universidade estadual do norte fluminense darcyribeiro luiz

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
LUIZ ANTONIO ECKHARDT DE PONTES
AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA DAS CAVIDADES ORAL E CLOACAL DE BOIDEOS
DE CATIVEIRO E VIDA LIVRE, COM ÊNFASE EM SALMONELLA SPP. NO BRASIL
CAMPOS DOS GOYTACAZES/RJ
ABRIL/2013
LUIZ ANTONIO ECKHARDT DE PONTES
AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA DAS CAVIDADES ORAL E CLOACAL DE BOIDEOS
DE CATIVEIRO E VIDA LIVRE, COM ÊNFASE EM SALMONELLA SPP. NO BRASIL
Tese de Doutorado apresentada ao Centro
de Ciências e Tecnologias Agropecuárias da
Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, como requisito para a
obtenção do grau de Doutor em Ciência
Animal na área de concentração de
Sanidade animal.
ORIENTADOR – OLNEY VIEIRA DA MOTTA
CAMPOS DOS GOYTACAZES
ABRIL/2013
LUIZ ANTONIO ECKHARDT DE PONTES
AVALIAÇÃO DA MICROBIOTA DAS CAVIDADES ORAL E CLOACAL DE BOIDEOS
DE CATIVEIRO E VIDA LIVRE, COM ÊNFASE EM SALMONELLA SPP. NO BRASIL
Tese de Doutorado apresentada ao Centro de
Ciências e Tecnologias Agropecuárias da
Universidade Estadual do Norte Fluminense
Darcy Ribeiro, como requisito para a obtenção
do grau de Doutor em Ciência Animal na área
de concentração de Sanidade animal.
Aprovada em 02 de abril de 2013
BANCA EXAMINADORA
Prof. João Carlos de Aquino Almeida (Doutor, Ciências Biológicas) - UENF
Profa. Dalia Prazeres Rodrigues (Doutora, Ciências - Bacteriologia) – FIOCRUZ
Prof. Leonardo Serafim da Silveira (Doutor, Produção Animal) - UENF
Prof. Carlos Eurico Pires Ferreira Travassos (Doutor, Ciências - Microbiologia) - UENF
Prof. Olney vieira da Motta (Doutor, Biociências e Biotecnologia) - UENF
(Orientador)
A
MINHA MÃE, JANET BORGES ECKHARDT (IN MEMORIAN), QUE SEMPRE ME APOIOU
EM TUDO.
AOS
AMIGOS QUE SE FORAM NESTA CAMINHADA E DEIXARAM SAUDADES, GUILHERME
VASCONCELOS MANHÃES E TIAGO MARTINS DAVID (IN MEMORIAN) .
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro (UENF), ao
Centro de Ciências e Tecnologias Agropecuárias (CCTA), ao Programa de Pósgraduação em Ciência Animal, pelo oferecimento deste curso e a FAPERJ pelo
fornecimento da Bolsa;
A Fundação Zoobotânica de Belo Horizonte, a Fundação Riozoo, ao Sítio
Xerimbabo (Criatório Comercial) por cederem os animais para as coletas;
Ao meu orientador Olney Vieira da Motta, pelos ensinamentos e por embarcar
neste projeto;
A Dra. Dália dos Prazeres Rodrigues, pelos ensinamentos e ajuda no
desenvolvimento deste trabalho;
Aos Técnicos e estudantes de graduação e Pós-graduação da Fiocruz por toda a
ajuda;
A minha mãe, Janet, que esteve sempre ao meu lado, mas agora somente olhará
por mim; A meus irmãos, Jorge Luiz Eckhardt, Anna Paula Eckhardt e Juliana Pontes
que sempre me apoiaram;
A minha esposa Melissa Paes Petrucci, minha sogra Sylvia Paes e minha
cunhada Anna Paes Petrucci;
Ao meu Padrasto, Frederico de Almeida Rego Jr. pelo apoio e o orgulho de
seguir sua profissão;
As técnicas, Maria de Lurdes e Gina, e toda a equipe pertencente aos
laboratórios de Sanidade Animal, pelos serviços prestados e ajuda nas horas de
dificuldade;
Aos alunos de graduação e Pós-graduação, Felipp Silveira, Elisabete Salles,
Fabio Queiroz e Carlos Henrique, Fernanda Queiroz, Shaytner Duarte e Heloísa Duarte
que sempre contribuíram positivamente durante o doutorado;
A Tia Rita Paes que vem me apoiando desde a época da graduação;
A todos os professores e amigos, que me deram muitos momentos de alegria e
que me ajudaram durante toda jornada.
Obrigado a todos!
EPÍGRAFE
“A grandeza de uma nação pode ser julgada pelo modo como seus animais são
tratados”
M. Gandhi.
RESUMO
Os répteis representam um importante segmento do mercado de animais de estimação
nos Estados Unidos da América (EUA) e a estreita relação entre esses animais e os
seres humanos têm sido associados ao aumento do fator de risco de transmissão de
várias doenças com caráter zoonótico, principalmente a Salmonella spp. O presente
estudo descreveu a micobiota de serpentes da espécie Boa constrictor em ambientes
de vida livre, no município de Campos dos Goytacazes e ambientes de cativeiro, como
um criatório comercial de serpentes localizado no Pará, e dois zoológicos na Região
Sudeste do Brasil, Fundação Riozoo, no Rio de Janeiro e Fundação Zoobotânica de
Belo Horizonte em BH, em um total de 130 animais. Foram coletadas amostras com
auxílio de suabes estéreis da cavidade oral e da cloaca das serpentes. Análises
bioquímicas foram realizadas na identificação fenotípica das amostras. Os padrões de
resistência e susceptibilidade a 12 antibacterianos padronizados para as espécies
Gram-positivas e 11 antibacterianos padronizados para espécies Gram-negativas,
foram estudados através da técnica de imunodifusão em ágar. Para a identificação de
isolados de salmonela foi utilizado o caldo de enriquecimento Rapapport Vassiliadis.
Foram identificados 246 isolados de bactérias na cavidade oral e 296 isolados na região
da cloaca, ambos pertencentes a vários gêneros bacterianos. Na cavidade oral foi
detectado um isolado de Salmonella spp. e na cloaca foram identificados 96 isolados,
todos foram sorotipados na Fundação Oswaldo Cruz utilizando a técnica de KauffmanWhite, os isolados de Salmonella spp. foram testados frente a 17 antimicrobianos. Os
46 isolados de S. enterica subsp. arizonae e S. enterica subsp. diarizonae e um isolado
de Salmonella ser. Typhimurium foram testados através da técnica de PCR para a
presença dos genes de fatores de virulência (invE/A, phoPQ, orgA, hilA, mgtC e sefA).
08 isolados de S. enterica subsp. arizonae e 20 de S. enterica subsp.
diarizonae
tiveram seu perfil genético determinado pela técnica de PFGE, com a utilização da
enzima de restrição Xba1 e foram divididos em grupos de acordo com o grau de
similaridade. No estudo, 62 animais foram positivos para Salmonella na região da
cloaca, o que demonstra uma prevalência de 47,7%, S. enterica subsp. diarizonae foi à
com maior prevalência de 39,6%. Quanto à resistência microbiana detectou-se 05
vii
isolados de Salmonella com resistência à enrofloxacina, 01 isolado resistente à
gentamicina, 01 à tetraciclina e 01 isolado resistente à neomicina, a maioria dos
isolados foram pan sensíveis. Todas as amostras testadas (100%) se mostraram
positivas para os genes phopPQ, invEA, orgA, 30,4%(14) positivas para hilA, 82,6%
(38) positivas para o gene mgtC e apenas o isolado de Salmonella ser. Typhimurium foi
positivo para todos os genes inclusive o gene sefA. Após a técnica de PFGE, observouse a presença de 10 grupos de S. enterica subsp. diarizonae (A-J) distintos de 20
amostras analisadas, todas com menos 80% de similaridade e S. enterica subsp.
arizonae foi obtido 05 grupos diferentes. As salmonelas isoladas de serpentes
apresentam baixa resistência a drogas e podem apresentar potencial de gerar
infecções, com caráter zoonótico, pois apresentaram fatores de virulência capazes de
penetrar, multiplicar-se e sobreviver dentro das células de defesa do hospedeiro.
.
Palavras chaves: Zoonose, Salmonella, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp.
diarizonae, Fatores de virulência, PFGE e Serpentes.
viii
ABSTRACT
Reptiles are an important market segment of pets in the United States of America (USA)
and the close relationship between reptiles and humans have been associated with an
increased risk factor for transmission of various diseases with zoonotic, mainly
Salmonella spp . The present study described the mycoflora of Boa constrictor snakes of
the species in environments free life in the city of Campos dos Goytacazes and captive
environments, like a snake breeding business located in Para, and two zoos in
southeastern Brazil, RIOZOO Foundation, in Rio de Janeiro and Belo Horizonte
Foundation of Zoobotânica, in a total of 130 animals. Sterile swabs were collected from
the oral cavity and cloaca of snakes. Biochemical analyzes were performed on the
phenotypic identification of the samples. The resistance and susceptibility patterns to 12
antimicrobial standards for the species Gram-positive antibacterial standardized to 11
and Gram-negative species were studied by immunodiffusion in agar. For the
identification of Salmonella isolates was used Rapapport Vassiliadis broth enrichment.
We identified 246 strains of bacteria in the oral cavity and 296 isolates in the region of
the cloaca, both belonging to various bacterial genera. In the oral cavity was detected
one isolate of Salmonella spp. cloaca and 96 strains were identified, all were serotyped
at the Oswaldo Cruz Foundation - Fiocruz using the technique of Kauffman-White, the
Salmonella isolates were tested against 17 antimicrobial agents. The 46 isolates of S.
enterica subsp. arizonae and S. enterica subsp. diarizonae and one isolate of S. ser.
Typhimurium were tested by PCR for the presence of genes for virulence factors
(invE/A, phoPQ, orgA, hilA, mgtC and sefA). 08 isolates of S. enterica subsp. arizonae
and 20 S. enterica subsp. diarizone had their genetic profile determined by PFGE
technique with the use of restriction enzyme Xba1 and were divided into clusters
according to the degree of similarity. In the study 62 animals were positive for
Salmonella in the region of the cloaca, which demonstrates a prevalence of 47.7%, S.
diarizonae with the highest prevalence was 39.6%. Regarding the microbial resistance
was detected 05 isolates of Salmonella resistant to enrofloxacin, gentamicin resistant
isolate 01, 01 and 01 isolated tetracycline resistant to neomycin, most of the isolates
were pan sensitive. All samples tested (100%) were positive for genes phopPQ, invEA,
orgA, 30.4% (14) hilA positive, 82.6% (38) positive for the gene and mgtC only isolate of
S. ser. Typhimurium was positive for all genes including the gene sefA. Following PFGE
technique, it was observed the presence of 10 clusters of S. enterica subsp. diarizonae
(AJ) of 20 different samples, all with less than 80% similarity and S. enterica subsp.
arizonae was obtained 05 different clusters. Salmonella isolated from snakes have low
resistance and the drug may have potential to generate infections with zoonotic because
they present virulence factors able to penetrate, survive and multiply within cells of host
defense.
.
Keywords: Zoonosis, Salmonella, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp.
diarizonae, Virulence factors, PFGE and Snakes.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Espécime de Boa constrictor de vida livre, próximo a um bambuzal dentro
da área urbana da cidade de Campos dos Goytacazes/RJ...........................................23
Figura 2 – Distribuição do número de sorovares de acordo com a espécie e subespécie
de Salmonella.................................................................................................................32
Figura 3 – Esquematização da expressão de possíveis fatores de virulência em
Salmonella ser. Typhimurium e Salmonella ser. Typhi...................................................40
Figura 4 – Esquema do sistema de secreção Tipo III....................................................43
Figura 5 – Locais de Coleta de amostras de serpentes pelo Brasil...............................62
Figura 6 – Técnica de coleta das amostras da cavidade oral, com auxílio de suabe
estéril de serpentes nas localidades descritas anteriormente........................................63
Figura 7 – Técnica de coleta das amostras da cavidade cloacal, com auxílio de suabe
estéril de serpentes nas localidades descritas anteriormente......................................64
Figura 8 – Serpente oriunda de vida livre, atendida no Hospital Veterinário da
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, com estomatite bacteriana
severa, causada por Pseudomonas aeruginosa............................................................71
Figura 9 – Isolados gerais obtidos da cavidade oral de serpentes da Família Boidae e
Família Pythonidae..........................................................................................................74
Figura 10 – Perfil de resistência aos antibióticos de Pseudomonas spp. isoladas da
cavidade oral de serpentes.............................................................................................76
Figura 11 – Isolados gerais obtidos da região da cloaca de serpentes da Família
Boidae e Família Pythonidae...........................................................................................81
Figura 12 – Perfil de resistência aos antibióticos de amostras de Pseudomonas spp.
isoladas da cloaca de serpentes....................................................................................85
Figura 13 – Condições de amplificação pela técnica da PCR, para os genes phoP/Q,
invE/A, mgtC e orgA ....................................................................................................100
Figura 14 – Condições de amplificação pela técnica da PCR, para o gene
hilA................................................................................................................................100
Figura 15 – Condições de amplificação pela técnica da PCR, para o gene sefA. ...101
Figura 16 – Sorovares encontrados em serpentes de vida livre, zoológicos e criatório
comercial.,,,,,,................................................................................................................105
Figura 17 – Prevalência de Salmonella spp. de serpentes divididos pelos locais
coletados,
Riozoo,
FZB-BH,
Criatório
comercial
e
Vida
livre...............................................................................................................................106
Figura 18 – Distribuição dos sorovares isolados das serpentes divididos pelos locais
coletados, Riozoo, FZB-BH, Criatório comercial e Vida livre........................................107
Figura 19 – Perfil de resistência aos antimicrobianos de amostras de Salmonella spp.
isoladas da cloaca de serpentes...................................................................................109
Figura 20 – Eletroforese do produto da PCR em gel de agarose 1,5%. Amostras
positivas nos poços 1-10 para o genes phopPQ com 299pb, invEA com 500pb e mgtC
com 655pb. LSA/HVET/UENF.......................................................................................110
Figura 21 – Eletroforese do produto da PCR em gel de agarose 1,5%. Poço 1: Amostra
Salmonella ser. Typhimurium positiva para o gene sefA 312 pb.; Poços 2 – 4: Amostras
Salmonella ser. Typhimurium e de Salmonella enterica subsp. diarizonae positivas para
o gene hilA 500 pb. LSA/HVET/UENF..........................................................................111
Figura 22 – Eletroforese do produto da PCR em gel de agarose 1,5%. Amostras de
Salmonella enterica subsp. diarizonae positivas poços 1-3 para o gene orgA.
LSA/HVET/UENF. C+ controle positivo e C- controle negativo....................................111
Figura 23 – Perfil de eletroforese do produto da PFGE em gel de agarose 1,0%,
amostras de Salmonella enterica subsp. diarizonae, poços 1-4 e 5-7, com o padrão de
Salmonella ser. Braenderup H9812. LRNEB/IOC/FIOCRUZ........................................112
Figura 24– Dendograma gerado no programa Bionumerics com o perfil de PFGE de
Salmonella
enterica
subsp.
diarizonae
encontrados
nas
serpentes.
LRNEB/IOC/FIOCRUZ..................................................................................................113
Figura 25 – Dendograma gerado no programa Bionumerics com o perfil de PFGE de
Salmonella
enterica
subsp.
arizonae
encontrados
nas
serpentes.
LRNEB/IOC/FIOCRUZ..................................................................................................114
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Quantidade e espécies de serpentes coletadas para o
levantamento microbiológico nas quatro regiões do estudo.............................71
Tabela 2 – Isolados gerais obtidos da cavidade oral de serpentes da Família
Boidae e Família Pythonidae............................................................................73
Tabela 3 – Perfil de resistência aos antibióticos de Pseudomonas spp.
isoladas da cavidade oral de serpentes...........................................................75
Tabela 4 – Perfil de resistência aos antibióticos de isolados Gram-negativos,
com origem na cavidade oral das serpentes....................................................77
Tabela 5 – Perfil de sensibilidade a drogas dos isolados de cocos positivos
extraídos da cavidade oral de Serpentes.........................................................79
Tabela 6 – Isolados gerais obtidos da região da cloaca de serpentes da
Família Boidae e Família Pythonidae...............................................................80
Tabela 7 – Perfil de resistência aos antibióticos de isolados Gram-negativos,
com origem na região da cloaca das Serpentes..............................................83
Tabela 8 – Perfil de resistência aos antibióticos de amostras de Pseudomonas
spp. isoladas da cloaca de serpentes..............................................................84
Tabela 9 - Gene, sequência de oligonucleotídeo, tamanho do produto
amplificado em pares de base e localização ou função de cada gene. ......99
Tabela 10 – Sorovares encontrados em serpentes de vida livre, zoológicos e
criatório comercial...........................................................................................104
Tabela 11 – Perfil de resistência aos antibióticos de amostras de Salmonella
spp. isoladas da cloaca de serpentes............................................................108
ABREVIATURAS E SIGLAS
ATCC – American Type Culture Collection
CDC – Centers for Disease Control and Prevention
DNA – Deoxyribonucleic acid
EUA – Estados Unidos da América
FDA – Food and Drug Administration
FZB-BH – Fundação Zoobotânica de Belo Horizonte
IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis
HIV – Human Immunodeficiency Vírus
mL – Mililitro
g – Micrograma
l – Microlitro
OPMV - Ophidian Paramyxovirus
PCR – Polymerase Chain Reaction
PFGE - Eletroforese em Gel de Campo Pulsado
Pb – Pares de bases
RIOZOO – Fundação Jardim Zoológico da Cidade do Rio de Janeiro
SPI - Salmonella pathogenicity islands
Sef - Salmonella Enteritidis fimbriae
TSA - Teste de sensibilidade a antibióticos
TSI – Triple sugar Iron
TTSS – Type III Secretiion System
UPEC - Uropathogenic E. coli
VM - Vermelho de Metila
VP – Prova de Voges-Proskauer
SUMÁRIO
RESUMO.....................................................................................................
VII
ABSTRACT.................................................................................................
IX
LISTA DE FIGURAS...................................................................................
XI
LISTA DE TABELAS...................................................................................
XIV
ABREVIATURAS E SIGLAS.......................................................................
XV
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................
19
2. REVISÃO DE BIBLIOGRAFIA................................................................
21
2.1. Os ofídios......................................................................................
21
2.2. Características gerais das serpentes............................................
22
2.3. Répteis em cativeiro....................................................................
24
2.4. Caracterização da microbiota oral e cloacal dos répteis..............
24
2.5. Descrição sobre répteis no Brasil e sua relação com o
desmatamento e o tráfico de animais silvestres...............................
27
2.6. Salmonella spp.............................................................................
29
2.6.1. Características gerais............................................................
29
2.6.2. Taxonomia.............................................................................
30
2.6.3. Cadeia epidemiológica..........................................................
34
2.6.4. Patogênese da salmonelose.................................................
35
2.7. Identificação dos sorotipos de Salmonella spp. ........................
37
2.8. Ilhas de patogenicidades..............................................................
38
2.9. Fatores relacionados à virulência...............................................
40
2.9.1. Sistema de secreção Tipo III.................................................
42
2.9.2. Gene inv.................................................................................
46
2.9.3. Gene sef................................................................................
47
2.9.4. Gene hil..................................................................................
48
2.9.5. Gene pho...............................................................................
49
2.9.6. Gene mgtC.............................................................................
49
2.9.7. Gene orgA..............................................................................
50
2.10. Eletroforese em Gel de Campo Pulsado (PFGE).......................
51
2.11. Importância da Salmonella arizonae e Salmonella diarizonae...
53
2.12. Ocorrência de Salmonella spp. em répteis – Histórico.............
54
2.13. Caráter zoonótico Salmonella spp. em seres humanos com
origem nos répteis...............................................................................
CAPÍTULO
I:
SUSCEPTIBILIDADE
IDENTIFICAÇÃO
A
DROGAS
E
DA
PERFIL
55
DE
MICROBIOTA
BACTERIANA QUE COLONIZA A CAVIDADE ORAL E A
CLOACA DE SERPENTES
60
3. OBJETIVOS............................................................................................
61
4. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................
61
4.1. Origem das amostras...................................................................
62
4.2. Coleta de amostras.......................................................................
62
4.2.1. Cavidade oral..........................................................................
63
4.2.2. Região da cloaca....................................................................
63
4.3. Isolamento e identificação bacteriana..........................................
64
4.4. Análise fenotípica........................................................................
64
4.4.1. Fermentação do manitol..........................................................
66
4.4.2. Teste da catalase.....................................................................
66
4.4.3. Teste da oxidase......................................................................
66
4.4.4. Teste de produção de coagulase............................................
66
4.4.5. Teste de Dnase........................................................................
67
4.4.6. Atividade hemolítica.................................................................
67
4.4.7. Agar ferro-açucar triplo (Agar TSI)...........................................
67
4.4.8. Prova de Voges-Proskauer (VP)..............................................
67
4.4.9. Prova do Vermelho de Metila (VM)..........................................
68
4.4.10. Utilização do citrato................................................................
68
4.4.11. Hidrólise da ureia...................................................................
68
4.4.12. Produção de sulfeto de Hidrogênio – H2S.............................
69
4.4.13. Descarboxilase......................................................................
69
4.5. Teste de sensibilidade a antibióticos – TSA ...........................
5. RESULTADOS........................................................................................
69
70
5.1. Isolados de cavidade oral...........................................................
72
5.2. Perfil de resistência à drogas – cavidade oral............................
75
5.3. Isolados da região da cloaca........................................................
79
5.4. Perfil de resistência à drogas – cloaca.........................................
82
6. DISCUSSÃO............................................................................................
86
7. CONCLUSÃO..........................................................................................
94
CAP II – IDENTIFICAÇÃO, PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE,
SOROTIPAGEM E PESQUISA DE FATORES DE VIRULÊNCIA
EM ISOLADOS DE SALMONELLA spp. EM SERPERTES.
95
3. OBJETIVOS............................................................................................
96
4. MATERIAL E MÉTODOS........................................................................
96
4.1. Identificação de bactérias do Gênero Salmonella spp.................
96
4.2. Teste de Sensibilidade a Antibióticos – TSA................................
97
4.3. Sorotipificação de Salmonella spp...............................................
97
4.3.1. Teste de soroaglutinação rápida...........................................
97
4.4. Pesquisa de fatores de virulência em isolados de Salmonella
– Análise Molecular......................................................................
98
4.4.1. Extração de DNA..................................................................
98
4.4.2. Realização da PCR S. arizonae e S. diarizonae...................
98
4.5. Eletroforese de campo pulsado – PFGE – Pulsed Field gel
Eletophoresis...............................................................................
101
4.5.1. Semeadura das amostras....................................................
101
4.5.2. Preparação dos Plugs de PFGE..........................................
102
4.5.3. Lavagem dos Plugs de PFGE..............................................
102
4.5.4. Digestão de DNA com Enzimas de Restrição.....................
102
4.5.5. Aplicação das Amostras no Gel de Agarose.......................
103
4.5.6. Condições para a Corrida Eletroforética..............................
103
4.5.7. Interpretação e Análise de Dados.......................................
103
5. RESULTADOS........................................................................................
104
5.1. Identificação dos isolados...........................................................
104
5.2. Perfil de resistência a drogas – Salmonella...............................
108
5.3. Detecção dos fatores de virulência ...........................................
110
5.4. Eletroforese em Gel de Campo Pulsado – PFGE........................
112
6. DISCUSSÃO............................................................................................
115
7. CONCLUSÕES........................................................................................
131
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………………….
132
ANEXOS......................................................................................................
177
FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca do CCTA / UENF 051/2013
Pontes, Luiz Antonio Eckhardt de
Avaliação da microbiota das cavidades oral e cloacal de Boidae de
cativeiro e vida livre, com ênfase em Salmonella spp. no Brasil / Luiz
Antonio Eckhardt de Pontes. – 2013.
181 f. : il.
Orientador: Olney Vieira da Motta.
Tese (Doutorado - Ciência Animal) – Universidade Estadual do
Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Centro de Ciências e Tecnologias
Agropecuárias. Campos dos Goytacazes, RJ, 2013.
Bibliografia: f. 132 – 176.
1. Salmonella 2. S. enterica subsp. arizonae 3. S. enterica subsp.
diarizonae 4. Fatores de virulência 5. PFGE 6. Cobra I. Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro. Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias. II. Título.
CDD – 597.96
19
1. INTRODUÇÃO
Pertencentes a Classe Reptilia, Ordem Squamata, Boidae é uma família que
engloba um conjunto de serpentes constritoras (as jiboias e as sucuris), e que
podem atingir grandes dimensões. A Boa constrictor, ou jiboia, animal pertencente à
fauna brasileira, habita regiões úmidas como as florestas tropicais e tem distribuição
geográfica que abrange desde o México ao norte da Argentina. Apresenta variações
de subespécies, são muito difundidos nos centros de pesquisas, criadouros
conservacionistas, zoológicos e é comercializada legalmente no Brasil, autorizado
pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis
(IBAMA), órgão responsável pela fauna brasileira.
As serpentes são utilizadas em laboratórios científicos para estudos ou
mantidas como mascotes não convencionais, muitas delas são reservatórios de
bactérias com potencial para transmissão de infecção ao ser humano. O estudo da
microbiota bacteriana favorece o conhecimento dos isolados presentes normalmente
em serpentes, além da detecção de possíveis causas de processos infecciosos, que
podem vir a acometer estes animais quando mantidos em cativeiro e ainda na
situação de vida livre, observando que existem nos dias de hoje poucos habitats
naturais para estes animais, propiciando avaliar os micro-organismos com caráter
zoonótico.
A criação de animais silvestres
como mascotes convencionais vem
aumentando a possibilidade da ocorrência de doenças infecciosas (zoonoses). Um
dos micro-organismos com esta característica e de grande prevalência na
colonização de répteis, a Salmonella spp., representa um risco para os seres
humanos que os criam e/ou os manuseiam, em particular crianças, mulheres
grávidas, idosos e indivíduos imunocomprometidos.
A Salmonella spp. tem sido considerada um importante agente bacteriano
causador de problemas relacionados à Saúde Pública. Habitam naturalmente o
intestino de vertebrados de sangue quente e frio, de onde normalmente são
disseminados ao ambiente sendo possível sua sobrevivência e multiplicação. Existe
uma dificuldade em avaliar a situação da Salmonella spp. no Brasil, devido a
escassez de dados e da falta de uma vigilância epidemiológica eficaz. A maior parte
dos dados referentes à salmonelose no Brasil estão associados à preparação
maciça de alimentos, ao armazenamento inadequado dos mesmos, ao consumo de
20
produtos crus e mal cozidos, ovos, produtos derivados de suínos e aves, carcaças
bovinas e avícolas e aves silvestres, sendo os poucos trabalhos relacionado ao
manejo e criação de répteis em cativeiro como potenciais fontes de infecção por esta
bactéria.
O presente estudo tem como objetivo descrever a microbiota de jiboias de vida
livre, encontradas na região periurbana do município de Campos dos Goytacazes,
oriundas de um criatório comercial em Belém/PA e de dois zoológicos na Região
Sudeste do Brasil, sendo um na cidade do Rio de Janeiro e outro em Belo Horizonte.
Baseado nas características dos isolados bacterianos encontrados nesta pesquisa,
foram traçados o perfil de resistência a drogas dos micro-organismos e investigados
os isolados de Salmonella spp. carreadas por estas serpentes, com estudos
fenotípicos, sorológicos e moleculares, visando conhecer melhor a epidemiologia da
Salmonella oriunda de animais de sangue frio no Brasil.
21
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 OS OFÍDIOS
Os ofídios surgiram por volta de 110 a 150 milhões de anos atrás. As
evidências atuais apontam para possibilidade das serpentes descenderem de
lagartos primitivos que possuíam hábitos subterrâneos e perderam seus membros
com o passar do tempo evolutivo (COSTA et al., 2011). No Brasil, utilizamos a
terminologia cobra para designar as serpentes, o termo foi trazido pelos portugueses
na época da colonização. Esta contradição existe, pois cobra é o nome próprio dado
a uma espécie de serpente encontrada no norte do continente Africano e na Ásia,
cujo nome científico é Naja hannah, ou Cobra-Rei (NETO, 2001).
As serpentes pertencem a Subclasse Diapsida, Superodem lepidossauria,
Ordem Squamata e Subordem Ophidia – Serpentes. São muitas vezes citadas como
topo da cadeia evolucionária da classe, de fato são os últimos animais a surgirem na
cronologia evolucionária (CARRILLO
e
ICOCHEA,
1995;
FRANCO,
2003,
GOULART, 2004). No grupo dos Squamata, os lagartos podem ser distinguidos das
serpentes, não filogeneticamente, porque as serpentes são derivadas dos mesmos.
Entretanto, uma separação coloquial entre lagartos e serpentes é extremamente útil
uma vez que lagartos e serpentes são distintos em muitos aspectos da sua ecologia
e comportamento. (POUGH, 2008).
As serpentes foram cultuadas entre os povos da antiguidade que, por meio da
adoração ou veneração, procuravam agradá-las para se livrarem do mal que
poderiam causar (AZAMBUJA et al., 2008).
Na Grécia Antiga, teve grande importância o mito da serpente “Píton” que
tinha 100 cabeças e foi morta por Apolo com suas flechas. Esculápio, pai da
Medicina e da magia, tinha a serpente como um dos seus principais atributos, visto
que ela simbolizava a renovação da vida, o rejuvenescimento e o renascimento. Era
igualmente considerada símbolo da prudência e da ponderação (ARAÚJO e ELY,
1978). No Antigo Egito, a serpente era considerada símbolo da fertilidade. Na Índia e
Indochina, era venerada a serpente de sete cabeças ou deus-serpente. Na mitologia
mexicana, Coatlicué, mulher-serpente, era protetora das parturientes. Entre os maias
e astecas, a serpente significava a força geradora da vida e da sexualidade
(ARAÚJO e ELY, 1978).
22
Na cultura ocidental não se encontram vestígios de culto ou veneração às
cobras (se houvesse, provavelmente seriam menos sacrificadas). O que se observa
é um medo exagerado e supersticioso transmitido de geração para geração desde
tempos imemoriais. Os ofídios possuem papel fundamental na cadeia alimentar dos
ecossistemas, mantêm o equilíbrio natural no ambiente, alimentando-se, por
exemplo, de roedores, que são atraídos pelas culturas agrícolas e pelo lixo que o
homem introduz nos meios rural e urbano (AZAMBUJA et al., 2008).
Segundo Franco (2003) existem cerca de 2900 espécies encontradas em
quase todas as partes do mundo. No Brasil existem representantes em nove famílias
de 75 gêneros e 321 espécies, que habitam regiões temperadas e tropicais,
dependem do calor externo, pois são animais ectotérmicos. Boa constrictor,
Linnaeus 1758, pertence à Família Boidae e possuem habitat de clima variado,
desde ambientes úmidos como as florestas tropicais, a áridas caatingas (AMARAL,
1978).
2.2. CARACTERÍSTICAS GERAIS DAS SERPENTES
As serpentes ou tanatofídio apresentam como características o corpo
extremamente alongado e revestido por escamas onde periodicamente sofrem a
chamada muda, onde a camada superficial da pele é trocada, são ápodes sem
apêndices locomotores e cintura escapular; desprovidos de pálpebras e de aparelho
auditivo externo, equilibrado pela sensibilidade por vibrações e a alta capacidade de
compreender variações de temperatura, por ter a visão deficiente, as serpentes
contam com outros órgãos sensoriais capazes de compensar as deficiências, uma
delas é a língua bífida ou bifurcada que com ela sondam o ambiente, captando
partículas soltas no ar, levando-as a um orifício situado no palato, chamado órgão de
Jacobson, onde é feita a “leitura” ou identificação dessas partículas. Com a perda da
sínfise mandibular, o que lhes permite abrir a boca e alimentar-se de presas de até
3,5 vezes o seu diâmetro, outras alterações anatômicas são verificadas, como o
fechamento lateral da parede da caixa craniana e perda das pálpebras móveis
(NETO, 2001, MARQUES et al. 2001, FRANCO, 2003).
As serpentes são animais que se alimentam de presas vivas e caçam
utilizando estruturas quimiossensíveis. São exclusivamente carnívoras, predando
tanto vertebrados quanto invertebrados (GREENE, 1997). Na família Boidae
23
encontram-se os maiores ofídios atuais, típicos do Novo Mundo. Possuem dentição
áglifa, com dentes maxilares e mandibulares anteriores maiores que posteriores,
cabeça em forma triangular, coberta por numerosas escamas pequenas e
irregulares. O corpo é forte e robusto, com musculatura bem desenvolvida e
matando por constrição (DUARTE et al., 2000).
A vulgarização do nome de Boa constrictor constrictor para jibóia (do tupiguarani y’bói + a, que significa cobra d’água), é considerada devido a sua aplicação
consistente em pelo menos uma área geográfica razoavelmente extensa, segundo
Cordeiro e Hoge, (1973) (Figura 1). Sua morfologia externa é de corpo cilíndrico e
levemente comprimido lateralmente, o que as particularizam como serpentes semiarborícolas. Possuem coloração geral marrom-claro, com faixas de cor escura no
dorso e desenhos laterais ovóides ou rômbicos (STIDWORTHY, 1993).
Figura 1 – Espécime de Boa constrictor de vida livre, próximo a um bambuzal dentro
da área urbana da cidade de Campos dos Goytacazes/RJ. Fonte: Arquivo Pessoal.
Desde 2008, os répteis podem ser criados em cativeiro como mascotes de
forma regular, pois a sua comercialização encontra-se liberada, somente para
criatórios comerciais registrados pelo órgão ambiental regulador, o IBAMA através
da Instrução Normativa n° 169 de 2008. Pouco é conhecido sobre o seu status
sanitário, embora vários parasitas, principalmente os intestinais, são relatados como
24
causa de mortalidade e morbidade destes animais (ARAÚJO et al., 1999, SÁNCHEZ
et al., 2004, BARBOSA et al., 2006). A manutenção desta espécie em cativeiro
requer instalações e cuidados adequados, incluindo manejo e dieta balanceada.
Contudo, muitos são os casos onde algumas medidas preventivas não são adotadas
ou são insuficientes, para preservar a saúde das serpentes, causando infecções e
infestações oportunistas (HOGE e FEDERSONI, 1981).
2.3. RÉPTEIS EM CATIVEIRO
Os répteis representam um importante segmento do mercado de animais de
estimação nos Estados Unidos da América (EUA). De acordo com Inquérito Nacional
de Proprietários de Pets (2007), existe um total de 13,4 milhões de répteis como
mascotes nos EUA, demonstrando uma curva crescente, pois em 2003/2004 eram
09 milhões e em 2006 representavam 11 milhões (APPMA, 2007). Anualmente, o
número de répteis importados nos EUA tem aumentado, com mais de um milhão de
animais contabilizados, e a estreita relação entre répteis e seres humanos tem sido
associada a um aumento do fator de risco de transmissão de doenças de caráter
zoonótico, principalmente a Salmonella spp. (CHOMEL et al., 2007). No Brasil,
dados sobre a criação de répteis em cativeiro ainda não foram disponibilizados pelo
IBAMA.
2.4. CARACTERIZAÇÃO DA MICROBIOTA ORAL e CLOACAL DOS RÉPTEIS
A microbiota bacteriana encontrada na cavidade oral das serpentes em
diversas regiões do mundo é variada (GARCIA LIMA e LAURE, 1986).
Estes
animais possuem língua bífida e úmida, substâncias químicas presentes no
ambiente, aderem- se à língua e ao se retrair, entra em contato com a cavidade oral
e o órgão de Jacobson (GOMES, et al., 1989). O bom funcionamento deste órgão
está diretamente relacionado na reprodução, monitoramento da presa, alimentação
e reconhecimento de predadores e, assim, tais funções exigem uma cavidade oral
saudável (GOLDSTEIN, et al., 1981). Draper, et al., (1981) e Blaylock, (2001)
observaram que a biota normal da cavidade oral dos répteis em cativeiro possui
como característica a presença de bactérias predominantemente Gram-positivas,
25
como Corynebacterium spp,. e Staphylococcus coagulase-negativa, bactérias Gramnegativas como Proteus spp., Pseudomonas spp. e Salmonella spp.
Ferronato et al., (2009) observaram a presença de Enterococcus faecium,
Staphylococcus spp., Micrococcus sp., Bacillus spp., Escherichia coli, Klebsiella
pneumoniae, Enterobacter agglomerans, Citrobacter freundii, Aeromonas spp.,
Edwardsiella spp. na cavidade oral de quelônios (Phrynops geoffroanus) de vida
livre. As variedades das bactérias estão presentes em tartarugas saudáveis, mas
esses micro-organismos podem se tornar patogênicos em animais sensíveis vivendo
sob condições de estresse (SANTORO et al., 2006). Segundo o mesmo autor o
conhecimento da microbiota bacteriana pode ser uma ferramenta útil para
compreender o papel das bactérias como agentes patogênicos em tartarugas
selvagens.
Segundo Jorge et al. (1990) foram isoladas tanto bactérias Gram-positivas
como Gram-negativas em serpentes do gênero Bothrops e as que mais
prevaleceram foram Providencia spp., Enterobacter spp., E. coli, Citrobacter spp.,
Staphylococcus aureus, Clostridium spp. e Salmonella spp. Em outro estudo foi
verificada a presença de outros micro-organismos causadores de patologias na
cavidade oral de tartarugas marinhas em cativeiro, como Pseudomonas aeruginosa,
causando estomatite ulcerativa associada à variação de temperatura (MELO et al.,
2008).
O índice de isolamento de Salmonella spp. através de necropsias em
serpentes foi de 26,8% de 41 serpentes de vida livre e 7,1% de 14 cativas, três
sorovares diferentes foram identificados no estudo de Hinshaw e Mcneil, (1945).
Sabe-se que bactérias do gênero Salmonella são rotineiramente isoladas do trato
gastrointestinal de répteis saudáveis (BEMIS et al., 2007, FONSECA et al., 2009).
Em um estudo com 10 espécies de serpentes das famílias Boidae,
Colubridae, Elapidae e Viperidae, foram observadas a maior diversidade bacteriana
na cavidade oral de Micrurus frontalis e Philodryas nattereri. As bactérias verificadas
foram Actinomyces spp. (M. frontalis), Bulkolderia spp. (Eunectes murinus),
Moraxella spp. (M. frontalis), Proteus spp. (B. constrictor), Sarcina spp. (P. nattereri),
Bacillus subtilis (Bothrops alternatus e Phalotris mertensi), Staphylococcus aureus
(M. frontalis), Staphylococcus coagulase negativa (Crotalus durissus e Mastigodryas
bifossatus) e Yersinia enterocolitica (Bothrops pauloensis) (FONSECA et al., 2009).
Avila-Agüero et al. (2001) concluíram que nos acidentes ofídicos envolvendo
crianças e adolescentes comumente ocorre infecção bacteriana secundária a picada,
26
devido à elevada colonização bacteriana na cavidade oral destas serpentes,
favorecendo o aumento das lesões no tecido afetado.
Segundo Ferreira Junior et al. (2009), na comparação das bactérias isoladas
da microflora aeróbica da cavidade oral, cloaca e veneno de serpentes do gênero
Crotalus durissus terrificus recém-capturadas da natureza e mantidas em cativeiro,
identificou-se a presença de Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris e
Morganella morganii. Os mesmos autores relataram que serpentes mantidas em
cativeiro (semi aberto), demonstraram menor número de agentes infecciosos na
cavidade oral, sugerindo a interferência do ambiente de cativeiro com diferentes
gradientes de temperatura, água corrente, ausência de manejo diário, ampla
circulação de ar, maior espaço físico para a movimentação, limpeza diária e acesso
ao sol.
A microbiota da cavidade oral de serpentes peçonhentas de vida livre do
Norte da América do Sul mantém-se em equilíbrio. Entretanto, as contaminações
observadas na cavidade oral destes animais mantidos em pequenos terrários,
podem ser explicadas pela dieta e pelas próprias fezes, que são frequentemente
encontradas em seus bebedouros. Mas em ambientes externos, esta contaminação
é minimizada devido ao manejo sanitário através de o uso de calcário, hipoclorito e
maçaricos (FERREIRA JUNIOR et al., 2009).
Quando se avalia a região da cloaca dos répteis, com auxílio de suabes ou
através da coleta de fezes, para a identificação microbiológica, observa-se a
presença maciça de enterobactérias, incluindo na maioria dos casos Salmonella spp.
(SANTORO et al. 2006, FERRONATO et al. 2009). Mas alguns autores observaram
que a microbiota gastrointestinal de répteis são compostas de bactérias Grampositivas
aeróbicas
e
anaeróbicas,
bactérias Gram-negativas,
leveduras e
protozoários (DIAZ-FIGUEROA e MITCHELL, 2006). Diferentes autores relatam que
micro-organismos normalmente encontrados como pertencentes à microbiota do
sistema digestivo nos répteis pode agir como agentes etiológicos de doenças
gastrointestinais, no entanto, poucas pesquisas têm definido as características da
microbiota das espécies brasileiras de répteis (DE SÁ e SOLARI, 2001, BASTOS et
al., 2008). Segundo Morais et al., (2011) a presença de enterobactérias na cavidade
oral e na cloaca de quelônios de vida livre no Parque Nacional do Araguaia, uma
área sem poluição e presença de coliformes fecais, foi considerada normal para os
27
animais, no entanto, os autores citam a Saúde Pública como significante
problemática no contato com estes animais.
Inúmeros autores relatam que sorovares de Salmonella fazem parte da
microbiota gastrointestinal normal da maioria dos répteis, tanto cativos, como de vida
livre em vários países do mundo. A Salmonella spp. transmitida pelos répteis aos
seres humanos é objeto de estudo e vem causando sérios problemas,
principalmente no EUA (CHAMBER e HULSE, 2006) Europa (GEUE e LOSCHNER,
2002, PEDERSEN et al., 2009), Asia (NAKADAI, et al., 2005, JANG, et al., 2008) e
alguns países da América Central e do Sul (FRANCO et al., 2011, LANKAU et al.,
2012)
2.5. DESCRIÇÃO SOBRE RÉPTEIS NO BRASIL E SUA RELAÇÃO COM O
DESMATAMENTO E O TRÁFICO DE ANIMAIS SILVESTRES
O Brasil, com 8.547.403,5 km2 de área, se encontra entre os países de maior
riqueza de fauna do mundo, ocupando a 1ª posição, com aproximadamente três mil
espécies de vertebrados terrestres (MITTERMEIER et al., 1992,
IBGE, 2001),
ocupando a 4ª posição mundial em quantidade de répteis, com cerca de 468
espécies (MITTERMEIER et al., 1992). Toda essa riqueza sempre gerou a idéia de
que a biodiversidade brasileira é abundante e inesgotável, e por isso vem sendo
explorada de forma desordenada e predatória, desde os tempos coloniais
(CARVALHO e CÂMARA, 2002).
As regiões de matas e reservas do país vêm perdendo espaço para
atividades que levam ao desmatamento, como a pecuária, exploração de madeiras,
plantações de soja, cana-de-açúcar e eucalipto. Estas atividades são provavelmente
as maiores causadoras da descaracterização da diversidade em répteis de vida livre.
A redução das áreas potencialmente diversificadas leva à limitação da área de uso
e, consequentemente, à restrição da variabilidade genética dos répteis (LEMA,
2002). Reduções drásticas em populações de répteis, provocadas por degradação
de área natural são comuns e podem ser observadas em espécies arborícolas, as
quais não se adaptam aos impactos antrópicos (SAMPAIO, et al., 2007).
A Região Sudeste possui alta diversidade, sendo rica em endemismo. Por
outro lado, a vegetação natural do sudeste sofre os mais diferentes tipos de
28
agressões,
acometendo consideravelmente a integridade das espécies,
e
consequentemente a descaracterização do patrimônio genético (GIULIETTI, 1992).
Restam apenas 7,26% da cobertura original de Mata Atlântica – o que
corresponde a 97.596 km² dos 1,3 milhões de km 2 originais. Nos últimos 20 anos,
segundo o INPE, foram perdidos 15.880 km² de floresta, o que equivale à metade do
Estado de Alagoas, ou a um terço do Estado do Rio de Janeiro. Um dos grandes
problemas da mata é que ela se encontra extremamente fragmentada, fato que só
pode ser resolvido por meio de restauração florestal. Os Estados que possuem mais
florestas nativas são os que mais desmatam, sendo considerado outro dado
preocupante. São eles: Santa Catarina e Paraná, principalmente nas formações das
araucárias, e Bahia e Minas Gerais, em suas porções Oeste, nos limites com o
Cerrado e a Caatinga. Os maiores causadores de desflorestamento nesses Estados
são a especulação imobiliária, nas regiões serranas, e a agropecuária, nas áreas de
plantio (PRADO, 2008).
Dados preliminares do Atlas dos Remanescentes Florestais da Mata Atlântica
mostram que a taxa de desmatamento deste bioma entre 2000 e 2005, diminuiu
71% em relação aos cinco anos anteriores. Dos oito Estados analisados até agora
(que representam 60% da área de Mata Atlântica no Brasil), os únicos que obtiveram
aumento no ritmo de desmatamento foram os Estados de Santa Catarina 8% e
Goiás 18%. Essa taxa caiu na maioria dos outros Estados, entre eles Espírito Santo
- 96%, Rio de Janeiro - 90% e Paraná - 88% de acordo com Mattos (2006).
O IBAMA é o respnsável pela fiscalização através do Centro de Conservação
e Manejo de Répteis e Anfíbios – RAN, que promove a fiscalização e a normatização
sobre comércio dos animais, segundo a Normativa 93, de 07 de julho de 1998 – que
regulamenta a importação e exportação de espécimes vivos produtos e subprodutos
da Fauna Silvestre Brasileira e Exótica. Havendo a proibição da importação de
espécimes vivos de répteis e anfíbios (exceto Rana catesbeiana – rã-touro) com
finalidade de criação comercial, manutenção em cativeiro como animal de estimação
ou ornamentação e exibição em espetáculos itinerantes e fixos, salvo em jardins
zoológicos (IBAMA, 1998).
No Brasil, a caça e o comércio predatório e indiscriminado da fauna silvestre
são práticas antigas, que passaram a ser ilegais no ano de 1967, pois até então não
havia legislação que proibisse essas atividades. No ano de 1967, junto com a
criação do Instituto Brasileiro de Desenvolvimento Florestal – IBDF, foi criada a Lei
29
Federal nº. 5.197, a Lei de Proteção à Fauna, declarando que todos os animais da
fauna silvestre nacional e seus produtos eram de propriedade do Estado e não
poderiam mais ser caçados, capturados, comercializados ou mantidos sob a posse
de particulares. No entanto, não foram dadas alternativas econômicas às pessoas
que até então viviam desse comércio contribuindo para o aumento da marginalidade.
Como consequência, surgiu um comércio clandestino de animais silvestres
(MARQUES e MENEGHETI, 1982). Começa a partir daí a história do tráfico da fauna
silvestre brasileira.
Atualmente, observamos a comercialização de répteis seja de origem nacional
ou importada, de forma ilegal e irresponsável, caracterizando muitas vezes o tráfico
de animais e a população que os adquire não possui nenhum conhecimento sobre
cuidados e prevenção de doenças a que estão expostas. A compra de animais vivos
da fauna brasileira é permitida apenas quando efetuada em lugares credenciados
pelo órgão ambiental competente, onde são comercializadas espécies autorizadas e
reproduzidas em cativeiro, acompanhadas do certificado de origem e/ou nota fiscal
(IBAMA, 2006).
O tráfico de animais movimenta cerca de 20 bilhões de dólares/ano no mundo,
sendo considerado o terceiro maior comércio ilegal ficando atrás somente do tráfico
de armas e drogas (WEBB, 2001). Sendo que o Brasil participa em torno de 10 a
15% deste valor (LOPES, 2000). Normalmente, o fluxo do tráfico funciona com a
retirada de animais das Regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e sendo levados
principalmente para a região Sudeste, em especial São Paulo e Rio de Janeiro de
onde partirão para abastecer o comércio ilegal internacional. O tráfico de animais
contribui para a disseminação de micro-organismos de caráter zoonótico.
2.6. SALMONELLA spp.
2.6.1. Características Gerais
São bacilos Gram negativos, pertencentes à família Enterobacteriaceae, não
formadores de esporos, anaeróbios facultativos, com temperatura ótima de
crescimento em média de 37ºC, sendo destruídas a temperaturas acima dos 60ºC
por 15 a 20 minutos, não crescem sob temperaturas abaixo de 5ºC e cresce com pH
entre 4,5 e 8,0, sendo o ótimo entre 6,0 e 7,5 (HIRSH, 2003, FORTUNA e FRANCO
30
2005, SVS, 2011). Produzem gás a partir da fermentação da glicose (exceto
Salmonella ser. Typhi, Salmonella ser. Pullorum, Salmonella ser. Gallinarum).
Fermentam a arabinose, maltose, manitol, manose, ramnose, sorbitol, trealose e
xilosel. A maioria das salmonelas de interesse clínico não fermenta lactose, gerando
reações alcalinas em ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI), porém algumas cepas podem
adquirir essa característica por meio de transferência plasmidial. Produzem gás
sulfídrico (H2S) a partir da redução do enxofre por ação da enzima cisteína
desulfidrase. São capazes de utilizar o citrato como única fonte de carbono no meio
Citrato de Simmmons. A maioria é móvel por flagelos peritríquios, à exceção da S.
ser. Pullorum e da S. ser. Gallinarum, que são imóveis e não são produtoras de
Indol. Não produzem urease, apresentando teste em Caldo Uréia negativo, além de
apresentarem testes de ágar Lisina Ferro (LIA) positivos, por descarboxilação da
Lisina e, também são capazes de descarboxilar a ornitina e reduzir nitrato a nitrito.
Podem ocorrer variações em função do sorovar e/ou da subespécie. A
caracterização bioquímica entre Salmonella ser. Typhi, Salmonella ser. Paratyphi A e
Salmonella enterica subespécie enterica (predominante em isolamentos de fontes
humanas e animais) (SVS, 2011).
2.6.2. Taxonomia
Os primeiros isolados de Salmonella spp. são de 1880, quando Erberth
reconheceu o que hoje se denomina Salmonella ser. Typhi como agente patogênico
para humanos. Em 1885, Daniel Salmon, juntamente com Theobald Smith,
descreveu o gênero após isolar, o que na época chamou de Bacillus cholera suis, de
suínos com os mesmos sinais clínicos gastroentéricos descritos em humanos por
Erberth. Em 1888, Gärtner isolou agentes parecidos de casos de doenças
transmitidas por alimentos, mas só em 1900 Lignières denominou o gênero como
Salmonella spp. Este nome foi validado pelo Subcomitê Internacional de Sistemática
Bacteriana, segundo a descrição de Bruce-White em 1929 (LE MINOR e POPOFF,
1987).
Diferentes formas de classificação das salmonelas vêm sendo sugeridas pela
diversidade inicial de seus sorovares que apresentavam etiologia não específica de
um determinado hospedeiro, ou seja, inicialmente, a designação do mesmo sorovar
em diferentes hospeiros, em locais distintos. A partir de 1920, um grupo de
31
microbiologistas liderados por Fritz Kauffmann, em Copenhagen e por Philip Bruce
White, em Londres, unificou a taxonomia tendo o aval do subcomitê de Salmonella
da Sociedade Internacional de Microbiologia em 1933, sendo conhecido como
esquema de Kauffmann-White e adotado atualmente pela Organização Mundial da
Saúde (OMS) após algumas modificações, tendo por base a utilização de métodos
clássicos e de métodos moleculares como AFLP e o sequenciamento 16S rRNA
(SVS, 2011).
A
caracterização
antigênica
constitui
uma
importante
ferramenta
epidemiológica complementar na identificação do gênero, permitindo determinar a
prevalência/emergência ou apontar tendência de um sorovar em distintas zonas
geográficas, bem como identificar surtos, conhecer as fontes de infecção e vias de
transmissão. A distribuição dos sorovares estão catalogadas no esquema de
Kauffmann-White, e envolve a identificação dos antígenos somáticos e flagelares,
com a utilização de antissoros de acordo com os critérios estabelecidos por Ewing
(1986), sendo utilizada a nomenclatura proposta por Popoff e Le minor (2001) –
Esquema de Kauffmann-White .
A classificação do gênero é baseada em características bioquímicas e
homologia de DNA (AABO, 1993) que divide o gênero em duas espécies: Salmonella
enterica, que está dividida em seis subespécies, enterica, salamae, arizonae,
diarizonae, houtenae, indica e S. bongori. Aproximadamente 60% pertencentes a
Salmonella enterica subespécie entérica, que coloniza o trato entérico de animais de
sangue quente, sendo responsáveis por 99% das infecções, enquanto outros
sorovares (em torno de 40%) acometem animais de sangue frio e vivem no meio
ambiente (POOF e LEMINOR, 1997, BRENNER et al., 2000, DE SÁ e SOLARI et al.,
2001). Atualmente existem cerca de 2.610 sorovares (GRIMONT e WEILL, 2007)
(Figura 2).
32
Figura 2 – Distribuição do número de sorovares de acordo com a espécie e
subespécie de Salmonella (GRIMONT e WEILL, 2007).
A sorotipagem vem sendo utilizada para identificar esse micro-organismo
além do nível de subespécie, a partir do esquema desenvolvido por Kauffman e
White (BRENNER et al., 2000), que divide o gênero em tipos sorológicos (sorovares
ou sorovares), tendo por base a composição antigênica das salmonelas com relação
aos seus antígenos “O” (somático), “Vi” (capsular – presente em alguns sorovares) e
“H” (flagelar), estando o antígeno “O” relacionado com a virulência da Salmonella
spp. (TINDALL et al., 2005, SABBAGH, et al., 2010). Uma cepa que não expressa o
antígeno O, é designada como variante “Rugosa” no lugar do antígeno O na sua
fórmula antigênica. Outra variante que impede a caracterização antigênica é a
“Mucoide” que expressa uma cápsula, impedindo a detecção do antígeno O, sendo
também designada no local do antígeno O em sua fórmula antigênica (CDC, 2005).
Os antígenos somáticos (O) são polissacarídeos e estão ligados a um
complexo lipídico (lipídio A), formando uma estrutura lipopolissacarídica denominada
LPS, presente na membrana externa de bactérias Gram negativas. Os açúcares que
formam a cadeia lateral deste polissacarídio variam no número de repetições, e são
estruturas antigênicas. Dessa forma, conferem características imunológicas que são
usadas para definir os sorovares de Salmonella, como citado anteriormente, sendo
de grande valia em questões epidemiológicas. Em geral, os antígenos flagelares (H)
ocorre em duas fases (fase um e fase dois), a Salmonella que as apresentam,
chamadas de bifásicas. Entretanto, algumas podem apresentar uma só fase
(monofásica) ou nenhuma (imóveis). Em relação ao antígeno capsular (Vi), são
encontrados somente nos sorovares Typhi, Paratyphi C e Dublin. Com base na
expressão dos antígenos, foi proposto o esquema de Kauffmann e White, o qual
33
agrupa o gênero em tipos sorológicos e, de acordo com os antígenos em comum,
em sorogrupos. (POPOFF e LE MINOR, 2001, TRABULSI et al., 2002).
As salmonelas são uma das bactérias mais extensivamente estudadas em
termos de fisiologia, genética e estrutura celular. Também são bactérias patogênicas
em termos de virulência (DARWIN e MILLER, 1999). Existem sorovares que, embora
não sejam adaptadas a alguma espécie hospedeira, podem causar a doença tanto
em humanos como em outros animais. Os mais importantes são S. ser. Typhimurium
e S. ser. Enteretidis, que têm sido envolvidos em muitos surtos de salmonelose
(CDC, 2004).
Os membros da família Enterobacteriaceae apresentam homologia em partes
do DNA e a Salmonella spp. estão estreitamente relacionadas com Escherichia coli
(SANDERSON e HARTMAN, 1978). A conjugação pode ocorrer entre Salmonella
spp. e Escherichia coli e Salmonella spp. e seus sorovares, com a transferência de
plasmídeos que transportam genes para resistência aos antibióticos e fatores de
virulência relacionados à patogenicidade (GUTHRIE, 1992).
Foram desenvolvidas técnicas para a caracterização de sorovares de
Salmonella, estas incluem Fagotipagem, Tipificação de bacteriocina, biotipagem,
perfil plasmidial e ribotipagem (GRIMONT e GRIMONT, 2000). Abordagens
moleculares para diferenciar as espécies do gênero são utilizadas também –
técnicas moleculares (LIM et al., 2005). Baseado no diagnóstico por PCR (Reação
em cadeia da Polimerase), foi demonstrado por Quintaes et al. (2004) que o
sorovares typhi, pode ser identificado entre diferentes isolados de Salmonella. Tais
abordagens
podem
favorecer
estudos
epidemiológicos
da
ocorrência
de
salmoneloses em populações afetadas por surtos epidêmicos.
A salmonelose em humanos afeta principalmente o sistema gastrintestinal,
sendo autolimitante após dois a quatro dias de curso. A incubação ocorre num
período de 6 a 72 horas, com início súbito causando febre, mialgia, cefaléia, malestar, seguido por dor abdominal, náusea, vômito e diarréia (ACHA e SZYFRES,
2001). Causa um amplo espectro de doenças em humanos variando de febre tifóide,
bacteremia, e infecções focais, sendo uma das principais causas de gastroenterite
veiculada por alimentos em todo o mundo, e um importante problema de saúde
pública, tanto em países industrializados como naqueles em desenvolvimento
(PAYMENT e RILEY, 2002, KUMAR et al., 2008, CHUANG et al., 2009).
34
2.6.3. Cadeia Epidemiológica
A salmonelose pode acometer animais domésticos, silvestres e humanos
(GOPEE et al., 2000, KANASHIRO et al., 2002, SMITH et al., 2002, CARVALHO,
2006) e sua forma de transmissão mais comum é pela via fecal-oral que pode
ocorrer por meio da ingestão de água ou alimentos contaminados (SMITH et al.
2002) ou por contato direto com animais infectados. Outras vias de transmissão
também foram relatadas como, por exemplo, o contato com superfícies
contaminadas com matéria orgânica, ou com solos úmidos, água, fezes onde o
agente pode sobreviver por longos períodos (OLSEN et al., 2001, CARVALHO,
2006). Um estudo americano indicou que a grande maioria (95%) dos casos de
salmonelose em humanos foram transmitidos por alimentos, e que crianças, idosos,
gestantes e pessoas imunodeprimidas fazem parte do grupo de risco à infecção
(OLSEN et al., 2001).
Segabinazi et al. (2005) isolaram 10 gêneros de bactérias da família
Enterobacteriacea em cascudinho (Alphitobius diaperinus) de granjas avícolas no sul
do Brasil. PETNEY et al. (2004) descreveram o carrapato Argas persicus como
provável vetor mecânico de Salmonella ser. Pullorum e Salmonella ser. Gallinarum,
corroborando com FORTUNA e FRANCO (2005) que citaram o controle de insetos
como forma de prevenção, sugerindo que os mesmos possam ser carreadores
destas bactérias.
Segundo Hall e Saito (2008), a ocorrência de surtos de salmonelose depende
de variáveis como sensibilidade da espécie hospedeira, idade do hospedeiro,
estresse e virulência do sorovar ou da cepa. Já Smith et al. (2002) relacionaram que
a prevalência de Salmonella spp. em populações de animais silvestres é
desconhecida e provavelmente variável. Millán et al. (2004) citaram as aves
silvestres como tendo um papel importante na cadeira epidemiológica da doença,
sendo algumas delas bastantes suscetíveis à morte por salmonelose como é o caso
de pequenos Passeriformes. A situação inversa também foi verificada, cujos autores
responsabilizaram o homem e seus animais domésticos de criação como
responsáveis por disseminação deste patógeno para a fauna silvestre (GOPEE et al.
2000, HERNANDEZ- DIVERS et al., 2006, PENNYCOTT et al., 2006, NEWMAN et
al., 2007), sugerindo a possibilidade de haver um elo entre as cadeias
35
epidemiológicas domésticas e silvestres da salmonelose, além de outras
enfermidades bacterianas.
Perdas financeiras resultantes de infecções são consideradas importantes.
Em 1996 o Serviço de Recursos Econômicos dos Estados Unidos (ERS) estimou
que infecções causadas por Salmonella spp. veiculadas por alimentos em seres
humanos causaram um prejuízo de 0.6 a 3,5 bilhões de dólares anuais em despesas
médicas e perdas na produtividade (DARGATZ et al., 1998). Foi observado que em
torno de 1,4 milhão de casos de salmonelose ocorrem a cada ano nos EUA,
resultando em cerca de 600 mortes. Apenas 2,5% desses casos são isolados e
sorotipados (BRENNER et al., 2000). No Brasil, entre os anos de 1999 e 2003 foram
notificados 724 surtos de salmonela. Uma grande variedade de alimentos tem sido
implicada como veículo de transmissão da salmonelose, isso inclui carne, ovos, leite,
frutas, sucos e vegetais, sendo que a contaminação pode ocorrer ao longo de toda
cadeia produtiva, incluindo produção, beneficiamento, distribuição, venda em
mercados, manuseio e preparo (OLSEN et al., 2001, ZHAO et al., 2003).
A resistência das salmonelas às adversidades ambientais é um ponto de
destaque na epidemiologia das toxinfecções alimentares, pois esta se mantém
virulenta por 89 dias em água de tanques, 120 dias em solo seco, 280 dias em
gramados, 28 meses em fezes de aves, 30 meses em fezes de bovinos e de répteis
em condições ideais, sendo dada pouca importância aos répteis na disseminação da
Salmonella spp. (VASCONCELLOS, 2001, LAIDLAW, 2005).
2.6.4. Patogênese da Salmonelose
A salmonela possui vários fatores de virulência, permitindo assim invadir e
sobreviver no interior do hospedeiro. Alguns sorovares de Salmonella spp. utilizam o
flagelo para a sua motilidade e para favorecer a adesão as células intestinais enterócitos (FINLAY e FALKOW, 1989). O lipopolissacarído (LPS) é um fator central
de virulência deste agente, sendo composto por três regiões: lipídeos A, uma parte
hidrofóbica que reside na face exterior da membrana, dando ao seu LPS
propriedades endotóxicas; o núcleo de oligossacarídeo e a porção hidrofílica que se
prolonga para o meio extra-celular (RYCROFT, 2000).
As infecções causadas por Salmonella spp. apresentam uma patogênese
complexa. O primeiro passo no processo de doença é a transmissão da bactéria
36
para um hospedeiro suscetível. Foi estimado, em estudos com voluntários, que
sejam necessárias 105 a 1010 bactérias para iniciar uma infecção, mas a quantidade
varia conforme a estirpe, o alimento consumido e o estado geral do hospedeiro. Um
inóculo grande é necessário para superar a barreira de acidez do estômago e
competir com a microbiota do intestino. Mas a dose infecciosa é reduzida quando
Salmonella spp. é consumida com alimentos que atravessam o estômago
rapidamente, como líquido, ou com alimentos que neutralizam a acidez estomacal,
como queijo e leite. Indivíduos com pH gástrico mais elevado são mais suscetíveis à
infecção (DARWIN e MILLER, 1999). Após a ingestão oral, as bactérias que
sobreviveram ao baixo pH provocado pelo ácido clorídrico, colonizam o intestino,
principalmente as Placas de Peyer, onde estão localizadas as células M. Depois da
colonização intestinal, a Salmonella invade as células M e os enterócitos, com o
auxílio do Sistema de Secreção do Tipo III (GAL- MOR, 2010). Após a invasão
celular, as células bacterianas são fagocitadas por macrófagos. Quando os
macrófagos conseguem deter a bactéria, ela causa apenas a infecção local no trato
digestivo. Por outro lado, quando as bactérias conseguem permanecer viáveis
dentro dos macrófagos, ocorre a infecção sistêmica. Dentro dos macrófagos, a
Salmonella consegue se multiplicar e é levada a todo o organismo (BAUMLER et al.,
1997).
Através de proteínas efetoras, a bactéria provoca a apoptose desses
macrófagos e, utilizando-se de um segundo tipo Sistema de Secreção do Tipo III
(codificado por outra região do DNA bacteriano), o micro-organismo consegue sair
desta célula e voltar para o lúmem intestinal para ser eliminado através das fezes
GAL- MOR, 2010). Esta sequência de fatos leva a uma lesão das vilosidades
intestinais e à redução da superfície de absorção. A Salmonella também faz com
que ocorra influxo de células polimorfonucleadas para a mucosa infectada, induzindo
a uma diarréia aquosa que pode conter sangue (WALLIS e GALYOV, 2000) A
salmonelose pode causar diversos sintomas, como infecções focais, febre entérica,
septicemia e enterocolite, sendo este último o mais comum (DARWIN e MILLER,
1999).
37
2.7. IDENTIFICAÇÃO DOS SOROVARES DE SALMONELLA spp.
Subtipagem é a análise de um grupo de isolados bacterianos para várias
características que permitam a discriminação abaixo do nível de espécie
(SWAMINATHAN e MATAR, 1993).
As técnicas clássicas de tipagem como a biotipagem, determinação do padrão
de suscetibilidade a antimicrobianos, sorotipagem e fagotipagem, baseiam-se na
presença ou ausência de atividades metabólicas ou biológicas expressas pelos
micro-organismos (FARBER, 1996).
Após a identificação da bactéria utilizando testes bioquímicos e sorológicos, o
sorotipo deve ser determinado em laboratórios de referência. A caracterização
antigênica é baseada em carboidratos da superfície celular, conhecidos como
antígenos somáticos O, e proteínas flagelares denominadas antígenos flagelares ou
H (reação de aglutinação dos antígenos). A sorotipagem e a fagotipagem requerem
reagentes especializados como antissoros, fagos e estirpes bacterianas para
propagar os fagos. Alguns isolados bacterianos podem ser não-tipáveis pela
sorotipagem ou fagotipagem (SWAMINATHAN e MATAR, 1993). Os sistemas de
fagotipagem e tipagem por bacteriocinas não são disponíveis para todas as espécies
bacterianas. Além disso, os marcadores fenotípicos podem não ser expressos de
forma estável em certas condições ambientais ou de cultivo (FARBER, 1996).
No intestino, os processos de aderência e invasão são fundamentais para o
estabelecimento das infecções causadas por bactérias do gênero Salmonella spp.
Antes de invadir qualquer tipo de célula, as bactérias devem localizar e aderir a um
ou mais tipos de células encontradas no intestino. Em Salmonella ser. Typhimurium
esse tropismo pode envolver vários tipos de fímbrias, quatro das quais foram
geneticamente definidas: fímbrias tipo 1 (Fim), fímbrias codificadas por plasmídeos
(PE), long polar fimbriae (LP) e fímbrias finas agregativas. Foi sugerido que cada
fímbria apresenta tropismo específico para certos tipos celulares e que
desempenham uma função no recrutamento de neutrófilos para o sítio de infecção
(DARWIN e MILLER, 1999).
A maioria dos fatores de virulência de Salmonella enterica são determinados
por genes cromossomais e são principalmente codificados dentro das ilhas de
patogenicidade da Salmonella – SPI (DE JONG et al., 2012).
38
2.8. ILHAS DE PATOGENICIDADES
O conceito de ilha de patogenicidade (Salmonella pathogenicity islands, SPI)
foi introduzido por Hacker et al. (1990), ao estudarem a virulência de amostras de
Escherichia coli causadoras de infecção urinária (Uropathogenic E. coli, UPEC), foi
observada uma ligação entre os genes que codificavam fatores de colonização que
permitem às UPECs aderirem às células de vias urinárias e o gene responsável pela
produção de hemolisina (fator de virulência das UPECs). Esses genes estavam
presentes em grandes regiões cromossômicas, que apresentavam características
próprias e grande instabilidade. A partir dessa nova visão, a presença de SPI foi
descrita em diversos micro-organismos causadores de doenças em humanos,
animais e plantas (HACKER, et al., 1997, SCHMIDT e HENSEL, 2004). Até o
momento foram 23 ilhas de patogenicidade de Salmonella (SPI) identificados
(BARROW et al., 2010).
Descritas como grandes elementos genéticos, capazes de apresentar
propriedades diferentes do restante do genoma bacteriano e apresentando pelo
menos um gene associado à patogenicidade, as SPI podem também codificar vários
fatores de virulência, bem como podem codificar parte ou todo arsenal molecular
para que esses fatores consigam alcançar o alvo na célula hospedeira. Um exemplo
é o sistema de secreção comumente encontrado nos enteropatógenos (VIEIRA,
2009).
Em resumo, as ilhas de patogenicidade são regiões do cromossomo que
carreiam um ou mais genes de virulência, estando presentes no genoma de
bactérias patogênicas, mas ausentes no genoma de representantes não patogênicos
da mesma espécie ou espécie intimamente relacionada e frequentemente estão
localizadas adjacentes a genes de tRNA (SCHMIDT e HENSEL, 2004).
A invasão da mucosa é necessária, mas não suficiente para o acúmulo de
líquido na causa da diarréia. Possivelmente, as enterotoxinas são as responsáveis
ou podem contribuir para o desencadeamento do processo diarreico associado à
Salmonella spp. (DARWIN e MILLER, 1999). Outra possibilidade é a interação da
Salmonella spp. com o epitélio, resultando não somente na invasão das células
epiteliais, mas na produção de uma variedade de moléculas sinalizadoras nestas
células. A produção de interleucina-8 (IL-8) e do quimioatrator epitelial induzido por
patógenos, (PEEC) pelas células epiteliais estimulam o processo inflamatório e a
39
transmigração dos leucócitos através do epitélio. A produção de prostaglandinas
pelos leucócitos induzem ao aumento da atividade da adenilatociclase nas células
intestinais, inibindo a absorção do Na +, o aumento na secreção do Cl -, provoca a
secreção de fluido que se manifesta como diarréia no hospedeiro (DARWIN e
MILLER, 1999).
Outra característica importante da Salmonella spp. é a capacidade de
sobreviver no interior dos fagócitos. Estudos realizados com Salmonella ser.
Typhimurium mostraram que esse é um processo complexo, requerendo o
envolvimento de cerca de 200 genes que incluem, os que auxiliam a bactéria a
sobreviver à exposição às formas reativas de oxigênio, baixo pH e defensinas. A
função da SPI-2 é essencial para a habilidade de Salmonella spp. causar infecções
sistêmicas e a proliferação nos órgãos do hospedeiro. O genótipo de virulência está
ligado à capacidade de sobreviver no interior de células fagocíticas e se replicar
dentro de vesículas que contém a bactéria em uma variedade de células eucarióticas
(SCHMIDT e HENSEL, 2004).
Salmonella ser. Typhimurium e Salmonella ser. Typhi são capazes de
expressar o sistema de secreção tipo III, lipopolissacarídeos, e polissacarídeos de
outra superfície, fímbrias e flagelina. O antigeno Vi é exclusivamente expresso por
Salmonella ser. Typhi, sendo capaz de evitar a resposta imune inata ao reprimir a
expressão da flagelina e LPS (Figura 3) (DE JONG et al., 2012).
40
Figura 3 – Esquematização da expressão de possíveis fatores de virulência em
Salmonella ser. Typhimurium e Salmonella ser. Typhi. Fonte: DE JONG, et al.
(2012).
2.9. FATORES RELACIONADOS À VIRULÊNCIA
Os micro-organismos patogênicos se distinguem de outros da mesma espécie
por possuírem e expressarem genes que codificam os fatores de virulência (VIEIRA,
2009), que conferem à bactéria a habilidade de causar doença no seu hospedeiro
(VAN ASTEN e VAN DIJK, 2005). Estes fatores propiciam a invasão e colonização
das células do hospedeiro pelo micro-organismo, levando à ocorrência de uma série
de eventos que levam ao aparecimento da doença. Estes fatores podem ser
mecanismos de invasão, que interfiram na resposta imune do hospedeiro ou
mecanismos de resistência a antimicrobianos (VIEIRA, 2009). Os fatores de
virulência podem estar localizados no próprio cromossomo da bactéria, como nas
Ilhas de Patogenicidade, ou em elementos genéticos transmissíveis, como
transposons, plasmídeos e bacteriófagos (VAN ASTEN e VAN DIJK, 2005).
O Lipopolissacarídeo (LPS) é o principal componente da membrana externa
observado em bactérias Gram-negativas sendo conhecido como um importante
41
ativador da resposta imunológica, composto por três regiões: cadeia de
polissacarídeos (antígenos O), oligossacarídeo (região do core) e molécula lipídica
(lipídeo A). LPS provoca uma série de reações que estão envolvidas com a
patogênese das infecções por Salmonella spp., sendo considerada uma endotoxina
(PERRY, 1993). Seus efeitos são mediados principalmente pelo NFKB (Nuclear
Factor kappa B), um fator de transcrição que se mantém inativo no citoplasma e que
migra para o núcleo após a interação do LPS com seus receptores, promovendo a
transcrição de diversos genes relacionados à resposta inflamatória aguda (CRUZMACHADO, 2010). O LPS é responsável pela indução de efeitos patofisiológicos no
hospedeiro, como febre, hipotensão, leucocitose, inflamação, choque séptico e
morte (PERRY, 1993, FREUDENBERG et al., 2001).
A maioria dos sorovares de Salmonella possui de cinco a dez flagelos que
estão diretamente relacionado a motilidade das bactérias. Os genes responsáveis
pelos antígenos flagelares de fase 1 e 2 em Salmonella são expressos pelos genes
fliC e fliB, respectivamente, e são localizados em duas regiões distintas do
cromossomo, sendo transcritos de forma alternada, podendo ocorrer uma inversão
reversível de fase flagelar, que pode estar relacionada com a capacidade da
Salmonella de não ser inativada pelo sistema de defesa do hospedeiro (VAN ASTEN
e VAN DIJK, 2005).
Como observado em outras bactérias patogênicas, a Salmonella spp. produz
apêndices de membrana chamados de fímbrias, mais curtos que os flagelos. São
compostas por apenas uma proteína estrutura - a pilina, estando dispostas na forma
helicoidal na superfície de bactérias Gram-negativas. As fímbrias têm papel
fundamental durante o processo de adesão às superfícies sendo importantes na
interação bactéria-hospedeiro, persistência ambiental, formação de biofilmes,
colonização e invasão de células intestinais (GIBSON et al., 2007).
Na Salmonella spp. já foram identificados 20 operons fimbriais. Fazendo parte
destes operons fimbrias Salmonella-específicos, o agf (Aggregative Fimbriae),
fimbrias codificadas por plasmídeos (Plasmid Encoded Fimbriae –pef) e fimbria polar
longa ( Long Polar Fimbriae- Ipf). Estudos demonstram que cada uma das fimbrias
possui tropismo por diferentes tipos celulares em diferentes hospedeiros. O sorovar
Salmonella ser. Enteritidis, também possui a fimbria sef (Salmonella Enteritidis
Fimbriae) (GIBSON et al. 2007).
42
Os plasmídeos são elementos genéticos que se replicam independentemente
do cromossomo do hospedeiro, sendo encontrado na forma circular no interior de
células procarióticas, são pequenas quantidades de DNA circular extracromossomal
que contêm genes que conferem propriedades especiais às bactérias, diferindo dos
genes localizados no cromossomo por não serem vitais à celula bacteriana
(MADIGAN et al., 2010).
2.9.1. Sistema de Secreção Tipo III
Os Sistemas de secreção do Tipo III (Type III Secretion System - TTSS) são
usados por muitos agentes bacterianos patogênicos para introduzir um conjunto de
proteínas efetoras no citosol da célula hospedeira durante a entrada celular e
interferir ou subverter as vias normais de sinalização celular (MARCUS et al., 2000,
DEANE et al., 2010, KIM et al., 2013). Os TTSS de Salmonella ser. Typhimurium são
compostos por mais de 20 proteínas que constituem a base da membrana, agulhas
e o complexo da ponta na extremidade distal da agulha do TTSS (Figura 6). A
ancoragem na membrana e a penetração entre o TTSS e as células hospedeiras é
seguida pela secreção de proteínas efetoras. Esta secreção das proteínas
formadoras de poros SIPB, SIPC e SIPD são controladas pelo regulador de proteína
do TTSS invE (KIM et al., 2013).
A interação inicial entre a bactéria e as células epiteliais do hospedeiro ainda
não é bem conhecida, mas sabe-se que neste processo estão envolvidos o TTSS e
as Ilhas de Patogenicidade (SPI) (BARROW et al., 2010, DEANE et al., 2010). Entre
as propriedades conferidas pelas SPIs, destacam-se a capacidade de aderir e
invadir o epitélio da célula hospedeira, produção de toxinas, captar ferro do meio
ambiente e síntese do TTSS, que é um complexo sistema de proteínas presente em
todas as bactérias Gram-negativas (MIRMOMENI et al., 2008). Nas bactérias
patogênicas, este complexo serve como um canal para secreção de proteínas
efetoras para o interior da célula eucariótica alvo, que manipulam as cascatas de
sinalização das células hospedeiras. Estas proteínas efetoras são sugeridas como
tendo atividades múltiplas dentro das células hospedeiras (IBARRA e STEELEMORTIMER, 2009) e possuem propriedades que auxiliam a bactéria a infectar as
células alvo (VIEIRA, 2009).
43
Mais de vinte proteínas do sistema de secreção tipo III codificado pela SPI-1
fazem parte da formação dessas estruturas de superfície da membrana celular, as
quais são essenciais para invadir tanto células M quanto células epiteliais (PLANO et
al., 2001, ZHOU e GALÁN 2001).
A expressão da TTSS através da SPI-1 é regulada por diversos estímulos
ambientais e genéticos, tais sinais ambientais incluem o pH, a osmolaridade, a
presença de bílis, concentração do magnésio e a presença de ácidos graxos de
cadeia curta (ALTIER, 2005). O local preferido da invasão por Salmonella spp. nas
células M é no intestino delgado distal. A expressão de SPI-1 é induzida pelo pH
próximo do neutro e alta osmolaridade (ALTIER, 2005, GARMENDIA, et al., 2003).
Segundo os mesmos autores a presença elevada do ferro, o regulador de absorção
férrico age para aumentar a expressão de hil D.
Figura 4 – Esquema do sistema de secreção tipo III. Fonte: VIEIRA, 2009.
Na figura 4 A, podemos observar o esquema do sistema de secreção tipo III
(TTSS), aqui apresentado com dois anéis atravessando a membrana e a agulha
44
surgindo da superfície da bactéria. As proteínas efetoras e translocadoras estão
estocadas. Já na figura 4 B, observa-se o esquema do TTSS em operação. As
proteínas translocadoras formam um poro na membrana da célula alvo e as
proteínas efetoras são translocadas para o citosol da célula alvo. Já em C, a
microscopia eletrônica da superfície de bactéria com agulhas do TTSS.
Das 23 ilhas descritas em Salmonella spp. algumas delas são conservadas
entre os diferentes sorovares, indicando que foram adquiridas há muitos anos, como
a SPI-1. Outras ilhas são específicas de determinados sorovares e, provavelmente,
adquiridas recentemente como SPI-7, SPI-8 e SPI-15 (HENSEL, 2004, BARROW et
al., 2010).
Diferentes genes associados à virulência de Salmonella spp. estão presentes
nestas ilhas, as mais bem descritas e estudadas são SPI-1 e SPI-2. A SPI-1 possui
genes que codificam proteínas para o TTSS (VIEIRA, 2009). A invasão e
sobrevivência da Salmonella spp. nas células hospedeiras estão relacionadas a uma
série de proteínas bacterianas, entre elas a SopE, AvrA, e SptP, que chegam até o
citoplasma da célula hospedeira através dos sistemas de secreção (MIRMOMENI et
al., 2008). A SPI-1 está presente em S. bongori e em todos os sorovares de S.
enterica analisados (HENSEL, 2004, MOTA et al., 2005). A principal função da SPI-1
é conferir uma maior capacidade de invasão da célula hospedeira pela bactéria,
visto que possui mais de 25 genes associados à invasão, além de estar relacionada
com a captação de ferro (BARROW et al., 2010).
De acordo com GALAN et al. (1992) o operon invABC em diversos sorovares
de Salmonella spp. desempenha uma função importante na invasão de células
epiteliais. O gene invA é o primeiro do operon estando situado na mesma unidade
transcricional dos genes invB e
invC, sendo que invD está alojado em outra
unidade.
Em estudo realizado por Pavlova et al. (2011) foram infectados macrófagos
alveolares de suínos com Salmonella ser. Typhimurium e Salmonella ser. Enteritidis
e suas estirpes mutantes que foram desprovidas da SPI-1. Os pesquisadores
observaram que os mutantes de ambos sorovares foram cerca de cinco vezes
menos eficientes no processo de invasão do hospedeiro e que apesar deste fato os
macrófagos infectados por estas bactérias responderam de forma satisfatória à
infecção, estes autores concluíram que a SPI-1 além de auxiliar na invasão celular, é
responsável pela supressão da expressão de citocinas pelos macrófagos.
45
A SPI-2 é composta por duas porções, uma delas presente apenas nos
sorovares de Salmonella enterica subsp. enterica e outra comum às espécies S.
bongori e S. enterica. A porção maior está relacionada com outro tipo de TTSS, que
é ativado pela bactéria quando ela já está dentro da célula do hospedeiro, ao
contrário da TTSS da SPI-1 (HENSEL, 2004). O TTSS da SPI-2 transporta proteínas
que protegem a bactéria dos mecanismos de defesa, permitindo que ela sobreviva
dentro das células fagocíticas, especialmente nos macrófagos (RYCHLIK et al.,
2009, VIEIRA, 2009). As proteínas efetoras secretadas pelo TTSS da SPI-1
relacionam-se com os primeiros estágios da infecção, enquanto que aquelas
secretadas pelo TTSS da SPI-2 atuam na infecção sistêmica (HENSEL, 2004).
Aparentemente, as duas SPIs foram adquiridas por transferência horizontal de
genes, pois as concentrações das bases nitrogenadas guanina e citosina (CG)
nestas ilhas são diferentes da concentração normalmente encontrada nos genes
típicos de Salmonella spp. (GROISMAN e OCHMAN, 1996).
A SPI-3 codifica elementos que protegem a bactéria dentro da célula
hospedeira (VIEIRA, 2009, BARROW et al., 2010). A principal função dessa ilha é
codificar um sistema de captação e alta afinidade por magnésio (Mg 2+), cátion
necessário para a adaptação nutricional da bactéria, permitindo sua sobrevivência
no interior das células fagocíticas. Esta SPI está conservada entre os sorovares
Salmonella ser. Typhi e Salmonella ser. Typhimurium e na espécie S. bongori.
A SPI-4 é conservada entre os diferentes sorovares de S. enterica subsp.
enterica, necessária para a sobrevivência de Salmonella spp. no interior dos
macrófagos e também possui o Sistema de Secreção Tipo I (HENSEL, 2004). A SPI5 codifica proteínas efetoras dos TTSS codificados por SPI-1 e SPI-2 (HENSEL,
2004; BARROW et al., 2010). A SPI-6 ou ilha cromossomal de Salmonella spp. está
presente nos sorovares Salmonella ser. Typhi e Salmonella ser. Typhimurium. Nesta
SPI estão localizados os genes sef, codificador de fimbrias, e pagN, codificador de
uma invasina e de proteínas sem função conhecida até o momento atual. Esta SPI
não está relacionada com a infecção sistêmica, mas possui influência na capacidade
de invasão da bactéria.
A SPI-7 ou Ilha Maior de Patogenicidade está presente apenas nos sorovares
S. ser. Typhi, S.ser. Dublin e S.ser. Paratyphi C (HENSEL, 2004, BARROW et al.,
2010). A SPI-8 parece estar restrita ao sorovar Salmonella ser. Typhi, ainda não se
sabe exatamente qual é sua função. A SPI-9 contém genes para o TTSS, sendo
46
descrito principalmente nos sorovares Salmonella ser. Typhi e Salmonella ser.
Typhimurium. A SPI-10 está relacionada ao operon sef para fimbrias. Está presente
somente no sorovares Salmonella ser. Enteritidis e outros do grupo D, sendo
considerado um dos fatores determinantes da especificidade do hospedeiro
(HENSEL, 2004). A SPI-11 está relacionada às proteínas efetoras do TTSS. SPI-12,
SPI-14 e SPI-15 são responsáveis pela produção de proteínas sem função
conhecida até o momento.
A SPI-13 está relacionada com a sobrevivência da Salmonella spp. no interior
dos macrófagos. SPI-16 e SPI-17 estão relacionadas aos genes de modificação do
LPS (BARROW et al., 2010). Além destas SPIs, outras duas ilhas foram descritas:
Ilha Genômica 1 de Salmonella (Salmonella Genomic Island 1 – SGI-1) e a Ilha de
alta Patogenicidade (High Pathogenicity Island – HPI) (HENSEL, 2004, KARASOVA
et al, 2010). A SGI-1 está relacionada à resistência à antimicrobianos, enquanto que
a HPI parece estar relacionar-se à capacidade de provocar septicemia (HENSEL,
2004) e à captação de ferro (BARROW et al., 2010).
Fatores de virulência têm sido extensivamente estudados em Salmonella spp.
a fim de determinar a sua relação com a fonte de localização geográfica, ou mesmo
a sua associação com a resistência antimicrobiana (HUEHN. et al., 2010, LITRUP et
al., 2010).
2.9.2. Gene inv
O mecanismo pelo qual a Salmonella spp. pode invadir as células
hospedeiras
é
considerado bastante
complexo.
A bactéria
promove
sua
internalização através da estimulação de células não fagocíticas. Um dos genes
envolvidos
neste
processo
é
o
invA,
que
está
localizado
no
operon
invABCD,presente na SPI-1. Este gene codifica a proteína InvA a membrana interna
da bactéria, sendo essencial para a invasão das células epiteliais do hospedeiro
(DARWIN e MILLER, 1999, OLIVEIRA et al., 2003). Este gene é conservado em
todos os sorovares de Salmonella (OLIVEIRA et al., 2003). Por ser considerado
específico deste gênero, invA é utilizado como gene alvo para a detecção de
Salmonella spp. através do uso de
técnicas moleculares (SALEHI et al., 2005,
NASHWA et al., 2009, AMINI et al., 2010, BORGES, 2011, SHANMUGASAMY et al.,
2011).
47
De acordo com Okamoto et al. (2009) , observaram que apenas amostras
positivas para os genes invA e spvC, simultaneamente, desenvolveram-se em
condições adversas de pH, temperatura e baixas concentrações de nutrientes. Ao
analisarem suas características fenotípicas e genotípicas, os sorovares Salmonella
ser. Typhimurium e Salmonella ser. Enteritidis foram considerados os mais virulentos
para o gênero (BACCI et al., 2006).
Como a Salmonella spp.
normalmente é
isolada da via oro-fecal, espera-se encontrar em todas as o gene invA, que está
associado ao processo de invasão das células epiteliais (NASHWA et al., 2009).
Muitas proteínas efectoras são codificadas na SPI-1 e sabe-se da sua importância
durante as fases de infecção (SMITH et al., 2010). A ausência do gene invA em
isolados de Salmonella spp. de diferentes sorovares poderia levar à redução na
virulência das amostras, pois o gene em questão é considerado essencial para a
virulência completa desta bactéria (AMINI et al., 2010, BORGES, 2011).
2.9.3. Gene sef
O genoma de Salmonella ser. Enteritidis contém diversos operons fimbriais,
como agf,bcf, fim, lpf, pef, saf, sef, stb, std, ste, stf, stg, sth e sti (PORWOLLIK e
McCLELLAND, 2003), mas a expressão das proteínas fimbriais tem sido
demonstrada por poucos destes operons (CRACIUNAS et al., 2010).
O operon sef está localizado em uma pequena Ilha de Patogenicidade, que
contém quatro genes estruturais (sefABCD). Este operon é requerido para
translocação e biogênese da fímbria SEF14, que está restrita ao sorovar S. ser.
Enteritidis e alguns outros soravares, este gene é importante na distinção de
Salmonella ser. Enterididis de estirpes de salmonela não enteritidis (PAN et al.,
2002, MIRZAIE et al., 2010). O gene sefA codifica uma única fímbria e é a maior
subunidade; sefB e sefC codificam proteínas que possuem similaridade com
proteínas acessórias de Escherichia coli e Klebsiela pneumoniae e sefC e com
outras proteínas da membrana externa, ainda, sefB e sefC não se expressam na
ausência de sefA, pois suas transcrições iniciam na região de sefA. O gene sefD
codifica adesinas e é a maior subunidade na codificação da fímbria SEF18
(GIBSON, et al., 2007).
O gene sef não vem sendo identificado em alguns sorovares de Salmonella
(PAN E LIU, 2002, CRACIUNAS et al., 2010) e a fímbria SEF14 foi identificada em
48
cinco de 42 sorovares pesquisados e vem sendo a sequência do gene altamente
conservada entre alguns sorovares. O operon sef possui uma distribuição
filogenética limitada, indicando que este foi adquirido, recentemente através de duas
linhagens distantes durante a evolução de Salmonella enterica subsp. enterica
(DORAN et al.,1996, BÄUMLER et al.,1997). Alguns autores referem-se a SEF14
como essencial para a adequada interação entre bactéria e macrófagos de células
hospedeiras, após a penetração e colonização intestinal. SEF14 foi a primeira
fímbria descrita que possui importância na interação com os macrófagos, enquanto
que as outras fímbrias descritas estão envolvidas na ligação com superfícies
epiteliais (EDWARDS et al., 2000).
Estudos sugerem que esta fímbria seja essencial para a aderência da S. ser.
Enteritidis no tecido reprodutivo de galinhas (THIAGARAJAN et al., 1996), mas
aparentemente não tem relação direta com a infecção sistêmica (OGUNNIYI et al.,
1997). Contrariando os trabalhos que observam diferenças entre as fímbrias,
Rajashekara et al. (2000) não observaram nenhum tipo de diferença entre SEF14,
SEF17 e SEF21 durante o processo de invasão dos enterócitos, fagocitose da pelos
macrófagos, habilidade na colonização do ceco e eliminação nas fezes.
Independente da importância de cada fímbria acredita-se que a aquisição ou perda
de operons fimbriais específicos deve ser um dos mecanismos pelos quais os
diferentes sorovares de Salmonella conseguiram adaptar-se a um maior número de
hospedeiros (BÄUMLER et al., 1997).
2.9.4. Gene hil
A expressão dos genes relacionados à invasão da célula hospedeira depende
do regulador central HilA, codificado pelo gene hilA (hiperinvasive) da SPI-1, que tem
sua importância para a regulação do aparelho de secreção de tipo III, a qual está
envolvida na invasão dos enterócitos (LOSTROH et al., 2000, MIROLD et al., 2001,
CARDONA-CASTRO et al., 2002). Esta proteína é necessária para a expressão dos
componentes do TTSS. A invasão das células epiteliais e a indução de apoptose dos
macrófagos é totalmente dependente da proteína HilA. A expressão deste gene está
relacionada com sua ativação pela proteína SirA, influenciada por sinais ambientais
que ativam a invasão celular (DARWIN e MILLER, 1999, TROXELL, et al., 2011).
Além do seu papel direto na regulação dos genes SPI-1, hilA também é um ativador
49
de um segundo regulador de transcrição, InvF. Regulando a expressão de proteínas
secretadas e a maquinaria do processo de formação do TTSS, controla também
indiretamente, a expressão de proteínas secretadas através da indução de invF
(ALTIER, 2005).
A expressão de Hila é controlada por um laço regulador complexo,
consistindo de Hild, HilC e RTSA, cada um dos quais pode independentemente
ativar a expressão Hila (ELLERMEIER, et al., 2005). Destes três, Hild tem o papel
predominante, mas aparentemente, sozinho não pode ativar SPI1 in vivo
(ELLERMEIER, et al., 2005). HilC e RTSA atuam como amplificadores de sinais. Um
certo número de outros sistemas de regulação também afetam a regulação de SPI1
(ALTIER, 2005, ELLERMEIER e SLAUCH, 2007) A maioria destes sistemas
parecem agir através de Hild (ELLERMEIER e SLAUCH, 2008), sugerindo então,
que a integração de Hild é o ponto para a transdução do sinal para o sistema de
SPI1 (CHUBIZ, et al., 2010).
2.9.5. Gene pho
PhoP-PhoQ é um sistema de dois componentes reguladores que controlam a
expressão de várias propriedades de virulência na Salmonella ser. Typhimurium e
outras bactérias Gram-negativas. PhoQ é uma quinase que responde as alterações
nas concentrações do Mg2+ ambiental, modificando a capacidade da proteína PhoP
para transcrever vários genes. As propriedades de virulência reguladas por esse
sistema incluem a capacidade de sobreviver dentro de macrófagos, suportar pH
ácido,
invadir células epiteliais, formar vacúolos, e alterar a apresentação de
antígenos. Estima-se que PhoP controla a expressão de umas 40 proteínas
diferentes (SONCINI, et al., 1996, ZWIR, et al., 2005, KATO e GROISMAN, 2008).
2.9.6. Gene mgtC
MgtC é um fator de virulência comum para vários agentes patogênicos
intracelulares que desempenham papel fundamental na sobrevivência intracelular
(ALIX e BLANC-POTARD, 2007). Este fator foi descrito pela primeira vez em
Salmonella ser.Typhimurium, onde ele é necessário para a multiplicação intracelular
e para o desenvolvimento em longo prazo da infecção sistêmica (BLANC-POTARD e
50
GROISMAN, 1997, LAWLEY et al, 2006). Na análise filogenética, sugere-se que
mgtC foi adquirido por transferência horizontal de genes, repetidamente ao longo da
evolução bacteriana (BLANC-POTARD e LAFAY, 2003). Em Salmonella ser.
Typhimurium, o gene mgtC é transportado pela ilha de patogenicidade – SPI-3
(BLANC-POTARD e GROISMAN, 1997). MgtC também está envolvido na adaptação
à baixa concentração do Mg2+ no ambientes intracelular (GÜNZEL et al, 2006, ALIX
e BLANC-POTARD, 2007, ALIX e BLANC-POTARD, 2008). O operon mgtCB é
regulado pelo sistema PhoP-PhoQ, que é altamente induzido pela baixa
concentração de Mg2+ (GARCÍA-VESCOVI et al., 1996, ALIX e BLANC-POTARD,
2008).
2.9.7. Gene orgA
O gene da orgA de Salmonella ser. Typhimurium está envolvido na promoção
de invasão celular deste patógeno. É uma proteína que, regula o oxigênio
necessário para a internalização bacteriana, está presente em SPI-1 (KLEIN, et al.,
2000, MCCLELLAND, et al., 2001, RUSSEL et al., 2004).
Apesar de demonstrada a importância de vários genes de virulência na
patogenicidade da Salmonella spp. o isolamento de cepas clínicas com ausência de
um ou mais fatores de virulência indica que a presença de apenas alguns destes
fatores pode desempenhar o papel de enteropatogenicidade da Salmonella. (SMITH
et al. 2010).
Após a ingestão, a colonização intestinal segue e Salmonella spp. penetra
nos enterócitos e células dendríticas no epitélio intestinal (IBARRA e STEELEMORTIMER, 2009). Subsequentemente, as salmonelas que atingem a submucosa
podem ser internalizadas pelos macrófagos residentes através de diferentes
mecanismos tais como a fagocitose, invasão ativa utilizando o TTSS utilizando
fímbrias ou por outras adesinas na superfície bacteriana.
51
2.10. ELETROFORESE EM GEL DE CAMPO PULSADO (PFGE)
PFGE (“pulsed field gel eletrophoresis”) é a sigla usada para indicar qualquer
técnica de eletroforese apropriada para separar grandes fragmentos de DNA, por
meio da reorientação do DNA em gel pela ação de campos elétricos alternados. A
PFGE é um método que vem sendo empregado para a análise dos fragmentos de
DNA genômico com alto peso molecular, digeridos por enzimas de restrição. Nesta
técnica, as moléculas de DNA são submetidas a campos elétricos que mudam de
direção de acordo com um padrão pré-determinado, o que permite que as moléculas
sejam reorientadas antes de ocorrer a migração, levando a uma separação de
acordo com o tamanho do fragmento da molécula, a visualização desta separação
ocorre através de eletroforese em uma base de gel de agarose (MAGALHÃES et al.,
2005). Os mesmo autores ressaltam que a qualidade da resolução desta técnica
depende de alguns fatores como voltagem, concentração de agarose, temperatura,
solução tamponante, tempo de pulso e de corrida eletroforética, bem como, da
integridade do DNA.
Na realização da técnica de PFGE, os micro-organismos são incorporados em
pequenos cubos de agarose, chamados plugs, estes são digeridos com enzimas de
restrição, que atuam em segmentos específicos do DNA. Os plugs então são
colocados em um gel de agarose e submetidos a campos elétricos com direções
alternadas, gerando perfis de bandas de DNA genômico. Os perfis produzidos são
comparados entre si a fim de identificar a correlação entre eles, detectando clones
iguais ou diferentes. A alta reprodutibilidade do método é atribuída à imobilização do
DNA dentro do plug de agarose, protegendo assim o DNA de possíveis danos
mecânicos e garantindo que as bandas geradas sejam decorrentes da atividade da
restrição enzimática e não causadas por outros fatores (FOLEY et al., 2007). Os
dados gerados pela técnica de PFGE são compilados em uma rede mundial, e são
somente os laboratórios membros que participam, denominada PulseNet. Para que
os dados enviados pelos laboratórios participantes sejam totalmente confiáveis e
reprodutíveis, o CDC padronizou um protocolo de procedimento laboratorial
denominado protocolo PulseNet (CDC, 2009).
A técnica possui poder discriminatório bastante elevado apresentando-se
como um instrumento eficaz na avaliação da diversidade genética, além de ser
reconhecida como padrão ouro para identificação de linhagens bacterianas, fúngicas
52
e de protozoários (THONG et al., 2002, MAGALHÃES et al. 2005, HUNTER et al.,
2005, KÉROUANTON et al., 2007) sendo uma ferramenta importante para
investigação de possível relação genética entre diferentes cepas no caso de uma
investigação epidemiológica (KÉROUANTON et al., 2007, STEVENS et al., 2008,
CDC, 2009) e tem se mostrado um método confiável, com alto grau de diferenciação
para subtipificação de patógenos (RIBOT et al., 2006).
Segundo Salve et al. (2006) por meio da PFGE, foi possível determinar as
relações genéticas entre cepas circulantes em diferentes locais, podendo-se aplicar
a técnica em estudos que envolvem casos esporádicos ou surtos, bem como, na
comparação de populações bacterianas envolvendo cepas de diferentes países,
como observaram os autores ao estudarem cepas com origem na Argentina e na
Colômbia. Já Moehario (2009) investigou cepas de cinco áreas geográficas
diferentes na Indonésia, identificando vários clones circulantes e através desta
técnica observou que um único clone estava presente em todas as regiões
estudadas. É importante ressaltar que os resultados da análise molecular devem ser
discutidos em conjunto com dados epidemiológicos para determinar a ocorrência de
um surto.
A PFGE revela-se um método útil para distinguir isolados na vigilância e
investigação de surtos, no mapeamento do genoma de diferentes espécies, e, além
disso, mais de 20 anos desde o seu desenvolvimento destaca-se como uma técnica
empregada para avaliar as relações epidemiológicas na maioria das bactérias
clinicamente relevantes (TORPDAHL et al., 2005, GOERING 2010, LOPES, 2011,
MARQUES, 2011). Estudos da epidemiologia molecular de Salmonella spp. estão
sendo realizados por meio da técnica de PFGE demonstrando significativa
diversidade genética das cepas isoladas em surtos e casos esporádicos da ação de
infecções por Salmonella spp. no mundo (MOEHARIO, 2009). Já Bemis et al. (2007)
analisou a distribuição dos sorovares e parentesco clonal de Salmonella isolados de
serpentes em dois tipos de instalações. Concluindo que o monitoramento contínuo
das subespécies de Salmonella e distribuições dos sorovares possuem relevância
na concepção e no desenvolvimento dos estudos da patogenia e estratégias para o
controle da salmonelose disseminada em serpentes.
Na atualidade, para a Salmonella enterica subsp. diarizonae, a técnica de
PFGE vem sendo empregada para a detecção da prevalência em ovinos
assintomáticos, já que parece ser bastante desafiador a detecção desta subespécie
53
em pequenos ruminantes (BONKE et al., 2012). Nos répteis, a técnica tem
aplicabilidade na detecção dos sorovares e nos padrões de similaridades entre os
isolados, visto que normalmente não são observados surtos em animais de sangue
frio (FRANCO et al., 2011). Os mesmos autores ao estudarem vários sorovares de
Salmonella em iguanas na ilha de Santa Cruz em Galápagos - Equador, detectaram
uma heterogeinidade em mesmos sorovares identificados nos animais, estes
mantidos isolados do continente.
2.11. IMPORTÂNCIA DA SALMONELLA enterica subsp. arizonae E SALMONELLA
enterica subsp. diarizonae.
Os principais sorovares isolados de pacientes com salmonelose associada ao
contato com répteis incluem Salmonella enterica subsp. diarizonae, Salmonella
enterica subsp. houtenae e S. enterica subsp. enterica java, stanley, poona
(ACKMAN et al., 1995). Salmonella enterica subsp. arizonae e S.enterica subsp.
diarizonae são conhecidas por estarem associadas a animais ectotérmicos,
principalmente répteis e nos ambientes arredores destes animais (DAVIES et al.,
2001, BAUWENS et al., 2006). Estas duas espécies vêm sendo isoladas de seres
humanos, ainda com baixa frequência quando comparada a S. enterica subsp.
enterica (SANYAL et al., 1997, SCHRÖTER et al., 2004). A maioria dos casos
descritos na literatura ocorreu no sudeste dos Estados Unidos, afetando
prioritariamente crianças até 10 anos de idade e adultos imunocomprometidos
(ANGULO et al., 1995, CDC, 1999, CDC, 2003, WYBO et al., 2004) podem afetar
também outros animais e vem sendo isolada principalmente em rebanhos ovinos, na
Europa. O sorovar 61:k:1,5(7) é o mais frequente isolado em ovinos na Grã-Bretanha
e em outras partes do mundo, como a Noruega, Suíça, África e América do Norte
(PRITCHARD, 1990, DAVIES et al., 2001, HJARTARDÓTTIR et al., 2002, ZWEIFEL
et al., 2004, WOLDEMARIAM et al., 2005, MILNES et al., 2008, , BONKE et al.,
2012). É o sorovar associado ao aborto, gastroenterite e natimorto (DAVIES et al.,
2001, ALVSEIKE e SKJERVE, 2002). A epididimo-orquite supurativa associada a S.
diarizonae sorotipo 61:k:1,5(7) vêm sendo relatada na Espanha (FERRERAS et al.,
2007). No entanto, a maioria das ovelhas adultas e juvenis, são portadores
assintomáticos (PRITCHARD, 1990). Na maioria dos casos estudados os isolados
de Salmonella são sensíveis aos agentes antimicrobianos mais utilizados para
54
terapia em ovinos e caprinos – sensibilidade elevada ou Pan sensíveis. (BONKE et
al. 2012).
2.12. OCORRÊNCIA DE SALMONELLA spp. EM RÉPTEIS – HISTÓRICOS
O primeiro relato confirmado de isolamento de Salmonella spp. em serpentes
(Pituophis catenifer deserticola ) foi em 1943 em uma fazenda de criação de perus. A
serpente era portadora de três sorovares: Salmonella ser. Maleagridis, Salmonella
ser. Panama e um não identificado de Salmonella ser. Paracolon. Várias outras
serpentes foram encontradas na fazenda, abrigando a mesma Salmonella ser.
Paracolon (HINSHAW e MCNEIL 1944).
Caldwell e Ryerson (1939) relataram o isolamento de uma bactéria a partir de
três lacertídeos (Heloderma suspectum – Monstro de Gila), com características
bioquímicas semelhantes à
Salmonella spp., porém sem confirmação na
identificação desta bactéria. O primeiro relato de isolamento de Salmonella spp. em
lagartos ocorreu em 1945, envolvendo um Monstro de Gila morto no Zoológico de
San Diego, foi identificada também em quelônios, em duas tartarugas Galápagos
(Geochelone giganteas) o isolamento ocorreu de múltiplos órgãos (HINSHAW e
MCNEIL, 1945).
Salmonelose em répteis geralmente ocorre de forma subclínica, mas existem
casos em que a patologia pode estar visível, com sinais clínicos que incluem
enterite, septicemia, letargia, diarréia e anorexia e pós mortem são observados focos
de necrose em vísceras (MARCUS, 1971). Na África do Sul, foram relatados surtos
de salmonelose, em criações de crocodilos do Nilo (Crocodylus niloticus), com
septicemia causada por vários sorovares de Salmonella spp. causando sinais
clínicos de letargia, debilidade aguda e morte (HUCHZERMEYER, 1991).
A regurgitação em répteis está associada a um sinal clínico de salmonelose
(ONDERKA e FINLAYSON, 1985). Nestes animais, Cambre e MCGuill (2000)
relatam que a Salmonella spp. pode estar associada a outros tipos de doenças,
incluindo osteomielite, estomatites infecciosas, pneumonias, hepatites, nefrites,
gastrites, enterites, epicardite, e miocardites.
Geue e Loschner (2002) na pesquisa de salmonelas em animais em cativeiro
e de vida livre colheram amostras fecais de répteis na Alemanha e Áustria, e destes
S. enterica foi isolada em 86 répteis (54,1%). Colheitas feitas de cloaca com suabes
55
em 67 crocodilos do Nilo (Crocodylus niloticus) de vida livre, no Zimbabue, renderam
18 (26,9%) amostras positivas para salmonelas, incluindo oito sorovares (MADSEN
et al., 1998). Em tartarugas atendidas em um centro de emergência de animais
silvestres na Itália, de 135 suabes cloacais, 106 culturas foram positivas para
salmonelas, incluindo 16 diferentes sorovares (PASMANS et al., 2000).
Em contrapartida, dois estudos recentemente realizados encontraram 0% de
prevalência de salmonelas em répteis selvagens no Centro de Vida Selvagem da
Virgínia, (EUA) representado por oito espécies de tartarugas e serpentes de um total
de 75 animais (RICHARDS et al., 2004). Deve-se notar que todos os estudos
baseiam-se em métodos de cultura de Salmonella e quase na totalidade, os estudos
examinam apenas uma amostra por animal, consequentemente aumentando as
chances de resultados falso-negativos (SAELINGER et al., 2006).
Os principais sorovares isolados de pacientes com Salmonella transmitida por
répteis incluem Salmonella enterica, Salmonella enterica subsp. diarizonae,
Salmonella enterica subsp. houtenae e sorovares chameleon e marina, e os
Salmonella enterica subsp. enterica sorovares java, stanley e poona (ACKMAN et
al., 1995). Foi demonstrado que as populações de répteis de um modo geral são
colonizadas por Salmonella spp. em percentagens muito elevadas (SCHRÖTER et
al., 2004, NAKADAI et al., 2005).
2.13.
CARÁTER ZOONÓTICO DE SALMONELLA spp. EM SERES
HUMANOS COM ORIGEM NOS RÉPTEIS
O primeiro caso relatado de salmonelose em seres humanos transmitidas por
répteis foi detectado em 1963 em uma criança de 07 meses que albergava
Salmonella ser. Hartford, após sintomatologia de diarréia, vômitos e febre e a
investigação sobre a origem do micro-organismo isolou-se o agente de uma
tartaruga de estimação da família, além de outras 25 tartarugas obtidas da mesma
origem (HERSEY e MASON, 1963). Durante os anos 60 e início dos anos 70, a
incidência de salmonelose em seres humanos após contato com tartarugas cresceu
especialmente em crianças. Na mesma época foram feitas tentativas para estimar a
magnitude do problema e estudos retrospectivos foram conduzidos para determinar
a frequência de proprietários de tartarugas ou de exposição aos agentes nos casos
de salmonelose confirmados (WILLIAMS e HELDSON, 1965, WELLS et al., 2004).
56
Em 1965, o Departamento de Saúde do Estado de Washington investigou
uma série de 21 casos de salmonelose transmitidas por répteis, em Seattle, um dos
quais um caso era uma criança (BAKER et al., 1972). Isto ajudou em parte a
proibição da comercialização de tartarugas pet pelo Instituto Nacional de Saúde de
Washington, em 1968. Em resposta ao provável risco à saúde pública representada
pelas tartarugas pet, o governo americano, através do Food and Drug Administration
(FDA) em 1972, instituiu normas rígidas que exigiam um certificado de livre de
Salmonella spp. para qualquer transporte interestadual de tartarugas, com intuito
comercial. O Centro para Controle de Doenças de Atlanta (CDC) realizou um estudo,
onde constatou que 38% das tartarugas certificadas como livres de Salmonella spp.
estavam contaminadas. Em 1975, o FDA instituiu regulamentações proibindo a
comercialização de tartarugas, com exceção de comercialização para fins
educacionais e científicos (CFR, 1975, COHEN et al., 1980).
A importação de tartarugas nos EUA não foi limitada pela regulamentação do
órgão FDA em 1975, pois Salmonella spp. foram isoladas de tartarugas provenientes
de outros países, incluindo o Reino Unido (BORLAND, 1975), Japão (FUJITA et al.,
1981), Israel (CHASSIS et al., 1986), Yugoslávia (TAUXE et al., 1985), e França
(SANCHEZ et al. 1988). Um surto de Salmonella enterica subsp. enterica pomona,
em Porto Rico em 1984, foi marcado por uma transferência de tartarugas importadas
e foi determinado que aproximadamente 15% de todos os casos de salmonelose em
crianças poderiam estar associados à importação destes répteis (RIGAUPEREZ,1984).
Em Porto Rico foi realizado um estudo de casos-controle, onde foram
encontradas 17% de salmonelose infantil e nenhum dos controles combinaram com
a exposição de indivíduos a tartarugas de estimação. Porém observaram o
isolamento de salmonelas em todos os animais importados. Salmonella ser. Pomona
foi o mais identificado, aparecendo em 89% dos lotes analisados. Sendo as
tartarugas potenciais fontes de contaminação e infecção por salmonelas, a questão
ética de exportação destes animais foi levantada no contexto da saúde pública
(GANGAROSA, 1985, TAUXE et al., 1985).
Herpercultores americanos contornaram a proibição da comercialização dos
quelônios, alegando propósitos educacionais. Os animais com comprimento de
carapaça inferior a 10,2 centímetros eram disponíveis para compra pela internet e
57
em feiras anuais de répteis e a venda das tartarugas pet levou ao surgimento de
casos de salmonelose em seres humanos em Wisconsin e Wyoming (CDC, 2005).
Apesar da proibição realizada pelo FDA em 1975, o número de casos de
salmoneloses transmitidos por répteis veio aumentando. O CDC estimou que em
1996, de 3 a 5% dos casos de salmonelose nos EUA foram causados por contato
com répteis (CAMBRE e MCGUILL, 2000). Até 2006, esse número havia aumentado
para
aproximadamente
7%
(CHOMEL
et
al.,
2007).
Esta
relação
de
proporcionalidade coincidiu com o aumento do número de répteis mantidos em
cativeiro, como animais de estimação. Em 2005 – 2006, o Inquérito Nacional de
Proprietários Pet, relatou mais de 13,4 milhões de répteis mantidos como animais de
estimação nos EUA (APPMA, 2007). O CDC estabeleceu recomendações sobre o
manuseio dos répteis como mascotes, pretendendo principalmente a proteção de
crianças, grávidas, idosos e indivíduos imuno-comprometidos (CDC,1995, WELLS,
et al., 2004, MOFFATT, et al., 2010, KOCIANOVÁ et al., 2010, KIRK et al., 2012).
Mermin et al. (1997) investigaram os aspectos clínicos e fatores de risco
associados à infecção por Salmonella ser. Marina oriundos de iguanas em seres
humanos no ano de 1994. Foram realizadas tentativas de contato com todos os
pacientes com este sorovares isolados e reportados ao Sistema de Vigilância
Nacional de Salmonella. Os dados sobre demografia, curso clínico, dieta, viagens,
história, répteis e contato durante a semana antes do aparecimento da doença foram
coletados por entrevista telefônica. Salmonella ser. Marina foi isolada de pessoas em
40 diferentes famílias em 16 estados americanos. Neste estudo foi observado que
81% foram crianças abaixo de um ano de idade e 34% foram hospitalizados de 2 a
21 dias, com apenas um caso fatal. Dos pacientes que reportaram o contato com
estes répteis, apenas 14% apresentarm convívio direto com o animal. A ocorrência
de Salmonella spp. em criações de répteis para a comercialização como mascotes
têm sido documentada nos EUA (CDC, 2003, CDC, 2007) e na Europa (GEUE e
LOSCHNER, 2002, SCHROTER et al., 2004).
As infecções causadas por Salmonella spp. são altamente prevalentes em
lagartos de cativeiro, na Bélgica. As características fenotípicas e genotípicas
sugerem que estas cepas são capazes de causar infecções clínicas em seres
humanos, enfatizando o papel dos lagartos, criados muitas vezes como animais de
companhia, como potenciais reservatórios de salmonelose humana (PASMANS, et
al., 2005). Este micro-organismo também foi identificado em 08 dos 20 filhotes, 3 em
58
cada 20 adultos e 7 de cada 16 superfícies de ovos em viveiro de iguanas verdes
em El Salvador (MITCHELL e SHANE, 2000).
Tartarugas, crocodilos, serpentes e lagartos são ainda hoje importantes fontes
de alimento para seres humanos (KLEMENS e THORBJARNARSON, 1995). A
crescente demanda de algumas carnes de répteis (por exemplo, tartarugas,
crocodilos,
jacarés
e
iguanas)
em
algumas
regiões,
tem
resultado
no
desenvolvimento dos programas de reprodução de répteis em cativeiro em mais de
30 países da América do Norte, Central e do Sul, África, Ásia e Austrália. Portanto, a
detecção das doenças de origem alimentar causadas pelo consumo da carne de
répteis tem alta relevância (HUTTON e WEBB, 2003). Ainda há falta de informações
relevantes sobre a presença de Salmonella spp. nas carnes destes répteis para o
consumo humano, com exceção dos crocodilianos que constituem um risco
significativo para a saúde pública devido às altas taxas de Salmonella spp.
observadas na região intestinal, que são refletidas em taxas de contaminação
semelhantes na carne fresca ou congelada (MAGNINO, et al., 2009).
Salmonella spp. foram recuperadas de esfregaços de cloaca coletados a
partir de 04 de 29 jacarés em viveiro e de 02 de 71 jacarés selvagens no Texas e
Louisiana (SCOTT e FOSTER, 1997). Estudos sobre a carne de crocodilo têm
documentado a presença de Salmonella spp. na carne para consumo humano, tanto
fresca, refrigerada ou congelada (MADSEN, 1996). Isso, provavelmente se deve às
altas concentrações de Salmonella spp. presente na água das lagoas de criação de
crocodilos (MADSEN, 1994), atuando assim como importante fonte de contaminação
da carne durante a preparação para o abate. Existe um alto grau de manipulação
durante a esfola, onde um grande cuidado é tomado para evitar danos à pele, muito
valiosa e, consequentemente, menos atenção é dada à possível contaminação da
carne (MADSEN et al., 1992).
Um surto de salmonelose com 36 casos humanos ocorreu em 1998 em uma
comunidade aborígene ao Norte da Austrália após o consumo de carne de tartaruga,
que é uma fonte de alimento nas comunidades costeiras do Pacífico (O'GRADY e
KRAUSE, 1999). O potencial de contaminação de outras espécies de répteis é
ilustrado por casos de infecção sistêmica (alguns dos quais fatais) por Salmonella
enterica subsp. arizonae nos EUA depois do consumo de carne seca de cascavel
utilizada como medicamento, entre as comunidades latino-americanas (KELLY et al.,
1995) e em 1987 em dois hospitais, de Los Angeles, Califórnia, quatro casos foram
59
relatados do isolamento de Salmonella enterica subsp. arizonae em comunidades
latinas. Todos os pacientes possuíam um histórico de ingerir cápsulas contendo
fragmentos de cascavel, antes do início da doença, em todos os quatro casos, a
cultura microbiológica das cápsulas de cascavel identificou Salmonella enterica
subsp. arizonae e outras bactérias entéricas. Os pacientes já possuíam doenças
crônicas, incluindo síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS) e câncer, e as
bactérias foram isoladas a partir de locais extra-gastrointestinais - sangue, líquido
pleural e linfa (RILEY et al., 1988).
60
CAPÍTULO I: IDENTIFICAÇÃO E PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE A DROGAS
DA MICROBIOTA BACTERIANA QUE COLONIZA A CAVIDADE ORAL E A
CLOACA DE SERPENTES.
61
3. OBJETIVOS
Descrever a prevalência e a densidade de distribuição da microbiota oral e da
região da cloaca de serpentes Boa constrictor de animais de vida livre, coletados no
município de Campos dos Goytacazes, de cativeiro, criados comercialmente e
mantidos em zoológicos em dois Estados do país, bem como, caracterizar o perfil de
resistência bacteriana dos isolados aos antibióticos pré-determinados, com intuito de
melhorar o manejo destes animais no cativeiro.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. ORIGEM DAS AMOSTRAS
Foram coletadas amostras de 35 serpentes da espécie Boa constrictor de
vida livre do município de Campos dos Goytacazes, resgatadas pela equipe do setor
de animais peçonhentos do CCZ (Centro de Controle de Zoonoses), estas foram
encaminhadas ao setor de Clínica Médica, aos cuidados do NEPAS (Núcleo de
Estudo e Pesquisa de Animais Selvagens), onde foram catalogadas e examinadas
clinicamente, tiveram os seguintes dados mensurados: tamanho, peso e condições
físicas e na situação de animais doentes as amostras foram coletadas antes da
realização do tratamento prévio.
No caso de animais cativos, foram coletadas 54 amostras de serpentes Boa
constrictor oriundas do cativeiro, com fins comerciais, Sítio Xerimbabo, em Santo
Antonio do Tauá, localizado no estado do Pará, Região Norte do País. Em dois
zoológicos da Região Sudeste, foram coletadas 21 serpentes, sendo 15 da Família
Boidae e 06 animais da Família Pythonidae oriundas da Fundação Riozoo, no
estado do Rio de Janeiro, e 20 serpentes da Família Boidae na FZB-BH, no Estado
de Minas Gerais (Figura 5).
62
Figura 5 – Locais de Coleta de amostras de serpentes pelo Brasil. (Adaptado de
http://abccapacitacao.wordpress.com/2012/11/30/abc-em-23-regioes/)
4.2. COLETA DAS AMOSTRAS
As coletas foram aprovadas e autorizadas pelo IBAMA através da certificação
do SisBio n° 23541-1 e aprovadas pela comissão de ética (CEUA) da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, com o n° de protocolo 165/12.
63
4.2.1. Cavidade oral
Os animais foram contidos fisicamente, as amostras foram coletadas com
suabe estéril da cavidade orofaríngea, com auxílio de um abaixador de língua para
promover a abertura da cavidade oral (Figura 6).
Figura 6 – Técnica de coleta das amostras da cavidade oral, com auxílio de suabe
estéril de serpentes nas localidades descritas anteriormente. Fonte: Arquivo Pessoal.
4.2.2. Região da cloaca
Na região da cloaca a coleta foi realizada, primeiro com a limpeza da região
próxima a cloaca com álcool 70%, para evitar o contato com bactérias
contaminantes das escamas e, posteriormente, foi promovida a abertura da mesma
com auxílio de uma pinça estéril e introdução do suabe na cloaca. Nesta coleta os
suabes foram coletados em duplicata (Figura 7).
64
Figura 7 – Técnica de coleta das amostras da cavidade cloacal, com auxílio de
suabe estéril de serpentes nas localidades descritas anteriormente. Fonte: Arquivo
Pessoal.
4.3. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO BACTERIANA.
Cada suabe da cavidade oral e da região da cloaca foi inoculado
primariamente, em Ágar sangue (Acumedia(R), EUA) acrescido de 5% de sangue
estéril desfibrinado de carneiro, Ágar Entérico Hektoen e Ágar McConkey
(Acumedia(R), EUA), para o isolamento de bactérias Gram-positivas e bactérias
Gram-negativas, respectivamente. As colônias foram observadas quanto à sua
morfologia, coloração e padrão de hemólise e em seguida analisadas por meio de
testes bioquímicos – Características fenotípicas.
Outros Agar utilizados:

Ágar EMB (Acumedia, EUA)

Ágar Cetrimide (Acumedia, EUA)

Ágar Volgel-Johnson (Acumedia, EUA)
4.4. ANÁLISE FENOTÍPICA
Bactérias classificadas como cocos Gram-positivos foram testadas quanto à
produção de catalase, oxidase, coagulase e DNAse, a fermentação do manitol e
atividade hemolítica, para a caracterização do gênero Staphylococcus, Micrococcus
e Streptococcus.
65
Após a obtenção de colônias puras, bactérias Gram-positivas foram testadas
por meio de testes de rotina microbiológica com o uso de meios padronizados para
identificação do gênero e espécie. Em casos de dúvida na classificação pela
metodologia de reação em tubo foi utilizado a confirmação do gênero/ espécie com o
uso de kits miniaturizados, Api ID32 Staph, (Biomeriéux, França) com leitura
automatizada pelo equipamento MiniApi (Biomeriéux, França).
As bactérias Gram-negativas provenientes do Ágar McConkey e Ágar
Entérico Hektoen foram avaliadas por testes de produção de oxidase e teste de
catalase, crescimento em Ágar Cetrimide e Ágar EMB, posteriormente, foi utilizado
meio de triagem (Identificação bioquímica presuntiva) como o TSI, além de serem
submetidas a testes para a caracterização bioquímica complementar – Fermentação
de carboidratos, reação do vermelho de metila (VM), utilização de citrato, produção
de acetoína (VP), uréase, SIM (indol, sulfeto de hidrogênio - H2S, mobilidade) e
descarboxilação de aminoácidos (SVS, 2011).
Após a obtenção de colônias puras, bactérias Gram-negativas foram testadas
com o uso de meios padronizados para identificação do gênero e espécie. Em casos
de dúvida na classificação pela metodologia de reação em tubo foi utilizado a
confirmação do gênero/ espécie com o uso de kits miniaturizados, Api E29,
(Biomeriéux,
França)
com
leitura automatizada
pelo
equipamento
MiniApi
(Biomeriéux, França).
Bactérias oxidase positiva foram inoculados em dois tubos contendo meio
semi-sólido Basal O-F (Difco, EUA) adicionado de 1% de Glicose (Merck,
Alemanha). Cinco mililitros de vaselina líquida estéril foram adicionados em um dos
tubos o qual foi mantido com a tampa bem fechada para tornar o ambiente
anaeróbico. Paralelamente, no outro tubo, a tampa foi mantida frouxa para manter
aerobiose e ambos foram incubados a 37 °C por 24 horas. Cepas padrãos de
Staphylococcus aureus ATCC 25923 e de Micrococcus luteus ATCC 4698 foram
inoculadas como controles positivos e negativos.
Para diferenciar os Micrococcus dos Staphylococcus foi utilizado o teste de
bacitracina. Neste teste as bactérias foram diferenciadas de acordo com o grau de
resistência e sensibilidade frente ao disco impregnado com bacitracina (0,04 UI).
Para controle positivo uma cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923 foi utilizada
e como controle negativo uma cepa de Micrococcus luteus ATCC 4698. A leitura do
diâmetro do halo foi realizada com auxílio de um paquímetro. Bactérias com halos
66
maiores que 10 mm de diâmetro são classificadas como Micrococcus de acordo com
Quinn et al. (1994).
4.4.1. Fermentação de manitol
A fermentação de manitol foi observada em aerobiose, com a inoculação das
bactérias em agar Volgel-Johnson com adição de telurito de potássio (incubadas por
18 horas a 37°C). Foram consideradas positivas as colônias que alteraram a
coloração do meio para amarelo e se tornaram negras. Trata-se de meio adequado
para a investigação de estafilococos manitol-positivos. Considerando a capacidade
de redução do telurito e a fermentação do manitol deste grupo de micro-organimos;
4.4.2. Teste de catalase
As colônias isoladas em agar sangue foram depositadas sobre lâmina de
vidro, em seguida 50L de peróxido de hidrogênio 10 volumes (Sigma, EUA) foram
depositados sobre as colônias. O imediato aparecimento de bolhas indicou a
positividade do teste para a produção de catalase.
4.4.3. Teste de oxidase
As colônias isoladas em agar sangue foram depositadas e espalhadas sobre
discos de papel contendo para-aminodimethylaniline, para detecção da produção de
oxidase pelos micro-organismos. Colônias de Staphylococcus spp. são consideradas
oxidase-negativos, portanto, não desenvolvem coloração violeta, típica dos microorganismos oxidase-positivos.
4.4.4. Teste de produção de coagulase
Amostras Gram-positivas identificadas como Staphylococcus spp. foram
transferidas para tubos (12mm x 75mm) contendo 0,5 mL de plasma de coelho
adicionado de EDTA, e em seguida incubados a 37°C. Periodicamente, foi
observado a formação de um coágulo, com cinco leituras durante 24 horas (uma,
67
duas, quatro, oito e 24 horas após incubação). A formação de coágulo visível, por
inspeção visual, foi indicativa do teste positivo.
4.4.5. Teste de DNase
Este teste determina a atividade da desoxiribonuclease dos organismos.
Consistiu na incubação de colônias puras em agar DNase test (Difco, USA) a 37°C
por 18 horas, adicionando-se em seguida ácido clorídrico (HCl) a 3,0 N sobre as
colônias. Após alguns segundos, fez-se a leitura. A formação do halo em torno das
colônias indica reação de positividade. Isolados positivos possuem uma enzima
extracelular, a desoxirribonuclease, responsável pela reação, onde esta enzima
quebra o DNA em subunidades compostas de nucleotídeos.
4.4.6. Atividade hemolítica
Os isolados foram inoculados em
agar sangue de carneiro 5%. Após as
placas serem submetidas a incubação a 37°C por 24 a 48 horas, foi verificado o
resultado, através da observação visual de zonas claras (hemólise) ao redor do
crescimento (resultado positivo), freqüentemente ocorrendo a lise completa das
células vermelhas do sangue, hemólise simples ou dupla podem ser observadas ou
a ausência dessas, sem alteração do meio (resultado negativo).
4.4.7. Agar ferro-açúcar triplo (Agar TSI)
Meio utilizado para diferenciação de bastonetes Gram-negativos com base na
fermentação e produção de gás dos carboidratos: Glicose, lactose, sacarose e
produção de sulfeto de hidrogênio.
4.4.8.Prova de Voges-Proskauer (VP)
Uma das vias metabólicas para a degradação do ácido pirúvico, leva à
produção de acetoína, um subproduto inativo. Na presença de oxigênio atmosférico
e hidróxido de potássio a 40%, a acetoína é convertida em diacetila e o alfa-naftol
68
atua como catalizador para revelar um complexo de cor vermelha, no caso da
positividade do teste.
4.4.9. Prova do Vermelho de Metila (VM)
É uma análise quantitativa de produção de ácidos fortes (lático, acético e
fórmico), a partir da glicose por meio da via de fermentação ácida mista.
4.4.10. Utilização do Citrato
O citrato de sódio é um sal de ácido cítrico, composto orgânico simples que
constitui um dos metabólitos do ciclo dos ácidos tricarboxílicos – Ciclo de Krebs.
Algumas bactérias podem utilizar energia de forma diferente da via de fermentação
de carboidratos, utilizando citrato como única fonte de carbono. Os meios
empregados para detectar a utilização do citrato são isentos de proteínas e
carboidratos como fonte de carbono. O indicador de positividade é o azul de
bromotimol, torna o meio azul, no caso de utilização do citrato.
4.4.11. Produção de Indol
O indol é um dos subprodutos metabólicos de degradação do aminoácido
triptofano.Na presença da enzima triptofanase são capazes de hidrolizar e
desaminar o triptofano com produção de indol, ácido pirúvico e amônia. A prova
baseia-se
na
reação
do
indol
com
o
reagente
de
Kovacs
–
p-
dimetilaminobenzaldeído (formação de complexos de cor vermelha).
4.4.12.Hidrólise da uréia
A urease é uma enzima presente em muitas espécies de micro-organimos.
Teste apresenta positividade quando ocorre uma grande quantidade de amônia, esta
aumenta o pH do meio e promove uma viragem do indicador (maior que 8,0).
69
4.4.13. Produção de sulfeto de Hidrogênio – H2S
Capacidade de certas espécies de bactérias para liberar enxofre na forma de
H2S a partir de aminoácidos ou de outros compostos.
H2S + metal pesado = sulfeto = precipitado negro
4.4.14. Descarboxilase
Representam um grupo de enzimas substrato específicas, capazes de atuar
sobre a porção carboxila dos aminoácidos, formando aminas de reação alcalina.
Lisina – sua descarboxilação resulta na liberação de cadaverina.
4.5. TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIBIÓTICOS - TSA
As bactérias isoladas
foram
testadas quanto a sua resistência
e
susceptibilidade a 12 antibacterianos padronizados para espécies Gram-positivas e
11 antibacterianos padronizados para Gram-negativas de acordo com o CLSI
(2012). Para tal, foi utilizada a técnica de difusão em agar Muller Hinton, e o perfil de
cada bactéria foi avaliado de acordo com o halo formado frente a cada antibiótico,
medido com auxílio de um paquímetro. Foram testados diante dos isolados
bacterianos
os
antimicrobianos
discos
impregnados
com
antibióticos
para bactérias Gram-positivas:
(Laborclin,
amoxicilina (AMO,
Brasil):
10
g),
clindamicina (CLI, 2g), cefalotina (CFL, 30g), penicilina G (PEN, 10U), oxacilina
(OXA, 1 g), tetraciclina (TET 30g), ampicilina (AMP, 10g), eritromicina (ERI,
15g), sulfazotrim (SUL, 25 g), gentamicina (GEN, 10g), cefoxitina (CFO, 30g) e
vancomicina (VAN, 30g);
Para espécies caracterizadas como Gram-negativas: enrofloxacina (ENO
5g), cefoxitina (CFO, 30g), cefalotina (CFL, 30g), ampicilina (AMP, 10g),
tobramicina (TOB, 10g), sulfazotrim (SUL, 25 g), amoxicilina mais ácido
clavulânico (AMC, 20/10g), tetraciclina (TET, 30g), ciprofloxacino (CIP, 5g)
gentamicina (GEN, 10g) e Florfenicol (FLF, 30g).
70
5. RESULTADOS
O foco do estudo baseou-se em serpentes da espécie Boa constrictor com um
total de 117 animais coletados, outros 07 animais analisados eram pertencentes à
família Boidae e 06 animais pertencentes à Família Pythonidae (Tabela 1). Nossa
pesquisa buscou trabalhar com animais considerados saudáveis clinicamente, mas
houve exceções.
De todos os animais analisados, dois eram de vida livre e cinco do Zoológico
de Belo Horizonte apresentaram sintomas a algum tipo de doença, uma jibóia de
vida livre foi atendida com estomatite severa, apresentava bolsões de caseosa
amarelo, pus amarelado nos tecidos moles, em algumas áreas houve a evolução
para o segmento ósseo, quando retirados os caseos cirurgicamente, foi observado o
compromentimento da dentição do lado esquerdo superior e inferior (Figura 8).
O outro animal de vida livre foi atendido com infestação severa por
carrapatos. Ambas as serpentes, participaram do experimento e tiveram suas
amostras coletadas antes do inicio dos tratamentos. A serpente com estomatite
identificou-se como possível causadora da enfermidade, a bactéria Pseudomonas
aeruginosa, sendo realizado subsequentemente o teste de sensibilidade a
antimicrobianos, onde foi detectado um perfil de resistência às drogas enrofloxacina,
florfenicol, cefalotina, cefoxitina, amocixilina + Ác clavulânico, ampicilina e
sulfazotrim no qual foi optado pelo tratamento com gentamicina, 2,5mg/kg por via
intramuscular a cada 72 horas durante 15 dias e limpeza local com malvona
diariamente. O animal obteve melhora e pode posteriormente ao tratamento ser
alimentado e reintroduzido na natureza, através do projeto de soltura de animais
silvestres realizado pelo NEPAS.
O animal infestado por carrapatos, apresentava-se apático, desidratado e
anoréxico, iniciou-se o tratamento com ivermectina e fluido terapia intra-celomática.
Este apresentou melhoras nas primeiras 12 horas pós- tratamento, mas logo veio a
óbito. Nenhum dos dois animais apresentaram Salmonella spp. em suas coletas de
material biológico.
Os cinco animais da FZB-BH, possuíam o diagnóstico positivo para
paramixovírus, e apresentavam-se com dificuldade de alimentação, deficiência de
vitamina C e lesões na pele em decorrência desta deficiência. Como os animais
apresentavam-se em um processo de infecção virótica e em tratamento suporte,
71
com uso de antibióticos, pode ter sido afetado o perfil de resistência verificado no
local.
Tabela 1 – Quantidade e espécies de serpentes coletadas para o levantamento
microbiológico nas quatro regiões do estudo.
Origem
Espécies (n° de amostras)
Total
Criatório Comercial
Boa constrictor (54)
54
Zoológico de Belo Horizonte
Boa constrictor (16), Corallus hortolanus
20
(02), Epicrates cenchria (02)
Zoológico do Rio de Janeiro
Boa constrictor (12),
(01),
Python
regius
Python Molurus
(03),
Python
21
reticulates (02), Eunectes notaeus (02) e
Corallus caninus (01)
Vida livre – Campos dos Boa constrictor (35)
35
Goytacazes/RJ
Total
130
Figura 8 – Serpente oriunda de vida livre, atendida no Hospital Veterinário da
Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, com estomatite
bacteriana severa, causada por Pseudomonas aeruginosa. (Arquivo Pessoal).
72
5.1.ISOLADOS DE CAVIDADE ORAL
Foram identificados 246 isolados na cavidade oral dos 130 animais
estudados. Na tabela 2 e figura 09 podem ser observadas as bactérias isoladas na
cavidade oral das serpentes amostradas, o seu número de amostras e o percentual.
Estas foram caracterizadas fenotipicamente, através de testes bioquímicos e quando
se fez necessário, foi utilizado o Kit Mini api na identificação.
Os resultados das amostras da cavidade oral apontam para uma
predominância de Gram-negativos, sendo isolados também Gram-positivos, como
Staphylococcus coagulase negativa, Micrococcus spp. e Enterococcus spp. Foram
observados em todos os locais coletados, no entanto houve maior prevalência em
animais de vida livre e no criatório comercial.
Ambas as
Citrobacter,
E.
localidades apresentaram as bactérias
coli,
Morganella morganii, Providencia
Aeromonas
spp.,
Proteus
spp.,
spp.,
Pseudomonas spp., e Serratia spp. com algumas exceções. Curiosamente, no
Zoológico de Belo Horinzonte identificou-se duas bactérias Gram-negativas, de
pouca ou nenhuma importância para os répteis, Xenorhabdus spp. e Arsenophonus
spp, encontradas no solo, normalmente não estão associadas a infecções em
indivíduos hígidos. Uma única amostra de Salmonella spp. e Escherichia hermannii
foi identificada na cavidade oral, nesta mesma localidade. As amostras de
Alcalinigenes spp. foram identificadas apenas em animais de vida livre e no Criatório
Comercial em Belém/PA. Bactérias Gram-negativas são normalmente descritas na
cavidade oral de serpentes.
Isolados de serpentes de outras espécies coletadas na FZB-BH de Belo
Horizonte e na Fundação Riozoo (13 animais), apresentaram microbiota semelhante
à observada na espécie Boa constrictor.
73
Tabela 2 – Isolados gerais obtidos da cavidade oral de serpentes da Família Boidae
e Família Pythonidae.
Micro-organismos isolados
Aeromonas hydrophila
Aeromonas spp.
Alcalinigenes faecalis
Alcalinigenes spp.
Arsenophonus spp.
Citrobacter spp.
Citrobacter freundii
Enterococcus spp.
Escherichia spp.
E. coli
E. hermannii
Microcococcus spp.
Morganella morganii
Providencia rettgeri,
Providencia spp.
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas spp.
Salmonella spp.
Serratia mascercens
Serratia spp.
Staphylococcus spp.
Staphylococcus caseolyticus
Staphylococcus lentus
Staphylococcus chromogenes
Staphylococcus saprophyticus
Xenorhabdus spp.
Total
Número de amostras%
06 (2.4)
06 (2,4)
04 (1,6)
08 (3.3)
01 (0,4)
12 (4,9)
17 (6,9)
07 (2,8)
04 (1,6)
09 (3,7)
01 (0,4)
16 (6,5)
12 (4.9)
07 (2,8)
10 (4.0)
12 (4,9)
16 (6,5)
29 (11,8)
10 (4,0)
01 (0,4)
13 (5,4)
09 (3,7)
09 (3,7)
08 (3,3)
05 (2,0)
02 (0,8)
11 (4,5)
01 (0,4)
n= 246(100%)
.
74
Bactérias Isoladas da Cavidade Oral de Serpentes
Pseudomonas aeruginosa
11,80%
Citrobacter freundii
6,90%
Microcococcus spp.
6,50%
Proteus mirabilis
6,50%
Serratia mascercens
5,40%
Morganella morganii
4,90%
Proteus vulgaris
4,90%
Citrobacter sp.
4,90%
Staphylococcus saprophyticus
4,50%
Pseudomonas spp.
4,00%
Providencia spp.
4,00%
Serratia spp.
3,70%
Staphylococcus spp.
3,70%
Escherichia coli
3,70%
Staphylococcus caseolyticus
3,30%
Providencia rettgeri
2,80%
Enterococcus spp.
2,80%
Staphylococcus lentus
2,0%
Escherichia spp.
Staphylococcus chromogenes
1,60%
0,80%
Xenorhabdus beddingii
0,40%
Salmonella spp.
0,40%
Escherichia hermannii
0,40%
Arsenophonus nasonie
0,40%
Figura 09 – Isolados gerais obtidos da cavidade oral de serpentes da Família Boidae
e Família Pythonidae.
75
5.2. PERFIL DE RESISTÊNCIA A DROGAS – CAVIDADE ORAL
Após a identificação das colônias, foram realizados os respectivos TSAs para a
verificação do perfil de resistência das mesmas aos antibióticos testados. De acordo
com o perfil de resistência, os isolados de Pseudomonas spp. apresentaram maior
resistência diante das drogas ampicilina, cefalotina, cefoxitina, florfenicol, amocixilina
+ ác clavulânico sulfazotrim, enrofloxacina e tetraciclina (Tabela 3 e Figura 10).
Isolados de Pseudomonas spp. e Pseudomonas aeruginosa de animais clinicamente
sadios apresentaram resistência considerável. Quando observamos o perfil de
resistência do animal com estomatite, encontrado neste experimento, não se nota
muita diferença da bactéria causadora da estomatite para os isolados nos animais
clinicamente saudáveis. O que sugere que esta bactéria possui esse perfil de multiresistência e as alterações no bem estar dos animais podem desencadear processos
infecciosos. No caso do animal supra-citado, como não havia histórico clínico, visto
que este era de vida livre e simplesmente foi encontrado na área urbana da cidade,
a infecção causada por Pseudomonas aeruginosa pode ter sido secundária a
alguma alteração na homeostase deste animal.
Tabela 3 – Perfil de resistência aos antibióticos de Pseudomonas spp. isoladas da
cavidade oral de serpentes. (n = 39)
Antibióticos
Enrofloxacina
Gentamicina
Ciprofloxacina
Florfenicol
Cefalotina
Cefoxitina
Tetraciclina
Amocixilina + Ác
clavulânico
Ampicilina
Sulfazotrim
Tobramicina
Sensível
15,4%
100%
100%
5,1%
5,1%
5,1%
20,5%
Intermediário
0%
0%
0%
0%
0%
0%
2,6%
Resistente
84,6%
0%
0%
94,9%
94,9%
94,9%
76,9%
0%
10,6%
89,4%
0%
12,8%
100%
2,6%
0%
0%
97,4%
87,2%
0%
76
Figura 10 – Perfil de resistência aos antibióticos de Pseudomonas spp. isoladas da
cavidade oral de serpentes. (n = 39)
Quando comparados o perfil de resistência das Pseudomonas spp. a outras
bactérias Gram negativas isoladas no experimento, observamos que existe certa
resistência nos isolados, mas estes não demostram um grau de multi-resistência
(Tabela 4 e 5). Amostras de E. hermannii e Salmonella spp. oriundas da cavidade
oral, apresentaram sensibilidade a todas as drogas testadas. Outros isolados
apresentaram resistência ao menos três antibióticos testados (Tabela 4).
Na cavidade oral houve maior prevalência de Pseudomonas aeruginosa, e
apresentaram um perfil de resistência característico, com baixa sensibilidade às
drogas testadas, apenas ciprofloxacina, gentamicina e tobramicina apresentaram
100% de eficácia ao gênero Pseudomonas. As amostras isoladas da FZB-BH
apresentaram maior grau de resistência quando comparados aos outros locais de
coleta.
77
Tabela 4 – Perfil de resistência aos antibióticos de isolados Gram-negativos, com
origem na cavidade oral das serpentes.
Gêneros
Aeromonas
Resistência
Ampicilina (25%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (8,3%),
Cefalotina (33,3%), Cefoxitina (33%)
Alcalinigenes
Ampicilina (25%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (8,3%),
Cefalotina (25%), Cefoxitina (41,6%), Enrofloxacina
(25%), Florfenicol (18,3%), Gentamicina (33,3%),
Sulfazotrim (16,6%), Tetraciclina (33,3%), Tobramicina
(16,6%)
Citrobacter
Ampicilina (66,6%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (57,1%),
Cefalotina (90,4%), Cefoxitina (95,2%), Enrofloxacina
(23,8%),
Escherichia
Ampicilina (28,5%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (7,1%),
Cefalotina (21,4%), Enrofloxacina (14,3%), Sulfazotrim
(21,4%), Tetraciclina (21,4%),
Morganella morgannii
Ampicilina (33,3%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (16,6%),
Cefalotina (41,6%), Cefoxitina (33,3%),
Providencia
Ampicilina (35,3%), Tetraciclina (17,6%)
Proteus
Ampicilina (53,6%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (10,7%),
Cefalotina (90,9%), Cefoxitina (46,4%), Tetraciclina
(32,1%)
Serratia
Amoxicilina+Ac. Clavulânico (18,1%), Cefoxitina (22,7%),
Cefalotina (31,8%), Tetraciclina (13,6%)
Nas amostras de Aeromonas spp. verificou-se resistência à cefalotina,
cefoxitina, ampiclina e amoxicilina+ac. clavulânico, não foi verificado resistência as
quatro drogas em um único isolado. Alcalinigenes spp.
apresentou um perfil
heterogênio, Alcalinigenes faecalis isolados da vida livre foram sensíveis a todas as
drogas,
já Alcalinigenes spp. isolados
no criatório comercial apresentaram
resistência a 10 drogas citadas. Citrobacter spp., Morganella morgannii, Providencia
78
spp., Proteus spp. e Serratia spp. apresentarm perfil de resistência semelhante em
todas as localidades coletadas. Os isolados de Xenorhabdus spp. apresentaram
resistência a ampicilina, amoxicilina+ác. clavulânico, cefalotina e cefoxitina e
Arsenophonus spp cefoxitina, ampicilina, tobramicina, cefalotina, tetraciclina e
amoxicilina+ác. clavulânico mesmo sendo encontrada no solo e não patogênica para
o ser humano ou para os animais, apresentaram alto perfil de resistência quando
comparados a outros isolados.
Um dado importante para o grupo de pesquisa foi relativo ao perfil de
resistência das espécies de Staphylococcus isoladas das serpentes. A experiência
dos trabalhos realizados com outras espécies de animais, como mamíferos e aves, e
também com amostras humanas, demostraram uma taxa de resistência a drogas
preocupante, elevada. Com os dados observados neste experimento onde o gênero
Staphylococcus apresentou 100% de sensibilidade às drogas, e levando em
consideração que estes animais têm preferência por habitat semi-aquático, podemos
considerar que possíveis resíduos de antimicrobianos nas áreas estudadas até o
momento, não apresentam a mesma preocupação com estas bactérias colonizando
serpentes. Na FZB-BH onde foi empregada a antibióticoterapia, observou-se alta
resistência a outros isolados, os Staphylococcus spp. apresentarm o mesmo perfil de
sensibilidade. Os gêneros Micrococcus spp. e Enterococcus spp. apresentaram um
perfil de resistência semelhante em todas as localidades que pode ser observado na
Tabela 5.
Tabela 5 – Perfil de sensibilidade a drogas dos isolados de cocos positivos extraídos
da cavidade oral de Serpentes.
Gêneros
Enterococcus
Resistência
Clindamicina, Cefalotina, Eritromicina,
Clotrimazol, Gentamicina e Cefoxitina.
Micrococcus
Eritromicina,
Gentamicina.
Staphylococcus
Alta sensibilidade (100%)
Clotrimazol
e
79
5.3. ISOLADOS DA REGIÃO DA CLOACA
Foram identificados 296 isolados na cloaca dos 130 animais estudados.
Amostras isoladas da cloaca foram verificadas em dois estágios, um suabe foi
inoculado em ágar McConkey e ágar Sangue e outro suabe foi pré-enriquecido em
caldo
Rappaport Vassiliadis
e
posteriormente
inoculado
em
agar Entérico
de Hektoen para pesquisa exclusiva em Salmonella spp. (Cap. 02) As bactérias
isoladas da região da cloaca podem ser observadas na tabela 6 e figura11.
Nas amostras isoladas na região da cloaca, verificou-se uma semelhança com
os isolados encontrados na cavidade oral, alguns isolados não foram visualizados na
boca e encontrados na cloaca, como é o caso de Klebsiella spp. que foi encontrada
em todos os locais de coleta e Shigella spp., somente isolada na Fundação Riozoo e
no Criatório comercial. Foram observadas algumas bactérias com caráter ambiental
e normalmente, não associadas a infecções em seres humanos hígidos, foram elas
Buttiauxella agrestis, Budvicia aquática, Hafinia alvei, Kluyvera spp., Pragia fontium e
Tatumella ptyseos.
Enterobactérias com caráter oportunista ou zoonótico foram observadas como
sendo
pertencentes
à
microbiota
normal
das
serpentes
estudadas,
pela
repetibilidade dos isolados, tanto em cativeiro como em vida livre. Nota-se também,
uma diminuição na prevalência de Pseudomonas spp. quando comparamos a
cavidade oral da região da cloaca. A bactéria com maior prevalência nesta região foi
Salmonella spp. com 96 isolados com 62 animais positivos, alguns albergando mais
de um sorotipo e outros do mesmo sorotipo, mas com características moleculares
diferenciadas (Cap.2)
Poucas amostras do gênero Staphylococcus spp. foram isoladas nas amostras
da região da cloaca, determinado uma maior prevalência de enterobactérias, como
era previsto. Estes isolados são oriundos da FZB-BH e do Riozoo. Animais de vida
livre e do criatório comercial somente apresentaram a colonização deste gênero na
cavidade oral.
As bactérias detectadas fazendo parte da microbiota oral e da cloaca de
serpentes cativas e de vida livre, podem em um determinado momento tornarem-se
patogênicas para seus hospedeiros.
80
Tabela 6 – Isolados gerais obtidos da região da cloaca de serpentes da Família
Boidae e Família Pythonidae.
Micro-organismos isolados
Aeromonas hydrophila
Aeromonas spp.
Budvicia aquática
Buttiauxella agrestis
Citrobacter spp.
Citrobacter freundii
Edwardsiella tarda
E. coli
Escherichia spp.
Enterobacter aerogenes
Enterobacter cloacae
Hafinia alvei
Klebsiella pneumoniae
Klebsiella spp.
Kluyvera spp.
Leminorella spp.
Morganella morganii
Pantoea aglomerans
Pragia fontium
Providencia spp.
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas spp.
Salmonella spp.
Serratia mascercens
Serratia spp.
Shigella spp.
Staphylococcus spp.
Staphylococcus chromogenes
Staphylococcus lentus
Staphylococcus saprophyticus
Tatumella ptyseos
Total = 33
Número de amostras/%
06 (2,0)
03 (1,0)
01 (0,3)
01 (0,3)
12 (4,0)
20 (7,0)
08 (2,7)
16 (5,4)
03 (1,0)
04 (1,4)
02 (0,7)
01 (0,3)
11 (3.7)
09 (3,0)
02 (0,7)
03 (1,0)
08 (2,7)
13 (4,4)
01 (0,3)
09 (3,0)
12 (4,0)
12 (4,0)
11 (3,7)
07 (2,4)
96 (32.4)
06 (2,0)
07(2,4)
04 (1,4)
02 (0,7)
01 (0,3)
01 (0,3)
01 (0,3)
03 (1,0)
n= 296 (100%)
81
Bactérias Isoladas da Cloaca de Serpentes
Salmonella spp.
32,40%
Citrobacter freundii
7,00%
E. coli
5,40%
Pantoea aglomerans
4,40%
Citrobacter spp.
4,00%
Proteus mirabilis
4,00%
Proteus vulgaris
4,00%
Klebsiella pneumoniae
3,70%
Pseudomonas aeruginosas
3,70%
Providencia spp.
3,00%
Klebsiella spp.
3,00%
Edwardsiella tarda
2,70%
Morganella morganii
2,70%
Serratia spp.
2,40%
Pseudomonas spp.
2,40%
Serratia mascercens
2,00%
Aeromonas hydrophila
2,00%
Enterobacter aerogenes
1,50%
Shigella spp.
1,50%
Aeromonas spp.
1,00%
Escherichia spp.
1,00%
Leminorella spp.
1,00%
Tatumella ptyseos
1,00%
Staphylococcus spp.
0,70%
Enterobacter cloacae
0,70%
Kluyvera spp.
0,70%
Pragia fontium
0,30%
Hafinia alvei
0,30%
Staphylococcus chromogenes
0,30%
Staphylococcus saprophyticus
0,30%
Staphylococcus lentus
0,30%
Buttiauxella agrestis
0,30%
Budvicia aquática
0,30%
Figura 11 – Isolados gerais obtidos da região da cloaca de serpentes da Família
Boidae e Família Pythonidae.
.
82
5.4. PERFIL DE RESISTÊNCIA A DROGAS – CLOACA
Na tabela 7, foi observado um perfil de resistência aos antimicrobianos de
bactérias isoladas na região da cloaca de serpentes cativas e vida livre. Estes
apresentaram pelo menos resistência a duas ou mais drogas, somente dois isolados
de Shigella spp. apresentaram resistência a ampicilina e as outras duas foram
sensíveis a todas as drogas testadas.
As
bactérias
Budvicia
aquática,
Buttiauxella
agresti,
Kluyvera
spp.,
Leminorella spp. Pantoea aglomerans, Pragia fontium e Tatumella ptyseos
apresentaram sensibilidade a todos os antimicrobianos testados. Amostras de
Staphylococcus também foram sensíveis a todas as drogas testadas, como já havia
sido observado nas amostras isoladas na cavidade oral. Em todas as localidades
foram detectados isolados considerados multi-resistentes.
Na FZB-BH 01 amostra de Morganella morganii foi resistente a enrofloxacina,
cefalotina,
cefoxitina,
ampicilina,
tobramicina,
sulfazotim,
Amoxicilina+Ac.
Clavulânico, tetraciclina e florfenicol, 01 amostra de Serratia mascercens resistente
às
drogas
enrofloxacina,
cefalotina,
cefoxitina,
ampicilina,
amoxicilina+Ac.
Clavulânico, florfenicol e intermediário para tetraciclina. A Fundação Riozoo
apresentou 01 amostra de Enterobacter aerogenes com multi-resistencia às drogas
cefalotina,
cefoxitina,
ampicilina,
sulfazotrim,
amoxicilina+Ac.
clavulânico,
tetraciclina, ciprofloxacina, florfenicol e gentamicina e duas amostras de Citrobacter
freundii resistente a todas as drogas testadas.
Nos animais de vida livre, foi observada 01 amostra de Morganella morganii
resistente
a
cefalotina,
cefoxitina,
sulfazotrim,
amoxicilina+Ac.
clavulânico,
tetraciclina e florfenicol, 01 amostra de Enterobacter aerogenes resistente às drogas
cefalotina, cefoxitina, ampicilina, sulfazotrim, amoxicilina+Ac. clavulânico, florfenicol
e intermediário para tetraciclina, 01 amostra de Citrobacter freundii resistente às
drogas cefalotina, cefoxitina, ampicilina, sulfazotrim, amoxicilina+Ac. clavulânico,
tetraciclina, florfenicol e 01 amostra de Proteus vulgaris com resistência às drogas
cefalotina, cefoxitina, ampicilina, sulfazotrim, tetraciclina e florfenicol.
83
Tabela 7 – Perfil de resistência aos antibióticos de isolados Gram-negativos, com
origem na região da cloaca das serpentes.
Gêneros
Aeromonas
Resistência
Ampicilina (22,2%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (22,2%),
Cefalotina (33,3%), Cefoxitina (33,3%)
Citrobacter
Ampicilina (46,8%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (43,7%),
Cefalotina (62,5%), Cefoxitina (59,4%), Enrofloxacina
(15,6%), Florfenicol (15,6%), Sulfazotrim (12,5%),
Tetraciclina (28,1%), Gentamicina (9,4%)
Edwardsiella
Ampicilina (50%), Cefalotina (25%), Cefoxitina (50%),
Escherichia
Ampicilina (21,1%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (5,3%),
Cefalotina (15,8%), Cefoxitina (5,3%), Tetraciclina (15,8%),
Sulfazotrim (15,8%)
Enterobacter
Ampicilina (66,6%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (33,3%),
Cefalotina (66,6%), Cefoxitina, (100%), Ciprofloxacina
(16,6%), Florfenicol (33,3%), Gentamicina (16,6%),
Sulfazotrim (33,3%), Tetraciclina (16,6%)
Klebsiella
Ampicilina (15%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (30%),
Cefoxitina (40%), Cefalotina (40%), Enrofloxacina (10%),
Sulfazotrim (5%)
Morganella morganni
Ampicilina (50%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (25%),
Cefalotina (50%), Cefoxitina (62,5%), Enrofloxacina
(12,5%), Florfenicol (25%), Sulfazotrim (25%), Tetraciclina
(25%), Tobramicina (12,5%)
Proteus
Ampicilina (66,6%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (12,5%),
Cefalotina (41,6%), Cefoxitina (58,3%), Tetraciclina
(33,3%), Sulfazotrim (4,2%)
Providencia
Ampicilina (55,5%), Tetraciclina (11,1%),
Serratia
Ampicilina (23%), Amoxicilina+Ac. Clavulânico (30,8%),
Cefoxitina (30,8%), Cefalotina (46,1%), Enrofloxacina
(15,4%), Florfenicol (7,7%), Tetraciclina (15,4%)
Shigella
Ampicilina (50%)
84
No criatório comercial foi detectada apenas uma amostra de Edwardsiella sp.
resistente às drogas cefoxitina, cefalotina, ampicilina, amoxicilina+Ac. clavulânico,
tetraciclina. Outro grupo de bactérias que se apresentaram multi-resistentes em
todas as localidades foi o grupo das Pseudomonas spp., como já havia sido
observado em isolados da cavidade oral (Tabela 8, Figura 12). A droga cefoxitina
apresentou 100% de resistência, seguida de cefalotina, tetraciclina, ampicilina,
amocixilina + ác. Clavulânico. As drogas com 100% de sensibilidade foram
gentamicina e ciprofloxacina, o mesmo perfil de sensibilidade observado na cavidade
oral.
Os isolados de Aeromonas spp., Citrobacter spp., Edwardsiella spp.
Escherichia spp. Enterobacter spp. Klebsiella spp., Morganella morganii, Proteus
spp., Providência spp. e Serratia spp. apresentaram maior resistência aos
antimicrobianos ampicilina, cefoxitina e cefalotina (Tabela 7).
Tabela 8 – Perfil de resistência aos antibióticos de amostras de Pseudomonas spp.
isoladas da cloaca de serpentes. (n = 18)
Antibióticos
Enrofloxacina
Gentamicina
Ciprofloxacina
Florfenicol
Cefalotina
Cefoxitina
Tetraciclina
Amocixilina +Ác
Clavulânico
Ampicilina
Sulfazotrim
Tobramicina
Sensível
50%
100%
100%
55,6%
16,7%
0%
16,7%
27,8%
21,2%
66,7%
94,4%
Intermediário
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
Resistente
50%
0%
0%
44,4%
83,3
100%
83,3%
0%
0%
0%
78,8%
33,3%
5,6%
72,2%
85
Figura 12 – Perfil de resistência aos antibióticos de amostras de Pseudomonas spp.
isoladas da cloaca de serpentes. (n = 18)
86
6. DISCUSSÃO
Uma micro-biota em equilíbrio mantém o funcionamento adequado das
funções do órgão de Jacobson que capta partículas soltas no ar, levando-as a um
orifício situado no palato. No caso de estomatites normalmente ocorre uma
dificuldade na alimentação, pois estes animais se alimentam de presas vivas e
caçam utilizando as estruturas quimiossensíveis (MARQUES et al,. 2001, FRANCO,
2003). O caso de estomatite encontrado no presente estudo é um tanto incomum em
animais de vida livre, devido a esta patologia ser considerada um problema comum
em répteis de cativeiro, devido ao manejo inadequado. As etiologias desta
estomatite são muitas vezes multifatoriais. Normalmente, está associada ao stress
(MADER, 2006). Os agentes bacterianos associados com a estomatite são
Pseudomonas spp., Aeromonas spp., Klebsiella spp., e Salmonella spp. (KAPLAN e
JEREB, 1995, MEHLER e BENNETT, 2006).
Os animais mais acometidos são serpentes e lagartos, com ocorrência menos
frequente nos quelônios. Os primeiros sinais clínicos podem ser sutis e muitas vezes
passam despercebidos pelo proprietário. Em casos de aparecimento repentinos e
graves, podem levar a inflamação aguda das membranas da cavidade oral e da
faringe ou necrose gengival, com bolsões amarelos contendo cáseos e pus
amarelado pode ocorrer nos tecidos moles. A lesão observada no animal de vida
livre com estomatite bacteriana, causada por Pseudomonas aeruginosa em nosso
estudo, se caracterizou com semelhança à descrita por Mader (2006). O mesmo
autor descreve outros micro-organismos capazes de causar estomatite bacteriana,
Aeromonas aerogenes, Aeromonas hydrophila, Citrobacter freundii, Proteus spp., P.
aeruginosa e P. fluorescens, Staphylococcus spp., e Streptococcus spp., muitos
micro-organismos encontrados em nosso estudo.
Pseudomonas aeruginosa encontrada no caso de estomatite, normalmente
está associada a várias patologias em répteis, mesmo quando isoladas de animais
saudáveis, qualquer alteração na homesostase destes animais pode fazer com que
um micro-organismo pertencente à microbiota torne-se patogênico. Bactérias do
gênero Pseudomonas são frequentemente cultivadas a partir de amostras clínicas
coletadas de animais de sangue frio com dermatite, estomatite, infecções de ouvido
e respiratórias e abscessos. Estes tipos de infecções podem levar a um quadro de
87
septicemia e, consequentemente, à morte do animal (KAPLAN e JEREB, 1995,
EBANI e FRATINI, 2005).
Os seres humanos podem entrar em contato com bactérias do gênero
Pseudomonas através do meio ambiente ou diretamente a partir do contato com os
animais portadores. Em alguns casos, esses micro-organismos são a causa direta
de patologias, principalmente em indivíduos imunocomprometidos, crianças, idosos
e mulheres grávidas, não sendo recomendado o contato, sem higiene adequada,
com os répteis e seus acessórios. (EBANI E FRATINI, 2005).
Os cinco animais da espécie Boa constrictor da FZB-BH, positivos para o
Paramyxovírus ofídico (OPMV), apresentavam sinais clínicos como distúrbios
respiratórios e lesões de pele, mesmos sinais descritos por Bronson e Crafield
(2006) resultando em até 100% de mortalidade e podendo ocorrer de forma
secundária através de pneumonias bacterianas, sinais gastrointestinais, como
diarréia mucóide e acúmulo de gases causando distensão abdominal. Os animais
doentes recebiam tratamento suporte para aumentar o tempo de sobrevida, que
consistiam em antibióticoterapia, fluidoterapia e complementos vitamínicos, o
tratamento recomendado na literatura (BRONSON e CRAFIELD, 2006). O uso de
antibióticos pode ter selecionado cepas resistentes para esta localidade, já que o
manejo normal das serpentes, não é realizado com antibióticos, quando é feito um
manejo adequado. O primeiro relato de Paramyxovírus no Brasil foi realizado em
Botucatu em uma cascavel com sinais de pneumonia (NOGUEIRA, et al. 2002).
Quanto à microbiota da cavidade oral das serpentes é provável que a
diversidade bacteriana encontrada vá refletir a variação da microbiota fecal de
presas ingeridas vivas que, normalmente, defecam enquanto estão sendo mortas e
consumidas (GOLDSTEIN et al., 1979).
Mas segundo Costello et al. (2010), ao
estudar a microbiota de pythons de cativeiro e das presas oferecidas a estes
animais, através de técnicas moleculares, sugerem que a maioria das bactérias
intestinais encontradas nas pythons eram consideradas indígenas as serpentes ao
invéz de adquiridas das presas. De acordo com Bastos, (2012) roedores vivos
utilizados na alimentação de serpentes no cativeiro passam por um controle
higiênico sanitário, no entanto muitas vezes os estudos sobre diferenças na
microbiota de serpentes de vida livre e cativas não especificam quais os itens
alimentares oferecidos a estes animais. Outra consideração importante é o estresse
que pode alterar a microbiota oral destas serpentes. Em nosso estudo, podemos
88
verificar que os animais cativos são alimentados com presas que passam por um
controle higiênico adequado e os animais de vida livre não podemos precisar sua
alimentação, sendo visualizados alguns representantes da dieta na hora da captura
destes animais, que regurgitam sua presa, devido ao estresse causado, foram
detectados gambás, roedores e até um filhote de gato doméstico em alguns dos
animais capturados.
Os isolados recuperados durante o presente estudo pertenciam a espécies de
bactérias normalmente presentes nos ambientes terrestres e aquáticos, e muitas
vezes responsáveis por diferentes patologias tanto em répteis, quanto em alguns
casos, podendo causar uma variedade de patologias em seres humanos,
particularmente em pessoas imunocomprometidas (EBANI E FRATINI, 2005).
Segundo Ferronato et al. (2009) observaram na investigação da cavidade oral
e da cloaca de serpentes de vida livre e cativas no Brasil, um amplo espectro
microbiológico, principalmente de bactérias Gram-negativas, e essa microbiota é
relatada com o potencial de gerar lesões e infecções em répteis. Vários outros
autores, ao estudarem a microbiota de serpentes e outros répteis de várias espécies,
no Brasil e no exterior, detectaram uma microbiota variada, compatível com a
descrita na tabela 2 e tabela 6, bactérias como Proteus spp., Staphylococcus
coagulase negativa, P. aeruginosa, Proteus vulgaris e Morganella morganii, A.
hydrophila, Citrobacter freundii, Salmonella spp., Enterobacter agglomerans, E.
cloacae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Providencia rettgeri, Providencia
spp e Serratia marcescens (AVILA-AGÜERO et al., 2001, DIAZ-FIGUEROA e
MITCHELL, 2006, FONSECA et al., 2009, MORAIS et al., 2011).
Foi observado em vários estudos com répteis de diferentes localizações do
mundo, que a microbiota pode ser semelhante, mas com a prevalência de diferentes
micro-organismos, Santoro et al. (2006) detectaram um maior número de bactérias
Gram-negativas ao estudarem filhotes de tartarugas marinhas na Costa Rica,
isolando os micro-organismos da cavidade nasal e cloacal, com um prevalência de
Klebsiella pneumoniae 38,5 % nasal e 47,1% na cloaca, em contrapartida nosso
estudo não detectou este micro-organismo na cavidade oral de serpentes, somente
observado na região da cloaca, com uma
pneumoniae
prevalência de 3,0% para Klebsiella
e 3,7% para Klebsiella spp. Draper et al. (1981) ao estudarem a
microbiota da cavidade oral de serpentes, saudáveis e doentes, encontraram
bactérias Gram-positivas em animais sadios, enquanto nos doentes observaram
89
mais frequentemente, Pseudomonas spp., Providencia spp. e outras bactérias Gramnegativas. Em nosso estudo verificou-se uma grande quantidade de bactérias Gramnegativas e pouco quantidade de Gram -positivas, não sendo detectada diferença da
microbiota de animais doentes (05 animais) para os animais saudáveis. Apenas
houve diferença em relação a isolados multiresistentes nos animais doentes da FZBBH.
No estudo de Fonseca et al. (2009) bactérias Gram-positivas foram comuns à
cavidade oral de todas as famílias de serpentes estudadas - Boidae, Colubridae,
Elapidae e Viperidae. A espécie E. coli foi predominante na cloaca e fezes de
quelônio da espécie Malaclemys terrapin (HARWOOD, et al., 1999) e Phrynops
geoffroanus (FERRONATO, et al., 2009), esta bactéria é associada a lesões em
tartarugas da espécie Caretta caretta (OROS et al. 2005) e com a mortalidade de
animais jovens de Chelonia mydas (RAIDAL et al., 1998). Santoro et al. (2006)
encontraram Aeromonas spp. e Citrobacter freundii mas não Shigella flexnerii e E.
coli
como
bactérias
frequentes
em
tartarugas
Lepidochelys
olivacea.
Surpreendentemente, E. coli foi pouco frequente nas serpentes estudadas com uma
prevalência de 5,4% na cavidade oral e 3,7% na cloaca. Com maior frequência
observamos Pseudomonas 15,8% na cavidade oral e 6,1% na cloaca, seguido de
Citrobacter spp. 11,8% e 11,0%, respectivamente.
Em nosso estudo verificou-se apenas um único isolado de Salmonella spp. na
cavidade oral de um animal de cativeiro e uma prevalência de 32,4% na cloaca, em
contra partida, no estudo de Morais et al. (2011) Salmonella spp. não foi obtida a
partir da cloaca de quelônios e apenas dois isolados foram obtidos na cavidade oral.
Alguns estudos demonstraram uma prevalência de 0% de Salmonella spp. na cloaca
de serpentes e outros répteis de vida livre (BRENNER et al., 2002, RICHARDS et al.,
2004). Uma prevalência inesperada, segundo os autores, dada a alta prevalência de
Salmonella spp. relatada na maioria dos estudos com répteis de cativeiro e vida livre
(MACIEL et al., 2010, FRANCO et al., 2011) e dependendo do tipo de análise, na
qual avalia-se a sazonalidade das coletas, pode-se verificar diferentes prevalências
de um determinado micro-organismo nos mesmos animais ou em mesmas áreas
geográficas, o que é descrito por Uhart et al. (2011) ao estudarem a prevalência de
Salmonella spp. em jacarés no charco Argentino e perceberem que a prevalência
normal era tida como baixa, mas em um determinado momento, esta aumentou
consideravelmente. Estes autores não conseguiram associar qualquer variável ao
90
aumento, sugerindo apenas a sazonalidade. Nosso estudo foi associado a uma
única coleta por região.
Considerando o hábito aquático das jiboias e levando em consideração que
os animais de vida livre podem ter contato com vários locais no município de
Campos dos Goytacazes, isto incluindo o Rio Paraíba do Sul e sua alimentação
incluir peixes, (WARWICK et al., 1995) credenciam-se esta espécie de serpente
como um possível reservatório de agentes zoonóticos, com caráter hídrico, como,
por exemplo, Alcaligenes spp., Proteus spp., Staphylococcus spp. e Citrobacter, que
podem ser encontradas em criatórios de peixes de cativeiro (NEWAJ-FYZUL et al.,
2008). Já Enterobacter agglomerans é encontrado em água e solo e tem sido
ocasionalmente isolado de humanos, mas raramente causa doenças em indivíduos
saudáveis (FRASER et al., 2010). No entanto é conhecido por causar doenças
urinárias e respiratórias em seres humanos (GILMORE e FERRETTI, 2003).
Goldstein et al. (2012), ao pesquisar a presença de Staphylococcus aureus
resistente à meticilina em estações de tratamento de água nos EUA, demonstrou a
ocorrência de MRSA no esgoto municipal, embora no estudo não se tenha detectado
S. aureus nas serpentes, o ambiente aquático que estes animais tem contato os
predispõe ao se infectarem de bactérias patogênicas.
A maioria das bactérias isoladas na cavidade oral e na cloaca das serpentes
de vida livre e cativeiro em regiões distintas do Brasil são considerados como
pertencentes à microbiota normal, mas as mesmas podem causar lesões nos
animais que apresentarem baixas de imunidade. Citrobacter freundii tem sido
associada com doença ulcerosa cutânea em tartaruga selvagem (JACKSON e
FULTON, 1970) e doença pulmonar e lesões hepáticas em Chelonia mydas
(RAIDAL et al., 1998). Enterobacter agglomerans foi isolada em estomatite e
dermatite em Jacaré de cativeiro mississippiensis (NOVAK e SEIGEL 1986) e
Micrococcus spp. em abscessos subcutâneos em iguanas (BOAM et al. 1970).
Morganella morganii obteve um percetual de 4,9% de prevalência na cavidade
oral e 2,7% na cloaca das serpentes estudadas e já foi isolada de abscesso
subcutâneo em jibóia de cativeiro no Estado da Bahia (FERREIRA, et al., 2012),
sendo este micro-organismo considerado de ampla distribuição e pertencente a
microbiota normal de ofídios, tanto da cavidade oral quanto na cloacal, sendo um
dos agentes bacterianos envolvidos em complicações locais por necrose secundária
em humanos após o acidente ofídico (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2001, CHITHRA
91
VALSAN, et al., 2008). Segundo Santoro et al. (2006), o isolamento de bactérias
oportunistas na cavidade oral e na cloaca de répteis não são sinônimos de processo
infeccioso e provavelmente dependerá do estado de saúde do animal.
A alta prevalência de Pseudomonas spp. na cavidade oral (15,8%) e na
região da cloaca (6,1%) observado neste estudo é descrita na literatura como
comum para os répteis (PARE et al., 2006). Este é considerado um patógeno
oportunista, que em qualquer quebra de homeostase pode se tornar patogênico,
como observamos anteriormente, um animal do experimento apresentou estomatite
por P. aeruginosa. Este micro-organismo foi o responsável pelo óbito de um iguana
verde com lesão óssea na coluna (osteomielite) (STEIN et al., 2009). Pseudomonas
spp. são associadas a surtos de infecções hospitalares o que foi descrito por Seki et
al. (2013) em um hospital universitário em Osaka, Japão, existindo o risco de
transmissão zoonótica deste micro-organismo, para indivíduos que venham a ter
contato com répteis.
Foram observadas algumas bactérias com caráter ambiental, associadas ao
solo e a água, porém, sem característica patogênicas para seres humanos e animais
hígidos. Foram elas Buttiauxella agrestis, Budvicia aquática, Hafinia alvei, Kluyvera
spp., Leminorella spp., Pragia fontium e Tatumella ptyseos. Buttiauxella tem sido
isolada de solo, água potável, água de superfície, esgoto e amostras fecais, ocorre
abundantemente no intestino de caracóis, lesmas e outros moluscos (MULLER et al.,
1996). Budvicia aquatica, foi isolada pela primeira na Checoslováquia (ALDOVA et
al., 1983). A bactéria é normalmente isolada em fontes de água doce, incluindo
vários poços, tubulações de água, piscinas, riachos e rios (SCHUBERT e
GROEGER-SOHN, 1998). Um único caso da doença causada por B. aquatica em
um indivíduo imunossuprimido exposto ao rescaldo do furacão Katrina nos EUA foi
descrito por Corbin et al., (2007). Demonstrando que mesmo bactérias ainda não
descritas como capazes de causar processos infecciosos, realmente não são
patogênicas até que se descreva um caso. Todos os isolados identificados são
patógenos oportunistas para seres humanos (VOELZ et al., 2010).
A microbiota verificada em animais de cativeiro na cavidade oral e na cloaca
assemelha-se em todos os locais coletados e esses dados podem ser explicados
pela dieta ofertada e pela autocontaminação, através do contato com suas próprias
fezes, que são frequentemente encontradas nos bebedouros, enquanto nos animais
de vida livre podemos observar o contato com fezes de outros animais e lixo
92
doméstico, já que estes foram capturados na região peri-urbana do município de
Campos dos Goytacazes/RJ.
Levando em consideração os ambientes que as serpentes de vida livre do
experimento podem ter contato, esperava-se um alto perfil de resistência aos
antimicrobianos testados, porém este perfil foi percebido nas localidades de cativeiro
e com maior percentual de isolados resistentes na FZB-BH onde se verificou alguns
isolados multi-resistentes. A resistência bacteriana é um fenômeno que ocorre em
todo o mundo, e é facilmente adquirida com o uso constante e inapropriado de
drogas terapêuticas em humanos e animais, ou pelo contato com quem já possua
essas cepas resistentes (LESSA, 2010).
Os isolados de Pseudomonas spp. observados no estudo apresentaram um
perfil de resistência compatível com o detectado por Ebani et al. (2008), ao
estudarem répteis criados como animais de estimação. Em contrapartida, foi
observado um perfil de 100% de sensibilidade às drogas ciprofloxacina, gentamicina
e tobramicina. Já Ebani et al. (2008) não observaram 100% de sensibilidade a
nenhuma droga testada. O perfil de alta resistência foi observado para as drogas
ampicilina, amoxilina+ác. clavulânico e sulfa e o mesmo perfil é descrito por Ebani et
al. (2008).
Já Ferreira Junior et al. (2009), observaram uma resistência mais
acentuada para estas mesmas bactérias sendo sugerido que a limpeza e ventilação
do ambiente possa favorecer a diminuição da prevalência e a identificação de
resistência .
Sabe-se que muitas penicilinas naturais, cefalosporinas de primeira geração e
macrolídeos têm efeito mínimo contra bactérias Gram-negativas, devido a fatores
intrínsecos de resistência (MITCHELL, 2006). No presente estudo verificou-se que
os derivados da penicilina e as cefalosporinas apresentaram um perfil de resistência
acentuado a todos os gêneros de bactérias Gram- negativas, tanto na cavidade oral
quanto na cloaca. Os aminoglicosídeos que são considerados as melhores opções
para casos de sepsia causada por bactérias Gram-negativa e geralmente são
indicados para infecções em répteis, incluindo processo infeccioso por
E. coli,
Klebsiella spp., Enterobacter spp., Pseudomonas spp., Proteus spp., Providencia
spp., Salmonella spp. e Serratia spp. (MITCHELL, 2006), apresentaram resistência à
Alcalinigenes spp., na cavidade oral com perfil de resistência de 33,3% para
gentamicina e 16,6% para tobramicina. Na região da cloaca observamos isolados de
93
Morganella morganii com 12,5% de resistência para tobramicina e Enterobacter spp
com 16,6% para gentamicina.
A sulfa potencializada com trimetoprim no presente estudo apresentou um
perfil de resistência na cavidade oral apenas para Escherichia spp. com 21,4%, na
região da cloaca Citrobacter spp. 12,5%, Escherichia spp. 15,8%, Enterobacter spp.
33,3%, M. morganii 25% e Proteus spp. 4,2% este resultado é mais baixo quando
comparado com o observado por Ferreira Junior, et al. (2009), onde descreveram
um percentual mais elevado de resistência para alguns gêneros como Pseudomonas
60%, M. morganni 67% e Enterobacter spp.100%. Já Bastos et al. (2008)
descreveram um perfil de resistência apenas para Aeromonas spp. 33,3% e
Escherichia spp. 22,2%, percentual mais próximo ao presente estudo. Microorganismos podem desenvolver resistência naturalmente através de mutação
(intrínseco) ou como resultado da exposição ao meio ambiente. O uso generalizado
de antibióticos em seres humanos e em répteis leva a cada dia a um maior número
de relatos de patógenos resistentes a antimicrobianos. Em seres humanos, milhares
de mortes estão associadas a bactérias resistentes a antimicrobianos (MITCHELL,
2006).
Bastos et al. (2008), detectaram isolados bacterianos apresentando baixas
taxas de resistência aos antibióticos testados e concluem que este dado permite o
uso dos antibióticos com segurança em processos infecciosos em jararacas. Além
disso, o conhecimento dos padrões de resistência bacteriana dos isolados de répteis
é de suma importância para o tratamento dos seres humanos infectados por
bactérias com caráter zoonótico transmitidas por estes animais.
94
7. CONCLUSÃO
A microbiota da cavidade oral e da cloaca se assemelha em serpentes de
cativeiro e vida livre.
Sendo esta considerada rica em bactérias com caráter patogênico e alta
resistência aos antimicrobianos.
O manejo adequado desses animais deve ser realizado com a máxima
higiene,
devendo-se
evitar
o
contato
de
indivíduos
imunocomprometidos,
principalmente, crianças, grávidas, idosos e pessoas com doenças crônicas (HIV+,
diabetes e etc.).
95
CAP II – IDENTIFICAÇÃO, PERFIL DE SUSCEPTIBILIDADE, SOROTIPAGEM E
PESQUISA DE FATORES DE VIRULÊNCIA EM ISOLADOS DE SALMONELLA spp.
EM SERPENTES.
96
3. OBJETIVOS

Identificar isolados de Salmonella spp. nas serpentes por técnicas
bioquímicas – Características Fenotípicas;

Identificar os sorovares dos isolados de Salmonella spp. encontrados –
caracterização antigênica;

Verificar o perfil de resistência e susceptibilidade às drogas destes
isolados;

Detectar genes de virulência em Salmonella enterica subsp. arizonae e
Salmonella enterica subsp. diarizonae isoladas, para a verificação de
possíveis características relacionadas à patogenicidade – invE/A,
phoP/Q, orgA, hilA, mgtC, sefA;

Avaliar através da técnica de PFGE a similaridade dos isolados de
Salmonella enterica subsp. arizonae e Salmonella enterica subsp.
diarizonae encontrados no Brasil.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS DO GÊNERO Salmonella spp.
Os suabes de cloaca foram coletados em duplicata para a pesquisa
específica de Salmonella spp. Estes foram inoculados em caldo de enriquecimento
seletivo – Caldo Rappaport Vassiliadis incubado por 24-48horas em temperatura de
43°C. Posteriormente inoculado em agar Entérico Hektoen e incubado por 24 horas.
Colônias com o aspecto verde-azuladas com ponto negro no centro – não
fermentadoras, foram testadas fenotipicamente para o teste TSI, fermentação de
carboidratos, reação do vermelho de metila (VM), utilização de citrato, produção de
acetoína (VP), uréase, SIM (indol, sulfeto de hidrogênio - H2S, mobilidade) e
descarboxilação da L-Lisina (SVS, 2011) – Caracterização dos testes ver cap. 01 .
Após a identificação fenotípica de Salmonella spp. no setor de microbiologia
do Laboratório de Sanidade Animal, CCTA, na Universidade Estadual do Norte
Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, estas foram encaminhadas ao
Laboratório de Referência Nacional de Enteroinfecções Bacterianas do Instituto
97
Oswaldo Cruz – IOC/Fundação Oswaldo Cruz – Fiocruz/RJ em Ágar Muller Hinton
para a caracterização antigênica.
4.2. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS - TSA
As bactérias isoladas
foram
testadas quanto a sua resistência e
susceptibilidade a 17 antibacterianos padronizados para espécies de Salmonella
spp.. Para tal, foi utilizada a técnica de difusão em Ágar Müller Hinton, e o perfil de
cada bactéria foi avaliado de acordo com o halo formado frente a cada antibiótico,
medido com auxílio de um paquímetro. Foram testados diante dos isolados
bacterianos
os
discos
impregnados
com
antibióticos
(Laborclin,
Brasil):
enrofloxacina (ENO 5g), cefoxitina (CFO, 30g), cefalotina (CFL, 30g), ampicilina
(AMP, 10g), tobramicina (TOB, 10g), cotrimoxazol (SUT, 25g), amoxicilina mais
ácido clavulânico (AMC, 20/10g), tetraciclina (TET, 30g), ciprofloxacino (CIP, 5g)
gentamicina (GEN, 10g), florfenicol (FLF, 30g), meropenem (MER, 10g),
amicacina (AMI, 30g), imipenem (IPM, 10g), Aztreonam (ATM, 30g), neomicina
(NEO, 30g) e estreptomicina (EST, 10g)
4.3. SOROTIPIFICAÇÃO DE Salmonella spp.
4.3.1. Teste de soroaglutinação rápida
O crescimento obtido em tubos com Agar Nutriente inclinado, após incubação
de 24h a 37°C, foi suspenso em 1 a 2 mL em solução de 0,85% de cloreto de sódio.
A caracterização antigênica foi realizada após verificação da estabilidade da
suspensão, eliminando as formas rugosas (auto aglutinantes), através da técnica de
soroaglutinação rápida em lâmina. Foram utilizados os antissoros polivalentes e
monovalentes somáticos (O) e flagelares (H) (POPOFF, 2001). Todos os antissoros
empregados foram produzidos no LRNEB/IOC/FIOCRUZ.
98
4.4. PESQUISA DE FATORES DE VIRULÊNCIA EM ISOLADOS DE SALMONELLA
- ANÁLISE MOLECULAR
4.4.1. Extração de DNA
A extração do DNA foi realizada de acordo com o protocolo do kit BLOOD
GENOMIC PREP SPIN KIT (GE Healthcare). As amostras foram cultivadas em 5 mL
de caldo BHI para o crescimento bacteriano e em seguida foi realizada a
centrifugação para a formação do sedimento bacteriano - Pellet. O protocolo seguiu
os passos recomendados pelo fabricante.
4.4.2. Realização da PCR em amostras de Salmonella enterica subsp. arizonae
e Salmonella enterica subsp. diarizonae
A amplificação do DNA da Salmonella spp.
foi realizada de acordo com
Soumet et al. (1999); Guerra et al. (2000); Bohez et al. (2006) e Soto et al. (2006).
Nesta
etapa,
realizada
no
Laboratório
de
Sanidade
Animal
–
Hospital
Veterinário/UENF (LSA/HVET/UENF), o objetivo foi detectar a presença de
diferentes fatores de virulência conforme tabela 9. Foram investigados 06 pares de
primers utilizando a PCR convencional: hilA, sefA phoPQ, orgA, invE/A e mgtC. Foi
utilizada a cepa de Salmonella ser. Enteritidis ATCC13076, como controle positivo e
a cepa de Staphylococcus aureus ATCC 33591 como controle negativo.
Para a reação em cadeia da polimerase foram preparadas soluções com
volume total de 50 μL de uma mistura contendo 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM
KCl, 2,5 mM de MgCl 2, 2 mM de cada deoxynucleosídeo trifosfato, 1,5 U de Taq
DNA polimerase, 5 μL de DNA das amostras e 2 μL de “primers”.
99
Tabela 9 - Gene, sequência de oligonucleotídeo, tamanho do produto amplificado
em pares de base e localização ou função de cada gene.
Gene
invE/A
Sequência de oligonucleotídeo
Produto
Localização/
(5’ a 3’)
amplificado (pb)
Função
500
SPI – 1 Invasão
TGCCTACAAGCATGAAATGG
AAACTGGACCACGGTACAA
phoP/Q
ATGCAAAGCCCGACCATGACG
GATAAGGCGAAATCGTACAATG
299
540
SPI – 1 Sistema
Guerra et
regulatório
al. (2000)
SPI – 1 Invasão
Soto et al.
GTAAGGCCAGTAGCAAAATTG
hilA
GGATCAGGTTCAATCCGAGA
(2006)
500
AGTAAGGCGCAATGCTGTTT
sefA
AGGTTCAGGCAGCGGTTACT
312
GGGACATTTAGCGTTTCTTG
mgtC
TGACTATCAATGCTCCAGTGAAT
ATTTACTGGCCGCTATGCTGTTG
Guerra et
al. (2000)
GTATCGACCACCACGATGGTT
orgA
Autores
655
SPI – 1 Fator global
Bohez et
de regulação
al. (2006)
Antígeno fimbrial
Soumet et
(adesão)
al. (1999)
SPI – 3
Soto et al.
Sobrevivência
(2006)
intramacrófago
Para a reação da PCR dos primers phoP/Q, invE/A, mgtC e orgA foram realizadas
nas condições descritas na figura 13.
100
Figura 13 – Condições de amplificação pela técnica da PCR, para os genes phoP/Q,
invE/A, mgtC e orgA
Para o gene hilA as condições utilizada para a reação de PCR foram realizadas nas
condições descritas na figura14:
Figura 14 – Condições de amplificação pela técnica da PCR, para o gene hilA.
Para o gene sefA as condições para a reação de PCR foram as descritas na figura
15.
101
Figura 15 – Condições de amplificação pela técnica da PCR, para o gene sefA.
Após a realização das reações, o produto do PCR foi visualizado por
eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio.
4.5. ELETROFORESE DE CAMPO PULSADO – PFGE – Pulsed Field gel
eletophoresis
A técnica foi realizada seguindo protocolo recomendado pelo PulseNet (CDC,
2009), indicado para os sorovares de Salmonella, cuja descrição estão apresentadas
nos itens subsequentes.
4.5.1. Semeadura das amostras
Amostras de Salmonella enterica subsp. arizonae e Salmonella enterica
subsp. diarizonae foram semeadas em agar Nutriente (Difco, U.S.A), para obtenção
de colônias isoladas incubando-se a 37ºC por 14 a 18h. As colônias foram
inoculadas em 2mL de Tampão de suspensão bacteriana (Cell Suspension Buffer 100 mM Tris: 100mM EDTA, ph 8,0), ajustando-se a turbidez para valores de
absorbância entre 1,3 e 1,4 e comprimento de onda de 610 nm, em P5500-1
Spectrophotometer (Sigma Aldrich Biotecnology – EUA).
102
4.5.2. Preparação dos Plugs de PFGE
Foram adicionados em tubos de 50 mL, 20 µL de Proteinase K (20 mg/mL),
400 µL da suspensão bacteriana. A agarose utilizada para fazer os plugs consiste
em 1,0% de agarose Seakem Gold (preparada com TE buffer - Tris 10 mM, EDTA 1
mM, pH 8.0). Uma alíquota de 400µL da agarose foi adicionada à suspensão
bacteriana e a mistura foi distribuída na cavidade de um molde para plugs. Os plugs
solidificam a temperatura ambiente por aproximadamente 10 minutos.
Posteriormente, foram distribuídos 5 mL da solução de lise celular (Tris
50mM, EDTA 50 mM pH 8.0; Sarcosil a 1%; proteinase K 0,1 mg/mL), previamente
preparada, em tubos cônicos de 50mL. Os plugs foram retirados do molde e
transferidos para os tubos contendo a solução de lise celular, com incubação a 54ºC
por 2h, sob agitação de 150 rpm.
4.5.3. Lavagem dos Plugs de PFGE
Foram realizadas duas lavagens adicionando-se 10 mL de água tipo 1 préaquecida a 54ºC, Outras quatro lavagens foram realizadas adicionando-se 10 mL de
tampão TE (10 mM Tris e 1,0 mM EDTA, pH:8,0) pré-aquecido a 54ºC, com
incubação em banho-maria a 54ºC por 10 minutos. Os plugs foram armazenados
com 20 mL de TE, sob-refrigeração a 4ºC.
4.5.4. Digestão de DNA com Enzimas de Restrição
Foi cortado um plug de aproximadamente 2 mm de largura e transferido
a tubos de polipropileno de 1,5 ml contendo 200 μL da solução de pré-digestão, com
tampão H da marca Roche® e Água tipo 1, incubando-se a 37ºC por 10 minutos.
Após a incubação a solução de pré-digestão foi retirada com uma
micropipeta, em seguida, foi preparada a solução de digestão com tampão H da
marca Roche®, enzima de restrição XbaI (5’ – T↓CTAG_A– 3’ 35) - (40 U - Roche®)
e Água tipo 1, com posterior incubação, sendo mantidos por 1,5 – 2h a 37ºC em
banho-maria, Os procedimentos também foram realizados para a cepa controle
Salmonella Braenderup.
103
4.5.5. Aplicação das Amostras no Gel de Agarose
A solução de digestão encontrada nos tubos de polipropileno de 1,5 mL foi
desprezada e adicionaram-se 200 µL tampão TBE para paralisar a ação da enzima e
os plugs foram colocados na extremidade do pente, com posterior fixação no molde,
após a secagem, o gel de agarose Seakem Gold (SKG) a 1,2% em TBE 0.5X foi
despejado deixando-se solidificar por aproximadamente 30 minutos. Nas posições
externas e central, foi colocada a cepa padrão de Salmonella ser. Braenderup
H9812 (Hunter, 2005).
4.5.6. Condições para a Corrida Eletroforética
O gel foi submerso em 2000 mL de tampão TBE 0.5X contido na cuba
eletroforética. Os fragmentos de DNA genômico foram separados por eletroforese
usando-se o equipamento CHEF-DR®III (Bio-Rad, Hercules, CA) com refrigeração
do TBE a 14 °C. A corrida eletroforética foi de 18 horas; com gradiente de voltagem
de 6 V/cm. Tempo de pulso inicial de 2.2s. Tempo de pulso final de 63.8s e ângulo
de inclinação de 120º. Após o término da corrida o gel foi corado com brometo de
etídio (10 mg/mL) por 1 hora, com posterior lavagem em água destilada. O padrão
de bandas foi observado sob luz ultravioleta (UV) e fotografado no formato TIFF
usando-se o sistema de foto-documentação modelo Photo-Print IP- 010.SD,
versão10.
4.5.7. Interpretação e Análise de Dados
Os diferentes fragmentos obtidos para cada isolado foram analisados
utilizando o software BioNumerics IV (Applied Maths/Bélgica), onde foram avaliadas
as similaridades “pair wise”, sendo calculados pelo coeficiente de similaridade DICE
com os clusters baseados no “Unweighted Pair-Group Method with Averages”
(UPGMA) tendo tolerância e optimização de 1,5%.
104
5. RESULTADOS
5.1. IDENTIFICAÇÃO DOS ISOLADOS
Foram identificados fenotipicamente, nas amostras de cloaca, 96 isolados de
Salmonella spp. em 12 sorovares. Estes foram sorotipados no Laboratório de
Enteroinfecções na Fundação Oswaldo Cruz – Rio de Janeiro, pela técnica de
Kauffman-White. Os sorovares são apresentados na Tabela 10 e Figura 18.
Observou-se maior prevalência de S. enterica subsp. diarizone.
Tabela 10 – Sorovares encontrados em serpentes de vida livre, zoológicos e criatório
comercial.
Sorovares de Salmonella
Numero de
Amostras (%)
Salmonella enterica subsp. diarizonae
38 (39,6)
Salmonella enterica subsp. arizonae
08 (8,3)
Salmonella enterica subsp. houtenae
11 (11,5)
Salmonella ser. Muenchen
10 (10,3)
Salmonella ser. Newport
09 (9,4)
Salmonella ser. Albany
04 (4,2)
Salmonella ser. Muenster
04 (4,2)
Salmonella enterica subsp. enterica (rugosa)
04 (4,2)
Salmonella ser. Oranienburg
03 (3,1)
Salmonella ser. Montevideo
02 (2,1)
Salmonella ser. Rubislaw
02 (2,1)
Salmonella ser. Typhimurium
01 (1,0)
Total = 12
96 (100%)
Apesar de identificados 96 isolados de Salmonella spp., apenas 62 animais
mantinham esta bactéria na região da cloaca no momento da coleta, o que demostra
uma prevalência de 47,7%, sendo que alguns animais albergavam mais de um
sorovar, ou o mesmo, com diferenças no padrão de resistência e molecular.
Podemos notar na Figura 16 a maior prevalência de Salmonella enterica
subsp. diarizonae, com 39,6% dos isolados, sendo isolada em todas as localidades
105
estudadas e este sorotipo é comumente isolado de animais de sangue frio e apenas
uma única Salmonella ser. Typhimurium foi isolada de um animal de vida livre, no
município de Campos dos Goytacazes/RJ.
Foram detectados 09 sorovares de Salmonella enterica que normalmente são
isolados em animais de sangue quente e possuem características patogênicas,
Salmonella ser. Albany, Salmonella ser. Muenchen, Salmonella ser. Rubislaw, ser.
Salmonella ser. Muenster e Salmonella ser. Newport, além das subspécies
Salmonella enterica subsp. diarizonae, Salmonella enterica subsp. arizonae e
Salmonella enterica subsp. houtenae, no criatório comercial. Este local cedeu 54
animais para o estudo e 33 animais, foram positivos para Salmonella.
Figura 16 – Sorovares encontrados em serpentes de vida livre, zoológicos e criatório
comercial.
A prevalência por localidades pode ser observada na figura 17, onde a maior
prevalência detectada foi na FZB-BH, onde 17/20 animais indicaram a presença da
bactéria do gênero Salmonella, seguida do Criatório Comercial com 33 animais
106
positivos de 54 no total. Já a Fundação Riozoo e os animais de vida livre,
apresentaram uma prevalência mais baixa, com 6/21 e 6/35, respectivamente.
Figura 17 – Prevalência de Salmonella spp. de serpentes divididos pelos locais
coletados, Riozoo, FZB-BH, Criatório comercial e Vida livre.
Na FZB-BH observamos a presença dos sorovares Salmonella ser.
Oranienburg, Salmonella ser. Newport, Salmonella enterica subsp. enterica (rugosa),
Salmonella ser. Muenchen. Salmonella ser. Muenster e a subspécie Salmonella
enterica subsp. diarizonae, participando com 20 animais. Na Fundação Riozoo
encontamos Salmonella ser. Newport, Salmonella enterica subsp. enterica (rugosa)
e as subspécies Salmonella enterica subsp. diarizonae e Salmonella enterica subsp.
arizonae, participando com 21 animais. Nos animais de vida livre, pudemos observar
os sorovares Salmonella ser. Muenchen e Salmonella ser. Typhimurium, além de
Salmonella enterica subsp. diarizonae e Salmonella enterica subsp. houtenae, com
um total de 35 animais (Figura 18).
107
Figura 18 – Distribuição dos sorovares isolados das serpentes divididos pelos locais
coletados, Riozoo, FZB-BH, Criatório comercial e Vida livre.
Na figura 18 observamos os sorovares de Salmonella spp. divididos pelas
localidades coletadas, o grupo de vida livre foi considerado o padrão (grupo controle
– com menor interferência antrópica) e foi comparado descritivamente com os
grupos da Fundação Riozoo, FZB-BH e com o criatório comercial. O criatório
comercial foi o local, onde obtivemos um maior número de animais albergando o
maior número de sorovares de Salmonella. Esta localidade contribuiu com um maior
número de animais e como os animais são criados comercialmente, acabam
sofrendo uma maior manipulação.
108
5.2. PERFIL DE RESISTÊNCIA A DROGAS - SALMONELLA
Após a realização do TSA verificou-se 05 isolados de Salmonella spp. com
resistência à enrofloxacina, 01 isolado resistente a cefalotina, 01 isolado resistente à
gentamicina e outro à tetraciclina todas pertencentes à FZB-BH. Um único isolado
resistente à neomicina foi observado no criatório comercial. O perfil intermediário foi
observado 01 isolados de cefalotina (FZB-BH), 03 isolados de tetraciclina (FZB-BH),
01 isolado de ampicilina, 01 isolado de amicacina (criatório) 16 isolados de
neomicina (08-FZB-BH, 05 Criatório, 01 Riozoo e 02 vida livre), 04 isolados de
estreptomicina (03 criatório e 01 do Riozoo). (Tabela 11 e Figura 19).
Tabela 11 – Perfil de resistência aos antibióticos de amostras de Salmonella spp.
isoladas da cloaca de serpentes. (n = 96)
Antibióticos
Enrofloxacina
Gentamicina
Ciprofloxacina
Florfenicol
Cefalotina
Cefoxitina
Tetraciclina
Amocixilina + Ác
clavulânico
Ampicilina
Sulfazotrim
Tobramicina
Amicacina
Aztreonam
Estreptomicina
Imipenem
Meropenem
Neomicina
Sensível
94,8%
98,9%
100%
100%
98,9%
100%
96,9%
Intermediário
0%
0%
0%
0%
1,1%
0%
3,1%
100%
0%
97,8%
100%
100%
98,9%
100%
94,8%
100%
100%
82,3%
1,1%
0%
0%
1,1%
0%
5,2%
0%
0%
16,6%
Resistente
5,2%
1,1%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
1,1%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
1,1%
Os isolados de Salmonella spp. que apresentaram perfil de resistência aos
antimicrobianos pertencem aos sorovares Salmonella enterica subsp. diarizonae e
Salmonella enterica subsp. enterica (rugosa). O que pode-se notar sobre a
resistência nos isolados de Salmonella spp. oriundos da FZB-BH, foi o uso de
antibibióticos em alguns dos animais, para tratamento de enfermidades, que pode
109
ter favorecido a resistência, pois observamos nas outras localidades, isolados do
mesmo sorotipo com sensibilidade de 100% a todas as drogas testadas. Apenas um
dos animais que apresentou resistência à enrofloxacina não era da espécie Boa
constrictor, sendo esse então da espécie Epicrates cenchria. O perfil intermediário,
principalmente a neomicina, chama a atenção por vários sorovares – Salmonella
enterica subsp. diarizonae, Salmonella enterica subsp. arizonae, Salmonella enterica
subsp. houtenae, Salmonella ser. Newport, Salmonella ser. Rubislaw e Salmonella
ser. Montevideo.
Figura 19 – Perfil de resistência aos antimicrobianos de amostras de Salmonella spp.
isoladas da cloaca de serpentes. (n = 96)
De forma geral, os sorovares de Salmonella apresentaram um perfil de baixa
resistência às drogas testadas, sendo na FZB-BH um ponto isolado de resistência
devido ao uso de drogas no tratamento dos animais acometidos com o
paramyxovírus.
110
5.3. DETECÇÃO DOS FATORES DE VIRULÊNCIA
Foram testados 46 isolados de Salmonella, sendo 38 isolados de Salmonella
enterica subsp. diarizonae e 08 isolados de Salmonella enterica subsp. arizonae
para os genes de virulência phopPQ, invEA, mgtC, hilA, sefA e orgA . Todas as
amostras (100%) se mostraram positivas para os genes phopPQ, invEA, orgA,
30,4%(14) positivas para hilA (12 Salmonella enterica subsp. diariazonae e 02
Salmonella enterica subsp. arizonae), das 32 amostras negativas,
28 eram de
Salmonella enterica subsp. diarizonae e 06 Salmonella enterica subsp. arizonae,
82,6% (38) positivas para o gene mgtC, sendo 06 isolados negativos de Salmonella
enterica subsp. diarizonae e todas negativas para o gene sefA. Um isolado de
Salmonella ser. Typhimurium foi testado para os mesmos genes sendo positivo para
todos, incluindo o gene sefA (Figuras 20, 21 e 22).
Figura 20 – Eletroforese do produto da PCR em gel de agarose 1,5%. Amostras
positivas nos poços 1-10 para o genes phopPQ com 299pb, invEA com 500pb e
mgtC com 655pb. LSA/HVET/UENF.
111
Figura 21 – Eletroforese do produto da PCR em gel de agarose 1,5%. Poço 1:
Amostra Salmonella ser. Typhimurium positiva para o gene sefA 312 pb.; Poços 2 –
4: Amostras Salmonella ser. Typhimurium e de Salmonella enterica subsp.
diarizonae positivas para o gene hilA 500 pb. LSA/HVET/UENF.
Figura 22 – Eletroforese do produto da PCR em gel de agarose 1,5%. Amostras de
Salmonella enterica subsp. diarizonae positivas poços 1-3 para o gene orgA.
LSA/HVET/UENF. C+ controle positivo e C- controle negativo.
112
Os genes de virulência associados ao perfil de resistência a antibióticos em
alguns sorovares de Salmonella spp. em serpentes brasileiras, sugerem que estes
isolados podem gerar infecções clínicas, demonstrando seu potencial zoonótico e o
papel das serpentes como reservatório para a salmonelose humana.
5.4. ELETROFORESE EM GEL DE CAMPO PULSADO – PFGE
Foram genotipados 28 isolados de Salmonella spp., sendo 20 isolados de S.
enterica subsp. diarizonae e 08 isolados de Salmonella enterica subsp.arizonae,
utilizando a enzima de restrição XbaI (Figura 23)
Figura 23 – Perfil de eletroforese do produto da PFGE em gel de agarose 1,0%,
amostras de Salmonella enterica subsp. diarizonae, poços 1-4 e 5-7, com o padrão
de Salmonella ser. Braenderup H9812. LRNEB/IOC/FIOCRUZ.
113
Figura 24 – Dendograma gerado no programa Bionumerics com o perfil de PFGE de
Salmonella
enterica
subsp.
diarizonae
encontrados
nas
serpentes.
LRNEB/IOC/FIOCRUZ.
Analisando o dendograma (Figura 24), pode-se verificar a presença de 10
grupos de Salmonella enterica subsp. diarizonae (A-J) distintos de 20 amostras
analisadas, todas com menos 80% de similaridade, foi observado que o isolado 11.2
não apresenta a mesma similaridade dos isolados 11.1 e 11.4 ambos do mesmo
animal e da mesma localidade. Os isolados F6 são idênticos (1.1, 2.3b, 4.1) e F7
(1.2) possuem similaridade de mais de 95%, ambas da mesma localidade. Grupos
H8 (41.1, 41,2 e 43.4) e H9 (11.2) possuem similaridade de mais de 85% e ambos
os grupos têm diferentes localidades, sendo H8 no Pará e H9 na Fundação Riozoo.
Na Fundação Zoobotãnica de Belo Horizonte foi observada a presença de dois
grupos de S. diarizonae (C e F). Na Fundação Riozoo foi descrito três grupos (A, H e
I). O criatório comercial no Pará apresentou o maior número de grupos de
Salmonella enterica subsp. diarizonae com 06 (A,B,D,E,G e H), já os animais de vida
livre apresentaram-se em um grupo (J) com um padrão de restrição diferente, não
observado em qualquer um dos outros isolados, com similaridade abaixo de 55%
das demais localidades, totalmente diferenciada dos outros. Com os genes avaliados
não foi possível realizar uma correlação entre os diferentes clones de Salmonella
enterica subsp. diarizonae.
114
Figura 25 – Dendograma gerado no programa Bionumerics com o perfil de PFGE de
Salmonella
enterica
subsp.
arizonae
encontrados
nas
serpentes.
LRNEB/IOC/FIOCRUZ.
Analisando a figura 25, foi observado que ao testar 08 isolados Salmonella
enterica subsp. arizonae foram obtido 05 grupos diferentes, onde o isolado da
Fundação Riozoo (A.1 -19.2) apresentou 67% de similaridade com um dos grupos
encontrados no criatório comercial (B2 – 45.1). Apenas no grupo C, os isolados
apresentaram perfil de similaridade de 95% (C3 e C4). Dois isolados do criatório
comercial apresentaram perfil com baixa similaridade (abaixo de 65%) com os
isolados da mesma área geográfica. No criatório foram observados 04 grupos
distintos de S. enterica subsp. arizonae após a análise de PFGE, com auxílio da
enzima de restrição Xba1. Com os genes avaliados não foi possível realizar uma
correlação entre os diferentes clones de Salmonella enterica subsp. arizonae.
115
6. DISCUSSÃO
A pesquisa com bactérias oriundas dos répteis vem crescendo muito no
mundo inteiro e ganhando importância no cenário de saúde pública. Normalmente
são pesquisados os animais de estimação não convencionais ou exóticos, como
iguanas, lagartos, tartarugas e serpentes (RAMSAY et al., 2002, PASMANS et al.,
2005), mas normalmente não em animais ameaçados de extinção ou animais de
vida livre, devido a dificuldade de se trabalhar com animais na natureza (PACHÓN et
al., 2011). Segundo Allgayer et al. (2009) informações sobre a ocorrência e
distribuição de Salmonella spp. em animais selvagens e domésticos são
fundamentais para detectar os possíveis reservatórios que possam ser responsáveis
pela manutenção e disseminação deste agente. A presente pesquisa faz um paralelo
entre a prevalência de Salmonella spp. de animais capturados em vida livre e
animais criados em cativeiro.
Pachón et al. (2011) ao estudar crocodilos e quelônios em ambiente aquático
na Colômbia detectaram 33% de prevalência de Salmonella spp. Este perfil pode ser
alterado dependendo da espécie estudada e do ambiente de criação dos animais.
Vários outros estudos determinam uma prevalência maior ou menor ao estudo de
Pachón et al. (2011). A prevalência global encontrada neste estudo foi determinada
em 47,7%, estando de acordo com estudos anteriores de prevalência de Salmonella
spp. em répteis de cativeiro, embora estas tenham revelado uma grande variação de
resultados pelo mundo: 31% em Trinidad (ADESIYUN et al., 1998), 46% na
Alemanha e Áustria (GEUE e LOSCHNER, 2002), 24% na Itália (EBANI et al.,
2005), 74% no Japão (NAKADAI et al., 2005), 30% na Coreia (JANG et al., 2008),
31% em Taiwan (CHEN et al., 2010),
11% na Nova Zelândia (KIKILLUS et al.,
2011). Maciel et al. (2010) ao estudar a prevalência de Salmonella em teiús
(Tupinambis merianae) nascidos no cativeiro em duas coletas observou na primeira
coleta 87% de Salmonella spp., já na segunda coleta foi detectado a presença desta
bactéria nos animais negativos a primeira, os autores observaram uma prevalência
de 100%.
Os animais do estudo só foram amostrados uma única vez, e a
prevalência pode ser maior devido à eliminação intermitente de Salmonella
(BURNHAM et al., 1998).
No presente estudo, detectamos uma prevalência global de 47,7% dos locais
amostrados e uma prevalência por localidade de 17,1% em vida livre, 28,6% na
116
Fundação Rio-zoo, 61% no criatório comercial e 85% na FZB-BH. O maior estudo
sobre Salmonella em répteis na Austrália com 294 répteis de vida-live e 210 de
cativeiro detectou uma prevalência de 14% para animais de vida livre contra 47%
observado no cativeiro, normalmente essa frequência é a detectada quando se
compara estudos de vida-live e no cativeiro (SCHEELINGS et al., 2011).
O estudo de Scheelings et al. (2011) sugeriram que algumas espécies de
répteis selvagens na Austrália não são portadores naturais de Salmonella spp. e que
a dieta no cativeiro podem influenciar a excreção de Salmonella em algumas
espécies de répteis. No presente estudo apenas coletou-se amostras de serpentes
da família Boidae. Contudo, o grupo de serpentes de criatório comercial se destacou
dos demais por motivos semelhantes, ou seja, a dieta destes animais poderia
influenciar na microbiota a partir das presas oferecidas, pois no ato da constrição
para se alimentar, estas presas defecam e o contato direto dessas fezes ocorrerá.
Foi observado que os resultados do grupo de animais de criatório diferiram quando
comparado os sorovares encontrados (Figura 18).
A possibilidade de algumas espécies animais não serem portadoras de
Salmonella spp. pode ser baseada no estudo de Richards et al. (2004) que ao
estudarem 75 répteis, entre eles oito serpentes de dois gêneros diferentes, não
detectaram esta bactéria em nenhum dos animais testados. Readel et al. (2008), que
pesquisaram Salmonella spp. em 100 quelônios Trachemys scripta elegans,
também não isolaram nenhuma amostra, o que contrasta com a maioria das
pesquisas que observam uma alta prevalência deste micro-organismo em répteis
cativos.
A prevalência significativamente maior de Salmonella spp. em répteis de
cativeiro pode ser explicada por duas hipóteses. Primeiro, répteis selvagens são
portadores naturais de Salmonella spp., mas não eliminam ativamente o microorganismo, a menos que sejam transferidos para um ambiente estressante (o
cativeiro) ou colocados sob pressão severa no seu habitat natural (concorrência
intensa). A segunda hipótese é que os répteis de vida livre não são portadores
naturais de Salmonella spp. mas adquirem o micro-organismo e começam a eliminálo quando entram em contato com o homem e/ou espécies domésticas
(SCHEELINGS et al., 2011).
Prapasarakul et al. (2012), na Tailândia, ao investigarem a presença de
Salmonella spp. em diferentes alvos, entre eles: fezes de serpentes cativas e de vida
117
livre, a alimentação das serpentes, composta por roedores e rãs, e criadores dos
animais cativos, observaram uma prevalência de 100% para animais de vida livre e
cativos, 50% para roedores e 91,7% em rãs e 37,5% nos criadores. O estudo sugere
que Salmonella spp. pode agir como residente no trato intestinal de serpentes com
alto risco de contaminação para o ambiente através da eliminação fecal, a mesma
possibilidade foi sugerida no presente estudo.
Segundo Hydeskov et al. (2012), a maioria das pessoas nos países do norte da
Europa, raramente são expostas a répteis. Contudo, muitos zoológicos têm
departamentos de educação ambiental, onde as crianças podem ter contato direto
com esse grupo de animais clinicamente saudáveis, podendo, no entanto, eliminar
Salmonella e, portanto, agir como uma ameaça zoonótica em potencial. Em seu
estudo, os autores detectaram uma prevalência de 35% dos 200 répteis testados e
as serpentes apresentaram maior prevalência de Salmonella spp. 62%, 33/53,
seguido de quelônios 36%, 24/66 e lagartos 15%, 12/81. Os mesmos autores
sugerem como justificativa o manuseio frequente, estresse e impacto negativo sobre
o sistema imune desses animais. No presente estudo, as amostras isoladas nos dois
zoológicos a prevalência foi discrepante, com 28,6% na Fundação Riozoo e 85% na
FZB-BH. Nestes dois locais os animais estão sob o manejo dos tratadores e na
maioria dos casos estes são os elos e o contato direto com a possível capacidade de
transmissão dos agentes microbianos, podendo os tratadores contrair a infecção
(FOSTER e KERR, 2005). Atribui-se a esta diferença de valores (mais elevada em
Belo Horizonte) o fato de 5 animais (de um total de 20 investigados) estarem
debilitados por um episódio de paramyxovírus, deixando os animais
mais
susceptíveis a intercorrências, entre elas a Salmonella spp. albergada no trato
intestinal.
Importante observar que estes cinco animais imunossuprimidos
eliminaram bactérias com perfil de resistência diferenciado (mais resistentes que os
demais), provavelmente devido ao tipo de tratamento de suporte utilizado a base de
antimicrobianos.
A salmonelose em serpentes demonstra um quadro de regurgitação, diarréia,
estomatite, entre outros (ONDERKA e FINLAYSON, 1985, CAMBRE e MCGUILL,
2000). Os sorovares Salmonella enterica subsp. arizonae e Salmonella enterica
subsp. diarizonae são frequentemente isolados em serpentes e identificadas como
as principais espécies envolvidas causando doenças em répteis (LAMBERSKI et al.,
2002, RAMSAY et al., 2002). Outros sorovares que são comumente implicados em
118
salmonelose cuja fonte de infecção são os répteis incluem Salmonella ser. Ajiobo,
Salmonella ser. Anatum, Salmonella ser. Carrau, Salmonella ser. Chameleon,
Salmonella ser. Durham, Salmonella ser. Infantis, Salmonella ser. Krefeld,
Salmonella ser. Montevideu, Salmonella ser. Muenchen, Salmonella ser. Oslo,
Salmonella ser. Pomona, Salmonella ser. Thompson, Salmonella ser. Typhimurium,
Salmonella ser. Saintpaul, e Salmonella enterica subsp. salamae e Salmonella
enterica subsp. houtenae (JOHNSON- DELANY, 2006). Alguns destes sorovares
foram detectados no presente estudo (Tabela 9, Figura 18) e demonstram a
importância de se estudar Salmonella spp. em répteis em geral no Brasil. Contudo,
os animais investigados no presente estudo não apresentaram sinais clínicos de
salmonelose, inclusive aqueles com diagnóstico positivos para Paramyxovírus. No
estudo de Scheelings et al. (2011) Salmonella enterica subsp. diarizonae foi a de
maior frequência, o que se assemelha a este estudo, onde 39,6% pertenciam a este
sorovar, tanto no cativeiro como na vida livre.
A salmonelose associada aos répteis tem sido descrita em países europeus,
Estados Unidos e Austrália, onde sorovares mais prevalentes são Salmonella ser.
Enteritidis, Salmonella ser. Typhimurium, Salmonella ser. Urbana, e Salmonella ser.
Rubislaw e Salmonella enterica subsp. arizonae, Salmonella enterica subsp.
diarizonae, e Salmonella enterica subsp. houtenae são frequentemente obtidas de
pacientes com diarréia aquosa e extra-gastrointestinal, tais como a infecção
linfadenite, pleurite, artrite, meningite e cistite, particularmente em gestantes,
neonatos e indivíduos imunocomprometidos (MAHAJAN et al., 2003, MOFFATT et
al., 2010, KOCIANOVÁ et al., 2011). Salmonella enterica subsp. diarizonae vem
sendo encontrada nas amígdalas de ovinos gerando prejuízos financeiros por
contaminação e eliminação das carcaças, além de oferecer riscos para o consumo
humano deste tipo de carne (BONKE et al., 2012).
Muitos dos sorovares descritos como patogênicos foram detectados nesta
pesquisa (Tabela 9, Figura 20). A transmissão de Salmonella spp. dos répteis de
estimação para os seres humanos poderia ocorrer a partir de um contato direto e
higiene inadequada do proprietário após o contato com o animal (HASSL e BENYR,
2003, SIMON-VIVAN et al., 2012)
Younus et al. (2010) ao realizarem um estudo com crianças com menos de 10
anos de idade, em Michigan, concluíram que as crianças com infecções por
Salmonella haviam relatado o contato com répteis de forma mais frequente. Os
119
mesmos autores, ainda sugerem esforços adicionais para conscientizar cuidadores
de crianças sobre o risco da transmissão de Salmonella spp. através do contato com
esses animais. Após uma pesquisa com mais de 250 indivíduos, o CDC (2007)
informou, que aproximadamente 20% dos entrevistados estavam cientes dos casos
de Salmonella spp. humana relacionadas aos répteis. No Brasil, este tipo de
pesquisa ainda não foi descrita, mas há a necessidade de tal informação, pois os
animais coletados no criatório comercial foram posteriormente comercializados
dentro do país.
Na Tailândia e em outros locais do mundo, a carne de répteis já foi incorporada
como alimentação e estas práticas podem representar um risco de infecção com
caráter zoonótico, apesar de Prapasarakul et al. (2012) identificarem Salmonella em
todos os animais pesquisados, até o momento não havia nenhum relato de
salmonelose humana associada ao contato com os répteis na Tailândia. No entanto,
os mesmos autores fornecem evidências da problemática e destacam a necessidade
de uma boa higiene ao manusear estes animais no cativeiro. A problemática pode
ser associada ao nosso país, pois em cidades do interior brasileiro é um hábito
alimentar-se de carnes de caça e estas incluem alguns tipos de répteis (ALVES et
al., 2012). No Brasil ainda não há relatos de salmonelose associadas aos répteis, em
contrapartida observamos alguns trabalhos que identificam sorovares de Salmonella
capazes de causar doenças clínicas nos animais e nos seres humanos (DE SÁ e
SOLARI, 2001, ARGÔLO FILHO, 2007, LOPES, 2008).
A importância do estudo e do manejo adequado dos répteis em cativeiro
justifica-se devido à estimativa do CDC, que a bactéria do gênero Salmonella causou
1,4 milhões de episódios de infecção entre 1999 e 2003, com mais de 7% destas
infecções causadas pelo contato de répteis com seres humanos e cada vez mais
estes animais ganham espaço como animais de estimação. Observa-se um aumento
da incidência de salmonelose associada à criação dos répteis, isto em países que
conseguem investigar e associar os casos. No Brasil esta vigilância epidemiológica
funciona muito bem para surtos alimentares (CDC, 1999, SCHRÖTER et al., 2004,
WELLS et al., 2004) , mas não existem dados sobre a salmonelose causada pelo
contato com répteis.
Weiss et al. (2011) demonstraram que os répteis são uma fonte potencial de
infecções para crianças na Europa e suas recomendações estão em conformidade
com as do CDC (CDC 2007), de que crianças devem evitar qualquer contato direto
120
ou indireto com os répteis e todos os membros da casa devem praticar a higiene
das mãos após qualquer contato com o animal. Meervenne et al. (2009) relatam um
caso de um bebe de 2 meses de idade com septicemia e meningite associada à
salmonelose por contato com répteis, Salmonella ser. Abony foi identificada como a
responsável, mesmo esse sorotipo sendo raro na Bélgica e após investigação
epidemiológica e verificação pela técnica de PFGE, detectaram o mesmo sorotipo
nas fezes da tartaruga de estimação. Este sorotipo apresentou sensibilidade a todas
as 13 drogas testadas. O mesmo é relatado por Cooke et al. (2009) que
identificaram o primeiro caso de infecção humana com Salmonella ser. Apapa
resultante da exposição a um lagarto de estimação, ambos os isolados
apresentaram o mesmo perfil genético.
No estudo de Lopes (2008) verificou-se um perfil de resistência alto à
neomicina, demonstrando uma ineficácia deste antimicrobiano para as salmonelas
isoladas de répteis em São Paulo/Brasil; no presente estudo verificaram-se vários
isolados com perfil intermediário a neomicina e um isolado com perfil de resistência,
proveniente do criatório comercial no Pará. Enrofloxacina, um antimicrobiano
relativamente novo e restrito a Medicina Veterinária, também apresentou resistência
segundo o mesmo autor e isso se deve à ampla utilização desta para todo e
qualquer problema de origem bacteriana (infecções) em animais, fato considerado
preocupante
pelo
autor.
Ebani
et
al.
(2005)
descreveu
resistência
aos
antimicrobianos enrofloxacina, eritromicina, amoxicilina e gentamicina ao estudarem
sorovares de Salmonella detectados em 305 amostras fecais de répteis. No atual
estudo foi detectada a presença de resistência para os antimicrobianos
enrofloxacina, gentamicina, ampicilina e neomicina (Tabela 9).
Alguns estudos investigaram a eficácia do uso de antimicrobianos para o
tratamento de Salmonella spp. nos répteis, por vezes combinados com o manejo
físico, na redução desta bactéria e experimentos laboratoriais iniciais mostraram-se
promissores (SIEBELING et al., 1984). No entanto, em ambientes controlados, o
tratamento de rotina de répteis utilizando drogas foi considerado um fator
complicante pelas condições de criação, eliminação intermitente de Salmonella,
infecções transovarianas, coprofagia e reservatórios naturais de água, e estes
tratamentos foram associados a um risco de resistência aos antibióticos (MITCHELL,
et al., 2007, HOELZER et al., 2011).
121
Em 2008, um surto de Salmonella ser. Typhimurium, com resistência à
tetraciclina (estirpe DT191) foi identificado na Inglaterra e no País de Gales, sendo
realizada uma pesquisa caso a caso, o que revelou a associação deste sorotipo com
os ratos oferecidos como alimentação aos répteis, com esta estirpe encontrada em
três grupos de ratos vinda de um fornecedor único nos EUA. As importações desse
fornecedor foram interrompidas e uma regulamentação mais rígida foi gerada a partir
deste surto (HARKER et al., 2011). Normalmente a alta resistência bacteriana é
observada em amostras de frango e amostras humanas (FASHAE et al., 2010). No
presente estudo, o maior perfil de resistência encontrado foi nos isolados da FZBBH, onde os animais recebiam tratamento com antimicrobianos para uma
enfermidade de caráter crônico.
Os isolados de Salmonella spp. que apresentaram perfil de resistência às
drogas são dos
sorovares Salmonella enterica subsp. diarizonae e Salmonella
enterica subsp. enterica (rugosa); o perfil intermediário, principalmente frente a
neomicina, foram detectados em vários sorovares, entre eles: Salmonella enterica
subsp. diarizonae, Salmonella enterica subsp. arizonae, Salmonella enterica subsp.
houtenae, Salmonella ser. Newport, Salmonella ser. Rubislaw e Salmonella ser.
Montevideo (tabela 9). A resistência pode ocorrer não só no mesmo sorovar, mas
também entre diferentes sorovares e subespécies de Salmonella (POPPE et al.,
2006).
Sabe-se também que o perfil de sensibilidade da Salmonella spp. pode ser
largamente condicionado pelas fontes das estirpes, como a exposição frequente do
micro-organismo aos medicamentos, a utilização de drogas quimioterapêuticas
utilizadas na medicina humana e veterinária, além de conjuntos diferentes de
medicamentos aprovados para uso em países específicos (PASMANS et a.l, 2005,
VIGO et al., 2011). De acordo com Nowakiewicz et al. (2012) que ao pesquisarem
tartarugas na Rússia
encontraram sensibilidade das bactérias às drogas
norfloxacina, sulfa com trimetoprim, florfenicol, gentamicina, tetraciclina e ampicilina.
Com relação à resistência, foi observada apenas frente à amoxicilina com ácido
clavulânico (12/56 cepas), geralmente acompanhada de sensibilidade intermediária
à colistina (58%), enrofloxacina (17%) e cefalexina (5%) (NOWAKIEWICZ et al.,
2012). Em semelhança ao atual estudo, verificou-se que frente as drogas
ciprofloxacina, florfenicol, sulfazotrim, amocixilina + ác. clavulânico, cefoxitina,
tobramicina, aztreonam, imipenem e meropenem houve 100% de sensibilidade.
122
A utilização indiscriminada de drogas antimicrobianas não somente para
tratamento de doenças na medicina humana e veterinária, mas também para
melhorar os índices zootécnicos de animais de produção tem contribuído para o
surgimento de bactérias multirresistentes (HUR et al., 2012). Apesar da informação,
serpentes de vida livre encontradas próximas a regiões de pastagens, não
apresentaram tal perfil de resistência. Já Bonke et al. (2012) descreveram alto perfil
de sensibilidade ou isolados pan sensíveis para a maioria das salmonelas aos
agentes antimicrobianos mais utilizados para terapia em ovinos e caprinos.
No atual estudo verificou-se um perfil de resistência baixo comparado a outros
estudos com Salmonella spp. (MIJOVIC et al., 2012). De acordo com Hur et al.
(2012), a análise do perfil de sensibilidade a antimicrobianos é uma ferramenta de
importância para análise e monitoramento epidemiológico de linhagens de
Salmonella spp. que nos últimos 30 anos tem emergido com fenótipos
multirresistentes causando graves implicações em Saúde Pública.
Nos ambientes estudados, animais do criatório comercial e os de vida livre
podem manter contato com aves migratórias, que percorrem grandes distâncias e
habitam uma variedade de ambientes. Provavelmente, adquirem bactérias
resistentes a antimicrobianos em ambientes sob influência humana ou de outras
aves que estiveram em contato com esses ambientes, podendo disseminá-las por
contato direto ou até pela eliminação através das fezes. Aves migratórias podem ser
consideradas importantes reservatórios e vetores de disseminação de bactérias
resistentes para o ecossistema (NUNES e TOMAS, 2008, ALLEN et al., 2010). Outra
possibilidade para o surgimento de isolados da bactéria com perfil de resistência
diferenciado daquele observado na maioria, poderia advir de áreas com influência de
resíduos de antimicrobianos no ambiente frequentado pelas serpentes, pois já foi
demonstrado que a transferência de genes de resitência entre micro-organismos
pode ocorrer no solo contaminado com resíduos de antibióticos veterinários
utilizados no tratamento de animais de produção (HEUER et al., 2010), e com
possibilidade de contaminação da água (PEI et al., 2006). Já nos zoológicos que
mantém os animais em ambientes fechados (terrários), o contato que pode gerar
resistência seria através do uso indiscriminado de antibióticos ou pelo contato
humano, principalmente via tratadores e outros profissionais (HUR et al., 2012).
No atual estudo foram verificados 100% de sensibilidade nos isolados de
serpentes frente às drogas ciprofloxacina, florfenicol, cefoxitina, amocixilina + ác
123
clavulânico, sufazotrim, tobramicina, aztreonam, imipenem e meropenem. Sorovares
de Salmonella resistentes a carbapenemicos são pouco descritos, apesar de
Miriagou, et al. (2003) reportarem um isolado de Salmonella ser. Cubana exibindo
resistência à maioria dos beta-lactâmicos, incluindo cefalosporinas e imipenem, o
qual foi isolado das fezes de um garoto de 4 anos de idade com gasotroenterite, em
Maryland, EUA. Já para aztreonam Cortez et al. (2006) relataram resistência de
86,21% ao estudar Salmonella spp. em abatedouros de frango no estado de São
Paulo. Os mesmos autores ainda destacam outros antibióticos que apresentaram
resistência como cefoxitina – 51,72%, amoxicilina + ác. Clavulânico – 55,17%,
sulfazotrim – 51,17% e tobramicina – 31,03%, concluindo que esses resultados
servem de alerta, pois o uso indiscriminado de antibióticos no tratamento de
infecções e a adição em rações animais como promotores de crescimento têm
contribuído para a emergência de resistência entre cepas de Salmonella spp. e
outras bactérias e estas podem estar presentes nos alimentos de origem animal e
causar graves infecções em seres humanos.
Zou et al. (2009) descrevem que a maioria do isolados (n = 409 - 96,2%) de
Salmonella spp. foram sensíveis a todos os 12 antimicrobianos testados. Apenas
alguns poucos isolados exibiram resistência aos agentes antimicrobianos como
ampicilina, estreptomicina e cefalotina. No presente estudo verificou-se um perfil de
resistência para ampicilina e sensibilidade intermediária à amicacina, estreptomicina,
tetraciclina e cefalotina.
A maioria dos genes pesquisados neste estudo estão localizados em SPI-1 e
SPI-3 (Figuras 20, 21 e 22), sendo responsáveis por codificar proteínas envolvidas
na translocação membranar de Salmonella spp. nas células hospedeiras,
sobrevivência intracelular e replicação (COURTNEY et al., 2006, LITRUP et al.,
2010,
ZOU et al., 2011). Nos estudos verificados até o presente momento, a
detecção da presença dos fatores de virulência é realizada para Salmonella ser.
Enteritidis, Salmonella ser. Typhimurium e outras entericas, que estão associadas a
maior parte dos surtos ocorridos no mundo, sendo observado poucos trabalhos na
literatura com descrição molecular que envolva Salmonella enterica subsp. arizonae
e Salmonella enterica subsp. diarizonae (PASMANS et al., 2005, SMITH et al.,
2010). Libby et al. (2002) descreveu o gene spv e a característica ancestral de
Salmonella enterica subsp.
arizonae e concluindo que
a sequência spv
cromossômica corresponde ao locus ancestral adquirido durante a evolução da S.
124
enterica, com a aquisição de um plasmídeo de genes spv nas cepas da subespécie
I. Katribe et al. (2009) compararam a colonização intestinal das subspécies IIIa e IIIb
com Salmonella ser. Typhimurium, com modelo in vivo de camundongos e
concluiram que a subspécie IIIa foi incapaz de colonizar o trato intestinal de
camundongos e se espalhar sistemicamente com eficiência, colonizando o fígado e
o baço em quantidades muito inferiores as S. entéricas do grupo I, já a subspécie IIIb
foi capaz de colonizar o trato intestinal, igualmente as Salmonella entericas do grupo
I, no entanto, a infecção sistêmica apresentou-se tão fraca quanto a subspécie IIIa. .
Pasmans et al. (2005) ao estudarem Salmonella spp. em lagartos na Bélgica,
através de técnicas moleculares, como a detecção de genes de virulência e
compará-las com isolados humanos, detectaram uma diferença nas duas linhagens,
onde a presença dos genes foi diferenciada para sorovares de S. ser. Enteritidis
humanos e Salmonella entéricas (grupo I) isoladas dos répteis. Em nosso estudo
foram estudadas as salmonelas dos grupos IIIa e IIIb, sendo detectado um padrão
de positividade de 100% para os genes phopPQ, invEA, orgA, todos envolvidos com
a formação do TTSS, os produtos destes genes são conhecidos por serem
essenciais durante o processo de
invasão das células epiteliais do hospedeiro
(MARCUS et al., 2000, OLIVEIRA et al., 2003).
A constatação da presença do gene invA relacionado ao processo de
invasão, em 100% dos nossos resultados, estão de acordo com as pesquisas
descritas na literatura (SALEHI et al., 2005, NASHWA et al., 2009, AMINI et al.,
2010, BORGES, 2011), No entanto, outros estudos não demonstraram 100% de
frequência deste gene em amostras de Salmonella ser. Enteritidis analisadas
(BACCI et al., 2006, OKAMOTO et al., 2009). Devido à frequência de 100% descrita
de detecção do gene invA, considera-se que este é conservado entre as espécies e
os sorovares, enfatizando-se sua utilização para a detecção molecular de
Salmonella spp. (MALORNY et al., 2003, SMITH et al., 2010, BORGES, 2011,
SHANMUGASAMY et al., 2011). Como bactérias do gênero Salmonella são
frequentemente isoladas na região oro-fecal, esperava-se que todas as amostras
analisadas apresentassem o gene invA, o qual é necessário para o processo de
invasão das células epiteliais (NASHWA et al., 2009). Várias proteínas efectoras
codificadas na SPI-1 são conhecidas por serem essenciais durante as diferentes
fases de infecção por Salmonella (SMITH et al., 2010). Ambos os genes de
virulência com 100% de prevalência pertencem a SPI-1. De acordo com Amini et al.
125
(2010) e Borges, (2011) a ausência do gene invA em isolados de Salmonella spp. de
diferentes sorovares poderia levar a uma redução na capacidade patogênica da
amostra, pois este gene é essencial para a virulência completa da bactéria, já que
desencadeia a invasão dos tecidos.
O sistema phoPQ é responsável por transcrever vários genes. As
propriedades de virulência reguladas por esse sistema incluem a capacidade de
sobreviver dentro de macrófagos, suportar pH ácido, invadir células epiteliais, formar
vacúolos e alterar a apresentação de antígenos (ZWIR, et al., 2005, KATO e
GROISMAN, 2008). A importância na demostração deste gene em 100% dos
isolados dos gupos IIIa e IIIb, pode ser sugerido como mais um dos fatores para a
capacidade patogênica destas subspécies. A presença do gene org em 100% das
amostras pesquisadas vem sendo descrita em Salmonella ser. Typhimurium na
regulação do oxigênio e no auxílio à promoção ao processo de invasão celular por
esta bactéria (MCCLELLAND, et al., 2001, RUSSELL et al., 2004).
A detecção de 38 isolados positivos para o gene mgtC, nos remete a sua
capacidade de sobrevivência intracelular, sendo decrito em
Salmonella ser.
Typhimurium, onde é necessário para a multiplicação intracelular e para o
desenvolvimento a longo prazo de infecções sistêmicas (BLANC-POTARD e
GROISMAN, 1997, LAWLEY et al, 2006). O operon mgtCB é regulado pelo sistema
PhoPQ, que é altamente induzido pela baixa concentração de Mg2+ (ALIX e
BLANNC-POTARD, 2008), demonstrando uma inter relação entre os genes
detectados. No entanto, Katribe et al. (2009), sugeriram que tanto a subsp. IIIa e
subsp. IIIb, não se espalharam para além do intestino e não colonizaram órgãos
sistêmicos em modelos murinos, sendo estes dois sorovares incapazes de se
replicar nos macrófagos. Em nosso estudo realizamos a detectação dos genes e não
a expressão dos mesmos.
O estudo de Katribe et al. (2009) vai contrário ao descrito na literatura, pois
segundo Hall e Rowe (1992) e Schroter et al. (2004) decrevem as subespécies Illa e
Illb colonizando o intestino humano e podendo ser isoladas mediante cultura fecal de
indivíduos infectados. Além disso, as infecções subespécies IIIa e IIIb são invasivas
em crianças e indivíduos imunocomprometidos, resultando em doença sistêmica
grave, incluindo sepse e meningite (COOMBES et al., 2004). Apesar do fato de que
as subespécies IIIa e IIIb podem colonizar o trato intestinal de vertebrados de
sangue quente e causar doenças nesses hospedeiros, as razões pelas quais estas
126
subespécies não circulam amplamente em populações de vertebrados de sangue
quente são desconhecidas.
A expressão dos genes relacionados à invasão da célula hospedeira depende
do regulador central de hilA, codificado pelo gene hilA (hiperinvasive) da SPI-1, que
foi observado em 14 isolados de Salmonella enterica subsp. diarizonae e Salmonella
enterica subsp. arizonae, resultado que não está de acordo com outros trabalhos,
que descrevem
100% de positividade para este gene em S. ser. Enteritidis
(TRAFNY et al., 2006, CRACIUNAS et al., 2010, CHUBIZ, et al., 2010, BORGES,
2011).
Segundo Craciunas et al. (2010) e Borges (2011) o gene hil é normalmente
encontrado em todos os sorovares de Salmonella, não sendo detectado em outras
bactérias. Por isto, da mesma forma que o invA, é considerado gene alvo para a
detecção de Salmonella spp, o que não podemos visualizar ao estudar as
subspécies IIIa e IIIb. Este gene é descrito como de importância para a regulação,
expressão de proteínas secretadas e maquinaria no processo de formação do TTSS,
envolvido na invasão dos enterócitos (LOSTROH et al., 2000, MIROLD et al., 2001,
CARDONA-CASTRO et al., 2002). A invasão celular e a indução da apoptose nos
macrófagos é considerada dependente desta proteína (TROXELL, et al., 2011).
Este gene tem a capacidade de ativar e regular todos os componentes
necessários para o TTSS funcional em Salmonella ser. Tyhpimurium, na SPI-1. Do
mesmo modo, a eliminação de hilA é fenotipicamente equivalente a suprimir
totalmente SPI1 (ALTIER, 2005, ELLERMEIER et al., 2005, CHUBIZ, et al., 2010).
As 14 amostras positivas para hilA, na verdade foram positivas para todos os outros
genes, com exceção do gene sefA. Foi observado no presente estudo a presença de
genes relacionados ao potencial de patogenicidade dos isolados de Salmonella
subsp. IIIa e IIIb. A indução da transcrição dos genes, a expressão da capacidade de
invasão e a expressão da TTSS através da SPI-1 dos isolados de Salmonella são
regulados pelas condições ambientais (FAHLEN et al., 2000, ALTIER, 2005). De
acordo com Durant et al. (2000) ao estudarem Salmonella ser. Enteritidis utilizaram a
expressão do gene hilA para avaliar os efeitos da variação de pH, do lactato e das
fontes de carboidrato e aminoácidos na expressão dos genes de virulência. Estes
observaram que, conforme as condições do meio havia uma maior ou menor
expressão deste gene, indicando que em condições favoráveis de crescimento, a
bactéria diminui sua virulência pela menor expressão de seus genes.
127
A SPI-1 possui genes que codificam proteínas para o TTSS (VIEIRA, 2009),
tendo sua principal função de conferir uma maior capacidade de invasão da célula
hospedeira pela bactéria (BARROW et al., 2010). Todos os genes detectados no
presente estudo caracterizam os isolados das subespécies IIIa e IIIb e um isolado de
Salmonella ser. Typhimurium, a capacidade de montar o TTSS e demostram ainda
uma semelhança gênica quando comparamos as duas subspécies ao isolado de
Salmonella ser. Typhimurium, levando em consideração SPI-1. Esta ilha de
patogenicidade é a principal na capacidade de penetração celular e na supressão de
citocinas pelos macrófagos (PAVLOVA et al., 2011).
Outros autores relatam a
ocorrência de deleções de genes em SPI-1, apenas em um isolado ambiental de
alguns sorovares de Salmonella (GINOCCHIO et al. 1997, SÁNCHEZ-JIMÉNEZ et
al., 2010).
O gene sefA vem sendo descrito como restrito ao sorotipo Salmonella ser.
Enteritidis e alguns outros sorovares. Em nosso estudo, todas as amostras de
Salmonella enterica subsp. arizonae e Salmonella enterica subsp. diarizonae foram
negativas para este gene, comprovando o descrito na literatura (PAN et al., 2002,
MIRZAIE et al., 2010). Este gene possui sua importância na distinção de Salmonella
ser. Enterididis de estirpes de Salmonella não Enteritidis e na translocação e
biogênese das fímbrias (PAN e LIV, 2002, MIRZAIE et al., 2010, AMINI et al., 2010,
BORGES, 2011).
O gene sef não foi identificado em alguns sorovares de Salmonella (PAN e
LIU, 2002, CRACIUNAS et al., 2010) e segundo Doran et al. (1996) a fímbria SEF14
foi identificada em apenas cinco dos 42 sorovares analisados: Salmonella ser.
Enteritidis, Salmonella ser. Berta, Salmonella ser. Pullorum, Salmonella ser.
Gallinarum e em outro sorovar do grupo D1, sendo a sequência do gene altamente
conservada entre estes sorovares. O operon sef possui uma distribuição filogenética
limitada, indicando que foi adquirido recentemente, através de duas linhagens
distantes na linha de evolução de Salmonella enterica subespécie enterica
(BÄUMLER et al.,1997). Alguns autores referem-se a SEF14 como essencial para a
adequada interação entre bactéria e os macrófagos das células hospedeiras, após a
penetração e colonização intestinal. SEF14 foi a primeira fímbria descrita que possui
importância na interação com os macrófagos, enquanto que as outras fímbrias
descritas estão envolvidas na ligação com superfícies epiteliais (EDWARDS et al.,
2000).
128
O isolado de Salmonella ser. Typhimurium foi positivo para todos os genes,
incluindo sefA e demonstrou a presença de genes com a capacidade de penetração
e a sobrevivência intracelular descrita anteriormente. O resultado é compatível com
Martins (2010), que detectou 33,33% (03 isolados) de Salmonella ser. Typhimurium
com a presença do gene sefC ao determinar o perfil genético e patogenicidade das
cepas. Agron et al. (2001) encontraram o gene sef em outros sorovares de
Salmonella não ser. Enteritidis, consequentemente, sugerem que este gene não é
específico para a detecção de S. ser. Enteritidis. Clouthier et al. (1994) detectou o
gene sefA em S. ser. Typhi, mas descreve não haver nenhuma evidência da
funcionalidade destas fímbrias como adesina. O isolado de S. ser. Typhimurium foi
encontrado em um animal resgatado na área urbana do município e pode ter sido
colonizado por este sorotipo pelo contato com outros animais ou seres humanos.
Esta bactéria altamente patogênica poderia ser transmitida para pessoas,
especialmente crianças, que se pudessem ter algum tipo de contato com este
animal.
A pesquisa dos fatores de virulência (proteínas efetoras) em isolados de
Salmonella spp. pode ser considerada de alta pertinência, visto que alterações no
repertório destas proteínas significam uma mudança na capacidade de diferentes
sorovares, no processo de adaptação a novos hospedeiros (PRAGER et al., 2000).
As combinações das proteínas efetoras podem variar dentro de um mesmo sorovar,
mesmo que se esperem certas semelhanças (MIROLD et al., 2001, BORGES,
2011). Os genes que obtiveram resultados negativos em nosso estudo podem ser
explicados por inserções ou deleções dentro das regiões das ilhas de
patogenicidade, e este fato pode ser atribuído a diferenças no processo evolutivo da
aquisição e/ou deleção dos genes correspondentes (SÁNCHEZ-JIMÉNEZ, et al.,
2010). Os dados sobre fatores de virulência observados neste trabalho apontam
para a necessidade de mais estudos em diferentes contextos epidemiológicos e
geográficos do país.
No presente estudo não verificamos a presença de surtos, mas sim, como
estão dispostos os clones circulantes de Salmonella enterica subsp. diarizonae e
Salmonella enterica subsp. arizonae na Região Sudeste e Norte do Brasil, devido à
técnica da PFGE possuir um poder discriminatório elevado e eficaz na avaliação da
diversidade genética (MAGALHÃES
KÉROUANTON et al., 2007).
et
al.
2005,
HUNTER
et
al.,
2005,
129
Os resultados obtidos neste estudo, com a presença de 10 clones distintos de
S. diarizonae e 04 clones distintos de Salmonella enterica subsp. arizonae, são
dados superiores aos descritos por
Bemis
et al. (2007) que verificaram uma
diversidade inferior no perfil genômico de Salmonella enterica subsp. diarizonae e
Salmonella enterica subsp. arizonae encontrando 05 grupos e 02 grupos,
respectivamente, ao estudarem cascavéis cativas e selvagens. No estudo de Franco
et al. (2011) com iguanas na ilha de Galapagos, estes relatam um heterogeinicidade
de clones circulantes nos animais em uma região restrita.
Oposto ao presente estudo, Mürmann et al. (2008) ao analisarem amostras de
alimentos envolvidos em dez surtos de toxi-infecção alimentar no Rio Grande do Sul,
identificaram todos os 14 isolados como S. ser. Enteritidis e estes apresentaram um
único padrão do PFGE, utilizando-se a enzima XbaI. Os mesmos autores concluem
que apesar dos surtos não serem relacionados, os resultados obtidos demonstraram
a relação clonal entre esses isolados, contribuindo para elucidar a origem dos casos
de salmonelose reportados. No presente estudo foram verificados dois isolados de
Salmonella enterica subsp. diarizonae da Fundação Riozoo com perfil genético com
mais de 80% de similaridade aos descritos no Pará.
Em um estudo realizado na Malásia, Tailândia e Indonésia, países endêmicos
para Salmonella ser. Typhi, foi possível observar através da PFGE, com enzima de
restrição Xba1, dois perfis genéticos entre os 133 isolados de casos esporádicos,
sugerindo a mobilidade e circulação destes isolados na região em questão (THONG
et al., 2002).
O emprego importante da técnica foi demonstrado no estudo do Centro de
Controle e Prevenção de Doenças (CDC), onde em 1996 e 1997, foi realizada uma
vigilância ativa para febre tifóide nos Estados Unidos. Os isolados foram obtidos de
pessoas que viajaram para 31 países diferentes, encontrando-se através da técnica
de PFGE, diversidade de clones no Sudoeste Asiático e subcontinente Indiano, e
clones idênticos presentes em locais geograficamente distantes. Foi importante o
emprego da genotipagem por PFGE, pois, sugeriu origem geográfica específica e
ajudou a focalizar a investigação epidemiológica sobre alimentos importados e
visitantes oriundos destes países (KUBOTA et al., 2005). No presente estudo,
verificou-se dois isolados de Salmonella enterica subsp. diarizonae circulantes entre
a Região Sudeste e Norte do país nas amostras de serpente pesquisadas.
130
7. CONCLUSÕES
Os sorovares encontrados nos animais de vida livre e cativeiro já foram
citados em outros estudos de Salmonella spp. em répteis e apresentam
características patogênicas e baixa resistência aos 17 antimicrobianos testados;
Os ambientes de cativeiro (Criatório Comercial, FZB-BH e Riozoo)
demonstraram a maior prevalência de bactérias do gênero Salmonella, quando
comparados ao ambiente de vida livre;
Salmonella enterica subsp. arizonae e Salmonella enterica subsp. diarizonae
apresentaram fatores de virulência relacionados à invasão celular, todos descritos na
SPI-1 e sobrevivência intracelular descritos na SPI-3, que sugere o poder de
desencadear o processo infecciosos;.
A técnica de PFGE foi discriminativa para ambas as subespécies de
Salmonella investigadas por região geográfica, descrevendo clones circulantes entre
as regiões estudadas;
Medidas sanitárias devem ser propostas e informadas para a criação de
répteis em cativeiro, para segurança do proprietário e sanidade dos animais.
131
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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176
ANEXOS

Certificado da Comissão de Ética

Certificado de Premiação – Pós-graduação.

Autorização do Sisbio.
177
178
Ministério do Meio Ambiente - MMA
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade - ICMBio
Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade - SISBIO
Autorização para atividades com finalidade científica
Número: 23541-1
Data da Emissão: 07/04/2010 16:28
Dados do titular
SISBIO
Nome: Olney Vieira da Motta
CPF: 433.401.567-00
Título do Projeto: Caracterização da microbiota oral e cloacal de jibóias (Boa constrictor, Linnaeus 1758) com ênfase no diagnóstico sorológico e
molecular em Salmonella spp.
Nome da Instituição : UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CNPJ: 04.809.688/0001-06
Cronograma de atividades
#
Descrição da atividade
Início (mês/ano)
1 Revisão de literatura
03/2010
2 Coleta das amostras
05/2010
3 Identificação das cepas
06/2010
4 Realização da fase molecular
03/2011
5 Análise estatística dos dados
12/2011
6 Redação, Envio para publicação em revista e desfesa da tese
10/2012
De acordo com o art. 33 da IN 154/2009, esta autorização tem prazo de validade equivalente ao previsto no cronograma de atividades do projeto.
Fim (mês/ano)
03/2013
11/2010
07/2011
11/2011
03/2012
03/2013
Observações e ressalvas
1
2
3
4
5
6
7
8
As atividades de campo exercidas por pessoa natural ou jurídica estrangeira, em todo o território nacional, que impliquem o deslocamento de recursos humanos e
materiais, tendo por objeto coletar dados, materiais, espécimes biológicos e minerais, peças integrantes da cultura nativa e cultura popular, presente e passa da,
obtidos por meio de recursos e técnicas que se destinem ao estudo, à difusão ou à pesquisa, estão sujeitas a autorização do Ministério de Ciência e Tecnologia.
Esta autorização não exime o titular e a sua equipe da necessidade de obter as anuências previstas em outros instrumentos legais, bem como do consentimento do
responsável pela área, pública ou privada, onde será realizada a atividade.
Esta autorização não poderá ser utilizada para fins comerciais, industriais, esportivos ou para realização de atividades inerentes ao processo de licenciamento
ambiental de empreendimentos. O material biológico coletado deverá ser utilizado para atividades científicas ou didáticas no âmbito do ensino superior.
A autorização para envio ao exterior de material biológico não consignado deverá ser requerida por meio do endereço eletrônico www.ibama.gov.br (Serviços on-line Licença para importação ou exportação de flora e fauna - CITES e não CITES). Em caso de material consignado, consulte www.icmbio.gov.br/sisbio - menu
Exportação.
O titular de licença ou autorização e os membros da sua equipe deverão optar por métodos de coleta e instrumentos de captura direcionados, sempre que possível,
ao grupo taxonômico de interesse, evitando a morte ou dano significativo a outros grupos; e empregar esforço de coleta ou captura que não comprometa a viabilidade
de populações do grupo taxonômico de interesse em condição in situ.
Este documento não dispensa o cumprimento da legislação que dispõe sobre acesso a componente do patrimônio genético existente no território nacional, na
plataforma continental e na zona econômica exclusiva, ou ao conhecimento tradicional associado ao patrimônio genético, para fins de pesquisa científica,
bioprospecção e desenvolvimento tecnológico.
Em caso de pesquisa em UNIDADE DE CONSERVAÇÃO, o pesquisador titular desta autorização deverá contactar a administração da unidade a fim de CONFIRMAR
AS DATAS das expedições, as condições para realização das coletas e de uso da infra-estrutura da unidade.
As atividades contempladas nesta autorização NÃO abrangem espécies brasileiras constante de listas oficiais (de abrangência nacional, estadual ou municipal) de
espécies ameaçadas de extinção, sobreexplotadas ou ameaçadas de sobreexplotação.
Equipe
#
Nome
1 Luiz Antonio Eckhardt de Pontes
Função
Aluno de doutorado
CPF
023.640.647-75
Doc. Identidade
11229511-8 DETRAN-RJ
Nacionalidade
Brasileira
Locais onde as atividades de campo serão executadas
#
1
2
3
Município
RIO DE JANEIRO
SANTO ANTONIO DO TAUA
BELO HORIZONTE
UF
RJ
PA
MG
Descrição do local
Tipo
Fundação Rio Zoo
Sítio Xerimbabo
Fundação Zoobotânica de Belo Horizonte
Fora de UC
Fora de UC
Fora de UC
Atividades X Táxons
#
1
Atividade
Táxons
Coleta/transporte de amostras biológicas ex situ
Boidae
SISBIO
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Ministério do Meio Ambiente - MMA
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade - ICMBio
Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade - SISBIO
Autorização para atividades com finalidade científica
Número: 23541-1
Data da Emissão: 07/04/2010 16:28
Dados do titular
Nome: Olney Vieira da Motta
SISBIO
CPF: 433.401.567-00
Título do Projeto: Caracterização da microbiota oral e cloacal de jibóias (Boa constrictor, Linnaeus 1758) com ênfase no diagnóstico sorológico e
molecular em Salmonella spp.
Nome da Instituição : UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CNPJ: 04.809.688/0001-06
Material e métodos
1
Amostras biológicas (Répteis)
Fezes, Sangue, Fragmento de tecido/órgão
Destino do material biológico coletado
#
1
Nome local destino
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
Tipo Destino
Laboratório de Sanidade Animal
SISBIO
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Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade - SISBIO
Autorização para atividades com finalidade científica
Número: 23541-1
Data da Emissão: 07/04/2010 16:28
Dados do titular
Nome: Olney Vieira da Motta
SISBIO
CPF: 433.401.567-00
Título do Projeto: Caracterização da microbiota oral e cloacal de jibóias (Boa constrictor, Linnaeus 1758) com ênfase no diagnóstico sorológico e
molecular em Salmonella spp.
Nome da Instituição : UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CNPJ: 04.809.688/0001-06
Registro de coleta imprevista de material biológico
De acordo com a Instrução Normativa nº154/2007, a coleta imprevista de material biológico ou de substrato não
contemplado na autorização ou na licença permanente deverá ser anotada na mesma, em campo específico, por
ocasião da coleta, devendo esta coleta imprevista ser comunicada por meio do relatório de atividades. O transporte do
material biológico ou do substrato deverá ser acompanhado da autorização ou da licença permanente com a devida
anotação. O material biológico coletado de forma imprevista, deverá ser destinado à instituição científica e, depositado,
preferencialmente, em coleção biológica científica registrada no Cadastro Nacional de Coleções Biológicas (CCBIO).
Táxon*
Qtde.
Tipo de amostra
Qtde.
Data
* Identificar o espécime no nível taxonômico possível.
SISBIO
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