Assunto 2: Bactérias no Ambiente I e II

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
CURSO: NUTRIÇÃO
APOSTILA
DE
AULAS PRÁTICAS
- DISCIPLINA BACTERIOLOGIA I
CURSO NUTRIÇÃO
Autores:
Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira
professor Adjunto de Bacteriologia
Thais Locha Zangali Vargas
Michelle
monitoras da disciplina de Bacteriologia 2001-2
2002
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
CURSO: NUTRIÇÃO
APRESENTAÇÃO
O conhecimento teórico-prático de microbiologia, principalmente
bacteriologia, para o futuro profissional de nutrição é de suma importância
em função das características particulares que envolvem o exercício dessa
profissão. O entendimento da participação de bactérias como a patógenos
veiculados por alimentos, ou deterioradores dos mesmos, bem como seu
importante papel na tecnologia de produção de diversos alimentos são
essenciais na formação do nutricionista.
A presente apostila resulta do aperfeioçoamento e complementação
de um roteiro de aulas práticas já disponibilizado aos alunos da disciplina
Bacteriologia I há cerca de 2 anos e pretende servir de subsídio ao
acompanhamento das aulas práticas. Todos as aulas são apresentadas na
forma de assuntos, uma vez que em alguns casos, mais de um assunto será
desenvolvido de forma concomitante. Cada assunto é apresentado por uma
breve introdução, a fundamentação teórica necessária ao entendimento do
tema, o material utilizado e a execução da prática e os resultados
esperados. No final de cada assunto o aluno poderá tirar as suas conclusões
da prática executada e encontrará algumas questões de fixação. Sempre
que possível procurou-se utilizar esquemas, gravuras e ilustrações que
facilitassem a compreensão do assunto.
Finalmente procurou-se acentuar a importância e aplicação de cada
prática no contexto das atividades de um nutricionista de modo a estimular
o aprendizado.
Os autores
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Assunto 1: Meios de cultura/
Técnicas de Semeadura I e II
1) Introdução:
O estudo das bactérias necessita normalmente do seu prévio isolamento e identificação. Para
tanto diversos meios de cultura são utilizados. Define-se meio de cultura como uma mistura de
nutrientes, incluindo fontes de carbono, nitrogênio, sais minerais e água, que propiciam o
crescimento in vitro de bactérias. A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. Exceções são
as riquétsias e clamídias que por serem parasitas intracelulares obrigatórios só se desenvolvem in
vitro em meios celulares (cultivo celular, ovos embrionados), Mycobaterium leprae e Treponema
pallidum. A inoculação das bactérias em diferentes meios envolve várias técnicas de semeadura.
Toda a manipulação de culturas bacterianas, meios e instrumental necessário deve ser feita
seguindo-se procedimentos básicos de assepsia e antissepsia, visando evitar qualquer tipo de
contaminação. contaminação
2) Fundamentação teórica:
2.1) Meios de cultura
Para uma melhor compreensão das diversas finalidades e usos dos meios de cultura,
apresentamos a seguir uma breve classificação dos mesmos:
A) Quanto à composição:
A.1) Naturais – são aqueles de origem vegetal (um pedaço de batata, pão, frutas) ou
animal (gema de ovo).
A.2) Artificiais – são aqueles constituídos de substâncias químicas podendo ser
definidos ou indefinidos (complexos).
 

Definidos: é sabido toda a sua composição.
 

Indefinidos ou Complexos: é desconhecido por si. Sabe-se apenas
aproximadamente. Os meios utilizados na rotina são complexos.
B) Quanto ao seu estado físico:
 Líquido – são os caldos, desprovidos de agar.
 Semi-sólido – são aqueles que apresentam em sua composição até 1% de agar.
 Sólido – são aqueles que apresentam em sua composição 1,5 a 2,5% de agar.
C) Quanto à finalidade e características:
Simples – contém apenas componentes básicos para o crescimento de uma bactéria.
 Enriquecido – meio que tem aumentada a sua capacidade nutricional para a bactéria
pela adição de substâncias como gema de ovo, sangue, plasma, soro,, leite. De uso freqüente
para bactérias de difícil crescimento (fastidiosas).
 De enriquecimento – meio seletivo que visa inibir o crescimento de bactérias
acompanhantes e permitir o crescimento da bactéria alvo que pretende-se posteriormente
isolar aumentando assim a proporção desta em relação às demais. Por ser um meio líquido não
destina-se ao isolamento da bactéria.
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 Seletivo – contêm substâncias seletivas que inibem o crescimento de certas bactérias
e permitem o crescimento de outras. São meios sólidos e têm como objetivo isolar culturas
puras.
 Indicadores – meios que permitem a diferenciação visual do crescimento bacteriano
facilitando a sua identificação. Freqüentemente os meios seletivos são também indicadorese
todos os meios utilizados na confirmação bioqumica dos isolamentos são indicadores. A
indicação mais freqüente é a alteração de cor do meio por mudança no pH do mesmo,
podendo ainda ser a produção de gás, precipitação de componentes do meio por atividade
proteolítica e lipolítica, etc...
 Estoque – são meios normalmente semi-sólidos com a finalidade de preservar uma
cultura bacteriana pura para posteriores utilizações no laboratório.
2.2 – Técnicas de Semeadura
Antes de apresentar as diferentes técnicas de semeadura é importante ter claro os
procedimentos que se deve adotar na manipulação segura dos meios, culturas bacterianas, etc, de
modo a evitar qualquer tipo de contaminação. tais procedimentos são denominados genericamente
de técnicas de assepsia e incluem:
 fazer a a desinfecção da área de trabalho e a antissepsia das mãos sempre antes e depois de
trabalhar (1);
 trabalhar sempre na área de segurança (aproximadamente 10cm) em volta da chama do
bico de Bunsen (2);
 esterilizar adequadamente alças e agulhas de inoculação antes e depois do seu uso, evitando
a criação de aerossóis, para isso aquecendo sempre da base para a ponta (3);
 flambar a boca dos frascos e tubos antes e depois das inoculações (4).
A finalidade básica das técnicas de semeadura é permitir a transferência (inoculação) de
bactérias ou de uma cultura bacteriana de um material (secreção, alimento, etc) ou de um meio de
cultura para outro(s) garantindo que apenas os microrganismos em questão sejam semeados. de
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acordo com o tipo de meio de origem e destino bem como da finalidade específica da inoculação,
diferentes técnicas são executadas, a saber:
 Semeadura em meios sólidos e semi-sólidos
A. Meio Inclinado em tubos (utilizar alça ou agulha)
 Em estria sinuosa: semear com alça de platina, em zig-zag, partindo da base para a
extremidade da superfície inclinada do meio. Este tipo de semeadura permite obtenção de intensa
massa microrganismos.
 Em estria reta: semear com agulha de platina, em estria reta, partindo da base para a
extremidade da superfície inclinada do meio. Este tipo de semeadura é utilizada quando se necessita
um inóculo pequeno de bactérias
B. Meio em camada alta
 Picada em profundidade: com agulha de platina perfurar o centro do meio sem
movimentos de lateralidade fazer o inóculo penetrar no a 2/3 ou até o fundo do tubo de acordo com
a finalidade. É bastante utilizado para conservação de bactérias, para a verificação da mobilidade e
para a verificação da fermentação de açúcares.
C. Em placa de Petri:
C.1 – Em superfície
 Estrias múltiplas ou esgotamento em estrias: faz-se o inóculo num ponto da superfície
do meio espalhando-se o mesmo por estrias em toda a placa de modo a gradativamente esgotar o
material contido no inóculo. Preferencialmente usa-se um esquema de divisão da placa em 4
quadrantes sendo que a estria de cada quadrante toca no final da estria do quadrante anterior
arrastando bactérias deste último.. Em meios de baixa seletividade pode-se flambar a alça após a
inoculação de cada quadrante. A estria do último quadrante ocupa a maior parte da placa.
Alternativamente pode-se fazer 3 estrias, a 1a. ocupando metade da placa e as outras 2 um quarto da
placa cada. Neste modo as estrias não se tocam. Este tipo de semeadura é empregado para o
isolamento de colônias bacterianas e obtenção culturas puras.
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 Por distensão: com pipeta, colocar no centro da superfície do meio um volume definido
do inóculo (geralmente 0,1 mL) e espalhar uniformemente com a própria ponta da pipeta, com swab
swab ou alça de Drigalski (bastão de vidro estérial). Utilizado para obtenção de crescimento
confluente, para realização de antibiogramas por exemplo ou para obtenção de colônias dispostas de
modo regular para as contagens microbianas.
C.2 – Em profundidade ou disseminação
 Pour-plate: depositar na placa de Petri 0,1 / 1,0 mL da suspensão bacteriana. Adicionar 10
mL do meio fundido em tubo de ensaio e resfriado a 45 - 50º C. Homogeneizar com movimentos
giratórios da placa sobre uma superfície plana. Utilizado principalmente para contagem bacteriana,
econforme o meio de cultura utilizado. Este tipo de semeadura permite também o crescimento de
bactérias anaeróbias.
 Semeadura em meios líquidos
A. Difusão: com alça de platina ou pipeta, introduzir o inóculo esfregando contra o interior
do tubo na área exposta pela inclinação do mesmo em 30º. Após se recolocar o tubo na posição
vertical as bactérias inoculadas se difundem para o meio. É um repique genérico para crescimento
bacteriano em meio líquido.
3) Objetivos
Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de executar e determinar a
finalidade das principais técnicas de semeadura de bactérias em meios líquidos (caldos),
semi-sólidos e sólidos (Agar), tanto em tubos como em placas; distinguir os meios de cultura e a
finalidade de cada um; obter culturas puras; proporcionar o crescimento bacteriano.
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Objetivos:
Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de:
1- Caracterizar os diferentes tipos de meios de cultura utilizados em
bacteriologia;
2- Executar e determinar a finalidade das principais técnicas de semeadura de
bactérias em meios líquidos (caldos) , e sólidos (agar) tanto em tubo como em
placas.;
3. Realizar as técnicas de semeadura de acordo com as técnicas de assepsia e
antissepsia.
Material:
Placas com agar EMB; agar triptcase soja (TSA) em tubo, placas
estéreis, caldo simples, agar inclinado em tubo (Citrato de Simons); cultura de E.coli
em caldo e agar; amostra de água em tubo (para pour plate); pipetas, alça e agulha de
platina
Execução:
a) A partir do crescimento de E.coli em caldo proceder às semeaduras:
- caldo  caldo :
difusão
- caldo  agar inclinado :
estria reta ou sinuosa
- caldo  agar em placa:
esgotamento em estria
- caldo agar semi sólido:
picada profunda
b) A partir do crescimento de E.coli em agar proceder às semeaduras:
-agar caldo:
difusão
c) A partir da amostra de água , do meio TSA em tubo (previamente
fundido),da placa estéril e da pipeta, proceder a semeadura pour plate
d) Incubar os meios a 37ºC por 24 horas
e) Observar e interpretar o crescimento nos meios, destacando aquele
empregado no isolamento de colônias.
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Assunto 2: Bactérias no Ambiente I e II
1) Introdução
A presença de bactérias pode ser verificada em quase todos os ambientes, no solo, na
água, no ar e colonizando o nosso corpo (ex: trato gastrointestinal, pele). A exposição de alimentos,
sua manipulação e conservação incorretas são fatores predisponentes à sua contaminação por
microrganismos. Dentre estes podem estar presentes microrganismos patogênicos ou
microrganismos deterioradores.
2) Fundamentação Teórica
A presença de bactérias é uma constante nos mais variados ambientes. Freqüentemente
tais bactérias não estão associadas a nenhum prejuízo. A microbiota intestinal desempenha
importante papel na defesa do organismo contra certas infecções; existem estudos que sugerem que
a microbiota normal estimula o desenvolvimento das defesas imunológicas. Ao mesmo tempo que
desenvolve atividades benéficas a microbiota pode ser responsável por uma série de doenças
oportunistas que podem ser relacionadas, por exemplo, ao uso constante de drogas
imunossupressoras, antibióticos e internações em UTI.
A contaminação de alimentos por microrganismos do ambiente é um dos importantes
fatores relacionados à deterioração dos mesmos. Portanto, o controle da carga microbiana do
alimento através da adequada proteção do mesmo é uma medida essencial.
Muitas infecções causadas por bactérias são adquiridas por contato direto ou veiculadas
por alimentos. Ao contrário do que se pensava antigamente, a disseminação de bactérias
patogências pelo ar e poeira não ocorre com grande freqüência, pois de um modo geral, não
sobrevivem por longos períodos no ambiente externo. Entretanto, estas vias de transmissão podem
ser de grande importância em determinadas situações. No caso de bactérias esporuladas a
transmissão aérea é mais importante.Os alimentos são uma importante via de transmissão de
doenças bacterianas como a shigelose, salmonellose, cólera e várias outras. O nutricionista deve
estar atento sempre. Uma pessoa pode contaminar alimentos, por ser portador de determinada
espécie ou ter contaminado as mãos mexendo em outras fontes de infecção. Um exemplo clássico é
o de uma cozinheira portadora da Salmonella typhi que, durante anos, transmitiu a febre tifóide para
todos os membros das famílias para as quais trabalhou em razão de seus hábitos precários de
higiene. Logo, é dever do profissional conhecer os riscos para uma melhor orientação e supervisão
evitando disseminação de doenças principalmente quem trabalha na área de restaurantes.
3) Objetivos
Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de constatar a presença de
bactérias no ambiente; compreender a importância dos critérios básicos de higiene na produção e
manipulação de alimentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais;
comentar sobre o papel de bactérias ambientais como eventuais deterioradoras de alimentos.
4) Material
- 01 placa com agar simples divididas em 4 quadrantes
- 01 placa com agar simples
- 01 swab estéril
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5) Execução
A) Inocular em cada quadrante, respectivamente:
- a impressão do dedo polegar
- um “carimbo” do tecido do jaleco
- alguns fios de cabelo
- um swab previamente passado sobre a bancada de trabalho
Incubar a 37o C por 24 horas
Analisar o crescimento obtido
1.º
DEDO
4.º
CABELO
2.º
JALECO
3.º
BANCADA
B) Abrir as placas, fora da área de segurança, deixando cada uma por 5’, 10’, 15’ e 20’,
fechando quando atingido o tempo respectivo. Incubar a 37 o C por 24 horas e analisar o crescimento
obtido.
5 min
10 min
15 min
20 min
6) Resultados e Observações
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Assunto 3 : Controle Microbiano I e II
1) Introdução
As taxas de crescimento e morte microbianas são fortemente influenciadas por vários
fatores ambientais. O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a
finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir ou impedir a multiplicação de
microrganismos existentes em um determinado equipamento, ambiente, em alimentos ou em
superfícies vivas. É de extrema importância apresentando inúmeras aplicações práticas na área
médica e de alimentos. A conservação de alimentos envolve sempre o uso de uma ou mais técnicas
empregadas no controle microbiano.
2) Fundamentação Teórica
É importante inicialmente definir alguns termos utilizados no controle microbiológico:
A) Desinfecção – significa redução do número de microrganismos em superfícies inanimadas
(ambiente ou materiais) e conseqüente eliminação de sua potencialidade
infecciosa.
B) Sanitização – mesmo significado de desinfecção, porém utilizado rotineiramente em indústria
de alimentos.
C) Antissepsia – significa redução do número de microrganismos em tecidos vivos.
D) Esterilização – destruição ou remoção completa dos microrganismos em ambientes ou materiais.
E) Assepsia – significa ausência de microrganismos/ as técnicas assépticas representam uma série
de cuidados que previenem a contaminação.
O controle de microrganismos pode ser feito por agentes físicos ou químicos.
2.1 – Controle Microbiano por Agentes Físicos
Calor
É o método mais empregado para destruição de microrganismos por ser barato, eficaz e
prático. Quando se tem finalidade esterilizante deve ser calculado para a destruição das
formas esporuladas de bactérias, mais resistentes. Pode ser utilizado na forma de calor seco
ou calor úmido em função da presença de água. O primeiro mata as bactérias por oxidação
proteica enquanto o segundo por desnaturação protéica. Além disso, o calor úmido é um
método de maior eficiência devido à água ser um melhor condutor de calor do que o ar.
 CalorSeco: na ausência de água
- Flambagem: contato direto do material a ser tratado com o fogo, é um tipo de esterilização.
- Forno ou Estufa: material submetido a uma temperatura de 170 a 180o C por 1 - 2 horas, é
um tipo de esterilização, porém não é qualquer material que pode ser submetido a esse tratamento.
Utilizado principalmente para vidraria e metais (instrumentos cirúrgicos p. ex.)
- Incineração: é a queima total de um material, método utilizado com materiais descartáveis,
principalmente aqueles materiais hospitalares.
 CalorÚmido: na presença de água (ou vapor d’água)
- < 100o C: pasteurização (método desinfetante). Muito utilizado para alimentos e bebidas. A
pasteurização rápida do leite emprega uma temperatura em torno de 72o C por 15 a 20 segundos,
seguida de resfriamento rápido. A pasteurização consegue eliminar cerca de 99,5% de
microrganismos, aqueles esporulados são termoresistentes, conseguindo resistir a esse tratamento.
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CURSO: NUTRIÇÃO
Alimentos pasteurizados – leite, sucos industriais.
- = 100o C: é a fervura (método desinfetante). O alimento é submetido a uma temperatura
igual a 100o C por até 15 minutos. Eficiente contra as formas vegetativas bacterianas mas não
destrói completamente as formas esporuladas.
- > 100o C: é a autoclavação (método esterilizante). Os materiais e alimentos são submetidos
a uma temperatura em torno de 121o C por 15-30 minutos, um tempo e temperatura bem inferiores
àqueles empregados em calor seco. Isso é possível pelo emprego de alta pressão interna (1 ATM) na
autoclave. A autoclave é similar a uma panela de pressão.
Ultravioleta (radiação não ionizante)
 Possui uma atividade máxima num comprimento de onda de 260nm, geralmente são
desinfetantes e usados em ambientes.
- Limitação: não tem poder de penetração, tudo que estiver embalado ou protegido por vidro não é
desinfetado, após umas 200 horas de uso da lämpada sua eficiência é diminuída.
- Por que mata?: ela penetra nos microrganismos e são captadas pelos seus cromossomos, causando
mutação letal por serem absorvidos diretamente.
Radiação Gama (radiação ionizante)
 É um método de esterilização, mais energético que as radiações UV com menor
comprimento de onda e desequilibra quimicamente as células irradiadas, todos os seus componentes
químicos podem ser alterados. Muito utilizado para esterilização de produtos hospitalares
descartáveis em uso crescente em indústrias de alimentos (esterilização superficial).
Filtração
 Clarificantes: são os filtros domésticos, retém as impurezas grosseiras, são desinfetantes.
 Esterilizantes: possuem poros iguais ou menores a 1m podendo reter inclusive alguns
vírus.
Outros:
 Pressão Osmótica (Salga) ; Dessecação (prod. Alimentícios em pó, liofilização) ; uso de
baixas temperaturas (refrigeração, congelamento)
2.2 – Controle Microbiano por Agentes Químicos
Fenóis e derivados: é um desinfetante fraco, porém utilizado como um desinfetante de
referência para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o
produto é mais ativo que o fenol.
 Atuação: fenóis/cresóis – desnaturam proteínas.
OBS: Dos cresóis o mais importante é a creolina, utilizada para pisos e sanitários. O hexaclorofeno
é muito usado na antissepsia cirúrgica.
 Álcool Etílico: possui vários mecanismos de ação, sendo relativamente eficiente, são
solventes de lipídios (ação detergente), são desidratantes (retiram a água das células) e desnaturam
proteínas. O álcool etílico pode ser usado como desinfetante ou anti-séptico. O álcool absoluto (não
hidratado) é fraco germicida. Um álcool parcialmente hidratado (60- 70%) é mais ativo que o
absoluto, pelo maior poder de penetração e conseqüente desnaturação protéica mais rápida.
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Cloro / Iodo (Halogênios)
- O Cloro é desinfetante de águas, alimentos e pisos. Mecanismo de ação é oxidante.
Cl2 + H2O  HCl + HClO
ácido hipocloroso instável,
espontaneamente forma mais
HCl e oxigênio nascente, isso
que matará os microrganismos.
- O mecanismo de ação do Iodo é a sua combinação irreversível com proteínas através da
interação com aminoácidos aromáticos, fenilalanina e tirosina, levando à desnaturação das mesmas.
É um dos anti-sépticos mais utilizados na prática cirúrgica.
Detergentes catiônicos (agentes de superfície): alteram a permeabilidade de membrana ( ex:
compostos quaternários de amônio cloreto de benzalcônio). Mais ativo contra Gram negativos
Sais de Metais Pesados:
- Mercúrio (Hg): anti-séptico . Em desuso pelo risco de intoxicação por absorção.
- Sulfato de Cobre (CuSO4): desinfetante para águas de recreação.
- Nitrato de Prata (AgNO3): anti-séptico, é altamente eficiente contra gonococos, que causam
oftalmia em recém-nascidos e gonorréia em adultos com vida sexual ativa.
 Atuação: afinidade por proteínas, inativando enzimas, por isso é importante não ingeri-los.
Uso tópico apenas.
Ácidos orgânicos e inorgânicos:
Freqüentemente usados na conservação de alimentos. Exs.: ácidos acético, lático, benzóico.
Álcalis:
Hidróxido de Sódio (NaOH)= presente nos sabões conferindo a estes a sua relativa ação
anti-séptica.
Outros: KOH, Ca(OH)2

Corantes Básicos: mais eficientes contra Gram positivos. Ex.: Cristal Violeta, Azul de
Metileno.
Oxidantes e Redutores
- Oxidantes: oxidam componentes celulares levando à morte das células. Ex.: Ozônio (O3),
água oxigenada (H2O2), permanganato de potássio, peróxido de zinco. Usados como anti-sépticos.
- Redutores: reduzem compostos celulares levando à morte das células.
 Aldeídos e derivados:
Formaldeído/ formalina: muito irritante / São usados para desinfectar paredes e pisos.
Glutaraldeído: mais ativo e menos tóxico que o formaldeído; esporocida após 6 horas de
contato)
 Óxido de Etileno (gás): é um agente alquilante inativando proteínas e ácido nucléico.
Usado em um recipiente fechado que recebe todo material a ser utilizado (contém algumas ampolas
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de óxido de etileno – líquido), à temperatura de 52o C, este líquido torna-se gasoso, assim, seus
vapores são esterilizantes. Usado para esterilização de materiais de borracha ou plástico.
A célula microbiana está em equilíbrio, oxidantes e redutores rompem esse equilíbrio,
matando a célula.
Antimicrobianos: ao contrário dos anteriores possuem ação seletiva contra microrganismos
por isso não serão discutidos neste assunto.
3) Objetivos
Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de conceituar e diferenciar
os termos utilizados no controle microbiológico; descrever os agentes físicos e químicos utilizados
no controle microbiano; entender o funcionamento de autoclaves e fornos de esterilização,
diferenciando calor úmido de calor seco; compreender as diferenças encontradas na destruição de
microrganismos esporulados e não esporulados frente à ação do calor; compreender as diferenças
encontradas na ação dos diferentes métodos de antissepsia utilizados.
4) Material
- Culturas bacterianas: Escherichia. coli e Bacillus cereus
- Placa de Petri com agar simples
- Soluções antissépticas
- Gase estéril
- Tripé e tela de amianto
- Recipiente com água em ebulição
5) Execução:
A – Agentes Químicos: observação da ação de antissépticos sobre bactérias a microbiota da
pele.
a) Numa placa de agar simples dividida em 4 quadrantes fazer a semeadura do 1º quadrante
utilizando a ponta do polegar (fazer a impressão digital suavemente para não ferir a camada do meio
de cultura);
b) Um segundo aluno lava seu polegar com sabão e água por 1 minuto, seca com gaze estéril e
inocula o segundo quadrante fazendo a impressão do dedo;
c) Um terceiro aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 1º antisséptico por
1 minuto, seca o dedo com gaze estéril e faz depois a impressão no terceiro quadrante;
d) Um quarto aluno faz a antissepsia de seu polegar com gaze embebida no 2º antisséptico por 1
minuto, seca o dedo com gaze estéril e faz depois a impressão no quarto quadrante.
- Incubar a placa a 37º C por 18 - 24 horas.
- Analisar o crescimento.
1.º DEDO 2.º DEDO
+ SABÃO
3.º DEDO +
ANTIS. 1
4.º DEDO +
ANTIS. 2
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B – Agentes Físicos: calor
a) Numa placa de agar simples dividida e marcada em 8 partes semear as culturas bacterianas no
espaço respectivo ao tempo T0 ;
b) Colocar as culturas em banho-maria fervente e reinocular os quadrantes T5, T10, T20 após 5,
10 e 20 minutos de tratamento térmico, respectivamente.
- Incubar a placa a 37o C por 18 – 24 horas.
- Analisar o crescimento.
t0
t5
t10
E t20
B
C – Atividade de Diferentes Agentes Químicos sobre bactérias in vitro (opcional pois a
metodologia é idêntica ao teste de sensibilidade a antimicrobianos)
a) Semear uma cultura bacteriana com swab (para crescimento confluente) em uma placa de
Petri com agar simples;
b) Assepticamente, com pinça, embeber discos de papel de filtro com diferentes agentes
químicos;
c) Colocar os discos eqüidistantes na placa semeada;
- Incubar a 37º C por 18 - 24 horas.
- Analisar os dados obtidos.
A
B
C
D
6) Importância da Aula de Controle Microbiano
Esta aula é de extrema importância para a área nutricional, já que constantemente há o
envolvimento com alimentos e a sua manipulação, sendo interessante o controle microbiano para
que não haja uma contaminação e posteriores intoxicações alimentares.
A sanitização de todo material utilizado na produção de alimentos é indispensável, por
isso é importante saber quais substâncias químicas a serem utilizadas com sucesso.
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CURSO: NUTRIÇÃO
O conhecimento sobre os agentes químicos é necessário, principalmente na área de
produção, para que não haja perda de equipamentos por utilização incorreta de desinfetantes. Existe
a substancia química para cada equipamento, para cada tipo de bancada e isso é responsabilidade do
nutricionista.
7) Resultados e Anotações
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DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
CURSO: NUTRIÇÃO
Assunto 4: Coloração de Gram
1) Introdução
O método de coloração de Gram é o mais utilizado em Bacteriologia e permite a
diferenciação da maioria das bactérias em 2 grupos pelas diferenças marcantes na parede celular
que apresentam. Baseado nessas diferenças de parede celular os corantes utilizados coram as
bactérias Gram-positivas em roxo e as Gram-negativas em vermelho.
O método de Gram é utilizado na maioria das infecções bacterianas, permitindo o
diagnóstico de algumas delas com bastante segurança. Porém não se aplica para micoplasmas,
bactérias desprovidas de parede, micobactérias pela presença de muitos lipídios insolúveis na
parede e espiroquetas pela estrutura muito delgada e pouco permeável aos corantes.
2) Fundamentação Teórica
A coloração pelo método de Gram é chamada de coloração diferencial porque são
utilizados dois corantes e as bactérias ficam coradas em tonalidades diferentes. Isso é possível
devido à composição da parede celular das mesmas.
Bactérias Gram-negativas possuem uma parede composta de várias camadas que diferem
na sua composição química e, conseqüentemente, são mais complexas, O arranjo dessa parede é
dado por uma fina camada de peptidoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por
lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos (membrana externa).
As bactérias Gram-positivas possuem parede celular mais espessa em comparação as
Gram-negativas, apesar disso, apresenta predominantemente um único tipo de macromolécula, uma
espessa camada de peptidoglicano (representando aproximadamente 90%) e ácido tecóico.
Essas bactérias podem ser aeróbias, anaeróbias facultativas e anaeróbias. Possuem a
forma de cocos, bacilos ou víbrios (bacilos encurvados). Muitas são patogênicas e outras, membros
da microbiota normal do corpo humano.
A maioria dos cocos é Gram-positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella
que são os únicos Gram-negativos; entre os bacilos Gram-positivos incluem-se aqueles pertencentes
aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus, Lactobacillus e Clostridium; os demais bacilos
são Gram-negativos (a maioria); os víbrios são Gram-negativos.
A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das
bactérias é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de
material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria
sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma.
O mecanismo da coloração de Gram se refere a composição da parede celular, sendo que as
+
G possuem uma espessa camada de peptideoglicano e ácido teicóico, e as G-, uma fina camada de
peptideoglicano, sobre a qual se encontra uma camada composta por lipoproteínas, fosfolipídeos,
proteínas e lipopolissacarídeos. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool (ou
ácool-acetona) extrai os lipídeos, daí resultando uma porosidade ou permeabilidade aumentada da
parede celular das G-. Assim, o complexo cristal violeta-iodo (CV-I) pode ser retirado e as G- são
descoradas. A parede celular das bactérias G+, em virtude de sua composição diferente, torna-se
desidratada durante o tratamento com álcool, a porosidade diminui, a permeabilidade é reduzida e o
complexo CV-I não pode ser extraído.
Outra explicação baseia-se também em diferenças de permeabilidade entre os dois grupos de
bactérias. Nas bactérias G+, o complexo CV-I é retido na parede após o tratamento pelo álcool, o
que causa, provavelmente, uma diminuição do diâmetro dos poros da camada de glicopeptídeo ou
peptideoglicano da parede celular. Os poros da parede das bactérias G- permanecem
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suficientemente grandes, mesmo depois do tratamento pelo álcool, possibilitando a extração do
complexo CV-I.
Segundo Trabulsi, na etapa diferencial com álcool, as bactérias G- devido à pequena
espessura da camada basal e às descontinuidades existentes nesta camada, em pontos de aderência
entre a membrana externa e a membrana celular, têm o complexo corado extraído pelo álcool que
deixa as células descoradas.
3) Objetivo
Após realizar a atividade prática você deverá ser capaz de executar a técnica da
coloração de Gram; utilizar a objetiva de imersão; relacionar a composição química da parede
celular das bactérias com os corantes de Gram; compreender a importância de realizar a coloração
de Gram a partir de um material submetido a exame microbiológico; descrever as formas, arranjos e
coloração das bactérias.
4) Material
- Lâminas
- Culturas bacterianas em meio líquido e sólido
- Alças e agulhas
- Bateria da coloração de Gram (corante cristal de violeta, lugol, álcool, água, fucsina
de Gram, papel de filtro e óleo de cedro)
- Microscópio
- Bico de Bunsen
5) Execução
A) Preparar um esfregaço fino, secar à temperatura ambiente e fixar pelo calor
B) Cobrir o esfregaço seco com solução cristal violeta por 1 minuto
C) Esgotar a lâmina, lavar rapidamente em água e cobrir com lugol por 1 minuto
D) Lavar rapidamente em água
E) Lavar (diferenciar) a lâmina (inclinada a 45o ) com álcool (aproximadamente 10 a 20
segundos)
F) Lavar com água e cobrir com solução diluída de Fucsina de Gram por 15-30 segundos
G) Lavar com água, secar entre as folhas de papel de filtro
H) Observar à microscopia de imersão
Vi
cristal
violeta
Lili
lugol
PARA MEMORIZAR!
Ali
Fumar Algo
A
álcool
água
fucsina
água
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Notas:
1. Os corantes empregados na técnica, se não filtrados, podem deixar resíduos (cristais) na
lâmina.
2. Um descoramento excessivo ou insuficiente pode levar a uma incorreta diferenciação da
bactéria pelo álcool.
3. A idade da cultura bacteriana tem importância fundamental na coloração de Gram. Em
culturas envelhecidas, células Gram-positivas freqüentemente se tornam
Gram-negativas. Enzimas líticas excretadas normalmente por culturas envelhecidas
podem causar danos à membrana e parede da célula, como por exemplo, alterando a
permeabilidade aos solventes. Conseqüentemente, o complexo iodo-cristal violeta
poderá ser retirado da célula.
6) Resultados
- Bactérias G+ coradas em roxo
- Bactérias G- coradas em vermelho.
7) Observações
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Assunto 5: Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos – TSA / Antibiograma
1) Introdução
O sucesso na terapêutica antimicrobiana de uma infecção bacteriana depende da
sensibilidade do agente à droga utilizada. Algumas bactérias apresentam um perfil de sensibilidade
previsível e constante, no entanto muitas outras são altamente suscetíveis ao desenvolvimento ou
aquisição de resistência a diversos antimicrobianos. Atualmente, o uso adequado e criterioso de
antimicrobianos é muito importante para prevenção da seleção de amostras bacterianas
multirresistentes.. O teste de sensibilidade a antimicrobianos ou antibiograma permite o
esclarecimento objetivo do perfil de sensibilidade do patógeno e a utilização de drogas eficazes no
tratamento.
O antibiograma ou TSA é indicado para qualquer microrganismo relacionado ao
processo infeccioso mas principalmente àqueles cuja sensibilidade a drogas normalmente
empregadas na terapia não seja previsível como por exemplos: S. aureus, bacilos gram-negativos
não fermentadores (Pseudomonas), bacilos Gram negativos fermentadores (enterobactérias) etc.
2) Fundamentação Teórica
Uma bactéria é considerada sensível a um antimicrobiano quando o seu crescimento é
inibido, in vitro, por uma concentração três, ou mais vezes, inferior àquela que o antimicrobiano
atinge no sangue, caso contrário ela é considerada resistente. O meio termo (bactérias
moderadamente resistentes) é dado por aquela cujo crescimento é inibido por concentrações
intermediárias.
A concentração inibitória do antimicrobiano pode ser determinada direta ou
indiretamente. A determinação direta é feita pelos chamados métodos da diluição, e, a indireta, pelo
método de difusão em placa com discos impregnados com as drogas.
No método de diluição, concentrações variadas do antibiótico, obtidas pela diluição em
caldo ou agar, são inoculadas com o microrganismo. A concentração mais baixa do antibiótico que
evita o crescimento após a incubação de 12 a 24 horas é a concentração inibitória mínima, é a
medida da sensibilidade.
Nos testes pelo método de difusão, discos de papel impregnados com o antibiótico são
colocados uniformemente na superfície do agar semeado com o microrganismo. Forma-se, então,
um gradiente de concentração pela difusão do antibiótico a partir do disco para o agar com
conseqüente inibição do crescimento do microorganismo sensível ao determinado (os) antibiótico
(os).
Devido à sua simplicidade e por poderem ser realizados rapidamente, os métodos de
difusão com disco (de Bawer e Kirby) têm preferência sobre os de diluição para os testes de rotina,
mas é indispensável que sejam, rigorosamente padronizados, a razão é que a presença de algumas
substâncias nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibição.
Então utilizamos o meio enriquecedor denominado Muller-Hinton, que é um meio
padronizado, lembrando que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura,
devendo-se fazer uma coloração de Gram antes de qualquer TSA para a confirmação da pureza da
cultura.
A base para o julgamento de sensibilidade é o tamanho real do halo de inibição (zona
sem crescimento em volta dos discos de antibiótico), o tamanho do halo sozinho não é uma medida
quantitativa da atividade do antibiótico, assim, é errôneo pensar que quanto maior o halo, mais
potente seja o antibiótico. Por essa razão, comparações diretas dos diâmetros dos halos produzidos
por antibióticos não relacionados são falsos e não devem ser realizados. Deve-se interpretar a
sensibilidade de acordo com os dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação aos dados da
tabela de interpretação do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na terapêutica clínica.
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Limites para Interpretação do Antibiograma com 32 Antimicrobianos
de uso corrente na Terapêutica Clínica
Antimicrobiano
Simbolo
CONC. DISCO
DIÂMETRO DO HALO DE INIBIÇÃO
RESISTENTE
INTERMEDIÁRIO
SENSÍVEL
Amicacina
BB
30 mcg
< 14
15-18
> 17
Ampicilina ao testar microorganismos
gram-negativos e enterococos
Ampicilina ao testar estafilococos e
microorganismos sensíveis à
penicilina G
Ampicilina ao testar
Haemophilus sp.
Ác. Nalidíxico
AP
10mcg
 11
12-13
 14
AP
10 mcg
< 20
21-28
> 29
AP
10 mcg
< 19
-
>20
NA
30 mcg
 13
14 -18
 19
Bacitracina
BC
10 un.
<8
9-12
>13
Carbenicilina ao testar Proteus sp. e
E. coli
Carbenicilina ao testar Pseudomonas
aeruginosa
Cefalotina ao relatar sensibilidade a
todas as cefalosporinas
Cefoxitina
CR
100 mcg
< 17
18-22
> 23
CR
100 mcg
< 13
14-16
> 17
CF
30 mcg
< 14
15-17
> 18
CT
-
 14
15-17
 18
Clindamicina ao relatar sensibilidade
à clindamicina e à lindomicina
Cloranfenicol
CI
2 mcg
< 14
15-16
> 17
CO
30 mcg
 12
13 -17
 18
Colistina
CL
10 mcg
<8
9-10
> 11
Eritromicina
EL
15 mcg
 13
14-17
 18
Estreptomicina
ET
10 mcg
 11
12 -14
 15
Gentamicina
GN
10 mcg
< 12
13-14
> 15
Konanilcina
KN
30 mcg
< 13
14-17
> 18
Nalidíxico ácido
AN
30 mcg
< 13
14-18
> 19
Neomicina
NO
30 mcg
< 12
13-16
> 17
Nitrofurantoína
NT
300 mcg
< 14
15-16
> 17
Novoblocina
NV
30 mcg
< 17
18-21
> 22
Oxocilina
OX
6 mcg
<9
10-13
> 14
Penicilina G. ao testar
Estafilococos
Penicilina G. ao testar outros
microorganismos
Penicilina G.
PN
10 un.
< 20
21-28
> 29
PN
10 un.
< 11
12-21
> 22
PL
500 un.
<8
0-11
> 12
Polimixina
-
-
8
09-11
 12
Sulfa-Trimetropim
STX
30 mcg
 10
11-15
 16
Sulfazotrim (Sulfamotoxazol +
Trimetoprim)
Sulfonamidas
SFT
25 mcg
 10
11 -15
 16
SF
300 mcg
 12
13-16
 17
Tetraciclina
TT
30 mcg
 14
15-18
 19
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Tobramicina
TB
10 mcg
 12
13-14
 15
Vancomicina
VC
30 mcg
9
10-11
 12
O Nutricionista deve conhecer bem a funcionalidade dos antibiogramas e dos
antibióticos que são utilizados para o tratamento de infecções a partir do conhecimento à
sensibilidade das bactérias aos mesmos, para então acompanhar a dieta do indivíduo, fazendo as
devidas modificações necessárias devido as inúmeras interações fármaco-nutrientes e a
biodisponibilidade dos fármacos, sem esquecer as possíveis deficiências de vitaminas e minerais
que podem vir a acontecer devido as introdução de alguns antibióticos.
3) Objetivos
Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de conceituar antibiograma
(TSA) e identificar os grupos ou quadros clínicos nos quais o antibiograma é indicado; diferenciar
os métodos de diluição (CIM ou MIC) do método de difusão e descrever as etapas para a realização
deste último; compreender a influência de alguns fatores no diâmetro do halo e inibição; ler e
interpretar resultados possíveis de um antibiograma; citar alguns grupos microbianos aonde o TSA
deve ser feito através de outras técnicas.
4) Material
- Cultura bacteriana
- Tubo com solução salina estéril
- Swab estéril
- Tubo no 0,5 da escala de Mac Farland
- Pipeta estéril
- Placa de agar Muller-Hinton
- 4 discos de antibióticos diferentes
- Pinça
- Régua graduada
5) Execução
a) ajustar a densidade do inoculo acrescentando a cultura à solução salina até esta se
igualar à turvação do tubo 5 da escala de Mac Farland
b) embeber o swab na suspensão bacteriana padronizada e inocular na placa Muller-Hinton de
modo a obter um crescimento confluente
c) após a placa absorver o inoculo (+/- 10’) colocar com o auxílio da pinça os discos de
antibióticos, pressionando levemente cada disco para que este fique aderido ao meio.
Deixar entre eles e deles à borda da placa um espaço não inferior a 15 mm
d) incubar 18-24 horas a 35o C, sendo que a placa se encontra invertida
e) medir com régua o diâmetro do halo de inibição, comparar com os dados da tabela e
expressar seus resultados.
NOTAS:
1. Leituras de 4 a 6 horas poderão ser feitas em caso de emergência, mas leituras
definitivas deverão ser feitas somente após o tempo estipulado.
Proceder as leituras dos halos de inibição com o auxílio de uma régua, e interpretar os
resultados de acordo com a tabela.
2. Não usar sinais para expressar os resultados. Usar as letras: "S" para os organismos
sensíveis e "R" para os organismos resistentes.
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Um halo de inibição maior que o outro não indica propriamente uma maior atividade
do antibacteriano sobre o organismo em teste. Outros fatores, tais como, carga antibiótica,
difusibilidade, etc., intervêm na formação dos halos. Portanto, deve ser utilizada a tabela na
interpretação dos resultados.
3. Atualmente, no intuito de minimizar erros de interpretação, considera-se a
sensibilidade intermediária como resistente.
6) Resultados e Observações
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Assunto 6: Cocos Gram-Positivos I, II e III
I- Staphylococcus
1) Introdução
Os estafilococos são cocos Gram-positivos, catalase positiva, que tendem a formar
agrupamentos semelhantes a cachos de uva, devido aos seus arranjos irregulares. São bactérias
anaeróbias facultativas de fácil crescimento. São amplamente distribuídos na natureza e fazem parte
da microbiota normal da pele e mucosas de mamíferos e aves (encontrados principalmente na
mucosa da nasofaringe).
De todas as espécies existentes, se destacam em patologias humanas o Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus e Staphylococcus haemolyticus.
Staphylococcus aureus representa a espécie que está geralmente envolvida em infecções
humanas (de origem comunitária e hospitalar) e apresenta uma freqüência de 30 a 40% de
portadores na população.
2) Importância
Por poderem causar intoxicações alimentares em função da produção e liberação no
alimento de uma ou mais enterotoxinas, S. aureus é uma das bactérias motivo de grande
preocupação do Nutricionista. O papel de portadores sadios desta bactéria é essencial na
contaminação do alimento. O risco associado a manipuladores de alimentos portadores desta
bactéria é grande. Apesar da bactéria ser facilmente destruída pela ação do calor (60 0 C por 5
minutos), suas enterotoxinas são termoestáveis, resistindo a 100o C por 30 minutos. Isso significa
que mais importante do que matar a bactéria, o profissional deve se preocupar em evitar a
contaminação desses alimentos.
3) Fundamentação Teórica
São membros da família Micrococcaceae constituída de várias espécies, sendo três de
maior interesse humano (S. aureus, S. epidermidis e S. saprophyticus). São microrganismos
esféricos, imóveis, Gram positivos que crescem em cachos. Causam diferentes doenças supurativas
tais como: furúnculo, impetigo, osteomielite, abscessos de tecido, pneumonia, meningite, artrite
purulenta... . Algumas amostras (S. aureus) produzem uma "enterotoxina" que provoca um quadro
agudo de intoxicação alimentar, enquanto outras (S. aureus e S. saprophyticus) causam infecções do
trato urinário. São membros normais da microbiota anfibiôntica da pele e membranas mucosas.
São inibidos pela presença de corantes do tipo azul de metileno e violeta de genciana.
Crescem em meio de agar simples, agar-sangue e Chapman. Suas colônias são redondas, elevadas,
opacas e de coloração amarelo dourado a branca. Crescem bem em presença de altas concentrações
de NaCl, sendo este um fator de estimulação da produção da coagulase. O meio Chapman é seletivo
porque contém 7,5% de NaCl, é indicador porque possui manitol e o indicador vermelho de fenol;
as colônias fermentadoras do manitol são amarelas após 24, 48 horas de incubação a 37º C. Após o
crescimento de colônias típicas, fazemos a coloração de Gram para observarmos a presença de
cocos Gram positivos dispostos em grupos ou isolados.
Diferenciamos o Staphylococcus do Streptococcus através da prova da catalase, e para
identificar a espécie, utilizamos a prova de fermentação do manitol, da coagulase, DNAse,
sensibilidade à novobiocina e redução de nitrato.
PROVAS BIOQUÍMICAS:
a. Prova da Catalase
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A prova da catalase se destina a verificação da presença da enzima catalase. A prova
pode ser efetuada com o crescimento bacteriano obtido em qualquer meio de cultura, exceto meios
com sangue pois este possui catalase, levando a resultados falso-positivos. A catalase é uma enzima
que decompõe o peróxido de hidrogênio com formação de água e oxigênio molecular. A verificação
da produção dessa enzima por determinada bactéria pode ser feita adicionando-se peróxido de
hidrogênio (H2O2 a 30%) a cultura em meio sólido ou líquido, e verificando-se desprendimento de
bolhas gasosas (O2). Na ausência de catalase, não há decomposição do peróxido. Uma leitura da
prova de catalase pode ser feita de maneira cuidadosa a partir de um crescimento em agar-sangue da
seguinte maneira: adiciona-se primeiramente uma gota de peróxido em uma área do meio
desprovida de crescimento e em seguida sobre uma colônia a ser testada. Considera-se positivo
apenas se o borbulhamento foi mais rápido e intenso sobre a colônia.
b. Fermentação do Manitol
A prova verifica a capacidade do microrganismo em fermentar (degradar) o manitol,
produzindo ácido e virando o meio de vermelho para amarelo (o indicador é o vermelho de fenol).
O resultado deste teste é observado no maio de Chapman ou A. Manitol Salgado. Quando a colônia
é isolada em Ágar sangue pode-se fazer o teste em meio específico não seletivo.
Interpretação: Positivo  meio amarelo
Negativo  meio ianlterado (laranja) ou alcalino (vermelho)
c. Prova da Coagulase
A prova da coagulase verifica a capacidade do microrganismo em coagular o plasma
através da enzima coagulase.
A coagulase estafilocócica se apresenta em duas formas; coagulase ligada e coagulase
livre.
A coagulase ligada converte fibrinogênio em fibrina diretamente, sem o envolvimento
dos fatores de coagulação, e pode ser detectada em teste direto em lâmina, utilizando-se da
suspensão de Staphylococcus acrescida de 2 gotas de plasma citratado, fazendo movimentos
circulares e observando-se a formação de coágulo no tempo de 1-2 minutos. Pode se tornar mais
sensível o teste em tubo, por este detectar tanto coagulase livre como coagulase ligada, sendo a
prova de escolha.
A coagulase livre reage com o fator de coagulação do plasma, o CRF, formando uma
substância semelhante, mas não idêntica à trombina, que converte fibrinogênio em fibrina. Para o
teste utilizamos plasma citratado humano ou de coelho, estéril, diluído na proporção 1:5 em solução
salina; a reação ocorre volume a volume (0,5ml de plasma + 0,5 ml da cultura) a 37º C.
Estudos recentes demonstraram que a produção da enzima coagulase se intensifica
quando o germe é crescido em meio contendo alta concentração de NaCl. Desta forma, aconselha-se
a utilização de colônias para a prova, crescidas em agar manitol salgado, este procedimento
aumentaria a sensibilidade do teste.
Semear uma alçada do germe em estudo em um tubo contendo o plasma diluído e
incubar a 37º C. Devem ser feitas leituras periódicas a cada1/2 hora por um período de até 4 horas e
uma leitura fianl após 24 horas, pois algumas espécies produzem também fibrinolisina, que dissolve
o coágulo formado. A menor coagulação é considerada prova positiva. Aconselha-se, também
utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus, previamente conhecida, como
comprovação do teste.
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d. Prova da DNAse
Utilizando-se meio contendo DNA distribuídos em placas de Petri, fazer no centro
superfície do agar um ponto de semeadura ("spot") com a bactéria em estudo. Incubar a 35-37º C
por 18 a 24 horas. Gotejar sobre o crescimento bacteriano, ácido clorídrico 1N e aguardar a
turvação do meio, decorrente da precipitação do DNA íntegro. Caso o teste se apresente positivo,
deverá ser observado um halo claro ao redor do repique, correspondendo à área onde houve
degradação do DNA pela ação da DNAse bacteriana..
e. Sensibilidade a Novobiocina
Semear a cultura suspeita em placa de agar Mueller-Hinton com swab, para se obter o
crescimento confluente, e adicionar o disco de novobiocina (5g/mL). Incubar a 37º C por 24 horas.
As bactérias sensíveis apresentarão um halo de inibição, enquanto que as resistentes não.
Interpretação das Provas Bioquímicas
Provas Bioquímicas
Cocos Gram-positivos
Pigmentação Colonial
Catalase
Coagulase
Fermentação do Manitol
DNAse
Sensibilidade a Novobiocina
Redução de Nitratos
S. aureus
+
Amarela ou
Branca
+
+/+
+
R
S. epidermidis
+
Branca
S. saprophyticus
+
Branca
+
S
+
+
R
-
4) Anotações
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II - Streptococcus
1) Introdução
Os estreptococos são cocos Gram-positivos, catalase negativo, que tendem a formar
agrupamentos em cadeia. Fazem parte da microbiota normal (sendo encontrados principalmente na
orofaringe), apesar disso, muitos deles são responsáveis por uma variedade de manifestações
clínicas, sendo considerados importantes agentes infecciosos tanto para o homem quanto para os
animais. A maioria necessita de meios enriquecidos, geralmente pela adição de sangue para o
crescimento.
O sistema de nomenclatura é baseado principalmente em características hemolíticas, de
acordo com o tipo de hemólise observada em meios contendo sangue (existindo também outros
testes para a classificação). Nesse sentido verificam-se três tipos de hemólise: alfa, beta e gama.
2) Fundamentação Teórica
O gênero apresenta espécies de interesse médico como: Streptococcus viridans,
Streptococcus beta hemolíticos do Grupo A (S. pyogenes) e do grupo B (S. agalactiae) e
Streptococcus pneumoniae. Os enterococos pertencem atualmente a um gênero separado e
possuem características peculiares (ver abaixo). Apresentam-se em forma de cadeia ou em pares, e
são Gram positivos.
Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou de
enriquecimento. O meio de seletivo específico para estreptococos mais usado é o caldo
Hitchens-Pike, seletivo por apresentar azida sódica e cristal violeta. Um meio alternativo para
enriquecimento é o caldo tioglicolato de sódio, adequado para o crescimento de bactérias, inclusive
aquelas microaerófilas e anaeróbias.
O meio clássico de isolamento de estreptococos é o agar sangue aonde pode-se observar
o perfil hemolítico dos mesmos.
Os estreptococos alfa-hemolíticos apresentam zonas de hemólise, possuindo hemácias
íntegras na parte mais interna junto a colônia, e hemólise maior na parte mais externa.
Freqüentemente, aparece uma coloração esverdeada na área de hemólise (devido a alteração da
hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da célula bacteriana e conseqüente liberação de biliverdina e
bilirrubina), que originou a qualificação "estreptococos do grupo esverdescente" ou Streptococcus
viridans. Os Streptococcus pneumoniae, principais agentes baterianos de penumonia, apresentam
hemólise alfa, uma colônia puntiforme com um aprofundamento no ápice da colônia (parecendo um
pequeno vulcão).
Os estreptococos beta-hemolíticos produzem uma zona de hemólise total, não se
observando hemácias íntegras (microscópio óptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes
apresenta dois tipos de hemolisinas O e S. A hemolisina O é destruída pela ação do oxigênio
atmosférico e, portanto, só demonstrada em colônias crescidas em profundidade no agar-sangue. A
hemolisina S é estável ao oxigênio do ar e produz hemólise mesmo nas colônias crescidas na
superfície do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam hemolisina O, se
torna necessária a semeadura do germe pela técnica em profundidade ("pour-plate") , ou a
realização de perfurações ("stabs") nos quadrantes de esgotamento ou a incubação em tamosfera
pobre em oxigênio (técnica da jarra com vela).
Os estreptococos gama não produzem hemólise, são anemolíticos, isso significa que não
têm capacidade lítica nenhuma sobre as hemácias. Muitas das espécies saprófitas são deste grupo.
As colônias de estreptococos isoladas em agar sangue são puntiformes (< 1mm de
diâmetro), transparentes à luz transmitida e peroladas à luz refletida. Os estreptococos são negativos
na prova de catalase o que os diferencia dos estafilococos (ver acima).
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Na identificação de estreptococos além do perfil hemolítico, a determinação do Grupo
Lancefield (carboidrato antigênico de parede) é importante. No entanto, em função do custo desta
investigação outras provas auxiliares são realizadas para a identificação das principais espécies. O
esquema abaixo apresenta estas provas:
Streptococcus (catalase -)
Hemólise 
Hemólise 
Optoquina
Hemólise 
Bacitracina
ou
Crescimento a 56ºC
Crescimento em meio Chapman
Crescimento em meio agar EMB
Bile solubilidade
+
-
Streptococcus
pneumoniae
Streptococcus
viridans
Sensível
(+)
Resistente
(-)
Streptococcus
pyogenes
Outros
Streptococcus
Grupo A
Não Grupo A
Enterococcus
(Streptococcus faecalis)
[classificação antiga]
 Provas
1. Sensibilidade à optoquina
Colocar um disco de optoquina na superfície do agar-sangue (pode-se incluir no
antibiograma). Havendo impedimento do crescimento das colônias ao redor do disco de optoquina
(2 cm de diâmetro), trata-se de teste positivo.
2. Bile solubilidade
A prova é realizada conforme esquema que se segue:
a. A 1,0 mL de cultura em caldo, adicionar uma gota de vermelho de fenol.
b. Acertar o pH em aproximadamente 7,5 com NaOH 0,1N (cor rósea).
c. Adicionar aproximadamente 4 gotas de desoxicolato de sódio ou bílis. Incubar
juntamente com um tubo sem bílis a 37º C por 3 horas.
 Clareamento  positivo
 Inalterado  negativo
3. Bacitracina
Utilizar discos impregnados com bacitracina (0,04 U) colocados na superfície do meio
de cultura semeado com o germe em estudo (pode-se incluir no antibiograma) e incubar a 35-37º C
por 24 horas em atmosfera de baixo teor de O2.
 Grupo A  sensível a bacitracina
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 Demais grupos  resistentes
4. Crescimento a 56º C
Para evitar dúvidas entre estreptococos e enterococos (Streptococcus faecalis), submeter
a cultura a um aquecimento de 56º C por 30 minutos. Somente os enterococos resistem a esse
tratamento.
5. Crescimento em meio de Chapman
Os enterococos toleram altas concentrações de NaCl, como acontece com os estafilococos.
6. Crescimento em agar EMB
Os enterococos suportam a presença de corante, como o azul de metileno.
.
3) Anotações
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III- Execução prática
1) Objetivos
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Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de compreender o papel dos
manipuladores de alimentos como potenciais reservatórios de S. aureus produtores de
enterotoxinas; caracterizar e compreender o modo de ação dos meios utilizados para o isolamento
de Staphylococcus (Chapman ou A. Manitol Salgado) e Streptococcus (Agar Sangue); caracterizar e
compreender as provas básicas de identificação e diferenciação de Staphylococcus e Streptococcus
(catalase, coagulase e DNAse), compreendendo o mecanismo de ação destas.
2) Material
1a aula: swabs estéreis, tubo com solução salina, Agar Chapman, Meio de Tioglicolato
(ou de Hitchens-Pike).
2a aula: Agar sangue, Caldo simples ou BHI, Agar inclinado, Agar DNAse, dessecador
com vela.
3a aula: reativo para catalase (H2O2), reativo para DNAse (HCl 1N), reativo para
coagulase (plasma sangüíneo), tubo controle positivo, lâminas e conjunto de
coloração de Gram.
3) Execução
1a aula: a) inocular o meio Chapman com material colhido das fossas nasais com o
auxílio de swab previamente umedecido em solução salina estéril.
ATENÇÃO: técnica de esgotamento em estria!
b) inocular o meio de Tioglicolato com material colhido da orofaringe com o auxílio de swab
previamente umedecido em salina estéril
c) incubar a 37o C por 24 horas
2a aula: a) observar o crescimento típico ou não de S.aureus no meio de Chapman e
inocular colônia isolada em caldo BHI, Agar DNAse e Agar inclinado
b) inocular por esgotamento o crescimento do meio Tioglicolato em placas de
Agar sangue e incubar em microaerofila pela técnica da vela
c) incubar a 37o C por 24 horas
3a aula: a) utilizando os reativos próprios, fazer as leituras das provas de catalase,
DNAse e coagulase
b) caracterizar a presença de colônias típicas de Streptococcus e seu eventual
padrão hemolítico no meio de Agar sangue
c) preparar lâminas contendo crescimento de Agar inclinado (Staphylococcus) e
Agar sangue ou Tioglicolato (Streptococcus), corar pelo método de Gram e
observar em microscopia.
4) Resultados e Anotações
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Assunto 7: Coloração de Ziehl-Neelsen / Visualização de Bactérias Espiraladas
1) Introdução
A coloração de Ziehl-Neelsen é o método mais utilizado para a visualização de
micobactérias. A presença de bacilos álcool-ácidos resistentes no escarro é forte sugestão de
tuberculose pulmonar, o encontro de micobactérias nas secreções nasais, sangue colhido do lóbulo
da orelha ou material colhido da própria lesão indica o diagnóstico da lepra (Mycobacterium
leprae); o Mycobacterium bovis é causador da tuberculose no gado bovino, tendo grande
importância para a Nutrição, pois pode ser transmitido ao homem através de alimentos como o
leite não-pasteurizado de vacas tuberculosas, causando a tuberculose zoonótica no homem. As
micobactérias penetram pela mucosa da orofaringe e do trato digestivo chegando aos nódulos
mesentéricos e a partir daí pode se disseminar para outros tecidos e órgãos, quando inaladas podem
provocar tuberculose pulmonar idêntica à causada pelo Mycobacterium tuberculosis.
Faz parte da prática do Nutricionista conhecer o assunto e atentar para a importância na
orientação do consumo de leite pasteurizado, de origem conhecida e inspecionado, pois as infecções
causadas por essas bactérias são graves.
Muitas bactérias espiraladas estão associadas a doença humana: Leptospira
(leptospirose); Treponema (sífilis) e Borrelia (doença de Lyme). Como são microrganismos muito
delgados e recobertos por uma bainha proteica, a coloração de Gram não é útil na sua visualização.
Para tanto são empregados métodos de impregnação com sais de prata (método de
Fontana-Tribondeau) que permite sua observação em microscopia de campo claro e a observação
direta em microscopia de campo escuro.
2) Fundamentação Teórica
O gênero Mycobacterium contém grande número de espécies, as patogênicas de maior
importância para o homem são Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis e
Mycobacterium bovis. Com exceção da Mycobacterium leprae, as micobactérias podem ser
cultivadas em laboratório (in vitro), em meio de cultura seletivo.
São bacilos finos, diferentes das demais bactérias em várias propriedades, a começar
pela parede celular que é composta de ácidos graxos (ácidos micólicos) e ceras (ésteres de ácidos
graxos); as micobactérias são aeróbias estritas, no organismo costumam atacar preferencialmente
lugares onde há mais oxigênio, pulmão, rim, terminações de ossos longos. A velocidade de
crescimento e a temperatura ótima para esse crescimento são variáveis. São bactérias intracelulares
facultativos que proliferam no interior de macrófagos, são álcool-ácidos resistentes, esta expressão
significa que essas bactérias quando coradas pela fucsina não se deixam descorar por uma mistura
de álcool e ácido clorídrico, isso decorre da firme fixação da fucsina a certos lipídeos da parede e
provavelmente devido a riqueza em lipídeos. São bactérias mais resistentes ao hidróxido de sódio,
ácido sulfúrico e a certos antissépticos.
Para a visualização de bactérias espiraladas pode-se utilizar um artifício que aumenta a
espessura das mesmas permitindo assim a sua observação. Isto é conseguido através da
impregnação da superfície da bactéria com sais de prata que uma vez aquecidos sofrem oxidação e
conseqüente escurecimento. A utilização de microscopia de campo escuro também permite a
visualização direta das bactérias. O campo escuro é conseguido pelo uso de um condensador
especial que faz com que os raios luminosos penetrem na objetiva apenas pelos seus bordos de
modo que a iluminação das partículas se faça por reflexão e não transmissão. Desse modo apenas as
partículas presentes são iluminadas contrastando com um findo escuro. Através desta visualização
se faz possível inclusive a realização do diagnóstico por soroaglutinação microscópica
(microaglutinação) na leptospirose.
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3) Objetivo
Após realizar a atividade da prática você deverá ser capaz de executar a técnica da coloração de
Zihel Neelsen; diferenciar a coloração de Zihel Neelsen da coloração de Gram; relacionar a
composição química da parede celular das micobactérias com os corantes de Zihel; diferenciar
BAAR e BNAAR; comprender o princípio do método de Fontana Tribondeau; diferenciar
microscopia de campo claro e campo escuro e associar a importância desta última na observação de
espiroquetas.
.
4) Material
- Lâminas com esfregaços fixados de escarro de paciente com tuberculose
- Bateria de coloração de Zihel Neelsen (fucsina de Zihel, azul de metileno, mistura de
álcool (97%) e ácido clorídrico (3%), água, papel de filtro, óleo de cedro)
- Microscópio
- Bico de Busen
5) Execução
A)
Cobrir o esfregaço seco com solução de fucsina fenicada
B) Aquecer em chama até a emissão de vapores. A partir disto, manter aquecimento
intermitente, evitando que o corante entre em ebulição, durante 5 minutos
C) Lavar rapidamente em água
D) Lavar (diferenciar) a lâmina (inclinada a 45 o ) com álcool - ácido clorídrico até que
não se desprenda mais corante (aproximadamente por 2 minutos)
E) Lavar com água
F) Cobrir o esfregaço com azul de metileno durante 30 segundos
G) Lavar com água, secar entre duas folhas de papel de filtro
H) Observar à microscopia de imersão
6) Resultados
As micobactérias se coram mal pelo método de Gram. No método de Zihel-Neelsen elas
permanecem coradas, por serem BAAR, com tonalidade vermelha, enquanto as outras estruturas e
bactérias se mostram azuis.
Pelas normas estabelecidas pela Campanha Nacional contra Tuberculose, a interpretação
da lâmina pode ser:
Negativo (-)
Positivo (+)
Positivo (++)
Positivo (+++)
ausência de BAAR em 100 campos microscópicos
menos de 1 bacilo/campo em 100 campos
1 a 10 bacilos/campo em 50 campos
mais de 10 bacilos/campo em 20 campos
7) Observações
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Assunto 8: Bacilos Gram Negativos I, II e III
1) Introdução
Dentre os bacilos Gram negativos a família Enterobacteriaceae se apresenta como a de
maior importância para a prática de Nutrição uma vez que inclui a maioria dos agentes
enteropatogênicos e microrganismos indicadores muito utilizados na avaliação de alimentos. O
enfoque da prática será portanto centrado nas bactérias desta família.
2) Fundamentação teórica
A pesquisa de enteropatógenos em alimentos normalmente requer várias etapas para que
seja possível o isolamento do mesmo. O enteropatógeno mais investigado em alimentos é
Salmonella. A legislação prevê a ausência deste patógeno em 25g da amostra.
Normalmente a pesquisa de Salmonella envolve as seguintes etapas:
a) pré-enriquecimento: feito em meio líquido não seletivo, visa permitir a recuperação de
bactérias injuriadas como conseqüência de algum processamento realizado no alimento
(congelamento, salga, etc...): meio usadocaldo latosado
b) enriquecimento seletivo: feito em meios líquidos seletivos, visa aumentar a proporção de
Salmonella em relação ao restante da microbiota e facilitar seu posterior isolamento:
meios usados caldo tetrationato, caldo selenito.
c) plaqueamento seletivo: em meios seletivo-indicadores sólidos, é a fase de isolamento.
Uma grande diversidade de meios foi desenvolvida para este fim. A maioria deles
apresenta lactose como açúcar de diferenciação: meios usados  agar EMB (Teague); a.
MacConkey; a. Hektoen; a. SS, etc...
d) triagem: visa uma identificação preliminar de colônias suspeitas selecionadas nos meios
de isolamento, utilizando um ou dois meios que permitem a realilzação de 2 ou mais
provas bioquímicas simultaneamente: meios usados a. TSI (ferro-três açúcares); a.
LIA (lisina-ferro).
e) confirmação bioquímica: visa uma identificação completa do gênero atrtavés de uma
série de provas bioquímicas: produção de urease em caldo uréia; determinação do tipo de
fermentação da glicose - provas VM e VP em caldo glicosado; utilização do citrato em
agar Citrato de Simons; produção de indolem água peptonada ou triptonada; motilidade
am meio semi-sólido; etc...
f) confirmação sorológica: visa confirmar a identificação através de uma reação de
aglutinação utilizando um antissoro polivalente contrra o antígeno O de Salmonella .
3)Objetivos:
Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de:
1- Compreender o papel das enterobactérias como agentes de toxinfecções alimentares;
2- Caracterizar e compreender o modo de ação dos meio de Teague (ou EMB) utilizado
para o isolamento de bacilos gram negativos, diferenciando o crescimento de fermentadores e não
fermentadores da lactose;
3- Citar outros meios utilizados no isolamento de enterobactérias;
4- Caracterizar as provas básicas de triagem e confirmação bioquímica para identificação e
diferenciação de enterobactérias compreendendo seu mecanismo de ação.
4)Material:
1a. aula: tubo de caldo triptcase soja (TSB) com crescimento de enterobactéria; placa de ágar EMB;
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2a. aula: ágar TSI, ágar Citrato de Simmons, ágar SIM, caldo (água) triptonada; caldo MR-VP
(glicosado tamponado) [2 tubos]; caldo uréia, caldos de fermentação com glicose (e tubo
de Durhan), lactose e manitol;
3a. aula: Reativo para indol (Kovac’s= paradimetilaminobenzaldeído); reativo para VM
(vermelho de metila), reativos para VP (VP1= -naftol; VP2= KOH)
5)Execução:
1o. dia a)inocular o meio de EMB com a cultura de TSB ATENCÃO: técnica de esgotamento
em estria !;
2o. dia b) observar o crescimento obtido: anotar as características das colônias e comparar com os
dados da tabela abaixo;
Característica colonial
Gêneros (ou espécies)
- colônias transparentes ou de cor âmbar
Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia
- colônias com brilho verde metálico à luz Escherichia coli
refletida e centro negro à luz transmitida
- colônias maiores que as de E. coli , Enterobacter, Klebsiella
mucosas, confluentes, com centro escuro à
luz transmitida
c) inocular os meios de triagem e confirmação bioquímica da seguinte forma:
- TSI e: picada central na coluna ou base e estria na superfície inclinada (agulha);
- SIM: picada central até o meio do tubo (agulha);
- citrato: estria reta na superfície (agulha);
- caldo uréia, caldo triptonado, caldos MR-VP e caldos de fermentação: repique com alça
(difusão)
3o.dia
d) utilizando os reativos próprios, quando necessário, e segundo orientação do professor,
fazer as leituras das provas bioquímicas e conferir de acordo com a tabela a seguir,
procurando identificar a enterobactéria estudada:
Gênero
GLI
LAC MAN
H2 S
MOT
IND
CIT
VM
VP
URE
Salmonella
+
-
+
+
+
-
+
+
-
-
Escherichia
+
+
+
-
+
+
-
+
-
-
Klebsiella
+
+
+
-
-
-
+
-
+
+
Proteus
+
-
-
+
+
+/-
+/-
+
-
+
6) Resultados e anotações:
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Assunto 9: Contagem em Placas e Número mais Provável (NMP)
1) Introdução
A quantificação de bactérias em alimentos, materiais, manipuladores, equipamentos,
bancadas e água é uma das formas de se avaliar a sua qualidade, permitindo a caracterização dos
mesmos como apropriados ou não para consumo ou utilização. Representa pois uma forma de
avaliação do risco que estes representam à saúde.
Basicamente há duas formas de se proceder a uma quantificação de bactérias. A
contagem de colônias em placas é uma técnica quantitativa direta aonde cada colônia crescida
numa placa de ágar corresponde a uma unidade formadora de colônia [UFC] (na maioria das vezes
uma única bactéria) proveniente do material.
A técnica do número mais provável é um método indireto de contagem em meio líquido
aonde a partir de uma evidência da presença de uma bactéria ou grupo de bactérias é possivel se
estimar o número mais provável (NMP) desta no material analisado.
Dentre os muitos microrganismos que podem ser quantificados incluem-se: contagem
total de bactérias, coliformes, Staphylococcus coagulase positiva, Bacillus cereus, etc.
2) Fundamentação Teórica

Colimetria
A água é elemento fundamental para a sobrevivência humana. Sua grande utilização no
abastecimento público, na recreação, na indústria, no uso doméstico atesta essa importância vital.
Uma alternativa para a avaliação da qualidade sanitária da água é a pesquisa de organismos
não patogênicos constituintes da microbiota normal das fezes de animais de sangue quente, que
quando encontrados indicam a ocorrência de contaminação fecal, evidenciando o risco da presença
de patógenos. Fezes humanas contém de 20-30% de resíduos alimentares não digeridos, sendo o
restante constituído de água e bactérias. No indivíduo saudável essas bactérias constituem os
habitantes normais do intestino, onde a Escherichia coli é a representante característica. O número
desses microrganismos pode atingir 109 células/g de fezes. Assim, a presença de Escherichia coli
em alimentos e água é indicativo de contaminação fecal e possibilidade de presença de patógenos
entéricos.
Microrganismos indicadores de poluição de água são utilizados para monitorar, classificar e
restringir o uso das águas. Um indicador ideal deveria preencher os seguintes critérios:
- Ser aplicável a todos os tipos de água;
- Estar presente simultaneamente com os microrganismos patogênicos, com um tempo de
sobrevivência igual àquele patógeno entérico mais resistente;
- Não reproduzir-se em águas contaminadas, para não resultar em valores aumentados.
Não se conhece nenhum microrganismo ou grupo de microrganismos que atenda a todos esses
requisitos, mas há vários que se aproximam das exigências referidas e que são muito
úteis.
As bactérias empregadas como indicadoras de poluição fecal em águas são: os coliformes
totais, coliformes fecais, estreptococos fecais e o Clostridium perfringens. Contagens de Salmonella
e de bactérias do gênero Bifidobactérias têm sido propostas. O indicador microbiológico mais
empregado é o grupo dos coliformes. Este e outros indicadores de poluição orientam a margem de
segurança sanitária de água potável, da água utilizada para fins recreativos e dos cultivos de
organismos marinhos comestíveis.
A Organização Mundial de saúde (OMS) recomenda para águas de recreação um
máximo de 100 coliformes fecais por 100 mL de água.
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- COLETA DE AMOSTRAS
A coleta de amostras para exame microbiológico deve ser feita em garrafas
esterilizadas que tenham sofrido tratamento prévio de limpeza e rinsagem com água destilada.
 Água clorada: adiciona-se 0,1 mL de tiossulfato de sódio 10% para cada 250 mL de
água para neutralizar-se o cloro livre presene, impedindo que continue com propriedades
desinfetantes entre o período da coleta e o momento da inoculação.
 Água com alto teor de zinco e cobre: coletar na presença de um agente quelante, de
forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais (0,3 mL de EDTA a 15%, pH = 6,5 para cada
120 mL de água).
Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espaço livre na garrafa (cerca de
2,5 cm) para facilitar a homogeneização antes da inoculação. As garrafas devem ser mantidas
vedadas até o momento da coleta da amostra e deve-se tomar todos os cuidados de assepsia no
momento da coleta, de forma a evitar-se contaminações secundárias.
- PONTO DE COLETA
1. Água da torneira
a. Abrir a torneira e deixar a água correr por 5 minutos, para eliminar as impurezas e a água
acumulada na tubulação.
b. Com algodão embebido em álcool, passar na abertura e internamente e em seguida
flambar.
c. Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos.
d. Abrir o frasco esterilizado e coletar a água. Introduzir água no frasco até cerca de ¾ do
seu volume.
e. Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratório.
2. Poços e Cisternas
a. Preparação do frasco - amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com um barbante
para facilitar a descida no poço.
b. Descer o frasco dentro do poço sem permitir que o mesmo toque nos lados.
c. Submergir o frasco completamente na água.
d. Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da água para criar um
espaço de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.
3. Rios, Lagoas e Mares
a. Coleta da amostra de água de rios e lagoas - nestes casos, deve-se mergulhar o frasco até
uma profundidade de 20cm, com a abertura voltada em direção contrária a corrente, a
fim de evitar a contaminação da água com as mãos.
b. Coleta da água do mar - a coleta deve ser feita na região onde as pessoas costumam
banhar-se, que corresponde à profundidade aproximada de 1,0m, que é a região das
praias mais utilizada para a recreação de contato primário, na maré baixa e 24 horas sem
chuvas.
- ACONDICIONAMENTO E TRANSPORTE DA AMOSTRA PARA O LABORATÓRIO
O ideal é a análise iniciar-se até 1 hora após a coleta. Caso isto seja impossível, a
amostra deve ser transportada sob refrigeração. A amostra deve ser mantida entre 4 a 10º C no
prazo máximo de até 30 horas após a coleta.
Amostras presumivelmente poluídas têm de ser inoculadas no máximo após 6 horas da
coleta.
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO BIOMÉDICO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
CURSO: NUTRIÇÃO
Entre o recebimento da amostra e o início da inoculação, a mesma deve ser mantida em
geladeira (cerca de 5ºC).
- EXAMES BACTERIOLÓGICOS DA ÁGUA
O exame bacteriológico da água é feito através de dois processos: Contagem de bactérias
heterotróficas viáveis na água e determinação ou estimativa do número de bactérias coliformes.
A metodologia padrão empregada no exame bacteriológico da água, para medida do
grupo coliforme, inclui a técnica dos tubos múltiplos (NMP).
- DETERMINAÇÃO DE COLIFORMES PELA TÉCNICA DOS TUBOS MÚLTIPLOS - NÚMERO MAIS PROVÁVEL
(NMP)
A técnica do número mais provável consiste no exame de uma série de tubos onde foram
inoculados volumes diferentes de amostra.
O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em fórmulas
de probabilidade. Considerações teóricas e determinações repetidas em grande escala, indicam que
este tipo de técnica tende a fornecer valores mais elevados do que o número real. As disparidades
tendem a diminuir quando adota-se séries com maior número de tubos em cada diluição. Portanto, a
sensibilidade do teste depende do número de tubos adotados.
Existem várias tabelas de NMP e a escolha da série a ser adotada é função das características
microbiológicas da amostra.
TABELA DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP)
Tubos Positivos por:
NMP para 100 mL
10 mL
1 mL
0,1mL
3 tubos
0
0
0
0
1
1
1
1
1
2
0
0
1
2
0
0
1
1
2
0
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
<3
3
3
6
4
7
7
11
11
9
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
1
2
2
3
0
0
0
1
1
0
1
0
1
0
0
1
2
0
14
15
20
21
28
30
23
39
64
43
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DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
CURSO: NUTRIÇÃO
3
3
3
3
3
3
3
3
3
1
1
2
2
2
3
3
3
3
1
2
0
1
2
0
1
2
3
75
120
93
150
210
240
460
1100
>2400
- Teste Presuntivo
Inocular, após a escolha da tabela, em tubos contendo caldo lauril sulfato triptose ou
caldo de lactose em concentrações dupla ou simples. Os tubos devem conter tubos de Durham.
Incubar a 35  2ºC por 24 + 24 horas.
O crescimento com formação de gás significa teste presuntivo positivo para coliformes
totais. Os tubos que não apresentarem formação de gás com 24 horas de incubação, devem ser
incubados até 48 horas.
Os tubos positivos com 24 horas devem ser imediatamente inoculados nos meios de
confirmação para se evitar que um crescimento muito abundante provoque o abaixamento do pH, o
que pode provocar resultados falsamente negativos.
- Testes de Confirmação
Coliformes Totais
A partir dos tubos com formação de gás, semear por alçada (diâmetro = 3 mm) em tubos
contendo caldo bílis verde brilhante. Incubar a 35  0,5º C por 48  3 horas.
A formação de qualquer quantidade de gás constitui teste positivo para coliformes totais.
Coliformes Fecais
Dos tubos positivos dos testes presuntivos, transferir com uma alça de platina uma
pequena porção do meio para igual número de tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a 44,5 
0,2º C por 24 horas.
A presença de gás no interior dos tubos de Durhan é considerada reação positiva,
indicando contaminação de origem fecal.
A ausência de gás, mesmo com evidência de crescimento indica a presença de
coliformes de outra fonte que não intestinos de animais de sangue quente.
- Teste Completo
A partir dos tubos positivos de caldo bílis verde brilhante ou caldo EC, semear por
estrias em placas contendo endo agar ou eosina azul de metileno agar (agar EMB). Incubar a 35 
0,5ºC por 24  2 horas.
Colônias típicas: Meio endo agar - colônias vermelhas
Meio agar EMB - colônias verdes com centro escuro.
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARASITOLOGIA
DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
CURSO: NUTRIÇÃO
De cada placa, escolher uma ou mais colônias típicas e bem isoladas; transferir cada
colônia para tubos contendo caldo de lactose ou caldo lauril sulfato triptose e para um tubo
inclinado de agar nutriente. Incubar a 35  0,5ºC por 24  2 horas, prosseguindo a incubação até
48  3 horas caso não tenha ocorrido formação de gás após a primeira incubação. A produção de
gás e a morfolgia típica após coloração de Gram do crescimento em ágar inclinado
(bacilos Gram negativos, pequenos, não esporulados) completa o teste para coliformes.
-Teste Completo para E.coli
Adicionalmente ao teste acima inocula-se os seguintes meios a partir de uma colônia
típica de coliforme:
a) Água triptonada ou outro meio adequado a prova de produção de Indol
b) Caldo glicosado Tamponado: para realização das provas de VM e VP
c) Agar Citrato de Simons para prova de utilização do Citrato
O conjunto destes testes denomina-se IMViC correspondendo às provas do Indol,
VM, VP e Citrato, respectivamente. E. coli pode apresentar os seguintes
rersultados: ++-- ou -+-- . Para uma explicação do fundamento destas provas veja a
prática de identificação de Bacilos Gram negativos.
3) Objetivos
Após a realização da atividade você deverá ser capaz de compreender os fundamentos
básicos dos métodos de quantificação de bactérias em água e alimentos, diferenciando a contagem
direta em placas da enumeração indireta em caldo (NMP); citar grupos de microorganismos
quantificados normalmente em alimentos; definir colimetria e citar suas fases e aplicações;
compreender a denominação NMP e UFC (unidade formadora de colônias); expressar o resultado
de uma contagem e NMP (após a consulta à tabela própria).
4)
-
Material
Frasco com amostra de água para análise
Tubos de caldo lactosado com tubos de Durhan (3 CLDuplo e 6 CLSimples)
1 pipeta de 10 mL
1 pipeta de 1 mL
1 tubo de 9,9 mL de diluente estéril
Placa estéril
1 tubo com agar padrão de contagem previamente fundido
5) Execução
Primeiro Dia
- Homogeneizar por agitação a amostra de água e inocular os tubos de caldo lactosado conforme o
esquema abaixo utilizando as pipetas estéreis;
- Diluir a amostra 100x (10-2) acrescentando 0,1 mL da amostra ao tubo com 9,9 mL de diluente.
Agitar e inocular com outra pipeta 1 mL na placa estéril. Verter o Agar pré-fundido e homogeneizar
para a incorporação homogênea do inoculo no meio através de movimentos circulares da placa;
Segundo Dia
- Proceder à leitura dos tubos positivos na colimetria e consultar a tabela para expressar o resultado
em NMP/100 mL (teste presuntivo);
- Inocular os tubos positivos na colimetria para caldo EC (teste confirmativo);
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DISCIPLINA DE BACTERIOLOGIA
CURSO: NUTRIÇÃO
- Contar as colônias no agar, multiplicar pelo fator de diluição e expressar o resultado
em UFC/mL.
Terceiro dia
-Proceder a leitura dos tubos de caldo EC (teste confirmativo)
6) Resultados e Observações
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