o complexo
ciclopaladado-dppf como um novo agente antitumoral.
Curiosamente, esse ciclopaladado não apresentou efeito in vivo contra o
melanoma murino B16F10-Nex2, embora tenha apresentado efeito citotóxico in
vitro contra essa linhagem tumoral.
15
A
B
[Pd2(C2,N-S(-)(dmpa)2(µ-dppf)Cl2]
[Pd2(C2,N-S(-)(dmpa)2(µ-dppe)Cl2]
Figura 1: Representação esquemática dos compostos ciclopaladados. (A)
Ciclopaladado 7A, com atividade antitumoral in vitro e in vivo contra o
melanoma murino B16F10-Nex2. (B) BCP, com atividade in vitro contra células
leucêmicas humanas e inibitória sobre Catepsina B.
1.7 Exemplos de composto metálicos em ensaios clínicos:
1.7.1 Compostos de Gálio
Toxicidade e atividade antitumoral dos sais de gálio foram descritas no
início da década de 70 (Hart & Adamson, 1971), e desde então, várias outras
propriedades biológicas vêm sendo relatadas. O mecanismo de ação do gálio
está relacionado à inibição da enzima ribonucleotídeo redutase, que catalisa a
conversão
entre
ribonucleotídeos
e
desoxirribonucleotídeos
(Louie
&
Meade,1999). Assim como o Fe(II), o gálio também é transportado pela
transferrina e é encontrado principalmente nos lisossomos das células. Dessa
forma, a toxicidade do gálio eleva-se bastante devido ao aumento do transporte
através da transferrina (Collery et al, 2002). Além de ser bastante eficiente nas
16
fases de crescimento exponencial dos tumores, estes compostos também
apresentam atividade nas fases estacionárias do crescimento tumoral e este
efeito depende exclusivamente do tempo de exposição das células tumorais
aos quimioterápicos (Collery et al, 2002; Rasey et al, 1982).
Ensaios clínicos de fases I e II estão sendo realizados utilizando nitrato e
maltolato de gálio. Nitrato de gálio, quando administrado intravenosamente,
não foi efetivo no tratamento de diversos tipos de câncer, entre eles melanoma
e câncer de mama. Mas em estudo de fase II para o tratamento de carcinoma
urotelial metastático utilizando uma combinação de nitrato de gálio, vimblastina
e ifosfamida, observou-se uma resposta antitumoral em 67% dos pacientes.
Entretanto, efeitos colaterais bastante acentuados foram relatados e os
pacientes ficaram protegidos em média por apenas vinte semanas (Einhorn et
al, 1994).
O complexo gálio 8-quinolinolato (KP46), em estudo de fase I,
demonstrou atividade antitumoral em carcinoma de células renais; uma
resposta parcial foi observada em um paciente, enquanto que dois pacientes
mantiveram a doença estabilizada por 11 meses (Hofheinz et al, 2005).
1.7.2 Compostos de Rutênio
Alternativamente aos compostos de platina e paládio, uma nova classe
de quimioterápicos, complexos de rutênio, vem sendo testada com sucesso,
contra diferentes tipos de tumores desde a década de 1970 (Ott & Gust, 2007).
Estes compostos apresentem menor citotoxicidade comparados à cisplatina,
são bem tolerados in vivo e podem ser uma alternativa na quimioterapia do
17
câncer, substituindo ou em associação aos tradicionais compostos de platina
(Kostova, 2006).
Complexos de Ru (III) mantém o estado de oxidação do metal até
alcançar o tumor, onde a baixa concentração de oxigênio permite a ativação
pela redução para Ru (II). Estudos demonstram que a atividade antitumoral
destes compostos depende exclusivamente deste processo de redução
(Clarke, 2003), que in vivo pode ser induzido por glutationa ou outros agentes
redutores presentes nos tecidos (Ott & Gust, 2007). A atividade antitumoral dos
complexos de rutênio envolve interação com o DNA, mas outros mecanismos
adicionais também são possíveis. A forte capacidade de ligação com a
albumina e transferrina influencia muito a biodistribuição destes compostos.
Uma importante característica destes compostos é a capacidade de inibir o
processo
angiogênico
e
metaloproteases
presentes
na
matriz,
consequentemente interferindo na formação de metástases in vivo (Alama et al,
2009).
Entre os diversos complexos de rutênio (III) que estão sendo testados
em ensaios clínicos, os mais promissores são os compostos KP1019 (trans[tetrachlorobis(1H-indazole)ruthenate(III)] e NAMI-A, abreviatura do nome New
Anti-tumour Metastasis Inhibitor –A, [(ImH)trans-Ru(Im)(Me2SO)Cl4).
KP1019 apresenta efeitos inibitórios na proliferação celular in vitro e,
quando é internalizado nas células, induz apoptose predominantemente por
ativação do processo apoptótico através da via intrínseca mitocondrial,
causando estresse oxidativo e dano ao DNA. A captação do KP1019 pelas
células é mediada por mecanismos dependentes ou independentes da
18
transferrina (Piccioli et al, 2004). Após incubação das células com este agente,
55% do rutênio intracelular é encontrado na região do núcleo da célula. Este
valor é significativamente elevado, se compararmos com a cisplatina, um outro
composto de metal, onde apenas 10% do metal intracelular é encontrado no
núcleo das células (Heffeter et al, 2004). Resultados promissores em ensaios
clínicos de fase I são demonstrados utilizando este composto. Cinco de seis
pacientes
com
tumores
sólidos,
submetidos
a
este
quimioterápico
permaneceram com a doença estabilizada. Apenas alguns efeitos colaterais
foram observados (Clarke, 2003).
O complexo de rutênio NAMI-A pertence a uma classe de compostos de
rutênio sintetizados com o objetivo de, seletivamente, atingir a massa de um
tumor sólido e somente ser ativado no microambiente tumoral, reduzindo a
toxicidade para os tecidos normais. Quando foi testado sobre linhagens
tumorais in vitro, mostrou-se pouco efetivo. Apesar desta baixa atividade in
vitro, NAMI-A apresenta atividade antitumoral bastante significativa in vivo
(Pluim et al, 2004). Em estudo clínico de fase I, observou-se que a infusão de
NAMI-A (300mg/dia; cinco dias durante três semanas) mostrou-se segura para
24 pacientes com câncer de pequenas células progressivo de pulmão, sendo
que um paciente permaneceu estável por 21 semanas (Rademaker-Lakhai et
al, 2004). Este efeito antitumoral é atribuído a propriedades anti-metastáticas
deste agente, que in vivo, demonstra efeito antiangiogênico pela inibição do
fator de crescimento para células endoteliais (VEGF), que pode ser resultado
da inativação do óxido nítrico (Vacca et al, 2002).
Em colaboração com o Dr Douglas Wagner Franco, da Universidade de
São Paulo – Campus São Carlos, foram testados in vitro e in vivo vários
19
compostos nitrosil-tetraamina rutênio, sendo que a particularidade destes
compostos é a capacidade de serem doadores de óxido nítrico. Compostos
capazes de liberar óxido nítrico podem ter uma grande aplicação e serem úteis
no estudo da ação fisiológica do óxido nítrico em diversos sistemas (Oliveira et
al, 2007).
A descoberta de diversas funções biológicas para o óxido nítrico (NO)
tem estimulado e facilitado o desenvolvimento de alvos farmacêuticos.
Processos biológicos mediados pelo óxido nítrico incluem neurotransmissão,
regulação da pressão sanguínea e respostas imnunológicas. Além disso, o
óxido nítrico é um excelente ligante para íons metálicos. Como conseqüência,
complexos de metais nitrosilados demonstram grande valor terapêutico (Zang
& Lippard, 2003).
O óxido nítrico pode ter ações dicotômicas durante o desenvolvimento
de diferentes tumores. Em alguns modelos o óxido nítrico tem efeito
antineoplásico (inibindo metástases, e levando as células tumorais ao processo
de apoptose) ou pode ter efeito pró-neoplásico (causando progressão, invasão
e angiogênese). Acredita-se que os efeitos biológicos mostrados pelos
doadores de NO dependem da meia-vida da droga utilizada e do tipo celular
exposto ao composto (Huerta et al, 2008).
A diversidade de efeitos biológicos do óxido nítrico tem estimulado
estudos para compreensão de sua interação com complexos de metais de
transição para a síntese compostos que funcionariam como liberadores de NO,
e uma melhor compreensão nos mecanismos associados com a formação e
20
dissociação dos complexos nitrosil levará à síntese de compostos mais efetivos
em condições biológicas (Zanichelli et al, 2007).
A fórmula geral dos compostos nitrosil-tetraamina rutênio testados é
[RuII(NO+)(NH3)4L]3+ (Figura 2), onde L corresponde a diferentes ligantes, que
determinam a velocidade de liberação do NO em meio aquoso (Toledo et al,
2005). Esses compostos apresentam baixa toxicidade, alta solubilidade e
estabilidade em água/meios aquosos na presença de oxigênio, e são ativados
para a liberação do NO por agentes redutores presentes em meios biológicos
(Zanichelli et al, 2006). Dois dos complexos de rutênio doadores de NO, trans[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3
e
trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3,
apresentaram
efeitos anti-proliferativos e tripanocidas contra o parasita Trypanosoma cruzi,
protegendo 80% dos animais tratados, e esses efeitos foram dependentes do
NO liberado (Silva et al, 2007). Os compostos eliminaram também formas
amastigotas do parasita de ninhos formados no miocárdio, e observou-se que a
diferença entre a dose efetiva 50% (ED50) e a dose letal 50% (LD50), calculadas
para camundongos Balb/c para ambos os complexos, foi bastante elevada
(Silva et al, 2009).
21
A
NO
L
B
N
N
N
HO
N
O
N
N
CH3
Imidazol (imN)
Pyridina (Py)
4-Picolina (4-Pic)
H2N
O
Isonicotinamida (isN)
NH2
Nicotinamida (Nic)
O
N
N
NH2
L-histidina (L-his)
Figura 2: Representação esquemática dos compostos de Rutênio. A. Fórmula
geral do composto doador de óxido nítrico [RuII(NO+)(NH3)4L]3+; B. Estrutura
dos
ligantes.
22
1.8 Apoptose
Nos últimos anos tem ficado claro que existem várias modalidades de
morte celular, tais como apoptose, entosis, catásfrofe mitótica, necrose,
necroapoptose e piroapoptose. De acordo com um Comitê específico formado
para estudos em morte celular, o Nomenclature Comitee on Cell Death (NCCD,
Kroemer et al 2009), regras foram estabelecidas para a correta denominação
da morte celular, e vários fatores devem ser analisados para a correta
classificação da mesma.
O processo de apoptose é largamente caracterizado por uma resposta
antiproliferativa aos agentes quimioterápicos e, portanto é o modelo prevalente
para se explicar o sucesso da maioria das terapias antitumorais (Portugal et al,
2009).
Apoptose é o processo de morte celular programada mais bem definido.
Este mecanismo de “suicídio celular” programado é essencial para o
desenvolvimento embrionário, funções do sistema imune e manutenção da
homeostase em organismos multicelulares (Jacobson et al, 1997). A
desregulação da apoptose está implicada em várias condições patológicas,
incluindo doenças neurodegenerativas, autoimunidade e câncer (Okada & Mak,
2004). Esse mecanismo de morte celular é mediado por uma família de cisteíno
proteases conhecida como caspases (Alnemri et al, 1996). As caspases estão
presentes em sua forma inativa em células saudáveis, na forma de enzimas
precursoras, com pouca ou nenhuma atividade proteolítica. Entretanto, um
estímulo apoptótico pode induzir ativação de caspases (Creagh et al, 2003)
23
Existem duas vias apoptóticas que podem ser iniciadas pela ativação das
caspases: uma via extrínseca, mediada por receptores presentes na superfície
celular, e uma via intrínseca, onde eventos extra e intracelulares induzem
alterações mitocondriais que culminam no processo de morte celular (Figura
3).
Figura 3: Esquema das vias de apoptose. Taylor CR. et al, 2008
24
1.8.1 Apoptose mediada pela Via Extrínseca
A morte celular induzida através da ativação da via extrínseca ocorre
pela interação de um ligante a um receptor específico, localizado na membrana
celular. Procaspases são convertidas em caspases ativas após a ativação
desses receptores pelos seus respectivos ligantes (Van Cruchten & Broeck,
2002). Os ligantes mais bem conhecidos são o ligante de Fas e o Fator de
Necrose Tumoral α (TNFα) (Saikumar et al, 1999). O Fas ligante interage com
um receptor Fas, enquanto que TNFα liga-se ao TNFR1. Ambos os receptores
apresentam um domínio citoplasmático responsável pela transdução do sinal
de apoptose. Este domínio citoplasmático é também conhecido como “domínio
de morte” (death domain ou DD) (Boldin et al, 1995). O acoplamento do
receptor de morte com seus respectivos ligantes provoca o recrutamento de
proteínas adaptadoras, FADD e TRADD. Este recrutamento provoca o acúmulo
de
várias
moléculas
de
caspase-8,
promovendo
assim
o
seu
autoprocessamento e ativação (Taylor et al, 2008). TRADD medeia a apoptose
através da ligação com FADD, portanto, eventualmente ambas Fas e TNFR1
utilizam FADD para transdução do sinal de morte celular. A transdução do sinal
mediada pelos dois receptores acontece via caspase-8 (Enari et al, 1995).
Procaspase-8 liga-se ao o domínio de morte FADD e torna-se ativada em
caspase-8. TRADD ativa caspase-8 indiretamente, através da associação com
o FADD. A ativação das caspase-8 efetora é essencial para as alterações
morfológicas típicas do processo apoptótico (Shiokawa et al, 1997).
25
1.8.2 Apoptose mediada pela Via Intrínseca
A apoptose mediada por receptores não é o único mecanismo de morte
celular programada. Alguns agentes citotóxicos e radiação causam apoptose
por uma via que envolve a mitocôndria e, mais especificamente, a proteína
mitocondrial Citocromo C (Van Cruchten & Broeck, 2002). A ativação do
processo apoptótico desencadeado por alterações mitocondriais é conhecido
como morte celular através da via intrínseca.
As barreiras para indução de apoptose dependem da integridade das
membranas mitocondriais, responsáveis por manter isolada uma grande
variedade de proteínas apoptóticas na sua forma ativa, confinadas no espaço
inter-membranar mitocondrial (Armstrong, 2006). O estímulo apoptótico induz
aumento da permeabilidade mitocondrial, permitindo liberação de agentes
proapoptóticos (tais como Citocromo C) no citosol. O Citocromo C liga-se à
proteína Apaf-1, recrutando e ativando caspase-9, formando assim o complexo
apoptossomo (Li &Yuan, 2008). Uma vez que o Citocromo C liberado, a
cascata de ativação de caspases torna-se irreversível (Goldstein et al, 2000). O
complexo apoptossomo e caspase-9 ativam a caspase 3 e/ou caspases 6 e 7,
desencadeando eventos proteolíticos que culminam em uma desintegração
celular coordenada (Acehan et al, 2002). Portanto as caspases 3, 6 e 7 são
consideradas caspases executoras do processo apoptótico, enquanto que
caspase-9 age apenas como um regulador do processo (Green & Kroemer,
1998).
Alterações mitocondriais, como a estimulação para a produção de
espécies reativas de oxigênio, inibição do metabolismo respiratório e
26
consequente diminuição dos índices de ATP, perda do potencial de membrana
e liberação de agentes proapoptóticos são eventos envolvidos no processo de
morte
celular
(Bras
et
al,
2005).
Portanto,
podemos
afirmar
que
permeabilização da membrana mitocondrial é um fator crucial para a indução
do processo apoptótico pela via intrínseca.
A permeabilização da membrana mitocondrial resulta em dissipação no
potencial de membrana, um parâmetro indispensável para as funções
essenciais desta organela, tais como, transporte de íons, biogênese e
produção de energia (Gordon et al, 2000; Smaili et al, 2000). Este evento de
permeabilização da membrana mitocondrial é regulado por genes pertencentes
à família Bcl-2 (Yip & Reed, 2008). A família consiste em proteínas
antiapoptóticas do grupo Bcl-2 e proteínas proapoptóticas do grupo Bax e
proteínas da família BH3 (Danial, 2007).
As proteínas antiapoptóticas da família Bcl-2, tais como Bcl2 e Bcl-XL
seqüestram as proteínas com domínio BH3 impedindo assim a formação de um
complexo proapoptótico (Li & Yuan, 2008). O grupo das proteínas
proapotóticas
inclui
constitutivamente
à
predominantemente
a
proteína
mitocôndria.
no
Bax
Já
e
a
compartimento
Bak.
Bak
proteína
Bax
citoplasmático
está
associada
está
localizada
na
sua
forma
monomérica, em células viáveis (Carvalho et al, 2004). Após algum estímulo
apoptótico, uma fração significante desta proteína forma dímeros e se transloca
para a membrana mitocondrial (Wolker et al, 1997). A translocação de Bax para
a mitocôndria está associada com liberação de Citocromo C e colapso no
potencial de membrana mitocondrial (Smaili et al, 2001).
27
Estudos
demonstram
que
a
proteína
Bax
e
outros
membros
proapoptóticos da família Bcl-2 podem modular os estoques de cálcio no
retículo endoplasmático e também causar alterações no conteúdo de cálcio na
matriz mitocondrial (Nutt et al, 2001; Pan et al, 2000). Além disso, a integridade
da membrana mitocondrial é alterada pela captação excessiva de cálcio
(Andreyev et al, 1998). Bax e outra proteína, Bak, podem translocar para o
retículo endoplasmático, depletando cálcio e ativando caspase-12 (Zong et al,
2003). Entretanto, ainda são necessários estudos mais avançados para
entender a função de Bax e outras proteínas proapoptóticas no retículo
endoplasmático, interação mitocondrial e redistribuição do cálcio entre estas
organelas durante o processo apoptótico (Carvalho et al, 2004).
Alterações no cálcio citosólico podem ocasionar a apoptose. Algumas
dessas alterações incluem mudanças na captação do cálcio pelas mitocôndrias
promovido por estímulos apoptóticos, a qual aumenta a probabilidade de
ativação do poro de transição de permeabilidade. Depleção dos estoques de
cálcio intracelular também está relacionada com indução de apoptose, já que
uma diminuição nas concentrações de cálcio provocado pelo aumento da
captação deste íon pelas mitocôndrias determina a quantidade de liberação de
Citocromo C (Gogvadze et al, 2008) e apoptose (Pinton et al, 2001).
1.8.3 Alterações celulares causadas pelo estímulo apoptótico
Além das diferentes alterações bioquímicas e moleculares que uma
célula sofre ao receber determinado estímulo apoptótico, existem também
algumas características que definem uma célula em processo de morte celular
28
por apoptose. Estas características baseiam-se em alterações da estrutura
celular levando às alterações clássicas do processo de morte induzido por
apoptose.
Após a ativação das caspases, estas têm a capacidade de clivar
constituintes do citoesqueleto celular. Estes substratos incluem microfilamentos
de actina como, por exemplo, a própria actina, e proteínas associadas à actina,
tais como, miosina, espectrina, α-actinina, gelsolina e filamina (Browne et al,
2000). Algumas proteínas de microtúbulos também são substrato para as
caspases, incluindo tubulinas e proteínas associadas aos microtúbulos (Adrain
et al, 2006). Proteínas dos filamentos intermediários também são afetadas (Ku
et al, 1997). A proteólise dos constituintes do citoesqueleto provavelmente
contribui para o arredondamento e retração da célula nos estágios iniciais da
apoptose. O enfraquecimento do citoesqueleto provoca a formação de blebbing
na membrana celular, uma característica de células em apoptose (Cotter et al,
1992).
Outra característica importante das células nos estágios iniciais do
processo apoptótico é a capacidade de liberação da matriz extracelular. Estas
células tipicamente se retraem das células vizinhas e perdem o contato com a
matriz. Este processo de descolamento envolve mecanismos dependentes de
caspases que, provavelmente tem como objetivo facilitar a remoção das células
apoptóticas pelos fagócitos (Rosenblatt et al, 2001). Outra forma de facilitar o
trabalho dos fagócitos é a geração dos chamados corpos apoptóticos. Estas
estruturas provavelmente são uma conseqüência do processo dirigido pela
actina-miosina para a formação dos blebbings (Cotter et al, 1992) Esta é talvez
a forma mais segura de se quebrar uma célula em diversos pedaços para que
29
estas possam ser engolfadas com facilidade. Isso tem como objetivo minimizar
possíveis falhas na fagocitose da célula morta a fim de se evitar liberação de
sinais de perigo que podem provocar ativação do sistema imune inato (Taylor
et al, 2008).
Apesar da importância da fagocitose, não está claro como a célula
apoptótica é reconhecida pelos fagócitos. O exemplo melhor caracterizado de
ligante fagocítico é o fosfolipídio de membrana fosfatidilserina. A fosfatidilserina
está confinada internamente na membrana plasmática de células saudáveis,
mas esta se transloca para a face externa da membrana após um estímulo
proapoptótico, induzindo assim a fagocitose (Martin et al, 1995). Esta
translocação também é caspase-dependente, mas como estas cisteínoproteases promovem esta translocação ainda não foi definido (Martin et al,
1996).
Alterações nucleares também estão presentes no processo de apoptose.
Apesar da fragmentação nuclear ser uma das características mais marcantes
da apoptose, permanece desconhecido o motivo pelo qual o núcleo fragmentase e se dispersa ao longo da célula durante este processo de morte celular
(Taylor et al, 2008). A fragmentação nuclear depende da desintegração da
lâmina nuclear e do colapso do envelope nuclear. O primeiro destes eventos
envolve a proteólise das proteínas laminas A, B e C através das caspases (Rao
et al, 1996). O citoesqueleto de actina também tem um papel na fragmentação
nuclear. Por causa das ligações entre o citoesqueleto de actina e do envelope
nuclear, ocorre destruição nuclear durante apoptose (Croft et al, 2005). A
clivagem da proteína lamina por si só não é suficiente para causar a
fragmentação nuclear na ausência da força contrátil do citoesqueleto de actina,
30
mas pode enfraquecer a membrana nuclear, permitindo que o envelope nuclear
se rompa (Croft et al, 2005). Na fragmentação do núcleo, os microtúbulos do
citoesqueleto têm sido implicados na dispersão de fragmentos nucleares na
membrana plasmática para a formação dos blebbings (Moss et al, 2006).
Um
dos
primeiros
sinais
bioquímicos
a
ser identificado
como
característico de um processo apoptótico é a degradação do DNA genômico
em fragmentos (ladder of fragments) (Wyllie, 1980). Este padrão de
fragmentação
é
resultado
da
clivagem
da
cromatina
em
sítios
internucleossomais mediada por endonucleases. E este processo é tipicamente
acompanhado de condensação da cromatina (Schulze-Osthoff et al, 1994). A
fragmentação do DNA durante o processo apoptótico exclui qualquer outra
possibilidade de divisão celular, tornando cromatina mais gerenciável para
posterior eliminação por células fagocíticas (Taylor et al, 2008).
Pelo exposto nesta Introdução, fica claro que as alternativas terapêuticas
disponíveis para o tratamento do melanoma apresentam efeitos limitados, logo,
o desenvolvimento de novos agentes que atuem inibindo o desenvolvimento
tumoral é de extrema importância. Além da descoberta de novas drogas, é
fundamental compreender o modo de ação das mesmas, para que os
mecanismos de resistência da célula tumoral ao quimioterápico, tão
frequentemente induzidos durante o tratamento, possam ser compreendidos e
eventualmente contornados.
Resultados anteriormente obtidos pelo nosso grupo sugeriram que o
ciclopaladado 7A, que apresentou um interessante efeito terapêutico in vivo,
31
induz nas células tumorais uma morte por apoptose caspase-independente,
levando ao final do processo à degradação de DNA de células tratadas
(Rodrigues et al, 2003). No entanto, como o mecanismo de ação do
ciclopaladado 7A ainda não foi totalmente elucidado, é de nosso interesse
determinar os eventos que precedem a degradação de DNA observada nas
células tumorais após tratamento com o ciclopaladado 7A.
Além disso, poucos trabalhos na literatura exploram o efeito anti-tumoral
de compostos de Rutênio, e mais especificamente, compostos de Rutênio
doadores de óxido nítrico. Foi nosso interesse o estudo desses compostos no
tratamento do melanoma murino experimental, assim como a determinação do
seu mecanismo de ação, tendo em vista que o efeito do óxido nítrico no
desenvolvimento tumoral ainda não está elucidado.
32
2.0 OBJETIVOS
O objetivo geral deste trabalho foi a avaliação de novos compostos
organometálicos derivados de Paládio e Rutênio em ensaios pré-clínicos.
Os objetivos específicos foram:
• Avaliar os efeitos citotóxicos do Complexo ciclopaladado 7A, [Pd2(S(-)C2,
N-dmpa)2 (m-dppe)Cl2], sobre linhagens celulares tumorais humanas;
• Avaliar a atividade do Ciclopaladado 7A no modelo metastático de
melanoma murino B16F10-Nex2;
• Elucidar o mecanismo pelo qual o Ciclopaladado 7A causa a morte das
células tumorais;
• Avaliar a atividade in vitro dos compostos tetraamina nitrosil Rutênio e os
respectivos equivalentes sulfatados sobre células de melanoma murino
B16F10-Nex2 e sobre células tumorais humanas;
• Avaliar a atividade in vivo dos compostos tetraamina Rutênio
previamente selecionados como ativos in vitro no modelo subcutâneo de
melanoma murino B16F10-Nex2;
• Investigar o mecanismo pelo qual os compostos tetraamina Rutênio
causam a morte das células tumorais.
33
3.0 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Quimioterápicos:
Complexo ciclopaladado 7A (C7A): O composto ciclopaladado foi
obtido através da síntese de N,N-dimethyl-1-phenethilamida, complexado com
o ligante 1,2 ethanebis (diphenylphosphina), conforme descrição detalhada em
Rodrigues et al, (2003). Fórmula molecular C44H52N2Cl2P2Pd2, com rendimento
de síntese de 92%. O complexo ciclopaladado foi sintetizado pelo Prof. Antonio
Carlos F. Caires, Centro Interdisciplinar de Investigação Bioquímica, da
Universidade de Mogi das Cruzes.
Compostos de Rutênio: Todos os compostos de Rutênio foram
sintetizados pela aluna Renata Osti, sob orientação do Prof Douglas Wagner
Franco, do Departamento de Química e Física Molecular, Universidade de São
Paulo, campus São Carlos. Os compostos de partida para a síntese dos
complexos
de
rutênio,
trans-[Ru(NH3)4SO2Cl]Cl,
trans-
[Ru(NH3)4(P(OEt)3)2](PF6)2 e K[Ru(Hedta)Cl], foram preparados seguindo
procedimentos descritos na literatura (Vogt et al, 1965). A partir desses
compostos de partida, foram sintetizados os seguintes compostos testados
neste trabalho:
34
A) trans-[Ru(NH3)4L(SO4)]+ : Os compostos trans-[Ru (NH3)4 L (SO4)]+
(L: py = piridina; 4-pic = 4-picolina; isn = isonicotinamida; nic = nicotinamida;
ImN = imidazol; L-his = L-histidina) foram preparados dissolvendo-se 100 mg
do complexo trans-[Ru(NH3)4SO2Cl] Cl em 3,5 ml de solução de NaHCO3 10-2
mol.l-1 previamente desaerada, e em seguida excesso de 10 vezes do ligante L
foi adicionado (2 vezes para a L-his). A mistura permaneceu em reação sob
atmosfera de argônio durante 20 minutos. Em seguida, 1 ml de HCl 6 mol.l-1 e
2,5 ml de H2O2 30 % foram adicionados. Acetona (aproximadamente 70 ml) foi
acrescentada, e a mistura permaneceu em refrigerador por 12 horas. O sólido
foi coletado por filtração, lavado com acetona, seco e estocado sob vácuo e na
ausência de luz.
B) trans-[Ru(NO)(NH3)4L]3+ : Os compostos trans-[Ru(NO)(NH3)4L]3+ (L:
py = piridina; 4-pic = 4-picolina; isn = isonicotinamida; nic = nicotinamida; ImN =
imidazol; L-his = L-histidina) foram preparados a partir dos respectivos
complexos do tipo trans-[Ru (NH3)4 L (SO4)]Cl. Inicialmente, 100 mg dos
sulfatos compostos são dissolvidos em 3 ml de solução de HCF3COO pH 5,4
desaerada, e reduzidos com amálgama de zinco por 30 minutos (50 minutos
para complexo com piridina) para gerar trans-[Ru(NH3)4L(H2O)]2+. A esta
solução foram adicionados 0,10 g de NaNO2 e 1,3 ml de solução desoxigenada
de HBF4 5 mol.l-1. A solução resultante foi mantida sob atmosfera de argônio
por 1 hora, após este período 100 ml de etanol desoxigenado foram
adicionados. O sólido foi coletado por filtração, lavado com etanol, seco e
estocado sob vácuo e na ausência de luz.
35
C) trans-[Ru(NO)(NH3)4P(OEt)3](PF6)3 : Dissolveram-se 0,20 g de trans[Ru(NH3)4(P(OEt)3)2](PF6)2 em 200 ml de solução desoxigenada de CF3COOH
0,001 mol.l-1. A mistura permaneceu em reação por 6 horas sob fluxo de
argônio, a 40 oC. Acompanhou-se a formação da banda em 316 nm (ε = 650 M1
) por UV-visível. Evaporou-se o excesso de solvente em evaporador rotatório
(a 40 oC) até volume de aproximadamente 3,0 mL, transferiu-se para 2,0 mL de
solução 2,0 mol.l-1 de CF3COOH, previamente desoxigenada. Adicionaram-se
0,200 g de NaNO2. A solução adquiriu uma coloração rósea. Acrescentaram-se
0,300 g de NH4PF6 e deixou-se no refrigerador até a formação de sólido
cristalino róseo. Coletou-se por filtração, lavando-se com éter. O complexo foi
seco e estocado a vácuo e ao abrigo da luz.
D) [Ru(NO)Hedta] : O complexo [Ru(NO)Hedta] foi preparado
dissolvendo-se 500 mg de K[Ru(Hedta)Cl] em 20 ml de uma solução 10-2 mol.l-1
de HCl em balão de fundo redondo. O balão foi tampado e permaneceu sob
atmosfera de argônio durante 30 minutos. Após este tempo, NO e argônio
foram borbulhados na solução durante 3 horas e 30 minutos. Etanol foi
adicionado à mistura e o nitrosilo composto formado precipitado na forma de
um sólido de cor lilás o qual foi então isolado, seco e armazenado sob vácuo e
protegido da luz.
3.2 Linhagens de células tumorais e condições de cultivo: Foram utilizadas
células de melanoma murino B16F10-Nex2, uma sublinhagem da linhagem
36
B16F10 (Fidler et al, 1975 que mantém as características da linhagem original
de baixa imunogenicidade e alta eficiência na implantação in vivo (Freitas et al,
2004). Células tumorais humanas isoladas de adecarcinoma de mama (SKBr-3
e
ZR753A),
adenocarcinoma
de
cólon (HCT-8
e
LS-180),
leucemia
promielocítica (HL-60), adenocarcinoma de cérvix uterino (HeLa, CasKi e
SiHa), melanoma (Me91 e SKMel-25) e glioblastoma (U-87 ) foram utilizadas.
Para os ensaios de angiogênese, foi utilizada a linhagem de células endoteliais
humanas isoladas de veia de cordão umbilical (HUVECs). Todas as células
foram cultivadas in vitro em meio RPMI-1640, suplementado como 10mM de
HEPES, 24mM de bicarbonato de sódio, 40mg/ml de gentamicina, pH 7.2 e
10% de soro fetal bovino. Para manuseio das células, foram utilizados PBS
(140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8mM KH2PO4, pH 7.4) para
lavagem e, PBS/EDTA (PBS com 0,02% de EDTA) para liberação das células
dos frascos e placas de cultura.
3.3 Animais: Camundongos C57Bl/6 machos (6 a 8 semanas) foram obtidos
do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais (CEDEME), da
Universidade Federal de São Paulo. Os animais foram mantidos em
microisoladores, com água, ração e serragem autoclavadas, e em estantes
ventiladas (Alesco, Brasil). Os experimentos envolvendo animais foram
desenvolvidos com aprovação do Comitê de Ética para Experimentação Animal
da Universidade Federal de São Paulo, projeto registrado sob número 1507/09.
37
3.4 Obtenção de macrófagos derivados de medula óssea: Precursores de
macrófagos presentes na medula óssea foram coletados de ossos femurais de
animais C57BL/6. Os ossos foram retirados e em seguida lavados em álcool
70%, álcool iodado e PBS. As epífises foram cortadas e a medula foi coletada
por pressão positiva com o auxílio de uma seringa de 10ml contendo meio de
diferenciação (meio RPMI acrescido de 30% de “meio L” e 20% de soro fetal
bovino). O meio L é constituído do sobrenadante das células L929, que
secretam constitutivamente CSF e G-CSF. O sobrenadante destas células foi
coletado, testado para garantir a ausência de Mycoplasma, e em seguida,
utilizado para a constituição do meio de diferenciação. Utilizamos placas de
Petri próprias para cultura celular (Corning) para diferenciar os macrófagos in
vitro. As células foram incubadas durante 4 dias em estufa a 37°C e 5% de
CO2, sendo então adicionados mais 10ml de meio de diferenciação. No sétimo
dia, as células diferenciadas foram coletadas. O meio metabolizado foi aspirado
para a adição de meio de troca (meio RPMI acrescido de 25% de “meio L” e
15% de soro fetal bovino). A placa permaneceu a 4°C por 1 hora, ou até que os
macrófagos diferenciados estivessem soltos da placa. A partir daí, as células
foram utilizadas para os ensaios.
3.5 Dosagem Protéica: O método de Bradford foi utilizado para quantificação
protéica (Bradford, 1976), adaptado a uma micrométodo. 10mg do Corante
Commasie Brilliant Blue G-250 (Sigma) foram diluídos em 5mL de etanol
absoluto (Merck) seguido da adição de 10mL de ácido ortofosfórico (Merck), e
completando-se o volume para 100mL com água destilada. Após agitação a
solução foi filtrada e protegida da luz. Para quantificação da proteína, 100µL de
38
reagente foi adicionado a 20µL da amostra, previamente diluída ou não, com
leitura imediata. A cada dosagem construiu-se uma curva padrão (de 0,2 a
1,0µg) a partir de uma solução de PBS/BSA 1mg/ml e a leitura da absorbância
foi feita em espectofotômetro de placas em 620nm (Titertek Multiskan MCC/340
MKII).
3.6 Ensaio de citotoxicidade celular in vitro: Células B16F10-Nex2
(1x104/poço), células tumorais humanas (2x105/poço), macrófagos murinos
(1x105/poço) e células HUVECs (5x103) foram cultivadas em placa de 96 poços
(TPP) e tratadas com diferentes concentrações do complexo 7A e com
compostos de rutênio. Após 24h de incubação a 37°C, os poços foram lavados
com PBS e o número de células viáveis aderentes foi determinado em câmara
de Neubauer, utilizando o corante de exclusão Trypan Blue (Invitrogen).
Gráficos de concentração da droga versus número de células viáveis foram
construídos, e a Concentração Inibitória 50% (IC50) foi calculada usando-se o
Programa Microsoft Excel, do software Microsoft Office.
3.7 Ensaio de inibição da citotoxicidade do complexo 7A in vitro com DTT:
Células B16F10-Nex2 (104/poço) foram plaqueadas em placa de
96 poços
(Corning). Após 24h de incubação, as células foram pré-tratadas ou não com
2mM de DTT por 10 minutos. As células foram lavadas com solução de PBS e
incubadas com uma dose elevada do Complexo 7A (10µM). Após 1h e 2h as
células viáveis foram coletadas com PBS-EDTA e contadas em presença de
Trypan Blue.
39
3.8 Ensaio de citotoxicidade in vitro em presença de inibidores de
proteases: Ca074-Me (catepsina B) ou E-64 (cisteíno-proteases): Células
B16F10-Nex2 (104/poço) foram plaqueadas em placa de 96 poços (Corning).
Após 24h de incubação, as células foram pré-tratadas ou não com diferentes
concentrações de Ca074-Me (L-3-trans-(Propylcarbamyl)oxirane-2-carbonyl)-Lisoleucyl-L-proline methyl Ester) ou E-64 (trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido-[4guanido]butane), ambos da Sigma, por 2 horas. As células foram lavadas com
solução de PBS e incubadas com uma dose elevada de compostos 7A (10µM).
Após 24h, as células foram destacadas com PBS-EDTA e as células viáveis
foram contadas utilizando Trypan Blue em Câmara de Neubauer.
3.9 Quantificação da acidificação extracelular: Células tumorais humanas
(HCT-8, Siha e Skmel25) foram plaqueadas (3x105/poço) em
cubetas
transwells com poros de 3.0 µm (Corning Costar) e os transwells foram
mantidos em placas de cultura de 12 poços (Corning) por 12h antes do
experimento. A taxa de acidificação extracelular de células tratadas e não
tratadas
foi
determinada
utilizando-se
um
microfisiômetro
Cytosensor
(Molecular Devices). As cápsulas contendo as células aderentes tratadas ou
não foram transferidas para câmaras sensoras e mantidas em RPMI com baixo
tamponamento e 1% BSA, a 37ºC. O meio de perfusão (50 µl/min) contendo as
drogas (C7A ou Cisplatina, usada como controle positivo) ou não (controle
negativo) foi bombeado através das câmaras de cada sensor com ciclos de 90
seg de fluxo, seguido de um período de 30 seg sem fluxo de meio. Durante os
40
períodos sem fluxo, os prótons H+ liberados pelas células se acumulam no
sensor e são quantificados.
3.10 Microscopia ótica: Células B16F10-Nex2 (1x104/lamínula) foram
cultivadas em lamínulas estéreis com diâmetro de 13mm em placas de cultura
de 12 poços. Após 24 horas as células foram tratadas com C7A (1µM) por
diferentes intervalos de tempo, sendo o tempo máximo de 25 minutos. Após o
tratamento, as lamínulas foram lavadas com PBS e as células fixadas com
paraformaldeído 4% em PBS. As lamínulas foram fixadas em lâminas e
analisadas por microscopia ótica utilizando-se um microscópio (Nikon Eclipse
E600 (aumento de 40x).
3.11 Microscopia Eletrônica de Transmissão: Células B16F10-Nex2 (105
células/lamínula) foram cultivadas em lamínulas com diâmetro de 13mm em
placas de 12 poços. O complexo 7A foi adicionado na concentração de 1µM e
incubado por apenas 15 minutos, tempo suficiente para que a droga provoque
alterações morfológicas nas células, sem que as mesmas se soltem
naturalmente do substrato. As células foram fixadas em 2,5% de glutaraldeído
em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,4. A pós-fixação foi realizada com
tampão cacodilato de sódio contendo 1% de tetróxido de ósmio, 0,08 % de
ferricianeto de potássio, 5 mM de cloreto de cálcio, durante 60 minutos ao
abrigo da luz. A desidratação foi feita com diluições em série crescente de
acetona e a infiltração em resina Epoxi Polybed (Polysciences). Cortes
ultrafinos foram obtidos por ultramicrotomia, coletados em grades (malha 300)
41
e contrastados em acetato de uranila e citrato de chumbo. A análise
ultraestrutural foi feita em Microscópio Eletrônico de Transmissão Zeiss EM900, no Centro de Microscopia Eletrônica (CEME) da UNIFESP.
3.12 Alterações no potencial de membrana mitocondrial (∆
∆Ψm) : Células
B16F10-Nex2 (5x104/poço) foram plaqueadas em lamínulas redondas de
25mm de diâmetro. Estas lamínulas foram previamente tratadas com poli-lisina
(0,1mg/ml). Para o preparo das lamínulas, estas foram lavadas com álcool
70%, seguida de lavagens com água destilada. Após este processo, cobrimos
as lamínulas com poli-lisina e incubamos em temperatura ambiente por 1 hora.
Retiramos a poli-lisina e deixamos por 30 minutos sob a luz ultravioleta, dentro
do fluxo laminar para esterilização. Após este procedimento, as células foram
plaqueadas. As lamínulas foram adaptadas em câmara de Leiden para
acondicionamento no microscópio. As células foram incubadas com o indicador
de fluorescência potenciométrico, tetrametilrodamina-etil-éster (TMRE, 50nM.
Molecular Probes) por 15 minutos em temperatura ambiente, na presença ou
ausência do inibidor DTT (2mM). As lamínulas foram então colocadas no
microscópio e as células foram tratadas com o Complexo 7A (1µM). Na fase
final do experimento, adicionamos o desacoplador mitocondrial FCCP (5µM).
Este reagente provoca uma rápida queda no potencial de membrana
mitocondrial, sendo utilizado como controle positivo do experimento. A
fluorescência do TMRE foi adquirida em tempo real, (548nm de excitação e
585nm de emissão), a 1 quadro / 6 segundos, usando o microscópio invertido
Nikon TE 300. As mitocôndrias foram identificadas individualmente, onde as
42
regiões de interesse foram desenhadas sobre cada organela para a
determinação da variação do potencial de membrana mitocondrial.
3.13 Translocação da Proteína Bax-GFP em células transfectadas: Células
B16F10-Nex2 (5x104/lamínula) foram plaqueadas em lamínulas com 25mm de
diâmetro,
pré-tratadas com poli-lisina (0,1mg/ml). Em seguida, as células
foram transfectadas com plasmídeo contendo inserto da quimera proteica BaxGFP (Green Fluorescent Protein) utilizando Lipofectina (Invitrogen), segundo
instruções do fabricante. O plasmídeo Bax-GFP foi construido como descrito
em (Wolter et al, 1997) e gentilmente cedido pela Profª Dra Soraya Smaili,
Departamento de Farmacologia da Universidade Federal de São Paulo. As
lamínulas contendo as células transfectadas foram adaptadas em câmara de
Leiden e incubadas com C7A (1µM). A translocação de Bax-GFP foi observada
em tempo real (458nm de emissão e 488 nm de excitação) a 1 quadro / 6
segundos. As imagens foram visualizadas em microscópio de luz (Nikon
E8000, Nikon, Osaka, Japan) e analisadas no programa Image Pro-Express
(Media Cybernetics, MD, USA).
3.14 Determinação da concentração intracelular de Cálcio: Células
B16F10-Nex2 (5x104/lamínula) foram plaqueadas em lamínulas redondas de
25mm de diâmetro, previamente tratadas com poli-lisina (0,1mg/ml) e
acondicionadas na câmara de Leiden. As células foram incubadas em meio
com o indicador de fluorescência Fura-2-AM (2µM) e Pluronic F127 (20%) por
30 minutos em tampão contendo 130mM NaCl, 5.36mM KCl, 0.8mM MgSO4,
43
1mM Na2HPO4, 25mM glicose, 20mM HEPES, 1mM piruvato de sódio, 1.50mM
CaCl2, 1mM ácido ascórbico, pH7.3. Para os ensaios com tampão livre de
cálcio, utilizamos o mesmo protocolo descrito acima, porém sem a adição do
CaCl2. Após este período, as células foram tratadas com o complexo 7A (1µM)
e a leitura da fluorescência do Fura-2 foi realizada em dois comprimentos de
onda de excitação, 340 e 380nm. O cálculo da razão 340/380 indica a
quantidade de Fura-2 que se encontra no citosol na forma complexada com
Cálcio (340nm) em relação à quantidade de Fura-2-AM que se encontra na
forma livre (380nm). As imagens foram visualizadas em microscópio invertido
(Nikon TE300, Nikon, Osaka, Japan) e analisadas no programa Image ProExpress (Media Cybernetics, MD, USA).
3.15 Ativação de caspases:
Para avaliar a atividade de caspases após
tratamento com drogas, utilizamos dois métodos: um método colorimétrico e
outro por citometria de fluxo. O método colorimétrico foi realizado utilizando um
kit denominado Caspase Colorimetric Protease Assay (Invitrogen). Este kit
permite a avaliação qualitativa da atividade de caspase-2, caspase-3, caspase6, caspase-8 e caspase-9. Resumidamente, células B16F10-Nex2 (5x106)
foram cultivadas e tratadas in vitro com o complexo 7A (1µM) por 5 minutos.
Para o controle positivo, o mesmo número de células B16F10-Nex2 foram
incubadas em exposição à luz ultravioleta por 7 minutos. Em seguida, as
células foram coletadas da placa com o auxílio de um cell scraper e
centrifugadas a 5.000g. Após a centrifugação, as células foram ressupendidas
em 50µL do tampão de lise, fornecido pelo kit, e incubadas no gelo por 10
minutos. Centrifugamos a 10.000g por 1 minuto e o sobrenadante foi
44
transferido para um novo tubo. A concentração proteica da amostra foi avaliada
pelo método de Bradford e a amostra foi diluída em tampão de lise a uma
concentração de 1mg/ml. Adicionamos 50µL do tampão de reação, contendo
10mM de DTT, fornecido pelo kit e incubamos com os respectivos substratos
referentes às caspases 2, 3, 6, 8 e 9 (VDVAD, DEVD, VEID, IETD, LEHD)
durante 2 horas a 37ºC. A leitura da absorbância foi feita em comprimento de
onda de 405nm em espectofotômetro de placas (Titertek Multiskan MCC/340
MKII). O aumento da atividade das caspases foi determinado pela comparação
direta com os níveis de caspases presentes no controle não tratado. A
caspase-3 foi também quantificada por citometria de fluxo. Células B16F10nex2 (1x106) foram tratadas por 12h com o ciclopaladado 7A ou Camptotensina
(10µM), como controle positivo. As células tratadas foram lavadas duas vezes
com PBS e ajustadas para 1x106 células por amostra. Em seguida, as células
foram incubadas com anticorpos anti-caspase-3 (Promega) diluído 1:000 em
PBS/BSA 1% por 1 hora, no gelo, protegido da luz. A atividade foi avaliada por
citometria de fluxo, onde foram capturadas 10.000 células. A marcação foi
analisada através do citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton-Dickinson), com
análise dos resultados pelo software CellQuerst®.
3.16 Avaliação de condensação nuclear por microcopia de fluorescência:
Células B16F10-Nex2 (1X104) foram plaqueadas em lamínulas de 13mm de
diâmetro e tratadas com o complexo 7A (1uM, por no máximo 25 minutos) ou
com compostos de rutênio trans-[Ru (NH3)4 ImN (SO4)]+ (444uM, por 24h). As
células foram marcadas com Hoescht 33342 (thyhidrocloride thihydrate, Sigma
Chemical) durante 15 minutos e depois visualizadas em microscopia de
45
fluorescência (microscópio invertido Nikon TE 300), excitado em 350nm e com
emissão em 450nm. Avaliamos a porcentagem das células com características
nucleares alteradas, tais como, condensação nuclear, núcleo picnótico e maior
intensidade de fluorescência. Foram contadas pelo menos 200 células por
lamínulas, em triplicatas. A partir destes dados, a porcentagem de células com
alterações nucleares foi calculada.
3.17 Ensaio de degradação de DNA: células B16F10-Nex2 (1x105/poço)
foram cultivadas em placa de 12 poços e tratadas com o complexo 7A (1µM,
por 24h) ou com compostos de rutênio trans-[Ru (NH3)4 ImN (SO4)]+, (444µM,
por 24h. Após 12h de incubação a 37°C, todas as cél ulas, aderentes ou em
suspensão foram coletadas e o seu DNA foi extraído utilizando o protocolo de
extração com tampão TELT [Tris-HCl 50mM pH8.0 (Gibco), 4% de Triton X-100
(LKB), EDTA 2.5mM pH 9.0 (Pharmacia) e 2.5M de LiCl (Merck)], para lise das
células. O material foi centrifugado a 12.000g por 10 minutos. Ao sobrenadante
adicionou-se igual volume de fenol (Gibco, pH 7.5), homogeneizando bem e
centrifugando-se por 15 minutos a 12.000g. A fase aquosa foi transferida para
novo tubo e a este adicionou-se igual volume de Clorofórmio (Merck),
centrifugando-se por 15 minutos a 12.000g. Adicionou-se ao sobrenadante 0,1
volume de acetato de sódio 3.0M e 2.5 volume de etanol absoluto (Merck),
incubando-se o material a -20ºC por 24h. Após este período, o material foi
centrifugado a 12.000g por 15 minutos, e ao precipitado adicionou-se 500uL de
etanol 70% (Merck) para lavagem. O material foi centrifugado a 7.500g e em
seguida o mesmo foi seco em temperatura ambiente. Depois de seco, o
precipitado foi ressuspendido em água contendo RNAse (50ug/mL). Ao final da
46
extração, o material foi quantificado por espectofotômetro a 260nm. Para
verificação da degradação do DNA, 1µg de DNA de cada amostra foi separado
eletroforeticamente em gel de agarose 0.8% (Pharmacia) contendo 2µL de
brometo de etídio. A corrida foi realizada a 100V por aproximadamente 40
minutos.
3.18 Ensaio de TUNEL (Terminal Transferase dUTP Nick End Labeling): A
fragmentação de DNA também foi analisada utilizando o “In Situ Cell Death
Detection kit, AP” (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) de
acordo com as instruções do fabricante. Esta técnica fundamenta-se na
marcação direta de fragmentos terminais de DNA (porção 3' -OH),
caracteristicamente relacionados com a fragmentação do DNA nuclear. As
células foram plaqueadas (1 x 104) em lamínulas de 13mm e incubadas por 24
h a 37° C em presença de meio RPMI com 10% SFB para adesão das células
na lamínula. As células foram incubadas com o composto de Rutênio trans-[Ru
(NH3)4 ImN (SO4)]+ por 24 h. Após o tempo de incubação, as células foram
lavadas 3 vezes com PBS em temperatura ambiente e em seguida fixadas com
2% de paraformaldeído por 30 minutos. Após a fixação das células foi realizada
a permeabilização da membrana celular, utilizando 0,1% Triton X-100 por 30
minutos. As células foram lavadas 3 vezes com PBS e incubadas por 1h com
os reagentes do kit (“enzyme solution” e “label solução” na proporção 1:9) a
37° C ao abrigo da luz. As células foram lavadas novamente e incubadas com
1mg/mL de DAPI por 10 minutos em temperatura ambiente. As lamínulas foram
aderidas às lâminas na presença de Vectashield (Vector) e em seguida, as
47
células foram observadas em um microscópio de fluorescência microscópio
(Nikon TE 300). O DAPI foi observado no comprimento de onda de 454-488nm
e a fluorescência do ensaio de TUNEL foi observada no comprimento de onda
de 515-565nm.
3.19 Detecção da translocação da fosfatidilserina (PS) para a superfície
celular: Para a determinação da translocação da PS para a superfície celular
após tratamento com o quimioterápico, foi utilizado o kit Annexin V-FITC
Apoptosis Detection Kit (Sigma), onde as células são coradas com Anexina VFITC e iodeto de propídio (PI), seguido por análise em citômetria de fluxo
(FACS). Células B16F10Nex2 (1x106) foram cultivadas em placas de 6 poços e
incubadas o composto trans-[Ru (NH3)4 ImN (SO4)]+ (444uM) por 12 horas a
37° C e 5% CO2. Células não tratadas foram utilizadas como controle. Após
incubação, células tratadas e não tratadas foram liberadas da placa com
tripsina, centrifugadas, coletadas e lavadas 3 vezes com PBS. As células foram
ressuspendidas em tampão “Binding Buffer” (Sigma) contendo 10 mM
HEPES/NaOH, pH 7.5 e 140 mM de NaCl e 2.5 mM CaCl2. Posteriormente as
células foram incubadas à temperatura ambiente com 0.5 µg/mL de Annexin-V
e 2 µg/mL de iodeto de propídio por 10 minutos. Durante o período de
incubação as amostras foram protegidas da luz. A determinação da
fluorescência foi realizada em Citômetro de Fluxo Becton-Dickinson, com
análise dos resultados pelo software CellQuest®. Células viáveis não
apresentam nenhuma marcaçao fluorescente. Células em processo de morte
por apoptose caracterizam-se pela marcação com o conjugado Anexina V-
48
FITC. Células duplamente marcadas foram consideradas como células nas
fases finais da apoptose e/ou em processo de necrose.
3.20 Ensaio de Angiogênese: Para observação dos efeitos do complexo 7A e
dos compostos de rutênio no processo angiogênico, foi realizado ensaio in vitro
com células endoteliais isoladas de veias de cordão umbilical humano
(HUVEC). Alíquotas de Matrigel (BD) foram descongeladas e 10uL foram
aplicados em placas de 96 poços com o auxílio de ponteiras geladas. As
células HUVEC (5x103) foram associadas aos compostos a serem testados em
10uL de meio RPMI 0.2% SFB e em seguida adicionadas sobre o Matrigel. A
concentração
dos
compostos
utilizada
neste
ensaio
foi
previamente
padronizada em ensaios de citotoxicidade celular sobre as células HUVECs,
conforme descrição no item 3.6. Após 24h de incubação, os poços foram
fotografados em um aumento de aproximadamente 8X com o auxílio de uma
Câmera digital Sony Cyber-shot. O resultado foi expresso em número de
formações pró-angiogênicas (anéis fechados) contadas visualmente nas
fotografias. Células não tratadas foram utilizadas como controle.
3.21 Ensaio de hemólise: Para verificar a toxicidade do ciclopaladado C7A,
hemácias humanas foram obtidas a partir da fração celular de sangue de
indivíduo normal, coletado na presença do anticoagulante citrato de sódio e
centrifugado a 3.000 rpm por 10 minutos. As células foram lavadas duas vezes
e ressuspendidas em PBS-BSA (1%). Os eritrócitos (3x107) foram incubados
em placas de 96 poços de fundo em “U” a 37ºC por 2 horas, sob agitação, na
49
presença de diferentes concentrações do complexo 7A. Após incubação, a
placa foi centrifugada a 2.000 rpm por 10 minutos. Os níveis de hemoglobina
no sobrenadante foram determinados por leitura em espectrofotômetro a 405
nm e comparados com o controle positivo obtido pela lise total utilizando-se
0.2% de Triton X-100. Os resultados foram expressos em porcentagem de
hemólise em relação ao controle sem tratamento.
3.22
Ensaio
de
colonização
pulmonar
e
tratamento
com
os
quimioterápicos: Para o ensaio de colonização pulmonar, 1x105 células
B16F10-Nex2 foram inoculadas endovenosamente pela veia da cauda dos
animais. A partir do dia seguinte, os animais foram tratados com 200ng/kg do
composto 7A, três vezes por semana. Após 13 dias, os animais foram
sacrificados e os pulmões retirados para contagem dos nódulos pulmonares.
Utilizamos o mesmo protocolo para o tratamento com os compostos de
Rutênio.
3.23 Desenvolvimento tumoral subcutâneo in vivo: camundongos C57Bl/6
foram injetados subcutaneamente com 5x104 células B16F10-Nex2 (lavadas e
diluídas em PBS). No dia seguinte, iniciou-se o tratamento com diferentes
concentrações
do
Composto
de
rutênio
trans-[Ru
(NH3)4ImN(SO4)]+,
administrados intraperitonealmente, três vezes por semana até o sacrifício dos
animais. Os tumores foram medidos também três vezes na semana e o volume
tumoral foi calculado usando a seguinte fórmula: V = 0.52 x D12 x D2, onde D1
e D2 correspondem respectivamente ao diâmetro menor e maior da massa
tumoral.
50
3.24 Análise estatística: A análise estatística foi realizada com Teste t de
Student do Programa Microsoft Excel, do software Microsoft Office,
considerando os valores iguais ou menores de p<0.05 como significativos. Os
valores de média e desvio padrão foram obtidos utilizando o mesmo programa.
51
4.0 RESULTADOS: CICLOPALADADO 7A
4.1 Efeitos sobre as células tumorais humanas in vitro
Em estudo anteriormente publicado pelo nosso grupo, observou-se a
atividade antitumoral do complexo 7A in vitro e in vivo contra o modelo de
melanoma murino B16F10-Nex2. Nesse trabalho, demonstrou-se que o
ciclopaladado 7A causou o colapso da atividade respiratória das células
B16F10-Nex2, sugerido pelo decréscimo abrupto na acidificação celular em
curtos tempos (Rodrigues et al, 2003).
Para avaliar se esse composto também seria eficaz contra tumores
humanos, foi testada a ação citotóxica do complexo 7A in vitro, contra várias
linhagens celulares tumorais humanas. Observou-se que o ciclopaladado 7A foi
citotóxico in vitro de modo dose-dependente contra células tumorais humanas
em doses muito baixas quando comparadas a um agente quimioterápico
regularmente utilizado no tratamento do câncer, a Cisplatina (Tabela 1).
Enquanto a maioria das linhagens celulares avaliadas apresentou um IC50
acima de 100 µM para a Cisplatina, essas mesmas células apresentaram um
IC50 menor que 0,5 µM para o Ciclopaladado 7A. Somente 2 linhagens testadas
apresentaram IC50 igual ou acima de 1 µM para o C7A, a linhagem HL-60 de
leucemia promielocítica e a linhagem U-87, de glioblastoma. O IC50 dessas 2
linhagens foram 70 e 150 µM para a Cisplatina, respectivamente.
52
No trabalho anterior foi realizado um teste de toxicidade in vivo do C7A,
onde doses crescentes do ciclopaladado foram injetadas em camundongos
C57Bl/6, e ao final do tratamento, vários órgãos foram coletados desses
animais e uma análise histopatológica não demonstrou alterações teciduais,
sugerindo uma baixa toxicidade do composto. No tratamento in vivo foi utilizada
a dose de 40ng/Kg, 3 vezes por semana, e no teste de toxicidade chegou-se à
dose de 240ng/kg (Rodrigues et al, 2003).
Foram realizados testes de toxicidade in vitro, complementares ao já
realizado in vivo, e observou-se que o ciclopaladado não afetou a viabilidade
de macrófagos murinos após 6h de incubação (Figura 1) ou eritrócitos
humanos (Tabela 2) tratados com até 50µM do composto.
Esses resultados sugerem que o Ciclopaladado 7A tem atividade
citotóxica contra células tumorais humanas in vitro e este composto apresenta
baixa toxicidade contra células normais.
53
Tabela 1: Citotoxicidade in vitro do complexo 7A e do quimioterápico Cisplatina
sobre o melanoma murino B16F10-Nex2 e células tumorais humanas. Cada
linhagem celular foi testada com diferentes doses do composto, e a IC50 foi
calculada como descrito em Materiais e Métodos.
IC50
Complexo 7A (µM)
IC50
Cisplatina (µM)
Melanoma murino
B16F10-Nex2
0,42
176
Carcinoma de cólon
humano
LS-180
HCT-8
0,26
0,22
> 200
> 200
Carcinoma de mama
humano
SKBr-3
ZR753A
0,26
0,34
66
> 200
Carcinoma do cervix
uterino humano
HeLa
CasKi
SiHa
0,3
0,24
0,19
68
140
> 200
Melanoma humano
Me91
SK-Mel 25
0,14
0,15
156
> 200
Leucemia
promielocítica humana
HL-60
1,0
70
Glioblastoma humano
U-87
3,5
150
54
Número de células viáveis (x104)
0
1
5
10
20
50
C7A (µM)
Figura 1: O complexo 7A não foi citotóxico para macrófagos murinos in vitro.
Macrófagos maturados a partir de progenitores de medula óssea foram incubados
com diferentes concentrações do ciclopaladado 7A. Após 6h, as células viáveis
foram contadas com o auxílio do corante de exclusão Trypan Blue.
55
Tabela 2: Porcentagem de hemólise causada por diferentes concentrações do
ciclopaladado 7A. Hemáceas coletadas de voluntários sadios humanos foram
incubadas por 2h com C7A, e a concentração de hemoglobina no sobrenadante
foi avaliada por leitura espectrofotométrica em 405 nm. Controles utilizados foram
hemáceas sem tratamento e hemáceas tratadas com 0.2% de Triton X-100. A
porcentagem de hemólise foi calculada em relação ao controle sem tratamento.
% de hemólise
Hemáceas sem tratamento
0
Triton X-100
100
Hemáceas + C7A 0,5µM
0
Hemáceas + C7A 1µM
0
Hemáceas + C7A 2,5µM
0
Hemáceas + C7A 5µM
0
Hemáceas + C7A 10µM
0
Hemáceas + C7A 20µM
0
56
Como foi demonstrado anteriormente que o mecanismo de ação do
complexo 7A sobre células de melanoma murino B16F10-Nex2 envolvia o
bloqueio da respiração celular, com a diminuição da acidificação extracelular,
esse parâmetro foi avaliado em algumas linhagens celulares tumorais
humanas. A acidificação extracelular foi avaliada utilizando-se um equipamento
específico, o Cytosensor Microphysiometer (Molecular Devices), onde a droga
é injetada nas células em pulsos, alternadamente a pulsos de meio sem droga
quando o pH do meio extracelular é quantificado. Esse sistema quantifica
alterações na acidificação extracelular em tempo real, que podem ser o
resultado de alterações na demanda de energia ocorrida em células viáveis,
respondendo a um estímulo, ou de alterações na troca de sódio-hidrogênio que
ocorre na membrana celular durante o controle homeostático do pH
intracelular.
Como se observa nos gráficos da Figura 2, enquanto o controle negativo
mantém valores estáveis durante todo o experimento, o ciclopaladado 7A
provoca uma queda abrupta na acidificação extracelular nas 3 linhagens
tumorais humanas testadas. Em 1h ou menos, a taxa de acidificação
extracelular diminuiu cerca de 80% nas células tratadas com o C7A, como
observado anteriormente com as células murinas B16F10-Nex2. Como
esperado, a Cisplatina não provocou alterações significativas no pH
extracelular das células analisadas, uma vez que o IC50 dessa droga nessas
linhagens foi muito alto, maior do que 200 µM.
O ciclopaladado 7A afeta tanto células de melanoma murino como
células tumorais humanas muito rapidamente, inibindo o seu metabolismo,
particularmente a geração de prótons na cadeia respiratória, sugerindo que a
57
mitocôndria pode ser um alvo do quimioterápico nas células tumorais, e que o
mecanismo de ação do C7A tanto em células tumorais murinas como humanas
pode ser o mesmo.
58
Acidificação (%)
Tampão
Cisplatina
C7A
Acidificação (%)
Tempo (min)
Tampão
Cisplatina
C7A
Acidificação (%)
Tempo (min)
Tampão
Cisplatina
C7A
Tempo (min)
Figura 2: Complexo 7A diminui os níveis de acidificação extracelular em células
tumorais humanas. As células foram plaqueadas em placas de transwell durante 24h
e mantidas em meio RMPI completo com 10% de soro fetal bovino. As cubetas
foram então ajustadas no Cytosensor Microphysiometer e o sistema foi calibrado
durante 20 minutos com meio RPMI contendo 1% de BSA. As drogas, C7A (10µM) e
Cisplatina (200µM), foram diluídas no mesmo meio, adicionadas no tempo zero e
inoculadas em pulsos durante todo o experimento.
59
4.2 Efeito antimetastático do Ciclopaladado 7A
A atividade antitumoral do complexo 7A foi anteriormente demonstrada no
tratamento do melanoma primário, onde células de melanoma murino B16F10Nex2 foram inoculadas subcutaneamente, e o volume tumoral, assim como a
mortalidade, nos animais tratados ou não foram acompanhadas (Rodrigues et
al, 2003).
Para
verificar
o
efeito
antimetastático
do
ciclopaladado
7A,
camundongos C57BL/6 foram inoculados intravenosamente com células
B16F10-Nex2 e a colonização pulmonar por essa linhagem tumoral foi avaliada
após 13 dias. Os animais receberam doses de 200ng/kg do composto a partir
do primeiro dia após a inoculação das células tumorais, 3 vezes por semana.
Após 13 dias, os animais foram sacrificados e os pulmões coletados para a
contagem de nódulos pulmonares. Em comparação ao grupo controle, que
receberam apenas injeções de PBS, notamos uma redução significativa no
número de nódulos pulmonares nos animais tratados com o ciclopaladado 7A,
mostrando que o protocolo utilizado reduziu significativamente a formação de
nódulos pulmonares (Figura 3).
Esse resultado sugere que o ciclopaladado 7A tem uma importante ação
antimetastática no melanoma murino B16F10-Nex2.
60
A
Controle
7A
B
Figura 3: O tratamento de camundongos C57Bl/6 inoculados com células de
melanoma murino com o Complexo 7A reduziu significativamente a formação de
nódulos
pulmonares
in
vivo.
Células
B16F10-Nex2
foram
inoculadas
intravenosamente em camundongos C57Bl/6. Os animais foram tratados
intraperitonealmente com 200ng/kg do complexo 7A, em dias alternados durante
13 dias. No 13º dia os animais foram sacrificados e o número de nódulos
pulmonares foi determinado. (A) Pulmões representativos dos animais controle
e tratados com C7A. (B) Quantificação dos nódulos pulmonares em animais
tratados e não tratados com o complexo 7A. Animais estão representados
individualmente em cada grupo e a linha horizontal representa a média, com a
barra de desvio padrão. p<0.05
61
4.3 Alterações morfológicas provocadas pelo Composto 7A:
Resultados preliminares anteriores sugeriram que o ciclopaladado 7A
leva células tumorais à morte por indução de apoptose. O tratamento de
células B16F10-Nex2 com C7A levou à degradação do DNA celular, de forma
independente de caspases 1 ou 3 (Rodrigues et al, 2003).
Iniciamos os estudos para determinação dos mecanismos pelos quais o
composto 7A causa morte das células tumorais pela avaliação das alterações
morfológicas sofridas pelas células tratadas. Células B16F10-Nex2 foram
cultivadas em lamínulas, tratadas com o quimioterápico e analisadas por
microscopia. Como pode ser observado na Figura 4, células B16F10-Nex2
tratadas com a droga apresentam alterações morfológicas em tempos bastante
curtos. Na presença da droga, observa-se uma retração do citoplasma e um
aumento da granulosidade citoplasmática, já visíveis após 5 minutos de
tratamento. A condensação nuclear fica mais evidente aos 15 minutos de
incubação com a droga (Figura 4D). Esses aspectos morfológicos são
característicos de eventos apoptóticos em células aderentes (Casciola-Rosen
et al, 1994).
62
A
B
C
D
Figura 4: Alterações morfológicas após tratamento com o complexo 7A
(10µM), observadas em microscopia óptica, como descrito em Materiais e
Métodos. Células B16F10-Nex2 (5x103 células/lamínula) foram incubadas com
10µM do ciclopaladado 7A. Mudanças na morfologia celular foram observadas
após 5 (B), 10 (C) e 15 (D) minutos de tratamento; (A) Células não tratadas.
Barra de aumento: 200µm
63
4.4 Interação do Ciclopaladado 7A com mitocôndrias
A inibição da geração de prótons pela cadeia respiratória provocada pelo
composto 7A sugeriu que a mitocôndria das células tumorais poderia ser
afetada pelo quimioterápico, e desta forma, avaliamos diversos parâmetros
ligados a essa organela após tratamento com o C7A.
O primeiro parâmetro estudado foi o potencial de membrana mitocondrial
(∆Ψm) em células tratadas. Para isso, as células tumorais foram pré-tratadas
com TMRE, reagente fluorescente capaz de atravessar membranas íntegras,
rapidamente seqüestrado por mitocôndrias ativas e utilizado para medir o
potencial de membrana dessas organelas. As células vivas foram então
observadas em microscópio de fluorescência sem fixação, desde antes da
adição do quimioterápico, e as mitocôndrias de várias células na presença da
droga foram acompanhadas. Em condições de repouso, previamente à adição
do complexo 7A, as mitocôndrias aparecem regularmente distribuídas como
estruturas alongadas ao longo do citoplasma celular, com um alto valor de
∆Ψm (Figura 5A). Após a adição do complexo 7A, observou-se uma rápida
redução dos valores de ∆Ψm, que se mantiveram até o momento que o FCCP
foi adicionado, reagente responsável pela promoção do colapso máximo de
potencial de membrana mitocondrial. As várias mitocôndrias de cada célula
foram analisadas individualmente, e nas Figuras 5B, 5C e 5D estão
representados gráficos que mostram as diferentes variações do ∆Ψm
observadas após o tratamento com o C7A. Na Figura 5B está representada
uma mitocôndria com colapso do ∆Ψm, efeito observado em 88% das
mitocôndrias das células tratadas (Tabela 3). Na Figura 5C observa-se o perfil
64
de uma mitocôndria com aumento do ∆Ψm, o que foi observado em 11% das
organelas analisadas (Tabela 3). E por fim, na Figura 5D está representado o
perfil de organelas não responsivas à droga C7A, que correspondem somente
a 1% das organelas analisadas no ensaio (Tabela 3).
Esse resultado demonstrou que quase a totalidade das mitocôndrias
analisadas foi afetada pelo ciclopaladado 7A, sofrendo uma diminuição ou
elevação do ∆Ψm, o que leva a uma inibição do processo respiratório e da
produção de energia para a manutenção da viabilidade celular.
65
A
+ C7A
B16F10 -Nex2
+ FCCP
B
500
400
300
200
100
0
Intensidade de Fluorescência
1 10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 100
C7A 1µM
FCCP 5µM
C
6000000
5000000
4000000
3000000
2000000
1000000
0
1
2500000
10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 100
C7A 1µM
FCCP 5µM
2000000
D
1500000
1000000
500000
0
1 10 19 28 37 46 55 64 73 82 91 100
C7A 1µM
FCCP 5µM
7A
1µM
FCCP
5µM
Imagem
Figura 5: Tratamento das células B16F10-Nex2 com o complexo 7A provoca colapso
no potencial de membrana mitocondrial (∆Ψm). (A) Imagem representativa da ∆Ψm
após adição de C7A e FCCP. As fotos mostram uma das 100 imagens adquiridas a 1
quadro/6 segundos com objetiva de 40X, representativa do colapso de ∆Ψm. Barra de
aumento: 20µm. Em B, C e D, gráficos representativos mostrando o colapso do
potencial de membrana, aumento do potencial de membrana e mitocôndrias não
responsivas, respectivamente. As setas indicam o momento de adição das drogas.
66
Tabela 3: Porcentagem de mitocôndrias totais que apresentaram variação
no ∆Ψm após tratamento com o ciclopaladado 7A.
C7A (%)
Colapso do
88
∆Ψm
Aumento do
11
∆Ψm
Não
1
responsivas
Foram também analisados outros parâmetros para confirmar a
participação da mitocôndria na morte celular pela via intrínseca provocada pelo
C7A.
Um dos eventos pró-apoptóticos mais importantes que levam a um
processo de morte celular pela via intrínseca é a translocação da proteína Bax.
Bax
é
um
membro
pró-apoptótico
da
família
Bcl-2
localizado
predominantemente no compartimento citosólico em células viáveis. Quando a
célula sofre qualquer estímulo apoptótico, uma fração significativa da proteína
Bax é translocada para a membrana externa mitocondrial (Wolter et al, 1997).
Para verificar se o tratamento com o ciclopaladado 7A induz a translocação da
67
proteína Bax para as mitocôndrias, células de melanoma murino foram
transfectadas
com
um
plasmídeo
expressando
a
proteína
quimérica
fuorescente GFP-Bax, e realizou-se um ensaio em microscopia vital, aonde as
células são mantidas viáveis e observadas, não fixadas, em tempo real. Como
mostra a Figura 6, o complexo 7A provoca translocação de Bax para as
mitocôndrias da célula. Após 2h30min, é possível visualizar a translocação da
proteína Bax, caracterizada pela presença de intenso pontilhado ao longo da
célula. A translocação de Bax para a mitocôndria está associada com a
liberação do citocromo C da mitocôndria e ao colapso do potencial de
membrana mitocondrial (Smaili et al, 2001).
68
0h
A
3h
0´
B
1h30´
30´
1h
2h
2h30´
3h
1h 30´
Figura 6: Complexo 7A promove translocação da proteína GFP-Bax citoplasmática para
mitocôndrias em células de melanoma murino. Células B16F10-Nex2 transfectadas com a
proteína GFP-Bax foram incubadas com o complexo 7A. A translocação da proteína próapoptótica Bax do citoplasma para as mitocôndrias foi observada em microscopia de
fluorescência vital, com objetiva de 40X. (A) Imagem representativa de um campo onde
todas as células transfectadas e tratadas com C7A sofreram translocação de Bax após
3h. Barra de aumento: 20µm. (B) Imagem representativa de uma única célula isolada em
diversos tempos.
69
Recentemente foi demonstrado por Santana et al (2009) que o
ciclopaladado 7B [Pd(C2,N-(R(+)dmpa)(dppe)].Cl, um enantiômero do complexo
7A, interage com grupos tióis em proteínas da membrana mitocondrial,
catalisando ligações cruzadas desses grupos e levando à permeabilização
mitocondrial, em ensaios utilizando mitocôndrias isoladas de fígado de rato.
Para verificar se C7A poderia apresentar esse mesmo efeito, células B16F10Nex2 foram incubadas, in vitro, com C7A na presença de DTT, um agente
redutor dos grupos tióis. Observamos que, na presença de DTT, o efeito
citotóxico do ciclopaladado foi completamente suprimido e as células
permaneceram
viáveis
mesmo
após
2 horas
de
incubação
com o
quimioterápico (Figura 7A). O efeito do DTT na alteração do potencial de
membrana mitocondrial causado pelo C7A também foi avaliado. Como
mostrado nas Figuras 7B e 7C, o DTT inibiu completamente o colapso de
potencial de membrana causado pelo C7A, inibindo a redução da fluorescência
do indicador TMRE.
Surpreendentemente, a análise individual das mitocôndrias nesse ensaio
demonstrou que 85% das células que receberam o tratamento com DTT
apresentaram organelas não responsivas ao ciclopaladado (Tabela 4).
Somente 15% das células apresentaram aumento ou diminuição do ∆Ψm.
Esses resultados sugerem que o complexo 7A interage diretamente com as
proteínas presentes na membrana mitocondrial, provocando um colapso no
potencial de membrana mitocondrial, translocação de Bax, com posterior
liberação de citocromo C, confirmando a morte celular através da via intrínseca
mitocondrial.
70
A
1 hora
B
C7A + DTT
+ FCCP
20.000.000
15.000.000
10.000.000
5.000.000
0
1
10
19
28
37
46
55
64
73
82
91
100
C
Intensidade de Fluorescência
B16F10 -Nex2
2 horas
Imagem
7A 1µM
+ DTT
FCCP
5µM
Figura 7: Efeito in vitro do complexo 7A é completamente inibido pela
adição de DTT. (A) Ensaio de citotoxicidade in vitro em presença e
ausência de DTT. Células B16F10-Nex2 foram pré-incubadas com 2mM
de DTT durante 15 minutos. Em seguida, as células foram tratadas com
10µM de C7A durante 1 ou 2 horas. A porcentagem de células viáveis
foi comparada às células sem tratamento. (B) Imagens representativas
da ∆Ψm após pré-incubação das células B16F10-Nex2 com DTT e
C
posterior tratamento com C7A e FCCP. As fotos mostram 3 de 100
imagens adquiridas a 1 quadro/6 segundos com objetiva de 40x. Barra
de aumento: 20µm. (C) Representação gráfica da intensidade de
fluorescência do ensaio. As setas indicam o momento de adição das
drogas.
71
Tabela 4: Porcentagem de mitocôndrias totais que apresentaram variação no ∆Ψm após
tratamento com o ciclopaladado 7A na presença de DTT.
C7A +DTT (%)
Colapso ∆Ψm
6
Aumento ∆Ψm
9
Não
responsivas
85
4.5 Alterações mitocondriais observadas por microscopia eletrônica de
transmissão em células de melanoma murino tratadas com C7A
Como demonstrou-se que o ciclopaladado 7A afeta as mitocôndrias das
células B16F10-Nex2, provocando um colapso do potencial de membrana
totalmente inibido por DTT, e a translocação de Bax, estudamos também a
morfologia dessas organelas após o tratamento com o quimioterápico.
Observou-se que as mitocôndrias das células tumorais tratadas com 1µM
de C7A por 15 minutos mostram-se alteradas, sem a disposição típica das
cristas mitocondriais. Observou-se também que o citoplasma das células
tratadas encontrava-se menos elétron-denso, e que a integridade da
membrana plasmática foi mantida (Figura 8).
72
Esse resultado comprova o efeito do ciclopaladado 7A sobre as
mitocôndrias da célula tumoral, induzindo um processo apoptótico intrínseco.
A
B
M
M
MP
N
N
Figura 8: Microscopia de transmissão eletrônica das células B16F10-Nex2
tratadas com o ciclopaladado 7A. (A) Células não tratadas. (B) Células
tratadas com 1µM de C7A, por 15 minutos. N: núcleo; M: mitocôndria; MP:
membrana plasmática. Barra da escala 0.5µm
73
4.6 Participação do cálcio no processo de morte induzido pelo
Ciclopaladado 7A.
A homeostase do cálcio, que se mantém em concentrações muito
baixas intracelularmente, na ordem de nanomolar, é importante para a fisiologia
celular e sua regulação depende de um sistema complexo (Haak et al, 2000).
Alterações na concentração de cálcio podem desencadear apoptose, ou ainda
exacerbar um estímulo apoptótico prévio. Avaliamos então se o tratamento com
o complexo 7A poderia aumentar a concentração de cálcio intracelular,
colaborando assim com a cascata pró-apoptótica. Células B16F10-Nex2 foram
incubadas com o fluoróforo Fura-2AM, que permite a quantificação do cálcio
intracelular. Quando as células foram incubadas em tampão contendo cálcio,
observou-se que o tratamento das células de melanoma murino com o
complexo 7A provoca um aumento significativo de cálcio intracelular. E quando
as células tumorais foram incubadas em tampão desprovido de cálcio,
observou-se também um aumento do cálcio intracelular, embora em menor
intensidade (Figura 9).
Esse resultado sugere que o tratamento com o ciclopaladado 7A induza
a
liberação
de
cálcio
de
organelas
celulares
(mitocôndrias,
retículo
endoplasmático), mas que também uma pequena concentração de cálcio
extracelular é internalizada, o que potencializa o efeito apoptótico causado pelo
quimioterápico.
74
B
+ Cálcio
- Cálcio
100
50
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0
-20
-40
0 100 200 300 400 500
-10
0 50 100 150 200 250 300 350
Imagem
Razão de Fluorescência(340/380 nm)
Razão de Fluorescência (340/360nm)
A
100
80
*
60
40
20
0
+ Cálcio
- Cálcio
.
Figura 9: Ciclopaladado 7A induz liberação de cálcio intracelular. (A)
Representação gráfica da variação da concentração de cálcio intracelular em
células B16F10-Nex2 marcadas com o indicador Fura-2AM e tratadas com C7A
em meio contendo ou não cálcio. Células tumorais foram pré-incubadas com
FURA-2AM e tratadas no tempo 0 com C7A (B) Gráfico que representa a média
da concentração do cálcio em 50 células analisadas ; *p<0,05
75
4.7 Ativação de caspases
Um dos eventos característicos da apoptose é a ativação de caspases.
Como nossos resultados sugerem uma morte celular por ativação da via
intrínseca mitocondrial, avaliamos o perfil de caspases ativadas nestes eventos
de morte celular gerados pelo ciclopaladado. O complexo 7A é capaz de ativar
a caspase-3, como observado em ensaio de citometria de fluxo, de maneira
bastante semelhante ao controle positivo, Actinomicina D (Figura 10A).
Avaliando-se a ativação de outras caspases, agora por um método
colorimétrico (Figura 10B), observou-se que o tratamento com o ciclopaladado
7A ativou todas as caspases avaliadas, caspase 2, 3, 6, 8 e 9, da mesma
forma que o tratamento com a luz UV (controle positivo no ensaio). A ativação
de caspases pode levar à degradação do DNA celular, levando assim a célula
à morte.
76
C7A
Actinomicina D
A
C2
C1
Ativação de Caspase 3 (%)
B
Controle
UV
7A
Figura 10: O tratamento com o ciclopaladado 7A ativa caspases nas células
B16F10-Nex2. (A) Ativação de caspase 3 nas células B16F10-Nex2 após 24h
de incubação com Actinomicina D (10µg) ou C7A (10µM). C1, células
B16F10-Nex2 sem nenhum tratamento. C2, células B16F10-Nex2 incubadas
somente com anticorpos anti-caspase 3. Amostras foram analisadas por
citometria de fluxo. (B) Ativação de caspases quantificada por ensaio
colorimétrico, após tratamento com C7A (10µM) ou exposição à luz UV, como
descrito em Materiais e Métodos. Controle, células sem nenhum tratamento.
77
4.8
Alterações nucleares e degradação do DNA induzidas pelo
Ciclopaladado7A
Células B16F10-Nex2 foram incubadas com o corante fluorescente
Hoechst 33342, que se liga ao DNA, com o objetivo de avaliar se o complexo
7A provoca alterações nucleares. Foram consideradas as seguintes alterações
nucleares: aumento na intensidade de fluorescência do indicador Hoescht
33342 e presença de núcleos picnóticos.
Observamos que o composto ciclopaladado 7A induz alterações
nucleares de modo tempo dependente (Tabela 4). Na Figura 11A, observa-se
que as células B16F10-Nex2 não tratadas apresentam núcleos corados e com
pouca ou nenhuma condensação nuclear. Entretanto, o tratamento das células
com o complexo 7A deixa os núcleos bastante fluorescentes, sugerindo uma
intensa condensação nuclear, e ainda alguns núcleos picnóticos.
Em seguida, foram realizadas extrações do DNA genômico de células
B16F10-Nex2 após tratamento com o complexo 7A. Através desta metodologia
é possível visualizar degradação do DNA característica de processo apoptótico,
observando-se fragmentos com pesos moleculares múltiplos de 200 pares de
bases,
resultante
da
atividade
da
nuclease
CAD
(caspase-activated
deoxyribonuclease), que é ativada por caspase-3. Podemos observar na Figura
11B que o DNA extraído das células tratadas com o C7A apresentou padrão
semelhante ao observado em células que sofreram apoptose, tratadas com
Actinomicina D (controle positivo do ensaio).
78
Esse resultado corrobora a ativação da caspase 3 com a consequente
ativação da nuclease CAD, e que o tratamento com o ciclopaladado 7A leva
células tumorais à morte por apoptose.
Tabela 4: Porcentagem das células B16F10-Nex2 que apresentaram
alterações nucleares como aumento na intensidade da fluorescência e núcleos
picnóticos após o tratamento com o ciclopaladado 7A.
Tempo (min)
%
0
5
10
25
6.5
12.5
41
85
79
A
Figura 11: Alterações nucleares e degradação de DNA causada pelo complexo 7A.
(A) Imagens representativas das células murinas tratadas com C7A durante 0, 5, 10 e
25 minutos. O aumento da fluorescência das células marcadas com Hoechst 33342
indica condensação nuclear. As setas representam alterações nucleares tais como:
aumento na intensidade de fluorescência e presença de núcleos alongados e/ou
picnóticos. (B) Células B16F10-Nex2 foram tratadas durante 24h com C7A (10µM) ou
Actinomicina D (Act D, 10µg). B16F0-Nex2, células sem tratamento. O DNA celular
foi extraído, separado por eletroforese em gel 0.8% e visualizado pela coloração por
brometo de etídio. STD: Marcador de peso molecular, fragmentos de 1Kb (Invitrogen).
Barra de aumento: 20µm.
80
C7A
25`
Act D
10`
B
B16F10 -Nex2
5`
STD
0`
4.9 A morte celular causada pelo ciclopaladado 7A em células tumorais
não é dependente de catepsinas
Um dos ciclopaladados sintetizados, denominado Ciclopaladado 6B
(Rodrigues et al, 2003), apresenta atividade antitumoral contra células
leucêmicas in vitro, levando as células tumorais à morte através de um
processo
de
apoptose
por
liberação
de
enzimas
lisossomais.
Este
quimioterápico induz a liberação de catepsina B das organelas lisossomais, e
catepsinas vem sendo implicadas na regulação das vias intrínseca e extrínseca
de apoptose, assim como cogita-se que as mesmas tenham uma atividade
enzimática direta sobre caspases. Para verificar se o efeito do ciclopaladado
7A poderia envolver a participação de enzimas lisossomais nas células de
melanoma murino B16F10-Nex2, catepsinas foram inibidas previamente ao
tratamento com o quimioterápico.
Primeiramente, foi utilizado o inibidor de cisteíno-proteases E-64, capaz
de atravessar a membrana das células tumorais. Após pré-incubação com o
inibidor na concentração de 200, 300 ou 400µM por 120 minutos, as células
foram tratadas com 1µM de C7A e a viabilidade celular foi avaliada. Como pode
ser observado na Figura 12A, o pré-tratamento com E-64 não conseguiu
prevenir a morte celular causada pelo complexo 7A, sugerindo que enzimas
lisossomais não estejam envolvidas no processo de morte causado pelo C7A.
O mesmo ensaio foi realizado utilizando um inibidor seletivo de catepsina B, o
CA-074-Me
(N-(L-3-trans-Propylcarbonyl-oxirane-2-carbonyl)-L-isoleucyl-L-
proline methyl ester), derivado metilado e permeável do composto CA-074
(Figura 12B). Novamente, não se observou inibição do efeito do C7A.
81
As concentrações utilizadas nos ensaios descritos foram previamente
determinadas
como
não
tóxicas
para
células
B16F10-Nex2,
e
são
concentrações capazes de inibir seletivamente a atividade enzimática nessas
células in vitro (Paschoalin, T. Comunicação pessoal).
Esses resultados mostram que catepsinas não participam no processo
de morte induzido pelo C7A.
82
número de células viáveis (x104)
A
60
50
40
30
20
10
0
Controle
7A 1µM
200µM
350µM
500µM
200µM
350µM
500µM
E-64 + 7A
E-64
B
50
45
40
n° de células viáveis (x104)
35
30
25
20
15
10
5
0
Controle
7A (1µM)
10µM
5µM
2.5µM
10µM
5µM
2.5µM
Figura 12: Atividade do ciclopaladado 7A sobre células tumorais não é
7A + Ca074-Me
Ca074-Me
dependente de catepsinas. Células B16F10-Nex2 foram pré-incubadas com
inibidores e tratadas com C7A por 24h. A viabilidade celular foi derminada com
Trypan Blue. (A) Diferentes concentrações de E-64 foram usadas na presença
ouE-64
não de 1 µM de C7A. (B) Diferentes concentrações de Ca074-Me foram
usadas na presença ou não de 1 µM de C7A.
83
4.10 Efeito do Ciclopaladado 7A no processo angiogênico
Além da atividade direta sobre as células tumorais, o composto 7A pode
afetar também o processo angiogênico. Este fenômeno caracteriza-se pela
formação de novos vasos sanguíneos no ambiente tumoral, favorecendo assim
o crescimento do tumor in vivo. Para este estudo, foi padronizado um ensaio in
vitro em nosso laboratório (Paschoalin et al, 2007) onde utiliza-se células
endoteliais do cordão umbilical humano (HUVECs) em presença de Matrigel. O
Matrigel consiste em matriz extracelular secretada por células de sarcoma
murino, que contém uma série de componentes presentes na matriz, como, por
exemplo, laminina e colágeno IV, capazes de ativar a formação de neo-vasos
por células endoteliais.
Primeiramente,
determinou-se
a
atividade
citotóxica
direta
do
ciclopaladado 7A in vitro sobre as células HUVECs, na ausência do Matrigel.
Na Figura 13A observa-se que o complexo 7A é bastante tóxico para a
linhagem de células endoteliais HUVEC, pois a concentração de 1µM é
próxima do IC50 do quimioterápico. A concentração de 0.5 µM corresponde
aproximadamente ao IC20 do C7A para essa linhagem celular. Desta forma,
utilizamos as concentrações de 0,5 e 0,2 µM para verificar a capacidade de
inibição da formação estruturas pró-angiogênicas no ensaio padronizado.
Observou-se que a concentração de 0,5 µM do C7A, que inibiu 20% do
crescimento da linhagem de células HUVEC in vitro, inibiu 100% da formação
de estruturas pró-angiogênicas in vitro, sugerindo que o ciclopaladado 7A
84
possa também apresentar um efeito sobre a angiogênese tumoral in vivo, além
da atividade citotóxica direta sobre as células tumorais.
1,4
A
1,2
Abs 570 nm
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,1
0,2
0,5
1
2
5
B
No. estruturas pré-angiogênicas
C7A (µM)
60
50
40
30
20
10
0
0
0,2
0,5
1
C7A (µM)
Figura 13: Efeito do ciclopaladado 7A sobre a angiogênese. Diferentes concentrações de
C7A foram diluídas em meio contendo 0,2% de SFB e adicionadas a 5x103 células
HUVEC. (A) Citotoxicidade do complexo 7A sobre as células HUVECs in vitro. (B)
Representação gráfica do número de estruturas pró-angiogênicas contadas por poço. As
células foram cultivadas em placa de 96 poços contendo Matrigel, como descrito em
Materiais e Métodos
85
5.0 RESULTADOS: COMPOSTOS DE RUTÊNIO
5.1 Compostos de Rutênio apresentam ação citotóxica in vitro
Em colaboração com o Prof. Dr. Douglas Wagner Franco, foram testados
compostos tetraamina rutênio doadores de óxido nítrico, que apresentam a
fórmula geral trans-[Ru(NH3)4L(NO)], onde L é um ligante de estabilização do
complexo e os grupos imidazol, isonicotinamida, L-histidina, piridina ou picolina
foram testados (Borges et al, 1998). Alguns destes compostos, como por
exemplo, trans-[Ru(NO)(NH3)4isn] (BF4)3 e trans-[Ru(NO)(NH3) 4imN] (BF4)3
já foram testados em modelo experimental de doença de Chagas, aonde
observou-se que estes compostos eram capazes de lisar o parasita
Trypanossoma cruzi in vitro e in vivo (Silva et al, 2009). Os compostos
conseguiram eliminar ninhos de amastigotas no tecido do miocárdio, com uma
dose de 400nmol/kg, garantindo a sobrevivência de todos os animais
infectados. Além disso, estes compostos tetraamina rutênio doadores de óxido
nítrico foram também eficientes na indução de vasodilatação, já que estes
agentes induziram um efeito relaxante nos anéis da artéria aorta (Zanichelli et
al, 2007).
A ação do óxido nítrico é bastante variada no câncer, já que a literatura
relata funções antineoplásicas versus proneoplásicas (Mocelin et al, 2007)
Portanto, a atividade final do óxido nítrico no câncer é dependente do
microambiente, incluindo o tipo de célula exposto ao composto, concentração
intracelular final e duração da exposição intracelular ao óxido nítrico (Huerta et
al, 2008). Alguns estudos demonstram que o óxido nítrico apresenta
86
propriedades antiapoptóticas em células de melanoma, enquanto que outros
trabalhos sugerem que o óxido nítrico pode inibir metástases, diminuindo a
resistência ao quimioterápico (Ekmekcioglu et al, 2005).
Para verificar se os compostos tetraamina rutênio sintetizados com o
objetivo de liberar NO apresentavam atividade antitumoral no modelo
experimental de melanoma, células B16F10-Nex2 foram incubadas por 24h na
presença dos diferentes compostos de rutênio sintetizados. As células viáveis
pós-tratamento foram contadas e os valores de IC50 foram calculados. Como
pode ser observado na Tabela 1, a maioria dos compostos nitrosados
causaram redução na viabilidade da linhagem celular analisada. Com exceção
do composto Ru(NO)Hedta, todos os compostos nitrosados apresentaram IC50
abaixo de 100
M. Os 3 compostos sulfatados testados, sintetizados com os
mesmos ligantes para controle dos compostos doadores de NO, apresentaram
IC50 acima de 100 µM, chegando a 1 mM.
Baseando-se nos valores de IC50 e na estrutura dos compostos testados,
escolhemos apenas três para seguir com os ensaios in vivo. Selecionamos dois
compostos doadores de óxido nítrico. São eles: trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3,
por apresentar o IC50 mais baixo dos compostos testados (1
M), trans-
[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, pelo seu valor intermediário de IC50 (74
M), e como
controle negativo dos experimentos, escolhemos um composto sulfatado,
incapaz de liberar óxido nítrico, mas com o mesmo ligante de um dos
compostos selecionados, trans-[Ru(NH3)4imN(SO4)]Cl, com um valor de IC50
bastante elevado, 444 µM.
87
Em seguida, um ensaio de citotoxicidade celular in vitro sobre linhagens
tumorais humanas foi realizado com os dois compostos selecionados: trans[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3
e
o
seu
controle
sulfatado
trans-
[Ru(NH3)4imN(SO4)]Cl. Analisando as Tabelas 2 e 3 observa-se que ambos os
compostos são citotóxicos contra células tumorais humanas. Entretanto, as
células tumorais humanas parecem ser mais resistentes ao composto doador
de óxido nítrico do que as células de melanoma murino, uma vez que os IC50
para as células humanas ficaram em torno de 300 µM enquanto para as células
murinas foi de 74 µM. Já para o composto sulfatado, os valores de IC50 foram
semelhantes, tanto para as células murinas como para as células humanas.
Esses resultados mostram que compostos de rutênio doadores de óxido
nítrico, além de atividades anti-parasitária e angiogênica, também apresentam
atividade antitumoral in vitro sobre células de melanoma murino e linhagens
tumorais humanas.
88
Tabela 1. Valores de IC50 dos compostos trans-[RuIII(NO+)(NH3)4(L)]3 e alguns
compostos sulfatados, sintetizados como controle, testados em células de
melanoma murino B16F10-Nex2
COMPOSTOS DE RUTÊNIO
IC50 (µM)
trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3
1
trans-[Ru(NO)(NH3)44-pic](BF4)3
6
trans-[Ru(NO)(NH3)4nic](BF4)3
20
trans-[Ru(NO)(NH3)4P(OEt)3](PF6)3
33
trans-[Ru(NO)(NH3)5](BF4)3
44
trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3
74
trans-[Ru(NO)(NH3)4py](BF4)3
86
[Ru(NO)Hedta]
> 4000
trans-[Ru(NH3)4isn(SO4)]Cl
137
trans-[Ru(NH3)4imN(SO4)]Cl
444
trans-[Ru(NH3)4L-his(SO4)]Cl
1000
89
Tabela 2. Valores de IC50 do composto trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3 em
células tumorais humanas tratadas in vitro.
Linhagens tumorais humanas
IC50 (µM)
A2058
335
HCT
287
Siha
333
Tabela 3. Valores de IC50 do composto trans-[Ru(NH3)4imN](SO4)]Cl em células
tumorais humanas tratadas in vitro.
Linhagens tumorais humanas
IC50 (µM)
SKMel25
338
SKMel28
297
HCT
271
LS180
399
Siha
272
MDA
319
MCF-7
459
U-87
389
HL-60
436
90
5.2 Alterações morfológicas causadas por Compostos de Rutênio nas
células tumorais in vitro
Para determinar o mecanismo de ação pelo qual os compostos de
rutênio nitrosados poderiam estar levando as células tumorais à morte, foram
primeiramente analisados os aspectos morfológicos das células B16F10-Nex2
tratadas com um dos compostos doadores de óxido nítrico, o trans[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, daqui para frente denominado de RuImNO e com o
composto controle trans-[Ru(NH3)4imN(SO4)]Cl, denominado RuImSO4. Após o
tratamento das células por 24h com as doses de IC50 já mostradas na Tabela 1,
pode-se observar alterações morfológicas bastante significativas (Figura 1). As
células incubadas na presença do composto RuImNO mostram uma completa
destruição celular, com perda da integridade de membrana, liberação do
conteúdo citoplasmático, e intensa formação de debris. Essas características
morfológicas sugerem a indução de um processo necrótico pelo composto
nitrosado. Por outro lado, as células de melanoma murino tratadas com o
composto RuImSO4 mostram uma retração citoplasmática, com a manutenção
da integridade da membrana plasmática, sugerindo a indução de um processo
apoptótico de morte celular.
91
200X
400X
Controle
RuImNO
RuImSO4
Figura 1: Alterações morfológicas nas células tumorais murinas após o
tratamento com os compostos trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3 (RuImNO) e
trans-[Ru(NH3)4imN(SO4)]Cl
(RuImSO4).
Células
B16F10-Nex2
(5x103
células/poço) foram incubadas com os valores de IC50 dos respectivos
compostos. Mudanças na morfologia celular foram observadas após 24h de
incubação, em microscópio ótico NiKon Eclipse E600, em aumentos de 200
e 400 X, em contraste de fase, como descrito em Materiais e Métodos. Barra
de aumento: 20µm.
92
5.3 Degradação de DNA provocada por Compostos de Rutênio
Em seguida, foi avaliada a integridade do DNA após o tratamento com os
compostos RuImNO e RuImSO4. O DNA genômico foi extraído das células
B16F10-Nex2 após o tratamento com o IC50 dos compostos por 24h. Pode-se
observar na Figura 2 que o DNA extraído das células tratadas apresentou
padrão de degradação semelhante ao observado em células que sofreram
apoptose induzida por 10 µM de Camptotensina, conhecido agente indutor de
apoptose.
93
-
1
B
6
F
0
vd
a
Z
vd
a
-
Z
-
Z
+
Z
+
m
n
IO
N
+
+
stC
a
n
m
p
o
ie
IN
m
n
O
stC
a
n
m
p
o
ie
B16F10-Nex2 + RuImSO4
-
-
B16F10-Nex2 + Captotensina
e
N
2
x+
vd
a
a
vd
B16F10-Nex2
Standard
1
B
6
F
0
m
n
IO
N
B16F10-Nex2 + RuImNO
-
B16F10-Nex2 + Captotensina
B16F10-Nex2
Standard
a
tn
S
d
r
e
N
2
x
stC
a
n
m
p
o
ie
stC
a
n
m
p
o
ie
e
N
2
x+
N
xe
2
+
-
-
1
B
6
F
0
0
1
F
6
B
=
0
N
1
F
xB
6
e
2
+
Figura 2: Degradação de DNA causada pelos compostos RuImNO e RuImSO4.
Células B16F10-Nex2 foram tratadas durante 24h RuImNO (74µM), RuImSO4
(444µM) e Camptotensina (10µM). O DNA celular foi extraído e separado por
eletroforese em gel 0.8% e visualizado pela marcação por brometo de etídio.
Standard: Marcador de peso molecular, fragmentos de 1Kb (Invitrogen). B16F10Nex2, células controle não tratadas.
94
5.3 Efeito do RuImNO na angiogênese
Existem vários relatos na literatura demonstrando o papel do óxido nítrico
na progressão tumoral, principalmente promovendo a angiogênese no
microambiente tumoral, facilitando o crescimento do tumor in vivo (Bonavida et
al, 2006; Ambs et al, 1998). Entretanto, existem relatos que, dependendo da
concentração, o óxido nítrico pode inibir o desenvolvimento tumoral (Huerta et
al, 2008). Desta forma, analisamos o efeito do composto RuImNO no processo
angiogênico in vitro.
Inicialmente, foi analisado se o composto apresentava ação direta in vitro
sobre as células HUVECs, na ausência do Matrigel. A Figura 3A mostra que o
composto RuImNO não apresenta atividade inibitória significativa sobre a
viabilidade das células endoteliais humanas nas concentrações utilizadas, de
10 a 500 µM. Na concentração mais alta houve uma redução de cerca de 25%
na viabilidade celular quantificada por MTT.
Para a verificação do efeito do complexo RuImNO no processo de
angiogênese, foi utilizado um ensaio in vitro, padronizado em nosso laboratório
por Paschoalin et al , 2007, com as concentrações de 25, 100 e 250µM do
complexo, e cultivo das células em presença de Matrigel. Após 18h de
incubação, o número de estruturas pré-angiogênicas foram contadas como
descrito em Materiais e Métodos (Figura 3B) e representadas graficamente
como mostrado na Figura 3C. Observa-se que nas concentrações de 100 e
250µM, o composto RuImNO foi capaz de inibir significativamente a formação
de novos vasos, sugerindo que in vivo o complexo de Rutênio doador de NO
95
pode
também
apresentar
um
efeito
desenvolvimento tumoral.
96
antiangiogênico,
interferindo
no
Abs (570nm)
A
0
B B
10
25
50
100
250
500
RuImNO (µM)
250 µ M
C
100 µ M
25 µ M
nº de estruturas pré-angiogênicas
Controle
0
250
100
25
RuImNO (µM)
Figura 3: Efeito do composto RuImNO sobre a angiogênese. O quimioterápico foi
diluído em meio contendo 0.2% de SFB em diferentes concentrações e incubado na
presença de 5x103 células HUVEC. As células foram adicionadas em placa de 96
poços contendo Matrigel. (A) Citotoxicidade in vitro do composto sobre as células
HUVECs. (B) Fotos representativas da formação de estruturas pré-angiogênicas após
18h de incubação na presença de Matrigel. (C) Representação gráfica do número de
estruturas pré-angiogênicas contadas. Cada ponto foi feito em triplicata.
97
5.4 Estabelecimento de protocolo terapêutico in vivo para avaliação do
efeito antitumoral dos Compostos de Rutênio
Foram realizados ensaios in vivo com os dois compostos de rutênio
doadores de NO selecionados pelos valores de IC50 obtidos in vitro, como
descrito anteriormente.
Camundongos C57Bl/6 foram desafios subcutaneamente com 5x104
células B16F10-Nex2. No dia seguinte após o desafio, os animais foram
tratados com injeções intraperitoneais com diferentes doses dos seguintes
compostos:
trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3
ou
RuIsnNO,
e
trans-
[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, ou RuImNO. Ambos os compostos apresentam
estruturas químicas bastante semelhantes, possuindo um átomo de Rutênio
complexado a 4 moléculas de NH3, que se liga ao NO e a um ligante que
estabiliza a estrutura. A diferença entre os dois é o ligante que estabiliza a
molécula: o composto RuImNO possui um grupo Imidazol como ligante,
enquanto que o composto RuIsnNO possui o grupo isonicotinamida. Foram
usadas as concentrações de 100nmol e 500nmol por dose, por animal para o
composto RuImNO e de 10 e 100nmol por dose, por animal para o composto
RuIsnNO. A concentração selecionada dos compostos para os ensaios in vivo
baseou-se nas concentrações utilizadas em ensaios com animais Balb/c para o
tratamento experimental da Leishmaniose e da Doença de Chagas, aonde
observou-se que o tratamento foi bastante eficiente. Cada grupo de animais foi
tratado durante duas semanas em dias alternados. Após este período, os
animais foram acompanhados para avaliação do desenvolvimento tumoral e
valores de sobrevida.
98
A Figura 4 mostra a evolução tumoral e as porcentagens de sobrevida
dos animais tratados com RuIsnNO. Observa-se que o tratamento dos animais
com a dose de 10nmol foi mais eficiente do que o tratamento com a dose de
100nmol. Observou-se que 40% e 20% dos animais ficaram livres de tumor nas
doses de 10 e 100nmol, respectivamente, sugerindo que doses menores do
composto apresentam menor toxicidade in vivo. No entanto, observa-se
claramente que enquanto um grupo de animais responde ao tratamento, o
desenvolvimento tumoral de alguns animais (60% e 80% para as doses de 10 e
100nmol, respectivamente) não é afetado pela droga, e os tumores se
desenvolvem de forma muito similar aos animais não tratados.
No tratamento com o composto RuImNO, tanto no grupo de animais
tratados com 100nmol do composto como no grupo que recebeu 500nmol da
droga observou-se que 40% dos animais ficaram livres de tumor (Figura 5).
Novamente, observam-se 2 grupos distintos de animais: os responsivos, que
são protegidos; e os não responsivos, que para este composto parecem
desenvolver os tumores de forma mais exacerbada que os controles não
tratados, indo a óbito mais rapidamente.
Apesar do efeito terapêutico dos compostos RuIsnNO e RuImNO in vivo
sobre um grupo de animais responsivos, tanto na Figura 4 quanto na Figura 5
nota-se que existem alguns animais do grupo tratado que morrem
precocemente, até mesmo antes dos animais do grupo tratado apenas com
PBS, com volumes tumorais abaixo dos 3 cm3. Isso se deve provavelmente ao
efeito tóxico destes compostos doadores de óxido nítrico. Observamos que
durante as semanas de tratamento, os animais que recebiam os compostos
ficaram bastante debilitados. Havia queda de pêlos e alguns animais perdiam
99
peso (dados não mostrados). Estes sintomas também foram observados nos
animais livres de tumor. Ao término das duas semanas de tratamento, estes
animais se recuperavam, mantendo assim os níveis de sobrevida em cerca de
40%.
Para diminuir essa possível toxicidade, um novo protocolo com o
composto RuImNO em dose mais baixa, 50nmol por animal, e com a dose já
testada anteriormente de 100nmol por animal, foi avaliado. Após o desafio
subcutâneo com 5x104 células B16F10-Nex2, os animais foram inoculados com
o quimioterápico intraperitonealmente durante duas semanas. Na primeira
semana os animais receberam o tratamento em dias consecutivos, enquanto
que na semana seguinte o tratamento se deu em dias alternados. Não foi
observada diminuição no efeito tóxico ou melhora no efeito terapêutico do
composto nesse novo protocolo (dados não mostrados).
Para avaliar se a atividade antitumoral e, ao mesmo tempo, tóxica para
os animais era devido a liberação do óxido nítrico pelos compostos nitrosados,
ensaios in vivo foram realizados com o composto controle sulfatado RuImSO4.
Este composto possui uma molécula de sulfato no sítio de coordenação do
óxido nítrico e tem como ligante o grupo imidazol, e foi sintetizado
primariamente como controle do composto nitrosado com o mesmo ligante de
estabilização.
No primeiro protocolo terapêutico utilizado, após o desafio com as
células tumorais, os animais receberam doses do composto RuImSO4 em dias
alternados pelo período de duas semanas. Surpreendentemente, como mostra
a Figura 6, 80% e 50% dos animais que receberam as doses de 100nmol e
100
500nmol, respectivamente, ficaram livres de tumor. Na dose de 100 nmol,
somente 1 animal de um grupo de 5 desenvolveu tumor subcutâneo, e mesmo
assim, com um retardo significativo em relação ao grupo controle. Já na dose
de 500nmol observou-se novamente a existência de um grupo de 50% de
animais não responsivos ao tratamento. Mais importante, não foi observado
efeito tóxico deste composto nos animais tratados.
O mesmo ensaio foi realizado com uma menor concentração do
composto RuImSO4. Os animais foram tratados com 50nmol ou 100nmol do
composto RuImSO4 por 2 semanas em dias alternados. Observa-se na Figura
7 que ambas as doses se mostraram bastante eficientes na inibição do
desenvolvimento tumoral. Houve um aumento significativo na sobrevida dos
animais tratados com a dose de 100nmol, e o tratamento com 50nmol de
RuImSO4, além de não ter ocasionado efeitos colaterais, protegeu cerca de
30% dos animais, que ficaram livres de tumores. Em ambas as doses, houve
um retardo significativo no desenvolvimento tumoral da maioria dos animais
tratados, comparados ao grupo de animais tratados com PBS. Utilizou-se
também o protocolo onde os animais eram inoculados na primeira semana em
dias consecutivos e na segunda semana em dias alternados com essas 2
doses, e
não observou-se melhora na resposta terapêutica ao composto
(dados não mostrados).
Como o composto sulfatado e com o ligante de imidazol mostrou-se mais
efetivo nos protocolos in vivo do modelo subcutâneo do melanoma murino, ele
também foi testado no modelo de metástase pulmonar. Animais C57Bl/6 foram
desafiados endovenosamente com 5x105 células B16F10-Nex2, e no dia
seguinte após o desafio, iniciou-se o tratamento com 100nmol do composto
101
RuImSO4, com injeções intraperitoneais, em dias alternados. No 13º dia, os
animais foram sacrificados e o número de nódulos pulmonares foi avaliado.
Como mostra a Figura 8, o tratamento com o composto RuImSO4 levou a uma
redução significativa na formação de nódulos pulmonares, demonstrando que o
composto é ativo tanto no tratamento de tumores primários como metastáticos.
102
3000
100
2500
Sobrevida (%)
Volume tumoral (mm 3)
A
80
2000
60
1500
40
1000
20
500
0
0
20
25
30
35
Dias após o desafio
B
20
40
60
RuIsnNO 10nmol
PBS
3000
100
2500
Sobrevida (%)
Volume tumoral (mm3)
30
40
50
Dias após o desafio
80
2000
60
1500
40
1000
20
500
0
0
20
25
30
35
Dias após o desafio
20
40
30
40
50
Dias após o desafio
60
RuIsnNO 100nmol
PBS
Figura 4: Composto RuIsnNO no tratamento de animais desafiados com
células
de
melanoma
murino.
Animais
C57Bl/6
foram
desafiados
subcutaneamente com células de melanoma murino B16F10-Nex2. No dia
seguinte, iniciou-se o tratamento intraperitoneal com RuIsnNO ou PBS por 2
semanas em dias alternados. (A) Animais tratados com 10nmol/kg. (B)
Animais tratados com 100nmol/kg. Foram utilizados 10 animais para o grupo
controle e 5 animais para o grupo experimental. Estão representados o
volume tumoral individual medido a cada 3 dias, como descrito em Materiais e
Métodos, e a sobrevida dos animais, observada por até 60 dias.
103
A
Volume tumoral (mm3)
3000
100
Sobrevida (%)
2500
80
2000
60
1500
1000
40
500
20
0
20
25
30
35
40
Dias após o desafio
25
28 30 32 34 36 38 40 42 44
Dias após o desafio
RuImNO 100nmol
100
3000
Sobrevida (%)
B
Volume tumoral (mm3)
PBS
80
2500
2000
60
1500
40
1000
20
500
0
20
25
30
35
Dias após o desafio
25
40
28 30 32 34 36 38 40 42
Dias após o desafio
RuImNO 500nmol
PBS
Figura 5: Composto RuImNO no tratamento de animais desafiados com
células
de
melanoma
murino.
Animais
C57Bl/6
foram
desafiados
subcutaneamente com células de melanoma murino B16F10-Nex2. No dia
seguinte, iniciou-se o tratamento intraperitoneal com RuImNO ou PBS por 2
semanas em dias alternados. (A) Animais tratados com 100nmol/kg do
composto. (B) Animais tratados com 500nmol/kg do composto. Foram
utilizados 10 animais para o grupo controle e 5 animais para o grupo
experimental. Estão representados o volume tumoral individual medido a cada
3 dias, como descrito em Materiais e Métodos, e a sobrevida dos animais,
observada por até 42 dias.
104
3000
100
2500
Sobrevida (%)
Volume tumoral (mm3)
A
80
2000
60
1500
40
1000
20
500
0
20
25
30
35
Dias após o desafio
0
40
60
100
2500
Sobrevida (%)
Volume tumoral (mm3)
3000
2000
1500
1000
500
0
35 40 45 50 55
Dias após o desafio
RuImSO4 100nmol
PBS
B
30
20
25
30
35
Dias após o desafio
80
60
40
20
0
40
30
35 40 45 50 55
Dias após o desafio
60
RuImSO4 500nmol
PBS
Figura 6: Composto RuImSO4 no tratamento de animais desafiados com
células
de
melanoma
murino.
Animais
C57Bl/6
foram
desafiados
subcutaneamente com células de melanoma murino B16F10-Nex2. No dia
seguinte, iniciou-se o tratamento intraperitoneal com RuImSO4 ou PBS por 2
semanas em dias alternados. (A) Animais tratados com 100nmol/kg do
composto. (B) Animais tratados com 500nmol/kg do composto. Foram
utilizados 10 animais para o grupo controle e 5 animais para o grupo
experimental. Estão representados o volume tumoral individual medido a cada
3 dias, como descrito em Materiais e Métodos, e a sobrevida dos animais,
observada por até 60 dias.
105
3000
100
2500
Sobrevida (%)
Volume tumoral (mm3)
A
2000
1500
1000
60
40
20
500
0
80
20
30
40
55
Dias após o desafio
0 20 25
60
RuImSO4 50nmol
3000
100
2500
Sobrevida (%)
Volume tumoral (mm3)
PBS
B
2000
1500
1000
500
0
30 35 40 45 50 55 60
Dias após o desafio
80
60
40
20
15
20 25
30
35
Dias após o desafio
40
0 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42
Dias após o desafio
RuImSO4 100nmol
PBS
Figura 7: Composto RuImSO4 promove aumento de sobrevida dos animais
desafiados com células de melanoma murino. Animais C57Bl/6 foram
desafiados subcutaneamente com células de melanoma murino B16F10Nex2. No dia seguinte, iniciou-se o tratamento intraperitoneal com RuImSO4
ou PBS por 2 semanas em dias alternados. (A) Animais tratados com
50nmol/kg do composto. (B) Animais tratados com 100nmol/kg do composto.
Foram utilizados 10 animais por grupo. Estão representados o volume tumoral
individual medido a cada 3 dias, como descrito em Materiais e Métodos, e a
sobrevida dos animais, observada por até 60 dias.
106
A
RuImSO4
B
Figura 8: Composto RuImSO4 foi capaz de reduzir significativamente a
formação de nódulos pulmonares in vivo. Células B16F10-Nex2 foram
inoculadas intravenosamente em camundongos C57Bl/6. Os animais foram
tratados intraperitonealmente com 100nmol/kg do composto, em dias
alternados. Após 13 dias, os nódulos pulmonares foram contados. (A)
Pulmões representativos dos animais controle e tratados com RuImSO4.
(B) Quantificação dos nódulos pulmonares em animais tratados e não
tratados com o composto RuImSO4. Foram utilizados 4 animais no grupo
controle e 5 animais no experimental. As barras horizontais representam a
média dos valores individuais
107
5.6 Determinação do mecanismo de ação do composto RuImSO4.
Dentre todos os compostos de Rutênio avaliados na terapia do
melanoma murino in vivo, o composto RuImSO4 foi, sem dúvida, o que
apresentou melhores resultados e menores efeitos colaterais para os animais
tratados. Este resultado nos surpreendeu, uma vez que a idéia inicial era testar
os compostos de rutênio doadores de óxido nítrico e os compostos sulfatados
funcionariam apenas como controle para os ensaios. Resolvemos, então,
avaliar no composto sulfatado o que estaria interferindo com o desenvolvimento
tumoral, se a atividade estava relacionada ao átomo metálico de Rutênio, ou
ainda se os ligantes também tinham participação no efeito terapêutico do
quimioterápico.
Para determinar o papel do ligante estabilizador desse complexo,
realizou-se um ensaio in vitro, onde as células de melanoma murino B16F10Nex2 foram incubadas com várias concentrações de imidazol (1,3-Diaza-2,4cyclopentadiene, Sigma Aldrich). Após 24h, a viabilidade celular foi avaliada. O
ligante Imidazol sozinho não foi capaz de reduzir a viabilidade das células
tumorais murinas in vitro (Figura 9).
Para determinarmos o papel do átomo metálico de Rutênio na ausência
de um grupamento sulfato no efeito antitumoral do composto RuImSO4,
utilizou-se um derivado desse composto, onde o ligante de estabilização
Imidazol foi substituído por um grupo trietilfosfito e o sulfato foi substituído por
NO, o trans-Ru(NO)(NH3)4P(OCH2CH3)3 (representado na Figura 10A). O
ligante trietilfosfito [P(OCH2CH3)3, ou P(OEt)3] é um composto organofosforado
utilizado amplamente como ligante na química organometálica, e que se
108
degrada facilmente em dietil- e monofosfito. A característica mais marcante
desse derivado trans-Ru(NO)(NH3)4P(OCH2CH3)3 é a extremamente rápida
liberação do NO de seu sítio de coordenação e a entrada de uma molécula de
água, devido à influência do ligante trietilfosfito presente. Desta forma, esse
derivado em solução não contém o grupo sulfato, que foi substituído por uma
molécula de água, e que foi denominado aqui de composto “Aquo”.
Em ensaio in vivo, o composto “Aquo” não foi capaz de interferir no
desenvolvimento tumoral ou na sobrevida dos animais tratados, quando
comparado aos animais tratados com PBS (Figura 10B), sugerindo que o
átomo de Rutênio sozinho não apresenta o efeito terapêutico observado com o
composto RuImSO4.
Animais tratados com o composto RuIsnSO4, onde o ligante de
estabilização é o grupo isonicotinamida, na presença do grupo sulfato,
apresentaram maior sobrevida e retardo no desenvolvimento tumoral nas 2
doses utilizadas, 50 e 100nmol (Figura 11).
Esses resultados em conjunto sugerem que o efeito terapêutico dos
compostos sulfatados de Rutênio deve-se à estrutura química do composto,
contendo o átomo de metal coordenado com os ligantes NH3, um ligante de
estabilização inespecífico e um grupo sulfato.
109
Imidazol
45
númerode célulasviáveis(104)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Controle
1800
1000
500
180
18
2
Concentração(µM)
Figura 9: Viabilidade celular após tratamento com Imidazol in vitro.
Células B16F10-Nex2 foram incubadas na presença de diferentes
concentrações
de
Imidazol
(1,3-Diaza-2,4-cyclopentadiene,
Sigma
Aldrich). Controle, células não tratadas. Após 24h, a viabilidade foi
avaliada utilizando o corante de exclusão Trypan Blue. p> 0,05 para
todos os pontos comparados ao Controle.
110
A
H2 O
Sobrevida (%)
B
Dias após o desafio
Figura 10: O átomo metálico de Rutênio não é capaz de interferir no
desenvolvimento tumoral in vivo. (A) Representação esquemática dos compostos
de Rutênio envolvidos neste ensaio. (B) Sobrevida dos animais tratados com
100nmol/kg do composto Aquo ou PBS.
111
A
Sobrevida (%)
Volume tumoral (mm3)
100
3000
2500
2000
1500
1000
80
60
40
20
500
0
20
30
40
50
Dias após o desafio
0
20
60
RuIsnSO4 50nmol
PBS
100
3000
Sobrevida (%)
Volume tumoral (mm3)
B
25 30 35 40 45 50 55 60
Dias após o desafio
2500
2000
1500
1000
80
60
40
20
500
0 15 20
25 30 35
40 45
0
10
50
20
30
40
Dias após o desafio
Dias após o desafio
50
RuIsnSO4 100nmol
PBS
Figura 11: Efeito do composto RuIsnSO4 sobre animais desafiados com
células
de
melanoma
murino.
Animais
C57Bl/6
foram
desafiados
subcutaneamente com células de melanoma murino B16F10-Nex2. No dia
seguinte, iniciou-se o tratamento intraperitoneal com RuIsnSO4 ou PBS por 2
semanas em dias alternados. (A) Animais tratados com 50nmol/kg do
composto. (B) Animais tratados com 100nmol/kg do composto. Foram
utilizados 10 animais por grupo. Estão representados o volume tumoral
individual medido a cada 3 dias, como descrito em Materiais e Métodos, e a
sobrevida dos animais, observada por até 60 dias.
112
A análise morfológica por microscopia óptica, mostrada na Figura 1,
sugere que as células tratadas com este composto estejam sofrendo um
processo apoptótico, já que se observam alterações morfológicas significativas,
com a manutenção das membranas celulares. Ensaios foram então realizados
para determinar o tipo de morte celular que o tratamento com os compostos
sulfatados estava induzindo, em colaboração com a Dra. Denise Arruda,
Unidade de Oncologia Experimental, UNIFESP.
Primeiramente, foi realizado ensaio para marcação fluorescente com
Anexina V e Iodeto de Propídio (PI), e leitura em citometria de fluxo. Neste
ensaio, células apoptóticas apresentam marcação positiva para Anexina V, pois
este marcador se liga diretamente à fosfatidilserina externalizada na membrana
de células apoptóticas. A marcação com PI sugere processo necrótico,
indicando que houve um aumento na permeabilidade da membrana com o
corante entrando livremente e corando o núcleo das células. A dupla marcação
caracteriza as fases finais do processo de morte celular. O gráfico da Figura 12
sugere que as células tumorais tratadas com o composto sulfatado RuImSO4
sofrem um processo de morte por apoptose, pois há um aumento expressivo
das células marcadas com Anexina V, chegando a 12% após 12h de
tratamento com o quimioterápico.
Analisando o núcleo das células tratadas com o composto sulfatado e
coradas com o corante Hoechst 33342, observa-se que após 24h de
tratamento com a dose correspondente ao IC50, as células de melanoma
murino mostram-se com núcleos condensados (Figura 13). A contagem das
células com este fenótipo demonstrou que na população estudada,
aproximadamente 70% das células de melanoma murino tratadas com o
113
composto sulfatado apresentavam núcleos condensados como os mostrados
na Figura 13.
Por fim, utilizou-se a metodologia de TUNEL para verificar o tipo de
morte celular que o composto de rutênio sulfatado induziu nas células de
melanoma murino. Neste ensaio, uma enzima específica que reconhece
terminações de DNA (TdT) insere nucleotídeo fluorescente a cada terminação,
o que faz com que a fluorescência seja proporcional à quantidade de
fragmentos de DNA presentes em células submetidas a um estimulo
apoptótico. Observou-se que as células tratadas com o quimioterápico
apresentaram marcação positiva no ensaio, enquanto células não tratadas não
apresentaram marcação (Figura 14).
Estes resultados sugerem que células de melanoma murino B16F10Nex2 tratadas com o composto RuImSO4 entrem em processo de apoptose,
como demonstrado pelas condensação nuclear, fragmentação do DNA e
exposição de fosfatidilserina na superfície celular.
114
25
Célulaspositivas(%)
20
15
Anexina+
PI+
10
Anexina+ PI+
5
0
3h
6h
12h
Figura 12: Marcação de Anexina e PI em células de melanoma murino B16F10Nex2 após tratamento com composto RuImSO4. Gráfico representativo da
porcentagem de células positivas para Anexina V e/ou PI, quantificadas em
citometria de fluxo como descrito em Materiais e Métodos.
115
A
B
Figura 13: Alterações nucleares causada pelo composto RuImSO4. (A) Células
B16F10-Nex2 murinas não tratadas e coradas com o corante Hoechst 33342. (B)
Células B16F10-Nex2 tratadas durante 24h com RuImSO4 e coradas com Hoechst
33342. Metodologia descrita em Materiais e Métodos. Nota-se, ao centro, células
com alterações nucleares (setas). Barra de aumento: 20µm.
116
Fase
Dapi
TdT
Controle
RuImSO4
Figura 14: Ensaio de TUNEL em células de melanoma murino B16F10-Nex2
tratadas com composto RuImSO4. Imagens representativas das células murinas
tratadas ou não com RuImSO4 e submetidas ao ensaio de TUNEL, como descrito
em Materiais e Métodos. Fase, visualização das células em microscopia de fase;
Dapi, células coradas com o corante nuclear Dapi; TdT, células após ensaio de
TUNEL. Barra de aumento: 20µm
117
6.0 DISCUSSÃO
6.1 Composto ciclopaladado C7A : mecanismo de ação
Complexos de paládio obtidos a partir da reação do dmpa (N,N-dimethyl1-phenethylamine) com derivados de diphenylphoshine (dppe) e dppf
mostraram-se potenciais agentes antitumorais em ensaios pré-clínicos. Um dos
complexos
sintetizados
com
os
derivados
dppe
[1,2-
ethanebis(diphenylphosphine)] mostrou atividade antitumoral in vitro e in vivo
contra o modelo singeneico e de baixa imunogenicidade do melanoma murino
B16F10-Nex2, parecendo exercer seu efeito citotóxico sobre mitocôndrias,
embora o mecanismo de ação não tenha sido completamente elucidado
(Rodrigues et al, 2003). Um outro complexo ciclopaladado, sintetizado com o
derivado dppf [1,1’-bis(diphenylphosphine)ferrocene] induziu a permeabilização
de lisossomas em células leucêmicas humanas K562, o que levou as células à
apoptose por via lisossomal (Barbosa et al, 2006). Esses resultados
demonstram que a ação antitumoral dos complexos ciclopaladados é o
resultado de uma atividade organela-específica, e que esses compostos não
compartilham um único mecanismo de ação.
Neste trabalho nós elucidamos o mecanismo de ação do enantiômero
S(-) do dppe-Ciclopaladado, denominado de Complexo Ciclopladado 7A, ou
C7A.
Estudos
anteriores
de
nosso
grupo
demonstraram
a
eficácia
antineoplásica in vitro e in vivo do Ciclopaladado 7A em células de melanoma
murino B16F10-Nex2 (Rodrigues et al, 2003). Esse composto foi selecionado
118
pelo seu marcante efeito in vivo, dentre vários compostos ciclopaladados
testados no modelo. Animais tratados com o C7A apresentaram um retardo no
desenvolvimento tumoral e um aumento significativo na sobrevida. In vitro, o
ciclopaladado 7A reduziu muito rapidamente a acidificação extracelular, que
atingiu valores 80% menores após 40 minutos de incubação, e reduziu a
acidificação extracelular em 100% após 110 minutos de incubação, o que
mostra a inibição do metabolismo e também da geração de prótons na cadeia
respiratória pelo composto. Foi também demonstrada degradação do DNA, e
não foi observada ativação de caspases efetoras 1 e 3, o que sugeriu que o
quimioterápico levasse as células à morte por indução de um processo
apoptótico independente de caspases. Foi também demonstrada uma interação
do C7A com um plasmídeo por dicroismo circular, sugerindo que o efeito do
quimioterápico poderia ser semelhante ao efeito da Cisplatina, que interage
com o DNA celular ativando a via apoptótica por ativação de p53 (Sedletska et
al, 2005)
Neste trabalho demonstramos que o ciclopaladado 7A também é ativo in
vitro contra diversas linhagens de células tumorais humanas. Quase todas as
células tumorais humanas testadas respondem muito bem ao tratamento com o
C7A, com doses de IC50 relativamente baixa, abaixo de 500 nanomolar. A
eficácia do quimioterápico em doses baixas é muito importante, pois isso pode
indicar uma atenuação de possíveis efeitos colaterais, tão comuns em
quimioterápicos antitumorais já utilizados. As doses efetivas de Cisplatina
sobre essas mesmas células foram cerca de 200 a 1.300 vezes maiores.
Este efeito citotóxico acentuado in vitro não foi observado em linhagens
tumorais de leucemia (HL60) e glioblastoma (U87) humanas, que mostraram
119
um IC50 para o quimioterápico de 1 e 3.5µM, respectivamente, sugerindo que
alguns tipos tumorais podem ser mais resistentes ao C7A. Mesmo assim, as
doses efetivas foram muito abaixo das doses efetivas de Cisplatina, que foram
70 e 43 vezes maiores para a linhagem HL-60 e U87, respectivamente.
Foi demonstrado anteriormente que o ciclopaladado 7A apresenta baixa
toxicidade in vivo. Concentrações crescentes do complexo foram inoculadas
em camundongos C57Bl/6, de 10 a 60µM, 3 doses em dias alternados para
cada concentração, e ao final do experimento vários órgãos foram analisados
histologicamente, não se observando alterações significativas (Rodrigues et al,
2003).
Complementando esse resultado, a incubação de macrófagos murinos e
eritrócitos humanos na presença de várias concentrações relativamente
elevadas do composto C7A, não levou essas células à morte. O fato do C7A
não causar a lise dos eritrócitos humanos sugere que este composto não age
diretamente sobre a membrana celular, mas em organelas essenciais para a
manutenção da homeostase da célula.
A rápida redução na atividade respiratória observada após o tratamento
das células tumorais humanas com o C7A sugere que o mecanismo de ação
do quimioterápico seja o mesmo tanto em células tumorais murinas como
humanas, envolvendo a participação da mitocôndria no processo de morte
causado pelo composto.
Nossos resultados demonstraram que o C7A interage diretamente com
proteínas contendo grupos tiol na membrana mitocondrial. A inibição, com o
agente redutor DTT, do colapso no potencial de membrana mitocondrial e no
120
efeito citotóxico in vitro sobre as células tumorais causados pelo C7A
comprovou
a
participação
de
proteínas
contendo
grupos
tiol
na
permeabilização da membrana mitocondrial.
Esse mesmo efeito foi observado por Santana et al (2009) quando
estudaram o efeito do C7A e do enantiômero R(+) do C7A, o complexo
[Pd(C2,N-(R(+)dmpa)(dppe)].Cl, sobre mitocôndrias isoladas de hepatócitos de
rato. Nesse estudo foi demonstrado que os paladociclos induziram inchaço da
mitocôndria
independente
de
cálcio,
permeabilização
mitocondrial,
desligamento da fosforilação oxidativa e liberação de cálcio mitocondrial,
efeitos totalmente prevenidos pelo tratamento com DTT. Foi observado um
decréscimo na quantidade de grupos tiol reduzidos nas proteínas da membrana
mitocondrial, e também presença de agregados proteicos na membrana da
mitocôndria, possivelmente formados pela indução de pontes dissulfeto entre
grupos tiol de proteínas de membrana vicinais, catalizadas pelo ciclopaladado.
Esses efeitos levaram à liberação de citocromo C, demonstrando uma alta e
específica reatividade do ciclopaladado com grupos tiol de proteínas da
membrana mitocondrial, catalisando a formação de pontes dissulfeto que levam
à permeabilização da mitocôndria, e a um efeito pró-apoptótico dos dppeciclopaladados. A reatividade dos ciclopaladados com grupos tiol presentes em
proteínas foi também demonstrado para os complexos dppf-ciclopaladados,
que mostram uma atividade inibitória sobre a Catepsina B, uma cisteínoprotease que contém um grupo tiol no seu sítio catalítico (Barbosa et al, 2006).
Nosso trabalho, realizado com células íntegras e viáveis, utilizando
métodos microscópicos que mantém a viabilidade celular, portanto, em um
121
sistema extremamente complexo, corroboram esses resultados obtidos com a
mitocôndria isolada.
Tanto
C7A
como
seu
enantiômero
R(+)
apresentaram
efeitos
semelhantes sobre mitocôndrias isoladas de hepatócitos de rato, mas o
enantiômero R(+) foi o mais potente nas condições in vitro do estudo (Santana
et al, 2009). Interessante observar que o enantiômero R(+) não apresentou
efeito in vivo contra o melanoma murino B16F10-Nex2, embora tenha
apresentado efeito citotóxico in vitro com IC50 semelhante ao C7A, abaixo de
1.25µM (Rodrigues et al, 2003), sugerindo que os enantiômeros possam ser
absorvidos e apresentem biodisponibilidades diferentes in vivo.
Já foi demonstrado que a depleção de ATP causa uma rápida
desfosforilação de proteínas próapoptóticas da família Bcl-2, translocação de
Bax para a mitocôndria, permeabilização da membrana externa mitocondrial e
subseqüente morte celular (Xu et al, 2005).
Não há dúvida de que as mitocôndrias desempenham um papel central
na morte celular programada. Alguns parâmetros de desregulação mitocondrial
têm sido descritos como características próprias de um processo apoptótico:
perda do potencial de membrana mitocondrial, a interrupção do transporte de
elétrons e fosforilação oxidativa, a geração de espécies reativas de oxigênio e
liberação de fatores próapoptóticos, que desencadeiam a ativação de
caspases. Já que tal organela desempenha um papel fundamental no
desencadeamento de apoptose, há um grande interesse em explorar as suas
funções próapoptóticas para interferir no crescimento de células tumorais. (Dias
& Bailly, 2005).
122
Nossos resultados demonstram que o ciclopaladado 7A causou uma
rápida queda no potencial de membrana mitocondrial, alterando assim a
permeabilidade da membrana desta organela, comprovada pela imagem da
microscopia eletrônica, que mostra um claro inchaço das estruturas
mitocondriais nas células tumorais de melanoma murino B16F10-Nex2 tratadas
com o C7A. Existe uma série de compostos antitumorais que agem dessa
mesma maneira são descritos na literatura. A Lonidamina é um agente
antitumoral derivado do ácido indazol-3 carboxílico, que atua na mitocôndria,
inibindo o consumo de oxigênio e bloqueando o metabolismo energético. A
Lonidamina causa perda do potencial de membrana mitocondrial e liberação de
citocromo C em mitocôndrias isoladas (Stryker & Gerweck, 1988)
A superexpressão de proteínas antiapoptóticas da família Bcl-2 em
diversas linhagens tumorais pode inibir a permeabilização da membrana
mitocondrial externa e formação de póros mediada pelas proteínas Bax/Bak. O
efeito antitumoral próapoptótico de alguns tratamentos convencionais (p.ex.,
radiação ionizante) é baseado na habilidade de estimular a produção de
espécies reativas de oxigênio (Gogvadze et al, 2009). Drogas antitumorais que
induzem a formação de um póro de transição de permeabilidade na membrana
mitocondrial podem induzir modificações nesta organela mediada pelo acúmulo
de reativos de oxigênio. Por exemplo, com altas doses do agente
quimioterápico trióxido de arsênico, observou-se uma modificação oxidativa em
grupos tiol e conseqüente liberação de citocromo C através da indução do poro
de transição de permeabilidade. Entretanto, em concentrações aceitáceis para
o uso clínico, esta droga estimula liberação de citocromo C e apoptose através
de mecanismos dependentes das proteínas Bax/Bak (Larochette et al, 1999).
123
Bax
é
um
membro
pró-apoptótico
da
família
Bcl-2
localizado
predominantemente no compartimento citosólico, na forma monomérica, em
células viáveis. Após um estímulo apoptótico, uma fração significativa desta
proteína formam dímeros e se transloca para a membrana externa mitocondrial
formando poros (Wolker et al, 1997).
A translocação da proteína Bax para as mitocôndrias foi observada em
células de melanoma murino B16F10-Nex2 transfectadas com uma proteína
quimérica Bax-GFP e tratadas com o C7A. Além das alterações mitocondriais
já descritas anteriormente, a translocação de Bax forma póros que liberam o
citocromo C, que por sua vez ativa caspases. A ativação de caspases foi
observada nas células de melanoma murino tratadas com o C7A. Verificou-se
um expressivo aumento na atividade das caspases efetoras 3 e 6.
Estudos têm demonstrado que Bax e outras proteínas pró-apoptóticas
podem modular estoques de cálcio no retículo endoplasmático e nas
mitocôndrias (Nutt et al, 2001). Foi também demonstrado que a integridade da
membrana mitocondrial pode ser alterada pela captação excessiva de cálcio
(Andreyev et al, 1998). Em condições fisiológicas, o aumento do cálcio
citosólico estimula a captação deste íon pela mitocôndria, provocando assim
um aumento de cálcio mitocondrial (Robb-Gaspers et al, 1998). Alterações no
cálcio citosólico podem ativar a via de apoptose. Algumas destas alterações
incluem mudanças na captação do cálcio mitocondrial, o que aumenta a
probabilidade de ativação do póro de transição de permeabilidade (Pacher et
al, 2002). A depleção dos estoques de cálcio intracelular também está
relacionada com indução de apoptose (Pan & Dilley, 2000).
124
Nossos resultados demonstram que o C7A provoca o acúmulo de grande
quantidade de cálcio intracelular, liberado do interior das organelas. Ensaios
preliminares demonstraram que o C7A provoca liberação de cálcio tanto do
retículo endoplasmático como das mitocôndrias (dados não mostrados). Além
do C7A causar uma importante liberação do cálcio intracelular, também
observou-se uma entrada de cálcio proveniente do meio extracelular. Este
cálcio em excesso não consegue ser captado totalmente pelas organelas
responsáveis pelo estoque deste íon, colaborando assim com mais um
estímulo apoptótico.
A condensação nuclear e a degradação de DNA observadas em células
de melanoma murino tratadas com o ciclopaladado 7A é mais uma forte
indicação de que as células tumorais estão morrendo por um processo
apoptótico. Diversos compostos metálicos, como por exemplo, drogas
derivadas de platina, em geral tem como alvo predominante o DNA (Brabec &
Kasparkova, 2005), embora estudos recentes sugiram que existam também
outros alvos (Gourdier et al, 2004; Cullen et al, 2007).
Um complexo dppf-ciclopaladado, denominado BCP (Biphosphinic
Palladacycle Complex), foi testado in vitro contra as linhagens celulares de
leucemia humana K562, HL-60 e Jurkat, e para todas elas o IC50 foi menor do
que 8µM. O ciclopaladado acumulou-se nos lisossomas celulares, levando à
permeabilização dessa organela com a liberação de catepsina B, que foi
responsável pela ativação das caspases 3 e 6, como demonstrado pela inibição
da ativação dessas enzimas efetoras da apoptose por um inibidor seletivo de
catepsina B (CA074) (Bincoletto et al, 2005; Barbosa et al, 2006; Oliveira et al,
2009). Nesse modelo, os autores levantam a hipótese de que a catepsina
125
liberada pelos lisossomas pode agir sobre outras organelas, principalmente
mitocôndrias e núcleo, o que levaria as células a um processo de morte por
apoptose (Oliveira et al, 2009).
Com o objetivo de verificarmos a possível participação de catepsinas no
efeito citotóxico causado pelo C7A em células de melanoma murino, células
B16F10-Nex2 foram tratadas com o ciclopaladado 7A, na presença de CA074Me, inibidor seletivo de catepsina B metilado, o que permite sua entrada na
célula. O mesmo procedimento foi realizado com o inibidor seletivo de cisteínoproteases E-64. Os resultados mostraram que a inibição da catepsina B e de
cisteíno-proteases em geral não foi capaz de impedir a morte celular causada
pelo C7A, sugerindo que não há participação dessas enzimas no processo de
morte celular causado pelo composto.
No início do desenvolvimento deste projeto, tínhamos como hipótese de
mecanismo de ação do C7A a indução de morte celular por necrose, uma vez
que observamos uma queda abrupta no pH extracelular, sugerindo a parada na
respiração celular e queda na produção de ATP, degradação nuclear e
ausência de ativação das caspases efetoras 1 e 3 (Rodrigues et al, 2003).
Concentrações muito baixas de ATP estão relacionadas à indução de processo
necrótico (Smaili et al, 2009).
Além disso, o resultado da microscopia
eletrônica de transmissão com células de melanoma murino mostrou um
inchaço das mitocôndrias após tratamento com o C7A, e alterações
mitocondriais são encontradas tanto no processo apoptótico como no necrótico
(Kroemer et al, 2009).
126
Golstein & Kroemer (2007) analisando seis diferentes sistemas
experimentais observaram que a necrose celular se caracteriza por uma
sequência de eventos bioquímicos intracelulares, que incluem alterações
mitocondriais como inchaço, depleção de ATP, falha na manutenção da
homeostase de cálcio, ativação de algumas proteases, como calpaínas e
catepsinas, entre outros eventos, que acumulados de uma forma programada e
organizada podem definir a necrose. Várias características observadas após o
tratamento com o ciclopaladado 7A eram similares às descritas como
indicativas de necrose, e testamos então, se essa via poderia estar implicada
na morte celular causada pelo C7A.
Ensaios pré-clínicos indicam que a inibição de várias moléculas
implicadas no processo de necrose apresenta efeitos benéficos, como por
exemplo, a inibição de PARP, RIP1,CypD, calpaínas e catepsinas que inibiu a
morte celular por necrose in vivo em modelos de perda aguda de células
(Kroemer & Martin, 2005). Em um ensaio para screening de novas drogas
foram identificadas as Necrostatinas, que inibiram in vitro a morte celular em
células Jurkat deficientes em FADD, e apresentaram efeitos benéficos em
modelo experimental de isquemia (Degterev et al, 2005). Necrostatina-1 inibe
quimicamente a quinase RIP1, envolvida na necrose mediada pelos receptores
TNFR1, Fas/CD95, TRAILR e TLR3 (Degterev et al, 2005; Degterev et al,
2008). Embora não haja um consenso, alguns grupos propuseram a utilização
do termo “necroptosis” para indicar um processo necrótico regulado, ao
contrário de um processo acidental. Em nível bioquímico, a necroptosis pode
ser definida como um processo que pode ser evitado pela inibição da quinase
RIP1 (Kroemer et al, 2009)
127
Necrostatina-1 (Sigma Aldrich) foi utilizada como inibidor da atividade do
C7A sobre células tumorais, sendo incubada em várias concentrações com as
células previamente ao tratamento com o quimioterápico, ou alternativamente
em associação com o C7A. Não foi observado efeito da necrostatina-1 nessas
condições (dados não apresentados).
Uma característica marcante das células tumorais é a produção de ATP
predominantemente através da via glicolítica, mesmo em condições aeróbias,
conhecido como "efeito Warburg". Devido a esta peculiaridade, mitocôndrias
das células tumorais desempenham papel fundamental na sobrevivência e
morte celular, o que torna essa organela um alvo importante para
quimioterápicos antitumorais. A exploração do efeito Warburg pode representar
uma nova e promissora abordagem para complementar os tratamentos
convencionais, que tem outros alvos na célula tumoral (Gogvadze et al, 2009),
e evidências sugerem que terapias antitumorais que tem a mitocôndria como
alvo podem tornar as células tumorais mais sensíveis a outros quimioterápicos
(Gogvadze et al, 2008).
A terapia sistêmica do melanoma metastático tem apresentado efeitos
muito aquém do esperado. Os quimioterápicos disponíveis poderiam, em
teoria, agir também sobre sítios metastáticos, mas com frequência metástases
não são responsivas aos tratamentos (Lowe e Soengas, 2003).
A atividade do C7A contra metástases pulmonares do melanoma murino
também foi avaliada. Observou-se uma redução significativa no número de
nódulos pulmonares dos animais tratados. Este é um achado importante pois
além do ciclopaladado mostrar eficácia no tratamento de tumores primários,
128
como observado por Rodrigues et al (2003), também poderia ser utilizado no
tratamento de tumores em estadios metastáticos mais avançados.
Como as terapias convencionais frequentemente apresentam baixa
eficácia no tratamento do melanoma, diferentes abordagens terapêuticas têm
sido avaliadas para o tratamento desse tumor, principalmente a associação da
quimioterapia com agentes imunoterápicos, denominada de bioquimioterapia
(Sun & Schuchter, 2001).
Recentemente foi demonstrado. pelo nosso grupo, que a neutralização
da interleucina 13, uma interleucina imunosupressora, com um receptor decoy,
in vivo, aumentou significativamente a sobrevida dos animais tratados. Mais
importante, a associação da neutralização da IL-13 com o ciclopaladado 7A
levou a um significativo retardo no desenvolvimento do melanoma murino
subcutâneo, com impressionantes 30% de animais tratados livres de tumor por
um tempo prolongado (Hebeler-Barbosa et al, 2008). Esses resultados
mostram que o C7A também pode ser usado com sucesso em associação a
outros tipos de terapias antineoplásicas.
Além da atividade direta antitumoral observada com o C7A, é possível
que o composto interfira também em outros processos importantes para o
desenvolvimento tumoral in vivo. Um dos eventos essenciais para o
crescimento do tumor é a formação de novos vasos sanguíneos, que tem como
função principal nutrir a população de células tumorais em crescente
proliferação (Bonavida et al, 2006)).
Nossos resultados demonstram que o ciclopaladado 7A apresenta uma
atividade citotóxica direta sobre uma linhagem de células endoteliais humanas,
129
e também foi capaz de inibir a formação de estruturas pré-angiogênicas em
ensaio in vitro, estruturas estas que se relacionam à capacidade de formação
de neovasos in vivo.
6.2 Compostos de Rutênio
Neste trabalho, além da determinação do mecanismo de ação de um
composto ciclopaladado com atividade antitumoral, avaliamos também o efeito
antitumoral de compostos tetraamina rutênio, doadores de óxido nítrico. Estes
compostos foram previamente testados in vitro e in vivo em diferentes modelos
experimentais, como na vasodilatação e no tratamento de parasitoses
(Leishmaniose e Doença de Chagas), e a atividade demonstrada foi
dependente do óxido nítrico liberado pelo composto (Zanichelli et al, 2007;
Silva et al, 2009)
Os complexos nitrosil-tetraamina-rutênio foram avaliados no relaxamento
de anéis aórticos desprovidos de endotélio e pré-contraídos com noradrenalina.
Observou-se que o NO liberado dos complexos reduzidos foi o responsável
pelo relaxamento, e que esse efeito pode ser modulado pela adição de
diferentes ligantes estabilizadores, que determinam a velocidade de liberação
do íon (Zanichelli et al, 2007).
A avaliação destes compostos no tratamento da doença de Chagas
experimental mostrou uma elevada atividade antiproliferativa e tripanocida in
vitro, mais efetiva do que Violeta Genciana, usada atualmente na profilaxia da
transmissão de Doença de Chagas em bancos de sangue. Em testes in vivo,
dois
compostos,
trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3
130
e
trans-
Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, eliminaram as formas extracelular e intracelular do
Trypanosoma cruzi no sangue e miocárdio, e aumentaram a sobrevida de até
80% dos camundongos infectados por um período superior a cinqüenta dias
(Silva et al, 2009).
O desenvolvimento de resistência das células tumorais a vários agentes
citotóxicos continua a ser um grande desafio na área da oncologia e novas
abordagens terapêuticas são urgentemente necessárias (Huerta et al, 2009).
Entre os novos agentes que surgiram recentemente, estão os que induzem
produção endógena de óxido nítrico ou agem como doadores desta molécula.
O óxido nítrico é um mensageiro intracelular produzido pelo organismo de
forma endógena a partir de reações catalisadas por uma família de enzimas
denominadas óxido nítrico sintases (NOS), que convertem o aminoácido Larginina em NO e L-citrulina. Há pelo menos quatro diferentes isoformas
conhecidas dessa enzima, duas delas são constitutivas, eNOS e cNOS (com
níveis de NO produzido comumente ao redor de µmol.l-1), e uma induzível,
iNOS, que é ativada após estímulo, que pode ser, por exemplo, durante uma
resposta inflamatória, quando NO é secretado em concentrações de mmol.L-1
por macrófagos ativados, e que pode ter uma função protetora. Uma quarta
enzima foi recentemente descoberta, mtNOS ou NOS mitocondrial, identificada
como uma isoforma da nNOS, e está envolvida na inibição da respiração
mitocondrial (Elfering et al, 2002).
Nos últimos anos, o papel do óxido nítrico no desenvolvimento tumoral
tem sido foco de numerosos estudos. A transfecção do gene que codifica iNOS
em células de melanoma murino induz apoptose, suprime a tumorigênese e
elimina a formação de metástases (Xie et al, 1995.; Xie et al, 1997). Altos
131
níveis de iNOS tem sido encontrados em metástases de melanoma nãoprogressivo comparativamente à melanomas progressivos (Tschugguel et al,
1999), e tratamentos que visam a liberação de NO no ambiente tumoral tem
sido extensivamente avaliados em modelos experimentais (Sonveaux et al,
2009).
No entanto, além do seu papel possivelmente protetor, o NO também
tem sido implicado na carcinogênese, progressão, invasão e metástases,
angiogênese, escape da vigilância imunológica, e na modulação da resposta
terapêutica (Ekmekcioglu et al, 2005).
Tornou-se claro que o óxido nítrico possui propriedades moduladoras em
várias vias de transdução de sinais, o que depende da concentração do íon e
do contexto em que ele se encontra.
Nossos resultados demonstraram que os compostos tetraamina rutênio
doadores de óxido nítrico testados apresentam uma importante atividade
citotóxica sobre células tumorais humanas e murinas in vitro. Dentre os
diversos compostos testados selecionamos para nosso trabalho o composto
mais ativo, com o mais baixo valor de IC50, o trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3, e
um
composto
com
valor
intermediário
de
IC50,
o
trans-
[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3.
O composto trans-[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3, denominado aqui de
RuImNO, causou alterações nas células tumorais in vitro (intensa destruição
celular com formação de debris e degradação de DNA), além de inibir a
angiogênese in vitro, como observado em ensaio de formação de estruturas
pré-angiogênicas por células endoteliais humanas. Possivelmente, a liberação
132
de NO pelos compostos nitrosil-tetraamina-rutênio, como demonstrado em
outros modelos experimentais, tenha provocado esses efeitos.
Os
compostos RuImNO
e o
trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3,
aqui
denominado de RuIsnNO, foram também avaliados in vivo no tratamento de
camundongos C57Bl/6 inoculados com células de melanoma murino B16F10Nex2 subcutaneamente. Embora tenhamos observado que um grupo de
animais foi responsivo a baixas doses dos compostos doadores de NO,
observamos
também
que
um
grupo
de
animais
apresentava
um
desenvolvimento tumoral muitas vezes mais rápido que os animais não
tratados. Mesmo os animais que responderam ao tratamento eliminando o
crescimento tumoral, apresentaram sintomas de intoxicação mesmo nas doses
mais baixas dos compostos RuImNO e RuIsnNO. Interessante notar que as
doses utilizadas no ensaio in vivo foram as mesmas doses utilizadas para o
tratamento de camundongos Balb/c infectados experimentalmente com T. cruzi.
Esses resultados mostraram que a utilização de compostos nitrosil tetraamina
rutênio, doadores de NO, em camundongos C57Bl/6 inoculados com células de
melanoma murino B16F10-Nex2, embora com algum efeito terapêutico, levou
ao aparecimento de efeitos colaterais bastante intensos. Diferença na
sensibilidade de linhagens de camundongos a agentes terapêuticos tem sido
demonstrado (Zhang et al, 2008; Gueders et al, 2009).
Para
a
síntese
dos
compostos
nitrosil-tetraamina-rutênio,
um
intermediário sulfatado é preparado, e estes compostos sulfato-tetraaminarutênio são utilizados normalmente como controles que contém o mesmo
Ligante de estabilização, mas que não é capaz de doar o NO em meio
biológico.
Assim,
compostos
trans-[Ru(SO4)(NH3)4isn](BF4)3
133
e
trans-
[Ru(SO4)(NH3)4imN](BF4)3 (RuIsnSO4 e RuImSO4, respectivamente) foram
avaliados in vitro e in vivo com relação ao seu efeito antitumoral.
Observou-se que in vitro, os IC50 para os compostos foram de 137 e 444µM
para RuIsnSO4 e RuImSO4, respectivamente, valores bem superiores aos
obtidos com compostos doadores de NO.
Surpreendentemente, in vivo, o composto RuImSO4 foi o composto de
tetraamina rutênio mais eficiente no tratamento de animais com melanoma
murino. Foram testadas 3 doses, 500, 100 e 50nmol, e as doses menores
apresentaram melhor efeito terapêutico contra tumores subcutâneos. Efeito
terapêutico foi também observado em modelo de metástase pulmonar, onde
100nmol do composto reduziu significativamente o número de nódulos
pulmonares nos animais tratados. Além da eficiência do composto sulfatado in
vivo tanto no tratamento do tumor primário como do metastático, não foram
observados efeitos colaterais, sugerindo uma baixa toxicidade do RuImSO4.
Esse achado nos levou a determinar o elemento citotóxico presente no
RuImSO4, e foram então testados componentes isolados da fórmula. Imidazol e
um composto onde o átomo de rutênio é o componente mais importante, pois o
ligante de imidazol foi substituído por um grupo trietilfosfito e o grupo sulfato
por um átomo de água (composto denominado aqui de “Aquo”), foram
avaliados e não apresentaram atividade antitumoral. No entanto, quando
utilizou-se o composto RuIsnSO4, a atividade antitumoral foi similar ao
composto RuImSO4, nas doses de 50 e 100nmol. São necessários ensaios
mais aprofundados para a determinação da estrutura-atividade dos compostos
tetraamina-rutenio-sulfato, mas nossos resultados sugerem que a estrutura
134
geral do composto tem importância na atividade antitumoral dos mesmos. Não
é conhecido se esses compostos são capazes de liberar o grupo sulfato em
meio biológico, o que poderia aumentar o grau de sulfatação dos componentes
da matriz extracelular e interferir com a interação da célula tumoral com a
matriz extracelular.
O composto RuImSO4 levou as células tumorais à morte por indução de
apoptose, como demonstrado pela inversão da fosfatidilserina na membrana
celular, condensação e fragmentação nuclear e pelas alterações morfológicas
apresentadas pelas células após tratamento com o complexo.
Alguns compostos de rutênio já foram testados no modelo de melanoma
murino B16. Gava e colaboradores (2006) utilizaram o composto de rutenio
NAMI-A
(imidazolium
trans-imidazoledimethylsulfoxide-tetrachlorouthenate),
que não apresenta atividade citotóxica direta sobre as células tumorais, para
tratamento de camundongos B6D2F1 inoculados nas patas com células B16 na
dose de 35 mg/kg por 6 dias intraperitonealmente. O composto não foi ativo
contra tumores primários, no entanto, reduziu em 20% e em 80% o número e o
tamanho das metástases pulmonares. O efeito foi relacionado à modulação do
efeito invasivo, com redução de atividade gelatinolítica das células in vitro e no
plasma de animais tratados in vivo. O composto doador de NO conhecido como
GIT-27NO [(S,R)-3-phenyl-4,5-dihydro-5-isoxazole acetic acid], mas não o
composto parental que não é capaz de liberar NO, apresentou atividade
citotóxica in vitro contra células tumorais humanas e murinas (MaksimovicIvanic, 2008). O composto induziu apoptose em algumas linhagens celulares in
vitro, enquanto em outras induziu morte por autofagia, incluindo as células de
melanoma murino B16. Quando utilizado no tratamento do melanoma B16
135
implantado em animais C57Bl/6, reduziu significativamente o tamanho dos
tumores subcutâneos após 30 dias, na dose de 0.5mg/animal/dia, durante 10
dias. Em nenhum dos dois estudos apresentados, o efeito dos compostos de
rutênio sobre a mortalidade dos animais tratados comparativamente aos
controles não tratados, ou a presença de efeitos colaterais, são descritos.
A aplicação de drogas baseadas em metais no tratamento do câncer
iniciou-se
apenas
em
1969
quando,
acidentalmente,
Rosemberg
e
colaboradores (1969) descobriram a atividade antitumoral da cisplatina. A
introdução da cisplatina na clínica está relacionada a efeitos colaterais e
resistência adquirida ao quimioterápico pelas células tumorais (Stewart, 2007).
O estudo dos mecanismos pelos quais as células tumorais tornam-se
resistentes ao uso da cisplatina e seus análogos foram extensivamente
investigados e categorizados em quatro principais alterações: redução no
acúmulo intracelular da droga devido a uma diminuição na captação pelas
células tumorais; conjugação da droga com grupos tiol de proteínas como, por
exemplo, metalothioneína e/ou glutationa; aumento no reparo do DNA;
alterações nas vias moleculares envolvidas na sobrevivência e/ou morte celular
(Heffeter et al, 2008).
Devido às limitações do uso dos compostos de platina, novos agentes
antineoplásicos vêm sendo desenvolvidos com o objetivo de reduzir os efeitos
colaterais e reduzir a indução de resistência pelas células tumorais (Ott & Gust,
2007). Existem poucas informações sobre as causas de resistência aos novos
compostos conjugados a íons metálicos. Sugerem-se quatro possíveis causas
para que as células tumorais tornem-se resistentes ao tratamento com estes
novos compostos, baseadas na ação dos compostos de platina: redução da
136
concentração intracelular das drogas, devido a diminuição na captação dos
compostos, aumento do efluxo e distribuição alterada do composto; ligação e
metabolização do composto, principalmente relacionado à sua conjugação com
tiol-proteínas; aumento nos mecanismos de reparo de DNA; modificações das
vias de sobrevivência, tais como aumento na expressão dos componentes da
família Bcl-2 (através da inibição de proteínas antiapoptóticas), inibição do
gene supressor de tumor p53, alterações na via JAK/STAT; e por último, pelo
controle do fator de transcrição responsivo aos metais (ativado para manter a
homeostase dos metais no organismo) (Heffeter et al, 2008).
Embora ainda sejam necessários estudos mais aprofundados para um
completo conhecimento dos mecanismos de ação e de indução de resistência
aos vários compostos conjugados a metais, orgânicos e inorgânicos, que estão
sendo recentemente avaliados, esses compostos tem apresentado resultados
promissores nos ensaios pré-clínicos já realizados, estimulando o estudo dessa
classe de moléculas antitumorais.
137
7.0 CONCLUSÕES
Neste trabalho, a atividade antitumoral e o mecanismo de ação de
organometálicos conjugados a íons de Paládio e Rutênio foram avaliados
em ensaios pré-clínicos. Os resultados são relevantes para a descoberta de
novos agentes antitumorais que, futuramente, poderão ser aplicados na
clínica médica.
As principais conclusões do presente trabalho foram:
•
O ciclopaladado 7A foi citotóxico in vitro tanto para linhagens celulares
tumorais humanas como para a linhagem de melanoma murino B16F10Nex2. A rápida redução da acidificação extracelular observada após
tratamento das células murinas e humanas sugere que o mecanismo de
ação desta droga seja semelhante nas células tumorais humanas e
murinas;
•
O ciclopaladado 7A é efetivo no tratamento do melanoma primário
(subcutâneo) e também no tratamento do melanoma metastático
experimental. O C7A apresentou baixa toxicidade tanto in vivo como em
ensaios in vitro;
•
O ciclopaladado 7A tem a mitocôndria como alvo na célula tumoral,
catalizando a formação de pontes dissulfeto entre proteínas da
membrana mitocondrial, levando à sua agregação. Esse efeito
desestabiliza a membrana da mitocôndria, permitindo a entrada de
solutos e destruição da estrutura mitocondrial, e apresentando um
138
colapso no seu potencial de membrana, translocação da proteína próapoptótica Bax para o interior da organela, liberação de cálcio
intramitocondrial e consequente aumento do cálcio intracitoplasmático,
ativação de caspases efetoras da apoptose e degradação de DNA. Os
efeitos fenotípicos e bioquímicos provocados pelo C7A indicam que o
composto leve a célula tumoral à morte por um processo apoptótico pela
via intrínseca.
•
Além da citotoxicidade direta sobre as células tumorais, o ciclopaladado
7A apresentou uma atividade citotóxica direta sobre células endoteliais
humanas e inibiu a formação de estruturas pré-angiogênicas in vitro,
sugerindo uma adicional atividade anti-angiogênica in vivo.
•
A citotoxicidade in vitro de diversos compostos nitrosil tetraamina rutênio
foi avaliada em linhagens celulares tumorais murinas e humanas. Esses
compostos são doadores de óxido nítrico (NO), e a velocidade com que
esse radical é liberado em meio biológico depende do ligante de
estabilização acoplado à estrutura do complexo.
•
Os resultados com os compostos nitrosil tetraamina rutênio, doadores de
óxido nítrico, demonstraram que estes compostos são citotóxicos in vitro
para linhagens celulares tumorais murinas e humanas
•
Os
composto
de
rutênio
[Ru(NO)(NH3)4imN](BF4)3
trans-[Ru(NO)(NH3)4isn](BF4)3 e
apresentaram
significativa
trans-
atividade
antitumoral in vivo, utilizando o modelo subcutâneo de melanoma murino
B16F10-Nex2. Entretanto, a toxicidade destes compostos foi bastante
acentuada quando ensaiados in vivo;
139
•
Surpreendentemente,
o
composto
de
rutênio
trans-
[Ru(NH3)4imN(SO4)]Cl, apresentou uma acentuada atividade antitumoral
in vivo, com ausência de efeitos tóxicos nos animais tratados com a
droga;
•
A
administração
intraperitoneal do
composto
de
rutênio trans-
[Ru(NH3)4imN(SO4)]Cl, em modelo de metástase também foi capaz de
inibir o desenvolvimento de nódulos pulmonares in vivo;
•
Aparentemente, a atividade antitumoral do composto sulfatado não se
dá apenas pelo sulfato ou ao íon metálico, e sim pela estrutura química
como um todo;
•
Os resultados para avaliar o mecanismo de ação do composto de
rutênio sulfatado sugerem que este quimioterápico provoca apoptose da
célula tumoral, já que observamos alterações morfológicas compatíveis
com processo apoptótico, bem como externalização de fosfotidilserina e
degradação de DNA.
140
8.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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