Anais da XVIII Semana Científica Benjamin Eurico Malucelli (2009)

APERTE “CONTROL” + F NO SEU TECLADO PARA BUSCAR POR SOBRENOME OU PALAVRA DO TÍTULO DO RESUMO COMPORTAMENTOS SEXUALMENTE DIMÓRFICOS E INFECÇÃO BACTERIANA
PÓS-NATAL NA PROLE DE RATAS
Nascimento de Almeida, A. Felicio, LF; Palermo-Neto J, Bernardi MM
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP,
Universidade Paulista (UNIP), Instituto de Ciências da Saúde, São Paulo, Brasil
Introdução
Atualmente diversas evidências indicam que processos inflamatórios no período pré e pósnatal estariam envolvidos com a expressão de comportamentos em animais de laboratório e, em
humanos, com doenças psiquiátricas como esquizofrenia, depressão, autismo e doença de Parkinson
(1). Neste sentido, já se mostrou também que doenças psiquiátricas são dependentes do gênero. O
lipoppolissacárideo - LPS – é uma endotoxina bacteriana freqüentemente empregada como ativador
do sistema imune. A administração em período precoce da vida de ratos promove alterações na
resposta exploratória da prole de ratos quando desafiados na idade adulta com a mesma endotoxina
(2). Estes fatos podem ter um significado clínico, pois fêmeas e machas expostos a infecções no
período pós-natal podem apresentar também diferente susceptibilidade a patógenos na idade adulta.
Portanto, no sentido de investigar mais a fundo estas diferenças, o objetivo deste trabalho foi
examinar as diferenças sexuais em ratos cujo sistema imune foi ativado no quinto dia pós-natal por
LPS.
Material e Métodos
Ratos machos e fêmeas receberam i.p. no dia 5 pós-natal (PND5) 50 μg/ kg de LPS ou
solução salina a 0,9%. No PND21 e na vida adulta, diferentes grupos de ratos, fêmeas e machos
tratados ou não pós-natalmente com LPS, receberam i.p 100 μg/ kg da endotoxina LPS e foram
observados em campo aberto para medida de sua atividade geral. A estereotipia induzida pela
apomorfina e catatonia induzida pelo haloperidol também foi observada em ratas e ratos na idade
adulta.
Resultados
Com relação à atividade geral na infância não foram detectadas alterações nos diferentes
parâmetros tanto de filhote machos como de fêmeas. No entanto, na idade adulta as fêmeas do
grupo experimental foram menos sensíveis que os machos do mesmo grupo aos efeitos depressores
do LPS (fig.1) uma vez que apresentaram maiores níveis destes comportamentos. Na catatonia e no
comportamento estereotipado não foram detectadas diferenças entre os grupos (Fig.2).
Conclusão
A ativação do sistema imune no início da vida em fêmeas atenua de forma significante as respostas
a uma outra infecção aumento das freqüências de locomoção e levantar observadas nas ratas
tratadas perinatalmente com o LPS e desafiadas na idade adulta com a mesma endotoxina fato que
não ocorre em machos. Estes dados sugerem que fêmeas desenvolvem maior tolerância aos efeitos
do LPS quando expostos na infância à mesma endotoxina.
Agradecimentos
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro
(Temático: 04/14128-0) e ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, onde este trabalho foi realizado.
LEVANTAR
LOCOMOÇÃO
25
MACHO
FEMEA
*
100
50
*
MACHOS
FEMEAS
20
Frequência
Frequência
150
15
10
5
0
TA
IS
RI
M
EN
N
TR
O
EX
PE
O
C
EX
PE
C
R
O
IM
N
EN
TR
O
TA
LE
IS
LE
S
0
Figura 1.- Efeitos da administração pós-natal de lipopolissacarídeo (LPS- 50 μg/Kg) no 5 0 dia da
lactação nas frequências de locomoção e levantar de ratos machos e fêmeas observados em campo
aberto na idade adulta, desafiados com a mesma endotoxina (100μg/Kg). São apresentadas as
médias e respectivos erros-padrão. N= 7/grupo. Anova de duas vias. * p< 0,05 em relação ao grupo
de ratos machos tratados com LPS.
Catatonia
ESTEREOTIPIA
40
MACHO
FÊMEA
MACHO
FÊMEA
es
ol
ta
on
C
r im
pe
Ex
tr
en
ol
tr
on
C
ta
0
en
0
r im
10
pe
10
Ex
20
is
20
is
30
es
frequência
30
40
Figura 2.- Efeitos da administração pós-natal de lipopolissacarídeo (LPS- 50 μg/Kg) no 5 0 dia da
lactação na catatonia experimental induzida pelo haloperidol e na estereotipia induzida pela
apomorfina em ratos machos e fêmeas observados na idade adulta. São apresentadas as medias e
respectivos limites inferior e superior. N= 7/grupo. Anova .
Referências
[1] Golan, H.M., Lev, V., Hallak, M., Sorokin, Y., Huleihel, M., 2005. Specific
neurodevelopmental damage in mice offspring following maternal inflammation during pregnancy.
Neuropharmacology 48, 903-917.
[2] Tenk CM, Kavaliers M, Ossenkopp KP. Sexually dimorphic effects of neonatal immune system
activation with lipopolysaccharide on the behavioural response to a homotypic adult immune
challenge.J Dev Neurosci. 2008,26:331-8
INJEÇÃO INTRACEREBROVENTRICULAR DE ESTREPTOZOTOCINA COMO
MODELO ANIMAL DA DOENÇA DE ALZHEIMER: ANÁLISE
COMPORTAMENTAL E BIOQUÍMICA
Mazucanti, C.H.Y1 .; Santos, T.O.1; Costa, M.P. ; Xavier, G.F.2; Torrão, A.S.1
1-Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Ciências Biomédicas – USP
2-Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências - USP
Introdução
A Doença de Alzheimer (DA) é causa mais comum de demência e é caracterizada
clinicamente por comprometimentos cognitivos. Histologicamente é caracterizada pela formação de
placas senis e emaranhados neurofibrilares intracelulares resultantes de alterações do metabolismo
do peptídeo beta amilóide e da hiperfosforilação da proteína tau, respectivamente. Essas alterações
parecem, em parte, ser uma decorrência de uma deficiência na sinalização da insulina e conseqüente
resistência do encéfalo a esse hormônio, sugerindo que a DA esporádica tenha uma relação com o
Diabetes mellitus. A streptozotocina tem sido utilizada como modelo de indução do Diabetes, e
mais recentemente como modelo experimental da DA. Nosso objetivo para esse projeto de pesquisa
é o de caracterizar molecularmente determinadas áreas do encéfalo de ratos submetidos à injeção de
estreptozotocina, utilizando a técnica de western blotting para avaliar a expressão de marcadores de
neurodegeneração e de proteínas relevantes, considerando a lesão como possível modela animal da
DA.
Material e Métodos
Para a realização dos experimentos foram utilizados ratos Wistar machos com 4 meses de
idade. Os animais foram submetidos a cirurgia estereotáxica com a finalidade de se fazer injeção
intracerebroventricular bilateral de estreptozotocina em uma dose de 3 mg/kg de animal.Os animais
foram submetidos a testes comportamentais no labirinto aquático de Morris, no qual foram
avaliadas as memórias de referência e operacional dos animais em períodos agudos e crônicos em
relação à injeção da droga. Foram realizadas também análises por western blotting de diversas
estruturas encefálicas de animais que receberam a dose icv da droga após 30 dias para avaliar
expressão de tau fosforilada, beta amilóide e GFAP, além de análise de neurodegeneração por
Fluoro-Jade Cem cortes histológicos de encéfalos de ratos após 1 e 15 dias da injeção de
estreptozotocina.
Resultados
A análise estatística mostra que a injeção icv de estreptozotocina causou prejuízo em
diversos parâmetros analisados nos testes comportamentais, indicando prejuízo na memória tanto de
referência quanto operacional. A análise por western blotting das estruturas encefálicas mostrou
nível de significância (teste T para amostras independentes) de P<0,01 para Beta-amilóide nas
estruturas amígdala (A), núcleos da base (B), córtex entorrinal (C) e hipotálamo (D); de P<0,03
para GFAP nas estruturas córtex (E), núcleos da base (F), hipocampo (G) e córtex entorrinal (H); de
P<0,04 para razão Tau/Tau-P nas estruturas córtex entorrinal (I) – com diminuição de expressão do
grupo STZ em relação ao controle -, cerebelo (J), córtex (L), amígdala (M), núcleos da base (N) e
prosencéfalo basal (O); e de P=0,0251 para ChAT na amígdala (P). A marcação por Fluoro-Jade C
evidenciou processo neurodegenerativo no hipotálamo e na área septal de encéfalos após 1 dia da
injeção de estreptozotocina, e no hipocampo após 15 da injeção.
Conclusão
Nossos resultados sugerem que animais injetados com STZ icv apresentaram desempenho
inferior nas tarefas de memória de referência e operacional, sugerindo que esse modelo compromete
aquisição, retenção e resgate de memória, capacidades também danificadas na Doença de
Alzheimer. É evidenciado também através deste trabalho as semelhanças bioquímicas entre a DA e
o modelo por injeção icv de estreptozotocina.
Figura 1: Memória de Referência em relação à Latência (LAT), Comprimento do Trajeto (CT),
Porcentagem de tempo no quadrante crítico (QD4) e porcentagem de tempo no anel crítico (ANB).
A ANOVA revelou a existência de efeito significativo no fator Grupo (F1,16 = 9,64-25,08;
P<0,07). Em relação aos parâmetros LAT, QD4 e ANB, a ANOVA revelou existência de efeito
significativo em relação ao fator Dia (F1,16 = 2,93-8,93; P<0,02).
CONTROLE
CA1 do HPC
15 dia
Área septal 1 dia
HPT
1 dia
STZ
Figura 2: Efeito da injeção intracerebro-ventricular de estreptozotocina sobre a marcação de FluoroJade C em algumas estruturas encefálicas. Imagens digitais de cortes coronais de encéfalo de rato,
ilustrando a expressão de Fluoro-Jade C. A e B demonstram marcação no hipotálamo e C e D na
Área septal, 1 dia após a injeção icv de STZ, E e F marcação na área CA1 do hipocampo após 15
dias da injeção. Notar a marcação puntiforme (A e C) indicadora de fibras e de corpos celulares (E)
em degeneração, indicados pelas setas.
ß-Amilóde
Figura 3. Efeito da injeção intracerebroventricular de estreptozotocina sobre a expressão de
diferentes proteínas nas diferentes estruturas encefálicas. Os resultados são expressos como valores
percentuais em relação ao grupo controle (considerado 100%), obtidos a partir dos valores absolutos
da densitometria óptica. O nível de significância adotado após o teste t (Student) para amostras
independentes foram de P<0,01 para Beta-amilóide nas estruturas amígdala (A), núcleos da base
(B), córtex entorrinal (C) e hipotálamo (D)
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA Euphorbia tirucalli (AVELOZ) SOBRE O
CRESCIMENTO DO TUMOR DE EHRLICH EM SUA FORMA ASCÍTICA
PAZ, D. P. A.; LATORRE, A. O.; DA SILVA, T. C.; AKISUE, G.; DAGLI, M. L. Z
Laboratório de Oncologia Experimental e Comparada, Departamento de Patologia, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, USP, SP
Introdução
O uso popular de plantas medicinais para o tratamento e prevenção de doenças é amplamente
realizado no Brasil. Euphorbia tirucalli, comumente conhecida como “aveloz” é uma planta
ornamental, encontrada nas regiões tropical e subtropical, tradicionalmente utilizada para o
tratamento de tumores [1].
Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos do látex de E. tirucalli,, diluído
em solução salina na mesma concentração utilizada popularmente, sobre o crescimento do tumor de
Ehrlich na forma ascítica em camundongos. Para tal, fez-se inicialmente um estudo de toxicidade
com a finalidade de verificar se as concentrações utilizadas causariam alterações sistêmicas nos
camundongos.
Material e métodos
Foram utilizados camundongos C57BL/6, machos, pesando de 25 a 35g. Durante o período de
experimentação, os animais permaneceram no Biotério, recebendo água e ração balanceada “ad
libitum”. Para o teste de toxicidade foram testadas 3 concentrações de látex, o qual foi colhido
diretamente da planta e diluído em solução salina: 0,0123%, 0,0246% e 0,0369% correspondendo,
respectivamente, à diluição de 3, 6 e 9 gotas de látex em um litro de solução salina. Para o estudo de
toxicidade foram utilizados 20 camundongos. Para cada camundongo, foi administrado um volume
equivalente a 5μl de cada uma destas concentrações por gavagem, por 13 dias. Ao final do
experimento, os animais foram eutanasiados, necropsiados e fragmentos representativos de seus
órgãos foram colhidos, fixados em formol tamponado e incluídos em parafina. Cortes histológicos
do fígado, rins, pulmões, baço e estômago foram examinados ao microscópio. Para avaliação dos
efeitos da E. tirucalli no crescimento do tumor ascítico de Ehrlich foram utilizados 30
camundongos, que foram inoculados com 9 x 106 células do tumor de Ehrlich, porvia
intraperitoneal, no dia 1 do experimento. O tratamento foi iniciado no mesmo dia que foi realizada a
inoculação do tumor. Os animais receberam, por gavagem, a dose de 5μl de E.tirucalli na diluição
de 0,0369% por 13 dias. O grupo controle recebeu somente a solução salina pela mesma via e
período de administração. Ao final do experimento os camundongos foram eutanasiados para
avaliação do crescimento tumoral através da quantificação do fluido ascítico e da contagem das
células tumorais viáveis, inviáveis e totais. Analisou-se também o peso relativo do baço.
Resultados
O teste de toxicidade resultou negativo para todas as concentrações testadas. Houve
diminuição significante na concentração de células tumorais viáveis do grupo tratado em relação ao
não tratado (p=0,0348, teste t student) na concentração de 0,0369% de látex diluído em solução
salina, com administração de 5μl desta concentração por animal. A concentração de células totais
diminuiu no grupo tratado com E.tirucalli em relação aos animais controle (próximo da
significância p=0,0564, teste t student). Houve também tendência a aumento no volume de fluido
ascítico total no grupo tratado com E.tirucalli (p=0,0634, teste t student).
Tabela 1. Volume ascítico e contagem de células tumorais
Total de volume do líquido ascítico (ml)
Células viáveis/ml (107)
Células totais/ml (107)
Controle
17,115 ± 1,839
6,269 ± 2,157
8,154 ± 2,715
Tratado (0,0369%)
18,500* ± 1,861
4,768** ± 1,254
6,286* ± 2,057
Dados apresentados como média ± desvio padrão.*variação quase significante em relação ao grupo controle. **
variação significante em relação ao grupo controle. (P<0,05)
Células viáveis/ml
9
Nº de células (107)
8
7
6
*
5
4
3
2
1
0
CT
0,0369%
Concentração
Figura 1. Concentração de células tumorais viáveis ao final do tratamento.
significante em relação ao grupo controle (P<0,05)
25
*
Variação
Total de volume do líquido ascítico
20
*
ml
15
10
5
0
CT
0,0369%
Concentração
Figura 2. Total de volume do líquido ascítico ao final do tratamento. * Variação quase significante
em relação ao grupo controle (p=0,0634)
Conclusões
Os resultados mostraram que a concentração de E. tirucalli utilizada na medicina popular
apresentou redução no desenvolvimento de células tumorais in vivo, sem apresentar toxicidade, o
que pode indicar uma ação antineoplásica.
Agradecimentos
Agradeço ao CNPQ pela concessão da bolsa referente à este projeto, assim como à
FMVZ/USP e ao Departamento de Patologia localizado na mesma, pela oportunidade de
desenvolvê-lo. Agradeço à Profª Dr. Maria Lúcia Zaidan Dagli, pela oportunidade de crescimento e
aprendizado, assim como pelo incentivo, estímulo e esclarecimentos. Agradeço também à Dr.
Tereza Cristina da Silva e à doutoranda Andréia Oliveira Latorre, pela grande ajuda esclarecendo
minhas dúvidas e me auxiliando nos experimentos. Agradeço ao Profº Dr Gokithi Akisue, pelas
dicas quanto à forma colheita do látex de E. tirucalli, preparo e concentração da diluição da mesma.
Referências
[1] VALADARES, MC; CARRUCHA SG; ACCORSI W; QUEIROZ MLS Euphorbia
tirucalli L. modulates myelopoiesis and enhances the resistance of tumor-bearing mice.
International Immunopharmacology 6: 294-299, 2006.
“ANÁLISE DOS CELOMÓCITOS EM HOLOTÚRIAS, ISOSTICHOPUS BADIONOTUS
(SELENKA, 1867)”
Nala, I.G. ¹; Branco, P.C.² ; Iunes, R.S. ² ; Gidali, D. ¹ ; Borges, J.C.S¹ ; Silva, J.R.M.C. ²
1- Faculdades Metropolitanas Unidas – São Paulo, Brasil
2- Depto de Biologia Celular e do Desenvolvimento - Instituto de Ciências Biomédicas –
Universidade de São Paulo – São Paulo, Brasil
Introdução
Os pepinos-do-mar são fonte de alimento em diversos países orientais, em alguns países esse hábito
gastronômico acarretou na sobrepesca destes, somando-se a isso há relatos na literatura de
mortalidade em massa desses animais[1]. Informações sobre o sistema imune de holotúrias é bem
escasso na literatura científica. Tendo em vista esses aspectos, o estudo das células do sistema
imune inato e ainda dos índices fagocíticos se torna fundamental para elucidar os conceitos até
então obscuros e servir de subsídio para futuros estudos envolvendo a relação existente entre a
resposta imune e os fenômenos de mortalidade em massa desse equinodermata[2]. A espécie a ser
estudada é a Isostichopus badionotus dada sua abundância e facilidade de coleta no litoral norte do
Estado de São Paulo. Vale ressaltar que o pepino-do-mar é, como os demais equinodermos, um
organismo séssil e que as alterações apresentadas por este organismo nos remete a alterações
daquele local específico onde os animais foram coletados, podendo portanto ser utilizados como
biomarcadores ambientais de poluição, por exemplo[3].
O presente trabalho tem por objetivo caracterizar os tipos celulares do pepino-do-mar Isostichopus
badionotus, mediante análise a fresco em miscroscopia de fase, alem da contagem absoluta e
relativa com o auxilio da camara de Neubauer.
Material e Métodos
Exemplares de pepinos-do-mar, Isostichopus badionotus (Selenka, 1867) (n=20) foram
colhidos no costão rochoso ao redor da ilha de Tiasussê (23o 49, 530’ Sul e 0,45º 26,394`Oeste), na
praia de Baraqueçaba, em São Sebastião, litoral norte do estado de São Paulo. Os animais foram
colhidos manualmente, em mergulho livre, a uma profundidade de 3 a 7 metros.
Os animais, durante o período de quarentena, foram mantidos em caixas d’água pintadas de epoxi
(500 litros) com água do mar (21.0±1.0o C, 35‰ salinidade).
A contagem dos celomócitos foi realizada sem diluição em câmara de Neubauer. Para ensaios de
fagocitose in vitro serão utilizadas leveduras S. cerevisae incubadas por 2 horas utilizando o
protocolo de Silva et. al, 2001.
Os celomócitos foram avaliados sob microscopia óptica, utilizando os métodos de coloração de
Peroxidase, Rosenfeld e Perls, e utilizaremos também, análises ultraestruturais sob microscopia
eletrônica.
Será realizada analise ultra estrutural com o auxilio de microscopia eletrônica de transmissão, alem
de analisar a fogocítose e o índices fagocíticos.
Os dados obtidos serão avaliados em função das médias e desvio padrão obtidos por análises
estatísticas pelo ANOVA.
Resultados
A coleta do líquido celomático foi realizada na cavidade celomática da região ventral com
auxílio de ultrassonografia.
Foram observados nove tipos celulares, a saber: amebócito fagocítico, esferulócito
vermelho, esferulócito incolor, céluas cristais, células progenitoras, hemócitos, células fusiformes,
células vibráteis e corpúsculos marrons. Foi realizada a contagem absoluta e relativa dos
celomócitos (Tabela 1), ambas contagens foram realizadas com o líquido celomático coletado sem
auxílio de anticoagulante e sem diluição prévia. A contagem absoluta foi realizada analisando nos
quatro quadrantes externos da camara de Neubauer e o valor obtido foi multiplicado pelo volume da
camara (105). A contagem relativa foi realizada a fresco em 100 células em lamina de vidro, optouse por realizar essa contagem a fresco para facilitar a identificação das células vibráteis, uma vez
que essas são identificadas pela presença de seus movimentos contínuos ao redor do próprio eixo, o
que não seria possível em material fixado.
Tabela 1. Contagem absoluta e relativa dos tipos celulares do pepino do mar Isostichopus
badionotus.
Tipo Celular
Contagem Absoluta (no cél/ml) Contagem relativa (%)
Amebócito Fagocítico
Esferulócitos Vermelhos
Esferulócitos Incolores
Células Vibráteis
Células Progenitoras
Hemócitos
Células Fusiformes
Corpúsculos Marrons
Células Cristais
Total
210
110
70
56
212
156
216
136
140
1,3 x 108
17
09
06
05
17
14
12
08
12
100
Conclusão
Pode se concluir que o resultado obtido para a contagem relativa e a contagem absoluta está
de acordo com os dados obtidos na literatura para outras espécies de pepinos do mar. É a primeira
vez que se estudam os celomócitos da espécie Isostichopus badionotus.
Futuramente pretende-se analisar ultra estruturalmente, por microscopia eletrônica de
transmissão, bem como analisar a resposta imune inata, por meio de fagocitose e índices
fagocíticos.
Agradecimentos
CNPq pelo apoio financeiro, e ao PIBIC. CEBIMar pelo auxílio nos experimentos pilotos.
Referências
[1] HUTCHINS, M. ; THONEY, D. , SCHLAGER, N. ; Grzimek's Animal Life Encyclopedia, 2nd
edition. Volume 1, Lower Metazoans and Lesser Deuterostomes. Farmington Hills, MI: Gale
Group, 2003
[2] SILVA, J. R. M. C. ; VELLUTINI, B. C. ; NETO, L. R. P. ; PRESSINOTTI, L. N. ; RAMOS,
M. C.; COOPER, E. L. ; BLAZQUEZ, F. J. H. ; JUNIOR, B. E. J. & BORGEs, J. C. S. ; Resposta
Imune Inespecífica de animais ectotérmicos antárticos sob temperaturas polares,Oecol. Bras., 11
(1): 110-121, 2007
[3] JONES, G.M.; HEBDA, A.J.; SCHEIBLING, R.E. E MILLER, R.J. Histopathology of the
disease causing mass mortality of sea urchins (Strongylocentrotus droebachiensis) in Nova Scotia.
J.Inv. Pathol., 45, 260-271, 1985.
EVOLUÇÃO DO PESO CORPORAL DE FÊMEAS DE HAMSTER SÍRIO (Mesocricetus
auratus) APÓS A OVARIECTOMIA
Annes, K1; Chelini, M.O.M.2 ; Souza, N.L.3 ; Cortopassi, S.R.G3. ; Milazzotto, M.P.1
1
Universidade Federal do ABC ; 2Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo; 3Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo.
Introdução
Os estrógenos, além do seu papel nas funções reprodutivas, também exercem influência
sobre o balanço energético e o ganho de peso. Ganho de peso acelerado acompanhado de maior
ingestão alimentar após a ovariectomia foi relatado em ratas e em diversas outras espécies como o
macaco rhesus e também na mulher após a menopausa [1].
No hamster, 90 dias após a ovariectomia, não foi observadadiferença entre as concentrações
de metabólitos fecais de estrógenos de fêmeas castradas e de fêmeas inteiras. Ademais, foi
evidenciada a expressão aumentada do gene responsável pela síntese da aromatase, enzima
catalisadora da síntese dos estrógenos, em diversos tecidos destas fêmeas (Chelini, comunicação
pessoal).
Com base neste dados, a hipótese deste trabalho é que fêmeas de hamster Sírio
(Mesocricetus auratus) ovariectomizadas produzem estrógenos não ovarianos que atuam no
metabolismo energético e na deposição de gordura, com conseqüente ganho de peso.
O objetivo deste estudo foi acompanhar a evolução do peso corporal de fêmeas de hamster
sírio ovariectomizadas e inteiras.
Materiais e Métodos
Onze fêmeas de hamster sírio adultas (± 50 dias de idade), inexperientes sexualmente, foram
divididas em dois grupos de maneira aleatória. A maturidade sexual foi confirmada antes do início
de qualquer procedimento. O peso corporal médio era similar nos dois grupos (IN: 105,0 ± 3,5 g;
OV: 109,0 ± 9,5; Mann-Whitney, p = 0,773).
Um dos grupos com seis fêmeas (OV) foi submetido a ovariectomia sob anestesia inalatória
com isoflurano. O outro grupo com cinco fêmeas (IN) foi submetido a procedimento sham de
incisão e sutura, sob o mesmo protocolo de anestesia. A partir do segundo mês após a ovariectomia,
as fêmeas foram pesadas mensalmente. Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de
Bioética da FMVZ-USP.
Os dados foram analisados com o software SPSS 13.0 for Windows. Com distribuição
normal e homogeneidade de variância, os ganhos de peso médios foram comparados entre os
grupos por analise de variância (ANOVA). Os pesos médios, por não apresentarem homogeneidade
de variância foram analisados pelo teste de Mann-Whitney.
Resultados
As fêmeas de ambos os grupos ainda estavam em fase de crescimento e, conforme o
esperado, todas ganharam peso nos dois meses subsequentes ao procedimento cirúrgico. O ganho
foi, no entanto, maior no grupo OV (OV: 54,4 ± 11,0g; IN: 39,5 ± 7,4g; p = 0,030), resultando em
peso médio diferente nos dois grupos. Esta tendência foi invertendo-se ao longo dos meses, com as
fêmeas inteiras ganhando peso no 4o e 5º meses enquanto o peso das fêmeas castradas se
estabilizava para a seguir diminuir (5º mês: OV -6,5 ±5,4g; IN 0,38 ± 3,1g; p = 0,024) (Figura 1).
Ao fim do 5º mês não havia diferença entre os pesos médios dos dois grupos (OV: 164,4 ± 21,3g;
IN: 171,0 ± 11,5g; p = 0,201).
Figura 1 – Evolução do ganho de peso médio de fêmeas de hamster Sírio ao longo de 5 meses após
ovariectomia (OV) ou procedimento sham (IN). T = ganho de peso acumulado em 5 meses. *
indicam diferenças entre os ganhos de peso médios nos dois grupos num mesmo mês (ANOVA p <
0,05).
Conclusão
O ganho de peso maior das fêmeas ovariectomizadas nos dois primeiros meses após a ovariectomia
sugere que, no hamster como no rato e no ser humano, a queda decorrente das concentrações
sistêmicas de estrógenos modifica o comportamento alimentar e favorece a deposição de gordura.
No entanto, tal efeito, de longa duração senão permanente no rato e na mulher [1], parece transitório
no hamster: a partir do terceiro mês as fêmeas ovariectomizadas deixaram de ganhar peso.
Associado à igualdade de concentrações de metabólitos fecais de estrógenos em fêmeas inteiras e
ovariectomizadas e ao aumento de atividade da aromatase em alguns tecidos da fêmea
ovariectomizada, esse resultado sugere um aumento da síntese de estrógenos em tecidos não
ovarianos em reação à ovariectomia. Esses estrógenos passariam a exercer sobre o comportamento
alimentar e a deposição de gordura efeitos compensatórios similares àqueles exercidos na fêmea
inteira pelos estrógenos sintetizados nos ovários.
Referências
[1] Butera, P.C., 2009. Estradiol and the control of food intake. Physiology & Behavior, 2009.
AVALIAÇÃO HEMATOLÓGICA DE CAMUNDONGOS SWISS TRATADOS COM
ÓXIDO DE NIÓBIO
Lima, P. M.¹, Dsouki, N. A²., Corazzini, R¹., Fonseca, F. L. A.²
¹Curso de Ciências Biológicas do Centro Universitário Fundação Santo André; ² Faculdade de
Medicina do ABC, Santo André/ SP.
Introdução
O nióbio, considerado elemento 41, foi descoberto na Inglaterra em 1801 por Charles Hatchett, na
época o denominou de colúmbio. Posteriormente, o químico alemão Heinrich Rose, pensando haver
encontrado um novo elemento ao separá-lo do metal tântalo, deu-lhe o nome de nióbio em
homenagem a Níobe, filha do mitológico rei Tântalo. É um material cinzento, moderadamente duro,
mais dúctil do que o tântalo, com ponto de fusão mais baixo, e cristaliza-se com estrutura cúbica de
corpo centrado. Além disso, é estável ao ar e apenas perde o brilho superficial ao ser aquecido
(CBMM, 2005, OHLWEILER, 1973). As informações mais antigas sobre o uso de nióbio datam de
1925, referindo-se à substituição do tungstênio na produção de ferramentas de aço. No início da
década de 1930, o nióbio passou a ser utilizado na prevenção de corrosão intergranular em aços
inoxidáveis (CBMM, 2005). Até a descoberta quase simultânea de depósitos de pirocloro no
Canadá e no Brasil (Araxá), na década de 1950, o uso do nióbio era restrito pela oferta limitada (era
um sub-produto do tântalo) e custo elevado. (CBMM, 2005). Estudos realizados por GOTO et al,
2005 em camundongos Swiss inoculados com óxido de nióbio 3%, observou-se a citotoxicidade,
elevada migração celular, redução no número de mastócitos, aumento de monócitos e em
quantidade equivalente aos animais tratados com BCG. Este trabalho tem por objetivo verificar a
influência do óxido de nióbio na celularidade hematológica: série branca e série vermelha
Materiais e Métodos
Foram utilizados 18 camundongos Swiss machos. A manutenção e o tratamento desses animais
foram realizados no Biotério do Centro Universitário Fundação Santo André, seguindo todos os
princípios éticos de experimentação com animais do COBEA - Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal.
Os animais foram submetidos à dose única ip de 0,1mL de solução estéril de óxido de nióbio a 3%,
e 0,1mL de solução salina para os animais controle. Os animais foram separados aleatoriamente em
três grupos de tratamentos: 3 dias, 7 dias e 12 dias, compostos por 06 animais cada: 02 controles e
04 tratados com óxido de nióbio 3%.
Resultados
Aumento do número total de células para animais tratados com óxido de nióbio por 3, 7, e 12 dias.
Com 7 dias, houve um aumento do número de células mortas. Em 3 dias, os animais apresentaram
diminuição no número de hemácias quando comparado com controle. Os neutrófilos apresentaram
valores diminuídos, para 3 e 7 dias de tratamento quando comparados com o controle.
Os linfócitos apresentaram diminuição ao longo do tempo de tratamento com óxido de nióbio.
Conclusão
Provavelmente há um fenômeno de citotoxicidade relacionado ao processo de inflamação aguda. O
trabalho será submetido em análise estatística.
Agradecimentos
Apoio
• Centro Universitário Fundação Santo André
• Faculdade de Medicina do ABC
Referências
[1] ANDRADE, Ricardo Ferreira; Determinação de nióbio em minério por polarografia de
pulso diferencial. 1990. 130f. Dissertação (Mestrado em Química analítica) – Instituto de Química,
Universidade de São Paulo, São Paulo, 1990.
[2] BARBOSA, D. Z.; DUARTE, L. G.; GOMIDE, H. A. Reações teciduais ao implante de
corpos de nióbio. Estudo histológico em ratos. Revista ABO nacional, Minas Gerais, v. 10, n. 3,
jul. 2002.
[3] CORAZZINI, Roseli; Avaliação morfo-fisiológica de macrófagos peritoniais de
camundongos submetidos ao choque térmico. 1993. 156f. Dissertação (Mestrado em Patologia
Experimental e Comparada) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, 1993.
[4] COMPANHIA BRASILEIRA DE METALURGIA E MINERAÇÃO - CBMM. História do
Nióbio. Disponível em: <www.cbmm.com.br>. Acesso em: 16 mar. 2005.
[5] KURODA, Syuhei; TAKEDA, Shoji; NAKAMURA, Masaaki. Effects of six particulate
metals on osteoblast–like MG-63 and HOS cells in vitro. Dental Materials Journal, Japan, v. 22,
n. 4, dec. 2003.
AVALIAÇÃO DO FIBRINOGÊNIO NO ÚTERO DE CAMUNDONGOS PRENHES
SUBMETIDOS AO VENENO DE Bothrops jararaca
Ferreira SS1, Santoro ML1, Katz SG2, Spadacci-Morena DD1
1
Laboratório de Fisiopatologia, Instituto Butantan, 2Disciplina de Histologia e Biologia Estrutural,
UNIFESP/EPM, São Paulo, Brasil
Introdução
Já é bastante conhecido que o veneno botrópico contem fatores capazes de ativar a coagulação
sanguínea. Spadacci-Morena et al [4] mostraram que o veneno da B. jararaca foi capaz de provocar
diminuição de fibrinogênio no plasma de camundongos prenhes e reabsorção fetal, entre os animais
submetidos a esse veneno. O fibrinogênio oriundo da mãe tem um papel crítico na manutenção da
gravidez tanto em humanos [1, 2] como em animais [3, 6], pois é necessário para estabilizar a
matriz extracelular na interface materno-fetal [3] juntamente com a fibronectina e/ou integrina [5].
Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a presença do fibrinogênio no útero de camundongos
prenhes submetidos ao veneno da Bothrops jararaca (Bj).
Material e Métodos
Camundongos no 8º dia de prenhez (dp) receberam 0,48mg de veneno de Bj/kg de peso, i.m. Como
controle, animais na mesma data da prenhez receberam salina estéril, i.m. Na manhã do 9ºdp, após a
exposição do útero, os sítios de implantação foram separados e submetidos aos seguintes
procedimentos: a- fixados em Bouin e processados de forma rotineira para avaliação morfológica;
b- homogeneização e solubilização das proteínas, eletroforese de SDS-PAGE e imunotransferência;
c- fixados em PFA 4% para a localização, através de imunohistoquímica, do fibrinogênio na matriz
extracelular do útero. O plasma de todos os animais foi coletado para a determinação da
concentração plasmática de fibrinogênio (Fg).
Resultados
A análise histológica dos tecidos uterino (mais especificamente a decídua antimesometrial) e
embriônico, pertencentes ao grupo salina, apresentaram características morfológicas semelhantes
àquelas reportadas para animais não submetidos a nenhum tratamento, no mesmo dia de prenhez,
onde as células trofoblásticas gigantres (T) e as deciduais maduras (CD) apresentavam aspecto de
células saudáveis (fig. 1). Entretanto, entre alguns animais do grupo que recebeu o veneno
botrópico, as dilatações esféricas presentes no útero apresentaram os tecidos materno e embrionário
desorganizados (figs.2 e 2A), com células trofoblásticas gigantes (T) e deciduais maduras (CD) com
sinais claros de morte celular, focos hemorrágicos (H) e presença de polimorfonucleares (setas). Os
resultados obtidos com a utilização de imunoperoxidase revelaram que a região antimesometrial
uterina, dos animais pertencentes ao grupo salina, apresentou acentuada marcação para
fibrinogênio, esparsa pela matriz extracelular (figs. 3 e 3A), sendo essa marcação mais intensa nesse
grupo do que no grupo dos animais que receberam o veneno de Bj (figs. 4 e 4A). A fig. 5 mostra o
resultado obtido através do imunoblotting onde é possível observar que a banda de fibrinogênio no
grupo Bj é menos intensa que no grupo de animais que recebeu salina, havendo uma correlação
entre estes resultados e os obtidos com a imunohistoquímica. Como indicado na figura 6, os animais
que receberam o veneno da Bj apresentaram queda no nível de fibrinogênio plasmático
(0,55g/L±0,07), quando comparado com o grupo salina (1,23g/L±0,24), havendo diferença
estatística entre os grupos(p=0,004).
Cortes transversais da região antimesometrial de camundongos no 9ºdp tratados com salina ou veneno de Bj.
Fotomicrografia. H&E.
Imunoblotting mostrando as bandas de
fibrinogênio (setas) em camundongos no
9ºdp tratados com salina ou veneno de Bj.
Níveis
de
fibrinogênio
de
camundongos no 9ºdp tratados com
salina ou veneno de Bj. p= 0, 004
Conclusão
Estes resultados parciais mostram que o veneno da B.jararaca foi capaz de provocar a diminuição
do fibrinogênio, tanto no plasma como no tecido uterino materno.
Agradecimento
INCTTox – CNPq/FAPESP.
Referências
[1]Inamoto Y. & Teraro T. Am. J. Obestet. Gynecol. 153: 803-4, 1985
[2]Inbal A. & Muszbek L. Semin. Thromb. Hemost. 29: 171-4, 2003
[3]Iwaki T., Sandoval-Cooper M.J., Paiva M., Kobayashi T., Ploplis V.A., Castellino F.G. Am. J.
Pathol. 160: 1021-34, 2002
[4]Spadacci-Morena D.D., de Tomy S.C., Sano-Martins I.S., Katz S.G. Toxicon 47: 196-207, 2006
[5]Suehiro K., Mizuguchi J., Nishiyama K., Iwanaga S., Farrell D.H., Ohtaki S. J. Biochem. 128:
705-10, 2000
[6]Suh T.T., Holmback K., Jensen N.J., Daugherty C.C., Small K., Simon D.I., Potter S., Degen
J.L. Genes Dev. 9: 2020-33, 1995
AVALIÇÃO DE ASPECTOS IMUNOPATOLÓGICOS EM LESÕES DE PELE
DESENVOLVIDAS EM PRIMATA Cebus apella PELA INOCULAÇÃO DE L. (L.)
amazonensis E L. (V.) braziliensis
1
2
Laurenti, M.D. ; Silveira, F.T. ; Passero, L.F.D.; Rocha, M.C.1; Tomokane, T.Y.1; Gomes, C.M.C.1;
Corbett, C.E.P.1
1
Laboratório de Patologia de Moléstias Infecciosas, Faculdade de Medicina, Universidade de São
Paulo (SP), 2Laboratório de Leishmanioses, Instituto Evandro Chagas, Belém (PA).
[email protected]
Introdução: Aspectos clínicos e histopatológicos da evolução da infecção causada por diferentes
species de Leishmania dermotrópicas no primata Cebus apella confirma sua suscetibilidade à
infecção por Leishmania e suportam indicações prévias de que este primata possa ser empregado
como modelo experimental para estudos em leishmaniaose cutânea [1,2,3]. Diante do exposto, o
objetivo deste estudo foi caracterizar mecanismos imunopatológicos envolvidos na evolução das
alterações histopatológicas cutâneas desencadeadas na pele do primata Cebus apella pela
inoculação de L. (L.) amazonensis e L. (L.) braziliensis, duas spécies dermotrópicas de maior
intresse médico em nosso país.
Material e métodos: 10 espécimes do primata Cebus apella foram utilizadas nos experimentos, 5
inoculadas com 3x106 promastigotes de L. (L.) amazonensis e 5 com 3x106 promastigotas de L. (V.)
braziliensis em 8 pontos da cauda. Biópsias de pele foram coletadas aos 2, 30, 60, 90, 120, 150, 180
and 300 dias pós-infecção (PI) para estudo histopatológico e imunoistoquímico empregando-se o kit
LSBA (DAKO) e como anticorpos primários: anti-Leishmania e anti-CD20 produzidos em
camundongo e anti-lisosima e anti-CD3 produzidos em coelho. Após análise comparativa dos
cortes, o parasitismo e os marcadores celulares foram avaliados semi-quantitativamente,
considerando-se: negativo (0), discreto (1) para 1-10, moderado (2) para 11-25 e intenso (3) para
mais que 25 parasitos ou células/campo microscópico em objetiva de 40X.
Resultados: As alterações histopatológicas da pele dos primatas inoculados com L. (L.)
amazonensis se caracterizaram por infiltrado inflamatório discreto e focal na derme formado por
leucócitos poli e mononucleares aos 2 dias PI. Este processo inflamatório aumentou com o tempo
de infecção sendo evidente a presença de macrófagos parasitados e plasmócitos. Aos 60 e 90 dias
PI, foi observado a formação de granulomas com células gigantes e áreas focais de necrose. A partir
de 150 dias PI as lesões se caracterizaram pela presença de tecido cicatricial com abundância de
colágeno e raras células inflamatórias. O estudo imunoistoquímico mostrou a prensença de parasitos
a partir de 30 até 120 dias PI. Ativação de macrófagos, caracterizada por reação positiva para
lisosima, mostrou-se discreta aos 2 dias PI, moderada ao 30o dia, intensa ao 60o dia, seguida por
moderada ao 90o dia e discreta a partir do 120o dia quando a carga parasitária já era discreta e o
tecido cicatricial estava presente na lesão. Células CD3+ estavam presentes na lesão, em caráter
moderado, entre o 30o e 150o dia PI. Células CD20+ foram observadas a partir do 60o dia de
infecção, em caráter discreto (Figura 1A).
As lesões de pele desencadeadas pela inoculação de L. (V.) braziliensis foram semelhantes aquelas
produzidas pela infecção por L. (L.) amazonensis. Caracterizaram-se por infiltrado inflamatório
discreto na derme aos 2 dias PI; e já evidência de macrófagos parasitados linfócitos e plasmócitos
ao 30o dia PI. Reação granulomatosa com células gigantes e áreas de necrose estavam presentes ao
60o e 90o dia PI; seguida pela formação de tecido cicatricial a partir de 120 dias PI. A reação de
imunoistoquimica mostrou a presence de parasitos na lesão do 2o ao 180o dias PI. A ativação de
macrófagos pode ser observada de forma discreta ao 2o dia PI, moderada ao 30o dia e intensa entre o
60o ao 300o dia PI. Células CD3+ estavam presentes nas lesões a partir do 30o dia PI e foi
caracterizada de intensidade moderada. Células CD20+ foram observadas em caráter discreto, do
30o ao 120o dia PI e moderado a partir do 150o dia PI (Figura 1B).
A
3
Score of labelled cells
Score of labelled cells
B
Parasite
Lysozyme
CD3
CD20cy
3
2
1
0
Parasite
Lysozyme
CD3
CD20cy
2
1
0
0
30
60
90
120
150
180
0
Time of infection (days)
30
60
90
120
150
180
Time of infection (days)
Figura 1 – Análise semi-quantitativa do parasitismo tecidual e marcadores celulares em lesão de pele de Cebus apella
inoculado experimentalmente com promastigotas de L (L.) amazonensis (A) e L. (V.) braziliensis (B).
Conclusão: Nossos resultados sugerem que os mecanismos imunopatológicos com a participação
de células imunocompetentes estão relacionados com os eventos sequenciais das alterações
histopatológicas causadas pela inoculação de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis na pele do
primata Cebus apella.
Agradecimentos: FAPESP e LIM50 HC-FMUSP.
Referências:
[1] Silveira F.T.; Lainson R.; Shaw J.J.; Garcez L.M.; Souza A.A.; Braga R.; Ishikawa E.A.
Leishmaniose Cutânea Experimental: I- Sobre a susceptibilidade do primata Cebus apella (Cebidae)
à infecção pela Leishmania (Viannia) lainsoni. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina
Tropical, 22 (3): 125-130, 1989.
[2] Silveira F.T.; Lainson R.; Shaw J.J.; Garcez L.M.; Souza A.A.; Braga R.; Ishikawa E.A.
Leishmaniose Cutânea Experimental: II- Aspectos evolutivos da infecção no primata Cebus apella
(Cebidae) pela Leishmania (V.) braziliensis e Leishmania (L.) amazonensis. Revista da Sociedade
Brasileira de Medicina Tropical, 23 (1): 5-12, 1990.
[3] Silveira F.T.; Moraes M.A.P.; Lainson R.; Shaw J.J.; Leishmaniose Cutânea Experimental: III –
Aspectos histopatológicos do comportamento evolutivo da lesão cutânea produzida em Cebus
apella (Primates: Cebidae) por Leishmania (Viannia) lainsoni, L. (V.) braziliensis e L. (L.)
amazonensis. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 32 (6): 387-394, 1990.
O PAPEL DA IMUNOTOXICIDADE CAUSADA PELA Pteridium aquilinum NA
CARCINOGÊNESE PULMONAR INDUZIDA EM CAMUNDONGOS
Caniceiro, B. D.1; Latorre, A. O.1; Fukumasu, H.2; Haraguchi, M.3; Górniak, S. L1
1
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ/USP; 2Faculdade de Zootecnia e
Engenharia de Alimentos – FZEA/USP; 3Instituto Biológico
Introdução
A Pteridium aquilinum (Pa), conhecida popularmente como “samambaia-do-campo”, é uma
das plantas tóxicas mais importantes no mundo devido seu alto potencial carcinogênico observado
em bovinos [4] e seres humanos que se alimentam com esta planta [5]. Ainda em bovinos, também
foi observado malignização de papilomas nos animais infectados por papiloma vírus bovino (BPV)
e que se alimentaram com a samambaia [2]. Além destes efeitos foi demonstrado, em
camundongos, efeito imunossupressor sobre as células natural killer (NK) [3], que são as células
responsáveis na resposta imune inata por eliminar tanto as células infectadas por microorganismos
intracelulares quanto às células cancerosas [1]. Assim o objetivo do presente estudo foi avaliar a
imunossupressão induzida pela samambaia no processo de carcinogênese, utilizando-se para tal um
modelo clássico de carcinogênese pulmonar induzida por uretano (U) em camundongos C57BL/6.
Materiais e métodos
Foram utilizados 60 camundongos fêmeas separados em 4 grupos: Co (água por gavage e
PBS ip), Pt (Pa por gavage e PBS ip), Ur (água por gavage e U ip) e PU (Pa por gavage e U ip),
sendo a administração de Pa (30g/kg pv.) realizada por 14 dias consecutivos e depois durante 5
dias/semana por 11 semanas e o tratamento com U (1mg/g pv) foi feito a partir do 15º dia de
experimento, por via ip., semanalmente, durante 11 semanas. Todos os grupos receberam água
suplementada com tiamina [10mg/L] para evitar os efeitos tóxicos da tiaminase presente na planta.
Após 31 semanas do início do experimento fez-se a eutanásia destes animais, avaliando-se as lesões
pulmonares macro e microscopicamente. Além disso, caracterizou-se a imunossupressão provocada
pela administração crônica de Pa (n=10 camundongos/grupo) com o objetivo de confirmar se a
redução da citotoxicidade de células NK induzida pelo tratamento agudo com a planta [2] se
mantinha no tratamento crônico e para tal utilizou-se células de tumor ascítico de Ehrlich (TAE)
como alvo. Por fim, avaliou-se o efeito do U sobre as células NK (n=5 camundongos/grupo), a fim
de descartar qualquer efeito deste carcinógeno sobre estas células, o que impossibilitaria a avaliação
da imunossupressão induzida pela samambaia no processo da carcinogênese, utilizando-se como
alvo as células YAC-1.
Resultados
A avaliação macroscópica dos pulmões mostrou que a associação dos tratamentos planta e
uretano (grupo PU) promoveu aumento no número de lesões/camundongo (p=0,0088; Teste t não
pareado) bem como na multiplicidade, que é o nº de lesões/camundongo com lesão quando comparado
aos camundongos tratados apenas com uretano (Tabela 1). Já na avaliação microscópica foram
observadas hiperplasias, histiocitoses, hiperplasia de tecido lindóide associado a bronquíolos
(BALT) e adenomas, sendo que os camundongos do grupo PU apresentaram maior incidência de
adenomas quando comparados aos do grupo Ur (Fig. 1). Em relação à administração crônica de Pa
observou-se diminuição da citotoxicidade das células NK nos camundongos tratados (p=0,0097
Mann-Whitney Test) (Fig. 2), corroborando com o estudo de Latorre et al. (2009). Por fim, avaliouse a atividade citotóxica das células NK de camundongos tratados cronicamente com uretano
observando-se que não houve alteração deste parâmetro (Fig. 2).
Tabela 1 – Avaliação macroscópica das lesões pulmonares de camundongos tratados com Pa (30g/kg/dia), U
(1mg/g) e Pa (30g/kg/dia) + U (1mg/g)
Grupos
Co
Pt
Ur
PU
A
24
24
96
96
Incidência
0,32
0,50
2,32
3,88**
Nº. lesões/ camundongo
B
1,33
2,00
2,46
4,12
Multiplicidade
A - % de camundongos com lesão e B - nº de lesões/ camundongo com lesão. PU x Ur **p=0,0088; Teste t não pareado
B)
nº. de adenomas/total de lesões
A)
80
%
60
40
20
0
Ur
PU
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
Ur
PU
Figura 1 – Avaliação microscópica dos adenomas pulmonares de camundongos após tratamento com Pa
(30g/kg/dia) e/ou U (1mg/g), n=15 camundongos/grupo. A) Incidência de adenomas. B) Nº. de
adenomas/total de lesões
B)
A)
5.5
8
6
4
**
2
0
Co
Pt
% citotoxicidade
% citotoxicidade
10
5.0
4.5
*
4.0
3.5
3.0
Co
Ur
PU
Figura 2 – Avaliação da atividade citotóxica de células NK esplênicas. A) Citotoxicidade de células NK de
camundongos tratados com Pa (30g/kg/dia) **p=0,0097 Teste de Mann- Whitney . B)
Citotoxicidade de células NK de camundongos tratados com a associação de Pa (30g/kg/dia) e U
(1mg/g) e daqueles tratados apenas com U *p<0,05 pós-teste Dunn
Discussão e Conclusão
Embora já tenha sido observada a ação carcinogênica direta da P. aquilinum em bovinos [4]
nada tinha sido demonstrado ainda, em animais de produção ou experimentação, sobre a sua ação
imunossupressora em células NK e conseqüentes efeitos no processo de carcinogênese. Portanto, os
resultados obtidos neste estudo demonstraram, pela primeira vez, que a ação imunossupressora
causada pela samambaia facilitou o desenvolvimento de câncer pulmonar induzido em
camundongos e a partir destes resultados pode-se supor que este mesmo efeito imunossupressor
também ocorra em bovinos e contribua para malignização de papilomas, que é observada apenas em
bovinos infectados por BPV que se alimentaram com a samambaia.
Referências
[1] Abbas, A. K.; Lichtman, A. H.; Pillai, S. 2007. Cellular and Molecular Immunology. 6. ed. Elsevier, Philadelphia. p.
572.
[2] Borzacchiello, G.; Ambrosio, V.; Roperto, S.; Poggiali, F.; Tsirimonakis, E.; Venuti, A.; Campo, M. S.; Roperto, F.,
2003. Bovine papillomavirus type 4 in oesophageal papillomas of cattle from the south of Italy. Journal of Comparative
Pathology. 128, 203-206.
[3] Latorre, A.O., Furlan, M.S., Sakai, M., Fukumasu, H., Hueza, I.M., Haraguchi, M., Górniak, S.L., 2009.
Immunomodulatory Effects of Pteridium aquilinum on natural killer cell activity and select parts of the cellular immune
response of mice. Journal of Immunotoxicology. 6, 104-114.
[4] Souto, M. A.; Kommers, G. D.; Barros, C. S. L. ; Piazer, J. V. M.; Rech, R. R.; Riet-Correa, F.; Shild, A. L. 2006.
Neoplasias do trato alimentar superior de bovines associadas ao consumo espontâneo de samambaia (Pteridium
aquilinum). Pesquisa Veterinária Brasileira, 26, 112-122.
[5] Sugimura, T., 2000. Nutrition and dietary carcinogens. Carcinogenesis, 21, 387-3.
ESTUDO ENDOCRINOLÓGICO DA DUPLA APLICAÇÃO DE GLUCONATO DE ZINCO
ASSOCIADO AO DIMETIL SULFÓXIDO (DMSO) PARA A ESTERILIZAÇÃO QUÍMICA
DE MACHOS DA ESPÉCIE CANINA
Mazzei, C.P. ¹*; Eyherabide, A. R.¹; Lúcio, C.F. ¹; Vannucchi, C.I. ¹
¹Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, SP. Departamento de Reprodução Animal.
*Bolsista CNPQ / PIBIC
Introdução
Atualmente, a tentativa de controlar o crescimento populacional canino é efetuada pela
esterilização cirúrgica em larga escala. Entretanto, buscam-se alternativas terapêuticas que possam
causar esterilidade, porém de características inócuas, eficientes e de baixo custo. O gluconato de
zinco é considerado um fármaco promotor de infertilidade quando em aplicação única por via
intratesticular, além de não ser carcinogênico, teratogênico e mutagênico e apresentar baixo custo.
Porém, não possui adequada difusão tecidual [1]. Sua associação ao dimetilsulfóxido (DMSO) visa
à maior penetração e transporte em membranas biológicas [2, 3].
O objetivo deste estudo é avaliar a eficácia da dupla aplicação testicular do gluconato de zinco
associado ao dimetilsulfóxido (DMSO) para esterilização química em cães.
Materiais e Métodos
Foram selecionados 22 cães machos, em idade reprodutiva, alocados em dois grupos
experimentais: controle (n=7) e tratado (n=15). Os animais tratados receberam 2 injeções
intratesticulares de 1 mL de gluconato de zinco e DMSO e o grupo controle 1 mL de solução de
NaCl 0,9%, ambos em intervalo mensal.
O delineamento experimental consistiu de duas etapas: pré-experimental (2 meses prévios à
primeira aplicação) e experimental (duração de 5 meses). Os animais foram avaliados
quinzenalmente por meio do exame físico geral (da freqüência cardíaca - FC, freqüência respiratória
- FR e temperatura corpórea - T°C) e específico do aparelho reprodutor (inspeção e palpação
testicular e epididimária), avaliação andrológica e mensuração do perímetro escrotal. As amostras
de sêmen foram submetidas à avaliação de volume, motilidade progressiva, vigor espermático,
concentração e morfologia espermática por meio da preparação em câmara úmida e esfregaços
corados pela Eosina/Nigrosina, Panótico Rápido® e Spermac®.
Mensalmente, os animais foram avaliados por ultra-sonografia testicular e dosagem sérica de
testosterona (Testosterone Coat-A-Count - DPC®). Ao término da fase experimental, os cães foram
submetidos à orquiectomia bilateral para posterior avaliação histopatológica dos testículos em
coloração de hematoxilina e eosina (HE).
Resultados
Todas as variáveis do exame físico permaneceram dentro dos padrões de normalidade para a
espécie canina, apenas a temperatura corpórea apresentou-se mais elevada no grupo controle. Não
foi observada alteração comportamental ou aumento de sensibilidade à palpação testicular após a
aplicação do fármaco.
Alterações na consistência testicular à palpação foram detectadas em 87% dos animais tratados
durante o período experimental e em 15% no grupo controle. Dos cães submetidos ao tratamento,
41% (6/15) apresentaram aumento de volume testicular após a primeira aplicação, porém com
reversão subseqüente após alguns dias. Em relação à libido, foi observada redução significativa em
60% dos cães do grupo tratado (9/15), principalmente após a segunda aplicação do fármaco; já no
grupo controle apenas 14,28% (1/7) apresentaram redução do interesse sexual. Os animais tratados apresentaram aumento na porcentagem de espermatozóides mortos e
anormais e redução significativa da motilidade, vigor, concentração de espermatozóides e volume
do ejaculado (Tabela 1), atingindo resultados inferiores ao limite de referência para a espécie (à
exceção do volume de ejaculado). Porém, apenas 27% foram considerados inférteis (azoospermia
ou aspermia) enquanto os demais (73%) desenvolveram um quadro de subfertilidade.
Tabela 1 – Média e desvio padrão dos parâmetros espermáticos nos grupos controle e tratado,
combinando-se o período de colheitas. São Paulo, 2009.
Volume (mL)
Vigor (1-5)
Motilidade (%)
Concentração (x 106 sptz/mL)
Vivos (%)
Defeitos - Panótico® (%)
Tratado
1,56 ± 0,08
2,02 ± 0,097
48,88 ± 2,22
169 ± 19
66,65 ± 2,57
24,05 ± 1,40
Controle
1,94 ± 0,12
3,35 ± 0,12
75,20 ± 1,99
451 ± 51
85,90 ± 1,77
14,41 ± 1,42
P
0,0096
<0.0001
<0.0001
<0.0001
<0.0001
<0.0001
Não foram observadas diferenças significativas das concentrações de testosterona sérica
comparando-se os grupos e os períodos e ao exame ultra-sonográfico, todos os animais do grupo
tratado apresentaram alterações na arquitetura, ecotextura e ecogenicidade testiculares após a
primeira aplicação da droga. No grupo controle, apenas 2 animais (28%) apresentaram leves
alterações testiculares. Em relação a morfometria testicular constatou-se não haver alteração nas
medidas testiculares em decorrência da aplicação da droga.
Ao exame histopatológico, a degeneração testicular completa ocorreu, em geral, de forma
localizada nos animais do grupo tratado demonstrando degeneração parcial do parênquima
testicular junto a áreas de integridade funcional de túbulos seminíferos (Figura 1). Não foram
observadas alterações testiculares dignas de nota nos animais do grupo controle.
A
B
Figura 1 – Fotomicrografia testicular contendo túbulos seminíferos alinhados apenas por células de
Sertoli (A – setas finas) e calcificação intratubular (B – setas largas). Coloração: HE. 40X.
Conclusão
A dupla aplicação intratesticular do gluconato de zinco associado com o dilmetilsulfóxido
(DMSO) mostrou-se segura, mantendo o bem-estar dos animais tratados. Promoveu significativa
diminuição da qualidade espermática e lesão irreversível do parênquima testicular principalmente
nos locais de aplicação, porém, não foi capaz de alterar a esteroidogênese testicular e promover a
esterilização de todos animais em até 5 meses após a sua primeira aplicação.
Referências
[1]Wilde, H., Hemachudha, T., 2005. Intratesticular Injection of a Balanced Zinc Solution for
Permanent Sterilization of Dogs. J Med Assoc Thai. 88, 686-689.
[2]Jacob, S. W., Herschler, R. Pharmacology of DMSO, [homepage on the
Internet],2003.Disponível em:http://www.dmso.org/articles/information/herschler.htm. Acessado
em 20 de agosto de 2007.
[3]Oliveira, E.C.S., Moura, M.R., Silva Jr, V.A., Peixoto, C.A., Saraiva, K.L.A., Sá, M.J.C.,
Douglas, R.H., Marques Jr, A.P., 2007. Intratesticular injection of a zinc-based solution as a
contraceptive for dogs, Theriogenology. 68, 137-145.
AVALIAÇÃO DA PRODUÇÃO DA PGE E DA PGF EM CÉLULAS ENDOMETRIAIS DE
OVELHAS NÃO GESTANTES TRATADAS COM ÁCIDOS GRAXOS
POLIINSATURADOS
Marcia de A. M. M. Ferraz1, Zanghuri Cheng2, Doroth Claire Wathes2
1
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - USP
2
Reproduction and development group, Royal Veterinary College, UK
Introdução
Os ácidos graxos poliinsaturados (PUFAs) são classificados em três grupos dependendo da
posição da dupla ligação no carbono da metila final da molécula: ômega-3 (n-3), ômega-6 (n-6) e
ômega-9. Os animais não conseguem sintetizar o n-3 nem o n-6, sendo que estes PUFAs devem
fazer parte da dieta. A alteração da concentração de PUFAs n-3 nas dietas influenciam a síntese e o
metabolismo de prostaglandinas (PGs) [3].
Foi demonstrado que a suplementação in vitro com n-3 PUFAs tem efeito inibitório sobre a
produção de PGF-2α, o que também foi demonstrado in vivo em ovelhassuplementadas. O aumento
da progesterona é fundamental paar o desenvldimento embrionário.A suplementação com estes
PUFAs também pode aumentar a produção de progesterona pelo corpo lúteo, visto que aumenta a
produção de PGE2, a qual é um fator luteotrófico [4].
Através da manipulação da quantidade dos PUFAs, se obtém melhoria nas taxas de
ovulação, tamanho e número de folículos, além de aumentar produção de progesterona pelo corpo
lúteo em vacas e outras fêmeas mamíferas.O objetivo do presente estudo foi avaliar se a
suplementação com PUFAs da família n-3 alteram a expressão in vitro dos genes da PGF e da PGE
em células endometriais de ovelhas.
Material e método
Animais e sincronização do ciclo estral: As ovellhas foram sincronizadas utilizando
esponjas intravaginais (Chronogest, Intervet UK Ltd, Milton Keyens, UK) por 10 dias, com 500μl
de clorprostenol 0,1% IM (Schering Plough Ltd, Welwyn Garden City, UK) no dia da remoção da
esponja. Os animais foram abatidos no dia 3 do ciclo e o útero coletado sobre condições estéreis.
Isolamento e cultivo celular: Células endometriaias foram isoladas como descrito por Cheng
et al. [1]. As células epiteliais e estromais cresceram juntas e foram separadas usando o método
descrito por Fortier et al. [2]. As células foram, então, cultivadas em DMEM com 10% de SFB por
sete dias.
Tratamentos com PUFAs: As células foram lavadas com meio sem SFB e cultivadas com
diferentes doses de PUFAs da série n-3 (ALA, SDA e EPA) nas concentrações 0, 20 ou 100 μM.
Análise da expressão gênica: O RNA total das células foi extraído e purificado, usando o kit
comercial e seguindo as instruções do fabricante (QIAGEN RNeasy Kit, UK), para posterior
determinação da expressão do mRNA da PGE e da PGF por qPCR.
Resultados
Não foram observadas alterações significativas na expressão gênica da PGE entre o grupo
controle e os grupos tratados (p>0,05). Em relação a expressão gênica da PGF, em todos os
tratamentos houve uma diminuição na sua expressão em relação ao grupo controle (p<0,05), sendo
que nos tratamentos 100 μM de SDA e 100 μM de ALA foram observados os menores níveis da
expressão gênica desta prostaglandina, como observado na tabela 1.
Tabela 1 - Valores médios da quantidade de DNA para PGE e PGF nos diferentes
tratamentos com PUFAs da série n-3.
Controle
100μM
ALA
0.00012221
20μM SDA
100 μM
SDA
0.00014235
20μM EPA
100μM
EPA
0.00009123
0.00002914
0.00003898
0.00011575
PGE (fg/μg
de RNA)
PGF (fg/μg de 8.52E-06d
1.85E-06a
4.56E-06c
4.62E-07a
4.78E-06c
2.50E-06b
DNA)
Letras diferentes na mesma linha indicam que os valores diferem estatisticamente.
Conclusão
A suplementação com PUFAs da série ômega 3 diminui significantemente a quantidade de
PGF in vitro, sendo que novos trabalhos devem ser desenvolvidos para avaliar seu efeito in vivo.
Agradecimento
Agradeço à professora Claire Wathes pela oportunidade de aprendizado e desenvolvimento
deste projeto na Royal Veterinary College.
Referências
[1]Cheng, Z., Elmes, M., Kirkup, S.E., Abayasekara, D.R.E., Wathes, D.C., 2004. Alteration of
prostaglandin production and agonist responsiveness by n-6 polyunsaturated fatty acids in
endometrial cells from late gestational ewes. J Endocrinol; 182:189.
[2]Fortier, M.A., Guilbault, L.A., Grasso, E., 1988. Specific properties of epithelial and stromal
cells from the endometrium of cows. J Reprod Fertil; 83:239-248.
[3] Wathes, D.C., Cheng, Z., Elms, M., Kirkup, S., Abayasekara, D.R.E., 2002. The effect of n-6
polyinsatured fatty acids (PUFAs) on prostaglandin production by the endometrium of late pregnant
ewes. Biol. Reproduction, v. 66, p. 340.
[4] Wathes, D.C., Abayasekara, D.R., Aitken, R.J., 2007. Polyunsaturated Fatty acids in male and
female reproduction. Biology of Reproduction 77, 190–201.
CITOLOGIA DE ASPIRADO TRAQUEOBRÔNQUICO DE EQÜINOS ESTABULADOS
Mariana Terzoni; Peter Reichmann; Giovana W. di Santis; Lilian E. S Michima
Universidade Estadual de Londrina
Introdução
A obstrução recorrente das vias aéreas (ORVA) é uma doença inflamatória e obstrutiva que afeta
cavalos de meia idade que permanecem, grande parte de suas vidas, estabulados em ambientes
desfavoráveis, onde inalam partículas orgânicas e inorgânicas como poeira, fungos, esporos e vírus,
além de gases nocivos como a amônia, que causam inflamação das vias aéreas profundas por
induzir alergia, infecção ou diminuir os mecanismos de defesa do sistema respiratório [1].
Estas obstruções são causadas por reações de hipersensibilidade do tipo I e III que destroem a
membrana das células, liberando mediadores como a histamina e a serotonina, responsáveis por
causar no sistema respiratório broncoespasmos, hipercrinia, discrinia, levando finalmente a
obstrução brônquica [2].
Os sinais clínicos dos animais com ORVA são variados e dependem da intensidade da doença. Nos
quadros mais brandos os eqüinos apresentam secreção nasal mucosa bilateral, tosse intermitente e
intolerância ao exercício. Nos quadros mais graves os animais podem apresentar intensa dispnéia
que pode levar a hipertrofia do músculo oblíquo abdominal externo (“heave line”)[3].
O diagnóstico da doença é baseado na história e sinais clínicos [3]. A endoscopia e a citologia do
aspirado traqueobrônquicos são úteis para fechar o diagnóstico de doença pulmonar obstrutiva [4].
Na endoscopia presença de muco em quantidade variável, edema e hiperemia de mucosa podem ser
encontrados [5]. Na citologia do aspirado traqueobrônquico ocorre principalmente aumento no
número de neutrófilos, macrófagos totais e presença de macrófagos espumosos [6].
Este trabalho tem como objetivo determinar através da citologia de secreção traqueobrônquica a
ocorrência e a intensidade de inflamação em vias aéreas profundas de cavalos que permanecem
estabulados.
Materiais e Métodos
Foram avaliados 8 eqüinos que permanecem em baias, pertencentes a duas escolas hípicas
diferentes, sendo 4 de cada uma delas. Foram realizados anamnese e exame físico dos animais, para
isto os animais estavam contidos no cabresto e dentro de suas baia.
Para a realização da broncoscopia foi utilizado um endoscópio Olympus CF-IBW de 1,3 metros de
comprimento por 1,3 centímetros de diâmetro. Para o aspirado traqueobrônquico foi utilizado um
cateter de polietileno acoplado ao canal de biópsia do endoscópio. As secreções foram colhidas logo
cranialmente à bifurcação da traquéia.
Para o exame citológico foi feito esfregaço em lâmina com o conteúdo do cateter, logo após a
colheita. As lâminas foram fixadas com metanol e coradas pelo método de Giemsa. A leitura da
lâmina foi feita com os aumentos de 4, 10 e 40 vezes. Com o aumento de 4 vezes, toda a lâmina foi
analisada. Com o aumento de 10 vezes, 10 campos foram escolhidos aleatoriamente. Em cada
campo fez-se a contagem e a apreciação do quadro morfológico das células e para isto foi utilizado
o aumento de 40 vezes.
Resultados
Todos os animais avaliados permanecem em baias, realizam atividade física moderada e
eventualmente participam de competições.
Os centros de treinamentos analisados diferem entre si, um, onde estão os animais de 1 a 4 tem
baias bem ventiladas com portas vazadas e de frente para um gramado. O outro, onde estão os
animais de 5 a 8, tem baias pouco ventiladas, sem portas vazadas e dentro de um galpão
Em relação a anamnese os treinadores e tratadores dos animais relataram presença de tosse
intermitente em 38% dos animais, queda no desempenho em 50% e presença de doença respiratória
anterior em 25%.
No exame físico os parâmetros clínicos de todos os animais estavam dentro da normalidade.
Já no exame específico do sistema respiratório constatou-se presença de secreção nasal serosa em
todos os animais, dispnéia em 63%, reflexo de tosse presente em 63%, e a área pulmonar na
percussão estava aumentada em 75%.
Na broncoscopia foi encontrada secreção traqueal em quantidade variável em todos os animais,
nenhum animal apresentou hiperemia de mucosa e 25% dos animais apresentou edema da carina.
Os resultados em número e em porcentagem da citologia de aspirado traqueobrônquico dos animais
avaliados neste trabalho se encontram na Tabela 1.
Tabela 1-Resultados em número e em porcentagem da citologia da secreção traquebrônquica dos
animais 1 a 8, março de 2009.
Animal
Total
de
células
NN
E
Lt
Mc/ McE
Mt
EC
EB
CC
CG
1
474
353(74.5%)
0
0
25/13(5.3/2.7%)
0
70(14.8%)
2(0.4%)
11(2.3%)
0
2
619
3(0.5%)
0
0
42/5(6.8/0.8%)
0
400(64.6%)
155(25%)
14(2.3%)
0
3
350
4(1.1%)
0
0
5/10(1.4/2.9%)
0
239(68.3%) 72(20.6%)
20(5.7%)
0
5
686
570(83%)
0
0
103/8(15/1.2%)
1(0.1%)
4(0.6%)
0
0
0
6
728
191(26.3%)
0
0
436/71(59.9/9.7%)
0
14(1.9%)
5(0.7%)
0
11(1.5%)
7
837
655(78.2%)
0
0
135/7(16.1/0.8%)
0
39(4.6%)
0
1(0.1%)
0
8
749
9(1.2%)
1(0.1%)
0
720/13(96/1.7%)
0
5(0.7%)
0
0
1(0.1%)
Legenda da tabela 1:
NN= Neutrófilos
E= Eosinófilos
Lt= Linfócitos
Mc= Macrófagos
McE= Macrófagos espumosos
Mt= Mastócitos
EC= Células epiteliais ciliadas
EB= Células epiteliais basais
CC= Células caliciformes
CG= Células gigantes
Conclusão
Através do exame clínico e da anamnese pôde-se encontrar alterações clínicas, menos ou mais
evidentes, que são indicativas de obstrução recorrente das vias aéreas, em todos os animais.
No exame citológico da secreção traqueobrônquica , 75% dos animais apresentou alterações típicas
encontradas nos quadros de ORVA. Encontrou-se neutrofilia, aumento no número de macrófagos
totais e presença de macrófagos espumosos.
Os animais de um dos centros de treinamento, onde as condições de alojamento eram adversas,baias
dentro de um barracão pouco ventilado e iluminado, apresentaram quadro clínico e citológico mais
evidente, demonstrando assim que a ocorrência desta doença é alta, principalmente em estábulos
com condições de manejo desfavoráveis. E também, que o exame citológico da secreção
traqueobrônquica foi útil para o diagnóstico e a avaliação da gravidade do problema.
Referências
[1] HODGSON, J. L.; MALIKIDES, N.; SPENDLOVE, P. J.; CHRISTLEY, R. M.; HODGSON, D. R.
Enviromental factors and airway inflammation in australian racehorses. 2005. Disponível em:
<http://www.ivis.org/proceedings/WEAS/2005/Hodgson/chapter.asp?LA=1>. Acesso em: 24 ago. 2008.
[2] DEEGEN, E. Etiologia e gênese patológica de bronquites crônicas em eqüinos. In: JORNADAS
BOEHRINGER DE PATOLOGIA EQÜINA 1, 2, 3., 1984, Porto Alegre, Rio de Janeiro, São Paulo. Anais...
São Paulo: Boehringer, 1984. p. 3-6.
[3] ROBINSON, N.E. Recurrent airway obstruction (heaves). 2001. Disponível em:
<http://www.ivis.org/special_books/Lekeux/robinson/chapter_frm.asp?LA=1>. Acesso em: 4 set. 2008.
[4] MAIR, T. S. Value of tracheal aspirates in the diagnosis of chronic pulmonary diseases in horses. Equine
veterinary Journal, v.19, n.5, p. 463-465, 1987.
[5] COUETIL, L.; HINCHCLIFF, K.W. Non-infectious diseases of the lower respiratory tract. In:
HINCHCLIFF, K. W.; KANEPS, A. J.; GEOR, R. J. Equine sports medicine and surgery. Philadelphia:
W.B. Saunders, 2004. p. 614-655.
[6] DECONTO, I. Novos conhecimentos nos exames citológicos da secreção traqueo-bronquial de cavalos
com doenças pulmonares crônicas. In: JORNADAS BOEHRINGER DE PATOLOGIA EQÜINA 1,2,3.,
1984, Porto Alegre, Rio de Janeiro, São Paulo. Anais... São Paulo: Boehringer,1984. p. 29-31.
EFEITOS DO ESTRESSE AGUDO POR CALOR SOBRE OS INDÍCES ZOOTECNICOS,
OS NÍVEIS SÉRICOS DE CORTICOSTERONA, O PESO RELATIVO DOS ÓRGÃOS
LINFOIDES, A INTEGRIDADE DO TRATO INTESTINAL E A ATIVIDADE DE
MACRÓFAGOS PERITONEAIS DE FRANGOS DE CORTE
Rodrigues, M.V*; Quinteiro-Filho, W.M.; Ribeiro, A.; Ferraz de Paula, V.; Pinheiro, M.L.;
Ferreira, A.J.P., Palermo-Neto, J.
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP
Introdução
As exigências com relação ao Bem-estar animal têm modificado a maneira de ver o estresse
na Avicultura. As interações bidirecionais entre os Sistemas Nervoso Central e Imune já estão bem
estabelecidas. Dessa forma, sabe-se que alterações induzidas na atividade do SNC pelo estresse
modificam a função imune (2). Um tipo particular de estressor ambiental relevante à avicultura é o
estresse térmico, mais especificamente por calor. De fato, esse estresse causa diminuição do
crescimento e da conversão alimentar das aves, assim como desajustes fisiológicos, e hormonais
(aumento dos níveis séricos de corticosterona e de catecolaminas), podendo aumentar a
suscetibilidade dos animais às doenças e/ou a mortalidade (4). De fato, alguns pesquisadores têm
mostrado ser o estresse térmico capaz de prejudicar a função imune de aves (1). Deste modo,
idealizamos esse estudo para analisar os efeitos do estresse agudo por calor sobre eixo neuroimune
de aves. Mais especificamente, sobre os índices zootécnicos, os níveis séricos de corticosterona, o
peso relativo dos órgãos linfóides, a integridade do trato intestinal e a atividade de macrófagos
peritoneais de frangos de corte.
Material e Métodos
Utilizamos 150 frangos de corte com 36 dias de vida. Estes animais foram mantidos em
temperatura termoneutra até o 35º dia de vida. As aves foram divididas em dois grupos, sendo um
grupo controle (C) e um grupo experimental (E). O grupo C foi mantido em temperatura
termoneutra do 35º ao 36º dia de vida (22°C±2°C), enquanto que o grupo E foi mantido a 31±2°C
das 8:00 as 18:00 horas (10 horas) do 35º dia de vida. O desempenho das aves foi avaliado
calculando-se o ganho de peso (GP), o consumo de ração (CR), a conversão alimentar (CA), o
consumo de água e a mortalidade. Após o período experimental, foi realizada a coleta de sangue das
aves para analise dos niveis séricos de corticosterona. Em seguida, os animais foram sacrificados,
sendo realizada a necropsia e a coleta de órgãos linfóides (timo, baço e bursa de Fabrícius) inteiros
para a avaliação dos seus pesos relativos. Durante a necropsia, foi realizada também a coleta de
fragmentos do intestino para a análise da integridade do trato intestinal. Para a analise da atividade
de macrófagos, selecionamos 20 frangos (10 controle e 10 experimentais), que foram inoculados
com Sephadex 48h antes das coletas. Realizamos o lavado peritoneal das aves, e posteriormente,
mensuramos a atividade de macrófagos peritoneais por citometria de fluxo.
Resultados
A Figura 1 mostra que estresse térmico por calor diminui estatisticamente o ganho de peso, o
consumo de ração e a conversão alimentar de frangos de corte. Não observamos diferenças
estatísticas no consumo de água das aves estressadas com relação ao grupo C, e observamos
aumento da mortalidade das aves submetidas ao estresse por calor. Este tipo de estresse por calor
não foi capaz de alterar estatisticamente o peso relativo dos órgãos linfóides (baço, bursa de
Fabricius e timo) e os níveis séricos de corticosterona de frangos de corte (p>0,05). Neste
experimento, também analisamos a atividade de macrófagos peritoneais de frangos de corte. A
fenotipagem dessas células foi realizada através do marcador KUL-01, identificando a população de
macrófagos peritoneais com uma média maior que 90% de marcação na área selecionada para
análise. Com relação à atividade de macrófagos observamos que o Burst Oxidativo basal
(C=158,417±91,774; E=314,998±132,290) dessas células, foi estatisticamente maior no grupo E
quando comparado ao grupo C (p<0,05), o Burst Oxidativo induzido pela Fagocitose
(C=70,581±40,656; E=147,349±70,240) também foi estatisticamente maior no grupo E quando
comparado ao grupo C (p<0,05). Já com relação à intensidade de fagocitose não encontramos
diferenças estatisticamente significantes entre os grupos. Porem, com relação a porcentagem de
fagocitose (C=0,821±0,118; E=0,640±0,049), encontramos uma diferença estatística, sendo menor
no grupo E quando comparado ao grupo C (p<0,05). No exame microscópico do intestino delgado,
mais especificamente em jejuno, observamos que o estresse de 31±1ºC foi capaz de causar discreta
enterite, porém, esse estresse não modificou o comprimento das vilosidades e a morfologia das
criptas. Observamos, também, a presença de um importante infiltrado linfocítico plasmocítico na
lamina própria. Foi possível observar presença de heterófilos na lâmina própria.
Tabela 1: Avaliação dos índices zootécnicos em frangos de corte com 36 dias de vida, submetidos
ou não a estresse agudo por calor (31±2ºC) no 35° dia de vida.
ÍNDICES ZOOTÉCNICOS
CONTROLE
31±2ºC
Ganho de peso (g)
69,219 ± 11,21
-38,210 ± 27,11***
Consumo de ração (g)
186,676 ± 6,427
128,048 ± 17,06*
Conversão alimentar
2,75 ± 0,50
-4,70± 2,72***
Consumo de água (L)
0,46 ± 0,09
0,41 ± 0,10
Mortalidade (%)
0
26%#
Os dados representam a média ± desvio padrão de N=5 lotes/grupo, sendo cada lote=12
animais.***p<0,001; *p<0,05, em relação ao controle. Teste “t” de student (paramétrico) e teste
Mann-Whitney (não paramétrico). #p<0,05, em relação ao controle. Teste Log-rank (Mantel-Cox).
Conclusão
Tomados os resultados em seu conjunto, observamos que o estresse térmico agudo por calor
não foi capaz de causar alterações significativas no peso relativo dos órgãos linfóides (timo, baço e
bursa de Fabrícius) e nos níveis de corticosterona. Com relação aos índices zootécnicos, o grupo
experimental apresentou queda de peso, diminuição no consumo de ração, diminuição da conversão
alimentar e aumento da mortalidade. Podemos sugerir que as reservas energéticas foram deslocadas
para controle térmico e manutenção das aves no estado de Eustress imunológico [3]. Acreditamos
que o desbalanço da atividade de macrófagos sejam decorrentes da ativação do eixo HHA e do
SNAS, mesmo não encontrando diferenças nos níveis de corticosterona. Alterações na imunidade
inata e, possíveis alterações na microbiota intestinal, danificariam a barreira intestinal, justificando
por sua vez, os processos inflamatórios no jejuno das aves estressadas, resultando em diminuição da
absorção de nutrientes, e assim do ganho de peso dos animais.
Agradecimentos
CNPq e FAPESP pelo apoio financeiro.
Referências
[1] Mashaly, M. M.; Hendricks, G, L.; Kalama, M, A.; Gehad, A, E.; Abbas, A. O. Patterson PH.
2004. Effect of heat stress on production parameters and immune responses of commercial laying
hens. Poult Sci. 83, 889-94.
[2] MCEWEN, B. S. Allostasis and allostatic load: implications for neuropsychopharmacology.
2000. Neuropsychopharmacology, 22(2); 108-24.
[3] MCEWEN, B. S. Stressed or stressed out: what is the difference? Journal of Psychiatry &
Neuroscience, v. 30, n. 5, p. 315-318, 2005
[4] Mujahid, A.; Akiba, Y.; Toyomizu, M. 2007. Acute heat stress induces oxidative stress and
decreases adaptation in young white leghorn cockerels by downregulation of avian uncoupling
protein. Poult Sci. 86; 364-71.
EXPRESSÃO DE BCL-2 EM MASTOCITOMAS CUTÂNEOS CANINOS COMO
POTENCIAL MARCADOR PROGNÓSTICO: ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
Leite, Nathalia Corrêa; Strefezzi, Ricardo de Francisco; Kleeb, Sílvia Regina; Catão-Dias, José
Luiz; Xavier, José Guilherme
Universidade Metodista de São Paulo
Introdução
Mastocitomas são tumorações compreendidas no grupo das neoplasias de células redondas,
sendo potencialmente malignas. Sua etiologia é desconhecida. Não há predisposição sexual e as
raças comumente acometidas são as que possuem Bulldog como ancestral, com idade média de 8,5
anos. O diagnóstico definitivo é dado por técnicas citológicas e histológicas. A excisão cirúrgica é o
tratamento de escolha. O prognóstico do paciente tende a ser reservado ou desfavorável, porém, em
proporções variáveis, sendo de interesse o conhecimento de fatores prognósticos visando uma maior
compreensão do seu comportamento biológico tumoral [3].
O objetivo do presente estudo foi avaliar com o uso de método imuno-histoquímico a
expressão do gene antiapoptótico, Bcl-2, em mastocitomas cutâneos caninos, comparando-a com a
evolução clínica dos animais, averiguando sua utilidade como potencial marcador prognóstico
nestes processos.
Material e Métodos
Utilizou-se 20 amostras de tecidos tumorais presentes em 17 cães portadores de mastocitoma
atendidos nos hospitais veterinários da USP, UMESP e UNIBAN. Os tecidos foram submetidos a
processamento histopatológico, seguindo-se da graduação neoplásica [2]. Posteriormente realizouse a técnica de imuno-histoquímica [1]. Empregou-se o anticorpo monoclonal anti-Bcl-2, DAKO
(Clone 124) e linfoma canino como controle positivo [4].
Resultados
Dos 17 cães, havia nove machos (53%) e oito fêmeas (47%) com idade média de 8,2 anos. A
raça mais freqüente foi a boxer (29,41%, 5/17), acompanhada dos S.R.D. (29,41%, 3/17).
Seguiram-se dachshund e poodle com dois representantes cada (11,76%, 2/17). Observou-se um
indivíduo de cada raça, fila, dogue alemão, pinscher, doberman e labrador (5,88%, 1/17). Dos 20
mastocitomas, 10 cursaram nas extremidades/membros (50%, 10/20); três casos deram-se na região
abdominal, assim como três casos em região torácica (15%, 3/20). Houve dois mastocitomas em
região inguinal e em dois casos não foi possível determinar a localização (10%, 2/20). Observou-se
30% dos mastocitomas classificados como grau I, 45% em grau II e 25% em grau III de
malignidade. Em relação aos resultados alcançados através da imuno-histoquímica, dos 20 tumores
estudados, em dez casos observou-se imunorreatividade positiva para Bcl-2, expressando padrão
citoplasmático difuso (50%, 10/20). Por fim, dez casos não expressaram o gene anti-apoptótico,
Bcl-2 (50%, 10/20) (Figura1).
Figura 1 Fotomicrografia exibindo imunomarcação positiva (esquerda) e negativa
(direita) para Bcl-2 em mastocitoma cutâneo. Obj. 40x
Identificou-se expressão de Bcl-2 em todos os tumores de grau I de malignidade e em
parcela dos de grau II, enquanto as neoplasias de grau III de malignidade foram negativas para a
proteína. Observaram-se diferenças estatisticamente significantes entre os animais que morreram ou
não em função do mastocitoma (p=0,0294) (tabela 1).
Tabela 1
Distribuição dos animais portadores de mastocitoma de acordo com a imunorreatividade
Bcl-2 negativo*
Bcl-2 positivo*
Total*
Óbitos*
5
0
5
Vivos*
4
8
12
Total*
9
8
17
*Teste exato de Fisher, p= 0,0294
Em relação à análise de sobrevida, identificou-se diferença estatisticamente significante
entre neoplasias que expressam ou não Bcl-2 (p=0,0099, Logrank test), revelando correlação entre a
expressão de Bcl-2 em mastocitomas cutâneos e tempo de sobrevida (Figura 2).
Figura 2 Representação gráfica da Curva de Sobrevida dos casos estudados em
função da marcação imuno-histoquímica para Bcl-2 (p=0,0099,Logrank Test).
Conclusão
Verificou-se correlação positiva entre a expressão do gene anti-apoptótico Bcl-2 e a
sobrevida dos animais. Portanto, é possível relacionar sua positividade a um prognóstico favorável.
Nesse sentido, sugere-se a inclusão do gene anti-apoptótico, Bcl-2, no painel de marcadores
prognósticos para mastocitomas cutâneos de cães, tendo-se em vista os resultados obtidos neste
estudo.
Agradecimentos
Ao orientador e professor José Guilherme Xavier. Ao Isaque e Joseane, técnicos do Hospital
Sírio Libanês, que auxiliaram na realização da imuno-histoquímica.
Referências
[1] HSU, M.K.; RAINE, L.; FANGER, H.,1981. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in
immunoperoxidase techniques: a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP)
procedures. Journal of Histochemestry and Cytochemistry. v.29, p.577-580.
[2] PATNAIK, A.K.; EHLER, W.J.; MACEWEM, E.G.,1984. Canine cutaneous mast cell tumor:
morphologic grading and survival time in 83 dogs. Veterinary Pathology. v.21, n.5, p. 469-474.
[3] THAMM, D.H.; VAIL, D. M., 2001. Mast Cell Tumours. In: Withrow, S.J.; MacEwen, E.G.
Small animal clinical oncology. W.B. Saunders company, Philadelphia, pp.261-280.
[4] YANG, W.Y.; LIU, C.H.; CHANG, C.J.; LEE, C.C.; CHANG, K.J.; LIN, C.T.,2006.
Proliferative Activity, Apoptosis and Expression of Oestrogen Receptor and Bcl-2 Oncoprotein in
Canine Mammary Gland Tumours. Journal of Comparative Pathology. v.134, p.70-79.
O PAPEL DA CICLOHEXAMIDA E ROSCOVITINA NO BLOQUEIO MEIÓTICO EM
OÓCITOS BOVINOS
The role of cyclohexamide and roscovitine on bovine oocyte meiotic arrest
P.H.B. Risolia1, M.G. Marques1, M.P. Milazzotto2, M.E.O.A. Assumpção1, J.A. Visintin1, F.F.
Paula-Lopes3
1
Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo, São Paulo-SP, Brasil; 2Centro de Ciências Naturais e Humanas,
Universidade Federal do ABC, Santo André-SP, Brasil; 3Departamento de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de São Paulo, Diadema-SP, Brasil.
E-mail: [email protected]
Introdução
O desenvolvimento de modelos in vitro utilizando oócitos em vesícula germinativa (VG) é de difícil
abordagem, pois a coleta dos oócitos de folículos antrais induz a progressão espontânea até o
estádio de metáfase II (MII) [1]. Dessa forma são necessárias ferramentas farmacológicas como a
ciclohexamida (CHX: inibidor de síntese protéica) e a roscovitina (ROSC: inibidor da subunidade
catalítica p34cdc2 do fator promotor da fase M) para bloquear a progressão meiótica. Experimentos
foram realizados para avaliar (1) a proporção de oócitos VG imediatamente após a coleta dos
oócitos de folículos antrais; (2) o efeito da suplementação do meio de coleta de oócitos com CHX
no bloqueio meiótico e (3) a dose de ROSC no bloqueio meiótico por um período de 12 horas.
Material e Métodos
Ovários de animais oriundos de abatedouro foram submetidos à técnica de fatiamento folicular para
coleta dos complexos cumulus-oócito (CCOs). No primeiro experimento os CCOs foram coletados
na presença de 0 ou 10 µg/mL de CHX. Em seguida, os CCOS foram desnudos e processados para
coloração com aceto-orceína para avaliação da proporção de oócitos VG (0 hora de cultivo). Foram
realizadas 6 réplicas utilizando 190-210 oócitos por tratamento. No segundo experimento os CCOs
coletados na presença de 10µg/mL de CHX foram cultivados na presença de 0; 6,25; 12,5; 25; 50;
100 ou 200 µM de ROSC por um período de 12 horas. Em seguida os oócitos foram processados
para coloração com aceto-orceína. Foram realizadas 4 réplicas utilizando 73-134 oócitos por
tratamento. Os dados foram submetidos à análise de variância pelo método dos quadrados mínimos
utilizando o programa estatístico SAS.
Resultados
A suplementação do meio de coleta de oócitos bovinos com 10 µg/mL de CHX não houve uma
alteração estatisticamente relevante (P> 0,05) a proporção de oócitos VG de 81,52 + 7,24 no grupo
controle para 88,25 + 6,40 no grupo tratado com CHX. No segundo experimento, as concentrações
de 25 (P= 0,07), 50, 100 e 200 µM de ROSC (P< 0,05) aumentaram a porcentagem de oócitos VG
quando comparadas ao controle.
Conclusão
A partir deste estudo pode-se concluir que a ROSC promove o bloqueio meiótico de maneira dosedependente, enquanto que o bloqueio meiótico promovido pela CHX não foi estatisticamente
relevante.
Agradecimentos
A FAPESP por permitir a realização deste experimento e a todos do Departamento de Reprodução
Animal da FMVZ – USP pelo auxílio sempre que necessário.
Referências
[1] Pincus G e Enzmann EV. The comparative behavior of mammalian eggs in vivo and in vitro. I.
The activation of ovarian eggs. J Exp Med, v. 62, p. 665-675, 1935.
COMPARAÇÃO DO PERFIL DA HSP70 EM TRUTAS Arco-íris (Oncorhynchus mykiss WALBAUM, 1792) DIPLÓIDE E TRIPLÓIDE PÓS ESTRESSE TÉRMICO
Iunes, R. S.1; Lima, A. R1; Kfoury Junior. J.R.1
1 Laboratório de Técnicas Imunológicas Aplicadas a Morfofisiologia (LTIAM)-Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia-USP
Introdução
Uma das espécies priorizadas pelo setor de pesca e aqüicultura é a truta arco-íris, que
fornece um alimento saudável, possui ainda um alto valor nutritivo. Estas características aliadas ao
elevado valor comercial fizeram da truta arco-íris uma das espécies mais intensamente pesquisadas
e um dos salmonídeos mais cultivados, sua produção é uma alternativa de empregos e renda em
localidades onde a agricultura é desfavorável, como zonas com grandes altitudes e baixas
temperaturas. Além de sua capacidade de adaptação a diversos sistemas aquáticos, a truta apresenta
um alto grau de domesticação, a alimentação artificial é realizada com sucesso, ambos os sexos
amadurecem em cativeiro, e os gametas podem ser facilmente coletados permitindo a manipulações
quanto ao controle da sexualidade e ploidia.[4]
A triploidização de peixes é bastante utilizada em truticulturas devido ao grande apelo
comercial por um produto de melhor qualidade. Isso porque as fêmeas triplóides estéreis desviam a
energia, que seria investida na gametogênese, para o crescimento somático. Pouco se sabe sobre os
efeitos da triploidização na higidez do animal e ainda existe muita controvérsia na questão se trutas
triplóides seriam mais resistentes ao estresse que as diplóides. [2]
Considerando o papel das HSP 70 no controle da homeostasia em situações de stress e o fato
dos animais triplóides apresentarem uma tendência a uma maior resistência às doenças,
analisaremos a expressão dessa proteína em truta arco-íris tripóides e diplóides estressadas pelo
choque térmico. [1]
Material e métodos
Vinte trutas fêmeas (10 diplóides e 10 triplóides) foram obtidas na Agência Paulista de
Tecnologia dos Agronegócios – Regional Vale do Paraíba, Estação Experimental de Salmonicultura
Dr. Ascânio de Faria, Campos de Jordão – SP, Brasil. Toda a manipulação com os peixes e coleta
de material foi feita nesse local.
Os peixes foram transferidos de tanques com água a 16˚C para tanques com água a 20˚C e
mantidos neles por 60 minutos. Antes da transferência, os peixes foram anestesiado com benzocaína
a 40 ppm para biometria e coleta do sangue pela veia caudal [3].Após os peixes foram transferidos
novamente para tanques com água a 16˚C e terão o sangue coletado 1, 12 horas pós estresse
térmico. O grupo controle será mantido a 16°C e passará por toda a manipulação dos grupos testes.
O sangue foi congelado em nitrogênio liquido e mantido a –80˚C até ser processado para
análise de HSP 70 pelo método de Western blot. Para isso, utilizamos eletroforese em gel de
poliacrilamida. O resultado em gel foi transferido para uma membrana de PVDF, seguimos com o
bloqueio de ligações não específicas, e incubação com o anticorpo primário anti-HSP 70
(Stressgen® anti-HSP 70 monoclonal SPA-810) overnight. Após este período procedemos à
lavagem e incubação de anticorpo secundário (ECLTm Western blotting Analysis System,
Amersham). A revelação da membrana em filmes de raios-X foi realizada em seguida. Esses filmes
foram escaneados e analisados com o uso software Image J (NIH, USA)
Resultados
No controle os indivíduos diplóides possuem uma quantidade maior de HSP70 que os
triplóides, porem não houve diferença estatística. Já ao compararmos uma hora depois há uma
maior quantidade de HSP70 em diplóides, porém não ao compararmos com o controle não há
diferença estatística, mas ao compararmos com os triplóides do mesmo prazo há diferença. Já no
prazo de 12 horas indivíduos triplóides tem maior quantidade de HSP70 qua diplóides. Os
resultados encontram-se na tabela 1.
Pelos testes estatísticos não existe diferença significativa entre os tempos nas trutas
diplóides, porém nas triplóides existe diferença significativa entre os indivíduos controles e testes e
entre os prazos. Ao compararmos os indivíduos controles diplóides e triplóides não há diferença
estatística entre eles já os grupos teste são diferentes estatisticamente.
Tabela 1: Tabela com valores assumiveis da quantidade de HSP70
Chip
Ploidia Grupo
T0
T1
T12
2C2
3n
Controle 23768 11741 11731
C6F
3n
Controle 14401
15747
11776
C05
3n
Controle 14207
22576
4397
6E3
3n
Teste
20144 24561 16667
21E
3n
Teste
16460 23384 17598
32E
3n
Teste
19246 24257 10265
4DB
3n
Teste
22231
7613
3083
7A9
3n
Teste
22947 18899
9993
B81
3n
Teste
23516
4480
4180
06D
3n
Teste
20963
6270 15136
322
2n
Controle 23175
7924
2413
1F0
2n
Controle 17861
22402
20792
FE7
2n
Controle 33033
10862
2326
D57
2n
Teste
14590 12876
8084
24D
2n
Teste
23587 18022
7310
F10
2n
Teste
21542 15984 17773
O64
2n
Teste
16287 22755 31297
260
2n
Teste
24529
26856
19965
B5F
2n
Teste
32422
5806
5657
Conclusão
Pelos nossos resultados podemos inferir que as trutas triplóides são mais sensíveis ao
estresse que as diplóides, e que após 12 horas de estresse há uma diminuição na quantidade da
HSP70 tanto em triplóides como em diplóides.
E que no tempo que utilizamos para estressar os animais não é suficiente para alterar
significativamente a quantidade da HSP70.
Agradecimentos
Agradeço aos funcionários da Estação Experimental de Salmonicultura Dr. Ascânio de
Faria, Campos de Jordão – SP, Brasil e ao pós- doutorando Emerson Fioretto.
Referências
[1] Basu, N.; Todgham, A.E.; Ackerman, P.A.; Bibeau, M.R.; Nakano,K.; Schulte, P.M. e Iwama,
G.K. 2002.Heat shock protein genes and their functional significance in fish. Gene. 295, 173–183.
[2] Benfey, T.J.; Biron, M.2000. Acute stress response in triploid rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss) and brook trout (Sallelinus fontinalis). Aquaculture. 184, 167–176.
[3] Silva, J.R.M.C., Hernandez-Blazquez, F.J.; Barbieri, R.L.1998 Induced inflammatory response
in the Antarctic fish Nothothenia neglecta. Polar Biology. 20, 206-212.
[4] Tabata, Y. A. 1998.Truticultura: situação mundial e no Brasil. Instituto de Pesca – APTA –
Secretaria de Agricultura e Abastecimento – SP; Núcleo Experimental de Salmonicultura – Campos
do Jordão – SP.
EXPRESSÃO DE CÉLULAS CD11c+ E ASSOCIAÇÃO COM A RESPOSTA IMUNE
CELULAR EM CAMUNDONGOS INFECTADOS EXPERIMETALMENTE COM L. (L.)
amazonensis E L. (V.) braziliensis
Carvalho, A.K.*; Passero, L.F.; Tomokane, T.Y.; Gomes, C.M.C.; Silveira, F.T.; Corbett, C.E.P.;
Laurenti, M.D.
Laboratório de Patologia de Moléstias Infecciosas (LIM-50), Faculdade de Medicina, Universidade
de São Paulo, São Paulo (SP), Brasil. e-mail: [email protected]
Introdução: Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma doença infecciosa causada por
várias espécies de Leishmania. L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis são as espécies com maior
interesse médico no Brasil. Em modelo experimental com camundongos BALB/c, L. (L.)
amazonensis apresenta uma doença progressiva associada com a resposta imune tipo Th2, enquanto
que L. (V.) braziliensis apresenta, em contraste uma doença auto curável associada com a resposta
imune tipo Th1. Deste modo, nosso objetivo foi avaliar a participação das células dendríticas
dérmicas (dDCs) na infecção experimental de L. (L.) amazonensis e L. (V.) braziliensis e associar
com a resposta imune celular Th1/Th2 mediada pela produção de citocinas.
Metodologia: Camundongos BALB/c foram inoculados subcutaneamente no coxim plantar das
patas tradeiras com 106 promastigotas em fase estacionária de L. (L.) amazonensis e L. (V.)
braziliensis. O grupo controle foi inoculado somente com PBS. A evolução da lesão foi
acompanhada semanalmente até a 60ª semana pós infecção (PI). No 60º dia PI, biópsias do sítio de
inoculação foram coletadas e processadas por imunoistoquímica para a marcação de células
CD11c+; células do linfonodo de drenagem foram cultivadas sob estimulo de Con-A, o
sobrenadante da cultura foi coletado e usado para a dosagem de IFN-γ, IL-4 e IL-10 por ELISA de
captura. Amostras de soro foram também processadas para IgG1, IgG2a e IgG2b por ELISA.
Resultados: A lesão causada pela inoculação de L. (L.) amazonensis progrediu durante todo o
período estudado e foi maior do que a causada pela infecção de L. (V.) braziliensis, a qual
desenvolveu um pequeno pico na 4ª semana PI e em seguida regrediu (Figura 1). No 60º dia PI,
apenas as peles de camundongos infectados com L. (V.) braziliensis apresentaram reação positiva
para CD11c+ (Figura 2) associado com o aumento dos níveis de IFN- γ (Figura 3A). Aumento dos
níveis de imunoglobulinas foram demonstrados apenas nos camundongos infectados por L. (L.)
amazonensis, especialmente IgG1 (Figura 3B).
Evolução do tamanho da lesão
4,00
Tamanho pata (mm)
3,50
3,00
Controle
L. (L.) amazonensis
L. (V.) braziliensis
2,50
2,00
1,50
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
Tempo Pós-Infecção (Dias)
Figura 1: Evolução do tamanho da lesão causada pela inoculação de formas promastigotas de L (L.)
amazonenesis e L. (V.) braziliensis em camundongos BALB/c.
Figura 2: Imunohistoquímica para CD11c+. A: pele de BALB/c infectado por Leishmania (L.)
amazonensis; B: pele de camundongo infectado por Leishmania (V.) braziliensis.
A
INF-gamma
B
IgG1
IgG2a
IgG2b
1,0
500
0,8
Abs 450 nm
[ ] pg/mL
400
300
200
0,6
0,4
0,2
100
0,0
0
L. amazonensis
L. braziliensis
L. amazonensis
L. braziliensis
Figura 3: Dosagem de citocinas em sobrenadante de cultura de linfócitos estimuladas com
Concanavalina-A por 48 horas (A). Determinação de imunoglobulinas nos soros de BALB/c
infectado com L.(L.)amazonensis e L.(V.)braziliensis aos 60 dias PI (B).
Conclusão: Estes dados preliminares sugerem que a presença das células marcadas por CD11c+
associada com o aumento dos níveis de IFN- γ nos camundongos infectados por L. (V.) braziliensis
pode estar associado com o desenvolvimento de uma resposta imune protetora nestes animais.
Agradecimentos: Suporte financeiro da FAPESP, CAPES e LIM-50 HC-FMUSP.
CARACTERIZAÇÃO DA PROTEÍNA Lsa31 DE Leptospira interrogans CAPAZ DE
ADERIR A COMPONENTES DE MATRIZ EXTRACELULAR
Monaris D1, Gonçales AP2, Morais ZM2; Vasconcellos SA2, Barbosa AS1, Abreu PAE1
1
Laboratório de Bacteriologia, Instituto Butantan, Brasil; 2Laboratório de Zoonoses Bacterianas,
Faculdade de Medicina Veterinária, USP, Brasil.
Introdução
A leptospirose é uma zoonose de importância global causada por espiroquetas patogênicas
do gênero Leptospira, que colonizam os túbulos renais e são liberadas ao ambiente externo pela
urina. As leptospiras são bactérias móveis, aeróbias e diferenciam-se das outras espiroquetas por
possuírem a célula terminada em gancho e dois flagelos periplasmáticos. A transmissão ocorre por
contato com água ou solo contaminados com urina de animais infectados principalmente roedores.
O tratamento para leptospirose é de alto custo e até o momento, no Brasil, não há vacinas
licenciadas para uso humano. O objetivo deste trabalho foi caracterizar uma provável lipoproteína
de membrana externa de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni, denominada Lsa31, quanto à
sua capacidade de adesão a componentes de matriz extracelular.
Material e métodos
A seqüência codificante da proteína Lsa31, correspondente ao gene LIC11087 sem peptídeo
sinal, foi amplificada a partir do DNA genômico de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni,
utilizando oligonucleotídeos contendo sítios de restrição apropriados. O produto de PCR purificado
foi clonado no vetor pAE desenvolvido para expressar proteínas heterólogas em fusão com uma
cauda amino-terminal de seis resíduos de histidina [3]. Para a expressão da proteína recombinante, a
linhagem E.coli BL21-C43 competente foi transformada com a construção pAE-LIC11087 e
induzida com 1mM de IPTG. A purificação da proteína recombinante foi realizada em
cromatografia de afinidade metálica. Também foram realizados espectros de dicroísmo circular da
proteína recombinante purificada. Para a produção de soro hiperimune, camundongos BALB/c
foram imunizados subcutaneamente com 10 μg da proteína recombinante purificada, com dois
reforços em intervalos de 15 dias. A titulação dos soros coletados foi feita por ELISA [4]. O soro
policlonal produzido foi utilizado em ensaio de adesão a componentes de matriz extracelular [1],
utilizando placas revestidas com 1μg de cada um dos seguintes componentes: laminina, colágeno I,
colágeno IV, fibronectina celular, fibronectina plasmática e fetuína como controle negativo. Os
resultados obtidos nos ensaios de adesão foram confirmados por experimentos de western-blotting
[2].
Resultados
A
B
C
1
2
3
4
5
97,0
66,0
45,0
30,0
20,1
kDa
Figura 1: A- Análise da expressão e solubilidade da proteína recombinante Lsa31 em SDS-PAGE (12%) 1:
Padrão de peso molecular; 2: Lisado total não induzido; 3: Lisado total induzido. 4: Células não lisadas; 5 e 6:
Sobrenadante - fração solúvel; 7 e 8: Corpúsculos de inclusão - fração insolúvel. B- Análise da purificação da
proteína recombinante Lsa31. 1: Padrão de peso molecular; 2 a 5: Proteína recombinante purificada e dialisada. CAnálise da presença de anticorpos no soro de camundongos imunizados com Lsa31 por ELISA. Inverso das
diluições dos soros: 1-20; 2-40; 3-80; 4-160; 5-320; 6-640; 7-1280; 8-2560; 9-5120; 10-10.240; 11-20.480; 12-40.960;
13-81.920; 14-163.840; 15-327.660; 16-655.320; 17-1.310.640.
Figura 2: A- Espectro de dicroísmo circular obtido para a proteína recombinante Lsa31. Os dados foram
coletados em cubetas de 1mm de caminho óptico, em uma temperatura de 20ºC, a 0,5 nm/seg com um “banwith” de
1nm. B- Análise do ensaio de adesão, da proteína recombinante Lsa31 aos componentes de matriz extracelular.
LAM: laminina; COL I: colágeno tipo I; COL IV: colágeno tipo IV; FC: fibronectina celular; FP: fibronectina
plasmática; FET: fetuína.
Figura 3: Análise da interação da proteína Lsa31 com fibronectina por western
blotting. A- Proteínas recombinantes em membrana de nitrocelulose corada com
Ponceau. P: Padrão de peso molecular; 1: proteína recombinante LIC11030 – controle
negativo; 2: proteína recombinante Lsa31. B- Proteína recombinante Lsa31
reconhecida por anti-fibronectina.
Conclusão
A proteína recombinante Lsa31 foi expressa em E. coli BL21-C43 e purificada a partir da
fração insolúvel. A proteína purificada exibe em gel SDS-PAGE 12% uma banda majoritária de
31,8 kDa. A análise por dicroísmo circular revelou uma estrutura secundária β-folha predominante
e mostrou sucesso no processo de renaturação. O soro hiperimune produzido apresentou altos títulos
de anticorpos contra a Lsa31, detectado por ELISA. Experimentos de adesão a componentes de
matriz extracelular, demonstraram forte interação da Lsa31 com laminina, colágeno tipo I, colágeno
tipo IV, fibronectina plasmática e fibronectina celular e ensaios de e western-blotting comprovaram
forte interação com fibronectina celular e plasmática, indicando que esta proteína seja uma possível
adesina.
Agradecimentos
Agradeço minhas orientadoras Dra. Patrícia Abreu e Dra. Angela Barbosa pela realização
deste trabalho, a colaboração dos colegas de laboratório e o apoio financeiro da FAPESP.
Referências
[1] Barbosa, A.S.; et al, (2006) A newly identified leptospiral adhesin mediates attachment to
laminin. Infection Immunity, 74(11):6356-64.
[2] Burnette, W.N. (1981) "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium
dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with
antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry, 112:195-203.
[3] Ramos CR, Abreu PA, Nascimento AL, Ho PL. (2004) A high-copy T7 Escherichia coli
expression vector for the production of recombinant proteins with a minimal N-terminal His-tagged
fusion peptide. Braz J Med Biol Res. 37:1103-1109.
[4] Sambrook, J.; Fritsch, E.F.; Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning a laboratory manual. 2a ed.
Cold Spring Harbor Laboratory, Press. New York.
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA RESTRIÇÃO ALIMENTAR NO DESENVOLVIMENTO
FÍSICO E NEUROCOMPORTAMENTAL DA PROLE DE RATAS: uma contribuição aos
estudos em toxicologia da reprodução
Ricci, EL; Bernardi, MM; Górniak,SL; Spinosa, HS.
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, SP, Brasil.
Introdução
A toxicologia do desenvolvimento abrange o estudo da toxicocinética, mecanismo de ação tóxico,
patogênese e as conseqüências da exposição a agentes tóxicos ou condições que levem ao
desenvolvimento anormal do animal [1].
O período de desenvolvimento embriológico e fetal consiste num desenrolar contínuo de mudanças
e variações complexas, sendo marcadas por fases durante as quais se desenvolvem processos
similares nas diferentes espécies de vertebrados. Este desenvolvimento embrio-fetal de mamíferos
pode ser dividido em quatro períodos: implantação, organogênese, desenvolvimento fetal e período
neonatal [2].
Condições maternas como alteração no fluxo sanguíneo uterino, anemia e desnutrição, as quais
comprometem seriamente a homeostase da gestante, podem afetar adversamente o organismo em
desenvolvimento[3]. Para alguns autores, o peso corpóreo materno durante a gestação é o principal
fator que contribui para a saúde do desenvolvimento fetal.
Este trabalho tem como objetivo re-avaliar os efeitos da restrição alimentar na prole de fêmeas
gestantes, utilizando-se protocolos de neuroteratogenicidade.
Material e Métodos
Cinqüenta fêmeas prenhes provenientes do Biotério do Departamento de Patologia, FMVZ/USP,
foram privadas de ração em diferentes níveis (30, 45, 60 e 85%) ou não (grupo controle) do dia 6 da
gestação (GD6) ao GD20. Acompanhou-se o peso materno durante toda gestação e ao nascer suas
proles foram observadas quanto ao peso, desenvolvimento físico (desdobramento de orelha, erupção
dos dentes incisivos, abertura dos olhos, aparecimento de pêlos, descida dos testículos e abertura
vaginal), reflexológico (reflexos de preensão palmar, endireitamento, geotaxia negativa, sobressalto,
dia de andar adulto) e comportamental (campo aberto).
Protocolo de ética- FMVZ: 1462/2008
Resultados
Os resultados mostraram que na mãe: 1) houve redução do peso e canibalismo proporcional ao nível
de restrição alimentar; 2) após o final desta restrição as fêmeas recuperaram rapidamente o peso
atingindo valores similares ao daquelas não privadas. Na prole: 1) houve redução do peso corporal,
nas proles de maior restrição nos dias 14 e 28 pós-natais; aos 30 dias de idade todos os grupos
apresentaram redução de peso em relação aquela prole não privada; 2) houve retardo no reflexo de
preensão palmar e geotaxia negativa nas proles de maior restrição; 3) na atividade geral observada
em campo aberto, as proles de 45 e 60% de restrição mostraram menores freqüências de locomoção
e levantar e maior tempo de imobilidade; 4) o desenvolvimento físico das proles submetidas a
restrição não foi diferente daquela não privada de ração.
Conclusões
Os presentes dados mostram que a restrição alimentar materna reduz o peso materno de forma
proporcional à restrição alimentar e após a retomada da alimentação ad libitum, seus pesos voltaram
a valores normais. Com relação à prole, observou-se redução tardia no peso dos filhotes e retardo no
desenvolvimento reflexológico e comportamental; no entanto, os parâmetros do desenvolvimento
físico destes animais não foram modificados de forma significante pela privação. Estes resultados
indicam que a restrição alimentar materna durante o período de organogênese promove alterações
neurológicas na prole, porém não afeta o seu desenvolvimento físico, exceto com relação ao peso
corporal em período mais tardio da vida.
Agradecimento
Á FAPESP (08/5153-9), pelo apoio financeiro.
Referências
[1] CLAUDIO, L.; KWA, W.C.; RUSSELL, A.L.; WALLINGA, D. Testing methods for
developmental neurotoxicity of environmental chemicals. Toxicology and Applied
Pharmacology, v.164, n.1, p. 1-14, 2000.
[2] OUSEY, J.C.; FOWDEN, A.L.; WILSHER, S.; ALLEN, W.R. The effects of maternal health
and body condition on the endocrine responses of neonatal foalts. Equine Vet J., 40(7): 673-9,
2008.
[3] WILSON, J.C. Methods for administering agents and detecting malformation in
experimental animal. In: Wilson, J.C.; Warkany, J., editors. Teratology: principles and techniques.
Chicago: University of Chicago Press; 1965, p. 262-327.
OBTENÇÃO DE PADRÃO ANALÍTICO DE SAXITOXINAS A PARTIR DE
CIANOBACTÉRIAS
Pípole F1, Hueza I.M1, Sant’Anna C.L2, & Carvalho L.R2
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo/SP – Brasil; 2 Seção de Ficologia, Instituto de Botânica de São Paulo, São
Paulo/SP – Brasil
Introdução
“Paralytic Shellfish Poison’’ (PSP) são um grupo de neurotoxinas alcaloídicas
estruturalmente relacionadas produzidas pelos dinoflagelados marinhos e cianobactérias de água
doce. A primeira toxina do grupo PSP foi isolada do molusco Saxidomus giganteus do Alasca e
mais tarde foi dado o nome trivial saxitoxina (SXT), que é a mais conhecida e estudada das toxinas
PSP. Esta SXT é conhecida como uma fonte de contaminação de reservatórios e lagos e pode
acumular-se a níveis elevados em crustáceos e moluscos filtradores[2]. Seu mecanismo de ação é
através do bloqueio do canal de sódio dos neurônios de mamíferos, que provoca sintomas
diferentes, como a paralisia, hipotensão, dispnéia e insuficiência respiratória[5]. Portanto, SXT
devem ser monitorizadas em águas de abastecimento e também na indústria da pesca. Para
quantificar os níveis de saxitoxinas por métodos usuais, como cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE), padrões de calibração são necessários[1]. No entanto, estes padrões de
calibração são muito caros porque são sazonalmente preparados a partir de toneladas de moluscos,
que têm de ser armazenado em baixas temperaturas [3]. Além disso, a retirada de moluscos pode ser
entendida como uma degradação ambiental. Desse modo, a produção de padrões a partir de cepas
de cianobactérias tem a vantagem de ser contínua, custo efetivo, e contribui para a proteção do
ambiente. Assim, o objetivo deste estudo foi construir um método para a obtenção de padrão STX à
partir de cianobactérias
Material e Métodos
A cepa Raphydiopsis brookii Hill 1972, SPC 338 foi cultivada em garrafas de cultura 5L em
meio ASM-1, pH 7,4 a 22 ± 1 ° C, sob luz contínua a uma irradiância de 45-50 mmol.m2 s-1 e uma
taxa de aeração moderada. As células foram cultivadas até o final da fase de crescimento
exponencial (cerca de três semanas), período em que a cultura foi interrompida.
O material cultivado foi liofilizado, extraído com ácido acético 0,1 M e ultra-som, e então
centrifugado. O sobrenadante foi liofilizado e submetido à purificação por métodos
cromatográficos. O grau de pureza da saxitoxina foi determinado por análise em HPLC-FLD
(método de purificação em processo de patente). Saxitoxinas foram visualizadas utilizando
derivatização pré-coluna HPLC com fluorescência on-line [4]. Cada amostra (20 μ l) foi injetado
em uma fase reversa Zorbax coluna ODS (250 x 4,6 mm, 5 μm), e as seguintes fases móveis foram
utilizadas em pH 6: A: formiato de amônio = 0,1 M e B Formiato de amônio = 0,1 M / 95:5
acetonitrila (v / v). O detector fluorimétrico foi fixado em um comprimento de onda de excitação
390 nm e emissão de uma onda de 340 nm.
Resultados
O extrato bruto de Raphydiopsis brookii SPC 338 (figura 1) foi pré purificado (figura 2) e então
repurificado obtendo-se SXT com 95% de pureza (figura 3) determinado por HPLC, similar à SXT
obtida à partir de moluscos (figura 4).
Sequencia Bruno
m
50
37
EMISSI
754-
25
1-
12
-
bruto
6-
0
3-
5
8-
10
10 -
12 -
15
13 -
20
17 -
20 -
25
30
35
mi
40
Figura 1. Cromatograma obtido por CLAE, do extrato bruto liofilizado, condições descritas no texto. A seta mostra
pico em (Tr = 21,3), referente à saxitoxina.
Sequencia Bruno 2 #8
400 mV
C18 2,4-1
7 - 8,140
8 - 9,096
EMISSION
300
6 - 7,534
200
5 - 6,831
1-
100
-10
0,0
5,0
16 - 21,313
14 - 20,540
- 14,141
- 13,441
13 - 15,702
9 - 10,6051112
- 5,876
2 3- -45,099
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
min
40,0
35,0
Figura 2. . Cromatograma obtido por CLAE, da fração pré-purificada, condições descritas no texto. A seta mostra pico
em (Tr = 21,3), referente à saxitoxina.
300 Sequencia Bruno 2 #19
mV
3G puro
EMISSION
EM:390 nm
%D: 0,0 %
%C: 0,0 %
6 - 21,313
200
100
80,0
-10
0,0
5,0
10,0
20,0
5 - 14,225
3 - 8,011
Flow: 1,000 ml/min
4 - 9,225
2 - 6,772
1 - 2,826
20,0
formato + acetonitrila: 0,0 %
15,0
0,0
min
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
Figura 3. . Cromatograma obtido por CLAE, da fração purificada, condições descritas no texto. A mostra pico em (Tr =
21,3), referente à saxitoxina com 91% de pureza.
Figura 4. Cromatograma do padrão de saxitoxina obtido de moluscos; condições descritas no texto. A seta mostra pico
em (Tr = 21.3 min), referente à saxitoxina.
Conclusões
O padrão obtido a partir de cianobactéria apresenta apenas uma saxitoxina, enquanto que o
padrão obtido de moluscos mostra saxitoxina e um análogo. Ao selecionar outra espécie de
cianobactérias pode ser possível a obtenção de diferentes análogos e com um preço mais baixo. A
biomassa é facilmente obtida em cultura, sua produção não é sazonal, e não é necessário
equipamento de armazenamento especial. Assim, pode-se concluir que este método representa uma
excelente opção para a obtenção de padrões SXT.
Agradecimentos
CAPES
Referências
[1] Alfonso, A., Vieytes, M.R., Botana, A.M., Goenaga, X. & Botana, L.M. 1993. Preparation of
mixtures of paralytic shellfish toxin (PSP) standards from mussels hepatopancreas.
Fresenius Journal of Analytical Chemistry, 345: 212-216.
[2] Falconer,I.R. 2005. Cyanobacterial toxins of drinking water supplies. , CRC Press, Boca Ratón.
[3] Lagos, N. 2006. oral comunication, Instituto de Botânica, São Paulo Brazil.
[4] Lawrence, J.F., Ménard, C. & Cleroux, C. 1995. Evaluation of pre-chromatographic oxidation
for liquid chromatographic determination of paralytic shellfish poisons in shellfish. Journal
of AOAC International 75(2): 514-520
[5] Llewellyn, L.E. 2006. Saxitoxin, a toxic marine natural product that targets a multitude of
receptors. Natural Product Reports 23: 200-222.
ESTUDO COMPARATIVO DA NEOVASCULARIZAÇÃO EM TRUTAS ARCO-ÍRIS
Oncorhynchus mykiss (WALBAUM, 1792) DIPLÓIDES E TRIPLÓIDES
Justino, J.1; Silva, J.R.M.C.1
1
Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento - ICB/USP
Introdução
O objetivo da esterilização pela triploidização na piscicultura comercial é impedir a maturação
sexual, que desvia a energia metabólica do crescimento somático para o desenvolvimento das
gônadas. Ao atingir essa fase, a qualidade da carne é comprometida, além de diminuir o ganho de
peso na fase reprodutiva e aumentar a mortalidade dos animais. A triploidização é reconhecida
como o método mais prático, econômico e efetivo para a produção de peixes estéreis em larga
escala [5].
Estudos vêm sendo realizados comparando o desempenho das trutas triplóides em relação às
diplóides. Taxas de crescimento e ganho de peso das trutas triplóides se mostram maiores[4], trutas
triplóides apresentam maior resistência a Aflatoxina B1[2], possuem menor incidência de tumores
[7], a regeneração tecidual ocorre mais rapidamente nas nadadeiras de trutas triplóides [1] e os
fagócitos peritoneais das trutas triplóides têm maior capacidade fagocítica [6].
De acordo com estudos realizados com salmonídeos [3], a intensidade e o tempo de resposta à
manipulação aguda e ao estresse de confinamento são semelhantes em diplóides e triplóides.
Entretanto, os peixes triplóides têm maior dificuldade em lidar com o estresse e são afetados por
condições adversas da água. Devido à diferença em número e tamanho das células, os efeitos da
triploidização sobre imunocompetência, resistência às doenças e capacidade de lidar com o estresse
crônico devem ser mais bem avaliados.
Este trabalho tem como objetivo comparar o efeito da triploidização na angiogênese após
injúria em trutas arco-íris.
Materiais e método
Foram utilizadas fêmeas de trutas arco-íris sendo 20 diplóides e 20 triplóides. A contenção e
anestesia dos peixes foram feitas por imersão em benzocaína.
Os peixes utilizados sofreram cauterização química na córnea com um cristal de nitrato de
prata. Além da anestesia geral, foi feita anestesia local com colírio anestésico de proparacaína.
Então o cristal de nitrato de prata é colocado em contato com a córnea por 15 segundos, e depois as
córneas são lavadas com solução fisiológica. Foram estabelecidos prazos de coleta dos olhos de 14,
28 e 35 dias após a cauterização.
No momento da coleta, quando os sinais clínicos da anestesia forem observados (desequilíbrio
postural, aumento da freqüência respiratória, diminuição da amplitude dos movimentos
respiratórios, irrefletividade aos estímulos sonoros e perda do tônus muscular), os animais são
retirados da água e mantidos anestesiados em uma mesa operatória para a canulação e perfusão.
Após a injeção dos vasos, os bulbos oculares destinados ao exame histológico são fixados em
solução de McDowell, onde permanecem por 24 horas para fixação. As córneas foram desidratadas
em gradientes crescentes de álcool e incluídas em historresina. Os resultados numéricos serão
obtidos após a marcação dos vasos com nanquim e observação dos vasos na córnea. O leito vascular
será, então, fotografado, digitalizado, e terá sua área mensurada para comparação entre os peixes
diplóides e triplóides.
Resultados
Após 15 dias da lesão, é possível definir o local da cauterização no corte histológico.
Observamos epitélios rompidos ou com espessura bastante diminuída, uma perda da definição da
lâmina limitante anterior e desorganização da substância própria. No tecido adjacente à lesão,
observamos edema e aumento da quantidade de fibroblastos no tecido conjuntivo da substância
própria.
Além do intenso infiltrado inflamatório, nota-se a presença de células inflamatórias
que estão dispersas na substância própria. É possível observar a presença de alguns vasos na
substância própria, em regiões mais distantes do limbo do que os vasos encontrados nos peixes
controle, porém ainda distantes da região onde ocorreu a cauterização.
21 dias após a lesão, podemos observar necrose inflamatória do epitélio anterior e extensas
áreas hemorrágicas decorrentes da neovascularização na substância própria da córnea. Observa-se
também intenso infiltrado de células inflamatórias na substância própria. No epitélio adjacente à
área da lesão é possível identificar um aumento do número de células de muco.
Após 28 dias, além de intenso infiltrado inflamatório, podemos observar claramente os
vasos neoformados no local da lesão.
Conclusão
Nota-se diferença na quantidade e calibre dos vasos entre os peixes diplóides e triplóides,
onde os peixes triplóides apresentam vasos mais desenvolvidos.
Em uma segunda fase do projeto faremos a quantificação e comparação do processo em
trutas arco-íris diplóides e triplóides.
Agradecimentos
CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Dra. Yara Aiko Tabata e MSc. Marcos G. Rigolino - Estação Experimental de Salmonicultura da
Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios
Prof. Dr. Wagner Intelizano – Universidade Metropolitana de Santos (UNIMES)
Referências
[1] ALONSO, M.; TABATA, Y.A.; RIGOLINO, M.G.; TSUKAMOTO, R.Y. Effect of induced
triploidy on fin regeneration of juvenile rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Journal of
Experimental Zoology, v. 287, p. 493-502. 2000.
[2] ARANA, S.; TABATA, Y.A.; SABINO, M.; RIGOLINO, M.G.; HERNANDEZ-BLAZQUES,
F.J. Differential effect of chronic aflotoxin B1 intoxication on the growth performance and
incidence of hepatic lesions in triploid and diploid rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Archivos
de Medicina Veterinária, v. 34, n. 2, p. 253-63. 2002.
[3] BENFEY, T.J.; BIRON, M. Acute stress response in triploid rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss) and brook trout (Salvelinus fontinalis). Aquaculture. v. 184, p. 167-76. 2000.
[4] BONNET, S.; HAFFRAY, P.; BLANC, J.M.; VALLÉE, F.; VAUCHEZ, C.; FAURÉ, A.;
FAUCONNEAU, B. Genetic variation in growth parameters until commercial size in diploid and
triploid freshwater rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and seawater brown trout (Salmo trutta).
Aquaculture, v. 173, p. 359-75. 1999.
[5] MAXIME, V. The physiology of triploid fish: current knowledge and comparisons with diplod
fish. Fish and Fisheries, v. 9, p. 67-78. 2008.
[6] PRESSINOTTI, L.N. Efeito da triploidização na imunidade celular inespecífica de trutas
arco-íris Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792). Dissertação apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Biologia
Celular e Tecidual. 94p. 2006.
[7] THORGAARD, G.H.; ARBOGST, D.N.; HENDRICKS, J.D.; PEREIRA, C.B.; BAILEY, G.S.
Tumor supression in triploid trout. Aquatic Toxicology, v. 46, p. 121-6. 1999.
EFEITOS ANTINEOPLÁSICOS DE BACCHARIS CORIDIFOLIA in vitro
Juliana Vieira1, Andréia O. Latorre1, Isis M. Hueza1, Mitsue Haraguchi2, e Silvana L. Górniak1
1 Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de
São Paulo, Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva, 87, CEP 05508-270, 2Departmento de
Farmacologia São Paulo-SP Brasil, Instituto Biológico, Av. Conselheiro Rodrigues Alves, 1252,
CEP 04014-002, São Paulo-SP Brasil
Introdução
A Baccharis coridifolia é uma planta tóxica da família Compositae, gênero Baccharis L.,
conhecida popularmente como “mio-mio”, a qual é encontrada no sul do Brasil e também em
algumas regiões do Estado de São Paulo (1). Os princípios ativos da B. coridifolia foram isolados e
identificados como sendo os tricotecenos macrocíclicos: as roridinas A, D e E; as verrucarinas A e J
(2) e a miotoxina A (3). Tricotecenos são potentes micotoxinas e têm sido isolados de uma grande
variedade de fungos comuns ao solo, que crescem na rizosfera das plantas, como ocorre na B.
coridifolia. Em relação aos tricotecenos macrocíclicos, trabalhos recentes in vitro demonstraram
que as roridinas e as verrucarinas, princípios ativos da B. coridifolia, promovem apoptose em tecido
linfóide (4).
Considerando que esta planta pode causar a toxicidade de tecido linfóide, o objetivo do
presente estudo foi investigar se o resíduo hexanico (RH), obtido de extração de B. coridifolia pode
induzir a morte em linfócitos normais e tumorais e células de Ehrlich (carcinoma mamário murino).
Materiais e Métodos
Amostras de B. coridifolia foram coletadas municipio de Santa Rita, Rio Grande do Sul,
Brasil. As amostras foram previamente secadas e moídas e posteriormente foram maceradas em 96
% de etanol. Após evaporação total sob pressão reduzida a 50º C, um extrato verde escuro foi
obtido e consecutivamente extraído com hexano resultando em um resíduo de hexano (RH). A
viabilidade de células de linfócitos normais e tumorais e células de Ehrlich foi determinada pela
técnica de MTT (3-[4,5-dimethylthiazol] - 2,5 - brometo de diphenyltetrazolium). Os animais
utilizados foram mantidos em conformidade com as orientações da comissão de bioética.
Linfócitos normais foram obtidos a partir de três camundongos BALB/C e Swiss (baço e timo) e as
células tumorais empregadas foram as linhagens: linfoma A20 e carcinoma de Ehrlich. Culturas em
quadruplicatas para cada linhagem de células (8 x 105 células/mL) foram realizadas da seguinte
maneira: células não tratadas e tratadas com RH 1 mg/ml; com incubação de 24 h em 37ºC em
atmosfera húmida, contendo 5 % de CO2 até doseamento por MTT.
Resultados
De acordo com os valores de absorbância obtidos em todas as culturas, observou-se que os
esplenocitos e timocitos cultivados com o RH 1mg/mL durante 24 horas, não demonstraram
diminuição de viabilidade. As células tumorais tratadas com o RH obtiveram valores de absorbância
menores que as células tumorais não tratadas, demonstrando portanto, que o cultivo com o RH foi
capaz de diminuir a viabilidade destas células em 24 horas.
Figura 01. MTT 24horas. Estudo in vitro dos efeitos do RH (resíduo hexânico) na concentração de
1mg/mL, sob diferentes linhagens celulares. *Diminuição significante da viabilidade celular das
células tumorais do linfoma A20 e de carcinoma mamário de Ehrlich, cultivadas com HR 1mg/mL.
Os esplenócitos e timócitos cultivados com a mesma concentração do RH não sofreram perda
significante da viabilidade celular. *p = 0,0005 ANOVA
Conclusões
Os resultados aqui obtidos mostram claramente que o tratamento in vitro diminuiu apenas a
viabilidade das duas linhagens de células tumorais (células A20 e Ehrlich) sem comprometer os
linfócitos normais. É possível sugerir que os tricotecenos macrociclicos contidos em RH de B.
coridifolia têm um mecanismo seletivo de ação sobre as células tumorais. Mais estudos in vitro e in
vivo serão conduzidos em nosso laboratório para verificar melhor esta suposição e também para
avaliar os possíveis efeitos tóxicos destes princípios ativos e a sua utilização como uma promessa
de possível nova terapia antitumoral.
Agradecimentos
Apoio Financeiro: FAPESP 2007/56665-0
Referencias
1.OCCHIONI, P. Contribuição ao estudo da “mio-mio”, Baccharis coridifolia D. C. Boletim da
Sociedade Brasileira de Medicina Veterinária, v. 13, n. ¾, p. 193-209, 1944.
2.JARVIS, B. B.; COMEZOGLU, S. N.; RAO, M.; PENA, N. B. Isolation of macrocyclic
trichothecenes from a large-scale extract of Baccharis megapotamica. The Journal of Organic
Chemistry. V. 52, p. 45-56, 1987 a .
3.HABERMEHL, G. G.; BUSAM, L.; HEYDER, P.; MEBS, D.; TOKARNIA, C. H.;
DOBEREINER, J.; SPRAUL, M. Macrocyclic trichothecene: cause of livestock poisonings by the
Brazilian plant Baccharis coridifolia. Toxicon. V. 23, n. 5, p. 731-745, 1985.
4.CHUNG, Y. J.; JARVIS, B. B.; PESTKA, J. J. Modulation of lipopolysaccharide induced
proinflamatory cytokine prodution by safratoxins and other macrociclyc trichothecens in the murine
macrophage. Journal of Toxicology and Environmental Health. 2003; 66: 379-391.
A TERAPIA CELULAR VISANDO À CURA DA OSTEOARTRITE
Silva, M. V. M.1; Nogueira, J. L.1; Passos, C. C.1
1
Departamento de Cirurgia – Setor de Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres - Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia - FMVZ/USP
Introdução
Nos últimos anos, com o avanço do conhecimento e das técnicas moleculares, a ciência
conseguiu gerar informações importantes para o diagnóstico e tratamento de doenças sem
tratamento. Novas expectativas foram criadas com as células não-diferenciadas, denominadas
células-tronco (CT), através da terapia celular [1].
A terapia celular enfrenta situações relacionadas com diversos tecidos e órgãos do corpo
humano, cujo objetivo é restabelecer o funcionamento normal desse tecido repovoando-o através
das CT. Embora o potencial para terapias com CT seja promissor, para várias doenças humanas,
numerosos desafios ainda precisam ser vencidos. Tais como: métodos de obtenção de transplantes,
indução de diferenciação, desenvolvimento da função e eliminação de reações imunes [8].
A osteoartrite (OA) é uma artropatia degenerativa, importante enfermidade reumática, não
apenas por ser a mais prevalente, como também pelo forte impacto socioeconômico. O problema de
doenças na junção da cartilagem articular é a perda total de sua mobilidade. Isso ocorre devido há
um desequilíbrio do metabolismo catabólico e anabólico [9,10].
O presente trabalho tem como finalidade compilar dados que auxiliem na busca de novas
perspectivas e alternativas para a terapia celular no tratamento da OA.
Material e métodos
Este estudo foi baseado em pesquisa bibliográfica sobre CT em vários aspectos, através de
livros, artigos, revistas especializadas e publicações que mostram resultados, permitindo uma breve
avaliação da utilização destas células, especificadamente as células-tronco mesenquimais de polpa
de dente humana (hIDPSC), como uma proposta de terapia celular, para restauração de osso e
cartilagem. O modelo experimental escolhido são os ovinos, podendo gerar informações para
futuras aplicações em humanos.
Resultados
A medicina regenerativa visa o reparo e/ou substituição de tecidos que sofreram
degeneração. O uso de CT permitirá recriar tecidos e repetir sua geração [8].
As CT são indiferenciadas, sem distinção do aspecto morfológico. Estão presentes nos
estágios embrionários e também nos tecidos adultos. São definidas por suas propriedades
funcionais, como o potencial de auto-renovação, proliferação, capacidade de responder a estímulos
externos e de originar linhagens celulares com diferentes funções [7].
Vários estudos foram realizados visando desenvolver métodos para a produção de diferentes
tecidos para transplantes a partir de células-tronco embrionárias (CTE). Estas são totipotentes e
pluripotentes. Já as células-tronco adultas (CTA) são consideradas multipotentes. Substituem e
reparam qualquer tecido lesionado e tem uma plasticidade mais limitada [7].
Neste contexto, têm-se as células-tronco mesequimais (MSC). São células nãohematopoiéticas, de fácil acessibilidade e multipotencialidade de diferenciação em vários tecidos
[3]. Dentre essas, temos as hIDPSC, que são MSC específicas, capazes de se diferenciar in vitro em
vários tipos de células e tecidos como cartilagem, osso, tecido neural e também para células
musculares [2].
A OA identifica-se como uma doença degenerativa das articulações caracterizada por
alterações na cartilagem articular, nos tecidos moles e ossos, que pode causar dor articular e rigidez
[9,10].
O achado inicial mais evidente é na cartilagem articular. Na matriz ocorre perda no
conteúdo de proteoglicanos, As cadeias de condroitinossulfato são encurtadas e a composição dos
glicosaminoglicanos é anormal [9,10].
As superfícies articulares perdem a sua congruência e osso subcondral sofre alterações
proliferativas [9]. As células da sinóvia tornam-se metaplásicas e produzem osteófitos. O líquido
sinovial é deslocado até o osso subcondral nos pontos de microfraturas. Já os elementos da
articulação, ligamentos, cápsula, tendões e músculos sofrem hipertrofia. O enfraquecimento do
colágeno e a depleção dos proteoglicanos, observados na OA avançada, reduz a capacidade da
cartilagem de resistir às forças de tensão de compressão [10].
A perda de elasticidade e as alterações na lubrificação articular torna-se mais susceptível a
falha mecânica, com capacidade reduzida de dissipar as forças através da articulação. Isto pode
resultar em necrose celular e erosões da cartilagem articular [6].
O achado mais evidente na OA ocorre na cartilagem. Percebe-se perda do conteúdo de
proteoglicanos, os quais têm sua capacidade de agregação alterada e um aumento no teor de água.
Já o condrócito divide-se para formar clones celulares. Aumentam a sua produção de colágeno tipo
II e de proteoglicanos, numa tentativa de reparar o processo destrutivo da matriz. Quando a
capacidade de síntese da matriz é menor do que a destruição, predomina o processo catabólito e a
superfície da cartilagem perde sua textura lisa, torna-se fibrilar, desenvolvendo fendas e erosões [4].
A perda de proteoglicanos e o aumento no teor de água levariam à perda da elasticidade,
com maior rigidez do tecido, aumentando a sua susceptibilidade a stress mecânico. Seguem-se
sofrimento do condrócito e alterações de permeabilidade em cartilagem, prejuízo de sua nutrição e
lubrificação, desenvolvimento de fibrilas e fissuras [5].
Conclusão
A terapia com CT deve ser aplicada com cautela, pois não se trata de um tratamento
imediato. O potencial terapêutico das CT vem se afirmando como altamente promissor. A
caracterização cada vez mais detalhada de novos tipos de CT, como as hIDPSC, pode ser uma
alternativa no tratamento da AO. Isto contribuirá com a qualidade de vida de muitas pessoas.
Referências
[1] GRECO, O. T.; GRECO, R. L.; ABREU, A. C. de., 2007. Uso de células-tronco no tratamento
de pacientes com miocardiopatia dilatada de diferentes etiologias, associada à ressincronização
cardíaca artificial. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. v. 29, n. 4.
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M.; BRÓLIO, M. P.; SANT’ANNA, O. A.; MIGLINO, M. A.; ZATS, M., 2008. Early
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muscular dystrophy (GRMD) dogs: local or systemic? Journal of Translational Medicine. v. 6, p.
36.
[3] KIRSCHSTEIN, R.; SKIRBOLL, L., 2001. The stem cells. Stem Cells: Scientific Progress and
Future Research Directions. National Institutes of Health. p. 1-3.
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[7] PEREIRA, L. V., 2008. A importância do uso das células-tronco para a saúde pública. Ciência e
Saúde Coletiva. v. 13, n. 1, p. 7-14.
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[10] YOSHINARI, H. N.; BONFA, O. E., 2000. Reumatologia para o Clínico, São Paulo: Rocca.
CONSTRUÇÃO DE UM VETOR PARA A EXPRESSÃO DE ERITROPOIETINA
HUMANA (HEPO) NO LEITE DE CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS
Giassetti, M.I.1; Mendes. C.M. 1; Martins, E.A.2; Assumpção, M.E.O.D1.; Visintin, J.A.1
1. Laboratório de Fecundação in vitro, Clonagem e Transgenia Animal; Departamento de
Reprodução Animal, Faculdade de MedicinaVeterinária e Zootecnia; Universidade de São
Paulo; São Paulo; Brasil.
2. Centro de Biotecnologia, Instituto Butantã; São Paulo; Brasil.
Introdução
Os animais transgênicos produzidos pela inserção de genes extrínsecos em seu material genético,
são modelos importantes para estudos na ciência básica. Podem ser utilizados como biorreatores
para a produção de proteínas de interesse como por exemplo, a eritropoietina humana (hEPO). A
rhEPO já foi produzida em diferentes animais transgênicos como: coelhos1, 2 e 3, camundongos 4 e 5 e
porcos 6 sob a ação de diferentes promotores. Em diversos trabalhos em camundongos e coelhos
ocorreram falhas na glicosilação, resultando a produção de uma proteína com baixa atividade
biológica. Sendo assim, faz-se necessário o desenvolvimento de vetores que gerem a correta
glicosilaçao e expressão da hEPO. O presente projeto objetivou a construção de um vetor
plasmideal utilizando a b-lactoglobulina (BGL) como região promotora para a expressão em
glândula mamária.
Material e Métodos
O gene da hEPO foi amplificado em dois fragmentos (2000 e 700 pb) que foram unidos por ação da
enzima T4 DNA ligase gerando um fragmento de 2.700 pb. Então este foi purificado e inserido em
um plasmídeo pGgem-Teasy para a multiplicação do gene de interesse em bactérias. Para a
realização da transferência da hEPO do plasmídeo pGem-Teasy (Promega) para o Bluescript
contendo as regiões promotora da BGL e a região 3’da a caseína, ambos plasmídeos tiveram de ser
previamente digeridos com as enzimas Cla I e Hind III.
O inserto e o plasmídeo digerido foram purificados e unidos com o uso da enzima T4 DNA ligase.
Este plasmídeo foi então introduzido em bactérias competentes para serem clonados. Foram
selecionadas colônias que cresceram de forma delimitada e realizada a extração do DNA com fenol
clorofórmio, que foi submetido à eletroforese unidimensional. As colônias que apresentavam o
plasmídeo com tamanho esperado (7000pb) foram purificadas e congeladas. O plasmídeo contendo
a região promotora, gene da hEPO e região codificadora foi posteriormente submetido a
seqüenciamento.
Resultados
Após a obtenção do vetor final (Figura1) foi realizado o seu seqüenciamento, sendo
observada a total compatibilidade com a seqüência gênica da hEPO disponibilizada no Gene Bank.
Figura 1: Figura representativa do vetor final.
Conclusão
O vetor foi construído apresentando a região promotora que confere a expressão proteica
direcionada para a glândula mamária (região promotora BGL), gene correto para a expressão da
hEPO e região codificadora (região 3’a-caseína). A região promotora da BGL promoverá a
expressão em tecido glandular mamário e a região codificadora (região 3’a-caseína) promoverá a
expresão proteica junto com caseína. Esta região 3’ confere mais estabilidade ao RNA formado,
permitindo expressar de maneira mais adequada a proteína de interesse.
Agradecimentos
À FAPESP pelo apoio finaceiro, ao pesquisador Stas Gorotedesk e à pesquisadora Elizabeth
Angélica Leme Martins pela colaboração.
Referências
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recombinant human erythropoietin in the milk.Transgenic Res 13: 487–498.
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erythropoietin produced in milk of transgenics pigs. Journal of Biotechnilogy 122: 362-371.
RECRUTAMENTO LEUCOCITÁRIO INDUZIDO PELO VENENO DE Bothrops moojeni
(VBm) E MECANISMOS ENVOLVIDOS NESTE EFEITO: PARTICIPAÇÃO DE
MASTÓCITOS E DA HISTAMINA
Sampaio, MC1,3, Fernandes, CM1, Leiguez Jr., E1, Frare, EO1, Faquim-Mauro, EL2,3, Teixeira,
CFP1,3.
1
Laboratório de Farmacologia e 2Laboratório de Imunopatologia, Instituto Butantan, São Paulo,
Brasil; 3Depto. Imunologia – Instituto de Ciências Biomédicas – USP – São Paulo
Introdução
Os acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops causam uma reação inflamatória grave no
local da picada, acompanhada de hemorragia e mionecrose. A serpente Bothrops moojeni é
responsável pelo maior número de acidentes ofídicos ocorridos na região de São José do Rio Preto –
SP, de densidade populacional elevada. As reações locais causadas por essa serpente são mais
graves do que aquelas causadas pela serpente B. jararaca. No entanto, os eventos e mecanismos
inflamatórios causados pelo veneno da B. moojeni não foram caracterizados. Os leucócitos
residentes, em particular os mastócitos, são as primeiras células a responderem a agentes exógenos.
Essas células são elementos centrais da resposta inflamatória por sua capacidade de liberar uma
ampla gama de mediadores inflamatórios, dentre os quais a histamina. No entanto, ainda não se
conhece a participação dos mastócitos e da histamina na resposta inflamatória local induzida por
venenos botrópicos. Este estudo teve por objetivos: i) caracterizar o influxo leucocitário induzido
pela injeção intraperitoneal do veneno de Bothrops moojeni (VBm), em camundongos, no que se
refere ao número, tipos celulares, cinética e relação dose-efeito; ii) avaliar os mecanismos
envolvidos no influxo leucocitário induzido, quanto à participação de mastócitos e da histamina,
analisando a contribuição dos receptores H1, H2 e H4; iii) avaliar a liberação dos mediadores
quimiotáticos TXA2, LTB4, MCP-1 e KC e iv) avaliar a ação do veneno quanto à capacidade de
desgranular mastócitos in vivo e in vitro.
Materiais e métodos
Foram utilizados camundongos Swiss machos (18-20 g) – Protocolo de aprovação da Comissão de
Ética em Experimentação Animal da USP nº 044/07 e do Instituto Butantan nº 241/08. O influxo de
leucócitos foi avaliado em lavados peritoneais após injeção do VBm (0,025 a 0,5 μg/g) ou de
solução fisiológica apirogênica (controle); o número de leucócitos circulantes foi avaliado no
sangue periférico dos animais, após essas injeções. O número total dos leucócitos foi determinado
em câmera de Neubauer, após diluição em líquido de Turk (1:20, v/v) e a contagem diferencial em
esfregaços celulares corados com Giemsa, sob microscopia de luz. Para avaliar a participação dos
mastócitos e da histamina no influxo leucocitário induzido pelo VBm, grupos de animais foram
tratados, pela via intravenosa, com inibidor da desgranulação dos mastócitos ou com antagonistas
seletivos dos receptores de histamina, antes da injeção i.p. do veneno ou de salina apirogênica. A
concentração dos mediadores inflamatórios foi avaliada por ensaios imunoenzimáticos. A
desgranulação de mastócitos in vivo foi determinada no tecido mesentérico corado por Giemsa e a
desgranulação in vitro determinada pela dosagem da β-hexosaminidase, por ensaio fluorimétrico, no
sobrenadante de culturas de mastócitos da linhagem PT-18.
Resultados
Os resultados obtidos mostraram que o VBm causou influxo leucocitário para a cavidade peritoneal,
entre a 3ª e a 24ª hora, com polimorfonucleares (PMN) entre a 3ª e 6ª hora e mononucleares (MN)
até a 24ª hora, além de aumento de neutrófilos circulantes na 3ª hora. O pré-tratamento dos animais
com cromoglicato (25 mg/kg, i.v., 30 min antes do VBm), inibidor da desgranulação de mastócitos,
aboliu o recrutamento de PMN e de MN, na 6ª hora. O tratamento com a difenidramina (10 mg/kg,
i.v., 10 min antes do VBm) ou ranitidina (10 mg/kg, i.v., 10 min antes do VBm) ou tioperamida (10
mg/kg, i.v., 20 min antes do VBm), antagonistas de receptores H1, H2 e H4 da histamina,
respectivamente, reduziu significativamente o recrutamento de PMN, mas não de MN. Ainda, o
veneno acarretou a liberação de TXA2 (10 minutos a 1 hora), LTB4 (6 hora), MCP-1 (1 a 3 horas) e
de KC (30 minutos a 1 hora). Adicionalmente, a injeção intraperitoneal do VBm causou a
desgranulação dos mastócitos mesentéricos, aos 10 minutos e a liberação de PGD2, entre 5 e 30
minutos após sua injeção. In vitro, o VBm causou aumento significativo da liberação de βhexosaminidase, a partir de mastócitos em cultura.
Discussão
Este estudo demonstra, pela primeira vez, que VBm induz o recrutamento de leucócitos PMN e MN
para o local de sua injeção. Em adição, o aumento do número de neutrófilos circulantes causado por
este veneno indica a sua capacidade de mobilizar leucócitos dos compartimentos de síntese e
reserva, o que deve ser relevante para o recrutamento destas células para o sítio inflamatório. Além
disso, o recrutamento leucocitário, induzido pelo veneno, é dependente da histamina, via receptores
H1, H2 e H4 e da ativação e desgranulação de mastócitos. A desgranulação e ativação destas células
decorre, ao menos em parte, da ação direta do veneno sobre as mesmas. Ainda, a capacidade do
VBm induzir a liberação dos mediadores quimiotáticos TXA2, LTB4, MCP-1 e a KC deve
contribuir para o influxo leucocitário causado pelo mesmo. Este estudo deve contribuir para o
melhor entendimento da fisiopatologia da ação local decorrente do envenenamento botrópico.
Agradecimentos
FAPESP (06/58333-1), CNPq, INCTTOX.
EFEITO DA TEMPERATURA NO SISTEMA IMUNOLÓGICO INATO DE OURIÇOS DO
MAR ANTÁRTICOS (Sterechinus neumayeri): DADOS PRELIMINARES
Branco, P.C.¹, Pressinotti, L.N.², Borges, J.C.S³, Kfoury-Júnior, J.R.4, Silva, M.O.³, González, M.5,
Silva, J.R.M.C.¹
1- Depto de Biologia Celular e do Desenvolvimento - Instituto de Ciências Biomédicas –
Universidade de São Paulo – São Paulo, Brasil
2- Faculdade de Ciências Biológicas – Universidade Estadual do Mato Grosso – São Paulo,
Brasil
3- Faculdade de Medicina Veterinária – Faculdades Metropolitanas Unidas – São Paulo, Brasil
4- Depto de Cirurgia – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Universidade de São
Paulo – São Paulo, Brasil
5- Instituto Antártico Chileno – Punta Arenas, Chile
Introdução
O IPCC (Intergovernmental Panel on Climate Change) é a mais alta autoridade científica
sobre aquecimento global. De acordo com o último relatório publicado, o aquecimento global está
se acelerando. A temperatura média global subiu cerca de 0,7º C entre 1901 e 2005 [3].
Alguns autores citam como conseqüência do aquecimento global, o aumento da ocorrência
de doenças no ambiente marinho [5]. [4] demonstram que o aquecimento global está relacionado
com o surgimento de doenças de forma direta e indireta. [2] afirmam que a maior ocorrência de
patologias está relacionada com o fato dos microrganismos terem maior taxa de crescimento e
multiplicação em temperaturas mais elevadas.
Os ouriços-do-mar pertencem ao filo Echinodermata, classe Echinoidea, este filo é
exclusivamente marinho com características conspícuas conhecidas desde tempos remotos. Os
equinóides adultos são bentônicos, possuem limitada capacidade de movimentação e se aderem
firmemente ao substrato, desempenhando um importante papel ecológico. Estes animais vêm
atraindo recentemente a atenção de pesquisadores que buscam encontrar mecanismos imunológicos
primitivos que seriam filogeneticamente ancestrais dos vertebrados [7].
O objetivo do presente trabalho é verificar o efeito do aquecimento global na água do mar na
imunidade inata de ouriços-do-mar Antárticos Sterechinus neumayeri submetidos a três diferentes
temperaturas (0, 2 e 4ºC) por três diferentes prazos (agudo e crônico de 2, 7 e 14 dias).
Material e Métodos
Exemplares do de Sterechinus neumayeri (n=60) foram colhidos nas proximidades da EACF
com redes de arrasto durante o verão a uma profundidade de 3 a 6 m na ilha do Rei George (S
62o09.568'; O 058o26.959'). Foram aclimatados por pelo menos uma semana antes do início dos
experimentos.
Assumimos a temperatura de 00C como média de manutenção para os ouriços-do-mar. A
variação térmica crônica foi realizada variando em 1 grau por dia a temperatura de manutenção dos
animais até atingirmos a temperatura desejada (0, 2 e 40C) onde permaneceram por mais 2, 7 e 14
dias para posterior análises. A variação térmica aguda será realizada aumentando abruptamente a
temperatura controle até as temperaturas desejadas.
A contagem dos celomócitos foi realizada sem diluição em câmara de Neubauer [1]. Para
ensaios de fagocitose in vitro foram utilizadas leveduras S. cerevisae incubadas por 2 horas
utilizando o protocolo de [6].
A avaliação da proteína do choque térmico HSP70 foi avaliada por imunofluorescencia e
Western blotting utilizando o anticorpo primário Stressgen® Bioreagents Limited Partnership,
Victoria, Canadá - mouse anti-HSP 70 monoclonal SPA-810
Os dados obtidos serão avaliados em função das médias e desvio padrão obtidos por análises
estatísticas pelo ANOVA.
Resultados
Os resultados obtidos demonstram aumento quantitativo de esferulócitos vermelhos (EV) na
temperatura de 2°C em todos os períodos, e diminuição na temperatura de 4 °C, com exceção do
período crônico de 2 dias, no qual a quantidade de EV continuou em elevação. Esses dados estão de
acordo com os observados na literatura existente para ouriços do mar expostos a outros fatores
estressores, no entanto foi a primeira vez que se observou o aumento de EV em casos de variações
térmicas. Outro dado obtido importante de ser mencionado é o aumento da capacidade fagocítica
em 2°C e sua diminuição em 4°C. Uma vez que o aumento de EV coincide com o aumento da
capacidade fagocítica, sugerimos a participação dessa célula, como ativadora da resposta
imunológica inata. Além disso, observou-se a expressão de HSP70 em amebócitos fagocíticos por
meio de imunoflorescência.
Conclusão
De acordo com os resultados até o presente momento, pode-se inferir que há uma relação
diretamente proporcional entre o efeito do aquecimento global até 4°C e sistema imune inato de
ouriços do mar Antárticos.
Agradecimentos
CNPq e Fapesp pelo apoio financeiro, Marinha do Brasil e Programa Antártico Brasileiro
pelo apoio logístico, CEBIMar pelo auxílio nos experimentos pilotos.
Referências
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[3] FAPESP, - O peso da mao humana, Agência Fapesp Sao Paulo, 02/02/2007.
Http://www.agencia.fapesp.br/boletim_dentro.php?Data[id_materia_boletim]=6682.
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J. The sea urchin immune system. ISJ 3:25-29, 2006.
AÇÃO INIBITÓRIA DA CROTOXINA SOBRE A ATIVIDADE
FAGOCÍTICA DE NEUTRÓFILOS
Lima, TS1; Iritus, ACC1; Cataneo, SC1; Sampaio, SC1; Cirillo, MC1
1- Lab. Fisiopatologia, Instituto Butantan, São Paulo, Brasil.
250
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*
150
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50
0
Atividade Fagocítica (score)
Atividade Fagocítica (score)
Introdução: O veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt) e seu principal componente, a
crotoxina (CTX), apresentam ação antiinflamatória prolongada [2, 3]. Além disso, o VCdt e a
crotoxina inibem a atividade fagocítica de macrófagos peritoneais [5, 6]. Recentemente, foi
demonstrado também o efeito inibitório in vitro e in vivo do VCdt sobre a fagocitose por neutrófilos
inflamatórios [1]. Entretanto, ainda não foi caracterizado o componente do VCdt responsável por
essa ação inibitória. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos in vitro e in vivo
da crotoxina e das demais frações do VCdt, obtidas durante o processo de purificação da crotoxina,
sobre a fagocitose, via C3b, por neutrófilos peritoneais. Material e Métodos: Neutrófilos
peritoneais foram obtidos de ratos Wistar (170g), 4 h após a administração i.p. de carregenina (4,5
mg/kg em 1 mL de PBS estéril). Para os estudos in vitro, os neutrófilos (1,2 x 106 cel/mL) foram
incubados com a crotoxina (pico II) ou com os demais picos (I e III) em diferentes concentrações
(0,02; 0,04; 0,08; 0,16 e 0,32 μg/mL) ou com meio RPMI 1640 (controle) por 1 h. Após esse
período, as células foram incubadas com partículas de zimosan opsonizado por 40 minutos; 37ºC,
5% de CO2. A seguir, as lâminas contendo 2,4 x 105 células foram coradas pancromicamente [4].
Um total de 100 células foi contado em microscopia óptica e o índice de fagocitose avaliado. Para
os estudos in vivo ratos Wistar (170g) foram injetados s.c. com CTX (0,11 mg/kg em 300 µL de
salina estéril) ou com salina estéril (controle) em diferentes tempos: 2 horas, 1, 4 ou 14 dias antes
ou 1 hora após a administração i.p. de carragenina. Após a obtenção dos neutrófilos peritoneais, o
processo de fagocitose de partículas de zimosan opsonizado foi realizado como descrito
anteriormente. Resultados: A incubação de neutrófilos peritoneais de ratos Wistar com os picos I e
III, por 1 h, nas diferentes concentrações não alterou a atividade fagocítica dessas células (Fig. 1).
Por outro lado, a incubação de neutrófilos com a crotoxina (pico II), por 1h, nas diferentes
concentrações reduziu a fagocitose de partículas de zimosan opsonizado, quando comparado ao
controle (cg+RPMI: 222 ± 5,2; p<0,001): 0,02 µg/mL: 29% (cg+ctx: 158 ± 5,2; p<0,001 ), 0,04
µg/mL: 24% (cg+ctx: 169 ± 7,0; p<0,001), 0,08 µg/mL: 28% (cg+ctx: 159,8 ± 7,5; p<0,001), 0,16
µg/mL: 26% (cg+ctx: 165,2 ± 8,5; p<0,001) e 0,32 µg/mL: 24% (cg+ctx: 169,6 ± 6,7; p<0,001 ).
Essa inibição foi semelhante ao VCdt bruto (Fig.2). Nos estudos in vivo a injeção s.c. de CTX
reduziu a porcentagem de fagocitose por neutrófilos peritoneais de ratos Wistar em todos os tempos
avaliados: 2 horas: 24% (ctx+cg: 158,2 ± 2,6; salina+cg: 208,4 ± 5,3; p<0,001 ), 1 dia: 31%
(ctx+cg: 142,6 ± 6,8; salina+cg: 207,2 ± 5,0; p<0,001), 4 dias: 25% (ctx+cg: 161 ± 11; salina+cg:
214,4 ± 0,8; p<0,001), 14 dias: 18% (ctx+cg: 162,6 ± 3,1; salina+cg: 198 ± 3,2; p<0,001) e 1 hora
após: 35% (cg+ctx: 130 ± 1,8; cg+salina: 198,4 ± 4,0; p<0,001) (Fig.3).
250
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0
RPMI 0,32 0,16 0,08 0,04 0,02 VCdt
PI (µg/mL)
*
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RPMI 0,32 0,16 0,08 0,04 0,02 VCdt
PIII (μg/mL)
Figura 1. Efeito dos picos I e III sobre a fagocitose por neutrófilos peritoneais. A atividade fagocítica foi determinada em neutrófilos
peritoneais de ratos Wistar coletados 4 horas após a administração i.p. de carragenina (4.5 mg/kg) e incubados por 1 hora com
diferentes concentrações dos picos I e III (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 and 0,32 µg/mL) ou com meio RPMI 1640 (controle). Partículas de
zimosan opsonizadas com soro de ratos normais foram utilizadas como estímulo fagocítico. Um total de 100 células foi contado e a
atividade fagocítica determinada. Os resultados correspondem à média ± SEM de 5 animais. *P<0,001, significativamente diferente
do grupo controle.
Atividade Fagocítica (score)
250
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RPMI 0,32 0,16 0,08 0,04 0,02 VCdt
CTX (μg/mL)
Atividade Fagocítica (score)
Figura 2. Efeito da crotoxina (pico II) sobre a fagocitose por neutrófilos peritoneais. A atividade fagocítica foi determinada em
neutrófilos peritoneais de ratos Wistar coletados 4 horas após a administração i.p. de carragenina (4.5 mg/kg) e incubados por 1 hora
com diferentes concentrações de crotoxina (0,02; 0,04; 0,08; 0,16 and 0,32 µg/mL) ou com meio RPMI 1640 (controle). Partículas de
zimosan opsonizadas com soro de ratos normais foram utilizadas como estímulo fagocítico. Um total de 100 células foi contado e a
atividade fagocítica determinada. Os resultados correspondem à média ± SEM de 5 animais. *P<0,001, significativamente diferente
do grupo controle.
250
Salina
CTX
200
150
*
*
*
*
*
100
50
0
2 horas
1 dia
4 dias
14 dias 1 hora depois
Figura 3. Atividade fagocítica de neutrófilos peritoneais de ratos tratados com crotoxina (pico II). Crotoxina (0,11 mg/kg) ou salina
estéril (controle) foi injetada s.c. em ratos Wistar 2 horas, 1, 4 ou 14 dias antes ou 1 hora após a administração i.p de carragenina (4.5
mg/kg). Um total de 100 células foi contado e a atividade fagocítica determinada. Os resultados correspondem à média ± SEM de 5
animais. *P<0,001, significativamente diferente do grupo controle.
Conclusão: Os resultados demonstram que a crotoxina é o componente do VCdt responsável pelo
efeito inibitório sobre a atividade fagocítica de neutrófilos peritoneais. Os ensaios in vitro mostram
que a crotoxina, em todas as concetrações avaliadas, inibe a atividade de fagocitose por neutrófilos
peritoneais, evidenciando ação direta da toxina sobre esse tipo celular. Ainda, os resultados
mostram que a crotoxina, administrada in vivo, apresenta ação prolongada semelhante à observada
para o VCdt bruto, uma vez que uma única dose de crotoxina é capaz de inibir a fagocitose por até
14 dias. Considerando a importância dos neutrófilos na resposta inflamatória esses resultados
contribuem para o esclarecimento dos mecanismos envolvidos na ação antiinflamatória prolongada
da crotoxina.
Agradecimentos: FAPESP, CAPES, Instituto Butantan e INCTOX.
Referências:
[1] Lima, T.S.; Nunes, F.P.B; Sampaio, S.C.; Sousa-e-Silva, M.C.C., 2007. Efeito do veneno de Crotalus durissus
terrificus sobre a fagocitose por neutrófilos no modelo de peritonite. 39° Congresso Brasileiro de Farmacologia e
Terapêutica Experimental, realizado em Ribeirão Preto, de __ a __ de outubro de 2007.
[2] Nunes, F.P.B.; Sampaio, S.C.; Sontoro, M.L.; Sousa-e-Silva, M.C.C., 2007. Long-lasting anti-inflammatory
properties of Crotalus durissus terrificus snake venom in mice. Toxicon. 49 (8), 1090-1098.
[3] Nunes, F.P.B.; Sampaio, S.C.; Sousa-e-Silva, M.C.C., 2008. Efeito antiinflamatório prolongado da crotoxina:
contribuição da lipoxina. 40° Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, realizado em Águas de
Lindóia, de 16 a 19 de outubro de 2008.
[4] Rosenfeld, G., 1947. Método rápido de coloração de esfregaços de sangue. Noções práticas sobre corantes
pancrômicos e estudos de diversos fatores. Mem. Inst. Butantan. 20, 315-328.
[5] Sampaio, S.C.; Brigatte, P.; Sousa-e-Silva, M.C.C.; Dos-Santos, E.C.; Rangel-Santod, A.C.; Curi, R.; Cury, Y.,
2003. Contribution of crotoxin for the inhibitory effect of Crotalus durissus terrificus snake venom on macrophage
function. Toxicon. 41 (7), 899-907.
[6] Sousa-e-Silva, M.C.C.; Gonçalves, L.R.C.; Mariano, M., 1996. The venom of South American rattlesnakes inhibits
macrophage functions and is endowed with anti-inflammatory properties. Mediators Inflamm. 5, 18-23.
O EFEITO ANTINOCICEPTIVO INDUZIDO PELO GLICOGÊNIO EM RATOS
SUBMETIDOS AO MODELO DE PRESSÃO DE PATA É DEPENDENTE DA MIGRAÇÃO
NEUTROFÍLICA E NÃO ESTÁ RELACIONADO À LIBERAÇÃO DE OPIÓIDES
Nogueira, TO1, Spadacci-Morena, DD1, Santoro, ML1, Pagano, RL2, Giorgi, R1. 1Laboratório de
Fisiopatologia, Instituto Butantan; 2Laboratório de Neurobiologia Celular, Departamento de
Fisiologia e Biofísica, ICB/USP
Introdução: A literatura tem demonstrado o envolvimento dos neutrófilos na modulação da
resposta dolorosa durante o processo inflamatório agudo. Entretanto, a participação dessas células
na gênese da dor ainda é contraditória, uma vez que tem sido sugerido o envolvimento dos
neutrófilos tanto na indução como na inibição da resposta dolorosa. Alguns trabalhos sugerem a
participação do neutrófilo no controle da dor inflamatória via liberação de peptídeos opióides.
Assim, a injeção intraplantar em ratos dos ligantes CXCL2/3 do receptor CXCR2 para quimiocinas,
na presença de inflamação no tecido plantar induzido por adjuvante completo de Freund (CFA),
acarreta o recrutamento de células polimorofonucleares (PMNs) com consequente liberação de
peptídeos opióides e indução de analgesia mecânica e térmica, as quais foram abolidas após a
depleção sistêmica de PMNs [4]. Entretanto, trabalhos do nosso grupo sugerem que os neutrófilos
inibem a resposta nociceptiva, via proteína ligante de cálcio S100A9, em peritonite induzida em
camundongos submetidos ao teste de contorção abdominal [1] [2]. O objetivo do presente trabalho
foi aprofundar os estudos sobre a participação do neutrófilo no controle da nocicepção em modelo
de inflamação aguda induzida pelo glicogênio na pata de ratos. Ainda, com base nos dados de
literatura foi avaliado o envolvimento dos opióides na antinocicepção induzida pelo glicogênio.
Métodos: Neste estudo foram utilizados ratos machos Wistar e a avaliação da sensibilidade
dolorosa dos animais foi realizada pelo teste de pressão de pata de ratos [3]. A inflamação aguda foi
induzida pela injeção intraplantar de solução de glicogênio (Gli 5%, 100µl/animal) e o teste
nociceptivo aplicado 2, 4, 6, 8, 12 e 24 horas após o tratamento. Para avaliar a participação do
neutrófilo no efeito induzido pelo Gli, ratos foram injetados via endovenosa com fucoidina, um
inibidor de selectina, na dose de 5mg/Kg (500µl/animal) 15 minutos antes da injeção intraplantar de
glicogênio e em diferentes tempos submetidos ao teste de pressão de pata. O perfil de migração
celular após o tratamento com Gli ou Gli mais fucoidina foi avaliado em ratos tratados com
fucoidina 15 minutos antes da injeção de glicogênio. Após 2, 4, 8 e 12 horas os animais foram
eutanasiados em câmara de CO2, o tecido plantar coletado e processado, de forma rotineira, para
análise histológica. Para quantificar as células polimorfonucleares (PMNs) migradas para o tecido
plantar, os cortes foram analisados no aumento de 1000X em microscópio de luz e a contagem de
PMNs foi realizada, de forma aleatória, em cinco campos do tecido conjuntivo, entre o tecido
epitelial e o muscular. O valor médio dos cinco campos foi tomado como valor representativo do
número de neutrófilos do corte total. Essa contagem foi realizada em 3 cortes não seriados do coxim
plantar dos diversos animais. A participação de peptídeos opióides na resposta antinociceptiva do
glicogênio foi avaliada em animais tratados com naloxona (1mg/Kg, 100µl/animal), um antagonista
inespecífico de receptores opióides. A naloxona foi administrada via subcutânea 15 minutos antes
da realização do teste nociceptivo em animais previamente injetados na pata com Gli ou
administrada via intraplantar 15 minutos antes da injeção do Gli, sendo que em ambos os protocolos
o teste de pressão de pata foi aplicado 2, 3 e 4 horas após o tratamento com Gli.
Resultados: Ratos injetados com Gli apresentaram antinocicepção 2, 3, 4, 6, 8 e 12 horas após o
tratamento. O pré tratamento com fucoidina reverteu a antinocicepção observada e induziu
hiperalgesia após 2, 4 e 6 horas da injeção do Gli. Já, 8 horas após a administração do Gli a
fucoidina apenas reverteu o efeito antinociceptivo observado. A fucoidina não foi capaz mais de
interferir no efeito do Gli após 12 e 24 horas da sua injeção (Fig.1A). A análise histológica
demonstrou um aumento na migração de células PMNs nos tempos iniciais após a administração
intraplantar do Gli, a qual foi inibida pelo pré tratamento com fucoidina nos tempos entre 2 e 8
horas (Figs. 1B e 2A e B). Com relação ao tempo de 12 horas, a fucoidina não induziu uma redução
significativa do número de PMNs migrados quando comparado com o Gli. Quanto à naloxona, tanto
sua administração subcutânea como intraplantar não interferiram com o efeito antinocicepção do
Gli em nenhum dos tempos avaliados.
*
Pressão (g)
75
60
45
*#
*
*#
*
*#
*
*
#
Gc M I
Gc
GC+Fuc M I
Gc+Fuc
30
15
0
1A
2
4
6
8
Tempo (h)
12
24
Nº de PMN
90
300
Gli
250
Gli + Fuc
200
150
*
100
*
50
1B
0
2 hs
4 hs
8 hs
12 hs
Tempo
Fig. 1A. Perfil da avaliação da resposta dolorosa de ratos submetidos ao modelo de pressão de pata injetados apenas
com glicogênio ou pré tratados com fucoidina. Os dados correspondem a media ± e.p.m. de 6 a 8 animais por grupo. (*)
p<0.05 em relação a medida inicial (MI) e (#) em relação ao grupo Gli. 1B. Contagem de neutrófilos nos cortes
histológicos de coxim plantar de ratos injetados apenas com glicogênio ou pré tratados com fucoidina. Os dados
correspondem a media ± e.p.m. dos cortes analisados. (*) p<0.05 em relação ao grupo injetado apenas com glicogênio.
Fig. 2A. Vista geral de coxim plantar de rato obtido após 4 horas da injeção de 100 µL de solução de glicogênio a 5%,
apresentando intenso infiltrado leucocitário no tecido conjuntivo (*). Barra = 100μm. Fig. 2B. Vista geral de coxim
plantar de rato pré tratado com fucoidina obtido após 4 horas da injeção de glicogênio, evidenciando uma diminuição do
infiltrado leucocitário no tecido conjuntivo (*). Fotomicrografia. H/E.
Conclusão: Estes resultados demonstram que o glicogênio induz antinocicepção nos tempos
iniciais do processo inflamatório, no modelo aqui estudado, e sugerem que os neutrófilos medeiam
esse efeito, uma vez que o tratamento com fucoidina reverteu a antinocicepção até a oitava hora
após a administração do Gli. A análise histológica do coxim plantar dos animais demonstrou que os
PMNs, mais especificamente os neutrófilos, são as células predominantes durante o efeito
antinociceptivo induzido pelo Gli e confirmou que a fucoidina acarreta uma redução da migração
dessas células no início da reação inflamatória. Ainda, quando a migração de PMNs não foi mais
inibida significativamente pela fucoidina também não foi mais observada a reversão do efeito
antinociceptivo do Gli. Uma vez que a administração sistêmica ou local do antagonista de
receptores opióides não inibiu a antinocicepção induzida pelo Gli, é plausível sugerir que os
peptídeos opióides não participam desse efeito. Em conjunto, esses dados permitem concluir que o
efeito antinociceptivo induzido pelo glicogênio em ratos submetidos ao modelo de pressão de pata é
dependente da migração neutrofílica e não está relacionado à liberação de peptídeos opióides. A
possível participação da proteína ligante de cálcio S100A9 nesse efeito está sob investigação.
Agradecimento: À FAPESP e à Fundação Butantan
Referências
[1]Giorgi R, Pagano RL, Dias MA, Aguiar-Passeti T, Sorg C, Mariano M. 1998. Antinociceptive effect of the calciumbinding protein MRP-14 and the role played by neutrophils on the control of inflammatory pain. J Leukoc Biol. 64(2):
214-20;
[2]Pagano, R. L. Mariano, M., Giorgi, R. 2006. Neutrophilic cell-free exudate induces antinociception mediate by the
protein S100A9. Mediator Inflamm. 4: 36765;
[3]Randall, L. O.; Selitto, J. J. 1957. A method for measurement of analgesic activity on
inflamed tissue. Arch Int Pharmacodyn Ther. 111 (4): 409-19;
[4]Rittner HL, Labuz D, Schaefer M, Mousa SA, Schulz S, Schäfer M, Stein C, Brack A. 2006. Pain control by CXCR2
ligands through Ca2+-regulated release of opioid peptides from polymorphonuclear cells. Faseb. J. 20 (14); 2627-9.
MODELOS PARASITÁRIOS PARA AVALIAÇÃO DE
SUBSTÂNCIAS BIOATIVAS
Valquiria F. Lozano1, Livia T. Oyafuso1, Emerson R. Martins1, Ana C. Medeiros2, Deborah
Gerhardt2 e Márcia Regina Machado dos Santos1.
Lab. de Biologia Celular e Molecular do Programa de Pós-graduação em Farmácia da Universidade
Bandeirante de São Paulo, UNIBAN
Introdução
A Tripanossomíase americana ou doença de Chagas é uma zoonose do continente americano
que se estende do sul dos Estados Unidos até a Argentina e o Chile (Rey, 2001), enfermidade de
caráter crônico causada pelo Trypanosoma cruzi. O parasita apresenta diferentes formas nas fases
aguda e crônica da doença, sendo as formas epimastigotas e tripomastigotas metacíclicas
encontradas no inseto vetor e as formas amastigotas intracelulares e tripomastigotas sanguínea no
hospedeiro humano. As drogas antiparasitárias usualmente utilizadas, nifurtimox um derivado do
nitrofuran (Bayer) e o Benzonidazol um derivado do nitroimidazol (LAFEPE) agem por geração de
radicais livres em seus metabolismos, sendo o T. cruzi muito suscetível aos danos causados por
esses radicais, porém atuam apenas na fase aguda e recente da infecção pelo T. cruzi e apresentam
grandes limitações pelos seus efeitos colaterais e pela necessidade do seu uso prolongado.
A leishmaniose é uma doença infecciosa parasitária de caráter antropozoonótico, amplamente
distribuída em todo mundo, afetando os vertebrados, através dos vetores dípteros hematófagos,
pertencentes aos Gêneros Phlebotomus (Velho Mundo) e Lutzomyia (Novo Mundo). A doença em
questão é de grande importância para os órgãos de saúde pública, principalmente em áreas
endêmicas, aonde, atualmente o cão vem representando o principal reservatório de transmissão ao
vetor. Estudos têm levado a várias pesquisas sob o aspecto de novos compostos e basicamente a
compreensão dos seus mecanismos de ação, tentando abolir o efeito tóxico sistêmico causado pelas
drogas usuais de tratamento como o antimônio pentavalente (Glucantime®), Pentamidina e
Anfotericina B.
A expressão diferencial de genes nas diferentes cepas e espécies dos parasitas expostas a
diferentes concentrações de drogas mostrou a existência de parasitas resistentes ao medicamento
[3]. Deve-se correlacionar o alvo a ser atingido com a atividade antiparasitária da droga e/ou seus
derivados, considerando o menor dano a célula hospedeira.
Dessa maneira se faz necessário e urgente o desenvolvimento de novas drogas, mais baratas
e fáceis de administrar e que sejam também eficazes para o tratamento da fase crônica das doenças.
A proposta do nosso trabalho foi estudar comparativamente a ação leishmanicida e
tripanomicida de compostos bioativos em diferentes espécies de Leishmania e cepas de
Trypanossoma cruz, inicialmente in vitro. Submetemos culturas de formas extracelulares
(epimastigotas ou promastigotas) e intracelulares (amastigotas) a tratamentos com compostos
bioativos, seus derivados e drogas usuais de tratamento das duas parasitoses.
Metodologia
Atividade antiparasitária em culturas das formas extracelulares dos parasitas em testes
iniciais de toxicidade e sensibilidade aos compostos cultivados com meio apropriado contendo Soro
Fetal Bovino por 24–48 h. Em seguida 1 ml contendo 106 parasitas será colocado em placas de 24
poços e diferentes concentrações (0,5 a 250 μg) do composto serão adicionadas aos respectivos
poços e as placas mantidas em cultura por 96 h a 28 °C. A atividade antiparasitária será avaliada
pela contagem do numero de parasitas em câmara hemocitométrica e pelos métodos já descritos que
avaliam a viabilidade celular para calculo do IC50.Dois experimentos diferentes serão feitos em
triplicatas.
Realizamos a validação de modelos parasitários para screening de painel de compostos
aplicando método colorimétrico de avaliação da sensibilidade do parasita num ensaio baseado no 3(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide -MTT, um sal tetrazólico amarelo que
é convertido a formazan, um precipitado violeta, por desidrogenases das células vivas [1]. Foram
utilizados 105 parasitas/mL distribuídos em placas de 96 poços contendo 200μL. Os compostos
usados foram diluídos de acordo com sua solubilização (H2O ou DMSO). Adicionamos aos poços
as diferentes concentrações dos compostos e as placas incubadas por 24 e 72 h.
A mudança de cor de amarelo para violeta indica viabilidade celular e a quantidade de
formazan formado é proporcional ao numero de parasitas vivos.
Resultado e Conclusão
A atividade antiparasitária em culturas das formas extracelulares foi avaliada nas diferentes
concentrações utilizadas e os dados sugerem uma diferença de susceptibilidade ao mesmo composto
entre parasitas das diferentes cepas e diferentes espécies, bem como ao tempo de exposição do
parasitas as substancias (24 e 72 h). Os dados obtidos estão sendo analisados e comparados para
procedermos a analise de sua significância estatística.
Referências
[1]Abate G, Mshana RN, Miorner H. Evaluation of a colorimetric assay based on 3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) for rapid detection of rifampicin
resistance in Mycobacterium tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 1998 Dec;2(12):1011-6.
[2]Avila AR, Dallagiovanna B, Yamada-Ogatta SF, Monteiro-Goes V, Fragoso SP, Krieger MA,
Goldenberg S. Stage-specific gene expression during Trypanosoma cruzi metacyclogenesis. Genet
Mol Res. 2003 Mar 31;2(1):159-68
[3]Villarreal D, Nirde P, Hide M, Barnabe C, Tibayrenc M. Differential Gene Expression in
Benznidazole-Resistant Trypanosoma cruzi Parasites. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,
July 2005, p. 2701-2709, Vol. 49, No. 7.
[4]REY, Luís. Parasitologia. 3 ed. Guanabara Koogan. 2001
PRINCIPAIS ALTERAÇÕES EM NECROPSIA ENCONTRADAS EM CÃES (Canis
domesticus) E GATOS (Felis catus) QUE VIERAM A ÓBITO DURANTE
PROCEDIMENTOS EM PETSHOPS E SIMILARES.
Maria, A.C.B.E¹, Rego, A.A.M.S.², Maiorka, P.C.¹
¹Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP - Universidade
de São Paulo – SP, Brasil; ²Médico veterinário autônomo
Introdução
Nos últimos anos, o mercado pet vem crescendo consideravelmente, assim como a preocupação
com o bem estar e saúde animal. Várias técnicas são desenvolvidas a fim de alcançar a máxima
perfeição e atingir as exigências do mercado, e é neste momento em que a atenção e conhecimento
destas técnicas são de extrema importância, visando evitar sérios contratempos.
Muitos animais encaminhados para necropsia apresentam histórico semelhante e curioso, onde o
óbito ocorre durante ou após procedimentos como banho e tosa, adestramento, traslados,
permanência em hotéis e outras situações similares.
A partir destes relatos e alterações anatomopatológicas apresentadas por estes animais uma
pergunta foi gerada: O que de fato acontece com estes animais?
Este trabalho tem por objetivo descrever as lesões anatomopatológicas encontradas nestes
animais.
Material e Métodos
Foram utilizados dados de exames necroscópicos de 104 cães e gatos que vieram a óbito entre o
período de janeiro de 2004 a maio de 2009.
Estes animais foram divididos em grupos de acordo com as causas de morte, e as lesões
anatomopatológicas encontradas foram tabuladas.
Resultados
Na análise dos dados, constatou-se a presença de dois grandes grupos: 30 (29%) animais
traumatizados (Gráfico 1) (Figura 1) e 74 (71%) animais não traumatizados (Gráfico 2) (Figura 2).
Gráfico 1: Porcentagem de animais traumatizados de acordo com as moléstias principais.
Gráfico 2: Porcentagem de animais não traumatizados de acordo com as moléstias principais.
Fig. 1: Crânio. Cão. Extenso
hematoma subcutâneo abrangendo
toda região de cabeça e fratura de osso
occipital (pinça).
Fig. 2: Pulmão. Cão. Hemorragia
pulmonar.
Conclusão
Dentre o grupo dos traumatizados, as principais lesões encontram-se na região da cabeça,
caracterizado por um trauma de força contundente, sugerindo queda ou golpe [1]. Nos não
traumatizados, as principais lesões encontram-se no pulmão, caracterizadas por edema e hemorragia
pulmonares, levando todos os 74 animais a um colapso respiratório [2].
Agradecimentos
Ao CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, ao
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de
São Paulo, e aos médicos veterinários Prof. Dr. Paulo Cesar Maiorka e Alexandre A. M. S. Rego.
Referências
[1] França, G.V., 1995. Medicina Legal, Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.
[2] Maxie, M.G., 2007. Jubb, Kennedy, and Palmer’s Pathology of domestic animals, 5º Ed.,
Elsevier Saunders, Ontario.
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS DA MONOCROTALINA NOS ESTUDOS DE
TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO
RICCI, EL; TELLOLI, C. S.; DALMOLIN, D.P.; BERNARDI, MM; GÓRNIAK,SL; SPINOSA,
HS
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo, SP, Brasil
Introdução
No Brasil, são conhecidas cerca de 40 espécies de Crotalaria [4] e estas são amplamente cultivadas
com objetivo de produzir “adubo verde”, haja vista que a Crotalaria spp, por ser uma Leguminosae,
possui a característica de fixar o nitrogênio no solo, sendo assim empregada em áreas de solo
“pobre” [2]. As principais formas de intoxicação de animais de produção são decorrentes da invasão
das áreas cultivadas por estas, principalmente em períodos de estiagem; invasão destas plantas em
pastagens; ou ainda, contaminação do feno pela planta ou por suas sementes [3]. Além de ser um
problema na pecuária decorrente das perdas econômicas que a toxicose causa, esta planta também
pode ser considerada como um problema de saúde pública, já que o metabólito tóxico de seu
princípio ativo, a monocrotalina (MCL), pode ser excretada no leite e também nos ovos e no mel
[5]. Ainda, o uso deliberado destas plantas na forma de chá e de “medicamentos” ditas populares
são preocupações constantes, não só no Brasil, como em todos os países onde estas plantas são
encontradas [1].
Este trabalho tem como objetivo re-avaliar os efeitos da monocrotalina na prole de fêmeas
gestantes, utilizando-se protocolos de neuroteratogenicidade.
Material e Métodos
Quarenta fêmeas prenhes provenientes do Biotério do Departamento de Patologia, FMVZ/USP,
receberam monocrotalina por gavagem nas doses de 7,0, 3,5 e 1,0mg/kg ou não (grupo controle) do
dia 6 da gestação (GD6) ao GD20. Acompanhou-se o peso materno durante toda gestação e ao
nascer suas proles foram observadas quanto ao peso, desenvolvimento físico (desdobramento de
orelha, erupção dos dentes incisivos, abertura dos olhos, aparecimento de pêlos, descida dos
testículos e abertura vaginal), reflexológico (reflexos de preensão palmar, endireitamento, geotaxia
negativa, sobressalto, dia de andar adulto) e comportamental (campo aberto).
Protocolo de ética- FMVZ: 1462/2008
Resultados
Os resultados parciais mostraram: 1) houve diminuição no número de filhotes nascidos dos grupos
que as mães receberam a monocrotalina em relação ao grupo controle, essa diminuição foi
proporcional a dose empregada; 2) não houve redução do peso materno durante a gestação; 3) não
houve redução do peso corporal dos filhotes nos dias observados; 4) não houve retardo no
desenvolvimento físico dos filhotes.
Conclusões
Os presentes dados mostram que a monocrotalina administrada na gestação não reduz o peso
materno, porém foi observado que essas mães tiveram número menor de filhotes em relação às
controles. Possíveis explicações são: devido a abortos, malformação dos fetos ou canibalismo
materno, é sabido que a mãe come os filhotes quando os mesmos não tem chances de sobrevivência,
como só foram contados um dia após nascimento, pode ter ocorrido canibalismo materno.
Agradecimento
Á FAPESP (08/5153-9), pelo apoio financeiro.
Referências
[1] HUXTABLE, R.J. Herbal teas and toxins: novel aspects of pyrrolizidine poisoning in the United
States. Perspect Biol Med v. 24 p. 1-14, 1980.
[2]JOLY, A.B. Botânica: chaves de identificação das famílias de plantas vasculares que ocorrem no
Brasil. Nacional, 4a. ed.,São Paulo, 1977.
[3] MEDEIROS, R.M.T. Toxicidade da monocrotalina: estudo em ratos, durante o período
perinatal. Tese FMVZ/USP, São Paulo, 1999.
[4] TOKARNIA, C.H.; DÖBEREINER, J. Plantas tóxicas da Amazônia: a bovinos e outros
herbívoros. Manaus, 1979.
[5] WILSON, D.W.; SEGALL, H.J.; PAN, L.C.; LAME, M.W.; ESTEP, J.E.; MORIN, D.
Mechanisms and pathology of monocrotaline pulmonary toxicity. Critical Reviews in Toxicology,
v.22, p. 307-325, 1992.
AVALIAÇÃO DA SÍNTESE DO SURFACTANTE PULMONAR DURANTE A FASE
FINAL DO DESENVOLVIMENTO FETAL EM CÃES
1
F.M. Regazzi , F. Grandi2, T.M. Sipriani1, C.R. Santos2, L.C.G. Silva1, G.A.L. Veiga1, P.C.
Maiorka2, C.I. Vannucchi1
1
Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia- USP;
2
Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia- USP.
Introdução
A maturação e crescimento do sistema respiratório fetal são eventos complexos e contínuos,
os quais iniciam-se na vida intra-uterina e estendem-se ao período pós-natal [1]. O desenvolvimento
histológico dos pulmões engloba cinco diferentes fases de evolução: embrionária, pseudoglandular,
canalicular, sacular e alveolar. No estágio canalicular ocorre a diferenciação das duas células de
revestimento alveolar, os pneumócitos tipo I e II, sendo o segundo tipo celular responsável pela
síntese de surfactante [2]. De modo geral, esta substância é constituída por lipídeos e proteínas (SPA, SP-B, SP-C e SP-D) [3]. A principal função do surfactante é diminuir a tensão superficial no
interior dos alvéolos pulmonares impedindo-os de colabar ao final da fase expiratória [4]. A
proteína SP-B, armazenada nos corpos lamelares dos pneumócitos tipo II, é fundamental para o
cumprimento desta função e sua deficiência torna o recém-nascido inapto à vida extra-uterina [3].
Desta forma, a produção de surfactante pulmonar pode, seguramente, ser correlacionada ao grau de
maturidade fetal e preparação para a vida extra-uterina [4]. Embora já se tenha relatos minuciosos
sobre a maturidade pulmonar temporal para a espécie humana, estudos pioneiros descrevem, de
forma lacônica, os achados bioquímicos e histopatológicos concernentes aos estágios do
desenvolvimento pulmonar em cães, impossibilitando efetivas intervenções ventilatórias e
medicamentosas a neonatos termo e pré-termo. Para complementar tais estudos, o presente trabalho
objetiva determinar o período gestacional a partir do qual se observa a produção de surfactante
pulmonar em fetos de cães.
Materiais e Métodos
Foram utilizados 13 fetos da espécie canina de raças variadas oriundos de cadelas gestantes
submetidas à interrupção da gestação. Os animais foram alocados em três grupos de acordo com a
idade gestacional, identificada por meio da medida crown-rump fetal: GRUPO A – fetos com idade
gestacional entre 45 e 49 dias (n=5); GRUPO B – fetos com idade gestacional entre 50 e 54 dias
(n=5); GRUPO C – fetos com idade gestacional entre 55 e 60 dias (n=3). A interrupção da gestação
foi realizada por ovário-histerectomia (OH) eletiva, servindo-se de fêmeas em campanhas de
castração e rotina de atendimento em clínicas particulares. Após a histerectomia e eutanásia fetal,
procedeu-se a histerotomia e remoção dos fetos da cavidade uterina. Estes foram submetidos à
lobectomia pulmonar. Os pulmões fetais foram lavados em abundância com solução fisiológica e
em seguida, foram removidas amostras de cada lobo pulmonar. Os lobos pulmonares foram
seccionados em fragmentos de 2 cm3 e armazenados em formol 10% à temperatura ambiente até o
processamento. Os fragmentos pulmonares foram inclusos em parafina de acordo com o protocolo
tradicional, seccionados em corte histológico de 0,5 µm e submetidos à técnica de
imunoistoquímica instituída por desparafinização, hidratação, desmascaramento com Tris EDTA,
bloqueio de reações inespecíficas e incubação overnight com anticorpos primários específicos para
a proteína SP-B do surfactante. Os cortes foram submetidos a uma segunda e terceira incubação
com anticorpo secundário biotinilado e complexo estreptavidina peroxidase respectivamente, foram
revelados, contracorados, admitiram posterior diafanização e montagem.
Resultados
A avaliação imunoistoquímica pulmonar realizada em fetos da espécie canina, possibilitou
identificar no citoplasma dos pneumócitos tipo II a síntese da proteína SP-B do surfactante, iniciada
no estágio canalicular do desenvolvimento pulmonar fetal ao 50° dia de gestação, conforme descrito
na tabela 1.
Tabela 1. Tempo de gestação e identificação da proteína SP-B no citoplasma dos pneumócitos tipo
II para as amostras dos grupos A, B, C.
Grupo
Amostras
Tempo de Gestação
PROTEÍNA SP-B
1
45
(-)
A
2
45
(-)
3
46
(-)
4
49
(-)
5
49
(-)
1
50
(+)
B
2
50
(+)
3
50
(+)
4
51
(+)
5
51
(+)
1
56
(+)
C
2
56
(+)
3
57
(+)
(-) ausência da proteína SP-B do surfactante pulmonar; (+) presença da proteína SP-B do surfactante
pulmonar.
Conclusão
A identificação da proteína SP-B a partir do 50° dia do desenvolvimento fetal em cães infere
início da síntese do surfactante pelos pneumócitos tipo II. Desta maneira, sugere-se que a atividade
secretora tenha início no estágio canalicular do desenvolvimento pulmonar.
Bibliografias
[1] Bolt, R.J., Weissenbruch, V., Lafeber, H.N., Wall, H.A.D., 2001
Glucocorticóides and Lung Development in the Fetus and Preterm Infant. Pediatric Pulmonology.
32, 76-91.
[2] Miyoshi, M.H., Guinsburg, R., 1998. Desenvolvimento e Crescimento Pulmonar Perinatal. In:
Kpelman, B., Miyoshi, M.H., Guinsburg, R., São Paulo: ed. Atheneu, pp 03-14.
[3] Rebello, C.M; Proença,R.S.M; Troster, E.J; Jobe, A.H., 2002. Exogenous surfactant therapy –
what is established and what still needs to be determined. Journal of Pediatrics. vol.78 suppl.2.
[4] Vestwebwer, J.G., 1997. Respiratory problems of newborn calves. Vet Clin North Am Food
Anim Pract. 13(3), 411-24.
EFEITO DOS NÍVEIS DO PREPARADO DE ANTICORPOS POLICLONAIS (PAP)
SOBRE PARÂMETROS DE FERMENTAÇÃO RUMINAL
João Paulo Sigolo T. Bastos1*; Carolina Tobias Marino2; Mário De Beni Arrigoni1; Danilo D.
Millen1; Rodrigo D. L. Pacheco1; Paulo Henrique Mazza Rodrigues2
1
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP) – Campus Botucatu – São Paulo
– SP – Brasil.
2
Universidade de São Paulo (USP) – Campus de Pirassununga – São Paulo –SP Brasil.
Introdução
Atualmente, com a intensificação dos sistemas de produção de bovinos, com o aumento da
densidade energética das dietas de confinamento de bovinos de corte [01][02] com o objetivo de se
obter respostas positivas em relação ao desempenho animal, qualidade de carcaça e facilidade de
manejo, tem se observado o aumento dos problemas de ordem digestiva como a acidose ruminal e o
timpanismo.
Surge, portanto, a necessidade de alternativas que visem melhorar o ambiente ruminal e, por
conseqüência, o desempenho animal. Assim, uma nova tecnologia em modificador de fermentação
ruminal contra populações específicas de bactérias ruminais causadoras de distúrbios metabólicos,
como a acidose, surge como ferramenta a mais à disposição dos nutricionistas. O objetivo deste
estudo foi de avaliar diferentes doses do PAP sobre os parâmetros de fermentação ruminal.
Material e Métodos
Este estudo foi realizado na FMVZ-USP, Campus de Pirassununga. Foram utilizadas oito
fêmeas bovinas, não gestantes e não lactantes, com peso vivo médio de 567,02 ± 103,7 kg, e
portadoras de cânula ruminal. O delineamento experimental foi o quadrado latino 4x4 replicado
duas vezes. Os tratamentos foram em número de quatro e estruturados de acordo com as diferentes
doses do PAP (T1: 0,0 g/animal/dia; T2: 1,5 g/animal/dia; T3: 3,0 g/animal/dia e T4: 4,5
g/animal/dia). O produto foi utilizado na forma em pó, administrado duas vezes ao dia, antes de
cada refeição, através da fístula ruminal. Cada período experimental foi constituído de 21 dias,
sendo quatro períodos experimentais, totalizando 84 dias de experimento.
Os alimentos foram oferecidos duas vezes ao dia as 0800 e 1600 horas, na forma de ração
completa, ad libitum. As dietas possuíam relação volumoso:concentrado de 27:73, nas quais a fonte
de volumoso empregada foi a cana-de-açúcar fresca e picada. As amostras de líquido ruminal foram
colhidas via fístula às 0, 2, 4, 6, 8, 10 e 12 horas após a refeição matinal do 21º dia. Imediatamente
após a colheita, 100 mL de fluido ruminal foram usados para a determinação do pH em
potenciomêtrico digital portátil. Logo em seguida, as amostras foram preparadas para a posterior
determinação da concentração total e proporção molar dos ácidos graxos de cadeia curta, bem como
nitrogênio amoniacal (N-NH3) e lactato ruminal.
Resultados e Discussão
Para os dados de pH não foi observado efeito de interação entre tempo e tratamento
(P=0,3513). Independentemente de tempo de amostragem também não foi observado efeito linear
ou quadrático dos níveis de administração do PAP sobre o pH ruminal. Também não foram
observadas interações, bem como efeitos significativos para os parâmetros de concentração total de
AGCC totais, N-NH3, bem como para as proporções molares de ácido acético, propiônico e butírico
(Tabela 01).
Tabela 1. Efeito dos diferentes níveis do PAP sobre os parâmetros de fermentação ruminal em
bovinos recebendo dieta de alto concentrado
Tratamentos
0,0
1,5
3,0
4,5
EPM
Probabilidades
Linea
r
Quad Desvio
6,03
103,0
0
6,14
6,13
0,03
0,2441
0,9310
0,0241
96,36
6,04
109,9
3
97,89
1,69
0,7572
0,4138
0,0017
Acetato, %Molar
Propionato,
%Molar
60,04
60,12
60,58
61,09
0,38
0,4313
0,7625
0,9299
26,14
26,40
27,02
24,91
0,42
0,7458
0,5106
0,4678
Butirato, %Molar
13,81
13,48
12,40
14,00
0,24
0,8987
0,3033
0,4107
Relação Ac:Pr
2,47
2,58
2,39
2,58
0,05
0,7020
0,6164
0,5217
N-NH3, mg/dL
10,04
9,24
8,12
10,20
0,49
0,8717
0,1235
0,3849
Variável
pH
AGCC Total, mM
Conclusões
Pode-se concluir que as diferentes doses do PAP não foram suficientes para alterar o
ambiente ruminal, sendo necessária a realização de mais testes que refutem ou não essa resposta.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer à FAPESP pela bolsa concedida, à UNESP – Botucatu e a USP –
Pirassununga por todo o apoio concedido durante a realização do presente estudo.
Agradecemos também a todas as pessoas envolvidas na elaboração, execução e finalização
deste trabalho.
Referências
[01]
EUROPA.
2003.
Regulation
(EC)
N°
1831/2003.
Disponível
em:
http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/site/en/oj/2003/l_268/l_26820031018en00290043.pdf
Acesso em 05 fev. 2006.
[02]
Fapri. 2005. World agricultural outlook. Iowa State University – University of Missouri
Columbia.
CEPAS DE E. coli ISOLADAS DE FRAGATAS (Fregata magnificens) DA COSTA
SUDESTE BRASILEIRA APRESENTAM FATORES DE VIRULÊNICAS QUE AS
CARACTERIZAM COMO POTENCIALMENTE ZOONÓTICAS
Saviolli, J. Y2; Catão-Dias, J. L.2; Osugui, L1; Carvalho, V. M.1
1. UNIP; LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR E CELULAR- ICS; Av. José Maria
Whitaker, 290- 04057-000- SP/SP- Brasil
2. USP; DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA- FMVZ; Av. Prof. Dr. Orlando Marques de Paiva,
87- 05508-900- SP/SP- Brasil
Introdução
Várias doenças humanas e animais são ocasionadas por cepas de Escherichia coli, algumas
delas com caráter zoonótico [1]. As aves migratórias podem desempenhar importante papel na
disseminação de bactérias patogênicas, pois podem ter contato direto com o homem, animais e
alimentos, em diferentes locais geográficos. Dentre as cepas patogênicas de E. coli que apresentam
potencial zoonótico, destacam-se as produtoras de toxina de Shiga e as APEC ("Avian pathogenic
E. coli") caracterizadas como E. coli patogênica extra-intestinal (ExPEC) [2] [3] [4]. O objetivo
deste estudo é pesquisar a ocorrência de Escherichia coli patogênica (STEC e APEC) em fragatas
(Fregata magnificens) da costa sudeste brasileira através da sua caracterização molecular.
Materiais e Métodos
Até o momento, o presente estudo foi realizado nos sítios de nidificação de fragatas do
litoral de São Paulo, a Ilha de Castilho, em Cananéia e Ilha principal do arquipélago dos Alcatrazes,
São Sebastião e do Rio de Janeiro, Ilha Jorge Greco em Angra dos Reis. Foram colhidos swabs de
cloaca e coana de 21 indivíduos aparentemente saudáveis, ocorrendo o isolamento e a identificação
bacteriana segundo método padronizado. Foram isoladas de três a sete cepas de E.coli de cada
amostra clínica e submetidas à reação de PCR pesquisando-se genes de virulência de STEC (stx1,
stx2 e eae), e EXPEC/APEC (papC, papEF, fimH, sfa, iha, iucD, fyuA, cnf1, hly, ibeA, tratT, cvaC
e malX). Todos os procedimentos de colheita foram autorizados pelo ICMBio (licença SISBIO
16553-1) e aprovados pela Comissão de Bioética da FMVZ-USP
Resultados
Considerando-se os 21 animais estudados, foi colhido um total de 42 swabs (21 de coana e
21 de cloaca). Houve crescimento bacteriano em 81% (34/42) das amostras clinicas estudadas,
sendo 38% (13/42) de coana e 62% (21/42) de cloaca. Isolou-se E.coli de 31% (4/13) da amostras
de coana positivas e 86% das (18/21) amostras de cloaca. Nos outros 35% (12/34) de amostras
foram isoladas diferentes enterobactérias. Uma vez que foram estudadas de três a sete cepas de
E.coli de cada amostra clinica, a pesquisa de marcadores de virulência ocorreu em um total de 64
cepas.
A seqüência fimH (fimbria do tipo 1) foi a de maior prevalência, sendo detectada em 94% (59/64)
dos isolados. As seqüências papC (fímbria P)e iucD (aerobactina) estiveram presentes em 13%
(8/64) das cepas. Os marcadores para yersiniabactina (fyuA) e para invasina (ibeA) foram detectados
em 44% (28/64) e 19%(12/64) dos isolados, respectivamente. Com relação ao marcador de
resistência ao soro, traT, 30%(19/64) dos isolados foram positivos. Já, a sequência relacionada ao
plasmídeo ColV (cvaC) esteve presente em 22% (14/64) das cepas. Finalmente, em 50% (32/64)
dos isolados foi detectado o gene malx, que caracteriza a ilha de patogenicidade de E. coli
uropatogênica,PAICFT073. Em apenas três (5%) isolados não foram detectados nenhum dos genes de
virulência pesquisados.
Em 48% das amostras houve associação de, no mínimo, três marcadores de virulência. Entre
os 61 isolados positivos para genes de virulência foram caracterizados 15 diferentes perfis, sendo o
mais frequente entre as cepas estudadas, a associação fimH, malX e fyuA, estando presente em 20%
dos isolados (Figura 1).
malX, fyuA, ibeA
fimH, traT
fimH, fyuA, traT, cvaC
fimH, fyuA
fimH, malX, fyuA, traT, cvaC, aer, papC
fimH, malX, ibeA, traT, cvaC, aer, papC
fimH, traT, cvaC
5%
fimH, malX, ibeA, traT, cvaC
10%
fimH, malX, ibeA
15%
fimH, malX
20%
fimH, malX, fyuA, ibeA, tratT, cvaC, aer,
papC
25%
fimH
30%
fimH, malX, fyuA, ibeA
fimH, malX, fyuA
35%
fimH, malX, fyuA, ibeA, traT, cvaC
Figura 1: Percentual de cepas de E. coli isoladas de cloaca e coana de fragatas (F. magnificens),
segundo os perfis de virulência apresentados
0%
Conclusão
Houve um percentual elevado de animais que albergavam amostras de E. coli com potencial
patogênico, embora aparentemente sadios. Na maioria dos animais, os isolados apresentaram
associação de genes de virulência. Até o momento não foram identificadas cepas de STEC nos
indivíduos pesquisados, por outro lado, os isolados albergam genes que caracterizam as ExPEC.
Tais resultados mostram que, além do potencial patogênico para as aves, estas cepas podem se
configurar como agentes zoonóticos, demonstrando a importância de se investigar a eventual
participação de aves migratórias na cadeia epidemiológica de doenças ocasionadas por E. coli.
Agradecimentos
Fundação de Amparo à Pesquisa – FAPESP (Processo 08/54338-4); Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPQ
Referências
[1] Carvalho, V. M., 2007. Colibacilose e Salmonelose. In: CUBAS, Z. SILVA, J. C. R., CATÃO
DIAS, J. L. São Paulo: Roca, Cap. 45, p. 742-750.
[2] Dho-Moulin M, Fairbrother, J. M., 1999. Avian pathogenic Escherichia coli (APEC). Vet Res,
30(2-3): 299-316
[3] Mainil, J., 1999. Shiga/verocytotoxins and Shiga/verotoxigenic Escherichia coli in animals. Vet
Res, 30(2-3): 235-257.
[4] Makino, S. & Asakura, H., et. al., 2000. Detection and characterization of Shiga toxinproducing Escherichia coli from seagulls. Epidemiol Infect, 125:55-61.
LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA: ALTERAÇÕES HISTOPATOLÓGICAS DE
ÓRGÃOS LINFÓIDES
Juliano Volpe Sacomori1; Celso Alberto Chassot1; Thaise Yumie Tomokane1; Mary Marcondes2;
Carlos Eduardo Pereira Corbett1; Márcia Dalastra Laurenti1
1
2
Laboratório de Patologia de Moléstias Infecciosas, Faculdade de Medicina da USP, São Paulo e
Clínica de Pequenos Animais, Curso de Medicina Veterinária da UNESP, Araçatuba (SP). e-mail:
[email protected]
Introdução
O cão doméstico é considerado o princiapal reservatório urbano da leishmaniose visceral. Sendo
assim, o Programa Nacional de Controle da Leishmaniose Visceral indica o sacrificio de animais
soropositivos. Porém, embora ainda muito controverso, há autores que sugerem a existência de
cães resistentes em área endêmica; uma vez que o contato com o parasito pode não levar ao
estabelecimento da patologia, mas conduzir ao desenvolvimento de imunidade humoral com a
produção de anticorpos.
Objetivo
Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as alterações histopatológicas
correlacionando com o parasitismo dos órgãos linfóides em cães naturalmente infectados por L.
(L.) chagasi.
Material e métodos
Fragmentos de baço e linfonodo poplíteo de 98 cães sacrificados pelo Centro de Controle de
Zoonoses do município de Araçatuba (SP), área endêmica para leishmaniose visceral, foram
colhidos. Os fragmentos foram fixados em formol 10% tamponado e processados pelas técnicas
usuais de microscopia óptica e pela técnica de imunoistoquimica para avaliação do parasitismo. De
acordo com a sintomatologia e a pesquisa de parasitos e/ou anticorpos, os cães foram divididos em
quatro grupos: sintomático 28,6% (28/98), oligossintomático 18,4% (18/98), assintomático 20,4%
(20/98) e negativo 32,6% (32/98).
Resultados
Na polpa branca do baço foi observada hiperplasia folicular que variou de discreta, moderada a
intensa; porém em alguns animais hipoplasia e até atrofia da polpa branca estavam presentes. As
alterações histológicas da polpa vermelha se caracterizaram por hipertrofia e hiperplasia de
macrófagos em caráter moderado a intenso com formas sugestivas de amastigotas de Leishmania
em 35 dos 98 casos estudados (35,7%). A presença de esboço granulomatoso assim como
granulomas epiteliódes bem formados com células gigantes foi evidente na maioria dos casos
(Figura 1).
Na área cortical e para-cortical dos linfonodos foi observada ativação folicular que variou de
discreta a moderada. Hiperplasia e hipertrofia de macrófagos na região medular estava presente,
variando de discreta, moderada a intensa; caracterizando em muitos casos, uma linfadenite
granulomatosa. Evidente plasmocitose também foi observada. A presença de formas amastigotas de
Leishmania em cortes histológicos do linfonodo corados pela técnica de imunoistoquímica foi
observada em 43 dos 98 casos estudados (43,9%) (Figura2).
A
B Figura 1 – A: Granuloma epitelióde com a presença de célula gigante ao centro em baço de cão
naturalmente infectado por L.(L.)chagasi (H&E – objetiva 20X). B: Parasitismo em baço de cão
naturalmente infectado por L.(L.)chagasi (ABC – objetiva 40X).
A B Figura 2 – A: Ativação folicular na área cortical e hiperplasia e hipertrofia de macrófagos em
linfonodo de cão naturalmente infectado por L.(L.)chagasi (H&E – objetiva 20X). B: Parasitismo
em linfonodo de cão naturalmente infectado por L.(L.)chagasi (ABC – objetiva 40X).
Conclusão
Uma vez que 66% dos animais estudos apresentaram lesão em baço e linfonodo e o parasitismo foi
confirmado em apenas 35,7% dos baços e 43,9% dos linfonodos, estudos adicionais precisam ser
feitos no sentido de aprimorar o diagnóstico parasitológico para melhor caracterizar a presença de
cães resistentes em área endêmica.
Agradecimentos
FAPESP, UNESP e LIM50 HC-FMUSP.
LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA: SUAS ALTERAÇÕES PATOLÓGICAS
1
Silva, M. V. M.1; Nogueira, J. L.1; PassoS, C. C.1
Departamento de Cirurgia – Setor de Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres - Faculdade
de Medicina Veterinária e Zootecnia - FMVZ/USP
Introdução
A Leishmaniose Visceral (LV) é uma zoonose podendo acometer o homem, quando este
entra em contato com o ciclo de transmissão do parasito, transformando-se em uma antropozoonose
[1].
O agente etiológico da LV é o protozoário do gênero Leishmania, da família
Trypanosomatidae, sendo a L. chagassi a espécie comumente isolada em pacientes com a
enfermidade [3]. Acomete os mamíferos, inclusive o homem, sendo que os cães atuam como
reservatório do parasita [3].
As alterações anatomopatológicas identificadas em animais infectados pela Leishmania
podem acometer vários órgãos, pois a enfermidade é sistêmica, com período de incubação variável,
mas geralmente prolongado [2].
O presente trabalho tem como objetivo relatar as principais alterações patológicas da
doença em animais infectados.
Material e métodos
Os dados obtidos são referentes à pesquisa e consulta ao tema por revisão bibliográfica em
artigos científicos, revistas especializadas e livros. Tal estudo justifica-se devido à relevância
mundial da doença, enfatizando as suas alterações patológicas que ocorrem nos animais infectados.
Resultados
A LV apresenta-se como importante doença parasitária em cães, em função das suas
características clínicas, transmissibilidade e potencial zoonótico [3].
A expressão morfológica da lesão macro e microscópica nos diversos órgãos está na
dependência da resposta imune do hospedeiro, associada à evolução da doença e sua amplitude [1].
Em relação à patogenia, a infecção dissemina-se para os linfonodos, o baço e a medula óssea
dentro das primeiras horas. As principais células responsáveis pela resposta imune à infecção são a
células Natural Killer (NK) [1,3].
O sistema hemolinfático é inicialmente acometido, porém as lesões mais notórias serão
percebidas em cães suscetíveis. Já nos resistentes, as alterações patológicas podem ser mais
discretas à macroscopia ou até mesmo imperceptíveis. O sistema linfático é caracterizado por
linfadenomegalia em mais de 90% dos casos, apresentando no início, aspecto exudativo evoluindo
para proliferativo-hiperplásico [2,4,5].
No baço observa-se a esplenomegalia. Nos casos sintomáticos e de evolução crônica,
apresenta-se consistência firme, cápsula espessa e rugosa, parênquima granular grosseiro. Em
outros casos, o órgão está aumentado de volume, cápsula tensa. Deixando transparecer a hiperplasia
de polpa branca como pontos brancacentos difusamente distribuídos e identificados na superfície de
corte do órgão [2,4].
O fígado é caracterizado por padrão lobular evidente, palidez extrema, consistência firme
ou nodulações de tamanhos variados, como conseqüência de processos degenerativos, anemias,
fibrose e da reação inflamatória crônica, respectivamente [4].
Devido à deposição de imunocomplexos circulantes que se depositam na membrana basal
glomerular, os rins apresentam algumas lesões. Incluem a glomerulonefrite mesangioproliferativa,
membranoproliferativa, glomeruloesclerose segmentar, espessamento e duplicação da parede dos
capilares glomerulares, às vezes ocorrendo deposição de amilóide nos glomérulos. No interstício e
ao redor dos glomérulos, predomina o infiltrado linfoplasmocitário. O parênquima renal apresentase com coloração pálida, superfície finamente granular e consistência firme [2,4].
As alterações pulmonares e cardíacas que ocorrem na LV são as de pneumonia intersticial
crônica, com infiltrado linfoplasmocitário e, ocasionalmente, macrófagos nos septos alveolares.
No sistema nervoso central, observa-se amastigotas no plexo coróide, em associação a
infiltrado linfoplasmocitário, além de macrófagos e células ependimárias parasitárias, através do
exame histopatológico do encéfalo [2].
Os achados laboratoriais caracterizam-se principalmente por alterações hematológicas como
a anemia, geralmente normocítica normocrômica, hiperglobulinemia, hipoalbuminemia,
hiperproteinemia, tromboctopenia, leucopenia associada à linfopenia ou leucocitose [6].
Os achados histopatológicos são, por vezes, inespecíficos e caracterizam-se por uma reação
inflamatória granulomatosa com presença de células mononucleares, reações estas comuns a várias
outras dermatoses. Quando há poucas formas amastigotas de Leishmania spp.. Nos tecidos, pode ser
difícil estabelecer-se o diagnóstico somente pela histopatologia [5].
Conclusão
Através deste estudo, percebe-se que a leishmaniose continua sendo um problema de saúde
pública e o cão vem atuando na difusão da doença. As alterações patológicas evidenciadas nos
animais infectados são de enorme valia para poder caracterizar a doença e discernir de outras
enfermidades.
Referências
[1] BRASIL, 2006. Ministério da Saúde. Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose
Visceral. Brasília: Ministério da Saúde, p. 120.
[2] FERER, L. M., 1999. Clinical aspects of canine leishmaniasis. Canine Leishmaniasis; an update.
Proceeding of the International Canine Leishmaniasis. Forum Barcelona-Spain, p. 6-10.
[3] GRIMA, M. Z. , 2005. Leishmaniosis canina panorama general de la enfermedad. Información
Veterinária. Revista Oficial del Consejo General de Colégios Veterinários de Espana, La
Leishmaniosis canina (parte I), p. 14-18.
[4] KEENAN, C. M. N.; HENDRICKS, L. D.; LIGHTNER, L.; JOHNSON, A. J., 1984. Visceral
leishmaniasis in the German shepherd dog. II. Pathology. Veterinary Pathology, v. 21, n. 1, p. 8086.
[5] MOREIRA, M. A. et al., 2007. Comparison of parasitological, immunological and molecular
methods of the diagnosis of leishmaniosis in dogs with different clinical signs. Veterinary
Parasitolog. v. 145, p. 245-52.
[6] MOURA, S. T. et al., 1999. Diagnóstico de leishmaniose canina na área urbana do município de
Cuibá, estado de Mato Grosso, Brasil. Braz J. Vet. Res. Anim. Sci. v. 36, n. 2, p. 123-126.
EFEITOS SISTÊMICOS DE ANTIINFLAMATÓRIOS ESTERÓIDES TÓPICOS:
AVALIAÇÃO DE PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS, IMUNOLÓGICOS,
ENDÓCRINOS E SOBRE O EDEMA INFLAMATÓRIO EXPERIMENTAL
Mattos, M.I.S; Latorre, A.O; Souza, F.N.; Ribeiro, A.; Ferraz de Paula, V.; Quinteiro-Filho, W.M.;
Mariano-Souza, D.P.; Caniceiro, B.D.; Costa-Pinto, F.A.
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, USP
Introdução
Uma grande proporção do uso de glicocorticóides na clínica veterinária é destinada a
combater a inflamação ou a alergia [1]. Corticosteróides administrados por via tópica são usados no
tratamento de doenças dermatológicas no homem e em outras espécies, determinando uma melhora
na inflamação cutânea. Embora o uso do esteróide tópico tenha como objetivo efeitos locais, a
absorção e conseqüentemente seus efeitos sistêmicos foram observados [2]. A hipersecreção do
córtex adrenal provoca uma condição patológica chamada de “Síndrome de Cushing” decorrente, na
maioria das vezes, a quantidades anormais de cortisol, embora a secreção excessiva de androgênios
também possa causar efeitos importantes [3]. Na prática clínica, a causa mais comum da síndrome
de Cushing é a administração exagerada de glicocorticóides.
O objetivo do trabalho é avaliar possíveis decorrências sistêmicas de um tratamento com
glicocorticóide tópico, através de exames hematológicos e bioquímica sérica; avaliação anátomo e
histopatológica das adrenais; resposta imunológica através de tecidos linfóides e lavado peritoneal.
Material e Métodos
Foram utilizados 10 animais (ratos, adultos e jovens) para o grupo controle com solução
salina injetável, IP, cada 12 horas, durante 7 dias; mais 10 animais para o grupo de Dexametasona
injetável, IP, cada 12 horas, durante 7 dias. No sétimo dia de tratamento, foi induzida uma
inflamação aguda (edema de pata) através da aplicação de carragenina por via intra-dérmica no
membro posterior esquerdo. Para o tratamento tópico, foi utilizado um veículo otológico (V), à base
de glicerina, como controle, e pomadas otológicas com os princípios ativos de hidrocortisona (H)
[10mg/20ml], betametasona (B) [122mg/20ml] e triancinolona (T) [1mg/20ml]; 10 animais foram
tratados com cada uma dessas substâncias, topicamente, por via auricular, durante 7, 14 e 21 dias, a
cada 12 horas; ao final do tratamento, foi induzido um processo inflamatório agudo, o edema de
pata, através da carragenina; no dia seguinte, os animais foram eutanasiados para a coleta de sangue
para hemograma completo e dosagem de corticosterona, fragmentos de baço e adrenais para
avaliação da atividade de neutrófilos por citometria de fluxo e amostras de fígado, rim, esterno,
linfonodos mesentéricos, timo para histopatológico.
Resultados
Na figura 1, observam-se as diferenças significativas da dosagem de corticosterona e pesos relativos
de baço e adrenais. Na figura 2, observam-se as diferenças do edema de pata.
Observou-se diferença de peso dos animais, no tratamento de 7 dias, VxH e VxB, P < 0,05; VxT e
HxB, P < 0,001; no tratamento de 14 dias, VxB, P < 0,001, VxT, P < 0,05 e HxB, P < 0,01; no
tratamento de 21 dias, VxB, P < 0,001, VxT e BxT, P < 0,01, HxB, P <0,001 e HxT, P <0,01.
Verificou-se diferença no hemograma completo após tratamento de 7 dias em: leucócitos, VxT e
HxT P<0,05; plaquetas, BxT, P<0,05; neutrófilos, BxT P<0,01; e nos monócitos, VxB P<0,05.
*
*
* **
200
0
g/100g pv
ng/ml
400
7d
14 d
**
**
0.2
0.08
0.04
0.00
7d
14 d
21d
Veículo
hidrocortisona
betametasona
triancinolona
***
***
**
0.4
0.0
21 d
0.12
g/100g pv
0.6
600
Peso relativo adrenais
Peso relativo do baço
Dosagem corticosterona
800
***
** *
**
**
7d
14 d
21d
Figura 1: Dosagem de corticosterona dos corticóides tópicos; VxH, no tratamento de 7 dias, * p<0,05; VxB, no
**
2.5
*
2.0
1.5
1.0
0
1
2
3
4
Tempo (h)
6
8
3.0
2.5
*
*
**
**
2.0
1.5
1.0
0
1
2
3
4
Tempo (h)
6
8
Volume do edema (ml)
3.0
Volume do edema (ml)
Volume do edema (ml)
tratamento de 7 dias, * p<0,05 e 21 dias, ** p<0,01; VxT, no tratamento de 7 dias, ** p<0,01 (ANOVA de duas vias
seguida de pós teste Bonferroni). Peso relativo do baço dos corticosteróides tópicos (Teste de múltiplas comparações
Dunnett’s); no tratamento de 7 dias, VxB, ** p<0,0001 e VxT, ** p<0,0001 ; no tratamento de 21 dias, VxB, **
p<0,0001. Peso relativo das adrenais dos corticosteróides tópicos (Teste de múltiplas comparações Dunnett’s); no
tratamento de 7 dias, VxB, ** p<0,0001 e VxT, ** p<0,0001; no tratamento de 14 dias, VxB, *** p<0,001; no
tratamento de 21 dias, VxH, ** p<0,001; VxB, * p<0,0001 e VxT, * p<0,05
3.0
2.5
2.0
***
*
**
*
**
*
*
0
1
2
3
4
Tempo (h)
*
**
* ***
**
Veículo
Hidrocortisona
Betametasona
Triancinolona
1.5
1.0
6
8
Figura 2: Edema de pata dos ratos; Tratamentos de 7, 14 e 21 dias. No tratamento de 7 dias, VxT, tempo 3, **
p<0,05 e VxB, tempo 8, * p<0,01; no tratamento de 14 dias, VxH, tempo 3, * p<0,05; HxB, tempo 2, * p<0,05 e tempo
4, ** p<0,01; HxT, tempo 8, ** p<0,01; no tratamento de 21 dias, VxB, nos tempos 0, 1,2,3 e 4, * p<0,001; no tempo 6,
** p<0,01 e no tempo 8, *** p<0,05; HxB, no tempo 0, ** p<0,01; nos tempos 1, 2, 3, 4 e 6, * p < 0,001 e no tempo 8,
*** p<0,05; BxT, no tempo 1, ** p<0,01; no tempo 3, *** p<0,05; nos tempos 4 e 6, * p<0,001; no tempo 8, p<0,01
Conclusão
Observou-se que ocorre uma diminuição na capacidade de fagocitose de macrófagos e
neutrófilos, influenciando assim a imunidade inata nestes animais; ocorreu também uma relativa
diminuição na intensidade dessa resposta, principalmente com triancinolona. Na indução do edema,
temos uma diferença, notada principalmente com a triancinolona. Sugere-se assim que tratamentos
tópicos com antiinflamatórios esteroidais possam gerar respostas sistêmicas, com possíveis
decorrências indesejáveis para os pacientes, tais como aquelas associadas à queda de resistência
inata às infecções.
Agradecimentos
Pela bolsa CAPES concedida; ao Ricardo Lazzarini por ensinar a técnica de edema de pata
e ao Fred meu orientador, pelas idéias, paciência e toda a ajuda.
Referências
[1] ADAMS, H.R. Farmacologia e Terapêutica em Veterinária. RJ: Guanabara Koogan. 2003.
[2] CHASTAIN, C.B. Uso de corticosteróides.In: ETTINGER, S.J. Tratado de medicina interna
veterinária. SP: Manole. 1992.
[3] GUYTON, A.C. Tratado de Fisiologia médica. RJ: Guanabara Koogan. 2002.
PROVENTRICULITE E VENTRICULITE EM ARARA-CANINDÉ (Ara ararauna,
Linnaeus, 1758): RELATO DE CASO CLÍNICO
Allegretti, L.1; Revolledo, L. 1; Guimarães, M. B.1, Sá, L. R. M.1, Kozu, F.2, Ferreira , A. J. P.1
1.
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
2.
Médico Veterinário autônomo.
Introdução
A arara é tida como um animal de estimação por possuir um alto grau de sociabilidade. Como
conseqüência desta popularidade, muitas são criadas em cativeiro e são representantes de uma das
famílias mais ameaçadas no mundo. As aves apresentam morfologia e fisiologia diferentes na
maioria dos aparelhos e sistemas quando comparadas com outros vertebrados [1]. A morfologia e
fisiologia do estômago das aves é única. Possuem dois compartimentos gástricos, o proventrículo e
o ventrículo. O proventrículo tem como função proporcionar a digestão química do alimento através
de suas enzimas gástricas, e o ventrículo, tem como função triturar o alimento [2]. Inúmeras
doenças podem afetar o proventrículo e ventrículo das aves, desde doenças virais à ingestão de
corpos estranhos, levando a lesões ulcerativas. As manifestações clínicas, geralmente são
inespecíficas, como regurgitação, perda de peso, anorexia ou polifagia, letargia, depressão, diarréia
com ou sem sangue e presença de fezes com alimentos não digeridos[3]. A determinação do
diagnóstico é difícil e baseia-se principalmente no histórico, nas manifestações clínicas, exames
radiográficos, endoscopia, culturas bacterianas e fúngicas, provas moleculares para detecção viral e
interpretação histopatológica de fragmento de biópsia. O tratamento pode variar de acordo com a
etiologia da doença. Este trabalho tem como objetivo apresentar um caso clínico de gastrite crônica
em uma arara-canindé (Ara ararauna).
Relato de Caso Clínico
Uma arara-canindé (Ara ararauna), de 25 anos de idade, foi encaminhada ao Ambulatório de Aves
da FMVZ-USP com queixa de emagrecimento (peso: 820g), prostração, melena e penas arrepiadas
há uma semana. Ao exame radiográfico simples não se observou nenhuma alteração digna de nota,
porém no exame radiográfico contrastado visualizou-se área de falha de preenchimento de
radiopacidade água homogênea, de contorno regular e formato ovalado, medindo aproximadamente
2,5 x 3,0 cm, junto à parede crânio-lateral direita do proventrículo. Esta imagem foi sugerida como
neoformação da parede do proventrículo. No exame hematológico notou-se anemia, leucocitose por
heterofilia acentuada e presença de heterófilos jovens na circulação sangüínea, sugerindo uma
possível infecção bacteriana. O exame coproparasitológico apresentou resultado negativo para
pesquisa de ovos leves e pesados de helmintos, oocistos de coccídea e para cistos de Giardia sp. A
coloração de gram das fezes acusou a presença de leveduras em brotamento duas cruzes (++-), 21%
de cocos gram-positivos, 61% de bacilos gram-positivos e 18% de bacilos gram-negativos. Como
tratamento administrou-se: alimentação forçada à base de papa de filhotes de psitacídeos ,
suplementada com aminoácidos e vitaminas , associada a antibioticoterapia (metronidazole 20
mg/kg/BID/ 7 dias e enrofloxacina 10 mg/kg/BID/7 dias).Foi realizada fluidoterapia com soro
ringer lactato por via subcutânea (30ml/kg). Com a melhora apenas parcial do quadro, realizou-se
exame endoscópico, onde observou-se importante espessamento, edema, eritema e regiões
enegrecidas compatíveis com necrose da mucosa do proventrículo. Eritema difuso, rarefação da
membrana de coelina e três pequenas formações arredondadas de coloração esbranquiçada na
mucosa do ventrículo, sugestivos de Candida sp. Biópsias das áreas lesionadas do proventrículo e
ventrículo foram realizadas e as amostras foram fixadas em formalina 10% e remitidas a
processamento rotineiro. As colorações solicitadas para o exame histopatológico foram: HE, PAS,
Gram e Ziehl-Nielsen. Pode-se observar a presença de fluido dentro da glândula proventricular
(Figura 1), não observou-se outra alteração nas glândulas proventriculares e o epitélio apresentou-se
normal apesar de ter-se observado um aumento de glândulas nesta região. Na figura 2 a lâmina
própria mostrou-se normal em relação à celularidade, porém observou-se a presença de espaços em
branco no tecido conjuntivo da submucosa demonstrando a presença de edema submucoso no
proventrículo e de infiltrado linfocítico focal na submucosa. Nenhuma alteração adicional
compatível com erosões ou úlceras foi identificada. Com os resultados obtidos, a ave ficou
internada. O tratamento realizado consistiu em : alimentação forçada a base de papa de filhote de
psitacídeos, amoxacilina associado com ácido clavulânico 125 mg/Kg – VO/BID/10 dias; nistatina
(100.000UI/kg – VO/BID/10 dias; ). O sucralfato (25 mg/Kg) era fornecido em jejum pela manhã,
durante 10 dias seguido por cimetidina 5 mg/Kg – VO/BID/30 dias. A ave apresentou melhora
parcial do quadro e há 8 meses vem mantendo a estabilidade de seu peso (880 gramas), porém com
quadros intermitentes de hiporexia. A inflamação da mucosa gástrica é, em muitos casos, crônica,
podendo ser de causa multifatorial, o que dificulta o diagnóstico preciso na ave, além disso, a
grande estima da proprietária pelo animal, os altos custos dos exames complementares dificultam
ainda mais a determinação do(s) agentes causador(es) desta patologia.
Figura 1. Glândula proventricular com presença de
fluido em seu interior (flecha). (PAS, 10X).
Figura 2
Mucosa proventricular intacta. Presença de
glândulas de estrutura normal. Edema na
lâmina própria. Infiltração linfocítica leve.
(PAS, 10X).
Conclusões
As manifestações clínicas presentes nos casos de proventriculite e ventriculite são inespecíficas; o
diagnóstico de proventriculite e ventriculite em aves é difícil e deve basear-se em um conjunto de
dados e exames complementares, como, hematologia, cultura bacteriana e fúngica, coloração de
Gram, radiografia e endoscopia; neste caso o uso da endoscopia para a avaliação do proventrículo e
do ventrículo mostrou-se uma ferramenta diagnóstica de grande utilidade, servindo como um exame
complementar ao exame radiográfico; o tratamento à base de sucralfato e cimetidina foi bastante
efetivo, apresentando um resultado satisfatório.
Referências
[1] Langlóis, I., 2003. The anatomy, physiology, and diseases of the avian proventriculus and
ventriculus. Vet. Clin. Exot. Anim. 6, 85-111.
[2] Furlan, R.L., 2000. Anatomia – Fisiologia. In: Berchieri – Jr., A., Macari, M. (Eds.), Doenças
das aves. FACTA, Campinas, pp. 15-28.
[3] Gelis, S., 2006. Evaluating and treating the gastrointestinal system. In: Harrison, G.J., Lightfoot,
T.I. (Eds.), Clinical Avian Medicine. Spix Publishing Inc., Florida, pp. 411-440.
COMUNICAÇÃO INTERCELULAR VIA CX43 APRESENTA UM IMPORTANTE PAPEL
NO CONTROLE E REGULAÇÃO DO PROCESSO FIBROGÊNICO HEPÁTICO
Cogliati B¹, Silva TC¹, Aloia TPA², Chaible LM¹, Real-Lima MA¹, Sanches DS¹, Matsuzaki P¹,
Hernandez-Blazquez FJ², Dagli MLZ¹.
¹Departamento de Patologia; ²Departamento de Cirurgia, Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, Brasil.
Introdução
A fibrose hepática resulta da perpetuação crônica da injúria celular, promovendo intensa
cicatrização tecidual, que envolve diversos mediadores e tipos celulares. A cirrose, o estágio mais
avançado da fibrose, é caracterizada por nódulos regenerativos circundados por septos fibrosos. O
acúmulo de matriz extracelular é causado, principalmente, pela ativação de fibroblastos portais e
células estreladas [2]. Estas células adquirem um fenótipo semelhante a miofibroblastos quando
ativadas e são conectadas entre si através de junções comunicantes do tipo Gap [3]. As junções Gap
são formadas por subunidades protéicas chamadas conexinas (Cx) e são responsáveis pelo fluxo
direto de moléculas e íons entre as células adjacentes e, assim, desempenham papel importante na
regulação da homeostasia tecidual [1]. Os fibroblastos portais e as células estreladas expressam
Cx43 quando ativadas [4], no entanto, a participação desta conexina nas doenças hepáticas crônicas
e sua correlação com o processo de fibrogênese hepática ainda não foi estabelecida. Assim, neste
estudo avaliamos a função da comunicação intercelular mediada pela Cx43 no desenvolvimento da
doença hepática crônica em camundongos knockout para esta proteína.
Materiais e Métodos
Devido a letalidade perinatal do camundongo knockout (Cx43-/-), neste trabalho foram utilizados
apenas os animais heterozigotos (Cx43+/-, n=10) e wild-type (Cx43+/+, n=10). A genotipagem foi
realizada pela análise do DNA por PCR. Para a indução da cirrose hepática, os camundongos
receberam 3 aplicações semanais de tetracloreto de carbono (CCl4) 10%, diluído em óleo de milho,
i.p., durante 2 meses. Após o sacrifício, foram analisados os dados biométricos dos animais e
amostras do tecido hepático e sangue foram colhidas para análises histopatológicas, ultra-estruturais
e bioquímicas. A morfometria do colágeno no parênquima hepático foi realizada pela mensuração
das fibras coradas pela técnica de picrossírius (Sirus Red). Foram realizadas dosagens bioquímicas
séricas de AST, ALT, albumina, fosfatase alcalina, proteína e bilirrubina totais. Foi analisada a
expressão gênica, por PCR em tempo real, de colágeno tipo I, fator de crescimento transformante
β1 (TGFβ-1), metaloproteinases 2 e 13 (MMP-2, MMP-13), ativador de plasminogênio tipo
uroquinase (uPA), inibidor tecidual das metaloproteinases 1 (TIMP-1) e α-actina de músculo liso
(α-SMA). A análise estatística utilizada para a comparação dos parâmetros quantificados foi análise
de variância seguida da aplicação do teste t-Student, adotando P<0,05.
Resultados
Os parâmetros biométricos não apresentaram diferença entre os animais cirróticos.
Macroscopicamente, os fígados dos animais Cx43+/- cirróticos apresentaram um processo de
micronodulação superficial mais acentuado, com comprometimento dos bordos e retração da
cápsula hepática mais grave (Fig. 1A-B). Estes resultados também foram observados na
microscopia eletrônica de varredura (Fig. 2A-C). A morfometria das fibras coradas pelo Sirius Red
demonstrou aumento de 66,8% na proporção volumétrica de colágeno no parênquima hepático dos
animais Cx43+/- em comparação com os animais wild-type cirróticos (Fig. 3). Os animais Cx43+/apresentaram redução de 23% na atividade necro-inflamatória, indicando menor intensidade e
freqüência das lesões hepáticas (Figs. 4). Os animais cirróticos Cx43+/- apresentaram redução de
26% na concentração sérica de AST e redução de 45,5% na concentração sérica de ALT em relação
aos animais cirróticos WT. Os animais Cx43+/- cirróticos apresentaram redução da expressão gênica
de colágeno tipo I, TGFβ-1, MMP-2, MMP-13, TIMP-1 em comparação com os animais wild-type
cirróticos. Não houve diferença na expressão gênica de uPA e α-SMA.
Conclusão
Pela primeira vez a função das conexina 43 foi avaliada no microambiente da cirrose hepática. No
processo de fibrogênese, o estroma deve ser remodelado por meio de lise da antiga matriz
extracelular (MEC) e síntese de uma nova matriz. Esta lise ocorre mediante ativação das
metaloproteinases (MMP) e são reguladas pelos inibidores teciduais das metaloproteinases
(TIMPs), sendo que o desequilíbrio entre os mecanismos de lise e síntese produz uma excessiva
deposição de colágeno nas doenças hepáticas crônicas [2]. Como não houve diferenças na expressão
gênica de α-SMA, podemos considerar que não existe alteração na ativação ou proliferação dos
miofibroblastos. Observamos ainda que todas as proteínas e enzimas produzidas pelos
miofibroblastos estavam com expressão gênica reduzida nos animais Cx43+/-, em especial a
metaloproteinases. Assim, inferimos que os animais deficientes em Cx43 apresentam uma maior
quantidade de colágeno no fígado devido sua menor capacidade de degradação da MEC: e não pela
maior produção e deposição de colágeno. Esses resultados indicam que a comunicação intercelular
reduzida produz um déficit na transmissão de moléculas sinalizadoras que estariam envolvidas na
regulação da síntese do colágeno nas células responsáveis pela produção, deposição, degradação e
remodelamento da MEC. Assim, os resultados obtidos neste trabalho demonstram a importante
participação da comunicação intercelular no controle da fibrose hepática.
Agradecimentos
Apoio Financeiro: FAPESP (Bolsa DD: 05/59583-9; Auxílio à Pesquisa: 06/56138-7).
Referências
[1] Evert, M., Ott, T., Temme, A., Willecke, K., Dombrowski, F., 2002. Morphology and
morphometric investigation of hepatocellular preneoplastic lesions and neoplasms in connexin32deficient mice. Carcinogenesis. 23, 697-703.
[2] Friedman S.L., 2008. Mechanisms of hepatic fibrogenesis. Gastroenterology. 134, 1655-1669.
[3] Guyot, C., Lepreux, S., Combe, C., Doudnikoff, E., Bioulac-Sage, P., Balabaud,
C.,Desmoulière, A., 2006. Hepatic fibrosis and cirrhosis: the (myo)fibroblastic cell subpopulations
involved. Int J Biochem Cell Biol. 38, 135-151.
[4] Vinken, M., Henkens, T., De Rop, E., Fraczek, J., Vanhaecke, T., Rogiers, V. 2008. Biology and
pathobiology of gap junctional channels in hepatocytes. Hepatology. 47, 1077-1088.
Fig. 1: (A) Wild-type; (B) Cx43+/-. Fig. 2:
Microscopia eletrônica de varredura. (A)
Animal normal; (B) Wild-type; (C) Cx43+/-.
Fig. 3: Colororação de picrossírius e
morfometria do colágeno. (B) Cx43+/-, (C)
Wild-type. Fig. 4: Análise histopatológica.
(A) Wild-type; (B) Cx43+/-. HematoxilinaEosina. Barra de escala = 20 μm.
TOXICIDADE DAS SEMENTES DE Senna occidentalis SOBRE A RESPOSTA IMUNE
NÃO ESPECÍFICA E SISTEMA HEMATOPOÉTICO DE RATOS RECÉMDESMAMADOS
Mariano-Souza, D.P.1; Paulino, C.A.2; Górniak, S.L1.
1 Departamento de Patologia – FMVZ-USP
2Universidade Bandeirante de São Paulo
Introdução
Os efeitos tóxicos da Senna occidentalis têm sido alvo de investigações pelo nosso grupo
desde 1993. Esta planta é o principal contaminante das culturas de cereais como o milho e a soja, e
não havendo a separação por densidade, esta pode vir a compor parte da ração destinada ao
consumo animal e humano, acarretando prejuízos econômicos e a saúde de seus consumidores [1].
Nos vários estudos conduzidos com a S. occidentalis nas diferentes espécies animais, verificou-se
que as alterações anatomopatológicas características da planta são: miopatia degenerativa da
musculatura esquelética e cardíaca, no músculo, estriado e cardíaco e também alterações hepáticas
[2]. Num destes trabalhos realizados por este grupo, verificou-se que os órgãos linfóides de frangos,
tratados com baixas concentrações de sementes de S. occidentalis (até 1%), apresentaram redução
nos diâmetros dos folículos e na densidade das regiões cortical e medular da bursa de Fabricius e
também redução da polpa branca do baço [3]. Com base nestes dados, um estudo subseqüente,
também realizado neste laboratório [4], indicou que da mesma maneira que ocorre em aves, em
mamíferos a S. occidentalis seria capaz de comprometer o sistema imunológico, já que foram
encontradas alterações no timo e baço de ratos adultos expostos à planta. Portanto, a presente
pesquisa visa dar continuidade aos estudos precedentes, avaliando agora o comprometimento do
sistema hematopoético e da resposta imune não específica, de ratos recém-desmamados tratados
durante 28 dias com a concentração de 4% de sementes de S. occidentalis.
Material e Métodos
Foram utilizados para os diferentes delineamentos experimentais 30 ratos machos Wistar,
recém-desmamados, alocados em dois grupos: 1 controle (0%) os quais receberam ração comercial
e 1 experimental que recebeu 4% de sementes de S. occidentalis (So4) incorporadas à ração
comercial. Existiu ainda um grupo denominado de peer-feeding (PF), os quais receberam a mesma
quantidade de ração consumida pelos ratos do grupo So4, entretanto livre de sementes da planta.
Durante os 28 dias do experimento avaliou-se o consumo de ração, o ganho de peso e os sinais
clínicos destes animais. No 29º dia procedeu-se a avaliação hematológica, do peso relativo do timo
e baço, da celularidade do baço e da medula óssea e foi realizado o estudo anatomopatológico
destes órgãos. O sangue destes animais também foi utilizado para os protocolos do burst oxidativo e
da fagocitose por neutrófilos.
Resultados
Após 28 dias de exposição, os resultados obtidos mostraram uma diminuição significante
nos parâmetros de consumo de ração e ganho de peso nos ratos do grupo So4. Na análise
hematológica verificou-se a ocorrência de anemia microcítica e hipocrômica, bem como diminuição
de neutrófilos na avaliação da extensão sanguínea nos animais So4. Na avaliação dos órgãos
linfóides observou-se redução o da celularidade da medula óssea e do peso relativo no timo dos
animais So4, por outro lado verifico-se um aumento no peso relativo do baço destes animais. Na
avaliação da resposta imune não especifica os ratos expostos às sementes da planta, apresentaram
redução do burst oxidativo e na porcentagem de fagocitose por neutrófilos. O estudo morfológico
do baço mostrou proliferação hematopoética extramedular e aumento de megacariócitos
multinucleados nos ratos do grupo So4.
Conclusão
Vários estudos, particularmente em organismos jovens, tanto em humanos [5], quanto em
animais [6] vêm demonstrando que as ações tóxicas promovidas pelos xenobióticos durante as fases
de proliferação e diferenciação de células imunocompetentes, comprometem o funcionamento do
sistema imune. De fato, a presente pesquisa revelou haver o comprometimento do sistema
hematopoético e na resposta imune não específica de ratos expostos a So4 durante 28 dias. Por
outro lado, os dados obtidos nos estudos anteriores utilizando ratos adultos tratados com So4, este
tipo de toxicidade não foi observada. Assim, os resultados obtidos e aqui apresentados permitem
sugerir que há maior vulnerabilidade do tecido hematopoiético e da resposta imune não específica
aos efeitos tóxicos da planta nos ratos recém-desmamados. Ressalta-se ainda que a inclusão de um
grupo de animais PF neste tipo de protocolo experimental contribui de forma evidente para
diferenciar as desordens nutricionais daquelas promovidas por toxicantes, em estudos desta
natureza. Assim sendo, uma importante sugestão, oriunda desta pesquisa, é a inclusão de um grupo
PF naqueles protocolos de imunotoxicidade propostos pelas principais agências regulamentadoras
de avaliação de risco.
Agradecimentos
Ao Departamento de Patologia da FMVZ-USP e a CAPES pelo apoio financeiro.
Referências
[1] Lorenzi, H., 1991. Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas, tóxicas e
medicinais. Nova Odessa: Plantarum.
[2] Barbosa-Ferreira, M.; Dagli, M. L.; Maiorka, P. C.; Gorniak, S. L., 2005. Sub-acute intoxication
by Senna occidentalis seeds in rats. Food and Chem Toxicol. 43, 497-503.
[3] Silva, T. C.; Górniak, S. L.; Oloris, S. C. S.; Raspantini, P. C.; Haraguchi, M.; Dagli, M. L. Z.,
2003. Effects of Senna occidentalis on chick bursa of Fabricius. Avian Pathol. 32, 633-637.
[4] Mariano-Souza, D. P., 2005. Avaliação dos efeitos tóxicos da Senna occidentalis em ratos.
Parâmetros bioquímicos, hematológicos, anatomopatológicos e inflamatórios. São Paulo. 2005.
159 f. Dissertação (Mestrado em Ciências). Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, São Paulo.
[5] Pestka, J. J., 2008. Mechanisms of deoxynivalenol-induced gene expression and apoptosis.
Food Addit Contam Part A Chem Anal Control Expo Risk Assess. 25, 1128-1140.
[6] Ortiz, R.; Cortés, L.; Cortés, E.; Medina, H., 2009. Malnutrition alters the rates of apoptosis in
splenocytes and thymocyte subpopulations of rats. Clin Exp Immunol. v. 155, 96-106.
POSSÍVEL PAPEL NEUROPROTETOR DO AGONISTA CANABINÓIDE
METANANDAMIDA EM CULTURA PRIMÁRIA DE CÉLULAS EXPOSTAS AO
NMDA
Chaves GP, Torrão AS
Departamento de Fisiologia e Biofísica, Instituto de Ciências Biomédicas - USP, São Paulo,
Brasil
Introdução
O sistema canabinóide endógeno é constituído pelos neuromediadores canabinóides, seus
receptores (CB1 e CB2) e suas enzimas de síntese e degradação [1]. Este sistema parece exercer um
papel modulador em vários processos neurobiológicos, como processos de neuroproteção e
plasticidade neural, entre outros [2,3]. Estudos recentes apontam ainda propriedades
neuroprotetoras do sistema canabinóide em diversos modelos de neurotoxicidade, incluindo
trabalhos em cultura de células e a utilização de canabinóides sintéticos [4,5].
O objetivo desse trabalho foi o de avaliar os efeitos do pré-tratamento com agonistas e
antagonistas canabinóides em um modelo de cultura de células de tecto óptico de embriões de
pintos (Gallus gallus) expostas ao N-Metil-D-Aspartato (NMDA).
Material e Métodos
Embriões de oito dias foram sacrificados por decapitação. Os tectos ópticos passaram por
dissociações mecânicas e enzimáticas e as células dissociadas foram cultivadas. Passados dois dias
de cultivo as células foram pré-tratadas com metanandamida 1µM e AM 251 1µM (agonista e
antagonista canabinóides, respectivamente) e expostas ao NMDA 100µM. Após 24 horas as
culturas foram avaliadas quanto à fragmentação do DNA e viabilidade celular por citometria de
fluxo e quanto à morfologia por imuno-citoquímica utilizando os anticorpos PAN (neurofilamentos
– marcador de axônios), MAP-2 (proteína associada a microtúbulos – marcador de dendritos) e
GFAP (proteína glial – marcador de astrócitos).
Resultados
A análise estatística por ANOVA (uma via) com pós-teste de Tukey mostra que o NMDA
aumentou os números de células com o DNA fragmentado (34%, n=4, p<0.001 em relação ao
controle) e de células inviáveis (23%, n=4, p<0.001 em relação ao controle). O pré-tratamento com
metanandamida parece reverter os efeitos do NMDA em ambos os processos. Na análise de
fragmentação do DNA este grupo apresentou 22% a mais de células com o DNA íntegro (n=4,
p<0.01 em relação ao NMDA), e na análise da viabilidade celular, 19% a mais de células viáveis
(n=4, p<0.001 em relação ao NMDA). O efeito obtido com a metanandamida parece ser via CB1
para a viabilidade celular, já que o tratamento conjugado com o antagonista específico do CB1 (AM
251) reverteu esse efeito (Figuras 1). Entretanto para a fragmentação do DNA, o efeito obtido com a
metanandamida parece ser parcialmente via CB1, pois o tratamento conjugado com AM 251 não
reverteu totalmente esse efeito. obtido com a metanandamida (Figura 2). Nossos resultados de
imuno-citoquímica não mostram alterações morfológicas nas células em nenhum dos tratamentos.
Conclusão
Nossos resultados sugerem um possível efeito neuroprotetor do agonista canabinóide,
metanandamida, em resposta aos efeitos tóxicos do NMDA. Este efeito neuroprotetor parece ser
via CB1 para a análise de viabilidade celular e parcialmente via CB1 para análise de fragmentação
do DNA. O tratamento com agentes canabinóides e NMDA não altera morfologicamente as células.
Agradecimentos
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro
(processo: 05/57485-0) e ao Departamento de Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências
Biomédicas, Universidade de São Paulo, onde este trabalho foi realizado.
Figura 1: Resultados da fragmentação do DNA, analisada por citometria de fluxo, em cultura
primária de células do tecto óptico de embriões de pintos, pré-tratadas com agentes canabinóides e
expostas ao NMDA. Análise estatística primária de por ANOVA (uma via) com pós-teste de Tukey.
Estatisticamente significante em relação ao controle (a) e ao NMDA (b). (* p< 0,05; ** p<0,01 e
***p>0,001, referente ao valor absoluto).
Figura 2: Resultados da viabilidade celular, analisada por citometria de fluxo, em cultura primária
de células do tecto óptico de embriões de pintos, pré-tratadas com agentes canabinóides e expostas
ao NMDA. Análise estatística por ANOVA (uma via) com pós-teste de Tukey. Estatisticamente
significante em relação ao controle (a), ao NMDA (b) e metanandamida + NMDA (c ). (* p< 0,05;
** p<0,01 e ***p>0,001, referente ao valor absoluto).
Referências
[1] DE PETROCELLIS, L.; CASCIO, M.G.; DI MARZO, V. The endocannabinoid system: a
general view and latest additions. Br. J. Pharmacol., v. 141, p. 765-774, 2004.
[2] DI MARZO, V.; MELCK, D.; BISOGNO, T; DE PETROCELLIS, L. ocannabinoids:
endogenous cannabinoid receptor ligands with neuromodulatory action. L.Trends Neurosci., v. 21,
p. 521-528, 1998.
[3] HASHIMOTODAN,I Y.; OHNO-SHOSAKU, T.; KANO, M. Endocannabinoids and Synaptic
Function in the CNS. Neurocientist, v. 13, p. 127-137, 2007.
[4] KIM, S.H.; WON, S.J.; MAO, X.O.; JIN, K.; GREENBERG D.A. Involvement of protein
kinase A in cannabinoid receptor-mediated protection from oxidative neuronal injury. J. Pharmacol.
Exp. Ther., v. 313, p. 88-94, 2005.
[5] VAN DER STELT, M.; VELDHUIS, W.B.; VAN HAAFTEN, G.W,; FEZZA, F.; BISOGNO,
T.; BAR, P.R.; VELDINK, G.A.; VLIEGENTHART, J.F.; DI MARZO, V.; NICOLAY, K.
Exogenous anandamide protects rat brain against acute neuronal injury in vivo. J. Neurosci., v. 21,
p. 8765-8771, 2001.
AVALIAÇÃO DOS EFEITOS TÓXICOS DA MIMOSINA SOBRE O SISTEMA IMUNE DE
CAMUNDONGOS
1
Cunha L. C. 1; Ameni A.1; Moreira B. M.1, Elias F. 1; Pípole F.1; Haraguchi M.2; Górniak S. L.1
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São
Paulo, São Paulo/SP – Brasil, 2Instituto Biológico, São Paulo/SP – Brasil.
Introdução
Mimosina é um aminoácido não protéico encontrado nas folhas e sementes de Leucaena
leucocephala. Esta planta é uma leguminosa originária do México, sendo encontrada em toda a
região tropical e dispersa para outras partes do mundo devido sua versatilidade de utilização [1]. É
uma planta altamente nutritiva, palatável e de boa digestibilidade, mas sua utilização como
forrageira tem sido limitada devido seus efeitos tóxicos. A mimosina é conhecida como um agente
anti-mitótico, pois pode bloquear especificamente e reversivelmente a fase G1 do ciclo celular [1].
Também possui efeito depilatório e bociogênico em ruminantes. Também é relatado que mimosina
causa apoptose via ativação mitocondrial e produção de espécies reativas de oxigênio. Trabalhos
recentes sugerem a aplicação da mimosina como agente antitumoral em camundongos [2]. Porém é
necessário avaliar se as doses empregadas não causam efeitos deletérios ao animal.
Assim, o objetivo principal do presente trabalho foi verificar os efeitos da minosina sobre o
sistema imune de camundongos machos.
Metodologia
Foram utilizados 25 camundongos machos da linhagem Swiss, com aproximadamente 50
dias de idade, divididos em quatro grupos, sendo um controle e três experimentais que receberam
mimosina nas doses de 10, 50, 100 mg/kg via gavage durante 15 dias, o grupo controle recebeu
água pela mesma via e período. Ao final do período de tratamento, os animais foram submetidos à
eutanásia e amostras do baço, timo foram coletadas para avaliação do peso relativo e
histopatológica, também foi avaliado a celularidade de medula óssea, hemograma, e
linfoproliferação através do teste do MTT. Para análise dos dados foi utilizado o programa
estatístico GraphPad Prism 4.00® (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Para dados
paramétricos, realizou-se a análise de variância ANOVA seguida do teste de Dunnett para
comparação dos grupos experimentais com o grupo controle. Foram consideradas significativas as
análises que apresentaram nível de significância p<0,05.
Resultados
Não foi observado alterações em nenhum dos parâmetros avaliados.
Conclusões
É provável que as doses ou período utilizados neste estudo não foram capazes de promover
alterações significativas sobre o sistema imune dos animais, porém é impossível afirmar que doses
ou períodos maiores do que estes empregados neste estudo sejam capazes de promover alterações
sobre o sistema imune. Assim, futuros experimentos serão conduzidos em nosso laboratório para
melhor compreensão desta toxicose.
Agradecimentos
CAPES
Referências
[1] ALMEIDA, A.P.M.G de ; KOMMERS, G ; NOGUEIRA, A. P. A. ; BUSSINATI JUNIOR, L.
G. ; BRENDA, M F P ; LEMOS, R. A. A. 2006. Avaliação do Efeito Tóxico de Leucaena
leucocephala (Leg.Mimosoideae) em ovinos. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 26, p. 190-194
[2] DIPE, V. V. ; GOTARDO, A. T. ; BLIND, L. Z. ; TIKUMA, M. ; HARAGUCHI, M. ;
GÓRNIAK, S.L. 2009,. Can mimosine be used for anti-tumoral therapy?. In: 8th International
Symposium on Poisonous Plants, João Pessoa - PB. 8th International Symposium on Poisonous
Plants - Program and abstracts.
AVALIAÇÃO DO PAPEL DO ÓXIDO NÍTRICO NO EFEITO ANTI-INFLAMATÓRIO DA
AMITRIPTILINA
Vismari, L1, Alves, G.J.1, Pinheiro, M.L.1, Sakai, M1, Muscará, M.N.2, Palermo-Neto, J. 1
1 Grupo de Pesquisa em Neuroimunomodulação, FMVZ-USP; 2 Depto de Farmacologia, ICB-USP
Introdução e Objetivos
Os inúmeros estudos baseados na Teoria Monoaminérgica da depressão ainda não encontraram a
explicação definitiva e satisfatória para uma série de questões a respeito deste transtorno [5]. Esta
realidade levou a uma nova teoria, que implica a depressão como um fenômeno neuroimunológico,
com perfil pró-inflamatório [4]. Apoiando esta hipótese, diversos estudos têm demonstrado um
efeito anti-inflamatório para diversos fármacos antidepressivos, dentre eles a amitriptilina,
originalmente utilizada como antidepressivo, cujos mecanismos envolvidos ainda não foram
elucidados [1,2]. O óxido nítrico (NO), por sua vez, além de seu importante papel nos processos
inflamatórios, tem sido implicado na fisiopatologia dos transtornos depressivos [3]. Diante destas
informações, o objetivo do presente estudo é avaliar a participação do óxido nítrico no efeito antiinflamatório da amitriptlina.
Material e métodos
Num primeiro momento, a influência da inibição da síntese de óxido nítrico sobre a ação antiinflamatória da amitriptilina foi testada no modelo do edema de pata induzido por carragenina.
Neste experimento, ratos Wistar foram pré-tratados com um inibidor inespecífico da síntese de
óxido nítrico (L-NAME, 50 mg/kg, i.p.) ou um precursor da síntese de óxido nítrico (L-arginina,
300 mg/kg, i.p.) ou seus veículos e após 1 hora receberam amitriptilina 10mg/kg ou NaCl 0,9%.
Após 1h, os animais foram injetados com carragenina 1% no coxim plantar, sendo o volume da pata
avaliado em diferentes horários por um plestismógrafo. Num segundo momento, efetuou-se
protocolo de tratamento semelhante ao experimento anterior e, três horas após a injeção
intraperitoneal de carragenina (500µg/cavidade em 2mL de Ringer) foram coletados o exsudato
peritoneal, para análise de volume e concentração de leucócitos, e o sangue periférico, para
avaliação da expressão das moléculas de adesão por citometria de fluxo. Em um terceiro
experimento, foram avaliados os níveis de nitratos no soro de ratos em condições não-inflamatórias.
Resultados
A co-administração de amitriptilina e L-NAME levou a uma potencialização do efeito antiinflamatório avaliado pelo modelo do edema de pata (p<0,05; figura 1A), a uma redução
significante na concentração de leucócitos (Kw=16,528, p<0,05) e no número total de leucócitos do
exsudato peritoneal induzido por carragenina (F3,25=11,385; p<0,05- figuras 2A e 2B,
respectivamente) e a uma redução significante do total de nitratos circulantes (F3,18=4,99; p<0,01 figura 3), quando comparados aos animais controle. Este efeito anti-inflamatório avaliado pelo
edema de pata não foi revertido pela administração de um precursor da síntese de NO (figura 1B). O
tratamento com amitriptilina ou L-NAME isoladamente ou em conjunto não produziram alterações
significantes na expressão das moléculas de adesão ICAM-1, PECAM-1, L-selectina e MAC-1 por
leucócitos do sangue periférico (p>0,05).
Conclusão
Podemos assim concluir que a amitriptilina apresentou um efeito anti-inflamatório na maioria dos
modelos avaliados. Os mecanismos parecem envolver a participação do óxido nítrico,
provavelmente pela inibição da cNOS e iNOS, com consequente redução na síntese de NO e das
ações pró-inflamatórias a ele associadas. Considerando-se a teoria que implica a depressão como
um fenômeno inflamatório, a compreensão do mecanismo envolvido no efeito anti-inflamatório da
amitriptilina poderia contribuir nas investigações envolvendo esta teoria.
control
1,40
1,00
control
*
L-NAME
L-NAME-ami
0,80
0,60
A
0,40
0,20
*
*
*
*
2
3
4
6
*
8
ami
1,20
ami
volume do edema (mL)
*
*
1,20
volume do edema (mL)
*
*
l-arg
l-arg-ami
1,00
*
0,80
0,60
0,40
*
0,20
0,00
*
*
*
*
*
4
6
B
0,00
1
1
2
3
8
tempo apos carragenina (h)
tem po após carragenina (h)
Figura 1 – Influência do pré-tratamento com um inibidor de síntese de NO (L-NAME) (A) ou um
precursor da síntese de NO (L-arginina)(B) nos efeitos da amitriptilina no edema de pata induzido
pela carragenina. Resultados referem-se às diferenças em relação ao volume basal (média ± desvio
padrão; * p<0,05 comparado ao grupo controle)
A
1600
núm ero total de leucócitos
número de leucócitos/mL
1200
1000
*
800
B
6000
1400
*
600
400
200
5000
4000
3000
*
2000
1000
0
0
control
am i
L-NAME
L-NAME-AMI
control
ami
L-NAME
L-NAME-AMI
Figura 2. Efeitos do pré-tratamento com L-NAME nas ações da amitriptilina sobre o exsudato
inflamatório peritoneal. A-concentração de leucócitos (number/mL); B- número total de leucócitos.
(média ± desvio-padrão; *p<0,05 comparado ao grupo controle)
80
total de nitratos (µM)
70
60
50
40
*
30
20
10
0
controle
amitriptilina
L-NAME
L-NAMEamitriptilina
Figura 3- Influência da administração de amitriptilina e L-NAME na produção de nitratos (média ±
desvio-padrão; *p<0,05 comparado ao grupo controle)
Agradecimentos
FAPESP processo no. O4/14128-0, CNPq processo no. 472083/2007-4 e 301177/2007-4, Cristália
Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda, e em especial, ao Departamento de Patologia da FMVZUSP.
Referências
[1] Abdel-Salam OM, Nofal SM, El-Shenawy SM. 2003. Evaluation of the anti-inflammatory and
anti-nociceptive effects of different antidepressants in the rat. Pharmacol Res. 48(2), 157-65.
[2] Achar, E.; Maciel, T. T., et al. 2009. Amitriptyline attenuates interstitial inflammation and
ameliorates the progression of renal fibrosis. Kidney Int. 75(6), 596-604.
[3] Oliveira, R.M.W.; Guimarães, F.S.; Deakin, J.F.W. 2008. Expression of neuronal nitric oxide
synthase in the hippocampal formation in affective disorders. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research. 41, 333-341.
[4] Smith RS. 1991. The macrophage theory of depression. Med Hypotheses. 35(4), 298-306.
[5] Stahl SM. 1997.Psychopharmacology of antidepressants. Martin Dunitz, London.
FRAÇÃO DE BAIXO PESO MOLECULAR LIBERADA/EXCRETADA DE Leishmania
(Viannia) shawi INDUZ PROTEÇÃO NA LEISHMANIOSE CUTÂNEA MURINA
ASSOCIADA A RESPOSTA Th-1
1*
Luiz FD Passero ; Cláudia Marques2, Inês V Gato2, Carlos EP Corbett1, Márcia D Laurenti1,
Gabriela Santos-Gomes2
1
2
Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo – Brasil
Unidade de Leishmanioses, CMDT-LA, Instituto de Higiene e Medicina Tropical, Universidade
Nova de Lisboa – Portugal
*[email protected]
Introdução: L. (V.) shawi pode ser uma importante fonte de antígeno para desenvolvimento de
vacinas contra Leishmaniose Tegumentar Americana, pois alguns relatos indicam que seus
antígenos mostram imunogenicidade e reações cruzadas com outras espécies de leishmanias. Assim,
o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito protetor de uma fração de baixo peso molecular isolada
de formas promastigotas de L. (V.) shawi.
Materiais e Métodos: Formas promastigotas foram lavadas 3 vezes em tampão fosfato (PBS), e
cerca de 109 promastigotas foram cultivadas em meio RPMI sem fonte de soro fetal bovino por 24h,
quando o sobrenadante foi coletado e concentrado usando centricons. A fração de baixo peso
molecular (LsPass3) foi isolada através de eletroeluição. Com esta fração, 30 camundongos
BALB/c foram imunizados duas vezes subcutaneamente no dorso, com 25μg de antígeno ou PBS
semanalmente. Após 7 dias, estes animais foram desafiados com 106 parasitos/pata ou PBS. Após 5
semanas, os animais foram sacrificados, e análise da carga parasitária da pele foi feita através de
diluição limitante. Linfonodos poplíteos foram coletados para purificação de células T CD4+,
CD8+ e duplo negativas (dn) CD4CD8 através de microbeads. Após purificação e contagem, o
RNA foi extraído e transcrito reversamente para cDNA. A expressão de IFN-γ, IL-4 e IL-10 foi
quantificada usando PCR em tempo real.
Resultados: A fração de baixo peso molecular induziu a redução do tamanho de lesão (Figura 1A),
associada com 93% de redução da carga parasitária na pele (Figura 1B). Esta proteção esteve
associada a aumento da expressão de IFN-γ pelas células T CD4+ e dnCD4CD8, diminuição da
expressão de IL-4 pelas células TCD8+ e IL-10 pelas células T CD4+ e CD8+ (Figura 2).
A
B
Figura 1 – Evolução do tamanho da lesão em animais infectados e imunizados com LsPass3 (A).
Análise da carga parasitária nos grupos infectados e imunizados com a fração LsPass3 (B).
Figura 2 – Análise da expressão de citocinas em células T CD4+ (A), CD8+ (B) e dnCD4CD8 (C)
dos animais infectados e imunizados com a fração LsPass3.
Conclusão
A fração de baixo peso molecular liberada/excretada pelas formas promastigotas de L. (V.)
shawi gerou proteção em modelo murino de leishmaniose cutânea. Esta proteção esteve associada à
alta expressão de células T CD4+Th1 e também a células dnCD4CD8, que consistem basicamente
de células dendrítcas, polimorfonucleares, macrófagos e células B. Além disto, este tipo de
imunização casou diminuição dos níveis de citocinas Th2, o que pode estar correlacionado com o
alto grau de proteção. Estudos com proteínas liberadas de formas promastigotas podem ser
importantes fontes para o desenvolvimento de vacinas eficientes.
Agradecimentos: os autores deste trabalho agradecem o auxílio financeiro das seguintes
instituições: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, LIM50-HCFMUSP,
Portuguese FCT e PTDC/FEDER (PTDC/CVT/70275/2006).
ESTABELECIMENTO DE MODELO XENOTRANSPLANTÁVEL DE MASTOCITOMA
CANINO EM CAMUNDONGOS ATÍMICOS PARA ESTUDO DE ANTINEOPLÁSICOS
Nagamine MK1, Pinello KC, Sanches DS1, Dagli MLZ1
1
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia/USP
Introdução
O mastocitoma ou tumor de mastócitos é uma das formas mais frequentes de câncer de pele
encontrado em cães correspondendo de 7 a 21% do total dos tumores de pele [2]. O comportamento
biológico do mastocitoma é amplamente variável. Alguns tumores têm comportamento benigno,
enquanto outros exibem um crescimento agressivo e se metastatizam [1]. Existe uma limitação no
tratamento oncológico para animais, por isso a importância dos modelos experimentais para estudos
de novas alternativas para o tratamento do câncer e para o entendimento do comportamento
biológico destes tumores.
Este estudo visa o estabelecimento e caracterização de modelo animal para o mastocitoma
canino para testes futuros de substâncias potencialmente terapêuticas.
Material e Métodos
Obtenção do mastocitoma canino – O animal doador foi uma cadela sem raça definida, 12
anos, apresentando formação neoplásica com 12 cm de diâmetro em membro posterior esquerdo.
Após procedimento cirúrgico realizado no Hospital Veterinário (HOVET) da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia/USP, fragmentos do tumor foram processados em condições
assépticas para obtenção de suspensão celular que foi inoculado em camundongos atímicos nudes
BALB/c nu/nu (0,5-1 x 107 células/animal em subcutâneo).
Passagens em camundongos e cultivo celular – Cada animal com crescimento tumoral
positivo foi eutanasiado quando o tumor atingiu um volume maior que 100 mm3. O tumor foi
fragmentado em pedaços de 1-2 mm e colocado em garrafas para cultivo celular em estufa de CO2
a 37ºC, para liberação das células (meio DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino e
antibióticos/antimicótico). Após diferentes períodos de cultivo celular (1 a 60 dias), as células
foram inoculadas (0,06-2 x 107 células/animal) por via subcutânea em região cervical dorsal ou
intraperitoneal. Os animais foram observados semanalmente para o crescimento tumoral. Alguns
animais foram acompanhados até seis meses após a inoculação. Foram obtidas lâminas em
hematoxilina-eosina para exame histopatológico e lâminas coradas em azul de toluidina para
evidenciação de grânulos metacromáticos dos mastócitos. O cultivo celular foi mantido até a
evidenciação de sua degeneração.
Resultados
O mastocitoma está em sua 12ª passagem nos camundongos atímicos. A avaliação
histopatológica do tumor do cão doador e dos animais inoculados revela semelhanças no padrão
histológico. De uma maneira geral, a análise dos tumores inoculados mostra uma formação
neoplásica de células redondas com discreto pleomorfismo celular, com arranjo difuso, quantidade
discreta a moderada de vasos e discreta de fibroblastos. Existe recrutamento de eosinófilos em
quantidade discreta. Notam-se mitoses, algumas atipícas. A coloração azul de toluidina mostra
quantidade discreta a moderada de grânulos intracitoplasmáticos.
A taxa de implantação do tumor nos camundongos é alta, quase 100%. A quantidade de células
inoculadas influencia na velocidade do aparecimento das lesões, que é aproximadamente 3 semanas
após a inoculação das células. Com 8 semanas obtêm-se lesões de 1-1,5cm de extensão no eixo
maior em animais inoculados no subcutâneo. O tumor apresenta comportamento invasivo para
tecido adjacente (musculatura). Não há evidências da ocorrência de metástases, mesmo nos animais
que permaneceram com o tumor por 6 meses. Em animais inoculados intraperitonealmente não se
observa ascite, ao contrário, há crescimento de tumor sólido em cavidade abdominal, ocorrendo
também colonização e invasão dos órgãos abdominais.
As células de mastocitoma em cultivo celular permanecem viáveis por cerca de um mês,
porém ocorre perda gradativa das características como granulação e aumento de células aderentes.
A inoculação de animais com células com 2 meses de cultura não produziu tumores, sendo mais
adequada a inoculação com cerca de 10 dias em cultura.
Conclusões
O modelo tem se mostrado semelhante ao tumor original e estável ao longo das passagens
nos camundongos, com crescimento lento, invasivo, porém não metastático.
A inoculação intraperitoneal de células de mastocitoma produz tumor sólido, com
colonização e invasão de órgãos abdominais.
As células em cultivo celular permanecem viáveis por cerca de um mês, com perda
gradativa de suas características.
Agradecimentos
Apoio financeiro CNPq (processo: 870246/1997-6).
Referências
[1] Dahm RL, Latimer KS. Mast cell disease in dogs and cats: an overview. Disponível em:
http://www.vet.uga.edu/vpp/clerk/dahm/index.php. Acesso em 2006.
[2] Preziosi R, Morini M, Sarli G, 2004. Expression of the KIT protein (CD117) in primary
cutaneous mast cell tumors of the dog. J Vet Diagn Invest. 16, 554-561
DEPRESSÃO PÓS-PARTO NÃO ALTERA A CONCENTRAÇÃO SALIVAR DE
CORTISOL DO BEBÊ
Chelini, M.O.M.1 ; Viau, P.2 ; Oliveira, C.A.2, Otta, E.1
1
Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo; 2 Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo.
Introdução
A Depressão Pós-Parto (DPP) é um distúrbio com sérias implicações potenciais para a mãe e para o
bebê, sendo considerado causa de retardo de desenvolvimento físico (ganho de peso) e cognitivo
[1]. Diversos estudos evidenciam os efeitos da depressão materna durante a gestação sobre o eixo
hipotálamo-pituitária-adrenal (HPA) do bebê [2; 3]. A concentração de cortisol na saliva apresenta
uma alta correlação com a concentração sérica da porção livre do hormônio e constitui, portanto,
uma ferramenta não-invasiva poderosa para o monitoramento da função adrenocortical [3]. Não
encontramos, no entanto, nenhum registro das relações da DPP com as concentrações de cortisol
salivar dos bebês.
A hipótese do presente estudo é que, estando submetidos a maior estresse, os bebês filhos de mães
com DPP devem apresentar níveis mais altos de cortisol. O nosso objetivo foi de comparar bebês
filhos de mães com e sem DPP quanto ao nível de cortisol na saliva.
Material e Métodos
Compuseram nossa amostra 99 bebês participantes com suas mães de um projeto longitudinal de
quatro anos sobre DPP desenvolvido no Instituto de Psicologia (IPUSP) e no Hospital Universitário
da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HU). As mães de 74 destas crianças
responderam, aproximadamente 4 meses após o parto, a um questionário conhecido como Escala de
Edimburgo, um instrumento para o diagnóstico da DPP. Dessas, 22 apresentaram indicadores de
DPP. Os 54 bebês de mães sem DPP constituiram nosso grupo controle.
Três amostras de saliva foram coletadas de cada bebê: a primeira no momento da saída do HU, em
média dois dias após o nascimento. As duas outras amostras foram coletadas aproximadamente 4
meses após o parto, antes e depois de um exame clínico realizado por um pediatra, para avaliar a
resposta adrenocortical a um estressor avaliado como médio. A concentração de cortisol foi
determinada por enzimaimunoensaio com kits comerciais específicos (Salimetrics®) no Laboratório
de Dosagens Hormonais da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP.
Resultados
A concentração média de cortisol na saliva no momento da alta foi significativamente maior do que
aquelas medidas no quarto mês, entre as quais também houve diferença significante (Teste t para
amostras pareadas p < 0,05 nos três casos). A variação média de concentração após o exame clínico
foi de 1,67 ± 6,22nmol/L.
Nenhuma diferença significante foi constatada em nenhum dos três momentos entre as
concentrações de cortisol salivar dos filhos de mães com e sem DPP. A variação de concentração
associada ao exame também foi similar nos dois grupos (Teste t para amostras independentes p >
0,05 em todos os casos) (Tabela 1). Não encontramos correlação significante entre as concentrações
de cortisol salivar e sua variação e o escore obtido pela mãe na Escala de Edimburgo (Spearman, r2
< 0,05, p > 0,19 nos 4 casos).
Não foi constatado efeito nem do sexo da criança, nem do fato da mãe ser (ou não) primípara, nem
do tipo de parto (normal, cesariana ou fórcipes), nem do tipo de aleitamento (materno ou artificial)
sobre os níveis de cortisol salivar dos bebês.
Tabela 1: Concentrações de cortisol (médias ± dp, nmol/L) medidas na saliva de bebês nascidos de
mães com ou sem DPP no HU da FMUSP.
Alta
4 meses (1)
4 meses (2)
Variação
9,59 ± 8,06
3,12 ± 4,02
4,69 ± 5,02
1,77 ± 6,22
Geral
(n = 99)
(n = 73)
(n = 63)
(n = 54)
11,24 ± 9,24
3,23 ± 4,97
5,40 ± 6,16
2,86 ± 6,80
Com DPP
(n = 22)
(n = 19)
(n = 18)
(n = 15)
9,63 ± 8,23
3,17 ± 3,77
3,88 ± 3,01
0,65 ± 4,68
Sem DPP
(n = 52)
(n = 51)
(n = 43)
(n = 37)
Conclusão
As concentrações de cortisol salivar medidas neste estudo estão em acordo com as faixas de
referência sugeridas na literatura para lactantes [3]. A ausência de diferença significante entre as
concentrações medidas em bebês filhos de mãe com ou sem DPP sugere que até os 4 meses de
idade, o funcionamento do eixo HPA do bebê ainda não foi afetado pela depressão da mãe. Em
outras palavras, no momento em que é possível diagnosticar a DPP talvez ainda seja tempo de
encaminhar mãe e filho para um atendimento terapêutico.
Agradecimentos
Os autores agradecem a todos aqueles que, seja no HU, seja no IPUSP, participaram da coleta das
amostras e à FAPESP e ao CNPq pelo apoio financeiro.
Referências
[1] Patel, V., DeSouza, N., Rodrigues M. 2003. Postnatal depression and infant growth and
development in low income countries: a cohort study from Goa, India. Arch Dis Child, 88, 34-37.
[2] Brennan,P.A., Pargas, R., Walker, E.F., Green, P., Newport, D.J., Stowe, Z. 2008. Maternal
depression and infant cortisol: influences of timing, comorbidity and treatment J Child Psychol
Psyc 49, 1099–1107.
[3] Azar, R., Paquette, D., Zocolillo, M., Baltzer, F., Tremblay, R.E. 2007. The Association of
Major Depression, Conduct Disorder, and Maternal Overcontrol with a Failure to Show a Cortisol
Buffered Response in 4-Month-Old Infants of Teenage Mothers. Biol Psychiatry, 62, 573–579.
ESTRÓGENOS E SUAS FONTES NA FÊMEA DE HAMSTER SÍRIO INTEIRA E
OVARIECTOMIZADA
Chelini M.O.M. 1, Milazzotto M.P. 2, Souza N.L.3, Cortopassi, S.R.G.3, Annes, K.2, Palme,
R.4,Oliveira C.A3.
1
Instituto de Psicologia, Universidade de São Paulo; 2Universidade Federal do ABC, 3 Faculdade
de Medicina Veterinária, Universidade de São Paulo; 4 Universidade de Medicina Veterinária de
Viena, Áustria.
Introdução
Na fêmea inteira como na mulher antes da menopausa, os ovários representam a principal fonte de
estrógeno, estradiol principalmente, o qual age como hormônio circulante, em tecidos distantes.
Após a menopausa, quando cessa a síntese de estradiol nos ovários, ou na fêmea ovariectomizada,
estrógenos são produzidos a partir de precursores de origem adrenal em diversos tecidos
extragonadais onde exercem efeitos locais parácrinos ou mesmo intrácrinos [1]. Testamos no
presente estudo a hipótese de que ocorre síntese de diferentes estrógenos em diversos tecidos não
ovarianos da fêmea de hamster Sírio (Mesocricetus auratus) especialmente após a ovariectomia.
Utilizamos a técnica de PCR em Tempo Real para verificar a expressão de mRNA da aromatase
(ARO) nestes tecidos, comparando fêmeas inteiras (IN) e ovariectomizadas (OX). Além disso,
caracterizamos e quantificamos os metabólitos de estrógenos nas fezes destas fêmeas.
Material e Métodos
Quatro de oito fêmeas de hamster Sírio heterogênicas, adultas (10 semanas de idade) foram
ovariectomizadas. Três meses depois, todos os animais foram eutanasiados e amostras de diversos
tecidos (ovários [IN], adrenal, cérebro, tecido adiposo, cartilagem, aorta, fígado, intestino delgado e
pulmão [IN e OX]) foram colhidas tanto de fêmeas inteiras quanto ovariectomizadas. O RNA total
de cada amostra de tecido foi isolado e o cDNA correspondente sintetizado numa reação de RTPCR. Os cDNAs foram submetidos a reação de PCR em tempo real. A eficiência da reação foi
determinada por reações de amplificação de diluições seriadas das amostras para cada tecido. O
experimento foi realizado em triplicata. Os resultados foram analisados com o software REST MCS
beta pelo teste Pair Wise Fixed Reallocation Randomization [2]. As reações foram normalizadas
pela freqüência de expressão do controle endógeno ACTH (ACTina alfa 1 de Hamster).
Num segundo experimento seis de 11 fêmeas foram ovariectomizadas. As cinco fêmeas restantes
foram submetidas a procedimento sham de incisão seguida de sutura sob o mesmo protocolo
anestésico. Passados 60 dias da ovariectomia, todas as fezes produzidas em 24 horas por cada
animal foram coletadas. Após extração dos esteróides fecais, os estrógenos presentes nestas
amostras foram dosados por enzimaimunoensaio e caracterizados por HPLC. As concentrações
fecais de estrógenos foram comparadas com o teste t para amostras não pareadas do programa SPSS
for Windows 13.0.
Resultados
A expressão do mRNA para ARO não foi detectada no tecido adiposo, na cartilagem, na aorta, no
fígado, intestino delgado nem nos pulmões apesar da amplificação adequada dos controles
endógenos. Como esperado, alta expressão de ARO foi verificada em ovários enquanto ACTH era
expresso em todas as amostras. A ovariectomia resultou em aumento significativo da expressão de
ARO em cérebro e adrenal (p<0.05) (Figura 1).
Não houve diferença entre as concentrações de estrógenos fecais medidas nos dois grupos (IN: 4,64
± 5,98ng/g de fezes; OX: 2,75 ± 5,20ng/g de fezes; Unpaired t test p = 0,621). A análise por HPLC
revelou, no entanto, perfis bioquímicos diferentes para os extratos fecais dos dois grupos. Foi
encontrada estrona tanto nas fêmeas OX como em IN, mas 17β-estradiol e estriol somente foram
detectados em IN e assim mesmo em concentração muito baixa.
A
B
C
Figura 1 – Alterações na expressão do mRNA de ARO em fêmeas IN e OX evidenciadas por PCR
em tempo real. As reações foram normalizadas pela freqüência de expressão do controle endógeno
ACTH. A expressão de ARO foi mais alta no grupo OX na adrenal (A) e no cérebro (B) em
comparação com IN (p<0.05). (C) Curvas de amplificação e dissociação para ARO e ACTH.
Conclusão
Este estudo atingiu plenamente os seus objetivos confirmando não somente a expressão do gene da
aromatase em diversos tecidos não ovarianos da fêmea de hamster Sírio como também o caráter
diferenciado, tanto quantitativamente com qualitativamente da síntese de estrógenos nas fêmeas
inteiras e ovariectomizadas. Os resultados da análise bioquímica sugerem uma natureza molecular
diferentes para os estrógenos produzidos após a ovariectomia em relação àqueles produzidos antes.
O achado de quantidades importantes de mRNA da aromatase nas glândulas adrenais dos dois
grupos sugere uma das vias de biossíntese dos estrógenos específica ao animal estudado e novas
perspectivas relativas às funções não reprodutivas desse grupo de esteróides no hamster e noutras
espécies.
Agradecimentos
Os autores agradecem à FAPESP pelo apoio financeiro.
Referência
[1] Simpson, E.R., Rubin, G., Clyne, C., Robertson, K., O’Donnell, L., Jones, M., Davis, S. 2000.
The role of local estrogen biosynthesis in males and females, Trends in Endocrinology and
Metabolism, 11, 184-188.
[2] Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. 2002. Relative expression software tool (REST) for
group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR.
Nucleic Acids Research 30, e36.
AGONISTAS NICOTÍNICOS E MUSCARÍNICOS APRESENTAM EFEITOS
DIFERENCIAIS SOBRE O FENÓTIPO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS E A PRODUÇÃO
DE CITOCINAS
1
Pinheiro, M. L. ; Ribeiro, A.1; Mariano-Souza, D. P.1; Palermo-Neto, J.1
1
Departamento de Patologia – FMVZ/USP
Introdução
Estudos recentes identificaram uma via colinérgica anti-inflamatória que tem como link as
fibras aferentes/eferentes do nervo vago [1]. Desta forma, tem-se postulado que esta conexão provê
um controle neural da inflamação aguda de uma forma direta e reflexa, sendo então chamada de
“reflexo inflamatório” [2]. O mecanismo molecular mais comumente proposto para explicar a
inibição da síntese de citocinas pelo “reflexo inflamatório” refere-se à ação da Aceticolina (ACh), o
principal neurotransmissor vagal, pois já foi demonstrado que tanto os macrófagos quanto outras
células produtoras de citocinas expressam receptores para Ach. Estes receptores, quando ativados,
inibem as cascatas intracelulares que levam a síntese de citocinas, principalmente o TNF-alfa e o
HMGB-1 [3,4]. O objetivo do trabalho foi avaliar os efeitos de um agonista nicotínico (Anabasina),
um agonista muscarínico (Betanecol) e de sua combinação, sobre o fenótipo de células dendríticas e
a produção de citocinas do sobrenadante de uma cultura de esplenócitos e do soro de camundongos
imunizados com ovalbumina (OVA).
Material e métodos
Trinta e dois camumdungos Balb/c machos foram divididos em 4 grupos: salina (S), anabasina
4mg/kg (A), betanecol 20mg/kg (B) e a combinação das mesmas drogas nas mesmas doses (AB).
Cada camundongo recebeu uma única dose do tratamento (i.p.) e após 30 minutos eles foram
imunizados com OVA grau V (50µg/camundongo, s.c.). Após 24 horas os animais foram
submetidos à eutanásia, para a coleta do sangue e do baço. O soro foi separado para a quantificação
de citocinas por citometria de fluxo utilizando o kit CBA mouse inflammation (BD®). Os
esplenócitos foram utilizados em uma cultura de células aderentes (células dendríticas) e não
aderentes (linfócitos) (12 horas), as células dendríticas foram marcadas (CD11c-FITC; Iab-PE;
CD80-FITC; CD86-PE) e o sobrenadante foi coletado para a quantificação de citocinas também por
citometria de fluxo.
Resultados
Os animais tratados com betanecol (S: 14,18±1,9; A: 14,80±2,0; B: 19,02±4,1; AB: 17,45±3,4;
p<0,05) apresentaram um aumento na porcentagem de células expressando CD80+CD86+ e os
animais tratados com a combinação das duas drogas (S: 15,61±3,6; A: 13,54±4,1; B: 16,44±4,0;
AB: 19,25±2,9; p<0,05) apresentaram um aumento na porcentagem de células expressando
CD11c+IAb+.
Ainda, o tratamento com betanecol aumentou os níveis de TNF no soro e no sobrenadante de
cultura, aumentou MCP1 somente no sobrenadante e aumentou IL-6 no soro. Além disso, o
tratamento com a combinação das duas drogas diminuiu a produção de IL-6 no soro. Os resultados
estão ilustrados na figura 1.
Conclusões
A fenotipagem das células dendríticas mostrou que o betanecol (agonista muscarínico) aumentou a
porcentagem de células que expressam MHC classe II e as moléculas co-estimulatórias B7.1 e B7.2.
Assim pode-se concluir que o agonista muscarínico foi capaz aumentar a apresentação de antígenos
pelas células dendríticas. Ainda, observou-se que o betanecol foi capaz de aumentar a concentração
das citocinas quantificadas no soro (TNF e IL-6) e no sobrenadante da cultura (TNF e MCP-1),
sugerindo, então, uma possível ação pró-inflamatória.
Desta forma, nossos resultados sugerem que o sistema colinérgico,via receptores muscarinicos,
pode estar envolvido na regulação da imunidade adaptativa.
TNF soro
50
b
40
15
30
pg/ml
pg/ml
TNF sobrenadante
20
a
20
10
5
10
0
0
S
A
B
AB
MCP1 Soro
600
S
A
B
AB
MCP1 Sobrenadante
80
c
60
pg/ml
pg/ml
400
200
0
40
20
S
A
B
0
AB
S
A
B
AB
IL 6 Soro
80
d
pg/ml
60
40
e
20
0
S
A
B
AB
Figura 1 – Dosagem de citocinas por citometria de fluxo no soro e no sobrenadante de cultura de
esplenocitos de camundongos tratados previamente com agonistas nicotínicos e muscarínicoas (30
min) a sensibilização com OVA. a: p<0,05 em relação ao grupo S; b: p<0,01 em relação ao grupo
A; c: p<0,05 em relação aos grupos S e A; d: p<0,001 em relação ao grupo A; e: p<0,01 em relação
ao grupo B. Kruskal-Wallis seguido pelo teste de múltiplas comparações de Dunn (n=8).
Agradecimentos
Este projeto tem o apoio financeiro da FAPESP (no. 08/54869-0). A dosagem de citocinas foi
realizada com o kit CBA mouse inflammation fornecido pela BD.
Referências
[1] BOROVIKOVA, L. V.; IVANOVA, S.; ZHANG, M.; YANG, H.; BOTCHKINA, G. I.; WATKINS, L.
R.; WANG, H.; ABUMRAD, N.; EATON, J. W.; TRACEY, K. J., 2000. Vagus nerve stimulation attenuates
the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature, v. 405, p. 458-462.
[2] TRACEY, K. J., 2002. The inflammatory reflex. Nature, v. 420, p. 853-859.
[3] WANG, H.; YU, M.; OCHANI, M.; AMELLA, C. A.; TANOVIC, M.; SUSARLA, S.; LI, J. H.; WANG,
H.; YANG, H.; ULLOA, L.; AL-ABED, Y.; CZURA, C. J.; TRACEY, K. J., 2003. Nicotinic acetylcholine
receptor α-7 subunits an essential regulator of inflammation. Nature, v. 421, p. 384-388.
[4] WANG, H.; LIAO, W.; OCHANI, M.; JUSTINIANI, M.; LIU, X.; YANG, L.; AL-ABED, Y.; WANG,
H.; METZ, C.; MILLER, E. J.; TRACEY, K. J.; ULLOA, L., 2004. Cholinergic agonists inhibit HMGB1
release and improve survival in experimental sepsis. Nature Medicine, v. 10, n. 11, p. 1216-1221.
INFECÇÃO BACTERIANA PRÉ-NATAL PREJUDICA MEMÓRIA ESPACIAL DE
RATOS MACHOS APÓS DESAFIO IMUNE
Kirsten TB, Palermo-Neto J, Bernardi MM
Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – USP,
São Paulo, Brasil
Introdução
As infecções pré-natais bacterianas e virais são descritas por induzirem inúmeros danos
neurológicos e comportamentais em humanos e outros mamíferos que podem perdurar por toda a
vida do indivíduo [2]. Especificamente, o estresse pré-natal decorrente de uma ativação do sistema
imune pode induzir déficits no aprendizado e perturbações na consolidação da memória, inclusive
com achados histopatológicos no hipocampo [2, 3].
Dessa forma, investigou-se os efeitos de uma infecção bacteriana pré-natal na memória
espacial de ratos, avaliada no labirinto em T. Para tanto, a infecção bacteriana foi induzida pela
administração do lipopolissacarídeo (LPS).
Material e Métodos
Ratas Wistar prenhes receberam o LPS (100 µg / kg, i.p) no 9,5º dia de gestação. A prole
masculina adulta (dia de vida pós natal 60) foi avaliada quanto a sua memória espacial em um
labirinto em T, no modelo de alternação espontânea [1, 4]. Quatro grupos perfizeram o teste:
tratados pré-natalmente com LPS ou salina, e os mesmos tratamentos com um desafio de LPS (100
µg / kg, i.p) 90 minutos antes do teste. Esses animais passaram pelo aparato quatro vezes, sendo
duas sessões de escolhas forçadas e duas de livre escolha (teste propriamente dito). Nas duas
sessões de livre escolha atribuiu-se os seguintes escores: 0- dois erros; 1- um acerto e um erro; 2dois acertos. A frequência de levantar também foi avaliada quando da passagem no labirinto, como
índice de atividade motora/exploratória.
Resultados
Com relação aos acertos dos animais, os valores da média ± S.E. foram: grupo salina prénatal 1,1 ± 0,26, grupo LPS pré-natal 1,6 ± 0,18, grupo salina pré-natal e LPS na idade adulta 0,56 ±
0,29, grupo LPS pré-natal e na idade adulta 0,13 ± 0,13. Os animais tratados pré-natalmente e
desafiados com LPS na idade adulta apresentaram um significante prejuízo na memória espacial,
comparado com os animais tratados apenas pré-natalmente com LPS (Figura 1). Além disso, não
foram observadas alterações entre os animais tratados apenas pré-natalmente com LPS, com relação
aos animais tratados pré-natalmente com salina, mostrando que o desafio imune foi fundamental
para os prejuízos comportamentais. Por fim, a frequência de levantar foi prejudicada nos dois
animais tratados instantes antes do teste, com relação aos animais tratados apenas pré-natalmente
(Figura 2), mostrando que o tratamento pré-natal não interferiu na atividade motora/exploratória dos
mesmos. Os resultados foram considerados significantes para p<0,05.
Conclusão
O LPS pré-natal não alterou a memória espacial dos animais, quando avaliados pelo
comportamento de alternação espontânea, mas perturbou a regulação da resistência inata do
organismo, promovendo aumento das respostas comportamentais à ativação imune, expresso pelo
prejuízo da memória espacial após a nova infecção pelo LPS na idade adulta. A atividade
motora/exploratória não foi prejudicada pela infecção pré-natal, reiterando o prejuízo da memória
espacial.
Agradecimentos
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo pelo apoio financeiro
(processo: 08/53861-5; temático: 04/14128-0) e ao Departamento de Patologia da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, onde este trabalho foi realizado.
*
100
75
Acertos
Erros
% 50
25
0
Co
LPS
Co+LPS
LPS+LPS
Figura 1: Efeitos da exposição pré-natal ao LPS (100 µg/kg no GD 9,5) na porcentagem de acertos
no labirinto em T da prole masculina de ratas. Co: grupo controle; LPS: grupo tratado prénatalmente com LPS; Co+LPS: grupo controle tratado com LPS na idade adulta; LPS+LPS: grupo
tratado pré-natalmente e desafiado na idade adulta com LPS. * p < 0,01 vs. grupo LPS (KruskalWallis, seguido pelo teste de Dunn). n = 9 para grupos Co e Co+LPS, n = 8 para grupos LPS e
LPS+LPS
frequência de levantar
10
8
6
4
**
2
0
Co
LPS
**
Co+LPS LPS+LPS
Figura 2: Efeitos da exposição pré-natal ao LPS (100 µg/kg no GD 9,5) na frequência de levantar
avaliada no labirinto em T na prole masculina de ratas. Co: grupo controle; LPS: grupo tratado prénatalmente com LPS; Co+LPS: grupo controle tratado com LPS na idade adulta; LPS+LPS: grupo
tratado pré-natalmente e desafiado na idade adulta com LPS. Média ± S.E. ** p < 0,001 vs. grupo
Co e grupo LPS (ANOVA de uma via, seguido do teste de Tukey). n = 9 para animais dos grupos
Co e Co+LPS, n = 8 para animais dos grupos LPS e LPS+LPS
Referências
[1] Baker, S., Chebli, M., Rees, S., Lemarec, N., Godbout, R., Bielajew, C., 2008. Effects of
gestational stress: 1. Evaluation of maternal and juvenile offspring behavior. Brain Res 1213, 98110.
[2] Golan, H.M., Lev, V., Hallak, M., Sorokin, Y., Huleihel, M., 2005. Specific
neurodevelopmental damage in mice offspring following maternal inflammation during pregnancy.
Neuropharmacology 48, 903-917.
[3] Kohman, R.A., Tarr, A.J., Day, C.E., McLinden, K.A., Boehm, G.W., 2008. Influence of
prenatal stress on behavioral, endocrine, and cytokine responses to adulthood bacterial endotoxin
exposure. Behav Brain Res 193, 257-268.
[4] Timofeeva, O.A., Roegge, C.S., Seidler, F.J., Slotkin, T.A., Levin, E.D., 2008. Persistent
cognitive alterations in rats after early postnatal exposure to low doses of the organophosphate
pesticide, diazinon. Neurotoxicol Teratol 30, 38-45.
DETERMINATION OF SERUM LEVELS OF ESTRADIOL AND CORTICOSTERONE IN
FEMALES OF Bothrops jararaca SUBMITTED TO PHYSICAL RESTRAINT AND
VENOM EXTRACTION
KATHLEEN F. GREGO1; MARCELO A.B.V. GUİMARÃES2; CLAÚDİO A. OLİVEİRA2; JOSÉ
L. CATÃO-DİAS2
1. Laboratório de Herpetologia, Instituto Butantan, São Paulo, Brazil. [email protected]
2. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo,
Brazil. [email protected]; [email protected]; [email protected]
Introduction
This study investigated the levels of serum corticosterone and estradiol in females of Bothrops
jararaca submitted to physical restraint (PR) and venom extraction (VE).
Material and methods
Thirteen 3 year-old snakes (mean weight and snout-vent length: 281 grams/99 centimeters), born in
captivity at the Instituto Butantan, Brazil, were divided in 3 groups: A - control (n = 3) - animals
were not submitted to PR nor to VE and did not have their management and placement modified
since their birth; B (n = 5) – animals were transferred to a VE room at the beginning of the
experiment and were monthly submitted to PR but not to VE; C (n = 5) – snakes were transferred
to the same room as GB and were monthly submitted to PR and VE. Every two months for a period
of 12 months, 2 mL of blood was collected by caudal vein venipuncture for corticosterone and
estradiol measurements by radioimmunoassay, at two different moments: 1) up to 120 seconds after
PR; 2) 90 minutes after the first PR and/or VE.
Results and Discussion
Results showed that all Groups had an adrenocortical response to PR and/or VE procedures, since
all snakes showed significant higher corticosterone serum levels comparing to basal measurements.
However, serum levels of estradiol varied within the physiological range seen during the quiescent
phase of female B. jararaca reproductive cycle (Almeida-Filho, 2005), suggesting that females in
the present study did not reach active vitelogenesis. Although the mean snout-length (99cm) was
higher than those reported in the literature (Janeiro-Cinquine et al 1993) for mature females (76cm),
data available on reproduction maturity of female captive born B. jararaca are still scarce. Further
studies are necessary to conclude if the absence of vitelogenesis was due to elevated corticosterone
levels in response to PR and/or VE or to sexual immaturity.
Acknowledgement
CNPq; FAPESP.
DETERMINATION OF SERUM LEVELS OF TESTOSTERONE AND
CORTICOSTERONE IN MALES OF Bothrops jararaca SUBMITTED TO PHYSICAL
RESTRAINT AND VENOM EXTRACTION
KATHLEEN F. GREGO1; MARCELO A.B.V. GUİMARÃES2; CLAÚDİO A. OLİVEİRA2; JOSÉ
L. CATÃO-DİAS2
3.
Laboratório de Herpetologia, Instituto Butantan, São Paulo, Brazil. [email protected]
4.
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo,
Brazil. [email protected]; [email protected]; [email protected]
Introduction
This study investigated the levels of serum testosterone and corticosterone in males of Bothrops
jararaca submitted to physical restraint (PR) and venom extraction (VE).
Material and methods
Seventeen 3 year-old specimens (mean weight and snout-vent length: 97 grams/ 75 centimeters),
born in captivity at the Instituto Butantan, Brazil, were divided in 3 groups: A - control (n = 7) animals were not submitted to PR nor to VE and did not have their management and placement
modified since their birth; B (n = 5) – animals were transferred to a VE room at the beginning of the
experiment and were monthly submitted to PR but not to VE; C (n = 5) – snakes were transferred to
the same room as Group B and were monthly submitted to PR and VE. Every two months for a
period of 12 months, 2 mL of blood was collected by caudal vein venipuncture for corticosterone
and testosterone measurements by radioimmunoassay, at two different moments: 1) up to 120
seconds after PR; 2) 90 minutes after the first PR and/or VE. Results showed that animals from the
three Groups had an adrenocortical response to PR and/or VE procedures. Ninety minutes after the
restraint and/or venom extraction, snakes showed significant higher corticosterone serum levels
comparing to basal measurements and Group C had the higher levels, followed by Group B.
Results
Regarding testosterone, animals in Group A presented an increase of 41% in the serum levels at the
end of the experiment, while Groups B and C showed a decrease of 67% and 91%, respectively.
Conclusion
These results suggest that PR and/or VE have potential effects on the reproductive capabilities of
males of B. jararaca and therefore animals bred for reproductive purposes should be kept in a stable
management condition and not be exposed to a VE routine.
Acknowledgement
CNPq and FAPESP.
QUITRIDIOMICOSE EM DENDROBATES AZUREUS: PRIMEIRO RELATO DE
BATRACHOCHYTRIUM DENDROBATIDIS EM ANFÍBIOS MANTIDOS EM CATIVEIRO
NO BRASIL
Catia Dejuste de Paula1; Érica C. Pacífico de Assis2; José Luiz Catão-Dias1
1. Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade
de São Paulo
2. Zooparque, Itatiba, São Paulo
Introdução
Os anfíbios sofrem globalmente severo declínio de suas populações, com quase um terço das
espécies ameaçadas de extinção. Dentre as espécies que sofreram declínio, as neotropicais foram as
mais afetadas. As causas do declínio são complexas e as doenças infecciosas são reconhecidas
como uma relevante causa deste processo. Considera-se que a enfermidade mais importante
impactando os anfíbios seja a quitridiomicose, causada pelo fungo Batrochochytrium dendrobatidis.
Este quitrídeo coloniza o epitélio de anfíbios adultos, invadindo os estratos córneo e granuloso da
epiderme. Topograficamente, os sítios mais comprometidos são os dígitos e superfície ventral,
principalmente região inguinal e coxas. Acredita-se que o patógeno dissemina-se pela água e os
zoósporos ao encontrarem o hospedeiro invadam as células epiteliais deste, onde se replicam. Na
célula, o zoósporo se transforma em um talo em crescimento com finos rizóides em formato de fio.
O talo se transforma em um zoosporângio com formato de urna e libera múltiplos zoósporos por um
tubo que se estende através da membrana da célula epitelial do hospedeiro. Os zoósporos são
móveis por até aproximadamente 24 horas, quando então encistam ou morrem. O mecanismo pelo
qual o patógeno causa a morte do animal ainda não é conhecido, mas há duas hipóteses: produção
de toxina ou então o crescimento do fungo interfere com a homestasia da pele do animal. O presente
trabalho tem o objetivo de relatar o primeiro caso de quitridiomicose em um espécime de
Dendrobates azureus mantido em cativeiro no Brasil.
Materiais e Métodos
O estudo foi realizado com dois animais mantidos em cativeiro em um zoológico no interior do
Estado de São Paulo. Estes animais vieram a óbito no ano de 2008. Fragmentos de pele foram
fixados em formol a 10%, processado de acordo com as técnicas rotineiras de histologia para a
obtenção de lâminas coradas em hematoxilina-eosina.
Resultados e Discussão
O estudo microscópico revelou severa infecção cutânea, caracterizada pela presença de grande
quantidade estruturas morfológicas compatíveis com Batrachochytrium dendrobatidis, compostas
por vários zoosporângios com diversos zoósporos em seu interior (figura 1), além de zoosporângios
vazios. Os zoósporos possuíam septação interna, conhecida como “colonial thalli”, achado
morfológico característica deste fungo (figura 2). O encontro deste patógeno em uma população de
Dendrobates mantida em cativeiro é de grande importância, pois o Brasil é o país com a maior
diversidade de anfíbios do mundo, e relatos oficiosos sugerem o declínio de suas populações. Por
conta de seu reconhecido papel patogênico para os anfíbios, o Batrachochytrium dendrobatidis é
uma severa ameaça às populações de vida livre e às mantidas em cativeiro.
Figura 1: Zooporos e zoosporângios. Coloração HE. Aumento 400X. Figura 2: Diversos zoósporos vazios com septação interna. Coloração HE. Aumento 1000X. Conclusão
O presente trabalho relata os primeiros casos de Batrochochytrium dendrobatidis em anfíbios
mantidos em cativeiro no Brasil. Considerando que o Brasil é detentor da maior riqueza de espécies
de anuros, conhecer a epidemiologia, assim como aspectos clínicos e patológicos desta enfermidade
é de grande importância para a conservação deste grupo de vertebrados.
Agradecimento
Apoio ao CNPq e Capes
ESTUDO GENÉTICO DO CAMUNDONGO MUTANTE B6br
Juliana Lech Bernardoni1, Enio Mori2, Claudia Madalena Cabrera Mori2, Silvia Maria Gomes
Massironi1
1
Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, Brasil, 2Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brasil. E-mail- [email protected].
Introdução
Na colônia de camundongos transgênicos C57BL/6 Twist foi observada uma mutação espontânea na
qual os camundongos, originalmente pretos e com olhos pretos, apresentaram coloração clara e
olhos vermelhos escuro. Os camundongos mutantes são diferentes dos albinos, uma vez que os
albinos apresentam pelagem branca e olhos vermelhos claro. O gene Twist foi identificado em
moscas estando envolvido no estabelecimento do padrão dorsoventral na gastrulação e na
especificação do destino da mesoderme durante a diferenciação celular [6]. Genes Twists ortólogos
foram identificados em diversas espécies, incluindo o camundongo [7]. A mudança de coloração
encontrada no mutante não tem relação com o transgene, pois através de cruzamentos foram
selecionados animais mutantes quanto à coloração, mas que não apresentavam o transgene, tendo
sido estabelecida uma colônia mutante. Os objetivos do trabalho foram o mapeamento genético
mutação obtida, feito com marcadores moleculares do tipo microssatélites, a seleção e
seqüenciamento de genes candidatos, e a descrição fenotípica da mutação.
Materiais e métodos
Estabeleceu-se um cruzamento entre camundongos C57BL/6 br (mut/mut) e C3H/HePas (+/+)
originando indivíduos F1 que foram retrocruzados com C57BL/6 br obtendo-se a geração N2
utilizada para o mapeamento genético. Microssatélites distribuídos por todos os cromossomos do
camundongo foram escolhidos, estabelecendo-se um painel de marcadores com o objetivo de
localizar o cromossomo portador da mutação. Após a localização da mutação no cromossomo 15
um haplótipo foi construído com os dados provenientes dos 182 animais gerados, posicionando o
locus mutado em uma região de um cromossomo. Os primers para seqüenciamento do gene
candidato foram construídos baseados na seqüência encontrada no site Mouse Genome Informatics.
Os fragmentos de DNA foram amplificados por PCR e purificados com o kit GFX PCR DNA and
Gel Band Purification (Biosciences). A reação de seqüenciamento dos produtos de PCR foi
realizada segundo o método enzimático de terminação em cadeia ou dos didesoxinucleotídeos com
BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Byosystems). Os cromatogramas gerados para
cada uma das seqüências senso e anti-senso de cada amostra foram conferidos manualmente com o
programa Chromas versão 2.31. As identidades dos nucleotídeos entre as seqüências alinhadas e
pré-estabelecidas foram analisadas pelo programa Bioedit. Para a caracterização fenotípica
fragmentos de pele da região dorsal foram analisados no 8º dia pós-depilação [4]. Os cortes
histológicos foram corados pela HE.
Resultados
A primeira etapa do mapeamento genético da mutação natural B6br envolveu a sua localização
cromossômica. Os resultados obtidos mostraram desequilíbrio de ligação no cromossomo 15,
sugerindo uma ligação do gene mutado com os marcadores deste cromossomo. Aumentando-se o
número de marcadores e o número de animais pode-se estabelecer o intervalo entre o centrômero e
12,3cM para a localização da mutação no cromossomo 15. Foram analisados 82 animais mutantes
resultantes dos retrocruzamentos e 80 animais selvagens para os marcadores D15Mit175, D15Mit53
e D15Mit226. Na primeira coluna à esquerda estão os nomes dos marcadores e ao lado direito da
tabela estão as posições dos respectivos marcadores em centimorgans e em pares de bases. Os
números acima dos quadrados representam o número de animais que apresentou cada padrão. Os
quadrados pretos nos haplótipos representam os animais recombinantes – ou seja, animais mutantes
heterozigotos e animais selvagens homozigotos - e os quadrados brancos representam os animais de
genótipo não recombinante – ou seja, animais mutantes homozigotos e animais selvagens
heterozigotos. A pesquisa do gene candidato à mutação levou a escolha do gene Slc45a2 (antigo
uw), escolhido por ser responsável por fenótipo semelhante ao mutante estudado. Os resultados do
sequenciamento do gene mutante utilizando primers para os exons 4, 5 e 8 não mostraram mutação
em relação ao selvagem. O produto obtido do primer 7 não foi sequenciado. O éxon 6 mostrou a
deleção de uma cisteína na posição 115 o que leva provavelmente a uma perda de função da
proteína que está associada ao transporte transmembranico de melanina. A análise histopatológica
da pele evidenciou ausência dos grânulos de melanina no interior dos folículos pilosos do
camundongo mutante.
Discussão
O gene Slc45a2 (antigo uw) foi escolhido como candidato por ser responsável por fenótipo
semelhante ao mutante estudado. Underwhite (uw) é uma mutação recessiva do cromossomo 15 que
apareceu espontaneamente em camundongos da linhagem C57BL/6J. O dorso dos animais
homozigotos é de coloração amarelo-clara enquanto o ventre é branco. Os olhos são
despigmentados ao nascer, mas escurecem para vermelho escuro com a maturidade [3]. O resultado
do sequenciamento dos éxons de 4 a 8 mostraram a deleção de uma base no éxon 6 nos
camundongos mutantes B6br. Essa deleção leva a modificação da proteína traduzida e
possivelmente modificação na sua conformação como demonstrado nas figuras 11 e 12. Apesar do
éxon 7 não ter sido sequenciado acreditamos que esse resultado pode ser o responsável pelo
fenótipo observado. O gene Slc45a2 tem sido relacionado a patologias humanas como albinismo
oculocutâneo (OCA 4) [1,5] e melanoma maligno [2,5]. O albinismo oculocutâneo é uma desordem
hipopigmentar recessiva que tem ação na pele, pelagem e olhos, na qual o processamento da
tirosinase e seu tráfego se dão de forma anormal nos melanossomas imaturos, interrompendo a
maturação desta organela [1]. A redução da pigmentação dos olhos resulta na redução da acuidade
visual e a perda de pigmentação na pele aumenta o risco de câncer de pele [5]. Slc45a2 foi
relacionado recentemente à susceptibilidade a melanoma maligno em um estudo populacional na
população hispânica [8].
Referências
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Costin, E. G., Valencia, J. C., Vieira, W. D., Lamoreux, M. L., Hearing, V. J. 2003. Tyrosinase Processing and
Intracellular Trafficking is Disrupted in Mouse Primary Melanocytes Carrying the Underwhite (uw) Mutation. A
Model for Oculocutaneous Albinism (OCA) Type 4. Journal of Cell Science. 116: 3203-3212.
Fernandez, L. P., Milne, R. L., Pita, G., Avilés, J. A., Lázaro, P., Benítez, J., Ribas, G. 2008. SLC45A2: A Novel
Malignant Melanoma-Associated Gene. Human Mutation. 29: 1161-1167.
MGI: http://www.informatics.jax.org/.
Muller-Rover S., Handjiski B., van der Veen C., Eichmuller S., Foitzik K., McKay I. A., Stenn K. S., Paus R.
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of Investigative Dermatology. 117: 3-15.
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Thisse, B., El Massal, M., Perrin–Schmitt, F. 1987. The Twist Gene: Isolation of a Drosophila Zygotic Gene
Necessary for the Establishment of Dorsoventral Pattern. Nucleic Acids Research. 15: 3439-3453.
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Expressed in Subsets of Mesodermal Cells and is Closely Relates to the Xenopus X-twi and the Drosophila Twist
Genes. Developmental Biology. 143: 363-373.
MODELO DE ESTUDO DA MENINGOENCEFALITE CAUSADA PELO HERPESVÍRUS
EQÜINO TIPO 1 EM CAMUNDONGOS ISOGÊNICOS
Claudia Madalena Cabrera Mori1, Enio Mori1, Larissa Lais Favaro1, Caio Rodrigues dos Santos1,
Maria do Carmo Custodio de Souza Hunold Lara2, Eliana Monteforte Cassaro Villalobos2, Elenice
Maria Sequetin Cunha2 & Paulo César Maiorka1
1
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo,
Brasil.2Instituto Biológico, São Paulo, Brasil. E-mail: [email protected]
Introdução
Os modelos animais são valiosos no estudo das encefalites virais, sendo responsáveis por grande
parte do nosso conhecimento atual sobre a infecção e a resposta imune no sistema nervoso central
(SNC). Camundongos infectados com a estirpe A4/72 do herpesvírus eqüino tipo 1 (EHV-1) são
excelentes modelos para o estudo das alterações no SNC decorrentes da encefalite viral. O principal
fator que determina a evolução da doença é a resposta imune do hospedeiro contra a infecção, sendo
responsável por conter e controlar a replicação do agente ou podendo contribuir para o
desenvolvimento das lesões no SNC [1]. A resistência ou susceptibilidade as herpesviroses nas
diferentes linhagens de camundongos está relacionada a fatores genéticos, particularmente ao gene
H2 do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), determinando assim linhagens
susceptíveis (haplotipo H2d) ou resistentes (haplotipos H2b e H2k) a infecção herpética [2]. O
presente estudo tem como objetivo investigar a susceptibilidade de diferentes linhagens de
camundongos isogênicos frente ao desafio viral com a estirpe neurotrópica A4/72 do EHV-1.
Materiais e métodos
Foram utilizados 24 camundongos, fêmeas, com oito semanas, das linhagens BALB/c (H2d),
BALB/c nude (H2d), C57BL/6 (H2b) e C3H/HeJ (H2k) provenientes do Biotério do Departamento
de Patologia da FMVZ/USP. As condições de alojamento e manejo, bem como os procedimentos
experimentais adotados, foram aprovados pela Comissão de Bioética do Instituto Biológico
(protocolo 70/08 CETEA-IB) e estão de acordo com a as recomendações internacionais. Após
anestesia pela associação de quetamina (100mg/kg) e xilazina (20mg/kg), três camundongos de
cada linhagem foram desafiados por via intranasal com a dose infectante de 104 DICT50/25µL da
estirpe A4/72 do EHV-1. Os animais do grupo controle foram submetidos aos mesmos
procedimentos e receberam 25 µL do meio de cultura MEM de Eagle estéril. No 3º d.p.i, um
camundongo de cada linhagem foi eutanasiado por overdose de anestésico. Fragmentos dos órgãos
internos (cérebro, fígado, pulmão, baço, e timo) foram utilizados para o isolamento viral em cultura
de células E-dermal. Para a avaliação histopatológica e imunoistoquímica foram realizadas
perfusões transcardíacas em dois camundongos de cada linhagem. Os fragmentos de tecido fixados
em formol a 10% foram utilizados para a confecção de lâminas coradas por HE. Para a realização
da prova de imunoistoquímica utilizou-se o anticorpo primário anti-EHV-1 specific goat serum
(VMRD Inc.) na diluição 1: 2.000.
Resultados
Os resultados demonstraram que as linhagens de camundongos testadas foram susceptíveis à
infecção pela estirpe A4/72 do EHV-1. Observou-se evolução aguda da doença com aparecimento
de sintomas neurológicos no 3º d.p.i., tais como: hiperexcitabilidade, perda da propriocepção, andar
em círculos, paralisia espástica e convulsões, indicando alto grau de neuroinvasividade e
neurotropismo desse agente. No 3º d.p.i., os camundongos BALB/c nude apresentaram apenas
sintomatologia respiratória, com as manifestações neurológicas surgindo apenas no quarto dia. No
isolamento viral observou-se efeito citopático característico do EHV-1, entre 24 e 72 horas, após a
inoculação da suspensão dos órgãos macerados (cérebro, pulmão, timo, fígado e baço) em cultura
de células E-dermal. As lesões microscópicas observadas no SNC foram leptomeningite,
hemorragia focal, ventriculite, gliose multi-focal, neuronofagia, inflamação não supurativa
degeneração e necrose dos neurônios, principalmente na região do hipocampo, e infiltrações
perivasculares por polimorfonucleares e mononucleares. Também foram observadas outras
alterações como a presença de infiltrado inflamatório nos pulmões, espessamento da parede dos
alvéolos pulmonares e depleção no tecido linfóide do timo e baço. Obteve-se marcação
imunoistoquímica positiva para o EHV-1 no pulmão e SNC dos animais infectados. Apesar de
todos os animais inoculados terem desenvolvido uma meningoencefalite severa, com 100% de taxa
de letalidade entre o 3º e o 4º d.p.i., observaram-se diferenças na intensidade das lesões no tecido
nervoso de acordo com a linhagem de camundongos. As alterações menos severas foram
observadas nos camundongos BALB/c e BALB/c nude; e a mais severas, com grandes áreas de
destruição tecidual, foram encontradas na linhagem C3H/HeJ.
Conclusão
As diferentes linhagens de camundongos submetidas ao desafio viral com a estirpe A4/72 do EHV1 foram susceptíveis à doença, desenvolvendo manifestações clínicas severas com
comprometimento do SNC, seguidas da morte dos animais inoculados. As lesões histopatológicas
observadas no SNC, apresentando variações no grau de destruição tecidual entre as diferentes
linhagens isogênicas, estão de acordo com a literatura e confirmaram o neurotropismo e a
neuroinvasividade desse vírus. Nas linhagens de camundongos que apresentam resposta
predominantemente Th1 (haplotipos H2b e H2k), ocorre ativação precoce dos macrófagos e dos
mecanismos citotóxicos mediados pelos lifócitos T, eficazes na eliminação de patógenos
intracelulares como os vírus; entretanto, esse mecanismo leva a uma extensa destruição dos tecidos
infectados. No entanto, é importante destacar que nossos resultados diferem dos observados por
outros autores em relação a neuropatogenicidade do EHV-1 em modelos murinos. O isolamento
viral a partir das amostras dos diferentes órgãos no terceiro d.p.i. indicam que, quando inoculado
por via intranasal, o vírus replica-se nos tecidos linfóides resultando em intensa viremia e,
conseqüentemente, atravessa a barreira hematoencefálica. Devido às características neurotrópicas
da estirpe A4/72, outra via de disseminação viral deve ocorrer pela replicação primária nas células
epiteliais da mucosa nasal com migração através dos bulbos olfatórios, atingindo o cérebro. O
modelo de encefalite viral pelo EHV-1 em camundongos reproduz lesões encontradas no cavalo e,
portanto, pode ser uma ferramenta importante na investigação de diversos aspectos da patogenia da
doença que ainda não foram esclarecidos.
Agradecimentos
Fundação de Amparo à Pesquisa
Referências
1.
Awan A.R., Chong Y.C., & Field H.J. 1990. The pathogenesis of equine herpesvirus type 1
in the mouse: a new model for studying host responses to the infection. Journal of General
Virology. 71: 1131-1140.
2.
Guénet J.L. 2005. Assessing the genetic component of the susceptibility of mice to viral
infections. Briefings in functional genomics & proteomics. 4: 225-240.
AVALIAÇÃO CLÍNICA MATERNA E NEONATAL EM DIFERENTES CONDIÇÕES
OBSTÉTRICAS EM BOVINOS DA RAÇA HOLANDESA
C. F. Lúcio1; J. A. Rodrigues1; L. C. G. Silva1; G. A. L. Veiga1; T. F. Rück 1; C. I. Vannucchi1
1
Departamento de Reprodução Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo
Introdução
Com o avanço de novas biotécnicas da reprodução (TE, FIV e Clonagem), exige-se o
controle mais acurado da gestação e do parto, em razão dos problemas obstétricos decorrentes do
nascimento de produtos com crescimento exacerbado ou com menor vitalidade por disfunções
placentárias. Desta forma, a redução da mortalidade neonatal justifica-se por acompanhar o
aprimoramento na área, visando ao bem-estar materno e neonatal, bem como aos interesses do
mercado pecuário. As distocias podem comprometer o fluxo sangüíneo materno-fetal e a ocitocina
utilizada como agente ecbólico nas atonias uterinas pode aumentar o estresse do parto [3]. Os
objetivos deste estudo foram: identificar alterações do escore Apgar de vitalidade neonatal,
temperatura corpórea, hemogasometria arterial, glicemia e cortisol ao nascimento e 1 hora pós-parto
de neonatos nascidos em distintas condições obstétricas e verificar modificações da pressão arterial
(PA), freqüência cardíaca, eletrocardiograma, glicemia e cortisol de vacas no período peri-parto.
Material e métodos
Foram utilizadas 30 fêmeas bovinas e 30 bezerros da raça Holandesa divididos em: Grupo
Eutocia (G EUT; n=10); Grupo Distocia com extração forçada moderada a intensa (G DIST; n=10);
Grupo Atonia ou hipotonia uterina com infusão de Ocitocina (50UI) (G OCT; n=10).
Os neonatos foram avaliados por meio do sistema Apgar e temperatura corpórea ao
nascimento, 5 minutos e 1 hora após o nascimento, bem como por avaliação hemogasométrica (pH,
pCO2, pO2, HCO3, base excess, TCO2, SO2 e anion gap), dosagem de cortisol e glicemia ao
nascimento e após 1 hora de vida. A avaliação materna constituiu no controle da pressão arterial,
monitorização cardíaca, glicemia e dosagem de cortisol em momentos pontuais no pré, intra, pósparto imediato e 1 hora após o término do parto.
Resultados
As vacas apresentaram hiperglicemia de estresse apenas 1 hora pós-parto no G EUT e
G OCT, no entanto, já no intra-parto no G DIST. A distocia também elevou os níveis de cortisol no
pós-parto imediato. Houve acréscimo significativo da PA no intra-parto do G DIST, decorrente de
contrações uterinas e abdominais mais intensas. Os traçados eletrocardiográficos denotaram ritmo
sinusal normal em todos os períodos. Os resultados apresentados demonstram adaptação
hemodinâmica materna frente às alterações do parto, mesmo com infusão exógena de ocitocina. Os
neonatos do G DIST ao nascimento apresentaram menor vitalidade (escore Apgar) e maior estresse
(nível de cortisol) em relação aos demais grupos. Os bezerros apresentaram hipotermia, a despeito
da redução da temperatura corpórea 1 hora pós-parto, e mantiveram-se normoglicêmicos. Ainda, os
valores de base-excess (BE), HCO3- e pO2 eram baixos, enquanto os níveis de anion-gap e pCO2,
elevados ao nascimento (tabela 1). No entanto, apenas no G DIST observou-se acidose mista
(metabólica e respiratória) evidente (pH<7,20), indicando maior grau de sofrimento fetal e redução
de suprimento sangüíneo (tabela 1). Os bezerros do G OCT apresentaram pCO2 superior e pO2
inferior aos demais grupos ao nascimento (tabela 1). A infusão de ocitocina pode promover padrões
de contração uterina diferenciados, comprometendo ainda mais a oxigenação fetal. A ocitocina
alterou momentaneamente as variáveis hemodinâmicas maternas com possível efeito bradicárdico e
hipotensor intra-parto, configurando uma menor adaptabilidade respiratória neonatal, impondo uma
assistência mais criteriosa ao nascimento [2]. Todos os neonatos apresentaram reduzidos valores de
hematócrito e hemoglobina, em decorrência da eritropoiese imatura e intensa metabolização de
eritrócitos fetais [1]. Os bezerros apresentaram recuperação satisfatória do desequilíbrio ácido-base
após 1 hora e capacidade evidente de termorregulação e manutenção glicêmica.
Tabela 1 - Valores médios e desvios-padrão da hemogasometria arterial em bezerros holandeses ao
nascimento e após 60 minutos. São Paulo, 2009.
GRUPO EUT
GRUPO DIST
Ao
1 hora de
Ao
Nascimento
vida
Nascimento
7,29 Ab
7,34 a
7,18 Cb
pH
±0,08
±0,03
±0,11
51,88 Ba
45,14Bb
53,42 B
pCO2 (mmHg)
±7,9
±10,3
±8,4
55,78 A
52,60
50,80 AB
pO2 (mmHg)
±9,3
±17,5
±18,2
21,84 A
23,22
19,17 Bb
HCO3
(mmol/L)
±5,0
±5,5
±8,1
-3,22 A
-1,33
-9,10Bb
BE (mmol/L)
±4,8
±4,7
±10,3
23,3A
24,5
20,6 Bb
TCO2
(mmol/L)
±5,3
±5,7
±8,3
74,7
77,3
60,3
SO2 (%)
±8,0
±11,3
±19,2
12,0
8,8
12,2
Anion Gap
±5,4
±5,0
±10,3
A,B
diferença significativa na mesma linha (p≤0,05)
a,b
diferença significativa na mesma coluna (p≤0,05)
Variável
1 hora de
vida
7,30 a
±0,07
49,40 AB
±8,0
48,80
±16,7
23,29 a
±6,8
-1,33 a
±6,3
24,7 a
±7,0
69,1
±16,7
12,2
±7,3
GRUPO OCT
Ao
Nascimento
7,25 Bb
±0,04
58,69 Aa
±5,4
37,29 B
±9,7
23,53 ±
4,4A
-1,67 A
±3,7
25,14 A
±4,2
60,7
±10,7
11,4
±6,3
1 hora de
vida
7,32 a
±0,04
51,31 Ab
±6,8
41,33
±9,1
25,52
±2,5
-0,44
±2,3
26,8
±2,6
70,2
±16,3
10,9
±2,5
Conclusão
A condição obstétrica ao nascimento é crítica para o desempenho clínico do neonato,
comprometendo sua vitalidade inicial e influenciando a circulação materno-fetal nos casos de
distocias. As alterações circulatórias momentâneas maternas ocasionadas pela ocitocina foram
reversíveis e não comprometeram o êxito neonatal.
Agradecimentos
À FAPESP pelo apoio financeiro (06/50485-7).
Referências
[1] Knottenbelt, D. C., Holdstock, N., Madigan, J. E. 2006. Perinatal review. In: Equine
neonatology. Medicine and Surgery. Philadelphia: Saunders, pp. 1-27.
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intrapartum hypoxia by middle cerebral and umbilical artery Doppler velocimetry with
simultaneous cardiotocography and pulse oximetry. Arch. Gynecol. Obst. 270, 4, 265-270.
EXPRESSÃO GÊNICA DOS RECEPTORES DE ESTRÓGENO E OCITOCINA NO
CORPO LÚTEO, ENDOMÉTRIO, MIOMÉTRIO E PLACENTA DURANTE A
GESTAÇÃO E PARTO EM CADELAS
1
Veiga, G.A.L. ; Millazotto, M.P. 1; Silva, L.C.G. 1, Lúcio, C.F. 1; Vannucchi, C.I. 1
1
Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo
Introdução
As diversas interações hormonais durante a gestação e o parto na espécie canina ainda são
parcialmente desconhecidas. Nos últimos anos, poucos foram os estudos concernentes à expressão
gênica dos principais receptores hormonais frente às mudanças uterinas que ocorrem nestas fases.
A queda dos níveis de progesterona e o aumento de estrógeno ao final da gestação são
possivelmente as principais causas para o descolamento de placenta, dilatação da cérvix e aumento
da contratilidade uterina para o desencadeamento do parto [1]. O controle da síntese de RNAm do
receptor de ocitocina (OTR) no útero é mediado pelo receptor de estrógeno alfa (ERα), este último
regulado pela queda da progesterona sérica [2]. Além da importante expressão no miométrio e
glândula mamária, o OTR também está presente no endométrio, placenta, ovário e outros tecidos
não reprodutivos [3]. Em relação à espécie canina, não há até o momento pesquisas que elucidem
tais mecanismos.
A partir do estuda da expressão gênica dos receptores hormonais, bem como o perfil
endócrino nas diferentes fases da gestação e parto será possível a aplicação terapêutica de
determinados hormônios em situações fisiológicas ou complicações durante a gestação e o parto.
Desta maneira, os objetivos do presente estudo foram caracterizar a expressão gênica dos receptores
de estrógeno e ocitocina no corpo lúteo, endométrio, miométrio e placenta, correlacionando com as
concentrações séricas destes hormônios durante a gestação e parto.
Material e Métodos
As cadelas gestantes foram alocadas em 4 grupos de acordo com a idade gestacional: até 20
dias de gestação (grupo 1, n=11), de 20 a 40 dias de gestação (grupo 2, n=12), de 40 a 60 dias de
gestação (grupo 3, n=12) e pródromos do parto (grupo 4, n= 11). As cadelas do grupo 1, 2 e 3 foram
submetidas à ovário-histerectomia e as cadelas do grupo 4, à cesariana seguida da ováriohisterectomia. Amostras de corpo lúteo, endométrio, miométrio e placenta foram colhidas, bem
como amostras de sangue. A extração do RNA total e a confecção do cDNA das amostras foram
realizadas a partir de kits comerciais. As reações da PCR em tempo-real foram realizadas para os
genes (RNAm) do ERα e OTR, utilizando-se o 18S e RPS5 como controles endógenos. A eficiência
das reações para os genes foi realizada a partir de diluições seriadas de cDNA para cada tecido e o
resultado obtido utilizado para o cálculo da eficiência relativa. As dosagens hormonais foram
realizadas por radioimunoensaio. Os resultados foram testados utilizando-se a análise de variância
para medidas repetidas (ANOVA). O teste de Tukey foi utilizado como teste de comparações
múltiplas complementar à ANOVA para identificação da origem das diferenças. O nível de
significância utilizado foi menor que 0,05.
Resultados
A expressão gênica do RNAmERα e RNAmOTR diferiram de acordo com o tecido e
período gestacional. No corpo lúteo, não houve expressão do RNAmERα durante todo o período
gestacional e no momento do parto, enquanto o RNAmOTR apresentou maior expressão ao início
da gestação (Grupo 1). No endométrio, a expressão do RNAmERα aumentou no momento do parto
(Grupo 4), já o RNAmOTR apresentou aumento da expressão a partir de 40º dia de gestação (Grupo
3 e 4). Em relação ao miométrio, observou-se expressão constante do RNAmERα durante todo o
período gestacional e no parto, enquanto o RNAmOTR é mais expresso a partir do 40º dia de
gestação (Grupo 3 e 4). Na placenta, o RNAmERα possui maior expressão até 40 dias da gestação e
início do parto, por outro lado o RNAmOTR é expresso de maneira constante durante toda a
gestação e início do parto. As concentrações séricas de ocitocina mantiveram-se constantes,
enquanto os níveis estrogênicos aumentaram significativamente a partir de 40 dias de gestação até o
início do parto (Figura 1 e 2).
2,4
2,1
a
1,94±0,11a 1,99±0,08 2,00±0,08b 2
1,9
1,8
20,95±28,05a 50
[ ] Ocitocinapg/ml
[ ] Estrógenopg/ml
2,2
60
2,14±0,16b 2,3
40
17,64±26,46a a
18,13±15,25 15,29±17,78a 30
20
10
0
1,7
1
2
3
4
GRUPOS
Figura 1 – Concentrações séricas de estrógeno nos grupos 1,2,3 e 4
a,b
indica diferença significativa entre grupos(p<0,05)
1
2
3
4
GRUPOS
Figura 2 – Concentrações séricas de estrógeno nos grupos
1,2,3 e 4 a,b indica diferença significativa entre
grupos(p<0,05)
Conclusão
Conclui-se que a expressão gênica dos RNAmERα e OTR diferem de maneira temporal
durante a gestação e o parto nos tecidos avaliados e as concentrações séricas de ocitocina não
interferem na expressão gênica de tais receptores, enquanto os níveis de estrógeno elevam-se ao
final da gestação, sendo possível atribuir a tal perfil a diferente modulação dos ERα e OTR.
Referências
[1] CONCANNON, P.W. Canine Pregnancy and Parturition. Veterinary Clinics of North America
Small Animal Practice, v. 16, n. 3, p. 453-475, 1986.
[2] MURATA, T.; NARITA, K.; HONDA, K.; MATSUKAWA, S.; HIGUCHI, T. Diferential
regulation of estrogen receptor α and β mRNA int the rat uterus during pregnancy and labor:
possible involvement o estrogen receptors in oxytocin receptor regulation. Endocrine Journal, v. 50,
n. 5, p. 579-587, 2003.
[3] KIMURA, T.; SAJI, F.; NISHMORI, K.; OGITA, K.; NAKAMURA, H.; KOYAMA, M.;
MURATA, U. Molecular regulation of the oxytocin receptor in peripheral organ. Journal of
Molecular Endocrinology, v. 30, p. 109-115, 2003.
TRATAMENTO COM BORTEZOMIBE REDUZ FIBROSE MUSCULAR E AUMENTA
EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ASSOCIADAS À DISTROFINA EM CÃES GOLDEN
RETRIEVER COM DISTROFIA MUSCULAR PROGRESSIVA
1
Araújo, K. P. C.1; Duarte, C. N.2; Miglino, M. A.1; Ambrósio, C. E.1
Departamento de Cirurgia – Setor de Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres – FMVZUSP
2
Aluno graduação – FMVZ- USP
Introdução
A Distrofia Muscular Progressiva que acomete cães da raça Golden Retriever (GRMD) é
uma miopatia genética homóloga a Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) em humanos, nos quais
há ausência da proteína distrofina [3]. Necrose das fibras musculares seguida de deposição de
tecido fibroso caracteriza o quadro distrófico de atrofia e fraqueza muscular [4]. Pesquisas recentes
revelam que o sistema proteolítico proteassoma esta associado à degradação da distrofina e de
proteínas do complexo distrofina-glicoproteina (DGC) na patogênese da DMD, e inibidores deste
complexo, como o Bortezomibe, poderiam resgatar a estrutura da distrofina e melhorar a condição
muscular, uma vez que reduz os níveis do fator nuclear kappaB (NFkB) fosforilado envolvido na
expressão de citocinas inflamatórias em diversas patologias, incluindo a DMD [1,2]. O objetivo
desse trabalho foi avaliar a morfologia das fibras musculares de cães GRMD tratados com
bortezomibe, bem como verificar a expressão de phospho-NFκB e das proteínas do complexo DGC
por meio de imunohistoquimica.
Material e Métodos
Administração do bortezomibe foi por via intravenosa nos dias 1, 4, 8 e 11 (segunda e
quintas feiras) durante duas semanas consecutivas seguida por 10 dias de descanso, esse período
compreendia um ciclo de aplicação. Foram realizados 3 ciclos ou 9 semanas de tratamento em dois
animais GRMD; outros três animais foram considerados controles. A dose no primeiro ciclo foi de
1,3 mg/m2, 1,45 mg/m2 no segundo e 1,65 mg/m2 no ultimo ciclo. Biópsias musculares dos cães
GRMD foram coletadas antes (T0) e após (T1) o tratamento com Botezomibe. As amostras foram
processadas para histologia com coloração de HE e microscopia eletrônica de transmissão. Na
imunohistoquimica utilizou-se os anticorpos contra distrofina (DYS-1), α-distroglicano (NCL-αDG), β- distroglicano (NCL-β-DG) obtidos da Novocastra e Phospho-NFκB da Cell Signaling. Os
nucleos positives para phospho-foram contados em 10 regioes de cada animal no aumento x40 e o
teste t de Student foi utilizado para avaliar os resultados.
Resultados
Os resultados de histologia demostraram que os cães tratados apresentaram menor
infiltração de células inflamatórias e menor deposição de tecido conjuntivo em perimisio das fibras
musculares (Fig. 1 A, B). Na microscopia eletrônica observou-se necrose mitocondrial em todas as
fibras musculares, presença de fibroblastos ativados em perimisio e fibras degeneradas com
macrófagos infiltrados. Comprovando os resultados da histologia, os cães não tratados apresentaram
maior deposição de fibras colágenas em endomiso e perimisio das fibras (Fig. 1 C,D). Quanto à
imunohistoquimica, a distrofina esteve ausente nos dois grupos analizados, porem nos animais
tratados observou-se maior expressão das proteinas do DGC (α-distroglicano e β- distroglicano),
indicando maior preservação da estrutura sarcoplasmática. Os cães não tratados apresentaram
significativa (p<.05) contagem de núcleos positivos para phospho-NFkB, sugerindo maior estímulo
pró inflamatório e ativação do proteassoma celular (Fig. 2).
Fig. 1: Histologia e microscopia eletronica de
transmissão do musculo biceps femoral de caes
GRMD em T1. A e C: Cão não tratado, nota-se
maior deposição de tecido conjuntivo em
perimisio e endomisio das fibras (►) e maior
infiltração de celulas inflamatórias (*); B e D:
cão tratado, observa-se melhora da condição
histopatologica muscular e menor deposição de
celulas inflamatórias e tecido fibroso. A e B:
10x (200µm); C e D: 3500x (5 µm)
Fig. 2: A, C: Imunohistoquimica de α e β
distroglicano respectivamente, em cães não
tratados, nota-se menor expressão dessas
proteínas quando comparado aos cães
tratados, evidenciado pela marcação em
marrom ao redor das fibras musculares (B e
D). E e F: Imunohistoquimica de phosphoNFkB, maior número de núcleos positivos
nos cães não tratados (E) quando
comparado aos tratados (F), sugerindo
maior ativação do proteassoma e
degeneração muscular. Aumento: 40x (50
µm)
Conclusão
O bortezomibe foi capaz de reduzir a infiltração de células inflamatórias e a deposição de
tecido conjuntivo nas fibras musculares, bem como aumentar a expressão de proteinas associadas à
distrofina nos cães tratados, sugerindo que a inibição do proteassoma pode melhorar a morfologia e
função do musculo distrófico.
Agradecimentos
Á Fapesp pela suporte financeiro, a Glória Bonuccelli pesquisadora do Kimmel Cancer
Center (Fildadelfia- EUA) pela ajuda técnica e científica na elaboração dos resultados apresentados.
Referências
[1] Bonuccelli, G. et al., 2003. Proteasome inhibitor (MG-132) treatment of mdx mice rescues the
expression and membrane localization of dystrophin and dystrophin-associated proteins. Am. J.
Pathol., 163:1663-1675.
[2] Bonuccelli, G. et al., 2007. Localized treatment with a novel FDA-approved proteasome
inhibitor blocks The degradation of dystrophin and dystrophin-associated proteins in mdx mice.Cell
Cycle, 6:1242-1248.
[3] Hoffman, E.P.; Gorospe, J.R.M., 1991.The animal models of Duchenne muscular dystrophy.
Cur. Top. Memb., 38:113-154.
[4] Valentine, B.A. et al., 1990. Canine X-linked muscular dystrophy: morphologic lesions. J.
Neurol. Sci., 97:1-23.
A DURAÇÃO DA FASE EXPULSIVA DO PARTO IMPÕE MODIFICAÇÕES À
ADAPTAÇÃO NEONATAL IMEDIATA EM BOVINOS?
Silva, L.C.G.1; Silva Jr, R.A.1, Mesquita, B.S.1; Fernandes, G. P. C.1; Mingoti, R.D.1; Freitas, B.
G.1; Vechiato, T.A.F.1; Risolia, P.1; Lúcio, C.F.1; Vannucchi, C.I.1.
1
Departamento de Reprodução Animal - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia –
Universidade de São Paulo
Introdução
O trabalho de parto prolongado, uma das principais causas de mortalidade neonatal, compromete o
fluxo sanguíneo materno-fetal e induz severa hipóxia ao nascimento. Bezerros nascidos em tais
condições apresentam baixa vitalidade clínica e maior probabilidade de óbito prévio ao aleitamento
[1]. Com a premissa de aprimorar a assistência a recém-nascidos bovinos, os objetivos específicos
deste experimento foram: comparar a vitalidade neonatal durante as 4 primeiras horas de vida, de
bezerros nascidos após distintos tempos de fase expulsiva do parto vaginal e avaliar o percentual de
retenção placentária em cada uma das situações obstétricas abordadas.
Material e Métodos
Utilizou-se 31 neonatos bovinos holandeses, nascidos a termo, de ambos os sexos, alocados em
grupos conforme a duração da fase expulsiva do parto: G2h – inferior a 2 horas (n = 16) ou G2/4h –
entre 2 a 4 horas (n = 15). Cada um dos grupos foi dividido em 2 sub-grupos: ESP – parto
espontâneo e DIST – extração fetal por meio de assistência obstétrica leve a moderada. Após a
remoção do fluido amniótico nasal, os neonatos foram avaliados por meio do escore Apgar de
vitalidade e temperatura corpórea aos 0, 5, 10 minutos pós-natal, a cada 10 minutos completando-se
90 minutos de vida e às 2, 3 e 4 horas e contemplou as seguintes determinações: pH, PO2 (mmHg),
PCO2 (mmHg), HCO3- (mmol/L), BE (mmol/L), TCO2 (mmol/L) e SO2 (%). Nos mesmos períodos
de tempo da hemogasometria, a glicemia venosa foi determinada. O padrão radiográfico pulmonar
foi avaliado em três projeções (latero-laterais esquerda e direita e ventro-dorsal) entre os 0 e 20
minutos de vida, sendo priorizado o grau de opacidade do parênquima pulmonar e a definição das
estruturas torácicas na interpretação das imagens. Considerou-se retenção placentária aquela cuja
expulsão foi superior a 12 horas. Os resultados foram testados por ANOVA e Teste de Tukey (p ≤
0,05).
Resultados
Houve significativo aumento dos valores de Apgar no decorrer das quatro horas de vida para todos
os grupos. Entretanto, o G2/4 (EXT) apresentou menor vitalidade ao nascimento e após 5 minutos
(Tabela 1). Não foi constatada hipotermia nos grupos experimentais, todavia, a temperatura
corpórea decresceu significativamente ao longo do período estudado. Os neonatos do G2/4 (ESP)
apresentaram queda significativa da temperatura logo aos 20 minutos de vida, enquanto para os
demais grupos, ocorreu mais tardiamente, entre os 50 e 60 minutos. Esta variável não apresentou
diferença estatística entre os grupos para cada momento avaliado. A avaliação hemogasométrica
não indicou diferença significativa entre os grupos nos diferentes momentos de análise. Todos os
grupos sustentaram o equilíbrio ácido-básico, embora o G2/4 (ESP) tenha apresentado pH
significativamente inferior ao nascimento. Foi observado eucapnia e hipoxemia nos grupos e
momentos avaliados. Notou-se depleção da concentração sanguínea de HCO3- para todos os grupos
e períodos à exceção do G2 (ESP) às 4 horas de vida e do G2/4 (EXT) as 2 e 4 horas do nascimento,
com valores dentro do intervalo fisiológico. Os neonatos dos grupos G2/4 (ESP) e G2/4 (EXT)
imediatamente ao nascimento, exibiram valores de BE abaixos do intervalo fisiológico e de SO2
(%) significativamente inferiores à avaliação após 4 horas, todavia não houve hipóxia. Todos os
bezerros mostraram-se normoglicêmicos. A auscultação pulmonar indicou irregularidade do padrão
respiratório, presença de ruído respiratório de moderado a intenso com evolução satisfatória já na
primeira hora de vida para todos os grupos. Na avaliação radiográfica torácica, todos os neonatos
apresentaram aumento de radiopacidade em região de lobos pulmonares caudais e/ou craniais, com
áreas de indefinição de ramificação brônquica e bronquíolos terminais caudais. Nos grupos G2
(ESP) e G2 (EXT), a visibilização de silhueta cardíaca esteve comprometida em 50 e 57,1% dos
bezerros, respectivamente (Figura 1). Diagnosticou-se retenção placentária em 10,34% das vacas,
todas submetidas à manobra obstétrica. O tempo de expulsão placentária foi significativamente
superior no grupo G2 (EXT) em relação ao G2 (ESP), somente.
Tabela 1. Valores médios e desvios padrão do escore Apgar (0-10) aos 0, 5, 60, 120 e 240 minutos,
do nascimento em neonatos pertencentes aos grupos 2 (ESP), 2 (EXT), 2/4 (ESP) e 2/4 (EXT).
Escore APGAR de vitalidade neonatal
Tempo pós-nascimento (minutos)
GRUPOS
0
5
60
120
240
B, ab
AB, a
A, a
A, a
2 (ESP)
7 ± 1,2
9 ± 0,7
10 ± 0,0
10 ± 0,0
10 ± 0,0 A, a
2 (EXT)
8 ±1,3 B, a
9 ± 0,5 AB, a
10 ± 0,0 A, a
10 ± 0,0 A, a
10 ± 0,0 A, a
2/4 (ESP)
8 ± 1,8 B, a
9 ± 0,6 AB, a
10 ± 0,0 A, a
10 ± 0,0 A, a
10 ± 0,0 A, a
C, b
B, b
A, a
A, a
2/4 (EXT)
6 ± 0,7
8 ± 1,6
10 ± 0,4
10 ± 0,4
10 ± 0,0 A, a
a,b
entre grupos no mesmo momento de avaliação indicam diferença estatística (p ≤ 0,05)
A,B,C
no mesmo grupo em diferentes momentos de avaliação indicam diferença estatística (p ≤ 0,05)
Figura 1. Imagens radiográficas torácicas de neonatos bovinos. A (VD): moderada opacificação em
lobos pulmonares craniais, definição de coração. B (LLD): parcial indefinição de silhueta cardíaca,
discreta opacificação pulmonar caudal. C (LLE): nítida visibilização de traquéia, brônquios,
bronquíolos principais e silhueta cardíaca.
Conclusão
Conclui-se que neonatos advindos de extração fetal e parto prolongado apresentam menor vitalidade
clínica ao nascimento, com recuperação subseqüente. Entretanto, os resultados hemogasométricos
indicam êxito na compensação ácido-básica. A hipoxemia presente é justificada pela presença de
fluidos pulmonares, absorvidos ao longo do período neonatal imediato. A assistência obstétrica leve
a moderada eleva a probabilidade de retenção placentária, independente do tempo de fase expulsiva
do parto. A intervenção obstétrica realizada até 4 horas após a ruptura das membranas fetais pode
ser considerada segura na assistência ao parto de bovinos, todavia em sendo realizada precocemente
(até 2 horas) resulta em maior vitalidade clínica e saturação sanguínea de oxigênio no período
neonatal imediato.
Referência
[1] Riley, D.G.; Chase, C.C.; Olson, T.A.; Coleman, S.W.; Hammond, A.C. 2004. Genetic and
nongenetic influences on vigor at birth and preweaning mortality of purebred and high percentage
Brahman calves. J. Anim. Sci. 82, 1581-1588.
PATOLOGIA DA ASPERGILOSE EM PINGUINS-DE-MAGALHÃES (SPHENISCUS
MAGELLANICUS) NO CENTRO DE RECUPERAÇÃO DE ANIMAIS MARINHOS
(CRAM, RIO GRANDE - RS)
1,5
Ralph Eric Thijl Vanstreels , Melissa Orzechowski Xavier2, Mauro Pereira Soares3, Mário Carlos
Araújo Meireles3, Rodolfo Pinho Da Silva Filho4, Andréa Corrado Adornes4, Alice Teixeira
Meirelles Leite4, José Luiz Catão-Dias1
1
= Laboratório de Patologia Comparada de Animais Selvagens, Depto. de Patologia, Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo; 2 = Depto. de Patologia, Faculdade
de Medicina, Universidade Federal do Rio Grande; 3 = Faculdade de Veterinária, Universidade
Federal de Pelotas; 4 = Centro de Recuperação de Animais Marinhos, Museu Oceanográfico,
Universidade Federal do Rio Grande; 5 = Autor para correspondência:
[email protected]
Introdução
A aspergilose é uma das doenças mais importantes acometendo pinguins em zoológicos e centros de
reabilitação. Foram estudados 20 casos de aspergilose em pinguins-de-Magalhães (Spheniscus
magellanicus) recebidos no Centro de Recuperação de Animais Marinhos da Universidade Federal
do Rio Grande (CRAM-FURG, 32ºS 52ºW, Rio Grande, RS) entre março de 2004 e junho de 2008.
Material e Métodos
Para estudar os casos foram examinados: histórico clínico, necrópsia completa, exame microscópico
direto (hidróxido de potássio 20%), cultura micológica (ágar Sabouraud dextrose com cloranfenicol,
incubação a 35°C por 7 dias) e histopatologia (hematoxilina-eosina, ácido periódico Schiff,
Gomori-Grocott). Os animais apresentaram morte súbita e, mais raramente, anorexia, apatia,
depressão, mudança de vocalização e dispnéia poucas horas antes da morte.
Resultados
À necropsia, constatou-se que a aspergilose restringiu-se ao aparelho respiratório em 50% dos casos
(10/20), com a formação de extensas placas e/ou nódulos de material purulento friável, de coloração
branco-amarelada em pulmões e sacos aéreos, com diâmetro de 1-10 mm, porém em alguns casos
formando massas coalescentes com diâmetro de até 10 cm, além de espessamento difuso de sacos
aéreos, edema e congestão pulmonares. Em 50% dos casos (10/20) a aspergilose apresentou uma
disseminação extra-pulmonar, em que além do comprometimento respiratório também foram
acometidos outros tecidos ou órgãos, como celoma, mesentério, adrenais, fígado e baço. Os exames
microscópicos diretos e culturas micológicas revelaram que a infecção foi causada Aspergillus
fumigatus em 95% dos casos (19/20) e por Aspergillus flavus em 5% dos casos (1/20).
Histologicamente, as lesões caracterizaram-se por extensa formação de material necróticogranulocítico nas áreas de proliferação de hifas, com infiltração granulocítica difusa e áreas de
edema, congestão e necrose nos tecidos circundantes. O padrão de resposta foi predominantemente
granulocítico, com presença de granulócitos ativos e em degranulação nas margens das lesões, mas
também com a ocorrência variável de infiltração mononuclear e proliferação do tecido linfóide
regional. Em alguns casos observou-se a formação de células gigantes tipo corpo estranho nas
margens das lesões, porém em apenas dois casos houve formação de granulomas típicos. Estes
granulomas apresentavam-se na forma de massas caseosas envoltas por uma camada de células
gigantes tipo corpo estranho, entremeadas com alguns granulócitos nas margens da lesão e sem
fibroplasia evidente. Embora as estruturas fúngicas tenham sido visíveis à hematoxilina-eosina, as
colorações especiais facilitaram a evidenciação das mesmas e revelaram que as hifas adquiriam
distribuição periférica nas massas necrótico-purulentas.
Conclusão
A aspergilose é frequentemente descrita como uma doença oportunista que acomete animais
imunocomprometidos, o que é coerente com o contexto de grande estresse e estado debilitado
(tipicamente por caquexia, anemia e hipotermia) em que os pinguins são recebidos nos centros de
reabilitação. Devido à dificuldade do diagnóstico precoce, à inevitabilidade da condição de
debilidade imunológica e à severidade potencial da doença, muitos centros de reabilitação têm
optado pela profilaxia medicamentosa com itraconazol nos animais mais debilitados (peso abaixo
de 2.5 kg) nas primeiras semanas de reabilitação, porém a eficiência desta abordagem só foi
estudada preliminarmente e ainda requer análises mais detalhadas.
Agradecimentos
O presente trabalho foi realizado com apoio do CNPq.
Fig. 1 (H.E. 400x): Observar a presença de extensa massa de material
necrótico contendo hifas e a infiltração granulocítica marginal.
Fig. 3 (Gomori-Grocott 400x): Notar hifas bem evidenciadas e com
distribuição delimitadas às áreas necróticas.
Fig. 5 (PAS 1000x): Notar a ocorrência de conídeos.
Fig. 2 (PAS 400x): Notar extensa massa necrótica contendo
hifas abundantes, infiltração granulocítica discreta, e
esparsas células gigantes do tipo corpo estranho.
Fig. 4 (PAS 400x): Observar o padrão
granulomatoso, com extensa formação de
células gigantes de tipo estranho e necrose
caseosa.
Fig. 6: Notar a presença de múltiplos
nódulos necróticos disseminados em pulmão
e traquéia.
PATOLOGIA DA MALÁRIA AVIÁRIA EM PINGUINS-DE-MAGALHÃES (SPHENISCUS
MAGELLANICUS) EM UM CENTRO DE TRIAGEM DE ANIMAIS SILVESTRES
(NÚCLEO DE FAUNA DO IBAMA, FLORIANÓPOLIS - SC)
Cristiane Kiyomi Miyaji Kolesnikovas1, Ralph Eric Thijl Vanstreels2,5, Mário Steindel3,
Sandro Sandri1, Sabrina Epiphanio4, José Luiz Catão-Dias2
1
= Associação R3 Animal (Florianópolis, SC); 2 = Laboratório de Patologia Comparada de Animais
Selvagens, Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade de São Paulo; 3 = Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Centro
de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Santa Catarina; 4 = Departamento de Ciências
Biológicas, Universidade Federal de São Paulo; 5 = Autor para correspondência:
[email protected]
Introdução
Os pinguins apresentam particular sensibilidade à malária aviária, causada por protozoários do
gênero Plasmodium (P. relictum, P. elongatum, P. juxtanucleare e P. cathemerium), e transmitidos
por mosquitos. Em cativeiro, a doença desenvolve um curso agudo e agressivo, levando à morte
súbita de 40-80% dos animais afetados. Em março de 2009, o Centro de Triagem de Animais
Silvestres do Núcleo de Fauna do IBAMA Florianópolis mantinha em reabilitação 28 pinguins-deMagalhães (Spheniscus magellanicus) recebidos ao longo do ano anterior.
Materiais e Métodos
Após a morte súbita de dois animais, esfregaços sanguíneos delgados corados pelo Giemsa foram
realizados de todos os animais sendo que 50% (14/28) mostraram-se positivos. Todos os animais
foram submetidos a tratamento inicial (1 mg/kg cloroquina hora zero; 5 mg/kg às 6, 18 e 24hs;
depois 5mg/kg SID por 10 dias) e testados novamente ao término do tratamento. Aqueles que
continuaram positivos foram submetidos a um tratamento complementar com trimetropim sulfa
(40mg/kg por 10 dias) e submetidos a sucessivos esfregaços delgados para controle. Após 45 dias
dos primeiros óbitos, 17 animais permaneciam vivos e sem sinais clínicos. Os 11 animais que
vieram a óbito (39,3%) foram necropsiados e fragmentos de seus órgãos foram coletados e fixados
para histopatológica.
Resultados
Nenhum desses pingüins apresentou sinais clínicos ante-mortem. À necropsia observou-se
cardiomegalia, hidropericárdio, hepatomegalia, esplenomegalia e intensa congestão pulmonar,
achados compatíveis aos descritos em literatura em surtos de malária em pinguins.
Os achados microscópicos mais relevantes foram congestão, edema e hemorragia pulmonares
moderados a severos, associados à infiltração granulocítica difusa moderada; esplenite necrótica
difusa moderada-severa, congestão moderada e áreas de hemorragia e eritropoiese extramedular;
congestão hepática moderada-severa associada à hepatite multifocal periportal mononuclear e áreas
de hemorragia. Nos pulmões e no baço observaram-se raras estruturas compatíveis com merontes
(esquizontes) teciduais, caracterizadas como estruturas císticas de 10-30 micrômetros repletas de
merozoítos, com pouca ou nenhuma reação inflamatória adjacente.
Conclusão
Embora sejam abundantes os relatos de surtos de malária aviária em pinguins cativos, poucos
estudos detalham a patologia e a patogenia do processo, assim como discutem os motivos da
elevada sensibilidade destas aves à enfermidade. Estudos moleculares complementares estão sendo
realizados para a confirmação da espécie do agente envolvido.
Agradecimentos
O presente trabalho foi realizado com apoio do CNPq, Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico - Brasil.
Esfregaço sanguíneo (Giemsa 1000x): Múltiplos
trofozoítos jovens, em formato típico de
“ringworm”; notar que em alguns casos há mais
de um parasita por eritrócito.
Esfregaço sanguíneo (Giemsa 1000x): Múltiplos
trofozoítos jovens e dois trofozoítos maduros;
notar que o deslocamento nuclear é
relativamente pequeno e as formas parasitárias
ultrapassam o tamanho do núcleo.
Pulmão (H.E. 1000x): Meronte tecidual (seta) Baço (H.E. 1000x): Meronte tecidual (seta) em
em célula reticuloendotelial do parênquima célula mononuclear fagocítica esplênica; notar a
pulmonar acentuadamente congesto.
acentuada esplenite necrótica difusa e
linfocitólise.
Cavidade celomática: Notar
severa e hidropericárdio.
hepatomegalia Pulmão: Observar a severa congestão pulmonar.
PREVALÊNCIA DE NEOPLASIAS EM CALLITHRIX GEOFFROYI HUMBOLDT, 1821
(CALLITRICHIDAE –PRIMATES) MANTIDOS EM CATIVEIRO NO CENTRO DE
PRIMATOLOGIA DO RIO DE JANEIRO
Santos, S.V¹.; Leite, M.C.P¹.; Pissinatti, A².; Catão-Dias, J.L¹.
¹ Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de
São Paulo.
² Centro de Primatologia do Rio de Janeiro-CPRj
e-mail: [email protected]
Introdução
Doenças neoplásicas estão entre as mais importantes causas de morbidade e mortalidade em
animais domésticos [2]. Apesar da prevalência de neoplasia em animais selvagens não ser
plenamente conhecida, sua incidência está aparentemente aumentando e acredita-se que um dos
principais fatores responsáveis por esta tendência é a maior sobrevida destes animais em cativeiro.
O Brasil abriga a maior fauna primatológica do planeta e enfrenta uma série de desafios em virtude
da destruição ambiental contínua: desse modo investigar processos mórbidos de espécies
ameaçadas, como Callithrix geoffroyi, fornece subsídios para sua conservação [4].
Relata-se a prevalência de 1.9% de neoplasias em um total de 1106 símios necropsiados [1,5].
Levantamentos apontam que as neoplasias afetam mais o trato gastro intestinal de platirrinos e
destes, 50% são malignos [5]. Casuística de linfomas e leucemias foram reportadas em diversas
espécies de animais, correlacionados muitas vezes com infecções por herpesvirus [6]. Quanto as
neoplasias epiteliais, 14 casos espontâneos de carcinomas de células escamosas em 13 babuínos e
um exemplar de macaco aranha foram descritos [3]. As neoplasias endócrinas são relatadas,
sobretudo as de glândula adrenal [1]. Pretende-se com o presente trabalho relatar casos de neoplasia
em C. geoffroyi, contribuindo para a compreensão destes processos em primatas não humanos
(PNH), bem como alertar clínicos de animais selvagens quanto ao aumento de mortalidade e
morbidade atribuídas aos casos neoplásicos frente a maior expectativa de vida dos animais em
cativeiro. Além disso, investigar oncologia em PNH contribui como modelo biológico para o
homem.
Material e métodos
Foram coletados 63 C. geoffroyi de ambos os sexos e de várias faixas etárias que vieram a óbito
entre os anos de 1978 e 1998 pertencentes ao acervo do Centro de Primatologia do Rio de Janeiro.
Estes animais possuíam detalhados históricos reprodutivo, clínico-laboratorial e necroscópico, além
de fragmentos de seus tecidos conservados em formol. A partir desse material foram
confeccionadas lâminas histológicas e procedeu-se ao estudo microscópico. Técnica de
imunoistoquímica streptovidina-biotina peroxidase foi empregada, visando uma maior acurácia
diagnóstica.
Resultados
Neoplasmas foram diagnosticados em 6% (4/63) dos animais estudados, sendo 3% (1/33) e 10%
(3/10) dos machos e fêmeas, respectivamente.
A necropsia do macho adulto (1476), revelou pâncreas aumentado de volume com nódulos
avermelhados e áreas amareladas ao corte. A histopatologia revelou diversas massas tumorais de
origem endócrina comprimindo severamente a porção exócrina do órgão. Através do estudo
imunoistoquímico com anticorpos (AC) policlonais anti-insulina (+),anti cromogranina A
(LK2H10) (+) e anti-glucagon (+/ -), demonstrou-se que o tumor pancreático era uma neoplasia
neuro-endócrina mista, com poucas células produtoras de glucagon, enquanto a maioria delas
produzia insulina.
Na necropsia da fêmea adulta (660) observaram-se escarificações em membros posteriores e
espessamento da parede intestinal, linfadenomegalia mesentérica, fígado e baço com aspectos
granulosos ao corte e petéquias e sufusões em parênquima pulmonar. O estudo histopatológico por
sua vez revelou a presença de múltiplos infiltrados neoplásicos compostos por células redondas com
pouco citoplasma, distribuídos pelos parênquimas hepático, renal, esplênica e adrenal. A
imunoistoquímica confirmou a suspeita diagnóstica histopatológica de leucemia mielóide a partir de
tecido hepático com imunoreatividade para anticorpo anti-mieloperoxidase (+).
Dois outros animais (450 e 591) desenvolveram neoplasias malignas. A fêmea 450 apresentava
metástase tumoral em diversos tecidos, mas devido adiantado estado de autólise do material não foi
possível identificar células responsáveis pelo processo, nem sua origem.
A fêmea 591 exibia neoplasia, de possível origem provável muscular (musculatura lisa de trato
digestivo: leiomiossarcoma). Os resultados, inclonclusivos, foram negativos para: anti CD45; antiCD3, anti-desmina, anti-actina muscular, anti-cd3, anti-citoqueratina AE1/AE3.
Fig.1a
Fig.1b
Fig.1c
Fig.3 Fig.2a
Fig.2b
Fig.2c
Figura 3. Macroscopia (caso 660).
Figura 1. Diagnóstico histopatológico (fig.1a/b) e imunoistoquímico (fig.1c) da leucemia mielóide.
Figura 2. Diagnóstico histopatológico (fig.2a/b) e imunoistoquímico (fig.2c) tumor neuro-endócrino
de ilhotas pancreáticas.
Conclusão
Pouco se sabe quanto aos fatores predisponentes neoplásicos que atuam em primatas neotropicais
mantidos em cativeiro. O presente relato objetiva contribuir para a compreensão destes processos
em uma espécie importante do bioma Mata Atlântica e, desta forma, agregar informações para a
pesquisa oncológica neste animais e para modelos biológicos em humanos.
Agradecimentos: CNPq e FAPESP.
Referências
[1] Brack, M. 2000. Adrenal gland tumors in two cotton-top tamarins (Saguinus Oedipus Oedipus).
Aboratório Animals.v.34, pp.106-1110.
[2] Cubas Z.S., Silva J.C.R. & Dias C.J.L. 2006. Neoplasias. In: Tratado de Animais Selvagens Medicina Veterinária. São Paulo: Roca, p. 83.
[3] Haddad JL, Dick EJ Jr, Guardado-Mendoza. 2009. Spontaneous squamous cell carcinomas in 13
baboons, a first report in a spider monkey, and a review of the non-human primate literature. J Med
Primatol. Jun;38(3):175-86.
[4] LEITE, M.C.L. Patologia comaparada de Callithrix geoffroyi Humboldt, 1812 (CallithrichidaePrimates) mantidos em cativeiro no Centro de Primatologia do Rio de Janeiro.2002.205p.
Dissertação (mestrado). Faculdade de medicina veterinária e zootecina da Universidade de São
Paulo-FMVZ/USP, São Paulo.781-814.
[5] Lowestine,L.J. Neoplasms and disorders in nonhumans primates.1986.Primates.New York:
Springer-Lerlag, PP.
[6]Ramer,J.C. O’rourke,C. 2000. Fatal lymphoproliferative diseases associated with a novel
gammaherpesvirus in captive population of common marmosets. Comparative medicine, v.50, n.1,
pp.59-68.
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA À ELETROQUIMIOTERAPIA EM FIBROSSARCOMA
DIFERENCIADO EM BOTHROPS ALTERNATUS. RELATO DE CASO
Santos, S.V.¹; Rangel, M.M ¹; Grego, K.².; Sant’Anna, S.S.²; Catão-Dias, J.L¹; Dagli, M.L.Z;
Sterman, F.A³; Pinto, A.C.B.C.F³.
¹Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de
São Paulo; ²Laboratório de Herpetologia-Instituto Butantan; ³ Departamento de Cirurgia da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo – Diagnóstico por
Imagem.
E-mail: [email protected]
Introdução
Apesar da prevalência de neoplasia em animais selvagens não ser plenamente conhecida, sua
incidência está aparentemente aumentando e acredita-se que um dos principais fatores responsáveis
por esta tendência é a maior sobrevida destes animais em cativeiro. Neoplasias estão entre as mais
importantes causas de morbidade e mortalidade em animais domésticos [1].
Em répteis as neoplasias são consideradas raras [4], sendo descritos apenas alguns relatos de casos.
Dentre os répteis as serpentes apresentam a maior prevalência de neoplasias. [5]
Levantamentos casuísticos antigos em zoológicos mostram uma incidência de apenas 2,5 a 3,8% de
neoplasias em relação às enfermidades que acometem os répteis [4]. Revisões recentes, porém,
apontam uma incidência de 12,4 a 23%, sugerindo um crescimento nesta freqüência [3]. A
eletroquimioterapia (EQT) é uma nova modalidade de terapia contra o câncer que consiste na
combinação da administração de um agente antineoplásico à aplicação de um campoelétrico
específico, potencializando a ação do agente [2]. Atualmente existem vários métodos de tratamento
contra o câncer, porém se diferem muito quanto à eficácia, custo, tempo de tratamento e
recuperação do paciente. Desse modo, o presente trabalho procurou avaliar a eficiência do
tratamento eletroquimioterapico em um espécimen de Bothrops alteternatus acometido por
fibrossarcoma diferenciado.
Relato de Caso: Um espécimen de serpente Bothrops alternatus, macho, com 285 gramas, 7 anos e
com 90-103 cm de comprimento cloacal, mantida no setor de produção de veneno do Laboratório
de Herpetologia do Instituto Butantan desde 2002, nascida em cativeiro apresentou uma massa
firme, medindo 1,6x1,4x1,5 cm, circunscrita, regular, localizada no terço distal dorsal-lateral do
corpo. O animal foi submetido a exame clínico-oncológico complementar, incluindo hemograma
completo, radiografias dorso-ventral e latero–lateral, além de biópsia com prévia anestesia local
infiltrativa em cordão com lidocaína 1% sem vasoconstrictor. A seguir o fragmento colhido, de
aspecto gelatinoso e amarelado, foi fixado em formalina a 10% e processado de acordo com as
técnicas rotineiras de histologia para a obtenção de lâminas coradas em hematoxilina-eosina.
Coloração específica de Tricrômio de Masson e Alcian foram realizadas para melhor elucidação e
diferenciação histopatológica. Os resultados histopatológicos confirmaram o diagnóstico da massa
como fibrossarcoma diferenciado. Após 3 meses do diagnóstico foi realizada anestesia local como
anteriormente descrita e aplicações de bleomicina intratumoral e endovenosa, ambas na dose de
15.000 UI/m², dose baseada em experimentos prévios de toxicidade para bleomicina em grupo de
seis serpentes, ainda em andamento. Em seguida, foi realizado aplicação local de 8 pulsos elétricos
bifásicos com duração de 100 microssegundos e intensidade de 1300 V/cm, como prescrito em se
tratando de lesão cutânea [2]. No pós cirúrgico foi utilizado meloxicam na dose de 2 mg/kg a cada
48 horas durante três dias.
Resultados
Os resultados mostraram que o tratamento foi bem tolerado, sendo que durante o evento observouse contração transitória involuntária muscular no instante do pulso elétrico que não apontou efeitos
adversos, exceto a anorexia no mês da realização do procedimento. No terceiro dia seguinte do
evento, o local afetado demonstrou discreta mudança na coloração com pouco eritema e diminutas
perdas de escamas dérmicas; notou-se também alteração na consistência da massa, que de firme e
circunscrita passou a macia e mal delimitada com redução de volume de 19% correspondente a
1,3x1,2x1,3cm de volume. Após 10 dias o animal desenvolveu miíase no local do procedimento.
Após a remoção mecânica das larvas, notou-se secreção purulenta amarronzada em pequena
quantidade no orifício central, com halo de necrose na margem da ferida. Observou-se também,
redução do volume de 61,5%, correspondente a 0,8x0,5x0,8 cm. Após 22 dias do procedimento foi
realizado um controle radiográfico dorso-ventral e latero-lateral do animal para pesquisa de focos
metastáticos, comparação com a imagem da formação antes e após EQT, bem como possíveis
efeitos colaterais como fibrose pulmonar. Avaliação recente do local afetado, apontou cicatriz frágil
sem eventos de inflamação ou neoformação. Quanto à toxicidade hematológica e bioquímica de
ácido úrico, os dados obtidos não apontaram alterações nas avaliações pré e pós EQT. Contudo o
controle radiográfico apontou discreta radiopacidade fibrilar pulmonar se comparada a imagem que
antecede a EQT. Até o momento o tratamento foi efetivo apresentando 100% de cura e 0% de taxas
de recidivas e metástases controladas com nova biópsia, além da radiografia. Monitoramento
clínico, patológico e por imagem serão realizadas a cada seis meses.
1
2
3
4
Figura 1. Microscopia 200X. H&E. Figura 2. Fibrossarcoma na pré EQT. Figura 3.
EQT. Figura 4. Pós EQT.
Conclusão
Pretende-se com o trabalho ampliar o conhecimento na área de oncologia em animais silvestres,
bem como sugerir a eletroquimioterapia, como uma alternativa para o tratamento de neoplasias de
diversas origens em serpentes. O tratamento mostrou-se pouco invasivo, de baixo custo e fácil
aplicação, com elevadas taxas de resposta positivas. Nosso trabalho demonstra a mesma eficácia
em répteis, trazendo benefícios conservacionistas bem como para produção toxinológica como no
caso desta espécie, B. alternatus, produtora de toxina e soro botrópico do Instituto Butantan.
Agradecimentos: Aos técnicos de Radiologia Hugo e Reinaldo e médica veterinária radiologista
Silvana do Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade
de São Paulo. Apoio: CNPq e FAPESP.
Referências
[1] Cubas Z.S., Silva J.C.R. & Dias C.J.L. 2006. Neoplasias. In: Tratado de Animais Selvagens Medicina Veterinária. São Paulo: Roca, p. 83.
[2] Cemazar M, Tamzali Y, Sersa G, Tozon N, Mir LM, Miklavcic D, Lowe R, Teissie J.
Electrochemotherapy in veterinary oncology. J Vet Intern Med. Jul-aug.; 22(4):826; 2008.
[3] Dias C.J.L. & Nichols D.K. Neoplasia in snakes at the National Zoological Park, Washington,
DC (1978-1997). J. Comp. Path. v. 120, p. 89-95; 1999.
[4] Lucke´ B. & Schlumberger H.G. Neoplasia in cold-blooded vertebrates. Physiological Review,
29, 91–126, 1949.
[5] Montali R.J. An overview of tumours in zoo animals. In: Comparative Pathology of Zoo
Animals, R.J. Montali and G. Migaki, Eds, Smithsonian Institution Press, Washington, D.C., pp.
531–542; 1980.
INFECÇÃO EXPERIMENTAL COM ESTIRPES NACIONAIS DO HERPESVÍRUS EQÜINO
TIPO 1 EM CAMUNDONGOS ISOGÊNICOS BALB/c (H2d), C57BL/6 (H2b) e C3H/HeJ (H2K)
Larissa Lais Favaro1, Claudia Madalena Cabrera Mori1, Maria do Carmo Custodio de Souza Hunold
Lara2, Eliana Monteforte Cassaro Villalobos2, Elenice Maria Sequetin Cunha2, Paulo Cesar
Maiorka1 & Enio Mori1
1
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo,
Brasil.2Instituto Biológico, São Paulo, Brasil. E-mail: [email protected]
Introdução
O herpesvírus eqüino tipo 1 (EHV-1) é um importante agente infeccioso em cavalos causando
rinopneumonite, abortamento a vírus, mortalidade perinatal e mieloencefalopatia. Investigações
utilizando o hospedeiro natural geralmente são trabalhosas, onerosas, de difícil padronização e,
freqüentemente, limitadas pelo fato do vírus encontrar-se endêmico na população eqüina.
Alternativamente, modelos em camundongos têm sido utilizados devido às similaridades
encontradas com a infecção no cavalo [1]. Estirpes nacionais do EHV-1 demonstraram ser
altamente virulentas quando inoculadas por via intranasal em camundongos BALB/c. Sabe-se que a
resposta imune as herpesviroses nas diferentes linhagens de camundongos está relacionada a fatores
genéticos, particularmente ao gene H2 do complexo de histocompatibilidade principal (MHC),
determinando assim linhagens susceptíveis (haplotipo H2d) ou resistentes (haplotipos H2b e H2k) à
infecção herpética [2]. O presente trabalho tem como objetivo comparar a resposta de diferentes
linhagens de camundongos isogênicos frente à infecção pelo EHV-1, visando o desenvolvimento de
um modelo animal que auxilie no estudo da patogenia da doença.
Materiais e métodos
Foram utilizados 54 camundongos, fêmeas, com oito semanas, das linhagens BALB/c (H2d),
C57BL/6 (H2b) e C3H/HeJ (H2k) provenientes do Biotério do Departamento de Patologia da
FMVZ/USP. Os animais foram mantidos em gaiolas de polipropileno com filtro na tampa medindo
365×270×140mm. Utilizou-se cama de maravalha de pinus autoclavada, trocada semanalmente.
Água filtrada e autoclavada e ração comercial autoclavada foram oferecidas ad libitum durante todo
o experimento. As condições de alojamento e manejo, bem como os procedimentos experimentais
adotados, foram aprovados pela Comissão de Bioética do Instituto Biológico (protocolo 70/08
CETEA-IB) e estão de acordo com a as recomendações internacionais. Após anestesia pela
associação de quetamina (100mg/kg) e xilazina (20mg/kg), três camundongos de cada linhagem
foram desafiados por via intranasal com as doses infectantes de 104, 103, 102 e 101 DICT50/25µL da
estirpe A4/72 e 102,7 DICT50/25 µL da estirpe A3/97 do EHV-1. Os animais do grupo controle
foram submetidos aos mesmos procedimentos e receberam 25 µL do meio de cultura MEM de
Eagle estéril. Os camundongos foram pesados individualmente e examinados duas vezes ao dia
observando-se o aparecimento de manifestações clínicas e neurológicas. De acordo com surgimento
dos sintomas, os animais foram eutanasiados por overdose de anestésico e fragmentos dos órgãos
internos (cérebro, fígado, pulmão, baço, e timo) foram utilizados para o isolamento viral em cultura
de células E-dermal.
Resultados
As três linhagens de camundongos testadas foram sensíveis à estirpe A4/72 do EHV-1. Todos os
animais que foram inoculados com doses infectantes variando entre 104 e 102 DICT50/25 µL
apresentaram manifestações clínicas severas, tais como: perda de até 4g de peso corpóreo, pêlos
arrepiados, apatia intensa, dispnéia, desidratação, hipotermia e decúbito lateral, ocorrendo 100% de
mortalidade entre o 3º e 4º d.p.i. Observaram-se também sinais neurológicos como
hiperexcitabilidade, paralisia espástica, perda da propriocepção, andar em círculos e convulsões,
indicando comprometimento do SNC. Nos grupos que receberam menor carga viral, ou seja, 101
DICT50/25 µL, houve sobrevida de dois camundongos das linhagens BALB/c e C3H/HeJ e de um
camundongo da linhagem C57BL/6, os quais não apresentaram sintomatologia clínica. Os achados
de necropsia mais importantes foram aumento de linfonodos submandibulares e mesentéricos,
hiperplasia de baço, edema pulmonar, atrofia do timo e hemorragia de meninges. Os camundongos
inoculados com a estirpe A3/97 não apresentaram manifestações clínicas evidentes até o vigésimo
d.p.i e não foram observadas alterações macroscópicas nos seus órgãos internos. Na prova de
isolamento viral observou-se efeito citopático característico do EHV-1 nas amostras de cérebro,
fígado, pulmão, baço, e timo de todos os camundongos desafiados como a estirpe A4/72, no período
de 24 a 72 horas após a inoculação da suspensão dos órgãos macerados em cultura de células. Já
nos camundongos inoculados com a estirpe A3/97, somente as amostras de pulmão foram positivas
para o isolamento viral.
Conclusão
Os resultados demonstraram diferenças na patogenicidade das estirpes nacionais A4/72 e A3/97 do
EHV-1 no modelo de infecção em camundongos. Enquanto as três linhagens de camundongos
submetidos ao desafio viral com a estirpe A4/72 do EHV-1 foram susceptíveis à doença,
desenvolvendo manifestações clínicas severas com comprometimento do SNC, seguidas da morte
dos animais inoculados; a estirpe A3/97 foi apatogênica nesses modelos animais. Nos grupos que
receberam menor carga viral houve sobrevida de alguns camundongos, os quais não desenvolveram
manifestações clínicas, sugerindo que uma resposta efetiva do hospedeiro contra a infecção é capaz
limitar a disseminação viral, sendo o principal fator que determina a evolução da doença. A resposta
imune é responsável por conter e controlar a replicação do agente; paradoxalmente, essa mesma
resposta pode contribuir para o desenvolvimento das lesões. Podemos concluir que o modelo em
camundongos é particularmente vantajoso na identificação e compreensão dos componentes da
resposta imune do hospedeiro frente à infecção viral, pois os fatores ambientais, bem como as
variáveis associadas ao hospedeiro e ao patógeno podem ser rigorosamente controlados.
Agradecimentos
Fundação de Amparo à Pesquisa (FAPESP).
Referências
1.Awan A.R., Chong Y.C., & Field H.J. 1990. The pathogenesis of equine herpesvirus type 1 in the
mouse: a new model for studying host responses to the infection. Journal of General Virology. 71:
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2.Guénet J.L. 2005. Assessing the genetic component of the susceptibility of mice to viral
infections. Briefings in functional genomics & proteomics. 4: 225-240.